Sekveneerimine

Sekveneerimine ehk järjestusanalüüs ehk järjendamine (inglise sequencing) on monomeeride (nukleotiidide, aminohapete) järjestuse kindlaksmääramine informatsiooniliste biopolümeeride (DNA, RNA, valkude) molekulides.
Sekveneerimine annab tulemuseks märkidest koosneva tõlgenduse, mida nimetatakse sekventsiks, ja kirjeldab suuremat osa sekveneeritud molekulist. "Suuremat osa" kirjeldab ta sellepärast, et sekveneerimismeetodid ei ole täiuslikud. Näiteks DNAd sekveneerides antakse järjestus nelja erineva nukleiinhappejäägi jadana (lühendatult A, T, C, G), kuid rakus endas võivad need olla modifitseeritud ehk sekveneerimisel tulemuseks saadud A ei pruugi olla sama rakus päriselt oleva monomeeriga. Samuti annab sekveneerimine tulemuseks polümeeri järjestuse, kuid ruumiline struktuur tuleb leida teiste meetodite abil ja see võib olla vägagi keeruline.
Sekveneerimine on tänapäeva bioteaduste alal üks vajalikumaid tehnikaid. Ilma selleta oleks näiteks pea võimatu koostada evolutsioonipuid või arendada välja kindlaid mehhanisme sihtivaid ravimeid ja isegi teada neidsamu mehhanisme tuvastada, sest kõige selle jaoks oli vähemalt mingis etapis kasutatud biomolekulide sekveneerimist.

Kronoloogia

1943. aastal näitasid Oswald Avery, Colin MacLeod ja Maclin McCarty, et DNA kannab pärilikkuse informatsiooni.
1951. aastal tegi Frederick Sanger kindlaks veise insuliini aminohappelise järjestuse.
1953. aastal avaldasid James D. Watson ja Francis Crick artikli DNA kaksikheeliksmudeli kohta.
1957. aastal sõnastas F. Crick molekulaarbioloogia põhidogma.
1965. aastal suudeti sekveneerida 77-nukleotiidiline lõik seene tRNAst (Robert W. Holley grupp).
1977. aastal avaldasid Allan Maxam ja Walter Gilbert artikli "DNA sequencing by chemical degradation" (DNA sekveneerimine keemilise degradatsiooni abil), 
Frederick Sanger tuli samal ajal välja enda meetodiga, DNA sekveneerimine ahela terminatsiooni abil.
1984. aastal dešifreerisid Medical Research Counsili teadlased Epsteini-Barri viiruse kogu genoomi (170 kb)
1987. aastal tuli Applied Biosystems turule esimese automatiseeritud sekvenaatoriga, mudel ABI 370.
1990. aastal alustati projektiga sekveneerimaks inimese genoomi (Human Genome Project HGP).
1996. aastal leiutasid Pål Nyrén ja Mostafa Ronaghi pürosekveneerimise.
1998 alustas Celera Genomics enda projektiga sekveneerimaks inimese genoomi.
2000. aastal tuli Lynx Therapeutics välja esimese, kuid kohmaka järgmise põlvkonna sekvenaatoriga.
2001. aastal avaldasid nii Human Genome Project kui ka Celera enda esialgsed genoomid.
2004. aastal tuli 454 Life Sciences välja pürosekveneerimisel põhineva järgmise põlvkonna sekvenaatoriga, mis vähendas sekveneerimishindu automatiseeritud Sangeri sekvenaatoriga võrreldes kuuekordselt.

