催化三联体

催化三聯體，又稱催化金三角，通常指在水解酶和轉移酶的活性位點中心同時作用的三個胺基酸殘基（如蛋白酶、醯胺酶、酯酶、醯基轉移酶、脂酶和β-內醯胺酶）。用於共價催化的親核殘基一般是酸-鹼-親核三聯體。殘基會形成一個電荷中繼網絡，以極化和活化親核試劑，來進攻底物形成共價中間體，然後中間體水解，再生出遊離的酶。親核試劑大多是絲氨酸或半胱氨酸，也有少量是蘇氨酸。
因為酶會摺疊成複雜的三維結構，催化三聯體的殘基可能在其所在的胺基酸序列（一級結構）中離得很遠，但最後它們將會摺疊到一起。
雖然在功能上（甚至是三聯體中的親核體）進化趨異，催化三聯體卻是趨同進化的最好案例。對催化的化學約束使得至少23個獨立的蛋白質超家族進化出了相同的催化方法。生物化學中，研究得最透徹之一的就是這些反應的作用機理。

歷史

早在20世紀30年代，就有人最早研究出了胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的結構。20世紀50年代，胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶所含三聯體中的絲氨酸被確認為親核體（通過二異丙基氟磷酸鹽的轉變）。20世紀60年代，對其他蛋白酶測序後發現了一系列的相關結構，現在稱之為S1家族。同時，在木瓜和枯草桿菌蛋白酶的結構中也發現了類似的三聯體，而它們在進化中毫不相干。20世紀60年代末，「電荷中繼」機制提出，解釋了親核體如何被其他三聯體成分所激活。70和80年代，隨著X射線晶體學測定了越來越多的蛋白質結構，發現了同源（如TEV蛋白酶）和非同源但類似（例如木瓜蛋白酶）的三聯體。20世紀90年代和2010年代，MEROPS分類系統開始將蛋白酶分類為結構相關的酶超家族，從而作為三聯體在20個超家族趨同進化的一個資料庫。使得這麼多酶家族歸於同一三聯體形狀的進化化學約束條件於2010年代開始研究。在催化三聯體的電荷中繼及共價催化機制上的大量工作使其成為生物化學中研究得最為透徹的部分之一。

親核體

側鏈上的親核殘基可共價催化底物。氧或硫上的孤對電子會進攻正電的羰基碳。20種天然生物胺基酸沒有足夠的親核性官能團以催化許多困難的反應。最常見的親核體是絲氨酸的醇（OH）和半胱氨酸的硫醇/硫醇鹽離子（SH/S⁻）。在三聯體中嵌入親核體提高了它的催化活性。一些蛋白酶採用的是蘇氨酸的仲醇，然而由於額外甲基的緣故，這些蛋白酶使用N端氨基附近的一個水分子作為鹼，而不是一個單獨的胺基酸。

鹼

由於所有的天然胺基酸都不具有強親核性，催化三聯體中的鹼極化並脫去親核體的質子，以提高其反應活性。此外，它還能質子化第一個生成物，以幫助離去基離開。其最常見為組氨酸，因為它的pKa值有助於高效的鹼催化，同時可與酸殘基以氫鍵結合，及對親核殘基去質子化。β-內醯胺酶如TEM-1使用賴氨酸殘基作為鹼。由於賴氨酸的pKa值如此之高（pKa=11），在循環催化的過程中，穀氨酸等幾個殘基要充當酸以穩定其去質子化的狀態。為了避免位阻效應，蘇氨酸蛋白酶以N端氨基附近的一個水分子作為鹼，以提高用於催化的蘇氨酸殘基的反應活性。

酸

酸性殘基能對齊並極化鹼性殘基。其通常為天冬氨酸或穀氨酸。有些酶只有一個二分體，例如在半胱氨酸蛋白酶中三聯體的酸就不是非常必要。如木瓜蛋白酶中的第三個三聯體成分為天冬醯胺，它能引導組氨酸轉變為鹼，但卻不作為酸出現。類似地，A型肝炎病毒蛋白酶的序列中含有一個水分子，而那個位置本該是一個胺基酸殘基。另外，巨細胞病毒蛋白酶使用一對組氨酸，一個作為鹼，另一個則如在其它的酶中那樣作為酸。作為酸而言，第二個組氨酸較常見的天冬氨酸或穀氨酸效率要低，因而其催化效率也不是很高。

