Ohutkerroskromatografia

Ohutkerroskromatografia eli ohutlevykromatografia (usein käytetään myös lyhennettä TLC, engl. Thin layer chromatography) on kromatografiamenetelmä, joka perustuu siihen, että tutkittava näyte kiinnitetään kiinteään faasiin (kromatografialevyyn) ja annetaan liikkuvan faasin (liuottimen) nousta sitä pitkin kapillaarivoimien avulla. Tutkittava seos liikkuu kromatografialevyn huokoisessa materiaalissa liuottimen eli eluentin tai ajoliuoksen avulla. Eri yhdisteet liikkuvat eri nopeuksilla johtuen niiden erilaisista vuorovaikutuksista liuottimen ja kromatografialevyn kanssa, jolloin ne erottuvat toisistaan. Ohutkerroskromatografian hyviä ominaisuuksia ovat erityisesti helppo toteutettavuus, huokea hinta, nopeus ja hyvä erotuskyky. Tämän vuoksi se on yksi käytetyimmistä kromatografisista menetelmistä seosten komponenttien määrittämiseen ja reaktioiden seurantaan.

Historia

Ohutkerroskromatografian historian voidaan katsoa alkaneeksi 1800-luvun loppupuolella. Alankomaalainen biologi M. W. Beijerinck tutki vuonna 1889 suolahappo- ja rikkihappoliuosten kulkeutumista ohuella gelatiinikerroksella ja huomasi niiden liikkuvan eri nopeuksilla. Suolahapon tunnistamiseksi hän lisäsi gelatiiniin hopeanitraattia ja rikkihapon tunnistamiseksi bariumkloridia. Toinen alankomaalainen biologi H. P. Wijsman kehitti Beijerinckin menetelmää ja käytti tutkimuksissaan analyyttien havaitsemiseen fluoresoivaa bakteerikantaa gelatiinikerroksessa. Tällä tavoin hän osoitti vuonna 1898, että maltaan diastaasi oli kaksi eri entsyymiä. Varsinaisesti ohutkerroskromatografian ensimmäisinä kehittäjinä pidetään kuitenkin Izmailovia ja Shraiberia, jotka vuonna 1938 esittivät idean käyttää komponenttien erottamiseen kiinteälle pinnalle sidottua adsorbenttia.
Yhdysvaltalaiset J. E. Meinhard ja N. F. Hall kehittivät vuonna 1949 tekniikan, jossa he käyttivät seliittiä (piimaata) sitomaan alumiinioksidia kiinteällä levylle. Tätä tekniikkaa he käyttivät erottamaan toisistaan muun muassa metallikationeja ja eteerisiä öljyjä. 1950- ja 1960-lukujen aikana Justus G. Kirchner kehitti ohutkerroskromatografian tekniikoita ja esitteli muun muassa kaksiulotteisen ohutkerroskromatografian ja menetelmiä ohutkerroskromatografian käyttämiseen reaktioiden seurantaan. Menetelmän yleistymisen kannalta merkittävää työtä teki Stahl 1950-luvun lopulla, kun hän kehitti helpon levyjen pinnoitusmenetelmän ja osoitti, että TLC:n avulla avulla voitiin helposti suorittaa useita erilaisia erotuksia. Kaupalliset pinnoitetut kromatografialevyt ilmestyivät vuonna 1961.
Uusimmat menetelmän kehityskohteista liittyvät kiraalisten molekyylien enantiomeerien erottamiseen toisistaan. Tämä perustuu erityiseen syklodekstriinipinnoitteeseen. Menetelmää on tutkittu muun muassa lääkeaineiden biologisesti aktiivisten enantiomeerien erottamiseen tehottomista isomeereista, käänteisfaasitekniikoihin ja stationäärifaasiseoksia sisältäviin ohutkerroskromatografialevyihin.

