Ydinmagneettinen resonanssispektroskopia

Ydinmagneettinen resonanssispektroskopia eli NMR-spektroskopia (eng. Nuclear Magnetic Resonance) tai pelkkä NMR on lähinnä kemiassa käytetty ydinmagneettiseen resonanssiin perustuva yleinen tutkimusmenetelmä, jolla voidaan tutkia molekyylien ominaisuuksia ja tunnistaa tuntemattomia molekyylejä. Molekyylejä sisältävän näytteen mittaus suoritetaan NMR-spektrometrillä, jossa näyte altistetaan vahvalle ja jatkuvalle magneettikentälle, joka nykyisin saadaan aikaan suprajohtein. 
Molekyylejä voidaan tutkia NMR:ssä vain jos niissä olevilla mittauksen kohteena olevilla atomiytimillä on spin. Kaikkien alkuaineiden isotooppeilla ei ole spiniä. Vedyn isotoopilla 1 (¹H) ja hiilen isotoopilla 13 (¹³C) on spin – nämä ovat NMR:ssä useimmin mitattuja ytimiä.
NMR:ssä mitattavat molekyylit usein nestemäisiä tai liuotettu nesteeksi. Tekniikalla voidaan myös mitata kiinteitä aineita. Tosin kiinteiden mittaustekniikat ovat usein vaativampia ja saadut mittaustulokset vaikeatulkintaisempia kuin nesteiden NMR-tutkimuksessa. Kiinteiden NMR-tutkimus on siten nesteiden NMR-tutkimusta harvinaisempaa. Poikkeustapauksissa myös kaasuja voidaan tutkia.
Nykyisten NMR-spektrometrien toimintaperiaate on seuraavanlainen. Molekyyleissä olevat tiettyjen isotooppien atomiytimet alkavat resonoida tai pikemminkin pyöriä (prekessoida) magneettikentässä niille ominaisilla Larmorin taajuuksilla, joka riippuu ydinten spineistä ja kemiallisesta ympäristöstä eli muiden läheisten ydinten ja niiden elektronien ominaisuuksista. Spektrometrin jatkuva magneettikenttä saa ydinten magneettikenttien suuntaa kuvaavat magneettiset momentit asettumaan keskimäärin paikalleen jatkuvan kentän myötäisesti. Mittauksessa nettomagneettimomentit ajetaan pyörintäliikkeeseen, joka ilmenee niiden Larmorin taajuuksilla. Muutos aiheutetaan lyhytkestoisin magneettikentin, joiden muuttuvilla taajuusalueilla on ydinten Larmorin taajuudet. Muuntuvien kenttien lakatessa, kestävät ydinten nettomagneettimomenttien pyörinnät hetken palaten lopulta jatkuvan kentän myötäisiksi. Pyörinnän aikana nettomagneettimomentit mitataan. Saadaan päällekkäisiä taajuuksia sisältävä signaali. Mittaus toistetaan kunnes signaali on kyllin vahva, josta ydinten taajuudet erotetaan Fourierin muunnoksella. Saadaan kuvaaja (NMR-spektri) ydinten ympäristöä kuvastavista Larmorin taajuuksista (ilmaistaan spektrissä ppm-arvoina) ja suhteellisiksi intensiteeteiksi muunnetuista amplitudeista, jotka tilanteesta riippuen kuvastavat ydinten lukumääriä. Spektristä voidaan ehkä päätellä jotakin molekyylin rakenteesta.
Magneettikuvauksen periaatteet ovat samankaltaiset kuin NMR-spektroskopiassa.

Spin ja magneettinen momentti

Useilla alkeishiukkasilla on spin, muun muassa elektroneilla, u- ja d-kvarkeilla. Spin on eräänlainen pyörimismäärä, joka kuvaa siis hiukkasen "pyörintää" akselinsa ympäri – hiukkaset eivät oikeasti pyöri, mutta ne käyttäytyvät lähes siten kuin ne pyörisivät.
Atomiydinten protonit ja neutronit koostuvat gluonien yhdistämistä u- ja d-kvarkeista. Protonin kvarkkiyhdistelmä on uud ja neutronin udd. U- ja d-kvarkkien spinit ovat ½, mutta kvarkkien spinit ovat arvoiltaan vastakkaiset eli ne sulkevat toisensa osin pois. Protoniin ja neutroniin jää siten ½ kokonaisspin.
Ytimen u- ja d-kvarkkien spinit voivat tosin olla samanarvoisetkin jos ytimellä on hyvin suuri energia. Siten vaikka protonin spin voi olla 3/2, jolloin se on Δ⁺-hiukkanen. Näitä on vain suurienergiaisissa olosuhteissa joten ne jätetään NMR:ssä huomiotta.
Spinin omaavilla hiukkasilla ja joskus näistä koostuvilla atomiytimillä on myös ominainen magneettikenttä, jonka suuntaa kuvaa vektori, magneettinen momentti μ (J T⁻¹). µ ja spin pyörimismäärävektori S (J s, vertaa ħ) vektorien välistä suhdetta kuvaa kerroin, gyromagneettinen suhde γ (tässä yhteydessä s⁻¹ T⁻¹)
Jos γ>0, µ- ja S-vektorit ovat hiukkaselle/ytimelle täysin samasuuntaiset. Jos γ<0, µ ja S ovat erisuuntaiset.

