מיקרו מערכי חלבון

מיקרו מערכי חלבון היא שיטה המשמשת למעקב אחר פעילות של חלבונים והקישור ביניהם על מנת לקבוע את תפקידם. היתרון העיקרי בשיטה זו היא בכך שניתן לאתר פעילות של מספר חלבונים גדול במיוחד, מאותו סוג או מסוגים שונים, על אותו מערך בו זמנית. המערך מורכב ממשטח המספק תמיכה, כגון זכוכית, ממברנת ניטרוצלולוזה, פלטה ביולוגית, מיקרו או ננו חרוזים, עליו מעגנים את מולקולות הקישור הרצויות, בעיקר חלבונים. למערך מוסיפים את המולקולות שברצוננו לאפיין (כגון, תערובת חלבונים), אשר לרב מסומנות בסמנים פלואורסצנטים או סמני צבע. כל קישור בין המולקולות המסומנות לבין מולקולות הקישור המעוגנות על המשטח יוצר פליטה פלואורסצנטית או שינוי צבע מקומי, אותו ניתן לקרוא על ידי סורק לייזר. שיטת המיקרו מערכי חלבון היא מהירה, אוטומטית, חסכונית ורגישה מאוד הדורשת שימוש בכמויות קטנות מהדוגמה הנבדקת ומהסמנים. העיקרון והמתודולוגיה של מיקרו מערכי חלבון הוצגו לראשונה במיקרו מערך של נוגדנים (המכונה גם מטריצת נוגדן) בשנת 1983, ופורסמו מספר פטנטים בנושא. טכנולוגיה זו מיישמת את אותן העקרונות של טכנולוגיית מיקרו מערכי דנ"א/רנ"א.

מוטיבציה לפיתוח

מיקרו מערכי חלבון פותחו בעקבות המגבלות של שיטת מיקרו מערכי דנ"א או רנ"א לקבוע ביטוי גנים בתחום הפרוטאומיקה. לעיתים קרובות כמות הרנ"א שליח בתא אינו משקף את הביטוי האמיתי של החלבונים המתורגמים מהם. שיטה זו פותחה מאחר שהחלבונים הם המשפיעים העיקריים על תפקוד התא. בנוסף, לעיתים מתבצעים שינויים בחלבון לאחר התרגום, דבר שהכרחי לתפקודו הסופי, אך לא ניתן להבחין בשינוי זה בשיטת מיקרו מערכי דנ"א. שיטת מיקרו מערכי חלבון מחליפה את השיטות המסורתית בתחום פרוטאומיקה כגון אלקטרופורזה דו-ממדית בג'ל כרומטוגרפיה, שיטות שהן טרחניות יחסית הדורשות עבודה רבה וגוזלות זמן יקר, בעת שכמותם של החלבונים בדוגמה הנבדקת זעום יחסית.

