מלך פורטוגל מנואל הראשון הסמיך ב-1517 את טומא פירש (Tomé Pires) ופרנאו פירש דה אנדרדה (Fernão Pires de Andrade) לעמוד בראש משלחת דיפלומטיה ומסחר לגואנגג'ואו ("קנטון" בפי האירופאים). טומא פירש אף הורשה להגיע לבייג'ינג, אם כי לא הצליח להיפגש עם הקיסר גֶ'נְגְדֶה (1521-1491), הקיסר ה-11 בשושלת מינג. שמועות על התנהלות אלימה של משלחת פורטוגזית אחרת בראשות סימאו דה אנדרדה (Simão de Andrade), אחיו של פרנאו פירש דה אנדרדה, בנוסף לשמועות על כך שהפורטוגזים חוטפים ילדים במטרה לאוכלם ולפניותיו של הסולטאן המודח של מלאקה (שהייתה מדינת חסות של סין) שביקש סיוע מהסינים לסלק את הפורטוגזים מממלכתו לשעבר, גרמו לסינים לשנות את עמדתם לרעה כלפי הפורטוגזים. טומא פירש נשלח חזרה לגואנגג'ואו, נכלא וככל הנראה מת בכלא. הממשל הסיני אסר על מסחר עם הפורטוגזים. ספינות פורטוגזיות נוספות שהגיעו ב-1521 וב-1522 לאי טוּנְמֶן, הסמוך לגואנגג'ואו (בקרבת הונג קונג של ימינו), על מנת לסחור, גורשו תוך שימוש בכוח על ידי הממשל של שושלת מינג שהיה עתה עוין. חרף זאת, הצליחו סוחרים פורטוגזים ששיחדו פקידי ממשל סינים להקים מושבת סחר באי שאנגצ'ואן. ב-1542 התיישבו הפורטוגזים שמיפו את חופה המזרחי של סין בנינגבו (פין-יין Níngbō), עיר נמל במחוז ג'ג'יאנג. שלוש שנים אחר כך החריב צבא סיני בן 60,000 חיילים את המושבה.
לאחר שספינה של פורטוגזים נטרפה בסמוך ב-1535, הורשו ספינות של סוחרים פורטוגזים לעגון בנמלים הטבעיים של מקאו ולסחור בה, אך לא להישאר על החוף. הפורטוגזים הראשונים שהגיעו לקצה חצי האי, שם היה (ועדיין קיים) מקדש א-מה, שאלו את המקומיים מה שם המקום ונענו "א-מה קאו", כלומר "מפרץ א-מה". השם "א-מה קאו" עוות בידי הפורטוגזים ל"מקאו" והפך לשם המקום בפיהם. היחסים בין סין של שושלת מינג לפורטוגל השתפרו בסוף שנות ה-40 של המאה ה-16, כאשר הפורטוגזים סייעו לסינים בחיסול הפיראטים שפעלו לאורך החוף. בשנים 1553-1552 קיבלו הפורטוגזים אישור זמני להקים מחסנים על החוף, במטרה לייבש סחורות שנרטבו במי ים. מאוחר יותר בנו הפורטוגזים כמה בתי אבן פשוטים סביב האזור המכונה כיום "נאם ואן". ב-1554 הצליח האציל הפורטוגזי לאונל דה סוֹאוּזה (Leonel de Sousa) לשכנע את הסינים לחתום על הסכם סחר שכלל את פירוט המס שהטילו הסינים על הסחורות הפורטוגזיות. ב-1557 התקבלה הסכמת חצר מינג להקמת בסיס סחר קבוע רשמי של הפורטוגזים במקאו. הפורטוגזים הורשו להקים יישוב קבע במקאו תמורת תשלום שנתי של 500 טאלים של כסף. מאוחר יותר באותה שנה הקימו הפורטוגזים יישוב קטן. ב-1558 נתמנה לאונל דה סוֹאוּזה כ-"capitão-mor", מפקדה הצבאי (למעשה המושל) השני של ההיאחזות במקאו. תשלומי שכירות שנתיים סדירים בגין הקרקע החלו ב-1573. ב-1573 או ב-1574 בנו הסינים חומה בקצה הצפוני הצר של חצי האי, קרוב למקום שבו קיים כיום השער בין סין למקאו, במטרה למנוע התפשטות של הפורטוגזים צפונה, על מנת לשלוט על האספקה למקאו ולפקח על הסחורות הנכנסות והיוצאות מהמושבה. סין שמרה על ריבונות ותושבים סינים היו כפופים לחוק הסיני, אך הטריטוריה הייתה תחת מנהל פורטוגזי. חוזה שכירות בגין מקאו נחתם ב-1582. תשלומי השכירות השנתיים הועברו לנפת שְׂיָאנְגְשָׁאן.
