כישוריו הארגוניים והכלכליים של אשכול הביאוהו להיות איש מפתח במספר יוזמות מרכזיות: ב-1937 הוא ייסד את חברת מקורות, שנוסדה כמפעל משותף של ההסתדרות (50%), הסוכנות היהודית (25%), והקרן הקיימת (25%). מפעל המים הראשון שהקימה החברה היה מפעל הקישון, שתוכנן על ידי שמחה בלאס, ואשר סיפק מים ל-16 יישובים חקלאיים (מהם 3 שהוקמו הודות למפעל זה), להר הכרמל ולשכונת הדר הכרמל בחיפה. חלק גדול ממימון מפעל הקישון השיג אשכול במסגרת הסכם העברה, אשר נחתם בין שלטונות גרמניה הנאצית לבין הסוכנות היהודית. מטרת ההסכם הייתה לאפשר ליהודים תושבי גרמניה למכור נכסי דלא ניידי הנמצאים בבעלותם בשטחים שתחת שלטון גרמניה הנאצית, וזאת טרם הפקעתם על ידי השלטונות. לאחר המכירה יכלו היהודים לקחת את התמורה איתם לארץ ישראל, וכך לעלות לארץ ישראל תוך שמירה על חלק מהונם. אשכול כיהן בהנהלת חברת מקורות עד 1951.
עוד בשנת 1939 הציג בפניו שמחה בלאס את תוכניתו "הפנטזיונרית" שהגיש לד"ר ארתור רופין, ראש מחלקת ההתיישבות של הסוכנות. בהצגה זאת הובאו שלושת המקורות האפשריים להשקיית הנגב: מי קידוחים קרובים, מי נחל הירקון ומים מן הצפון. ב-12 בפברואר 1941 קיבל אשכול את התזכיר שהגיש בלאס למקורות על "ישוב מדבריות ארץ ישראל על ידי משיכת מים מנחלים", שבו הציע להשקות כ-15–17 מיליון דונם בנגב, באזור הכנרת ובצפון ישראל, באמצעות מקורות מים גלויים בלבד, וללא קידוחים. על בסיס תזכיר זה, ולאחר ועדת בדיקה, השיג אשכול, יחד עם פנחס ספיר, את התקציב להקמת משרד טכני, שעיבד את התוכניות הראשונות למפעל מים ארצי שהזכיר את המוביל הארצי העתידי, שתוכנן ונבנה לאחר הקמת המדינה.
בהתקבל החלטת הקונגרס הציוני לתמוך בהצעתו, הוא החל בעבודות תכנון מפורטות (ביחד עם המהנדס שמחה בלאס) ורתם את חברת ניר לביצוע קידוחים. בראשית 1937 הוקמה חברת מקורות ובמשך ארבע-עשרה השנים הבאות, עד 1951, אשכול היה מנהל-שותף בחברה. ב-1938 הורחבה פעילותה גם אל המגזר העירוני. תוכנית החברה ליישוב מדבריות היוותה ב-1941 את הבסיס לתוכנית ארוכת טווח להקמת המוביל הארצי.
כבר מ-1941 פעלה מקורות גם במרכז הארץ וגם בדרומה. עד 1948 הניחה החברה מעל מאתיים קילומטרים של צינורות מים, אשר נמתחו בין היתר אל אתרי ההקמה של 11 הנקודות בדרום הארץ, עובדה שהכריעה את גורל הנגב בתוכנית החלוקה.
בהגנה ובהקמת צה"ל.
מאז היה שותף להקמת ארגון ההגנה בשנת 1920, אשכול היה פעיל בארגון, במיוחד בנושאי כספים ורכש.
בקיץ 1931 כיהן לבקשת אליהו גולומב, יחד עם משה בילינסון ושמעון דוד יפה, בוועדה לבירור התלונות החמורות שהועלו כנגד יוסף הכט בנוגע לפעילותו בזמן פרעות תרפ"ט. ועדת הבירור מצאה אותו אשם וסילקה אותו מפעילות ב"הגנה" למשך שנה.
בין השנים 1940–1948 היה אשכול חבר המפקדה הארצית (המ"א) של ההגנה, וגזבר הארגון. בתקופה זו כינויו המחתרתי היה "ליש".