הכנת המערך

מערך החלבונים מעוגן על גבי משטחים מוצקים כגון זכוכית, ממברנות, מיקרו או ננו חרוזים או פלטות מרובות באריות (צלחת מיקרוטיטר). משטחים אלו משמשים מצע לקישור החלבונים. המשטחים צריכים להיות בעלי מאפייני קישור לחלבון, כך שישמרו על המבנה הטבעי שלו באופן כזה שלא ייפגע פעולתו. שימוש בחומרים כמו זכוכית או סיליקון נפוצה מאוד משום שהם מותאמים למערך הרובוטי וסורקי הלייזר הקיימים שפותחו לשיטת מיקרו מערכי דנ"א. 
המשטח שנבחר עבור המערך מכוסה בציפוי שתפקידו לעגן את החלבונים לפני השטח, למנוע דנטורציה, לאפשר מיצוב נכון של החלבונים במרחב כך שאתרי הקישור יהיו נגישים למולקולות המטרה ולספק סביבה הידרופילית כדי שהקישור יתבצע. בנוסף, יש לשמור על רמת קישור לא ספציפית מינימלית על מנת למזער רעשי רקע. יתר על כן, המערך צריך להיות תואם למערכות קריאה מגוונות. תרכובות המשמשות לעיגון החלבונים כוללות שכבות של אלומיניום או זהב, פולימרים הידרופילים וג'ל העשוי מפוליאקרילאמיד, ופולימרים אחרים בעלי קבוצות אלדהיד או אפוקסי. משתמשים בטכנולוגיות שכבות דקות כמו PVD  ו CVD כדי להכין את הציפויים על המשטח. 
סביבה מימית היא חיונית בכל שלבי ייצור ותפעול המערך למניעת הגרעה (דגרדציה) של החלבון, לפיכך משתמשים בבופרים המכילים אחוז גבוה של גליצרול (כדי להגדיל את נקודת קיפאון), כמו כן הלחות בסביבת הייצור מבוקרת בקפדנות. שימוש בפלטות מרובות באריות מהווה יתרון כפול הן במתן סביבה מימית והן במניעת זיהום בין דגימות בשל הדפנות החוצצות ביניהן. 
השיטה הנפוצה להכנת מערך חלבון היא הטבעה של חלבונים או ליגנדים במספר גדול באמצעות רובוטים על משטח מוצק בתבנית מוגדרת מראש, שיטה המכונה "הטבעה רובוטית" או "הכתמה רובוטית". שיטת ייצור מערך חלבון נוספת מבוססת על טכנולוגיית הזרקת דיו, המבוצעת ללא מגע ישיר עם המשטח המוצק ונועדה לפזר את הפולימרים החלבוניים בדפוס הרצוי. הכתמה פיאזואלקטרית מיישמת אותן עקרונות בהזרקת דיו, בה ראש ההדפסה זז על פני המערך, ובעזרת גירוי חשמלי מזריק מולקולות על פני המשטח במערך מסודר, ללא מגע ישיר עם המצע. שיטה נוספת היא פוטוליתוגרפיה, בה מצפים את המצע בפוטורזיסט ולאחר מכן מקרנים אור אולטרה סגול דרך מסכה בתבנית הרצויה. לאחר תהליך הפיתוח מוטבעת התבנית שבמסכה על פני שטח המצע. סדרה של טיפולים כימיים משלימים מאפשרים את קיבועו של החלבון על פני התבנית שנוצרה.
דוגמאות למולקולות המוטבעות על המשטח המוצק הן נוגדנים, אנטיגנים, ליגנדים, מולקולות המבוססות על חומצות גרעין, Affibody  (מולקולות קטנות מהונדסות המדמות נוגדנים חד שבטיים) וחלבונים תפקודיים. מקורם של מולקולות אלו הם: בידוד חלבונים ממערכות המבוססות על ביטוי תוך תאי של חלבונים רקומביננטיים, מיצוי ממקורות טבעיים, ייצור אין ויטרו וסינתזת פפטידים. חלק משיטות אלו מבוצעות בתהליכים אוטומטיים לייצור בתפוקה גבוה בתנאים המונעים דנטורציה של החלבון, אשר עלול לפגוע ביכולת הקישור שלהם, דבר ההופך את המערך לחסר תועלת. 
חלבונים רגישים מאוד לשינויים בסביבתם הטבעית. עובדה זו מציבה אתגר לשמירה על יציבות מערכי החלבון לפרקי זמן ממושכים. בשיטת אין סיטו התגברו על אתגר זה על ידי סינתזה של החלבונים על גבי המשטח, ישירות מדנ"א, בעזרת מערכת ביטוי חלבונים ללא תאים. הדנ"א היא מולקולה יציבה, ולכן היא מתאימה לאחסון לטווח ארוך. זאת ועוד, גישה זו עוקפת את התהליכים המייגעים והיקרים של הפרדת חלבונים ושיבוט בעזרת דנ"א, שכן החלבונים במערך מופקים ומוטבעים בשלב אחד על פני המשטח.

זיהוי

בשיטות זיהוי מערך חלבונים חייב להיווצר אות גבוה ורעש רקע נמוך ככל שניתן. השיטה הנפוצה היא תיוג פלואורסצנטי, אשר רגישה מאוד, בטיחותית ומותאמת לעבודה עם סורקי לייזר זמינים. ניתן להשתמש בתגים נוספים, כגון תגי זיקה, פוטוכימי או רדיו-איזוטופי. דא עקא, תגים אלו המחוברים למולקולות המטרה יכולים להפריע לקישור בין מולקולות אלו לחלבון המעוגן. מספר שיטות זיהוי הנמנעות משימוש בתגים הן: תהודה פלסמונית מקומית, ננו-צינורית פחמן, חיישני ננוחוטי פחמן (שבו הזיהוי מתרחש באמצעות שינויים במוליכות) ומערכות מיקרו-אלקטרו מכניות (MEMS). שיטות אלו הן שיטות חדישות יחסית ואינן מתאימות עדיין לגילוי אינטראקציות חלבון בתפוקה גבוהה. עם זאת, הן בעלות פוטנציאל לשימוש עתידי.