Somatiskā embrioģenēze

Embriogēnās kultūras iniciācija

Katra auga somatiskā šūna satur visu nepieciešamo ģenētisko informāciju, lai varētu reģenerēt veselu augu, līdz ar to, lai varētu sākties somatiskā embrioģenēze vispirms ir nepieciešams apturēt tā brīža somatiskās šūnas gēnu ekspresiju, un jāpanāk embrioģenēzes sākšanai nepieciešamā gēnu ekspresija. Embrijos un sēkleņos ir ekspresēti aptuveni 3*10⁴ gēnu un aptuveni 3,500 gēni ir iesaistīti tieši embriju veidošanā. DNS metilēšana auksīna ietekmē ir viena no iespējām, kā pārtraukt tā brīža gēnu ekspresiju. Fitohormoni un izraisītais stress ir galvenie faktori, kuri izraisa signālu kaskādi, kas noved pie gēnu ekspresijas izmaiņām. Šo izmaiņu rezultātā sākās vairākkārtēja šūnu dalīšanās, kas noved vai nu pie neorganizētā kallusa veidošanās vai arī pie polārās dalīšanās, kas aizsāk somatisko embrioģenēzi. Visas šūnas nespēj uzsākt somatisko embrioģenēzi, ko skaidro ar šūnu specifisko jūtīgumu pret auksīnu vai arī šūnu individuāli raksturīgajiem auksīna receptoriem. Divi nozīmīgākie mehānismi, kas norit šajā posmā ir šūnu asimetriskā dalīšanās un kontrolēta pagarināšanās. Asimetrisko dalīšanos ierosina fitohormoni, kas ietekmē šūnu polaritāti un maina pH vai elektrisko lauku ap šūnām.
Parasti izmanto auksīnu, lai panāktu mezglainas formas proembriālās massas veidošanos, kā arī daudzām augu sugām izmanto auksīnu un citokinīnu konkrētā koncentrācijā un savstarpējā attiecībā. Konkrētām sugām arī citu augšanas regulējošo savienojumu pievienošana var veicināt iniciāciju.
Augu sugām atšķiras spēja veidot somatiskos embrijus, daļa var veidot tos no jebkāda eksplanta veida, bet citām tikai no konkrētiem juvenīlu augu daļu eksplantiem.

Embriogēnās kultūras proliferācija

Pēc embriogēno šūnu izveidošanās tās turpina dalīties palielinot proembriogēno masu, jo auksīns inhibē somatisko embriju veidošanos. Embriogēno kallusu var turpināt audzēt uz puscietas barotnes, bet ja nepieciešams lielāks apjoms labāk izvēlēties šķidro barotni, kultūras uzturēšanai nepieciešams pazemināts pH. Kultūru ir nepieciešams pārnest jaunā barotnē ik pēc 1—4 nedēļām, lai nodrošinātu nepieciešamās barības vielas un atbilstošo augšanas regulatoru koncentrāciju. Embriogēnā kallusa kultūru nav iespējams uzturēt neierobežotu laiku, jo tai zūd spēja veidot somatiskos embrijus, kā arī ar laiku palielinās somaklonālās mainības risks.
Lai saglabātu kultūru embriogēnā kallusa veidā ilgāk par sešiem mēnešiem, var izmantot kriosaglabāšanas metodes.

Somatisko embriju priekšnobriešana

Šis posms nodrošina pāreju no proembriogēnās masas uz organizētu somatisko embriju attīstību, ko panāk pārtraucot auksīna ietekmi. Vispirms izmanto sintētisko auksīnu 2,4-D, kas sekmē un nostiprina proliferāciju, bet netiek pilnībā metabolizēts kā dabīgais auksīns, bet pēc tam kultūru pārceļ uz barotni, kas nesatur auksīnu, lai veicinātu tālāku somatisko embriju attīstību. Šajā brīdī kultūra sastāv gan no atsevišķām šūnām, gan šūnu agregātiem, lai sinhronizētu šūnu attīstību tās var skalot vai izsijāt.

Somatisko embriju nobriešana

Nobriešanas posmā norit vairākas morfoloģiskas un bioķīmiskas izmaiņas. Veidojas uzkrājējorgāni, dīgļlapas vienlaicīgi norit rezerves vielu akumulācija, kā arī ir bremzēta dīgšana un attīstās sausuma stresa izturība. Somatiskie embriji uzkrāj tos pašus savienojumus, ko no zigotas attīstījušies embriji, bet to daudzums un sintēze process var atšķirties.
Nobriešanas stimulācijai dažām sugām pievieno abscīzskābi, it sevišķi tas nepieciešams skuju kokiem, kā arī tā nomāc sekundāro embrioģenēzi un pāragru dīgšanu. Parasti apstrāde ar abscīzskābi ilgst mēnesi. Bez abscīzskābes arī citi faktori, tādi kā etilēns, osmotiskais stress, pH, fotoperiods var ietekmēt somatisko embriju attīstību.
Sēklās embriju nobriešanu apstādina izžūšana, jo tā rezultātā samazinās metaboliskā aktivitāte. Sēklām uzņemot ūdeni, tās sāk dīgt, jo tādā veidā tiek pārmainīta gēnu ekspresija no embriju nobriešanas uz dīgšanu. Bet ir arī rekalcitranti embriji, kas nepanes izžūšanu, līdz ar to tiem neapstājās attīstība nobriešanas periodā.
Somatiskajiem embrijiem miera periodu panāk arī tos pakļaujot sausuma ietekmei, tam izmanto osmotiski aktīvas vielas (dažādus sāļus, aminoskābes, cukurus u.c.), vai tie tiek turēti pazeminātā temperatūrā. Strauja ūdens uzņemšana sākotnējā dīgšanas procesā ir graujoša ietekme, tādēļ jānodrošina pakāpeniska mitruma atgūšana, ko var nodrošināt nobriedušos embrijus noturot petrī platēs ar atbilstošu gaisa mitrumu.

Jaunā auga reģenerācija

Par veseliem un dzīvotspējīgiem augiem attīstīsies tikai tie embriji, kuri ir uzkrājuši pietiekoši daudz barības vielas, un ir ieguvuši pietiekošu sausuma stresa toleranci. Lielākoties somatiskie embriji attīstās par nelieliem augiem līdzīgi sēklu dīgstiem barotnēs bez augšanas regulējošiem savienojumiem, bet ir sugas kurām auksīnu un citokinīnu pievienošana veicina dīgšanu. Augiem sasniedzot atbilstošu izmēru tos pārstāda ex vitro, kur sākotnēji nepieciešams nodrošināt augstu gaisa mitrumu. Tālākajā augu attīstības gaitā lielākoties nav novēroja atšķirība starp augiem, kuri ir izaudzēti no sēklām, tomēr dažu sugu augiem, kas izaudzēti no somatiskajiem embrijiem ir vērojama somaklonālā mainība.