膜電位感受性色素

B. C. 的背景

生物学、医学における光学的観察あるいは光学的測定の歴史は古いが、神経系の研究へもかなり早くから導入されている。

・1848年にはすでに F. Ehrenbergが神経線維に2つの異なった屈折率があることを見いだしたことを Francis O. Schmitt (1939) が Physiological Reviews誌に発表した総説に引用している。

・さらに、1865年には、Klebsが神経線維のミエリン鞘の偏光性についての論文を発表している。

・この線に沿った研究は、やや間を置いて、1920〜30年代に F. O. Schmittらによってとりあげられた (Schmitt, 1939)。これらの研究は、複屈折や偏光性を測定することによって、神経線維やミエリン鞘の微細構造を調べようとしたものである (Schmitt, 1939 ; Schmitt and Bear, 1939)。しかしながら、1940年代の後半になると、この方向での研究は途切れてしまっている。これは、電子顕微鏡の開発によって微細構造についての研究法がそちらへ移ったためと思われる。

一方、19世紀の終わりごろには、神経活動と関係づけたもう1つの方向での光学的研究がみられる。

・Hodge (1892)は、スズメ、ハト、ツバメの生体染色を施した脊髄神経節を連続的に電気刺激して、刺激前後の神経細胞、細胞核、液胞の形や、さらにそれらの色素 (osmic acid) による染まり具合を光学顕微鏡で詳細に観察し比較している。

・同じ時期に、Mann (1894) もまた同様の実験をウサギ、イヌの交感神経節を用いて行い、神経活動に伴って細胞や核の大きさが増大すること、またそれらと Methyl blue や Eosinなどとの親和性が変化することを観察している。これらの研究で注目すべきことは、実験を行うにあたって、彼らが、ニューロン活動の根底にあるエネルギー消費が、何らかの形で神経細胞の形態あるいは神経組織の性状の変化に反映されるはずであるという考えを念頭においていることである。

・さらに生体染色法を用いて、神経活動に伴う神経組織の色素による染まり具合を観察している(Lillie, 1969)。

その後、今世紀に入って、神経活動とより密接に関連づけた光学的測定がなされている。

・その先駆的役割を果たしたのは、F. O. Schmittと O. H. Schmitt (1940) である。彼らは、偏光顕微鏡に光電子増倍管を取り付けて、ヤリイカ (Loligo pealei) の巨大神経線維の電気的興奮に伴う複屈折の変化の測定を初めて試みたが、光学的変化を記録することはできなかった。これは、彼らが用いた当時の装置では感度が不足していたことに起因するもので、彼らも論文の末尾で、この失敗は用いられた測定装値の感度が充分でなかったためであり、もっと性能のよい装置を用いれば記録できるはずであると言及している。

・また、もしカニの歩行脚神経を用いておれば、彼らの感度でも光学的変化は記録できたという可能性については、L. B. Cohen (1973) によって指摘されている。

このSchmittらの研究に続いて神経活動の光学的研究は1950年前後に活発に行われている。その中心となったのは、D. K. Hill, R. D. Keynes, J. M. Tobiasである。

・まず、HillとKeynes (1949) は、不成功に終わったSchmittらの試みをうける形で、カニ (shore crab : Carcinus maenus) の歩行脚神経幹を電気刺激して引き起こされる神経線維の不透明度 (opacity) の変化の測定を行った。彼らの実験では、タングステンランプから神経線維を垂直方向に白色光で照射し、スリットを通して、神経線維からの透過光 (transmitted light) をフォトセルで直接detectしている。これが、現在われわれが用いている光学測定の原型といえる。彼らはこの実験で、1秒当たり50回の電気刺激を5秒から10秒間続け、それに伴う神経線維のopacityの増大を記録することに成功した。神経刺激に伴う光学的変化の記録としては、これがおそらく最初のものである。

