Πρωτεΐνη

Επίπεδα οργάνωσης

Οι πρωτεΐνες παράγονται από τα ριβοσώματα που βρίσκονται μέσα στο κυτταρόπλασμα και αρχικά εμφανίζονται ως απλές μη διακλαδωμένες αλληλουχίες αμινοξέων, δηλαδή πεπτιδίων ή πολυπεπτιδίων, σχηματίζοντας την "πρωτοταγή δομή", για την οποία καθοριστικοί παράγοντες είναι τα νουκλεϊκά οξέα, τα οποία και φέρονται να ελέγχουν όλες τις λειτουργίες αλλά και τα κληρονομικά γνωρίσματα των οργανισμών.
Στη συνέχεια όλα τα πολυπεπτίδια υφίστανται μια φυσική διαμόρφωση προκειμένου να αποκτήσουν μια "δευτεροταγή δομή" η οποία προκαλείται από δεσμούς υδρογόνου που αναπτύσσονται μεταξύ των καρβοξυλομάδων και των αμινομάδων των αμινοξέων. Ο πλέον διαδεδομένος τύπος τέτοιας μορφής πολυπεπτιδίου είναι η λεγόμενη "α-έλικα", δεξιόστροφη, όπου οι σπείρες διατηρούνται στη θέση τους με δεσμούς υδρογόνου μεταξύ των καρβοξυλομάδων και των αμινομάδων των αμινοξέων. Μια άλλη δευτεροταγής δομή είναι η λεγόμενη "β-πτυχωτή επιφάνεια" όπου στη περίπτωση αυτή διασταυρώνονται παράλληλες αλυσίδες πολυπεπτιδίων που ενώνονται στις διασταυρώσεις με δεσμούς υδρογόνου σχηματίζοντας έτσι μια εξαιρετικά σφιχτή δομή, όπως στο μετάξι. Οι πρωτεΐνες με τέτοιες σχετικά απλές δισδιάστατες δευτερογενείς δομές ονομάζονται γενικά ινώδεις πρωτεΐνες.
Στη συνέχεια τα πολυπεπτίδια υφίστανται ακόμα πιο περίπλοκο δίπλωμα (πτύχωση) το οποίο καλείται "τριτοταγής δομή". Με τον όρο τριτοταγή δομή, εννοούμε το τελικό και λειτουργικό σχήμα που αποκτά το πολυπεπτίδιο, οπότε ονομάζεται πλέον πρωτεΐνη. Αυτή η αναδίπλωση πραγματοποιείται από την αλληλεπίδραση των πλευρικών ομάδων των αμινοξέων (π.χ. σχηματισμός δισουλφιδικών δεσμών μεταξύ δύο κυστεϊνικών καταλοίπων). 
Τέλος, υπάρχουν και πρωτεΐνες που αποτελούνται από πολλές πολυπεπτιδικές αλυσίδες που είναι χαλαρά ενωμένες και αυτό αποτέλεί τη λεγόμενη "τεταρτοταγή δομή". Παράδειγμα είναι η αιμοσφαιρίνη.
Επίσης στις πρωτεϊνες ανακαλύφθηκε και άλλο ένα επιπέδο οργάνωσης. Πρόκειται για τη πρωτεϊνική περιοχή (protein domain), η οποία μπορεί να διπλωθεί ανεξάρτητα σε μια συμπαγή, σταθερή δομή. Μια περιοχή αποτελείται από 100 με 250 αμινοξέα και αποτελεί μονάδα από την οποία δομούνται πολύ μεγαλύτερες πρωτεϊνες. Οι διαφορετικές περιοχές σχετίζονται με διαφορετική λειτουργία.

Κατάταξη πρωτεϊνών

Γενικά οι πρωτεΐνες ανάλογα της μορφής τους διακρίνονται σε ινώδεις πρωτεΐνες και σε σφαιρικές πρωτεΐνες.
 
