יחסו של בן-גוריון לדת המסורתית היה עוין ושלילי. הוא דחה את קיומם של אלוהות פרסונלית ושל מושג ההתגלות. הוא לא היה אתאיסט משום שמעולם לא שלל את קיומו של אלוהים. בראיון ב-1968 נשאל אם הוא מאמין באלוהים, וענה: "השאלה היא מיהו אלוהים... אני לא מאמין שאלוהים דיבר עם משה. משה שמע קול אדם בלבו וכך ידע שהוא צריך לעשות את זה." ברוב חייו החזיק בתפיסה שפינוזאיסטית, המזהה את האלוהות עם הטבע. בשנותיו האחרונות אמר שמושג האלוהות שלו הוא הפנתאיזם של שפינוזה, ואף שוחח עם איינשטיין על הנושא. אניטה שפירא העריכה כי בן-גוריון היה אגנוסטיקן. עם זאת לא היה היה בהכרח נטורליסט לגמרי. באותו ראיון הצהיר: "אינני מאמין שיש רק כוחות פיזיים בעולם... שמוח זה רק פרוצס (=תהליך) טבעי... יש משהו מעל זה". לדברי מיכאל בר-זוהר, בן-גוריון "בערוב ימיו נכבש בכל לבו לאמונה בקיומו של אלוהים".
ב-1936 טען בן-גוריון בפני ועדת פיל: "זכותנו ביחס לארץ-ישראל נובעת לא מהמנדט והצהרת-בלפור. היא קודמת לאלה... התנ"ך הוא המנדט שלנו". מאוחר יותר הקים את החוג לתנ"ך בבית ראש הממשלה. הוא ראה את מדינת ישראל כממשיכת ממלכת יהודה והסמיך את מלחמת העצמאות והקמת המדינה למלחמות ישראל בסוף תקופת בית שני (עד תום מרד בר כוכבא). בעיניו המשמעות של תולדות עם ישראל הייתה רק בתקופת ישיבתו בארצו ועצמאותו המדינית, תוך המעטת החשיבות של כל מה שביניהן. בן-גוריון עשה שימוש רב בתנ"ך, כולל שימוש פוליטי ואקטואלי שעורר את זעם החוגים החרדים. הוא נהג להתפלמס איתם, תוך המעטת ערכה של הספרות הבתר-מקראית.
כפי שרווח בחוגי הציונות, בן-גוריון דחה את סמכות התורה שבעל פה ובייחוד את התלמוד הבבלי, בהם ראה תוצרים של תרבות גלותית מנוונת. ב-1968 אמר בראיון: "אינני מחשיב את התלמוד, אינני יכול להעמיד את התלמוד בשורה אחת עם התנ"ך". המקור הבלעדי בעיניו היה התנ"ך, אותו פירש עצמאית, ושאותו שאף להפוך לבסיס לזהות הלאומית הישראלית, בייחוד אחרי הפסקת השליטה הבריטית והתווסדות המדינה. התנ"ך עבורו, כמו מרבית ההוגים הציונים, היה יצירה היסטורית-תרבותית אנושית ששיקפה את הגניוס הלאומי של העם, לא תיעוד של התגלות אלוהית. בד ובד עם שלילתו את מקורם האלוהי של הכתובים, גם התעקש על כך שבעיקרם הם מדויקים היסטורית ודחה את התפישה שלהם כפולקלור, שכל חשיבותו בהיותו מסורת ושאלת אמינותו שולית (כפי שגרס למשל אחד העם). הוא היה אוהד גדול של יחזקאל קויפמן, שדגל בגישה שמרנית לביקורת המקרא ושאף להוכיח את קדמותו ואחדותו היחסית של הטקסט המקראי. בנימין בית-הלחמי ייחס לבן-גוריון ולאופן חשיבתו השפעה מכרעת על האופן בו התקבל התנ"ך בחברה החילונית בישראל, כטקסט המעוקר ממשמעות אמונית אך גם חסין ברובו בפני מסקנות הביקורת הרדיקלית, כשהכרונולוגיה המקראית ואירועיה עצמם מקובלים כאמת היסטורית למעט פרשיות ההתערבות האלוהית. עם זאת, בנובמבר 1958 בנוסף למקור מהתנ"ך, מצא לנכון לציין על גבי הצוללת "רהב", את מקור שמה גם מהמשנה במסכת בבא בתרא.
