מבנה ביולוגי מוגדר על ידי מיקום המולקולות המרכיבות את המבנה. באופן דומה, תמונה פלואורסצנטית מוגדרת על ידי הקואורדינטות המרחביות של הפלורופורים היוצרים את התמונה. אפשר לנצל זאת, ועל ידי מציאת מיקום הזהירה במדגם ברמת דיוק גבוהה ניתן להגיע לרזולוציית-על. למרות שהתמונה המתקבלת מפלורופור בודד היא נקודה בגודל סופי, קביעת מיקום הפלורופור מהתמונה המתקבלת יכולה להיות מדויקת הרבה יותר מגבול הדיפרקציה, כל עוד התמונה מתקבלת ממספר רב של פוטונים אשר נפלטים מהפלורופור. אפשר להתייחס להרכבת תמונה בעזרת N פוטונים כאל מדידת מיקומם של N פלורופורים, עם אי ודאות המוערך על ידי Δloc≈ Δ/√N כאשר Δloc הוא אי ודאות המיקום, וΔ הוא אי ודאות של מדידת מיקום בודדת. קנה מידה זה מאפשר מיקרוסקופיה ברזולוציית-על, אשר לא מוגבלת על ידי דיפרקציית האור. מדידה בדיוק גבוה של מקורות אור, כמו חלקיקים פלואורוצנטים, נפוצה בניסויים ביופיזיקליים, והגיע לרמת דיוק שקרובה ל 1Å(אנגסטרום). דגימה ביולוגית-פלואורוצנטית אופיינת מכילה אלפי, או אפילו מיליונים פלורופורים בצפיפות גבוהה, דבר המקשה על קבלת תמונה ברורה בשיטת הSMLM. על ידי שימוש בגשושיות פלואורוצנטיות (פלורופורים) הניתנות לשליטה (photoswitchable probes), היכולות להחליף בין מצב חשוך למצב פולט אור, אפשר לחלק את תמונת הזהירה המתקבלת לתחומי זמן שונים, כך בעיית התמונה החופפת שמתקבלת ממולקולות שונות ניתנת לפתרון. בשיטה זו, מולקולות הנמצאות בתחומי דיפרקציית האור יכולות להיות להיות "מצולמות" בנקודות זמן שונות, כך שעבור מולקולות חופפות, ניתן לצלם מולקולה מסוימת, לאחר מכן "לכבות" את המולקולה ולצלם את המולקולה הבאה, כך שהתמונה הכוללת המתקבלת כבר לא תהיה מוגבלת על ידי החפיפה. בצורה זו קואורדינטות הפלורופורים ממופות, ונבנית תמונה ברזולוציית-על. שיטה זו תוכננה ויושמה באופן עצמאי על ידי שלוש מעבדות, והיא קיבלה את השמות STORM PALM  ו- FPALM בהתאמה. שלושת המעבדות השתמשו בתחילה בפלורופורים אשר עשויים מצבעים או חלבונים פלואורסצנטיים המופעלים על ידי אור הדמיה חלש, המפעיל רק חלק קטן מהם. הפרדה זאת מאפשרת שליטה על כמות המולקולות הנמצאות במצב פלואורסצנטי מסוים בזמן נתון, כך שהמולקולות המופעלות ניתנות להפרדה ומיקומם מתקבל. חזרה על התהליך מאפשר למפות את מיקומי הפלורופורים בדיוק רב, ולקבל תמונה ברזולוציית-על.
המאפיינים הפיזיים והכימיים של הפלורופורים קריטיים לקבלת תמונה ברזולציית על בשיטת הSMLM. עד כה נעשה שימוש במספר גדול של פלורופורים הניתנים לשליטה על ידי אותות אופטיים. הפלורופורים הללו יכולות להיות עשויות ממגוון רחב של חומרים, החל מצבעים אורגנים עד לחלבונים פלואורסצנטים, המאפשרים סיווג של דגימות ביולוגיות בעזרת מגוון של שיטות. הרזולוציה של טכניקה זו מוגבלת על ידי מספר הפוטונים שנקלטו בכל אירוע של פליטת אור מהפלורופור, אשר משתנה ממאות עבור חלבונים פלואורוצנטים, עד אלפים עבור צבעים אורגניים מסוג ציאנין, כגון Cy5. מספרים אלה מאפשרים שיפור של יותר מסדר גודל אחד ברזולוציה המרחבית של המיקרוסקופ. בפועל, חוקרים  הצליחה להגיעה לרזולוציה רוחבית של 20 ננומטר באמצעות שימוש בפלורופורים העשויים מציאנין. שיטה זו אפשרה להגיע לרזולוציות גבוהות בחקר מבנה הDNA ומבנה החלבונים השונים המרכיבים אותו, בנוסף למבנים תאיים אחרים.
