Hiina hamstri munasarja rakud

Ajalugu

Hiina hamstreid (Cricetulus griseus) kasutati teadaolevalt esimest korda katseloomadena 1919. aastal, et uurida pneumokokke. Kahekümnenda sajandi keskpaigaks olid hiina hamstrid labori tingimustes nö kodustatud ning Dr. George Yerganian ja teised märkasid, et sugulusaretuse tulemusel tekkis mitmeid pärilikke haigusi. See nähtus tekitas huvi hamstrite geneetika vastu. Leiti, et hiina hamstritel on vähe kromosoome (2n = 22), mis muutis nad kasulikeks mudelorganismideks tsütogeneetika ja koekultuuride uurimiseks. Dr. Theodore T. Puck tegeles erinevate somaatiliste rakkude geneetikaga ning 1957. aastal isoleeris ta emasest hiina hamstrist 0,1 g munasarja rakke ja külvas need söötmeplaadile. Peagi selgus, et rakud suutsid kasvada kunstlikes tingimustes suhteliselt kiire generatsiooniajaga. Sellest ajast peale on CHO rakud kogunud väga suurt populaarsust ning antud rakkudega on tehtud uurimistöid biomeditsiini, metabolismi, rakutsükli, toksikoloogia ja paljudes muudes valdkondades. Alles hiljuti on hakatud neid rakke kasutama kui tööstuslikke reaktoreid.

CHO rakuliinid

Pärast esimeste CHO rakkude isoleerimist on rakud võetud kasutusele üle maailma ning neist on aretatud väga palju liine ja neist veel omakorda uusi alamliine. Tänapäevaks on niivõrd palju erinevaid CHO rakuliine, et natiivse hiina hamstri DNA-ga võrreldes on uutes rakuliinides üle 3,7 miljoni punktmutatsiooni, 551 240 indelit (sisestust või deletsiooni) ja 7063 koopiaarvu variatsiooni. Erinevate CHO rakkude alamliinide genoomid ja fenotüübid varieeruvad, kuid peamised iseloomulikud jooned siiski säilinud. Järgnevalt on iseloomustatud enim kasutatavaid CHO rakuliine.

CHO-K1

Dr. T. T. Pucki poolt isoleeritud CHO originaalrakkudest aretati 1960ndate lõpul nende alamkloon CHO-K1. Uus rakuliin leidis laialdast kasutust kogu maailmas. Tänapäeval on CKO-K1 rakud eelistatud unikaalse glutamiin süntetaasi (GS) geeniülekande süsteemi tõttu.
GS sünteesib glutamiini, mis on imetaja rakkudele eluks vajalik. Kui lisada rakkudele GS inhibiitorit, metioniin sulfoksimiini, siis surevad kõik rakud peale nende, millesse on sisse viidud plasmiidid, kus on sees GS geen ning sihtmärk võõrgeen. Nii jäävad ellu vaid soovitud mutatsiooniga rakud.

CHO-DXB11 (DHFR negatiivne)

CHO-DXB11 rakuliin oli esimene rakuliin, mida kasutati sadade kilogrammide koe plasminogeeni aktivaatori (tissue plasminogen activator, TPA) tootmiseks. CHO-DXB11 (või DUK-XB11) rakuliin loodi 1980. aastatel dr. Chasini poolt. Rakuliini eesmärk oli dihüdrofolaat reduktaasi (DHFR) deletsioon. Selleks kustutati rakkudes ära üks DHFR lookus ja teises DHFR lookuses missense mutatsioon (T137R).
DHFR reguleerib tetrahüdrofolaate, mis on vajalikud puriinide ja tümidülaatide sünteesiks. Nendeta on raku elutegevus väga häiritud. Selleks, et rakk ellu jääks DHFR puudumisel, on tal vaja saada keskkonnast glütsiini, aminohappeid ja tümidiini.
Rakuliini edasiarenduseks pandi töökorras DHFR geen ühte plasmiidi ja huvipakkuv geen teise plasmiidi. Kaks plasmiidi sisestati rakku korraga ehk transfekteeriti CHO-DXB11 rakkudesse ning rakk hakkas tootma mõlemaid rekombinantsed valke (nii DHFR kui ka huvipakkuva geeni produkt). Tavaline, ilma kahe plasmiidida rakk vajab elamiseks glütsiini, aminohappeid ja tümidiini. Kui transfektsioon on läbi viidud, siis need rakud kuhu kaks plasmiidi sisenesid, ei vaja enam eelnevalt mainitud kolme ühendit. Rakud pannakse kasvama glütsiini, aminohapete ja tümidiini vaesesse keskkonda ning jäävad ellu ainult DHFR plasmiidi sisaldavad valgud, mutandid, sest siis suudab valk ise tümidiine sünteesida. Sellise süsteemiga saab vaadata, missugustesse rakkudesse on soovitud DNA sisenenud ja millistesse mitte.

CHO-DG44

DG44 rakud loodi 1976. aastal. See rakuliin võimaldas mõlema DHFR geeni lookuse kustutamist. Kahe lookuse deleteerimine hoidis ära DHFRi nö lekkimise võimaluse, mis parandas transfekteerunud rakkude selekteerimist. Kahe DHFR negatiivse rakuliini kasutamisega võeti peagi kasutusele DHFR antagonist ehk vastandtoimeaine metotrekstaat. Metotrekstaati kontsentratsiooni järkjärguline tõstmine surus alla DHFR valgu toime ühes plasmiidis ning võimaldas teisel plasmiidil oleva huvipakkuva geeni aktiivsemat ekspressiooni.

CHO-S

Antud rakuliin aretati CHO-Toronto (teatakse ka kui CHO pro-5) rakkudest, mis oli CHO-K1 sõsarrakuliin. CHO-S rakud, erinevalt CHO-K1 rakkudest, on võimelised elama suspensioonis ehk vedelas söötmes ning taluvad rotatsiooni, mida kasutatakse söötme hapnikuga rikastamiseks. Dr. R. A. Tobey laboratoorium andis rakuliini edasi suurfirmale ning seda hakati CHO-S nime all müüma alates 2002. aastast. Vedelkultuuris kasvatamine andis aluse CHO rakkude kasvatamisele suurtes segamistankides (10 000 l), mille tõttu on võimalik kiiresti toota erinevaid terapeutilisi peptiide.

CHO rakuliinides toodetud ravimid

Terapeutilisi valke toodetakse bioloogilise aktiivsuse tagamiseks imetajate rakkudes. Tavalised laborites kasutatavad bakterid nagu näiteks Escherichia coli ei suuda sünteesida valgule vajalikke glükovorme ega tagada korrektset voltumist. Imetaja rakkude valik terapeutiliste valkude tootmiseks on mitmekesine. Näriliste või inimrakkudest on valgu ekspressiooniks levinuimad rakuliinid 3T3, CHO, BHK, HeLa ja HepG2. 2012. aasta seisuga oli ligi 70% terapeutilistest valkudest toodetud CHO rakkudes, mille saaduste läbimüük oli ligi 30 miljardit USA dollarit aastas. CHO rakkudes on toodetud bioloogilisi ravimeid viljatuse, hemofiilia A ja B, vähi, Pompe'i tõve mukopolüsahharidoosi I ja VI, astma, aneemia, ägeda müokardiinfarkti ja muude haiguste vastu. Peamised seda tüüpi ravimite tootjad on Amgen, Genzyme, Sereno ja Genentech.