התאוריה האבולוציונית, לפיה מינים משתנים לאורך זמן, לא הייתה חידוש מקורי של דרווין. רעיון זה הוצע כבר לפני כן על ידי גורמים בחוגים מסוימים, אך התפיסה של המנגנון האבולוציוני הייתה שונה. למארק, למשל, הציע מנגנון בו שינוי במידת השימוש של איבר השפיע על תפקוד אותו איבר בפרט מסוים, ושינוי זה עובר בתורשה. דרווין, לעומתו, הציג רעיון בו שינויים מתרחשים כתוצאה מהישרדותם של הכשירים ביותר על ידי תהליך של ברירה טבעית.
רבים מהמדענים בני זמנו של דרווין תחילה כלל לא קיבלו את הרעיון שלו. לבסוף, עם השנים החלו חלק ממדעני התקופה, כמו תומאס הנרי האקסלי, לקבל את קיומו של המנגנון של דרווין לשינוי המינים אשר התבסס על עדויות מאובנים; מספר מדענים הקימו את מועדון ה־X על מנת להגן על התאוריה מפני התנגדויות דתיות ומפני חובבים עתירי־ממון.
בספרו הציג דרווין את תיאורית הברירה הטבעית, מנגנון אבולוציוני אשר בזמנו היה שנוי במחלוקת, מאחר שעמד כנגד תאוריות מקובלות יותר בזמנים אלו כגון לאמארקיזם ואורתוגנסיס. בנוסף, התיאור ההדרגתי של דרווין נתקל בהתנגדות של תומכי רעיון הקפיצות והקטסטרופיזם.
אחד הקשיים העיקריים בתאוריה של דרווין בא מתחום ההורשה. ב-1867 שאל המהנדס הסקוטי פלימינג ג'נקין כיצד פרטים בעלי יתרון שיאפשר להם לשרוד מסוגלים להתרבות במספרים גדולים מספיק כדי לשנות את האוכלוסייה. תהייה זו באה על רקע תפיסה רווחת באותה תקופה בתחום ההורשה: ההורשה המעורבת, אשר לפיה תכונות שני ההורים מתערבבות ומתמזגות אצל צאצאיהם. כך, תכונות חדשות, גם אם הן מועדפות, יתפוגגו תוך דורות בודדים. טענה זו נפתרה חלקית באמצעות הרעיון שבידוד גאוגרפי תורם ליצירת מינים חדשים. בהמשך, בספרו המאוחר יותר "מגוון בעלי חיים וצמחים בתנאי ביות" (1868), הגה דרווין את מנגנון ההורשה המכונה "פנגנזה", אשר לפיו כל איבר בגוף שולח חלקיקים קטנים, או גמולות, לאיברי המין, וכך מתאפשרת הורשת תכונותיו על ידי ארגון מחדש של תכונות אלו לדורות הבאים. תאוריה זו מצביעה על סינתזה מסוימת של רעיונותיו של דרווין עם רעיונותיו של למארק, אשר סבר כי איבר שנעשה בו שימוש רב (או מועט) מתפתח (או מתנוון), והשינוי עובר לצאצאים. עם פרסום תאוריה זו, רעיון הפנגנזה הותקף מכול עבר, אף על ידי בן דודו של דרווין פרנסיס גולטון אבי תורת האאוגניקה.
באותה העת שקד הנזיר הצ'כי גרגור מנדל על ניסויֵי הכלאה בין זני אפונה, מהם הוא גזר את חוקי התורשה של מנדל, שהם הבסיס לגנטיקה המודרנית. למרות שמנדל שלח לדרווין את מאמרו, אין כל עדות לכך שדרווין קרא אותו, או שחשב שמחקרו של מנדל רלוונטי לעבודתו. הבעייתיות הנובעת מהורשה מעורבת המשיכה להיות מקור לביקורת על דרוויניזם עד שהתקבלה תורתו של מנדל בשנות ה-20 של המאה ה-20, ומוזגה עם תאוריית הברירה הטבעית של דרווין. תורת הגנטיקה המנדליאנית התיישבה עם תחזיותיו של דרווין והפריכה, בעיני ביולוגים, את תאוריות ההורשה המתחרות. כל אלו הובילו לעלייתה, בשנות ה-30 של המאה ה-20, של הסינתזה האבולוציונית המודרנית, שהיא תאוריה מאוחדת של תורשה מנדלית־גנטית וברירה טבעית דרוויניסטית. יותר מיובל לאחר שדרווין פרסם את ספרו "מוצא המינים", הסינתזה המודרנית הפכה לבסוף למקובלת על כלל הביולוגים.
