דנטורציה

דֵּנָטוּרַצְיָה (מאנגלית: Denaturation. בעברית: צְמִיתָה, בתרגום מילולי: שלילת המצב הטבעי) היא תהליך שבו משתנה המבנה המרחבי, הטבעי של מולקולה ביולוגית גדולה. המושג מתייחס בדרך כלל לחלבונים או לחומצות גרעין. דנטורציה נגרמת עקב שינויים בסביבה של המולקולה, כגון עלייה בטמפרטורה, שינוי ברמת ה-pH (חומציות או בסיסיות יתר), שינוי בריכוזי יונים, נוכחות של חומרים שונים וכדומה.
בחלבונים, שינוי המבנה המרחבי שלהם פוגע בתפקודם ומוציא אותם מכלל פעולה. דנטורציה מלאה היא בלתי הפיכה בדרך כלל. אם הדנטורציה לא התרחשה במלואה, או שהתרחשה בתנאי מעבדה מיוחדים, גדל הסיכוי שבהסרת הגורמים לדנטורציה יתרחש התהליך ההפוך - רנטורציה, והחלבון ישוב לתפקד לאחר זמן מה.
בחומצות גרעין, דנטורציה מתבטאת בהפרדה בין שני גדילי ה-DNA. היא מתרחשת דרך קבע בתא בתהליכי השעתוק (טרנסקריפציה) וההכפלה (רפליקציה) של ה-DNA, ויש לה שימושים רבים במחקר הגנטי ובתעשייה. רנטורציה במקרה זה היא תהליך איחוים של שני הגדילים זה לזה (אנילינג בעגה המדעית), וגם היא נפוצה במחקר, בצמוד לדנטורציה.

טמפרטורה

כשמעלים את הטמפרטורה של גוף מסוים הדבר מתבטא בהגברת מהירות החלקיקים שמהם הוא מורכב. כשמחממים חלבונים, מוגבר קצב תנודות האטומים בחלבון. הדבר גורם לכך שאותן אינטראקציות חלשות בין חומצות האמינו המרכיבות את החלבון תתפרקנה, והמבנה הטבעי שלו יתערער. כתוצאה מכך תיווצר שרשרת אקראית חסרת מבנה מוגדר. תהליך זה מתרחש לדוגמה בעת בישול (או טיגון) ביצה. בלובן הביצה מצויים חלבונים רבים, שאחד הנפוצים שבהם הוא אלבומין. החלבונים מתחממים והקשרים הלא-קוולנטיים שבהם מתפרקים וגורמים להיחלשות המבנה. בטמפרטורה מסוימת קורס המבנה בבת אחת למבנה אקראי, והאלבומין הופך למשקע לבן. תהליך הדנטורציה איננו הדרגתי: מיד לאחר שהיחלשות האינטראקציות עוברת סף מסוים, קורס המבנה בבת אחת. סף זה מצוי ברוב החלבונים מתחת ל-70 מעלות צלזיוס. חלבוני חיידקים תרמופיליים, החיים בטמפרטורה הקרובה ל-100 מעלות, בקרבת מבועים ומעיינות חמים, הם היוצאים מהכלל. לחלבונים המופקים מחיידקים אלה מקום מרכזי בשיטות מעבדתיות כגון PCR.
העובדה שלכל חלבון ישנן טמפרטורות שבהן הסיכוי שיעבור דנטורציה גבוה במיוחד, יוצרת גבול עליון לטמפרטורה המתאימה לפעילות יעילה של החלבון. טמפרטורות נמוכות, גם הן אינן מאפשרות את פעילותו של החלבון, לא בשל דנטורציה אלא מכיוון שככל שהטמפרטורה נמוכה יותר המולקולות נעות לאט יותר, ולפיכך פעילות החלבון גם היא איטית יותר (מכיוון שהיא מוכתבת בין השאר על ידי מהירות תנועת המולקולות). בטמפרטורות נמוכות מדי, החלבון איננו פועל ביעילות בשל המהירות הנמוכה של המולקולות בתמיסה, מה שיוצר גבול תחתון לפעילותו של החלבון. לכן לכל חלבון קיים טווח טמפרטורות אידיאלי לפעילותו. הטמפרטורה האידיאלית לחלבוני גוף האדם היא בין 36 ל-38 מעלות צלזיוס. בטמפרטורות אלה עוד לא מתרחשת דנטורציה, אך הן מספיק גבוהות כדי שפעילות החלבון תהיה יעילה.
קיימות טענות על כך שדנטורציה מתרחשת גם בטמפרטורות נמוכות, קרוב לנקודת הקיפאון. כדי להסביר את התופעה, המכונה דנטורציה בקור, נדרשו החוקרים לשלב בטיעוניהם מודלים תרמודינמיים, המסבירים מדוע חלה ירידה ביציבות התרמודינמית של המערכת מתחת לטמפרטורה מסוימת. הסבר אפשרי, הנתמך בשלל ראיות, טוען כי רמות האנתלפיה והאנטרופיה של המים בסביבתו הקרובה של החלבון הן המשמעותיות, ובאינטראקציה של המים עם האזורים ההידרופוביים של החלבון טמון הכוח המניע את הדנטורציה בקור. דנטורציה בקור היא תופעה מעניינת, בשל הסברה כי הבנתה עד תום תחשוף מידע על מנגנון התקפלותו של החלבון בעת היווצרותו.

