Enzim kinetiği

Enzim kinetiği enzimler tarafından katalizlenen kimyasal reaksiyonların bilimidir. Enzim kinetiğinde reaksiyon hızı ölçülür ve reaksiyon şartlarını değiştirmenin etkisi araştırılır. Bir enzimin kinetiğinin bu şekilde çalışılması enzimin katalitik mekanizmasını, metabolizmadaki rolünü, aktivitesinin nasıl kontrol edildiğini ve bir ilaç veya zehrin enzimi nasıl inhibe edebileceğini ortaya koyabilir. Enzimler genelde diğer molekülleri (enzimin substratları) manipüle eden protein molekülleridir. Bu hedef moleküller enzimin aktif bölgesine bağlanır ve, enzim mekanizması denen bir seri adımlar sonucunda, ürünlere dönüşür. Bu mekanizmalar tek substratlı ve çok substratlı mekanizmalar olarak ayrılabilir. Tek bir substrata bağlanan enzimler (triozfosfat izomeraz gibi) üzerinde yapılan kinetik çalışmalar, enzimin substratına bağlanma afinitesini (ilgisini) ve devir hızını ölçmeyi amaçlar. Enzimler birden çok substrata bağlanınca, (sağda gösterilen) dihidrofolat redüktaz gibi, enzim kinetiği bu substratların bağlanma sırasını ve ürünlerin salınma sırasını gösterebilir. Bir tek substrata bağlanıp birden çok ürün salan enzimlere örnek, proteazlardır, bunlar bir protein substratı kesip iki polipeptit ürün oluştururlar. Başka enzimler iki substratı birleştirir, öreneğin DNA polimeraz'ın DNA'ya bir nükleotit eklemesi gibi. Bu mekanizmalar genelde karmaşık bir adımlar dizisi olsa da, tipik olarak bir hız belirleyici basamak, tüm reaksiyonun hızını belirler. Bu hız belirleyici basamak kimyasal bir reaksiyon veya, enzim veya substratlarında konformasyonel bir değişim olabilir, ürünlerin enzimden salınması sırasında görüldüğü gibi. Enzimin yapısının bilinmesi kinetik verilerin yorumlanmasında faydalıdır. Örneğin, yapının bilinmesi sayesinde substrat ve ürünlerin kataliz sırasında nasıl bağlandıkları, reaksiyon sırasından hangi değişikliklerin meydana geldiği, ve hatta mekanizmadaki belli amino asit kalıntılarınını rolleri tahmin edilebilir. Bazı enzimler mekanizma sırasında önemli derecede biçimlerini değiştirirler; böylesi durumlarda enzimin tek başına yapısının ve enzimatik reaksiyona girmeyen substrat analogları ona bağlı ikenki yapısının belirlenmesi yararlı olur. Tüm biyolojik katalizörler protein değildir; ribozim ve ribozom gibi RNA-temelli katalizörler pek çok hücresel işlev için esastırlar, örneğin RNA uçbirleştirmesi (splicing) ve çeviri (translasyon) gibi. Ribozimler ve enzimler arasındaki temel fark, RNA katalizörlerin nükleotitlerden, enzimlerin ise amino asitlerden oluşmasıdır. Ribozimler daha sınırlı bir reaksiyonlar grubunu katalizler, ama reaksiyon mekanizmaları ve kinetikleri protein enzimleri ile aynı yöntemlerle analiz edilebilir ve sınıflandırılabilir. == Genel ilkeler == küçükresim|300px|sağ|Substrat konsantrasyonu arttıkça reaksiyon hızı da artar ama yüksek substrat konsantrasyonunda doyuma ulaşır. Bir enzim tarafından katalizlenen reaksiyon, katalizlenmeyen reaksiyon ile aynı denge özelliklerine sahiptir. Diğer katalizörler gibi, enzimler substrat ve ürünler arasındaki dengenin konumunu değiştirmezler. Ancak, katalizlenmeyen bir kimyasal reaksiyondan farklı olarak, enzimle katalizlenen reaksiyonlar doyum kinetiği gösterirler. Belli bir enzim konsantrasyonu