流加培養

流加培養（りゅうかばいよう、フェッドバッチ、fed-batch culture）とは、微生物や動物細胞の培養法のひとつ。半回分培養（はんかいぶんばいよう、semi-batch culture）ともいう。

概要

流加培養とは、微生物または動物や植物の細胞をバイオリアクター（培養槽）で液体培養する際に、培養中ある特定の基質（栄養源、培地成分）をバイオリアクターへ供給するが、培養ブロス（菌体、細胞と培養液）は収穫時までバイオリアクターから抜きとらないような培養法である。。流加基質としては、1成分または2成分以上でもよい。
この特性から考えると、本質的には回分培養（かいぶんばいよう）（バッチ培養）であり、その1つの変形とみなされよう。英語ではFed-batch culture またはsemi-batch cultureと呼ばれ, extended culture という言葉も以前は用いられた。ドイツ語では, Zulaufsverfahren と呼ばれている。これらの呼称のうち, 半回分（はんかいぶん） semi-batchという言葉は、反応工学では既に確立した用語となっているが、微生物反応の半回分操作においては、供給される基質は微生物に摂取される栄養物質である場合が多いので, fed-batchという言葉か一番適切であろう。事実、多くの英文の報文や総説でこの専門用語が用いられている。今日では、微生物や細胞の培養工学では、回分培養、流加培養、連続培養(batch, fed-batch, and continuous culture)が3点セットで記述されている。
流加培養において、どのような栄養物を添加基質とし、どのように添加するかは、企業のノウハウ に属する極秘技術であり、工業的流加発酵の詳細を知ることは困難であるが、相当数の工業的発酵がこの方法で行われている。
流加培養の利点は、培養液中の流加基質濃度を任意に制御できることである。すなわち、回分培養では、必要な培地成分はすべて、一度に前もって加えられ、それらの濃度はまったく制御されないで微生物まかせである。これに対して流加培養では流加基質(類)は目的に応じて少しずつ供給されるので、培養液中のそれらの濃度を最適に制御できる（ほとんどの場合、低濃度に制御される）。一方、連続培養 (ケモスタット) では、増殖制限基質も含めてすべての培地成分が一定の値に維持される。したがって、微生物の置かれている環境制御という視点からすると、流加培養は回分培養と連続培養との中間に位置する培養であると言えよう。現在、雑菌汚染、ファージ汚染、あるいは突然変異などの問題により、工業的な連続発酵は、いくつかの限られた発酵以外は実施されていない。ゆえに、回分発酵の改良という観点から流加発酵はますます重視される。

歴史

この発酵プロセスないし操作法で、一番古く（第1次世界大戦後であるという）また一番よく知られている例は、パン酵母製造においてアルコールの生成をできるだけ抑えるために、低糖濃度を維持するように糖を間欠的に逐次添加する方法であろう。流加法によるパン酵母の製造は、その後いろいろ改良が加えられており、工業的に重要な流加発酵プロセスである。
歴史上、次いで現われたのは、ペニシリン発酵において、エネルギー源(たとえば、グルコース、ラクトースなど)とペニシリンの前駆体(たとえばフェニル酢酸)とを逐次添加する方法である。
さらに、遺伝子工学の発展後、組替え体（主として大腸菌の組替え体）の高密度培養に流加法が採択された。組替え酵母による異種タンパクし生産にも適用されている。
最近では、動物細胞（主としてチャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞）の高密度液体培養による抗体医薬製造に適用されている。

