Molekulárne klonovanie

Molekulárne klonovanie, tiež nazývané expresné klonovanie je súbor metód molekulárnej biológie vyvinutých v 70. rokoch 20. storočia pre prípravu a replikáciu tzv. rekombinantnej DNA určenej na produkciu ňou kódovaného proteínu v hostiteľskom organizme. Produkcia proteínov rekombinantnými technikami je výhodná z viacerých dôvodov, predovšetkým z dôvodov väčších výťažkov produkcie rekombinantného proteínu, jeho jednoduchšej purifikácie a tiež pre možnosť produkcie vybraného alebo prakticky ľubovoľného úseku proteínu alebo sekvencie aminokyselín. 
V najbežnejšom experimente je vyžadovaná DNA izolovaná z organizmu alebo nasyntetizovaná pomocou restrikčných endonukleáz zaklonovaná do tzv. vektoru a tento vektor rozšírený o vyžadovanú DNA je vnesený do hostiteľského organizmu, v ktorom sa nechá namnožiť. Následne je vektor izolovaný a purifikovaný .

Vektor

Klonovací vektor je typicky dvojvláknová molekula DNA, ktorá sa môže v hostiteľských bunkách reprodukovať, a do ktorej je vkladaná rekombinantná DNA.

Vírusové vektory

Vektory odvodené od vírusov prakticky infikujú hostiteľské bunky. Typickým je baktériofág λ, ktorý umožňuje vnesenie inzertu dlhého až do 16 000 párov bází. Inzert vo fágovi nahrádza 48 500 párov báz dlhý nepotrebný úsek ich genómu a do fága sa vnáša in vitro zbaľovacím systémom. Zlepšené fágy, do ktorých možno klonovať DNA pomocou tzv. cos miest, môžu niesť až 49 000 párov báz dlhú rekombinantnú DNA; nazývajú sa kozmidy. Ďalšími použiteľnými vírusovými systémami sú baktériofág M13 (inzert do 1 000 párov báz) a baculovírus (do 15 000 párov báz), ktorým sa infikujú hmyzie bunky.

Vektory YAC a BAC

Väčšia rekombinantná DNA môže byť zaklonovaná do tzv. umelého kvasinkového chromozómu (YAC, z angl. yeast artificial chromosome) alebo umelého bakteriálneho chromozómu (BAC, z angl. bacterial artificial chromosome). YAC sú lineárne chromozómy obsahujúce všetko potrebné pre replikáciu v kvasinkách. BAC sú odvodené od kruhového baktériochromozómu, sú replikované v E. coli, a ich na jednu bunku pripadá v priemere jeden takýto umelý chromozóm.

Ligácia

Po naštiepení vektoru aj inzertu restrikčnými endonukleázami na nich vznikajú lepivé konce, ktorých bázy sú navzájom komplementárne. Tieto konce sa navzájom párujú a na ich vzájomné prepojenie sa používa ďalší enzým - ligáza. Väčšinou ide o T4 DNA ligázu izolovanú baktériofága T4 .

Transformácia

Pojem transformácia znamená v molekulárnej biológii prenesenie DNA do hostiteľského organizmu. Bunky hostiteľského organizmu musia byť za účelom transformácie tzv. kompetentné, čiže schopné DNA prijať. Laboratórne sa pripravujú kompetentné bunky vystavením bivalentným iónom (typicky chloridom horečnatým) a následným tepelným šokom, čím sa zvyšuje fluidita cytoplazmatickej membrány a v prípade G- baktérií znižuje množstvo proteínov v lipopolysacharidovej vrstve.

Selekcia

Aby boli bunky hostiteľského organizmu, ktoré prijali vektor, rozlíšiteľné od buniek ostatných, je potrebné ich selektívne odlíšiť. Najčastejšie ide o selekciu pomocou antibiotika, pri ktorej sú hostiteľské bunky ponechané rásť v médiu obohatenom o antibiotikum, na ktoré nesie daný vektor rezistenciu. Bunky, ktorý daný vektor nemajú, na takomto médiu uhynú. Ďalšou možnosťou selekcie je využitie upraveného génu lacZ'. Tento gén kóduje enzým ß-galaktozidázu, ktorá je schopná okrem galaktózy štiepiť aj molekulu X-gal (5-brómo-4-chlóro-3-indolyl-ß-D-galaktozid). Táto molekula je bezfarebná, no produkt jej štiepenia ß-galaktozidázou (5-brómo-4-chlóro-3-hydroxyindol) je modrý. Selekcia je prevedená tak, že zaklonovaním inzertu do vektoru sa naruší gén lacZ' a preto kolónie hostiteľských buniek so správne zaklonovanými vektormi nemajú modrú farbu, na rozdiel od ostatných .

Purifikácia a verifikácia

Z kolónií sú dané vektory izolované a purifikované kombináciou metód centrifugácie a chromatografie. Ak nebola použitá selekcia pomocou lacZ' génu, je potrebné overiť, či bol daný vektor správne zaligovaný (mohlo dôjsť, napríklad, ku opätovnej ligácii oboch koncov pôvodného vektoru). Pre overenie sa používa PCR, restrikčná analýza, sekvenácia DNA alebo hybridizačné techniky ako napr. Southern blot.