Datasets:

jerteh

/

PaSaz

like 0

Histological and ultrastructural alterations of rat interscapular brown adipose tissue in experimentally induced systemic hyperthyroidism

Histološke i ultrastrukturne promene interskapularnog mrkog masnog tkiva pacova u eksperimentalno indukovanom sistemskom hipertiroidizmu

Povećana telesna težina i gojaznost prouzrokovane disbalansom izmeñu unosa energije i njenog trošenja, predstavljaju rastući zdravstveni problem u svetu. Mrko masno tkivo (MMT), kao tkivo koje rasipa energiju, postaje moguće ciljno tkivo za lečenje gojaznosti. Tiroidni hormoni imaju važnu ulogu u regulaciji temperaturne homeostaze i energetskog metabolizma i uključeni su u regulaciju aktivnosti MMT. Prema tome, postojanje stalne komunikacije izmeñu tiroidne žlezde/tiroidnih hormona i masnog tkiva može biti značajno za kontrolisanje telesne težine. I dok je značaj tiroidnih hormona za ispravno funkcionisanje MMT dobro poznato, uticaj sistemskog hipertiroidizma na njegovu aktivnost još uvek nije u potpunosti shvaćen. Ova disertacija bazirana je na dve meñusobno suprotstavljene polazne pretpostavke koje se tiču mesta MMT u tiroidnoj termogenezi. Prva podrazumeva supresiju termogene funkcije MMT u sistemskom hipertiroidizmu, dok prema drugoj MMT predstavlja efektorski organ tiroidne termogeneze. Prema tome, cilj ove disertacije bio je ispitivanje efekata eksperimentalno indukovanog sistemskog hipertireoidizma na strukturno remodeliranje i termogeni kapacitet MMT, kako bi se doprinelo razjašnjavanju mehanizama njegove regulacije. Isto tako, cilj je bio analizirati razlike, ako ih ima, u efektima dva glavna tiroidna hormona, T3 i T4. Eksperiment je izveden na ukupno 18 mužjaka Wistar pacova, držanih pod standardnim laboratorijskim uslovima, na sobnoj temperaturi. Životinje iz prve eksperimentalne grupe primale su T3 u dozi od 200 =g/kg b.w., ����. dok su životinje iz druge eksperimentalne grupe primale T4 u dozi 300 =g/kg b.w.,�����., jednom dnevno, tokom pet dana. Pacovi iz treće grupe bili su tretirani samo prenosnikom, prema istom rasporedu. Histološka i histohemijska analiza MMT obavljena je na nivou svetlosne mikroskopije, korišćenjem 5 =m parafinskih preseka rutinski sprovedenog tkiva, obojenih hematoksilinom�eozinom, PAS metodom, Bodian metodom i Novelli metodom. Za detekciju apoptoze korišćen je metod bojenja propidijum�jodidom Imunohistohemijska detekcija UCP1, Ki67 i TNFα, uz korišćenje LSAB (obeleženi streptavidin�biotin) metoda, služila je za procenu efekata primenjenih tretmana na ekspresiju proteina vezanih za termogenezu, dinamiku ćelijske populacije i signalizaciju. Ultratanki preseci MMT ukalupljenog u Aralditu korišćeni su za morfološku analizu na nivou elektronske mikroskopije. Stereološka analiza rañena je na nivou svetlosne i elektronske mikroskopije. Statistička analiza razlika izmeñu vrednosti dobijenih za svaku od eksperimentalnih grupa i kontrolu vršena je Studentovim ��testom. Dobijeni rezultati pokazali su da je sistemski hipertiroidizam, bez obzira na to koji je hormon do njega doveo, izazvao rast MMT. Kod T4�tretiranih životinja ovaj rast bio je usklañen sa remodeliranjem nervne i vaskularne mreže, što nije u potpunosti bio slučaj u T3�tretiranoj grupi. Oba hormona pozitivno su uticala na termogeni kapacitet MMT, povećavajući ekspresiju UCP1. Ukazano je i na moguću pojavu transdiferencijacije unilokularnih ka termogeno kompetentnim UCP1�pozitivnim ćelijama. Stereološka anliza, meñutim, nije pokazala promene u zastupljenosti glavnih tkivnih komponenti, najverovatnije zbog kratkog trajanja eksperimenta. Na ultrastrukturnom nivou, tiroidni hormoni različito utiču na obrazac akumulacije lipida u mrkim adipocitima: u obe tretirane grupe sadržaj lipida je povećan, ali je kod T4�tretiranih životinja multilokularnost dobro očuvana, dok se posle T3� tretmana ona smanjuje. I T3 i T4 utiču na dinamiku mitohondrija, što se manifestuje pojavom mitohondrija neobičnog oblika i veličine. Posle T4�tretmana, mitohondrije uspostavljaju intenzivnije kontakte sa površinom lipidnih tela nego što je to slučaj u kontrolnoj grupi i grupi T3�tretiranih životinja. Ovo je još jedan važan podatak, s obzirom na to da topografski odnosi mitohondrija i lipidnih tela u mrkim adipocitima odražavaju metaboličko "punjenje" mitohondrija masnim kiselinama osloboñenim iz lipidnih tela i mogu da ukažu na odvijanje termogeneze u MMT T4�tretiranih pacova. Eksperimentalni dizajn korišćen u ovoj studiji obezbedio je inače retko korišćen model pogodan za ispitivanje egzogeno indukovanog hipertiroidizma na tiroidnu žlezdu. Stoga je još jedan cilj ove disertacije bio ispitivanje mogućih toksičnnih efekata T3 ili T4 na tiroidnu žlezdu. Strukturno, u tiroidnoj žlezdi je došlo do involutivnih promena. Uočene promene najverovatnije su bazirane na odsustvu citoprotektivnih efekata TSH, uz prijem jače izraženih proapoptotskih signala. Imajući u vidu činjenicu da strukturne promene tiroidne žlezde udružene sa disfunkcijom mogu zahtevati period oporavka čija je dužina nepredvidiva, ovi rezultati ukazuju na neophodan oprez prilikom korišćenja tiroidnih hormona u terapijske svrhe.

Overweight and obesity, caused by imbalance between energy intake and energy expenditure, are growing public health problem worldwide. Brown adipose tissue (BAT), as energy dissipating tissue, emerged as possible target for antiobesity therapy. Thyroid hormones play an important role in regulation of temperature homeostasis and energy metabolism and they are involved in regulation of BAT activity. Thus, continuous cross�talk between thyroid gland/hormones and adipose tissue may be important for body weight control. While the importance of thyroid hormones for proper BAT function is well known, the influence of systemic hyperthyroidism on BAT activity is not yet fully understood. This dissertation started from two directly confronted premises concerning the place of BAT in thyroid thermogenesis. The first of them implies that BAT thermogenic function in systemic hyperthyroidism is suppressed while according to the other one BAT is effectory organ of thyroid thermogenesis. Therefore, this dissertation aims to investigate the effects of experimentally induced systemic hyperthyroidism on structural remodelling and thermogenic capacity of BAT in order to shed more light on regulatory mechanisms controlling its function. Also, the aim was to analyse differences, if any, between effects of two thyroid hormones, T3 and T4. The experiment was performed on a total of 18 male Wistar rats, kept under standard laboratory conditions, at the room temperature. Animals from the first experimental group received T3 in dose of 200 =g/kg b.w., ����. while animals from the second experimental group received T4 in dose of 300 =g/kg b.w.,�����., once a day, during five days. Rats from the third group were treated with vehicle only, according to the same schedule. Histological and histochemical analyses of BAT were performed at the level of light microscopy using 5 =m thick paraffin sections of routinely processed tissue stained with hematoxylin�eosine, PAS, Bodian and Novelli methods. For detection of apoptosis, propidium iodide method was used. Immunohistochemical detection of UCP1, Ki67 and TNFα, using LSAB (labelled streptavidin�biotin) method, served to estimate the effects of applied treatments on expression of proteins related to thermogenesis, cell population dynamics and signalling. Ultrathin sections of Araldite�embedded BAT tissue samples were used for morphological analysis at the level of electron microscopy. Stereological analysis was performed at the level of light and electron microscopy. Statistical analysis regarding differences between control and each of experimental groups was performed using Student’s ��test. Obtained results showed that systemic hyperthyroidism, regardless on which hormone induced it, caused growth of BAT. In T4�treated animals this growth was synchronised with remodelling of vascular and neural networks which was not the case in T3�treated group. Both hormones positively affected BAT thermogenic capacity, which was manifested by increased expression of UCP1. Possible transdifferentiation of unilocular cells toward thermogenically competent UCP1�positive cells was also suggested. Stereological analysis, however, did not confirm the existence of changes in abundance of main tissue components, most probably due to short duration of experiment. At the ultrastructural level, thyroid hormones differently affected pattern of lipid accumulation in brown adipocytes. In both treated groups, lipid content was increased but in T4�treated animals multilocularity was well preserved, while after treatment with T3 it was reduced. Both T3 and T4 affected mitochondrial dynamics, which was manifested by the occurrence of mitochondria displaying unusual size and shape. After treatment with T4 mitochondria established more intensive contacts with surface of lipid bodies than it was noted in control and T3�treated animals. This was another important finding since topographic relation between mitochondria and lipid bodies in brown adipocytes reflects metabolic fuelling of mitochondria by fatty acids released from lipid bodies and thus may indicate that thermogenesis takes place in BAT of T4� hypethyroid rats. Experimental design used in this study provided a rarely employed model for investigating the effects of exogenously induced hyperthyroidism on thyroid gland. Therefore, another aim of this dissertation was to investigate possible toxic effects of T3 or T4 on thyroid gland. Structurally, thyroid gland was subjected to involutive changes after treatment with both T3 and T4. Observed changes are most probably based on the absence of cytoprotective effects of TSH, together with reception of more pronounced proapoptotic signals. Given that structural alterations of the thyroid gland associated with dysfunction may require an unpredictable recovery period, current findings point to necessary caution needed when thyroid hormones are used as therapeuticals.

Morfološki, genetički i fitogeografski pokazatelji diferencijacije populacija kompleksa Sesleria rigida Heuff. ex Rchb. (Poaceae)

Morphological, genetic and phytogeographical indicators of differentiation among populations of Sesleria rigida Heuff. ex Rchb. (Poaceae) complex

Vrste roda Sesleria (Seslerieae, Pooideae, Poaceae) su rasprostranjenje u većem delu Evrope, a javljaju se marginalno i u severnoj Africi (Maroko, Libija) i zapadnoj Aziji (Kavkaz). Rod obuhvata oko 40 taksona u rangu vrsta i podvrsta, rasprostranjenih na području Balkanskog poluostrva, Karpata i Alpa. Pretpostavlja se da je rod nastao u Alpima, ali je centar morfološkog i taksonomskog diverziteta na području Balkanskog poluostrva. Kako morfološki i anatomski karakteri po pravilu postepeno variraju, nije bilo lako ustanoviti kvalitativne razlike koje bi imale veći taksonomski značaj, što je dovelo do pogrešnih taksonomskih klasifikacija roda Sesleria. U skladu sa tim, evolutivna istorija, morfološka varijabilnost, rasprostranjenje i ekološke karakteristike pojedinih vrsta roda Sesleria su još uvek slabo poznati. Istraživani kompleks Sesleria rigida je rasprostranjen u Rumuniji, Bugarskoj, Srbiji, Bosni i Hercegovini i Grčkoj, a prostire se duž nekoliko planinskih venaca Balkanskog poluostrva – centralni i istočni delovi Dinarskih planina, Karpato–Balkanidi (istočni i južni Karpati, planine u severoistočnoj i istočnoj Srbiji, zapadnoj i centralnoj Bugarskoj), Rodopske planine u Bugarskoj i jugoistočnoj Srbiji i Grčkoj. Vrste ovog kompleksa su zabeležene u širokom dijapazonu nadmoskih visina (od 70 mnv do 2400 mnv), naseljavaju staništa pretežno na karbonatima, ali se mogu javiti i na serpentinitima. S obzirom na različitost stavova po pitanju taksonomije kompleksa i njegovu nedovoljnu morfološku, genetičku, fitogeografsku i ekološku istraženost,osnovni ciljevi ovog rada su: utvrñivanje areala pojedinačnih taksona, utvrñivanje osnovnih karakteristika njihovih staništa i samim tim i njihove ekološke preferencije, opisivanje varijabilnosti morfo-anatomskih karaktera, kao i genetičke varijabilnosti populacija primenom molekularnih metoda. Konačan cilj ovog rada predstavljala bi taksonomska revizija čitavog kompleksa. Areali pojedinačnih taksona su kartirani na osnovu podataka iz literature, kao i na osnovu revizija herbarskog materijala i terenskih istraživanja. Podaci o ekologiji vrsta su prikupljeni obradom literaturnih podataka, a vegetacijske grupe koje odgovaraju tipovima staništa na kojima se javljaju analizirani taksoni su utvrñene klaster i ordinacionim analizama. Varijabilnost morfo- anatomskih karaktera je utvrñena na osnovu merenja 42 morfo-anatomska karaktera. Na kraju, metodom polimorfizma dužine umnoženih fragmenata (engl. AFLP - Amplified Fragment Length Polymorphism) analizirana je genetička struktura istraživanog kompleksa. Populacioni uzorci ispitivanih vrsta kompleksa S.rigida za potrebe ovog istraživanja su sakupljeni na čitavom arealu kompleksa, od najnižih do najviših nadmorskih visina na kojima su registrovane populacije istraživanog kompleksa. Sakupljeno je ukupno 970 jedinki iz 55 populacija za anatomska istraživanja i 692 jedinke iz 48 populacija za morfometriju, kao i 218 jedinki iz 45 populacija za AFLP analize. Rezultati ove sveobuhvatne studije pokazali su jasnu morfološku, genetičku i fitogeografsku diferencijaciju unutar kompleksa Sesleria rigida. Molekularne analize (AFLP) u su pokazale visok stepen izdiferenciranosti analiziranih taksona, što je podržano morfometrijskim i fitogeografskim analizama. Izvršena je taksonomska revizija kompleksa, tako da su potvrñena četiri taksona u rangu vrste: S. achtarovii, S. filifolia, S. rigida i S. serbica. Od 42 analizirana morfo-anatomska karaktera, najbolja diskriminacija vrsta kompleksa S. rigida dobijena je na nivou karaktera anatomije listova. Iako je poznato da su variranja anatomskih karaktera kod srodnih vrsta roda Sesleria uglavnom kvantitativne prirode, ipak je na osnovu njih moguće jasno razlikovanje vrste kompleksa S. rigida. Predloženi ključ za identifikaciju četiri vrste potvrñene ovim istraživanjem, upravo se bazira prvenstveno na karakterima anatomije listova. Ustanovljene genetičke odnose, kao i morfo-anatomsku diferencijaciju, prati i jasna geografska izdiferenciranost vrsta kompleksa S. rigida. Na osnovu detaljne obrade i georeferenciranja literaturnih i herbarskih podataka, kao i terenskih opažanja, urañene su karte rasprostranjenja pojedinačnih vrsta kompleksa. Pokazalo se da ove vrste imaju izraženo alopatrijsko rasprostranjenje. Vrsta S. rigida je rasprostranjena isključivo na Karpatima u Rumuniji, gde se u oblasti Banata u Rumuniji slivom reke Černe njen areal razdvaja od areala vrste S. filifolia čiji se areal dalje nastavlja preko ogranaka Južnih Karpata u severoistočnoj Srbiji na planine Balkanskog sistema istočne Srbije, kao i zapadne i centralne Bugarske. Areal vrste S. serbica se prostire preko unutrašnjih Dinarida centralne i istočne Bosne, kao i zapadne i centralne Srbije. Na kraju, areal vrste S. achtarovii je vezan za Rodopski masiv u Bugarskoj i Grčkoj. Izražena geografska razgraničenost areala istraživanih vrsta je praćena i njihovom finom fitogeografskom izdiferenciranošću, jer su im areali smešteni u različitim fitogeografskim horionima. Na osnovu analize distribucije vrsta kompleksa u odnosu na klimatske tipove i podtipove, pokazalo se da vrste S. serbica i S. achtarovii naseljavaju različita klimatska područja. Vrsta S. serbica naseljava prostor sa ilirskim varijantama umereno-kontinentalne i planinske klime, a S. achtarovii prostor sa egejskim varijantama umereno-kontinentalne i planinske klime. Nasuprot njima, vrste S. rigida i S. filifolia naseljavaju prostor sa mezijsko-karpatskim varijantama umereno-kontinentalne i planinske klime. Jasne bioklimatske razlike u geografskom prostoru u kom se nalaze areali vrsta kompleksa S. rigida su podržane klaster i analizom osnovnih komponenti bioklimatskih parametara. Rezultati analiza fitocenološke diferencijacije vrsta S. rigida kompleksa su potvrdili njihovu izdiferenciranost opisanu i na ostalim nivoima – genetičkom, morfološkom i horološkom. Iako sve četiri istraživane vrste naseljavaju iste ili vrlo slične tipove staništa, visok procenat ukupne prosečne različitosti izmeñu četiri klastera koji grupišu snimke svih analiziranih zajednica pojedinačnih vrsta (96,86 %), ukazuje na to da su staništa na kojima se ove vrste javljaju fitocenološki jasno različite. Vrlo izražena genetička i fitocenološka diferencijacija, koju prati pre svega anatomska diferencijacija, ukazuje na to da su populacije četiri vrste potvrñene ovim istraživanjem – S. achtarovii, S. filifolia, S. rigida i S. serbica – koje danas naseljavaju četiri različita horiona, najverovatnije bile prostorno odvojene tokom dužeg perioda geološke istorije.

Species of the genus Sesleria (Seslerieae, Pooideae, Poaceae) are distributed throughout most of Europe, but could also be found marginally in Northern Africa (Morocco, Libya) and Western Asia (Caucasus). Genus comprises about 40 taxa on species and subspecies levels, distributed on Balkan Peninsula or on Carpathians and Alps. The Alps are presumed to be the place of the genus origin, but the centre of its morphological and taxonomic diversity is in Balkan Peninsula. Since morphological and anatomical characters vary gradually as a rule, it was not easy to establish qualitative differences to have greater taxonomic importance, which have led to erroneous taxonomic classifications of the genus Sesleria. The investigated Sesleria rigida complex is distributed in Romania, Bulgaria, Serbia, Bosnia and Herzegovina and Greece, extending its range throughout several mountain systems on Balkan Peninsula – Central and Eastren parts of Dinaric Mountains, Carpatho-Balkan Mountains (Eastern and Southern Carpathians, mountains in Northeastern and Eastern Serbia, Western and Central Bulgaria), Rhodopes in Bulgaria, Southeastern Serbia an Greece. The representatives of the complex can be found in a wide altitudinal range (from 70 to 2400 m a.s.l.), mostly on carbonates, but also on serpentinites. Considering the opposing opinions on the taxonomy of the complex and its insufficient morphological, genetic, phytogeographic and ecologic exploration, the main aims of this work were: to define the ranges of individual taxa, to determine basic characteristics of its habitats and accordingly their ecological preferences, variability of its morpho-anatomical characters, genetic variability by molecular methods. The final aim of this work was to revise taxonomicaly the complex. The ranges of individual taxa are charted based on literature data, as well as on the revisions of herbarium data and field explorations. Data on ecology of the species were collected by processing the literature data, and the vegetation groups corresponding the habitats where analized taxa can be found were determined by the cluster and ordination analyses. Variability of morpho-anatomical characters was determined by measuring 42 morpho-anatomical features. Finally, the genetic structure of the complex was analyzed using the Amplified Fragment Lenght Polymorphism (AFLP) method. Population samples of the investigated taxa were collected throughout the whole range of the S. rigida complex, and the entire vertical profile, from the lowest up to the highest altitudes on which the populations of the investigated complex are recorded. The total number of the collected material were 970 individuals from 55 populations for anatomical analyses, 692 individuals from 48 populations for morphometrics and 218 individuals from 45 populations for AFLP analyses. Results of this comprehensive study showed clear morphological, genetic and phytogeographical differentiation within the Sesleria rigida complex. The results of the molecular analyses (AFLP) in this study have shown the high level of differentiation of analyzed taxa, which is additionally supported by the results of morphometric and phytogeographic analyses. Taxonomic revision of the complex was carried out, hence four taxa on the species level were confirmed: S. achtarovii, S. filifolia, S. rigida i S. serbica. From the total of 42 analyzed morpho-anatomic characters, the best discrimination of the species was obtained on the basis of anatomic characters of the leaves. Although varying of the anatomic characters within related species of the Sesleria genus is known to be of quantitative significance, it is however, possible to distinguish clearly the species of the S. rigida complex thanks to these characters. Moreover, the proposed identification key to four species here confirmed is based on these very characters of the leaf anatomy. The established genetic relationships, as well as morpho-anatomical differentiation are supported by a clear geographic differentiation of the species in S. rigida complex. Distribution maps of individual species of the complex were obtained on the basis of the detail interpretation and georefferencing of literature and herbarium data, as well as field observation data. These species were shown to have an alopatric distribution. Species S. rigida is distributed exclusively on Carpathians in Romania where in the area of Banat its range separates from the range of species S. filifolia, extending from Southern Carpathians branches in Northeastern Serbia all the way to Balkan mountain system in Eastern Serbia, and Central and Western Bulgaria. The range of the species S. serbica spreads over inner Dinarides of Central and Eastern Bosnia, and also Western and Central Serbia. Finally, the range of the species S. achtarovii is tied to Rhodopes in Bulgaria and Greece. The clear geographic differentiation in ranges of the investigated taxa is accompanied also by their fine phytogeographic differentiation, since their ranges are confined to the different phytochorions. Based on the distribution analyses of the species in relation to climate types and sub- types, it was shown that species S. serbica and S. achtarovii inhabit the areas with the specific climate. While S. serbica inhabits areas with the illyric variants of the temperate and mountain climate, S. achtarovii inhabits areas with the aegeian variants of the temperate and mountain climate. On the other hand, species S. rigida and S. filifolia inhabit areas with moesian- Carpathian variants of the temperate and mountain climate. Clear bioclimatic differences in ranges within species of S. rigida complex are supported by the cluster analysis and also the Principal component analysis of bioclimatic parameters. Results of the phytocoenological differentiation analyses of species within S. rigida complex have confirmed their differentiation, which was also described on several other levels – genetic, morphological and chorological. Although all the four investigated taxa inhabit the same or very similar habitat types, high percent of overall average difference amongst the four clusters comprising the stands of individual species (96,89 %), points to the obvious phytocoenological separation of their habitats. Highly expressed genetic and phytocoenological differentiation, additionally supported by anatomical differentiation, points to the fact that the populations of four species, confirmed in this study – S. achtarovii, S. filifolia, S. rigida i S. serbica –inhabiting today four different chorions, were probably spatially separated during the long period in geological history.

Govorno jezički razvoj kod dece sa intrakranijalnim krvarenjem na rođenju

Speech and language development at children with intracranial hemorrhage at birth

Prema izveštaju publikovanom od strane Instituta za Medicinu u Sjedinjenom Američkim Državama, stopa prevremeno rođene a samim tim rizične dece je povećana za više od 30 procenata u poslednje dve dekade. U Evropi 5-10% dece rađa se pre vremena. Prospektivno i longitidunalno praćenje ove populacije, pokazuje da ta deca u kasnijem uzrastu imaju neurorazvojne poremećaje u znatno većoj meri od opšte populacije. U ovom istraživanju praćene su dve grupe dece, sa cerebralnom paralizom i intrakranijalnom hemoragijom prvog i drugog stepena. Konstantovano je da poslednjih 40 godina nema značajnih promena u pogledu učestalosti cerebralne paralize i da je njena prevencija za sada nedovoljno efikasna. Učestalost u svetu varira od 0,5 do 6% (promila), u proseku se kreće 2 do 3% na 1000 rođenih, 2 do 3 deteta su su sa cerebralnom paralizom. Intrakranijalna krvarenja prvog i drugog stepena često se nazivaju i tzv. nekomplikovana krvarenja i retko uzrokuju trajne motoričke i kognitivne deficite, dok prema nekim autorima 30% ove dece ispoljava neki neurorazvojni poremećaj. Ovo istraživanje je obuhvatilo prospektivno praćenje govorno-jezičkog razvoja 62–je novorođenčadi do navršene treće godine života. Sva deca su bila pacijenti Specijalne bolnice ѕa cerebralnu paralizu i razvojnu neurologiju u Beogradu. Polovinu uzorka (31) su činila novorođenčad kod kojih je dijagnostikovana intrakranijalna hemoragija prvog i drugog stepena (I /II). Deca su u našu ustanovu došla sa postavljenom dijagnozom (ultrazvuk) i upućena su na praćenje psihomotornog razvoja. Druga polovina uzorka (31) bila su visoko rizična deca, koja su vođena kao cerebralno ugrožena deca, ili zaostajenje u psihomotornom razvoju a kod svih (31) je do treće godine pre ili kasnije u našoj ustanovi potvrđena dijagnoza cerebralna paraliza. Sva deca su timski obrađena i prošla su sve preglede : fizijatrijski (dečji fizijatar), neurološki, logopedski i psihološki. Iz istraživanja su isključena deca sa sličnim neurološkim stanjima i sindromima. U istraživanju su korišćeni Dijagnostički komplet za ispitivanje sposobnosti govora, jezika, čitanja i pisanja (Jadranka Bjelica, Ilona Posohova, Zagreb 2001) i Testovi za ispitivanje dizartrije (Filičeva, Čeveljeva 1987; Mastjukova 1989,1997). Postavljene hipoteze o kašnjenju prejezičkog razvoja dece sa intrakranijalnom hemoragijom I/II i cerebralnom paralizom potvrđene su u celini. Kašnjenje u govorno jezičkom razvoju između prve i treće godine kod obe grupe dece je nastavljeno. Ono se ispoljilo kod pojave prvih reči, fonda reči i rečnika i kvaliteta izgovora glasova. Njihova postignuća u svim oblastima ispitivanja bila su ispod normi tipičnog razvoja. Deca sa intrakranijalnom hemoragijom I/II stepena sa navršenom trećom godinom života, uspela su da dostignu tipičan nivo govorno jezičkog razvoja. Ovim je potvrđena i ta postavljena hipoteza. Najintenzivniji skok u oblasti govorno jezičkog razvoja kod dece sa intrakranijalnom hemoragijom I/II bio je u periodu između 30 i 36 meseca života. Govorno jezički razvoj dece sa cerebralnom paralizom na uzrastu 3 godine i dalje kasni. Njima je neophodna intenzivna logopedska terapija i habilitacija.

According to the report published by the Institute of Medicine (U.S), the rate of prematurely born children, therefore children born with riscs, has increased more than 30 percent in the last two decades. In Europe, 5-10% of children are born prematurely. Prospective and longitudinal study of this population shows that number of preterm children with neurodevelopmental disorders at later age is significantly greater than in the general population. This study observed two groups of children, children with cerebral palsy and children with intracranial hemorrhage of first and second degree. It has been concluded that in the last 40 years, there has been no significant changes in the incidence of cerebral palsy and that its prevention is not efficient enough, for now. The incidence in the world ranges from 0.5 to 6% (per thousand), on average from 2 to 3% per 1000 births, 2 to 3 children are born with cerebral palsy. Intracranial hemorrhage of first and second degree, often referred to as uncomplicated hemorrhage, rarely causes permanent motor and cognitive deficits, while according to some authors, 30% of these children manifest some neurodevelopmental disorders. This study included a prospective followup of speech and language development of 62 newborns up to the age of three. All of the children were patients of the Special Hospital for Cerebral Palsy and Developmental Neurology in Belgrade. Half of the sample (31) consisted of infants who were diagnosed with intracranial hemorrhage of first and second degree I/II. These children came to our institution with established diagnosis (ultrasound), and they were referred for psychomotor development monitoring. The other half of the sample (31) were children born with highrisk, they were administered as cerebrally compromised, or children with a delay in psychomotor development, all of these children (31) were diagnosed with cerebral palsy until their third year. All the children were examined by the team of specialists and subjected to the checks: physiatric (pediatric physiatrist), neurological, speech therapy and psychological. Children with similar neurological conditions and syndromes were excluded from the study. A diagnostic kit for examination of capacities for speech, language, reading and writing (Jadranka Bjelica, Iliona Posokhova, Zagreb 2001.) and Assessment of dysarthria (Filičeva, Čeveljeva 1987; Mastjukova 1989, 1997) were used in the study. The proposed hypothesis about the delayed prelingual development in children with intracranial hemorrhage I/II and cerebral palsy were confirmed in general. The delay in speech and language development between the first and the third year in both groups of was continued. It was manifested with the appearance of the first words, vocabulary and a quality of pronunciation. Their achievements in all of the examined areas were below the norms of typical development. Children with intracranial hemorrhage I/II degree have managed to reach the typical level of a speech and language development by the age of three. This confirms proposed hypotheses. The most intensive leap in the field of speech and language development in children with intracranial hemorrhage I/II, was between 30 and 36 months of age. Speech and language development in children with cerebral palsy was still delayed at the age of three. For those children, intensive speech therapy and habilitation is necessary.

Molekulske osnove strukturnog remodeliranja mitohondrija indukovanog kalcijumom i insulinom u mrkim adipocitima pacova

Molecular basis of mitochondrial structural remodeling induced by calcium and insulin in rat brown adipocytes

Osnovna uloga mrkog masnog tkiva je održanje tjelesne temperature i održanje energetske homeostaze organizma. Izlaganje hladnoći, a i povećan unos hrane, dovodi do stimulacije, proliferacije i diferencijacije mrkih adipocita, što je praćeno remodeliranjem mitohondrija, termogenih organela mrkih adipocita. U okviru strukturnog remodeliranja mitohondrije pokazuju širok dijapazon morfoloških promjena (broj mitohondrija u ćeliji, srednji dijametar, fuzija i fisija mitohondrija, volumenska gustina kristi) što je povezano sa prisustvom pojedinih kompleksa elektron transportnog lanca, ATP sintaze, familije UCP proteina, posebno UCP1, a i drugih proteina unutrašnje membrane mitohondrija. Kalcijum igra veoma važnu ulogu u termogenezi, njegova koncentracija u citoplazmi i organelama mrkih adipocita je hormonski regulisana, prije svega noradrenalinom. Mitohondrije, s jedne strane, imaju važnu ulogu u oblikovanju signalnih puteva kalcijuma, a kalcijum, s druge strane, u fiziološkim koncentracijama stimuliše mitohondrijalni metabolizam i povećava produkciju energije, dok u visokim koncentracijama indukuje apoptozu. Insulin je jedan od glavnih modulatora termogene funkcije mrkih adipocita, gdje stimuliše sintezu i deponovanje lipida u mrkim adipocitima, proliferaciju mrkih adipocita, angiogenezu i vazodilataciju. Pokazano je da insulin utiče na aktivnost elektron transportnog lanca, a i da mitohondrije pojačavaju insulinsku osjetljivost putem redoks regulacije proteina tirozin kinaze i insulinskog receptora. Cilj ove doktorske disertacije je rasvjetljavanje kako kalcijum, s jedne strane, a insulin, s druge strane, utiču na molekulske mehanizme koje su uključene u strukturno remodeliranje mitohondrija mrkih adipocita pacova. U eksperimentu su korišćeni Wistar pacovi, starosti dva mjeseca. U eksperimentu sa Ca-SANDOZ, životinje su podijeljene u dve grupe, jedna je pila Ca-SANDOZ rastvoren u vodi, a druga, kontrolna, česmensku vodu, tri dana. U eksperimentu sa insulinom, pacovi su podijeljeni u šest grupa, četiri grupe su primale nisku (0.4 IU) ili visoku (4 IU) dozu insulina i to jedan (akutno) ili tri dana (hronično). Ostale dvije grupe, kontrolne, su primale fiziološki rastvor akutno ili hronično. Trećeg dana tretmana Ca-SANDOZ, odnosno tri sata poslije posljednjeg tretmana insulinom, životinje su žrtvovane dekapitacijom, a interskapularni depo BAT je izolovan i pripremljen za biohemijske, mikroskopske i molekularno-biološke analize, i za izolaciju mitohondrijalnih frakcija. BAT i mitohondrijama bogata frakcija su analizirane Western Blot analizom, imunohistohemijskom, imunofluorescentnom i imunogold analizama, ultrastukturnim i stereološkim analizama, a analizirana je i aktivnost ATP sintaze...

Essential role of brown adipose tissue is maintaining body temperature and energy homeostasis of organism. Exposure to cold and increased diet intake lead to stimulation, proliferation and differentiation of brown adipocytes, what is followed by remodeling of mitochondria, thermogenic organelles of brown adipocytes. In the context of structural remodeling, mitochondria show wide repertoire of morphological changes (e.g. mitochondria number in cell, mean diameter, fusion and fission of mitochondria, volume density of mitochondrial cristae) what is connected with abundance of components of electron transport chain (ETC), ATP synthase, UCP proteins - especially UCP1 protein, and other proteins of inner mitochondrial membrane. Calcium plays important role in thermogenesis, and its concentration in cytosol and organelles of brown adipocytes is hormone regulated, particularly by noradrenaline. Mitochondria has essential role in shaping calcium signaling pathways, and calcium, on other hand, stimulates mitochondrial metabolism and increases energy production, but in high concentrations induces apoptosis. Insulin is one of major modulators of thermogenic function of brown adipocytes, and stimulates synthesis and storage of lipids in brown adipocytes, proliferation of brown adipocytes, angiogenesis and vasodilatation. It is showed that insulin has effect on electron transport chain activity, but also mitochondria enhances insulin sensitivity via redox regulation of tyrosine kinases and insulin receptor. The aim of this doctoral dissertation is elucidation how calcium and insulin effect on molecular mechanisms involved in structural remodeling of mitochondria of rat brown adipocytes. Two-month-old male Wistar rats were used. In Ca-SANDOZ study, they were divided into two groups - Ca-SANDOZ drinking or tap water drinking for three days. In insulin experiment, rats were divided into six groups, where four groups treated with low (0.4 IU) or high (4 IU) dose of insulin, for one (acutely) or three (chronically) days. Another two groups served as control, treated with 0.9% saline solution for one or three days. On third day of Ca-SANDOZ treatment, or three hours after last administration of insulin, they were sacrificed by decapitation, and interscapular portion of BAT was isolated and prepared for biochemical, microscopic and molecular biology analyses, also for isolation of mitochondria-enriched BAT fraction. BAT and mitochondria-enriched fraction were analyzed by Western blot analysis, imunohistochemical, immunofluorescent, immunogold, ultrastructural and stereological analyses. Also, ATP synthase activity was measured...

Vaskularna flora brdsko-planinskog područja severozapadne Srbije i Šumadije - ekološko fitogeografska studija

Vascular flora of mountainous areas of northwestern Serbia and Šumadija regions - ecological phytogeographical study

Cilj ovog rada je utvrđivanje ukupnog broja taksona u rangu vrsta i podvrsta u flori dela severozapadne Srbije i Šumadije. Na osnovu višegodišnjih terenskih istraživanja i sagledavanja postojeće literaturne građe, formirana je obimna herbarska zbirka i prikupljena velika količina florističkih i ekoloških informacija, uobličenih u vidu baze podataka, koji govore o strukturnim karakteristikama i zakonitostima formiranja flore na pomenutom području. Sistematskim terenskim istraživanjima i na osnovu malobrojnih publikovanih referenci koje se odnose na florističku i fitocenološku literaturu utvrđeno je da floru severozapadne Srbije i Šumadije izgrađuje 1333 taksona u rangu vrste i podvrste svrstanih u 535 rodova i 115 familija. Rezultati ovog rada predstavljaju listu u kojoj je predstavljen svaki pojedinačni takson zabeležen u flori severozapadne Srbije i Šumadije uz navođenje svih lokaliteta na kojima je na navedenom području takson konstatovan. U odnosu na izvore podataka, tip rasprostranjenja i ekološke karakteristike svakog pojedinačnog taksona, prikazan je kritički osvrt na kvalitet i pouzdanost literaturnih podataka koji se odnose na floru ovog područja. Na osnovu opšteg rasprostranjenja, za svaki pojedinačni takson određen je florni element i pripadnost određenom areal tipu i areal grupi. Za svaki takson je određena detaljna životna forma, gde su prikazane i njegove ekološke karakteristike, koje podrazumevaju detaljne karakteristike staništa, dijapazone nadmorskih visina i tipove geološke podloge i vegetacije koje naseljava taj takson na istraživanom području. Od ukupnog broja taksona dominiraju skrivenosemenice sa prisutnih 1302 taksona. Od ovog broja 1070 vrsta i podvrsta pripada klasi Dicotyledones, obuhvatajući 94 familije i 418 rodova. Skrivenosemenice iz klase Monocotyledones predstavljene su sa 12 familija, 100 rodova i 229 vrsta i podvrsta. Pteridophyta obuhvataju 8 familija, 11 rodova i 26 taksona. Klasa Gymnospermae zastupljena je sa svega 2 familije, 6 rodova i 8 vrsta. Analize taksona flore severozapadne Srbije i Šumadije, ukazuju da se po broju zastupljenih taksona dominantne familije Compositae (Asteraceae), Graminea (Poaceae), Leguminosae (Fabaceae), Labiatae (Lamiaceae), Rosaceae, Cruciferae (Brassicaceae) i Umbelliferae (Apiaceae) itd. Analiza takođe pokazuje da su po brojnosti posebno ističu rodovi Carex, Veronica, Vicia, Euphorbia, Hieracium+(Pilosellla) Trifolium, Lathyrus, Ranunculus, Galium, Allium, Silene, Potentilla, Geranium, Campanula, Dianthus, Festuca, Bromus, Hieracium, Stachys itd. Fitogeografska analiza flore severozapadne Srbije i Šumadije pokazuje dominaciju evroazijskog (27%) i srednjeevropskog areal tipa taksona (19,1%), pri čemu ova dva areal tipa čine blizu polovine ukupne flore severozapadne Srbije i Šumadije, što je s obzirom na geografski položaj istraživanog područja i očekivano. Značajan procenat flore istraživanog područja pripada i mediteransko-submediteranskom areal tipu (15,9%), što ukazuje na relativnu blizinu mediteranskim klimatskim uticajima i otvorenošću prostora ka Mediteranu. Evroazijsko-planinski areal je zastupljen sa 10,1%, što ukazuje na značajno prisustvo planinskih sistema, odnosno teritorija sa izraženom nadmorskom visinom u istraživanom području. Areal tip adventivnih i kultivisanih biljaka sa prisutnih (8,7%) kao i pontski areal tip sa približno 6% zastupljenosti u ukupnoj flori sevrozapadne Srbije i Šumadije ukazuju na relativno veliki uticaj antropogenog faktora na datom području. Ostali areal tipovi su slabije zastupljeni u flori severozapadne Srbije i Šumadije. Spektar životnih formi ukazuje da flora severozapadne Srbije i Šumadije ispoljava dominantno hemikriptofitski karakter, jer najveći broj predstavnika (46,59%) pripada višegodišnjim zeljastim hemikriptofitama, što je pod uticajem kontinentalne klime koja vlada u centralnim delovima Balkanskog poluostrva i uticajem planinske klime na većim nadmorskim visinama. Druge po zastupljenosti u istraživanom području su terofitne jednogodišnje biljke zastupljene sa (18,23%), što ukazuje na značajan submediteranski uticaj. Sledeće po zastupljenosti su geofite (12,68%) i fanerofite (10,42%), dok su ostale životne forme zastupljene sa skromnim udelom. Analize ekoloških karakteristika flore severozapadne Srbje i Šumadije podrazumevale su utvrđivanja preferencije svakog pojedinačnog taksona u odnosu na dijapazone nadmorskih visina, tipove staništa, tipove vegetacije i tipove geološke podloge, koje svaka od njih naseljava. Uticaj nadmorske visine na floru istraživanog područja analiziran je u šest različitih dijapazona, pri čemu je za širinu pojasa odabrana visinska razlika od 250 m. Analiza pokazuju da je najveći apsolutni broj taksona zabeležen u visinskom pojasu 500-750 m (78,16%), sledi visinski pojas 250-500 m (70,06%), a zona 750-1000 m se takođe karakteriše većim brojem taksona (59,86%). Najmanji broj taksona registrovan je na visinama između 1250 i 1500 m, odnosno svega 4,13% od ukupnog broja registrovanih taksona. Najveći broj vrsta i podvrsta konstatovan je u okviru šumskih staništa (65,86% ukupne flore ispitivanog područja), dok je nešto manji broj taksona zabeležen na travnatim tipovima staništa (57,83%). Znatno manji broj biljaka javlja se u šumskim progalama 20,85%), dok su ruderalni tipovi staništa zastupljeni sa 19,27% od ukupnog broja taksona ispitivanog područja. Ostali tipovi staništa su znatno manje zastupljeni. U odnosu na vegetacijsku pripadnost staništa najveći broj vrsta i podvrsta registrovan je u svezi Quercion petraeae-cerris (37,05%) i vegetacijskog reda Festucetalia valesiacae (33,75%). Treća po zastupljenosti u odnosu na ukupan broj vrsta i podvrsta je sveza Fagion (28,28%), zatim slede sveze Quercion frainetto i Orno-Ericion sa preko 20% prisutnih taksona. Ostale vegetacijske klase su zastupljena sa znatno manjim brojem taksona. Analiza florističkog bogatstva i diverziteta u odnosu na različite tipove geološke podloge pokazala je da je ubedljivo najveće bogatstvo vrsta (S), čak 958 ili 71,6% ukupne flore, registovano na karbonatima. Na serpentinitima je registrovano 800 taksona (59,8%), a na silikatima 793 taksona (59,3%). Ostali parametri diverziteta pokazuju veoma ujednačene vrednosti za sva tri tipa geološke podloge. Pored toga, nekoliko statističkih analiza je pokazalo da a) određeni tipovi staništa na serpentinitu pokazuju veći floristički diverzitet nego ekvivalentni tipovi staništa na drugim geološkim podlogama; b) sličnost u okviru istog tipa staništa serpentinskih, karbonatnih i silikatnih flora veća je od sličnosti između različitih serpentinskih flora različitih tipova staništa i c) ekološki faktori kao što su vlažnost i tip staništa imaju veći uticaj na diferencijaciju flore u odnosu na tip geološke podloge. Na prostoru brdsko-planinskog područja severozapadne Srbije i Šumadije konstatovano je prisustvo 45 endemičnih taksona u rangu vrste i podvrste, što u odnosu na ukupan broj taksona pomenutog istraživanog područja iznosi 3,37% U okviru trans-regionalnih balkanskih endemita istraživanog područja severozapadne Srbije i Šumadije zabeleženo je 32 taksona (gotovo 70% ukupnog broja), zabeleženo je i 9 regionalnih endemita, kao i 4 lokalna Knautia pancicii, Edraianthus canescens, Thymus adamovicii i Salvia pratensis subsp. pozegensis. U Evropsku crvenu listu istraživanog područja uvršćen je 151 takson, što čini 11,33% ukupnog broja taksona na istraživanom području. Biljke koje su na Listi strogo zaštićenih biljnih vrsta biljaka, životinja i gljiva, na teritoriji Srbije čini grupa od 36 taksona, odnosno 2,7% ukupnog broja vaskularnih biljaka prisutnih u flori severozapadne Srbije i Šumadije. Na Listi zaštićenih divljih vrsta biljaka, životinja i gljiva nalazi se 127 vrsta i podvrsta, odnosno 9,52 % ukupnog broja vaskularnih biljaka prisutnih na području severozapadne Srbije i Šumadije.

The objective of this research was to determine the total number of taxa at the level of species and subspecies in the flora of part of north-western Serbia and Šumadija. Based on field and literature surveys conducted over a number of years, an extensive herbarium collection was made and vast amounts of floristic and ecological data were collected and organised in a database on the structural characteristics and patterns of formation of the flora in the study area. As determined by systematic field surveys and based on very few published references available on floristic and phytocoenological data, the flora of north-western Serbia and Šumadija includes 1333 taxa at the level of species and subspecies classified into 535 genera and 115 families. Research results are reported in the form of a list presenting each individual taxon recorded in the flora of north-western Serbia and Šumadija and indicating its locations in the area surveyed. In terms of sources of information and type of distribution and ecological characteristics of each individual taxon, a critical review of the quality and reliability of literature data on the flora of this region is given. Based on their general distribution, the taxa were classified into floral elements, range types and range groups. Detailed life forms were determined for all taxa, with data provided on their ecological characteristics, including detailed habitat characteristics, altitude ranges and types of geological substrate and vegetation inhabited by each individual taxon in the study area. Among the taxa, flowering plants predominate with 1302 taxa, including 1070 species and subspecies that belong to the class Dicotyledones, making up 94 families and 418 genera; and flowering plants of the class Monocotyledones comprising 12 families, 100 genera and 229 species and subspecies. Pteridophyta are represented by 8 families, 11 genera and 26 taxa. Gymnospermae embrace only 2 families, 6 genera and 8 species. The taxonomic analysis of the flora of north-western Serbia and Šumadija shows that the following families predominate in terms of the number of taxa: Compositae (Asteraceae), Graminea (Poaceae), Leguminosae (Fabaceae), Labiatae (Lamiaceae), Rosaceae, Cruciferae (Brassicaceae) and Umbelliferae (Apiaceae) etc. Moreover, the most abundant genera are Carex, Veronica, Vicia, Euphorbia, Hieracium (incl. Pilosella) Trifolium, Lathyrus, Ranunculus, Galium, Allium, Silene, Potentilla, Geranium, Campanula, Dianthus, Festuca, Bromus, Hieracium, Stachys etc. The phytogeographical analysis of the flora of north-western Serbia and Šumadija shows the predominance of the Eurasian range type (27%) and Central European range type (19.1%), the two range types accounting for almost half of the total flora of north-western Serbia and Šumadija, as expected given the geographical location of the study area. A significant percentage of the flora belongs to the Mediterranean-sub-Mediterranean range type (15.9%), suggesting relative closeness to the impact of the Mediterranean climate and the region's openness to the Mediterranean. The Eurasian Mountain range covers 10.1%, indicating a significant presence of mountain systems or high-altitude areas in the region analysed. The Adventive and Cultivated Plants range type and Pontic range type, accounting for 8.7% and almost 6% of the total flora of north-western Serbia and Šumadija, respectively, suggest a relatively high impact of anthropogenic factors in the region. The presence of other range types in the flora of north-western Serbia and Šumadija is low. The spectrum of life forms shows that the flora of north-western Serbia and Šumadija exhibits a predominantly hemicryptophytic character, since most representatives (46.95%) belong to herbaceous perennial plants, as affected by both the continental climate of the central parts of the Balkan Peninsula and the mountain climate at high elevations. They are followed by annual therophytes (18.23%), which is indicative of a significant impact of the warm Mediterranean climate. Geophytes (12.68%) and phanerophytes (10.42%) follow, along with a minor presence of other life forms. The analysis of the ecological characteristics of the flora of north-western Serbia and Šumadija involved determination of preferences of each individual taxon with respect to altitude range, habitat type, vegetation type and type of geological substrate inhabited by each of them. The effect of altitude on the flora of the study area was analysed at six different ranges, with the altitude difference of 250 m taken as belt width. The analysis shows that the highest absolute number of taxa was recorded in the altitudinal belt 500-750 m (78.16%), followed by the altitudinal belt 250-500 m (70.06%) and the zone 750-1000 m (59.86%). The lowest number of taxa was recorded at altitudes between 1250 and 1500 m, i.e. as low as 4.13% of the total number of taxa recorded. The highest number of species and subspecies was recorded in forest habitats (65.86%) of the total flora of the area surveyed, and fewer taxa were recorded in grassland habitats (57.83%). A considerably lower number of plants occur in forest gaps (20.85%), and those found in ruderal habitats account for 19.27% of the total number of taxa in the study area. Other habitat types are present to a much lesser extent. In terms of vegetation type, the highest numbers of species and species were recorded in the alliance Quercion petraeae-cerris (37.05%) and the order Festucetalia valesiacae (33.75%), followed by the alliance Fagion (28.28%) and the alliances Quercion frainetto and Orno-Ericion with over 20% taxa present. Other vegetation classes include a considerably lower number of taxa. The analysis of species richness and diversity with respect to the distinct geological substrates inhabited by the species recorded in the survey showed that by far the highest species richness (S), 958 or 71.6% of the total flora, was recorded on carbonates. Eight hundred taxa (59.8%) were recorded on serpentinites and 793 taxa (59.3%) on silicates. Other parameters of floristic diversity were found to have uniform values for the three geological substrates. Furthermore, several statistical analyses showed that a) the particular habitat types on serpentinites exhibit greater floristic diversity than the equivalent habitat types on other geological substrates, b) similarity within the same habitat type of serpentinite, carbonate and silicate floras is greater than the similarity between the different serpentine floras of the different habitat types and c) environmental factors such as moisture and habitat type have a larger impact on the differentiation of the flora, compared to the type of geological substrate. In the uplands of north-western Serbia and Šumadija, 45 endemic taxa at the level of species and subspecies were recorded, accounting for 3.37% of the total number of taxa in the study area. Within the trans-regional Balkan endemites of north-western Serbia and Šumadija, 32 taxa (almost 70% of the total number) were recorded. In addition, 9 regional endemites and 4 local endemites Knautia pancicii, Edraianthus canescens, Thymus adamovicii and Salvia pratensis subsp. pozegensis were recorded. The European Red List includes 151 taxa, which make up 11.33% of the total number of taxa in the study area. The plants on the List of Strictly Protected Plant, Animal and Fungal Species in Serbia include a group of 36 taxa, accounting for 2.7% of the total number of vascular plants in the flora of north-western Serbia and Šumadija. The List of Protected Wild Species of Plants, Animals and Fungi includes 127 species and subspecies i.e. 9.52% of the total number of vascular plants present in north-western Serbia and Šumadija surveyed in this study.

Uloga donora ugljen-monoksida CORM-A1 u modulaciji eksperimentalno indukovanog dijabetesa tipa 1 kod C57BL/6 miševa

The role of carbon monoxide-releasing molecule CORM-A1 in modulation of experimentally induced type 1 diabetes in C57BL/6 mice.

Dijabetes tipa 1 (DT1) je autoimunsko inflamatorno oboljenje koje se razvija kao posledica uništavanja  ćelija pankreasa posredstvom autoagresivnih ćelija i njihovih pro-inflamatornih medijatora. Glavno obeležje DT1 je insulitis – infiltracija pankreasa populacijama imunskih ćelija. Makrofagi se smatraju prvim ćelijama koje infiltriraju pankreasna ostrvca i imaju važnu ulogu u aktivaciji autoreaktivnih T ćelija. Smatra se da klasiĉno aktivisani M1 makrofagi doprinose razvoju i progresiji bolesti, dok alternativno aktivisani M2 makrofagi uĉestvuju u njenom spreĉavanju. B limfociti imaju ulogu u produkciji autoantitela, dok su T (CD4+ i CD8+) ćelije jedne od glavnih efektorskih ćelija koje su ukljuĉene u ubijanje  ćelija. Citokini koje sekretuju razliĉite imunske ćelije, ukljuĉujući makrofage i T ćelije, mogu da regulišu u kom smeru će se razviti imunski odgovor: ka Th1 (engl. T helper) dijabetogenom odgovoru ili Th2 protektivnom odgovoru. Aktivisani makrofagi, pomoćniĉki i citotoksiĉni T limfociti, kao i sekretovani pro-inflamatorni medijatori, sinergistiĉki uĉestvuju u razaranju  ćelija i razliĉitim mehanizmima pokreću apoptozu ovih ćelija, što rezultuje nastankom autoimunskog DT1. Kako terapija DT1 uglavnom podrazumeva primenu egzogenog insulina, sve više se istražuju novi terapijski pristupi koji bi spreĉili ili usporili pokrenuti autoimunski odgovor. Ugljen monoksid (CO) je potencijalni kandidat za tretman autoimunskih bolesti, kao što je DT1, zbog svojih anti-inflamatornih i anti- apoptotskih karakteristika. CO nastaje u organizmu delovanjem enzima hem oksigenaze (HO) koja razgraĊuje hem do CO, biliverdina i gvožĊa. Uprkos izuzetnoj toksiĉnosti u visokim koncentracijama, primenjen u niskim koncentracijama egzogeni CO ima terapijski potencijal kao anti-inflamatorni agens koji moduliše brojna imuno- inflamatorna stanja. Sintetisana metalo-organska jedinjenja koja oslobaĊaju CO (CORM engl. Carbon Monoxide Releasnig Molecule) predstavljaju grupu jedinjenja sposobnih da otpuštaju CO na kontrolisani naĉin u ćelijskim sistemima. Jedno od brojnih CORM je i CORM-A1 koji se izdvaja od ostalih jedinjenja jer je rastvorljiv u vodi, ne sadrži prelazne metale u svojoj strukturi i vreme poluživota ovog jedinjenja u fiziološkim uslovima je 21,4 minut. U ovoj studiji je po prvi put ispitivan terapijski potencijal CORM-A1 u modelu DT1 izazvanog davanjem višestrukih malih doza streptozotocina (VMDS). UtvrĊivani su ćelijski i molekulski mehanizmi pokrenuti u odgovoru na tretman CORM-A1 u imunskim ćelijama, kao i efekti donora CO na nivou ciljnog tkiva,  ćelija pankreasnih ostrvaca u in vitro uslovima. U in vitro uslovima tretman CORM-A1 nije bio toksiĉan za ćelije limfnog ĉvora, niti je uticao na proliferaciju i aktivaciju ovih ćelija stimulisanih anti-CD3/anti-CD28 antitelima. MeĊutim, u prisustvu CORM-A1 bila je smanjena sekrecija pro- inflamatornih citokina IFN- i IL-17, kao i procenat ćelija koje produkuju ove citokine, Th1 (CD4+IFN-+) i Th17 (CD4+IL-17+) ćelija, respektivno, dok je procenat Th2 (CD4+IL-4+) ćelija bio povećan. TakoĊe, pod uticajem donora CO bila je smanjena ekspresija transkripcionog faktora RORT, koji uĉestvuje u diferencijaciji Th17 ćelija, dok ekspresija transkripcionih faktora Th1 i Th2 ćelija nije bila promenjena. Davanje CORM-A1 u ranom ili kasnom profilaktiĉkom, kao i terapijskom režimu, spreĉilo je razvoj hiperglikemije u modelu DT1 izazvanim VMDS kod osetljivog visokosrodnog soja miševa C57BL/6. Kliniĉka slika bila je praćena povećanom sekrecijom insulina, smanjenim insulitisom i manjim oštećenjem pankreasnih ostrvaca nakon tretmana CORM-A1. Kod eksperimentalnih miševa koji su primali CORM-A1 bio je smanjen procenat pro-inflamatornih M1 makrofaga i produkcija njihovih medijatora u peritoneumskoj šupljini, kao i Th1 odgovor u slezini, dok je u pankreasnim drenirajućim limfnim ĉvorovima bila favorizovana diferencijacija Th2 ćelija. Na nivou pankreasa davanje agensa koji oslobaĊa CO smanjilo je ulazak M1 makrofaga, B, CD4+ i CD8+ limfocita. TakoĊe, imunomodulatorni efekti CORM-A1 na nivou ciljnog tkiva ukljuĉivali su smanjeno prisustvo Th1 ćelija i povećanu zastupljenost anti-inflamatornih Th2 ćelija. Smanjena diferencijacija Th1 ćelija merena ex vivo bila je povezana sa manjom aktivacijom transkripcionog faktora STAT4 kod miševa koji su primali VMDS + CORM-A1. Osim efekata na imunske ćelije, tretman CORM-A1 ispoljio je direktno citoprotektivno dejstvo na nivou pankreasnih ostrvaca i  ćelija u in vitro uslovima. Naime, primena donora CO redukovala je smrt pankreasnih ostrvaca i ćelija insulinoma poreklom iz miša (MIN6) i pacova (RINm5F) izazvanu pro-inflamatornim citokinima. Anti-apoptotsko dejstvo CORM-A1 ukljuĉivalo je smanjenu koliĉinu citohroma c i manju aktivaciju egzekutorske kaspaze-3. Citoprotektivni efekti bili su poništeni kada je primenjena inaktivna forma CORM-A1, koja ne otpušta CO, ili hemoglobin, koji funkcioniše kao hvataĉ CO. Rezultati ove disertacije ukazuju da se farmakološka primena CO upotrebom donora CORM-A1 predstavlja potencijalni terapijski pristup za tretman inflamatornih i autoimunskih oboljenja, ukljuĉujući i DT1.

Type 1 diabetes (T1D), an autoimmune inflammatory disorder, develops as a consequence of pancreatic beta cell destruction mediated by various pro-inflammatory mediators. The major hallmark of T1D is infiltration of different populations of immune cells into pancreas called insulitis. Macrophages are the first cell types to infiltrate the pancreatic islets and play essential role in the development and activation of autoreactive T cells. Classically activated M1 macrophages are involved in disease development and progression, while alternatively activated M2 macrophages participate in disease suppression. B lymphocytes produce autoantibodies against pancreatic  cell antigens, and T cells are known to play a crucial role as final effectors that kill  cells. Cytokines secreted by various immune cells, including macrophages and T cells, may regulate the direction of the immune response toward helper T (Th) 1 cells, related to diabetes development, or Th2 response, which has protective role in T1D. Therefore, the activated macrophages, Th and cytotoxic T cells, as well as secreted pro- inflammatory mediators, act synergistically in destruction of  cells through different mechanisms, resulting in development of autoimmune T1D. Since current T1D therapy mainly involves insulin replacement, constant efforts are being directed toward establishing novel therapeutic approaches that could inhibit or suppress autoimmune response. Carbon monoxide (CO) could be a potential therapeutic molecule for the treatment of autoimmune diseases, such as T1D, due to its anti-inflammatory and anti- apoptotic abilities. CO, together with biliverdin and iron, arises endogenously from degradation of heme molecules by heme oxygenase (HO) enzyme. Despite extreme toxicity when given at high concentrations, exogenous CO delivered at low concentrations is showing therapeutic potential as an anti-inflammatory agent and, as such, can modulate numerous immunoinflammatory states. The carbon monoxide- releasing molecules (CORMs) represent a group of compounds capable of liberating controlled quantities of CO in the cellular systems. Among various CORMs synthetized, CORM-A1 is one of the most promising because it is soluble in water, does not contain a transition metal and liberates CO at a much slower rate under physiological conditions (half-life 21.4 min). In our study for the first time we evaluated the therapeutic potential of CORM-A1 in preclinical model of T1D induced by multiple low doses of streptozotocin. We determined cellular and molecular mechanisms initiated in response to the CORM-A1 treatment in the immune cells, and the effects of CO donor at the target tissue,  cells of pancreatic islets, in vitro. CORM-A1 did not show toxicity against lymph node cells (LNC) and did not affect proliferation and activation of LNC in vitro stimulated with anti-CD3/CD28 antibodies. However, CORM-A1 successfully reduced the secretion of pro- inflammatory cytokines, IFN-γ and IL-17, as well as the percentage of cells that secrete these cytokines, Th1 (CD4+IFN-+) and Th17 (CD4+IL-17+) cells, respectively, whereas Th2 (CD4+IL-4+) cell population increased after the treatment. In addition, CORM-A1 significantly reduced expression of transcription factor RORT, necessary for Th17 development, but the expression of Th1- and Th2-related transcription factors remained unchanged. CORM-A1, given at early or late prophylactic, as well as therapeutic treatment, suppressed hyperglycemia development in model of T1D induced by multiple low doses of streptozotocin in C57BL/6 mice. Clinical features of the disease were followed by increased insulin secretion, reduced insulitis and lesser damage of pancreatic islets after CORM-A1 treatment. The percentage of pro-inflammatory M1 macrophages and production of their mediators in the peritoneal cavity, as well as Th1 response in the spleen were decreased, while differentiation of Th2 cells was favored in the pancreatic draining lymph nodes of mice treated with CORM-A1. Application of CO donor reduced the influx of M1, B, CD4+ and CD8+ cells in pancreas. Furthermore, immunomodulating effects of CORM-A1 in target tissue included decreased proportion of Th1 cells and increased percentage of anti-inflammatory Th2 cells. Reduced differentiation of Th2 cells ex vivo was followed by lower activation of transcription factor STAT4 in mice treated with VMDS + CORM-A1. Besides the effects on immune cells, CORM-A1 treatment showed direct cytoprotective effects in the pancreatic islets and  cells in vitro. CORM-A1 reduced cytokine-induced death of pancreatic islets and mouse (MIN6) and rat (RINm5F) insulinoma cells. Anti-apoptotic effect of CORM-A1 was mediated through the downregulation of cytochrome c amount and suppression of caspase 3 activity. Finally, the cytoprotective effect of CORM-A1 was lost when iCORM-A1, which does not liberate CO in the cellular environment, was applied or when haemoglobin, a scavenger of CO, was present. Our findings generate valuable proof of concept of how pharmacological application of CO delivered by CORM-A1 can be exploited for potential translation to clinical settings for treatment of inflammatory and autoimmune diseases, including T1D.

Ekspresije gena markera inflamacije i fibroze i gena kandidata za optimizovanu ćelijsku terapiju kod pacijenata sa sistemskom sklerozom

Expression of genes associated with inflammation and fibrosis and candidate genes for cell therapy optimization in patients with systemic sclerosis

Sistemska skleroza (SSc) je retka, heterogena, multisistemska, autoimuna bolest nepoznate etiologije sa varijabilnim kliničkim manifestacijama i nepredvidivim i često letalnim ishodom. Osnovne karakteristike ove bolesti su poremećaji u imunom sistemu i inflamacija, vaskulopatija, preterana produkcija komponenti vanćelijskog matriksa i progresivna fibroza kože i unutrašnjih organa. Pronalaženje novih biomarkera, koji bi omogućili bolje razumevanje patogeneze same bolesti, bilo bi od presudne važnosti za ranije uspostavljanje dijagnoze, bolju klasifikaciju pacijenata i primenu adekvatnije terapije. Stoga je u okviru ove teze ispitana asocijacija odabranih genetičkih varijanti u genima IRAK1 i miRNK-146a sa predispozicijom za razvoj SSc. Takođe, u cilju otkrivanja potencijalno novih i pouzdanih biomarkera praćena je ekspresija odabranih učesnika signalnih puteva JAK2/STAT3 i NF-kB, uključenih u proces inflamacije na sistemskom i proces fibroze na lokalnom nivou. Upotreba ćelijske terapije u lečenju oštećenja malih zglobova kod ovih pacijenata jedan je od potencijalno novih terapeutskih pristupa. Uprkos rastućem znanju i upotrebi mezenhimskih matičnih ćelija izolovanih iz adopoznog tkiva (aMMĆ) u ćelijskoj terapiji, veoma malo se zna kako gajenje ovih ćelija u laboratorijskim uslovima utiče na njihovu sposobnost samoobnove i potencijal za diferencijaciju u hondrocite. U cilju ispitivanja uticaja dužine gajenja ćelija na njihovu sposobnost samoobnove i potencijala za hondrogenu diferencijaciju, praćena je ekspresija gena markera matičnosti i hondrogene diferencijacije tokom in vitro kultivacije ovih ćelija. Studija asocijacije odabranih genetičkih varijanti, IRAK1 rs3027898 C>A i miRNK- 146a rs2910164 G>C izvedena je na grupi od 102 SSc pacijenata i 66 zdravih ispitanika, direktnim sekvenciranjem po Sangeru. Relativna kvantifikaciona analiza ekspresije gena IL6, JAK2, STAT3, TLR7, TLR9, IRAK1 i miRNK-146a u mononuklearnim ćelijama periferne krvi (MNĆPK), izvršena je na podgrupi od 50 SSc pacijenata i 13 zdravih ispitanika, dok je ekspresiona analiza odabranih gena na lokalnom nivou izvedena na uzorcima tkiva kože, sa i bez fibrotičnih promena, poreklom iz 5 SSc pacijenata. Nakon fenotipske karakterizacije matičnih ćelija poreklom iz masnog tkiva 4 pacijenta, za ispitivanje uticaja dugotrajne in vitro propagacije ovih ćelija u kulturi na njihove karakteristike, pratili su se, tokom ranog i kasnog pasaža, tokom hondrogene diferencijacije, ekspresioni nivoi gena matičnosti OCT4 i NANOG, i gena SOX5, SOX6, SOX9 i COL1A1, uključenih u najranije faze hondrogeneze. Sve ekspresione analize vršene su metodom RT-qPCR. Rezultati studije asocijacije na našoj grupi pacijenata ukazali su na to da varijanta IRAK1 rs3027898 nije predisponirajući faktor za nastanak SSc. Analiza distribucije genotipa za varijantu miRNK-146a rs2910164 pokazala je da nosioci CC genotipa imaju 10 puta veću šansu za razvoj plućne fibroze i aktivnog oblika bolesti u odnosu na nosioce GG i GC genotipa. Na sistemskom nivou, kod SSc pacijenata, detektovane su povišene ekspresije gena IL6 i TLR7, kao i snižene ekspresije gena TLR9, JAK2, IRAK1 i miRNK-146a. Ekspresije gena JAK2, IRAK1 i miRNK-146a pokazale su se kao polno specifične. Izmenjene ekspresije gena TLR7, IRAK1 i miRNK-146a, usled asociranosti sa određenom kliničkim simptomom, predstavlaju potencijalne markere za bolju stratifikaciju SSc pacijenata. Preliminarna analiza relativnih ekspresija odabranih gena na lokalnom nivou, pokazala je snažan trend ka redukciji ekspresije svih ispitivanih gena u uzorcima tkiva kože sa fibrotičnim promenama u odnosu na tkivo bez promena poreklom iz istog pacijenta. Merenjem ekspresije gena markera matičnosti, OCT4 i NANOG, tokom in vitro propagacije aMMĆ u kulturi, dobija se uvid o razlikama u sposobnosti samoobnavljanja ovih ćelija poreklom iz različitih pacijenata, jer su rezultati dobijeni ispitivanjem ekspresije ovih gena u ranom i kasnom pasažu, pokazali različit trend kod analiziranih pacijenata. Kvantifikaciona analiza ekspresije odabranih gena, pre i nakon hondrogene difrencijacije u in vitro uslovima, pokazala je da geni SOX5, SOX6 i COL1A1 pokazuju isti trend povećanja ekspresije u difrenciranim u odnosu na nediferencirane ćelije, kako u ranom tako i u kasnom pasažu. Ovi rezultati pokazuju da ovi geni mogu biti potencijalno dobri prognostički markeri za praćenje potencijala aMMĆ za hondrogenu diferencijaciju. Rezultati ove studije pružili su nove uvide u složenu i nedovoljno istraženu genetičku osnovu SSc i ukazali da ispitivana genetička varijanta miRNK-146a rs2910164 predstavlja faktor rizika za razvoj plućne fibroze i aktivnog oblika bolesti kod obolelih od SSc. Takođe, rezultati kvantifikacionih analiza ukazuju na to da su izmenjena ekspresija analiziranih gena i njihove narušene međusobne interakcije uključene u mehanizam nastanka i održavanja procesa inflamacije u SSc na sistemskom nivou, i da mogu predstavljati potencijalno nove i pouzdane biomarkeri za SSc, ali i markere koji mogu doprineti boljoj klasifikaciji, praćenju toka bolesti i prognozi ishoda. Preliminarna analiza ekspresionih profila gena uključenih u proces fibroze na lokalnom nivou ukazala je na to da je izmenjena ekspresija odabranih gena uključena u patološki proces zarastanja rana i posledični nastanak fibroze. Osim toga, rezultati ove studije pružili su nove informacije o uticaju broja ćelijskih ciklusa pri propagaciji aMMĆ u ćelijskoj kulturi na održavanje matičnosti aMMĆ i njihovog potencijala za hondrogenu diferencijaciju. Ovakav pristup može doprineti dodatnoj optimizaciji ovog personalizovanog terapijskog pristupa. Razumevanje biologije matičnih ćelija će dovesti do saznanja o tome koji geni su ključni za uspeh terapije i njihova se ekspresija može koristitit kao biomarker za optimizaciju i individualizaciju lečenja artritisa malih zglobova kod SSc pacijenata.

Systemic sclerosis (SSc) is a rare heterogeneous, multisystem, autoimmune disease with unknown etiology, characterized with variable clinical manifestations, and unpredictable and often lethal outcome. The basic mechanism of the disease appears to involve aberrant immune activation and inflammation, vasculopathy, overproduction of extracellular matrix proteins and progressive fibrosis of skin and internal organs. The identification of novel biomarkers will not only enable a better understanding of the disease pathogenesis, but also contribute to earlier establishment of diagnosis, better classification of patients, and the application of more appropriate therapy. Therefore, within this thesis, it was examined the association of selected genetic variants in the IRAK1 and miRNA-146a genes with the predisposition for development of SSc. In order to discover potentially novel and reliable biomarkers, the expression of selected participants of JAK2/STAT3 and NF-kB signal pathways, involved in the process of inflammation at the systemic and process of fibrosis at the local level, was examined. Stem cell therapy, is one of the potential new therapeutic approaches in the treatment of small-joint damage in SSc patients. Despite growing knowledge and utilization of adipose tissue-derived mesenchymal stem cell (aMSC) in therapy, very little known about how prolonged cultivation of these cells in laboratory conditions affects their ability for self-renewal and their potential for differentiation into functional chondrocytes. In order to investigate the influence of the long-term ex vivo cultivation on their potency and potential for chondrogenic diferrentiation, the expression of genes, markers of stemness, as well as markers for chondrogenic differentiation, during prolonged in vitro aMSC cultivation, was investigated. The association study between selected genetic variants, IRAK1 rs3027898 C> A and miRNA-146a rs2910164 G> C, and susceptibility to SSc was performed on a group of 102 SSc patients and 66 healthy subjects, by Sanger sequencing. Relative quantification analysis of the IL6, JAK2, STAT3, TLR7, TLR9, IRAK1 and miRNA-146a gene expressions in peripheral blood mononuclear cells, were performed on a subgroup of 50 SSc patients and 13 healthy subjects, while the expression analyzes of selected genes at the local level were performed on skin tissue samples, with and without fibrotic changes, originating from 5 SSc patients. After phenotypic characterization of MSC derived from adipose tissue of 4 patients, for examining the effect of long-term in vitro propagation of these cells in culture on their characteristics, the expression levels of stemness genes, OCT4 and NANOG, and genes involved in the earliest stages of chondrogenesis, SOX5, SOX6, SOX9, and COL1A1, were determined during early and late passage, during the course of chondrogenic differentiation. All expression analyzes were performed using the RT-qPCR method. The results of the association study on our patient group indicated that the IRAK1 rs3027898 variant is not a predisposing factor for the development of SSc. The analysis of the genotype distribution for the miRNA-146a rs2910164 variant showed that carriers of the CC genotype have a 10 times greater chance for developing pulmonary fibrosis and the active form of the disease. At systemic level, the elevation of IL6 and TLR7, and reduction of TLR9, JAK2, IRAK1 and miRNA-146a gene expression was detected in SSc patients . The expression of the JAK2, IRAK1 and miRNA-146a genes was shown to be gender specific. The altered expression of the TLR7, IRAK1 and miRNA-146a genes, due to its association with a particular clinical symptoms, might present a potential markers for better stratification of SSc patients. Preliminary analysis of relative expression of the selected genes at the local level, showed a strong trend towards reducing the expression of all examined genes in skin tissue samples with fibrotic changes in comparison with the tissue without changes, originating from the same patient. By measuring the expression levels of the stemness genes, OCT4 and NANOG, during in vitro propagation of aMSC in culture, we got an insight into the differences in the self- renewal ability of these cells between patients. The results obtained by monitoring the expression of these genes in early and late passage, showed a different trend of expression changes in analyzed patients. The quantification analysis of the expression of selected genes, during the course of chondrogeic differentiation in in vitro conditions, showed that the genes SOX5, SOX6, and COL1A1 exhibit the same trend towards increasing their expression in differentiated compared to undifferentiated cells, both in the early and late passage. These results show that these genes may be potentially good prognostic markers for monitoring the potential of aMSC for chondrogenic differentiation. The results from this study provided new insights into the complex and insufficiently investigated genetic basis of SSc and indicated that the investigated miRNA-146a rs2910164 genetic variant, represents a risk factor for the development of pulmonary fibrosis and active form of disease in SSc patients. The results of the quantification analyzes indicated that changed expression of the analyzed genes and their altered interactions are involved in the mechanism for appearance and maintenance of the inflammation process at the systemic level in SSc, and that they can represent potentially novel and reliable biomarkers for SSc, but also markers that can contribute to better classification, disease monitoring and outcome prediction. Preliminary analysis of gene expression profiles involved in the process of fibrosis at the local level, indicated that altered expression of selected genes was involved in the pathological process of wound healing and consequent fibrosis. In addition, the results of this study provided new information on the impact of the number of cell cycles on maintaining the aMSC self-renewal ability and potential for chondrogenic differentiation. This approach can contribute to the additional optimization of this personalized therapeutic approach. The understanding of the stem cell biology can provide knowledge about crucial genes for the therapy success and their expression levels can be used as biomarkers for the optimization and individualization of treatment of small joint arthritis in SSc patients.

Starost i poreklo populacija vrste Salvia officinalis L. (Lamiaceae) u centralnom delu Balkanskog poluostrva - morfometrijski i molekularni pokazatelji

The age and origin of Salvia officinalis L. (Lamiaceae) populations from the central part of the Balkan peninsula - morphometrical and molecular parameters

zahvata jadransko primorje i zaleđe. Postavlja se međutim, pitanje autohtonosti disjunktnih, kontinetalnih populacija u centralnom delu poluostrva, jer se ova termofilna vrsta od davnina koristi u lekovite svrhe, pa postoji mogućnost da su ove populacije antropogene, nastale nakon ledenog doba. Da bi se utvrdila starost i poreklo ovih disjunktnih populacja uzorkovano je 8 populacija za molekularna i 11 populacija za morfmetrijska ispitivanja. Za filogeografski deo istraživanja korišćene su sekvence dva intragenska spejsera hloroplasta 3’rps16-5’trnK and rpl32-trnL. Detektovano je sedam haplotipova koji nisu bili nasumično zastupljeni i poseduju filogeografsku strukturu, kao i visok ukupni genetički diverzitet (HT = 0.695) i genetičku diferencijaciju (GST = 0.682). Prema molekularnom satu i bajeziskoj analizi, razdvajanja predačkog genskog pula S. officinalis na dve linije desilo se u pliocenu (pre 3,267 mil. godina), što se podudara sa vremenom kada su centralni deo Balkana prekrile velike vodene površine i po svoj prilici podelile pretpostavljeni predački areal S. officinalis. Strukturirana, manje divergentna kontinetalno-primorska linija (CAL, Hd = 0.426, π = 0.00106) i divergentnija isključivo primorska linija (PAL, Hd = 0.403, π = 0.00257) nemaju odlike nedavne demografske ekspanzije i danas se preklapaju na jugoistočnom delu jadranskog primorja, koje je označeno kao glavni glacijalni refugijum S. officinalis. Četiri populacije iz kontinentalnog dela Balkanskog poluostrva, koje čine kontinetalnu podliniju CAL odlikuje skoro isključivo prisustvo posebnog haplotipa koji je redak u primorskoj podliniji CAL i odsutan u PAL. Zbog bliske genealoške veze ovog i ancestralnog haplotipa prema parsimonijskoj statističkoj analizi, kao i zbog specifičnih odlika kontinetalnih populacija, one su okarakterisane kao reliktne i refugijalne...

Within Balkan Peninsula, Salvia officinalis L. (Lamiaceae), common or Dalmatian sage, grows naturally along the Adriatic coast. However, the indigeneity of its distant continental disjunctions in Central Balkans is questionable, since this thermophilous species has been used in medicine for thousands of years and it may have been established post-glacially via anthropogenic mediation. To reveal the origin and the age of its disjunctions, 8 and 11 populations were sampled for molecular and morphometrical investigation, respectively. Sequences of two chloroplast intergenic spacers, 3’rps16-5’trnK and rpl32-trnL, were used for phylogeographic study. Seven haplotypes, non-randomly distributed in space were found as well as high total gene diversity (HT = 0.695) and genetic differentiation (GST = 0.682) showing a phylogeographic structure. According to the strict clock Bayesian analysis, the divergence of an ancient S. officinalis gene pool to two lineages was dated to the Pliocene (3.267 Ma), which coincides with the period when the vast water bodies covered the central part of the Peninsula and presumably divided the paleo-distribution of S. officinalis. A substructured and less diverse continental-Adriatic lineage (CAL, Hd = 0.426, π = 0.00106) and a more diverse, purely Adriatic lineage (PAL, Hd = 0.403, π = 0.00257) do not exhibit signs of recent demographic expansions and currently overlap on the southeastern Adriatic coast, a region designated as the main glacial refugium of S. officinalis. All four populations from the continental Balkans comprising the continental sub-lineage of CAL were almost fixed for a distinct haplotype which was rare in the Adriatic sub-lineage of CAL and absent in PAL. Given the close genealogical relation of that haplotype to the ancestral haplotype as inferred from a statistical parsimony analysis and other features of these populations, they were characterized as relict and refugial...

Ekspresija gena za ribozom-inaktivirajući protein (SoRIP2) kao marker za analizu embriogenog potencijala spanaća (Spinacia oleracea L. cv. Matador) in vitro

Expression of gene encoding ribosome-inactivating protein (SoRIP2) as a marker for the analysis of spinach (Spinacia oleracea L. cv. Matador) embryogenic potential in vitro

Somatska embriogeneza je indukovana iz apikalnih fragmenata lateralnih korenova spanaća (Spinacia oleracea L.) sorte "Matador", gajenih u uslovima in vitro na indukcionom Murashige & Skoog medijumu koji je sadržao 20 µM α-naftilsirćetnu kiselinu (NAA) i 5 µM giberelnu kiselinu (GA3). Embriogeni potencijal je testiran na 30 nasumično odabranih klijanaca. Rezultati ukazuju da je regenerativni potencijal individualnih klijanaca bio vrlo varijabilan; sa frekvencom regeneracije od 0.3% do 100% i prosečnim brojem somatskih embriona (SE) po eksplantatu od 0.001 do 9.96. Samo 4 od 30 linija su imale visoku frekvencu regeneracije (85-100%), sa ukupno 227-347 SE regenerisanih sa 30 odsečaka korenova tokom 12 nedelja gajenja. Tokom prve subkulture (4 nedelje) regenerisala je samo jedna linija. Rezultati ukazuju da su jedinke sa visokim regenerativnim potencijalom retke u populaciji sorte "Matador". SE izolovani sa korenova istog klijanca su gajeni kao jedna linija na medijumu sa 5 µM kinetinom. Sa klijanaca čiji su korenovi korišćeni za indukciju regeneracije paralelno su izolovani i apikalni pupoljci i gajeni pojedinačno, u epruvetama na medijumu bez regulatora rastenja (BRR). Biljke koje su se razvile iz apikalnih izdanaka klijanaca i iz SE su se samooprašile i dale semena u uslovima in vitro. Na ovaj način, samooplođenjem in vitro i isklijavanjem sakupljenog semena, dobijene su 4 generacije potomačkih klijanaca označenih kao S1-S4. Korenovi ovih klijanaca su korišćeni za indukciju regeneracije SE i njihov embriogeni potencijal je upoređen sa roditeljskim. Embriogeni potencijal S1 i S2 linija je bio takođe vrlo varijabilan. Selekcijom potomstva sa najvećim embriogenim potencijalom dobijene su tri S3 i jedna S4 linija sa izuzetno visokim embriogenim potencijalom, koji je bio 33-53 puta veći u odnosu na majku-biljku. Frekvenca regeneracije ovih linija se kretala oko 100%, a sa 30 fragmenata korenova je izolovano ukupno 1339-2181 SE po klijancu tokom 12 nedelja. Sve linije su regenerisale tokom prve subkulture, 2-4 nedelje ranije u odnosu na roditeljsku liniju. Fragmenti korenova izolovani sa biljaka koje su se razvile iz SE (regeneranti) su imali sličan regenerativni kapacitet klijancu sa kog su indukovani. Ova istraživanja su pokazala snažan uticaj genotipa na nivou individue na embriogeni potencijal spanaća. U daljim istraživanjima je testiran uticaj svetlosti i egzogenih giberelina (GA) na genetički identičnom materijalu, da bi se eliminisao uticaj genotipa na procenu embriogenog potencijala. Svetlost u smislu trajanja (fotoperiod) i gustine fluksa fotona je značajno uticala na efikasnost somatske embriogeneze. Eksplantati svih testiranih linija su pokazali veći embriogeni potencijal u uslovima dugog dana (DD, 16h svetlost) nego u uslovima kratkog dana (KD, 8h svetlost), dok je 7 od 40 linija regenerisalo samo u uslovima DD. Osim toga, regeneracija je započinjala oko 4 nedelje ranije u uslovima DD. Maksimalan embriogeni potencijal kod svih testiranih linija je zabeležen pri gustini fluksa fotona od 100 µmol/(m2s). Egzogeni giberelini (GA1 i GA3) su takođe značajno uticali na embriogeni potencijal, pri čemu je GA3 imao izraženiji efekat na indukciju somatske embriogeneze od GA1. Većina linija nije regenerisala u odsustvu GA, a u odsustvu GA i u mraku je regenerisala samo jedna linija sa izuzetno niskim embriogenim potencijalom. Pokazan je snažan sinergistički uticaj auksina (NAA), GA i svetlosti na indukciju somatske embriogeneze spanaća. Nedostatak bilo kog faktora je izazivao veliki pad embriogenog potencijala eksplantata. Najveći broj linija dobijenih u ovom radu su imale stabilan embriogeni potencijal tokom ograničenog vremenskog perioda, najviše godinu dana. U cilju skraćenja perioda za procenu regenerativnog potencijala pojedinačnih linija, razvijen je model-sistem za brzu i preciznu determinaciju embriogenog potencijala praćenjem ekspresije gena koji kodira ribozom-inaktivirajući protein spanaća (SoRIP2). Ekspresija ovog gena je bila na niskom bazalnom nivou u korenovima spanaća pod neinduktivnim uslovima, da bi bila 285 puta veća u globularnim SE i zatim opala na nivo kontrole u SE>5mm na kotiledonarnom stupnju razvića. Ekspresija SoRIP2 je analizirana 4 nedelje od početka indukcionog tretmana, pre nego što se SE mogu uočiti pomoću stereomikroskopa. Za procenu embriogenog potencijala kod istih linija konvencionalnom kvantifikacijom bilo je potrebno 12 nedelja. Pokazan je visok stepen pozitivne korelacije (r2=0.81) između ekspresije SoRIP2 i embriogenog potencijala, što ukazuje da se ekspresija SoRIP2 može uspešno koristiti za procenu embriogenog potencijala spanaća, 8 nedelja ranije nego konvencionalnom metodom. Izolovani apikalni odsečci korenova spanaća su sposobni za percepciju svetlosti i biosintezu GA posle 4 nedelje tretmana. Analizom ekspresije ključnih gena za anabolizam (SoGA20-ox1 i SoGA3-ox1) i katabolizam (SoGA2-ox1) GA, u eksplantatima korenova pod induktivnim uslovima je pokazano da je embriogeni potencijal u korelaciji sa supresijom gena za anabolizam GA i indukcijom ekspresije gena za katabolizam GA. Kod linija spanaća sa višim embriogenim potencijalom je uočena izraženija supresija gena za anabolizam GA. Ova analiza ukazuje da je interakcija auksina, svetlosti i egzogenih GA uzrokovala pokretanje katabolizma GA i da je embriogeni potencijal u korelaciji sa ovim fiziološkim stanjem eksplantata. Rezultati ovog rada su dobra osnova za dalje istraživanje molekularnog mehanizma indukcije somatske embriogeneze upotrebom kolekcije genotipova i model-sistema koji je razvijen tokom ovih istraživanja.

Somatic embryogenesis was induced from apical sections of the lateral roots of spinach seedlings (Spinacia oleracea L. cv. Matador), cultivated in vitro on Murashige & Skoog induction medium supplemented with 20µM α-naphthaleneacetic acid (NAA) and 5 µM gibberellic acid (GA3). The capacity for somatic embryo formation was tested in 30 randomly chosen seedlings (lines). Results indicated that the regeneration potential is very variable among the seedlings, with the frequency of regeneration ranging from 0.3% to 100% and the mean somatic embryo (SE) number per explant ranging from 0.001 to 9.96. Only 4 out of 30 lines displayed high regeneration frequency (85-100%), with the total number of 227-347 SEs regenerated from 30 root sections over a 12-week period. Only one line regenerated during the first subculture (4 weeks). Results indicate that the lines with high embryogenic potential are very rare within the population of cultivar "Matador". SEs isolated from a single seedling were maintained as a line on medium with 5µM kinetin. Apical shoots, isolated from the same seedlings, which have been used for the induction of regeneration, were cultivated separately in test tubes, on plant growth regulator-free medium. Plants derived from seedlings’ apical shoots and SEs flowered, self-fertilised and set seeds in vitro. Thus, four generations of descendent seedlings, designated as S1-S4, were obtained by self-fertilisation and germination of the collected seeds in vitro. Roots of these seedlings were used for the induction of SE regeneration and their embryogenic capacities were compared to parental lines. The embryogenic capacities of S1 and S2 lines were also very variable. By selection of offspring with high embryogenic response and through further cycles of self-fertilisation, three S3 and one S4 line with extremely high embryogenic capacities, 33-35 fold higher than in the mother-plant, were obtained. The regeneration frequencies of these lines were approximately 100%, and 1339-2181 SEs were isolated from 30 root sections per seedling over a 12-week period. All lines regenerated during the first subculture, and 2-4 weeks earlier compared to parental lines. Root sections of plants regenerated from SE (regenerants) exhibited similar regeneration capacity as the respective seedling from which they originated. The results indicate that the regeneration capacity of spinach is strongly influenced by the genotype at the individual plant level. In further studies, the impact of light and exogenous gibberellins (GA) was tested on genetically identical material in order to eliminate the influence of the genotype on the assessment of the regeneration capacity. Light, in terms of duration (photoperiod) and photon flux density, significantly affected the efficiency of somatic embryogenesis. Explants of all tested lines exposed to long day conditions (LD, 16h light) showed higher embryogenic capacity compared to those exposed to short day conditions (SD, 8h light). In addition, 7 out of 40 lines regenerated only with LD, and the regeneration started approximately 4 weeks earlier with LD than with SD. The highest embryogenic capacity was recorded at 100µmol/(m2s) in all tested lines. Exogenous GA (GA1 and GA3) significantly affected embryogenic capacity as well, with GA3 beeing more effective than GA1. Most of the lines did not regenerate in the absence of GA, while in the absence of both GA and light, only one line regenerated, but with extremely low embryogenic capacity. Strong synergistic influence of auxin (NAA), GA and light on the induction of somatic embryogenesis has been demonstrated. The lack of any of these factors caused a sharp decrease of the explants' embryogenic capacity. The vast majority of lines obtained in the present study displayed a stable embryogenic capacity during a limited period of time, a maximum of one year. In order to shorten the period of individual lines' embryogenic capacity assessment, a model-system for rapid and precise determination of embryogenic capacity was developed. This model-system included the monitoring of expression of a gene encoding spinach ribosome-inactivating protein (SoRIP2). The expression of this gene was at a low basal level in the roots grown under non-inductive conditions, and it increased 285-fold in globular SEs, but then dropped to the control level in the cotyledonary stage (SEs>5mm). The expression of SoRIP2 was analyzed 4 weeks following the start of the induction treatment, before SE could be seen with the aid of a stereomicroscope. Using the same lines, the determination of embryogenic capacity by conventional quantification took 12 weeks. A high positive correlation (r2=0.81) between the expression of SoRIP2 and the index of embryogenic capacity was demonstrated. The results indicate that the expression of SoRIP2 could be successfully used to evaluate the regeneration capacity of spinach, even 8 weeks earlier than by the conventional method. Isolated apical root sections of spinach were capable of light perception and GA biosynthesis following 4 weeks of treatment. The expression of the key genes involved in GA anabolism (SoGA20-ox1 and SoGA3-ox1) and catabolism (SoGA2-ox1), tested under inductive conditions, revealed that the embryogenic capacity correlated with the suppression of GA anabolism and the induction of GA catabolism. The more pronounced suppression of GA anabolism was observed in lines with higher embryogenic capacities. The analysis suggested that the interaction of auxins, light and exogenous GA promoted GA catabolism and the embryogenic capacity correlated with this physiological state of the explants. The results of this thesis are a good basis for further research on the molecular mechanism underlying the initiation of somatic embryogenesis, using the collection of genotypes and the model-system developed during this research.

Funkcionalna karakterizacija primarnih mezenhimskih matičnih ćelija u proinflamatornim i uslovima izmenjene oksigenacije

Functional characterization of primary mesenchymal stem cells under proinflammatory and altered oxygenation conditions

Mezenhimske matične ćelije (MMĆ) deo su populacije multipotentnih matičnih ćelija prisutnih u mnogim adultnim tkivima gde učestvuju u održavanju homeostaze. Zahvaljujući sposobnosti samoobnove, potencijalu diferenciranja u specijalizovane ćelije mezodermskog porekla i imunomodultatornim svojstvima, ove nediferencirane ćelije karakteriše širok opseg potencijalne terapijske primene. Regenerativnom kapacitetu MMĆ doprinosi i sposobnost migracije do oštećenih tkiva gde učestvuju u njihovom obnavljanju što ove ćelije čini pogodnim za ćelijsku terapiju. Mezenhimske MĆ su do sada izolovane iz velikog broja adultnih tkiva i mnoge studije potvrdile su da njihov regenerativni potencijal u velikoj meri zavisi od izvora iz kojeg potiču. Prvobitno su izolovane iz kostne srži koja je do sada najčešće korišćen izvor MMĆ, međutim zbog invazivnih metoda izolacije i malog prinosa MMĆ, stvorena je potreba za alternativnim izvorima. Činjenica da su MMĆ izolovane i iz periferne krvi jedno je od značajnih otkrića iz ove oblasti i smatra se da ove ćelije najverovatnije vode poreklo iz kostne srži, međutim nije dovoljno poznato na koji način migriraju i bivaju privučene u oštećena tkiva. Poslednjih godina se kao povoljan izvor MMĆ sa potencijalnom primenom u regenerativnoj medicini sve češće pominju i perinatalna tkiva (pupčanik i placenta). Prednost pupčanika kao izvora MMĆ ogleda se u lakoj dostupnosti tkiva koje se smatra medicinskim otpadom, neinvazivnoj izolaciji ćelija i činjenici da su izolovane MMĆ po kapacitetu samoobnove i većoj ekspresiji markera pluripotentnost slične embrionalnim MĆ. Iako se već nekoliko decenija MMĆ intenzivno istražuju, uprkos velikom doprinosu nauci i medicini, o njihovom upkupnom terapijskom potencijalu se još uvek nedovoljno zna. Trenutno nije poznat univerzalan mehanizam terapijskog delovanja MMĆ, a mnogobrojni nalazi sve više u poslednje vreme upućuju da ponašanje i uloge MMĆ zavise od konteksta mikrosredine u kojoj obitavaju i/ili deluju, kao mestu integracije spoljnih signala koji određuju sudbinu MMĆ i usmeravaju ih ka određenoj funkciji...

present in many adult tissues where they participate in maintaining of homeostasis. Due to their self-renewal capacity, differentiation potential into specialized cells of mesodermal origin and immunomodulatory features, these undifferentiated cells are characterized with wide range of potential therapeutic applications. Their ability to migrate towards damaged tissues where they participate in tissue repair, also contributes to their regenerative potential which makes them suitable for cell therapy. MSCs have so far been isolated from various adult tissues and many studies confirmed that MSCs’ regenerative potential depends largely on the suorce which they originate from. They were originaly isolated from bone marrow which has been the most commonly used source of MSCs so far, however due to invasive methods of isolation and low MSCs yield, there is a need for alternative sources of MSCs. The fact that these cells were isolated from peripheral blood is one of the significant discoveries in this area and it is believed that these MSCs are most likely to originate from bone marrow, but how they migrate and home to damaged tissues has not yet been elucidated completely. Perinatal tissues (umbilical cord and placenta) have been recently increasingly suggested as favourable sources of MSCs with potential applications in regenerative medicine. The advantage of umbilical cord as a source of MSCs is reflected in easy availability of tissue considered as medical waste, non-invasive cell isolation methods, and the fact that MSCs isolated from umbilical cord are similar to embryonic stem cells in the terms of self-renewal capacity and pluripotency markers’ expression. Eventhough MSCs have been extensively investigated for several decades, and despite their great contribution to science and medicine, their overall therapeutic potential is still poorly understood. Currently, there is no universal mechanism of MSCs’ therapeutic action known, and many findings have recently suggested that behaviour and roles of MSCs depend on the context of microenvironment in which they reside and/or act, as sites of integration of external cues that determine the fate of MSCs and govern them towards specific function...

Energetski metabolizam matičnih ćelija hematopoeze periferne krvi bolesnika sa malignim oboljenjima

Energy metabolism in peripheral blood hematopoetic stem cells of patients with malignant diseases

Iako se transplantacija matičnim ćelijama hematopoeze kao oblik lečenja koristi više decenija, još uvek nije potpuno jasno zašto postoje razlike u brzini oporavka hematopoeze (vremenu prihvatanja kalema, engl. engrafment) kod bolesnika sa istim oboljenjima, kod kojih su primenjeni istovetni mobilizacioni protokoli i režimi kondicioniranja. Za sagledavanje terapeutskog potencijala matičnih ćelija neophodno je poznavanje njihovih funkcionih karakteristika, između ostalog metaboličkog (energetskog) statusa i redoks- spregnutih mehanizama kontrole diferencijacije u različitim ćelijskim stanjima (mirovanje, opredeljivanje, diferencijacija, aktivacija), tokom hematopoeze. Cilj disertacije je da se ispitaju metabolički parametari u matičnim ćelijama hematopoeze periferne krvi bolesnika sa solidnim tumorima (neuroblastom, NB), Juingov sarkom (engl. Ewing Sarcoma, ES) i limfoma (Hočkinov, HL i non Hočkinov, NHL). Ispitivani su ekspresioni profili enzima ključnih metaboličkih puteva energetskog metabolizma: glikolize, -oksidacije masnih kiselina, ciklusa limunske kiseline, procesa oksidativne fosforilacije (ND4 subjedinica kompleksa I, Ndufa6 subjedinica kompleksa I, citohrom b, citohrom c i subjedinice II (COX II) i IV(COX IV) citohrom c oksidaze) i same sinteze ATP. Ispitivan je i funkcioni status mitohondrija i nivo mitohondrijalne DNK, ekspresija NADPH oksidaze, ekspresija izoformi azot oksid sintaza i produkcija azot oksida, ekspresija enzima antioksidativne odbrane matičnih ćelija hematopoeze (glutation- peroksidaze, GSH-Px), katalaze, mangan superoksid dismutaze (MnSOD), bakar cink superoksid dismutaze (CuZnSOD) i ekspresija interleukina-6 (IL-6) i faktora nekroze tumora  (engl. tumor necrosis factor , TNF). Eksperimenti su rađeni na uzorcima monojedarnih ćelija periferne krvi pacijenata koji su primali protokol mobilizacije (MP), pacijenata koji nisu primali protokol mobilizacije i od zdravih davalaca (kontrola). Na osnovu dobijenih rezultata zaključuje se da se izdvajaju dva metabolička fenotipa monojedarnih ćelija iz periferne krvi. Prvi fenotip karakterističan je za monojedarne ćelije periferne krvi kod svih ispitivanih tumora, bez primene protokola mobilizacije. Drugi fenotip istovetan je za monojedarne ćelije periferne krvi svih ispitivanih tumora posle primene protokola mobilizacije. Ova dva fenotipa odslikavaju funkciono stanje matičnih ćelija iz periferne krvi (engl. peripheral blood stem cell, PBSC), na nivou antioksidativne odbrane, energetskog metabolizma (glikolize, -oksidacije masnih kiselina, ciklusa limunske kiseline, oksidativne fosforilacije (engl. oxidative phosphorylation, OXPHOS)), sinteze ATP, mitohondrijalne DNK (mtDNK), ekspresije NADPH oksidaze, kao i ekspresije citokina: IL-6 i TNF-6. U uzorcima ne-mobilisanih pacijenata, uočava se snažna aktivacija metabolizma monojedarnih ćelija periferne krvi kod pacijenata obolelih od HL, NHL i NB, u poređenju sa kontrolnim uzorcima (monojedarne ćelije zdravih osoba). Ekspresija GAPDH na nivou iRNK i na nivou proteina je nekoliko desetina puta povećana u svim uzorcima ove grupe pacijenata. Ekspresija (na proteinskom nivou) acil-CoA dehidrogenaze srednjeg lanca (ACADM) veća je u monojedarnim ćelijama dva puta kod HL, a skoro četiri puta kod pacijenata sa NHL i NB. Ovi rezultati sugerišu veću metaboličku aktivnost u grupi ne-mobilisanih pacijenata pokazujući sličnosti sa Warburgovim fenotipom. Drugi metabolički fenotip monojedarnih ćelija periferne krvi mobilisanih pacijenata pokazuje znatno niže vrednosti metaboličkih parametara u poređenju sa zdravim kontrolama i ne-mobilisanim pacijentima. Utišani fenotip karakteriše: nizak nivo glikolize, -oksidacije masnih kiselina, ciklusa limunske kiseline, OXPHOS (kompleksi respiratornog lanca) i sinteze ATP. Detektovan je i manji broj kopija mtDNK što je u saglasnosti sa rezultatima koji potvrđuju nisku stopu oksidativnog metabolizma u mitohondrijama. Izuzetak je ekspresija citohroma c na nivou iRNK i kompleksa IV na proteinskom nivou. Proteinski ekspresioni nivo antioksidativnih enzima (CuZnSOD i GSH-Px, dominantno lokalizovanih u citoplazmi, a MnSOD u mitohondrijama) može biti jedan od parametara koji ukazuje na prirodu oksidativnih procesa u matičnim ćelijama hematopoeze, a posebno na ulogu koju ima vodonik peroksid. Povećana ekspresija citokina, IL-6 i TNF, na proteinskom nivou, kod svih ispitivanih grupa pacijenata (sa i bez mobilizacije matičnih ćelija hematopoeze) navodi na zaključak da imaju važnu ulogu u pokretanju i sinhronizaciji kompleksnih događaja u monojedarnim ćelijama. Rezultati disertacije ne ukazuju na jasnu korelacija između utišanog metaboličkog fenotipa i vremena prihvatanja kalema granulocitne i megakariocitne loze posle transplantacije matičnih ćelija hematopoeze periferne krvi. Prihvatanje kalema obe loze je individualno, vremenski heterogeno i nezavisno od osnovne bolesti. Moguće je, da iako utišan, metabolički fenotip matičnih ćelija hematopoeze poseduje različite individualne potencijale da se eksprimira u zavisnosti od opšteg stanja pacijenta, stepena progresije oboljenja, infekcija i specifičnosti mikrosredina koje mogu uticati na prihvatanje kalema.

Hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) is a standard clinical practice for more than 50 years. However, we still cannot predict with certainty a rate of recovery in the patients with the same disease undergoing identical therapeutic protocols. To determine therapeutic potential of hematopoietic stem cell (HSC), we need to understand better correlation between the metabolic/energy status of the cells and stages of stem cell differentiation during hematopoiesis. Main goal of this work is to investigate metabolic status of peripheral blood mononuclear cells (PBMC) in patients with solid tumors (neuroblastoma, Ewing sarcoma) and lymphoma (Hodgkin and nonHodgkin). We determined expression profiles of key enzymes involved in glycolysis, fatty acid β-oxidation, citric acid cycle, oxidative phosphorylation and adenosine triphosphate (ATP) synthesis: ND4 subunit complexes I, Ndufa6 subunits of complex I, cytochrome b, cytochrome c and subunits II (COX II) and IV (COX IV) cytochrome c oxidase. Next, we investigated number of mitochondria and their function as well as expression levels of nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH) - oxidase, expression isoforms of nitric oxide synthase and production of nitric oxide, expression of HSC antioxidant enzymes (glutathione-peroxidase (GSH-Px), catalase, manganese superoxide dismutase (MnSOD), copper-zinc superoxide dismutase (CuZnSOD)) and expression of interleukin-6 (IL-6) and tumor necrosis factor  (TNF). Experiments were performed on PBMC samples of patients that were: a) subjected to mobilization of stem cells from bone marrow, b) not subjected to mobilization, and c) healthy donors (control group). Our results suggested that PBMC metabolic phenotypes differ between mobilized and non-mobilized patients, regardless of diagnosis. These two phenotypes represent functional status of the PBSC at the level of anti- oxidative defense, energy metabolism (glycolysis, -oxidation of fatty acids, citric acid cycle, oxidative phosphorylation-OXPHOS), ATP synthesis, mitochondrial DNA (mtDNK), expression of NADPH oxidase and cytokines IL-6 and TNFα. In samples of non-mobilized HL, NHL and NB patients, we detected a strong metabolic activation of PBMC in comparison with control samples from healthy individuals. GAPDH mRNA and protein levels are significantly higher in this group of patient samples. Protein level of acyl-CoA dehydrogenase medium chain (ACADM) is higher two folds in HL and 4 folds in NHL and NB. These results suggested a higher metabolic activity in non mobilized patients, show similarity to Warburg phonotype. The second metabolic phenotype of PBMC characteristic for mobilized patients demonstrated significantly lower metabolic parameters in comparison with healthy controls and non-mobilised patients. Such quiescent phenotype is reflected through low levels of glycolysis, -fatty acid oxidation, citric acid cycle, OXPHOS and ATP synthesis. We also detected less mtDNA expression of an NADPH oxidase, as well as the expression of cytokines: IL-6 and TNFα. In all patients that were subjected to mobilization and chemotherapy, PBMC have lower number of mitochondria and lower level of metabolism, regardless of diagnosis. Exceptions are mRNA levels of cytochrome c and protein levels of mitochondrial complex IV. Expression levels of anti-oxidative enzymes CuZnSOD i GSH-Px, localised predominantly in cytoplasm and MnSOD in mitochondria, might reflect oxidative processes in HSC, especially those including H2O2. Higher expression of IL-6 and TNFα in all patient groups, with and without mobilization of HMSC, pointed to their important role in PBMC biology. However, our results did not find a correlation between metabolic status of PBMC and successful engraftment of the cells of granulocyte and megakaryocyte lineages following autologous HSCT. Engraftment of both lineages is patient specific and does not depend on time or type of tumour examined. We have still to take in account that quiescent phenotype of PBSC has potential to be expressed, depending on status of the patient, disease progress, infection and specific microenvironment which may all have an influence on engraftment.

Morfološka i ekološka diferencijacija populacija kompleksa Jovibarba heuffelii (Schott) A. Löve & D. Löve (Crassulaceae)

Morphological and ecological differentiation of populations of Jovibarba heuffelii (Schott) A. Löve & D. Löve (Crassulaceae) complex

taksona koji su izvorno opisani kao zasebne vrste: Diopogon stramineus, S. ciliatum, S. heuffelii, S. kopaonikense, S. patens, S. reginae-amaliae i S. velenovskyi, i njihovi infraspecijski taksoni: S. heuffelii var. albanicum, S. heuffelii var. bulgaricum, S. heuffelii var. glabrum, S. heuffelii var. vestitum. Taksoni J. heuffelii kompleksa su zabeleženi na području centralnog Balkana i Južnih i Centralnih Karpata, na staništima sa širokim dijapazonom nadmorskih visina od 50-2550 m i na različitim podlogama (silikat, krečnjak, serpentinit). Ovakva heterogenost staništa je rezultirala velikom morfološkom varijabilnošću proučavanog kompleksa. Analiza morfoloških karaktera ovog kompleksa, kao i pronalaženje karaktera koji bi eventualno mogli da se koriste u taksonomiji je vrlo bitno u rešavanju vrlo komplikovane situacije kod ovog kompleksa. Osnovni ciljevi ovog istraživanja su bili: utvrđivanje osnovnih karakteristika staništa ispitivanog kompleksa, opisivanje varijabilnosti morfoloških karakteristika vegetativnih i reproduktivnih organa ispitivanih taksona u okviru kompleksa J. heuffelii, utvrđivanje korelacija između promenljivosti morfoloških karakteristika i ekoloških uslova staništa i utvrđivanje rasprostranjenja istraživanog kompleksa. Konačan cilj ovog rada je provera do sada predloženih taksonomskih statusa istraživanih taksona i eventualna promena njihovog ranga. U ovom radu je analizirano 14 populacija kompleksa J. heuffelii koje pokrivaju veći deo areala kompleksa. Tri populacije predstavljaju tipske populacije za taksone S. kopoanikense Pančić (SR-Treska, SR-Nebeske Stolice) i S. patens (RO-Domogled). Morfološka analiza je obuhvatila 299 individua a merenje je izvršeno na 51 karakteru. Podaci o ekologiji i rasprostranjenju kompleksa su prikupljeni terenskim istraživanjima, pregledom herbarijumskih zbirki i literature. Rezultati ove studije su pokazali veću varijabilnost vegetativnih morfoloških karaktera u odnosu na reproduktivne karaktere vrste J. heuffelii. Karakteri koji su dali najveći doprinos u diferencijaciji populacija su: debljina hrskavičavog oboda na listu rozete, dužina cilije na obodu lista rozete i broj listova u rozeti, dužina čašičnog listića, dužina najduže cvetne grane u fazi plodonošenja i dužina semena. Karakteri nektarija se ne mogu koristiti kao sistematski karakteri u taksonomiji J. heuffelii kompleksa. Kanonijska diskriminantna analiza (CDA) i klaster analiza (UPGMA) svih kvantitativnih karaktera pokazale su diferencijaciju populacija u 4 morfološke grupe: prvu grupu čini populacija BU-Trojanski prolaz, drugu grupu SR- Gradac, treću grupu populacije RO-Domogled, SR-Suvaja i SR-Studenica dok četvrtu grupu čine sve ostale populacije (SR-Nebeske Stolice, SR-Treska, SR-Radan, SR-Besna Kobila, MA- Mavrovo, SR-Basarski kamik, SR-Stara planina, SR-Pljačkovica i MA-Treskavec). Multipna korespodentna analiza (MCA) kvalitativnih karaktera je pokazala da se samo populacija BU-Trojanski prolaz diferencira po kvalitativnim karakteristikama u odnosu na ostale populacije. Korelaciona i regresiona analiza su pokazale da od orografskih faktora nadmorska visina, ekspozicija i nagib terena imaju najveći uticaj na varijabilnost morfoloških karaktera J. heuffelii kompleksa. Geografski faktori (geografska dužina i širina ) i bioklimatski faktori (BIO8- srednja temperatura najvlažnijeg kvartala i BIO4- temperaturna sezonalnost i BIO15 sezonalnost padavina) ostvaruju uticaj na varijabilnost morfoloških karaktera J. heuffelii kompleksa. Primećen je trend promene dimenzije organa pod uticajem nadmorske visine i geografske širine. Skoro svi karakteri pokazuju trend smanjenja veličine sa porastom nadmorske visine. Slično, svi karakteri pokazuju trend povećanja dimenzija od severa ka jugu. Rezultati su pokazali da geološka podloga ne utiče značajno na diferencijaciju populacija. Tipske populacije S. kopaonikense sa Kopaonika u Srbiji (SR-Nebeske Stolice i SR-Treska) se jasno morfološki diferenciraju od tipske populacije S. patens sa Južnih Karpata u Rumuniji (RO-Domogled). Registrovana varijabilnost bi se mogla tretirati kao morfološka plastičnost, a u taksonomskom smislu bi se mogla interpretirati na nivou varijeteta. Molekularne studije koje su u toku će možda dati dodatnu argumentaciju da se neka od morfoloških grupa definiše na višem taksonomskom nivou. Najprespektivnija je populacija iz Bugarske (BU-Trojanski prolaz), koja se i na kvalitativnom morfološkom nivou najjasnije odvaja od ostalih populacija.

Complex Jovibarba heuffelii represents a group of morphologically, chorologically and ecologically very close taxa that were originally described as separate species: Diopogon stramineus, S. ciliatum, S. heuffelii, S. kopaonikense, S. patens, S. reginae-amaliae and S. velenovskyi Cheshm., as well as their infraspecies taxa: S. heuffelii var. albanicum, S. heuffelii var. bulgaricum, S. heuffelii var. glabrum, S. heuffelii var. vestitum. Taxa of J. heuffelii complex were recorded in the region of Central Balkans and South and Central Carpathians, in habitats within a wide range of altitudes (50-2550 m) and on various substrates (silicate, limestone, serpentinite). This heterogeneity of habitat resulted in high morphological variability of the studied complex. Analysis of morphological characters recorded in this complex and determining the characters that might be used in taxonomy are very important for resolving the very complicated situation in this complex. The main goals of this study were to determine: the main characteristics of habitat inhabited by the studied complex, variability of morphological characteristics of vegetative and reproductive organs of studied taxa within the complex of J. heuffelii, correlations between the variability of morphological characteristics and ecological conditions of habitats, and the range of the studied complex. The final goal of this paper is a thorough examination of previously suggested taxonomic statuses of studied taxa and possible changes in their ranking. This paper includes analysis of 14 population of J. heuffelii complex, covering most of the combined range of this complex. Three of these populations are type populations, for taxa S. kopaonikense Pančić (SR-Treska, SR-Nebeske Stolice) and S. patens (RO-Domogled). The morphological analysis included 299 individuals, and measurements were taken for 51 characters. The data on ecology and distribution of this complex were collected in field studies and reviews of herbarium data and literature. The results of this study have shown greater variability in the vegetative morphological characters than in the reproductive characters of species J. heuffelii. The characters with the greatest contribution to differentiation of populations include: thickness of cartilaginous margin on the rosette leaves, length of cilia at the margin of rosette leaves, length of sepals within the calyx, length of the longest flowering stem during the fruit-bearing phase, and length of seeds. The characters of nectaries may not be used as systematic characters in taxonomy of J. heuffelii complex. The canonical discriminant analysis (CDA) and cluster analysis (UPGMA) performed on all quantitative characters have shown differentiation of populations into 4 morphological groups: the first group includes population BU-Trojanski prolaz, the second group includes the population SR-Gradac, the third group includes populations RO-Domogled, SR-Suvaja and SR-Studenica, while the fourth group includes all other populations (SR- Nebeske Stolice, SR-Treska, SR-Radan, SR-Besna Kobila, MA-Mavrovo, SR-Basarski kamik, SR-Stara planina, SR-Pljačkovica and MA-Treskavec). The multiple correspondent analysis (MCA) of qualitative characters has shown that only the population BU-Trojanski prolaz was differentiated from other populations according to its qualitative characteristics. The correlation and regression analyses have shown that among the orographic factors, altitude, exposition and slope of the terrain have the greatest impact on variability of morphological characters in J. heuffelii complex. The geographical factors (longitude and latitude) and bioclimatic factors (BIO8- mean temperature of most humid quarter, BIO4-temperature seasonality and BIO15- precipitation seasonality) have pronounced influence on variability of morphological characters of J. heuffelii complex. There was a noticeable trend of changes in organ size under the influence of altitude and latitude. Almost all characters have shown the trend of size decrease with altitude increase. In a similar manner, all characters have shown a trend of size increase from North to South. The results have shown that the geological substrate does not contribute significantly to differentiation of populations. The type populations of S. kopaonikense from Kopaonik in Serbia (SR-Nebeske Stolice and SR-Treska) are clearly morphologically differentiated from the type population of S. patens from the Southern Carpathians in Romania (RO-Domogled). The recorded variability might be treated as morphological plasticity, while in the taxonomic sense it may be interpreted at the level of variety. The ongoing molecular studies may provide additional argumentation for defining some of the morphological groups at a higher taxonomic level. The population with the highest probability for change is BU-Trojanski prolaz from Bulgaria, as even on the qualitative morphological level it shows the clearest differentiation from other populations.

Uticaj vodenog, metanolnog i etil-acetatnog ekstrakta grčkog origana Origanum vulgare ssp. hirtum na dijabetes tip 1 indukovan višestrukim malim dozama streptozotocina kod C57BL/6 miševa

Effect of aqueous, methanolic and ethyl acetate extract of Origanum vulgare ssp. hirtum on type 1 diabetes induced by multiple low doses of streptozotocin in C57BL/6 mice

Dijabetes tip 1 (DT1) je autoimunsko oboljenje koje nastaje kao rezultat uništavanja insulin-produkujućih beta ćelija pankreasa od strane inflamacijskih medijatora. Uništavanje beta ćelija pankreasa dovodi do smanjene sekrecije insulina i posledične hiperglikemije. Glavna odlika DT1 je insulitis- infiltracija ćelija imunskog sistema u pankreasna ostrvca. Prve ćelije koje infiltriraju pankreasna ostrvca su makrofagi. Smatra se da inflamacijski M1 makrofagi doprinose patogenezi DT1, dok anti- inflamacijski M2 makrofagi imaju protektivnu ulogu. Makrofagi aktiviraju autoreaktivne T limfocite- smatra se da su CD4+ i CD8+ T limfociti najvažnije efektorske ćelije u patogenezi DT1. U zavisnosti od citokina koje sekretuju ćelije imunskog sistema nastaju različite subpopulacije pomoćničkih T limfocita (Th) koje usmeravaju imunski odgovor u DT1 ka destruktivnom (Th1 i Th17) ili protektivnom (Th2 i Treg) odgovoru. Različiti efektorski mehanizmi ćelija imunskog sistema dovode do stvaranja inflamacijskog miljea u paknreasnim ostrvcima koji dovodi do apoptoze beta ćelija pankreasa i razvoja DT1. Terapija DT1 podrazumeva doživotno unošenje insulina. Kako ovo sa sobom nosi potencijal kratkoročnih i dugoročnih komplikacija, ulažu se veliki napori u pronalaženje novih, efikasnih terapija u lečenju DT1. Jedan od potencijalnih pristupa u lečenju DT1 je korišćenje biljaka i njihovih ekstrakata koji se od davnina koriste u tradicionalnoj medicini. Napredak istraživanja u ovoj oblasti doveo je do saznanja da različiti biofenoli koji ulaze u sastav biljaka mogu ostvariti povoljna dejstva na patogenezu različitih oboljenja, što stavlja biljke i njihove ekstrakte u fokus naučnih studija. Origanum vulgare ssp. hirtum (grčki origano) je biljka bogata fenolskim i estarskim jedinjenjima i koja se u tradicionalnoj medicini koristi kao antiseptik, kao i u lečenju stomačnih i respiratornih jedinjenja. Glavna do sada pokazana dejstva origana su anti-bakterijsko i antioksidantno, a pokazano je i anti- hiperglikemijsko dejstvo origana u modelu toksičnog DT1, što čini origano potencijalnim kandidatom za terapiju DT1. U ovoj studiji je po prvi put ispitivano dejstvo različitih ekstrakata origana (metanolni, vodeni i etil-acetatni) na razvoj DT1 izazvanog višestrukim malim dozama streptozotocina (VMDS) kod miševa C57BL/6. Ispitivani su ćelijski i molekulski mehanizmi dejstva ekstrakata origana na ćelije imunskog sistema i beta ćelije pankreasa in vitro i in vivo. Takođe su vršena in vitro i in vivo ispitivanja najobilnijih jedinjenja u sastavu ekstrakata origana kako bi se otkrio mogući aktivni princip ekstrakata origana. In vitro ispitivanja su pokazala da su ekstrakti, primenjeni u koncentracijama koje nisu bile citotoksične, promenili imunski odgovor makrofaga poreklom iz peritonealne tečnosti i limfocita izolovanih iz cervikalnih limfnih čvorova. Vodeni i etil-actetatni ekstrakti origana su smanjili inflamacijski potencijal makrofaga putem smanjene sekrecije azot monoksida (NO) (vodeni ekstrakt origana) i smanjene sekrecije inflamacijskog citokina IL-1β (vodeni i etil-acetatni ekstrakt origana), dok je metanolni ekstrakt origana smanjio sekreciju NO makrofaga, a povećao sekreciju citokina IL-1β i TNF. Metanolni i etil-acetatni ekstrakti origana su smanjili i inflamacijski kapacitet limfocita putem smanjene sekrecije citokina IL-2, IFN-γ i IL-17 (metanolni) i IFN-γ i IL-17 (etil-acetatni). Osim efekta na imunske ćelije, ekstrakti origana su ispoljili i citoprotektivno dejstvo na beta ćelije pankreasa in vitro. Naime, metanolni i vodeni ekstrakti origana su sprečili smrt beta ćelija pankreasa indukovanu citotoksičnim citokinima, dok je etil-acetatni ekstrakt origana ovaj efekat ispoljio u najnižim primenjenim koncentracijama. Metanolni ekstrakt origana je sprečio apoptozu beta ćelija indukovanu citokinima smanjenjem aktivnosti kaspaze 3. In vivo ispitivanja na animalnom modelu kod koga je DT1 indukovan VMDS pokazala su da je profilaktički tretman sa metanolnim i etil-acetatnim, ali ne i vodenim ekstraktom origana, sprečio nastanak DT1 kod miševa soja C57BL/6. Ovo je bilo podržano i očuvanjem broja i funkcije pankreasnih ostrvaca na fiziološkom nivou- metanolni i etil-acetatni ekstrakti origana su sprečili infiltraciju ćelija imunskog sistema u pankreasna ostrvca, a metanolni ekstrakt origana je inhibirao i produkciju pro- oksidativih medijatora i održao koncentraciju insulina na fiziološkom nivou. Terapijski treman sa metanolnim ekstraktom origana doveo je do prolaznog smanjenja incidence DT1 kod miševa. Ex vivo ispitivanja mehanizma dejstva ekstrakata origana na DT1 pokazala su da je metanolni ekstrakt origana sprečio nastanak DT1 direktnim dejstvom na Th17 ćelije i pomeranjem balansa od destruktivnog Th1/Th17 imunskog odgovora ka protektivnom Th2/Treg imunskom odgovoru. Sa druge strane, etil-acetatni ekstrakt origana je antidijabetogeno dejstvo ostvario umirivanjem inflamacijskog M1/Th1/Th17 imunskog odgovora, kao i pomeranjem funkcionalnog fenotipa makrofaga ka antiinflamacijskom M2 fenotipu. Ruzmarinska i salvijanolična kiselina, kao i karvakrol su supstance koje su najzastupljenije u metanolnom i etil-acetatnom ekstraktu origana. U ovoj studiji je pokazano da, uprkos ispoljavanju imunomodulatornog dejstva in vitro, nijedna od ovih supstanci nije uspela da spreči nastanak DT1 u VMDS animalnom modelu ove bolesti. Određivanje jednog ili više aktivnih principa metanolnog i etil-ecatatnog ekstrakta origana moglo bi biti predmet budućih istraživanja. Rezultati ove disertacije ukazuju na to da primena metanolnog i etil-acetatnog ekstrakta origana može biti pogodna u potencijalnom tretmanu DT1, kako u preventivnim tako i u kombinovanim terapijskim strategijama lečenja DT1.

Type 1 diabetes (T1D) is autoimmune disorder which develops as a consequence of destruction of insulin-producing pancreatic beta cells which is induced by pro- inflammatory mediators. Beta cell destruction leads to impaired insulin production and loss of glucose homeostasis. The hallmark of T1D is formation of insulitis- immune cells infiltration in pancreatic islets. Macrophages are the first cells that infiltrate pancreatic islets. It is considered that proinflammatory M1 macrophages contribute to T1D pathogenesis, while antiinflammatory M2 macrophages play a protective roll in T1D development. Macrophages can activate autoreactive CD4+ and CD8+ T lymphocites that are considered to be key players in T1D pathogenesis. Cytokines produced by immune cells lead to differentiation of specific T helper cells (Th) subsets, that can be destructive (Th1 and Th17) or protective (Th2 i Treg) in T1D development. Immune cells, by vast effector mechanisms, lead to formation of inflammatory milleu around pancreatic islets which ultimately stimulates beta cell apopotosis. Treatment for T1D includes lifetime intake of insulin which can potentially cause a number of short- and long term complications. This is why scientists invest significant efforts in developing new therapeutic approaches for T1D treatment. Plants and their extracts are promising candidates for treatment of T1D, due to their rich content of phenolic compounds which are proven to be beneficial for human health. Origanum vulgare ssp. hirtum (Greek oregano) is native plant rich in phenolic and ester compounds. It is used in traditional medicine as antiseptic, as well as in the treatment of respiratory and stomach ailments. Main known activities of oregano are antibacterial and antioxidant. Also, recently is reported anti-hyperglycaemic activity of oregano in the model of toxic diabetes. These facts make oregano a promising candidate for the treatment of T1D. This study for the first time investigates the effect of different oregano extracts (methanolic, aqueous and ethyl acetate) on multiple low doses streptozotocin (MLDS)- induced T1D in C57BL/6 mice. Also, cellular and molecular mechanisms of oregano extracts action on immune cells (macrophages and lymphocytes) and pancreatic beta cells were investigated both in vitro and in vivo. Additionaly, the effects of specific predominant substances found in oregano extracts on T1D pathogenesis were explored. Oregano extracts, in non-cytotoxic concentrations, showed immunomodulatory effects in vitro. Aqueous and ethyl acetate oregano extracts decreased inflammatory macrophage potential by reducing secretion of nitric oxide (NO) (aqueous oregano extract) and proinflammatory citokine IL-1β (aqueous and ethyl acetate oregano extracts). On the other hand, methanolic oregano extract decreased secretion of NO, while increasing secretion of IL-1β and TNF. Also, methanolic and ethyl acetate oregano extracts reduced in vitro lymphocite secretion of cytokines IL-2 (methanolic oregano extract), IFN-γ and IL-17 (methanolic and ethyl acetate oregano extracts). Besides the effect on immune cells in vitro, oregano extracts exhibited cytoprotective effects on pancreatic beta cells in vitro, protecting them from death induced by cytotoxic cytokines. MEO inhibited beta cell apoptosis by reducing acitivity of caspase 3. Prophylactic treatment with methanolic and ethyl acetate, but not aqueous oregano extract, reduced incidence of MLDS induced T1D in C57BL/6 mice. This was accompanied by preservation of beta cell number and function- methanolic and ethyl acetate oregano extracts inhibited infiltration of immune cells in pancreatic islets, while methanolic oregano extract also augmented production of oxidative mediators and kept insulin levels in the physiological range. Therapeutic treatment of T1D with methanolic oregano extract showed only transient effects. Detailed investigation of oregano extracts mechanisms of action showed that methanolic oregano extract ameliorated T1D by direct effect on Th17 cells and by shifting the balance from proinflammatory Th1/Th17 immune response towards protective Th2/Treg immune response. Ethyl acetate oregano extract, on the other hand, inhibited T1D by attenuating inflammatory M1/Th1/Th17 immune response, and by shifting macrophages towards protective M2 functional phenotype. Rosmarinic and salvianolic acid, as well as carvacrol, are most prevalent substances in methanolic and ethyl acetate oregano extracts. Although they showed immunomodulatory effects in vitro, they failed to protect mice from T1D development in vivo. Determination of one or more active principles of methanolic and ethyl acetate oregano extracts could be the subject of future studies. Results of this dissertation implicate methanolicic and ethyl-acetate oregano extracts as new potential candidates in the treatment of T1D, both in the preventive or combined therapeutic strategies.

Morfološka i genetička diferencijacija kečige (Acipenser ruthenus L.) u srednjem i donjem toku Dunava

Morphological and genetic differentiation of sterlet (Acipenser ruthenus L.) from the middle and lower Danube section

Kečiga (Acipenser ruthenus L., 1758) predstavlja potamodromnu jesetarsku vrstu, koja naseljava reke u slivovima Crnog, Azovskog, Kaspijskog, Baltičkog, Belog, Barencovog i Kara mora. Značajan pad brojnosti usled izlova tokom XX veka doveo je do potrebe za boljom zaštitom, pa je na IUCN Crvenoj listi ugroženih vrsta, kečiga svrstana među ranjive vrste (VU). Radi ispitivanja morfološke i genetičke diferencijacije kečige u srednjem i donjem toku Dunava, uzorkovano je 95 jedinki iz tri populacije, od kojih dve iz Srbije (Novi Kneževac na Tisi i Bačka Palanka na Dunavu) i jedna populacija iz Rumunije (Grindu na Dunavu). Međupopulaciona varijabilnost spoljašnje morfologije (promene veličine i oblika tela i glavenog regiona) analizirana je primenom metoda geometrijske morfometrije. Uni- i multivarijatnom analizom varijanse utvrđeno je postojanje statistički značajnih razlika u veličini i obliku analiziranih morfoloških celina između jedinki sa različitih lokaliteta. Kanonijska diskriminantna analiza (CVA) ukupne varijabilnosti oblika, kod lateralnog i ventralnog prikaza tela i lateralnog prikaza glavenog regiona, pokazala je da se po prvoj osi razdvaja populacija iz Rumunije od populacija iz Srbije. Na nivou ventralne perspektive tela, kao i na nivou obe perspektive glave utvrđen je statistički značajan efekat alometrije na ukupnu varijabilnost oblika. Na osnovu CVA nealometrijske komponente varijabilnosti oblika tela (ventralna perspektiva) i glavenog regiona (lateralna i ventralna perspektiva) utvrđeno je da po prvoj osi postoji razdvajanje jedinki iz Rumunije u odnosu na jedinke iz Srbije. Takođe, CVA nealometrijske komponente varijabilnosti oblika glavenog regiona u obe perspektive ukazuje na mogućnost da kečige iz Srbije (naročito one iz Tise) odgovaraju kratkoriloj, dok kečige iz Rumunije odgovaraju dugoriloj formi. Upotrebom mitohondrijske DNK i mikrosatelita kao molekularno-genetičkih markera, detektovan je značajan nivo diverziteta (13 haplotipova, prosečan broj alela po lokusu i populaciji 4.3 – 4.9 i dobijena heterozigotnost 0.577 – 0.648) ali ne i jasna diferencijacija između populacija. Takođe je utvrđeno postojanje pet novih haplotipova, dok je za osam prethodno identifikovanih haplotipova prošireno rasprostranjenje. Analiza molekularne varijanse pokazala je da je genetička varijabilnost skoro u potpunosti raspoređena između individua i da izostaje međupopulaciona varijabilnost. Najveća genetička diferencijacija (FST=0.038) uočena je kod uzoraka iz Dunava, dok je najniža (FST=0.018) uočena između uzoraka iz Srbije (Tisa i Dunav). Nije utvrđeno prisutvo recentnog ''uskog grla'' ni u jednoj analiziranoj populaciji. Najniže vrednosti za efektivnu veličinu populacije su zabeležene na lokalitetu Bačka Palanka (8.1). Budući da razlike na genetičkom nivou kečiga sa različitih lokaliteta u srednjem i donjem slivu Dunava izostaju, uočene međupopulacione razlike na morfološkom nivou mogu ukazivati na fenotipsku plastičnost jedinki, odnosno njihovo prilagođavanje uslovima sredine. Rezultati istraživanja ovog rada predstavljaju doprinos poznavanju morfološke i genetičke varijabilnosti populacija kečige u srednjem i donjem toku Dunava i mogu služiti kao osnova za donošenje aktivnih mera u okviru programa zaštite ove ugrožene vrste.

Sterlet (Acipenser ruthenus L., 1758) is a potamodromus sturgeon species, which inhabits river stretches of Black, Azov, Caspian, Baltic, White, Barents and Kara sea drainages. Sterlet experienced a decline during 20th century, which led to necessity for better protection, and inclusion on IUCN Red List of endangered species as a vulnerable species (VU). То analyse morphological and genetic differentiation of sterlet in Middle and Lower Danube sections, 95 specimens were sampled from three populations, two from Serbia (Novi Kneževac on Tisza River and Bačka Palanka on Danube River) and one from Romania (Grindu on Danube River). Variability of external morphology (size and shape variation of body and head region) was examined using geometric morphometric methods. Statistically significant interpopulation differences in size and shape of analyzed morphological structures were found. Canonical variate analysis (CVA) of overall shape variation (for lateral and ventral views of body and for lateral view of head region) showed that first CV axis separated Romanian sample from Serbian samples. Statistically significant effect of alometry was observed for ventral view of the body, as well as for lateral and ventral views of the head. CVA of non-allometric component of shape variation for body in ventral view and for head in lateral and ventral views showed separation of Romanian population from Serbian populations. Also, non-allometric shape changes of head in lateral and ventral views correspond to shape differences between blunt-snout and pointed-snout sterlet morphs. Use of mitochondrial DNA and microsatellite markers, showed significant level of diversity (13 haplotypes, allelic richness range from 4.3 to 4.9, observed heterozygosity from 0.577 to 0.648). Genetic analysis (mtDNA and microsatellite) showed lack of clear population differentiation. Additionally, five new haplotypes were detected, while eight previously described haplotypes had extended their previous range. Analysis of molecular variance indicated that the genetic variance could be attributed almost entirely to individuals from same populations and that interpopulation variability was absent. Samples from the Danube River were most divergent (FST=0.038), while lowest FST (0.018) was observed between samples from Serbia (Tisza and Danube River). Recent bottleneck was not detected in any of the analyzed populations. Lowest effective population size (8.1) was determined in Bačka Palanka population. The lack of differentiation at genetic level, but the presence of interpopulation differences at morphological level, pointed to phenotypic plasticity of sterlet from Middle and Lower Danube River sections. Findings from this research could contribute to the knowledge about morphological and genetic variability of sterlet populations in Middle and Lower Danube River basin and represent a basis for future conservation programs of this endangered species.

Molekularno profilisanje i karakterizacija trostruko negativnih i hormonski zavisnih tumora dojke

Molecular profiling and characterisation of triple negative and hormone dependent breast tumors.

Karcinom dojke je i klinički i genetički heterogeno oboljenje sa varijabilnim odgovorom na terapiju. Estrogenski – ER, progesteronski – PR i receptor za humani epidermalni factor rasta 2 – HER2, najbitniji su biološki markeri na osnovu čije ekspresije se karcinomi dojke dele na: trostruko negativne (TNBC) koji ih ne eksprimiraju i na hormonski zavisne (ER+) tumore koji eksprimiraju ER, a pokazuju varijabilnu ekspresiju PR i HER2. Ovi markeri ključni su i za izbor terapije. TNBC i ER+ karcinomi dojke se rezlikuju po svom kliničkom ponašanju, karateristikama i agresivnosti. TNBC je daleko agresivniji. Navedene razlike posledica su genetičkih lezija čije bi tumačenje moglo da doprinese razvoju novih strategija u terapiji ovih tumora. U vezi sa tim, osnovni cilj ove studije bio je utvrđivanje amplifikacionog obrasca odabrane grupe onkogena, FGFR1, c-MYC, EGFR i CCND1, u oba tipa karcinoma dojke kao i povezivanje njihovog amplifikacionog statusa sa kliničkim tokom i ishodom bolesti. Rezistencija na sistemsku terapiju je osnovni problem u tretmanu oba tipa karcinoma dojke. Ovaj problem posebno je izražen kod obolelih od TNBC koji se zbog odsustva ekspresije ER, PR i HER2, tretiraju isključivo citostaticima na koje vrlo često razvijaju rezistenciju. Zato je jedan od osnovnih ciljeva ove studije bio i identifikacija bioloških mehanizama koji leže u osnovi rezistencije na hemioterapiju, odnosno ispitivanje ekspresionog profila BCRP i MRP1 membranskih transportera i njihove povezanosti sa tokom i ishodom bolesti. Amplifikacioni status analiziranih onkogena ispitan je RT-qPCR metodom, a ekspresioni profil membranskih transportera imunohistohemijskom analizom – IHC. Uporednom analizom amplifikacionog profila četiri onkogena u dva tipa karcinoma dojke, utvrđeno je da se drugačije ponašanje, karaketristike i agresivnost TNBC tumora mogu pripisati značajno češćoj amplifikaciji c-MYC onkogena u ovoj grupi tumora. Utvrđeno je, takođe, da bi amplifikacioni profil c-MYC onkogena mogao biti dobar prognostički marker i dobar parameter za odabir terapije obolelih od TNBC, jer je kod ove grupe bio u asocijaciji sa najvišim histološkim gradusom i stadijumom bolesti. Suprotno tome, u grupi ER+ tumora detektovana je značajno češća amplifikacija drugog, CCND1 onkogena. Iz ko- alteracione analize odabranih onkogena u dve grupe karcinoma dojke, utvrđeno je da su ko-amplifikacije c-MYC/FGFR1 i FGFR1/EGFR onkogena značajno češće kod TNBC, a ko-amplifikacije onkogena FGFR1/CCND1 i EGFR/CCND1 kod ER+ tumora. Iz uporedne ekspresione analize membranskih transportera u obe grupe karcinoma dojke, utvrđeno je da bi BCRP i MRP1 mogli biti odgovorni za sticanje rezistencije na hemioterapiju u TNBC populaciji, jer su značajno češće i sa višim skorom eksprimirani kod obolelih iz ove grupe. Utvrđeno je da BCRP povećava rezistenciju i istovremeno smanjuje agresivnost tumora čime doprinosi boljem preživljavanju obolelih od TNBC-a. Drugim rečima, u ovoj studiji se po prvi put, ukazuje na dvostruku ulogu BCRP proteina kod obolelih od TNBC-a. Inhibicija MRP1, ali ne i BCRP, uz istovremenu primenu hemioterapije, mogla bi biti logična strategija u tretmanu obolelih od TNBC.

Breast cancer is both clinically and genetically a heterogeneous disease with variable response to therapy. Based on the expression of tree most important biological markers, estrogen receptor – ER, progesterone receptor – PR and human epidermal growth factor receptor 2 – HER2, breast cancer can be divided into: triple negative (TNBC) that do not express these receptors and hormone dependent (ER+) tumors that express ER and have a variable expression of PR and HER2. These markers are key for determining therapy. TNBC and ER+ breast cancers differ in their clinical behavior, characteristics and aggressiveness. TNBC is by far more aggressive type. Clarification of genetic lesions that induce the mentioned differences could contribute to the development of new therapeutic strategies for these tumors. Therefore, the main aim of this study was to determine the amplification pattern of the selected oncogene group, FGFR1, c-MYC, EGFR and CCND1, in both types of breast cancer, as well as to investigate a possible connection of amplification status of these oncogenes with the clinical course and outcome of the disease. Resistance to systemic therapy is a primary problem in treatment of both types of breast cancer. This problem is especially pronounced in patients with TNBC that, due to the absence of ER, PR and HER2 expression, are only treated with cytostatics to which they frequently develop resistance. For this reason, one of the main aims of this study was to identify biological mechanism that are the basis of chemoresistance, namely, to investigate the expression profiles of BCRP and MRP1 membrane transporters and their connections with the clinical course and outcome of the disease. The amplification profile of the analyzed oncogenes was investigated using RT- qPCR, while the expression profile of the membrane transporters was analysed by immunocytochemistry – IHC. Comparative analysis of the amplification status of the four oncogenes in both types of breast cancer, revealed that the different behavior, characteristics and aggressiveness of TNBC could be contributed to significantly more frequent amplification of c-MYC oncogene in these tumors. The amplification profile of c-MYC could, potentially, be a good prognostic marker and a good parameter for choosing optimal therapy for TNBC patients since it was associated with the highest histological grade and stage of this disease. On the contrary, a significantly more frequent amplification of CCND1 oncogene was detected in ER+ tumors. From co-alteration analysis of the selected oncogenes in both types of breast cancer, it was determined that co-amplifications of c-MYC/FGFR1 and FGFR1/EGFR oncogenes were significantly more frequent in TNBC, while co-amplifications of FGFR1/CCND1 and EGFR/CCND1 were predominantly present in ER+ tumors. Comparative, expression analysis of membrane transporters in both types of breast cancer revealed that BCRP and MRP1 were significantly more frequently and with a higher score, expressed in TNBC, and could, therefore, be responsible for the development of chemoresistance in TNBC population. It was determined that BCRP increases chemoresistance, while, at the same time, reduces tumor aggressiveness contributing to the better overall survival of TNBC patients. In other words, this study is the first to indicate a possible double role of BCRP protein in TNBC. The inhibition of MRP1, but not BCRP, together with chemotherapy, could be a logical strategy in treatment of TNBC patients.

Asocijacija promena antropometrijskih i metaboličkih parametara i aktivnosti enzima antioksidativne zaštite sa polimorfizmom LEP G2548A u genu za leptin kod gojaznih osoba u Srbiji

Association of changes in anthropometric and metabolic parameters and activities of antioxidative enzymes with leptina gene polymorphism LEP G-2548 in obese people in Serbia

Stopa rasta gojaznosti predstavlja glavni javni zdravstveni problem. U Evropi je njena učestalost u opsegu 10-25% kod muškaraca i 10-30% kod žena. Prevalenca gojaznosti je povećana u Srbiji i ona je postala značajan zdravstveni problem kod odraslih u Srbiji: do 54% ispitanika odraslog stanovništva je gojazno. Gojaznost je bolest koja se definiše kao patološka akumulacija telesne masne mase, koja može nastati kao rezultat povećanog unosa energije i smanjene potrošnje energije. Danas se smatra da je genetska predispozicija za nastanak gojaznosti jedan od glavnih faktora rizika za pojedince, ali identifikaciju gena koji su uključeni u nastanak gojaznosti je još uvek teško razjasniti. S obzirom na činjenicu da je koncentracija leptina znatno povećana kod gojaznih osoba, a istovremeno je proporcionalna telesnoj masi, gen leptina (LEP) je procenjivan u odnosu na genetičke varijante koje bi eventualno mogle biti u vezi sa patofiziologijom gojaznosti i njenim komplikacijama. Leptin je hormon protein kodiran genom gojaznosti (ob), a sintetiše ga pretežno belo masno tkivo. Centralni nervni sistem, tačnije jedra hipotalamusa su meta u kojima leptin ispoljava većinu svojih efekata na metabolizam energije. Leptin ostvaruje nekoliko sistemskih efekata kao što: su smanjenje unosa hrane, povećanje energetske potrošnje, kao i smanjenje metaboličke efikasnosti. Pored toga, leptin utiče na širok spektar bioloških funkcija poput metabolizma lipida i glukoze, sintezu glukokortikoida kao i insulina, a postoji sve više dokaza da je leptin uključen i u patogenezu inflamatornih i autoimunih bolesti. Adekvatne masne naslage i koncentracija leptina smanjuju potrebu za unosom hrane, a omogućavaju potrošnju energije putem raznih neuroendokrinih osa i autonomne aktivnosti. Retki sindromi gojaznosti su povezani sa mutacijama LEP gena kod ljudi. Česta genetička varijanta jednog nukleotida u 5 'promotorskom regionu koji se sastoji u supstituciji G u A na nukleotidu (nt) -2548 (LEP G-2548A, -dbSNPID rs7799039) uzvodno od starta transkripcije ATG u promotoru LEP je povezan sa varijacijama koncentracije leptina u plazmi i indeksom telesne mase (BMI) kod gojaznih osoba. Pokazano je da genetička varijanta LEP G-2548A utiče na ekspresiju i sekreciju leptina u masnom tkivu. Iako LEP varijante mogu biti važne za patofiziologiju humane gojaznosti i sa njom povezanih komplikacija, rezultati asocijacije genetičke varijante LEP G-2548A sa gojaznošću su kontradiktorni. Jedan od ciljeva ove doktorske disertacije bio je da se ispitaju moguće asocijacije genetičke varijante LEP G-2548A sa gojaznošću povezanih antropometrijskih i metaboličkih parametara i aktivnosti antioksidativnih enzima u populaciji gojaznih osoba. U studiji je uključena grupa koju je činio 31 ispitanik sa hiperalimentacionim tipom gojaznosti (prosečne starosti 39,26 ± 11,45 godina, BMI: 41.51 ± 9.22 kg/m2) i grupa od 36 zdravih, normalno uhranjenih osoba (prosečne starosti: 33.55 ± 6.46 godina; BMI: 22.63 ± 1.94 kg/m2). Uzorci krvi su sakupljeni za izolaciju DNK, serumi za određivanje koncentracije leptina i lipida, lipoproteina, slobodnih masnih kiselina (SMK), azot monoksida (NO) i C- reaktivnog proteina (CRP) kao markera inflamacije i za merenja 4-hidroksi-2-nonenola (4-HNE), markera lipidne peroksidacije i aktivnosti antioksidativnih enzima, kao što su superoksid dismutaza (SOD), katalaza (CAT), glutation peroksidaza (GPx), glutation reduktaza (GR), kao i odredjivanje ukupnog antioksidativnog statusa (TAS). Genotipovi varijante LEP G- 2548A su određeni lančanom reakcijom polimeraze (PCR) i restrikcionom analizom sintetisanih fragmenata DNK (RFLP). Rezultati ove doktorske disertacije pokazuju da su gojazni ispitanici imali značajno veću telesnu masu (BW), indeks telesne mase (BMI), obim struka (WC), sistolni krvni pritisak (SBP) i dijastolni krvni pritisak (DBP). Kod gojaznih ispitanika uočen značajno viši nivo insulina našte u plazmi (FPI) i 2 sata posle jela (2 h PI), indeks rezistencije na insulin našte (HOMA-IR) i 2 sata posle jela (2 h HOMA-IR), lipoproteina male gustine (LDL), kao i odnos LDL/lipoproteini velike gustine (HDL), triglicerida (TG), apolipoproteina B (ApoB), dok su nivoi HDL i apolipoprotein AI (ApoA-I) bili značajno niži u poređenju sa kontrolnim ispitanicima. Nisu uočene značajne promene nivoa glukoze našte u plazmi (FPG), kao ni 2 sata posle jela (2 h PG), ukupnog holesterola (TC) i lipoproteina (a) (Lp (a)) između gojaznih i kontrolnih ispitanika. Nivoi leptina bili su značajno viši kod gojaznih ispitanika u poređenju sa kontrolnim. Raspodela frekvencije genotipova varijante LEP G-2548A je bila u Hardi- Vajnbergovoj ravnoteži i kod gojaznih i kod kontrolnih ispitanika. Distribucija frekvencija genotipova se nije značajno razlikovala između ispitivanih grupa. Učestalost alela G i alela A za genetičku varijantu LEP G-2548A je: 0,60 i 0,40 u grupi gojaznih i 0,53 i 0,47 u kontrolnoj grupi. Rezultati ove doktorske teze pokazuju postojanje statistički značajne asocijacije između genotipova varijante LEP G-2548A i antropometrijskih parametara BW, WC i BMI kod kontrolnih ispitanika. Koristeći dominantni model kod kontrolnih ispitanika nosilaca heterozigota GA i kontrolnih ispitanika nosilaca homozigota AA pokazana je statistički značajno manja telesna masa, obim struka i indeks telesne mase u poređenju sa kontrolnim ispitanicima nosiocima homozigota GG. Takođe, koristeći dominantan model kod kontrolnih ispitanika nosilaca heterozigota GA i kontrolnih ispitanika nosilaca homozigota AA koncentracija NO u plazmi bila je statistički značajno veća u poređenju sa kontrolnim ispitanicima nosiocima homozigota GG. Takođe, rezultati pokazuju postojanje statistički značajne asocijacije između genotipova varijante LEP G- 2548A i metaboličkih parametara LDL i ApoB kod gojaznih ispitanika. Koristeći kodominantni model kod gojaznih ispitanika nosilaca genotipa AA varijante LEP G- 2548A utvrđena je značajna asocijacija sa nižim nivoom LDL u poređenju sa gojaznim ispitanicima nosiocima genotipa GA, odnosno, nosiocima genotipa GG. Koristeći recesivni model analize, kod gojaznih ispitanika nosilaca genotipa AA uočena je značajna asocijacija sa nižim nivoom LDL u odnosu na gojazne ispitanike nosioce genotipa GG kao i gojazne ispitanike nosioce genotipa GA. Koristeći kodominantni model analize kod gojaznih ispitanika nosilaca genotipa AA uočeno je postojanje značajne asocijacije sa nižim nivoom ApoB u odnosu na gojazne ispitanike nosioce genotipa GA. Za ostale ispitivane parametre nije uočeno postojanje asocijacije sa LEP G-2548A. U zaključku, ovo je prva studija koja istražuje asocijaciju genetičke varijante LEP G-2548A sa antropometrijskim i metaboličkim parametrima i aktivnosti antioksidativnih enzima kod gojaznih osoba u srpskoj populaciji. U ovoj doktorskoj disertaciji pokazano je postojanje asocijacije između genetičke varijante LEP G-2548A sa antropometrijskim parametrima (BW, WC i BMI) i markerom inflamacije (NO) kod kontrolnih ispitanika, kao i sa metaboličkim parametrima (LDL i ApoB) kod gojaznih ispitanika.

The growth in obesity rates presents a major public health concern. In Europe, its prevalence is within the range of 10–25% in men and 10–30% in women. The prevalence of obesity increased in Serbia and it became a significant public health problem among adults: up to 54% examinees of adult populations were obese. Obesity is a disease defined as abnormal accumulation of body fat mass, which may arise as a result of increased energy intake and decreased energy expenditure. Genetic predisposition to obesity has been reported as a major risk factor for individuals, but identification of the involved genes is still difficult to elucidate. Considering the fact that leptin concentration is significantly increased in obese persons and at the same time is proportional with body weight, the leptin gene (LEP) has been evaluated for polymorphisms that could potentially be related to the pathophysiology of obesity and its complications. Leptin is a protein hormone encoded by the obese (ob) gene, and is synthesized predominantly by white adipose cells. Central nervous system, namely hypothalamic nuclei, is the target where leptin exerts most of its effects on energy metabolism. Leptin has several systemic effects such as decreases food intake, increases energy expenditure, and decreases metabolic efficiency. In addition, leptin has been shown to influence a wide spectrum of biological functions, such as lipid and glucose metabolism, synthesis of glucocorticoids as well as insulin, and there is an increasing evidence that leptin is involved in the pathogenesis of inflammatory, and autoimmune diseases. Adequate fat stores and leptin concentrations decrease the need for food intake however, allow expenditure of energy via a variety of neuroendocrine axes, autonomic outputs and activities. Rare obesity syndromes are associated with mutations of LEP in humans. A common single nucleotide polymorphism within the 5′ promoter region consisting in G to A substitution at nucleotide (nt) -2548 (LEP G-2548A, -dbSNPID rs7799039) upstream of the ATG start site, in LEP promoter has been associated with variations in the concentrations of plasma leptin and body mass index (BMI) in obese individuals. It has been shown that LEP G-2548A polymorphism influences expression and secretion of leptin in adipose tissue. Although the LEP variants may be important to the pathophysiology of human obesity and associated complications, the associations of LEP G 2548A polymorphism with obesity have been inconclusive. The one of the aims of this doctoral dissertation was to investigate possible associations of LEP promoter polymorphism LEP G-2548A and obesity-associated anthropometric and metabolic parameters and activities of antioxidative enzymes in obese population. Group of 31 examinees with hyperalimentary type of obesity (mean age: 39.26 ± 11.45 years; BMI: 41.51 ± 9.22 kg/m2) and 36 healthy, nonobese, normal weight examinees (mean age: 33.55 ± 6.46 years; BMI: 22.63 ± 1.94 kg/m2) were studied. Blood samples were collected for DNA isolation, serum leptin and serum lipids, lipoproteins, free fatty acid (FFA), nitrogen oxide (NO) and C- reactive protein (CRP) as markers of inflammation measurements as well as for 4-hydroxy -2- nonenol (4-HNE), i.e. marker of lipid peroxidation and activities of antioxidant enzymes such as superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), glutathione peroxidase (GPx), glutathione reductase (GR) together with total antioxidant status (TAS). LEP G-2548A genotypes were determined by PCR restriction fragment length polymorphism based analyses. Results from this doctoral dissertation show that obese examinees had significantly higher body weight (BW), BMI, waist circumference (WC), systolic blood pressure (SBP) and diastolic blood pressure (DBP) compared with control examinees. As for metabolic parameters the obese subjects had significantly higher fasting plasma insulin (FPI), 2 h plasma insulin (2 h PI) values, homeostatic model assessment-insulin resistance (HOMA-IR), 2 h HOMA-IR levels, low density lipoproteins (LDL), LDL/high density lipoproteins (HDL) ratio, triglycerides (TG), apolipoprotein B (ApoB) levels while HDL and apolipoprotein A-I (ApoA-I) levels were significantly lower compared with control examinees. No significant changes of fasting plasma glucose (FPG), 2 h plasma glucose (2 h PG), total cholesterol (TC) and lipoprotein (a) (Lp(a)) levels between obese and control examinees were observed. Leptin levels were significantly higher in obese examinees compared with control. The genotype frequency distribution for LEP G-2548A gene polymorphism was in Hardy–Weinberg equilibrium for both obese and control examinees. The distribution of the genotype frequencies was not significantly different between the studied groups. The frequencies of alleles G and A for LEP G-2548A polymorphism was: 0.60 and 0.40 in the obese group, and 0.53 and 0.47 in control group. Statistically significant associations between LEP G-2548A genotypes and anthropometric parameters BW, WC and BMI in control examinees were observed. Results obtained by using dominant model of analysis show that control examinees with GA heterozygote and AA homozygote, both have significantly lower levels of BW, WC and BMI compared with control examinees with GG homozygote. The same analysis shows that control examinees with GA heterozygote and AA homozygote both, have significantly higher levels of NO concentration compared with control examinees with GG homozygote. Furthermore, results show statistically significant associations between LEP G-2548A genotypes and metabolic parameters LDL and ApoB in obese examinees. Using codominant model of analysis, results show that obese examinees with AA homozygote have significantly lower levels of LDL compared with both the obese examinees with GG homozygote and obese examinees with GA heterozygote. Recessive model of analysis demonstrate that AA homozygote have significantly lower levels of LDL compared with both, obese examinees with GG homozygote and obese examinees with GA heterozygote. Analysis by using codominant model shows that obese examinees with homozygote AA have significantly lower levels of ApoB compared with obese examinees with GA heterozygote. No other association was found. In conclusion, this is the first study that investigates the association between LEP G-2548A polymorphism with anthropometric and metabolic parameters and activities of antioxidant enzymes in Serbian population. Results generated within this doctoral thesis show the association between LEP G-2548A polymorphism with anthropometric parameters (BW, WC and BMI) and marker of inflammation (NO) in control examinees and with metabolic parameters (LDL and ApoB) in obese examinees.

Antiinflamatorna i antioksidativna svojstva benfotiamina u aktiviranoj liniji mikroglijskih ćelija miša: uloga proinflamatornih signalnih puteva

Antiinflammatory and antioxidative properties of benfotiamine in activated microglial mouse cell line: role of proinflammatory signaling pathways

Inflamacija je zajedničko obeležje različitih patologija centralnog nervnog sistema (CNS), od traumatskih povreda i ishemije, preko neurodegenerativnih oboljenja, do psihijatrijskih poremećaja. Mikroglijske ćelije su rezidentne imunske ćelije CNS-a koje predstavljaju glavne pokretače i učesnike u inflamaciji. Mikroglija se aktivira u odgovoru na promene u homeostazi CNS-a pri čemu menja svoje morfološke i funkcionalne karakteristike. U aktiviranoj mikrogliji dolazi do reorganizacije citoskeleta što omogućava uvećanje ćelijskog tela, fagocitozu patogena ili ćelijskog otpada, kao i migraciju do mesta infekcije ili povrede. Takođe, aktivirana mikroglija produkuje brojne proinflamatorne medijatore, kao što su proinflamatorni citokini, hemokini, proteaze, reaktivne kiseonične i azotne vrste. Iako ovi molekuli imaju važnu ulogu u odbrani CNS-a od patogena i drugih štetnih stimulusa, oni tokom hronične aktivacije mikroglije dovode do snažnog inflamatornog odgovora, oštećuju i zdrave ćelije i dovode do neurodegeneracije. Stoga je smanjenje prekomerne mikroglijske aktivacije jedna od glavnih strategija u terapiji oboljenja CNS-a koja se odlikuju inflamacijom. Benfotiamin (S-benzoiltiamin O-monofosfat) je analog vitamina B1 sa većom biološkom raspoloživošću i dobrim farmakološkim profilom. Benfotiamin pokazuje povoljne efekte u lečenju neuropatija, nefropatija i retinopatija izazvanih dijabetesom. Pored toga, pokazana su antiinflamatorna i antioksidativna svojstva benfotiamina, ali njegov efekat na aktiviranu mikrogliju do sada nije poznat. Stoga, cilj ove disertacije bio je da se ispita potencijal benfotiamina da smanji aktivaciju mikroglije u in vitro modelu neuroinflamacije. Eksperimenti su rađeni na BV-2 mikroglijskoj ćelijskoj liniji koja je bila stimulisana lipopolisaharidom (LPS), što predstavlja dobro okarakterisan in vitro model aktivacije mikroglije. Rezultati dobijeni u ovoj disertaciji pokazuju da benfotiamin sprečava morfološke promene izazvane stimulacijom BV-2 ćelija LPS-om. Benfotiamin efikasno smanjuje površinu ćelija i sprečava reorganizaciju citoskeleta indukovanu stimulacijom LPS-om. Takođe, benfotiamin smanjenjem produkcije proinflamatornih medijatora ostvaruje antiinflamatorno dejstvo u aktiviranoj mikrogliji. Benfotiamin smanjuje oslobađanje azot-monoksida, snižavajući gensku i proteinsku ekspresiju inducibilne azot oksid sintaze u aktiviranoj BV-2 mikrogliji. Benfotiamin takođe smanjuje gensku i proteinsku ekspresiju ciklooksigenaze-2 i proinflamatornih citokina TNF-α i IL-6, dok sa druge strane povećava oslobađanje antiinflamatornog citokina IL-10. Povrh toga, benfotiamin smanjuje ekspresiju imunoregulatornog receptora CD40 čija aktivacija dovodi do aktivacije proinflamatornih signalnih puteva. Osim antiinflamatornih, benfotiamin pokazuje i antioksidativna svojstva. Benfotiamin smanjuje koncentraciju superoksid- anjona i malondialdehida, indikatora povišenog oksidativnog stresa, čiji nivo raste posle stimulacije BV-2 ćelija LPS-om. Pored direktnog antioksidativnog dejstva, benfotiamin deluje i posredno, povećavajući antioksidativnu odbranu aktiviranih BV-2 ćelija. Benfotiamin povećava gensku i proteinsku ekspresiju antioksidativnih enzima mangan superoksid dismutaze i katalaze, kao i aktivnost bakar cink superoksid dismutaze, katalaze i glutation reduktaze. Pored toga, benfotiamin povećava ukupnu koncentraciju glutationa, glavnog neenzimskog antioksidansa u aktiviranim BV-2 ćelijama. Ispitivanjem signalnih mehanizama u osnovi aktivacije mikroglije zaključeno je da benfotiamin ove efekte ostvaruje smanjujući aktivaciju ERK, JNK i PI3K/Akt signalne kaskade, kao i sprečavanjem translokacije NF-κB transkripcionog faktora iz citoplazme u jedro. Važno je istaći da benfotiamin svoje dejstvo ostvaruje ne menjajući vijabilnost BV-2 ćelija. Na osnovu rezultata prikazanih u ovoj disertaciji može da se zaključi da benfotiamin pokazuje antiinflamatorna i antioksidativna svojstva u aktiviranim BV-2 mikroglijskim ćelijama i da je stoga dobar kandidat za terapiju oboljenja CNS-a koja se karakterišu inflamacijom i preteranom aktivacijom mikroglije.

Inflammation is a hallmark of many central nervous system (CNS) diseases, including traumatic injuries, ischemia, neurodegenerative and psychiatric diseases. Microglia are resident immune cells of the CNS and main initiators and participants in inflammation. They are activated in response to any change in CNS homeostasis. In this process they change their morphological and functional characteristics. Activated microglia is characterized by cytoskeleton reorganization which enables enlargement of cell body, phagocytosis of pathogens or cell debris, and migration to site of infection or injury. Also, activated microglia release a diverse set of proinflammatory mediators, such as proinflammatory cytokines, chemokines, proteases, reactive oxygen and nitrogen species. Although these molecules have an important role in the defense against pathogens and other harmful stimuli, in chronic microglial activation they trigger strong inflammatory response and lead to damage of healthy cells and subsequent neurodegeneration. Consequently, suppression of microglial overactivation is one of the main strategies in therapy of CNS diseases characterized by inflammation. Benfotiamine (S-benzoylthiamine O-monophosphate) is an analogue of vitamin B1 with higher bioavailability and good pharmacological profile. Benfotiamine exerts beneficial effects in treatment of diabetic complications such as neuropathy, nephropathy and retinopathy. In addition, recent studies have shown that benfotiamine has antiinflammatory and antioxidative properties, but its effect on activated microglia has not been elucidated. Therefore, the aim of this thesis was to examine the potential of benfotiamine to suppress microglial activation in vitro. The experiments were conducted using BV-2 microglial cell line activated with lipopolysaccharide (LPS), which represents a well characterized model of microglial activation. Results obtained in this study show that benfotiamine prevents morphological alterations evoked by stimulation of BV-2 cells with LPS. Benfotiamine efficiently reduces cell surface area and prevents cytoskeleton reorganization induced by LPS stimulation. Also, benfotiamine exerts antiinflammatory properties in activated microglia by inhibiting production of proinflammatory mediators. Benfotiamine suppresses the release of nitric oxide, by inhibiting expression of nitric oxide synthase at the gene and protein level in activated BV-2 microglia. Additionally, benfotiamine decreases gene and protein expression of cyclooxygenase-2 and proinflammatory cytokines TNF-α and IL-6, whereas it increases the release of antiinflammatory cytokine IL-10. Moreover, benfotiamine suppresses the expression of immunoregulatory receptor CD40 whose activation leads to activation of proinflammatory signaling pathways. Aside from exerting antiinflammatory properties, benfotiamine also shows antioxidative effects. Benfotiamine decreases levels of oxidative stress indicators, superoxide anion and malondialdehyde, which are upregulated after LPS stimulation. In addition to direct antioxidative effects, benfotiamine upregulates antioxidative system in activated BV-2 cells. Benfotiamine increases gene and protein expression of antioxidative enzymes manganese superoxide dismutase and catalase, while enhancing activity of copper zinc superoxide dismutase, catalase and glutathione reductase. Furthermore, benfotiamine upregulates the content of total glutathione, main non enzymatic antioxidant in activated microglial cells. Examination of signaling mechanisms that underlie microglial activation led to a conclusion that benfotiamine exerts its effects by decreasing activation of ERK, JNK and PI3K/Akt signaling cascades, in conjunction with inhibiting translocation of NF-κB transcription factor from the cytoplasm to the nucleus. Importantly, benfotiamine exerts these effects without affecting viability of BV-2 cells. In conclusion, benfotiamine shows antiinflammatory and antioxidative properties in activated BV-2 microglial cells and therefore is a good therapeutic candidate for CNS diseases that are characterized by inflammation and overactivation of microglia.

Komparativna analiza pigmentnih lezija i zdravog tkiva kože optičkim spektroskopskim metodama

Comparative analysis of pigmented skin lesions and normal skin using optical spectroscopic methods

Optiĉka spektroskopija i imidţing tehnike mogu biti korisne za ranu dijagnostiku kancera. U ovoj tezi, razlike u luminescentnim odgovorima pigmentnih lezija (melanoma i nevusa) i po svemu sudeći nepigmentne koţe ljudi su analizirane sinhronom luminescentnom spektroskopijom. Merenja su izvršena u opsegu eksitacione talasne duţine od 330 do 545 nm i sinhronom intervalu od 30 do 120 nm, da bi se dobili osnovni i trodimenzionalni sinhroni luminescentni spektri (3DTSLS) za svaki uzorak. Normalna koţa, nevus i melanom se razlikuju u naĉinu na koji fluoresciraju, i te razlike su više naglašene u sinhronim fluorescentnim spektrima nego u klasiĉnim emisionim i eksitacionim spektrima. Razlike u fluorescentnim karakteristikama pigmentnih lezija i zdrave koţe potiĉu od razliĉitih koncentracija endogenih fluorofora i hromofora. Analizom glavnih komponenata i linearnom diskriminantnom analizom sinhronih spektara izmerenih za razliĉite sinhrone intervale pokazano je da je najveća razlika izmeĊu grupa uzoraka dobijena za sinhroni interval 70 nm. Ovi spektri su zatim korišćeni za pravljenje klasifikacionih modela diskriminantnom analizom parcijalno najmanjih kvadrata. Testiranjem uspešnosti ovih modela krivom operativnih karakteristika pokazano je da su oni optimalni, sa maksimalnom vrednošću od jedan za površinu ispod krive operativnih karakteristika za detekciju melanoma. Za testiranje primenjivosti pomenutih tehnika korišćene su veštaĉke neuronske mreţe. U ovu svrhu, samoorganizujuće mape (SOM) i višeslojni perceptron (MLP) su obuĉene na osnovu luminescentnih podataka, a zatim je izvršeno grupisanje uzoraka tkiva. Pokazano je da su obe mreţe SOM i MLP dale dobre rezultate sa stopom uspešnosti klasifikacije uzoraka tkiva od 96% i 98%. Drugi deo eksperimentalnog rada u ovoj tezi se sastojao od merenja difuzno refleksionih spektara koţe volontera na dve regije tela, ĉelu i šaci, u cilju analize svojstava boje koţe na objektivan naĉin. Dobijeni spektri su analizirani korišćenjem analize glavnih komponenata (PCA) i L*a*b* sistema boja koji je preporuĉen od MeĊunarodne komisije za osvetljenje (CIE). Na osnovu rezultata analiza pokazano je da difuzno refleksiona spektroskopija uz korišćenje analize glavnih komponenata i L*a*b* sistema boja predstavlja korisnu i objektivnu metodologiju za analiziranje karakteristika koţe.

Novel optical spectroscopy and imaging methods could be valuable in the early detection of cancer. Differences in the luminescence responses of pigmented skin lesions (melanomas and nevi) and apparently non-pigmented human skin were analyzed using synchronous luminescence spectroscopy in this thesis. Measurements were performed in the excitation range of 330-545 nm, with synchronous interval varyng from 30-120 nm to obtain ordinary and three-dimensional total synchronous luminescence spectra (3DTSLS) of each specimen. Normal skin, nevi and melanomas differ in the way they fluorescence, and these differences are more distinct in the syncronous fluorescence spectra than in the conventional emission and excitation spectra. The differences in the fluorescence characteristics of pigmented and normal skin samples were ascribed to differences in concentracions of endogenous fluorophores and chromophores. Principal component and linear discriminant analysis of the synchronous spectra measured at different synchronous intervals showed that the greatest variance among the sample groups was at the 70 nm interval spectra. These spectra were then used to create partial least squares discriminant analysis-based classification models. Evaluation of the quality of these models from the recevier operating characteristic curves showed they performed well, with a maximum value of one for the area under the curve for melanoma detection. To test applicability of the presented techniques artificial neural networks were used. For this purpose self organizing maps (SOM) and multi layer feed-forward neural network (MLP) were trained with luminescence data and then used for tissue specimen clustering. It was shown that both SOM and MLP gave promising results with 96 to 98% success tissue classification rate. Second part of experimental work in this thesis were measurements of diffuse reflectance spectra from skin sites located on a forehead and top of a hand of healthy volunteers in order to analyze skin color properties in an objective way. Obtained spectra were analyzed using principal component analysis (PCA) and standard Commission International d'Eclairage (CIE) L*a*b* color scheme. Based on results of analysis it was shown that diffuse reflectance spectroscopy combined with the PCA and the L*a*b* color system is a convenient and objective methodology for analyzing skin properties.

Distribucija mutacija u F8 genu kod pacijenata iz Srbije obolelih od hemofilije A

Distribution of F8 gene mutations in Serbian hemophilia A patients

Uvod: Hemofilija A (HA) je X-vezano recesivno oboljenje, koje spada u grupu koagulopatija. Nastaje kao posledica mutacija u F8 genu (Xq28) i javlja se sa uĉestalost od 1:5 000 muškaraca. U cilju odreĊivanja distribucije mutacija kod obolelih od HA sa teritorije Srbije, u ovoj studiji sprovedene su analize za detekciju specifiĉnih mutacija: inverzije introna 1 (inv1) i introna 22 (inv22) , kao i velikih delecija i duplikacija i taĉkastih mutacija gena F8. Materijal i metode: Istraţivanje je sprovedeno na uzorku od 71 pacijenta, muškog pola, koji su upućeni sa dijagnozom HA u Laboratoriju za medicinsku genetiku Instituta za zdravstvenu zaštitu majke i deteta Srbije ,,Dr Vukan Ĉupićˮ. Analize za detekciju inv22, delecija i duplikacija introna 22 i inv1, sprovedene su kod ĉitave grupe od 71 pacijenta primenom IS-PCRa. U cilju detekcije velikih delecija i duplikacija kodirajućeg regiona F8 gena, korišćena je MLPA metoda, a obraĊena je grupa od 20/71 pacijenata negativnih za inv22 i inv1. Presekvencioni skrining, sproveden SSCP metodom, obuhvatio je pacijente sa negativnim statusom u prethodnim testiranjima (46/71), a izdvojena su tri pacijenta kod kojih je sumnja na postojanje taĉkaste mutacije proverena metodom sekvenciranja. Detekcija statusa nosilaca mutacija uraĊena je kod 46 ĉlanova porodica obolelih (15 majki, 23 sestre i 4 ćerke obolelih). Ove analize omogućile su davanje adekvatnog genetiĉkog saveta i prenatalnu dijagnostiku HA kod 6 trudnica u 9 trudnoća. Statistiĉka analiza dobijenih rezultata sprovedena je metodom Hi kvadrat testa. Rezultati i diskusija: Rezultati studije su pokazali uĉestalost inv22 od 28,1% (20/71) (tip1 22,5 % (16/71) , tip2 5,6% (4/71)) i inv1 od 4,2 % (3/71) dok delecije i duplikacije introna 22 nisu detektovane. Detektovane su velike delecije sa uĉestalošću od 15% (3/20); kod jednog pacijenta je uoĉeno postojanje delecije egzona 7 , a kod dva delecija egzona 2-3. Prisustvo taĉkastih mutacija, missense tipa (c.6532C>T ) i delecije (c.1332_1332delA) definisano je kod dva (2/71; 2,8%) pacijenta. Raspodela uĉestalost detektovanih mutacija je dalje definisana u odnosu na kliniĉke karakteristike: kliniĉki oblik bolesti i prisustvo inhibitora za FVIII. UtvrĊena je uĉestalost inv22 kod pacijenata sa teškom HA od 39,1% (18/46) i kod pacijenata sa umerenom HA od 14,3% (2/14), dok kod pacijenata sa blagim oblikom ova mutacija nije detektovana. Na osnovu toga statistiĉkom analizama dokazana je pozitivna korelacija prisustva inv22 i teškog kliniĉkog oblika bolesti. Prisustvo inv1 detektovano je iskljuĉivo kod pacijenata sa teškom HA (3/46; 6,5%), ali pozitivna genotip–fenotip korelacija nije utvrĊena. Velike delecije uoĉene su kod pacijenata sa teškom (2/15; 13%) i umerenom HA (1/5; 25%), a statistiĉka analiza takoĊe nije potvrdila pozitivnu genotip-fenotip korelaciju. Kod pacijenata sa prisustnim inhibitorom FVIII, detektovana je uĉestalost inv22 od 37,5% (3/8), dok je kod 12,5% (1/8) pacijenata utvrĊeno prisustvo velike delecije. Sprovedena statistiĉka analiza korelacije inv22 genotipa i fenotipa sa inhibitorom FVIII kod obolelih od teške HA, dala je negativne rezultate. Detekcija statusa nosilaca mutacija uraĊena je kod 46 ĉlanova porodica obolelih (15 majki, 23 sestre i 4 ćerke obolelih). Ove analize omogućile su davanje adekvatnog genetiĉkog saveta i prenatalnu dijagnostiku HA kod 6 trudnica u 9 trudnoća. Kod 3/9 fetusa, kod kojih je analizama najpre definisan muški pol, utvrĊeno je i prisustvo inv22.Kao poseban sluĉaj u ovoj studiji, predstavljeni su rezultati analiza sprovedenih kod jedne ţenske osobe obolele od HA. Molekularnim testovima pacijentu je definisano heterozigotno prisustvo delecije introna 22 tip 2 i delecije egzona 1-22, dok je citogenetiĉkim i molekularno–citogenetiĉkim analizama (FISH) uoĉen mozaiĉni kariotip: a) citogenetiĉka analiza: mos 47,XX,+mar(2)/47,XXX(2)/46,XX(47); b) FISH analiza: mos nuc ish(DXZ1x1)(15/162)/(DXZ1x3)(12/162)/(DXZ1x2)(135//162); mos ish (DXZ1x4)(1/28)/(DXZ1x3)(2/28)/ (DXZ1x1)(5/28)/ (DXZ1x2)(20/28). Dobijeni rezultati diskutovani su u odnosu na dostupnu literaturu.. Zaključak: Rezultati ove studije predstavljaju prve do sada objavljene podatke o molekularnoj osnovi kod obolelih od HA sa teritorije Srbije i utvrĊeno je da odgovaraju rezultatima do sada objavljenih studija. Pored toga, primenjene metode i strategija testiranja ovim istraţivanjem su uvrštene u standardnu dijagnostiĉku proceduru ĉime je znatno poboljšan tretman obolelih sa ovih prostora.

Introduction: Hemophilia A (HA) is a common X-linked recessive bleeding disorder, with incidence of 1 in 5 000 male and caused by mutations of F8 gene (Xq28). In order to detect the distribution of F8 mutations in Serbian HA population, , the analyses for detection of recurrent inversions of intron 1 (inv1) and intron 22 (inv22) of F8, large deletions and duplications and point mutations, were performed in this study. Matherial and methods:The investigation considered the cohort of 71 male paitents, whose blood samples was colected at the Laboratory for Medical Genetics, Mother and Child Health Care Institute of Serbia “Dr Vukan Cupic” (IMD) with HA diagnosis. Detection of the inv 22, inv1 and duplications and the deletions of intron 22, were performed using IS-PCR for entire group of HA patients. The group of 20 patients, with negative inv22 and inv1 status, were analysed for the presence of large detetions and duplications of coding region of F8 gene, using MLPA. Next step was the pre-sequencing screening for point mutations, using SSCP, for 46 patients with previous negative mutation status. Carrier status testing were obtained for 46 relatives (15 mothers, 23 sisters and 4 daughters) and allowed adequate genetic concealing and prenatal diagnostic in 9 pregnancies.Statistic analyses were performed using chi-squared test. Results and discussion: The results showed the inv22 frequency of 28,1% (20/71) (type1 22,5 % (16/71) and type 2 5,6% (4/71)) and inv1 frequency of 4,2 % (3/71). No deletions or duplications were detected. The large deletions was detected in 15% ( 3/20) of patientes ; one patient with deletion of exon 7 and two patientes with deletion of exon 2-3. The sequencing analyses in 3/46 of them showed one missense mutation ((c.6532C>T ) and one deletion (c.1332_1332delA). The distribution of the detected mutation was matched with clinical caracteristics: severity of the disease and pressence of FVIII inhibitor. Analysis for clinical severity of the disease, showed the occurience of inv22 in 39,1% (18/46) patients with severe and 14,3 % (2/14) patientes with moderate HA. Inv22 genotype was not found in patientes with mild HA. Statistic analyses verified the positive corelation between inv22 genotipe and severe HA phenotype. Whole group of patients with inv1 genotype had the severe HA (3/46; 6,5%), but genotipe- phenotype corellation wasn’t shown as positive. Large deletions were found in 2/15 (13%) severe and 1/5 (25%) moderate HA patientes, but positive genotype-phenotype corellation also did not acheeved. In a group of patients with FVIII inhibitor the genotype with inv22 and large detetions were detected with the frequencies of 37,5% (3/8) and 12,5% (1/8). Statistic analysis of corelation between inv22 genotype and phenotype with FVIII in severe HA patientes was not verified as positive. Carrier status testing were obtained for 46 relatives (15 mothers, 23 sisters and 4 daughters) and allowed adequate genetic concealing and prenatal diagnostic in 9 pregnancies. Prenatal analyses showed the presence of mail foetuses in 3/9 cases and all of them had the inv22 genotype. In addition, in this study we presented the case report of one female HA patient. Molecular analyses revealed that the woman was a carrier of the deletion of intron 22 type 2 and deletion of exone 1-22. Cytogenetic and molecular-cytogenetic analyses also showed the presence of mosaic karyotype: a) mos 47, XX,+ mar [2] / 47, XXX [2]/ 46, XX [47]; b) mos nuc ish (DXZ1x1)(15/162)/(DXZ1x3)(12/162)/ (DXZ1x2)(135//162); mos ish (DXZ1x4)(1/28)/(DXZ1x3)(2/28)/ (DXZ1x1)(5/28)/ (DXZ1x2)(20/28). Presented results were discussed according to present literature data. Conclusion: The resultes of this study are the first published data of molecular basis of HA in Serbian population and we concluded that they are in line with similar literature data from the other populations. The great advantage of this study is also the fact that presented methods and strategy of testing after this investigation, become a routine diagnostic program for Serbian HA patients.

Primena Komet testa na slatkovodnim školjkama Unio pictorum (Linnaeus, 1758), Unio tumidus (Philipsson, 1788) i Sinanodonta woodiana (Lea, 1834) u ekogenotoksikološkoj proceni akvatičnih ekosistema

Aplication of the Comet assay on freshwater mussels Unio pictorum (Linnaeus, 1758), Unio tumidus (Philipsson, 1788) and Sinanodonta woodiana (Lea, 1834) in ecogenotoxicological assesment of aquatic ecosystems

Široka rasprostranjenost slatkovodnih školjki, ishrana filtriranjem, sesilni način života i sposobnost da akumuliraju zagađivače čine ih pogodnim organizmima za procenu nivoa zagađenja spoljašnje sredine i uticaja različitih zagađivača. Komet, test ili elektroforeza pojedinačnih ćelija (eng. single cell gel electrophoresis - SCGE) je osetljiva i brza tehnika za detekciju DNK oštećenja u pojedinačnim ćelijama i predstavlja jednu od osnovnih metoda u praćenju genotoksičnog efekta zagađivača na akvatične organizame. Da bismo odredili osetljivost školjki kao bioindikatora u ekogenotoksikološkim studijama, primenom alkalnog komet testa pratili smo nivo oštećenja molekula DNK u hemocitama slatkovodnih školjki Unio pictorum i U. tumidus (autohtone vrste) i Sinanodonta woodiana (alohtona vrsta) izlaganih sredinskom stresu in situ i ex situ. U okviru in situ proučavanja, aktivnim i pasivnim biomonitoringom, pratio se uticaj sredine na nivo oštećenja DNK molekula. Procena kvaliteta vode na različitim lokalitetima vršena je na osnovu mikrobioloških i fizičko-hemijskih parametara. Pasivni biomonitoring je rađen u okviru istraživanja na reci Velika Morava, na jedinkama vrste S. woodiana i u okviru istraživanja na reci Dunav, na jedinkama roda Unio. Aktivni biomonitoring je rađen sa jedinkama istog roda na lokalitetima Save i Dunava na teritoriji grada Beograda. U okviru ex situ proučavanja, pratio se uticaj citostatika: 5-fluorouracila, cisplatine, etopozida, vinkristin sulfata i imatinib mezilata na nivo oštećenja DNK molekula u hemocitama vrsta roda Unio in vivo, izlaganjem jedinki 72 h, i in vitro, izlaganjem sveže izolovanih hemocita (30 min) ili hemocita u primarnoj kulturi (22 h). Kao model mutagen, korišćen je kadmijum hlorid koji je u svim tretmanima doveo do indukcije oštećenja DNK molekula. Rezultati in situ studija su pokazali da se primenom komet testa na jedinkama vrsta U. pictorum, U. tumidus i S. woodiana može detektovati i kvantifikovati prisustvo genotoksičnog zagađenja. Nivo oštećenja DNK u hemocitama pokazao je značajnu korelaciju sa koncentracijama različitih grupa genotoksičnih polutanata u vodi, kao i sa mikrobiološkim indikatorima fekalnog zagađenja. Prilikom in vivo tretmana nije detektovan uticaj imatinib mezilata, dok su najniže efektivne koncentracije (LOEC) 5-fluorouracila, cisplatine, etopozida i vinkristin sulfata bile daleko više od njihovih očekivanih koncentracija u površinskim vodama. Efektivne koncentracije za 5-fluorouracil i cisplatinu su bile u rangu koncentracija u kojima se ovi lekovi mogu naći u otpadnim vodama bolnica. Rezultati dobijeni prilikom in vitro tretmana sveže izolovanih hemocita pokazali su da je period od 30 min izlaganja suviše kratak za detekciju genotoksičnog efekta citostatika. Tretman u primarnoj kulturi hemocita se može preporučiti za detekciju genotoksičnog potencijala in vitro ali uz dodatne modifikacije, kao što su stimulacija hemocita na proliferaciju, a uzimajući u obzir mehanizam dejstva testiranih supstanci. Naučna oblast: Biologija Uža naučna oblast: Genotoksikologija, Mikrobiologija UDK broj: [574.64:594.141][57.088:577.113](043.3)

Due to generally wide distribution of considerable number of species, filter feeding, a sessile life form and an ability to accumulate pollutants, freshwater mussels were found to be favourable organisms for estimating the environmental pollution level and the impact of various pollutants. The comet assay or the single cell gel electrophoresis (SCGE) represents a sensitive and rapid technique for detection of DNA damage and thus this method is commonly employed for detection of genotoxic pollution in aquatic ecosystems. To evaluate the sensitivity of freshwater mussels as bioindicators in ecogenotoxicological studies, we studied the level of DNA damage with alkaline comet assay in haemocytes of freshwater mussels Unio pictorum and U. tumidus (autochtonous species) and Sinanodonta woodiana (alochtonous species) exposed to environmental stress in situ and ex situ. For in situ studies, active and passive biomonitoring were employed for the evaluation of the impact of environmental stress on the level of DNA damage. Water quality assessment on studied sites was based on physical, chemical and microbiological parameters. Passive biomonitoring was performed on specimens of S. woodiana collected from the Velika Morava River, and on two species bellonging to genus Unio collected from the Danube River. Active biomonitoring was performed on specimens of the same species exposed in the Sava and Danube rivers in the urban area of the Belgrade city. Ex situ studies of the impact of cytostatics: 5-fluorouracil, cisplatin, etoposide, vincristine sulphate and imatinib mesylate were performed in vivo, by treatment of the whole animals for 72, and in vitro, by treatment of freshly isolated haemocyes for 30 min or by treatment of haemocytes in primary cultures for 22 h. Treatment with cadmium chloride (model mutagen) resulted in significant induction of DNA damage in all treatment conditions. The results of in situ studies indicated that the presence of genotoxic pollution could be detected and quantified by comet assay on specimens of U. pictorum, U. tumidus i S. woodiana. The level of DNA damage in haemocytes showed significant correlation with concentration of genotoxic pollutants measured in water and with microbiological indicators of faecal pollution. The effect of imatinib mesylate was not detected following in vivo treatment, while the lowest observable effective concentrations (LOECs) of 5-fluorouracil, cisplatin, etoposide and vinkristine sulphate were few orders of magnitude higher than their concentrations in the surface waters. The efective concentrations for 5-fluorouracil and cisplatin were in the range of concentrations which could be found in hospital wastewaters. The results obtained in vitro indicated that exposure of freshly isolated haemocytes for 30 min was too short for detection of genotoxic effect. The treatment of haemocytes in primary culture can be proposed for detection of genotoxic potential in vitro with some modifications, such as stimulation of haemocytes on proliferation. Research field: Biology Specific research field: Genotoxicology, Microbiology UDC No.: [574.64:594.141][57.088:577.113](043.3)

Regulacija produkcije labdanskih diterpena u kulturi in vitro Cistus creticus L. i analiza njihove biološke aktivnosti

Regulation of labdane diterpenes production in Cistus creticus L. in vitro culture and analysis of their biological activity.

Cistus creticus L. je višegodišnja, žbunasta biljka koja nastanjuje suva i topla područja Mediterana. Smolu ove vrste lokalno stanovništvo Krita sakuplja od davnina zbog izraženih aromatičnih i lekovitih svojstava. Dominantna biološki aktivna komponenta smole i izdanaka ove biljke su labdanski diterpeni, dok je koren biljke još uvek nepoznatog sastava. U cilju iznalaženja optimalnih uslova za produkciju labdanskih diterpena predmet istraživanja ove disertacije bio je ispitivanje regulacije produkcije labdanskih diterpena u biljkama C. creticus gajenim in vitro pod uticajem različitih abiotičkih faktora i hranljivih podloga sa varirajućim sadržajem različitih šećera. Uspešno je uspostavljena in vitro kultura biljaka C. creticus na MS medijumu bez fitohormona, pri čemu parametri rastenja i razvića eksplantata nisu pokazali značajne razlike između ispitivanih klonova. Optimalne koncentracije ugljenih hidrata za rastenje i razviće biljaka C. creticus u uslovima in vitro su od 0,03 M do 0,1 M saharoze i glukoze. Histohemijskim analizama listova izdanaka gajenih in vitro je utvrđeno da kapitatne glandularne trihome tipa II C. creticus predstavljaju mesto akumulacije labdanskih diterpena i fenolnih jedinjenja. Genetička transformacija C. creticus je izvršena pomoću Agrobacterium rhizogenes A4M70GUS, pri čemu je uspostavljena kultura transformisanih korenova. Fitohemijska karakterizacija biljaka C. creticus gajenih in vitro, omogućila je identifikaciju i kvantifikaciju glavnih grupa sekundarnih metabolita (terpena i fenolnih jedinjenja) koji se u ovim uslovima produkuju. Labdanski diterpeni su dominantna jedinjenja u izdancima biljaka C. creticus gajenim in vitro, a među njima su najzastupljeniji labd-7,13-dien-15-ol i labd-7,13-dien-15-ol acetat. Od isparljivih sekundarnih metabolita najzastupljeniji su monoterpeni i seskviterpeni. U dihlormetanskim ekstraktima eksudata kapitatnih trihoma tipa II najzastupljenije jedinjenje je labd-7,13-dien-15-ol acetat. U korenovima C. creticus potvrđeno je prisustvo fenolnih jedinjenja i masnih kiselina, dok labdanski diterpeni nisu detektovani. Analiza sadržaja fenolnih jedinjenja ukazala je da su u etanolnim ekstraktima izadanaka i korenova prisutna fenolna jedinjenja kao što su hininska kiselina, galokatehin i katehin. Nivo ekspresije odabranih gena koji učestvuju u MEP i MVA biosintetskom putu se povećavao nakon povrede biljaka gajenih in vitro, ali u ovom periodu nije zabeležena promena u relativnoj količini labdanskih diterpena. Tokom procesa dehidratacije uočeno je značajno smanjenje nivoa ekspresije gena koji su uključeni u MEP i MVA biosintetski put, dok se u procesu rehidratacije nivo ekspresije vratio na kontrolni nivo. Tokom procesa dehidratacije/rehidratacije u uslovima in vitro nisu uočene promene u relativnoj količini labdanskih diterpena. Trend povećanja relativnog sadržaja labdanskih diterpena je uočen u izdancima gajenim na medijumu sa 0,1 M saharozom ili 0,1 M glukozom. Uzimajući u obzir i parametre rastenja i razvića optimalna podloga u smislu najbolje produkcije labadnskih diterpena je MS podloga sa dodatkom 0,1 M glukoze. Analizirana je biološka aktivnost etanolnih ekstrakata izdanaka, transformisanih i netransformisanih korenova dobijenih u kulturi in vitro. Antioksidativni potencijal ekstrakata izdanaka i korenova je bio zadovoljavajući i u skladu sa količinom ukupnih fenola i flavonoida u njima. Etanolni ekstrakti izdanaka i korenova C. creticus su pokazali značajnu antimikrobnu aktivnost prema osam vrsta bakterija i sedam vrsta gljiva, a aktivnost potiče od labdanskih diterpena i fenolnih jedinjenja. Etanolni ekstrakti izdanaka C. creticus su pokazali citotoksičnu aktivnost prema HeLa ćelijama kancera cerviksa, kao i prema ćelijama kancera dojke (MDA-MB-453) i melanoma (FemX). Pokazana citotoksična aktivnost može se pripisati labdanskim diterpenima prisutnim u ekstraktu izdanaka.

Cistus creticus L. is a perennial, bushy plant that inhabits mainly dry and warm areas of the Mediterranean. The resin of this species has been actively collected by the local inhabitants of Crete since ancient times due to its aromatic and medicinal properties. The predominant bioactive component of the resin and the shoots of this plant are labdane diterpenes, while the chemical composition of the roots is still unknown. In order to find the optimal conditions for the labdane diterpenes production, the subject of this thesis was to investigate the regulation of labdane-type diterpenes production in in vitro grown plants of C. creticus, as influenced by various abiotic factors and growth media with varying content of different carbohydrates. In vitro culture of C. creticus was successfully established on hormone-free MS medium, and the parameters of growth and development of explants showed no significant differences among analyzed clones. Optimal concentrations of carbohydrates for in vitro growth and development of C. creticus ranged from 0.03 M to 0.1 M sucrose or glucose. Genetic transformation of C. creticus was performed with Agrobacterium rhizogenes A4M70GUS and the culture of transformed roots was established. Regeneration of transformed plants was unsuccessful. Histochemical analysis of the leaves from in vitro cultured C. creticus shoots showed that labdane diterpenes and phenolic compounds accumulate in the type II capitate glandular trichomes. Phytochemical characterization of in vitro grown C. creticus has enabled the identification and quantification of two major groups of secondary metabolites (terpenes and phenols), which are produced under these conditions. Predominant compounds accumulating in shoots of C. creticus grown in vitro were labdane diterpenes, the most abundant among them being labd-7,13-diene-15-ol and labd-7,13-dien-15-ol acetate. Amongst the volatile secondary metabolites, the most abundant were monoterpenes and sesquiterpenes. Labd-7,13-dien-15-ol acetate was the most abundant compound in dichloromethane extracts of type II capitate trichomes exudates. In the roots of C. creticus, the presence of the phenolic compounds and fatty acids was determined, whereas labdane diterpenes were not detected. Analysis of the phenolic compounds content in the ethanol extracts of shoots and roots indicated presence of compounds such as quinic acid, gallocatechin, and catechin. Expression levels of selected genes involved in the MEP and MVA biosynthetic pathway increased after wounding of in vitro grown plants, but there was no change in the relative amount of labdane diterpenes. During the dehydration process, a significant reduction in the expression levels of genes involved in the MEP and MVA biosynthetic pathway was observed, whereas in the process of rehydration their expression returned to control levels. During in vitro process of dehydration/rehydration, no change in the relative amount of labdane diterpene was observed. An increasing trend of labdane-type diterpenes relative content was observed in shoots cultured on medium containing 0.1 M sucrose or 0.1 M glucose. Considering the optimal growth parameters, the best medium for labdane diterpene production was MS medium supplemented with 0.1 M glucose. Biological activity of ethanol extracts of shoots, transformed and non- transformed roots obtained from in vitro culture was analyzed. Antioxidant potential of shoot and root extracts was satisfactory and in accordance with the amount of phenolics and flavonoids. Ethanol extracts of shoots and roots of C creticus exhibited significant antimicrobial activity against eight bacterial species and seven fungal species, and this activity originated from labdane diterpenes and phenolics. Ethanol extracts of C. creticus shoots also exhibited cytotoxic activity against HeLa (cervix), MDA-MB-453 (breast) and FemX (melanoma) cancer cells. Demonstrated cytotoxic activity can be attributed to the labdane diterpenes present in the shoot extract.

Funkcionalna analiza genske varijante C20068T u 3' kraju gena za protrombin čoveka i njena uloga u patogenezi trombofilije

The functional analysis of the C20068T gene variant in the 3' end of the prothrombin gene and its role in the pathogenesis of thrombophilia

Protrombin (Faktor II) je prekursor trombina, jednog od ključnih molekula u održavanju hemostazne ravnoteže. Povišeni nivo protrombina dovodi do poremećaja hemostazne ravnoteže i stanja hiperkoagulacije, koje se manifestuje pojavom tromboza. Pokazano je da 3kraj protrombinskog gena poseduje nekanonsku organizaciju, usled čega je podložan mutacijama koje dovode do povećane ekspresije protrombina i povišenog rizika za pojavu trombofilije. U okviru prethodne studije, sprovedene u Laboratoriji za molekularnu biologiju, Instituta za molekularnu genetiku i genetičko inženjerstvo, Univerziteta u Beogradu, u poslednjem egzonu gena za protrombin identifikovana je promena citozina (C) u timin (T) na mestu 20068. Ova genska varijanta dovodi do zamene CGC kodona za arginin u CGT kodon koji takođe kodira za arginin na poziciji 608 u proteinu. U bazi dsSNP/NCBI je klasifikovana kao sinonimna promena, pod brojem rs3136532. Pokazano je da je ova genska varijanta zastupljenija kod pacijenata sa trombozama i da njeno prisustvo dovodi do povećane ekspresije iRNK. Prvi deo istraživanja, u okviru ove doktorske disertacije, podrazumevao je određivanje učestalosti genske varijante C20068T u grupi pacijenata sa trombofilijom, kao i u odgovarajućoj grupi zdravih ispitanika, čime bi se utvrdilo da li ova varijanta predstavlja potencijalni novi trombofilni marker. Drugi deo istraživanja obuhvatio je funkcionalnu analizu C20068T varijante, u cilju rasvetljavanja mehanizma kojim ova sinonimna varijanta utiče na promenu ekspresije gena za protrombin. U okviru ove studije testirano je ukupno 797 ispitanika, od toga 606 pacijenata i 191 ispitanik kontrolne grupe. Pacijenti su podeljeni u grupe, shodno poremećaju od koga su bolovali, u grupu pacijenata sa trombotičkim poremećajima (443 pacijenta, od čega: 106 sa cerebrovaskularnim insultom, 101 sa plućnim embolizmom, 175 sa trombozom dubokih vena i 61 sa kombinovanim trombotičkim poremećajima) i grupu pacijentkinja sa spontanim pobačajima (163 pacijentkinje). U grupi pacijenata sa cerebrovaskularnim insultom detektovana su tri heterozigotna nosioca C20068T varijante (OR 5,53; P=0,13). U grupi pacijenata sa izolovanim plućnim embolizmom takođe su detektovana tri heterozigotna nosioca (OR 5,81; P=0,12). Kod pacijenata sa trombozom dubokih vena detektovano je šest nosilaca (OR 6,74; P=0,057), dok su kod pacijenata sa kombinovanim trombotičkim poremećajima detektovana tri nosioca (OR 9,83; P=0,045). U ukupnoj grupi pacijenata sa trombotičkim poremećajima, prisustvo C20068T varijante u heterozigotnom obliku je predstavljalo statistički značajan faktor rizika (OR 6,66; P=0,049). U grupi žena sa spontanim pobačajima detektovana su 4 heterozigotna nosioca ove genske varijante (OR 4,26; P=0,31). U ovoj studiji nisu detektovani homozigotni nosioci C20068T varijante. Prisustvo C20068T varijante dovodi do povećanja količine protrombina u plazmi pacijenata koji su heterozigotni nosioci ove varijante. U odnosu na standardnu plazmu (referentna vrednost 100), kvantifikovana količina protrombina u plazmi pacijenata iznosila je 143,65±28,8; P<0,05. Dalja funkcionalna analiza C20068T je pokazala da ova varijanta dovodi do 1,60 puta povećane ekspresije protrombinske iRNK u odnosu na wt (wild type). Ovi rezultati su dobijeni relativnom kvantifikacijom iRNK metodom real-time PCR na odabranim klonovima stabilno transfekovanih cos-7 ćelija za koje je utvrđeno da imaju isti broj kopija inserata. Za potrebe ovog eseja, prvi put je standardizovana nova metoda za određivanje broja kopija transgenih inserata (metod qfPCR-kapilarna elektroforeza). In silico predikcija sekundarne strukture poslednjeg egzona protrombinskog gena je pokazala da prisustvo T na mestu 20068 dovodi do promena u sekundarnoj strukturi egzona i potencijalno može da utiče na stabilnost iRNK. Međutim, esej ispitivanja stabilnosti iRNK u cos-7 ćelijama stabilno transfekovanim wt i 20068T konstruktima je pokazao da prisustvo bazne zamene C u T ne dovodi do značajnih promena u stabilnosti iRNK za protrombin. Ova studija je obuhvatila i određivanje potencijalnih razlika u mestu iskrajanja između protrombinskih iRNK dobijenih iz ćelija transfekovanih wt i 20068T konstruktima. Rezulati su pokazali da prisustvo 20068T varijante dovodi do stvaranja transkripata sa manjom dužinom 3kraja u poređenju sa wt transkriptima. Analiza DNK/protein interakcija je obuhvatila EMSA esej sa identifikacijom vezanih proteina masenom spektrometrijom i metod određivanje mesta vezivanja proteina za jednolančanu DNK probu esejem FP-PCR (Footprinting Primer-PCR) koji je standardizovan u okviru ove studije. Rezultati masene spektrometrije su pokazali da se za region wt probe vezuje 11 proteina, dok se za 20068T probu vezuju tri proteina iz jedarnog ekstrakta HepG2 ćelijske linije. Identifikovani proteini pretežno pripadaju familiji heterogenih nuklearnih ribonukleoproteina, ali na osnovu njihovih do sada opisanih funkcija nije moguće pretpostaviti koja bi bila njihova uloga u regulaciji ekspresije gena za protrombin. Ispitivanje interakcije jedarnih proteina HepG2 ćelija sa jednolančanom DNK probom FP-PCR metodom je pokazalo da prisustvo T na mestu 20068 dovodi do stvaranja vezivnog mesta za protein ili proteinski kompleks koje se ne vezuje za wt varijantu. Rezultati ove studije su pokazali da C20068T varijanta predstavlja novi, značajni trombofilni marker sa učestalošću od oko 3% u grupi pacijenata sa trombofilijom. Funkcionalna analiza je pokazala da prisustvo ove varijante dovodi do povećane količine protrombina u plazmi pacijenata, kao i do povećane ekspresije iRNK za protrombin u ćelijama stabilno transfekovanim 20068T konstruktom. Dalja funkcionalna analiza je pokazala da ova genska varijanta dovodi do povećane ekspresije protrombina na više nivoa regulacije, utičući na dužinu 3kraja protrombinske iRNK, njenu sekundarnu strukturu, DNK-protein interakcije i interakcije sa regulatornim proteinima. Na osnovu dobijenih rezultata, C20068T predstavlja funkcionalnu sinonimnu gensku varijantu, čiji mehanizam delovanja do sada nije opisan i potrebne su dalje studije da bi se on do kraja rasvetlio.

