אלקטרופורזה

אלקטרופורזה (באנגלית: Electrophoresis) היא שיטה בכימיה אנליטית ובביולוגיה מולקולרית המאפשרת הפרדת חומרים המצויים בתערובת. זוהי אחת השיטות המדעיות הנפוצות בכימיה ובביולוגיה.
באלקטרופורזה מונחת התערובת (מומסת בנוזל או נוזלית בעצמה) על גבי משטח העשוי ג'ל. זרם חשמלי מועבר דרך הג'ל, כך שצידו האחד טעון חיובית והשני - שלילית. המולקולות בתערובת, אשר טעונות חשמלית, נודדות באיטיות לעבר קצהו האחד של הג'ל, כתוצאה מהכוח החשמלי הפועל עליהן.
המולקולות בתערובת אינן נודדות בקצב זהה. מולקולות כבדות יותר נודדות באיטיות, ואילו מולקולות קלות נודדות במהירות ומגיעות רחוק יותר בג'ל. גם אם לשתי מולקולות שונות משקל זהה, הרי שצורתן המרחבית משפיעה אף היא על קצב הנדידה. כך מושגת הפרדת התערובת למרכיביה.
עקרון פעולת האלקטרופורזה מזכיר את זה של הכרומטוגרפיה, אף היא שיטה אנליטית נפוצה. ההבדל ביניהן הוא שבכרומטוגרפיה לא נעשה שימוש בחשמל; התערובת נודדת הודות לכוחות כימיים (מים המטפסים ספונטנית במעלה הנייר בכרומטוגרפיית נייר, למשל) או עקב הפעלת לחץ (ב-HPLC, כרומטוגרפיית נוזל בלחץ גבוה). באלקטרופורזה מניעה המשיכה החשמלית את המולקולות באופן בלעדי.
השימוש הנפוץ ביותר של האלקטרופורזה הוא בביולוגיה, ובמיוחד בביוכימיה, בביולוגיה מולקולרית ובגנטיקה. חלבונים וגדילי DNA ו-RNA מתאימים מאוד להפרדה באלקטרופורזה, וזוהי השיטה העיקרית להפרדתם (במיוחד של שני האחרונים).

הפרדת חלבונים

בהפרדת חלבונים עשוי הג'ל מפולימר אמידי הקרוי פוליאקרילאמיד. לפני הרצת התערובת בג'ל מוסיפים לה בדרך-כלל דטרגנט הנקרא SDS (סודיום דודציל סולפט); עתה מכונה השיטה באופן מלא SDS-PAGE, ראשי תיבות באנגלית של Sodium Dodecyl Sulfate - PolyacrylAmide Gel Electrophoresis. הדטרגנט נקשר לחלבון ביחס התואם לגודל החלבון - מולקולת SDS אחת נקשרת לכל שתי חומצות אמינו. ה-SDS טעון שלילית, וכך מגביר את יכולת הנדידה של החלבון בשדה החשמלי; רוב יכולת הנדידה מושגת למעשה באמצעות ה-SDS, ולא מסתמכת על המטען החשמלי של החלבון עצמו. בנוסף, גורם ה-SDS לשבירת קשרים בחלבון ולהרס המבנה השניוני והשלישוני שלו. לאחר טיפול ב-SDS כל החלבונים בתערובת הופכים לליניאריים (קוויים), כך שהפרדתם עתה מבוססת באופן מלא על גודלם (כלומר, על מספר חומצות האמינו המרכיבות אותם). ללא טיפול ב-SDS עלולים חלבונים השונים במבנם המרחבי לנדוד האחד ביחס לשני במהירויות שאינן יחסיות למסה המולרית שלהם. כך, חלבונים בעלי מסה מולרית זהה עשויים לנדוד במהירויות שונות, עקב הסתבכות של חלבונים בעלי מבנה מרחבי רחב בחריצים הזעירים שבג'ל.
שני חומרים נוספים בהם משתמשים בדרך כלל לפני הרצת תערובת חלבונים הם DTT ויודואצטאמיד. הראשון מחזר קשרים דיסולפידיים (קשרי גופרית-גופרית בין שיירי ציסטאין בחלבונים), והשני מוסיף לשיירי הציסטאין החשופים קבוצת אצטיל (CH₃CO) כדי למנוע מהם מליצור קשרים דיסולפידיים מחדש. לעיתים משתמשים בבטא-מרקפטואתנול לצורך חיזור הקשרים הדיסולפידיים. קשרים אלו תורמים רבות ליציבות החלבון ולצורתו התלת-ממדית; הטיפול בשני חומרים אלו תורם אף הוא, אם כן, לקבלת חלבונים קוויים, בעלי צורה אחידה.
לתערובת החלבונים יש להוסיף תרכובת צבע כלשהי אשר מאפשרת לחוקר לקבל אינדיקציה על התקדמות החלבונים ולכן גם מתי להפסיק את ההרצה. קומאסי כחול (באנגלית: Coomassie blue) משמש לעיתים קרובות למטרה זו.

