בשלב הראשון נמצאו חמישה חלבונים שונים שמשביתים את מערכת CRISPR-Cas מסוג I-F והם: AcrF1, AcrF2, AcrF3, AcrF4 ו-AcrF5. שמות חלבוני האנטי קריספר נקבעים על פי המערכת אותה הם מעכבים ועל פי סדר הגילוי שלהם. מאחר שחמשת החלבונים מעכבים מערכת מסוג I-F הם קיבלו את התחילית AcrF והמספר של כל אחד מהם נקבע בהתאם לסדר גילויים. על ידי בדיקה של חמשת גני האנטי קריספר האלו שעברו אינטגרציה לתוך גנום ה-PA14 בעקבות התקפת פאג', הראו כי ביטוי גנים אלו לא גרם לשינוי ברמת הביטוי של מערכת ה-CRISPR. השערה זו חוזקה על ידי בדיקת PCR שבה נבדקה הימצאותם של גני cas3 ו-csy3. מניסויים אלו הסיקו כי גני האנטי קריספר פועלים רק לאחר הביטוי של רכיבי מערכת ה-CRISPR.
גני האנטי קריספר מהווים הסבר אפשרי להמשך פעילות הפאג'ים ותקיפת החיידקים על-אף קיום מערכות ה-CRISPR-Cas. יתר על כן, נראה כי בעקבות השוני הקיים בין גני אנטי קריספר נוצרו גם מגוון רחב של מערכות CRISPR-Cas לאורך האבולוציה, ולעיתים אף קיימות מספר מערכות שונות בחיידק אחד. כלומר, מדובר בתהליך של קו-אבולוציה המתבססת על מרוץ חימוש בין יצירת מגוון גני אנטי קריספר לבין יצירות מערכות ההגנה השונות של החיידקים.
לאחר מחקר נוסף, התגלו עוד ארבע משפחות שונות של חלבונים קטנים יותר, AcrE1, AcrE2, AcrE3 ו-AcrE4, והראו כי הם מעכבים מערכות CRISPR-Cas מסוג I-E של פסאודומונס אארוגינוזה. הגנים המקודדים את ארבעת חלבונים אלו נגד מערכות מסוג I-E סמוכים על הגנום הנגיפי לאלו המקודדים את החלבונים נגד מערכת מסוג I-F.
תשעת הגנים שזוהו לא הכילו מוטיב רצפי שיכל היה להקל במציאת גני אנטי קריספר דומים או משפחות נוספות. חוקרים גילו כי פאג'ים שהכילו קידוד בגנום לגני אנטי קריספר הכילו בקר שעתוק שנקרא אנטי קריספר associated 1 (Aca1), בסמיכות לגנים של אנטי קריספר. על הקשר בין הגנים הללו העיד גם הממצא כי פאג'ים שלא הכילו כלל גני אנטי קריספר לא קודדו כלל ל-Aca1. שני החלקים האלו, גני אנטי קריספר ו-"aca1" מהווים אופרון, כאשר חלבון הבקרה Aca שולט בביטוי של אנטי קריספר ושל גני "aca" כדי להבטיח פעילות אופטימלית במהלך מעגל ההדבקה של הפאג'. מחקרים ביואינפורמטיים שהתמקדו בחקר גנים בשיטת "חיזוי על פי אסוציאציה" (guilt-by-association), זיהו עוד גני אנטי קריספר בהתבסס על מיקומם בגנום – בקרבה לגנים המקודדים לחלבון הרגולטורי Aca1 באלמנטים גנטיים ניידים. בעקבות כך זוהו גנים הומולוגיים שחשבו שהם אנטי קריספר שהיו ממוקמים בסמיכות לגנים אחרים שהיו שונים מאלו של Aca1 מה שהוביל לגילוי משפחת החלבונים Aca2. כך זוהו עוד חמש משפחות נוספות מתוך קבוצת המערכות מסוג I-F (AcrF6, AcrF7, AcrF8, AcrF9 ו-AcrF10).
