Kromatografi kolom

Fasa diam

Fasa diam atau adsorben (penjerap) dalam kromatografi kolom adalah zat padat. Fasa diam yang paling umum untuk kromatografi kolom adalah silika gel, diikuti dengan alumina. Serbuk selulosa pernah banyak digunakan. Kromatografi kolom memungkinkan melakukan teknik kromatografi pertukaran ion, kromatografi fasa terbalik, kromatografi afinitas, atau penjerapan bed ekspansi (bahasa Inggris: expanded bed adsorption, EBA). Fasa diam biasanya serbuk halus atau gel dan/atau mikropori untuk peningkatan permukaan, meskipun dalam EBA digunakan bed berfulida. Ada rasio penting antara berat fasa diam dan berat kering campuran analit yang dapat diaplikasikan ke dalam kolom. Untuk kolom silika, rasio berada antara 20:1 hingga 100:1, bergantung pada kedekatan jarak elusi antar komponen analit.

Fasa gerak (eluen)

Fasa gerak atau eluen dapat berupa pelarut murni atau campuran pelarut. Pemilihan dilakukan sedemikian rupa sehingga nilai faktor retensi senyawa yang diinginkan berada pada kisaran 0,2 - 0,3 untuk meminimalkan waktu dan jumlah eluen yang diperlukan selama kromatografi. Eluen dapat pula dipilih berdasarkan daya pisahnya sehingga senyawa yang berbeda dapat dipisahkan secara efektif. Optimasi eluen dilakukan melalui uji pendahuluan berskala kecil, biasanya menggunakan kromatografi lapisan tipis (KLT) dengan fasa gerak yang sama.
Ada laju aliran optimum untuk masing-masing pemisahan. Semakin cepat laju aliran eluen akan meminimalkan waktu yang dibutuhkan untuk melalui kolom sehingga meminimalkan difusi, menghasilkan pemisahan yang lebih baik. Namun, laju aliran maksimum perlu dibatasi karena analit memerlukan waktu tertentu untuk berada pada kesetimbangan antara fasa diam-fasa gerak, lihat persamaan Van Deemter. Kolom laboratorium sederhana bekerja dengan prinsip aliran gravitasi. Laju aliran kolom semacam ini dapat dinaikkan dengan menambah eluen baru di bagian atas fasa diam, atau diturunkan dengan mengatur keran di bagian bawah. Laju aliran yang lebih cepat dapat diperoleh dengan menggunakan pompa atau gas bertekanan (misalnya: udara, nitrogen, atau argon) untuk menekan pelarut melalui kolom (kromatografi kolom kilat).
Ukuran partikel fasa diam pada kromatografi kolom kilat biasanya lebih halus daripada kromatografi kolom gravitasi. Misalnya, silika gel untuk kromatografi kilat berukuran antara 230 – 400 mesh (40 – 63 µm), sementara untuk kromatografi gravitasi antara 70 – 230 mesh (63 – 200 µm).
Telah dikembangkan lembar lajur (spreadsheet) yang mendukung suksesnya pengembangan kolom kilat. Lembar lajur memperkirakan volume retensi dan pita volume analit, jumlah fraksi yang diperkirakan untuk masing-masing kandungan analit, dan resolusi antara dua puncak yang berdekatan. Informasi ini memungkinkan pengguna memilih parameter optimal untuk pemisahan berskala preparatif sebelum dicobakan pada kolom kilat.

Sistem otomasi

Kromatografi kolom adalah tahapan yang sangat memakan waktu dalam laboratorium apapun, dan dapat berubah menjadi suatu proses leher botol dalam sekejap. Oleh karenanya, beberapa pabrikan seperti Buchi, Interchim dan Teledyne Isco telah mengembangkan sistem otomasi kromatografi kilat (biasanya dirujuk sebagai KCTR, kromatografi cair tekanan rendah (bahasa Inggris: low pressure liquid chromatography, LPLC) dengan tekanan antara 350–525 kPa atau 50,8–76,1 psi, yang meminimalisir keterlibatan manusia dalam proses pemurnian. Sistem otomasi meliputi komponen-komponen yang secara normal ditemukan dalam sistem yang lebih mahal kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) seperti pompa gradien, port injeksi sampel, detektor UV, dan pengumpul fraksi untuk mengoleksi eluen. Biasanya, sistem otomatis ini dapat memisahkan sampel mulai beberapa miligram hingga skala industri kilogram, dan menawarkan solusi yang lebih murah dan cepat untuk melakukan injeksi multipel pada sistem KCKT-preparasi.
Resolusi (kemampuan memisahkan campuran) pada sistem LPLC pasti lebih rendah daripada KCKT, karena bahan kemasan dalam kolom KCKT dapat lebih kecil, biasnya hanya 5 mikrometer sehingga meningkatkan luas permukaan fasa diam, meningkatkan luas permukaan interaksi dan pemisahan menjadi lebih baik. Namun, penggunaan media berkemasan kecil ini menyebabkan tekanan balik yang tinggi dan itulah mengapa disebut kromatografi cair tekanan tinggi. Kolom LPLC biasanya dikemas dengan silika sekitar 50 mikrometer, sehingga mengurangi tekanan balik dan resolusi, tetapi juga menghilangkan kebutuhan pompa bertekanan tinggi yang mahal. Pabrikan juga sekrang mulai berpindah kepada sistem kromatografi kilat bertekanan tinggi dan memberinya nama sistem kromatografi cair tekanan menengah (bahasa Inggris: medium pressure liquid chromatography, MPLC) yang beroperasi pada tekanan di atas 1 Mpa (150 psi).