Prothrombin (Factor II) is a precursor of thrombin, one of the key regulatory enzymes in the maintainance of haemostasis. Elevated level of prothrombin leads to haemostatic disbalance and hypercoagulation, which can manifest as thrombotic disorders. The 3end of the prothrombin gene has noncanonical architecture that is sensitive to gain-of-function mutations, leading to increased prothrombin expression and elevated risk for thrombophilia. In our previous study we detected a novel C to T point mutation at the position 20068 in the last exon of the prothrombin gene. This gene variant leads to exchange of CGC to CGT codon which both code for arginine at the position 608 in the protein. C20068T gene variant is clasified as synonymous gene variant, under reference SNP ID number 3136532. This variant was more frequent in the patients with thrombosis compared to controls and leads to increased prothrombin mRNA expression. The first aim of this study was to determine the prevalence of C20068T gene variant in patients with thrombophilia, as well as in healthy controls. The second aim of this study was to elucidate the mechanism by which C20068T variant affects the prothrombin gene expression and pathogenesis of thrombophilia. This study included 797 subjects, divided in study and control groups. Patients were divided in five groups, according to thrombotic event they suffered from: 443 with several thrombotic manifestations, including 106 patients with cerebrovascular insult, 101 patient with pulmonary embolism, 175 patients with deep vein thrombosis and 61 patient with combined thrombotic events. This study also included 163 women who suffered from foetal losses. In the groups of patients with cerebrovascular insult, we have detected three heterozygous carriers of C20068T variant (OR 5.53; P=0.13), as well as in the group of patients with isolated pulmonary embolism (OR 5,81; P=0,12. In patients with deep vein thrombosis, 6 carriers of 20068CT genotype were detected (OR 6.74; P=0.057. Three heterozygous carriers were detected in the patients with combined thrombotic manifestations (OR 9.83; P=0.045). Our results indicate that C20068T represents significant risk factor for thrombotic occurence (OR 6.66; P=0.049). Four heterozygous carriers were detected in women with foetal loss (OR 4.26; P=0.31). No homozygous carriers of C20068T gene variant were detected in this study. Our results have shown that the presence of C20068T variant leads to the increase of prothrombin level in the plasma of heterozygous carries. Compared to the standard plasma (reference value 100), quantified the amount of prothrombin in the plasma of patients was 143.65 ± 28.8 (P < 0.05). Further functional analysis of C20068T variant showed that this variant leads to 1.60-fold increased prothrombin mRNA expression, compared to wild type (wt) prothrombin mRNA. These results were obtained by relative quantification of mRNA by real-time PCR, using the stably transfected cos-7 cell clones with same transgene copy number. For the purposes of this study, we have standardized the new method for determination of the transgene copy number (qfPCR-capillary electrophoresis). In silico prediction of the secondary structure of the last exon of the prothrombin gene revealed that the presence of T at the position 20068 leads to a change in the secondary structure and can potentially affect the stability of the mRNA. However, the measurment of mRNA stability in cos-7 cells stably transfected with wt and 20068T constructs showed that C to T substitution does not lead to significant changes in the stability of prothrombin mRNA. This study also included the determination of potential differences in the choice of cleavage site in prothrombin mRNA extracted from cells transfected with wt and 20068T constructs. The results showed that the presence 20068T leads to generation of transcripts with a shorter 3end compared to wt transcripts. DNA-protein interaction analysis included EMSA assay with the identification of proteins by mass spectrometry and the assay for determination of the protein interactions with the single-stranded DNA probes. This assay, Footprinting Primer-PCR (FP-PCR), was for the first time standardized in this study. The results of the mass spectrometry revealed that 11 proteins have bonded with wt probe and 3 proteins have bonded with 20068T probe. Identified proteins mainly belong to the family of heterogenous nuclear ribonucleoproteins, but their role in the regulation of the prothrombin expression remains to be elucidated. Investigation of the interaction of HepG2 nuclear proteins with single-stranded DNA (ssDNA) probe by FP-PCR method have shown that the presence of T at the position 20068 results in the formation of the ssDNA/protein complex binding site that does not exist in the wt DNA probe. The results of this study showed that C20068T variant represents a new significant thrombophilic marker, with a frequency of approximately 3% in the group of patients with thrombophilia. Functional analysis demonstrated that the presence of this variant leads to increased prothrombin plasma level in, as well as, to an increased prothrombin mRNA expression. Further analysis has elucidated that C20068T variant most likely affects prothrombin expression on several levels of gene expression regulation, including the lenght of the prothrombin mRNA 3end, its secondary structure, DNA-protein interactions and interactions with other regulatory proteins. Based on our results, C20068T variant is a functional synonymous gene variant, whose exact mechanim of action remains to be elucidated in our further studies.

The significance of polymorphisms for Toll-like receptors (TLR) 2, 3, and 4 genes, and gene for vitamin D receptor for the course and outcome of the disease in patients with trauma and/or sepsis

Značaj polimorfizama gena za Toll-u slične receptore (TLR) 2, 3 i 4 i gena za receptor za vitamin D za tok i ishod bolesti kod pacijenata sa traumom i/ili sepsom

Imajući u vidu da TLR2, TLR3, TLR4 i VDR igraju veoma važnu ulogu u procesu inflamacije, posatvlja se pitanje da li je prisustvo polimorfizama ovih gena pitanje u vezi sa mogućnođću za razvoj sepse. Cilj ovog istraživanja je ispitivanje asocijacije polimorfizama TLR2, TLR3, TLR4 i VDR gena sa kliničkim karakteristikama i ishodom vitalno ugroženih pacijenata sa intenzivnom negom u Srbiji. Studija je uključila 121 vitalno ugroženog pacijenata sa intenzivnom negom bele rase u Srbiji. Izvršena uje genotipizacija devet polimorfizama TLR i VDR gena: TLR2 (rs5743708), TLR3 (rs3775291, rs5743312), TLR4 gene (rs4986790, rs4986791), VDR FokI (rs2228570), VDR TaqI (rs731236), VDR ApaI (rs7975232), i VDR EcoRV (rs4516035) primenom Real Time PCR metode. Ispitiani polimorfizmi u TLR2 i TLR4 genima nisu povezani sa kliničkim karakteristikama i ishodom vitalno ugroženih pacijenata sa intenzivnom negom. TLR3 rs3775291 polimorfzam je povezan sa ishodom vitalno ugroženih pacijenata sa intenzivnom negom (p=0.018). Pacijenti sa sepsom i TLR3 rs3775291 mutiranim genotipom imaju četiri puta veći stepen mortaliteta u poređenju sa nosiocima wild type genotipa i heterozigotima. Multivarijantna regresiona analiza je pokazala da su godine, pol i TLR3 rs3775291 polimorfizam nezavisne varijable ishoda vitalno ugroženih pacijenata sa intenzivnom negom. Po prvi put, nađi preliminarni nalazi ukazuju na ulogu TLR3 sa MyD88 nezavisnom signalizacijom i njegovog polimorfizma (TLR3 rs3775291) u sepsi i preživljavanju vitalno ugroženih pacijenata sa intenzivnom negom u Srbiji. Dalje, u ovoj studiji je pokazana statistički zmačajna razlika u zastupljenosti VDR FokI (rs2228570) polimorfizma izmežu vitalno ugroženih pacijenata sa intenzivnom negom i zdravih osoba. Međutim, kod pacijenata sa traumom koji nisu razviji sepsu nije detektovano prisustvo VDR FokI mutatiranog genotipa. Multivarijantna regresiona 6 analiza koja se koristi za procenu nezavisnih varijabli koje mogu da utiču na mortalitet vitalno ugroženih pacijenata sa intenzivnom negom pokazala je da su godine i VDR FokI rs2228570 polimorfizam statistički značajne varijable. Zabeležena je i značajna povezanost VDR FokI rs2228570 polimorfizma i uzroka sepse kod vitalno ugroženih pacijenata sa intenzivnom negom. Po prvi put je pokazana tendencija ka značajnoj povezanosti između TLR4 rs4986791 i VDR FokI rs2228570 polimorfizama kod vitalno ugroženih pacijenata sa intenzivnom negom u Srbiji. Značaj ovog istraživanja je u istovremenom odreživanu polimorfizama ove dve grupe receptora koji su važni za imunski odgovor.

Considering that TLR2, TLR3, TLR4, and VDR play very important role in inflammatory processes, the question arises whether presence of polymorphisms in these genes is associated with susceptibility to sepsis. The aim of this study was to examine the association of TLR2, TLR3, TLR4, and VDR genes polymorphisms with clinical characteristics and outcome of Serbian critically ill patients. A follow-up study was conducted on 121 Caucasian Serbian critically ill patients. Nine polymorphisms in TLRs and VDR genes: TLR2 (rs5743708), TLR3 (rs3775291, rs5743312), TLR4 gene (rs4986790, rs4986791), VDR FokI (rs2228570), VDR TaqI (rs731236), VDR ApaI (rs7975232), and VDR EcoRV (rs4516035) were genotyped by Real Time PCR method. Investigated polymorphisms in TLR2 and TLR4 genes were not associated with clinical characteristics and outcome of critically ill patients. The TLR3 rs3775291 polymorphism was associated with patient’s outcome (p=0.018). Patients with sepsis and TLR3 rs3775291 mutated genotype had four times higher mortality rate compared to the wild type and heterozygous carriers. Multivariate regression analysis showed that age, sex and TLR3 rs3775291 polymorphism are independent variables of outcome of critically ill patients. For the first time, our preliminary findings indicate role of TLR3 with MyD88 independent signaling and its polymorphism (TLR3 rs3775291) in sepsis and survival in Serbian critically ill patients. Further, in this study statistically significant difference in the frequency of VDR FokI (rs2228570) between the critically ill patients and healthy subjects is shown. However, in patients with trauma, who did not develop sepsis, did not detected VDR FokI mutated genotype. Multivariate regression analysis which was used to asses the independent variables that may affect mortality of critically ill patients, showed that age, and VDR FokI rs2228570 polymorphism are statistically 4 significant variables. Significant association between VDR FokI rs2228570 polymorphism and cause of sepsis and critically ill status was noticed. For the first time, the significant tendency toward negative association between TLR4 rs4986791 polymorphism and VDR FokI rs2228570 was noticed in the Caucasian Serbian critically ill population. Importance of this research is in simultaneously determining the polymorphisms of two receptor groups which are important to immune response.

Imunski mehanizmi rezistencije imunokompetentnih jedinki Dark Agouti i Albino Oxford pacova na pulmonarnu infekciju izazvanu gljivom Aspergillus fumigatus Fresen

Immune mechanisms in resistance of immunocompetent Dark Agouti and Albino Oxford rats to pulmonary infection with fungi Aspergillus fumigatus Fresen

Iako se pacovski model pulmonarne aspergiloze koristi podjednako kao i mišiji modeli u ispitivanju antigljivičnih terapija, slabije su ispitane karakteristike imunskog odgovora na infekciju izazvanu gljivom roda Aspergillus kod pacova. U ovom radu ispitan je imunski odgovor u plućima na subletalnu infekciju izazvanu gljivom A. fumigatus kod dva soja pacova, Albino Oxford (AO) i Dark Agouti (DA), za koje je poznato da razvijaju kvalitativno različit odgovor u nekim inflamatornim oboljenjima. Sporije uklanjanje gljive nakon intratrahealnog (i.t.) ubrizgavanja 107 konidija zapaženo je kod jedinki AO soja (do 21. dana nakon infekcije u poređunju sa 14 dana kod DA pacova). Kod oba soja uklanjanje gljive iz pluća se odigrava u sličnoj sredini: povišeni nivoi proinflamatornih citokina interferona -γ (IFN-γ) (nivo IFN-γ je blago viši kod inficiranih jedinki DA soja trećeg dana nakon infekcije) i interleukina-17 (IL-17) dok je nivo Th2/antiinflamatornih citokina (IL-4 i IL-10) bio nepromenjen. Iako je sadržaj proinflamatornih citokina u homogenatu pluća sličan kod oba soja, kod jedinki AO soja uklanjanje gljive iz pluća je povezano sa manjim stepenom infiltracije leukocita u tkivo i nižim osnovnim efektorskim aktivnostima ćelija (ekspresija CD11b molekula, adhezija, produkcija reaktivnih vrsta kiseonika i aktivnost unutarćelijske mijeloperoksidaze). Leukociti izolovani iz pluća jedinki oba soja produkovali su slične količine citokina koji stimulišu efektorske aktivnosti ćelija, IFN-γ i IL-17, u toku infekcije (izuzev u kasnijim terminima nakon infekcije). Nasuprot tome, količina produkovanog IL-10 je bila značajno viša u kulturi leukocita pluća izolovanih iz jedinki AO soja. U regionalnim limfnim čvorovima (mestima gde se nastaju ćelije koje produkuju citokine) zapaža se diferencijacija ćelija u smeru produkcije IFN-γ (veće količine u kulturi ćelija jedinki AO soja), IL-17 (niže količine kod jedinki AO soja) i IL- 10. Nepromenjena (smanjena antigen specifična) produkcija IL-4 je takođe zapažena. CD4+ ćelije u regionalnom čvoru su glavni producenti IFN-γ, IL-17 i IL-10. Ove ćelije nakon diferentovanja migriraju u pluća sudeći po povećanju broja CD4+ ćelija u digestu pluća i bronholaveolarnom ispirku. Poznavanje mehanizama odbrane u infekciji izazvanoj gljivom A. fumigatus kod pacova može da doprinese upotrebi pacovskog modela pulmonarne aspergiloze u razvijanju i testiranju novih terapeutskih modaliteta u tretmanu infekcija izazvanih gljivama.

Although rat models of pulmonary aspergillosis are used to same extent as mouse models in exploring antifungal therapeutics, the understanding of immunology of Aspergillus infection in rats is deficient. In this study pulmonary immune responses to sublethal A. fumigatus infection were investigated in two rat strains, Albino Oxford (AO) and Dark Agouti (DA), differently susceptible to some inflammatory diseases. Slower elimination of fungus following intratracheal (i.t.) application of 107 conidia was noted in AO rats (by the day 21 post infection, compared to day 14 in DA rats). In both rat strains elimination of fungi occurs in similar environment: enriched in proinflammatory cytokines interferon-γ (IFN-γ) (level of IFN- γ was slightly higher in infected DA rats at day 3 p.i.) and interleukin-17 (IL-17) and unchanged Th2/anti- inflammatory cytokines (IL-4 and IL-10). Although proinflammatory cytokines were present at similar amount in lung tissue homogenates, in AO rats elimination of fungi from lungs was associated with lower degree of lung leukocyte infiltration and their basic effector activities (i.e. CD11b expression, adhesion, production of reactive oxygen species, intracellular myeloperoxidase content). Generally, similar levels of effector cell-stimulating proinflammatory cytokines IFN-γ and IL -17 production by lung leukocytes during the entire post-infection period (except late in infection) were noted in both strains. In contrast, production of IL-10 was found to be significantly higher in AO rats. In draining lymph nodes (as sites of generation of cytokine-producing cells) cells differentiate toward IFN-γ-producing cells (higher amount of this cytokine detected in infected AO compared to DA rats), IL-17-producing cells (levels of cytokine produced lower in AO compared to DA rats) and IL-10 producing cells (similar levels in both strains). Unchanged (and even decreased antigen specific) IL-4 production was noted as well. CD4+ cells differentiated in draining lymph nodes are the main source of IFN-γ, IL-17 and IL-10. These cells following differentiation migrate to the lung tissue, judging by increased number of CD4+ cells in lung tissue digest and BAL cells. The knowledge of mechanisms of defense against A. fumigatus in rats might be helpful in the future use of rat models of pulmonary aspergillosis in developing and testing immunotherapeutic interventions of fungal diseases.

Ekspresija i aktivnost matriksnih metaloproteinaza 2 i 9 kao potencijalnih prognostičnih markera tumora štitaste žlezde čoveka

Expression and activity of matrix matalloproteinases 2 and 9 as potential prognostic markers of human thyroid tumors

Matriksne metaloproteinaze (MMP) i tkivni inhibitori matriksnih metaloproteinaza (TIMP) su molekuli odgovorni za procese remodeliranja ćelijske mikrosredine i neophodni su za održanje homeostaze tkiva. Neadekvatna regulacija ovih procesa je uzrok mnogih patoloških stanja uključujući nastanak i progresiju malignih oboljenja. Tiroidni karcinom predstavlja najčešći endokrini malignitet sa incidencom u porastu u različitim delovima sveta. Neoplastičnom transformacijom tiroidnog epitela potencijalno nastaje veliki broj malignih i benignih neoplazija sa velikim varijacijama u kliničkoj slici, agresivnosti i ishodu. Ograničena mogućnost predikcije razvoja nepovoljnih i metastatskih karakteristika tiroidnih karcinoma je trenutno jedan od glavnih problema u kliničkoj praksi pri izboru tretmana obolelih. Cilj ove teze bio je ispitivanje ekspresije i aktivnosti dve metaloproteinaze, MMP-2 i MMP-9, kao i ekspresije njihovog inhibitora TIMP-2, kao markera koji bi mogli da budu od pomoći u diferencijalnoj dijagnostici tiroidnih neoplazija i prognostičkoj stratifikaciji obolelih. Analiza je obuhvatila arhivski i svež materijal tiroidnog tkiva dobijen nakon operacije pacijenata sa benignim ili malignim tumorom štitaste žlezde, a kao kontrolni materijal korišćeno je “zdravo” tiroidno tkivo pacijenata odstranjeno uz tumor. Za analizu je korišćena imunohistohemijska metoda i metode želatin zimografije (SDS-PAGE i in situ). Imunohistohemijskom analizom pokazano je da MMP-2, MMP-9 i TIMP-2 imaju veću ekspresivnost u papilarnom tiroidnom karcinomu u odnosu na folikularni tiroidni adenom, folikularni tiroidni karcinom i uslovno zdravo tkivo štitaste žlezde, što pruža dodatne informacije prilikom rutinske mofološke analize tkiva. Poređenjem imunohistohemijske ekspresije MMP-2 sa kliničkopatološkim parametrima pacijenata sa papilarnim tiroidnim karcinomom utvrđena je značajna korelacija između ekspresije MMP-2 i prisustva metastaza u limfnim čvorovima, dok su ekspresioni profili TIMP-2 pokazali značajnu korelaciju sa kliničkopatološkim parametrima vezanim za progresiju karcinoma (veličina tumora i pojava ekstratiroidne invazije). Imunohistohemijski detektovana aktivna forma MMP-9 je pokazala snažnu asocijaciju sa većinom ispitanih kliničkopatoloških parametara papilarnog karcinoma: veličinom tumora, prisustvom ekstratiroidne invazije i limfnih metastaza, stadijumom karcinoma i dubinom njegove neoplastične infiltracije, što ovaj molekul čini odličnim prediktorom agresivnih formi papilarnog karcinoma. Uz pomoć gel-zimografije izračunati su nivoi aktivacije MMP-2 i MMP-9, odnosno udeo aktivne u ukupnoj formi svakog od ovih enzima. Ovaj odnos za MMP-2 nije bitno varirao u uzorcima papilarnog karcinoma, dok je nivo aktivacije MMP-9 bio značajno viši u uzorcima prezentovanim sa ekstratiroidnom invazijom i limfnim metastazama, kao i u uzorcima sa višim stepenom neoplastične infiltracije i uznapredovalim stadijumom bolesti u odnosu na karcinome bez navedenih karakteristika Kako bi se vizualizovale enzimske reakcije ispitivanih enzima u tiroidnim neoplazijama, u ovom radu je prvi put upotrebljena tehnika zimografije in situ sa fluorescentno obeleženim supstratom. Ovom tehnikom je bilo moguće utvrditi tačnu lokalizaciju enzimske aktivnosti MMP-2 i -9, a nakon selektivne inhibicije MMP-2, analizirana je in situ proteolitička aktivnost MMP-9. Visok nivo fluorescence poreklom od aktivnosti MMP-9 detektovan je u maligno transformisanim tirocitima i elementima tumorske strome karcinoma sa visokim stepenom tumorske infiltracije. Nakon rezultata iznesenih u ovom radu zaključujemo da je pojačana aktivnost enzima MMP-9 jedan od faktora koji utiču na razvoj agresivnog fenotipa papilarnog tiroidnog karcinoma. Detekcija aktivnosti ovog enzima u papilarnom karcinomu može biti od koristi u predviđanju biološkog ponašanja ovog maligniteta u kliničkoj praksi.

Matrix metalloproteinases (MMPs) and their tissue inhibitors (TIMPs) are molecules that can remodel the cellular microenvironment and are necessary for maintaining tissue homeostasis. Inadequate regulation of these processes leads to many pathological conditions, including the formation and progression of malignant diseases. Thyroid carcinoma is the most frequent endocrine malignancy with increasing incidence over recent years worldwide. Neoplastic transformation of thyroid epithelial tissue potentially gives rise to many malignant and benign tumors with great diversity in clinical pesentation, aggressiveness and outcome. The limited possibility of predicting the development of unfavorable and metastatic features in thyroid carcinoma is currently one of the major problems in clinical practice and patient management. The aim of this thesis was to investigate the expression and activity of two metalloproteinases, MMP-2 and MMP-9, as well as their inhibitor, TIMP-2, as markers that might be helpful in differential diagnostics of thyroid neoplasia and prognostic stratification of patients. The analysis included archival and fresh tissue obtained by surgical removal from patients with benign or malignant thyroid tumors, while “healthy” peritumoral tissue was used as the control. Methods of analysis included immunohistochemistry and gelatin zymography (SDS-PAGE and in situ). The immunohistochemical analysis revealed that MMP-2, MMP-9 and TIMP-2 are expressed more strongly in papillary thyroid carcinoma than in follicular thyroid adenoma, follicular thyroid carcinoma and conditionally healthy thyroid tissue, which administers additional information during routine morphological tissue analysis. Comparison of MMP-2 immunohistochemical expression with clinicopathological data revealed a significant correlation with the presence of metastases in lymph nodes, while the expression profile of TIMP-2 was correlated with clinicopathological parameters involved in papillary carcinoma progression (tumor size and occurrence of extrathyroid invasion). The immunohistochemically detected active form of MMP-9 was strongly associated with most clinicopathological parameters of papillary carcinoma: tumor size, extrathyroid invasion and lymph node metastasis, cancer stage and depth of neoplastic infiltration. This makes this molecule an excellent predictor of aggressive forms of papillary carcinoma. Using gel-zymography, the activation ratios of MMP-2 and MMP-9 were calculated. The ratio for MMP-2 did not vary significantly in papillary carcinoma samples, but that for MMP-9 was significantly higher in cases presenting with extrathyroid invasion and lymph node metastases, as well as those with high stage and tumor infiltration grades, when compared to samples lacking these features. In this study the technique of in situ zymography with fluorescently labeled substrate was employed for the first time in order to visualise the reaction of the enzymes in question in thyroid neoplasia. This technique enabled precise localisation of the enzymatic activity of MMP-2 and MMP-9, while, after selectively inhibiting MMP- 2, it was possible to analyze the proteolytic activity of MMP-9 in situ. Intense fluorescence originating from MMP-9 activity could be detected in malignantly transformed thyrocytes and elements of tumor stroma in carcinomas with extensive tumor infiltration. Based on the results presented in this work, we conclude that increased activity of MMP-9 is one of the factors involved in the development of aggressive features of papillary thyroid carcinoma. The immunohistochemical detection of active MMP-9 can be useful in predicting the biological behavior of papillary carcinoma.

Biosinteza gvajanolida kod cikorije (Cichorium intybus L.) - uticaj transformacije na produkciju i ispitivanje aktivnosti germakren A-sintaze i -oksidaze korišćenjem promotorskih fuzija i utišavanja gena

Guaianolide biosynthesis in chicory (Cichorium intybus L.) - influence of transformation on the production and study of germacrene A synthase and oxidase activity using promoter fusions and gene silencing

Cikorija (Cichorium intybus L.) je tradicionalno korišćena lekovita biljka bogata gvajanolidima - bioaktivnim seskviterpenskim laktonima. U ovom istraživanju cikorija je transformisana uz pomoć Agrobacterium rhizogenes, radi evaluacije produkcije gvajanolida u transgenim kulturama korenova i regenerisanim biljkama, i ispitivanja uticaja floralne tranzicije i ekspresije bakterijskih onkogena na akumulaciju ovih jedinjenja. A. rhizogenes soj A4M70GUS je uspešno transformisao cikoriju, dajući HR kulture iz kojih spontano regenerišu izdanci, a regeneranti cvetaju in vitro. Kod regenerisanih transgenih biljaka, gvajanolidi se akumuliraju u toku floralne tranzicije, što nije slučaj u netransformisanim biljkama. Akumulacija ovih jedinjenja bila je posebno izražena u korenu transformanata, što je korelisalo sa povišenom ekspresijom RolC gena. Gvajanolidi potiču od zajedničkog prekursora - germakrena A, koji nastaje dejstvom germakren A sintaze (GAS). U sledećem koraku biosinteze, germakren A oksidaza (GAO) u nekoliko koraka prevodi germakren A do germakren A kiseline, od koje nastaje kostunolid - prekursor ostalih seskviterpenskih laktona. GAS RNK cikorije je prethodno izolovana u kraćoj i dužoj formi - CiGASlo (GAS long) i CiGASsh (GAS short). Iz BAC biblioteke cikorije je izolovan jedan promotor za GAS long, dva promotora za GAS short i jedan za GAO, koji su fuzionisani sa fluorescentnim reporterom GFP. Funkcionalnost i jačina promotora je praćena agroinfiltracijom na zelenoj salati i stabilnom kotransformacijom cikorije A4M70GUS sojem sa unetim konstruktima. Kao reporter za kotransformaciju je korišćen drugi fluorescentni marker, DsRED. Usled inkompatibilnosti korišćenih fluorescentnih reportera DsRED i GFP, aktivnost promotora u regenerisanim transgenim biljkama je detektovana RT-PCR i qRT-PCR tehnikama. Promotori su se odlikovali različitom jačinom i delimičnom tkivnom specifičnošću. Promotor GAS long gena odlikovao se manjom tkivnom specifičnošću od GAS short, koji je pretežno bio aktivan u korenu cikorije. Uloga GAS long i GAS short gena u biosintezi gvajanolida je ispitivana i utišavanjem RNK interferencom. Cikorija je stabilno transformisana amiRNA konstruktima dizajniranim da specifično utišavaju jedan od ova dva gena, a regenerisane transgene biljke su testirane na nivou ekspresije gena i sadržaja seskviterpenskih laktona. Utišavanje gena je uspešno obavljeno kod većine dobijenih klonova, koji su pokazivali smanjenu ekspresiju ovih gena i smanjen sadržaj jedinjenja nizvodno u putu biosinteze - oksalata gvajanolida. Konstrukti, međutim, nisu bili specifični za CiGASlo ili CiGASsh, tako da su utišavali oba gena kod većine transgenih biljaka. Zaključeno je da su ova dva gena verovatno zajedno odgovorna za biosintezu gvajanolida, i da od njihovog kompleksnog odnosa ekspresije u različitim delovima biljke zavisi i količina prisutnih gvajanolida i njihovih derivata.

Chicory (Cichorium intybus L.) is traditionally used medicinal plant rich in guaianolides - bioactive sesquiterpene lactones. In this research, chicory was transformed with Agrobacterium rhizogenes in order to evaluate the production of guaianolides in transgenic root cultures and regenerated plants, and to explore the influence of floral transition and bacterial oncogene expression on guaianolide accumulation. A. rhizogenes strain A4M70GUS was successfully used for chicory transformation, producing hairy root cultures, which spontaneously regenerated shoots and plants that were flowering in vitro. In transgenic plants, guaianolides were accumulated during floral transition, which was not the case in untransformed plants. Accumulation of these compounds was especially significant in transformed plants' roots, which correlated with the expression of RolC gene. Guaianolides originate from a common precursor - germacrene A, which is synthesized by germacrene A synthase (GAS). In subsequent steps, germacrene A is converted to germacrene A acid in a series of steps catalyzed by germacrene A oxidase (GAO), which is then converted into costunolide - precursor of other sesquiterpene lactones. Two GAS mRNAs have been previously isolated from chicory - CiGASlo (GAS long) and CiGASsh (GAS short). One promoter for GAS long, two for GAS short and one promoter for GAO have been isolated from chicory BAC library, and fused with a fluorescent reporter GFP. Strength and functionality of the promoters were characterized by lettuce agroinfiltration and by cotransformation of chicory by A4M70GUS strain containing the constructs. DsRED, another fluorescent reporter, was used as a marker for cotransformation. Due to incompatibility of DsRED and GFP, promoter activity was detected in regenerated transgenic plants by RT-PCR and qRT- PCR. The promoters were characterized by different strength and partial tissue specificity. GAS long promoter was less tissue specific than GAS short, which was active mainly in chicory roots. GAS long and GAS short gene function in guaianolide biosynthesis was also studied by gene silencing through RNAi. Chicory was transformed with amiRNA constructs designed to specifically silence one of the two genes, and regenerated transgenic plants were tested for gene expression and sesquiterpene lactones content. Silencing was successful in most of the clones, which had reduced gene expression and reduced content of downstream compounds - guaianolide oxalates. However, the amiRNA constructs were not specific for CiGASlo or CiGASsh, so that both genes were silenced in most transgenic plants. It was concluded that both genes were probably involved in guaianolide biosynthesis, and that their complex pattern of expression in different parts of the plant determines the amount of guaianolides and their derivatives.

Oplemenjivanje mandarina (Citrus reticulata Blanco) metodama somatske i seksualne hibridizacije u cilju dobijanja novih bezsemenih kultivara

Application of somatic and sexual hybridization in mandarin (Citrus reticulata Blanco) improvement with the emphasis on seedlessness

Dobijanje novih kultivara mandarina na klasičan način je izuzetno spor i dug proces zbog nemogućnosti da se prevaziđu problemi vezani za reproduktivnu biologiju mandarina kao što su apomiksija (nucelarna poliembrionija), seksualna nekompatibilnost i dug juvenilni period. U novije vreme, da bi se prevazišli ovi problem, primenjuju se dve savremene metode koje su postale neizostavni deo programa oplemenjivanja mandarina - somatska hibridizacija (fuzija protoplasta) i interploidno seksualno ukrštanje. Obe metode su bazirane na izmeni ploidnosti postojećih kultivara. Primenom somatske hibridizacije, u prvom koraku moguće je dobiti tetraploidne hibride sa kumulativnim roditeljskim kombinacijama genoma koje određuju nasleđivanje kvalitetnih osobina oba diploidna roditelja. Dobijeni tetraploidni somatski hibridi mogu dalje, u drugom koraku, da se koriste u interploidnom seksualnom ukrštanju sa izabranim diploidnim, komercijalno važnim kultivarima u cilju dobijanja triploidnih hibrida. Triploidne hibridne biljke uvek daju bezsemene plodove što je najvažniji cilj programa za oplemenjivanje mandarina. Pored bezsemenosti, postoje i drugi ne manje značajni ciljevi, u programu oplemenjivanja mandarina kao što su lako ljuštenje, produženje sezone plodonošenja, poboljšanje ukusa ploda, poboljšanje kvaliteta isceđenog soka, produženje dužine trajanja svežine ploda na policama prodavnica, otpornost na niske temperature i bolesti. Kompleksni sistem oplemenjivanja koji uključuje ove dve savremene biotehnološke metode je već bio primenjen na druge pripadnike roda Citrus, a u ovoj doktorskoj disertaciji je primenjen za oplemenjivanje mandarina koje se gaje na Floridi. U prvom delu disertacije su prikazani rezultati somatske hibridizacije gde je dobijeno 65 somatskih hibrida. Somatski hibridi su dobijeni kroz “hemijsku“ fuziju protoplasta izolovanih iz embriogenog nucelarnog kalusa i mezofila listova uz primenu polietilen- glikola (PEG). Nivo ploidnosti regenerisanih hibrida je utvrđen metodom “flow” citometrije. Dobijeni somatski hibridi su bili rezultat hibridizacije šest roditeljskih kombinacija koje uključuju šest diploidnih roditelja – kultivara/selekcija sa vrhunskim kvalitetom ploda: tri mandarine [‘Ponkan’ (C. reticulata Blanco), ‘Willowleaf’ (C. deliciosa Tenore) i ‘Kinnow’ (‘King’ tangor (C. nobilis Lour.) × ‘Willowleaf’ mandarina (C. deliciosa Tenore))] i tri tangora [‘Murcott’ (C. reticulata Blanco x C. sinensis Osbeck), ‘W.Murcott’ (C. reticulata Blanco x C. sinensis Osbeck) i ‘Snack’ (C. reticulata Blanco × C. sinensis Osbeck)]. Regenerisane biljčice koje su aklimatizovane i gajene dalje u uslovima staklenika su testirane molekularnom markerima, primenom “expressed sequence tag – simple sequence repeat (EST-SSR)“ metode, da bi se utvrdila komplementarnost genoma dobijenih somatskih hibrida i njihovih roditelja. Uz pomoć EST-SSR markera je dokazano da su 46 somatskih hibrida autotetraploidi, 18 alotetraploidi a za jedan somatski hibrid nije bilo moguće odrediti genetičko poreklo. U grupi autotetraploida sa udvojenim genomom jednog od roditelja, 20 biljaka je imalo SSR alelske profile koji su bili potpuno podudarni sa alelskim profilom genoma tog roditelja. Neke biljke su bile autotetraploidi svog ženskog roditelja: ‘Murcott’, ‘W.Murcott’ i ‘Ponkan’ a jedna biljka je bila autotetraploid svog muškog ‘Willowleaf’ roditelja. Sve druge autotetraploidne biljke (26) su imale udvojene genome svog ženskog roditelja ‘W.Murcott’ tangora ali EST-SSR markerima nije bilo moguće u potpunosti potvrditi identitet genoma majke biljke. Dodatno testiranje EST-SSR markerima kalusnih linija kultivara ‘W.Murcott‘ dobijenih iz individualnih ovula je pokazalo je da neke kalusne linije imaju zigotsko a ne, kao što se očekivalo, nucelarno poreklo. Takođe, u grupi alotetraploidnih biljaka, poređenje SSR profila hibrida sa zbirom alela od oba roditelja je pokazalo da profili hibrida nisu identični roditeljskim što se posebno odnosi na muškog roditelja tj. kultivar ‘W.Murcott’. Na osnovu ovih rezultata se može zaključiti da su neke od ‘W.Murcott’ in vitro biljaka koje su korišćene kao izvor mezofilnih protoplasta takođe bile zigotskog porekla (proizvod unakrsnog a ne samo-oprašivanja). Urađena je morfološka analiza listova dobijenih somatskih hibrida kao i analiza plodova odabranih somatskih hibrida gajenih u polju. Analiza dobijenih plodova je pokazala da su oni po mnogim morfološkim osobinama i kvalitetu isceđenog soka jednakog ili čak višeg kvaliteta od unapred utvrđenih standardnih vrednosti za minimum zrelosti i kvaliteta za grupu mandarina. U drugom delu doktorske disertacije su prikazani rezultati primene metode seksualne hibridizacije kroz tri različite vrste ukrštanja (2x × 2x, 2x × 4x i 4x × 2x) iz kojih je dobijena velika populacija triploidnih (3x) hibrida. Za potrebe seksualnog ukrštanja je korišćeno ukupno 29 roditelja – 14 diploidnih (2x) i 15 tetraploidnih (4x) adultnih biljaka. Urađena je interploidna seksualna hibridizacija kod 48 roditeljskih kombinacija, od čega je kod 34 roditeljske kombinacije ukrštanje bilo uspešno i dobijeno je 4051 semena. Tehnika “spašavanja“ zigotskih embriona se pokazala kao neophodan deo protokola za dobijanje triploidnih hibrida mandarina jer je uz njenu primenu procenat klijanja embriona izolovanih iz semena bio 66% u 2x × 4x ukrštanjima i 92% u 2x × 2x ukrštanjima. Potpuno razvijene biljčice dobijenih seksualnih hibrida koji su se razvile u in vitro uslovima i čiji je nivo ploidnosti bio utvrđen metodom “flow” citometrije su bile nakalemljene na klijance podloga. Od 43 roditeljske kombinacije interploidnog 2x × 4x ukrštanja, 33 su bile uspešne i proizvele 689 triploida, što je predstavljalo 62% od ukupno regenerisanih biljaka in vitro. Preostale dobijene biljke su bile diploidi 35% (394 biljke) i tetraploidi 3% (31 biljka). Četiri recipročna interploidna 4x × 2x ukrštanja nisu dovela do stvaranja nijednog triploida. Iz jedine roditeljske 2x × 2x kombinacije dobijeno je 735 biljaka od čega su njih 4% (29 biljaka) bile triploidi a 96 % diploidi (706 biljaka). Efikasnost dobijanja triploida je za pojedinačne roditeljske kombinacije izračunata kao broj triploidnih seksualnih hibrida po dobijenom plodu. Ovaj parametar je zavisio od nekoliko faktora koji uključuju genotipove oba roditelja kao i sredinske faktore. Naučna oblast: Biologija Uža naučna oblast: Fiziologija biljaka UDK broj: 577.21:581.145.2(043.3) 581.16:634.322(043.3)

Development of improved cultivars through conventional hybridization in mandarins has been hampered by several characteristics of their reproductive biology, mainly apomixis (nucellar polyembriony), sexual incompatibility, and long juvenility. As an alternative, two unconventional methods - somatic hybridization via protoplast fusion and interploid sexual hybridization have become integral part of mandarin variety improvements programs worldwide since they can easily overcome mentioned limitations of reproductive biology characteristics. Both techniques are based on ploidy manipulation. By using somatic hybridization, it is possible to produce novel germplasm at tetraploid level that combines all the good qualities of fused diploid selections. Used further in interpoid sexual hybridization, these newly produced somatic hybrids crossed with selected diploid commercial cultivars could generate eventually triploid hybrids. Triploid hybrids always produce seedless fruit which is a primary objective of mandarin breeding program. Besides seedlessness, there are other main breeding objectives for mandarins: easy-peel fruit, extension of the season of availability (early and late), improved flavor, juice quality, shelf life, cold hardiness, and disease resistance. This complex system of two unconventional biotechnological methods, used to generate triploid hybrids in other citrus species, was successfully applied in this thesis for mandarin cultivar improvement in Florida. In the first part of the thesis, a total of 65 somatic hybrids were obtained via somatic hybridization. They were produced by using chemically (polyethylene glycol - PEG) induced fusion of embryogenic suspension- derived protoplasts with leaf-derived protoplasts. “Flow” citometry was used to determine ploidy level of regenerated somatic hybrids. Somatic hybrids came from six different parental combinations involving six diploid parents - cultivars/selections with exceptional fruit qualities: three mandarins [‘Ponkan’ (C. reticulata Blanco), ‘Willowleaf’ (C. deliciosa Tenore), and ‘Kinnow’ (‘King’ tangor (C. nobilis Lour.) × ‘Willowleaf’ mandarina (C. deliciosa Tenore))] and three tangors [‘Murcott’ (C. reticulata Blanco × C. sinensis Osbeck), ‘W.Murcott’ (C. reticulata Blanco × C. sinensis Osbeck), and ‘Snack’ (C. reticulata Blanco × C. sinensis Osbeck)]. Produced plants, that survived in vitro conditions and aclimation in the greenhouse, were tested with expressed sequence tag – simple sequence repeat (EST-SSR) marker analysis to examine complementation of their nuclear genomes with their parental genomes. EST- SSR markers identified 46 autotetraploid plants, 18 allotetraploid plants, and one undefined plant. In autotetraploid group, 20 plants had SSR profiles completely matching the allelic profiles of one of their parents’ genomes but in duplicate. Following plants were autotetraploids of their female parents: ‘Murcott’, ‘W.Murcott’, and ‘Ponkan’ and in one case the plant was autotetraploid of ‘Willowleaf’ male parent. All other autotetraploid plants (26) had a duplicate genome of their female parent ‘W.Murcott’, except that EST-SSR markers did not completely match their maternal genome. Further testing with EST-SSR markers of some ‘W.Murcott’ callus lines derived from individual ovules discovered unexpected zygotic origin of several lines which were presumed to be of nucellar origin. In allotetraploid group of plants, comparison of SSR profiles of hybrids with the sum of allels from both parental profiles showed that they were also not completelly identical to profiles of their ‘W.Murcott’ male parent. It was concluded that some of in vitro ‘W.Murcott’ stock plants used as a source of mesophyl protoplasts in fusion experiments must have been of zygotic origin (coming from cross pollination and not from selfing). Hybrids growing in the field were used for leaf morphological analysis and evaluation of commercial qualities of the fruit. Fruit evaluation has shown that according to their features and juice quality they meet or exceed the standards for quality and maturity of mandarins. In the second part of the thesis, where sexual hybridization was employed, three different types of crosses (2x × 2x, 2x × 4x, and 4x × 2x) were preformed in order to produce large population of triploid (3x) hybrids. Total of 29 parents were utilized - 14 diploid (2x) and 15 tetraploid (4x) mature plants. Out of 48 parental combinations in sexual hybridization experiments, 34 were successful and generated 4051 seeds. Embryo rescue proved to be an indispensable part of the protocol for triploid hybrid recovery as germination rate of embryos from extracted seeds was 66% in 2x × 4x and 92% in 2x × 2x hybridization. Ploidy level of all obtained sexual hybrids was determined by means of “flow“ citometry and those which were fully developed in in vitro conditions were grafted onto rootstock seedlings. Thirty three out of fourty three parental combinations of interploid 2x × 4x crosses were successful at producing total of 689 triploids which represented 62% of successfully regenerated plants in vitro. The rest of the plants were diploids 35% (394) and tetraploids 3% (31). Four reciprocal interploid 4x × 2x crosses did not yield any triploids. The single parental combination of 2x × 2x cross generated total of 735 plants out of which were triploids 4% (29) and the rest of 96% (706) were diploids. Efficiency of triploid hybrid production was calculated as the number of triploid genotypes per harvested fruit for each parental combination. This parameter was affected by several factors including genotypes of both parents and environmental conditions. Scientific field: Biology Specific scientific field: Plant Physiology UDC number: 577.21:581.145.2(043.3) 581.16:634.322(043.3)

Karakterizacija prirodnog izolata Lactobacillus sp. BGRA43 kao potencijalnog probiotika

Prirodni izolat BGRA43, izolovan iz gastrointestinalnog trakta čoveka, determinisan je na osnovu klasičnih mikrobioloških i molekularno-bioloških metoda kao vrsta Lactobacillus helveticus. Soj poseduje jedan plazmid (pRAl), veličine 2.4 kb, koji se stabilno održava u ćeliji i nakon 10 sukcesivnih presejavanja. Za potrebe genetičkih manipulacija soj je uspešno transformisan plazmidom pAl-6, mada je efikasnost transformacije niska. Optimalna temperatura za rast ovog soj a je 42°C, pri čemu je pokazano da soj dobro raste kako u MRS-u tako i u 10% obranom mleku. Nakon 6 sati rasta u 10% obranom mleku na temperaturi od 37°C dolazi do obaranja pH vrednosti u mleku na 4.53 pri čemu takodje dolazi do formiranja homogenog gruša visokog stepena viskoznosti. Soj BGRA43 pokazuje antimikrobijalnu aktivnost na veći broj Gram-pozitivnih i Gram-negativnih bakterija. Takodje je utvrdjeno da soj BGRA43 poseduje ekstracelulamu proteinazu. Cele ćelije ovog soj a hidrolizuju sve tri glavne kazeinske frakcije u Na-fosfatnom puferu pH 6.5 i temperaturi od 45°C za samo 2 h. Proteolitička aktivnost soja BGRA43 inhibirana je inhibitorom serinskih proteaza (PMSF). Oslobadjanje proteinaze soja BGRA43 sa ćelijskog zida nije zavisno od Ca+T jona. Na osnovu DNK-DNK hibridizacija, PCR analize kao i sekvenciranjem kloniranog PCR produkta koji odgovara katalitičkom regionu proteinaze utvrdjen je visok stepen homologije sa ptrH genom iz soja Lactobacillus helveticus CNRZ32. Izolovan je i okarakterisan spontani Prt" derivat soja BGRA43, označen kao BGRA433. Derivat BGRA433 nije hidrolizovao ni jednu kazeinsku frakciju i pokazano je da poseduje deleciju u katalitičkom regionu proteinaznog gena. Celije soja BGRA43 preživljavaju u visokom procentu u uslovima niske pH vrednosti kao i u prisustvu 0.3% žučnih soli. Humano poreklo, široki spektar antimikrobijalnog delovanja i sposobnost preživljavanja u uslovima koji vladaju u gastrointestinalnom traktu čine soj BGRA43 potencijalnim probiotikom. Lactobacillus helveticus BGRA43 je uspešno iskorišćen i kao starter kultura za proizvodnju jogurta i kiselog mleka.

Natural isolate BGRA43 was isolated from the human intestinal tract. Using the microbiology and molecular biology tests this thermophilic human isolate was determined as Lactobacillus helveticus. The strain BGRA43 was transformed with plasmid pAl-6, but efficiency of transformation was very low. It was found that BGRA43 contains only one small plasmid pRAl about 2.4 kb. The strain BGRA43 grow very fast in milk (6h, pH 4.5) as well as in MRS (Aćoonm? 0.858, lOh). Growth of Lactobacillus helveticus BGRA43 in non-fat skim milk after 6 h at 37°C resulted in a lowering of the pH value to 4.53. Besides the fast acidification, the strain generated a high viscosity of skim milk. The strain BGRA43 produced antagonistic substances against both Gram­ positive and Gram-negative bacteria and also exhibited an inhibitory effect on the growth of Clostridium sporogenes. Determination of caseinolytic activity done under optimal conditions (pH 6.5 and 45°C), revealed that proteinase from this strain completely hydrolysed all three casein fractions. The proteolytic activity of whole cells was inhibited by serine proteinase inhibitor (PMSF), suggesting that BGRA43 strain produce serine-type of proteinase. In addition, release of the proteinase from the cell envelope of strain BGRA43 is not CaT+-dependent. DNA-DNA hybridisation, PCR analysis and analysis of subcloning PCR fragments from catalytic region of proteinase showed high similarity (98.9% identity) with prtH gene isolated from Lactobacillus helveticus CNRZ32. Spontaneous Prf derivative BGRA433 was isolated. This derivative is not able to hydrolyse any of casein fractions and hybridisation and PCR analysis showed deletion in catalytic region of proteinase gene. Human origin, antimicrobial activity and surviving at low pH and in presence of bile salts are all properties that consider this strain to be a potential probiotic. Finally, it was demonstrated that the strain BGRA43 can be very attractive as starter culture for production of fermented milk product.

Morfološka varijabilnost i distribucija roda Theodoxus Montfort, 1810 (Neritomorpha, Gastropoda) u centralnom delu Balkanskog poluostrva i na južnom obodu Panonske nizije

Morphological variability and distribution of Theodoxus Montfort, 1810 (Neritomorpha, Gastropoda) in the central Balkan and southern edge of Pannonian plain

Ispitivanje je obuhvatilo velik broj podataka, kako literaturnih tako i terenskih, u pogledu nalaza proučavanih vrsta. Uočena je prostorna distribucija i odnosi između vrsta, pri čemu je zabeleženo širenje vrste T. fluviatilis u velikim nizijskim rekama, kao i znatno šire rasprostranjenje vrsta T. danubialis i T. transversalis u prošlosti. Rečni nerit je danas dominantan nerit u potamon-tpu reka Panonske nizije ovog područja. Bosanske reke Una Sana I Vrbas su potencijalni koridori za širenje vrste T. fluviatilis, i povezivanje njenog panonskog i dalmatinskog areala Pojedini stariji nalazi ove vrste, u rekama van pomenutog tipa, u skladu sa rezultatima ovog istraživanja bi zahtevali proveru, obzirom na mogućnost pogrešne identifikacije. Rasprostranjenje T. transversalis, je pretrpelo i najveće promene, odnosno drastično smanjenje samog areala vrste. U prošlosti su zabeleženi su nalazi sa nekoliko mesta na Dunavu, od Novog Sada, preko Đerdapa do ušća Timoka. Sem toga postoje nalazi i sa nekih drugih reka (Sava, Moravica). Naše istraživanje sugeriše da je i dalje prisutan, ali vrlo redak na Dunavu u ovom delu njegovog toka. Lokalitet na kome je nađen, Stari Slankamen može biti jedno od retkih utočišta retke vrste u ovom delu Dunava. Treba naglasiti i nalaze po jedne jedinke sa Tise (Martonoš) i Crnog Timoka (Zaječar), koji takođe mogu ukazivati na prisustvo populacija ovih puževa. Recentna distribucija pokazuje da je rečni sistem Velika Morava – Južna Moorava – Nišava glavni refugijum za retku vrstu T. transversalis. Bosanske reke Una Sana I Vrbas su potencijalni koridori za širenje vrste T. fluviatilis, i povezivanje njenog panonskog i dalmatinskog areala. Rezultati izvedene analize, potvrđuju opšte preference ovih vrsta u odnosu na tip reke, pa su tako vrste T. danubialis i T. transversalis najprisutnije u tipu 2 (velike reke van područja Panonske nizije), dok je T. fluviatilis dominantan u tipu 1 (velike nizijske reke). Ispitivanje odnosa sa setom fizičko-hemijskih parametara je pokazalo, da se, kao najvažniji faktori vode koji utiču na ispitivanu zajednicu teodoksusa mogu izdvojiti zasićenje vode kiseonikom, koncentracija ortofosfata i amonijum jona, te temperatura vode. Rezultati multivarijantne kanonijske analize dalje ukazuju na očekivanu veću toleranciju vrste T. fluviatilis na manju količinu rastvorenog kiseonika, više temperature, kao i na povećano prisustvo amonijuma u vodi. Druge dve vrste su osetljive na pomenute uslove, naročito T. danubialis. Kod najređe vrste T. transversalis, interesantna je ipak nešto povećana toleranca na sve pomenute faktore, pogotovo na povećane koncentracije ortofosfata, koje kako izgleda najbolje podnosi od ispitivanih vrsta. Prilikom analize odabranih parametara (morfometrijskih indeksa) u odnosu na pol, utvrđđeno j prisustvo samo jednog polno dimorfnog karaktera – G/D (standardizovano međuočno rastojanje). Opet je interesantan slučaj T. transversalis kod koga ovaj karakter nije polno dimorfan. Razlog, može biti u malom uzorku, efektom koji je dodatno pojačan izrazito nejednakim odnosom polova (samo 8 ženskih jedinki), na šta ukazuju i velika odsstupanja od srednje vrednosti karaktera kod ove vrste. Izvedene morfometrijske analize primenom seta morfometrijskih indeksa izdvojile su kao najzančajnije karaktere D2/D3, D2/D, D2/Š2, zasnovane na dimenzijama ljušture, odnosno kolumelarne ploče pre svega. Pri odvojenoj analizi recentnih populacija kao značajni parametric izdvojili su se i D1/D, D1/Š1, V/Š i D3/D. Multivarijantne analize ovih karaktera su pokazale i određeni stepen morfološke diskriminacije na nivou vrsta, pri čemu sun a jednom polu vrste T. fluviatilis i T. danubialis, dok je vrsta T. transversalis između. Testiranja muzejskih populacija, nisu pokazala značajna populaciona razdvajanja unutar vrsta, dok između vrsta postoji razlika. Najzad analiza i recentnih i muzejskih podataka zajedno ukazuje na određen stpen razdvajanja između muzejskih i recentnih populacija, prvenstveno zbog razlika kod vrste T. transversalis, kod koje su prisutne značajne razlike između ovih dveju grupa, zahvaljujući razlikama u parametrima V/Š i V/D, koji opisuju opšti oblik ljušture

The study includes a large number of data collected on the field, as well as the literature data. The spatial distribution and relationships between species are investigated. The spread and estabished dominance of T. fluviatilis in large lowland rivers, and much wider distribution of species T. danubialis i T. transversalis in the past were noted. Studied rivers Una, Sana and Vrbas are noted as potential corridors for the spread of T. fluviatilis, and connecting its Pannonian and Dalmatian range of distribution. It schould be mentioned that some of this species previous findings, apart of its typical habitats (potamon rivers) schould be rechecked. Distribution of T. transversalis, suffered the biggest change, resulting in a drastic reduction in its range. In the past, there have been records from several sites on the Danube, from Novi Sad through the Iron Gate to the mouth of the Timok River. Furthermore, reports were from other rivers ae well (the Sava River, the Moravica River). Despiteliterature data, the findings of this rare species in some localities in the Danube River suggests that it is still present but very rare. The site on which it is found (Stari Slankamen), could acts as one of the few remaining refugia for this rare species in the Danube. Findings from the Tisa River (Martonoš) and the Crni Timok River (Zaječar), schould be noted also. The analyses of its recent distribution showed that the Velika Morava River – Južna Morava River – Nišava River river system is the main refuga for the species. Results of preformed analysis have confirmed the general preferences of the species regarding the river type. Species T. danubialis i T. transversalis are the most present in river type 2 (large rivers outside of the Pannonian basin), while T. fluviatilis is dominant in river type 1 (large lowland rivers). Regarding its relation to water chemistry it has been showed that the most important of studied physico-chemical parameters on Theodoxus community were oxygen content, orthophosphates, ammona and water temperature. Multivariate analyzes indicate increased tolerance of T. fluviatilis to the low oxygen content and higher water temperature, as well as for increased ammona concentrations. Unlike the other two species are less tolerante to this conditions, especially T. danubialis. It is somewhat interesting that the rarest species T. transversalis has increased tolerance to organic nutrients (orthophosphates and nitrates). Analysis of selected morphological parameters (morphometric index) in regard to sex dimorphism revealed presence of just one sexuall dimorph charachter - G/D. The exception is T. transversalis which lacks noted dimorphsm but it could be explaned with small samle used. Performed morphometric analysis on the set of morphometric indices singled out the most significant characters D2/D3, D2/D, D2/Š2, which are based on schell and columelar plate dimensions. Analysis of recent population besides mentioned parameters revealed significance of parameters D1/D, D1/Š1, V/Š and D3/D also. Peformed multivariate analysis based on these characters have showed some degree of morphological discrimination at the species level. Species T. fluviatilis and T. Danubialis were the most clearly separated while T. transversalis was with the mixed charachters. Analysies performed on museum samples, showed less intraspecies variability while inerspecies variability was present. The pooled data analyses indicatets notable variability regarding museum and recent populations primarily due to intraspecific T. Transversalis diffecences. These differences were mainly based on charachters describing the general shape of the schell (V/Š and V/D).

Intra- i interspekcijska taksonomska diferencijacija vrsta roda Heterocypris Claus, 1892 (Ostracoda, Crustacea) na centralnom delu Balkanskog poluostrva i južnom obodu Panonske nizije

Intra- and interspecific taxonomic differentiation of species of the genus Heterocypris Claus, 1892 (Ostracoda, Crustacea) in central part of Balkan peninsula and southern edge of Pannonian plain

Ostracoda su jedna od najrasprostranjenijih grupa zglavkara. Prisutni u velikom broju različitih staništa i imaju najviše zabeleženih fosilnih nalaza. Rod Heterocypris Claus, 1982 ima kosmopolitsko rasprostranjenje i obuhvata 63 vrste. Prisustvo mešovite reprodukcije sa mogućnošću intra- i interspecijske hibridizacije doveli su do visoke genetičke i morfološke varijabilnosti unutar ovog roda. Taksonomija vrsta ovog roda se uglavnom zasniva na karakteristikama karapaksa, dok su razlike u strukturama na ekstremitetima malobrojne. Ova studija se bavi uporedno-morfološkom analizom karapaksa i mekih delova kod osam vrsta roda Heterocypris, sa ciljem da se uvedu dodatni morfološki karakteri i izvrši ocena postojećih karaktera. Razlike u obliku kapaka su analizirane kod 26 populacija iz Panonske nizije, Balkanskog poluostrva i Pirinejskog poluostrva. Deskriptivne obsevacije i morfometrijska analiza morfoloških karaktra karapaksa i mekih delova su date za 10 populacija. Geometrijskom analizom digitalizovanih kontura oblika kapaka u programu MORPHOMATICA, postignuta je ujednačenost deskripcije oblika kapaka i objektivniji pristup pri analizi intra i interspecijke varijabilnosti. Prvi put je sagledana intraspecijska varijabilnost i interspecijska diferencijacija morfoloških karakteristika gornje usne na vrstama roda Heterocypris, čime su konstatovani novi taksonomski karakteri. Prisustvo senzitivnog Wouters-organa na prvom segmentu antene kod svih analiziranih vrsta je takođe novi karakter konstatovan kod vrsta roda Heterocypris. Diferencijacija na multivarijantnom nivou je pokazala postojanje morfoloških razlika zasnovanih na morfometrijskim karakterima ekstremiteta ženki. Konstatovani su karakteri koji najviše doprinose diskriminaciji i ocenjene su značajnosti razlika između pojedinih taksona. Dve vrste koje se najviše razdvajaju od ostalih su Heterocypris gevgelica i H. exigua. Zbog prisustva značajnih razlika, na osnovu kojih se H. erikae i H. vitrea definišu kao zasebni morfološki entiteti, predložene sinonimije sa H. barbara su dovedene u pitanje.

Ostracoda are one of the most common arthropod groups. They are found in a wide variety of environments, and they also have the most complete fossil record. The genus Heterocypris Claus, 1982 has a cosmopolitan distribution and comprises 63 species. The presence of mixed reproduction with possible intra- and interspecific hybridization has resulted in high genetic and morphological variability. The taxonomy of this genus is based mostly on carapace characteristics, while distinctive features of appendages are few. This study is based on comparative morphology of carapace and soft parts of eight species within the genus Heterocypris, with the aim of introducing additional morphological traits and reevaluating existing characters. Differences of valves shapes were analyzed in 26 populations from the Pannonian Plain, Balkan Peninsula and Iberian Peninsula. Descriptive observations and morphometric analysis of morphological traits of the carapace and soft parts are given for 18 populations. Geometric analysis of digitized valves outlines was performed in MORPHOMATICA software, providing balanced description of valve shapes and objective approach in analyses of intra- and interspecific variability. Specific differences morphological traits of the upper lip were ascertained for the first time for eight species of the genus Heterocypris, bringing new taxonomical characters. The presence of Wouters-organ on the first segment of antenna is also noted for the first time in Heterocypris species. Multivariate analysis of variance showed significant variation of morphometric characters of females among groups. The characters that contribute most to the discrimination are identified and statistical significances of differences between individual taxa are assessed. The two species with greatest distinctiveness are Heterocypris gevgelica and H. exigua. Zbog prisustva značajnih razlika, na osnovu kojih se H. definišu kao zasebni morfološki entiteti, predložene sinonimije sa H. barbara su dovedene u pitanje. The proposed synonymy of Heterocypris erikae and H. vitrea with H. barbara was challenged, due to the presence of distinct morphological differences.

Uticaj ishrane bogate fruktozom na ekspresiju komponenti renin-angiotenzin sistema i inflamacije u tkivu srca pacova: polno specifične razlike

The effect of fructose rich diet on the expression of renin-angiostensin system components and inflamatory molecules in the rat heart: sex specific differences

Ishrana bogata fruktozom predstavlja bitan faktor u razvoju metaboličkog sindroma koji je povezan sa povećanim rizikom za nastanak kardiovaskularnih bolesti. Smatra se da hronična inflamacija ima bitnu ulogu u njegovoj patogenezi. Ženke su zaštićene od ishranom izazvanih metaboličkih poremećaja i hipertenzije u reproduktivnom periodu. Estrogen, koji utiče na normalno funkcionisanje kardiovaskularnog sistema, bi mogao doprinositi uočenim polno specifičnim razlikama u nastanku simptoma metaboličkog sindroma. Proteinske komponente renin-angiotenzin sistema (RAS) imaju bitnu ulogu u nastanku inflamacije, hipertenzije i insulinske rezistencije i na njihovu ekspresiju utiče estradiol. Ova doktorska disertacija je za cilj imala da ispita da li pol i estradiol doprinose promenama u ekspresiji komponenti RAS-a [angiotenzin konvertujućeg enzima (ACE), angiotenzin konvertujućeg enzima 2 (ACE2), angiotenzinskog receptora tipa 1 (AT1R), angiotenzinskog receptora tipa 2 (AT2R) i kolektrina] i medijatora inflamacije i remodelovanja tkiva srca [nuklearnog faktora κB (NFκB), matriks metaloproteinaze-9 (MMP-9) i liganda 16 iz familije hemokina CXC (CXCL16)] kod animalnog modela metaboličkog sindroma. Mužjaci i ženke pacova koji su pili 10% rastvor fruktoze umesto vode u trajanju od 9 nedelja predstavljali su animalni model metaboličkog sindroma korišćen u ovoj studiji. Radi ispitivanja efekata estradiola jedan deo ženki pacova je ovarijektomisan i podeljen u tri grupe pri čemi je jedna grupa pored standardne laboratorijske hrane pila vodu, druga grupa je pila 10% rastvor fruktoze, a treća grupa je pored rasvora fruktoze primala i supstitucionu terapiju estradiolom. Ishrana bogata fruktozom je uzrokovala povećanje krvnog pritiska samo kod mužjaka pacova. Ovaj tip ishrane nije doveo do promena u masi srca niti u odnosu masa srca/masa tela ni kod jednog pola, kao ni kod ovarijektomisanih životinja što ukazuje da se hipertrofija srca nije razvila. Rezultati biohemijskih analiza su pokazali da ishrana bogata fruktozom dovodi do hipertrigliceridemije kod oba pola, kao i kod ovarijektomisanih pacova. Kod ovarijektomisanih pacova ovaj tip ishrane dovodi i do hiperinsulinemije i insulinske rezistencije za koje se pokazalo da su revertibilne supstitucionom terapijom estradiolom. Western blot analiza je pokazala da ishrana bogata fruktozom uzrokuje povećanje nivoa ACE, istovremeno sa smanjenjem nivoa ACE2 i AT2R u srcu mužjaka pacova i ovarijektomisanih ženki. Metodom Real-time PCR je ustanovljeno da ishrana bogata fruktozom u srcu mužjaka pacova inhibira transkripciju gena koji kodira AT2R. Kod ženki ishrana obogaćena 10% rastvorom fruktoze ne dovodi do promena u nivou ACE, ACE2 i AT2R. Iako ni kod jednog pola nije došlo do promene u nivou AT1R i MMP-9 nakon ishrane bogate fruktozom, ipak je detektovan veći nivo ovih molekula u srcu mužjaka pacova hranjenih fruktozom u odnosu na ženke. S druge strane, kod ovarijektomisanih ženki je ovaj tip ishrane doveo do povećanja nivoa i AT1R i MMP-9. U srcu pacova nakon ishrane obogaćene fruktozom nisu detektovane promene u nivou iRNK za CXCL16 i kolektrin. Kao posledica ishrane bogate fruktozom u srcu ovarijektomisanih pacova došlo je do povećanja nivoa iRNK za CXCL16 i do povećanja fosforilacije p65 subjedinice NFκB. Supstituciona terapija estradiolom kod ovarijektomisanih životinja koje su pile 10% rastvor fruktoze je dovela do vraćanja nivoa ACE2 i AT2R na nivo detektovan kod kontrole, dok je nivo ACE, AT1R i MMP-9 bio čak manji od nivoa izmerenog kod kontrola. Uporedo sa ovim, estradiol je delovao antiinflamatorno smanjujući nivo fosforilacije NFκB i nivo iRNK za CXCL16. Na osnovu rezultata dobijenih u ovoj studiji može se zaključiti da detektovane polno specifične promene u nivou proteinskih komponenti RAS-a u srcu i razvoj hipertenzije, zajedno sa povećanjem nivoa medijatora inflamacije i remodelovanja, doprinose tome da mužjaci pacova budu podložniji za nastanak eventualnih budućih patoloških promena u strukturi i funkciji srca indukovanih ishranom bogatom fruktozom. Estrogen pokazuje zaštitni efekat na srce ovarijektomisanih ženki pacova ukidajući metaboličke promene na biohemijskom i molekularnom nivou nastale kao posledica ishrane bogate fruktozom, smanjujući inflamaciju i remodelovanje srca. Ova doktorska distertacija je omogućila bolje razumevanje polno specifičnih razlika u patogenezi metaboličkog sindroma, kao i bolje razumevanje uloge RAS u ovom procesu.

Fructose rich diet (FRD) represents an important factor in the development of metabolic syndrome. Metabolic syndrome is associated with increased risk for cardiovascular diseases occurrence and chronic inflammation has a major role in its pathogenesis. Females are protected from diet-induced metabolic disturbances and hypertension in their reproductive period. Estrogen, which influences the cardiovascular system, could contribute to the observed gender-specific differences in the onset of metabolic syndrome. Components of the renin-angiotensin system (RAS), the synthesis of which is mediated by estrogen, have an important role in the inflammatory processes, hypertension and insulin resistance. Almost all of the components of metabolic syndrome increase the activity of RAS, which finally results in increased oxidative stress and inflammation. The aim of this doctoral dissertation was to investigate sex specific changes and role of estradiol in the expression of RAS components [angiotensin converting enzyme (ACE), angiotensin converting enzyme 2 (ACE2), angiotensin receptor type 1 (AT1R), angiotensin receptor type 2 (AT2R) and collectrin], as well as mediators of inflammation and remodeling of heart tissue [nuclear faktor κB (NFκB), matrix metalloproteinse-9 (MMP-9) and CXCL16 chemokine] in the animal model of metabolic syndrome. Male and female rats, which consumed 10% fructose solution instead of water for 9 weeks, represent an animal model of metabolic syndrome that was used in this study. In order to examine the effects of estradiol in the context of FRD, female rats were ovariectomized and divided in three groups: fed normal diet, fed FRD, and fed FRD and subjected to estradiol replacement therapy. FRD increased blood pressure only in male rats. This diet regime didn't cause heart hypertrophy neither in intact males and females, nor in ovariectomized females. Biochemical analyses showed that FRD resulted in hypertriglyceridemia in both sexes, as well as in ovariectomized females. Further, in ovariectomized females FRD caused hyperinsulinemia and insulin resistance, which were reverted with estradiol replacement therapy. Western blot analyses revealed that fructose fed males and fructose fed ovariectomised females had inceased level of ACE, and decreased levels of ACE2 and AT2R in the heart compared to adequate controls. Real- time PCR method showed that FRD abolished gene transcription of AT2R in male rats. In females, there were no changes in RAS molecules expression as a consequence of FRD. Although FRD didn't cause changes in levels of AT1R and MMP-9 neither in males nor in females, their levels were higher in fructose fed males compared to fructose fed females. On the other side, we detected increased mRNA levels of AT1R and MMP-9 in ovariectomized fructose fed females. FRD didn't affect mRNA level of CXCL16 and collectrin in the heart of intact animals. In the heart of ovariectomized females this diet led to the increased mRNA level of CXCL16 and increased phosphorylation of p65 subunit of NFκB. Estradiol reverts changes in the level of MMP-9 and RAS components in the heart of fructose fed ovariectomised female rats. Further, estradiol showed antiinflammatory effect since it decreased phosphorylation of p65 subunit and mRNA level of CXCL16 in heart of fructose fed ovariectomized animals. Based on the results obtained in this study we can conclude that detected sex specific changes in the development of hypertension and cardiac RAS proteins expression, together with elevated inflammation and remodeling contributed to greater susceptibility of male rats for the occurrence of possible further pathological changes in the function and structure of the heart. Estrogen, demonstrating the ability to revert the biochemical and molecular changes, protects female rats from metabolic disorders and additionally reduces inflammation and heart remodeling that followed the FRD. This doctoral dissertation contributes to better understanding of gender specific differences in the pathogenesis of metabolic syndrome, as well as to better understanding of the role of RAS in this process.

Fitocenološka klasifikacija vegetacije jezerskog tipa u Srbiji

Phytocenological classification of lake vegetation in Serbia

Ekološki status akvatičnih ekosistema se određuje na osnovu bioloških, hidromorfoloških, hemijskih i fizičko-hemijskih elemenata kvaliteta. Najvažniji i najobuhvatniji dokument iz oblasti upravljanja, uređenja, zaštite i monitoringa akvatičnih ekosistema na području Evrope je Okvirna Direktiva Evropske Unije o vodama (Water Framework Directive -WFD). Države članice EU su već kreirale i uspostavile sisteme nacionalnog monitoringa i procene ekološkog statusa, od kojih su neki testirani na nivou većeg dela Evropskog kontinenta. Jedan od tih sistema, koji se bazira na kompoziciji i zastupljenosti akvatične vegetacije i čija je relevantnost testirana i potvrđena na području severne, zapadne i srednje Evrope je LEAFPACS metod. LEAFPACS predstavlja višemetrički sistem za procenu biološkog statusa akvatičnih ekosistema jezerskog tipa na osnovu stepena eutrofizacije, specijskog diverziteta i diverziteta životnih formi akvatičnih biljnih vrsta. Cilj ove disertcije je bila revizija klasifikacije akvatične i semiakvatične vegetacije, kao osnove za izradu vegetacisjke klasifikacije jezera i kalibracije LEAFPACS metode za područje Srbije, u skladu sa Okvirnom Direktivom EU o vodama. Terenska istraživanja akvatične i semiakvatične vegetaije, kao i fizičko-hemijska i hidromorfološka karakterizacija staništa su obavljeni na 31 jezeru, tokom letnjih meseci u periodi 2009-2011. godine. Od ukupno 31 istraživanog jezera, na 26 je konstatovana akvatična i semiakvatična vegetacija. Konstatovano je ukupno 97 biljnih vrsta, čija je relativna pokrovnost izračunata za svako jezero. Najučestalije vrste i vrste sa najvećom pokrovnošću su: Myriophyllum spicatum L., Phragmites australis (Cav.) Trin. ex Steud., Typha angustifolia L., Ceratophyllum demersum L. subsp demersum, Najas marina L. i Potamogeton nodosus Poir. U odnosu na fizičko-hemijski kvalitet vode, većina jezera se može okarakterisati kao visoko alkalna, neutralne do slabo bazične pH reakcije, među kojima su se jezera Palić, Ludaš, i lokaliteti na području Koviljskog rita svrstali u izraženo eutrofna jezera, a veštačka vodena tela, akumulacije i kopovi šljunka, u jezera pretežno oligotrofnog i mezotrofnog karaktera. Istorijski podaci za akvatičnu i semiakvatičnu vegetaciju na području Srbije su kompletirani u vidu baze podataka od 394 vrste i 1720 fitocenoloških snimaka u 6 TurboVeg formatu. Baza je obuhvatila podatke iz 38 različitih publikacija, neravnomerne geografske distribucije. Najzastupljenije vegetacijske klase u bazi su: Phragmitetea communis R. Tx. et Prsg. 1942, Potametea R. Tx. et Preising 1942 i Lemnetea minoris W. Koch et R. Tx. 1955, dok su u skladu sa tim asocijacije sa najvećim brojem snimaka: Scirpo-Phragmitetum W. Koch 1926, Salvinio-Spirodeletum polyrrhizae Slavnić 1956 i Myriophyllo-Potametum Soo 1934. Na osnovu terenskih i istorijskh vegetacijskih podataka izrađena je vegetacijska tipologija jezera Srbije. Jasno se izdvojilo 6 grupa jezera (TW1-6), od čega 2 obuhvataju oligotrofna i mezotrofna jezera (TWI), a 4 grupe sadrže eutrofna jezera (TWII). Kao fizičko-hemijski parametri, čije vrednosti najbolje odražavaju tipologiju jezera, izdvojili su se biološka potrošnja kiseonika, hemijska potrošnja kiseonika i rastvoreni kiseonik, ukazujući na značajnost faktora eutrofizacije u diferenciranju vegetacijskog pokrivača jezera istraživanog područja. MSI trofički indeks je izračunat za 46 hidrofita, na osnovu kog je računat trofički skor jezera (LIMNIS indeks). Upotrebljivost LIMNIS indeksa je testirana i potvrđena u odnosu na izvedenu vegetacijsku tipologiju jezera i u odnosu na fizičko-hemijske parametre trofičkog statusa. Prema rezultatima CCA analize i vrednostima MSI indeksa, izdvojile su se vrste osetljive na eutrofizaciju: Najas minor All., Riccia fluitans L. i Utricularia vulgaris L., i vrste indikatori eutrofizacije Lemna gibba L., Ranunculus circinatus Sibth. i Azolla filiculoides Lam. Analizom nemetrijskog klasterovanja istorijskih podataka za akvatičnu i semiakvatičnu vegetaciju je izdvojeno 48 vegetacijskih grupa (VG) za područje Srbije: VG1 Lemna minor - Lemna gibba, VG2 Lemna minor - Lemna trisulca, VG3 Lemna minor - Riccia fluitans, VG4 Lemna minor - Ricciocarpus natans, VG5 Lemna minor - Utricularia vulgaris, VG6 Lemna minor - Azolla filiculoides, VG7 Salvinia natans - Spirodela polyrhiza, VG8 Wolffia arrhiza, VG9 Trapa natans, VG10 Ceratophyllum demersum subsp. demersum, VG11 Potamogeton crispus, VG12 Potamogeton pectinatus, VG13 Potamogeton obtusifolius, VG14 Potamogeton nodosus, VG15 Nymphaea alba, VG16 Nuphar lutea, VG17 Nymphoides peltata, VG18 Hydrocharis morsus-ranae, VG19 Najas marina, VG20 Vallisneria spiralis, VG21 Elodea canadensis, VG22 Elodea nuttallii, VG23 Ranunculus aquatilis, VG24 Utricularia vulgaris, VG25 Nitella opaca, 7 VG26 Phragmites australis, VG27 Beckmannia eruciformis subsp. eruciformis, VG28 Glyceria fluitans, VG29 Agrostis stolonifera- Rorippa kerneri, VG30 Acorus calamus - Glyceria maxima, VG31 Glyceria maxima, VG32 Glyceria plicata, VG33 Glyceria fluitans - Sparganium erectum subsp. microcarpum, VG34 Equisetum fluviatile, VG35 Scirpus maritimus subsp. maritimus, VG36 Sparganium erectum subsp. erectum, VG37 Eleocharis palustris subsp. palustris, VG38 Chenopodium botrys, VG39 Phalaris arundinacea subsp. arundinacea, VG40 Carex elata subsp. elata, VG41 Carex acuta, VG42 Carex riparia, VG43 Carex vesicaria - Carex rostrata, VG44 Carex paniculata subsp. paniculata, VG45 Carex acutiformis, VG46 Eleocharis acicularis, VG47 Cyperus michelianus subsp. michelianus - Filaginella uliginosa subsp. uliginosa i VG48 Oenanthe aquatica - Rorippa amphibia. Za izdvojene vegetacijske grupe je prikazan odnos sa konkretnim sintaksonomskim jedinicama u skladu sa važećim Kodeksom fitocenološke nomenklature. Nemetrijskim klasterovanjem LEAFPACS terenskih podataka, izdvojeno je 14 LEAFPACS vegetacijskih grupa (LVG) za područje Srbije, među kojima većina ima svoje ekvivalnente u VG klasifikaciji, osim: LVG8 Vallisneria spiralis – Potamogeton perfoliatus, LVG10 Polygonum amphibium i LVG11 Paspalum paspaloides. Ove LVG se mogu smatrati novim vegetacijskim jedinicama za istraživano područje. Fizičko-hemijski parametri kvaliteta staništa su objasnili 20-52 % varijabilnosti vegetacijskih podataka, u zavisnosti od analiziranog seta podataka. Kao najsignifikantniji fakori su se izdvojili saturacija i masena koncentracija rastvorenog kiseonika, zatim biološka potrošnja kiseonika, ukupni organski ugljenik, elektroprovodljivost i ukupna i karbonatna alkalnost. Brojnost, diverzitet vrsta, ukupno prisustvo i maksimalna dubina prostiranja makrofita su generalno ispoljili slabu do umerenu pozitivnu korelaciju sa fizičko-hemijskim pokazateljima trofičnosti vode, uključujući i LIMNIS indeks. Hidromorfološki parametri kvaliteta staništa su objasnili 13-29 % varijabilnosti vegetacijskih podataka, među kojima su najznačajniji: krakteristike i tip podloge priobalne zone, zastupljenost posebnih mikrostanišnih karakteristika u litoralu, hidrološki režim, režim sedimenta, ukupni LHMS skor, varijabilnost dubine litorala, i prirodnost i izmenjenost obale. 8

The European Water Framework Directive (WFD) provides an opportunity to plan and deliver a better water environment, focusing on ecology. Aquatic macrophytes are considered one of the most reliable biological parameters for ecological status assessment under the WFD. These subjects were analysed at the wider European scale using LEAFPACS (Lake Assessment Methods, Macrophyte and Phytobenthos) method. LEAFPACS uses a suite of metrics for various pressures, including the LMNI index (Lake Macrophyte Nutrient Index). The LMNI index is based on Ellenberg Nutrient -N indicator values and has shown high applicability in lake eutrophication assessment. The aim of this study was to create a numerical classification of aquatic and semiaquatic vegetation and to describe a vegetation classification for lakes in Serbia based on LEAFPACS method. LEAFPASC sample quadrats, physic-chemical and hydromorphological parameters were collected during the summer months of 2009, 2010 and 2011 at 31 lakes in Serbia. Aquatic and semiaquatic vegetation was described for 26 lakes. A total of 97 species were identified, of which the most frequent were: Myriophyllum spicatum L., Phragmites australis (Cav.) Trin. ex Steud., Typha angustifolia L., Ceratophyllum demersum L. subsp demersum, Najas marina L. and Potamogeton nodosus Poir. According to physico-chemical parameters, lakes could be classified as high alkalinity lakes with moderate pH. TurboVeg database for aquatic and semiaquatic vegetation was created, compiling 1720 relevés, collected over the decades (1940-2010), and published by 24 authors in 38 papers, monographs, MSc and PhD theses. Most relevés are of Classes: Phragmitetea communis R. Tx. et Prsg. 1942, Potametea R. Tx. et Preising 1942 and Lemnetea minoris W. Koch et R. Tx. 1955; while most frequent Association are: Scirpo- Phragmitetum W. Koch 1926, Salvinio-Spirodeletum polyrrhizae Slavnić 1956 and Myriophyllo-Potametum Soo 1934. TWINSPAN analysis (Two-Way INdicator SPecies ANalysis) revealed two main lake vegetation types (TWI and TWII). TWII is characterized by typically species-rich, 10 eutrophic sites with Ceratophyllum demersum L. subsp. demersum dominant, followed by Hydrocharis morsus-ranae L., Lemna minor L., Salvinia natans (L.) All. as constants, while TWI comprises species-poor, meso-eutrophic sites with Myriophyllum spicatum L. constant. These two main lake vegetation types are further divided into seven site groups (TW1-6). Instead of predicting the vegetation lake groups using predefined physico-chemical categories, the reverse approach has been applied. BOD (Biological Oxygen Demand) and COD (Chemical Oxygen Demand) values (as proxies of trophic status) verified the TWINSPAN-derived classification based on lake vegetation. The nutrient indices (MSI) for 46 lake hydrophytes in Serbia were calculated. A Macrophyte Nutrient Index (LIMNIS) was developed for Serbian lakes. The LIMNIS strongly correlated with the existing Lake Typology. According to CCA analysis and MSI values, species Najas minor All, Riccia fluitans L. and Utricularia vulgaris L. could be selected as sensitive to eutrophication, while Lemna gibba L., Ranunculus circinatus Sibth. and Azolla filiculoides Lam. could be charaterised as species tolerant to eutrophication. The non-metric clustering of relevés from the phitocenological database revealed 48 vegetation groups (VG): VG1 Lemna minor - Lemna gibba, VG2 Lemna minor - Lemna trisulca, VG3 Lemna minor - Riccia fluitans, VG4 Lemna minor - Ricciocarpus natans, VG5 Lemna minor - Utricularia vulgaris, VG6 Lemna minor - Azolla filiculoides, VG7 Salvinia natans - Spirodela polyrhiza, VG8 Wolffia arrhiza, VG9 Trapa natans, VG10 Ceratophyllum demersum subsp. demersum, VG11 Potamogeton crispus, VG12 Potamogeton pectinatus, VG13 Potamogeton obtusifolius, VG14 Potamogeton nodosus, VG15 Nymphaea alba, VG16 Nuphar lutea, VG17 Nymphoides peltata, VG18 Hydrocharis morsus-ranae, VG19 Najas marina, VG20 Vallisneria spiralis, VG21 Elodea canadensis, VG22 Elodea nuttallii, VG23 Ranunculus aquatilis, VG24 Utricularia vulgaris, VG25 Nitella opaca, VG26 Phragmites australis, VG27 Beckmannia eruciformis subsp. eruciformis, VG28 Glyceria fluitans, VG29 Agrostis stolonifera- Rorippa kerneri, VG30 Acorus calamus - Glyceria maxima, VG31 Glyceria maxima, VG32 Glyceria plicata, VG33 Glyceria fluitans - Sparganium erectum subsp. microcarpum, VG34 Equisetum fluviatile, VG35 Scirpus maritimus subsp. maritimus, VG36 Sparganium erectum subsp. erectum, VG37 Eleocharis palustris subsp. palustris, 11 VG38 Chenopodium botrys, VG39 Phalaris arundinacea subsp. arundinacea, VG40 Carex elata subsp. elata, VG41 Carex acuta, VG42 Carex riparia, VG43 Carex vesicaria - Carex rostrata, VG44 Carex paniculata subsp. paniculata, VG45 Carex acutiformis, VG46 Eleocharis acicularis, VG47 Cyperus michelianus subsp. michelianus - Filaginella uliginosa subsp. uliginosa and VG48 Oenanthe aquatica - Rorippa amphibia. The nomenclature of associations for vegetation groups was revised according to the International Code of Phytosociological Nomenclature. On the other hand, non-metric clustering of LEAFPACS data revealed 14 LEAFPACS vegetation groups (LVG). In comparison to VG list, three LVG groups could be considered as new vegetation units for the area studied: LVG8 Vallisneria spiralis – Potamogeton perfoliatus, LVG10 Polygonum amphibium and LVG11 Paspalum paspaloides. After accounting for effects of hydromorphology, physico-chemical variables explained 20-52 % of the total variance macrophytes assemblage. The most significant variables were oxygen saturation, dissolved oxygen, biological oxygen demand, total organic carbon, electroconductivity and alkalinity. Species richness, species diversity and extending macrophytes lakewards were positivly correlated with physico-chemical indicators of eutrophication. Hydromorphological variables explained 13-29 % of total variance. The pCCA analysis highlighted importance of extent of natural land cover types in riparian zone, extent of littoral habitat features, hydrological and sediment regime, LHMS score, hypsographic variation, shore zone modification and shore intensive use for macrophyte assemblages.

Ishrana šakala (Canis aureus L. 1758) na području Srbije

Diet of the golden jackal (Canis aureus L. 1758) in Serbia

Zlatni šakal (Canis aureus L. 1758) je široko rasprostranjena vrsta iz porodice pasa. Spada u kanide srednje veličine tela sa izraženom socijalnom organizacijom. Centrom rasprostranjenja u evropskom delu areala se smatra Balkansko poluostrvo. Tokom novije istorije, areal šakala je u Evropi bio vrlo dinamičan. Prva polovina XX veka bila je u znaku neprestanog i veoma snažnog opadanja brojnosti populacija, kao i smanjivanja areala. Uzroci tako brzog nestajanja sa velikih prostranstava leže u brojnim akcijama trovanja (koje su naročito bile intenzivne u periodu nakon završetka II svetskog rata), kao i u prekomernom lovu i narušavanju staništa. Tokom poslednje dve decenije XX veka se povećava brojnost šakala koji šire svoj areal i rekolonizuju svoja prirodna staništa. Pored rekolonizacije, šakal se širi i na nove prostore koje istorijski nije naseljavao. Danas se vagrantne jedinke mogu naći i u pojedinim zamljama zapadne i severne Evrope. Trend širenja je zabeležen i u Srbiji gde je vrsta do kraja sedamdesetih godina prošlog veka praktično bila na rubu opstanka. Od osamdesetih godina, populacija počinje da se oporavlja i širi iz tri područja sa kojih nikad nije nestala: Srema, okoline Negotina i Bele Palanke. Brzina širenja populacija i uvećavanje areala, odnosno proces rekolonizacije je tako snažan da se može označiti kao ekspanzija. Danas se šakal može naći na preko 2/3 teritorije Srbije. Šakal je u Srbiji lovna vrsta i posmatrano prema odstrelu, najveće brojnosti se nalaze u području Negotinske Krajine, Pomoravlja, Donjeg Podunavlja i Srema. Sveobuhvatna istraživanja ekologije šakala u Srbiji su započeta 2003. godine na Biološkom fakultetu Univerziteta u Beogradu. Posebna pažnja je usmerena na istraživanja trofičke ekologije. Sastav, način i strategija ishrane su neki od ključnih faktora koji mogu objasniti rapidno uvećanje brojnosti i širenja populacija. Priroda ishrane je izučavana na osnovu analize želudačnog sadražaja legalno odstreljenih jedinki i jedinki koje su stradale u saobraćaju. U jedanaestogodišnjem periodu (2004-2014. godine) prikupljen je 761 želudac (354 ženki i 406 mužjaka), dok je analiza ishrane bazirana na 634 želuca koji su imali sadržaj. Uzorci su sakupljeni sa šireg područja rasprostranjenja šakala, pri čemu većina uzoraka potiče sa šest ključnih lokaliteta: Surčin, Smederevo, Svilajnac, Velika Plana, Veliko Gradište i Negotin. Ishrana šakala je analizirana na nivou cele Srbije kao i po lokalitetima. Uočene su i razlike u ishrani po sezonama, kao i pojedine sličnosti među njima. Komparirana je i ishrana između uzrasnih kategorija, odnosno adultnih i juvenilnih šakala. Ustanovljen je i značajan ekonomski benefit na lokalnom nivou od ekosistemskih servisa koju populacija šakala omogućava u Srbiji. Analiza ishrane šakala na području Srbije je pokazala da oni koriste široki spektar izvora hrane. Zabeleženo je ukupno 14 kategorija hrane: domaći papkari, živina, sitni sisari, divlja svinja, srna, zec, ptice, biljni materijal, ostale (divlje) karnivore, psi i mačke, vodozemci i gmizavci, nejestivi materijal, beskičmenjaci i riba. Kategorije domaći papkari i živina su najvećim delom bile zastupljene u vidu klaničnog otpada. Divlja svinja, srna i zec su uglavnom bili predstavljeni ostacima nakon obrade odstreljene životinje. Psi i mačke su uglavnom bili zastupljeni kao lešina poreklom od stradalih životinja. Rezultati ovog istraživanja ukazuju da su šakali vrlo prilagodljivi stanišnim uslovima i da koriste lako dostupne izvore hrane. U tom smislu, dominantno su zastupljeni antropogeni izvori hrane. Generalni obrazac ishrane šakala je prisutan na svim istraživanim područjima i u okviru šireg areala šakala. Po pitanju ishrane šakal ispoljava oportunističko ponašanje pri čemu često ne lovi već pronalazi hranu. Na području Srbije se dominantno hrane klaničnim ostacima domaćih papkara, naročito svinja. Ovaj tip hrane se često može pronaći na mnogobrojnim divljim deponijama širom Srbije. Klanični otpad je posebno zastupljen u ishrani šakala tokom zimskog perioda, kada vlada oskudica prirodne hrane. Klanični otpad ostaje svež duže vremena usled niskih temperatura, što omogućava njegovu dugotrajniju dostupnost brojnim životinjama, pa i šakalima. Sličan obrazac ishrane se primećuje i tokom proleća. Kao plen su u najvećoj meri zastupljeni sitni sisari. Ovu kategoriju čine prevashodno glodari. Češće su pronalažene voluharice nego miševi jer se sporije kreću pa predstavljaju lakši plen. Razlike u ishrani tokom sezona ukazuju na visok nivo plastičnosti ove vrste. Sitni sisari su glavni hranidbeni resurs šakalima tokom letnjeg perioda. Tokom iste sezone značajnog udela u ishrani ima i biljna hrana, pre svega trava i voće, koja lokalno predstavlja i glavni izvor hrane. Tokom jesenjeg perioda u pogledu procenta konzumirane biomase, klanični otpad domaćih papkara postaje najzastupljeniji dok su po učestalosti najčešće bili registrovani sitni sisari. Gajene vrste divljači (srna, divlja svinja i zec) su zastupljene u malim količinama u ishrani šakala. Uglavnom su bile lokalno zastupljene u okviru područja sa visokim intenzitetom lova a gde se nepropisno odlažu ostaci nakon obrade odstreljenih jedinki. Porast brojnosti populacija šakala se u Srbiji nije negativno odrazio na populacije gajenih vrsta divljači. Ove tri kategorije hrane nisu zabeležene u ishrani štenaca. Ishrana štenaca se nije bitnije razlikovala od ishrane adultnih jedinki, izuzev u količini konzumirane hrane. Dominirali su sitni sisari, a značajan udeo imali su biljna hrana i klanični otpad. Na osnovu rezultata ovog istraživanja, može se zaključiti da šakal u Srbiji češće pronalazi hranu nego što lovi plen. Obzirom na način ishrane i visok lovni pritisak, indirektno se može zaključiti da šakali na području Srbije u lov idu sami ili u paru i da se ne udružuju u veće grupe radi savladavanja krupnijeg plena. Šakali su u mnogim delovima Srbije vršni predatori usled dugogodišnjih akcija istrebljivanja vukova. Pored uloge "top" predatora u ekosistemima, značajan je i za uklanjanje animalnog otpada jer je gilda lešinara danas značajno osiromašena. Na godišnjem nivou ekosistemski servisi uklanjanja animalnog otpada su procenjeni na 66,8 miliona dinara (oko 557000 evra) što predstavlja značajnu uštedu u ekonomskom smislu za Srbiju. Mogao bi se izvesti zaključak da je u Srbiji danas veća korist od prisutnosti populacije šakala nego što su to gubici u pogledu gajene divljači i domaćih životinja.

Golden jackal (Canis aureus L. 1758) is a widespread species of the dog family. It is a medium sized canid with a prominent social organization. Balkan Peninsula is considered the center of its distribution in the European part of the range. During recent history, jackal distribution in Europe has been very dynamic. The first half of the twentieth century was marked by constant and very strong decline in population number, as well as range reduction. The causes of the very rapid disappearance from vast areas are large poisoning activities (which were particularly intense in the period after the end of World War II), as well as over-hunting and habitat disruption. Jackal population number was increasing during the last two decades of the twentieth century, and jackals expanded their range and recolonized indigenous habitats. Moreover, jackals expanded into new areas that were not inhabited before by this species. Today, vagrant specimens can be found in some countries in western and northern Europe. The spreading of jackals was also recorded in Serbia where they were almost on the verge of extinction by the end of the 1970's. Since the 1980's, the population begins to recover and expand from three areas within which they have never disappeared: Srem region, Negotin area, and Bela Palanka. Rapid spread of populations and range increase, in fact the process of recolonization was so powerful that it could be designated as expansion. Today jackals are present on more than 2/3 of the territory of Serbia. Jackal is a hunting species in Serbia and according to hunting bag data, the largest populations are in the area of Negotinska Krajina, along Morava river, the Lower Danube, and Srem region. Extensive research of jackal ecology in Serbia started in 2003 at the Faculty of Biology, University of Belgrade. Focus of the research was on trophic ecology, since the diet composition and strategy of feeding are one of the key factors for the ability for rapid increase in number and spread of populations. Diet composition is based on the stomach content analysis of legally hunted jackal specimens as well as of road kills. In the eleven-year period (2004-2014) 761 stomachs were collected (354 females and 406 males), while the analysis was based on 634 stomachs with stomach contents. Samples were collected from the wider distribution of jackals, but the majority of the samples originated from six main localities: Surčin, Smederevo, Svilajnac, Velika Plana, Veliko Gradiste, and Negotin. The diet was analyzed for the whole territory of Serbia and for each locality separately. Differences and similarities in the diet of jackals according to seasons are registered. The diet was compared according to age categories, i.e. adult and juvenile jackals. Significant economic benefit from jackal ecosystem services for local communities in Serbia is specified. Diet analysis of jackals in Serbia showed that they use a wide range of food sources. Total of 14 categories were recorded: domestic ungulates, poultry, small mammals, wild boar, roe deer, brown hare, birds, plant material, other (wild) carnivores, dogs and cats, amphibians and reptiles, inedible material, invertebrates, and fish. Domestic ungulates and poultry were mostly represented in the form of slaughterhouse waste. Categories wild boar, roe deer, and brown hare were mainly represented by the remains after processing of hunted animals. The category dogs and cats was mainly represented with carcasses i.e. road kills. The results of this research show that the jackals are highly adaptable and that they use readily available food sources. Anthropogenic food sources are dominant in its diet. The general pattern of jackal’s diet is present at all six localities, and within the broader range of its distribution. They exert opportunistic foraging behaviour. Jackals in Serbia are predominantly feeding on slaughterhouse waste of domestic ungulates, especially pigs. This type of food can often be found at numerous illegal dumps across Serbia. Slaughterhouse waste is particularly represented during winter period in the diet of jackals, when natural food sources are scarce. Slaughter waste stays fresh for a longer period of time due to low temperatures, which allow long-term availability of this food source for many animals including jackals. A similar pattern of feeding is observed also during spring. Jackals' main prey is mostly represented with small mammals. This category consists mainly of rodents. Slow moving vole species were more frequently found than mice species, since they are easier to catch. Dietary differences between seasons indicate a high degree of plasticity of this species. Small mammals are the main food resource for jackals during summer. During the same period, plant food is consumed significantly (primarily grasses and fruit) which locally represent the main source of food. During autumn, slaughter waste of domestic ungulates is dominant in terms of biomass consumed while small mammals are the most common ones regarding frequency of occurrence. Mammal game species (roe deer, wild boar, and hare) are represented in small amounts in jackal’s diet. These categories were mainly represented locally within areas with a high intensity of hunting and where the remains after processing of hunted animals were unlawfully deposited. The increase in number of jackal population in Serbia did not adversely affect the populations of mammal game species. Moreover, these three categories of food are not recorded in the diet of juvenile jackals. There were no statistically significant differences in diet composition between juveniles and adults although there was a difference in amount of food ingested. Small mammals dominated the cub`s diet while plant matter and domestic ungulates were also important. Based on the results of this study, it can be concluded that jackals in Serbia use more often foraging instead of hunting strategy. Considering the diet and high hunting pressure, indirectly, it can be concluded that the jackals in Serbia are likely to hunt alone or in pairs instead of associating in large groups to overcome the larger prey. Jackals became in many parts of Serbia top predators due to long- standing action of extermination of wolves. In addition to the role of top predators in ecosystems, jackals' role in removal of animal waste is significant even more now when the guild of obligate scavengers (vultures) is depleted. Ecosystem services for removing animal waste on annual level are estimated at 66.8 million Serbian Dinars (about 557000 Euros), which represents a significant saving in economic terms for Serbia. It could also be inferred that in Serbia today, greater benefit comes from the presence of jackal population, than the losses are in respect of game and domestic animals.

Analiza mutacionog statusa gena p53 i metilacionog statusa promotora gena p14 i p16 u liposarkomima

Analysis of the p53 gene mutation status and methylation status of the promoters of p14 and p16 genes in liposarcoma

Liposarkomi, tumori mezenhimalnog porekla, predstavljaju najučestaliji histološki tip sarkoma mekih tkiva. Grupu karakteriše velika raznolikost kako u pogledu patohistološke organizacije tumora tako i biologije ponašanja. Uobičajena podela liposarkoma obuhvata sledeća tri podtipa: a.) dobro diferentovani / dediferentovani, b.) miksoidni / okrugloćelijski i v.) pleomorfni. S obzirom na značajne kliničko-patološke razlike između tri podtipa liposarkoma, verovatno je da su različiti mehanizmi uključeni u njihov nastanak i razvoj. Na osnovu studija koje su se fokusirale na istraživanje genetike sarkoma mekih tkiva i kostiju, može se zaključiti da signalni putevi p53-p14 i Rb-p16 igraju određenu ulogu u svim tipovima sarkoma. Razjašnjavanje uloge ovih signalnih puteva u patogenezi liposarkoma, može da bude doprinos kako dijagnostici i prognostici liposarkoma, tako i definisanju potencijalnih terapeutskih ciljeva. Studija je obuhvatila ispitivanje mutacionog statusa gena r53 i metilacionog statusa gena r14 i r16, na 33 uzorka liposarkoma, sva tri podtipa. U cilju sveobuhvatnije analize ispitivana je i ekspresija proteina r16, ciklina D1 i faktora proliferacije Ki-67, primenom imunohistohemijskog bojenja. Rezultati eksperimenta su pokazali da promene u signalnim putevima r53-r14 i r16-Rb mogu imati značaja u patogenezi sva tri podtipa liposarkoma. Razlike se ogledaju u kvalitetu i kvantitetu promena.

