לאחר שלוש שנים, בשנת 1993, התגבשה תוכנית החומש השנייה, שנבנתה לאור ההתפתחויות הטכנולוגיות (שאפשרו סיום חלק מהמטרות מוקדם מהצפוי), והניסיון שנצבר מהעבודה על המיזם. שוב נפגשו אנשי מחלקת האנרגיה וה-NIH עם מדענים ואישי ציבור, ופרסמו תוכנית חומש חדשה לשנים 1993-1998. בין ההתפתחויות הטכנולוגיות המרכזיות שהשפיעו על ההתקדמות ניתן למנות (א) פיתוח סוגי סמנים גנטיים נוספים, הניתנים לזיהוי על ידי PCR, (ב) פיתוח מערכות לשיבוט מולקולרי של מקטעי DNA ארוכים וכלים חישוביים כדי לחבר אותם וליצור מהם מפות פיזיקליות, (ג) הגדרות STS כיחידת מידה למיפוי פיזקלי, (ד) שיפור הטכנולוגיה ואוטומציה של תהליך הריצוף.
מטרות תוכנית החומש השנייה:
תוכנית החומש השלישית (1998-2003).
מטרות תוכנית החומש השלישית:
דיווח תוצאות המיזם.
טיוטה ראשונה התפרסמה בשנת 2000, והוכרז בהודעה משותפת של נשיא ארצות הברית ביל קלינטון וראש ממשלת בריטניה טוני בלייר ב-26 ביוני. המאמרים הנלווים פורסמו בפברואר 2001.
במסגרת המיזם רק DNA אאכרומטי רוצף, המהווה כ-92.1% מגנום האדם. יתר ה-DNA ההטרוכרומטי, נמצא בעיקר בצנטרומרים ובטלמורים שלא רוצפו במיזם. אזורים אלו קשים יותר לריצוף, מכיוון ששיטת הריצוף התבססה על חלוקת הגנום למקטעים קצרים, ואזורים אלו מאופיינים במקטעים חוזרניים.
הטיוטה הראשונה כיסתה למעלה מ-90% מהגנום, אך עם שגיאה אחת לכל אלף בסיסים ו-150,000 מרווחים, ורק 28% מהגנום היה מרוצף ברמת אמינות גבוהה. טיוטה נוספת פורסמה ב-2003 אשר סימנה את סיום המיזם, אך הגנום עצמו טרם פוענח לחלוטין. בטיוטה זו היו פחות מ-400 מרווחים, ו-99% מהגנום היה בעל שגיאה אחת לכל 10,000 בסיסים. בדיקת איכות לגרסה זו מצאה שעל אף שדווח על כיסוי של 99% של ה-DNA האאכרומטי בדיוק של 99.99%, בפועל למעלה מ-92% היה באיכות גבוהה מזו.
בשנת 2006 התפרסם רצף הכרומוזום האחרון, כרומוזום 1, הכרומוזום הגדול ביותר באדם. טיוטת רצף הגנום המשיך להתעדכן עם השנים. בשנת 2009 פורסמה טיוטה נוספת שהכילה מעל 300 מרווחים, ובשנת 2015 נותרו עדיין 160 מרווחים. בשנת 2020 הוכרז על 79 מרווחים כבלתי פתורים, המהווים 5% מהגנום. חודשים ספורים לאחר מכן נעשה שימוש בטכנולוגית ריצוף חדשה, המאפשרת ריצוף מקטעים ארוכים, ולראשונה רוצף כרומוזום X מטלומר לטלומר. שאר הכרומוזומים גם רוצפו שוב בשיטה זו בשנת 2021 הושלם התהליך על כל הכרומוזומים, מלבד כרומוזום Y.במרץ 2022 הושלם רשמית פענוח הגנום האנושי.
זמינות לציבור.
הרצפים זמינים לציבור הרחב במאגרי מידע במרשתת. ה-NCBI ומוסדות מקבילים מאירופה ומיפן אוגרים את כל המידע הרצפי שנצבר.
כלים שפותחו.
גופים נוספים יצרו כלים לשימוש במידע, כמו הדפדפן הגנומי של אוניברסיטת קליפורניה בסנטה קרוז ו-Ensembl שבאמצעותם ניתן להתבונן בנתונים בצורה ויזואלית, יחד עם ערוצי מידע נוספים ולבצע ניתוחים שונים.
שיטות וניתוח.
שיטות.
