הדמות הראשית במשחק היא Ratohnhaké:ton (יש לבטא רא-דון אה גיי דו), הידוע בשם הבדוי קונור קנוויי (Connor Kenway), שאביו בריטי ואמו מוהיקנית (ולכן שמו מוהיקני), אשר נלחם למען ארגון המתנקשים (Assassins), אך בפועל פועל לפי רצונותיו שלו, שהם להגן על כפרו ולהביא לחירות בארצו.
במהלך המשחק קונר מבצע את משימות העלילה, שמטרתם השתלטות האמריקאים על הארץ וגירוש הבריטים. במשחק מתוארים אירועים אמיתיים רבים כמו טבח בוסטון, מסיבת התה של בוסטון, קרב גבעת בנקר ועוד. בכל השחקן יכול לצאת ממשימות העלילה ולהסתובב ברחובות, שם הוא יכול לשחרר את הערים מהטמפלרים, להכין חפצים, לבצע משימות איסוף, לצאת למלחמות ימיות, לגלות מעברים תת-קרקעיים חדשים ועוד. הכמות הרבה של המשימות מחוץ לעלילה הראשית מהוות חלק נכבד מהמשחק.
לקונור יש מספר כלי נשק וכלים. בכל עת הוא יכול לאחסן עד שני דברים - אחד לנשק לטווח קרוב (כגון חרב, גרזן, להב מוחבא וכו'), ואחד לנשק לטווח רחוק או לכלים אחרים (חץ וקשת, אקדח וכו'). מלבד יכולת להרוג בני אדם, קונור יכול גם לצוד בעלי חיים בעזרת כלי הנשק והכלים - איילים, ארנבות, זאבים ועוד. את בעלי החיים שניצודו הוא יכול למכור בחנויות ולהרוויח כסף.
עלילה.
לפי המשחק, מאז תחילתה של האנושות קיימים שלושה סוגי אנשים: טמפלרים - אנשים שמטרתם היא לשלוט על אנשי העולם כדי לשמור על סדר ושגרה ולמנוע כאוס. מתנקשים - אנשים המאמינים כי לכל אדם מגיע חופש (דבר שנוגד את מטרת הטמפלרים) ובחירה חופשית. הסוג השלישי הוא האנשים הפשוטים שאינם בעד שום אידאולוגיה. הטמפלרים מנסים לשלוט עליהם (כחלק ממטרתם) והמתנקשים הודפים מנגד את הטמפלרים, דבר שגורם ליריבות ושנאה תמידית בין שתי הקבוצות.
במשחקים הקודמים אדם בשם דזמונד מיילס נחטף על ידי חברת אבסטרגו. אנשי החברה מחברים את דזמונד למכשיר הנקרא אנימוס - מכשיר אשר נותן לאדם המשתמש בו יכולת לשחזר את זכרונותיהם ופעולותיהם של אבותיו הקדומים.
לאחר שדזמונד משחזר את זכרונותיו של מתנקש ערבי-מוסלמי מהמאה ה-12 בשם אלטאיר, אנשי אבסטרגו כולאים את דזמונד במפעל הראשי של החברה ומתכננים להרוג אותו. דזמונד בורח יחד עם אישה בשם לוסי סטילמן מהמפעל הראשי של תעשיות אבסטרגו, בה הוא כלוא.
לאחר שהוא בורח הוא פוגש את רבקה קריין ושון הייסטינגס אשר בנו מכשיר זהה לזה של האנימוס של אבסטרגו, בשם אנימוס 2.0.
דזמונד מתחבר לאנימוס 2.0 ומשחזר את זיכרונותיו של אציו אודיטורה דה פירנצה - מתנקש איטלקי בן המאה ה-15. לאחר מכן משתלטת על דזמונד רוח בשם ג'ונו שגורמת לו להרוג את לוסי סטילמן. לאחר שהוא משתחרר מהרוח אנשי אבסטרגו כמעט מוצאים אותו אך הוא בורח יחד עם רבקה, שון ואביו ביל לניו יורק כדי למצוא מקום חדש להפעיל בו את האנימוס וכדי לברוח מאנשי אבסטרגו.
