Metagenomics

Nguồn gốc từ

Thuật ngữ "metagenomics" được giới thiệu bởi Jo Handelsman, Jon Clardy, Robert M. Goodman và một số người khác, và xuất hiện lần đầu trong một bài báo vào năm 1998. Thuật ngữ metagenome phản ánh ý tưởng về bộ sưu tầm các gen được giải mã trực tiếp từ môi trường với cách tương tự như nghiên cứu về từng genome. Kevin Chen and Lior Pachter (University of California, Berkeley) đã định nghĩa metagenomics là " việc ứng dụng các kỹ thuật di truyền hiện đại trong nghiên cứu về quần xã vi sinh vật một cách trực tiếp trong môi trường tự nhiên của chúng mà không cần phải phân lập và nuôi cấy chúng trong phòng thí nghiệm".

Lịch sử

Việc giải trình tự theo kiểu truyền thống thường bắt đầu bằng việc nuôi cấy các tế bào giống hệt nhau để làm nguồn phân lập DNA. Các nghiên cứu metagenomic đã cho thấy vẫn còn rất nhiều nhóm vi sinh vật trong tự nhiên mà chúng ta không thể phân lập và nuôi cấy được, và vì vậy không thể giải trình tự của chúng được. Những nghiên cứu đầu tiên của metagenomic tập trung vào đoạn trình tự của rRNA 16S (16S ribosomal RNA), là đoạn trình tự tương đối ngắn, bảo thủ và đặc trưng cho mỗi loài. Từ đó người ta đã phát hiện ra rất nhiều đoạn trình tự rRNA 16S mới, không giống bất cứ một loài đã biết nào. Những khảo sát về gen trên rRNA thực hiện trực tiếp từ môi trường đã cho thấy, số lượng loài vi khuẩn và vi khuẩn cổ (archaea) đã tìm thấy trước đây bằng phương pháp giải trình tự theo kiểu truyền thống chỉ tương đương khoảng 1% số lượng thực của chúng trong môi trường.  
Những nghiên cứu đầu tiên ở mức độ phân tử đã được thực hiện bởi Norman R. Pace và các cộng sự. Họ sử dụng PCR để khám phá ra sự đa dạng của các trình tự rRNA. Với những kết quả của nghiên cứu này, vào năm 1985 Pace đã đề xuất ý tưởng nhân dòng DNA trực tiếp từ môi trường. Tới năm 1991 ông và cộng sự tại Khoa Sinh học, trường đại học Indiana đã có báo cáo đầu tiên về nhân dòng một lượng lớn DNA từ môi trường. Nghiên cứu của họ đã khẳng định rằng không hề có lỗi trong quá trình thực hiện PCR và những loài mới trong quần xã vi sinh vật là thực sự tồn tại. Mặc dù chỉ thực hiện với đoạn trình tự bảo thủ và không mã hóa, công trình trên đã chứng minh và giải thích tại sao các nghiên cứu về đa dạng sinh học trước đây bằng phương pháp hình thái học thường mang lại nhiều kết quả hơn so với phương pháp phân tích qua phân lập và nuôi cấy. Ngay sau đó, vào năm 1995 Healy đã công bố kết quả phân lập metagenomic của các gen chức năng trong "thư viện động vật" xây dựng từ hệ sinh vật tự nhiên trên cỏ khô trong phòng thí nghiệm. Sau khi rời phòng thí nghiệm của Pace, Edward DeLong  tiếp tục nghiên cứu về lĩnh vực này và đã xuất bản công trình làm nền móng cho phân loại sinh vật môi trường dựa trên trình tự 16S, đó là thành lập thư viện trình tự của các mẫu lấy từ biển.
Vào năm 2002, Mya Breitbart, Forest Rohwer và các cộng sự đã sử dụng phương pháp shotgun sequencing để chứng minh rằng trong 200 lít nước biển có chứa trên 5000 loài virus khác nhau. Nghiên cứu sau đó đã tìm ra khoảng hơn 1000 loài virus trong phân người và khoảng 1 triệu virus trong mỗi kilogam trầm tích biển, trong đó có rất nhiều thể thực khuẩn. Năm 2004 Gene Tyson, Jill Banfield và cộng sự tại trường đại học California, Berkeley và Joint Genome Institute đã giải mã DNA từ mẫu môi trường bị axit hóa do khai khoáng (acid mine drainage, AMD). Nghiên cứu đã tìm ra một số nhóm vi khuẩn và vi khuẩn cổ mà trước đó chưa thể phân lập được.
Năm 2005, Stephan C. Schuster ở trường đại học Penn State University và các cộng sự đã công bố những trình tự đầu tiên giải bằng phương pháp hiện đại (kỹ thuật Pyrosequencing phát triển bởi 454 Life Sciences). Năm 2006 Robert Edward, Forest Rohwer và cộng sự ở San Diego State University cũng đã công bố thêm một công trình thuộc lĩnh vực này.

