בניגוד להתמודדותו ב-2000, הפעם הגיע מקיין אל הבחירות לנשיאות ארצות הברית 2008 כבעל הכרה לאומית, כשברזומה שלו רפורמה מצליחה בתחום מימון הבחירות ויוזמות גדולות לרפורמות בתחום השדלנות, ונודע היטב בזכות יכולתו לעמוד מול מפלגתו ולשתף פעולה עם הדמוקרטים. שירותו הצבאי ותקופתו כשבוי מלחמה, נוסף על קריירה ארוכה, מוצלחת ועשירה בהצעות חוק בסנאט של ארצות הברית תרמו אף הם להתמודדותו לנשיאות. במהלך מחזור הבחירות של 2006 השתתף מקיין ב-346 אירועי תרומות והצליח לגייס למעלה מ-10.5 מיליון דולר מטעם המועמדים הרפובליקנים. ב-2007 החל מקיין לגייס תרומות פוליטיות מטעם עסקים ומהתעשייה עבור מסע הבחירות הנשיאותי הקרב ובא, תוך שהוא מבטיח כי תרומות שכאלה לא ישפיעו על החלטות שיקבל. אף על פי שנחשב למועמד המוביל בבחירות המקדימות במפלגה הרפובליקנית למועמדות הנשיאותית על ידי פרשנים אחדים, מקיין פיגר בסקרים במקום השני אחרי ראש עיריית ניו יורק לשעבר רודי ג'וליאני בראשית שנה זו.
למקיין היו בעיות גיוס כספים ותרומות במחצית הראשונה של 2007, בין היתר בשל תמיכתו ברפורמת ההגירה המקיפה מאותה השנה, שלא הייתה פופולרית בקרב ציבור הבוחרים הרפובליקני. בראשית יולי נערך קיצוץ כוח אדם במטה הבחירות של מקיין, אך מקיין הודיע כי ימשיך בהתמודדותו לנשיאות. מאוחר יותר באותו חודש, מנהל מסע הבחירות של מקיין והאסטרטג הראשי עזבו שניהם את מטה הבחירות. מקיין פיגר מאוד בסקרים הלאומיים, ולעיתים קרובות ניצב במקום השלישי או הרביעי עם 15% או פחות תמיכה.
במהלך הבחירות המקדימות לנשיאות ארצות הברית חידש מקיין את מעמדו כאנדרדוג פוליטי. בדיוק כמו בבחירות הנשיאותיות ב-2000, הוא התנייד על אוטובוס בחירות בשם "שיחת אקספרס ישירה" ועשה שימוש רב בכלי התקשורת, כדוגמת עימותי בחירות ואירועי נתינת חסות. בדצמבר 2007, הבחירות המקדימות במפלגה הרפובליקנית היו הפכפכות: אף אחד מהמועמדים לא הוביל במירוץ ולכל אחד מארבעת המועמדים העיקריים (מקיין, מיט רומני, רודי ג'וליאני ומייק האקבי) אסטרטגיית בחירות שונה. גורל מסע הבחירות של מקיין נקשר במידה רבה במצב בעיראק. עוד ב-2006 קרא מקיין לתגבור משמעותי כוחות ארצות הברית בעיראק. עמדה זו לא הייתה פופולרית, ותרמה לירידה בכוחו בתחילת 2007, שכללה מלבד ירידה בסקרים גם ירידה בתרומות וקיצוץ חד בפעולות מטה הבחירות. אולם בסוף השנה, כאשר התגבור אותו ביצע לבסוף ממשל בוש הצליח להוריד את רמת האלימות בעיראק, עלתה שוב קרנו של מקיין. מקיין התמקד בניסיון לנצח בניו המפשייר, בה ניצח ב-2000 את ג'ורג' בוש בתקווה שניצחון שם ישמש כמקפצה להמשך ההתמודדות.