מערכות ה-CRISPR-Cas9 נמצאות כיום בשימוש נרחב בתחומי הביוטכנולוגיה והרפואה עבור עריכה גנטית. על כן הייתה חשיבות גדולה במיוחד לגילויי חלבוני אנטי קריספר אלו, שכן הם יכולים לשמש לבקרה על החלבונים אשר מבצעים את העריכה הגנטית וכך לייעל ולבקר אותה. על-ידי שימוש נוסף בכלים ביואינפורמטיים ושיטת ה"חיזוי על פי אסוציאציה" זוהו המעכבים הראשונים של מערכות CRISPR-Cas מסוג II. נמצאו שלוש משפחות של חלבונים קטנים (AcrIIC1, AcrIIC2 ו-AcrIIC3) החוסמים את פעילות מערכת CRISPR-Cas9 מסוג II-C ב-"Neisseria meningitidis". כמו כן, נעשה שימוש בגישה ביואינפורמטית חלופית לגילוי מעכבים של מערכות CRISPR-Cas9 מסוג II-A. במחקר זוהו זני חיידקים שמקודדים מערכות CRISPR-Cas9 מסוג II-A שלכאורה תוקפים את הגנום שלהם עצמם. צורת גילוי נוספת נראית שיטת הזיהוי עצמי (self-targeting) לגילוי גנים חדשים כמועמדים לגני anti-CRISPR. השיטה נשענת על ההנחה שמערכת CRISPR-Cas פעילה ו-CRISPR RNA (crRNA) שמכוונות לגנום המארח לא יכולות להתקיים במקביל מבלי לגרום לזיהוי עצמי ומוות תאים. זאת מאחר שחלבוני anti-CRISPR שמקודדים באלמנטים גנטיים ניידים ומבוטאים באותו התא יכולים למנוע מוות של תאים שנגרם על ידי זיהוי עצמי על ידי השבתת מערכת CRISPR מה שמאפשר התמודדות עם מקרים של זיהוי. על ידי שימוש בשיטה הזו התגלו עוד ארבע משפחות חדשות של חלבוני אנטי קריספר (AcrIIA1, AcrIIA2, AcrIIA3 ו-AcrIIA4) המעכבים את מערכת ה-CRISPR-Cas מסוג II-A של "Listeria monocytogenes". שניים מחלבוני האנטי קריספר, crIIA2 ו-AcrIIA4, נמצאו כיעילים כנגד חלבון CRISPR-Cas9 מסוג II-A של "Streptococcus pyogenes", חלבון זה הוא החלבון העיקרי המשמש לעריכה גנטית.
מבנה.
קיים מגוון רחב של חלבוני אנטי קריספר. חלק מהמבנים זוהו בפני עצמם ואילו חלק זוהו על בסיס הקישור לקומפלקס ה-CRISPR-Cas. עד כה לא זוהה הבדל משמעותי בין הצורה לפני קישור של חלבוני ה-Acr לצורה אחריה במקרים שבהם שתי התצורות נחקרו ופוענחו. רובם שונים זה מזה, דבר המעיד על מקור אבולוציוני ייחודי של כל אחת ממשפחות חלבוני ה-Acr. עם זאת, למרות השוני הנראה בין המבנים, קיים דמיון מבחינת תפקוד המנגנונים. דוגמה טובה לכך היא הקישור של חלבוני Acr לאזורי אינטראקציה ב-PAM או קרוב אליהם, תכונה אשר משותפת ל: AcrIF2, AcrIF10, AcrIIA2, AcrIIA4 ו-AcrVA1. זוהי דוגמה לאבולוציה מתכנסת.
מחקרים הראו כי גם אופן הפעולה של AcrIE1, אשר חוסם את המערכת מסוג I-E, דומה לזה של AcrIF3. חלבון AcrIE1 זה גם נקשר לנוקלאז (Cas3) וכנראה מונע את הגיוס של קומפלקס ה-DNA אשר קשור ל-I-E CRISPR-Cas. המבנה של Acr זה, אשר נקבע בעזרת קריסטלוגרפיה, מורכב מדימר שכל תת-יחידה שלו מורכבת משלושה סלילי α-helix ו-β-sheet בקצה ה-C-terminal. הדמיון בין AcrE1 ל-AcrIF3 בא לידי ביטוי רק במבנה ה-α-helix וסוברים שהם מונעים פעילות של Cas3 ו-Cas2-3 בהתאמה, בדרכים שונות.
מנגנון.
לרוב, כאשר הבקטריופאג' מחדיר את הגנום שלו לחיידק, אם אין לחיידק מערכת הגנה, הפאג' יכול לנצל את משאבי התא לשכפול המידע הגנטי שלו. בחיידקים בהם קיימת מערכת ה-CRISPR, בעקבות תקיפות של פאג'ים יש אינטגרציה של מקטע מהגנום הפאג'י לתוך גנום החיידק, אלו רצפי ה-CRISPR. בהגנה מהדבקה של פאג'ים יש ביטוי של crRNA, המגיוסים על-ידי חלבוני Cas ומובילים אותם לחיתוך של הגנום הפאג'י. כך, תהליך ההדבקה של הפאג', נעצר על ידי קווי ההגנה של החיידק עוד לפני שהחל. הזיהוי נעשה על בסיס חלקי DNA של הבקטריופאג'ים שנשמרו בגנום החיידק, חלקים אלו משועתקים בהמשך כחלק ממקטעים הנקראים CRISPR RNA (crRNA), אשר יכולים להתחבר ולזהות את הגנום הנגיפי שמוחדר לתאי החיידקים.