טענה נוספת הועלתה על-ידי הפיזיקאי ויליאם תומפסון, לימים לורד קלווין, אשר טען ב-1866 שכדור הארץ צעיר מדי מכדי לאפשר אבולוציה. על פי מדידותיו הגאולוגיות של קלווין, גילו של כדור הארץ אינו יותר ממאה מיליון שנה ולא חלף מספיק זמן כדי שהאבולוציה תוכל להתקיים. דרווין ותומכיו, שהאמינו בגישת היוניפורמיטריאניזם בחקר כדור הארץ, כלומר, בתהליכים גאולוגיים איטיים על פני עידנים, נותרו המומים וללא טיעוני נגד. הם ציינו כי ייתכן שהאבולוציה יותר מהירה ממה שחשבו או שמתרחשת בקפיצות כפי שטען האקסלי. בנוסף, הצהירו בפשטות שקלווין כנראה טועה. טענות לגבי גיל כדור הארץ המשיכו להיות מקור להתנגדות לאבולוציה עד לראשית המאה ה-20 עם גילוי הרדיואקטיביות, אשר סיפקה דרך יותר מדויקת לקבוע את גילו של כדור הארץ.
טענה נוספת, שעדיין עולה בחוגים מסוימים כיום, הייתה כי חסרות עדויות למאובנים שיכולים להצביע על התפתחות הדרגתית של מינים חדשים. מתנגדי דרווין הסבירו כי אם, למשל להיפופוטם וללווייתן יש אב משותף, חייב להימצא תיעוד מאובני של יצור ביניים שמצביע על התפתחות ופיצול. טענה זו נענתה על ידי דרווין בכך שמאובנים אלו קיימים אך טרם נמצאו. תשובה זו של דרווין התחזקה עם השנים עם מציאת עוד מאובנים של שלבי ביניים שונים.
נטען עוד כי התאוריה של דרווין אינה יכולה להסביר התפתחות אבולוציונית של איברים מורכבים כמו העין או הכנף. על פי טענה זו, עד להתפתחות האיבר המורכב לבעל האיבר המתפתח לא היה כל יתרון הישרדותי על פני פרטים אחרים, על כן האורגניזם לא היה בהכרח שורד ומעביר את תכונותיו לצאצאיו. איברים מורכבים אלו, לשיטת כמה מהמתנגדים, מחזקים את הטענה לקיומו של יוצר תבוני. מצדדי תורת האבולוציה טוענים בתגובה שלבעל חיים עם "חצי עין" – קולטנים לאור, למשל – יש יתרון במאבק הקיום וכך מתרחשת ההשתנות ההדרגתית שהביאה את העיניים למצביהן הנוכחיים בבעלי החיים השונים.
טיעונים דתיים.
הספר השפיע מאוד על החברה הוויקטוריאנית, חברה שהייתה דתית מאוד, רבים קראו את ספרו, כולל המלכה ויקטוריה עצמה. בנוסף להתנגדות המדעית לדרווין, גם התנגדויות דתיות הועלו מייד עם פרסום הספר, ופרסומו הוסיף להרחבת המרדנות כנגד הממסד הדתי. בדומה למהפכה הקופרניקאית, התאוריה של דרווין איימה לשנות את מיקומו של האדם ביחס לשאר החיות, לבני האדם ולאל. עד סוף המאה ה-18 התבססו הוגים של היסטוריה טבעית (שממנה התפתחה הביולוגיה המודרנית) על סיפור הבריאה התנ"כי על מנת להסביר את מסתורי היקום. על פי טענתם, המגוון בטבע נובע מהאל ואת ההיסטוריה הטבעית אפשר להסביר באמצעות סיפורי התנ"ך כמו המבול. המנגנון שהציע דרווין איפשר להוציא את האל מהתמונה. על פי תפיסתו, עולם היצורים החיים נע סביב מאבק תמידי על מנת לשרוד. דרווין עצמו הציע שהסבל הרב בעולם החי הוא טיעון חזק לשלילת קיום האל. ישנם הוגים דתיים שלדעתם הבעייתיות החמורה ביותר בדרוויניזם היא המשמעות החברתית והדתית שלה.
