Kokoerottelukromatografia

Sovellukset

Geelisuodatuksen pääsovellus on proteiinien ja muiden vesiliukoisten polymeerien fraktiointi, kun taas geelipermeaatiokromatografiaa käytetään orgaanisiin liuottimiin liukenevien polymeerien molekyylipainojakauman analysointiin. Kumpaakaan tekniikkaa ei tulisi sekoittaa geelielektroforeesiin, jossa sähkökenttää käytetään liikuttamaan molekyylejä geelin läpi riippuen niiden sähkövarauksesta.
Kokoerottelukromatografia on laajasti käytetty tekniikka synteettisten ja biologisten polymeerien, kuten proteiinien, polysakkaridien ja nukleiinihappojen, puhdistukseen ja analyysiin. Biologit ja biokemistit käyttävät stationaarifaasina tyypillisesti polyakryyliamidia, dekstraania tai agaroosia ja suodattavat näytteet alhaisella paineella. Polymeerikemistit käyttävät stationaarifaasina tyypillisesti silikaa tai ristisidottua polystyreeniä ja ajavat näytteet korkealla paineella.

Edut

Kokoerottelukromatografian etuihin kuuluu hyvä kookkaiden molekyylien erottelukyky pienistä molekyyleistä minimaalisella ajoliuoksen tilavuudella ja erilaisten ajoliuosten soveltuvuus, koska ne eivät häiritse suodatusprosessia, jolloin eroteltavien partikkelien biologinen aktiivisuus voidaan säilyttää niille sopivalla ajoliuoksella. Kokoerottelu yleensä yhdistetään muihin erottelutekniikoihin, jotka erottelevat molekyylejä muiden ominaisuuksien, kuten happamuus, emäksisyys, varaus ja affiniteetti tiettyihin yhdisteisiin, perusteella. Kokoerottelulla saadaan lyhyet ja hyvin määritellyt erotteluajat ja kapeat eluutiopiikit, mitkä johtavat hyvään herkkyyteen. Hyvä resoluutio edellyttää kuitenkin ainakin 10 % molekyylipainoeroa näytteen molekyylien välillä. Näytettä ei menetetä kokoerottelussa, koska ne eivät interaktoi stationaarifaasin kanssa.

Teoria ja menetelmä

Yksi kokoerottelukromatografian vaatimuksista on se, että analyytti ei interaktoi stationaarifaasin pinnan kanssa. Eluutioajan erot perustuvat ainoastaan analyytin "näkemään" tilavuuteen. Täten pieni molekyyli, joka kykenee penetroitumaan starionaarifaasin kaikkiin huokosiin, "näkee" täyden huokostilavuuden ja stationaarifaasin partikkelien välisen tilavuuden ja eluoituu myöhään – kun huokosten ja partikkelien välinen tilavuus ajoliuosta on kulkeutunut kromatografiapylvään läpi. Toisessa ääripäässä hyvin suuret molekyylit, jotka eivät pääse penetroitumaan huokosiin, "näkevät" vain partikkelien välisen tilavuuden ja eluoituvat varhain – kun partikkelien välinen tilavuus ajoliuosta on kulkeutunut pylvään läpi. Kokoerottelun periaate on siis se, että erikokoiset partikkelit eluoituvat (suodattuvat) eri nopeuksin. Kun näytepartikkelit syötetään samanaikaisesti, samankokoiset partikkelit eluoituvat yhtäaikaisesti, mutta pienemmät partikkelit eluoituvat hitaammin kuin isommat.
Makromolekyylin koolle on olemassa eilaisia mittoja (esimerkiksi hitaussäde ja hydrodynaaminen säde), mikä aiheuttaa olennaisen ongelman: millä molekyylikokoparametrillä molekyylit eroteltaisiin. Benoit tutkimuskumppaneineen löysi kokeellisesti erinomaisen korrelaation eluutioajan ja molekyylien hydrodynaamisen tilavuuden välillä useille ketjurakenteille ja kemiallisille koostumuksille. Havaittu hydrodynaamiseen volyymiin perustuva korrelaatio hyväksyttiin perustaksi yleiseen kokoerottelukromatografiakalibrointiin.
Kullakin kokoerottelustationaarifaasilla on tietty molekyylipainoerottelualue. Jos molekyylipainoerottelualue on esimerkiksi 1-100 kDa, kyseinen menetelmä kykenee erottelemaan molekyylit, joiden massa on 1 kDa:sta 100 kDa:iin. Yläraja eli ekskluusioraja määrittää molekyylipainoerottelualueen rajan, jonka ylittävät molekyylit ovat niin kookkaita etteivät ne penetroidu stationaarifaasin huokosiin. Alaraja eli permeaatioraja määrittää puolestaan rajan, jonka alittavat molekyylit ovat niin pieniä, että ne kulkeutuvat kaikkiin huokosiin. Permeaatiorajan alittavat molekyylit kulkeutuvat yhtäaikaisesti pylvään läpi. Eli kokoerottelukromatografia ei siis erottele käytetyn stationaarifaasin kokoerotteluekskluusiorajan ylittäviä ja permeaatiorajan alittavia molekyylejä.
Kokoerottelukromatografia suoritetaan tavallisesti pylvääksi kutsutussa laitteessa, jossa onttoon putkeen on pakattuna äärimmäisen pieniä huokoisia polymeeripaloja, joissa on erikokoisia huokosia. Huokoset voivat olla pinnallisia painumia paloissa tai palan läpäiseviä kanavia. Kun liuos kulkee pylvään läpi, jotkut hiukkaset penetroituvat huokosiin. Kookkaammat hiukkaset eivät voi kulkeutua yhtä moniin huokosiin kuin pienemmät. Joten mitä kookkaampi hiukkanen on, sitä nopeammin se eluoituu pylväästä.

Analyysi

Yksinkertaisissa manuaalisissa kokoerotteluissa pylväästä tuleva ajoliuos eli eluentti kerätään vakiotilavuuden omaaviin fraktioihin. Mitä samanlaisempia partikkelit ovat, sitä todennäköisemmin ne ovat samassa fraktiossa eikä niitä tunnisteta erillisesti. Edistyneemmät laitteet mittaavat eluenttia jatkuvasti.
Kerätyt fraktiot tutkitaan usein spekroskooppisin menetelmin eluoitujen partikelien pitoisuuden määrittämiseksi. Yleisiä käytettyjä spektroskooppisia tekniikoita ovat taitekerroin ja ultravioletti. Spektroskooppisesti samankaltaisten hiukkasten tunnistukseen ja identifiointiin tarvitaan muita tekniikoita.
Eluutiotilavuus eli –volyymi vähentyy lähes lineaarisesti molekulaarisen hydrodynaamisen tilavuuden logaritmin noustessa. Pylväät kalibroidaan usein 4-5 standardinäytteellä (esim. tunnetun molekyylipainon omaavilla natiiveilla proteiineilla) ja hyvin suuren molekyylipainon molekyylillä, kuten tyreoglobuliini, määrittämään pylvään Void-tilavuus eli stationaarifaasin partikkelien välinen tilavuus. Myös siniseksi leimattua dekstraania käytetään kokoerottelukromatografiassa Void-tilavuuden määrittämiseen. Standardinäytteiden eluutiotilavuudet jaetaan Void-tilavuudella ja tulokset asetetaan kuvaajaan, jossa y-akselilla on standardien molekyylipainojen logaritmit.