הפונקציה השנייה הנפוצה ביותר של חלבוני אנטי קריספר היא מניעת חיתוך של DNA. החלבונים להם יכולת זו הם: AcrIF3, AcrIE1 ו-AcrIIC1. מבנה של חלבוני Acr אלו פוענח על ידי קריסטלוגרפיה.
AcrIF3 הוא חלבון שכולו מורכב מסלילי הליקס ופועל כדימר של זוג חלבונים אשר מתחברים לCas2-3 תוך כיסוי אזור הקישור וקצוות החלבון, אינטראקציה המונעת ממנו לחתוך את גנום הפאג'. מחקרים הראו כי מבנה ה-AcrIF3 מחקה את מבנה הדומיין ב-Cas8f אשר אמור לגייס את ה-Cas2-3 לקומפלקס שאמור לקשור את ה-DNA. טרם התגלה המנגנון המלא של החלבונים האחרים אך נראה כי המנגנון של AcrIE1 דומה לזה של AcrIF3. מבחינת מבנה נראה כי מבניהם שונים זה מזה, דבר המרמז כי הם פועלים בדרכים אחרות לעיכוב מערכת ה-CRISPR-Cas. AcrIE1 קושר את הנוקלאז Cas3 וכנראה מונע גיוס לקומפלקס של I-E CISPR-Cas.
AcrIIC1 אשר פועל כנגד מערכות מסוג II-C נקשר לדומיין ה-HNH של Cas9, כאשר ה-AcrIIC1 קשור ל-Cas9 חלבון ה-Cas עדיין יכול להיקשר לגנום אך הוא לא מצליח לחתוך אותו.
עיכוב על ידי יצירת דימר.
AcrIIC3 מונע קישור ל-DNA של Cas9 וגורם לו לעבור דימריזציה, כלומר קישור של זוגות Cas9, זאת על ידי קשירת דומיין הנוקלאז HNH של Cas9. הוא נקשר ל-Cas9 לצד הנגדי של אתר ה-HNH בהשוואה ל-AcrIIC1. צורה זו גורמת לדומיין ה-HNH להיות במצב לא פעיל ורחוק מנקודת החיתוך המיועדת.
עיכוב של קישור ל-Guide RNA.
AcrIIC2 נקשר ל-Cas9 אשר מעורב בשלב האינטראקציה עם gRNA. בהתאם לאזור הקישור, הקומפלקס של Cas9 ו-AcrIIC2 מונע אינטראקציה עם gRNA. הצורה של AcrIIC2 היא דימר עם מטען שלילי גדול אשר נקשר לאתר הקישור החיובי ב-Cas9. בעקבות הקישור יש הפרעה מרחבית המונעת קישור של ה-Cas9 עם ה-gRNA.
עיכוב קשירה ל-DNA בעזרת מנגנון אנזימטי.
AcrVA1 נקשר לקומפלקס של Cas12a ו-crRNA ונמצא באינטראקציה בעיקר עם אזורים אשר קושרים PAM ובכך בעצם מחקה את ה-DNA. כמו כן, הוא יכול לחתוך את ה-crRNA וכך למנוע באופן מוחלט קישור ל-DNA. זהו חלבון ה-Acr הראשון שהתגלה אשר פועל במנגנון אנזימטי.
גם AcrVA5 מעכב פעילות קשריה ל-DNA של Cas12a. הוא מבצע אצטילציה לאזור ב-Cas12a ובכך מונע זיהוי של ה-PAM דבר המונע אינטראקציה עם גנום המטרה.
דרכי פעולה.
מטרת חלבוני האנטי קריספר היא לאפשר לפאג' לשרוד בתא החיידק על ידי פגיעה במערכת ה-CRISPR-Cas אשר מגינה על החיידק. ישנן שתי דרכי פעולה עיקריות בהן פועלים חלבוני האנטי קריספר, מניעת הריסת המידע הגנטי של הפאג' אשר הוחדר לתוך תא החיידק וכן רצף הדבקות, כאשר הפאג' הראשון מייצר פלטפורמה המאפשרת לפאג' הבא שיתקוף את אותו התא לשרוד.
מניעת הריסת גנום הפאג'.
אחד מהתפקידים העיקריים של חלבוני האנטי קריספר הוא להיות באינטראקציה ישירה עם מרכיבים של מערכת ה-CRISPR Cas, בין היתר הנוקלאזות, במטרה למנוע את פעולתן ולחסום את הרס הגנום של הפאג'.