שינוי ה-pH

שינוי בחומציותה של תמיסת החלבון גורם אף הוא לדנטורציה. ככל שתמיסה חומצית יותר, יש בה למעשה יותר יוני מימן (⁺H, או ליתר דיוק ⁺H₃O). עלייה או ירידה בריכוזם של יוני המימן גורמת ליינונן של קבוצות צדדיות בחומצות אמינו מסוימות, ולטעינתן במטען חשמלי. המטען החשמלי גורם למשיכה או לדחייה חשמלית שלא הייתה קיימת קודם לכן בין קטעי חלבון שונים. אלו הן אינטראקציות חדשות בין חומצות האמינו, שלא היו קיימות לפני כן. הדבר מערער את המבנה הטבעי של החלבון וגורם לפתיחה חלקית שלו. פתיחה זו חושפת לסביבה החומצית או הבסיסית קבוצות צדדיות שלא היו חשופות עד כה, ומייננת גם אותן, מה שגורם לקריסתו הסופית של החלבון והופכת אותו לשרשרת אקראית חסרת מבנה.
לכל חלבון טווח pH שבו הוא נותר במצבו הטבעי והפעיל, על אף שינוי ריכוז יוני המימן. מרבית החלבונים אינם יכולים לחרוג בהרבה מה-pH הפיזיולוגי, שבין 6 ל-8. אך ישנם חלבונים רבים היוצאים מכלל זה, כגון האנזימים הפועלים בקיבה (פרוטאזות, כגון פפסין), ומסייעים בעיכולם של חלבונים אחרים. במיצי הקיבה מצויה חומצת מימן כלורי (HCl), שהיא חומצה חזקה. הסביבה החומצית גורמת לדנטורציה של החלבונים במזון, ובכך מסייעת לאנזימי העיכול (שהם עצמם, כאמור, סוג של חלבון) לפרק את הקשרים הפפטידיים שבין חומצות האמינו שבחלבוני המזון. האנזימים עצמם לא נפגעים, ויתרה מכך, אף זקוקים לנוכחות החומצה לצורך פעולתם.

השפעות הדנטורציה

שינויים במבנה המרחבי של החלבון גורמים לשינויים בתכונותיו השונות. על כך גם מרמז שמה של הדנטורציה, שפירושה המילולי הוא אובדן הטבע, או אובדן התכונות הטבעיות. השפעה זו על תכונות החלבון ניתנת לעיתים רבות למדידה. עובדה זו מנוצלת לשם איתור או מדידה של הדנטורציה למטרות מחקר, או למטרות תעשייתיות.

