Ülegenoomne assotsiatsiooniuuring

Ülegenoomne assotsiatsiooniuuring (inglise genome-wide association study; lühend GWAS) on uuringutüüp, kus uuritakse erinevaid indiviide paljude levinud geneetiliste variantide suhtes, et leida, kas mõni variant on seotud mingi kindla tunnusega. Ülegenoomsed assotsiatsiooniuuringud keskenduvad peamiselt üksiku nukleotiidi polümorfismide (SNP-de) ja laialt levinud haiguste vaheliste seoste uurimisele.
GWAS seisneb kahe uuritava grupi DNA võrdlemises juhtkontrolluuringuga. Üks grupp koosneb haigust põdevatest inimestest (juhud) ja teine grupp inimestest, kellel uuritav haigus puudub (kontrollid). Iga inimene annab DNA proovi, millelt loetakse SNP-de analüüsi kiipe (SNP array) kasutades miljoneid geneetilisi markereid. Kui üht tüüpi varianti esineb haigust põdevate inimeste hulgas tihemini, peetakse antud SNP-d seostatuks selle haigusega. Haigusega seostatud SNP-sid loetakse inimese genoomi kindla regiooni markeriks, mis mõjutab riski haigestuda. 
GWAS erineb teistest uuringutüüpidest selle poolest, et uuritakse kogu genoomi, mitte ainult ühte või mõnda geneetilist regiooni. Seetõttu on selline mittekandidaatpõhine lähenemine kontrastiks geenspetsiifilistele kandidaatpõhistele uuringutele. Ülegenoomsed assotsisatsiooniuuringud identifitseerivad SNP-sid ja teisi variatsioone järjestustes, mis võivad olla haigusega seotud olla, aga ainuüksi nende põhjal ei saa täpselt öelda, mis geenid on haiguse põhjustajaks.
Esimene õnnestunud GWAS, mis uuris kollatähni ealise taandarenguga (age-related macular degeneration; ARMD) patsiente, avaldati 2005. aastal. Selle uuringuga leiti kaks SNP-d, millel oli oluliselt erinev alleelisagedus juhtude hulgas võrreldes kontrollrühmaga. 
2012. aasta seisuga on tehtud üle 1300 ülegenoomse assotsiatsiooniuuringu, mille käigus on uuritud üle 200 haiguse ja tunnuse, ja avastatud üle 7400 SNP, mis on haigusega seostatud.

Taust

Inimeste genoomid erinevad üksteisest väga palju. Võivad esineda nii väikesed ühe nukleotiidi variatsioonid genoomis (SNP-d) kui ka suuremad variatsioonid, nagu deletsioonid, insertsioonid ja koopiaarvu variatsioonid (copy-number variations, CNV-d). Neist variatsioonidest võib igaüks muuta indiviidi tunnuseid või fenotüüpi, näiteks suurendades indiviidi riski haigestuda või füüsilisi tunnuseid, nagu inimese pikkus.
Enne GWAS-ide kasutuselevõttu oli peamiseks uurimismeetodiks perekondades geenide aheldatusel põhinevad pärilikkuse uuringud. Selline lähenemine oli äärmiselt efektiivne ühe geeni põhjustatud haiguste uurimisel, kuid laialt levinud ja komplekshaiguste puhul oli keeruline saadud tulemusi korrata.
Ühe võimalusena soovitati geneetilise assotsiatsiooni uuringut. Seda tüüpi uuring uurib, kas teatud geneetilist varianti sisaldav alleel esineb uuritava fenotüübiga inimestes sagedamini, kui on eeldatud. Esmased arvestused näitasid sellise lähenemise suuremat statistilist mõjusust kui seni nõrkade geneetiliste mõjude otsimiseks kasutatud geneetilisel aheleldusel põhinevad uuringud.
GWAS-ide kasutuselevõtule aitasid kaasa biopangad, mis on inimese geneetilise materjali hoidlateks. Biopankade loomine muutis oluliselt odavamaks ja kergemaks uuringute tarbeks vajaliku arvu bioloogiliste proovide kogumise.
Oluline oli ka rahvusvaheline HapMap-projekt, mis alates 2003. aastast on tuvastanud enamiku levinud SNP-dest, mida ülegenoomsetes assotsiatsiooniuuringutes kasutatakse. 
HapMapi projektiga tuvastatud haplogrupi struktuur võimaldas tähelepanu koondada SNP-de alamrühmale, mis kõige rohkem variatsiooni kirjeldab. Oluliseks eelduseks oli ka SNP-de genotüüpimiseks vajalike kiipide areng.

