תיקון DNA לא הומולוגי

תיקון DNA לא הומולוגי (באנגלית: Non-homologous end joining, או בקיצור: .N.H.E.J) הוא מסלול לתיקון שברים דו-גדילים בDNA. המונח "לא הומולוגיים" מכוון לכך שקצוות ה-DNA בהם נוצר שבר מוארכים כפי שהם ללא צורך בכרומוזום הומולוג כתבנית (כרומטידה אחות) בניגוד למסלול המכונה
Homology directed repair שבו יש רצף כרומוזום הומולוג המנחה את תהליך התיקון. המינוח NHEJ נקבע בשנת 1996 על ידי המדענים מור והבר (Moore and Haber).
במרבית המקרים מסלול NHEJ מנצל רצפי DNA קצרים הומולוגיים המכונים מיקרוהומולוגים לצורך התיקון. מיקרוהומולוגים אלו לרוב מהווים בליטה של DNA חד-גדילי בקצה של שבר ב-DNA דו-גדילי. כאשר הבליטות מהוות רצף משלים, NHEJ לרוב מצליח להביא לתיקון מדויק של השבר. תיקון לא מדויק המוביל לאיבוד נוקלאוטידים יכול להתרחש גם כן אך הוא נפוץ יותר כאשר המיקרוהומולוגיים לא משלימים. תהליך NHEJ לא מדויק יכול להוביל לטרנסלוקציות ואיחוי טלומרים, המהווים נורת אדומה להתפתחות תאים סרטניים.
NHEJ זהו תהליך שמור באבולוציה בכל ממלכות החיים והוא המסלול השולט לתיקון שבר ב-DNA דו-גדילי ביונקים. לעומת זאת, בשמרים מסוג (Saccharomyces cerevisiae) הגדלים בתנאי מעבדה המסלול השולט הוא רקומבינציה הומולוגית.
כאשר המסלול NHEJ אינו תקין, שברים דו-גדיליים ב-DNA יכולים לעבור תיקון על ידי מסלול המכונה Microhomology-mediated end joining בו הסיכוי לשגיאה גדול בהרבה. במסלול זה מתבצע חיתוך יזום בקצוות ה-DNA השבור חושף מיקרוהומולוגים קצרים משני צידי השבר שמיושרים לצורך התיקון. זה מנוגד לתהליך ה-NHEJ הקלאסי בו משתמשים במיקרוהומולגים שכבר נחשפו בהיווצרות השבר הדו הגדילי ה-DNA.לכן, תיקון מסוג זה מוביל להחסרה/מחיקה (deletion) של רצף DNA בין שני המיקרוהומולוגים.

חיידקים

בזנים רבים של חיידקים, כולל Escherichia coli, המסלול מסוג NHEJ חסר ולכן הם מתבססים באופן מלא על המסלול מסוג רקומבינצית הומולוגיים לתיקון שבר דו-גדילי. לעומת זאת, חלבונים הקשורים למסלול NHEJ זוהו במספר זני חיידקים כולל Mycobacterium Bacillus subtilis, Mycobacterium tuberculosis smegmatis. חיידקים מפעילים גרסה קומפקטית להפליא למסלול ה-NHEJ שבה דרושה הפעלה של שני חלבונים בלבד. הומו-דימר של החלבון Ku – המזהה את השבירה מתיישב ומיישר את המיקרוהומולוגים וחלבון נוסף LigD- בעל מספר פעילויות של ליגאז, פולימראז ונוקלאז.
במיקרו בקטריות מסלול ה- NHEJ נוטה לשגיאות רבות לעומת בשמרים, מכיוון שבהרבה מקרים בסיסים מוספים או נמחקים מקצוות ה-DNA בו נוצר שבר במהלך התיקון. הרבה מהחיידקים המקיימים את מסלול NHEJ נמצאים במשך זמן משמעותי ממסלול חייהם בפאזה נייחת כהפלואיד שבו בתא כרומוזום יחיד מכל סוג ולכן לא קיימת תבנית לצורך רה-קומבינציה. NHEJ יכול לאפשר לאורגניזמים אלו הישרדות במצב של שברים דו-גדיליים במצב של מחסור בנוטריינטים ונוזלים.
בניגוד לתהליך של רקומבינצית הומולגים שנחקר רבות בחיידקים, NHEJ התגלה באיקריוטים וזוהה בפרויקטים רק בעשור האחרון.

