בשנת 2001 החל מקיין להתנגד לבוש תוך נקיטת עמדות נגד ממשלו בנושאים אחדים. בינואר 2001 נכנס "חוק מקיין-פיינגולד" לישורת האחרונה בסנאט האמריקאי; החוק זכה להתנגדות מצד בוש ורוב הממסד הרפובליקני, אך בעקבות תוצאות הבחירות לקונגרס של ארצות הברית ב-2000, החוק עבר את הדיונים בסנאט בעת ובעונה אחת עד שמכשולים פרוצדורליים עיכבו את החוק שוב. במאי 2001, הצביע מקיין נגד רפורמת קיצוצי המס הראשונה של בוש. מקיין נמנה בין שני הרפובליקנים היחידים (השני היה לינקולן צ'ייפי) שהצביעו נגד הרפורמה.
כאשר הסנאטור הרפובליקני ג'ים ג'פורדס מורמונט עזב את המפלגה הרפובליקנית ונהיה לסנאטור עצמאי, והשליטה בסנאט עברה מידי הרפובליקנים לדמוקרטים, גונן מקיין על ג'פורדס. באותה התקופה החלו להתפרסם השערות כי גם מקיין עשוי לעזוב את שורות המפלגה הרפובליקנית ולהיהפך לסנאטור עצמאי במחצית הראשונה של שנת 2001. באותה תקופה היה למפלגה הרפובליקנית רוב בסנאט ביחס של 49–51, ומקיין היה נמנה בין שלושה רפובליקנים שהיה קיים חשש לגביהם שיהפכו לעצמאים ובכך יערערו את מאזן הכוחות בסנאט, לצד ג'פורדס ולינקולן צ'ייפי. מקיין תמיד הכחיש בתוקף את ההשערות לפיהן יעזוב את המפלגה הרפובליקנית כעצמאי, אם כי הודה כי רעיון זה עבר בראשו לא פעם. מכל מקום, הדיון הציבורי סביב הישארותו של מקיין רפובליקני היווה עילה למבקריו השמרנים באריזונה לארגן נגדו עצרות מחאה במאי וביוני 2001.
פיגועי 11 בספטמבר ולאחריהם.
פיגועי 11 בספטמבר היו נקודת מפנה ביחסי בוש-מקיין. במהלך הפיגועים, שבוצעו ב-11 בספטמבר 2001, מקיין שהה במשרדו שבקפיטול. לאחר שפונה מהקפיטול אל אזור אחר בוושינגטון הבירה, הופיע מקיין שבע עשרה פעמים בכלי התקשורת הלאומיים ובאריזונה כדי להגיב על ההתקפות. בימים שלאחר מכן, נהפך לאחד קולות ההנהגה הבולטים ביותר בארצות הברית, באומרו: "אם יש דבר שעל האמריקאים לדעת, זה שזה יהיה מאבק ארוך ... האמריקאים התרגלו לניצחונות מהירים. לא נקלענו למאבק ממושך שכזה מאז מלחמת וייטנאם". מקיין הצביע בעד חוק הפטריוט של בוש באוקטובר 2001. מקיין נהפך לתומך נלהב של בוש ודגל בשימוש באמצעים צבאיים נגד האחראים למלחמת אפגניסטן. לאחר שדגל בגישה חריפה נגד שלטון הטליבאן באפגניסטן, כולל שימוש בכוחות קרקע צבאיים, סיכם את מאמרו בוול סטריט ג'ורנל: "מלחמה היא עסק אומלל, בואו נעבור את זה כבר". יחד הסנאטור הדמוקרטי ג'ו ליברמן ניסחו את החוק שייסד את הוועדה לחקר אירועי 11 בספטמבר, בעוד הוא והסנאטור פריץ הולינגס נתנו את חסותם ל"חוק אבטחת התעופה והתעבורה", אשר הקים את רשות אבטחת התעבורה של ארצות הברית (TSA). ב-18 באוקטובר 2001 אמר מקיין בתוכנית האירוח "הלייט שואו עם דייוויד לטרמן" כי "ישנה אינדיקציה מסוימת, ואין לי את המסקנות, שמוצאה של מחלת הגחלת שהגיעה אלינו אולי - בדגש על אולי - מעיראק". להצהרה זו ניתן פומבי פחות משבוע לפני סדרת תחקירים של רשת הטלוויזיה ABC לפיהן דגימות ממתקפת האנתרקס מצביעות על כך שהן קשורות באופן ייחודי לעיראק.
