Enzim kinetiği

Enzim kinetiği enzimler tarafından katalizlenen kimyasal reaksiyonların bilmidir. Enzim kinetiğinde reaksiyon hızı ölçülür ve reaksiyon şartlarını değiştirmenin etkisi araştırılır. Bir enzimin kinetiğinin bu şekilde çalışılması enzimin katalitik mekanizmasını, metabolizmadaki rolünü, aktivitesinin nasıl kontrol edildiğini ve bir ilaç veya zehrin enzimi nasıl inhibe edebileceğini ortaya koyabilir.
Enzimler genelde diğer molekülleri (enzimin substratları) manipüle eden protein molekülleridir. Bu hedef moleküller enzimin aktif bölgesine bağlanır ve, enzim mekanizması denen bir seri adımlar sonucunda, ürünlere dönüşür. Bu mekanizmalar tek substratlı ve çok substratlı mekanizmalar olarak ayrılabilir. Tek bir substrata bağlanan enzimler (triozfosfat izomeraz gibi) üzerinde yapılan kinetik çalışmalar, enzimin substratına bağlanma afinitesini (ilgisini) ve devir hızını ölçmeyi amaçlar.
Enzimler birden çok substrata bağlanınca, (sağda gösterilen) dihidrofolat redüktaz gibi, enzim kinetiği bu substratların bağlanma sırasını ve ürünlerin salınma sırasını gösterebilir. Bir tek substrata bağlanıp birden çok ürün salan enzimlere örnek, proteazlardır, bunlar bir protein substratı kesip iki polipeptit ürün oluştururlar. Başka enzimler iki substratı birleştirir, öreneğin DNA polimeraz'ın DNA'ya bir nükleotit eklemesi gibi. Bu mekanizmalar genelde karmaşık bir adımlar dizisi olsa da, tipik olarak bir hız belirleyici basamak, tüm reaksiyonun hızını belirler. Bu hız belirleyici basamak kimyasal bir reaksiyon veya, enzim veya substratlarında konformasyonel bir değişim olabilir, ürünlerin enzimden salınması sırasında görüldüğü gibi.
Enzimin yapısının bilinmesi kinetik verilerin yorumlanmasında faydalıdır. Örneğin, yapının bilinmesi sayesinde substrat ve ürünlerin kataliz sırasında nasıl bağlandıkları, reaksiyon sırasından hangi değişikliklerin meydana geldiği, ve hatta mekanizmadaki belli amino asit kalıntılarınını rolleri tahmin edilebilir. Bazı enzimler mekanizma sırasında önemli derecede biçimlerini değiştirirler; böylesi durumlarda enzimin tek başına yapısının ve enzimatik reaksiyona girmeyen substrat analogları ona bağlı ikenki yapısının belirlenmesi yararlı olur.
Tüm biyolojik katalizörler protein değildir; ribozim ve ribozom gibi RNA-temelli katalizörler pek çok hücresel işlev için esastırlar, örneğin RNA uçbirleştirmesi (splicing) ve çeviri (translasyon) gibi. Ribozimler ve enzimler arasındaki temel fark, RNA katalizörlerin nükleotitlerden, enzimlerin ise amino asitlerden oluşmasıdır. Ribozimler daha sınırlı bir reaksiyonlar grubunu katalizler, ama reaksiyon mekanizmaları ve kinetikleri protein enzimleri ile aynı yöntemlerle analiz edilebilir ve sınıflandırılabilir.

