Ensüümiinhibiitor

Ensüümiinhibiitor on molekul, mis seob ennast ensüümiga ja vähendab selle aktiivsust. Kuna see on võimeline tapma patogeeni või korrigeerima metaboolset tasakaalu, siis põhinevad paljud ravimid ensüümiinhibiitoritel. Neid kasutatakse ka herbitsiidide ja pestitsiididena. Kõik molekulid, mis ennast ensüümiga seovad, ei ole ensüümiinhibiitorid: ensüümaktivaatorid näiteks seovad ensüümiga, aga hoopis tõstavad selle aktiivsust.
Inhibiitori sidumine võib takistada substraadi sisenemist aktiivtsentrisse, ensüümil reaktsiooni katalüüsi või mõlemat korraga. Inhibiitori sidumine võib olla pöörduv või pöördumatu. Pöördumatud inhibiitorid muudavad harilikult ensüümiga reageerides seda keemiliselt. Need inhibiitorid muudavad harilikult tähtsaid aminohappejääke, mis on vajalikud ensüümaktiivsuse tagamiseks. Pöörduvad inhibiitorid seovad ennast aga mittekovalentselt ja toimub erinevaid tüüpe inhibeerimisi, sõltuvalt sellest, kas inhibiitor seob ensüümiga, ensüüm-substraat kompleksiga või mõlemaga.
Paljude ravimite molekulid on ensüümiinhibiitorid. Seetõttu on nende avastamine ja arendamine enamasti seotud bioorgaaniliste ja farmakoloogiliste uurimustega. Meditsiinilist inhibiitorit hinnatakse enamasti tema spetsiifilisuse (võime siduda ennast ainult kindla valguga) ja aktiivsuse (inhibiitori dissotsiatsioonikonstant, mis viitab ensüümi inhibeerimiseks vajalikule inhibiitori kontsentratsioonile) järgi. Inhibiitori kõrge spetsiifilisus ja aktiivsus kindlustavad, et ravimil on vähe kõrvalnähte ja seetõttu ka madal toksilisus.

Pöörduvate inhibiitorite näiteid

Kuna ensüümid on arenenud nõnda, et nende side substraadiga oleks tugev ja pöörduvad inhibiitorid seovad enamasti ensüümi aktiivtsentrisse, siis pole väga üllatav, et paljud neist inhibiitoritest on väga sarnased sihtmärkidele suunatud substraatidega. Üheks taoliseks substraadi struktuuri matkivaks näiteks on proteaasi inhibiitorid, mis on väga edukas klass retroviirusevastaseid ravimeid, millega raviti HI-viirust. Ritonaviiri, peptiidsel ehitusel põhineva proteaasi inhibiitori, struktuur on näha paremal. Kuna see ravim sarnaneb HIV proteaasi substraadiga, konkureerib inhibiitor ensüümi aktiivtsentrisse sidumisel substraadi endaga.
Tihti on inhibiitorid disainitud jäljendama ensüüm-katalüüsitud reaktsioonide aktiveeritud olekut ja vaheolekut. See näitab ära, et inhibiitor kasutab ära ensüümi aktiveeritud oleku stabiliseerituse efekti, mille tulemusel paraneb sidumise afiinsus (madalam Kᵢ) võrreldes substraadi-tüüpi inhibiitoritega. Üks näide sellistest aktiveeritud oleku inhibiitoritest on viirusevastane ravim oseltamiviir, mis matkib tasapinnalist oksooniumiooni olemust reaktsioonis viraalse ensüümi neuraminidaasiga.
Kõik inhibiitorid aga ei põhine substraadi struktuuridel. Näiteks ühe teise HIV proteaasi inhibiitori, tipranaviiri, struktuur on näidatud vasakul. See molekul ei baseeru peptiidsel ehitusel ega oma ka ilmseid sarnasusi substraadiga. Taolised mittepeptiidsed inhibiitorid võivad olla stabiilsemad kui peptiidsidemega inhibiitorid, kuna nad pole substraadid peptitaasile.
Ravimi disaini juures on tähtis arvestada substraadi kontsentratsiooni, millele ensüüm on avatud. Näiteks on olemas proteiinkinaasi inhibiitoreid, mis sarnanevad struktuurilt adenosiintrifosfaadiga (inglise keeles adenosine triphosphate – ATP), mis on ka ensüümi üheks substraadiks. Sel juhul peavad inhibiitorid, mis on lihtsalt konkureerivad, võistlema ATP kõrge kontsentratsiooniga rakus. Proteiinkinaase võib inhibeerida ka inhibiitoriga, mis konkureerib kinaasi peptiidsubstraadi sidumispiirkonnaga, kuna enamiku taoliste peptiidi kontsentratsioon rakus on palju väiksem kui ATP oma. Kui on kaks sarnase afiinsusega proteiinkinaasi inhibiitorit, millest vaid üks konkureerib ATP-ga, teine aga ensüümi peptiidi siduva piirkonnaga, siis inhibeeritakse ensüümi palju efektiivsemalt.

