הרעיון של ריצוף DNA בשיטת תעלות מרצפות הוצע בתחילת שנות ה-90 של המאה ה-20 בידי שתי קבוצות שעבדו באופן עצמאי: האחת בראשות Mark Akeson והשנייה בראשות Jens Gundlach. שתי הקבוצות גילו שניתן להעביר מולקולת DNA יחידה דרך תעלה חלבונית ביולוגית וכי זרם יונים שנמדד מהתעלה המרצפת בעת מעבר המולקולה דרך התעלה נותן מידע על רצף הנוקלאוטידים של המולקולה.
שיטת תעלות מרצפות.
עיקרון הריצוף בעזרת תעלות, מבוסס על כך ש-DNA חד-גדילי עובר דרך תעלה, והזרם היוני הנמדד, מעיד על סוג הנוקלאוטיד (אדנין (A), ציטוזין (C), גואנין (G) או תימין (T)) העובר בתעלה ברגע זה.
ריצוף בעזרת תעלות נעשה על ידי זיהוי האות החשמלי שנמדד מהתעלה בעזרת רישום אלקטרופזיולוגי של מתח הממברנה. האות החשמלי הוא פונקציה של הזרם היוני, המעיד על סוג הנוקלאוטיד.
ישנם שלושה עקרונות חשובים לביצוע מדידות אלקטרופזיולוגיות באמצעות תעלה:
מעבר היונים בתוך התעלה מהיר יותר מהמעבר של המולקולה הנמדדת. בכל 1μs (מיקרו-שנייה) של מעבר נוקלאוטיד ממולקולת ה-DNA בתוך התעלה מתקבל זרם של 20pA (פיקו-אמפר), שהוא שווה ערך למעבר של 124 יונים. כאשר מופיע זרם בתוך הממברנה שמכילה את התעלה, מתרחשות באלקטרודות שתי תגובות אלקטרוכימיות הפיכות:
בממברנה, היונים משתתפים גם ביצירת האות החשמלי הנמדד מהתעלה וגם ביצירת סיגנל הרעש. המדידה בתעלה מתקבלת בעקבות היונים שעוברים בתוך התעלה ומשלימים את המעגל האלקטרוכימי.
לכל אחד מהנוקלאוטידים ישנה תגובה אופיינית לו, כלומר נמדד זרם שונה מהתעלה. כאשר נוקלאוטידים מסוג פורין עוברים בתוך התעלה מתקבל סיגנל עמוק יותר מאשר כשעוברים נוקלאוטידים מסוג פרמידנים בתוך התעלה.
סוגים של תעלות מרצפות.
הסוגים העיקריים של ריצוף בעזרת תעלות הם תעלות ביולוגיות (Biological nanopores) ותעלות במצב מוצק (Solid-state nanopores).
תעלות ביולוגיות.
תעלות ביולוגיות (Biological nanopores) הן חלבונים היוצרים נקבוביות בממברנה שומנית, שדרכן יכולות לעבור מולקולות DNA. לתעלות הביולוגיות מספר יתרונות כאשר משתמשים בהן לאנליזה של מולקולת DNA בודדת:
אחד מהחלבונים הנפוצים בסוג זה של תעלות הוא (a-hemolysin pore (a-HL שקוטרו הפנימי הוא כ-2 ננומטר (2nm). תעלה זו מורכבת משבע תת-יחידות מונומריות, שהופקה מ-"Staphylococcus aureus". ייחודה של התעלה מתבטא בכך שהיא נותרת פתוחה ב-pH נייטרלי ובמתח יוני גבוה.
תעלות במצב מוצק.
תעלות במצב מוצק (Solid-state nanopores) עשויות לרוב מסיליקון, כאשר הסיליקון הנפוץ ביותר הוא סיליקון ניטריד. התעלות מיוצרות בשיטות שונות, כגון פיסול בעזרת קרן יונים ואלומות אלקטרונים. תעלות מסוג זה יוצרו לראשונה ב-2001, והפכו לאלטרנטיבה זולה ויעילה לתעלות הביולוגיות. היתרונות בשיטה הזו הם:
יתרונות השיטה.
