אחת-עשרה שנים מילא הראל את תפקיד הממונה על שירותי הביטחון. בשנים אלה התגבשו ועוצבו המבנה ושיטות הפעולה של הארגונים. שנים אלה היו גם שנים של הישגים בתחום המודיעין והביטחון. שירות הביטחון הצליח לחשוף בשנת 1953 מחתרת של הימין הקיצוני שכונתה בשם מחתרת צריפין ולגרום להעמדת חבריה לדין. עם זאת היו שטענו כי התנהגותו של איסר כוחנית והוא נוטה להתעלם מהחוק במידת הצורך, כך למשל כאשר החליט להעלים את גופתו של קצין ישראלי שנחשד במכירת סודות צבאיים למצרים ונהרג בטעות בזמן הניסיון להביאו לדין במבצע ברן.
בשנות ה-50, בעיצומה של המלחמה הקרה, הכריע בן-גוריון כי האוריינטציה של ישראל תהיה פרו-מערבית. בתוך זמן קצר הפכה ברית המועצות מידידתה של ישראל, ליריבתה הגדולה. היו אלו ימיו האחרונים של הרודן סטלין, אשר באחרית ימיו הפנה את הפרנויה שממנה סבל אל היהודים, והחל במהלך אנטישמי במסגרתו הואשמו רופאים יהודים כי קשרו קשר לרציחתו. "משפט הרופאים", אשר הידיעות אודותיו החלו להתפרסם בינואר 1953, הביא עד מהרה להידרדרות היחסים בין ברית המועצות לבין ישראל, ולאחר שפצצה הושלכה לחצר שגרירות ברית המועצות בתל אביב, אף נותקו היחסים הדיפלומטיים בין שתי המדינות.
בלב הראל התעורר חשש כי מפלגות פרו-סובייטיות בישראל יפעלו נגד האינטרסים של מדינת ישראל ויעמדו לצד ברית המועצות אם תתלקח מלחמה בין-גושית. על המפלגה הקומוניסטית הישראלית מק"י (בגלגולה הקודם כפ.ק.פ) הוטל מעקב על ידי הש"י עוד בתקופת המנדט, ומעקב זה נמשך על ידי שירות הביטחון בתקופת המדינה. בדינמיקה זו נסחף איסר וביצע פעולה שזכתה לגינוי בזמנה ונחשבת גם בימינו ככתם על יוקרתו, והיא הטלת מעקב על מפלגה ציונית ממסדית, מפ"ם, מפלגתם של אנשי השומר הצעיר והקיבוץ הארצי. הראל, שחשש מפעולתם של משה סנה וקבוצתו במפ"ם, שדגלו במדיניות פרו-סובייטית קיצונית, הורה להטמין מתקן האזנה במשרדו של מנהיג מפ"ם מאיר יערי. ב-28 בינואר 1953 לכדו אנשי מפ"ם שניים מאנשי שירות הביטחון, בעת שהללו התקינו את המתקן בחדרו של מאיר יערי. הדבר עורר סערה בארץ. אנשי סנה פרשו ממפ"ם כעבור זמן לא רב, לאחר שהצהירו על אמונתם באשמתם של נאשמי משפטי פראג ומשפט הרופאים, והקימו את "סיעת שמאל".
להראל הייתה יד במעצרו של אהרן כהן, ממנהיגי מפ"ם ומראשי הקיבוץ הארצי, שהורשע באשמת מסירת מידע לסוכן זר ונידון לארבע שנות מאסר, לאחר שנפגש עם דיפלומט סובייטי בשנת 1958. מאסרו של כהן, שכונה "אהרונצ'יק", הכה בתדהמה את אנשי מפ"ם, מכיוון שהיה מדובר במנהיג פוליטי מן הזרם המרכזי במפלגה שייצגה אז זרם מרכזי בציבוריות הישראלית. הראל טען, בתקופה שבה נערך משפטו ובשנים שלאחריו, כי פעילותו של כהן עברה את גבול המפגש הלגיטימי וחרגה אל התחום הפלילי.