Με κριτήριο τη σύνθεσή τους διακρίνονται σε απλές (όταν αποτελούνται μόνο από αμινοξέα) και σε σύνθετες (όταν στο μόριό τους περιλαμβάνονται και μη πρωτεϊνικά τμήματα όπως μέταλλα, σάκχαρα, λίπη κ.λπ.).

Επίσης με κριτήριο ακόμη τη λειτουργία τους διακρίνονται σε δομικές (όταν αποτελούν τα δομικά υλικά του κυττάρου), και λειτουργικές (όταν συμβάλλουν σε κάποιες λειτουργίες).

Βιολογικός ρόλος

Οι διάφορες λειτουργίες που παρατηρούνται στους οργανισμούς γίνονται χάρη στις πρωτεΐνες. Ο δε βιολογικός τους ρόλος καθορίζεται κάθε φορά από την τρισδιάστατη δομή τους που είναι συνέπεια της αλληλουχίας των αμινοξέων, η οποία και ξεκινά από την πρωτοταγή δομή. 
Όπως άλλα βιολογικά μακρομόρια (π.χ. οι πολυσακχαρίτες, τα λιπίδια, και νουκλεϊκά οξέα) έτσι και οι πρωτεΐνες είναι απαραίτητες για όλους τους ζωντανούς οργανισμούς και συμμετέχουν σε κάθε διαδικασία μέσα στα κύτταρα. Πολλές πρωτεΐνες δρουν ως ένζυμα που καταλύουν τις βιοχημικές αντιδράσεις, και είναι ζωτικής σημασίας στο μεταβολισμό. Άλλες πρωτεΐνες έχουν δομικές ή μηχανικές λειτουργίες, όπως οι πρωτεΐνες του κυτταρικού σκελετού, οι οποίες συμβάλλουν στη διατήρηση της μορφής των κυττάρων. Οι πρωτεΐνες είναι επίσης σημαντικές στη διακυτταρική επικοινωνία, τη δράση του ανοσοποιητικού συστήματος, τον σχηματισμό κυτταρικών ιστών, και τον κυτταρικό κύκλο. 
Οι πρωτεΐνες είναι απαραίτητα συστατικά στη διατροφή μας, δεδομένου ότι τα ζώα δεν μπορούν να συνθέσουν όλα τα αμινοξέα, αλλά πρέπει να τα λάβουν από τα τρόφιμα. Μέσω της διαδικασίας της πέψης, τα ζώα αποικοδομούν την πρωτεΐνη στα ελεύθερα αμινοξέα που μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την πρωτεϊνική σύνθεση

Μελέτη πρωτεϊνών

Υπάρχει μια μεγάλη ποικιλία πρωτεϊνών, η κάθε μία με ξεχωριστή διαμόρφωση στο χώρο, η οποία οφείλεται στη διαφορετική αλληλουχία αμινοξέων τους, και ξεχωριστές ιδιότητες και τρόπο με τον οποίο δρουν. Για να γίνει η μελέτη τους, οι πρωτεΐνες πρέπει να απομονωθούν από  το κυτταρικό διάλυμα στο οποίο βρίσκονται, κάτι που επιτυγχάνεται με ποικίλες διαδικασίες που καθαρίζουν τις πρωτεΐνες ώστε να μην έχουν προσμίξεις. Στη συνέχεια μπορεί να βρεθεί η αλληλουχία της πρωτεΐνης με τη μέθοδο Edman, αλλά πρόσφατα σε αυτό το τομέα η χρήση τεχνικών του ανασυνδυασμένου DNA έχει προσφέρει νέες πληροφορίες. Στο προσδιορισμό της δομής μιας πρωτεΐνης πολύ χρήσιμη έχει αποδειχθεί η χρήση της φασματοσκοπίας πυρηνικού συντονισμού (NMR) και η κρυσταλλογραφία με ακτίνες Χ. Τέλος, σημαντική για τη κατανόηση της φυσιολογικής δράσης μιας πρωτεΐνης είναι ο εντοπισμός της στον οργανισμό.

