עם הזמן החליט חתושיליש השלישי להעביר את המלכות לתודחליאש על אף שלא היה היורש הטבעי לכס המלכות. עם עלייתו לשלטון קידם תודחליאש הרביעי את היחסים הדיפלומטיים החמים עם קוּרוּנְתַש (בנו הנוסף של מוותליש השני) לבקשת אביו, אשר המשיך למשול על העיר תַרְחוּנְתַשַש (העיר טרם נחשפה). תודחליאש אף יצר טבלאות נחושת אשר עליהן נרשם הסכם הידידות בין השניים.
תקופתו של תודחליאש הרביעי התברכה בזכות תנופת הבנייה הנרחבת ברחבי הממלכה כגון, הכשרת המבצר המלכותי בלב העיר חתושש.
אך הפרויקטים הנודעים מכל אשר הותיר אחריו תודחליאש הרביעי היו בניית מערכת של 13 סכרים כתשובה מיידית לבצורת הכבדה שפקדה את הממלכה. אחד מהסכרים הללו נשמר בצורה די טובה ועומד עד ימינו בסמוך לעיירה הטורקית אלג'ה, מקומו של האתר הארכאולוגי אַלַג'הויוק, וסיום בניית מקדש הסלע שביַאזִילִיקַאיָה (המרוחקת שני ק"מ מחתושש). מקדש הסלע מהווה בפני עצמו אתר יוצא דופן מפני שהוא בנוי משתי אכסדרות טבעיות שדפנותיהן מכוסות בתבליטים המציגים 71 אלים מתוך פנתיאון האלים החתי.
תספיג חלבון
תספיג חלבון (באנגלית: Western blot; נקרא לעיתים גם אימונו-בלוט) היא שיטה לזיהוי חלבון מסוים בתערובת חלבונים על ידי הפרדתם על גבי ג'ל לפי משקל מולקולרי או לפי מטען חשמלי ומבנה מרחבי. גילוי החלבון נעשה על ידי נוגדן ייחודי לחלבון המטרה על גבי קרום ניטרוצלולוזה.
תספיג חלבון (בישראל נפוץ הכינוי "וסטרן בלוט") היא שיטה המשמשת בתחומים שונים של המחקר ביולוגי: ביוכימיה, ביולוגיה מולקולרית וגנטיקה.
השיטה הומצאה במעבדתו של ג'ורג' סטרק מאוניברסיטת סטנפורד וקיבלה את שמה מניל בורנט כמשחק מילים לשיטת "סאת'רן בלוט" (תספיג DNA, שנקרא על שם ממציאו Edwin Southern) ו-"נורת'ן בלוט" (תספיג RNA).
מבוא.
תספיג חלבון הוא שיטה לזיהוי חלבון מטרה בדוגמת חלבונים המופקת ממקורות מומסים שונים כגון נוזלים מן החי (סרום, פלזמה, שתן וכדומה) או ממבנים מן החי שעברו הומוגניזציה לשחרור הנוזלים הכלואים בהם (איברים בבעלי חיים, תאים מתרבית רקמה או מנוזלים ביולוגים וחיידקים).
לפי שיטה זו החלבונים מופרדים על גבי ג'ל באלקטרופורזה בהתאם למשקלם המולקולרי (בג'ל מצמית) או בהתאם למטענם החשמלי והמבנה המרחבי שלהם (בג'ל לא מצמית או תם). לאחר מכן מועברים החלבונים לקרום ניטרוצלולוזה או (PVDF (polyvinylidene difluoride על ידי הפעלת כוח חשמלי. גלוי החלבון נעשה על ידי נוגדן ייחודי לחלבון המטרה. הנוגדן מאפשר את גילוי החלבון על ידי תגובה כימית.
הטרחה הכרוכה בשיטה זו מונעת שימש בה בבדיקות רפואיות שגרתיות והיא משמשת בעיקר במחקרים רפואיים. גילוי חלבונים למטרות רפואיות קליניות נעשה בעיקר בשיטת ELISA.
הכנת הדוגמה.
דוגמאות חלבונים הנבדקות בתספיג חלבון חייבות להיות מומסות בנוזל מימי. נוזל המכיל חלקיקים בלתי מסיסים ייצור עיוותים בתוצאה. יש מספר שיטות להכנת הדוגמה המסיסה בהתאם למקור הדוגמה:
חלבונים שמקורם בנוזלים ביולוגים.
