Enzim inhibitörü

Enzim inhibitörü, bir enzime bağlanan ve onun etkinliğini azaltan bir moleküldür. Bir enzimin aktivitesini engellemek, bir patojeni öldürebildiği veya bir metabolik dengesizliği düzeltebildiği için, çoğu ilaç aslında birer enzim inhibitörüdür. Ayrıca herbisit ve pestisit olarak da kullanılırlar. Enzimlere bağlanan her molekül inhibitör değildir; enzim aktivatörleri enzimlere bağlanıp onların enzim aktivitesini artırırlar.
Bir inhibitörün bağlanması bir substratın enzimin aktif bölgesine girmesine durdurabilir ve/veya enzimin kataliz yapmasını engelleyebilir. İnhibitör bağlanması tersinir veya tersinmez olabilir. Tersinir olmayan inhibitörler genelde enzim ile reaksiyona girip onu kimyasal olarak değiştirir. Bu inhibitörler enzimin aktivitesi için esas olan amino asit kalıntılarını değişime uğratırlar. Buna karşın, tersinir inhibitörler non-kovalent olarak bağlanır ve inhibitörün enzime mi, enzim-substrat kompleksine mi, yoksa ikisine birden mi bağlı olmasına bağlı olarak, farklı tip inhibisyonlar meydana gelir.
Çoğu ilaç molekülü enzim inhibitörüdür, bu yüzden onların keşfi ve geliştirilmesi biyokimya ve farmakolojide aktif bir araştırma konusudur. İlaç özelliği olan bir enzim inhibitörü çoğu zaman spesifitesi (başka proteinlere bağlanmaması) ve güçlülüğü (enzimi inhibe etmesi için gereken konsantrasyonu belirtmeye yarayan ayrışma katsayısı) ile değerlendirilir. Yüksek bir spesifisite ve güçlülük (potans), bir ilacın yan etkilerinin az ve dolasıyla toksisitesinin düşük olmasını sağlar.
Enzim inhibitörleri doğada da bulunur ve metabolizmanın düzenlenmesinde görev alır. Örneğin, bir metabolik yolaktaki enzimler, son ürünler tarafından inhibe edilebilir. Bu tip negatif geri besleme, ürünler birikmeye başlayınca yolaktaki akıyı yavaşlatır ve bu yüzden hücre içinde homeostaz sağlamanın önemli bir yoludur. Diğer hücresel enzim inhibitörleri ise bir hedef enzime spesifik olarak bağlanıp onu inhibe edebilen proteinlerdir. Bu sayede hücreye zarar verebilen enzimler, örneğin proteaz veya nükleazlar, kontrol altında tutulabilir. Bunun iyi bilinen bir örneği ribonükleaz inhibitörüdür, bu protein, bilinen en sıkı protein-protein etkileşimi ile ribonükleazlara bağlanır. Doğal enzim inhibitörleri zehir de olabilirler, yırtıcılara karşı savunma olarak veya av öldürmek için kullanılırlar.

