一氧化碳脱氢酶

分类

一氧化碳脱氢酶可以被分为两大类：存在于需氧微生物中的Mo-Fe-黄素（flavin）酶类和存在于厌氧微生物中的Ni-Fe酶类。由于在这两类金属酶中，位于活性位点起关键作用的金属分别是钼（Mo）和镍（Ni），因此分别称这两类酶为Mo-CODH和Ni-CODH。Mo-CODH对CO有很高的亲和力， 适合于除去环境中痕量的一氧化碳气体；而就催化活性而言，Ni-CODH则是Mo-CODH的近1000倍。

Mo-CODH

Mo-CODH存在于一类被称为一氧化碳自养菌（carboxydotrophs）的化能自养微生物中。此类细菌中的CODH是一类含Mo的铁硫黄素蛋白。与Ni-CODH相比，Mo-CODH对氧气不敏感。 在嗜温菌Oligotropha carboxidovorans和嗜热菌Oligotropha thermocarboxydovorans中，Mo-CODH具有相似的分子量（230 kDa – 310 kDa）和相同的亚基组成。
在一氧化碳自养菌中，除少量定位于细胞质外，大多数的Mo-CODH连接在细胞质膜的内表面上， 从而有利于其与同样连在内膜上的其生理条件下的电子受体——细胞色素b561之间进行电子传递。 在Mo-CODH中，Mo结合在molybdopterin胞嘧啶二核苷酸（MCD）辅因子上。序列分析显示Mo-CODH属于含Mo的羟化酶（hydroxylase）家族。 以下以研究较多的O. carboxidovorans中的Mo-CODH为例进行详述。

亚基组成

Mo-CODH由L（88.7 kDa，809个氨基酸）、M（30.2 kDa，288个氨基酸）、S（17.8 kDa，166个氨基酸）三个亚基组成。这三个亚基结合在一起形成“LMS复合物”，且LMS复合物两两结合形成（LMS）₂，即Mo-CODH的天然活性形式为二聚体。 L亚基又被称为molybdoprotein，含有Mo和与之结合的MCD分子，其中Mo离子与另一金属离子Cu形成活性中心的[CuSMoO₂]簇；M亚基为黄素蛋白（flavoprotein），其结合有黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）；S亚基属于铁硫蛋白，结合了两个[2Fe-2S]簇。
含有两个[2Fe-2S]簇的S亚基从结构上可以被分为N端和C端两个结构域，这两个结构域各结合了一个[2Fe-2S]簇。两个铁硫簇之间的距离约为12Å，在可以进行电子传递的最长距离（14 Å）之内。结合在C端结构域，靠近活性中心的铁硫簇被称为铁硫簇I（[2Fe-2S] I），其被包埋在蛋白内部。结合在N端结构域远离活性中心的铁硫簇被称为铁硫簇II（[2Fe-2S] II）。铁硫簇II位于S亚基和M亚基结合面上，暴露在溶剂环境中，距离FAD分子的异咯嗪环（isoalloxazine ring）大约9 Å，因此其功能被认为是在铁硫簇I和FAD分子之间传递电子。 这两个结构域的折叠类型和结合铁硫簇II的氨基酸序列普遍存在于其他含Mo的羟化酶家族成员中。
M亚基由N端、中间和C端三个结构域组成。其FAD分子的结合位点为两段特征性的“双甘氨酸（double-glycine）”序列，在含Mo的羟化酶家族中非常保守。 其中一个双甘氨酸序列位于N端结构域的一段loop上，与FAD分子上的焦磷酸根相互作用。另一个双甘氨酸序列则位于中间结构域的一个小段α螺旋上与FAD分子相互作用。FAD分子结合在N端和中间结构域之间的缝隙中，且FAD的结合需要通过M亚基与L和S亚基作用所产生的构象变化来实现，游离的M亚基没有FAD的结合活性。 M亚基作为铁硫簇II与细胞色素b561之间电子传递的中间体，一方面接受来自铁硫簇II的电子，另一方面向细胞色素b561提供电子。
分子量最大的L亚基不仅包含有活性位点，也在LMS复合物形成及Mo-CODH二体化中起主要作用。L亚基含有N端结构域和C端结构域，而Mo原子就定位在这两个结构域的结合面上。MCD辅因子的一端连接Mo的部分与活性中心的[CuSMoO2]簇一起结合在N端结构域的凹槽中；而辅因子的另一端则插入C端结构域的裂缝中。L亚基的N端结构域与M和S亚基相互作用以形成LMS复合物；而C端结构域则主要参与形成Mo-CODH二体结构。