אין צורך למצות חלבונים הנמצאים בנוזלים ביולוגים כך שהם זמינים לשימוש, עם זאת נוזלים ביולוגים מכילים לעיתים קרובות מרכיבים בלתי מסיסים, כך סרום או פלזמה מכילים תאי דם, שתן מכיל חיידקים ומדיום גידול מתרבית רקמה מכיל שברי תאים. כדי להיפטר מחלקיקים אלו ניתן לסרכז את הדוגמה, לרוב סרכוז בעצמה של 12,000g למשך 10 דקות מאפשר את השקעת רוב החלקיקים הבלתי מסיסים. אפשרות נוספת להוצאת חלקיקים בלתי מסיסים היא על ידי סינון עם מסנן בעל פתחים של 0.45 או 0.2 מיקרון. סינון מאפשר גם הוצאת חלקיקים קטנים כמו וירוסים שאינם שוקעים בסרכוז בתנאים רגילים או חלקיקים המכילים אלמנטים שומניים ולכן אינם שוקעים בסרכוז כלל.
לעיתים דוגמאות חלבונים המופקות מנוזלים ביולוגים הן דלילות מדי לגילוי בווסטרן בלוט. על מנת להתגבר על בעיה זאת ניתן לרכז הנוזל בצנטריקון או בהשקעה על ידי מלחים קלי תמס כגון אמוניום סולפט.
חלבונים שמקורם בתאים.
כדי לבחון חלבונים מתאים יש למצות את החלבונים מן התאים. בכל השיטות, ראשית, יש להוציא את הנוזל בו גדלו התאים: בתאים הגדלים בתרבית ניתן לשטוף את מדיום הגידול בתמיסה פיזיולוגית, תאי דם, מח עצם או תרבית ברקמה של תאים שאינם נדבקים למצע ניתן לבודד בסרכוז ואז לשטוף בתמיסה פיזיולוגית (לדם חשוב להוסיף נוגדי קרישה כדי למנוע את קרישת התאים). בדם ניתן להפריד את אוכלוסיות התאים השונות מן הסרום ואחת מן השנייה על ידי פיקול, (Ficoll) וכך לבודד את האוכלוסייה הרצויה.
לאחר בידוד וניקוי התאים הרצויים ניתן לפוצץ אותם במספר שיטות:
לאחר קריעת ממברנת התא יש לסרכז את הליזט הנוצר על מנת להפריד את הפזה המסיסה מן הפזה הבלתי מסיסה. רק הפזה המסיסה משמשת לווסטרן בלוט.
ניתן להשתמש בצירוף של מספר שיטות שונות על מנת לבודד חלבונים מאברונים שונים בתא, לדוגמה בידוד חלבונים ציטופלזמטיים נעשה על ידי שימוש בדטרגנט בריכוז נמוך ותמיסה איזוטונית. לבידוד חלבונים מגרעין התא יש לבודד תחילה את החלבונים הציטוזמטיים ולאחר מכן לקרוע את ממברנת הגרעין על ידי תמיסה היפוטונית וגלי אולטרה סאונד או הקפאה-הפשרה.
חלבונים שמקורם ברקמה.
על מנת לבודד חלבונים מאיבר או מצמחים יש לכתוש את הרקמה בהומוגנייזר חשמלי או בעזרת מכתש ועלי (לרוב בנוכחות בופר וגרגרים קשיחים, כגון חול מעוקר). את הדוגמה יש לסרכז כדי לבודד את הפזה המסיסה.
הפרדת חלבונים באלקטרופורזה.
ניתן להפריד חלבונים על פי גודל, מבנה, נקודה איזואלקטרית ושילוב של הגורמים השונים. אופי ההפרדה תלוי בטיפול בחלבונים לפני הפרדה ובמרכיבי הג'ל.
טיפול בחלבונים לפני ההפרדה.
