מיצוי נוגדני של כרומטין

מיצוי נוגדני של כרומטין (באנגלית: Chromatin Immunoprecipitation‏; בראשי תיבות: ChIP) הוא שיטה המיישמת מיצוי נוגדני הבוחנת אינטראקציות בין חלבונים לחומצות גרעין בתאים. מטרת השיטה היא לזהות חלבונים מסוימים הבאים במגע עם אתרים מסוימים בגנום של התא, כגון פקטורי שעתוק הבאים במגע עם פרומוטורים, או אתרי קישור DNA אחרים, והגדרה של ציסטרומים (cistromes)‏
. כמו כן מיצוי נוגדני של כרומטין משמש לזיהוי אתרים ספציפיים בגנום שבהם בוצעו עריכות היסטונים (histone remodeling), ומציינים את אתרי המטרה של חלבונים עורכי היסטונים.
בקצרה, השיטה מתבצעת כדלהלן: חלבונים וכרומטין נמצאים בקישור זמני במיצוי תאים, גדילי הDNA נחתכים ותלכיד החלבון – DNA הקשורים לחלבונים ספציפיים מושקעים על ידי שימוש בנוגדנים ספציפיים להם, גדילי DNA אלו מנוקים ונבדקים ולעיתים מרוצפים. ניתן להסיק שרצפי DNA אלו באים במגע עם החלבון הנבדק בתוך התא (in vivo).

מיצוי נוגדני של כרומטין טיפוסי

ישנן שתי שיטות עיקריות של מיצוי נוגדני של כרומטין, והשלב השונה ביניהן הוא הכנת מיצוי התאים וצורת חיתוך גדילי הDNA. הראשונה משתמשת בטכניקת הצלבה הפיכה וחיתוך גדילי הDNA באמצעות סונקציה ונקראת מיצוי נוגדני של כרומטין בקיבוע מוצלב ( (XChIP. בעוד השיטה השנייה אינה מבצעת הצלבה ובה חיתוך הDNA מבוצע באמצעות אנזימים המעכלים DNA  המופקים מחיידקי המיקרוקוס.

מיצוי נוגדני של כרומטין בקיבוע מוצלב (XChIP)

מיצוי נוגדני של כרומטין בקיבוע מוצלב היא שיטה למפות אתרי קישור של פקטורי שעתוק, וחלבונים קושרי כרומטין אחרים על גבי הDNA. חומרי המוצא שלו הוא מיצוי תאים שעבר קיבוע הצלבה הפיך. קיבוע זה נעשה באמצעות פורמלדהיד או קרינה אולטרה סגולית (UV).

תיאור השיטה

מצוי תאים עובר תהליך של קיבוע הצלבה הפיכה באחת השיטות המוזכרות לעיל.
לאחר קיבוע ההצלבה גדילי הDNA מפורקים בדרך כלל על ידי סונקציה, תהליך המותיר שברים באורך של בין 300-1000 בסיסים חנקניים. 
שברים באורכים של בין 400-500 בסיסים מתאימים ביותר לזיהוי מוטיבים של קישור מאחר שהם באורך קורלטיבי למספר נוקלאוזומים בודד ומאפשרים הסקה של קישור על פי מבנה מרחבי.
שאר מיצוי התא מופרד מהתמיסה בהשקעה, ותלכידי חלבון-DNA מושקעים בהשקעה באמצעות נוגדנים ספציפיים לחלבון הנבדק. נוגדנים אלו בדרך כלל מחוברים לחומר המאפשר הפרדה פשוטה, כגון : אגרוז, ספרוז או חלקיקים מגנטיים. התלכיד נוגדני המושקע (זאת אומרת, החלקיק-הנוגדן-חלבון המטרה-הDNA) נאספים ונשטפים על מנת להפריד כרומטין שנקשר בצורה לא ספציפית. תלכידים אלו מעוכלים בפרוטאז K, על מנת לשחרר את הDNA להמשך אבחון. 
גרסאות מתויגות של החלבון הנבדק או ביוטינילציה של החלבון יכולים לשמש במקום נוגדנים ספציפיים לחלבון ולאפשר להפרידו ביעילות גבוהה ובעלות נמוכה משעולה לייצר נוגדן חד שבטי.
ניתן לזהות את גדיל הDNA שהופרד מהתלכיד במספר שיטות, כגון : ריאקציית PCR, שבב, ריצוף מולקולרי, ריצוף מהיר-עיבוד.

מיצוי נוגדני של כרומטין בתנאים טבעיים (NChIP)

שיטה זו בעיקר משמשת למיפוי אתרי מטרה של חלבונים עורכי היסטונים. חומר המוצא הוא מיצוי תאים טבעי ללא טיפולים. הDNA במצבו הטבעי מלופף סביב ההיסטונים ליצירת הנוקלוזומים. חותכים את הDNA באמצעות אנזימים המעכלים DNA המופקים מחיידקי המיקרוקוס, אשר חותכים DNA בין הנוקלאוזומים ומשאירים את הנוקלוזומים שלמים, חלקי הDNA נעים באורכים בין 200 בסיסים (נוקלואוזם בודד), עד לכ-1000 בסיסים (חמישה נוקלוזומים).
שאר הטכניקה זהה למה שתואר במיצוי מוצלב (XChIP), בנוגע לניקוי, מיצוי, הפקה ואנליזה של DNA מופרד.

