ELISA (immunoensüümmeetod)

ELISA ehk immunoensüümmeetod (inglise keeles enzyme-linked immunosorbent assay) on biokeemias laialdaselt kasutatav laboratoorse diagnostika meetod, mis võimaldab selektiivselt tuvastada valke ning neid kvantitatiivselt iseloomustada määramispiiriga alla ühe nanogrammi. ELISA on mugav ja kiire meetod, mis kasutab sihtmärkide tuvastamiseks antikehasid ja värvimuutust.
ELISA meetodit kasutatakse diagnostikavahendina meditsiinis, taimepatoloogias ning kvaliteedi kontrollimiseks paljudes muudeski tööstusharudes. ELISA meetodeid on kolme tüüpi: otsene (direct) ELISA, kihiline (sandwich) ELISA ja konkureeriv (competitive) ELISA.

Põhimõte

ELISA toimib spektrofotomeetrilise meetodina tänu ensüümidele, mis katalüüsivad substraadist värvilise saaduse teket. Ensüüm on kovalentselt seotud antikehaga, mis tuvastab spetsiifiliselt huvipakkuva antigeeni. Antigeeni olemasolu korral seostub sellega antikeha-ensüüm kompleks. Signaal tekib, kui uuritav lahus sisaldab antigeeni. Tavaliselt on signaaliks värvimuutus. Juhul, kui lahus ei sisalda antigeeni, ensüümi-antikeha kompleks pinnale ei seondu ning substraadi lisamisega signaali ei kaasne.
ELISA katse läbi viimiseks peab vähemalt üks antikeha olema spetsiifiline konkreetse antigeeni suhtes. Teadmata hulgal antigeeni sisaldav proov immuniseeritakse tahkele pinnale kas mittespetsiifiliselt (adsorptsioon) või spetsiifiliselt (kihiline ELISA). Pärast antigeeni immuniseerimist lisatakse tuvastusantikeha, mis moodustab antigeeniga kompleksi. Tuvastusantikeha võib kovalentselt seonduda ensüümiga. Teise võimalusena võib tuvastusantikeha tuvastada sekundaarse antikehaga, mis on seotud ensüümiga biokonjugatsiooni abil. Iga etapi vahel pestakse üldjuhul plaat pesulahusega, et eemaldada valgud või antikehad, mis pole spetsiifiliselt seondunud. Pärast viimast pesu lisatakse substraat nähtava signaali saamiseks, mis näitab antigeeni kogust proovis.
ELISA on heterogeenne meetod, mis immobiliseerib analüüdi lahusest tahkele faasile ehk pinnale. Proovilahus lisatakse eriliste sidumisomadustega statsionaarsele faasile. Üksteise järel lisatakse mitmed reagendilahused, inkubeeritakse ja pestakse. Sellele järgneb lõpplahuse värvimuutus, millest mõõdetakse analüüdi hulka. Kvalitatiivne lugemine põhineb tavaliselt valguse intensiivsuse mõõtmisel spektrofotomeetriga. Tuvastamise intensiivsus sõltub signaali võimendusest analüütilise reaktsiooni vältel. Kuna ensüümireaktsioonid on väga hästi tuntud võimendusprotsessidena, tekitatakse signaal ensüümidega, mis on seotud tuvastusantikehade külge kindlates kogustes, et võimaldada täpne kvantitatiivne määramine.

Rakendused

Doktor Dennis E. Bidwell ja Alister Voller lõid ELISA meetodi, et diagnoosida teatud haigusi (malaariat, Chagasi haigust, Johne haigust). ELISA meetodit kasutatakse ka in vitro diagnostikas meditsiinilaborites ning tuberkuloosi mükobakterite antikehade, rotaviiruse, B-hepatiidi markerite ja HIV-infektsiooni tuvastamiseks.
ELISA oli esimene laialt kasutatav analüüs tänu suurele tundlikkusele HIV-infektsiooni avastamisel. ELISA meetodi puhul lahjendatakse seerumilahus 400 korda ja kantakse HIV antigeenidega kaetud plaadile. Juhul kui HIV antikehad on seerumis olemas, võivad nad seonduda nende HIV antigeenidega. Plaat pestakse, et eemaldada kõik seerumi komponendid. Spetsiaalselt ette valmistatud sekundaarne antikeha (antikeha, mis seondub teiste antikehadega), kantakse plaadile ja korratakse pesu. See sekundaarne antikeha on keemiliselt seotud ensüümi külge. Niisiis sisaldab plaat ensüümi vastavas koguses sekundaarse antikehaga, mis on seotud plaadi külge. Lisatakse ensüümi substraat ja ensüümi katalüüs viib värvi muutuseni. ELISA tulemused esitatakse numbriliselt. Kõige vastuolulisem testi juures on määramispiiri kindlakstegemine, mida määratakse võrreldes seda referentsväärtusega. Narkootikumide määramise puhul on avastamispiiriks seatud 50 ng/ml.
ELISA-t saab kasutada nii antigeeni kui ka antikeha olemasolu hindamiseks proovis. Seega on ELISA-t hea kasutada seerumis antikeha kontsentratsioonide (Lääne-Niiluse viirus) määramiseks. Samuti on ELISA kasutust leidnud toidutööstuses võimalike allergeenide (piim, maapähklid, Kreeka pähklid, mandlid ja munad) tuvastamiseks. Toksikoloogias kasutatakse ELISA-t teatud narkootikumide kiirprooviks.