היסטופתולוגיה

היסטופתולוגיה עוסקת באבחון מיקרוסקופי של רקמות לצורך אבחון וחקר ביטויי המחלה.  ברפואה קלינית, מתייחסת ההיסטופתולוגיה באופן מיוחד, לבדיקת דגימות ביופסיה או דגימות כירורגיות שנעשו על ידי רופא פתולוג, לאחר שהדגימה עובדה ועברה חתכים היסטולוגיים (חתכים בגושי רקמה או איברים) שהונחו על גבי סליידים (זכוכית נושאת). הציטופתולוגיה לעומת זאת בוחנת (1),  תאים חופשיים או (2) חלקי רקמה.
המונח היסטופתולגיה (Histopathology) נגזר משלוש מילים ביוונית: (ἱστός (היסטוס) - "רקמות", πάθος (פאתוס) - "סבל", ו -λογία  (לוגיה) - "לימוד".
מקצוע ההיסטופתולוגיה הנו אחד ממקצועת המעבדה הרפואית בתחום הפתולוגיה האבחנתית.

איסוף של רקמות

בדיקה היסטופתולוגית של רקמות מתחילה בניתוח, ביופסיה, או בנתיחה שלאחר המוות. הרקמה מוסרת מהגוף,  ואז בדרך כלל, לאחר מייד לאחר ניתוח  של פתולוג מומחה, מוכנסת הדגימה לחומר מקבע (פיקסאטיב) אשר מייצבת את הרקמות כדי למנוע ריקבון. החומר המקבע הנפוץ ביותר הוא פורמלין (מותרס ב 10% פורמלדהיד במים).

הכנה להיסטולוגיה

לאחר מכן מכינים את החומר לבחינה תחת מיקרוסקופ תוך שימוש בקיבוע כימי או בחתכים קפואים.
כאשר מסופק מדגם גדול, לדוגמה, לאחר הליך כירורגי,  הפתולוג בוחן את דגימת הרקמה ובוחר את החלק ברקמה שסביר ביותר ייתן את האבחון האמין והמדויק ביותר. חלק זה מוסר מתוך המדגם לבדיקה בתהליך הידוע כחיתוך ראשוני או גולמי. דגימות גדולות יותר נחתכות על מנת לאפשר את המיקום הנכון של מבנים אנטומיים בקסטה. דגימות מסוימות (במיוחד ביופסיות) ניתן להעביר לתוך מצע אגר כדי להבטיח אורינטציה נכונה של הרקמות בקסטה, ואז בתוך הבלוק ולאחר מכן על הסלייד לאבחון מיקרוסקופי. תבחין זה מוכנס אז לתוך קסטת פלסטיק לצורכי מרבית המשך התהליך.

קיבוע כימי

בנוסף לפורמלין, קיימים חומרי קיבוע כימיים אחרים. אבל, עם הכנסתה של הצביעה האימונוהיסטוכימית (IHC), והאבחון בפתולוגיה המולקולרית, הפך הפורמלין למקבע הכימי התקני לדגימות אבחון היסטופתולוגיות כאלה ממקור אנושי. זמן הקיבוע לדגימות נמוך וקצר יותר. קיימים תקנים לאבחון היסטופתולוגי אנושי.

