Protein

Sự xuất hiện trong tế bào

Các nhà sinh học ước tính một vi khuẩn kích thước trung bình chứa khoảng 2 triệu protein trong một tế bào của nó (ví dụ E. coli và Staphylococcus aureus). Vi khuẩn nhỏ hơn, như Mycoplasma hay spirochetes chứa ít phân tử hơn, vào cỡ 50.000 đến 1 triệu phân tử protein. Ngược lại, các tế bào nhân thực có kích thước lớn hơn và do vậy chứa nhiều protein hơn. Ví dụ, tế bào nấm men ước tính có khoảng 50 triệu protein và tế bào người có từ 1 đến 3 tỷ protein. Bộ gen của vi khuẩn mã hóa ít hơn 10 lần so với của người cho các protein (ví dụ vi khuẩn nhỏ ~1.000, E. coli: ~4.000, nấm men: ~6.000, loài người: ~20.000).
Mức độ tập trung của từng protein có từ một vài phân tử trong một tế bào đến hàng trăm nghìn, và khoảng một phần ba tổng số protein không được sản sinh ra trong tế bào hay chỉ sinh ra trong những điều kiện nhất định. Ví dụ, trong số 20.000 protein được mã hóa bởi bộ gen ở loài người chỉ có 6.000 được phát hiện trong nguyên bào lympho. Hơn nữa, số lượng protein mà bộ gen mã hóa có mối tương quan với cấu trúc phức tạp của cơ thể vật chủ. Sinh vật nhân thật, vi khuẩn, vi khuẩn cổ và vi rút tương ứng có trung bình 15145, 3200, 2358 và 42 protein được mã hóa trong bộ gen của chúng.

Hóa tổng hợp

Các protein ngắn có thể được tổng hợp hóa học bằng một số phương pháp gọi là tổng hợp peptide, mà dựa trên những kỹ thuật tổng hợp hữu cơ như kỹ thuật nối hóa học (chemical ligation) để tạo ra các peptide với chiều dài lớn. Tổng hợp hóa học cho phép đưa những axit amino nhân tạo vào trong chuỗi polypeptide, như gắn các phân tử thăm dò huỳnh quang vào mạch bên của chuỗi axit amino. Những phương pháp này hữu hiệu trong phòng thí nghiệm hóa sinh và sinh học tế bào, mặc dù nói chung không thương mại hóa được. Tổng hợp hóa học trở lên không hiệu quả đối với chuỗi polypeptide dài hơn khoảng 300 axit amino, và các protein được tổng hợp có thể không gập về dạng cấu trúc bậc bốn như mong đợi. Hầu hết các phương pháp tổng hợp hóa học bắt đầu từ đầu C đến đầu N, trái ngược so với các phản ứng sinh học.

