מעכבי אנזימים

דוגמאות למעכבי אנזימים הפיכים

משום שאנזימים התפתחו לקשור את הסובסטרט שלהם בחוזקה, ורוב מעכבי האנזימים ההפיכים נקשרים לאתר הפעיל של האנזימים, אין זה מפתיע כי יש דמיון בולט במבנה של חלק ממעכבים אלו למבנה הסובסטרטים של מטרתם. דוגמה ל"חקייני סובסטרט" אלו הם מעכבי פרוטאז, משפחה מוצלחת במיוחד של תרופות נוגדות רטרו וירוסים (Antiretroviral drugs) המשמשות לטיפול ב-HIV. ריטונאביר, מעכב פרוטאז המבוסס על פפטיד הכולל שלושה קשרים פפטידיים מוצג משמאל. מאחר שתרופה זו דומה לחלבון שהוא סובסטרט של פרוטאז ה-HIV, היא מתחרה עם סובסטרט זה באתר הפעיל של האנזים. מעכבי אנזימים בנויים לעיתים קרובות כדי להידמות למצב המעבר או מצב ביניים של תגובת קטליזת-אנזים. זה מבטיח שהמעכב מנצל את השפעת ייצוב אנזים של מצב המעבר ובכך לאפיניות קשירה טובה יותר (Kᵢ נמוך יותר) מאשר המבנים מבוססי הסובסטרט. דוגמה למעכב מצב מעבר שכזה היא התרופה האנטיוויראלית אוסלטמיביר; תרופה זו מחקה את טבעה השטוח של טבעת יון האוקסוניום בתגובת האנזים הוויראלי נאורמינידז.
עם זאת, לא כל המעכבים מבוססים על מבנה של סובסטרטים. למשל, מבנהו של מעכב פרוטאז HIV אחר טיפרנאביר (Tipranavir) המוצג מימין. מולקולה זו אינה מבוססת על פפטיד ואין לה דמיון מבני ברור לסובסטרט חלבון. מעכבים לא פפטידים אלו יכולים להיות יציבים יותר ממעכבים הכוללים קשרים פפטידים, כיוון שלא יהוו סובסטרטים בעבור פפטידז ויש סיכוי נמוך יותר לכך שיופחתו בכמותם בתא.
בתכנון תרופות חשוב לשקול את ריכוזי הסובסטרטים שאליהם נחשפים אנזימי המטרה. לדוגמה, חלק מהמעכבים של חלבוני קינאז הם בעלי מבנים כימיים שדומים ל-ATP, אחד הסובסטרטים של אנזימים אלו. תרופות שהן מעכבים תחרותיים פשוטים יצטרכו להתחרות בריכוזים גבוהים של ATP בתא. חלבוני קינאז יכולים להיות מעוכבים גם על ידי תחרות באתרי הקישור שבהם הקינאזים פועלים עם חלבוני הסובסטרטים שלהם, ורוב החלבונים מצויים בתוך תאים בריכוזים נמוכים בהרבה מאשר ריכוז ה-ATP. כתוצאה מכך, אם שני מעכבים של חלבוני קינאז קשורים יחדיו באתר הפעיל עם אפיניות דומה, אך רק אחד מהם צריך להתחרות ב-ATP, אז המעכב התחרותי באתר הקישור של החלבון יעכב את האנזים בצורה יעילה יותר.

