אחת הגישות המוקדמות להתמודדות עם פריימר דיימר הייתה כיול כימי-פיזיקאלי של המערכת, כלומר שינוי ריכוזי הפריימרים, הנוקלאוטידים, המגנזיום כלוריד והטמפרטורה של הראקציה. גישה זאת, גם אם עובדת לעיתים, סובלת מכשל מובנה. שינוי אותם פרמטרים המפחיתים את הופעת הפריימר דיימר גורם גם להפחתת יעילות מערכת ה PCR עצמה. מסיבה זאת פותחו גישות שנועדו להפחית את יעילות יצירת הפריימר דיימר באופן ספציפי. ההתמודדות עם פריימר דיימר משלבת שיטות מגישות שונות.
תוכנות לעיצוב פריימרים.
תכנון פריימרים הוא משימה מורכבת הדורשת התייחסות לשני סוגי פרמטרים, ביולוגיים ופיזיקאליים. הפרמטרים הביולוגיים מתמקדים בספציפיות של מערכת ה PCR. לדוגמה, ספציפיות ל RNA של הגן, ספציפיות ל
, ספציפיות לאורגניזם במקרה של וריאנטים דומים של הגן באורגניזמים שונים (נפוץ בעיקר בהבחנה בין זנים שונים של חיידקים ונגיפים) ועוד.
לעומת הפרמטרים הביולוגים, מטרת השינויים בפרמטרים הפיזיקאלים היא הפחתת יצירת פריימר דיימר והגברת יעילות הראקציה. בין הפרמטרים הפיזיקאלים הנלקחים בחשבון ניתן למנות אחוז נוקלאוטידים מסוג GC, כך שלא יעלה על 60-70%, ובעיקר לא בקצה ה 3'; דומה של הפריימרים; מציאת רצף להגברה עם קצוות שלא יצרו מבנים עצמיים יציבים בצורת ; קומפלמנטריות נמוכה בין הפריימרים ואורך רצף בין 60 ל 200 בסיסים.
לרשימה מקיפה של תוכנות חינמיות ומסחריות לתכנון פריימרים ראה את עמוד תכנון הפריימרים של המרכז לגנטיקה אנושית וקלינית במרכז הרפואי האוניברסטאי לינדן (הולנד).
מניעת היווצרות פריימר דיימר לפני תחילת הראקציה.
היכולת של רצפי DNA להתחבר אחד לשני תלויה במידת ההתאמה של הרצפים (), באורכם, ב של התמיסה, בריכוז הפריימרים ובטמפרטורה.
בגלל שהפריימרים מתוכננים כך שיהיו עם קומפלמנטריות נמוכה אחד לשני, הם יכולים להתחבר אחד לשני (שלב I באיור) בעיקר כאשר תערובת הראקציה נמצאת בטמפרטורה נמוכה, קרי, לפני תחילת הראקציה.
האנזים או קרובים לו המשמשים ב PCR, מיועדים לעבודה בטמפרטורה גבוהה (עד מעל ל 90 מעלות צלזיוס), אך הוא עדיין פעיל בטמפרטורה נמוכה (חדר), גם אם בקצב נמוך יותר. לכן, כאשר תערובת הראקציה נמצאת בטמפרטורת חדר יש סיכוי גבוה להתרחשות שלבים I ו II.
כדי להפחית היווצרות פריימר דיימר לפני שמבחנת הראקציה מגיעה לטמפרטורה גבוהה, בה כמעט ולא נוצרים פריימר דיימר מחדש, מפרידים את האנזים מהראקציה, או מעכבים את פעילות האנזים עד שהראקציה מגיעה לטמפרטורת עבודה. גישה זאת נקראת וקיימות מספר דרכים שונות לביצועה.
ואקס - בשיטה זאת מפרידים את האנזים מתערובת הראקציה באמצעות ואקס הנמס בטמפרטורה גבוהה ומאפשר את התערבבות האנזים עם שאר הראגנטים..
שחרור מושהה של מגנזיום - בשיטה זו מוסיפים לתערובת הראקציה רכיב המשחרר יוני מגנזיום לתמיסה רק עם עליית הטמפרטורה. מכיוון שפעילות ה DNA Polymerase תלויה בנוכחות יוני מגנזיום באתר הפעיל של האנזים הוספת יוני מגנזיום לראקציה רק כאשר התערובת מגיעה לטמפרטורה הרצויה תפחית היווצרות פריימר דיימר.
