עד לתחילת שנות ה-50 הניסיון היחיד כמעט לטעון כי ייתכן שנושאי המטען הגנטי אינם החלבונים שבכרומוזום אלא דווקא חומצות הגרעין, הופיע במאמר משנת 1944 שלא רבים הבחינו בו, של אוסוולד אייברי (Oswald Avery) ואחרים. אייברי, חוקר במכון רוקפלר בניו יורק, פרסם מאמר ביחד עם עמיתיו במגזין לרפואה ניסויית, ובו דיווח על האפשרות של העברת המידע הגנטי באמצעות מולקולת ה-DNA לבדה בבקטריה בשם "Pneumococcus". היו שטענו כנגד מחקרו של אייברי כי מנגנון זה קיים ככל הנראה רק בחיידקים, ושעצם קיומו אינו מצביע על כך שהחומר התורשתי של שאר האורגניזמים נמצא גם הוא ב-DNA, ואולם כאמור, מעטים שמו לב למידע זה והקהילה המדעית הוסיפה להתמקד במחקר החלבונים.
ניסוי נוסף של שני חוקרים, אלפרד הרשי ומרתה צ'ייס (שקרוי היום ניסוי הרשי-צ'ייס), נערך בשנת 1952 והיווה חיזוק לגישה לפיה החומר התורשתי נמצא בחומצות הגרעין הנמצאות בגרעין התא ולא בחלבונים. הרשי וצ'ייס חקרו בקטריופאגים הבנויים הן מחלבונים והן מ-DNA. בניסוי שלהם הם סימנו בסמנים כימיים (איזוטופים של גופרית ושל זרחן) את החלבונים של הבקטריופאגים והן את ה-DNA שלהם. לאחר מכן הניחו להם להדביק אוכלוסייה של חיידקים. בבדיקת אוכלוסיית החיידקים המודבקת התגלה כי החלבונים נשארו מחוץ לתאים שהודבקו ואילו ה-DNA נמצא בתוכם, דבר שאישש את המסקנה כי ה-DNA מהווה את החומר התורשתי, שכן הוא החומר שחדר לתא הפונדקאי על מנת להדביק אותו.
בסוף שנות ה-40 של המאה העשרים הבחין ארווין צ'רגף, מדען יהודי שפעל באוניברסיטת קולומביה, כי ה-DNA של כל תא בכל אורגניזם מכיל כמות גואנין שווה לכמות הציטוזין וכמות אדנין השווה לכמות התימין.
הוא גם שם לב לכך שהתפלגות סוגי הבסיסים שונה מעט מאורגניזם לאורגניזם. הבחנות אלה נודעו כחוקי צ'רגף. החוקים חיזקו את הרעיון כי החומר הגנטי הוא ה-DNA, לאור השונות שהוא יכול לגלות בין אורגניזמים. השוויון בין בסיסי פירימידין ופורין רמז על מבנה של זוגות.
גילוי תפקיד ומבנה ה-DNA.
DNA התגלה לראשונה על ידי פרידריך מישר בשנת 1869 אך נזנח מבחינה מחקרית מכיוון שהתפיסה המדעית המקובלת באותה תקופה הייתה שחלבונים משמשים כחומר התורשתי. בשנת 1944 התפרסם ניסוי איוורי-מקלאוד-מקארתי, המראה כי DNA מסוגל להעביר תכונות ביולוגיות בין חיידקים. בשנת 1953 ג'יימס ווטסון ופרנסיס קריק פרסמו את מודל הסליל כפול, המתבסס על פענוח תצלום קריסטלוגרפיה בקרני רנטגן של מבנה ה-DNA שנעשה על ידי רוזלינד פרנקלין. לפי מודל זה, DNA מורכב מסליל כפול המחובר בקשרי מימן בין זוגות הנוקליאוטידים. מבנה זה מאפשר השלמת סליל אחד מתוך רצף הסליל הנגדי, מה שמאפשר את העברת המידע במלואו בתורשה.
התשתית לפענוח רצף חומצות האמינו של חלבון הונח על ידי פרדריק סנגר, שהצליח לפענח בשנת 1955 את רצף חומצות האמינו המרכיבות אינסולין. גילוי זה הוכיח בצורה חד משמעית שחלבונים מורכבים מישויות כימיות בעלות תכונות מולקולריות מסוימות, ולא מתמהיל אקראי של חומרים, ואתגר את הביולוגים למצוא את התבנית שקובעת איך מרצף ה-DNA נוצרים חלבונים. פרנסיס קריק השתתף בסוף שנת 1954 בסדרת הרצאות שהעביר פרדריק סנגר, שלאחריהן פיתח את הדוֹגמה המרכזית של הביולוגיה המולקולרית, אותה פרסם בשנת 1958. לפי דוֹגמה זו, DNA יוצר חלבונים באמצעות RNA.
