رونویسی (ژنتیک)

پیشینه

یک واحد رونویسی DNA که برای پروتئین رمزگذاری می‌شود، می‌تواند شامل هر دو توالی کدگذاری (که به پروتئین ترجمه می‌شود) و توالی‌های تنظیم کننده (که سنتز پروتئین را هدایت و تنظیم می‌کنند) باشد. توالی تنظیمی قبل از توالی کدگذاری، پنج ناحیه اصلی غیر ترجمه (5'UTR) نامیده می‌شود؛ توالی پس از توالی کدگذاری، سه ناحیه نخست غیر ترجمه (3'UTR) نامیده می‌شود.
در مقایسه با تکثیر DNA، رونویسی در یک مکمل RNA که شامل اوراسیل نوکلئوتیدی (U) در تمام مواردی است که تیمین (T) در یک مکمل DNA رخ داده‌است، نتیجه می‌شود.
تنها یکی از دو رشته DNA، به عنوان یک الگو برای رونویسی عمل می‌کند. رشته Antisense DNA توسط RNA پلیمراز از انتهای ۳ 'تا انتهای ۵' در طی رونویسی خوانده می‌شود. RNA مکمل در جهت مخالف، در جهت ۵ به ۳، ایجاد می‌شود، مطابق با دنباله ای از زنجیره معنی به استثناء تعویض Uracil به thymine. این جهت برای این است که RNA پلیمراز تنها می‌تواند نوکلئوتیدها را به انتهای ۳ از زنجیره mRNA در حال رشد اضافه کند. این استفادهٔ تنها از رشته ۳ به 5 DNA نیاز به قطعات Okazaki که در تکرار DNA دیده می‌شود را از بین می‌برد. همچنین نیاز به یک آغازگر RNA برای آغاز سنتز RNA، همان‌طور که در مورد تکثیر DNA نیز هست، حذف می‌شود.
رشته غیرمتمرکز (حسی) DNA رشته کدگذاری نامیده می‌شود، زیرا دنباله آن همان رونوشت جدید RNA ایجاد شده‌است (به جز جایگزین uracil برای thymine). این رشته‌است که طبق توافق در هنگام ارائه توالی DNA استفاده می‌شود.
رونویسی برخی از مکانیسم‌های اصلاح را دارد، اما آنها از نظر تعداد کمتر و از نظر مؤثر بودن نیز کمتر از کنترل برای کپی کردن DNA هستند. در نتیجه، رونویسی دارای یک درستیِ کپی کمتری نسبت به کپی DNA است.

مراحل اصلی

رونویسی در چهار مرحله آغاز، پروموتر اسکیپ، طویل شدن و خاتمه انجام می‌شود.

