Protein saflaştırması

Protein saflaştırması, karmaşık bir karışımdan tek bir tip proteini izole etmek için izlenen bir seri süreçtir. İlgi duyulan bir proteinin işlevi, yapısı ve diğer proteinlerle etkileşiminin karakterizasyonu için protein saflaştırması şarttır. Başlangıç malzemesi genelde bir biyolojik doku veya mikrobiyal kültürdür. Saflaştırma sürecinin çeşitli adımları sonucunda, protein içinde hapsolduğu ortamdan kurtarılır, karışımda bulunan protein olan ve protein olmayan kısımlar birbirinden ayrılır, ve nihayet arzulanan protein tüm diğer proteinlerden ayrıştırılır. Bir proteinin diğer tüm proteinlerden ayrıştırmak, protein saflaştırmasının en zahmetli yanıdır. Ayrıştırma adımlarında proteinlerdeki büyüklük, fizikokimyasal özellikler, bağlanma afinitesi ve biyolojik etkinlik gibi unsurlardaki farklılıklardan yararlanılır.

Amaç

Saflaştırma preparatif veya analitik olabilir. Preparatif saflaştırmada, nispeten büyük miktarda saflaştırılmış protein üretimi amaçlanır. Bu tür proteinlerin örnekleri arasında enzimler (örneğin laktaz), gıdasal proteinler (örneğin soya protein izolatı) ve bazı biyofarmasötikler (örneğin insülin) sayılabilir. Analitik saflaştırmada ise, bir protein nispeten küçük miktarlarda, araştırma veya analiz amaçları için üretilir. Bu tür amaçlara örnek olarak, protein kimliklemek, nicelemek, ve onun yapısını, çevrim sonrası değişimleri ve fonksiyonları üzerinde araştırma yapmak sayılabilir. Üreaz ve pepsin enzimleri, kristalize edilebilecek derecede saflaştırılan ilk proteinler olmuştur.

Stratejiler

Bir saflaştırma sürecinin tasarımındaki en temel seçim, başlangıç malzemesidir. Bir bitki veya hayvanın gövdesinde belli bir protein homojen şekilde dağılmış olmaz;  proteinin konsantrasyonu farklı organ veya dokularda daha az veya daha çok olabilir. En yüksek konsantrasyona sahip doku veya organın kullanılması, saflaştırma işlemini daha verimli kılar, çünkü belli miktarda saf protein elde etmek için gereken hacim daha az olur. Eğer protein düşük miktarda mevcutsa veya ekonomik değeri yüksekse, bilim adamları rekombinant DNA teknolojisi kullanarak arzu edilen proteini yüksek miktarda üretecek hücreler geliştirebilirler (bu ekspresyon sistemi olarak adlandırılır). Rekombinant ekspresyon sayesinde  protein, saflaştırılmasını kolaylaştıracak şekilde (örneğin Histidin etiketi ile) işaretlenebilir, böylece saflaştırma daha az sayıda adımla gerçekleşebilir. Ayrıca, rekombinant ekspresyonda arzu edilen proteinin oranı, doğal kaynaklardakine kıyasla daha yüksek miktarda olur.
Analitik saflaştırma genelde proteinlerin saflaştırılması için genelde üç özellikten yararlanır. Birincisi, proteinler izoelektrik noktalarına göre ayrıştırılırlar, pH gradyanlı bir jel veya iyon değişim kolonu kullanılarak. İkincisi, proteinler boyları veya moleküler ağırlıklarına göre ayrıştırılırlar, boy dışlama kromatografisi veya SDS poliakrilamit jel elektroforezi (SDS-PAJE) ile. Üçüncüsü, proteinler polarite veya hidrofobisitelerine göre ayrıştırılabilirler, ters faz kromatografisi ile.
Proteinler çoğu zaman iki boyutlu polikarilamit jel elektroforezi (2B-PAJE) ile saflaştırılıp sonra kütle spektrometresi ile peptit parmak izlemesi ile kimlikleri tespit edilir. Bu yöntem için protein miktarının nanogramlar mertebesinde olması yeterlidir.