Varjostus

Elektronien sanotaan varjostavan (eng. shield) ympäröimiään atomiytimiä sillä elektronien liike orbitaaleillaan B₀-kentässä saa ne muodostamaan omia magneettikenttiään. Kenttien ollessa ytimen kohdalla B₀ vastaisia, heikentävät ne ytimen kokemaa kenttää B₀ paikallisesti. Siten ytimet prekessoivat hitaammin eli niiden Larmorin taajuus pienenee. Elektronikenttien ollessa B₀ vastaisia ytimen kohdalla, puhutaan diamagneettisesta varjostuksesta, jota ilmenee erityisesti pallosymmetrisiä orbitaaleja (s-orbitaali) sisältävillä ytimillä kuten H.
Elektronikenttien ollessa B₀ myötäisiä ytimen kohdalla, puhutaan paramagneettisesta varjostuksesta, jota ilmenee erityisesti epäsymmetrisiä orbitaaleja sisältävillä raskailla ytimillä kuten C, F ja P. Paramagneettinen varjostus suurentaa ytimen prekessiotaajuutta. Ytimen varjostus on dia- ja paramagneettisen varjostuksen summa.
Varjostukseen vaikuttaa myös ydinten läheinen kemiallinen ympäristö. Tämä siirtää erilaisten kemiallisten ryhmien prekessiotaajuuksia niille ominaisille taajuusalueille. Siksi ¹H-ytimet prekessoivat vaikkapa CH₂- ja CH₃-ryhmissä eri taajuuksilla. Ilmiötä kutsutaan kemialliseksi siirtymäksi.

Signaalin saanti

NMR-spektrometrissä on johdinkelat, joihin johdetaan tietyn taajuinen vaihtovirta. Yksinkertaisissa mittauksissa virta aiheuttaa näytteeseen vaihtovirran taajuudella muuntuvan magneettikentän B₁ (katso Maxwellin yhtälöt-artikkeli), joka tuotetaan usein 90° kulmaan suhteessa kenttään B₀. Vain ne ytimet, jotka prekessoivat samalla Larmorin taajuudella kuin kelojen aiheuttama kenttä muuntuu, kääntyvät nopeasti µ-vektoreiltaan samaan tasoon kuin B₁ eli noin 90° kulmaan niiden alkuperäisestä B₀ myötäisestä suunnasta. Yksittäisten ydinten µ ei välttämättä ole täysin samassa tasossa kuin B₁, mutta niiden nettomagneettimomentti on.
Nettomagneettimomentti alkaa siis pyöriä ympyrää samassa tasossa kuin B₁ vaikuttaa sen sijaan, että se olisi liikkumatta B₀ myötäisesti. Kelojen virransyöttö lopetetaan ja B₁ lakkaa vaikuttamasta. Nettomagneettimomentti eli ydinten aiheuttama muuttuva magneettikenttä jää silti vaikuttamaan hetkeksi ja tuottaa siksi samoihin keloihin vaihtovirran. Muodostuneen vaihtovirran taajuus on verrannollinen ydinten Larmorin taajuuteen, joka on kemiallisille ympäristöille ominainen, ja amplitudi on usein verrannollinen ydinten lukumäärään. Tutkittava aine voidaan siten ehkä tunnistaa mittaamalla sen kaikkien tai osan NMR:ssä näkyvien ydinten intensiteetit ja taajuudet.
Käytännössä B₁ taajuutta muutetaan mikrosekuntien aikana laajan taajuusalueen läpi, sähkönsyöttö lopetetaan ja sitten kaikkien alueelle Larmorin taajuuksiltaan osuvien ydinten signaalit mitataan kerralla. Tämä nopeuttaa mittausta merkittävästi suhteessa tilanteeseen, jossa eri Larmorin taajuuksien ytimet mitattaisiin taajuus kerrallaan.
Laajaa taajuusaluetta käytettäessä usealla eri Larmorin taajuudella prekessoivat ytimet reagoivat kenttään lähes yhtäaikaisesti, jolloin niiden nettomagneettimomentit siirtyvät pyörimään samaan tasoon kuin B₁. Pyörintä kuitenkin ilmenee kunkin ytimen eriävillä Larmorin taajuuksilla. Siten mittauksessa saadussa raakasignaalissa (eng. free induction decay, FID) taajuuksiltaan erilaisten ydinten signaalit ovat päällekkäin toisiaan paikoitellen vahvistaen ja heikentäen. Ne voidaan kuitenkin tietokoneen avulla erottaa matemaattisesti Fourierin muunnoksella.

NMR-spektri

Raakasignaali, jossa ydinten nettomagneettimomenttien aiheuttamat jännitemuutokset (amplitudit) ovat ajan funktiona, muutetaan Fourierin muunnoksella NMR-spektriksi kutsuttuun kuvaajaan. Yksiulotteisessa spektrissä ydinten signaalien eli "piikkien" intensiteetit ovat niiden Larmorin taajuuden funktiona, mutta yksiulotteisen spektrin x-akselin yksikkönä käytetään ppm-arvoja taajuuden sijaan.
On tosin olemassa mm. kaksi-, kolmi- ja neliulotteisia NMR-spektrejä tuottavia menetelmiä, joita kutsutaan vastaavasti 2D, 3D ja 4D NMR-spektroskopiaksi. Näissä ppm-akseleita on useita.

