עוד פורסמו דיווחים על שיירי צמחים שנשתמרו במשקעים המתוארכים לתקופת המיוקן. בשנת 1994, וודוורד ועמיתיו כתבו כי את מה שנחשב לאחד הממצאים המשמעותיים עד אותה העת, רצפי ציטוכרום מיטוכונדריאלי שמוצו מעצמות דינוזאור שגילן המשוער הוא למעלה מ-80 מיליון שנה.
בשנת 1995, שני מחקרים נוספים דיווחו כי רצפי DNA של דינוזאור מוצו מביצה מתקופת הקרטיקון. נדמה היה כי תחום חקר ה-DNA העתיק יחולל מהפכה בכל הקשור לידע על עברו האבולוציוני של כדור הארץ. מעבר לממצאים אלה גם שוחזרו רצפים הלו-בקטריאליים בני 250 מיליון שנה שמוצו מהליט.
בתקופה זו גם התפתחה ההבנה של קינטיקת שימור DNA. הסיכונים של זיהום דוגמאות וגורמי סיבוך מחקריים, הובילו את החוקרים בתחום זה להסתכל על הממצאים בצורה ספקנית יותר. מספר ניסיונות זהירים נעשו על מנת לשחזר רבים מהממצאים הקודמים, והתחוור כי כל הטענות בדבר DNA עתיק בן עשרות מיליוני שנים ששוחזר ורוצף כהלכה, אינן אותנטיות.
שנות האלפיים.
על מנת להתמודד עם נזקי השינויים ב-DNA לאחר המוות, בשנת 2007 הוצגה שיטת הגברה באמצעות הרחבה של פריימר יחיד. בשנת 2009, תחום חקר ה-DNA העתיק עבר מהפכה עת הוצגו טכניקות מחקר זולות ביחס לקיים עד אותה תקופה. השימוש בטכניקות ריצוף של הדור הבא, ומאפשרות תפוקה גבוהה, התבררה כחיונית לשחזור הגנומים של אורגניזמים עתיקים או כאלה שנכחדו. כמו כן, נבנתה ספריית DNA חד-גדילי, אשר הציתה עניין רב בקרב חוקרי DNA עתיק.
בנוסף להתפתחויות הטכנולוגית, התפתחו גם תקנים וקריטריונים טובים יותר המשמשים להערכת תוצאות DNA, כמו גם הבנה טובה יותר של סך הבעיות הפוטנציאליות הטמונות במחקר DNA עתיק.
בעיות אפשריות.
זיהום.
דגימות DNA עתיקות עשויות להיות מזוהמות על ידי DNA אנושי מודרני ועל ידי DNA מיקרוביאלי (שרובו עתיק). בשנים האחרונות פותחו שיטות למניעת זיהום אפשרי של דגימות aDNA. השיטות כוללות חילוץ חלקים בתנאים סטריליים ושימוש במתאמים מיוחדים לזיהוי מולקולות ששייכות לדגימה המקורית. בנוסף, קיימים יישומים מתחום הביואינפורמטיקה המאפשרים להעריך את מידת הזיהום ברצף באמצעות השוואה לרצפים מוכרים.
תהליכי פירוק.
עקב תהליכי פירוק שעובר DNA בחלוף הזמן (בין היתר דיאמינציה וקיטוע), ה-DNA העתיק פחות איכותי מחומר גנטי מודרני. חוסר השרידות של ה-aDNA לאורך זמן מגביל את אפשרויות הניתוח שלו, ובחלוף זמן רב קשה לקבל דגימות מוצלחות. קיים מתאם בין כמות הזמן שחלפה לבין פירוק ה-DNA, אך תנאי הסביבה יכולים לגרום למתאם להיות לא אחיד. בשל כך, סביר שדגימות שהשתמרו בתנאים שונים תתפרקנה באופן שונה, גם אם גיל הדגימות זהה. תנאי הסביבה עשויים להשפיע על הדגימה גם לאחר שלב החפירה, שכן שיעורי ריקבון ה-DNA עשויים להשתנות בהתאם לתנאי האחסון. גם בתנאי השימור הטובים ביותר, 0.4-1.5 מיליון שנים הן הגבול העליון לגיל הדגימה המאפשר ריצוף של ה-DNA בטכנולוגיות מודרניות.
