בשנת 2010, בעקבות חפירת הצלה באתר התחנה המרכזית של באר שבע, התגלו שרידיה של העיר הביזנטית שהתקיימה במאות ה-5 וה-6. השרידים המשתרעים על-פני שטח גדול בהרבה מזה של התחנה נחפרו ונחקרו. עם הקמת המבנה החדש של התחנה, הוצבה בכניסה למבנה רצפת זכוכית שקופה מחוסמת, בגודל של כ-2 מ"ר, המאפשרת לעוברים ושבים להתבונן בעתיקות מלמעלה.
בתקופה העות'מאנית.
לאחר מאות שנים של חוסר עניין באזור הנגב, הביאה פתיחת תעלת סואץ, בשנת 1869, להתעניינות השלטון העות'מאני במרחב זה ולהכרה בחשיבותו האסטרטגית. בשנת 1900 מחליטים הטורקים לייסד מחוז שלטוני חדש בבאר־שבע ולהקים בו עיר מחוז חדשה שתשמש מוקד שלטוני בנוסף לעזה, מתוך כוונה להגביר את אחיזתם בשולי האימפריה ותוך ניסיון להפוך את הבדואים ליושבי־קבע. מיקום העיר נבחר בגבול שלושת המטות הבדואים הגדולים בנגב (עזאזמה, זורבה ומחמדין), בנוסף, במיקום זה היו מי תהום גבוהים, דבר שאיפשר השגת מים ליישוב בקלות יחסית.
ראשית הוקמה תחנת משטרה בת שתי קומות במטרה להשיג שליטה טובה יותר על הבדואים באזור, להפחית את מעשי השוד ולמנוע סכסוכים בקרב הבדואים. העיר החדשה נקראה ביר א-סבע (ערבית: بئر السبع) והוקמה על הגדה הצפונית של נחל באר שבע.
העיר נבנתה כ־5 קילומטרים מערבית ליישוב העתיק, לפי תוכניותיהם של שני מהנדסים ערבים, סייד אפנדי אלנשאשיבי ורג'ב אלנשאשיבי ושני מהנדסים אירופאים (גרמני ושווייצרי) בתבנית בעלת סגנון מודרני של רחובות במתווה שתי וערב, כאשר רק המסגד הגדול שפונה לכיוון מכה משבש דפוס זה. כל בתי העיר נבנו מחומרים מקומיים והיו חד-קומתיים. רוב האוכלוסייה היו ערבים מאזור חברון ועזה ומיעוטם בדואים. בשיאה היו בה כ-1,000 תושבים: כמעט כולם מוסלמים, מעט נוצרים, ויהודים בודדים.
תוך פחות משני עשורים צמחה מן המדבר עיר בנויה בעיצוב אירופי מודרני ובה מוסדות ציבור ושלטון רבים, לצד חצרות ובנייני מגורים בסגנון בנה ביתך - העיר באר־שבע הפכה למרכז יישובי, מינהלי ומסחרי שוקק חיים.
בשנת 1914, עם הצטרפותה של טורקיה למלחמת העולם הראשונה כבת-בריתן של המעצמות גרמניה ואוסטרו־הונגריה, גדלה חשיבותו האסטרטגית של הנגב, אשר הפך לאזור חיץ בין צבא בריטניה שחנו במצרים, ובין צבא טורקיה, אשר שלט בארץ־ישראל.
באר-שבע, אשר ישבה על צומת תחבורה מרכזי, שימשה כנקודת זינוק מצוינת לכיוון מצרים, בעיר היו כבר 17 בארות אשר סיפקו כמיליון וחצי ליטרים מים ביום וכן מלאי גדול של מחסנים, בניינים וכוח-אדם, שיכול היה לשמש עורף לוגיסטי למאבק שניהלו הטורקים בבריטים. ההכרה של השלטון העות'מאני כי מלחמה על ארץ ישראל היא רק עניין של זמן, הביאה גם להחלטה לסלול מסילת רכבת שתחבר את ציר יפו ירושלים עם באר־שבע ומשם לכיוון ניצנה וסיני, לעבר תעלת סואץ. בתאריך 30 באוקטובר 1915, לאחר תשעה חודשי בנייה, נחנכה תחנת הרכבת שחיברה את העיר דרך "מסילת הדרום" ללוד ובהמשך התחברה למסילת הרכבת החיג'אזית. באירוע זה נכח אחמד ג'מאל פאשה וכן פקידים עות'מאנים בכירים נוספים. המסילה תוכננה להמשיך דרומה ולהגיע עד לקרבת תעלת סואץ, אותה קיוו הצבאות הטורקי והגרמני לכבוש, אולם לא נבנתה עד תומה. לשם כך נבנה הגשר הרכבת הטורקי על נחל באר שבע שהוא אחד מסמלי העיר. בבנייתו השתתפו גם פועלים יהודיים שכמה מהם נהרגו בהפצצה של חיל האוויר הבריטי.