Relaksaatio

Vietäessä näytteen ytimet B₀-kenttään, kestää hetki ennen kuin ne kehittävät B₀ myötäisen nettomagnettimomentin maksimin. Nettomagneettimomentin M kehittyminen on logaritmista (käänteisen eksponentiaalista). Taas otettaessa näyte pois B₀-kentästä, M katoaa näytteestä ajan kuluessa eksponentiaalisesti. Tämä johtuu mm. ydinten omien magneettikenttien vuorovaikutuksista toistensa µ-vektorien suuntautumiseen, jotka lopulta sekoittavat ydinten suuntautumisen aiemmin vaikuttaneen B₀ myötäisesti. Ytimet siis rentoutuvat eli relaksoituvat.
B₀ myötäisen M muodostumiseen ja katoamiseen kuluu tietty aika, joka saadaan laskettua yhtälöllä, johon sijoitetaan T₁-aikakerroin. M muodostumista/katoamista kutsutaan pitkittäisrelaksaatioksi ja joskus spin-hila-relaksaatioksi (eng. longitudinal/spin-lattice relaxation). Jälkimmäinen termi on harhaanjohtava erityisesti puhuttaessa kaasujen tai nesteiden T₁-relaksaatiosta, joilla ei ole kidehilarakennetta. Termi tulee historiallisesta selityksestä relaksaatiolle, jonka teoretisoitiin pohjautuvan ydinspinien ja hilan vuorovaikutukseen.
B₁ kanssa samassa tasossa pyörivän M palatessa B₀ myötäiseksi B₁ lakatessa vaikuttamasta, kuvaa tähän kuluvaa aikaa yhtälö, johon sijoitetaan T₂-aikakerroin. M muodostumista kutsutaan pitkittäisrelaksaatioksi ja joskus spin-spin-relaksaatioksi (eng. transverse/spin-spin relaxation). Jälkimmäinen termi on harhaanjohtava, sillä se vihjaa ydinspinien vuorovaikutusten johtavan T₂-relaksaatioon. Relaksaatio aiheutuu siitä, että ytimet kokevat magneettikentän hieman eri tavoin riippumatta siitä, että vuorovaikuttavatko ytimet keskenään, vai eivät.
Kaikille ytimille pätee T₁≥T₂. Mitä suurempi T₁ tai T₂ ytimelle on, sitä pidempi aika relaksaatioon kuluu. Tutkittaessa pieniä molekyylejä sisältäviä nestenäytteitä, T₁ ja T₂ ovat likimain samat. Suurien molekyylien nestenäytteiden kohdalla T₂ on usein paljon pienempi kuin T₁. T₁-kerroin on usein muutamia millisekunteja, mutta harvinaissa tapauksissa se voi olla päiviä tai kuukausia.

Korrelaatiotaulukot

Kunkin NMR-aktiivisen ytimen δ ovat usein vain tietyillä ppm-arvojen alueilla. Siten siirtymien ppm-arvoja voidaan listata taulukoihin, joita kutsutaan usein kemiallisen siirtymän korrelaatiotaulukoiksi (eng. correlation tables). Kukin taulukko pätee vain tietylle standardille (katso Ppm-sarake) ja osin myös liuottimelle. Taulukoiden avulla voidaan siten tulkita jonkin molekyylin NMR-spektrissä havaittavat piikit jos molekyylin spektri on mitattu samoissa oloissa kuin taulukonkin arvot on esitetty. Tällaista taulukkoa käyttäen tuntemattoman molekyylin rakenne voidaan ehkä päätellä.
¹H-spektreissä δ ovat tavanomaisilla kemiallisilla ryhmillä usein alueella 10–0 ppm. Esimerkiksi TMS standardia käytettäessä RC(O)H eli aldehydin vahvennetun vedyn signaali näkyy ¹H-spektrissä usein alueella 9.5–1.5 ppm. Jos tällä alueella näkyy signaali tuntemattoman molekyylin ¹H-spektrissä, voidaan aineen ehkä päätellä olevan aldehydi.
¹³C-spektreissä δ siirtymät ovat usein 200–0 ppm. Esimerkiksi RC(O)H näkyy usein alueella 200–190 ppm.
On myös kehitetty kokeellisesti määritettyjä kaavoja, kuten osin yleispätevä Shooleryn sääntö X–CH₂–Y molekyyleille. X ja Y ovat ryhmiä, joilla on vastaavasti taulukoihin listatut vakiot ΔX ja ΔY kaavassa

