TOL-plasmiid

TOL-plasmiid on kataboolne plasmiid, mis kodeerib ensüüme, mis lagundavad tolueeni. TOL-plasmiid vahendab ka m- ja p-toluaadi ning m- ja p-ksüleeni lagundamist atseetaldehüüdiks ja püruvaadiks. Lühend "TOL" tuleb sõnast tolueen.
Esimene TOL-plasmiid pWW0 isoleeriti Pseudomonas putida mt-2-st, mida kirjeldasid Williams ja Murray 1974. aastal. Kuigi TOL-plasmiid pWW0 kandub üle peamiselt Pseudomonas liikide vahel, on leitud seda ka Escherichia coli, Erwinia chrysanthemi, Hydrogenophaga palleronii, Serratia ja Burkholderia liikides. On leitud ka TOL-sarnast plasmiidi Alcaligenes eutrophus'es.

Iseloomustus

TOL-plasmiid pWW0 on 116 580 aluspaari suurune. Sellest umbes 40 kiloaluspaari on vaja kataboolsete radade ning regulaatorgeenide toimimiseks. Plasmiid on iseülekanduv ning kuulub IncP-9 mittesobivusgruppi. Plasmiid pWW0 kandub edukalt üle biofilmis, erinevatel muldadel ja aedoa lehtedel. Ülekandumise määr sõltub doonortüve kasvust, substraadi kontsentratsioonist ja bakteri metaboolsest aktiivsusest.
Plasmiidi pWW0 nukleotiidsest järjestusest võib oletada, et plasmiidil on 148 avatud lugemisraami (ORFi). Neist 77 on sarnased järjestustele, mis on andmebaasides avaldatud. Neile on ennustatud ka funktsioone nagu näiteks plasmiidi replikatsioon, fenotüübilised tegurid, geeni regulatsioon ja ekspressioon, transpositsioon ning plasmiidi säilitamine ja ülekanne. Plasmiidi pWW0 replikatsioon on termosensitiivne.
Esmane TOL-plasmiidi pWW0 metaboolse raja iseloomustus saadi tänu kataboolsetele geenidele, mis asuvad sel plasmiidil. Eriti tänu katehhooli lagundamiseks mõeldud geenidele. Nimelt Pseudomonas putida mt-2 kromosomaalsed geenid kodeerivad orto-rada, kuid TOL-plasmiid kodeerib meta-rada. Neid radu indutseerivad erinevad substraadid. Näiteks, bensoaat lagundatakse meta-rada pidi, katehhool, mis on tolueeni lagundamise vaheühendiks, aga orto-rada pidi.

xyl geenid

Tolueeni ja ksüleeni lagundamiseks vajalike ensüümide kodeerimise eest vastutavad xyl geenid.
xyl geenid asuvad kahe 1275 aluspaari suuruse IS-elemendi vahel (IS1246), võttes enda alla 39 kiloaluspaari. Kataboolne regioon (xyl geenid) võib plasmiidilt deleteeruda homoloogse rekombinatsiooni tõttu otsekorduste vahel. Selle tagajärjel tekib väiksem, kuid konjugatiivne 78 kiloaluspaari suurune Tol⁻ plasmiid pWW0-8, mis ei oma fenotüübilist efekti. pWW0-8-l on ainult üks koopia IS-elementi IS1246.
pWW0-l on kaks suurt üksteise sees asetsevat transposooni. Tn4651 on 56 kiloaluspaari ning ümbritseb 39 kiloaluspaari suurust kataboolset ala. Tn4653 on 70 kiloaluspaari suurune ja ulatub Tn4651 sisse. Mõlemad on klass II transposoonid ("lõika ja kleebi"). Neil on ühised tnpT, tnpS ja res geenid, kuid eraldi tnpR ja tnpA geenid. Kataboolsete geenide deletsiooni tõttu tekib transposoon Tn4652, mis ei oma fenotüübilist efekti.

Kataboolne rada

Tolueeni ja teiste ühendite lagundamine on initsieeritud aromaatse ühendi metüülrühma progressiivse oksüdatsiooni poolt, et toota karboksüülhapet (ülemine rada). Viimane muudetakse Krebsi tsükli vaheühenditeks meta-lõikusraja abil.
TOL-plasmiidi pWW0 kataboolsed geenid on organiseeritud kahte operoni – ülemine ja alumine ehk meta-operon.

Ülemine operon

Ülemine operon – xylUWCMABN – kodeerib tolueeni ja ksüleenide lagundamist bensoaatideks ja toluaatideks. Ülemine operon koosneb kolmest ensüümist: ksüleeni monooksügenaas (XO), bensüülalkohol dehüdrogenaas (BADH) ja bensaldehüüd dehüdrogenaas (BZDH). Ksüleeni monooksügenaasil on lai substraadi spetsiifilisus. Lisaks tolueenile oksüdeerib ksüleeni monooksügenaas ka bensüülalkoholi bensaldehüüdiks.
Nende ensüümide struktuurgeenid asuvad 8 kiloaluspaari suuruses alas, hõivates ainult 50% DNAst. XO, BZDH ja BADH struktuurgeenid on vastavalt xylA, xylC ja xylB. Geen xylM osaleb ka ksüleeni monooksügenaasi subühikute moodustamises. Geene xylU ja xylW ei ole vaja tolueeni ja ksüleeni metaboliseerimiseks. Geen xylN sünteesib 52 kDa suurust valku, mis hiljem töödeldakse 47 kDa suuruseks valguks.

