עם התפתחות ענף הרפת בקיבוצים החדשים התעוררה בעיית הובלת החלב הרגיש אל שוקי הכרך. בשנת 1922 בוצעה פנייה ראשונה של חברי קבוצת דגניה שביקשו לקבל קרון ייעודי ברכבת הבוקר לשילוח תנובת החלב אל חיפה. "רכבת החלב" אושרה בקרב השלטונות כעבור זמן קצר, והחלה עושה את דרכה בשעות הבוקר המוקדמות מצמח, אותה עזבה בשעה 2 לפנות בוקר ועד לחיפה שם פרקו הסבלים את החלב שנאסף במחלבות העמק.
משמר הרכבת.
עם פרוץ המרד הערבי בשנת 1936 הפכה מסילת הברזל שבעמק למוקד ההתנכלויות הערביות באזור. הערבים הפורעים הניחו מוקשים על פסי המסילה, גרמו לירידה של מספר רכבות מהפסים והביאו לפגיעה ברכוש ובנפש. כמו כן, על מנת לזרוע הרס רב ככל הניתן נהגו נוהגי הקטרים להשליך פחם בוער מכבשן הקטר אל שדות התבואה, ועל ידי כך להצית בהם דליקות הרסניות.
מספר חודשים לאחר תחילת המהומות, החלה ממשלת המנדט בגיוס נוטרים יהודיים שירכיבו את ה-P.P.R.D, "מחלקת הרכבת של משטרת פלשתינה" (Palestine Police Railway Department), אשר כונתה בקיצור "משמר הרכבת". הכוח מנה לבסוף יותר מ-700 איש, אשר עברו קורסים מיוחדים אצל חברי ארגון ההגנה.
משמר הרכבת החל את פעולתו באפריל 1938, לאחר שהמהומות הערביות חודשו. הקו הראשון שזכה להגנת המשמר היה קו לוד-חיפה. קו זה, שעבר באזורים בהם היוו הערבים רוב, סבל קשות מפגיעות חוזרות ונשנות במסילה וברכבות העוברות בה. אנשי המשמר, על ניסיונם הדל, ספגו גם הם פגיעות ואבדות בנפש בקרבות אותם ניהלו אל מול הפורעים.
משמר הרכבת שנקרא פלוגת הרכבת קיבל תגבור מיוצאי פלוגות הלילה של ווינגייט ואנשי הגנה מאומנים. אנשי פלוגת הרכבת שמרו על רכבות מצמח ועד פורט סעיד.
מאוחר יותר הוחלה השמירה על המסילות גם ברכבת העמק. הנוטרים הקימו מגדלי תצפית ושמירה וערכו סיורים ממונעים לאורך תוואי המסילה בחיפוש אחר פורעים. לטובת המשמר נבנו קרונות מיוחדים שהורכבו משני טנדרים מתוצרת חברת "פורד" האמריקאית אשר נשאו שיריונות פלדה והולחמו כשהם בכיוונים מנוגדים זה לזה. חיבור זה איפשר תנועה קלה לשני כיווני המסילה ללא צורך בסיבוב הקרון. קרונות אלו היו קלים ובעלי מהירות גבוהה יחסית וכן נהנו מעמידות ואף כח אש שלא היה לרכבות הרגילות. בחלק מהמקטעים נהגו הנוטרים לקחת עמם בסיוריהם את ראשי המגזר הערבי באזור, וזאת כדי להבטיח שהמסילה עליה נעה קרוניתם לא תמוקש. פתיחת הצירים הייתה לפי יישום שיטות פלוגות הלילה של ווינגייט. איש כנופיות אשר נלכד בלילה הקודם היה נקשר לכיסא שנע לפני הרכב המשוריין והיה מסמן היכן הוטמנו מטענים.
לאור ההצלחה שנחלו שומרי הרכבת הורחבה פעילותם גם לאבטחת מתקנים אסטרטגיים נוספים דוגמת נמל חיפה, מפעלי מים ושדות תעופה. פעילות זו נמשכה גם בזמן מלחמת העולם השנייה, תקופה בה נשמרה שיגרת הרכבת ללא קשר למאמץ המלחמתי.
הרכבת כמטרה במאבק נגד הבריטים.
בעקבות סיכומי שיחות סייקס-פיקו בהן הוחלט על ידי הבריטים והצרפתים לחלק את ארץ ישראל בין המנדט הבריטי והמנדט הצרפתי, עלתה מורת רוח רבה ביישוב כאשר גבול הצפון סומן בקו ישר כך שיישובי "אצבע הגליל" נשארו בתחום המנדט הצרפתי וסופחו למעשה ל"וואילת-דמשק". ב-17 ביוני 1916 פוצץ ג'יסר-אל-האווי, הרמז הובן, והיישובים מטולה כפר גלעדי ותל חי נשארו בתחום המנדט הבריטי (עד היום לא ידוע מי ביצע את הפיצוץ).
