Elektrofüsioloogia

Optilise elektrofüsioloogia meetodid

Optilise elektrofüsioloogia meetodite peamiseks eesmärgiks on klassikaliste meetodite põhiliste piirangute ületamine. Klassikaliste meetoditega saab elektrilist aktiivsust jälgida umbkaudselt ühes kindlas punktis raku terviklikust mahust. Seeläbi loomu poolest ei erista klassikalised mõõtemeetodid rakkude kogumikule iseloomulikke hajutatud nähtusi ühe raku piires toimuvatest lokaalsetest nähtustest. Huvi bioelektrilise aktiivsuse ruumilise jaotuse vastu kiirendas valgust kiirgavate molekulide väljaarendamist, mis reageerivad vastavalt elektrilistele või keemilistele keskkonnatingimustele. Ühe- või kahemõõtmelist elektrilise aktiivsuse jaotust saab jälgida ja mõõta, kui lisada seda tüüpi aineid kudemesse.

Rakuväline mõõtmine

Rakumembraani elektrilist aktiivsust saab jälgida ka väljaspool rakku klaasist mikropipettide või elektroodide abil Võrreldes rakusisese mõõtmisega, mille korral mõõteelektrood läbistab rakumembraani, mõjutab rakuväline mõõtmine rakku tunduvalt vähem ja ühtlasi saab selle meetodiga teha ka mitmes punktis korraga mõõtmisi, kasutades mitme elektroodiga kiipe (MEK). Rakuvälise mõõtemeetodi korral kasutatavate elektroodide suurus on umbes 5–10 mikromeetrit, mille suhteliselt suured mõõtmed tagavad mõistliku takistuse väärtuse elektroodi ja elektrolüütlahuse piirpinnal ning hea signaali-müra suhte aktsioonipotentsiaalide detekteerimisel. MEK-e kasutatakse mitmesugustel uurimisaladel, näiteks kasvatatud (inglise cultured) neuronivõrgustike dünaamika ja elektrilise aktiivsuse arendamisel ja uurimisel , neuraalse aktiivsuse uurimisel ajudes  jne. Samas MEK-ide suurus ja sellest tulenev väike lahutusvõime muudab rakkudest väiksemate struktuuride, näiteks aksonite ja tendriidide, mõõtmise keeruliseks. Ühtlasi on MEK-ide suuruse tõttu keeruline seostada üks-üheselt konkreetse raku tekitatud signaali ja sellele rakule kõige ligemal paiknevat elektroodi, kuna elektroodid kipuvad mõõtma mitme naabruses oleva raku aktiivsust. Seetõttu spetsiifilise raku signaali identifitseerimine vajab hiljem keerulist järeltöötlust.
MEK-ide suurusest tingitud probleemidele pakub lahenduse nanomõõtmetes seadmed. Signaalide registreerimiseks kasutatakse enamasti väljatransistoreid, mille kanalid on keemiliselt sünteesitud pooljuhist nanojuhtmed (inglise SiNW FET – Silicone NanoWire Field Effect Transistor). Asetades SiNW FETi huvipakkuvasse elektrofüsioloogilisse keskkonda, muudab SiNW FETi nanojuhtmest kanal oma juhtivust vastavalt välise potentsiaali mõjudele. Kuna väljatransistorid on pingega juhitavad, pole elektroodi ja elektrolüütlahuse piirpinna takistus SiNW FET-tehnoloogiat kasutades enam probleemiks ning seega saavad seadmed olla väga väikesed.

Üksikraku mõõtemeetod

Elusorganismi kudemesse sisestatud elektrood detekteerib enamasti mitmete elektroodi otsa ligiduses paiknevate rakkude summaarset elektrilist signaali. Kui aga elektroodiks on umbes 1 mikromeetri suuruse otsaga mikroelektrood, siis detekteeritav signaal pärineb tõenäoliselt ühest rakust. Seesugust mikroelektroodidega rakuvälist mõõtemeetodit nimetatakse üksikraku mõõtmiseks (inglise single-unit recording). Nii mõõdetud aktsioonipotentsiaalid on väga sarnased rakusisese mõõtemeetodiga saadud tulemustega, kuid signaalitugevus on tunduvalt nõrgem (tüüpiliselt umbes 1 mV). Rakuvälist üksikraku mõõtemeetodit kasutatakse peamiselt teadvusel tuimestatud loomade neuronite signaalide mõõtmisel, andes olulist teavet sellest, kuidas aju töötleb informatsiooni.
Kui elektroodi ots on veidikene suurem, siis detekteeritav informatsioon võib pärineda mitmest rakust. Seda tüüpi meetodit nimetatakse mitme raku mõõtmiseks (inglise multi-unit recording) ja seda kasutatakse peamiselt teadvusel loomade üksikute aju osade aktiivsuse monitoorimisel looma normaalse talitluse korral. Mitme seesuguse kõrvuti asetatud elektroodiga on võimalik hinnata ümberkaudsete rakkude arvu ja signaalipiikide päritolu. Üldiselt on suure elektroodiga võimalik jälgida ainult rakkude kogumi summaarset aktiivsust, mitte üksikuid rakke.