שיטות ריצוף מוקדמות.
השיטה הראשונה לפענוח רצף DNA פותחה על ידי ריי וו באוניברסיטת קורנל בשנת 1970. שיטה זו התבססה על הארכת תחל וסימון נוקליאוטידים, עקרונות העומדים בבסיס שיטות ריצוף רבות. באמצעות שיטה זו הצליח לרצף חלק מהגנום של בקטריופאג' למדא, ובמשך שלוש השנים הבאות הראה וו יחד עם עמיתיו ששיטה זו ניתנת ליישום על כל רצף DNA שניתן לתכנן לו תחל ספציפי. סנגר שיכלל אסטרטגיה זו והצליח לקצר משמעותית את התהליך, ופרסם את שיטתו בשנת 1977. עם זאת, שיטת סנגר מוגבלת לאורך של מאות בסיסים. שיטה נוספת פותחה על ידי וולטר גילברט ואלן מקסם באוניברסיטת הרווארד, המתבססת על דגרדציה כימית.
ריצוף גנומים שלמים ופיתוח מכונות ריצוף.
הגנום הראשון שרוצף במלואו הוא של הבקטריופאג' ΦX174 בשנת 1977, באורך של 5,386 זוגות בסיסים. בשנת 1984 חוקרים פרסמו את רצף ה-DNA של נגיף אפשטיין-בר, באורך כולל של 172,282 זוגות בסיסים. זוהי נקודת ציון חשובה מכיוון שלחוקרים לא היה שום ידע מוקדם על תוכן רצף ה-DNA של הנגיף. כדי לרצף מקטעים ארוכים, פותחה שיטת ה-Shotgun sequencing, שבה המקטע הארוך מחולק באופן אקראי למקטעים קצרים, ולאחר מכן נעשה שימוש בחלקים חופפים כדי להרכיב מחדש את המקטע הארוך.
בראשית שנות ה-80 של המאה ה-20 הרברט פול ועמיתים פיתחו שיטה שאינה משתמשת בחומרים רדיואקטיביים כדי להעביר תגובות ריצוף למטריצה מקובעת במהלך אלקטרופורזה. התפתחות זו אפשרה לחברת GATC ביוטק לייצר את מכונת הריצוף הראשונה, ששימשה לפענוח רצף כרומוזום II של שמר האפייה. בשנת 1986 לירוי הוד מהמכון הטכנולוגי של קליפורניה הכריז על מכונת ריצוף חצי אוטומטית, ושנה לאחר מכן חברת Applied Biosystems השיקה מכונת ריצוף אוטומטית לחלוטין. בשנה זו חברת דופונט הפיצה מכונת ריצוף שבה נעשה שימוש בסמן פלואורסצנטי כדי להבדיל בין ארבעת הנוקליאוטידים כך שניתן להפריד ביניהם ביתר קלות. באמצעות כלים אלו המכונים הלאומיים לבריאות החלו לרצף גנומים של יצורים שונים, ובהם "Escherichia coli", "Caenorhabditis elegans", מיקופלזמה, ושמר האפייה, בעלות של 0.75$ לנוקליאוטיד. במקביל, במעבדתו של קרייג ונטר ריצפו את ה-cDNA האנושי כדי לגלות את חלקי הגנום שעוברים שיעתוק. בשנת 1995 ונטר, המילטון או. סמית' ועמיתים פרסמו את הגנום הראשון השלם של יצור – החיידק "Haemophilus influenzae". הגנום המעגלי שלו מכיל 1,830,137 זוגות בסיסים. שיטות אלו שימשו גם בסיס לפרויקט גנום האדם.
המעבר לשיטות ריצוף מהדור החדש.
במהלך שנות ה-90 של המאה ה-20 פותחו שיטות נוספות לריצוף DNA, שהוטמעו במכונות ריצוף שונות. שיטות אלו נקראו שיטות ריצוף מהדור החדש (next-generation sequencing), הידוע בקיצור NGS, כדי לבדל אותן מהשיטות המוקדמות. בשיטות אלו ניתן לרצף גנום שלם בהרצה בודדת, לרוב באמצעות חלוקתו למקטעים קצרים אשר מרוצפים במקביל במכונת ריצוף. בתקופה זו התפתחה גם שיטה נוספת לזיהוי רמות ביטוי של גנים, הנקראת מערך DNA, ומתבססת על עיצוב שבב עם מקטעי DNA חד-גדיליים, ומדידת עוצמת פלואורסצנציה הנוצרת מיצירת דו-גדיל בין ה-DNA בשבב ל-DNA אותו מוסיפים.
