PCR

Polymerase Chain Reaction (PCR, på norsk polymerasekjedereaksjon (PKR)) er en metode for å amplifisere (lage mange kopier av) en bestemt DNA-sekvens uten bruk av levende organismer. Teknikken kan bare brukes til å lage korte sekvenser (maksimum rundt 40 kb), f.eks. et gen eller en del av et gen.

Historikk

Amerikaneren Kary B. Mullis utviklet PCR-metoden tidlig på 1980-tallet, da han var den første som rapporterte bruk av en termostabil DNA-polymerase til å amplifisere DNA. Mullis, som på den tiden arbeidet for bioteknologiselskapet Cetus, fikk Nobelprisen for dette arbeidet i 1993. Cetus solgte senere patenten for metoden til Roche Molecular Systems. 
Grunnprinsippet for PCR (uten bruk av termosensitiv DNA-polymerase) ble imidlertid først utviklet av den norske biokjemikeren Kjell Kleppe, som da arbeidet i H. Gobind Khorana sin forskningsgruppe ved Universitetet i Wisconsin. Allerede i 1969 presenterte Kleppe sine arbeider på Gordon-konferansen i USA og disse arbeidene ble publisert i 1971. Det er senere blitt kjent (i radiointervju med Nobelprisvinneren Arthur Kornberg) at Stuart Linn, som var ordstyrer ved Kleppes presentasjon, senere brukte denne informasjonen i forelesninger, hvor bl.a. Kary B. Mullis var tilstede. På den tiden da Kleppe og hans kollegaer gjorde sine eksperimenter var det flere forhold som bidro til at PCR, slik vi kjenner metoden i dag, ikke ble utviklet. Det skyldtes først og fremst at termostabile DNA-polymeraser ikke var tilgjengelige og at det på den tiden tok svært lang tid å kjemisk syntetisere DNA, som brukes som primere (se nedenfor).

Bruksområder

PCR benyttes for å produsere mange kopier av enkelte deler av DNA, for eksempel ved isolering av et gen eller deler av et gen fra genomisk DNA. Forskere ønsker ofte å isolere enkeltgener for å undersøke funksjonen til proteinet som produseres fra genet. Diagnostisk brukes PCR for å påvise feil (mutasjoner) i gen, og det benyttes også av kriminalteknikere ved såkalt DNA fingerprinting.

Prinsipp

Den doble DNA-tråden denaturerer og splittes i to enkelttråder ved temperaturer omkring 93-98°C. Dette gjør det mulig å få tilgang til sekvensen som ellers ligger gjemt inne i dobbelttråden. Primere, som er designet av brukeren og tilsettes i reaksjonen, kan binde til ønsket sekvens i DNA. Et enzym kopierer sekvensen, normalt ved 72°C. Deretter denatureres DNA igjen, og dette gjentas 15-30 ganger for å få ønsket mengde kopier av DNA-fragmentet. PCR foregår i spesielle maskiner som justerer temperaturen automatisk ut fra et forhåndslaget program.
Kopieringen av DNA ved PCR skjer eksponentielt. Fra hvert templat oppstår det to kopier, som i sin tur et opphavet til to nye kopier og så videre.

Kort om DNA

DNA består av to tråder med basepar som er komplementære til hverandre. Det betyr at en sekvens i den ene tråden har en "negativ" motsats i den andre. Dette er mulig på grunn av at basene danner par i fastsatte mønstre: adenin (A) pares med tymin (T), og guanin (G) med cytosin (C).

DNA polymerase

DNA produseres av enzymet DNA polymerase. For at polymerasen skal kunne syntetisere nytt DNA er den avhengig av tre ting: en kodende sekvens som fungerer som templat, en startsekvens som er koplementær til templatet, og tilgang på frie nukleotider (A, T, G og C bundet til karbohydratet deoksyribose og en fosfatgruppe).

Polymeraser i PCR

Vanligvis opererer enzymer best ved relativt lave temperaturer, typisk 15-40°C. Ved temperaturer høyere enn dette vil de vanligvis denatureres og miste form og funksjon. Siden PCR-reaksjoner foregår ved opp mot 100°C, vil vanlige polymeraser være ubrukelige. I PCR tilsettes derfor polymeraser fra termofile bakterier som finnes i varme kilder og andre steder med ekstreme temperaturer og temperatursprang. Tidligere var det DNA polymerasen fra Termofilus aquaticus som var mye brukt, men etter hvert har en rekke andre polymeraser kommet på markedet fra kommersielle aktører.