Alumine ehk meta-operon

Alumine operon – xylXYZLTEGFJQKIH – kodeerib bensoaadi ja toluaatide lagundamist Krebsi tsükli vaheühenditeks atseetaldehüüdiks ja püruvaadiks. Alumine operon moodustab 11 kiloaluspaari suuruse ala ning on üks suurimaid operone prokarüootides.
Meta-lõikuse operon koosneb 13st geenist. Geenid xylXYZ kodeerivad kolme toluaat 1,2-dioksügenaasi subühikut.
Geeni xylE produktiks on ensüüm katehhooli-2,3-dioksügenaas. Ensüüm koosneb neljast identsest subühikust, mille molekulmass on 35 kDa. TOL-plasmiidil pWW0 on ainult üks selline ensüüm. Teistel TOL-plasmiididel aga enamasti kaks.
Geen xylF kodeerib ensüümi 2-hüdroksümukonsemialdehüüdi hüdrolaas, mis kujundab ühte kataboolse raja osa. Selle ensüümi molekulmass on 65 kDa ning ensüüm on funktsionaalne dimeerina.
Geenid xylT ja xylQ funktsioonid pole teada.
Alumist rada kirjeldasid Sala-Trepat ja Evans kasutades Azotobacter tüvesid. Nad suutsid demonstreerida, et neid radu ühendab ühine vaheühend. Harayama jt näitasid, et erinevad algkomponendid metaboliseeritakse erinevates raja osades. Näiteks, m-toluaat lagundatakse xylF harus. Samas bensoaat ja p-toluaat lagundatakse xylGHI osas. Ensüümide afiinsused näitavad, missugune haru metaboliseerib mingit kindlat lähteühendit.

Geneetiline regulatsioon

TOL-plasmiidil pWW0 on teada kaks regulaatorgeeni, milleks on xylS ja xylR. Neid transkribeeritakse füüsiliselt lähedastel, kuid funktsionaalselt erinevatel promootoritel. Geeni xylR kodeeritud valgu XylR suuruseks arvatakse olevat 68 kDa. xylS geen kodeerib 36,5 kDa suurust valku.
Valk XylR on peamine TOL raja regulaator, mis kuulub suurde AAA+ ATPaaside perekonda. Meta-rajas osalev valk XylS kuulub XylS/AraC perekonda.
Kataboolsete operonide geneetiline regulatsioon väljendab nende biokeemilist organisatsiooni. TOL-plasmiidil pWW0 on kaks regulatoorset tsüklit. Meta-tsükkel reguleerib toluaadil kasvamist. Kaskaadne tsükkel, mis on kompleksne süsteem, reguleerib ksüleenil kasvamist. Lisaks kindlustab kaskaadne tsükkel ka ülemise ja meta-raja koordineeritud ekspressiooni.

Meta-tsükli funktsioon

Kui rakud kasvavad näiteks glükoosil või glütseroolil, ekspresseeritakse xylS geeni vähesel määral σ⁷⁰-sõltuvalt promootorilt Ps2-lt. Sünteesitakse väikeses koguses inaktiivset XylSᵢ valku. Kui aga kasvukeskkonda lisatakse bensoaati, interakteerub XylSᵢ bensoaadiga. Inaktiivne valk muutub aktiivseks XylSₐ-ks, mis stimuleerib transkriptsiooni meta-raja operoni promootorilt Pm-ilt.

Kaskaadse tsükli funktsioon

Geen xylR on peamine regulaator, mis osaleb kataboolse raja transkriptsiooni kontrollis, kui rakud kasvavad ksüleeni juuresolekul. Geeni xylR transkribeeritakse kahelt σ⁷⁰-sõltuvalt tandeemselt promootorilt. Valk XylR kontrollib ise oma sünteesi. Kui inaktiivne valk XylRᵢ seondub tolueeni või ksüleeniga, muutub ta aktiivseks valguks XylRₐ. Aktiivne valk stimuleerib transkriptsiooni ülemise raja operoni promootorilt Pu. See protsess vajab σ⁵⁴ sisaldavat RNA polümeraasi ning histoonilaadset valku IHF-i. Aktiveeritud XylR indutseerib transkriptsiooni ka teiselt σ⁵⁴-sõltuvalt promootorilt Ps1, stimuleerides geeni xylS ekspressiooni. Seda protsessi abistab histoonilaadne valk HU. Kokkuvõttes ekspresseeritakse geeni xylS kahelt promootorilt: xylS promootorilt Ps2, mis ei sõltu valgust XylR, ja promootorilt Ps1, mis on XylR sõltuv. Kui geen xylS on üleekspresseeritud,  toodetakse valku XylS liiga palju, mistõttu teatud hulk XylS valgust muutub aktiivseks, isegi kui puudub meta-rada aktiveeriv substraat.