מאז שעלה לארץ ישראל ועד לקום המדינה, ביקר בן-גוריון רק פעמיים בבית כנסת: הפעם הראשונה הייתה בעלייה לתורה של נכדו, על פי דרישתם של הוריו, מרי ועמוס. על פי עדותו, הפעם השנייה הייתה ערב הקמת המדינה. עם זאת, סמוך לפתיחת המושב הראשון של האספה המכוננת, הלך לבקשת הרב מאיר בר-אילן לבית הכנסת ישורון בירושלים לשמוע תפילת הודיה, וציין ביומנו: "זו לי הפעם הראשונה בארץ ישראל שאני נוכח בבית כנסת בשעת תפילה". ביום העצמאות הראשון בתש"ט ביקר בבית הכנסת הגדול בתל אביב.
בשאלות הפוליטיות של דת ומדינה היה יחסו של בן-גוריון זהיר ומחושב. ביוני 1947 הוא ניצב בראש החותמים על מכתב הסטטוס קוו שנשלח לראשי אגודת ישראל, בו נקבעו יחסי דת ומדינה במדינה העתידית. המכתב הבטיח להפוך את יום השבת ליום המנוחה הרשמי של המדינה לכשתוקם והבטיח את האוטונומיה של זרמי החינוך הדתיים. מטרת המכתב הייתה ליצור הבנה עם אגודת ישראל כדי שזו תסייע להקמת מדינה יהודית בארץ ישראל בעדותה בפני ועדת אונסקו"פ. המכתב עיצב למעשה את אופייה של מדינת ישראל בנושאי דת ומדינה למשך עשרות בשנים.
ביוני 1954 הזהיר בן-גוריון את ראש הממשלה שרת: "אין לנו להפריד הדת והמדינה". הוא נימק זאת בכך ש"קיימת שותפות גורל בין מדינת ישראל ובין העם היהודי", וכפי הנראה סבר שהפרדת הדת מהמדינה תיצור קרע בין העם היהודי למדינת ישראל.
פרופ' ישעיהו ליבוביץ, שהיה ממבקריו החריפים של בן-גוריון, כתב על שיחה פרטית שהייתה להם בתחילת שנות ה-50 בנושא הפרדת הדת מהמדינה, בה בן־גוריון אמר לו: "אתה דורש את הפרדת הדת והמדינה כדי שהדת תשוב להיות גורם עצמאי אשר השלטון המדיני יצטרך להתמודד עמו. אני שולל הפרדה זו – אני רוצה שהמדינה תחזיק את הדת בידה".
בראשית מלחמת העצמאות נעתר לבקשת ראשי היהדות החרדית לדחיית שירותם הצבאי של בחורי הישיבה במסגרת הסדר "תורתו אומנותו". באותה שעה הצהיר שמספרם כ-400, אולם עם השנים גדל מאוד מספר תלמידי הישיבה שנהנו מהשחרור ומספרם הגיע לכמה אלפים מדי שנה. ב-1958 נודע על כוונתו של בן-גוריון לשנות את המעמד הקיים של מתן הדחייה (אשר בפועל הפכה לפטור) לתלמידי הישיבות החרדיות. כוונתו הייתה לגייס את כולם מלבד מי שמקדיש את כל חייו ללימוד תורה, שגם הוא ילך לאימונים בסיסיים של שלושה חודשים. ההצעה עוררה חשש בקרב חלק ממנהיגי הציבור החרדי והדתי, והרב הרצוג שלח לבן-גוריון מכתב בו הביע את דאגתו וביקש "שחרור מכל חובת גיוס כל דהו, כל עוד הם יושבים באהלה של תורה". על כך בן-גוריון השיב לו: "כשפטרתי לפני עשר שנים בחורי הישיבה משרות בצבא היה מספרם מועט וגם, כפי שנאמר לי אז, הייתה זו הארץ היחידה, שבה נשארו לומדי תורה לשמה, אם כי עלי לציין בשמחה כי בחורי הישיבה לקחו חלק במלחמה על הגנת ירושלם כשאר צעירי ירושלם. המצב מאז השתנה. בחורי הישיבות רבו".
ב-20 באוקטובר 1952 נערכה פגישה בין בן-גוריון והחזון איש בביתו של הרב בבני ברק, ביוזמתו של ראש הממשלה. במהלך הפגישה שאל אותו בן-גוריון: "איך יהודים דתיים ולא-דתיים יחיו יחד בארץ הזאת, בלי שנתפוצץ מבפנים?". החזון איש המשיל את היהודים הדתיים לגמל טעון משא (עול המצוות), העומד מול גמל שאין עליו מטען - הם היהודים החילוניים, ש"צריכים לפנות את הדרך". לדברי יצחק נבון, אמר לו בן-גוריון: "ומצוות יישוב הארץ אינה מצווה? וזה לא משא? ומצוות ההגנה על החיים אינה מצווה? ומה שעושים הבחורים שאתם כל כך מתנגדים להם, והם יושבים על הגבולות ושומרים עליכם, האין זו מצווה?"