Kytkeytymismekanismi

J-kytkeytymistä selittävistä mekanismeista yksi on Fermin kontaktimekanismi (eng. Fermi contact mechanism). Tämä on suurin selittävä tekijä kytkeytymisvakioiden positiivisille tai negatiivisille etumerkeille, joissa ¹H-ytimet ovat osana. Mekanismin yksinkertaistus on alla.
¹JHC-kytkeytymisvakiot ¹H ja ¹³C välillä ovat aina positiivisia. Nämä ytimet voivat olla vastakkaisissa Zeeman-tiloissa ±½. Sidoksessa H–C on 2 sidoselektronia, joista kullakin voi olla tila ±½. Oletetaan että ¹H on magneettikentän B₀ myötäisesti, eli +½ tilassa. ¹H-ytimen spin "kääntää" eli polaroi molekyyliorbitaalissa läheisemmän sidoselektronin spinin vastakkaisesti tilaan -½ Paulin kieltosäännön mukaisesti. Siten spinit voivat olla samalla avaruusalueella. Ydin ja elektroni ovat "kontaktissa". Kieltosäännön mukaisesti toisen sidoselektronin σ-sidosorbitaalissa tulee polaroitua tilaan +½. Tilan +½ elektroni polaroi ¹³C spinin tilaan -½. Siten ¹H ja ¹³C spinit ovat kytkeytyneet vastakkaisesti (kuva, rakenne 1). Kytkeytyneiden ydinten spinien ollessa vastakkaiset, ovat kytkeytymisvakiot positiivisia. Jos H–C sidoksessa ¹H ja ¹³C spinit olisivat samasuuntaiset, olisi yhdistelmä suurienergiainen ja siten epäsuotuisa (kuva, rakenne 2). Kontaktimekanismista erillisenä on myös toinen vaikutus: ydinten magneettiset momentit ovat vastakkaiset, sillä molempien ydinten γ>0 (katso Spin ja magneettinen momentti-sarake). Ydinten magneettikentät ovat siis toistensa myötäiset ja myös tämä on energiallisesti suotuisa vuorovaikutus.
²JHH-kytkeytymisvakiot ovat usein negatiivisia sidoksessa HA–C–HB, jossa on ytimet ¹H ja ¹³C tai ¹²C. +½ HA polaroi läheisen sidoselektronin tilaan -½, elektroni polaroi C läheisen elektronin tilaan +½. C-ytimen sidoksiin luovuttamat 2 elektronia ovat samanenergiaisillä sidosorbitaaleillaan Hundin säännön mukaisesti samasuuntaiset. Siten C–HB välinen C:n läheinen elektroni on myös tilassa +½. Tämä elektroni polaroi HB läheisen elektronin tilaan -½. HB polaroituu tilaan +½. Ydinten spinit ovat samasuuntaiset ja kytkeytymisvakiot ovat yleensä negatiiviset. Tilanne ei muutu vaikka H–C–H sidoksessa olisi ¹³C. Sen spin olisi polaroitunut tilaan -½. ²JHH metaanissa on -12.4 Hz, mutta (H₃C)₂C=CH₂ kaksoissidoksen päässä se on +2.5 Hz. Kontaktimekanismi ei siis ole ainoa J-vakioihin vaikuttava tekijä, vaikka se on osin yleispätevä selitys ¹H välisten kytkeytymisten kohdalla.
³JHH-kytkeytymisvakiot ovat usein positiivisia HA–CA–CB–HB sidoksissa. Edellä kuvattujen periaatteiden mukaisesti +½ HA polaroi HA-CA sidoselektronit tiloihin -½ ja +½ vastaavasti. CA–CB sidoselektronit ovat tiloissa +½ ja -½ vastaavasti. CB–HB sidoselektronit ovat tiloissa -½ ja +½ vastaavasti. HB polaroituu teoriassa tilaan -½, ja HA ja HB spinit ovat vastakkaiset (kuva, rakenne 3).
γ<0 ydinten kohdalla edeltävät yleistykset voivat muuttua päinvastaisiksi. ¹JCH-vakioiden suuruuteen vaikuttavat suoraan myös ¹³C-ydinten s- ja p-orbitaaliluonne. Vakiot muuttuvat positiivisemmiksi mitä enemmän kytkeytyneillä ytimillä s-luonnetta. S-orbitaalit välittävät kontaktimekanismin kautta ydinspin tiedon helpommin eteenpäin kuin p-orbitaalit. Yksöissidoksissa kuten etaanissa hiilten hybridiorbitaalien s-luonne on pieni (25%) ja positiivinen ¹JCH on pienempi (125 Hz), kuin etyynissä, jossa s-luonne on 50% ja ¹JCH on suuri (249 Hz). γ ja s lisäksi ³JHH-vakioihin vaikuttavat konformaatioiden kiertokulmat. Tätä vaikutusta kuvaa Karplus-yhtälö.

Multiplettien muodostuminen

Multiplettien muodostuminen johtuu erilaisten Zeeman-tilojen J-kytkeytymisestä. Esimerkiksi etanolin CH₃-ryhmän ¹H-ytimiin kytkeytyvät visinaalisesti CH₂-ryhmän ¹H-ytimet. Kunkin ¹H-ytimen Zeeman-tila voi olla +½ eli α tai -½ eli β. Etanolin CH₃-ryhmän kohdalla kytkeytymisyhdistelmiä on 4: ββ, αβ, βα ja αα. Yhdistelmistä suurienergiaisin on ββ. Siten sen varjostus on suurin eli sen taajuus ja ppm on pienin. αα on pienienergiaisin. Sen varjostus on pienin eli sen taajuus ja ppm on suurin. αβ ja βα ovat samanenergiaiset. Siten niiden ppm-arvot ovat yhtä suuret. Yhdistelmät ovat likimain yhtä todennäköisiä ja signaaleja antavia ytimiä on näytteessä suuria määriä. Siksi CH₃ ¹H-ytimet muodostavat 1:2:1 intensiteettisuhteisen tripletin ¹H NMR-spektriin (kuva).
¹H-spektreissä ei usein nähdä J-kytkeytymistä hapen kautta, eli etanolissa OH-ryhmän ¹H jää kytkeytymättä ja näkyy singlettinä. Normaalisti piikki on kuitenkin leventynyt jos etanoli ei ole hyvin puhdasta. Myös CH₂ ¹H-ytimet jäävät kytkeytymättä OH ¹H kanssa, mutta kytkeytyvät CH₃ ¹H-ydinten kanssa muodostaen kvartetin. Kvartetin muodostuminen voidaan perustella kuten tripletti, eli Zeeman-tilayhdistelmien kautta. Kussakin yhdistelmässä on tällöin kytkeytyneenä 3 Zeeman-tilaa: (βββ), (αββ) jne.
Etanolin multipleteissä olevien piikkien väliset ppm-erot ovat likimain samat koska ne muodostavien ydinten ³J-kytkeytymisvakiot ovat suunnilleen samat. Jos multipletin muodostavien ydinten J-kytkeytymisvakiot eivät olekaan likimain yhtä suuret, voi muodostua monimutkaisempia multiplettejä (kuva alla). Jos J-vakioiden välillä on vain pieni ero, signaali näyttää yksinkertaiselta. Kuitenkin ns. korkean resoluution NMR-spektrometrien erikoisvahvoissa magneettikentissä nämä pienetkin erot voivat näkyä, jolloin spektri on monimutkainen.
Multipletin rakenne voidaan esittää kytkeytymisvakiopuuna (kuva alla).