Saflaştırma eldesinin belirlenmesi

Bir saflaştırma sürecini izlemekte kullanılan en genel yöntem, farklı adımların SDS-PAJE ile analizidir. Bu yöntem karışımdaki çeşitli proteinlerin miktarları hakkında ancak kaba bir fikir verir ve aynı moleküler kütleye sahip proteinlerin ayırt edilmesi mümkün olmaz.
Eğer proteinin ayırt edici bir spektroskopik niteliği veya enzim etkinliği varsa, bu özellikten yararlanılarak protein tespit edilebilir ve nicelenebilir. Böylece, ayrışımın fraksiyonları (farklı bölümleri) içinde saflaştırılan proteini bulunduranlar seçilebilir. Eğer proteini tanıyan antikorlar varsa, Western blot ve ELISA yöntemleri ile arzu edilen protein spesifik olarak tespit edilip nicelenebilir. Bazı proteinler reseptör işlevine sahiptir, saflaştırma adımları sırasında bir ligand bağlanma ölçümü kullanılarak bunların varlığı tespit edilebilir.
Çok adımlı bir saflaştırmayı değerlendirmek için, belli bir proteinin miktarı toplam protein miktarı ile kıyaslanmalıdır. Toplam protein tespiti için ışığın 280 nm dalga boyunda soğurulması ölçülür veya Bradford protein ölçümü kullanılır. Ancak, saflaştırmada kullanılan bazı reaktifler bu ölçümlere aykırı düşebilirler. Örneğin, imidazol (poli-histidin işaretli proteinlerin saflaştırılmasında kullanılır) bir amino asit analogudur ve toplam protein ölçümünde kullanılan bisinşoininik asit ölçümüne etki eder. Düşük kaliteli imidazolda bulunan katışkılar da 280 nm'de soğurur, dolayısıyla morötesi absorbansına dayanan protein ölçümleri hatalı olur.
Protein saflığını belirlemekte kullanılan bir diğer yöntem, yüzey plazmon resonansıdır (YPR). YPR sayesinde proteinlerin bir yonga (silikon çip) yüzeyine bağlanması algılananabilir. Eğer arzu edilen protein bir antikora bağlı ise, yonga yüzeyine olan bağlanma oranı, söz konusu protein cinsinden ölçülebilir. Bu yolla proteinin toplam proteine oranı da belirlenebilir.

Protein saflaştırma yöntemleri

Proteinleri saflaştırmak için kullanılan yöntemler kabaca analitik ve preparatif yöntemler olarak ayrılabilir. İkisi arasındaki fark, kullanılan yöntemle ne kadar protein üretilebildiğine bağlıdır. Analitik yöntemlerde, bir karışım içindeki protein tespit edilip, miktarının belirlenmesi amaçlanır; preparatif yöntemlerde ise başka amaçlar için (yapısal biyoloji veya endüstriyel kullanım gibi) bir proteinin büyük miktarda üretilmesi amaçlanır. Genelde, preparatif yöntemler analitik amaçla da kullanılabilir ama bunun tersi doğru değildir.
Protein saflaştırması için çeşitli yöntemler mevcuttur ve genelde bunlardan birkaçının kombinezonu sonucu kullanılır. İlk defa saflaştırılacak bir protein durumunda bunlardan hangisinin uygulanacağı, kısmen deneme yanılma esasıyla belirlenir. Alternatif yöntemler arasında karar kılınırken göz önünde tutulan faktörlerden bazıları, harcanan zaman, malzemelerin masrafı ve elde edilen proteinin kalitesidir.

Ekstraksiyon (özütleme)

Bazı durumlarda bir doku veya hücrenin parçalanarak arzu edilen bir proteinin çözelti içine sokulması gerekir. Bu amaca ulaşmanın birkaç yolu vardır: tekrarlı dondurma ve eritme, sonikasyon, yüksek basınçla homojenizasyon, filtreleme, veya organik çözücülerle hücre zarının geçirgenleştirilmesi (permeabilizasonu). Seçilecek yöntem, proteinin ne derece hassas olduğu ve hücrelerin ne derece sağlam olduğuna bağlıdır. Bu özütleme sürecinden sonra çözünür proteinler çözelti içine girerler; hücre zarı, DNA ve diğer hücre bileşenlerinden santrifüjleme yoluyla ayrıştırılabilirler. Bu süreçte hücrenin proteazları da çözeltiye karışıp ve diğer proteinleri sindirmeye başlayabilirler. Eğer saflaştırılacak protein bu proteazlar tarafından parçalanmaya (proteoliz) duyarlı ise, bu işlemin hızla tamamlanması ve özütün soğuk tutulması tercih edilir, proteolizi yavaşlatmak için.