איקריוטים

בניגוד למסלול NHEJ בחיידקים מסלול זה באיקריוטים מנצל מספר חלבונים המשתתפים לפי השלבים הבאים:

כריכת וקשירת הקצוות

בשמרים הקומפלקס MRX-Mre11-Rad50-Xrs2 מגויס לשבר הדו-גדילי ב-DNA מוקדם בתהליך וחשוב לאפשר יצירת גשרים של קצוות ה-DNA. הקומפלקס המקביל ביונקים לMRX גם הוא מעורב ב-NHEJ, אבל יכול להשתתף במספר שלבים במסלול מעבר להחזרה נכונה ל הקצוות.DNA-PKcs - קינאז שפעילותו תלויה ב-DNA גם הוא משתתף ביצירת גשרי קצוות ה-DNA ביונקים.
החלבון Ku של איקריוטים הוא הטרודימר הבנוי מ-Ku70 ו-Ku80, ויוצר קומפלקס עם DNA-PKcs, שנמצאים בתהליך ביונקים אך לא בשמרים. Ku הוא חלבון בצורת סל שמחליק על גבי קצות ה-DNA ומעביר כלפי פנים. Ku יכול לשמש כאתר עגינה עברו חלבונים אחרים במסלול ה-NHEJ ויודע לבצע אינטראקציה עם קומפלקס DNA ligase IV ו-XLF.

עיבוד הקצוות

בעיבוד הקצוות מתרחשת הסרה של נוקלאוטידים הרוסים או לא תואמים בעזרת נוקלאזות וסינתזה מחודשת של DNA על ידי DNA פולימראז. שלב זה לא הכרחי כאשר הקצוות חמש ושלוש כבר תואמים. מעט ידוע על פעילות הנוקלאזות במסלול ה-NHEJ . הנוקלאזה Artemis
 דרושה לפתיחת מבני ה-DNA דוגמת hairpins במהלך מסלול V(D)J recombination, שזהו סוג ספציפי של NHEJ ויכול להשתתף גם בעיבוד בקצוות ב-NHEJ הכללי. לחלבון Mre11 פעילות של נוקלאז אבל נראה שהוא משתתף ברקומבינצית הומולוגית ולא במסלול NHEJ.
משפחת הפולימרזות הכוללת את Polλ ו-Pol4) μPol בשמרים) ממלא חורים של נוקלאוטידים (gaps) במהלך ה-NHEJ. שמרים להם חסר Pol4 לא מסוגלים למלא gaps בקצה שלוש אך מסוגלים למלא כאלו בקצה חמש. זה מכיוון שהפריימר בטרמינל שמשמש לאתחול סינתזת ה-DNA פחות יציב בקצה שלוש מה שמחייב קיום פולימרזות ספציפיים לתהליך ה-NHEJ.

קשירה

הקומפלקס DNA ligase IV המכיל את היחידה הקטליטית DNA ligase IV ואת הקו פקטור שלו XRCC4 ׁׁ(בשמרים DNL4 ו-LIF1) מבצע את תהליך הקשירה הדרוש לתיקון. XLF המוכר גם בשם Cernunnos, הוא הומולוג ל-Nej1 בשמרים וגם נחוץ ל-NHEJ. בעוד התפקיד של XLF לא ידוע, הוא מבצע אינטראקציה עם הקומפלקס XRCC4/DNA ligase IV וגם משתתף בשלב הקשירה. עדויות חדשות, משערות ש-XLF מאפשר re-adenylation של DNA ligase IV אחרי קשירה, ומאפשר לליגאז לזרז פעם נוספת של קשירה.

אחר

בשמרים, Sir2 זוהה במקור כחלבון NHEJ, אך כיום יודעים שהוא דרוש ל-NHEJ רק מכיוון שהוא דרוש לשעתוק של Nej1.

רגולציה

ההחלטה האם לבחור במסלול ה-NHEJ או ברקומבינצית הומולוגיים לצורך תיקון של שבר דו גדילי ב-DNA מבוקרת בשלב אתחול תהליך הרקומבינציה בו יש הסרה/כריתה של קצה 5'. בשלב זה, קצה 5' עובר דגרגציה על ידי נוקלאזות ליצירת זנבות ארוכים של קצה 3' חד גדילי. שבר דו גדילי שלא עבר כריתה יכול עבור NHEJ אבל כריתה אפילו של מספר נוקלאוטידים בודדים יכול לעכב NHEJ ובאופן אפקטיבי מחייב את השבר הדו גדילי לעבור תיקון על ידי רקומבינציה. NHEJ פעיל במהלך מחזור התא אך הוא הכי משמעותי בשלב G1 שבו אין תבנית של הומולוג שזמינה לרקומבינציה. הרגולציה מושגת על ידי Cyclin-dependent kinase 1 שסוגר את שלב G1 במחזור התא ומבוטא בשלבים S, G2. האנזים CDK1 מזרחן את הנוקלאז Sae2, ומאפשר לכריתת הנוקלאוטידים בקצה 5' להתחיל.