Xác định cấu trúc

Khám phá ra cấu trúc bậc ba của protein, hay cấu trúc bậc bốn của phức hợp protein, mang lại những chứng cứ quan trọng về chức năng của protein. Các phương pháp thực nghiệm phổ biến xác định cấu bao gồm tinh thể học tia X và kỹ thuật phổ NMR, cả hai đều cho thông tin ở mức phân giải cấp nguyên tử. Tuy nhiên, kỹ thuật NMR có thể cung cấp thông tin ước lượng về khoảng cách giữa từng cặp nguyên tử, và hình dạng khả dĩ cuối cùng đối với protein được xác định thông qua giải bài toán hình học khoảng cách. Kỹ thuật giao thoa phân cực hai sóng dẫn (Dual polarisation interferometry) là một phương pháp giải tích định lượng cho phép đo hình dạng tổng thể của protein và những thay đổi hình dạng do tương tác giữa các nguyên tử hoặc bởi các tác động khác. Lưỡng hướng sắc phân cực tròn (circular dichroism) là một kỹ thuật trong phòng thí nghiệm giúp xác định các thành phần cấu trúc bậc hai dải β / xoắn α của protein. Kính hiển vi điện tử truyền qua quan sát mẫu lạnh (cryoelectron microscopy) được sử dụng để thu được thông tin về cấu trúc có độ phân giải thấp hơn của các phức hợp protein rất lớn, bao gồm tổ hợp các virus; một kỹ thuật biến thể khác gọi là "xác định cấu trúc tinh thể bằng kính hiển vi điện tử truyền qua" (electron crystallography) có thể thu được độ phân giải lớn ở một số trường hợp, đặc biệt đối với những tinh thể hai chiều ở các protein dạng màng. Thông tin về những cấu trúc quan sát được thường lưu trữ ở Ngân hàng Dữ liệu Protein (Protein Data Bank, PDB), một hệ thống nguồn truy cập tự do mà dữ liệu cấu trúc của hàng nghìn protein có thể nhận được dưới dạng tọa độ Descartes cho từng nguyên tử trong protein.
Có thêm nhiều trình tự gen được giải mã hơn so với số lượng protein có cấu trúc được làm rõ. Ngoài ra, tập hợp những cấu trúc được quan sát bị chệch khỏi hình dạng nguyên sinh của protein do tác động từ những điều kiện quan sát đòi hỏi trong kỹ thuật tinh thể học tia X, một trong những phương pháp chính nhằm xác định cấu trúc protein. Đặc biệt, những protein dạng cầu thường dễ dàng chuẩn bị làm mẫu tinh thể hóa trước khi tiến hành kỹ thuật chụp tinh thể học tia X. Ngược lại, các protein dạng màng, lại rất khó để đưa về dạng tinh thể và chưa có dữ liệu về chúng trong PDB. Hướng nghiên cứu "bộ gen mã hóa cấu trúc protein" (structural genomics) được khởi xướng gần đây đã cố gắng giảm bớt những lỗ hổng hiểu biết này bằng cách giải quyết một cách hệ thống cho cấu trúc của một số lớp protein thông qua cách chúng uốn gập. Phương pháp dự đoán cấu trúc protein có mục đích mang lại một bức tranh sơ bộ về cấu trúc của những protein mà chúng chưa được xác định cấu trúc bằng thực nghiệm.

Tín hiệu tế bào và liên kết phối tử

Nhiều protein tham gia vào các giai đoạn của quá trình truyền tín hiệu tế bào và tải nạp tín hiệu. Một số protein, như insulin, là những protein ngoại bào thực hiện truyền tín hiệu từ tế bào mà chúng được sinh tổng hợp đến những tế bào khác trong mô ở xa. Những protein khác là protein màng (membrane protein) hoạt động như là những thụ thể mà chức năng chính là liên kết với một phân tử tín hiệu và cảm ứng một đáp ứng hóa sinh bên trong tế bào. Nhiều thụ thể có vị trí liên kết nằm bên trên bề mặt tế bào và miền tác dụng nằm bên trong tế bào, mà hoạt động chức năng enzyme có thể trải qua một sự thay đổi hình dáng (conformational change) được phát hiện bởi những protein khác bên trong tế bào.
Kháng thể là những thành phần protein của một hệ miễn dịch thu được (adaptive immune system) có chức năng chính là liên kết với các kháng nguyên, hoặc những cơ chất lạ bên trong tế bào của cơ thể, và nhận diện đánh dấu chúng để tiêu hủy. Kháng thể có thể tiết vào môi trường ngoại bào hoặc bám vào màng của những tế bào B chuyên biệt (B cell) gọi là tế bào plasma. Trong khi các enzyme bị giới hạn ở ái lực liên kết với các chất nền bởi tính cần thiết cho việc điều khiển phản ứng mà chúng tham gia, các kháng thể lại không bị giới hạn này. Ái lực liên kết của các kháng thể với mục tiêu của nó là cực kỳ cao.
Nhiều phối tử (ligand) vận chuyển các protein gắn đặc hiệu cùng với các phân tử sinh học nhỏ và vận chuyển chúng đến những vị trí khác nhau trong cơ thể của một sinh vật đa bào. Những protein này phải có ái lực liên kết lớn khi các phối tử có mặt ở mức độ tập trung lớn, nhưng cũng giải phóng được phối tử khi sự có mặt của chúng ở mức độ thấp tại những mô đích đến. Ví dụ điển hình của protein liên kết phối tử là haemoglobin, mà vận chuyển ô xi từ phổi đến các mô và các cơ quan khác ở động vật có xương sống và có sự tương đồng gần gũi trong mọi giới sinh học. Lectin là những protein liên kết với đường có chức năng đặc hiệu cao với phân tử đường của nó. Lectin đóng vai trò điển hình trong hiệu ứng nhận dạng phân tử ở tế bào và các protein. Các thụ thể và hormone là những protein liên kết đặc hiệu cao.
Protein liên màng (transmembrane protein) cũng được coi như những protein chuyên chở phối tử mà làm thay đổi tính thấm của màng tế bào đối với những phân tử nhỏ và ion. Riêng ở màng có một lõi kị nước mà các phân tử phân cực hay mang điện không thể khuếch tán qua nó. Protein màng chứa các kênh bên trong cho phép các phân tử như vậy đi vào và thoát ra khỏi tế bào. Nhiều protein kênh ion là chuyên biệt cho phép chỉ một ion đặc biệt đi qua; ví dụ, các kênh kali và natri chỉ cho một loại ion tương ứng đi qua.

