בבחירות לכנסת השישית, שנערכו ב-2 בנובמבר 1965, זכה המערך (הראשון) בראשות אשכול ב-45 מנדטים אל מול 10 מנדטים בלבד בהם זכתה רפ"י. כישלונה של רפ"י היה חרוץ; נראה היה כי דרכו של אשכול, ואנשי דור הביניים במפא"י, היא שניצחה, וכי בן-גוריון "והצעירים" הוסטו הצידה לשנים רבות ולא תהיה להם עוד תקומה.
ראש ממשלה - הקדנציה השנייה 1966–1969.
מיד לאחר הבחירות אושפז אשכול בשל בעיות בריאות. גם לאחר שחרורו מן האשפוז, כעבור כמה ימים, לא הצליח להרכיב ממשלה. בעיות עם השותפים מבחוץ ובעיות במינוי השרים בתוך מפא"י הקשו על התהליך. הממשלה הוצגה בפני הכנסת רק ב-12 בינואר 1966 ונתמכה על ידי 71 הח"כים של מפא"י, מפ"ם, מפד"ל, פועלי אגודת ישראל והליברלים העצמאים. רפ"י, על שלל כוכביה, נותרה באופוזיציה. את עיקר נאום הבכורה הקדיש אשכול לבעיות הכלכלה, ואלה אכן עמדו בראש סדר היום הציבורי בתחילת כהונתו.
ב-27 במאי 1966 יצא אשכול למסע בן שלושה שבועות בשבע מדינות באפריקה. הוא התקבל בהן באהדה גדולה ובמהלך ביקוריו נחתמו הסכמים כלכליים, מדיניים וצבאיים.
המיתון.
עוד לפני תום שנת 1966 הסתיימו כמה פרויקטים גדולים: המוביל הארצי, נמל אשדוד, מפעלי ים המלח. סיום העבודה על פרויקטים אלו הביא לירידה בהיקף העבודות הציבוריות, ולצמצום הפעילות הכלכלית; במשק קטן כמו המשק הישראלי היו לכך תוצאות מיידיות. בנוסף, מאזן התשלומים השלילי של ישראל, העלייה באינפלציה, הירידה בעלייה, סיום שלב הפיצויים הלאומיים (להבדיל מהאישיים) של הסכם השילומים עם גרמניה, והתגברות הדרישות מצד ועדי עובדים גדולים במשק, בראשם ארגון 'האקדמאים' (שערכו ב-1965 שביתה פראית), כל אלו הביאו את הממשלה עוד במהלך 1964 וביתר שאת ב-1965, לנקיטת צעדי ריסון תקציבי, כלומר - מיתון יזום.
בנאום מ־14 בפברואר 1966, תוך כדי הצגת תקציב המדינה בכנסת, פרט שר האוצר פנחס ספיר את הבעיות העיקריות העומדות בפני המשק הישראלי:
גירעון במאזן התשלומים, עליות שכר במשק, הגדלת תקציב הביטחון. הכלים למלחמה בבעיות אלה: העלאת מסים וכן התייקרויות, או בלשונו של ספיר "הגענו למצב שבו חייבת הממשלה להשתמש בכלים שברשותה כדי שעליות השכר הגדולות לא יביאו לזעזועים קשים במשק". המדיניות כונתה "מיתון", ובפי מתנגדיה הוצגה כ"יציאה מכלל שליטה" של המשק. את הפרשנות הזו הובילו חברי האופוזיציה מימין - (גח"ל), ומשמאל - (רפ"י).
בחלוף 1966 ותחילת 1967 התברר כי המדיניות הביאה לעלייה חריפה באבטלה, לירידה ברמת החיים ולעצירת השקעות חוץ. לראשונה ראתה ישראל מאזן הגירה שלילי, שבו מספר העוזבים את הארץ (שכונו "יורדים") עלה על מספר העולים אליה. בשנת 1966 לבדה ירדו מהארץ 11,000 איש. בנוסף, בינואר 1967 התמוטטו שני בנקים פרטיים קטנים, "בנק פויכטוונגר" ו"בנק אלרן", עקב פרשיות שחיתות ומעילות, ופסקה פעילות חברת הבנייה הגדולה "רסקו".