ve nispeten düşük substrat konsantrasyonu için, reaksiyon hızı substrat konsantrasyonu ile doğrusal orantılı olarak artar; enzim moleküllerinin çoğu, reaksiyonu katalizlemek için müsaittir ve substrat konsantrasyonun artırılması, enzim ve substrat moleküllerinin birbirine rastlama hızının artması demektir. Ancak, nispeten yüksek substrat konsantrasyonlarıda, reasiyon hızı asimptotik şekilde teorik maksimuma yaklaşır; enzim aktif bölgelerinin hemen hepsi doludur ve reaksiyon hızını, enzimin kendine has (içsel) devir hızı belirler. Bu iki sınır durumun ortasındaki substrat konsantrasyonu KM olarak belirtilir. Bir diğer deyişle, en yüksek reaksiyon hızının (Vmax) yarısının elde edildiği substrat konsantrasyonu KM olarak tanımlanır. Bir enzimin en önemli iki kinetik özelliği, enzimin belli bir substrat ile ne kadar çabuk doyuma ulaştığı ve ulaşabildiği en hızlı reaksiyon hızıdır. Bu özelliklerin bilinmesi bir enzimin hücre içinde ne yaptığını ve o şartlardaki değişiklere nasıl tepki verdiği hakkında fikir verir. == Enzim ölçümleri == Enzim ölçümleri enzim reakasiyonunun hızını ölçen laboratuvar yöntemleridir. Enzimler katalizledikleri reaksiyonlar tarafından tüketilmediği için, enzim ölçümlerinde reaksiyon hızını takip etmek için genelde ya substrat konsantrasyonu ya da ürün konsantrasyonu izlenir. Ölçüm için pek çok yöntem vardır. Spektrofotometrik ölçümlerde substrat ve ürünlerdeki ışık absorbansındaki değişim gözlemlenir; radyometrik ölçümlerde radyoaktivitenin bir ürüne dahil oluşu veya substrattan ayrılmasına bakarak zamana göre ürün oluşumunu ölçülür. Spektrofotometrik ölçümler en kullanışlıdır, çünkü reaksiyon hızının sürekli olarak ölçülmesi mümkündür. Radyometrik ölçümler numunelerin alınıp onların ölçümünü gerektirse de (yani kesintili ölçümlerdir) genelde daha duyarlıdırlar ve çok düşük enzim aktivite düzeyleri ölçülebilir. Benzer bir yaklaşım, kütle spektrometresi kullanarak, ürüne stabil bir izotopun enkorpore olmasının veya substrattan salınmasının izlenmesidir. En duyarlı enzim ölçümleri bir mikroskop içinden odaklanmış bir lazer kullanarak reaksiyonunu katalizleyen tek bir enzim molekülünü gözlemler.Bu ölçümler enzimin reaksiyon mekanizması sırasında kofaktörlerin floresansındaki değişimi, veya protein üzerinde belli konumlara bağlanmış floresan boyalardaki değişimi ölçer, kataliz sırasındaki hareketleri izlemek için. Milyonlarca enzim molekülünün ortalama davranışını gözlemleyen geleneksel enzim kinetiğine karşın, bu tür çalışmalar tekil enzimlerin kinetiği ve dinamiği hakkında yeni bir bakış açısı sağlar. Bir enzim ölçümü için bir ilerleme eğrisi örneği yukarıda gösterilmiştir. Enzim, reaksiyonun başlamasında sonra kısa bir süre için doğrusal şekilde ürün meydana getirir. Reaksiyon ilerledikçe ve substrat tüketildikçe, hızı gittikçe azalır (substrat doyum seviyesinde olmadıkça). İlk (ve en yüksek) hızı ölçmek için, enzim ölçümleri tipik olarak substratın sadece yüzde birkaçı tüketilene kadar yapılır. Bu ilk hız döneminin uzunluğu ölçüm şartlarına bağlıdır ve milisaniyeleden saatlere kadar değişebilir. Ancak, sıvıların çok hızlı karşmasını sağlayan araçlar, bir sanıyeden kısa sürelerde ilk hızların ölçülebilmesini olanak verir. Aşağıda anlatıldığı