למרות רשימת היכולות הצבאיות שהציג, ההזמנה הראשונה שקיבל מלודוביקו הייתה ציור דיוקן של פילגשו הצעירה והיפה צ'יצ'ילה גלראני, פורטרט המוכר בשם "הגבירה עם ההרמין" מהשנים 1488–1490. סדנתו של לאונרדו במילאנו הפיקה מספר יצירות, בעיקר דיוקנאות של אנשי חצר וציורים דתיים, חלקם מעשה ידיו של לאונרדו וחלקם נעשו בידי עוזרים בהנחייתו של המאסטרו. מיצירות הסדנה המיוחסות ללאונרדו ניתן למנות את "דיוקנו של מוזיקאי", ו"לה בל פרונייר", עוד פילגש צעירה של לודוביקו ספורצה. אחד מעוזריו בסדנה היה ג'ובאני ג'קומו די פייטרו קפרוטי, שכונה על ידי לאונרדו "סָלָאי" ("שד קטן"), והיה ללאונרדו עוזר, תלמיד ואולי מאהב, ובן לוויה שובב ומחוצף עד מותו של האמן. למרות הקשר ההדוק ביניהם לא נכח סלאי ליד לאונרדו כשזה נפח את נשמתו. מלאונרדו הוא ירש רק את הכרם שניתן לו על ידי לודוביקו ספורצה. סלאי נישא אך כהולל ידוע לשמצה, נרצח לאחר מספר שנים. סלאי נודע לימים גם כצייר, אך לא השכיל להטמיע את כישרונו הייחודי של מורו וללמוד ממנו. אחת מיצירותיו הידועות ביותר מתייחסת למונה ליזה שאותה ניסה להעתיק.
בשנת 1489 הזמין העוצר ספורצה מלאונרדו אנדרטה לזכר אביו, הדוכס פרנצ'סקו ספורצה, כפרש על סוס. להזמנה שני שלבים: ראשית הוזמן דגם חומר של הפסל בגודל מלא, שאמור היה לשמש בשלב השני כבסיס לתבנית יציקת הברונזה. לאונרדו תכנן בתחילה פסל דרמטי של סוס העומד על שתי רגליו האחוריות, אך לאחר שנתקל בקשיים טכניים חזר לדמות הפרש המקובלת, בה הסוס מטופף על שלוש רגליים. לשם הקמת הפסל הענק - הפסל התנשא לגובה שבעה מטרים ומחצה - קיבל לאונרדו מהעוצר בית מפואר ורחב מידות. מודל החמר הושלם בשלהי 1493 וזכה לקילוסים רבים, וכבר ב-1492 החל לאונרדו לתכנן את היציקה המורכבת. במסגרת העבודה חקר והמציא מכשירים שונים: עגורנים, דיסקיות, שרשראות וברגים. הפסל שילב רבים מתחומי העניין שלו - מכניקה, אנטומיה, פיסול ותיאטרון. ואולם, בטרם הספיק לאונרדו להשלים את מלאכת היציקה, החרים לודוביקו את הברונזה שיועדה לפסל, יש האומרים שעשה זאת כדי לבנות תותחים לצבאו, ויש האומרים שעשה זאת כדי לכסות על חוב שחב לדוכס פרארה. גם גורלו של הדגם לא שפר עליו: בשנת 1499 פלשו כובשים צרפתים לעיר והרסו את פסל החומר.
בשנת 1496 התיידד דה וינצ'י עם הנזיר המתמטיקאי הנודד לוקה פאצ'ולי, שהוזמן למילאנו על ידי לודוביקו. לאונרדו הכיר כבר את ספריו, ופאצ'ולי הפך למורהו למתמטיקה וגאומטריה, ויחדיו חקרו את כללי ההרמוניה והפרופורציה. ישנה סברה לפיה תכננו שני המלומדים להקים יחד אקדמיה, אך לא ברור אם התוכנית זכתה למימוש כלשהו. בין השנים 1496 - 1499 שקד פאצ'ולי על כתיבת יצירת המופת שלו "על הפרופורציה האלוהית" ("De divina proportione"), ולאונרדו הוסיף איורים גאומטריים לספר, ובהם לא פחות מ-60 איורי פאונים. איורים אלו הם היצירות המודפסות הראשונות של לאונרדו. על תרומתו פאצ'ולי מודה לו במילים חמות:
בשנת 1494 הוזמן לצייר ציור קיר גדול בכנסיית סנטה מריה דלה גרציה, לאחר שיפוץ גדול שעברה הכנסייה בהוראת לודוביקו, שייעד אותה להיות המאוזוליאום המשפחתי. על הקיר הצפוני של חדר האוכל צייר לאונרדו את יצירת המופת "הסעודה האחרונה", המתארת את סעודתו האחרונה של ישו, בה הודיע לתלמידיו כי אחד מהם יבגוד בו (מתי, כו, 21 - 23). הציור החל להיסדק ולהתפורר כבר בימי חייו של האמן, משום שזה מיאן להשתמש בטכניקת הפרסקו המקובלת באותם ימים ובמקום זאת השתמש בתערובת של טמפרה וצבעי שמן. הטכניקה החדשנית אפשרה לו לעבוד לאט יותר, ולהוסיף שכבות זו על זו, אך תוך זמן קצר התגלתה כהרסנית, בעת ששכבות הצבע החלו להתקלף. בציור יוצר לאונרדו אשליה כאילו משטח היצירה הוא המשכו של אולם חדר האוכל, אך הודות לעיוות פרספקטיבי, מאפשר למסתכל לראות את אשר על השולחן שגבוה מעיניו. בעקבות ספרו של דן בראון "צופן דה וינצ'י", התרבו הפרשנויות הטוענות כי הדמות היושבת מימינו של ישו (לפי עיני המסתכל - משמאלו) היא אישה.
