בשנת 1903 החלה בניית המסילה בין חיפה לדרעא. האתגר הגדול ביותר שהוצב בפני הבונים היה קטע המסילה מצמח לדרעא לאורך נהר הירמוך. אורכו של קטע זה היה 73 קילומטרים והפרש הגבהים בין קצוותיו 529 מטרים. לאורך קטע זה נכרו 8 מנהרות באורך כולל של 1,100 מטרים ונבנו 329 גשרים ומעבירי מים. הקושי בהנחת המסילה בתוואי הירמוך האמיר את עלותה של השלוחה החדשה בעשרות אחוזים. לשם ההשוואה, עלותו של קילומטר מסילה בקו דמשק דרעא הייתה כ-2,070 לירות טורקיות. לעומת זאת קילומטר אחד בקו חיפה דרעא נשא את תו המחיר 3,480 לירות, 68 אחוזים יותר.
עם השלמתו של הקו החדש היו לאורכו שמונה תחנות. הראשונה והמערבית ביותר, תחנת חיפה, נבנתה בסגנון אירופי מהודר וכך גם התחנה בבית שאן. בינואר 1904 נחנך הקטע הראשון של מסילת רכבת העמק בין חיפה לבית שאן, קטע שאורכו 59 קילומטרים. המסילה כולה נחנכה ב-15 באוקטובר 1905. בטקס החנוכה, במהלכו יצאה הרכבת הראשונה מחיפה לדמשק, הוסר הלוט מעל אנדרטת שיש הניצבת עד לימינו בסמוך לתחנה.
האנדרטה, שמוקדשת לסולטאן עבד אל-חמיד מקים המסילה, נושאת כתובת בה נאמר:
"בשם אללה הרחום והמיטיב, הללו את אללה ושלום יבוא על כל המאמינים. אדוננו ומורנו אמיר המאמינים וח'ליף כל הקדושים, סולטאן שתי היבשות ומלך שני הימים, הסולטאן בן הסולטאן, הסולטאן הכובש עבד אל-חמיד חאן בן הסולטאן הכובש עבד אל מג'יד חאן (מי ייתן ואללה יסוכך על מלכותו ויאריך ימיו), ציווה את מלאכת בניית קו מסילת הברזל מדמשק כדי להקל על קהל המאמינים לקיים מצוות העלייה לרגל למשכנו של אללה והשפלת המצח על קבר שליח האלוהים. כי אז פקד הסולטאן את דברו החשוב (יאריך אללה הרחום את שלטונו) שקו מסילת ברזל יבנה מחיפה על מנת שיתחבר למסילת חיג'אז החמידית. אי לכך חובת כל מוסלמי שקיים מצוות העלייה לרגל להיכל אללה והשתטחות על קבר הנביא, להתפלל לאללה שיעשת את ח'ליפות הסולטאן וירומם ימינו למען העם.נחתם בשנת 1319 להיג'רה, בידי הדל מוחמד בן עומר אל ברביד, מחל לו אללה."
שנת 1319 להיג'רה היא תאריך סתום. על פי הלוח המוסלמי החלה שנה זו ב־20 במאי 1901 ואילו לפי שנת המס העות'מאנית החלה השנה ב־14 במרץ 1903. כך או כך, חקיקת הכתובת של האנדרטה נעשתה כפי הנראה זמן רב לפני השלמת המסילה ואולי אף לפני תחילת העבודה. האנדרטה נבנתה באנטוליה על ידי אמנים מקומיים והובאה לחיפה בחלקים בדרך הים.
המעורבות היהודית בסלילה.
חרף היות פרויקט הקמת רכבת העמק מיזם ראשון במעלה לפיתוח ארץ ישראל, המעורבות של הארגונים היהודיים והציוניים במיזם זה הייתה אפסית. המיזם נוהל לכל אורך הקמתו כפרויקט בעל צביון מוסלמי דתי טהור ועקב כך נמנע מהיהודים לקחת בו חלק של ממש. הניסיון היחיד של השתלבות יהודית במפעל הבנייה היה בשנת 1908 כאשר שלח נשיא ההסתדרות הציונית העולמית, דוד וולפסון, המחאה על סך 500 ליש"ט לטובת התמיכה במפעל.