תהליך התקיפה מתחיל בכך שהפאג' מחדיר את הגנום שלו לתוך חיידק. לרוב, החיידק מזהה את הרצף שהוחדר אליו על ידי הפאג', דבר המעורר את מערכת ה-CRISPR-Cas על מנת להרוס את הגנום הזר ולמנוע שכפול של הפאג'. למרות זאת, אם קיים בגנום שהוחדר רצף ראשוני המקודד לחלבוני אנטי קריספר ייתכן שהם ימנעו את הרס הגנום של הפאג'. הרצף הראשוני המדובר נמצא לפני מקטע המטרה אשר מזוהה על ידי מערכת ה-CRISPR-Cas ולכן נוצר לפני שרצף המטרה נקרא. כך פעילות מערכת החיסון של החיידק נחסמת לפני שהחלה את פעולתה.
הדבקה משנית.
חיידקים בעלי מערכות CRISPR-Cas חסינים באופן חלקי לפאג'ים המקודדים חלבוני אנטי קריספר מקודד (נקראים גם Acr-phages). לעיתים, לאחר הדבקה ראשונית של Acr-phages נוצרת הדבקה משנית על ידי פאג' אחר, כלומר בסיום התהליך יש הדבקה מוצלחת. הפאג' הראשון חוסם את מערכת החיסון של החיידק, CRISPR-Cas, כדי לאפשר שכפול של ה-Acr-phage הבא שיתקוף. רצף אירועים זה, פאג'-פאג', יכול להוביל לנקודות מפנה אפידמיולוגיות בהן הריכוז הראשוני של Acr-phage יכול להטות את המצב בתא המארח מהכחדת הפאגים למגפת הפאג'ים.
מחקרים הראו כי הריכוז התוך-תאי של חלבון אנטי קריספר אשר דרוש לצורך השבתה של מערכת ה-CRISPR-Cas תלוי ביחסים של המעכב (חלבוני אנטי קריספר) למול החסינות של מערכת ה-CRISPR-Cas. מכך נובע כי תא בודד יכול להיות מדוכא חיסונית על ידי חלבוני אנטי קריספר שנכנסו לתא מאירועי הדבקה בודדים. בהיעדר שכפול ויראלי, אירועי הדבקה כאלה יכולים להוביל להפסקת החסינות התאית, ובכך להגדיל את ההסתברות לאירועי הדבקה מוצלחים בעתיד.
מכך נובע כי אינטראקציות בין חלבוני אנטי קריספר המקודדים על ידי הפאג'ים לבין מערכות ה-CRISPR-Cas שבהם החלבונים מיועדים לפגוע, מעצבים את הדינמיקה של אוכלוסיית החיידקים.
שימושים.
הספציפיות הגבוהה של הנוקלאזות מסוג CRISPR-Cas והיכולת ל"תכנת" אותן בקלות משמשות ליישומים מולקולריים, ביו-טכנולוגיים ורפואיים שונים, כולל עריכת גנים, ביצוע נוקאאוט גנטי וויסות גנים. עם זאת, חרף היתרונות המהפכניים שמציעות מערכות ה-CRISPR-Cas, עדיין יש כמה אתגרים ליעילותן ולבטיחותן של טכנולוגיות אלה. לדוגמה, פעילות נוקלאזית של Cas בתאים במהלך עריכת vivo in או ex vivo יכולה להוביל להשפעות מחוץ למטרה (off-target), להשפעות בלתי צפויות, להרעלה תאית, ולאימונוגניות. יש צורך לטפל ולהתייחס לבעיות אלו בכל הפיתוחים של יישומים לעריכה גנטית.
שימוש בחלבוני אנטי קריספר יכולה להגביל עריכה באזורים שאינם אתר המטרה של אנזים ה-Cas. לדוגמה, חלבון AcrIIA4 הוא אחד מהחלבונים האחראים על עיכוב מערכת CRISPR-Cas9, אשר משמש כיום עבור עריכה גנטית בתאים של יונקים. כאשר מכניסים AcrIIA4 לתאים אנושיים, הוא מונע את האינטראקציה של Cas9 עם מערכת CRISPR, ועל ידי כך מפחית את יכולת המערכת לחתוך DNA. עם זאת, מחקרים הגיעו למסקנה כי הוספתו של חלבון האנטי קריספר כמה שעות לאחר הכנסת ה-Cas9, מפחיתה את מספר החיתוכים מחוץ לאזור המטרה באתרים בהם מתבצעת אינטראקציה עם Cas9. זאת מכיוון שלאחר שמתבצעת עריכה באתרי המטרה, Cas9 מבצע גם עריכה באזורים אחרים. לכן שימוש בחלבון אנטי קריספר גורם לתהליך העריכה הגנטית להיות מדויק הרבה יותר.