תור הזהב של מקאו.
לאחר שההיאחזות הפורטוגזית במקאו הפכה ליישוב קבע התקבצו במקום סוחרים סינים ופורטוגזים רבים, אם כי האוכלוסייה הפורטוגזית ביישוב הייתה תמיד במיעוט (רק כ-900 איש ב-1583, ורק 1,200 מתוך אוכלוסייה של 26,000 ב-1640). המושבה הפכה במהירות לצומת חשוב בהתפתחות המסחר הפורטוגזי בשלושה צירי מסחר עיקריים: מקאו-מלאקה-גואה-ליסבון, גואנגג'ואו-מקאו-נגסאקי ומקאו-מנילה-מקסיקו. נתיב הסחר גואנגג'ואו-מקאו-נגסאקי היה רווחי במיוחד. הפורטוגזים פעלו בו כמתווכים, כשהם משנעים משי סיני ליפן וכסף יפני לסין, ומקבלים עמלה גבוהה במיוחד עבור השירות. הרווח מנתיב זה גדל עוד יותר לאחר שהסינים העניקו בעקיפין לפורטוגזים מונופול עליו ב-1547, באוסרם על סוחרים סינים לסחור ישירות עם יפן בשל פעילות פיראטים סינים ויפנים.
תור הזהב של מקאו חפף לתקופת קיומה של אוניה פרסונלית בין הכתר הספרדי לפורטוגזי המכונה "האיחוד האיברי", בין 1580 ל-1640. בהמלצת יועציו לא שינה המלך הספרדי פליפה השני את תנאי המושבה ואפשר את המשך הסחר בינה לבין מנילה הספרדית ובינה לבין סין. ב-1583 הוקם ביוזמת הבישוף של מקאו גוף מוניציפלי המכונה כיום ליאל סנאדו (הסנאט הנאמן), שמטרתו הייתה לנהל את היישוב ולייצג את התושבים מול השלטונות הספרדיים. ב-1587 קידם פליפה את מעמד המושבה מ"התיישבות או נמל בשם האלוהים" ל"עיר בשם האלוהים" (Cidade do Nome de Deus de Macau).
בעקבות האיחוד האיברי בין ספרד לפורטוגל, הפכו המושבות הפורטוגזיות מעבר לים ליעד להתקפות של הולנד, שהייתה נתונה במאבק ממושך על עצמאותה מספרד באותה תקופה, תקופת מלחמת שמונים השנים. לאחר הקמת חברת הודו המזרחית ההולנדית ב-1602, ניסו ההולנדים לכבוש את מקאו ללא הצלחה כמה פעמים, כשניסיון הפלישה העיקרי נבלם ביוני 1622, כאשר 150 מגינים הצליחו להדוף 800 תוקפים שרובם נהרגו או נפלו בשבי. יום הניצחון על ההולנדים נחגג כל שנה ב-24 ביוני, עד העברת השלטון במקאו לסין. אחת הפעולות הראשונות של דון פרנסישקו דה מָשְקָרֶנִיאָש (Dom Francisco de Mascarenhas), המושל הרשמי הראשון של מקאו (1626-1623) שהגיע שנה אחר כך, הייתה לחזק את ההגנות של העיר, שכללו את בניית מצודת גיאה. הסינים, שהתנגדו קודם לכן לכל ניסיון לבנות ביצורים במקאו, מתוך חשש שאלו מהווים סימן ליישוב קבע, הסירו את התנגדותם בשל ההתקפה ההולנדית.
פעילות דתית.
מלבד היותה מרכז מסחר חשוב, הייתה מקאו מרכז לפעילותם של מיסיונרים קתולים, שראו ביישוב שער אל האוכלוסיות הגדולות של יפן וסין שאותן שאפו לנצר. הישועים הגיעו לראשונה בשנות ה-60 של המאה ה-16 והדומיניקנים הגיעו בשנות ה-80. שני המסדרים בנו במקום כנסיות ובתי ספר, כשהבולטים שבהם היו הקתדרלה של סאו פאולו (São Paulo) הישועית וכנסיית סאו דומינגוש (São Domingos) הדומיניקנית. ב-23 בינואר 1576 הורה האפיפיור גרגוריוס השלושה עשר על יצירת הדיוקסיה של מקאו, ובלשיור קרניירו לייטאו (Belchior Carneiro Leitão) מונה לתפקיד הבישוף הראשון. הבישוף הורה לבנות את בית החולים הראשון במקאו, "בית חולים לעניים" (Hospital dos Pobres) ששמו שונה אחר כך ל"בית החולים על שם רפאל הקדוש" ("Hospital de São Rafael"), מוסד צדקה ("Santa Casa da Misericórdia"), בית חולים למצורעים ובתי ספר.
