עם פרוץ מלחמת העולם השנייה, הוחלף הגלדיאטור כמטוס קו ראשון על ידי ההוריקן והספיטפייר, אך שתי טייסות גלדיאטור השתתפו במערכה על צרפת ובנורווגיה. עם זאת, שירת הגלדיאטור בזירות לחימה רבות באזורים מרוחקים יותר של האימפריה הבריטית בשנות המלחמה הראשונות. מטוס הקרב הדו-כנפי הקלאסי היה אחד מענפי הייצוא הגדולים המוצלחים של בריטניה בשנים שלפני המלחמה ושירת במדינות רבות. הוא הופעל בהצלחה יחסית בשירות פינלנד כנגד מטוסי הקרב הסובייטיים במהלך מלחמת החורף, אך סבל מנחיתות כשפעל נגד מטוסי קרב גרמניים בזירות אחרות. טייסות הגלדיאטור שהופעלו בצרפת סבלו מאבדות כבדות ולא היוו יריב ראוי למטוסים הגרמניים החד-כנפיים. הסי גלדיאטור תפקד בצורה מוצלחת יותר מכיוון שאיטיותו הפכה אותו מתאים לפעולה מעל גבי נושאות מטוסים ועם פחות סיכוי להתמודד כנגד מטוסי קרב מודרניים ממנו. בזירת צפון אפריקה כנגד מטוסי הקרב האיטלקיים פעל הגלדיאטור בצורה סבירה.
סין.
באוקטובר 1937 הזמינה הממשלה הסינית המרכזית 36 מטוסי גלדיאטור סימן I, אשר נשלחו בארגזים דרך הונג קונג לגואנגג'ואו בשני משלוחים. המטוסים הורכבו עד לפברואר 1938 וטיסת הבכורה המבצעית בוצעה ב-24 בפברואר, כאשר שני מטוסי קרב מדגם מיצובישי A5M של הצי הקיסרי היפני הופלו בקרב אוויר מעל אזור ננקינג, במחיר שני מטוסי גלדיאטור שאבדו. מטוסי גלדיאטור סיניים השיגו ניצחונות נוספים על מטוסי קרב יפניים בין השנים 1938–1940 במהלך מלחמת סין–יפן השנייה והיו בשימוש נרחב על ידי הסינים בטייסות ה-17, ה-28 וה-29 של הקבוצה האווירית ה-3. הגלדיאטור נחשב על ידי הטייסים הסינים כמטוס קרב מצוין לסוגו כאשר היה איטי רק במעט בהשוואה ליריבו העיקרי באותה תקופה, המיצובישי A5M, ובעל עליונות בהבטים האחרים כמו יכולת הפניה והתמרון. הופעתו בזירה של ה-A6M זירו ועליונותו המכרעת, הביאה לסיום שירותו של הגלדיאטור בסין. הטייסים האמריקאים ממוצא סיני, סון-שואי "באפאלו" וונג (John "Buffalo" Wong) וארתור צ'ין (Arthur Chin) הפכו לאלוף ההפלות בגלדיאטור ואלוף ההפלות האמריקאי הראשון, בהתאמה. הם היו חלק מהקבוצה המקורית בת 15 טייסים סינים-אמריקאים מתנדבים שנלחמו בפלישה היפנית לסין.
פינלנד.
במהלך מלחמת החורף, השיגו הפינים 30 מטוסי גלדיאטור סימן II מבריטניה: עשרה מטוסים שניתנו במתנה ו-20 שנרכשו על ידי חיל האוויר הפיני, נשלחו בין ה-18 בינואר ל-16 בפברואר 1940. הגלדיאטור שירת בחיל האוויר הפיני עד 1945 אך סבלו מנחיתות רבה מול מטוסים סובייטיים מודרניים יותר במלחמת ההמשך, כתוצאה מכך שימש הגלדיאטור בעיקר לתפקידי סיור מ-1941 והלאה. במלחמת החורף הפילו טייסי גלדיאטור 45 מטוסים ובמלחמת ההמשך הופל מטוס אויב אחד. תריסר מטוסי גלדיאטור אבדו ושני טייסי גלדיאטור פיניים הפכו לאלופי הפלות.
