เอเอฟแอลพี

ขั้นที่สอง

คือ การเพิ่มปริมาณชิ้นดีเอ็นเอบางส่วนโดยใช้ไพรเมอร์ที่จำเพาะ ไพรเมอร์ที่ใช้มีลำดับเบสทางปลาย 5’ เหมือนกับลำดับเบสของ adapter ต่อด้วยลำดับเบสบริเวณจดจำหรือบริเวณตัดจำเพาะของเอนไซม์ และเพิ่มเบสเข้าไปที่ปลาย 3’ อีกส่วนหนึ่งเพื่อให้เกิดการคัดเลือกเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอบางชิ้น ส่วนของไพรเมอร์ที่เหมือนกับ adapter และบริเวณจดจำของเอนไซม์ เรียกว่า common part ส่วนเบสที่เพิ่มเข้าไปที่ปลาย 3’ เรียกว่า selective part จำนวนเบสที่เพิ่มเข้าไปที่ปลาย 3’ จะช่วยลดจำนวนดีเอ็นเอที่จะเพิ่มปริมาณลง โดยชิ้นดีเอ็นเอที่จะเพิ่มปริมาณได้ต้องมีลำดับเบสที่อยู่ต่อกับตำแหน่งตัดจำเพาะของเอนไซม์สอดคล้องกับเบสที่เพิ่มเข้าไป ถ้าเพิ่มเบสเพื่อคัดเลือกมากขึ้นจำนวนชิ้นดีเอ็นเอบที่จะเพิ่มจะลดลงประมาณ 4 เท่าต่อทุกๆ เบสที่เพิ่มขึ้น ในการศึกษาจีโนมขนาดเล็กหรือโคลนที่อยู่ในพลาสมิด คอสมิด หรือ BAC (bacterial artificial chromosome) ไม่จำเป็นต้องเพิ่มเบสเพื่อคัดเลือก เนื่องจากจำนวนชิ้นดีเอ็นเอที่เกิดจากการตัดโดยเอนไซม์ตัดจำเพาะมีจำนวนน้อยอยู่แล้ว สิ่งมีชีวิตที่มีจีโนมขนากไม่ใหญ่มาก เช่น แบคทีเรีย หรือ เชื้อรา จะเพิ่มเบสเพื่อคัดเลือก 1-2 เบส ส่วนพวกที่มีจีโนมขนาดใหญ่จะเพิ่มเบสมากกว่า 2 เบสที่ไพรเมอร์ทั้งสองชนิด ไพรเมอร์ที่เพิ่มเบสเพื่อคัดเลือกที่ปลาย 3’ จะเรียกว่าเป็นไพรเมอร์ +1, +2, +3 และ +4 ตามลำดับ เช่น ไพรเมอร์ทางปลาย EcoRI adapter จะเรียกว่า EcoRI+1, EcoRI+2, EcoRI+3, EcoRI+4 เป็นต้น
การทำ PCR โดยใช้ไพรเมอร์ที่เพิ่มเบสที่ปลาย 3’ มากกว่า 2 เบส จะทำปฏิกิริยาเพิ่มปริมาณ 2 ครั้ง ครั้งแรก เรียกว่า Preselective amplification และการทำ PCR ครั้งที่ 2 เรียกว่า selective amplification การทำปฏิกิริยา Preselective amplification เป็นการเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอต้นแบบให้มากขึ้น และ ช่วยให้เกิดการคัดเลือกเพิ่มปริมาณชิ้นดีเอ็นเอที่ถูกต้อง มีการทดลองเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอเพียงครั้งเดียวโดยใช้ไพรเมอร์ที่เพิ่มเบสเพื่อคัดเลือก +1,+2,+3 และ +4 เบสตามลำดับ พบว่า จำนวนชิ้นดีเอ็นเอที่เพิ่มปริมาณได้ลดลงเป็นลำดับจากการใช้ไพรเมอร์แบบ +1,+2,+3 และ +4 แสดงถึงประสิทธิภาพในการคัดเลือกที่ถูกต้อง แต่ไพรเมอร์ +4 ให้ผลไม่สอดคล้องกัน สามารถตรวจพบแถบดีเอ็นเอจำนวนมากที่ไม่ตรงกับแถบดีเอ็นเอที่เกิดจากการเพิ่มปริมาณโดยไพรเมอร์ 1,+2 และ +3 แสดงว่าเกิดการจับคู่ของเบสที่ไม่ถูกต้อง (mismatch) ในตำแหน่งที่อยู่ห่างจากปลาย 3’ 3 เบส หรือ เบสคัดเลือกตัวแรกที่อยู่ติดกับตำแหน่งตัดจำเพาะนั่นเอง ในการทดลองต่อมา พบว่าการเพิ่มเบสเพื่อคัดเลือกครั้งเดียว 3 เบส ก็ทำให้เกิดการจับคู่ไม่ถูกต้องของเบสที่เพิ่มขึ้นตัวแรกสุดได้เช่นเดียวกันแต่เกิดในความถี่ต่ำ ดังนั้น ถ้าต้องการเพิ่มเบสเพื่อคัดเลือกตั้งแต่ 3 เบสขึ้นไป จึงต้องใช้วิธีเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอ 2 ครั้ง โดยครั้งแรกใช้ไพรเมอร์ที่เพิ่มเบสคัดเลือกเพียง 1-2 เบส และครั้งที่ 2 จึงใช้ไพรเมอร์ที่เพิ่มเบสคัดเลือกต่อจากไพรเมอร์ที่ใช้เพิ่มปริมาณดีเอ็นเอในครั้งแรกอีก 1-2 เบส รวมเบสที่เพิ่มเพื่อการคัดเลือก 3-4 เบสตามที่ต้องการ
การทำปฏิกิริยาเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอเป็น 2 ขั้น นอกจากเป็นการประกันว่า การคัดเลือกเพิ่มปริมาณชิ้นดีเอ็นเอของไพรเมอร์ที่ใช้เป็นไปอย่างถูกต้อง และมีประสิทธิภาพสูงสุดแล้ว ยังช่วยลด background ที่เป็นพื้นดำในลายพิมพ์ดีเอ็นเอด้วย นอกจากนี้ยังอาจทำ Preselective amplification โดยใช้ไพรเมอร์ที่ไม่มีเบสคัดเลือก (ไพรเมอร์ +0) ได้ในกรณีการวิเคราะห์จีโนมขนาดเล็ก ที่ต้องใช้ไพรเมอร์ที่เพิ่มเบสคัดเลือกจำนวนน้อย เพื่อทำให้ปริมาณดีเอ็นเอเพิ่มมากขึ้น และสามารถตรวจสอบแถบดีเอ็นเอได้ชัดเจนขึ้น (สุรินทร์, 2552)

