מקור המילה כרומטוגרפיה ביוונית: כרומו - "צבע", גרפיה - "כתיבה". השיטה פותחה במהלך המאה ה-19 על ידי הבוטנאי הרוסי מיכאיל צבט. צבט חקר את הפיגמנט כלורופיל המקנה לצמחים את צבעם הירוק. כתוצאה מבידוד הכלורופיל התקבלה שורה של צבעים האופייניים למרכיביו ומכאן שם השיטה. כיום הכרומטוגרפיה התפתחה ונחשבת לכלי אנליטי מדויק להפרדה ולמדידות גזים, מוצקים ונוזלים ללא תלות בהיותם בעלי צבע.
צבט פיתח את השיטה בשנת 1901, הגם שעקרונותיה היו ידועים עוד לפני כן; תרומתו של צבט הייתה ביישום העקרונות לשימוש מעשי. צבט לא הצליח לפרסם את שיטתו במידה רבה, אולי כיוון שכתב את עבודותיו רק ברוסית. במהלך המאה ה-20 התפתחה הכרומטוגרפיה בצעדים משמעותיים; ב-1952 זכו שני בריטים בפרס נובל לכימיה על פיתוח תאוריות מתקדמות ומספר סוגים של כרומטוגרפיה.
שיטות כרומטוגרפיות על-גבי משטח.
כרומטוגרפיית נייר.
בשיטה פשוטה זו הפאזה הנחה היא רצועת נייר (העשוי ברובו מתאית), שבמרכזה מניחים טיפה מהתערובת שרוצים להפריד (יש לוודא שאף אחד ממרכיביה לא עלול להגיב עם הנייר). הנייר מוטבל בקצהו אל תוך הפאזה הנעה - מים או אתנול, למשל. הפאזה הנעה מתחילה "לטפס" במעלה הנייר; כשהיא פוגשת את טיפת התערובת היא גוררת את מרכיביה איתה. עתה מתבצעת ההפרדה: מרכיבי התערובת שאינם יוצרים אינטראקציות חזקות עם מולקולות הנייר מטפסים במהירות עם הפאזה הנעה אל קצה הנייר; המרכיבים שיוצרים אינטראקציות עם הנייר מזדחלים באיטיות. התוצאה המתקבלת היא שורה של נקודות, כל אחת מייצגת אחד ממרכיבי התערובת.
את התוצאות ניתן להשוות לתוצאות ידועות של החומרים המדוברים. ניתן לחשב את שיעור הנדידה של כל חומר. שיעור הנדידה (מסומן RF) שווה למרחק שנדד החומר (2 ס"מ, לדוגמה) חלקֵי המרחק שנדדה הפאזה הנעה (5 ס"מ, למשל; במקרה זה שווה ה-RF ל-0.4).
בכרומטוגרפיית נייר דו-ממדית מסובבים את הנייר באמצע התהליך ב-90 מעלות. כתוצאה מכך נוצרת הפרדה כפולה, מדויקת יותר; זו משמשת בדרך-כלל להפרדת תערובות בעלות מספר רב של מרכיבים דומים מאוד.
כרומטוגרפיה ברובד דק.
שיטה זו, הידועה יותר כ-TLC (באנגלית: Thin Layer Chromatography), זהה בעקרונותיה לכרומטוגרפיית נייר, אלא שכאן הפאזה הנייחת (בדרך כלל סיליקה או אלומינה) מצופה על גבי משטח (זכוכית, אלומיניום או פלסטיק). שיטת ה-TLC מהירה ומדויקת יותר מכרומטוגרפיית נייר ומשום כך, עם התפתחותה של שיטה זו - שיטת כרומטוגרפיית הנייר נעלמה כמעט לחלוטין. שיטת ה-TLC משמשת בעיקר לזיהוי של חומרים לא ידועים המוטענים על גבי המשטח ו"רצים" על גביו לצד חומרים ידועים (סטנדרטים). בסיום תהליך ההרצה מושווה מרחק הנדידה של החומר הנעלם למרחקי הנדידה של הסטנדרטים. ההנחה שעומדת במרכזה של שיטת ה-TLC היא שלחומרים זהים יהיה מרחק נדידה זהה. לכן, על פי מרחק של חומר לא ידוע ניתן לקבוע את זהותו. היא משמשת רבות בכימיה אורגנית בעיקר לבדיקת דרגת הניקיון של החומר ולבדיקה ראשונית של כמות המרכיבים בתערובת.
