Fluorestsentsmikroskoop

Fluorestsentsmikroskoop on optiline mikroskoop, mida kasutatakse orgaaniliste ja anorgaaniliste ühendite omaduste uurimiseks, lähtudes pigem fluorestsentsist ja fosforestsentsist kui peegeldumisest ja absorptsioonist, aga samas ei välista nende koos kasutamist. Mõiste "fluorestsentsmikroskoop" on kõnekeeles tuntud ka epifluorestsentsmikroskoobina, kuid see mõiste viitab ka selle mikroskoobi sarnasusele konfokaalmikroskoobiga, mis samuti kasutab oma töös fluorestsentsi.

Algteadmisi fluorestsentsmikroskoopiast

Kõik fluorestsentsmikroskoopia meetodid kasutavad sama põhimõtet. Proovis olevate molekulide ergastamiseks kasutatakse valgusallika sellist lainepikkust või lainepikkuste vahemikku, mille juures proovis olevad molekulid fluorestseeruvad. Proovi fluorestseerumisel kiirguv valgus, mis on enamasti pikemal lainepikkusel kui ergastuslainepikkus (Stokesi fluorestsents), detekteeritakse läbi mikroskoobi objektiivi. Sellise meetodi puhul kasutatakse tavaliselt kahte filtrit: esiteks ergastusfilter, mis tagab ergastuskiirguse kasutamise soovitud lainepikkusel ja selle monokromaatsuse, ning teiseks emissioonfilter, mis tagab selle, et ergastuskiirgus ei jõuaks tajurisse. Fluorestsentsmikroskoopia kasutab kujutise saamiseks põhimõtteliselt teistsugust lähenemist võrreldes neeldunud ja peegeldunud valge valguse tehnikatega, nagu faasikontrastiga ja diferentsiaalinterferentsiga. Need kaks kontrastoptilise mikroskoopia meetodit annavad väga erinevat, kuid teineteist täiendavat infot.

Epifluorestsentsmikroskoopia

Rääkides fluorestsentsmikroskoopiast, eriti just loodusteaduste vallas, mõeldakse selle all enamasti epifluorestsentsmikroskoopiat. Ergastuskiirgus lastakse proovile peale ülevalt, kui just ei ole tegu tagurpidi mikroskoobiga, mille puhul suunatakse see proovile alt. Ergastuskiirgus läbib objektiivläätse enne, kui see langeb proovile. Analüüdi fluorestseerumisel emiteeruv kiirgus fokuseeritakse detektorisse läbi sama objektiivi, mida kasutatakse ergastuskiirguse koondamiseks. Antud meetod annab parandatud signaali-müra suhte seoses sellega, et detektor ei asu samas sihis valgusallikaga, mistõttu objektiivi jõuab ainult tagasi peegeldunud ergastuskiirgus koos fluorestsentskiirgusega. Proovilt tagasi peegeldunud valgusallikast pärit kiirgusest aitab vabaneda dikromaatse lisafiltri kasutamine objektiivi ja detektori vahel.

Valgusallikad

Fluorestsentsmikroskoopia vajab suure intensiivsusega ja monokromaatsusele lähenevat ergastusvalgust (juhul kui mõõtmistel ei kasutata lainepikkuste vahemikku), mida osad laialt levinud valgusallikad, nagu halogeenlamp, pakkuda ei suuda. Levinud on kahte tüüpi valgusallikad: elavhõbe-gaaslahenduslambid ja ksenoonkaarlampid koos ergastusfiltritega või laserid. Laserite kasutusala piirab lainepikkuste varieerimisvõimaluse puudumine või laseri kallidus, kui see võimalus olemas on. Enamjaolt kasutatakse lasereid just komplitseeritumate fluorestsentsmikroskoopia meetodite puhul, milleks on konfokaalmikroskoopia ja totaalne sisepeegeldusfluorestsentsmikroskoopia. Samas sobivad ksenoonkaarlamp ja elavhõbe-gaaslahenduslamp laia lainepikkuste vahemikuga mõõtmiste jaoks epifluorestsentsmikroskoopias.

