Kahedimensionaalne geelelektroforees

Kahedimensionaalne geelelektroforees (2DE- või 2D-elektroforees) on elektroforeesi rakendus, mida klassikaliselt kasutatakse valkude analüüsimiseks. See tehnika eraldab valgud erinevate omaduste kaudu. Esimene dimensioon on isoelektriline fokuseerimine, mis eraldab valgud vastavalt nende isoelektrilisele punktile (pI). Teine dimensioon on SDS-polüakrüülamiidgeelelektroforees (SDS-PAGE), mis eraldab valgud vastavalt molekulmassidele.
Selle meetodi võtsid esimestena kasutusele 1975. aastal Patrick H. O'Farrell ja Joachim Klose.

Isoelektriline fokuseerimine

Isoelektrilise punkti järgi valkude eraldamist nimetatakse isoelektriliseks fokuseerimiseks (IEF). Kui valk on puhvris, millel on pH gradient ja rakendatakse elektrivälja, siis lõpuks hakkab valk liikuma elektroodi suunas, millel on vastaslaeng. Üleüldiselt on igal valgul laeng. Kui valgud on positiivselt laetud, siis neid tõmmatakse negatiivsema geeli otsa poole ja kui valgud on negatiivselt laetud, siis positiivsema otsa poole. Valgud liiguvad geelis ja akumuleeruvad nende isoelektrilises punktis: see on punkt, kus valgu üleüldine laeng on 0 (neutraalne).
pH gradienti läbiva migratsiooni ajal valk kas korjab prootoneid üles või kaotab neid. Kui valk migreerub, siis netolaeng ja liikuvus kasvavad, aga valgu liikumine aeglustub. Lõpuks jõuab valk punkti, kus tema pH gradient on võrdne isoelektrilise punktiga. Seal on valk laenguta ja lõpetab "rändamise". Kui peaks juhtuma, et valk difundeerub madalama pH-ga regiooni, siis toimub protoneerumine ja valk sunnitakse elektriväljaga tagasi katoodi suunas. Teistpidi, kui valk difundeerub regiooni, kus pH on kõrgem isoelektrilisest punktist, siis valk muutub negatiivselt laetuks ja suunatakse anoodi suunas. Tänu sellele omadusele valgud kondenseeruvad pH gradiendis selgeteks ribadeks oma individuaalse isoelektrilise punkti järgi. IEF süsteemis migreeruvad valgud oma püsiasendisse kogu süsteemist. Võrdluseks võib tuua, et tavalises elektroforeesis liiguvad valgud senikaua, kuni elektriväli eemaldatakse.

Teine dimensioon

Pärast esimese dimensiooni lõppu hävitatakse valgukompleksid, denatureerides neid naatriumdodetsüülsulfaadiga (SDS) teises dimensioonis. SDS denatureerib valgud ja SDS molekulid seotakse vastavalt valgu pikkusele. Valgu pikkus on ligikaudu proportsionaalne tema massiga. Teine dimensioon on standardne polüakrüülamiidgeel. Valgud, mis eraldati esimeses dimensioonis isoelektrilise fokuseerimisega, pannakse SDS polüakrüülamiidgeeli ja eraldatakse suuruse järgi. Esimesest elektroferogrammist eraldatakse molekulid 90-kraadise nurga all (ristloodis). See toimub molekulmassi alusel.
Selleks, et analüüsida rakkudes olevaid valke, on väga oluline teada nende koostööd. Kõige sagedamini töötavad valgud koos mitmetes kompleksides, et nad saaksid olla täielikult funktsionaalsed. Säilitada tuleb valgukomplekside natiivne vorm. Selleks kasutatakse polüakrüülamiidgeelelektroforeesi, kus valgukompleksid säilitavad natiivse vormi ja lahutatakse elektriväljas nende massile vastavalt. Et oleks võimalik säilitada eraldust suuruse, mitte laengu järgi, nagu IEF puhul, viiakse valkudele lisalaeng Coomassie sinise või liitiumdodetsüülsulfaadi abil.
Nagu eespool mainitud, rakendatakse teises dimensioonis taas elektrilist potentsiaali, kuid 90-kraadise nurga all võrreldes esimese väljaga. Valgud tõmmatakse geeli positiivsemale poolele proportsionaalselt nende massi-laengu suhtega. Kuna SDS molekulid on negatiivselt laetud, siis kõikidel valkudel on ligikaudu sama mass-laengu suhe üksteise suhtes. Valgu edasijõudmist takistab hõõre. Seega geel käitub nagu molekulaarne sõel. Valgud eralduvad pinge rakendamisel nende molekulmassi põhjal: suuremad valgud jäävad pidama geeli ülaossa ning väiksemad suudavad selle molekulaarse sõela läbida ning jõuavad geeli madalamasse ossa.

Valkude tuvastamine

Kahedimensionaalse elektroforeesi tulemuseks on geel, kus valgud on laotunud selle pinnale. Neid valke saab tuvastada mitmesuguste vahenditega, kuid kõige sagedamini kasutatavad värvained on hõbe ja Coomassie sinine. Esimese meetodi puhul rakendatakse geelile hõbeda kolloidi, mis seondub valkudes olevate tsüsteiingruppidega. Seejärel hõbe tumendatakse, eksponeerides seda UV valguses. Hõbeda koguse saab vastavusse viia tumedusega ning sealt edasi järeldada mingi teatud valgukoguse geelis ja seeläbi tuvastada kindel valk.
Mõõtmine annab kahjuks ainult ligikaudsed tulemused, kuid see on enamiku otstarvete korral piisav. Kasutatakse ka Coomassie sinisega värvimist, kuid hõbedaga värvimine on 100x tundlikum ja seega ka tulemused täpsemad.

Kahedimensionaalne DNA elektroforees

2D-elektroforeesiga saab eraldada ka teisi molekule peale valkude, näiteks DNAd. DNA superspiralisatsiooni analüüsides eraldatakse esimeses dimensioonis spiraliseeritud DNA. Teises dimensioonis denatureeritakse DNA interkalaatoriga, milleks tavaliselt on etiidiumbromiid või vähem kantserogeenne klorokviin. Analüüs ja tuvastamine toimub veidi teistmoodi kui valkude puhul.