Can thiệp ARN

Dòng thông tin di truyền

Theo "Học thuyết trung tâm" (DNA  RNA  Protein) thì thông tin di truyền được lưu trữ ở DNA, và để tạo ra protein thì thông tin di truyền được phiên mã thành RNA và được dịch mã thành protein. Bộ gene (gene là một đoạn DNA quy định một tính trạng) của chúng ta có khoảng 30.000 gene. Tuy nhiên không phải mọi thông tin di truyền trên DNA đều dịch mã thành protein, các gene không được dịch mã gọi là non-coding gene. Các non-coding gene này tuy không đựoc dịch mã nhưng lại tham gia vào rất nhiều quá trình trong cơ thể sinh vật như: tạo small RNA (microRNA, RNAi, hcsiRNA, piwiRNA, trans-acting RNA), được sử dụng để định danh, phân loại, tham gia vào cơ chế chống các loại bệnh, chống chịu với tác nhân môi trường,....

Khái niệm về RNAi trong tế bào

"RNA can thiệp" (RNAi- RNA interference) là một loại small RNA có kích thước khoảng 19-25 nu, có khả năng tham gia can thiệp vào quá trình phiên mã và dịch mã, giúp kiểm soát các gene đang hoạt động. "RNA can thiệp" được tạo ra bên trong tế bào chất ở dạng dsDNA (double strand DNA) hình kẹp tóc và thoát ra ngoài, tiếp đó RNAi được các enzyme Dicer cắt thành dạng dsDNA hoạt tính (mature RNAi), sau đó nó được tách ra thành sợi đơn và kết hợp với AGO protein tạo thành đơn vị RISC(RNA-induced silencing complex) có khả năng ức chế quá trình phiên mã hoặc ngăn cản quá trình dịch mã. Trên động vật sẽ có các đơn vị Dicer và AGO protein khác với trên thực vật.
Dưới tác động các loại Dicer và AGO protein khác nhau sẽ tạo ra các loại RNA có tên gọi khác nhau như: microRNA, piwiRNA, RNAi, trans-acting RNA,... và chúng có chức năng khác nhau.

Khám phá cơ chế RNAi và giải thưởng Nobel y học 2006

Andrew Fire và Craig Mello đã tiến hành nghiên cứu về cơ chế điều khiển biểu hiện gene ở giun tròn Caenorhabditis elegans (C.elegans). Hai ông đã thực hiện hàng loạt các thí nghiệm ngoạn mục nhằm kiểm tra kiểu hình ảnh hưởng của việc tiêm RNA vào bộ phận sinh dục của C.elegans.

Những suy luận từ kết quả thí nghiệm

RNA chuỗi đôi có thể làm các gene ngừng hoạt động (bất hoạt gene). Cơ chế can thiệp RNA này mang tính đặc trưng đối với gene mang mã di truyền giống với mã di truyền của phân tử RNA được tiêm vào.
Ngoài ra, cơ chế can thiệp RNA có thể lan giữa các tế bào và thậm chí được di truyền sang đời sau. Chỉ cần tiêm một lượng nhỏ phân tử RNAi cũng có thể đạt được kết quả mong muốn. Do vậy, có thể coi cơ chế can thiệp RNAi là một quá trình xúc tác.

Ý nghĩa khoa học của công trình nghiên cứu

Công trình nghiên cứu này của hai nhà bác học Z.Fire và C.Mello đã được công bố trên tạp chí Nature vào ngày 19/2/1998. Kết quả của nghiên cứu này vô cùng quan trọng. Chúng cung cấp lời giải thích cho các hiện tượng nghiên cứu ở thực vật: sự bất hoạt gen sau phiên mã (PTGS- post transcriptional gene silening). Khám phá của họ đã làm sáng tỏ nhiều quan sát thí nghiệm mâu thuẫn và khó hiểu trong nhiều năm trước đây. Đồng thời nó tiết lộ một cơ chế tự nhiên để kiểm soát dòng thông tin di truyền trong tế bào, báo hiệu sự khởi đầu cho một lĩnh vực nghiên cứu mới.
RNAi được sử dụng trong khoa học cơ bản nghiên cứu chức năng của gene. Ngoài ra, cơ chế này có ý nghĩa rất quan trọng đối với việc điều khiển các biểu hiện gene, tham gia bảo vệ cơ thể chống nhiễm virus và kiểm soát gene thay đổi đột ngột. Với nghiên cứu mới này, giới khoa học cũng đang tìm ra các ứng dụng của RNAi trong những nghiên cứu y học chữa bệnh bằng liệu pháp gene, các ứng dụng trên cây trồng, vật nuôi trong nông nghiệp nhằm tạo ra các sản phẩm với chất lượng tốt hơn; trong điều trị các bệnh nhiễm khuẩn, các bệnh do virut, bệnh tim, ung thư, rối loạn nội tiết và nhiều chứng bệnh khác.
Từ kết quả của nghiên cứu này đã mở ra nhiều hướng nghiên cứu và được tạp chí Science bình chọn là "Break Through in 1998 "(Bước đột phá của năm 1998) dựa theo số lượng gia tăng cấp số nhân các bài báo khoa học đăng trên các tạp chí khoa học quốc tế hàng đầu.