פעולה שזכתה בזמנה לגינוי נגעה לשבועונו של אורי אבנרי, "העולם הזה". השבועון היה כלי ביטוי אנטי-ממסדי קיצוני וביקר בחריפות את שלטונו של דוד בן-גוריון ושל מפלגתו מפא"י. בה בעת היה אבנרי בשבועונו מבין הראשונים שקראו למתן זכויות לעם הפלסטיני. השבועון צבר פופולריות רבה בארץ וזכה לתפוצה גבוהה. השבועון היה לצנינים בעיני הממסד של מפא"י באותם הימים, וכונה "השבועון המסוים". הראל, אשר מחמת עודף חשש של איש ביטחון סבר כי השבועון מהווה מקור להסתה חתרנית, מימן בשנת 1956 מתקציב השירותים, הוצאה לאור של שבועון מתחרה, בשם "רימון", בעל נימה סנסציונית, המודפס בצבע (דבר נדיר בעיתונות העברית באותה תקופה), במטרה ששבועון זה יגרום לנטישת הקוראים את "העולם הזה" ונדידתם ל"רימון". הדבר לא צלח והשבועון נסגר תוך זמן קצר. הדבר היה נקודת שפל בקריירה של הראל.
השירותים זכו בתקופת הראל להישגים גדולים ותדמיתם בציבור הישראלי הייתה בשיאה. גם בעולם הכירו בערכו של "המוסד" כאשר הצליח להבריח למערב את נאומו הסודי של ניקיטה חרושצ'וב, שנישא ב-24 בפברואר 1956 בוועידה ה-20 של המפלגה הקומוניסטית הסובייטית, ובו הוקיע את פשעי סטלין. הייתה זו תפנית חדה במדיניותה של ברית המועצות, כאשר מנהיג המדינה הודה בפשעיו של סטלין ולאחר עשרות שנות תעמולה התנער מן הסטליניזם. על אף שתוכן הנאום היה ידוע בצורה כללית, ראו גורמים במערב חשיבות עליונה בהשגת נוסחו המדויק. מאמצי ארגוני מודיעין בעולם להשיג את הנאום נכשלו, אולם עיתונאי יהודי פולני בשם ויקטור גרייבסקי השיג עותק של הנאום והעביר אותו לשגרירות ישראל בוורשה, וזו העבירה אותו למטה השב"כ בארץ, ולאחר בדיקת תוכנו, הועבר הנאום על ידי נציגי המוסד לידי ה-CIA. העברת הנאום העלתה את קרנו של המוסד בעיני השירותים החשאיים האחרים, והביאה להכרה העולמית כי המדובר בארגון חשאי המשתווה ואף עולה ביכולותיו על ארגונים ותיקים ומנוסים ממנו.
הישג שהיה בעל ממדים היסטוריים וייזכר לדורות הוא גילוי מקום הימצאו של אדולף אייכמן, ראש המדור היהודי באס אס, איש הביצוע בארגון השמדת יהודי אירופה שהצליח להימלט ולהיעלם בתום מלחמת העולם השנייה למשך חמש עשרה שנה. אייכמן נתגלה על ידי המוסד בארגנטינה, נלכד בפעולה נועזת של המוסד בפיקודו האישי של הראל בשטח ב-11 במאי 1960. והובא לארץ ב-21 במאי 1960 כדי לעמוד לדין במשפט אייכמן ההיסטורי, שבו נדון למוות, והוצא להורג בתלייה ב-31 במאי 1962. מאמצים דומים שהשקיע המוסד באיתורו של יוזף מנגלה, "רופא המוות" ממחנה אושוויץ, עלו בתוהו, ומקום הימצאו בברזיל התפרסם רק לאחר מותו.
תפיסת אייכמן הייתה שיא הקריירה של הראל. לימים יכתוב הראל על מבצע זה את ספרו רב המכר "הבית ברחוב גריבלדי", אשר תורגם לשפות רבות ואף היה לסרט בכיכובו של חיים טופול (בסרט שיחק השחקן היהודי מרטין בלסם את תפקידו של הראל). סרט נוסף על לכידת אייכמן יצא בשנת 2018 בנטפליקס בשם מבצע פינאלה, את הראל בסרט מגלם השחקן ליאור רז. על אף ששמו ותפקידו נותרו חסויים מעיני הציבור, העניקה תפיסתו של אייכמן לשירותים בראשם עמד הראל מעמד ציבורי, מוניטין ויוקרה.
הישג נוסף של שירות הביטחון היה חשיפתו ב-1961 של ד"ר ישראל בר, סגן-אלוף (במילואים) ופרשן צבאי נודע המקורב לצמרת הביטחונית, כמרגל סובייטי. כן נחשף בשנה זו קורט סיטה, אשר שימש כפרופסור לפיזיקה בטכניון, כמרגל של המודיעין הצ'כי. לא היה מדובר בפרשה בסדר גודל של עניינו של בר, אשר היה בשר מבשרו של הממסד הביטחוני של אותם הימים.