Çökeltme ve ayrımcı çözeltme

Toptan protein saflaştırmasında, yaygın olakrak kullanılan bir ilk adım, amonyum sülfat ( (NH₄)₂SO₄ ) gibi yüksek çözünürlüklü bir tuz ile proteinlerin çökeltilmesidir. Bu işlemde, çözeltiye giderek artan miktarda amonyum sülfat eklenir ve farklı protein çökelek fraksiyonları toplanır. Bu yöntemin bir avantajı, çok büyük hacimler için dahi oldukça ucuz olmasıdır. Proteinleri ayrımcı olarak çökeltmek için butanol veya etanol gibi organik çözücüler de kullanılabilir.
Isıya dayanıklı bazı proteinlerin saflaştırılmasında kullanılan bir yöntem, ısıtma yoluyla diğer proteinleri denatüre etmektir. Denatüre olan proteinler çökelir, ısıya dayanıklı olan protein ise sıcaklık azaltıldıktan sonra tekrar katlanıp doğal konformasyonuna kavuşur. Çökelen proteinler çözeltide kalanlardan santrifüjleme yoluyla ayrılabilir.
Membran proteinlerinin saflaştırılması için hücre zarının parçalanması gerekir, böylece arzu edilen bir membran proteinin diğer membran proteinlerinden ayrılabilir. Sodyum dodesil sülfat (SDS) gibi bir deterjan hem hücredeki membranları çözmek hem de membran proteinlerini çözelti içinde tutmak için kullanılabilir. Ancak, eğer söz konusu proteinin saflaştırma sırasında üç boyutlu yapısını muhafaza etmesi arzu ediliyorsa, daha mülayim deterjanlar (Triton X-100 veya CHAPS gibi) kullanılır, çünkü SDS proteinlerde denatürasyona yol açar.
Hücrenin belli bir organelinde (mitokondri gibi) bulunan bir proteinin saflaştırılması durumunda, önce o organelin saflaştırılması, ardından o organeldeki proteinin saflaştırılmasına gitmek verimli bir yoldur.

Dializ

Dializ, protein saflaştırmasının çeşitli aşamalarında proteinlerin küçük moleküllerden ayrıştırılması için kullanılan bir işlemdir. Örneğin, amonyum sülfat ile çökeltmenin ardından kullanılacak bir iyon değişim kromatografisi (bkz. aşağıdaki bilgili bölüm) adımı için bu tuzun giderilmesi gerekir, bunun için diyaliz yapılır. Diyalizde, yarı geçirgen bir membran kullanılır, porlu bir selüloz membran gibi. Porların büyüklüğü proteinlerin geçmesine izin vermez ama küçük moleküller ve tuz iyonları geçebilir. Diyaliz edilecek protein karışımı bir dializ torbasına konur, torba da büyük hacimli bir tampon çözeltisi içine yerleştirilir. Birkaç saat sonra torbanın dışındaki ve içindeki çözelti dengelenir, iki taraf küçük moleküller bakımından aynı bileşime sahip olur.

Kromatografik yöntemler

Genelde bir protein saflaştırma protokolünde bir veya daha çok kromatografik adım bulunur. Kromotografideki temel uygulama, proteini içeren bir çözeltinin, içinde özel bir malzeme (genelde "reçine" tabir edilir) bulunan bir kolon (cam veya metal bir boru) içinden geçirilmesidir. Çözelti kolon içinde ilerlerken farklı proteinler reçine ile farklı şekilde etkileşir ve bu nedenle kolonun içinden geçme süreleri farklı olur. Kolonun öbür ucundan çıkan proteinler zamana bağlı olarak farklı tüplerde toplanır, böylece arzu edilen protein karışımdaki diğer proteinlerin çoğundan ayrılmış olarak elde edilir. Bazı durumlarda proteinler kolon malzemesine sıkıca bağlanırlar, sonradan özel şartların uygulanması ile kolondan koparlar; kopmalarını sağlayan şartlar proteinden proteine fark eder. Proteinler kolondan çıkarken genelde 280 nm dalga boylu ışığı soğurmaları ile tespit edilirler. Çeşitli kromatografik yöntemler mevcuttur:

Etiketli bir proteinin saflaştırılması

Bir proteine RuBPS gibi bir etiket takılması sayesinde normalde olmayan bir bağlanma afinitesine sahip olabilir. Genelde, karışım içindeki proteinler arasında bu afiniteye sahip olan tek rekombinant protein bu olduğundan, etiketin varlığı saflaştırmayı büyük oranda kolaylaştırır. En yaygın kullanılan etiket, Histidin etiketidir (His-tag), bunun nikel ve kobalt iyonlarına afinitesi vardır. Dolayısıyla, nikel veya kobalt iyonlar bir reçine üzerinde sabitlenerek, histidin etiketli proteinleri spesifik olarak bağlayan bir afinite yüzeyi elde edilmiş olur. Saflaştırılacak protein histidin etiketli tek protein olduğu için, karışımda bulunan diğer tüm proteinler kolona bağlanmadan içinden geçerler, ve geriye sadece reçineye bağlanmış olan histidin etiketli protein kalır. Bu proteinin daha sonra yıkama (elüsyon) denen bir işlemle kolondan çıkması sağlanır. Histidin etiketi kullanılması durumunda, elüsyon için imidazol kullanılır, çünkü bu bileşiğin halka yapısı histidininkine benzer ve nikel iyonlarına bağlanmak için histidin etiketleri ile yarışır.  Arzu edilen protein, yıkama sıvısının ana bileşenidir, ikinci bir saflaştırma adımı (boy dışlama kromatografisi veya yüksek performanslı sıvı kromatografi gibi) kullanılması ile, istenmeyen diğer ikincil katışkılardan kolaylıkla arındırılabilir.
Bir proteini etiketlemenin  bir diğer yolu, genetik mühendislik yoluyla proteinin içine bir antijen peptit dahil etmektir. Sonra, proteini içeren karışım ya bir kolondan geçirilir, ya da sabitlenmiş bir antikor ile kaplanmış gevşek reçine ile karıştırılıp bekletilir (inkübe edilir). Antikor sadece o antijen peptit ile spesifik bağlanma yaptığı için, kolon (veya reçine) yüzeyine bağlanan sadece arzu edilen protein olur. Bu işleme immünopresipitasyon (immüno-çökeltme) denir. Diğer proteinler çözeltide kaldığı için onlar reçineye bağlanmış etiketli proteinden kolaylıkla ayrılırlar. Antikora bağlı protein ise daha sonradan pH veya tuzluluk değişikliği ile reçine yüzeyinden akıtılabilir.
Etiketlere gerek kalmayınca bunlar bir proteaz aracılığıyla çıkarılabilir. Bunun olabilmesi için saflaştırılacak protein ile etiket arasına genetik mühendislik yoluyla önceden bir proteaz kesme dizisi eklenir.

