RRNA transkriptsiooni regulatsioon soolekepikeses

Ribosomaalse RNA (rRNA) transkriptsiooni regulatsioon on protsess, mille teel mõjutatakse rRNA hulka rakkudes. Antud artikkel kirjeldab seda protsessi soolekepikeses (Escherichia coli ehk E. coli). Kuna E. coli on üks geneetika, molekulaarbioloogia ja biokeemia uuritumatest mudelorganismidest, siis olemasolevate teadmiste najal E. colist on võimalik otsida analoogilisi mehhanisme ka teistest organismidest.
rRNA on rakkude elutegevusele oluline, sest vastavad molekulid (bakterites 16S, 23S ja 5S rRNA molekulid) moodustavad vahekorras 1:1:1 koos ribosomaalsete valkudega ribosoomid. Ribosoome on rakkudes vaja valkude tootmise jaoks. Ribosoomide hulka rakus kontrollitakse põhiliselt rRNA transkriptsiooni tasemel.
E. colis on seitse peaaegu identset rrn operoni, kuhu on koondunud 16S, 23S ja 5S rRNA molekule kodeerivad geenid. Nendelt viib rRNA transkriptsiooni läbi ensüüm RNA polümeraas (RNAP). Selle protsessi käigus toimub transkriptsiooni alustamine ehk initsiatsioon, RNA ahela pikenemine ehk elongatsioon ning RNA ahela lõpetamine ehk terminatsioon. rRNA transkriptsiooni regulatsioon toimub põhiliselt initsiatsiooni etapis. Erinevad tegurid võivad soodustada RNAP seostumist promootorile (positiivne regulatsioon) või seda takistada (negatiivne regulatsioon).
rRNA transkriptsiooni regulatsioon sõltub keskkonnatingimustest ja rakkude kasvukiirusest. Kui keskkonnas on piisavalt toitaineid, toodetakse palju rRNAd ja rakud saavad kiiresti jaguneda. Rakud saavad paljuneda ainult siis, kui neis on piisavalt ribosoome, et toota piisavas koguses rakkude jagunemiseks vajalikke valke. rRNA transkriptsioon moodustab raku kogutranskriptsioonist 75%. Kui keskkonnas on mõnda toitainet vähe või puudu (näiteks suhkruid või aminohappeid), siis satuvad rakud stressi ja rRNA transkriptsioon aeglustub.