במחקר שעסק בדעיכה של DNA מיטוכונדריאלי וגרעיני בעצמות מואה, הוצג מודל של פירוק DNA מיטוכונדריאלי לכדי אורך ממוצע של זוג בסיסים יחיד וזאת לאחר 6.83 מיליוני שנים בטמפרטורה של 5- מעלות צלזיוס. קינטיקת הדעיכה נמדדה על ידי ניסויי התיישנות מואצת שהדגימו בפירוט את ההשפעה המשמעותית של תנאי האחסון (כגון טמפרטורה ולחות) על דעיכת ה-DNA. פירוק של DNA גרעיני מתרחש לכל הפחות במהירות כפולה מזה של רעהו המיטוכונדריאלי. מסיבה זו, המסקנות במחקרים מוקדמים שדיווחו על שחזור של DNA עתיק בהרבה, לדוגמה של הדינוזאור מתקופת הקרטיקון, ייתכן כי נבעו מזיהום של הדגימה.
התיישנות.
מאמר ביקורתי שסקר את הספרות בנושא DNA עתיק במהלך שנות התפתחות התחום, גרס כי מספר מחקרים שנעשו לאחר שנת 2002 הצליחו בהגברת DNA שמוצה משרידים בני למעלה ממאות אלפי שנים. הערכת סיכונים מקיפה יותר שנעשתה לגבי זיהום סביבתי, כמו גם מחקרים בנושא היציבות הכימית של DNA, הציפו סימני שאלה לגבי הממצאים שפורסמו עד אותה עת. כך, ה-DNA שנטען כי מוצה מדינוזאור נחשף בהמשך ככרומוזום Y אנושי, וכן ה-DNA שדווח כי היה עטוף בהלו-בקטריה ספג ביקורת שהתבססה על הדמיון שלו לבקטריות מודרניות, מה שהצביע על קיומו של זיהום. מחקר משנת 2007 הציע כי דגימות ה-DNA הבקטריאלי הללו ככל הנראה לא שרדו מימי קדם ועד זמננו, אלא המדובר בתוצר של פעילות מטבולית איטית וארוכת שנים.
DNA עתיק עשוי לכלול כמות גדולה של מוטציות הנוצרות לאחר המוות, והמתעצמות ברבות הזמן. מספר אזורים של הפולי-נוקלאוטיד רגישים יותר לפירוק שכזה, כך שרצף מידע יכול עקרונית "לעקוף" מסננים סטטיסטיים שמטרתם לוודא את תקפות המידע בעת תהליך ניתוח הנתונים. למול שגיאות ריצוף אפשריות, יש לנקוט משנה זהירות בכל הקשור לפרשנות של גודל האוכלוסייה הנחקרת. התמרות כימיות שמקורן בדיאמינציה של שיירי ציטוזין נוטות להופיע בהמוניהן ברצפי DNA עתיק. קידוד שגוי מציטוזין לתימין ומגואנין לאדנין ניצב בבסיס מרבית השגיאות הללו.
DNA לא אנושי.
על אף הבעיות שנקשרו בשמו של DNA מתקופת טרום-המבול, פורסמה מאז מיסוד התחום שורה הולכת וגדלה של רצפי DNA עתיק שמוצו ממינים רבים של בעלי חיים וצמחים. רקמות שנבחנו כוללות שרידי בעלי חיים שנחנטו מלאכותית או טבעית, עצמות, צואה קדומה, דוגמאות כוהל שנשתמרו, ערימות פסולת של מכרסמים, שרידי צמחים יבשים, וכן מיצויים של DNA מבעלי חיים או צמחים היישר מתוך דגימות קרקע.
ביוני 2013, קבוצה של חוקרים ובהם אסקה ווילרסלב, מרכוס תומאס, פיוס גילברט ואורלנדו לודוביק מהמרכז לגאו-גנטיקה במוזיאון הטבע של דנמרק (המשויך לאוניברסיטת קופנהגן) הכריזה כי הצליחה לרצף DNA של סוס, בן 560–780 אלפי שנים, וזאת באמצעות מיצוי חומרים מעצם רגלית שנמצאה קבורה בקפאת-עד ביוקון שבקנדה.
קבוצה גרמנית פרסמה, גם כן בשנת 2013, כי הצליחה לשחזר גנום מיטוכונדריאלי של דב בן למעלה מ-300 אלפי שנים, ובכך הוכיחה כי DNA עתיק אותנטי יכול להשתמר במשך מאות אלפי שנים מחוץ לקפאת-עד. בשנת 2021 דווח כי רצף DNA עתיק אף יותר, אשר השתמר בקפאת-עד, מוצה מתוך שתי ממותות סיביריות בנות למעלה ממיליון שנה.
