UV/Vis-spektroskoopia

Ultravioletne-nähtav spektroskoopia ehk ultravioletne-nähtav spektrofotomeetria (UV/Vis ehk UV-Vis) on absorptsiooni- või peegeldusspektroskoopia ultravioletses (190–400 nm) ja nähtavas (400–800 nm) spektrialas. See tähendab, et kasutatakse valgust nähtavas ja sellele lähedal asuvas (lähi-UV ja lähiinfrapuna (NIR)) vahemikus. Absorptsioon või peegeldus nähtavas alas on otseselt seotud analüüsitava kemikaali värviga. Selles elektromagnetilise spektri regioonis toimub molekulides elektronergastus. See meetod on komplementaarne fluorestsentsspektroskoopiaga. Fluorestsents toimub relaksatsioonil ergastatud olekust põhiolekusse. Absorptsioon tekib ergastusel põhiolekust ergastatud olekusse.

Beeri-Lamberti seadus

UV/Vis-spektroskoopias kasutatakse enamasti lahuses ultravioletset või nähtavat kiirgust neelava aine kontsentratsiooni määramiseks Beeri-Lamberti seadust:
A=log₁₀ (I₀/I) = ε*c*L
Selles valemis on A neelduvus, I₀ esialgne valguse intensiivsus antud lainepikkusel, I proovi läbinud valguse intensiivsus, L optiline teepikkus ja c neelava aine kontsentratsioon. Igale ainele ja lainepikkusele on omane konstant ε(kasutatakse ka tähistust a), mida kutsutakse molaarseks neeldumisteguriks või ekstinktsioonikoefitsiendiks. See konstant on molekulile omane fundamentaalne omadus antud solvendis kindlal temperatuuril ja rõhul. Ühikuteks on 1/M*cm või AU/M*cm.
Neelduvust ja ekstinktsioonikoefitsienti defineeritakse mõningatel juhtudel naturaallogaritmiga kümnendlogaritmi asemel.
Beeri-Lamberti seadus on kasulik paljude ühendite karakteriseerimisel, aga samas ei ole universaalselt rakendatav kõikide ainete jaoks. Palju keerulisem kontsentratsiooni ja neeldumisteguri vaheline sõltuvus võib esineda näiteks väga suurte, keeruliste orgaaniliste molekulide (ksülenooloranž, toluüleenpunane jt.) korral.

Praktilised kaalutlused

Beeri-Lamberti seadusel on teatud nõuded, mis peavad olema eksperimentaalselt tagatud. Proovi keemiline koostis ja füüsikaline keskkond võivad muuta ekstinktsioonikoefitsienti. See tähendab, et proovi keemilised ja füüsikalised tingimused peavad ühtima referentsmõõtmiste omadega, et tagada tulemuste õigsus.

UV/Vis-spektromeeter

Instrumenti, mida kasutatakse UV/Vis-spektroskoopias, kutsutakse UV/Vis-spektromeetriks (UV/Vis-spektrofotomeeter). Instrument mõõdab proovi läbiva valguse intensiivsust (I) ja võrdleb seda valguse intensiivsusega enne proovi läbimist (I₀). I/I₀ suhet nimetatakse läbilaskvuseks ja seda väljendatakse tavaliselt protsentuaalselt (%T). 
Neelduvus (A) sõltub läbilaskvusest:
A = −log (%T/100%)
UV/Vis-spektromeetrit on võimalik seadistada peegelduse mõõtmiseks. Sel juhul mõõdab spektromeeter proovist peegeldunud valguse intensiivsust (I) ja võrdleb seda referentsmaterjalilt (nt valge plaat) peegeldunud valguse intensiivsusega (I₀). I / Iₒ suhet nimetatakse peegeldusteguriks ja seda väljendatakse protsentuaalselt (%R).
Spektromeetri põhilised osad on valgusallikas, proovikamber, monokromaator, et eraldada erineva lainepikkusega valgus ja detektor. Kiirgusallikaks on tihti volfram hõõgniit (300–2500 nm), deuteeriumlamp, mis annab pidevat kiirgust ultravioletses alas (190–400 nm), ksenoonlamp, mis on pidev lainepikkustel 160–2000 nm, ja viimasel ajal ka valgusdioodid (LED) nähtava valguse jaoks. Detektoriks on tavaliselt fotoelektronkordisti, fotodiood või fotodioodide rivi. Fotodioode ja fotoelektronkordistit kasutatakse skaneeriva monokromaatoritega, mis filtreerivad valgust nii, et ainult kindla lainepikkusega valgus jõuab detektorisse samal ajal. Skaneeriv monokromaator liigutab difraktsioonivõret läbi kõikide lainepikkuste nii, et intensiivsust on võimalik mõõta lainepikkuse funktsioonina. 
Spektrofotomeeter võib olla kas ühe- või kahekiireline. Ühekiirelises instrumendis läbib prooviküvetti kogu pealelangev valgus. Iₒ mõõdetakse proovi küvetikambrist eemaldades. See on kõige varajasem spektromeetri tüüp, mis sellegipoolest leiab laialdast kasutust õppe- ja tööstuslaborites.
Kahekiirelises instrumendis jagatakse valguskiir enne proovini jõudmist kaheks. Üht kiirt kasutatakse referentsiks ja teine läbib proovi. Referentskiire intensiivsus loetakse 100% läbitavuseks (neelduvus puudub) ja saadud mõõtetulemus on nende kahe kiire intensiivsuste suhe. Mõnel kahekiirelisel instrumendil on kaks detektorit (fotodioodi) ning referentskiire ja proovi läbiva kiire intensiivsus mõõdetakse samal ajal. Teist tüüpi instrumentides läbivad mõlemad kiired katkestit, mis laseb korraga läbi ainult ühe kiire. Detektor mõõdab kordamööda proovi läbiva kiire ja referentskiire intensiivsust. Katkesti tsüklis võib olla üks või mitu tumedat intervalli. Sel juhul on võimalik mõõdetud intensiivsusi korrigeerida eraldades nendest tumeda intervalli intensiivsuse.
UV/Vis-spektroskoopias on proovideks enamasti vedelikud, kuigi on võimalik mõõta gaaside ja isegi tahkiste neelduvust. Proov asetatakse tavaliselt läbipaistvasse rakku, mida kutsutakse küvetiks. Küvetid on enamasti ristkülikukujulised, sisemise küljepikkusega 1 cm. (Sellest pikkusest saab Beeri-Lamberti seaduses optiline teepikkus L.) Mõningates instrumentides on küvettide asemel võimalik kasutada katseklaase. Proovi sisaldav anum peab laskma läbi kiirgust vajalikus spektrialas. Kõige laialdasemalt kasutatavad küvetid on valmistatud kõrge kvaliteediga kvartsist, sest see on läbipaistev UV-, nähtavas ja lähiinfrapuna piirkonnas. Klaas- ja plastküvetid on samuti levinud, aga klaas ja enamik plaste neelab UV-kiirgust, mistõttu on nende kasutusala piiratud nähtava valguse lainepikkustega.
Valmistatud on ka spetsiifilisi instrumente. Nende hulka kuuluvad näiteks spektromeetrid, mis on ühendatud teleskoopidega, et mõõta astronoomilisi karakteristikuid. UV/Vis-nanospektromeetritega saab ilma küvettideta mõõta väga väikseid proovikoguseid (alates 0,3 µl). UV/Vis-mikrospektromeeter koosneb UV/Vis-mikroskoobiga ühendatud UV/Vis-spektromeetrist.