rrn operonide asendi mõju transkriptsioonile

E. coli kromosoomis on seitse peaaegu identset operoni, millelt rRNAd toodetakse: rrnC, rrnA, rrnB, rrnE, rrnD, rrnG ja rrnH. Neli neist, operonid rrnCABE, paiknevad replikatsiooni alguspunkti oriC lähedal. Need seitse operoni hõlmavad kromosoomi suurusest (4,6 megaaluspaari) vaid 38 kiloaluspaari ehk vähem kui 1% genoomist. Seega peavad need operonid võistlema ülejäänud 99% genoomiga RNAPga seondumise pärast, et transkriptsioon toimuda saaks. Kuna RNAP hulk on rakus kindlal ajamomendil piiratud, ei jätku seda, et transkriptsioon saaks kõikidelt genoomi operonidelt ja geenidelt korraga toimuda.
rRNA transkriptsiooni toimumist lihtsustab asjaolu, et rrn operonide transkriptsiooni ja kromosoomi replikatsiooni suunad ühtivad. Seega on tõenäosus, et RNAP ja replikatsiooni läbi viiv DNA polümeraas põrkuksid, väiksem ning transkriptsioon kulgeb suurema tõenäosusega lõpuni. Kui geeni asend genoomis on selline, et transkriptsiooni ja replikatsiooni suunad on vastandlikud, võivad DNA polümeraas ja RNAP replikatsiooni toimumisel põrkuda. Seetõttu võivad RNAP ja DNA polümeraas DNA ahelalt lahti tulla ning transkriptsioon ja replikatsioon enneaegselt seiskuda. DNA polümeraasi ja RNAP põrkumine võib kaasa tuua DNA kahjustusi ja kromosoomide ebastabiilsust.
Operonide rrnCABE paiknemine oriC läheduses põhjustab kiirelt kasvavas rakus geenidoosi efekti. Terve kromosoomi replikatsiooniks kulub umbes 40 minutit, aga rakk võib soodsas kasvukeskkonnas jaguneda kiiremini, seega alustatakse kiirelt kasvavates ehk kiirelt jagunevates rakkudes replikatsiooni üha uuesti enne seda, kui eelmine replikatsiooni tsükkel lõpuni jõudnud on. Seetõttu toodetakse rRNAd ühes rakus korraga rohkemalt kui seitsmelt operonilt. Näiteks on hinnatud, et metsiktüüpi E. coli rakus, mille raku poolestusaeg on 23 minutit, on 38 rrn operoni ekvivalenti, samas kui 36-minutilise poolestusajaga rakus on 22 rrn operoni ekvivalenti.
rRNA transkriptsiooni kiirust mõjutab ka eukarüootsete rakkude tuumakeste laadsete struktuuride teke bakteri nukleoidis. Kiiresti kasvavates rakkudes moodustavad rrn operone kandvad kromosoomi lingud kolmemõõtmelise struktuuri nii, et need operonid asuksid üksteise läheduses. Nende struktuuride juurde koondub suurem osa rakus olevast RNAPst ning operonide lähedus soodustab RNAP taaskasutamist ülejäänud rrn operonides, mitte teistes genoomi operonides ja geenides. Sellised tuumakeselaadsed struktuurid kaovad siis, kui raku kasv peatub.
Seega aitab rrn operonide asetus genoomis kaasa RNAP seondumisele promootorile ja RNAP taaskasutamisele just rrn operonides ning ennetab rRNA transkriptsiooni liiga varajast katkestamist DNA polümeraasiga põrkumise teel.

rrn operonide struktuuri mõju transkriptsioonile

Iga rrn operon koosneb regulaatoralast, promootoritest P1 ja P2, antiterminatsiooni süsteemist, pausi aladest, 16S, 23S ja 5S rRNA ja paarist tRNA geenist ning terminaatorist.
Nii P1 kui P2 promootor on raku kiire kasvu tingimustes äärmiselt tugevad ja tõhusad promootorid. Seda järeldatakse RNAP tihedusest, võrreldes teiste E. coli promootoritega samades tingimustes. Samas on kiire kasvu tingimustes ülekaalus P1 aktiivsus  ning madala kasvukiiruse juures ja stressi tingimustes kasutatakse põhiliselt P2 promootorit . P1 ja P2 erinev ekspressioon kiire kasvu tingimustes tuleneb arvatavasti transkriptsiooni häirumisest P2 juures, mida põhjustab RNAP liikumine läbi P2, kui transkriptsioon on alanud P1 juurest.
P1 promootorist ülesvoolu olevas regulaatoralas asub UP element. UP element suurendab P1 aktiivsust rohkem kui 30 korda. UP element parandab RNAP seondumist, pakkudes täiendavaid alasid interaktsiooniks RNAP ja promootori P1 vahel. UP elemendist ülesvoolu asuvad ka selliste regulaatorite nagu Fis, H-NS ja Lrp seostumiskohad, mis võivad ka UP elemendiga kattuda.
P1 promootori −10 regioonist allavoolu, aga enne transkriptsiooni alguskohta +1, on G/C (guaniini ja tsütosiini) rikas diskriminaator-regioon. Arvatakse, et kuna G/C rikas ala on äärmiselt stabiilne, on vaja lisaenergiat, et transkriptsiooni initsiatsiooniks vajalik RNAP avatud kompleks võiks tekkida ja säilida. Seega annab G/C rikka piirkonna olemasolu oma panuse avatud kompleksi ebastabiilsusse, mis kestab enne esimeste fosfodiestersidemete moodustumist, ning P1 tundlikkusse muutuvate keskkonnatingimuste suhtes.
rrn operonide antiterminatsiooni süsteemi, mis asub P2 promootorist allavoolu, on vaja selleks, et rRNA elongatsioonil oleks suurem kiirus kui mRNAde elongatsioonil ning et ennetada enneaegset terminatsiooni.