・さらに、Hill (1950) は測定装置に改良を加え、カニ (Maia squinado) の歩行脚神経線維を電気刺激 (50～100/secで約5～10秒) することによって、透過光強度（光散乱：light scattering）が増大することを見いだした。彼は、細胞外液の浸透圧を変えたときの神経線維の透過光の変化も調べ、その結果と照らし合わせて、測定された光散乱の変化は神経線維の直径が大きくなったことによることを示唆した。

・Hill (1950)は同様の実験を、イカ (Sepia officialis) の単一巨大神経線維でも行い、この場合も、電気刺激によって光散乱が増加することを見いだし、これも神経線維の直径が大きくなったこと（容積の増大）に起因することを示唆した。そして、直径220μmの神経線維を連続して1万回の電気刺激をおこなったとき引き起こされる直径の変化は、約 0.1 であると見積もっている。

・この結果は、その後、Cohenら (1971) の実験によっても支持され、さらに、Terakawa (1988)  の、ひと工夫された方法での追試でも確かめられている。

・J. M. Tobiasら (Tobias, 1952 ; Bryant and Tobias, 1952 ; Tobias and Nelson, 1959) も神経活動に伴う光散乱変化を測定している。Tobias (1952) は刺激電極の陽極側では光散乱強度は小さくなり、陰極側では大きくなることを示し、それは陽極側での神経線維の収縮、陰極側での膨潤に対応することを示している。なお、この時期における光学的測定についてはTobias (1959) による総括的なレビューにまとめられている。

ところが、1950年代の中ごろから1960年代の終わりごろまで、このような光学的測定はほとんど中断された状態になっている。これは、LingとGerard (1949) に始まる微小電極法の導入により、これを用いた電気生理学的研究が神経生理学の中心となったためであろう。

膜電位の対応性

吸光および螢光シグナルの大きさは通常、おのおのの背景光、すなわち静止電位での螢光強度および吸光度 との変化分 との比、すなわちfractional changeで表す。実際には、吸光変化は入射光に対し前方方向での透過光の変化として推定されることになる。したがって、透過光の増大は吸光の減少に、透過光の減少は吸光の増大に対応する。

光学的シグナルは電極を用いて記録される活動電位とほとんど同じ時間経過と同じ形状を示す。このことだけからも、光学的変化が活動電位をよくコピーしていることがわかるが、膜電位と光学的変化の直接的な対応関係は、ヤリイカ巨大神経線維での膜電位固定法を用いた実験によって詳細に検討された (Cohen, et al, 1974 ; Ross, et al, 1977 ; Gupta, et al, 1981)。膜電位感受性色素で染色したヤリイカ巨大神経線維を膜電位固定して、膜電位、膜電流、吸光、および螢光を同時記録すると、光学的変化は膜電位を脱分極、過分極側いずれに固定した場合でもみられ、変化の方向は逆であるが、変化の大きさは等しく対称性を示す。しかしながら、先にもふれたように、膜電流との対応性は全くみられず、光学的変化が過分電極側への膜電位変化に対しても脱分極の場合と同じように現れることが、光学的変化はコンダクタンスの変化には依存せず、興奮のメカニズムとは関係がないということの根拠になった。

また、膜に対して非透過性の色素であるfast-response dyesでは神経線維の外側から染色した場合と内側から染色した場合とでは、吸光あるいは螢光変化の方向は逆になる (Gupta, et al, 1981)。この場合も脱分極側、過分極側への電位変化に対する吸光、螢光の変化の方向の対称性はくずれない。

膜電位をいろいろなレベルに固定し、これに合わせて、測定された吸光、螢光の変化を膜電位に対してプロットすると、静止電位から±100mVぐらいの範囲では光学的変化と膜電位は近似的に直腺関係で対応づけられる。Tasakiら (1972) はTNSを用いた実験ではこのような直接関係は脱分極側ではくずれると報告したが、その後の実験では (Conti, et al, 1974), 直線関係が得られている。また、このような光学変化と膜電位間の直接関係はイカ神経線維以外でも確かめられた (Patrick, et al, 1971)。

