Proteiinkinaas B

AKT ülevaade ja isovormid

AKT/PKB ehk proteiinkinaas B on seriin- või treoniinkinaas, millel on oluline roll mitmetes raku protsessides. Substraate fosforüleerides osaleb AKT glükoosi metabolismi, apoptoosi, translatsiooni, rakkude jagunemise ja migratsiooni regulatsioonis. Rakkude jagunemist reguleerib AKT läbi tuuma lamiinide fosforüleerimise, mille tulemusena on võimalik läbida rakutsükli G2/M kontrollpunkt ja toimub tuumaümbrise lagunemine mitoosis. Tuumaümbrise lagunemine on eelduseks tütarrakkude tekkele. AKT on PI3-K signaaliraja üks komponente ning arvatakse, et on seeläbi seotud vähirakkude vohamise ning teistesse kudedesse tungimisega.
AKT leidub rakus kolme järgneva isovormina: AKT1 ehk PKBα, AKT2 ehk PKBβ ning AKT3 ehk PKBγ. AKT isovormid on kodeeritud erinevate geenide poolt, mis paiknevad erinevates kromosoomides, kuid sellest olenemata on kõigil isovormidel sarnane struktuur. Erinevate isovormide vaheline homoloogia on 80%.
AKT1 osaleb raku ellujäämise regulatsioonis läbi apoptoosi inhibeerimise ning indutseerib valgu tootmist, mis avaldub AKT1-defektsete hiirte väiksemas kasvus. Valkude sünteesi reguleerimise kaudu mõjutab AKT1 ka kudede kujunemist ja arengut. Apoptoosi inhibeerimise tõttu mängib antud isovorm olulist rolli erinevate kasvajavormide arengul. AKT2 on oluline komponent insuliini signaalirajas ja seega vajalik glükoosi homöostaasi hoidmiseks. AKT2 defektsed hiired on diabeedile iseloomuliku fenotüübiga. AKT3 roll on ebaselge, kuid peamiselt on selle ekspressiooni tuvastatud ajus. AKT isovormid on üleekspresseeritud mitmetes kasvajates.

AKT struktuur

AKT/PKB kuulub proteiinkinaaside perekonda, mis sõltuvad cAMP-st. Kõikidel selle perekonna kinaasidel on homoloogiline struktuur ja sarnane aktivatsiooni mehhanism. AKT isovormid on sarnase ülesehitusega, sisaldades PH-domeeni, kinaasi domeeni ja C-terminaalset regulatoorset domeeni, mis sisaldab hüdrofoobset motiivi.
N-terminaalne PH-domeen koosneb keskmiselt 120 aminohappest ja interakteerub PIP3-ga (fosfatidüülinositool-3,4,5-trisfosfaat, ingl phosphatidylinositol-3,4,5-trisphosphate), mis on seotud membraaniga. PH-domeenist C-terminuse poole jäävad katalüütiline domeen ning regulatoorne domeen. Katalüütilise domeeni koosseisus on konserveerunud treoniinijääk, mille fosforüleerimine on vajalik AKT aktivatsioonil. Kinaasi domeenile järgneb C-terminaalne regioon, mis sisaldab hüdrofoobset motiivi: F-X-X-F/Y-S/T-Y/F (F- fenüülalaniin, Y- türosiin, S- seriin, T- treoniin, X- varieeruv aminohape). Hüdrofoobse domeeni seriini- ja treoniinijäägid peavad olema fosforüleeritud, et tagada AKT täielik aktiivsus. Esimesena toimub aga AKT kotranslatsiooniline fosforüleerimine mTORC2 poolt positsioonis T450. mTORC2 on seotud endoplasmaatilise retiikulumi ehk tsütoplasmavõrgustikuga ning antud fosforüülimine stabiliseerib AKT ning kaitseb valku lagundamise eest. PH-domeeni ja katalüütilise regiooni kinaasi vahele jääb lühike α-helikaalne regioon, mille funktsioon on ebaselge, kuid mis võib võimaldada AKT spetsiifilist toimimist.

AKT aktiivsuse regulatsioon

AKT funktsioneerimist kontrollitakse läbi aktiveerimise ja inhibeerimise. Aktiveerimisel on olulised signaalirajad, mille tulemusena AKT fosforüleeritakse. AKT aktiivsuse inhibeerimiseks on vajalik aga fosfataaside stimuleerimine.

