Mitteinvasiivne sünnieelne diagnostika

Mitteinvasiivne sünnieelne diagnostika on üks diagnostika võimalusi, mille eesmärk on võimalikult vähese sekkumisega raseduse kulgu määrata võimalikult täpselt ning usaldusväärselt loote võimalikke arenguhäireid. 
Sünnieelne diagnostika on loote kaasasündinud arenguhäirete uurimine. Keskendutakse nii geeni- kui ka kromosoomihäiretele, aga ka väärarendite ning kaasasündinud haiguste tuvastamisele. Sünnieelse diagnostika saab jagada kaheks – mitteinvasiivne ja invasiivne diagnostika. Invasiivseid meetodeid iseloomustab kõrge sekkumise tase ning küllalt suur oht raseduse katkemiseks pärast protseduuri. ‎‎‎‎ Seega on vaja viia mainitud meetodite kasutamine võimalikult minimaalseks, et välistada liigne oht rasedusele. Selleks on võetud kasutusele mitteinvasiivsed diagnostikameetodid. ‎ Mitteinvasiivsete diagnostikameetodite hulka kuuluvad näiteks ultraheliuuring, kardiotokograafia, aga ka ema veres leiduvate diagnostiliste tunnuste ehk markerite kindlaksmääramine. ‎‎‎‎

Testide metoodika

Mitteinvasiivsete sünnieelse diagnostika meetodite väljatöötamisel on probleemile võimalik läheneda erinevaid teid pidi. Testi väljatöötamisel lähtutakse ema veres ringlevast loote geneetilisest materjalist, mis võib olla nii DNA kui ka RNA kujul.

DNA-põhised meetodid

DNA-põhised meetodid lähtuvad enamasti loote rakuvabast DNA-st (cffDNA) ema veres. cffDNA satub ema verre kui trofoblasti rakud, mis moodustavad platsenta, surevad apoptoosi teel. See moodustab kogu ema veres ringlevast DNA-st ligikaudu kümnendiku. CffDNA on heaks loote geneetilise materjali allikaks lisaks mitteinvasiivsele kogumisvõimalusele veel kahel põhjusel – see on ema veres tuvastatav juba raseduse esimesel kolmandikul ning see kaob ema verest küllalt kiiresti pärast sünnitust.  Selleks, et eraldada ema veres loote DNA ema DNA-st, on mitmeid meetodeid.

Geelelektroforees

CffDNA moodustab kogu ema veres leiduvast rakuvabast DNAst üsna väikese osa ning seetõttu on vaja meetodit, mis võimaldaks cffDNA eraldada ema rakuvabast DNAs-t. Kuna cffDNA fragmendid on reeglina väiksemad kui ema rakuvaba DNA, võiks kasutada näiteks geelelektroforeesi, et eraldada teatud suuruses DNA fragmendid. See meetod on üsna aeganõudev, annab üsna ebastabiilseid tulemusi ega sobi seetõttu laialdasemaks kasutuseks. ‎‎

Epigeneetiliste mustrite analüüs

Teine võimalus loote DNA-d ema omast eraldada on uurida loote DNA epigeneetilisi markereid, mis erinevad ema DNA-st. Tegemist on muutustega geenide avaldumise regulatsioonis, mitte konkreetsetes DNA järjestustes, ning enamasti kantakse need edasi teatud DNA järjestuste metülatsiooni abil. Kui mõnda geeni on vaja ekspresseerida, siis on tema promootorala reeglina üsna madala metülatsioonitasemega ehk hüpometüleeritud ja sisaldab vähe lisametüülrühmadega tsütosiine. Samas kui geeni ekspressioon on vaja alla suruda, on vastav ala hüpermetüleeritud ehk sisaldab keskmisest rohkem metüleeritud tsütosiini molekule.  Erinevate uuringutega on näidatud, et ema veres ringlev loote DNA on pärit platsentast. Platsentas ning loote arengu käigus avalduvad hoopis erinevad geenid nendest, mis parajasti ema organismis kõrgelt ekspresseeritud on ning seetõttu esinevad ka erinevused DNA metülatsioonimustris. Siin võib eristada kahte suunda – juhud, kus loote DNA piirkond on hüpometüleeritud ning emal hüpermetüleeritud, või vastupidi – lootel hüpermetüleeritud ja emal hüpometüleeritud.‎
Kui võtta uurimisel aluseks DNA epigeneetilised mustrid, on võimalik tuvastada tavalisemates kromosoomiarvu häireid põhjustavates kromosoomides DNA piirkondi, mille puhul metülatsioonimuster erineb emal ja lootel. Sel juhul saab eraldada konkreetse metülatsioonitaseme järgi loote vastava DNA lõigu, seda mitmekordistada polümeraasi ahelreaktsiooni (PCR) abil ning võrrelda selle taset normaalse kromosoomistiku puhul esinevaga. ‎‎