ההמחאה הועברה לממשל העות'מאני על ידי שגריר האימפריה העות'מאנית בברלין, אולם משהגיעה אל יעדה סירבו העות'מאנים לערב במפעלם אידאולוגיות פוליטיות ודחו את התרומה בטענה כי מיזם בניית המסילה הוא מפעל מוסלמי קדוש וכי אין בכוונתם לקבל תרומה המגיעה מיהודים כופרים. מכל מקום, ההמחאה הנדיבה נשמרה בידי העות'מאנים ולא הושבה לתורמים, אולם היא אכן לא שימשה לתמיכה במפעל הבנייה משום שזה הסתיים זה מכבר.
עם הדחתו של הסולטאן באותה השנה הושג הסכם לפיו כספי התרומה יועברו לטובת הקמתו של בית יתומים באיסטנבול.
הרכבת בתקופת השלטון העות'מאני.
עם הקמתה שימשה מסילת הברזל החדשה שבעמק בעיקר להעברת הציוד הדרוש לבניית המסילה החיג'אזית. אולם זמן קצר ביותר לאחר הפעלת הקו נוכחו המפעילים כי גלום בחובו פוטנציאל עסקי מהמעלה הראשונה. הרכבת העות'מאנית, שהייתה פרויקט ממשלתי אידאולוגי-דתי שלא נוהל בידי חברה למטרות רווח, החלה מהווה איום עסקי על המסילה הצרפתית המסחרית. עד מהרה החלה תחרות בין שתי החברות על הובלת הסחורות מן החורן אל הים התיכון ועם התחרות החלה הוזלה משמעותית בתעריפי ההובלה והנסיעה. במאבק זה יצאו העות'מאנים כשידם על העליונה מאחר שיכלו להרשות לעצמם להוריד את התעריף קרוב ביותר למחיר התפעול, וזאת בניגוד לרכבת הצרפתית שנזקקה לרווחים גדולים על מנת לחלקם כדיבידנד למשקיעים וזאת כדי שתוכל להמשיך ולהתקיים.
עם הוזלת המחירים בקו דרעא-חיפה הפך הקו לרווחי ביותר מכל קטעי המסילה החיג'אזית. על אף היותו ארוך יותר מהקו הצרפתי, מרבית מסוחרי החורן בחרו דווקא בקו העות'מאני בשל מחירי ההובלה הנוחים, וחלקם אף שלחו את סחורותיהם ברכבת לחיפה ומשם שינעו אותן על סיפונן של מפרשיות אל ביירות במקום לשלוח את הסחורות ישירות לביירות באמצעות המסילה הצרפתית.
עם ההצלחה המסחרית של הרכבת החדשה החלה עלייה גם בשימוש הפרטי בשירותי הרכבת. תדירות הרכבות בקו החלה עולה וטכנולוגיה חדישה הוכנסה לשימוש על מנת לקצר את זמני הנסיעה. תואי המסילה החדשה חיבר אל המרכז המסחרי של חיפה אזורים שעד אז היו מבודדים ביותר, וזאת חרף הימצאותם במרחק של עשרות קילומטרים ספורים מהעיר. באותה התקופה היו בצפונה של ארץ ישראל שלושה כבישים בלבד שהתאימו לנסיעת עגלות. השלושה: כביש חיפה-נצרת, כביש נצרת-עפולה-ג'נין וכביש חיפה-עכו, הכתיבו למעשה את קצב התפתחותם של היישובים בהתאם לאפשרות הגישה הנוחה אליהם. חנוכתה של מסילת הברזל שחצתה את עמק יזרעאל והגיע עד לשפת הכנרת הפכה למעשה את אזורי הספר לכמעט "פרוורים" של העיר חיפה.
העיר טבריה למשל, שעד אז הייתה מבודדת ביותר, קיבלה חיבור ישיר למרכז העסקי של צפון הארץ וזאת באמצעות תחנת הרכבת צמח הקרובה. בתחילה הייתה הרכבת עוצרת בצמח והנוסעים היו מגיעים לטבריה על סיפונה של הספינה "נורדוי", לשעבר ספינה גרמנית שהוטבעה בכנרת. לאחר מלחמת העולם הראשונה נבנה גשר על נהר הירדן בסמוך לקיבוץ דגניה שאיפשר הקמת שירות תחבורה קרקעי שהעביר את הנוסעים מצמח לטבריה בפחות משעת נסיעה. התקרבותה של טבריה לכדי שעות בודדות של נסיעה מחיפה (לעומת מספר ימים לפני הקמת הרכבת) היוותה גורם מכריע בהתפתחותה של העיר באותה התקופה.
