一氧化碳脱氢酶

分類

一氧化碳脫氫酶可以被分為兩大類：存在於需氧微生物中的Mo-Fe-黃素（flavin）酶類和存在於厭氧微生物中的Ni-Fe酶類。由於在這兩類金屬酶中，位於活性位點起關鍵作用的金屬分別是鉬（Mo）和鎳（Ni），因此分別稱這兩類酶為Mo-CODH和Ni-CODH。Mo-CODH對CO有很高的親和力， 適合於除去環境中痕量的一氧化碳氣體；而就催化活性而言，Ni-CODH則是Mo-CODH的近1000倍。

Mo-CODH

Mo-CODH存在於一類被稱為一氧化碳自養菌（carboxydotrophs）的化能自養微生物中。此類細菌中的CODH是一類含Mo的鐵硫黃素蛋白。與Ni-CODH相比，Mo-CODH對氧氣不敏感。 在嗜溫菌Oligotropha carboxidovorans和嗜熱菌Oligotropha thermocarboxydovorans中，Mo-CODH具有相似的分子量（230 kDa – 310 kDa）和相同的亞基組成。
在一氧化碳自養菌中，除少量定位於細胞質外，大多數的Mo-CODH連接在細胞質膜的內表面上， 從而有利於其與同樣連在內膜上的其生理條件下的電子受體——細胞色素b561之間進行電子傳遞。 在Mo-CODH中，Mo結合在molybdopterin胞嘧啶二核苷酸（MCD）輔因子上。序列分析顯示Mo-CODH屬於含Mo的羥化酶（hydroxylase）家族。 以下以研究較多的O. carboxidovorans中的Mo-CODH為例進行詳述。

亞基組成

Mo-CODH由L（88.7 kDa，809個胺基酸）、M（30.2 kDa，288個胺基酸）、S（17.8 kDa，166個胺基酸）三個亞基組成。這三個亞基結合在一起形成「LMS複合物」，且LMS複合物兩兩結合形成（LMS）₂，即Mo-CODH的天然活性形式為二聚體。 L亞基又被稱為molybdoprotein，含有Mo和與之結合的MCD分子，其中Mo離子與另一金屬離子Cu形成活性中心的[CuSMoO₂]簇；M亞基為黃素蛋白（flavoprotein），其結合有黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD）；S亞基屬於鐵硫蛋白，結合了兩個[2Fe-2S]簇。
含有兩個[2Fe-2S]簇的S亞基從結構上可以被分為N端和C端兩個結構域，這兩個結構域各結合了一個[2Fe-2S]簇。兩個鐵硫簇之間的距離約為12Å，在可以進行電子傳遞的最長距離（14 Å）之內。結合在C端結構域，靠近活性中心的鐵硫簇被稱為鐵硫簇I（[2Fe-2S] I），其被包埋在蛋白內部。結合在N端結構域遠離活性中心的鐵硫簇被稱為鐵硫簇II（[2Fe-2S] II）。鐵硫簇II位於S亞基和M亞基結合面上，暴露在溶劑環境中，距離FAD分子的異咯嗪環（isoalloxazine ring）大約9 Å，因此其功能被認為是在鐵硫簇I和FAD分子之間傳遞電子。 這兩個結構域的摺疊類型和結合鐵硫簇II的胺基酸序列普遍存在於其他含Mo的羥化酶家族成員中。
M亞基由N端、中間和C端三個結構域組成。其FAD分子的結合位點為兩段特徵性的「雙甘氨酸（double-glycine）」序列，在含Mo的羥化酶家族中非常保守。 其中一個雙甘氨酸序列位於N端結構域的一段loop上，與FAD分子上的焦磷酸根相互作用。另一個雙甘氨酸序列則位於中間結構域的一個小段α螺旋上與FAD分子相互作用。FAD分子結合在N端和中間結構域之間的縫隙中，且FAD的結合需要通過M亞基與L和S亞基作用所產生的構象變化來實現，游離的M亞基沒有FAD的結合活性。 M亞基作為鐵硫簇II與細胞色素b561之間電子傳遞的中間體，一方面接受來自鐵硫簇II的電子，另一方面向細胞色素b561提供電子。
分子量最大的L亞基不僅包含有活性位點，也在LMS複合物形成及Mo-CODH二體化中起主要作用。L亞基含有N端結構域和C端結構域，而Mo原子就定位在這兩個結構域的結合面上。MCD輔因子的一端連接Mo的部分與活性中心的[CuSMoO2]簇一起結合在N端結構域的凹槽中；而輔因子的另一端則插入C端結構域的裂縫中。L亞基的N端結構域與M和S亞基相互作用以形成LMS複合物；而C端結構域則主要參與形成Mo-CODH二體結構。

