تحليل الحمض النووي على نطاق واسع

و التسلسل المتوازي على نطاق واسع هو أي من عدة طرق عالية الإنتاجية لتسلسل الحمض النووي باستخدام مفهوم المعالجة المتوازية على نطاق واسع ؛ ويسمى أيضًا تسلسل الجيل التالي  أو تسلسل الجيل الثاني . ظهرت بعض هذه التقنيات في الفترة 1994-1998      وأصبحت متاحة تجاريًا منذ عام 2005. تستخدم هذه التقنيات منصات مصغرة ومتوازنة لتسلسل ما بين مليون إلى 43 مليار قراءة قصيرة (50-400 قاعدة لكل منها) لكل مرة في تحليلها. 
تختلف العديد من منصات التسلسل المتوازي في التكوينات الهندسية والكيمياء التسلسلية. يتشاركون في النموذج التقني للتسلسل المتوازي الهائل عبر قوالب الحمض النووي المنفصلة مكانيا والمضخمة كلونيًا أو جزيئات الحمض النووي الفردية في خلية التدفق . يختلف هذا التصميم تمامًا عن تصميم تسلسل سانقر - المعروف أيضًا باسم التسلسل الشعري أو تسلسل الجيل الأول - الذي يعتمد على الفصل الكهربي لمنتجات نهايات السلسلة المنتجة في تفاعلات التسلسل الفردية.

طرق إعداد قالب للتسلسل

يتم استخدام طريقتين في إعداد القوالب لتفاعلات التسلسل: القوالب المتضخمة التي تنشأ من جزيئات الحمض النووي الأحادي ، وقوالب جزيء الحمض النووي المنفردة. لأنظمة التصوير التي لا يمكن الكشف عن أحداث مضان واحد ، يلزم تضخيم قوالب الحمض النووي. طرق التضخيم الثلاثة الأكثر شيوعًا هي مستحلب   ودائرة التدوير وتضخيم الطور الصلب. يمكن أن يكون التوزيع النهائي للقوالب عشوائيًا أو مكانيًا على الشبكة.

مستحلب تفاعل البوليمرز المتسلسل

في طرق تفاعل البوليمرز المتسلسل المستحلب ، يتم إنشاء مكتبة الحمض النووي لأول مرة من خلال تجزئة عشوائية من الحمض النووي الجيني. يتم ربط شظايا الحمض النووي المفرد التي تقطعت بهم السبل (قوالب) على سطح الخرز مع محولات أو روابط ، ويتم ربط حبة واحدة بشظية واحدة من الحمض النووي من مكتبة الحمض النووي. يحتوي سطح الخرزات على مجسّات قليلة النكليوتيد بتسلسلات تكمل المحولات التي تربط شظايا الدنا. ثم يتم تقسيم الخرزات إلى قطرات مستحلب زيت الماء. في مستحلب الماء المائي المائي ، كل قطرة تلتقط حبة واحدة هي مصغر دقيق PCR ينتج نسخًا مضخمة من قالب الحمض النووي المفرد.

جيل مستعمرة الحمض النووي (تضخيم الجسر)

يتم ربط الإشعال الأمامي والخلفي بشكل تساهمي بكثافة عالية إلى الشريحة في خلية التدفق. تحدد نسبة الاشعال إلى القالب الموجود على الدعم الكثافة السطحية للمجموعات المضخمة. يتعرض خلية تدفق إلى الكاشف ل البلمرة تمديد المستندة،. يؤدي تمسخ وتوسع المجرى المتكرر إلى تضخيم شظايا الحمض النووي في ملايين المواقع المنفصلة عبر سطح خلية التدفق. ينتج تضخيم الطور الصلب مجموعات من القوالب مفصولة مكانيا بما يتراوح بين 100 و 200 مليون ، مما يوفر نهايات حرة يتم بعدها تهجين أولي تسلسل عالمي لبدء التفاعل المتسلسل.   تم تقديم هذه التقنية للحصول على براءة اختراع في عام 1997 من معهد الأبحاث الطبية الحيوية (GBRI) التابع لـ غلاكسو-ويلكم ، من قبل باسكال ماير وإريك كاواشيما ولوران فارينيلي ،   وتم تقديمها للجمهور للمرة الأولى في عام 1998.  في عام 1994 ، قدم آدمز وكرون براءة اختراع على طريقة تضخيم سطحية متشابهة ، ولكن غير مستنسخة ، تسمى "تضخيم الجسر"  تكييفها لتضخيم نسيلي في عام 1997 من قبل الكنيسة وميترا.