آغاز

رونویسی با اتصال RNA پلیمراز همراه با یک یا چند فاکتور رونویسی عمومی آغاز می‌شود تا یک توالی خاص DNA که به عنوان پروموتر شناخته می‌شود به منظور ایجاد پروموتر بسته RNA پلیمراز تشکیل شود.
در کمپلکس پروموتور بسته، DNA همچنان دورشته ای است. در این هنگام RNA پلیمراز به کمک یک یا چند فاکتور رونویسی کلی تقریباً ۱۴ جفت باز DNA را باز می‌کند تا یک کمپلکس باز RNA پلیمراز- پروموتر ایجاد کند. در کمپلکس باز، DNA پروموتر تا حدی بدون پیچ خوردگی و تک رشته‌ای است.DNA تک رشته‌ای در معرض حباب رونویسی قرار می‌گیرد.در این هنگام RNA پلیمراز با کمک یک یا چند فاکتور رونویسی عمومی یک محل شروع رونویسی را در حباب رونویسی انتخاب می‌کند و به NTP آغاز شده و NTP گسترش یافته (یا یک پرایمر کوتاه RNA و یک NTP گسترش یافته) متصل می‌شود که مکمل مسیر توالی محل رونویسی است، و تشکیل یک رابط را برای تولید یک محصول اولیه RNA تسهیل می‌کند. در باکتری RNA پلیمراز holoenzyme متشکل از پنج زیر واحد است:۲ زیرواحد α، ۱ زیر واحد β و۱زیر واحد ω. در باکتری‌ها، یک فاکتور رونویسی عمومی RNA شناخته شده به عنوان عامل سیگما وجود دارد. آنزیم هسته ای RNA پلیمراز به عامل رونویسی باکتریایی (سیگما) برای ایجاد RNA پلیمراز هولوآنزیم متصل می‌شود و سپس به پروموتر متصل می‌شود. (RNA پلیمراز holoenzyme این‌طور تعریف می‌شود، زمانی که واحد سیگما به آنزیم RNA پلیمراز هسته ای متصل می‌شود که شامل ۲ واحد α، ۱ β واحد و ۱ واحد β ' است).در آرکی‌ها و یوکاریوت‌ها RNAA پلیمراز حاوی زیرمجموعه‌های همولوگ با هر یک از پنج زیر واحد RNA پلیمراز در باکتری است و همچنین حاوی زیرمجموعه‌های اضافی نیز می‌باشد. در آرکی‌ها و یوکاریوت‌ها عملکردهای فاکتور رونویسی باکتریایی سیگما توسط عوامل متعدد رونویسی عمومی انجام می‌شود که با هم کار می‌کنند. در آرکی، سه عامل رونویسی عمومی وجود دارد: TBP, TFB و TFE. در یوکاریوت‌ها در رونویسی وابسته به RNA پلیمراز II، شش فاکتور عمومی رونویسی وجود دارد: TFIIA, TFIIB (یک ارتولوگ از TFB آزکی‌ها)، TFIID(یک فاکتور چند زیر واحدی که واحد کلیدی آن TBP است که ارتولوگ TBP ارکی‌ها است)، TFIIE (ارتولوگ TFE ارکی‌ها)، TFIIF , TFIIH
در آرکی‌ها و یوکاریوت‌ها کمپلکس بستهٔ RNA پلیمراز-پروموتر معمولاً به عنوان کمپلکس preinitiation اشاره می‌شود.
آغاز رونویسی توسط پروتئین‌های اضافی شناخته شده به عنوان activators (فعال کننده‌ها) و repressors (ممانعت کننده‌ها) تنظیم می‌شود و در بعضی موارد، coactivators یا corepressors، که تنظیم کنندهٔ شکل‌گیری و عملکرد مجموعه پیچیده رونویسی است، مرتبط می‌باشند.

پروموتر اسکیپ

بعد از اینکه اولین باند سنتز شده، RNA پلیمراز باید از پروموترجدا شود. در طول این زمان تمایل به انتشار رونوشت RNA و تولید رونوشت‌های کوتاه شده وجود دارد. این حالت را abortive initiation یا آغاز ناهنجاری می‌نامند که هم در ارکی‌ها و هم در پروکاریوت‌ها رایج است. آغاز ناهنجاری همچنان ادامه دارد تا زمانی که یک محصول RNA از یک آستانه حدود تقریباً ۱۰ نوکلئوتید سنتز شود، در آن نقطه فرار پروموتر اتفاق می‌افتد و یک کمپلکس رونویسی بلند تشکیل می‌شود. به‌طور مکانیکی، فرار پروموتورها از طریق شکستن DNA انجام شده و انرژی لازم برای شکستن تعاملات بین RNA پلیمراز هولوآنزیم و پروموتر را فراهم می‌کند.
در باکتری‌ها، از لحاظ تاریخی تصور می‌شد که بعد از ترمیم پروموتور، عامل سیگما عیناً آزاد می‌شود. این تئوری به عنوان مذل ملزم کننده انتشار شناخته شده بود با این حال داده‌های بعدی نشان دادند بر اساس و پس از برداشتن پروموتر، عامل سیگما با توجه به یک مدل تصادفی که به عنوان مدل انتشار تصادفی شناخته می‌شود، منتشر می‌شود.
در یوکاریوت‌ها در روی RNA پلیمراز II وابسته به پروموتور بر برداشتن پرومتور TFIIH phosphorylates serine 5 در C ترمینال دومین RNA پلیمراز منجر به استخدام کپینگ انزیم(CE) می‌شود. هنوز مکانیسم دقیقی که چگونه CE باعث تحریک برداشت پروموتور می‌شود شناخته نشده‌است.