בשנת 1996 פותחה שיטת ריצוף המתבססת על זיהוי של שחרור פירופוספט בעת הוספת נוקליאוטיד; השיטה, שנקראת Pyrosequencing, פותחה על ידי מוסטפא רונגי ופל ניירן במכון המלכותי לטכנולוגיה בסטוקהולם. בשנת 1997 פסקל מאייר ולורן פרנילי רשמו פטנט על טכנולוגיה להכנת DNA לריצוף בתפוקה גבוהה, כולל שלב של הגברת מקטעי DNA על גבי שבב. פטנט זה, יחד עם שיטה נוספת שפותחה על ידי רוג'ר טסיין משמשת כבסיס לשיטות ריצוף בתפוקה גבוהה של חברת אילומינה.
הזמינות של שיטות לריצוף בתפוקה גבוהה מאיצה את עידן הרפואה המותאמת אישית. עם זאת, יש להתאים כלים חישוביים כדי להתמודד עם כמויות המידע המתקבלות משיטות אלו.
שיטות בסיסיות לריצוף.
שיטת מקסם-גילברט.
שיטה זו דורשת סימון רדיואקטיבי בקצה 5' של ה-DNA. ארבעה טיפולים כימיים שונים במולקולה גורמים ליצירת שברים מסוימים ב-DNA (G, A+G, C, C+T), אשר מטופלים בריכוז כזה שיגרום שבר אחר פר מולקולת DNA. כך נוצרת ספרייה של מקטעי DNA באורכים משתנים, החל מהקצה המסומן. על ידי הפרדת המקטעים באמצעות הרצה בג'ל אלקטרופורזה, ניתן להסיק את זהות הבסיס בכל עמדה. מורכבות השיטה והשימוש בחומרים רדיואקטיביים, יחד עם התפתחות שיטות ריצוף אחרות צמצמה את השימוש בשיטת ריצוף זו.
שיטת סנגר.
שיטת ריצוף ה-DNA הנפוצה ביותר היא השיטה שפותחה על ידי פרדריק סנגר בשנת 1975 ושוכללה ב-1977. על פיתוח השיטה והשימוש בה, זכה סנגר בפרס נובל שני בכימיה בשנת 1980. בשיטה זו משתמשים בפריימרים (תחלים) המתאימים לרצף DNA הצמוד לקטע אותו רוצים לרצף, ובאנזים DNA פולימראז, המשמש להארכת התחל ליצירת רצף משלים לקטע ה-DNA. בנוסף, יש לספק לתגובה האנזימטית גם dNTPs מארבעת הסוגים (אדנין (A), גואנין (G), תימין (T) וציטוזין (C)). מבצעים ארבע תגובות מקבילות שלכל אחת מהן מספקים גם ddNTP אחד (C, T, A או G) בו יש מימן (במקום הידרוקסיל) גם בעמדה '3 בנוסף לעמדה '2. שילוב של ddNTP ברצף ה-DNA המסונתז במבחנה מביא לעצירת הפולימריזציה. כך, מתקבלים מגוון רצפים שנקטעו באורכים שונים. הרצת תוצרי התגובות האנזימטיות בג'ל אגרוז בעל יכולת הפרדה של נוקלאוטיד אחד מספקת את הרצף. בכל מבחנה יהיו תוצרים שאורכם הוא המרחק מהתחל ועד הבסיס/הנוקלאוטיד המסוים שהוסף לאותה תגובה בתור ddNTP.
בשיטה זו יש פחות שימוש בחומרים מסוכנים וברדיואקטיביות, והיא נחשבת פשוטה יותר משיטת מקסם-גילברט. לכן מכונות הריצוף הראשונות שפותחו התבססו על שיטה זו. במהלך השנים פותחו שיכלולים רבים לשיטת הריצוף לפי סנגר, כגון שימוש בסימון פלאורוסנטי, אלקטרופורזה קפילרית, ואוטומציה של שלבים רבים. שיפורים אלו הפכו את תהליך הריצוף למהיר יותר וגם הורידו את מחירו, מ-100,000,000$ לריצוף גנום האדם בשנת 2001 ועד 1,000$~ בשנת 2020.
שיטות מהדור החדש לריצוף בתפוקה גבוהה.