Replisoom

Ülevaade prokarüootsest ja eukarüootsest replikatsioonist

Prokarüootides replitseeritakse väike tsirkulaarne genoom vaid ühest spetsiifilisest alguspunktist (ingl origin – oriC). Algussaiti tekib kaks eraldiseisvat replikatsioonikahvlit, mis lahknevad vastassuunas. Koos kahvlitega liiguvad kaasa ka replisoomid, mis tagavad kahesuunalise replikatsiooni (ühte ahelat pikendatakse ühes suunas, teist teises). Genoomi tsirkulaarsuse tõttu kohtuvad replisoomid uuesti terminaatorpiirkonnas ter ning tekkinud ahelad jäävad ketina seotuks, neid eraldab topoisomeraas II.  
Eukarüootidel on suur hulk replikatsiooni algussaite ning üheaegselt tekib mitmeid replikatsioonimulle üle kogu kromosoomi. Sarnaselt prokarüoodiga saab ka siin igast alguspunktist alguse kahesuunaline replikatsioon.

DNA ahelate lahtiharutamine

Helikaas on ensüüm, mis lõhub ATP hüdrolüüsi jõul DNA dupleksi sees olevate aluspaaride vahelisi vesiniksidemeid. Selle rõngakujuline heksameerne struktuur seondub ümber dsDNA ning harutab lahti edasisse sünteesi minevaid ahelaid, tekitades replikatsioonikahvli. Helikaasid on vajalikud nii replikatsiooni initsiatsiooniks kui ka elongatsiooniks. 
Prokarüootidel on helikaasiks DnaB, mis aga suudab lahti harutada vaid juba avatud dsDNA-d. Selleks avajaks on initsiaatorvalk DnaA, mis seondub DNA algussaidile (oriC) ja harutab lahti kõrvaloleva DNA. Valk-valk-interaktsioonidega kutsutakse kohale helikaasi laadija DnaC ning see omakorda helikaasi DnaB.  Eukarüoodis on helikaasiks MCM2–7 (ingl minichromosome maintenance) kompleks ning selle reguleerimine toimub vastavalt rakutsüklile. Esmalt laetakse MCM2–7 kompleks ORC-dega (ingl origin recognition complex) märgistatud algussaitidele, selle jaoks on vajalikud lisavalgud Cdc6 (ingl cell division cycle 6) ja Cdt1 (ingl chromatin licensing and DNA replication factor 1). Sünteesi faasis helikaasid aktiveeritakse ning tekib CMG kompleks, mis on võimeline dsDNA ahelaid lahti harutama ning replikatsiooni alustama.

Superspiraliseerumise vältimine

Helikaaside pöörlev liikumine DNA ahelate lahti harutamisel muudab DNA topoloogiat ning tekitab superspiraliseerumisi ehk DNA vinti keerdumisi. Replikatsioonikahvli esine piirkond muutub aina enam positiivselt ning kahvli taha jääv osa negatiivselt superspiraliseerunuks. Superspiraalid akumuleeruvad eemaldatud aluspaaride tõttu. Topoloogisi pingeid vähendavad topoisomeraasid, mis on võimelised tekitama lühiajalisi ühe- või kaheahelalisi katkeid DNA-sse. Tekivad sälgud, mille kaudu on DNA-l võimalik superspiraalist välja keerduda.

Üheahelalise DNA kaitsmine

Üheahelaline DNA on termodünaamiliselt väga ebastabiilne ja võib spontaanselt iseendaga sekundaarstruktuure moodustada. Lisaks on ssDNA ka oluliselt tundlikum keemiliste ja nukleolüütilste (nukleaasid lõhuvad nukleiinhappe fosfodiestersidemeid) reaktsioonide suhtes. Vältimaks genoomse info kahjustusi, seostub ssDNA kaitsvate valkudega, millel on kõrge afiinsus ehk vastuvõtlikkus ssDNA suhtes. Valgud seostuvad kooperatiivselt (üks ees, teine järgi) ja järjestus-mittespetsiifiliselt. Lisaks on kaitsvate valkudega seotud ssDNA polümeraasile paremaks substraadiks. Sünteesi käigus üksikahelaga seotud valgud eemaldatakse. ssDNA-ga seonduvad kaitsvad valgud on leitavad kõigis eludomeenides, kuid valkudel on eri organismides võrdlemisi vähe sarnasusi. 
Eukarüootidel on vastavad valgud heterotrimeersed ehk kolmest identsest subühikust koosnevad RPA-d (ingl replication protein A) ning prokarüootidel, näiteks Escherichia coli´l, homotetrameersed SSB-d (ingl single-stranded binding protein) . 
Üheahelalisele DNA-le seonduvaid valke reguleeritakse aminohappejääkide fosforüülimise kaudu, eukarüootsel RPA-l vastavalt seriini ja treoniini jäägid ning bakteriaalsel SSB-l türosiini jäägid . RPA ja SSB on olulised ka homoloogilisel rekombinatsioonil ja nukleotiidide väljalõikereparatsiooni (NER) rajas .