流加培養が有利な場合

一般的に言って、ある培地成分の濃度の大小が生産性や収量に著しく影響されるような場合には流加発酵が従来の回分発酵より有利である。そのような場合としては、次の7つの場合か挙げられる。
3.1 高密度培養（高菌体濃度培養）
1L当たり50〜150 g乾燥菌体程度の高菌体濃度（高密度）を達成しようとする時、それに必要な栄養素を一度に仕込めば高濃度となり、たとえ通常は基質阻害を起こさないと考えられているような基質でも浸透圧効果と高濃度阻害のため、菌は増殖しない。よって、ほとんど総ての栄養源を過不足なく流加し続ける以外に方策はない。 組替え大腸菌の高密度培養については、多くの研究がなされた。
3.2 高濃度基質阻害のある場合
メタノール、エタノール、酢酸、芳香族化合物など、比較的低い濃度でも増殖阻害を起こす基質の場合は、基質を流加することにより、誘導期の短縮と増殖阻害の軽減が期待できる。
3.3 クラブトリー効果の存在する場合
クラブトリー効果(Krabtree effect)とは、酵母（主としてパン酵母）の培養において、糖濃度が高くなりすぎると、たとえ溶存酸素（DO）が十分存在していても、糖からエチルアルコール（および少量のグリセリンと酢酸）が生成し、それだけ菌体の対糖収率が低下する現象である。グルコース効果(glucose effect)とも呼ばれる。大腸菌や枯草菌などの細菌の好気培養においても、糖濃度が高いと、酢酸、乳酸、蟻酸などの有機酸が副生し、増殖阻害を起こしたり代謝活性に悪影響を与える。これを細菌クラブトリー効果(bacterial Krabtree effect)と呼ぶ。 ゆえに、酵母の対糖収率低下をきたさない程度に糖濃度を低く抑える必要があり、そのためパン酵母生産では流加法が常用されている。また、遺伝子組換え大腸菌も酢酸などの有機酸の生成を抑えるために、流加培養法が適用されている。
3.4 異化物抑制を受ける場合
グルコースのように容易に資化される炭素源で微生物を回分的に増殖させると、ある種の酵素、とくに異化代謝に関係する酵素（群）の生合成は抑制させる。この効果は異化物抑制（catabolite repression）と呼ばれる。そのような酵素生合成の抑制効果に打ち勝つ1つの強力な手段か流加法であり、これによって、糖濃度を低下させ、増殖を抑え、酵素生成は脱抑制される。また、ペニシリンなどの抗生物質の生合成代謝にも異化物抑制効果がみられ、流加法は収量の向上をもたらす。
3.5 栄養要求変異株を用いる発酵
栄養要求変異株（auxotroph mutant）を用いる発酵では、要求される物質を過剰に加えると菌体増殖のみか起こって、目的代謝産物の生成は少ない。一方、非常に不足の場合も菌体増殖は抑えられ、その微生物による代謝産物の生成は少ない。したがって、その中間に最適濃度があるはずであり、それを達成するために流加発酵が実施されている。例えば、L-グルタミン酸発酵に用いられるコリネ菌（Corynebacterium glutamicum）のホモセリン要求株をL-ホモセリン、あるいはL-スレオニンとL-メチオニンを制限して培養する（栄養要求物質を生育に必用な量よりも少なく与えて培養する）ことにより、著量のL-リジンが培地中に蓄積する。絶えず制限して培養するために、栄養要求物質は流加される。
3.6 抑制性プロモーターを持つ遺伝子の発現制御
組替え微生物による異種タンパク質生産に影響する因子は多数存在するが、遺伝子の分子構造上の因子のうち、特に重要なのはプロモーターの種類と強さである。プロモーターはその発現様式から、構成的(constitutive)なものと調節性(regulable)なものに大別され、後者はさらに誘導性(inducible)なものと抑制性(repressible)なものとに細分される。抑制性プロモーターでは、培地中にある化合物が存在すると、その化合物（もしくはその代謝産物）がコリプレッサーとしてアポリプレッサーと結合しホロレプレッサーとなり、これが遺伝子上流のオペレーターに結合して転写ができなくなる。しかし、通常その化合物は菌の増殖には必須である。よって、遺伝子発現に好適な非常に低い濃度に保ちつつ培養する。そのため、その化合物は流加される。trp（トリプトファン）やphoA（リン酸塩）などがその例である。
3.7 反応時間の延長、水分損失の補填、培養液粘度の低下
目的代謝産物の生成が指数期から減速期にかけて顕著である場合、この期間を引き延ばし1回当たりの生産量を増大させることが可能である。長時間、好気培養を続けると、排気ガスによって、培養液量が減少することがある。また、目的代謝産物が多糖類などの場合は、培養液の粘度が異常に高くなって、発酵の続行が難しいこともある。これらの問題を解決するために、時として、流加法が適用される。