Sangeri sekveneerimine

Sangeri sekveneerimise ehk ahela termineerimise metoodika oli 1980. aastatest alates põhiline DNA sekveneerimise meetod (laialdane kasutus tänapäevalgi). Järgmise põlvkonna sekveneerimistehnoloogiad on hakanud eelmise kümnendi keskpaigast alates sekveneerimist enda peale võtma ja enamik sekveneerimise informatsioonist tuleb tänapäeval sealt. Sellegipoolest ei tasuks alahinnata selle meetodi panust bioteadustesse. Suurem osa eri liikide genoome, mis sekveneeriti enne järgmise põlvkonna sekvenaatorite ajastut (sealhulgas ka inimese oma), sekveneeriti selle sama metoodika abil. Lisaks kasutati Sangeri sekveneerimist ka teiste biopolümeeride, valkude ja RNA, kaudseks sekveneerimiseks, sest nende sekveneerimine otse on keerukam.
Ahela terminatsiooni meetod vajab üheahelalist DNAd, DNA praimerit, polümeraasi, vastavaid desoksüribonukleotiidtrifosfaate (dNTP) ja modifitseeritud nukleotiide (didesoksüNTP-d e. ddNTP), millel puuduvad sünteesi jätkamiseks vajalikud 3’-OH rühmad. Kõigepealt liituvad DNA praimerid DNA maatriksmolekuliga täpselt samast kohast, siis seondub sinna DNA polümeraas. Edasine põhimõte seisneb algsele üheahelalisele DNA molekulile komplementaarse vastasahela sünteesis sel moel, et vastasahela süntees katkeks juhuslikul hetkel, kuid kindlat tüüpi nukleotiidi (kas siis A, T, C või G) juures. Algselt saavutati see, viies vastasahela süntees läbi neljas eri reaktsiooninõus, kus igas nõus asus vaid ühte tüüpi ddNTPd. Kuna igas nõus on korraga väga palju samasuguseid DNA maatriksmolekule, tekib ddNTPde juhuslikul ahelasse liitumisel suur kogus erineva pikkusega DNA ahelaid, mis lõppevad kindla nukleotiidiga. Need ahelad tuleb siis panna kõrge lahutusvõimega geelile, iga reaktsioonitüüp eri rajale ja sealt lahutuvad nad pikkuse alusel kindlasse järjekorda. Nelja rada korraga vaadates saab DNA järjestuse kindlaks teha. Automatiseeritud masinates kasutatakse reaktsioonisegus nelja eri ddNTPd korraga, iga ddNTP eri värviga flourestsentseeruvalt märgistatud. Tänu sellele ei ole vajadust reaktsiooni neljas eri nõus läbi viia ja ka geelil, mis asub masinates kapillaari sees, piisab ühest ainsast rajast, et järjestus edukalt välja lugeda.
ddNTP (varem märgistati ka praimereid ning dNTP-sid) märgistatakse kas fluorestsentselt või radioaktiivselt , et hiljem eri nukleotiididel vahet teha. Siis viiakse nende koostisosade abil läbi DNA vastasahela süntees, mis mingil hetkel lülitab endasse ka ddNTP, mille peale ahela süntees lõpeb. Pärast seda denatureeritakse reaktsioonisegu ja sünteesitud eri pikkustega DNA ahelad liiguvad geelil eri kiirusega, ja on seetõttu eristatavad. Algupärases meetodis pandi iga ddNTP-ga tehtud reaktsioon polüakrüül-uurea geeli eri rajale ja saadi selle kaudu sekvents teada, kuid tänapäeval saab eri lainepikkusega fluorestseeruva ddNTP kaudu teha neil vahet ka läbi ühe raja jooksutades. Automatiseeritud masinates on see rada kapillaari sees, mis jookseb mõõteandurite eest läbi, andes sellega järjestuse.