בשנות מלחמת העולם השנייה תמך בתחילה בהתגייסות ארץ-ישראלית לשורות הצבא הבריטי. מאוחר יותר סבר כי ההתגייסות לצד הבריטים לא הביאה תוצאות מדיניות מספקות ותמך בהחלטת הנהגת היישוב היהודי בארץ ישראל לחדש את המאבק בשלטון המנדט. עם הקמתה של "ועדת x" לתיאום בין המחתרות היהודיות בתנועת המרי העברי, אשכול היה חבר בוועדה מטעם מפא"י.
בשנת 1947 מונה אשכול לחבר "ועד הביטחון" של היישוב היהודי, כנציג מפא"י. הוא שימש כעוזרו של דוד בן-גוריון ושירת ב"מפקדה הארצית", שם רוכזה פעילות הגיוס הצבאי מקרב היישוב היהודי כולו. בחודשי מלחמת העצמאות אשכול פעל בתפקידו זה בתחומי גיוס, אספקה ורכש. כמו כן היה לו חלק בארגון סלילת "דרך בורמה", והוא עסק בין היתר גם בפירוק הפלמ"ח ובאיחוד המחתרות לכדי יצירת צבא מאוחד.
עם הקמת מדינת ישראל הוא שימש כמנכ"ל הראשון של משרד הביטחון. הוא המשיך ועסק בארגון הצבא, ברכש, בהנחת יסודות לתעשייה הצבאית, בהקמת חיל המדע ובבניית משוריינים לצה"ל.
אשכול עמד בראש משרד הביטחון עד ינואר 1949. בתפקידו זה שימש למעשה כסגן שר הביטחון מבלי שהיה זה תוארו הרשמי. את כישוריו הכלכליים יישם גם בתפקידו כיושב ראש ועדה לייעול הצבא.
הנהגת מחלקת ההתיישבות.
בשנת 1946, לאחר השבת השחורה, ישבה הנהלת הסוכנות בחוץ לארץ, כאשר חברי הנהלת הסוכנות ששהו בארץ הושמו במעצר. נקבעה הנהלה זמנית של הסוכנות בארץ, שבה כיהן אשכול כראש מחלקת ההתיישבות יחד עם זלמן שזר והרב מאיר בר-אילן. ביום "השבת השחורה" הביא אשכול לאישור בהנהלה הזמנית של הסוכנות את תוכנית הקמת 11 הנקודות בנגב, אותה הוא יזם. הנקודות הוקמו בערב יום הכיפורים תש"ז, והיו גורם עיקרי לכך שוועדת האו"ם לעניין ארץ ישראל, ועדת אונסקופ, המליצה להכליל את הנגב בתחומי המדינה היהודית.
בספטמבר 1948 עזב אשכול את משרד הביטחון ואת משרתו כמזכיר פועלי תל אביב–יפו. באותו חודש עִברת בלחצו של בן-גוריון את שמו מ"שקולניק" ל"אשכול", והתמנה כחבר הנהלת הסוכנות היהודית וב-7 בספטמבר מונה לראש מחלקת ההתיישבות שלה. ב-18 באוקטובר 1949 מונה לגזבר בפועל של הסוכנות היהודית במקום יצחק גרינבוים, וב-30 בינואר 1950 מונה לגזבר הקבוע.
אשכול עמד בראש מחלקת ההתיישבות במשך 15 שנה, עד כניסתו לתפקיד ראש הממשלה. עד 1952 ייסד ואכלס במסגרת תפקידו 371 יישובים חקלאיים חדשים ששימשו לקליטת העלייה הגדולה.
לאחר מכן ריכז מאמצים בחיסול מחנות העולים, שהחלו להיבנות במהלך 1949: בתחילה הגה את רעיון הקמת המעברות, שהחלו להיבנות ב-1950, ולאחר מכן דחף להקמת עיירות הפיתוח. כן שימש בין השנים 1949–1953 יו"ר מועצת המנהלים של עמידר – תפקיד חשוב ומרכזי בימי קליטת העלייה והפיתוח המואץ. במחצית השנייה של שנות החמישים יזם וליווה בין היתר את מפעלי ההתיישבות בחבל לכיש ובחבל עדולם.
עד שנת 1952 כיהן, בנוסף, גם בתפקיד גזבר הסוכנות ומנהל חברת המים "מקורות".
שר האוצר.
ב־30 ביולי 1951 אשכול נבחר לראשונה לכנסת מטעם מפא"י. ב־8 באוקטובר מונה לשר החקלאות והפיתוח, ושימש בתפקיד במשך תשעה חודשים.