"יום שלישי הגדול" (Super Tuesday), שבמהלכו נערכו בחירות מוקדמות בספר רב של מדינות, ביסס כמעט לחלוטין את ניצחונו של מקיין. בשל פיצול הקולות בין רומני להאקבי זכה מקיין במספר רב של צירים, כמעט פי שלושה מרומני, בעיקר בזכות ניצחונותיו במדינות המאוכלסות קליפורניה ואילינוי. בעקבות התוצאות פרש רומני מהמירוץ, אך האקבי (שהיה במקום השלישי במניין הצירים) החליט להמשיך להתמודד על אף שסיכוייו לזכות במועמדות נראו אפסיים. כשנשאל מדוע הוא ממשיך להתמודד אף על פי שמתמטית אין לו כמעט סיכוי, ענה האקבי, "לא למדתי מתמטיקה, אבל למדתי משהו על נסים, ואני עדיין מאמין בהם." בתמיכת האגף השמרני המאוחד (לאחר פרישת רומני) הצליח האקבי להביך את מקיין ולזכות בניצחונות בהתמודדויות הראשונות אחרי "יום שלישי הגדול", בלואיזיאנה ובקנזס. אך בהמשך זכה מקיין בהתמודדויות ב"מדינות הפוטומק" (וירג'יניה, מרילנד ווושינגטון הבירה), וב-4 במרץ הצליח לאסוף את מספר הצירים הנדרש לזכות בהתמודדות.
המועמד הרפובליקני לנשיאות ארצות הברית.
מקיין נולד באזור תעלת פנמה, אשר היה תחת ריבונות אמריקאית. אילו היה נבחר לנשיאות, היה הופך לנשיא ארצות הברית הראשון שנולד מחוץ לארבעים ושמונה המדינות היבשתיות (כלל המדינות פרט לאלסקה והוואי). הנושא הפך למחלוקת משפטית ציבורית, שכן חוקת ארצות הברית מחייבת את הנשיא להיות אזרח ארצות הברית בלידתו (natural born citizen). אחרי שהעניין היה נתון לביקורת משפטית משתי המפלגות, החלטה לא מחייבת של הסנאט של ארצות הברית, קבעה פה אחד כי מקיין עונה להגדרת "יליד ארצות הברית בלידתו" כבחוקה. לו היה נבחר, היה מקיין נכנס לתפקידו בגיל 72 שנים ו-144 ימים, כנשיא המבוגר ביותר שנכנס אל הבית הלבן.
מקיין התייחס לחששות שהועלו לגבי גילו המתקדם ובעיותיו הבריאותיות מעברו, וציין ב-2005 שהבריאות שלו "במצב מצוין". בשנים שקדמו לבחירתו כמועמד הרפובליקני לנשיאות, טופל מקיין בסוג של סרטן העור הקרוי מלנומה, וניתוח שעבר ב-2000 השאיר צלקת בולטת בצד שמאל של פניו. על פי מומחים עצמאיים מצבו הבריאותי של מקיין היה חיובי והוא לא עבר אירוע רפואי משמעותי בשבע השנים האחרונות. במאי 2008, התיר מטה הבחירות של מקיין לעיתונות לעיין ברשומותיו הרפואיות של מקיין באופן רופף, בהם נכתב כי החלים ממחלת הסרטן, בעל לב תקין וחזק, ובדרך כלל במצב בריאותי טוב.
כאשר הסנאטור ברק אובמה מאילינוי נבחר למועמדה המשוער המפלגה הדמוקרטית לנשיאות בראשית יוני 2008, הציע מקיין לערוך עמו עימותי בחירות בהיכלים עירוניים מקומיים, אך אובמה סירב ודרש לערוך עימותי בחירות מסורתיים לקראת הסתיו. בחודש יולי נערך ארגון מחדש במטה הבחירות של מקיין, וסטיב שמידט נהיה לאסטרטג הראשי ולבעל השליטה המבצעית המלאה על מסע הבחירות. ריק דייוויס נותר כמנהל במסע הבחירות אך הורד בבכירות תפקידו. דייוויס ניהל את מסע הבחירות הנשיאותי של מקיין ב-2000; בשנים 2005 ו-2006 התריעה קהילת המודיעין האמריקאית בפני הסגל של הסנאטור מקיין על חשדותיה לגבי קשרים חשודים שניהל דייוויס עם עמיתיו ברוסיה, אך לא התריעה על תפקודו של דייוויס פעם נוספת. במהלך קיץ 2008, הוביל אובמה בכלליות בסקרים הלאומיים על מקיין בפער דו-ספרתי, והוביל גם במדינות עיקריות אחדות. מקיין הצליח להשיב את תדמית האנדרדוג המוכרת שלו, שהייתה חלק משמעותי מהאתגרים הכלליים שעמדו בפני הרפובליקנים בשנת הבחירות.