Järgmise põlvkonna sekveneerimine

Kuigi Inimese Genoomi Projekt (HPG) oli edukas, olid ka selle kulud väga suured: 13 aastat kestnud projekti hinnaks kujunes üle 3 miljardi dollari. Kuna vajadus ülegenoomsete andmete järele oli väga suur, siis tuli leida uusi ja odavamaid viise DNA sekveneerimiseks. Suuna näitas kätte Lynx Therapeuticsi RNA sekvenaator. Sellel tehnikal oli küllaldaselt vigu, näiteks lühikesed readide pikkused (17–20 aluspaari), kuid massiivse paralleelse sekveneerimise põhimõttel oli potentsiaal ühe sekveneerimisega genereerida üüratul hulgal andmeid. Esimesena tulid enda NGS platvormiga välja Jonathan Rothbergi asutatud 454 Corporation (aastal 2004). Samal ajal töötasid S. Balasubramanian ja D. Klenerman välja enda sekveneerimistehnoloogiat ja asutasid firma Solexa. Nende sekvenaator oli esimene instrument, mis oli võimeline genereerima 1 GB andmeid ühe jooksuga. Esialgsed readid olid aga kõigest 26 aluspaari pikad, kuid nende tehnoloogias oli potentsiaali ja aastal 2007 maksis Illumina selle tehnoloogia eest 600 miljonit USA dollarit. George Church ja tema kolleegid tulid 2005 välja enda sekveneerimistaktikaga, mille ostis ära Applied Biosystems. Need kolm firmat on haaranud suurema osa teise põlvkonna sekvenaatorite tootmise turust ja esialgsed seadmete andmetootmismahud on suurenenud sadu kordi.
Erinevates teise põlvkonna sekveneerimisplatvormides kasutatakse erinevaid, üksteisele järgnevaid tehnikaid, kuid neid saab sarnasuste abil koondada järgmiselt: maatritsi (inglise keeles template) valmistamine, sekveneerimine ja signaali lugemine.
Alguses tuleb valmistada DNA-genoteek ehk genoomiraamatukogu (inglise keeles library), mis kujutab endast ühtlase pikkusega adapteritega DNA juppe. Siis tuleb genoteegis olevad jupid seondada pinnale, millelt toimub hilisem sekventsi väljalugemine, ning enamikul platvormidel toimub selles kohas ka kohalik PCR võimendus. Illumina puhul näeb see protsess välja nii, et DNA-genoteegi üksik molekul seondub kiibile kusagile suvalisele kohale, mis asub teistest genoteegi molekulidest suhteliselt kaugel ja sinna moodustub spetsiaalse PCR lahenduse kaudu tihe grupp samu molekule. Sealt edasi toimub kõikidel platvormidel erinev, kuid põhimõttelt mingisugust sünteesireaktsiooni kasutav vastasahela süntees, kus iga uue nukleotiidi või oligomeeri lisandumisel registreeritakse mingisugune signaal (enamasti kindla lainepikkusega valgus). Kuigi kiipidele paigutumine oli algselt juhuslik, ei muutu maatriksahela asukoht ja seade on võimeline järjestama samast asukohast pärit olevaid signaale readiks. Siit tulebki NGS platvormide suur eelis Sangeri sekvenaatorite ees, sest kuigi Sangeri sekvenaatorid genereerivad enamasti pikemaid reade, ei ole võimalik paigutada nii paljusid kapillaare paralleelselt, kui seda NGS platvormid suudavad. Näiteks loeb Illumina võimsaim masin järjestusi ühelt kiibilt (flow cell) paralleelselt 3 miljardist positsioonist.
NGS sekvenaatoritest tulevad toorandmed koosnevad suhteliselt lühikestest juppidest. Olenevalt platvormist on keskmised readid mõnikümmend kuni 700 aluspaari pikad. Inimese puhul oleks sääraste juppide osalise kattuvuse abil genoomi koostamine tarbetult arvutusvõimsust kulutav operatsioon. Selle asemel võrreldakse neid juppe juba teada oleva genoomiga ja kaardistatakse need jupid sinna. Kogu protsess nõuab arvutitelt sellegipoolest väga palju ja tänapäeval on nende tehnoloogiate viga juba selles, et arvutusvõimsus ei kasva nii kiiresti, nagu kasvab andmete tekitamispotentsiaal.