Fosforylaatio

Signalointiproteiinien fosforyloinnin historiaa ja tätä päivää

Vuonna 1906 Phoebus A. Levine tunnisti fosfaatin Vitellin-proteiinissa. Vuoteen 1923 mennessä hän ja Fritz Lipmann havaitsivat fosfoseriinin. Kahdenkymmenen vuoden päästä Eugene Kennedy kuvaili ensimmäisenä "proteiinien entsymaattisen fosforylaation". Hitaan alun jälkeen alkoi tapahtua, koska haluttiin ymmärtää hormonitoiminnan biokemiallinen perusta. Silloin vielä solusignaloinnin perustavanlaatuiset periaatteet olivat tuntemattomia. Glukagonin ja insuliinin mekanismin keksiminen innoitti eri alojen tutkijat työskentelemään hormonitoiminnan eri osa-alueiden selvittämiseksi. Earl Sutherland ja Thomas Rall tutkivat epinefriinin ja glukagonin suhdetta glykogeenifosforylaasiin maksassa. He selvittivät että molemmat hormonit stimuloivat 3'5'-syklistä adenosiinimonofosfaattia (cAMP), joka toimii solun sisällä fosforylaasiaktiivisuuden muutoksien lisäämiseksi. He osoittivat cAMP:in olevan solun sisäinen säätelijä tietyissä hormonaalisissa signaaleissa. Suunnilleen samoihin aikoihin Edwin Crebs ja Edmund Fischer tutkivat inaktiivisen fosforylaasi b:n muuntumista aktiiviseksi fosforylaasi a:ksi lihasuutteesta. He selvittivät että fosforylaasin aktivaatioon tarvitaan ATP:tä ja kalsiumia, jota tässä kokeessa vuoti filtteripaperilta kun uutetta suodatettiin. Kalsium osoittautui tärkeäksi ko-faktoriksi. Käyttämällä γ-32P-leimattua ATP:tä, he osoittivat että fosfaatti oli yhdistetty spesifiseen fosforylaasin seriiniin ja muutti aktivoidun fosforylaasin a-muotoon. Seuraavaksi Fischer, Krebs ja kollegat vahvistivat että fosforylaasi a säätelee fosforylaasi b kinaasi, jota puolestaan säätelee cAMP:iin reagoiva kinaasi, tämä johti ideaan kinaasikaskadista. 1968 Krebs puhdisti tämän cAMP:ista riippuvaisen proteiinikinaasin (PKA). Ora Rosen, Paul Greengard, Jackie Corbin ja Susan Taylor puolestaan selvittivät että esiintyy tetrameerinä säätely- ja katalyyttisissä yksiköissä. 1970-luvun puolivälissä Philip Cohen ja Bruce Kemp määrittivät monien PKA-fosforylaatioiden rakenteellisesti rajoittavia tekijöitä ja toiminnallisia seurauksia. Myöhemmin 1989 Louise Johnson ja Davis Barford paljastivat fosforylaasi a:n kristallirakenteen, näyttäen ensimmäistä kertaa 3D-kuvan proteiinifosforylaation molekulaarisesta säätelystä. Kun tähän mennessä saavutettu tieto yhdistettiin Alfred Gilmanin ja Martin Rodbellin löytämään G-proteiiniin ja Robert Lefkovichin G-proteiiniin kytkeytyneiden reseptoreiden analyysiin, kanonisen signaalireitin luonnos muodostui ja seriini/treoniini-fosforylaatio tunnustettiin säätelevän proteiinin avaintekijäksi.
Tähän mennessä hydroksiiniaminohappojen seriini ja treoniini tiedettiin olevan proteiinifosforylaation kohteita eläinsolussa. 1979 Tony Hunter ja kollegat identifioivat fosfotyrosiinin proteiinikinaasiaktiivisuuden tuotteeksi viraalisen onkoproteiinin immunopresipitaateissa. Tämä paljasti uuden proteiinifosforylaatiomuodon, joka liittyi epäsuorasti kasvaimen muodostumiseen. Pian selvisi että sytoplasmisilla retroviraalisilla onkoproteiineilla kuten v-Src, v-Abl ja v-Fps on luontainen tyrosiinikinaasiaktiivisuus, jonka ansiosta ne saavat esiin solun muutoksia. Useiden kasvutekijöiden ja metabolisten hormonien transmembraanireseptorit havaittiin myös olevan luontaisesti proteiinikinaasiaktiivisia. Huomattavaa, poikkeavaa tyrosiinikinaasiaktiivisuutta pidetään syynä joihinkin ihmisonkogeeneihin, kuten kimeeriseen Brc-Abl proteiiniin, joka on tunnusomainen krooniselle myelogenoidiselle leukemialle, kuten Owen Little ja kollegat osoittivat.