ב-29 במרץ 1917 כאשר לישנסקי (מחתרת ניל"י) היה בתצפית על תחנת ג'יסר, הוא היה צריך להחליט אם להודיע לאוניית הריגול הבריטית "מאנאגאם" לשלוח לו את חומר הנפץ לפיצוץ הרכבת הטורקית, החליט שלא לבצע זאת כיוון שהטורקים היו למעשה בבריחה צפונה ולא סיכנו את היישוב.
בשנת 1945, בעקבות האכזבה ששררה ביישוב היהודי בארץ ישראל ממדיניות הבריטים בנושא הקמת הבית הלאומי ליהודים וזכויות ההגירה לארץ ישראל, הוקמה בארץ תנועת המרי העברי. תנועה זו, שהייתה ארגון גג לכל תנועות המרד היהודיות שנלחמו בבריטים, שמה לה למטרה לפגע בנכסים אסטרטגיים וביטחוניים ברחבי הארץ, וזאת כדי להניא את ממשלת בריטניה מכוונותיה הפוגעניות כלפי יהודי הארץ.
אחת הפעולות הראשונות שביצעה תנועת המרי כוונה אל רשת הרכבות הארצית הייתה "מבצע מסיבה" וזכתה לכינוי "ליל הרכבות". חודש אחד לאחר הקמת התנועה, בליל ה־1 בנובמבר 1945, פשטו עשרות חוליות חבלה מקרב תנועות המרד השונות על מתקני הרכבת הפזורים לכל אורכה של הארץ. במבצע מתוזמן היטב נפגעו 153 נקודות הקשורות לרכבת. הפגיעה ברכבת העמק נעשתה במסוט קטן בקרבת תחנת עפולה. המסוט פוצץ מתחת לאפם של חיילי המשמר ההודים שאבטחו את התחנה.
ההצלחה לה זכתה הפעולה, בעיקר לאור הפגנת יכולת האלתור והארגון בקרב שורות ההתנגדות היהודית והביצוע המושלם ללא נפגעים משני הצדדים, הביאה לסדרה ממושכת של התנכלויות חבלניות למתקנים צבאיים בריטים, חלקם שייכים לרשת מסילות הברזל. המפורסמת ביותר מבין פעולות אלו הייתה "מבצע מרכולת" זכתה לכינוי "ליל הגשרים". בלילה זה, של ה-16 ביוני 1946, פשטו פלוגות פלמ"ח על אחד עשר גשרים מרכזיים שחיברו את ארץ ישראל עם הארצות השכנות לה. בפעולה פוצצו שלושה גשרים עליהם עברו מסילות ברזל. בצפון פוצץ גשר א-זיו בקרבת אכזיב, בפעולה בה נהרגו 13 מלוחמי הפלמ"ח. מדרום לעזה פוצץ גשר שעבר מעל ואדי עזה.
הגשר השלישי שנפגע באותו הלילה היה הגשר עליו עברה רכבת העמק בסמוך לחמת גדר. גשר זה, ג'יסר-אל-האווי, שהיה הארוך ביותר בארץ ישראל (130 מטר אורכו) פוצץ באישון ליל. עם פיצוץ גשר חמת גדר נותק המעבר שבין ארץ ישראל לעבר הירדן ומסילתה של רכבת העמק נקטעה ממערכת המסילה החיג'אזית. לאחר שהגשר פוצץ בפעם השלישית, הוא לא תוקן יותר והוא ניצב שבור עד היום.
מאותו היום, מי שרצה לנסוע לסוריה, היה מגיע ברכבת העמק עד צמח ומשם לסוריה היה ממשיך במכונית, וכך גם בכיוון ההפוך.
סופה של רכבת העמק.
בליל ה־5 במרץ 1948 פשטו פלוגות ההגנה על כ-200 נקודות על פני רשת מסילות הברזל וחיבלו בהן קשות. מטרת הפשיטה הייתה ניטרול יכולת התפעול של המסילות וזאת כדי למנוע ולעכב את פלישת צבאות ערב המתרגשת ובאה. הפגיעה האנושה ביותר ברכבת העמק נעשתה בגשר החניה של זרעין בקילומטר ה-44 של המסילה. פיצוץ הגשר והחרבתו הפסיקו את תנועת הרכבת ברחבי העמק, שהפכה בחודשים שקדמו לפיצוץ לדרך המרכזית בה נשלחו חילות תגבורת לעזרת הלוחמים הערבים בקרבות מלחמת העצמאות.