חוק מקיין-פיינגולד המשיך להתעכב בגלל פיגועי 11 בספטמבר וההתאוששות מהם. לבסוף, במרץ 2002, בסיוע השפעותיה של שערוריית אנרון, עבר החוק בבית הנבחרים ובסנאט, ובאורח רשמי קרוי "החוק הדו-מפלגתי לרפורמה במימון בחירות". באותו היום חתם הנשיא בוש על החוק. בוש סירב לערוך את טקס החתימה על החוק בגן הוורדים של הבית הלבן, ולא רצה לתת להצלחה של מקיין במה ציבורית. אף על פי כן, החוק הוא החקיקה המוצלחת ביותר של מקיין. לדברי פול אלכסנדר, שכתב ביוגרפיה אודות מקיין ב-2002: "החוק הוא מהמפורסמים ביותר בתחום החקיקה הפדרלית בהיסטוריה הפוליטית-מודרנית של ארצות הברית".
בינתיים, בדיונים הציבוריים על הפעולה הצבאית האפשרית של ארצות הברית נגד עיראק, היה מקיין תומך נלהב בעמדתו של בוש, ותיאר את סדאם חוסיין כ"עריץ בעל שיגעון גדלות, אשר אכזריותו ופגיעתו בנורמות הציוויליזציה ידועות לשמצה". לאחר שהצהיר באופן חד-משמעי כי הוא מאמין שלעיראק נשק להשמדה המונית, אמר מקיין כי עיראק היא "סכנה נוכחית וברורה לארצות הברית". לפיכך, באוקטובר 2002 הצביע בעד "החלטת עיראק" (Iraq Resolution). טרם מלחמת עיראק ומיד לאחר מכן, הסכים מקיין עם טענות ממשל בוש כי הכוחות המזוינים של ארצות הברית הם המושיעים של העם העיראקי.
בחודש מאי 2003 הצביע מקיין נגד רפורמת קיצוצי המס השנייה של בוש, שאפשר את הארכתה והאצתה של רפורמת הקיצוצים הראשונה (אשר הצביע גם נגדה), ואמר כי אין זה נכון בזמן מלחמה. בנובמבר 2003, לאחר שנסע לעיראק, תהה מקיין בפומבי על טיפולו של מזכיר ההגנה של ארצות הברית דונלד רמספלד בכל הנוגע למלחמה שמנהלת ארצות הברית בשלט רחוק בעיראק, ואמר כי "כל המגמות נמצאות בכיוון הלא נכון" ושיש צורך יותר במספר גדול יותר של חיילים אמריקאים כדי להתמודד עם המצב המתדרדר במשולש הסוני. בדצמבר 2004, מקיין הכריז כי איבד כל אמון ברמספלד. בתחום ההתחממות העולמית פעל כנגד מדיניות ממשל בוש, כאשר יחד עם ג'ו ליברמן ניסה מאז 2003, ללא הצלחה, לחוקק חוקים שיטילו מכסות מרביות לפליטת גזי חממה.
הבחירות לנשיאות ארצות הברית 2004.
במהלך הבחירות לנשיאות ארצות הברית 2004 שוב עלה שמו של מקיין כמועמד אפשרי לתפקיד סגן נשיא ארצות הברית, רק הפעם כעמיתו למרוץ של המועמד הדמוקרטי, הסנאטור ג'ון קרי ממסצ'וסטס. קרי ומקיין היו קרובים מאוד מאז עבודתם המשותפת בשנות ה-90 של המאה ה-20 בוועדה המיוחדת של הסנאט לענייני שבויי מלחמה וחיילים נעדרים במלחמת ווייטנאם, והשילוב בין שני הסנאטורים הקסים את הבוחרים העצמאיים. גם הסקרים שבחנו האם זוג נשיאותי המורכב מקרי ומקיין יצליח להיבחר ביססו את תמיכתם של העצמאיים. דומה היה כי מקיין אכן לא פסל את האפשרות בריאיון עיתונאי שנערך במרץ 2004, אך המטה שלו דחה את האפשרות שעות לאחר מכן. ביוני 2004 דווח כי קרי הציע למקיין באורח רשמי להיות עמיתו למרוץ אך מקיין מיאן לבקשתו. לשכתו של מקיין הכחישה אף היא באורח רשמי כי מטהו של קרי הציע למקיין את תפקיד סגן הנשיא. בכינוס הוועדה הרפובליקנית הלאומית לשנת 2004 תמך מקיין בנלהבות במועמדותו של הנשיא בוש לכהונה שנייה כנשיא, ושיבח את טיפולו של בוש במלחמה העולמית בטרור מאז פיגועי 11 בספטמבר.