Shotgun metagenomic

Nhờ các tiến bộ trong ngành tin sinh học, trong khuếch đại DNA và sự phát triển của công nghệ tính toán mà ta có thể phân tích các đoạn trình tự DNA từ các mẫu môi trường và ứng dụng giải trình tự shotgun cho các mẫu metagenomic. Có thể kể đến một số kết quả giải trình tự của vi sinh vật và của hệ gen người, ghép nối các đoạn DNA ngẫu nhiên ngắn thành các đoạn trình tự consensus. Giải trình tự shotgun và sàng lọc thư viện dòng cho biết các gen tồn tại trong mẫu môi trường. Nhờ vậy mà ta sẽ biết được loại sinh vật nào hay quá trình trao đổi chất nào đang diễn ra trong quần xã , từ đó có thể hiểu rõ hơn về sinh thái học và so sánh các mẫu môi trường với nhau.
Bên cạnh đó có thể dùng Shotgun metagenomic để giải trình tự gần như hoàn toàn hệ gen của vi sinh vật trực tiếp từ môi trường. Phân tích DNA của một mẫu thường cho kết quả là dữ liệu DNA của vi sinh vật có nhiều nhất trong mẫu. Để có được cái nhìn toàn diện hơn ta cần tìm cách giải trình tự bộ gen của các thành viên khác trong quần xã bằng cách phân tích một lượng mẫu lớn. Với giải trình tự shotgun ngẫu nhiên ta có thể phát hiện được các thành viên này ngay chỉ với các đoạn trình tự vô cùng nhỏ bé.
 

Giải trình tự hiện đại (High-throughput sequencing)

Những nghiên cứu metagenomic giải trình tự hiện đại đầu tiên đều được thực hiện bằng phương pháp 454 Pyrosequencing. Các kỹ thuật tiếp theo được ứng dụng là Giải trình tự Ion Torrent PGM, Phân tích genome Illumina và Hệ thống SOLiD. Bằng những kỹ thuật này ta chỉ đạt được các đoạn trình tự ngắn hơn so với phương pháp giải trình tự Sanger: các reads với IonTorrent PGM và 454 Pyrosequencing thường có độ dài khoảng 400 bp, với Illumina và SOLiD dài 25-75 bp , trong khi đó với phương pháp Sanger ta có các reads với độ dài khoảng 750 bp. Tuy vậy, để bù lại điều này, các phương pháp mới cho số lượng reads nhiều hơn hẳn so với phương pháp Sanger truyền thống: Pyrosequencing cho 200-500 megabases, Illumina cho khoảng 20-50 gigabase metagenome. Một ưu điểm nữa của giải trình tự đoạn ngắn (short-read) là các phương pháp này không đòi hỏi phải nhân dòng trước khi giải trình tự, vì vậy có thể duy trì được tính đa dạng của mẫu phân tích. 

Tin sinh học - Bioinformatics

Dữ liệu của metagenomics thường rất lớn và tương đối nhiễu, vì nó chứa các mảnh dữ liệu của hàng chục ngàn loài sinh vật trong quần xã. Khi giải trình tự metagenome của dạ cỏ bò người ta đạt được dữ liệu chứa 279 gigabase (279 tỉ bp), và hệ quần xã ở ruột người có chứa các gen khoảng 3,3 triệu bp (sau khi đã ghép nối từ 567,7 gigabase dữ liệu). Chính vì thế việc thu thập và xử lý các dữ liệu này đã từ lâu trở thành thách thức không nhỏ cho các nhà nghiên cứu.
 

Bước đầu sàng lọc trình tự

Bước đầu tiên của phân tích dữ liệu metagenome đòi hỏi thực hiện một số bước lọc nhất định (loại bỏ chất tạp, các đoạn trình tự chất lượng kém và các trình tự (có thể) của sinh vật nhân chuẩn eukaryotes). Một số phương pháp loại bỏ trình tự DNA của sinh vật nhân chuẩn có thể kể đến phương pháp Eu-Detect và DeConseq.