כרומטוגרפיה

כרוֹמטוֹגרפיה (באנגלית: Chromatography) היא שיטה בכימיה אנליטית המאפשרת הפרדה של חומרים המצויים בתערובת, זיהויים וקביעת כמוּתם. בנוסף לשימושים המדעיים הרבים שיש לכרומטוגרפיה בכימיה ובביולוגיה, ניתן לפגוש בה רבות בתחום הזיהוי הפלילי, בתעשיית המזון, בתעשיית התרופות ובבתי חולים.

היסטוריה

מקור המילה כרומטוגרפיה ביוונית: כרומו - "צבע", גרפיה - "כתיבה". השיטה פותחה במהלך המאה ה-19 על ידי הבוטנאי הרוסי מיכאיל צבט. צבט חקר את הפיגמנט כלורופיל המקנה לצמחים את צבעם הירוק. כתוצאה מבידוד הכלורופיל התקבלה שורה של צבעים האופייניים למרכיביו ומכאן שם השיטה. כיום הכרומטוגרפיה התפתחה ונחשבת לכלי אנליטי מדויק להפרדה ולמדידות גזים, מוצקים ונוזלים ללא תלות בהיותם בעלי צבע.
צבט פיתח את השיטה בשנת 1901, הגם שעקרונותיה היו ידועים עוד לפני כן; תרומתו של צבט הייתה ביישום העקרונות לשימוש מעשי. צבט לא הצליח לפרסם את שיטתו במידה רבה, אולי כיוון שכתב את עבודותיו רק ברוסית. במהלך המאה ה-20 התפתחה הכרומטוגרפיה בצעדים משמעותיים; ב-1952 זכו שני בריטים בפרס נובל לכימיה על פיתוח תאוריות מתקדמות וכמה סוגים של כרומטוגרפיה.

כרומטוגרפיית נייר

בשיטה פשוטה זו הפאזה הנחה היא רצועת נייר (העשוי ברובו מתאית), שבמרכזה מניחים טיפה מהתערובת שרוצים להפריד (יש לוודא שאף אחד ממרכיביה לא עלול להגיב עם הנייר). הנייר מוטבל בקצהו אל תוך הפאזה הנעה - מים או אתנול, למשל. הפאזה הנעה מתחילה "לטפס" במעלה הנייר; כשהיא פוגשת את טיפת התערובת היא גוררת את מרכיביה איתה. עתה מתבצעת ההפרדה: מרכיבי התערובת שאינם יוצרים אינטראקציות חזקות עם מולקולות הנייר מטפסים במהירות עם הפאזה הנעה אל קצה הנייר; המרכיבים שיוצרים אינטראקציות עם הנייר מזדחלים באיטיות. התוצאה המתקבלת היא שורה של נקודות, כל אחת מייצגת אחד ממרכיבי התערובת. 
את התוצאות ניתן להשוות לתוצאות ידועות של החומרים המדוברים. ניתן לחשב את שיעור הנדידה של כל חומר. שיעור הנדידה (מסומן RF) שווה למרחק שנדד החומר (2 ס"מ, לדוגמה) חלקֵי המרחק שנדדה הפאזה הנעה (5 ס"מ, למשל; במקרה זה שווה ה-RF ל-0.4).
בכרומטוגרפיית נייר דו-ממדית מסובבים את הנייר באמצע התהליך ב-90 מעלות. כתוצאה מכך נוצרת הפרדה כפולה, מדויקת יותר; זו משמשת בדרך-כלל להפרדת תערובות בעלות מספר רב של מרכיבים דומים מאוד.

כרומטוגרפיה ברובד דק

שיטה זו, הידועה יותר כ-TLC (באנגלית: Thin Layer Chromatography), זהה בעקרונותיה לכרומטוגרפיית נייר, אלא שכאן הפאזה הנייחת (בדרך כלל סיליקה או אלומינה) מצופה על גבי משטח (זכוכית, אלומיניום או פלסטיק). שיטת ה-TLC מהירה ומדויקת יותר מכרומטוגרפיית נייר ומשום כך, עם התפתחותה של שיטה זו - שיטת כרומטוגרפית הנייר נעלמה כמעט לחלוטין. שיטת ה-TLC משמשת בעיקר לזיהוי של חומרים לא ידועים המוטענים על גבי המשטח ו"רצים" על גביו לצד חומרים ידועים (סטנדרטים). בסיום תהליך ההרצה מושווה מרחק הנדידה של החומר הנעלם למרחקי הנדידה של הסטנדרטים. ההנחה שעומדת במרכזה של שיטת ה-TLC היא שלחומרים זהים יהיה מרחק נדידה זהה. לכן, על פי מרחק של חומר לא ידוע ניתן לקבוע את זהותו. היא משמשת רבות בכימיה אורגנית בעיקר לבדיקת דרגת הניקיון של החומר ולבדיקה ראשונית של כמות המרכיבים בתערובת. 
כרומטוגרפיה ברובד דק נחשבת לשיטה כרומטוגרפית זולה, קלה ויעילה. היא משמשת בעיקר לזיהוי של חומרים ויש לה יישומים נרחבים בן התחום הכימיה האנליטית והן בתחום הכימיה האורגנית בעיקר לבדיקת דרגת הניקיון של החומר ולבדיקה ראשונית של כמות המרכיבים בתערובת. 
ניתן לבצע בעזרת שיטה זו בדיקות כמותיות למציאת ריכוז חומרים, אך שיטות אלו פחות נפוצות. לצורך כימות חומרים בשיטות כרומטוגרפיות ישנו שימוש נרחב בשיטות של כרומטוגרפיה נוזלית בלחץ גבוה (HPLC) וכרומטוגרפיה גזית (GC).

