Enzim restriksi

Enzim restriksi atau endonuklease restriksi adalah enzim yang memotong molekul DNA. Enzim ini memotong DNA pada rangka gula-fosfat tanpa merusak basa. Setiap enzim mempunyai sekuens pengenalan yang unik pada utas DNA, biasanya sepanjang 4-6 pasang basa.

Sejarah

Pada akhir 1960-an, ilmuwan Stewart Linn dan Werner Arber mengisolasi dua contoh enzim yang berperan dalam menghambat pertumbuhan bakteriofag yang menyerang E. coli. Salah satu enzim bekerja memetilasi DNA, sedangkan enzim yang satunya bekerja memotong DNA yang tidak termetilasi pada beberapa lokasi di sepanjang molekul DNA. Enzim yang pertama disebut metilase (methylase), sedangkan enzim yang satunya disebut nuklease restriksi (restriction nuclease). Kemudian pada tahun 1968, H.O. Smith, K.W. Wilcox, dan T.J. Kelley, yang bekerja di Johns Hopkins University, mengisolasi dan mengkarakterisasi enzim nuklease restriksi pertama. Enzim ini berasal dari bakteri Haemophilus influenzae, dan diberi nama HindII. Enzim ini selalu memotong molekul DNA pada sekuen spesifik dengan panjang situs pengenalan enam pasang basa.

Perkiraan Pemotongan

Panjang dari sekuen pengenalan memengaruhi seringnya enzim restriksi memotong DNA dalam ukuran tertentu. Misalnya pada enzim yang memiliki panjang 4 basa, enzim ini diperkirakan akan memotong setiap 256 nukleotida. Perhitungan tersebut diperoleh dengan mengasumsikan setiap basa mempunyai kemungkinan yang sama untuk muncul, yaitu sebesar 1/4 (kemungkinan muncul 1 dari 4 basa). Jadi jika sekuen pengenalan mempunyai panjang 6 basa, maka perhitungannya menjadi: (1/4)⁶ = 1/4096. Perhitungan ini hanya sebagai perkiraan, pada kenyataannya belum tentu demikian. Beberapa sekuen bisa jadi lebih sering atau lebih jarang ditemui dalam suatu organisme. Seperti pada mamalia, sekuen CG sangat jarang ditemui sehingga enzim HpaII yang mempunyai sekuen pengenalan CCGG akan lebih jarang memotong pada DNA mamalia.
Enzim restriksi yang mempunyai sekuen pengenalan yang pendek akan menghasilkan banyak potongan DNA; sedangkan jika mempunyai sekuen pengenalan yang panjang, akan dihasilkan potongan DNA yang lebih sedikit. Baik enzim yang mempunyai sekuen pemotongan pendek maupun panjang, mempunyai fungsi masing-masing dalam rekayasa genetika.
Beberapa enzim sering yang digunakan dalam laboratorium dibagi menjadi tiga berdasarkan perkiraan pemotongan:

6-cutters

Ezim restriksi yang tergolong dalam 6-cutters memiliki situs pemotongan yang spesifik pada 6 nukleotida. Ezim ini cocok digunakan untuk pekerjaan kloning sehari-hari karena enzim ini lumayan sering memotong satu atau dua situs pada plasmid, tetapi jarang memotong bagian penting seperti titik asal replikasi (origin of replication) atau gen resisten ampisilin. Contoh enzim 6-cutters adalah HindIII (AAGCTT) yang memotong genome bakteriofage lambda (48 kbp) pada 7 situs.

8-cutters

Enzim restriksi ini mempunyai situs pengenalan sepanjang 8 nukleotida; cocok digunakan untuk membentuk kromosom menjadi potongan-potongan yang spesifik dalam ukuran yang besar. Sebagai contoh: PacI (enzim 8-cutters) memotong-motong kromosom E. coli menjadi 20 bagian, sedangkan BamHI (enzim 6-cutters) memotong sekitar 300 bagian. Jika langsung menggunakan enzim 6-cutters, maka fragmen yang dihasilkan terlalu kecil dan banyak. Untuk itu digunakan enzim 8-cutters terlebih dahulu, kemudian dilanjutkan dengan menggunakan enzim 6-cutters.

