Shotgun sequencing

ריצוף גנום שלם בשיטת ה-shotgun sequencing

ריצוף גנום שלם על ידי שימוש בשיטת ה-shotgun sequencing עבור גנומים קטנים (4000 עד 7000 זוגות בסיסים) היה בשימוש כבר ב-1979. שיטת ה-pairwise end sequencing (ריצוף מבוסס קצוות), הידועה יותר בשם double-barrel shotgun sequencing (ריצוף בשיטת רובה הציד כפול הקנה) תרמה ליישום נרחב יותר של השיטה. ככל שפרויקטי הריצוף התחילו להתמודד עם רצפי DNA ארוכים ומורכבים יותר, קבוצות רבות הבינו שניתן לקבל מידע מועיל על ידי ריצוף של שני הקצוות של מקטע DNA. אף על פי שריצוף שני הקצוות של אותו מקטע ומעקב אחר הנתונים היה מסורבל יותר מאשר ריצוף של קצה יחיד של שני רצפים שונים, הידע ששני הרצפים היו בכיוונים הפוכים והיו בערך במרחק של אורך מקטע אחד זה מזה (כלומר המרחק ביניהם היה ידוע באופן מקורב), היה בעל ערך לצורך שחזור הרצף של מקטע המטרה המקורי. התיאור הראשון שפורסם על שימוש בזיווג קצוות (paired ends) היה ב-1990, כחלק מריצוף הלוקוס ההומני HGPRT, אם כי השימוש בזיווג קצוות היה מוגבל לסגירת הפערים שנותרו לאחר יישום שיטת ה-shotgun sequencing המסורתית. התיאור הראשון של שימוש באסטרטגיית pairwise end טהורה, המניחה שהמקטעים הם באורך קבוע, פורסם בשנת 1991. באותו תקופה היה קונצנזוס בקהילה שאורך המקטע האופטימלי עבור ריצוף בשיטת pairwise end אמור להיות פי 3 מאורך רצף הקריאה. ב-1995 חוקרים ממעבדתו של Roach הציגו את החידוש שבשימוש במקטעים ממגוון גדלים, והדגימו שריצוף באסטרטגיית pairwise end-sequencing טהורה הוא אפשרי עבור רצפים גדולים. בעקבות זאת, אסטרטגיה זו אומצה על ידי המכון למחקר גנומי (The Institute for Genomic Research ,TIGR) על מנת לרצף את הגנום של החיידק Haemophilus influenzae בשנת 1995, ולאחר מכן על ידי חברת Celera Genomics כדי לרצף את הגנום של Drosophila melanogaster (זבוב הפירות) בשנת 2000, ולבסוף לריצוף הגנום האנושי.
כדי ליישם את השיטה, DNA בעל משקל מולקולרי גבוה מחולק למקטעים רנדומליים, נבחר על סמך גודל (בדרך כלל 2, 10, 50, ו-150 אלפי בסיסים), ומוחדר לתוך וקטור (פלסמיד) מתאים. לאחר מכן המקטעים מרוצפים משני קצותיהם בשיטת ה-chain termination, מה שמניב שני רצפים קצרים. כל רצף נקרא קריאת קצה (end-read) או קריאה (read) ולשתי קריאות מאותו מקטע קוראים mate pairs (זוגות משלימים). מאחר ששיטת ה-chain termination יכולה בדרך כלל להפיק קריאות באורך של בין 100 ל-500 בסיסים, זוגות משלימים יהיו חופפים ברצפם לעיתים רחוקות למעט המקרים של ריצוף מקטעים קצרים ביותר.
הרצף המקורי משוחזר מהקריאות באמצעות שימוש בתוכנה להרכבת רצפים. תחילה, קריאות חופפות נאספות לרצפים ארוכים ומורכבים יותר המכונים contigs. רצפים אלו יכולים להיות מקושרים יחדיו להרכבת "פיגומים" (scaffolds) על ידי מעקב אחר הקשרים בין זוגות משלימים. ניתן להסיק לגבי המרחק בין contigs על סמך המיקום של זוגות משלימים, אם ידוע האורך הממוצע של מקטע בספרייה ויש לו טווח סטייה צר. בהתאם לגודל הפער בין ה-contigs, טכניקות שונות יכולות למצוא את הרצפים שבפערים. אם הפער הוא קטן (5 עד 20 אלפי בסיסים) אז נדרש שימוש ב-PCR על מנת להגביר את האזור הרצוי, ולאחר מכן מבוצע הריצוף. אם הפער גדול (יותר מ-20 אלף בסיסים) אז המקטע הגדול משובט לוקטורים מיוחדים כדוגמת כרומוזומים בקטריאליים מלאכותיים (BAC) ולאחר מכן מבוצע ריצוף של הווקטור.
חסידי הגישה הזו טוענים כי ניתן לרצף את כל הגנום בפעם אחת באמצעות שימוש במערכים גדולים של מכונות ריצוף (sequencers), מה שהופך את כל התהליך להרבה יותר יעיל לעומת הגישות המסורתיות יותר. המתנגדים לשיטה טוענים כי אף על פי שהשיטה מרצפת בצורה מהירה אזורים גדולים של DNA, היכולת שלה לקשור רצפים אלו בצורה נכונה נתונה בספק, במיוחד עבור גנומים עם אזורים אשר חוזרים על עצמם. ככל שתוכנות להרכבת רצפים הופכות למתוחכמות יותר וכוח המחשוב הופך לזול יותר, ייתכן וניתן יהיה להתגבר על מגבלה זו.