ההיסטוריה של טכניקות מיצוי נוגדני של כרומטין

בשנת 1984 ג'ון ליס (John T. Lis) וחוקר במעבדתו דוד גילמור (David Gilmour), השתמשו בקרינה אולטרה סגולית על מנת לעשות קיבוע מוצלב של חלבונים לDNA בתאי חיידקים חיים. לאחר מיצוי תכולת התאים הם השקיעו באמצעות נוגדנים כנגד RNA פולימראז חיידקי, את הDNA שהושקע הם בדקו עם גלאים לאזורים שונים בגנום החיידק כדי לזהות פיזור וצפיפות של RNA פולימראז באזורי הגנים השונים.
ב-1985 הם השתמשו באותה השיטה רק הפעם לבדיקת RNA פולימראז 2 באוקריוים בתאי זבוב הפירות, ובדיקה של גלאים של גני עקת חום.
עבודות אלו מוגדרות כפריצות הדרך של עבודה עם מיצוי נוגדני של כרומטין.
מיצוי נוגדני של כרומטין בקיבוע מוצלב שופר ופותח על ידי אלכסנדר ורשבסקי (Alexander Varshavsky) ושותפים, שבדקו את הנוכחות של היסטון H4 על גני עקת חום, במקום להשתמש בקרינה אולטרה סגולית הם השתמשו בפורמלדהיד על מנת לקבע.
טכניקות אלו שופרו ופותחו מאוד מאז.
מיצוי נוגדני של כרומטין בתנאים טבעיים (NChIP) תואר לראשונה על ידי מעבדתו של הביס (Hebbes) ב-1988, וגם שיטה זו פותח ושופרה רבות לשימוש נפוץ.
שיטת המיצוי המקורית לוקחת כ 4-5 ימים ודורשת כ10⁶- 10⁷ תאים. שיטות חדשות מאפשרות לבצע את התהליך תוך יום אחד ודורשות הרבה פחות תאים כ-100-1000.

מיצוי נוגדני של כרומטין באמצעות נשא - (Carrier ChIP (CChIP

שיטה זו יכולה להיות יעילה גם בשימוש של רק כ-100 תאים, על ידי הוספה של תאי זבוב פירות (Drosophila) ככרומטין נשא, ובכך להפחית את אובדן הכרומטין הנבדק בהשקעה, על ידי הטיית שיווי המשקל של ההשקעה. אך כמובן הוא דורש גלאים ספציפיים שיוכלו לזהות את הDNA הנבדק על גבי הרקע של הכרומטין הנשא, שיטה זו לוקחת כיומיים שלושה.

מיצוי מהיר נוגדני של כרומטין - (Fast ChIP (qChIP

שיטה זו מאיצה את התהליך על ידי האצה של שני שלבים במהלך המיצוי :
1. אמבט אולטראסוני מאיץ את תהליך הקשירה של הנוגדנים לחלבוני המטרה ובכך מאיץ את תהליך ההשקעה.
2. פרוטוקול מבוסס שרף (Chelex-100) להפרדת DNA מקצר את הפקת הDNA והיפוך הקיבוע המוצלב.
הניצולת של תהליך זה אינה גבוהה ולכן צריך תמצית תאים המופקת מכמות תאים רבה (כ10⁶~ 10⁷). ניתן לייצר באמצעות שיטה זו עד 24 מקטעי DNA מוכנים לPCR בתוך 5 שעות, שיטה זו מאפשרת בדיקה של פעילות מספר פקטורי שעתוק בו זמנית ולהסתכל על שינויים באוכלוסיות תאים לאורך זמן.

מיצוי נוגדני של כרומטין מהיר וכמותי (Quick and quantitative ChIP (Q2ChIP

שיטה זו משתמשת בחומר מוצא מיצוי של 10⁵ תאים, ומאפשרת בדיקה של 1000 היסטונים או 100 פקטורי שעתוק. בשיטה זו דוגמאות כרומטין רבות יכולות להיות מוכנות במקביל ולהיבדק במקביל. אורך הבדיקה הוא כיום
.

מיקרו מיצוי נוגדני של כרומטין (MicroChIP (µChIP

שיטה זו בדרך כלל משתמשת במיצוי מכ-1000 תאים, ומאפשרת לבצע 8 תהליכי מיצוי ללא שימוש בנשא. שיטה זה יכולה להיעשות גם ממיצוי 100 תאים בלבד אך תהליך מיצוי בודד. כמו כן ניתן להשתמש ברקמת ביופסיה של 1 ממ3 . שיטה זו מבוצעת תוך יום אחד.

מיצוי נוגדני של כרומטין במיקרו-פלטה - Matrix ChIP

שיטה זו מאפשרת רמה גבוהה יותר של עיבוד ומפשטת את התהליך, כל תהליך מבוצע במיקרו-פלטה ומאפשר את הפוטנציאל של אוטומציה. בתהליך זה ניתן לעשות 96 מיצויים במקביל, וכל התהליך לוקח יום בודד.
מיצוי נוגדני של כרומטין נעשה גם על גנום שלם באמצעות טכנולוגיית "מיצוי נוגדני של כרומטין על שבב" (ChIP-on-chip) או טכנולוגיית ריצוף DNA חדשניות (Chip-Sequencing). כמו כן ניתן לשלב שיטה זו עם טכניקת "ריצוף קצוות מזווגים מתויגים" (paired end tags sequencing) בשיטה הנקראת "בחינת אינטראקציות כרומטין באמצעות ריצוף קצוות מזווגים" Chromatin Interaction Analysis using Paired End Tag sequencing (ChIA-PET), שיטה שנועדה לבחינה של אינטראקציות של כרומטין במבנה מרחבי של יצורים אוקריוטים.