Rakuväline mõõtmine SiNW FET-ide abil

Nanojuhtmetel põhinev väljatransistor (SiNW FET), nagu ka tavaline väljatransistor, koosneb pooljuhtmaterjalist kanalist, lättest, neelust ja paisuelektroodidest, mis on kasvatatud ühisele aluspinnale (peamiselt räni). Läte ja neel on omavahel ühendatud läbi pooljuhtmaterjalist kanali ning paisuga moduleeritakse kanali juhtivust elektrivälja muutuste läbi. SiNW FETi nanojuhtmest kanalit kasutatakse sensorina, mis muudab oma juhtivust paisu suhtes vastavalt välistele mõjudele kanali pinnal.
Kuna SiNW FET põhineb peamiselt ränil, siis see annab suure eelise teiste mõõtemeetodite ees, kuna räni juhtivust on läbi legeerimise suhteliselt lihtne muuta. SiNW FETi enamus laengukandjatest paikneb väga õhukesel pindmisel kihil, muutes seadme ülimalt tundlikuks väliste muutuste suhtes. Seega saab SiNW FETi seadmega mõõta väga väikseid välise elektrivälja muutusi.

Rakuväline mõõtmine EOS FET-ide abil

Tavalistes metall-oksiid-räni väljatransistorites tekib madalsageduslik müra peamiselt elektronide tunneliefekti tõttu paisu oksiidis olevate laengulõksude pärast. Müra saab vähendada, kui transistori kanal paigutada räni substraadi sisse (nn matta ära). Sarnast disaini kasutatakse müra vähendamiseks ka EOS-transistorites neuronite jälgimise jaoks. Epitaksiaalselt kasvatatud transistorite neelud, ühine late ja suurem osa ränist kaetakse metalliga ning transistorite kiip pühendatakse juhtmetega keraamilise pakendi külge.
Neuroni ja transistori sidestamise korral kinnitatakse neuron väljatransistori paisu külge läbi elektrolüüt-oksiid-pooljuht ühenduse (EOP inglise electrolyte-oxide-semiconductor ehk EOS). Rakuväline potentsiaali muutus elektrolüüdis (raku ja transistori vaheline ala) moduleerib otseselt transistori lätte ja neelu vahelist voolu. Et transistor oleks moduleeritud üksiku neuroni poolt, kasvatatakse neuronid kiibile võimalikult hõredalt ning kasvuperioodiks on umbes 7–12 päeva. Sellistes tingimustes ei teki tihedaid neuronite, neuriitide kihte ega teki schwanni rakke. Seesuguse sidestamise puhul aga ei saa jälgida terviklike kudede aktiivsust, kuna meetod eeldab kudemest proovitükkide võtmist ja sellest edasi kasvatamist.
Transistori väljundsignaali amplituud on seotud raku ja paisu geomeetriaga. Transistor reageerib raku ja kiibi vahelisele pingele, mis on põhjustatud neuroni ergastustest. Ergastustest tekkinud iooniline vool tekitab raku ja kiibi vahelises alas pingelangu, mille maksimaalne amplituud on raku ja transistori ühenduse keskel ning väheneb äärealadel.

Transistor-nõelkiip

Transistor-nõelkiibid (TNK) on seadmed, mis koosnevad mitmetest elektroodidest, mille otsa on tüüpiliselt ühendatud EOS väljatransistorid. TNK eeliseks on asjaolu, et sellise seadmega saab jälgida lokaalsete ajukudede aktiivsust ja signaali mustreid ilma kudet spetsiaalselt isendist eraldamata.

Rakusisene mõõtmine

Rakusisene mõõtmine kujutab endast peamiselt ette pinge ja/või voolu mõõtmist läbi rakumembraani. Et raku membraanipotentsiaali mõõta, peab sisestama terava ja väikese mikroelektroodi läbi rakumembraani. Puhkeolekus on tüüpiliselt terve raku membraanipotentsiaal umbes −60 kuni −80 mV ning aktsioonipotentsiaali jooksul võib membraanipotentsiaal ulatuda kuni +40 mV. 1963. aastal võitsid Alan Lloyd Hodgkin ja Andrew Fielding Huxley Nobeli meditsiiniauhinna neuronite aktsioonipotentsiaali genereerimise toimemehhanismide kirjeldamise eest. Nende eksperimendid kätkesid Atlandi kalmaari (Loligo pealei) aksonite rakusisest mõõtmist ning olid üheks esmaseks rakenduskohaks pingekinnistuse (inglise voltage-clamp) meetodile. Tänapäeval on rakusisesel mõõtmisel levinumateks mikroelektroodideks klaasist mikropipetid, mille otsa läbimõõt on alla ühe mikromeetri ja takistus on mõne megaoomi suurusjärgus. Mikropipetid on täidetud lahusega, millel on rakusisese vedeliku omaga sarnane iooniline koostis. Pipett sisaldab ka kloriiditud hõbedast juhet, mis ühendab elektrolüütlahuse elektriliselt võimendi ja signaalitöötlusseadmega. Elektroodi vahendusel mõõdetud pinget võrreldakse võrdluselektroodiga, mis asub väljaspool rakku ja on ühenduses rakuvälise vedelikuga. Mida väiksem on elektroodi ots, seda suurem on selle elektriline takistus, seega elektroodi valimisel tuleb teha kompromiss suuruse ja takistuse vahel. Mida suurem on elektrood, seda suuremaid kahjustusi tekitatakse rakule, samas väikese elektroodi korral on termiline müra eristamatum neuroni signaalidest.