מאמציו של ספיר לשווק את "המיתון" כשלו. ראש הממשלה ושר האוצר שלו ניסו לטעון שמדובר במשבר חולף, וכדברי ספיר "ניתוח אינו יכול שלא להכאיב" – אך הציבור חש אי אמון כלפי שניהם. אשכול הואשם בהססנות ובחוסר יוזמה אל מול המשבר. גישתו הפשרנית, שזכתה לאהדה במשבר רפ"י, נראתה עתה כחוסר החלטיות גרידא. בציבור נפוצו עליו בדיחות, ואף הופץ ספרון בשם "כל בדיחות אשכול". אמרות הכנף שיוחסו לו, כגון "חצי-תה-חצי-קפה", וכן "הבטחתי, אבל לא הבטחתי לקיים" - נראו עתה כמלמולים של אדם חלש, שאינו ראוי למשרתו הרמה. אלה היו מתקפות מתוזמרות מצד האופוזיציה, שנתמכה על ידי עיתונים 'בלתי תלויים'. בפועל, האופוזיציה כמו גם העיתונאים הביקורתיים, לא הציגו שום חלופה למדיניות הממשלה שנועדה לשנות את מבנה המשק - להעביר יותר עובדים מענפי השירותים לייצור, ולהגדיל את הייצוא - תחת מיזמי הענק שהקמתם הסתיימה משכבר.
המצב הביטחוני.
תקופת המיתון הייתה תקופת התעצמות חסרת תקדים ביכולתו של צה"ל. הטנקים מסוג פטון (מג"ח M48 ו-M60) ומטוסי המיראז' נקלטו בהצלחה בצה"ל. את בניין הכוח וחיזוקו, גם בשנות מיתון אלה, יש לזקוף בלעדית לזכות אשכול, אשר השכיל - גם נוכח המשבר הכלכלי - לפעול על פי סדר עדיפויות ראוי. מבחינה בינלאומית הייתה הברית שיצר אשכול עם הנשיא ג'ונסון במאי 1964, נדבך חשוב בהעצמתו של צה"ל לקראת יום פקודה.
בנובמבר 1966 הודיע אשכול בנאום בכנסת כי הממשל הצבאי הסתיים; הוא עשה זאת בהתאם להסכם הקואליציוני עם מפ"ם, ובגלל לחץ פוליטי וציבורי שהלך וגבר ואף דיבר ללבו, אך גם משום רצונו לנקוט בעוד צעד הפגנתי כנגד מורשת בן-גוריון. למעשה, הממשל לא בוטל לחלוטין, אלא שסמכויות אכיפתו הועברו לידי המשטרה והמשטרה הצבאית, והוא צומצם בהדרגה עד שחדל להתקיים מספר שנים אחר כך.
צה"ל נאבק על בסיס יום-יומי עם חוליות חבלה של אש"ף וארגונים אחרים, והגיב בפעולות תגמול. הגדולה בפעולות אלה הייתה פעולת סמוע ב־13 בנובמבר 1966, שבה חדר כוח צה"ל לירדן, ופוצץ עשרות בתים בכפר סמוע, לאור יום.
תגובתו של אשכול לפעולות החבלה הייתה בתחילה פשרנית. אמרתו "הפנקס פתוח והיד רושמת" נועדה לרמוז לכך שישראל תגיב להתנכלויות בזמן ובמקום שייראו לה; אך המסר לא התקבל על דעת הציבור, וההנהגה הצבאית אף התעמתה עם אשכול בדרישה להחריף את התגובות ולנקוט בקו ביטחוני אקטיביסטי. נראה כי פעולת סמוע עצמה הייתה בהיקף גדול בהרבה ממה שאישר אשכול. המאבק בין הממסד הצבאי להנהגה האזרחית קיבל אופי אישי, למשל בתקריות כמו זו מספטמבר 1966, שבה התבטא רבין כי ישראל צריכה לפגוע בשלטון הסורי, ובתגובה אסר אשכול קטגורית על אלופי צה"ל להתבטא בנושאי מדיניות.
מאבק זה עתיד היה להסלים ולהחריף ככל שהתקרבה מלחמת ששת הימים, כאשר - בהדרגה - הן ההנהגה הצבאית, והן העם, איבדו אמונם בכוחו של אשכול להתמודד עם בעיות הביטחון של המדינה.
לקראת מלחמת ששת הימים 1967.
תקופת ההמתנה.
ב-15 במאי 1967 נערך בירושלים מצעד יום העצמאות. על בימת הכבוד עמדו אשכול, ולידו הרמטכ"ל יצחק רבין. עוד במהלך המצעד הגיעו לאוזני הנוכחים ידיעות כי גמאל עבד אל נאצר נשיא מצרים הכניס לסיני כוחות צבא גדולים, בניגוד להסכמי שביתת הנשק. עם חדירת הכוחות המצריים לסיני, ובעקבות דרישתו של נאצר, הורה מזכ"ל האו"ם או תאנט על פינוי כוחות האו"ם שהיו מוצבים בסיני. פעולה זו הביאה למעשה לכך שנאצר שלט במצרי טיראן – מה שיצר בפועל מצור ימי על מדינת ישראל. בתוך יומיים, מ-19 במאי ואילך, גויס כוח המילואים של מדינת ישראל והועמד בכוננות. החלה "תקופת המתנה", במהלכה שותק המשק הישראלי עקב גיוס מרבית כח העבודה הכשיר לשירות מילואים ב"צו 8". חרדה קיומית ירדה על המדינה.
