ג'פרסון אמנם העריץ את סגנון מנהיגותו של וושינגטון אולם הרגיש שהמפלגה הפדרליסטית מובילה את האומה בכיוון הלא נכון. ג'פרסון לא נכח בהלווייתו של וושינגטון ב-1799 ונשאר בביתו.
בחירות 1800.
בבחירות הנשיאותיות של 1800, שוב התמודד ג'פרסון מול ג'ון אדמס. אדמס נחלש בגלל המיסים הלא אהודים שלו וסכסוך פנימי בתוך המפלגה הפדרליסטית על פעולותיו במהלך המלחמה עם צרפת. הרפובליקנים הזכירו את חוקי הזרים וההסתה והאשימו את הפדרליסטים במונרכיזם, ואילו הפדרליסטים טענו שג'פרסון היה אתאיסט מופקר שהיה כבול לצרפת. הבחירות נחשבו למרות ביותר בתולדות המדינה.
הרפובליקנים אמנם השיגו יותר אלקטורים, אולם ג'פרסון וסגנו, ארון בר, השיגו את אותו מספר קולות. בגלל התיקו, הבחירות הוכרעו בידי בית הנבחרים הפדרליסטי (הבעיה נפתרה לאחר אשרור התיקון ה-12 לחוקת ארצות הברית ב-1804, שהפריד בין בחירת הנשיא לבחירת סגנו). המילטון לחץ על הפדרליסטים לתמוך בג'פרסון בטענה שהיה פחות נורא מבר. ב-17 בפברואר 1801, לאחר שלושים ושישה סיבובים, בחר בית הנבחרים בג'פרסון לנשיאות ובבר כסגנו.
הניצחון הוביל לחגיגות רפובליקניות ברחבי המדינה. חלק מיריביו של ג'פרסון טענו שניצחונו הושג בזכות מספרם הגדול של האלקטורים הדרומיים, מפני שהעבדים קיבלו זכות הצבעה של "שלוש חמישיות" מאדם רגיל. אחרים טענו שג'פרסון הצליח להשיג תמיכה פדרליסטית בזכות שוחד לכמה פדרליסטים שישאיר עובדי ממשל פדרליסטים בתפקידם. ג'פרסון הכחיש זאת.
חילופי השלטון עברו באופן חלק, והייתה זאת אחת מהפעמים הראשונות בהיסטוריה המודרנית בה השלטון עבר ממפלגה אחת לאחרת ללא שימוש בכוח.
נשיאותו.
נשיאותו של ג'פרסון החלה עם השבעתו ב-4 במרץ 1801, והסתיימה כעבור שמונה שנים, ב-4 במרץ 1809. כהונתו של ג'פרסון סימלה את תחילת שלטונה של המפלגה הדמוקרטית-רפובליקנית בפוליטיקה האמריקנית.
השבעתו לתפקיד הייתה הראשונה שהתרחשה בבירה החדשה, וושינגטון די. סי.. באותו הבוקר, נורו מטחי כבוד על גבעת הקפיטול עם שחר, וג'פרסון מסר עותק של נאומו לעיתון. הוא נאם נאום בן 1,721 מילים באולם הסנאט בתוך הקפיטול. הוא לא היה דובר חזק, והקהל בקושי שמע את מילותיו, שדרשו אחדות לאומית. השופט העליון ג'ון מרשל השביע אותו. הנשיא היוצא ג'ון אדמס עזב את הבירה באותו היום בלי להגיע לטקס.
בענייני פנים, ניסה ג'פרסון לחזק את הרפובליקניזם במדינה. הוא הצליח להגביל את גודלה של הממשלה, הקטין מיסים ואת החוב הלאומי. הוא הקים אקדמיה צבאית, השתמש בצי כדי להגן על ספינות סוחר מפירטים בצפון אפריקה, ופיתח תוכנית להגנה על המוצבים האמריקניים מפני פלישה זרה בעזרת ספינות תותחים (תוכנית שלא הצליחה במלחמת 1812).
בנושאי חוץ, ההתפתחויות המשמעותיות היו רכישת לואיזיאנה מצרפת ב-1803, חרם על סחר עם בריטניה וצרפת, והחמרת היחסים עם בריטניה כשארצות הברית ניסתה להישאר נייטרלית במהלך המלחמות הנפוליאוניות באירופה. ג'פרסון, למרות הנייטרליות, אישר משלוח נשק לסנטו דומינגו במהלך מרד העבדים וסירב לתת הלוואות לצרפת, כך שעזר למרידות העבדים ולהשגת העצמאות ב-1804. אולם לאחר מכן, עם התנגדות הקונגרס, סירב להכיר בהאיטי, ואסר על סחר איתה, מה שגרם לקושי של המדינה לשמור על עצמאותה. בנוסף אישר את משלחת לואיס וקלארק.