Loote DNA hüpometülatsioon

Olukorras, kus loote DNA uuritav lõik on hüpometüleeritud ja sisaldab võrdlemisi vähe metüülrühmi, peaks ema DNA olema hüpermetüleeritud. Üheks näiteks on SERPINB5 geeni promootorala. See geen asub 18. kromosoomis ning on seega heaks markeriks selle kromosoomi trisoomia testimisel. Teadlastel õnnestus metülatsioonspetsiifilise polümeraasi ahelreaktsiooni abil see loote geen eraldada ema rakuvabast DNA-st ema veres ning tõestada ka selle seos rasedusega. SERPINB5 on esimene tuvastatud universaalne cffDNA marker, mida saab kasutada sõltumata loote soost ja genotüübist. Kasutatud metoodikal on siiski üks oluline viga – selline metülatsioonispetsiifiline PCR põhineb DNA töötlemisel vesiniksulfitiga, mis muudab metüleerimata tsütosiini uratsiiliks ning lagundab seetõttu ligikaudu 95% analüüsitavast DNA-st. ‎‎

Loote DNA hüpermetülatsioon

Olukord, kus on hüpermetüleeritud loote DNA ning ema vastava geeni promootorala on hüpometüleeritud, pakub tunduvalt perspektiivikamaid võimalusi sobilike DNA markerite leidmiseks. Sel juhul pole probleemiks ka metülatsioonspetsiifilise PCR käigus kasutatav vesiniksulfitiga töötlemine, sest see ei kahjusta hüpermetüleeritud DNA-d. Geene, mille promootorala on lootes hüpermetüleeritud ning ema DNA-s hüpometüleeritud, on tuvastatud nii 13., 18. kui ka 21. kromosoomis.‎‎

RNA-põhised meetodid

Nagu mainitud, on platsenta hea allikas loote geneetilise materjali saamiseks. Sarnaselt cffDNA-ga eritab platsenta ka loote rakuvaba RNA-d (cffRNA), kuid tunduvalt suuremas koguses kui cffDNA-d. Samas on RNA isoleerimine tehniliselt palju keerulisem ning RNA-de koostises ja avaldumise tasemes esineb populatsioonis väga palju variatsioone. Test, millega saaks määrata kõigi populatsioonis esinevate raseduste korral geneetiliste häirete esinemist, peaks sisaldama enam kui ühe markeri samaaegset määramist ühe kromosoomi jaoks, et välistada polümorfismidest tingitud valenegatiivsed tulemused. Praeguseks on tuvastatud mitmed markeriks sobilikud mRNA molekulid, mis on transkribeeritud 13., 18. või 21. kromosoomilt.‎‎

Kromosoomide arvu hindamine

Kui ema verest on tuvastatud sobilik DNA või RNA marker, tuleb selle hulk kvantiteerida ning määrata kindlaks, kas tegemist on euploidse või aneuploidse lootega. Praeguste teadmiste juures on üks töökindlamaid viise seda teha alleelide suhte hindamine. Alleelide suhte hindamisel kasutatakse üksiknukleotiidsete polümorfismide (SNP) määramist.‎‎ Kuna loode pärib ühe alleeli ühelt vanemalt ning teise teiselt, peaks heterosügootse euploidse loote korral ema veres nende omavaheline suhe olema ligikaudu 1:1. Kui aga tegemist on aneuploidse lootega, erineb see suhe märkimisväärselt. Erinevaid alleele saab eraldada siiski vaid heterosügootse loote puhul, kes on vanematelt pärinud erinevad alleelid. Kui aga loode on homosügootne antud DNA piirkonna suhtes, tuleb kasutada mõnda teist markerit. Selleks, et kogu populatsiooni saaks ühe testiga hinnata, tuleks kombineerida mitme eri markeri määramine ühe kromosoomi arvu kõrvalekalde kohta.  See meetod on küll loote soost sõltumatu, kuid polümorfismide esinemisest sõltuv. Seetõttu esinevad selle kasutamisel küllalt suured piirangud.‎‎
Teine võimalus määrata kromosoomi ploidsust on epigeneetiline-geneetiline lähenemine. Selle meetodiga määratakse võimaliku aneuploidse kromosoomi puhul loote epigeneetilise markeri (näiteks metülatsioonimustri) tase ning võrreldakse seda mõne teise teadaolevalt euploidse kromosoomi geneetilise markeri (DNA järjestuse) tasemega. Kui need erinevad teineteisest oluliselt, võib eeldada, et lootel on tuvastatud uuritava kromosoomi aneuploidsus.