הנשא המעגלי מבוקע על ידי אנזים הגבלה (אחד או יותר) ליצירת DNA ליניארי. ביקוע כזה יכול להותיר קצוות קהים (שיכולים לעבור ליגציה עם כל קצה קהה אחר, ללא תלות ברצף) או קצוות דביקיים (בהם אחד הגדילים ארוך מהשני, וזמין ליצור זיווג בסיסים, ראו איור). חיתוך הנשא ומקטע ה-DNA באנזים זהה (או שמשאיר קצה דביקי זהה) מאפשר לתכנן את כיווניות החיבור, ונחשב ספציפי יותר. רוב הפלסמידים הנמצאים בשימוש מכילים אזורי הכרה לאנזימי הגבלה, שהם אזורים המכילים סדרה של אתרי הכרה ייחודיים לשורה ארוכה של אנזימי הגבלה. אם הסדרת ממוקמת בגן כמו בטא גלקטוסידאז, ניתן להשתמש בו לברירת הפונדקאים בשלב מאוחר יותר. בכדי למנוע סגירה חוזרת של הנשא (ויצירת חיוביים שגויים), ניתן להשתמש בשני אנזימים שונים מאזור ההכרה אשר אינם יוצרים קצוות דביקיים משלימים, ובנוסף להשתמש בפוספטאז, המוריד את הזרחן ובכך מונע ליגציה עצמית. רק אם יוחדר שם מקטע DNA שישלים את הפלסמיד יתבצע שכפול בפונדקאי.
3. הכנת המקטע המיועד לשיבוט.
בכדי לשבט מקטע גנומי, יש לבודד את המקטע מתוך הגנום. מכיוון שרוב התאים בייצור מכילים את כלל ה-DNA של היצור, ניתן להשתמש בכל רקמה כמקור (כולל רקמות של חיות שנכחדו), כל עוד ה-DNA לא התפרק. ה-DNA עובר ניקוי בכדי להסיר חלבונים, RNA ומולקולות קטנות אחרות, ולאחר מכן מקטע ספציפי מוגבר באמצעות PCR. ניתן להשתמש גם ב-RNA, באמצעות המרתו ל-DNA בתגובת RT-PCR.
ניתן לחלופין לעצב DNA סינתטי. דבר זה נדרש בכדי להתאים את הרצף לקוד הגנטי כאשר מעבירים גן בין מערכות שונות (לדוגמה, בין הגרעין למיטוכונדריה), או באמצעות אופטימזציה של הקודונים בכדי להעלות את רמות הביטוי.
אם נעשה שימוש בקצוות DNA קהים, אין צורך לבצע שלב נוסף. אם נעשה שימוש בקצוות DNA דביקיים, מקטע ה-DNA מבוקע גם כן על ידי אנזימי הגבלה שיתירמו לרצף הדביק של הנשא. אם רצף ה-DNA לא מכיל אתר הכרה של אנזים הגבלה מתאים, ניתן בשלב ה-PCR להוסיף בתחל רצף הכרה לאנזים הרצוי.
4. יצירת פלסמיד DNA רקומביננטי על ידי ליגציה של הנשא עם המקטע.
בכדי לחבר את הנשא (שנמצא במצב ליניארי, בעקבות הביקוע בשלב 2) עם מקטע ה-DNA, מדגירים את שני המרכיבים במבחנה יחד עם DNA ליגאז, היוצר קשר קוולנטי בין קצוות DNA. ה-DNA ליגאז עובד בצורה אקראית, כך שמלבד התוצר הרצוי עשויים להיווצר תוצרים נוספים, כמו נשא שנסגר מחדש ללא מקטע ה-DNA, נשא המכיל שני מקטעי DNA ברציפות וכדומה. אם הנשא בוקע בצורה שהשאירה קצוות קהים, מקטע ה-DNA יתחבר בשתי אוריינטציות. במצב של קצוות דביקיים, הכיווניות אמורה להישמר לפי זיווג הבסיסים.
בשלב זה ניתן לבקע שוב את ה-DNA באנזים הגבלה שיבקע תוצרים לא רצויים, כמו נשא שנסגר על עצמו, ובכך להוריד את הרקע.
5. הכנסת הפלסמיד לפונדקאי.
ישנן שיטות רבות להחדיר DNA לתוך תאים חיים, והשם של שלב זה ישתנה לפי השיטה (לדוגמה: טרנספורמציה, התמרה, טרנספקציה, אלקטרופורציה). כאשר חיידק מסוגל להכניס ולשכפל DNA מהסביבה, הוא נקרא חיידק קומפטנטי. בכדי להפוך חיידק להיות קומפוטנטי, נדרשים תנאי גידול מיוחדים וטיפול בחומרים כימיים מסוימים המשתנים בין הזנים השונים שבשימוש.