波長スペクトル

膜電位依存性の色素の吸光や螢光の変化は、通常、可視波長で観測され、色素の種類により特有の波長スペクトルを示す。

・一般的に螢光色素は膜と結合することにより、その螢光強度の増強がみられ、色素によっては長波長側へシフトするものもある。

・吸光の場合は、色素自体の吸光スペクトルと膜電位依存性の吸光変化のスペクトルは必ずしも一致しない（神野、1978）。

・さらに、これらの波長依存性は、神経細胞とか筋細胞というような膜の種類、あるいは両棲類や哺乳類などの用いる生物の種によっても違いがみられる (Ross and Reichardt, 1979 ; Yagodin, et al, 1989)。Merocyanine-oxazolone系色素 (NK2367) の吸光スペクトルがヤリイカの神経線維と心筋では異なることを見いだされている(Fujii, et al, 1980)。

このようなスペクトルの性状は膜の構成要素の微細な違いを反映しているものと考えられる。

DiO/DPAペア

DiO/DPAペアは、FRETに基づく膜電位感受性色素の一種である (Jonathan Bradley, et al. 2009)。
まず、蛍光分子DiO(カルボシアニン色素の一種)と、クエンチャーであるDPAを細胞へ同時に導入する。DPAはアニオン(負電荷をもつ分子)であるため、膜電位に応答して細胞膜の内膜・外膜間を移動する。DiOと内外膜を移動するDPAの距離によってFRET効率が変化し、膜電位がDiOの蛍光強度へ反映される。
　（DPA: dipicrylamine ジピクリルアミン. 2つのピクリン酸から水酸基を取り去ってアミンにしたもの. (ヘキサニトロジフェニルアミンと同一物質？英語版に詳細). ナトリウム塩: CAS 13474-21-0））

分解能

膜電位感受性色素を用いた電位変化の光学的測定で、時間分解能は電位変化に対する色素の応答時間と測定システムの時間分解能の2つの因子に依存する。色素の応答時間については先にもふれたが、merocyanine系色素の場合、時定数は2.0～5.0 秒であり、また、測定システムの分解時間は0.1-1.0m秒である。

空間分解能では二次元分解能と三次元分解能の問題がある。

・二次元分解能は顕微鏡の分解能、すなわち倍率と開口数に依存する。しかし、高倍率にして解像力を上げると、S/Nが小さくなるという問題が生じてくる。これは、detectorがうける背景光強度が小さくなるためで、S/Nは背景光の平方根に反比例する。これが、二次元分解能を制約する因子になる。さらに、組織の散乱光が空間分解能に影響を与えることも指摘されている (Orbach, et al, 1985 ; London, et al, 1987)。

・三次元分解能は現在の光学的測定で困難性として最も大きいものであり、これが光学測定の適用範囲を規定している大きな要因の1つにもなっている。

・さらに、組織のどれくらいの深さまでの信号を検出できるかという問題がある。これは、組織の光学的不透明度 (opacity) あるいは光学密度 (optical density) の大きさや色素の組織内への拡散の度合いによる。

膜電位感受性色素の適用例

膜電位感受性色素を導入して研究を展開している研究室は現在たくさんあり、その適用例の全てを網羅して紹介することはむずかしい。ここでは、初期の測定例を中心に紹介する。

無脊椎動物の神経節

ニューロン活動の多チャネル同時測定は、Cohenの研究室で、まず巨大フジツボの神経節 (supraesophageal ganglion) に適用することから始められた (Salzberg, et al, 1977) 。これは、下等動物の行動、学習の神経機構解析を目指したものである。下等動物の神経節を構成するニューロンの数は比較的少なく、それらのほとんどすべてのニューロンから光学的方法で電位活動を同時記録することも可能である、というCohenの考えに基づいている (Boyle, et al, 1983)。

