Phương pháp khối phổ

Ví dụ về cách hoạt động

Các hóa chất khác nhau thì có khối lượng phân tử khác nhau. Dựa vào đó, khối phổ kế sẽ xác định chất hóa học nào có nằm trong mẫu. Ví dụ, muối NaCl hấp thụ năng lượng (năng lượng hấp thụ tùy theo nguồn ion, ví dụ MALDI năng lượng là tia laser) tách ra thành các phân tử tích điện, gọi là ion), trong giai đoạn đầu của phương pháp phổ khối. Các ion Na⁺, Cl⁻ có trọng lượng nguyên tử khác biệt. Do chúng tích điện, nghĩa là đường đi của chúng có thể được điều khiển bằng điện trường hoặc từ trường. Các ion được đưa vào buồng gia tốc và đi qua một khe vào miếng kim loại. Một từ trường được đưa vào buồng đó. Từ trường sẽ tác động vào mỗi ion với cùng một lực và làm chệch hướng chúng về phía đầu đo. Ion nhẹ hơn sẽ bị lệnh nhiều hơn ion nặng vì theo định luật chuyển động của Newton gia tốc tỉ lệ nghịch với khối lượng của phân tử. Đầu đo sẽ xác định xem ion bị lệnh bao nhiêu, và từ giá trị đo này, tỉ lệ khối lượng-trên-điện tích của ion có thể được tính toán. Từ đó, có thể xác định được thành phần hóa học của một mẫu gốc. Trên thực tế thì hai ion Na⁺ và Cl⁻ sẽ không được đo trong cùng một lần, vì các máy đo chỉ có thể nhận ra ion điện tích dương hoặc điện tích âm nên nếu máy khối phổ kế được điều chỉnh để đo các ion điện tích dương thì chỉ có ion Na⁺ là được nhận ra bởi máy.
.Một trong những tính năng lớn của khối phổ lượng là có thể tìm thấy cấu tạo không gian của phân tử ví dụ phân tử C₇H₁₄O₂ có thể là acid hoặc ester... Và khả năng phát hiện ra hợp chất với độ nhậy cực cao từ 10⁻⁶ dến 10⁻¹² gram. Dưới đây là một khối phổ (electrospray)của phân tử Kaempferol-rhamnose-rhamnose-glucose(m/z 741) trong loại cỏ thaliana, phân tích với 5.10⁻⁶L (nếu dùng máy MALDI thì chỉ cần 0,5.10⁻⁶L).

Protein và các phân mảnh peptit

Protein mà các nhà nghiên cứu sinh học quan tâm thường là sự kết hợp phức tạp của nhiều protein và phân tử khác nhau, cùng tồn tại trong một môi trường sinh học. Điều này đặt ra hai vấn đề chính. Thứ nhất, hai kĩ thuật ion hóa dùng cho các phân tử lớn chỉ làm việc tốt khi mà hỗn hợp từ các thành phần có cấu tạo gần giống, trong khi trong các mẫu sinh học, các protein khác nhau thường là có lượng khác biệt nhau lớn. Nếu hỗn hợp được ion hóa dùng phương pháp phun ion hay MALDI, thì những protein dạng mà dư thừa nhiều có xu hướng giảm tín hiệu so với những cái ít dư thừa hơn. Vấn đề thứ hai, quang phổ khối từ hỗn hợp phức tạp là rất khó để nghiên cứu do có quá nhiều thành phần phức hợp. Đó là vì với tác động của enzym, một protein tạo ra hàng loạt sản phẩm peptit.
Để giải quyết vấn đề này, hai phương pháp được sử dụng rộng rãi để phân mảnh protein, hay các sản phẩm peptit từ sự tác động của enzym. Phương pháp đầu tiên sẽ phân mảnh toàn bộ protein và được gọi là điện chuyển gel hai chiều (2-DE: two-dimensional gel electrophoresis). Phương pháp thứ hai, sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) được dùng với các phân mảnh peptit sau khi protein phân tách bởi tác động của enzym. Trong một số tình huống, có thể cần phải kết hợp cả hai phương pháp.
Các vết gel được xác định trên 2D Gel thường là thuộc về một protein. Nếu cần biết định danh của protein đó, thì có thể xem xét vết gel đó. Khối peptit kết quả từ tác động của enzym lên protein có thể được xác định bằng khối phổ dùng lấy dấu khối peptit. Nếu thông tin này không cho phép xác định danh tính của protein một cách chính xác, các peptit của nó có thể xem là thuộc về đo phổ khối tandem.
Việc xác định đặc tính của hỗn hợp protein dùng HPLC/MS còn được gọi là shotgun proteomics và mudpit. Một hỗn hợp là kết quả của sự tác động của enzym lên hỗn hợp protein sẽ được phân mảnh theo một hay hai bước bằng ghi sắc lỏng. Chất tách rửa từ giai đoạn ghi sắc có thể hoặc là trực tiếp đưa vào máy đo phổ khối thông qua ion hóa phun điện tử (ESI), hay tách ra thành một loạt các vết nhỏ để sử dụng sau này trong phân tích khối bằng MALDI.