Protein cấu trúc

Các protein cấu trúc đem lại tính vững trãi và sự đặc chắc cho các thành phần sinh học ngoài trạng thái lỏng khác. Hầu hết các protein cấu trúc là những protein dạng sợi; ví dụ, collagen và elastin là những thành phần quan trọng của mô liên kết như sụn, và keratin được tìm thấy trong các cấu trúc cứng hoặc có dạng sợi như lông, móng, lông vũ, móng guốc, và vỏ giáp ngoài. Một số protein dạng cầu cũng đóng vai trò làm chức năng sinh học, ví dụ, sợi actin và tubulin có dạng cầu và hòa tan được khi là các monome, nhưng khi bị polyme hóa tạo thành dạng sợi dài, cứng giúp cấu thành lên bộ xương tế bào, cho phép tế bào duy trì hình dạng và kích thước của nó.
Những protein khác phục vụ chức năng cấu trúc là protein động cơ như myosin, kinesin, và dynein, mà chúng có khả năng sinh ra lực cơ học. Những protein này đặc biệt quan trọng cho sự di chuyển (motility) của tế bào ở những sinh vật đơn bào và của tinh trùng ở phần lớn sinh vật đa bào cho hoạt động sinh sản. Chúng cũng sinh ra lực đẩy làm cơ co lại và đóng vai trò quan trọng ở quá trình vận chuyển bên trong tế bào.

Phương pháp nghiên cứu

Các hoạt động và chức năng của protein có thể nghiên cứu trong ống nghiệm, (in vitro) in vivo, và in silico. Phương pháp in vitro nghiên cứu các protein được sàng lọc trong những môi trường có kiểm soát giúp tìm hiểu một protein thực hiện chức năng của nó như thế nào: ví dụ, lĩnh vực nghiên cứu động học enzyme (enzyme kinetic) khám phá cơ chế phản ứng của sự hoạt động xúc tác của một enzyme và ái lực của nó đối với nhiều phân tử cơ chất khác nhau. Ngược lại, phương pháp thực nghiệm in vivo cung cấp thông tin về vai trò sinh lý của một protein bên trong tế bào hay thậm chí toàn bộ sinh vật. Phương pháp in silico sử dụng các phương pháp của tin sinh học để nghiên cứu protein.