המתיחות בין ארצות הברית ובין בריטניה, היו נושא מרכזי במהלך כהונתו השנייה של ג'פרסון. המדינות היו מעורבות במלחמת סחר, כשהצי המלכותי הבריטי השפיל את צי ארצות הברית כשהכריח מלחים אמריקנים שבויים לשרת בשורותיו. ג'פרסון התנגד למלחמה והשתמש בחרמות ובאיומים כלכליים, שפגעו יותר בארצות הברית. ההתנגדות בצפון מזרח המדינה גרמה לביטול החרם כשעזב את תפקידו.
במהלך כהונתו השנייה, התמקד גם במשפטו של סגן הנשיא לשעבר, בר, בעוון בגידה, שהסתיימה בזיכוי, ובנושא העבדות ובייבוא עבדים. ב-1806, טען שסחר העבדים הבינלאומי הוא הפרה של זכויות אדם והוביל חוק בקונגרס שאסר על ייבוא עבדים.
ג'פרסון נחשב לאחד מחמשת הנשיאים הטובים ביותר בכל הזמנים.
דמוקרטיה ג'פרסונאית.
חזונו של ג'פרסון היה לחזק את הערכים הרפובליקניים במדינה. הנשיא החדש דגל במה שכונה לימים "דמוקרטיה ג'פרסונאית", שהאמינה בחקלאות ובהגבלה על הממשל המרכזי. האישים החשובים בממשלו היו ג'יימס מדיסון, שהיה מזכיר המדינה של ארצות הברית, ואלברט גלטין שהיה מזכיר האוצר של ארצות הברית. ג'פרסון עבד בשיתוף פעולה עם מנהיגי מפלגתו בקונגרס, כשהמפלגה הפדרליסטית המשיכה להיחלש.
הדמוקרטיה הג'פרסונאית הובילה לשני שינויים בחיים הפוליטיים האמריקניים. אחוז ההצבעה עלה, ומספר הזכאים לבחור עלה גם הוא. לפני שנת 1790, ניהול מסע בחירות נחשב להתערבות בזכותו של האזרח לחשוב ולהצביע באופן עצמאי. ללא תחרות על משרות ציבוריות, אחוזי ההצבעה היו נמוכים, ולעיתים היו פחות מ-5%. לאחר מכן, אחוזי ההצבעה עלו ל-20%. כששתי המפלגות החלו להתחרות אחת בשנייה, כ-80% מהגברים הלבנים יצאו להצביע.
תחת לחץ מטעם תומכי ג'פרסון, העניקו המדינות זכות הצבעה לכל הגברים הלבנים, ללא מגבלת רכוש. ב-1825 רק שלוש מדינות לא עשו זאת: רוד איילנד, וירג'יניה ולואיזיאנה. הרחבת זכות ההצבעה הובילה לכך שפשוטי עם החלו לעלות לתפקידים פוליטיים מרכזיים. מדינות אחרות הגבילו זכות הצבעה בגזע. למרות זאת, ארצות הברית של אז הייתה המדינה בעלת מערכת הבחירות הרחבה ביותר שהייתה קיימת.
אפילו הפדרליסטים החלו לאמץ שיטות מפלגתיות כארגון מפלגתי, עיתונים ומועדונים. הם יצרו רשת של ועדות מפלגתיות בכל מדינה ובכל מחוז, עם רצון להשפיע על דעת הקהל המקומית.
ההיסטוריונים טענו שהתחרות בין ג'פרסון והמילטון נחשבה לאחת מהגדולות בפוליטיקה, מדעי המדינה, מדיניות כלכלית והכיוון של ארצות הברית. פרט לבית המשפט העליון של ג'ון מרשל הפדרליסט, תומכי ג'פרסון ניצחו בקלות.
בחירות 1804.
בבחירות של 1804, ניצח בקלות ג'פרסון את צ'ארלס קוטוורת' פינקני הפדרליסט, עם 162 אלקטורים לעומת 14, ונבחר מחדש. הפדרליסטים נחלשו בכל מקום פרט לניו אינגלנד, אולם לאחר כהונתו של ג'פרסון, עם פרוץ מלחמת 1812, החלו להתחזק שוב.
מדיניות פנים.
משלחות, משלחת לואיס וקלארק.
לאחר רכישת לואיזיאנה, רצה ג'פרסון למפות את החלק החדש ביבשת לצורך התרחבות מערבה. כעבור שנתיים מכניסתו לתפקיד שכנע את הקונגרס לממן משלחת. ב-1804 מינה את מזכירו האישי מריווד'ר לואיס ואת ויליאם קלארק להנהיג את המשלחת. המשלחת חזרה עם ידע גאוגרפי ומדעי רחב.