Cohenのグループが、巨大フジツボに続いて取り上げたのはNavanax （軟体動物 後鰓類）の口球神経節 (buccal ganglion) である。神経節をoxonol系色素 (RH155) で染色し、Navanaxの食餌中の電位活動を、神経節内の128カ所の領域から同時測定した (London, et al, 1987)。この実験で、Navanaxの口唇の動きに伴って22個のニューロンから活動が記録されている。これは、動物の行動に伴う中枢神経系のニューロン活動の最初の記録である。もう1つは、アプリシアのえら引っ込め反射 (gill-withdrawal reflex) が取り上げられている (Zecević, et al, 1989)。これは Eric Kandelら (Kupferman, et al, 1988) が詳細に調べているが、Cohenらの研究は、このアプリシアのえら引っ込め反射に関する神経回路網とその動的神経機構を解析することがそのねらいである (Cohen, et al, 1989)。サイフォン、えら、および腹部神経節を含む神経系を付けたままで切り出した標本で、サイフォンに軽い機械的な刺激を加えると、えらの運動が引き起こされる。この運動をビデオテープに撮りながら、一方で腹部神経節内のニューロン活動を多数部位から同時記録するという方法である。12×12-素子photodiode arrayでニューロン活動を同時記録して、えら引っ込め反射時は、これまでに示唆されているよりはるかに多くのニューロンが活動していることを示した。さらに慣れ (habituation) および感作 (sensitization) に伴うニューロン活動の記録で、急性的に感作された神経節内で、えら引っ込め反射に伴って活動するニューロンの数は250から400個ぐらいと見積もっている。

両生類および魚類の中枢神経系

Salzbergら (1983) はツメガエルの神経性下垂体 (neurohypophsis) をmerocyanine-rhodanine色素 (NK2761) で染色して、活動電位を吸光シグナルとして記録した。この実験で、後葉から得られるシグナルはスパイクのシグナルとそれに続く方向が逆向きでやや持続時間の長いシグナルの2つの成分から成ることが見いだされた。この遅いほうの成分は外液の低Ca²⁺ 濃度で抑制され、TTXの添加では速い成分、遅い成分とも消失あるいは抑制される。続く実験で、スパイク状の速い成分は神経終末の活動電位を反映した色素の吸光変化であり、遅い成分は色素の吸光変化によるものではなく、神経終末からの神経ホルモン分泌過程を反映した光散乱の変化であることが示された (Salzberg, et al, 1985 ; Obaid, et al, 1989 ; Salzberg and Obaid, 1988)。なお、Salzbergら (1985) は同じタイプのシグナルをマウスの神経性下垂体からも記録している。興奮-分泌連関を光学的シグナルとして捉えたことは神経分泌現象の研究に新しい測定方法を打ち出したものであり、その点でも注目すべきものである。さらに空間分解能を上げることにより興奮-分泌過程をより詳細に解析できる可能性が期待できる。

カエルの中枢神経系では、Grinvaldら (Grinvald, et al, 1984) によって視蓋 (optictectum) のニューロン応答が光学的方法で測定された。これは、カエルを“まるごと”のままで行う in situでの測定であり、光学的測定方法としては、その適用面での新しい展開の1つである。カエルの頭蓋骨を部分的に開けて視蓋部を露出し、そこを螢光色素 (styryl dyes) で染色して、眼球の散発的な光照射（フラッシュ）によって引き起こされる視蓋皮質の電位応答を螢光シグナルとして記録するというやり方である。“まるごと”の動物を用いる実験で問題となるのは、雑音である。その原因として、Grinvaldは呼吸運動と心拍動をあげている (Grinvald, 1985 ; Grinvald, et al, 1988)。さらには、 脳皮質血管内の不連続的な赤血球の流動による影響も考えられる。