ב-29 באוגוסט 2008, חשף מקיין כי מושלת אלסקה, שרה פיילין, תהא עמיתתו למרוץ והמועמדת הרפובליקנית לסגנית נשיא ארצות הברית. מקיין היה המועמד הנשיאותי השני (אחרי וולטר מונדייל ב-1984) לבחור באישה כעמיתתו למרוץ והמועמד הרפובליקני הראשון לעשות כן. ב-3 בספטמבר 2008, מקיין ופיילין הוכרזו כמועמדי המפלגה הרפובליקנית לנשיאות ולסגנות הנשיאות בהתאמה, בכינוס הוועדה הרפובליקנית הלאומית בסיינט פול שבמינסוטה. מקיין זינק בסקרים הלאומיים ועקף את אובמה בעקבות כינוס הוועדה המוצלח, בשעה שפיילין העלתה את שיעור התמיכה הרפובליקני במקיין. עם זאת, החשיפה הראשונית של פיילין לתקשורת הלאומית כמועמדת לסגנית הנשיא הייתה גרועה להפליא. תגובות הבוחרים לפיילין נעשו שליליות יותר ויותר, במיוחד בקרב עצמאים ובוחרים אחרים שהיו מודאגים לגבי כישוריה, ושהטילו דופי וספק ביכולותיה לכהן כפוליטיקאית הראשונה בסדר הירושה של נשיא ארצות הברית.
ב-24 בספטמבר הודיע מקיין כי הוא משהה באופן זמני את מסע הבחירות שלו ואת שיבתו אל הקפיטול כדי להשתתף בגיבוש חוק החירום לייצוב כלכלת ארצות הברית לשנת 2008. הוא קרא לאובמה לחבור אליו והציע לדחות את עימות הבחירות הנשיאותי הראשון עם אובמה, במטרה לדון על חוק החירום לייצוב כלכלת ארצות הברית בפני הקונגרס, שנגרם כתוצאה ממשבר הסאבפריים והמשבר הכלכלי העולמי. התערבותו של מקיין סייעה להעניק לרפובליקנים בבית הנבחרים הזדמנות להציע שינויים בתוכנית הייצוב שהייתה קרובה להסכמה. כיוון שאובמה דחה את הצעת דחיית העימות של מקיין, הסכים מקיין לערוך את העימות כמתוכנן ב-26 בספטמבר לאחר שהתכנסו הוא ואובמה ביוזמת הנשיא ג'ורג' ווקר בוש בעניין ייצוב הכלכלה. עימות בחירות נשיאותי נוסף התקיים ב-7 באוקטובר, וכמו לאחר העימות הראשון קבעו סקרים כי אובמה ניצח בעימות. עימות נשיאותי סופי נערך ב-15 באוקטובר, בו קבעו סקרים כי אובמה ניצח שוב כשמנגד פרשנים קבעו כי מקיין ניצח.
במהלך עימות הבחירות הנשיאותי האחרון ולאחריו, השווה מקיין את מדיניותו המוצעת של אובמה לסוציאליזם, ותיאר את "ג'ו השרברב" כסמל לחלומותיהם של עסקים קטנים ובינוניים בארצות הברית, שיסוכלו במהלך נשיאותו של אובמה. בשעה שמקיין נמנע מלהזכיר את דרשותיו השנויות במחלוקת של הכומר של אובמה ג'רמייה רייט, מטה הבחירות של מקיין תקף לעיתים תכופות את יחסיו של אובמה עם ביל איירס, ממנהיגי מחתרת מזג האוויר. עצרות הבחירות של מקיין נעשו ארסיות יותר ויותר, ותומכיו בעצרות השמיצו את אובמה והביעו רגשות אסלאמופובים ואנטי-אפרו-אמריקאים. במהלך עצרת בחירות במינסוטה, אמרה גייל קווינל, אחת מתומכותיו, שהיא "לא סומכת על אובמה כי הוא ערבי". מקיין השיב כתגובה: "לא גברתי. הוא איש משפחה הגון, אזרח, ואני חולק עליו רק בנושאים עקרוניים". תגובתו של מקיין נחשבה לאחד מן הרגעים העדינים ביותר במסע הבחירות ואף שנים מאוחר יותר נחשבה האמירה כסמן של נימוס בפוליטיקה של ארצות הברית.