قوالب جزيء واحد

غالبًا ما تكون البروتوكولات التي تتطلب تضخيم الحمض النووي مرهقة في التنفيذ وقد تؤدي إلى حدوث أخطاء في التسلسل. يعد تحضير قوالب الجزيء المفرد أكثر وضوحًا ولا يتطلب PCR ، والذي يمكن أن يؤدي إلى حدوث أخطاء في القوالب المتضخمة. غالبًا ما تظهر متواليات الهدف الغني بـ AT والـ GC الغنية تحيز التضخيم ، مما يؤدي إلى نقص تمثيلها في محاذاة الجينوم والتجمعات. عادة ما يتم تجميد قوالب الجزيء المنفردة على دعامات صلبة باستخدام واحد من ثلاثة طرق مختلفة على الأقل. في النهج الأول ، ترتبط جزيئات التمهيدي الفردية الموزعة مكانيا بالدعم القوي. يتم بعد ذلك تهجين القالب ، الذي يتم تحضيره عن طريق تجزئة المادة البادئة عشوائياً إلى أحجام صغيرة (على سبيل المثال ، حوالي 200-250 قاعدة) وإضافة محولات شائعة إلى نهايات الأجزاء ، إلى البادئة المثبتة. في النهج الثاني ، ترتبط قوالب الجزيء المنفردة الموزعة مكانياً بالدعم الصلب عن طريق تمهيد وتمديد قوالب الجزيئات المنفردة التي تقطعت بها السبل من الاشعاعات الثابتة. ثم يتم تهجين التمهيدي المشترك إلى القالب. في النهج الثالث ، يتم ربط جزيئات بوليميريز أحادية الموزعة مكانياً بالدعم الصلب ، الذي يرتبط به جزيء قالب معبأ. يتم استخدام هذا النهج من قبل العلوم البيولوجية في المحيط الهادئ. يمكن استخدام جزيئات الحمض النووي الأكبر حجمًا (حتى عشرات الآلاف من أزواج القاعدة) مع هذه التقنية ، وخلافا للطريقتين الأوليين ، يمكن استخدام الطريقة الثالثة بطرق في الوقت الفعلي ، مما ينتج عنه طول قراءة محتمل.

سلسلة البايرو

في عام 1996 ، نشر Pål Nyrén وطالبه مصطفى روناغي في المعهد الملكي للتكنولوجيا في ستوكهولم طريقتهما في التتابع . تلألؤ بيولوجي تقيس إطلاق البيروفوسفات غير العضوي عن طريق تحويله نسبيًا إلى ضوء مرئي باستخدام سلسلة من التفاعلات الأنزيمية. على عكس مناهج التسلسل الأخرى التي تستخدم النيوكليوتيدات المعدلة لإنهاء تخليق الحمض النووي. يتم تسجيل ترتيب وشدة قمم الضوء على شكل برامج تدفق ، والتي تكشف عن تسلسل الحمض النووي الأساسي.

