In situ hübridisatsioon

Materjali ettevalmistamine

Tavaliselt kasutatakse in situ hübridisatsiooni puhul kolme koelõiget.
a) Külmutatud lõigud. Värske kude külmutatakse väga kiiresti (pannakse −80-kraadisesse jääkappi). Seejärel asetatakse jäätunud lõigud spetsiaalsesse meediumi, mis on mõeldud õhukestele jäätunud koekihtidele. Lõigud fikseeritakse 4%-lisse paraformalaldehüüdi just enne hübridisatsiooni esilekutsumist.
b) Parafiini sisse pandud lõigud. Lõigud on fikseeritud formaliini (nagu on fikseeritud tavalised histoloogia preparaadid), mis pannakse omakorda vaha sisse (parafiinilõigud). 
c) Rakud suspensioonis. Rakud pannakse kindla tehnikaga (cytospin) klaasilõikudele ja fikseeritakse metanooliga.

Erinevad satelliidid

On olemas nelja erinevat tüüpi sonde, mida kasutatakse in situ hübridisatsioonil.

Oligonukleotiidsed satelliidid.

Neid produtseeritakse automaatse keemilise sünteesiga. See meetod kasutab desoksünukleotiide. See on ökonoomiline aga eeldab, et kasutaja juba teab spetsiifilist nukleotiidide järjestust, mida soovitakse ette valmistada. Nendel satelliitidel on eelisteks on väike suurus (tavaliselt umber 40–50 aluspaari) ja resistentsus RNaasile. See sobib ISH jaoks hästi, kuna need on väikesed ja suudavad läbida huvipakkuvad rakud või koed. Oligonukleotiidsed satelliidid on ühe ahelalised ja seetõttu ei saa toimuda renaturatsiooni (DNA ei saa võtta oma tavalist kaksikahela kuju).

Üksikahelalised DNA satelliidid.

Need satelliidid on umbes 200–500 aluspaari pikad. Neid sonde toodetakse RNA pöördtranskriptsiooniga.

Kaheahelalised DNA satelliidid

Neid sonde toodetakse nii, et bakteritesse viiakse sisse meid huvitav järjestus, baktereid paljundatakse, lüüsitakse, eraldatakse, DNA puhastatakse ja huvipakkuv järjestus väljub koos piiravate ensüümidega. Bakteriaalse meetodi eeliseks on, et korraga on võimalik saada suur kogus uuritavat satelliitjärjestust. Kuna see satelliit on kaheahelaline siis denaturatsioon peab toimuma enne hübridisatsiooni, et oleks võimalik ahela hübridisatsioon huvialuse mRNA-ga. Seda meetodit ei kasutata tänapäeval palju, kuna üksikud DNA ahelad kipuvad üksteisega rehübridiseeruma ja see vähendab sondide tundlikkust.

RNA satelliidid (cRNA satelliidid või ribosoomi satelliidid)

RNA satelliitide eeliseks on, et RNA-RNA hübriidid ei ole tundlikud temperatuuri suhtes ja RNaasid ei mõju neile. See lubab pärast hübridisatsiooni RNaasiga lagundada mittehübridiseerunud RNA ja sellega ka võimaluse taustasodiks.

Protsess

In situ hübridisatsiooniks kogutakse kõigepealt kudede või rakkude proovid. Seejärel töödeldakse neid nii, et huvipakkuv järjestus oleks fikseeritud kohas, kus nukleotiidhappe ahel oleks kõige paremini kättesaadav. See satelliitjärjestus on kas märgistatud komplementaarne DNA ahel või tihedamini RNA komplementaarne ahel. Konkreetne sond hübridiseerib kõrgel temperatuuril sihtmärkjärjestusega ja seejärel peseb minema üleliigse materjali, mis ei moodustanud sidet (pärast varasemat hüdrolüüsi, kasutades RNaasi, et lagundada üleliigne RNA ahel). Lahuse parameetreid, nagu temperatuuri, soola ja/või lahusti kontsentratsiooni, saab muuta, et eemaldada terve ahel, mis ei hübridiseerunud. See jätab alles ainult komplementaarsete järjestustega ahelad. Seejärel sildistatud ahel, mis oli märgistatud kasutades radio-, fluorestsents- või antigeenmärgistamise baasi, lokaliseeritakse ja mõõdetakse selle kogused koes. Neid mõõdetakse vastavalt kas autoradiograafiaga, fluorestsentsmikroskoopiaga või immunohistokeemia meetoditega. ISH-d võib kasutada ka kahe või enama transkripti tuvastamiseks, kui need on märgistatud radioaktiivse satelliidi või teiste mitteradioaktiivsete satelliitidega.
On olemas alternatiivne tehnoloogia RNA (mRNA, IncRNA ja miRNA) in situ hübridiseerimiseks ühe molekuli täpsusega – hargnenud DNA meetod (ingl branched DNA assay). See lähenemine (nt WiewRNA meetod) võimaldab visualiseerida kuni neli sihtmärki läbiviimise jooksul ning see kasutab patenteeritud sondimudelit ja bDNA amplifikatsiooni, et tekitada tundlikke ja spetsiifilisi signaale.
Proovid (rakud, koed ja ringlevad kasvajarakud) fikseeritakse ja töödeldakse, et saada ligi RNA sihtpunktidele (ingl RNA un-masking). Sihtmärgile spetsiifilised sondid (üksikud oligonukleotiidid, mis seostuvad kõrvuti RNA sihtkohtadel). Tüüpiline sond sisaldab 40 oligonukleotiidi, mis teeb kokku 20 paari, mis seostuvad kõrvuti sihtkohal, et tuvastada mRNA-d ja IncRNA-d, ning üks paar, mis seostub miRNA-ga.
Signaali võimendamine saadakse järjestikuste hübridisatsioonireaktsioonidega. Kõigepealt seostub eelvõimendaja molekul (ingl pre-amplifier molecule) iga oligonukleotiidipaariga sihtmärgi-spetsiifilisel RNA-l, seejärel seostub mitu võimendajamolekuli iga eelvõimendajamolekuliga. Järgnevalt seostuvad mitu märgisega sond-oligonukleotiidi (konjugeeritud aluseliseks fosfataasiga või otse fluorofooriga) võimendajatega.
Täielikult seostunud signaali võimendamise mehhanismil (ingl „tree“ – 'puu') on 400 seostumiskohta märgisega sondimolekulile. Kui kõik sihtmärgispetsiifilised sondid seostuvad sihtmärk-mRNA-ga, toimub 8000-kordne signaali võimendamine ühe transkriptsiooni jooksul. Erinevad kokkusobivad signaalivõimendamised lubavad teha mitu protseduuri (assay'd). Signaali saab teha nähtavaks fluorestsents- või valgusmikroskoobi abil.