Naujos kartos sekoskaita

Signalo apdorojimas

Signalo apdorojimas – procesas, kurio metu tikslinis signalas atskiriamas nuo foninio signalo. Šis pirminis žingsnis, dėl savo technologinio sudėtingumo įtakoja visą tolesnę analizės eigą ir yra pirminė klaidų dažnio didėjimo sekoskaitos eigoje tendencingumo priežastis. Iššūkius su kuriais susiduriama signalo apdorojimo metu vaizdžiai galima atskleisti IonTorrent sekoskaitos pavyzdžiu (1 pav.). Vykstant sekoskaitai sintezės metu, matuojamas srovės pokytis mikrograndyno šulinėliuose, kai į DNR grandinę įjungus nukleotidą atsiskiria vandenilio jonas. Nustatomas srovės pokytis yra ypatingai mažas ir jį labai įtakoja tėkmėse (angl. flows) naudojamų reagentų neefektyvus pašalinimas, bei ne 100 % efektyvumu vykstanti DNR sintezė, dėl ko kyla fazinis triukšmas, kuris kiekviename sekoskaitos cikle vis stiprėja.

Nuskaitymų analizė

Surikiavus milijonus NKS nuskaitymų (angl. read allignment), prasideda duomenų analizės žingsniai, tokie kaip genomo surinkimas (angl. genome assembly]) ar surinktų skirtingų fragmentų kiekybinis įvertinimas, kuriuose ir atsiskleidžia perdengimo tendencingumo daroma žala. Perdengimo tolygumas yra ypač svarbus RNR sekoskaitoje (RNA-Seq), chromosomų imunoprecipitacijos sekoskaitoje (ChIP-Seq) ar kopijų skaičiaus nustatymui dedikuotuose sekoskaitos eksperimentuose, kur reikalingas tikslus kiekybinis įvertinimas. NKS generuojami duomenys smarkiai nukrypsta nuo teorinio tolygaus nuskaitymų pasiskirstymo. Ypač dideliu tendencingumu pasižymi GC turtingų sekų, kurios sudaro ir daugybę žmogaus genome esančių promotorių, sekoskaita (5 pav.). Prastai perdengtose genomų srityse tampa sudėtinga nustatyti VNP (angl. SNP), taip pat šios sritys yra kritiškos De novo genomų surinkimui, nes gaunama tik daug trumpų sąrankų (angl. contig). Literatūroje plačiai aprašomi GC sudėties, sudėtingų sričių, genų ilgio (RNR sekoskaita) bei nuo DNR fragmentacijos ar sekoskaitos sistemai specifinių adapterių ligavimo priklausantys NKS tendencingumai bei būdai jiems stebėti ir išvengti.

DNR fragmentavimo tendencingumas

Didesni ar mažesni DNR fragmentavimo tendencingumai stebimi naudojant plačiai taikomus NKS fermentinius (DNazės, transpozazės, restrikcijos endonukleazių mišiniai) ir mechaninius (sonifikacija, nebulizacija, hidrodinaminis skaldymas ir kt.) DNR fragmentavimo metodus. Šie tendencingumai gali sumažinti tam tikrų genomo sričių padengimus, nes DNR jose, dėl nepalankios bazinės sudėties, bus suskaldyta į sekoskaitos sistemai per ilgus ar per trumpus fragmentus, kurie iš analizės bus pašalinti. Fragmentavimo tendencingumus paprasta stebėti sekų vizualizacijos įrankiais (pLogo, bLogo, kt.) generuojamuose grafikuose. Grafikų generavime naudojamos nuskaitymų pradžios ir galo pozicijos prilygintos prie šabloninio (angl. reference) genomo (11 pav.).

Sekoskaitos sistemai specifinių adapterių ligavimo tendencingumas

Pats populiariausias NK sekoskaitos sistemai specifinių DNR adaptorinių sekų pridėjimo būdas išlieka ligavimas. Adapteriai dažniausiai liguojami AT lipniais ar bukais galais. Yra pastebėta, kad buko ligavimo tendencingumas yra daug mažesnis už AT ligavimo tendencingumą (12 pav.), bet, kadangi DNR ligavimo tendencingumas yra pakankamai mažas palyginti su kitais sekoskaitos tendencingumais, todėl yra svarbus tik tais atvejais, kai dirbama su mažais sekų perdengimais. Ligavimo tendencingumą (taip pat ir DNR fragmentavimo tendencingumą) stebėti patogu grafikuose, kuriuose išreikštas kiekvieno nukleotido pasikartojimo dažnis nuskaitymų pradžioje ir gale (dažniausiai pateikiamos ne ilgesnės nei 10 bazių sritys, kurios, manoma, gali kontaktuoti su fermentu ir įtakoti reakcijos eigą).
Labai reikšmingas ligavimo tendencingumas yra stebimas ruošiant sekoskaitai mažų RNR (sRNR) bibliotekas. Prie sRNR adapteriai liguojami panaudojant RNR ligazes, kurios rodo tendencingumą ne RNR sekai, o adapterių ir sRNR antrinei struktūrai (13 pav.). Ligavimas efektyviausias tada, kai po reakcijos gauta RNR sudaro stabilias antrines struktūras. Sorefan K. et al. NKS būdu nuskaitė bibliotekoms ruošti ekvimoliariniais kiekiais panaudotas degeneruotos sekos trumpas RNR ir gautus kiekybinius rezultatus palyginęs su bioinformatiniais metodais nustatyta nuskaitytų RNR antrinių struktūrų minimalia laisvąja energija (MLE), pastebėjo ryškią koreliaciją tarp sekų dažnio NKS ir MLE reikšmės.
Dėl RNR ligavimo tendencingumo NKS duomenis reikia atsargiai naudoti sRNR kiekybiniam įvertinimui. Tikimasi, jog pašalinus RNR ligavimo tendencingumą, NKS būdu bus galima atrasti daug naujų mažųjų RNR.