Liposarcoma, tumors of mesenchymal origin, represent the most frequent type of soft tissue sarcomas. The group is characterized by a great diversity regarding pathohistology and biological behavior. The group can be divided into three different subtypes: a.) well differentiated / dedifferentiated, b.) myxoid / round cell and c.) pleomorphic. Given the significant clinical and pathological differences between the three subtypes of liposarcoma, it is likely that different mechanisms are involved in their formation and development. Based on the studies that have been focused on genetic research of sarcoma of soft tissues and bones, conclusion can be drawn that the p53-p14 and Rb-p16 signaling pathways play a certain role in sarcomagenesis. Clarification of the role of these signaling pathways in the pathogenesis of liposarcoma, could be a contribution towards better diagnostic and prognostic criteria and the identification of potential therapeutic targets. The study included examination of the p53 gene mutation status and assessment of the p14/p16 gene methylation status in 33 liposarcoma samples of all three subtypes. For the purpose of more comprehensive analysis, protein expression of the p16, cyclin D1 and Ki-67 has been evaluated by immunohistochemical staining. The results of the study have showed that the alterations of the targeted signal pathways are important in the pathogenesis of all three subtypes of liposarcoma. The differences are reflected in the quality and quantity of the detected alterations.

In vitro studija nesitnoćelijskog karcinoma pluća: efekat jonizujućeg zračenja i inhibitora tirozin kinazne aktivnosti receptora za epidermalni faktor rasta

In vitro study of non-small cell lung carcinoma: effects of ionizing radiation and epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor

Zračenje indukuje povišenu ekspresiju receptora za epidermalni faktor rasta (EGFR). Polazeći od značaja EGFR signalnog puta u procesu tumorogeneze, ovaj receptor je postao važan ciljani molekul u terapiji tumora. Utvrđeno je da je on pojačano eksprimiran i u nesitnoćelijskom karcinomu pluća i da ima važnu ulogu u patogenezi i prognozi terapijskog ishoda ove bolesti. Erlotinib, inhibitor tirozin kinazne funkcije EGFR je jedan od prvih agenasa koji su uvedeni u ciljanu terapiju nesitnoćelijskog karcinoma pluća. S obzirom na navedeno, istraživanja sinergističkog delovanja erlotiniba i zračenja u cilju poboljšanja antitumorskog efekta ovih agenasa su veoma aktuelna. Mehanizmi koji se nalaze u osnovi kombinovane terapije i njenog uticaja na nastanak različitih tipova ćelijske smrti su još uvek nedovoljno istraženi. U ovoj disertaciji je in vitro ispitivan antitumorski efekat pojedinačnih i kombinovanih tretmana γ-zračenjem i erlotinibom na CRL-5876 ćelije nesitnoćelijskog karcinoma pluća čoveka. Efikasnost pojedinačnih i kombinovanih tremana na ćelijsko klonogeno preživljavanje, vijabilnost, proliferaciju, kao i na kinetiku nastanka i nestanka dvolančanih prekida na DNK i distribuciju ćelija po fazama ćelijskog ciklusa, praćena je u funkciji vremena. U okviru ove studije analizirani su i efekti navedenih tretmana na promenu morfologije i ultrastrukture ćelija. U cilju utvrđivanja tipova ćelijske smrti do kojih ovi agensi dovode i njihovog međusobnog odnosa, uveden je inhibitor autofagije, hlorokin. Na osnovu radiobioloških parametara utvrđeno je da CRL-5876 ćelije adenokarcinoma pluća čoveka pripadaju grupi radiorezistentnih tumorskih ćelija. Promene radiobioloških parametara nakon kombinovanog tretmana ukazuju da erlotinib značajno povećava radioosetljivost CRL-5876 ćelija. Ove promene su praćene i na nivou ćelijskog ciklusa. Zračenje izaziva G2/M blok, dok erlotinib dovodi do smanjenja S faze. Kombinovani tretmani izazivaju najveće promene posle 48 h, kada je smanjenje S faze praćeno povećanjem broja ćelija u G1 fazi. Predtretman erlotinibom dodatno povećava broj γ-H2AX fokusa indukovanih zračenjem. Uticaj erlotiniba se ogleda u povećanju broja rezidualnih fokusa posle 24 h, što ukazuje na kašnjenje u reparaciji DNK i u vezi je sa smanjenim klonogenim kapacitetom ćelija. Utvrđeno je da zračenje indukuje pojavu mitotske katastrofe CRL-5876 ćelija, a takođe dovodi i do autofagije koja ovde ima citoprotektivnu ulogu. Tretman zračenjem je u najvećem stepenu indukovao senescenciju ovih ćelija. Efekti erlotiniba se prvenstveno ostvaruju putem indukcije apoptoze. Predtretman erlotinibom kod ozračenih CRL-5876 ćelija dovodi do daljeg porasta broja ćelija u apoptozi. Pokazano je da hlorokin povećava citotoksičnost izazvanu erlotinibom i zračenjem kod CRL-5876 ćelija, ali da se efekti samog hlorokina gube posle sedam dana. Takođe je utvrđeno da u kombinovanim tretmanima dolazi do povećanja apoptoze i smanjenja senescencije CRL-5876 ćelija. Rezultati dobijeni na modelu adenokarcinoma pluća čoveka ukazuju na značajan radiosenzitizirajući efekat erlotiniba. Takođe, ovi rezultati sugerišu da bi primena inhibitora autofagije u kombinaciji sa navedenim tretmanima mogla da ima dodatni antitumorski efekat u terapiji NSCLC.

It is known that radiation therapy increases EGFR expression in cancer cells, thus promoting radioresistence. Considering the importance of EGFR signaling pathway in tumorigenesis, this receptor has become an important target molecule for the treatment of tumors. It has been shown that EGFR is frequently overexpressed in non-small cell lung cancer (NSCLC) and plays an important role in the pathogenesis and the prediction of the therapeutic outcome of the disease. Erlotinib inhibits the tyrosine kinase activity of the EGFR and is used in molecular targeted therapy of NSCLC. Given the above findings, combining radiation with erlotinib in order to boost antitumor effects of these agents represents an actual field of research. However, the mechanisms underlying combined therapy and its impact on the induction of different modes of cell death have not been fully explained. This theasis examines the antitumor effect of single and combined treatments with γ-rays and erlotinib on CRL-5876 human lung adenocarcinoma cells in vitro. The efficiency of single and combined treatments on clonogenic survival, cell viability, proliferation, kinetics of formation and disappearance of DNA double strand breaks and cell cycle distribution is monitored as a function of time. In this study the effects of these treatments on cell morphology and ultrastructure are analyzed. In order to determine the modes of cell death caused by these agents and to reveal their mutual relations, the autophagy inhibitor chloroquine is introduced in the analysis. Based on the radiobiological parameters it is found that CRL-5876 human lung adenocarcinoma cells belong to the radiorezistant group of cells. Changes in radiobiological parameters after combined treatments show that erlotinib significantly increases radiosensitivity of CRL-5876 cells. Moreover, changes in cell cycle distribution after treatments are observed. It is revealed that radiation causes G2/M arrest while erlotinib induces a decrease in S phase. The combined treatments lead to a major change after 48 h, when the reduction in S phase is followed by an increase in the number of cells in G1 phase. Pretreatment with erlotinib further enhances the number of radiation induced γ- H2AX foci. The impact of erlotinib on the kinetics of the disappearance of DNA DSB is reflected in the increase of residual foci after 24 h. This indicates a delay in DNA repair which is related to the reduced clonogenic capacity of cells. It is found that irradiation induces mitotic catastrophe in CRL-5876 cells, but also provokes autophagy that is shown to have a citoprotective role. Radiation treatment induces senescence of the cells at highest degree. Pretreatment with erlotinib in irradiated CRL-5876 cells leads to a further increase in the number of cells in apoptosis. In this theasis, it is shown that chloroquine increases cytotoxicity induced by radiation and erlotinib in CRL-5876 cells, but the effects of chloroquine, as single agent, are lost after seven days. It is also found that the combined treatments increase apoptosis and decrease senescence in CRL-5876 cells. The results obtained on human lung adenocarcinoma model indicate significant radiosensitizing effect of erlotinib. Also, these results suggest that the application of an autophagy inhibitor in combination with the above treatments may have an additional antitumor effect on NSCLC cells.

Značaj molekularne detekcije bakterija u proceni efikasnosti terapije Rajterovog sindroma

Significance of molecular detection of bacteria in assessing effectiveness of treatment of Reiter's syndrome

Nalaz bakterija u sinoviji i sinovijskoj tečnosti inflamiranog zgloba je pobudilo nadu da bi antibiotska terapija mogla biti terapija izbora kod bolesnika sa Rajterovim sindromom. Cilj ove studije je bio da se evaluira efekat sinovijktomije i antibiotske terapije na klinički tok i ishod artritisa kod bolesnika sa dijagnostikovanim urogenitalnim oblikom Rajterovog sindroma. Posle sinovijektomije je kod 20 bolesnika primenjena antibiotska terapija azitromicinom (prva grupa), a kod 22 bolesnika kombinovana antibiotska terapija ciprofloksacinom, tetraciklinom i roksitromicinom (druga grupa). Prisustvo bakterija (Chlamydia trachomatis, Chlamydia pneumoniae, Mycoplasma hominis i Ureaplasma urealyticum) u uzorcima sinovije, sinovijske tečnosti i mononuklearnih ćelija periferne krvi je detektovano testom lančane reakcije polimerizacije (PCR). Vijabilnost C. trachomatis, najčešće nađene bakterije u drugoj grupi bolesnika, je u pomenutim uzorcima određivana RT- i „real-time” PCR testom. Pre uvođenja terapije, DNK jedne ili više ispitivanih bakterija je detektovana kod svih bolesnika u najmanje jednom od ispitivanih uzoraka, izuzev kod jedne bolesnice lečene azitromicinom. Posle terapije, 8/16 bolesnika kod kojih je primenjena monoterapija azitromicinom i 9/18 bolesnika lečenih kombinovanom antibiotskom terapijom su imali negativan PCR nalaz u mononuklearnim ćelijama periferne krvi, dok su vijabilne bakterije C. trachomatis nađene u mononuklearnim ćelijama periferne krvi bolesnika kod kojih nije postignuta klinička remisija. Hirurška metoda sinovijektomije zajedno sa antibiotskom terapijom dovodi do postizanja kliničke remisije kod većine bolesnika. Na molekularnom nivou, remisija je povezana s negativnim PCR nalazom i/ili smanjenom ekspresijom hlamidijskih gena u mononuklearnim ćelijama periferne krvi.

The finding of bacteria in the synovial fluid and tissue of the inflammated joint implied the possibility that the antibiotic treatment would be the therapy of choice for patients with Reiter´s syndrome. The aim of this study was to evaluate effects of synovectomy followed by an antibiotic therapy on the clinical course and outcome of arthritis in patients with the urogenital form of Reiter's syndrome. After synovectomy, the group of 20 patients received azithromycin (the first group), and another group of 22 patients underwent an antibiotic combination therapy with ciprofloxacin, tetracycline and roxithromicin (the second group). The synovial tissue and fluid obtained during the synovectomy and the peripheral blood mononuclear cells collected before and after the therapy were assessed by polymerase chain reaction (PCR) and Real-time PCR for (1) the presence of Chlamydia trachomatis, Mycoplasma hominis, Ureaplasma urealyticum and Chlamydia pneumoniae and (2) the viability of Chlamydia trachomatis, the most frequently found bacteria in the second group of patients. Before the introduction of the therapy, the bacterial DNA was identified in at least one of investigated samples from all the patients, except for one in the azithromycin group. After the treatment, 8/16 patients receiving the azithromycin monotherapy, as well as 9/18 patients treated with an antibiotic combination therapy became PCR-negative for bacteria in the peripheral blood mononuclear cells. The patients who didn't achieve the clinical remission had viable Chlamydia trachomatis in the the peripheral blood monononuclear cells. The surgical method, synovectomy, in addition to the antibiotic therapy resulted in clinical remission in the majority of patients. At molecular level, the remission was associated with the negative PCR findings and/or decreased expression of chlamidial genes in the mononuclear cells of peripheral blood.

Ekofiziološke adaptacije vrsta Pinus nigra Arn., Aesculus hippocastanum L. i Platanus acerifolia (Ait.) Willd. u urbanim sredinama sa različitim izvorima zagađenja

Ecophysiological adaptations of Pinus nigra Arn., Aesculus hippocastanum L. and Platanus acerifolia (Ait.) Willd. species in urban environments with different sources of pollution

Urbana staništa su pod snažnim antropogenim uticajem i karakteriše ih intenzivno zagađenje vazduha, vode i zemljišta materijama poreklom iz različitih stacionarnih i mobilnih izvora. Specifična vrsta polutanata u ovim sredinama su metali koji se zbog svoje toksičnosti i biološke nerazgradivosti akumuliraju u zemljištu. Istraživanja u okviru ove disertacije su obavljena u urbanim parkovima u Pančevu, Smederevu, Obrenovcu i Beogradu koji su izloženi zagađivanju hemijskim elementima uključujući toksične metale poreklom iz različitih izvora. Obuhvatala su analize biljaka, kao i zemljišta na kojima rastu. Za ekofiziološka istraživanja odabrane su tri drvenaste vrste biljaka koje se dugi niz godina uspešno gaje na urbanim staništima: Pinus nigra Arn., Aesculus hippocastanum L. i Platanus acerifolia (Ait.) Willd. Osnovni cilj doktorske disertacije je bio definisanje faktora limitirajućih za razvoj biljaka, kao i ispitivanje njihovih ekofizioloških karakteristika i adaptivnog odgovora. Posebna pažnja je posvećena problemu zagađivanja metalima i metaloidima, njihovoj mobilnosti i dostupnosti biljkama, kao i njihovom uticaju na fiziološke procese u biljkama (efikasnost fotosinteze i sadržaj fotosintetičkih pigmenata). Ispitivanja fizičko-hemijskih karakteristika zemljišta su pokazala da urbana zemljišta karakteriše visok udeo frakcije peska, nizak sadržaj higroskopne vlage, organskog ugljenika i azota, alkalna reakcija, ali i povoljan odnos C/N za mineralizaciju organske materije i oslobađanje minerala esencijalnih za biljke. Navedeni limitirajući faktori (toksičan sadržaj B, Cr, Ni i Pb izmerenih u zemljištu urbanih parkova) u sinergističkom delovanju sa visokim temperaturama i malom količinom padavina u značajnom delu ispitivane vegetacijske sezone su uticali na funkcionisanje ispitivanih vrsta biljaka na urbanim staništima. Analiza sadržaja hemijskih elemenata u četinama i listovima je pokazala da postoje razlike u sadržaju elemenata između vrsta, ali i da su ispitivane vrste izložene toksičnim koncentracijama B i Sr i istovremenom deficitu esencijalnih elemenata Cu, Mn i Zn. Generalno, kod P. nigra, A. hippocastanum i P. acerifolia postoje razlike u fotosintetičkoj efikasnosti, sadržaju pigmenata i u morfološkim oštećenjima listova. Uprkos navedenom, sve ispitivane vrste, pre svega listopadne A. hippocastanum i P. acerifolia su pokazale visok potencijal za toleranciju stresa zagađivanja toksičnim metalima i metaloidima, što ih čini pogodnim za sadnju u urbanim parkovima i industrijskim zonama, pa kao takve predstavljaju značajan resurs za dalja istraživanja.

Urban habitats are under strong anthropogenic influence and are often characterized by intense air, water and soil pollution originating from various stationary and mobile sources. The specific type of pollutants in these habitats are metals that due to their toxic, persistent and nonbiodegradable properties accumulate in the soil. Research was conducted in urban parks in Pančevo, Smederevo, Obrenovac and Belgrade that are exposed to pollution by chemical elements, including toxic metals originating from various sources. Research included plant and soil analyses. For ecophysiological research, three woody plant species that have been successfully grown in urban areas were selected: Pinus nigra Arn., Aesculus hippocastanum L. i Platanus acerifolia (Ait.) Willd. The central aim and subject of this doctoral dissertation was to define the factors that limit the functioning of plants, and to determine their ecophysiological characteristics and adaptive responses. Special attention was paid to the problem of pollution by toxic metals and metalloids, their mobility and availability to plants, as well as their impact on physiological processes in plants (photosynthesis efficiency and photosynthetic pigment content). Analyses of the physical and chemical properties of the soils showed that urban soils are characterized by high proportion of a sand fraction, a low content of hygroscopic moisture, organic carbon and nitrogen and an alkaline reaction, but also a favorable C/N ratio for mineralization of organic matter and release of essential minerals for plants. The limiting factors (toxic levels of B, Cr, Ni and Pb measured in soils from urban parks) in synergy with high temperatures and low precipitation during a significant part of the vegetation season, influenced the functioning of the examined plant species in urban habitats. Analysis of the chemical element contents in pine needles and leaves revealed species differences, and also that the examined species were exposed to toxic concentrations of B and Sr and, at the same time, deficits of the essential elements, Cu, Mn and Zn. Generally, in P. nigra, A. hippocastanum and P. acerifolia, differences in photosynthetic efficiency, pigment contents and in morphological symptoms of injury were observed. In spite of the above, all the investigated species, first of all A. hippocastanum and P. acerifolia, exhibited a high potential for tolerance to stress pollution by toxic metals and metalloids, which makes them suitable for planting in urban parks and industrial zones. These species represent a significant resource for further research.

Akvatične oligohete (Annelida, Clitellata, Oligochaeta) u različitim tipovima tekućih voda u Srbiji

Aquatic oligochaetes (Annelida, Clitellata, Oligochaeta) in different types of running waters in Serbia.

Proučavanje akvatičnih oligoheta u tekućicama Srbije predstavlja doprinos izradi popisa celokupne faune Oligochaeta Srbije. Istraživanjem je obuhvaćeno deset rečnih slivova koji se prostiru na području južno od Dunava, uključujući i glavni tok Dunava koji protiče kroz Srbiju. Analizom materijala zabeležen je 61 takson iz 9 porodica, pri čemu je do nivoa vrste determinisano 56 taksona. Jedan rod i 11 vrsta konstatovano je po prvi put u tekućim vodama Srbije: Achaeta sp., Bothrioneurum vejdovskyanum, Chaetogaster langi, Cognettia sphagnetorum, Enchytraeus buchholzi, E. christenseni, Henlea ventriculosa, Marionina argentea, Potamothrix danubialis, P. heuscheri, P. moldaviensis i Vejdovskyella intermedia. Većina zabeleženih vrsta su česte i sa kosmopolitskim rasprostranjenjem. Tubificidae i Naididae su najznačajnije porodice u pogledu raznovrsnosti i uočene su u svim slivovima. U neposrednom slivu Dunava zabeležena je najveća raznovrsnost zajednice oligoheta (37 vrsta), zatim slede slivovi Zapadne Morave, Ibra i Kolubare sa po 27, 24 i 23 vrste, dok je najmanja raznovsrnost konstatovana u kanalima beogradskog regiona (10 vrsta). Diverzitet oligohetne faune pokazao je jasan obrazac – manja raznovrsnost uočena je u pritokama, a veća u glavnom toku. Najrasprostranjenija vrsta jeste Limnodrilus hoffmeisteri sa učestalošću pojavljivanja u uzorcima F=0,51, a značajnu zastupljenost ima i Stilodrilus heringianus (F=0,33). Dva roda i deset vrsta konstatovano je samo na po jednom lokalitetu (Acheta sp., Fridericia sp., Chaetogaster diaphanus, Ch. limnaei, Dero dorsalis, Nais simplex, Uncinais uncinata, Vejdovskyella intermedia, Potamothrix heuscheri, Spirosperma ferox, Cognettia sphagnetorum i Rhynchelmis limosella) sa frekvencijom F=0,004. Ekološkom analizom zajednica oligoheta u tekućicama Srbije uočeno je da je najviše zabeleženo potamalnih vrsta, većina je adaptirana finom supstratu – mulj, glina i viii sitan pesak, i većina vrsta su tolerantne na povećano organsko opterećenje (alfa- mezosaprobna i beta-mezosaprobna grupa). Razmatranje faune oligoheta u odnosu na abiotičke tipološke deskriptore (nadmorska visina, geološka podloga, površina sliva i tip dna) pokazalo je pravilnost u distribuciji oligoheta. Najveća raznovrsnost konstatovana je u velikim nizijskim rekama sa dominacijom finog nanosa (vodna tela tip 1), dok je najmanja u veštačkim vodnim telima (vodna tela tip 8). Veza oligohetne faune i tri najznačajnije grupe faktora okruženja u vodenoj sredini (nivo hidromorfoloških izmena, tip podloge i osnovni fizičko-hemijski parametri vode i sedimenta) anlizirana je na materijalu prikupljenom tokom Drugog zajedničkog ispitivanja Dunava (JDS 2) i utvrđeno je da nema značajnog izdvajanja definisanih sektora Dunava na osnovu sastava zajednica oligoheta. Ovakav rezultat ukazuje na veliku heterogenost staništa duž celog toka, kao posledicu hidromorfoloških izmena, izmena vodnog režima i sastava podloge.

The study of aquatic Oligochaeta in freshwaters in Serbia represents a contribution to the development of the entire oligochaetan fauna inventory of Serbia. The investigation included ten river basins that cover the area south of the Danube River, including the stretch of the Danube that flows through Serbia. In total, 61 taxa from nine families were recorded and 56 taxa were identified to the species level. One genus and eleven species were noted for the first time in the running waters of Serbia: Achaeta sp., Bothrioneurum vejdovskyanum, Chaetogaster langi, Cognettia sphagnetorum, Enchytraeus buchholzi, E. christenseni, Henlea ventriculosa, Marionina argentea, Potamothrix danubialis, P. heuscheri, P. moldaviensis, and Vejdovskyella intermedia. The majority of the identified species are frequent and cosmopolitan. In terms of the species richness, the most dominant families were Tubificidae and Naidiae and they were recorded in all investigated river basins. The highest species richness was observed in the Danube catchment area (37 species), followed by the Zapadna Morava, Ibar, and Kolubara basins (27, 24, and 23 species, respectively), while the lowest was recorded in the channels of the Belgrade region (10 species). The composition of the oligochaetan community showed a clear pattern – lower diversity in tributaries, higher diversity in the main flow. The most frequent species in Oligochaeta assemblages was Limnodrilus hoffmeisteri (F=0,51), but Stilodrilus heringianus also showed a significant occurrence (F=0,33). Two genus and ten species were recorded at only one locality each with frequency of F=0,004 (Acheta sp., Fridericia sp., Chaetogaster diaphanus, Ch. limnaei, Dero dorsalis, Nais simplex, Uncinais uncinata, Vejdovskyella intermedia, Potamothrix heuscheri, Spirosperma ferox, Cognettia sphagnetorum and Rhynchelmis limosella). x The ecological analysis of Oligochaeta communities in running waters of Serbia showed that the majority of the recorded species are classified as the potamal species, adapted to the fine substrate – mud, clay, and fine sand, and that most of the identified species are tolerant to a high organic load (alpha-mesosaprobic and beta-mesosaprobic group). Analyses of the oligochaetan fauna in relation to the abiotic typology descriptors (altitude, geological substrates, catchment area, and substrate type) showed regularity in their distribution. The highest diversity was recorded in large lowland rivers with the dominance of the fine sediment (water bodies type 1), while the lowest was in artificial water bodies (type 8). Based on the material collected during the Joint Danube Survey 2 (JDS 2), the relationship between the oligochaetan fauna and the three most important abiotic factors in the aquatic environment (hydromorphological changes, substrate type, and physical- chemical parameters in water and sediment) was analyzed and it was found that there is no significant separation of the defined sectors of the Danube River according to the oligochaetes community composition. This result indicates that there is a great heterogeneity of habitats along the entire water course as a result of hydromorphological changes, changes in water regime, and bottom composition.

Farmakogenetika 6-merkaptopurina i metotreksata u dečjoj akutnoj limfoblastnoj leukemiji

Pharmacogenetics of 6-mercaptopurine and methotrexate in childhood acute lymphoblastic leukemia

Farmakogenomika proučava odnos između genetičkog sklopa individue i njegovog odgovora na lekove i jedan je od stubova personalizovane medicine. Dosadašnji princip lečenja da se standardna doza leka daje svim pacijentima sa istom dijagnozom po unapred utvrđenom protokolu se napušta. Za veliki broj pacijenta ta doza leka često nije efikasna i/ili sigurna za upotrebu. Cilj farmakogenomičkih studija je da identifikuju farmakogenomičke markere, varijacije u genomu koje mogu pouzdano da predvide odgovor na terapiju, što je osnov za individualizaciju terapije. Model sistemi bolesti za analizu farmakogenomičkih markera korišćeni u ovom radu su dečja akutna limfoblastna leukemija (ALL) i reumatoidni artritis (RA). Lečenje ovih bolesti uključuje imunosupresivne i citotoksične lekove 6-merkaptopurin (6-MP), metotreksat (MTX), antibiotik baktrim, antimikotik nistatin, kao i anti-TNF lekove. Genetičke varijacije koje modulišu metaboličke puteve povezane sa ovim lekovima su kandidati za farmakogenomičke markere. Cilj ove studije je da ispita učestalosti genetičkih varijanti u genima TPMT, ITPA, ABCB1, ABCC4, TYMS, MTHFR, SLC19A1, DHFR, TNF i IL-6, kao i da oceni farmakogenomički potencijal ovih varijanti u srpskoj populaciji. Biće ispitana i uloga ovih farmakogenomičkih markera kao faktora rizika za razvoj dečje ALL. Ispitaće se i uticaj terapije održavanja, gde okosnicu terapije čine lekovi 6-MP i MTX, kao i pola i uzrasta dece sa ALL na ekspresiju gena TPMT. Biće funkcionalno okarakterisane varijante u genu TPMT, potencijalni modulatori ekspresije gena TPMT, sa posebnom pažnjom na ulogu VNTR regiona u promotoru gena TPMT. U studiju je bilo uključeno 174 pedijatrijskih ALL pacijenata, 73 RA pacijenata i 104 kontrolnih zdravih ispitanika. Genetičke varijacije u svim gorepomenutim genima su određene metodama baziranim na PCR-u. Uticaj 6-MP tretmana i VNTR regiona na nivo transkripcije gena TPMT je određen funkcionalnim CAT esejima in vitro koristeći K562 ćelijsku liniju. Nivo ekspresije gena TPMT u mononuklearnim ćelijama krvi i kosne srži ALL pacijenata analiziran je real-time PCR metodom. Rezultati populacione studije su pokazali da je učestalost alela u genima TPMT, ABCB1, TYMS, MTHFR, SLC19A1, DHFR, IL-6 i TNF slična kao kod drugih evropskih populacija. Alel c.94A u genu ITPA ima manju učestalost, dok alel rs9516519, nukleotid G, u genu ABCC4 ima veću učestalost u srpskoj populaciji u odnosu na druge evropske populacije. Ovaj podatak može biti važan prilikom procene njihovog farmakogenomičkog potencijala. Kod RA pacijenata, varijacije u genima IL-6 i TNF su se pokazale farmakogenimički relevantne za terapiju anti-TNF lekom. Učestalosti genotipova u genima ITPA, ABCB1, ABCC4, TYMS, MTHFR, SLC19A1 i DHFR koji kodiraju enzime i transportere metaboličkih puteva lekova 6-MP-a i MTX-a su bile slične u grupi zdravih kontrolnih ispitanika i ALL pacijenata. Ovaj rezultat ide u prilog tezi da izučavane varijacije ne učestvuju u etiologiji dečje ALL. Tretman K562 ćelija lekom 6-MP-om smanjuje TPMT transkripciju in vitro i to smanjenje je zavisno od VNTR arhitekture u promotoru ovog gena. VNTR aleli mogu uticati na malo smanjenje (AB4C), intermedijarno smanjenje (A2B3C, A4BC, AB2C, A5BC, A2BC i A3BC) i veliko smanjenje (A6BC, AB5C, A3B2C i A2B2C) transkripcije gena TPMT. Sa povećanjem broja A ponovaka TPMT transkripcija se izraženije smanjuje kod K562 ćelija tretiranim lekom 6-MP-om in vitro. Ekspresija TPMT gena kod dečjih ALL pacijenata je oko 3.3 puta veća u toku terapije održavanja, kada oni dobijaju lekove 6-MP i MTX, nego pre početka hemoterapije. Povećanje nivoa TPMT ekspresije je bilo najizraženije za nosioce VNTR*5a/*5a genotipa, dok je najmanje povećanje TPMT ekspresije zabeleženo kod nosilaca VNTR*7a alela. Veći broj ponovaka tipa A u okviru VNTR regiona u promotoru gena TPMT smanjuje nivo ekspresije gena TPMT u toku terapije održavanja kod dečjih ALL pacijenata. Rezultati ove studije doprinose razumevanju složenog problema personalizacije terapije lekovima kojima se dečji ALL pacijenti leče u toku terapije održavanja. Istaknut je značaj populacione specifičnosti farmakogenomičkih markera. Povećanje ekspresije gena TPMT u toku terapije održavanja kod dečjih ALL pacijenata, ukazuje da bi od velikog značaja bilo razmotriti varijante u genu TPMT na samom početku terapije održavanja kod ALL pacijenata naročito kod nosilaca određena četiri VNTR alela koji doprinose velikom smanjenju transkripcije gena TPMT in vitro. Na osnovu farmakogenomičke analize varijacija u genima TNF i IL-6 kod RA pacijenata, moglo bi se razmotri uvođenje anti-TNF terapije kod pedijatrijskih ALL pacijenata kod kojih se bolest teško klinički kontroliše.

Pharmacogenomics is focused on exploring the relation between the genomic signature of an individual and their drug response. It is the basis for implementation of personalized medicine. The old-fashioned therapeutic paradigm of »one protocol dose fits all patients with the same diagnosis« is getting abandoned. The standard drug dose is often not efficient and/or safe for many of patients. Pharmacogenomic studies identify pharmacogenomic markers, genomic variations that could reliably predict the drug response, which is the basis for therapy individualization. In order to analyze pharmacogenomic markers, childhood acute lymphoblastic leukemia (ALL) and rheumatoid arthritis (RA) are used as disease model systems. ALL and RA therapy protocols include cytotoxic and immunosuppressive drugs 6-mercaptopurine (6-MP) and methotrexate (MTX), antibiotic bactrim and antimycotic nystatin, as well as anti-TNF drugs. Genetic variations that modulate metabolic pathways related to these drugs are candidate pharmacogenomic markers. The aim of this study is to analyze frequencies of genetic variants in TPMT, ITPA, ABCB1, ABCC4, TYMS, MTHFR, SLC19A1, DHFR, TNF and IL-6 genes in Serbian population and to evaluate the pharmacogenomic potential of these variants. Also, the role of these pharmacogenomic markers as risk factors for development of childhood ALL will be assessed. Influence of the maintenance therapy, which includes 6-MP and MTX as most important drugs, as well as the age and gender of patients will be analyzed in regard to TPMT gene expression. Functional assays will be carried out in order to identify potential modifiers of TPMT expression with a special focus on VNTR region in promoter of TPMT gene. In this study, 174 pediatric ALL patients, 73 RA patients and 104 healthy subjects were enrolled. Genetic variants in above-mentioned genes were detected using PCR-based methodology. The influence of 6-MP treatment and VNTR region on TPMT transcription was evaluated using functional CAT assays in vitro in K562 cell line. The level of TPMT expression in blood and bone marrow mononuclear cells was analyzed using the real-time PCR method. Population analysis revealed that allelic frequencies of TPMT, ABCB1, TYMS, MTHFR, SLC19A1, DHFR, IL-6 and TNF studied genetic variants are similar in comparison to other European populations. Variant ITPA c.94C allele is less frequent, while ABCC4 rs9516519, nucleotide G, is more frequent in Serbian population in comparison to other European populations. This result might be important when assessing their pharmacogenomic potential. In RA patients, IL-6 i TNF genetic variations were relevant pharmacogenomics markers for anti-TNF therapy. Genotype frequencies in ITPA, ABCB1, ABCC4, TYMS, MTHFR, SLC19A1 and DHFR, genes that encode enzymes and transporters of 6-MP and MTX drugs, were similar for pediatric ALL patients and healthy individuals. This result suggests that analyzed variants are not involved in etiology of childhood ALL. In 6-MP-treated K562 cells, TPMT transcription level decreased in VNTR architecture dependent manner in vitro. Various VNTR constructs can be categorized in three different groups, depending on the level of TPMT transcription decrease, namely minor decrease (AB4C), intermediate decrease (A2B3C, A4BC, AB2C, A5BC, A2BC i A3BC) or major decrease (A6BC, AB5C, A3B2C i A2B2C). In 6-MP-treated K562 cells, higher number of type A repeats resulted in more prominent decrease of TPMT transcription. TPMT gene expression level was 3.3 times higher during the maintenance therapy when 6- MP and MTX drugs are given to childhood ALL patients, than before chemotherapy. During the maintenance therapy VNTR*5a/*5a carriers showed considerable elevation while VNTR*7a allele carriers showed the least prominent elevation of TPMT expression level. Higher number of type A repeats in VNTR region of TPMT promoter, decreases level of TPMT gene expression both before chemotherapy and during the maintenance therapy. Results of this study could fill in some pieces in the complicated puzzle of the maintenance therapy individualization for childhood ALL patients. This study highlights importance of population-specificity of pharmacogenomic markers. It could be of great importance to consider TPMT genetic variants at the very beginning of the maintenance therapy for childhood ALL patients, especially for carriers of one of specific four VNTR alleles that contribute to major decrease of TPMT transcription in vitro. Taking into consideration pharmacogenomic analysis of TNF and IL-6 variants in RA patients, it might be beneficial to introduce anti-TNF therapy for childhood ALL patients with refractory disease.

Evaluacija hirurške metode ablacije tumora kao optimalnog načina lečenja bilijarnih mucinoznih cistadenoma jetre

Evaluation of a surgical method of tumor ablation as an optimal treatment of biliary mucinous cystadenoma of the liver

Bilijarni cistadenom (BCA) i njegova maligna strana bilijarni cistadenokarcinom (BCACa) retki su cistični tumori poreklom iz bilijarnog sistema...

Biliary cystadenoma (BCA) and its malignant side, biliary c<stadenocarcinoma (BCACa) are rare cystic tumors originating from the biliary system...

Model generalisane plastičnosti kod nelinearne analize prostornih okvirnih konstrukcija

Generalized plasticity model for nonlinear space frame analysis

Predmet disertacije je efikasna nelinearna analiza okvirnih konstrukcija grednim konačnim elementima sa težištem na modeliranju materijalnih nelinearnosti. Geometrijska nelinearnost se uzima u obzir poznatim metodama. U tezi su analizirana i unapređena dva gredna konačna elementa: fiber element i element koncentrisane plastičnosti i napisan je sopstveni kompjuterski program kojim su elementi implementirani u postojeći open-source program za analizu konstrukcija – FEDEASLab. Tokom rada na tezi, ostvareni su sledeći ciljevi. Izvršena je optimizacija integracije poprečnog preseka čeličnih i armirano-betonskih elemenata u cilju poboljšanja efikasnosti fiber elemenata kako pri cikličnom pseudo-statičkom opterećenju, tako i pri nelinearnoj dinamičkoj analizi pojedinih delova i čitave konstrukcije. Formulisana su praktična pravila i definisane jasne smernice za diskretizaciju poprečnog preseka čeličnog I profila i pravougaonog armiranobetonskog preseka, u zavisnosti od vrste analize koja se sprovodi i željene tačnosti. Razvijen je novi konačni elementa iz grupe elemenata koncentrisane plastičnosti koji prevazilazi ograničenja postojećeg elasto-plastičnog elementa kao što su nemogućnost opisivanja postepene plastifikacije poprečnog preseka i opisivanja ponašanja materijala sa ojačanjem. Pri tome, element je zadržao svoju veliku kompjutersku efikasnost koja je osnovna prednost elemenata koncentrisane plastičnosti. Za određivanje stanja elementa razvijena su dva algoritma prema “general closest point projection” i “convex cutting plane” return mapping algoritmima i analizirana je zavisnost konvergencije od implementiranog algoritma. Mogućnosti novog elementa za modeliranje okvirnih konstrukcija pri delovanju statičkog i dinamičkog opterećenja su potvrđene kroz niz numeričkih primera. Specijalna pažnja je posvećena primeni novog GP elementa za modeliranje CFT stubova spregnutih konstrukcija...

The objective of this study is the efficient nonlinear analysis of space frames with beam/column finite elements considering material nonlinearity. Geometric nonlinearity is taken into account using known methods. Two different nonlinear beam/column elements are analyzed and improved: a fiber element and a concentrated plasticity element. Own computer code is written and implemented into the existing matlab toolbox for nonlinear structural analysis – FEDEASLab. During this study, the following objectives are achieved. By the optimization of the number and position of material integration points at monitored steel and reinforced concrete cross-sections, the significant improvement in efficiency of the fiber beam-column element under cyclic static and dynamic loading conditions is gained. The practical rules for an efficient discretization of steel wide-flange sections and rectangular reinforced-concrete sections are defined, depending on the desired level of accuracy and the type of analysis. In addition, the new three-dimensional nonlinear beam-column element is formulated. The element is of concentrated plasticity type and overcomes the common limitations of the existing elasto-plastic elements, such as the inability to describe gradual plastification of a cross-section and the hardening behavior. Also, the element keeps its high computational efficiency which is one benefit of concentrated plasticity elements. Two algorithms for element state determination are developed in accordance with the general closest point and convex cutting plane return mapping algorithms. Their influence on element convergation is studied. The ability of the element to simulate frame behavior is confirmed on a number of numerical examples. The special attention is devoted to model CFT composite column behavior...

Granična nosivost armiranobetonskih grednih nosača od betona sa recikliranim agregatom

Ultimate strenght of reinforced recycled concrete

Recikliranje betonskog otpada je jedno od održivih rešenja za rastuće probleme sa deponijama građevinskog otpada i nekontrolisano iskorišćavanje prirodnih resursa. Rezultat procesa je agregat od recikliranog betona koji se trenutno dominantno koristi za podloge puteva i nekonstruktivne betonske elemente. Sa stanovišta zaštite resursa, smanjenja energije i razvoja ekološke svesti, važno je istražiti da li se beton na bazi recikliranog agregata može koristiti za elemente armiranobetonskih konstrukcija. Predmet istraživanja u ovoj disertaciji su elementi konstrukcije, tačnije gredni nosači napravljeni od betona na bazi recikliranog agregata (RAC) i njihovo ponašanje pod dejstvom kratkotrajnog opterećenja do loma savijanjem ili smicanjem. Formirana je baza podataka i obavljena statistička analiza o mehaničkim svojstvima RAC betona u odnosu na uporedne betone sa prirodnim agregatom (NAC). Eksperimentalni rad obuhvatio je ispitivanje recikliranog agregata, betona na bazi recikliranog agregata i grednih nosača napravljenih od takvog betona. Rezultati ispitivanja svojstava agregata i probna ispitivanja fizičko-mehaničkih svojstava serija RAC i NAC betona poslužili su kao ulazni parametar za projektovanje sastava 3 betonske mešavine sa 0%, 50% i 100% recikliranog agregata krupne frakcije, iste projektovane čvrstoće pri pritisku. Ukupno je do loma ispitano 18 greda, statičkog sistema prosta greda, raspona 3.0 m. Od toga, napravljene su 3 serije od po 3 grede sa različitom količinom podužne armature (0.28%, 1.46% i 2.54%). Koncept ispitivanja postavljen je tako da se faznim povećanjem opterećenja dođe do loma nosača usled savijanja u sredini raspona. Takođe, napravljene su 3 serije od po 3 grede od betona sa 0%, 50% i 100% krupnog RAC i sa različitom količinom poprečne armature (0%, 0.14% i 0.19%), predviđenih za ispitivanje smičuće nosivosti. Izvršeno je poređenje zavisnosti sila-pomeranje, slika prslina, ugiba, dilatacija u betonu i armaturi, oblika loma i graničnih nosivosti greda od klasičnog i RAC betona, bazirano na sopstvenim i drugim rezultatima ispitivanja. Testirana je mogućnost primene savremenih propisa koji se odnose na NAC betone na gredne RAC elemente, kroz poređenje analitičkih predikcija i eksperimentalnih vrednosti momenta savijanja pri pojavi prve prsline, ugiba, graničnih momenata savijanja i granične smičuće sile. Takođe, izvršeno je poređenje sopstvenih i drugih rezultata eksperimentalnih ispitivanja Rezime v osnovnih parametara nosivosti greda koje su dominantno izložene savijanju ili smicanju. Iz statističke analize baze podataka proistekle su analitičke zavisnosti odnosa osnovnih mehaničkih svojstava kod RAC i uporednih NAC betona. Izvršen je pregled literature koja se odnosi na dosadašnja istraživanja ponašanja armiranih RAC grednih nosača i utvrđen prostor za dalja istraživanja. Na osnovu sopstvenog eksperimentalnog istraživanja zaključeno je da betoni sa 50% krupnog RCA mogu imati iste čvrstoće pri pritisku i modul elastičnosti kao i uporedni NAC spravljen sa istim efektivnim vodocementnim faktorom, dok za RAC sa 100% krupnog RCA istih svojstava treba primeniti 3% više cementa. Analizom sopstvenih i drugih eksperimentalnih podataka zaključeno je da se gredni RAC nosači ponašaju slično uporednim NAC nosačima pri eksploatacionom i graničnom opterećenju. Moguće je primeniti aktuelne propise i na RAC grede, ali su predikcije manje konzervativne nego kod NAC greda. Po pitanju granične nosivosti na savijanja i smicanje, svi podaci i analize ukazuju da nema bitne razlike između NAC i RAC elemenata bez obzira na količinu krupnog recikliranog agregata u betonu. Prezentovane analize i zaključci potvrđuju da je primena RAC u armiranobetonskim gredama tehnički izvodljiva, komparativna i kompetitivna primeni betona od prirodnog agregata. Time je sa tehničke strane pružen podsticaj otvaranju velikog polja za primenu recikliranog agregata, što predstavlja napredak u promociji održivog razvoja u građevinarstvu.

Recycling of waste concrete is one of the sustainable solutions for the growing waste disposal crisis and depletion of natural aggregate sources. As a result, recycled concrete aggregate (RCA) is produced, and so far it has mostly been used in low-value applications such as for the pavement base. But, from the standpoint of promoting resource and energy savings and environmental preservation, it is essential to study whether a concrete made of recycled aggregates - recycled aggregate concrete (RAC) can be effectively used as a structural material. Structural reinforced concrete elements were in the focus of this investigation, i.e. beam girders made of RAC and their behaviour up to flexural and shear failure under short-time loading. A very wide data base was formed and statistic analysis of relations between mechanical properties of RAC and corresponding natural aggregate concrete (NAC) was performed. The experimental research consisted of investigations of recycled concrete aggregate, recycled aggregate concrete and structural behaviour of beams made of RAC. Test results of RCA investigation and trial investigations of physical and mechanical properties of RAC were used as basic parameters for the design of 3 concrete mixtures with 0%, 50% i 100% of coarse RCA with the same compressive strength. Full-scale tests were performed on 18 simply supported beams with span of 3.0 m until the failure load due to flexure or shear was reached. Firstly, three series of beams made of three types of concrete and different ratio of flexural reinforcement (0.28%, 1.46% and 2.54%) were formed. Experiment on beams was performed by increasing the load level until flexural failure in the middle of span occurred. Furthermore, three series of beams with different ratio of shear reinforcement (0%, 0.14% i 0.19%) and concrete with 0%, 50% and 100% of coarse RCA were prepared to examine shear behavior. Comparison of load-deflection behavior, crack patterns, service deflections, strains in concrete and reinforcement, failure modes and ultimate flexural and shear capacity of NAC and RAC beams was made. The possibility of using equations from NAC codes to RAC beams was tested by comparison of an analytical expressions and experimental results related to cracking moments, deflections, ultimate bending moments and ultimate shear Abstract vii capacity. The analysis of own and other authors’ test results was performed both on flexural and shear behavior of RAC reinforced concrete beams. The analytic expressions related to the ratio of the basic mechanical properties of NAC and RAC were drawn from conducted statistics and regression analysis of data base. The insight in literature dealing with experimental research of structural behavior of reinforced RAC beams had been performed and the room for improvement was found. Based on own experimental results it was concluded that RAC with 50% of RCA had the same compressive strength and modulus of elasticity as corresponding NAC with the same effective water-to-cement ratio. The production of RAC with 100% of RCA having the above mentioned properties the same compared to the corresponding NAC was possible with increase in cement content for about 3%. The results of conducted analysis showed that the flexural and shear behavior of RAC and comparative NAC beams were very similar for both the service and ultimate loading. Presented analysis and conclusions proved that the use of RAC in reinforced concrete beams is technically feasible, comparable and competitive with the use of conventional reinforced concrete. The stimulus for recycled concrete aggregate use in a wide field of high-value application has been given, which can be considered as improvement in promotion of sustainable construction development.

Uticaj purinskih nukleozidnih analoga, ribavirina i tiazofurina, na aktivaciju mikroglije u uslovima inflamacije

The effect of purine nucleoside, analogues, ribavirin and tiazofurin, on microglial activation under inflammatory conditions

Aktivacija mikroglije jedno je od glavnih obeležja eksperimentalnog autoimunskog encefalomijelitisa (EAE) i drugih neuroloških poremećaja koje odlikuje hronična inflamacija. Cilj ove studije bio je da se proceni sposobnost dva analoga purinskih nukleozida, ribavirina (RBV) i tiazofurina (TR), da modulišu inflamatorni odgovor aktivirane mikroglije, in vivo i in vitro. U in vivo studiji, koja je izvedena na EAE modelu indukovanom ubrzgavanjem encefalitogene emulzije u šapu Dark Agouti pacova, pokazano je da tretman životinja kombinacijom oba analoga, počev od pojave prvih simptoma pa tokom sledećih 15 dana, dovodi do smanjenja težine bolesti, a na histološkom planu do smanjenja broja i stepena aktivacije mikroglije. Budući da kombinovani tretman RBV i TR dovodi do supresije simptoma EAE i do redukcije reaktivne mikroglioze, formulisana je hipoteza da ovaj tretman, pored ranije opisanih sistemskih efekata u imunskom i vaskularnom sistemu, ostvaruju centralni efekat i to delujući prvenstveno na ćelije mikroglije. Uticaj RBV i TR, kao i kombinovane primene oba analoga detaljnije je ispitan u primarnoj kulturi mikroglijskih ćelija. Aktivacija mikroglije, indukovana lipopolisaharidom bakterijskog zida gram negativnih bakterija, (LPS), izazvala je tipičan odgovor reaktivne mikroglioze. Antiinflamatorni potencijal RBV, TR i RBV+TR ispitan je u pogledu citotoksičnosti, indukcije morfoloških promena, produkcije azot monoksida (NO), oslobađanja proinflamatornih citokina i nuklearne translokacije NF-κB. Ispitan je citototoksični potencijal RBV (1 – 20 μM), TR (1 – 20 μM) i kombinovanog tretmana (10 μM RBV + 5 μM TR) i određene su EC50 doze pri kojima se postiže polovina maksimalnog citotoksičnog efekta. RBV, TR i kombinovani tretman smanjuju ukupnu produkciju NO u kulturi stimulisanoj LPS-om, a taj efekat se pripisuje smanjenju ukupnog broja ćelija u kulturi. RBV, TR i RBV+TR menjaju ameboidnu morfologiju aktivirane mikroglije, tako što smanjuju prosečnu površinu ćelija u kulturi. Tretman RBV, TR i RBV+TR smanjuju translokaciju NF-κB/p65 u jedro. Primenjeni tretmani smanjuju ukupno oslobađanje TNF-α i IL-6, što je verovatno posledica smanjenja ukupnog broja aktiviranih ćelija, a RBV i kombinovani tretman povećavaju ekspresiju IL-1β. U primarnoj kulturi mikroglijskih ćelija potvrđena je genska i proteinska ekspresija uravnotežujućih nukleozidnih transportera 1 i 2 (ENT1, 2), koji učestvuju u transportu RBV i TR u ćelije. Ukupno gledano, rezultati dobijeni ovom studijom ukazuju da RBV i TR, pojedinačno ili u kombinaciji, deluju citotoksično na aktiviranu mikrogliju i menjaju njenu morfologiju, a ispoljavaju i imunomodulatorno dejstvo tako što snižavaju produkciju NO, smanjuju signalizaciju posredovanu NF-κB/p65 i redukuju produkciju proinflamatornih citokina.

Activation of microglia is the hallmark of experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) and other neurodegenerative disorders associated with chronic neuroinflammation. The present study addressed the potency of purine nucleoside analogues ribavirin (RBV) and tiazofurin (TR) to modulate the microglial inflammatory response in vivo and in vitro. In this study, we induced animal model of multiple sclerosis – experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) by subcutaneous injection of encephalitogenic emulsion in the hind paw of Dark Agouti rats and showed that therapeutic treatment of EAE animals with combination of these two nucleoside analogues reduced disease severity. In addition, histological analysis indicated that RBV and TR also decreased the number and activation status of microglial cells. Since the combined treatment with RBV and TR leads to suppression of EAE symptoms and reduction of reactive microgliosis, we proposed hypothesis that this treatment, in addition to previously described effects in immune and vascular system, may act in central nervous system targeting primarily microglial cells. Therefore, in further experiments we examined effect of RBV, TR and their combination (RBV+TR) on primary microglial cell culture. Activation of microglial cells with bacterial lipopolysaccharide (LPS) triggers typical microglial responses to inflammation. Anti-inflammatory potential of RBV, TR and RBV+TR was tested in terms of influencing microglial morphological changes, NO production, nuclear factor-κB translocation and proinflammatory cytokines release, after LPS stimulation. The cytotoxic effects of RBV (1 – 20 μM), TR (1 – 20 μM) and their combination (10 μM RBV + 5 μM TR) are determined, as well as the dosages that achieved half-maximal inhibitory effect (EC50). RBV, TR and combination treatment lowered NO levels in LPS stimulated cultures as a result of decreased cell number. RBV, TR and RBV+TR induced shrinkage of average cell surface of LPS activated amoeboid microglial cells. Treatment with RBV, TR and RBV+TR of activated microglia strongly reduced the nuclear translocation of NF-κB/p65 and suppressed proinflammatory immune response genes. Applied treatments also exerted suppression of TNF-α and IL-6 release in activated microglia manly by reduction of cell number. At the same time, RBV and RBV + TR treatment additionally increased LPS-induced IL-1β gene expression and release. In primary microglial cell culture, gained results confirmed gene and protein expression of equilibrative nucleoside transporters (ENTs), proteins that are responsible for the putative entry of RBV and TR into cells. Results obtained in this study indicate that RBV and TR, alone or in a combination, attenuate neuroinflammatory response, probably by exerting cytotoxicity on activated microglial cells, reduction of NO levels, attenuation NF-κB signaling and decrease of proinflammatory cytokine release.

Biokompatibilnost i imunomodulatorne osobine nanomaterijala na bazi nanočestica zlata i ugljeničnih nanocevi, i naprednih biomaterijala na bazi NiTi i CuAINi legura

Biocompatibility and immunomodulatory properties of nanomaterials based on gold nanoparticles and carbon nanotubes, and NITi-and CuAINi alloy-based advanced biomaterials

Napredni biomaterijali na bazi NiTi i CuAlNi legura koje memorišu oblik (SMA) su vrlo atraktivni za izradu biomedicinskih implantata i uređaja. Međutim, biokompatibilnost NiTi i CuAlNi legura proizvedenih konvencionalnim metodama je često loša usled njihove neodgovarajuće površinske mikrostrukture koja omogućava oslobađanje metalnih jona u okolni medijum. U ovom radu je primenjen nov metod sinteze brzo stvrdnutih (RS) SMA valjanjem rastopine. Biokompatibilnost i imunomodulacijske osobine SMA legura su ispitane na modelima peritoneumskih makrofaga pacova (PMØ) i humanih dendritskih ćelija monocitnog porekla (DC), i na humanim mononuklearima periferne krvi (PBMC) izolovanim iz 20 različitih donora. Pokazano je da RS SMA, za razliku od kontrolnih SMA pripremljenih konvencionalnim metodama istog sastava, ne ispoljavaju citotoksičnost prema ispitivanim ćelijama. Osnovni razlog tome je što je na površini RS SMA formiran tanak homogeni sloj oksida koji štiti SMA od korozije, a inkubiranjem u medijumu dolazi do njegovog zadebljavanja. Međutim, pokazano je da CuAlNi RS SMA stimulišu produkciju IL-6 i izazivaju oksidativni stres kod PMØ, ali ne menjaju produkciju proinflamacijskih citokina u većini kultura PBMC stimulisanih mitogenom. Sa druge strane, NiTi RS SMA stimulišu produkciju IL-10 u 25% kultura stimulisanih kultura PBMC. U skladu sa tim je pokazano da NiTi RS SMA stimulišu fenotipsko sazrevanje DC koje produkuju veći nivo IL-10 i IL-27, i stimulišu produkciju IL-10 i TGF-β u ko-kulturi sa CD4+T ćelijama. Međutim, DC kultivisane na NiTi RS SMA u prisustvu LPS-a poseduju veći alostimulatorni kapacitet i stimulišu Th1 imunski odgovor in vitro. Ovi rezultati ukazuju na to da se RS SMA mogu bezbedno iskoristiti kao implantati kod većine pacijenata, ali je neophodno razmotriti i da li bi imunomodulacijske osobine ovih legura mogle izazvati neželjene posledice kod nekih pacijenta. Nanočestice zlata (GNP) su vrlo atraktivne za primenu u dijagnostici i fototermalnoj terapiji tumora. Međutim, njihova biokompatibilnost i imunomodulacijske osobine nisu dovoljno ispitane, što je neophodno za njihovu bezbednu primenu u biomedicini. U ovom radu je primenjen nov metod sinteze GNP ultrasoničnom sprej pirolizom (USP). Pri tome je sintetisano 5 različitih frakcija GNP različitih mikrostrukturnih odlika. Citotoksičnost GNP vi sintetisanih USP metodom je ispitivana u kulturi L929 ćelija, timocita i splenocita pacova, a imunomodulacijske osobine u modelu konkanavalinom A (ConA) stimulisanih splenocita. Pokazano je da frakcije 1 i 2, sastavljene od čistog zlata, ne izazivaju citotoksičnost ispitivanih ćelija. Ostale frakcije GNP izazivaju citotoksičnost u zavisnosti od koncentracije mikrolegirajućih elemenata u njihovom sastavu i osetljivosti ispitivane ćelijske linije. Frakcija 2, koja je sintetisana pod većom ultrasoničnom frekvencijom i sadrži partikule manje veličine u poređenju sa frakcijom 1, ispoljava anti-proliferativni efekat, inhibira produkciju IL-2 i stimuliše produkciju IL-10 u kulturi splenocita stimulisanih pomoću ConA. Sličan imunosupresivni efekat je potvrđen i u kulturi humanih DC kultivisanih u prisustvu GNP veličine 10 nm ili 50nm. Naime, pokazano je da DC internalizuju GNP mehanizmima koji dominantno zavise od dinamina. Oba tipa GNP inhibiraju maturaciju i alostimulacijsku sposobnost DC stimulisanih LPS-om, s tim da su efekti GNP10 izraženiji. GNP10 suprimiraju produkciju IL-12p70 od strane DC stimulisanih LPS-om, i potenciraju njihovu Th2 polarizacijsku sposobnost u ko-kulturi sa CD3+ T ćelijama, dok GNP50 potenciraju Th17 imunski odgovor in vitro. Ovakvi efekti GNP10 koreliraju sa snažnijom inhibicijom promena u oscilaciji Ca2+ koje indukuje LPS, ali i sa većim brojem internalizovanih nanočestica, kao i njihovom češćom ekstra-endozomalnom lokalizacijom. GNP10 inhibiraju maturaciju i funkcije DC i kada se oslobode iz nekrotičnih tumorskih HEp-2 ćelija. Na ovom modelu je pokazano da GNP10, za razliku od GNP50, potenciraju Th2/Th17 polarizacijsku sposobnost DC, i suprimiraju njihov kapacitet da indukuju citotoksične T ćelije prema HEp-2 ćelijama. Na osnovu ovih rezultata je zaključeno da GNP10, delovanjem na DC, mogu potencijalno indukovati više nepoželjenih efekata na imunski sistem, u odnosu na GNP50. Funkcionalizovane višeslojne ugljenične nanocevi (MWCNT) su veoma pogodne za primenu kao nosači lekova i biomolekula do ciljnih ćelijskih odeljaka. Međutim, njihova biokompatibilnost i imunomodulacijske osobine zavise od prirode biomolekula koji je za njih vezan. U tom smislu je ispitana mogućnost internalizacije, citotoksičnost i imunomodulacijske osobine MWCNT konjugovanih sa dapsonom (dap), lekom protiv intracelularnih bakterija, ili 7-tia-8-oksoguanizinom (7-TOG), agonistom Toll-u sličnog receptora (TLR)-7, na modelu PMØ pacova i humanih DC. Konjugacija dap-MWCNT i 7- TOG-MWCNT je potvrđena infracrvenom spektroskopijom sa Fuorierovom transformacijom, transmisionom elektronskom mikroskopijom, termogravimetrijskom i vii elementalnom analizom. Analiza na svetlosnoj, konfokalnoj, elektronskoj mikroskopiji i protočnoj citometriji je potvrdila da PMØ i DC internalizuju dap-MWCNT i 7-TOG- MWCNT. Pri tome je pokazano da se dap-MWCNT akumuliraju u endozomima PMØ i DC u sličnoj meri kao i kontrolne oksidovane (o)-MWCNT. Sa druge strane, 7-TOG- MWCNT se akumuliraju u endozomima DC u znatno većoj meri nego o-MWCNT, pri čemu 7-TOG-MWCNT interaguju sa TLR7 u endozomima DC. Ispitivanjem bioloških svojstava dap-MWCNT, pokazano je da ovaj konjugat poseduje manju citotoksičnost prema PMØ i DC u poređenju sa kontrolnim o-MWCNT, koje izazivaju oksidativni stres u PMØ. Solubilni dapson indukuje manji oksidativni stres kod PMØ, i sam inhibira apoptozu PMØ, dok u prisustvu o-MWCNT snažno potencira njegova dejstva. U skladu sa tim, o- MWCNT, za razliku od dap-MWCNT, inhibiraju oksidativni prasak PMØ, produkciju NO i IL-6 od strane PMØ. Sa druge strane, dap-MWCNT u prisustvu LPS-a inhibira produkciju IL-6. U netoksičnim koncentracijama o-MWCNT stimulišu sazrevanje i produkciju proinflamacijskih citokina od strane DC. dap-MWCNT, za razliku od solubilnog dapsona, ne smanjuju ekspresiju HLA-DR i ne povećavaju produkciju IL-23 od strane nezrelih DC. U prisustvu proinflamacijskih citokina (IL-1β, IL-6, TNF-α i PGE2), dap-MWCNT stimulišu ekspresiju CD86, a inhibiraju ekspresiju CCR7 i produkciju IL-10 i IL-27 od strane DC u poređenju sa kontrolom. Ovi rezultati ukazuju na to da se, akumulacijom u endozomima PMØ i DC i stimulacijom povoljnih imunomodulatornih efekata kod ovih ćelija, dap-MWCNT mogu iskoristiti u terapiji visoko-rezistentnih intracelularnih patogena, dok se 7-TOG-MWCNT mogu iskoristiti u stimulaciji DC u anti-tumorskoj terapiji.

Advanced biomaterials based on NiTi CuAlNi shape memory alloys (SMAs) are very attractive for the production of biomedical implants and devices. However, the biocompatibility of NiTi and CuAlNi alloys, prepared by conventional methods, is often poor due to their inadequate surface microstructure causing the release of toxic metal ions into the surrounding medium. Therefore, we applied a novel method for the preparation of SMAs using Rapid Solidification (RS) via Melt-Spinning. Biocompatibility and immunomodulatory properties of SMA alloys were studied using the in vitro models of rat’s peritoneal macrophages (PMØs), human monocyte-derived dendritic cells (DCs), and mitogen-stimulated human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) isolated from 20 different donors. It was shown that RS SMAs, in contrast to control SMAs of the same composition but prepared by conventional methods, do not exhibit cytotoxicity towards the tested cells. The main reason for this phenomenon is the formation of a thin homogeneous oxide layer on the surface of RS SMAs that protects the SMAs from corrosion, and the conditioning in cell culture medium leads to its thickening. However, CuAlNi RS SMAs induce the production of IL-6, cause oxidative stress in PMØ, but do not modify the production of pro-inflammatory cytokines in most of the mitogen-stimulated PBMCs cultures. In contrast, NiTi RS SMAs stimulate the production of IL-10 in 25 % of the stimulated PBMC cultures. Accordingly, we showed that NiTi RS SMAs stimulate the phenotypic maturation of DCs, which produce higher levels of IL-10 and IL-27, and stimulate the production of IL-10 and TGF-β in co-culture with CD4+ T cells. However, in the presence of LPS, DCs cultivated on RS NiTi SMA possess a stronger allostimulatory capacity, and potentiate the development of Th1 immune response in vitro. These results indicate that RS SMAs can be safely used as implants for most patients, but special care should be taken as to whether the immunomodulatory properties of these alloys would cause some adverse effects in some patients. Gold nanoparticles (GNP) are quite promising for the use in diagnostics and photo-thermal cancer therapy. However, their biocompatibility and immunomodulatory properties have not been investigated sufficiently for their safe use in biomedicine. In this paper we applied ix Ultrasonic Spray Pyrolysis (USP) as a novel method for the synthesis of GNP. USP enabled the synthesis of 5 different fractions of GNP, and their cytotoxicity was evaluated in vitro using of L929, rats’ thymocytes and splenocytes, whereas a model of concanavaline A (ConA) - stimulated splenocytes was used for the evaluation of the GNP-mediated immunomodulatory properties. We found that fractions 1 and 2, composed of pure gold nanoparticles, do not cause the cytotoxicity of the tested cells. The cytotoxicity of other GNP fractions depends on the concentration of micro-alloying elements in their composition, and susceptibility of the tested cell. Fraction 2, produced using a higher ultrasonic frequency, contains smaller particles compared to fraction 1, exhibits an anti- proliferative effect on ConA-treated splenocytes, inhibits IL-2, and stimulates IL-10 production in these cultures. A similar immunosuppressive effect was observed in culture of DC treated with 10 nm- or 50nm- sized GNP. Namely, we showed that DC internalise GNP predominantly via dynamin-dependent mechanisms. Both GNPs impair the maturation and allostimulatory capacity of these cells in presence of LPS, but the effects of GNP10 are more prominent. Furthermore, GNP10 inhibit LPS-stimulated production of IL-12p70 by DC, and potentiate their Th2 polarisation capacity in co-culture with CD3+ T cells, whereas GNP50 potentiate Th17 immune response in vitro. Such effects of GNP10 correlate with a stronger inhibition of LPS-induced changes in Ca2+ oscillations, their higher number per DC, and more frequent extra-endosomal localization. Even when released from heat-killed necrotic HEp-2 cells, GNP10 inhibit the necrotic tumour cell-induced maturation and functions of DCs. Using this model, we showed that GNP10, unlike GNP50, potentiate DCs’ Th2/Th17 polarisation capacity, and thus, impair their capacity to induce T cell-mediated anti-HEp2 cytotoxicity in vitro. Based on these results we concluded that GNP10 could potentially induce more adverse DC-mediated immunological effects, compared to GNP50. Functionalised multi-walled carbon nanotubes (MWCNT) represent very suitable system for the targeted-delivery of drugs and biomolecules to specific cellular compartments. However, their biocompatibility and immunomodulatory properties depend on the nature of the attached biomolecules. Therefore, we investigated the internalization, cytotoxicity and immunomodulatory properties of MWCNTs conjugated with dapsone (dap) or 7-thia-8- oxoguanosine (7-TOG), used as a drug against intracellular bacteria or Toll-like receptor (TLR)-7 agonist, respectively, using a model of rats’ PMØ and human DC. Conjugation of dap-MWCNT and 7-TOG-MWCNT was confirmed by using Fourier transformed infrared x spectroscopy, transmission electron microscopy, thermogravimetric and elemental analysis. By using light-, confocal-, and electron microscopy, and flow cytometry, we confirmed that PMØ and DC internalize dap-MWCNTs and 7 TOG-MWCNTs. Thereby, dap-MWCNTs accumulated within the endosomes of PMØ and DC to a similar extent as control, oxidized (o)-MWCNTs. In contrast, 7 TOG-MWCNTs accumulate in DCs’ endosomes to a much higher extent as compared to o-MWCNTs, thereby 7-TOG-MWCNTs co-localise with TLR7 within the endosomes of DCs. The biological examination of dap-MWCNTs revealed their lower cytotoxicity to PMØ and DCs, as compared to the control o-MWCNTs that potentiate the oxidative stress in PMØ. Soluble dapsone induces a weak oxidative stress in PMØ, and inhibits their apoptosis, but potentiates strongly the effects of o-MWCNTs in its presence. Accordingly, o-MWCNTs inhibit oxidative burst of PMØ, and production of NO and IL-6 by these cells, unlike dap-MWCNTs. In contrast, dap-MWCNTs inhibit the production of IL-6 in the presence of LPS. The non-toxic concentrations of o-MWCNTs stimulate the maturation and production of pro-inflammatory cytokines by DC. In contrast to soluble dapsone, dap-MWCNTs do not down-regulate the expression of HLA-DR, nor stimulate the production of IL-23 by immature DCs. In the presence of pro-inflammatory cytokines (IL-1β, IL-6, TNF-α and PGE2), dap-MWCNTs stimulate the expression of CD86, and inhibit the expression of CCR7, and the production of IL-10 and IL-27 by the DC, as compared to the control. These results suggest that, by accumulating in endosomes of PMØs and DCs, and by stimulation of favourable immunomodulatory effects, dap- MWCNTs and 7-TOG-MWCNTs could be beneficial for the treatment of highly resistant intracellular pathogens, and the stimulation of DCs in anti-tumour therapy, respectively.

Interleukin 8 i matriksne metaloproteinaze 2 i 9 kao markeri invazivnosti u hormonski zavisnom karcinomu dojke

Interleukin 8 and matrix metalloproteinases 2 and 9 as markers of invasiveness in hormone dependent breast cancer

Ekspresija receptora za estrogen (ER) i receptora za progesteron (PR) je preduslov hormonske zavisnosti karcinoma dojke. Hormonski receptori su još uvek jedni od najpouzdanijih parametara prognoze i predikcije ovog karcinoma, mada su klinički ishod pacijentkinja i odgovor na hormonsku terapiju varijabilni. Uključivanje receptora za humani epidermalni faktor rasta 2 (HER2) u klasifikaciju karcinoma dojke zajedno sa hormonskim receptorima, samo je donekle doprinelo utvrđivanju preciznijeg prognostičkog profila, što je ukazalo na potrebu za traženjem dodatnih, selektivnijih markera prognoze i predikcije. Prognostički značaj potencijalnih biomarkera se najbolje sagledava praćenjem prirodnog toka bolesti tj. toka bolesti koji nije bio prekidan adjuvantnom (postoperativnom) terapijom. O prirodnom toku bolesti karcinoma dojke ima vrlo malo literaturnih podataka s obzirom da se u savremenoj kliničkoj praksi svim pacijentkinjama daje neki oblik adjuvantne terapije. Literaturni podaci ukazuju na značaj interleukina 8 (IL8) i matriksnih metaloproteinaza 2 i 9 (MMP2, MMP9) kao potencijalnih biomarkera prognoze i predikcije u različitim tipovima humanih kancera. Studije koje se odnose na hormonsku regulaciju ekspresije ovih potencijalnih biomarkera u karcinomu dojke su kontroverzne. Više studija je ukazalo da bi ovi biomarkeri mogli biti potencijalni indikatori rezistencije na hormonsku terapiju. Ciljevi: Ciljevi istraživanja su bili: da se ispita prognostički i prediktivni značaj kliničko- patoloških parametara i odabranih biomarkera (IL8, MMP2, MMP9); da se proceni da li i na koji način interakcije između ER, PR i HER2 kao glavnih determinanti karcinoma dojke, imaju uticaja na ekspresiju odabranih biomarkera; da se proceni eventualno postojanje sprege između odabranih biomarkera, što bi moglo doprineti razumevanju progresije hormonski zavisnog karcinoma dojke i objašnjenju rezistencije na hormonsku terapiju. Materijal i metode: U studiju je bilo uključeno 150 postmenopauzalnih pacijentkinja sa primarnim karcinomom dojke i poznatim kliničko-patološkim parametrima. Detektabilni nivoi hormonskih receptora bi trebalo da ukazuju na hormonski zavisni karcinom dojke. Nakon operacije histološki uzorci tumora su pregledani i klasifikovani po kriterijumima AJCC (American Joint Committee on Cancer) za TNM status i histopatološki tip, i deo tumora je postoperativno zamrznut. Pacijentkinje sa povoljnim kliničko-patološkim parametrima (negativni nodalni status) nisu primale adjuvantnu terapiju, prema u to vreme važećem protokolu. Ostale pacijentkinje, pretežno sa pozitivnim nodalnim statusom, su primale adjuvantnu hormonsku terapiju (tamoksifen). Tok bolesti pacijentkinja je praćen od hirurške intervencije do pojave relapsa, što je definisano kao vreme preživljavanja do pojave relapsa (engl. relapse-free survival, RFS). Status HER2 gena (odsustvo ili prisustvo amplifikacije) je određivan na tkivnim presecima tumora iz parafinskih kalupa hromogenom in situ hibridizacijom (CISH metoda). Koncentracije odabranih biomarkera (IL8, MMP2, MMP9) su određivane u homogenatima tkiva tumora ELISA esejem. Neparametrijski statistički testovi su korišćeni za analizu dobijenih podataka. Rezultati: Nije bilo statistički značajnih razlika u ekspresiji odabranih biomarkera (IL8, MMP2, MMP9) između podgrupa pacijentkinja formiranih na osnovu ER/PR/HER2 statusa (Mann-Whitney Rank Sum test, p>0,05). Dobijena je statistički značajna razlika u ekspresiji IL8 između podgrupa pacijentkinja formiranih na osnovu medijalne vrednosti MMP9 (M=1,87 ng/mg). Ekspresija IL8 je bila značajno povišena kod pacijentkinja sa koncentracijama MMP9 većim od medijane u poređenju sa pacijentkinjama sa koncentracijama MMP9 manjim od medijane (p=0,008). Statistički značajna negativna korelacija je dobijena između koncentracija ER i IL8 kao i između koncentracija PR i IL8 (Spearman Rank Order Correlation test, p=0,02 i p=0,006, redom). Nisu dobijene statistički značajne korelacije između koncentracija hormonskih receptora i matriksnih metaloproteinaza 2 i 9. Statistički značajna pozitivna korelacija je dobijena između koncentracija IL8 i MMP9 (p<0,001). Pacijentkinje koje nisu primale adjuvantnu terapiju su imale značajno duže vreme preživljavanja do pojave relapsa u poređenju sa pacijentkinjama koje su primale hormonsku terapiju (Log Rank, p=0,008). U grupi pacijentkinja koje nisu primale adjuvantnu terapiju, pacijentkinje sa manjim tumorima (T<2cm) i invazivnim duktalnim karcinomom su imale značajno duže vreme preživljavanja u poređenju sa pacijentkinjama sa većim tumorima (T≥2cm) i invazivnim lobularnim karcinomom (p=0,03 i p=0,01, redom). U istoj grupi, pacijentkinje sa koncentracijama IL8 manjim od medijane (M=88,82 pg/mg) su imale značajno duže vreme preživljavanja u poređenju sa pacijentkinjama sa koncentracijama IL8 većim od medijane (p=0,002). Pored toga, pacijentkinje sa IL8–MMP2– i IL8–MMP2+ fenotipovima su imale značajno duže vreme preživljavanja u odnosu na pacijentkinje sa IL8+MMP2– fenotipom (p<0,001 i p=0,02, redom). Poređenjem preživljavanja do pojave relapsa pacijentkinja koje nisu primale adjuvantnu terapiju grupisanih u različite fenotipove na osnovu statusa receptora i medijane IL8 (M=88,82 pg/mg), u svim kombinacijama fenotipova pacijentkinje sa IL8– statusom su imale manji procenat relapsa i duže vreme preživljavanja u poređenju sa pacijentkinjama sa IL8+ statusom, i to bez obzira na ER/PR/HER2 status. Pri tom su pacijentkinje sa ER+IL8– fenotipom imale značajno duže vreme preživljavanja u odnosu na one sa ER+IL8+ i ER–IL8+ fenotipovima (p=0,04 i p=0,02, redom); pacijentkinje sa PR–IL8– fenotipom su imale značajno duže vreme preživljavanja u odnosu na one sa PR–IL8+ i PR+IL8+ fenotipovima (p=0,003 i p=0,02, redom); i pacijentkinje sa HER2–IL8– fenotipom su imale značajno duže vreme preživljavanja u odnosu na one sa HER2–IL8+ i HER2+IL8+ fenotipovima (p=0,01 i p=0,02, redom). Poređenjem preživljavanja do pojave relapsa pacijentkinja koje nisu primale adjuvantnu terapiju grupisanih u različite fenotipove na osnovu statusa receptora i medijane MMP2/MMP9 (M=12,12 ng/mg za MMP2, M=1,82 ng/mg za MMP9), ni u jednoj kombinaciji fenotipova nije dobijena statistički značajna razlika u dužini vremena preživljavanja. U grupi pacijentkinja koje su primale hormonsku terapiju, pacijentkinje sa ER+ statusom su imale značajno duže vreme preživljavanja u poređenju sa pacijentkinjama sa ER– statusom (Log Rank test, p=0,04). Nijedan od potencijalnih biomarkera, pojedinačno ili kombinovano, nije pokazao statistički značaj za predikciju odgovora (efikasnost ili rezistencija) na hormonsku terapiju. Poređenjem preživljavanja do pojave relapsa pacijentkinja koje su primale hormonsku terapiju grupisanih u različite fenotipove na osnovu ER/PR/HER2 statusa i medijane IL8 (M=9,15 pg/mg), pacijentkinje sa ER+IL8– i ER+IL8+ fenotipovima su imale značajno duže vreme preživljavanja u odnosu na pacijentkinje sa ER–IL8+ fenotipom (p=0,04 i p=0,02, redom), dok u svim ostalim kombinacijama fenotipova nije bilo statistički značajnih razlika u dužini vremena preživljavanja. Poređenjem preživljavanja do pojave relapsa pacijentkinja koje su primale hormonsku terapiju grupisanih u različite fenotipove na osnovu statusa receptora i medijane MMP2/MMP9 (M=11,55 ng/mg za MMP2, M=2,51 ng/mg za MMP9), ni u jednoj kombinaciji fenotipova nije dobijena statistički značajna razlika u dužini vremena preživljavanja. Zaključci: Od kliničko-patoloških parametara, veličina tumora i histopatološki tip tumora su pokazali prognostički značaj za praćenje prirodnog toka bolesti. Od potencijalnih biomarkera jedino je IL8 pokazao prognostički značaj za praćenje prirodnog toka bolesti, te bi IL8 iz tkiva tumora mogao biti marker loše prognoze. Dodatno, IL8 se pokazao kao pouzdaniji prognostički marker u odnosu na status receptora (ER, PR, HER2) kod pacijentkinja koje nisu primale adjuvantnu terapiju. Nijedan od potencijalnih biomarkera, pojedinačno ili kombinovano, nije pokazao značaj za predikciju odgovora na hormonsku terapiju. Istovremeno, ER status se pokazao kao pouzdaniji prediktivni marker odgovora na hormonsku terapiju u odnosu na ispitivane biomarkere. Značajna negativna korelacija između koncentracija hormonskih receptora i interleukina 8 potvrđuje da bi ekspresija IL8 mogla biti hormonski regulisana. Odsustvo značajnih relacija i korelacija između koncentracija hormonskih receptora i matriksnih metaloproteinaza 2 i 9, ukazuje da ekspresija ovih enzima nije hormonski regulisana. Odsustvo značajnih relacija između koncentracija ispitivanih biomarkera i amplifikacije HER2 gena ukazuje da HER2 nema uticaja na ekspresiju odabranih biomarkera (IL8, MMP2, MMP9). Značajna pozitivna relacija i značajna pozitivna korelacija između koncentracija IL8 i MMP9 ukazuju da bi eventualno postojanje pozitivne sprege između IL8 i MMP9 moglo doprineti progresiji hormonski zavisnog karcinoma dojke.

Expression of estrogen receptor (ER) as well as progesterone receptor (PR) is the prerequisite of hormonal dependence of breast cancer. Hormone receptors are still among the most reliable prognostic and predictive parameters of this cancer, although the clinical outcome of patients and the response to hormonal therapy are variable. Inclusion of human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) in the classification of breast cancer together with hormone receptors, only partly contributed to the determination of more precise prognostic profile, which pointed out the need for searching additional, more selective prognostic and predictive markers. The best way to evaluate the prognostic significance of potential biomarkers is by following the natural course of the disease – the course that hadn’t been interrupted by adjuvant (postoperative) therapy. Very few literature data is available regarding this issue as some kind of adjuvant therapy is given to all breast cancer patients nowadays. Literature data have indicated the significance of interleukin 8 (IL8) and matrix metalloproteinase 2 and 9 (MMP2, MMP9) as potential prognostic and predictive biomarkers in different types of human cancers. Available data regarding hormonal regulation of expression of these potential biomarkers in breast cancer are controversal. Many studies have indicated that these biomarkers could be potential indicators of resistance to hormonal therapy. Aims: The aims of this study were: to evaluate the prognostic and predictive significance of clinicopathological parameters and selected biomarkers (IL8, MMP2, MMP9); to examine if and how interactions among ER, PR and HER2 as the main determinants of breast cancer influence the expression of selected biomarkers; to examine the possible existence of feedback between selected biomarkers, which might contribute to understanding of progression of hormone dependent breast cancer as well as to the explaination of resistance to hormonal therapy. Material and methods: The study included 150 postmenopausal primary breast cancer patients with known clinicopathological parameters. Detectable levels of hormone receptors should indicate hormone dependent breast cancer. After surgical removal of primary tumor, histological specimens were examined and classified according to the criteria of the AJCC (American Joint Committee on Cancer) for TNM stage and histological type and part of the tumor was frozen. Patients with favorable clinicopathological parameters (negative nodal status) did not receive adjuvant therapy according to valid protocol at that time. The rest of patients, predominantly with positive nodal status, received adjuvant hormonal therapy (tamoksifen). The course of the disease was followed from surgical intervention till relapse, so-called, relapse free survival (RFS). HER2 status (absence or presence of gene amplification) was determined on paraffin-embedded tumor tissue sections by chromogenic in situ hybridization (CISH). Concentrations of selected biomarkers (IL8, MMP2, MMP9) were determined in tumor tissue homogenates by ELISA. Nonparametric statistical tests were used for data analysis. Results: There were no statistically significant differences in the expression of selected biomarkers (IL8, MMP2, MMP9) between the subgroups of patients formed according to ER/PR/HER2 status (Mann-Whitney Rank Sum test, p>0,05). There was a statistically significant difference in the expression of IL8 between the subgroups of patients formed according to MMP9 median value (M=1,87 ng/mg). IL8 expression was significantly higher in patients with levels of MMP9 higher than the median value compared to patients with MMP9 levels lower than the median (p=0.008). A statistically significant negative correlation was found between ER and IL8 levels as well as between PR and IL8 levels (Spearman Rank Order Correlation test, p=0,02 and p=0,006, respectively). There were no statistically significant correlations between levels of hormone receptors and matrix metalloproteinases 2 and 9. A statistically significant positive correlation was found between IL8 and MMP9 levels (p<0,001). Untreated patients had significantly longer RFS compared to patients treated with hormonal therapy (Log Rank test, p=0,008). In the group of untreated patients, patients with smaller tumors (T<2cm) and invasive ductal carcinoma had significantly longer RFS compared to patients with larger tumors (T≥2cm) and invasive lobular carcinoma (p=0,03 and p=0,01, respectively). In the same group of untreated patients, patients with IL8 levels lower than the median value (M=88,82 pg/mg) had significantly longer RFS compared to patients with IL8 levels higher than the median (p=0,002). Furthermore, untreated patients with IL8–MMP2– and IL8–MMP2+ phenotypes had significantly longer RFS compared to patients with IL8+MMP2– phenotype (p<0,001 and p=0,02, respectively). When comparing RFS of untreated patients stratified in different phenotypes according to receptor status and median IL8 value (M=88,82 pg/mg), in all combinations of phenotypes patients with IL8– status had lower percentage of relapses as well as longer RFS compared to patients with IL8+ status, irrespective of ER/PR/HER2 status. Furthermore, patients with ER+IL8– phenotype had significantly longer RFS compared to those with ER+IL8+ and ER–IL8+ phenotypes (p=0,04 and p=0,02, respectively); patients with PR–IL8– phenotype had significantly longer RFS compared to those with PR–IL8+ and PR+IL8+ phenotypes (p=0,003 and p=0,02, respectively); and patients with HER2–IL8– phenotype had significantly longer RFS compared to those with HER2–IL8+ and HER2+IL8+ phenotypes (p=0,01 and p=0,02, respectively). When comparing RFS of untreated patients stratified in different phenotypes according to receptor status and median MMP2/MMP9 value (M=12,12 ng/mg for MMP2, M=1,82 ng/mg for MMP9), there were no statistically significant differences in terms of RFS in any combination of phenotypes. In the group of patients treated with hormonal therapy, patients with ER+ status had significantly longer RFS compared to those with ER– status (Log Rank test, p=0,04). None of the potential biomarkers, neither individually nor in combination, showed statistical significance for prediction of response (efficacy or resistance) to hormonal therapy. When comparing RFS of patients treated with hormonal therapy, stratified in different phenotypes according to ER/PR/HER2 status and median IL8 value (M=9,15 pg/mg), patients with ER+IL8– and ER+IL8+ phenotypes had significantly longer RFS compared to patients with ER–IL8+ phenotype (p=0,04 and p=0,02, respectively), but in all other combinations of phenotypes there were no statistically significant differences in terms of RFS. When comparing RFS of patients treated with hormonal therapy, stratified in different phenotypes according to receptor status and median MMP2/MMP9 value (M=11,55 ng/mg for MMP2, M=2,51 ng/mg for MMP9), there were no statistically significant differences in terms of RFS in any combination of phenotypes. Conclusions: Among clinicopathological parameters, tumor size and histopathological type showed prognostic significance in following the natural course of the disease. Among potential biomarkers only IL8 showed prognostic significance in following the natural course of the disease, and IL8 from tumor tissue could be a marker of unfavorable prognosis. In addition, IL8 proved as more reliable prognostic marker than receptor status (ER, PR, HER2) in untreated patients. None of the potential biomarkers, neither individually nor in combination, did not show significance for prediction of response to hormonal therapy. Concurrently, ER status proved as more reliable predictor of response to hormonal therapy compared to examined biomarkers. A significant negative correlation between levels of hormone receptors and IL8 confirmed that IL8 expression could be hormonally regulated. The absence of significant relations and correlations between levels of hormone receptors and matrix metalloproteinases 2 and 9, indicated that the expression of these enzymes was not hormonally regulated. The absence of significant relations between levels of examined biomarkers and amplification of HER2 gene indicated that HER2 did not influence the expression of selected biomarkers (IL8, MMP2, MMP9). A significant positive relation as well as correlation between IL8 and MMP9 levels indicated that the possible existence of positive feedback between IL8 and MMP9 might contribute to progression of hormone dependent breast cancer.

Analiza regulatornih regiona i ekspresija sgm gena bakterije Micromonospora zionensis

Analysis of regulatory regions and expression of the sgm gene from Micromonospora zionensis

Proizvodjac aminoglikozidnog antibiotika G-52, Micromonospora zionensis, poseduje sgm gen koji kodira 16$ rRNK metilazu cijom se ak'uvnoscu ostvaruje rezistencija na 4,6-disupstituisane dezoksistreptaminske aminoglikozide. Identifikovana su dva promotora uzvodno od kodirajuce sekvence sgm gena. Jedan promoter je reiativno slab i on otpocinje transkripciju od G nukleotida koji se nalazi 72 bp uzvodno od translacionog start kodona (ATG). Drug: promotor je mnogo jaci i Iociran je na vecoj udaljenosti od ATG kodona (~250 nukleotida). Postojanje ovih tandemskih promotora bi moglo da omoguci diferencijalnu gensku ekspresiju pa je postulirana njihova razlicita funkcija kod proizvodjaca. Tako 1e predlozeno da je slabiji P1 promoter odgovoran za konstitutivnu transkripciju sgm gena, dok je P2 zaduzen za ekspresiju nizvodnih (biosintetskih) gena u vreme kada otpocinje sinteza antibiotika. Prema tome, P2 promotor bi mogao biti potencijalno koristan za favorizovanu ekspresiju kloniranih gena u stacionarnoj fazi rasta micromonospora. Konstruisana je serija transkripcionih i translacionih sgm-Iacz genskih fuzija na plazmidu pPLti7G. Transkripcija obe vrste fuzija se odvija pod kontrolom snaznog PLtI promotora, posto promotori sgm gena nisu funkcionalni u bakteriji E. coli. Nivo ekspresiie lacZ gena u pojedinim transformantima sa transkripcionim ili translacionim fuzijama odredjivan je merenjem B-galaktozidazne aktivnosti. Transformanti sa translacionom fuznjom koji imaju i ekstra kopiju sgm gena bilo u cis iii u trans poziciji, pokazuju izrazit pad B-galaktozidazne aktivnosti. U slicnim eksperimentima sa transkripcionim fuzijama nije uocen znacajan efekat ekstra kopije sgm gena. Ovi rezultati su pokazali da je ekspresija sgm gena autoregulisana transiacionom represijom, najverovatnije zbog vezivanja metilaze za sopstvenu iRNK. Ekspresijom sgm gena u razlicitim sojevima aktinomiceta utvrdjeno je da je visok nivo rezistenqije na higromicin B zaista determinisan sgm genom, ali da je ispoljavanje ove rezistencije zavisno od soja u kome se sgm gen eksprimira. Ovaj podatak sugerira na zakljucak da ispitivani sojevi mikromonospora poseduju identican mehanizam rezistencije na higromicin. Iz toga se moze zakljuciti da mikromonospore najverovatnije poseduju odredjenu specificnost u gradji male subjedinice ribozoma koja je. konzervirana medju sojevima ovog roda.

The sisomicin-gentamicin resistance methylase (sgm) gene from Micromonospora zionensis (producer of 6-52antibiotic), encodes an enzyme thatmodifies 16S rRNA, and thereby conferring resistance to 4,6-disubstituted deoxystreptamine aminoglycosides. Two promoters were identified upstream of the sgm coding sequence. One promoter (Pi) is relatively weak and initiates transcription at the G which is 72 nucleotides upstream of the translational initiation codon (ATG). A second (P2) promoter is much stronger and is located more upstream from the ATG codon (~250 nucleotides). These tandem promoters could enable differential gene expression of the sgm gene, and it has been postulated that promoters have specialized functions in the producing organism. The apparent weak P1 promoter is probably responsible for constitutive transcription of the sgm gene, whereas the P2 promoter may play a specialized role in expressron of the downstream (biosynthetic) genes, during the time that the antibiotic (3-52 is produced. Therefore, P2 promoter could be potentially used in expressing cloned genes especially during the stationary growth phase of micromonospora. A set of transcriptional and translational fusions oi the sgm gene and the feel reporter gene have been constructed by using the pPLtl7G plasmid. Both transcriptional and translational fusions were transcribed under the strong PLtl promoter,since it has been shown that the sgm promoters are non-functional in E. coli. Transformants harbouring either the transcriptional and translational fusions were assayed for B-gaiactosidase activity. Translational fusion transformants which also carried an extra copy of sgm gene either in cis or in trans position, exhibited a substantial decrease in B-galactosidase activity. No significant effect was observed in comparable experiments with the transcriptional fusions. These results demonstrate that the expression of the sgm gene is regulated by translational autorepression, presumably due to methylase binding to the specific site/s on its own mFiNA. The translational repression model is discussed in light of overall control of the sgm gene expression. The expression of the sgm gene in various actinomycetes strains revealed that expression of high-level resistance to hygromycin B, determined by sgm gene, is background dependent. This evidence suggests that it may well be that ail tested micromonospora strains share a common mode of hygromycin B resistance. Factors that might be contributed to background-dependent expression of hygromycin B resistance are discussed.

Inter- i intrapopulaciona varijabilnost oblika lista Mercurialis perennis L. i delova cveta Iris pumila L.: uticaj heterogenih uslova svetlosti i antropogeno indukovanog stresa

Inter-and intrapopulation variability in leaf shape in Mercurialis perennis L. and flower parts Iris pumila L.: heterogenus light condition and anthropogenically induced sress.

Uticaj heterogenih uslova svetlosti i antropogeno indukovanog stresa (gaženja i aerozagađenja) na oblik i veličinu lista Mercurialis perennis i delova cveta Iris pumila, procenjen je primenom geometrijske morfometrije. Takođe je proučavan i uticaj navedenih faktora na varijabilnost osobina izdanaka M. perennis (visine biljke, broja listova i broja internodija). S obzirom na to da je M. perennis dvodoma biljka, analizirano je i prisustvo polnog dimorfizma i potencijalnih polno–specifičnih reakcija na suboptimalne uslove staništa. Uticaj heterogenih uslova svetlosti i aerozagađenja na stepen integracije oblika različitih delova cveta I. pumila procenjivan je na osnovu obrazaca korelacionih odnosa. Biljne vrste M. perennis i I. pumila su se u dosadašnjim istraživanjima pokazale kao pogodni model–sistemi za istraživanja u oblasti evolucione biologije biljaka. Šumski prosinac, Mercurialis perennis L. (Euphorbiaceae), je dvodoma višegodišnja zeljasta biljka, karakteristična pre svega za stara šumska staništa, primarna ili manje narušena, ali se može naći i na otvorenim, kao i na staništima pod jakim antropogenim uticajem. Kao dvodoma vrsta, predstavlja atraktivan objekat za proučavanje različitih aspekata polnog dimorfizma kod biljaka. Patuljasta perunika, Iris pumila L. (Iridaceae), je višegodišnja monokotila iz grupe geofita, karakteristična je pre svega za otvorena, uglavnom suva nizijska do brdska staništa. U ovo istraživanje uključene su populacije M. perennis sa lokaliteta Avala i Bele stene (Kopaonik), kao i populacije I. pumila sa lokaliteta Deliblatska peščara i Beograd. Pored toga, analizirani su i cvetovi I. pumila gajeni u eksperimentalnim uslovima jasno definisanog intenziteta i kvaliteta svetlosti. Analizirano je 90 biljaka M. perennis i 120 biljaka (ukupno 60 genotipova) I. pumila sa prirodnih staništa izloženih heterogenim uslovima svetlosti, 170 biljaka (33 genotipa) I. pumila gajenih u eksperimentalnim uslovima pod različitim svetlosnim tretmanima, kao i 119 biljaka M. perennis i 120 biljaka (41 genotip) I. pumila sa staništa izloženih različitom nivou antropogeno indukovanog stresa. Na osnovu rezultata ovog istraživanja utvrđeno je da su oblik i veličina listova M. perennis sa staništa pune dnevne svetlosti i staništa pod vegetacijskom senkom pokazali statistički značajnu varijabilnost. Listovi sa staništa pune dnevne svetlosti bili su širi i kraći, sa manjim vrednostima veličine centroida, nego listovi sa staništa pod vegetacijskom senkom. Biljke izložene antropogeno indukovanom stresu (gaženju usled rekreativnih aktivnosti) imale su kraće i šire listove, sa manjim vrednostima veličine centroida, u odnosu na biljke koje nisu bile izložene tom stresu. Značajan uticaj suboptimalnih uslova sredine uočen je za neke od analiziranih osobina izdanka. Biljke na staništu izloženom punoj dnevnoj svetlosti bile su značajno niže u odnosu na biljke na staništu pod vegetacijskom senkom, dok se broj listova i broj internodija nisu značajno razlikovali između staništa. S druge strane, biljke izložene antropogeno indukovanom stresu (gaženju) bile su značajno niže, ali sa većim brojem listova u poređenju sa biljkama koje nisu bile izložene tom stresu. Značajan polni dimorfizam kod M. perennis nije utvrđen za osobine oblik i veličina lista, kao ni značajna interakcija pola i staništa. Kada su u pitanju osobine izdanka, muške i ženske biljke sa staništa pune dnevne svetlosti i staništa pod vegetacijskom senkom značajno su se razlikovale u broju internodija (muške biljke su imale veći broj internodija na oba staništa), ali ne i u visini. Broj listova bio je značajno veći kod muških biljaka u odnosu na ženske na staništu pod vegetacijskom senkom. U uslovima različitog prisustva antropogeno indukovanog stresa (gaženja) značajan polni dimorfizam je dobijen za sve osobine izdanka M. perennis – ženske biljke bile su niže, i imale su manji broj listova i internodija na oba staništa. Heterogeni uslovi svetlosti na staništima su uticali na fenotipsku varijabilnost osobina oblika i veličine centroida delova cveta I. pumila (spoljašnjih listova perijanta – folova, unutrašnjih listova perijanta – standarda, i tučka). Na staništu pod vegetacijskom senkom, analizirani cvetovi su bili veći, imali su šire i kraće standarde i tučkove, a uže folove, u poređenju sa cvetovima sa staništa pune dnevne svetlosti. Različiti mikrosredinski uslovi unutar staništa su doprineli razlikama između populacija. U eksperimentalnim uslovima (niskog i visokog inteziteta svetlosti), veće vrednosti veličine centroida folova su dobijene za biljke poreklom sa staništa pod vegetacijskom senkom, u odnosu na biljke sa staništa pune dnevne svetlosti. Tučkovi poreklom sa staništa pod vegetacijskom senkom, u tretmanu niskog svetlosnog intenziteta imali su manje vrednosti veličine centroida, nego tučkovi poreklom sa staništa pune dnevne svetlosti. U oba tretmana, kraći i širi folovi i standardi, i uži tučkovi dobijeni su za populaciju poreklom sa staništa pod vegetacijskom senkom u poređenju sa delovima cvetova biljaka poreklom sa staništa pune dnevne svetlosti. Fenotipska varijabilnost oblika delova cvetova se razlikovala za svaku od populacija između svetlosnih tretmana. U tretmanu visokog svetlosnog intenziteta folovi poreklom sa staništa pune dnevne svetlosti imali veće vrednosti veličine centroida, nego u tretmanu niskog svetlosnog intenziteta, dok je kod standarda u istom poređenju dobijen suprotan obrazac. Cvetovi poreklom sa staništa pune dnevne svetlosti u tretmanu visokog svetlosnog intenziteta imaju kraće i šire folove i tučkove, i kraće standarde, u odnosu na delove cveta u tretmanu niskog svetlosnog intenziteta. U tretmanu visokog svetlosnog intenziteta, standardi poreklom sa staništa pod vegetacijskom senkom, imali su manje vrednosti veličine centroida, u odnosu na tretman niskog svetlosnog intenziteta, dok je kod tučkova u istom poređenju uočeno postojanje suprotnog obrasca. Cvetovi biljaka poreklom sa staništa pod vegetacijskom senkom, u tretmanu visokog svetlosnog intenziteta imali su kraće i šire folove i tučkove, i uže i duže standarde, u poređenju sa tretmanom niskog svetlosnog intenziteta. Razlike svetlosnih inteziteta nisu dovele do promena obrazaca korelacionih odnosa delova cveta, bili su slični dobijenim u prirodnim staništima i eksperimentalnim uslovima. Obrasci korelacionih odnosa između oblika delova cveta I. pumila zavisili su od heterogenih uslova svetlosti, kao i od prisustva antropogeno indukovanog stresa (aerozagađenja). Oblik folova i standarda je bio statistički značajno korelisan, kao i oblik folova i tučkova, unutar svakog od prirodnih staništa, u eksperimentalnim uslovima, kao i u urbanoj sredini izloženoj antropogenom stresu (aerozagađenju). Dobijeni rezultati ukazuju da se strukturni i funkcionalni odnosi između ovih delova cveta nisu značajno menjali u suboptimalnim uslovima sredine.