Metoodika

Kõige sagedamini kasutatakse ülegenoomsete assotsiatsiooniuuringutes juhtkontroll tüüpi uuringut, mis võrdleb kahte suurt gruppi indiviide, kus juhtude näol on tegu indiviididega, kellel on vaadeldav haigus, ja kontrollide puhul tervete indiviididega. Mõlemas grupis olevate indiviidide DNA genotüübitakse tuntud SNP-de suhtes. Kasutatavate SNP-de arv sõltub vastavast uuringust, üldjuhul jääb see arv miljoni lähedale (500 000 – 700 000), mõnel juhul rohkem (kuni 2 500 000 SNP-d). Seejärel uuritakse nende SNP-de alleelsageduste esinemist juhtude ning kontrollide seas.
Sellise uuringu puhul on peamine ühik mõjususe suuruse tõlgendamisel šansside suhe (odds ratio, OR). OR näitab kahe suhtarvu vahelist suhet, mis GWAS-i kontekstis tähendab juhtgrupis nende indiviidide, kellel on spetsiifiline alleel, ja kontrollgrupis olevate indiviidide, kellel on sama alleel, suhtarvude suhet. Kui alleelisagedus juhtgrupis on oluliselt kõrgem kui kontrollgrupis, siis on OR suurem kui 1 ja vastupidi. Lisaks arvutatakse tavaliselt χ2-testi kasutades p väärtus OR mõjususe määramiseks. OR suhete, mille väärtus erineb tunduvalt 1-st, leidmine ongi ülegenoomse assotsiatsiooniuuringu eesmärk, sest see näitab, et SNP on seotud uuritava haigusega.
Juhtkontrolluuringu kasutamisele on mitmeid alternatiive. Üks tavalisematest on kvantitatiivsete fenotüüpiliste andmete, näiteks pikkuse või biomarkerite kontsentratsioonide või isegi geeniekspressiooni, analüüs. Samamoodi on võimalik kasutada ka dominantse või retsessiivse penetrantsuse mustrite uurimiseks mõeldud alternatiivseid statistikuid. Arvutuste tegemiseks kasutatakse bioinformaatilist tarkvara, nagu PLINK, mis toetavad neid alternatiivseid statistikuid.
Tavaliselt võetakse arvesse ka mitmeid muutujaid, mis võivad saadud tulemusi mõjutada. Sellisteks muutujateks on sugu ja vanus. Lisaks on teada, et geneetilised variatsioonid on seostatud geograafiliste ja ajalooliste populatsioonidega, kus mutatsioonid esimesena tekkisid. Seetõttu peavad uuringud arvestama uuringus osalejate geograafilise ja etnilise päritoluga – seda kontrollitakse populatsiooni stratifikatsiooniga. 
Pärast kõikide SNP-de OR ja p väärtuse arvutamist moodustatakse Manhattani joonis. GWAS-i kontekstis näitab see p väärtuse negatiivset logaritmi genoomil olevate lookuste funktsioonina. Kõige suurema tähtsusega seostatud SNP-d on joonisel selgesti eristatavad punktide virnana haplogrupi struktuuri tõttu. Täpne lävi erineb olenevalt uuringust, aga tavaliselt on p väärtus väga madal (10⁻⁷ või 10⁻⁸), et seda saaks arvestada kui olulist kõikide testitud SNP-de hulgast. Lisaks kasutatakse tänapäevastes ülegenoomsetes assotsiatsiooniuuringutes metoodikat, kus esimene analüüs tehakse avastatud kohordis, seejärel kontrollitakse tulemusi kõige mõjusamate SNP-de suhtes eraldi tulemuste kontrolliks mõeldud kontrollrühmas.