PI3K/AKT/mTOR signaalirada

AKT erinevad isovormid omavad ühist mitmeetapilist aktiveerimisrada, mis on võimalik sarnase struktuuri tõttu. Kõik AKT isovormid lokaliseeruvad inaktiivsena tsütoplasmas. AKT aktiveeritakse plasmamembraani tsütoplasma poolesel küljel, kuhu AKT on seondunud PIP3 abil.
PI3K signaalirada on keeruline võrgustik, mis algab ligandi (nt kasvufaktori) seondumisega retseptor türosiinkinaasiga (RTK). RTK on rakumembraanil asuv retseptor, mille tsütoplasmaatilisel poolel on türosiinkinaas. Kasvufaktori seondumine toob kaasa türosiinkinaaside dimeriseerumise ja vastastikuse fosforüleerimise ehk trans-autofosforüleerimise. Tekkinud fosfotürosiiniga seondub heterodimeerne fosfoinositiid-3-kinaas (PI3K), mis koosneb katalüütilisest (p110) ja regulatoorsest (p85) alaühikust. Fosfotürosiiniga seondumise tulemusel muutub PI3K konformatsioon ning aktiveeritakse katalüütiline alaühik, mis fosforüleerib fosfatidüülinositool-4,5-bisfosfaadi (PIP2) fosfatidüülinostiool-3,4,5-trisfosfaadiks (PIP3). PIP3-ga seondub PH- domeeni kaudu AKT ehk AKT liigub tsütoplasmast plasmamembraanile. Plasmamembraanile kinnitunud AKT aktiveeritakse mitme järjestikuse etapi tulemusel. Lisaks AKT-ile seondub PIP3 abil plasmamembraanile fosfoinositiidist sõltuv kinaas 1 (PDK-1). Membraanile kinnitumine kutsub esile PDK-1 konformatsiooni muutuse, mille tagajärjel muutub aktiivseks kinaasse aktiivsusega domeen. Aktiveeritud kinaas fosforüleerib AKT treoniinijäägi (T308). AKT täielikuks aktiveerimiseks on vajalik veel seriinijäägi (S473) fosforüülimine, mis kuulub C-terminaalse hüdrofoobse motiivi koosseisu. Seriini fosforüleerimise mehhanism ei ole täielikult selge. On pakutud küll mitmeid kandidaatkinaase, mis on rakutüüpidele spetsiifilised ja universaalset kinaasi ei ole leitud. Seriinijäägi fosforüülimine on üks aktivatsiooni olulisemaid sündmusi, sest see tagab AKT aktiivse konformatsiooni stabiilsuse.
Pärast T308 ja S473 fosforüülimist vabaneb AKT tsütoplasmasse või translokeerub tuuma. Seega on seondumine membraaniga lühiajaline. Tsütoplasmas säilitab AKT katalüütiliselt aktiivse konformatsiooni ning võib rakusiseselt liikuda oma substraatide juurde. Tsütoplasmas aktiveerib AKT näiteks mTORC1 (ingl mammalian target of rapamycin complex 1).

Fosfataasid ja PIP3

Fosfataasid kontrollivad PI3K-st sõltuvat AKT aktivatsiooni. PTEN on fosfataas, mis kuulub tuumorsupressorvalkude hulka. Tuumorsupressorite ülesanne on inhibeerida rakkude jagunemist ja kasvajate ehk tuumorite kujunemist. PTEN on PI3K antagonist ehk defosforüleerib PIP3 PIP2-ks. PIP3 puudumine ei võimalda AKT-il raku plasmamembraanile kinnituda ning ühtlasi välistab AKT fosforüleerimise. PTEN aktiivsuse korral AKT ja tema substraatide aktiivsus väheneb märkimisväärselt.
PIP3 võivad 5’-positsioonis defosforüleerida ka SHIP perekonda kuuluvad inositoolfosfataasid SHIP1 ja SHIP2. Vastavad ensüümid defosforüleerivad samuti PIP3 PIP2 tekkega.

AKT degradeerimine

Normaalsetes rakkudes fosforüleeritakse AKT kotranslatsiooniliselt T450-positsioonis (türosiinijääk 450). Kui antud aminohappejäägile fosfaatrühma ei lisata, ei voltu valk õigesti. Defektse konformatsiooniga AKT-ile lisatakse ubikvitiinijääk, mis suunab valgu proteasoomi. Proteasoomis lagundatakse valgud proteaaside ehk proteolüütiliste ensüümide poolt.
Lisaks võib toimuda AKT fosforüleerimine positsioonides T308 ja S473 vastusena IGF-1-le (insuliini sarnane kasvufaktor 1, ingl insulin-like growth factor 1). Tulemuseks on polüfosforüleeritud AKT, millele lisatakse ubikvitiinijääk. Suurem osa polüfosforüleeritud ja ubikvitinüleeritud AKT-ist lagundatakse samuti proteasoomis. Osa modifitseeritud AKT-ist translokeerub tuuma, kus fosforüleerib oma substraadid. Kasvajatest leitud mutantne AKT1 (E17K, 17. aminohape PH-domeenis on asendunud) on sagedamini fosforüleeritud ja ubikvitinüleeritud kui metsiktüüpi (ingl wild type ) AKT. Lisaks translokeerub AKT1-E17K efektiivsemalt tuuma ja võib seeläbi olla seotud kasvajate kujunemisega. AKT-E17K mutantset varianti on leitud näiteks inimese rinna- ning kopsuvähi rakkudest.

