קריספר

קריספר (באנגלית: CRISPR‏) הוא אזור בדנ"א של חיידקים וארכאות רבים, והוא חלק ממנגנון חיסון נגד נגיפים. כאשר נגיף כדוגמת בקטריופאג' תוקף חיידק הוא מחדיר לתוכו את סליל הדנ"א הכפול שלו, הדנ"א הוויראלי מנצל את סביבת התא כדי לייצר חלבונים ולהשתכפל, וגורם למותו של התא. התגלה שבדומה לבעלי חיים עיליים, גם חיידקים פיתחו מערכת חיסונית נרכשת שלומדת לזהות את הנגיף ולחסל אותו, והחיסון מורש גם לתאי הבת.
ראשי התיבות CRISPR פירושם Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats. הקריספר הוא מעין ספרייה של קטעי דנ"א ויראלי, שנחתכו מהפולש ושובצו בתוך הדנ"א של החיידק עצמו. קטעי הדנ"א הוויראלי מופרדים על ידי רצפים קבועים מחזוריים. בסמוך לאזור הקריספר בדנ"א של החיידק נמצאים גנים לקידוד הנוקלאז Cas9 ונוקלאזים אחרים, שמסוגלים לחתוך סלילי דנ"א. נוקלאזים אלה בעזרת מקטע הדנ"א הוויראלי יכולים להיצמד לקטע הדנ"א המדויק בפולש ולחתוך אותו, וכך לשבש את פעולתו. מנגנון זה גויס על ידי מיקרוביולוגים כשיטה זולה ומהירה להנדסה גנטית, והשיטה כה מדויקת שאפשר בעזרתה להוציא זוג בסיסים בודד מתוך דנ"א.
אזורי ה-CRISPR מזהים את ה-DNA הזר וחותכים אותו. באופן טבעי חיידקים יכולים להכניס DNA זר ולהשתמש בו, אולם מערכת CRISPR היא מערכת הפוכה בה ה-DNA נכנס, אולם במקום להשתמש בו הוא מפורק ומשמש כחלק ממערכת חיסונית.

היסטוריה

ב-1987 חקרו כמה מדענים מיפן גנים מסוימים בחיידק המעיים Escherichia coli ומצאו שרצף DNA סמוך לגן שחקרו מכיל כמה מקטעים זהים עם רווחים (ספייסרים) ביניהם, אך משמעותם לא פוענחה. ב-1993 מצא החוקר הספרדי פרנסיסקו מוחיקה (Francisco Mojica) רצפים חוזרים דומים ונתן להם את השם Short Regularly Spaced Repeats או בקיצור SRSR. בשנת 2000 זוהו רצפים דומים במינים אחרים של בקטריות וארכיאה. השם שונה ב-2002 ל-CRISPR כאשר התגלה כי הרצפים תמיד מופיעים ליד גנים המאפשרים לייצר אנזימים החותכים DNA כגון נוקלאז והליקאז שכונו בשם cas.
ב-2005 גילו כמה קבוצות מחקר שהספייסרים הכילו DNA זר כגון בקטריופאג' ופלסמיד, והתגלה שהספייסרים הם למעשה חלק ממערכת החיסון של בקטריות. כאשר וירוס חודר לבקטריה, חלק ממערכת הקריספר חותכת מקטעים מהדנ"א הוויראלי ומחדירה אותו לתוך רצף הספייסרים. יוג'ין קונין הציע שמנגנון זה מאפשר לתאים לזהות ולתקוף דנ"א ויראלי ופועל כסוג של מערכת חיסונית של בקטריות וארכיאה.
ב-2007 השתמשו בחברת Danisco בספייסרים כדי להקנות לחיידקי Streptococcus thermophilus עמידות נגד וירוסים מסוימים בשביל למנוע זיהומים של וירוסים בייצור יוגורט. הם לקחו את הספייסרים של ה-CRISPR ועשו עימוד רצפים, ומצאו שהרצפים הם לרוב מ-DNA שחיצוני לחיידקים (פאג'ים, פלסמידים, טרנספוזונים וכו'). ב-2010 מצאו שיש כמה סוגים של CRISPR שחלקם תוקפים RNA וחלקם DNA.
ב-2012 הראו לראשונה הביוכימאיות ג'ניפר דאודנה ועמנואל שרפנטייה את השימוש במערכת ה-CRISPR/cas לחיתוך דנ"א מחוץ לחיידק. החידוש במחקר זה הוא שימוש ברצף רנ"א שמורכב ממקטע ה-trcrRNA וה-crRNA, וגרם לפריחה בתחום. מקטע זה נקרא single guide RNA או sgRNA. פיתוח נוסף הוא השימוש בחלבון cas אחד שכולל בתוכו את כל האזורים הנחוצים לקשירה ופתיחה של דנ"א וחיתוכו ולא בקומפלקס של חלבונים שונים. אנזים cas זה נמצא בחיידק Streptococcus pyogenes ונקרא cas9. השימוש באנזים יחיד ורצף יחיד הפך את השימוש במנגנון להרבה יותר פשוט ובכך הנגיש אותו לשימוש ככלי בהנדסה גנטית.
ב-2013 במעבדתו של פנג ז'נג הראו לראשונה את השימוש ב-CRISPR בהנדסה גנטית בתאי עכבר ואדם. מאז 2013, מערכת ה-CRISPR/Cas משמשת לצורך הנדסה גנטית ועריכת גנים, כולל הוספה, שינוי או הקטנת הביטוי של גנים. באמצעות הכנסה של חלבון Cas9 ו-guide RNAs לתא, אפשר לחתוך את הגנום בכל מקום שהוא.

מנגנון

הגנים שסמוכים לרצפי ה-CRISPR מקודדים לקומפלקס של חלבונים שמכונים: crispr associated proteins - cas. קומפלקס זה מכיל שני אזורים של נוקלאז, הליקאז ואזור לקישור רנ"א. יש צורך ברצף רנ"א נוסף שיתחבר לקומפלקס כדי שהוא יהיה פעיל. רצף זה נקרא (tracer RNA) trcrRNA ובחיידקים נמצא לפני הרצף שמקודד לגני ה-cas. כאשר וירוס מדביק חיידק, רצפי הקריספר נחתכים לרצפים קצרים של ספייסר ומקטע. רצף זה, אשר נקרא crRNA (CRISPR RNA), מתחבר לקומפלקס ה-cas. קומפלקס הקריספר/cas עובר על הדנ"א הוויראלי ומחפש אזורים בדנ"א שמשלימים לרצף ה-crRNA כשנמצא רצף מתאים, הנוקלאזות חותכות את הדנ"א הוויראלי במקומות מקבילים בשני הגדילים. בעזרת מנגנון זה החיידק מפרק את הדנ"א הוויראלי. קומפלקס הקריספר/cas לא מסוגל לחתוך כל רצף קיים וצריך להימצא רצף מסוים של כשלושה נוקלאוטידים על הדנ"א הוויראלי כדי שהקריספר/cas יפעל. רצף קצר זה נקרא PAM - protospacer adjacent motifs. רצף ה-PAM המתאים משתנה בין סוגי ה-cas השונים.
היכולת לחתוך במדויק מקטע DNA, שיכפולו והכנסתו למקטע DNA אחר בצורה זולה ויעילה פרצה את הדרך בפני המדעים וב-2014 השקיעה ארצות הברית 160 מיליון דולר בפרויקטים המשתמשים בקריספר.