ב-25 ביוני 1952 מונה לשר האוצר, בהחליפו בתפקיד את השר אליעזר קפלן, שהתפטר עקב מחלה. פרץ נפתלי מונה במקומו לשר החקלאות, ואילו משרד הפיתוח עבר לתחום סמכותו של משרד האוצר.
בתפקידו כשר האוצר שימש אשכול במשך אחת-עשרה שנים. ראש הממשלה דוד בן-גוריון ראה עצמו כמדינאי האחראי בלעדית לענייני החוץ והביטחון ולעיצוב המורשת העתידית של מדינת ישראל. את ענייני היום-יום והכלכלה הותיר לאשכול.
בתחילה המשיך ב"מדיניות הכלכלית החדשה", כינוי להחלטת ממשלה שהתקבלה עוד במהלך כהונת קודמו בתפקיד, אליעזר קפלן. בשנת 1954 ניתן היה לראות מפנה חיובי: סיוע רב שהתקבל מחוץ לארץ, וכן כספי השילומים מגרמניה, היו בין הגורמים לכך שבשנים (1954–1963) היה שיעור הגידול השנתי הממוצע בתוצר הלאומי הגולמי 10% לשנה, ואילו שיעורי האבטלה והאינפלציה היו נמוכים מאוד. עם זאת, סממן נוסף היה גידול בצריכה הפרטית, שהשיג בהרבה את גידול התל"ג לנפש, מה שהביא לפער במאזן המסחרי בין היבוא ליצוא, וכן לתופעות של אי-שוויוניות ופער בין עשירים לעניים.
בחודשים יוני–יולי 1960 ערך אשכול מסע בשש מדינות מערב אפריקה, שם נפגש עם אישי ממשל בכירים ודן עמם בפיתוח הסחר עם ישראל. במסע זה נחתמו מספר הסכמים כלכליים. בספטמבר אותה שנה ביקר במספר ערי בירה באירופה המערבית, בניסיון להסדיר את קבלתה של ישראל כ"חברה נלווה" לשוק האירופי המשותף.
ב-9 בפברואר 1962 הכריז אשכול בשידור רדיו מיוחד לאומה על פיחות הלירה הישראלית לעומת הדולר מ-1.8 לירות לדולר ל-3 לירות לדולר. הפיחות הביא לסערה במשק, לשביתות ולעליות מחירים. מטרת הפיחות הייתה ניסיון לצרף את ישראל אל השוק האירופי המשותף כ"חברה נלווית", ולהוכיח עמידה בסטנדרטים הכלכליים הנדרשים לקראת מהלך זה, משימה שאכן הושגה ב-1964. אמנם המסחר עם מדינות אירופה השתפר מעט, אך ככל שמטרת המהלך הייתה הורדת הצריכה הפרטית, הרי שהעלייה ברמת המחירים, עקב הפיחות, התקזזה עם מנגנון הצמדת השכר במשק. בפרספקטיבה מאוחרת נראה צעד דרסטי זה כהקדמה למיתון הגדול עליו הכריז אשכול ב-1966, אף הוא על רקע העלייה בצריכה הפרטית, בלא עלייה מקבילה בתוצר הלאומי.
פרשת לבון והבחירות לכנסת החמישית.
במהלך עבודתו לצדו של בן-גוריון רכש אשכול את אמונו ואת חיבתו, והפך ליורשו המועדף. כאשר התפטר בן-גוריון לראשונה מתפקידו בשנת 1953, הודיע לראשי מפלגתו כי הוא רואה באשכול את האדם המתאים ביותר לרשת את תפקיד ראש הממשלה, אך סירובו של אשכול ולחצים מפלגתיים אחרים הביאו למינויו של משה שרת, שנהנה מתמיכה גורפת של הנהגת מפא"י.
בזמן כהונתו של משה שרת כראש ממשלה ופנחס לבון כשר הביטחון, אירעה פרשת העסק הביש – הנחיה לקבוצת צעירים יהודים במצרים לחבל במוסדות בריטיים ואמריקניים שם, על מנת לסכסך בין מצרים למדינות אלו, ולמנוע, או לדחות, את הלאמת תעלת סואץ על ידי מצרים. תוכנית זו סופה שעלתה בחיי אדם, כאשר הצעירים נתפסו ונעצרו, וחלקם הוצאו להורג.
בעקבות האירועים במצרים, נאלץ לבון להתפטר מתפקידו. אשכול התנגד להדחתו, אולם נכשל בניסיונותיו למנוע אותה.