6. גידול אוכלוסיית הפונדקאים וברירת אלו המכילים את הפלסמיד.
היעילות בכל אחת מהשיטות הידועות להכנסת DNA לפונדקאי נמוכה, כך שרק אחוז קטן מהפונדקאים אכן יכניסו את הפלסמיד לתוכם. באמצעות הגן המשמש לברירה מדענים יוצרים ברירה גנטית המאפשרת רק לפונדקאים המכילים את הפלסמיד להתרבות. בחיידקים השימוש הנפוץ הוא בגן עם עמידות לאנטיביוטיקה אשר נמצא בפלסמיד, והאנטיביוטיקה מוספת למצע הגידול. רק חיידקים בעלי עמידות (אותה רכשו באמצעות הפלסמיד) ישרדו.
7. סריקה של השיבוטים לזיהוי המקטע הרצוי.
מבין החיידקים ששרדו את שלב הברירה, יש לאתר את החיידקים המכילים את הפלסמיד הרצוי. ישנן מערכות המתבססות על שינוי צבע, וכך ניתן לאתר בצורה חזותית מושבות חיידקים המכילות את הפלסמיד. כמעט תמיד ישנו צורך לבדוק מספר מושבות בכדי לאתר את אלו המכילות את הפלסמיד המדויק הרצוי. ישנן שיטות רבות לבצע זאת, כמו תספיג DNA, תספיג חלבון, PCR, ריצוף DNA.
יישומים.
שיבוט מולקולרי מאפשר למדענים ליצור כמויות רבות של מקטעי DNA מכל מקור, היכולים לשמש הן לתחומי מחקר בסיסי והן לשימושים יישומיים. להלן כמה דוגמאות:
ארגון גנום וביטוי גנים.
שיבוט מולקולרי הוביל בצורה ישירה לפענוח גנומים של יצורים רבים ולמחקר אודות הגיוון הגנומי. מגבלות הריצוף למקטעים קצרים הצריך את חלוקת הגנום למקטעים קטנים, שעברו שיבוט, ובאמצעות חיבור החלקים החופפים הורכבו הגנומים.
ברמת הגן הבודד, שיבוטים גנטיים משמשים ליצירת גלאי ביולוגי, המשמש למדידת רמות ביטוי של גנים, וכיצד רמות ביטוי אלו קשורות לתהליכים ביולוגיים שונים, כולל הסביבה המטבולית, אותות חוץ תאיים, התפתחות, למידה ומוות תאי. גנים משובטים משמשים כלים בכדי לבחון פעילות ביולוגית וחשיבות של גנים בודדים, באמצעות ביצוע מניפולציות שונות על הרצף ומדידת התוצאות.
יצירת חלבונים רקומביננטיים.
כאשר ישנו רצף DNA תקין, ניתן להכניסו למערכת המסוגלת לבטא את החלבון המצוי בו. משימה זו קשה עשרות מונים מאשר שיבוט DNA, מכיוון שלחלבון דרושים אותות רבים נוספים, וכן נדרש קיפול, יציבות, הובלה ומודיפקציות שונות. עם זאת, ישנם חלבונים רקומביננטיים שונים הזמינים כיום לשימוש, ובהם:
יצורים טרנסגניים.
באמצעות שיבוט מולקולרי ניתן ליצור אורגניזמים מהונדסים גנטית (GMO). אף על פי שרוב היצורים מהונדסים גנטית לצורכי מחקר, ישנן יצורים שונים ששובטו לצרכים מסחריים, כמו יצירת זני צמחים עמידים לקוטלי עשבים, ייצור תרופות בתאי צמחים ויצירת דגי נוי (GloFish).
ריפוי גני.
בתהליך ריפוי גני מספקים לתא גן פעיל כתחליף לגן פגוע (בצורה גנטית או נרכשת). השימוש בריפוי גני עוד נמצא בחיתוליו, אך צופים לו עתיד מזהיר.
דוכס קווינסברי
דוכס בקלאוך
דוכס בקלאוך (באנגלית: Duke of Buccleuch) הוא תואר אצולה סקוטי, הניתן בממלכה המאוחדת. התואר ניתן לעומד בראש שבט סקוט והוא קרוי על שם אזור בקלאוך בגבול הסקוטי והענף המרכזי של שבט סקוט. דוכסות בקלאוך נוסדה פעמיים, לראשונה ב-1663 כאשר קיבל ג'יימס סקוט, דוכס מונמות' הראשון את התואר, אך מספר חודשים לאחר מכן נלקחו ממנו תאריו לאחר מרד מונמות', ובשנית כאשר אשתו אן סקוט קיבלה את התואר מחדש מידי הכס הבריטי. דוכס בקלאוך השלישי ירש גם את דוכסות קווינסברי ומאז הדוכסויות ניתנות בירושה יחד.
