Lap-süsteem

Lap-süsteem on oluline süsteem biokile tekkeks bakteritel Pseudomonas fluorescens ja Pseudomonas putida. Mõlemad bakterid on risosfäärsed bakterid, mis moodustavad taimejuurtel biokile ning soodustavad taimede kasvu. Lap-süsteemi olulisim valk LapA on hädavajalik biokile tekkeks nii P. fluorescens'is kui ka P. putida's.
Biokile ehk pinnale kinnitunud bakterite struktureeritud kogumi moodustamiseks peavad keskkonnas vabalt liikuvad bakterid stabiilselt taime juurele kinnituma. Biokile moodustamine on mikroobidele kasulik, sest biokiles saavad bakterid paremini hakkama erinevates keskkonnatingimustes.

Lap-süsteemi valgud

Lap-süsteemi tähtsaimaks valguks võib pidada LapA-d, mis on bakteri pinnal asuv adhesiin ehk kleepvalk. LapA transporditakse bakteri pinnale ABC-transporteriga, mis koosneb kolmest valgust, LapE, LapB ja LapC. LapEBC transporter vajab tööks ATP energiat. LapG ja LapD reguleerivad LapA hulka bakteri pinnal posttranslatsioonilise regulatsiooni abil.
P. putida biokile moodustamisel osaleb ka teine suur adhesiin, LapF, mida P. fluorescens'is ei ole.
LapF on oluline rakk-rakk interaktsioonide tekkeks küpses biokiles.

LapA

LapA on vajalik biokile moodustamise esimeses etapis ehk pinnale kinnitumiseks. Lisaks on LapA oluline biokile järgmises etapis, kui bakter läheb esmaselt pöörduvalt kinnitumiselt üle pöördumatule kinnitumisele pinnaga.
LapA on suur kleepvalk, mille molekulmass P. fluorescens'is on umbes 520 kDa. LapA põhijärjestuse moodustavad valgu keskel paiknevad 37 kordusjärjestust (RTX), millest igaüks on 100 aminohapet pikk. Kordusjärjestuste ala on vajalik pinnaga ehk substraadiga seondumiseks, et võimaldada biokile moodustumist. C-terminaalset valgu otsa kasutab LapA samuti pinnaga seondumiseks, kuid selles alas paikneb ka 1. tüübi sekretsioonisüsteemi signaaljärjestus, mille abil on valk võimeline seda sekretsioonisüsteemi läbima. N-terminaalse otsaga kinnitub valk aga bakteriraku pinnale. N-terminaalses otsas asub ka LapG lõikesait, mis on vajalik LapA hulga reguleerimiseks pärast valgusünteesi ehk posttranslatsiooniliseks regulatsiooniks.
LapA hulka rakus ja kinnitumist raku pinnale reguleerivad P. fluorescens'is LapD ja LapG, P. putida's kahekomponendiline regulatsioonisüsteem GacS/GacA ja transkriptsioonifaktor FleQ ning mõlemas bakteris c-di-GMP tase. C-di-GMP ja LapD-LapG osalusel toimuv posttranslatsiooniline regulatsioon on enim uuritud LapA regulatsiooni mehhanism.

LapA transport raku pinnale ja pinnaga seostumine

Kui LapA on lapA geenilt kodeeritud, siis see transporditakse raku pinnale. Valk transporditakse raku pinnale läbi 1. tüübi sekretsioonisüsteemi, milleks on vajalik valgu C-terminaalses otsas paiknev signaaljärjestus. Seejärel seondub valk mikroobiraku pinnaga N-terminaalse osa kaudu. Seondumist raku pinnaga abistab ka RTX kordusjärjestus, kuid selle olemasolu pole raku pinnaga seondumiseks hädavajalik.

LapA seondumine substraatidega

LapA kaudu võib bakter seonduda nii hüdrofoobsete kui ka hüdrofiilsete pindadega. Kui LapA-d on raku pinnal palju, siis toimub seondumine mõlemale pinnale sarnase tõhususega. Juhul kui LapA-d on raku pinnal vähe, on eelistatud kinnitumine hüdrofoobsele pinnale. Kuigi LapA seondub erinevate pindadega, sõltub kinnitumise mehhanism siiski pinna omadustest. Hüdrofoobsele pinnale seondub LapA peamiselt RTX kordusjärjestustega, mis sisaldavad suures hulgas hüdrofoobseid aminohappeid. Hüdrofiilsete pindadega seondub LapA aga põhiliselt C-terminaalse otsa kaudu.
Kinnitudes substraadi pinnale, voltuvad LapA kordusjärjestused kokku. See vähendab kaugust mikroobi ja substraadi vahel, mis muudab tekkinud substraat-LapA-mikroob kompleksi struktuuri jäigemaks.
Mikroob seondub LapA valgu hüdrofoobset pinda kasutades tugevamalt, sest raku pinna ja substraadi pinna vaheline kaugus on väiksem kui hüdrofiilse pinnaga seondudes. Lisaks alustatakse hüdrofoobse pinnaga seondudes biokile moodustamist kiiremini ja efektiivsemalt.