Funktsioon

Aktiveeritud AKT translokeerub tsütoplasmasse ja tuuma, kus paiknevad ensüümi substraadid. AKT mõjutab substraate läbi fosforüleerimise. Fosforüleerimine võib olla stimuleeriv või inhibeeriv ehk substraate aktiveeriv või inaktiveeriv.

Rakkude ellujäämine ja apoptoos

Aktiveeritud AKT mõjutab mitmeid faktoreid, mis osalevad apoptoosis, läbi transkriptsiooni reguleerimise või otsese fosforüleerimise. Tuumas inhibeerib AKT transkriptsioonifaktoreid, mis on vajalikud apoptoosiks, ja stimuleerib antiapoptootiliste geenide avaldumist. Lisaks aktiveerib AKT transkriptsioonifaktoreid, mis on olulised ellujäämist tagavate geenide ekspressioonil. Näiteks fosforüleerib AKT IκB kinaasi ja võimaldab seeläbi transkriptsioonifaktor NFκB aktiivse vormi tekkimise. Antud transkriptsioonifaktor on samuti oluline apoptoosi regulatsioonis, lisaks mõjutab rakkude kasvu, kudede arengut ja immuunvastust.

Rakutsükkel

AKT võimaldab rakutsüklis G1-S-faaside vahelist üleminekut, fosforüleerides ja inaktiveerides glükogeeni süntaas-kinaasi 3 (GSK-3). See takistab tsükliin D1 ja β-kateniini degradatsiooni. Tsükliini ja β-kateniini kuhjumine omakorda suurendab tsükliin D1 ekspressiooni ehk toimub positiivne tagasiside. AKT suurendab ka tsükliin D1 translatsiooni läbi mTOR fosforüleerimise. mTOR on seriin- või treoniin-proteiinkinaas, mille üheks märklauaks on valkude sünteesi regulatsioon. Tsükliinide kuhjumine võimaldab ülemineku rakutsükli järgmisse faasi. S-faasis toimub DNA replikatsioon, mis on vajalik rakkude jagunemiseks.

Rakkude migratsioon

AKT fosforüleerib mitmeid valke, mis osalevad tsütoskeleti komponendi aktiini polümeriseerimisel ja stabiliseerimisel. Näiteks fosforüleerib AKT valku girdin, mis mõjutab filamentide paiknemist ja on hädavajalik migratsioonil. Normaalsetes rakkudes aktiini polümeriseerumine stabiliseerib teisi tsütoskeleti komponente või kutsub esile rakkude migratsiooni tsütoskeleti ümberkujundamise tulemusel. Lisaks interakteerub AKT teiste tsütoskeleti komponentidega. Näiteks fosforüleerib AKT vimentiini ja seeläbi takistab antud filamendi degradatsiooni. Vimentiin on vajalik normaalsete kudede stabiliseerimiseks.

Seos kasvajatega

AKT reguleerib rakkude vohamist, kasvu (suurust), liikuvust, glükoosi metabolismi ja angiogeneesi ehk veresoonte moodustumist. Nende protsesside regulatsioonihäired viivad kasvaja tekkeni. Mitmed uuringud on näidanud, et paljudes kasvajatüüpides on AKT üleaktiveeritud ning see on muutnud AKT signaaliraja oluliseks kasvajavastase võitluse märklauaks. AKT üleaktiveeritus võib olla saavutatud järgnevate muutuste kaudu: AKT geeni amplifikatsioon või liiga kõrge transkriptsioonitase ning PTEN inaktivatsioon.

Angiogenees

Angiogenees on uute veresoonte moodustumine ning see on hädavajalik kasvajarakkude elus püsimiseks ning toitainetega varustamiseks. AKT aktiveerib endoteliaalse lämmastikoksiidi süntaasi (eNOS), mis suurendab lämmastikoksiidi (NO) tootmist. Lämmastikoksiid osaleb veresoonte ümberkujundamises.

Glükoosi metabolism

Kasvajarakkudes on AKT seotud glükoosi metabolismi aktiveerimisega. Kasvajarakud eelistavad energiat saada glükolüüsi kaudu, mitte oksüdatiivse fosforüleerimise teel, isegi kui hapnikuallikas on olemas. Sellist moodust nimetatakse Warburg-i efektiks või aeroobseks glükolüüsiks. AKT suurendab glükoosi transporterite GLUT1 ja GLUT4 arvu plasmamembraanil, aktiveerib heksokinaasi ekspressiooni ning fosforüleerib GSK3 (glükogeen süntaas-kinaas 3). Need muutused mõjutavad glükoosi metabolismi ning stimuleerivad glükogeeni sünteesi. Lisaks mõjutab AKT glükolüüsi kaudselt, läbi transkriptsioonifaktorite ning fosfofruktokinaas-2 (PFK2) fosforüleerimise. PFK2 omakorda aktiveerib fosfofruktokinaas-1 (PFK1).