Organoģenēzes regulācija

Eksplanta lielums

Organoģenēze lielā mērā ir atkarīga tieši no eksplanta lieluma. Lielākiem eksplantiem, kas sastāv no parenhīmas, vaskulārajiem audiem un kambija, ir augstāka reģenerēšanās spēja nekā mazākiem eksplantiem

Eksplanta izcelsmes vieta un sezona

Līdzīgi kā baktērijām, arī augu audu kultūru masas, šūnu skaita vai orgānu lieluma pieaugumu raksturo sigmoidāla matemātiskā līkne. Dažādiem eksplantiem var būt nepieciešams dažāds ievākšanas laiks  Auga daļai, no kuras ņemts eksplants, ir nozīmīga loma organoģenēzes potenciāla paredzēšanā. Piemēram, kā eksplantu no zieda Sanpaulijas var izmantot lapas fragmentus lapas dzīslojuma tuvumā, no Krizantēmas - galotņu pumpurus, no mūžzaļā rododendra – no ziedpumpura atdalītas auglenīcas apakšējo daļu, no tomātiem - to sēklas, no burkāna - burkāna saknes kambija apvidu. Savukārt ievākšanas sezona var ietekmēt, vai vispār iespējams panākt organoģenēzi no izvēlētā auga (LU Botāniskā dārza personāla pers.ziņ.).

Eksplanta vecums

Dažādi augi uzrāda dažādus attīstības posmus, kad vislabāk sagatavot eksplantus. Piemēram, adventīva dzinuma reģenerācija Nicotina sp. ( Tabaka) lapu eksplantu gadījumā novērojama tikai tad, ja eksplanti ir ievākti auga veģetatīvajā fāzē – pirms ziedēšanas

Skābekļa gradients

Orgānu veidošanos augu audu kultūrā ietekmē arī pievadītā (augu audu kultūrai pieejamā) skābekļa daudzums. Piemēram, dažās augu kultūrās vasas veidošanās notiek tikai tad, kad skābekla daudzums ap augu audu kultūru ir samazināts. Savukārt sakņu attīstībai nepieciešams augsts skābekļa gradients.

Gaismas kvalitāte un intensitāte

Augu audu kultūru attīstību lielā mērā ietekmē gan tas, kādos apstākļos attīstās konkrētā kultūra (gaismā / tumsā), gan arī gaismas/tumsas attiecība, gaismas kvalitāte un intensitāte. Pētījumi ar dažādiem gaismas viļņu garumiem liecina, ka t.s. zilā gaisma pozitīvi ietekmē pumpuru un sāndzinumu veidošanos, savukārt īsāks gaismas viļņu garums – sarkanā gaisma – pozitīvi ietekmē sakņu veidošanos  Liela gaismas intensitāte piemērota organoģenēzei, kamēr maza gaismas intensitāte piemērota kallusa uzturēšanai . Gaismas veida maiņa arī ietekmē augu audu kultūras attīstību, tāpat arī tas, vai apgaismojums ir dabīgs vai mākslīgs (D. Graudas pers.ziņ.). Dažādi veiktie eksperimenti liecina, ka augu audu kultūru attīstība ir atkarīga no apgaismojuma. Tā, piemēram, burkāna kallusa kultūras, kas augušas tumsā, daudz retāk sintezē hlorofilu, nekā tās pašas augu audu kultūras, kas ņemtas no tiem pašiem eksplantiem un ar relatīvi vienādiem pārējiem faktoriem (barotnes sastāvs, temperatūra u.c.), un augušas gaismā.

Temperatūra

Lai arī lielāko daļu augu audu kultūru var veiksmīgi kultivēt 25⁰C, būtu jāņem vērā arī izvēlētā auga, no kura ņemts eksplants, dabīgās vides sastopamās temperatūras. Dažādu sīpolaugu sugu optimālā kultivēšanas temperatūra var būt zemāka, ap 15⁰ vai 18⁰C, savukārt tropisko augu kultivēšanas temperatūras optimums var būt augstāks par “istabas temperatūru” – 27⁰C palmām vai 30⁰C Monstera deliciosa (Garšīgā monstera, izplatīts istabas augs).

Barotnes sastāvs

Svarīgākās jebkuras augu audu kultūru barotnes sastāvdaļas ir makro un mikro elementi. Augu šūnu sekmīgai attīstībai in-vitro nepieciešamas arī citas sastāvdaļas, kā vitamīni, aminoskābes, ogļhidrāti (oglekļa avots), kalcija sāļi u.c. Mēdz uzskatīt, ka minerālelementi nepieciešami ne tikai augu šūnu veiksmīgai attīstībai, bet var kalpot arī kā signālelementi auga attīstībā. Bieži dažādām augu audu kultūrām ir nepieciešami dažādi barotņu sastāvi, ne tikai starp dažādu augu dzimtām, bet arī sugām; būtisku lomu spēlē arī vēlamais augu audu kultūras attīstības virziens. Barotņu izstrāde ir kā viens no sākuma posmiem katras augu audu kultūras pētnieka uzdevumiem, jo, tā kā augu audu kultūras ietekmē vairāk nekā viens faktors un iespējams visi faktori vēl nemaz nav zināmi, bartotne, kas ir atbilstoša vienā pasaules malā var nebūt piemērota citā (D. Auzenbahas pers. ziņ.). Daļēji augu audu kultūras attīstību ietekmē arī tas, vai barotnei ir pievienots agars (t.s. šķidrās un cietās barotnes – cietajām barotnēm pievienots agars). Lai arī agars nav būtisks barotnes sastāvam, dažādi agari, pirmkārt, var saturēt piemaisījumus, kas var ietekmēt kultūras attīstību, un otrkārt, ja barotnē ir augsta agara koncentrācija, tie apgrūtināta barotnē esošo sastāvdaļu difūzija, kas var ietekmēt organoģenēzi