Impact of heterogeneous light conditions and anthropogenically induced stress (trampling and air polluton) on shape and size of leaves in Mercurialis perennis and flower parts in Iris pumila, was assessed by means of geometric morphometrics. The effect of mentioned factors on variability of shoot traits in M. perennis (plant height, number of leaves and internodes) was also explored. Since M. perennis is a dioecious plant, presence of sexual dimorphism and potential sex–specific reaction to suboptimal habitat conditions was investigated. The effect of heterogeneous light conditions and air pollution on degree of integration of shape of different floral parts of I. pumila was determined based on changes in patterns of covariation among mentioned structures. Mercurialis perennis and Iris pumila have proved themselves to be suited model systems in plant evolutionary biology research. Dog`s mercury, Mercurialis perennis L. (Euphorbiaceae), is a dioecious perennial forb, typical of ancient undisturbed woodlands, but it can also occur in open conditions and under strong antropogenic disturbance. As a dioecious herb, it represents an attractive object for research of different aspects of sexual dimorphism in plants. Dwarf iris, Iris pumila L. (Iridaceae), is monocot, perennial, geophyte typically inhabiting open, dry lowlands. This research included M. perennis populations from Avala and Bele stene (Kopaonik) as well as I. pumila populations from Deliblato Sands and Belgrade. Additionally, flowers of I. pumila grown under experimentally explicitly manipulated light intensity and quality conditions were analyzed. The study included a total of 90 M. perennis and 120 I. pumila plants (sum 60 genotypes) from natural habitat exposed to heterogeneous light conditions, 170 I. pumila plants (33 genotypes) grown under different light experimental treatments, as well as 119 M. perennis and 120 I. pumila plants (41 genotypes) from sites exposed to different levels of anthropogenically induced stress. Results show statistically significant difference in shape and size of M. perennis leaves from the open site and from the shade. The leaves from the open site were wider and shorter, with lower centroid size value compared to leaves from the shade. Plants exposed to anthropogenically induced stress (trampling during recreational activities) had shorter and wider leaves with lower centroid size value compared to leaves of plants that were not stressed. Suboptimal environmental conditions affected some of the analyzed shoot traits. Light exposed plants were significantly shorter compared to the plants from the shade, whilst number of leaves and internodes did not differ. On the other hand, plants subjected to anthropogenically induced stress (trampling) were significantly shorter with higher number of leaves compared to the plants that were not exposed to the same stress. Sexual dimorphism was not detected in shape and size of leaves in M. perennis, nor was sex and site interaction signifficant. Male plants from both open and shade had signifficantly higher number of internodes compared to the females, however they were not higher. Number of leaves was higher in males from the shade compared to the females from the same site. Under the influence of trampling all shoot traits in M. perennis exibited sexual dimorphism – the females had shorter stems with lower number of leaves and internodes. Phenotypic variability of shape and centroid size of flower parts of I. pumila (outer tepals – falls, inner tepals – standards, styles) was affected by heterogeneous habitat light conditions. Under vegetation shade the flowers were bigger, with wider and shorter standards and styles; and narrow falls compared to flowers from light exposed site. Microhabitat variances in conditions contributed to interpopulation differences. Plants grown under vegetation shade had higher centroid size of falls under both experimental treatments (low and high light conditions) compared to the falls of plants grown exposed to sunlight. Styles from plants grown under vegetation shade in low light treatment had lower centroid size value than styles from plants grown under full sunlight. In both treatments plants from vegetation shade had shorter and wider falls and standards with narrower styles compared to corresponding parts of plants grown under full sunlight. Phenotypic variability of shape of floral parts differed in each populations between light treatments. In high light treatment falls of flowers of plants grown in full daylight had higher centroid size values compared to the low light treatment, whilst in the same comparison for the standards the opposite pattern emerged. Flowers of plants grown under full daylight in high light treatment had shorter and wider falls and styles with shorter standards, compared to corresponding flower parts of plants under low light treatment. In high light treatment, standards of flowers from plants grown under vegetation shade had lower centroid size values compared to the low light treatments, whilst the same comparison showed the opposite pattern in styles. Flowers of plants grown under vegetation shade in high light treatment had shorter and wider falls and styles with narrower and longer standards compared to low light treatment. Light intensity differences did not cause change in pattern of correlations among flower parts, which were similar under both natural and experimental condition. Patterns of covariations among shape of flower parts I. pumila were influenced by heterogenous light conditions as well as anthropogenically induced stress (air pollution). Falls and standard shapes were statictically correlated, same applied to falls and styles at natural habitats and urban habitat exposed to anthropogenically induced stress (air pollution) as well as in experimental conditions. These results indicate that structural and functional relations among flower parts did not suffer significant alterations under suboptimal environmental conditions.

Varijante u genima za editovanje RNK, serotoninski receptor 2C i triptofan-hidroksilazu 2 kao faktori rizika za pokušaj samoubistva kod psihijatrijskih bolesnika

Variants in RNA editing, serotonergic receptor 2C and tryptophan-hydroxylase 2 genes as risk factors for suicide attempt in psychiatric patients

Samoubilačko ponašanje predstavlja globalni zdravstveni problem s obzirom da oko milion ljudi godišnje izvrši samoubistvo, a efikasne mere prevencije ili lečenja ne postoje. Kao i drugi složeni fenotipovi, etiologija samoubilačkog ponašanja vezuje se za brojne genetičke i sredinske faktore rizika i njihove međusobne interakcije. Pokušaj samoubistva je često, ali ne i nužno, povezan sa psihijatrijskim oboljenjima i stresnim događajima tokom života, kao što su stresni događaji iz detinjstva i akutni stresni događaji. Neurobiološka istraživanja ukazuju na hipofunkciju serotoninskog sistema kod osoba sa samoubilačkim ponašanjem. Editovanje RNK deaminacijom adenozina u inozin, katalizovan enzimima ADAR i ADARB1, doprinosi finoj i dinamičnoj regulaciji i održavanju optimalne serotoninske transmisije kroz editovanje transkripata za triptofan- hidroksilazu 2 (TPH2), enzima koji katalizuje sintezu serotonina u mozgu, i transkripata za postsinaptički serotoninski receptor 2C (HTR2C). Cilj ove doktorske teze je identifikacija varijanti u genima TPH2, HTR2C, ADAR i ADARB1, stresnih životnih događaja i njihovih međusobnih interakcija koje mogu napraviti razliku između psihijatrijskih bolesnika koji su pokušali samoubistvo i onih koji to nikada nisu uradili. Studija je uključila 353 psihijatrijska bolesnika sa dijagnozom depresivnog poremećaja, bipolarnog afektivnog poremećaja i shizofrenije, od kojih je 165 pokušalo samoubistvo, dok njih 188 nije. Stresni događaji iz detinjstva i akutni stresni događaji procenjeni su korišćenjem upitnika Early Trauma Inventory–Self Report i List of Threatening Experiences Questionnaire, redom. Primenom Pirsonovog 2–testa i logističke regresije testirane su potencijalne pojedinačne asocijacije stresnih događaja tokom detinjstva, akutnih stresnih događaja, 23 tag varijante gena ADAR i ADARB1, varijanta rs6318 gena HTR2C i varijante rs7305115 i rs4290270 gena TPH2 sa pokušajem samoubistva. Generalizovani linearni modeli i selekcija unazad primenjeni su za ispitivanje udruženih efekata pojedinačnih faktora i njihovih interakcija na rizik za pokušaj samoubistva, uključujući psihijatrijske dijagnoze, pol i starost bolesnika kao konfaunderi. Opšte traume i emocionalno zlostavljanje tokom detinjstva, akutni stresni životni događaji, rs9983925 i rs4819035 gena ADARB1, haploblok rs9637192-rs2253763- rs4819035 iz 3' kraja gena ADARB1, kao i rs6318 gena HTR2C identifikovani su kao pojedinačni faktori rizika za pokušaj samoubistva u ispitivanom uzorku psihijatrijskih bolesnika. Ispitivanjem udruženog efekta pojedinačnih i interaktivnih efekata sredinskih i genetičkih faktora rizika ustanovljena su dva najbolje fitovana minimalna modela koja bi mogla identifikovati psihijatrijske bolesnike sa povećanim rizikom za pokušaj samoubistva. Jedan model obuhvatio je udruženi efekat emocionalnog zlostavljanja, akutnih stresnih događaja, rs9983925 gena ADARB1 i rs6318 gena HTR2C, kao pojedinačnih faktora rizika, i interakcije opštih trauma iz detinjstva sa psihijatrijskim dijagnozama i emocionalnim zlostavljanjem. Drugi model identifikovao je udruženi efekat opštih trauma iz detinjstva, kao pojedinačnih faktora rizika, dvostruku interakciju opštih trauma i rs4290270 gena TPH2 i trostruku interakciju opštih trauma, rs4290270 gena TPH2 i rs4819035 gena ADARB1. Rezultati studije ukazuju da geni ADARB1, HTR2C i TPH2 i kumulativno izlaganje različitim stresnim događajima tokom detinjstva i akutnim stresnim događajima ostvaruju udruženi efekat koji doprinosi predispoziciji za pokušaj samoubistva kod psihijatrijskih bolesnika, pre svega onih sa dijagnozom depresivnog poremećaja ili bipolarnog afektivnog poremećaja.

Suicidal behavior is a global health problem since about one million people per year commit suicide and there is no effective prevention or treatment. Like other complex phenotypes, etiology of suicidal behavior is associated with numerous genetic and environmental risk factors and their interactions. A suicide attempt is often, although not necessarily, associated with psychiatric disorders and stressful life events, such as childhood abuse and acute stressful life events. Neurobiological studies have indicated a hypofunction of the serotonin system in patients with suicidal behavior. RNA editing by deamination of adenosine to inosine, catalysed by ADAR and ADARB1 enzymes, contributes to fine and dynamic tuning and maintenance of an optimal serotonin transmission through the editing of transcripts encoded by the tryptophan-hydroxylase 2 (TPH2) and serotonin receptor 2C (HTR2C) genes. TPH2 is a rate limiting enzyme for serotonin synthesis in the brain, while HTR2C is a postsynaptic receptor. The aim of this doctoral thesis was to identify variants in the TPH2, HTR2C, ADAR and ADARB1 genes, individual stressful life events, and possible interaction among these factors that might help to differentiate between psychiatric patients who attempted suicide and those who did not. The study included 353 patients diagnosed with major depressive disorder, bipolar affective disorder and schizophrenia, of which 165 attempted suicide, while 188 did not. Childhood abuse and acute stressful life events were evaluated using the Early Trauma Inventory Self-Report questionnaire and the List of Threatening Experiences Questionnaire, respectively. Pearson’s 2–test and logistic regression were performed to test potential individual association of various domains of child abuse, acute stressful events, 23 ADAR and ADARB1 tag variants, HTR2C variant rs6318 and TPH2 variants rs7305115 and rs4290270 with attempted suicide. Generalized linear models and backward selection were applied to test the joint effect of individual and interacting effects of examined factors on suicide attempt, including psychiatric diagnoses, patients’ gender and age as potential confounders. Childhood general traumas and emotional abuse, acute stressful life events, ADARB1 rs9983925 and rs4819035, haploblock rs9637192-rs2253763-rs4819035 at the 3' end of the ADARB1 gene, and HTR2C rs6318 were identified as individual risk factors for suicide attempt in the examined sample of psychiatric patients. The examination of the joint effect of the individual and interactive effects of environmental and genetic risk factors revealed two best fitting minimal models which might identify psychiatric patients with an increased risk for suicide attempt. One model included the joint effect of emotional abuse, acute stressful events, ADARB1 rs9983925 and HTR2C rs6318 as individual risk factors and the two-way interactions of childhood general traumas with psychiatric diagnoses and with emotional abuse. Another model revealed the joint effect of childhood general traumas as individual risk factors, a two-way interaction of general trauma and TPH2 rs4290270 and a three-way interaction of general traumas, TPH2 rs4290270 and ADARB1 rs4819035. The results of this study indicate that ADARB1, HTR2C and TPH2 genes and a cumulative exposure to a variety of childhood and acute stressful events display a joint effect that contributes to a predisposition for suicide attempt in psychiatric patients, primarily in those suffering from major depressive disorder or bipolar affective disorder.

Kvantitativno kartografsko modeliranje zemljišnog pokrivača

Quantitative cartographic land cover modeling

Izazovi povezani sa stanjem životne sredine i klimatskim promenama značajno povećavaju potrebu različitih disciplina za adekvatnim podacima i informacijama koje imaju prostornu i vremensku dimenziju. Ove potrebe se mogu zadovoljiti isključivo kroz programe operativnog monitorina zemljišta koji uključuju kartiranje zemljišnog pokrivača. Operativni sistem za monitoring zemljišta zahteva integrisano korišćenje prikupljenih podataka, njihovu efikasnu i kontinuiranu transformaciju u korisne standardizovane i pravovremene informacije, njihovu asimilaciju u modele i njihovo korišćenje u procenama, kreiranju politike i sistemima za podršku odlučivanju. Trenutno dominantna paradigma kartiranja zemljišnog pokrivača se zasniva na sistemima kvalitativne klasifikacije pri čemu se prostor deli u entitete koji se pridužuju klasama iz prethodno ustanovljenog sistema klasifikacije. Osnovni problem tradicionalnih metodologija kartiranja zemljišnog pokrivača leži u činjenici da su izvedene informacije, kao proizvod klasifikacije, podložne konceptualizaciji kako kreatora tako i korisnika pri čemu se često ove konceptualizacije ne poklapaju. Harmonizacije i standardizacije kartiranja zemljišnog pokrivača kao pokušaji da se dođe do jedinstvene konceptualne ravni ne mogu suštinski da premoste ovaj problem. Rešenje se može tražiti u kvantitativnom modeliranju zemljišnog pokrivača. Predmet istraživanja ove disertacije predstavljaju koncept, zahtevi i mogućnosti kvantitativnog kartografskog modeliranja zemljišnog pokrivača u uslovima izražene potrebe za odgovarajućim, kvalitetnim i ažurnim informacijama o životnoj sredini i prirodnim resursima. Kako optički satelitski senzori predstavljaju osnovni izvor podataka za generisanje informacija o zemljišnom pokrivaču, istraživanje je fokusirano na kvalitet podataka satelitskog osmatranja Zemlje kao i kvalitet metoda modeliranja kvantitativnih parametara koje služe za opisivanje karakteristika pojava zemljišnog pokrivača. Kao sredstva kvantitativnog opisivanja osnovnih kategorija zemljišnog pokrivača: vegetacije, vode, zemljišta i veštačkih površina, analizirani su u praksi najčešće korišćeni spektralni indeksi i biofizički parametri. Spektralni indeksi su pogodni u kvantitativnom modeliranju jer su direktna funkcija satelitskih podataka, ali kako oni ne predstavljaju apsolutne biofizičke karakteristike pojava, njihova interpretacija je često problematična, posebno pri opisivanju vegetacije kao najkompleksnije kategorije. Sa druge strane, modeliranje biofizičkih parametara predstavlja izazov. Jednostavni empirijski modeli ocene biofizičkih parametara iz spektralnih indeksa opterećeni su značajnom nesigurnošću zbog čega nisu pogodni za operativnu upotrebu. Deterministički (fizički) modeli ocene biofizičkih parametara predstavljaju dobru teorijsku osnovu za operativno kartiranje, ali je potrebno poznavanje njihove nesigurnosti. Poseban fokus je stavljen na eksperimentalno ispitivanje nesigurnosti fizički modeliranih biofizičkih parametara za opisivanje vegetacije kao najkompleksnije kategorije zemljišnog pokrivača i to u zavisnosti od različitih izvora nesigurnosti...

Challenges related to environment and climate changes significantly increase demands of various disciplines for appropriate data and information that are spatial in nature. These needs can be fulfilled only through the programmes of operational land monitoring that include land cover mapping. An operational system for land monitoring requires integrated use of observations, their efficient and continual transformation into useful, standardized and timely information, their assimilation into models and their application in assessments, policy and decision making. The current dominant paradigm of land cover mapping is based on qualitative classification systems that separate the space into entities to which classes are then assigned. The major problem of the traditional land cover mapping methodologies lies in the fact that the extracted information, being products of classification, are subject to conceptualization of both the producers and the users. However, they do not often match. Initiatives for harmonization and standardization of land cover mapping are attempts to reach a common conceptual platform. Nevertheless, these solutions cannot essentially overcome the problem. The premise of this research is that the solution could be found in quantitative land cover modeling. The objective of the research is concept, requirements and possibilities of quantitative cartographic land cover modeling under conditions of increased demand for appropriate, quality and up-to-date information on the environment and natural resources. Since the optical satellite sensors are the primary data source for generating the land cover information, the research was focused on quality of both the Earth observation data and the methods of quantitative parameters modeling that serve for the description of land features’ characteristics. The most often used spectral indices and biophysical parameters that are considered instruments for quantitative description of basic land cover categories (vegetation, water, land and artificial surfaces) are analyzed. Spectral indices are suitable for quantitative modeling because they are direct function of satellite data. However, as they do not represent absolute biophysical characteristics of features, their interpretation is often problematic, especially in the case of describing vegetation as the most complex category. On the other hand, modeling of biophysical parameters is a challenge. Simple empirical models of biophysical parameters’ estimation from spectral indices are connected with significant uncertainty which makes them inappropriate for operational use. Deterministic (physical) models of biophysical parameters’ estimation are good theoretical basis for the operational mapping, but knowledge of the uncertainty is necessary. Special attention was paid to experimental assessment of uncertainty of physically modeled biophysical parameters of vegetation in terms of various uncertainty sources. The concept of operational quantitative land cover monitoring is also analyzed from the aspect of spectral and spatial heterogeneity of the Earth observation data. A system of organizing data and information by use of multiscale hierarchical reference grid is introduced with the grid structure adjusted to the major operational optical multispectral satellite sensors. Such a system enables the optimal use of available data and the possibility to apply object oriented analysis...

Izolacija, karakterizacija i ispitivanje probiotskih osobina autohtonih sojeva laktobacila

Isolation, characterization and investigation of probiotic properties of indigenous lactobacilli strains

Cilj ove doktorske disertacije je bio ispitivanje probiotskih osobina novih, autohtonih sojeva laktobacila izolovanih iz gastrointestinalnog trakta zdravih beba i uzoraka domaćeg kravljeg sira sa područja Gornjeg Milanovca. Ukupno je obrađeno 46 uzoraka (43 humanog i 3 poreklom iz sira) iz kojih su izolovana 143 bakterijska soja. Od ovog broja 120 izolata su bili Gram pozitivne koke, 15 izolata Gram pozitivni bacili i 8 izolata Gram negativni bacili. Pripadnost rodu Lactobacillus je potvrđena kod 8 izolata (7 humanog i 1 poreklom iz sira) za koje je pokazano da su katalaza negativni, nesporulativni Gram pozitivni bacili, sposobni da rastu na MRS podlozi u anaerobnim uslovima. Genotipska identifikacija je pokazala da izolati Lac1, Lac2, Lac6 i Lac7 pripadaju vrsti Lactobacillus plantarum, izolati Lac3 i 5s vrsti Lactobacillus casei, izolat Lac4 vrsti Lactobacillus paracasei i izolat Lac5 vrsti Lactobacillus gasseri. Iz daljih ispitivanja je isključen izolat Lac5 zbog slabog rasta na čvrstoj podlozi. Fiziološkom i biohemijskom karakterizacijom ispitivanih izolata pokazano je da se radi o nehemolitičnim, homofermentativnim vrstama koje rastu u širokom opsegu temperature (10-40ºC), koncentracije NaCl (2,0-6,5%) i pH vrednosti (2,0-8,0). Takođe, utvrđeno je da izolat 5s raste mnogo sporije u odnosu na ostale izolate. Izolati su pokazali visok stepen otpornosti na lizozim, kisele uslove sredine i prisustvo žučnih soli. Proteolitička aktivnost je detektovana samo kod izolata Lac1. Svi ispitivani izolati rastu u prisustvu fenola od 0,4%, a izolat Lac2 i pri koncentraciji od 1%. Ispitivanje osetljivosti na najčešće upotrebljavane antibiotike pokazalo je da su svi izolati rezistentni prema vankomicinu, amikacinu, gentamicinu i norflokscinu, a osetljivi prema ampicilinu i rifampicinu. Ni jedan od ispitivanih izolata nije pokazao osetljivost prema -amilazi, tripsinu, himotripsinu, pronazi E i katalazi. Ispitivanje osnovnih probiotskih osobina pokazalo je visok procenat (preko 79%) preživljavnja izolata u simuliranim uslovima gastrointestinalnog trakta. Osim toga, bezćelijski supernatanti svih izolata su pokazali antimikrobno dejstvo prema pojedinim Gram pozitivnim i Gram negativnim bakterijama, dok je ono izostalo prema kvascima i plesnima, kao i prema vrstama iz roda Lactobacillus. Ova poslednja osobina je značajna jer daje mogućnost kombinovanja dve i više vrsta u potencijalnoj proizvodnji probiotika. Antimikrobni efekat izostaje nakon neutralizacije bezćelijskog supernatanta, što pokazuje da se on pripisuje proizvodnji organskih kiselina i sniženju pH. Ispitivani izolati su pokazali srednji i visok stepen hidrofobnosti ćelijskog zida, a poseduju i sposobnost autoagregacije i koagregacije sa E. coli i L. monocytogenes. Prilikom ispitivanja sposobnosti adhezije izolata na HCT 116 ćelijsku liniju pokazan je umereni adhezioni potencijal. Dobijeni rezultati ukazuju na to da svi izolovani sojevi poseduju probiotske osobine, pri čemu se među njima izdvajaju Lac 6 i Lac7 (oba L. plantarum), kao izolati sa najvišim stepenom preživljavanja u humanom gastrointestinalnom traktu i najširim antimikrobnim spektrom, kao i izolati 5s (L. casei) i Lac2 (L. plantarum) koji su pokazali najviši adhezioni potencijal.

The aim of this Doctoral thesis was to investigate the probiotic properties of new, indigenous lactobacilli strains isolated from the gastrointestinal tract of healthy babies and homemade cheese samples originating from the area of Gornji Milanovac. We collected 46 samples (43 of human and 3 of dairy origin), from which 143 bacterial strains were isolated. Among them, 120 isolates were identified as Gram positive cocci, 15 isolates as Gram positive bacilli and 8 isolates as Gram negative bacilli. We showed that 8 isolates (7 of human and 1 of dairy origin) were catalase-negative, Gram positive bacilli that do not form spores and are able to grow on MRS medium in anaerobic conditions, and confirmed that they belong to the genus Lactobacillus. Genotypic identification showed that isolates Lac1, Lac2, Lac6 and Lac7 belong to the species Lactobacillus plantarum, isolates Lac3 and 5s to the Lactobacillus casei, Lac 4 to the Lactobacillus paracasei and isolate Lac5 to the Lactobacillus gasseri. Isolate Lac5 was excluded from further studies due to its poor growth on agar medium. Physiological and biochemical characterization showed that all isolates were nonhemolytic, homofermentative species, growing in a wide range of temperature (10 to 40ºC), NaCl concentration (2.0 to 6.5%) and pH (2.0 to 8.0). Comparing to the other isolates, the 5s grew slower. The isolates showed high degree of resistance to lysozyme, acidic environmental conditions and the presence of bile salts. Only Lac1 isolate possessed proteolytic activity. All isolates grew in the presence of 0.4% phenol and Lac2 even at its concentration of 1%. Investigation of isolates sensitivity to antibiotics showed that all isolates were resistant to vancomycin, amikacin, gentamicin and norfloxacin, but sensitive to ampicillin and rifampicin. All tested isolates showed no sensitivity to α- amylase, trypsin, chymotrypsin, pronase E and catalase. Investigation of probiotic properties showed that isolated strains survived in high percentage (over 79%) in simulated conditions of gastrointestinal tract. Additionally, all isolates showed antimicrobial effect against certain Gram positive and Gram negative bacteria, but not against yeasts and molds. No antimicrobial effect was detected against other species of the Lactobacillus genus. This last feature is important because it gives the possibility of combining two or more species in the potential probiotic product. There was no antimicrobial effect after neutralization of cell-free supernatant, indicating that this feature can be attributed to the production of organic acids and lowering of the pH. The tested isolates showed medium and high degree of hydrophobicity of the cell wall, the ability of auto-aggregation, and also of co-aggregation with E. coli and L. monocytogenes. Moderate adhesion potential was detected when we investigated the ability of isolates to adhere to HCT 116 cell line. The obtained results indicate that all isolated strains do possess probiotic properties, but isolates Lac 6 and Lac7 (both L. plantarum) could be marked as the most prosperuous ones, due to their highest level of survival in the human gastrointestinal tract and the broadest antimicrobial spectrum, as well as isolates 5s (L. casei) and Lac2 (L. plantarum), due to their pronounced adhesion potential.

Prirodne i antropogene vrijednosti u funkciji razvoja turizma na primjeru regije Birač

Natural and anthropogenic values in tourism development on Birac region example

Regija Birač predstavlja složenu cjelinu koja se odlikuje različitim prirodnim zakonomjernostima i antropogenim uticajima. Birač čini administrativno uokvireni prostor sedam opština u prostornom sistemu potencijalnih i dijelom aktiviranih prirodnih i antropogenih turističkih vrijednosti. Ključna slabost razvoja turizma u organizacionom smislu jeste nedostatak odgovarajuće institucionalne infrastrukture. Turističke organizacije republike, regije i opština, treba da stvaraju sistemska operativna rješenja za realizaciju potencijalnih mogućnosti u regionalnom, međuregionalnom i širem prostoru. Materijalnu bazu kao bitan elemenat turističkog razvoja treba unapređivati poboljšanjem kvaliteta turističko-ugostiteljskih kapaciteta kroz planski koncept obnove i osavremenjivanja smještajnih kapaciteta i izgradnje novih koji mogu zadovoljiti potrebe i zahtjeve turističke potražnje. Opštinama Birča nedostaje inventarizacija i kategorizacija privatnog smještaja, gdje bi se na bazi zbirnih podataka mogla napraviti kvalitetna ponuda smještaja u kućnoj radinosti. Razvoj turizma podrazumijeva usaglašavanje održivog modela ekonomskog razvoja, usaglašen razvoj sa ostalim korisnicima prostora na osnovu planske prostorne organizacije i uvažavanje ekoloških standarda. Tranzitni turizam je poseban vid turizma kojem se u Birču treba posvetiti veća pažnja zbog sve veće mobilnosti turista da se udobnije i brže kreću, potrebno je udovoljiti njihovim zahtjevima i na putu do krajnjeg odredišta. Turistička propaganda i drugi vidovi medijskog predstavljanja su bitan segment ukupnog turističkog razvoja i komunikacije sa stanovništvom i potencijalnim turistima. Izradnjom jedinstvene turističke karte za regiju Birač i ostalim propagandnim materijalom obogatilo bi se prezentovanje ovog prostora. Značajna je i uloga medija koja se odnosi na razvijanje ekološke kulture i odnosa stanovništva prema kulturnom nasljeđu. Poštujući savremene ekološke standarde stvoreni su uslovi da se u skladu sa lokalnim ekološkim planovima može računati na bitne perspektive za razvoj eko-turizma koji svoju afirmaciju stiče kao komplementarni segment sa drugim granama, a posebno sa etno-turizmom. Turizam kao djelatnost u Birču treba posmatrati kao značajnu privrednu granu koja sa osnovama prirodnih i antropogenih vrijednosti ovaj geoprostor izdvaja van lokalnih i regionalnih okvira sa tendencijom postepenog primanja odlika turističke regije...

Summary The region of Birac is a complex unity which is specific for its different natural regularities and anthropogenic influences. Birac is consistent of seven administratively connected municipalities within territorial system of potential and partly activated natural and anthropogenic tourist assets. The key of underdeveloped tourism, concerning organization, lies in the lack of suitable institutional infrastructure. The republic, regional and municipality tourist organizations need to provide a systematic and workable solution to realization of potential possibilities in regional, interregional and wider area. The material base, as important element of tourist development, needs to be improved by making better tourist offer using planed concept of renovation and improvement of accommodation capacities as well as building new ones which can satisfy all the needs of tourist requirements. Every municipality lacks inventory and categorization of private accommodation, where, using the base of summarized data, we could provide a highquality accommodation offer in the households. The development of tourism implies adjustment of sustainable model of economic development, coordinated development with the inhabitants of the area based on a planed organization of the space usage in compliance with ecological standards. Transit Tourism is a special type of tourism to whom in the Birac region should be granted more attention because of the growing mobility of tourists, in order to provide the tourists with better and more comfortable accommodation on their way to their destinations. Tourist propaganda as well as other means of media attention is a very important part of overall tourist development and communication with the citizens and potential tourists. Making the unique tourist map for the Birac region as well as using other propaganda material would improve presentation of this area. The role of the media is also important for developing ecological culture and public's atitude toward cultural heritage. Based on the local ecological planes, by complying the modern ecological standards the conditions that we can rely on important perspectives for development of eco-tourism, that gets its affirmation as a complementary part along with the other branches, and especially ethic-tourism, are made. Tourism in Birac region should be treated as an important part of economy, which with its natural and anthropogenic assets puts this geographical area out of its local and regional frames, providing the tendency for gradual development of it into tourist region...

Fizičkogeografski faktori vodnog bilansa i mogućnosti održivog korišćenja vodnih resursa u slivu Timoka

Physical geographic factors of the water balance and the possibilities for a sustainable use of water resources in the Timok River basin

Osnovni cilj istraživanja u okviru ove disertacije je postavljanje naučno relevantnih, teorijsko ispravnih i aplikativno prihvatljivih osnova vrednovanja fizičkogeografskih faktora vodnog bilansa u funkciji održivog korišćenja vodnih resursa u slivu Timoka. Zadaci istraživanja se, pre svega, odnose na iznalaženje najrelevantnijih uzročno-posledičnih veza i odnosa faktora prirodne sredine i vodnih resursa, kao i vodnih resursa i njihovog održivog korišćenja. Poznavanje elemenata rečnih režima i bilansa predstavlja neophodan preduslov optimalnog korišćenja površinskih voda. S obzirom na složenost i obim predmeta istraživanja, u radu je postojala potreba za primenom odgovarajućih metoda pogodnih za postavljanje polaznih hipoteza, dokazivanje stavova, proveravanje i oblikovanje naučnih zaključaka do kojih se u radu želelo doći. U radu se težilo svojevrsnom doprinosu metodologiji i unapređenju logičko-saznajnog postupka pri čemu su objektivnost, preciznost i praktična primenjivost dobijenih rezultata bili u fokusu. Doprinos je dat opisivanjem, sistematizacijom, objašnjenjima i novim podacima, kao i činjenicom da se vodni bilans i održivo korišćenje vodnih resursa posmatraju u prostornom kontekstu i u uzročno-posledičnom odnosu međuzavisnosti. Vodni režim je analiziran na osnovu podataka izmerenih na 10 hidroloških stanica u slivu. Analiza srednjemesečnih i godišnjih vodostaja reka u slivu je pokazala da je kontinualnost kretanja vodostaja tokom godine uslovljena zajedničkim dejstvom pluvijalnog i nivalnog činioca. Timok pripada rekama sa pluvio-nivalnim režimom umereno- kontinentalne varijante. Režim proticaja Timoka je u direktnoj zavisnosti od režima proticaja njegovih sastavnica, Belog i Crnog Timoka. Amplituda proticaja pokazuje da je maksimalni srednjemesečni proticaj 12,1 puta veći od minimalnog srednjemesečnog proticaja, što ukazuje na neujednačen režim proticaja. Urađena je prognoza obezbeđenja vode u rekama i dobijeni su maksimalni i minimalni proticaji za verovatnoće pojave od 0,01 do 99,9%. Na osnovu dobijenih rezultata konstruisana je kriva verovatnoće pojavljivanja malih i velikih voda za određene profile u slivu Timoka. Najizdašniji delovi sliva su izvorišta reka koja su u planinama i pod karstom. Raspored oticanja u slivu je nepovoljan, što se veoma loše odražava na korišćenje voda, jer je nje najmanje u onim delovima sliva gde su potrebe za vodom najveće. Raspored oticanja u toku godine po mesecima i godišnjim dobima vrlo je neujednačen i nepovoljan. Najmanje vode otiče i površinskim i podzemnim putem u leto i jesen, u avgustu, septembru i oktobru, a najviše u proleće, u martu i aprilu. U pojedinim delovima sliva odnos između površinskog i podzemnog oticanja je različit. Utvrđeno je da se sa porastom nadmorske visine sliva podzemni oticaj povećava na račun površinskog. Sa površine sliva Timoka otiče prosečno oko 23,56 m3/s vode, što na godišnjem nivou iznosi 743,55·106 m3 vode. To je oko 3 768 m3 vode godišnje na jednog stanovnika sliva. Srbija raspolaže sa 1 709 m3 sopstvene vode po stanovniku godišnje, što je 2,2 puta manje od raspoložive vode po čoveku u slivu Timoka. Ovo prividno veliko bogatstvo u količini površinske vode je manje rezultat velike izdašnosti sliva, koja je na nivou proseka za celu državu, a više malog broja stanovnika i male gustine naseljenosti, koja je dva puta manja od srednje gustine naseljenosti u Srbiji. Najveća gustina naseljenosti je u slivu Svrljiškog i Crnog Timoka, a posledica je uticaja gradova Knjaževca i Zaječara. Najmanja je u slivu Trgoviškog Timoka, jer je sliv ove reke razvijen na padinama Stare planine. Iz istih razloga, raspoloživa količina vode po stanovniku godišnje je daleko najveća u slivu Trgoviškog Timoka, oko 11 184 m3, a najmanja u slivu Svrljiškog Timoka, oko 3 006 m3, pa su nužne preraspodele vode, što se može postići usmeravanjem voda iz jednog u drugi sliv izgradnjom regionalnih vodoprivrednih sistema. Primena indikatora Srpski indeks kvaliteta vode i indeks eksploatacije vode može predstavljati značajan pomak u održivom korišćenju vodnih resursa u slivu Timoka. Njihova primena doprinosi sistematičnom prikupljanju relevantnih i kvalitetnih podataka za korišćenje u praktične svrhe. Društveni i privredni razvoj u slivu Timoka trebalo bi da bude praćen održivim razvojem vodnih resursa koji podrazumeva međusobnu zavisnost korišćenja voda, zaštite voda i zaštite od voda jer bi se time doprinelo celokupnom razvoju društva.

The main purpose of the body of research presented in this thesis is to establish scientifically relevant, theoretically correct and applicatively acceptable bases for the evaluation of physical geographic factors of the water balance with the aim of achieving a sustainable use of water resources in the Timok River Basin. The tasks of the study are primarily related to identifying the most relevant causal connections and relations between environmental factors and water resources, as well as those between water resources and their sustainable use. The knowledge of the elements of river regimes and balances is a necessary precondition for an optimal use of surface waters. Having in mind the complexity and the scope of the subject of research, it was necessary to apply appropriate methods in order to define the initial hypotheses, prove the postulates, test and shape scientific conclusions towards which this study has led us. This thesis seeks to contribute to the methodology and improve the logical cognitive procedure, while laying focus on objectivity, accuracy and practical applicability of the results. The contribution consists in descriptions, systematization, explanations and new data, as well as the fact that the water balance and sustainable use of water resources are analyzed in a spatial context, taking into account the causal relationship between interdependent variables. The water regime is analyzed on the basis of data measured at ten hydrological stations in the basin. The analysis of average monthly and annual water levels in the river basin has shown that continuous water level fluctuations during the year are a result of a joint effect of pluvial and nival factors. The Timok belongs to rivers with a moderately continental pluvio-nival regime. Its flow regime directly depends on the flow regimes of its constituent tributaries, the Beli Timok and the Crni Timok. The amplitude of the flow shows that the maximum average monthly flow is 12.1 times higher than the minimum average monthly flow, indicating an uneven flow regime. A river water security forecast has been performed and the maximum and minimum flows for the occurrence probabilities between 0.01 and 99.9% have been calculated. Based on the obtained results, the probability curve for the occurrence of low and high water levels for certain profiles in the Timok River basin has been constructed. The most water-abundant parts of the basin are the river sources located in mountains and under karst layers. The runoff rhythm in the basin is unfavourable, which has a very bad impact on water use, because those parts of the basin where there is the least water coincide with the areas where water needs are the greatest. The monthly and seasonal runoff distribution over a year is rather uneven and unfavourable. The surface and underground runoff is the lowest in summer and autumn – in August, September and October; it is the highest in spring – in March and April. In some parts of the basin, the relationship between surface and underground runoff is different. It has been established that with the increase of altitude underground runoff increases at the expense of surface runoff. The average surface runoff in the Timok basin is 23.56 m3/s, which annually amounts to 743.55·106 m3 of water, i.e. about 3 768 m3 of water annually per resident in the basin. Serbia now has 1 709 m3 of water per capita per year, which is 2.2 times less than the available water per capita in the Timok River basin. This seemingly great abundance in the amount of surface water is to a lesser degree a result of the great water abundance in the basin, which is approximately equal to the national average, but rather of the small population and low population density, which is two times lower than the average population density in Serbia. The population density is the highest in the basins of the Svrljiški Timok and the Crni Timok, due to the impact of the towns of Knjaževac and Zaječar. It is the lowest in the basin of Trgoviški Timok because the basin of this river is mainly located on the slopes of Stara Planina. For the same reasons, the amount of water available per capita per year is by far the largest in the basin of Trgoviški Timok – about 11 184 m3, and the lowest in the basin of Svrljiški Timok – about 3 006 m3. Accordingly, water redistribution is required and it can be achieved by directing water from one basin into another through regional water resources systems, which are yet to be constructed. The application of the indicators known as the Serbian Water Quality Index and Water Exploitation Index may be a significant improvement in sustainable use of water resources in the Timok basin. Their application contributes to the systematic collection of relevant and quality data for practical use. The social and economic development in the Timok River basin should be accompanied by a sustainable development of water resources, which implies an interdependence of water use, water protection and protection from water; this would contribute to an overall development of the society.

Signalni putevi estradiola uključeni u regulaciju ekspresije i aktivnosti inducibilne azot-monoksid-sintaze i natrijum-kalijum adenozintrifosfataze u srcu gojaznih ženki pacova

Estradiol signalling pathways involved in the regulation of inducible nitric oxide synthase and sodium-potassium-ATPase in the heart of obese female rats

Gojaznost je oboljenje povezano sa nizom patoloških stanja kao što su: rezistencija na insulin (IR), kardiovaskularne bolesti (KVB) i Diabetes Mellitus tipa 2 (DMT2). Povećana ekspresija i aktivnost inducibilne azot-monoksid-sintaze (iNOS; engl. Inducible Nitric Oxide Synthase) u srcu u stanju gojaznosti, moţe dovesti do apoptoze kardiomiocita i hipertrofije srca, dok sa druge strane gojaznost zdruţena sa IR doprinosi smanjenoj aktivnosti Na+/K+- ATPaze, što dovodi do smanjenja kontraktilnosti vaskulature i razvoja sistemske hipertenzije. Endogeni estradiol svojim delovanjem sprečava nastanak IR i hiperglikemije i ostvaruje pozitivne efekte na kardiovaskularni sistem (KVS), ali sinteza i kardioprotektivni uticaj estradiola mogu biti smanjeni usled razvoja gojaznosti. Estradiol ostvaruje kardioprotektivne tako što utiče na smanjenje ekspresije i aktivnosti iNOS, kao i povećanje ekspresije i aktivnosti Na+/K+-ATPaze, posredstvom različitih signalnih molekula i kinaza, kao što su: supstrat receptora za insulin 1 (IRS-1; engl. Insulin Receptor Substrate)/ fosfatidil-inozitol-3-kinaza (PI3K; engl. Phosphatidylinositide 3- Kinase)/ protein kinaza B (Akt; engl. Protein Kinase B), ekstracelularnim signalima regulisane kinaze 1 i 2 (ERK1/2; engl. Extracellular Signal-Regulated Protein Kinases 1 i 2) kao i RhoA (engl. Ras homolog gene family, member A)/ROCK (engl. Rho-associated protein kinase). Pored direktnog efekta na srce, estradiol posredno reguliše i njegovu funkciju tako sto utiče na metabolizam i transport glukoze i SMK, preko transportera glukoze (GLUT; engl. Glucose Transporters) i translokaze masnih kiselina (FAT; CD36 ; engl. Fatty Acid Translocase). Za izradu ove doktorske disertacije je korišćeno 16 adultnih ţenki pacova soja Wistar, podeljenih u dve eksperimentalne grupe. Prva grupa pacova je tokom 10 nedelja hranjena standardnom laboratorijskom hranom za pacove, dok je druga grupa pacova tokom 10 nedelja hranjena standardnom laboratorijskom hranom obogaćenom sa 42% masti (HF reţim ishrane). Nakon 10 nedelja pacovi su ţrtvovani, sakupljena je krv i izolovan je serum, a srca su ekstrahovana i delovi tkiva su korišćeni za izolovanje proteina i RNK. U serumu pacova je odreĎivana koncentracija estradiola, dok su u lizatu srca pacova odreĎivane koncentracije L- Arginina (L-Arg), NO i slobodnih masnih kiselina (SMK). Metodom qRT-PCR odreĎivan je nivo iRNK iNOS u srcu pacova. Aktivnost Na+/K+-ATPaze odreĎivana u plazma membranskoj frakciji proteina srca pacova. Korišćenjem Western blot metode odreĎivan je nivo proteina iNOS, NFkB-p50, ERα, p85 i p110 subjedinica PI3K, NDRG2, RhoA, ROCK1 i ROCK2 u lizatima srca. TakoĎe je u lizatima srca odreĎivan i nivo fosforilacije i ekspresije Akt i ERK1/2 kinaza kao i asocijacija IRS-1/PI3K. Nivo CD36, GLUT-1 i GLUT-4 odreĎivan je u plazma membranskoj frakciji i lizatu srca pacova, dok je ekspresija α1 i α2 subjedinica Na+/K+-ATPaze odreĎivana u plazma membranskoj frakciji srca pacova. Rezultati prikazani u ovoj doktorskoj disertaciji pokazuju povećanje fosforilacije Akt na Ser473, kao i ekspresije gena za iNOS na nivou iRNK i proteina u srcu gojaznih ţenki pacova. TakoĎe, u lizatu tkiva srca gojaznih ţenki pacova došlo je povećanja sledećih proteina: NFkB-p50, CD36, NDRG2, RhoA i ROCK2, dok je u membranskim frakcijama proteina došlo do povećanja nivoa CD36 i GLUT-4 transportera. Sa druge strane, kod gojaznih ţenki pacova zabeleţena je smanjena koncentracija estradiola u serumu. Dalje, u lizatu tkiva srca gojaznih ţenki pacova pokazana je smanjenja asocijacija IRS-1/PI3K-p85, kao i smanjen nivo ERα i ROCK1 proteina. Nivo α1 subjedinice Na+/K+-ATPaze u plazma membranskoj frakciji srca gojaznih ţenki pacova je bio smanjen, dok su nivo α2 subjedinice i aktivnost Na+/K+-ATPaze ostali nepromenjeni. Na osnovu dobijenih i prikazanih rezultata u okviru ove doktorske disertacije moţe se zaključiti da kao posledica inflamacije indukovane gojaznšću, kao i usled gubitka kardioprotektivih efekata estradiola, nastalog usled primene HF reţima ishrane dolazi do povećanja ekspresije i aktivnosti iNOS i posledične aktivacije RhoA/ROCK signalnog puta u srcu ţenki pacova. Aktivacija RhoA/ROCK signalnog puta dovodi do smanjenja asocijacije IRS-1 sa PI3K što na kraju dovodi do smanjenja α1 subjedinice Na+/K+-ATPaze u srcu ţenki pacova. Kompletno razumevanje mehanizama poremećene regulacije iNOS i Na+/K+-ATPaze je neophodno za razvoj adekvatne terapije u patofiziološkim stanjima gojaznosti, IR i hipertenzije. Istraţivanja obuhvaćena ovom doktorskom disertacijom doprinose sagledavanju molekulskih mehanizama kojima estradiol reguliše iNOS i Na+/K+-ATPazu u srcu ţenki pacova.

Obesity is associated with several pathological conditions such as: insulin resistance (IR), cardiovascular disease (CVD) and Diabetes Mellitus type 2 (DMT2). Obesity related inducible nitric oxide synthase (iNOS) overexpression could lead to cardiac hypertrophy, while on the other hand obesity induced IR contributes to the reduced Na+/K+-ATPase activity, leading to vascular contractility impairment and development of systemic hypertension. Endogenous estradiol prevents IR and hyperglycaemia and has protective effects on the cardiovascular system (CVS), but the synthesis and cardioprotective effect of estradiol can be reduced due to the development of obesity. Estradiol exerts cardioprotective effects by reducing the expression and activity of iNOS, as well as by increasing the expression of Na+/K+-ATPase activity by regulating the activity of signaling molecules and kinases, such as: insulin receptor substrate 1 (IRS- 1)/phosphatidylinositol-3-kinase (PI3K)/protein kinase B (Akt, PKB), extracellular signal regulated kinase 1 and 2 (ERK1/2) as well as RhoA (Ras homolog gene family, member A)/ROCK (Rho-associated protein kinase). Additionally, estradiol indirectly regulates CVS function by influencing the metabolism and transport of glucose and free fatty acids (FFA), through glucose transporter (GLUT) and FAT; CD36 (Fatty Acid Translocase). In this doctoral dissertation 16 adult female Wistar rats were used and divided into two experimental groups. The first group of rats was fed a standard chow for laboratory rats for 10 weeks, while the second group of rats was fed a standard chow for laboratory rats enriched with 42% fat (HF diet) for 10 weeks. After 10 weeks, the rats were sacrificed, blood was collected and the serum isolated, the hearts were collected, and its tissue fragments were used to isolate proteins and RNA. The concentration of estradiol was measured in serum, while concentrations of L-Arginine (L-Arg), NO and free fatty acids (FFA) were measured in the heart lysates. qRT-PCR method was used to measure the level of iNOS mRNA in rats’ hearts. Na+/K+-ATPase was measured in plasma membranes of rats’ hearts. Western blot was used to measure the level of the following proteins: iNOS, NFkB-p50, ERα, p85 and p110 subunits of PI3K, NDRG2, RhoA, ROCK1 and ROCK2 in heart lysates. The level of phosphorylation and expression of Akt and ERK1/2 kinases, as well as the IRS-1/PI3K associations, were determined in heart lysates. The levels of CD36, GLUT-1 and GLUT-4 were determined both in plasma membranes and heart lysates, while the expression of α1 and α2 subunits of Na+/K+- ATPase was determined in the plasma membranes of the rats’hearts. The results shown in this doctoral dissertation show an increase in the Akt phosphorylation at Ser473, as well as in the expression of the iNOS gene at the level of mRNA and protein, in the heart of obese female rats. Additionally, in the heart lysates of obese female rats, the following proteins were increased: NFkB-p50, CD36, NDRG2, RhoA and ROCK2, while in the plasma membranes there was an increase in the levels of CD36 and GLUT-4. On the other hand, serum estradiol concentration was decreased in obese female rats. Furthermore, in the heart lysates of obese female rat, there was a decrease in IRS-1/PI3K association, as well as in ERα and ROCK1 levels. The level of α1 subunit of Na+/K+-ATPase was reduced in the plasma membranes of the obese female rats’ hearts, while the α2 subunit and Na+/K+-ATPase activity remained unchanged. Based on the results presented in this doctoral dissertation, it can be concluded that, because of obesity-induced inflammation, as well as due to the loss of cardioprotective effects of estradiol, iNOS expression and activity increased, which consequently led to the activation of RhoA/ROCK2 signaling cascade. Activation of RhoA/ROCK2 pathway led to the reduction of IRS-1/PI3K association which eventually leads to a decrease in α1 subunit of Na+/K+-ATPase expression in the heart of female rats. Complete understanding of the mechanisms of disturbed regulation of iNOS and Na+/K+-ATPase is necessary for the development of adequate therapy in the pathophysiological conditions of obesity, IR and hypertension. Research included in this doctoral dissertation contributes to the examination of molecular mechanisms by which oestradiol regulates iNOS and Na+/K+-ATPase in the heart of female rats.

Ekološka analiza zajednica slatkovodnih makrobeskičmenjaka tri tipa tekućih voda na području Beograda

Ecological analysis of aquatic macroinvertebrate communities in three types of running waters in Belgrade region

Proučavanjem zajednica akvatičnih makrobeskičmenjaka tekućih voda na području Beograda u periodu 2007-2011. godina zabeleženo je 115 taksona iz 48 porodica, 8 klasa i 5 razdela. Istraživani vodotoci nalaze se pod velikim antropogenim stresom i prema važećem Pravilniku o parametrima ekološkog i hemijskog statusa površinskih voda i parametrima hemijskog i kvantitativnog statusa podzemnih voda (Službeni glasnik RS 74/2011), svrstani su u tri tipa i to: tip 1, vrlo velike ravničarske reke sa dominacijom finog nanosa – Dunav i Sava; tip 2, velike reke sa dominacijom srednje krupnog nanosa – Kolubara; i tip 3, male i srednje velike reke nadmorske visine do 500 m sa dominacijom krupnog nanosa – Topčiderska i Železnička reka. Istraživanja su vršena od 2007. do 2011. godine u periodu visokih voda (maj/jun) i niskih voda (septembar/oktobar). Takođe je korišćen i materijal prikupljen u periodu od 1996. do 2000. godine od strane istaživača laboratorije Odeljenja za hidroekologiju i zaštitu voda Instituta za biološka istraživanja "Siniša Stanković" Univerziteta u Beogradu. U tipu 1 vodotoka na području Beograda zabeležena su 63 taksona u Dunavu i 43 u Savi, sa dominacijom oligoheta. Najveći broj taksona zabeležen je u tipu 2 vodotoka, 78 taksona u Kolubari, sa dominacijom insekatske komponente u zajednici. U tipu 3 vodotoka, u Topčiderskoj i Železničkoj reci, zabeleženo je 25, odnosno 36 taksona, pri čemu je u Topčiderskoj reci dominirala grupa oligoheta, dok su u Železničkoj reci najveći udeo u zajednici imale hironomide. Poređenjem sa rezultatima prethodnih istraživanja, analizirane su promene u sastavu i strukturi zajednica u istraživanim tokovima. Rezultati multivarijantne analize ukazuju da je karakterističnoj distribuciji vrsta u sva tri tipa istraživanih vodotoka u najvećoj meri doprineo hemijski sastav sedimenta. Fizički i hemijski parametri vode su takođe, u velikoj meri, pokazali uticaj na zajednice akvatičnih beskičmenjaka. Uočeno je da je u velikim rekama efikasnije razmatrati vezu zajednice akvatičnih beskičmenjaka i višemesečne prosečne vrednosti fizičkih i hemijskih parametara vode, dok su u manjim vodotocima bujičnog karaktera trenutno izmerene vrednosti pokazale veći uticaj na zajednice akvatičnih beskičmenjaka. U toku istraživanja zabeležene su 34 vrste iz porodice Chironomidae. Najveći broj zabeleženih vrsta je iz potporodice Chironominae. U tipu 1 vodotoka dominirale su vrste Polypedilum scalaenum, Einfeldia pagana, Chironomus riparius i Ch. gr. plumosus, koje su pelofilne i karakteristične za rečni potamal. U tipu 2 vodotoka, dominantne su Procladius sp., C. riparius i Polypedilum scalaenum, dok u tipu 3 vodotoka dominiraju vrste iz rodova Chironomus i Cricotopus. Vrste Chironomus riparius, Ch. gr. plumosus, Procladius sp. i Cricotopus sylvestris zajedničke su za sva tri tipa vodotoka. Rezultati multivarijantne analize pokazuju da postoji jaka veza između zajednice hironomida i karakteristika sedimenta, naročito prisustva Zn, Pb i PAH. Među analiziranim parametrima vode se, kao najznačajniji faktori koji utiču na distribuciju hironomida u sva tri tipa vodotoka na području grada, izdvajaju nutrijenti (NH3 i NO2) i kiseonični parametri, dok u velikim rekama distribuciji hironomida značajno doprinosi i providnost vode.

During the survey of the communities of aquatic macroinvertebrates of rivers and streams in Belgrade region 115 taxa from 48 families, 8 classes and 5 phyla were detected. These waterbodies are under a high anthropogenic stress and, based on the Regulation on the parameters of the ecological and chemical status of surface waters and the parameters of the chemical and quantitative status of groundwater (Official Gazette of RS 74/2011), they are classified into three types: Type 1, large lowland rivers with the domination of fine bottom sediments – the Danube and the Sava River; Type 2, large rivers with the domination of medium sized sediments – the Kolubara River; and Type 3, small to medium sized rivers at elevation of up to 500 m, with the domination of the hard bottom substrate – the Topčiderska River and the Železnička River. The research was carried out from 2007 to 2011, in the period of high water levels (May/June) and of low water levels (September/October). Additional material, collected from 1996 to 2000 by researchers from the laboratory of the Department of Aquatic Ecology of the Institute for Biological Research "Siniša Stanković" of the University of Belgrade, was also included in the analyses. In the Type 1 watercourses in Belgrade region, 63 taxa were recorded in the Danube and 43 in the Sava River, with Oligochaeta as the dominant group. The largest number of taxa were identified in the Type 2 watercourses, 78 taxa in the Kolubara River, with the dominance of the insect component of the community. In the Type 3 watercourses, in the Topčiderska River and the Železnička River, 25 and 36 taxa were recorded, respectively. While Oligochaeta prevailed in the Topčiderska River, Chironomidae were the dominant group in the Železnička River. Changes in the composition and structure of communities in the studied streams were observed following the comparison with the previous findings. The results of a multivariate analysis indicate that the chemical composition of the sediment largely contributed to the characteristic distribution of species in all three investigated watercourses. Physical and chemical parameters of water also showed a significant impact on communities of aquatic invertebrates. Our results suggest that it is more effective to analyse the relation of the average values of chemical parameters across several months and macroinvertebrate assemblages in the case of large rivers, while for smaller size watercourses of torrential character, the current values of chemical parameters were better correlated with these communities and had a greater impact on them. During the survey 34 species from the Chironomidae family were recorded. The largest number of recorded species belonged to the subfamily Chironominae. In the Type 1 watercourses, dominant species were Polypedilum scalaenum, Einfeldia pagana, Chironomus riparius and Ch. gr. plumosus, which are pelophylous and characteristic for the river potamal. In the Type 2 watercourses, dominant species were Procladius sp., Ch. riparius and Polypedilum scalaenum, while in the Type 3 watercourses, the dominant species were from the genus Chironomus and Cricotopus. Ch. riparius, Ch. gr. plumosus, Procladius sp. and Cricotopus sylvestris are common for all three types of watercourses. The results of the multivariate analyse show that there is a strong connection between the chironomid community and the sediment characteristics, in particular the presence of Zn, Pb, and PAHs. Nutrients (NH3 and NO2) and oxygen parameters emerge as the most important factors among the analysed water parameters for the distribution of Chironomidae in all three types of watercourses in the city area, while in the large rivers, the distribution of Chironomidae is significantly influenced by the water transparency.

Karakterizacija ekstracelularnih proteina bakterija iz rodova Staphylococcus i Lactobacillus

Characterization of extracellular proteinases of bacteria from Staphylococcus and Lactobacillus genera

H, {(pfoQ)^ UNIVERZITET U BEOGRADU BIOLOŠKI FAKULTET Đorđe A. Fira KARAKTERIZACIJA EKSTRACELULARNIH PROTEINAZA BAKTERIJA IZ ROD OVA Staphylococcus I Lactobacillus Doktorska disertacija Beograd, 1998 MENTOR: dr Ljubiša Topisirović, redovni profesor, Biološki fakultet, Beograd. ČLANOVI KOMISIJE: dr Ljubiša Topisirović, redovni profesor, Biološki fakultet, Beograd. dr Draga Simić, redovni profesor, Biološki fakultet, Beograd. dr Jelena Knežević, vanredni profesor, Biološki fakultet, Beograd. DATUM ODBRANE: DATUM PROMOCIJE: DOKTORAT NAUKA: Ovaj rad je uraden u Institutu za Molekulamu genetiku i genetičko inženjerstvo pod rukovodstvom prof.dr Ljubise Topisirovića. Koristim ovu pri- liku da se zahvalim profesoru Topisiroviću na mnogobrojnim idejama, sugesti- jama i usmeravanju u eksperimentalnom radu, kao i na savetima koji su doprineli tome da ovaj rad dobije svoju konacnu formu. Zahvaljujem se, takode, prof, dr Dragi Simić i prof, dr Jeleni Knežević na kritickoj oceni ovog rada. Zahvaljujem se i dr Milanu Kojiću na visegodisnjoj saradnji i velikoj pomoći u toku eksperimentalnog dela ovog rada, mr Sinisi Đuraševiću na pomoći u obradi fmalne verzije teksta, kao i svima koji su na bilo koji nacin ucestvovali u realizaciji ovog rada. APSTRAKT K-Olekcija. prirodnih izolata bakterija. iz rodova Staphylococcus i Lactobacillus formi- rana je izolovanjem iz uzoraka prehrambenih proizvoda sa različitih lokacija, Kod svih izola- ta je testirana sposobnost sinteze ekstracelulamih proteinaza. Od 171 izolata stafilokoka detektovano je 55 proteolitički aktivnih izolata čije kulture izazivaju proteolitičku koagulaciju mleka. Specifičnost ekstracelulamih proteinaza stafilokoka u odnosu na frakcije kazeina je elektroforetski testirana i poredena sa delovanjem himozina na kazein. Proteinaze stafilokoka su tokom koagulacije mleka pored K-kazeina u visokom stepenu hidrolizovale i asi- i p- kazein, na osnovu čega je zaključeno da one ne bi mogle da posluže kao adekvatna zamena zahimozin, odnosno za proizvodnju sirila. Proteinaze izolata F22, F86, M l04, S2007 i S2105 su detaljnije biohemijski okarakterisane. Utvrdeno je da se radi o proteinazama relativno male molekulske mase (od 20 do 32 kDa) koje spadaju u prave ekstracelulame enzime, pošto se sa površine ćelije odvajaju u medijum za rast. Temperatumi optimum! ovih proteinaza se kreću od 30°C do 37°C, a pH optimum! u opsegu od 6,5 do 8,7. Joni bakra inhibiraju njihovu aktivnost, dok joni kalcijuma stimulišu aktivnost proteinaza iz izolata F22, M104 i S2007. Pored kazeinskih frakcija, proteinaze stafilokoka hidrolizuju i druge proteinske supstrate, kao sto su želatin i BSA. U eksperimentima sa proteinaznim inhibitorima utvrdeno je da pro­ teinaze izolata F22 i Ml 04 pripadaju serinskoj klasi, proteinaze S2007 i S2105 klasi metalo- proteinaza, dok proteinazu izolata F86 na o\'aj način nije bilo moguće klasifikovati. Od 75 prirodnih izolata mezofilnih laktobacila detektovano je 17 izolata koji sintetisu ekstracelulame proteinaze. Sve ove proteinaze pripadaju serinskoj klasi i hidrolizuju samo P* kazein, sa izuzetkom proteinaze soja Lactobacillus divergens BG742 koja hidrolizuje s\e tii kazeinske frakcije, i koja, za razliku od ostalih, najeflkasnije vrši hidrolizu supstrata na baznoj pH vrednosti. Totalna DNK sojeva Lactobacillus paracasei subsp. paracasei BGLil7 i BGLilS hibridizuje sa laktokokalnim proteinaznim probama. Restrikcione mape protemaznih regona ovih sojeva pokazuju visoku homologiju sa laktokokalnim proteinaznim regionima. Razdvajanje genomske DNK ovih sojeva na PFGE i hibridizacija sa laktokokalnim pro­ teinaznim probama pokazuje da su, za razliku od laktokoka, njihovi proteinazni legioni najverovatnije locirani na hromozomu.

H, {(pfoQ)^ UNIVERZITET U BEOGRADU BIOLOŠKI FAKULTET Đorđe A. Fira KARAKTERIZACIJA EKSTRACELULARNIH PROTEINAZA BAKTERIJA IZ ROD OVA Staphylococcus I Lactobacillus Doktorska disertacija Beograd, 1998 MENTOR: dr Ljubiša Topisirović, redovni profesor, Biološki fakultet, Beograd. ČLANOVI KOMISIJE: dr Ljubiša Topisirović, redovni profesor, Biološki fakultet, Beograd. dr Draga Simić, redovni profesor, Biološki fakultet, Beograd. dr Jelena Knežević, vanredni profesor, Biološki fakultet, Beograd. DATUM ODBRANE: DATUM PROMOCIJE: DOKTORAT NAUKA: Ovaj rad je uraden u Institutu za Molekulamu genetiku i genetičko inženjerstvo pod rukovodstvom prof.dr Ljubise Topisirovića. Koristim ovu pri- liku da se zahvalim profesoru Topisiroviću na mnogobrojnim idejama, sugesti- jama i usmeravanju u eksperimentalnom radu, kao i na savetima koji su doprineli tome da ovaj rad dobije svoju konacnu formu. Zahvaljujem se, takode, prof, dr Dragi Simić i prof, dr Jeleni Knežević na kritickoj oceni ovog rada. Zahvaljujem se i dr Milanu Kojiću na visegodisnjoj saradnji i velikoj pomoći u toku eksperimentalnog dela ovog rada, mr Sinisi Đuraševiću na pomoći u obradi fmalne verzije teksta, kao i svima koji su na bilo koji nacin ucestvovali u realizaciji ovog rada. APSTRAKT K-Olekcija. prirodnih izolata bakterija. iz rodova Staphylococcus i Lactobacillus formi- rana je izolovanjem iz uzoraka prehrambenih proizvoda sa različitih lokacija, Kod svih izola- ta je testirana sposobnost sinteze ekstracelulamih proteinaza. Od 171 izolata stafilokoka detektovano je 55 proteolitički aktivnih izolata čije kulture izazivaju proteolitičku koagulaciju mleka. Specifičnost ekstracelulamih proteinaza stafilokoka u odnosu na frakcije kazeina je elektroforetski testirana i poredena sa delovanjem himozina na kazein. Proteinaze stafilokoka su tokom koagulacije mleka pored K-kazeina u visokom stepenu hidrolizovale i asi- i p- kazein, na osnovu čega je zaključeno da one ne bi mogle da posluže kao adekvatna zamena zahimozin, odnosno za proizvodnju sirila. Proteinaze izolata F22, F86, M l04, S2007 i S2105 su detaljnije biohemijski okarakterisane. Utvrdeno je da se radi o proteinazama relativno male molekulske mase (od 20 do 32 kDa) koje spadaju u prave ekstracelulame enzime, pošto se sa površine ćelije odvajaju u medijum za rast. Temperatumi optimum! ovih proteinaza se kreću od 30°C do 37°C, a pH optimum! u opsegu od 6,5 do 8,7. Joni bakra inhibiraju njihovu aktivnost, dok joni kalcijuma stimulišu aktivnost proteinaza iz izolata F22, M104 i S2007. Pored kazeinskih frakcija, proteinaze stafilokoka hidrolizuju i druge proteinske supstrate, kao sto su želatin i BSA. U eksperimentima sa proteinaznim inhibitorima utvrdeno je da pro­ teinaze izolata F22 i Ml 04 pripadaju serinskoj klasi, proteinaze S2007 i S2105 klasi metalo- proteinaza, dok proteinazu izolata F86 na o\'aj način nije bilo moguće klasifikovati. Od 75 prirodnih izolata mezofilnih laktobacila detektovano je 17 izolata koji sintetisu ekstracelulame proteinaze. Sve ove proteinaze pripadaju serinskoj klasi i hidrolizuju samo P* kazein, sa izuzetkom proteinaze soja Lactobacillus divergens BG742 koja hidrolizuje s\e tii kazeinske frakcije, i koja, za razliku od ostalih, najeflkasnije vrši hidrolizu supstrata na baznoj pH vrednosti. Totalna DNK sojeva Lactobacillus paracasei subsp. paracasei BGLil7 i BGLilS hibridizuje sa laktokokalnim proteinaznim probama. Restrikcione mape protemaznih regona ovih sojeva pokazuju visoku homologiju sa laktokokalnim proteinaznim regionima. Razdvajanje genomske DNK ovih sojeva na PFGE i hibridizacija sa laktokokalnim pro­ teinaznim probama pokazuje da su, za razliku od laktokoka, njihovi proteinazni legioni najverovatnije locirani na hromozomu. Ključne reči: Staphylococcus, Lactobacillus, prirodni izolati, ekstracelulame pro­ teinaze, sirilo, kazein, inhibitor!, hibridizacija, laktokoke, homologija. ABSTRACT A collection of natural isolates from bacterial genera Staphylococcus and Lactobacillus is obtained from food samples which originate from different locations.The isolates have been screened for production of extracellular proteinases. Amongst 171 isolate of staphylococci, 55 of them are found to be proteolyticaly active, since their cultures proteolyticaly coagulate milk. Specificity of staphylococcal extracellular proteinases towards casein fractions has been analysed by electrophoresis and compared to the action of chymosin on casein. In the process of milk coagulation, staphylococcal proteinases, beside K-casein, significantly hydrolyzed asi- and (3-casein, which suggested that they could not be used as a substitute for chymosin in the commercial production of rennet. Biochemical characteristics of proteinases from isolates F22, F86, M l04, S2007 and S2105 have been studied more completely. It has been foud that these proteinases have relatively low molecular masses (from 20 to 32 kDa), an that they are released from the cell envelope in the growth medium. Their temperature optima are between 30°C and 37°C, since their pFl optima ranging from 6,5 to 8,7. Coper ions inhibit their activ­ ity, since the presence of calcium ions stimulates the activity of proteinases from isolates F22, M104 and S2007. Beside casein fractions, they also hydrolyze heterologous protein substrates, such as BSA and gelatin. Experiments with specific proteinase inhibitors revealed that pro­ teinases from isolates F22 and M l04 belong to the serine group of proteinases, S2007 and S2105 proteinases were classified as metaloproteinases, since the type of F86 proteinase in these experiments could not be determinated. Amongst 75 natural isolates of mesophilic lactobacilli, 17 of them are identified as extracellular proteinase producers. All these proteinases belong to the serine class and hydrolyze (3- casein only, except the proteinase from the strain Lactobacillus divergens BG742 which hydrolyze all three casein fractions, and which is, in contrast to others, more efficient at basic pH values. Total DNA from strains Lactobacillus paracasei subsp. paracasei BGLil7 and BGLil 8 hybridizes with the probes from lactococcal proteinase gene regions. On the basis of PFGE analysis of genomic DNA of these strains and hybridization with lactococcal pro­ teinase probes, it could be suggested that their proteinase gene regions are chroniosomaly located.

Filogenija, biogeografija i postembrionalno razviće predstavnika holarktičke porodice Anthroleucosomatidae Verhoeff, 1899 (Myriapoda, Diplopoda, Chordeumatida)

Phylogeny, biogeography and post-embryonic development of representatives of the Holartic family Anthroleucosomatidae Verhoeff, 1899 (Myriapoda, Diplopoda, Chordeumatida).

Holarktička porodica Anthroleucosomatidae jedna je od najheterogenijih i najproblematičnih porodica u okviru klase Diplopoda. U mnogim radovima je označavana kao „noćna mora“ i u mnogim slučajevima je služila kao „korpa za otpatke“ za taksone hordeumatida koji nisu mogli biti uvršteni u neke bolje definisane porodice. Stoga je ova disertacija fokusirana na rešavanju kompleksnih sistematskih, filogenetskih, biogeografskih i razvojnih odnosa među predstavnicima porodice Anthroleucosomatidae. Kako se radi o porodici sa mnogobrojnim premeštanjima taksona unutar i izvan nje, u uvodnom delu teze dat je kompletan, hronološki i taksativan istorijat proučavanja taksonomije i sistematike porodice Anthroleucosomatidae. Navedeni su svi taksoni koji su počev od 1876. pa zaključno sa 2016. godinom svrstavani u navedenu porodicu. U prvom delu ove doktorske disertacije, na osnovu čitavog niza relevantnih uporedno- morfoloških karaktera, kao i biogeografskih osobenosti, izvršen je rearanžman 35 rodova antroleukozomatida, sa ukupno 84 vrste, u 12 kompleksa rodova — Alloiopus, Anamastigona, Anthroleucosoma, Bulgarosoma, Caucaseuma, Dentatosoma, Enghoffiella, Flagellophorella, Herculina, Leschius, Ratcheuma i Vegrandosoma. Polovina ovih kompleksa uključuje samo po jedan rod, dok su tri monotipska. Za svaki kompleks je dat kratak opis njegovih pripadnika sa opisima najbitnijih uporedno-morfoloških karaktera, a pre svega strukture anteriornih i posteriornih gonopoda, kao i pregonopodalnih nogu kod mužjaka. U okviru nekih kompleksa izvršena je podela na nekoliko grupa vrsta. Ovi kompleksi predstavljaju osnovu za uspostavljanje suprageneričkih kategorija. Rodovi Bulgardicus, Camptogona i Ghilarovia su isključeni iz porodice Anthroleucosomatidae. Za određivanje filogenetskih odnosa između kompleksa rodova i unutar njih uključen je veći broj karaktera mužjaka, pre svega struktura njihovih gonopoda koja ima najveći informacioni značaj u filogenetskim razmatranjima. Dobro razvijeni telopoditi na gonopodama mužjaka smatraju se pleziomorfnim stanjem karaktera kod Diplopoda, pa je na osnovu njihovog prisustva ili odsustva, kao i strukture utvrđeno da postoji više filetičkih linija antroleukozomatida, čak i u okviru određenih kompleksa rodova. Na osnovu građe posteriornih gonopoda utvrđeno je da kompleksi Alloiopus i Anthroleucosoma predstavljaju bazalnu granu antroleukozomatida, dok su najizvedeniji Bulgarosoma i Leschius kompleksi. U nastavku teze fokus je na biogeografskim obeležjima predstavnika porodice Anthroleucosomatidae. Ova grupa ima široku, disjunktnu distribuciju u Holarktičkoj oblasti, sa centrima geneze i diverzifikacije na Balkanskom poluostrvu i širem prostoru Kavkaza. Od ukupno 12 kompleksa rodova, čak 10 je karakteristično za prethodno pomenute teritorije. Za svaki kompleks su ukratko data biogeografska obeležja rodova i vrsta sa distribucionim mapama. Kompleksi Alloiopus, Caucaseuma, Dentatosoma, Enghoffiella, Flagellophorella, Herculina, Ratcheuma i Vegrandosoma su endemični za teritoriju Kavkaza, dok su kompleksi Anthroleucosoma i Bulgarosoma endemiti karpato-balkanskog luka i Rodopa na Balkanu. Monotipski kompleks Leschius je jedini takson antroleukozomatida poznat iz Nearktičke regije u Severnoj Americi. Najširu distribuciju ima severno mediteranski kompleks Anamastigona koji uključujuje predstavnike nativne na Apeninskom i Balkanskom poluostrvu, mnogim ostrvima Grčke, na Kipru i Bliskom istoku, sa jednim predstavnikom antropogeno raširenim i u zapadnim regionima Evrope. Porodica Anthroleucosomatidae se karakteriše relativno visokim brojem kavernikolnih taksona, pri čemu je čak 15 rodova poznato samo iz podzemnih staništa. Utvrđeno je da je broj kavernikolnih taksona daleko veći na Balkanu (23 vrste iz 13 rodova) nego na Kavkazu (11 vrsta iz šest rodova). Svi podzemni predstavnici antroleukozomatida se mogu smatrati troglobiontima. Pored sistematskih, filogenetskih i biogeografskih odnosa unutar porodice Anthroleucosomatidae, pažnja je posvećena i njihovim razvojnim odnosima. Predstavnici ove porodice se karakterišu teloanamorfnim tipom postembrionalnog razvića, koji podrazumeva seriju sukcesivnih presvlačenja i dodavanje tačno određenog boja segmenata. Presvlačenje se zaustavlja na određenom stadijumu koji je uvek isti za pol i vrstu, i ujedno predstavlja adultni stadijum. Anthroleucosomatidae uključuju predstavnike sa 25, 27, 28, 29 i 30 pleurotergita. Broj pleurotergita je karakterističan za rod; izuzetak je rod Caucaseuma koji uključuje predstavnike sa 29, ali i jednog predstavnika sa 27 pleurotergita. Utvrđeno je da predstavnici sa 29 i 30 pleurotergita imaju osam presvlačenja i ukupno devet postembrionalnih stadijuma. Deveti stadijum je ujedno i adultni. Isti scenario najverovatnije karakteriše i predstavnike sa 28 pleurotergita. Predstavnici sa 25 i 27 pleurotergita imaju skraćenu teloanamorfozu koja uključuje sedam presvlačenja i osam postembrionalnih stadijuma. Analiza anamorfnog modela postembrionalnog razvića kod predstavnika ispitivane porodice i komparacija sa ostalim hordeumatidama, ukazuje da je evolucija teloanamorfoze kod nekih linija ovog reda diplopoda išla u pravcu kontrakcije.

The Holarctic family Anthroleucosomatidae is one of the most heterogeneous and problematical of families within the class Diplopoda. It is referred to as a “nightmare” in many publications, and in numerous cases it has served as a “wastebasket” for chordeumatid taxa that could not be relegated to some better defined families. For this reason, the present dissertation is focused on the resolution of complex systematic, phylogenetic, biogeographical and developmental relationships among representatives of the family Anthroleucosomatidae. Since we are here treating a family with frequent rearranging of taxa within and outside the family, a complete and exhaustive chronological history of study of the taxonomy and systematics of the family Anthroleucosomatidae is given in the introductory part of the thesis. This includes all taxa that have been placed in the family throughout its history, from 1876 to 2016. In the first part of this doctoral dissertation, a rearrangement of 35 genera of anthroleucosomatids with a total of 84 species into 12 complexes of the genera Alloiopus, Anamastigona, Anthroleucosoma, Bulgarosoma, Caucaseuma, Dentatosoma, Enghoffiella, Flagellophorella, Herculina, Leschius, Ratchema and Vegrandosoma is carried out on the basis of a whole series of relevant comparative-morphological characters and biogeographical characteristics. Half of these complexes include only one genus each, while three are monotypic. For each complex, a brief description of its members is given, together with descriptions of the most important comparative-morphological characters, above all structure of the anterior and posterior gonopods and pre-gonopodal legs in males. A division into several groups of species is carried out within some of the complexes. The given complexes represent the basis for recognition of suprageneric categories. The genera Bulgardicus, Camptogona and Ghilarovia are excluded from the family Anthroleucosomatidae. For determination of phylogenetic relationships between complexes of genera and within them, a large number of characters of males are taken into account, primarily characters of male gonopod structure having the greatest informational significance in phylogenetic deliberations. The existence of well developed telopodites on the gonopods of males is considered to be the plesiomorphic condition of the character in the Diplopoda, and on the basis of their presence or absence, as well as their structure, it is established that a number of phyletic lines of anthroleucosomatids exist, even within the framework of certain complexes of genera. On the basis of structure of the posterior gonopods, it is established that the Alloiopus and Anthroleucosoma complexes represent the basal branch of anthroleucosomatids, while the Bulgarosoma and Leschius complexes are the most advanced. In the next part of the thesis, the focus is on biogeographical characteristics of representatives of the family Anthroleucosomatidae. This group has a broad disjunct distribution in the Holarctic Region, with centers of genesis and diversification on the Balkan Peninsula and the wider area of the Caucasus region. Of the total of 12 complexes of genera, even as many as 10 are characteristic of the aforementioned territories. For each complex, biogeographical characteristics of the included genera and species are briefly presented, together with distribution maps. The Alloiopus, Caucaseuma, Dentatosoma, Enghoffiella, Flagellophorella, Herculina, Ratcheuma and Vegrandosoma complexes are endemic to territory of the Caucasus region, while the Anthroleucosoma and Bulgarosoma complexes are endemites of the Carpatho-Balkan Arc and Rhodope Mountains on the Balkan Peninsula. The monotypic Leschius complex is the only complex of anthroleucosomatids known from the Nearctic Region in North America. The complex with the widest distribution is the North-Mediterranean Anamastigona complex, which includes representatives native to the Apennine and Balkan Peninsulas, many of the Greek islands, Cyprus and the Middle East, with one representative having been spread by man in western regions of Europe as well. The family Anthroleucosomatidae is characterized by a relatively high number of cavernicolous taxa, and even as many as 15 genera are known only from underground habitats. The number of cavernicolous taxa is far greater on the Balkan Peninsula (23 species from 13 genera) than in the Caucasus region (11 species from six genera). All underground representatives of anthroleucosomatids can be considered troglobionts. In addition to systematic, phylogenetic and biogeographical relationships among members of the family Anthroleucosomatidae, attention is also paid to characteristics of their development. Representatives of this family are characterized by the teloanamorphic type of post-embryonic development, which involves a series of successive moults and addition of a precisely determined number of segments. Moulting stops at a definite stadium that is always the same for each sex and species and which represents the adult stadium. The family Anthroleucosomatidae includes representatives with 25, 27, 28, 29 and 30 pleurotergites. The number of pleurotergites is characteristic of each genus, with the exception of the genus Caucaseuma, which includes members with 29 pleurotergites and one representative with 27. It is established that representatives with 29 and 30 pleurotergites have eight moults and a total of nine post-embryonic stadia. The ninth stadium is the adult stadium. The same scenario is probably also characteristic of forms with 28 pleurotergites. Representatives with 25 and 27 pleurotergites have shortened teloanamorphosis that includes seven moults and eight post- embryonic stadia. Results of this thesis indicate that the evolution of teloanamorphosis in some lines of chordeumatids has proceeded in the direction of contraction.

Dinamička interakcija noseće strukture i kolica portalnih dizalica visokih performansi

Dynamic interaction between the structure and the trolley of high performance gantry cranes

U radu se analizira dinamičko ponašanje noseće konstrukcije portalne dizalice usled dejstva kolica kao pokretnog opterećenja. Dat je prikaz klasifikacije portalnih dizalica pri čemu su izdvojene portalne dizalice za kontejnerske terminale sa svojim visokih performansama koje imaju stalnu tendenciju poboljšanja. Prvo je dat koncept primene analitičkog pristupa za modeliranje noseće konstrukcije preko sistema elastičnih tela tipa prizmatične grede i razmatranje slobodnih poprečnih oscilacija. Kao savremen i pre svega neophodan, usvojen je kombinovani pristup za istraživanje naslovnog problema, tj. konačnoelementni pristup je iskorišćen za modeliranje noseće konstrukcije portalne dizalice a principi analitičke mehanike su iskorišćeni za modeliranje kolica. Razmatraju se dva najčešća konstrukciona tipa portalne dizalice za formiranje modela strukture. Kolica su obuhvaćena kroz model pokretne mase, model pokretnog oscilatora i kroz model pokretnog oscilatora sa klatnom koji predstavlja originalan model pokretnog opterećenja. Za svaki od modela je utvrđena dinamička interakcija između ovih sistema i postavljeni su matematički modeli koji predstavljaju sistem diferencijalnih jednačina drugog reda sa promenljivim koeficijentima. Rešenja su dobijena pomoću originalnih programa, na bazi metode direktne integracije‐ Njumarkove metode. Identifikacija i analize odziva su izvršene za dva realna primera portalnih dizalica. Istražen je uticaj brzine, ubrzanja/usporenja i težine kolica, kao i uticaj klaćenja tereta i elastične opruge u sistemu kolica. Dobijeni rezultati se mogu iskoristiti u početnim fazama konstruisanja portalnih dizalica koje imaju tendenciju da ostvare veoma visoke performanse, u smislu ostvarivanja boljeg uvida u dinamičko ponašanje.

The dynamics of a two‐dimensional gantry crane structure subjected to various types of moving load is examined in this work. First, the classification of gantry cranes is suggested and group of gantry cranes at container terminals are distinguished because of high performances which have tendency to become even better in near future. The analytical approach is introduced in modeling the gantry structure as continuous system with transverse vibrations. However, modern approach, i.e. combined finite element and analytical method is adopted to solve the title problem. Two types of structure of gantry cranes are considered. Three types of trolleys are implemented in calculation, i.e. moving mass, moving oscillator and moving oscillator with swinging payload as original model are considered as moving loads acting upon the structure of the gantry cranes. The interaction between the structure and each moving load model is derived and the governing equations for MDOF systems are obtained. The postulated equations, which are second order differential equations with time dependent coefficients, are solved with direct integration method‐Newmark method. The analysis is applied to two types of gantry cranes and dynamic responses are obtained for both the structure and the trolley. There are studied factors of moving loads such as magnitude, speed, acceleration, deceleration and factors within the trolley structure such as swinging of the payload and spring stiffness. Numerical results reveal that used approach is useful and can draw conclusions for structural design purposes of gantry cranes.

Uloga silicijuma u prevazilaženju nedostatka gvožđa kod krastavca (Cucumis sativus L.)

The Role of Silicon in Alleviation of Iron Deficiency in Cucumber (Cucumis sativus L.)

Nedostatak gvožđa (Fe) predstavlja jedan od glavnih ograničavajućih faktora u proizvodnji useva širom sveta, koji značajno umanjuje prinos i kvalitet. Sa druge strane, koristan efekat silicijuma (Si) na rastenje i razviće biljaka, posebno u uslovima stresa, dobro je poznat u literaturi. Cilj ove teze je bio da se prouči mehanizam kako Si ublažava stres izazvan nedostatkom Fe kod dikotiledonih biljaka (strategija I usvajanja Fe), o kome se do sada ništa nije znalo. Kao model biljka odabran je krastavac (Cucumis sativus L.) kao vrsta koja akumulira Si. Izvršena su detaljna izučavanja mobilnosti Fe u apoplastu, biosinteze jedinjenja koja mobilišu Fe i njegovog daljeg usvajanja na bazi redukcije u korenu, zajedno sa ekspresijom gena uključenih u te procese. U nadzemnom delu biljke, proučavana je remobilizacija Fe iz starijih u mlađe listove, tako što su paralelno mereni distribucija 59Fe u listovima na različitim pozicijama i koncentracija helatora nikocijanamina (NA), zajedno sa ekspresijom gena za nikocijanamin sintazu (NAS) uključenu u njegovu biosintezu i YSL (eng. yellow stripe-like) transporter koji posreduju u transportu Fe-NA floemom. Ishrana Si uticala je na povećanu akumulaciju Fe u apoplastu i Fe-mobilizirajućih jedinjenja u korenu, kao i na stimulaciju mašinerije za usvajanje Fe. U listovima, Si je uticao na relativnu distribuciju Fe povećavajući remobilizaciju Fe iz starijih listova zbog povećane akumulacije NA i ekspresije YSL1, što je pospešilo heliranje Fe i njegovu retranslokaciju u mlađe listove. Ova teza pruža, po prvi put, objašnjenje mehanizma koji Si ispoljava u prevazilaženju nedostatka Fe, a koji se sastoji u povećanju rezervi Fe u apoplastu korena, njegove mobilizacije i trasporta iz korenu u izdanak, kao i poboljšane remobilizacije iz starijih u mlađe listove.

Iron (Fe) deficiency represents a major limiting factor for crop production worldwide, affecting both crop yield and quality. Beneficial effect of silicon (Si) on plant growth and development, especially under stress conditions, is well documented in the literature. The objective of this thesis was to investigate the mechanisms of how Si ameliorates Fe deficiency in Strategy I plants, which has not been understood until recently. Cucumber (Cucumis sativus L.) was selected as a common model plant for Fe research and which is also known as a Si-accumulating dicot. Detailed analyzes of the dynamics of apoplastic Fe, biosynthesis of Fe-mobilizing compounds and reduction-based Fe acquisition were performed in roots along with the expression of relevant genes involved in these processes. At the shoot level, distribution of 59Fe was measured in the in leaves at different positions and developmental stages in parallel with the concentration of the Fe chelator nicotianamine (NA) and the gene expression of nicotianamine synthase (NAS) involved in its biosynthesis. The expression of yellow stripe-like (YSL) transporters mediating pholem transport of Fe-NA in shoot was also determined. Silicon nutrition increased the accumulation of apoplastic Fe and Fe mobilizing compounds in roots. In leaves, Si affected relative Fe distribution by enhancing Fe remobilization from old leaves via increased NA accumulation and expression of the YSL1, which stimulated Fe chelation and its retranslocation to younger leaves. This thesis for the first time elucidates the mechanism of Si-mediated alleviation of Fe deficiency stress, by increasing the root apoplastic Fe pool, enhancing its acquisition by roots and translocation to shoots and also remobilization of Fe from older to younger leaves.

Efekat kratkotrajnog gladovanja na ekspresiju insulina i insulinsku signalizaciju u hipotalamusu pacova

Effect of short-term fasting on insulin expression and insulin signaling in the rat hypothalamus

Gladovanje predstavlja stanje tokom kojeg nema unosa hrane, pa se stoga potrebe za energijom zadovoljavaju razgradnjom endogenih energetskih depoa. U zavisnosti od dužine trajanja gladovanje može narušiti energetsku homeostazu. Hipotalamus kao mesto integracije signala o energetskom statusu organizma ima veoma važnu ulogu u regulaciji energetske homeostaze. Prethodne studije su pokazale da tokom kratkotrajnog gladovanja dolazi do smanjenja koncentracije insulina u krvi, dok je u hipotalamusu detektovana povećana količina insulina. Ovo neočekivano saznanje otvorilo je mnogobrojna pitanja, stoga je predmet ove doktorske disertacije bio ispitivanje uticaja šestočasovnog gladovanja na ekspresiju insulina u hipotalamusu i ispitivanje adaptivnog značaja ovog fenomena. U ekperimentima su korišćeni mužjaci pacova Wistar soja. Jedna grupa životinja imala je neometan pristup hrani (ad libitum), a drugoj je hrana uklonjena u trajanju od šest sati. Analizirana je genska i proteinska ekspresija insulina u hipotalamusu. Pokazano je da nakon šest sati gladovanja dolazi do povećanja količine insulina, kao i povećanja ekspresije iRNK za insulin. Proinsulin i insulin su detektovani u neuronima periventrikularnog jedra hipotalamusa i u ependimskim ćelijama koje okružuju treću moždanu komoru. Koncentracija glukoze i insulina u krvi bila je smanjena nakon kratkotrajnog gladovanja dok je u cerebrospinalnoj tečnosti ostala nepromenjena. Nakon kratkotrajnog gladovanja zabeležena je povećana količina aktivnog insulinskog receptora u periventrikularnom jedru. Pored toga, u membranskoj frakciji proteina izolovanih iz hipotalamusa zabeleženo je povećano prisustvo GLUT1 (55kDa), izoforme karakteristične za endotelne ćelije, povećanje neuronskih GLUT2 i GLUT3, dok je količina astrocitne GLUT1 (45 kDa) izoforme i GLUT4 ostala nepromenjena. Nakon šestočasovnog gladovanja nije zabeležena koekspresija aktivnog insulinskog receptora i glukoznih transportera. Količina glikogena u hipotalamusu ostala je nepromenjena. Ukupna i fosforilisana forma proteina uključenih u PI3K-AKT/PKB signalni put (IRS1, pIRS1-Tyr612, IRS2, pIRS2-Ser731, mTOR i pmTOR-Ser2448) ostala je nepromenjena nakon šestočasovnog gladovanja. Nasuprot tome, iako je ukupna količina ERK1/2 bila smanjena, detektovano je povećano prisustvo aktivne forme ovih enzima. Na osnovu dobijenih rezultata može se zaključiti da tokom kratkotrajnog gladovanja dolazi do de novo sinteze insulina u periventrikularnom jedru hipotalamusa. Takođe, rezultati ukazuju da se u početnoj fazi gladovanja procesi preuzimanja glukoze od strane nervnih ćelija kao i sinteza glikogena u hipotalamusu odvijaju nezavisno od dejstva insulina. Na osnovu promena detektovanih u količini glukoznih transportera rezultati sugerišu da se u kratkotrajnom gladovanju neuronima daje prioritet u snadbevanju glukozom odnosu na astrocite. Nakon kratkotrajnog gladovanja iako je detektovana aktivacija insulinskog receptora, ne dolazi do aktivacije PI3K-AKT/PKB signalnog puta, ali je zabeležena aktivacija ERK1/2. Dodatnom analizom signalnih puteva nishodno od ERK1/2 ostaje da se otkrije koja je uloga aktivacije ERK1/2 i da li de novo sintetisani insulin tokom kratkotrajnog gladovanja doprinosi njihovoj aktivaciji.

Fasting, a condition characterized by the absence of food intake, requires that the endogenous fuel depots be depleted. Depending on its duration, fasting can disturbe energy homoeostasis. The hypothalamus is the major integrating center of central and peripheral signals regarding energy status, and thus plays an important role in the energy homeostasis maintenance. Having discovered that short-term fasting decreases insulin circulating levels while simultaneously increasing its hypothalamic content the main goal of this doctoral dissertation was set to examine effects of six-hour fasting on the insulin expression in the hypothalamus and elucidate their adaptive significance. One group of male Wistar rats had unrestricted access to food (ad libitum), while the other was subjected to six-hour fasting. The gene and protein hypothalamic insulin expression was analyzed. It was shown that, after six hours fasting, both insulin content and insulin iRNA expression were increased. The proinsulin positivity was detected in the neurons of the hypothalamic periventricular nucleus and in the ependymal cells surrounding the third ventricle. Furthermore, following the short-term fasting, increased amount of the activated insulin receptor in the same hypothalamic region was also observed. Additionally, the 55kDa endothelial GLUT1 expression was increased in the membrane fraction of proteins isolated from the hypothalamus. The same pattern was also detected in the case of the neuronal GLUT2 and GLUT3 isoforms, while the amount of the 45 kDa astrocytic GLUT1 and GLUT4 remained unchanged. After six-hour fasting, no co- expression of the activated insulin receptor and glucose transporters was observed. The glycogen amount and distribution in the hypothalamus remained unchanged. The amount of total and phosphorylated forms of IRS1, IRS2, PI3K and mTOR remained unaffected by fasting. However, there was a significant increase in the activated form of ERK1/2, although the total amount of these enzymes was reduced. In conclusion, de novo synthesis of insulin occurs during short-term fasting in the periventricular nucleus of the hypothalamus. Results indicate that in the initial stage metabolic response to fasting, glucose uptake and glycogen synthesis in the hypothalamus appear to be independent of the insulin action. Based on the changes in the amount of GLUTs, the results suggest that during short-term fasting neuronal glucose supply represents a priority over the one of astrocytes. Although there was an increase in the activation of the insulin receptor, the PI3K-AKT/PKB signaling pathway was not activated, but significant increase in the activation of ERK1/2 was detected. Further analysis of signaling pathways downstream of ERK1/2 are needed to explain the role of ERK1/2 activation and give answer to whether de novo synthesized insulin contributes to their activation during short-term starvation.

Uloga azot-monoksida u regulaciji ekspresije CXCL12 u eksperimentalnom autoimunskom encefalomijelitisu u pacova

The role of nitric-oxide in CXCL12 expression regulation in experimental autoimmune encephalomyelitis in rats

Multipla skleroza (MS) je hronična, inflamatorna, demijelinizirajuća i degenerativna bolest centralnog nervnog sistema (CNS), koja se najčešće javlja kod mlañih osoba. Smatra se da imunski sistem ima ključnu ulogu u patogenezi MS, odnosno da bolest nastaje usled autoimunskog odgovora usmerenog prema proteinima mijelinskog omotača. MS je veoma raznolika bolest u svom kliničkom ispoljavanju, što je najverovatnije posledica različitih molekulskih mehanizama koji su uključeni u njenu patogenezu. Usled destrukcije mijelinskog omotača i degeneracije aksona neurona, dolazi do deficita u motornim, senzornim i kognitivnim funkcijama obolelih, koji mogu biti prolaznog ili trajnog karaktera. Trenutnim terapijskim pristupima može se uticati na odlaganje pojave novih neuroloških ispada i može se usporiti hronično pogoršavanje stanja kod pacijenata, ali se ne omogućava njihovo izlečenje. Eksperimentalni autoimunski encefalomijelitis (EAE) je najčešće korišćeni eksperimentalni model za proučavanje patofiziologije MS. Upotreba ovog modela, koji oponaša autoimunsku patogenezu MS, dovela je do mnogih saznanja o mehanizmima neuroimunoloških procesa, to jest, o prelasku imunskih ćelija iz krvotoka u CNS, o njihovoj interakciji sa lokalnim ćelijama glije i neuronima i o sledstvenoj inflamaciji, kao istaknutom aspektu MS. Hemokini su citokini koji imaju ključnu ulogu u regulaciji migracije imunskih ćelija na mesto inflamacije prilikom odbrane organizma od patogena ili tokom patoloških imunskih procesa, poput MS. Hemokini najčešće stimulišu imunski odgovor privlačenjem ćelija imunskog sistema na efektorska mesta, meñutim neki od njh ispoljavaju i regulatorne ili antiinflamatorne uloge, poput CXCL12. CXCL12 deluje antiinflamatorno sprečavanjem prelaska autoreaktivnih imunskih ćelija iz perivaskularnog prostora u parenhim CNS-a, izazivanjem apoptoze autoreaktivnih T ćelija i stimulisanjem promene proinflamatornog karaktera ovih ćelija u antiinflamatorni. Sa druge strane azot-monoksid (NO) je molekul čija preterana produkcija od strane inducibilne sintaze azot-monokida (eng. iNOS) tokom neuroinflamacije može uzrokovati mnoge štetne efekte po tkivo CNS-a. Visoke koncentracije NO povećavaju propustljivost krvno-moždane barijere, deluju citotoksično na oligodendrocite i neurone i ometaju adekvatno sprovoñenje nervnih impulsa. U ovoj doktorskoj disertaciji ispitivana je uloga NO u regulaciji ekspresije CXCL12 u EAE-u u pacova podložnih njegovoj indukciji, Dark Agouti (DA), i pacova otpornih na njegovu indukciju, Albino Oxford (AO). U homogenatima kičmene moždine (HKM) na piku EAE-a detektovana je visoka ekspresija informacione RNK (iRNK) za CXCL12 kod AO pacova i niska kod DA pacova, što visoku ekspresiju ovog hemokina dovodi u vezu sa otpornošću na razvoj EAE-a. Sa druge strane ekspresija iRNK za iNOS, je bila visoka na piku EAE-a kod DA pacova i niska kod AO pacova, što implicira ulogu NO u razvoju EAE-a. Analizom koja je obuhvatila veliki broj uzoraka zdravih pacova i pacova u raznim fazama bolesti, uočen je odnos negativne korelacije izmeñu ekspresije iRNK za iNOS i CXCL12. Dalje, ispitivan je direktan uticaj NO na ekspresiju CXCL12 in vitro i in vivo. In vitro, NO je inhibirao ekspresiju iRNK za CXCL12 u malim krvnim sudovima (MKS) kičmene moždine i astrocitima. U astrocitima je NO inhibirao ekspresiju iRNK za CXCL12 smanjivanjem aktivacije p38 MAP kinaze. In vivo blokada aktivnosti iNOS u efektorskoj fazi EAE-a kod DA pacova dovela je do povećanja ekspresije iRNK za CXCL12 u HKM i MKS, kao i produkcije CXCL12 u tkivu kičmene moždine. Takoñe, blokada aktivnosti iNOS uslovila je slabije simptome EAE-a, potvrñujući ulogu NO u podsticanju neuroinflamacije. Ekspresija iRNK za CXCL12 bila je smanjena u HKM AO pacova nakon tretmana natrijum nitroprusidom, molekulom koji otpušta NO. Pored toga, ispitana je ekspresija iRNK za CXCL12-γ tokom EAE-a. Ekspresija ove izoforme takoñe je bila viša kod AO pacova u poreñenju sa DA pacovima. Zanimljivo je da je ova izoforma kod AO pacova najviše eksprimirana u vreme početka i oporavka od EAE-a kod DA pacova, za razliku od ekspresije ukupnog CXCL12, koji je najviše eksprimiran na piku EAE-a. Takoñe, NO je smanjivao ekspresiju CXCL12-γ in vivo i in vitro. Rezultati prikazani u ovoj doktorskoj tezi pokazuju da NO inhibira ekspresiju CXCL12 u neuroinflamaciji. Takoñe, ovi rezultati ističu mogućnost različitih, i možda komplementarnih uloga pojedinih izoformi hemokina CXCL12 u otpornosti na indukciju EAE-a kad AO pacova. Imajući u vidu višestruke štetne efekte preterane produkcije NO tokom inflamacije u CNS-u i, sa druge strane, mnoge efekte CXCL12 koji ograničavaju i smanjuju neuroinflamaciju, inhibitorni efekat NO na ekspresiju CXCL12 predstavlja još jedan škodljiv efekat ovog molekula u patološkim stanjima CNS-a. Iz pomenutih razloga potencijalni terapeutski pristupi, kojima bi se uticalo na smanjenje produkcije NO i sledstveno povećanje ekspresije CXCL12 u CNS-u, mogli bi da dovedu do ograničavanja autoimunskog odgovora prema CNS-u, i na taj način do smanjenja destrukcije tkiva CNS-a kod MS pacijenata.

