Western blot

Rakkude töötlemine

Rakud lõhutakse mehaaniliselt klaaskuulide abil. Rakkude lüüsimiseks ja valkude lahustamiseks kasutatakse erinevaid pesuaineid, soolasid ja puhvreid. Proteaasi ja fosfataasi inhibiitoreid lisatakse, et vältida proovide lagunemist raku ensüümide toimel. Rakkude ettevalmistustöö viiakse läbi jää peal, et vältida valkude degradatsiooni ja denatureerumist.

Geelelekroforees

Valguproovid eraldatakse geelelektroforeesiga. Eraldamiseks võib kasutada isoelektrilist punkti (pI), molekulaarmassi (kDa), elektrilaengut või kombinatsiooni nendest faktoritest.
Kõige ulatuslikumalt kasutatakse elektroforeesil akrüülamiidgeeli ja SDS-puhvit. Negatiivselt laetud SDS puhvriga kaetud valguproovid liiguvad positiivselt laetud elektroodide poole läbi akrüülamiidgeeli. Väiksemad valgud liiguvad geelis kiiremini, seetõttu on võimalik valke eraldada suuruse järgi. Akrüülamiidi kontsentratsioon geelis määrab valkude eraldumise üksteisest. Madala akrüülamiidi kontsentratsiooni juures eralduvad geelis teineteisest paremini suure molukulaarmassiga valgud.
Proovid ja marker kantakse geeli hammastesse. Marker on kaubanduslikult kättesaadav valkude segu, mille kõikidel valkudel on molekulaarmassid määratud. Seejärel rakendatakse vool üle geeli, valgud liiguvad erineval kiirusel sõltuvalt nende suurusest.

Ülekanne

Elektroforeesil eraldunud fragmendid (band'id) kantakse geelilt üle nitrotselluloosmembraanile elektrivoolu abil. Valgud liiguvad membraanile samas suunas, nagu nad on geelil paigutunud. Ülekande jaoks asetatakse western blot'i masinale Biometra kõigepealt kolm ülekandepuhvris immutatud Whatmani paberit, nende peale asetatakse ülekandepuhvris immutatud nitrotselluloosmembraan, mille peale pannakse geel ja selle veel kolm ülekandepuhvris immutatud Whatmani paberit (sandwich). Ülekanne tehakse nitrotselluloosmembraanile 10V juures 15–45 minutit. Ülekande aeg sõltub filtrile kantavate valkude suurustest.

Blokeerimine

Peale valkude ülekannet pannakse membraan loksuma blokeerimispuhvrisse, millega blokeeritakse mittespetsiifiliste valkude kinnitumine membraanile. Antikeha ja membraani vastastiktoimel ilmuvad fotofilmil nähtavale ainult uuritavad valgud. Mittespetsiifiliste sidemete blokeerimiseks kasutatav blokeerimispuhver sisaldab tavaliselt 3–5% BSA või lõssipulbrit, mis on lahustatud TBS lahuses ja lisatud minimaalselt detergenti Tween20 või Triton-X-100. Uuritavad valgud seonduvad nitrotselluloosmembraaniga blokeerimispuhvris. Peale antikehade lisamist ei saa teised valgud membraanile seonduda. Blokeerimise abil saadakse fotofilmil puhas pilt uuritavast valgust, millelt on kõik teised valgud eemaldatud.

Uuritava valgu tuvastamine

Valkude selekteerimiseks kasutatakse western blot'i analüüsi jaoks tavaliselt hiire monoklonaalseid või jänese polüklonaalseid antikehasid. Monoklonaalsed antikehad on valguanalüüsi meetodi jaoks tõhusamad. Hiire monoklonaalsed antikehad seondavad uuritavaid valke membraanile paremini ning western blot'i fotofilmil on näha ainult uuritavad valgud.

Primaarsed antikehad

Membraani inkubeeritakse HRP/AP-ga kovalentselt seotud primaarse antikehaga, mis on spetsiifiline uuritava antigeeni (valgu) suhtes.

Sekundaarsed antikehad

Peale membraani loputamist üleliigselt primaarsest antikehast kantakse membraanile sekundaarne antikeha. Sekundaarne antikeha seondub biotiiniga või ensüümiga ja primaarse antikehaga.
Horseradish peroxidase'iga seotud sekundaarset antikeha kasutatakse kemoluminestsentse agendi lõhestamiseks. Sellega tagatakse produkti luminestsentsuse tootmine sõltuvalt valgu hulgast.
Western blot'i analüüsi otsese meetodi puhul kasutatakse spetsiifilise valgu tuvastamiseks ainult primaarset antikeha. Kaudse meetodi puhul kasutatakse nii primaarset kui ka sekundaarset antikeha.

Analüüs

Peale inkubeerimist antikehadega pestakse nitrotselluloosmembraan seondumata antikeha jääkidest puhtaks ning ilmutatakse film.