Con đường hình thành siRNA

Quá trình hình thành siRNA diễn ra ở tế bào chất (cytoplasma). RNAi được kích hoạt bởi dsRNA có đầy đủ các cặp bazơ và có ít nhất 21 -23 cặp bazơ. Còn những phân tử dsRNA dài sẽ được là cắt thành những mảnh có độ dài khoảng 21-23 bp bởi một enzyme ngoài tế bào chất được gọi là "Dicer".
Những mảnh RNA được gọi tắt là siRNA (short interfering RNA - RNA ngắn can thiệp) và liên kết bởi protein của RNA- phức hệ gây nên sự im lặng (RISC). Những phức hệ RISC nhận ra và làm suy biến RNA sợi đơn tương ứng trong trình tự siRNA. dsRNA (double strand RNA) là đoạn RNA dài mạch kép mang trình tự bắt cặp bổ sung được với gene mục tiêu.
Khi dsRNA vào tế bào, nó bị Dicer (một loại enzyme cắt RNA mạch kép) cắt thành những đọan ngắn gọi là siRNA (small interfering RNA). Một mạch đơn của siRNA gắn với RISC (RNA - induced silencing complex) tạo phức hợp. Phức hợp này tương tác với mRNA của gene mục tiêu và cắt nhỏ mRNA này.
Trong 2 mạch đơn này, chỉ mạch nào có đầu 5’ có hoạt lực với Agronauttrong phức hệ RISC mới gắn được với phức hệ RISC => tạo phức hợp siRNA-RISC. Mạch còn lại đầu 5’ không có hoạt lực với Agronaut => không liên kết với RISC được. Sự xuất hiện của mạch đơn siRNA sẽ hoạt hoá RISC thành trạng thái hoạt động (RISC*).

Con đường hình thành miRNA

Quá trình hình thành miRNA diễn ra ở nhân tế bào (nuclear) và trong tế bào chất (cytoplasma)
Ở trong nhân, các phân tử miRNA được tạo ra thông qua quá trình phiên mã từ các gene gọi là các phân tử miRNA nguyên thuỷ (pri- miRNA), các phân tử này có chứa các cấu trúc kẹp tóc (hairpin). Các phân tử pri-miRNA được cắt bởi enzyme Drosha để tạo thành những sợi Pre-miRNA (phân tử tiền microRNA)=> gọi là quá trình chế biến pri- miRNA. Các phân tử Pre- miRNA sẽ được di chuyển ra ngoài tế bào chất.
Ngoài tế bào chất, Pre- miRNA sau khi được di chuyển ra ngoài tế bào chất sẽ được enzyme Dicer cắt thành những đoạn RNA nhỏ (khoảng 19 – 21 nu). Các đoạn miRNA được tách đôi, tạo ra các sợi miRNA đơn. Trong đó sợi có đầu 5’ có hoạt lực với Agronaut trong phức hợp RISC => sẽ kết hợp với phức hợp RISC tạo thành phức hệ miRNA-RISC.

Sự khác nhau giữa siRNA và miRNA

Về mặt nguồn gốc, RNA mạch kép (dsRNA) có cấu trúc là chuỗi xoắn kép. Tiền miRNA(Pre-miRNA) có cấu trúc dạng thân vòng (steen-loop) hay dạng kẹp tóc (hairpin).
Xét về vị trí hình thành, chúng xảy ra ở ngoài tế bào chất. Trong nhân và ngoài tế bào chất.