סוגים של עיכוב בלתי הפיך

מעכבים בלתי הפיכים משנים בדרך כלל את האנזים מבחינה קוולנטית ובעקבות כך העיכוב הוא בלתי הפיך. מעכבים בלתי הפיכים כוללים לעיתים קרובות קבוצות פונקציונליות ראקטיביות כגון חרדל חנקן (nitrogen mustard), אלדהידים, הלואלקאנים או אלקנים. קבוצות אלקטרופיליות אלו מגיבות עם חומצות אמיניות של קבוצות צד ליצירת קשרים קוולנטים. הקבוצות המשתנות הן אלו עם קבוצות צד שכוללות נוקלאופיל כגון קבוצות הידרוקסיל וסולפהידריל, זה כולל את החומצות האמיניות סרין, ציסטאין, תראונין וטירוזין.
עיכוב בלתי הפיך שונה מאינאקטיביזציה בלתי הפיכה של אנזים. מעכבים בלתי הפיכים הם ספציפיים בדרך כלל לסוג אחד של אנזים, ולא משביתים את כל החלבונים; הם לא פועלים באמצעות הרס מבנה החלבון אלא באמצעות שינוי ספציפי של האתר הפעיל של מטרתם. לדוגמה, מצבים קיצוניים של pH וטמפרטורה גורמים בדרך כלל לדנטורציה של כל מבנה החלבון, אך זוהי השפעה לא ספציפית. באופן דומה, כמה טיפולים כימיים לא ספציפיים הורסים את מבנה החלבון; למשל חומצה הידרוכלורית מרוכזת תגרום להידרוליזה של הקשרים הפפטידים שמחזיק את הפפטידים יחדיו, וישתחררו חומצות אמינו חופשיות.

אנליזה של עיכוב בלתי הפיך

כמוצג באיור מימין, מעכבים בלתי הפיכים יוצרים תצמיד לא קוולנטי הפיך עם האנזים (EI) או עם תצמיד האנזים-סובסטרט (ESI) ואז גורמים לתגובה שבה נוצר תצמיד שעבר שינוי קוולנטי, תצמיד שלא מתפקד עוד - EI*. הקצב שבו נוצר EI* נקרא קצב האינאקטיביזציה או kinact. מאחר שהתהוות EI עשויה להתחרות עם ES, קשירה של מעכבים בלתי הפיכים ניתנת למניעה על ידי תחרות עם סובסטרט או בתחרות עם מעכב שני, הפיך. אפקט הגנה זה הוא הוכחה טובה לתגובה ספציפית של מעכב בלתי הפיך עם האתר הפעיל.
צעדי הקשירה והאינאקטיביזציה של תגובה זו נחקרים באמצעות השמת האנזים עם מעכב ובחינת כמות הפעילות שנותרת במהלך הזמן. הפעילות תפחת באופן תלוי בזמן, בדרך כלל על פי דעיכה אקספוננציאלית. התאמת נתונים אלו למשוואת הקצב נותנת את קצב האינקטיבציה בריכוז זה של מעכב. תהליך זה נעשה בריכוזים שונים של מעכב. אם תצמיד הפיך של EI מעורב, קצב האינקטיבציה יהיה בר רוויה ובהתאם לעקום שכזה יינתנו kinact ו-Kᵢ
שיטה נוספת שנמצאת בשימוש נפוץ באנליזות אלו היא ספקטרומטריית מסות. בשיטה זו, מדידה מדויקת של המסה של האנזים שלא עבר שינוי ושל האנזים הלא פעיל נותנת את העלייה במסה שנגרמת מתגובה עם מעכב ומראה את הסטוכיומטריה של התגובה. זה נעשה בדרך כלל באמצעות ספקטרומטר מסה MALDI-TOF. בשיטה משלימה, PMF‏ (Peptide mass fingerprinting) מבוצע עיכול של החלבון במצב המקורי ובמצב שעבר שינוי, באמצעות פרוטאז כגון טריפסין. בסופו של התהליך נוצר מערך של פפטידים שניתן לבצע עליהם אנליזה באמצעות ספקטרומטר מסה. הפפטיד שהשתנה במסתו לאחר התגובה עם המעכב יהיה זה שבו יש את אתר השינוי.