طویل شدن

یک رشتهٔ DNA رشتهٔ الگو (یا رشتهٔ کد نشده) به عنوان یک الگو برای سنتز RNA استفاده می‌شود. همان‌طور که رونویسی ادامه می‌یابد RNA پلیمراز از رشته الگو عبور می‌کند و از مکمل جفت بازها با الگو DNA برای ایجاد یک کپی RNA (که در طول گذر طویل می‌شوند) استفاده می‌کند. اگر چه RNA پلیمراز از رشتهٔ الگو از ۳`→۵` عبور می‌کند رشتهٔ کد شده (غیر الگو) و RNA جدید ایجاد شدهٔ تواند به عنوان نقاط مرجع مورد استفاده قرار گیرد بنابراین رونویسی می‌تواند از۳` →۵` اتفاق بیافتد این اتفاق باعث می‌شود یک نسخه دقیق مانند رشته الگو حاصل شود (با این تفاوت که به جای تیمین، یوراسیل جایگزین می‌شود و مولکول‌های نوکئوتید با قند ۵ کربنه در جایی که DNA دارای دئوکسی ریبوز (یک اکسیژن کمتر) در اسکلت ساختمانی و فسفات می‌باشد ترکیب می‌شوند.
رونویسی mRNA نیازمند چندین RNA پلیمراز از یک الگو تک رشته‌ای DNA و چندین دور رونویسی است که موجب تقویت یک Mrna خاص می‌شود همچنین بسیاری از مولکول‌های mRNA را می‌توان به سرعت از یک نسخه از یک ژن تولید کرد. میزان طول مشخص شده در پروکاریوت‌ها و یوکاریوت‌ها حدود ۱۰ تا 100 nts/sec است.
در یوکاریوت‌ها با این حال نوکلئوزوم‌ها به عنوان موانع عمده ای برای ترک کردن پلیمرازها در طول رونویسی عمل می‌کنند. در این موجودات، موانع ناشی از نوکلئوزوم‌ها می‌توانند با عوامل طویل سازی رونویسی مانند TFIIS تنظیم شوند. In these organisms, the pausing induced by nucleosomes can be regulated by transcription elongation factors such as TFIIS.
طویل شدن همچنین شامل مکانیسم اصلاح نیز می‌باشد که می‌تواند عوامل اشتباه جایگذاری شده را جایگزین کند. این ممکن است با وقفه ای کوتاه طی رونویسی صورت گیرد که باعث می‌شود عوامل مناسب ویرایش RNA بتوانند به درستی متصل شوند. این وقفه‌ها ممکن است به دلیل ذاتی خود RNA پلیمراز یا به علت وظیفه ساختار کروماتین باشد.