Stationäärifaasimateriaalit

Yleisin stationäärifaasi ohutkerroskromatografiassa on silikageeli, joka valmistetaan levyn pinnalle hydrolysoimalla polypiihappoja emäksisellä tai happamalla liuoksella. Kerroksen paksuus on tyypillisesti 0,25 millimetriä ja hiukkaskoko 5–25 mikrometriä. Korkean suorituskyvyn ohutkerroskromatografiassa eli HPTLC:ssä hiukkaskoko on pienempi kuin tavallisessa ohutlevykromatografiassa. Silikageeli on hivenen hapanta. Silikageelin joukkoon voidaan lisätä apuaineita, kuten sinkkisilikaattia, joka fluoresoi, kun sitä valaistaan UV-valolla, jonka aallonpituus on 254 nanometriä. Näytetäplät näkyvät tummina fluoresoivalla levyllä.
Alumiinioksidi on hieman emäksistä, joten emäksiset yhdisteet kulkeutuvat ja erottuvat siinä paremmin kuin silikageelilevyillä. Alumiinioksidi adsorboi orgaanisia yhdisteitä melko voimakkaasti. Se adsorboi myös vettä, joten levyt usein aktivoidaan ennen käyttöä 125–150 °C:n lämpötilassa, jolloin vesi poistuu ja adsorptiopaikat vapautuvat.
Piimaa eli seliitti on fossiloituneiden piilevien jauhettua kuorta. Se on hyvin hienojakoista, mutta adsorptiokyky on melko heikko. Tyypillisesti sitä käytetään yhdessä muiden adsorbenttimateriaalien kanssa stationäärifaasina.
Mikrokiteistä tai jauhettua selluloosaa voidaan käyttää myös stationäärifaasina. Parhaiten selluloosaa stationäärifaasinaan sisältävät ohutkerroskromatografialevyt soveltuvat hydrofiilisten yhdisteiden, kuten sokereiden ja aminohappojen, erottamiseen. Selluloosa voi olla myös muunneltua, kuten karboksimetyyli-, dietyyliaminoetyyli- tai polyetyleeni-imiiniselluloosaa.
Polyamidien, kuten polykaprolaktaamin ja Nylon 6.6:n, käyttö stationäärifaasina on yleistynyt. Niillä muuten heikosti erottuvat fenolit erottuvat hyvin. Näitä levyjä käytettäessä myös vesi sopii ajoliuokseksi.
Ohutkerroskromatografia voidaan suorittaa myös käänteisfaasikromatografiana, jolloin stationäärifaasi on pooliton (rasvaliukoinen) ja eluentti poolinen (vesiliukoinen). Nämä levyt sisältävät stationäärifaasinaan silikaa, joka on tehty sisältämään poolittomia silyylieetteriryhmiä käsittelemällä sitä diklooridimetyylisilaanilla.
Hyvin valikoivia ohutkerroskromatografialevyjä ovat ioninvaihtokerroksen tai syklodekstriiniä sisältävät levyt. Ioninvaihtostationäärifaasi sopii hyvin sekä orgaaniseen että epäorgaaniseen faasiin. Syklodekstriini on rengasmainen molekyyli, jonka onkaloon toinen enantiomeereista pidättyy paremmin kuin toinen ja näin ne erottuvat. Menetelmää käytetään erityisesti lääkeaineiden optisen puhtauden varmistamiseen.

Eluenttisysteemit

Eluentin eli liuottimen valinta on ohutlevykerroskromatografiassa tärkeää, koska se vaikuttaa suuresti komponenttien erottumiseen ja käytössä on suuri määrä erilaisia liuottimia ja niiden seoksia. Polaaristen (vesiliukoisten) yhdisteiden erottamiseen käytetään vahvasti polaarisia ajoliuoksia, kun poolittomille (rasvaliukoisille) yhdisteille myös pooliton liuotin on yleensä paras vaihtoehto. Yleisliuottimena ohutkerroskromatografiassa käytetään dikloorimetaania tai etyyliasetaattia. Muita usein käytettyjä ajoliuoksia ovat metanoli, heksaani ja petrolieetteri sekä näiden seokset eri suhteissa, joissa on pooliton ja polaarisempi komponentti.
Eluentin vahvuutta kuvaava parametri E⁰ kuvaa ajoliuoksen adsorptioenergiaa adsorbenttiyksikköä kohden. Mitä suurempi arvo on, sitä suurempia ovat myös komponenttien Rf-arvot. E⁰-arvot ovat suurempia poolisilla kuin poolittomilla eluenteilla. Voimakkailla eluenteilla Rf-arvot ovat suurempia kuin heikommilla liuottimilla, mutta myös erottuminen voi olla huonompaa. Resoluutio voi parantua, jos käytetään proottisia ajoliuoksia, jotka voivat muodostaa vetysidoksia. Jos näyte liikkuu levyllä huonosti, käytetään polaarisempaa ajoliuosta ja jos Rf-arvo on liian suuri, lisätään ajoliuokseen poolitonta liuotinta tai vaihdetaan koko ajoliuos poolittomampaan.

Suorittaminen

Ohutkerroskromatografia suoritetaan eli ajetaan sille tarkoitetussa, tyypillisesti lasisessa, astiassa. Näyte lisätään ohuella kapillaariputkella noin viisi senttimetriä korkealle levylle hieman alareunan yläpuolelle ja levy asetetaan astiaan, jonka pohjalla on eluenttikerros. Astiassa voidaan käyttää suodatinpaperia eluentin höyrynpaineen tasaamiseksi. Eluentin annetaan nousta levyä pitkin ylös, minkä jälkeen levy visualisoidaan.
Levy voi olla myös pyöreä, jolloin kromatografia suoritetaan sitä varten kehitetyssä laitteistossa. Näyte lisätään levylle ja eluentti kulkee joko keskeltä reunoille tai reunoilta keskelle, jolloin komponentit erottuvat rengasmaisina vyöhykkeinä.