Regulaatorite mõju transkriptsioonile

rrn operonide P1 promootorilt toimuva transkriptsiooni kiirust piirav etapp on RNAP avatud kompleksi moodustumine ja säilimine transkriptsiooni initsiatsioonil enne esimeste fosfodiestersidemete tekkimist. Seetõttu reguleeritakse rRNA transkriptsiooni kiirust põhiliselt selles etapis. Avatud kompleksi moodustumise tõhusust ja stabiilsust mõjutavad mitmed tegurid, reguleerides seega transkriptsiooni aktiivsust P1 promootorilt.

Positiivsed regulaatorid

Superspiralisatsioon ehk DNA vinti keerdumine soodustab rRNA transkriptsiooni. Superspiraliseerunud DNAd kasutades on transkriptsioon rrn operonide promootoritelt väga tõhus, kuid lineaarset DNAd kasutades on märgatud nendelt promootoritelt vaid minimaalse aktiivsusega transkriptsiooni. Lineaarse DNAga seondunud RNAP avatud kompleksid on ebastabiilsemad ja soolade suhtes tundlikumad.
Fis on nukleoidiga seostatud valk, millel on palju funktsioone. Kui Fis seostub teatud aladega, mis eelnevad P1 promootorile, aktiveerib ta sealt transkriptsiooni, interakteerudes RNAP-ga. Samuti on katsed näidanud, et Fis stabiliseerib RNAP avatud kompleksi, ent selle nähtuse mehhanism pole veel teada.

Negatiivsed regulaatorid

ppGpp ehk võlutäpike on signaalmolekul, mis kuhjub rakku nii osmootse kui näljastressi tingimustes. Kui kiirelt kasvavatel rakkudel tekib aminohapete puudus, toob see kaasa poomisvastuse (stringent response) ning rakku kuhjub 100 korda enam ppGpp-d, kui seda seal tavatingimustes on. Sellega kaasneb kohene rRNA sünteesi ja kasvu peatumine. ppGpp rRNA transkriptsiooni inhibeeriv mõju avaldub tingimustes, kus on vähenenud avatud kompleksi tekke tõhusus (näiteks lineaarsele DNAle seostunud RNAP või mõõdukate soola kontsentratsioonide (50 mM KCl) puhul), ent siis vähendab ta oluliselt RNAP avatud kompleksi eluiga. ppGpp seostub RNAPga selle kahe subühiku ω ja β' vahele. Samuti mõjutab ppGpp negatiivselt transkriptsiooni elongatsiooni etappi, suurendades transkriptsiooni ajal RNAP seiskumist mitmes piirkonnas nii lineaarse kui ka superspiraliseerunud DNA puhul. Ent ppGpp mõju rRNA ahela elongatsioonile in vivo kontekstis on veel vastuoluline.
DksA on valk, mis seostub RNAPga ja vähendab selle avatud kompleksi eluiga rrn operonide P1 promootoritel. DksA võimendab ka ppGpp toimet, vähendades nii avatud kompleksi eluiga veelgi.
H-NS on nukleoidiga seostatud valk, mille seostumiskoht asub P1 promootorist ülesvoolu. Fis-i puudumisel püüab H-NS DNAga seotud RNAP lõksu, moodustades P1-st üles-ja allavoolu jäävatest DNA järjestustest linge ja moodustades nende vahele sildu, nii et RNAP ei saa mööda DNAd edasi liikuda. Fis-i seondumine töötab H-NSi negatiivsele efektile vastu, sest Fis-i ja H-NSi seondumiskohad kattuvad regulaatoralas üksteise ja UP elemendiga üle.
Lrp (leutsiini-tundlik regulatoorne valk) soodustab H-NSi seondumist rrn operonide P1 promootoritele. Sarnaselt H-NS-iga inhibeerib Lrp ka üksi transkriptsiooni initsiatsiooni, seondudes promootorala lähedale, kuid leutsiini juuresolul kaotab Lrp selle võime. Lrp-i ekspressiooni stimuleerib ppGpp.