1H NMR-spektrit

¹H NMR-spektreissä eli protonispektreissä orgaanisten yhdisteiden ¹H-ydinten visinaalista J-kytkeytymistä (H–C–C–H) havaitaan lähes aina.
Taas ¹H J-kytkeytymistä sitä sitovaan hiileen (H–C) ei tavallisesti nähdä spektreissä sillä hiilen isotoopeista luonnossa noin 99% on ¹²C-isotooppeja. ¹²C I=0, eli se ei näy NMR:ssä. Hiilen toisen vakaan isotoopin eli ¹³C:n I=½. Se siis näkyy NMR:ssä. ¹H ja ¹³C välillä tapahtuu kytkeytymistä, mutta ¹³C yleisyys on noin 1%, eli se on harvinainen. Kytkeytyminen on siten niin heikkoa, ettei sitä yleensä nähdä.
¹H-ydinten välistä geminaalista kytkeytymistä (H–C–H) ei usein nähdä spektreissä koska niissä olevat hiilten väliset yksöissidokset yleensä kiertävät huoneenlämmössä nopeasti ympäri (katso konformaatio-artikkeli). Tällöin geminaaliset vedyt ovat kemiallisilta ympäristöiltään keskimäärin samanlaiset. Kiertymisen vähentyessä esimerkiksi näytettä viilentämällä tai kiertymisen muuten estyessä geminaalista kytkeytymistä saatetaan havaita spektrissä. Kiertyminen estyy esimerkiksi steerisistä syistä, kuten substituoidussa eteenissä (esim. kloorieteeni), jossa on kaksoissidoksen vuoksi E/Z-asemissa olevilla ¹H-ytimillä eri siirtymät.
Kaikki kemialliset ryhmät eivät aina tuota selkeitä piikkejä, vaan piikit ovat leventyneitä ja niiden intensiteetti on heikko. Leventymistä nähdään niiden ¹H-ydinten kohdalla, jotka ovat sitoutuneet muun muassa happiin ja typpiin. Esimerkkejä: alkoholit, karboksyylihapot, fenolit, amiinit, amidit ja imidit. Näissä olevat ¹H-ytimet voivat vaihtua molekyylin näistä kemiallisista ryhmistä toiseen ja vaihtua myös deuteroidun liuottimen deuteriumin kanssa, jollaisia käytetään yleisesti NMR:ssä. Tätä tapahtuu lähinnä poolisten liuottimien kuten D₂O kohdalla. Näytteeseen epäpuhtauksina jääneet hapot tai emäkset katalysoivat ¹H siirtymistä. Visinaalista kytkeytymistä ei myöskään yleensä havaita mm. typpien ja happien kautta, sillä nopea ¹H siirtyminen estää Zeeman-tilojen tiedon välittymisen ytimeltä toiselle (katso Kytkeytymismekanismi-sarake).
Puhdistamalla näyte ¹H siirtymistä edesauttavista epäpuhtauksista ja/tai laskemalla lämpötilaa, voidaan piikkien leventymistä vähentää ja kytkeytymistä mm. happien kautta saatetaan havaita. Lisäksi näytteen viilentäminen hidastaa tai voi estää konformeerien muuttumisen toisiksi. Esimerkiksi viilentämällä sykloheksaania noin -89 °C:n lämpötilaan, estyy sen rengaskäännös, jolloin aksiaaliset ja ekvatoriaaliset ¹H näkyvät spektrissä kahtena piikkinä yhden keskimääräisen piikin sijaan.

13C NMR-spektrit

Orgaanisten yhdisteiden ¹³C NMR-spektreissä näkyy J-kytkeytymistä toisiinsa suoraan sitoutuneiden ¹H- ja ¹³C-ydinten välillä.
¹³C välistä suoraa, geminaalista tai muuta kytkeytymistä ei havaita ¹³C isotoopin harvinaisuuden takia. On siis tilastollisesti epätodennäköistä että signaalin antavan ¹³C-ytimen vieressä (tai muualla läheisyydessä) olisi toinen ¹³C, jonka kanssa ydin kytkeytyisi ja täten signaali jakautuisi multipletiksi. Ytimen vieressä on todennäköisemmin ¹²C, jonka I=0, eli ydin ei näy NMR:ssä eikä ¹³C voi myöskään kytkeytyä sen kanssa. ¹³C NMR-spektreissä ¹³C välistä kytkeytymistä tapahtuu, mutta se on niin vähäistä että signaaleita ei nähdä spektreissä. Kytkeytyminen tosin muuttuu havaittavaksi jos näytemolekyylit tarkoituksellisesti tehty pääosin ¹³C-ytimistä eli rikastettu niillä.

Irrottaminen

Irrottaminen (eng. decoupling) tarkoittaa tiettyjen J-kytkeytymisten poistamista. ¹³C NMR-spektristä voidaan poistaa ¹H kytkeytymiset, jolloin ¹³C-signaalit näkyvät orgaanisten yhdisteiden spektreissä singletteinä muiden multiplettien sijaan. ¹³C-spektriä, josta on irrotettu ¹H-ytimet, kutsutaan ¹³C{¹H} NMR-spektriksi. Nimeämiskäytäntö pätee muihinkin spektreihin: ¹³C{¹H, ¹⁹F}, ³¹P{¹H} jne.
Irrottamisen pyrkimyksenä on usein yksinkertaistaa muuten monimutkaisia spektrejä. Tämä helpottaa spektrien tulkintaa.
Signaalin saantiin käytetyn magneettikentän B₁ lisäksi yksinkertaisimmissa kaksoisresonanssi-irrottamismenetelmissä näytteeseen kohdistetaan toinen magneettikenttä (B₂) jonka avulla irrottaminen tapahtuu.

