יצירת חוליה מקשרת.
סטטיסטית, כל מולקולת DNA בטבע מכילה אתרי מטרה לאנזימי הגבלה, אך לעיתים הנשא (וקטור) הרצוי אינו כולל אתרי קיטוע מתאימים. במקרים כאלו ניתן ליצור ולהחדיר לנשא חוליה מקשרת.
השלב הראשון כולל תכנון של רצפי DNA משלימים קצרים (אוליגונוקלאוטידים) המכילים את אתרי הקיטוע של אנזימי ההגבלה הרצויים, כשבקצותיהם בסיסים משלימים נוספים המתאימים לנשא המעוכל.
לאחר מכן ניתן לאחות את רצפי האוגלינוקלאוטידים אל תוך הנשא בעזרת האנזים DNA-ליגאז.
שימושים.
החוליה המקשרת מאפשרת הכנסת DNA זר לפלסמיד מבלי לפגוע בו, תכונה שהופכת אותה לשימושית במיוחד בתחומי הביוטכנולוגיה, הנדסת הביוטכנולוגיה והביולוגיה המולקולרית.
היא יכולה לסייע בין היתר בייצור תרופות, מחקר גנטי ובהכנת אורגניזמים טרנסגניים, המוכרים כאורגניזמים מהונדסים גנטית (GMO).
הוספת אנזים הגבלה מתאים לפלסמיד המכיל חוליה מקשרת מביאה לחיתוך הפלסמיד באתר הקיטוע ולהפיכת הפלסמיד למולקולה קווית. הקיטוע לרוב יתבצע כך שייווצר חתך משונן, בו קטע חד גדילי קצר נמצא בכל צד של המולקולה הקווית (שני הקטעים החד גדיליים משלימים זה לזה). כעת ניתן להוסיף לתמיסה המכילה פלסמידים קטועים רבים את הגנים אותם רוצים להחדיר אליהם. חיתוך הגנים הרצויים עם אותו אנזים הגבלה יביא ליצירת חתך משונן זהה לחתך שנוצר בפלסמיד, כך שהקצוות ה"דביקים" של הגנים משלימים לאלו של הפלסמיד. הוספת האנזים DNA-ליגאז לתמיסה המכילה את הגנים והפלסמידים החתוכים יביא לאיחוי של חלק מהגנים אל תוך חלק מהפלסמידים. ניתן לאתר את הפלסמידים אליהם אוחה הגן בהצלחה בשיטות שונות.
החדרת הפסלמיד המאוחה עם הגן הרצוי לחיידק מארח תביא להכפלת מספר עותקי הגן פעמים רבות. גנים שהוחדרו למיקום מתועתק בפלסמיד (לאחר פרומוטור) ושהרצף שלהם עבר התאמות נחוצות לאורגניזם המארח כגון הוצאת אינטרונים, יביאו ליצירת התוצר החלבוני אותו הם מקודדים, אותו ניתן לאחר מכן לסנן ולהפריד מהמארח לקבלת החלבון הנקי. כך ניתן ליצר חלבונים שונים ובכללם חיסונים ותרופות, כגון אינסולין ואנטיביוטיקות שונות, בכמויות גדולות ובאיכות גבוהה. תהליך זה משמש גם בטיפולים שונים של ריפוי גני.
במחקר גנטי ניתן להכפיל את הפלסמידים המכילים את הגן המוחדר בשיטות שונות, כגון PCR, ולייצר מספר עותקים רב מאותו גן.
דוגמאות לנשאים ואורגניזמים מארחים.
pUC18 הוא פלסמיד חיידקי נפוץ המשמש בהנדסה גנטית כנשא שיבוט. החוליה המקשרת שלו סונתזה מאתרי קיטוע של מספר אנזימי הגבלה נפוצים, כגון EcoRI ,BamHI ו-Pstl, שהונדסו יחד למקטע אחד. נשא נפוץ נוסף הוא pUC19, הדומה ל-pUC18 אך בעל חוליה מקשרת הפוכה. אורגניזם מארח (מאכסן) נפוץ הוא E. coli, בעיקר בשל זמינותו, קצב הכפלתו המהיר והתאמתו למגוון רחב מטרות.
בייבי מטאל
בייבי מטאל (באנגלית: BABYMETAL) הם להקת קוואי מטאל יפנית. הלהקה מורכבת מסוזוקה נקמוטו בתור "סו-מטאל" (ווקאלי וריקוד) ומואה קיקוצ'י בתור "מואמטאל" (צעקה וריקוד). הלהקה מופקת על ידי קובמטל מסוכנות הכישרונות Amuse. השירה שלהם מגובה במכשור כבד מטאלי, המבוצע על ידי קבוצת נגני מושבים המכונה "להקת קמי" בהופעות.