Proovi ettevalmistus

Selleks, et proov oleks mõõdetav fluorestsentsmikroskoobiga, peab proovis sisalduv analüüt olema fluorestseeruv. Kui analüüt ei ole fluorestseeruv, siis tema fluorestseeruvaks muutmiseks on mitmeid võimalusi. Peamised neist on järgmised: tehisliku fluorestsentsmärgise kasutamine ja fluorestsetseeruvate proteiinide ekspressioon rakus (levinud bioloogiliste proovide puhul). Alternatiivse meetodina kasutatakse proovi sisemist fluorestseerumist ehk autofluorestsentsi. Sellised proovid sisaldavad autofluorestseeruvaid bioloogilisi molekule (näiteks NADPH ja flaviin), mida kasutatakse sageli selleks, et eraldada kunstlikult lisatud märgiste emissioonkiirgust loomulikult fluorestseeruvate molekulide omast. Fluorestsentsmikroskoop on üks võimsamaid tööriistu loodusteadustes, mis võimaldab uurida valkude või teiste huvipakkuvate molekulide jaotust tänu spetsiifilisele ja tundlikule analüüdi märgistamisele. Kuna fluorestsentsmikroskoopia on üks madalamaid avastamispiire võimaldav spektroskoopiline meetod, siis seetõttu on bioloogiliste molekulide märgistamiseks leiutatud väga palju erinevaid tehnikaid.

Bioloogilised fluorestsentsmärgised

Paljudele bioloogilistele molekulidele on disainitud fluorestsentsmärgised. Ühte märgiste klassi kuuluvad väiksed, sisemiselt fluorestseeruvad ja spetsiifiliselt seostuvad molekulid. Tähtsaimad näited sellistest molekulidest on DAPI ja Hoechst (kuulub siniste fluorestsentsmärgiste perekonda), mis seostuvad DNA väikse vaoga, märgistades seega rakutuuma. Teine suur klass on fluorofooriga derivatiseeritud droogid ja mürkained, mis seostuvad kindlate rakustruktuuridega. Selle klassi parim näide on fluorestsentsmärgistatud falloidiin, mida kasutatakse aktiini filamentide ja imetajarakkude märgistamiseks.
Väga paljud fluorofoorid, näiteks fluorestsiin ja DyLight 488, on võimelised moodustama keemilisi sidemeid erinevate molekulidega, mis seostuvad uuritava ainega proovis.

Immunofluorestsents

Immunofluorestsentsmeetod baseerub antikehade omadusel seostuda kõrgspetsiifiliselt antigeenidele (enamasti organismile võõrad ained), et märgistada konkreetseid valke või muid aineid rakus. Kõigepealt töödeldakse proovi esmaste antikehadega, et need seostuksid uuritavate ainetega. Kusjuures esmane antikeha võib olla vahetult konjugeeritud fluorofooriga. Alternatiivselt kasutatakse fluorofooridega konjugeeritud sekundaarseid antikehasid, mis seostuvad spetsiifiliselt esmaste antikehadega. Näiteks hiirtes kasvatatud tubuliiniga spetsiifiliselt seostuvaid primaarseid antikehasid, mis on ühinenud fluorofooriga derivatiseeritud sekundaarantikehadega, võib kasutada mikrotuubulite märgistamiseks rakus.

Fluorestsentsvalgud

Tänapäevane arusaamine geneetikast ja DNA modofitseerimise tehnikatest on jõudnud sinnamaani, et teadlased suudavad valke geneetiliselt muundada nii, et proteiinis oleks ka fluorestseeruv valguosa. Tänu sellele on võimalik bioloogilistes proovides sisalduv uuritav aine muuta otseselt fluorestseeruvaks. Seega saab proteiinide asukoha otseselt kindlaks teha ka elusrakkudes.