Χρώση κατά Γκραμ

Χρώση κατά Γκραμ (Gram stain) ονομάζεται μια απλή μέθοδος η οποία κατατάσσει τα είδη των βακτηρίων σε δύο μεγάλες ομάδες, τα «θετικά κατά Γκραμ» και τα «αρνητικά κατά Γκραμ». Στην πρώτη περίπτωση τα βακτήρια διατηρούν το μπλε-ιώδες χρώμα της πρώτης χρώσης, ενώ στη δεύτερη λαμβάνουν ερυθρό χρώμα οφειλόμενο στη δεύτερη χρώση. Η διαφορά αυτή οφείλεται στη χημική σύσταση του κυτταρικού τοιχώματος των βακτηρίων και ιδιαίτερα στην ύπαρξη ή μη πεπτιδογλυκάνης. Η μέθοδος οφείλει το όνομά της στον Δανό ερευνητή βακτηριολόγο Χανς Κρίστιαν Γιόαχιμ Γκραμ (Hans Christian Joachim Gram, 1853 - 1938), ο οποίος την επινόησε.

Ιστορικό

Κατά το 19ο αιώνα ο Γερμανός παθολόγος Καρλ Φριντλέντερ (Carl Friedländer), ο οποίος εργαζόταν στο νεκροτομείο του νοσοκομείου του Βερολίνου προσπαθούσε να εντοπίσει τα αίτια της πνευμονίας. Το 1882 και το 1883 εξέδωσε δύο μελέτες, στις οποίες περιέγραφε την ιστολογική εικόνα των μικροοργανισμών όπως παρατηρούνταν στα ινώδη εκκρίματα μολυσμένων πνευμόνων ασθενών που είχαν αποβιώσει από λοβώδη πνευμονία και απομόνωσε τους μικροοργανισμούς που αποκάλεσε τότε «μικρόκοκκους». Η βακτηριολογική έρευνα στην πραγματικότητα έγινε από ένα μαθητή του Ρόμπερτ Κοχ ονόματι Φρομπένιους (Frobenius). Στις μελέτες αυτές ο Φριντλέντερ έδωσε ιδιαίτερη έμφαση στην παρουσία μιας κάψας, η οποία περιέκλειε τους παρατηρούμενους μικροοργανισμούς. Σήμερα δεν υπάρχει αμφιβολία ότι ο Φριντλέντερ στις μελέτες του περιέγραψε τον πνευμονιόκοκκο (Streptococcus pneumoniae). Τα άρθρα του Φριντλέντερ και ιδιαίτερα η έμφασή τους στην παρουσία κάψας προκάλεσαν το έντονο ενδιαφέρον του Άλμπερτ Φρένκελ (Albert Fraenkel, 1864–1938) καθηγητή στο Πανεπιστήμιο της Χαϊδελβέργης, ο οποίος είχε επίσης απομονώσει μικροοργανισμό από ασθενείς με λοβοπνευμονία, αλλά ήταν τελείως διαφορετικός από αυτόν που περιέγραφε ο Φριντλέντερ. Στη σχετική μελέτη που δημοσίευσε είναι σήμερα φανερό ότι περιέγραψε την Κλεμπσιέλλα (Klebsiella pneumoniae).
Ένα από τα μεγαλύτερα προβλήματα που αντιμετώπισαν και οι δύο ερευνητές ήταν η δυνατότητα να παρατηρήσουν τους μικροοργανισμούς σε πτύελα με πύον που αποβάλλονταν από τους μολυσμένους πνεύμονες και σε τομές ιστών. Αιτία ήταν η παρουσία ινιδίνης (fibrin) αλλά οι ίδιοι οι πυρήνες των μικροοργανισμών, που αντιδρούσαν με τις χρωστικές που χρησιμοποιούνταν εκείνη την εποχή για τη χρώση ιστολογικών παρασκευασμάτων. Έτσι ήταν σχεδόν αδύνατη η παρατήρηση βακτηρίων που βρίσκονταν ανάμεσα στα κύτταρα των ιστών. Στο σημείο αυτό παρενέβη ο Γκραμ, συνεργάτης τότε του Φριντλέντερ, ο οποίος είχε αναπτύξει μια μέθοδο χρώσης των βακτηρίων. Τη μέθοδο αυτή ανέφερε ο Φριντλέντερ στις μελέτες του, αλλά το 1884 ο Γκραμ εξέδωσε ο ίδιος μια μελέτη, στην οποία περιέγραφε με λεπτομέρειες τη μέθοδο χρώσης και τα αποτελέσματά της.