פעילות ביולוגית

לחלבונים רבים פעילות ביולוגית מוגדרת, הדורשת מבנה מרחבי מסוים. הידועים שבחלבונים אלה הם האנזימים. לאנזים אתר פעיל שבו מתרחשת הריאקציה שאותה הוא מזרז. האתר הפעיל מותאם לסובסטרט, דהיינו המולקולה עליה האנזים פועל, ולאופן הפעולה, בצורה מדויקת מבחינת מיקומן של חומצות האמינו במרחב. לפיכך, שינויים במבנה המרחבי של האתר הפעיל פוגעים בתפקודו התקין של האנזים. לחלבונים נוספים פעילות ביולוגית הדורשת קשירת מולקולות אחרות לאתר ספציפי, כגון נוגדנים וחלבוני הובלה כהמוגלובין. גם חלבונים אלה מאבדים מפעילותם כתוצאה מדנטורציה. אובדן הפעילות הביולוגית מנוצל לאיתור דנטורציה בחלבונים אלה, ואף למדידת עוצמתה. כך, כאשר חפצים בבדיקת הדנטורציה של אנזים, תיבדק כמות התוצר המופקת בחשיפתו של האנזים לסובסטרט שלו במשך זמן מוגדר. כמות תוצר אפסית יכולה להתפרש כביטוי לדנטורציה.

מסיסות

במקרים רבים, חלבונים אשר מסיסים באופן טבעי בתמיסה מימית, מאבדים ממסיסותם ושוקעים כתוצאה מדנטורציה שלהם. הדבר קורה בשל תהליכים רבים המתרחשים תוך כדי הדנטורציה הגורמים לזיקה בין מולקולות חלבון שונות לגדול, בעוד הזיקה לתמיסה שסביבם קטנה. למשל, הדנטורציה חושפת חלקים הידרופוביים של החלבון לתמיסה ההידרופילית, דבר שאינו רצוי מבחינה אנרגטית. לכן, החלקים ההידרופוביים של חלבונים שונים מתקרבים האחד לשני, ויוצרים ביניהם אינטראקציות הידרופוביות, המקטינות את שטח הפנים ההידרופובי החשוף למים. כשחלבונים רבים מתקרבים זה לזה בצורה זו, הדבר גורם להצטברותם של החלבונים למשקעים בלתי-מסיסים. אך הסבר זה פשטני במקצת, ואובדן המסיסות מתרחש רק לאחר סדרה של שינויים רבים במבנה החלבון, ושינוי בתכונות רבות שלו. גם לאחר שינויים אלה לא מובטחת שקיעה של החלבון, והדבר תלוי בסוג החלבון הנבדק ובתנאי הבדיקה.
אובדן המסיסות מנוצל בתעשיית מוצרי החלב. בתהליך הפקתם של מוצרים כיוגורט וגבינה, מוכנסים לחלב חיידקים המבצעים תהליך של תסיסה, שבמהלכו מופקת חומצה לקטית. החומצה מורידה את ה-pH של החלב, וגורמת לדנטורציה של החלבונים שבו. החלבונים מאבדים ממסיסותם ושוקעים, וכך יוצרים את המרקם הסמיך של היוגורט. הפרדה בין הרכיב הנוזלי של החלב (מי חלב), לבין הרכיב המוצק שלו כתוצאה משקיעת החלבונים, מאפשרת את ייצור הגבינה. אותו תהליך מתרחש כשחלב מתקלקל ומחמיץ - חלבוני החלב יוצרים משקעים בחלב וגורמים למרקם לא אחיד ולגושים, הנוספים לטעם החמוץ שיוצרת החומצה הלקטית.