מקאו הייתה הבסיס לפעילות המיסיונרית של הישועים ביפן ובסין. האב הישועי האיטלקי אלסנדרו ואלינאנו הקים במקאו ב-1571 את הקולג' על שם סאו פאולו שהכשיר כמרים ומיסיונרים אירופאים, ומתנצרים מיפן ומסין. בנוסף לקולג' הקימו הישועים במקאו במאה ה-18 סמינריון על שם סאו ג'וזה (São José). שני המוסדות אינם קיימים עוד. הקולג' נשרף ב-1835 והסמינריון נסגר מחוסר ביקוש.
על מנת לחדור לסין הורה ואלינאנו לאב הישועי האיטלקי מיקלה רוג'רי שהגיע למקאו ב-1579 ללמוד מנדרינית, ניב השפה הסינית שבו דיברו הפקידים והמשכילים בכל רחבי האימפריה של סין. תוך כדי כך, ובהיותו מודע לכך שיבואו אחרים בעקבותיו, הקים רוג'רי במקאו את "שֶׁנְגמָאֶרדִינְג גִ'ינְגְיְוֵּ'אן" (בית סט. מרטין), בית הספר הראשון ללימוד סינית על ידי זרים. ב-1581 הורה ואלינאנו לאב הישועי האיטלקי מטאו ריצ'י להצטרף לרוג'רי, והשניים, שקיבלו רשות להיכנס לסין, התיישבו בג'אוצ'ינג, אז עיר הבירה האדמיניסטרטיבית של גואנגדונג. רוג'רי נקרא בסופו של דבר לחזור, אבל ריצ'י הצליח לאחר מאמצים רבים להגיע לבייג'ינג ב-1601, ואף שלא הצליח להיפגש עם ואן-לי קיסר סין, הוא הצליח להקים מיסיון מצליח בכמה ערים בסין. ריצ'י מת ב-1610, אבל בעקבותיו הגיעו מיסיונרים ישועים נודעים אחרים כאדם של (Johann Adam Schall von Bell) הגרמני ופרדיננד פרביסט (Ferdinand Verbiest) הפלמי, שהצליחו להתברג בחצר הקיסר הסיני (פרביסט שימש האסטרונום המלכותי של הקיסר קאנגשי). בדרכם לסין עברו כל המיסיונרים דרך מקאו, ואדם של הספיק להשתתף בהדיפת ההתקפה ההולנדית על מקאו ב-1622 ולקח בשבי קפיטן הולנדי. המיסיונרים הצליחו באמצעות השפעתם על הקיסר להשיג הקלות למקאו מדרישות מחמירות שניסו להטיל פקידי הממשל בגואנגג'ואו על מקאו.
הידרדרות.
חשדות גוברים לגבי כוונותיהם של המיסיונרים הפורטוגזים והספרדים הקתולים הובילו בסופו של דבר את השוגון של יפן להורות לסגור ב-1639 את המדינה בפני כל השפעה מבחוץ. במסגרת מדיניות זו, שכונתה אחר כך סאקוקו ("מדינה נעולה" ביפנית), נאסר על יפנים לעזוב את המדינה (או לחזור ליפן אם התגוררו בחו"ל), ונאסר על ספינות ממדינות זרות לעגון בנמלים יפניים. יוצאי הדופן היחידים היו ההולנדים הפרוטסטנטים, שהותר להם להמשיך לסחור עם יפן בתנאים מגבילים מאוד בדג'ימה, אי מעשה ידי אדם במפרץ נגסאקי, בלבד. החלטה זו הפסיקה את הסחר בין סין ליפן באמצעות נתיב הסחר שעבר במקאו, שהיה מקור ההכנסה העיקרי של מקאו. המשבר החריף שנתיים אחר כך. ב-1641 כבשו ההולנדים מידי הפורטוגזים את מלאקה שהייתה תחנת מעבר חשובה בין גואה למקאו.