בשנת 1498 הכריזה הנסיכות על תחרות נגינה בנבל. לתחרות באו שמונים מתחרים וביניהם דה וינצ'י, שלהפתעת הכול הביא עמו נבל מיוחד שבנה בעצמו. אף אחד לא ידע מתי ובאיזו הזדמנות למד דה וינצ'י לנגן בנבל, אבל הוא עשה זאת בצורה מושלמת כל כך, שיתר המתחרים הודו בתבוסתם.
ב-1499 נפלה מילאנו בידי לואי השנים עשר, מלך צרפת. ייתכן שלאונרדו יצר קשר עם הכובשים הצרפתים, ואולי נפגש כבר אז עם צ'זארה בורג'ה, שפיקד על גדוד צרפתי. בסוף אותה שנה עזב את העיר לאחר שמונה-עשרה שנות שהות בה.
מאנטובה, ונציה, פירנצה, צ'זארה בורג'ה, 1500–1506.
לאחר עזיבתו את מילאנו שהה דה וינצ'י במנטובה אצל המרקיזה ופטרונית האמנות איזבלה ד'אסטה, שהזמינה אצלו דיוקן שלה בתמורה (הדיוקן, אם צויר, אבד. נותר רישום של ד'אסטה המצוי בלובר). לאחר מכן נדד לוונציה, אולי כמהנדס שהוזמן לייעץ לעיר בנושא ביצורים וסכרים. בשנת 1500 שב להתגורר בפירנצה, כששמו כאמן הולך לפניו, והוזמן לצייר את ציור המזבח הראשי בכנסיית אַנוּנְצִיאָטָה. לאונרדו הכין רישום הכנה גדול בנושא מריה עם ישו העולל ועם הקדושה אנה, שאבד לימים. במקביל עבד על ציור קטן של מריה וישו העולל שנקרא המדונה של הפלך.
בשנת 1502 שוב העמיד דה וינצ'י את כישוריו לשירותו של שליט עריץ ואכזר, צ'זארה בורג'ה, דוכס רומאניה וולנצ'יה, מפקד כוחות הכנסייה, ובנו הלא חוקי של האפיפיור, ששמו נודע לשמצה בשל עורמתו, רצחנותו ואורח חייו המופקר. לאונרדו עבד ככרטוגרף וכמהנדס צבאי אצל בורג'ה, שמינה אותו למנהל של מספר עבודות ביצורים באזור שליטתו. בנוסף, נלווה לדוכס בכמה מסעות כיבוש ודיכוי מרידות. בחצרו של בורג'ה הכיר את ניקולו מקיאוולי, ששירת שם כשגריר פירנצה. מאוחר יותר יעבוד כמהנדס אצל מקיאוולי במערכה נגד העיר פיזה. בראשית 1503 עזב לאונרדו את חצרו של בורג'ה, זמן קצר לפני שהעריץ החל לאבד את בסיס כוחו כתוצאה ממות אביו, האפיפיור.