התקדמויות אחרונות במיקרוסקופיה ברזולוציית-על.
בשנים האחרונות נעשתה התקדמות בתחום של רזולוציית-על, המאפשרת יישומים חדשים בדגימות ביולוגיות. ההתקדמות הטכנית הזו התאפשרה באמצעות פיתוח השיטות של הדמיה אופטית ושימוש בפלורופורים בעלי מגוון רחב של תכונות.
הדמיה מרובת צבעים (Multi-Color Imaging):
קבלת תמונה של מבנה ביולוגי חשובה על מנת להבין את הפונקציונליות שלו, אך אין זה תמיד מספיק כיוון שתהליכים ביולוגיים רבים מעורבים באינטראקציות בין מבנים ותתי מבנים שונים. אחת מהדרכים להתמודד עם אינטראקציות אלה היא באמצעות שימוש במיקרוסקופיה מרובת צבעים, בה מרכיבים שונים במבנה מסומנים בצבעים שונים. הצבעים השונים בתמונה משמשים כאינדיקטורים לאינטראקציות אפשריות, אך רמת הדיוק בשיטה זו מוגבלת על ידי הרזולוציה של שיטת ההדמיה. הדמיה מרובת צבעים ברזולוציית-על מאפשרת לקדם באופן ניכר את ההבנה של אינטראקציות מולקולריות בתאים.
הדמיה מרובת צבעית בשיטת תבנית העירור המרחבית:
הדמיה מרובת צבעים בשיטת STED ניתנת לביצוע באמצעות פלורופורים בעלי דרגת עירור ופליטת אורך גל שונה. על מנת לקבל הדמיה מרובת צבעים, יש להשתמש בלפחות שני סוגי פלורופורים. באמצעות שימוש בזוג צבעים פלואורסצנטיים ואלומות לייזר STED, ניתן לקבל הדמיה של קולוקליזציה (Colocalization) בין אשכולות החלבון הסינפטי והמיטוכונדריה, ברזולוציה שמגיעה ל 5 ננומטר. שימושים נוספים בשיטה זו איפשרו לדמות את קרום הממברנה החיצוני של המיטוכונדריה בשלושה ממדים.
הדמיה מרובת צבעית בשיטת הSMLM:
המפתח להדמיה רב צבעית בשיטת מיקום מולקולה יחידה היא להבדיל בין התכונות של כל אחת מהגשושיות הפלואורסצנטיות המורכבת מהפלורופורים. מלבד פליטה של גל כתוצאה מעירור, אורך הגל המשמש להפעלה יכול לשמש כחתימה של הפלורופורים. לכן הדרישה המוקדמת של הדמיה בשיטה זו היא שהגשושיות הפלואוסנטיות יהיו בעלי אורכי גל שונים עבור עירור, פליטה או הפעלה, דבר המאפשר הבדלה ביניהם. גשושיות אלו נוצרו על בסיס צבעים אורגנים-פלואורסצנטיים מסוג ציאנין. הגשושיות מורכבות מפלורופור "מדווח", שיכול להפוך לחשוך כאשר מעורר על ידי אור ההדמיה, ופלורופור "מפעיל", אשר מאפשר את ההפעלה של הפלורופור ה"מדווח" כאשר מואר על ידי אור באור גל מתאים. צבעי ציאנין בתחומים שונים החל מאדום כהה עד אינפרא-אדום, מתפקדים כ"מדווחים" הניתנים לשליטה, וגם לצבעי הציאנין עבור ה"מפעילים" יש מגוון רחב של אפשרויות, החל מסגול ועד צהוב. שילוב של "המדווחים" וה"מפעילים" יוצר מגוון רחב של גשושיות פלואורצנטיות הנבדלות באורכי גל ההפעלה והפליטה. הדמיה תלת-צבעית של מולקולות DNA, הדמיה דו-צבעית של מיקרוטובולים בתאים והדמיה דו-צבעית תלת-ממדית של מיקרוטובלים ומיטוכונדריה הושגו באמצעות שיטה זו
הדמיית תאים חיים :
אחד מהיתרונות של מיקרוסקופיית אור הוא היכולת ליצור הדמיה של תאים חיים. ישנן שתי דרישות עיקריות על מנת לערוך הדמיית תאים חיים: יש לסווג את התאים,  ולוודא שרזולוציית הזמן גבוהה מספיק כדי לעקוב אחרי התנועות בתא. השיטות ברזולוציית-על שיושמו עד כה, כוללות את שיטת תבנית העירור המרחבית ושיטת מיקום המולקולה היחידה. שתי שיטות ההדמיה איטיות באופן יחסי. האחרונה כרוכה בהכנסת גשושיות פלואורסצנטיות לתאים חיים, מה שמוסיף אתגר נוסף. עם זאת, מספר רב של חומרים התגלו כניתנים לשליטה על ידי אותות אופטיים, דבר שהקנה גמישות.