Kaksiulotteinen ohutkerroskromatografia

Kaksiulotteisessa ohutkerroskromatografiassa ensimmäinen ajo suoritetaan normaalisti ja komponentit erottuvat pystysuorassa suunnassa. Tämän jälkeen eluentin annetaan haihtua levyltä ja suoritetaan toinen ajo asettaen tällä kertaa levy poikittain ajoastiaan. Näin saadaan tietoa esimerkiksi näytekomponenttien mahdollisesta hajoamisesta kromatografian suorituksen aikana. Toinen ajo voidaan suorittaa myös eri eluentissa tai levylle voidaan lisätä vertailuyhdisteitä ennen toista ajoa.

Käänteisfaasimenetelmä

Ohutkerroskromatografiaa voidaan suorittaa myös käänteisfaasikromatografiana. Siinä stationäärifaasi on pooliton ja eluentti poolinen. Käänteisfaasikromatografian etuna ovat normaaliin ohutkerroskromatografiaan verrattuna parempi valikoivuus, parempi polaarittomien yhdisteiden erottuminen, helpompi näytteen puhdistus ja levyn aktivoinnin tarpeettomuus.

Epäorgaaninen analyysi

Ohutkerroskromatografiaa käytetään epäorgaanisessa analytiikassa erottamaan erityisesti metallikationeja seoksesta. Ensimmäisenä tähän tarkoitukseen menetelmää käyttivät Meinhard ja Hall, jotka erottivat näin rauta- ja sinkkikationeja seoksesta. Menetelmää käytetään muun muassa kivi-, maaperä-, teollisuus- ja jätevesinäytteiden tutkimiseen. Myös metallien läsnäoloa biologisissa näytteissä ja lääkeaineissa voidaan tutkia.

Orgaaninen analyysi

Orgaanisessa analyysissä ohutlevykromatografiaa käytetään useisiin eri tarkoituksiin. Tärkeimmät ovat seoksessa olevien komponenttein määrän selvittäminen, analyytin puhtauden määrittäminen ja reaktioiden seuranta. Ohutkerroskromatografialla voidaan esimerkiksi määrittää, onko näyte riittävän puhdasta herkempää kaasukromatografia- tai HPLC-analyysiä varten.

Reaktioiden seuranta käyttäen ohutkerroskromatografiaa

Ohutkerroskromatografiaa käytetään usein erityisesti orgaanisten reaktioiden etenemisen seuraamiseen. TLC-levylle asetetaan ohuella kapillaarilla kolme täplää: yksi täplä on reaktiota rajoittavalle lähtöaineelle, toinen lähtöaineen ja reaktioseoksen niin kutsuttu ”co-spot” ja kolmas reaktioseoksesta otettava näyte. Jos ohutkerroskromatografian ajon jälkeen levyllä ei erotu reaktioseoksesta otetussa näytteessä lähtöaineen täplää, on reaktio päättynyt.

Muita reaktionseurantatekniikoita

Ohutkerroskromatografia on nopea ja helppo tekniikka orgaanisten reaktioiden seurantaan, mutta muita menetelmiä käytetään yha enemmissä määrin. Kaikki yhdisteet eivät erotu kovin hyvin ohutkerroskromatografialla ja tällöin käytetään yleensä HPLC-laitteistoa tai helposti haihtuvilla yhdisteillä kaasukromatografiaa. HPLC on hitaampi menetelmä kuin ohutkerroskromatografia, mutta kaasukromatografia on lähes yhtä nopea. Näiden etuna on myös se, että niitä voidaan käyttää myös kvantitatiivisen analyysiin eli määrittämään tuotteiden konsentraatioita näytteissä. Hyvin pienen mittakaavan reaktioissa edistymisen seurantaan voidaan käyttää myös NMR-spektrometriä.

Ohutkerroskromatografia verrattuna muihin kromatografiatekniikoihin

Ohutkerroskromatografian etuja ovat helppo tekniikka, jossa ei vaadita erikoislaitteistoja, helppo näytteenkäsittely, menetelmän nopeus, halvat käyttökustannukset, pieni näytemäärän tarve ja vähäinen liuottimien kulutus. Paperikromatografiaan verrattuna menetelmä on nopeampi ja erotuskyvyltään parempi. Kaasukromatografia ja HPLC ovat ohutkerroskromatografiaa parempia erotuskyvyltään ja vähemmän alttiita olosuhteiden vaikutuksille ja niissä on helpommin mahdollisuus kvantitatiiviseen analyysiin. Ne vaativat kuitenkin huomattavasti kalliimpia laitteistoja.