Pöördfaaskromatograafia

Pöördfaaskromatograafia on enim kasutatud eraldusmeetod ainete lahutamiseks kromatograafiliselt. Umbes 90% kromatograafilistest analüüsidest tehakse tänapäeval pöördfaaskromatograafiaga. Pöördfaaskromatograafiat kasutatakse enamasti vedelikukromatograafias, vähem gaasikromatograafias. Ainete segu kantakse läbi liikumatu ehk statsionaarse faasi eluendi vooluga. Pöördfaaskromatograafias on statsionaarne faas mittepolaarne, hüdrofoobne ning liikuv faas ehk mobiilne faas on polaarne. Normaalfaaskromatograafias, mida kasutati enne pöördfaaskromatograafiat, on statsionaarne faas polaarne ja mobiilfaas mittepolaarne.
Kasutatakse laialdaselt analüütilise keemia harudes, nagu kriminalistika, toidutehnoloogia, biotehnoloogia, ravimitööstus ja meditsiin.

Statsionaarsed faasid ja kolonnid

Pöördfaaskromatograafias kasutatav statsionaarne faas on mittepolaarne. Enamasti on kolonnide täidsimaterjaliks silikageel.
On olemas ka polümeerseid aluseid, alumiiniumoksiidist ja tsikooniumoksiidist aluseid, kuid neid kasutatakse enamasti vaid kindlates rakendustes.
Kolonnid on täidetud väikese diameetriga poorsete osakestega. Kõige rohkem kasutatakse osakesi suurusega 5 mikromeetrit, 3,5 mikromeetrit ja 2,6 mikromeetrit. Kolonn täidetakse osakestega suure rõhu all, et nad oleksid kolonni kasutades stabiilsed. Osakeste pinnal on keemiliste sidemetega seotud mittepolaarsed süsivesinikahelad (tavalisemad on C18 või C8 ehk vastavalt 18 või 8 süsinikku reas, aga ka C2), mis eraldavad proovi komponendid üksteisest.
Silikageeli baasil valmistatud statsionaarsed faasid annavad suurema efektiivsuse, võrreldes kõigi teiste alusmaterjalidega. Silikageel on mehaaniliselt tugev (jäik), mis tagab stabiilsed omadused. See ei pundu vees ega orgaanilistes solventides ning võimaldab gradientelueerimist. Pind on keemiliselt modifitseeritav ehk muudetav.

End-capping

Kromatograafias kasutamiseks peab silikageeli pind olema kaetud silanooli kihiga –SiOH. Selleks modifitseeritakse silikageeli pinda mittepolaarsete rühmadega. Suurem osa vabadest silanoolidest jääb siiski reageerimata steerilise takistuse tõttu. Kuna sidumata silanoolid on happelised ja reaktsioonivõimelised proovi aluseliste komponentidega, siis on vaja vabade silanoolide hulka vähendada. Selleks viiakse läbi end-capping ning aluse pinda töödeldakse mõne väiksema silanooliga (nt trimetüülkloorsilaaniga). Kui asendada pikk hüdrofoobne (nt C18) ahel metüülrühmaga, muutub reagent väiksemaks ja pääseb järelejäänud vabadele silanoolidele ligi. Selle järel on kolonn end-capped. Ka pärast seda protseduuri on umbes pooled silanoolidest siiski sidumata.
Kui kasutada ainult end-cappingu reagenti (ilma C18 ahelate lisamiseta), siis vastav pind ei oleks väga stabiilne, sest väiksemad rühmad hüdrolüüsuvad madala pH juures kiiresti. Happelistes tingimustes kolonni stabiilsus kasvab seotud faasi pikkuse kasvades. Pikemad ahelad kaitsevad end-capped rühmi hüdrolüüsi eest ja need omakorda vähendavad sidumata pinna reaktiivsust. Seetõttu kasutatakse pöördfaaskromatograafias peamiselt C8 ja C18 ahelaga end-capped kolonne.

Mobiilsed faasid

Pöördfaaskromatograafias kasutatakse analüütide elueerimiseks vee (solvent A) ja orgaaniliste solventide (B) segu. Solvendid peavad veega segunema. Kõige enam kasutatavad orgaanilised solvendid on metanool(MeOH), atsetonitriil(MeCN) ja tetrahüdrofuraan(THF). Võimalik on kasutada nii isokraatilist elueerimist kui ka gradientelueerimist.
Mobiilfaasi pH mõjutab analüüdi retentsiooniaega ja võib muuta teatud analüütide selektiivsust.
Kui mobiilne faas on polaarsem kui statsionaarne faas, siis polaarne analüüt liigub kiiremini ning väljub kolonnist esimesena ja vähempolaarne aine aeglasemalt ning tuleb kolonnist välja hiljem.

Isokraatiline elueerimine

Mobiilse faasi koostis analüüsi/jooksu käigus ei muutu (näiteks metanool – vesi 50/50). Kasutatakse rohkem lihtsate proovide analüüsimiseks ja kvaliteedikontrolli teostamiseks.
Isokraatiline elueerimine võtab vähem aega, sest kolonni ei ole vaja analüüsi järel tasakaalustada. Nõuab lihtsamat aparatuuri.

Gradientelueerimine

Mobiilse faasi koostis muutub analüüsi käigus (näiteks 5 kuni 100% metanool – vesi). Tugevamat elueerivat jõudu omava mobiilfaasi komponendi sisaldus mobiilfaasis kasvab elueerimise käigus. Mobiilse faasi solvent "B" osakaal tõuseb ajas.
Kasutatakse rohkem bioloogiliste ning teiste keerukate proovide analüüsimiseks, mis sisaldavad suuri molekule. Kõige rohkem kasutatakse lineaarset gradienti.
Gradientelueerimist kasutatakse ka proovide puhul, mis sisaldavad pika retensiooniajaga segavaid ühendeid ning mis võivad kolonni rikkuda või elueeruda järgmistel kromatograafilistel jooksudel.
Kõige tavalisem põhjus, miks valida gradientelueerimine, on analüütide lai retentsioonivahemik. Kui proovi mõni aine elueerub nõrgema mobiilse faasi juures (nt 50% solvent B-d) ja mõni tugevama mobiilse faasi juures (nt 80% solvent B-d), siis on kasulikum teha gradientelueerimist. Gradientelueerimine nõuab keerukamat aparatuuri ja kõik vedelikkromatograafias kasutatavad detektorid ei sobi selle meetodi jaoks.

Populaarsus ja kasutus

Pöördfaaskromatograafia on rakendatav väga paljudele analüütilise keemia harudele ja sobib paljude ainete eraldamiseks just oma laia molekuli suuruse vahemiku tõttu. Seda kasutatakse nii looduslikult esinevate kui ka keemiliselt sünteesitud peptiidide ja valkude ehk proteiinide analüüsimiseks ja puhastamiseks. Samuti uuritakse sellega peptiide seedimisprotsessi tulemusena ja keemiliselt sünteesitud oligonukleotiidide. Pöördfaaskromatograafia kolonnid on tõhusad ja stabiilsed ning meetod on üsna robustne ja korratav. Saab kontrollida orgaanilise solvendi tüüpi ja kontsentratsiooni, pH-d ja temperatuuri. Populaarsusele aitab kaasa ka see, et suures osas on eluendiks vesi, mis on odav ja keskkonnasõbralik.