کشت سه بعدی سلول

پیشینه

مطالعات اولیه در دههٔ ۸۰ میلادی توسط مینا بیسل از آزمایشگاه ملی لارنس برکلی، اهمیت تکنیک‌های سه بعدی را برای ساخت مدل‌های کشت درون‌کشتگاهی صحیح، برجسته ساخت. این کار بر روی اهمیت ماتریکس خارج سلولی و توانایی کشت‌ها در ماتریکس‌های سه بعدی مصنوعی، در تولید ساختارهای چندسلولی مرتبط فیزیولوژیکی همانند ساختارهای آسینار در مدل‌های سالم و سرطانی بافت سینه، متمرکز بود. این تکنیک‌ها در مدل‌های درونکشتگاهی ای که برای ارزیابی پاسخ‌های سلولی به ترکیبات دارویی استفاده شده بودند، اعمال گردیدند.
اریک سیمون (در ۱۹۸۸ در یک گزارش گرنت  NIH SBIR) نشان داد که می‌توان از الکتروریسی برای تولید حصیرهای فیبری پلی‌استیرنی و پلی‌کربناتی در ابعاد نانو و ساب‌میکرون استفاده کرد (امروزه به عنوان داربست شناخته می‌شود) که به‌طور ویژه می‌توان از آن‌ها به عنوان سوبستراهای سلولی درون‌کشتگاهی استفاده کرد. این استفادهٔ اولیه از توری‌ها و شبکه‌های فیبری الکتروریسی شده برای کشت سلول و مهندسی بافت نشان داد که انواع متفاوتی از سلول‌ها شامل سلول‌های HFF , HEp_2 و MLE به فیبرها متصل خواهند شد و تکثیر خواهند کرد. فهمیده شد که برخلاف مورفولوژی مسطحی که معمولاً در کشت‌های دو بعدی می‌بینیم، سلول‌هایی که بر روی فیبرهای الکتروریسی شده رشد داده شده بودند، یک مورفولوژی بیشتر گرد و سه بعدی که شبیه به بافت بود را نشان دادند که این حالت معمولاً در محیط‌های درون‌جانداری(In vivo) مشاهده می‌شود.

خواص

در بافت زنده، سلول در یک microenvironment سه بعدی با روابط پیچیده و در هم سلول-سلول و سلول-ماتریکس، ودینامیک حمل و نقل پیچیده‌ای برای مواد مغذی و سلول‌ها قرار دارد. محیط کشت دو بعدیِ استاندارد یا monolayer برای ترسیم این محیط کافی نیست؛ این مسئله باعث شده‌است که این محیط‌ها معمولاً پیش‌بینی کننده‌های قابل اطمینانی برای بررسی عملکرد و سمیت داروها در شرایط in vivo نباشند. اسفروئیدهای سه بعدی شباهت نزدیک تری با شرایط in vivo از نظر ارتباطات سلولی و ایجاد ماتریکس خارج سلولی دارند. این ماتریکس‌ها کمک می‌کنند که سلول‌ها همان گونه که در بافت زنده حرکت می‌کند در داخل اسفروئیدهایشان هم حرکت کنند. بدین ترتیب اسفروئیدها مدل‌های ارتقا یافته‌ای برای مهاجرت سلولی(کوچ یاخته)، تمایز(دگرگونی یاخته)، بقا و رشد سلول‌ها هستند. به علاوه، کشت‌های سه بعدی سلول ترسیم دقیق تری را از قطبیت (polarization)سلولی فراهم می‌کنند، حال آنکه در محیط دو بعدی سلول تنها می‌تواند به‌طور جزئی قطبیت پیدا کند. علاوه بر این، سلول‌های رشد یافته در محیط سه بعدی ،بیان ژن متفاوتی را از آن‌هایی که در محیط دو بعدی کشت داده شده‌اند، نشان می‌دهند.
سومین بعدِ رشد سلول ارتباط فضایی بیشتری را برای ورودی‌های مکانیکی و چسبندگی سلولی فراهم می‌کند که این امر برای اتصال اینتگرین‌ها، انقباض سلولی و حتی پیامرسانی درون سلولی ضروری است. انتشار طبیعی حل شونده و اتصال آن به پروتئین‌های effector (مثل فاکتورهای رشد و آنزیم‌ها) نیز همچنین وابسته به ماتریکس سه بعدی سلول است، بنابراین بعد سوم برای ساخت شیب غلظت حل شونده در ابعاد بافتی نیز ضروری است.
برای مقاصد غربالگری سم‌شناسی داروها، بررسی بیان ژن سلول‌هایی که در محیط in vitro سه بعدی رشد یافته‌اند سودمند تر از سلول‌های رشد یافته در محیط دو بعدی است، چراکه بیان ژن در اسفروئیدهای سه بعدی بیشتر به بیان ژن در محیط in vivo شبیه خواهد بود ۰در آخر، محیط‌های کشت سه بعدی ثبات و طول عمر بهتری از محیط‌های کشت دو بعدی دارند. این به این معناست که آن‌ها برای مطالعات طولانی مدت و نشان دادن اثرات طولانی مدت داروها مناسب ترند. محیط‌های سه بعدی همین‌طور به سلول‌ها اجازه می‌دهند که بدون اختلال رشد کنند حال آنکه در محیط‌های دو بعدی سلول‌ها نیاز به اجرای منظم (تریپسین‌سازی پروتئازها: trypsinization) دارند تا مواد مغذی کافی و رشد سلولی طبیعی برایشان فراهم شود. اسفروئیدهای سه بعدی تا ۳۰۲ روز در یک آزمایشگاه کشت داده شده‌اند؛ در حالی که هنوز سالم باقی ماندند و بدون سرطانی شدن، رشد داشتند.