活性位点

Mo-CODH的活性位点位于L亚基，并被包埋于蛋白质内部，但从外部可以通过一个约17Å长的通道到达活性位点。这一通道由疏水残基构成，从而允许CO分子进入而防止极性溶剂分子（如水分子）进入。最初的研究认为活性位点的Mo与三个氧原子形成配位，且存在硒代巯基（SeH）共价连接在氨基酸残基Cys388上。 然而随后的研究表明，Mo-CODH的活性位点是一个Cu-Mo金属簇，其包含有一个Cu离子和一个[MoO₂]，Cu离子和Mo离子之间通过一个配位硫原子（μS，又称为硫桥sulfido）来连接，结合在Cys388的Sγ原子上将此金属簇[CuSMoO₂]与L亚基共价连接的是Cu而不是Se。 而MCD是通过其上的两个S原子与Mo离子形成配位连接。这种由Mo和Cu两种金属组成的双核金属簇非常独特，因为所有已知的含molybdopterin或MCD的Mo金属蛋白中都是单核的。
无论Mo-CODH处在还原态还是氧化态，活性位点的Cu离子总是保持+I价，而连接Mo离子的MCD分子的构象也没有发生明显的变化。在空气中，Mo-CODH处于氧化态，此时Mo离子为+VI价，位于Mo离子与MCD的两个配位硫原子所形成平面垂直方向上的氧配基Oₐ与Mo离子之间形成双键连接；而与Mo离子配位的另一个氧配基Ob则有可能与之形成单键或双键。 与氧化态的结构相比，还原态中Cu-Mo距离和Mo-Ob距离都有所延长。结合CO时，活性位点很可能是处于非常短暂的中间态，难以捕捉，因此研究者利用异腈基团与活性位点结合的结构来模拟中间态。由研究结果推测CO应该连接在Cu离子上而不直接与Mo连接。
在Mo-CODH二聚体中，由于两个活性位点的间距超过了可以直接进行电子传递的距离，而且没有辅因子位于它们之间，两者之间不可能进行电子传递；因此Mo-CODH二聚体中的两个单体很可能可以独立进行催化活动，即每个单体都是一个完整的催化单位。

催化机理

通过对不同状态下活性位点的结构变化，可以推测整个催化过程：
处于氧化态的Mo（+VI价）离子与MCD上的两个硫原子以及Oₐ和Ob形成扭曲的金字塔形的四配位结构；当CO结合上后，CO与硫桥、Ob以及Cu离子连接并处于同一平面上，Mo离子被还原为+IV价，Mo与Oₐ之间距离缩短，可能形成了三键连接；在H₂O分子的攻击下，CO₂和H⁺被释放出来，Mo与Oₐ之间回到双键连接，而Ob变为OH基团与Mo离子之间形成单键连接，整个活性中心处于还原态；将两个电子传递给铁硫簇II后，活性中心又重新回到氧化态，从而完成一轮催化过程。

抑制作用

Mo-CODH很容易被氰化物所抑制，这种抑制主要是通过氰化物与[CuSMoO2]簇的硫桥和Cu离子反应生成游离的硫氰离子（SCN-）和氰化铜（CuCN）来使活性位点失活。