העלילה מתחילה כאשר דזמונד מיילס, ביל, שון, ורבקה מגיעים למקדש גדול בתוך מערה שנמצאת מתחת לניו יורק. הם מרכיבים שם את האנימוס, ומגלים מספר מקומות במערה הדורשים מקורות כוח ומפתח (מדליון). דזמונד מתחבר לאנימוס, אותה מכונה המראה למשתמש בה את זיכרונות אבות-אבותיו (אלו של דזמונד היו מטובי המתנקשים בעולם, חברי ארגון המתנקשים). הפעם הוא משחזר את זיכרונותיו של טמפלר בריטי, היית'ם שמו, החי במאה ה-18.
היית'ם נכנס לבית אופרה, ושם הוא רוצח מישהו בעל מדליון ולוקח אותו. לאחר שהוא בורח מבית האופרה הוא מגיע לישיבה של מסדר הטמפלרים הבריטי בו הוא חבר, שם הם מסיקים שהמדליון הוא מפתח של מחסן של "אלה שבאו קודם". רג'ינלד בירץ', האחראי על הארגון, נותן להיית'ם רשימה בעל שמות של אנשים שיעזרו לו למצוא את המחסן. הם שולחים את היית'ם לאמריקה לחפש את אותו המחסן שאותו המפתח פותח. היית'ם עולה על ספינה בדרך לאמריקה, שם נמצא איש אשר יודע על קיומו של הרצח באופרה, והשאיר אחרי הספינה בה היית'ם נמצא עקבות כדי שספינות אחרות יכבשו את הספינה. היית'ם חומק מהספינות, ומגיע לבסוף לבוסטון שבאמריקה.
היית'ם מגיע לבוסטון, שם פוגש טמפלר בריטי שהיגר לארצות הברית בשם צ'ארלס לי. הוא מכיר להיית'ם את העיר. לאחר מספר חודשים, היית'ם משיג את כל האנשים מהרשימה ויוצר את מסדר הטמפלרים האמריקאי (תחת מסדר הטמפלרים העולמי), ולבסוף הם מתכנסים יחד לשיחה. הם מנסים להעלות השערות בקשר למדליון, ומבצעים מספר משימות התנקשות. תוך שרשרת משימות למען שחרור האינדיאנים מעבדות, היית'ם הגיע למערה (ל"מחסן"), וגילה להפתעתו כי המדליון לא משפיע על דלת המערה והיא לא נפתחת. רגע אחרי שמגלה הוא כי אין הדלת נפתחת, הוא מתאהב באינדיאנית שפגש תוך כדי שיחרורה, היולדת לו את בנו הבכור רטונאנהקטון (קונור בעתיד), ומגדלת אותו. בינתיים היית'ם, שמתברר כמנהיג את מסדר הטמפלרים האמריקאי, מחליט לקבל את צ'ארלס כחבר מן המניין, ומשביע אותו לארגון הטמפלרים. הדבר מפתיע שכן עד כה חשבו כי היית'ם הוא מארגון המתנקשים ולא חבר הארגון היריב.
לאחר מכן, רואים את רטונאנהקטון (Ratonhnhaké:ton), אינדיאני מכפר בשם קאנאטאסטון (Kanatahséton) כילד צעיר משחק מחבואים עם חבריו. שם תופס אותו בחוזקה צ'ארלס לי - יד ימינו של היית'ם אביו, המצווה עליו לגלות לו איפה הכפר שלו, אך רטונאנהקטון לא מוכן לגלות. צ'ארלס לי מטיח את רטונאנהקטון לאדמה ורטונאנהקטון מבטיח שהוא ינקום. אחד מעוזריו של צ'ארלס מכה את רטונאנהקטון בראשו בעזרת כת של רובה והוא מתעלף. כאשר הוא קם וחוזר לכפר, הוא מוצא אותו עולה בלהבות (ומבין שצ'ארלס לי מצא את המחנה) ואת אמו תקועה מתחת לערימת עצים, נשרפת למוות. היא אומרת לו לעזוב אותה ושהיא אוהבת אותו. אחרי תשע שנים, זקנת השבט מהמחנה החרוך ששוקם, מראה לרטונאנהקטון התגלות של ג'ונו, אישה מ"אלו שבאו מקודם" רבת עוצמה, שמסבירה לו מה עליו לעשות ומראה לו את סמל המתנקשים שעליו למצוא. זקנת השבט אומרת לו ללכת לאכילס (מתנקש לשעבר) כדי שיאמן אותו להיות מתנקש. בתחילה אכילס מסרב לקבל את רטונאנהקטון כתלמיד אבל לאחר שהוא מראה אומץ וכישורים מתאימים מתחיל אכילס לחבב אותו. הוא מלמד אותו להיות מתנקש, משנה את שמו לקונור, ומסביר לו את סיפור אבותיו והמלחמה של המתנקשים (שבמערכה זו בעד האמריקאים) נגד הטמפלרים (שבמערכה זו משתפים פעולה עם הבריטים).
