הכימיה של ההפרדה מתוארת בספר HPLC columns: theory, technology, and practice. החומר ממנו בנויה הפאזה הנייחת נקרא גם 'מצע' (support). בין שתי הפאזות האלה יש הבדלים בתכונות הפיזיקליות-כימיות (לדוגמה, באופן הנפוץ ביותר הפאזה הנייחת היא הידרופובית והפאזה הנעה היא הידרופילית) המונעים מהן להתערבב. הפאזה הנעה זורמת כל הזמן ללא הפסקה דרך כל מרכיבי המערכת, כולל גם הדוגם והגלאי. הדוגמה שעומדת לעבור אנליזה מוכנסת לדוגם, וממנו עוברת מנה קבועה ממנה אל זרם הפאזה הנעה היישר אל העמודה הכרומטוגרפית. בתוך העמודה כל אחד ממרכיבי התערובת נמשך לפאזה הנחה בעוצמה שונה עקב שוני בתכונות הפיזיקליות או הכימיות שלו. לכן הפאזה הנחה מעכבת כל מרכיב במידה שונה על ידי הצמדה זמנית שלו אליה, מכאן שלכל מרכיב מהירות שונה, ולכן זמן השהות שלו במערכת שונה. כלומר, מרכיבי התערובת יוצאים מהקולונה בזמנים שונים, ובכך מופרדים.
בקצה הקולונה יש צינור שמוביל אל מתקן שנקרא גלאי (בגרסה הנפוצה בשימוש הגלאי הוא ספקטרופוטומטר הפועל באורכי הגל של אור נראה ואור אולטרא סגולי) שתפקידו לעקוב אחרי כל מרכיב ומרכיב, ולאתר את רגע היציאה שלו, ובעזרת שעון פנימי. המערכת מציינת את זמן השהות של החומר בקולונה, והוא נקרא זמן השהייה Retention Time. החומרים מתגלים בצורה של שיאים - Peaks - (פיקים) בתוך גרף שנקרא כרומטוגרמה - Chromatogram. זמן יציאתו של השיא שמייצג את החומר המסוים מאפשר זיהוי ראשוני של החומר וגובהו מאפשר חישוב כמותו, כפי שניתן ללמוד מתוך הספר Quantitative analysis using chromatographic techniques.
סוגי השיטות ב- HPLC.
היפוך פאזות.
הרוב המוחלט של הפרדות ואנליזות בעזרת HPLC כיום נעשה באופן הכרומטוגרפי (chromatographic mode) שנקרא היפוך פאזות - Reversed Phase . בשיטת ה- Reversed Phase החומרים מתעכבים במערכת ככל שהם הידרופוביים יותר. לשם ההשהייה של החומרים האורגניים הפאזות הנחות הארוזות בתוך העמודות (קולונות - columns) הן מצע הידרופובי, שמורכב בעיקר מגרגרים נקבוביים של סיליקה ג'ל בצורות שונות, בעיקר כדוריות (spherical), בקטרים שונים (2, 3, 5, 7, 10 מיקרומטר) ובקוטר נקבוביות משתנה (60, 100, 150, 300, אנגסטרם), שעל שטח פניו קשורים כימית פחמימנים שונים כמו C3, C4, C8, C18 ועוד. יש גם מצעים הידרופוביים פולימריים המשמשים כפאזות נחות כאשר יש צורך בתמיסות ב-pH קיצוני או מצעי הכלאות של סיליקה עם קבוצות אורגניות. ברוב השיטות הקיימות כיום להפרדת חומרי רפואה משתמשים בקולונות מטיפוס C-18 שנקראות לעיתים בשמות מסחריים כמו ODS (Octadecylsilane) או RP-18. ככל שהפחמימן שקשור לפאזה הנייחת ארוך יותר כך מתעכבים יותר מרכיבי הדוגמה ומתאפשרת ההפרדה ביניהם.
הפאזות הנעות הן תערובות של מים וממסים אורגניים פולאריים, ברובם המכריע מתנול ואצטוניטריל. התערובות הללו מכילות לרוב תוספים שונים כמו בופרים (אצטאט, פוספאט, ציטראט), או חומרים פעילי שטח (אלקיל-אמינים או אלקיל-סולפונאטים) או תוספים מיוחדים (EDTA). המטרה בשימוש בתוספים כאלו או אחרים היא הגברת היעילות או הסלקטיביות, ובעיקר השליטה בהשהיית המומסים.