Ni-CODH

Ni-CODH广泛存在于以一氧化碳为碳源和能源的厌氧微生物中，如乙酸生成细菌（acetogenic bacteria）、光养细菌（phototrophic bacteria）、氢气生成细菌（hydrogenogenic bacteria）、硫酸还原细菌和古菌（sulfate-reducing bacteria and archaea）以及甲烷生成古菌（methangenic archaea）。
与Mo-CODH相比，Ni-CODH在活性位点处的关键金属为Ni，负责电子传递的铁硫簇为[4Fe-4S]而非[2Fe-2S]，且没有发现有像Mo-CODH中的FAD和MCD辅因子，整体结构上也没有相似性。除此之外，不同来源的Ni-CODH差别很大：既有单功能的一氧化碳脱氢酶只负责催化CO的氧化；又有双功能酶，即同时具有一氧化碳脱氢酶和乙酰辅酶A合成酶（ACS）的活性，生理状态下需要Ni-CODH与ACS结合共同发挥功能。因此，又常常以CODH/ACS复合物的名称来代替Ni-CODH。与Mo-CODH相似的是，CODH/ACS也需要形成二聚体来发挥催化作用。

亚基组成

这四类酶的亚基组成也有较大差别。 第一/二类CODH/ACS都由五个不同的亚基（αβγδε）组成。第三类CODH/ACS则由α和β两个亚基组成，其中α亚基与第一/二类中的β亚基同源，但α亚基多了N端30 kDa的一段序列；而其β亚基与第一/二类中的α亚基同源，但同源性较差，且相比之下，β亚基的分子量要小一些。虽然第三类的来源菌中也存在与第一/二类CODH/ACS对应的γ和δ亚基，但不存在ε亚基的同源蛋白，且γ和δ亚基不参与CODH/ACS的组成，而是形成异二聚体发挥甲基传递作用。第四类CODH/ACS中只含有与第三类中β亚基具有很高同源性的单个蛋白。

活性位点

由于除了第四类CODH/ACS外，其他类酶都是双功能，甚至多功能酶，从而具有两个或多个活性位点。其中，两个核心反应，即CO的氧化和乙酰辅酶A的合成，对应的活性位点金属簇分别为C簇 和A簇。其中，C簇位于α亚基（第三类CODH/ACS中为β亚基），其组成为[Ni-4Fe-4S]或[Ni-4Fe-5S]； 而A簇位于β亚基（第三类CODH/ACS中为α亚基）。A簇和C簇之间通过一个疏水通道相连，从而可以相互传递催化产物。 此外，α亚基（第三类CODH/ACS中为β亚基）二聚体中还含有5-7个铁硫簇[4Fe-4S]，负责电子传递。

催化机理

负责CO的氧化的活性位点C簇的催化机制主要由两步反应组成。 第一步，CO被氧化，而C簇被还原；第二步，电子从C簇传递到蛋白外的电子受体，如ferredoxin蛋白，C簇回到初始状态。在这一过程，C簇中存在四种氧化还原态：Cₒₓ，Cred1，Cᵢₙₜ和Cred2。其中，处于氧化状态（Ni²⁺-Fe1³⁺）的Cox在获得一个电子之后转化为Cred1。Cred1被证明是与CO和OH基团结合时C簇的状态；而Cred2出现在Cred1之后，此时CO可能已被氧化为CO₂，并释放出H⁺离子。这步反应可能是由OH基团攻击连接在Ni上的CO引发，因为在C簇周围有多个碱性残基（包括一个赖氨酸和多个组氨酸），使结合在Fe1上的水分子的pKa值显著降低，从而使水分子转变为活性的OH基团，对CO进行攻击。此外，在C簇附近还有一个保守的天冬氨酸，可以与组氨酸形成氢键连接，促进此酸碱反应的发生。反应生成的H⁺离子通过组氨酸形成的质子通道传递到外部溶剂中。CO被氧化为CO₂后，C簇接受两个电子从Cred1转变为Cred2，随后两个电子一个接一个地被传递到B簇。传走第一个电子后，C簇转化为中间态Cᵢₙₜ；两个电子都传到B簇后，C簇又重新转化为Cred1，从而完成一次催化循环。