تحليل دورة الخلية

تحليل دورة  الخلية من خلال قياس محتوى الحمض النووي هي طريقة تستخدم التدفق الخلوي لتمييز الخلايا في المراحل المختلفة من دورة حياة الخلايا . قبل عملية التحليل ، يتم جعل الخلايا قابلة للنفاذ و يتم معالجتها بصبغة فلورية مضيئة والتي تقوم بصباغة الحمض النووي (دي ان ايه DNA )، ومن الامثلة على هذه الصبغات يوديد البوربيديوم ( بي آي PI) . كثافة الاضاءة في الخلايا المصبوغة تتناسب مع كمية الحمض النووي DNA التي تحتويه طرديا ،محتوى الحمض النووي في الخلية يحدد المرحلة اللتي تمر بها الخلية (G0 ,G1, S, G2, M). تنقسم المراحل السابقة إلى جزأين الأول يشمل (G0, G1, S) و الثاني يشمل (G2, M) و يتضاعف محتوى الحمض النووي(DNA)في مرحلة S..و يمثل محتوى الحمض النووي (DNA)غالبا على رسم بياني ليقدم معلومات من خلال الترددات التي رسمت لكل مرحلة من مراحل دورة الخلية .
بعض الترددات غير الطبيعية يمكن ان تظهر في حال حصل تلف للخلية مهما كان نوعه , مثلا التلف في الحمض النووي(DNA) يمكن ان يقاطع تقدم دورة الخلية عند مراحل معينة ,مثل هذا التهديد على تقدم دورة الخلية يمكن ان يؤدي اما إلى اصلاح الحمض النووي (DNA)او إلى موت الخلية , اصلاح الحمض النووي (DNA)يمكن ان يؤدي إلى تحول الخلية الطبيعية إلى خلية سرطانية , اما موت الخلية فيحصل غالبا من خلال ما يسمى بالاستماتة او موت الخلية المبرمج( طراز مورفولوجي لموت الخلايا المفردة المتميز بانكماش الخلية وتكثف الكروماتين وتشكل فقاعات هيولية ثم تتجزأ الخلية إلى شدف مرتبطة بالغشاء، ثم تبتلعها البلاعم حتى تختفي ).المشاكل التي تواجه الخلية في مراحل (G0 و G1)غالبا ما تكون بسبب قلة المواد  الغذائية (مثل الحرمان من الامصال ) . بدا التعبير عن (تحليل دورة حياة الخلية ) في عام 1969 في مختبرات لوس امالوس العلمية من قبل مجموعة من جامعة كاليفورنبا مستخدمين طريقة صبغة فيولجين ,أول ببروتوكول لاستخدام صبغة يوديد البوربيديوم في تحليل دورة الخلية كان عام 1975 من خلال اوتار كريشان من كلية هارفرد الطبية و ما زالت هذه الطريقة مستخدمة حتى وقتنا هذا .
تحليل دورة الخلية متعدد الوسائط يشمل , بالاضافة إلى قياس محتوى الحمض النووي ,خصائص اخرى متعلقة بدورة الخلية ,مثل القياس المتزامن لمحتوى الحمض النووي(DNA ) و الحمض الريبي النووي (RNA), او قياس قابلية الحمض النووي (DNA) للتحطم عند رقم هيدروجيني (PH)منخفض من خلال استخدام صبغة الاكريدين البرتقالية ,فتحدد  مكونات مرحلة (G1Q, G1A, G1B) و تجعل من الممكن التمييز بين الخلايا في مرحلتي Sو Mو الخلايا المنقسمة .الخلايا في مرحلة (G1Q) تكون خاملة و موجودة بشكل مؤقت في دورة الخلية ويمكن ملاحظتها ايضا في (G0) ,الخلايا في مرحلة G1A تكون في طور النمو ,اما في مرحلة G1B فتكون عبارة عن الخلايا تماما قبل دخولها مرحلة S و يكون نموها (سواء بكمية الحمض النووي الريبي RNA او البروتين او حجمها ) مشابه للخلايا التي تبدا عملية تضاعف الحمض النووي . يمكن اكتشاف مكونات مشابهة في دورة الخلية من خلال التحليل متعدد الوسائط الذي يشمل قياس التعبير الذي يحدثه السايكلين دي 1 (CYCLIN D1) و السايكلين اي (CYCLIN E) و السايكلين ايه(CYCLIN A) و السايكلين بي 1 (CYCLIN B1). القياس المتزامن لمكونات الحمض النووي و وجود المركب الاولي 5-بروميد-2-دي اوكسي يوريدين من خلال التدفق الخلوي يعتبر  طريقة مفيدة بشكل خاص و التي يتم استخدامها بشكل واسع مؤخرا في تحليل الخلية في المختبر او بالجسم الحي .مع ذلك تحليل وجود 5-ايثينيل-2-دي اوكسي ريودين اصبح الان الطريقة المفضلة لتحديد وجود الخلايا المضاعفة للحمض النووي في مرحلة S.