אוכלוסיית העיר גדלה פי ארבעה במהלך המלחמה ובקרבתה הוקם שדה התעופה הראשון בארץ ישראל.
מושלי העיר.
אחרי אסמעיל כמאל בק נתמנה למושל המחוז מוחמד ג'אראללה. בימיו הותקנו תיקונים רבים במחוז החדש. הוא יסד שתי מועצות - האחת להנהלת המחוז (המועצה המנהל "מג'לס אלאידארה" הראשונה הורכבה מחמשה שייחים והשנייה להנהלת ענייני העיר (המועצה העירונית כללה את השייח חמאד אל סופי (תראבין) ואחד מעזאזמה. חנג'רה, תיאהא וג'באראת. תקציב העירייה הגיע אז לעשר לירות. כמו כן קנתה הממשלה בימיו אלפים דונם (מחיר הדונם מגידה אחת) מקרקעות עזאזמה ונתנה אותם מתנה לעירייה על־מנת למכור משטח זה לכל בדואי שירצה להתיישב, לבנות בית ולשבת בו. אז נבנה הבניין המשמש עד היום למשרדי שלטון המחוז, וכן הוקם גם משכן לשוטרים ולז'נדרמים. עובדה תוכנית חדשה לעיר החדשה, שחילקה לחלקים שווים כשבין שטח לשטח מבדיל רחוב נרחב.
אחרי ג'אראללה נתמנה תופיק בק אלגוסיין כמושל המחוז. אחריו משלו בזה אחר זה: חמדי בק, תופיק עבד אלהאדי, סלים טהביב, עאצף בק הדמשקאי ופריד אלעמסי. באר שבע גדלה והתפתחה, הטורקים קבעו את באר שבע כמקום מושבו של סגן המותצרף עבד אלכרים בק, שפעל לפי הוראותיו של המותצרף הירושלמי רשיד בק.
נראה כי שלטון הממשלה הטורקית באחרית ימי התקופה העבד־אלחמידית היה חלש ורופף ולא הייתה ברירה אחרת אלא להישען על שלטון השייִחים עצמם. על כן ראה סגן המותצרף אכרם בק (בנו של הסופר הטורקי המפורסם נאמק כמאל בק) להתקרב אל הבדואים במתנות ובאותות־כבוד.
החגיגות שהיה עורך לרגל ברית־המילה של בני השייחים היו בהידור רב: שולחנות ערוכים ביד רחבה ותחרויות רכיבה על סוסות אצילות.
כשהוכרזה הקונסטיטוציה בטורקיה (בשנת 1900), שגררה אחריה את ההפיכות הידועות, הוחזרה באר־שבע לדרגתה הקודמת ונקבעה כ"קאימקמיה". למושל נתמנה בה עלי אצף הטורקי. אחריו באו מחמוד נזים בק, ערפאן בק אלג'אבי, כאמל אלבודיירי, חסאם אלדין בק וצאדק בק אלמוגרבי, הוא היה הקאימקאם הטורקי האחרון. באר־שבע נמצאה בהנהלתו עד הכיבוש האנגלי.
בתקופת המושל המתקן עאצף בק הדמשקאי הוקמו מפעלים קונסטרוקטיביים רבים. הוא בנה בניין לעירייה, ששימש לאחר מכן מעון למושלי המחוז, הכניס מכונת־שאיבה שהביאה מים לעיר מבאר אלנשל, ובנה בריכה גדולה שחילקה את המים לכל קצות העיר. כמו כן בנה טחנת קמח ומסגד, אשר מגדלו ("מאדנדה") הוקם מאבנים שהובאו מחורבת חלצה (חליסה). מבחינה הנדסית נחשב מגדל זה למשוכלל בתכלית השכלול. כמו כן נטע עצים במספר רב וייסד דואר וטלגרף ובית־ספר לילדי הבדואים. בית ספר זה היה הראשון במחוז הזה. בימיו נשלח מספר בדואים לבית־הספר השבטי אשר בקושטא.
התיישבות יהודית.
עוד לפני שנת 1900 התיישבו יהודים באזור. היהודי הראשון שנטה אוהלו ביישוב היה נסים אלקיים, אשר היה מעורב בהקמת היישוב החדש. לאחר מכן, בשנת 1901 התיישבה במקום משפחת גורדון בכדי להקים טחנת קמח.