Kauerら (1987) は、嗅上皮の臭気剤刺激によって引き起こされる嗅球におけるニューロン応答を測定した。この実験では摘出標本でなく、嗅上皮と嗅球を露出した“まるごと”のサンショウウオが用いられ、嗅上皮に amyl acetateとcamphorの気体を吹きつけて刺激した。先のOrbachとCohen (1983) の電気刺激による測定では、ニューロン応答のシグナルは嗅球のほとんど全域で記録されているが、amyl acetateとcamphorによる刺激では、その両者の間でシグナルの大きさには違いがみられる。応答はいずれの場合も外顆粒層と内顆粒層に限局しており、シグナルは外顆粒層で大きく内顆粒層では小さい。また、神経線維層および糸球体層には応答がみられない。これは、電気刺激と大きく違うところであり、実験的電気刺激と生理的条件という自然刺激による応答の空間的パターンの違いをよく示している。

魚類では、Konnerthら (1987) によってエイ (Raja erinacea) の小脳スライスの平行線維についての測定がなされている。この論文では、RH155とRH482のシグナルの波形の違いから、neuronとgliaの染色性についても解析されている。なお、このほか金魚の視蓋部についてManisとFreeman (1988) よる測定があるが、この実験ではシナプス電位が螢光シグナルとして記録されている。

末梢神経

光学的多チャネル測定の末梢神経線維への応用は少ないが、ShragerとRubinstein (1990) の論文が興味をひいた。彼らの実験はツメガエル (Xenopus) の坐骨神経の軸索内にlysolecithinを注入して脱髄を起こさせて、それに伴う興奮の伝播速度の変化を調べたものである。

培養神経細胞

Grinvald, RossとFarber (1981)は10×10-素子photodiode arrayを用いて培養されたNIE-115ニューロブラストーマから電位活動を記録したが、これが、光学的測定を培養神経細胞へ適用したものとしては最初である。細胞体に電極を刺して刺激を行い、そこから活動電位を電気的に記録するとともに細胞の多数部位から光学的シグナルを同時記録した。活動電位のシグナルは細胞体を含めて神経突起に沿って各部位から検出され、それらのスパイクは部位ごとに異なった形状を示している。また、活動電位は刺激部位から神経突起に沿って伝播し、その速度は比較的小さく、約0.1m/秒という値が得られている。さらに、Grinvaldら (1980) はレーザーのマイクロビームを用いて、NIE-115ニューロブラストーマ細胞体と成長円錐 (growth cone) からカルシウム活動電位を同時記録している。

その後、培養細胞での光学的測定は Bill Rossに引き継がれ、活発な研究が行われているが、彼らは、膜電位感受性色素とカルシウム指示薬を組み合わせた測定というもう1つの方向をひらいた (Ross, et al, 1987, 1989)。

Developmental neurophysiology

脊椎動物の個体発生、特にその初期過程では中枢神経系のニューロンは非常に微小でかつ脆弱ということもあって、通常のガラス微小電極法による測定は技術的にほとんど不可能といってもよい。したがって、個体発生に伴う中枢神経系の形態学的、細胞生物学的、さらには分子生物学的研究の著しい進展ぶりに比べて、動的システムとしての生理学的研究あるいは機能構築過程に関する研究は大きい遅れをとっている。これは個体発生の早い段階での神経細胞は微小で、微小電極が刺入できないことや、多領域からのニューロン活動を同時記録できないという方法論的制約に起因している。そこで、神野らは膜電位感受性色素を用いた光学的方法を導入することによって初期胚の心臓、中枢神経系におけるニューロン応答を検出しながら、その機能構築過程の追跡を進めた。（Kamino, et al, 1989 ; Kamino, 1990, 1991 ; 神野, 他, 1983 ; 神野、1985, 1991）。

