Restriktaasid

Ajalugu

Esimene restriktaas, mis rakkudest puhastati, oli HindII. Selle eraldamise, 1970. aastal, ja mitmete hilisemate uute restriktaaside karakteriseerimiste tunnustuseks anti 1978. aastal füsioloogia ja meditsiini Nobeli auhind järgmistele teadlastele: Daniel Nathans, Werner Arber ja Hamilton O. Smith. Nende avastus pani aluse rekombinantse DNA tehnoloogia arengule, mis omakorda andis võimaluse näiteks suures mahus kiireks insuliini tootmiseks diabeetikutele, kasutades E. coli baktereid.

Järjestuse spetsiifika

Restriktaasid tunnevad nukleotiidse järjestuse järgi spetsiifilise koha ja lõikavad DNA kaksikheeliksit läbi mõlema ahela. Restriktaasi spetsiifiline ala on 4–8 nukleotiidi, mille järgi leiab see koha kust lõigata, kui võib juhtuda, et DNA järjestuses on palindroomne ala, mis vastab lämmastik alustele mõlemapidiselt. DNA-l on kaks palindroomse järjestuse võimalust. "Peegelpalindroom" on sarnane tekstides kasutatavate sõnadega, näiteks "udu", mida võib lugeda mõlemat pidi, DNA järjestuses on need üheahelalise DNA puhul, näiteks GTAATG. "Pöördkorduv palindroom" on samuti järjestus, mis on identne mõlemat pidi lugedes, kuid sarnased järjestused esinevad "komplementaarsetes" DNA järjestustes. Näiteks kui järjestuse GTATAC komplementaarne ala on CATATG. Pöördkorduvad palindroomid on laiemalt levinud ja omavad suuremat tähtsust kui peegelpalindroomid. Palindroomid võivad tekitada ahelates pundumisi, kus osa ahelast jääb U-kujuliselt üheahelaliseks.
EcoRI restriktaas jätab lõigates "kleepuvad" otsad:
SmaI restriktaas jätab lõigates "nüri" otsa:
DNA järjestuse äratundmine varieerub erinevate restriktaaside vahel, lõigates tekivad eri pikkusega "kleepuvad" üleulatuvad osad. "Kleepuvad" üleulatuvad osad võivad olla nii peaahelal kui "komplementaarsel" ahelal.
Ensüüme, mis seonduvad sama järjestuse järgi, kuid lõikavad erinevate nukleotiidide vahelt, nimetatakse neoschisomeerideks.
Ensüüme, mis seonduvad sama järjestuse järgi ja ka lõikavad samade nukleotiidide vahelt, nimetatakse isoschisomeerideks.

I tüüp

I tüüpi restriktaasid olid esimesed, mille omadusi uuriti ja iseloomustati. Need avastati E. coli bakterist. I tüüpi ensüümid lõikavad seondumisalast eemalt, mis varieerub erinevate ensüümide vahel ja on vähemalt 1000 aluspaari kaugusel seondumisalast. Lõikamine järgneb DNA translokatsioonile, mis tähendab, et need ensüümid on ka molekulaarmootorid. Äratundmisala on asümmeetriline, mis koosneb kahest spetsiifilise järjestusega nukleotiidide järjestusest – esimene ala koosneb 3–4 nukleotiidist, sellele järgneb ebaspetsiifiline 6–8 nukleotiidi pikkune ala ja teine 4–5 nukleotiidi pikkune spetsiifiline ala. Sellised ensüümid on multifunktsionaalsed ning on võimelised nii restriktsiooniks kui modifitseerimiseks, sõltuvalt DNA metüleeritusest. Selleks, et ensüümid oleksid täielikult aktiivsed, on neil vaja kofaktoreid, S-adenosüülmetioniini (AdoMet), hüdrolüüsitud adenosiintrifosfaati (ATP), ja magneesiumiooni (Mg²⁺). I tüüpi restriktaasidel on 3 allüksust, HsdR, HsdM ja HsdS. HsdR on vajalik restriktsiooniks, HsdM on vajalik metüülrühma lisamiseks algsele DNA-le ja HsdS on vajalik DNA-ga seondumiseks.