Tersinir inhibitörler için örnekler

Enzimler substratlarına sıkıca bağlanmak için evrimleşmiştir ve çoğu tersinir inhibitör enzimin aktif bölgesine bağlandığı için, bu inhibitörlerin yapısal olarak hedeflerinin substratına benzer bir yapı göstermesi şaşırtıcı değildir. Bu substrat taklitçilerinin bir örneği, HIV tedavisinde etkili bir antiretroviral ilaç grubu olan proteaz inhibitörleridir. Yapısı bir peptide dayalı olan ve üç peptit bağına sahip olan Ritonavir'in yapısı sağda gösterilmiştir. Bu ilaç HIV proteazının substratı olan proteine benzediği için, enzimin aktif bölgesine bağlanmak için bu substrat ile yarışır.
Enzim inhibitörleri çoğu zaman bir enzim tarafından katalizlenen reaksiyonun geçiş hâlini veya ara ürününü taklit edecek şekilde tasarlanır. Böylece geçiş hâlini stabilize edici enzim özelliği değerlendirilir ve substrata dayalı tasarımlara kıyasla daha iyi bir bağlanma afinitesi (daha düşük bir Kᵢ) elde edilir. Bu tür bir geçiş hâli inhibitörüne örnek, antiviral bir ilaç olan oseltamivir'dir. Bu ilaç, viral nöraminidaz enziminin reaksiyonundaki halkasal oksonyum iyonunun düzlemsel özelliğini taklit eder.
Ancak, tüm inhbitörler substrat yapısına dayalı değildir. Örneğin, bir diğer HIV proteaz inhibitörü olan tipranavir'in yapısı sağda gösterilmiştir. Bu molekül bir peptidin yapısına dayalı değildir ve bir protein substratı ile bariz bir yapısal benzerliği yoktur. Bu peptit olmayan inhibitörler, peptit bağı içeren inhibitörlerden daha kararlı olabilir, çünkü peptidazlar için substrat değildir ve yıkıma uğrama olasılığı daha düşüktür.
İlaç tasarımında hedef enzimin gördüğü substrat konsantrasyonunu göz önüne almak önemlidir. Örneğin, bazı protein kinaz inhibitörlerinin kimyasal yapısı, bu enzimin substratlarından biri olan adenozin trifosfatınkine benzer. Ancak, basit yarışmalı inhibitör olan ilaçların hücredeki yüksek ATP konsantrasyonu ile yarışması gerekir. Protein kinazlar, kinazın substrat proteini ile etkileştiği bağlanma yeri için yarışarak da inhibe olabilir ve çoğu proteinin hücre içindeki konsantrasyonu ATP konsantrasyonundan çok daha düşüktür. Dolayısıyla, eğer iki protein kinaz inhibitörü aktif bölgeye benzer afinite ile bağlanırsa, ama biri ATP ile yarışmak zorunda ise, proteine bağlanan yerdeki yarışmalı inhibitör, enzimi daha etkili şekilde inhibe edecektir.

Tersinmez inhibisyon tipleri

Tersinmez inhibitörler genelde bir enzimi kovalent olarak değişime uğratır (modifiye eder) ve dolayısıyla inhibisyon geriye döndürülemez. Tersinmez inhibitörler çoğu zaman reaktif fonksiyonel gruplar taşırlar, örneğin 
nitrojen mustard, aldehitler, haloalkanlar, alkenler, Michaelis akseptörü, fenil sülfonat, fluorofosfonatlar. Bu elektrofilik gruplar amino asit yan zincirleri ile tepkiyip kovalent katımlar (adduct) oluştururlar. Değişime uğrayan amino asit kalıntıları, yan zincirleri hidroksil veya sulfhidril grubu gibi nükleofiller içerenlerdir. Bu amino asitler arasında serin (DFP ile reaksiyona girer), sistein, treonin veya tirozin sayılabilir.
Tersinmez inhibisyon, tersinmez enzim inaktivasyonundan farklıdır. Tersinmez inhibitörler genelde belli bir enzim sınıfına özgüldür (spesifiktir) ve tüm proteinleri inaktive etmezler; protein yapısını bozarak değil, hedeflerinin aktif bölgesini spesifik olarak değişime uğratarak çalışırlar. Örneğin aşırı pH veya sıcaklıklar genelde tüm protein yapısının denatürasyonuna neden olur ama bu spesifik olmayan bir etkidir. Benzer şekilde, bazı non-spesifik (spesifik olmayan) kimyasal işlemler protein yapısını imha eder: örneğin derişik hidroklorik asit peptit bağları hidroliz edip proteini parçalar.
Tersinmez inhibitörler zamana bağlı inhibisyon gösterir ve dolayısıyla %50 inhibisyon sağlayan bir konsantrasyon ile nitelenemezler. Belli bir konsantrasyonda tersinmez inhibitör ile bulunan aktif enzim miktarı, inhibitörün enzim ile ne kadar süre bekletildiğine (inkübe edildiğine) bağlı olacaktır. Onun yerine, kobs/[I] değerleri kullanılır, burada kobs, gözlemlenen psödo-birinci derece inaktivasyon hızıdır, aktivite yüzdesinin logaritmasını zamana göre grafikleyerek elde edilir) ve [I] , inhibitörün konsantrasyonudur. kobs/[I] parametresi, inhibitörün enzime bağlanması doyuma ulaşmadıkça geçerlidir (doyuma ulaşması hâlinde kobs = kinact) .