Ahelate praimeerimine

Uute DNA ahelate sünteesiks ei piisa üheahelalisest DNA-st (koos SSB-ga), sest DNA polümeraas ei suuda uut ahelat sünteesida de novo. Replikatiivne polümeraas vajab nukleotiidse ahela elongatsiooniks eelnevalt eksisteerivat lühikest RNA juppi, mida nimetatakse praimeriks. Praimer pakub vaba 3´ OH otsa, mille külge saab polümeraas uusi nukleotiide sünteesida.  
Selle probleemi lahendavad praimeerivad ensüümid (DNA sõltuvad RNA polümeraasid), mis loovad lühikesi RNA praimereid, mis on komplementaarsed üheahelalise matriits-DNA-ga. RNA polümeraas on erinevalt DNA polümeraasist võimeline alustama uut RNA ahelat de novo. Spetsiaalne RNA polümeraas – praimaas – sünteesib lühikesi oligonukleotiidseid RNA praimereid nii juhtiva kui ka mahajääva ssDNA matriitsile. Praimaas seega ei vaja spetsiifilist DNA järjestust uue RNA praimeri sünteesi initsiatsiooniks ehk alustamiseks. Replikatsiooni lõpus eemaldab praimerid 5´→ 3´ suunaline eksonukleaas. Juhtivale ahelale sünteesitakse praimer vaid ühe korra, kuid mahajäävat ahelat praimeeritakse umbes iga tuhande nukleotiidi järel (igale Okazaki fragmendile toodetakse üks praimer). Prokarüoodis on praimeriks DnaG, mis aktiveerumiseks assotsieerub DnaB helikaasiga.  Eukarüoodis on heterodimeerne praimaas, mis moodustab nelja subühikulise kompleksi DNA polümeraas α-ga. Kui praimaas sünteesib RNA praimeri, siis tekkinud RNA praimer-matriitsühendus on kohe substraadiks DNA polümeraas α-le DNA sünteesi initsiatsiooniks (sünteesib umbes 20–30 nukleotiidi pikkuse jupi). DNA polümeraas α on aga madala protsessiivsusega, mistõttu toimub polümeraasi vahetus kõrgelt protsessiivsete polümeraaside DNA Pol δ ja DNA Pol ε vastu.

Replikatsiooni protsessiivsus

Korrektne replikatsioon peab olema kõrge protsessiivsusega, seega kiire, täpne ja katkematu. Seda tagab rõngakujuline mitmest identsest subühikust koosnev libisev klamber, mis hoiab DNA polümeraasi kopeeritava ahelaga tugevalt seotuna ning ei lase sel dissotseeruda ehk eralduda. Klambri keskel olev avaus on piisavalt suur mahutamaks DNA kaksikheeliksit ning ühe kuni kahe molekuli paksust veekihti DNA ja klambri vahel. Need klambrid libisevad mööda DNA-d dissotseerumata. Libisevad klambrid seonduvad tugevalt DNA polümeraasidele replikatsioonikahvlites. Klambri asetab DNA-le libiseva klambri laadija, see on valgukompleks, mis katalüüsib klambri avamist ja asetamist DNA-le, kasutades ATP hüdrolüüsi energiat. Klambri lisamine saab toimuda vaid siis, kui rakus on olemas praimer-matriits DNA hübriidkompleks (nn DNA A vorm), sellele seondudes toimub energia eraldumine, mis on piisav klambri avamiseks ning selle keeramiseks DNA ahelate ümber. Laadiv kompleks vastutab ka klambri eemaldamise eest replikatsiooni lõpus (või Okazaki fragmendi lõpus). Klambri puudumisel DNA polümeraas dissotseeruks pärast 20–100 aluspaari sünteesi. Klambriga seotuna võib polümeraasi aktiivsait küll 3´ OH otsast lahti haakuda, kuid klamber ei lase sel minema difundeeruda. Kui ssDNA matriits on kopeeritud, muutub afiinsus DNA polümeraasi ja klambri vahel. DNA polümeraas, mis on seotud praimer-matriitsühendusele, on klambri suhtes kõrge afiinsusega, lõppu jõudes (näiteks Okazaki fragmendi lõpus) toimub konformatsiooniline muutus ja DNA polümeraasi vastuvõtlikkus klambri ja DNA suhtes väheneb. Seega kui polümeraas lõpetab DNA jupi replikatsiooni, siis klamber vabastab ensüümi nii, et see saab seonduda uue praimer-matriitsiga.  
Klambri laadija on üldnimetus, mis viitab prokarüoodis replikatsiooni faktorile γ või eukarüoodis replikastiooni faktorile C (RFC). Prokarüoodis on libisevaks klambriks homodimeerne β klamber (koosneb polümeraas III β subühikutest) ning eukarüoodis homotrimeerne PCNA (ingl proliferating cell nuclear antigen).  
Libisev klamber ja tema laadija on absoluutselt vajalikud replikatsiooni läbiviimiseks, mistõttu on nad ka erinevates elu domeenides oma struktuurilt kõrgelt konserveerunud (struktuurilt sama, aga nukleotiidselt järjestuselt erinev).