בנוסף לשירותו של הגלדיאטור בחיל האוויר הפיני, היה גם חיל האוויר של המתנדבים השוודים, שקיבל אחריות להגנתה האווירית של צפון פינלנד בשלב האחרון של מלחמת החורף, מצויד בגלדיאטור (סומן על ידי השוודים כ-J8 עבור סימן I, ו-J8A עבור סימן II). הרגימנט האווירי F 19 הגיע ללפלנד הפינית ב-10 בינואר 1940 ונשאר שם עד תום המלחמה. ברגימנט שירתו תריסר גלדיאטורים סימן II (שניים אבדו בלחימה), חמישה מפציצי צלילה מדגם הוקר הארט, מטוס קישור מדגם ראאב-קאצנסטיין RK-26 (Raab-Katzenstein RK-26) ומטוס תובלה מדגם יונקרס F 13. מטוסי הגלדיאטור, שסומנו בצבעי חיל האוויר הפיני, הפילו שמונה מטוסי אויב בקרבות אוויר והשמידו ארבעה נוספים על הקרקע.
נורווגיה.
בזמן המערכה בנורווגיה היה הגלדיאטור בשימוש על ידי הבריטים וגם על ידי הנורווגים, כאשר גף מטוסי הקרב (Jagevingen) שלהם נלחם ביומה הראשון של הפלישה הגרמנית לנורווגיה. מאוחר יותר סיפקו מטוסי גלדיאטור בריטיים חיפוי אווירי לתגבורות בעלות הברית שנשלחו לסייע לממשלה הנורווגית.
Jagevingen.
טייסי הגלדיאטור הנורווגיים של ה-Jagevingen חנו בשדה התעופה בפרבר פורנבו (Fornebu) שליד אוסלו. ב-9 באפריל 1940, יום הפלישה לנורווגיה, שבעת הגלדיאטור השמישים הצליחו להפיל חמישה מטוסים גרמניים: שני מטוסי קרב מדגם מסרשמיט Bf 110, שני מפציצים בינוניים מדגם היינקל He 111 ומטוס תובלה נושא צנחנים מדגם יונקרס Ju 52. גלדיאטור אחד הופל בקרב אוויר ושניים נוספים הושמדו על הקרקע בזמן שהתחמשו ותדלקו מחדש בפורנבו. המטוסים הנותרים קיבלו פקודה להתרחק מהבסיס ונחתו על אגמים קפואים סביב אוסלו, ננטשו על ידי טייסיהם ונהרסו בידי אזרחים שחיפשו "מזכרות".
טייסת מס' 263.
הגלדיאטור שירת בטייסת מס' 263 של חיל האוויר המלכותי במהלך המערכה בת החודשיים בנורווגיה. הטייסת הגיעה לנורווגיה על גבי נושאת המטוסים אה"מ גלוריוס ב-24 באפריל ופעלה בתחילה ממסלול נחיתה מאולתר שהוכשר על ידי מתנדבים נורווגיים על גבי אגם קפוא במחוז אופלנד (Oppland) בדרום נורווגיה. לאחר פחות משבוע, הפכו כלל המטוסים לבלתי שמישים והטייסת פונתה לבריטניה.
לאחר הצטיידות מחדש, הטייסת שבה לפעול ב-21 במאי, כשהפעם מוקמה בצפון נורווגיה ופעלה מבסיס ברדופוס (Bardufoss) הסמוך לנרוויק. טייסת מס' 263 תוגברה על ידי מטוסי ההוקר הוריקן של טייסת מס' 46, שלאחר פעילות של מספר ימים ממסלול מאולתר עברה גם היא לברדופוס ב-27 במאי. משימת הטייסות הייתה להגן על ספינות הצי המלכותי ולקיים עליונות אווירית מעל אזור נרוויק. הפעילות הייתה קצרה אך אינטנסיבית, כאשר ב-2 ביוני, בתגובה לפלישת הגרמנים לצרפת הורתה ממשלת בריטניה על הכנות לפינוי נורווגיה.
עד לפינוי, הטייסת ביצעה 249 גיחות והפילה 26 מטוסי אויב. עשרת מטוסי הגלדיאטור ששרדו נחתו על סיפונה של הגלוריוס ב-7 ביוני. במהלך הפלגתן של הגלוריוס ומשחתות הליווי שלה בחזרה לבריטניה הן יורטו על ידי סיירות המערכה של הקריגסמרינה, השרנהורסט והגנייזנאו. נושאת המטוסים טובעה ועליה מטוסים של ארבע טייסות שונות. טייסת מס' 263 איבדה בקרב הימי את מפקדה ותשעה טייסים נוספים.
הקרב על בריטניה.
טייסת מס' 247 פעלה מדבון שבדרום-מערב אנגליה בזמן הקרב על בריטניה. אף על פי שלא בוצעו גיחות קרביות במהלך שיא הקרב, הצליח גלדיאטור אחד ליירט מפציץ היינקל He 111 באוקטובר 1940 אך נכשל בהפלתו. טייסת מס' 239 שטסה במשימות של שיתוף פעולה עם הצי, וטייסת מס' 804 של זרוע האוויר של הצי המלכותי (שהפעילה מטוסי סי גלדיאטור), פעלו גם הן בזמן הקרב על בריטניה.
