עוד באוגוסט 1911 החל העיתונאי בראזול-ברושקובסקי (שאשתו הייתה יהודייה) לחקור את פרשת הרצח באופן פרטי, לאחר שהגיע למסקנה כי בייליס חף מפשע. ורה צ'בריאק שכנעה את ברושקובסקי לקיים פגישה בחרקוב עם "אדם חשוב" שיש בידיו פרטים חשובים על הרצח. ברושקובסקי האמין שהפגישה עשויה להוביל למציאת האשמים ושכנע את מרגולין להשתתף בה, אולם נתברר כי אותו "אדם חשוב" לא היה קיים. צ'בריאק סיפרה לנוכחים שאת הרצח ביצעה קבוצת פושעים ובראשה לוקה פריכודקו, אביו החורג של אנדריי, ופאול מיפלה, מאהבהּ לשעבר, ושהרצח בוצע במערה. שיחה זו דווחה למשטרה וצ'בריאק טענה בחקירתה כי ברושקובסקי היה זה שיזם את הפגישה, והוצע לה בה סכום של 40,000 רובל תמורת הסכמתה לקבל על עצמה את האשמה ברצח. מרגולין וברושקובסקי הכחישו את סיפור השוחד, אולם הוא זכה לפרסום רב בעיתונות הימנית. בשל פרשה זו, נאלץ מרגולין להופיע במשפט כעד ומשום כך גם לוותר על תפקידו כסנגור. אף על פי כן, איוואנוב החזיק בדעתו לגבי האשמים ברצח. במכתב לממונים עליו בבירה, כתב: "הננו חוזרים על הנחתנו הקודמת, לאמור, יושצ'ינסקי נרצח על ידי ורה צ'בריאק, בשיתוף עם פושעים מחבורתה".
בינואר 1912 פרסם ברושקובסקי את כתבתו, שהפנתה את החשד לאותה כנופיה שצ'בריאק הצביעה עליה. בעקבות זאת, פנה אליו בהצעת עזרה סטודנט בשם מאכאלין, שהביא עמו סטודנט אחר, קאראייב, שנודע לתהילה בעולם התחתון, בשל כך שרצח סוהר אך יצא זכאי במשפט. לאחר שבדצמבר 1911 הודח קראסובסקי ממשרתו כקצין-מחוז, חזר באפריל 1912 לטפל בפרשת הרצח כחוקר פרטי. מאוחר יותר הסביר זאת ברצון להיאבק על כבודו ולהיאבק במדיחיו. חוקרי המשטרה סיפרו לו על עדותן של האחיות דיאקונובה, ידידותיה של ורה צ'בריאק. השתיים סיפרו כי בבוקר בו נעלם אנדריי, הן ביקרו בביתה של צ'בריאק והפתיעו את הנוכחים: ברגע כניסתן, נמלטו מספר אנשים זרים לחדר סמוך ואילו הן עצמן ראו גוף עטוף בשמיכה. ברושקובסקי קישר בין שני הסטודנטים לבין הבלש ויגראנוב, שותפו בחקירה, וקראסובסקי, ונוצר שיתוף פעולה. מאכאלין וקאראייב הצליחו לרכוש את אמונו של פיוטר סינגאייבסקי, אחיה החורג של צ'בריאק וחבר בכנופייתה, עד שהודה בפניהם כי יחד עם שני חברים אחרים, בוריס רודזינסקי ואיוואן לטישב, רצח את יושצ'ינסקי בביתה של ורה. בעקבות ההודאה הזו, ב-6 במאי דרשו קראסובסקי וברושקובסקי מאיוואנוב את חידוש החקירה נגד כנופיית צ'בריאק. איוואנוב מסר את המידע לצ'פלינסקי, אולם מועד המשפט כבר נקבע ל-25 במאי וצ'פלינסקי התנגד לדחייתו ואסר על פתיחת חקירה חדשה.