מקרים מיוחדים

לא כל מעכבי האנזימים הבלתי הפיכים יוצרים קשרים קוולנטים עם מטרות האנזים שלהם. ישנם מעכבים הפיכים שנקשרים כה חזק לאנזימי המטרה שלהם, עד כדי כך שניתן להתייחס אליהם כמעכבים בלתי הפיכים. המעכבים שנקשרים כה חזק יכולים להראות קינטיקה דומה לזו של מעכבים קוולנטים בלתי הפיכים. במקרים אלו, חלק מהמעכבים הללו נקשרים במהירות לאנזים בתצמיד EI עם אפיניות נמוכה ותצמיד זה עובר אז סידור איטי מחדש לתצמיד EI* עם קשר חזק (ראו איור לעיל). התנהגות קינטית זו קרויה קשירה-אטית (slow-binding). הסידור האיטי מחדש לאחר הקשירה לעיתים קרובות מערב שינויי קונפורמציה. בין הדוגמאות למעכבים שמבצעים קשירה-אטית נמנות כמה תרופות חשובות בהן מטוטרקסט, אלופורינול, וצורתו המשופעלת של אציקלוביר.

דוגמאות למעכבים בלתי הפיכים

דיאיסופרופילפלורופוספט (DFP) מוצג בתרשים לעיל מצד שמאל כדוגמה למעכב פרוטאז בלתי הפיך. האנזים מבצע הידרוליזה של הקשר זרחן-פלואור ב-DFP, אך קבוצת הזרחן נותרת קשורה לסרין באתר הפעיל, ומשבשת את פעילותו. באופן דומה, ה-DFP מגיב גם עם האתר הפעיל של אצטילכולין אסטראז בסינפסה של הנוירונים, וכתוצאה מכך הוא נוירוטוקסין חזק, ומינונו הקטלני הוא פחות מ-100 מ"ג.
עיכוב "התאבדותי" (Suicide inhibition) הוא סוג לא נפוץ של עיכוב בלתי הפיך שבו האנזים הופך את המעכב לצורה ריאקטיבית באתר הפעיל שלו. דוגמה לכך היא המעכב של ביוסינתה של פוליאמין, α-דיפלורומתילאורניתין או DFMO, אשר דומה לחומצה האמינית אורניתין, ומשמש לטיפול במחלת השינה. האנזים אורניתין דהקרבוקסילאז יכול לזרז את הוצאת הקרבוקסילים של DFMO במקום אורניתין. ואולם, תגובת הוצאת הקרבוקסילים מובילה להסרת אטום הפלואור, שהופך את מתווך קטליטי זה לאימין, אלקטרופילי מאוד. צורה ריאקטיבית זו של DFMO מגיבה אז עם קבוצת ציסטין או ליזין באתר הפעיל להשבתה בלתי הפיכה של האנזים.
מאחר שעיכוב בלתי הפיך מערב לעיתים קרובות יצירה ראשונית של תמיד EI לא קוולנטי, לעיתים אפשרי שהמעכב ייקשר לאנזים ביותר מצורה אחת. למשל, באיור המציג את האנזים טריפנותיון רדיוקטז מהטפיל החד תאי Trypanosoma cruzi, ישנן שתי מולקולות של המעכב quinacrine mustard, שקשורות באתר הפעיל שלו. המולקולה הראשונה קשורה בצורה הפיכה, אך התחתונה קשורה קוולנטית לאחר שהגיבה עם קבוצת חומצת האמינו דרך קבוצת החנקן-חרדל שלה.