خاتمه دادن

باکتری‌ها از دو روش مختلف برای ختم رونویسی استفاده می‌کنند - ختم مستقل از Rho و وابسته به Rho. در خاتمه مستقل از Rho، رونویسی RNA وقتی متوقف می‌شود که مولکول RNA سنتز شده جدید به شکل یک حلقه سنجاق سر غنی با G-C را تشکیل دهد. هنگامی که شکل گیره موی شکل می‌گیرد، تنش مکانیکی پیوند rU-dA را از بین می‌برد، و در این حال hybrid DNA-RNA را پر می‌کند. جدا کردن poly-U به بیرون از محل فعال RNA پلیمراز رونویسی را خاتمه می‌دهد.
در نوع وابسته به Rho یک عامل پروتئینی که "Rho" نامیده می‌شود، تعامل بین الگو و mRNA را بی‌ثبات می‌کند بنابراین انتشارm RNA تازه سنتز شده از کمپلکس طویل شدگی را سبب می‌شود. خاتمهٔ رونویسی در یوکاریوت‌ها کمتر از باکتری‌ها قابل درک است ولی شامل شکافتن رونویسی جدید و به دنبال آن افزودن آدنین به الگوی مستقل در پایانه ۳` در مکانیسمی تحت عنوان polyadenylation است. (انتهای ۳' از RNA جدید توسط مجموعه‌ای از پروتئینها شکافته می‌شود. این پروتئین‌ها سپس دنبالهٔ آدنین را در انتهای 3' RNA تولید می‌کنند)

مهار کننده‌ها

مهار کننده‌های رونویسی می‌توانند به عنوان آنتی‌بیوتیک‌ها در برابر، به عنوان مثال، باکتری‌های بیماری‌زا (ضد باکتری‌ها) و قارچ‌ها (ضد قارچ‌ها) استفاده شوند. یک نمونه از آنتی باکتریال، ریفامپیسین است که رونویسی باکتری DNA را به mRNA مهار می‌کند بوسیله مهار RNA پلیمراز وابسته به DNA، بوسیله اتصال بتا زیر واحد آن، در حالی که ۸ هیدروکسی کینولین یک مهار کننده رونویسی ضد قارچی است. اثرات متیلاسیون هیستون نیز ممکن است برای مهار عملکرد رونویسی باشد.

مهار کننده‌های اندوژن

در مهره داران، اکثر پروتئین‌های ژنی شامل جزیره CpG با سایت‌های CpG متعدد است. وقتی که بسیاری از سایت‌های CpG پروموتر ژنی متیل شوند، ژن مهار می‌شود (خاموش می‌شود). سرطانهای کولورکتال معمولاً ۳ تا ۶ محرک جهش و ۳۳ تا ۶۶ جهش رونده دارند. با این حال، مهار رونویسی (خاموش شدن) ممکن است اهمیت بیشتری نسبت به جهش در ایجاد پیشرفت به سرطان داشته باشد. به عنوان مثال، در سرطانهای کولورکتال، حدود ۶۰۰ تا ۸۰۰ ژن توسط متیلاسیون جزیره CpG رونویسی می‌شوند (به تنظیم رونویسی در سرطان نگاه کنید). سرکوب رونویسی در سرطان همچنین می‌تواند با مکانیزم‌های دیگری از قبیل بیان تغییرات میکرو RNAها رخ دهد. در سرطان پستان، سرکوب رونوشت BRCA1 ممکن است با بیان بیش از حد microRNA-182 توسط hypermethylation از promoter BRCA1 رخ دهد (نگاه کنید پایین بیان BRCA1 در سرطان سینه و تخمدان).

عوامل رونویسی

واحدهای رونویسی فعال در هسته، در سایت‌های گسسته به نام کارخانه‌های رونویسی یا euchromatin خوشه بندی می‌شوند. چنین سایت‌هایی را می‌توان با اجازه دادن به پلیمرازهای درگیر گسترش رونوشت خود در پیش برچسب (Br-UTP یا Br-U) و ایمن‌سازی برچسب RNA نوظهور، نشان داده شوند. کارخانه‌های رونویسی همچنین می‌توانند با استفاده از فلورسانس در موقعیت هیبریداسیون یا مشخص شده توسط آنتی‌بادی‌هایی که در برابر پلیمرازها مشخص شده‌اند، موضعی باشند. حدود ۱۰٬۰۰۰ کارخانه در هسته سلول HeLa وجود دارد که شامل ۸۰۰۰ کارخانه پلیمراز II و حدود ۲٬۰۰۰ کارخانه پلیمراز III است. هر کارخانه پلیمراز II حاوی حدود ۸ پلیمراز است. همان‌طور که بیشتر واحدهای فعال رونویسی تنها با یک پلیمراز همراه است، هر کارخانه معمولاً شامل حدود ۸ واحد رونویسی مختلف است. این واحدها ممکن است از طریق promoters و/ یا تقویت کننده‌ها همراه باشند، با حلقه‌هایی که یک ابر را در اطراف عامل تشکیل می‌دهند.

