Kính hiển vi đồng tiêu

Khái niệm

Kính hiển vi đồng tiêu sử dụng kỹ thuật kính hiển vi quang học/huỳnh quang có khả năng tăng độ phân giải của hệ quan sát nhờ sử dụng lỗ hội tụ (pinhole) và chùm sáng quét được hội tụ vào một điểm nhỏ trên mặt phẳng tiêu (point illumination). Ánh sáng phản xạ sẽ tạo lại hình ảnh của vật, được ghi lại bởi các CCD camera trong đa số kính hiển vi đồng tiêu hiện nay với độ phân giải tới khoảng 100 nm ở độ phóng đại 1500 lần hoặc thấp hơn nữa, vượt xa các kính quang học truyền thống vốn bị giới hạn bởi hiện tượng nhiễu xạ (200 nm). Gần đây, kính hiển vi đồng tiêu đang được phát triển rộng rãi trong các ngành khoa học vật liệu, nghiên cứu y sinh, khoa học tế bào, bán dẫn...Confocal Microscopes: ANDOR,Leica Microsystems

Hoạt động

Kính hiển vi đồng tiêu về bản chất là một dạng tân tiến hơn của kính hiển vi huỳnh quang (fluorescence microscope). Điểm khác biệt là kính hiển vi đồng tiêu có độ phân giải lớn hơn nhờ sử dụng các lỗ hội tụ để loại đi các ánh sáng không hội tụ hoàn toàn (out-of- focus) và chùm tia được quét trên mẫu vật (do kích thước mũi chùm tia được hội tụ rất nhỏ). Mẫu vật thường được nhuộm bởi các chất huỳnh quang (fluorophores) như cyanine, DAPI hay các protein tổng hợpwww.fluorophores.tugraz.at/.
Chùm sáng sơ cấp được phát ra từ các đèn halogen, đèn thủy ngân hoặc điốt quang năng lượng cao (high-power LED) với các kính hiển vi đồng tiêu truyền thống (confocal microscopy) hay từ các đèn laser trong các kính đồng tiêu quét laser (laser scanning confocal microscopy). Đôi lúc là ánh sáng trắng được cho đi qua các tấm lọc màu (filter) để lựa chọn ánh sáng đơn sắc có màu sắc cần thiết, thường từ 680 nm (đỏ và hồng ngoại), 550 nm (xanh lá cây), 480 nm (xanh dương) cho tới 280 - 400 nm (dải cực tím). Việc lựa chọn bước sóng cho phép tạo ra sự huỳnh quang ở các loại fluorophores khác nhau www.physics.emory.edu/~weeks/confocal/. Ánh sáng sơ cấp được cho đi qua một lỗ hội tụ sơ cấp để loại bỏ các tia bị cầu sai (spherical aberration) hoặc kém hội tụ (out-of-focus).Sau đó, ánh sáng đi qua một gương lọc/bán mạ (dichroic mirror) và được hội tụ tại một điểm rất nhỏ trên mặt phẳng tiêu của mẫu vật, với độ sâu trường ảnh (depth-of-field) vào khoảng vài trăm nanomet (do vậy tạo ra được ảnh ba chiều của mẫu vật)www.microscopyu.com. Ánh sáng phản xạ hoặc ánh sáng huỳnh quang (ánh sáng thứ cấp) sẽ được phản chiếu tại gương lọc (do có bước sóng dài hơn bước sóng cho phép của gương), đi qua thêm một pinhole loại ánh sáng out-of-focus thứ hai trước khi đi vào bộ phận ghi ảnh. Các kính hiển vi đồng tiêu có thị kính quan sát như kính quang học truyền thống, nhưng có thể được trang bị các CCD camera hoặc CMOS để ghi ảnh, đặc biệt cần thiết vì mắt người mẫn cảm và không quan sát được tia laser hay tia cực tím .
Hình ảnh cuối của vật là ảnh ba chiều (khác với kính quang học truyền qua truyền thống là ảnh hai chiều). Ở các phiên bản đặc biệt, các kính hiển vi đồng tiêu được gắn thêm các máy đo thời gian cực nhanh để ghi ảnh bốn chiều của vật (cỡ nano giây tới mili giây) cho các ứng dụng đo thời gian của các hoạt động tế bào (time-lapse microscopy).