üzere, bu çok hızlı ölçümler, sabit durum öncesi (pre-steady state) kinetiğinin ölçülmesi için şarttır. Çoğu enzim kinetik çalışmaları enzim reaksiyonlarının bu ilk, yaklaşık doğrusal, kısmı üzerine yoğunlaşır. Ancak, tüm reaksiyonu ölçüp bu verileri doğrusal olmayan bir hız denklemine uydurmak da mümkündür. Enzim reaksiyonlarının bu şekilde ölçülmesi, ilerleme eğrisi analizi (İng. progress-curve analysis) olarak adlandırılır. Eğer ilk hız, hızlı kinetik ile doğru ölçülemeyecek kadar yüksek ise, bu yaklaşım yararlı bir alternatiftir. == Tek substrat reaksiyonları == Tek substrat mekanizmalı enzimlere örnek olarak, izomerazlar (triozfosfat izomeraz veya bisfosfogliserat mutaz gibi), adenilat siklaz gibi hücre içi liyazlar, ve bir RNA liyaz olan çekiçbaşı ribozimi sayılabilir. Ancak, tek bir substratı olan bazı enzimler bu mekanizma kategorisi içine girmezler. Bunun bir örneği olan katalaz, substratı olan hidrojen peroksit ile reaksiyona girince yükseltgenir (okside olur) ve sonra ikinci bir substrat molekülü tarafından indirgenir. Substrat tek olsa da, modifiye olmuş bir enzim ara ürününün varlığı, katalaz mekanizmasının aslında bir pinpon (masa tenisi) mekanizması olduğunu gösterir. Bu mekanizma tipi aşağıda Çok substratlı reaksiyonlar bölümü altında açıklanmıştır. === Michaelis-Menten kinetiği === küçükresim|300px|Substrat konsantrasyonu ile hız arasındaki ilişkiyi gösteren bir enzim doyum eğrisi. küçükresim|300px|sağ|Bir enzim reaksiyonu için tek sustrat mekanizması. k1, k-1 ve k2 ayrı basamakların hız sabitleridir. Enzimle katalizlenmiş reaksiyonlar doyumlu olduğu için, kataliz hızları artan substrata doğrusal bir tepki göstermez. Eğer ilk reaksiyon hızı çeşitli substrat konsantrasyonları ([S] ile gösterilir) için ölçülürse, reaksiyon hızı (v) [S] arttıkça artar, sağda gösterildiği gibi. Ancak, [S] yükseldikçe, enzim doygunlaşır (satüre olur) ve hız, enzimin en büyük hızı olan Vmax'a ulaşır. Tek substratlı reaksiyon için Michaelis-Menten kinetik modeli sağda gösterilmiştir. Enzim E ve substratı S arasında önce bir iki moleküllü reaksiyon olup bir enzim- substrat reaksiyonu ES meydana gelir. Tek moleküllü reaksiyon ES \overset{k_{cat}} {\longrightarrow} E + P için enzim reaksiyonu çok karmaşık olabilirse de, tipik olarak hız belirleyici tek bir enzimatik adım vardır. Bu sayede bu reaksiyon, tek bir katalitik basamağı olan, tek moleküllü hız sabiti görünüşte kcat imiş gibi modellenebilir. Eğer reaksiyon yolu bir veya birkaç araürün üzerinden gidiyorsa, kcat birkaç öğesel (elementer) hız sabitinin fonsiyonu olacaktır. Oysa en basit durum olan tek bir öğesel reaksiyonda (yani araürün olmaması hâlinde), öğesel tek moleküllü sabit k2'ye eşit olacaktır. Görünür tek-moleküllü hız sabiti kcat devir hızı olarak da adlandırılır ve bu, saniyedeki katalizlenen en yüksek enzim reaksiyon sayısına karşılık gelir. Michaelis–Menten denklemiMichaelis L. and Menten M.L. Kinetik der Invertinwirkung Biochem. Z. 1913; 49:333–369 İngilizce çevirisi Accessed 6 April 2007 (başlangıç) reaksiyon hızı v0'nin substrata bağlanma denge konumuna ve hız sabiti k2'ye nasıl bağlı olduğunu betimler. : v_0 = \frac{V_\max[\mbox{S}]}{K_M + [\mbox{S}]} (Michaelis–Menten denklemi) sabitler: : \begin{align} K_M \ &\stackrel{\mathrm{def}}{=}\ \frac{k_{2} + k_{-1}}{k_{1}} \approx K_D\\\ V_\max \ &\stackrel{\mathrm{def}}{=}\ k_{cat}{[}E{]}_{tot} \end{align} Bu Michaelis-Menten denklemi çoğu tek substratlı enzim kinetiğinin temelinde yatar. Mekanizma hakkında genel bir varsayım, araürün veya ürün inhibisyonu olmadığı, ve alosterisite veya kooperativite olmadığıdır. Bu denklemin altında yatan iki önemli varsayım daha vardır. Birincisi, sabit-durumumsuluk varsayımı (İng. quasi-steady-state assumption) (veya sahte sabit durum hipotezi) olarak adlandırılır, substrata bağlı enzim konsantrasyonundaki (ve dolayısıyla bağlı olmayan enzimin konsantrasyonundaki de) değişim hızının, ürün ve substratın konsantrasyonlarındaki değişmeden çok daha az olduğudur, dolayısıyla kompleksteki değişimin zamana bağlı değişiminin sıfıra eşitlenebileceğidir. d{[}ES{]}/{dt} \; \overset{!} = \;0 . İkinci varsayım ise, toplam enzim konsantrayonunun zaman içinde değişmediği, yani {[}E{]}_\text{tot} = {[}E{]} + {[}ES{]} \; \overset{!} = \; \text{const} . Bu denklemlerin türetilmesinin ayrıntıları burada bulunabilir. Michaelis sabiti KM'nin deneysel tanımı, enzim reaksiyon hızının Vmax'ın yarısı olduğu substrat konsantrasyonudur. Michaelis–Menten denkleminde [S] = Km substitusyonu yapılarak bu tanım doğrulanabilir, ayrıca grafik olarak da gösterilebilir. Eğer hız belirleyici enzimatik adım, substrat ayrışma hızına (k_2 \ll k_{-1} ) kıyasla yavaş ise, Michaelis sabiti KM kabaca ES kompleksinin ayrışma katsayısı KD'ye eşittir. Eğer [S], K_M'ye kıyasla küçükse, [S] / (K_M + [S]) \approx [S] / K_M ve çok az ES kompleksi oluşur, yani [E]_0 \approx [E]. Dolayısıyla, ürün oluşma hızı :v_0 \approx \frac{k_{cat}}{K_M} [E] [S] \qquad \qquad \text{eger } [S] \ll K_M Yani, ürün oluşma hızı hem enzim konsantrasyonuna, hem de substrat konsantrasyonuna bağlıdır; psödo-ikinci derece hız sabiti k_2 / K_M olan iki moleküllü reaksiyonunun denklemine benzer bu denklem. Bu sabit, katalitik verimliliğin bir ölçütüdür. En verimli enzimler 108 \- 1010 M−1 s−1 aralığında k_2 / K_M değerlerine sahiptir. Bu enzimler o kadar verimlidir ki, bir substat molekülüne her rastladıklarında bir reaksiyon katalizlerler ve dolayısıyla verimliliğin teorik üst sınırına (difüzyon sınırına) ulaşmışlardır. Bu enzimler çoğu zaman mükemmel enzim olarak adlandırılır. === Michaelis-Menten denkleminin zaman bağımlı kinetik analizi için kullanımı === Michaelis-menten denklemi tarafından öngörülen reaksiyon hızlarından yararlanılarak zaman bağımlı substrat yokoluşu ve ürün oluşumu doğrudan modellenebilir. Bunu yapmak için birinci derece kimyasal kinetik denklemi içine Michaelis-Menten denklemi dahil edilir. Birinci derece kimayasal kinetiğin tarifinde Euler sayısının kullanımı ile ilgili problemin farkına varmak gerekir, yani e-k hesaplamalara sistematik bir hata sokan bir ayrık katsayıdır. Bu, tek bir katsayı kullanılarak yeniden yazılabilir, bu yeni katsayı her zaman aralığından sonraki kalan substrat miktarına karşılık gelir.Walsh R, Martin E, Darvesh S. A method to describe enzyme-catalyzed reactions by combining steady state and time course enzyme kinetic parameters. Biochim Biophys Acta. 2010 Jan;1800:1-5 :[S]=[S]_0(1-k)^{t}\, :[S]=[S]_0(1-v/[S]_0)^{t}\, :[S]=[S]_0(1-(V_\max [S]_0 / (K_M + [S]_0)/[S]_0))^{t}\, === Michaelis–Menten denklemi için doğrusal grafikler === küçükresim|350px|sağ|Kinetik veri için Lineweaver–Burk veya çifte-reciprocal grafiği, eksen kesim noktalarının ve eğimin anlamları gösterilmiştir. Yukarıda gösterilen, [S]'ye bağlı v grafiği doğrusal değildir; grafik, düşük [S] için başlangıçta doğrusal olsa dahi, yüksek [S]'de eğilerek doyuma ulaşır. Bu konuda yapılan ilk çalışmalarda, bu nonlineerlik KM ve Vmax'ın hatasız olarak kestirilmesini zor kılmaktaydı. Bu yüzden, bazı araştırmacılar Michaelis-Menten denkleminin lineerleştiren grafik yöntemler geliştirdiler: Lineweaver–Burk grafiği, Eadie–Hofstee çizimi ve Hanes–Woolf grafiği gibi. Bu lineer gösterimlerin hepsi verinin görüntülenmesi için yararlıdır, ama kinetik parametrelerinin belirlenmesi için günümüzde bilgisayar yazılımları mevcuttur ve nonlineer regresyon yöntemleri kullanarak daha hatasız sonuçlar elde edilmesi mümkündür. Lineweaver-Burk grafiği veya çifte evrik (İng. reciprocal) grafiği kinetik veriyi görüntülemek için yaygın kullanılır. Bunu elde etemk için Michaelis-Menten denkleminin iki tarafının evrik yapılır. Sağda gösterildiği gibi, bu, Michaelis-Menten denkleminin doğrusal bir biçimidir ve y = mx + c denklemli bir doğru üretir, y ekseni kesişim noktası 1/Vmax'ye x eksen kesişimi -1/KM'ye karşılık gelir. :\frac{1}{v} = \frac{K_{M}}{V_\max [\mbox{S}]} + \frac{1}{V_\max} Tabii ki, negatif 1/[S] değerleri için deneysel değerler elde edilemez; 1/[S] = 0 alt sınırı (y kesişimi) sonsuz substrat konsantrasyonuna karşılık gelir, orada 1/v=1/Vmaxdır, sağda gösterildiği gibi. Dolayısıyla x-kesişimi pozitif konsantrasyonlarda elde edilen deneysel verilerin bir ekstrapolasyonudur. Daha genel olarak, Lineweaver–Burk grafiği düşük konsantrasyonlarda elde edilen ölçümlerin önemini çarpıtır ve dolayısıyla Vmax ve KM'nin hatalı kestirilmesine yol açabilir. Daha hatasız bir lineer grafikleme yöntemi Eadie- Hofstee grafiğidir. Bu durumda v, v/[S]'ye bağlı olarak grafiklenir. Yaygın kullanılan yöntemlerden üçüncüsü olan Hanes-Woolf grafiğinde, [S]/v, [S]'ye bağlı olarak grafiklenir. Genelde, data normalizasyonu deneysel iş miktarını azaltmaya yarar, sonucun güvenilirliğini artırabilir ve hem grafik hem de sayısal analiz için uygundur. === Kinetik sabitlerin pratik anlamı === Enizm kinetiğinin araştırılması iki temel nedenden dolayı önemlidir. Birincisi, enzimlerin nasıl çalıştığının anlaşılmasını sağlar, ikincisi, enzimlerin organizmalarda nasıl davrandığını öngörmeye yardımcı olur. Yukarıda tanımlanan kinetik katsayılar KM ve Vmax, metabolima kontrolünde enzimlerin nasıl çalıştığının anlaşılmasında önemli rol oynar. Bu öngörülerin yapılması sıradan değildir, basit sistemler için dahi. Örneğin, oksaloasetat, mitokondride bulunan malat dehidrojenaz tarafından meydana gelir. Oksaloasetat sonra sitrat sentaz, fosfoenolpirüvat karboksikinaz veya aspartat aminotransferaz tarafından tüketilebilir ve, sırasıyla, sitrik asit döngüsü, glükoneojenez veya aspartik asit biyosentezini besleyebilir. Bu yolaklardan her birine ne kadar oksaloasetat gittiğini öngörmek için oksaolasetat konsantrasyonunu bilmek, ayrıca bu enzimlerin konsantrasyon ve kinetik özelliklerini bilmek