Pöördumatute inhibiitorite tüübid

Tavaliselt modifitseerivad pöördumatud inhibiitorit kovalentselt, nii et inhibeerimist ei ole võimalik tagasi lükata. Taolised inhibiitorid sisaldavad tihti reaktiivsed funktsionaalrühmi, nagu näiteks aldehüüde, haloalkaane, Michaeli reagente, fenüülsulfonaate või fluorofosfonaate. Need elektrofiilsed rühmad reageerivad aminohapete kõrvalahelatega, moodustades kovalentseid ühendeid. Modifitseeruvad ühendid tekivad aminohapetega, mis sisaldavad nukleofiile, nagu hüdroksüül- ja tioolrühmasid. Sellisteks aminohapeteks on näiteks seriin, tsüsteiin, treoriin või türosiin.
Pöördumatu inhibeerimine on erinev pöördumatust ensüümi deaktiveerumisest. Pöördumatud inhibiitorid on harilikult selektiivsed ühe klassi ensüümide suhtes ega deaktiveeri kõiki valke. Samuti ei funktsioneeri nad kui valkude struktuuride lõhkujad, vaid inhibiitorid muudavad spetsiifiliselt oma sihtmärgi aktiivtsentrit. Näiteks pH ja temperatuuri ekstreemumid põhjustavad harilikult kõikide valkude struktuuride denaturatsiooni, aga see efekt pole selektiivne. Samuti on mitteselektiivseid keemilisi töötlemisi, mis hävitavad valkude struktuuri. Näiteks valkude kuumutamine vesinikkloriidhappes hüdrolüüsib peptiidsidemed, mis hoiavad valke koos ja lagundab valgu vabadeks aminohapeteks.
Pöördumatud inhibiitorid näitavad ajast sõltuvat inhibeerimist ja nende potentsiaali ei saa seetõttu kirjeldada IC₅₀-ga. Põhjuseks on, et aktiivse ensüümi hulk kindla kontsentratsiooniga pöördumatu inhibiitori juuresolekul sõltub sellest, kui kaua on ensüümi ja inhibiitori segu eelinkubeeritud. Selle asemel kasutatakse väärtust kobs/[I], kus kobs on näilik esimese astme inaktivatsiooni määr ja [I] on inhibiitori kontsentratsioon. Liige kobs/[I] on kasutatav seni, kuni inhibiitor ei küllastu ensüümiga sidumisel (sel juhul kobs=kinact).

Pöördumatute inhibiitorite kineetika

Nagu skeemil on näha, moodustavad pöördumatud inhibiitorid ensüümiga mittekovalentse pöörduva kompleksi (EI ja ESI), mis järgnevalt reageerivad, luues kovalentselt seotud "tupiku" kompleksi EI*. See määr, mil EI* moodustub, on deaktivatsiooni määr ehk kinact. Kuna EI moodustamine võib konkureerida ES tekkimisega, saab pöördumatu inhibiitori seostumist ennetada konkureerides kas substraadi või teise, pöörduva inhibiitoriga. Taoline kaitse on hea tõestus pöördumatu inhibiitori selektiivsele reaktsioonile ensüümi aktiivtsentriga.

