אף שווילנה הוקמה כבר בראשית המאה ה-14 וזכתה למעמד מרכזי בין ערי ליטא, זכויות מגדבורג והעדפות כלכליות נוספות, נראה שבתחילה נתקלו היהודים בהתנגדות לישיבתם בעיר. היהודים הראשונים שהגיעו להתיישב בעיר עשו זאת רק לקראת מחצית המאה ה-15 ואף אז הייתה זאת התנחלות בודדים. רק בראשית המאה ה-16 כבר ישבו בעיר יהודים במספר שהיה בו כדי לפתח מוסדות קהילתיים, הקמת בית כנסת וכדומה. גם ביסוס ראשוני זה של הקהילה נתקל בהתנגדות עזה של תושביה העירוניים, ובשנת 1527 הצליחו להשיג כתב זכות מאת זיגמונט הראשון, מלך פולין, שאסר על יהודים להתגורר בווילנה. הוראה זו אסרה למעשה על יהודים גם את המסחר בעיר בשל כתב-זכויות קודם משנת 1492 שאסר על סוחרים אורחים לסחור בווילנה ולהתחרות בסוחרים המקומיים. במהלך המאה ה-16 היו יהודים בודדים שקיבלו היתר מיוחד לחרוג מכתב הזכויות של העירוניים ולהתיישב בעיר, מוזכרים שמעון דוקטורוביץ וישראל בן יוסף שקיבלו ב-1551 אישור לשכור נכסי דלא-ניידי בעיר ולסחור בה. מה שאיפשר למעשה את ראשית ההתיישבות היהודית המשמעותית בעיר הייתה הפרדת רשויות שנכפתה בידי בני משפחות האצולה שהעבירו החלטה בוועד הליטאי ולפיה בתים שירכשו חברי מועצת הנסיך בעיר לא יהיו כפופים לבית המשפט העירוני ולא יחויבו במיסים עירוניים. הפרדה זו יצרה הלכה למעשה טריטוריות בעיר שלא היו כפופות לכתב-הזכויות של העירוניים, וכך התיישבו יהודים רבים בבתים של חברי המועצה, אף שעדיין נמנעו מהם פעולות אזרחיות במרחב העירוני כמו הקמת בית כנסת ומוסדות אחרים.
בעקבות איחוד לובלין ב-1569 התחזק מעמד האצולה הליטאי-פולני. האצילים שהעדיפו את שיתוף הפעולה עם סוחרים, בעלי מלאכה ובעלי הון יהודיים, על פני חיזוק מעמד העירוניים, החלו מסייעים ליהודים להשגת תנאי קיום נאותים בווילנה. בעקבות הכרזת חופש דת בידי שלטונות האיחוד הליטאי-פולני ב-1573, יכלו האצילים להקים בתי כנסת בשטחים שברשותם ואף מימשו את זכותם זו. בית הכנסת הגדול של וילנה הוקם לראשונה בתקופה זו, על שטח שהיה שייך לאחד האצילים ולפיכך מחוץ לתחום השיפוט העירוני. סביב בית הכנסת החלה מתגבשת קהילה יהודית וב-1592 או קודם לכן נקרא הרחוב שבו ניצב בית הכנסת, רחוב היהודים. התבססות הקהילה היהודית בעיר תוך עקיפת החוק העירוני, הביאה להתמרמרות בקרב המקומיים וב-7 במאי 1592 התקהלו עירוניים רבים ובהם גם חברי מועצת העיר וחבר בית המשפט העירוני וערכו פוגרום ברחוב היהודים. בית הדין הגבוה של האיחוד הליטאי-פולני שישב אז בווילנה ששימשה באותה תקופה בירת האיחוד, גזר על המתפרעים מאסר ופיצוי כספי, הם סירבו לעונש והעניין סודר לבסוף בהסכם פשרה מחוץ לכותלי בית המשפט. בעקבות פסיקת בית הדין הגבוה, פנו היהודים ותומכיהם בקרב חברי מועצת האיחוד ותבעו להכשיר חוקית את ישיבתם והתנהלותם כקהילה דתית מובחנת בווילנה, כדי למנוע התפרעויות דומות בעתיד. ב-3 ביוני 1593, העניק המלך זיגמונט השלישי ואזה כתב-זכויות ליהודי וילנה. בכתב הזכויות הודגשה העובדה שהוא מהווה למעשה רק אשרור של המציאות בשטח שבה היהודים גרים בבתי האצילים, תוך הרחבה ואישור של קיום מסחר, שכירת ורכישת בתי האצילים וחופש פולחן. מבחינה משפטית הוכפפו היהודים לבית המשפט במבצר העיר שאליו היו כפופים האצילים ולא לבית המשפט העירוני הכללי. במקביל, כתב-זכויות נפרד אישר ליהודים להקים מערכת שיפוט אוטונומית, להקים בית קברות ובית מרחץ ולקיים איטליז. סעיפים רבים בכתבי הזכויות הושארו מעורפלים, והשאירו תלות של הקהילה בפרשנות בית המשפט לזכויותיהם.
