SiRNA

RNA התערבותי קטן (siRNA), המכונה לעיתים RNA התערבותי קצר או משתיק RNA הוא סוג של מולקולת RNA דו גדילי, 20-25 זוגות בסיסים באורכו. siRNA ממלא תפקידים רבים, אבל בולט ביותר במסלול ההפרעה ל-RNAi) RNA), שבו הוא מפריע לביטוי של גנים ספציפיים עם רצף נוקליאוטידים משלים. siRNA פועל גם במסלולים הקשורים ל-RNAi, למשל, כמנגנון נגיפי או בעיצוב מבנה הכרומטין של הגנום. המורכבות של המסלולים האלה נחקרת ומתגלת רק בזמן האחרון.
siRNA ותפקידם בהשתקת גנים לאחר תעתיק (PTGS) בצמחים נתגלה לראשונה על ידי הצוות של דייוויד פאולקומב במעבדת סנסבורי בנוריץ', אנגליה ודווחו ב-Science בשנת 1999. תומאס תסקל ועמיתיו דיווחו ב-Nature כי siRNA מלאכותי יכול לגרום ל-RNAi בתאי יונקים. גילוי זה הוביל לפריצת דרך בעניין רתימת RNAi למחקר ביורפואי ופיתוח תרופות.

מבנה

יש ל-siRNA מבנה מוגדר היטב: RNA קצר (בדרך כלל 20-24 זוג בסיסים) דו-גדילי (dsRNA) עם זרחון של קצוות 5' והידרוקסילציה של קצוות 3' ושני נוקלאוטידים בולטים. אנזים הדייסר (Dicer) מזרז ייצור של siRNA מ-RNA דו-גדילי ארוך (dsRNA). מאחר שבאופן עקרוני siRNA מלאכותי עם רצף משלים יכול להשתיק כל גן, הוא נחשב לכלי חשוב לאימות תפקוד הגן ולמיקוד תרופות.

תפקיד siRNA ב-RNAi

לעיתים טרנספקציה של siRNA אקסוגני במטרה לגרום להשתקת גנים לא גורמת להשתקה, גם לא זמנית, בעיקר בתאים המתחלקים מהר. ניתן להתגבר על בעיה זו על ידי יצירת וקטור ביטוי ל-siRNA. בפלסמיד, רצף ה-siRNA משתנה, אך הוא צריך ליצור לולאה קצרה שבין שני הגדילים. תוצאת השעתוק של הרצף היא מולקולת shRNA, אשר יכולה להיות מעובדת ל-siRNA פונקציונלי על ידי האנזים Dicer. קסטות שעתוק אופייניות משתמשות בפרומוטר של RNA polymerase III (למשל U6 או H1) כדי לכוון את השעתוק של RNA גרעיני קטן (snRNAs)(ה-U6 מעורב בשחבור גנים, H1 הוא רכיב RNase של RNase P של האדם).
הפעילות של siRNA ב-RNAi תלויה במידה רבה ביכולתו להיקשר לגורם ההשתקה המורכב של RISC) RNA). לאחר היקשרות דופלקס siRNA ל-RISC הוא נבקע לשני גדילים בודדים על ידי אנזים הנאנדונקלזס. רק אחד הגדילים נקשר ל-RISC, ואז כל הקומפלקס נקשר ל-mRNA הרצוי ומשתיק אותו (ההתבטאות של הגנים הוא מקודד).

שפעול RNA

dsRNA יכול גם להפעיל את ביטוי הגנים, מנגנון שזכה לכינוי "הפעלת גנים מושרה של RNA קטן" (RNAa). הוכח כי dsRNA שמטרתו היא פרומוטרים של גנים מעורר הפעלת שעתוק חזקה של הגנים הקשורים. RNAa הודגם בתאי אדם בעזרת dsRNA מלאכותי, המכונה "RNA משפעל קטן" (saRNA). בשלב זה לא ידוע אם RNAa מבוטא גם באורגניזמים אחרים.

השפעות לא רצויות

היות ש-RNAi מצטלב במסלולים רבים, אין זה מפתיע שבמקרה אנו מעוררים תופעות בלתי רצויות במהלך קידום המחקר של siRNA. כאשר תאים של יונקים פוגשים RNA דו גדילי, כגון siRNA, התא עלול לטעות ולטפל בו כנגיף, וכך לגרום לתגובה חיסונית. בנוסף, כיוון ש-microRNA מווסת התבטאות גנים על ידי אינטראקציות משלימות של זוג בסיסים עם ה-mRNA הרצוי, החדרת siRNA עלולה לגרום לדיכוי המטרה באופן בלתי צפוי.

חסינות מולדת

החדרת הרבה מולקולות של siRNA עלולה לגרום לאירועים בלתי צפויים עקב ההפעלה של מערכת החיסון המולדת. רוב הראיות עד כה מצביעות על כך שזה כנראה תוצאה של הפעלת חיישן ה-PKR של ה-dsRNA, על אף שגן חומצה רטינואית מושרה (RIG-I) יכול להיות מעורב גם. האינדוקציה של ציטוקינים דרך קולטן TLR7 גם תוארה כסיבה. אחת השיטות המבטיחות להפחתת תופעה זו היא להמיר את ה-siRNA לתוך microRNA. תהליך של microRNA מתרחש באופן טבעי בגוף, ועל ידי רתימת מסלול אנדוגני זה, אמור להיות אפשרי להשיג את אותו דיכוי גנים בריכוזים נמוכים יחסית של siRNA. זה אמור למזער את ההשפעות הלא רצויות.

יעד שגוי

אתגר נוסף לשימוש ב-siRNA לדיכוי גנים הוא פעולתו המוטעית על תאים שיש להם רצף לא משלים וחסימת התבטאות הגנים (למעשה, siRNA פועל כ-miRNA), דבר שמוביל לבעיות בעיבוד הנתונים ורעילות פוטנציאלית. עם זאת, ניתן לטפל בחלק מהבעיה על ידי תכנון ניסויי בקרה מתאימים, ועיצוב siRNA שהוא חופשי מטעיות אלה. נכון ל-2014, טכניקה כזו נמצאת בשלבי פיתוח.

יישומים ואתגרים טיפוליים

בהתחשבות ביכולת ה-siRNA להשתיק כל גן רצוי, פעולתו ב-RNAi יוצרת עניין רב בתחום הביולוגיה הבסיסית. ישנו שימוש הולך וגובר בו לזיהוי גנים חשובים במסלולים ביולוגיים של וירואידים.
עם זאת, יישום RNAi באמצעות siRNA בבעלי חיים, במיוחד בני אדם, מציב אתגרים רבים. לפי ניסויים, siRNA מראה יעילות שונה בסוגי תאים שונים באופן שעדיין לא מובן כל כך: תאים מסוימים מגיבים היטב ל-siRNA, בעוד שתאים אחרים לא מראים תגובה ברורה (אפילו שיש טרנספקציה יעילה).