בן-גוריון התנגד עקרונית לנישואי תערובת ביהדות. הוא סבר כי הן "תופעה לא טובה", אך עם זאת "יש יוצאים מהכלל". הוא סבר כי החיים בישראל מבטיחים שילדים מנישואים כאלה יחיו כיהודים, בזמן שילדים כאלה החיים מחוץ לישראל יתרחקו מהיהדות. בשנות ה-50 תמך בהגירתם לישראל של בני-זוג וצאצאים לא-יהודים ממשפחות מעורבות, בעיקר ממדינות מזרח אירופה. הוא שלל הליך גיור כלשהו עבורם אף למול הפצרות השרים הדתיים בממשלתו, וטען בתוקף שההזדהות הלאומית והמגורים במדינה הם שהופכים אדם ליהודי. בן-גוריון סבר כי יש לרשום ככזה כל המצהיר זאת בתום לב ואל לה למדינה להתערב בענייני דת; הוא הצדיק רבנים שסירבו לגייר חלק מהעולים שפנו אליהם, באמרו שהללו אינם מתעתדים לקיים אורח חיים דתי. עד 1958 אכן נוהלו הדברים ברוחו, אם כי באופן לא רשמי, והרשויות רשמו כל מהגר שהצהיר על כך כיהודי. ניסיון הממשלה למסד זאת כמדיניות גלויה הוביל לפרישת המפד"ל מהקואליציה ביולי, וכדי לפתור את המשבר החריף שנודע בשם "מיהו יהודי?", פנה בן-גוריון למי שהגדיר כ"חכמי ישראל" בעת ההיא: 51 רבנים, פילוסופים, סופרים ואנשי אקדמיה. מתוך 45 שהשיבו, תמכו 37 בהגדרה האורתודוקסית המקובלת. בינואר 1960 נקבע שיירשם כיהודי "מי שנולד לאם יהודייה ואינו בן דת אחרת, או מי שנתגייר כהלכה."
במאי 1961 נערך בישראל מפקד אוכלוסין וראשון המתפקדים היה ראש הממשלה בן גוריון. בסעיף הדת ענה לפוקד: "יהודי. לא דת. יהודי. אני אומר, לא לא-דת, אבל יהודי".
לדברי הביוגרף מיכאל בר-זוהר, "היה בן-גוריון בראש־ובראשונה מנהיג יהודי", מושרש "בתולדות היהדות ובתרבותה" ו"אוהב אהבה עזה את מורשתו התרבותית וההיסטורית". לדבריו, "הוא רחש כבוד עצום לדת היהודית ולמי שהיה מעורה בה".
יחסו לשטחי יהודה ושומרון, רצועת עזה, רמת הגולן וסיני.
בספטמבר 1954 כתב בן-גוריון לצעיר שהציע לו לכבוש את יהודה ושומרון: "לא שטח חסר לנו בשלב זה אלא יהודים. וכיבוש שטח נוסף - לא יוסיף יהודים אלא ערבים". בישיבת הממשלה ב-28 באוקטובר 1956, ערב מבצע קדש, התייחס לכיבוש הצפוי של רצועת עזה: "אילו הייתי מאמין בנס, הייתי רוצה שתיבלע בים".
ביום שחרור הר הבית והכותל המערבי במלחמת ששת הימים ב-1967, אמר בן-גוריון כי זהו היום השני הגדול בחייו, שני רק ליום עלייתו לארץ ישראל. במהלך המלחמה החל לגבש את תפיסתו לגבי עתיד השטחים שנכבשו. מיד עם שחרור ירושלים העתיקה, הפציר בראש העיר טדי קולק ובשר הפנים חיים משה שפירא ליישב אותה במהירות ביהודים. ב-8 ביוני כתב ביומנו: "מירושלים אסור לזוז, יש למהר ולהקים בתוכה ישוב יהודי גדול, כמו כן בחברון. הגדה המערבית אין להחזיר לחוסיין, אבל סיפוחה לישראל פירושו תוספת מיליון ערבים למדינה. זוהי סכנה חמורה. יש גם בעיה של הפליטים ברצועת עזה".