روش‌ها

امروزه، تعداد زیادی ابزار کشت که ادعا می‌کنند مزیت‌های کشت سه بعدی را فراهم می‌کنند، به صورت تجاری در دسترس‌اند. به‌طور کلی، اساس این شیوه‌ها می‌تواند به دو نوع از روش‌های کشت سه بعدی تقسیم شود: ۱)تکنیک‌های وابسته به داربست ۲)تکنیک‌های مستقل از داربست.

تقسیم‌بندی روش‌های کشت سه بعدی

به‌طور کلی، اساس این شیوه‌ها می‌تواند به دو نوع از روش‌های کشت سه بعدی تقسیم شود :تکنیک‌های وابسته به داربست و تکنیک‌های مستقل از داربست.

تکنیک‌های وابسته به داربست

تکنیک‌های وابسته به داربست شامل استفاده از داربست‌های جامد، هیدروژل‌ها و سایر مواد می‌شود.

هیدروژل‌ها

از آنجایی که ماتریکس خارج سلولی طبیعی برای بقا، تکثیر، تمایز و مهاجرت سلول‌ها مهم است، ماتریکس‌های مختلف هیدروژلی ای که ساختار ماتریکس خارج سلولی طبیعی را تقلید می‌کنند، به عنوان رویکردهای بالقوه‌ای در جهت کشت سلولی شبه‌درون‌جانداری(in vivo)، شناحته می‌شوند.
هیدروژل‌ها از شبکهٔ به هم متصلی از حفرات تشکیل شده‌اند که با حفظ و احتباس بالای آب،انتقال مؤثر موادی مثل مواد مغذی و گازها را، ممکن می‌سازد.
انواع مختلفی از هیدروزل‌ها، از طبیعی گرفته تا سنتز شده، برای کشت‌های سه بعدی در دسترس می‌باشد؛ به‌طور مثال مواردی شامل:هیدروژل‌های استخراج شده از ECM حیوانات، هیدروژل‌های پروتئینی، هیدروژل‌های پپتیدی، هیدروژل‌های پلیمری و هیدروژل نانوسلولوزی بر پایهٔ چوب.

تکنیک‌های مستقل از داربست

تکنیک‌های مستقل از داربست رویکرد دیگری را که غیر وابسته به استفاده از داربست است، به کار می‌گیرند.
تکنیک‌های مستقل از داربست به‌طور مثال شامل موارد زیر می‌شوند:پلیت‌های با چسبندگی کم، پلیت‌های هنگیگ دراپ، سطح‌های دارای ریزالگو، بیورآکتورهای چرخان، شناوری مغناطیسی و پرینت زیستی سه بعدی مغناطیسی.

اسفروئیدها

اسفروئیدها نوعی مدل‌سازی سلولی سه بعدی هستند که شرایط یک محیط سلولی زنده را در مقایسه با مدل سلولی دو بعدی، بهتر شبیه‌سازی می‌کنند، به خصوص در زمینهٔ برهمکنش‌های بین سلول‌ها و واکنش‌های بین سلول‌ها و ماتریکس. اسفروئیدها در زمینهٔ مطالعهٔ تغییرات فیزیولوژیکی ویژگی‌های سلول‌ها به درد بخور هستند، همچنین در مطالعهٔ تفاوت‌های ساختاری سلول‌های سالم و سلول‌های توموری و تغییراتی که سلول‌ها در هنگام توموری شدن ایجاد می‌کنند نیز کاربردی هستند. سختی یکی از ویژگی‌هایی است که برای سنجش سلول‌های سرطانی به کار می‌رود. مطالعاتی که بر روی اسفروئیدها با استفاده از موچین‌ها میکرومکانیکی صورت گرفته‌است نشان می‌دهد که اسفروئیدهای BT474 و T47T (سرطان سینه) ۳ تا ۶ برابر نرم‌تر از اسفروئیدهای MCF 10A (اپیتلیال طبیعی) هستند. از اسفروئیدهایی که در آن‌ها کشت همراه سلول‌های سرطانی و سالم بوده‌است برای شبیه‌سازی برهمکنش سلول‌های سرطانی با سلول‌های سالم استفاده شده‌است. اسفروئیدها می‌توانند با استفاده از چند شیوهٔ مختلف کشت داده شوند. یک روش متداول استفاده از پلیت‌های با چسبندگی سلولی کم (معمولاً یک پلیت ۹۶ ول برای تولید انبوه کشت‌های اسفروئیدی، که تجمعات در کف گرد پلیت سلولی تشکیل می‌شوند) می‌باشد. اسفروئیدها همچنین می‌توانند با استفاده از شیوهٔ هنگینگ دراپ(Hanging drop)، کشت داده شوند؛ این شیوه شامل تشکیل تجمعات سلولی در قطراتی است که از سطح پلیت سلولی آویزان‌اند. یکی دیگر از شیوه‌های در دست بررسی شامل استفاده از بیورآکتورهای با ظرف دارای دیوارهٔ چرخان می‌باشد که می‌چرخند و سلول هارا کشت می‌دهند و آن‌ها پیوسته در سقوط آزاد هستند و تجمعات را در چند لایه شکل می‌دهند.