גנום האדם מכיל כ-3.1 מיליארד זוגות בסיסים. כדי לאפשר ריצוף הגנום חולק למקטעים באורך של כ-150,000 זוגות בסיסים. העבודה מכאן התייחסה לכל מקטע בנפרד: הוא הונדס לתוך BAC, שהם כרומוזומים מלאכותיים (ממקור חיידקי שעברו הנדסה גנטית). ה-BAC הוחדר לתוך חיידקים, שם עברו שכפול על ידי המערכת התאית. לאחר מכן ה-DNA הופק, ורוצף בשיטת Shotgun sequencing. יתרון השימוש בשיטה זו הוא שעל אף שלא ניתן לרצף מקטעי DNA ארוכים, בהכרח כל 150,000 הבסיסים הגיעו מאותו מקום בגנום, ולכן מיפויו בחלקים פשוט יותר. לשיטה זו קוראים ריצוף היררכי.
אנוטציה.
בביואינפורמטיקה, התהליך של זיהוי הגנים בתוך הגנום נקרא אנוטציית DNA. אנוטצייה ידנית מדויקת יותר, אך גם איטית יותר. המיזם הפיק כמויות עצומות של מידע, ולכן פותחו כלים חישוביים לאנוטצייה. בשנת 2008 הוצגה שיטה לריצוף כלל ה-mRNA בתא, RNA-seq, המייצג את כל הגנים המבוטאים. עד להמצאת שיטה זו, האנוטציות התבססו על מאפיינים רצפיים שנמדדו בצורה ישירה ומדויקת. כיום האנוטצייה מתבססת על ריצוף עמוק בשיטת RNA-seq לזיהוי כלל התעתיקים בכל סוגי התאים האפשריים. ניסויים אלו חשפו שמעל ל-90% מהגנים באדם עוברים שחבור חליפי, כך שממרבית הגנים מיוצרים שני חלבונים (או יותר) שונים.
הגנום שפורסם לא מייצג את הגנום של אדם יחיד. זהו פסיפס של מספר תורמים אנונמיים, כולם ממוצא אירופאי. פסיפס זה מהווה את גנום הייחוס בו משתמשים המדענים.
ממצאים.
ממצאים מרכזיים מפרסום תוצאות המיזם:
המיזם הפרטי לפענוח גנום האדם.
קרייג ונטר היה מדען ה-NIH בשנות ה-90 המוקדמות כאשר המיזם החל. בעקבות חילוקי דעות לגבי העלויות והשיטות, פרש ונטר מהמכון, והקים בשנת 1998 חברה בשם Celera Genomics, והציב מטרה לסיים לפני המיזם הציבורי, ובעשירית מהעלות (300 מיליון דולר). המיזם הפרטי הצליח להתקדם בקצב מהיר יותר מהמיזם הציבורי ובעלות נמוכה יותר מכיוון שהשתמשה בנתונים שפורסמו על ידי המיזם הציבורי.
סלרה השתמשו בשיטה הנקראת ריצוף גנום שלם בשיטת ה-shotgun sequencing. שיטה זו התבססה על יצירת מולקולת DNA ארוכות, קריאה של הקצוות הנמצאים במרחק ידוע זה מזה. שיטה זו כבר שימשה להרצפת גנומים של חיידקים שונים באורך של שישה מיליון זוגות בסיסים, המהווה רק אחוז קטן מכמות הבסיסים באדם.
סלרה הכריזה התחילה כי הם שואפים לרשום פטנט רק על 200-300 גנים, אך מאוחר יותר ביקשה הגנה על קניין רוחני של 100-300 "מבנים חשובים שאופיינו במלואם". בפועל הגישה החברה בקשת מקדימה לרשם הפטנטים של 6,500 גנים (או חלקי גנים). החברה הבטיחה לפרסם את ממצאיה בהתאם לתנאי הצהרת ברמודה משנת 1996, באמצעות פרסום מידע פעם בשנה (המיזם הציבורי עדכן את המאגרים על בסיס יומי), אך בניגוד למיזם הציבורי הם לא יאפשרו שימוש במידע.
המיזם הציבורי הזדרז לפרסם את טיוטת הגנום כדי להקדים את חברת סלרה. במרץ 2000, נשיא ארצות הברית ביל קלינטון וראש ממשלת בריטניה טוני בלייר קראו לחברות הפרטיות לאפשר למדענים גישה בלתי מותנית לממצאים. ההצהרה גרמה לצניחת המנייה של סלרה, מה שגרר ירידה בנאסד"ק של תחום הביוטכנולוגיה. המגזר הביוטכנולוגי הפסיד שווי שוק של כ-50 מיליארד דולר בתוך 48 שעות מההצהרה. בסוף יוני הוכרז על פרסום הטיוטה של המיזם הציבורי, וב-7 ביולי 2000 פורסמה הטיוטה הציבורית הראשונה על ידי קבוצת הביואינפורמטיקה של הגנום ב-UCSC, ללא פירוט. בתוך 24 שעות הקהל הרחב הוריד מידע בנפח של 500 ג'יגה בתים.