הלהקה הוקמה בשנת 2010, עם ההרכב המקורי של סו-מטאל (ווקאל וריקוד), מואמטאל (צעקה וריקוד) ויואי מיזונו בתור "יומטאל" (צעקה וריקוד), עם הרעיון של מיזוג הבי מטאל בסגנון "אליל יפני". בייבי מטאל, שהייתה במקור תת-יחידת של קבוצת האלילים היפנית סאקורה גאקוין , והייתה למעצמה עצמאית בשנת 2013, לאחר עזיבתו של נקאמוטו מסאקורה גאקוין. בייבי מטאל הוציאו את אלבום הבכורה המפורסם שלהם בפברואר 2014. אלבומם השני "Metal Resistance" (התנגדות מטאלית) יצא ברחבי העולם ב-1 באפריל 2016, שזכה להצלחה בינלאומית. בייבי מטאל יצאה גם היא למספר סיורים, ורוב הסיורים שלהם מתקיימים מחוץ לאסיה.
ב-19 באוקטובר 2018, הודיעה בייבי מטאל כי יוי מיזונו (Yuimetal) החליט לעזוב את הלהקה בגלל בריאות לקויה, בעקבות היעדרותה מהופעות חיות מאז דצמבר 2017. מאז עזיבתה הופיעה הלהקה עם רקדני גיבוי אחד או יותר שהוזעקו להופעות חיות. בשנת 2019 הציגה הלהקה שלושה רקדני גיבוי שנכחו בסיבוב בכל הופעה חיה כדי להקים שלישייה עם Moametal ו-Sumetal, והרקדנים נקראו "הנוקמים".
היסטוריה.
2010–2012: התחלות.
קובמטל, מפיק הלהקה וחובב הכבד המטאל היושב -ראש, החל לתכנן את השקת היתוך להקת "אליל יפני" / הבי מטאל בשנת 2009, לאחר שהתרשם מההופעה של סוזוקה נקמוטו בקבוצה הקודמת שלה, קרן גירל, מתוך מחשבה שהיא מתאימה להיות המובילה זמרת הקבוצה החדשה. הלהקה הוקמה בשנת 2010 בטוקיו, יפן, כ-"הבי מיוזיק קלאב", או תת-יחידה, של קבוצת האלילים הנשית סאקורה גאקוין, שהוקמה גם היא באותה השנה. לטענת קובמטל, יוי מיזונו ו-מואה קיקוצ'י נוספו כדי להשלים את "הנוכחות הבימתית הייחודית" של נקמוטו עם קומותיהם הקטנות, כשהן רוקדות סביבה "כמו מלאכים". איש משלושת החברים לא הכיר את מוזיקת המטאל לפני הקמת הלהקה.
ההופעה החיה הראשונה של "בייבי מטאל" הייתה ב-28 בנובמבר 2010, בקונצרט הסולו הראשון בפסטיבל "סאקורה גאקוין 2010". ביולי 2011 הציגו לראשונה בייבי מטאל את השיר "איג'ימה, דאם, זטאי" ("לא עוד בריונות"), בהופעה ב"סאקורה גאקוין", אך הוא בוצע אז רק במהלך הופעות חיות. הסינגל הראשון של הלהקה, "בוקר דוקי דוקי", הופיע במקור באלבום הבכורה של "סאקורה גאקוין 2010 ננדו: הודעה", שיצא ב-27 באפריל 2011. וידאו קליפ לשיר הועלה לערוץ "טוי פקטורי" (Toy's Factory) ביוטיוב ב־12 באוקטובר 2011, והוא יצא לאור כסינגל DVD בסוף 2011, תחת תת-המותג העצמאית Toy's Factory Juonbu Records. הסרטון המוזיקלי הסתכם בסוף למעלה ממיליון צפיות.