Genel ilkeler

Bir enzim tarafından katalizlenen reaksiyon, katalizlenmeyen reaksiyon ile aynı denge özelliklerine sahiptir. Diğer katalizörler gibi, enzimler substrat ve ürünler arasındaki dengenin konumunu değiştirmezler. Ancak, katalizlenmeyen bir kimyasal reaksiyondan farklı olarak, enzimle katalizlenen reaksiyonlar doyum kinetiği gösterirler. Belli bir enzim konsantrasyonu ve nispeten düşük substrat konsantrasyonu için, reaksiyon hızı substrat konsantrasyonu ile doğrusal orantılı olarak artar; enzim moleküllerinin çoğu, reaksiyonu katalizlemek için müsaittir ve substrat konsantrasyonun artırılması, enzim ve substrat moleküllerinin birbirine rastlama hızının artması demektir. Ancak, nispeten yüksek substrat konsantrasyonlarıda, reasiyon hızı asimptotik şekilde teorik maksimuma yaklaşır; enzim aktif bölgelerinin hemen hepsi doludur ve reaksiyon hızını, enzimin kendine has (içsel) devir hızı belirler. Bu iki sınır durumun ortasındaki substrat konsantrasyonu KM olarak belirtilir. Bir diğer deyişle, en yüksek reaksiyon hızının (Vₘₐₓ) yarısının elde edildiği substrat konsantrasyonu KM olarak tanımlanır.
Bir enzimin en önemli iki kinetik özelliği, enzimin belli bir substrat ile ne kadar çabuk doyuma ulaştığı ve ulaşabildiği en hızlı reaksiyon hızıdır. Bu özelliklerin bilinmesi bir enzimin hücre içinde ne yaptığını ve o şartlardaki değişiklere nasıl tepki verdiği hakkında fikir verir.

Tek substrat reaksiyonları

Tek substrat mekanizmalı enzimlere örnek olarak, izomerazlar (triozfosfat izomeraz veya bisfosfogliserat mutaz gibi), adenilat siklaz gibi hücre içi liyazlar, ve bir RNA liyaz olan çekiçbaşı ribozimi sayılabilir. Ancak, tek bir substratı olan bazı enzimler bu mekanizma kategorisi içine girmezler. Bunun bir örneği olan katalaz, substratı olan hidrojen peroksit ile reaksiyona girince yükseltgenir (okside olur) ve sonra ikinci bir substrat molekülü tarafından indirgenir. Substrat tek olsa da, modifiye olmuş bir enzim ara ürününün varlığı, katalaz mekanizmasının aslında bir pinpon (masa tenisi) mekanizması olduğunu gösterir. Bu mekanizma tipi aşağıda Çok substratlı reaksiyonlar bölümü altında açıklanmıştır.

Kinetik sabitlerin pratik anlamı

Enizm kinetiğinin araştırılması iki temel nedenden dolayı önemlidir. Birincisi, enzimlerin nasıl çalıştığının anlaşılmasını sağlar, ikincisi, enzimlerin organizmalarda nasıl davrandığını öngörmeye yardımcı olur. Yukarıda tanımlanan kinetik katsayılar KM ve Vₘₐₓ, metabolima kontrolünde enzimlerin nasıl çalıştığının anlaşılmasında önemli rol oynar.
Bu öngörülerin yapılması sıradan değildir, basit sistemler için dahi. Örneğin, oksaloasetat, mitokondride bulunan malat dehidrojenaz tarafından meydana gelir. Oksaloasetat sonra sitrat sentaz, fosfoenolpirüvat karboksikinaz veya aspartat aminotransferaz tarafından tüketilebilir ve, sırasıyla, sitrik asit döngüsü, glükoneojenez veya aspartik asit biyosentezini besleyebilir. Bu yolaklardan her birine ne kadar oksaloasetat gittiğini öngörmek için oksaolasetat konsantrasyonunu bilmek, ayrıca bu enzimlerin konsantrasyon ve kinetik özelliklerini bilmek gerekir. Metabolik yolakların davranışlarını öngörüsünün en karmaşık kısmı, tüm bir organizmaya ait matematiksel modellerin içine girmesi gereken kinetik ve gen ifadesi verilerinin sentezini yapılmasındadır. Buna alternatif olarak, kinetik metabolizma  probleminin faydalı bir sadeleştirmesi, enzim kinetiklerini dikkate almayıp sadece reaksiyon ağının stokyometresi hakkındaki bilgileri dayanmaktır, bu yöntem akı denge analizi olarak adlandırılır.