Tersinmez inhibisyonun analizi

Soldaki şekilde gösterildiği gibi, tersinmez inhibitörler enzim (EI veya ESI) ile önce tersinir, kovalent olmayan bir kompleks oluşturur, sonra bu reaksiyona girip kovalent değişime uğramış tersinmez kompleks EI*'yi oluşturur. EI*'nin oluşma hızına inaktivasyon hızı denir ve bu hız, kinact katsayısı ile belirtilir. EI'nin oluşumu ES ile yarışabileceği için, tersinmez inhibitörlerin bağlanması bir substrat ile, veya ikinci, tersinir bir inhibitör ile  engellenebilir. Bu koruyucu etki, tersinmez inhibitörün aktif bölge ile spesifik reaksiyonuna iyi bir kanıt sayılır.
Bu reaksiyonun bağlanma ve inaktivasyon adımlarının tahkiki için enzim, inhibitörle birlikte bekletilir (inkübe edilir) ve kalan aktivitesi zaman içinde ölçülür. Aktivite zamana bağlı şekilde azalır, genelde üssel azalma göstererek. Bu ölçüm değerleri bir hız denklemine uydurularak inhibitörün bu konsantrayonu için inaktivasyon hızı bulunur. Bu işlem inhibitörün birkaç farklı konsantrasyonu için yapılır. Eğer tersinir bir EI kompleksi varsa, inaktivasyon hızı doymalı olacaktır ve bu eğriye uydurarak kinact ve Kᵢ elde edilir.
Bu analizlerde yaygın olarak kullanılan bir diğer yöntem kütle spektrometresidir. Burada, değişime uğrmamamış enzimin ve inaktive olmuş eznimin kütlelerinin hassas ölçümü, inhibitör ile reaksiyon sonucu meydana gelen kütle artışını verir ve reaksiyonun stokyometresini verir. Bu ölçüm genelde bir MALDI-TOF kütle spektrometresi ile yapılır. Tamamlayıcı bir teknik olan, peptit kütle parmakizlemesinde, asıl ve değişime uğramış protein, tripsin gibi bir proteaz ile sindirilir. Sindirim sonucu, kütle spektrometresi ile analiz edilebilecek bir peptitler kümesi elde edilir. İnhibitör ile reaksiyon sonucu kütlesi değişen peptit, modifikasyon yerini içerir.

Özel durumlar

Tüm tersinmez inhibitörler hedef enzimleri ile kovalent katım ürünleri oluşturmazlar. Bazı tersinir inhibitörler hedef enzimlerine o kadar sıkı bağlanırlar ki tersinmez inhibitör gibidirler. Bu sıkı bağlanan inhibitörler, kovalent tersinmez inhibitörlere benzer kinetik özelliklere sahip olabilir. Bu durumlarda, bu inhibitörlerin bazıları enzime düşük afiniteli bir EI kompleksi oluşturacak şekilde bağlanır, bu kompleks sonra yavaş bir değişime uğrayıp sıkı bağlanmalı bir EI* kompleksi oluşturabilir (yukarıdaki şekle bakınız). Bu kinetik davranışa yavaş bağlanma denir. Bağlanmayı takiben enzimin bu şekilde yeniden yapılanması çoğu zaman bir konformasyon değişimi içerir, çoğu durumda enzim inhibitör molekülün etrafına sarılır. Yavaş bağlanan inhibitör örneklerinden metotraksat, allopurinol, ve asiklovir (acyclovir)'in aktive olmuş hâli sayılabilir.