כרומטוגרפיה ברובד דק נחשבת לשיטה כרומטוגרפיית זולה, קלה ויעילה. היא משמשת בעיקר לזיהוי של חומרים ויש לה יישומים נרחבים בן התחום הכימיה האנליטית והן בתחום הכימיה האורגנית בעיקר לבדיקת דרגת הניקיון של החומר ולבדיקה ראשונית של כמות המרכיבים בתערובת.
ניתן לבצע בעזרת שיטה זו בדיקות כמותיות למציאת ריכוז חומרים, אך שיטות אלו פחות נפוצות. לצורך כימות חומרים בשיטות כרומטוגרפיות ישנו שימוש נרחב בשיטות של כרומטוגרפיה נוזלית בלחץ גבוה (HPLC) וכרומטוגרפיה גזית (GC).
שיטות כרומטוגרפיות בעמודה.
כרומטוגרפיית גודל המולקולה.
הפרדה לפי משקל מולקולרי או הפרדה לפי גודל מולקולה Size Exclusion Chromatography - SEC. כרומטוגרפיה סינון בג'ל, או SEC היא שיטה להפרדת חלקיקים לפי נפחם בממס מסוים. לרוב שימושיה הן טיהור ואנליזה של מולקולות סינתטיות וביולוגיות כמו: חלבונים, פוליסוכרים וחומצות גרעין.
ביולוגים וכימאים משתמשים בתמיסה ג'לטינית ספדקס שמורכבת מחרוזים קטנים בעלי חריצים המרכיבים את הפזה הנייחת, דרכה תעבור תמיסת הבופר ובה החלקיקים המיועדים להפרדה. יתרונה של השיטה הוא בכך שניתן להשתמש במגוון גדול של תמיסות מבלי שהן יפגעו בתהליך הסינון ולא יפגעו בפעילות הביוכימית של המולקולות המיועדות להפרדה.
לרוב לא די רק בשיטה זאת להפרדה מושלמת ולכן היא משמשת כאחד השלבים מני רבים (כרומטוגרפיית זיקה, כרומוטוגרפיה לפי מטען וכו').
השיטה היא המסת חומר בממס מסוים והנעתו בתוך קולונה על ידי ממס (בופר) נוסף דרך השכבה הנייחת לשם הפרדתו לפי גודל, כאשר לפי נפח הממס המניע שיצא (אילוציה), מחליטים על גודל המולקולה.
הפרדה לפי משקל (Size-Exclusion Chromatography – SEC) היא שיטה שנועדה להבדיל בין מולקולות כתלות בגודלם במרחב.
תאוריה ושיטות:
ישנן שתי הנחות בסיסיות שמניחים בשיטת SEC. (יש לשים לב שהן לא תמיד מתקיימות).
אם לחבר את שתי ההנחות, אז העיקרון המנחה הוא שמולקולות בגדלים שונים יצאו בנפחי אילוציה שונים (אילוציה היא התמיסה שנאספת בתחתית עמודת ההפרדה ובה החלקיקים שעברו סינון). ההפרדה מתבצעת בתוך עמודת הפרדה (Column או קולונה) שמורכבת מצינור חלול ובתוכו ארוזים חרוזים מחוררים (נקראים בידיים - bead) עשויים פולימר (לרוב דקסטרן, אגרוז או מפוליאקרילאמיד (Polyacrylamid)). הבידים מעוצבים בגדלים שונים ויוצרים תעלות דרכם החלקיקים (המתאימים בגודל) יוכלו לנוע, כלומר החלקיקים נעים בתוך הקולונה בנוזל הבופר כאשר בהתאם לגודלם היחסי חלקם נכנסים גם לחריצים של הבידים וחלקם ממשיכים עם הנוזל אל קצה הקולונה.
ככל שהחלקיק גדול יותר כך הנפח בו הוא יוכל לנוע בתוך הקולונה קטן יותר ולכן חלקיק גדול יצא בנפח אילוציה קטן יותר.
גורמים המשפיעים על הסינון:
כרומטוגרפיית זיקה.