میکروفلوئیدیک

ساختارهای مختلف سلولی در بدن انسان، نیاز دارند که حتماً رگ‌زایی داشته باشند تا بتوانند مواد مغذی را دریافت کنند و تبادلات گازی ای را که به بقایشان کمک می‌کندانجام دهند. به همین شیوه، کشت‌های سه بعدی سلول در محیط‌های in vitro نیز نیاز به سطوح مشخصی از گردش مایع دارند. نبود چنین گردشی در محیط‌های سه بعدی و متراکم که ممکن است همهٔ سلول‌ها به‌طور مناسبی در معرض مواد مغذی قرار نگیرند، می‌تواند مشکل ساز باشد. این مسئله خصوصاً در مورد کشت هپاتوسیت‌ها اهمیت دارد چراکه کبد اندامی است که سیستم عروقی وسیعی دارد. در یک مطالعه، سلول‌های هپاتوسیت و سلول‌های عروقی با هم در داربستی کلاژنی در بین کانال‌های میکروفلوئیدیک، کشت داده شدند و رشد سلول‌ها در محیط ایستا با محیط دارای جریان مقایسه شد؛ و نیاز به مدل‌هایی با بافت‌ها و ریزشبکه‌های عروقی نشان داده شد.

انتقادها

هیچ‌یک از تکنیک‌های سه بعدی تا کنون نتوانسته‌است در مقیاسی وسیع جایگزین تکنیک‌های دو بعدی شود؛ این مسئله فرایندهای اکتشاف دارو را نیز شامل می‌شود. تکنیک‌های سه بعدی حاضر بدون محدودیت نیستند، این محدودیت‌ها شامل مواردی نظیر مقیاس پذیری (انجام فرایند در مقیاس‌های دلخواه)، تکرار پذیری، حساسیت و سازگاری با دستگاه‌های غربالگری با توان بالا (HTS) می‌شود. HTS مبتنی بر سلول، بر پایهٔ تعیین سریع پاسخ سلول به برهمکنش آن با دارو استوار است (مثل توان زیستن سلول در دزهای مختلف، برهمکنش سلول-سلول و سلول-ماتریکس یا مهاجرت سلولی)، اما تست‌های در دسترس فعلی برای کشت سلولی سه بعدی بهینه‌سازی نشده‌اند. چالش دیگری که پیش روی کشت سه بعدی سلولی می‌باشد تعداد کم داده‌ها و انتشاراتی است که در مورد مکانیسم‌های برهمکنش دارو، تمایز سلولی و پیام رسانی سلولی در محیط سه بعدی in vitro سخن می‌گویند و همبستگی نتایجشان را با پاسخ دارو در محیط in vivo می‌سنجند. اگر چه تعداد موضوعات منتشر شده در مورد کشت سه بعدی سلول به سرعت در حال افزایش است، اما تعیین مشخصات بیوشیمایی محدود فعلی برای بافت‌های سه بعدی، اعتماد لازم برای پذیرش شیوه‌های سه بعدی را به عنوان تکنیکی جدید، کاهش می‌دهد. به هر میزان که این چالش‌ها برآورده شوند به همان سرعت هم کشت سه بعدی سلول به عنوان ابزاری متداول پذیرفته می‌شود.
در مورد استفاده از اسفروئیدها به عنوان مدل‌های سرطانی نیز مشکلاتی وجود دارد. با وجود مزیت‌های کشت بافت سه بعدی، از اسفروئیدهای سه بعدی به علت چالش‌برانگیز یا غیرممکن بودن کنترل دقیق گرادیان مولکول‌های حل شده در سازهٔ اسفروئیدی و تعیین دقیق ویژگی سلول‌ها در این گرادیان‌های پیچیده انتقاد می‌شود.