تسلسل الحمض النووي الرايبوزي

يستخدم RNA-Seq ، الذي يُطلق عليه أيضًا التسلسل الكامل للبندقية المنقولة  
للكشف عن وجود الحمض النووي الريبي وايضا عن كمية هاذ الحمض في عينه معينه بوقت محدد يستخدم NGS   
تستخدم سلسلة RNA لتحليل النسخ التي ناخذها من الخلايا ويسهل العمل في مجالات كثيره مثل القدره على النظر إلى الجينات واجراء عمليات تعديل بعد حدوث نسخ وايضا يستخدم في عمليات التعبير الجيني وحالات حدوث الطفرات 
 بالإضافة إلى نصوص mRNA ،نسخدم سلسلة  RNA في المجالات التي نستخدم فيها RNA بشكل كامل او جزء منه وايضا يستخدم في تحديد مناطق ال entron , exon   
بداية  RNA-Seq ، أجريت دراسات التعبير الجيني  على التهجين باستخدام array صغيره بحجم المايكرو. 
صاحب ذلك مجموعة مشكلات مثل ان التهجين متشابك وكميه الجينات قد تكون منخفضة التعبير الجيني او عالية التعبير تم استخدام نموذج sanger للتعبير الجيني للتقليل من المشكلات واخيرا التكنولوجيا الحديثه استخدمت cDNA

RNA صغير / تسلسل RNA غير مشفر

عندما نستخدم RNA  بدلا من mRNA  يجب اجراء تعديلات ويتم استخدام RNA  حسب الحجم المطلوب بعدها يتم العزل باستخدام هلام من خلال حبات مغناطيسيه او يتم العزل باستخدام مجموعه متطوره الكترونيا تجاريا  
بمجرد عزلها ، تتم إضافة الروابط إلى النهاية 3 'و 5' ثم تنقيتها. والخطوة الأخيرة هي الجيل [cDNA] من خلال النسخ العكسي.

تسلسل الحمض النووي الريبي المباشر

لأن تحويل RNA إلىcDNA] ، ربط، والتضخيم وغيرها قد تتداخل في الخصائص وعمليات النسخ   وقد تم اكتشاف واحد جزيء تسلسل الحمض النووي الريبي المباشر من قبل الشركات بما في ذلك Helicos (المفلسة) ، أوكسفورد نانوبور تكنولوجيز ،  وغيرها. هذه التكنولوجيا تعطي تسلسل جزيئات الحمض النووي الريبي مباشرة بطريقة موازية على نطاق واسع.

تسلسل RNA أحادي الخلية (scRNA-Seq)

هناك الطرق القياسية مثل المصفوفات الصغيره (مايكرو اري )وتحليل المعيار RNA-Seq اهميتهاتحلل تعبير RNAs من مجموعات كبيرة من الخلايا. 
في مجموعات الخلايا المختلطة ، قد تحجب هذه القياسات الاختلافات الحرجة بين الخلايا الفردية داخل هذه المجموعات.   
يوفر تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية (scRNA-Seq) 
يوفر تعريف للخلايا مع انه لا يمكن الحصول على معلومات كافيه من خلاله عن RNA  داخل الخليه نستخدم احيانا تعبيرات جينيه للكشف عن انواع خلايا لم يسبق وان شاهدناها من قبل مثال ذلك خلايا متخصصه في الرئه تعبر عن منظم توصيل غشاء التليف الكيسي على مجرى الرئه