אלא שלאנשי הממשל המרכזי בסנקט פטרבורג היו שיקולים אחרים. בשני מכתבים שונים, בפברואר ובמאי 1912, כתב להם הפולקובניק שרדל שלפי דעתו חומר העדויות הקיים נגד בייליס אינו מספיק והזהיר כי הגשת כתב אישום המבוסס על עדויות רופפות עלול להטיל קלון על הממשל כולו. לכך נוסף שיקול מדיני פנימי: הבחירות הקרבות לדומה. ב-3 במאי כתב שר הפנים מקארוב לשר המשפטים שצ'גלוביטוב מכתב סודי: "יש יסוד רציני להניח, כי משפט בייליס ייגמר בזיכוי הנאשם. משפט זה עורר תשומת לב רבה לא רק ברוסיה, כי אם גם בחוץ לארץ. אם יזוכה בייליס, הדבר יעשה רושם מדכא על הציבור הרוסי, מחד – ויעורר שמחה בחוגי הגזעים האחרים, ובראש ובראשונה בחוגי היהודים, מאידך – הואיל ועל ידי כך תוסר הסכנה הרצינית, שהייתה תלויה על ראשם... על־כן יש צורך לנקוט אמצעים לאפשר ניהול שקט ונורמלי של הבחירות... לפיכך, הנני מבקש מכבודו לבדוק את האפשרות של דחיית המשפט עד לאחר הבחירות". ב-30 וב-31 במאי פרסם ברושקובסקי בעיתונו את מה שגילה לגבי חבורת הפושעים של ורה צ'בריאק, בצירוף תמונותיהם. פרסום זה עורר סערה בדעת הקהל ובהוראת שצ'גלוביטוב נדחה תאריך המשפט.
הכנת כתב האישום השני.
בעקבות דחיית המשפט, החל צ'פלינסקי לפעול לחיזוק העדויות נגד בייליס. ב-2 ביוני 1912 נפגש לבקשתו עם ורה צ'בריאק ועדכן אותה שהחקירה נגדה ונגד חבריה מתחדשת. מאוחר יותר הסביר כי הזמנתה לשיחה אישית נעשתה "למען הגנה על הנוצרים, מפני היהודים". הוא הצליח לשכנע את שצ'גלוביטוב להדיח את פננקו ובמקומו מונה לשופט-חוקר נאמנו של שר המשפטים, האנטישמי משקביץ'. העיתונות האנטישמית הסבירה את הדחתו של פננקו, כמו גם את הדחותיהם של בראנדורף וקראסובסקי, בכך שהם "מכוּרים ליהודים", וטענה כי יש לנהל את החקירה ללא השפעתם של היהודים. ב-10 ביולי מסרה צ'בריאק לשופט החוקר החדש עדות נוספת, בה הצהירה כי נזכרה בפרטים נוספים ששמעה מבנה לפני מותו: בבוקר 12 במרץ 1911, הוא שיחק עם אנדריי, עם בנותיה, לודמילה וולנטינה, ועם ילדים אחרים בחצר בית החרושת, ובייליס סחב את אנדריי אל משרפת הלבנים "ביחד עם עוד שני יהודים". ב-11 באוגוסט 1912 העידה גם בתה לודמילה, כי כאשר בייליס ושני יהודים נוספים גירשו אותם מהחצר, כולם ברחו, אבל בייליס הצליח לתפוס את אנדריי ושני היהודים "סחבו את אנדריי למשרפת בית החרושת". היא אמרה כי את הפרט על המשרפה שמעה מאחותה הקטנה, שלא היה ביכולתה לרוץ מהר וכך הספיקה לראות זאת.
במהלך תקופה זו, מת אובלונסקי, אחד משני המומחים שביצעו את הנתיחה השנייה, וצ'פלינסקי חיפש מומחה אחר שיתמוך בחוות דעתו של טופאנוב, המומחה השני. הוא בחר בדמיטרי קוסורוטוב , פרופסור לרפואה משפטית באוניברסיטת פטרסבורג. במרץ 1913 אישר קוסורוטוב את ממצאיהם של קודמיו לגבי תיאור הפצעים וקבע כי הם מוכיחים ללא ספק שכוונת הפוצע הייתה להקיז כמות גדולה של דם, למטרות קבועות מראש. באביב 1913 קיבלה ועידת הרופאים ברוסיה החלטה, שפורסמה גם בעיתון אגודת הרופאים, המגנה את חוות דעתם הרפואית-משפטית של טופאנוב ואובלונסקי ואת חוות הדעת הגזענית של הפסיכיאטר סיקורסקי. אף על פי כן, השתמשה הקטגוריה בחוות דעתו של סיקורסקי כבסיס להצגת אופיו הדתי של הרצח בכתב האישום ואף הזמינה אותו לשמש כעד ראשי במשפט. לאחר מלחמת העולם הראשונה התברר כי סיקורסקי קיבל עבור חוות דעתו זו, בנוסף לשכר טרחה גבוה מהרגיל, סכום של 4,500 רובל שקיבל מ"הקופה הסודית" של מחלק המשטרה במשרד הפנים. בוועדת החקירה של 1917 נתברר כי גם קוסורוטוב קיבל תשלום ממשרד הפנים, בסך 4,000 רובל.