הדמיית תאים חיים בעזרת שיטת תבנית העירור המרחבית:
בגלל שהרזולוציה בשיטת STED גדולה הרבה יותר מאשר שימוש במיקרוסקופיה קונפוקלית, כך הזמן הדרוש לביצוע סריקה של דגימה גם הוא ארוך יותר בצורה משמעותית. באמצעות הגדלת זמן הסריקה והגבלת שדה התמונה למספר מיקרו-מטרים, הצליחו לצפות בתנועה בראונית של חלקיקים בגודל של מספר ננומטרים בקצב של 80 פריימים לשנייה. לאחרונה הצליחו מדענים לדמות נוירונים בהיפוקמפוס ולהבחין בתנועת שלפוחית סינפטית בודדה ברזולוציה של 60-80 ננומטרים.
הדמיית תאים חיים בשיטת ה SMLM:
הדמיה ברזולוציית-על בשיטת הSMLM גם היא איטית יחסית, כיוון שהתמונה הסופית היא למעשה מפה של מיקומי הפלורופורים שהצטברו על פני מחזורים רבים. הדמיה ברזולוציה גדולה מגבול הדיפרקציה של חלבוני אדהזיה פוקליים(focal adhesion proteins) הושגה לאחרונה. בעזרת שימוש בחלבון פלואורסצנטי הניתן לשליטה באמצעות אותות אופטיים (EosFP), הצליחו לקבל הדמיה ברורה של החלבון פקסילין . רזולציית הזמן אשר הושגה הייתה בין 25–60 פריימים לשנייה, ובמהלך פרק זמן זה, הופעלו כ-103 פלורופורים בכל מיקרומטר מקובע, והושגה רזולוציה של 60-70 ננומטר. לאחרונה הצליחו להכניס חלבון פלואורסצנטי צהוב הניתן לשליטה לתוך תא בקטריה חי, דבר האפשר מעקב אחרי חלבון הMreB .
גשושיות פלואורסצנטיות יכולות להקל מאוד על מעקב אחר החלקיקים. בניגוד לניסויים קונבנציונלים של מעקב אחרי חלקיק יחיד, שבו מתבצע סיווג ומעקב רק אחר חלק קטן של המטרות, השימוש בגשושיות הפלואורסצנטיות מאפשרות לעקוב אחר מטרות בצפיפות גבוהה יותר. למרות שניתן להפעיל את הגשושיות רק בחלק קטן של המבנים בזמן נתון,  לאחר מחזורי פעולה רבים מתקבלת מפה מפורטת של מסלולי החלקיקים. גישה זו שימשה לבדיקת קיומם של מיקרו-מבנים בממברנה על ידי בחינת תכונות המפה המרחבית של החלבונים בממברנה.
הדמיה תלת ממדית (3D super resolution imaging):
מרבית המבנים התאיים הם תלת ממדיים מטבעם, והיכולת לפענח מבנה תלת ממדי מוגבלת על ידי המימד בעל הרזולוציה הנמוכה ביותר. מכאן נבע הצורך לפתח שיטות המאפשרות קבלת רזולציית על בשלושה ממדית.
הדמיה תלת ממדית בשיטת הSMLM זו יושמה לראשונה באמצעות שיטת אסטיגמציה למיקום הצירים. בשיטה זו מוכנסת למכשיר עדשה גלילית, המאפשרת פוקוס שונה בכיווני x ו- y. כתוצאה מכך, התמונה המתקבלת מפלורופור יחיד הופכת לאליפטית, דבר המאפשר מדידה בו זמנית של המיקום הצירי שלה מפחיסות האליפסה, ואת המיקום הרוחבי ממרכז התמונה .שיטה זו הגיעה לדיוק רוחבי של ~ 25 ננומטר ודיוק צירי של ~ 50 ננומטר. תיאור מלא של מבנים ביולוגים, לדוגמה הדמיה מלאה של תאי יונקים, הושגו באמצעות שיטה זו .