ویروئید

ویروییدها کوچکترین بیمارگرهای گیاهی شناخته شده محسوب می‌شوند. اصطلاح ویروئید اولین بار توسط دینر در سال ۱۹۷۱ برای توصیف عامل بیماری دوکی شدن غده سیب زمینی (PSTVd) به کار برده شد.
ویروییدها دارای یک رشته RNA تک لایه  حلقه‌ای به طول ۲۴۶ تا ۴۰۱ نوکلئوتید، با ساختمان‌های ثانویهٔ متعدد و فاقد پوشش پروتئینی هستند. این بیمارگرها فاقد چارچوب ژنی فعال هستند و توانایی سنتز پروتئین را ندارند.
به رغم فقدان پروتئین پوششی، به علت دارا بودن ساختار پیچیده ثانویه، در مقابل عوامل مخرب نوکلئیک اسیدها مقاومت زیادی دارند.
ویروئیدها مولکول‌های اسید نوکلئیک بدون پوشش پروتئینی هستند. ویروئیدهای گیاهی حاوی مولکول RNA حلقوی تک رشته ایی متصل می‌شود به‌طور کووالانسی و دارای 360 نوکلئوتید می‌باشند که از بازهای جفت شده با ساختمان میله ایی تشکیل شده‌اند. ویروییدها نمیتوانند پروتئین بسازند اما درون سلول‌های میزبان تکثیر می‌شوند، که ظاهراً از آنزیم‌های میزبان استفاده می‌کنند. به نظر می‌رسد ویروییدها در سیستم رشد گیاهان اختلال ایجاد می‌کنند. نشانه‌های بارز بیماری‌های ویروییدی رشد غیرطبیعی یا عقب ماندگی در رشد است. یک بیماری ویروییدی به اسم کدنگ-کدنگ بیش از 10 میلیون درخت نارگیل را از بین برد.

ارتباط تکاملی

فرضیه ی دیرر که در سال ۱٩٨٩ منتشر شد، بیان می کند که خصوصیات منحصر به فرد ویروئیدها، آنها را به عنوان ماکرومولکول هایی قابل قبول تر از اینترانین یا دیگر RNA هایی که در گذشته به عنوان "موجود زنده" در نظر گرفته می شدند، تبدیل کرده است. ویژگی های ویروئیدها سبب میشود که  آنها نامزدهای احتمالی بهتری نسبت به سایر RNA ها برای انجام مراحل حیاتی در تکامل زندگی،از ماده بی جان (abiogenesis) باشند. فرضیه ی او تا سال ٢۰۱۴ میلادی ، تقریبا فراموش شده بود تا اینکه  در مقاله ای که در آن  فلورس و همکارانش این فرضیه را مورد بررسی قرار داده بودند ، دوباره این فرضیه مورد توجه محافل علمی قرار گرفت.در آن مقاله، نویسندگان با شواهد و مدارک مختلف، از فرضیه ی او حمایت کردند.

وضعیت تاکسونومیکی

در نهمین گزارش ICTV یاInternational Committee on Taxonomy of Viruses ویروییدها به عنوان عوامل بیماریزای زیرویروسی (Subviral) شناخته شدند و بر اساس ساختمان ثانویه، محل همانندسازی و مسیر تکاملی، به دو خانواده Avsunviroidae با دو جنس (Pelamoviroid و Avsunviroid) و Pospiviroidae با پنج جنس (Cocadviroid, Hostuviroid, Apscaviroid, Coleviroid و Pospiviroid) تقسیم می‌شوند.
در خانواده Pospiviroidae برای ساختار ثانویه پنج دامنة ساختمانی و عملکردی شامل: دامنهٔ مرکزی حفاظت شده (central conserved region, CCR)، دامنهٔ بیماری زائی (pathogenicity, P)، دامنهٔ متغیر(variable, V)، دامنهٔ انتهای سمت راست (terminal right, TR) و دامنهٔ انتهای سمت چپ (terminal left, TL) پیشنهاد شده‌است.