活性位點

Mo-CODH的活性位點位於L亞基，並被包埋於蛋白質內部，但從外部可以通過一個約17Å長的通道到達活性位點。這一通道由疏水殘基構成，從而允許CO分子進入而防止極性溶劑分子（如水分子）進入。最初的研究認為活性位點的Mo與三個氧原子形成配位，且存在硒代巰基（SeH）共價連接在胺基酸殘基Cys388上。 然而隨後的研究表明，Mo-CODH的活性位點是一個Cu-Mo金屬簇，其包含有一個Cu離子和一個[MoO₂]，Cu離子和Mo離子之間通過一個配位硫原子（μS，又稱為硫橋sulfido）來連接，結合在Cys388的Sγ原子上將此金屬簇[CuSMoO₂]與L亞基共價連接的是Cu而不是Se。 而MCD是通過其上的兩個S原子與Mo離子形成配位連接。這種由Mo和Cu兩種金屬組成的雙核金屬簇非常獨特，因為所有已知的含molybdopterin或MCD的Mo金屬蛋白中都是單核的。
無論Mo-CODH處在還原態還是氧化態，活性位點的Cu離子總是保持+I價，而連接Mo離子的MCD分子的構象也沒有發生明顯的變化。在空氣中，Mo-CODH處於氧化態，此時Mo離子為+VI價，位於Mo離子與MCD的兩個配位硫原子所形成平面垂直方向上的氧配基Oₐ與Mo離子之間形成雙鍵連接；而與Mo離子配位的另一個氧配基Ob則有可能與之形成單鍵或雙鍵。 與氧化態的結構相比，還原態中Cu-Mo距離和Mo-Ob距離都有所延長。結合CO時，活性位點很可能是處於非常短暫的中間態，難以捕捉，因此研究者利用異腈基團與活性位點結合的結構來模擬中間態。由研究結果推測CO應該連接在Cu離子上而不直接與Mo連接。
在Mo-CODH二聚體中，由於兩個活性位點的間距超過了可以直接進行電子傳遞的距離，而且沒有輔因子位於它們之間，兩者之間不可能進行電子傳遞；因此Mo-CODH二聚體中的兩個單體很可能可以獨立進行催化活動，即每個單體都是一個完整的催化單位。

催化機理

通過對不同狀態下活性位點的結構變化，可以推測整個催化過程：
處於氧化態的Mo（+VI價）離子與MCD上的兩個硫原子以及Oₐ和Ob形成扭曲的金字塔形的四配位結構；當CO結合上後，CO與硫橋、Ob以及Cu離子連接並處於同一平面上，Mo離子被還原為+IV價，Mo與Oₐ之間距離縮短，可能形成了三鍵連接；在H₂O分子的攻擊下，CO₂和H⁺被釋放出來，Mo與Oₐ之間回到雙鍵連接，而Ob變為OH基團與Mo離子之間形成單鍵連接，整個活性中心處於還原態；將兩個電子傳遞給鐵硫簇II後，活性中心又重新回到氧化態，從而完成一輪催化過程。

抑制作用

Mo-CODH很容易被氰化物所抑制，這種抑制主要是通過氰化物與[CuSMoO2]簇的硫橋和Cu離子反應生成游離的硫氰離子（SCN-）和氰化銅（CuCN）來使活性位點失活。