gerekir. Metabolik yolakların davranışlarını öngörüsünün en karmaşık kısmı, tüm bir organizmaya ait matematiksel modellerin içine girmesi gereken kinetik ve gen ifadesi verilerinin sentezini yapılmasındadır. Buna alternatif olarak, kinetik metabolizma probleminin faydalı bir sadeleştirmesi, enzim kinetiklerini dikkate almayıp sadece reaksiyon ağının stokyometresi hakkındaki bilgileri dayanmaktır, bu yöntem akı denge analizi olarak adlandırılır.. === Ararürünlü Micahelis-Menten kinetiği === Basit olan şu durum ile başlayalım: : \begin{align} E + S \underset{k_{-1}}{\overset{k_{1}} {\begin{smallmatrix}\displaystyle\longrightarrow \\\ \displaystyle\longleftarrow \end{smallmatrix}}} ES \overset{k_2} {\longrightarrow} EI \overset{k_3} {\longrightarrow} E + P \end{align} burada bir enzim ve araürün mevcuttur, araürün ikinci adımda ürüne dönüşür. Bu durumda çok benzer bir denklem ortaya çıkar.Denklemin türetilmesi için bakınız: here : \begin{align} v_0 &= k_{cat}\frac{{[}S{]} {[}E{]}_0}{K_M^{\prime}+ {[}S{]}} \end{align} ama sabitler farklıdır : \begin{align} K_M^{\prime} \ &\stackrel{\mathrm{def}}{=}\ \frac{k_3}{k_2 + k_3} K_M = \frac{k_3}{k_2 + k_3} \cdot \frac{k_{2} + k_{-1}}{k_{1}}\\\ k_{cat} \ &\stackrel{\mathrm{def}}{=}\ \dfrac{k_3 k_2}{k_2 + k_3} \end{align} Sınırlayıcı durum olan k_3 \gg k_2 için, yani EI den E + Pye olan adım bir evvelki adımdan çok daha hızlı olunca, ilk denklemi elde edilir. Matematik olarak, K_M^{\prime} \approx K_M ve k_{cat} \approx k_2. == Çok-substratlı reaksiyonlar == Çok substratlı reaksiyonlarda subsratların nasıl bağlandığını ve hangi sırayla bağlandığını belirten karmaşık hız denklemleri vardır. Eğer A substratının konsantrasyonu sabit tutulur ve B substratınınki değiştirilirse, bu reaksiyonların analizi çok basitleşir. Bu şartlar altında, enzim tek substratlı bir enzim gibi davranış gösterir, vyi [S]'ye bağlı olarak grafiklendiğinde, B substatı için görünür KM ve Vmax sabitleri elde edilir. Eğer bu ölçümler A'nın farklı sabit konsantrasyonları için yapılırsa, bu veriler kullanılarak reaksiyonun mekanizması anlaşılabilir. İki substrat A ve B'yi alıp bunları iki ürün P ve Q'ya dönüştüren bir enzim için iki tip mekanizma vardır, üçlü kompleks veya pinpon. === Üçlü kompleks mekanizmaları === küçükresim|310px|sağ|Bir enzim reaksiyonu için rastgele sıralı üçlü kompleks mekanizması. Reaksiyon bir çizgi şeklinde gösterilmiştir, substratlar A ve B veya ürünler P ve Q'yu içeren enzim araürünleri çizginin altına yazılmıştır. Bu enzimlerde, her iki substrat enzime aynı anda bağlanıp bir EAB üçlü kompleksi meydana getirir. Bağlanma sırası rastgele olabilir (rastgele mekanizmada) veya substratların belli bir sıra sıra ile bağlanması gerekebilir (sıralı mekanizmada). Üçlü kompleks mekanizmalı bir enzim için bir v-[S] eğriler kümesi (sabit A, değişen B) bir Lineweaver-Burk grafiğinde çizilirse, doğrular bir noktada kesişir. Üçlü kompleks mekanizmalı enzimler arasında glutatyon S-transferaz, dihidrofolat reductaz and DNA polymeraz sayılabilir. Dihidrofoloat redüktaz ve DNA polimeraz için üçlü-kompleks mekanizmalarını gösteren kısa animasyonlar şu bağlantıda izlenebilir. and \alpha^{\prime} = 1 + \frac{[\mbox{I}]}{K_{i}^{\prime}} Burada Ki ve K'i, sırasıyla, enzime