זמן קצר לאחר פתיחת המסילה התגלה גם הפוטנציאל התיירותי הגלום בה. ב-1906 החלה חברת "תומאס קוק ובנו", שעסקה בשיווק חבילות נופש במצרים ובארץ ישראל עוד מ-1869, לשווק חבילת תיור אל תוככיה הבתוליים של ארץ הקודש. החברה הציעה ללקוחותיה האירופים חבילת תיור במסגרתה ישונעו התיירים ברכבת העמק עד לצמח ומשם יפליגו בספינת הקיטור "נורדוי" אל טבריה ואתרי הקודש הנוצריים שבצפון הכנרת. עם תחילת היותה של רכבת העמק רכבת תיירותית, שופרו תנאי הנסיעה ללא הכר לטובת המכובדים האירופאים שהגיעו כדי לטעום מטעם הלבנט. מפעילי הרכבת דאגו לרכישתם של קרונות מחלקה ראשונה אשר בהם תאי שינה מרווחים וב-1912 נוספו גם קרונות מחלקה שנייה שאיפשרו נסיעה נוחה יותר מאשר זו המבוצעת בקרונות המחלקה השלישית אך ללא דרגשי שינה כגון אלו שבמחלקה הראשונה.
הביקוש הגדול שהביעו תושבי צפונה של ארץ ישראל הביא להגברה מתמדת בתדירות הרכבות, הגברה שהשפיעה באופן מיידי על בטיחות הנסיעה ברכבת. באותה התקופה לא היה בנמצא מוקד מרכזי שניהל את תנועת הרכבות ומנע התנגשויות צפויות ותיאום מעבר הרכבות בנקודות המפגש השונות נעשה על ידי הודעות טלגרף ששוגרו במערכת שנבנתה בסמוך למסילה.
שיטת הבקרה המיושנת, יחד עם העלייה בתדירות תנועת הרכבות הביאה לא פעם למפגשים אשר נסתיימו באסון. בגיליון עיתון "החרות" שהופיע ב-7 ביולי 1909 הופיעה הידיעה הבאה:
התפתחות רשת המסילות של רכבת העמק.
עם חנוכת המסילה שבעמק ב-1905 היו לאורכה שמונה תחנות. זמן קצר לאחר תחילת הפעלתה של הרכבת עלתה דרישה מיישובי העמק הצעירים לבניית תחנות נוספות לאורך הנתיב ותוך מספר שנים נוספו בקטע שבין חיפה לחמת גדר 12 תחנות נוספות.
התחנות החדשות לא היו אפיק ההתפתחות היחיד של המסילה באותן שנים. כשבע שנים לאחר תחילת הפעלת הקו החל מייסנר בונה שלוחות מקומיות שייצאו משלוחת רכבת העמק אל כל עבר. הראשונה להבנות הייתה מסילת דרעא-בוסרה, שנבנתה ב-1912 והמשיכה את קו רכבת העמק למרחק של 33 קילומטרים ממזרח לדרעא. בשלהי 1912 נסללה שלוחה שחיברה את המסילה הראשית לעיר עכו. מסילה זו השתרעה לאורך של 17.8 קילומטרים וחיבורה למסילת העמק הוקם בתחנת בלד א-שייח' - (תל חנן).
בראשית 1913 נפתח הקטע הראשון של מסילת השומרון שהייתה עתידה להבנות על ההר המרכזי ולחבר את מסילת רכבת העמק עם ירושלים. קטע זה חיבר בתחילה את עפולה וג'נין ואורכו היה 17 קילומטרים. תכנונו של מייסנר להמשיך את מסילה זו דרך השומרון עד לירושלים לא יצא לפועל מעולם וזאת עקב הלחץ הכבד שהפעילה ממשלת צרפת על הממשלה העות'מאנית כדי שהאחרונה תמשוך ידיה ממיזם הקמת הרכבת, אשר הייתה עתידה להתחרות בקו הצרפתי שחיבר את ירושלים ויפו. לחץ הממשל הצרפתי נשא פרי והמסילה המדוברת הגיעה אך למרחק של 40 קילומטרים מדרום לעפולה, בקרבת הכפר סילת א-ד'אהר. עם הצטרפותה של האימפריה העות'מאנית למלחמת העולם הראשונה השתמש מייסנר במסילה זו והמשיך לבנותה מסילת א-ד'אהר דרומה עד לחצי האי סיני.