Perhitungan resolusi kromatogram

Ada juga kromatografi kolom yang dilengkapi dengan pompa peristaltik, mengalirkan dapar dan larutan sampel melalui bagian atas kolom. Larutan dan dapar mengalir melalui kolom hingga mencapai pengumpul fraksi di bagian akhir kolom untuk mengumpulkan sampel yang terelusi. Sebelum mencapai pengumpul sampel, sampel yang dielusi dari kolom melewati suatu detektor seperti spektrofotometer atau spektrometer massa sehingga konsentrasi sampel yang sudah dipisahkan dalam campuran dapat ditentukan.
Sebagai contoh, jika kita ingin memisahkan dua protein yang berbeda dengan kapasitas ikatan terhadap kolom yang berbeda dari suatu larutan, jenis detektor yang baik adalah spektrofotometer dengan panjang gelombang 280 nm. Semakin tinggi konsentrasi protein yang melalui kolom, semakin besar absorbansinya pada panjang gelombang tersebut.
Oleh karena kromatografi kolom mempunyai aliran tetap untuk semua eluat yang melalui detektor dengan berbagai macam konsentrasi, harus dibuat plot dari detektor antara konsentrasi sampel terelusi melawan waktu. Plot konsentrasi sampel versus waktu ini disebut dengan kromatogram.
Tujuan utama kromatografi adalah untuk memisahkan komponen yang berbeda dari suatu campuran larutan. Resolusi menyatakan daya pemisahan antar komponen dalam campuran. Semakin tinggi resolusi kromatogram, semakin baik pemisahan sampel yang dihasilkan oleh kolom. Data ini adalah cara terbaik menentukan sifat pemisahan kolom untuk sampel tertentu. Resolusi dapat dihitung dari kromatogram.
Kurva terpisah dalam diagram mewakili profil konsentrasi elusi sampel yang berbeda selama proses, berdasarkan afinitasnya terhadap resin kolom. Untuk menghitung resolusi, diperlukan waktu retensi dan lebar kurva.
Waktu retensi: waktu dari awal sinyal terdeteksi oleh detektor hingga titik puncak profil konsentrasi elusi masing-masing sampel yang berbeda.
Lebar kurva: lebar kurva profil konsentrasi sampel yang berbeda dalam kromatogram dalam satuan waktu.
Metode yang sudah disederhanakan dalam menghitung resolusi kromatogram adalah menggunakan model pelat. Model pelat berasumsi bahwa kolom dapat dibagi menjadi sejumlah seksi tertentu, atau pelat, dan kesetimbangan massa dapat dihitung untuk masing-masing pelat tunggal. Pendekatan ini memperkirakan kurva kromatogram sebagai kurva distribusi Gaussian. Dengan melakukan ini, lebar kurva diperkirakan 4 kali standar deviasi kurva, 4σ. Waktu retensi adalah waktu dari awal deteksi sinyal hingga waktu di titik puncak kurva Gaussian.
Dari variabel dalam gambar di atas, resolusi, jumlah pelat, dan tinggi pelat model pelat kolom dapat dihitung menggunakan persamaan:
Resolusi (Rₛ):
Rₛ = dengan:
tRB = waktu retensi solut B
tRA = waktu retensi solut A
wB = lebar alas kurva Gaussian solut B
wA = lebar alas kurva Gaussian solut A
Jumlah pelat (N):
N = 
Tinggi pelat (H):
H = 
dengan L adalah panjang kolom.

Kesetimbangan adsorpsi kolom

Untuk sebuah kolom adsorpsi, resin kolom (fasa diam) tersusun atas butiran mikro (microbead). Bahkan partikel-partikel yang lebih kecil seperti protein, karbohidrat, ion logam, atau senyawa kimia lainnya berkonjugasi pada microbead ini. Masing-masing partikel yang terikat pada microbead diasumsikan dapat mengikat solut sampel yang akan dimurnikan atau dipisahkan dengan rasio 1:1, dialirkan melalui kolom.
Ikatan antara molekul target yang akan dipisahkan dengan molekul yang terikat pada microbead dapat dituliskan sebagai reaksi kesetimbangan sederhana Keq =  dengan Keq adalah tetapan kesetimbangan, [C] dan [S] adalah konsentrasi molekul target dan molekul yang terikat pada resin kolom. [CS] adalah konsentrasi senyawa kompleks molekul target yang terikat pada resin kolom.
Berdasarkan ini, tiga kondisi isotermal yang berbeda dapat digunakan untuk menjelaskan dinamika ikatan kromatografi kolom: linear, Langmuir, dan Freundlich.
Isotermal linear terjadi ketika konsentrasi solut yang akan dimurnikan relatif sangat kecil dibandingkan molekul terikat. Oleh karena itu, kesetimbangannya dapat didefinisikan sebagai:
[CS] = Keq[C].
Untuk penggunaan skala industri, total molekul terikat pada butiran resin harus diperhitungkan karena ruang-ruang kosong harus diperhitungkan. Isotermal Langmuir dan isotermal Freundlich berguna untuk menjelaskan kondisi kesetimbangan ini. Isotermal Langmuir:
[CS] = , dengan Sₜₒₜ total molekul terikat pada butiran penyangga fasa diam.
Isotermal Freundlich:
[CS] = Keq[C]1/n
Isotermal Freundlich digunakan ketika kolom dapat mengikat banyak sampel yang berbeda dalam larutan yang akan dimurnikan. Oleh karena banyak sampel berbedah memiliki tetapan ikatan terhadap butiran yang berbeda, akan muncul banyak Keq. Oleh karenanya, isotermal Langmuir bukan merupakan model yang bagus untuk kasus ikatan ini.