בשנת 1908 נפטר יעקב גורדון והמשפחה עזבה. בטחנה נותר שותפו שניידרוביץ. בשנת 1909 הגיעה לעיר משפחת מרגולין, אשר גרה ועבדה בטחנת הקמח של גורדון ושניידרוביץ.
מלחמת העולם הראשונה.
כשהוכרז הגיוס הכללי בטורקיה (בשנת 1914) והטורקים עמדו לצד בני בריתם הגרמנים, היה ראשית מעשיה של הממשלה לשים את פניה לעבר תעלת סואץ - אם לא לשם כיבוש מצרים, כפי שהפיצו והודיעו, אז הרי כדי לגרום לאנגלים להקצות חלק גדול מכוחותיהם הצבאיים בים וביבשה לחזית זו, למען הגדלת הלחץ על האנגלים ביתר שדות הקטל.
הטורקים ריכזו לשם כך צבא תחת פיקודו של המצביא ג'מאל פחה הגדול (כינוהו כך כדי להבדיל בינו לבין ג'מאל פחה, מפקד הדיוויזיה השמינית). לג'מאל פחה הגדול (המכונה גם "העריץ" ו״שופך הדמים") ניתן שלטון בלתי מוגבל בסוריה ובארץ ישראל. הוא התאמץ לדכא את התנועה הפוליטית הערבית ותלה מספר גדול מאנשיהם וצעיריהם. כן ידועים מעשיו האכזריים כלפי הארמנים ולאומים אחרים של האימפריה העות'מאנית.
המסע לחציית התעלה וכיבוש מצרים נעשה בלי כל ההכנות הדרושות בין מבחינת גודל הצבא ובין מבחינת התחמושת והאספקה. רוב התוקפים והכובשים שבאו מצרימה מסוריה או לסוריה ממצרים חצו אותה הדרך, שהטורקים הסיעו בה את צבאותיהם.
הטורקים סללו את הדרכים בין באר שבע וחברון ובין באר שבע ועוג'א אל חפיר. כן סללו מסילת ברזל מוואדי סראר עד באר שבע. הם הביאו חשמל לבאר שבע, בנו ביח"ר לקרח, טחנת קמח ממוכנת והפכו את בנין בית הספר ילדי בדואים לבית חולים לפצועיהם.
תקופת המנדט הבריטי.
כיבוש באר שבע.
עם תחילת המערכה וכיבוש סיני על ידי הבריטים בסוף 1916 הופך המרחב הדרומי חיוני בהגנת ארץ־ישראל כולה ובראשית שנת 1917 מקימים הטורקים קו הגנה חדש, אשר ראשיתו בעזה ואגפו המזרחי מבוסס על הביצורים, הבארות והכוחות הקיימים בבאר־שבע. ביום 26.3.1917 יצאו הכוחות הבריטיים למתקפה הראשונה על עזה. הכוחות הרכובים הצליחו להפתיע בתנועתם המהירה את הטורקים ולחדור לעיר, ובתוך שלוש שעות הגיעו עד לחלקה הצפוני. מאוחר יותר נכבשו הרכסים המקיפים את העיר ופרשי אנז״ק (דיוויזיית הפרשים האוסטרלית - ניו זילנדית) חדרו אל העיר מצפון. במפקדה הטורקית־גרמנית הבינו כי גורל העיר והמערכה נחרץ והחלו בהכנות לכניעה. עקב תקלות בתקשורת מהשטח לא ידע הפיקוד הבריטי הבכיר אשר ישב במפקדה הכללית באל־עריש על הצלחת המתקפה ולכוחות הבריטים בשטח ניתנה פקודת נסיגה. עד שהבינו הבריטים את טעותם שיפרו הטורקים את לחימתם ומאוחר יותר, בהגיע התגבורת, הצליחו להדוף את הכוחות הבריטיים מהעיר. ביום 17.4.1917 יצאו הבריטים למתקפה נוספת על עזה. גם התקפה זו לא הצליחה להשיג תוצאות משמעותיות ולעת ערב, משהוברר כי הכוחות נבלמו כליל וניסיונות ההתקדמות עולים במחיר דמים גבוה, ניתנה פקודת נסיגה.
בעקבות כישלונות כיבוש עזה הוחלף מפקד הגזרה ולתפקיד מונה גנרל אדמונד אלנבי. אלנבי החליט לתקוף באזור הפחות מוגן של החזית - בבאר־שבע. הטורקים סמכו על המחסום הטבעי של המדבר שיגן על האגף המזרחי של הגזרה מפני מתקפה, והחזיקו במקום כוח קטן יחסית של חיילים.