Multiple sclerosis (MS) is a chronic, inflammatory, demyelinating and degenerative disease of the central nervous system (CNS) that occurs preferentially in young adults. Immune system plays a key role in its pathogenesis. It is considered that MS develops due to an autoimmune response directed against myelin sheet components. MS is a very heterogeneous disease in its clinical manifestations, which is most probably a consequence of diverse molecular mechanisms involved in its pathogenesis. As a consequence of myelin sheet destruction and axonal degeneration, transient or permanent deficits in motor, sensory and cognitive functions appear in MS patients. Therapies which are currently in use decrease the frequency and the severity of acute attacks and slow down the rate of neurological deterioration, but do not cure the patients. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is the most widely used experimental model for studying pathophysiology of MS. The use of this model, which mimics autoimmune pathogenesis of MS, led to many discoveries about neuroimmunological processes, such as egression of immune cells from the blood stream into the CNS, immune cell interaction with resident glial cells and neurons and subsequent inflammation, as an important aspect of MS. Chemokines are cytokines with a central role in regulation of immune cell migration at the site of inflammation during pathogen invasion and during pathological immune processes, such as MS. Most often, chemokines boost immune response by attracting immune cells at the effector sites. However, some chemokines, including CXCL12, exert regulatory or antiinflammatory roles. CXCL12 prevents egress of autoreactive immune cells from the perivascular space into the CNS parenchyma, induces autoreactive T cell apoptosis and stimulates shifting of proinflammatory phenotype of these cells towards antiinflammatory phenotype. On the other hand, nitric-oxide (NO) is a molecule whose excess production by inducible nitric-oxide synthase (iNOS) during neuroinflammation can cause numerous adverse effects in the CNS. High concentrations of NO can increase blood- brain barrier permeability, exert cytotoxic effect on oligodendrocytes and neurons and disturb normal nerve impulse conduction. In this thesis the effect of NO on regulation of CXCL12 expression in rat EAE was evaluated. To this end, a susceptible rat strain, Dark Agouti (DA), and a resistant rat strain, Albino Oxford (AO) were used. High expression of CXCL12 in spinal cord homogenates (SCH) of AO rats and low in SCH of DA rats at the peak of EAE were detected. This implied that high CXCL12 expression contributed to resistance of AO rats to EAE induction. Conversely, expression of iNOS was high in DA rats and low in AO rats at the peak of EAE, suggesting that NO contributes to EAE pathogenesis. By analyzing large number of samples, obtained from healthy or EAE rats of both strains, negative correlation between expression of messanger RNA (mRNA) for iNOS and CXCL12 was noticed. Further, effect of NO on CXCL12 mRNA expression in vitro and in vivo was evaluated. In vitro, CXCL12 mRNA expression in spinal cord blood vessels (SCBV) and astrocytes was inhibited by NO. In astrocytes NO inhibited CXCL12 mRNA expression by downregulating p38 MAP kinase activity. In vivo blockade of iNOS activity led to upregulation of CXCL12 mRNA expression in SCH and SCBV, as well as CXCL12 production in spinal cord tissue. Additionally, inhibition of iNOS activity ameliorated EAE symptoms, confirming harmful role of excessive NO production in neuroinflammation. CXCL12 mRNA expression was downregulated in SCH of AO rats, after treatment with NO donating molecule, sodium nitroprusside. Alongside, CXCL12-γ expression in the CNS during EAE was determined. Expression of this isoform was also higher in AO rats CNS compared to DA rats. However, the highest CXCL12-γ expression in AO rats was detected at the time of onset and the recovery of EAE in DA rats, unlike expression of total CXCL12 which was the highest at the peak of EAE. NO also inhibited CXCL12-γ mRNA expression in vivo and in vitro. These results are showing that NO inhibits CXCL12 expression in neuroinflammation. Additionally, our results are suggesting the possibility of different and perhaps complementary roles of various CXCL12 isoforms in resistance of AO rats to EAE induction. Having in mind multiple adverse effects of high NO production during CNS inflammation and effects of CXCL12 that downregulate neuroinflammation, inhibitory effect of NO on CXCL12 expression could be added to the list of harmful effects of this molecule in the autoimmune CNS pathology. For this reason, therapeutic approaches in which NO production would be restricted and subsequently CXCL12 expression upregulated within the CNS, could lead to reduction of autoimmune CNS response and, thus, to decrease of CNS tissue destruction in MS patients.

Definisanje vrednosnog okvira za ocenu zemljišnih komasacionih sistema

A framework for the evaluation of land consolidation systems

Komasacija je danas veoma značajna i predstavlja provereni instrument za razvoj poljoprivrede i seoskih područja. Glavni cilj komasacije oduvek je bio ukrupnjavanje poljoprivrednih poseda u što manji broj bolje oblikovanih parcela, kako bi se poboljšala primarna poljoprivredna proizvodnja i unapredio njen razvoj. Naime, razvoj poljoprivrede je jedan od suštinskih faktora razvoja i unapređenja života na selu. U razvijenim zemljama se već dugo na selo ne gleda kao na poligon namenjen isključivo poljoprivrednoj proizvodnji. Zbog toga u zemljama Zapadne Evrope komasacija služi i kao sredstvo za sveobuhvatni razvoj sela. Novi koncept ruralnog razvoja tretira komasaciju kao složeni projekat koji, između ostalog, ima za cilj i trajnu obnovu i unapređenje seoske zajednice. Uspešno izvršena komasacija dovodi do opšteg unapređenja poljoprivrede, povećanja produktivnosti, efikasnosti i konkurentnosti kompletnog poljoprivrednog sektora. Ona takođe vodi i boljem planiranju i upravljanju zemljištem, otvara nova radna mesta u poljoprivrednim regionima, olakšava priliv privatnih i javnih investicija u ovoj oblasti, doprinosi unapređenju zaštite životne sredine i omogućava upravljanje prirodnim resursima na efikasan način. U mnogim državama Centralne i Istočne Evrope uslovi života na selu su se pogoršali tokom tranzicionog perioda. Velika nezaposlenost i loša infrastruktura dovele su do toga da su sela postala manje atraktivna mesta za život. Radi poboljšanja situacije realizovan je veliki broj pilot-projekata komasacije sa namerom da se zemljama u tranziciji omogući pokretanje komasacije u sopstvenim uslovima i unapredi poljoprivredna proizvodnja i kvalitet života na selu. Prevashodni cilj ovog rada je razvoj metodologije za ocenu zemljišnih komasacionih sistema koja bi na najoptimalniji način doprinela uspostavljanju efikasnog sistema komasacije u datim uslovima...

Land consolidation is still very important today and represents a proven instrument of development of agriculture and rural regions. The main objective of land consolidation has always been the consolidation (reallocation) of the agricultural holdings into the fewest number of better designed parcels, in order to improve the primary agricultural production and promote its development. Namely, the development of agriculture is one of the essential factors of development and improvement of rural living. In the developed countries for quite some time village has not been perceived as the training ground intended solely for agricultural production. For that reason in West European countries land consolidation also serves as the means for comprehensive rural development. The new rural development concept treats land consolidation as a complex project which, among other things, aims at continual renewal and promotion of the rural community. Successfully implemented land consolidation leads to overall upgrading of agriculture, increase in productivity, efficiency and competitiveness of the entire agricultural sector. It also leads to a better planning and land management, creates new jobs in agricultural regions, facilitating the flow of private and public investments into this field, contributes to promotion of the environment protection and enables efficient natural resources management. The primary objective of this research is development of methodology for valuation of land consolidation systems which would contribute in the most optimal way to establishing the efficient system of land consolidation in the circumstances. The first difficulty encountered in development of the methodology was the lack of a clear definition of land consolidation as a system. In Chapter 3 for the first time the optimal land consolidation system has been defined which best logically connects all the elements of the system. The optimal model also presents an example of a good model which was necessary to define in order to compare the concrete land consolidation systems...

Promena aktivnosti Na+/K+ pumpe i njen uticaj na spontanu bioelektričnu aktivnost neurona vinogradskog puža Helix pomatia L. pod dejstvom magnetnog polja

Change in the activity of Na+/K+ pump and its effect on the spontaneous bioelectric activity of neuron of the garden snail Helix pomantia L. in the magnetic field

aktivnost neurona ima veliki značaj jer je magnetno polje umerene jačine prisutno u životnoj sredini. Jednako važno je i proučavanje mehanizama delovanja umereno jakog statičkog magnetnog polja na biofizičke osobine membrane neurona usled sve veće terapijske primene ovog polja, s tim što odgovarajuća jačina polja i dužina izlaganja polju tek treba da budu precizno određene. Uporednim eksperimentima primenom tehnike intracelularne registracije utvrđeno je da kratkotrajno izlaganje (15 min) umereno jakom statičkom magnetnom polju jačine 2,7 mT i 10 mT dovodi do promena bioelektrične aktivnosti spontano aktivnog Br neurona, dok promene nisu uočene kod nemog N1 neurona. Magnetno polje od 2,7 mT povećalo je amplitudu i skratilo trajanje akcionog potencijala, dok je magnetno polje od 10 mT hiperpolarisalo membranu, povećalo amplitudu, smanjilo frekvenciju i trajanje akcionog potencijala Br neurona. Veličine promena ispitivanih parametara zavisile su od jačine magnetnog polja i uočavane su i tokom perioda od 20 min nakon prestanka izlaganja Br neurona polju od 2,7 mT i 10 mT. Kombinovanim eksperimentima, biohemijskim analizama i 31P NMR spektroskopijom na okoloždrelnom ganglijskom kompleksu kao i tehnikom intracelularne registracije na Br neuronu vinogradskog puža, pronađeno je da kratkotrajno izlaganje (15 min) statičkom magnetnom polju jačine 10 mT povećava aktivnost Na+/K+ pumpe. Povećana aktivnost Na+/K+ pumpe dovodi do povećanja potrošnje ATP-a, kao i povećanja pHi posredstvom povećanja aktivnosti Na+/H+ izmenjivača, pH regulatornog sistema čija je aktivnost zavisna od gradijenta Na+ jona koji stvara i održava Na+/K+ pumpa. Rezultati elektrofizioloških eksperimenata na Br neuronu u saglasnosti su sa rezultatima dobijenim na okoloždrelnom ganglijskom kompleksu. Naime, u uslovima kada je pumpa blokirana ouabainom, promene potencijala mirovanja membrane, trajanja akcionog potencijala i intervala između akcionih potencijala u paketićima, veće su u Br neuronu koji je izlagan magnetnom polju. Na taj način je pokazano da Na+/K+ pumpa igra važnu ulogu u uočenim promenama bioelektričnih parametara Br neurona u magnetnom polju jačine 10 mT. Signalni putevi delovanja magnetnog polja na aktivnost Na+/K+ pumpe u nervnom sistemu puža uključuju procese fosforilacije i defosforilacije pošto se nakon blokiranja ovih procesa ne može uočiti opisani efekat magnetnog polja.

It is important to investigate the effects of moderate intensity static magnetic field on the bioelectric activity of neurons, since this field is present in the environment. Equally important is to reveal the mechanism of action of moderate intensity static magnetic field on biophysical properties of neuronal membranes, as this field has been applied in disease treatment, whereby proper dosages of exposure still need to be determined. Comparative intracellular registration studies showed that short term exposure (15 min) to the moderate intensity static magnetic field of 2,7 mT and 10 mT strength changed bioelectric activity of the spontaneously active Br neuron, while bioelectric activity of silent N1 neuron remained unchanged. The 2,7 mT magnetic field increased amplitude and decreased duration of action potential, whereas the 10 mT magnetic field hyperpolarized membrane potential, increased amplitude, decreased firing frequency and duration of action potential of the Br neuron. The magnitude of change of measured bioelectric parameters depended on the strength of applied magnetic field, and was still observed during the period of 20 min after exposure of Br neuron to the 2,7 mT and 10 mT magnetic field. Combined experiments, using biochemical analysis and NMR spectroscopy on whole snail brains and intracellular registration on Br neuron, showed that short-term exposure (15 min) to the 10 mT magnetic field increased activity of Na+/K+ pump. Increased Na+/K+ pump activity in the snail brain caused an increase in ATP consumption and increase in the pHi which is mediated through an increase in the activity of Na+/H+ exchanger, a pH regulatory system governed by the gradient of Na+ ions created and maintained by Na+/K+ pump. Electrophysiology from Br neuron is in agreement with the results obtained on the whole snail brain. Magnitude of ouabain effect measured on the membrane resting potential, action potential and interspike interval duration, was higher in Br neurons exposed to the magnetic field, demonstrating that Na+/K+ pump plays an important role in modulation of bioelectric activity of Br neuron caused by 10 mT magnetic field. Pathways through which the magnetic field influenced the Na+/K+ pump activity involve phosphorylation and dephosphorylation, as blocking these processes abolished the effect of the static magnetic field.

Strukturne promene i prostorna diferencijacija poljoprivrede u seoskim naseljima regiona Beograda

Structural changes and spatial diferentiation of agriculture in rural settlements of Belgrade region

Tokom 1990-ih godina Republika Srbija je prolazila kroz tranzicioni period obeležen dugoročnom krizom koja se odlikovala društvenim raslojavanjem, političkim sistemom koji se protivio reformamai dubokom ekonomskom recesijom...

During the 1990s the Republic of Serbia endured a transitional phase marked bz long-lasting and permanent crisis phenomena characterized by social stratification, a political system that resisted reform, and a deep economic recession...

Survivin i VEGF-C u papilarnom i anaplastičnom karcinomu štitaste žlezde: ekspresioni profili, uloga u biologiji tumora i kliničko-patološki značaj

Survivin and VEGF-C in papillary and anaplastic thyroid carcinoma: expression profiles, biological role and their clinico-patological significance

Progresija malignih tumora štitaste žlezde od dobro diferenciranih (papilarni karcinom) u nediferencirane, agresivne forme (anaplastični karcinom) praćena je različitim promenama na molekularnom nivou, koje omogućavaju malignoj ćeliji kontinuiranu aberantnu stimulaciju rasta i izbegavanje apoptotske smrti, što uz neoangiogenezu (formiranje novih krvnih i limfnih sudova) predstavlja preduslove tumorskog rasta i širenja. Predmet ovog rada je izučavanje molekularnih promena koje prate dediferencijaciju papilarnog u anaplastični karcinom štitaste žlezde, tj. ispitivanje promena ekspresionih profila apoptotskih molekula (Bcl-2, Bax, survivin) i limfangiogenog faktora (VEGF-C) u korelaciji sa kliničkim parametrima tokom progresije maligniteta tumora štitaste žlezde. Imunohistohemijskom analizom ekspresionih profila članova Bcl-2 familije konstatovano je da tokom progresije dolazi do smanjenja ekspresije Bcl-2 (antiapoptotski molekul), ali da je in situ apoptotska smrt detektovana TUNEL metodom na niskom nivou, uprkos visokih ekspresionih nivoa Bax (pro-apoptotskog) molekula. U isto vreme sa smanjenjem ekspresije Bcl-2 tokom progresije maligniteta dolazi do postepenog povećanja drugog antiapoptotskog molekula, survivina, koji je operativan nizvodno od Bax-a. Visoka ekspresija survivina je bila u korelaciji sa sniženim stepenom in situ detektovane apoptotske smrti, što sugeriše da survivin, a ne odnos Bcl-2/Bax ima ulogu u inhibiciji finalizacije programirane ćelijske smrti. Poređenjem imunohistohemijske ekspresije survivina sa kliničko-patološkim parametrima pacijenata utvrđena je značajna korelacija između visoke ekspresije survivina i prisustva metastaza u limfnim čvorovima. Ekspresioni profili VEGF-C proteina (angiogeni faktor koji promoviše formiranje tumorske vaskulature, a time i rast i širenje tumora) pokazali su porast tokom tumorske progresije i značajnu korelaciju sa prisustvom limfnih metastaza, ekstratiroidnom invazijom i uznapredovalim stadijumom tumorske bolesti. Značajna međusobna korelacija imunohistohemijske ekspresije survivina i VEGF-C proteina u tumorima sa prisutnim limfnim metastazama, kao i u njihovom metastatskom tkivu, sugeriše koordinisanu ulogu ova dva molekula u metastatskom procesu. Klinički značaj evaluacije ekspresije survivina i VEGF-C proteina je u predikciji metastatskog potencijala tumora i agresivnijeg toka bolesti karcinoma štitaste žlezde. Sagledavanje uloge ova dva proteina u biologiji tumora otvoriće mogućnosti za kreiranje i primenu ciljanih molekulskih terapija kojima će aktivacija apoptoze i inhibicija angiogeneze sigurno biti integralni deo.

Progression of malignancy of thyroid gland tumors from well differentiated (papillary carcinoma) to undifferentiated, aggressive form (anaplastic carcinoma) is accompanied by molecular changes. These enable continuous stimulation of aberrant growth and escape from apoptotic death, together with neoangenesis (formation of new blood and lymphatic vessels) which are prerequisites for tumor growth and spread. The objective of this work was examination of some molecular changes accompaning dedifferentiation of papillary to anaplastic carcinoma of the thyroid gland, i.e. an investigation of alterations in expression profiles associated with apoptosis (Bcl-2, Bax, survivin) and lympfhangiogenic factor, VEGF-C, in correlation with clinico- pathological parameters during the progression of malignancy of thyroid gland tumors. Immunohistochemical analysis of expression profiles of Bcl-2 family members revealed decrease of Bcl-2 expression (anti-apoptotic molecule) during this progression, but a low level of in situ apoptotic cell death detected by the TUNEL method, despite high levels of Bax (pro-apoptotic molecule). The decrease of Bcl-2 expression was followed by increase of another anti-apoptotic molecule, survivin, which acts downstream from Bax. High survivin expression was found to correlate with the lower rate of in situ apoptotic cell death, suggesting that survivin, but not the Bcl-2/Bax ratio, has a role in finalization of programmed cell death. By comparing survivin immunohistochemical expression with clinico-pathological parameters of patients we found a significant positive correlation between high survivin expression and the presence of lymph node metastases. Expression profiles of VEGF-C protein (an angiogenic factor which promotes the formation of tumor vasculature, and thereby tumor growth and spread) revealed increased levels during tumor progression and a significant correlation with the presence of lymph node metastases, extrathyroid invasion and advanced stages of disease. Significant correlation between the expressions of two molecules, survivin and VEGF-C, in tumors with the presence of lymph metastases and in their metastatic tissues, suggests their coordinated roles in the metastatic process. The clinical significance of the evaluation of survivin and VEGF-C expressions could be in predicting the metastatic potential of tumors and an aggressive course of the disease. Better insight into the roles of these two proteins in tumor biology may open possibilities for creating targeted molecular therapies in the future in which activation of apoptosis and inhibition of angiogenesis should be integral parts.

Racionalni cenovni baloni u tradicionalnim i bihevioralnim finansijama

Rational price bubbles in traditional and behavioral finance

U ovoj disertaciji analiziraju se različiti aspekti racionalnih cenovnih balona u tradicionalnim i bihevioralnim finansijama. Studije koje proučavaju cenovne balone u tradicionalnim finansijama su veoma retke, jer se smatra da je cena jednaka fundamentalnoj vrednosti. Kratkotrajna pogrešna određivanja cene sredstava se objašnjavaju konceptima tradicionalnih finansija, ostajući u domenu hipoteze o racionalnim očekivanjima i hipoteze o efikasnim tržištima. S druge strane, bihevioralne finansije uvode kognitivno-psihološke i sociološke koncepte kako bi objasnile uočene anomalije i tržišne zagonetke. Motivacija i inspiracija za istraživanja sprovedena u ovoj disertaciji je uočen obrazac koji je postojao kod većine cenovnih balona u istoriji: često im je prethodila ekspanzivna monetarna politika, kao i pojava novih tehnologija, koje su obećavale da će biti veoma profitabilne, ali su bile i veoma rizične. Da bi se proverile hipoteze postavljene u radu, sproveden je ekonomski eksperiment, sa dva tretmana: jedan simulira ekspanzivnu, a drugi restriktivnu monetarnu politiku. Eksperimentalna struktura je osmišljena tako da obezbeđuje visok nivo interne i eksterne validnosti eksperimenta. Pri analizi podataka su primenjene ekonometrijske procedure za proveru stacionarnosti vremenskih serija cena i dividendi po akciji, kao i procedure za proveru postojanja kointegracije između njih. Rezultati istraživanja pokazuju da su cenovni baloni najčešći u uslovima ekspanzivne monetarne politike, pri trgovanju akcijama koje potencijalno mogu doneti visok prinos. Na osnovu ovih rezultata može se zaključiti da je ekspanzivna monetarna politika jedan od uzroka nastanka racionalnih cenovnih balona. Pored toga, uočeno je i da su psihološke karakteristike učesnika u eksperimentu uticale na formiranje cenovnih balona. Migracija tražnje iz akcija koje donose stabilne prinose u akcije koje potencijalno mogu da donesu visoke prinose se nije pokazala kao značajan uzrok formiranja racionalnih cenovnih balona. Zaključeno je da se značajni viškovi prinosa ii javljaju nakon nastanka dividendnih šokova. Uočeno je statistički signifikantno smanjenje vrednosti transakcija u uslovima restriktivne monetarne politike, odakle sledi pouka kreatorima monetarne politike da monetarna politika ne sme biti previše restriktivna, da se ne bi gušio obim trgovanja na berzi i smanjivala njena likvidnost. Cilj istraživanja sprovedenih u ovom radu bio je da se, sticanjem uvida u faktore koji utiču na formiranje racionalnih cenovnih balona, pokuša uticati na iste, kako bi se smanjila verovatnoća pojave cenovnih balona i ublažile njihove negativne posledice. Zaključeno je da, pored monetarne politike, ključnu ulogu u upravljanju cenovnim balonima ima makroprudencijalna politika i da je posebno važno obezbediti stabilnost cena sredstava. Imperativ je povećati stepen nadzora nad celokupnim finansijskim sistemom i upravljati sistematskim, često međusobno povezanim rizicima. Rezultat ovih aktivnosti treba da bude ostvarivanje vrhunskog cilja u vidu postizanja visoke finansijske stabilnosti.

Different aspects of rational price bubbles in traditional and behavioral finance are analysed in this dissertation. Studies about rational price bubbles in traditional finance are very rare, because it is assumed that price equals fundamental value. Short-term asset mispricing is explained by traditional finance concepts, thereby staying in the domain of rational expectation hypothesis and efficient market hypothesis. On the other side, behavioral finance introduces cognitive psychological and social concepts in order to explain observed anomalies and market puzzles. The researches carried out in this doctoral thesis are motivated and inspired by a conspicuous pattern that has emerged in most of the previous price bubbles during history: they were often preceded by the expansionary monetary policy, as well as the emergence of innovative technologies that promised to be very profitable, but were also very risky. In order to test the hypotheses stated in the thesis, the economic experiment is conducted. There are two treatments in the experiment: one simulates expansionary, and the second one contractionary monetary policy. The experiment is designed with the aim to ensure high level of its internal and external validity. Adequate econometric procedures are implemented during data analysis in order to test stationarity and co- integration between price and dividend per share time series. Research results point out that price bubbles are most often to form in the conditions of expansionary monetary policy in trading with stocks that potentially bear high return. On the basis of these results, it can be concluded that expansionary monetary policy is one of the causes of rational price bubbles. Additionally, it was noticed that psychological characteristics of experimental participants had an effect on price bubbles’ emergence. The migration of demand from stocks that bear stable returns to those that can potentially bear high returns was not identified as an important reason for rational price bubbles’ forming. It is concluded that there are significant excess returns after dividend shocks occurrence. Statistically significant iv decrease in the transaction value is noticed in the contractionary monetary policy treatments. The lesson for the monetary authorities is that monetary policy must not be overmuch contractionary in order not to reduce the stock market trading volume and its liquidity. The goal of the researches done in this thesis was to gain insight into the factors which cause price bubbles’ forming with. The final intention was to try to influence on these factors in order to decrease the probability of price bubbles occurrence and to mitigate their negative consequences. It is concluded that, beside monetary policy, macroprudential policy has the key role in price bubbles managing as well as that asset price stability is very important to be ensured. It is the imperative to increase the level of monitoring of the whole financial system and to manage systematic and interconnected risks. The result of these activities should be the achievement of the crucial goal - high level of financial stability.

Filogeografski status i genetička struktura populacija potočne pastrmke (Salmo cf. trutta) Đerdapa i Timočke krajine

Phylogeographic status and genetic structure of brown trout populations (Salmo cf. trutta) in Đerdap and Timočka krajina regions

Kontrolna regija mitohondrijske DNK pokazala se kao odličan filogeografski marker kad je kompleks potočne pastrmke (Salmo cf. trutta) u pitanju. Krajem 20. veka ustanovljeno je pet osnovnih filogeografskih linija (haplogrupa) potočne pastrmke: dunavska, atlanska, mediteranska, jadranska i marmoratus koje uglavnom korespondiraju sa odgovarajućim slivovima. Analizirane jedinke na području Srbije nosile su haplotipove dunavske, atlanske i jadranske haplogrupe. Najdominantniji haplotip u slivu Crnog Timoka i rekama desne obale Dunava u Đerdapskom regionu pripadao je dunavskoj liniji i opisan je pod imenom Da23c (ACCN KC630984). Obzirom da je ovaj haplotip zasada otkriven samo u ovoj oblasti i to sa velikom učestalošću smatra se autohtonim za ovu regiju. U okviru Đerdapskog regiona uočen je i haplotip Da1, ali samo u Rečkoj reci u njenom desnom delu iznad nepremostive prepreke, vodopada visine 10 m. Kao pleziomorfni u odnosu na haplotip Da23c i široko rasprostranjen na ovom delu Balkanskog poluostrva postoji velika verovatnoća da je i on autohton za ovo područje, međutim nije isključena ni mogućnost da je unesen poribljavanjem. U okviru sliva Crnog Timoka osim autohtonog haplotipa Da23c otkriven je i Da2, koji je najverovatnije alohton. U prilog tome govore činjenice o rasprostranjenju haplotipova na zapadnom Balkanu, kao i podaci o korišćenju jedinki ovog haplotipa za poribljavanje i gajenje u Austrougarskoj, a kasnije u celoj Evropi i Srbiji. Osim dunavske u okviru šireg područja Đerdapa otkriveno je i prisustvo atlanske linije u rekama Brnjica, Dobrinjska, Porečka i Vratna, a samo u poslednjoj jedinke atlanskog haplotipa koegzistiraju sa pastrmkama koje nose autohtoni haplotip, Da23c. Atlanski haplotip ne smatra se autohtonim za Balkansko poluostrvo, pa je najverovatnije u reku Vratnu dospeo poribljavanjem, a analize jedarnog gena, laktat dehidrogenaze, pokazale su da se ove jedinke međusobno ukrštaju. Programske analize podataka osam mikrosatelitskih lokusa ukazale su na postojanje pet izdvojenih populacija u regionu severoistočne Srbije: sliv Crnog Timoka, reka Kožica, reka Rečka, reke Vratna i Zamna zajedno i reke Mala Boljetinska i Zlatica zajedno, što ukazuje na verovatnu komunikaciju i protok gena između ovih populacija. Mere upravljanja ovim ribolovnim područjima isključuju poribljavanje, jer trenutno ne postoji veštački mrest gde se koristi genetički materijal autohton za ovu oblast. Postojanje autohtonog haplotipa za ovu oblast može biti od velikog konzervacionog značaja, takođe prisustvo atlanskog haplotipa u pojedinim rekama predstavlja ozbiljnu pretnju autohtonom genofondu, pa je hitnost u preduzimanju odgovarajućih konzervacionih koraka utoliko veća. Dalje praćenje strukture populacija koji čine ovaj deo genofonada predstavlja samo jedan od njih.

Control Region of mitohondrial DNA is a good phylogeographic marker for brown trout species complex (Salmo cf. trutta). Five main brown trout phylogeographic lineages (haplogroups) that mostly correspond to the particular basins have been established at the end of 20th century: Danubian, Atlantic, Mediteranean, Adriatic and marmoratus. Individuals from Serbia held haplotypes of Danubian, Adriatic and Atlantic haplogroups. Prevailing haplotype in the River Crni Timok drainage area and in the right tributaries of the River Danube from Đerdap region is Da23c (ACCN KC630984) of Danubian haplogroup. This haplotype is considered indigenous there since it has been found only in this area and with a great frequency. Another haplotype also detected in the Đerdap region is Da1, but only in the River Rečka, in its right fork above the 10 m high waterfall, which is an impassable obstacle for upstream dispersal of brown trout from downstream section. Considering its plesiomorphic character compared to haplotype Da23c and its wide distribution in this part of Balkan Peninsula, there is a high probability that it is indigenous for this region, as well. However, the possibility that it has been imported by stocking activities cannot be excluded. In addition to the indigenous haplotype Da23c, the haplotype Da2 was also detected in the Crni Timok drainage area, probably as an allochthonous one. This was supported by haplotype distribution in Western Balkans, as well as by history of stocking and breeding with the Da2 haplotype in Austria-Hungary and later, both in middle and southeastern Europe, including Serbia. Individuals of the Atlantic haplogroup were detected in rivers Brnjica, Dobrinjska, Porečka and Vratna of the broader Đerdap area. Only in the last river these individuals coexist in sympatry with brown trout of indigenous Da23c haplotype. Since Atlantic haplotype was not considered indigenous for Balkan Peninsula, it has been probably introduced there by stocking. Analysis of nuclear gene lactate dehydrogenase showed that individuals of two lineages occurring in sympatry interbreed. Data software analyzes of eight microsatellite loci revealed the existence of five separated populations in Eastern Serbia: (1) Crni Timok drainage area, (2) River Kožica, (3) River Rečka, (4) Rivers Vratna and Zamna, and (5) River Mala Boljetinska and River Zlatica, indicating a potential communication and gene flow between these populations. Management of fisheries in these areas must not include stocking activities, since no indigenous stocking material for them is available. The existence of indigenous haplotype in this area could be of a great conservational importance. The urgency in taking conservational steps is even greater considering that presence of Atlantic haplotype in some rivers poses a serious threat to indigenous gene pools. Further monitoring of genetic structure is one of those steps.

Dinamika i mogući uzroci temperaturnih i padavinskih ekstrema na teritoriji Crne Gore u periodu 1951-2010

Dynamics and possible causes of temperature and precipitation extremes in the territory of Montenegro from 1951 to 2010.

Opšte je mišljenje da se sa današnjom klimom nešto dešava, da se menja. U dugoj polovini 20. i početkom 21. veka je zaista prisutan trend porasta globalne temperature vazduha, i u to nema sumnje. Međutim, kada je u pitanju uzrok porasta globalne temperature i kolebanja klime u novije vreme, definitivnog odgovora još uvek nema. Po mišljenju jednih čovek je glavni krivac, po mišljenju drugih današnji trend zagrevanja planete i ekstremeni vremenski i klimatski događaji su deo prirodnog ciklusa, odnosno dominacije uticaja prirodnih faktora. Ova disertacija je imala dva osnovna cilja. Prvi je utvrđivanje dinamike, a drugi mogućih uzroka temperaturnih i padavinskih ekstrema na teritoriji Crne Gore u periodu 1951-2010. Istraživanje u okviru navedene teme realizovano je detaljnom analizom trenda i kolebanja preko 20 parametara temperature i padavina sa 23 meteorološke stanice i ispitivanjem njihove veze sa promenama cirkulacije atmosfere. Ovakav pristup potencira dva osnovna geografska principa: vremenski i prostorni. Da bi se preciznije definisala ,,struktura’’ promena dva najvažnija klimatska elementa, urađena je kompleksna analiza nekoliko indeksa, definisanih od strane WMO-CCL/CLIVAR, koji se koriste u poslednje vreme u istraživanju klimatskih promena, odnosno u istraživanju promena ekstrema nastalih usled varijacija klime. U cilju utvrđivanja uzroka, sa fizičke tačke gledišta, u radu je ispitana veza između parametara temperature i padavina sa 16 telekonekcionih obrazaca, na sezonskom i godišnjem nivou. U posmatranom 60-godišnjem periodu, tendencija porasta srednje godišnje temperature na teritoriji Crne Gore, matematički posmatrano, posledica je izrazitog rasta u toplijem delu godine, naročito od maja do avgusta. U zimskoj sezoni su promene beznačajne, dok u jesenjoj dominira trend zahlađenja. Sa sezonskim i godišnjim sumama padavina na teritoriji Crne Gore, u periodu od 1951. do 2010. godine, ništa se bitnije ne dešava. Međugodišnje varijacije, koje inače karakterišu ovaj element, nisu povećane u poslednje vreme, niti trend komponenta pokazuje značajne promene. Spuštajući analizu na dnevne ekstreme, na teritoriji Crne Gore se sve češće javljaju maksimalne i minimalne dnevne temperature koje imaju ,,toplije’’ vrednosti i u većem delu zemlje postoji trend porasta broja dana sa intenzivnim padavinama, ali je uglavnom beznačajan . Procena uticaja nekoliko velikih i uglavnom udaljenih telekonekcionih obrazaca je pokazala da njihova varijabilnost utiče na posmatrane parametre temperature i padavina na teritoriji Crne Gore, kako u pogledu sezonskih srednjih vrednosti, odnosno suma, tako i na učestalost i intenzitet ekstremnih događaja prikazanih pomoću klimatskih indeksa. Rezultati dobijeni u ovom radu su uglavnom u skladu sa opštom predstavom o globalnom otopljavanju, ali neretko su uočene i određene nelogičnosti, koje nisu u saglasnosti sa modelima IPCC. Istraživanja su jasno pokazala da je pogrešno stavljati akcenat na isključivu i postojanu dominaciju jednog faktora, jer je očigledno da se radi o interakcijskom delovanju više uticaja. Istina, u poslednje vreme su oboreni pojedini rekordi i povećana je čestina određenih vremenskih i klimatskih ekstrema, ali se ništa zabrinjavajuće ne dešava, niti se detektuje značajnija pogođenost sistema ekologije i čovekovog života i rada.

The general opinion about the climate today is that something is happening, changing. Undoubtedly, in the second half of the 20th and the beginning of the 21st century the increase in global air temperature is present. Nevertheless, there is still no answer when the increase in temperature and climate fluctuation is in question. Some people think that humans are responsible for that, others believe that planet heating and extreme weather and climate events are a part of a natural cycle, that is, a part of strong influence of natural factors. This dissertation had two basic aims.The first one is determination of the dynamics, and the second one is determination of possible causes of temperature and precipitation extremes in the territory of Montenegro from 1951 to 2010. The research on the topic was realized by a detailed analyses of trends and fluctuation of over 20 parameters of temperature and precipitation from 23 meteorological stations as well as studying their connections with the changes in atmosphere circulation.This kind of approach emphasizes two basic geographical principles: time and space. In order to define “the structure” of the two most important climate elements more precisely, a complex analysis of several indexes has been done. They are defined by WMO-CCL/CLIVAR that has been used lately in climate changes research, that is, in the research of the changes of extremes that appeared because of climate variations. In order to define the cause, from a physical point of view, the connection between temperature and precipitation parameters with 16 teleconnection patterns, on seasonal and annual level has been examined. In the monitored 60-year period, the tendency of increasing average annual temperature in the territory of Montenegro, from the mathematical point of view, is the consequence of a distinct increase during the warm part of the year, especially from May to August. During the winter the changes are insignificant, but in autumn the trend of cooling dominates. There were no significant events in seasonal and annual sums of precipitation in Montenegro during the 1951-2010 period. Interannual variations, that define this element, have not been increased lately and the trend component has not shown significant changes. By narrowing down the analyses to daily extremes, the maximal and minimal daily temperatures that reach „warmer“ values, in the territory of Montenegro, are more common. In addition, in a larger area of the country there is an increase of the number of the intensive precipitation days, but it is mostly insignificant. The evaluation of the influence of large-scale and mostly remote teleconnection patterns showed that their variability influence the monitored parameters of temperature and precipitation in the territory of Montenegro, in seasonal average values, or sums, as well as in frequency and intensity of the extreme events presented with climate indexes. The results given in this work are mostly in accordance to the general idea about global warming, but also, some inconsistencies, that are not in accordance to IPCC models, have been noticed.These researches clearly state that it is wrong to emphasize the only and consistent domination of one factor, because it is obviously an interaction of many influences. It is true that some records have been broken lately and the frequency of certain weather and climate extremes have been increased. Still, there are no disturbing events and significant impact on ecology and human life and work have not been noticed.

Morfogeneza i regeneracija biljaka šalota (Allium ascalonicum L.) i vlašca (A. schoenoprasum L.) in vitro

In vitro morphogenesis and plant regeneration in shallot (Allium ascalonicum L.) and chive (A. schoenoprasum L.)

Šalot (Allium ascalonicum L.) i vlašac (A. schoenoprasum L.) pripadaju lukovima roda Allium, koji predstavlja jedan od najbrojnijih rodova među monokotilama. Ove ekonomski značajne biljne vrste se koriste u kulinarstvu širom sveta, zbog svog specifičnog mirisa, ukusa i dokazane antioksidativne aktivnosti. U procesima unapređivanja nutritivnih vrednosti i poboljšanja prinosa korišćenjem savremenih biotehnoloških metoda neophodan preduslov je efikasan i pouzdan protokol za regeneraciju in vitro. Pošto takve procedure za regeneraciju in vitro kod šalota i vlašca nisu bile dostupne, osnovni cilj ove disertacije je bio razvijanje efikasnih protokola za indukciju regeneracije pupoljaka/somatskih embriona kod ovih biljnih vrsta. Regeneracija pupoljaka/somatskih embriona je indukovana iz odsečaka korenova šalota i vlašca. Kod obe biljne vrste samo je apikalni deo korena imao regenerativni potencijal pod testiranim eksperimentalnim uslovima, ali se regeneracija odvijala različitim procesima: indirektnom kaulogenezom kod šalota i indirektnom somatskom embriogenezom kod vlašca. Snažan uticaj genotipa na regenerativni potencijal je uočen kod obe biljne vrste. Regenerativni potencijal je testiran na 30 nasumično izabranih linija šalota. Liniju su činili regeneranti dobijeni iz apikalnih odsečaka korenova biljke koja se razvila iz jednog klijanca. Među testiranim linijama je uočena visoka varijabilnost učestalosti regeneracije (0,93-100%) i prosečnog broja pupoljaka po eksplantatu (0,01-20,67). Linija 6 je pokazala najveći kaulogeni i rizogeni potencijal, kao i najbrži regenerativni odgovor. Koristeći apikalne odsečke korenova regenerisanih biljaka linije 6 kao izvor eksplantata, izvršena je optimizacija uslova za indukciju regeneracije. Svetlost, odnos 2,4-dihlorfenoksisirćetne kiseline (2,4-D) i 6-benziladenina (BA) u podlozi i trajanje faze indukcije kalusa su statistički značajno uticali na kaulogeni potencijal ove linije. Optimalna procedura za regeneraciju pupoljaka iz apikalnih odsečaka korenova šalota se sastojala iz pet nedelja kultivacije eksplantata na podlozi za indukciju kalusa sa 5 µM 2,4-D i 5 µM BA, zatim osam nedelja na podlozi za indukciju regeneracije sa 5 µM BA u prisustvu svetlosti i pri gustini fluksa od 100 µmol m-2s-1 tokom obe faze. Primenom ovog protokola kod linije 6 za 13 nedelja je postignuta učestalost regeneracije od 100%, sa prosečno 18,4 pupoljaka po eksplantatu. Protokol optimizovan za liniju 6 je zatim primenjen na odsečke korenova osam linija sa različitim regenerativnim potencijalom, da bi se utvrdilo da li se njihov regenerativni potencijal može poboljšati. Primena ovog optimizovanog protokola dovela je do značajnog povećanja regenerativnog potencijala jedinki linija sa niskim regenerativnim potencijalom, ali je on i dalje ostao statistički značajno niži nego kod jedinki linije 6, što potvrđuje snažan uticaj genotipa na proces kaulogeneze. Kod vlašca, linija 3 se izdvojila po superiornom regenerativnom potencijalu, pa su odsečci korenova in vitro regenerisanih biljaka ove linije korišćeni kao izvor eksplantata. Za indukciju embriogenog kalusa iz apikalnih odsečaka korenova vlašca neophodno je bilo prisustvo 2,4-D i citokinina. Najveći embriogeni potencijal ovih eksplantata je postignut kada je kalus indukovan na podlozi sa 5 μM 2,4-D i 10 μM BA ili tidiazuronom (TDZ). Dobijeni somatski embrioni su se umnožili i razvili apikalni pupoljak na podlozi sa kinetinom (Kin), ali im je za razviće korenovog sistema bila neophodna kultivacija na podlozi bez regulatora rastenja. Uprkos tome što je proces indukcije somatske embriogeneze i razviće somatskih embriona vlašca bio relativno efikasan, proces regeneracije iz apikalnih odsečaka korenova vlašca je bio suviše dugotrajan proces (24 nedelje), pa je razvijena efikasna procedura za indukciju direktne kaulogeneze iz bazalnih odsečaka linije 3. Od šest testiranih citokinina (BA, Kin, zeatina, meta-topolina, N-(2-hloro-4-piridil)-N'-feniluree i TDZ), predstavnika svih strukturnih grupa, 10 μM TDZ je bio najefikasniji u indukciji kaulogeneze, ali su regenerisane biljke imale inferiorne morfološke karakteristike. Kako su eksplantati gajeni na podlozi sa 5 μM Kin pokazali najbolje morfološke parametre, ovaj tretman je bio uključen u proceduru regeneracije. Stoga, optimizovana procedura podrazumevala je kultivaciju bazalnih odsečaka debljine 5 mm na podlozi sa 10 μM TDZ tokom četiri nedelje, a zatim na podlozi sa 5 μM Kin tokom još četiri nedelje. Koristeći optimizovani protokol, postignuta je učestalost regeneracije od 100% sa prosečno 16,9 pupoljaka po eksplantatu. Dobijene biljke sa dobro razvijenim korenovim sistemom su već posle osam nedelja bile spremne za aklimatizaciju. Histološkom studijom je utvrđeno da su adventivni pupoljci regenerisali iz bazalnih delova listova i iz meristemoida formiranih iz površinskih slojeva bazalne ploče vlašca. Baš u ovom regionu eksplantata kultivisanih na podlozi sa 10 µM TDZ detektovano je prisustvo H2O2. Pored toga, detektovane su brže promene i viši nivo aktivnosti antioksidativnih enzima (peroksidaza, katalaza i superoksid-dismutaza) u eksplantatima gajenim na podlozi sa 10 µM TDZ u odnosu na eksplantate gajene na podlozi sa 1 µM Kin, koji su imali najniži regenerativni potencijal u ovom eksperimentu. Specifična izoforma peroksidaze je uočena samo u eksplantatima izloženim dejstvu 10 µM TDZ posle trećeg dana od početka tretmana i njena pojava je koincidirala sa povećanjem aktivnosti ukupnih peroksidaza u ovim eksplantatima. Rezultati ukazuju na značajnu ulogu oksidativnog stresa u pokretanju procesa morfogeneze iz bazalnih odsečaka biljaka vlašca.

Shallot (Allium ascalonicum L.) and chive (A. schoenoprasum L.) belong to the genus Allium, which represents one of the largest genera of the monocotyledonous plants. These economically important plant species have been used worldwide as culinary herbs due to their specific odor, taste and proven potent antioxidative capacity. Crop improvement using modern biotechnological approaches requires an efficient and reliable protocol for in vitro plant regeneration. Since no such protocols for in vitro regeneration of shallot and chive had been available, the main objective of this dissertation was to develop efficient protocols for the induction of bud/somatic embryo regeneration in these plant species. Regeneration of shoots/somatic embryos was induced from root sections of shallot and chive. In both species, only the root-tip sections had the regeneration capacity under the experimental conditions tested, but the regeneration proceeded via different pathways: indirect caulogenesis in shallot and indirect somatic embryogenesis in chive. The strong influence of genotype on regeneration capacity was observed in both species. The regeneration capacity was tested in 30 randomly chosen lines of shallot. A line constitutes the root-tip-derived regenerants originating from a single seed-derived plant. High variability in the frequency of regeneration (0.93-100%) and the mean bud number per explant (0.01-20.67) was observed among these lines. Among them, line 6 exhibited both the highest caulogenic and rizogenic capacity, and the fastest regeneration response. Using the root-tip-derived in vitro regenerated plants of line 6 as an explant source, the regeneration procedure was further optimized. Light intensity, the 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D)/6-benzyladenine (BA) ratio in callus induction medium and the duration of the callus induction phase significantly affected the caulogenic capacity of this line. Thus, the optimized protocol included a 5-week-long cultivation of the explants on callus induction medium supplemented with 5 µM 2,4-D and 5 µM BA followed by an 8-week-long cultivation on regeneration induction medium containing 5 µM BA, under light with a photosynthetic photon flux density of 100 µmol m-2s-1 during both phases. Using this protocol, a 100% frequency of regeneration and 18.4 buds per explant were attained in line 6 after 13 weeks of treatment. The protocol optimized for line 6 was applied to the root-tips of eight lines selected for their variable regeneration responses, to see if their regeneration capacities could be increased. The application of the optimized protocol enhanced the regeneration capacity in lines with the inferior tissue culture response, but their regeneration capacities were still considerably lower compared to line 6, thus confirming the strong influence of genotype on caulogenesis. In chive, line 3 exhibited the superior regeneration capacity, so the root-tip-derived in vitro regenerated plants of this line were used as an explant source. 2,4-D and cytokinin were indispensable for the induction of embryogenic callus from the apical root sections of chive. The highest embryogenic capacity of the explants was achieved when the calli were induced on medium containing 5 µM 2,4-D and 10 µM BA or thidiazuron (TDZ). Obtained somatic embryos multiplied and developed the shoot apex on medium supplemented with kinetin (Kin), but for development of the root system cultivation on plant growth regulator-free medium was necessary. Despite somatic embryos induction and their subsequent development were quite efficient, the process of regeneration from chive apical root section was too time-consuming (lasting for 24 weeks), hence a more efficient protocol for induction of direct caulogenesis from the basal sections of line 3 plants was developed. Of six tested cytokinins (BA, Kin, zeatin, meta-topoline, N-(2-chloro-4-pyridyl)-N'-phenylurea and TDZ), representatives of all cytokinin structural groups, 10 µM TDZ was the most efficient for the induction of caulogenesis, but the morphological parameters of the regenerated plants were inferior. As the explants cultivated on 5 µM Kin-supplemented medium showed the best morphological performances, this treatment was included in the regeneration procedure. Therefore, an optimized procedure involved a 4-week cultivation of 5 mm-thick basal sections on 10 µM TDZ-supplemented medium followed by cultivation on 5 µM Kin-supplemented medium for additional 4 weeks. Using the optimized procedure, the frequency of regeneration of 100% and a mean number of 16.9 buds per explant were obtained. The obtained plants with well-developed root system were capable of acclimatization in only 8 weeks. Histological analyses revealed that adventitious buds regenerated from the leaf sheath bases and meristemoids formed on the surface of the basal plate of chive plants. In this exact region of the 10 µM TDZ-treated explants the presence of accumulated H2O2 was detected. In addition, the activity of antioxidative enzymes (peroxidases, catalases and superoxide dismutases) in 10 µM TDZ-treated explants was higher and was changing more rapidly than in 1 µM Kin-treated explants that showed the lowest regeneration capacity. A unique peroxidase isoform was observed only in TDZ-treated explants on the 3rd day of the treatment and its appearance has coincided with an increase in the activity of total peroxidases in these explants. The results suggest an important role of oxidative stress in induction of morphogenesis from the basal sections of chive plants.

Povezanost polimorfizama gena koji kodiraju enzime folatnog ciklusa sa efikasnošću i toksičnošću metotreksata kod pacijenata sa reumatoidnim artritisom

Association of polymorphisms in genes that code for folate cycle enzymes with efficacy and toxicity of methotrexate in patients with rheumatoid arthritis

Reumatoidni artritis (RA) je hronična autoimuna bolest koju karakteriše hronično zapaljenje, oštećenje zglobova i bol. Najčešće korišćen lek u terapiji reumatoidnog artritisa jeste metotreksat (MTX). Dokazano je da metotreksat redukuje akitvnost bolesti i odlaže početak pojave erozija na zglobnim okrajcima kostiju. Međutim, pacijenti sa reumatoidnim artritisom ne pokazuju istovetne odgovore na terapiju metotreksatom, koji nekada mogu biti praćeni manje ili više izraženim neželjenim efektima leka. Samo oko 50% pacijenata pokazuje dobar klinički odgovor na terapiju metotreksatom, dok je oko 30% njih prinuđeno da prekine terapiju usled pojave ozbiljnih neželjenih događaja tokom lečenja. Može se pretpostaviti da je ovo, između ostalog, posledica prisustva različitih varijanti gena koji kodiraju enzime odgovorne za transport, delovanje i metabolizam metotreksata, a koje mogu dovesti ili do promenjene ekspresije gena ili do izmenjene enzimske aktivnosti proteina koje kodiraju. Predmet ove doktorske disertacije jeste identifikovanje genotipova izabranih polimorfizama u genima koji kodiraju enzime koji učestvuju u transportu (RFC-1) i metabolizmu (DHFR, MTHFR, MTHFD-1) metotreksata kod pacijenata sa reumatoidnim artritisom lečenih metotreksatom u trajanju od najmanje šest meseci i ispitivanje eventualne veze genotipova i efikasnosti i/ili neželjenih efekata leka. Klinički odgovor na terapiju metotreksatom procenjuje se na osnovu EULAR (engl. European League Against Rheumatism) kriterijuma, odnosno, praćenjem DAS28 vrednosti (engl. Disease Activity Score), izračunate na osnovu pregleda 28 zglobova, brzine sedimentacije eritrocita i subjektivne procene pacijenta o sopstvenom opštem zdravstvenom stanju. Neželjeni efekti leka registruju se na osnovu izjava pacijenata, rezultata laboratorijskih merenja i pregleda lekara. U istraživanje su bila uključena 243 pacijenta sa reumatoidnim artritisom lečena na Institutu za reumatologiju Medicinskog fakulteta Univerziteta u Beogradu, koji su duže od šest meseci bili na terapiji metotreksatom. Dijagnoza je postavljena na osnovu EULAR (engl. European League Against Rheumatism) kriterijuma. Studija je urađena na Institutu za humanu genetiku Medicinskog fakulteta Univerziteta u Beogradu. U našoj studiji nije utvrđena statistički značajna ascocijacija između polimorfizama MTHFR C677T, A1298C, MTHFD-1 G1958A, RFC-1 G80A i efikasnosti i toksičnosti metotreksata kod pacijenata sa reumatoidnim artritisom. Uočen je statistički značajan protektivni efekat alela 1 DHFR rs3045983 polimorfizma kada je u pitanju toksičnost metotreksata. Nije primećena veza ovog polimorfizma sa odgovorom na terapiju. Ispitivanjem rs1650697 polimorfizma u DHFR genu uočena je statistički značajno viša učestalost C alela kod pacijenata sa povišenim nivoom transaminaza, odnosno hepatotoksičnim efektima metotreksata. Asocijacija ovog polimorfizma sa efikasnošću metotreksata nije uočena. Dobijeni rezultati mogu poslužiti kao smernica za dalja istraživanja povezanosti određenih haplotipova koji sadrže rs3045983 i rs1650697 DHFR polimorfizme sa efikasnošću i toksičnošću metotreksata kod pacijenata sa reumatoidnim artritisom.

Rheumatoid arthritis (RA) is a chronic autoimmune disease characterized by systematic inflammatory status, joint destruction and pain. Among agents for the treatment of rheumatoid arthritis, methotrexate (MTX) is the most commonly used drug. Methotexate has been confirmed to reduce disease activity and delay the development of bone erosions. However, major drawbacks are that patients show great interindividual variability in response to methotrexate and only about 50% show a good clinical response. Additionally, occurrence of a broad spectrum of side effects forces 30% of patients to discontinue therapy. It is suspected that this interindividual variability is due, among other reasons, to presence of different alleles of genes coding for enzymes responsible for transport and metabolism of methotexate, which may cause changes in gene expression or modify enzyme activity. The aim of this study was to identify genotypes of the patients with rheumatoid arthritis that have been treated with methotrexate at least six months and investigate whether selected polymorphisms in DHFR, MTHFR, MTHFD-1 and RFC-1 genes modulate methotrexate efficacy and/or influence adverse drugs effects. The efficacy of the methotrexate has been estimated using the disease activity score in 28 joints based on EULAR (European League Against Rheumatism) criteria and relative DAS28 (Disease Activity Score) values based on 28 swollen or tender joints count, erythrocyte sedimentation rate and subjective assessment of patients themselves about their general health condition. All adverse drug events were recorded based on patient's statements, laboratory analysis and medical examination. Association studies have been conducted between obtained genotypes and the efficacy and toxicity of methotrexate. The study included 243 patients with rheumatoid arthritis treated and prospectively followed at the Institute of Rheumatology, Faculty of Medicine, University of Belgrade, Serbia. Current or past treatment with methotrexate for at least six months was the main criterion for patient inclusion in the study. For each patient diagnosis was established according to EULAR (European League Against Rheumatism) criteria for RA. The study was conducted at the Institute for Human Genetics, Faculty of Medicine, University of Belgrade. In our study, association between MTHFR C677T, A1298C, MTHFD-1 G1958A, RFC-1 G80A polymorphisms and efficacy and toxicity of methotrexate in RA patients was not observed. However, we have found a significant protective effect of DHFR rs3045983 allele 1 in regards to methotrexate toxicity. There was no association of this polymorphism with therapy response. We have also found a higher frequency of C allele of rs1650697 DHFR polymorphism among the patients with elevated transaminaze levels, result of MTX hepatotoxicity in those patients. Association of this polymorphism with the efficacy of methotrexate has not been noticed. These findings may be considered as a guide mark for further research of association of certain haplotypes containing rs3045983 and rs1650697 DHFR polymorphisms with efficacy and toxicity of methotrexate in RA patients.

A Method for designing domain-specific reconfigurable arrays

Metoda projektovanja namenskih programabilnih hardverskih akceleratora

Namenski računarski sistemi se najčesće projektuju tako da mogu da podrže izvršavanje većeg broja željenih aplikacija. Za postizanje što veće efikasnosti, preporučuje se korišćenje specijalizovanih procesora Application Specific Instruction Set Processors–ASIPs, na kojima se izvršavanje programskih instrukcija obavlja u za to projektovanim i nezavisnimhardverskim blokovima (akceleratorima). Glavni razlog za postojanje nezavisnih akceleratora jeste postizanjemaksimalnog ubrzanja izvršavanja instrukcija. Me ¯ dutim, ovakav pristup podrazumeva da je za svaki od blokova potrebno projektovati integrisano (ASIC) kolo, čime se bitno povećava ukupna površina procesora. Metod za smanjenje ukupne površine jeste primena DatapathMerging tehnike na dijagrame toka podataka ulaznih aplikacija. Kao rezultat, dobija se jedan programabilni hardverski akcelerator, sa mogućnosću izvršavanja svih željenih instrukcija. Međutim, ovo ima negativne posledice na efikasnost sistema. često se zanemaruje činjenica da, usled veoma ograničene fleksibilnosti ASIC hardverskih akceleratora, specijalizovani procesori imaju i drugih nedostataka. Naime, u slučaju izmena, ili prosto nadogradnje, specifikacije procesora u završnimfazama projektovanja, neizbežna su velika kašnjenja i dodatni troškovi promene dizajna. U ovoj tezi je pokazano da zahtevi za fleksibilnošću i efikasnošću ne moraju biti međusobno isključivi. Demonstrirano je je da je moguce uneti ograničeni nivo fleksibilnosti hardvera tokom dizajn procesa, tako da dobijeni hardverski akcelerator može da izvršava ne samo aplikacije definisane na samom početku projektovanja, već i druge aplikacije, pod uslovom da one pripadaju istom domenu. Drugim rečima, u tezi je prezentovana metoda projektovanja fleksibilnih namenskih hardverskih akceleratora. Eksperimentalnom evaluacijom pokazano je da su tako dobijeni akceleratori u većini slučajeva samo do 2 x veće površine ili 2 x većeg kašnjenja od akceleratora dobijenih primenom DatapathMerging metode, koja pritom ne pruža ni malo dodatne fleksibilnosti.

Typically, embedded systems are designed to support a limited set of target applications. To efficiently execute those applications, they may employ Application Specific Instruction Set Processors (ASIPs) enriched with carefully designed Instructions Set Extension (ISEs) implemented in dedicated hardware blocks. The primary goal when designing ISEs is efficiency, i.e. the highest possible speedup, which implies synthesizing all critical computational kernels of the application dataflow graphs as an Application Specific Integrated Circuit (ASICs). Yet, this can lead to high on-chip area dedicated solely to ISEs. One existing approach to decrease this area by paying a reasonable price of decreased efficiency is to perform datapath merging on input dataflow graphs (DFGs) prior to generating the ASIC. It is often neglected that even higher costs can be accidentally incurred due to the lack of flexibility of such ISEs. Namely, if late design changes or specification upgrades happen, significant time-to-market delays and nonrecurrent costs for redesigning the ISEs and the corresponding ASIPs become inevitable. This thesis shows that flexibility and efficiency are not mutually exclusive. It demonstrates that it is possible to introduce a limited amount of hardware flexibility during the design process, such that the resulting datapath is in fact reconfigurable and thus can execute not only the applications known at design time, but also other applications belonging to the same application-domain. In other words, it proposes a methodology for designing domain-specific reconfigurable arrays out of a limited set of input applications. The experimental results show that resulting arrays are usually around 2£ larger and 2£ slower than ISEs synthesized using datapath merging, which have practically null flexibility beyond the design set of DFGs.

Genomski profil pacijenata dečijeg uzrasta sa hepatičnim glikogenozama: korelacija genotipa i fenotipa i funkcionalna karakterizacija novih varijanti

Genomic profiling of pediatric patients with liver glycogenosis: genotype-phenotype correlation and functional characterization of novel variants

Bolesti koje nastaju usled naslednog enzimskog poremećaja u sintezi ili razgrad- nji glikogena i koje primarno pogađaju jetru i bubrege, nazivaju se hepatične glikog- enoze. Glikogenoza tip I (GSD tip I) je jedan od najčešćih oblika i zauzima posebno mesto u grupi ovih bolesti zbog prepoznatljivog kliničkog fenotipa koji jasno odražava složenu patofoziologiju poremećaja u metabolizmu glikogena. GSD tip Ia razvija se usled deficitarne aktivnosti enzima glukozo-6-fosfataze α (G6Paza-α ili G6PC), a GSD tip Ib nastaje kao posledica deficijencije transportera glukozo-6-fosfat translokaze (G6PT ili SLC37A4) koja se nalazi na membrani endoplazmatičnog retikuluma (ER). U jetri, bubrezima i mukozi creva, G6Paza-α i G6PT formiraju funkcionalni kompleks koji učestvuje u održavanju homeostaze glukoze u krvi između obroka. Ukoliko je ovaj proces narušen, dolazi do nakupljanja glikogena u jetri, bubrezima i intestinalnoj mukozi i razvoja hipoglikemije, hiperlaktatemije, hiperlipidemije, hiperurikemije, i hepatonefromegalije. Ove metaboličke abnormalnosti rezultiraju dugoročnim komplik- acijama bubrežnih bolesti i hepatocelularnih adenoma/karcinoma, čiji su molekularni mehanizmi slabo istraženi. Kod pacijenata obolelih od GSD tip Ib dodatno se javljaju neutropenija i disfunkcija neutrofila i makrofaga, pa zbog toga ovi pacijenti razvijaju rekurentne bakterijske infekcije, neretko praćene simptomima inflamatorne bolesti creva slične Kronovoj bolesti. Uzimajući u obzir patofiziološke posledice metaboličkog stresa kod pacijenata obolelih od GSD tip Ib, od velikog interesa su adaptivni odgovori i molekularni mehanizmi koje ćelije aktiviraju pod takvim uslovima. Poznato je da poremećaj homeostaze ER-a, nastalog kao posledica gubitka intraćelijske produkcije glukoze, dovodi do hronične aktivacije „odgovora nesavijenih proteina” (UPR) čime doprinosi patogenezi mnogih bolesti. Stres ER-a je impliciran u mnogim hroničnim bolestima, ali se vrlo malo zna o hroničnom stresu ER-a uzrokovanog nedostatkom G6PT. Osim GSD tip I, postoji još šest hepatičnih GSD (tipovi 0, III, IV, VI, IX i XI), kao i desetine tipova GSD koje pogađaju skeletne mišiće, srce i druge organe. Pošto su pos- ledice bolesti ozbiljne i ireverzibilne, molekularno-genetičko testiranje je od presudne važnosti za precizno postavljanje dijagnoze i što raniju primenu adekvatne terapije. U okviru ove teze je po prvi put urađeno genomsko profilisanje 41 pacijenata iz 39 nesrodnih porodica iz Srbije. U studiju su uključene samo osobe sa kliničkim Anita Skakić simptomima karakterističnim za različite tipove hepatičnih glikogenoza, kao i 75 ispi- tanika kontrolne grupe iz Srbije. S obzirom da se radi o grupi bolesti sa heterogenom genetičkom osnovom i da je neophodno analizirati više gena kako bi se postavila precizna dijagnoza, pored Sangerovog sekvenciranja korišćeno je i sekvenciranje nove generacije (NGS). Takođe, izvršena je i funkcionalna karakterizacija novoot- krivenih varijanti u genu SLC37A4 koji je odgovoran za razvoj GSD tip Ib. Analiziran je ekspresioni profil kod pacijenata i kontrolnih ispitanika koji su po polu i uzrastu odgovarali analiziranim uzorcima. Takođe, u ovoj studiji je po prvi put upotrebljena metoda CRISPR/Cas9 za precizno editovanje gena SLC37A4 bubrežne ćelijske linije HEK293FlpIn u cilju formiranja novog in vitro model sistema za GSD tip Ib. Dodatno, ispitano je da li narušavanje funkcije transportera G6PT dovodi do razvoja hroničnog stresa ER-a i povišene apoptoze u precizno editovanoj ćelijskoj liniji HEK293FlpIn sa homozigotnom, humanom, patogenom varijantom c.248G>A u genu SLC37A4 u cilju utvrđivanja povezanosti ovih procesa sa renalnim komplikacijama kod paci- jenata obolelih od GSD tip Ib. Upotrebom metode RT-qPCR izmerena je ekspresija molekularnih markera odgovora UPR (ATF4, DDIT3, HSPA5 i XBP1s) i apoptoze (BCL2, BAX) u klonalnim ćelijskim linijama HEK293FlpIn. Proliferacija i vijabilnost klonova detektovana je upotrebom MTT testa. Prikazan je genomski profil kod svih analiziranih pacijenata, od kojih je 5 obolelo od GSD tip Ia, 31 od tip Ib, po jedan pacijent od tip III, tip VI i tip IXa. Kod dva pacijenta koji su bili suspektni na GSD, upotrebom NGS tehnologije identifikovane su patogene varijante u genima uzročnicima za bolest nakupljanja holesterol estara i Shwachman-Bodian-Diamond sindrom. Na osnovu spektra i učestalosti varijanti u genima uzročnicima GSD, konstruisan je genetički algoritam koji omogućava brzu, laku i preciznu detekciju patogenih varijanti. Kod pacijenata obolelih od GSD tip Ia u genu G6PC detektovane su dve poznate patogene varijante, p.Arg83Cys i p.Leu173Pro, dok je kod pacijenata obolelih od GSD tip Ib u genu SLC37A4 detektovano sedam različitih var- ijanti, među kojima su 3 poznate varijante p.Asn27Lys, p.Ser54Arg, p.Leu348Valfs*53, i 4 nove varijante p.Gly83Glu, p.Gly135Asp, p.Pro191Ser i p.Ser263Glyfs*33. Pokazano je odsustvo jasne korelacije genotipa i fenotipa kod pacijenata obolelih od GSD tip Ia iz Srbije, međutim prisustvo varijante p.Ser263Glyfs*33 u genu SLC37A4 nagoveštava da ova promena predstavlja faktor rizika za ranu pojavu neutropenije kod pacijenata obolelih od GSD tip Ib. Svi upotrebljeni bioinformatički alati za predviđanje potencijalnog patogenog efekta, ekspresione studije kao i klinička prezentacija bolesti kod pacijenata obolelih od GSD tip Ib, nedvosmisleno su ukazali da najčešće novootkrivene varijante u genu SLC37A4 (p.Gly83Glu i p.Ser263Glyfs*33) narušavaju funkciju translokaze G6PT. Anita Skakić Optimizovan je protokol za precizno editovanje genoma upotrebom tehnologije CRISPR/Cas9 i formirana je bubrežna ćelijska linija HEK293FlpIn_SLC37A4_c.248G>A koja se karakteriše odsustvom ekspresije gena SLC37A4 i predstavlja novi in vitro model sistem za GSD tip Ib. Pokazano je da u stanju hroničnog stresa, ćelije pokreću odgovor UPR izazvan stresom ER-a, što dovodi do supresije svih UPR molekularnih markera, i promoviše preživljavanje ćelija (sniženi nivoi ekspresije gena ATF4, DDIT3, HSPA5). Međutim, perzistentni metabolički stres uzrokovan izostankom ekspresije gena SLC37A4 prevazilazi mehanizme adaptacije ćelije na hronični stres i induku- je apoptozu kroz povišenu ekspresiju pro-apoptotičkih markera (snižen BCL2/BAX odnos). Sveobuhvatnom molekularno-genetičkom analizom pacijenata suspektih na hepatične GSD iz Srbije, postignuta je 100% uspešnost detekcije patogenih varijanti, čime je omogućena rana primena odgovarajuće terapije specifične za genotip paci- jenta. Rezultati ove studije ukazali su na postojanje najviše incidence GSD tip Ib do sada zabeležene u svetskim okvirima. Takođe, grupa pacijenata iz Srbije sa GSD tip Ib predstavlja najveću nacionalnu kohortu obolelih od ove retke bolesti. Rezultati ove teze istakli su značajnost upotrebe NGS tehnologije za postavljanje precizne dijag- noze GSD i diferencijalne dijagnoze kod pacijenata sa preklapajućim fenotipovima. Ovo je prva studija koja se bavi ispitivanjem uloge molekularnih markera stresa ER-a i apoptoze u patogenezi GSD tip Ib. Takođe, rezultati ove studije dodatno rasvetlja- vaju molekularne mehanizme stresa ER-a, UPR i apoptoze i njihove povezanosti sa bubrežnim komplikacijama kod pacijenata sa GSD tip Ib. Štaviše, novi in vitro model sistem bi mogao biti koristan za proučavanje patogeneze GSD tip Ib i potencijalnih targeta za molekularnu terapiju dizajniranu da koriguje metaboličke abnormalnosti povezane sa disfunkcijom bubrega kod pacijenata obolelih GSD tip Ib.

Hepatic glycogen storage diseases (GSD) are inherited disorders of glycogen synthesis or degradation, which primarily affect the liver and kidneys. GSD type I is one of the most common types and takes a special place in the group of these diseases due to a recognizable clinical phenotype that clearly reflects the complex pathophysiology of disorders in glycogen metabolism. GSD type Ia and type Ib are due to a deficiency of an enzyme glucose-6-phosphatase α (G6Pase-α or G6PC) and endoplasmic reticulum (ER) glucose-6-phosphate translocase (G6PT or SLC37A4), respectively. G6Pase-α and G6PT form a functional complex on the ER membrane, that maintenance the blood glucose homeostasis between the meals, and its deficiency results in excessive accu- mulation of glycogen in the liver, kidney, and intestinal mucosa, leading to the hypogly- cemia, hyperlactatemia, hyperlipidemia, hyperuricemia, and hepathonephromegaly. These metabolic abnormalities result in long-term complications of kidney diseases and hepatocellular adenomas/carcinoma, whose molecular mechanisms are poorly understood. Patients with GSD type Ib, also develop neutropenia and dysfunction of neutrophils and macrophages followed by recurrent bacterial infections, and symptoms of inflammatory bowel disease like Crohn’s disease. Considering the pathophysio- logical consequences of this metabolic stress, the adaptive responses and molecular markers which cells activate under such conditions are of great interest. It is known that disturbance of ER homeostasis, resulting from a loss of intracellular glucose production, leads to the chronic activation of the unfolded protein response (UPR), which contributes to the pathogenesis of many diseases. ER stress is implicated in many chronic diseases, but little is known how the UPR corresponds to the chronic ER stress caused by a deficiency of G6PT. Besides GSD type I, there are six additional hepatic GSD types (0, III, IV, VI, IX and XI), as well as dozens of GSD forms that affect skeletal muscles, heart and other organs. Since the consequences of the disease are serious and irreversible, molecular-genetic testing is crucial for precise diagnosis and applying the appropriate therapy as early as possible. In this study, for the first time, genomic profiling of 41 patients from 39 unrelated families from Serbia was done. Only patients with clinical symptoms specific to different types of hepatic GSD, as well as 75 control subjects from Serbia, were Anita Skakić included in the study. Since GSD is a group of diseases with a heterogeneous genetic basis and it is necessary to analyze several genes in order to establish a precise diagnosis, in addition to Sanger’s sequencing, the Next Generation Sequencing (NGS) was performed. Furthermore, the functional characterization of the novel variants detected in the SLC37A4 gene responsible for the development of GSD type Ib was accomplished. The expression profile of the SLC37A4 gene was analyzed in patients and control subjects, which according to sex and age corresponded to the analyzed samples. In this study, we used the CRISPR/Cas9 precise gene editing method to establish a novel human kidney cell model system for the GSD type Ib. Therefore, we aimed to test if a deficiency of SLC37A4 gene triggers the activation of the UPR response in the ER of precise edited kidney HEK293FlpIn cells, thus contributing to the pathogenesis of GSD Ib. Furthermore, it was tested whether the disturbance of the G6PT in the precisely edited HEK293FlpIn cell line with the homozygous, human, pathogenic variant c.248G>A in the SLC37A4 gene leads to the development of chronic ER stress and elevated apoptosis in order to determine the association of these processes with renal complications in GSD type Ib. Using the RT-qPCR method, the expression of molecular markers of the UPR response (ATF4, DDIT3, HSPA5, and XBP1s) and apoptosis (BCL2, BAX) in HDR clones of HEK293FlpIn was measured. The proliferation and viability of the single cell clones were detected using the MTT test. The genomic profile of analyzed patients identified 5 patients with GSD type Ia, 31 patients with type Ib, and one patient of each types III, VI and IXa. Additionally, in two patients with clinical suspicion of hepatic GSD, the next-generation sequencing revealed known pathogenic variants in non-GSD-associated genes responsible for cholesteryl ester storage disease and Shwachman-Bodian-Diamond syndrome, respectively. Based on the spectrum and frequency of the GSD genetic variants, a genetic algorithm was constructed which enables fast, easy and precise detection of pathogenic variants. Only two known variants were identified in the G6PC gene of GSD type Ia patients, p.Arg83Cys and p.Leu173Pro, while seven different variants were detected in the SLC37A4 gene of GSD type Ib patients, three previously reported in the literature, p.Asn27Lys, p.Ser54Arg, p.Leu348Valfs*53, and 4 novel variants p.Gly83Glu, p.Gly135Asp, p.Pro191Ser and p.Ser263Glyfs*33. Results clearly demonstrated the absence of a genotype-phenotype correlation of GSD type Ia patients from Serbia, but the presence of the variant p.Ser263Glyfs*33 in the SLC37A4 gene suggests that this variant represents a risk factor for the early development of neutropenia in GSD type Ib patients. Computational, expression analysis and clinical presentation in patients undoubtedly confirmed the pathogenic effect of the most common novel variants (p.Gly83Glu and p.Ser263Glyfs*33) in SLC37A4 gene. Anita Skakić Protocol for precise genome editing was optimized using CRISPR/Cas9 technology and the renal cell line HEK293FlpIn_SLC37A4_c.248G>A, characterized by the absence of SLC37A4 gene expression, represents the new in vitro model system for the GSD type Ib. It has been shown that chronic stress triggers an ER-induced UPR response, leading to a suppression of all UPR molecular markers, and promoting cell survival (expression levels of ATF4, DDIT3, HSPA5 were decreased). However, the persistent metabolic stress caused by the absence of SLC37A4 gene expression exceeds the mechanisms of cell adaptation to chronic stress and induces apoptosis through increased expression of pro-apoptotic markers (BCL2/BAX ratio was decreased). Comprehensive molecular-genetic analysis of patients with clinical suspicion of hepatic GSD from Serbia achieved 100% mutation detection rate, allowing early application of appropriate therapy specific to the patient’s genotype. Results of this study revealed the highest worldwide incidence of GSD type Ib. Also, a group of patients from Serbia with GSD type Ib is the largest national cohort of patients with this rare metabolic disease. The results of this thesis supported the usefulness of NGS for correct diagnostics of hepatic GSD and differential diagnosis in patients with overlapping phenotypes. This is the first study of the role of ER stress molecular markers and apoptosis in the pathogenesis of the GSD type Ib. Also, the results of this study further illuminate the molecular mechanisms of the ER stress, UPR, and apoptosis associated with renal complications in patients with GSD Ib. Moreover, the new in vitro model system could be significant for understanding the pathogenesis of the GSD type Ib and exploring the potential molecular therapeutic targets designed to correct metabolic abnormalities associated with renal complications in patients with GSD type Ib.

Gladijatorske igre provincije Dalmacije : uloga spektakla u konstruisanju rimskog identiteta

Gladiatorial games in province of Dalmatia: the role of spectacles in construction of Roman identity

Rad se bavi istraživanjem gladijatorskih spektakala i njihovog značaja u konstruisanju lokalnih identiteta u imperijalnom kontekstu provincije Dalmacije. Gladijatorski spektakli predstavljaju jedan od važnijih aspekata svakodnevnog života u društvima rimskih provincija. Međutim, pored velikog broja radova koji se bave različitim aspektima spektakala, (gladijatorima, organizacijom ili izgradnjom amfiteatara i sl.), malo pažnje je posvećeno ulozi koju igraju prilikom kontakta rimske imperijalne vlasti i lokalnih zajednica. Najveći broj radova, opterećen je tradicionalnim konceptom romanizacije koji podrazumeva binarne pozicije Rimljana i lokalnih zajednica i u kome su Rimljani superiorni u tehnološkom, vojnom, ekonomskom, političkom ili kulturnom smislu. Stoga se i proces promena posmatra jednosmerno, gde lokalne kulture postaju u sve većoj meri „rimske“. Pored ovakve prilično uprošćene pozicije, koncept podrazumeva i uvođenje termina „stepen romanizacije“ koji se obično meri prisustvom i obimom materijalne kulture koja je prethodno obeležena kao „rimska“. U takvom kontekstu spektakli postaju signal već završenog procesa romanizacije u kome nema mesta za lokalna razumevanja, nove rimske kulture. U ovom radu u potpunosti je napušten tradicionalni koncept romanizacije i otvoren je prostor za drugačije perspektive, koje se baziraju, pre svega, na teoriji identiteta. U tom smislu, materijalna kultura se posmatra kao sredstvo za konstrukciju, održavanje i naglašavanje društvenih identiteta. Ciljevi istraživanja su (1) razmatranje materijalne kulture u svetlu konstruisanja lokalnih identiteta, (2) prepoznavanje odnosa različitih individualnih i kolektivnih identiteta, kako bi se što jasnije predstavile prakse čije razumevanje vodi ka objašnjenju provincijalnog koncepta „biti Rimljanin“ u Dalmaciji i (3) pokušaj definisanja odnosa lokalnog provincijalnog društva prema učesnicima gladijatorskih spektakala, njihovog statusa i uloge u društvu rimske Dalmacije. Rezultati istraživanja baziraju se na uzorku koji se sastoji od građevinskih objekata (amfiteatara), epigrafskog i pokretnog arheološkog materijala. Raznovrsnost uzorka omogućila je uvid u različite aspekte organizacije igara, izgradnje objekata u Dalmaciji, popularnosti spektakla među njenim stanovništvom, ali i načina života i statusa učesnika spektakla. Pored osnovnih pitanja postavljenih u radu, tokom diskusije je otvoreno još važnih pitanja. Posebno bi trebalo naglasiti ulogu vojske u organizaciji spektakla. Trebalo bi pomenuti i važnost proučavanja svakodnevnice u razumevanju kulturnih promena. Dok rimski natpisi, svakodnevni predmeti ili arhitektura ne moraju nužno značiti dublje društvene promene (kako tradicionalan pogled na romanizaciju podrazumeva), običaji koji podrazumevaju nove svakodnevne prakse poput odlaska u kupatilo, teatar ili amfiteatar mogu biti indikator takvih procesa. Upravo takve promene na svakodnevnom planu vode do rasprave o širim promenama u okviru zajednica u prošlosti. Bez obzira sa koje strane posmatramo promene, da li podrazumevamo namernu politiku Rima ili spontane procese u sudaru različitih kulturnih ili političkih elemenata, smatram da upravo svakodnevnica može biti ključ za razumevanje zajednica u prošlosti i načina na koji su doživljavali sebe i svet oko sebe.

This paper deals with gladiatorial spectacles and their significance in construction of local identities within imperial context of the Roman province of Dalmatia. The spectacles present one important aspect of provincial societies’ everyday life. However, despite great number of papers concerning different aspects of the spectacles, i.e., gladiators’ status, organization of the games or amphitheatre building, little attention has been paid to their role within contexts of contacts between Roman imperial authorities and local communities, which had no previous knowledge of spectacle concept. Most of these papers are burdened with traditional Romanization concept, which implies binary oppositions between the Romans and the local communities, supposing the Romans as technologically, militarily, economically, politically or culturally superior. In such interpretative setting, change is always perceived as unidirectional and the locals are supposed to be trying to become more Roman. Besides this simplified understanding of the identity constructions, the concept also involves the term of ‘Romanization level’ which, supposedly, can be measured by the amount of material culture previously labeled as Roman. In such a context, appearances of the spectacles are perceived as signs of fully accomplished process of Romanization, where one could not find place for local understanding of Roman culture. This paper abandons the traditional concept of Romanization and opens space for different perspectives on identity construction wherein material culture presents an important agency in the processes of construction, maintenance and emphasizing the local social identities. Research goals of this research are: (1) consideration of the material culture as an active participant in the local identities construction; (2) recognizing the importance of individual and collective identities interrelations in order to more accurately present practices of provincial concept of „being Roman“; and (3) defining the relations between the local societies as participants in gladiatorial spectacles and their subsequent emerging status and roles in society of Roman Dalmatia. Results derive from a sample consisting of: architectural structures (amphitheaters), epigraphic and archaeological finds. Varieties of the sample enable some insight into the different aspects of the game organization, architectural structures in Dalmatia, popularity of the spectacles with the population of the province, and the way of life and social status of the participants in the spectacles. Beside these basic questions, more problems that are important arise within discussion. The importance of Roman army in organization of the spectacles, and significance of leisure studies for understanding of the cultural changes are the most prominent ones. While Latin inscriptions, everyday objects or architecture do not necessary imply some deeper social changes, as the traditional Romanization concept implies, new customs including everyday practices and routines (e.g.: visiting baths, theaters or amphitheaters) indicate some social changes. These changes of everyday life enable the discussion of wider social changes in the past. Regardless of our point of view, whether we look on those changes as a result of deliberate Roman policy or spontaneous moves in collision of the different cultural and political elements, leisure and everyday life may be the key for better understanding of the past societies and their perception of one’s position within the local and imperial world.

Uticaj temperature i kvaliteta hrane na varijabilnost komponenti adaptivne vrednosti i fiziologiju varenja larvi gubara Lymantria dispar L.

Effect of temperature and food quality on variability of fitness components and physiology of digestion in the gypsy moth larvae Lymantria dispar L.

Temperatura i kvalitet hrane utiču na performansu larvi gubara, Lymantria dispar L. nezavisno ili u međusobnoj interakciji. Strategije preživljavanja larvi gubara u temperaturno kao i nutritivno heterogenoj sredini obuhvataju različite tipove reverzibilne i ireverzibilne fenotipske plastičnosti, koje preko uticaja na usvajanje i raspodelu resursa utiču na osobine životne istorije i rezistentnost prema ekstremnim uslovima životne sredine. U cilju ispitivanja efekata temperature i kvaliteta hrane, tj. sadržaja proteina i ugljenih hidrata u hrani na komponente adaptivne vrednosti, kao i ekspresiju genetičke varijabilnosti, larve gubara su izložene delovanju tri različite temperature (suboptimalna, optimalna i supraoptimalna) i 4 kombinacije hranljivog sastava dijete, koje su se međusobno razlikovale kako u ukupnom sadržaju proteina i ugljenih hidrata, tako i u njihovom međusobnom odnosu. U istim eksperimentalnim uslovima ispitivana je uloga procesa varenja, odnosno aktivnosti digestivnih enzima u usklađivanju odnosa i količine unetih nutienata sa potrebama organizma na različitim temperaturama. Takođe, ispitan je uticaj nutritivne vrednosti i balansiranosti hrane na senzitivnost gubara prema stresnim temperaturama. Nepovoljne temperature i nizak sadržaj proteina u hrani, kao i disbalans proteina u odnosu na ugljene hidrate, smanjuju performansu larvi gubara. Uticaji temperature i kvaliteta hrane na komponente adaptivne vrednosti: preživljavanje, trajanje razvića, masu i relativnu brzinu rasta, uglavnom su međusobno nezavisni. Pokazano je da povišena temperatura smanjuje preživljavanje i trajanje razvića larvi ali dovodi do povećanja relativne brzine rasta. Nutritivni sastav hrane nije uticao na preživljavanje, ali je nizak sadržaj proteina u hrani dovodio do produžavanja razvića, smanjenja mase i relativne brzine rasta larvi. Relativna brzina rasta larvi je bila manja i pri visokom sadržaju ugljenih hidrata u hrani, dok je smanjenje mase larvi na hrani sa niskim sadržajem proteina bilo veće ako je i sadržaj ugljenih hidrata bio nizak. Ako se larve hrane dijetom sa visokim sadržajem proteina dolazi do smanjenja aktivnosti proteolitičkih enzima, ukupnih proteaza i tripsina, dok se u uslovima niskog sadžaja proteina i visokog sadržaja ugljenih hidrata smanjuje aktivnost karbohidraza, α-amilaze i α-glikozidaze. Temperatura i hrana deluju nezavisno na aktivnost elastaze i tripsina, α-glikozidaze i kiselih fosfataza, dok je za aktivnost ukupnih proteaza, leucin aminopeptidaze, α-amilaze, lipaze i alkalne fosfataze pokazana značajna interakcija temperature i nutritivnog sastava dijete. Promena aktivnosti ukupnih proteaza sa porastom temperature sastoji se u povećanju aktivnosti na nutritivno najsiromašnijoj i smanjivanju aktivnosti na nutritivno najbogatijoj hrani, dok se promena aktivnosti α-amilaze u odgovoru na povećanje temperature sastoji u povećanju aktivnosti na hrani sa niskim sadržajem ugljenih hidrata. Odgovor lipaze i kiselih fosfataza na nizak sadržaj proteina i visok sadržaj ugljenih hidrata u hrani, kao i nutritivno siromašnu hranu sastoji se u povećanju njihove aktivnosti, dok se aktivnost alkalne fosfataze sa porastom temperature povećava i na hrani sa niskim sadržajem proteina i na hrani sa niskim sadržajem ugljenih hidrata. U odgovoru na delovanje temperature, pokazan je „obrnut obrazac“ promene aktivnosti između endo i egzopeptidaze (elastaze i leucin aminopeptidaze), između endo i egzokarbohidraze (-amilaze i -glikozidaze) i između alkalne i kiselih fosfataza, kao i promena fenotipskih korelacija između pojedinih klasa enzima na nepovoljnim temperaturama i suboptimalnom nutritivnom sadržaju hrane. Uticaj temperature i kvaliteta hrane uočava se i na nivou promene ekspresije genetičke varijabilnosti trajanja razvića, kao i preko značajne varijabilnosti fenotipske plastičnosti u odgovoru na delovanje temperature. Na optimalnoj temperaturi dolazi do porasta heritabilnosti mase larvi na nutritivno najsiromašnijoj hrani, dok porast temperature smanjuje heritabilnost mase ako je u hrani nizak sadržaj jednog ili oba nutrijenta. Genetičke korelacije izmedju trajanja razvića i mase larvi u nepovoljnim uslovima životne sredine su negativne, tj. larve koje karakteriše duže larveno razviće istovremeno imaju i manju masu, dok u optimalnim uslovima nisu detektovane značajne korelacije između ovih osobina. Većina genetičkih korelacije između sredina, kako za trajanje razvića, tako i za masu larvi bila je pozitivna, što je očekivan rezultat za vrste generaliste. Sve genetičke korelacije između sredina za trajanje razvića larvi su pozitivne i nisu značajno različite od „1” tako da predstavljaju ograničenje za evoluciju fenotipske plastičnosti. Genetičke korelacije između sredina za masu larvi su pozitivne i značajno različite od „1” i, mada za masu larvi nije ustanovljena varijabilnost fenotipske plastičnosti, evolucija plastičnosti je moguća usled značajnih razlika u heritabilnosti između sredina. Larve gubara mogu „profitirati“ u nepovoljnim uslovima nutritivno siromašne hrane, jer je rezistentost gubara na temperaturni stres procenjena na osnovu vremena preživljavanja, pokazala najveću vrednost u takvim uslovima. Nasuprot tome, ograničavajući faktori preživljavanja su prethodna aklimacija na (konstantno) povišenu temperaturu tokom ranih stupnjeva larvenog razvića i visok sadržaj proteina i ugljenih hidrata u hrani. Suboptimalna temperatura gajenja i hrana koju karakteriše najmanji odnos proteina u odnosu na ugljene hidrate, kao i povećanje temperature gajenja na nutritivno najsiromašnijoj hrani, značajno smanjuju sposobnost larvi gubara da se presvlače na stresnoj temperaturi.

Temperature and food quality affect the performance of gypsy moth larvae Lymantria dispar L. independently or in an interaction with each other. Survival strategies of gypsy moth larvae in temperature and nutritionally heterogeneous environments include various types of reversible and irreversible phenotypic plasticity, which due to the effect of uptake and distribution of resources affect the life-history traits and resistance to extreme environmental conditions. In order to investigate the direct and interactive effects of temperature and food quality on fitness components, as well as the expression of genetic variation, gypsy moth larvae were exposed to three different temperatures (suboptimal, optimal and supraoptimal) and 4 sets of nutrient composition of the diet, which differed in protein and carbohydrate content. Under the same experimental conditions, the role of digestion and digestive enzyme activity in adjusting nutrient quantity and ratio with organism needs at different temperatures was investigated. Also, it was investigated the effect of nutritional value of the food on sensitivity of gypsy moth larvae to stressful temperatures. An adverse temperature and low protein content in food, as well as an imbalance of protein compared to carbohydrates, reduced performance of gypsy moth larvae. Effects of temperature and food quality on fitness components - survival, developmental time, larval weight and relative growth rate were mainly independent. It has been shown that elevated temperature reduces survival and duration of development, but leads to an increase of the relative growth rate. Nutritional composition of food had no effect on survival, but the low protein content led to prolonged developmental time, reduced larval weight and relative growth rate of gypsy moth larvae. The relative growth rate of larvae was lower if carbohydrate content in food was high, while larval weight reduction was greater if protein content was low and the carbohydrate content was high. Diet with high protein content led to the decrease in specific activities of total protease and trypsin, while low protein and high carbohydrate diet decreased specific activities of carbohydrases, α-amylase and α-glucosidase of larvae. Temperature and food independently influenced activity of elastase and trypsin, α- glucosidase and acid phosphatase, while total protease, leucine aminopeptidase, lipase and alkaline phosphatase activities were significantly affected by interaction of food and temperature. Change of total protease activity with increasing temperature consisted in its increased activity on nutritionally poorest and reduced activity in the richest food, whereas the changes of α-amylase activity in response to increasing temperatures consisted in increased activities in low carbohydrates food conditions. Responses of lipase and acid phosphatase to low protein and high carbohydrate content in food, i.e. nutritionally poor food, were an increase in their activities, while alkaline phosphatase activity increased with increasing temperature on food that are low in both protein and carbohydrate content. In response to temperature, “reverse pattern" of activity was demonstrated between the endo and exopeptidase (elastase and leucine aminopeptidase), endo and exocarbohydrase (α-amylase and α-glucosidase) and among alkaline and acid phosphatases, as well as changes in phenotypic correlations between certain classes of digestive enzymes to adverse temperatures and suboptimal nutritional content of food. The effects of temperature and food quality were also noticeable at the level of expression of the genetic variability of developmental time, as well as by significant variability of phenotypic plasticity in response to temperature. At the optimal temperature there was an increase of heritability of larval weight on nutritionally poorest food, while rise in temperature decreased heritability of larval weight if the food was low in one or both nutrients. Within environments genetic correlations for developmental time and larval weight in adverse environmental conditions are negative, i.e. larvae, which were characterized by longer larval development had lower larval weight but, in optimal conditions did not reveal any significant correlation between these traits. Majority of the across- environment genetic correlations both for developmental time and larval weight were positive, which was an expected result for generalist species. Across- environments genetic correlations for developmental time were positive and not significantly different from “one”, which represented a constraint for the evolution of optimal phenotypic plasticity. Across-environments genetic correlations for larval weight were positive and significantly different from “1” and although, for larval weight was not found variability of phenotypic plasticity, evolution of plasticity was possible due to the significant difference in heritability between environments. The larvae of gypsy moth ”can benefit” from adverse conditions of nutritionally poor food, because the gypsy moth resistance to temperature stress, which was estimated based on survival time, showed the highest value particularly in such conditions. In contrast, the limiting factor for survival was the previous acclimation to (constant) elevated temperature during early larval stages and high content of protein and carbohydrates in food. Suboptimal temperature and food with the lowest ratio of proteins compared to carbohydrates, as well as an increase in temperature on nutrient-poorest food, significantly reduced the ability of gypsy moth larvae to molt in stressful temperatures.

Izolacija, karakterizacija i funkcionalna svojstva humanih matičnih ćelija masnog tkiva

Isolation, characterization and functional properties of human adipose tissue stem cells

modulatorna svojstva zahvaljujući kojima se intenzivno izuĉava njihova primena u regenerativnoj medicini i ćelijskoj terapiji. Mezenhimske matiĉne ćelije (MMĆ) su rasprostranjene u mnogim tkivima i organima i izolovane su iz brojnih adultnih i neonatalnih tkiva. Najvažnije karakteristike MMĆ su samoobnavljanje i sposobnost diferenciranja u ćelije mezenhimskog (osteogene, adipogene, hondrogene, miogene), ali i ektodermalnog i endodermalnog porekla. Iako su ove osobine osnova za njihovu potencijalnu terapijsku primenu, mehanizmi regulacije brojnih funkcija MMĆ, kao i same diferencijacije nisu dovoljno ispitani i objašnjeni, što upućuje na neophodnost detaljnih analiza pre njihove kliniĉke primene. Kako su prvootkrivene MMĆ izolovane iz kostne srži, ispitivanja njihove uloge u procesu hematopoeze, ali i transplantacijama hematopoetskih matiĉnih ćelija, usmerila su aktuelna istraživanja na interakcije MMĆ sa ćelijama imunskog sistema, pri ĉemu je pokazano da su ove interakcije dvosmerne prirode i uzrokuju promene fenotipa i funkcionalnih osobina i MMĆ i imunskih ćelija. Poznato je da MMĆ svoje delovanje na imunske ćelije ostvaruju kako direktnim ćelijskim kontaktima, tako i preko brojnih solubilnih faktora koje produkuju, pri ĉemu molekularna osnova mehanizama modulacije imunskog odgovora nije u potpunosti poznata. Široka rasprostranjenost, multipotentni potencijal diferencijacije i imunomodulatorna svojstva, ĉine MMĆ važnim uĉesnicima u procesu reparacije oštećenih tkiva, u kojem produkujući brojne solubilne faktore uĉestvuju u svim fazama obnavljanja oštećenog tkiva: regulaciji aktivacije i mobilizacije imunskih ćelija, angiogenezi, mobilizaciji fibroblastnih ćelija, obnavljanju i remodelovanju ekstracelularnog matriksa. Kako su ovi procesi ukljuĉeni i u razvoj tumorskog tkiva, mnoga savremena istraživanja usmerena su na prouĉavanje interakcija MMĆ i tumorskih ćelija. Pokazano je da MMĆ mogu biti privuĉene u tumorsku mikrosredinu posredstvom inflamatornih faktora prisutnih u tumorskom tkivu, ali njihovo delovanje, kao i mehanizmi i posledice interakcija sa tumorskim ćelijama još uvek nisu razjašnjeni...

Numerous studies demonstrated that stem cells possess regenerative and modulatory properties and therefore their application in regenerative medicine and cell therapy is intensively considered. Mesenchymal stem cells (MSCs) are distributed in many tissues and organs, and have been isolated from numerous adult and perinatal tissues. The selfrenewal and capacity for differentiation into mesodernal cell types, such as osteoblasts, chondrocytes, adipocytes, but also into cells of ectodermal and endodermal origin, are the most important chracteristics of MSC. Although this properties provide MSCs pivotal role in regenerative medicine, mechanisms involved in regulation of differentiation, as well as in the other functions of MSCs are only partly understood, and therefore additional studies are necesseary before their clinical application. Discovery of bone marrow MSCs and investigation of their role in hematopoiesis and hematopoietic stem cells transplantation, focused current research toward mutual interactions between MSCs and immune cells, which affect the phenotype and functions of both immune cells and MSCs. Immunomodulatory activity of MSCs could be mediated by direct cell contact or by secreted molecules, but the mechanisms by which MSCs exert this activity are still unclear. Due to their wide distribution, multipotent differentiation potential and immune properties, MSC are also important participants in tissue renewal and repair. However, it was shown that beside the innate tropism for injured tissue, MSCs have the capacity to home to tumors and participate in tumor stroma formation. Additionally recent studies indicated that the proangiogenic, anti-apoptotic and/or immunomodulatory properties of MSCs may also act together as tumor promoters, raising significant safety concerns. Adipose tissue is the most distributed tissue in adult organism, consisting predominantly of adipocytes, but also progenitor cells and MSCs which contribute to tissue organization maintenance, as well as heterogeneous population of many other cell types, including immune cells. Adipose tissue is also the most abundant tissue in breast region, and breast cancer is the most frequent malignancy in women today, often associated with the reconstructive surgery as an integral part of breast cancer treatment in which adipose tissue engineering and structural fat grafting, as well as the use of MSCS, are being applied as options for regenerative therapy...

Unapređenje metodologije za vrednovanje i poboljšanje performansi vodovodnih sistema

Advances in methodology for evaluation and improvement of the water distribution system performance

Za potrebe vrednovanja performansi vodovodnih sistema Međunarodna asocijacija za vode je 2006. godine predložila osnovnu metodologiju podele vodnog bilansa na komponenete potrošnje vode i gubitaka vode, i preporučila primenu niza pokazatelja rada vodovodnih sistema kao sredstva za kvantifikaciju i poređenje performansi vodovodnih sistema, po različitim parametrima. Ova metodologija se bazira na podacima o pojedinim komponentama vodnog bilansa, fizičkim karakteristikama sistema i pokazateljima poslovanja vodovodskog preduzeća. Od početka primene ove metodologije, kao osnovni problem u primeni pokazala se neodređenost ulaznih podataka, koja se u daljim proračunima propagira na izračunate vrednosti komponenti vodnog bilansa i indikatore performansi sistema (IP). Podaci velike neodređenosti mogu da navedu na pogrešne zaključke i samim tim dovedu do pogrešnih upravljačkih odluka. U disertaciji je razvijena metoda, zasnovana na ISO metodologiji, za procenu neodređenosti ulaznih podataka o vodovodnom sistemu i propagacije neodređenosti na IP vodovodnih distributivnih sistema. Analiza grešaka i neodređenosti obuhvata proučavanje i kvantifikovanje neodređenosti, kao i mere koje treba preduzeti za njeno minimiziranje. U skladu sa tim, u disertaciji su definisane i aktivnosti koje je potrebno preduzeti kako bi se smanjila neodređenost komponenti vodnog bilansa i odgovarajućih IP. Metoda je uspešno primenjena na primeru vodovodnog distributivnog sistema grada Požarevca. Prikazano je kako sprovedene aktivnosti utiču na smanjenje neodređenosti ulaznih parametara na osnovu kojih se računaju komponente vodnog bilansa i IP i samim tim utiču na povećanje njihove pouzdanosti. U komponentama bilansa vode, značajnu neodređenost ima komponenta prividnih gubitaka vode (voda koju su korisnici vodovoda utrošili ali koja nije obračunata). Za procenu prividnih gubitaka vode još uvek nije razvijena opšteprihvaćena metoda. Sva dosadašnja istraživanja uglavnom su se svodila na procenu netačnosti merenja potrošnje vode na vodomerima, zanemarujući ostale komponente prividnih gubitaka. U ovoj disertaciji prikazana je nova metoda određivanja ukupnih prividnih gubitaka vode. Metodologija se bazira na određivanju srednje godišnje ostvarene potrošnje vode različitih kategorija potrošača, dobijene odovarajućom obradom rezultata merenja minimalne noćne potrošnje, i poređenjem sa obračunatom potrošnjom vode. Primenom računskog algoritma Monte Carlo procenjuje se neodređenost izračunatih prividnih gubitaka vode. Metoda je uspešno primenjena na vodovodnom sistemu Požarevca i rezultati ukazuju na njenu dobru praktičnu primenu. U ovoj disertaciji je takođe razvijena i nova metoda za određivanje smanjenja ukupnih potreba za vodom usled smanjenja radnog pritiska u vodovodnom sistemu, gde je posebna pažnja posvećena analizi i kvantifikaciji uticaja pritiska na pojedine komponente vodnog bilansa. Ovo je od posebnog značaja za pravilno određivanje IP vezanih za gubitke vode, i ocene njihovog poboljšanja pri smanjenju radnog pritiska. Metodologija je primenjena na distributivoj vodovodnoj mreži naselja Kotež (Beograd), gde su dobijeni rezultati pokazali dobra slaganja sa rezultatima merenja. Takođe, metoda je uspešno primenjena i na vodovodnom istemu Požarevca.