Tinh sạch protein

Để thực hiện phân tích in vitro, một protein cần nghiên cứu phải được tinh sạch và sàng lọc (protein purification) khỏi những thành phần khác của tế bào. Quá trình này thường bắt đầu bằng cách phá tế bào (hay tiêu tế bào, cytolysis), khi ấy màng tế bào bị phá vỡ khi lượng nước thẩm thấu quá nhiều vào trong tế bào và các thành phần bên trong được giải phóng vào một dung môi gọi là dung dịch thủy phân tế bào (crude lysate, hay cytolysate). Hỗn hợp thu được được tinh sạch bằng phương pháp siêu ly tâm (ultracentrifugation), mà phân tách nhiều thành phần tế bào thành các phần chứa các protein hòa tan khác nhau; như màng lipid và protein; bào quan tế bào, và axit nucleic. Hỗn hợp được kết tinh bằng phương pháp tách tinh thể muối (salting out) cho phép tập trung protein từ dung dịch này. Sau đó sử dụng nhiều kỹ thuật sắc ký để cô lập một hoặc một vài protein cần nghiên cứu dựa trên những tính chất của chúng như trọng lượng phân tử, tổng điện tích và ái lực liên kết. Mức độ sàng lọc được giám sát nhờ sử dụng nhiều kỹ thuật điện di trên gel (gel electrophoresis) nếu biết trọng lượng phân tử và điểm đẳng điện (isoelectric point) của protein cần nghiên cứu, hoặc bằng phân tích phổ nếu protein có những đặc trưng phổ dễ phân biệt, hoặc bằng thí nghiệm thử enzyme (enzyme assay) nếu protein có hoạt tính enzyme. Thêm vào đó, protein có thể được cô lập theo điện tích của chúng nhờ sử dụng phương pháp tập trung đẳng điện (isoelectric focusing).
Đối với các protein tự nhiên, cần phải thực hiện một chuỗi các bước tinh sạch trước khi có thể thu được một lượng protein đủ thuần khiết cho mục đích sử dụng trong phòng thí nghiệm. Để làm đơn giản quá trình này, các nhà hóa sinh thường sử dụng kỹ thuật di truyền để thêm vào các đặc điểm cho protein giúp dễ dàng sàng lọc chúng hơn mà không làm ảnh hưởng đến cấu trúc hay hoạt động của chúng. Ở đây, một "chất đánh dấu" (tag) chứa một trình tự axit amino đặc hiệu, thường là một chuỗi histidine (chất "His-tag"), được gắn vào một đầu của protein. Kết quả là, khi đưa dung dịch hòa tan protein vào các ống nghiệm của máy sắc ký chứa niken, histidine liên kết phối tử với niken và đọng lại trong cột trong khi những thành phần không được đánh dấu trong dung dịch sẽ chảy qua không bị cản trở. Nhiều phương pháp đánh dấu đã được phát triển để giúp các nhà nghiên cứu sàng lọc các protein đặc biệt từ những hợp chất phức tạp.