גילוי ותכנון מעכבים

תרופות חדשות הן תוצר של תהליך ארוך של פיתוח תרופה, שאחד הצעדים הראשונים שבו הוא לעיתים קרובות גילוי של מעכב אנזים חדש. בעבר הדרך היחידה לגילוי מעכבים חדשים אלו הייתה באמצעות ניסוי וטעייה: בדיקת מאגר גדול של תרכובות נגד אנזים מטרה בתקווה שיתגלו תכונות שימושיות. גישת ניסוי וטעייה זו עדיין מצליחה ואף הורחבה על ידי הכימיה הקומבינטורית שבה נסרקות מספר גדול של תרכובות בטכנולוגית סריקת HTC ‏(High-throughput screening) לסריקה מהירה של אוספים כימיים ענקיים אלו במטרה למצוא מעכבים שימושיים.
לאחרונה, מיושמת גם גישה חלופית בשם "Rational drug design", שבה נעשה שימוש במבנה התלת ממדי של האתר הפעיל של אנזים כדי לחזות אילו מולקולות עשויות לפעול כמעכבים. לאחר מכן נבדקות תחזיות אלו ואחת מן התרכובות הנבדקות עשויה להיות מעכב חדש. המעכב החדש משמש אז כדי לנסות להשיג את המבנה של האנזים בתצמיד האנזים/מעכב כדי לראות עד כמה נקשרת המולקולה לאתר הפעיל. מבנה זה נבדק אז ונערכים שינויים במעכב בניסיון להשיג קשירה אופטימלית. מסלול בדיקה ושיפור זה חוזר אז עד ליצירה של מעכב בעל השפעה מספקת. לרוב תהליך זה מכוון לייצור מעכב עם קבוע דיסוציאציה של <10⁻⁹ מולר

שימושים במעכבים

מעכבי אנזימים נמצאים בטבע ומופקים במסגרת הפרמקולוגיה והביוכימיה. רעלים המצויים בטבע הם לעיתים קרובות מעכבי אנזימים שהתפתחו כדי להגן על צמח או בעל חיים מפני טורף. רעלים טבעיים אלו כוללים כמה מהתרכובות הרעילות ביותר המוכרות כיום. מעכבים מלאכותיים משמשים לעיתים קרובות כתרופות, אך גם כמדבירי חרקים כדוגמת מלתיון, או כחומרים קוטלי עשבים כדוגמת גליפוסט, או כחומרי חיטוי כדוגמת טריקלוסן.

כימותרפיה

השימוש הרווח ביותר במעכבי אנזימים הוא כתרופות לטיפול במחלות. רבים ממעכבים אלו מכוונים לעכב אנזים אנושי במטרה לתקן מצב פתולוגי. חלק מהתרופות המשפיעות על פעילות של אנזימים פועלות שלא בצורה של עיכוב אנזים שנידונה כאן. לדוגמה, תרופות אנטי-אפילפטיות משנות פעילות אנזים באמצעות הגדלה או הפחתה של האנזים המיוצר. תרופות כאלו מבוססות על שינויים בביטוי גנים. תרופות אחרות פועלות על מטרות תאיות שאינן אנזימים, כגון תעלות יונים או קולטני ממברנה.
דוגמה מעניינת למעכב אנזימים המשמש כתרופה הוא סילדנפיל (ויאגרה), הנפוץ לטיפול בבעיות זיקפה (ראו איור משמאל). תרכובת זו היא מעכב חזק של האנזים cGMP פוספודיאסטרז ספציפי סוג 5, אשר מקטין את הסיגנלים של מולקולת ה-cyclic guanosine monophosphate. האחרונה היא מולקולת העברת סיגנלים שמעוררת רגיעת שריר חלק ומאפשרת לדם לזרום לגוף המחילתי, דבר שגורם לזקיפה. מאחר שהתרופה מקטינה את פעילותו של האנזים שעוצר את הסיגנל, היא מאריכה את זמן הסיגנל לזמן ארוך יותר.
דוגמה נוספת לדמיון המבני של חלק מהמעכבים לסובסטרטים של אנזימי המטרה שלהם נראית באיור המשווה את התרופה מטוטרקסט לחומצה פולית. חומצה פולית היא צורתו המחומצנת של הסובסטרט של האנזים די-הידרו-פולאט רדוקטאז, אנזים שמעוכב בעוצמה על ידי מטוטרקסט. מטוטרקסט חוסם את פעולתו אנזים ה-DHFR ועל ידי כך עוצר את הביוסינתזה של תימידין. חסימה זו של הביוסינתזה של נוקלאוטיד זה היא רעילה באופן סלקטיבי לתאים שגדלים במהירות, ולכן לעיתים קרובות נעשה שימוש במטוטרקסט בכימותרפיה לטיפול בסרטן.
תרופות משמשות גם לעיכוב אנזימים החיוניים להישרדותם של פתוגנים. למשל, חיידקים מוקפים בדופן תא עבה העשוי מופלימר דמוי רשת, פפטידוגליקן. אנטיביוטיקות רבות כדוגמת פניצלין וואנקומיצין מעכבות את האנזימים שאחראים על ייצור וקישור יחד של שרשראות פולימר זה. כך גורמים מעכבים אלו לדופן התא לאבד מחוזקו ולהרג החיידק. באיור משמאל, מולקולה של פניצלין מוצגת קשורה למטרתה, הטרנספפטידז מהחיידק Streptomyces R61.
תהליך תכנון תרופה נעשה ביתר קלות כאשר אנזים שנחוץ להישרדות פתוגן אינו קיים או שונה באופן משמעותי אצל בני אדם. בדוגמה לעיל, בני אדם לא יוצרים פפטידוגליקן, ולכן מעכבים של תהליך זה רעילים באופן סלקטיבי לחיידקים. רעילות סלקטיבית נוצרת באנטיביוטיקות גם באמצעות ניצול הבדלים במבנה של הריבוזומים בחיידקים, או באופן שבו הם יוצרים חומצות שומן.