פירוק פרוטאוליטי

דנטורציה עשויה להשפיע על רגישותו של החלבון לפירוק פרוטאוליטי, היינו לפעילותם של אנזימי עיכול. גם הגברת הרגישות לעיכול, כמו אובדן המסיסות, לא נזקפת לתהליך בודד, אלא היא תוצאה של שינויים רבים במבנה החושפים חלקים רגישים לפירוק לפני השטח (כשלפני כן היו בחלקים הפנימיים של החלבון), וגורמים להגברת רגישותם של חלקים אחרים. בכל אופן כמו שהוזכר, עובדה זו מנוצלת בקיבה, כאשר הסביבה החומצית גורמת לדנטורציה של החלבונים הנכנסים לקיבה, כך שרגישותם לאנזימי העיכול גדלה. כך הפעילות הפרוטאוליטית מואצת, ופירוק החלבונים נעשה יעיל יותר. גם לתכונה זו שימוש באיתור דנטורציה - חשיפת החלבון לאנזימי עיכול גורמת לפירוק מואץ וטוב יותר של חלבונים דנטורטיביים.

דנטורציה חלקית ורנטורציה

תהליך הדנטורציה יכול להתרחש במספר רמות. הוא יכול להתרחש כדנטורציה מלאה, המביאה את החלבון לידי קריסה כללית כפי שתואר קודם לכן. אולם יכול להתרחש גם תהליך מתון יותר - דנטורציה חלקית. בדנטורציה חלקית התנאים אינם כה קיצוניים כדי להביא לקריסת המבנה במלואו, אבל הם כן גורמים לשינוי מבני כלשהו עקב היחלשות האינטראקציות הטבעיות. שינוי קטן זה פוגם גם הוא בפעילות החלבון. כאשר מתקיימת דנטורציה חלקית בתנאים תאיים (in vivo), אנו מוצאים כי בתוך דקות ספורות מרגע התרחשות הדנטורציה, החלבון חוזר לתפקודו התקין. מתרחש אפוא התהליך ההפוך - רנטורציה (renaturation) או התקפלות מחדש. הרנטורציה מתרחשת משום שהמבנה הטבעי של החלבון הוא המבנה היציב ביותר, ולכן הוא נוצר ספונטנית. דנטורציה מלאה גוררת היווצרות אינטראקציות חדשות ואקראיות רבות בין שיירי חומצות האמינו אשר לא מאפשרות רנטורציה בתנאים פיזיולוגיים. למרות זאת, תחת תנאי מעבדה (in vitro), ניתן לגרום לדנטורציה קיצונית על ידי החומרים הדנטורטיביים שהוזכרו לעיל, שלאחריה החלבון חוזר למבנה ותפקוד תקינים.

דנטורציה ורנטורציה של DNA

דנטורציה של DNA (המכונה גם התכה) משמעה ניתוק הקשרים הבין-מולקולריים בין שני הגדילים ויצירת מולקולות של DNA חד-גדילי. התהליך ההפוך, בו נוצרים קשרים בין שני גדילי DNA ונוצרת מולקולת DNA דו-גדילית, קרוי רנטורציה או זיווג מחדש. תהליכים אלו עשויים להתרחש לא רק בין שני גדילי DNA אלא גם בין DNA ל-RNA, חומצת גרעין אחרת, בעלת מבנה הדומה ל-DNA חד-גדילי.
קיימות שתי דרכים עיקריות הגורמות לדנטורציה של DNA: חימום, וחשיפה לבסיסים חזקים.

חימום

חימומה של תרכובת גורמת להגברת קצב תנועת האטומים ממנה היא מורכבת. תנועה מוגברת של המולקולה מובילה להחלשה של קשרים לא קוולנטיים שהיא מכילה, כגון קשרי המימן במולקולת ה-DNA. העלאת טמפרטורת התמיסה בה מצויות מולקולות DNA תגרום משום כך להחלשת הקשרים בין הגדילים, ומעבר לטמפרטורה מסוימת תגרום להפרדת הגדילים זה מזה ולדנטורציה. ההפרדה מתרחשת בטמפרטורות שבקרבת 100 מעלות צלזיוס, ותלויה ביציבותה האנרגטית של המולקולה טרם החימום, היינו במספר היחסי של קשרי המימן שבה. ככל שהכמות היחסית של זוגות הבסיסים G-C לעומת A-T גבוהה יותר, כמותם של קשרי המימן ליחידת אורך במולקולה עולה, ועל כן טמפרטורת ההתכה של ה-DNA תהיה גבוהה יותר. בנוסף, אם הרצפים בשני הגדילים אינם משלימים במדויק זה לזה, טמפרטורת ההתכה של המולקולה יורדת, כשככל שרמת ההשלמה נמוכה יותר, הגדילים יפרמו בטמפרטורה נמוכה יותר.
קירור איטי של הגדילים לאחר החימום מאפשר לקשרים הלא-קוולנטיים לשוב ולהיווצר. הדבר מוביל לרנטורציה, והגדילים מזדווגים מחדש על פי רצפי הבסיסים שלהם. קירור מהיר לעומת זאת, לא מאפשר רנטורציה וה-DNA נותר חד גדילי.