באותה השנה עמד מקיין לבחירה מחדש לסנאט. חבר בית הנבחרים של ארצות הברית ג'ף פלייק נחשב למועמד רפובליקני אפשרי נגדי למקיין. סטיבן מור, נשיא המועדון לצמיחה כלכלית, הוביל את הדיון הציבורי על מועמדותו האפשרית של פלייק וציין כי "החברים במועדון שלנו מתעבים את ג'ון מקיין". פלייק החליט בסופו של דבר שלא להציג מועמדותו. בבחירות הכלליות לסנאט באריזונה זכה מקיין ב-77% מקולות הבוחרים והביס את המועמד הדמוקרטי סטיוארט סטרקי, מורה למתמטיקה בכיתה ח'.
אחרי מסע הבחירות לנשיאות שערך ב-2000, הופיע מקיין פעמים רבות בתוכניות בידור בטלוויזיה ואף בקולנוע, במספר שעלה יותר ויותר לאחר הבחירות הנשיאותיות ב-2004. ב-12 באוקטובר 2004 התארח בפרק של סאטרדיי נייט לייב, והיה לסנאטור השלישי שמתארח בתוכנית הפופולרית לאחר פול סיימון וג'ורג' מקגוורן.
הקונגרס ה-109 (2005-2007).
במאי 2005 הוביל מקיין את "כנופיית הארבע עשר" בסנאט (שכללה 7 סנאטורים מכל מפלגה, בהם מרי לנדרו, סוזן קולינס, לינדזי גרהאם, קן סלזאר, מייק דה ויין, דניאל אינווי, אולימפיה סנואו, רוברט בירד, לינקולן צ'ייפי וג'ו ליברמן), אשר פישרה מחלוקות תוך ניצול זכותם של חברי הסנאט של ארצות הברית לבצע פיליבסטר בדיונים על מינוי שופטים פדרליים, אך ורק ב"נסיבות יוצאות-דופן". הפשרות שהובילה הכנופיה ערערו את השימוש במנהג הפיליבסטר. רפובליקנים אחדים נותרו מאוכזבים מכך שהפשרות הללו לא באו במקום פיליבסטרים אחרים על מועמדים לתפקידי שופטים. מתוקף תפקידו כ"מנהיג" הכנופיה, מקיין הכריע באמצעותה את מינויים של ג'ון רוברטס וסמואל אליטו, וכינה אותם "שניים מהשופטים המשובחים ביותר שמונו אי פעם לבית המשפט העליון של ארצות הברית".
בניגוד להצבעותיו ב-2001 וב-2003, תמך מקיין בהארכת קיצוצי המס של בוש במאי 2006, באומרו כי אם לא יתמוך בהארכה, ייתן יד להגדלת שיעור המס. יחד עם הסנאטור הדמוקרטי טד קנדי, מקיין היה תומך נלהב ברפורמה מקיפה בתחום ההגירה לארצות הברית, אשר כללה בין היתר תוכניות למהגרי עבודה ואכיפת בקרת גבולות. בסופו של דבר "חוק הגנת אמריקה והגירה מבוקרת" לא עבר ב-2005, ואילו חוק ההגירה הממלכתי מ-2006 עבר בסנאט במאי 2006 אך לא בבית הנבחרים של ארצות הברית. ביוני 2007, קידם הנשיא בוש בתמיכתם של מקיין ואחרים חקיקה בקונגרס שתאפשר לו לתת את אשרות העבודה שרצה לספק למהגרים שבארצות הברית, ומצד שני להגדיל עוד יותר את תקציב משטרת הגבולות. הצעת החוק (Comprehensive Immigration Reform Act of 2007) קודמה כיוזמה דו-מפלגתית.
מסע הבחירות לנשיאות (2008).
הבחירות המקדימות במפלגה הרפובליקנית.
מקיין הודיע ​​רשמית על כוונתו להתמודד לתפקיד נשיא ארצות הברית מטעם המפלגה הרפובליקנית ב-25 באפריל 2007 בפורטסמות' שבניו המפשייר, אם כי כבר הצהיר על כוונתו להתמודד כבר חודש טרם ההכרזה הרשמית בתוכניתו של דייוויד לטרמן. הוא אמר: "אני יודע להילחם - אך גם לעשות שלום. אני יודע מי אני - ומה אני רוצה לעשות", אמר מקיין בנאום. "עומדים בפנינו אתגרים - אך איני חושש מהם. אני מוכן לקראתם".