Çok-substratlı reaksiyonlar

Çok substratlı reaksiyonlarda subsratların nasıl bağlandığını ve hangi sırayla bağlandığını belirten karmaşık hız denklemleri vardır. Eğer A substratının konsantrasyonu sabit tutulur ve B substratınınki değiştirilirse, bu reaksiyonların analizi çok basitleşir. Bu şartlar altında, enzim  tek substratlı bir enzim gibi davranış gösterir, v'yi [S]'ye bağlı olarak grafiklendiğinde, B substatı için görünür KM ve Vₘₐₓ  sabitleri elde edilir. Eğer bu ölçümler A'nın farklı sabit konsantrasyonları için yapılırsa, bu veriler kullanılarak reaksiyonun mekanizması anlaşılabilir. İki substrat A ve B'yi alıp bunları iki ürün P ve Q'ya dönüştüren bir enzim için iki tip mekanizma vardır, üçlü kompleks veya pinpon.

Üçlü kompleks mekanizmaları

Bu enzimlerde, her iki substrat enzime aynı anda bağlanıp bir EAB üçlü kompleksi meydana getirir. Bağlanma sırası rastgele olabilir (rastgele mekanizmada) veya substratların belli bir sıra sıra ile bağlanması gerekebilir (sıralı mekanizmada). Üçlü kompleks mekanizmalı bir enzim için bir v-[S] eğriler kümesi (sabit A, değişen B) bir Lineweaver-Burk grafiğinde çizilirse, doğrular bir noktada kesişir.
Üçlü kompleks mekanizmalı enzimler arasında glutatyon S-transferaz, dihidrofolat reductaz and DNA polymeraz sayılabilir. Dihidrofoloat redüktaz ve DNA polimeraz için üçlü-kompleks mekanizmalarını gösteren kısa animasyonlar şu bağlantıda izlenebilir.{{Ref_label|B|β|none}

Pinpon mekanizması

Sağda gösterildiği gibi, pinpon mekanizmalı enzimler iki durumda bulunabilir: asıl hâlleri olan E ve kimyasal olarak modifiye bir hâl olan E*. Enzimin bu modifiye olmuş hâli "reaktif araürün" olarak adlandırılır. Bu mekanizmada, substrat A enzime bağlanır, aktif bölgeye bir kimyasal grup aktararak, enzimi E*'a dönüştürür, ve sonra enzimden salınır. İlk substrat salındıktan sonra ancak substrat B bağlanabilir ve modifiye olmuş enzimle reaksiyona girip modifiye olmamış E biçimini yeniden oluşturur. Pinpon mekanizmalı bir enzim için bir v-[S] eğriler kümesi (sabit A, değişen B), Lineweaver-Burk grafiğinde çizilirse, doğrular bir noktada kesişir. Bu grafik, ikincil grafik olarak adlandırılır.
Pinpon mekanizmalı enzimler arasında bazı oksidoredüktazlar (tiyoredoksin peroksidaz gibi), transferazlar (asilnöraminat citidililtransferaz gibi) ve serin proteazlar (tripsin ve kimotripsin gibi) sayılabilir.  Serin proteazlar yaygın ve çeşitli üyelere sahib bir enzim ailesidir, aralarında sindirici enzimler (tripsin, kimotripsin ve elastaz), kan pıhtılaşma kaskadının bazı enzimleri ve diğerleri sayılabilir. Serin proteazlarda, E* araürünü bir asil-enzim türüdür, aktif bölge serin kalınıtısının bir protein substratının peptit bağına saldırısı sonucu meydana gelir. Kemotripsin mekanizmasını gösteren bir kısa animasyona bir bağlantı şurda verilmiştir