Tulemused

Ülegenoomsete assotsiatsiooniuuringute käigus leitud SNP-de, mis on haigusega seotud, tarbeks on püütud luua laialdasi andmebaase. Seoses kiire arenguga GWAS-ide vallas võib leida uusi Vikipeedia stiilis ressursse, mis võimaldaksid luua andmebaase. Hetkel on haigusega seostatud SNP-sid tuhandeid.
Üheks tähtsamaks ülegenoomseks assotsiatsiooniuuringuks oli kõige esimene GWAS, mis võrdles 96 patsienti, kellel oli kollatähni ealisuse taandareng, 50 terve kontrolliga. Uuringus leiti kaks SNP-d, mille alleelisagedus kahes grupis oli oluliselt erinev. Need SNP-d leiti komplemendi faktorit H kodeerivast geenist, mis oli ARMD uuringus uudseks avastuseks. Leiud esimesest GWAS-ist on andnud tõuke edasistele funktsionaalsetele uuringutele komplemendisüsteemi terapeutilise manipuleerimise vallas ARMD raviks.
Teine oluline uuring oli 2007. aastal Wellcome Trust Case Control Consortiumi tehtud GWAS, mille käigus uuriti 14 000 juhtu seitsme laialt levinuma haiguse puhul ja 3000 jagatud kontrolli. See oli kõige suurem GWAS, mis uuris aterosklerootilist südamehaigust, esimest tüüpi diabeeti, teist tüüpi diabeeti, reumatoidartriiti, Crohni tõbe, bipolaarset häiret ja hüpertensiooni. Selle uuringuga tuvastati hulgaliselt uusi geene, mis on nende haiguste põhjustajaks.

Piirangud

GWAS-ide puhul on kõige tavalistemaks probleemideks hästi määratletud juht- ja kontrollrühmade puudus, liiga väike valim ja populatsiooni stratifikatsiooni puudumine. Üheks probleemiks GWAS-i kui uuringumeetodi puhul on paljude statistiliste testide tegemine, mis toob kaasa suure hulga valepositiivsete tulemuste avaldumise. Korraliku kvaliteedikontrolli ja metoodikaga on neid võimalik vältida. 
Lisaks välditavatele probleemidele on ülegenoomsetele uuringute puhul osutatud nende laialivalguvusele. GWAS-id uurivad seoste leidmiseks kogu genoomi, mitte lühemaid kandidaatregioone. See on tinginud palju kriitikat GWAS-ide suunas teemal, et GWAS-ide teostamine pole selliseid kulutusi väärt.
Moodsatel GWAS-idel, mis hõlmavad suuri kohorte, on suur võime detekteerida haigusele vastuvõtlikkust mõjutavaid faktoreid ja osutada isegi madalale suhtelisele riskile. Siiski ei ole teada, kas GWAS-i abil on täielikult võimalik mõista komplekshaiguste geneetilist olemust. Limiteerivaks faktoriks on ka koopiaarvu variantide (CNV) laialdane levik tervete inimeste genoomides. CNV-sid leidub küll arvuliselt vähem kui SNP-sid, aga CNV-d hõlmavad mitut nukleotiidi. Nii mõjutavad CNV-d tegelikult suuremat arvu nukleotiidse järjestuse varieeruvust kui SNP-d. Seetõttu on vanema põlvkonna assotsiatsiooniuuringud, mis kasutavad SNP-sid, üsna nõrga võimega detekteerimaks CNV-de poolt põhjustatud vastuvõtlikkust haigusele. Uuema põlvkonna SNP-kiibid (SNP array) sisaldavad siiski juba ka levinumaid CNV-sid.