Tersinmez inhibitörlere örnekler

Diizopropilfluorofosfat (DFP)  yukarıda sağdaki resimde tersinmez bir proteaz inhibitörü örneği olarak gösterilmiştir. Enzim fosfor-flor bağını hidrolizler ama kalan fosfat, aktif bölgedeki serine bağlı kalır ve enzimi inaktive eder. Benzer şekilde, DFP nöronların sinapslarındaki asetilkolin esteraz enziminin aktif bölgesi ile reaksiyona girer ve dolayısıyla güçlü bir nörotoksindir, öldürücü dozu 100 mg'ın altındadır.
İntihar inhibisyonu, olağan dışı bir inhibisyon türüdür, enzim aktif bölgesinde inhibitörü onun aktif biçimine dönüştürür. Bir örnek, poliamin biozentezinin inhibitörü α-difluorometilornitin veya DFMO, ornitin amino asidinin bir analogudur ve uyku hastalığının tedavisi için kullanılır. Ornitin dekarboksilaz DFMO'nun dekarboksilasyonunu katalizleyebilir, yukarıda gösterildiği gibi. Ancak, bu dekarboksilasyon reaksiyonunu, flor atomunun eliminasyonu izler, bu flor, katalitik ara ürünü son derece elektrofilik olan bir konjüge imin'e dönüştürür. DFMO'nun bu reaktif biçimi sonra aktif bölgedeki bir sistein veye lizin kalıntısı ile tepkiyip enzimi tersinmez olarak inaktive eder.
Tersinmez inhibisyon genelde kovalent olmayan bir EI kompleksinin oluşumunu greektirdiği için, bazen bir inhibitör bir enzime birden çok şekilde bağlanabilir. Örneğin, yukarıda tripanotiyon redüktaz enzimini gösteren resimde, kuinakrin mustard adı verilen bir inhibitörün iki molekülü enzimin aktif bölgesine bağlıdır. Üstteki molekül tersinir bağlanmıştır ama alttaki kovalent bağlıdır çünkü nitrojen mustard grubu ile bir amino asit kalıntısı ile reaksiyona girmiştir.

Enzim inhibitörlerinin keşfi ve tasarımı

Yeni ilaçlar, uzun bir ilaç geliştirme sürecinin ürünüdür, bu sürecin ilk adımı çoğu zaman bir enzim inhibitörünün keşfidir. Geçmişte bu yeni inhibitörlerin keşfinin tek yolu deneme ve yanılmaydı: onbinlerce kimyasal bileşikten oluşan koleksiyonlar taranarak hedef enzime etki eden faydalı bir adayın ortaya çıkması umidedilirdi. Bu kaba kuvvete dayalı yaklaşım hâlâ başarılıdır ve kombinatoryal kimya yaklaşımı ile genişletilirek kısa sürede çok sayıda yeni bileşikler üretimini sağlar. Muazzam kimyasal "koleksiyonlar" içinden, yüksek hacimli tarama teknolojileri kullanılarak kısa sürede faydalı inhibitörler tespit edilebilir.
Daha yakın zamanda alternatif bir yaklaşım yaygınlaşmıştır: rasyonel ilaç tasarımında, bir enzimin aktif bölgesinin üç boyutlu yapısını kullanarak hangi moleküllerin inhibitör olabileceğini öngörülür. Bu öngörüler sonra deneysel olarak sınanır ve test edilen bileşiklerden birinin yeni bir inhibitör olduğu bulunabilir. Bunun ardından, bu molekülün aktif bölgeye nasıl bağlandığını görebilmek için bu yeni inhibitörün enzime bağlanarak oluşturduğu kompleksin yapısı çözülmeye çalışılır. Bu sayede inhibitörün moleküler yapısında değişiklikler yapılarak enzime bağlanması optimize edilebilir. Bu deneme ve iyileştirme döngüsü yeterince güçlü bir inhibitör bulunana kadar tekrar edilir. Bir inhibitörün bir enzime olan afinitesinin Bilgisayara dayalı yöntemler ile öngürüsü, örneğin moleküler yanaştırma (docking) ve moleküler mekanik, hâlen üzerinde yoğun çalışılan araştırma konularından biridir.

