Apaf1

דומיין CARD

דומיין CARD (‏Caspase Activation and Recruitment Domain) מורכב מ-100 (בקירוב) שיירי חומצת האמינו הראשונים של Apaf-1, ומתפקד כאתר הגיוס של פרוקספאז 9 באמצעות יצירת אינטראקציית CARD-CARD יחד עם דומייני CARD אחרים המצויים אצל פרוקספאז 9. המבנה התלת ממדי של Apaf-1 ושל האפופטוזום האנושי נחקר ונקבע באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים ובאמצעות קריסטלוגרפיה בקרני רנטגן; לדומיין CARD של Apaf-1 מבנה גלובולרי ארוז היטב, והוא מורכב מצרור של 6 סלילי המקופל בצורת מפתח יווני (Greek key), הידועה גם בשם "קיפול המוות". פני השטח של הסלילים H1/H1'/H4 מורכב משיירי חומצות אמינו בסיסיות - ליזין וארגינין (Arg6 ,Arg13 ,Lys42 ,Lys58 ,Lys62 ו-Lys63), הגורמים לפני השטח להיות קעורים, בה בשעה שהצד הנגדי של החלבון (סלילים H2/H3/H5/H6) הוא בעיקרו חומצי ומורכב בעיקר מחומצות האמינו אספרטט וגלוטמט (Asp27, Asp32 ,Asp64 ,Asp66 ,Glu40 ,Glu41 ו-Glu78), הגורמים לפני השטח להיות קמורים.
מחקרים בהם נעשה שימוש במוטגנזה מכוונת הצביעו על כך שהשיירים Asp27 על סליל H2 ו-Glu40 על סליל H3, אשר יוצרים את ליבת פני השטח החומציים בדומיין ה-CARD של APAF-1, מעורבים ביצירת אינטראקציית CARD-CARD עם קספאז 9; מוטציה של אחד משיירים אלו לחומצת האמינו אלנין הפסיקה לחלוטין את היכולת ליצור אינטראקציה כזו. לעומת זאת, מוטציות ב-4 השיירים הבסיסיים Arg13,‏ Lys42,‏ Lys58 ו-Lys62 שמרכיבים את הצד הטעון חיובית של דומיין CARD ב-APAF-1, והחלפתן לאלנין, לא השפיעו על יצירת האינטראקציה בין APAF-1 לבין קספאז 9. מכאן שלסלילים H2 ו-H3 יש תפקיד חשוב בזיהוי וביצירת האינטראקציה עם קספאז 9.
מלבד הפונקציה של גיוס קספאז 9, לדומיין CARD ב-APAF-1 יש גם יכולת ליצור קשרי CARD-CARD רבים נוספים עם קספאז 9, המשחקים תפקיד חשוב באיקטובה של הקספאז.

דומיין WD40

דומיין WD40 משמש בתפקיד בקרה ב-APAF-1, ובעל יכולת של אוטו-אינהיביציה (יכולת עיכוב עצמית) באמצעות שינוי קונפורמציה של החלבון. כאשר נוצרת אינטראקציה בין דומיין WD40 לבין ציטוכרום c, חל שינוי קונפורמציה באופן שמאפשר את גיוסו של קספאז 9.
באופן טיפוסי, הדומיין מורכב ממספר חזרות של רצף בן 44 - 60 חומצות אמינו, המקופלות יחד ליצירת דומיין. רצף זה בנוי למעשה מ-3 רצפים: רצף שמור בליבה, שמאוגף בקצה האמיני שלו על ידי 11 - 24 דיפפטידים של GH (גליצין-היסטידין) ובקצה הקרבוקסילי שלו מדיפפטידים של WD (טריפטופן-חומצה אספרטית). הדומיין מורכב מ-2 מבנים של "β-propeller" (דמוי פרופלור) המכונים WD1 ו-WD2. המבנה של β-propeller מכיל בדרך כלל 4 - 8 "להבים", ובמקרה של Apaf1, הדומיין מורכב מ-2 β-propeller א-סימטריים, שאחד מהם מכיל 7 להבים (WD1) והשני 8 להבים (WD2). ‏WD1 משתרע על פני שיירי חומצות האמינו 608 - 910, ואילו WD2 משתרע על השיירים 593 - 598 ו-921 - 1249. המבנה של ה-β-propeller הוא מאוד קשיח ולכן שינויי קונפורמציה אצלו מוגבלים מאוד.
שני ה-β-propeller ממוקמים ב-Apaf1 בחלק העליון של דומיין NOD, כאשר WD2 ממוקם מעל דומיין HD2, ו-WD2 יוצר קשר עם הדומיינים HD2 ו-NBD.