הגורמים המשפיעים על מידת ההשהיה של מומסים במערכות ה- Reversed Phase הם כדלקמן:
האופי הכימי של שטח הפנים של הפאזה הנחה.
האופי הכימי של פני השטח של הפאזה הנייחת נקבע על ידי סוג הפחמימן הקשור על פני הסיליקה ג'ל, על ידי מידת הכיסוי שלו (Bonding Density) ביחידות של umole/m2, על ידי איכות וטוהר הסיליקה ג'ל ועל ידי מרכיבים שונים של הפאזה הנעה הספוחים באופן קבוע על פניו. ככלל, ככל שמספר הפחמנים בפחמימן הקשור אל הסיליקה גדול יותר, כן גדלה יכולתו להשהות מומסים אורגניים בתנאי שמשווים בין אחוזי הכיסוי זהים. כלל נוסף הקשור באופי שטח הפנים של הפאזה הנחה הוא, שככל שגדול יותר מידת הכיסוי שלו על ידי הפחמימן, כך גדלה מידת ההשהיה של כל המומסים האורגניים. קולונות נחשבות להידרופוביות יחסית אם מידת הכיסוי עולה על umole/m2 3.
גורם חשוב באופי של שטח הפנים של העמודות הוא התוספים פעילי השטח, או במינוח המקצועי "יוצרי זוג-יונים" (Ion Pairing Reagents). אלה הם תוספים כמו אלקיל-אמינים ) (triethylamine, tetrabutylamine או אלקיל-סולפונאטים (dodecylsulfonate, heptyl, hexyl or octyl sulfonates), הנספחים על פני הפאזה הנחה ההידרופובית ומצפים אותה במטען חיובי (האמינים) או שלילי (הסולפונאטים). בצורה כזאת הם יכולים להשפיע מאוד על מידת ההשהיה של מומסים טעונים חשמלית.
הרכב הממסים של הפאזה הנעה – חוזק ממס (Modifiers and Solvent Strength).
שני הגורמים משפיעים על זמני ההשהייה של מרכיבי הדוגמה, המומסים. אחד הוא סוג הממסים המרכיבים את הפאזה הנעה והשני הוא היחסים ביניהם. בהגדרה, ממס חלש גורם למרכיבי הדוגמה המומסים להשתהות יותר בעמודה, וממס חזק יותר גורם להם לנדוד מהר יותר ולצאת מוקדם יותר. בזכות זאת ניתן ליצור תערוכות ממסים שישפיעו באופן שונה על כל אחד ממרכיבי הדוגמה. ככלל, הממס החלש ביותר בשיטת היפוך הפאזות ה- Reversed Phase הוא המים, והוא גם הממס הפולארי ביותר. כשמוסיפים למים ממסים אורגניים כמו מתנול MeOH או אצוניטריל או איזופרופנול, מחזקים את כוח ההמסה של הפאזה הנעה ובכך מזרזים את זמני היציאה של מרכיבי הדוגמה. ככל שאחוז הממס האורגני במים גבוה יותר כך גם יורדים זמני ההשהייה.
pH של הפאזה הנעה.
כאשר מדובר בדוגמאות המכילות מומסים בעלי קבוצות פונקציונליות מיוננות, כמו אמינים, קרבוקסילטים, פוספאטים, פוספונאטים, סולפאטים וסולפונאטים, ניתן לשלוט בדרגת היינון של הקבוצות הללו בעזרת שימוש בבופרים בפאזה הנעה. קבוצות קרבוקסיליות במומסים מקבלות מטען יותר ויותר שלילי ככל שה- pH של הפאזה הנעה עולה מעל ל- pKa שלהן, ואז הן הופכות את כל המולקולה לפולארית יותר. כלומר, העלאת ה- pH של הפאזה הנעה מעל 4–5 = pH (שהוא תחום ה- pKa המקובל לקבוצות קרבוקסיליות) מורידה את מידת ההשהיה של חומרים המכילים קבוצות קרבוקסיליות, והפוך, שימוש בפאזה ענה ב- pH נמוך מ־4 יגביר את ההשהיה שלהם כי אינן מיוננות. לעומת זאת, חומרים המכילים קבוצות פונקציונליות בסיסיות כמו אמינים, שתחומי ה- pKa שלהם מעל 8, יתעכבו יותר ויותר ככל שיעלה ה- pH של הפאזה הנעה, ויתקרב ל־8 משום שהם פחות מיוננים, ולכן פחות פולריים. מאחר שבדרך כלל אסור להשתמש בעמודות Reversed Phase בפאזות נעות בעלות pH גבוה מ־8 והשליטה על מידת ההשהיה של אמינים בתחום זה היא מוגבלת.