各種流加方式

流加培養では、基質（溶液）の流加によって、バイオリアクター内の培養液量は多かれ少なかれ、増大する。増加量が無視できる場合と、無視できない場合に大別される。前者を培養液量一定流加培養(constant-volume fed-batch culture)、後者を培養液量可変流加培養(variable-volume fed-batch culture)と区別できる。前者は液状基質（メタノール、エタノール、グリセリンなど）や粉末状のグルコースや濃厚基質溶液を流加する場合であり、後者はそうでない場合である。基質の水溶液をフィードする場合は、基質と共に水がフィードされが、実用的な観点からすると、水を供給しても培養液が希釈され培養液量が増えるだけで、何のメリットもない。運転・解析の容易さを考えると、出来るだけ濃厚な溶液をフィードすべきである。 さて、流加培養の要点は、流加基質濃度を制御することであるから、その中心的問題は、何を流加するかということと、いかに流加するかということである。後者には、いつ流加を開始するかという問題も含まれる。前者を決定するには、微生物生理学、生化学、遺伝学の知識が必要である。エンジニアリングは後者とかかわりがある。流加の仕方により流加培養を分類できる。表1に各種流加方式として、その分類を示す。
表1　流加培養法の分類
　（1） フィードバック制御のない流加法
　　　　1.1　定流量流加法　　　1.2　指数的流加法　　　1.3　最適化流加法（最大原理（MP），動的計画法（DP）など）　　 1.4　間欠的添加法
（2） フィードバック制御のある流加法
　　2.1　直接的
　　　（培養液中の流加基質濃度を測定して、その値を直接的に制御指標とする。）　　　　　
　　2.2　間接的
　　　（微生物反応に密接に関連している可観測なパラメータを制御指標とする。
　　　　パラメータとしては、pH、DO，qo₂, RQ，濁度、アンモニア添加量、排ガス中のCO₂分圧、などがある。）
　　2.a　 定値制御（PID制御）　　　2.b　プログラム制御　　　2.c　最適制御　　　2.d　知的制御（ファジー制御（FC）、ニューラルネットワーク（NN）など）
　　
4.1 定流量流加培養
定流量流加培養(Constantly fed-batch culture, CFBC)は基質の質量流量、fₘ[g/h]、あるいは体積流量、fᵥ[L/h]、が一定の場合で、最も簡単な流加培養である。なお、流量とは単位時間当たりの流体の移動量であり、流速とは区別されねばならない。流速とは、文字通り、流体の流れの速度（速さ）である。定流量流加培養の数学的解析および実験的研究はほぼ完成している。 この流加方式の最大の特色は、直線増殖 (linear growth) が起こることである。
すなわち、菌体濃度をx（単位はg乾燥菌体/L）、培養時間をt（単位はh）、流加開始時の培養液量をv₀とすると、培養液量一定流加培養の場合は、
（一定）
または、培養液量をv（単位はL）とすると、培養液量可変流加培養の場合は、
（一定）
しかし、初期条件によっては、その前に指数増殖期（対数増殖期）が現われる。この指数増殖から、直線増殖への移行はきわめて急激であり、直線増殖期では比増殖速度 μ（単位は1/h）はずっと低くなり、時間的にあまり変化しない。菌体濃度の変化は、初期条件と希釈の程度によっていろいろな場合があり、減少することもある。また、ある特定の条件の時は、菌体濃度が時間的に変化せず一定となる。このように、定流量流加培養において菌体濃度が時間的に変化しない状態は‘準定常状態'と名付けられた。しかし、菌体濃度が時間的に変化するかどうかは、微生物の増殖の程度と流加液中の水による培養液の希釈の程度の大小によって決まるので、微生物の置かれている環境の状態からすると、直線増殖期では、非定常状態にあると言える。基質濃度s（単位はg/L）は指数増殖から直線増殖へ移行する時点できわめて急激に(数百分の一に)減少し、直線増殖期においては、sは基質飽和定数Kₛ（単位はg/L）より低いところでゆるやかに減少しその値はKₛにはよらない。 なお、流加培養で収穫時に培養液を一部残し、同じバイオリアクター内で次の流加培養の種菌として使い、これを繰り返すような操作法は反復流加培養（Repeated fed-batch culture (fermentation)）と呼ばれる。
4.2 指数的流加法
微生物の増殖は理想的には時間に関して指数関数的であり、ケモスタッドでは流量によって希釈率を制御し、比増殖速度 μ （単位は1/h)を一定に保っている。よって、流加操作によってもμ を一定に保つように基質濃度、s を制御できるはずである。 流量を培養時間に関して指数関数的に増加させることになるので、このタイプの流加操作は指数的流加法(Exponentially fed-batch culture, EFBC)と呼ばれる。