6 חודשים לאחר מכן קונור מגיע עם אכילס לבוסטון שם הם נמצאים ליד כנסייה שבה אנשי העיר מנסים למרוד בחיילים הבריטים, קונור רואה את היית'ם, אביו, ומציע להורגו. אז הוא מגלה שצ'ארלס לי נמצא על גג ויורה ירייה שפותחת קרב בין החיילים הבריטים לאזרחי בוסטון (טבח בוסטון). היית'ם מגלה את קונור ומורה על חייליו להרוג אותו אך קונור מצליח לברוח ופוגש את סמואל אדמס (אחד מהאבות המייסדים של ארצות הברית כיום) שמראה לו מערכת מנהרות תת-קרקעיות המאפשרות לו לעבור לכל מקום מבלי שיגלו אותו.
בינתיים אכילס ממשיך לאמן את קונור, למען התנקשותו של קונור באנשי מסדר הטמפלרים האמריקאי של היית'ם. השניים הראשונים הם ויליאם ג'ונסון, וג'ון פיטקיירן. לאחר ההתנקשויות בשניים הראשונים, הוא מנסה בלא הצלחה להתנקש בת'ומס היקי. זה מכניס אותו לכלא, ולאחר בריחה נועזת, קונור נשלח להוצאה להורג. בעזרתו של אכילס הוא בורח, ובדרך הוא מחסל את היקי. אחרי מספר משימות נוספות קונור פוגש שוב את היית'ם, המציע לו לשתף פעולה ברצח בנג'מין צ'רץ', עוד איש ממסדר הטמפלרים, שבגד במסדרי הטמפלרים האמריקאי והעולמי. קונור, מהיותו טיפוס תמים, מסכים על אף חילוקי הדעות ביניהם לשתף פעולה, והם מחסלים אותו.
היית'ם מנסה לשכנע את קונור בצדקת דרכם של הטמפלרים, ואף אומר כי ג'ורג' וושינגטון אינו אדם כה טוב כפי שחשב. הם נוסעים לפילדלפיה, שם היית'ם מגלה כי וושינגטון יצר תוכנית להשמדת כפרו של קונור, והוא מראה לו זאת. קונור כועס על וושינגטון, אך גם על היית'ם, כי הוא חושב שזה ידע זאת קודם ולא כעת בדרך מקרה (דבר שאכן נכון), ומפרק את הברית ביניהם. קונור רץ אל הכפר, שם מגלה כי זקנת הכפר, שלחה את חייליה, שיהרגו את החיילים שוושינגטון שלח. קונור בלית ברירה הורג את חיילי הכפר, כדי למנוע קונפליקט, אך מגלה כי חבר הילדות שלו עבר שטיפת מוח על ידי צ'ארלס לי שסיפר לו שקונור עבר לצד של וושינגטון ושהוא רוצה להשמיד את הכפר כדי לבנות עליו מושבה אמריקאית, ולכן הוא חושב שקונור הוא בוגד. הוא פוגע בקונור וזורק אותו לרצפה. חבר הילדות של קונור לוקח סכין ומנסה לדקור את צווארו של קונור על הרצפה. לאחר היאבקות קצרה מצליח קונור לשחרר את ידו ולשלוף סכין, איתה הוא דוקר את חברו באזור העורק הראשי והורג אותו. קונור רוכן מעל הגופה ומבקש סליחה.
לאחר מכן, קונור יוצא למסע להריגת אבו כי הוא מאמין שהוא זה שאמר לצ'ארלס לשטוף את מוחו של חברו, ולבסוף הורג אותו. אביו אמר לו רגע לפני המוות, שהוא גאה בו בדרך מסוימת ושהיה צריך להרוג אותו לפני הרבה זמן.
קונור לאחר מכן מתכנן לחסל את צ'ארלס לי (האדם האחרון שנותר במסדר הטמפלרים האמריקאי).