בקרה מטבולית

למעכבי אנזימים יש חשיבות גם בבקרה מטבולית. מסלולים מטבוליים רבים בתא מעוכבים על ידי מטבוליטים שמבקרים את הפעילות האנזימטית דרך רגולציה אלוסטרית או עיכוב סובסטרט. דוגמה טובה לכך היא הרגולציה האלוסטרית של הגליקוליזה. מסלול קטבולי זה מנצל גלוקוז ומייצר ATP, NADH ופירובט. שלב מפתח ברגולציה של גליקוליזה הוא תגובה מוקדמת במסלול שמזורזת על ידי פוספופרוקטוקינז-1 (PFK1). כשרמת ה-ATP עולה, ATP נקשר לאתר אלוסטרי ב-PFK1 ובכך מקטין את קצב תגובת האנזים; הגילוקליזה מעוכבת ויצירת ה-ATP פוחתת. בקרת משוב שלילי זו מסייעת בתחזוקת ריכוז יציב של ATP בתא. אולם, מסלולים מטבוליים לא מווסתים רק באמצעות עיכוב, זאת מפני שיש חשיבות גם לאקטיביזציה של האנזים. ביחס לאנזים PFK1, פרוקטוז 2,6-ביספוספט ו-ADP הם דוגמאות למטבוליטים שהם מפעילים אלוסטריים.
עיכוב אנזים פיזיולוגי יכול להיות מושג גם באמצעות מעכבים חלבוניים מסוימים. תהליך שכזה מתרחש בלבלב, אשר מסנתז זימוגנים (אנזימים במצב בלתי פעיל) שבמצבם הפעיל מסוגלים לבצע עיכול. חלק מהם הופכים לפעילים על ידי פרוטאז טריפסין, כך שיש חשיבות לעיכוב פעילות הטריפסין בלבלב כדי למנוע מהאיבר לעכל עצמו. אחת הדרכים שבאמצעותן מבוקר הטריפסין היא ייצור של חלבון מעכב טריפסין ספציפי וחזק בלבלב. מעכב זה נקשר בחוזקה לטריפסין, ומונע פעילות טריפסין שאחרת הייתה מזיקה לאיבר. על אף שמעכב הטריפסין הוא חלבון, הוא אינו עובר הידרוליזה כסובסטרט על ידי הפרוטאז, זאת הוא משיג באמצעות הוצאת מים מהאתר הפעיל של טריפסין ופגיעה ביציבות מצב המעבר. דוגמה נוספת לחלבון עיכוב אנזים פיזיולוגי היא מעכב Barstar של הריבונוקלאז החיידקי Barnase.