Integraalit

Yleensä NMR-spektrissä kunkin multipletin pinta-alat lasketaan integroimalla tietokoneella ja ilmoitetaan spektrissä jollain tapaa. Usein pinta-alat ovat likimain verrannollisia multipletin antamien ydinten suhteelliseen lukumäärään ja spektrin voidaan sanoa olevan kvantitatiivinen. Määrät ovat suhteellisia ja siksi esimerkiksi dietyylieetterin ¹H-spektrissä CH₃-signaalin pinta-ala on noin 1.5 ja CH₂:n ~1. Etanolin ¹H-spektrissä CH₃:n pinta-ala on noin 3, CH₂:n ~2 ja OH:n ~1.
Pinta-alat eivät silti aina kerro ydinten lukumääristä muun muassa ytimen Overhauser-ilmiön takia (eng. nuclear Overhauser effect, NOE). NOE voi voimistaa tai heikentää piikkien intensiteettejä suhteessa niiden odotettuun intensiteettiin. Ilmiötä havaitaan ¹³C-spektreissä, muttei juurikaan ¹H spektreissä. Tämä johtuu eri ¹³C-ydinten hyvin eriävistä relaksaatioajoista suhteessa ¹H-ytimiin. Siten integrointia ei juuri käytetä ¹³C-spektrien käsittelyssä.

Magneetti

NMR-spektrometrit koostuvat useista kuorista. Laitteen keskellä on sen pystysuunnassa läpäisevä ontto putki.
Putkea ympäröivässä sisimmässä kuoressa on noin -269 °C heliumnestettä, johon on upotettu sisäputken ympärille solenoidiksi kierretty suprajohde. Johteessa kiertävä tasavirta tekee siitä sähkömagneetin, joka aiheuttaa laitteen sisä- ja ulkopuolelle voimakkaan magneettikentän B₀. Solenoidi menettää suprajohtavuuden jos helium ei jäähdytä sitä. Toimintavalmiissa NMR-laitteen käämissä kiertää siis sähkövirta lähes loputtomiin ilman ulkoista sähkönsyöttöä. Useimmissa laitteissa heliumia on 40–100 litraa.
B₀ vahvuus on usein 4–20 T, mutta voi olla jopa 32 T. Mitä vahvempi kenttä on, sitä nopeammin ydinsignaalit saadaan erottumaan kohinasta (katso Mittaus-sarake), sillä mitattujen signaalien intensiteetti on likimain verrannollinen B₀ neliöön.
Heliumkuori on eristetty sitä ulommasta kuoresta ja laitteen sisimmästä putkesta tyhjiöllä, jotta heliumiin ei pääse johtumalla lämpöä (vertaa termospulloon). Eristeittä helium kiehuisi pian pois. Tyhjiötä ympäröivässä kuoressa on noin -196 °C typpinestettä. Tämäkin kuori on eristetty ulkopuolelta tyhjiöin.
Helium ja typpi haihtuvat hitaasti ja laitteen yllä on siksi varoventtiilit. Nämä päästävät ylimääräisen kaasun pois. Joskus laitteiden oheen on rakennettu niistä erillinen järjestelmä, jolla uusiutumaton helium kerätään ja kierrätetään taas nesteeksi. Yllä on myös täyttöaukot kylmänesteille. Haihtumisen takia säiliöihin lisätään kylmänesteitä säännöllisesti. Heliumia lisätään laitteesta riippuen esim. 1–2 viikon välein ja typpeä 5–6 kuukauden välein.

Ilmaisin

Sisimpään putkeen on asetettu laitteen pohjasta tutkittavalle ytimelle ja sen tutkimusmenetelmälle sopiva ilmaisin (eng. probe). Ilmaisin on usein vaihdettavissa ja siinä on ainakin yhdet vastakkaiset ja toisiinsa johtimin kytketyt käämiparit, joiden väliin näyte asetetaan spektrometrin yläosasta.
Nestenäytteitä sisältäviä lasiputkia yleensä pyöritetään mittauksen aikana pystysuuntaisesti ilmaisimessa noin 10–100 Hz taajuudella. Magneettikenttä ei ole näytteen kohdalla täysin tasalaatuinen, joten pyöritys vähentää spektrin näytesignaalien levenemää eli ne erottuvat paremmin toisistaan.

Näyte

¹H-spektriä nesteestä mitattaessa jopa alle 1 µg näytettä voi uusissa laitteissa riittää nestenäytteen valmistukseen. ¹³C-spektrin kohdalla näytettä vaaditaan usein muutama milligramma. Erityisen hyvillä laitteilla vaaditut määrät voivat kuitenkin vastaavasti olla vain muutamia nano- ja mikrogrammoja. Näyte on liuotettuna sopivaan deuteroituun liuottimeen kuten CDCl₃, CD₃OD tai DMSO-d₆. Näiden ²H-signaalit eivät häiritse ¹H-mittausta.
Kiinteiden aineiden mittauksessa käytetään usein MAS NMR-spektroskopiaa (eng. magic angle spinning), jossa näyte asetetaan mittauksen ajaksi maagiseen kulmaan 54.74° (≈ arc cos √2) pyörimään jopa 70 kHz taajuudella. Kiinteissä ydinten ja elektronien vuorovaikutukset ovat vahvempia ja monimuotoisempia kuin nesteissä ja MAS:n käyttö vähentää niiden havaittua vaikutusta. Vuorovaikutukset mm. leventävät spektripiikkejä.
Näyte mitataan usein huoneenlämmössä, mutta lämpötilaa voidaan myös muuttaa sopivin laittein.

