ב־22 באוקטובר 1964 הגיש בן־גוריון לשר המשפטים דב יוסף את תביעתו לפתוח בחקירה מחודשת של "הפרשה", בצירוף תזכיר על מעורבותו האישית, המחקר של חגי אשד וחוות דעת משפטית על התנהלות "ועדת השבעה". יוסף המליץ בפני הממשלה על חקירה מחודשת, ואף הציע כי החקירה תעסוק ב"עסק הביש" ב־1954 ולא בוועדה של 1960. בן־גוריון הודיע כי הוא מסכים להמלצה, אולם אשכול סירב להקים ועדת חקירה משפטית וב־13 בדצמבר הגיעו הדברים לכדי עימות גלוי ביניהם בישיבת מרכז מפא"י. אלא שלמחרת הודיע אשכול לממשלה על התפטרותו וכך העמיד את מפלגתו בפני ברירה. ב־16 וב־17 בדצמבר החליטו מזכירות ומרכז מפא"י לקרוא לאשכול להרכיב ממשלה חדשה ודחו את ההצעה לחקור את פרשת 1954. אשכול הרכיב מחדש את אותה ממשלה והמלצת דב יוסף לא הועלתה בה. בפברואר 1965 נערכה בוועידת מפא"י בהיכל התרבות בתל אביב ההתמודדות האחרונה בין בן־גוריון לבין אשכול. ב־17 בפברואר אמר בן־גוריון בנאומו: "אמת וצדק נעשו בפי רבים מילים בטלניות וסיסמאות מלוגלגות. לא האמת קודמת לכל – אלא הכיסא קודם לכל. לא הצדק קובע – אלא הפחד מהתפטרות הממשלה... אם הלילה אעמוד בפני ברירה... אני בוחר בגילוי האמת". הוא דחה את הטיעון כי העם אינו רוצה בחידוש הפרשה: "אינני יודע מה רוצה ומה לא רוצה העם. אני יודע רק – כך נדמה לי – מה רצוי לעם... לעם רצוי שבארצנו ישלטו האמת והצדק". מיד אחרי בן־גוריון נאם משה שרת, אשר היה על ערש דווי והגיע על כיסא גלגלים. הוא טען כי "המשבר הזה הוא פרי עמדה, קו, דרישה, מגמה של איש אחד ויחיד". נאומה של גולדה מאיר היה אחד הקשים שנישאו אי פעם כלפי בן־גוריון. בן־גוריון ויתר על דברי התשובה שלו ועזב את הישיבה. ביומה האחרון של הוועידה נשא אשכול נאום שבו קבע כי הממשלה החליטה לא לעסוק ב"פרשה". הוא התגונן בפני התקפותיו של בן־גוריון על הקמת "המערך החדש", ולקראת סיום דבריו פנה אליו בקריאה נרגשת: "תן לי אשראִי!". בסיום הוועידה הצביעו רוב הצירים כנגד הצעת בן־גוריון לבירור "הפרשה" בוועדת חקירה משפטית.
בן־גוריון לא ויתר. ב־13 במאי 1965 אמר לעיתון "דבר" כי אשכול "אינו רשאי לעמוד על־יד הגה המדינה", באותו יום אמר ל"מעריב" כי במפא"י שורר משטר "הפחד והרמיה", וב־18 במאי אמר לעיתון "הבוקר" כי יהיה מוכן להרכיב ממשלה בעצמו. אלא שב־3 ביוני בחר מרכז מפא"י את מועמד המפלגה לראשות הממשלה (ללא השתתפות בן־גוריון), ואשכול זכה ברוב גדול של 63.5% לעומת 36.5% לבן־גוריון.
הקמת רפ"י (1965).
ב־29 ביוני אסף בן־גוריון את תומכיו והודיע על הקמת רשימה עצמאית. הוא העריך כי היא עתידה לקבל בין 20 ל־25 מנדטים, בעיקר על חשבון המערך, ותכנן לאחר הבחירות להציע לחברי מפא"י להתאחד שוב. הוא קרא לרשימה "רשימת פועלי ישראל" (רפ"י). הוא טען כי חבריה נשארים חברי מפא"י, אולם מזכירות מפא"י פסקה כי ראשי הרשימה הוציאו עצמם מהמפלגה. יחד עם כמה מתומכיו, גורש בן־גוריון מן המפלגה שבראשהּ עמד עשרות שנים, על ידי בית דין מפלגתי שבראשו עמד יעקב שמשון שפירא, שגם כינה את בן־גוריון "פחדן" ואת רפ"י "קבוצה נאו־פאשיסטית". ב־2 בנובמבר עזב בן־גוריון את מפא"י והקים את מפלגתו החדשה. מצע רפ"י היה ממלכתי וקרא לשינוי במשטר ובחברה הישראלית, אולם המפלגה לא זכתה לאמון הציבור, שלא הסכים לקבל את אנשיה, שהיו עד אותה עת סמל הממסד, כ"מהפכנים" שעתידים לחולל שינוי במדינה. תדמיתו של בן־גוריון נותרה של מנהיג נוטר הקם על יורשו. בבחירות לכנסת השישית ב־1965 זכתה רפ"י בעשרה מושבים בלבד ונותרה באופוזיציה.