Primere - starten på det hele

Genomisk DNA kan være enormt og bestå av flere millioner eller milliarder basepar. For å kunne finne det riktige genet trenger man en primer. Dette er korte DNA-fragment på 15-30 basepar som er koplementære til sekvensen man er ute etter og dermed er i stand til å binde til den kodende tråden. I en PCR-reaksjon trengs to primere, kalt primerpar; en i starten på genet (forward primer) og en i slutten (revers primer). Når primerne binder til templatet kan polymerasen syntetisere nytt DNA. Design av primere er viktig for utbyttet av PCR-reaksjonen. Ikke bare må de binde til riktig sekvens, men de må også ha rett smeltetemperatur og lengde for å kunne binde til riktig DNA-sekvens.

Utførelse

Først må det lages en blanding med nødvendige ingredienser. Disse er: DNA-templat, en blanding av to typer primere, DNA-polymerase (enzym) og nukleotider (dNTP). Dette blandes sammen i en buffer som gir det riktige kjemiske miljøet og settes så i en PCR-maskin (termosykler), som er en varmeblokk av metall. Denne kan programmeres til å heve og senke temperaturen raskt. Prosessen i maskinen foregår i tre hovedtrinn:

Trinn 1: Denaturering

PCR-maskinen varmer opp blandingen til ca. 95ºC (temperaturen kan heves noe hvis templatet er stort) i rundt 1 minutt eller mer. Da denatureres DNA, dvs. at det går fra dsDNA til ssDNA fordi hydrogenbindingene mellom nukleotidene i spiralen brytes. Bindingene i enkelttrådene brytes først ved høyere temperaturer.

Trinn 2: Hybridisering (annealing)

Blandingen avkjøles til ca. 50ºC (40-70ºC), og denne temperaturen skal være lav nok til at primerne kan binde seg til templaten. Begge primerne er spesielt designet for å være komplementære til hver sin ende av det DNA som skal amplifiseres (mål-DNA), dvs. til flankerende DNA. De hybridiserer til hver sin tråd. Størrelsen på en primer er normalt 20-30 baser, og hvor høy temperaturen i dette trinnet kan være er avhengig av størrelsen; for at en primer skal kunne feste seg, må temperaturen være under smeltepunktet til primeren(vanligvis ca. 5ºC under). Smeltepunktet varierer med størrelsen slik at store primere har høyt smeltepunkt. Både veldig små og veldig store primere kan være problematisk å bruke.

Trinn 3: Polymerisering

Mål-DNA blir syntetisert av DNA polymerase fra primerne. Dette skjer ved ca. 72ºC. Ved oppvarming til 95ºC ved denatureringen vil DNA polymerase fra E. coli. ødelegges. Hvis man skal slippe å tilsette ny polymerase for hvert polymiseringstrinn, må det brukes et enzym som tåler høyere temperaturer. Derfor brukes en varmestabil DNA polymerase fra bakterien Thermus aqaticus, kalt Taq polymerase. Denne fungerer best ved 72ºC. DNA-syntesen går fra den frie 3’OH-enden på begge primere. Primer 1 syntetiserer den ene DNA-tråden, mens primer 2 syntetiserer den andre. De to første produktene vil være halvlange, siden flankerende DNA fra bare den ene siden (før primeren) er borte fra det opprinnelige templatet.

Gjentakelse

Prosessen starter da på nytt med de tre trinnene, og de 4 trådene etter første runde blir i andre runde til 8. 2 av de 4 nye trådene vil da være korte, dvs. at de bare inneholder mål-DNA og primere (flankerende DNA fra den andre siden er også fjernet). Dette er de som er syntetisert fra de halvlange trådene fra første runde. I videre runder vil det fortsatt bare være 2 lange tråder, mens 2 nye halvlange vil syntetisere fra de lange for hver ny runde. Antallet av de korte (som er viktige) vil imidlertid øke eksponentielt. Den totale mengden tråder etter n runder er 2^(n+1). Hver runde tar 4-5 minutter. Man kan f.eks. la PCR-reaksjonen gå 30 runder, slik at den totale tiden blir 2-3 timer.

Feilkilder

Det er ikke alltid man ved bruk av PCR får en mengde av det riktige DNA-produktet – det er mange feilkilder. Dette kan være:

Unøyaktighet

Ved DNA polymerisering kan feil base komme inn. Dette skjer oftere ved PCR enn med DNA-kopiering inne i celler (in vivo).

Falsk negativ

Hvis det ikke kommer et DNA-produkt, kan det være naturlig å tro at primeren ikke passer, men det kan også ha andre årsaker. Dette kan være f.eks. gal temperatur eller at primere hybridiserer med hverandre.

Falsk positiv

Primeren kan hybridisere flere steder langs templat-DNA, noe som kan gi uønskede DNA-produkter.

Analyse

For å undersøke om det riktige resultatet er oppnådd, kan man gjøre en gel elektroforese med en ladder (blanding av DNA-fragmenter med kjent størrelse) å sammenlikne med. Da ser man om det finnes syntetisert DNA og i så fall om denne har riktig størrelse.