הים התיכון והמזרח התיכון.
בזירות הים התיכון והמזרח התיכון בשנים 1940–1941, שירת הגלדיאטור בארבעה חילות אוויר של בעלות הברית: חיל האוויר המלכותי, חיל האוויר המלכותי האוסטרלי, חיל האוויר הדרום-אפריקאי וחיל האוויר המלכותי היווני. לגלדיאטור הייתה הצלחה יחסית כנגד חיל האוויר המלכותי האיטלקי (הרג'ה אירונאוטיקה) שהיה מצויד בעיקר במטוסים הדו-כנפיים מהדגמים פיאט CR.32 ופיאט CR 42, וכנגד מפציצי הלופטוואפה. הם סבלו אבדות כבדות יותר בקרבות כנגד המטוסים החד-כנפיים פיאט G.50 ומאקי C.200. אלוף ההפלות הדרום אפריקני (ששירת בחיל האוויר המלכותי) מרמדוק "פאט" פאטל הפיל 15 מטוסים איטלקיים במערכות צפון אפריקה ויוון כטייס גלדיאטור, מה שהפך אותו לאלוף ההפלות הבריטי הבכיר ביותר במטוס דו-כנפי במלחמת העולם השנייה.
המלחמה האנגלו-עיראקית ב-1941 הייתה ייחודית בכך שהשתתפו בה מטוסי גלדיאטור משני צדי המתרס כמטוס הקרב העיקרי של חילות האוויר העיראקי והבריטי. הגלדיאטור השתתף גם במערכה בסוריה ובלבנון כנגד צרפת של וישי.
מלטה.
אחת המערכות הידועות בהן השתתף הגלדיאטור היה בזמן המצור על מלטה ב-1940. כוח מטוסי הקרב שהגן על מלטה היה מורכב, במשך עשרה ימים, ממספר קטן של מטוסי גלדיאטור, מה שהוביל למיתוס לפיו הגנתה האווירית של מלטה התקיימה בזכות שלושה מטוסי סי גלדיאטור שנקראו תקווה, אמונה וצדקה (Faith, Hope and Charity). למעשה ניתנו השמות למטוסים רק לאחר סיום הקרב ומספר גדול יותר של מטוסים היה בשימוש, אף על פי שלא תמיד באותו הזמן, ואחרים שימשו כמקור לחלקי חילוף.
משלוח של 18 מטוסי סי גלדיאטור מטייסת מס' 802 של הזרוע האווירית של הצי המלכותי הגיע (בארגזים) למלטה בתחילת 1940 על גבי נושאת המטוסים אה"מ גלוריוס. שלושה נשלחו לקחת חלק במערכה בנורווגיה ושלושה נוספים נשלחו למצריים. באפריל הוחלט שמלטה זקוקה להגנת מטוסי קרב והוקם גף מטוסי קרב שפעל מבסיס חאל פאר, כאשר כוח האדם הורכב מטייסי חיל האוויר המלכותי וזרוע האוויר של הצי המלכותי. מספר מטוסי סי גלדיאטור הורכב ונערכו טיסות ניסוי. עד יוני, התרסקו שני מטוסים ושניים נוספים הורכבו. צדקה הופל ב-29 ביולי 1940 בעת ניסיון ליירט מפציצי סבויה מרקטי SM.79 בליווי תשעה מטוסי פיאט CR 42. תקווה הושמד בהפצצה אווירית בעודו על הקרקע במאי 1941. אמונה שרד את המלחמה. גורלם של לפחות חמישה מטוסים נוספים שפעלו ממלטה לא תועד היטב כגורלם של שלושת המטוסים הנ"ל.
צפון אפריקה.
בתחילת המערכה בצפון אפריקה התמודד הגלדיאטור בעיקר כנגד הפיאט CR 42. לכאורה, המטוס האיטלקי הדו-כנפי היה מהיר מהגלדיאטור ובעל יכולת תמרון טובה יותר, אך הגלדיאטור היה מצויד במכשיר קשר, שהיווה יתרון טקטי חשוב בביצוע תקיפות מתואמות עם מספר גדול של מטוסים. כמו כן, בגובה נמוך היו ביצועיו של הגלדיאטור טובים יותר ויכולת התמרון האופקית שלו האפילה על זו של יריבו האיטלקי.