יחד עם אלברט גלטין, החליט ג'פרסון לבקש מימון למשלחת בעזרת מסר סודי לקונגרס, בגלל יחסים עכורים עם האופוזיציה בקונגרס.
ג'פרסון הושפע מתיעודים של מסעות, וטען שהיה חשוב לבסס את הנוכחות האמריקנית באזורים של היבשת לפני שהאירופאים יגיעו לשם. הוא קיווה למצוא את המעבר הצפון-מערבי שיקדם את הסחר במדינה. הידע על מערב היבשת היה מוגבל. לואיס הוביל את המשלחת בגלל ניסיונו הצבאי והיכרותו עם האינדיאנים. ג'פרסון הנחה את לואיס בנושא מיפוי, היסטוריה טבעית, מינרלים וניווט. בספרייתו במונטיצ'לו, היה לג'פרסון את האוסף הגדול ביותר בעולם של ספרי גאוגרפיה על היבשת, ואוסף גדול של מפות, ולואיס השיג גישה לספרייה. מלומדים שהיו חבריו של ג'פרסון הציעו את עזרתם למשלחת. לואיס וקלארק גייסו ארבעים וחמישה אנשים והתכוננו בחורף ליד סנט לואיס.
בעזרת שבטים אינדיאניים, המשלחת, שהפליגה על נהר קולומביה, הגיעה אל האוקיינוס השקט בנובמבר 1805. לאחר סיום החורף, החלה המשלחת לחזור ב-22 במרץ 1806, וחזרה לסנט לואיס ב-23 בספטמבר, עם ידע רב בנושא, כולל ידע על האינדיאנים איתם קיווה ג'פרסון לסחור. המשלחת נחשבה להצלחה, כשרק אחד מהשליחים מת בעקבות מחלה. היא נמשכה ממאי 1804 עד לספטמבר 1806, והובילה לפיתוחו של שביל אורגון. חודשיים לאחר סיום המשלחת, נאם ג'פרסון לראשונה בפני הקונגרס על הצלחת המשלחת והבטיח החזר הוצאות בעבורה.
בנוסף לכך, ארגן ג'פרסון עוד שלוש משלחות אל המערב, אל הרי הרוקי ואל דרום מערב היבשת. כל המשלחות הביאו מידע חשוב על אזורי הספר.
מדיניות פדרליסטית.
ג'פרסון המשיך בתוכניתו הבסיסית של אלכסנדר המילטון בנוגע לבנק לאומי ולמכסי מגן. לאחר תפוגת חוקי הזרים וההסתה ב-1801, שוחררו כל אלו שנעצרו בשל החוק. הפדרליסטים אפשרו לג'פרסון לבחור בחברי הקבינט שלו ובממונים בדרגים הגבוהים.
ניסיון לחסל את החוב הלאומי.
ג'פרסון רצה לחסל את החוב הלאומי כיוון שראה בו פתח לשחיתות. למרות זאת, רכישת לואיזיאנה הייתה הזדמנות יקרה מפז, וג'פרסון לווה זהב מאנגליה באיגרות חוב כדי לשלם בעבורה.
ג'פרסון לא סבר שלמדינה צריך להיות חוב כדי לבנות את דירוג האשראי שלה, השקפה שהמילטון תמך בה. הוא ביטל מיסים פדרליסטיים רבים, כולל מס על ויסקי שהוביל למרד הוויסקי. ג'פרסון האמין שהממשלה תוכל לפעול בעזרת הכנסות ממכסים וללא מיסוי ישיר. אמנם בתחילה הצליחה מדיניות זאת, אולם היא נכשלה כשהסחר נפגע בשל המלחמות הנפוליאוניות בין בריטניה וצרפת.
ג'פרסון הקטין את גודלו של הצבא, שהאמין שגזל משאבים שלא לצורך מהרפובליקה. רוב הצי שנוצר בממשל אדמס שותק. הפדרליסטים טענו שהמדינה תהיה חשופה להתקפות, אולם ג'פרסון טען שחיילים אזרחים יגנו על המדינה במקרה של התקפה, כמו שעשו ב-1775. הוא הבין שיש צורך במנהיגות צבאית כשהאזרחים יצאו לקרב, הקים את חיל ההנדסה האמריקני ואת האקדמיה הצבאית של ארצות הברית בוסט פוינט ב-1802 כדי לאמן חיילים רפובליקנים ללא פדרליזם.
מינויים פוליטיים ופדרליסטים.