Καθαρισμός

Η μελέτη μιας πρωτεΐνης πρέπει να γίνει σε καθαρή πρωτεΐνη ώστε να προκύψουν σαφή συμπεράσματα. Έτσι η πρωτεΐνη πρέπει να απομονωθεί από το αρχικό υλικό, το οποίο μπορεί να είναι καλλιέργεια κυττάρων από φυτικούς η ζωικούς οργανισμούς. Ο καθαρισμός γίνεται με βάση πρωτοκόλλα καθαρισμού.
Για να γίνει σωστά η απομόνωση πρέπει να υπάρχει μια δοκιμασία (essay) ώστε να επιβεβαιωθεί η παρουσία της πρωτεΐνης στο διάλυμα. Η δοκιμασία αυτή πρέπει να είναι όσο το δυνατό πιο εξειδικευμένη για τη πρωτεΐνη που ψάχνουμε ώστε ο καθαρισμός να γίνει αποτελεσματικότερος. Αν η πρωτεΐνη είναι ένζυμο, τότε αυτή η δοκιμασία βασίζεται συνήθως στην αντίδραση που καταλύει. Επίσης χρήσιμη στο καθαρισμό είναι η γνώση της συγκέντρωσης της πρωτεΐνης που μπορεί να γίνει εύκολα και με ακρίβεια. Με βάση αυτά τα δύο μεγέθη μπορεί να υπολογιστεί η ειδική δραστικότητα, η οποία είναι ο λόγος της ενζυμικής δραστηριότητας προς τη συγκέντρωση όλων των πρωτεϊνών του διαλύματος. Όσο ο καθαρισμός προχωρά, η ενζυμική δραστηριότητα αυξάνεται.
Ο καθαρισμός αρχίζει με την φυγοκέντρηση ενός ομογενοποιήματος, το οποίο αποτελείται κύτταρα χωρίς την κυτταρική μεμβράνη τους. Η φυγοκέντρηση γίνεται σε τρεις φάσεις στις οποίες χωρίζονται τα μέρη του κυττάρου. Σε κάθε φάση το υπερκείμενο φυγοκεντρείται ξανά σε μεγαλύτερη ταχύτητα για περισσότερη ώρα. Αυτή η διαδικασία λέγεται διαφορική φυγοκέντρηση και από αυτή προκύπτουν κλάσματα ελαττωμένης πυκνότητας. Αρχικά καθιζάνει το πυρηνικό κλάσμα μετά το μιτοχονδριακό κλάσμα και τέλος το μικροσωμικό κλάσμα, ενώ το υπερκείμενο της τελευταίας φυγοκέντρησης λέγεται κυτοσόλιο και περιέχει διαλυτές πρωτεΐνες. Ένα κλάσμα από αυτά θα έχει μεγαλύτερη ενεργότητα και αυτό θα επιλεχθεί για περαιτέρω καθαρισμό.