In 2006 the International Water Association proposed an overall methodology for breaking down the water balance into components of water consumption and water losses for purposes of water distribution systems performance assessment, and recommended the application of various water distribution systems performance indicators as a quantification and benchmarking tool. This methodology is based on the water balance components data, the physical properties of the system and the water utility company business performance data. Since the introduction of this methodology, the main problem in its application has been the uncertainty of the input data, which is propagated in further calculations into calculated values of the water balance components and Performance Indicators (PI). Data of great uncertainty may lead to incorrect conclusions and consequently lead to incorrect management decisions. A novel method has been developed within this dissertation which is based on the ISO methodology for the evaluation of uncertainty of distribution system properties input data and the propagation of uncertainty to the PI. The analysis of inaccuracies and uncertainties involves the examination and quantification of uncertainties, and based on the obtained results, measures for their minimization are applied. Accordingly, activities that need to be implemented in order to reduce the uncertainty of the components of the water balance and corresponding PI are defined. The method has been successfully applied in the Požarevac Water Distribution System example which shows how the implemented activities affect the reduction of uncertainty of input parameters, based on which the components of the water balance and the PI are calculated, thus resulting in an increase of their reliability. In terms of uncertainty of the water balance components, the apparent water losses (unbilled water actually used by consumers) represents a component with a large uncertainty for which a generally accepted method of determination has not yet been developed. Previous studies were mostly limited to the evaluation of metered water consumption measuring inaccuracies, while ignoring the other components of apparent losses. This dissertation presents a new method for assessment of total apparent water losses based on the estimate of the mean annual water consumption of different consumer categories obtained from analysis of the minimum night flow method measurements, which is compared with the billed water consumption, while the uncertainty of the results is estimated using the Monte Carlo computational algorithm. The method was applied in the Požarevac Water Distribution System and the results indicate its successful practical application. Additionally, this dissertation presents a new method for determining the reduction in the overall water demand resulting from a reduction of operating pressure in the water distribution system, with special attention given to the analysis and quantification of the impacts of operating pressure on water balance components. This is of particular importance for the proper assessment of PI related to water losses and evaluation of their improvement due to the reduction of operating pressure. This methodology has been applied to the water distribution network of Kotež (Belgrade), where the obtained results showed very good agreement with the measurement results. The method has also been successfully applied to the Pozarevac Water Distribution System.

Elongacioni faktor translacije 1A kod krompira (Solanum tuberosum L.): karakterizacija izoformi, ekspresija i uloga u odgovoru biljaka na toplotni stres

characterisation of isoforms, expression, and role in plant response to heat-stress.

Eukariotski elongacioni faktor translacije 1A (eEF1A) je citosolni, multifunkcionalni protein koji ima ključnu ulogu u elongacionoj fazi tokom sinteze proteina, vršeći transport aa-tRNK do mesta A na ribozomima. Pored osnovne funkcije, ovaj elongacioni faktor može učestvovati i u eksportu molekula iz nukleusa, organizaciji citoskeleta, proteolitičkoj degradaciji proteina, kao i posedovati aktivnost molekularnog šaperona. U ovoj tezi ispitan je uticaj visoke temperature na proces tuberizacije, rastenje i razviće, kao i ekspresiju eEF1A u izdancima, listovima i krtolama kod različitih sorti krompira gajenih u kontrolisanim uslovima ili u polju. Pored toga, urađena je i karakterizacija izoformi eEF1A u listovima kod različitih sorti krompira gajenih ex vitro ili u polju. Kod različitih sorti krompira izvršena je procena broja kopija gena koji kodiraju eEF1A, a ekspresija eEF1A gena u uslovima visoke temperature je ispitana kod sorti Désirée i Festival. Analiza zastupljenost eEF1A u mikro- i minikrtolama kod toplotno-osetljive sorte Désirée, je pokazala da u uslovima dugotrajnog toplotnog stresa dolazi do smanjenja zastupljenosti eEF1A, dok sa druge strane kod toplotno-tolerantne sorte Festival, dolazi do povećanja zastupljenosti eEF1A, kako u mikrokrtolama, tako i u starijim minikrtolama. Ovaj rezultat ukazuje na ulogu eEF1A u ublažavanju negativnog uticaja visoke temperature na proces tuberizacije kod krompira. Značajna korelacija ustanovljena je između zastupljenosti eEF1A u listovima krompira gajenih u polju tokom dve izuzetno tople godine (2011. i 2012.) i prinosa krompira. Rezultati eksperimenata u uslovima ex vitro, kao i polju, su pokazali da je relativna molekulska masa eEF1A krompira 49,2 kDa i da ima 5-8 izoformi. Povećanoj zastupljenosti eEF1A u uslovima visoke temperature, najviše su doprinela 2-3 polipeptida/izoforme iz bazne grupe. Genomska analiza je ukazala na postojanje više gena koji kodiraju eEF1A kod krompira, kao i da se ispitivane sorte razlikuju po broju kopija gena. Analiza ekspresije eEF1A gena u minikrtolama toplotno-osetljive sorte Désirée pokazala da je ekspresija većine gena osetljiva na delovanje visoke temperature, te dolazi do značajnog smanjenjenja broja većine eEF1A transkripata u uslovima toplotnog stresa. Sa druge strane, kod toplotno-tolerantne sorte Festival, visoka temperatura je imala blaži efekat na ekspresiju većine eEF1A gena, odnosno zastupljenost pojedinih transkripata se blago povećala ili ostala na nivou kontrole u uslovima visoke temperature. Izuzetak je predstavljao transkript eEF1A-12 gena koji se karakterisao izuzetnom inducibilnošću. Na osnovu dobijenih rezultata može se zaključiti da ekspresija gena eEF1A-12 u uslovima visoke temperature najviše doprinosi povećanju zastupljenosti eEF1A proteina u krtolama toplotno-tolerantne sorte Festival, što otvara mogućnost za njegovo korišćenje u kreiranju novih, termotolerantnih sorti krompira putem klasičnih metoda selekcije ili metoda genetičkog inženjeringa.

Eukaryotic elongation factor 1A (eEF1A) is a cytosolic, multifunctional protein that plays a central role in the elongation phase of translation by delivering aa-tRNA complex to the A site of the ribosome. The eEF1A is also implicated in the nuclear export of aa-tRNA, organization of the cytoskeleton, participates in proteolysis, and possess chaperone activity. In this thesis, the effects of high temperatures on tuberization, growth, and development, as well as the expression and accumulation of eEF1A in shoots, leaves, and tubers, were investigated in different potato cultivars grown in a controlled environment and field. In addition, the characterization of eEF1A isoforms in leaves of different potato cultivars grown ex vitro or in the field was done. Also, in different potato cultivars, the number of eEF1A-coding genes, as well as the eEF1A genes' transcript expression under a high-temperature treatment, were investigated. Investigation of eEF1A accumulation in micro- and minitubers of heat- sensitive cultivar Désirée revealed a lower level of eEF1A under prolonged heat-stress, while in heat-tolerant cultivar Festival, a higher level of eEF1A in microtubers and older minitubers was found. Also, a significant positive correlation between eEF1A abundance in potato leaves and the potato productivity in the field was observed in two extremely hot years 2001. and 2012. These results indicate an important eEF1A role in mitigation of the adverse impacts of high temperature on the tuberization in potato. Results from ex vitro and field experiments have shown that potato eEF1A is a protein of 49.2 kDa with multiple isoforms (5-8). Increase in eEF1A abundance under high- temperature condition was mainly due to 2-3 basic polypeptides/isoforms. Genomic analysis indicated the existence of multiple genes encoding eEF1A in potato. Analysis of eEF1A genes' transcripts in minitubers of heat-sensitive cultivar Désirée revealed that expression of the most genes was sensitive to high temperature, and there was a significant reduction in number of eEF1A transcripts. On the other hand, in heat-tolerant cultivar Festival, high temperature had a milder effect on eEF1A gene-expression. The abundance of most eEF1A transcripts slightly increased or remained unchanged under high-temperature condition, with the exception of the eEF1A-12 transcript which was highly heat-inducible. Based on results obtained in this thesis, it can be concluded that eEF1A-12 gene expression mainly contributes to an observed increase in eEF1A abundance under high-temperature conditions in tubers of heat-tolerant cultivar Festival, which opens the possibility for its utilization in the development of new heat-tolerant potato varieties by classical breeding or genetic engineering.

Rani elektrofiziološki znaci poremećaja spavanja i motorne kontrole u starenju pacova sa neurodegeneracijom holinergičkih neurona

Early electrophysiological markers of the sleep and motor control disorders during aging in rats with neurodegeneration of the cholinergic neurons

Cilj ove doktorske disertacije bio je da ispita uticaj starenja na spavanje u eksperimentalnim modelima holinergičke neuropatologije Alchajmerove i Parkinsonove bolesti, i da pronađe najranije znake poremećaja spavanja u fiziološkom starenju i u starenju sa neurodegenerativnim bolestima. Uticaj starenja na arhitekturu spavanja, elektroencefalografsku (EEG) mikrostrukturu i motornu kontrolu, u toku svake faze spavanja, je praćen u eksperimentalnim modelima bilateralnih oštećenja jedara nucleus basalis (NB) i nucleus pedunculopontinus tegmentalis (PPT) u pacova, kao eksperimentalnim in vivo modelima funkcionalno različitih holinergičkih neuropatologija. Fiziološko starenje dovodi do topografski različitih promena arhitekture spavanja i motorne kontrole iz senzomotorne kore (SMCx) u odnosu na motornu koru (MCx). Pored promena arhitekture spavanja koje su se javile samo u SMCx, fiziološko starenje dovodi i do povećanja propagacije delta i beta oscilacija iz obe kore za vreme budnosti, ali samo iz MCx za vreme REM faze spavanja. Najraniji znaci starenja u eksperimentalnim modelima funkcionalno različitih holinergičkih neuropatologija, dokazani po prvi put, predstavljaju topografski specifične razlike u EEG mikrostrukturi za vreme REM faze spavanja. Smanjenje delta EEG relativne amplitude u SMCx predstavlja najraniji znak starenja kod NB lediranih pacova, dok povećanje sigma EEG relativne amplitude u MCx predstavlja najraniji znak starenja kod PPT lediranih pacova, za vreme REM faze spavanja. Pored toga, starenjem izazvane promene su različito izražene kroz mišićnu kontrolu iz SMCx, a istovremeno i istovetno izražene iz MCx u toku svih faza spavanja. Ova doktorska disertacija je po prvi put dokazala različite poremećaje REM faze spavanja i motorne kontrole u toku spavanja, kao najranije znake početka starenja u funkcionalno različitim holinergičkim neuropatologijama.

The aim of the present doctoral dissertation was to evaluate the impact of aging during sleep in the rat models of Alzheimer’s and Parkinson’s disease cholinergic neuropathology, and to determine the possible different and earlier onset of age-related sleep disorder during healthy aging and aging with the neurodegenerative diseases. We used the bilateral nucleus basalis (NB) and nucleus pedunculopontinus tegmentalis (PPT) lesioned rats as the in vivo models of functionally distinct cholinergic neuropathology, and we followed the impact of aging on sleep architecture, the electroencephalographic (EEG) microstructure and motor control across sleep/wake states. We evidenced the topographically distinct impact of healthy aging on sleep architecture and motor control within the sensorimotor (SMCx) vs. motor cortex (MCx). Whereas healthy aging consistently altered only the SMCx sleep architecture, it increased the delta and beta cortical drives from both cortices during Wake, but only through the MCx drive during rapid eye movement sleep (REM). Our results have shown for the first time that the earliest signs of aging during distinct cholinergic neuropathology were expressed through a different and topographically specific EEG microstructure during REM. EEG delta amplitude attenuation within the SMCx was the earliest sign of aging in the NB lesion, whereas EEG sigma amplitude augmentation within the MCx was the earliest sign of aging in the PPT lesion during REM. In addition, aging was differently expressed through the SMCx drive alterations, but it was commonly expressed through the MCx drive alterations during all sleep/wake states. This doctoral dissertation provided for the first time an evidence of distinct REM sleep disorders and sleep state related cortical drives as the signs of aging onset during functionally distinct cholinergic neuropathologies.

Svetlosni program, gustina naseljenosti i sastav obroka u funkciji proizvodnih parametara,kvaliteta mesa i dobrobiti brojlerskih pilića

Lightening program, stocking density and diet composition in the function of production parameters, meat quality and welfare of broiler chickens

Cilj istraţivanja bio je da se ispita uticaj svetlosnog programa (konstantnog – KS i opadajuĆe- rastuĆeg - ORS), gustine obroka i gustine naseljenosti i njihove interakcije na proizvodne i klaniČne osobine brojlerskih piliĆa, kvalitet mesa i ošteĆenje tabanskih jastuČiĆa. Istraţivanja su sprovedena na farmi piliĆa Donji Crnci nadomak Podgorice u tri ogleda: u prvom su ispitivani efekti svetlosnog programa i gustine obroka, u drugom programi svetla i gustina naseljenosti piliĆa, a u treĆem program svetla i gustina obroka (smeše sa standardnim i poveĆanim sadrţajem energije i proteina, pri Čemu je odnos energija : protein bio konstantan). U svakom ogledu bilo je 320 piliĆa linijskog hibrida Cobb 500, mešanih po polu, a ogledi su trajali 42 dana. U sva tri ogleda formirane su po Četiri grupe sa Četiri ponavljanja i u svakoj grupi bilo je 80 jednodnevnih piliĆa. Proizvodni parametri (telesna masa, utrošak hrane i uginuĆa) praĆeni su u svim ogledima, a izraČunati su konverzija hrane i proizvodni indeks. Telesne mase su merene u uzrastu od 1; 7; 14; 21; 28; 35 i 42 dana. Utrošak hrane utvrčivan je na kraju perioda primene pojedinih smeša, i to: 14. dana koliČina konzumirane starter smeše, 35. dana grovera i 42. dana finišer smeše. Mortalitet je odrečivan beleţenjem broja uginulih piliĆa u toku trajanja ogleda. Na osnovu telesnih masa, konverzije hrane i mortaliteta izraČunati su proizvodni indeksi. Na kraju svakog ogleda, sa 6 nedelja starosti, piliĆi su izmereni pojedinaČno, izraČunati su proseci tretmana, a zatim je od svakog tretmana izdvojeno 20 piliĆa (10 muških i 10 ţenskih) radi ispitivanja klaniČnih karakteristika. Pre klanja piliĆi su gladovali 12 sati. Nakon klanja i ČišĆenja trupovi su ohlačeni na 40C u toku 24 sata, a potom obračeni kao: „klasiČna obrada” „spremno za peČenje” i „spremno za roštilj”. Pri konfekcioniranju trupova izdvojena je abdominalna mast, izmerene mase obračenih trupova i dobijeni randmani. Radi utvrčivanja prinosa i udela osnovnih i sporednih delova trupa izvršeno je rasecanje ohlačenih trupova. Ocena konformacije trupova izvršena je na osnovu utvrčenih apsolutnih mera: duţine piska, duţina kobilice, dubina grudi i obim bataka. KorišĆen je indeks koji predstavlja odnos ţive mase pre klanja i posmatrane mere (g/mm). U ogledu II izvršeno je i fiziČko ispitivanje kostiju, na femuru nakon izdvajanja od skeleta brojlera, a u ogledu III odrečeni su sadrţaj vlage, sadrţaj ukupne masti, ukupnog pepela i ukupnih proteina belog i crvenog mesa, na uzorcima mišiĆnog tkiva grudi i karabataka od 5 muških i 5 ţenskih trupova u svakom tretmanu (ukupno 20). Rezultati ukazuju da svetlosni program nije statistiČki znaČajno uticao na završne telesne mase u ogledima I i II, dok su u ogledu III veĆe mase utvrčene kod piliĆa tovljenih pri KS. Primena ORS uticala je na usporavanje stope rasta u prvom periodu tova, a kao rezultat kompenzacionog porasta bez uticaja na završne mase, sem u treĆem ogledu. Bolju konverziju hrane u periodu ishrane finišerom postigli su piliĆi u ogledu I pri ORS nego pri KS, kao i u ishrani starterom u ogledu III. Svetlosni programi u ogledu II nisu uticali na konverziju hrane i mortalitet piliĆa. Gustina obroka nije uticala na završne mase, konverziju hrane, mortalitet i proizvodni indeks. Kod piliĆa hranjenih obrocima sa višim sadrţajem proteina i energije utvrčene su veĆe telesne mase na kraju tova (P<0.01). Gustina obroka u ogledima I i III nije imala uticaj na konverziju hrane, mortalitet i proizvodni indeks. Znatno je veĆa završna masa piliĆa tovljenih pri gustini naseljenosti od 12 grla/m2 (2667,08 g) nego pri 17 grla/m2 (2435,76 g) i razlike su bile statistiČki visoko znaČajne. Nije utvrčen uticaj gustine naseljenosti na konverziju hrane, mortalitet i proizvodni indeks. Ispitivani faktori (svetlo, gustina obroka i gustina naseljenosti) nisu uticali na randmane, ali jesu interakcije nekih od njih. U svim ogledima utvrčen je manji udeo abdominalne masti pri ORS nego pri KS, ali bez statistiČke znaČajnosti. Gustina obroka i gustina naseljenosti nisu uticali na sadrţaj abdominalne masti. VeĆi je sadrţaj abdominalne masti u svim ogledima bio kod ţenskih nego muških piliĆa. Udeo grudi veĆi je pri KS nego pri ORS, ali su razlike statistiČki znaČajne samo u treĆem ogledu. Gustina obroka i gustina naseljenosti nisu uticale na udeo grudi. Udeo bataka bio je veĆi kod piliĆa tovljenih pri ORS nego pri KS, ali su razlike statistiČki znaČajne samo u prvom ogledu. Udeo karabataka u prvom i drugom ogledu nije se znaČajno razlikovao izmeču svetlosnih programa, dok je u treĆem bio veĆi pri ORS nego pri KS (P<0.01). Nije utvrčen uticaj gustine naseljenosti i gustine obroka na udeo bataka i karabataka. Kod muških piliĆa utvrčen je veĆi udeo bataka, a kod ţenskih karabataka. Relativne vrednosti mera konformacije nisu bile pod uticajem svetlosnih programa i gustine obroka, osim što je pri manjoj gustini naseljenosti relativna vrednost dubine grudi bila veĆa (P<0.05). Na ošteĆenje tabanskih jastuČiĆa nije utvrčen uticaj svetla i gustine obroka, ali su piliĆi pri veĆim gustinama naseljenosti, poČev od 28. dana, imali znatno veĆa ošteĆenja tabanskih jastuČiĆa nego pri manjoj gustini. Svetlosni program i gustina naseljenosti nisu uticali na fiziČke osobine femura: površinu preseka, silu loma i specifiČnu silu loma. Muški piliĆi imali su veĆi površinu preseka i silu loma femura, razlike za površinu preseka su statistiČki znaČajne, ali ne i za silu loma. Procenat masti u tamnom mesu bio je veĆi, a proteina niţi pri ORS nego pri KS. Ostali parametri hemijske analize tamnog i belog mesa nisu bili pod uticajem svetlosnih programa. Gustina obroka nije imala uticaj na hemijski sastav mesa grudi i karabataka. Na osnovu svega iznesenog moţe se zakljuČiti da su sva tri faktora (svetlosni program, gustina obroka i gustina naseljenosti), kao i njihove interakcije, uticali na brojne proizvodne parametre i kvalitet mesa brojlera, pa i na njihovu dobrobit u razliČitim fazama tova. ImajuĆi u vidu ogromne razlike u efektima koji se mogu postiĆi pri razliČitim kombinacijama ovih Činilaca, rezultati ovih i sliČnih istraţivanja treba da olakšaju izbor tehnologije koja Će davati najbolje ekonomske efekte u tovu piliĆa. Takoče, tamo gde su rezultati nejasni ili kontradiktorni, treba nastaviti istraţivanja na veĆem broju jedinki i fokusirati se na ekonomski vaţnije proizvodne i klaniČne osobine piliĆa.

The purpose of the research was to investigate the effect of the lighting program (constant – KS and intermittent – ORS), feed density and stocking density and their interaction with production and slaughterhouse characteristics of broiler chicken, meat quality and feet pad damage. The research was conducted on a chicken farm Donji Crnci in the vicinity of Podgorica, in three trials: the first trial focused on effects of the lighting program and feed density, the second on the lighting program and stocking density and the third on the lighting program and the feed density (mixes with standard and increased content of energy and protein, with a constant energy:protein ratio). Each of the trials included 320 chicken of the Cobb 500 hybrid line, mixed sexes; trials lasted for 42 days. In all three trials, four groups were formed with four repetitions and each group included 80 one-day chickens. Production parameters (weight, feed consumption and deaths) were monitored in all trials and feed conversion ratio and production index were calculated. Weight was measured when broilers were 1; 7; 14; 21; 28; 35 and 42 days old. Feed consumption was determined at the end of the use of specific mixes, as follows: 14th day the quantity of starter mix consumed, 35th day the quantity of grower mix consumed and 42nd day quantity of the finisher mix. Mortality rate was determined by recording the number of chicken that died during the trial. Production indices were calculated based on weight, food conversion ratio and mortality. At the end of all trials, at 6 weeks of age, the chickens were measured individually, group averages were calculated and then by random sampling, 20 chicken were taken from each group (10 males and 10 females) in order to analyse slaughter characteristics. Pre-slaughter fasting lasted for 12 hours. After slaughter and cleaning, the carcasses were cooled to 40C over 24 hours and then processed as: “classical processing”, “ready to grill” and “barbecue ready”. In carcass processing, abdominal fat was taken out, weight of processed carcases measured and carcass yield values were obtained. In order to determine the yield and share of the main and secondary parts of the carcass, cooled carcasses were cut out. Evaluation of carcass conformation was done on the basis of absolute measures of the following: metatarsus length, keel length, breast depth and drumsticks circumference. Index representing the ratio of live weight before slaughter and measure observed was used (g/mm). In Trial II, physical examination of bones was done, on femur, upon separation from the broiler skeleton, and in Trial III moisture content, total fat content, total ash content and total protein of white and red meat was determined on samples of muscle tissue of breasts and thighs of 5 male and 5 female carcasses in each of the treatments (20 in total). The results show that lighting program had no statistically significant effect on final body weight in Trials I and II, while in Trial III, higher weights were recorded in chicken fattened under KS. ORS resulted in slowing down of the growth rate in the first fattening period, and as a result of compensatory growth it had no effect on final weights, except in the third trial. Better food conversion ratio in the period of finisher mix diet was achieved by chicken in Trial I under ORS than those under KS, as well as in starter mix diet in Trial III. Lighting program in Trial II had no effect on food conversion ratio and mortality of chicken. Feed density did not have an effect on final weights, feed conversion, mortality and production index. In chicken fed with meals with higher protein and energy content, higher weight was recorded at the end of the fattening period (P<0.01). Feed density in Trials I and III did not have an effect on feed conversion ratio, mortality and production index. Significantly higher weight was recorded in chicken fattened at the stocking density of 12 animals/m2 (2667.08 g) than at the density of 17 animals/m2 (2435.76 8 g) and differences had statistically high significance. No effect of stocking density was identified in terms of feed conversion, mortality and production index. Factors analysed (light, feed density and stocking population) did not have an effect on carcass yield, but interactions of some of them did. In all the trials, a smaller share of abdominal fat was established under ORS than under KS, but it was not statistically significant. Feed density and stocking density had no effect on abdominal fat content. Higher abdominal fat content in all trials was found in female than in male chicken. The share of breasts is larger under KS than under ORS, but differences are statistically significant only in the Trial III. Feed density and stocking density had no effect on the share of breasts in the carcass. The share of drumsticks was higher in chicken fattened under ORS than those under KS, but differences were statistically significant only in the Trial I. The share of thighs in Trials I and II did not differ significantly between lighting programs, while in the Trial III it was higher under ORS than under KS (P<0.01). Effect of stocking density and feed density on the share of drumsticks and thighs was not determined. Higher share of drumsticks was determined in male chicken while in female, the share of thighs was higher. Relative values of conformation measures were not influenced by the light programs and feed density, except that in lower stocking density the relative value of the breast depth was higher (P<0.05). Effect of light and feed density on feet pads damage was not determined, but chicken in higher stocking density, as of 28th day, had significantly higher feet pad damage than those in lower stocking density. Light program and stocking density did not have an effect on physical properties of femur: cross-sectional area, breaking force and specific breaking force. Male chicken had larger cross-sectional area and femur breaking force, differences in cross-sectional area were statistically significant, but this was not the case with the breaking force. Percentage of fat in dark meat was higher and that of proteins lower under ORS than under KS. Other parameters of the chemical analysis of dark and white meat were not under the influence of the light programs. Feed density had no effect on chemical composition of breasts and thighs meat. Based on all stated above, it can be concluded that all three factors (light program, feed density and stocking density) as well as their interactions had effect on numerous production parameters and quality of broiler meat, including on their welfare in different fattening phases. Taking into account enormous differences in effects that may be achieved in different combinations of these factors, the results of these and similar researches should make easier the selection of the technology that would yield the best economic effects in chicken fattening. Furthermore, where results are unclear or contradictory, further research should be conducted on a larger number of animals and focus on economically more significant production and slaughterhouse characteristics of chicken.

Predeono-ekološka analiza biljnih vašiju i njihovih prirodnih neprijatelja u agroekosistemima: diverzitet, biološka kontrola i taksonomski status parazitoida

Landscape-ecology analysis of aphids and their natural enemies in agroecosystems: diversity, biological control and taxonomic status of parasitoids

Procesi i dobra, koje ekosistemi pružaju čovečanstvu besplatno, a koji su esencijalni za njegov opstanak, nazivaju se ekosistemskim uslugama. Ekosistemske usluge, imaju svoju ekološku, socijalnu i ekonomsku vrednost, i za poljoprivredu imaju veliki značaj, jer utiču na kvalitet zemljišta, kontrolu štetočina, oprašivanje, a samim tim i na prinos useva. Upravljanje poljoprivrednim predelima, sa ciljem očuvanja biodiverziteta i ekosistemskih usluga, nemoguće je bez razumevanja prirode procesa koji na njih utiču. U predelima različite vrste insekata opažaju i koriste svoje okruženje na različit način. Na višim trofičkim nivoima vrste su u većoj meri osetljive na promene sredine, naročito kada imaju specifične zahteve u pogledu resursa ili staništa, a odlikuju se malom veličinom tela i slabim disperzivnim sposobnostima. Parazitoidi, kao značajni prirodni neprijatelji biljnih vašiju, smatraju se bitnim agensima biološke kontrole u mnogim agroekosistemima. Mnoge studije na istom model-sistemu u različitim područjima ili različitim godinama imaju oprečne rezultate u pogledu uticaja predeonih karakteristika na diverzitet, brojnost biljnih vašiju i njihovih parazitoida i biološku kontrolu. Očuvanje biodiverziteta i ekosistemskih servisa u poljoprivrednim predelima zahteva razumevanje ne samo strukture i kompozicije predela, već i funkcionalnog značaja predeonih elemenata za različite organizame i procese od interesa. Istraživanje, sprovedeno u periodu 2010-2012. godine, obuhvata dve predeono- ekološke studije, koje su realizovane u dva odvojena područja (šira okolina Smedereva i područje Pančevačkog rita), kao i taksonomsko-faunističku analizu prikupljenog materijala. U istraživanju koje je sprovedeno u okolini Smedereva proučavan je interaktivni efekat lokalnih i predeonih faktora na brojnost i bogatstvo vrsta biljnih vašiju i njihovih prirodnih neprijatelja, kao i stope primarnog parazititizma i hiperparazitizma. Utvrđeno je da su ekosistemske kontra-usluge (pritisak biljnih vašiju i hiperparazitizam) jače izražene u poljima pšenice, u kojima su biljne vaši pokazale najjači odgovor na udeo poluprirodne žbunaste vegetacije u predelu. Brojnost predatora, bogatstvo vrsta predatora i parazitoida i stope primarnog parazitizma su bile najviše u poljima lucerke, koja karakteriše intermedijerni intenzitet antropogenog remećenja, a ne kao što je očekivano u najmanje antropogeno remećenim utrinama. U poljima lucerke predatori su pokazali najjači negativan odgovor na udeo jednogodišnjih useva u predelu, ali ne i na udeo polu-prirodnih staništa (poluprirodna zeljasta vegetacija, žbunasta vegetacija). Rezultati ovog istraživanja jasno ukazuju na značaj razumevanja funkcionalnog aspekta staništa za organizme u predelu. U dvogodišnjem istraživanju sprovedenom na području Pančevačkog rita analiziran je direktni i interaktivni uticaj sezone i karakteristika predela na brojnost biljnih vašiju i stope primarnog parazitizma u poljima lucerke. Utvrđeno je da brojnosti biljnih vašiju u odnosu na sezonski aspekt variraju između godina i pojedinačnih vrsta. Stope primarnog parazitizma su bile najviše u ranom letnjem periodu tokom obe godine istraživanja. Na brojnost biljnih vašiju lucerke udeo jednogodišnjih kultura u predelu i Shannon-ov indeks diverziteta predela nisu imali uticaj. Sa druge strane, brojnosti monoecičnih vrsta (Acyrthosiphon pisum (Harris, 1776) i Therioaphis trifolii Monell, 1882), su pokazale jasnu zavisnost u odnosu na dostupnost staništa u predelu za koje su svojim životnim ciklusom usko vezane (udeo lucerke u predelu). Nijedna ispitivana predeona karakteristika nije imala uticaj na efikasnost primarnih parazitoida u kontroli brojnosti biljnih vašiju lucerke. U taksonomsko-faunističkom delu istraživanja urađene su morfološke i molekularne analize radi utvrđivanja taksonomskog statusa uočene specifične žute forme “Aphidius eadyi”, koja pripada kompleksu primarnih parazitoida zelene lucerkine vaši, Acyrthosiphon pisum. Rezultati ukazuju na to da je moguće da se radi o širenju geografske rasprostranjenosti orijentalne vrste Aphidius smithi Sharma & Subba Rao, 1959, koje se dešava neprimetno usled velike morfološke sličnosti ove vrste sa vrstom Aphidius eadyi Stary, Gonzalez & Hall, 1980. Takođe, faunistički doprinos istraživanja se ogleda u utvrđenom prisustvu tri nove vrste za Srbiju (Ammiaphis sii (Koch, 1855), Aphis jacobaeae Schrank, 1801, Alloxysta kovilovica Ferrer-Suay & Pujade-Villa, 2013), od kojih je Alloxysta kovilovica nova za nauku.

Processes and goods provided for free by ecosystems to humans, many of which are essential for our existence, are called ecosystem services. Ecosystem services have ecological, social and economic value, and are of great importance for agriculture because they influence soil quality, pest control, pollination, and consequently affect crop yields. Effective management of agricultural landscapes to protect biodiversity and ecosystem services is not possible without understanding the nature of the processes that affect them. In landscapes, different species of insects perceive and use landscapes in different ways. Species at higher trophic levels are more sensitive to environmental changes, especially if they have specific habitat or food requirements, have small body size, or low dispersal abilities. Parasitoids are important natural enemies of aphids and are highly effective biological control agents in many agroecosystems. Many studies of the effects of landscape properties on diversity, abundance of aphids and their parasitoids, and biological control, conducted in the same model-systems in different regions or different years, have opposing results. Protecting biodiversity and ecosystem services in agricultural landscapes requires understanding not only landscape structure and composition, but also the functional importance of landscape elements for different species and specific processes of interest. For this thesis, research was conducted from the year 2010 through 2012. This research consists of two landscape ecology studies, which were carried out in two different regions (in the vicinity of Smederevo and Pančevački rit), as well as taxonomic and faunistic analyses of the collected material. In the vicinity of Smederevo, interactive effects of local and landscape factors on the abundance and species richness of aphids and their natural enemies, as well as primary parasitism and hyperparasitism rates, were investigated. The results of this study show that ecosystem disservices (aphid pressure and hyperparasitism) are promoted in wheat fields, where aphids have the strongest positive response to the percentage of shrublands in the landscape. Contrary to expectations, the abundance of predators, number of predator and parasitoid species, and primary parasitism rates were the highest in alfalfa fields, which had an intermediate level of antropogenic disturbance, and not in antropogenically least distrubed fallows. In alfalfa fields, predators had the strongest negative response to percentage of annual crops per landscape, but showed no response to percentage of semi-natural habitats (grasslands and shrublands). The results of this study clearly demonstrate the importance of understanding the functional roles of different habitats for the organisms in a landscape. During two years of study in the region of Pančevački rit, direct and interactive effects of season and landscape properties on abundance of aphids and primary parasitism rates in alfalfa fields were examined. The results of this study show that the effect of season on abundance of aphids varies between years and aphid species. Primary parasitism rates were highest in early summer in both years. Neither the percentage of annual crops in a landscape nor Shannon’s diversity index of the landscape had any effect on aphid abundance. On the other hand, the abundance of monoecious species (Acyrthosiphon pisum (Harris, 1776) and Therioaphis trifolii Monell, 1882) depended on the availability of habitat in the landscape for which these species are highly specialized (percentage of alfalfa in the landscape). None of analyzed landscape characteristics affected primary parasitoids and their role in controlling aphid numbers in alfalfa fileds. In the taxonomic and faunistic portion of this research, morphological and molecular analyses were conducted to determine the taxonomic position of a specific yellow form of “Aphidius eadyi,” which belongs to the suite of primary parasitoids attacking the pea aphid, Acyrthosiphon pisum. The results of this work suggest these parasitioids are not Aphidius eadyi Stary, Gonzalez & Hall, 1980 but instead the oriental species Aphidius smithi Sharma & Subba Rao, 1959, which may have expanded its geographic distribution while remaining unnoticed due to high morphological similarity between the species. Additionally, the faunistic portion of this research includes findings of three new species for Serbia (Ammiaphis sii (Koch, 1855), Aphis jacobaeae Schrank, 1801, Alloxysta kovilovica Ferrer-Suay & Pujade-Villa, 2013), with Alloxysta kovilovica being new for the science.

Teorijsko i eksperimentalno istraživanje ponašanja veze armiranobetonskog i čeličnog elementa preko armaturnih spojnica

Theoretical and experimental research of the behaviour of reinforced concrete and steel element connection by rebar couplers

Savremenu primenu spregnutih konstrukcija od armiranobetonskih i čeličnih elemenata prate intenzivna istraţivanja njihovih meĎusobnih veza. Istovremeno, nova tehnološka rešenja, vezana za pojednostavljenje oplate i povećanje brzine betoniranja, donose sve širu upotrebu armaturnih mehaničkih spojnica, pre svega za nastavljanje armature, ali i kao jedan od načina za vezu armiranobetonskih i čeličnih elemenata. Osnovni cilj istraţivanja u okviru ove teze je da se ispita mogućnost i način primene konektora formiranih od mehaničke spojnice sa armaturnim ankerom, ugraĎenih u armiranobetonski element, i čeličnog zavrtanja, za prenos sila smicanja u okviru spoja čeličnog i armiranobetonskog elementa u spregnutoj konstrukciji. Posebno se kod ovakvih spojeva ističu problemi lokalnog naprezanja betona u zoni spoja, kao i problemi vezani za prenos sila smicanja, odnosno sila upravnih na pravac mehaničkih spojnica. Nakon izvršenog detaljnog istraţivanja savremene naučnoistraţivačke i stručne literature u oblasti smičućih veza u spregnutim konstrukcijama, u okviru ove teze su izvršena eksperimentalna, numerička i teorijska istraţivanja granične nosivosti i ponašanja smičućih konektora sa mehaničkom spojnicom i armaturnim ankerom. Eksperimentalna ispitivanja su sprovedena na 18 uzoraka, rasporeĎenih u 5 serija. Numerička nelinearna analiza u programu ABAQUS sprovedena je na 28 numeričkih modela u konačnim elementima, prethodno kalibrisanih prema rezultatima eksperimentalnih isptivanja. U okviru ovih istraţivanja je pokazano da se smičući konektori sa mehaničkom spojnicom i armaturnim ankerom, sa aspekta nosivosti, mogu koristiti kao elementi smičućih spojeva u spregnutim konstrukcijama, i da se njihovo ponašanje moţe uporediti sa ponašanjem naknadno ugraĎenih ankera i ostalih ankera koji se ne sidre glavom. Na osnovu rezultata istraţivanja je zaključeno da granična nosivost ispitivanog smičućeg konektora po betonu u blizini ivice, moţe biti odredjena korišćenjem izraza za odreĎivanja iste nosivosti za naknadno ugraĎene ankere, opterećene paralelno sa betonom, uz prethodno odreĎivanje efektivne duţine iii zamenjujućeg konektora sa mehaničkom spojnicom konstantnog poprečnog preseka. U okviru ove teze je razvijen je originalni izraz za odreĎivanje ove duţine, u funkciji od prečnika zavrtnja, prečnika mehaničke spojnice i čvrstoće betona pri pritisku. Parametarskom analizom razmatran je uticaj čvrstoće betona pri pritisku, prečnika zavrtnja i spojnice kao i osnog rastojanja konektora od ivice armiranobetonskog elementa na njegovu nosivost i ponašanje, kao i efekat trenja izmeĎu površina čeličnog i armiranobetonskog elementa u spregnutoj vezi opterećenoj na smicanje.

Contemporary structures composed from reinforced concrete and steel elements use is followed by intensive research of their interconnection. Simultaneously, new technologies, regarding the simplification of formwork and concreting speed increase, are bringing mechanical couplers into the wider use, firstly as rebar splices, than as a mean of the connection between reinforced concrete and steel elements in composite structures. The main research goal within the theses is to investigate the possibilities and ways of use of the connectors composed from mechanical couplers with rebar anchors, embedded in concrete, and steel bolts, as a mean of shear transfer in composite structures connections. Specific issues related to this type of connections are local concrete pressure in the connector vicinity, as well as the sear flow along the connector axes. After detailed reviewing of the state of the art regarding shear connectors in composite structures, experimental, numerical and theoretical research on the shear connectors composed from mechanical couplers and rebar anchors resistance and behavior were conducted within this theses. The experimental research was conducted on 18 specimens, arranged in 5 series. Nonlinear numerical analyses, using ABAQUS software, was conducted on 28 numerical models in finite elements, after calibration with the experimental research results. The research resulted in conclusion that the shear connectors composed from mechanical couplers and rebar anchors have sufficient capacity to be used as shear connectors in composite structures, and that their behavior is similar to behavior of post installed anchors, as well as other types of connectors anchored without the head. Based in the research results, it can be concluded that the concrete edge breakout capacity of the investigated connectors subjected to the shear load parallel to the edge can be calculated using the formula for post installed anchors, after determining the effective length of the corresponding constant diameter shear connector with mechanical coupler. The original formula for determining of this length, as a function of coupler and rebar anchor diameter, as well as the concrete compression v strength, was developed within this thesis. Parametric analysis were conducted in order to determine the influence of the concrete compression strength, the bolt and coupler diameter and the edge distance on shear connectors capacity and behavior, as well as the effect of friction between steel and concrete surface.

Morfološka i molekularna karakterizacija humanog masnog tkiva i lipoma različitih anatomskih lokalizacija i ispitivanje izolovanih mezenhimskih ćelija in vitro

Morphological and molecular characterization of human adipose tissue and lipomas of different anatomical localization and examination of isolated mesenchymal cells in vitro

Lipomi su benigni tumori masnog tkiva sa još uvek nedovoljno razjašnjenom etiologijom i patogenezom. Lipomi su uglavnom lokalizovani potkožno ali se mogu naći i intramuskularno, u telesnim šupljinama i organima, mogu biti solitarni ili multipli, mogu varirati u veličini i histološkoj građi, ali podaci o njihovom molekularnom profilu i mehanizmima nastanka su vrlo oskudni. Mezenhimske matične ćelije iz lipoma (eng. lipoma- derived stem cells - LDSCs) su predložene za primenu u tkivnom inženjerstvu i regenerativnoj medicini od strane autora nekoliko studija zato što je pokazano da imaju karakteristike slične mezenhimskim matičnim ćelijama iz masnog tkiva (eng. adipose-derived stem cells - ADSCs). Osim podataka o potencijalu izolovanih LDSCs da proliferišu i da se diferentuju u adipocite, osteoblaste i hondrocite, nema podataka o ostalim karakteristikama ovih ćelija a ni detaljnog poređenja sa ADSCs na ćelijskom i molekularnom nivou. Cilj jednog dela ovog istraživanja je bio ispitivanje molekularnog profila izolovanih LDSCs i poređenje sa ADSCs u kulturi in vitro, ispitivanje kapaciteta LDSCs da se diferentuju u adipocite i osteoblaste, na ćelijskom, proteinskom i genskom nivou, ispitivanje uticaja kondicioniranih medijuma LDSCs na odgovor makrofaga, kao i ispitivanje imunomodulacijske aktivnosti i efekta na zarastanje rana u sistemu indirektne ko-kulture in vitro, u poređenju sa ADSCs. Cilj drugog dela ovog istraživanja je bio morfološka i molekularna karakterizacija tkiva lipoma i potkožnog belog masnog tkiva (eng. subcutaneous white adipose tissue – scWAT) različitih anatomskih lokalizacija. Rezultati su pokazali da LDSCs i ADSCs poseduju karakteristike mezenhimskih matičnih ćelija i da imaju sličan fenotip ali različitu molekularnu osnovu za diferencijaciju. Obrazac ekspresije gena markera adipogeneze i prisustvo manjeg broja zrelih adipocita u kulturi LDSCs u odnosu na ADSCs nakon 21 dan adipogene diferencijacije ukazuju na slabiji kapacitet LDSCs za diferencijaciju u adipocite u poređenju sa ADSCs. Analiza osteogenih markera nakon 16 dana osteogene diferencijacije je pokazala da i LDSCs i ADSCs imaju fenotip karakterističan za osteoblaste, ali su bile u različitim fazama osteogeneze. Kondicionirani medijumi LDSCs (LDSC-CM) i ADSCs (ADSC-CM) dovode do funkcijske aktivacije nestimulisanih makrofaga i ispoljavaju anti-inflamacijsku aktivnost, sa izraženijim efektom LDSC-CM. LDSC-CM i ADSC-CM deluju povoljno na zarastanje rana u sistemu indirektne ko-kulture in vitro, bez značajnih razlika, i u nivou su pozitivne kontrole. Viša ekspresija gena PPARG i DLK1 u lipomima u odnosu na scWAT ukazuje na intenzivniju adipogenezu u lipomima što je u skladu sa hemijskom analizom tkiva gde je pokazano da se više ukupnih lipida i proteina nalazi u lipomima u odnosu na scWAT. Uočena je viša ekspresija ADIPOQ i niža ekspresija LEP, kao i viša ekspresija gena markera osteogeneze u lipomima u odnosu na scWAT. Viša ekspresija UCP1 i viša imunoekspresija PRDM16 u lipomima u odnosu na scWAT ukazuje na to da lipomi ispoljavaju neke karakteristike mrkog masnog tkiva. Ultrastrukturna analiza tkiva je pokazala prisustvo većeg broja mitohondrija i sitnih lipidnih tela u adipocitima lipoma u odnosu na scWAT. Histološka i histomorfometrijska analiza tkiva su pokazale da postoje razlike u građi tkiva lipoma i scWAT, a analiza imunoekspresije markera makrofaga da je više CD163 pozitivnih M2 makrofaga u odnosu na CD40 pozitivne M1 makrofage prisutno u lipomima u odnosu na scWAT. Uporedna analiza navedenih parametara i markera u tkivima različitih anatomskih lokalizacija je pokazala da postoje razlike između različitih lokalizacija i u grupi lipoma i u grupi scWAT. Na osnovu rezultata in vitro karakterizacije izolovanih LDSCs i ADSCs može se zaključiti da su uočene razlike u kapacitetu za diferencijaciju i njihovoj aktivnosti posledica različitog molekularnog potpisa ovih ćelija i opredeljenja u tkivu. Razlike između lipoma i scWAT u histološkoj građi tkiva, ultrastrukturi, hemijskom sastavu, genskoj i proteinskoj ekspresiji karakterističnih markera adipogeneze, osteogeneze i inflamacije, ukazuju na promene koje su se desile u masnom tkivu, a koje su mogle dovesti do benigne transformacije i nastanka lipoma. Rezultati ove studije značajno doprinose rasvetljavanju potencijalnih mehanizama nastanka lipoma i ukazuju na mogućnosti i ograničenja potencijalnih primena matičnih ćelija iz lipoma.

Lipomas are benign adipose tissue tumors with still insufficiently clarified etiology and pathogenesis. Lipomas are mainly localized subcutaneously but can also be found intramuscularly, in the body cavities and organs, may be solitary or multiple, may vary in size and histological structure, but data on their molecular profile and mechanisms of formation are still scarce. Lipoma-derived stem cells (LDSCs) have been proposed for use in tissue engineering and regenerative medicine by the authors of several studies since it has been shown that these cells have characteristics similar to adipose-derived stem cells (ADSCs). In addition to data on the potential of isolated LDSCs to proliferate and differentiate into adipocytes, osteoblasts and chondrocytes, there is no data on other characteristics of these cells, nor a detailed comparison with ADSCs at the cellular and molecular levels. The aim of one part of this study was to examine the molecular profile of isolated LDSCs and comparison with ADSCs in culture in vitro, to examine the capacity of LDSCs to differentiate into adipocytes and osteoblasts on cellular, protein and gene level, to examine the influence of conditioned media of LDSCs on macrophages’ response, as well as to examine immunomodulatory activity and effect of wound healing in indirect co- culture system in vitro, in comparison with ADSCs. The aim of the second part of this study was the morphological and molecular characterization of lipoma tissue and subcutaneous white adipose tissue (scWAT) of various anatomical localizations. The results showed that LDSCs and ADSCs possess the characteristics of mesenchymal stem cells and have similar phenotype but different molecular basis for differentiation. The pattern of expression of genes that are markers of adipogenesis and the presence of less number of mature adipocytes in LDSCs compared to ADSCs culture after 21 day of adipogenic differentiation, indicate lower capacity of LDSCs for differentiation into adipocytes compared to ADSCs. Analysis of osteogenic markers after 16 days of osteogenic differentiation showed that both LDSCs and ADSCs have a characteristic osteoblast-like phenotype, but they were at different stages of osteogenesis. Conditioned media of LDSCs (LDSC-CM) and ADSCs (ADSC-CM) led to the functional activation of unstimulated macrophages and exhibited anti-inflammatory activity, with pronounced effect of LDSC-CM. LDSC-CM and ADSC-CM acted favorably on wound healing in indirect co-culture system in vitro, without significant differences and at the level of positive control. Higher expression of PPARG and DLK1 gene in lipomas compared to scWAT indicates more intense adipogenesis in lipomas, which is consistent with chemical tissue analysis where it has been shown that more total lipids and proteins were found in lipomas compared to scWAT. Higher expression of ADIPOQ and lower expression of LEP, as well as higher expression of genes that are markers of osteogenesis, was noticed in lipomas compared to scWAT. Higher expression of UCP1 and higher immunoexpression of PRDM16 in lipomas compared to scWAT suggests that lipomas exhibit some characteristics of brown adipose tissue. Ultrastructural tissue analysis revealed the presence of greater number of mitochondria and small lipid bodies in adipocytes within lipoma tissue compared to scWAT. Histological and histomorphometrical analysis showed that there are differences in the structure of lipoma tissue and scWAT, while the analysis of macrophages’ markers expression revealed that there were more CD163 positive M2 macrophages than CD40 positive M1 macrophages presented in lipoma compared to scWAT. Comparative analysis of examined parameters and markers in tissues of different anatomical localizations has shown that there are differences between different localizations in the group of lipomas as well as scWAT group. Based on the results of in vitro characterization of isolated LDSCs and ADSCs, it can be concluded that differences observed in the differentiation capacity and activity are due to different molecular signature of these cells and their commitment in the tissue. Differences between lipomas and scWAT in the histological tissue structure, ultrastructure, chemical composition, expression of genes and proteins that are characteristic markers of adipogenesis, osteogenesis and inflammation, pointed out the changes that occurred in the adipose tissue and that could led to the benign transformation of adipose tissue and lipoma formation. The results of this study significantly contribute to the clarification of the potential mechanisms of lipoma formation and indicate the possibilities and limitations of potential application of stem cells derived from lipoma.

Kliničke i epidemiološke karakteristike sindroma multiple endokrine neoplazije tip 1 i mehanizmi inaktivacije MEN1 gena u tumorskim tkivima endokrinog i van endokrinog sistema

Clinical and epidemiological characteristics of multiple endocrine neoplasia type 1 and mechanisms of MEN1 gene inactivation in endocrine and non-endocrine tumor tissues.

Multipla endokrina neoplazija tip 1 (MEN1) je nasledni tumorski sindrom koji se u svom klasičnom obliku karakteriše pojavom primarnog hiperparatiroidizma (PHPT), neuroendokrinih tumora pankreasa (pNET) i pituitarnih adenoma (PA). Gen odgovoran za nastanak sindroma jeste MEN1 gen koji kodira protein menin, ubikvitarno eksprimirani protein koji učestvuje u brojnim ćelijskim procesima. Germinativna mutacija u MEN1 genu i gubitak heterozigotnosti (GH) govore u prilog tumor- supresorske uloge menina u ovim tumorima. Uprskos ubikvitarnoj ekspresiji menina, za MEN1 je karakteristična predilekcija za endokrine organe. Ipak, ni svi endokrini organi nemaju istu predispoziciju za nastanak tumora. Iako je GH očekivani mehanizam inaktivacije, izvesni stepen heterogenosti među tumorima postoji i u pogledu inaktivacije gena. Razlozi ovakve tkivne specifičnosti nisu razjašnjeni. Cilj studije: Cilj ove doktorske disertacije jeste da se ispitaju kliničke, patohistološke i genetske karakteristike pacijenata sa MEN1 sindromom, kao i analiza inaktivacije MEN1 gena u endokrinim i neendokrinim tumorima ovih pacijenata. Materijal i metode: retrospektivno su analizirane genetičke, kliničke i patohistološke karekteristike 102 uzastopna pacijenta sa MEN1 sindromom (prosečna starost 41,1  18,7 godina, od 3 do 72 godine, žene 68,6%, muškarci 31,4%). Direktno sekvenciranje i MLPA MEN1 gena sprovedeno je kod svih pacijenata. Gubitak genskog materijala 11q13 ispitivan je na 30 različitih uzoraka MEN1 tumora od 10 ispitanika. Rezultati: Analizirano je 75 indeksnih pacijenata i njihovih 27 srodnika koji su pripadali 31 različitoj porodici. PHPT je nađen kod 70/88, (79,5%), PA kod 59/88 (67%) a pNET kod 27/88 (30.7 %) pacijenata. Četrnaest (20,9%) pacijenata je bilo asimptomatsko. Mutacija u MEN1 genu je nađena kod 53,3% (40/75) indeksnih slučajeva, odnosno 65,7% u ukupnom broju ispitanika. Većina pacijenata su bile žene, ali je ovo naročito bilo izraženo među MEN1-negativnim pacijentima (86% odn. 59% kod nosilaca, p<0.01). Opisano je 6 novootkrivenih mutacija (W220G, 941delG, 1088del7, 1184insA, 1473del10, 1602del17). Mutacije koje dovode do skraćenja proteina predvidele su pojavu pNET (OR=5.8, 95% CI 1.7 – 19.7%) i PHPT (OR= 4.3, 95% CI 1.5 – 12.4%). Nosioce mutacije u MEN1 genu odlikovala je značajno ranija pojava svih klasičnih MEN1 tumora, dok ni u jednog od MEN1-negativnih pacijenata nije dijagnostikovano više od 2 klasična MEN1 tumora. PA su bili češći kod nosilaca mutacije (83% odn. 57%, p<0.01), ali je akromegalija gotovo isključivo dijagnostikovana kod MEN1-negativnih pacijenata (41% vs. 3% kod nosilaca, p<0.001). PNET su dominantno dijagnostikovani kod nosilaca mutacije (45% odn. 9% kod MEN1-negativnih, p<0.01), a u većini slučajeva se radilo o multiplim tumorima (58%). PHPT je bio podjednako zastupljen u obe grupe, ali je postojanje poliglanularne bolesti bilo glavno obeležje nosilaca mutacije (77% odn. 0 kod MEN1-negativnih). Gubitak heterozigotnosti je nađen kod 100% pNET, uključujući i dva uzorka nezidioblastoze, 77,8% paratiroidnih lezija (adenoma i hiperplazije), ni u jednom od uzoraka pituitarnih adenoma (3/3) i bronhijalnih NET (2/2), u dva uzorka tumora nadbubrega, jednom uzorku adenokarcinoma dojke, NET timusa i papilarnom karcinomu štitnjače (100%). Zaključak: zastupljenost mutacije u MEN1 genu kod pacijenata sa MEN1 sindromom kao i veliki broj novootkrivenih mutacija u skladu su sa podacima u literaturi. Pankreasni NET i PHPT su bili značajno češći kod pacijenata sa mutacijama koje dovode do skraćenja proteina. Pacijenti sa MEN1 fenokopijom razlikuju se od genetski potvrđenog MEN1 sindroma u nekoliko aspekata: postojanju najviše dva solitarna, koegzistetna tumora koji nastaju u kasnijm godinama života, značajno češćoj zastupljenosti žena, čestom pojavom akromegalije i retkom pojavom pNET. Različita zastupljenost GH među MEN1 tumorima godovi u prilog izražene tkivne specifičnosti i kod klasičnih MEN1 tumora.

Multiple endocrine neoplasia type 1 (MEN1) is an autosomal dominant heritable cancer syndrome characterized by the occurrence of primary hyperparathyroidism (PHPT), pancreatic neuroendocrine tumor (pNET) and pituitary adenoma (PA). The gene responsible for MEN1 is MEN1 tumor suppressor gene which encodes menin, ubiquitously expressed scaffold protein, influencing various cellular processes. The coexistence of heterozygous germline mutation in MEN1 gene, and loss of heterozygosity (LOH) in tumor tissues, demonstrates tumor suppressor role of menin in these tumors. Despite ubiquitous expression of menin, there is strong tissue specificity for endocrine tissue, but some endocrine organs are more frequently affected than other. Although LOH is an expected mechanism of gene inactivation in tumor-suppressor genes, there is heterogeneity in types of gene inactivation among tumors. The aim of the study: The aim of this doctoral thesis is to examine clinical, pathohistological and genetic characteristics of patients with MEN1 syndrome, and to analyze mechanisms of inactivation of MEN1 gene in endocrine and non-endocrine MEN1 tumors in these patients. Materials and methods: Genetic, clinical and histopathological features were analyzed in a retrospective study of 102 consecutive patients with MEN1 (mean age 41,1  18,7 years, range 3 – 72, females 68,6%, males 31,4%). Direct sequencing and MLPA of MEN1 gene were performed in all patients. The presence of 11q13 loss was examined in 30 different MEN1 tumors belonging to 10 patients. Results: We have analyzed 75 index cases and 27 family members, belonging to 31 different families. PHPT was found in 70/88, (79,5%), PA in 59/88 (67%) and pNET in 27/88 (30.7 %) patients. Fourteen (20,9%) patients were asymptomatic. Mutation in MEN1 was found in 53,3% index cases (40/75), or 65,7% of all patients. Women were more prevalent among all patients, but this was especially pronounced in mutation- negative patients (86% vs. 59% in mutation-positive, p<0.01). Six novel point mutations (W220G, 941delG, 1088del7, 1184insA, 1473del10, 1602del17) were found. Truncating mutations predicted development of pNETs (OR=5.8, 95% CI 1.7 – 19.7%) and PHPT (OR= 4.3, 95% CI 1.5 – 12.4%). MEN1 mutation carriers. All major MEN1 tumors appeared earlier in mutation carriers, and none of mutation-negative patients had more than two major MEN1-tumors. PA was more frequent in mutation-negative than in mutation-positive patients (83% vs. 57% respectively, p<0.01). Acromegaly appeared almost exclusively in mutation-negative patients (41% vs. 3% in mutation positive, p<0.001). PNETs predominantly appeared in mutation-positive patients (45% vs. 9% in mutation-negative, p<0.01), and majority of them were multiple (58%). PHPT was equally distributed, but the presence of polyglandular disease was a major feature of mutation carriers (77% vs. none in mutation-negative). The LOH was found in 100% of pNETs, including two samples of nesidioblastosis, 77, 8% of parathyroid lesions (both adenoma and hyperplasia), two samples of adrenal tumors, and one sample of adenocarcinoma of the breast, thymic NET, and papillary thyroid carcinoma (100%). None of PA (3/3) and brNETs (2/2) displayed loss of 11q13. Conclusions: the frequency of MEN1 mutation carriers does not differ from previously reported. Large number of novel mutations among MEN1 patients confirmed previously reported data. PNETs and PHPT were more frequent in patients with truncating mutations. MEN1 phenocopy differs from genetically confirmed MEN1 syndrome in several aspects: the presence of only two, solitary, coexisting major MEN1-tumors that develop later in life, marked female predominance, frequently occurring acromegaly, and rare pNETs. Different LOH rate among tumors suggest that the mechanism that drives LOH may be influenced by the tissue context.

Fenotipska plastičnost ekofizioloških, morfoloških i fenoloških osobina Iris variegata L. (Iridaceae) i diferencijacija genotipova poreklom iz staništa sa različitim svetlosnim karakteristikama

Phenotypic plasticity of ecophysiological, morfological and phenological traits of Iris variegata L. (Iridaceae) and differentiation of genotypes originating from contrasting light habitats

Osnovni ciljevi ovog istraživanja bili su proučavanje efekata heterogenih uslova svetlosti na veličinu i obrazac fenotipske plastičnosti morfoloških, ekofizioloških, fenoloških osobina i njihov uticaj na reproduktivni potencijal kod genotipova Iris variegata u kontrolisanim eksperimentalnim uslovima. Iris variegata kao i kongenerična vrsta Iris pumila su se u dosadašnjim istraživanjima pokazale kao pogodni model sistemi za istraživanja u oblasti evolucione biologije biljaka. Prirodna staništa Iris variegata, mađarskog ili žutog irisa, na teritoriji Srbije se nalaze u severnom, istočnom i južnom delu. U ovo istraživanje uključene su biljke Iris variegata iz specijalnog rezervata prirode "Deliblatska peščara". Izabrani su genotipovi koji su u svojim prirodnim staništima izloženi heterogenim uslovima svetlosti: otvorena staništa u kojima su izloženi punom sunčevom zračenju, i zasenčena staništa u okviru sprata zeljastih biljaka različitih šumskih sastojina sa smanjenim intenzitetom i promenjenim kvalitetom svetlosti (vegetacijska senka). Delovi genotipova su transplantirani na eksperimentalnu površinu sa jasno definisanim intenzitetima i kvalitetima svetlosti. Eksperimentalna površina se sastojala od dva svetlosna tretmana: jednog sa višim intenzitetom svetlosti i višim odnosom crvene i tamnocrvene svetlosti i drugog sa nižim intenzitetom i nižim odnosom crvene i tamnocrvene svetlosti. Eksperiment je trajao dve godine, a vrednosti morfoloških i ekofizioloških osobina su merene tri puta tokom godine - u proleće, leto i jesen. Osobine cvetanja i plodonošenja su praćene tokom perioda cvetanja i formiranja plodova (maj, juni). Varijabilnost praćenih osobina Iris variegata procenjena je analizom varijanse ponovljenih merenja, dok su međusobni odnosi osobina procenjeni korelacionom analizom. Na osnovu rezultata ovog istraživanja utvrđeno je da morfološke i ekofiziološke osobine lista Iris variegata manifestuju značajnu fenotipsku plastičnost prouzrokovanu promenom intenziteta i kvaliteta svetlosti. Veličina i pravac fenotipske promene bili su specifični kako za osobinu, tako i za svetlosni tretman. U uslovima višeg intenziteta i odnosa crvene i tamnocrvene svetlosti dobijene su veće vrednosti gustine stoma. Specifična površina lista je povećana u tretmanu niskog intenziteta i odnosa crvene i tamnocrvene svetlosti. Koncentracije fotosintetičkih pigmenata listova su takođe povećane u delu svetlosnog gradijenta sa nižim intenzitetom i odnosom crvene i tamnocrvene svetlosti. Fenotip Iris variegata se značajno menjao kako tokom vegetacionih sezona tako i tokom dve eksperimentalne godine, a veličina i pravac tih promena su bili specifični za pojedinačne osobine. Značajno različiti obrasci variranja između dve eksperimentalne godine su potvrđeni za sve morfološke i ekofiziološke osobine osim za koncentraciju karotenoida. Promena intenziteta i kvaliteta svetlosti tokom eksperimenta nije značajno uticala na osobine cvetanja i reproduktivni potencijal biljaka Iris variegata. Kod gotovo svih osobina cvetanja i plodonošenja u ovom eksperimentu nije dobijena značajna fenotipska plastičnost, genetička varijabilnost i genetička varijabilost fenotipske plastičnosti. Osobine cvetanja su značajno varirale između eksperimentalnih godina, dok su osobine plodonošenja imale relativno slične vrednosti u dve godine trajanja eksperimenta. Statistički značajne razlike između genotipova utvrđene su za manji broj osobina cvetanja i plodonošenja. Genotipovi Iris variegata različitog porekla su se značajno razlikovali u srednjim vrednostima broja cvetova i masi semena, dok su se genotipovi sa istog prirodnog staništa značajno razlikovali u prosečnom trajanju vremena cvetanja. Koeficijenti heritabilnosti osobina Iris variegata su imale relativno niske vrednosti i bili su specifični za osobinu i svetlosni tretman, vegetacionu sezonu i godinu izvođenja eksperimenta. Heritabilnosti osobina cvetanja i plodonošenja su uglavnom imale veće vrednosti u poređenju sa morfološkim i ekofiziološkim osobinama vrste Iris variegata. Gustina stoma je imala najveće vrednosti heritabilnosti među morfološkim i fiziološkim osobinama. Korelacije između ekofizioloških osobina su gotovo u svim slučajevima bile značajne i pozitivne. Uprkos razlikama u svetlosnom okruženju i poreklu biljaka, korelacioni odnosi između osobina cvetanja i plodonošenja su se pokazali stabilnim u obe godine izvođenja eksperimenta. Mantelovim testom nisu potvrđene značajne razlike korelacionih matrica između eksperimentalnih godina, tretmana, kao i vegetacionih sezona. Poređenjem dobijenih rezultata za Iris variegata i rezultata prethodnih eksperimenata na kongeneričnoj vrsti Iris pumila utvrđeno je da postoje slični obrasci variranja morfoloških i ekofizioloških osobina, ali i značajno različiti obrasci cvetanja i plodonošenja. Eksperiment je izveden na velikom broju genotipova Iris variegata i upućuje na potrebu uključivanja većeg broja faktora u ekološko-evoluciona istraživanja. Značajni efekti godine u kojoj su vršeni ovi eksperimenti, kao i značajne razlike vrednosti osobina između proleća, leta i jeseni, jasno pokazuju da je u istraživanjima evoluciono značajnih odgovora neophodno pratiti, pored prostorne, i vremensku heterogenost sredine. Značajno različiti odgovori određenih tipova osobina na promenu istog sredinskog faktora (svetlost), kod Iris variegata i srodne Iris pumila ukazuju na značaj komparativnog pristupa i neophodnost praćenja različitih tipova osobina u budućim eksperimentima.

The main aims of this research were to study the effects of heterogeneous light conditions on the amount and pattern of phenotypic plasticity of morphological, ecophysiological and phenological traits as well as their influence on the reproductive potential in genotypes of Iris variegata growing in controlled experimental conditions. It has been shown in the previous research, that Iris variegata as well as the congeneric Iris pumila are good model systems for research in evolutionary studies of the plants. The natural habitats of Iris variegata, hungarian or yellow iris, are on the territory of Serbia in the north, east and south parts. This research included plants of Iris variegata from the protected natural reserve of the Deliblato Sands. We have selected genotypes which are in their natural habitats exposed to heterogeneous light conditions: open habitats where they are exposed to full sun light, and the shade habitats under a cover of green plants of different forest stands with less intensity and changeable light quality (vegetative shade). The parts of genotypes have been transplanted to the experimental garden with clearly defined light intensities and qualities. The experimental garden consisted of two light treatments: one with higher light intensity and higher red/far-red ratio and the other with lower intensity and lower red/far-red ratio. The experiment lasted two years, and the values of morphological and ecophysiological traits were measured three times during a year - in spring, summer and autumn. Flowering and fruiting output were recorded during the flowering time and fruit forming (May and June). The variability of researched traits of Iris variegata has been evaluated by the analysis of the variance of repeated measurements, and the mutual relation of traits by correlation analysis. Referring to the results of this research it was noted that morphological and ecophysiological leaf traits of Iris variegata show significant phenotypic plasticity caused by light intensity and quality change. The amount and direction of phenotypic change were specific for the trait as well as for the light treatment. During higher intensity conditions and red/far-red ratio there were higher values of stomatal density. Specific leaf area was larger under low intensity treatment and red/far-red ratio. The concentration of photosynthetic leaves pigments was higher in the part of light gradient with lower intensity and red/far-red ratio. The phenotype of Iris variegata has significantly changed during the vegetative seasons as well as during two experimental years, and the amount and direction of those changes were specific for individual traits. Significatly different patterns of variation between two experimental years were confirmed for all morphological and ecophysiological traits except for the concentration of carotenoids. Effects of different intensity and quality of light on flowering phenology and various reproductive traits were not detected. Absence of plasticity, genetic variability and genetic variability of phenotypic plasticity was uncovered for almost all phenological and reproductive traits. Flowering traits significantly varied between the experimental years, and the fruiting traits had relatively similar values in two years of the experiment. Significant differences between genotypes were found for a small number of flowering traits and for traits describing fruiting success. Significant differences in mean values were observed between genotypes from different habitat types in Iris variegata regarding number of flowers and seed mass per capsule. Plants originating from same habitat differed significantly in average duration of flowering time. Heritability estimates had a low range of variation and were -trait, treatment, year and seasonal specific. Heritability coeficients of flowering and fruiting traits were mainly with higher values comparing with morphological and ecophysiological traits of Iris variegata. Stomatal density had the highest individual values of heritability among morphological and ecophysiological traits. The correlations between ecophysiological traits were in almost all cases significant and positive. In spite of the differences in light environment and the plant origin, the correlational relations between flowering and fruiting traits were stable in both years of the experiment. Mantel’s test did not show significant difference of correlational matrix among the experimental years, treatments as well as the vegetative seasons. Comparing the results of research carried out at two congeneric species (I. variegata and I. pumila), it was noted that there are similar responses for some traits (morphological and ecophysiological), but also significant differences in some components of flowering and fruiting success. The experiment was conducted on a large number of genotypes of Iris variegata and points to the need of involving a number of factors in ecological and evolutionary research. Significatly different patterns of variation between two experimental years, as well as significant change in trait values during spring, summer and autumn, clearly show necessity of monitoring spatial as well as temporal environmental heterogeneity. Considering that genotypes of Iris variegata and Iris pumila display a significant variability in response to variation in the light conditions, indicate the importance of the comparative approach and the need of following different types of traits in future experiments.

Fitocenološka studija vegetacije sa dominacijom vrsta roda Stipa L. na ultramafitima centralnog Balkana

Phytosociological study of Stipa L. species dominated vegetation on ultramafics of central Balkans

Ultramafitska (serpentinska) geološka podloga, odnosno flora i vegetacija koje se na njoj razvijaju, do danas su bile predmet brojnih botaničkih istraživanja. Najveće površine pod ultramafitima u Evropi se nalaze upravo na Balkanskom poluostrvu, i to u njegovom centralnom delu, koji je i bio područje istraživanja za ovu tezu. Istraživana stepolika vegetacija sa dominacijom vrsta roda Stipa na plitkim zemljištima povrh ultramafita, koja je predmet ove teze, do sada nije detaljno istraživana. Iako su u drugoj polovini prošlog i početkom ovog veka publikovani pojedinačni radovi o konkretnim biljnim asocijacijama na ultramafitima u kojima dominiraju različite vrste roda Stipa (Sileneto multicaulis-Stipetum pulcherrimae R. Jovanović 1978, Potentillo-Stipetum pennatae Marković 2007, Stipo mayerii-Convolvuletum compacti Millaku et al. 2011, Stipetum novakii Kabaš et D. Lakušić 2013), njihovi odnosi sa asocijacijama iz vegetacijskog reda Halacsyetalia sendtneri Ritter-Studnička 1970 ili pak Festucetalia velesiacae Br.-Bl. et R. Tx. 1943, nisu razjašnjeni. Ove su asocijacije, naime, tradicionalno svrstavane u vegtacijski red Halacsyetalia sendtneri koji je obuhvatao ultramafitsku vegetaciju na plitkim zemljištima. Takođe, pregledi i zaključci relativno skorašnjih radova ističu činjenicu da je evidentna nedovoljna istraženost, kao i nedostatak informacija o najotvorenijim, inicijalnim tipovima vegetacije na ultramafitima Balkanskog poluostrva. Takođe, samoj problematici diverziteta vrsta roda Stipa koje se javljaju na ultramafitima, u savremenoj literaturi nije posvećena adekvatna pažnja, pri čemu su identifikacije vrsta, kao i imena samih taksona zbog komplikovane taksonomije i nedostatka jasnih diferencijalnih karaktera, a priori preuzimana iz ranijih radova, bez njihove detaljne provere. U tom smislu, diverzitet roda Stipa, kao i sintaksonomska pozicija i detaljna ekološka karakterizacija stepolike ultramafitske vegetacije na plitkim zemljištima sa njihovom dominacijom, do danas nisu rešeni na zadovoljavajući način. Upravo zbog toga, ciljevi ovog rada su sledeći: utvrđivanje taksonomskog diverziteta i rasprostranjenja vrsta roda Stipa na ultramafitima centralnog Balkana, nomenklaturna revizija sintaksona planinskih stepa centralnog Balkana, opisivanje i sintaksonomska karakterizacija zajednica sa dominacijom vrsta roda Stipa na ultramafitima centralnog Balkana, opisivanje florističkog diverziteta i biogeografska karakterizacija analiziranih zajednica, ekološka analiza zajednica sa dominacijom vrsta roda Stipa na ultramafitima centralnog Balkana i sagledavanje ekoloških karakteristika staništa na kojima se analizirane zajednice razvijaju. Najzad na osnovu svih rezultata, krajnji cilj doktorske disertacije bila bi biogeografska i fitocenološka karakterizacija i sintaksonomska klasifikacija stepolike vegetacije sa dominacijom vrsta roda Stipa na plitkim zemljištima povrh ultramafita na području centralnog Balkana. Areali pojedinačnih taksona su kartirani na osnovu podataka iz literature, kao i na osnovu revizija herbarskog materijala i terenskih istraživanja. Ekološki podaci su beleženi na terenu za originalne snimke, dok su za ostale preuzeti iz literature. Za potrebe analize florističkog diverziteta koji je zabeležen u fitocenološkim snimcima istraživane vegetacije određivano je bogatsvo taksona u rangu vrsta i podvrsta. Takođe je urađena i fitogeografska analiza ove flore, kao i njen biološki spektar. Za numeričke fitocenološke anlaize korišćeno je 233 originalna fitocenološka snimka, kao i dodatnih 1695 fitocenoloških snimaka preuzetih iz litearturnih izvora. U fitocenološkoj klasifikaciji praćena su i primenjivana načela klasične Braun-Blankeove metodologije, uz pojedine izmene ovog pristupa. Primenjen je koncept tzv. "relativne vernosti" za dijagnostičke taksone, kako bi se, među floristički i fiziognomski sličnim zajednicama, definisala grupa u kojoj takson ima svoj optimum. Rezultati ove sveobuhvatne studije pokazali su da je na ultramafitima centralnog Balkana prisutno 8 taksona roda Stipa iz dve sekcije i četiri serije, a to su: S. capillata, S. crassiculmis subsp. picentina, S. epilosa, S. mayeri. S. novakii, S. pulcherrima, S. tirsa i S. ucrainica. S. mayeri i S. novakii predstavljaju usko endemične serpentinofite. Areal vrste S. mayeri obuhvata južne delove centralne Srbije, južnu Srbiju, Kosovo i severne delove Albanije, dok areal vrste S. novakii obuhvata zapadnu i centralnu Srbiju. Takson S. crassiculmis subsp. picentina do sada poznat kao endemit južne Italije i Sicilije, konstatovan je i u Makedoniji, zbog čega je dobio status balkansko-apeninskog subendemičnog taksona. Ostali taksoni su sa širokim evroazijskom arealima. Pravi stepski element, takson Stipa ucrainica konstatovan je na ultramafitima severne Makedonije i ova tačka predstavlja najzapadniji nalaz ovog taksona. Sve konstatovane vrste, izuzev vrste S. capillata, na zabeleženim ultramafitskim loklitetima grade otvorene stepolike travne sastojine u kojima dominiraju svojom pokrovnošću i biomasom. Opisano je ukupno 7 novih asocijacija i 4 nove subasocijacije. S. novakii gradi jednu asocijaciju i jednu subasocijaciju, S. pulcherrima dve nove asocijacije i jednu subasocijaciju, S. mayeri učestvuje u izgradnji jedne nove asocijacije i njene dve subasocijacije, dok S. crassiculmis subsp. picentina i S. ucrainica i S. tirsa grade po jednu novu asocijaciju. Novoopisane zajednice sa ultramafita Srbije pripadaju vegetacijskom redu Halacsyetalia sendtneri i svezama Potentillion visianii i Centureo kosaninii-Bromion fibrosi, dok sintaksoni sa ultramafita Makedonije pripadaju vegetacijskom redu Astragalo-Potentilletalia i svezi Saturejo-Thymion. Zajednice se razvijaju uglavnom na otvorenim staništima sa slabo razvijenim zemljištem, najčešće su vidljivi komadi gole matične stene koji mogu štrčati iznad površine. Sastojine su najčešće južno eksponirane, na blažim ili strmijim nagibima i razvijaju se u dijapazonu 250-1050 m.n.v. u zoni hrastovih i crnoborovih zonalnih šuma (Quercion frainetto- cerris, Quercion petraea-cerris, Erico-Pinetalia), u uslovima lokalno modifikovanih varijanti umereno kontinentalne i mediteransko-submediteranske klime. U celokupnoj flori zabeleženoj u svim fitocenološkim snimcima konstatovano je ukupno 244 taksona, od toga je 27 taksona endemičnog karaktera. Poseban pečat i kvalitet ovoj vegetaciji daju endemične serpentinofite, kao i stepski relikti. U areal spektru dominiraju evroazijski i mediteransko-submediteranski areal tipovi, a značajno je učešće i pontskog areal tipa. U ekološkom spektru apsolutno dominiraju hemikriptofite, a za njima slede hamefite i terofite. Istraživana vegetacija na ultramafitima centalnog Balkana danas ima sekundarni stepoliki karakter. Ova vegetacija je u prirodnom obliku verovatno postojala u malim fragmentima na nepristupačnim i strmim mikrostaništima, ali se antropogeno proširila zahvaljujući degradaciji zonalne šumske vegetacije.

Ultramafic geological substrate and corresponding flora and vegetation have been very attractive object of botanical investigations till today. The largest areas over ultramafics are in Europe, especially on the central part of Balkan penisula, which was the investigation area for this study. Studied steppe-like Stipa species dominated vegetation on shallow ultramafic soils has not been elaborated in detail. Indeed, certain papers describing Stipa species dominated associations on ultramafics had been published in the second half of the last and later (Sileneto multicaulis-Stipetum pulcherrimae R. Jovanović 1978, Potentillo-Stipetum pennatae Marković 2007, Stipo mayerii- Convolvuletum compacti Millaku et al. 2011, Stipetum novakii Kabaš et D. Lakušić 2013). However, these studies did not involve sintaxonomic revisions or relationships within Halacsyetalia sendtneri Ritter-Studnička 1970 order or Festucetalia velesiacae Br.-Bl. et R. Tx. 1943 alliance. These associations were traditionally classified within ultramafic vegetation on shallow soils of the Halacsyetalia sendtneri order. Moreover, recent reviews and studies point out the lack of informations on the open initial types of vegetation on ultramafics of the Balkan peninsula. Further on, problems with identification of Stipa species and their diversity on ultramafics were not properly dealt with in the modern literature. The names were a priori taken from the previous papers without checking .The reasons are complicated infraspecific taxonomy and the lack of stable differential characters. Considering all this, the diversity of the genus Stipa, together with sintaxonomic position and characterisation of steppe-like ultramafic vegetation with their dominance, have not been solved in a satisfactory way untill today. Having this in mind, the aims of the study were the following: to determine taxonomic diversity and distribution of Stipa species on ultramafics of the central Balkan; nomenclatural revision of syntaxa of the so-called "mountain steppes" of the central Balkan; to describe and to characterize communities dominated by Stipa species; to describe their floristic diversity and chorologiacal position; to evaluate ecological conditions in these communities. Based on all mentioned, the furthermost aim was biogeographic and phytosociological characterisation and sintaxonomic classification of Stipa species dominated steppe-like vegetation on shallow soils over ultramafics of the central Balkan peninsula. Areas of the individual taxa were mapped based on the literature data, as well as field data and the herbarium revisions. Ecological data were taken from the field for the original releves, or from the literature sorces for literature data. For the purpose of the floristic diversity analyses, the richness of the taxa was estimated on the species and subspecies levels. Also the phytogepgraphic analysis and the analysis of the ecological spectrum were done. For numerical analyses, 233 new and additional 1695 releves from the literature sources releves were taken into account. For the syntaxonomic classification the classic principles of the Braun-Blanquet methodology were used with some modifications. The concept of the "relative fidelity" was used for the diagnostic taxa to search for the optimum occurrence of a species among a group of floristically similar communities. The results of this comprehensive study revealed that 8 taxa of the genus Stipa from 2 sections and 4 series are present on the ultramafics of central Balkan peninsula. These are: S. capillata, S. crassiculmis subsp. picentina, S. epilosa, S. mayeri, S. novakii, S. pulcherrima, S. tirsa i S. ucrainica. S. mayeri and S. novakii are the endemic serpentinophytes. S. mayeri is endemic for central and southern Serbia, Kosovo and northern Albania, while S. novakii is endemic for western and central Serbia. S. crassiculmis subsp. picentina known as endemic for southern Italy and Sicily was found also in Macedonia, so it gained the status of the balkan-apennine subendemic species. The remaining taxa are with wide euroasian areas. S. ucrainica was also found in Macedonia, and this is the utmost western spot of its distribution. All the noticed taxa build up stands with the exception of S. capillata. The total of 7 new associations and 4 new subassociations were described. S. novakii dominates in one association and its subassociation, S. pulcherrima builds up two associations and one subassociation, S. mayeri dominates in one association with two subassociations, while S. crassiculmis subsp. picentina, S. tirsa and S. ucrainica build up one new association each. Newly described associations and subassociations from Serbian ultramafics belong within Potentillion visianii and Centureo kosaninii-Bromion fibrosi alliances of the Halacsyetalia sendtneri order. Syntaxa from the ultramafics of Macedonia belong to alliance Saturejo-Thymion of the Astragalo-Potentilletalia order. Investigated stands develop mostly on open sites with shallow soils, the outcrops of the bare bedrock can often be seen. Iin most cases, stands are southly exposed, developed on slopes, within altitude range of 250-1050 m. a.s.l. in the zone of termophilous mixed deciduous broadleaved forests (Quercion frainetto-cerris, Quercion petraea-cerris) and pine forests (Erico-Pinetalia) within the local modifications of temperate and meditteranean- submediterranean climat. In the total flora 244 taxa were noticed, 27 of which were endemics. Endemic serpentinophytes and the steppic relics are the ones to give the special signet to this vegetation type. In the area spectrum, the dominance of the eurasian and mediterranean-submediterranean type is evident, as well as the pontic area type. In the life form spectrum, there is significant dominance of hemicryptophytes, followed by hamephytes and therophytes. Investigated vegetation on ultramafics of the central Balkans today has the secondary character. It most likely existed naturally in some small inaccessible steepy fragments, but it has been expanded thaks to the antropogenic degradation of zonal forest vegetation.

Identifikacija, genetički diverzitet i biološka kontrola Pseudomonas syringae pv. aptata sa područja Srbije

Identification, genetic diversity and biological control of Pseudomonas syringae pv. aptata from Serbia

Ovaj rad predstavlja opsežnu studiju koja obuhvata identifikaciju, utvrđivanje genetičkog diverziteta, filogenetskog statusa, patogenih karakteristika i biološke kontrole uzročnika bolesti lisne pegavosti šećerne repe koji je izolovan sa komercijalnih zasada na teritoriji AP Vojvodina. Kombinovanjem konvencionalnih mikrobioloških tehnika, LOPAT testova i amplifikacije specifičnih DNK fragmenata, 104 bakterijska izolata su determinisana kao Pseudomonas syringae pv. aptata. Procena genetičkog diverziteta kolekcije izolata, metodama genetičkog profilisanja i analizom sekvenci više genskih lokusa, pokazala je značajan diverzitet unutar patovara i postojanje tri različite linije infekcije. Rep-PCR je pokazao 25 različitih grupa genetičkih profila, dok je korišćenjem PFGE metode pokazano 17 različitih profila. Analiza parcijalnih sekvenci dva visoko konzervirana gena utvrdila je da postoje četiri različite alelske varijante za gyrB gen, dok su za gapA gen izdvojene tri alelske varijante. Dodatno, određivan je filogenetski status reprezentativnih izolata u okviru P. syringae kompleksa, i utvrđeno je da svi izolati pripadaju 02d filogenetskoj grupi. Ocenjivanje patogenog potencijala na osnovu utvrđivanja virulentnosti i agresivnosti reprezentativnih izolata je sprovedeno na 4 sorte šećerne repe. Veliki diverzitet u patogenim karakteristikama je pronađen među testiranim izolatima, dok su najagresivniji izolati P97 i P100 koji uzrokuju intenzitet bolesti u opsegu od 51-75%. Sorte šećerne repe, Lara i Jasmina su se pokazale rezistentnije na bolest nego sorte Marinela i Serenada. Testiranje opsega domaćina pokazalo je veliki diverzitet među izolatima, gde su izolati P21 i P23 imali najširi opseg domaćina. Utvrđivanje biološke kontrole P. syringae pv. aptata sprovedeno je na četiri sorte šećerne repe korišćenjem bakterijske kulture Bacillus amyloliquefaciens SS-12.6, pri čemu je detektovana inhibicija nekroze tkiva i do 92%. Sveukupno, dobijeni rezultati ukazuju na postojanje patogena šećerne repe, sa visokim intra-patovar diverzitetom, koji može voditi poreklo sa drugih biljaka ili može biti rezervoar infekcije ze druge biljke. Biološka kontrola izolata P.syringae pv. aptata je moguća i efikasna.

This work represents a comprehensive study concerning identification, determination of genetic diversity, phylogenetic status, pathogenic characterization and biological control of causative agent of leaf spot disease on sugar beet isolated from commercial fields at the Serbian province AP Vojvodina. Combining conventional microbiological techniques, LOPAT tests and amplification of specific DNA fragments 104 isolates were determined as Pseudomonas syringae pv. aptata. Assessment of genetic polymorphism of collected isolates with genetic fingerprinting methods and Multi-locus sequence analysis showed significant intra-pathovar diversity and existing of three different lines of infection. In particular, Rep-PCR showed 25 different groups of genetic profiles, while PFGE method showed 17 different profiles. Analysis of partial sequences of two highly conserved housekeeping genes (gyrB and gapA genes) showed four and three different allelic variants, respectively. Additionally, the phylogenetic status of representative isolates within a P. syringae complex was determined and all isolates belonged to 02d phylogenetic group. The estimation of pathogenic potential by determining virulence and aggressiveness of representative isolates was conducted on four sugar beet cultivars. Large diversity of the pathogenic characteristics was found among tested isolates and the most aggressive isolates were P97 and P100 which caused disease severity in range from 51% to 75%. Cultivars Lara and Jasmina were showed much more resistant to disease then cultivars Marinela and Serenada. Host range testing showed large diversity between isolates, while isolates P21 and P23 has the broadest host range and caused disease symptoms on each tested plant species. Assessment of biological control of P. syringae pv. aptata was conducted on all four sugar beet cultivars using cell culture of Bacillus amyloliquefaciens strain SS-12.6. Inhibition of tissue necrosis was up to 92%. Overall, the obtained results point out to emerging sugar beet pathogen, with high intra-patovar diversity, which can originate from other plants or be a reservoir of infection for other plants. Biological control of isolates P. syringae pv. aptata is possible and efficient.

Identifikacija i genotipizacija kolekcije Bacillus spp. izolata: karakterizacija bakteriocina liheniocina 50.2

Identification and genotyping of the collection of Bacillus spp. isolates: characterisation of the bacteriocin licheniocin 50.2

Filogenetska raznovrsnost kolekcije 166 izolata roda Bacillus je analizirana upotrebom PFGE metode profilisanja kombinovane sa sekvenciranjem tuf gena odabranih izolata. Analiza PFGE profila je pokazala veliku genetičku raznovrsnost izolata koja je grupisana u 21 grupu. Po jedan izolat, predstavnik svake grupe, identifikovan je na osnovu sekvence tuf gena. Pokazano je veoma jasno i nedvosmisleno grupisanje izolata. Ukupno je identifikovano osam vrsta: Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus safensis, Bacillus thuringiensis, Bacillus cereus i Bacillus anthracis. Posebno zadovoljavajući rezultati su postignuti u razdvajanju B. subtilis i B. amyloliquefaciens izolata kao i B. thuringiensis i B. cereus u posebne klade na filogenetskom stablu. Ispitivanje antibakterijske aktivnosti čitave kolekcije Bacillus spp. je pokazalo da samo izolat VPS50.2, tada identifikovan kao B. licheniformis, proizvodi antimikrobno jedinjenje tipa bakteriocina aktivno protiv indikatorskog soja B. subtilis 168 (Berić, 2010). U ovom radu je bakteriocin liheniocin 50.2 okarakterisan kao termostabilni protein, koji zadržava svoju aktivnost i na visokim temperaturama (30 min na 121°C); tolerantan je na vrlo širok opseg pH vrednosti (najveću aktivnost pokazao je na pH 9); delimično je otporan na dejstvo proteolitičkih enzima i i zadržava aktivnosti i u prisustvu različitih katjona. Na osnovu određenih osobina, liheniocin 50.2 predstavlja novi bakteriocin koji pripada klasi II.3. Sinteza liheniocina 50.2 zavisi od faze rasta soja producenta B. licheniformis VPS50.2 i koincidira sa početkom sporulacije. Testiranjem je utvrđeno da su optimalni uslovi za proizvodnju bakteriocina: gajenje 42h od početka inkubacije, u LB hranljivom medijumu na 37°C, uz aeraciju. Antibakterijski spektar liheniocina 50.2 pokriva samo Gram-pozitivne bakterije, ali pokazuje aktivnost protiv velikog broja različitih vrsta, uključujući i Listeria monocytogenes, meticilin-rezistentne Staphylococcus aureus, β- hemolitičke streptokoke i koagulaza negativne stafilokoke (KNS). Sirovi ekstrakt liheniocina 50.2 je, pri koncentracijama od 2×MIC i 4×MIC, pokazao značajnu baktericidnu aktivnost protiv L. monocytogenes već u prvom času aplikacije. Taj rezultat, kao i već opisane osobine liheniocina 50.2 preporučuju ga kao kandidata za biokonzervans za kontrolu patogenih mikroorganizama, kao i onih koji izazivaju propadanje hrane. Za ispitivanje aktivnosti liheniocina 50.2 protiv formiranja biofilma i na već formirani biofilm KNS iz uretralnih briseva i patogenih L. monocytogenes iz vaginalnih briseva, u istraživanje je uključena i ekstrakt bakteriocina koji proizvodi Lactococcus lactis subsp. lactis biovar. diacetylactis BGBU1-4, zbog toga što prepoznaju različite receptore na površini osetljivih bakterija. Značajna inhibicija na formiranje biofilma je detektovana pri ½ × i ¼ × MIC za liheniocin 50.2 na KNS i ½ × i ¼ × MIC za BGBU1- 4 na L. monocytogenes, ukazujući tako da su funkcije relevantne za formiranje biofilma bile ometene pri subinhibitornim koncentracijama bakteriocina liheniocina 50.2 i eksrakta bakteriocina soja BGBU1-4. Bakteriocin liheniocin 50.2 i i eksrakt bakteriocina soja BGBU1-4 su pokazali statistički značajnu aktivnost i na već formiran biofilm četiri izolata koagulaza negativnih stafilokoka i četiri izolata L. monocytogenes pri koncentracijama od 100 AU/ml i 200 AU/ml. Efekat dobijen kombinacijom bakteriocina liheniocina 50.2 i ekstrakta bakteriocina soja BGBU1-4 sa antibioticima (gentamicinom i ampicilinom) ide od sinergizma, aditivnosti i indiferentnog efekta do antagonizma. Najznačajniji sinergizam je utvrđen u kombinaciji liheniocina 50.2 sa gentamicinom protiv Staphylococcus epidermidis ATCC12228, ekstrakta bakteriocina soja BGBU1-4 sa gentamicinom protiv izolata S. epidermidis 24 i u kombinaciji liheniocina 50.2 sa ekstraktom bakteriocina soja BGBU1-4 protiv izolata S. hominis 10.

The phylogenetic diversity of the Bacillus collection, containing 166 isolates, was analyzed by using the PFGE fingerprinting method combined with the sequencing of the tuf gene of the selected isolates. According to the PFGE analysis which showed a high genetic diversity, the isolates were grouped into 21 clusters. A representative of each group was identified based on the sequence of the tuf gene. Very clear and unambiguous grouping of the isolates was demonstrated. In total, eight species were identified: Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus safensis, Bacillus thuringiensis, Bacillus cereus and Bacillus anthracis. Particularly satisfactory results have been achieved in the separation of B. subtilis and B. amyloliquefaciens isolates, as well as B. thuringiensis and B. cereus, into the individual clades on the phylogenetic tree. Examination of the antibacterial activity of whole collection of Bacillus spp. showed that only isolate VPS50.2, identified as B. licheniformis produces a bacteriocin which has antimicrobial activity against indicator strain B. subtilis 168 (Berić, 2010). In this research, the bacteriocin licheniocin 50.2 was characterized as the thermostable protein, which retains its activity even at the higher temperatures (30 min at 121 ° C); tolerates a very wide range of pH values (the highest activity was shown at pH 9); it is partially resistant to the action of proteolytic enzymes and it also maintains activity in the presence of various cations. Based on certain properties, licheniocine 50.2 represents a new bacteriocin belongs to the II.3 bacteriocin class. Production of the licheniocine 50.2 depends on the stage of the growth of the B. licheniformis VPS50.2 strain and it coincides with the onset of sporulation. The optimal conditions for the production of this bacteriocin were as followed: 42h cultivation in the LB medium at 37° C, with aeration. The antibiotic spectrum of licheniocine 50.2 covers only Gram-positive bacteria. However, it shows activity against the large number of different species, including Listeria monocytogenes, methicillin-resistant Staphylococcus aureus, β-hemolytic streptococci and coagulase-negative staphylococci (CNS). Within the first hour of application, 2×MIC and 4×MIC concentrations of the crude extract of licheniocin 50.2 showed significant bactericidal activity against L. monocytogenes. Due to the described properties, licheniocin 50.2 could be considered as a good candidate as a bio-conservatives for pathogenic microorganisms control, as well as for the control of the microorganisms that cause food degradation. In order to investigate the activity of licheniocin 50.2 against the formation of the CNS biofilm and against the already formed biofilm of the CNS from urethral swabs, as well as the pathogenic L. monocytogenes from vaginal swabs, this study also includes a mixture of bacteriocins produced by Lactococcus lactis subsp. lactis biovar. diacetylactis BGBU1-4, because they use different receptors on the surface of the sensitive bacteria. Significant inhibition of biofilm formation was detected at ½ × and ¼ × MIC for licheniocine 50.2 against CNS, but also at ½ × and ¼ × MIC for extract of BGBU1-4 against L. monocytogenes, indicating that functions relevant for biofilm formation were impaired at subinhibitory concentrations of bacteriocin licheniocin 50.2 and extract of bacteriocins from BGBU1-4. Bacteriocin licheniocin 50.2 and extract of bacteriocins from BGBU1-4 showed statistically significant activity against the already formed biofilm of four isolates of coagulase-negative staphylococci and four L. monocytogenes isolates at concentrations of 100 AU/ml and 200 AU/ml. The obtained results showed that combination of bacteriocin licheniocin 50.2 and extract of bacteriocins from BGBU1-4 with different antibiotics (gentamicin and ampicillin) on CNS and L. monocytogenes could have distinct effects - synergism, additivity, indifferent effect as well as antagonism. The most significant synergism was determined in combination of licheniocin 50.2 with gentamicin against Staphylococcus epidermidis ATCC12228, in combination of extract of bacteriocins from BGBU1-4 with gentamicin against isolate S. epidermidis 24 and in combination of licheniocins 50.2 with extract of bacteriocins from BGBU1-4 against isolate S. hominis 10.