כרומטוגרפיית חילוף יונים או הפרדה לפי מטען

בשיטה זו, הידועה יותר כ-IEC (באנגלית: Ion-Exchange Chromatography). IEC) מופרדות מולקולות לפי מטענן החשמלי. בשיטה ניתן להפריד כמעט כל סוג של מולקולה טעונה לרבות, חלבונים, חומצות גרעין וחומצות אמיניות. התמיסה המיועדת להפרדה נקראת דוגמית. את הדוגמית מעמיסים לתוך עמודה (קולונה), שהיא בעצם צינור חלול המורכב משכבת ג'ל עשויה חרוזים קטנים (בידים, באנגלית: bead), החרוזים קשורים קוולנטית לשיירים טעונים, ומהווים את הפזה הנייחת. הדוגמית מוזרמת דרך הקולונה על ידי תמיסת בופר ונקראת הפזה הניידת. ניתן גם להשתמש בשיטה זו להפרדה פרפרטיבית (לא לצורך אנליזה), כפי שיוסבר בדוגמה למטה.
הפרדה זו מתבססת על כך שלחלבונים מספר גדול של קבוצות פונקציונליות טעונות (חיובית או שלילית) כתלות בחומציות התמיסה בה הם נמצאים. IEC מפרידה בין חלבונים על סמך המטען הכללי על שרשרת הפפטיד, כאשר המטען תלוי בחומציות הפזה הניידת.
IEC מפרידה בין מולקולות על ידי אינטראקציה יונית בין המולקולות הטעונות הנמצאות בפאזה הניידת לבין השיירים הטעונים (R-X) הנמצאים על הפאזה הנייחת. השיירים מגיבים עם מולקולות טעונות (במטען הנגדי) מהדוגמית.
ניתן לחלק כרומטוגרפיה מסוג זה לשתי תת-קבוצות: כרומטוגרפיית קטיונים וכרמטוגרפיית אניונים. כרומטוגרפיית קטיונים מפרידה בין המולקולות מהדוגמית בעזרת האופי השלילי של השייר על הפאזה הנייחת, כאשר בכרומטוגרפיית אניונים משתמשים בשייר טעון חיובית.
אופי האינטראקציה בין המולקולות יכול להיות מבוקר על ידי pH תמיסת הבופר, כאשר השינוי ב-pH נעשה על ידי הוספה של מלח. ככל שמולקולה טעונה יותר כך ידרשו ריכוזים גבוהים יותר של מלח כדי להזרימה מתוך הקולונה. ניתן לקבל פרופיל אילוציה הדומה ליתר שיטות הכרומטוגרפיה בעמודה, כלומר כדי להזרים חלבון טעון יותר דורש כמות מלחים גבוהה יותר.

כרומטוגרפיית גז

בשיטה זו (GC), הפאזה הנעה היא גז (המורכב ממולקולות דו-אטומיות של הליום, מימן או חנקן, על-מנת שלא יגיב עם החומרים בתערובת). ההפרדה נעשית בעמודת הפרדה או בנים (Capillary) דק וארוך (אורכו עשוי להגיע ל-100 מטרים). שיטה זו מתאימה רק לחומרים המתאדים או רותחים בטמפרטורות נמוכות יחסית. זיהוי החומרים המופרדים נעשה על ידי גלאים משוכללים, המתרגמים את הנתונים לצורה גרפית. 
זמן הנדידה של כל אחד מהחומרים בתערובת - הזמן שעובר עד שהם חוצים את העמודה לאורכה - תלוי בנקודת הרתיחה שלהם, בעיקר, ופחות באינטראקציות עם הפאזה הנחה. לפיכך, השיטה יעילה במיוחד להפרדה של סדרות הומולוגיות - תרכובות אורגניות המשתייכות לאותה משפחה, אך הנבדלים זה מזה באטום פחמן אחד (לדוגמה: האלקאנים מתאן, אתאן, פרופאן, בוטאן). כל אטום פחמן נוסף מגביר את חוזקה של המולקולה, ובכך את נקודת הרתיחה שלה; לכן החומרים מגיעים אל הגלאי לפי סדר גודל המולקולה.
ההפרדה ב-GC נעשית במהירות, תוך מספר דקות. אחד מחסרונות השיטה הוא שהתערובת הנבדקת רותחת ונהרסת; אלא אם כן ניתן לוותר עליה, יש להשתמש בשיטה אחרת. חיסרון נוסף הוא מחירם של מכשירי ה-GC, המתחיל בעשרות אלפי דולרים.