Tạo Hoa Hồng Xanh

Trong cây trồng có một loại phân tử được gọi là anthocyanin được coi là sắc tố chủ đạo trên hoa, trái và các mô tế bào khác. Thông thường các màu chính của hoa bắt nguồn từ anthocyanin với sự có mặt của một ít các chất carotenoid màu vàng. Ngoài ra anthocyanin dihydrokaempferol (DHK) lại là một enzyme chi phối cho cả ba chu trình hình thành sắc tố trên cây trồng bao gồm: cyanidin, pelargonidin và delphinidin.
Gene cyanidin mã hóa một enzyme làm thay đổi enzyme DHK nhằm hình thành chu trình cyanidin dẫn đến biểu hiện các màu đỏ, hồng hay màu tím hoa cà. Trong khi đó gene delphinidin không hiện diện trong cây hoa hồng sẽ mã hóa một enzyme khá tương đồng cho việc thay đổi enzyme DHK nhằm hình thành sự tổng hợp màu theo chu trình delphinidin. Một loại enzyme khác có tên gọi là dihydroflavinol reductase (DFR) sẽ hỗ trợ các màu chỉ chị trong cả ba chu trình trên. Enzyme này rất quan trọng vì không có nó sẽ không thể tạo màu trên các cánh hoa. Chính vì vậy mà các đột biến gene DFR đều cho ra những hoa có màu trắng. Trong hoa hồng không có gene delphinidin để hình thành màu theo chu trình của nó. Chu trình delphinidin có thể hình thành màu đỏ hoặc xanh trên hoa dưới sự tác động của DRF và pH.
Để tạo ra bông hồng xanh, các nhà khoa học của Suntory đã áp dụng một bộ 3 gene. Một gene nhân tạo được dùng cho kỹ thuật RNAi nhằm ức chế gene DFR của hoa hồng làm cho hoa hồng không biểu hiện màu. Sau đó chuyển gene delphinidin từ loài hoa păng-xê và gene DFR từ loài hoa iris sẽ tạo ra hoa hồng có hàm lượng delphinidin rất cao trong cánh hoa. Tuy nhiên cũng phải lưu ý một yếu tố ảnh hưởng đến màu xanh trên cánh hoa đó chính là độ pH tế bào và đó là một trong những lý do chính là tại sao các loài hoa có cùng chu trình anthocyanin nhưng lại có màu khác nhau. Khi nồng độ pH tế bào mang tính kiềm thì sắc tố của anthocyanin thường trở nên xanh hơn. pH của đất không ảnh hưởng hay ảnh hưởng rất ít đến pH tế bào cánh hoa. Nồng độ pH tế bào cánh hoa thường mang tính di truyền. Cánh hoa hồng thông thường có nồng độ pH khoảng 4.5 chính vì vậy để tạo ra các cánh hoa hồng có nồng độ pH thấp thì rất hạn chế. Vì vậy các nhà khoa học mới nghĩ đến kỹ thuật ức chế gene bằng kỹ thuật RNAi nhằm xác định những gen ảnh hưởng đến tính axít của cánh hoa hay điều chỉnh màu của cánh hoa theo những hướng khác.