למוסד היה הישג בפרשה שהסעירה את הארץ בראשית שנות ה-60, הפרשה של יוסל'ה שוחמכר, ילד שנחטף בינואר 1960 על ידי סבו החרדי, נחמן שטרקס, מידי הוריו החילוניים, הוברח לארצות הברית כדי לגדלו כחרדי וכל החיפושים אחריו עלו בתוהו. הפרשה הביאה לקיטוב ולאיבה רבה בין דתיים וחילוניים (וזכורה "קריאת הקרב" שנקראה אחר חרדים בעוברם ברחוב - "איפה יוסל'ה"). הפרשייה צברה תאוצה עד כדי כך שראש הממשלה הטיל על המוסד לאתר את יוסל'ה. המוסד הצליח במשימה, וביולי 1962 גילה את הילד בשכונה חרדית בניו יורק. הילד שב לחיק הוריו, דבר שזכה לתגובה נלהבת של דעת הקהל.
פרישה.
בפרשת המדענים הגרמנים במצרים, גרס הראל שהסכנה מוחשית והפעיל את המוסד באירופה לפגיעה במדענים והרתעתם מעבודה במצרים. לאחר ששני סוכני מוסד נעצרו בשווייץ על איומים כלפי בתו של אחד המדענים, הורה ראש ממשלת ישראל, דוד בן-גוריון, על הפסקת פעילות המוסד נגד המדענים. במקום זאת פתח הראל במסע תעמולה נגד גרמניה המערבית, במטרה ללחוץ עליה להביא את המדענים לשוב לגרמניה. בן-גוריון, לעומת זאת, על סמך הערכת אמ"ן סבר שהסכנה אינה כה גדולה ולא כדאי בגללה לפגוע ביחסים עם גרמניה שסיפקה לישראל סיוע בהלוואות ובנשק. בפגישה ביניהם לקראת סוף מרץ 1963 דחה בן-גוריון את הערכתו של הראל וזה הודיע על התפטרותו. בעיתונות נטען שהראל חשש שבן-גוריון ינטרל את החלטת הכנסת והצהרת גולדה מאיר נגד הגרמנים. על פי אחד מהתיאורים, הראל התפטר לאחר שבן-גוריון הוכיח אותו על שטען שממשלת גרמניה המערבית רצתה בפעילות המדענים הגרמנים במצרים, כי היא עצמה לא יכלה לפתח נשק להשמדה המונית בגרמניה. על פי טענות אחדות, נבעה התפטרותו מהתנגדותו להוראה שקיבל מבן-גוריון לחדול מן הפעילות נגד המדענים הגרמנים במצרים. יש אומרים כי הסכסוך האמיתי אשר הביא לשנים של יחסים עכורים ולהשמצות הדדיות היה עם ראש אמ"ן, האלוף מאיר עמית.
באיסר הראל תמכו אנשי מפלגת אחדות העבודה - פועלי ציון, אנשי מפ"ם וגם כמה מראשי מפא"י ובהם שרת החוץ גולדה מאיר. לעומת זאת, אנשי רפ"י תמכו בנחרצות בבן-גוריון.
גרסה אחרת מדברת על כך שפרס הגיע להסכם חשאי עם שטראוס, שר ההגנה הגרמני, שגרמניה תעביר לישראל את כל המידע על המדענים ולכן "המוסד" לא יצטרך לטפל בזה יותר. איסר הראל התנגד. הוא ראה במדענים הגרמנים את אחד האיומים הגדולים ביותר על מדינת ישראל, ובהסכם של פרס ראה ניסיון למדר אותו מפעילות בנושא. אחרי שההתנגדות שלו לא התקבלה התפטר הראל מראשות "המוסד".
בראייה היסטורית התברר כי עמדתו של דוד בן-גוריון, שהתבססה על דו"ח אמ"ן, הייתה הנכונה, ולא זו של הראל ו"המוסד": נשק השמדה המונית לא נמצא בידי המצרים בשתי המלחמות בינה לבין מדינת ישראל שהתחוללו לאחר מכן, מלחמת ששת הימים בשנת 1967 ומלחמת יום הכיפורים בשנת 1973.
פעילותו הציבורית.
לאחר משבר המדענים, התפטר במפתיע בן-גוריון מראשות הממשלה, ב-16 ביוני 1963, ובמקומו התמנה לוי אשכול.