トロンボテスト

検査法の歴史

診断薬の開発の歴史においては、1959年ポール・オーレン(Paul Owren：ノルウェイ）により開発された。
INRにおける診断法においては、国際血栓止血学会の科学標準化委員会におけるトロンボプラスチン製剤の標準化により、動物あるいはヒト由来原材料を利用したPT測定のINR表記が普及してきている。PT測定による単位としてのINR表記であり、PT-INR測定法という診断法ではないことに留意すべきである。
日本、北欧やオーストリアなどの欧州では、トロンボテストによるワルファリンのモニタリングが検査法として利用されている。近年、Owren-Type PT 試薬として一般的に普及している。その理由は、ワルファリンをモニタリングする検査薬の測定精度という観点で、トロンボテストの方がPT測定法よりも、ワルファリン投与によって生ずるビタミンK依存性凝固タンパク質（第Ⅱ因子、第Ⅶ因子、第X因子）を正確に測定できるというアッセイ原理になっているからである。Quick一段法とも呼ばれているPT測定は、第Ⅱ因子、第Ⅶ因子、第X因子だけではなく、フィブリノゲン（第I因子）および第V因子の影響を含めた凝固活性としてINRに影響を及ぼすことを考慮する必要がある。 INRとTT(%)の関係は一般的に以下となる。
INR 1.0 =　TT 100% 　INR 2.0 =　TT 17% 　INR 3.0 =　TT 9%　。

※下記の参考文献に欧州でのOwren PT (TT)　法の概要を記載する。

ワルファリンを投与するとビタミンKサイクルにおいて、Glaドメインを欠いたビタミンK依存性血液凝固因子（Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、X、PC、PS、PZなど）が不活性化されて、PIVKA　を生じる。古くから、1970年代にはDensonやHemkerらにより、組織因子（TF）の種差（ヒト、ウサギ、ウシなど）の影響により、PIVKAに対する感受性　あるいは　PIVKAによる阻止反応、あるいはPIVKAを含んで測定される、という理解があった。しかしながら、1980年代に始まった、WHOによる国際標準化においては、このPIVKAの存在によるIRP（International Reference Preparation）の違いやISI値への影響は、全く言及されていないことに着目しなければならない。したがって、今日のPTおよびTT測定においては、PIVKAの存在によりINRへの影響が無いという理論を前提にISI/INRシステムが成り立っている。　

被検者のクエン酸加ナトリウム全血あるいは血漿を採取する。近年では血漿を検体に用いる事が一般的である。血漿（30μL）を試験管に採取し、予め37℃加温されたトロンボテスト試薬（250μL）を添加して凝固するまでの時間を測定する。トロンボテスト試薬の成分は、ウシ大脳由来の組織因子（英名：Tissue Factor）、ウシ吸着血漿およびカルシウムからなる生物製剤である。近年、遺伝子組換え技術による遺伝子組換えウシ組織因子を用いる事により、BSE（狂牛病）のリスクが回避できる凝固検査薬が開発されており、今後も動物由来原料に依存せず、均質かつ安定的な凝固検査試薬が継続的に供給される時代になってきた。
＜プレスリリース＞
＜日経バイオ＞

上述したISI/INRシステムの歴史およびトロンボプラスチン製剤の混乱と標準化の経緯は参考文献を参照してください。

トロンボテストの意義

上記の概略とも重複するが、トロンボテスト試薬（TT）やプロトロンビン時間測定試薬（PT）はワルファリンという抗凝固薬の出血リスクをモニタリングするためにノルウェイ（北欧）のオーレン（Owren）先生が開発されてきた凝固検査薬である。
一方、北米のクイック（Quick）による一段法のプロトロンビン測定（PT）では組織因子(トロンボプラスチン)の動物種特異性の違いにより、抗凝固療法のコントロールで混乱を生じた時代が続いてきた。こうした事情より1960年代に国際血栓止血学会（ISTH：International Society on Thrombosis and Haemostasis）が中心となって検査の標準化というどこでも統一された検査結果が得られるような取り組みが進められ、1982年に第一次国際参照物質IRP（International Reference Preparation）のヒト大脳由来の Human Combined Thromboplastin 試薬という現在のトロンボテスト試薬のヒト大脳TFによる国際標準試薬が製造され、以後、Human plain (BCT/253)と呼ばれるヒト大脳PT試薬も製造されており、今日では凝固検査値をINR（International Normalized Ratio）として報告できるようになった。なお、PT測定検査では、トロンボテスト（TT）検査のように、凝固活性（%）では全く統一した活性（%）を得ることができないスクリーニング検査であるので、やむを得ず、標準化という対策により、凝固時間を比で算出して算術的に対数処理されたINRが導入されたという経緯がある。トロンボテスト（TT）試薬は、国際感度指標（ISI）という検査試薬の測定感度が一定に高感度であり、検査値（INRや活性%）に高い精度が得られる測定系から成り立っている。
※下記の参考文献に欧州でのOwren PT (TT)　法の概要を記載する。