עיבוד

מים מוסרים מהדגימות בשלבים עוקבים, תוך שימוש בריכוזים עולים של אלכוהול. קסילן משמש בשלב האחרון של הייבוש במקום האלכוהול, וזאת משום שהשעווה שבשימוש בשלב הבא מסיס בקסילן כאשר היא אינה מושרית באלכוהול ומאפשר לשעווה לחדור (בהסננה) לדגימה. התהליך הנו בדרך כלל אוטומטי, ומתבצע במשך הלילה. הדגימה שהשעווה חדרה לתוכה, מועברת למיכל הטבעת דגימה (בדרך כלל מתכת). בסופו של דבר, שעווה מותכת מיושמת מסביב לדגימה במיכל ועוברת תוך כדי כך קירור ומיצוק כדי להשקיע אותה בבלוק שעווה. תהליך זה נדרש על מנת לספק לדגימה יציבות בכיוון הראוי, כדי לספק חתכי  מיקרוטום להעמסה על הסלייד (זכוכית נושאת).
לאחר שהבלוק המוטבע בשעווה הוכן, מכינים ממנו חתכים הממוקמים בדרך כלל תוך כדי ציפה במשטח באמבט מים אשר מפזר את החתכים החוצה. הדבר נעשה בדרך כלל ידנית ודורש מיומנות (של היסטוטכנולג), כאשר צוות המעבדה מחליט אילו חלקים של הדגימה מתוך סרט חתכי השעווה שהופרדו מהמיקרוטום יונחו על הסליידים.  בדרך כלל יוכנו מספר סליידים משכבות שונות לאורך הבלוק. לאחר מכן נצבעים  הסליידים עם החתכים הדקים ועליהם מניחים זכוכית מכסה למיגון. לתהליכי צביעה רגילים, משתמשים בדרך כלל בתהליך צביעה אוטומטי; אולם כאשר משתמשים בצבעים נדירים, הצביעה מתבצעת בדרך כלל ידנית.

עיבוד חתכים קפואים

השיטה השנייה של עיבוד היסטולוגי נקרא עיבוד בחתכים קפואים. זו שיטה ברמה מדעית וטכנית גבוהה, המבוצעת על ידי היסטולוג מומחה ומיומן  (עובד מעבדה רפואית בכיר בהיסטופטולוגיה או רופא פתולוג בהתמחות של  5-6 שנים הכשרה לאחר תואר ברפואה). בשיטה זו, הרקמה מוקפאת, ונפרסת לפרוסות דקות באמצעות מיקרוטום רכוב על מכשיר הקרוי קריוסטט (מכשיר המיועד להחזיק רקמת בטמפרטורות קיפאון לאורך זמן) המצוי בטמפרטורה מתחת לאפס לקירור. החתכים הדקים הקפואים מורכבים על זכוכית נושאת (סלייד), עוברים מיידית ולזמן קצר לנוזל קיבוע, ונצבעים בשיטה דומה לצביעה המסורתית המיושמת לחתכים המוטבעים בשעווה. יתרונות השיטה שהיא מהירה בזמן עיבוד, נדרש פחות ציוד, וניתן להיסתפק בפחות אוורור במעבדה (בשל נוכחות אדי פורמלין). החיסרון הוא האיכות הירודה של הסלייד הסופי. השיטה משמשת כשלב ביניים לצורך בחירת השלב הבא במהלך ניתוח פעיל (לדוגמה, לקביעה פרלימינרית של שולי הכריתה מחדש של הגידול במהלך הניתוח).