חודשיים מאוחר יותר, ב־14 במאי של אותה השנה, פגעו הכוחות היהודים במסילה פעם נוספת. בליל ה־14 במאי, ערב הכרזת העצמאות הישראלית ופלישת צבאות ערב אל המדינה הצעירה, פוצץ גשר הרכבת שמעל הירדן, בסמוך לקיבוץ גשר ולתחנת ג'יסר אל מג'מעייה. תכליתה של הפעולה הייתה פגיעה בשני גשרים: גשר רומי עתיק וגשר עליו עבר כביש סלול. לאחר פיצוץ שני הגשרים הבחינו תצפיתני הפלמ"ח כי במקום קיים גשר שלישי, אשר שימש את מסילת רכבת העמק. הלוחמים, שחששו כי הגשר ישמש למעבר כלי רכב, פוצצוהו בטרם עלה השחר.
פעולות החבלה במסילת רכבת העמק השיגו את מטרתן, ובמשך כל ימות הלחימה עמדה הרכבת דוממה ושוממת. עם שוך הקרבות עברה המסילה, יחד עם שאר מסילות הארץ, לידיה של רכבת ישראל. כבר יוני 1948 נערך ניסיון מוצלח לחידוש פעילות הרכבת לעפולה ועמק יזרעאל, לאחר תיקון הגשר שפוצץ בזרעין. שאר תיקוני החבלות מתקופת המלחמה באזור עמק הירדן לא בוצעו מעולם, וזאת משום שלאחר תום המלחמה נשארה נהריים בתחומי ממלכת ירדן, דבר שמנע את מעבר הרכבת הישראלית אל צמח והכנרת. חוסר היכולת להגיע ברכבת למקומות אלו מנע את תיקון המסילה בקטע זה. הפעלת הרכבת לעפולה פסקה עוד בשנת 1949.
לצד חוסר הכדאיות הכלכלית הברור בהפעלת הקו לעפולה, עמדה פעם נוספת סוגיית רוחב המסילה. במהלך מלחמת העולם השנייה הרחיבו הכוחות הבריטים את מסילת הברזל שלאורך חופי הים התיכון לרוחב הסטנדרטי המקובל בעולם. במסגרת עבודות אלו הוארך קו החוף של המסילה עד לביירות. שרידיו של קו זה ניראים במנהרות החצובות שבקרבת ראש הנקרה. הרחבת מסילה זו לא כללה את הרחבתה של מסילת העמק, ועם תחילת הפעלת הרכבות בידי מדינת ישראל נוצר מצב בו הרכבות הנעות בציר הראשי לאורך החוף, אינן מתאימות לתנועה במסילת העמק הצרה.
בראשית ימי המדינה הופעלה הרכבת בקו עפולה-חיפה לצורך הצבא, להסעת עובדי הרכבת ולטיולים. בחודש ספטמבר שנת 1951 נעשה ניסיון להפעיל את הרכבת והיישובים שלאורך המסילה נתבקשו להתחייב לכמות נוסעים ומטען, אולם הם כלל לא ענו לבקשת הנהלת הרכבת, וב-14 בנובמבר 1951 נרשמה הנסיעה האחרונה של הרכבת מעפולה לחיפה. בשנת 1954 פורקו הקרונות והקטרים ששימשו בקו זה ונמכרו כגרוטאות. מתוך הצי הקטן ששירת ברכבת העמק בשנותיה הראשונות של המדינה נותרו רק קרון ארגזי, קרון סלון וקטר קיטור לעיתוק מספר 10 שהוסב למזוט. שרידים אלה מוצגים במוזיאון הרכבת, הנמצא בתחנת הרכבת חיפה מזרח. שני קרונות נוספים נמצאים באתר גשר וקרון ארגזי, בתחנת כפר יהושע.
הניסיונות לחידוש המסילה.
ניסיונות החידוש הראשונים של רכבת העמק היו עוד בשנות ה-50. באותה תקופה נערכו סקרי קרקע רבים ונבחנה האפשרות להסב את המסילה לרוחב סטנדרטי.
בשנת 1962 נערכו חילופי דברים בין ראש מועצת עפולה, יואש דובנוב, לבין מנהל רכבת ישראל מנחם סבידור לגבי חידוש פעולתה של רכבת העמק. בפגישה שנערכה ב-13 ביוני הכריז סבידור כי אם יצליחו יישובי הסביבה להבטיח את ריכוזם של 400,000-500,000 טון סחורה בשנה שישונעו ברכבת, יהיה הפרויקט כדאי והחברה תתמוך בביצועו.