לצד התואר 'דוכס בקלאוך' ו-'דוכס קווינסברי' שאר תוארי הדוכס כוללים תארים קודמים שנותרו, כאלו שנוספו או כאלו שהתמזגו מנישואים וכדומה: מרקיז דמפרישייר, רוזן בקלאוך, רוזן דלקיית', רוזן דונקסטר, רוזן דרמלנריג וסנקאר, ויקונט נית' טורת'ולוולד ורוס, ברון סקוט מטינדייל, לורד סקוט מבקלאוך, לורד סקוט מוויטצ'סטר ואסקדייל, ולוד דאגלס מקילמאונט מידלבי ודורנוק. הדוכסות מחזיקה במספר אחוזות, בהן בית באוהיל, טירת דרמלנריג, בית באוטון וארמון דלקיית' (בבעלות הדוכסות אך לא בשימושה).
סמל הדוכסות.
שלט האצולה של הדוכסות מורכב ממגן המחולק לארבע רבעים, כל רבע מייצג בית אחר הקשור בדוכסות וכולל בתוכו שני זוגות סמלים זהים. בקדמת השלט מוצב שלט האצולה של שבט סקוט
חואקין קוראה
טשיקאפה
טשיקאפה (באנגלית: Tshikapa) היא עיר הבירה של מחוז קסאי ברפובליקה הדמוקרטית של קונגו. העיר ממוקמת כ־64 קילומטרים מצפון לגבול עם אנגולה ו- 190 קילומטרים מערבית לעיר קאנאגה. היא ממוקמת במפגש הנהרות טשיקאפה וקסאי. על פי רישומים שפרסמה ספריית אוניברסיטת אוטרכט בהולנד, אוכלוסיית העיר גדלה מ־38,900 בשנת 1970 ל 180,900 בשנת 1994. עם זאת, שתי מלחמות קונגו האחרונות גרמו לשטף רב של פליטים עובדה הופכת את הנתונים לבלתי אמינים.
ליד העיר טשיקאפה נמצא אתר לכריית יהלומים מאז הקמתה בתחילת המאה ה-20. העיר הוקמה על ידי פורמניאר (Forminière) , שהיה קונסורציום כרייה אמריקאי / בלגי שגילה יהלומים בקרבת העיר בתחילת המאה העשרים.
בעיר נמצא שדה התעופה טשיקאפה . ענף היהלומים הוא ענף התעסוקה העקרי בעיר.
שדה התעופה אינו מצופה אספלט כמו כן גם יתר הדרכים אחרות אינן סלולות (נכון לשנת 2012).
היסטוריה.
בשנת 1907, באזור של אדמת חמרה אדומה על גדות הנהרות קסאי וטשיקאפה, גילה הגאולוג מחפש המחצבים ג'אן ז'דוט Jean Jadot מחברת פורמניאר, את היהלום הראשון של קסאי . מיד החל המרוץ אחר חיפוש האבנים היקרות והקמת היישוב טשיקאפה. תוצאה נוספת מתגלית זו הייתה, ירידה חדה באזור בעיסוק בחקלאות, לטובת פעילות הכרייה וסחר היהלומים. בעיר התפתחו עשרות מתחמי כריית יהלומים. שני המתחמים הראשונים שנפתחו היו של חברת מלטקס-Meltax, חברה בת של חברה שווצרית מציריך, וחברת בריטמונד-Britmond, חברה בת של חברה בריטית. שתי החברות התמחו בכרייה ועיבוד יהלומים. שלושה רבעים מהגברים, צעירים בפרט שחיו בעיר, עסקו בחיפושים בנהרות או בכרייה באדמה, במכרות פתוחים. בעיר קמו דלפקי יהלומים שהיוו עם הזמן "שוק פשפשים" ליהלומים גולמיים, שקבל את פני המוכרים בחופשיות. האינטרס העיקרי של תושבי טשיקאפה התרכז בשוק היהלומים. שאר העיר הייתה נטושה. אוכלוסיית העיר בשנת 1951 הייתה 5,552 נפש .
גאוגרפיה.
היישוב ממוקם במפגש של נהר טשיקאפה ונהר קסאי על הכביש הלאומי מספר 1 במרחק 842 קילומטרים דרומית-מזרחית לבירה קינשאסה. העיר משתרעת לאורך שתי גדות הנהר קסאי המחוברות ביניהן באמצעות גשר מתכת.
אקלים.
האקלים בטשיקאפה הוא אקלים טרופי לח.
ישנן שתי עונות:
אוכלוסייה.