RluA

RluA (ingl Ribosomal large subunit pseudouridine synthase A, sünonüüm yabO) on pseudouridiini (Ψ ehk psii) süntaas. Tegemist on ribosoomi suure subühiku ensüümiga, mis muudab uridiini pseudouridiiniks. RluA-le omased modifikatsioonikohad on 23S RNA-l positsioonis 746 ja tRNAᴾʰᵉ, tRNSCys ja tRNAᴸᵉᵘ⁴-l positsioonis 32. Pseudouridiini süntaaside perekondasid on leitud kõigist senini uuritud bakteritest, eukarüootidest ja arhedest. Pseudouridiini süntaaside perekondi on praeguseks leitud viis: RsuA, RluA, TruB, TruA, TruD.

Kirjeldus

Lisaks üldiselt teadaolevatele RNA nukleosiididele (adenosiin, uridiin, tsütidiin, guanosiin) sisaldab rakkudes olev RNA ka teistsuguseid nukleosiide. Kõiksugustel organismidel on neid kokku rohkem kui sada erinevat. Selleks, et teistmoodi nukleosiide RNA sisse saada, on vaja juba olemasolevaid pärast transkriptsiooni kohaspetsiifiliselt muuta.
Kõige esimesena avastati selliste nukleosiidide seast pseudouridiinid. Neid on ka kõige rohkem. Näiteks pärmi tRNA-s on 4% kõigist nukleosiididest just pseudouridiinid. Pseudouridiin on uridiini viiendas positsioonis asuva glükoosi glükosiidsideme isomeer.

Tähtsus

Päris täpselt ei ole veel pseudouridiinide funktsioonist ja olulisusest aru saadud. Praeguseks on nii palju märgatud, et mitmed pseudouridiini süntaaside sünteesikohad on fülogeneesis tugevalt konserveerunud. Tihti asuvad pseudouridiinid rakulistele RNA-dele funktsionaalselt oluliste piirkondade läheduses. Bioloogiliselt võib tähtsaks pida ka seda, et pseudouridiin, erinevalt uridiinist, suudab RNA suures vaos moodustada lisaks veel ühe vesiniksideme. Pseudouridiine sisaldavad RNA-d on struktuurilt jäigemad ja stabiilsemad.
Pärmil on näidatud, et üksiku pseudouridiini puudumine ei mõjuta märgatavalt tema elukvaliteeti. Kui eemaldada mitu pseudouridiini korraga, võib see aga teatud juhtudel rakkudele saatuslikuks osutuda.
RluD-l ja TruB-l on näidatud, kuidas pseudouridiini süntaasi puudumine aeglustab rakkude kasvu. Samas on selle juures oluline arvestada, et kui süntaas alles jätta ja rikkuda ainult konserveerunud aspartaat (näiteks punktmutatsiooniga), siis jääb rakkude kasv normaalseks. See justkui näitaks, et pseudouridiini süntaasidel võib olla rakus veel mõni seni teadmata lisafunktsioon. On võimalik järeldada ka hoopis seda, et posttranskriptsioonilised RNA modifikatsioonid moodustavad suurema struktuurse ja funktsionaalse liidu, mille stabiilsus on üksteisest sõltuv.
Täpselt ei ole veel teada, mis juhtub rakuga, kui RluA puudub. On näidatud, et kui on tehtud segu rakkudest, mis sisaldavad rluA geeni, ja sellistest rakkudest, kus see geen on deleteeritud, siis soodustab looduslik valik tüvesid, milles rluA geen on olemas ja nemad on segus elujõulisemad. Kui kasvatada neid kahte tüüpi rakke eraldi, siis on kasv mõlemal normaalne ja omavahel võrdne.

Struktuur

Pseudouridiini süntaaside erilisus peitub nende võimes substraati väga spetsiifiliselt ära tunda. See on võimalik tänu süntaaside struktuurile.
Kõigil pseudouridiini süntaasidel on samasugune südamik. Südamiku kõige olulisem ja konserveerunum osa on üks kindel aspartaat. See aspartaat on ühine kõigile pseudouridiini süntaasidele, mistõttu paistab, et kõik pseudouridiini süntaasid pärinevad ühest eellasest.  Aspartaat on vajalik katalüütiliseks aktiivsuseks ning ta paikneb aktiivlõhe põhjas.
Kõigil RluA-del on ühine konserveerunud aktiivsaidi konsensusjärjestus: XXHRLD. Substraadi konserveerunud konsensusjärjestus on ΨUXXAAA.
RluA koosneb mitmetest α-heeliksitest ja β-lehtedest. Tema ruumiline struktuur sisaldab kolme konserveerunud järjestust ehk motiivi (nimetatakse motiiv I, II ja III).
Aktiivsait on peamiselt hüdrofoobne ja sisaldab ainult kolme konserveerunud polaarset osa. Üks neist on varem nimetatud aspartaat. On näidatud, et ta mängib olulist rolli pigem katalüüsis ja on vähem vajalik RNA äratundmiseks või struktuurse koostisosana. Teiseks konserveerunud osaks saab olla lüsiin või arginiin. Mõlemad saavad katalüütilise aspartaadiga oma kõrvalahela kaudu soolasildu moodustada. Aktiivsaidi kolmas oluline konverveerunud polaarne komponent on türosiin.
Konserveerunud aspartaat asub motiiv II sees, katalüütilises saidis. Motiiv I ei kuulu otseselt aktiivsaiti, tema peamine funktsioon on olla toeks aktiivsaidi lingule. Motiiv III C-terminaalne ots sisaldab konserveerunud lüsiini või arginiini, mis moodustavad aspartaadiga soolasildu. Motiiv III N-terminaalne ots seondub modifikatsioonikohas substraat RNA 5’ selgrooga.
RluA-l asub katalüütiline aspartaat 64. positsioonis.