חלבוני אנטי קריספר מעכבים את תפקוד CRISPR-Cas במגוון דרכים, למשל על ידי אינטראקציה ישירה עם חלבון Cas החוסמת קשירת DNA לאתרי מטרה מוכרים בגנום הפאג' או מונעת את פעולת החיתוך של אתרי המטרה. כמו כן, הם יכולים לפגוע ב-crRNA, המכוון את חלבון ה-Cas למטרתו.
נראה כי באופן כללי חלבוני Acr יעילים בעיקר אם הם יכולים למנוע באופן ישיר את הפעילות של קומפלקס CRISPR-Cas שכבר נוצר, מה שקורה לרוב כאשר DNA זר נכנס לתא.
גני ה-anti-CRISPR מתורגמים לחלבונים בעלי כמה נקודות התערבות ומניעת פעולות מערכת ה-CRISPR. הם מתחלקים לשני סוגי פעילות עיקריים שהם עיכוב קשירת הגנום ועיכוב חיתוך של הגנום, אך ישנן גם דרכי פעולה נוספות.
מעכבי קשירה של DNA.
זו הפונקציה הנפוצה ביותר בקרב חלבוני אנטי קריספר. החלבונים שעושים זאת הם: AcrIF1, AcrIF2, AcrIF10, AcrIIA2, AcrIIA4 ו-AcrVA4.
מחקרים אודות המבנה הראו כי יש קשירה של שני חלבוני AcrIF1 לחלבון Cas7, ובכך נוצרת הפרעה מרחבית ונמנע קישור ל-DNA. ה-AcrIF2 וה-AcrIF10 נקשרים שניהם ל-Cas8f: AcrIF2 נקשר, ככל הנראה, באזור של החיבור בין Cas7 ו-Cas8 וכך גורם לשינוי בקונפורמציה ומונע אפשרות לקישור עם ה-DNA, ולעומתו AcrIF10 גורם, ככל הנראה, לשינוי קונפורמציה של ה-Cas8 עקב חיקוי מבנה ה-DNA הגורם לו להתקרב ל-Cas7. על אף ש-AcrIF2 וה-AcrIF10 נקשרים ויוצרים אינטראקציה עם Cas7 ו-Cas8 הם נקשרים באזורים עם חפיפה קטנה וגורמים לשינוי קונפורמציה של Cas8 בכיוונים מנוגדים.
AcrIIA4 הוא החלבון הראשון מסוג II שאופיין בצורה מעמיקה. זהו חלבון מאוד חומצי אשר נקשר ל-Cas9 על ידי חיקוי אזור ה-PAM של ה-DNA הדו גדילי וכך מונע קישור ל-DNA המטרה. יעילות של AcrIIA4 כמעכב נובעת מהקישור החזק שלו לקומפלקס של Cas9, שעוצמתי הרבה יותר מהקשירה ל-DNA המטרה.
AcrIIA2 שמשתק גם הוא חלבוני Cas9 מאותה משפחה, שונה משמעותית במבנהו ובצורתו המרחבית מ-AcrIIA4. עם זאת, שני החלבונים נקשרים לאזורים סמוכים ב-Cas9, ולפיכך לא רק ששניהם מתחרים בקשירה של DNA ל-Cas9 אלא גם קיימת ביניהם תחרות. זו דוגמה מעולה נוספת למקרה של אבולוציה מתכנסת של שני חלבונים אשר נקשרים לאתר בצורה דומה. למרות הדמיון בפעולה שלהם, AcrIIA2 יכול להיקשר גם לדומיינים HNH ו-REC2 ב-Cas9 אשר אינם מהווים אזורי מטרה עבור AcrIIA4.
AcrVA4 החוסם את הפעילות של Cas12a גורם לדימריזציה של החלבון וכך מונע את יכולתו להיקשר ל-DNA. ראשית, ה-AcrVA4 נקשר לאזורים בדומיין ה-REC אשר מעורבים בקשירה ובעיבוד של crRNA. ה-AcrVA4 מחקה למעשה את ה-pre-crRNA, מבנה ראשוני ארוך אשר מתורגם מרצפים זיכרון של CRISPR במארח, שלאחר עיבוד הופך להיות crRNA. נקודת הקשירה של חלבון ה-Acr רחוקה מנקודת הקשירה של ה-DNA אך קשירתו גורמת להפרעה מרחבית המונעת את שינוי הקונפורמציה שנחוץ ל-Cas12a על מנת שיוכל להיקשר ל-DNA המטרה.
מונעי חיתוך של ה-DNA.