80S ribosoom

80S ribosoom on ribosoom, mis on iseloomulik ainult eukarüootidele. See koosneb alati kahest alaühikust: väike 40S ja suur 60S.
Pagaripärmi Saccharomyces cerevisiae 80S ribosoomi mass on umbes 3,3×10⁶ Da ehk 5,48×10⁻¹⁸ g, inimese 80S ribosoomi mass on suurem ja võrdub 4,3×10⁶ Da ehk 7,14×10⁻¹⁸ g. 80S ribosoomi diameeter on umbes 250–300 Å.
Ribosoomide ülesanne on valkude biosüntees, kasutades mRNA ahelates olevat informatsiooni, mis on kodeeritud koodonite kombinatsioonidega. Iga valk kujutab endast aminohappejääkidest moodustatud biopolümeeri ahelat. Aminohapetega "laetud" transpordi-RNA (tRNA) siseneb ribosoomi ja kui sellel tRNA-l olev antikoodon paardub mRNAs oleva koodoniga (komplementaarsuse alusel) edukalt, siis toimub selle aminohappe kovalentne liitumine kasvavasse valguahelasse.
80S nimi tuleneb sellest, et eukarüootide ribosoomide sadestumiskoefitsient (sedimentatsioonikoefitsient) on ligikaudu 80 Svedbergi (S) ühikut. Tegelikult ribosoomi sedimentatsioonikoefitsient ei ole täpselt 80S, vaid natuke varieerub. Sedimentatsioonikoefitsient sõltub erinevatest liigispetsiifilistest rRNA või r-valgu struktuuride erinevustest, mis omakorda sõltuvad rRNA või r-valgu järjestusest sellel konkreetsel liigil. Näiteks pagaripärmi (punguva pärmi) Saccharomyces cerevisiae ribosoomide sedimentatsioonikoefitsient on umbes 83,2S-83,6S, poolduva pärmi Schizosaccharomyces pombe ribosoomide sedimentatsioonikoefitsient võrdub 87,5S, Sporobolomyces salmonicolor ribosoomide sedimentatsioonikoefitsient on ligikaudu 83,7S-84,1S.

Üldiseloomustus

Ribosoomi alaühikud koosnevad ribosomaalsetest valkudest (r-valgud) ja ribosomaalsetest RNA (rRNA) molekulidest. Üks pagaripärmi Saccharomyces cerevisiae 80S ribosoom koosneb 79 r-valgust ja 4 rRNA-st, mis on tihedasti kokku pakitud. Mõned valgud esinevad ribosoomis mitme koopiana, rRNA ja r-valgud on seotud kokku mittekovalentselt, peamist rolli ribosoomi kokkupanemisel mängivad vesiniksidemed (H-sidemed). On kirjeldatud kolme tüüpi kontakte ribosoomis: rRNA-rRNA, rRNA-valk ja valk-valk. Üldiselt on eukarüootne 80S ribosoom umbes 40% suurem kui prokarüootne 70S ribosoom, kuna 80S ribosoomidel on olemas eukarüoodile spetsiifilised rRNA lisasegmendid (inglise expansion segments ehk ES) ja r-valkude lisadomeenid. Enamus lisasegmentidest ja lisadomeenidest paiknevad 80S ribosoomi välises pinnas. Nad katavad evolutsiooniliselt konserveerunud ribosoomi põhistruktuuri (inglise common core), mis on ühine nii eukarüootides kui ka prokarüootides. Põhistruktuuril on katalüütiline aktiivsus, eukarüoodile spetsiifilisel osal on tõenäoliselt tähtis roll valkude biosünteesi regulatsioonis – sellega võivad ennast siduda erinevad eukarüootidele iseloomulikud regulatoorvalkud ja faktorid.

Alaühikute vahelised sillad

Valgu biosünteesi käigus peavad ribosoomi alaühikud teineteisega interakteeruma. Selleks on olemas ribosoomi alaühikute vahelised sillad (inglise intersubunit bridges). 80S ribosoom on suurem kui 70S ribosoom, kokkupuutepind 80S alaühikute vahel on umbes kaks korda suurem kui 70S oma. Selleks, et valgu biosünteesi käigus alaühikuid koos hoida, on vaja rohkem alaühikute vahelisi sildasid. Pagaripärmi Saccharomyces cerevisiae 80S ribosoomi alaühikute vahel on 17 silda, millest 12 on konserveerunud nii eukarüootides kui ka prokarüootides. Konserveerunud sillad sisaldavad kõiki kolme tüüpi interaktsioone: rRNA-rRNA, rRNA-valk ja valk-valk. Ülejäänud 5 on eukarüoodile spetsiifilised sillad, mis koosnevad kas rRNA-valk või valk-valk kontaktidest (rRNA-rRNA kontakte siin ei esine). Need kontaktid on võimalikud rRNA lisasegmentide ja r-valkude lisadomeenide tõttu. Näiteks eukarüoodile spetsiifiline sild eB12 on moodustunud eukarüoodile spetsiifilise r-valgu eL19 ja eukarüoodile spetsiifilise 18S rRNA lisasegmendi ES6S vahel. Ribosoomi töö käigus mõned sillad muudavad oma kuju rohkem kui teised. Üldise reeglina mida lähemal asub sild ribosoomi keskpunktile, seda vähem ta muudab oma kuju.