אפופטוזה

גורמי עקה תוך-תאיים כגון נזקי דנ"א, קרינת על סגול (UV) ועוד, עלולים לגרום לשחרור של ציטוכרום c מהמיטוכונדריה לציטופלזמה ובסופו של דבר למוות תאי מתוכנת במסלול האפופטוטי. בציטופזלמה, מולקולות ציטוכרום c נקשרות למולקולות Apaf1, ובעקבות אינטראקציה זו וההחלפה של ADP ב-ATP, ‏Apaf1 משנה את המבנה הרבעוני שלו למבנה הפטמרי (אוליגומר) וכך מסוגל לגייס מולקולות של פרוקספאז 9 (בצורתן הבלתי פעילה). הקומפלקס שנוצר נקרא אפופטוזום, ומשמש כפלטפורמה תאית לאקטיבציה של פרוקספאז 9 במסלול הפנימי של האפופטוזה. קספאז 9 בתורו מאקטב את הקספאזות ה"מוציאות לפועל" (executioner caspases) -‏ 3, 6 ו-7, שלהן עשרות רבות של מטרות חלבוניות הקשורות לשלד התא, לתיקון נזקי דנ"א ועוד, אותן הן מבקעות ומפסיקות את פעילותן ובכך מוציאות לפועל את מסלול האפופטוזה.
האפופטוזום מורכב מ-7 מולקולות של Apaf1, להן 7 דומייני CARD. ל-Apaf1 דרושים ציטוכרום c ו-dATP לאוליגומריזציה שלו וליצירת האפופטוזום. Apaf1 אמנם נקשר לציטוכרום c גם בהיעדר dATP או ATP, אך אינו יכול לעבור אוליגומריזציה וליצור את קומפלקס האפופטוזום.
הביטוי של Apaf1 בתא הוא נמוך, ועל כן הוא הגורם המגביל בתהליך יצירת האפופטוזום ובהפעלת המסלול האפופטוטי. הבקרה על הביטוי של Apaf1 נעשית בשלבי השעתוק והתרגום. האזור הלא מתורגם בקצה 5' של ה-mRNA המקודד ל-Apaf1 מכיל קומפלקס רנ"א בעל אלמנט מבני המכונה IRES - אזור אליו הריבוזום יכול להיקשר באופן ישיר, ללא תלות בסריקה מכיוון ה-5' ("סריקה ללא תלות ב-cap"). הסריקה הרגילה של הריבוזום ("סריקה תלוית-cap") פוחתת בעקבות תנאי עקה כגון היפוקסיה, הלם אוסמוטי, הלם חום ועוד, ומנגנון ה-IRES פועל להתחלת סינתזה של החלבון על מנת לשמור על ריכוז קבוע של Apaf1 בתא.
עלייה בביטוי של Apaf1 נגרמת על ידי פקטור השעתוק E2F1, שלו תפקיד חשוב בהגברת הביטוי של גנים הקשורים לשכפול דנ"א ולבקרה על שלב S במחזור התא. נוסף על כך, Apaf1 הנו מטרה ישירה של "שומר הגנום" p53, היכול להגביר את שעתוקו.

מחזור התא

מלבד תפקידו החשוב במסלול האפופטוטי, ל-Apaf1 יש גם השפעה על מחזור התא בעקבות נזק לדנ"א שנגרם על ידי עקה גנטוקסית. 4 האיזופורמים העיקריים של Apaf1: ‏Apaf1XL, ‏Apaf1L, ‏Apaf1M ו-Apaf1S מתווכים עיכוב של מחזור התא בעקבות עקה גנטוקסית ובאמצעות אקטיבציה של Chk1. לצורך תפקיד א-אפופטוטי זה נדרשת טרנסלוקציה של Apaf1 לגרעין התא במהלך השלבים G₁-S; הטרנסלוקציה מתבצעת על ידי הקינאזות ATM ו-ATR (המאוקטבים בעקבות נזק לדנ"א). טרנסלוקציה לגרעין של Apaf1 על ידי ATR מתרחשת בתגובה לגלי על סגול קצרים (UV-C) וכן בתגובה לציספלאטין, ואילו על ידי ATM בתגובה לקרינת גמא.
לאחר אקטובם של ATR/ATM, הללו מעלים את רמות הזרחון של Apaf1, דבר המתבטא בשינויים קונפורמטיביים שמביאים לתעדוף יצירת אינטראקציה בין Apaf1 ל-Nup107. ‏Nup107 מורכב מ-9 תת-יחידות ומהווה חלק מה-NPC (נקב הגרעין), שתפקידו לתווך מעבר מקרומולקולות בין הציטופלזמה והגרעין. האינטראקציה בין Nup107 ל-Apaf1 דרך דומיין NBD שלו גורמת להצטברות של Apaf1 בציטופלזמה לאחר עקה גנטוקסית. לאחר כניסתו של Apaf1 לגרעין התא מתרחשת אקטיבציה של Chk1, אשר לו תפקיד בבקרת מחזור התא, בעצירת מחזור התא ובתיקון נזקי דנ"א.