קשירה לא קוולנטית של מעכב - בשיטה זאת פפטיד, נוגדן או , נקשרים לאנזים בטמפרטורה נמוכה ומעכבים את פעולתו, אך מתנתקים ממנו בהדגרה של דקה עד חמש דקות ב 95 מעלות צלזיוס ומאפשרים את הפעלתו מחדש. עם זאת, הקשר הלא קוולנטי בין האנזים למעכב מאפשר למעכב להיקשר לאנזים כאשר הטמפרטורה יורדת במהלך ה PCR, דבר שעלול לגרום באופן חלקי לדאקטיבציה חוזרת של האנזים.
Taq polymerase שאינו עובד בטמפרטורות נמוכות - זהו אנזים מוטנטי שאיבד כמעט את כל יכולתו לפעול בטמפרטורת חדר.
מודיפיקציה כימית - בשיטה זאת מבצעים מודיפיקציה קוולנטית על שייר חומצה אמינית, בדרך כלל באתר הפעיל של האנזים. לפני תחילת הראקציה יש לחמם את תערובת הראקציה למשך 10-15 דקות על מנת לשחרר את המודיפיקציה הקוולנטית.
דאקטיבציה של הפריימרים - בשיטה זאת מוסיפים לתערובת הראקציה רכיב הנקשר באופן ספציפי ל DNA חד גדילי, לדוגמה Gene 32 protein. כאשר מחממים את תערובת הראקציה החלבון נהרס, משתחרר מן הפריימרים ובכך משפעל אותם. שיטה זאת כמעט ואינה בשימוש כיום מכיוון שהיא דורשת זמן להדגרת הפריימרים עם החלבון.
מניעת הופעת אות הנוצר מפריימר דיימר (ב real-time PCR).
גישה אחרת להתמודדות הבעיה במקרה של real-time PCR, היא על ידי מניעת הופעת אות מהפריימר דיימר. כל הפתרונות בגישה זאת אינם פותרים את הבעיות העלולות להיגרם מהפריימר דיימר, קרי, עיכוב הראקציה או השפעה על התוצאה.
מדידת אות פלואורסצנטי בטמפרטורה גבוהה - כאשר מבצעים ראקציית Real Time PCR עם , צבע לא ספציפי ל DNA דו גדילי, ניתן בדרך כלל להפחית את קריאת האות המתקבל מהפריימר דיימר באמצעות העלאת טמפרטורת קריאת האות כך שתהייה מעט מתחת לנקודת ההתכה של רצף המטרה ומעל נקודת ההתכה של הפריימר דיימר.
שימוש ב sequence specific probes - כגון , מאפשר קבלת סיגנל מרצף המטרה בלבד.
מודיפיקציה מבנית של פריימרים.
גישה אחרת להתמודדות עם פריימר דיימר היא באמצעות הכנסת שינויים בפריימרים.
HANDS - Homo-Tag Assisted Non-Dimer System (HANDS), היא שיטה בה מוסיפים לפריימר בקצה ה 5' זנב של מספר בסיסים המשלימים לקצה ה 3' של אותו הפריימר. כאשר פריימר כזה נמצא חופשי בתמיסה הקצוות שלו מתחברים אחד לשני ויוצרים מבנה Stem-loop, שאינו זמין להתחברות לפריימרים אחרים.
פריימר כימרי - בשיטה זאת מכניסים לתוך רצף ה DNA של הפריימר מספר מועט של בסיסי RNA. תוצר ה PCR של פריימרים אלו מכיל RNA בצד שמכיל את הפריימר (צד 5'), אך בצד ה 3' הוא כולו DNA. לכן, כאשר במחזור הבא יתחבר לתוצר ה PCR פריימר חדש בצד ה 3' הוא יתחבר ל DNA בלבד. לעומת זאת כאשר פריימר יתחבר לפריימר אחר ייווצר קומפלקס דו גדילי שכל גדיל מורכב מ DNA-RNA. מכיוון שקומפלקס דו-גדילי של DNA-RNA עם DNA-RNA הוא פחות יציב נוצרים פחות פריימר דיימר.