בסיס

נוכחותם של בסיסים חזקים בתמיסה מעלה את ה-pH שלה. בדומה למצב בחלבונים, pH גבוה גורם ליינון של מולקולות בתמיסה, ובכך ליצירת מטען חשמלי על אותן מולקולות. לכן, בחשיפת DNA לבסיס חזק דוגמת נתרן הידרוקסידי (NaOH), הבסיס יגרום ליינון של מולקולות ה-DNA. היינון יוצר מטענים שווים בשני הגדילים, אשר דוחים זה את זה. כשה-pH גבוה דיו, הדחייה החשמלית גורמת לניתוק הקשרים בין הגדילים ולהתרחקותם אחד מן השני, ולמעשה לדנטורציה.
לעיתים בשיטות מחקריות לדנטורציה על ידי בסיס יתרון על פני דנטורציה בחימום. ראשית, ישנן שיטות בהן לאחר הדנטורציה קושרים את הגדילים הבודדים למשטח ניטרוצלולוז או ניילון, ובסיס מסייע בביצוע קשירה זו. שנית, בסיס עשוי לסייע בהרחקת שאריות RNA מהתמיסה, כשאלה קיימות.
ניתן לבצע דנטורציה לDNA באמצעות חומרים דנטורטיבים כמו אוראה. חומרים אלו מתחרים על קישרי המימן שמייצבים את הסליל ושוברים אותם.

שימושי הדנטורציה בחומצות גרעין

לדנטורציה ולרנטורציה של DNA חשיבות גדולה במחקר מעבדתי, כששיטות בסיסיות בהנדסה גנטית מסתמכות על שני תהליכים אלו. לשיטות אלו יישומים מעבר למחקר הגנטי, למשל במחקר האבולוציוני או ביישומים רפואיים.

היברידיזציה

אחת השיטות הנפוצות ביותר הנעזרות בדנטורציה היא ההיברידיזציה. בהיברידיזציה גורמים לדנטורציה של מולקולות DNA, ולאחר מכן מאפשרים לחד-גדילים לעבור רנטורציה עם גדילים אחרים של DNA או גדילי RNA, אשר לעיתים קרובות מסומנים כך שיהיה ניתן לזהותם רדיואקטיבית או פלואורסצנטית. היברידיזציה יכולה לשמש לצרכים מגוונים. היברידיזציה באתר מבצעת את התהליך על כרומוזומים שלמים, כך שבשלב הרנטורציה ניתן לזווג קטע DNA או RNA ספציפיים מסומנים, וכך לגלות את האזור בכרומוזום בו נמצא הרצף המשלים להם. בשיטת סאת'רן בלוט משתמשים בהיברידיזציה כשגורמים דנטורציה לקטעי DNA קצרים, ואז מזווגים אותם עם קטעי DNA ידועים. ה-DNA יזדווג רק עם קטעי ה-DNA המשלימים לו וכך ניתן לזהות את קטע ה-DNA המבוקש. גישה אחרת של היברידיזציה גורמת לדנטורציה של DNA משני גנים שונים או משני מקורות שונים (ממינים שונים) על ידי חימום, ולאחר מכן מאפשרת זיווג של גדילים משני המקורות. גדילי ה-DNA הנוצרים הם בני כלאיים של DNA משני המקורות. חימומם של הגדילים החדשים גורם לדנטורציה שלהם, כשהטמפרטורה שבה תתרחש הפרדה בין הגדילים עומדת ביחס ישר לרמת ההשלמה בין הגדילים משני המקורות או הגנים. ככל שהטמפרטורה גבוהה יותר וההשלמה גדולה יותר, יעיד הדבר על רצפים דומים יותר בשני הגנים, ולפיכך על קרבה אבולוציונית או גנטית ביניהם.

