BacMam-süsteem

Üldised omadused

BacMam-süsteemi geeni kättetoimetamise tehnoloogia on transientne ekspressiooni süsteem, mis hõlbustab toksiliste geeniproduktide ekspressiooni. See hõlmab laia transduktsiooni ulatuse, sealhulgas ka erinevaid algraku tüüpe ja tüvirakke. Bakuloviiruslikul genoomil on suur võime võõraste geenide sisseviimiseks, mis on edukalt saavutatud alates geenidest suurusega 38 kiloaluspaari. Teostatav on ka samaaegne mitmekordne geeni ülekanne samasse rakku. Mikroskoopiliselt vaadeldavaid tsütopatoloogilisi BacMam-süsteemi osakeste efekte imetajarakkudes on väga vähe. Geeniekspressiooni tase võib olla kohandatud viirusliku annuse või keemiliste lisandite poolt, kasutades histooni deatsetülaasi inhibiitorit. Rakkude transduktsiooni teostatakse ainult lahuse lisamise teel ja seetõttu on BacMam-süsteem ka järeleandlik automatiseeritud meetod. Viirusosakesed jäävad lõpuks stabiilseks, kui neid hoida pimedas pika ajavahemiku jooksul 4 °C juures.

Tehnoloogia ülevaade

BacMam-tehnoloogia baseerub putukaviiruse kaksikhelikaalsel DNA-l kui transpordivahendil efektiivseks geeniülekandeks ning geenide ekspresseerumiseks imetajarakkudes. BacMam-reagente (valik reagente:) kasutatakse rakupõhistel analüüsidel, elusrakkude uurimisel, tüvirakkude bioloogias ja paljudes teistes rakendustes.
Geenide ülekandmiseks imetajarakkudesse kasutatakse standardset transduktsiooni protsessi. BacMam-süsteemi osakesed viiakse endotsütoosi ja vabastatakse transkriptsiooni ja geeniekspressiooni ajal. Transduktsiooni puhul kannavad geene edasi viirused. Paljud viirused liidavad rakku sisenedes oma DNA peremeesraku genoomi ning genoomist lahkudes ja rakust väljudes võtavad koos oma genoomiga kaasa ka peremehe geene. Uude peremeesrakku sisenedes on neil niiviisi kaasas eelmise peremehe geenid ja need võivad uues peremehes alles jääda ning toimima hakata. Geeniekspressioon algab 4–6 tunni jooksul transduktsiooni ajal ning paljude rakutüüpide puhul lõpeb täielikult alles pärast üleööd. Sõltudes transduktsiooni efektiivsusest, rakutüübist ja rakujagunemise määrast, jääb transgeen märgatavaks 5–14 päevaks.

Bioohutusalased kaalutlused

Bakuloviirused on esimese riskigrupi esindajad, mida on laialdaselt kasutatud juba üle 25 aasta putukarakkude valgu ekspressiooni rakendamiseks. Bakuloviirused on loodud putukarakkudes ja on võimetud paljunema imetajarakkudes ning ei ole teada ka ühtegi haigust, mille põhjustajaks tervetele täiskasvanud inimestele võiksid nad olla. Lisaks on BacMam viirusosakesed inaktiveeritud inimese poolt, mis vähendab riski teaduritele. Peale selle ei saa viirused paljuneda ka putukates, mistõttu puudub igasugune oht keskkonnale.

Viiruslik sisenemine

Uuringud bakuloviiruse sisenemisel inimese hepatotsellulaarsetesse vähkkasvaja rakkudesse vihjavad sellele, et BacMam siseneb imetajarakkudesse läbi klatriin-vahendatud endotsütoosi ning võimalikult läbi makropinotsütoosi . Hilisemad uuringud on vihjanud ka spetsialiseerunud lipiidiparve – caveolae, mis omab mitmeid signaaliülekande funktsioone, kaasamisest bakuloviiruse sisenemisse imetajarakkudesse.

Peremeesraku vastus

Et tehnoloogia toimiks efektiivselt, siis geeni toimetamise meetod ei tohi normaalseid rakulisi funktsioone segama hakata.Tsütotoksilisuse hinnangud ning transkriptsiooni analüüsid inimese HEK rakuliinidel (HEK293) on näidanud, et bakuloviiruse transduktsioon ei ole tsütotoksiline ega põhjusta muutusi transkriptsioonilistes vastustes. Samamoodi nakatunud Schwanni rakud säilitavad omale iseloomuliku morfoloogilise ja molekulaarse fenotüübi ja on võimelised diferentseeruma katseklaasis ja ekspresseerima P0 müeliinisatsiooni markerit. Kasutades komplementaarse DNA (cDNA) mikrorivi tehnoloogiat, et kontrollida in vitro (katseklaasis) ja in vivo (elusas rakus/organismis) üldist rakulist geeni väljenduse profiile roti ajus, aretatud inimese astrosaite ning inimese närvirakke pärast viiruslikku transduktsiooni, on täheldatud peremehe antiviiruslik vastus. Suguluses olevad geenid on peamiselt need, mis on seotud kaasasündinud immuunsusega, kaasa arvatud erinevad geenid, olles kaasatud nuku-laadse retseptori signaaliülekandesse ja tsütokiin-tsütokiin retseptori interaktsiooni.

BacMam-viiruste kasutamine südamehaiguste raviks

Geneetiliselt muundatud kardiomüoblastide ehk südamelihasrakkude võime ravida kahjustatud südamelihast on hästi teada. Siiski on ravimisel suureks probleemiks selliste rakkude efektiivne ülekanne. Piiravaks faktoriks on massiivsed rakkude surmad pärast nende lihasrakkudevälist siirdamist verd pumpavasse südamesse. Selle probleemi adresseerimiseks on loodud rekombinantsed bakuloviirused (BacMam-viirused), mis transdukteerivad efektiivselt südamelihasrakke optimeeritud tingimustes. Need geneetiliselt modifitseeritud rakud jäävad kaitstuks uue polümeerse mikrokapsli tekke tõttu, mistõttu rakud säilitavad elujõulisuse. See toetab rakkude kiiret levikut vähemalt 30 päevaks. Need kapslid omavad tugevat immuunkaitset ning rohkem kui 70%-l tervetel kapslitel on kõrge mehaaniline ja osmootne stabiilsus. Siiski on vaja teha kliinilisi uuringuid, et teada selle pikaajalisi mõjusid. Uuringutes loodi rekombinantsed viirused BacMam-süsteemi kasutades. See on tõhus tööriist mitmesugustegeeniteraapiate rakendamiseks, kuna see kombineerib laialdase rakkude kasvamise ning kõrge efektiivsusega transientse transgeeni avaldumise. Kuigi rekombinantset bakuloviirust võib pidada teatud mõttes süsteemi võlaks, on see siiski soovitum tunnus, arvestades selle bioohutust. Transientne ekspressioon on tunnuseks loodusliku mehhanismi puudumisel bakuloviiruse integreerumisel peremeesraku genoomiga. Kui alade tõttu, kus teiste imetaja viiruste nagu adenoviiruste ja lentiviiruste (nt HIV1, HIV2, SIV jt) vektoritel on suur tõenäosus juhuslikuks liitumiseks peremehe spetsiifilisse genoomi regiooni, võib esineda tahtmatute kasvajate teket, siis bakuloviirusega on selline oht võimalikult madal. Seetõttu kasutatakse just bakuloviirusi geenide ülekandmiseks, kuna tagatud on bioloogiline ohutus.