Αντιπυρηνικά αντισώματα

Τα αντιπυρηνικά αντισώματα (ANAs, γνωστά και ως αντιγονικός πυρηνικός παράγοντας ή ANF) αποτελούν μια ετερογενή ομάδα αυτοαντισωμάτων που στρέφονται κατά διαφόρων αντιγονικών συστατικών του πυρήνα όπως του DNA, ιστονικών και μη πρωτεϊνών. Η δοκιμασία ΑΝΑ μετρά το ποσοστό των αυτοαντισωμάτων, τα οποία επιτίθενται στον ανθρώπινο ιστό σαν να ήταν ξένο υλικό. Παρουσιάζονται σε υψηλότερο από το φυσιολογικό ποσοστό σε αυτοάνοσες ασθένειες. Στο γενικό πληθυσμό, τα αυτοαντισώματα εμφανίζουν χαμηλούς τίτλους, αλλά σε ποσοστό περίπου 5% του πληθυσμού υπάρχει μια τάση προς αύξηση, από το οποίο περίπου το 2,5% έχει τελικά μια αυτοάνοση ασθένεια.

Ιστορία

Η μελέτη των αντιπυρηνικών αντισωμάτων άρχισε το 1948 όταν οι Hargraves et al ανακάλυψαν τα κύτταρα λύκου (LE κύτταρα) στο μυελό των οστών μιας άρρωστης με συστηματικό ερυθηματώδη λύκο (ΣΕΛ). Τα κύτταρα λύκου είναι λευκά αιμοσφαίρια που εμφανίζουν μία ομοιογενή μάζα στο κυτταρόπλασμα. Χρειάστηκε να γίνουν πολλά πειράματα για να εξακριβωθεί ότι η μάζα αυτή αποτελείται από συμπλέγματα αντιγόνου – αντισώματος (ανοσοσυμπλέγματα) στα οποία το αντιγόνο είναι δεοξυριβοζονουκλεοπρωτεΐνη. Με τη μέθοδο αυτή ο ορός που εξετάζεται επωάζεται με πυρήνες κυττάρων, σχηματίζονται τα ανοσοσυμπλέγματα και στη συνέχεια φαγοκυτταρώνονται από λευκοκύτταρα με τη βοήθεια του συμπληρώματος. Έτσι δημιουργείται η εικόνα των κυττάρων λύκου που χαρακτηρίζονται από την ύπαρξη των φαγοκυτταρομένων πυρήνων σαν μια ομοιογενής μάζα, βασεόφιλης χρώσης, στο κυτταρόπλασμα. Η δοκιμασία των LE κυττάρων είναι δύσκολη στην εκτέλεση της, η εκτίμηση της είναι υποκειμενική, δεν είναι ποσοτική μέθοδος, ούτε αρκετά ευαίσθητη και ειδική.     Για πολλά χρόνια τα κύτταρα λύκου βοήθησαν στη διάγνωση του ΣΕΛ, αποτελώντας ένα από τα 11 διαγνωστικά κριτήρια της Αμερικανικής Ρευματολογικής Εταιρίας, σήμερα όμως τείνουν να εγκαταλειφθούν` καθώς αντικαθίστανται από μια πιο ευαίσθητη μέθοδο, την ανίχνευση αντιπυρηνικών αντισωμάτων (ΑΝΑ, antinuclear antibodies) με τη χρήση του έμμεσου ανοσοφθορισμού. Τη μέθοδο αυτή εισήγαγαν το 1957 συγχρόνως τρείς ερευνητές που δούλευαν ανεξάρτητα. Η εφαρμογή της έκανε εφικτή την ανίχνευση αντισωμάτων που αναγνωρίζουν ένα ευρύ φάσμα πυρηνικών αυτοαντιγόνων, συγχρόνως προσδιορίζοντας και τον τίτλο αυτών των αυτοαντισωμάτων.

Η δοκιμασία ΑΝΑ

Γίνεται στον ορό του αίματος, το οποίο έχει παρθεί από φλέβα. Ο προσδιορισμός γίνεται των αυτοαντισωμάτων:

Με τη χρήση έμμεσου ανοσοφθορισμού (IFA) (ημιποσοτικός προσδιορισμός)

Η τεχνική της εξέτασης είναι απλή. Ένα υπόστρωμα κυττάρων επωάζεται με αραιωμένο δείγμα ορού αίματος. Τα αντιπυρηνικά αντισώματα θα συνδεθούν με τα αντιγόνα που αναγνωρίζουν. Αφού ξεπλυθεί η περίσσεια του ορού, το υπόστρωμα επωάζεται με αντιανθρωπίνη ανοσοσφαιρίνη, συνδεδεμένη με φθοριόχρωμα (π.χ. ισοθειοκυανούχο φλουορεσκεϊνη ή ροδαμίνη) αυτή, θα αναγνωρίσει την ανθρώπινη ανοσοσφαιρίνη. Η περίσσεια της συζευγμένης ανοσοσφαιρίνης ξεπλένεται και το υπόστρωμα εξετάζεται στο μικροσκόπιο φθορισμού. Η ύπαρξη φθορισμού θα αντανακλά έμμεσα την παρουσία αντιπυρηνικών αντισωμάτων. Σε περίπτωση θετικού αποτελέσματος κατά την αρχική αραίωση γίνεται τιτλοδότηση (διαδοχικές υποδιπλάσιες αραιώσεις μέχρι την τελευταία θετική), ενώ παράλληλα καταγράφονται όλοι οι τύποι φθορισμού που παρατηρήθηκαν.