4-cutters

Enzim restriksi ini cocok untuk percobaan yang menginginkan pemotongan pada beberapa situs yang potensial. Contohnya: jika ingin mengumpulkan fragmen DNA secara acak, dan pada potongan tersebut terdapat gen yang diinginkan; dapat dilakukan digestsi parsial (partial digestion) menggunakan enzim 4-cutters.

Jenis-jenis enzim restriksi

Enzim restriksi secara tradisional dibagi menjadi 3 tipe berdasarkan komposisi subunit, posisi pemotongan, spesifisitas sekuens dan kofaktor yang diperlukan:

Enzim restriksi tipe I

Enzim restriksi ini kompleks dengan multisubunit, memotong DNA secara acak dan jauh dari sekuens pengenalannya. Pada awalnya enzim ini dikira langka; tetapi setelah analisis sekuens genom, enzim ini ternyata umum. Enzim restriksi tipe I ini memiliki pengaruh besar dalam biokimia, tetapi mempunyai nilai ekonomis yang rendah karena tidak dapat menghasilkan potongan fragmen DNA yang diinginkan sehingga tidak diproduksi.

Enzim restriksi tipe II

Enzim ini memotong DNA dekat atau pada situs pengenalan. Enzim ini menghasilkan fragmen-fragmen sesuai dengan yang diinginkan sehingga biasa digunakan untuk analisis DNA dan kloning gen. Enzim tipe II yang umum digunakan adalah HhaI, HindIII, EcoRI, dan NotI; dan enzim-enzim tersebut tersedia secara komersil. Enzim ini tergolong kecil dengan subunit yang memiliki 200-350 asam amino dan memerlukan Mg²⁺ sebagi kofaktor. Selanjutnya enzim jenis tipe II yang umum, biasanya digolongkan sebagai tipe IIs, adalah FokI dan AlwI. Enzim ini memotong di luar situs pengenalan, berukuran sedang, 400-650 asam amino, dan memiliki 2 domain khusus. Domain pertama untuk berikatan dengan DNA, sedangkan domain yang satunya untuk memotong DNA.

Enzim restriksi tipe III

Enzim restriksi tipe II ini merupakan enzim restriksi yang tidak digunakan dalam laboratorium. Hal ini dikarenakan enzim ini memotong di luar situs pengenalan dan membutuhkan dua sekuen dengan orientasi berlawanan pada DNA yang sama untuk menyelesaikan pemotongan sehingga enzim ini jarang menghasilkan potongan sempurna.

Hasil Pemotongan Enzim Restriksi

Enzim restriksi yang biasa digunakan dalam laboratorium biologi molekuler memotong molekul DNA pada situs pengenalan dan menghasilkan salah satu dari ketiga jenis pola hasil pemotongan. Ketiga pola hasil pemotongan enzim restriksi sebagai berikut:

Ujung menggantung 5’

Enzim restriksi memotong secara asimetris pada situs pemotongan, menghasilkan hasil pemotongan memanjang pada ujung 5’. Contoh enzim yang menghasilkan ujung menggantung 5’ adalah BamHI

Ujung menggantung 3’

Enzim restriksi ini juga memotong secara asimetris pada situs pengenalan, tetapi menghasilkan hasil pemotongan memanjang pada ujung 3’. Contoh enzim yang menghasilkan pola seperti ini adalah KpnI

Ujung tumpul

Enzim ini memotong secara simetris antara kedua utas DNA sehingga menghasilkan ujung tumpul. Contoh enzim yang menghasilkan pola seperti ini adalah SmaI
Pola ujung menggantung, baik yang 3’ ataupun 5’, sering disebut juga dengan ujung lengket (sticky ends) atau ujung kohesif (cohesive ends). Pola seperti ini lebih mudah menempel (annealing) dengan pasangan DNA nya karena adanya ikatan basa antara ujung-ujung yang menggantung.

Menghentikan Proses Digesti

Setelah proses inkubasi selesai, reaksi digesti enzim dapat dihentikan dengan menambahkan EDTA. Penambahan EDTA akan mengkelat ion logam; dalam reaksi ini ion logam yang dikelat adalah Mg²⁺. Untuk beberapa tipe enzim lainnya, inaktivasi dapat dihentikan dengan cara pemanasan; menggunakan pendenaturasi protein, contohnya fenol atau kloroform; atau memisahkan enzim dari DNA menggunakan kolom kromatografi.