Seondumine

Pseudouridiinid ei vaja katalüüsiks kofaktoreid. Nende võime RNA-d spetsiifiliselt ära tunda on üks põhilisi nähtusi, mille uurimisele pseudouridiini süntaaside juures keskendutakse. Pseudouridiini süntaasid seonduvad uridiinile just RNA peal, sest vastasel juhul, kui nad modifitseeriks vabu uridiine, saaks viimased rakus kiirelt otsa. See jätaks pooleli teised olulised sünteesirajad.
RluA on eriline selle poolest, et ta suudab seonduda kahele väga erinevale RNA struktuurile (tRNA ja rRNA). Kahetist spetsiifilisust võimaldab substraatidel esinev samasugune järjestuse osa. RluA-l ei ole seondumiseks eraldi struktuurset domeeni. Samuti ei ole seondumine järjestusspetsiifiline nagu teistel pseudouridiini süntaasidel. RNA-ga saavutatakse kontakt nii, et RluA lükkab välja oma N-terminaalses osas paikneva lingu, mis loob sideme RNA-ga. RNA molekulist kinni haaramiseks on RluA-l niinimetatud pöidla ja nimetissõrme domeen. Pöial asub 6. ja 9. β-lehe vahel ning interakteerub RNA suure vaoga. Nimetissõrm loob kontakti väikese vaoga.

Mehhanism

Üldiselt on vaja pseudouridiini sünteesiks esimese asjana lõhkuda C-N glükosiidne side. Seejärel on vaja pöörata lahtist alust 180 kraadi kindla telje suhtes. Viimaseks ülesandeks on moodustada uus C-C glükosiidside.
Kui RluA seondub tRNA-ga, siis kutsub ta RNA struktuuris esile väga suuri muutuseid, mis võimaldavad isomerisatsioonil aset leida. Toimub neli suuremat muutust. Esiteks positsioonides 32, 34 ja 37 lükatakse osa RNA-st helikaalsest struktuurist välja. Seejärel täidetakse 37. positsiooni jupi lahkumise tagajärjel tekkinud auk 36. positsiooni adeniiniga. Seejärel moodustab 33. positsiooni uridiin pöörd-Hoogsteeni paari koos ümber tõstetud 36. positsiooni adeniiniga. Lõpuks pöörab 35. positsiooni adeniin end 180 kraadi ümber ja asetub äsja paardunud 33. positsiooni uridiini alla. 35. positsiooni adeniin on tavaliselt RluA substraatide seas konserveerunud.
Enamik interaktsioonist toimub 5' RNA osas. RluA puutub väga vähe otseselt kokku ümber tõstetud aluspaaridega RNA-s. Äratundmine sõltub ennekõike struktuuride komplementaarsusest.

Pseudouridiini süntaaside võrdlus

Järjestuselt on pseudouridiini süntaasid üsna erinevad, kuid struktuuri uurides võib märgata, et aktiivsait on neil samasugune. Neil on sarnased südamikud, mis koosnevad 8-ahelalisest ristsuunaliste β-lehtede osast, mitmetest heeliksitest, lingudest ja katalüütilisest vaost, milles asub katalüütilist aspartaati sisaldav ling. Nende sarnaseid südamikke ümbritsevad kõigil erinevad sekundaarsed struktuurielemedid. Osal on ka N- ja C-terminuses veel eraldi lisadomeenid, mis pikendavad struktuuri. Näiteks RluA ja RsuA perekondadel on N-terminaalses osas domeen, mis meenutab ribosoomivalku S4. Vaadates eri pseudouridiini süntaaside struktuure ja järjestusi, joondub sealt välja nende evolutsiooniline seotus.
RluA seondumist substraadiga saab võrrelda TruB-ga, sest nende mõlema jaoks on eriti oluline pöörd-Hoogsteeni paari väljaulatumine. Samas on nende erinevus selles, et substraadile seostumine toimub 60 kraadi erineva nurga alt. Sellest lähtuval on neil ka erinevusi perifeersetes struktuurides. Kui TruB saab hakkama ainult pöidlaga, siis RluA-l on olemas lisaks veel nimetissõrm. Nimetissõrm moodustub eraldi väljaulatuvast lingust. Nimetissõrm on olemas ka RsuA-l ja TruA-l. TruB-l ei ole ka motiiv III.