המאה ה-17.
פיצול מערכות המשפט של היהודים ושל שאר העירוניים בווילנה עמד בעוכריהם של היהודים ב-1606 כאשר ביקשו להעמיד לדין את האספסוף שהתנפל בפוגרום על בית הכנסת ובתי כמה יהודים, בית המשפט של המבצר היה נטול סמכויות באשר לעירוניים, ומנגד סירב בית המשפט העירוני להעמיד לדין את המתפרעים בטענה שאין לו סמכות שיפוטית לדיני היהודים. מצב זה תוקן עם התבססות הקהילה היהודית בהמשך המאה, בולטים בכתובים מתקופה זו שמואל בן משה ואליעזר בן משה, שני יהודים ילידי פרנקפורט בעלי הון והשפעה רבה, שהביאו לאשרור כתבי הזכויות של היהודים ולהחלת כתב-זכויות כללי שהיה תקף לשטחי האיחוד הליטאי-פולני כולו. ההסדר החדש והתיאום בין כתב-הזכויות הכל-ארצי לכתבי-הזכויות המקומיים, הטמיע את הקהילה היהודית עמוק יותר במרקם החברתי העירוני בהשיתו עליה מסי עירייה כעל יתר העירונים, היהודים שהיו חייבים במס גולגולת נפטרו בשל כך מתשלום מיסים חריגים בלתי-קבועים והשלטון המרכזי הכיר בהסכמי תושבות שערכו ערים מסוימות מול יהודיהן. יהודי וילנה הורשו להתדיין בפני בית המשפט המקומי, ואולם לא היה ניתן לתבוע יהודי שלא בבית המשפט של המבצר, הן בדיני ממונות והן בדיני נפשות. שתדלנים אלו השתתפו במושב ההכתרה של המלך ולדיסלב הרביעי ואזה לאחר פטירת המלך זיגמונט ב-1632, ובעקבות פעילותם אושרר כתב הזכויות של יהודי ליטא כולה מחדש. במקביל השיגו כתב-זכויות חדש ומשופר לקהילת יהודי וילנה, המסמך שנחתם ב-19 בפברואר 1633 היה הבסיס החוקי לקיומה של קהילת וילנה היהודית ומוסדותיה בשנים הבאות והרחיב את הפטור של יהודי העיר ממסים. המסמך העניק ליהודים זכות שווה בשימוש בנכסי העירייה ובשירותי העירייה השונים, התירה להם לנהל בתי מרחץ נפרדים ליהודים, והסדירה את עסקי ההלוואות בכך שהתירה למלווים היהודים למכור משכונות ללא הודעה מוקדמת כעבור שלוש עשרה וחצי חודשים מתאריך ההלוואה. במקביל ביטל כתב-זכויות זה את תוקפם של כל כתבי-הזכויות של עירוני וילנה או הסכמים מוקדמים לו, ככל שיעמדו בסתירה לזכויות המוקנות ליהודים.
בכתב-הזכויות של ולדיסלב ה-4, הוגבל לראשונה שטח המושב העירוני של יהודי וילנה. הגבלה זו באה באופן רשמי כדי להגן על היהודים בפני הפוגרומים שהתרגשו ובאו במשך השנים, עם קביעת הגבולות ניתן היה להחריג את השטח היהודי מתחום השיפוט של מערכת החוק העירונית וניתן היה להטיל איסור כניסה לאזור זה בזמנים מועדים לפורענות. עם תיחום השטח, חויבו היהודים לרכוש את השטח שהוקצה עבורם במשך חמש עשרה שנה שבסיומן ייאסר עליהם לגור בשאר חלקי העיר. כדי למנוע הפקעת מחירים בתהליך ההגירה הוקמה ועדת שומה עירונית שתפקידה היה להעריך את שווי הנכסים. יהודים הורשו להמשיך להחזיק בתים מחוץ לתחום המושב אם קיבלו אותם כתשלום על הלוואה, אך היה ניתן לחייב אותם למכור את הבית לפי שומה.