このように、国際的な標準化の流れが早くからPT測定試薬を中心に日本へも導入されてきたにも関わらず、INR表記法に至っては未だにPT試薬の特性の違いや凝固分析装置の特性差に依存して検査データが異なる実態が続いている。なお、トロンボテスト（TT）では日本での臨床経験値やエビデンスが豊富であり、活性（%）での検査値が得られる。近年、PT測定と同じように、INRキャリブレータという検量物質により、欧州ではトロンボテスト（TT）によるINRが得られるシステムも普及してきている。なお、PT-INRとTT試薬のINRの相関性は相関係数r>0.90　という互換性で高いことも検証されており、WHOの国際標準は ISI と INR であり、検査で用いられる凝固検査装置や試薬を規定していない。なお、臨床エビデンスの多い北米では、PT-INRがもっぱら普及しており、欧州ではトロンボテスト（TT）による臨床エビデンスの蓄積により、PTおよびTTによる「INR」でも普及しているのが実態である。
欧州で実施されている国際INRプロジェクトにより、INR表記法によるサーベイラインが随時報告されている。

反応原理

分析科学的に凝固検査という生物学的製剤試薬のアッセイ原理を概説する。
PTは上述にも説明したように北米のQuick一段法に準じており、大過剰の組織因子（TF）を外因系の引き金として血漿に存在する第Ⅶ因子と複合体を形成させて、第V因子、第X因子、そして第Ⅱ因子が順次に活性化されていき、その検体中に存在している患者由来のフィブリノゲン（凝固第I因子）がフィブリンとなって凝固するまでの時間を測定するという原理である。日本だけではなく世界中で最も多く、かつ安価で外因系凝固異常や出血傾向のスクリーニングとして利用されている凝固検査の1つである。PT試薬の測定対象は、凝固第Ⅱ因子、凝固第Ⅶ因子、凝固第X因子だけではなく、凝固第I因子であるフィブリノゲンと凝固第V因子の凝固活性（%）も含めたPT-INR値として測定される事になる。したがって、ワルファリンという抗凝固薬によって測定されるはずの凝固第Ⅱ因子、凝固第Ⅶ因子、凝固第X因子だけではなく、かつ、PT試薬に用いる組織因子の由来差（ヒト胎盤、ウサギ大脳など）のヒト凝固因子への感受性の違いで、第X因子と第Ⅶ因子に高感度になってしまうという特性面の欠点が大きく、ワルファリンにより低下するプロトロンビン（第Ⅱ因子）を実施的に検出できているとは言えない欠点もある。
一方、トロンボテスト（TT）試薬は、1943年にOwren（オスロ大学；ノルウェイ）によってQuick一段法の変法として第V因子の発見と同じ時代に開発された凝固検査試薬である。トロンボテスト試薬中にはウシ大脳由来TF以外に予め第V因子とフィブリノゲンが含有されている。患者検体から持ち込まれる第Ⅱ因子、第Ⅶ因子、第X因子がトロンボテスト試薬に添加されると、微量適量なTFを引き金にして薬そのものが凝固するという反応メカニズムであり、検体中の第V因子とフィブリノゲン濃度に依存しないで実質的に患者検体中のプロトロンビン（第Ⅱ因子）に最も高い感受性を有する試薬特性を持っており、第Ⅶ因子そして第X因子の低下も反映させた複合因子活性を正確に測定できるというアッセイである。凝固時間が延長するとINRが大きくなるが、幅広い凝固時間の測定レンジが得られる試薬特性であることから、実質的に高い測定精度の検査値が得られている。また、ISI値という試薬感度が”1.0”という非常に高い感度を示す試薬であり、PT測定よりも感度の高いアッセイに基づく。なお、国際的に論文等で用いられてきているのはPT-INRであるが、これはやむを得ずロット間差や組織因子（ヒト胎盤やウサギ大脳など）の試薬特性が大きいために標準化せざるを得ないのが実状があったためである。それでも市販PT試薬によっては、検査結果であるINRに乖離や差異が生じることが、しばしば議論されている。
近年、人種差（モンゴロイド、コーカシアン、アフリカン）によってワルファリン薬剤の代謝酵素の遺伝多型が明らかになっている。白人（コーカシアン）では、INRが2〜7という幅広いレンジでモニタリングに利用できるが、一方、我々日本人（モンゴロイド）ではINR2〜3という非常に狭いレンジでモニタリングしなければならないという事も明確になってきた。したがって、INRだけで日本人に適用されるには困難さも知られており、トロンボテスト（TT）試薬による正確な抗凝固能の低下を把握することができる検査法が訴求点として知られている。
このように学問的あるいは国際的な流れだけではなく、論理的かつ実用的なアッセイを把握した上で、ワルファリン抗凝固薬のモニタリングに適した凝固検査試薬を選択する必要性が求められる。