ve enzim-substrat kompleksinin ayrışma sabitleridir. Tersinir bir inhibitörün varlığında aşağıdaki tipik durumlar için gösterildiği üzere enzimin görünen Km ve Vmax değerleri, sırasıyla, (α/α')Km ve (1/α')Vmax olur. İnhibisyon tipi Görünür Km Görünür Vmax Ki sadece (\alpha^{\prime}=1) yarışmalı K_m \alpha~ ~V_\max ~ Ki' sadece (\alpha=1~) yarışmasız \frac{K_m}{\alpha^{\prime}} \frac{V_\max}{\alpha^{\prime}} Ki = Ki' (\alpha = \alpha^{\prime}) sınırlı yarışmalı ~K_m~ \frac{V_\max}{\alpha^{\prime}} Ki ≠ Ki' (\alpha eq \alpha^{\prime}) karışık \frac{K_m\alpha}{\alpha^{\prime}} \frac{V_\max}{\alpha^{\prime}} non-lineer regresyon ile enzim kinetik verilerini hız denklemlerine uydurunca ayrışma katsayıları Ki ve K'i için yüksek doğruluklu olarak kestirmek mümkün olur. Denklemlerin basit bir düzenlemesi inhibitör bağlanması ve maksimum hız arasındaki ilişkiyi ortaya koyar. :\cfrac{V_\max}{1 + \cfrac{[I]}{K_i}} :\cfrac{V_\max}{\cfrac{[I]+K_i}{K_i}} Aşağıya sıfır ekleyince ([I]-[I]) :\cfrac{V_\max}{\cfrac{[I]+K_i}{[I]+K_i-[I]}} [I]+Ki ile bölünce :\cfrac{V_\max}{\cfrac{1}{1 - \cfrac{[I]}{[I]+K_i}}} :V_\max - V_\max \cfrac{[I]}{[I]+K_i} Yani, reaksiyon hızının substrat ile etkileşen enzim oranına bağlı olduğu Michaelis–Menten denklemine benzer şekilde, substrata bağlı enzim oranı :\cfrac{[S]}{[S]+K_m} inhibitöre bağlı enzim oranı :\cfrac{[I]}{[I]+K_i} İnhibitörün etkisi, inhibitörle etkileşen enzim popülasyonunun yüzdesinin bir sonucudur. Bu denklemle ilgili tek sorun, inhbitör bağlanması ile enzimin mutlak olarak inhibe olduğunu varsaymasıdır, oysa bu etki substrat kullanımının %100 ila %1'in biraz fazlası arasında değişebilir. Değişken dereceli inhibisyonu hesaba katmak için denkleme bir delta Vmax terimi eklenir. :V_\max - \Delta V_\max \cfrac{[I]}{[I]+K_i} veya :V_\max1 - (V_\max1 - V_\max2 ) \cfrac{[I]}{[I]+K_i} Bu terim sayesinde, inhibitör popülasyondaki enzim molekülleri ile etkileşirken kalan enzim aktivitesi tanımlananbilir. Ayrıca, bu terimin denkleme dahil edilmesinin bir avantajı, ikincil Vmax terimi ilk terimden daha büyük olması halinde aktivasyon olasılığının da hesaplanmasını mümkün kılmasıdır. Aktivasyon olasılığını hesaba katmak için, İnhibitör için kullanılan "I" harfi yerine, aşağıda "X" olarak gösterilen bir modifikatör kavramına geçilebilir. :V_\max1 - (V_\max1 - V_\max2 ) \cfrac{[X]}{[X]+K_x} Bu terminoloji Michaelis-Menten denklemineki maksimal hız ile ilşkili kinetik etkileri daha basit bir şekilde ele almaya sağlamasına karşın, Km ile ilişkili etkileri tarif etmekte ortaya çıkabilen potansiyel problemleri de ortaya çıkarır. Enzimin substratına afinitesi ile ilgili olan Km, çoğu durumda enzim-inhbitör etkileşiminin sonucu olarak enzimin bağlanma yerindeki potansiyel değişikliklerle ilişkili olmalıdır. Bu yüzden, Vmax'yi modüle eden, yukarıdaki benzer bir terim olması çoğu durum için uygun olurdu:Walsh R, Martin E, Darvesh S. A versatile equation to describe reversible enzyme inhibition and activation kinetics: modeling beta-galactosidase and butyrylcholinesterase. Biochim Biophys Acta. 2007 1770:733-46. :K_m1 - (K_m1 - K_m2 ) \cfrac{[X]}{[X]+K_x} === Tersinmez inhibitörler === Enzim inhibitörleri enzimleri tersinmez olarak da inaktive