Reaalaja polümeraasi ahelreaktsioon

Taustinfo

Rakud reguleerivad geeniekspressiooni RNA-dega või valkudega. Oluline on, kui palju mingit kindlat valku sünteesitakse. Et seda saaks mõõta, on vaja geeni transkripti paljundada. Üheks enamlevinud meetodiks DNA amplifitseerimiseks on polümeraasi ahelreaktsioon ehk PCR, RNA uurimiseks viiakse läbi pöördtranskriptsioon ning saadakse cDNA ehk komplementaarne DNA. 
DNA amplifitseerimiseks kasutatakse soovitud DNA lõiku šabloonina, disainitakse vastavale lõigule kaks praimerit (5'-3' ahelale ja 3'-5' ahelale), lisatakse desoksüribonukleotiide, mis on DNA ahela komponendid, lisatakse sobiv puhverlahus, mis loob sobiva keskkonna sünteesimiseks, ja termostabiilne DNA polümeraas (tööd tehakse teatud etappides kõrgetel temperatuuridel). Enamlevinuks polümeraasiks on Taq polümeraas. Lahusesse lisatakse ka 
fluorestseeruvat ainet, et hiljem oleks võimalik kindlal lainepikkusel mõõta produkti kogust. Kvantitatiivne PCR võimaldab kogust mõõta iga tsükli lõpus, kuid tavalise PCR puhul saame produkti kogust hinnata kogu protsessi lõpus. Siit tuleb ka qPCR-i üks nimetustest: reaalaja PCR. Juhul kui sünteesitakse cDNA pealt produkti, siis nimetatakse seda ka q-RT-PCR-iks (lühend ingliskeelsest väljendist quantitative-reverse transcription-polymerase chain reaction).
* Lühend RT-PCR võib segadusse ajada, sest seda kasutatakse kahes tähenduses: revertaasi-transkriptsiooni polümeraasi ahelreaktsioon ja reaalaja polümeraasi ahelreaktsioon.

Mõisted

Reaalaja PCR andmeanalüüsiks vajalikud põhimõisted:
algtase (baseline) – näitab signaali taset esimeste tsüklite ajal (enamasti kuni 15 tsüklit), näitab vähest fluorestseeruvat signaali. Algtaset määratakse ka kui taustamüra;
läviväärtus (threshold) – signaalitase, mis peegeldab statistiliselt suurt tõusu võrreldes algtasemega, kuid peab jääma PCR-i eksponentsiaalsesse faasi. Määratakse lävitsükkel (CT);
lävitsükkel (threshold cycle ehk CT) – CT on tsüklite arv, millal reaktsiooni fluorestseeruv signaal ületab läviväärtuse. CT oleneb ka DNA kogusest;
sulamiskurv – peegeldab fluorestseeruva signaali muutust, kui kaheahelaline DNA koos värvimolekulidega dissotseerub üheahelaliseks DNA-ks (sulamine toimub temperatuuri tõusu tagajärjel). Kui võrrelda fluorestseeruvat signaali muutust temperatuuri muutusega, siis saame selge pildi sulamise dünaamikast. Samuti annab see meile infot, kas tegu on ühe produktiga või on proov saastunud.

MikroRNA analüüs

MikroRNA analüüsiks tuleb RNA isoleerida, profileerida (RNA tüüpimine), paljundada ja see kinnitada. 
MiRNA-d on väikesed, väga konserveerunud RNA molekulid, mis reguleerivad raku arengut, raku tsüklit ning takistavad rakkude kontrollimatut paljunemist. Aktiivne miRNA on üheahelaline molekul, keskmiselt 17–24 nukleotiidi pikk. Arvatakse, et rohkem kui kolmandik geenidest on reguleeritud miRNA-de poolt.

Geeni variatsiooni analüüs

Reaalaja PCR seadmeid ja metoodikat kasutatakse ka geeni variatsiooni analüüsideks. Need tehnikad pole kvantitatiivseteks mõõtmisteks ja genotüüpimiseks kasutatakse alleeli-spetsiifilisi proovide-komplekte. Andmed kogutakse pärast kõikide tsüklite lõppu.
Teadlased, kes uurivad geenide funktsioone, peavad arvestame geenide variatsioonidega. Geenide variandid võivad olla looduses mitmekesised, alates ühest nukleotiidi variandist, tandeemsetest järjestustest, väiksematest insertsioonidest või deletsioonidest kuni suurte koopiaarvude variantideni. Varem oli vähe informatsiooni geneetilisest variatsioonist, kuid nüüd tänu meetodite arengule on infot palju.