画像法

これまで述べてきた測定は、吸光とか螢光の変化をシリコンphotodiodeを用いて検出する方法であるが、もう1つの方法としてビデオカメラやCMOSカメラを用いて、光学的変化を画像化する方法が用いられるようになってきた。これを最初に発表したのはBlasdelとSalama (1986)の論文である。BlasdelとSalamaの測定法は、脳皮質の光を照射し、その“reflectance”をTVカメラでモニターするものである。彼らは、サルの視覚野皮質を露出させ、そこをmerocyanine-oxazolone系色素（NK2367）で染色したうえで、サルに垂直、水平スリットの光をみせたとき皮質に誘発される“reflectance”の変化を画像化し、皮質における眼球優位性 (ocular dominance) と方位選択性 (orientation selectivity) のパターンを捉えることができた。これは、ニューロンの光学的測定で新しい局面をひらいたものとして大きな意義をもっていることは確かである。しかしながら、光学的測定という面からみるとき、いくつかの問題は残されている。この論文では、光学的変化は単に“reflectance”と表現されているが、この“reflectance”という表現の意味はそれほど簡単ではない。このような系に対して、“reflectance”を厳密に定義することは難しいが、平面の鏡の場合とは違って、いわゆる拡散反射 (diffuse reflection) という意味に近い。一方、皮質のほうから考えると、それは光を反射、拡散、吸収する粒子（細胞）が不均一に詰まった層でもある。かつ、その散乱は大粒子の多重散乱である。これに加えて、着色系で吸光度の変化がreflectanceの中にどの程度入ってくるかという問題もある。したがって、測定している光学的変化が、皮質のどのような変化を反映しているかを一意的に決めることは難しい。この実験で膜電位感受性色素を用いているということで、ストレートに皮質における電位活動を見ていると結論づけるのは危険であるようにみえる。事実、ここで使われている色素NK2367の活動電位に伴う吸光変化は背景光に対して10⁻⁴～10⁻³ のオーダーであり、ビデオカメラで、それを捉えることはほとんど不可能といってよい。したがって、ここでは、電位活動によって引き起こされた何かほかの現象を拾っているかもしれない。

膜電位感受性色素を用いた画像法では、Kauer (1988) も発表している。彼はサンショウウオの嗅球をstyryl系色素 (RH414) で染色し、嗅神経線維を電気刺激して、嗅球での螢光変化（励起波長530nm,　螢光波長610nm）をTVカメラで捉え、画像化した。この実験では対照測定としては膜電位に対して非感受性色素が併用されており、その結果からも、この画像は明らかに嗅球での電位変化の場所的分布を示していると考えられる。

色素を用いない方法 (Intrinsic optical imaging)

膜電位感受性色素を用いないで、内因性 (intrinsic) の光学的変化を捉えることによってネコやサルの中枢神経系のニューロン活動をモニターしようとする方法が、Amiram Grinvaldらによって開発された(Grinvald, et al, 1986) ; Frostig, et al, 1990 ; Ts’o, et al, 1990)。

彼らは、photodiode法で、ネコの視覚野の皮質から、スリット光刺激に応じた持続時間が比較的長い（約3秒）内因性の光学的変化 (reflectance) を見いだし、これがニューロン応答を表しているとして、その画像化を行った。測定方法は、膜電位感受性色素を用いないという以外は、BlasdelとSalamaと全く同じである。Photodiodeで測定される内因性の変化 (fractional change) は2×10⁻⁴ で、膜電位感受性色素の場合よりも1桁から2桁小さい。ここでも問題になるのは、このreflectanceの変化が実質的に何を表しているかということである。ニューロン活動を反映していることは間違いないと考えられるが、変化の持続時間が長いことからみても、活動電位のような電位変化を拾っている可能性はまずない。Grinvald自身も電位変化以外に、いろいろな生理学的因子を上げている。最近の論文で彼らが特に注目しているのはcytochrome-oxidaseとの対応である。しかし、一方では微小循環との対応性も論じている (Ts’o, et al,1990)。
　この方法は、色素を用いないことから脳外科手術中の患者にも適応することが可能であり、intraoperative intrinsic optical imagingと呼ばれている。