מלחמת ששת הימים 1967.
ב־15 במאי 1967 חצו יחידות של הצבא המצרי את תעלת סואץ ונכנסו לתוך שטח סיני. נאצר דרש מהכוח הבינלאומי של משקיפי האו"ם לצאת מהאזור וב־19 במאי החליטה ישראל על גיוס מילואים חלקי. בן־גוריון סבר שיש לעשות הכל כדי למנוע מלחמה חדשה והאשים את אשכול במצב. ב־22 במאי, בתקופת ההמתנה המתוחה, הגיע הרמטכ"ל יצחק רבין, על פי בקשתו, לפגישה עם בן־גוריון בביתו בתל אביב, כדי לשמוע את הערכתו על המצב ולקבל את עצתו. אולם רבין לא קיבל ממנו עידוד והגדיר את השיחה "זעזוע גדול". בן־גוריון טען בפניו כי "אסור בשום פנים ואופן שתפרוץ מלחמה" וכי גיוס המילואים "סיכן את עם ישראל". דעתו זו נגדה לחלוטין את תדמיתו בציבור באותה עת. עם החמרת המשבר, גברה הביקורת הציבורית על אשכול, שאינו מעז לצאת למלחמה, ורבו הקולות שדרשו להחזיר את בן־גוריון להנהגת המדינה.
ב־24 במאי הציע מנחם בגין לאשכול להעמיד את בן־גוריון בראש ממשלת ליכוד לאומי, אולם אשכול סירב. הערכתו של בן־גוריון הוצגה על ידי שמעון פרס בפני אישים מרכזיים בצמרת במדינה, להם סיפר שבן־גוריון סבור כי יש להמתין, להתחמש ולצאת למלחמה במועד נוח יותר. למשה דיין הסביר בן־גוריון כי "אם נצא עכשיו בהתקפה, כל העולם יהיה נגדנו ולא נוכל לקבל סיוע". דיין חלק על הערכתו וטען כי המתנה תעניק את היתרון הצבאי למצרים. בן־גוריון השיב: "השיקול המדיני עדיף ואם נצא עתה להתקפה, יהיה זה אסון". ב־27 במאי הגיעו לביתו ראשי גח"ל ושמעו ממנו את הערכותיו. בגין וחבריו התאכזבו מעמדתו ונסוגו מהצעתם להחזרתו לממשלה. התנועה להחזרתו גוועה והתחלפה בלחץ ציבורי על אשכול למנות את דיין לשר הביטחון. ב־1 ביוני נכנע אשכול לדרישה ורפ"י הצטרפה לממשלת ליכוד לאומי. ב־5 ביוני פרצה מלחמת ששת הימים, שהסתיימה בניצחון ישראלי גדול. לדברי מיכאל בר־זוהר, מינוי דיין וההחלטה לצאת למלחמה "הביאו לשקיעתו הסופית של בן־גוריון כמדינאי" – תהליך שארך "כימי מלחמתה של ישראל".
1967–1970.
לאחר שישב שלושה חודשים בתל אביב, שב בן־גוריון לשדה בוקר. לאחר המלחמה הרפה מפרשת לבון וחדל לתבוע חקירה משפטית, אולם המשיך לבקר בחריפות את אשכול. בינואר 1968 נפטרה אשתו, פולה. באותה שנה התאחדה רפ"י עם מפא"י ואחדות העבודה למפלגה משותפת – מפלגת העבודה, אולם בן־גוריון התנגד לאיחוד, סירב להצטרף למפלגה ונותר למעשה כסיעת יחיד בכנסת. לקראת יום העצמאות באותה שנה סירב לקבל את פרס ישראל שהוצע לו על "תרומה מיוחדת לחברה ולמדינה", ונימק: "לא מגיע לי פרס בעד מילוי חובתי לארצי".