Säätelytyrosiinin fosforylaatio voi aiheuttaa substraatin konformationaalisen muutoksen, joka stimuloi entsymaattista aktiivisuutta. Tyrosiinikinaasit autofosforyloituvat kinaasidomeenin aktivaatiosegmentin sisällä, josta aiheutuu muutos aktiivisempaan tilaan. Joka tapauksessa tyrosiinifosforylaation jatkuva seuraus on luoda spesifisiä sitomispaikkoja Scr homologin 2 (SH2) domeeneille, jotka ovat yleinen komponentti muutoin niin sekalaisissa sytoplasmisissa proteiineissa jotka säätelevät normaalien ja onkogeenisten tyrosiinikinaasien solunsisäistä signalointia. Mekanismi jolla fosforylaatio muokkaa proteiinien toimintaa on osoittautunut hyödylliseksi muiden post-translationaalisten vaikutusten kuten asetylaation, metylaation, ubikinaation ja hydroksylaation ymmärtämisessä. Eri post-translationaalisia modifikaatioita voi käyttää peräkkäin tai samanaikaisesti laajentamaan signaalisen systeemin valikoimaa. Esimerkiksi yksittäisen histonin N-terminaalisella hännällä voi olla useita asetylaatio-, metylaatio-, fosforylaatio-, ubikitinylaatio- ja sumylaatiokohtia jotka voivat toimia synergestisesti tai molemminpuolisesti kontrolloidakseen kromatiinin organisaatiota ja geeniekspressiota. Post-translationaalisten muokkausten yhdistetty käyttö lisää suuresti niiden biologisten aktiviteettien vaihtelua.
Proteiinikinaasit ovat houkuttelevia lääkkeiden kohteita monissa sairauksissa, mutta kehittyvät proteiinikinaasi-inhibiittorit jotka kilpailevat ATP:n kanssa nähtiin aluksi vaikeana haasteena koska solussa on niin suuri konsentraatio ATP:tä ja ATP:n sitomiskohdat ovat niin konservoituneita. Alexander Levitzki ja muut onnistuivat silti selvittämään että on mahdollista suunnitella sellainen molekyyli, joka on lisäksi yllättävän selektiivinen. Viimeisimmät inhibiittorit ovat osoittaneet selkeää kliinistä aktiivisuutta. Novartiksen Nicholas Lydonin ja kollegoiden kehittämä imatinibi, lisäksi Kit RTK ja verihiutaleesta peräisin oleva kasvutekijäreseptori, inhiboivat Bcr-Abl:ää. Imatinibilla on terapeuttisia vaikutuksia CML:ään ja ruoansulatusreitin kasvaimiin, kuten Brian Druker, Charles Sawyers ja muut osoittivat. Rakenteellinen analyysi osoittaa, että Imatinib sitoutuu spesifisesti Abl-kinaasidomeenin autoinhiboituun konformaatioon ja siten vie onkogeenisen kinaasin inaktiiviseen rakenteeseen. Toiset inhibiittorit voivat sitoutua Abl-kinaasiin sen aktiivisessa tilassa. Näiden eri inhibiittoriluokkien yhdistetty käyttö saataisi olla erityisen hyödyllistä syöpähoidoissa, esimerkiksi rajoittamassa lääkeresistenttien varianttien vaikutusta.
Useimmat yksittäiset kinaasi-inhibiittorit osoittavat merkittävää ristireaktota. Vaikka tätä piirrettä alun perin pidettiin epätoivottavana, se on potentiaalisesti hyödyllinen kun asiaa katsoo käytännölliseltä kannalta. Esimerkiksi Imatinib on aktiivinen useita kinaaseja vastaan ja siten vähintään kahta erilaista syöpää vastaan. Lisäksi Kevin Skokatin ja kollegoiden työ osoittaa että samanaikaisesti inhiboimalla kahta eri sykliinistä riippuvaista kinaasia Saccharomyces cerevisiaessa saa esiin solun vasteita jotka eivät indusoituisi estämällä pelkästään jompikumpi kinaasi. Löydökset sopivat näkemykseen, että solun käytöstä kontrolloi signaaliverkosto jolla on yhtenäiset ominaisuudet ja inhiboimalla useita solmukohtia tällaisessa verkostossa voi olla kliinisesti hyödyllisiä synergistisiä vaikutuksia.
Fosforylaatiotutkimuksen tulevaisuudessa ja jo nyt bioinformatiikka yhdistettynä biokemialliseen tutkimukseen on suuressa osassa koska signalointiverkosto on laaja ja yksittäisen kinaasin mahdollisia sitoutumiskumppaneita ja substraatteja voi olla lukemattomia. 50 vuoden aktiivisen fosforylaatiotutkimuksen jälkeen aletaan vähitellen ymmärtää proteiinien fosforylaatiota ja sen merkitystä solubiologialle.