Ni-CODH

Ni-CODH廣泛存在於以一氧化碳為碳源和能源的厭氧微生物中，如乙酸生成細菌（acetogenic bacteria）、光養細菌（phototrophic bacteria）、氫氣生成細菌（hydrogenogenic bacteria）、硫酸還原細菌和古菌（sulfate-reducing bacteria and archaea）以及甲烷生成古菌（methangenic archaea）。
與Mo-CODH相比，Ni-CODH在活性位點處的關鍵金屬為Ni，負責電子傳遞的鐵硫簇為[4Fe-4S]而非[2Fe-2S]，且沒有發現有像Mo-CODH中的FAD和MCD輔因子，整體結構上也沒有相似性。除此之外，不同來源的Ni-CODH差別很大：既有單功能的一氧化碳脫氫酶只負責催化CO的氧化；又有雙功能酶，即同時具有一氧化碳脫氫酶和乙醯輔酶A合成酶（ACS）的活性，生理狀態下需要Ni-CODH與ACS結合共同發揮功能。因此，又常常以CODH/ACS複合物的名稱來代替Ni-CODH。與Mo-CODH相似的是，CODH/ACS也需要形成二聚體來發揮催化作用。

亞基組成

這四類酶的亞基組成也有較大差別。 第一/二類CODH/ACS都由五個不同的亞基（αβγδε）組成。第三類CODH/ACS則由α和β兩個亞基組成，其中α亞基與第一/二類中的β亞基同源，但α亞基多了N端30 kDa的一段序列；而其β亞基與第一/二類中的α亞基同源，但同源性較差，且相比之下，β亞基的分子量要小一些。雖然第三類的來源菌中也存在與第一/二類CODH/ACS對應的γ和δ亞基，但不存在ε亞基的同源蛋白，且γ和δ亞基不參與CODH/ACS的組成，而是形成異二聚體發揮甲基傳遞作用。第四類CODH/ACS中只含有與第三類中β亞基具有很高同源性的單個蛋白。

活性位點

由於除了第四類CODH/ACS外，其他類酶都是雙功能，甚至多功能酶，從而具有兩個或多個活性位點。其中，兩個核心反應，即CO的氧化和乙醯輔酶A的合成，對應的活性位點金屬簇分別為C簇 和A簇。其中，C簇位於α亞基（第三類CODH/ACS中為β亞基），其組成為[Ni-4Fe-4S]或[Ni-4Fe-5S]； 而A簇位於β亞基（第三類CODH/ACS中為α亞基）。A簇和C簇之間通過一個疏水通道相連，從而可以相互傳遞催化產物。 此外，α亞基（第三類CODH/ACS中為β亞基）二聚體中還含有5-7個鐵硫簇[4Fe-4S]，負責電子傳遞。

催化機理

負責CO的氧化的活性位點C簇的催化機制主要由兩步反應組成。 第一步，CO被氧化，而C簇被還原；第二步，電子從C簇傳遞到蛋白外的電子受體，如ferredoxin蛋白，C簇回到初始狀態。在這一過程，C簇中存在四種氧化還原態：Cₒₓ，Cred1，Cᵢₙₜ和Cred2。其中，處於氧化狀態（Ni²⁺-Fe1³⁺）的Cox在獲得一個電子之後轉化為Cred1。Cred1被證明是與CO和OH基團結合時C簇的狀態；而Cred2出現在Cred1之後，此時CO可能已被氧化為CO₂，並釋放出H⁺離子。這步反應可能是由OH基團攻擊連接在Ni上的CO引發，因為在C簇周圍有多個鹼性殘基（包括一個賴氨酸和多個組氨酸），使結合在Fe1上的水分子的pKa值顯著降低，從而使水分子轉變為活性的OH基團，對CO進行攻擊。此外，在C簇附近還有一個保守的天冬氨酸，可以與組氨酸形成氫鍵連接，促進此酸鹼反應的發生。反應生成的H⁺離子通過組氨酸形成的質子通道傳遞到外部溶劑中。CO被氧化為CO₂後，C簇接受兩個電子從Cred1轉變為Cred2，隨後兩個電子一個接一個地被傳遞到B簇。傳走第一個電子後，C簇轉化為中間態Cᵢₙₜ；兩個電子都傳到B簇後，C簇又重新轉化為Cred1，從而完成一次催化循環。