דוגמאות לשימושים אפשריים נוספים בגנים של Acr בפרוקריוטיים:
סוגים.
שמות חלבוני האנטי קריספר נקבעים על פי המערכת אותה הם מעכבים ועל פי סדר הגילוי שלהם. לדוגמה, חלבון AcrIIA4 הוא החלבון הרביעי שזוהה מתוך החלבונים אשר מעכבים את מערכת CRISPR-Cas מסוג II-A וכך נקבע שמו.
הטבלה מציגה סיכום של סוגי האנטי קריספר המוכרים, כולל סיווג עבור הדרך שבה החלבונים מבצעים עיכוב אם המנגנון זוהה. בין היתר זוהו כמה חלבוני Acr אשר מעכבים מערכות ממספר תתי סוגים.
שאלת המלוכה
שאלת המלוכה הייתה משבר פוליטי נרחב בבלגיה בשנים 1945–1951, והגיע לשיאו במרץ–אוגוסט 1950.
ה'שאלה' הייתה האם המלך לאופולד השלישי, מלך הבלגים יכול לשוב לבלגיה ולקבל את תפקידיו הציבוריים על רקע הטענות כי מעשיו בעת מלחמת העולם השנייה היו בניגוד להוראות החוקה הבלגית. המשבר נפתר באוגוסט 1950, כשלאופולד החליט לוותר על כסאו עבור בנו, המלך בודואן, מלך הבלגים. המהלך יצא לפועל ביולי 1951.
היסטוריה.
בשנת 1940, בעת הקרב על בלגיה במהלך מלחמת העולם השנייה, ניסה המלך לאופולד להשליט משטר סמכותני, ועם פרוץ המלחמה לקח שליטה על הצבא הבלגי.
לאופולד סירב להצטרף לממשלה הבלגית הגולה בצרפת, וב-28 במאי 1940 הודיע על כניעה לגרמנים, בניגוד לדעתו של ראש ממשלת בלגיה איבר פיירלו. פיירלו ושריו עברו לצרפת שעדיין נלחמה, והכריזו משם שכניעתו של לאופולד לא הייתה חוקית, וכי על הצבא הבלגי להמשיך במאבק בכל מצב.
במהלך כל המלחמה הוחזק המלך לאופולד במעצר בית בארמונו, וזמן קצר לפני שבעלות הברית שחררו את בלגיה - גורש לגרמניה על ידי הנאצים.
בעת שחרור בלגיה המלך עדיין היה בשבי, ולכן מונה אחיו, הנסיך שארל, רוזן פלנדריה, לעוצר, כשהמלך הוכרז כ"אינו מסוגל לשלוט". תושבי המדינה נחלקו בשאלה האם המלך יכול לשוב לתפקידו או לא, ובינתיים הוא נשלח לגלות בשווייץ.
בשנת 1950 עלתה לשלטון ממשלת מרכז-ימין, שערכה משאל עם שבו ניצחו אוהדי המלך בהפרש קטן. תוצאות משאל העם גרמו למחלוקת גדולה בין תושבי פלנדריה הפלמים, שתמכו בהחזרת המלך לאופולד, לתושבי ולוניה ומחוז בריסל, שהתנגדו למהלך.
ביולי 1950 שב המלך לבלגיה. שובו לווה בשביתה כללית בוולוניה, ובהפגנות ענק שהסלימו לאחר שנהרגו בהן ארבעה מפגינים מירי שוטרים. ב-1 באוגוסט, על מנת למנוע הסלמה נוספת, הודיע המלך לאופולד כי הוא החליט לוותר על כסאו עבור בנו, המלך בודואן, מלך הבלגים. הדבר יצא לפועל ביולי 1951.
צבי ריזל
צבי (הרברט) ריזל (Zvi Herbert Riesel; 14 במרץ 1922 - 2 בספטמבר 2002) היה מחלוצי המחשוב בישראל, מבוני המחשבים הראשונים בישראל - הוויצק והגולם. על כך הוענק לו פרס רוטשילד להנדסה לשנת 1969.
ביוגרפיה.
ריזל נולד ב-1922 בעיר האלה שבגרמניה, לדינה ומיכאל ריזל. ב־1937 עלה עם הוריו ואחיו לארץ ישראל, אחרי שרבים מבני משפחתו היגרו לארצות הברית, לברזיל, לדרום אפריקה ולאנגליה. משפחתו שנותרה בגרמניה נספתה בשואה. המשפחה התיישבה בתל אביב. למרות כישרונו הלימודי לא התאפשר לו להשלים את לימודי התיכון בארץ מטעמים כלכליים, והוא נשלח לעבוד כשוליה למתקן מכשירי רדיו (פיליפס).