Ahelate polümeriseerumine

DNA polümeraasid moodustavad ensüümiperekonna, mis katalüüsivad DNA ahelate polümerisatsiooni ehk pikenemist. Replikatiivne polümeraas moodustab asümmeetrilise dimeeri, mille struktuur tagab juhtiva ja mahajääva ahela üheaegse polümerisatsiooni. DNA polümeraas saab lisada vabu nukleotiide ainult sünteesitava ahela 3’ otsa, selle tõttu toimub uue ahela pikendamine ainult 5´→ 3’ suunal. Juhtiv ja mahajääv ahel on aga anti-paralleelsed (vastassuunalised), seega sünteesitakse neid erinevalt. Juhtiva ahela kopeerimine toimub katkematult, kuid mahajäävat ahelat sünteesitakse lühikeste lõikudena, nn Okazaki fragmentidena. Okazaki fragmendid varieeruvad pikkuselt, 1000–2000 nukleotiidi prokarüootides ja 100–400 nukleotiidi eukarüootides. Mahajäävale ahelale komplementaarse ahela süntees saab toimuda alles siis, kui helikaas on lahti harutanud piisava pikkusega DNA-d, tekitades ssDNA lingu (silmuse). Polümeraas töötab senikaua, kui kohtub eelmise fragmendi RNA praimerit, seejärel libisev klamber ja polümeraas dissotseeruvad ning tsükkel algab uuesti.  
Prokarüoodis teostab replikatiooni polümeraas III, mis on kõrge protsessiivsusega ning enamasti leidub see osana suuremast kompleksist – DNA polümeraas III holoensüüm – mis tagab veelgi suurema täpsuse . Eukarüoodis on replikatsiooni initsiatsiooniks vajalik polümeraas α, mis aga oma madala protsessiivsuse tõttu vahetatakse kiiresti välja DNA Pol δ ja DNA Pol ε vastu .

Praimerite eemaldamine ja sälkude ligeerimine

Pärast juhtiva ja mahajääva ahela sünteesi jäävad dupleksi alles RNA praimerid ning mahajäävale ahelale ka väikesed sälgud iga Okazaki lõigu vahele. Praimerite eemaldamine ja sälkude ligeerimine tagavad keemiliselt stabiilse ja vigadevaba DNA topeltheeliksi.
Prokarüoodis viivad neid protsesse läbi RNaas H, DNA polümeraas I ja DNA ligaas. RNaas H tunneb ära ja eemaldab enamiku RNA praimeritest, välja arvatud viimase nukleotiidi praimeri 3´ otsas, seda sellepärast, et see ensüüm on võimeline lõhkuma sidemeid ainult ribonukleotiidide vahel (mitte desoksüribonukleotiidide vahel). Seega viimase nukleotiidi eemaldab eksonukleaasse aktiivsusega polümeraas I. Erinevalt DNA polümeraas III-st, on polümeraas I-l ka 5′→ 3′ suunaline eksonukleaasne aktiivsus, millega eemaldataksegi RNA praimeri viimane nukleotiid. Tekkinud augud täidab sama polümeraas ning lõpuks ligeerib ehk ühendab fragmendid kokku üheks ahelaks DNA ligaas.   
Eukarüoodis on samuti olemas RNaas H ja DNA ligaas, aga eksonukleaasse aktiivsusega polümeraas puudub. Selle asemel on eukarüoodil olemas ensüüm nimega FEN1 (ingl flap endonuclease 1). Okazaki fragmente ühendatakse teistsuguse mehhanismi järgi kui prokarüoodis. Iga kord kui polümeraas δ sünteesib uue fragmendi, siis osa sellest "sõidab sisse" eelneva fragmendi 5´ otsa, tekitades nihke ja lahtise otsa, mis sisaldab nii RNA praimerit kui ka väikest DNA segmenti. Seda kõrvaletõrjutud ahelat eemaldab endonukleaas FEN1. Alles jääb väike sälk, mille ühendab DNA ligaas. Kui aga kõrvaletõrjutud ahelad sisaldavad sekundaarstruktuure või on liiga pikad, siis FEN1 pole suuteline neid eemaldama. Sellised ssDNA jupid kaetakse ka RPA-dega ning on substraadiks helikaasse ja nukleaasse aktiivsusega ensüümile Dna2, mis eemaldab liiga pikad ahelad, jättes alles lühikese otsa, mis on sobivaks substraadiks FEN1-le.