אנפוליס
מטמנה
מטמנה (או מטמנת אשפה או מזבלה או מדמנה או אתר הטמנה) היא אתר המשמש להטמנת פסולת לאחר שסולקה מהמקום שבו נוצרה. קיימים מספר סוגים מטמנות אשפה:
הכשרת אתר הטמנה לפסולת מעורבת כולל עבודות איטום הקרקע למניעת חלחול נוזלים למי התהום, ניקוז נוזלים ושאיבתם מתחתית המטמנה באופן סדיר, הנחת צינורות לשחרור מבוקר של "גז מטמנה" המורכב ברובו מגז מתאן (בדרך כלל בין 55%-60%) הנוצר עקב פירוק הפסולת האורגנית על ידי חיידקים (תסיסה). שחרור גז המטמנה נמשך שנים רבות ובמהלך השנים הראשונות הפקת חשמל מפליטתו באמצעות גנרטור היא כלכלית.
החשמל המופק נמכר לחברת החשמל אשר מחויבת לרכוש אותו על פי חוק החשמל. בדרך כלל כעבור 5 עד 7 שנים פוחתת פליטת הגז כך שייצור החשמל ממנו אינו פעולה כלכלית ואז מוחלף הגנרטור בלפיד.
פעולת ההטמנה כוללת פיזור הפסולת בשטח המטמנה, דחיסתו באמצעות מכבש עפר, וכיסויו בעפר.
לאחר מילוי המטמנה מבוצעות פעולות שיקום לאתר הכוללות כיסוי בשכבת עפר עבה נטיעת עצים ושתילים.
כל תכנון מטמנה בישראל מבוסס על הקטנת הסיכוי האפשרי לזיהום והפחתת הסיכונים לציבור ע"פ עקרונות IRBCA.
פסולת יכולה להגיע אל מטמנות ישירות ממפעלים או מרשויות מקומיות (לרוב באמצעות משאיות דחס), מתחנות מעבר לפסולת או כשאריות מיון מתחנות מיון ומעבר (לרוב באמצעות משאיות משא).
הטמנה סניטרית.
הטמנה סניטרית היא דרך לטיפול בפסולת מוצקה. הפסולת מוטמנת באדמה בצורה מבוקרת על מנת למנוע חלחול מזהמים, לכידת גזים ולכידת ריחות שלא יצאו מהשטח של המזבלה.
זוהי דרך הכרוכה בעלויות גבוהות, אך בעלת יתרונות סביבתיים. באתר ההטמנה ניתן לבנות גני שעשועים.
אתרי פסולת בלתי חוקיים.
אתרי פסולת בלתי חוקיים הם כל אתר הטמנה נטול אישורים של הרשות המקומית ונטול תשתית שבו הושלכה פסולת בצורה בלתי חוקית. גובה הפסולת הבלתי חוקית שמושלכת באתר שכזה יכולה להיערם לכמה מטרים. מקור הפסולת הוא על פי רוב פסולות בניין שלא מועברות בצורה מסודרת לאתרי ההטמנה. תהליך ניקוי יכול לכלול ניסיון להפריד ולמיין את הפסולת לפי סוגים על מנת למחזר את הבטון, למשל לאגרגטים לבניה, איסוף ושליחת המתכות לגריטה, וטיפול בחומרים האורגניים.
עבד אל ווהאב
BSK בלגרד
דאנדי יונייטד
שוודיה החדשה
שוודיה החדשה (שוודית: Nya Sverige) הייתה קולוניה שוודית קטנה לאורך נהר הדלאוור על החוף האטלנטי של צפון אמריקה. מרכז ההתיישבות בה היה במבצר כריסטינה, עכשיו וילמינגטון, והיא כללה חלקים מהמדינות המודרניות, דלאוור, ניו ג'רזי ופנסילבניה. ההתיישבות הוקמה ב-29 במרץ 1638 ונכבשה על ידי הולנד החדשה ב-15 בספטמבר 1655. בנוסף לשוודים ופינים, כללו המתיישבים גם הולנדים וגרמנים.
היסטוריה.
באמצע המאה ה-17, שוודיה הגיעה לשיאה הטריטוריאלי והייתה לאחד הכוחות האירופאים החשובים של התקופה. שוודיה כללה בתוכה את פינלנד ואת אסטוניה ושלטה גם על חלקים מפולין, גרמניה, לטביה ורוסיה המודרניות. השוודים רצו להגדיל את השפעתם על ידי סחר במוצרים חקלאיים (טבק) ופרוות כדי לעקוף את הסוחרים הבריטים הצרפתים וההולנדים. חברת שוודיה החדשה שכרה סוחרים משוודיה הולנד וגרמניה.
המשלחת השוודית הראשונה לצפון אמריקה יצאה מנמל גטבורג בשלהי שנת 1637. המשלחת אורגנה ופוקחה על ידי קלס פלמינג, גנרל שוודי מפינלנד.