במרץ 1503 שב לאונרדו לפירנצה ונטל חלק, יחד עם מקיאוולי, בתכנון מיזם שאפתני וכושל, שנועד להסיט את נתיבו של הנהר ארנו, לנתק את פיזה מגישה לים, כחלק ממאבק רב שנים בין הערים, ולבסוף להעניק לפירנצה גישה משלה לים. לאונרדו תכנן את הנתיבים, הסכרים ומכונות החפירה למפעל. בסוף אותה שנה הוזמן מטעם מועצת העיר (הסיניוריה) לצייר ציור קיר ענק באולם המועצה בארמון "פאלאצו וקיו", על אודות ניצחון פירנצה ב"קרב אנגיארי". יחד עם לאונרדו הוזמן יריבו הפלורנטיני הצעיר, מיכלאנג'לו, להכין ציור מקביל על קיר סמוך באותו אולם. לאונרדו הכין מתווה בגודל מלא של היצירה, וטרח על עבודתו עד שנת 1506, אך הציור לא הושלם מעולם. כעבור חצי מאה נעלם המתווה, משום שציור אחר צויר על גביו. אי השלמת היצירה גרמה לסכסוך בין לאונרדו לבין הסיניוריה, ששילמה לו כסף רב מראש בעבורה.
בשנת 1503 לערך החל דה וינצ'י לצייר את ה"מונה ליזה", ציור שהפך לאחד המפורסמים והמשועתקים ביותר בעולם. זהו כנראה דיוקנה של ליזה גרארדיני, אשת סוחר הבדים פרנצ'סקו דל ג'וקונדו, ומכאן שמה באיטלקית, "לה ג'וקונדה" (La Gioconda), שם תואר שפירושו גם "העליזה". תיאור מוקדם של הציור מעלה סברה לפיה לא הבעל הוא שהזמין את הציור, אלא ג'וליאנו דה מדיצ'י, שחשק בפורטרט של מאהבתו. בשנת 1504 החל ככל הנראה לעבוד על ציורו שאבד לימים, לדה והברבור.
מילאנו, 1506–1513.
בשלהי מאי 1506 עזב לאונרדו את פירנצה למילאנו, עם אישור זמני בלבד מאת הסיניוריה של פירנצה, שכן היה מחויב להשלים עבורה את ציור הפרסקו "קרב אנגיארי", עליו קיבל כבר חלק מהתשלום. במילאנו התקבל בחום על ידי המושל הצרפתי, היה אורח של כבוד בארמונותיו, וקיבל קצבה שנתית מאוצר מלך צרפת. גם במילאנו היה עדיין מסובך בוויכוח משפטי סביב ציור הבתולה של הסלעים, ונדרש להמשיך לעבוד על אחת הגרסאות. במקביל עבד על הגרסה הסופית לציור אנה הקדושה, הבתולה וישו הילד (מצוי כיום בלובר), ועל ציורו לדה והברבור. בחסות הצרפתים הצליח לחמוק מדרישות פירנצה להשיבו לעיר לשם השלמת ה"אנגיארי". לאונרדו עבד גם כאדריכל בשירות הצרפתים, ותכנן בתי מידות לשליטים.
בשנת 1507 חבר לפמלייתו פרנצ'סקו מליצי, בן אצולה ומשכיל, שהייה לבן לווייתו המסור, מזכירו ואיש סודו, ומי שבידיו הפקיד לאונרדו את כל כתביו לאחר מותו. באותה שנה, לאחר מות דודו האהוב, פרנצ'סקו, שהוריש לו את כל הונו, שב לאונרדו לפירנצה, בשל מחלוקת משפטית שנתגלעה בינו לבין אחיו החורגים, אשר נושלו מהירושה. בעודו בפירנצה חזר לעסוק ביתר שאת במחקריו באנטומיה, אותם המשיך מאוחר יותר בפאביה, בתיעוד ניתוח גוויות באוניברסיטה שבעיר. בשנים הבאות נדד לאונרדו בין ערי איטליה, אך מקום מושבו המרכזי היה מילאנו.
רומא, 1513–1515.
בשנת 1512 שבו בני מדיצ'י לשלוט בפירנצה, וב־1513 נבחר ג'ובאני דה מדיצ'י לאפיפיור ליאו העשירי. אחי האפיפיור, ג'וליאנו דה מדיצ'י, עבר להתגורר ברומא, לאחר שמונה לגונפלונייר של צבא האפיפיור, והזמין את לאונרדו להצטרף אליו.
ברומא עסק לאונרדו בניסויים מטאורולוגיים, משחקים גאומטריים בצורת רישומי ירחים, וניסויים באקוסטיקה. ב-1515 הזמין האפיפיור מלאונרדו ציור של יוחנן המטביל, פטרון עירו פירנצה. על היצירה המשיך לעבוד דה וינצ'י עד ימיו האחרונים, בצרפת. יוחנן של לאונרדו הוא דמות אנדרוגנית ומינית. ישנו עוד ציור של יוחנן המיוחס ללאונרדו משנים אלו, בו מופיע יוחנן עם אטריבוטים של בכחוס.
צרפת, אצל פרנסואה הראשון, 1516–1519.