Barotnes pH

Lielākoties augu audu kultūru pH tiek pielāgots starp 5,2 – 5,8. Ja, pagatavojot barotni, pH ir augstāks, pievieno 1M HCl ( Sālsskābe ), ja zemāks, pievieno 1M NaOH ( Nātrija hidroksīds ). Augu audu kultūrai atrodoties barotnē, tā var izdalīt dažādus blakusproduktus, kas var uzkrāties barotnē un kaitēt kultūras attīstībai, pazeminot barotnes pH līmeni

Augu hormoni

Jau 19. gs. dzīvās dabas pētnieki konstatēja, ka ķīmiskiem signāliem ir loma augu augšanas regulācijā. Mūsdienās daudzi no šiem ķīmiskajiem signāliem ir identificēti kā fitohormoni  20. gs. pirmajā pusē tika demonstrēti pirmie pierādījumi, kas liecināja tieši par fitohormonu lomu augu orgānu attīstībā. Skoog (1944) novēroja, ka noteiktos apstākļos auksīnu pievienošana sķidrajai barotnei kavēja orgānu diferenciāciju tabakas audu kultūrās. Vēlāk tika demonstrēts, ka ne vien atsevišķi fitohormoni, bet arī attiecība starp dažādu fitohormonu koncentrācijām ietekmē orgānu veidošanos un citas auga attīstības izpausmes  Pie fitohormoniem pieskaita dažādus strukturāli nesaistītus ķīmiskos savienojumus, kurus augi paši sintezē un kuri regulē augu augšanu, attīstību un mijiedarbību ar vidi. Svarīgākie augu hormoni ir abscizskābe, auksīni, brasinosteroīdi, citokinīni, giberelīni, etilēns, jasmonskābe un salicilskābe . Organoģenēzē īpaši nozīmīga ir fitohormonu ietekme tieši uz meristēmu šūnām, no kurām veidojas auga orgāni (Durbak, Amanda, Hong Yao, and Paula McSteen. (2012) Hormone signaling in plant development. Current opinion in plant biology 15.1: 92-96). Pirmie fitohormoni, kuru ietekme uz orgānu veidošanos in vitro tika pētīta, bija auksīni  Tie ir iesaistīti ļoti daudzos augu fizioloģijas un attīstības procesos. Piemēram, augsta auksīna un citokinīna koncentrācijas attiecība barotnē ierosina sakņu veidošanos, bet zema attiecība - vasas veidošanos no kallusa  Auksīna un citokinīna koncentrācijas attiecība regulē arī citu orgānu, kā ziedu pumpuru un veģetatīvo pumpuru veidošanos. Auksīna gradienti, ko uztur transporta proteīni, vērojami arī veselos augos  Savukārt lokāla auksīna koncentrācijas palielināšanās nepieciešama, lai veidotos jaunas lapas  vai sānsaknes . Tātad dažādu auga orgānu attīstībā būtiska nozīme ir gan auksīna lokālai koncentrācijai, gan koncentrācijas gradientam visā augā, gan mijiedarbībai ar citiem augu hormoniem. Auksīna iedarbība ir saistīta gan ar transkripcijas regulāciju, gan ar citiem mehānismiem  Daudzos augu attīstības procesos ir iesaistīti arī citokinīni. Citokinīni vieni paši neizraisa jaunu orgānu veidošanos eksplantu kultūrās, taču tie regulē auksīna transportieru darbību un līdz ar to arī auksīna gradientus augā , kas saskan ar iepriekš minēto, ka daudzu orgānu veidošanās atkarīga tieši no auksīna un citokinīna koncentrāciju attiecības. Interesanti, ka citokinīnam ir loma arī mijiedarbībā starp augiem un mikroorganismiem, tai skaitā slāpekli fiksējošo gumiņu veidošanās procesā . Iespējams, tas saistīts ar to, ka citokinīnu signālceļi ir līdzīgi signālu sistēmām, kādas sastopamas baktērijās  Giberelīni vislabāk pazīstami ar savu stimulējošo iedarbību uz orgānu augšanu garumā un lomu sēklu un ziedu attīstībā , tomēr tabakas audu kultūrā dažādu giberelīnu koncentrācijas paaugstināšana inhibē sakņu un vasas veidošanos  Kā redzams šeit aprakstītajos piemēros, fitohormonu iedarbība ir kompleksa, un bieži ietekmi uz organoģenēzi nosaka vairāku hormonu kombinācija nevis viens atsevišķs hormons, un vieni un tie paši ķīmiskie signāli var atšķirīgi ietekmēt dažādas augu sugas . Orgānu veidošanos regulē gan labi pazīstamie tradicionālie fitohormoni (auksīni, citokinīni, giberelīni utt.), gan arī dažādi jaunatklāti ķīmiskie signāli, piemēram, strigolaktons , un šobrīd vēl tāls ceļš ejams līdz pilnīgai izpratnei par fitohormonu darbības mehānismiem organoģenēzē un citos augu attīstības posmos.