Ribosoomi uuringute eesmärgid

Paljud antibiootikumid tõkestavad ribosoomide tööd. Kuna 80S ja 70S ribosoomide struktuurid erinevad, siis seda võib kasutada selektiivseks 70S ribosoomide tõkestamiseks, et näiteks tappa kahjulikud bakterirakud või vähemalt pidurdada nende kasvu. Igal antibiootikumil on temale iseloomulik seondumiskoht ribosoomis ja toimemehhanism. Näiteks mõned aminoglükosiidsed antibiootikumid takistavad tRNA seondumist mRNA-ga; makroliidid seonduvad peptiidi väljumistunneliga ja takistavad sellega peptiidi biosünteesi; sarnaste molekulaarsete struktuuridega antibiootikumid ditüromütsiin ja GE82832 seonduvad r-valguga S12 ja takistavad valgu biosünteesi käigus ribosoomi edasiliikumist mRNA-l. Veel näiteks looduses esinev antibiootikum baktoboliin A seondub nii tRNA-ga kui ka rRNA-ga ja seega hoiab tRNA-d ribosoomi sees kinni; klooramfenikool ja antibiootikumid tetratsükliini perekonnast seonduvad tugevasti rRNA-ga ja pidurdavad peptiidi polümerisatsiooni; puromütsiin lõpetab enneaegselt valgu biosünteesi, tulemusena tekkib valgu mittefunktsionaalne lühike fragment. Mutatsioonid ribosoomi valkude geenides või ribosoomi biogeneesi faktorite geenides võivad häirida rRNA või r-valgu järjestust, mis omakorda muudab ribosoomi struktuuri. Tihti sellised struktuurimuutused viivad organismi surmani varastes arenguetappides (nn letaalsed mutatsioonid), kuna need mutantsed ribosoomid ei suuda läbi viia valkude biosünteesi piisava kiirusega. Kuid on olemas ka sellised mutatsioonid, mis ei vii organismi surmani, vaid tekitavad igasuguseid haigusi, näiteks mõnesid aneemia tüüpe, rikutud erütropoeesi, luu arengu defekte ja isegi leukeemia teket. Neid haigusi on nimetatud üldise nimega ribosomopaatiadeks. Perspektiivis on leida lihtsamaid meetodeid ribosoomi normaalse struktuuri taastamiseks.

Polüribosoomide profiilide analüüs (ribosoomide lahutamine sahharoosi gradiendis)

Ribosoomide lahutamine sahharoosi gradiendis on levinud meetod valkude biosünteesi aktiivsuse hindamiseks või ribosoomide eraldamiseks. Alguses kasvatatakse rakke teatud tingimustes. Pärast seda valmistatakse sahharoosi gradiendid – tuubid sahharoosi lahusega, mille kontsentratsioon, ja seega tihedus ning viskoossus, väheneb sujuvalt ülemise pinna suunas. Siis rakke töödeldakse antibiootikumiga nimega tsükloheksimiid, et ribosoomid seisaksid paigal mRNA-l. Pärast seda rakud lüüsitakse ja saadud lüsaat puhastatakse ebavajalikest rakkude komponentidest nagu tuum, mitokondrid, plasmamembraani fragmendid, mitte-ribosoomsed valgud jne. Kindlat kogust puhastatud lüsaati (sõltub kogu RNA kontsentratsioonist) kantakse gradiendi pinnale ja ultratsentrifuugitakse. Kuna mRNA-del võib "istuda" üks, kaks, kolm jne ribosoomi, siis nad moodustavad keti-taolised osakesed. Kui ühel mRNA-l on seondunud 2 või rohkem ribosoomi, siis seda nimetatakse polüsoomiks. Nendel osakestel on erinev sedimentatsioonikoefitsient ja nad kihistuvad gradiendi sees. Mõned üksikud ribosoomid dissotsieeruvad alaühikuteks, seega nad ka esinevad gradientides. Pärast tsentrifuugimist gradiendid analüüsitakse ultraviolettkiirgusega, kuna RNA neelab seda hästi. Neeldumist registreeritakse graafiku kujul, viimaseks etapiks on polüsoomide/üksikute ribosoomide suhete leidmine – selleks kasutatakse graafiku vastavate piikide pindalade väärtuseid. Seda tehakse arvuti abil. Polüsoomide/ribosoomide suhe on väga mugav parameeter valkude biosünteesi aktiivsuse hindamiseks. Kui toimub intensiivne valkude biosüntees, siis polüsoomide arv suureneb, üksikute ribosoomide arv vastavalt väheneb – suhe on umbes 0,9–1,2. Kui valkude biosüntees pidurdub (näiteks nälgimise puhul), siis toimub polüsoomide arvu järsk vähenemine ja üksikud ribosoomid vabanevad lahusesse – siis suhe on ligikaudu 0,08–0,1.

Kõrgsurvevedelikkromatograafia

Kõrgsurvevedelikkromatograafiat (inglise High-Pressure Liquid Chromatography või High-Performance Liquid Chromatography ehk HPLC) kasutatakse peamiselt rRNA keemiliste modifikatsioonide (pseudouridinileerimine ja metüleerimine) tuvastamiseks.

Röntgenkristallograafia

Röntgenkristallograafia meetodis alguses kristalliseeritakse ribosoomid teatud konformatsioonis, siis kiiritatakse kristallid röntgenikiirtega ja saadud difraktsioonipilti analüüsitakse arvuti abil.

Krüo-elektronmikroskoopia

Krüo-elektronmikroskoopia puhul külmutatud proove (tavaliselt vedelas lämmastikus) vaadatakse elektronmikroskoobiga. Raskus on selles, et biomolekulid on väga tundlikud elektronkiirte suhtes (isegi kui proov on hästi jahutatud), seega on vaja ettevaatust, muidu põleb proov lihtsalt ära.