התפתחותן של טכנולוגיות ריצוף הדור-הבא (Next-generation sequencing) או ריצוף בתפוקה-גבוה (High-throughput sequencing), פתחו דלתות חדשות לתחום ריצוף הדנ"א (DNA sequencing). ככל שהבנת טכנולוגיות אלו נהיית יותר נפוצה וכלים חדשים מפותחים, שיטות חדשניות ליישום טכנולוגיות אלו נוצרות גם כן.
בהסתמך על הדרישות הנמוכות של טכנולוגיות הריצוף בתפוקה-גבוה לתוצר רצף נוקליאוטידים, יחד עם הכיסוי, העמוק, והרזולוציה ברמת הבסיס, הובילו לכך שהשימוש בטכנולוגיות אלה התרחב לתחום הטרנסקריפטומיקה (Transcriptomics). טרנסקריפטומיקה הוא ענף מחקרי העוסק באפיון הרנ"א המשועתק מגנום נחקר מסוים. אף על פי שטרנסקריפטומים דינמיים יותר מדנ"א גנומי, מולקולות אלה מספקות גישה ישירה לבקרת גנים ומהוות אינדיקציה לגבי רמות חלבון. ריצוף טרנסקריפטומים אינו רעיון חדש. שיטות שונות המבוססות על שיטת ריצוף – סאנגר (Sanger sequencing) המסורתית (והיקרה יותר), פותחו בעבר על מנת לקבוע רצף דנ"א קומפלמנטרי (cDNA). כמו כן קיימות שיטות נוספות המשתמשות במתודולוגיות כגון SAGE (Serial analysis of gene expression), CAGE (Cap analysis of gene expression) ו-MPSS (Massively parallel signature sequencing).
ריצוף הטרנסקריפטום (רנ"א–סק) יכול להתבצע על בסיס מגוון פלטפורמות, על מנת לבחון רעיונות והיפוטזות שונות. לדוגמה, שימוש בפלטפורמת האנליזה הגנומית של אילומינה ( Genome AnalyzerIllumina) מאפשר ריצוף טרנסקריפטומים לקבלת פרופיל ביטוי בתאי יונקים, בתאי גזע (על ידי ABI Solid Sequencing) וכן לקבלת מפת הפולימורפיזם החד-בסיסיים (SNPs) בתירס באמצעות 454 Sequencing Roche's. למרות ההבדלים הטכנים בין פלטפורמה לפלטפורמה, האינפורמציה הנאספת מכל אחת היא במהותה זהה.
שיטות.
ספריית רנ"א 'פולי (איי).
תהליך יצירת ספריות רצפים יכול להשתנות בהתאם לפלטפורמה בה משתמשים בריצוף בתפוקה-גבוה, כאשר לכל אחת מן הפלטפורמות ישנם מספר ערכות שעוצבו לצורך בניית ספריות מסוגים שונים, המסגלות את תוצאות הריצוף לדרישות הספציפיות של אותו מכשיר.
בהתאם לסוג התעתיק הנבדק, ישנם מאפיינים משותפים לכל טכנולוגיה. לרוב באנליזת אמ-רנ"א (mRNA) מקודד, הזנב ה-3' בעל פולי אדנילציה (poly A) משמש כמטרה על מנת להבטיח הפרדה בין רנ"א מקודד לרנ"א לא מקודד. תהליך זה יכול להיות מושג בקלות יחסית על ידי קשירת אוליגונוקליאוטידים של פולי טי (poly T) בצורה קוולנטית לסובסטראט מסוים (בדרך כלל בקולונה). מחקרים רבים משתמשים בבידים מגנטים לצרוך שלב זה. באתר Protocol Online ניתן למצוא רשימה של פרוטוקולים לבידוד אמ-רנ"א (mRNA).
מחקרים הבודקים את הטרנסקריפטום גם מחוץ לטווח הפולי איי, כלומר גם גנים אשר לא מקודדים לחלבון, הראו שכאשר היה שימוש בבידים מגנטים מסוג פולי טי, תעתיקי הרנ"א שדווקא לא נקשרו לבידים, יכולים לספק מידע חשוב אודות רנ"א לא מקודד שטרם התגלה והיה עובר ללא אבחנה אחרת.
כמו כן, מכיוון שרנ"א ריבוזומלי (rRNA) מהווה מעל 90% מסה"כ הרנ"א בתא נתון, מחקרים הראו שהוצאת רנ"א זה מהדגימה, באמצעות היברידיזציה של גלאים ספציפיים כנגדו, מגדילה את היכולת לשלוף מידע מהחלק הנותר של הטרנסקריפטום.
