Kromatografi lapisan tipis

Persiapan pelat

Pelat KLT biasanya tersedia secara komersial, dengan ukuran partikel standar yang bervariasi untuk meningkatkan reprodusibilitas. Mereka disiapkan dengan mencampur adsorben, seperti silika gel, dengan sejumlah kecil pengikat inert seperti kalsium sulfat (gipsum) dan air. Campuran ini tersebar sebagai bubur tebal pada lembaran pembawa yang tidak reaktif, biasanya kaca, aluminium foil tebal, atau plastik. Pelat yang dihasilkan kemudian dikeringkan dan diaktivasi dengan memanaskannya pada oven selama tigapuluh menit pada 110 °C. Ketebalan lapisan adsorben berkisar antara 0,1 – 0,25 mm untuk keperluan KLT analitik, dan sekitar 0,5 – 2,0 mm untuk KLT preparatif.

Proses dan prinsip pemisahan

Senyawa yang berbeda dalam campuran sampel bergerak dengan laju yang berbeda karena perbedaan gaya tariknya pada fasa diam serta perbedaan kelarutannya dalam eluen. Dengan mengganti pelarut, atau mungkin menggunakan suatu campuran, pemisahan komponen (diukur berdasarkan nilai Rf) dapat diatur. Selain itu, pemisahan yang diperoleh dengan pelat KLT dapat digunakan untuk memperkirakan pemisahan kromatografi kolom cepat (flash chromatography).
Pemisahan senyawa terjadi berdasarkan kompetisi pengikatan solut dan solven pada fasa diam. Misalnya, jika digunakan silika gel fasa normal sebagai fasa diam, maka fasa diam bersifat polar. Jika dua senyawa yang berbeda kepolarannya melintas, maka senyawa yang lebih polar akan memiliki interaksi dengan silika gel lebih kuat daripada yang lainnya. Oleh karena itu, lebih mudah menghilangkan fasa gerak dari tempat terikatnya. Sebagai konsekuensi, senyawa yang kurang polar akan bergerak lebih tinggi pada pelat (menghasilkan nilai Rf yang lebih besar). Jika fasa gerak diganti dengan pelarut atau campuran pelarut yang lebih polar, maka lebih mudah untuk melepaskan solut dari ikatan silikanya, dan semua senyawa pada pelat KLT akan bergerak lebih tinggi pada pelat. Umum dikatakan bahwa pelarut (eluen) "kuat" mendorong analit lebih tinggi daripada eluan "lemah. Urutan kekuatan eluan bergantung pada lapisan tipis (fasa diam) pada pelat KLT. Untuk pelat KLT dengan lapisan silika gel, kekuatan eluen meningkat sesuai urutan berikut: perfluoroalkana (paling lemah), heksana, pentana, karbon tetraklorida, benzena/toluena, diklorometana, dietil eter, etil asetat, asetonitril, aseton, 2-propanol/n-butanol, air, metanol, trietilamina, asam asetat, asam format (paling kuat). Pelat lapisan tipis C₁₈ adalah fasa terbalik. Artinya bahwa jika campuran etil asetat dan heksana digunakan sebagai fasa gerak, penambahan etil asetat menghasilkan nilai Rf yang lebih tinggi untuk semua senyawa pada pelat KLT. Mengubah polaritas fasa gerak tidak akan menghasilkan urutan kebalikan Rf senyawa pada pelat KLT. Seri eluotropik dapat digunakan sebagai pandauan pemilihan fasa gerak. Jika dilakukan sistem fasa terbalik pada senyawa yang diinginkan, harus digunakan fasa diam apolar seperti silika bergugus fungsi C₁₈.

Karakterisasi

Dalam kimia organik, reaksi dimonitor secara kualitatif menggunakan KLT. Noda sampel dalam tabung kapiler ditotolkan pada pelat: noda bahan awal, noda dari hasil reaksi, dan persilangan noda keduanya. Pelat KLT kecil (3 x 7 cm) hanya memerlukan waktu beberapa menit untuk mengelusinya. Analisisnya bersifat kualitatif, dan akan menunjukkan kapan bahan awal menghilang, yaitu reaksi telah selesai sempurna. Sayangnya, KLT pada reaksi temperatur rendah dapat memberikan hasil yang menyesatkan, karena sampel dihangatkan pada temperatur kamar di dalam kapiler, yang dapat mengganggu reaksi —sampel hangat yang dianalisis dengan KLT tidak sama dengan apa yang terjadi dalam labu kimia bertemperatur rendah. Contoh reaksi yang demikian adalah reduksi DIBALH ester menjadi aldehida.
Dalam suatu penelitian, KLT telah diaplikasikan dalam screening reaksi organik, misalnya dalam fine-tuning sintesis BINAP dari 2-naftol. Dalam metode ini, alkohol dan larutan katalis (misalnya besi(III) klorida) diletakkan terpisah pada baseline, kemudian direaksikan dan dianalisis.

Isolasi

Oleh karena senyawa yang berbeda akan menempuh jarak yang berbeda pada fasa diam, maka kromatografi dapat digunakan sebagai suatu teknik isolasi. Senyawa yang terpisah masing-masing memiliki luas area yang spesifik pada pelat, dan dapat dikerok, kemudian dilarutkan dalam pelarut untuk memisahkannya dari fasa diam untuk digunakan dalam analisis lanjutan. Sebagai contoh ekstrak hijau daun (misal bayam) dalam 7 tahapan pengembangan, karoten terelusi dengan cepat dan hanya tampak hingga tahap 2. Klorofil A dan B menempuh separuh jalan, dan lutein adalah senyawa pertama yang berwarna kuning. Setelah kromatografi selesai, karoten dapat dikerok dari pelat, dilarutkan dalam suatu pelarut dan dilakukan uji spektrofotometri untuk menentukan panjang gelombang absorpsinya. Tahapan pada gambar berikut merupakan langkah-langkah perlakuan analisis mengunakan kromatografi lapisan tipis.