Χρωματογραφία

Η χρωματογραφία (αγγ. chromatography) είναι χημική αναλυτική τεχνική διαχωρισμού ουσιών από μείγμα τους. Ονομάστηκε έτσι επειδή αρχικά χρησιμοποιήθηκε για διαχωρισμό εγχρώμων ουσιών .

Αρχή λειτουργίας

Η χρωματογραφία είναι μια τεχνική στην οποία το δείγμα τοποθετείται στην μία άκρη ενός υλικού προσρόφησης που ονομάζεται ακίνητη (στατική) φάση. Στην συνέχεια αυτό εκλούεται (ξεπλένεται) από την κινητή φάση (έναν διαλύτη ή ένα αέριο), η οποία κινείται προς την άλλη άκρη της ακίνητης φάσης. Όσες ουσίες είναι πολύ διαλυτές στην κινητή φάση και προσροφώνται λίγο από την ακίνητη φάση "τρέχουν" πρώτες, ενώ όσες προσροφώνται ισχυρά κινούνται πιο αργά. Το αποτέλεσμα είναι ο διαχωρισμός τους.

Χρωματογραφία στήλης

Είναι η πρώτη ιστορικά χρωματογραφία που έγινε. Κατ΄ αυτήν, μία στήλη (σωλήνας) είναι γεμάτη με κατάλληλο για τον επιθυμητό διαχωρισμό προσροφητικό υλικό (τα συνηθέστερα είναι η γέλη πυριτίου και η αλουμίνα), τοποθετημένη κάθετα. Στο άνω μέρος της στήλης τοποθετείται το δείγμα και ακολουθεί έκλουση: Κατάλληλα επιλεγμένος διαλύτης τοποθετείται στο πάνω μέρος της στήλης και όπως ρέει προς τα κάτω εκλούει το δείγμα. Έτσι μέσα στη στήλη επιτελείται διαχωρισμός των συστατικών του δείγματος, τα οποία είναι ορατά σε χρωματιστές ζώνες (εξ ου και το όνομα χρωματογραφία), εφόσον βέβαια τα συστατικά είναι έγχρωμα. Αν δεν είναι έγχρωμα, ο διαχωρισμός είναι εξίσου καλός, αλλά επειδή δεν είναι ορατά με το μάτι χρησιμοποιούνται διάφορες τεχνικές για να τα "δει" ο αναλυτής(π.χ. αν φθορίζουν στο υπεριώδες φως τα φωτίζει με τέτοιο, οπότε έχουμε φθορίζουσες ζώνες). Εξέλιξη της χρωματογραφίας στήλης είναι η χρωματογραφία υψηλής πίεσης ή απόδοσης (HPLC - High pressure (performance) liquid chromatography), στην οποία χρησιμοποιείται ο ακόλουθος ηλεκτρονικός/μηχανολογικός εξοπλισμός: Μία αντλία πιέζει τον διαλύτη προς την στήλη (στην απλή χρωματογραφία, ο διαλύτης ρέει με την δύναμη της βαρύτητας)με πιέσεις τάξεως μερικών χιλιάδων psi. Το έκλουσμα περνά στην συνέχεια μέσα από ανιχνευτή, ο οποίος μετρά συνεχώς είτε τον δείκτη διαθλάσεως του υγρού, είτε την ειδική απορρόφηση (φασματοφωτόμετρο) είτε άλλο χαρακτηριστικό με  άλλη διάταξη (φθορισμόμετρο, φασματοφωτόμετρο μάζας,αγωγιμόμετρο κλπ) το οποίο παρέχει ένα σήμα σε ένα καταγραφικό. Το καταγραφικό καταγράφει το σήμα (είτε απευθείας είτε μέσω υπολογιστή) με τη μορφή που υπάρχει στη σχετική απεικόνιση. Ακριβώς λόγω της υψηλής πιέσεως, η HPLC είναι ταχύτατη (παρέχει αποτέλεσμα σε μερικά λεπτά της ώρας) και επειδή χρησιμοποιούνται λεπτόκοκκα υλικά προσρόφησης (λίγα μικρόμετρα) έχει μεγάλη ικανότητα διαχωρισμού.

Αέριος χρωματογραφία (GC)

Σε αυτήν η κινητή φάση είναι αέριο και η όλη οργανολογία είναι αρκετά πολύπλοκη. Το δείγμα εισάγεται σε ένα χώρο που αεριοποιείται άμεσα. Αυτό σημαίνει ότι όλα τα συστατικά του δείγματος πρέπει να μπορούν να αεριοποιηθούν, γεγονός που περιορίζει το είδος των δειγμάτων που μπορούν να αναλυθούν με την τεχνική αυτή. Σε ορισμένες περιπτώσεις οι ενώσεις του δείγματος μπορούν να μετατραπούν σε πτητικές με παραγωγοποίηση. Το αέριο πλέον δείγμα παρασύρεται μέσα σε μια στήλη που περιέχει ένα προσροφητικό υλικό, οπότε γίνεται ο διαχωρισμός. Έτσι από την άλλη άκρη της στήλης εξέρχονται με τη σειρά τα διαχωρισθέντα συστατικά. Από εκεί οδηγούνται στον ανιχνευτή (ηλεκτρονικό μέρος) ο οποίος στέλνει ένα σήμα σε ένα καταγραφικό ανάλογα με την ένταση ανίχνευσης. Πετυχαίνει πάρα πολύ καλούς διαχωρισμούς, ενώ η ικανότητα ανίχνευσης των αναλυόμενων συστατικών είναι πολύ μεγάλη (φτάνει και μερικά τρισεκατομυριοστά του γραμμαρίου (pg) σε κάποιες περιπτώσεις - συνήθως είναι σε μερικά δισεκατομυριοστά (ng))

Χρωματογραφία υψηλής απόδοσης (High Performance Liquid Chromatography - HPLC)

Όπως και η χρωματογραφία στήλης, στην HPLC  ο διαχωρισμός πραγματοποιείται καθώς εκλούεται το δείγμα με την βοήθεια υγρής κινητής φάσης από στήλη γεμάτη με την ακίνητη φάση σε μορφή στερεών κόκκων. Όμως επειδή η ακίνητη φάση βρίσκεται στη μοργή πολύ λεπτών κόκκων η κινητή φάση διέρχεται από την στήλη με την βοήθεια αντλίας. Η χρήση της αντλίας αυξάνει την πίεση στο εσωτερικό της στήλης, εξού και το αρχικό όνομα της τεχνικής αυτής (high pressure liquid chromatography). Οι ενώσεις του δείγματος ταυτοποιούνται και βρίσκεται η συγκέντρωση τους με την βοήθεια κάποιου ανιχνευτή.

HPLC κανονικής φάσης

Σε αυτή την περίπτωση ως ακίνητη φάση χρησιμοποιείται γέλη πυριτίου (silica gel), ένας μη πολικός διαλύτης ως κινητή φάση π.χ. εξάνιο.

HPLC αντίστροφης φάσης

Είναι το είδος HPLC με τις περισσότερες εφαρμογές. Ως ακίνητη φάση χρησιμοποιείται γέλη πυριτίου που στην επιφάνεια του έχουν προστεθεί αλειφατικές ομάδες (συνήθως ευθείες αλυσίδες -(CH₂)₁₇CH₃ ) που καθιστά την ακίνητη φάση υδρόφοβη. Αντίστοιχα, ως κινητή φάση επιλέγεται ένας πολικός διαλύτης π.χ. μεθανόλη ή ακετονιτρίλιο.