בשנת 2016 נחקר DNA כלורופלסטי שמוצה מליבת משקעים ימיים, ונמצא DNA של צורניות שמתוארך ל-1.4 מיליון שנה טרם זמננו ובכך נקבע שיא חדש של גיל DNA עתיק אותנטי. קבוצתו של קירקפטריק מצאה כי ה-DNA עבר תהליך דעיכה לאורך זמן מחצית חיים של כ-100 אלף שנים, לאחריו התרחשה דעיכה בקצב איטי יותר (שמתואר מתמטית על ידי חוק חזקה).
DNA אנושי.
בשל העניין האנתרופולוגי, הארכאולוגי והציבורי בשרידי אדם, אלו זכו לתשומת לב רבה של חוקרי DNA. בעיית הזיהום מתגברת בחקר דגימות אנושיות, שכן הדגימות מגיעות ממין זהה לזה של החוקרים שאוספים ומעריכים את הדגימות.
מקורות.
בשל אופן השימור של מומיות, מחקרים רבים משנות ה-90 וה-2000 השתמשו ברקמה חנוטה כמקור ל-DNA אנושי עתיק. חלק מהמקורות הללו כוללים דגימות שהשתמרו באופן טבעי, למשל מומיות שהשתמרו בקרח, כגון אצי, איש הקרח, או מומיות שנשמרו ביובש, כמו מומיות הנמצאות בגובה רב בהרי האנדים. כמו כן, נעשה גם שימוש ברקמות שהשתמרו באופן מלאכותי, למשל במומיות שנחנטו במצרים העתיקה.
עם זאת, דגימות חנוטות הן משאב מוגבל. רוב המחקרים שעוסקים ב-aDNA אנושי התמקדו בהפקת DNA משני מקורות נפוצים יותר שניתן למצוא בחפירות ארכאולוגיות - עצמות ושיניים. העצם שמשתמרת בצורה הטובה ביותר היא הפטרוס, בזכות המבנה הצפוף שלה. לכן, זו העצם הנפוצה ביותר לשימוש בהפקת aDNA. ניתן גם להפיק DNA ממקורות נוספים, למשל מצואה מאובנת, ומשיער.
DNA של פתוגנים עתיקים הופק בהצלחה מדגימות שגילן מתוארך ליותר מ-5,000 שנים בבני אדם, ולמעל 17,000 שנים במינים אחרים. בנוסף למקורות הרגילים שמשמשים להפקת DNA כמו רקמות חנוטות, עצמות ושיניים, המחקרים בתחום בחנו גם מגוון דגימות של רקמות אחרות, כולל דגימות מקרום החזה, קמות משומרות בפרפין, ורקמות שנשתמרו בפורמלין. כדי לאפשר הפקת aDNA מפתוגנים וממיקרואורגניזמים, פותחו כלים חישוביים לניתוח aDNA, כדוגמת QIIME ו-FALCON.
תוצאות.
בנובמבר 2015, מדענים דיווחו על מציאת שן בת 110,000 שנים המכילה DNA של האדם הדניסובי, מין נכחד של בני אדם בסוג הומו. מחקרים נוספים חשפו מידע על קשרים בין אבותיהם של תושבי מרכז אסיה לבין העמים הילידים של ישבת אמריקה. באזור יבשת אפריקה, DNA מתכלה במהירות גדולה יותר בגלל האקלים הטרופי החם, אך בספטמבר 2017 נמצאו דגימות DNA עתיקות, שגילן תוארך לכ-8,100 שנים.
DNA עתיק שימש חוקרים בניסיונות תארוך של התפצלות האנושות המודרנית ממיני אדם אחרים. באמצעות ריצוף גנומים אפריקאיים של שלושה ציידים לקטים מתקופת האבן (בני 2000 שנה) וארבעה חקלאים מתקופת הברזל (בני 300 עד 500 שנים), החוקרים הצליחו לשאר שההתפצלות הקדומה ביותר בין אוכלוסיות אנושיות התרחשה לפני 350,000 עד 260,000 שנים.
נכון לשנת 2021, הגנומים האנושיים העתיקים ביותר ששוחזרו לחלוטין הם בני כ-45,000 שנים. נתונים גנטיים תורמים לקבלת תמונה מדויקת יותר של ההגירה ושל ההיסטוריה הגנטית האנושית, ומאפשרים להבין את הרגלי הרבייה של בני אדם קדומים עם מיני אדם אחרים, למשל עם האדם הניאנדרטלי.
היבטים אתיים.