الإجراءات التجريبية

تتضمن بروتوكولات scRNA-Seq الحالية الخطوات التالية:  
عزل خلية واحدة و RNA ، النسخ العكسي (RT) ، والتضخيم ، وتوليد المكتبة ، والتسلسل. طرق مبكرة فصل الخلايا الفردية إلى آبار منفصلة. طرق أكثر حداثة تغلف الخلايا الفردية في قطرات في جهاز ميكروفلويديك ، حيث يحدث رد فعل النسخ العكسي ، وتحويل الحمض النووي الريبي إلى [cDNA. كل قطرة تحمل "الباركود" DNA الذي يسمي بشكل فريد [cDNA] المستمدة من خلية واحدة. بمجرد اكتمال النسخ العكسي ، يمكن خلط [cDNA] من العديد من الخلايا معًا للتسلسل ؛ يتم التعرف على النصوص من خلية معينة عن طريق الباركود الفريد.   
تشمل تحديات scRNA-Seq الحفاظ على الوفرة النسبية الأولية للـ mRNA في الخلية وتحديد النصوص النادرة.  تعتبر خطوة النسخ العكسي أمرًا بالغ الأهمية نظرًا لأن كفاءة رد فعل RT تحدد مقدار تحليل الحمض النووي الريبي للخلية الذي سيتم تحليله في نهاية الأمر بواسطة المنظم. قد تؤثر قابلية نسخ النصوص العكسية واستراتيجيات التحضير المستخدمة على إنتاج [cDNA] كامل الطول وتوليد مكتبات منحازة نحو نهاية 3 أو 5 من الجينات. 
في خطوة التضخيم  
عاده ما يتم استخدام  PCR  (IVT) لتضخيم [cDNA].وهذه تستخدم في النسخ المخبريه  تكمن اهميتها   PCR هي القدرة على توليد [cDNA] كامل الطول. ومع ذلك ، قد يتم تضخيم كفاءة PCR مختلفة على تسلسلات معينة  مما ينتج مكتبات ذات تغطية غير متساوية. من ناحية أخرى ، في حين أن المكتبات التي تم إنشاؤها بواسطة IVT يمكنها تجنب تحيز التسلسل الناتج عن PCR ، فقد يتم نسخ تسلسلات محددة بطريقة غير فعالة ، وبالتالي تسبب في ترك تسلسل متسلسل أو توليد تسلسلات غير مكتملة.   تم نشر العديد من بروتوكولات scRNA-Seq: . ،  STRT ،  SMART-seq ،  CEL-seq ،  RAGE-seq ،  ، الكوارتز وما يليها.  و C1-CAGE.  تختلف هذه البروتوكولات من حيث استراتيجيات النسخ العكسي ، وتوليف [cDNA] والتضخيم ، وإمكانية استيعاب الباركود الخاصة بالتسلسل (أي UMIs ) أو القدرة على معالجة العينات المجمعة.  
في عام 2017 ، تم ايجاد طريقتين لقياس  mRNAوحيد الخلية والتعبير البروتين من خلال الأجسام المضادة المسمى قليل النوكليوتيد المعروف باسم REAP-seq ، و CITE-seq.

تطبيقات

أصبح scRNA-Seq يستخدم على نطاق واسع عبر التخصصات البيولوجية بما في ذلك التنمية ، وعلم الاعصاب وعلم الاورام  مرض المناعة  والامراض المعديه التي تنقل وما يخص المناعه .  
قدمت scRNA-Seq نظرة ثاقبة كبيرة في تطور الأجنة والكائنات الحية ، بما في ذلك الدودة Caenorhabditis elegans ،  والمستوصف الشمسي التجديدي المتوسطي . 
 تم استخدام وتعيين حيوان الزرد وتمت دراسة الجينات على مراحل مختلفه كي يتم رسم مراحل التطور في الخليه بشكل واضح

الكميات المطلقه

الكميات المطلقه  للتعبير الجيني غير ممكن في معظم تجارب RNA-Seq ، والتي تقيس التعبير بالنسبة لجميع النصوص. من الممكن عن طريق إجراء RNA-Seq مع spike-ins ، عينات من RNA بتركيزات معروفة. بعد التسلسل ، تُستخدم تعدادات القراءة للتسلسلات الإضافية لتحديد العلاقة بين تعدادات القراءة لكل جين والكميات المطلقة من الأجزاء البيولوجية.   في أحد الأمثلة ، تم استخدام هذه التقنية في أجنة Xenopus المدارية لتحديد حركية النسخ.

شبكات التعايش

شبكات Coexpression هي تمثيلات مستمدة من البيانات من الجينات تتصرف بطريقة مماثلة عبر الأنسجة والظروف التجريبية.  يكمن هدفها الرئيسي في توليد الفرضيات وأساليب  لاستنتاج وظائف الجينات غير المعروفة سابقًا.  تم استخدام بيانات RNA-Seq لاستنتاج الجينات المشاركة في مسارات محددة تعتمد على ارتباط بيرسون ، سواء في النباتات  والثدييات.  الميزة الرئيسية لبيانات RNA-Seq في هذا النوع من التحليل على تغطية النص بأكمله ، مما يتيح إمكانية كشف تمثيلات أكثر اكتمالا لشبكات تنظيم الجينات. يمكن الكشف عن التنظيم التفريقي لعناصر الشكل العظميةنفسها واستخدامها للتنبؤ ووظائفها البيولوجية.   تم بنجاح استخدام تحليل شبكة المشاركة في التعبير الجيني الموزون لتحديد وحدات التعبير المشترك والجينات الوراثية داخل العضل استنادًا إلى بيانات RNA seq. قد تتوافق وحدات التعبير المشترك مع أنواع الخلايا أو المسارات. يمكن تفسير لوحات الوصل الفائقة المتصلة ببعضها البعض كممثلين لوحدة كل منها. إن eigengene هو عبارة عن مجموع مرجح للتعبير عن جميع الجينات في وحدة نمطية. Eigengenes هي علامات حيوية مفيدة (ميزات) للتشخيص والتشخيص.  تم اقتراح مناهج تحويل التباين المستقر لتقدير معاملات الارتباط بناءً على بيانات RNA seq.