כיסוי (coverage)

כיסוי ("עומק הקריאה" או פשוט ה"עומק"), הוא המספר הממוצע של קריאות המייצגות נוקליאוטיד מסוים ברצף שהורכב מחדש. את הערך ניתן לחשב על סמך האורך של הגנום המקורי (G), מספר הקריאות (N) ואורך קריאה ממוצעת (L) לפי הנוסחה הבאה: N*L/G. לדוגמה, לגנום היפותטי בעל 2,000 זוגות בסיסים אשר מורכב מחדש מ-8 קריאות עם אורך ממוצע של 500 נוקלאוטידים, יהיה עומק של X2 ‏(2x redundancy). פרמטר זה מאפשר גם להעריך כמויות אחרות, כדוגמת אחוז הגנום המכוסה על ידי הקריאות (גם הוא לעיתים מכונה באנגלית coverage). כיסוי גבוה בריצוף shotgun sequencing רצוי משום שהוא יכול להתגבר על שגיאות בקריאת בסיסים והרכבתם. הנושא של תאוריית ריצוף DNA מטפל ביחסים שבין כמויות כאלה.
לעיתים נעשית הבחנה בין כיסוי רצפים לבין כיסוי פיזי. כיסוי רצפים הוא המספר הממוצע של פעמים שבהם בסיס נקרא (כפי שתואר קודם). כיסוי פיזי הוא מספר הפעמים הממוצע שבסיס נקרא או שנמצאו עבורו קריאות משלימות מתאימות.

ריצוף בשיטת shotgun ובשיטות ריצוף מהדור החדש

הריצוף הקלאסי בשיטת shotgun sequencing מבוסס על ריצוף בשיטת סנגר (sanger sequencing), הטכניקה המתקדמת ביותר לקביעת רצף הגנום מאז 1995-2005. כיום עדיין נעשה שימוש ב-shotgun sequencing, זאת תוך כדי שימוש בטכנולוגיות אחרות הנקראות Next-generation sequencing (הדור החדש של הריצוף). טכנולוגיות אלה מייצרות קריאות קצרות יותר (25-500 בסיסים) אך יחד עם זאת, הן מייצרות מאות אלפים או מיליוני קריאות בזמן קצר. דבר זה מאפשר כיסוי גבוה, אבל תהליך ההרכבה הרבה יותר יקר מבחינה חישובית. טכנולוגיות אלה עדיפות על פני ריצוף בשיטת סנגר משום הנפח הגדול של הנתונים והזמן הקצר שנדרש על מנת לרצף את כל הגנום. החיסרון העיקרי הוא שהדיוק נמוך יותר (אף על פי שהכיסוי הגבוה מפצה על כך).