בניגוד לתחום הפתולוגי-פסיכיאטרי, בו מצא צ'פלינסקי מומחים שיעידו במשפט, בתחום המדעי-דתי נוצר קושי במציאת מלומדים נוצרים שיסכימו לבוא ולהוכיח את אמיתות קיומו של רצח פולחני בקרב היהודים. הכמורה הפרבוסלבית, השלטת במדינה, לא שיתפה פעולה עם עלילת הדם, וכל הפניות לראשיה, כמו גם הפניות לראשי דת קתוליים מחוץ לרוסיה, לא נענו בחיוב. בסופו של דבר, זומן למטרה זו הכומר פראנייטיס, מחבר הספר האנטישמי "התלמוד והנוצרים", שכיהן אז בכנסייה בטשקנט והתיישב עתה במשך חמישה חודשים בארכיונים לצורך הכנה למשפט.
ב-13 באפריל 1913 הושלם כתב האישום השני, שנכתב בכתב צפוף על פני 30 עמודים. הוא הועבר ל"לשכת האישום" וזו החליטה ב-24 במאי, ברוב של 3 נגד 2, להעמיד לדין את בייליס, הפעם באשמת רצח פולחני-דתי. שלושת המצדדים נימקו את עמדתם: "חובה מוטלת עלינו, להביא לדין אדם, שהחזיקו אותו זמן כה רב במעצר, ויהיה זה רק מתוך הצורך להגן על כבודו של החוק". שני המתנגדים היו השופטים החשובים בלשכה, הנשיא קמניצב והמזכיר ריז'וב, שנימקו את התנגדותם בכתב: "לא נכתים את שמנו ולא נמיט חרפה על עצמנו, בשנות חיינו האחרונות, על ידי ביצוע מעשה מחפיר כזה – האשמת אדם חף־מפשע".
המשפט.
הרכב בית המשפט.
נבחרו 12 מושבעים ושני ממלאי מקום. לזקן המושבעים נבחר מ. מלניקוב. המושבעים היו סגורים ומנותקים מכל השפעה מן החוץ במשך כל ימי המשפט.
מחאות ערב המשפט.
כבר בשלבים הראשונים של הפרשה, נקט העיתון הימני "קייבליאנין" עמדה המתנגדת להתנהלות הממשל, ובין המצדדים בחפותו של בייליס היה גם עורכו האנטישמי, וסילי שולגין , שתקף בחריפות את השלטונות.
ערב פתיחת המשפט פרץ גל מחאות. ביום השני של ראש השנה נאמרו בכל בתי הכנסת של רוסיה תפילות לשלומו של בייליס ומספר קהילות אף הכריזו על יום צום נוסף למחרת יום הכיפורים. פועלים יהודים במספר ערים הכריזו על שביתות וגם ציבורים לא יהודיים השתתפו במחאה: מעל 20,000 פועלים שבתו בסנקט פטרסבורג וביום פתיחת המשפט החליטו נהגי החשמליות בקייב לתרום רבע משכרם היומי לסיוע למשפחתו של בייליס.
פתיחת המשפט.
ב-25 בספטמבר 1913, ז' בתשרי תרע"ד, נפתח המשפט. בשעה 9:40 הובא מנדל בייליס לבית המשפט בקרון אסירים, לבוש בבגדים אזרחיים. בתוך האולם נדחק קהל רב וגם מחוצה לו ביקשו המונים להיכנס לבניין. ברחובות העיר קייב הסתובבו אנשי "ברית העם הרוסי" וחוליות משטרה סיירו גם הן, כדי למנוע הפגנות ותעמולה. מספר חוליות משטרה שמרו על בית המשפט עצמו ובחצרות הבתים הסמוכים לו הוצבו שתי פלוגות צבא. בזיכרונותיו כתב בייליס:
ביום פתיחת המשפט נכתב במאמר הראשי בעיתון "הצפירה": "איש יהודי אחד – ואתו כל עם ישראל ותורתו, כל בן ישראל החי אתנו היום ואשר חי, מימות משה ועד היום הזה, ניצבים היום לדין בקייב... לא נפיל את רוחנו בקרבנו... לא אך רוצחים, אבל גם מעלילי עלילות נתעבות לא נמצאו מעולם בקרבנו!".
ביום הראשון של המשפט הושבעו העדים ונבחר חבר המושבעים.