צביעת סליידים היסטולוגיים

הצביעה יכולה להתבצע על ידי קיבוע כימי של סליידים  או סליידים של חתכים קפואים. בכדי לבחון את הרקמה מתחת למיקרוסקופ, החתכים יצבעו באחד או יותר פיגמנטים. מטרת הצביעה היא כדי לחשוף את רכיבי התא; גוונים ניגודיים מספקים ניגודיות.
הצביעה הנפוצה ביותר בהיסטופתולוגיה היא השילוב בין  המטוקסילין ואיאוזין (לעיתים קרובות משתמשים בקיצור H&E). המטוקסילין משמש לצביעת גרעין התא בכחול, בעוד שאאוזין משמש לצביעת הציטופלסמה ואת החומר רקמת החיבור החוץ תאית בורוד. קיימות מאות  טכניקות שונות אשר משמשות לצביעת תאים באופן בררני. תרכובות אחרות המשמשות לצביעת חתכי רקמות  כוללות ספרינין (צובע גרעיני תא באדום),  שמן O אדום ( Oil Red O (Solvent Red 27, Sudan Red 5B, C.I. 26125), קונגו אדום, מלחי כסף וצבעים מלאכותיים. היסטוכימיה מתייחסת למדע השימוש בתגובות כימיות מעבדתיות בין חומרים כימיים לבין רכיבי הרקמה.  הטכניקה שמשתמשים בה הרבה היא התגובה של צבע כחול פרוסי של פרלס, המשמש להדגמת משקעי ברזל במחלות כמו המוכרומטוזיס.
לאחרונה, משתמשים בנוגדנים  מסוימים  לצביעה של חלבונים, שומנים ופחמימות. הטכניקה הזו מכונה אימונוהיסטוכימיה, טכניקה זו הגבירה מאוד את היכולת לזהות תחת מיקרוסקופ קטגוריות שונות של תאים. טכניקות מתקדמות אחרות כוללות שימוש בהיברידיזציה באתר לזיהוי ספציפי של מולקולות דנ"א או רנ"א.  שיטות צביעה בנוגדנים אלו מחייבות לעיתים קרובות את השימוש בהיסטולוגיה של חתכים קפואים. הליכים כאלה שתוארו לעיל מבוצעים במעבדה בתנאי בדיקה מחמירים ומדויקים על ידי מדענים מומחים ומיומנים במעבדה רפואית היסטולוגית, שעברו הכשרה מיוחדת. מצלמות דיגיטליות נכנסות יותר ויותר לשימוש כדי לצלם תמונות היסטופתולוגיות.

פרשנות

הסליידים ההיסטולוגיים נבחנים במיקרוסקופ על ידי רופא מומחה בפתולוגיה, שהוסמך מבחינה רפואית ואשר סיים תוכנית הכשרה מוכרת.  אבחון רפואי זה מנוסח כדוח פתולוגי המתאר את הממצאים ההיסטולוגיים ואת חוות דעתו של הפתולוג. במקרה של סרטן, הדבר מייצג את אבחון הרקמה הנדרש למרבית הליכי הטיפול. במקרה של הסרת גידול סרטני, על הפתולוג לציין האם שולי הכריתה נקיים או מעורבים (האם קיימת רקמה שיורית של סרטן שנשארה מאחור). הדבר משמש  גם לשיטת הפריסה לפרוסות (Bread loafing) או שיטת העיבוד CCPDMA (שיטה מקובלת להסרת סוגי סרטן מסוימים במיחוד בעור).

אוטם שריר הלב

לאחר אוטם שריר הלב (התקף לב), לא ניתן להבחין בשינויים היסטופתולוגיים במשך כ- 30 הדקות הראשונות.  הסימן האפשרי הראשון מופיע רק כעבור 4 השעות הראשונות הוא גליות של הסיבים בגבול. עם זאת מאוחר יותר, מתחיל נמק של קרישת דם, עם בצקת ושטפי דם. כעבור 12 שעות, ניתן לראות קריופיקנוזיס (karyopyknosis = דחיסה אי רורסיבלית של כרומטין בתא העובר נמק) והיפראאוזינופילה (hypereosinophilia) של תאי השריר עם התכווצות נמק ברצועת השוליים, כמו גם תחילתה של הסננת נויטרופילים. כעבור 1 – 3 ימים מתקיים נמק קרישה עם אבדן של גרעינים ופספוס וחדירה מוגברת של נויטרופילים לנוזל הבין תאי. עד סוף השבוע הראשון לאחר האוטם ישנה התחלה של התפוררות של מסת סיבי שריר, נמק של נויטרופילים, והתחלה של הסרת תאים מתים על ידי  מקרופאגים על הגבול, אשר מתגבר עם הזמן. כעבור שבוע יש גם התחלה של היווצרות רקמה גרנולרית בשוליים, המבשילה במהלך החודש הבא, והגברה של משקעי קולגן וירידה בצלולריות עד השלמה מלאה של הצטלקות שריר הלב כחודשיים לאחר אוטם שריר הלב.