לדוגמת החלבונים מוסיפים בופר המכיל יונים לשמירה על חומציות ומלחיות מתאימה, גליצרול המקל על שקיעת החלבונים על הג'ל, וצבע (לרוב ברומופנול בלו) המאפשר מעקב אחרי קצב התקדמות ההפרדה בג'ל. בג'לים דנטורטיבים - ג'לים בהם נבדק גודל החלבון, יש להוסיף חומר הגורם לדנטורציה של החלבונים על ידי פתיחת המבנה המרחבי שלהם, קיפולם מחדש למבנים גלובולריים אחידים, וטעינת פני השטח שלהם במטען חשמלי שלילי, כל זאת כדי להקל ולאפשר אחידות בתנועה על הג'ל לכוון הקתודה, כך שהפרמטר היחיד שישפיע באופן משמעותי על מהירות תנועתם בג'ל יהיה משקלם המולקולרי (ולא צורתם המרחבית או מטענם החשמלי). לרוב, למטרות אלו נעשה שימוש ב-SDS (סודיום דודציל סולפט). כדי לפרק את הקשרים הדי-סולפידים שבחלבונים מוסיפים לדוגמה גם חומר מחזר. תהליך החיזור נחוץ לשם הפרדת חלבונים פולימרים לשרשראות החלבוניות (תת-היחידות) המרכיבות אותם, וכן לפירוק הקשרים הדי-סולפידיים המייצבים את המבנה השלישוני של החלבון. החומר המחזר הוא לרוב בטא מרקפטו אתנול, , או שילוב של שניהם. יש להרתיח את הדוגמה למספר דקות ולצננה במהירות מייד לאחר מכן, כדי להבטיח את יעילות הדנטורציה והחיזור.
תהליך ההפרדה באלקטרופורזה.
הג'לים המקובלים ביותר מבוססים הפולימר פולי-אקריל אמיד. ג'לים אלו מורכבים ממים ומבופר (לרוב בופר Tris ב-pH 8.8, תערובת של אקרילאמיד וביס-אקריל אמיד (ביס אקריל אמיד גורם להסתעפות הפולימר ובכך מחזק את הג'ל). אחוז האקרילאמיד בג'ל קובע את צמיגותו ולכן קובע אלו חלבונים ניתן יהיה להפריד בעזרתו - חלבונים קטנים (בגודל 5 עד 30 אלף דלטון) מומלץ להפריד בג'לים בריכוז 12% אקרילאמיד, בעוד חלבונים גדולים (מעל 200 אלף דלתון) מופרדים טוב ביותר בג'ל בריכוז 7% אקרילאמיד. כדי שהאקרילאמיד ייקרש לפולימר פולי-אקריל אמיד, יש להוסיף אמוניום פר-סולפט (APS) ו-Tetramethylethylenediamine, המכונה לרוב TEMED. שני חומרים אלו גורמים ליצירת רדיקלים חופשיים ובעקבות זאת לתגובת הפולימריזציה.
כדי ליצור ג'ל דנטורטיבי יש להוסיף לג'ל את הדטרגנט SDS, המשחק תפקיד דומה כמו בטיפול בחלבונים לפני ההפרדה: הוא הנקשר לפפטידים למניעת יצירת קשרים בין מולקולארים ביניהם, ומקנה לחלבונים מעטפת של מטען חשמלי שלילי, המאפשרת לו לנוע בהתאם למתח החשמלי המושרה משני צידי הג'ל.
דוגמאות החלבונים מוטענות לתוך בארות שנמצאות בג'ל, הבארות בג'ל דנטורטיבי נמצאות האזור המכיל ג'ל הטענה: ג'ל בצפיפות נמוכה (בסביבות 4% אקריל אמיד) המאפשר לכל החלבונים להגיע לאותה נקודת התחלה. לאחר שהחלבונים יוצאים מג'ל ההטענה עם נכנסים לג'ל ההפרדה (הג'ל התחתון) שם הם מופרדים לפי משקל. לרוב, פרט לדוגמאות החלבונים הנבדקות, באחת הבארות נעשה גם שימוש מרקר (סמן). המרקר מורכב מתערובת של חלבונים צבועים שמשקלם ידוע, על פי המרקר ניתן לקבוע את גודלו של החלבון שהתגלה.
הג'ל מוכנס לתמיסה המעבירה מתח חשמלי (לרוב תמיסה המכילה Tris ו-SDS), כאשר מופעל מתח חשמלי על דוגמת החלבונים, החלבונים נעים לכיוון האלקטרודה החיובית כאשר החלבונים הקטנים נעים בג'ל מהר יותר מן גדולים והכבדים.
ג'ל דו ממדי (2D Gel).
שיטה מקובלת פחות להפרדת חלבונים היא על ידי ג'ל דו-ממדי. בשיטה זו, דוגמאות החלבונים מוטענות תחילה על ג'ל לא דנטורטיבי, בהפרדה זאת מופרדים החלבונים לפי מטענם החשמלי. לאחר מכן מונחים החלבונים המופרדים על גבי ג'ל דנטורטיבי בזווית של 90 מעלות ומופרדים בהתאם למשקלם המולקולרי.
טרנספר (העברת חלבונים).