Standardit

Muun muassa nestenäytteissä standardiainetta saatetaan lisätä mitattavan näytteen joukkoon pieni määrä eli se on sisäinen standardi. Standardeja on monia ja yksi ¹H-ydinten mittauksissa usein käytetty standardi on tetrametyylisilaani (TMS). TMS:ää käytetään sisäisenä standardina myös 13C-mittauksissa. TMS ei ole vesiliukoinen, joten jos näyte on liuenneena usein käytetyn deuteroidun kloroformin sijaan vaikka deuteroituun veteen (D₂O), käytetään standardina usein vesiliukoista DSS:ää eli 4,4-dimetyyli-4-silapentaani-1-sulfonihappoa. ³¹P-mittauksissa standardi on usein fosforihappo (H₃PO₄), joka voi kuitenkin reagoida näytteen kanssa. Siksi nestenäytteiden ³¹P-mittauksessa se lisätään esimerkiksi NMR-näyteputkiin sisälle pieneen kapillaariputkeen erilleen muusta näytteestä, eli se on ulkoinen standardi. CCl₃F käytetään usein ¹⁹F-mittauksissa; (CH₃)₄NI (tetrametyyliammoniumjodidi), NH₃ tai CH₃NO₂ käytetään usein ¹⁵N-mittauksissa.

Lukitseminen

NMR-spektrometrin magneettikentän B₀ voimakkuus muuttuu aikaa myöten. Tätä ilmenee mittauksen aikana, jolloin spektrin signaalit levenevät. Signaalien erottumisen parantamiseksi B₀ lukitaan (eng. locking). Nestenäytteiden kohdalla lukitseminen suoritetaan usein siten, että näytteen deuteroidun liuottimen ²H-signaalia mitataan jatkuvasti ja verrataan laitteessa olevassa oskillaattorissa tuotettuun vakiotaajuuteen. Näiden taajuudet muutetaan ennen mittausta puoliautomaattisesti samoiksi eli lukitaan. Kun B₀ muuttuu mittausten aikana, muuttaa laitteisto automaattisesti takaisinkytkennän avulla näytteeseen kohdistuvaa kokonaiskenttää toisen magneettikentän tuottavin keloin siten, että kokonaiskenttä B₀ pysyy samana. Lukkosysteemi on tietyssä mielessä jatkuva NMR-mittaus, joka suoritetaan samanaikaisesti varsinaisen mittauksen ohella.
Lukkosignaalin ydin ei voi olla sama kuin mitattava ydin. Deuteriumsignaalia käytetään ¹H sijaan koska ¹H-signaaleita muutetaan mittauksen aikana. Kiinteiden näytteiden mittauksessa lukkosignaalin antava signaali on usein ulkoinen eli se ei ole kiinteän näytteen joukossa.

Shimmaus

Magneettikenttä B₀ ei ole kaikissa näytteen kohdissa täysin tasalaatuinen eli kemiallisilta ympäristöiltään samanlaiset ytimet kokevat sen eri vahvuisina. Siten niiden Larmorin taajuudet ja ppm-arvot ovat eri. Pienetkin eriävyydet kentässä leventävät spektripiikkejä ja aiheuttavat sivupiikkejä (eng. spinning sidebands).
Kentän eriävyydet johtuvat monista seikoista kuten NMR-spektrometrin valmistuksessa siihen jääneistä epätasalaatuisuuksista ja mitattavasta näytteestä. Täysin tasalaatuista kenttää ei ole mahdollista tuottaa teknisistä syistä, mutta sitä voidaan pyrkiä tasalaatuistamaan.
Ilmaisinta ympäröivät useat erilliset shimmauskelat. Kelojen ympärille luodaan magneettikenttiä johtamalla niihin tasavirtoja, joiden jännitesäätöä sanotaan shimmaukseksi (eng. shimming). Shimmauksessa heikennetään tai vahvistetaan B₀-kenttää paikoitellen tarpeen mukaan, jotta se saadaan kyllin tasalaatuiseksi näytteen kohdalta. Shimmauskelat ovat usein magneetissa ja ne ovat resistiivisiä. Suprajohtavia shimmauskeloja voi olla myös sisäänrakennettu nesteheliumsäiliöön.
Shimmaus tehdään puoliautomaattisesti toistuvasti kokeilemalla, kunnes on saatu kyllin tasalaatuinen kenttä. Shimmaus tehdään joka näytteen kohdalla erikseen ennen varsinaista mittausta, sillä näytteiden ja näyteputkien eriävät magneettiset ominaisuudet muuttavat B₀-kenttää näytteen kohdalta.
Shimmaus tulee englanninkielen sanasta shim. Sanalla tarkoitettiin diamagneettisia metallipaloja, joita siirtelemällä tasalaatuistettiin varhaisten NMR-spektrometrien magneettikenttiä, joissa ei ollut sähkösäätöisiä keloja.