Το κλάσμα που προέκυψε από τη φυγοκέντρηση περιέχει χιλιάδες διαφορετικές πρωτεΐνες. Για να γίνει απομόνωση της ζητούμενης πρωτεΐνης χρησιμοποιούνται τεχνικές που βασίζονται στα διακριτά χαρακτηριστικά των πρωτεϊνών, όπως είναι η διαλυτότητα, το φορτίο, το μέγεθος και η αλληλεπίδραση με άλλες ουσίες λόγω χημικής συγγένειας. Σε κάθε στάδιο, το διάλυμα ελέγχεται για τη παρουσία της πρωτεΐνης. Μια πρώτη διαδικασία που χρησιμοποιείται είναι η εξαλάτωση. Οι περισσότερες πρωτεΐνες παρουσιάζουν μικρή διαλυτότητα σε υψηλή συγκέντρωση άλατος, αλλά η ποσότητα άλατος που απαιτείται για τη απομάκρυνση της πρωτεΐνης από το διάλυμα, με αποτέλεσμα η εξαλάτωση να χρησιμεύει για τη κλασμάτωση των πρωτεϊνών. Το περιττό άλας στη συνέχεια μπορεί να απομακρυνθεί με τη μέθοδο της διαπήδησης. Ο διαχωρισμός με βάση το μέγεθος γίνεται με χρωματογραφία διήθησης σε πηκτή. Το μίγμα πρωτεϊνών διέρχεται μέσα από μια στήλη που περιέχει πορώδες πολυμερές. Μια μικρή πρωτεΐνη χρειάζεται περισσότερο χρόνο να διέλθει από το διάλυμα από μια μεγαλύτερη και έτσι οι πρωτεΐνες με διαφορετικό μέγεθος θα εκλουστούν σε διαφορετικούς χρόνους. Ο διαχωρισμός με βάση το φορτίο γίνεται με βάση το φορτίο γίνεται με χρωματογραφία ιοντοανταλλαγής. Το μίγμα πρωτεϊνών διέρχεται από μια στήλη με φορτισμένα ιόντα (είτε θετικά είτε αρνητικά), ενώ βρίσκεται σε pH 7. Οι πρωτεΐνες φορτισμένες αντίθετα με τα ιόντα θα παραμείνουν μέσα στη στήλη, ενώ οι υπόλοιπες θα διέλθουν. Τέλος, η χρωματογραφία συγγένειας βασίζεται στην υψηλή συγγένεια με μία χημική ουσία, με αποτέλεσμα όταν διέλθουν από μια στήλη που τη περιέχει, η πρωτεΐνη να παραμείνει σε αυτή.
Για να καθοριστεί πόσο αποτελεσματικό είναι ένα πρωτόκολλο καθαρισμού υπάρχουν δύο τρόποι. Ο πρώτος είναι με τη συνεχή εξέταση της ειδικής δραστικότητας, η οποία αυξάνει όσο προχωρά ο καθαρισμός, και ο δεύτερος είναι με τη εξέταση των πρωτεϊνών που εμφανίζονται σε κάθε στάδιο  του καθαρισμού. Το δεύτερο είναι δυνατό μια ηλεκτροφόρηση δύο διαστάσεων, η οποία χωρίζει τις πρωτεΐνες με βάση του ισοηλεκτρικό σημείο και το μέγεθός τους.