ריצוף בעזרת תעלות מרצפות מאפשר לרצף מקטעי DNA ארוכים. יתרון זה יאפשר בעתיד לרצף מולקולת DNA גנומית בזמן קצר ובאופן יעיל תוך כדי קבלת מידע על שינויים שחלו ברצף הגנטי כמו מקטעים שהוספו, מקטעים שהוסרו וכו'. למעשה, ריצוף בשיטה זו אינו מוגבל באורך ה-DNA. לשיטה זאת יתרון נוסף: ניתן להשתמש בתעלה אחת לסוגים רבים של מולקולות DNA, כלומר השיטה אינה ספציפית אלא גנרית ולכן אינה דורשת הכנות מוקדמות, הגברה של המקטע וכדומה. יתרונותיה העיקריים של השיטה הם מהירות הריצוף ועלותו הנמוכה, הואיל והשיטה אינה דורשת שימוש באנזימים, כגון DNA פולמראז או בנוקלאוטידים מסומנים פלואורסצנטית, אך חסרונה העיקרי הוא אחוז שגיאה גבוה.
ייעול עתידי של המערכת.
נניח כי קיימת תעלת מרצפת אידיאלית שניתן להעביר בה מולקולת DNA. התעלה לא יוצרת אינטראקציה חזקה עם ה-DNA היא רק רחבה מספיק בשביל להכיל את מולקולת ה-DNA ואת זרם היונים שעובר בתוכה במהלך ריצוף ה-DNA. בנוסף, כל נוקליאוטיד מספק זרם יונים שונה במהלך מעבר בתוך התעלה. השאלה שעולה מתוך הנחה זאת ונשאלה על ידי חוקרים בנושא זה על מנת לפתח את הנושא ולהפוך את החזון למציאות:
האם תעלה יונית מסוגלת באופן ישיר לרצף גדיל של מולקולות DNA? על מנת שהחזון יהפוך למציאות יש להתמודד ולהמשיך לחקור את הקשיים שעלו בדרך.
מעבר מונחה מתח של פולינוקליאוטיד בתוך התעלה הוא מאוד פשוט, עדיין התנאים המיקרוסקופיים של המעבר של הגדיל בתוך התעלה לא נשלטים באופן מלא בגלל מגבלות פנימיות של תהליך ההעברה בתוך התעלה. לדוגמה, תהליך הדיפוזיה הטבעית לתוך התעלה עדיין לא נחקר באופן משמעותי מספיק בשביל להגיע למסקנות לגבי תהליך זה. בנוסף, תהליך המעבר של המולקולה הוא מהיר מאוד וכמעט בלתי ניתן למדידה. הפחתת המתח של המעבר מגדיל את זמני המעבר הממוצעים, אך תהליך הדיפוזיה (שמגביר את הרעש של המערכת) הופך לאיטי יותר אך גם לתהליך פחות מבוקר ומסודר. תוצאה זאת משאירה את החוקרים עם מידע בלתי מספק לקביעת רצף גדיל ה-DNA מסיבות שאינן בשליטתם.
בשביל לנסות ולפתור את בעיית המעבר ניסו להשתמש בדופלקס של DNA לא מזווג. הקינטיקה של התהליך צריכה להיות יותר מבוקרת בעזרת בחירת מתח התעלה וגודל הדופלקס. למרות זאת, DNA לא מזווג לא ייכנס לתוך התעלה בסיס אחר בסיס בשל המבנה של הדופלקס שהוא מבנה יציב יותר הבנוי מכמה נוקלאוטידים שלא מאפשרים מעבר בתעלה באופן של בסיס אחר בסיס. המסקנה הנ"ל מצריכה את החוקרים להרחיב את החומצות האמינו הפנימיות וכתוצאה מכך זמן הריצוף מתארך. משימה זאת יכולה להיות מאתגרת מאוד בעיקר מהסיבה שיש את הצורך להגדיל את הפוטנציאל של התעלה המרצפת לקרוא מקטעים ארוכים יותר ולאורך זמן ארוך יותר.
שיטת "צעד מוטורי תלוי אנזים" היא דרך נוספת לוויסות המעבר בתוך התעלה. בשיטה זאת משתמשים באנזים DNA פולימראז כדי להניע את גדיל ה-DNA הבודד להיכנס לתוך התעלה בסיס אחד בכל פעם, כך שגדיל ה-DNA נמשך לתוך התעלה בעזרת כוחות חשמליים. למעשה התהליך הוא סימולטני – בזמן שהאנזים DNA פולימראז מפלמר את גדיל ה-DNA מנוקלאוטידים שבתמיסה, הגדיל עצמו "משתחל" דרך התעלה המרצפת, ובכל פעם שהאנזים משלב נוקליאוטיד לשרשרת, נוקליאוטיד אחד נדחף לתוך התעלה. ניתן לבקר את היעילות של האנזים בעזרת שינוי הריכוז של הנוקלאוטידים בתמיסה, שינוי המתח או בחירה של אנזים פולימראז שונה ויותר יעיל למדידה. היתרון של "צעד מוטורי תלוי אנזים" יכול להוות התקדמות גדולה בתחום ולהוות פתרון יעיל לריצוף מולקולת DNA ארוכה במעט זמן ובכמה שפחות משאבים.