تاریخچه

یک مولکول که اجازه می‌دهد تا مواد ژنتیکی به عنوان یک پروتئین شناخته شود، اولین بار توسط فرانسیس ژاکوب و ژاک مونو مطرح شد. Severo Ochoa در سال ۱۹۵۹ جایزه نوبل فیزیولوژی و پزشکی را برای توسعه یک فرایند سنتز RNA با آزمایش in vitro با فسفوریلاس پولی نوکلئوتیدی به دست آورد که برای شکستن کد ژنتیک مفید بود. سنتز RNA توسط RNA پلیمراز در سال ۱۹۶۵ توسط آزمایشگاه‌های مختلف آزمایش شد. با این حال،RNA که توسط این آنزیم‌های سنتز شده بود دارای خواصی بود که نشان دهنده وجود یک فاکتور اضافی که نیازمند به اتمام رساندن اصلاح رونویسی به درستی بود.
در سال ۱۹۷۲ والتر فایر اولین فرد بود که واقعاً آنزیم متوقف کننده را اثبات کرد.
راجر دی کورنبرگ برنده جایزه نوبل سال ۲۰۰۶ در شیمی شد برای مطالعات خود در "اساس مولکولی رونویسی یوکاریوت ".

اندازه‌گیری و شناسایی

رونویسی می‌تواند به روشهای مختلف اندازه‌گیری و شناسایی شود:
تست رونویسی G-Less Cassette: اندازه‌گیری قدرت پروموتور
تست رونویسی: Run-offسایت‌های شروع رونویسی را شناسایی می‌کند (TSS)
آزمایش هسته ای: اندازه‌گیری فراوانی نسبی رونوشت‌های جدید ایجاد شده‌است
تست حفاظت RNase و Chip-Chip RNAP: شناسایی سایت‌های فعال رونویسی
RT-PCR: میزان فراوانی مطلق سطوح کل RNA یا هسته را اندازه‌گیری می‌کند، اما ممکن است با میزان رونویسی متفاوت باشد
Microarrays DNA: میزان فراوانی نسبی کل سطوح کل یا RNA هسته را اندازه‌گیری می‌کند؛ با این حال، این ممکن است با نرخ رونویسی متفاوت باشد
Hybridization in situ: حضور یک رونوشت را تشخیص می‌دهد
برچسب زدن MS2: با ترکیب حلقه‌های ساقه RNA، مانند MS2، به یک ژن، این تبدیل به RNA سنتز شده جدید تبدیل می‌شود. سپس حلقه‌های ساقه را می‌توان با استفاده از ترکیب پروتئین GFP و پروتئین پوشش MS2 شناسایی کرد که دارای ارتباط متقابل خاصی با حلقه‌های ساقه MS2 است. استخدام GFP به سایت رونویسی به صورت یک نقطهٔ فلورسنت تجسم می‌شود. این رویکرد جدید نشان داده‌است که رونویسی در انفجارهای متناوب یا پالس‌ها رخ می‌دهد (نگاه کنید به ریزش موازی). با استثناء قابل توجه در تکنیک‌های in situ، اکثر روش‌های دیگر متوسط جمعیت سلولی را تأمین می‌کنند و قادر به تشخیص این ویژگی اساسی ژن نیستند.
بلوط شمالی: روش سنتی، و تا زمان ظهور RNA-Seq، بیشترین از نظر کمّی بودن است
RNA-Seq: تکنیکهای توالی نسل بعدی را برای رونویسی کامل ترانسکتیکوم‌ها استفاده می‌کند، که اجازه اندازه‌گیری فراوانی نسبی RNA، و همچنین تشخیص تغییرات اضافی مانند ژن‌های همجوشی، ویرایش‌های پس از رونویسی و سایت‌های جدید رشته را می‌دهد