למשבר קדמו חודשים של חיכוכים עם סוריה, שהביאו לפגיעות ביישובי הצפון, ששיאו היה קרב אווירי באפריל 1967 בו הופלו שישה מטוסי מיג 21 סוריים, בלא כל אבדות לחיל האוויר הישראלי. יש הסוברים כי החלטתו של נאצר להזרים כוחות לסיני הייתה צעד שנועד להניא את ישראל מהתערבות בסוריה בניסיון להפיל את המשטר שם. אחרים סברו כי המשבר החל מבלי שתהיה כוונה אצל מי הצדדים להביא למלחמה כוללת, אלא ששורת צעדים, שלא ניתן היה לחזותם מראש, גררו את האזור למלחמה.
הציבור הישראלי איבד אמונו בראש הממשלה כשר ביטחון. ככל שהתמשכה תקופת ההמתנה ואשכול נמנע מלהורות על יציאה למלחמה, גבר החשש שמדינות ערב יקדימו את מדינת ישראל ויפתחו ראשונות במתקפה.
ב-23 במאי התמוטט הרמטכ"ל רבין מאפיסת כוחות, והוחלף למשך 48 שעות על ידי סגנו, עזר ויצמן. האירוע הגביר את החשש הן בצבא והן במערכת הפוליטית מהתמשכות תקופת ההמתנה. החלו לחצים על אשכול להסכים להצטרפות אנשי רפ"י לממשלה ולמינויו של משה דיין כשר הביטחון. אשכול לא הסכים לחזרת יריביו מרפ"י לשולחן הממשלה, וראה בדרישות אלה משום חתירה תחת סמכותו.
הוא ניסה למצות את כל האפשרויות לתיווך בינלאומי על מנת לסיים את המשבר. שר החוץ אבא אבן יצא לצרפת ולארצות הברית בניסיון להביא באמצעות פעולה בינלאומית לפתיחת השיט במצרי טיראן - ללא הצלחה, והמשבר הלך והחריף. בפגישה ב-2 לפנות בוקר ב-27 במאי מסר שגריר ברית המועצות לידי אשכול שדר חריף מראש הממשלה הסובייטי אלכסיי קוסיגין, שהזהיר מפני פעולה צבאית. בצהרי אותו יום התקבל שדר ברוח זו אף מידידו של אשכול, הנשיא לינדון ג'ונסון. בהצבעה שנערכה בממשלה בשעות הלילה, היו הדעות חלוקות בשאלת היציאה למלחמה. תשעה שרים, בהם אשכול, תמכו ביציאה מיידית למלחמה, ותשעה תמכו בהמתנה. אשכול לא הצליח להכריע בין המחנות, ודחה את המשך הדיון למחרת.
הקמת ממשלת הליכוד הלאומי.
עוד בערב ה-28 במאי 1967, נשא ראש הממשלה נאום לאומה ששודר ברדיו. לקראת הנאום נוצרו כמה נוסחים, ואשכול עשה במהירות הגהה לנוסח המודפס. הנאום שודר בשידור חי, וכשהגיע אשכול לפסקה ששונתה בנוסח המודפס, במקום "כמו כן נקבעו קווי פעולה להזזת הכוחות" נכתב "כמו כן נקבעו קווי פעולה להסגת הכוחות"; אשכול לא הבין את התיקון שנעשה, ונשמע מגומגם. תקלה זו יצרה רושם קשה בציבור כאילו בראשות הממשלה יושב אדם הססן, חסר יכולת הכרעה, ולכן המדינה נתונה בסכנה גדולה.
מאולפני הרדיו הגיע אשכול לישיבת המטכ"ל. מצב הרוח במטה היה סוער, עד כדי כך שאריאל שרון, מפקד אוגדה 38 במינוי חרום במלחמה, דיבר על נקיטת יוזמה צבאית מבלי להמתין להוראה מהדרג המדיני. האלופים אריאל שרון, עזר ויצמן, אברהם יפה והרמטכ"ל הטיחו באשכול מילים קשות, והוא עזב את הישיבה בכעס. באותו יום הודיעה ירדן על הצטרפותה לברית נגד ישראל לצד סוריה ומצרים.