Προσδιορισμός αλληλουχίας  αμινοξέων

Η γνώση της πρωτοταγούς δομής μιας πρωτεΐνης, δηλαδή η αλληλουχία των αμινοξέων, παρέχει χρήσιμα στοιχεία για τη λειτουργία και την εξέλιξη μιας πρωτεΐνης. Ο προσδιορισμός της αλληλουχίας των αμινοξέων αρχίζει με το προσδιορισμός της σύστασης των αμινοξέων του πεπτιδίου. Η πρωτεΐνη υδρολύεται με θέρμανση σε διάλυμα υδροχλωρίου στους 110 βαθμούς Κελσίου για μια ημέρα. Τα υδρολυμένα αμινοξέα στη συνέχεια διαχωρίζονται με χρωματογραφία ιοντοανταλλαγής και η ταυτότητα του αμινοξέως προσδιορίζεται από τον όγκο ρυθμιστικού διαλύματος που απαιτείται για την απομάκρυνσή του από τη στήλη. Στη συνέχεια, η ποσότητα του αμινοξέως προσδιορίζεται με αντίδραση νινυδρίνης. Το αμινοξύ θερμαίνεται μαζί με τη νινυδρίνη και με φασματοφωτομετρία μετράται η απορρόφησή του. Η απορρόφηση είναι ανάλογη με τη συγκέντρωση του αμινοξέως. Άλλες μέθοδοι είναι πιο ευαίσθητες, όπως η χρήση φθορεσκαμίνης, η οποία φωσφορίζει όταν αντιδρά με τις αμινικές ομάδες.
Το επόμενο βήμα είναι ο προσδιορισμός του αμινικού τελικού άκρου. Σήμερα αυτό γίνεται με τη χρήση ουσιών γνωστών ως dabsyl και dansyl χλωρίδιο. Συγκεκριμένα, το dabsyl αλληλεπιδρά με μία μη φορτισμένη αμινική ομάδα και δημιουργεί ένα σταθερό παράγωγο σουλφαμιδίου, το οποίο δεν καταστρέφεται κατά τη υδρόλυση της πρωτεΐνης. Αν και αυτή η μέθοδος είναι ευαίσθητη και αποτελεσματική για το προσδιορισμό του αμινοτελικού άκρου, δε μπορεί να επαναληφθεί διότι η όξινη υδρόλυση της πρωτεΐνης προκαλεί την αποδιάταξή της. Για το προσδιορισμό της αλληλουχία τώρα χρησιμοποιείται η αποικοδόμηση Edman. Το κύριο αντιδραστήριο αυτής της μεθόδου είναι το φαινυλοϊσοθειοκυανικό, το οποίο αντιδρά με το αμινοξύ που βρίσκεται στο αμινοτελικό άκρο της πρωτεΐνης και σχηματίζει ένα παράγωγο φαινυλο-θειοκαρβαμοϋλίου, και υπό ήπιες συνθήκες από τη πρωτεΐνη απελευθερώνεται ένα κυκλικό παράγωγο του τελικού αμινοξέως, η ένωση φαινυλο-υδαντοϊνο(PTH)-αμινοξύ. Στη συνέχεια ο κύκλος μπορεί να επαναληφθεί ξανά στο υπόλοιπο πεπτίδιο. Το PTH αμινοξύ αναγνωρίζεται με υγρή χρωματογραφία υψηλής πίεσης. Ο κύκλος αποικοδόμησης Edman μπορεί να αναγνωρίσει μέχρι 50 αμινοξέα. Για να προσδιοριστεί η αλληλουχία πρωτεϊνών με περισσότερα αμινοξέα, η πρωτεΐνη τεμαχίζεται σε μικρά κομμάτια με ενζυμικές και χημικές μεθόδους. Η αλληλουχία των αμινοξέων προσδιορίζεται με τη μέθοδο Edman, ενώ η σειρά των πεπτιδίων με βάση τα αλληλεπικαλυπτόμενα κομμάτια τους. Για πρωτεΐνες που αποτελούνται από πολλές αλυσίδες, πρώτα γίνεται ο προσδιορισμός του αριθμού των αλυσίδων, είτε μετρώντας αμινοτελικά άκρα, είτε με ηλεκτροφόρηση, και μετά η εύρεση της αλληλουχίας των αμινοξέων γίνεται για κάθε αλυσίδα ξεχωριστά.
Μια άλλη μέθοδος αφορά τη χρήση του DNA για το προσδιορισμό της αλληλουχία της πρωτεΐνης. Το γονίδιο που κωδικοποιεί την πρωτεΐνη κλωνοποιείται και έτσι μπορεί να βρεθεί η αλληλουχία νουκλεοτιδίων του. Στη συνέχεια, η αλληλουχία νουκλεοτιδίων αποκαλύπτει αμέσως την αλληλουχία αμινοξέων της πρωτεΐνης που κωδικοποιείται από το γονίδιο. Το μειονέκτημα αυτής της μεθόδου είναι ότι πολλές πρωτεΐνες τροποποιούνται μετά τη σύνθεσή τους στα ριβωσώματα, με αποτέλεσμα να εξακολουθεί να απαραίτητη η απομόνωση της πρωτεΐνης.

Προσδιορισμός δομής

Η ενότητα αυτή είναι κενή, ανεπαρκώς ανεπτυγμένη ή ανολοκλήρωτη. Η βοήθειά σας είναι καλοδεχούμενη!
Οι δύο σημαντικότερες τεχνικές προσδιορισμού της δομής μιας πρωτεΐνης είναι η φασματοσκοπία πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού και η κρυσταλλογραφία με ακτίνες Χ.