הפרדת חומצות גרעין

בהפרדת חומצות גרעין עשוי הג'ל מאגרוז (Agarose), פחמימה הדומה לאגר; כאן לא נעשה שימוש ב-SDS. בנוסף יש להוסיף לג'ל תרכובת כלשהי אשר תיצמד אל חומצות הגרעין כדי שניתן יהיה לראותן לאחר שנדדו (חומצות הגרעין עצמן שקופות ולא ניתן לראותן). התרכובת הנפוצה ביותר לשימוש זה היא אתידיום ברומיד. תרכובת זו היא פלואורסצנטית ולפיכך ניתן לראות את תוצאות הג'ל אך ורק תחת קרינה אולטרה-סגולה, בניגוד לאלקטרופורזת SDS.
את דגימות ה-DNA או ה-RNA שאותן מטעינים על גבי הג'ל יש לערבב עם תערובת צבע מיוחדת; תערובת זו נודדת בשדה החשמלי (תמיד בקצב זהה, ללא קשר לדגימות עצמן) ומסמנת למפעיל את המיקום המוערך של הדגימות ואת קצב התקדמות התהליך (הרצה ארוכה מדי של הג'ל גורמת בפשטות לנדידתן של הדגימות אל מחוץ לג'ל ולכישלון הבדיקה). התערובת מכילה מעט גליצרול, העוזר לתמיסה המימית של חומצות הגרעין לשקוע בחריץ ההטענה. היות שהמבנה התלת-ממדי של חומצות הגרעין לא נהרס בתהליך האלקטרופורזה, ניתן לחתוך את הדגימות מהג'ל בסכין לאחר הרצתן, לטהרן משיירי האגרוז ולהשתמש בהן בהמשך. קיימות ערכות מסחריות רבות המשמשות במיוחד לטיהור חומצות גרעין בג'ל.

סולם

ללא נקודות ייחוס ידועות לא ניתן להעריך את גודלם של החלבונים או של חומצות הגרעין שהופרדו באמצעות אלקטרופורזה. למטרה זו משמשת בדרך כלל תערובת מסחרית ומוכנה מראש - "סולם" - המכילה דגימות חלבון או חומצת גרעין שגודלן ידוע מראש. במקרה של חומצות גרעין מיוצרים הסולמות באמצעות חיתוך של גדיל DNA מסוים באמצעות אנזימי הגבלה. הגדיל בו משתמשים יכול להיות פלסמיד מסוים, גנום של נגיף (בקטריופאג' למדא, למשל), או כל גדיל אחר אשר חיתוכו מייצר פסים נאים וברורים אשר גודלם ידוע. כך, למשל, חיתוך של הגנום השלם של פאג' למדא באמצעות אנזים ההגבלה HindIII מייצר תמיד 8 פסים. הפס הקטן ביותר הוא בן 125 נוקלאוטידים; הפס שאחריו - 564 נוקלאוטידים; וכן הלאה. באמצעות הרצת סולם הלמדא במקביל להרצת דגימות DNA ניתן להשוות מיקומם של הפסים המתקבלים בדגימה אל מול הפסים שבסולם, ובכך להעריך את גודלם של הראשונים. בשלוש תמונות האלקטרופורזה משמאל ניתן לראות את הסולם בקצה השמאלי של הג'ל.

וריאציות של אלקטרופורזה

ב-1975 פותחה האלקטרופורזה הדו-ממדית, המשלבת מיקוד איזואלקטרי עם אלקטרופורזה. בשיטה זו, המדויקת בהרבה מכל אחת משתי השיטות כשמשתמשים בהן בנפרד, ציר ה-Y של הג'ל מבוסס על אלקטרופורזה, והשדה החשמלי משתנה לאורכו. ציר ה-X מבוסס על מיקוד איזואלקטרי, ודרגת החומציות (ה-pH) משתנה לאורכו. החלבונים מופרדים באופן כפול, לפי גודלם ולפי הנקודה האיזואלקטרית שלהם. בשיטה זו ניתן לבודד בהצלחה אלפי חלבונים על-גבי ג'ל אחד.
באלקטרופורזה בְנִים (באנגלית: Capillary) מתרחש כל התהליך בצינור גמיש, ארוך (עד 100 מטרים) ודק ביותר (קוטרו הפנימי פחות ממילימטר). התערובת מוזרקת בלחץ או תוך שימוש בוואקום אל הנים, אשר אינו מכיל ג'ל, כי אם מצופה בצידו הפנימי בסיליקה או בחומר דומה. התוצאות מפוענחות על ידי גלאי ומוצגות באופן גרפי על-גבי צג או מודפסות על-גבי נייר. בניגוד לאלקטרופורזה הפשוטה, הפרימיטיבית והזולה, מכשירי אלקטרופורזה בנים הם יקרים מאוד ונמצאים בחזית הטכנולוגיה העכשווית. השיטה מהירה ומדויקת ביותר.