ขั้นสุดท้าย

คือ การวิเคราะห์ลายพิมพ์ดีเอ็นเอที่ได้โดยทำอิเล็กโทรโฟรีซิสใน denaturing polyacrylamide gel แบบเดียวกับที่ใช้หาลำดับเบสของดีเอ็นเอ แถบดีเอ็นเอที่เหมาะสมในการแยก โดยวิธีนี้อยู่ในช่วง 50-100 แถบ การตรวจสอบแถบดีเอ็นเอที่เกิดขึ้นใช้วิธีการติดฉลากไพรเมอร์ชนิดใดชนิดหนึ่งด้วยสารกัมมันตรังสี หลังจากทำอิเล็กโทรโฟรีซิสเสร็จแล้ว ตรวจผลโดยการทำออโตเรดิโอกราฟ หรืออาจใช้วิธีติดฉลากด้วยสารเรืองแสง (fluorescent dye) แล้วตรวจสอบโดยใช้เครื่องหาลำดับเบสแบบอัตโนมัติ (automated sequencer) ก็ได้ จากการที่ต้องตรวจสอบผลการทำ AFLP โดยใช้สารกัมมันตรังสี หรือใช้เครื่องหารลำดับเบสแบบอัตโนมัติ ทำให้เกิดข้อจำกัดในห้องปฏิบัติการหลายแห่ง เนื่องจากขาดประสบการณ์และระบบการปฏิบัติงานที่ใช้สารกัมมันตรังสี หรือไม่สามารถซื้อเครื่องหาลำดับเบสอัตโนมัติที่มีราคาแพงได้ จึงมีการประยุกต์ใช้วิธีตรวจสอบ AFLP ด้วยการไฮบริไดเซชันโดยใช้โพรบ (Probe)ที่ติดฉลากด้วยสารปลอดรังสี (non radioactive label)หรือวิธีย้อมเจลด้วยซิลเวอร์ไนเตรท (silver staining) ซึ่งให้ผลเป็นที่น่าพอใจ และ สามารถทำได้ในห้องปฏิบัติการทางดีเอ็นเอทั่วไป (สุรินทร์, 2552)