Εντόπιση στον οργανισμό

Η εντόπιση μιας πρωτεΐνης μέσα στο κύτταρο, και γενικότερα μέσα στον οργανισμό είναι το ίδιο σημαντική για τη μελέτη της φυσιολογικής της δράσης με τον προσδιορισμό της αλληλουχίας αμινοξέων και τη ς δομής της πρωτεΐνης. Για το εντοπισμό μιας πρωτεΐνης χρησιμοποιούνται μονοκλωνικά αντισώματα, τα οποία προσδένουν την πρωτεΐνη με την οποία εμφανίζουν συγγένεια. Τα αντισώματα αναγνωρίζουν μια συγκεκριμένη περιοχή της πρωτεΐνης, το αντιγόνο, στην οποία και προσδένονται. Στη συνέχεια, ιχνηθετημένα με φθορίζουσες ή ραδιενεργές ουσίες αντισώματα προσδένουν στα πρώτα και επιτρέπουν τον εντοπισμό τους. Τα μονοκλωνικά αντισώματα χρησιμοποιούνται ευρέως στις εργαστηριακές εξετάσεις επειδή είναι εξειδικευμένα, με αποτέλεσμα να συνδέονται με ένα μόνο αντιγόνο.
Υπάρχουν αρκετές τεχνικές που χρησιμοποιούν μονοκλωνικά αντισώματα για να εντοπιστεί μια συγκεκριμένη πρωτεΐνη. Όταν η πρωτεΐνη βρίσκεται σε ένα διάλυμα, όπως για παράδειγμα ο ορός του αίματος, χρησιμοποιείται η ενζυμοσύνδετη ανοσοπροσροφητική μέτρηση (γνωστή εν συντομία ως ELISA). Μια διαφορετική μέθοδος για την ανίχνευση πρωτεϊνών στο κύτταρο ή σε ένα κυτταρικό υγρό είναι η ανοσοαποτύπωση ή αποτύπωση Ουέστερν (Western blotting). Σε αυτή τη τεχνική το διάλυμα ηλεκτροφορείται σε πηκτή SDS-πολυακρυλαμιδίου και για να αντιδράσουν πιο εύκολα με το αντίσωμα μεταφέρονται σε μια άλλη επιφάνεια. Έπειτα, ένα δεύτερο ιχνηθετημένο αντίσωμα συνδέεται με το πρώτο και βοηθά στον εντοπισμό του. Για την παρατήρηση πρωτεϊνών μέσα στο κύτταρα χρησιμοποιείται ο ανοσοφθορισμός. Φθορίζοντα αντισώματα προσδένονται στη πρωτεΐνη στόχο και στη συνέχεια ένα μικροσκόπιο φθορισμού αποκαλύπτει τη θέση τους (άρα και τη θέση της πρωτεΐνης) μέσα στο κύτταρο.

Ιστορία

Το όνομα πρωτεΐνη προέρχεται από το ελληνικό "πρώτα", το οποίο σημαίνει "πρωταρχικής σημασίας" και περιγράφηκε αρχικά και ονομάστηκε από τον Γιονς Γιάκομπ Μπερτσέλιους το 1838. Εντούτοις, ο κεντρικός ρόλος τους στους ζωντανούς οργανισμούς δεν εκτιμήθηκε πλήρως έως το 1926, όταν ο Τζέιμς Σάμερ (James B. Sumner) έδειξε ότι το ένζυμο ουρεάση ήταν μια πρωτεΐνη. Η πρώτη πρωτεϊνική δομή, αυτή της μυοσφαιρίνης, βρέθηκε από τους Μαξ Πέρουτζ (Max Perutz) και Τζον Κέντριου (John Kendrew) το 1958, η οποία τους χάρισε το βραβείο Νόμπελ στη Χημεία.