İnhibitörlerin kullanımları

Enzim inhbitörleri doğada bulunur, ayrıca farmakoloji ve biyokimya araştırmalarının bir sonucu olarak tasarlanır ve üretilir. Doğal zehirler genelde bir bitki veya hayvanın doğal düşmanlarına karşı kendini korumasını sağlayacak şekilde evrimleşmiştir. Bu doğal toksinler arasında, bilinen en zehirli bileşikler bulunur. Yapay inhibitörler genelde ilaç olarak kullanılır, ama insektisit (malatyon gibi), herbisit  (gliyofosat gibi) veya dezenfektan (triklosan gibi) de olabilirler.

Metabolik kontrol

Enzim inhibitörleri metabolik kontrolde de önemlidirler. Hücredeki çoğu metabolik yolak, enzim aktivitesini kontrol eden metabolitler tarafından, allosterik düzenleme (regülasyon) veya substrat inhibisyonu yoluyla, inhibe olurlar. Bunun iyi bir örneği, glikolitik yolağın allosterik düzenlemesidir. Bu katabolik yolak glükoz tüketir ve ATP, NADH ve pirüvat üretir. Glikoliz düzenlemesinde önemli bir nokta, yolağın ilk adımlarından olan, fosfofrüktokinaz-1 (PFK1) tarafından katalizlenen reaksiyondur. ATP düzeyi yükselince, ATP PFK1'deki bir allosterik yere bağlanıp enzim reaksiyon hızını azaltır; glikoliz inhibe olur ve ATP üretimi düşer. Bu negatif geribesleme hücredeki ATP konsantrasyonunun istikrarlı kalmasını sağlar. Ancak, metabolik yolaklar sadece inhibisyon yoluyla düzenlenmezler çünkü enzim aktivasyonu da aynı derecede önemlidir. früktoz 2,6-bisfosfat ve ADP, PFK1 durumunda allosterik aktivatör olarak etki eden metabolitlere örnektir.
Spesifik protein inhibitörler ile de fizyolojik enzim inhibisyonu elde edilebilir. pek çok sindirim enzim öncülünün (prekürsörünün) üretildiği pankreasta bu mekanizma görülebilir. Bu öncüllerin çoğu, tripsin proteazı tarafından aktive edilir, bu yüzden pankreasın kendi kendini sindirmemesi için bu sindirim enzimlerinin inhibe edilmesi gereklidir. Tripsin aktivitesinin kontrol edilme yollarından biri, spesifik ve güçlü bir tripsin inhibitörünün pankreas tarafından üretimidir. Bu inhibitör tripsine sıkıca bağlanarak organ için zararlı olacak tripsin aktivitesini engeller. Tripsin inhibitörü bir protein olmasına rağmen, tripsinin aktif bölgesindeki suyu dışlayarak ve reaksiyon geçiş durumunu kararsız hâle getirerek, kendisinin tripsin için substrat olmasının önüne geçer. Fizyolojik enzim inhibitör proteinlerinin diğer örnekleri arasında bakteriyel ribonükleaz inhibitörü barnaz ve protein fosfataz inhibitörleri sayılabilir.

Pestisit ve herbisitler

Çoğu herbisit ve pestisit enzim inhibitörüdür. Asetilkolinesteraz (AChE), böceklerden insanlara kadar hayvanlarda bulunan bir enzimdir. Sinir hücrelerinin işlev görebilmesi için bu enzimin asetilkolin adlı nörotransmitteri asetat ve kolin olarak parçalaması gereklidir. Bu mekanizma nörotransmitterler arasında nispeten enderdir, çünkü çoğu diğer nörotransmitter, serotonin, dopamin ve norepinefrin dahil olmak üzere, parçalanmak yerine sinaptik boşluk tarafından absorbe edilirler. Hem tıpta hem tarımda çok sayıda AChE inhibitörleri kullanılır. Tersinir yarışmalı inhibitörler, edrophonium, fizostigmin ve neostigmin gibi, miyasteni tedavisi ve anestezi için kullanılır. Karbamat pestisitleri de tersinir AChE inhibitörlerine örnektir. Organofosfat insektisitlerden olan malatyon, paratyon ve klorpirifos tersinmez olarak asetilkolinesterazı inhibe ederler.
Glifosat herbisiti 3-fosfoşikimat 1-karboksiviniltransferaz'ın inhibitörüdür, başka herbisitler ise, sülfonilüreler gibi, asetolaktat sentaz enzimini inhibe eder. Bu iki enzim de bitkiler tarafından dallı zinciri olan amino asitler yapmak için kullanılır. Herbisitler tarafından inhibe edilen pek çok başka enzim de vardır, bunların arasında lipit ve karotenoit biyosentezi, fotosentez ve oksidatif fosforilasyonda görev alan enzimler vardır.