半胱氨酸-組氨酸-天冬氨酸

半胱氨酸蛋白酶的幾個家族使用這個三聯體組，例如菸草花葉病毒蛋白酶（PA超家族，C4家族）和木瓜蛋白酶（CA超家族，C1家族）。其作用類似於絲氨酸蛋白酶中的三聯體，它們之間的差異將在下文「絲氨酸和半胱氨酸水解酶機制的比較」一節中闡述。目前尚不清楚天冬氨酸對木瓜蛋白酶中三聯體的催化作用和幾種半胱氨酸蛋白酶（如A型肝炎病毒蛋白酶）中二分體的高效性有何重要作用。

絲氨酸-組氨酸-組氨酸

巨細胞病毒蛋白酶（SH超家族，S21家族）同時使用組氨酸作為三聯體中的酸和鹼。除去酸性組氨酸僅使活性降低了10倍（與之相比，從胰凝乳蛋白酶中除去天冬氨酸活性會降低>10,000倍）。有人認為這個三聯體可能是用來降低酶的活性，以控制卵裂速率。

絲氨酸-穀氨酸-天冬氨酸

在Sedolisin蛋白酶(SB超家族, S53家族)中，人們發現了這種不尋常的三聯體。由於穀氨酸羧基pka值較低，只有在較強的酸性環境下它才能充當三聯體中的鹼性基團。有人認為這種酶的存在可能是為了滿足生物在特定酸性環境下（例如酸性溫泉中、溶酶體內）的催化需求。

蘇氨酸-水-N端氨基

蘇氨酸蛋白酶，例如蛋白酶體中的蛋白酶亞基（PB超家族，T1家族）和鳥氨酸乙醯基轉移酶（PE超家族，T5家族），使用這個三聯體組。在該三聯體組中，蘇氨酸的二級醇羥基作為親核基團，以代替絲氨酸中的一級醇羥基。 由於蘇氨酸末端甲基的空間位阻效應，如果形成普通的三聯體則反應時底物就會與末端甲基發生排斥作用，致使定向變為不可能。所以這種酶起催化作用的蘇氨酸位於其N端，N端氨基起到三聯體酸性基團的作用。在催化過程中，氨基氮原子與酶分子內部的一個有序排列的水分子形成氫鍵並使之極化，從而令水分子奪取蘇氨酸羥基上的質子，使得後者的反應活性（親核性）大大加強，最終與底物發生反應。

絲氨酸-水-N端氨基和半胱氨酸-水-N端氨基

亦存在以絲氨酸-水-N端氨基或半胱氨酸-水-N端氨基為三聯體的酶，例如青黴素G醯胺水解酶（PB超家族，S45家族）和青黴素V醯胺水解酶（PB超家族，S59家族）。就進化的角度而言，這些酶與蘇氨酸蛋白酶存在關聯，其作用機制亦與後者類似。

絲氨酸-(cis)-絲氨酸-賴氨酸

這種不尋常的三聯體僅出現在醯胺水解酶的一個超家族中。含這種三聯體的酶在催化反應中，賴氨酸氨基先極化處於中間位置的絲氨酸，使其羥基分別與另一（作為親核試劑的）絲氨酸的羥基和骨架上的醯胺基形成兩根強氫鍵，從而提高了（親核）絲氨酸的反應活性。該三聯體中部的絲氨酸採取反常的順式取向，以保證其與另外兩個胺基酸殘基可以精確接觸。更加不同尋常的是，在該三聯體中，中間位置的絲氨酸與賴氨酸均起到其他三聯體中鹼性基團的作用，即加強（親核）絲氨酸的反應活性。與此同時賴氨酸又起到酸性基團的作用。