Fitohemijska analiza i biološka aktivnost Ferulago macedonica Micevski et Mayer, Echinophora sibthorpiana Guss., Laserpitium ochridanum Micevski, Heracleum orphanidis Boiss. i Angelica pancicii Vandas (Apiaceae)

Phytochemical analysis and biological activity of Ferulago macedonica Micevski et Mayer, Echinophora sibthorpiana Guss., Laserpitium ochridanum Micevski, Heracleum orphanidis Boiss. and Angelica pancicii Vandas (Apiaceae)

Osnovni cilj ove doktorske disertacije je karakterizacija hemijskog sastava etarskih ulja i ekstrakata retkih i endemičnih vrsta iz Republike Makedonije koje su delimično ili potpuno neistražene: Ferulago macedonica Micevski et Mayer, Echinophora sibthorpiana Guss., Laserpitium ochridanum Micevski, Heracleum orphanidis Boiss. i Angelica pancicii Vandas (Apiaceae). Drugi deo ovog istraživanja odnosi se na utvrđivanje in vitro biološkog potencijala etarskih ulja, metanolnih, etanolnih i vodenih ekstrakata navedenih vrsta i to njihovog antioksidativnog, antimikrobnog i anti-quorum sensing dejstva. U ovom radu su prvi put predstavljeni rezultati hemijske analize etarskih ulja vršnog i nadzemnog dela F. macedonica kao i metanolnih ekstrakata nadzemnog dela i korena vrsta H. orphanidis i A. pancicii. Do sada nije bilo ni literaturnih podataka o biološkim aktivnostima vrsta F. macedonica, H. orphanidis i A. pancicii. GC-FID i GC-MS analiza sastava etarskih ulja proučavanih vrsta pokazala je dominantno prisustvo monoterpenskih i seskviterpenskih ugljovodonika i njihovih oksidovanih formi. Ove analize su pokazale da su etarska ulja vršnog i nadzemnog dela F. macedonica bogata α-pinenom (43,10%; 22,78%) i sabinenom (26,73%; 15,46%). Za etarsko ulje E. sibthorpiana karakteristično je prisustvo velike koncentracije metil eugenola (60,40%), p-cimena (11,18%) i α-felandrena (10,23%), a za etarsko ulje L. ochridanum veliki sadržaj sabinena (22,8%), viridiflorola (14,7%) i α-pinena (11,4%). U etarskom ulju H. orphanidis kao glavna jedinjenja identifikovani su n-oktanol (39,57%), n-oktil heksanoat (17,62%) i n-oktil acetat (14,12%), dok su bornil acetat (8,08%), n-oktanol (5,82%), kesan (4,26%) i β-selinen (4,25%) najzastupljenije komponente etarskog ulja A. pancicii. Rezultati tentativne analize sastava metanolnih ekstrakata odabranih vrsta, dobijenih pomoću HPLC-DAD/ESI-ToF-MS sistema, prvi put su predstavljeni i opisani u ovoj disertaciji. Identifikacija sekundarnih metabolita ekstrakata urađena je na osnovu molekulske formule dobijene korišćenjem Mass Hunter Workstation softvera za prikupljanje i obradu podataka i na osnovu literaturnih podataka o hemijskom sastavu vrsta odgovarajućih rodova i predstavnika drugih rodova familije Apiaceae. U metanolnim ekstraktima F. macedonica, E. sibthorpiana i L. ochridanum identifikovan je mali broj komponenata ili identifikacija jedinjenja nije bila moguća zbog nedostatka literaturnih podataka. Preliminarnom analizom identifikovano je 18 jedinjenja u metanolnom ekstraktu nadzemnog dela H. orphanidis i 25 jedinjenja u korenu ove biljke, dok je u metanolnom ekstraktu nadzemnog dela A. pancicii identifikovano 52, a u korenu 53 metabolita. Kumarini su bili najzastupljenija klasa jedinjenja u analiziranim uzorcima. Iz korena vrste A. pancicii izolovano je 6 poznatih furanokumarina: tert-O-metil-oksipeucedanin hidrat, oksipeucedanin hidrat, oksipeucedanin, saksalin, ostrutol, izoimperatorin i prvi put je izolovan hromon acetilknidimol A. Spektrofotometrijskim metodama najveći ukupan sadržaj fenola izmeren je u etanolnom ekstraktu nadzemnog dela A. pancicii (143,990 mg GA/g suvog ekstrakta), a flavonoida u etanolnom ekstraktu L. ochridanum (67,690 mg QE/g suvog ekstrakta). U ovom radu se pokazalo da je vršni deo F. macedonica bio bogatiji fenolnim jedinjenja od nadzemnog dela biljke, dok je kod ostalih vrsta koncentracija ovih metabolita bila veća u nadzemnom delu u odnosu na koren biljke. Etarska ulja i ekstrakti proučavanih vrsta su primenom tri različita antioksidativna testa pokazali dozno zavisnu sposobnost u neutralisanju slobodnih radikala. Najefikasniji u neutralizaciji slobodnih radikala u DPPH testu bili su ekstrakti vrste L. ochridanum (0,115-0,127 mg/mL), slično pokazanoj aktivnosti sintetičkih antioksidanasa BHA i BHT. Pregled rezultata dobijenih korišćenjem ABTS testa pokazao je da je etarsko ulje E. sibthorpiana (c=0,1 mg/mL) posedovalo najjaču antioksidativnu aktivnost (2,021 mg vit. C/g etarskog ulja), dok je od svih ispitivanih ekstrakata (c=1 mg/mL) najefikasniji bio vodeni ekstrakt nadzemnog dela L. ochridanum (2,172 mg vit. C/g suvog ekstrakta), slično dejstvu standarda kvercetin hidrata. Kao najefektivniji antioksidativni agens u β-karoten/linolna kiselina testu pokazao se metanolni ekstrakt nadzemnog dela A. pancicii (IC50=2,453 mg/mL), dok je antioksidans BHA pokazao duplo jači efekat (IC50=1,216 mg/mL). Metodom mikrodilucije određene su antimikrobne aktivnosti testiranih uzoraka protiv 16 vrsta patogenih mikroorganizama i determinisane su MIK, MBK/MFK koncentracije etarskih ulja i ekstrakata odabranih vrsta. Testirani uzorci su ispoljili umerenu antibakterijsku aktivnost u poređenju sa antibiotikom streptomicinom, a etarska ulja su imala jače dejstvo u odnosu na ekstrakte. Metanolni i etanolni ekstrakti korena A. pancicii i etarsko ulje H. orphanidis imali su jako inhibitorno dejstvo na rast bakterija, slično aktivnosti streptomicina. Najosetljivije bakterije u ovom radu bile su B. cereus i S. aureus, dok su najrezistentnije bile M. flavus, P. aeruginosa, L. monocytogenes i E. coli. Uporedni pregled rezultata antifungalne aktivnosti implicirao je slabo do umereno dejstvo testiranih ektrakata i umerenu do jaku efikasnost etarskih ulja. Kao najjači antifungalni agensi izdvojili su se metanolni ekstrakti korena H. orphanidis i vršnog dela F. macedonica i etanolni ekstrakt korena A. pancicii, a među etarskim uljima je to bio uzorak ulja vrste L. ochridanum. Najsenzitivnije mikrogljive korišćene u ovom istraživanju bile su P. ochrocloron, A. versicolor i T. viride, a najotpornije A. niger i A. ochraceus. U okviru ovog istraživanja određena je i anti-quorum sensing aktivnost biljaka na odabrane viruletne faktore Gram negativne bakterije Pseudomonas aeruginosa PAO1. Pokazalo se da u prisustvu testiranih uzoraka dolazi do promena u izgledu kolonija i do promena u pojavi i dijametru flagela na površini ove bakterije. Najjači anti-quorum sensing uzorak u ovom radu bilo je etarsko ulje E. sibthorpiana u čijem prisustvu je došlo do slabije produkcije piocijanina, a s tim u vezi i promene boje kolonije od svetlo zelene u belu boju, kao i do smanjenja rasta kolonije (prečnika od 6,67 mm), bez prisustva flagela. Anti-biofilm aktivnost odabranih vrsta može se predstaviti u sledećem opadajućen nizu: A. pancicii, H. orphanidis, L. ochridanum, E. sibthorpiana, F. macedonica, a najefikasniji agens u ovom testu bio je etanolni ekstrakt korena A. pancicii. Testirani uzorci su bili najbolji u redukciji sinteze toksičnog pigmenta piocijanina, gde su se po efikasnosti izdvojili etarska ulja nadzemnog dela vrsta F. macedonica (5,22%) i E. sibthorpiana (10,69%). Opadajući efekat u inhibiciji sinteze ovog toksina predstavljen je za odabrane biljke sledećim nizom: E. sibthorpiana, L. ochridanum, F. macedonica, H. orphanidis i A. pancicii. Dobijeni rezultati predstavljeni u ovoj doktorskoj disertaciji pružaju informaciju o hemijskom sastavu etarskih ulja pet proučavanih vrsta iz familije Apiaceae i daju prve podatke o hemijskom sastavu metanolnih ekstrakata vrsta H. orphanidis i A. pancicii. Pokazalo se da su pojedini uzorci ispitivanih biljaka posedovali snažnu biološku aktivnost i stoga se mogu smatrati potencijalnim prirodnim antioksidativnim, antimikrobnim i anti- quorum sensing agensima.

The main goal of this doctoral dissertation was chemical characterization of essential oils and methanolic extracts of rare and endemic unexplored or partially investigated species originating from Republic of Macedonia: Ferulago macedonica Micevski & Mayer, Echinophora sibthorpiana Guss. Laserpitium ochridanum Micevski, Heracleum orphanidis Boiss. and Angelica pancicii Vandas (Apiaceae). Other part of this investigation was dedicated to determination of in vitro biological potential of essential oils, methanol, ethanol and aqueous extracts of selected species including antioxidant, antimicrobial and anti-quorum sensing effects. To date, no published results are available on phytochemical investigation of essential oils of F. macedonica and H. orphanidis and metanolic extracts of H. orphanidis and A. pancicii aerial parts and roots. Additionally, there is no literature data about biological potential of F. macedonica, H. orphanidis and A. pancicii species. GC-FID and GC-MS analysis showed a dominant presence of monotererpene and sesquiterpene hydrocarbons and their oxygenated forms in essential oils. This analisys showed that essential oils of F. macedonica apical and aerial parts were rich in α-pinene (43,10%; 22,78%) and sabinene (26,73%; 15,46%). E. sibthorpiana essential oil was characterised by dominant presence of methyl eugenol (60,40%), p-cymene (11,18%) i α-phellandrene (10,23%), while the most abundant compounds of L. ochridanum essential oil were sabinene (22,8%), viridiflorol (14,7%) and α-pinene (11,4%). As the main components of H. orphanidis essential oil were identified n-octanol (39,57%), n-octyl hexanoate (17,62%) and n-octyl acetate (14,12%), while bornyl acetate (8,08%), n-octanol (5,82%), kessane (4,26%) and β-selinene (4,25%) were present in the highest percentage in A. pancicii essential oil. The results of tentative analysis of methanol extracts of selected species, using HPLC-DAD/ESI-ToF-MS system, were described for the first time in this work. The identification of secondary metabolites of these samples was based on molecular formulas obtained by Mass Hunter Workstation software and based on literature data on the composition of the respective genera and other species from Apiaceae family. In methanol extracts of F. macedonica, E. sibthorpiana and L. ochridanum, a small number of compounds were identified or the identification of the compounds was not possible due to lack of literature data. Preliminary analysis revealed total of 18 compounds in methanol extracts of H. orphanidis aerial parts and 25 compounds in the roots, while in methanol extract of A. pancicii aerial parts were identified 52 metabolites and 53 compound were identified in the roots. Coumarins were the main constituents in all analysed samples. In addition, six well-known furanocoumarins: tert-O-metil-oxypeucedanin hydrate, oxypeucedanin hydrate, oxypeucedanin, saxalin, ostruthol, isoimperatorin and one new chromone - acetilcnidimol A were isolated from A. pancicii roots. Using spectrophotometric methods, the highest total phenolic content was measured in ethanol extract of A. pancicii aerial parts (GA 143,990 mg/g of dry extract), while the highest flavonoid content was detected in ethanol extract of L. ochridanum (67,690 mg QE/g of dry extract). It was shown that apical parts of F. macedonica had higher amounts of phenolic compounds than aerial part of the plant, while the concentrations of these metabolites were higher in aboveground parts than in roots of other species. The results of antioxidant activity, obtained by three different tests, suggested essential oils and extracts of investigated species neutralized free radicals in a dose-dependent manner in all applied assays. In DPPH test, the lowest IC50 concentrations were observed for extracts of L. ochridanum (0,115-0,127 mg/mL) similar to the activity of antioxidants BHA and BHT. According to results obtained in ABTS assay, E. sibthorpiana essential oil (c=0,1 mg/mL) possessed the strongest antioxidant activity (2,021 mg Vit. C/mL of essential oil), while the strongest extract (c=1 mg/mL) was L. ochridanum aqueous extract of aerial parts (2,172 mg vit. C/g of dry extract), which activity was slightly lower in comparison to standard quercetin hydrate. A. pancicii ethanol extract of aerial parts (IC50=2,453 mg/mL) revealed to be the most potent agent in β/carotene/linoleic acid assay, while antioxidant BHA had twice stronger effectiveness (IC50=1,216 mg/mL). Determination of antimicrobial activity of tested samples against 16 pathogenic microorganisms was performed using micro-well dilution method and MIC/MBC/MFC values of essential oils and extracts were obtained. It was observed that tested samples exhibited moderate antibacterial activity compared to antibiotic streptomycin and that essential oils had stronger inhibitory effects on bacterial growth than the extracts. Methanol and ethanol extracts of A. pancicii roots and essential oil of H. orphanidis expressed high antimicrobial potential, similar to the activity of streptomycin. The most sensitive bacteria in this study were B. cereus and S. aureus, while M. flavus, L. monocytigenes, P. aeruginosa and E. coli were the most resistant straines. Obtained results for antifungal activity indicated weak to moderate activity of tested extracts and moderate to strong efficiency of essential oils. The methanol extracts of H. orphanidis roots, apical parts of F. macedonica and ethanol extract of A. pancicii roots were the strongest antifungal agents in this work. L. ochridanum essential oil showed the strongest antifungal potency among tested essential oils. The most sensitive microfungi used in this investigation were P. ochrocloron, A. versicolor and T. viride, while A. niger and A. ochraceus were the most resistant strains. Determination of anti-quorum sensing activity of investigated plants was conducted against selected virulent factors of Gram negative bacteria Pseudomonas aeruginosa PAO1. It was shown that in the presence of tested samples, the appearance of the colonies, twitching motility and diameter of flagella of these bacterium were modified. The strongest anti-quorum sensing sample was essential oil of E. sibthorpiana which reduced pyocyanin synthesis, the growth of the colony which coloration went from light green to white and no flagella were noticed. A significant difference of anti- biofilm activity of selected species was noted in the following order: A. pancicii, H. orphanidis, L. ochridanum, E. sibthorpiana, F. macedonica, while the most effective in reduction of biofilm synthesis was ethanol extract of A. pancicii roots. The samples were the most effective in reduction of pyocyanin synthesis where F. macedonica (5,22%) and E. sibthorpiana (10,69%) essential oils of aerial parts most efficiently reduced this toxic pigment’s production. The effects of selected species in inhibition of pyocyanin synthesis decreased in the following order: E. sibthorpiana, L. ochridanum, F. macedonica, H. orphanidis and A. pancicii. Obtained results in this doctoral dissertation give an information about the chemical composition of essential oils of five selected species from family Apiaceae and provide first data on the composition of H. orphanidis and A. pancicii methanol extracts. It was shown that some tested samples possessed strong biological activity and could be considered as potential natural antioxidant, antimicrobial and anti-QS agents.

Faktori rizika za pojavu poremećaja srčanog ritma i variranja krvnog pritiska u toku maksilofacijalnih i operacija uva, grla i nosa

Risk factors for cardiac rhythm disturbances and blood pressure variation during maxillofacial, ear, nose and throat operations

Cilj rada je da se odredi učestalost i faktori rizika za pojavu intraoperativnih poremećaja srčanog ritma i variranja krvnog pritiska. Metodologija: Ova kohortna, retrospektivna studija, uključila je 2304 pacijenta podvrgnuta maksilofacijalnoj ili hirurgiji uva, grla ili nosa. Ispitivani su sledeći faktori rizika: pol, životno doba, ASA status, otežana intubacija, vrsta hirurgije, trajanje anestezije, intraoperativna transfuzija, indukovana hipotenzijai sledeći komorbiditeti: hipertenzija, kardiomiopatija, poremećaji srčanog ritma, ishemijska bolest srca, prethodni cerebrovaskularni insult, hronična bubrežna insuficijencija, hiperlipoproteinemija i dijebetes melitus. Registrovani su sledeći intraoperativni poremećaji: hipertenzija, hipertenzivna kriza i poremećaji srčanog ritma (tahikardija, bradikardija, novonastala intraoperativna atrijalna fibrilacija, supraventrikularne i ventrikularne ekstrasistole). Za statističku obradu korišćen je Mann Whitney U test, Pirson-ov2test (tablicekontingencije), logistička regresiona analiza i ROC krive. Rezultati: Većina bolesnika je bila muškog pola pola (63.2%), starija od 50 godina i ASA1 klase (48%). Najviše bolesnika bilo je podvrgnuto hirurgiji grla (38.2%). Intraoperativno variranje krvnog pritiska i/ ili intraoperativne poremećaje srčanog ritma imalo je 29.4% pacijenata. Najveća učestalost intraoperativnih minor srčanih komplikacija bila je u maksilofacijalnoj hirurgiji (35.4%), odmah zatim u hirurgiji uva (35.1%),a najređe u hirurgiji nosa (21.3%). Od svih minor srčanih komplikacija najčešća je bila bradikardija (20.5%), zatim hipertenzija (5.3%), tahikardija (4.7%), ventrikularne ekstrasistole (0.5%), supraventrikularne ekstrasistole (0.3%), dok novonastala intraoperativn aritmija absoluta nije registrovana ni kod jednog pacijenta. Logističkom regresijom kao faktori rizika izdvojili su se: prethodna srčana aritmija, trajanje anestezije, indukovana hipotenzija i hirurgija uva. Zaključak: Intraoperativno variranje krvnog pritiska i poremećaji srčanog ritma, naročito bradikardija, su česti tokom maksilofacijalne i hirurgije uva, grla i nosa i to pre svega kod pacijenata sa prethodnim srčanim aritmijama i indukovanom hipotenzijom. Hirurgija uva i duže trajanje anestezije, takođe povećavaju rizik za nastanak intraoperativnih poremećaja srčanog ritma i variranja krvnog pritiska.

The aim of our study was to determine the incidence and the risk factors for intraoperative cardiac rhythm disturbances and blood pressure variation in maxillofacial, ear, nose and throat surgery. Methods: This cohort retrospective study included 2304 patients who underwent either maxillofacial, ear, nose or throat surgery. These risk factors were studied:gender,age, ASA status, difficult airway management, type of surgery, duration of anaesthesia, intraoperative transfusion,induced hypotension and comorbidity such as: hypertension,cardiomyopathy,cardiac arrhythmias, ischemic heart disease, history of cerebrovascular insult,chronic kidney disease,hyperlipoproteinemiaana diabetes mellitus. These intraoperative minor cardiac complications were registered: hypertension, hypertension crisis, tachycardia, bradycardia, new onset of atrial fibrillation, supraventricular and ventricular extrasystoles. For statistical data analysis we used: Mann Whitney U test, Pirson’s2test, logistic regression and ROC curves. Results: The majority of patients were male (63.2%), older than 50 years and ASA status 1. The most of patients underwent throat surgery (38.2%). Intraoperative blood pressure variation and/or cardiac rhythm disturbances were present in 29.4% of patients. The highest incidence of intraoperative minor cardiac complications were in maxillofacial surgery (35.4%), then in ear surgery (35.1%), and the lowest incidence were in nose surgery (21.3%). Among all minor cardiac complications, the most frequent was bradycardia (20.5%), then hypertension (5.3%), tachycardia (4.7%), ventricular extrasystoles(0.5%),supraventricular extrasystoles(0.3%) and no new onset atrial fibrillation was registered. Logistic regression analysis idenified these risk factors: previous cardiac arrhythmia, anaesthesia suration, induced hypotension and ear surgery. Conclusion: Intraoperative blood pressure variation and cardiac rhythm disturbances, particularly bradycardia, are common in maxillofacial, ear, nose and throat surgery, especially in patients with previous cardiac arrhythmias and induced hypotension. The ear surgery and longer anaesthesia duration raise the risk for occurrence of intraoperative blood pressure variation and cardiac rhythm disturbances.

Vizantija u srpskoj postmodernističkoj prozi : (Borislav Pekić, Milorad Pavić, Goran Petrović i Radoslav Petković)

Byzantine in Serbian postmodern literature : (Borislav Pekić, Milorad Pavić, Goran Petrović, Radoslav Petković)

Rad obuhvata dela Borislava Pekića: pripovetku „Megalos Mastoras i njegovo delo, 1347.“ i planove za roman Srebrna ruka; dela Milorada Pavića: Gvozdena zavesa, Mali noćni roman, Hazarski rečnik, Konji svetoga Marka, Izvrnuta rukavica, Ruski hrt, kao i njegova naučna i naučno-popularna dela koja bi mogla da osvetle piščev odnos prema vizantijskom kulturnom krugu i nasleđu: Kratka istorija Beograda, Istorija, stalež i stil, Jezičko pamćenje i pesnički oblik II, Gavril Stefanović Venclović, brojni intervjui, sa posebnom pažnjom na razgovore sa Anom Šomlo objavljenim pod naslovom Hazari, ili obnova vizantijskog romana; dela Radoslava Petkovića: Izveštaj o kugi, Vizantijski Internet, Savršeno sećanje na smrt; i roman Gorana Petrovića Opsada crkve Svetog Spasa. Milorad Pavić je za života nazivan „poslednjim Vizantincem“, a ova teza, između ostalog, treba da pokaže i kako se dvojica pisaca mlađe generacije odnose prema tom nasleđu. Istraživanje obuhvata najčešće teme kojima su se pisci u pomenutim delima bavili. Pod temom Vizantije podrazumevaju se istorijske činjenice, parodirane ili afirmisane, vizantijsko društvo, vladari, državno uređenje, religija, na prvom mestu pravoslavlje, ali i druge veroispovesti koje su postojale u Carstvu, zatim, Carigrad, kao mesto odigravanja radnje, ali i kao tema, odnosi sa Zapadom i Istokom, borbe sa Turcima, opsade i pad pod neprijateljsku vlast, filozofija (neoplatonizam). Međutim, Vizantija je i srednjovekovna Srbija, na čemu je poseban naglasak u delima Pavića i Petrovića, ona se ne može izopštiti iz vizantijskog kulturnog kruga (religija, politika, kultura, umetnost). Vizantija je konzervator paganske antike i ranog ortodoksnog hrišćanstva, što ostavlja mnogo prostora za istoriografsku metafikciju (Petković, Petrović), a osim toga, privlačna je i zgodna za aludiranje na sudbinu sopstvenog naroda. Posebno je posvećena pažnja temi opsade utvrđenja (Carigrad, Žiča) i na motiv grada koji je usko vezan za temu opsade. Pored toga, autori se bave i temom smrti i zagrobnog života, motivima putovanja duše, sna, čuda, relikvija, borbe dobra i zla, uz neizostavan arhetip đavola, kult Bogorodice i čudotvorne ikone i motivom kraja sveta. Autori teže da preispitaju i da prevrednuju znanja o prošlosti, o vizantijskom kulturnom nasleđu i srpskoj srednjovekovnoj tradiciji. Iako ne pripada postmodernističkom literarnom krugu, modernista Borislav Pekić anticipira brojne postmodernističke postupke. Istraživanje je pokazalo da Milorad Pavić vrlo afirmativno pristupa književnoj građi, kao i Goran Petrović, njegov književni sledbenik. Za razliku od njih, Radoslav Petković teži da putem intertekstualne ironije i postmodernističke igre delimično raskrinka neka ranije utvrđena mišljenja o istorijskim činjenicama. Dela ovih pisaca pokazuju snažne veze i živ dijalog između srpske savremene proze i srpskovizantijske pravoslavne tradicije.

Works of Borislav Pekić used in this research are: The Great Master and His Work, 1347. and plans for novel The Silver Hand. Works of Milorad Pavić: Dictionary of the Khazars, Small night novel, The inner side of the wind, The Iron curtain, St Marcos horses and others. Work of Goran Petrović: The Siege of the Saint Salvation church. Works of Radoslav Petković: The Byzantine Internet, The perfect memory of the Death and The report about the Plague. This research includes the most common topics about Byzantine culture. It means historical facts, relations in the society of Byzantine Empire, rulers, state regulation, religion, orthodoxy, Constantinople and other important places as locations of action, relations between East and West Europe, battles against The Turks, sieges, political failures and philosophy (neoplatonism). However, middle age Serbia iz also included in postmodern Serbian view of Byzantine. It can not be excommunicated from Byizantine cultural circle (religion, politics, literature, art). Byzantine saved heritage of antic Greeks, and early christianity, which allowes historical metafiction. Besides, this topic is useful for telling the story about Serbian nation. Very important topis is fortification surrounded with anemis (Constantinople, Žiča) and other like: motive of the middle age city, death, other world, soul traveling, dreams, miracles, relics, battle of Good and Evil, infallible archetype of the Devil, cult of the Virgin Mary, miraculous icons and motive of apocalypse. Authors want to reassess knowledge about the past, Byizantine cultural heritage and Serbian middle age tradition. Although Borislav Pekić was not a postmodern writer, he anticipated many postmodern acts in nis literature. Research showed that Milorad Pavić and Goran Petrović had seen literature timber in a very affirmative way. But, Radoslav Petković tried to use intertextual irony and postmodern play to break earlier determined opinions about history. Their works show strong relations and live dialogue between Serbian contemporary prose and Serbian-Byzantine orthodox tradition.

Uloga ekto-5ʹ-nukleotidaze (CD73) u inflamatornoj aktivaciji i migraciji astrocita

The role of ecto-5ʹ-nukleotidase (CD73) in inflammatory astrocyte activation and migration

Neuroinflamacija je urođeni akutni imunski proces u centralnom nervom sistemu, koji ima za cilj oporavak tkivne homeostaze nakon metaboličke, mehaničke i ishemijske povrede ili infekcije patogenima. Centralnu ulogu u neuroinflamaciji imaju rezidentne ćelije CNS, astrociti i mikroglija, i veliki broj reaktivnih, signalnih i trofičkih molekula, koje štite nervno tkivo od daljih oštećenja i pokreću proces rezolucije i oporavka. Neodgovarajuća ili nedovoljno izvedena rezolucija vodi ka hroničnoj neuronflamaciji i neurodegeneraciji. Dok je karakter akutne neuroinflamacije reaktivni i zaštitni, hronična forma dovodi do glioze i autoimunske reakcije i predstavlja osnovu za razvoj brojnih neuropatologija. Jedan od prvih fenomena u inicijalnoj fazi neuroinflamacije jeste aktivacija astrocita, koja podrazumjeva brojne morfološke i funkcionalne promjene. Te su promjene inicirane signalima opasnosti (DAMP), među kojima je jedan od najvažnijih ATP. Ovaj purinski nukleotid se oslobađa u vanćelijsku sredinu, gdje preko svojih P2 receptora, djeluje kao „nađi me“ signal za astrocite i mikrogliju. U vanćelijskoj sredini se ATP razgrađuje djelovanjem enzima ektonukleotidaza, koje sekvencijalno razgrađuju ATP do adenozina. Adenozin je takođe signalni molekul, koji djelujući na svoje P1 receptore, ostvaruje homeostatske i imunosupresivne uloge. Ektonukleotidaze svojom aktivnošću kontrolišu odnos koncentracija ATP/adenzina u vanćelijskom prostoru, a u tom smislu ključni enzim je ekto-5’-nukleotidaza (eN/CD73). Ovaj enzim katalizuje konverziju AMP u adenozin, ali i funkcioniše kao ćelijski adhezivni molekul za interakciju sa molekulima vanćelijskog matriksa. Brojna istraživanja su pokazala da u akutnoj ili hroničnoj neuroinflamaciji, naročito na reaktivnim astrocitima, dolazi do snažne ushodne regulacije Nt5e gena, a takođe i do posledičnih promjena na nivou količine proteina i aktivnosti eN/CD73...

with a physiological purpose of restoring the tissue homeostasis, endangered by a metabolic, ischemic and physical injury or pathogen invasion. Physiological significance of acute neuroinflammation is to protect the tissue from further damage and to support the recovery and restore the homeostasis. Central role in neuroinflammation is performed by resident glial cells, astrocytes, and microglia, which produce and liberate various reactive, signaling and trophic molecules, to restrict and protect the tissue from further damage and initiate the process of resolution and reparation. However, insufficient or inadequate resolution may lead to chronic neuroinflammation and neurodegeneration. While the nature of acute neuroinflammation is reactive and protective, chronic neuroinflammation leads to fibrosis and autoimmune reaction, which are the basis of many neuropathological conditions. One of the first events in neuroinflammation is activation of astrocytes, which comprises prominent morphological and functional changes of the cells. The changes are initiated by danger signals (DAMP), among which ATP has a particularly important role. Challenged or daying cells massively release the purine nucleotide into the extracellular space, where it acts upon its P2 purinoreceptors as a „find me“ signal for astrocytes and microglia. Extracellular ATP is degraded by ectonucleotidase enzyme chain, which sequentially hydrolyzes ATP to adenosine. Nucleoside adenosine is also a very strong signal, which acts upon P1 adenosine receptors, to impose its homeostatic and immunosuppressive actions. Ectonucleotidases control the ratio of ATP/adenosine in the extracellular milieu, thus determing the inflammatory state of the tissue. As the only enzyme which produces adenosine in the extracellular space and the rate-limiting enzyme of the cascade, ecto-5′-nucleotidase (eN/CD73) plays a critical role in this matter. Ecto-5′-nucleotidase/CD73 hydrolyzes conversion of AMP to adenosine, but it also functions as cell adhesive molecule which interacts with extracellular matrix components...

Morfološko variranje, fenotipska plastičnost i fluktuirajuća asimetrija oblika cvetnih organa kod Iris pumila L.

Morphological variation, phenotypic plasticity and fluctuating asymmetry of floral organ shapes in Iris pumila L.

Analize unutar - i među - individualnihih razlika morfoloških struktura omogućuju otkrivanje obrazaca fenotipskog variranja, kao i ekološko - evolucionih mehanizama koji dovode do njihove divergencije. U ovoj disertaciji utvrđene su komponente fenotipske varijanse oblika funkcionalno različitih cvetnih organa kod entomofilne biljne vrste Iris pumila L., polimorfne u odnosu na boju cveta. Eksperimenti su vršeni na biljkama gajenim u eksperimentalnoj bašti, poreklom iz recipročnih ukrštanja 24 klonalna genotipa. Metodama geometrijske morfometrije utvrđeni su obrasci variranja oblika tri bilateralno simetrična organa: fola, standarda i grane tučka. Kod sva tri organa udeo simetrične komponente u ukupnom variranju oblika bio je najveći, dok je fluktuirajuća asimetrija (FA) dominirala u asimetričnoj komponenti. Iako se smatra da je primarni uzrok FA nestabilnost razvića, naša istraživanja su pokazala da fenotipska plastičnost može takođe da proizvede FA. Naime, replike cvetnih organa sa različitom orijentacijom prema suncu imale su različite vrednosti asimetričnih komponenti varijanse oblika, kao rezultat plastičnosti u odnosu na mikro- sredinsku heterogenost ambijentalne svetlosti. Da veličina, oblik i boja cveta predstavljaju vizuelne signale za privlačenje potencijalnih oprašivača potvrdila su poređenja veličine cvetnih organa oprašenih i neoprašenih biljaka. Oprašeni cvetovi su, po pravilu, imali veće organe od neoprašenih, sa izuzetkom grane tučka. Regresione analize su pokazale da je veličina fola bila pod delovanjem pozitivne, a grane tučka negativne direkcione selekcije. Suprotno tome, oblik cvetnih organa se razlikovao u zavisnosti od boje, što ukazuje da je preferencija oprašivača prema specifičnim kombinacijama vizuelnih signala bila važan mehanizam morfološke divergencije reproduktivnih organa I. pumila. MORFOLOŠKO VARIRANJE, FENOTIPSKA PLASTIČNOST I FLUKTUIRAJUĆA ASIMETRIJA OBLIKA CVETNIH ORGANA KOD Iris pumila L. Sažetak

Analyzes of intra - and inter - individual differences of morphological structures allow the detection of patterns of phenotypic variation, as well as ecological evolutionary mechanisms leading to their divergence. In this dissertation, components of the phenotypic variation of the shape of functionally distinctive flower organs were determined in the entomophilous plant, specific for striking flower color polymorphism, Iris pumila L. Experiments were carried out on plants grown in experimental garden, originating from reciprocal crossing of 24 clonal genotypes. Using the methods of geometric morphometrics patterns of variation of the shape of three bilaterally symmetrical organs (falls, standards and style branches) have been revealed. In all three floral organs, the proportion of the symmetric component in the overall shape variation was the highest, while the fluctuating asymmetry (FA) was dominated in asymmetric component. Although it is thought that primary cause of FA is developmental instability, our research has shown that phenotypic plasticity can also produce FA. Namely, replicas of flower organs with different orientations towards the sun had different values of asymmetric components of variance of the shape, as an outcome of plasticity in relation to the microenvironmental heterogeneity of ambient light. In this dissertation it is confirmed that size, shape and color of flowers are visual attractants for pollinators. Pairwase comparisons in size between pollinated and unpollinated flowers revealed that pollinated falls and standards are bigger related to their unpollinated pairs. Regression analyzes have shown that the size of the falls was under positive selection, while size of style branches was under negative direct selection. In contrast, the shape of the flower organs differed depending on their color, indicating that the pollinator's MORPHOLOGICAL VARIATION, PHENOTYPIC PLASTICITY AND FLUCTUATING ASYMMETRY OF FLORAL ORGAN SHAPES IN Iris pumila L. Abstract preference for specific combinations of visual signals was an important mechanism of morphological divergence of the reproductive organs of I. pumila.

Histološka građa jetre, creva, škrga i bubrega šarana (Cyprinus carpio L., 1758) gajenog u poluintenzivnom sistemu : efekti različitih tipova dodate hrane

Liver, intestine, gills, and kidney histology of common carp (Cyprinus carpio L., 1758) reared in semi-intensive system : effects of different supplemental feeds

Šaran (Cyprinus carpio L., 1758) je jedna od najznačajnijih vrsta za srpsku, evropsku i svetsku akvakulturu...

Carp (Cyprinus carpio L., 1758) is one of the most important fish species in Serbian, European and World aquaculture...

Molekularna karakterizacija bakteriocina i agregacionih sposobnosti prirodnog izolata Lactobacillus paracasei subsp. paracasei BGSJ2-8

Molecular characterization of bacteriocin and aggregation ability of a natural isolate Lactobacillus paracasei subsp. paracasei BGSJ2-8

UNIVERZITET U BEOGRADU BIOLOŠKI FAKULTET Jelena M. Lozo MOLEKULARNA K AR AKTERIZ ACI J A BAKTERIOCINAI AGREGACIONIH SPOSOBNOSTI PRIRODNOG IZOLATA Lactobacillus paracasei subsp. paracasei BGSJ2-8 B doktorska disertacija ' . Beograd, 2008. UNIVERZITET U BEOGRADU BIOLOŠKI FAKULTET Jelena M. Lozo MOLEKULARNA KARAKTERIZACIJA BAKTERIOCINA I AGREGACIONIH SPOSOBNOSTI PRIRODNOG IZOLATA Lactobacillus paracasei subsp. paracasei BGSJ2-8 doktorska disertacija Beograd, 2008. MENTOR: dr Ljubiša Topisirović, redovni profesor Biološki fakultet, Univerzitet u Beogradu ČLANOVI KOMISIJE: dr Ljubiša Topisirović, redovni profesor Biološki fakultet, Univerzitet u Beogradu dr Đorđe Fira, docent Biološki fakultet, Univerzitet u Beogradu dr Milan Kojić, naučni savetnik Institut za molekularnu genetiku i genetičko inženjerstvo, Univerzitet u Beograd dr Slaviša Stanković, docent Biološki fakultet, Univerzitet u Beogradu Datum odbrane: Ova doktorska disertacija urađena je u Laboratoriji za molekularnu genetiku industrijskih mikroorganizama u Institutu za molekularnu genetiku i genetičko inženjerstvo. Ovom prilikom želim da se zahvalim: Prof, dr Ljubiši Topisiroviću, koji prati moj naučni rad od samog početka, na ukazanom poverenju, savetima i vremenu koje smo proveli diskutujud o dobijenim rezultatima što mi je pomoglo da ovaj rad dovedem do kraja, kao i za sugestije tokom pisanja i kriticku ocenu teze. Dr Milanu Kojiću na nesebičnoj pomoći, savetima tokom eksperimentalne izrade ovog rada, za sve što me je naudo i izuzetno korisnim sugestijama koje su bile neophodne za finalno oblikovanje teze. Neizmerno sam mu zahvalna i na vremenu i trudu koje je sa mnom uložio u tumačenju dobijenih rezultata i kritičkoj oceni teze. Dr Đorđu Firi na pomoći, kritičkoj oceni teze i svim e-mail porukama u kojima je brzo, detaljno i duhovito odgovarao na sva moja mnogobrojna pitanja vezana za izolovanje bakteriocina i tako moj rad u Francuskoj učinio mnogo lakšim. Dr Slaviši Stankoviću na kritičkoj oceni teze. Jedan deo ove teze je uraden u laboratoriji, Biopolymeres Interactions Assemblages, INRA, Fonctions et Interactions des Proteines Laitieres, Nant, Francuska. Koristim priliku da se zahvalim prof, dr Thomas Haertle i dr Michele Dalgalarrondo na stručnoj pomod koja je omogudla dobijanje dela rezultata predstavljenih u tezi. Branko, Jelena, Kalina, Majo, Milice, Amarela, Ivana, Nataša, sad je prilika da vam se zahvalim za sve divne trenutke ispunjene smehom, zanimljive razgovore, razumevanje i nesebičnu pomoć uz koju je posao u laboratoriji bio pravo uživanje. Sve teško sam lakše pregurala, a svaki uspeh smo zajedno proslavili. Bez vas bi eksperimentalni rad na ovoj tezi bio duži i mnogo tezi, a sve što kažem je "mičkica", znate vi.. ..LAB6 NAJBOLJI STE! Posebno želim da se zahvalim mojoj porodici za podršku, razumevanje i ljubav koji su bili neophodni da se ovaj rad dovede do kraja. APSTRAKT Prirodni izolat BGSJ2-8 je izolovan iz sira napravljenog u domaćinstvu. Korišćenjem mikrobioloških i metoda molekulame determinacije ovaj prirodni izolat je detenninisan kao Lactobacillus paracasei subsp. paracasei. Soj BGSJ2-8 sintetiše bakteriocin, označen kao BacSJ, proteinazu PI tipa i pokazuje agregacioni fenotip. Čišćenjem plazmida soja BGSJ2-8 dobijena su dva tipa derivata. Jedan koji ima sposbnost agregacije ali je izgubio sposobnost sinteze i imunost na bakteriocin BacSJ i drugi koji je izgubio obe fenotipske karakteristike. Geni za sintezu, obradu i eksport bakterocina BacSJ su locirani na plazmidu pSJ2-8. Sekvenciranjem plazmida pSJ2-8 i kompjuterskom analizom dobijene sekvence ustanovljeno je postojanje 15 otvorenih okvira čitanja (ORF). Bakteriocin BacSJ je izolovan korišćenjem katjonske jonoizmenjivačke hromatografije, reverzno-fazne hromatografije i reverzno-fazne hromatografije visokih performansi. Molekulska masa od 5372 Da je određena masenom spektrometrijom. N- terminalna sekvenca, YSYFGGSNGY je iskorišćena za određivanje ORF-a (ORF 10) koji kodira struktumi gen za bakteriocin, bacSJ2-8. BacSJ čini 50 aminokiselina i tipičan lider peptid dvoglicinskog tipa od 18 aminokiselina. Na pSJ2-8 plazmidu se nalaze i geni za ABC transporter i pomoćni protein sto ukazuje da su oni uključeni u obradu i eksport bakteriocina BacSJ. Bakteriocin, BacSJ je termostabilan molekul, aktivan u širokom opsegu pH vrednosti, osetljiv na delovanje proteolitičkih enzima, uskog spektra delovanja ograničenog na blisko srodne vrste. Biohemijska i genetička analiza je pokazala da je BacSJ nov bakteriocin, do sada neopisan u literaturi, koji spada u bakteriocine klase II. Sposobnost agregacije soja BGSJ2-8 se spontano gubi pri svakoj rekultivaciji soja kada se dobija spontani derivat, označen kao BGSJ2-81 (Agg~). U sposobnost agregacije soja BGSJ2-8 je uključen i protein veći od 200 kDa koji verovatno deluje zajedno sa drugim površinskim proteinima, a nije prisutan kod derivata BGSJ2-81. Uporedna analiza soja divljeg tipa i njegovog spontanog derivata koji nema sposobnost agregacije je ukazala da faktor odgovoran za agregaciju utiče i na razliku koja je uočena u bakteriocinskoj i proteolitičkoj aktivnosti. Aktivnost i otpomost bakteriocina BacSJ prema delovanju različitih faktora je bila veća kod soja koji ima sposobnost agregacije. Nasuprot tome, proteolitička aktivnost je bila intenzivnija kod derivata koji nema sposobnost agregacije.

UNIVERZITET U BEOGRADU BIOLOŠKI FAKULTET Jelena M. Lozo MOLEKULARNA K AR AKTERIZ ACI J A BAKTERIOCINAI AGREGACIONIH SPOSOBNOSTI PRIRODNOG IZOLATA Lactobacillus paracasei subsp. paracasei BGSJ2-8 B doktorska disertacija ' . Beograd, 2008. UNIVERZITET U BEOGRADU BIOLOŠKI FAKULTET Jelena M. Lozo MOLEKULARNA KARAKTERIZACIJA BAKTERIOCINA I AGREGACIONIH SPOSOBNOSTI PRIRODNOG IZOLATA Lactobacillus paracasei subsp. paracasei BGSJ2-8 doktorska disertacija Beograd, 2008. MENTOR: dr Ljubiša Topisirović, redovni profesor Biološki fakultet, Univerzitet u Beogradu ČLANOVI KOMISIJE: dr Ljubiša Topisirović, redovni profesor Biološki fakultet, Univerzitet u Beogradu dr Đorđe Fira, docent Biološki fakultet, Univerzitet u Beogradu dr Milan Kojić, naučni savetnik Institut za molekularnu genetiku i genetičko inženjerstvo, Univerzitet u Beograd dr Slaviša Stanković, docent Biološki fakultet, Univerzitet u Beogradu Datum odbrane: Ova doktorska disertacija urađena je u Laboratoriji za molekularnu genetiku industrijskih mikroorganizama u Institutu za molekularnu genetiku i genetičko inženjerstvo. Ovom prilikom želim da se zahvalim: Prof, dr Ljubiši Topisiroviću, koji prati moj naučni rad od samog početka, na ukazanom poverenju, savetima i vremenu koje smo proveli diskutujud o dobijenim rezultatima što mi je pomoglo da ovaj rad dovedem do kraja, kao i za sugestije tokom pisanja i kriticku ocenu teze. Dr Milanu Kojiću na nesebičnoj pomoći, savetima tokom eksperimentalne izrade ovog rada, za sve što me je naudo i izuzetno korisnim sugestijama koje su bile neophodne za finalno oblikovanje teze. Neizmerno sam mu zahvalna i na vremenu i trudu koje je sa mnom uložio u tumačenju dobijenih rezultata i kritičkoj oceni teze. Dr Đorđu Firi na pomoći, kritičkoj oceni teze i svim e-mail porukama u kojima je brzo, detaljno i duhovito odgovarao na sva moja mnogobrojna pitanja vezana za izolovanje bakteriocina i tako moj rad u Francuskoj učinio mnogo lakšim. Dr Slaviši Stankoviću na kritičkoj oceni teze. Jedan deo ove teze je uraden u laboratoriji, Biopolymeres Interactions Assemblages, INRA, Fonctions et Interactions des Proteines Laitieres, Nant, Francuska. Koristim priliku da se zahvalim prof, dr Thomas Haertle i dr Michele Dalgalarrondo na stručnoj pomod koja je omogudla dobijanje dela rezultata predstavljenih u tezi. Branko, Jelena, Kalina, Majo, Milice, Amarela, Ivana, Nataša, sad je prilika da vam se zahvalim za sve divne trenutke ispunjene smehom, zanimljive razgovore, razumevanje i nesebičnu pomoć uz koju je posao u laboratoriji bio pravo uživanje. Sve teško sam lakše pregurala, a svaki uspeh smo zajedno proslavili. Bez vas bi eksperimentalni rad na ovoj tezi bio duži i mnogo tezi, a sve što kažem je "mičkica", znate vi.. ..LAB6 NAJBOLJI STE! Posebno želim da se zahvalim mojoj porodici za podršku, razumevanje i ljubav koji su bili neophodni da se ovaj rad dovede do kraja. APSTRAKT Prirodni izolat BGSJ2-8 je izolovan iz sira napravljenog u domaćinstvu. Korišćenjem mikrobioloških i metoda molekulame determinacije ovaj prirodni izolat je detenninisan kao Lactobacillus paracasei subsp. paracasei. Soj BGSJ2-8 sintetiše bakteriocin, označen kao BacSJ, proteinazu PI tipa i pokazuje agregacioni fenotip. Čišćenjem plazmida soja BGSJ2-8 dobijena su dva tipa derivata. Jedan koji ima sposbnost agregacije ali je izgubio sposobnost sinteze i imunost na bakteriocin BacSJ i drugi koji je izgubio obe fenotipske karakteristike. Geni za sintezu, obradu i eksport bakterocina BacSJ su locirani na plazmidu pSJ2-8. Sekvenciranjem plazmida pSJ2-8 i kompjuterskom analizom dobijene sekvence ustanovljeno je postojanje 15 otvorenih okvira čitanja (ORF). Bakteriocin BacSJ je izolovan korišćenjem katjonske jonoizmenjivačke hromatografije, reverzno-fazne hromatografije i reverzno-fazne hromatografije visokih performansi. Molekulska masa od 5372 Da je određena masenom spektrometrijom. N- terminalna sekvenca, YSYFGGSNGY je iskorišćena za određivanje ORF-a (ORF 10) koji kodira struktumi gen za bakteriocin, bacSJ2-8. BacSJ čini 50 aminokiselina i tipičan lider peptid dvoglicinskog tipa od 18 aminokiselina. Na pSJ2-8 plazmidu se nalaze i geni za ABC transporter i pomoćni protein sto ukazuje da su oni uključeni u obradu i eksport bakteriocina BacSJ. Bakteriocin, BacSJ je termostabilan molekul, aktivan u širokom opsegu pH vrednosti, osetljiv na delovanje proteolitičkih enzima, uskog spektra delovanja ograničenog na blisko srodne vrste. Biohemijska i genetička analiza je pokazala da je BacSJ nov bakteriocin, do sada neopisan u literaturi, koji spada u bakteriocine klase II. Sposobnost agregacije soja BGSJ2-8 se spontano gubi pri svakoj rekultivaciji soja kada se dobija spontani derivat, označen kao BGSJ2-81 (Agg~). U sposobnost agregacije soja BGSJ2-8 je uključen i protein veći od 200 kDa koji verovatno deluje zajedno sa drugim površinskim proteinima, a nije prisutan kod derivata BGSJ2-81. Uporedna analiza soja divljeg tipa i njegovog spontanog derivata koji nema sposobnost agregacije je ukazala da faktor odgovoran za agregaciju utiče i na razliku koja je uočena u bakteriocinskoj i proteolitičkoj aktivnosti. Aktivnost i otpomost bakteriocina BacSJ prema delovanju različitih faktora je bila veća kod soja koji ima sposobnost agregacije. Nasuprot tome, proteolitička aktivnost je bila intenzivnija kod derivata koji nema sposobnost agregacije. Ključne reči: Bakteriocin, plazmid, sposobnost agregacije, proteolitička aktivnost ABSTRACT Natural isolate BGSJ2-8 was isolated from homemade cheese. According to microbiological and molecular methods for the identification, this natural isolate was determined as Lactobacillus paracasei subsp. paracasei. The strain BGSJ2-8 produces a bacteriocin, designated as BacSJ, proteinase similar to Pi-type of lactococcal proteinases and showing the aggregation phenomenon. After plasmid curing of the strain BGSJ2-8, two types of different derivatives are obtained. One derivative contained the aggregation ability but lost the ability to produce a bacteriocin and it was sensitive to BacSJ and the other who had lost both phonotypical characteristics. Genes that encoded synthesis, maturation and export of the BacSJ are located on the plasmid pSJ2-8. Sequencing and in silico analysis of the plasmid pSJ2-8 revealed 15 open reading frames (ORF). BacSJ was purified using cation exchange chromatography, reverse-phase (RP) chromatography and RP-high performance liquid chromatography. Mass spectrometry established molecular mass of the active peptide at 5372 Da. N-terminal sequence, YSYPGGSNGY was used to determine ORFIO as the one that encodes bacteriocin gene, bacSJ2-8. BacSJ is a 50-amino-acid peptide with the typical double-glycin leader containing 18 amino acids. Genes that encode ABC transporter and accessory protein are also located on the plasmid pSJ2-8 indicating their roll in bacteriocin maturation and export. Bacteriocin BacSJ is heat stable, active within broad pH range, protease sensitive and exhibits a narrow range of antimicrobial activity to the closely related bacteria. Biochemical and genetic analyses showed that BacSJ is a new bacteriocin that belongs to class II bacteriocin. An aggregation phenotype of BGSJ2-8 was spontaneously lost during the recultivation Agg“ derivative, designated as BGSJ2-81, and was obtained. The aggregation phenotype of wild-type (wt) strain BGSJ2-8 was mediated by secreted protein of molecular mass > 200 kDa, probably acting in cooperation with other cell surface proteins and it is not detected in BGSJ2-81 derivative. Comparative study of wt and its spontaneous non aggregating derivative revealed that aggregation factor was responsible for the observed differences in the bacteriocin and proteinase activities. BacSJ activity and resistance to different stresses were higher in the presence of aggregating factor. In contrary, proteinase activity was stronger in the non aggregating derivative.

Molekularna osnova genetičkih rearanžmana izazvanih IS5 elementima u polA1 mutatorskom soju Escherichia coli K12

Molecular basis of genetic rearrangements induced by IS5 elements in polA1 mutator strain of E.coli K12

U našem prethodnom radu na polA1 mutantima pokazali smo da polA1 kreira mutacije isključivo tipa minus fs i delecija. U mutacionom spektru histidinskih auksotrofa bila je prisutna i jedna specifična kategorija delecija, velike delecije, koje su prolazile preko celog his operona. Veličina delecija je ukazivala da one nastaju u procesu rekombinacije izmedju homologih sekvenci, a poznato je da u polA mutantima dolazi do povećane frekvence rekombinacije. Ovaj rad predstavlja završni deo naše originalne studije polA1 indukovane mutageneze praćene na histidinskom operonu hromozoma E.coli. Analizirani su molekularni mehanizmi nastajanja velikih delecija, ili proces rekombinacije koji promoviše ove genomske rearanžmane. Pokazali smo da velike delecije nastaju kao rezultat rekombinacije izmedju dve IS5 sekvence koje se nalaze sa obe strane his operona. Sve četiri nezavisno izolovane delecije su bile jednake i iznosile su 35 kb. Analizom sekvence rekombinovanih IS5 elemenata pokazali smo da rekombinacija uvek prolazi kroz levi terminus IS5 i da se odigrava po tipu “site specific” rekombinacije. Levi terminus IS5 elementa ima karakteristično zakrivljenje DNK uslovljeno njenom primarnom strukturom i sadrži mesto za vezivanje IHF proteina. Rezultati ovog rada zajedno sa podacima iz literature ukazuju na moguću ulogu IHF proteina u nastajanju velikih delecija i u procesu rekombinacije. Primenom PCR tehnologije pokazli smo da je frekvenca nastajanja velikih delecija povećana kod polA1 i dam mutanata i da velike delecije nastaju na recA nezavisan način. PolA1 ne pokazuje nikakvu specifičnost jer se rekombinacija dešava na isti način i kod divljeg soja, ali je frekvenca rekombinacije dva puta povećana u polA1 mutantima u odnosu na divlji soj.

In our previous work on polA1 mutants we have shown that polA1 creates exclusively minus fs and deletions types. In mutational spectra of histidine auxotrophs, one specific category of deletions, large deletions, that cover all his operon, was present. The size of deletions pointed out that they appear in a process of recombination between homology sequences; it is known that polA1 mutants show an increased frequency of recombination. This work presents final part of our original study of polA1-induced mutagenesis followed on histidine operon of chromosome E.coli. Molecular mechanisms of appearances of large deletions, or process of recombination promoting this chromosomal rearrangement, was analysed. We showed that large deletions appear as a result of recombination between two IS5 sequences located on both sides of his operon. Four independently isolated deletions were identical, 35 kb long. Sequence analysis of recombinant IS5 elements was show that recombination always goes throught the left terminus of IS5, as a “site specific” recombination. Left terminus of IS5 contains a characteristic sequence-directed bent DNA, including a binding site for IHF protein. The data from literature, including the present results, point to a possible role of IHF protein in appearance of large deletions and process of recombination. Applying a PCR technology, we show that the frequency of large deletions is increased in polA1 and dam mutants, and that large deletions appear on recA independent way. PolA1 is not sequence specific because the process of recombination between two IS5 is identical in wild type and polA mutants, but the frequency of recombination is two times higher in regard to wild type.

Efekat kratkotrajne moždane ishemije/reperfuzije i tretmana dehidroepiandrosteronom na komponente signalnog puta NMDA receptora u hipokampusu i prečeonoj kori pacova

Effects of brief cerebral ischemia/reperfusion and dehydroepoandrosterone treatment on components of NMDA receptor-mediated signalling in rat hippocampus and prefrontal cortex

Stanje moţdane ishemije/reperfuzije (I/R) karakteristično je za cerebro- vaskularna oboljenja kao što su moţdani udar i tranzitorni ishemijski atak (TIA). Promena signalizacije posredovana N-metil-D-aspartat (NMDA) receptorom ima značajnu ulogu u I/R-uzrokovanom oštećenju, dok je dehidroepiandrosteron (DHEA), pozitvni alosterični modulator NMDA receptora, najčešće okarakterisan kao neuroprotektivan u tretmanu ishemičnih stanja. U ovoj disertaciji ispitivana je proteinska ekspresija komponenti kompleksa NMDA receptora i njegove nishodne signalizacije u hipokampusu i prečeonoj kori muţjaka pacova Wistar soja 24 sata nakon podvezivanja obe zajedničke karotidne arterije u trajanju od 15 min i/ili efekat tretmana DHEA primenjenog 4 sata od hirurške procedure. Praćenje senzo-motorne funkcije i prisustvo infarktnih lezija na presecima celog mozga korišćeno je za validaciju I/R modela za proučavanje blaţih ishemičnih stanja poput TIA. Takođe, izvršeno je ispitivanje efekata I/R i tretmana na histo/morfološkom nivou. Odsustvo senzo-motornih deficita i infarktnih lezija kao i očuvana struktura tkiva i morfologija neurona u hipokampusu i prečeonoj kori nakon I/R ukazuju na potencijalnu primenu modela u ispitivanju umerenih ishemičnih stanja. Region-specifične promene signalnog puta NMDA receptor/neuralna azot oksid sintaza/azot oksid nakon kratkotrajne I/R govore u prilog većoj osetljivosti hipokampusa u odnosu na prečeonu koru. Efekat DHEA uočen je isključivo nakon I/R, vraćajući u prečeonoj kori parametare na kontrolnu vrednost, dok u hipokampusu promene Bax/Bcl-2 odnosa i potencijala mitohondrijske membrane ukazuju na pokretanje pro-apoptotskih dešavanja. Stoga, prethodno okarakterisani neuroprotektivni efekat DHEA treba dodatno istraţiti.

Cerebral ischemia/reperfusion (I/R) is characteristic of cerebro-vascular diseases such as stroke and transient ischemic attack (TIA). Alterations of N- methyl-D-aspartate (NMDA) receptor-mediated signalling pathway are well recognized features of I/R-governed damage, while dehydroepiandrosterone (DHEA), its positive allosteric modulator, has been previously described as neuroprotective and potentially promising for therapy of ischemic conditions. In this doctoral dissertation changes of components of the NMDA receptor complex and downstream signalling in hippocampus and prefrontal cortex were examined in male Wistar rats 24 h following 15 min bilateral common carotid artery occlusion. In addition, effects of 4 h post-surgical DHEA treatment were investigated. Sensory-motor function and presence of infarct lesions were used to validate suitability of I/R model for studying mild ischemic conditions such as TIA. Additionally, effects of I/R and treatment were evaluated on histo/morphological level. Absence of sensory-motor deficits and infarct lesions, as well as preserved tissue structure and overall neuronal morphology in hippocampus and prefrontal cortex following I/R and treatment were detected indicating suitability of used I/R model for investigation of mild ischemic states. Region- specific postischemic changes of NMDA receptor/neuronal nitric oxide synthase/nitric oxide following short-term I/R indicate higher sensitivity of hippocampus compared to prefrontal cortex. DHEA effect was detected exclusively following I/R, returning the parameters in prefrontal cortex to the control value, while hippocampal Bax/Bcl-2 ratio and mitochondrial membrane potential changes indicate the initiation of pro-apoptotic events. Therefore, previously reported neuroprotective effect of DHEA should be considered with caution and further investigated.

Molekularna struktura, poreklo i funkcija B hromozoma kod žutogrlog šumskog miša Apodemus flavicollis (Mammalia, Rodentia)

Molecular structure, origin and function of B chromosomes in yellow-necked wood mouse Apodemus flavicollis (Mammalia, Rodentia)

B hromozomi predstavljaju prekobrojne hromozome koji nisu neophodni za normalan rast i razviće. Ovi prekobrojni hromozomi se javljaju kod svih višećelijskih eukariotskih grupa, osim kod ptica, i različiti su po poreklu, morfologiji, veličini, broju, genetičkoj strukturi i efektima na fenotip. Njihova prisutnost u živom svetu procenjuje se na 3% kariotipski analiziranih vrsta. Karakteriše ih nasleđivanje koje ne prati Mendelova pravila, kao i izostanak rekombinacije sa hromozomima osnovnog A seta. Glavna pitanja koja se postavljaju u savremenim istraživanjima B hromozoma se odnose na njihovo poreklo, mehanizme nastanka i održavanja. Poznavanje genetičkog sadržaja, transkripcionog statusa i efekata prekobrojnih hromozoma, omogućuje rasvetljavanje njihovog biološkog značaja. Glodari su najbrojniji nosioci B hromozoma među sisarima. Rod Apodemus broji ukupno 20 vrsta, od kojih je kod šest zabeleženo prisustvo B hromozoma. U ovoj studiji izučavani su B hromozomi na jedinkama vrste žutogrli miš, Apodemus flavicollis. Nosioci imaju najčešće jedan ili dva B, dok je maksimalan zabeležen broj osam B hromozoma. Prekobrojni hromozomi se kod ove vrste javljaju u svim do sada proučavanim populacijama na teritoriji Republike Srbije, sa različitom učestalošću. Brojne populacione studije na ovoj vrsti pokazuju da jedinke sa B hromozomima imaju višu adaptivnu vrednost u poređenju sa jedinkama bez prekobrojnih hromozoma. Cilj ove studije bio je utvrđivanje sekvence, proučavanje porekla, kao i analiza transkripcione aktivnosti pojedinih sekvenci B hromozoma vrste A. flavicollis. U istraživanje su uključene životinje sa lokaliteta u Republici Srbiji, Ruskoj federaciji i Republici Belorusiji. Metodom mikrodisekcije iz kariotipa tri jedinke su izolovani B hromozomi koji su potom umnoženi u lančanoj reakciji polimeraze (PCR). Proizvedene su fluorescentne B-specifične probe. Procena homologije između B-specifičnih proba i hromozoma osnovnog kariotipa iste vrste izvršena je putem fluorescentne in situ hibridizacije (FISH). Utvrđena je homologija između sekvence B hromozoma i: a) pericentromernog regiona (PR) polnih hromozoma, b) subtelomernih regiona dva para malih autozoma, kao i c) slabija homologija sa distalnim regionom Y hromozoma. Homologija između sekvenci različitih B hromozoma je potvrđena bez obzira na geografsku udaljenost populacija iz kojih uzorci vode poreklo i nezavisno od broja B hromozoma u kariotipu. Ovo ukazuje na isto poreklo i/ili strukturu svih B hromozoma kod vrste A. flavicollis. U ovoj studiji je takođe pokazano da i pored česte zastupljenosti C-kit gena na B hromozomima različitih vrsta sisara, ovaj gen nije pronađen na B hromozomima vrste A. flavicollis. Poređenjem sekvenci B hromozoma sa referentnim genomom vrste Mus musculus, identifikovano je 39 gena sa 22 hromozomska regiona koja vode poreklo sa 16 hromozoma referentnog genoma. Sa izuzetkom B hromozoma poreklom iz Ruske federacije, koji u sekvenci sadrži jedan dodatni hromozomski region koji nije nađen kod populacija iz Republike Srbije, rezultati pokazuju da su svi analizirani B hromozomi izgrađeni od istih regiona hromozoma A seta. Sekvenca B hromozoma je u najvećoj meri sadrži gene koji kodiraju proteine mikrotubula i ćelijskog ciklusa. Takođe su prisutni i geni koji kodiraju nukleotid-vezujuće, metal-vezujuće proteine kao i proteine membrane, identifikovan je i veliki broj repetitivnih sekvenci, među kojima su transpozoni u nekim slučajevima bili tandemski organizovani. Utvrđeno je i da se geni smešteni na B hromozomima nalaze u različitim stadijumima degradacije. Nasuprot višedecenijskom uverenju da su B hromozomi genetički inertni, u ovom istraživanju je pokazano da se pseudogeni poreklom sa B hromozoma transkribuju. Pored toga, neizmenjeni geni sa B hromozoma, ili sa osnovnog genoma, u prisustvu B hromozoma, pokazuju viši nivo transkripcije kod ženki u mlađem životnom dobu. Transkripcija gena Cenpe je povezana i sa brojem B hromozoma, tako da je nivo transkripcije najviši kod jedinki koje imaju jedan B hromozom. B hromozomi vrste A. flavicollis, najverovatnije vode poreklo od pericentromernog regiona X hromozoma koji se nalazi neposredno uz pseudoautozomalni region, odlikuju se stabilnom genetičkom strukturom na širokom arealu vrste, transkripciono su aktivni na način koji je povezan sa polom, starošću i brojem B hromozoma u kariotipu.

B chromosomes (Bs) are supernumerary chromosomes in a standard karyotype, unnecessary for normal growth and development. Bs are present in all main groups of multicellular eukaryotes, except birds, and extremely variable considering origin, morphology, size, number, molecular structure, and phenotypic effects. 3% of all analyzed species have B chromosomes. The Bs do not follow rules of Mendelian segregation law and do not recombine with members of the basic A chromosome complement. The main questions considered in contemporary studies of Bs are surrounding their origin, mechanisms of formation and maintenance. Knowledge of their molecular structure, transcriptional activity, and phenotypic effects, will allow a deeper understanding of their biological importance. Within mammals, the most frequent carriers of Bs are rodents. The genus Apodemus includes 20 species, six of which carry Bs, in addition to A chromosome set. In this study, B chromosomes were analyzed in specimens of the yellow-necked mouse, Apodemus flavicollis. Carriers usually have one or two Bs, and the highest recorded number in this species is eight B chromosomes. In different frequencies, supernumeraries are present in all studied populations of A. flavicollis in the territory of the Republic of Serbia. Numerous population studies of this species are indicating that B carriers have a higher fitness compared to individuals without B chromosomes. The aim of this study was to define sequence, origin and transcriptional activity of selected B regions in species A. flavicollis. Specimens were collected from different localities in the Republic of Serbia, Russian Federation and the Republic of Belarus. B chromosomes have been isolated by microdissection from the karyotype of three individuals and amplified in the polymerase chain reaction (PCR). B-specific fluorescent probes were synthesized. Estimation of homology between B-specific probes and chromosomes of A set had been obtained by fluorescent in situ hybridization (FISH). Homology was shown between the B chromosome and: a) pericentromeric region (PR) of sex chromosomes b) subtelomeric region of the two pairs of small chromosomes and c) lower homology with the distal region of the Y chromosome. Despite the distinct geographical origin of samples and different number of Bs in karyotypes, hybridized probes showed the same affinity to Bs. This indicates the same origin and/or structure of all Bs in A. flavicollis. This study has demonstrated that C-kit gene does not contribute to the composition of supernumeraries in A. flavicollis, contrary to the studies of Bs in numerous mammalian species. Comparing sequences of Bs and referent genome of the species Mus musculus, 39 genes in 22 chromosomal regions that originate from 16 chromosomes of the referent genome have been identified. With the exception of one region present on B chromosome from Russian Federation, that contained one additional chromosomal region not present on the samples from Serbian populations, results demonstrate that all analyzed Bs are composed of the same A-chromosomes’ regions. B chromosomes are rich in microtubule and cell cycle protein-coding genes. Other present categories include genes that are coding nucleotide-binding, membrane, and metal-binding proteins, as well as a high amount of repetitive elements. Transposable elements were tandemly arranged in some cases. Genes present on B chromosomes are at different stages of degradation. In contrast to the view accepted for many decades that Bs are genetically inert elements, this study demonstrates that pseudogenes on Bs are transcribed. The study also demonstrates that Bs-genes, or standard-genome genes in the presence of Bs, show higher transcriptional levels in young females. Furthermore, transcription of Cenpe gene is linked with the number of Bs, in the manner that samples with one B show the highest transcription level. B chromosomes in A. flavicollis probably originate from the pericentromeric region of the X chromosome which is positioned near pseudoautosomal region, they are featured with stable genetic structure throughout the whole areal of the species and are transcriptionally active depending on the sex, age and number of Bs.

Funkcionalno urbani region instrument policentričnog prostornog razvoja Srbije

Functional urban region – the instrument of polycentric spacial development of Serbia

Predmet istraživanja doktorske disertacije je utvrđivanje mogućnosti primene teorije i metodologije funkcionalne regionalizacije u determinisanju i delimitiranju značaja i uloge funkcionalno urbanih regiona (koji imaju različite teritorijalne i demografske veličine) u prostorno-funkcionalnoj organizaciji Srbije. Na bazi relevantnih teorijskih i metodoloških postavki savremenog prostornog planiranja, društvene geografije i njenih socijalnih i ekonomskih disciplina, uz poštovanje principa funkcionalne regionalizacije i novijih doktrina regionalnog razvoja, dat je model održivog funkcionalno urbanog regiona koji u skoroj budućnosti može da postane instrument policentričnog prostornog razvoja Srbije. Tim modelom stvoriće se uslovi za racionalnu decentralizaciju funkcija i za novu prostorno-funkcionalnu organizaciju i regionalizaciju Srbije. Polazeći od poznate i u nauci i praksi geografije, prostorne ekonomije i regionalnog prostornog planiranja potvrđene činjenice da funkcionalno urbani regioni imaju izuzetnu ulogu u integraciji i povezivanju heterogenih prostornih struktura i sistema u prirodnogeografskom, socioekonomskom i funkcionalnom smislu, akcenat u radu je stavljen na utvrđivanje i planiranje njihovog uticaja na policentričnu prostornu organizaciju Srbije. Teorijsko-metodološki okvir rada zasnovan je na naučnim pristupima prostorno planerskih i geografskih istraživanja funkcionalne organizacije prostora u dosadašnjoj istoriji i mogućnosti primene ovih znanja na primeru definisanja sistema naselja u Republici Srbiji. Izvršena istraživanja u radu potvrdila su da je u postupku delimitacije i planiranja buduće funkcionalne organizacije prostora Srbije najpogodniji koncept nodalnog regiona (koji ima svoje teorijsko metodološko ishodište u teoriji centralnih naselja Valtera Kristalera), odnosno funkcionalno urbanog regiona koji polazi od činjenice da gradska naselja svojim delovanjem utiču na regionalnu integraciju i diferencijaciju prirodnoekološki, socioekonomski, naseobinsko demografski, fizionomski i funkcijski heterogenog prostora. Njihovim zajedničkim delovanjem formiraju se specifični prostorni sistemi- nodalni-čvorišni, odnosno funkcionalno urbani regioni. Ovo je naročito izraženo u uslovima ubrzane urbanizacije koja je uslovila socioekonomsku i funkcionalnu transformaciju naselja u bližoj ili daljoj okolini gradskih centara, tj. formirani su gradski regioni kao nove regionalne strukture...

The subject of the doctoral dissertation research is determining the possibility of applying the theory and methodology of functional regionalization in defining and delimiting the importance and role of functional urban regions (which have different territorial and demographic sizes) in the spatial-functional organization of Serbia. Based on the relevant theoretical and methodological conceptions of modern spatial planning, human geography and its social and economic disciplines, respecting principles of functional regionalization and new doctrines of regional development, given is the model of sustainable functional urban region who may become, in the near future, an instrument of polycentric spatial development of Serbia. This model will create the conditions for rational decentralization of functions and for new spatial and functional organization and regionalization of Serbia. Starting from the known and proven fact, in the science and practice of geography, spatial economics and regional spatial planning, that the functional urban regions have a unique role in integrating and connecting heterogeneous spatial structures and systems in the physical-geographic, socio-economic and functional terms, the emphasis in this paper is to establish and plan their impact on the polycentric spatial organization of Serbia. The theoretical and methodological framework of dissertation is based on the scientific approaches to spatial planning and geographical studies of functional organization of territory in the past history and opportunities to apply these knowledge on the example of defining the system of settlements in Serbia. Research carried out in this paper confirmed that, in process of delimitating and planning the future functional organization of Serbian space, the most suitable is the concept of nodal region (which has its theoretical and methodological bases in the Walter Christaller’s theory of central places), that is, functional urban region which is based on the fact that urban settlements are influencing the regional integration and differentiation of socio-economically, demographically, physiognomically and functionally heterogeneous space. Influencing together, formed are specific physical systems-nodal or functional urban regions. This is especially evident in conditions of rapid urbanization that has caused socioeconomic and functional transformation of settlements in the near or distant cities’ environment, i.e. urban regions are formed as the new regional structures...

Parametri antioksidacionog sistema u tkivima žaba Pelophylax esculentus kompleksa kao biomarkeri izlaganja metalima

Parameters of antioxidative defense system in tissues of the frogs from the Pelophylax esculentus complex exposure to metals

Organizmi su u životnoj sredini izloženi različitim zagađivačima i sredinskim faktorima. Metali su obeleženi kao rastući problem zbog svoje postojanosti i toksičnosti. Oksidacioni stres je jedan od glavnih načina delovanja metala na organizme. Redoks aktivni (Cu, Co, Cr, Fe, Ni i Zn) metali izazivaju direktno oksidacioni stres kroz Fentonovu i Haber-Vajsovu reakciju, dok redoks neaktivni metali (As, Cd, Hg i Pb) indirektno dovode do oksidacionog stresa kroz promenu aktivnosti antioksidacionog sistema (AOS). Pelophylax esculentus hibridni kompleks se sastoji od tri vrste semiakvatičnih žaba (od roditeljskih vrsta Pelophylax ridibundus i Pelophylax lessonae i njihovog hibrida Pelophylax kl. esculentus) koje koegzistiraju i mogu da stupaju u reproduktivne odnose. Žabe su zbog svojih životnih karakteristika (složen životni ciklus, polupropustljiva koža, prisutnost u vodenoj i terestričnoj sredini) podložne akumulaciji metala preko vode i kroz lanac ishrane i zato predstavljaju potencijalno dobre bioindikatore. Ciljevi ove doktorske disertacije su bili utvrđivanje razlika u bioakumulaciji metala, aktivnosti i koncentracijama parametara antioksidacionog sistema i aktivnosti holinesteraze u tkivima jetre, kože i mišića vrsta P. esculentus kompleksa sa četiri različita lokaliteta, zatim promene parametara antioksidacionog sistema pod uticajem različitih koncentracija akumuliranih metala, i na kraju potencijalna upotreba ovih parametara kao biomarkera efekata metala. Lokaliteti sa kojih su žabe izlovljavane su: jezero Popovica u okviru Nacionalnog parka “Fruška gora”, Specijalni rezervat prirode “Obedska Bara”, Park prirode “Ponjavica” i Veliki Bački kanal kao deo kanala Dunav- Tisa-Dunav. Parametri antioksidacionog sistema koji su analizirani u okviru enzimskih komponenti su: superoksid-dismutaza (SOD), katalaza (CAT), glutation-peroksidaza (GSH-Px), glutation-reduktaza (GR), enzim faze II biotransformacije glutation-S- transferaza (GST), a od neenzimskih komponenti: ukupni glutation (GSH) i slobodne sulfhidrilne grupe (SH). Određivana je i koncentracija metala (As, Cd, Co, Cr, Cu, Fe, Hg, Mn, Ni, Pb, Zn) u tkivima i vodi. Rezultati bioakumulacije metala u tkivu jetre, kože i mišića vrste Pelophylax esculentus kompleksa pokazali su da je vrsta P. ridibundus akumulirala najveće količine metala, a zatim slede P. esculentus i P. lessonae. Razlike u bioakumulaciji metala mogu se povezati sa životnim navikama, hibernacijom, izborom plena i veličinom tela ovih vrsta. P. ridibundus je najkrupnija i uvek hibernira u vodi, dok ostale dve vrste imaju sitnije telo, drugačiji diverzitet plena i/ili hiberniraju na kopnu. Od svih ispitivanih parametara antioksidacionog sistema, enzimi SOD, GSH-Px i koncentracija SH grupa pokazali su najveću varijabilnost kod vrsta Pelophylax esculentus kompleksa. Dok je odnos enzima CAT i GSH-Px u jetri odvojio P. esculentus od roditeljskih vrsta. P. esculentus je imala veću aktivnost CAT i značajno manju aktivnost GSH-Px u odnosu na P. ridibundus i P. lessonae. Dobijeni rezultati ukazuju na to da se pored različitih interakcija sa spoljašnom sredinom (razlike u akumulaciji metala) i fizioloških razlika (u bazalnom metabolizmu) vrste ovog kompleksa razlikuju i u parametrima antioksidacionog sistema. Ispitivanje međutkivnih razlika u parametrima AOS, aktivnosti holinesteraze i akumulaciji metala između jetre, kože i mišića vrsta P. esculentus kompleksa pokazalo je da jetra ima najveće vrednosti ispitivanih parametara, kao i da akumulira najveći broj i najveće koncentracije metala (posebno izraženo u koncentracijama Fe, Cu, Al, Cd, Hg, i Ni). Zatim sledi koža, dok su najniže vrednosti AOS parametara i koncentracije metala zabeležene u mišićima. Efekti različitih lokaliteta na vrste P. esculentus kompleksa pokazuju da se koncentracije akumuliranih metala u tkivima razlikuju od koncetracija metala izmerenih u vodi, što ukazuje da postoji povremeno zagađenje, ili su metali u tkiva dospeli na neki drugi način (npr., ishranom preko plena, ili su u nekom trenutku u toku svog životnog ciklusa bile izložene povećanim koncentracijama metala). Opšti trend je da povećanje zagađenja prati i veća akumulacija metala u tkivima žaba, dok se kod parametara AOS ne uočava jasan obrazac promene. Odnos koncentracija metala i parametara AOS pokazuje da vrsta P. esculentus ima najveći broj Pirsonovih korelacija, zatim sledi P. ridibundus, dok je najmanji broj korelacija zabeležen kod P. lessonae. Redoks aktivni metali koji pokazuju najveći efekat na ispitivane parametre kod žaba su: Cr, As, Ni, Fe i Cu, a redoks neaktivni: Hg i Cd. Među parametrima AOS najveći broj korelacija sa metalima pokazuju SH grupe, zatim SOD i GR. Od svih parametara antioksidacionog sistema koji se koriste kao biomarkeri, tri navedena (SH grupe, SOD i GR) se izdvajaju kao vrlo efikasni u biomonitoringu efekta različitih metala na tkiva žaba P. esculentus kompleksa. Aktivnost holinesteraze kao parametar neurotoksičnosti pokazao je promene koje su u direktnoj vezi sa promenama koncetracija akumuliranih metala, i to pozitivne sa Al, Zn i Cu i negativne sa As i Hg. Ovo ukazuje da se i ChE može koristiti kao biomarker u studijama koje prate prisustvo i efekte metala kod žaba. Istraživanja sprovedena u ovoj doktorskoj disertaciji pokazala su da se vrste P. esculentus kompleksa razlikuju u akumulaciji metala i parametrima antioksidacinog sistema, kao i da se ispitivani parametri mogu koristiti kao biomarkeri izlaganja i efekata metala. Na osnovu svega što je zabeleženo može se zaključiti da su vrste P. esculentus kompleksa pogodni bioindikatori prisustva i efekta metala u životnoj sredini.

Organisms are exposed to different environmental factors and contaminants. Metals are marked as a major problem due to their ubiquitous and toxicity. The oxidative stress has been suggested as one of the main mechanisms of metal toxicity effects on organisms. The redox active metals (Fe, Cu, Cr and Ni), induce oxidative stress directly through the Fenton and Haber-Weiss reactions, while the redox inactive metals (Cd, Pb, Zn, and Hg) act indirectly through alterations of the antioxidant defense system (AOS). The Pelophylax esculentus hydride complex is comprised of three semiaquatic frog species (parent species Pelophylax lessonae and Pelophylax ridibundus and their hybrid Pelophylax kl. esculentus) that coexist and can crossbreed. Frogs are distinguished by a number of properties (biphasic life- aquatic and terrestrial, complex life cycle and semipermeable skin) that make them highly susceptible to metal accumulation trough water and food chain and are therefore potentially useful bioindicator species. The aims of this doctoral dissertation were to determine: differences in metals bioaccumulation, activities and concentration of antioxidative defense system parameters and activity of cholinesterases in the liver, skin and muscle tissues of P. esculentus complex species from four localities; the changes in antioxidative defense system parameters and activity of cholinesterases induced by different metals concentration, and in the end potential usefulness of examined parameters as biomarkers of metals effects. Frogs were caught from next localities: Lake Popovica as a part of National Park “Fruška Gora”, Special Nature Reserve "Obedska Bara", Nature Park "Ponjavica" and the Grand Canal as part of the Danube-Tisa-Danube canal. Analyzed parameters of antioxidative defense system included enzymatic components: activities of superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), glutathione peroxidase (GSH-Px), glutathione reductase (GR), enzyme of phase II biotransformation glutathione-S- transferase (GST), and non-enzymatic components: the concentration of glutathione (GSH) and free sulfhydryl groups (SH). The concentrations of metals (As, Cd, Co, Cr, Cu, Fe, Hg, Mn, Ni, Pb, Zn) were measured in the water and tissues. The results of metals accumulation in liver, skin and muscle of P. esculentus complex frogs showed that P. ridibundus accumulated highest concentrations of metals, then P. esculentus and P. lessonae. Differences in metals accumulation of examined frogs could be related with some interspecies differences in life history, hibernation, prey diversity and body size. P. ridibundus is the largest and always hibernate in water, while other two have smaller body, different prey diversity and/or hibernate on land. Among the all examined AOS parameters, enzymes SOD, GSH-Px and concentration of SH groups displayed the highest level of variability. Relationship between activities of CAT and GSH-Px in liver denoted of hydride P. esculentus from its parental species. P. esculentus had higher activity of CAT and lower activity of GSH-Px in comparison to P. ridibundus and P. lessonae. The results indicate that beside differences in interaction with environment and in some physiological processes the species of this complex also differ in parameters of AOS. Intertissue differences in AOS, cholinesterase activity and metals accumulation between liver, skin and muscle of P. esculentus frogs point out liver as tissue with highest values of all parameters and highest number and concentration of metals, then followed by skin and the lowest were for muscle. The effects of different localities on P. esculentus comlpex species revealed that the concentrations of metals in tissues and water differ, this can be the result of the exposure of frogs to elevated concentrations of metals in the past, and/or to indirect accumulation of these elements via food intake. The general trend showed that the increased locality pollution is in compliance with increased metal accumulation, this trend was not observed for changes in AOS. Relationship between concentration of metals and AOS parameters showed that P. esculentus exhibited the highest number of correlations, this was followed by P. ridibundus and by P. lessonae which exhibited the lowest number of correlations. The highest effects on frogs antioxidative defense system had next redox active metals: Cr, As, Ni, Fe i Cu, and redox inactive metals: Hg i Cd. The highest number of correlations were determined for the following biomarkers: SH groups, SOD and GR. This parameters (SH groups, SOD and GR) can be used as biomarkers of metal pollution- induced oxidative stress in frogs tissues. Cholinesterase activity correlated with concentration of metals, positively with Al, Zn and Cu and negatively with As and Hg, this indicate that cholinesterase could be included in biomonitoring studies of metals effects. Research conducted in this doctoral dissertation showed: that the species of P. esculentus complex differ in concentration of accumulated metals and antioxidative defense system parameters; and that used parameters can be good biomarkers of exposure and effects of metals. In the light of these findings we can suggest the use of P. esculentus complex species as a biomonitoring species in studies of metal accumulation and metal-induced oxidative stress.

Proteinaze mlečno-kiselinskih bakterija: diverzitet u mezofilnim vrstama laktobacila i uticaj na aktivnost bakteriocina

Proteinases of lactic acid bacteria: diversity in mesophilic species of lactobacilli and impact on bacteriocin activity

Mlečno-kiselinske bakterije su mikroorganizmi od izuzetnog značaja kako za industriju fermentisanih proizvoda, tako i za medicinu gde kao probiotici dobijaju sve veći značaj. Proteinaze i bakteriocini, molekuli koje ove bakterije sekretuju u ekstraćelijsku sredinu, imaju važnu ulogu u oba ova aspekta. Proteinaze su veliki ekstraćelijski enzimi uključeni u prvi korak digestije proteina iz vanćelijske sredine i neophodne su za efikasan rast bakterija u sredinama siromašnim malim peptidima i slobodnim aminokiselinama. U ovom radu je analizirana proteolitička aktivnost različitih mezofilnih laktobacila, pripadnika Lb. casei i Lb. plantarum grupa prema pet različitih proteina mleka. Utvrđeno je da Lb. zeae LMG17315 poseduje najefikasniju proteolitičku aktivnost, s obzirom da hidrolizuje sve ponuđene supstrate. Takođe pokazano je da se proteinaze ovog soja odvajaju u medijum u aktivnom obliku. Lb. casei ATCC393, soj sa kontroverznim sistematičkim statusom, pokazao je sličnu, ali manje efikasnu proteolitičku aktivnost. Prisustvo različitih proteinaznih gena u ispitivanim sojevima analizirano je DNK-DNK hibridizacijom i PCR metodom. Utvrđeno je da LMG17315 poseduje sekvence gena koje kodiraju katalitičke domene za tri, a ATCC393 za jednu proteinazu. Kod soja LMG17315 je utvrđeno da poseduje prtP-sličan i prtR-sličan gen, dok je kod oba soja pronađen i novi proteinazni gen, označen kao prtP1. S obzirom na dosadašnji problematičan sistematički status ovih sojeva urađena je i njihova molekularna determinacija čime je stečen bolji uvid u njihove filogenetske odnose. Iako je u relevantnoj literaturi predloženo da ATCC393 treba da bude reklasifikovan u vrstu Lb. zeae, dobijeni rezultati ukazuju na značajne razlike između soja ATCC393 i tipskog soja Lb. zeae LMG17315. Analizirani sojevi vrste Lb. plantarum, takođe su efikasno hidrolizovali proteine mleka, iako kod ove vrste do sada nije opisana proteinaza odgovorna za ovakvu aktivnost. Slično kao kod Lb. zeae LMG17315 i kod Lb. plantarum LMG9208 je detektovano prisustvo prtR-sličnog gena, ranije uočenog samo u vrsti Lb. rhamnosus. Katalitički region ovog gena je sekvenciran, i poređenjem sa ostalim proteinaznim genima utvrđeno je da se radi o novom tipu proteinaze, s obzirom na razlike na nivou nukleotidne i aminokiselinske sekvence. Kod ostalih sojeva Lb. plantarum nisu detektovani analizirani geni, što ukazuje da poseduju novi do sada neokarakterisani tip proteinaze. U drugom delu istraživanja, ispitivana je regulacija ekspresije bakteriocina LcnB kod soja L. lactis subsp. lactis BGMN1-501, kao i moguća interakcija ovog bakteriocina i proteinaze PrtP. Bakteriocini su bakterijski antimikrobni molekuli, strukturno i funkcionalno raznovrsni. LcnB je bakteriocin poznatog načina i spektra delovanja, međutim nisu definisani njegov aktivni i vezujući domen, niti su poznati mehanizmi regulacije njegove ekspresije. Pokazano je da je antimikrobna aktivnost LcnB bakteriocina zavisna od koncentracije peptida u medijumu za rast bakterija, pri čemu sa porastom ove koncentracije, raste i aktivnost LcnB. Međutim, analizom aktivnosti promotora lcnB gena, uočeno je da u istim uslovima dolazi do opadanja aktivnosti ovog promotora. S obzirom na dobijene rezultate, ispitana je interakcija LcnB bakteriocina i proteinaze PrtP, čija je ekspresija na sličan način regulisana koncentracijom peptida u medijumu. Konstruisani su mutanti kojima su ovi geni inaktivirani pomoću insercije pG+host9 vektora. Nasuprot ishodnom soju, PrtP– mutant je pokazao povišen nivo bakteriocinske aktivnosti. Takođe, izgubila se zavisnost aktivnosti od pomenutih uslova spoljašnje sredine, tako da variranje koncentracije peptida u medijumu nije uticalo na ovu aktivnost. Na osnovu dobijenih rezultata postulirano je da u prisustvu proteinaze PrtP dolazi do hidrolize bakteriocina LcnB od strane ovog enzima. Ova hipoteza je testirana dodavanjem proteinaznog ekstrakta dobijenog iz LcnB– mutanta u uzorak bakteriocina dobijenog iz PrtP– mutanta. Aktivnost proteinazom tretiranog bakteriocina se smanjivala dok nije dostigla nivo aktivnosti ishodnog soja BGMN1- 501. Time je pokazano da proteinaza narušava aktivnost LcnB bakteriocina, ali ne u potpunosti, najverovatnije putem hidrolize nakon koje digerirani LcnB zadržava nešto nižu aktivnost. Da do isecanja dela bakteriocina zaista dolazi potvrđeno je izolacijom i analizom molekulske mase samog LcnB bakteriocina iz ishodnog soja BGMN1-501, nakon njegovog rasta u uslovima koji indukuju ekspresiju PrtP proteinaze. Pomoću RF-HPLC i LC/MS utvrđeno je da je molekulska masa ovog bakteriocina manja od one koja je izračunata na osnovu aminokiselinske sekvence. Poređenjem veličina detektovane i očekivane molekulske mase zaključeno je da do hidrolize dolazi između šeste i sedme aminokiseline sa N terminusa LcnB bakteriocina.

Lactic acid bacteria are microorganisms of great importance for the industry of fermented products as well as for medicine, where they are gaining great attentionas probiotics. Proteinases and bacteriocins, molecules secreted by these bacteria, have important roles in both of these aspects. Proteinases are large enzymes involved the in first steps of digestion of extracellular proteins and are necessary for efficient bacterial growth in environments with low concentrations of small peptides and free amino acids. The proteolytic activity of different mesophilic lactobacilli, members of Lb. casei and Lb. plantarum groups, was tested against five main milk proteins, in this thesis. It was determined that Lb. zeae LMG17315 possessed the most efficient proteolytic activity, since it hydrolyzed all given substrates. In addition, it was shown that proteinases of this strain could be released from cell wall in active form. Lb. casei ATCC393, a strain with controversial systematics, showed similar, but less efficient proteolytic activity. Presence of different proteinase genes in tested strains was analyzed with DNA-DNA hybridization and PCR. It was determined that strain LMG17315 possessed gene sequences coding for catalytic domains of three proteinases, while ATCC393 possessed only one such sequence. Two of these genes in strain LMG17315 were similar to previously characterized prtP and prtR genes, while the third one was a new proteinase gene, here named prtP1. The same gene was found in the genome of ATCC393. Considering the problematic taxonomic status of these strains, methods of molecular determination were applied for better understanding of their phylogenetic relationship. Although many authors suggest that ATCC393 should be reclassified in taxon Lb. zeae, results obtained in this work highlighted some significant differences between these strains. Analyzed strains of Lb. plantarum also showed potent proteolytic activity, even though proteinases in this species are not described. Similarly to Lb. zeae LMG17315, prtR-like gene was found in Lb. plantarum LMG9208. This proteinase gene was previously found only in species Lb. rhamnosus. Catalytic region of the gene found in LMG9208 was sequenced and, as observed for prtP1, comparing the sequence with other proteinase genes indicated that it belongs to a new proteinase type. Analyzed genes were not found in other strains of Lb. plantarum, suggesting that they possess new, unknown type of proteinase. In the second part of this research, regulation of expression of bacteriocin LcnB was investigated in L. lactis. subsp. lactis BGMN1-501, as well as possible interaction between this bacteriocin and proteinase PrtP. Bacteriocins are bacterial antimicrobial proteins, showing great diversity in structure and function. LcnB is a bacteriocin of known antimicrobial spectrum but neither its mechanism of action, nor active/binding site are defined. The study showed that its activity was dependent of the peptideconcentration in growth medium, where higher concentrations led to higher antimicrobial activity. Nevertheless, the analysis of lcnB promoter activity showed that the same conditions caused a decrease in PlcnB activity. Considering these results, possible interaction between bacteriocin LcnB and proteinase PrtP was studied, given that proteinase activity showed similar dependence of peptide concentration in medium. For that purpose, mutants in both genes (prtP and lcnB) were constructed by inactivation through insertion of pG+host9 vector. Compared to the original strain, PrtP– mutant exhibited elevated level of bacteriocin activity. Moreover, dependence on medium conditions was lost, since variations in peptide concentration had no influence on this activity. Based on these results, it was postulated that PrtP proteinase hydrolyzed LcnB bacteriocin. This hypothesis was tested by adding proteinase extract obtained from LcnB– mutant into bacteriocin sample obtained from PrtP– mutant. Activity of this bacteriocin lowered with the treatment, until it reached the level of the original BGMN1-501 activity. This result proved that proteinase impairs bacteriocin LcnB activity, but not completely, probably through digestion of bacteriocin molecules which renders them less active. Isolation and molecular mass analysis of LcnB bacteriocin from the original BGMN1-501 strain grown in conditions favoring proteinase PrtP expression were further used to fully confirm the hypothesis. RF-HPLC and LC/MS analysis showed that molecular mass of LcnB bacteriocin was lower than predicted. After comparative analysis of obtained and predicted molecular mass values, it was determined that hydrolysis occurs between sixth and seventh amino acid on the N terminus of LcnB bacteriocin.

Ekogenotoksikološka procena kvaliteta površinskih voda komet testom na različitim tkivima klena (Squalius cephalus L.)

Ecogenotoxicological evaluation of surface water quality with comet assay on different tissues of european chub (Squalius cephalus L.)

Intenzivni procesi proizvodnje i oslobađanje velikog broja hemijskih agenasa, kao i metala u spoljašnju sredinu, najvećim delom u rečne tokove, dovela je do potrebe za primenom testova koji će detektovati njihov genotoksični potencijal. Mnogi akvatični organizmi, među kojima bitno mesto zauzimaju ribe, imaju sposobnost bioakumulacije genotoksičnih agenasa u tkivima, te se mogu koristiti kao bioindikatori u ekogenotoksikološkim studijama. Ribe se smatraju za jedne od značajnijih indikatora za procenu nivoa metala u slatkovodnim sistemima, jer su u vrhu lanca ishrane sa mogućnošću akumulacije visokih koncentracija pojedinih metala. Procena genotoksičnosti površinskih voda vršena je na osnovu detekcije oštećenja DNK molekula alkalnim komet testom, testom elektroforeze pojedinačnih ćelija, (engl. Single Cell Gel Electroforesis, SCGE), u krvi, jetri i škrgama klena (Squalius cephalus L.). Rangiranje parametara za procenu DNK oštećenja: dužina repa komete (TL), intenzitet repa komete (TI) i „Olive tail moment” (OTM), urađeno je metodom SRD (engl. Sum of Ranking Differences). Paralelno sa komet testom, u jetri i škrgama, pratila se i koncentracija metala i metaloida pomoću induktivno spregnute plazme – optičko emisione spektrometrije (ICP - OES). Analiza metala i metaloida je urađena i u mišićima i gonadama istom metodom. Procena ekološkog statusa površinskih voda određivala se na dve akumulacije, Garaši i Zlatar (Uvac) i dve reke, Peštan i Beljanica tokom 2011/2012 godine. Procena kvaliteta vode određena je na osnovu fizičko-hemijskih i mikrobioloških parametara. Analizirano je 7 grupa mikroorganizama: ukupni koliformi, fekalni koliformi, fekalne enterokoke, aerobni mezofili, aerobni heterotrofi, heterotrofi i oligotrofi. Poreklo zagađenja dobijeno je na osnovu odnosa fekalnih koliforma i fekalnih enterokoka F/E, a status samoprečišćavanja dobijen je iz odnosa heterotrofa i oligotrofa O/H. Integrisani odgovor biomarkera (IBR) je korišćen kao pokazatelj odnosa različitih grupa mikroorganizama tokom višemesečnog monitoringa. Osnovne procene kvaliteta vode, na osnovu analize fizičko-hemijskih i mikrobioloških parametara, izdvojile su akumulacije, Uvac i Garaši, u I klasu kvaliteta voda. Sa druge strane, analize vode sa Peštana i Beljanice su pokazale povećane koncentracije primarnih nutrijenata, i svih mikrobioloških bioindikatora, koje su uglavnom odgovarale III i IV klasi kvaliteta voda. Najviše vrednosti oštećenja DNK molekula za sva tkiva su zabeležena na Peštanu i Beljanici. Kako je na ovim rekama uzorkovanje rađeno tokom cele godine, pokazan je i pad oštećenja za sva tri tkiva tokom leta. Oštećenje DNK na ćelijama krvi, jetre i škrga sa Garaša nisu bila značajno različita od oštećenja na istim tkivima sa Peštana i Beljanice. Niže oštećenje DNK molekula pokazala su tkiva jedinki uzorkovanih na Uvcu u poređenju sa ostala tri lokaliteta, Garaši, Peštan i Beljanica.Visok kvalitet vode akumulacije Uvac potvrđen je niskim vrednostima primarnih nutrijenata, mikrobioloških parametara i DNK oštećenja na tkivima klena. Analiza akumulacije metala u različitim tkivima klena pokazala je visok stepen njihove diferencijacije, kao i značajne razlike u distribuciji elemenata u tkivima između ispitivanih lokaliteta. Analiza elemenata u tkivima klena sa Uvca pokazala je da je većina elemenata bila najniža u mišićima, dok su više vrednosti zabeležene u škrgama (Ba, Hg, Mn, Mo, Sr) i jetri (B, Cr, Cu, Fe i Mo). Takođe, analiza elemenata u tkivima klena na Garašima je pokazala da je većina elemenata bila najniža u mišićima, dok su više vrednosti zabeležene u škrgama (Al, B, Ba, Cr, Fe, Mn, Sr i Zn), dok je jetra u najvišim koncentracijama akumulirala As, Cu i Mo. Na osnovu PCA analize na obe reke Hg se izdvojila kao element koji je pokazao veći stepen akumulacije tokom jeseni. Na obe reke škrge su akumulirale veće koncentracije elemenata u odnosu na druga tkiva. Sa druge strane mišić je za većinu elemeneta imao najniže vrednosti. Na Peštanu je jetra pokazala izraženiju sezonsku varijaciju u akumulaciji metala (Cr, Mn, Sr, Hg i Zn), dok su na Beljanici to bile škrge (Ba, Cu, Mo, Sr, Zn). Kanonijska diskriminantna analiza (CDA) je, u odnosu na ukupni sadržaj elemenata u tkivima, pokazala odvajanje škrga u odnosu na druga tkiva na obe reke. Naučna oblast: Biologija Uža naučna oblast: Genotoksikologija, Mikrobiologija UDK broj: [579.68:574.64]+597.551.2:[57.088 : 577.113](043.3)

Intensive production and release of a large number of chemical agents, as well as metals into the environment, mainly in river flows, has led to the need for tests which can determine their genotoxic potential. Many aquatic organisms, especially fish, have a potential for bioaccumulation of genotoxic agents in the tissues, and hence can be used as bioindicators in ecogenotoxicological studies. Fish are considered one of the most important indicators for assessing the levels of metals in freshwater systems, because they are at the top of the food chain with the ability to accumulate high concentrations of certain metals. Assessment of surface water genotoxicity was carried out based on the detection of DNA damage with alkaline comet assay or single cell gel electrophoresis (SCGE) in the blood, liver and gills of chub (Squalius cephalus L.). Ranking of parameters for assessing the DNA damage: comet tail length (TL), the intensity of the tail of the comet (TI) and "Olive tail moment" (OTM), was done by the SRD (Sum of Ranking Differences) method. In parallel with the comet assay in liver and gills, inductively coupled plasma - optical emission spectrometry (ICP - OES) was used to follow the concentration of metals and metalloids. The same method was used for the analysis of metals and metalloids in the muscles and gonads. Assessment of the ecological status of surface waters was conducted at two reservoirs, Garaši and Zlatar (Uvac), and two rivers Peštan and Beljanica, during the 2011/2012 year. Water quality assessment is based on the physicochemical and microbiological parameters. Microbiological analysis included: total coliforms, fecal coliforms, fecal enterococci, aerobic mesophile, aerobic heterotrophs, heterotrophs and oligotrophs. The type of contamination was determined by the ratio of fecal coliforms and fecal enterococci F/E, and the status of self-purification is obtained from the ratio of heterotrophs and oligotrophs O/H. Integrated biomarker response (IBR) has been used as an indicator of the relationship between different groups of microorganisms during the months of monitoring. Basic water quality assessment, based on the analysis of physicochemical and microbiological parameters, classify the reservoirs, Uvac and Garaši as having class I water quality. On the other hand, the analysis of water from Pestan and Beljanica showed increased concentrations of primary nutrients and all microbial bioindicators, which are mainly suited to the III and IV class of water quality. The highest values of DNA damage of all tissues were recorded at Pestan and Beljanica. As the sampling on these rivers was done throughout the year, during the summer a decrease of damage for all three tissues was observed. DNA damage of blood cells, liver and gills at Garasi were similar to the measured damage of the same tissues at Peštan and Beljanica. Tissue specimens collected at Uvac showed lower DNA damage when compared to the other three sites, Garasi, Peštan and Beljanica. High water quality at reservoir Uvac was confirmed by low values of the primary nutrients, microbiological parameters and DNA damage on chub tissues. Analysis of heavy metal accumulation in different chub tissues showed a high level of differentiation, as well as significant differences in the distribution of elements in the tissues between the studied sites. Elemental analysis in chub tissues at Uvac showed that most of the elements had the lowest concentration in muscles, while higher values were recorded in the gills (Ba, Hg, Mn, Mo, and Sr) and liver (B, Cr, Cu, Fe, and Mo ). The analysis of the elements in chub tissues at Garasi also showed that most of the elements had the lowest concentration in muscles, while higher values were recorded in the gills (Al, B, Ba, Cr, Fe, Mn, Sr, and Zn), while the liver accumulated the highest concentrations of As, Cu and Mo. Based on PCA analysis on both rivers Hg showed a greater degree of accumulation in the fall. On both rivers gills accumulated higher concentrations of elements compared to other tissues. On the other side muscle had the lowest values for the majority of elements. At Pestan the liver displayed a pronounced seasonal variation in the accumulation of metals (Cr, Mn, Sr, Zn, and Hg), while at Beljanica it was gills (Ba, Cu, Mo, Sr, and Zn). Canonical discriminant analysis (CDA) based on the total contents of the elements in the tissues showed a high degree of separation of gills from other tissues at both rivers. Research field: Biology Specific research field: Ecogenotoxicology, Microbiology UDC No.: [579.68:574.64]+597.551.2:[57.088 : 577.113](043.3)