国際感度指標（INR）

トロンボテスト（TT）あるいはプロトロンビン時間（PT）の凝固検査に用いている組織因子（あるいはトロンボプラスチン）という動物臓器種が異なるため、凝固時間にバラツキや種特性の差異が観察される。そこで、上述にも示したが、国際血栓止血学会（ISTH）での標準化委員会において、市販各試薬の特異性のバラツキを算術的に補正するために導入されて現在に至ったのが”INR”（International Normalized Ratio）である。ワルファリンの効果判定の指標は、北米での臨床研究の成果により、INRによって検査結果が報告される時代になってきているが、後述するように、人種（モンゴロイド、コーカシアン、アフリカン）によって、INRの適用範囲がINR=2〜3、あるいは　INR=4〜7など、モニタリングする領域が異なってくる。白人（コーカシアン）では比較的にINR>5であっても出血しにくい傾向があることも経験的に知られている。したがって、北米でのINRをそのまま非常に狭いINR領域（1.5～2.5）を必要とする日本人（モンゴロイド人種）に適用することは危険であることも推測される。　なお、下記の計算式で表される。

INRの理論を整理すると、PT-INR あるいは 単に「INR」という検査結果は、病院施設間での検査値（=INR）の差が少なくなるように算術的に工夫された数値と理解されますが、PTやTT試薬のISI値や測定レンジには出来る限り類似する結果となります。しかしながら、見落とし箇所としては、仮に世界中のPT試薬のISI値が"1.0"で普及する時代になると、検査結果は約40年前のPT比と同じ結果報告になることも欧州の臨床家　Denson らが言及しています。ただ、PT試薬の感度（=ISI）や測定レンジは均質化するが、PT試薬が保有する生物学的製剤としての特異性や正確性の是正には限界があることも理解しなければならない。
また、北米を中心としたINRの標準化を日本にそのまま適用できるとは言い難い。近年、CYP2C9という肝代謝酵素において人種（モンゴロイド、コーカシアン、アフリカン）の差が明確になってきており、遺伝多型の存在により、個人個人のワルファリンの投与量やINRにも影響を与えることが明白になってきた。
なお、INRはワーファリンのモニタリングだけに適用された凝固検査の単位であり、これを肝機能異常や外因系凝固異常症の検査の単位として用いることは、WHOガイドラインでも明記されていないので、INR単位を利用する意味を理解、把握することが重要である。

下記　参考文献　（8）　を参照

検査に用いる各凝固試薬毎にISIという国際感度指標が設定されているので、検査結果をINRに換算して表示すれば、どの凝固試薬を利用しても近似した検査結果（INR）を得ることができる。
なお、トロンボテスト（TT）は、ウシ脳由来の組織因子（トロンボプラスチン）を世界どの製造メーカーでも統一して使用しているために、PT試薬と比較しても、均質な試薬特性を持つことから、臨床検査の施設間のバラツキやINRの差異が少ないと考えられている。
ワルファリンのモニタリングにおいては、国際標準としてINR表記法が普及している。TT試薬においてもINRは適用できる。昭和63年に日本において臨床検査施設で全国サーベイランスが実施されており、TT試薬の適用性が良い事が報告されている。ここでは、PT試薬の施設間差やINRのバラツキが大きいことが言及されており、もっぱら、特異性に差が大きいPT試薬の是正手段としてINRが検討されてきた。

欧州のスカンジナビア地方（ノルウェイ、スウェーデン、フィンランド）、ベネルクス三国（ベルギー、ルクセンブルク、オランダ）、オーストリア、ロシアでは、Owren-Type PT 試薬というトロンボテストの変法がもっぱら普及している。これは、ウシTFあるいはウサギTFにバリウム吸着血漿とカルシウムを加えた”複合凝固因子測定試薬”であり、日本のトロンボテストあるいは複合因子試薬と同じ測定原理に基づく。フィンランドのHorstiらが北欧での普及点やトロンボテスト（TT）測定による抗凝固療法のモニタリングに適しているという臨床論文が近年でも報告がなされている。

参考文献（リンク）

・家庭の医学（第13改訂版）　時事通信社　　（細田瑳一ら監修）
・抗凝固薬の適正な使い方 （第2版）,2008年10月発行　（ISBN 978-4-263-73105-5） 櫻川信男・上塚芳郎・和田英夫 編.　参考書籍：
・抗凝固薬の適正な使い方 （第2版）〜序文の抜粋：
・トロンボテストとINR　
・INRと活性(%)の関係　
・トロンボテスト（TT）ってどんな検査？　
・ワルファリンについて　
・欧州で市販されているOwren TT 試薬について　その①　
・欧州で市販されているOwren TT 試薬について　その②
・欧州で市販されているOwren TT 試薬について　その③
・欧州で市販されているOwren TT 試薬について　その④
・欧州で市販されているOwren TT 試薬について　その⑤
・欧州での国際INRプロジェクト（International INR Project）　レポート　その⑥　PDFファイル