Khu trú tế bào

Phương pháp nghiên cứu in vivo cho protein thường đề cập đến sự tổng hợp và sự định vị (khu trú, localization) protein bên trong tế bào. Mặc dù nhiều protein nội bào được sinh tổng hợp bên trong tế bào chất và ở các vị trí liên kết với màng tế bào hoặc protein được tiết ra từ mạng lưới nội chất, chi tiết cụ thể bằng cách nào mà các protein được định hướng (protein targeting) đến những bào quan cụ thể hoặc các cấu trúc của tế bào vẫn chưa được hiểu rõ. Một kỹ thuật hữu ích để đánh giá sự khu trú tế bào bằng cách sử dụng kỹ thuật di truyền nhằm biểu hiện bên trong một tế bào một protein dung hợp (fusion protein, hay chimera, một protein được tạo ra thông qua việc nối hai hoặc nhiều đoạn gen với nhau mà ban đầu mã hóa cho từng protein riêng biệt) chứa protein tự nhiên cần nghiên cứu mà nó liên kết với một "thành phần báo cáo" như protein huỳnh quang xanh (GFP). Vị trí của protein dung hợp bên trong tế bào có thể dễ dàng nhận ra và chụp ảnh dưới kính hiển vi, như minh họa ở hình bên cạnh.
Những phương pháp khác nhằm lý giải vị trí của protein trong tế bào đòi hỏi sử dụng các ngăn nội bào chỉ thị đã biết cho từng vùng chuyên biệt như lưới nội chất ER, bộ máy Golgi, thực bào, không bào, ty thể, lục lạp, màng sinh chất, vv. Bằng cách sử dụng các phân tử đánh dấu huỳnh quang xanh cho những vùng chỉ thị này hoặc của những kháng thể cho những phân tử chỉ thị đã biết, người ta có thể dễ dàng nhận ra vị trí của protein cần nghiên cứu trong tế bào. Ví dụ, kỹ thuật hiển vi huỳnh quang miễn dịch gián tiếp (indirect immunofluorescence) sẽ cho phép huỳnh quang các vị trí và hiển thị chúng. Bột huỳnh quang được sử dụng để đánh dấu các ngăn của tế bào cho các mục đích tương tự.
Có những kỹ thuật khác, ví dụ như kỹ thuật hóa mô miễn dịch (immunohistochemistry) thường lợi dụng một kháng thể của một hay nhiều protein cần nghiên cứu mà liên hợp với các enzyme để thu được hoặc là vị trí phát sáng hoặc là tín hiệu tạo sắc tố (chromogenic) mà các nhà nghiên cứu có thể so sánh giữa các mẫu, cho phép họ thu thập thông tin về vị trí của protein. Một kỹ thuật ứng dụng khác là đồng cất phân đoạn (cofractionation) trong gradien sucrose (hoặc những vật liệu khác) sử dụng các bước lọc ly tâm phân đoạn (differential centrifugation). Trong khi kỹ thuật này không cho biết sự đồng khu trú của một khoang của tỷ trọng đã biết và protein quan tâm, nó tăng tỷ lệ tinh khiết, và tuân theo các nghiên cứu trên quy mô lớn.
Cuối cùng, phương pháp tiêu chuẩn vàng để xác định sự khu trú tế bào là bằng kỹ thuật hiển vi điện tử miễn dịch (immunoelectron microscopy). Kỹ thuật này cũng sử dụng một kháng thể với protein cần nghiên cứu, và kết hợp với các kỹ thuật hiển vi điện tử cổ điển khác. Mẫu được chuẩn bị như đối với kiểm tra qua kính hiển vi điện từ thông thường, và sau đó được xử lý bằng một kháng thể với protein quan tâm mà liên hợp với vật liệu có mật độ electron dày đặc, mà thường là vàng. Kỹ thuật này cho phép xác định được chi tiết siêu cấu trúc cũng những vị trí của protein đang cần nghiên cứu.
Thông qua các ứng dụng kỹ thuật di truyền khác được biết đến như gây đột biến định hướng điểm (site-directed mutagenesis), các nhà nghiên cứu có thể thay đổi được trình tự của protein và do đó đến cấu trúc của nó, sự khu trú tế bào, và tính nhạy cảm đối với sự điều hòa biểu hiện. Kỹ thuật này thậm chí cho phép đính những phân tử axit amino không có trong tự nhiên vào protein, bằng sử dụng các tRNA được sửa đổi, và có thể cho phép đánh giá sự hợp lý trong thiết kế protein mới với những tính chất nổi bật.

Proteomic

Tổng toàn bộ protein ở một thời điểm có trong một tế bào hoặc loại tế bào được gọi là bộ protein hay proteome, và ngành nghiên cứu tập hợp dữ liệu lớn như thế gọi là proteomic, được đặt tên tương tự như của ngành genomic. Các kỹ thuật thực nghiệm quan trọng của proteomic bao gồm điện di trên keo hai chiều (2D gel electrophoresis), cho phép tách số lượng lớn các protein, phương pháp khối phổ, cho phép nhanh chóng nhận ra loại protein và trình tự các peptide (hầu hết sau khi tiêu hóa trên gel (in-gel digestion)), protein microarray, cho phép xác định mức độ tương đối của một số lớn các protein có mặt trong một tế bào, và sàng lọc thể lai hai mảnh (two-hybrid screening), cho phép khám phá một cách có hệ thống tương tác protein-protein. Tổng toàn bộ các tương tác sinh học khả dĩ như những tương tác này gọi là interactome. Nỗ lực có hệ thống nhằm xác định cấu trúc của protein biểu diễn cho mỗi hình dạng gập khả dĩ gọi là ngành nghiên cứu bộ gene cấu trúc (structural genomics).

Dự đoán protein mất trật tự và cấu trúc không cố định

Nhiều protein (ở sinh vật nhân thực Eucaryota ~33%) chứa nhiều đoạn với cấu trúc không ổn định nhưng có chức năng sinh học và được phân loại thành protein mất trật tự nội tại (intrinsically disordered proteins).
Dự đoán và phân tích protein mất trật tự do đó là một mảng quan trọng của nghiên cứu cấu trúc protein.