B12-vitamiinin sitoutuminen transkobalamiiniin

B₁₂-vitamiinin sitoutuminen transkobalamiiniin tarkoittaa biokemiassa kemiallisten reaktioiden sarjaa, jonka seurauksena B₁₂-vitamiini siirtyy transkobalamiiniin kuljettamana solukalvon läpi soluun käytettäväksi.
Kaksi nisäkkäiden aineenvaihdunnassa toimivaa entsyymiä, metioniinisyntaasi sekä metyylimalonyylikoentsyymi-A-mutaasi, vaativat kofaktoreikseen B₁₂-vitamiinin eli kobalamiinin (Cbl) johdannaisen. Metioniinisyntaasin kofaktorina toimii metyylikobalamiini (metyyli-B12). Metyyli-malonyyli-koentsyymi A -mutaasi vaatii toimiakseen puolestaan 5’-adenosyylikobalamiinia (kofaktori B12 eli Ado-Cbl).
Nisäkkäät eivät pysty itse syntetisoimaan B₁₂-vitamiinia, vaan ovat täysin ravinnosta saatavan – ja pieneliöiden kuten eräiden salmonella- ja Propionibacterium-bakteerilajien valmistaman – B₁₂-vitamiinin varassa. Tämän seurauksena nisäkkäille on kehittynyt monimutkainen kolmeen eri kantajaproteiiniin ja näiden kalvoreseptoreihin perustuva B₁₂-vitamiinin kuljetusjärjestelmä, jolla ravinnon B₁₂-vitamiini saadaan otettua ruoansulatuskanavan seinämän läpi verenkiertoon ja soluihin.

B12-vitamiinin sitoutuminen elimistössä

Vapaa B₁₂-vitamiini sitoutuu ensimmäisenä syljen haptokorriiniin (HC), ja pysyy sitoutuneena HC-Cbl-kompleksin ohutsuolessa tapahtuvaan proteolyysiin saakka. Tämän jälkeen kobalamiini sitoutuu ohutsuolessa mahan epiteelisolujen erittämälle sisäiselle tekijälle eli intrinsic factorille (IF), ja IF-Cbl siirtyy ohutsuolen seinämän läpi reseptorivälitteisellä endosytoosilla. Tämän jälkeen noin neljäsosa B₁₂-vitamiinista sitoutuu transkobalamiini II -proteiiniin (TC-II), ja loput sitoutuvat plasman haptokorriiniin, joka voi imeytyä ainoastaan maksasoluihin. Myös TC-Cbl-kompleksi otetaan soluihin plasmasta reseptorivälitteisellä endosytoosilla, mutta tämän mekanismia ei vielä tunneta tarkkaan. TC-Cbl hajotetaan lysosomeissa ja vapautunut kobalamiini muokataan sytoplasmassa metyylikobalamiiniksi ja Ado-Cbl:ksi mitokondrioissa.

Transkobalamiinin rakenne

Suurin osa transkobalamiinin rakennetutkimuksesta on tehty ihmisen ja naudan transkobalamiinilla, joiden aminohapposekvenssit ovat 73-prosenttisesti yhdenmukaiset ja proteiinit ovat myös sekundääri- ja tertiäärirakenteeltaan hyvin samankaltaisia. Ilmeisesti verisuonten endoteelin tuottama TC koostuu kahdesta alayksiköstä, N-terminaalisesta noin 300 aminohapon ”α-domeenista” sekä C-terminaalisesta ”β-domeenista”, jotka nimensä
mukaisesti koostuvat pääasiassa α-helikseistä ja β-juosteista, tässä järjestyksessä. α-heliksit muodostavat α6α6-tynnyrin, jonka ”kantena” on yksi 3/10-heliksi. Globulaarinen rakenne vakautuu disulfidisilloilla. Noin 100 aminohapon β-domeeni muodostaa 5-juosteisen β-levyn, sekä sitä vasten toisen kolmejuosteisen levyn ja yhden α-heliksin muodostavan rakenteen. Lajista riippuen 9-11 aminohapon linkkerijakso yhdistää alayksiköt.