Με ELISA (ποιοτικός προσδιορισμός)

Η μέθοδος αυτή περιλαμβάνει την αλληλεπίδραση των αντισωμάτων που υπάρχουν στο δείγμα του ορού με προπαρασκευασμένα αντιγόνα και την προσθήκη ενός αντισώματος που προσκολλάται σε αυτό το σύμπλοκο και προκαλεί μια αλλαγή χρώματος. Το αποτέλεσμα είναι μια τιμή οπτικής πυκνότητας (φωτομετρική κλίμακα) που διαβάζεται ως θετική, αρνητική ή διφορούμενη. Το εύρος τιμών αναφοράς για αντιπυρηνικά αντισώματα είναι αρνητικό με ELISA. Εάν η μέθοδος με την ELISA οδηγεί σε θετικό ή διφορούμενο εύρημα τότε το δείγμα τιτλοδοτείται χρησιμοποιώντας έμμεσο ανοσοφθορισμό ανιχνεύοντας επί των κυττάρων Hep-2 και οποιαδήποτε τιμή μικρότερη από ή ίση με αραίωση 1:40 (ή <1/0 IU) είναι αρνητική.

Με τη χρήση απλής ακτινωτής ανοσοδιάχυσης – RID (Radial ImmunoDiffution) - Μέθοδος Manhcini

Πρόκειται για μέθοδο ποσοτικής μέτρησης της συγκέντρωσης ενός αντιγόνου ή ενός αντισώματος σε κάποιο διάλυμα (ορό). Στην πρώτη περίπτωση, παρασκευάζεται πήκτωμα, στο οποίο ενσωματώνεται το αντίσωμα. Το υπό εξέταση διάλυμα του αντιγόνου τοποθετείται σε φρεάτιο που σχηματίζεται στο πήκτωμα. Έτσι, το αντιγόνο διαχέεται ακτινωτά γύρω από το φρεάτιο δημιουργώντας ομόκεντρους κύκλους βαθμιδωτής συγκέντρωσης. Στα σημεία που η συγκέντρωση του αντιγόνου θα βρεθεί σε σημείο ισορροπίας με την εντός του πηκτώματος σταθερή συγκέντρωση του αντισώματος, σχηματίζεται δακτύλιος καθίζησης, η διάμετρος του οποίου είναι ανάλογη της συγκέντρωσης του αντιγόνου στο διάλυμα. Η μέτρηση επιτυγχάνεται με τη σύγκριση της διαμέτρου του δακτυλίου με τις διαμέτρους των δακτυλίων προτύπων διαλυμάτων του αντιγόνου, που εξετάζονται παράλληλα. Για τη μέτρηση συγκέντρωσης αντισώματος, χρησιμοποιείται πήκτωμα, στο οποίο ενσωματώνεται το αντίστοιχο αντιγόνο.

Με διπλή ανοσοδιάχυση – GDD (Gradial ImmunoDiffution) - Μέθοδος Ouchterlony

Πρόκειται για ποιοτική μέθοδο με περιορισμένη ευαισθησία, που χρησιμοποιείται κυρίως για την αναγνώριση της ταυτότητας των αντιδράσεων αντιγόνων διαφόρων λοιμωδών παραγόντων με αντίσωμα γνωστής ειδικότητας. Αν σε δύο φρεάτια, δίπλα στο φρεάτιο του αντιορού, τοποθετηθούν διαλύματα δύο αντιγόνων, οι γραμμές ιζηματίνης που θα σχηματισθούν είναι ενδεικτικές της αντίδρασης του αντιορού με τους επιτόπους του ενός ή του άλλου ή κανενός από αυτά.

Με τη χρήση της ραδιοανοσοδοκιμασίας – τεχνική RIA (RadioImmunoAssay)

Η ραδιοαονοσοδοκιμασία είναι μία από τα χαρακτηριστικά παραδείγματα τεχνικής ραδιοανίχνευσης χρησιμοποιώντας ένα ραδιοϊσότοπο. Ο ανταγωνισμός ενός αναλύτη με τον ραδιενεργά επεξεργασμένο ανταγωνιστή του για ένα περιορισμένο ποσό αντισώματος, είναι η βασική αρχή αυτής της τεχνικής. Η αύξηση της συγκέντρωσης του αναλύτη αναστέλλει τη σύνδεση του επεξεργασμένου με ραδιενέργεια αναλύτη στο αντίσωμα. Η συγκέντρωση του αγνώστου προκύπτει από τη σύγκριση της ανασταλτικής δράσης της σύνδεσης του ραδιενεργά επεξεργασμένου αναλύτη σε σχέση με εκείνο ενός γνωστού προτύπου (φθίνουσα καμπύλη). Εν συντομία, το αντιδραστήριο RIA περιέχει δοκιμαστικά σωληνάρια που έχουν επωαστεί με το αντίσωμα. Πρότυπα διαλύματα ή οροί προστίθεται (10-200μl όγκο) μαζί με τον ραδιενεργό ανιχνευτή. Το περιεχόμενο επωάζεται για 1- 5 ώρες και τα σωληνάρια εκκενώνονται με την απόχυση ή αναρρόφηση του περιεχομένου. Τα σωληνάρια πλένονται με το παρεχόμενο πλυστικό διάλυμα και μετριούνται σε ένα μετρητή γ-ακτινοβολίας. Οι κρούσεις που παράγονται από τα γνωστά πρότυπα διαλύματα που χρησιμοποιούνται στη δοκιμασία παράγουν μία καμπύλη δόσης-απάντησης και η άγνωστη συγκέντρωση στα δείγματα των ορών εξάγεται από τα δεδομένα της καμπύλης.