Αλκαλική φωσφατάση

H αλκαλική φωσφατάση (Alkaline Phospatase – ALP) είναι ένα ένζυμο που ανήκει στην κατηγορία των υδρολασών. Οι υδρολάσες είναι ένζυμα που διασπούν υδρολυτικά μια σειρά από δεσμούς. Όπως υποδηλώνει το όνομα «αλκαλική φωσφατάση» η συγκεκριμένη υδρολάση είναι πιο αποτελεσματική στο αλκαλικό περιβάλλον.

Φυσιολογία

Σε υγιή άτομα η ολική ALP προέρχεται κυρίως από το ήπαρ και τα οστά. Περίπου το 25% των υγιών ατόμων έχουν εντερικό ισοένζυμο.

Μέθοδοι προσδιορισμού αλκαλικής φωσφατάσης στο εργαστήριο

Υπάρχουν δύο κοινές μέθοδοι προσδιορισμού της αλκαλικής φωσφατάσης στο εργαστήριο, η μέθοδος DEA Buffer της Γερμανικής Εταιρείας Κλινικής Χημείας (DGKC) και η μέθοδος AMP Buffer της Διεθνούς Ένωσης Κλινικής Χημείας (IFCC).

Αρχή μεθόδου της DEA Buffer

Η δραστικότητα του ενζύμου αλκαλική φωσφατάση προσδιορίζεται κινητικά σύμφωνα με τις προδιαγραφές της Γερμανικής Eταιρίας Kλινικής Xημείας (DGKC). Η παρουσία του ενζύμου σε αλκαλικό περιβάλλον διαιθανολαμίνης (DEA) καταλύει την υδρόλυση του υποστρώματος p-φωσφορική νιτροφαινόλη (pNPP) προς σχηματισμό της έγχρωμης ένωσης p-νιτροφαινόλης. Η αύξηση της απορρόφησης στα 405 nm είναι ανάλογη της δραστικότητας της ALP στο δείγμα. Τιμές αναφοράς Παιδιά: 180 - 1200 U/L 370C Ενήλικες: 98 - 279 U/L 370C

Αρχή μεθόδου της AMP Buffer

Η μέθοδος του ρυθμιστικού διαλύματος AMP προτείνεται από την Διεθνή Εταιρία Κλινικής Χημείας (IFFC). Η αλκαλική φωσφατάση ALP καταλύει την μεταφορά της φωσφορικής ομάδας από p-νιτροφαινυλοφωσφορικό σε 2 αμινο -2 μεθυλο-1 προπανόλη (AMP) απελευθερώνοντας p-νιτροφαινόλη.  Άνδρες: 40 - 129 U/L (37οC) Γυναίκες: 35 - 104 U/L (37οC) Παιδιά: Έως ενός έτους: < 462 U/L (37οC) Από 1 έως 12 έτη: < 300 U/L (37οC) Από 13 έως 17 έτη αγόρια : < 390 U/L (37οC) κορίτσια: < 187 U/L (37οC)

Η ALP των λευκοκυττάρων

Η λευκοκυτταρική αλκαλική φωσφατάση (LAP) βρίσκεται εντός των λευκών αιμοσφαιρίων. Τα επίπεδα της λευκοκυτταρικής εστεράσης μπορεί ορισμένες φορές να βοηθήσουν στην διάγνωση ορισμένων νοσημάτων. Αυξημένα επίπεδα παρατηρούνται στη γνήσια πολυκυτταραιμία (PV), σε πρωτοπαθή θρομβοκυττάρωση (ET), στην πρωτογενή μυελοϊνωση (PM) καθώς και στη λευχαιμοειδή αντίδραση. Τα χαμηλότερα επίπεδα βρίσκονται σε χρόνια μυελογενή λευχαιμία (ΧΜΛ), παροξυσμική αιμοσφαιριναιμία (ΠΝΑ) και οξεία μυελογενή λευχαιμία (AML).

Χρήση της ALP στην έρευνα

Η αλκαλική φωσφατάση έχει καταστεί ένα χρήσιμο εργαλείο στα εργαστήρια μοριακής βιολογίας δεδομένου ότι και το ίδιο το DNA διαθέτει φωσφορικές ομάδες στο 5΄ άκρο. Η απομάκρυνση αυτών των φωσφορικών ομάδων εμποδίζει την ένωση των δύο άκρων του DNA, το 5΄ άκρο συνδέεται με το 3΄ άκρο, διατηρώντας έτσι γραμμικά μόρια DNA απαραίτητα για τα επόμενα στάδια των μοριακών τεχνικών. Η απομάκρυνση των φωσφορικών ομάδων επιτρέπει την ραδιοσήμανση (αντικατάσταση με ραδιενεργά σεσημασμένες φωσφορικές ομάδες) προκειμένου να μετρηθεί η παρουσία του σεσημασμένου DNA στα επόμενα στάδια. Για τον σκοπό αυτό η αλκαλική φωσφατάση από γαρίδες είναι πιο χρήσιμη καθώς είναι πολύ εύκολο οι ραδιενεργές ομάδες να απενεργοποιηθούν στη συνέχεια. Άλλη σημαντική χρήση της αλκαλικής φωσφατάσης είναι ως ιχνηθέτης σε ανοσοενζυμικούς προσδιορισμούς. Τα αδιαφοροποίητα πολυδύναμα κύτταρα έχουν αυξημένα επίπεδα αλκαλικής φωσφατάσης στην κυτταρική τους μεμβράνη, επομένως η χρώση αλκαλικής φωσφατάσης χρησιμοποιείται για την ανίχνευση αυτών των κυττάρων.

Χρήση της ALP στη βιομηχανία

Η αλκαλική φωσφατάση χρησιμοποιείται επίσης στην βιομηχανία γαλακτοκομικών προϊόντων ως δείκτης παστερίωσης του αγελαδινού γάλακτος. Η αλκαλική φωσφατάση μετουσιώνεται στις υψηλές θερμοκρασίες της παστερίωσης, γεγονός που μπορεί να ελεγχθεί με την αλλαγή χρώματος ενός υποστρώματος (παρα-νιτροφαινυλοφωσφορικό άλας) σε κατάλληλο ρυθμισμένο διάλυμα (Aschaffenburg Muller Test). Το νωπό γάλα παράγει συνήθως κίτρινο χρωματισμό μέσα σε ελάχιστα λεπτά ενώ το σωστά παστεριωμένο γάλα δεν εμφανίζει καμία αλλαγή. Υπάρχουν φυσικά εξαιρέσεις σε αυτή την περίπτωση εξαιτίας ορισμένων βακτηρίων.