Sabit hâl öncesi kinetik

Bir enzim substratı ile karıştırlmasından sonraki ilk anda henüz bir ürün oluşmamış ve araürün yoktur. Bunu takip eden milisaniylerin araştırması sabit hâl öncesi kinetik veya çoğuşma kinetiği (İngilizce Burst kinetics) olarak adlandırılır. Dolayısıyla, sabit hâl öncesi kinetiği, sabit hâl konsantrasyolarına ulaşılana dek enzim substrat araürünlerinin (ES veya E* gibi) oluşumu ve tükenişi ile ilgilidir.
Bu yaklaşım ilk defa kimotripsin tarafından katalizlenen hidroliz reaksiyonuna uygulanmıştır. Genelde, bir araürünün tespiti, bir enzimin takip ettiği mekanizmayı araştırmada çok önemli bir delildir. Örneğin, yukarıda gbelirtilen pinpon mekanizmasında, hızlı kinetik ölçümler bir P ürününün enzimden salınmasını ve değişime uğramış bir E* enzim araürününün oluşumu izlenebilir. Kimotripsin durumunda, aktif bölgedeki nükleofilik serin substrata saldırarak bir asil-enzim araürünü meydana gelir.
Sağdaki resimde, reaksiyonun ilk birkaç saiyesi sırasında enzim hızla E* oluşturur. Sonra, sabit hâle yaklaştıkça reaksiyon yavaşlar. Reaksiyonun bu hızlı "çoğuşma" evresi, enzimdeki tek bir devinime karşılık gelir. Dolayısıyla, bu patlama sırasında salınan ürün miktarı (grafikte y eksenindeki kesim noktasına karşılık gelir), aynı zamanda reaksiyondaki fonksiyonel enzim miktarına eşittir.

Kimyasal mekanizma

Enzim kinetiğinin ölçümünde önemli bir amaç, enzim reaksiyonunun kimyasal mekanizmasının, yani substratın ürüne dönüştürülmesindeki kimyasal adımlar dizisinin belirlenmesidir. Yukarıda anlatılan bu kinetik yaklaşım ile araürünlerin ne hızla oluştuğu ve birbirine dönüştüğünü gösterir ama bu araürünlerin tam olarak ne olduğunu tespit edemez.
Farklı çözelti şartlarında yapılan veya biraz modifiye edilmiş enzim veya substratlar üzerinde yapılan kinetik ölçümler çoğu zaman bu kimyasal mekanizmanın anlaşılmasına yardımcı olur, çünkü hız belirleyici adım veya reaksiyon araürünlerini ortaya çıkarır. Örneğin, bir hidrojen atomuna olan bir kovalent bağın kırılması sık görülen bir hız belirleyici adımdır. Olasıl hidrojen transferlerinden hangisinin hız belirleyici olduğu, her bir hidrojeni (onun kararlı izotopu olan) döteryum ile değiştirmenin kinetik etkilerini ölçülerek gösterilebilir. Kinetik izotop etkisinden dolayı döteryum bağlarının kırılması hidrojene olan kovalent bağların kırılmasından daha zordur, bu yüzden kritik hidrojen değiştirildiğinde reaksiyon hızı değişir. Başka izotop substitusyonları ile de (¹³C/¹²C ve ¹⁸O/¹⁶O) benzer etkilerin ölçülmesi mümkündür, ama bu etkiler aynı derecede bariz değildir.
İzotoplar substrat molekülünün farklı kısımlarının kaderini ortaya çıkarmak için de kullanılabilir. Örneğin, bazen nihai üründeki bir oksijenin kaynağını ayırt etmek zor olabilir, çünkü bu atom sudan veya substrattan geliyor olabilir. Hangisi olduğunu belirlemek için, reaksiyona katılan çeşitli moleküllere oksijenin kararlı izotopu olan ¹⁸O sistematik olarak substitüe edilir ve üründe bu izotopun varlığına bakılır. Kimyasal mekanizmanın anlaşılması için kullanılabilen diğer yöntemler, kinetik ve izotop etkileri farklı pH şartlarında, enzime bağlanan metal iyonları veya diğer kofaktörleri değiştirerek, korunmuş amino asit kalıntılarının mutagenezi ile veya substrat analoglarının varlığında enzimin davranıçını incelemektir.

Tersinmez inhibitörler

Enzim inhibitörleri enzimleri tersinmez olarak da inaktive edebilirler, genelde aktif bölgedeki amino asit kalıntısını değişime uğratarak. Kendilerini de yok ettikeri için "intihar substratı" olarak düşünülebilecek olan bu inhibitörler, reaksiyon sırasında üssel bir azalma gösterirler ve konsantrasyona bağlı olarak enzime olan etkileri genelde doyum özelliği gösterir. Doyum noktasının altında bu reaksiyonlar inhibitör için birinci derece reaksiyon kinetiği gösterirler.