اكتشاف البديل

RNA-Seq تباين الحمض النووي يتضمن ، بما في ذلك متغيرات النوكليوتيدات الفردية والإدخالات / الحذف الصغيرة . والتباين الهيكلي . يشبه الاتصال المتغير في RNA-Seq استدعاء متغير الحمض النووي ، وغالبًا ما يستخدم نفس الأدوات (بما في ذلك SAMtools mpileup  و GATK HaplotypeCaller  ) مع تعديلات لحساب الربط. أحد الأبعاد الفريدة لمتغيرات الحمض النووي الريبي هو التعبير الخاص بالأليل (ASE) : قد يتم التعبير عن التفضيلات من النمط الفرداني واحد بشكل تفضيلي بسبب التأثيرات التنظيمية بما في ذلك التوضيح والتعبير في موضع السمات الكمية والتغيرات النادرة غير المشفرة.   قيود تحديد هوية الحمض النووي الريبي (RNA) المتغير أنه يعبر فقط عن المناطق المعبر عنها (عند البشر ، <5٪ من الجينوم) وله جودة أقل بالمقارنة مع تسلسل الحمض النووي المباشر.

تحرير الحمض النووي الريبي (التعديلات بعد النسخ)

يمكن أن يساعد وجود تسلسلات مطابقة للجينوم والنسخ للفرد في الكشف عن التعديلات بعد النسخ ( تحرير RNA ).  يتم تحديد حدث تعديل ما بعد النسخ إذا كان نص الجين يحتوي على أليل / متغير لم يلاحظ في البيانات الجينية.

كشف الجينات الانصهار

بسبب التعديلات الهيكلية المختلفة في الجينوم ، اكتسبت جينات الاندماج الانتباه بسبب علاقتها بالسرطان.  إن قدرة RNA-Seq على تحليل النص الكامل للعينة بطريقة غير متحيزة تجعلها أداة جذابة للعثور على هذه الأنواع من الأحداث الشائعة في السرطان.  
وتأتي الفكرة من عملية محاذاة القراءات النصية القصيرة إلى الجينوم المرجعي. ستندرج معظم القراءات القصيرة ضمن إكسون واحد كامل ، ومن المتوقع أن تحدد مجموعة أصغر ولكن لا تزال كبيرة على تقاطعات إكسون المعروفة. وبعد ذلك سيتم تحليل القراءات القصيرة المتبقية غير المعينة لتحديد ما إذا كانت تتطابق مع تقاطع إكسون حيث يأتي الإكسون من جينات مختلفة. قد يكون هذا دليلًا على حدوث اندماج محتمل ، ولكن نظرًا لطول القراءات ، فقد يكون هذا صاخبة للغاية. هناك طريقة بديلة تتمثل في استخدام قراءات نهاية الزوج ، عندما يقوم عدد كبير يحتمل من القراءات المقترنة بتعيين كل طرف إلى إكسون مختلف ، مما يوفر تغطية أفضل لهذه الأحداث (انظر الشكل). ومع ذلك ، فإن النتيجة النهائية تتكون من مجموعات متعددة وربما جديدة من الجينات توفر نقطة انطلاق مثالية لمزيد من التحقق من الصحة.

التاريخ

تم تطوير RNA-Seq لأول مرة في منتصف عام 2000 مع ظهور تقنية التسلسل من الجيل التالي.  تتضمن المخطوطات الأولى التي استخدمت RNA-Seq حتى دون استخدام المصطلح تلك الخاصة بخطوط خلايا سرطان البروستاتا  (بتاريخ 2006) ، Medicago truncatula  (2006) ، الذرة  (2007) ، و Arabidopsis thaliana  (2007) ، في حين أن مصطلح "RNA-Seq" نفسه تم ذكره لأول مرة في عام 2008.  يزداد عدد المخطوطات التي تشير إلى RNA-Seq في العنوان أو الملخص (الشكل ، الخط الأزرق) بشكل مستمر مع 6754 مخطوطة نُشرت في عام 2018 ( رابط للبحث في النشرات الطبية PubMed ). تقاطع RNA-Seq والدواء (الشكل ، الخط الذهبي ، رابط البحث في النشرات الطبية PubMed ) له مرونة مماثلة.

تطبيقات على الطب

RNA-Seq لديه القدرة على تحديد البيولوجيا المرضية الجديدة ، المؤشرات الحيوية الشخصية للمؤشرات السريرية ، استنتاج مسارات قابلة للتخدير ، وجعل التشخيص الوراثي. يمكن تخصيص هذه النتائج بشكل أكبر للمجموعات الفرعية أو حتى للمرضى الأفراد ، مما قد يؤدي إلى تسليط الضوء على مزيد من الوقاية الفعالة والتشخيص والعلاج. تملي جدوى هذا النهج جزئياً التكاليف في المال والوقت ؛ أحد القيود ذات الصلة هو فريق المتخصصين المطلوب (خبراء المعلومات الحيوية والأطباء / الأطباء والباحثون الأساسيون والفنيون) لتفسير كامل الكم الهائل من البيانات الناتجة عن هذا التحليل.