Η τεχνική

Η αρχική τεχνική που δημοσιεύτηκε το 1884 από τον Γκραμ βελτιώθηκε το 1921 από τον Χάκερ (Hucker), παρέχοντας μεγαλύτερη σταθερότητα στη χρώση και καλύτερα αποτελέσματα στην ασφαλή διάκριση.
Η βάση της τεχνικής είναι το κρυσταλλικό ιώδες (crystal violet) ή ιώδες της γεντιανής (gentian violet), κατά IUPAC ονομασία χλωριούχος εξαμεθυλοπαραροσανιλίνη (hexamethyl pararosaniline chloride). Σε ορισμένες περιπτώσεις μπορεί να αντικαθίσταται από κυανούν του μεθυλενίου, το οποίο παρέχει εξ ίσου αποτελεσματική χρώση. Η τεχνική αυτή στηρίζεται στην ικανότητα του κυτταρικού τοιχώματος των βακτηρίων να συγκρατούν το κρυσταλλικό ιώδες κατά την επεξεργασία με διαλύτες. Τα κατά Γκραμ θετικά βακτήρια έχουν τοίχωμα υψηλής περιεκτικότητας σε πεπτιδογλυκάνη και χαμηλότερης σε λιπίδια. Το κυτταρικό τοίχωμα χρώννυται με την επίδραση του κρυσταλλικού ιώδους. Στη συνέχεια προστίθεται ιώδιο ως στερεωτικό, το οποίο σχηματίζει σύμπλοκο με το κρυσταλλικό ιώδες, με αποτέλεσμα τη στερέωση της χρώσης. Στη συνέχεια στο παρασκεύασμα προστίθεται ένας διαλύτης, αιθυλική αλκοόλη, ακετόνη ή μίγμα και των δύο. Ο διαλύτης απομακρύνει τη στιβάδα των λιπιδίων από τα κατά Γκραμ αρνητικά βακτήρια, πράγμα που διευκολύνει τη διάχυση της αρχικής χρώσης στο περιβάλλον. Αντίθετα, ο διαλύτης αφυδατώνει το κυτταρικό τοίχωμα των κατά Γκραμ θετικών βακτηρίων, σφραγίζοντας και τους πόρους του καθώς αυτό συρρικνώνεται, εμποδίζοντας έτσι τη διάχυση της χρωστικής, οπότε τα βακτήρια παραμένουν κεχρωσμένα. Σημαντικό σημείο στην επιτυχία της διαδικασίας είναι ο χρόνος που αφήνεται να επιδράσει ο διαλύτης: Αν είναι ιδιαίτερα παρατεταμένος, ο διαλύτης μπορεί να απομακρύνει τη χρωστική τόσο από τα κατά Γκραμ αρνητικά όσο και από τα κατά Γκραμ θετικά βακτήρια. Μερικά θετικά κατά Γκραμ βακτήρια είναι πιθανό να χάσουν σχετικά εύκολα τη χρώση τους και στο παρασκεύασμα τελικά να εμφανίζεται μια μίξη θετικών και αρνητικών βακτηρίων. Αυτού του τύπου τα βακτήρια χαρακτηρίζονται ως κατά Γκραμ μεταβλητά.
Τέλος, στο παρασκεύασμα προστίθεται νέα χρωστική, συνήθως φουξίνη (fuchsine) ώστε να χρωματιστούν τα (αποχρωματισμένα) αρνητικά κατά Γκραμ βακτήρια και να είναι δυνατή η παρατήρησή τους.

Χρησιμότητα

Η τεχνική χρώσης κατά Γκραμ χρησιμοποιείται κύρια για το διαχωρισμό των επιμέρους ειδών των βακτηρίων σε δύο κατηγορίες (θετικά και αρνητικά). Η μέθοδος δεν έχει χρησιμότητα στα Αρχαία (παλαιότερα αρχαιοβακτήρια) καθώς η τεχνική δίνει ποικίλα αποτελέσματα, ανάλογα με τις φυλογενετικές τους ομάδες.
Η μέθοδος δεν είναι αλάνθαστη για τη διάγνωση και την ταυτοποίηση μικροοργανισμών, για τις οποίες έχουν αναπτυχθεί νεότερες τεχνικές, βασιζόμενες κυρίως στη μοριακή Βιολογία, οι οποίες είναι πολύ πιο αποτελεσματικές. Η ταξινόμηση των βακτηρίων που έχει γίνει με βάση τη χρώση κατά Γκραμ παραμένει σε χρήση, παρά το γεγονός ότι υπάρχουν τα κατά Γκραμ μεταβλητά βακτήρια αλλά και ορισμένα, όπως τα βακτήρια του γένους Mycobacterium, στο οποίο περιλαμβάνονται τα Mycobacterium tuberculosis (προκαλεί τη φυματίωση) και το Mycobacterium leprae (προκαλεί τη νόσο του Χάνσεν (λέπρα)). Το κυτταρικό τοίχωμα αυτών των βακτηρίων εμφανίζει σημαντικές διαφοροποιήσεις (αν και περιέχει μεγάλες ποσότητες πεπτιδογλυκάνης), εμπεριέχοντας ένα κηρώδες υλικό, το οποίο εμποδίζει τη χρώση τους κι έτσι τα βακτήρια παραμένουν αόρατα.

Κατά Γκραμ θετικά

Κύρια ομάδα κατά Γκραμ θετικών βακτηρίων είναι τα βακτήρια του φύλου Firmicutes, που περιλαμβάνει γένη όπως Bacillus, Listeria, Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus και Clostridium.

Κατά Γκραμ αρνητικά

Η μεγαλύτερη ομάδα των κατά Γκραμ αρνητικών βακτηρίων περιλαμβάνει τα πρωτεοβακτήρια. Αρνητικά εμφανίζονται επίσης τα κυανοβακτήρια, οι σπειροχαίτες και τα πρασινοβακτήρια. Υπάρχουν ακόμη αρκετοί κόκκοι και βάκιλλοι που σχετίζονται κυρίως με ενδονοσοκομειακές λοιμώξεις, που εμφανίζονται κατά Γκραμ αρνητικοί.