Erijuhtumid

Kõik pöördumatud inhibiitorid ei moodusta kovalentseid ühendeid oma sihtmärgiliste ensüümidega. Mõned pöörduvad inhibiitorid seostuvad ensüümiga nii tihedalt, et nad on põhimõtteliselt pöördumatud. Need tihedalt seostuvad inhibiitorid võivad toimida sarnase kineetika alusel kui pöördumatud inhibiitorid. Sel juhul seovad mõned nendest inhibiitoritest ennast kiirelt ensüümi madala afiinsusega EI kompleksi külge ja läbivad siis aeglase ümberkorralduse tihedalt seotud EI* kompleksiks. Sellist kineetilist käitumist nimetatakse aeglaseks sidumiseks. Taoline aeglane ümberkorraldus pärast sidumist toob tihti kaasa konformatsioonimuutuse, kui ensüüm justkui klammerduks ümber inhibiitori molekuli. Taoliste aeglaste sidumiste näiteks võib tuua mõned üpris tähtsad ravimid, nagu allopurinool ja atsükloviiri aktiveeritud vorm.

Pöördumatute inhibiitorite näited

"Enesetapu" inhibeerimine on üks pöördumatu inhibeerimise ebatavaline vorm, mille käigus ensüüm muudab inhibiitori oma aktiivtsentris reaktiivseks. Näiteks võib tuua polüamiidide biosünteesi inhibiitori, α-difluorometüülornitiini (DFMO), mis on aminohappe ornitiini, millega ravitakse ka unitõve (African trypanosomniasis), analoog. Ornitiini dekarboksülaas võib katalüüsida ornitiini asemel DFMO dekarboksüleerimist, nagu näidatud ülemisel pildil. Siiski järgneb dekarboksüleerimisele fluori aatomi eemaldamine, mis muudab katalüütlise vaheoleku konjukeeritud imiiniks. See reaktiivne DFMO vorm reageerib siis kas tsüsteiini või lüsiini jäägiga ensüümi aktiivtsentris, mis deaktiveerib ensüümi pöördumatult.
Kuna pöördumatu inhibeerimine eeldab tihti mittekovalentse EI kompleksi moodustamist, on vahel võimalik, et inhibiitor seostub ensüümiga mitut erinevat moodi. Näiteks nagu pildilt näha, on ühe inimese ainurakse parasiidi Trypanosoma cruz'i reduktaasi inhibeerib aktiivtsentris kaks molekuli. Ülemine molekul on seotud pöörduvalt, aga alumine on moodustanud aktiivtsentris olevate aminohappe kõrvalrühmadega kovalentse sideme.

Inhibiitorite avastamine ja disainimine

Uued ravimid on pika ravimiarenduse tulemus, mille esimeseks sammuks on uue inhibiitori avastamine. Vanasti oli uute inhibiitorite avastamine võimalik vaid katseeksituse meetodil: suure hulga ühendite katsetamine ühe kindla ensüümi juures, ainult lootes, et kuskilt tuleb mõni juhtlõng, millest kinni haarata. Taoline metoodika on tegelikult kasutusel ka tänapäeval, aga seda on täiendatud kombineeritud keemia lähenemisviisidega, mis lubavad valmistada suurel hulgal uusi ühendeid ning mõõtmisel kasutatakse kõrgefektiivset katsetamist, mis sorteerib välja kasulikud inhibiitorid.
Alles hiljuti on hakatud kasutama alternatiivsemat metoodikat: ratsionaalset ravimi disaini, mis kasutab ensüümide kolmemõõtmelist struktuuri ennustamaks, millised ühendid võiksid olla inhibiitorid. Potentsiaalselt sobivad ühendid analüüsitakse täiendavalt ja nõnda võivad sündida uued ning piisava selektiivsusega inhibiitorid. Kui uus ja piisavalt selektiivne ühend on sünteesitud, uuritakse selle sidumist aktiivtsentrisse. See annab teadmisi, et viia läbi muudatusi ja optimeerida seostumist. Sellist testimist ja parandamist viiakse läbi seni, kuni tõhus inhibiitor on valmis. Arvutitel põhinevad meetodid(molekulaarmehaanika), mis suudavad ennetada inhibiitori afiinsust ensüümi suhtes, on veel arendamisjärgus.

Inhibiitorite kasutamine

Ensüümiinhibiitoreid leidub looduses ning neid disainitakse ja valmistatakse ka bioorgaanilises keemias ja farmakoloogias. Paljud looduslikud mürgid on tihti ensüümiinhibiitorid, mis on välja arendatud selleks, et kaitsta taime või looma kiskjate eest. Need looduslikud toksiinid on ühed kõige mürgisemad teadaolevad ühendid. Tehislikult valmistatud inhibiitoreid kasutatakse tihti ravimitena, kuid neid leidub ka putukamürkides (malatioon), taimemürkides (glüfosaat) või desinfitseerijates (triklosaan).