絲氨酸和半胱氨酸水解酶機制的比較

這一部分所有的論述及列出的所有參考文獻均是針對蛋白酶的研究，不過這些酶的作用機制可以推廣到所有絲氨酸和半胱氨酸水解酶。
作親核催化的酶依靠一系列空間位置接近的活性殘基來獲得催化活性。這個活性中心系統是如此的精密和完美，以致活性中心及其相鄰胺基酸序列在同一家族的各酶中具有最高的相似性，亦即在進化中幾乎保持不變，這種性質稱為保守性。在催化三聯體中，最常見的親核基團是絲氨酸的醇羥基和半胱氨酸的硫醇巰基。與氧原子相比，硫原子電子層數多了一層。這使得硫原子的原子半徑更大（大約大了0.4 Å），且更易變形。就軟硬酸鹼理論的角度而言，硫負離子比氧負離子是更「軟」的鹼。雖然硫的電負性比氧小，但硫原子還擁有空的3d軌道可充填電子。因而硫負離子是比氧負離子更弱的鹼。（例如HS⁻的Kb值比OH⁻大七個數量級） 
催化反應的第一步是親核基團對底物羰基進攻，形成四面體中間體（Ⅰ）的過程。半胱氨酸巰基之pKa值是如此之低，以至於部分半胱氨酸蛋白酶（例如木瓜蛋白酶）在基態下催化三聯體中半胱氨酸巰基氫是電離的（見(a)）。一些甚至不需要酸性基團參與即能有效催化反應（見(b)）。催化過程中，已電離的烷硫負離子可以直接進攻底物羰基。然而，在絲氨酸蛋白酶中，絲氨酸羥基pKa值較大，不容易電離。因此，絲氨酸蛋白酶在催化反應時，酸性基團-鹼性基團從絲氨酸羥基上奪氫和產生的烷氧負離子對底物羰基的親核進攻，這兩個過程是協同進行的（見(c)）。顯然這種情形下，三聯體中酸性基團和鹼性集團採取有利的取向並形成氫鍵（見(d)），會加強鹼性基團之鹼性，促進羥基氫的脫去，進而加快酶的催化速率。
第二步是四面體中間體（Ⅰ）分解產生一個產物和中間產物酯或硫酯的過程。這是一個親核消除反應，故離去基團的離去性越好，消除越易進行。對兩種蛋白酶而言，這步反應的離去基團是胺負離子（當然其他酶可依此類推），而後者鹼性極強，不是好的離去基。因而四面體中間體在分解前（或分解同時），需要對其離去部分進行質子化，從而使離去基團變成一個中性的胺，以確保反應能夠順利進行。事實上，酶的空間結構保證了中間體（或胺負離子）和三聯體中的鹼性基團（在第一步反應後一定處於質子化狀態）具有正確的取向，能夠發生質子交換。值得注意的是，該中間體不僅能夠分解產生中間產物，還能夠分解產生反應物，即第一步反應是可逆的。其逆反應機理與第二步反應類似（本質上說，這兩個反應為平行反應），故上述討論同樣適用。考慮到巰基負離子是很好的離去基團，對半胱氨酸蛋白酶這步逆反應速率也較大，即該酶形成的中間體（Ⅰ）轉化為中間產物的轉化率較低，這也是該酶的一個不足之處。因而上述的正確取向對半胱氨酸蛋白酶顯得尤為重要，只有兩者精確配合，才能抗衡逆反應帶來的不利因素。（見(e)）
接著另一反應物（對蛋白酶而言為水，其餘酶依此類推）參與反應，產生四面體中間體（Ⅱ）。此反應與第一步反應類似，不同的是，這裡水代替了絲氨酸或半胱氨酸作為親核試劑。當然這一步也是可逆的。最後中間體（Ⅱ）分解，得到另一個產物，酶復原。對半胱氨酸蛋白酶，可以直接產生巰基負離子。對絲氨酸蛋白酶，仍需使中間體（Ⅱ）在分解時奪走鹼性基團上的一個質子。（見(f)）
與氧相比，硫的原子半徑較大，所成共價鍵較長，需要匹配更大的活性位點。故某個絲氨酸蛋白酶催化三聯體中的絲氨酸變異成了半胱氨酸，或是半胱氨酸蛋白酶催化三聯體中的半胱氨酸變異成了絲氨酸，均會失去活性。因為它們結合底物後，各基團的取向不對。例如，對硫代胰蛋白酶的晶體結構研究證實，其中的半胱氨酸不僅沒有與底物接近，反而與氧陰離子穴發生了相互作用。
酶的進化專一化使得蛋白酶催化三聯體中的親核基團具有不可代替性（當然在絕大多數其他酶中也是如此），否則會導致其反應性降低，結構與底物不匹配，進而使其催化活性急劇下降（超過四個數量級）。

趨同演化

對蛋白酶的酶學研究為趨同演化理論提供了最清晰的證據。在不同的超家族中，具相同排列和結構的三聯體曾經歷了超過20次的獨立演化。這是因為雖然酶作為一種蛋白質，其胺基酸排列方式有無數種，但是其中只有按照少數幾種方式排列才能形成具有催化作用的酶——化學性質使然。這導致了具有相同結構的酶被各種生物重複地、獨立地演化出來。