すなわち、流加液の体積流量をfᵢₙ（単位はL/h）、流加液の中の基質濃度をsᵢₙ（単位はg/L）、培養液中の流加基質濃度をs（単位はg/L）、菌体収率をYx/s（単位はg乾燥菌体/g基質）、最大比増殖速度をμₘₐₓ（単位は1/h）、指数関数的に増加させる際の指数をk、培養時間をt（単位はh）、とする。一般に、先に述べたように、s<<sᵢₙであるから、
とすれば、
(i) s = s₀ (一定)、
(ii) μ = k （一定）となり、μはk<μₘₐₓの範囲で外部から任意に制御できる、
という2つのユニークな特徴かある。この2点からして、指数的流加法はケモスタットに類似している。
なお、この場合バイオリアクター内の総バイオマス量は、
である。
このタイプの流加法は、パン酵母の培養において、一定の時間に増殖する菌体量から必要糖蜜量を計算し添加する方式に起源を発する。この流加法に関する数学的解析は、ほぼ完成している。
この流加法は、メタノールのように、高濃度では誘導期の延長と増殖速度の低下を示す基質を用いて、最短の時間で可能な限り多量の菌体を得るのに適している。 一般に、細胞内に存在する物質を短時間で多量に生産しようとすれば、μ=μₘₐₓ附近で、指数的流加法を行い、最終菌体濃度を可能な限り増大させることである。
4.3 最適化流加発酵
前述の2種類の流加法は、基本的なものとして意義があるが、流加発酵により菌体外に分泌する代謝産物を生産しようとする場合、流量は目的に応じて最適に変化させるべきである。このように最適化された流加発酵を最適化流加発酵（Optimized fed-batch fermentation）と呼ぶ。このタイプの流加法については多くの研究報告があるが、工業的な実施例の情報は少ない。
4.4 フィードバック制御がある流加培養
基質をあらかじめ決められた通りに流加する方式では、途中、発酵が好ましくない状態に陥っても、それに対処するのが困難である。したがって、可能ならば、何らかのフィードバック制御を行いたいと考えるのは当然である。ある場合には、これは直接現場の技術者が手動で行う。
フィードバック制御のある流加発酵は、制御方式の観点から、間接的なものと直接的なものとに分類できよう。また、制御される流加基質濃度の観点から、一定値に保つ場合(定値制御)と、濃度を時間的に変化させて制御する場合(プログラム制御)とに分類できよう。後者は、たとえば、発酵の初期、濃度を高く保ち、後半に入って低く保つ、といった場合を想定している。
間接的フィードバック制御のある場合:　 プロセスに密接に関連している可観測なパラメータを制御指標とする方式である。制御指標としては、溶存酸素(DO)、呼吸速度、排ガス中のCO₂分圧、呼吸商(RQ)、pH、代謝産物、濁度、螢光、などか報告されている。DOを一定に保つ方式では、基質濃度が臨界値より低下するとDOが上昇し、基質がある程度以上に存在するとDOが減少する現象を利用する。培養の進行とともに菌体濃度が上昇し、それにつれて酸素需要も多くなるから、通気量・攪拌速度を増やすかして気液間酸素移動容量係数kLaを増加させるか、もしくは、空気に純酸素を補充して推進力を高めるかして、いずれにしても酸素移動速度を大きくしていかねばならない。オン・オフ的に流加することが多く、微生物は基質に関して半飢餓状態とそうでない状態とに交互に頻繁にさらされる。
RQを制御指標とする方式は、パン酵母製造において提案されており、炭酸ガス生成速度と酸素消費速度とを実測し、両者の比RQとを1.0より少し高い水準に保って糖濃度を低レベルに抑え、その結果、副産物であるエタノール生成を減少させる。発酵槽入口、出口のO₂とCO₂の分圧を正確に実測し、それらのデータをコンピュータに入力し、物質収支式からRQを計算し、糖密な流加を制御している。pHを制御指標とする方式では、発酵の進行とともに培地成分が消費され、pHが設定値からずれる(通常減少する)現象を利用する。あるいは、酢酸のようにそれ自身pHの変化をきたす基質の流加に応用される。この制御方式では、無機塩を主体とした合成培地であることが望ましい。 代謝産物濃度を制御指標とする方式は、代謝産物は副産物であり、できるだけその生成を抑えたい場合に利用できる。パン酵母生産におけるエタノールがそのよい例である。 最後に、特異な制御方式として、細胞内に存在するNADHの螢光を利用する方法かある。RQや生細胞の螢光のように、生物学的パラメータを制御指標に用いることは、大変興味ある方式である。
直接的フィードバックのある場合: 培養液中の流加基質濃度を連続的、あるいは間欠的に測定し、その値を制御指標とする方法である。もし、基質か揮発性で、廃気ガス中の分圧と培養液中の濃度とがほぼ平衡にあれば、培養液から抜け出た直後のガスの分圧が制御指標に使える。
どのようなフィードバック制御を適用するにしても、いかなる情報をコンピュータに入力し、どのような情報処理をしてどのようなソフトウェアを用いて基質の流加を最適化するか、が重要である