דוד קנוט
דוד קנוט (ברוסית: Довид Кнут ; 23 בספטמבר 1900 - 15 בפברואר 1955), שמו הספרותי של דוד מאירוביץ פיקסמן (ברוסית: Дувид Меерович [Давид Миронович] Фиксман), היה משורר רוסי יהודי וממייסדי המחתרת הצרפתית "הצבא היהודי".
ביוגרפיה.
תחילת הדרך ברוסיה.
דוד פיקסמן נולד בעיירה הבסרבית אורגיב באימפריה הרוסית (כיום אורחיי, במולדובה), בנו הבכור של בעל מכולת. את שנותיו הראשונות עשו הוא ומשפחתו בקישינב, לשם הוריו עברו בתחילת 1903, והוא למד בחדר ובבית הספר "מדינה ליהודים". בגיל ארבעה עשרה הוא החל לפרסם שירה בכתבי עת מקומיים, ובשנת 1918 ערך את המגזין "המחשבה הצעירה", כשהוא משתמש בשם העט דוד קנוט (אולי מהמילה קנוט, שברוסית וביידיש משמשת כסמל של דיכוי ועבדות).
בשנת 1920, כאשר הפך האזור לחלק מבסרביה שברומניה, עברה המשפחה לפריז.
כמשורר ועורך בפריז.
בפריז עבד קנוט במפעל ובעבודות אחרות, למד צרפתית בבית ספר ערב של "הברית הצרפתית", פתח מסעדה משלו ברובע הלטיני, למד במחלקה לכימיה של אוניברסיטת קאן בנורמנדי, ועבד כמהנדס.
קנוט לקח חלק בחיים התרבותיים של המהגרים בפריז ועזר לארגן את תערוכת "שלוש עשרה" ביולי 1922. הוא הצטרף לאיחוד של משוררים וסופרים צעירים, השתתף בעריכת המגזין "הבית החדש" ("Dom Novy") ותרם שירים לפרסומים שונים שהוציאו המהגרים. קובץ השירים הראשון שלו, "אלף שנים שלי" (Moikh tysyachiletii), הופיע בשנת 1925 והתקבל כבעל "אינטונציה תנ"כית וחיוניות מילולית". הקובץ השני שלו, שפורסם בשנת 1928, נסקר באהדה על ידי ולדימיר נבוקוב ששיבח את "הפסוקים האנרגטיים" שלו, אך התלונן על מעידות שונות של טעם.
בשנות ה-30 המוקדמות נפרד קנוט מאשתו הראשונה שרה, אם בנו דניאל, והתקרב לאריאדנה סקריאבינה, בתו של המלחין הרוסי אלכסנדר סקריאבין. באותו הזמן נעשה מעורב יותר ויותר באקטיביזם היהודי. הוא ואריאדנה ביקרו בארץ ישראל מאוגוסט עד דצמבר 1937 ובזמן הביקור, עיתון הארץ פרסם את אחד משיריו בתרגום לעברית. מינואר 1938 ועד ספטמבר 1939 הוא ערך את העיתון היהודי "ההצהרה" ותקף סופרים ואנשי רוח שגילו אהדה לאנטישמיות.
איש מחתרת.
בספטמבר 1939 גויס קנוט לצבא הצרפתי, ואריאדנה הקדישה עצמה בלהיטות לעניין היהודי. הם נישאו במרץ 1940 והיא התגיירה באותה עת. חודש לאחר מכן עברו בני הזוג לטולוז, ושם הקימו יחד עם אחרים מחתרת סודית בשם La, ראשי תיבות של "היד החזקה", שהפכה לצבא היהודי, תנועת התנגדות לצרפת של וישי במלחמת העולם השנייה. התנועה הצילה ממוות יהודים רבים. בדצמבר 1942, לאחר שנרדף על ידי הגסטפו, נמלט קנוט לשווייץ. אריאדנה ילדה את בנו יוסי במאי 1943. היא נהרגה על ידי אנשי המיליציה הצרפתית בזמן כינוס של אנשי המחתרת בדירתה בטולוז ביולי 1944, שבועיים לפני שחרור העיר.
לאחר המלחמה ועלייה לישראל.