روش بیولوژیک

جز اولین روش‌ها در تشخیص بیماری‌های ویروییدی می‌باشد. در این روش به گیاهان محک مناسب نیاز داریم تا پاتوژن در آن‌ها علایم اختصاصی تولید نماید به گونه‌ای که از سایر پاتوژن‌ها قابل تفکیک باشد.
انتقال بیماری به گیاهان محک به روش‌های مختلف از جمله: از طریق پیوند، ناقل، مکانیکی یا روش‌های تکثیری صورت می‌گیرد.

الکتروفورز پی در پی (S-PAGE)

۲بار عمل الکتروفورز انجام می‌شود؛ تحت شرایط غیر واسرشتی و به دنبال آن در شرایط واسرشتی اولین الکتروفورز:  به مدت ۳ ساعت با جریان ثابت ۵۵ میلی آمپر، در دمای ۴ درجه سانتی گراد در قالب ژل ۵٪ به ابعاد ۱۵۰*۱۲۰*۱/۵ میلی‌متر، حاوی بافر TAE زمانی که رنگ زایلن سیانول به اواسط ژل رسید، دومین الکتروفورز را انجام می‌دهیم.  دومین الکتروفورز:  قسمتی از ژل که حاوی RNAهای ویروییدی است را بریده و در بالای ژل ۵٪ واسرشتی ثانویه که حاوی بافر TAE (PH 6.5) و ۸ مول اوره است، قرار داده می‌شود. به مدت ۴-۴/۵ ساعت، با جریان ثابت ۱۵ میلی آمپر در دمای ۵۵درجه سانتی گراد با استفاده از بافر TBE x0/25 انجام می‌شود. طی این عمل RNAهای ویروییدی از سایر RNAهای میزبان جدا می‌شود.

الکتروفورز برگشتی (R-PAGE)

براساس تفاوت در ویژگی‌های مولکول ویرویید، تحت شرایط طبیعی و واسرشتی استوار است.  اولین الکتروفورز، در شرایط طبیعی که حرکت الکتروفورزی ویرویید، مشابه سایر مولکول‌های اسیدنوکلئیک خطی گیاه است، انجام می‌شود. این مرحله در ولتاژ ثابت و تا زمانی که زایلن سیانول به یک سانتی‌متری پایین ژل برسد؛ صورت می‌گیرد. سپس دستگاه خاموش، بافر الکترود تخلیه و برای اجرای الکتروفورز برگشتی بافر داغ با دمای ۷۰ درجه سانتی گراد با آن جایگزین می‌شود. قطبیت معکوس می‌شود و تانک الکتروفورز در اینکوباتور ۷۰ درجه سانتی گراد قرار داده و مرحله را تا زمانی که رنگ زایلن سیانول به بالای ژل برسد؛ ادامه می‌دهیم. این مرحله معمولاً نصف مرحله قبل زمان خواهد برد.

RT-PCR

نیاز به مقدارکمتری نمونه می‌باشد
معمولاً ۱۰ تا ۱۰۰ بار حساس تر از روش هیبریداسیون و ۲۵۰۰ بار حساس تر از روش الکتروفورز برگشتی ژل پلی اکریل آمید می‌باشد
اغلب نیاز به شناساگرهای نشانه دار شده با مواد رادیواکتیو ندارد
علی رغم حساسیت این روش به دلیل تشکیل ساختار ثانویه در ویروئیدها، امکان بروز نتایج غیرقابل استناد همواره وجود دارد.

روش‌های تلفیقی در تشخیص ویروییدها

تلفیق روش بیولوژیک و روش‌های مولکولی:تشخیص قطعی ۲ ویرویید CEVd و HSVd از یکدیگر در مرکبات با استفاده از روش بیولوژیک و روش‌های مولکولی مثل هیبریداسیون و RT-PCR به خاطر اختلاف در اندازه، توالی نوکلئوتیدی و بیماری زایی آن‌ها امکان‌پذیر است.
روش RT-PCR-DBH:این روش تلفیقی از ۲ روش RT-PCR و dot blot hybridization می‌باشد. در این روش به جای استخراج نوکلئیک اسید از گیاه برای عمل DBH، محصول RT-PCR در DBH استفاده می‌شود. این روش ۱۰۰۰بار حساس تر از southern blot و ۱۰۰ بار حساس تر نسبت به PCR در تشخیص ویرویید Hot stunt viroid در مرکبات می‌باشداین روش برای تشخیص ویروییدها با غلظت پایین مناسب می‌باشد.