על אף מחאות העירונים על הזכויות שהוענקו ליהודים, המשיכו השתדלנים הווילנאים לדאוג להרחבת זכויות המסחר של היהודים בפנותם אל האצילים ששמחו להעמיד גורם כלכלי מתחרה למעמד העירוני. מנגד הגישו עירוני וילנה את התנגדויותיהם לזכויות היהודים, והמלך שהגיע לעיר עם בית המשפט המלכותי הוציא כתב זכויות מתוקן שמחד הגביל יותר את היהודים אך במקביל העניק להם זכויות נוספות. היהודים חששו שאין בכוונת העירייה לממש את זכויות המסחר שהוענקו להם, ופנו אל המלך שעשה את דרכו בחזרה מן העיר. מכתב האזהרה ששלח המלך לעיריית וילנה ובו איום שאם ייפגעו זכויות היהודים יקנוס את העירייה וישלול מן העיר את זכויותיה, עורר את רוגז ההמון. המון זועם, לטענת היהודים בארגון העירייה, התנפל ב-3 במרץ 1634 על בית הקברות היהודי, תקף ופצע עשרות יהודים ששהו במקום. במרץ 1635 נערך פוגרום נוסף, הפעם בבית הכנסת החדש. נקרעו וחוללו מספר ספרי תורה ונבזזו בתים אחדים. בעקבות הפוגרומים הורה המלך על הקמת ועדת חקירה, שתבדוק את מקרי ההתנפלות ואת הדרכים למניעת הישנותם. חברי הוועדה היו: הבישוף העירוני אברומאס ווינה ; הנסיך והוויווד הווילנאי קשישטוף רדווילה ; מיקולאי קישקה (Mikołaj Kiszka) הוויווד של מסטיסלב , הקנצלר הליטאי אלברכט סטניסלב רדזיוויל וסגן הקנצלר סטפן פאץ . הוועדה החליטה כי אין להאשים את כלל האוכלוסייה העירונית של וילנה במעשיו של אספסוף אנונימי, כדי לפצות את היהודים הוענקו להם הטבות מסחר עתידיות, וכדי להבטיח את הפסקת הפוגרומים נקבע קנס עתידי שיושת על העירייה במקרה של פוגרום שבו יוכח כי העירייה לא מנעה את התרחשותו ולא העמידה את המתפרעים לדין. יישומם המוחלט של מסקנות הוועדה ושל כתבי-הזכויות הקודמים התנהל בעצלתיים, תוך הארכות חוזרות ונשנות של תוקף הזכויות ושל זמן המימוש של הגירת היהודים ומכירת הנכסים, תביעות הדדיות בבתי המשפט ותקנות-שעה של המלך. הלכה למעשה במשך מאה וחמישים שנה מאז הוצא הצו המורה על תחום מושב ליהודי וילנה, מעולם לא התגוררו כל היהודים בגטו, לא רכשו את כל בתיו ולא מכרו את כל נכסיהם ברחבי העיר. רק ב-1783 בוטלה ההוראה על כינון גטו יהודי בווילנה מתוך הבנה שיישום הדבר לא אפשרי.
במהלך המאה ה-17, הצליחה הקהילה למצב את מעמדה כקהילה ראשית וחשובה בליטא, מעמד שהיה שמור עד אז לקהילות הוותיקות שבערים בריסק, גרודנו ופינסק. התרכזו בה רבנים ודיינים מן המעלה הראשונה, בין השמות הבולטים: רב העיר, רבי משה לימא, וחברי בית הדין שלו: רבי אפרים הכהן מחבר "שער אפרים", רבי שבתי כהן ("הש"ך") ורבי שמואל קאיידנובר מחבר "ברכת הזבח". רב נוסף מפורסם היה רבי משה רבקש, מחבר "באר הגולה".