流加培養のスタートアップ

流加培養の要は、培養液中の流加基質濃度を制御することであるから、流加開始時に多量の基質が存在していてはならない。しかし、一般に発酵では初期に誘導期かおり、それを短縮するためにはどうしてもある量は存在していなければならない。そこで、少量の基質を加え、しばらくは回分操作を行いactiveに増殖している状態でかつsが低下してから流加操作をスタートするのがよい。DOを連続計測し、回分操作中、基質かほとんどなくなってDOが急激に上昇し始める時に流加を開始するとよい。

流加培養のスケールアップ

実験室規模のバイオリアクターではほとんど問題にならないが、10m³〜100m³スケールの工業的バイオリアクターでは、流加基質溶液が流入口から培養液へ出て速やかに混合され、槽内の流加基質の濃度は完全に均一であるということは必ずしも保証されない。すなわち、濃厚な基質が流入するが、一方では槽内の流加基質濃度は10〜100mg/Lのオーダーであるので、混合時間に依存して槽内では高濃度部分とほとんどゼロとなっている部分が混在して、濃度に位置的分布と時間的変動が生じる。この不均一性が全体として菌体収率や代謝産物収量に影響する。これを解決する1つの方法は、濃厚流加基質溶液のバイオリアクター内への流入口を複数設けることであろう。