Saflaştırılmış proteinin konsantrasyonu

Protein saflaştırmasının sonunda, protein genelde büyük bir hacim içinde bulunur ve konsantre edilmesi gerekir. Bunun için çeşitli yöntemler mevcuttur.

Liyofilizasyon

Eğer çözelti içinde proteinden başka çözünür bileşik bulunmuyorsa, protein liyofilize edilebilir (dondurulurak kurutulabilir). Bu çoğu zaman bir HPLC işleminden sonra yapılır. Böylece tüm uçucu bileşenler gider ve geriye proteinler kalır.

Membran filtrelemesi

Seçici geçirgen membranlar kullanılarak proteinler konsantre edilebilir. Su ve küçük moleküller membranın içinden geçer, protein ise geride kalır. Çözeltinin membranın içinden geçmeye zorlanması için mekanik bir pompa, gaz basıncı veya santrifügasyon kullanılabilir.

Elektroforez

Jel elektroforezi hem analitik hem preparatif amaçla kullanılabilen, yaygın bir laboratuvar tekniğidir. Elektroforez, bir elektrik alan içinde iyonları hareketidir.

Denatürasyonlu elektroforez

Çok yaygın kullanılan bir yöntem olan sodyum dodesil sülfat (SDS) poliakrilamit jel elektroforezinde, proteinler bir deterjan (SDS) ile denatüre edilirler. Bu şartlar altında proteinler katlanmış hallerini kaybeder ve negatif yüklü deterjan molekülleri ile kaplanırlar. Elektrik alanı içinde, bu deterjan kaplı  proteinler boyları ile ters orantılı bir hızla hareket ederler, böylece büyüklüklerine göre ayrışırlar.
Bu yöntem analitik amaçla kullanıldığında, bir jel içinde ayrıştırılan proteinlerın yerleri, Kumasi boyası ve Gümüş boyaması ile tespit edilir. Preparatif yöntemlerde elektroforetik jelin içinden proteinin izole edilmesi gerekir. Proteinin bulunduğu jel bölgesi kesilip çıkarılabilir veya protein jelin ucundan dışarı akarken doğrudan toplanabilir.
Saflaştırma stratejisi bakımından değerlendirildiğinde, denatürasyonlu elektroforez yüksek ayrırım gücü sağlar (boy dışlama kromatografisine kıyasla) ama kromotografik kolon yöntemler kadar kolaylıkla yüksek miktarda protein saflaştırılmasına ölçeklenemez.

Denatürasyonsuz elektroforez

Proteinler SDS ile denatüre edilmeden de bir jel içinde elektroforez ile ayrıştırılabilirler. Ancak, SDS-PAJE'de olduğu gibi üzerlerindeki yük boyları ile orantılı olmaz, hareket hızları hem kütlelerinin, hem taşıdıkları elektrik yükünün hem de şekillerine bağlı olur.

İzoelektrik odaklama

İzoelektrik odaklamada, proteinlerin içinde hareket ettikleri jel bir pH gradyanına sahiptir. Numune jelin bir tarafına yerleştirilip elektrik akımı verilince, proteinler hareket etmeye başlar. Her protein, yüksüz olduğu pH'de hareketini durdurur.  Böylece proteinler izoelektrik noktalarına göre ayrıştırılabilirler. İzoelektrik odaklama, iki boyutlu jel elektroforezinin genelde birinci adımı olarak kullanılır. Bu teknik protein saflaştırmasında preparatif bir adım olarak da kullanılabilir.