رونویسی معکوس

برخی از ویروس‌ها (مانند HIV) توانایی رونویسی RNA و تبدیل آن به DNA را دارند.HIV دارای ژنوم RNA ا. ست که بر اثر رونویسی معکوس به DNA تبدیل شده‌است.DNA حاصل می‌تواند با ژنوم DNA میزبان ادغام شود. آنزیم اصلی برای سنتز DNA از یک الگوی RNA، ترانس کریپتاز معکوس نامیده می‌شود. در مورد HIV، ترانس کریپتاز معکوس، مسئول سنتز رشته DNA مکمل (cDNA) به ژنوم RNA ویروسی است. سپس آنزیم ریبونوکلئاز H، رشته RNA را اصلاح می‌کند و ترانس کریپتاز معکوس یک رشته مکمل DNA را می‌سازد تا یک ساختار DNA دورشته ای مارپیچی (cDNA)را تشکیل دهد.cDNA توسط آنزیم اینتگراز (که باعث می‌شود که سلول میزبان پروتئین‌های ویروسی ای تولید کند که این ذرات دوباره وارد درات ویروسی جدید می‌شوند) وارد ژنوم سلول میزبان شده و با آن ادغام می‌شود. در HIV، پس از این، سلول میزبان وارد دوره مرگ سلولی برنامه‌ریزی شده یا آپوپتوز سلول‌های T می‌شود. با این حال در دیگر رتروویروس‌ها، سلول پس از جوانه زدن ویروس‌ها به خارج سلول، سالم باقی می‌ماند. برخی از سلول‌های یوکاریوتی دارای آنزیمی با فعالیت رونویسی معکوس به نام تلومراز هستند. تلومراز آنزیمی برای رونویسی معکوس است که باعث افزایش طول انتهای کروموزوم‌های خطی می‌شود. تلومراز دارای یک الگو RNA است که از آن توالی تکراری DNA یا DNA بدون رمز تولید می‌کند. این توالی مکرر از DNA، تلومر نامیده می‌شود و می‌تواند به عنوان «کلاهک» برای یک کروموزوم مورد توجه قرار گیرد. این مهم است زیرا که هر بار یک کروموزوم خطی تکثیر می‌شود، کوتاه می‌شود. فرایند کوتاه شدن، این DNA بدون رمز و کلاهک که قسمت‌های غیرضروری و تکراری DNA هستند و دورتر از انتهای کروموزوم هستند را به جای بخش‌های دارای رمز DNA برای ساختن پروتئین، حذف می‌کند. تلومراز اغلب در سلول‌های سرطانی فعال می‌شود تا سلول‌های سرطانی را قادر سازد تا ژنوم‌های خود را به‌طور نامحدود تکثیر کنند بدون اینکه از بخش‌های DNA که برای پروتئین رمزگذاری شده‌اند، استفاده شود. فعال شدن تلومراز می‌تواند بخشی از پروسه ای باشد که سلول‌های سرطانی را جاودانه می‌کند. ثابت شده‌است که عوامل جاودانگی سلول‌های سرطانی (طولانی کردن تلومرها) به وسیله تلومراز در ۹۰ درصد تمامی تومورهای سرطان زای درون تنی فعالند و ۱۰ درصد باقی مانده، به روش دیگری توسط تلومرها نگهداری می‌شوند که به این روش ALT یا روش جایگزین افزایش طول تلومراز می‌گویند.