خطوات عملية تحليل دورة الخلية

في حالة تم الصببغ باستخدام صبغة غير هوشست33342  (Hoechst 33342) فيجب اولا جعل الغشاء البلازمي للخلايا قابل للنفاذ ويتم ذلك من خلال وضعها في محلول يحافظ على درجة الرقم الهيدروجيني و يحتوي على منظف مخفف مثل تريتون اكس 100 (TRITON-X100)او ان بي 40 (NP 40) ,او من خلال تثبيت الخلايا في الايثانول ,اغلب الصبغات باستثناء هوشست333422 (Hoechst 33342)غير قابلة  للنفاذ من خلال الغشاء البلازمي بالتالي تعتبر الخطوة السابقة ضرورية للنجاح الخطوة التي تليها , وهي صبغ الخلايا.
قبل او خلال عملية الصبغ يتم معالجة الخلية بمحطمات للحمض النووي الريبي (RNase) للتخلص منه لان الصبغات ستصبغه كما ستصبغ الحمض النووي و بالتالي ستؤثر على النتيجة , الا في حالة استخدام صبغة الاكريدين البرتقالية لانها ستعطي الحمض النووي الريبي (RNA) اضاءة حمراء و الحمض النووي (DNA) اضاءة خضراء ,و في حالة تم ازالة الحمض النووي الريبي (RNA) و تحطمت بعض اجزاء الحمض النووي (DNA) فانه سيصبغ الحمض النووي ثنائي الشريط (الغير محطم ) بصبغة مختلفة عن الحمض النووي احادي الشريط (المحطم ).و لان الخلايا تميل إلى الالتصاق ببعضها البعض يجب التخلص من الخلايا المتجمعة و استثناءها من عملية التحليل ,لان الخلايا من مرحلة G0 و G1  لهما نفس كمية الحمض النووي و التي ستكون مجتمعة مساوية لكمية الحمض النووي الموجودة في خلية من مرحلة S او M باتالي تعطي قراءة خاطئة .

اختبار نيوكليتي

اختبار نيوكليتي (Nicoletty Assay) ,والذي سمي باسم مخترعه الايطالي الفيزيائي الدو نيوكليتي (Ildo Nicoletty ),هو صورة معدلة عن عملية تحليل دورة حياة الخلية , والذي يقيس عدد الخلايا المستميتة (في عملية الموت المبرمج او الاستماتة ) و يتم ذلك من خلال قياس ما يسمى ب (خلايا G0/G1 الثانوية ) و التي تحتوي على كمية اقل من  الكروموسومات التي من المفترض تواجدها داخل الخلية في مرحلتي G0 و G1  ( يجب ان تكون الكروموسومات في هذه المراحل مضاعفة 2N), مثل هذه الخلايا يمكن ان تنتج من خلال تحطيم الحمض النووي (DNA) بواسطة محطمات الحمض النووي (DNase) خلال عملية الاستماتة بالتالي تكون نواة الخلية تحتوي على اقل من الكمية المفترض تواجدها من الكوروموسومات,مما سسيؤدي إلى حدوث قفزة في الرسم البياني الخاص بالخلايا المصبوغة المضيئة بالتالي يحدد عدد الخلايا المستميتة .تم تطوير هذه الطريقة من خلال نيكوليتي و مساعديه في كلية الطب بجامعة بيروجيا .من الجدير بالذكر ان الجزيئات التي يتم قياسها من ضمن القفزة التي سبق ذكرها و التي تحتوي على اقل من 5% من كمية الحمض النووي المفروض تواجدها في خلايا G1 و G0  الثانوية تعتبر اجسام مسستميتة و ليست خلايا مستميتة .