มิญชวิทยา

การคงสภาพด้วยฟอร์มัลดีไฮด์และสารเคมีอื่นๆ

สารคงสภาพใช้ป้องกันเนื้อเยื่อจากการเสื่อมสภาพและยังช่วยรักษาโครงสร้างแล้วส่วนประกอบต่างๆ ภายในเซลล์ (e.g., nucleus, endoplasmic reticulum, mitochondria). สารคงสภาพที่ใช้โดยทั่วไปสำหรับการเตรียมเนื้อเยื่อศึกษาด้วยกล้องจุลทรรศน์แบบแสง คือ 10% บัฟเฟอร์ฟอร์มาลีน (4% ฟอร์มัลดีไฮด์ ใน ฟอสเฟตบัฟเฟอร์ซาไลน์). For electron microscopy, the most commonly used fixative is glutaraldehyde, usually as a 2.5% solution in phosphate buffered saline. These fixatives preserve tissues or cells mainly by irreversibly cross-linking proteins. The main action of these aldehyde fixatives is to cross-link amino groups in proteins through the formation of CH₂ (methylene) linkage, in the case of formaldehyde, or by a C5H10 cross-links in the case of glutaraldehyde. This process, while preserving the structural integrity of the cells and tissue can damage the biological functionality of proteins, particularly enzymes, and can also denature them to a certain extent. This can be detrimental to certain histological techniques. Further fixatives are often used for electron microscopy such as osmium tetroxide or uranyl acetate

Frozen Section Fixation

Frozen section เป็นวิธีการที่รวดเร็วสำหรับการรักษาสภาพเนื้อเยื่อตัวอย่าง และ  ติดตั้งตัวอย่างเนื้อเยื่อ. โดยถูกใช้ในการวินิจฉัยเพื่อการผ่าตัดกำจัดเซลล์มะเร็ง วิธีนี้ใช้สำหรับการผ่าตัดเซลล์มะเร็งและหาขอบเขตภายหลังการผ่าตัดเซลล์มะเร็ง 
การแช่แข็งเนื้อเยื่อตัวอย่างจะใช้เครื่องมือที่เรียกว่า cryostat หลังจากที่เนื้อเยื่อที่ถูกแช่แข็งแล้วจะถูกสไลซ์ด้วยเครื่องมือตัดที่เรียกว่า microtome, ทำการแช่แข็งและติดตั้งตัวอย่างเนื้อเยื่อบนกระจกสไลด์ สำหรับการย้อมสีตัวอย่างสามารถกระทำได้เช่นเดียวกับวิธีการติดตั้งตัวอย่างแบบอื่นๆ สำหรับเนื้อเยื่อบางชนิดก็ต้องใช้การย้อมสี (stained) แบบพิเศษ เช่น แอนติบอดี้ (antibody) ต้องใช้วิธีการที่เรียกว่า การย้อม immunofluorescence

การดึงน้ำออกและแทรกซึม

เนื่อเยื่อจำเป็นต้องถูกฝังอยู่ในวัสดุที่แข็งพอเพื่อให้สามารถตัดออกมาเป็นเซคชั่นได้ โดยทั่วไป ความหนา 5 μm (ไมโครเมตร; 1000 ไม่โครเมตร = 1 มิลลิเมตร) สำหรับกล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสง และ 80-100 nm (นาโนเมตร; 1,000,000 นาโนเมตร = 1 มิลลิเมตร) สำหรับกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอน สำหรับกล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสงจะใช้พาราฟินเป็นหลัก เนื่องจากเป็นสารที่ไม่ละลายน้ำและเนื่อเยื่อในสิ่งมีชีวิตมักประกอบด้วยน้ำ ในขั้นแรกจึงต้องมีการดึงน้ำออกจากเนื่อเยื่อ โดยการนำเนื้อเยื่อผ่านเอทานอลความเข้มข้นจากต่ำไปสูง ตามด้วยสารเคลียริ่ง โดยทั่วไปคือไซลีนเพื่อนำแอลกอฮอล์ออกจากเนื้อเยื่อ และทำให้เนื้อเยื่อใส, สุดท้ายคือพาราฟินซึ่งจะเข้าไปแทนทีไซลีนในเนื้อเยื่อและทำให้เนื้อเยื่อมีความแข็งพอ. 
อย่างไรก็ตาม พาราฟิน ไม่สามารถทำให้เนื้อเยื่อแข็งพอที่จะตัดเซคชั่นให้บางสำหรับกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนได้ จึงใช้วัสดุเรซินแทน. Epoxy resins are the most commonly employed embedding media, but acrylic resins are also used, particularly where immunohistochemistry is required. Thicker sections (0.35μm to 5μm) of resin-embedded tissue can also be cut for light microscopy. Again, the immiscibility of most epoxy and acrylic resins with water necessitates the use of dehydration, usually with ethanol.