Kobalamiinin sitoutuminen transkobalamiiniin

Kobalamiini sitoutuu α- ja β-domeenien väliin niin kutsutussa base on -konformaatiossa, eli korriinirenkaan koboltti-keskusatomi koordinoituna dimetyylibentsimidatsoliin ja kohtisuorassa alayksiköiden välistä tilaa vastaan.
Kobalamiinin ja transkobalamiinin välille muodostuu kahdenlaisia voimakkaita vuorovaikutuksia. Ensinnäkin Co-atomi (hapetusluvulla +3) muodostaa koordinaatiosidoksen ylemmän aksiaalisen ligandin ja His-175:n (naudalla, ihmisellä His-173) sivuketjun kanssa. Lisäksi joukko vetysidoksia muodostuu joko suoraan tai liuotinmolekyylien avulla TC:n ja kobalamiinin välille. Vetysidoksiin osallistuvat kaikki korriinirenkaan sivuketjut sekä kaksi happiatomia sen fosfaattiryhmästä. α-alayksikkö muodostaa yhteensä 13 vetysidosta (kuusi suoraan ja seitsemän liuotinmolekyylien välityksellä) kobalamiinin kanssa ja β-alayksikkö muodostaa vielä 12 vetysidosta lisää. Näistä kuusi on suoria vetysidoksia kobalamiiniin. α-alayksikkö reagoi pääasiassa aminohappotähteiden sivuketjuilla, kun taas β-domeeni muodostaa vetysidoksia vain rungon happi- ja typpiatomeilla.
Kobalamiini on hyvin tiukasti hautautuneena transkobalamiinialayksiköiden väliin, sillä sen pinnasta jää vain noin 7 % liuottimen ulottuville. Proteiinin ulkopuolelle kobalamiinista näkyy vain sivuketjun nukleotidin riboosi ja sen 5’-hydroksyyliryhmä. Kobalamiini puristuu sen verran tiukasti proteiinin sisälle, että ihmisen TC-Cbl:ssä havaitaan korriinirenkaan hiiliatomin lievä deformaatio, joka johtuu steerisestä esteestä metyyliryhmän ja Tyr-362:n fenyylihapen välillä. Naudan transkobalamiinissa tätä aminohappoa vastaa pienikokoisempi Phe-367, joten steerisiä esteitä ei synny.
Kobalamiini voi sitoutua vetysidoksin ensin joko α- tai β-domeeniin. Kun sitoutuminen jompaankumpaan on tapahtunut, domeenit liikkuvat lähemmäksi toisiaan ja B₁₂-vitamiini ”kapseloidaan” sitoutumispaikkaansa. Sulkeutuminen tapahtuu yhdessä vaiheessa ja sen nopeusvakio on noin 107–108 M⁻¹s⁻¹. Sitoutumisnopeuden tarkastelussa on muistettava, että kobolttiatomin ylempään aksiaaliseen asemaan voi olla koordinoituneena esimerkiksi syano- tai nitriloryhmä (CN- ) tai vesi, kuten aquokobalamiinin tapauksessa. Kobolttiin sitoutuva histidiinitähde ei syrjäytä CN- tai N3-ryhmää, mutta aquokobalamiinin sitoutuessa havaitaan toinen hitaammin tapahtuva sitoutumisvaihe, joka itse asiassa kuvaa veden substituutiota histidiinillä. Veden koordinaatiosidos kobolttiatomiin on sen verran heikompi, että melko vapaasti α7- ja α8-heliksien välissä liikkuva histidiini voi syrjäyttää vesimolekyylin, vaikka H₂O → His substituutioreaktion aktivaatioenergia onkin kohtuullisen korkea 120 kJ mol⁻¹.
Ohjattu mutageneesi -kokeissa todettiin, että TC:n Ser-174-Thr-186-jakson sisältämien seriini-, aspartaatti- ja treoniinitähteiden osittainen korvaaminen hydrofobisemmalla alaniinilla hävittää TC:n kyvyn sitoa B₁₂-vitamiinia, mutta esimerkiksi yhden vetysidoksen (Asp-176) poistaminen ei vaikuta sitomiskykyyn mitenkään. Tämä tukee aiemmin esitettyä havaintoa sitoutumisen ”epäselektiivisyydestä”, eli siitä ettei se, kumpaan alayksikköön B₁₂ ensimmäisenä sitoutuu ja vetysidosten tarkka lukumäärä tai se, kummalta alayksiköltä ne ovat peräisin, ole sitoutumisen kannalta niin olennaista. Transkobalamiinilla on joka tapauksessa kyky sitoa kobalamiinia ja eri kobalamiinijohdannaisia nopeasti ja tiiviisti.
B₁₂-vitamiinin tiivis sitoutuminen plasmassa esiintyvään kantajaproteiiniinsa on siis hyvä esimerkki siitä kuinka vesiympäristössä liukoinen ja suurikokoinen molekyyli saadaan kuljetettua turvallisesti proteiinivaipan sisällä soluihin ja sitä tarvitseville entsyymeille.