השלב הבא הוא שיעתוק-מהופך (Reverse transcription). עקב הנטייה הרנדומלית ל-5' הנגרמת כתוצאה משיעתוק-מהופך וגם השפעת המבנים השניוניים על אתרי הקשירה לפריימרים, מומלץ לעשות הידרוליזה של הרנ"א לכ-200–300 בסיסים טרם השיעתוק המהופך וע"י כך לצמצם את היקף שתי הבעיות בו זמנית. למרות זאת, ישנם שיקלולי תמורות עם שיטה זו, שכן באופן כללי רוב גופי התעתיקים מומרים בצורה יעילה לדנ"א, בעוד שקצוות ה-3' וה-5' פחות. בהתאם למטרות המחקר, חוקרים יכולים להחליט האם ליישם שלב זה או לא.
לאחר סינטוז הדנ"א הקומפלמנטרי ניתן להמשיך ולקטעו בהתאם לאורך המקטע הרצוי כפי שמצוין בטבלה 1. התבנית כעת מוכנה לשיטת הריצוף הרצויה.
טכנולוגיות ריצוף של הדור-הבא.
טכנולוגיות ריצוף בתפוקה-גבוה מייצרות מיליוני קריאות קצרות מספריה של רצפי נוקליאוטידים. בין אם רצפים אלה הם רנ"א, דנ"א או תערובת של שניהם, מנגנון הריצוף של כל פלטפורמה זהה. הטכנולוגיות הנפוצות ביותר הן של אילומינה, סוליד, איון טורנט, 454 ועוד.
ריצוף רנ"א ישיר.
מכיוון שהמרת רנ"א לדנ"א קומפלמנטרי באמצעות שיעתוק-מהופך יכול ליצור ארטיפקטים אשר עשוים להפריע לאפיון ולכימות התעתיקים, מפותחת כעת טכנולוגיה חדשה בשם ' ריצוף רנ"א ישיר ברמת המולקולה הבודדה' (DRSTM) על ידי חברת הליקוס (Helicos). טכנולוגיה זו מרצפת מולקולות רנ"א בצורה ישירה באופן מאסיבי-מקבילי, מבלי להמיר רנ"א לדנ"א קומלפמנטרי או לבצע מניפולציות אחרות כגון ליגציה ואמפליפיקציה לתעתיקים.
עימוד הטרנסקריפטום (Transcriptome alignment).
עקב אורכן הקצר של הקריאות (בפלטפורמת האנליזה הגנומית של אילומינה יכול להגיע לכ-60 בסיסים) הרכבה דה-נובו (de Novo) עשויה להיות קשה מאוד (על אף שקיימות מספר תוכנות המסוגלות לעשות זאת כגון Velvet algorithm). קושי זה נובע מהעובדה שלא ניתן ליצור אזורי חפיפה גדולים בין הקריאות השונות, טכניקה אשר מקלה באופן משמעותי לבנות מחדש את הרצף המקורי. כמו כן גם הכיסוי העמוק של הקריאות מקשה על המחשב לעקוב אחר כל צורות היישור האפשריות. ניתן לעקוף מכשול זה במידה מסוימת על ידי ריצוף רצפים ארוכים יותר מאותה דגימה באמצעות טכנולוגיות ריצוף אחרות כמו סאנגר, ולהשתמש בקריאות ארוכות אלה כ"שלד" או תבנית על בסיסו יהיה ניתן להרכיב קריאות מאזורים בעיתיים (רצפים חוזרניים למשל).
הגישה המומלצת היא ליישר את מיליוני הקריאות לרצף ייחוס (Reference genome). ישנם כלים רבים לעימוד קריאות גנומיות לרצף ייחוס (כלים לעימוד רצפים - Sequence Alignment Tools), אך תשומת לב מרובה נזקקת כאשר מעמדים טרנסקריפטום לגנום, במיוחד כאשר מתמודדים עם גנים בעלי אינטרונים.