PCR

שיטה חשובה אחרת בהנדסה גנטית היא PCR. זוהי שיטה לבידודם ולריבויים של גנים המסתמכת על מחזור שינויי טמפרטורה הגורמים לפרימה ולבנייה של גדילי ה-DNA לסירוגין. המחזור מתחיל בחימום התמיסה בה מצוי ה-DNA לטמפרטורה של 95 מעלות צלזיוס, הגורמת לדנטורציה. לאחר מכן מקוררת התמיסה לטמפרטורה של 50°C, המאפשרת את התחברותם של קטעי DNA קצרים לגדילים הפרודים. אלו הם תחלים המשמשים לתחילת הסינתזה של גדילי DNA משלימים חדשים ל-DNA החד-גדילי על ידי האנזים DNA פולימראז ממקור חיידקי. אז הטמפרטורה מועלית ל-75°C, בה DNA פולימראז זה פעיל, ומסנתז גדילים משלימים. לאחר הסינתזה, מועלית שוב הטמפרטורה ל-95°C, שוב מתרחשת דנטורציה וחוזר חלילה. לאחר מחזורים רבים, מתקבלת כמות גדולה של ה-DNA המבוקש בזמן קצר.
האנזים DNA פולימראז המשמש בתהליך זה מקורו בדרך כלל בחיידק התרמופילי Thermus aquaticus, או חיידקים תרמופיליים דומים החיים בטמפרטורות גבוהות. הטמפרטורה האופטימלית לפעילותו של החיידק, וכן של האנזימים שבו, גבוהה מ-70°C. הפולימראז התרמופילי לא עובר דנטורציה גם בטמפרטורות של 95 מעלות ולעיתים למעלה מזה, אשר הכרחיות לדנטורציה של ה-DNA. תכונה ייחודית זו של החלבון היא אשר מאפשרת את התהליך היעיל של ה-PCR.

דנטורציה של RNA

אף על פי שהמודל הפשטני מציג את מולקולות ה-RNA כמולקולות קוויות, חד גדיליות, ונעדרות זיווג בסיסים, פעמים רבות המצב אינו כזה. מולקולות RNA מסוגים שונים יוצרות מבנה שניוני, בו רצפי בסיסים משלימים באותה מולקולה מזדווגים זה עם זה, ויוצרים מבנה דו-גדילי בחלקים מסוימים של המולקולה, בעוד חלקים אחרים נותרים חד-גדיליים. דוגמה מובהקת לכך הוא ה-tRNA, שהיא מולקולת RNA המשתתפת בתהליך תרגום ה-RNA לחלבון, אשר לה מבנה מרחבי דמוי עלה תלתן.
מכיוון שמולקולות RNA עשויות ליצור זיווג בסיסים, אין כל מניעה שהן תעבורנה דנטורציה, בדיוק כמו DNA. ואכן, המנגנונים הגורמים דנטורציה ל-DNA משפיעים גם על RNA באותה הצורה. בדומה לחלבונים, כשגורמים דנטורציה ל-RNA בעל מבנה מרחבי ותפקוד מוגדר, תפקודו עשוי להיפגע. כך tRNA למשל מפסיק לתפקד לאחר טיפול דנטורטיבי.
שימוש נפוץ לדנטורציה של RNA הוא באפיון המולקולות באלקטרופורזה בג'ל. כדי שהתהליך יהיה תקין, על ה-RNA להיות קווי, ללא לולאות וזיווגי בסיסים, ולכן דנטורציה הכרחית לקבלת תוצאות נכונות.