DNA ligase

DNA ligase merupakan enzim yang mengkatalisis pembentukan ikatan fosfodiester antara ujung 5’-fosfat dan 3’-hidroksil pada DNA yang mengalami nick. Nick pada DNA dapat terjadi pada saat replikasi DNA, rekombinasi dan kerusakan. Secara biologis, DNA ligase diperlukan untuk menggabungkan fragmen Okazaki saat proses replikasi, menyambung potongan-potongan DNA yang baru disintesis, serta berperan dalam proses reparasi DNA. Oleh karena pentingnya peranan DNA ligase, sekarang ini telah dikembangkan obat antibakterial yang menginhibisi DNA ligase. Dengan diinhibisinya DNA ligase, diharapkan kromosom menjadi terdegradasi dan sel akan mati. DNA ligase merupakan enzim yang sangat berguna baik di dalam sel, maupun di luar sel. Untuk penggunaan di luar sel, penggabungan dengan enzim restriksi telah membuat terobosan baru di bidang teknologi DNA rekombinan. Enzim restriksi diibaratkan seperti gunting yang memungkinkan kita untuk memotong DNA di tempat yang spesifik. Kemudian DNA ligase berperan sebagai lem yang menyambung DNA yang telah terpotong sehingga menjadi DNA yang fungsional.

Jenis-Jenis DNA Ligase

DNA ligase dapat digolongkan menjadi 2 jenis berdasarkan kofaktor yang diperlukan, yaitu NAD⁺ atau ATP. DNA ligase NAD⁺-dependent ditemukan hanya di bakteri. Sementara itu, DNA ligase ATP-dependent ditemukan di bakteriofage, eubacteria, archaea, dan virus. Walaupun kedua jenis enzim ini memerlukan kofaktor yang berbeda, keduanya memiliki mekanisme katalitik yang sama. DNA ligase ATP-dependent yang umum adalah T4 DNA ligase dan T7 DNA ligase.

T4 DNA Ligase

T4 DNA ligase berasal dari T4 bakteriofage. Enzim ini akan meligasi fragmen DNA yang menggantung, memiliki ujung kohesif maupun ujung tumpul. Untuk meligasi fragmen DNA yang memiliki ujung tumpul, diperlukan konsentrasi enzim yang lebih besar. Proses ligasi DNA T4 memerlukan larutan penyangga yang mengandung ATP dengan konsentrasi 0.25-1 mM. Proses ini dapat berlangsung pada kisaran suhu yang luas, namun untuk beberapa kasus, proses ligasi dilakukan pada suhu tertentu. Seperti pada saat menginginkan efisiensi yang tinggi dalam ligasi (contohnya membuat pustaka genom) suhu yang disarankan adalah 16 °C. Sementara itu, jika ligasi bertujuan untuk subcloning, ligasi dapat dilakukan pada suhu 4 °C semalaman, atau pada suhu ruang selama 30 menit hingga beberapa jam.

T7 DNA Ligase

T7 DNA ligase merupakan DNA ligase dengan ukuran terkecil, yaitu sebesar 41 kDa. DNA ligase ini berasal dari bakteriofage T7, mempunyai struktur yang terdiri dari dua domain dengan sisi aktif ATP yang terbentuk oleh ujung-N domain yang lebih besar.

Mekanisme DNA Ligase

Mekanisme DNA ligase dimulai dari hidrolisis kofaktor, yaitu NAD⁺ atau ATP. Peristiwa ini menghasilkan kompleks enzim-adenylate AMP yang berikatan kovalen dengan grup α-amino residu lysin pada sisi aktif dengan melepaskan pyrofosfat inorganik (PPi), jika kofaktor berupa ATP; atau nicotinamide mononucleotide (NMN), jika kofaktor berupa NAD⁺. Kemudian sebagian AMP akan berpindah dari sisi aktif lysin ke ujung bebas 5’-fosfat yang berada pada nick utas DNA. Pada akhirnya, iktan fosfodiester akan terbentuk antara ujung 3’-OH yang berada di ujung nick dengan 5’-fosfat dan melepaskan AMP dan enzim adenylate.