כפי שהוזכר לעיל, ספריות הרצפים המקודדים נוצרות על ידי מיצוי כלל ה-mRNA מדגימה באמצעות גלאים לזנב הפולי-A של התעתיק, אשר מוסף למולקולת ה-mRNA לאחר שיעתוק, כלומר לאחר הליך השיחבור. לפיכך, מקורן של הספריות שנוצרות, כמו גם הקריאות הקצרות עצמן המתקבלות מהמכשיר, אינו יכול להיות מרצפי אינטרונים. עקב כך, כאשר מנסים לעמד קריאות קצרות אלו לגנום-מקור, רק הקריאות הקצרות המעומדות בטווח אקסוני לחלוטין יתאימו, בעוד שלקריאות מצמתים בין אקסונים לא תמצא התאמה.
שיטה אפשרית לנסות ולעקוף בעיה זו היא על ידי עימוד קריאות קצרות אלו לגנום-פרוקסי אשר נוצר באמצעות רצפי אקסונים ידועים. אין צורך שבגנום זה יהיה כיסוי של רצפי אקסונים שלמים, אלה מספיק רק טווח שיבטיח שהקריאות הקצרות יוכלו להתאים לשני צדדיו של צומת אקסון-אקסון עם מינימום חפיפה. כמו כן, קיימים פרוטוקולים ניסיוניים אשר מאפשרים יצירת קריאות המבדילות לגדיל ספציפי.
קיימות מספר ערכות תוכנה לעימוד קריאות קצרות (short read alignment), ולאחרונה אף פותחו אלגוריתמים מיוחדים ליישור טרנסקריפטומים כגון TopHat ו-Cufflinks.
אנליזה.
ביטוי גנים.
אפיון רמות ביטוי של גנים (Gene expression) על ידי כימות רמות האמ-רנ"א בתא, הוא מושא מחקרי חשוב עבור חוקרים כבר לא מעט זמן. בעקבות גילוים של אירועים רגולטורים שונים המתרחשים לאחר-שיעתוק (כגון RNA interference), הוכח בעבר כי לא תמיד קיימת קורלציה חזקה בין רמות האמ-רנ"א לבין רמות החלבון של אותו תעתיק. אף על פי כן, מדידת רמות האמ-רנ"א עדיין מהווה כלי שימושי ביותר לקביעת השפעותיהם של איתותים חיצוניים (כגון טיפול תרופתי) על מכונות השיעתוק התאיות, וכן מצביעה על הבדלים בין תאים במצבם הבריא והחולה.
גישת המיקרו-אריי (Microarray).
לפני המצאת הרנ"א-סק, דנ"א מיקרו-אריי (DNA microarrays) הייתה השיטה המחקרית השולטת לאנליזת הטרנסקריפטום על ידי יצירת פרופילים של רמות ביטוי גנים. למרות שגם כיום מחקרים לא מעטים משתמשים במיקרו-אריי ומייצרים תוצאות מלהיבות במעט זמן יחסית, מגבלות ניסויות פנימיות של שיטה זו גורמות לרנ"א-סק להיות השיטה המועדפת. מגבלה גדולה וחשובה ביותר של האריי היא העובדה שיש צורך לדעת איזה רצפים מחפשים, ולהכין לכל רצף נחקר גלאי מתאים על מנת לזהות ובסופו של דבר לכמת את התעתיקים, בעוד ששיטת הרנ"א- סק היא בעלת אופי של "שאלה פתוחה" אשר מניבה תוצאות גם ללא ידע מוקדם כלל על רצפי התעתיקים הנחקרים. ככל שהמחקר בתחום הרנ"א-סק גדל ומתרחב ומניב תוצאות מבטיחות וקבועות, נשאלת השאלה "האם זהו תחילתו של סוף עידן המיקרו-אריי?". אף על פי כן, עדיין ליישומים רבים, מיקרו-אריי היא השיטה המועדפת. לא רק ששיטה זו זולה פי 10–100 בהשוואה לאותה רזולוציית דיוק ברנ"א-סק, אלה שגם פרוטוקולי העבודה של רנ"א-סק עדיין לוקים בחסר בכל הקשור לשלבי הליגציה הנחוצים. מגבלה נוספת לכימות פרופיל ביטוי גנים באמצעות רנ"א-סק היא שתעתיקים שכיחים (כמו אלה של גנים "שומרי-בית") אחראים לעיקר האינפורמציה המרוצפת. כך למשל בדגימה טיפוסית, 5% מהגנים מהווים כ-75% מהקריאות המרוצפות. כתוצאה מכך קשה למדוד את שכיחות התעתיקים הנותרים בצורה אמינה ולכן רוב המדידות מושפעות מ"רעש" רב.
כיסוי כמדד לביטוי.