Lịch sử

Vào năm 1957, Marvin Minsky đã nhận bằng sáng chế cho lý thuyết về kính hiển vi đồng tiêu. 21 năm sau đó, tức vào năm 1978, Thomas và Christoph Creme đã thiết kế một kính hiển vi đồng tiêu quét laser để ghi ảnh ba chiều của mẫu vật. Trong thập kỷ kế tiếp, kính hiển vi huỳnh quang quét laser được hoàn thiện bởi Trường Đại học Amsterdam và Phòng Thí Nghiệm Sinh học Phân Tử châu Âu (European Molecular Biology Laboratory - EMBL) và được thương mại hóa vào những năm sau đó với các bộ phận cải tiến, biến thể và dần trở nên nhỏ gọn hơn, độ phân giải tốt hơn.

Ứng dụng, Ưu điểm và nhược điểm

Kính hiển vi đồng tiêu là một dụng cụ quang học cho phép vượt xa khả năng quan sát của các kính hiển vi truyền thống, do đó được áp dụng để quan sát các chi tiết vốn quá nhỏ để quan sát bởi các kính hiển vi quang học thông thường (dưới 200 nm). Các ứng dụng hiện nay bao gồm các ngành y sinh học (nghiên cứu tế bào), bán dẫn (quan sát vật liệu ở dạng ảnh ba chiều)...
Kính hiển vi đồng tiêu có độ phân giải cao mà kết cấu và điều khiển không quá phức tạp, giá thành rẻ hơn các kính hiển vi điện tử nhưng độ phân giải tốt hơn nhiều so với kính hiển vi quang học thông thường, có thể xuống tới dưới 10 nm ở các biến thể hoặc ở độ phóng đại trung bình (1500 lần, càng phóng đại, độ phân giải càng giảm), đồng thời có độ sáng rất cao và phân biệt tốt các chi tiết nhờ sử dụng các chất nhuộm màu. Khả năng ghi ảnh ba chiều và đo thời gian của kính hiển vi đồng tiêu cũng là một lợi điểm, cho phép nghiên cứu "chiều cao" của các chi tiết trong mạch bán dẫn hay thời gian hoạt động của các tế bào sống (các hoạt động nội bào, phân chia hoặc phát triển), đồng thời không yêu cầu phải phá hủy mẫu vật. Một ưu điểm nữa của kính hiển vi đồng tiêu là tốc độ quét nhanh (cỡ mili giây) nếu so với các kỹ thuật quét khác như kính hiển vi điện tử truyền qua quét (cỡ giây), kính hiển vi điện tử quét (cỡ vài chục giây tới vài chục phút) và kính hiển vi quét đầu dò (cỡ vài chục phút)Nikon MicroscopyU | Confocal Microscopy.
Nhược điểm của kính hiển vi đồng tiêu là giá thành, mặc dù rẻ hơn so với các loại biến thể hay kính hiển vi điện tử hay kính hiển vi quét đầu dò, nhưng vẫn ở mức khá đắt (trên 5,000 đôla Mỹ tùy vào loại biến thể và các thiết bị phụ trợ) tức khoảng 105 triệu VND so với kính hiển vi quang học thông dụng từ 16 đến dưới 80 triệu VND. Một điểm kém khác là yêu cầu các chất nhuộm màu cho quá trình quan sát các phần tử không phát xạ huỳnh quang nguyên sinh như nhân tế bào, DNA, RNA, vi khuẩn, virut... Điều này làm ảnh hưởng tương đối lớn đến giá thành của thiết bị và hoạt động, đồng thời trong một số trường hợp không thích hợp cho các mẫu vật sống (mặc dù đa số trường hợp đều có thể áp dụng với tế bào sống)Nikon MicroscopyU | Confocal Microscopy Vả lại, khả năng phân giải của kính hiển vi đồng tiêu, dù được liệt vào loại tốt, vẫn còn thua xa các thiết bị quan sát hiện đại hơn như kính hiển vi điện tử hay kính hiển vi quét đầu dò (có khả năng phân giải tới cấp đơn phân tử, nguyên tử)www.microscopyu.com. Một số biến thể của kính hiển vi đồng tiêu có khả năng phân giải được các protein và virus (10 - 100 nm).