II tüüp

Tavaline II tüüpi restriktaas erineb I tüüpi restriktaasist mitmel moel. Need on homodimeersed, mille seondumisalad on lahutamata palindroomid, mis on 4–8 nukleotiidi pikad. DNA-d lõikavad sama koha pealt, kuhu seonduvad ning ei vaja ATP-d ega AdoMet-i, kuid siiski vajavad Mg²⁺ iooni kofaktorina. 
Selliseid ensüüme kasutatakse enim ja need on teaduslaborites laialt levinud. 1990-ndail ja 2000-ndate algusaastail leiti sellest ensüümide klassist uued ensüümid, mis ei vastanud täpselt eelpool mainitud tingimustele. Seetõttu lisati uued alamklassid, et jaotada see suur perekond alamklassidesse nende erinevuste põhjal II tüüpi restriktaasidest. Sellised alamklassid defineeriti järelliitega.
IIB tüüpi restriktaasid (nt: BcGI ja BplI) on multimeerid, need koosnevad rohkem kui ühest allüksusest. IIB tüüpi restriktaasid lõikavad mõlemalt poolt seondumisala, sealjuures lõigates välja ka seondumisala. Vajavad AdoMet ja Mg²⁺ kofaktoreid.
IIE tüüpi restriktaasid (nt: NaeI) kasutavad kahte seondumisala DNA-l, ühel neist toimub kaksikahela lõikamine, teist ala kasutab ensüüm allosteeriliseks mõjutuseks, mis kiirendab või muudab efektiivsemaks restriktaasi lõikamise.
IIF tüüpi restriktaasid (nt: NgoMIV) seonduvad sarnaselt IIE tüüpi restriktaasidega, kuid lõikavad DNA järjestuse mõlemast seondumisalast.
IIG tüüpi restriktaasidel (nt: Eco57I) on sarnaselt II tüüpi restriktaasidega üks kofaktor, kuid vajavad lisaks kofaktor AdoMet-i, et olla aktiivsed.
IIM tüüpi restriktaasid (nt: DpnI) on võimelised äratundma ja lõikama metüleeritud DNA-d.
IIS tüüpi restriktaasid (nt: FokI) lõikavad DNA-d kindla nukleotiidse järjestuse kauguselt nende mitte-palindroomse asümmeetrilise seondumise alast. Need ensüümid võivad töötada ka kui dimeerid.
IIT tüüpi restriktaasid (nt: Bpu10I ja BslI) koosnevad kahest erinevast allüksusest. Osad seonduvad palindroomse järjestusega, teised asümmeetrilise järjestusega.

III tüüp

III tüüpi restriktaasid (nt: EcoP15) tunnevad kahte erinevat mitte-palindroomset spetsiifilist ala. Ensüüm lõikab DNA-d 20–30 aluspaari kauguselt seondumisalast. Neil ensüümidel on rohkem kui üks allüksus ja nad vajavad AdoMet ja ATP kofaktoreid DNA lõikamiseks ja metüleerimiseks. Selliseid restriktaase kasutavad prokarüoodid selleks, et kaitsta end sissetungiva võõra DNA eest. III tüüpi restriktaasid on hetero-oligomeersed, multifunktsionaalsed valgud, mis koosnevad kahest allüksusest (Res ja Mod). Mod allüksus tunneb ära spetsiifilise DNA järjestuse ja on metüültransferaas. Res on vajalik lõikamiseks, kuigi sellel pole üksinda ensümaatilist võimet. Need restriktaasid tunnevad spetsiifilise DNA ahela ala 5–6 aluspaari järgi ning lõikavad 25–27 aluspaari kauguselt pärisuunas, jättes lühikese üheahelalise üleulatuva 5’ otsa. Selleks, et ensüüm lõikaks, on vaja kaht vastupidiselt orienteeritud mitte-metüleeritud seondumisala. Sellised ensüümid metüleerivad vaid ühte ahelat DNA-st, mis on N-6 positsioonis adenosüüljäägist, seega uuel replikeeritud DNA-l on ainult üks ahel metüleeritud, kuid see on piisav kaitsmaks seda uue restriktsiooni eest.

Tehislikud restriktaasid

Tehislikke restriktaase valmistatakse ühendades looduslikke või tehislikke DNA seondumisalasid restriktaaside domeenidega (tihti kasutatakse IIS tüüpi restriktaasi, FokI, lõikamisdomeeni) Sellised tehisrestriktaasid suudavad seonduda suurte aladega (kuni 36 aluspaariga) ja on võimelised siduma soovitud DNA järjestusega. Tsink-sõrmrestriktaasid on enim kasutatavad tehisrestriktaasid, mida kasutatakse geenitehnoloogias.