التسلسل بواسطة الكيمياء المنهي عكسها

يستخدم هذا النهج دي ان تي بي سي عكسها المنهي المنهي في طريقة دوري الذي يضم دمج النوكليوتيدات ، التصوير مضان والانقسام. يتم تصوير فاصل ذو علامة فلورسنتية حيث يتم إضافة كل  دي ان تي بي سي ثم يتم فكه للسماح بدمج القاعدة التالية. يتم حظر هذه النيوكليوتيدات كيميائياً بحيث يكون كل دمج حدثًا فريدًا. تتبع خطوة التصوير كل خطوة من خطوات التأسيس الأساسي ، ثم تتم إزالة المجموعة المحظورة كيميائيًا لإعداد كل حبلا للإدخال التالي بواسطة بوليميريز الحمض النووي. تستمر هذه السلسلة من الخطوات لعدد محدد من الدورات ، كما هو محدد بواسطة إعدادات الأداة المعرفة من قبل المستخدم. تم تصميم مجموعات الحجب 3 في الأصل إما على أنها إنزيمية  أو انعكاس كيميائي   وكانت الطريقة الكيميائية هي أساس آلات Solexa و Illumina. يمكن أن تكون التسلسل بواسطة كيمياء فاصل عكسية عبارة عن دورة بأربعة ألوان مثل المستخدمة بواسطة Illumina / Solexa ، أو دورة أحادية اللون مثل المستخدمة بواسطة Helicos BioSciences. تستخدم هيوكس بايوساينس "أجهزة إنهاء افتراضية" ، وهي عبارة عن أجهزة فصل غير مؤمَّنة مع نظير ثاني أكسيد النيوكليوزيد يعمل كمثبط. هذه الأطراف لديها التعديلات المناسبة لإنهاء أو تثبيط المجموعات بحيث يتم إنهاء تخليق الحمض النووي بعد إضافة قاعدة واحدة.

التسلسل بواسطة ربط بوساطة الانزيمات

في هذا النهج ، لا يتم تنفيذ تفاعل تمديد التسلسل بواسطة بوليميرازات ، ولكن عن طريق ligase الحمض النووي وإما تحقيقات مشفرة بقاعدة واحدة أو تحقيقات ثنائية القاعدة. في أبسط أشكاله ، يختلط مسبار ذي علامات الفلورسنت بتسلسله التكميلي المجاور للقالب المجهز. ثم يتم إضافة لايقيز الحمض النووي للانضمام إلى التحقيق المسمى صبغ إلى التمهيدي. يتم غسل المجسات غير المربوطة ، متبوعة بتصوير مضان لتحديد هوية مسبار الترابط. يمكن تكرار الدورة إما باستخدام تحقيقات قابلة للتجزئة لإزالة صبغة الفلورسنت وتجديد مجموعة بي او فور فايف لدورات ربط لاحقة (ربط بالسلاسل   ) أو عن طريق إزالة وتهجين بادئة جديدة للقالب (غير مقيدة ربط   ).

النيوكليوتيدات الفلورية الفوسفورية أو التسلسل في الوقت الحقيقي

تقود العلوم البيولوجية في المحيط الهادئ هذه الطريقة حاليًا. طريقة في الوقت الحقيقي التسلسل ينطوي تصوير التأسيس المستمر من النيوكليوتيدات المسمى صبغ خلال توليف الحمض النووي: هي التي تعلق الجزيئات البلمرة للحمض النووي واحدة في السطح السفلي للكشف عن الفردية الصفر وضع الدليل الموجي (كشف زد ام دبليو) التي يمكن الحصول على معلومات تسلسل بينما فوسفو لينك النيوكليوتيدات يتم دمجها في حبلا التمهيدي المتزايد. تستخدم العلوم البيولوجية في المحيط الهادئ بوليميريز الحمض النووي فريد من نوعه والذي يدمج بشكل أفضل النيوكليوتيدات المرتبطة بالفسفول ويمكّن من إعادة تشكيل القوالب الدائرية المغلقة. بينما تبلغ دقة القراءة الفردية 87٪ ، تم إثبات دقة الإجماع عند 99.999٪ بأطوال قراءة متعددة الكيلوبايت.   في عام 2015 ، أصدرت باسيفيك بايو ساينس أداة تسلسل جديدة   يزيد السعة بنحو 6.5 أضعاف.