בפברואר 2001 פרסם המיזם הציבורי ב-Nature פירוט על השיטות שבאמצועתן יצרו את הטיוטה והציעו ניתוח רצפי. במקביל, חברת סלרה פרסמה מידע אודות הטיוטה שלהם באותו החודש בכתב העת Science. ההודעה לעיתונות הכריזה ששני המיזמים הגיעו לקו הסיום יחדיו.
השלכות יישומיות.
פענוח התוכן של גנום האדם בעל פוטנציאל להועיל בתחומים רבים, ובהם רפואה מולקולרית ואבולוציה של האדם. דוגמאות לתחומים בהם המיזם סייע: הבנת מחלות, אפיון גנטי של נגיפים המאפשר טיפול מתאים, זיהוי מוטציות האופייניות למחלות מסוימות, הנדסת תרופת וחיזוי מדויק יותר של יעילותן, זיהוי פלילי, דלק ביולוגי, חקלאות, גידול בעלי חיים, הנדסה ביולוגית, הערכת סיכונים, ביוארכאולוגיה, אנתרופולוגיה ואבולוציה (גנטיקה אבולוציונית).
פענוח הגנום מאפשר לגלות את הקשר בין רצף ה-DNA להסתברות לחלות במחלות רבות, כגון סרטן וסוכרת. עם פרסום המידע במיזם הציבורי, חברות פרטייות (Myraid Genteics, למשל) החלו להציע בדיקות גנטיות כדי לבדוק נשאות למגוון מחלות, כמו סרטן השד, מחלות דם, סיסטיק פיברוזיס, מחלות כבד ועוד.
רצף ה-DNA זמין לכל במרשתת, באתר ה-NCBI ובאתרים אירופאיים ויפניים מקבילים. מלבד אספקת המידע עצמו, המיזם הציבורי גם עודד פיתוח מגוון כלים ומאגרי מידע והנגשת המידע שנצבר. מי שמתעניין בגן מסוים, יכול לא רק לגשת דרך המרשתת לרצף עצמו, אלא גם לראות בקלות היכן הוא נמצא בגנום, דמיון לכלל הרצפים הידועים, באילו רקמות הגן מתבטא ובאיזו רמה, המבנה התלת ממדי, קשרים שהוא יוצר עם חלבונים אחרים, מחלות בהם הוא מעורב ועוד, באמצעות כלים כמו הדפדפן הגנומי של אוניברסיטת קליפורניה בסנטה קרוז.
המיזם גם סלל דרך לתחומים נוספים, כגון חקלאות. לדוגמה, מחקר גנומי שהשווה בין חיטת הלחם ואם החיטה מאפשר להבין את תהליך הביות שעברה החיטה. פענוח הגנום מאפשר לדעת אילו גנים תרמו לתהליך, ואיך ניתן לשפר את התזונה והעמידות למחלות של החיטה.
זהות התורמים.
שני המיזמים יצרו קבוצה של כ-20 תורמים, מתוכם נבחרו באקראי כמה פרטים ששימשו לריצוף. במיזם הציבורי, המידע נאסף בצורה של סמיות כפולה. התברר שה-DNA שמקורו באחד התורמים, שכונה RP11, גבר מבאפלו, ניו יורק, הוא המתאים ביותר מבחינה טכנית לעבודה במעבדה, ולכן רוב ה-DNA בגנום הייחוס (70%&lt;) מקורו מ-RP11. שאר התורמים ששימשו למיזם הם עוד גבר ושתי נשים, ומקור ה-DNA הוא תאי דם לבנים.
אחד ממטרות המיזם הציבורי היה לחקור את השונות הגנטית באוכלוסייה ולשם כך היה צורך לאסוף דוגמאות מאנשים ממגוון מוצאים. כדי לחקור SNP והפלוטיפים, נאספו 270 דגימות מאנשי יורובה, יפנים, בני האן, צרפתים ואמריקאים ממוצא אירופאי.
המיזם הפרטי בחר מתוך המאגר ההתחלתי חמישה פרטים ששימשו לפענוח הגנום. לימים המדען המוביל של החברה, קרייג ונטר, פרסם שהוא אחד מעשרים ואחד התורמים במאגר של חברת סחרה ששימש לריצוף. הגנום של קרייג ונטר פורסם במלואו בשנת 2007, וכמה חודשים לאחר מכן פורסם הגנום של ג'יימס ווטסון, שרוצף תוך ארבעה חודשים ובעלות של 1.5 מיליון דולר.
סוגיות אתיות, משפטיות וחברתיות.