רעלים טבעיים

בעלי חיים וצמחים פיתחו יכולת לסנתז מגוון רחב של תוצרים רעילים בהם מטבוליטים שניוניים, פפטידים וחלבונים שמסוגלים לתפקד כמעכבים. רעלנים טבעיים הם בדרך כלל מולקולות אורגניות קטנות והם כה שונים עד כדי כך שקיימים כנראה מעכבים טבעיים לרובם של התהליכים המטבוליים. התהליכים המטבוליים שכלפיהם מכוונים רעלים טבעיים כוללים לא רק אנזימים במסלולים מטבוליים, אלא גם עיכוב של קולטנים, תעלות וחלבונים מבניים הפועלים בתא. לדוגמה, פקליטקסל (טקסול), מולקולה אורגנית המצויה בעצי טקסוס, נקשרת בחוזקה לדימרים של טובולין ומעכבת את הרכבתם למיקרוטובולים בשלד התא.
רעלים טבעיים רבים מתפקדים כנוירוטוקסינים שיכולים לגרום לשיתוק שמוביל למוות ולהם תפקידים בהגנה נגד טורפים או בצייד ובתפיסת טרף. חלק ממעכבים טבעיים אלו, חרף התכונות הרעילות שלהם, הם בעלי ערך לשימושים רפואיים במינונים נמוכים. דוגמה לנוירוטוקסין היא גליקואלקלואידים, ממיני צמחים השייכים למשפחת הסולניים, שהם מעכבים של האנזים אצטילכולין אסטראז. עיכוב של אנזים זה גורם לעלייה בלתי מבוקרת בנוירוטרנסמיטור אצטילכולין, לשיתוק שרירים ואז למוות. נוירוטוקסיות יכולה להיגרם גם כתוצאה מעיכוב של קולטנים; לדוגמה, אטרופין מאטרופה רפואית שמתפקד כאנטגוניסט תחרותי של קולטני אצטילכולין מוסקריניים.
אף על פי שרעלים טבעיים רבים הם מטבוליטים שניוניים, רעלים אלו כוללים גם פפטידים וחלבונים. דוגמה לפפטיד רעיל הוא אלפא אמניטין שנמצא בפטריות מהסוג אמנית (Amanita). זהו מעכב אנזים חזק שמונע מהאנזים רנ"א פולימרז II מלתעתק דנ"א. גם הרעלן מיקרוציסטין (microcystin) המיוצר על ידי כחוליות הוא פפטיד והוא מעכב של חלבוני פוספטזות. רעל זה יכול לזהם מאגרי מים לאחר פריחת אצות והוא קרצינוגן מוכר, ובריכוזים גבוהים יכול לגרום גם לדימום חמור בכבד ולמוות.
גם חלבונים יכולים להיות רעלים טבעיים, כדוגמת מעכבי טריפסין (ראו לעיל) שמצויים בכמה קטניות. דוגמה פחות נפוצה של רעלים טבעיים היא אנזימים רעילים: הם פועלים כמעכבים בלתי הפיכים של מטרות האנזימים שלהם ופועלים באמצעות שינוי כימי של אנזימי הסובסטרט שלהם. דוגמה לכך הוא הריצין, חלבון רעיל במיוחד הנמצא בקליפת הזרע של צמח הקיקיון. אנזים זה הוא גליקוסידז שמסוגל להוציא ריבוזומים מכלל פעולה. מאחר שריצין הוא מעכב בלתי הפיך קטליטי, די במולקולה בודדת שלו כדי להרוג תא.