Kolorimeetriline analüüs

Kolorimeetrilise analüüsi puhul sõltub tulemus sekundaarse antikehaga kovalentselt seotud substraadi ja reporterensüümi inkubeerimise ajast. Sellega muudetakse lahustuv värvaine lahustumatuks erinevate värvidena, mis sadestavad ensüümi ja seeläbi ka sihtmärkvalgu nitrotselluloosmembraanile. Reaktsiooni lõpetamiseks pestakse membraan värvainest puhtaks. Valgu fragmente (band'e) saab hinnata spektrofotomeetri või sensitomeetriga.

Kemoluminestsentne analüüs

Kemoluminestsentse analüüsi korral sõltub luminestsents substraadi ja ensüümi inkubeerimise ajast sekundaarse antikeha lahuses. Valgud on näha fotofilmil. Hiljuti võeti kasutusele ka CCD kaamerad, mis teevad western blot'ist digitaalse pildi. Pilti analüüsitakse sensitomeetriga. Sensitomeeter hindab suhtelist valgu hulka ning väljendab kindla ajavahemiku jooksul optilist tihedust. Uuemat tüüpi sensitomeetritega on võimalik analüüsida ka valkude molekulaarmasse.

Radioaktiivne analüüs

Radioaktiivse analüüsi puhul ei ole valgu tuvastamiseks vajalikud ensüümi substraadid. Röntgenfilmil tekivad tumedad regioonid, mis vastavad uuritava valgu fragmentidele. Tänapäeval kasutatakse radioaktiivset meetodit valkude määramiseks vähem, sest radiatsioon on tervisele kahjulik. Radioaktiivsele meetodile on olemas ka alternatiivne kemoluminestsentne meetod ehk ECL (enhanched chemiluminescence).

Fluorestsentsanalüüs

Flourestsentsmeetodi analüüsi korral on neelduvus ja ergastuvus nähtavad fotosensori abil. CCD-kaamera, millel on sobiva neelduvusega filter, salvestab digitaalse pildi western blot'i analüüsist. Meetodi abil saab kindlaks määrata ka valgu molekulaarmassi. Fluorestsentsmeetodit peetakse üheks parimaks kvantitatiivseks western blot'i analüüsimeetodiks, kuid see on vähem tundlik kui kemoluminestsentne meetod.

SDS-PAGE

Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electroforesis – naatriumdodetsüülsulfaat-polüakrüülamiid geelelektroforees.
SDS geeli maatrikseid kasutatakse valkude eraldamiseks suuruse järgi elektrivoolu juuresolekul. Madala kontsentratsiooniga geelis eralduvad paremini suure molekulaarmassiga valgud ning kõrgema akrüülamiidi kontsentratsiooniga geelis eralduvad paremini väikesed valgud. SDS lisamine geelile aitab seostuda valkude kõikidel aminohapetel ning sellega neutraliseeritakse valkude laengute erinevused. Seetõttu on võimalik eraldada valke nende suuruse, mitte laengu järgi. Valgud jooksevad geelis positiivsele ’’+’’ poolele, sest nad on kaetud negatiivselt laetud SDS puhvriga.

HRP

Horseradish peroxidase on peamine reporterensüüm kemoluminestsentsetes substraatides. HRP on väike (40 kDa), stabiilne ja odav ensüüm. Ensüümi ja produkti reageerimisel tekib kohe hele signaal, mis mõne minuti jooksul ära kaob.

AP

Alkaline phosphatase on teine peamiselt kasutatav reporterensüüm. Erinevalt HRP-st on AP palju suurem (140 kDa), ebastabiilsem ja kallim. AP ja substraadi puhul tekib signaal palju aeglasemalt kui HRP puhul. Tavaliselt kulub valguse tekkeks vähemalt 30 minutit. AP eeliseks on see, et signaal võib kesta maksimaalselt mõne päeva. Seetõttu on piisavalt aega valguanalüüsi töö tingimuste optimeerimiseks.

Western blot kasutamine meditsiinilises diagnostikas

Western blot'i analüüsi kasutatakse HIV-testina inimestel, et kindlaks määrata viirusevastaseid antikehasid vereplasmas. HIV-ga nakatunud rakkude valgud eraldatakse SDS-geelil ning kantakse nitrotselluloosmembraanile. Testitavale vereplasma valkudega membraanile lisatakse primaarset antikeha. Peale inkubeerimist pestakse vabad antikeha jäägid ära ning inkubeeritakse membraani sekundaarse inimesevastase antikehaga, mis on seotud signaali andva ensüümiga. Nähtavad fragmendid näitavad, milliste HIV-valkude vastu sisaldab patsiendi vereplasma antikehasid.
Lisaks kasutatakse western blot'i analüüsi veel testsüsteemina Bovine spongiform encephalopathy (BSE) ehk hullulehmatõve puhul ja puukborrelioosi testimiseks. Samuti leiab meetod kasutamist ka B-hepatiidi infektsiooni kinnitustestina.
Western blot'i kasutatakse veterinaarmeditsiinis kasside immuunpuudulikkuse viiruse (FIV) testimiseks.