Doğal zehirler

Hayvan ve bitkiler, geniş bir zehirli ürünler yelpazesi oluşturacak şekilde evrimleşmişlerdir. Bunların arasında inhibitör etkisi olan ikincil metabolitler, peptitler ve proteinler bulunmaktadır. Doğal toksinler genelde küçük organik moleküllerdir ve o kadar çeşitlidirler ki muhetemelen çoğu metabolik süreç için doğal inhibitörler mevcuttur. Doğal zehirlerin hedefi olan metabolik süreçler sadece metabolik yolaklardaki enzimler değildir, ayrıca hücredeki reseptör, kanal ve doğal fonksiyonlar da inhibe olabilir. Örneğin, paklitaksel (taksol), Pasifik porsuk ağacı'de bulunan bir organik molekül, tübülin dimerlerine sıkıca bağlanır ve onların hücre iskeletindeki mikrotübülleri oluşturmasını inhibe eder.
Çoğu doğal zehir, felce ve dolayısısıyla ölüme yol açan nörotoksin olarak etkir. Bunlar avcılara karşı korunmaya veya avcı canlıların av yakalamasına yarar. Bu doğal inhibitörlerin bazıları, toksik özelliklerine rağmen, düşük dozda tedavi edici özellikleri nedeniyle tıpta değerlidir. Bunun bir örneği Solanaceae ailesinden (patates, domates ve patlıcan, bu ailenin üyelerindendir) elde edilen glikoalkaloitlerdir, bunlar asetilkolinesteraz inhibitörleridir. Bu enzimin inhibisyonu asetilkolin nörotransmitterinin kontrolsuz şekilde artmasına ve bunun sonucu kas felci ve ölüme neden olur. Nörotoksisite ayrıca reseptörlerin inhibisyonu sonucu da meydana gelebilir; örneğin, zehirli güzelavrat otunda (Atropa belladonna)'da bulunan atropin, muskarinik asetilkolin reseptörünün  yarışmalı agonisti olarak işlev gösterir.
Çoğu doğal toksin ikincil metabolit olmakla beraber, bunların arasında peptit ve proteinler de bulunur. Toksik bir peptite örnek alpha-amanitin'dir, köygöçüren mantarının akrabalarında bulunur. Bu peptit, güçlü bir enzim inhibitörüdür, RNA polimeraz II enziminin DNA'yı çevriyazmasını (transkribe etmesini) engeller. Yosun toksini mikrosistin de bir peptittir ve protein fosfatazların inhibitörüdür. Bu toksin yosun patlamasından sonra su kaynaklarını kontamine edebilir, yüksek dozlarda akut karaciğer kanaması
ve ölüme yol açabilen, bildik bir kanserojendir.
Proteinler doğal zehir veya antigıda olabilirler. Bazı baklagillerde bulunan (ve yukarıda bahsi geçen) tripsin inhibitörleri bunun bir örneğidir. Daha ender görülen bir toksin sınıfı ise toksik enzimlerdir: bunlar, hedef enzimlerinin tersinmez inhibitörleridir ve substrat enzimlerini kimyasal olarak modifiye ederek etkirler. Bunun bir örneği olan risin, Hint yağı tohumlarında bulunan son derece güçlü bir protein toksinidir. Bu enzim, ribozomları inhibe eden bir gliyosidazdır. Risin, katalitik tersinmez bir inhibitör olduğu için, tek bir risin molekülü bir hücreyi öldürmeye yeterlidir.