Ứng dụng cơ chế can thiệp RNA trong nghiên cứu ung thư

Tế bào ung thư phát sinh từ sự tích lũy và chọn lọc nhiều đột biến có liên tiếp có lợi cho sự phân chia và tồn tại của chúng. Những biến đổi di truyền và đôi khi trên vật chất di truyền (epigenetic) giúp tế bào ung thư vượt qua sự khống chế của các nguyên tắc điều hòa tế bào và cơ thể như chương trình tự sát tế bào (apoptosis) hay các tín hiệu kìm hãm phân chia (antiproliferative signals). Sự khám phá ra cơ chế can thiệp RNA không lâu được nhận thức rằng đây chính là công cụ cần thiết để dò tìm các cơ chế phân tử bị thay đổi trong tế bào ung thư. Do tính đặc hiệu của quá trình can thiệp RNA kết hợp với tính dễ dàng nhân rộng tiến trình thực nghiệm từ hàng ngàn gene lên tới toàn bộ genome tronng một thí nghiệm, hệ thống các "điểm yếu" của ung thư sẽ được giải mã và hàng loạt thuốc đặc hiệu ung thư sẽ được điều chế.
Các nhà khoa học Austaylia đã tìm ra phương pháp mang tên "con ngựa thành Troy" có khả năng tiêu diệt trực tiếp tế bào ung thư mà không gây tác dụng phụ với cơ thể người.
Cụ thể, các nhà khoa học sử dụng một tế bào nano có tên EDV để thâm nhập và làm suy yếu tế bào ung thư bằng cách tiết ra phân tử axit Ribonucleic (siRNA). SiRNA làm ngưng trệ quá trình ADN sản xuất protein vốn giúp tế bào ung thư có thể kháng thuốc hóa trị. Sau đó, một đợt EDV thứ hai sẽ tiêu diệt tế bào ung thư bằng thuốc hóa trị.
Biện pháp "con ngựa thành Troy" có khả năng tiêu diệt trực tiếp tế bào ung thư mà không ảnh hưởng tới các mô khác trong cơ thể. Hiện nay, các bác sĩ điều trị ung thư thường sử dụng phương pháp tiêm hay uống thuốc theo liệu pháp hóa trị, khiến cả tế bào lành và ung thư đều bị tiêu diệt, ảnh hưởng đến sức khỏe bệnh nhân.

Ứng dụng cơ chế can thiệp RNAi trừ sâu bệnh

RNAi kiểm soát côn trùng thuộc Coleoptera. Côn trùng thuộc Coleoptera và Lepidoptera hiện được nghiên cứu về tính kháng của cây trồng nhờ protein BT sau khi thực hiện chuyển nạp gene. Một cách tiếp cận mới đối với việc kiểm soát này là sử dụng RNA can thiệp (RNAi) được các nhà khoa học của Monsanto ve Devgen N.V. thực hiện. Báo cáo khoa học được công bố trên tạp chí Nature Biotechnology.
RNAi-làm im lặng những gene cần thiết của côn trùng gây hại cây trồng, làm chúng dừng hấp thu dinh dưỡng và làm chất ấu trùng. Các nhà khoa học này đã ứng dụng RNAi để kiểm soát côn trùng gây hại rễ bắp (thuật ngữ tiếng Anh là: western corn rootworm = WCR) làm mô hình mẫu cho những nghiên cứu tiếp theo.
Phân tử RNA dây kép (dsRNA) với trình tự các cặp gốc, bổ sung cho các gen ATPase và tubulin (cytoskeletal component). Chúng thể hiện trong giống bắp biến đổi gen. Cây transgenic thể hiện sự suy giảm có ý nghĩa thiệt hại do chích hút (WCR). Tiếp cận phương pháp này, các nhà nghiên cứu còn quan sát được sự chết của ấu trùng khi phân tử dsRNA được chèn vào hai côn trùng "southern root worm" và "Colorado potato beetle". Phân tử dsRNA kiểm soát được sâu đục quả trong bông vải (boll weevil larvae), tuy nhiên, không gây ảnh hưởng đến sự chết.
Việc sử dụng RNAi để kiểm soát côn trùng gây hại cây trồng sẽ bổ sung đáng kể cho chiến lược giống chuyển gene Bt (protein diệt côn trùng) trên cây bắp, bông vải, đậu nành.

Triển vọng của việc nghiên cứu ứng dụng RNAi

Việc nghiên cứu ứng dụng cơ chế can thiệp RNA có nhiều triển vọng to lớn mà con người có thể không ngờ tới được. Một số hướng nghiên cứu chính như:
1. Can thiệp RNA chống lại sự nhiễm virus.
2. Can thiệp RNA bảo đảm ổn định hệ gen bằng cách chống lại các yếu tố di truyền vận động (transposon).
3. Can thiệp RNA như cơ chế kiềm chế tổng hợp protein và điều khiển sự phát triển của tổ chức.
4. Can thiệp RNA như cơ chế giữ gìn nhiễm sắc tử cô đặc và tăng cường phiên mã.
5. Can thiệp RNA cống hiến một công cụ thí nghiệm mới để kiềm chế gene chuyên biệt.
6. Can thiệp RNA phải là một giải quyết hữu ích trong điều trị bệnh di truyền trong tương lai