אלבום הסינגל הראשון של "בייבי מטאל" היה שיתוף פעולה עם הלהקה "קיבה של עקיבא", שנקרא "בייבי מטאל / קיבה של עקיבא" והוא יצא במרץ 2012 על ידי ג'ונבו רקורדס, הסינגל שדורג במקום השלישי במצעד האינדי השבועי של אוריקון, ומספר אחד בדירוג האינדי השבועי של טאוור רקורדס שיבויה. בקיץ 2012 הוציאה הלהקה וידאו קליפ לסינגל הבא שלהם, "הד-באנגר!!!!!" (Headbangeeeeerrrrr!!!!!), בבימויו של הידנובו טנאבה. באוגוסט 2012, עלתה "בייבי מטאל" לראשונה בפסטיבל הקול סוניק של יפן, והפכה למופע הצעיר ביותר שאי פעם ביצע בפסטיבל, בגיל 12 הממוצע. באותה שנה, הופיעה בייבי מטאל מחוץ ליפן לראשונה, פסטיבל אנימה אסיה 2012, בסינגפור.
2013-2015: בכורה תחת חברת תקליטים גדולה ו-"בייבי מטאל".
ב־9 בינואר 2013, הלהקה עלתה לראשונה בלייבל תקליטים גדול עם "איג'ימה, דאם, זטאי" שיצא תחת המותג הראשי של "מפעל הצעצועים" (Toy Factory) ו-"ג'ונבו רקורדס" ומכר 19,000 עותקים בשבוע הראשון, כשהוא מעפיל לראשונה למספר שש במצעד הסינגלים השבועי של אוריקון. באביב 2013 סיים נקמוטו את לימודיו בחטיבת הביניים ועל כן נאלץ "לסיים את לימודיו" מסקורה גאקוין (קבוצת בנות יסודיות וחטיבות ביניים). עם זאת, הנהלתם החליטה כי "בייבי מטאל" לא תתמוסס ותמשיך בפעילותה כלהקה. הקבוצה הוציאה את הסינגל הבא שלה, "מגיטסון" (Megitsune), ב-19 ביוני 2013, תחת "טוי פקטורי" ותת הלייבל החדש של הלהקה BMD Fox Records.
ב-10 ו-11 באוגוסט 2013, השתתפה שוב "בייבי מטאל" בפסטיבל הקיץ של סוניק, והופיעה גם בטוקיו וגם באוסקה. מאוחר יותר, באוקטובר 2013, הפכה "בייבי מטאל" גם למופע הצעיר ביותר שאי פעם ביצע בפסטיבל הבי מטאל "לאוד פארק". בנובמבר 2013, "בייבי מטאל" הוציאה סרטון פרומו לפרמיירה היפנית של סרטה של להקת מטאליקה "Through the Never", והוציאה את סרטון המוזיקה החי הראשון שלה "Live: Legend I, D, Z Apocalypse", שעלה לראשונה במקום השביעי. במצעד השבועי של אוריקון Blu-ray Disc ובמקום השני ב-Blu-ray למוזיקה. בדצמבר 2013 התייצבו "בייבי מטאל" שוב מעבר לים, בפסטיבל אנימה אסיה אינדונזיה 2013, והופיעו בפעם השנייה בסינגפור, לאחר סיבוב ההופעות הראשון שלהם באסיה מעבר לים בשנת 2012.
ב -26 בפברואר 2014, "בייבי מטאל" הוציאו לאור את האלבום הראשון, שלהם, eponymous. הוא הכיל שלושה עשר שירים והיה זמין גם במהדורה מוגבלת שכללה DVD עם קטעי וידאו ומוזיקה חיה. האלבום התקבל יפה מאוד על ידי מבקרי המוזיקה כמו גם בציבור, ומכר מעל 37,000 עותקים ביפן בשבוע הראשון שלו, כשהוא מגיע לראשונה למקום הרביעי במצעד האלבומים השבועיים של אוריקון, ובמקום השני ב"בילבורד יפן". היא גם עקפה את תרשימי ה-iTunes Metal בגרמניה, בריטניה וארצות הברית, והגיעה למספר 187 "במצעד Billboard" 200 האמריקאי ב-22 במרץ; מעט אמנים יפנים שנכנסו אי פעם למצעד. אלבומם הגיע גם לרשימת Heatseekers במקום הרביעי. ב-1 וב-2 במרץ 2014 העבירה הלהקה שני קונצרטים בניפון בודוקאן. עם הגיל הממוצע 14.7, הם הפכו להופעה הנשית הצעירה ביותר אי פעם שנתנה שם הופעה. בשני הקונצרטים השתתפו 20,000 איש. ב-3 באפריל 2014, בפרק של האחים פיין "יוטוברים מגיבים" הועלה פרק שעסק בלהקה, כמו גם קליפים של 'בוקר דוקי דוקי', 'Iine!', ו-'תנו לי שוקולד' (Gimme Chocolate!!) ; התגובה של חברי הלהקה עצמם לסרטון יצאה מאוחר יותר ב-30 באפריל 2016.