בשיטה זו, הידועה גם ככרומטוגרפיית אפיניות (באנגלית: Affinity Chromatography) והמשמשת בעיקר להפרדת חלבונים, משתמשים באינטראקציות ביולוגיות ספציפיות (לא קוולנטיות). דוגמאות לאינטראקציות כאלו הן: אנזים וסובסטראט, קולטן וליגנד וכו'.השיטה הזאת דומה לשיטת SEC, כאשר גם פה ישנה עמודה (Column - קולונה) שמורכבת מפאזה נייחת, רק שבמקרה זה אל החרוזים קשורה קוולנטית מולקולה, שזיקתו אליה של אחד החומרים המועמסים לקולונה גבוה. את הפאזה הנעה, נוזל המכיל את התערובת, מוזגים אל הפתח העליון של העמודה. התערובת מחלחלת לאיטה דרך העמודה, כשמרכיביה נודדים במהירויות שונות, עד שהיא מגיעה לתחתית, בשלב זה החומר אותו נרצה לבודד יהיה קשור לפאזה הנייחת (ליתר דיוק לליגנד) בצורה הפיכה ויתר המולקולות שהועמסו לקולונה ישטפו על ידי נוזל הבופר. כשמבצעים כרומטוגרפיית אפיניות, יש לדעת מראש אילו חלבונים מצויים בתערובת, ולבחור את הליגנד בהתאם. שיטת כרומטוגרפיית הזיקה פותחה בידי פרופ' מאיר וילצ'ק ממכון ויצמן למדע.
תאוריה ושיטות
כאשר רוצים להפריד על ידי קולונת אופייניות נלקחים מספר דברים בחשבון:
לפיכך כדי לבודד חלבון מסוים על ידי קולונת אפיניות צריך להכיר את החלבון אותו מבקשים לבודד. לפי הידע המוקדם יודעים לקשור בצורה קוולנטית, אל החרוזים מולקולה אליה לחלבון המטרה אפיניות גבוהה. את החרוזים עם המולקולה הקשורה מעמיסים אל הקולונה והם יהוו את הפאזה הנייחת. בהמשך מעמיסים לתוך הקולונה תמיסה ובה החלבון אותו מבקשים לבודד, לאחר מכן מוזרמת תמיסת בופר שתשטוף את יתר החלבונים שלא נקשרו מהקולונה. בשלב הבא מוזרם לתוך הקולונה את אותה המולקולה שקשרה את החלבון לחרוזים, והיא תתחרה על הקישור לחלבון, כלומר בריכוז גבוה החלבון יקשר אליה וכל שנשאר לעשות הוא לאסוף את האילוציה מתחתית הקולונה.
שימושים
כרומטוגרפיית חילוף יונים או הפרדה לפי מטען.
בשיטה זו, הידועה יותר כ-IEC (באנגלית: Ion-Exchange Chromatography). IEC) מופרדות מולקולות לפי מטענן החשמלי. בשיטה ניתן להפריד כמעט כל סוג של מולקולה טעונה לרבות, חלבונים, חומצות גרעין וחומצות אמיניות. התמיסה המיועדת להפרדה נקראת דוגמית. את הדוגמית מעמיסים לתוך עמודה (קולונה), שהיא בעצם צינור חלול המורכב משכבת ג'ל עשויה חרוזים קטנים (בידים, באנגלית: bead), החרוזים קשורים קוולנטית לשיירים טעונים, ומהווים את הפזה הנייחת. הדוגמית מוזרמת דרך הקולונה על ידי תמיסת בופר ונקראת הפזה הניידת. ניתן גם להשתמש בשיטה זו להפרדה פרפרטיבית (לא לצורך אנליזה), כפי שיוסבר בדוגמה למטה.
הפרדה זו מתבססת על כך שלחלבונים מספר גדול של קבוצות פונקציונליות טעונות (חיובית או שלילית) כתלות בחומציות התמיסה בה הם נמצאים. IEC מפרידה בין חלבונים על סמך המטען הכללי על שרשרת הפפטיד, כאשר המטען תלוי בחומציות הפזה הניידת.
IEC מפרידה בין מולקולות על ידי אינטראקציה יונית בין המולקולות הטעונות הנמצאות בפאזה הניידת לבין השיירים הטעונים (R-X) הנמצאים על הפאזה הנייחת. השיירים מגיבים עם מולקולות טעונות (במטען הנגדי) מהדוגמית.
ניתן לחלק כרומטוגרפיה מסוג זה לשתי תת-קבוצות: כרומטוגרפיית קטיונים וכרמטוגרפיית אניונים. כרומטוגרפיית קטיונים מפרידה בין המולקולות מהדוגמית בעזרת האופי השלילי של השייר על הפאזה הנייחת, כאשר בכרומטוגרפיית אניונים משתמשים בשייר טעון חיובית.