Virittäminen ja sovittaminen

Ilmaisimen käämeihin tulee duplekserin kautta lyhytkestoinen ja taajuudeltaan ja muuttuva vaihtovirtapulssi. Tämä aiheuttaa NMR-signaalin muodostumiseen johtavan muuttuvan B₁ magneettikentän. Käämiparin välissä on niiden virittämiseen (eng. tuning) käytetty kondensaattori, jolla on kapasitanssi CT (faradi). Käämeillä on induktanssi L (henry). Käämit on rakennettu siten, että ne toimivat LC-värähtelypiirinä kulmataajuudella ωLC (rad s⁻¹)
CT säädetään puoliautomaattisesti siten, että värähtelypiiri vastaa likimain duplekserilta tulevan sähkösignaalin kulmataajuutta ωdup eli ωLC ≈ ωdup. Tätä kutsutaan virittämiseksi ja se tehdään aina mitattavaa näytettä vaihdettaessa. Värähtelypiiri vahvistaa duplekserilta tulevan taajuuden amplitudia ja voimistaa siten käämien tuottamaa ytimiin kohdistuvaa B₁-kenttää. Virransyötön loppuessa B₁ lakkaa ja käämeihin ytimiltä tuleva niiden Larmorin kulmataajuuksista koostuva signaali vastavuoroisesti voimistuu piirissä, jonka taajuus vastaa likimain myös ydinsignaalien taajuuksia. Täten näytteestä tuleva heikko signaali vahvistuu.
Värähtelypiiriin vievässä johtimessa duplekserin jälkeen on myös sovittamiseen (eng. matching) käytetty kondensaattori, jonka kapasitanssi on CM. Kapasitanssia säädetään, jotta käämeiltä näytteeseen tuleva ja näytteestä sitten käämeille tulevan sähkösignaalin energia saadaan maksimoitua.

Mittaus

Mitattavalle ytimelle ja spektrometrin ilmaisimelle valitaan sopiva pulssiohjelma. Tämä on NMR-laitteistoon kytketyn tietokoneen ohjelmiston tulkitsema koodinpätkä, jonka arvoja eli parametrejä määritetään halutusti. Valmisteluiden (mm. lukitseminen, shimmaus, virittäminen ja sovittaminen) jälkeen ydinten resonanssi mitataan pulssiohjelman ja sen parametrien määrittämällä tavalla. Vaihtovirtapulssi(t) kulkee (kulkevat) kaapelistoa pitkin vahvistimien kautta duplekserille. Ytimet antavat analogisen signaalin, joka kulkee duplekserista toiseen kaapelistoon ja siinä oleviin vahvistimiin. Näistä signaali kulkee lopulta A/D-muuntimille. Näissä digitoitu signaali tallennetaan tietokoneelle. Mittaus toistetaan useasti, jotta heikoista ja ei-satunnaisista ydinsignaaleista saadaan vähennettyä satunnaista kohinaa. Kohina on lähtöisin lähinnä ilmaisimen käämien elektronien lämpöliikkeestä ja osin näytteen varautuneiden hiukkasten kuten ionien lämpöliikkeestä. Lopuksi digitoitu raakasignaali muutetaan NMR-spektriksi Fourierin muunnoksella. Muitakin matemaattisia muutoksia usein tehdään.
Toistuvien mittausten takia koko mittaus voi kestää jopa päiviä riippuen mm. mitatusta ytimestä, molekyylistä, näytepitoisuudesta ja käytetyistä mittausmenetelmistä. ¹H mittaus vie harvoin yli tunnin. ¹³C mittauksia tulee ¹³C-ydinten harvinaisuuden takia toistaa useammin kuin ¹H-ydinten kohdalla, jolloin mittaus voi kestää useita tunteja. Mittausten välissä tulee odottaa, jotta ytimet ehtivät T₂-relaksoitua (katso Relaksaatio-sarake). ¹H kohdalla mittaus voidaan usein toistaa 4 sekunnin välein.

Vaarat ja huomiot

Toimintavalmiin NMR-spektrometrin ympärillä on aina magneettikenttä. Siksi kyllin lähellä laitetta sydämentahdistimet tai muut elektroniset implantit voivat häiriintyä. Ferromagneettiset implantit voivat vetäytyä kohti laitetta vahingoittaen tai tappaen henkilön, jolla niitä on. Ferromagneettiset esineet voivat lentää kohti laitetta tai vetää niitä pukevan henkilön kohti laitetta. Muuttuva magneettikenttä voi myös kuumentaa näitä esineitä aiheuttamalla niihin pyörrevirtoja. USB-tikuissa, maksukorttien magneettiraidoissa ja muissa tallennuslaitteissa olevat tiedot voivat tuhoutua lähellä kenttää. Magneettikenttä ei silti itsessään ole vaarallinen ihmisille.
Suprajohteen varaus voi purkautua, jolloin sen magneettinen energia muuntuu lämmöksi. Tämä kuumentaa johteen saaden siten nesteheliumin ja -typen kiehumaan nopeasti kaasuksi. Ilmiön nimi on englanniksi quench. Kaasu purkautuu laitteesta ulos ja täyttää NMR-mittaushuoneen syrjäyttäen ilman happea. Huoneesta on poistuttava heti sillä kaasu voi tukehduttaa huoneessa olijat. Huoneessa on siten myös hyvä olla kunnon ilmanvaihto. Suprajohteen purkautuminen voi olla vahinko tai tarkoituksellinen teko. Jälkimmäisessä pyrkimyksenä voi olla esimerkiksi ferromagneettisen kappaleen ja magneetin väliin jääneen henkilön vapauttaminen.
Nestetyppi ja -helium voivat aiheuttaa vakavia paleltumia – erityisesti spektrometrin jälleentäytössä.