כרומטוגרפית חילוף יונים.
כרומטוגרפית חילוף יונים (Ion Exchange Chromatography) מתוארת בספר Handbook of Ion Chromatography. בעזרת סוג זה של כרומטוגרפיה מפרידים חומרים יוניים בתמיסות מימיות ממקורות סביבתיים, תעשייתיים וביולוגיים, כיום היישום הוא בעיקר לאניונים אי-אורגניים. האריזה בנויה ממצע גרגירי של סיליקה ג'ל או פולימרים, או הכלאה ביניהם, לכן היא מסוגלת לעמוד בלחצים גבוהים יחסית הנהוגים בטכניקת HPLC.
תהליך ההפרדה מתואר בסכימה המצורפת . על פני שטח האריזה של הקולונה קשורות קבוצות פונקציונליות מיוננות חיובית (אמינים) או שלילית (סולפונאטים או קרבוקסילאטים), אליהן קשורים יונים נגדיים לאיזון חשמלי, למשל &lt;chem&gt;OH-&lt;/chem&gt; הוא יון נגדי לאמינים ו-&lt;chem&gt;Na+&lt;/chem&gt; הוא יון נגדי לקרבוקסילטים וה. כאשר לדוגמה מגיעים מומסים טעונים שלילית אל הקולונה שעל פניה קשורות קבוצות אמיניות חיוביות עם יון נגדי שלילי, הם יוצרים במהלך נדידתם בקולונה קשר יוני עם הקבוצות החיוביות האלה, תוך כדי החלפת היונים הנגדיים השליליים שלהן, מכאן השם "חילוף יונים" – Ion Exchange. ככל שצפיפות מטענם של מרכיבי הדוגמה גדולה יותר כך הם מתעכבים יותר ומושגת ההפרדה ביניהם.
הקולונות הפולימריות מסוגלות לעמוד בתנאי pH קיצוניים, אך יש להן נטייה לתפוח או להצטמק לפי הרכב הפאזה הנעה, והן רגישות יותר ללחצים גבוהים. לעומתן קולונות מחליפי יונים המבוססות על סיליקה ג'ל עמידות בלחצים גבוהים, אך הן רגישות לתנאי pH קיצוניים, שדווקא הם נדרשים לעיתים קרובות.
מערכת ה-HPLC המתאימה לסוג זה של כרומטוגרפיה היא לעיתים קרובות אל-מתכתית בכל חלקיה, או בנויה ממתכת אל-חלד אינרטית או מטיטניום באיכות טובה, כדי שתוכל לעמוד בתנאים קיצוניים של חומצה ובסיס בפאזה הנעה. הגלאים הנפוצים ביותר הם גלאיי מוליכות חשמלית, אך גם יש שימוש לגלאים אלקטרוכימיים או גלאי ספקטרומטרית מסה בחלק מהשיטות. גלאי המוליכות מודד כל הזמן את מוליכות הפאזה הנעה, וכאשר מופיעים מומסים בעלי מוליכות שונה מזו של הפאזה הנעה מתקבל סיגנל. הסיגנל הוא חיובי, אם מוליכותם גבוהה מזו של הפאזה הנעה, או שלילי אם היא נמוכה ממנה. מאחר שהפאזות הנעות מורכבות בדרך כלל מבופרים, שיכולים להגיע לריכוזים גבוהים ולערכי pH קיצוניים, לעיתים יש צורך להשתמש באביזרי 'דיכוי' יונים Ion Suppression שמורידים את כמות היונים בפאזה הנעה בעלת המוליכות הגבוהה מדי, כדי לקבל אותות ניתנים לכימות מהמומסים.
כרומטוגרפיה בפאזה נורמלית - Normal Phase.
הכרומטוגרפיה נוזלית בפאזה נורמלית מתחלקת לשני סוגים, האחד מתרחש בסביבה אל-מימית והשני בסביבה מימית.
כרומטוגרפיה בפאזה נורמלית - בסביבה אל-מימית.