Immunofluorestsents

Immunofluorestsents on antigeen-antikehakompleksi asukoha määramiseks kasutatav meetod, kus antigeeni või antikehaga seotakse fluorestseeruvat värvainet. 
Selle metoodika abil saab välja selgitada huvipakkuvate biomolekulide asukohta erinevates rakkudes ning kudedes. Metoodika aluseks on antikehade spetsiifilisus oma antigeenile. Immunofluorestsentsmeetod võimaldab teadlastel kindlaks määrata, kas uuritavades rakkudes ekspresseerub mingi spetsiifiline antigeen. Immunofluorestsentsmeetodit saab rakendada rakukultuuridele, koelõikudele või individuaalsetele rakkudele. Selle meetodiga saab analüüsida valkude, glükaanide ning väikeste bioloogiliste molekulide jaotust uuritavas proovis. Immunofluorestsentsi saab kasutada kombinatsioonis mõne muu fluorestsentsil põhineva värvimisega, näiteks kasutades DAPI-t (4',6-diamino-2-fenüülindool) DNA märgistamiseks. Saadud preparaate saab uurida epifluorestsentsmikroskoobiga ning konfokaalmikroskoobiga. Kasutada saab ka erinevaid superresolutsioonmikroskoope, mis on palju suurema lahutusvõimega.

Otsene ja kaudne immunofluorestsents

Olenevalt eksperimendi tüübist on kaks immunofluorestsentsi meetodit. 
Otsese ehk primaarse meetodi puhul seondub fluorokroomiga konjugeeritud spetsiifiline primaarne antikeha sihtmärkstruktuuriga (antigeeniga).
Kaudse ehk sekundaarse immunofluorestsentsi puhul tehakse kaheetapiline inkubatsioon. Kõigepealt tunneb primaarne antikeha ära sihtmärkstruktuuri. Seejärel lisatakse fluorokroomiga märgistatud sekundaarne antikeha, mis seondub spetsiifiliselt primaarse antikehaga. See spetsiifilisus saavutatakse nii, et sekundaarne antikeha on tehtud selle looma vastu, milles primaarne antikeha on toodetud. Näiteks kui primaarne antikeha on toodetud jäneses, siis peaks kasutama jänese vastast sekundaarset antikeha. Mõlemal meetodil on nii oma tugevused kui puudused.
Otsene immunofluorestsents on kiirem meetod, kuid hea tulemuse saamiseks on vaja, et kasutatav antikeha oleks võimalikult hästi funktsioneeruv ning kõrge afiinsusega oma antigeeni suhtes.
Kaudse immunofluorestsentsi puhul saab sekundaarseid antikehasid kombineerida erinevate primaarsete antikehadega (arvestades seda, missuguses loomas on primaarne antikeha toodetud). Kaudse immunofluorestsentsi abil saab signaali amplifitseerida, sest mitu sekundaarset antikeha, mis on fluorokroomiga konjugeeritud, saab seonduda primaarse antikehaga ning see viib fluorestsentsi tugevnemiseni. Seetõttu pole tarvis kasutada ka niivõrd suurtes kogustes primaarset antikeha. Kaudne immunofluorestsents võtab küll rohkem aega, kuid on üldkokkuvõttes ökonoomsem ja sobivam meetod enamikule teadlastele.

Fikseerimine

Fikseerimine on immunofluorestsentsi protokolli kõige esimene etapp. Fikseerimise eesmärgiks on säilitada rakke, rakulisi moodustisi või kudet oma hetkelises seisukorras. Fikseerimise juures on oluline see, et rakulised struktuurid jääksid oma natiivsesse vormi nii kauaks kui võimalik. Immunofluorestsentsil kasutatakse mitmesuguseid fikseerimise meetodeid ning need võivad primaarse antikeha epitoobile erinevalt mõjuda. Antikeha seondumiskohad võivad fikseerimise tagajärjel maskeeruda või kahjustuda ning see nõrgendab immunofluorestsentsi kvaliteeti. Kuna paljud antikehad seonduvad fikseerimisühenditest sõltuvalt erinevalt oma antigeeniga, siis on uue antikeha kasutamisel vaja testida erinevaid fikseerimismeetodeid.
Fikseerimisreagente saab jaotada kaheks: keemilised ristsidujad ja orgaanilised lahustid. Keemilised ristsidujad nagu näiteks formaldehüüd ristseovad valke nende vabade aminorühmade kaudu. Enamasti raku morfoloogia seejuures säilitatakse, kuid antigeenid ristseotakse samuti ning see võib vähendada antikeha seondumist. Orgaanilised lahustid nagu näiteks metanool ja atsetoon on vett eemaldava toimega ja sadestavad valkusid ning on seetõttu rakke fikseeriva toimega. Sellise fikseerimise puhul aga kaotatakse palju rakus leiduvaid lahustuvaid ühendeid ning lipiidseid komponente. Tihti kasutatakse metanooli ja atsetooni koos, sest kuigi metanool on parim vahend rakuliste struktuuride säilitamiseks, on tal kahjustav efekt paljudele epitoopidele. Kui primaarse antikeha tootja pole ühtegi fikseerimise meetodit soovitanud, siis enamikule rakuliinidele ja antigeenidele sobib 4% formaldehüüdi lahus 10 minuti jooksul toatemperatuuril.