Ainevahetuse kontroll

Ensüümiinhibiitoritel on roll ka ainevahetuses. Mitmeid rakus olevaid metaboolseid radasid inhibeerivad metaboliidid, mis kontrollivad ensüümi aktiivsust allosteerilise regulatsiooni või substraadi inhibeerimise kaudu. Heaks näiteks on glükolüüsi allosteeriline regulatsioon. Selle katabolismi raja käigus tarbitakse ära glükoos ja sellest saadakse ATP, NADH ja püroviinamarihape. Glükolüüsi regulatsiooni üks võtmeetappe on raja varajane reaktsioon, mida katalüüsib fosfofruktokinaas (PFK1). Kui ATP tase tõuseb, seostub ta PFK1 allosteerilise piirkonnaga ja vähendab ensüümi reaktsiooni määra: glükolüüs on inhibeeritud ja ATP tootmine langeb. See negatiivse tagasiside kontroll aitab säilitada ATP stabiilset taset rakus. Siiski pole metabolismi rajad reguleeritud ainult inhibitsiooniga, sest ensüümi aktivatsioon on samuti tähtis. FPK1-ga seoses on fruktoos-2,6-bifosfaat ja ADP näiteks metaboliidid, mis on seotud allosteerilise aktivatsiooniga.
Ka füsioloogilised ensüümiinhibeerimised võivad olla seotud spetsiifiliste valgu inhibiitoritega. Selline mehhanism võib esineda pankreases, mis sünteesib mitmeid seedimise prekursori ensüüme, mida nimetatakse tsümogeenideks. Paljusid neist aktiveerib trüpsiin proteaas, nii et on oluline inhibeerida trüpsiini aktiivsust pankreases, et vältida organi enda ära seedimist. Trüpsiini aktiivsust on võimalik kontrollida, kui valmistada kõhunäärmes selektiivset trüpsiini inhibiitorvalku. See inhibiitor seob ennast tihedalt trüpsiiniga, ennetades trüpsiini liigset aktiivsust, mis oleks kahjulik organile endale. Kuigi trüpsiini inhibiitor on valk, väldib ta hüdrolüüsumist kui substraat, väljastades vett trüpsiini aktiivtsentrisse ja destabiliseerides aktiviseeritud olekut. Teiseks näiteks võib tuua proteiin fosfataasi inhibiitorid.

Putuka- ja taimemürgid

Paljud putuka- ja taimemürgid on samuti ensüümiinhibiitorid. Atsetüülkoliinesteraas (AChE) on ensüüm, mida on leitud putukatest kuni inimesteni. AChE on hädavajalik, et tagada närvirakkude normaalne toimimine, mille käigus lagundatakse neurotransmitter atsetüülkoliin algosadeks, atsetaadiks ja koliiniks. Selline tegevus on neurotransmitterite ,nagu serotoniini, dopamiini ja norepinefriini hulgas üpris unikaalne, kuna enamik neist imenduvad, mitte ei lagune. Suurt hulka AChE inhibiitoreid kasutatakse nii meditsiinis kui ka põllumajanduses. Pöörduvaid konkureerivaid inhibiitoreid, nagu edrofooniumi, füsostimiini ja neostigmiini kasutatakse müasteenia ravis ning narkoosis. Karbamaadi pestitsiidid on samuti näited pöörduvatest AChE inhibiitoritest. Organofosfaatidega kahjurimürgid, nagu näiteks malatioon, paratioon ja kloropürifoss on pöördumatud atsetüülkoliini inhibiitorid.
Taimemürgid, nagu sulfonüülureaas inhibeerivad ensüümi atsetoolatsetaat süntaasi. Seda ensüümi on vaja taimedel hargnenud ahelatega aminohapete valmistamiseks. Veel paljusid ensüüme inhibeerivad taimemürgid, kaasa arvatud ensüüme, mida on vaja lipiidide ja karotenoidide biosünteesiks ning protsessideks, nagu fotosüntees ja oksüdatiivset fosforüülimine.
Samuti on paljud inhibiitorid kasutusel mitte ainult mürkidena, vaid ka loomade ja taimede kaitsevahendina. Nad kasutavad neid inhibiitoreid kaitseks neid ohustavate kiskjate vastu.