בסוף המאה ה-18 החלו הוגים להצביע על ממצאים ממאובנים והעלו תאוריות אבולוציוניות שמסבירות את המגוון הביולוגי, את הדמיון בין יצורים חיים ואף בין יצורים שכבר אינם קיימים. הוגים כמו קיוויה וארסמוס דרווין המשיכו את רעיונותיו של אריסטו אשר דיבר על תכליתיות של היקום והטבע: תינוק נועד להיות בן-אדם, זרע נועד לגדול ולהפוך לעץ, לכל דבר ישנו ייעוד ומטרה. ארסמוס דרווין פיתח את הרעיון של "שרשרת הקיום" בה יש היררכיה מסודרת ומובנת של יצורים חיים בהם האדם הוא עליון. התאוריה של צ'ארלס דרווין נכדו איימה להפיל את שרשרת זו. על פי ספרו של דרווין, האדם הוא עוד חיה בטבע, ללא בכורה או מיקום מיוחד. מעבר לכך טען דרווין כי המוסר, שעל פי הדת הנוצרית מגיע מהאל, תלוי בנסיבות ותרבות. דוגמה לכך היא אמירתו שאם בני אדם היו חיים בתנאים של דבורים, ייתכן שהיה לנו המוסר של דבורים.
היו שניסו לשלב בין התאוריה של דרווין לבין הדת. דוגמה לסינתזה מעניינת בין דת למדע היא ספרו של צ'ארלס הוג שפורסם ב-1874 בו הוא טען כי אין לראות בדרוויניזם ניגוד של האמונה באל, אלא בברירה הטבעית תהליך המונחה על ידי האל. בעקבות כך, היו מדענים כמו חברו של דרווין, אסא גריי, ששילבו בין טענות אלו על ידי החזרת התכליתיות המוסר וייעוד עתידי לדרוויניזם, כלומר, הבנה כי יש תכנון מוסרי מאחורי השינויים בטבע וציר מתוכנן וייעודי לעולם הטבע עם היררכיה מסודרת, דבר שדרווין התנגד לו מאוד.
במקביל לתהליך הסינתזה בין הדרוויניזם לדת נוצר גם מאבק בין תומכי דרווין למתנגדיו. הדוגמה הטובה ביותר וגם אחת המפורסמות ביותר בהיסטוריה של המדע היא ויכוח פומבי בין תומכו וחברו של דרווין תומאס האקסלי, לבין הבישוף סמואל וילברפורס מאוקספורד ב-30 ביוני 1860. בוויכוח חריף זה אמר הבישוף כי "אין אדם רציני יכול באמת להאמין שהאדם בא מצדפות". במהלך הוויכוח שאל הבישוף את האקסלי אם הוא "קרוב לקופים מצד סבא שלו או מצד סבתא שלו". כתשובה הסביר האקסלי באריכות את עליונותה של התאוריה של דרווין וסיים במשפט: "הייתי מעדיף שסבא שלי יהיה קוף אומלל ולא אדם שבחר להכניס גיחוך לדיון מדעי רציני".
טיעון דתי נוסף של מתנגדי הדרוויניזם הוא אנלוגיית השען, תאוריה זו שזוהתה עם ויליאם פיילי טוענת כי בדומה לשעון מורכב, מורכבות היקום והמגוון הביולוגי מחייבים את קיומו של שען או ארכיטקט תבוני, כלומר אל בורא. על מנת להתמודד עם טיעון זה הציג דרווין מספר דוגמאות המצביעות לדעתו על חוסר השלמות בטבע, כגון העובדה שכאשר דבורה עוקצת תוקף היא מתאבדת למעשה, דבר שנוגד את האינסטינקט ההישרדותי שלה. הוא אמר שדוגמאות כמו זו אינן שוללות את קיומה של הברירה הטבעית, משום שהסתגלות אינה מחייבת שלמות; אבל הן סותרות את רעיון השען משום שתאוריה זו מחייבת תכנון תבוני מושלם.