בשנת 1969 ניסה בן־גוריון לרתום את מנחם בגין למאבקו באשכול וכתב לו: "מבחינה אישית לא הייתה לי אף פעם טינה אישית נגדך וכל מה שהכרתי אותך יותר בשנים האחרונות – הוקרתי אותך יותר". בפברואר אותה שנה נפטר אשכול ובן־גוריון סירב להשתתף בלוייתו.
לקראת הבחירות לכנסת השביעית באוקטובר 1969, הסכים בן־גוריון להצעות להקים מפלגה חדשה, ובקיץ אותה שנה נוסדה הרשימה הממלכתית בראשותו, שמצעה התמקד בשינוי שיטת הממשל, בגישה ביטחונית אקטיביסטית וביוזמה כלכלית חופשית. הרשימה זכתה בארבעה מושבים ואחד מנציגיה בכנסת היה איסר הראל. בן־גוריון נעדר מרוב ישיבות הכנסת, וב־27 במאי 1970 סיים את כהונתו בה. באותה שנה הודיע במכתב לאחד מצעירי המפלגה, כי אינו שייך יותר לרשימה הממלכתית, וכי פרש מפעילות פוליטית.
שנותיו האחרונות 1970–1973.
את שארית חייו הקדיש בן-גוריון לכתיבה, בעיקר של זיכרונותיו, אותם החל לכתוב לאחר פרישתו מראשות הממשלה ב-1963, אולם בשל התעקשותו לעבור בעצמו על החומר הארכיוני העצום שהצטבר, לא הצליח להשלים את כתיבתה של אוטוביוגרפיה.
בנובמבר 1970 נענה להצעתה של ראש הממשלה גולדה מאיר וייצג את ממשלת ישראל, יחד עם הנשיא זלמן שזר, בטקס האשכבה הציבורי שנערך בפריז לשארל דה גול.
בפברואר 1971 ערך את נסיעתו האחרונה מחוץ לישראל, ונאם בקונגרס היהודי העולמי שהתכנס בבריסל, למען עליית יהודי ברית המועצות לישראל. בשלהי יוני אותה שנה חדל לכתוב ביומנו.
ביום הולדתו ה-85 ביקרה אצלו בשדה בוקר הממשלה ובראשה גולדה מאיר. הכנסת חוקקה חוק מיוחד, כדי שיוכל לנאום בפניה, וב-25 באוקטובר נאם בה על עתיד עם ישראל בארצו והתקבל בקימה ובתשואות מצד כל סיעות הבית.
בתחילת שנת 1973 נאלץ בן-גוריון לעבור לגור בתל אביב, כדי להיות קרוב לרופאו ולבית החולים תל השומר. בזמן מלחמת יום הכיפורים באותה שנה, היה בודד בביתו. כעבור מספר שבועות לקה בשטף דם במוח. שטף הדם גרם לו לשיתוק חלקי, ובזמן שהיה בהכרה מלאה לא יכול היה לדבר. במשך כשבועיים נאבק על חייו בבית החולים, ונפטר ב-1 בדצמבר 1973 (ו' בכסלו תשל"ד), בשעה 11:06 לפני הצהריים, בגיל 87. ארונו הוצב ברחבת הכנסת, שם עברו על פניו כ-250 אלף איש, כעשירית מתושבי ישראל באותה עת. רק כמאה איש בלבד הורשו ללוות אותו למקום מנוחתו בשדה-בוקר. בן-גוריון ביקש כי לא יינשאו הספדים על קברו ולא יירו מטחי כבוד בטקס הלוויה. קבריהם של דוד ופולה בן-גוריון נמצאים בגן לאומי קבר בן גוריון סמוך למדרשת בן-גוריון, מול נחל צין.
משפחתו.
בשנת 1917, במהלך שהותו בניו יורק, נישא בן-גוריון לפולה מונבז, אחות במקצועה ופעילה במפלגה הציונית פועלי ציון. פולה לקחה חלק פעיל בפעילותו הציבורית של בן-גוריון והתלוותה אליו בסיורים ובשליחויות.
לזוג בן-גוריון נולדו שלושה ילדים: גאולה (1918–1998; נישאה לעמנואל בן אליעזר), מורה, עמוס, שהיה ניצב במשטרת ישראל, ורננה (לשם, לאחר נישואיה), פרופסור למיקרוביולוגיה.
אחד מנכדיו, בנה של גאולה, הוא חוקר התקשורת יריב בן אליעזר.
דעותיו.
יחסו לדת היהודית.