การฝังเนื้อเยื่อ

After the tissues have been dehydrated and infiltrated with the embedding material they are ready for embedding. During this process the tissue samples are placed into moulds along with liquid embedding material which is then hardened. This is achieved by cooling in the case of paraffin wax and heating in the case of the epoxy resins (curing). The acrylic resins are polymerised by heat, ultraviolet light or chemical catalysts. The hardened blocks containing the tissue samples are then ready to be sectioned. 
Formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) tissues may be stored indefinitely at room temperature, and nucleic acids (both DNA and RNA) may be recovered from them decades after fixation, making FFPE tissues an important resource for historical studies in medicine. 
Embedding can also be accomplished using frozen, non-fixed tissue in a water-based medium.  Pre-frozen tissues are placed into moulds with the liquid embedding material, usually a water-based glycol or resin, which is then frozen to form hardened blocks.

การตัดเซคชั่น

For light microscopy, a glass knife mounted in a microtome is used to cut 10-micrometer-thick tissue sections which are mounted on a glass microscope slide. For transmission electron microscopy, a diamond knife mounted in an   ultramicrotome is used to cut 50-nanometer-thick tissue sections which are mounted on a 3-millimeter-diameter copper grid. Then the mounted sections are treated with the appropriate stain. 
Frozen tissue embedded in a freezing medium is cut on a microtome in a cooled machine called a cryostat.

Staining

Biological tissue has little inherent contrast in either the light or electron microscope. Staining is employed  to give both contrast to the tissue as well as highlighting particular features of interest. Where the underlying mechanistic chemistry of staining is understood, the term histochemistry is used. Hematoxylin and eosin (H&E) is the most commonly used light microscopical stain in histology and histopathology. Hematoxylin stains nuclei blue; eosin stains the cytoplasm pink. Uranyl acetate and lead citrate are commonly used to impart contrast to tissue in the electron microscope.
Special staining: There are hundreds of various other techniques that have been used to selectively stain cells and cellular components. Other compounds used to color tissue sections include safranin, oil red o, Congo red, fast green FCF, silver salts, and numerous natural and artificial dyes that were usually originated from the development dyes for the textile industry.
Histochemistry refers to the science of using chemical reactions between laboratory chemicals and components within tissue. A commonly performed histochemical technique is the Perls Prussian blue reaction, used to demonstrate iron deposits in diseases like hemochromatosis.
Histology samples have often been examined by radioactive techniques.  In historadiography a slide (sometimes stained histochemically) is X-rayed.  More commonly, autoradiography is used to visualize the locations to which a radioactive substance has been transported within the body, such as cells in S phase (undergoing DNA replication) which incorporate tritiated thymidine, or sites to which radiolabeled nucleic acid probes bind in in situ hybridization.  For autoradiography on a microscopic level, the slide is typically dipped into liquid nuclear tract emulsion, which dries to form the exposure film.  Individual silver grains in the film are visualized with dark field microscopy.
Recently, antibodies are used to specifically visualize proteins, carbohydrates, and lipids: this is called immunohistochemistry, or when the stain is a fluorescent molecule, immunofluorescence. This technique has greatly increased the ability to identify categories of cells under a microscope. Other advanced techniques, such as nonradioactive in situ hybridization, can be combined with immunochemistry  to identify specific DNA or RNA molecules with fluorescent probes or tags that can be used for immunofluorescence and  enzyme-linked fluorescence amplification (especially alkaline phosphatase and tyramide signal amplification).  Fluorescence microscopy and confocal microscopy are used to detect fluorescent signals with good intracellular detail.  Digital cameras are increasingly used to capture histological and histopathological image

Alternative techniques

Alternative techniques include cryosection. The tissue is frozen and cut using a cryostat.  Tissue staining methods are similar to those of wax sections. Plastic embedding is commonly used in the preparation of material for electron microscopy.  Tissues are embedded in epoxy resin. Very thin sections (less than  0.1 micrometer) are cut using diamond or glass knives.  The sections are stained with electron dense stains (uranium and lead) so that they can possibly be seen with the electron microscope.

History

In the 19th century, histology was an academic discipline in its own right.  The 1906 Nobel Prize in Physiology or Medicine was awarded to histologists Camillo Golgi and Santiago Ramon y Cajal.  They had dueling interpretations of the neural structure of the brain based in differing interpretations of the same images. Cajal won the prize for his correct theory and Golgi for the staining technique he invented to make it possible.

Artifacts

Artifacts are structures or features in tissue that interfere with normal histological examination. These are not always present in normal tissue and can come from outside sources. Artifacts interfere with histology by changing the tissues appearance and hiding structures. These can be divided into two categories:

Pre-histology

These are features and structures that have being introduced prior to the collection of the tissues. A common example of these include: ink from tattoos and freckles (melanin) in skin samples.

Post-histology

Artifacts can result from tissue processing. Processing commonly leads to changes like shrinkage, color changes in different tissues types and alterations of the structures in the tissue. Because these are caused in a laboratory the majority of post histology artifacts can be avoided or removed after being discovered. A common example is mercury pigment left behind after using Zenker's fixative to fix a section.