ความแตกต่างระหว่างลายพิมพ์ AFLP (Differences between AFLP fingerprints)

คือ ลายพิมพ์ดีเอ็นเอที่เกิดจากการทำ AFLP มีลักษณะเป็นลายพิมพ์แบบสุ่ม (random fingerprint) ซื่งใช้กับดีเอ็นเอใดๆก็ได้ ไม่ขึ้นกับขนาดและความซับซ้อนของจีโนม สามารถปรับให้เกิดลายพิมพ์ที่เหมาะสมโดยการปรับจำนวนเบสคัดเลือกที่ปลาย 3’ ของไพรเมอร์ที่ใช้ แม้ว่าวิธีการทำ AFLP จะค่อนข้างยุ่งยาก แต่ผลที่ได้นับว่าดี เพราะสามารถทำซ้ำได้ผลคงเดิม (reproducible) และสามารถเลือกคู่ผสมของไพรเมอร์ได้หลายแบบ ทำให้เกิดลายพิมพ์ดีเอ็นเอจำนวนมาก ในการเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอโดยไรเมอร์คู่หนึ่งๆ นั้นจะเกิดแถบดีเอ็นเอจำนวนมากในเวลาเดียวกัน แบบของแถบดีเอ็นเอที่แตกต่างกันในแต่ละตัวอย่าง หรือพอลิเมอร์ฟิซึมที่เกิดขึ้น มาจากการเปลี่ยนแปลงเบส (point mutation) มีตำแหน่งจดจำของเอนไซม์ ทำให้ตำแหน่งจดจำของเอนไซม์หายไปหรือเกิดขึ้นใหม่ หรือการเปลี่ยนแปลงของเบสที่ตำแหน่งติดกับตำแหน่งจดจำของเอนไซม์ ตรงส่วนที่มีการเพิ่มเบสเพื่อคัดเลือกของไพรเมอร์ที่ใช้ ทำให้สามรถหรือไม่สามารถเพิ่มปริมาณชิ้นดีเอ็นเอดังกล่าวแล้วแต่กรณี หรือ อาจเกิดจากมีชิ้นดีเอ็นเอสั้นๆ ขาดหายไป หรือ สอดแทรกเข้ามา(deletion/insertion) ในระหว่างตำแหน่งตัดจำเพาะของเอนไซม์ ผลที่เกิดขึ้น คือ การมีแถบดีเอ็นเอหรือไม่มีแถบดีเอ็นเอที่ตำแหน่งนั้นๆ หรือชิ้นดีเอ็นเอที่เพิ่มปริมาณได้มีขนาดเปลี่ยนไป การถ่ายทอดลักษณะของแถบดีเอ็นเอจากการทำ AFLP จึงมีทั้งแบบที่แสดงลักษณะข่ม (dominance) โดยปรากฏเป็นการมีหรือไม่มีแถบดีเอ็นเอ และแบบที่แสดงลักษณ์ข่มร่วมกัน (codominance) โดยปรากฏเป็นแถบดีเอ็นเอที่มีขนาดต่างกัน โดยทั่วไปจะพบเครื่องหมาย AFLP (AFLP marker) แบบที่เป็นลักษณะข่มมากกว่า