LapA posttranslatsiooniline regulatsioon

LapA N-terminaalne ots on hädavajalik valgu kinnitumiseks raku pinnale. Seega toimub LapA hulga posttranslatsiooniline regulatsioon N-terminaalse otsa äralõikamise kaudu. Selle eest vastutab periplasmas asuv proteaas LapG. Kui keskkonnas on liiga madal anorgaanilise fosfori kontsentratsioon, on tingimused biokile tekkeks ebasobivad. Sellises olukorras lagundab Pho regulonist kodeeritud fosfodiesteraas RapA c-di-GMP-d, langetades selle hulka rakus. Madala c-di-GMP kontsentratsiooni korral ei ole tsütoplasmamembraanis paiknev c-di-GMP retseptor LapD enam oma ligandiga c-di-GMP-ga seotud ja muudab konformatsiooni nii, et ei suuda enam LapG-d siduda. Nii saab LapG vabalt periplasmas ringi liikuda ning lõigata LapA N-terminaalset otsa, vabastades LapA raku pinnalt keskkonda.
Kui keskkonnas on palju fosforit, siis on rakus ka palju c-di-GMP-d, mis seondub oma retseptori LapD-ga. LapD-s toimuvad konformatsioonilised muutused, mille tulemusena on see võimeline siduma LapG-d. LapD-ga seotud LapG ei saa periplasmas vabalt liikuda ega LapA N-terminaalset otsa lõigata. Selle tulemusel jääb LapA seotuks raku välismembraaniga, soodustades biokile teket.
LapG on kaltsiumsõltuv (Ca²⁺) valk. Ca²⁺ kontsentratsiooni tõus põhjustab LapG-s konformatsioonilised muutused, mis ei lase enam LapG-l LapD-ga seonduda. Seega suurendab Ca²⁺ kõrge kontsentratsioon biokile teket. Looduslikes tingimustes võib Ca²⁺ taset rakus kontrollida tsitraat, mis suudab Ca²⁺ siduda. Tsitraadiga seotud Ca²⁺ ei ole enam LapG-le kättesaadav, mis põhjustab LapG seondumise LapD-ga ning biokilet ei saa enam tekkida.

LapA transkriptsiooniline regulatsioon

LapA transkriptsioonilisest regulatsioonist on oluliselt vähem teada kui translatsioonilisest regulatsioonist. P. putida lapA (LapA valku kodeeriv geen) promootorit transkribeeritakse juba varajases eksponentsiaalses kasvufaasis, kuid statsionaarsesse faasi sisenedes transkriptsiooni tase tõuseb veelgi. P. putida lapA transkriptsiooni reguleerib c-di-GMP ja arvatavasti ka GacS/GacA kahekomponendiline regulatsioonisüsteem. Nii c-di-GMP kui ka GacS mõjutavad lapA transkriptsiooni positiivselt.

LapF

Kui varajases biokile moodustamises on oluline LapA olemasolu, siis P. putida biokile küpses staadiumis on vajalik ka LapF. LapF soodustab bakter-bakter interaktsioonide teket, mis on oluline mikrokolooniate tekkeks ja hilisemaks küpse biokile moodustumiseks. LapF-i olulisus biokile moodustumisel ilmneb ainult toitainetevaeses keskkonnas, täissöötmes pole LapF-i olemasolu biokile tekkeks vajalik.
LapF kodeeritakse lapFHIJ operonilt, mille ülejäänud geenid kodeerivad arvatavasti ABC transporterit LapHIJ. See transporter võib osaleda LapF-i transpordil raku pinnale.
P. putida lapF-i ekspressiooni regulatsiooni on uuritud transkriptsiooni tasemel.
LapF ekspressiooni mõjutavad transkriptsiooni tasemel alternatiivne statsionaarse faasi sigma-faktor RpoS (σS) ja globaalne regulaator Fis. RpoS-i hulk sõltub kasvufaasist, suurenedes oluliselt statsionaarse faasi alguses. Seega aktiveerib RpoS lapF-i transkriptsiooni statsionaarses faasis. Fis-i kontsentratsioon on aga kõrgem logaritmilises faasis. Fis mõjutab lapF-i transkriptsiooni negatiivselt, seondudes promootoralale ja arvatavasti takistades RNA-polümeraasi seondumist.
RpoS-i ja Fis-i kaudu toimuva regulatsiooniga saab seletada, miks ekspresseeritakse LapF-i peamiselt küpses biokiles. P. aeruginosa biokiles on mõõdetud fis-i ja rpoS-i mRNA hulga muutusi ja näidatud, et neid reguleeritakse vastassuunaliselt, fis-i mRNA hulk biokile moodustumisel väheneb ja rpoS-i hulk suureneb .
Biokile moodustamise algusetappidel kasvavad rakud kiiresti ja neis kodeeritakse Fis-i, mis mõjub lapF-i transkriptsioonile negatiivselt. Fis seondub lapF-i promootoralale nii, et RNA-polümeraas ei saa sinna enam seonduda. Küpses biokiles rakkude kasvu kiirus langeb, mille tagajärjel RpoS-i hulk suureneb ja Fis-i hulk väheneb. Fis ei seondu enam promootoralale, mille tulemusel saab RNA-polümeraas RpoS-i abil promootorile seonduda ja lapF-i transkribeerida.
Lisaks reguleerib lapF-i transkriptsiooni taset rakus ka c-di-GMP, kuid vastupidiselt lapA-le põhjustab c-di-GMP taseme tõus lapF-i transkriptsiooni vähenemist. Täpset mehhanismi, kuidas c-di-GMP lapF-i transkriptsiooni mõjutab, pole teada.