Pingekinnistuse meetod

Pingekinnistuse meetod seisneb raku
membraanipotentsiaali fikseerimises teatud väärtusele. Seeläbi saab mõõta
rakumembraani läbivat ioonilist voolu antud membraanipotentsiaali väärtusel.
Membraanipotentsiaali võimendi mõõdab membraani pinget ja saadab tulemuse tagasisidevõimendisse. Tagasisidevõimendi lahutab mõõdetud membraanipinge eksperimentaatori poolt seatud pingest, mis pärineb signaaligeneraatorist. Saadud pingete erinevuse põhjal tuvastatakse membraanipotentsiaali erinevus seatud väärtusest ja vastavalt korrigeeritud vool rakku suunatakse tagasi, eesmärgiga minimeerida viga.
Selline mõõtemeetod on tähtis sellepoolest, et neuroni membraani ioonkanalid on pingest sõltuvad, mis avanevad ainult siis kui membraanipotentsiaal on teatud väärtuste piires.

Selektiivse isolatsiooni meetod

See meetodi töötasid välja Erwin Neher ja Bert Sakmann, kes said selle eest ka Nobeli auhinna. Tüüpiliselt tähendab rakusisene mõõtmine rakumembraani läbistamist peene elektroodiga, samas selektiivse isolatsiooni meetod on teistsuguse lähenemisega.
Selektiivse isolatsiooni mikroelektroodiks on suhteliselt suure otsadiameetriga mikropipett. Mikropipett asetatakse raku lähedusse ja läbi pipeti tekitatakse
kerge tõmme, eesmärgiga imeda rakumembraan pipeti otsa. Elektroodi klaasist ots moodustab membraaniga tiheda ühenduse. Seesugust mõõtmise konfiguratsiooni nimetatakse kinnitatud seisundiks (inglise cell-attached mode), nii saab uurida pipetiga piiritletud membraanitükis paiknevate ioonkanalite aktiivsust. Kui aga tekitada läbi pipeti suurem tõmme, siis elektroodi otsas paiknev membraanitükk võib liikuda paigast, säilitades siiski elektroodi ja raku vahelise ühenduse. Seesugune täieliku ühenduse seisund (inglise whole-cell mode) tagab väga stabiilsed tingimused rakusisesteks mõõtmisteks. Täieliku ühenduse seisundi negatiivseks küljeks (võrreldes näiteks membraani läbistavate teravate elektroodidega mõõtmisega) on aga asjaolu, et pipetis olev elektrolüütlahus seguneb rakusisese vedelikuga ning mõne tähtsa rakusisese vedeliku komponendi sisaldus võib väheneda. Alternatiiv täieliku ühenduse meetodile on tekitada membraani sisse nii pisikesed poorid, et suured molekulid, erinevalt ioonidest, ei pääse neist läbi.

BIT FET-tehnoloogia

Nii nagu selektiivse isolatsiooni meetodi puhul, saab ka rakusiseseid mõõtmisi teha nanomõõtmetes torude abil. Üks võimalus on kasutada BIT-transistoreid (BIT – Branched Intracellular nanoTube). BIT-väljatransistorite (BIT FET) puhul on väljatransistori külge ränidioksiidist kasvatatud nanomõõtmetes toru, mille eesmärgiks on läbi toru rakku sisestamise juhtida rakus paiknev tsütosool väljatransistorini, täpsemalt ränist moodustatud nanojuhtmest kanalini. Seeläbi saab transistori abiga mõõta raku membraanipotentsiaali. Kuna elektrivool praktiliselt puudub ja mõõdetavaks parameetriks on pinge, siis selliste tavaliste mõõtemeetodite nagu pinge kinnistamise ja selektiivse isolatsiooni meetod puhul esinev oomilise takistuse suurenemine elektroodi mõõtude vähenedes ei ole BIT FET-i puhul probleemiks. Seetõttu saab nanotoru sisediameeter olla väga väike, isegi umbes 3 nanomeetrise diameetri puhul on võimalik mõõta kõrge mõõtmissageduse ja aktsepteeritava signaali-müra suhtega. Ühtlasi mõjutab BIT FET-tehnoloogia tunduvalt vähem raku struktuuri kui teised mitte nanoskaalas meetodid. Kui nanotoru modifitseerida fosfolipiididega, läbistab nanotoru raku spontaanselt, moodustades tiheda ühenduse ja head mõõtetingimused.