Permeabiliseerimine

Permeabiliseerimise käigus tehakse rakumembraani augud (kuid ei eemalda kogu rakumembraani) ning see aitab antikehadel pääseda fikseeritud rakkudesse, sest tavaolukorras ei suuda antikehad membraani läbida. Kui rakke fikseerida orgaaniliste lahustitega, siis rakumembraanid muutuvad läbitavaks ning eraldi permeabiliseerimise protseduuri pole tarvis läbi viia. Keemiliste ristsidujatega fikseerides on aga permeabiliseerimine vajalik. Permeabiliseerimiseks kasutatakse mitmeid detergente, nagu näiteks NP-40, Triton X-100, Tween-20 ja saponiin. Raku pinnal asuvaid valke uurides pole permeabiliseerimine vajalik. Fikseerimine ja permeabiliseerimine mõjutavad raku morfoloogiat ja uuritava antigeeni kättesaadavust.

Blokeerimine

Blokeerimine on vajalik mittespetsiifilise värvimise takistamiseks ehk selleks, et antikehad ei seonduks millegi muuga kui vaid oma antigeeniga. Ebapiisava blokeerimise tõttu võib tulemuste analüüsimisel olla liiga palju segavat taustamüra ning ülemäärase blokeerimise tagajärjeks võib olla see, et signaal on nõrk või puudub. Blokeerimisel võib kasutada ükskõik missugust valku, mis ei seondu huvialuse valgu epitoobiga ega immunofluorestsentsil kasutatavate antikehadega. Sagedasti kasutatakse normaalse seerumi valke, mis on toodetud samas loomaliigis, milles kasutatav sekundaarne antikeha. Levinud on ka valgupuhvrite, näiteks veise seerumi albumiini (BSA) ning rasvavaba piimalahuse kasutamine.

Immunoreaktsioon

Preparaate inkubeeritakse primaarse antikehaga. Korraga saab inkubeerida ka mitme primaarse antikehaga. Antikeha lahustatakse blokeerimislahuses vastavalt antikeha tootja soovitustele. Kui tootja pole täpsustanud, missuguses kontsentratsioonis peaks antikeha kasutama, siis oleks mõistlik proovida kontsentratsioone vahemikus 1:50-1:1000. Antikehaga inkubeerimise aeg võib varieeruda vastavalt afiinsusele. Sagedasti inkubeeritakse antikehaga kas 1-2 tundi toatemperatuuril või 4 °C juures üleöö. Otsese immunofluorestsentsi korral võib nüüd edasi minna sulundamise etapi juurde, sest primaarsel antikehal on juba fluorokroom küljes. Kaudse immunofluorestsentsi puhul on tarvis inkubeerida sekundaarse antikehaga. Enne seda peab preparaati hoolikalt pesema, et vähendada sekundaarse antikeha ebaspetsiifilist seondumist. Sekundaarset antikeha võib lahustada kas blokeerimislahuses või pesupuhvris. Sekundaarse antikehaga inkubatsioon peab toimuma pimedas, et vältida fluorokroomi pleegitamist.

Tuuma värvimine ja preparaadi sulustamine

Tavaliselt värvitakse tuumad peale immunoreaktsiooni DNA värvidega. Kõige enamkasutatavamad DNA värvid on DAPI ja Hoechsti värv. Tuumade värvimine aitab hiljem mikroskopeerimisel paremini rakkude või kudede suhtes orienteeruda ning samuti saadakse infot rakutsükli kohta, näiteks kas rakud on mitoosis või mitte. Tuumade värvimiseks lahustatakse värv PBS-is (fosfaatpuhverdatud soolalahuses) ning inkubeeritakse preparaati 10 minutit toatemperatuuril. 
Pärast immunofluorestsentsiprotokolli läbimist tuleb preparaadid sulustada, et neid saaks mikroskoobis vaadata. Selleks kasutatakse kommertsiaalseid paigaldusmeediume (mounting medium), mis kinnitavad proovi katteklaasi ning alusklaasi vahele ja takistavad preparaadist vee aurustumist. On olemas ka paigaldusmeediumid, milles on juba DNA värvid sees. Peale paigaldusmeediumiga sulustamist peab laskma preparaadil kuivada. Järgmisel päeval on preparaat valmis mikroskoobiga vaatamiseks.