Kryoelektronimikroskopia

Kryoelektronimikroskopia, elektroni kryomikroskopia tai kryo-EM (engl. cryo-EM) on läpivalaisuelektronimikroskopian (TEM) muoto, jossa näytteen rakennetta tutkitaan läpäisemällä se 200–300 kV elektronisuihkun avulla hyvin kylmissä (kryogeenisissä) olosuhteissa, jotka on tavallisesti saavutettu nestemäisen typen avulla. Elektronisuihku on ikään kuin "valo" ja näytteen tätä "valoa" puoliläpäisevät molekyylit muodostavat suihkulla valaistaessa "varjon" mittalaitteelle, josta näytteen molekyylirakenne voidaan päätellä esimerkiksi sen luonnollisessa eli natiivissa muodossa. Kryo-EM:n käyttö rakennebiologiassa on saavuttanut suosiota 2010-luvulla.
Kryo-EM sopii muun muassa virusten, ribosomien, mitokondrioiden, ionikanavien ja jopa pienten 170 kDa entsyymikompleksien rakennetutkimukseen noin 4.5 Å erotustarkkuudella eli resoluutiolla. Kryo-EM laitteistojen resoluutio on kuitenkin parantunut vuosien myötä ja 2015 mennessä kryo-EM:n avulla on saavutettu jopa 2.2 Å resoluution kuva erään bakteerin entsyymistä (PDB-koodi: 5A1A).
Kryo-EM:n eräs versio on kryoelektronitomografia (engl. CET, ECT, cryo-ET), jossa tutkitun näytteen eri kulmiin jäätyneistä 2D-kuvista tehdään 3D-ennallistus/kollaasi, eli tomogrammi. Lisäksi näytelevyä käännellään tietokoneohjatusti kuvauksen aikana useamman kuvakulman saamiseksi. Pelkässä kryo-EM:ssä tehdään saman kuvakulman molekyyleistä pelkkä 2D-kuva ilman näytelevyn kääntelyä.

Ohuen kalvon menetelmä

Ohuen kalvon menetelmässä nestemäinen näyte levitetään elektronimikroskoopin näytelevyverkkoon alle 500 nm paksuiseksi kalvoksi, sillä yli 1000 nm kalvoa elektronisuihku ei kykene läpäisemään merkittävästi. Tyypillisesti kalvo jäädytetään nopeasti kastamalla näyte nestemäisellä typellä jäähdytettyyn nestemäiseen etanoliin. Tällä menetelmällä jäähtyminen on kyllin nopeaa estämään tutkittavan aineen rakenteen rikkovien suurten vesikiteiden muodostuminen. Epätasaisen kiteytymisen sijaan tapahtuu tasainen vitrifikaatio. Toisin kuin valomikroskopian valo, elektronit siroavat voimakkaasti ilman kaasuseoksesta: jäädyttämällä näyte voidaan se sijoittaa elektronimikroskoopin vaatimaan vakuumiin, eli lähellä tyhjiötä olevaan tilaan, jossa elektronisuihku voi edetä vapaasti. Jäädytettyä näytettä on myös mahdollista säilyttää useita päiviä ilman merkittävää sublimoitumista.
Vaikka kylmä lämpötila suojaa näytettä hajoamiselta, liian voimakas tai pitkäaikainen elektronisuihkutus voi silti vaurioittaa helposti herkimpiä näytteitä, joten niitä täytyy usein säteilyttää elektronisuihkulla mahdollisimman vähän. Pienten säteilyannosten käyttö kuitenkin vähentää menetelmällä saatujen kuvien tarkkuutta, joten jos on mahdollista, niin tietyssä kulmassa olevista näytemolekyyleistä tehdään tietokoneohjelman avulla automaattisesti päällekkäinen kuvakollaasi. Tämä parantaa kuvatarkkuutta. Tomografisessa menetelmässä näytelevyä tämän lisäksi käännellään 3D-kuvan saamiseksi.

Muut näytteet

Kryo-EM:ää voidaan käyttää myös kuvaamaan näytteitä, jotka ovat liian helposti haihtuvia huoneenlämmössä tapahtuvalle tavalliselle elektronimikroskooppiselle kuvantamiselle. Kryo-EM:ää voidaan käyttää esimerkiksi neste-kiinteä rajapintojen tutkimiseen tai vaikka rikin rakennetutkimukseen, sillä rikki sublimoituu helposti elektronimikroskoopin vakuumissa huoneenlämmössä.