edebilirler, genelde aktif bölgedeki amino asit kalıntısını değişime uğratarak. Kendilerini de yok ettikeri için "intihar substratı" olarak düşünülebilecek olan bu inhibitörler, reaksiyon sırasında üssel bir azalma gösterirler ve konsantrasyona bağlı olarak enzime olan etkileri genelde doyum özelliği gösterir. Doyum noktasının altında bu reaksiyonlar inhibitör için birinci derece reaksiyon kinetiği gösterirler. == Kataliz mekanizması == küçükresim|300px|Reaksiyon koordinatına göre enerji değişimi, geçiş hâlinin bir enzim tarafından stabilize edilmesini gösterir. Enzim-substrat etkileşimi ile ilgili favori model, indüklenmiş uyum modelidir. Bu modele göre, enzim ile substrat arasındaki ilk etkileşimin zayıftır, ancak bu zayıf etkileşimler enzimde konformasyonel değişiklikler doğurur (indükler), ve bunun sonucu olarak bağlanma güçlenir. Bu konformasyonel değişiklikler ayrıca aktif bölgedeki katalitik amino asit kalıntılarını, substratta reaksiyon sonucu değişecek kimyasal bağların yakınına getirir. Konformasyonel değişimler dairesel dikroizm veya eşlek polarizasyon enterformetrisi (İng. dual polarisation interferometry) ile ölçülebilir. Bağlanma olduktan sonra, kataliz mekanizmaları sayesinde, reaksiyon için alternatif kimyasal yolaklar sağlanarak reaksiyonun geçiş halinin enerjisi alçalır. Bunun olmasını sağlayan kataliz mekanizmaları arasında: bağ gerginliği yoluyla kataliz; yakınlık ve doğrultu ile kataliz; aktif bölge proton vericileri veya alıcıları ile kataliz; kovalent kataliz; ve kuvantum tünellemesi sayılabilir. Enzim kinetiği ölçümleri bir enzim tarafından hangi kataliz yolunun kullanıldığını kanıtlayamaz. Ancak, bazı kinetik veriler, başka yöntemlerle doğrulanabilecek olasılıkları öne sürebilir. Örneğin, sabit-hâl öncesi çoğuşmalı pinpon kinetiği gösteren bir reaksiyon, kovalent katalizin bu enzim reaksiyonunda önemli olabileceğini ima eder. Alternatif olarak, Vmax üzerinde kuvvetli bir pH etkisi olması ama Km üzerinde bir pH etksisi olmaması, katalizin olabilmesi için aktif bölgedeki bir amino asit kalıntısının belli bir iyonizasyon hâlinde olması gerektiğine işaret edebilir. == Ayrıca bakınız == *Protein dinamikleri == Dipnotlar == α. Interaktif Michaelis–Menten kinetiği eğitseli (Java gereklidir) β. dihidrofolat redüktaz mekanizması (Gif) γ. DNA polimeraz mekanizması (Gif) δ. Şimotripsin mekanziması (Flash gereklidir) == Kaynakça == == Konuyla ilgili yayınlar == Giriş düzeyi * * * İleri düzey * * * * * == Dış bağlantılar == * Bir enzim ölçümünün animasyonu — Shows effects of manipulating assay conditions. * MACiE — Enzim mekanizmaları veritabanı. * ENZYME — Expasy enzim adlandırma sistemi veritabanı. * ExCatDB — Enzim katalitik mekanizmaları veritabanı. * BRENDA — Kapsamlı bir enzim veritabanı, substratlar, inhibitörler ve reaksiyon çizimleri bulunmaktadır. * SABIO-RK — Reaksiyon kinetkileri veritabanı. * Joseph Kraut Araştırma Grubu, University of California San Diego — Birkaç enzim reaksiyonun mekanizmasının animasyonu. * Enzim kinetiğinde sembolizm ve terminoloji — Enzim kinetiğindeki kavramlar ve terminolojinin kapsamlı bir açıklaması. * Enzim kinetiğine bir giriş — Enzim kinetiği hakkında çevrimiçi, kolay anlaşılır bir eğitsel. * Enzim kinetiği animasyonlu eğitsel