V(D)J recombination

NHEJ מהווה שחקן קריטי ברקומבינצית V(D)J, התהליך בו תאי B ורצפטורים של תאי T עוברים יצירה של גיוון (diversity) במערכת החיסון. ברקומבינצית V(D)J, מבנה דו גדילי של DNA מסוג hairpin-capped עובר שבירה על ידי הנוקלאז RAG1/RAG2, שמבקע את ה-DNA ברצף ספציפי שמהווה סיגנל לרקומבינציה (recombination signal sequences). מבנה hairpin זה בהמשך נפתח על ידי הנוקלאז Artemis
 ומחובר בתהליך NHEJ. DNA פולימראז ספציפי המכונה Terminal deoxynucleotidyl transferase, המבוטא רק ברקמת הלימפה, מוסיף נוקלאוטידים ללא תבנית לקצוות לפני שהאיחוי מתרחש. תהליך זה מאגד V- variable, D- diversity, J- joining שכשנעשים כמקבץ מאפשרים את היווצרות האזורים הואריבילים בתאי B וברצפטורים שעל גבי תאי T. בשונה מתהליך NHEJ טיפוסי שבו התיקון הוא התוצאה הרצויה ביותר, טעויות באיחוי ברקומבינצית V(D)J מועילים לגיוון מקסימלי של גנים אלו. מטופלים עם מוטציות בגנים הקשורים למסלול ה-NHEJ אינם מסוגלים ליצר תאי B ו-T פונקציונליים וסובלים מכשל חיסוני משולב חמור.

טלומרים

באופן תקין הטלומרים מוגנים על ידי "cap" שמונע מהם להיות מזוהים כ-DNA חד גדילי. איבוד החלבונים שיוצרים את ה-cap גורם לקיצור הטלומרים וחיבור במסלול NHEJ ליצירת הכרומטידות האחיות שלאחר מכן נפרדות במיטוזה. באופן פרדוקסלי חלבונים מסוימים ממסלול ה-NHEJ מעורבים ב-capping של הטלומרים. למשל, החלבון Ku ממוקם על גבי הטלומרים והחסרה שלו מוביל לקיצורם. Ku דרוש גם ל- subtelomeric silencing שזהו התהליך בו גנים הממוקמים סמוך לטלומרים עוברים השתקה.

השלכות של תפקוד לקוי

מספר סינדרומים מקושרים לחוסר תפקוד של NHEJ. מוטציה היפומורפית LIG4 ב- LIG4 ו-XLF גורמת לתסמונת LIG4 ול-XLF -SCID בהתאמה. תסמונות אלו חולקות הרבה מאפיינים כולל רגישות לקרינה מייננת, מיקרוצפליה, כשל חיסוני משולב חמור בשל רקומבינצית V(D)J לקויה.
מוטציה שגורמת לאיבוד פעילות החלבון Artemis
 גם כן גורמת לכשל חיסוני משולב חמור, אך מטופלים אלו לא מראים את הליקויים הנוירולוגים שמקושרים למוטציה LIG4 או XLF. רמות חומרה שונות ניתן להסברי על ידי מיהו החלבון המוטנט שהתקבל. Artemis
 הוא נוקלאז שדרוש אך ורק לשלב של עיבוד הקצוות בתיקון שבר דו גדילי ב-DNA בעוד DNA Ligase IV ו- XLF דרושים לכל שלבי התהליך NHEJ.
רבים מהגנים במסלול NHEJ עבור נוקאאוט בעכברים. החסרה של XRCC4 או LIG4 הייתה לטלית בשלב העוברי מה שמצביע ש- NHEJ חיוני ליונקים.
בניגוד לכך, עכברים ללא Ku או DNA-PKcs שורדים כנראה מכיוון שפעילות נמוכה של NHEJ עדיין יכולה להתרחש בחוסר של חלבונים אלו. כל העכברים המוטנטים לחלבונים שונים של NHEJ הראו פנוטיפ לכשל חיסוני משולב חמור, רגישות לקרינה מייננת ואפופטוזיס של נוירונים.

הזדקנות

מערכת למדוד את היעילות של NHEJ פותחה בעכברים. ניתן להשוות את תהליך ה-NHEJ ברקמות שונות בעכברים ובעכברים בגילאים שונים. יעילות התהליך גבוהה יותר בעור, בריאות, בפיברובלסטים שבכליות, ונמוכה בפיברובלסטים בלב ובאסטרוציטים במוח. בנוסף, יעילות תהליך ה-NHEJ יורדת עם הגיל. הירידה היא בפי 1.3 – 3.8 כתלות ברקמה בעכברים בני 5 חודשים לעומת בגיל 24 חודשים. אנליזה של רמות החלבון Ku80 ממסלול ה-NHEJ באדם, פרה ועכבר מזהה הבדל משמעותי ברמות החלבון באורגניזמים השונים ושרמות החלבון בקורלציה חזקה לאריכות חייו של האורגניזם.

רשימת חלבונים המעורבים בתהליך NHEJ באדם

Ku70/80
DNA-PKcs
XRCC4
XLF
Artemis
DNA polymerase mu
DNA polymerase lambda
PNKP
Aprataxin
BRCA1
BRCA2
APLF
CYREN