כאשר יש לאנזים מספר סובסטרטים, מעכבים יכולים לגלות סוגים שונים של עיכובים בהתאם לסובסטרט הנבחן. עובדה זו נובעת מכך שהאתר הפעיל מכיל שני אתרי קישור שונים בתוכו, אחד לכל סובסטרט. כך למשל, מעכב עשוי להתחרות עם סובסטרט א' על אתר הקישור אחד, אך להוות מעכב לא תחרותי בהתייחס לסובסטרט ב' באתר הפעיל השני.
אומדן קבועי הדיסוציאציה של מעכב הפיך.
כפי שהוזכר לעיל, מעכב אנזימים מאופיין על ידי שני קבועי דיסוציאציה, "K"i ו-"K"i'‎, לאנזים ולתצמיד האנזים-סובסטרט, בהתאמה. קבוע מעכב-אנזים "K"i ניתן למדידה באופן ישיר באמצעות מספר שיטות; שיטה מדויקת במיוחד היא טיטרציה קלורימטריה איסותרמית (Isothermal Titration Calorimetry; ITC), שבה המעכב מטוטר לתמיסה של אנזים והחום שמשתחרר או שנקלט נמדד. לעומת זאת, קבוע הדיסוציאציה "K"i'‎ קשה למדידה ישירה, היות שתצמיד האנזים-סובסטרט מתקיים רק זמן קצר ועובר תגובה כימית ליצירת התוצר. "K"i'‎ נמדד אפוא בצורה לא ישירה בדרך כלל, על ידי תצפית על הפעילות האנזימטית בריכוזים שונים של מעכב וסובסטרט, והתאמת הנתונים למשוואת מיכאליס-מנטן מותאמת:
שבה הפקטורים המותאמים α ו-α' נקבעים על ידי ריכוז המעכב ושני קבועי הדיסוציאציה שלו:
לפיכך, בנוכחות המעכב ה-"K"m וה-"V"max האפקטיביים של האנזים הופכים ל-(α/α')"K"m ו-(1/α')"V"max, בהתאמה. עם זאת, משוואת מיכאליס-מנטן המותאמת מניחה שהיקשרות המעכב לאנזים הגיעה לשיווי משקל, דבר שעשוי להיות תהליך איטי מאוד במעכבים בעלי קבועי דיסוציאציה הקטנים מננומולרים. במקרים אלו, מעשי יותר לטפל במעכב שיוצר קשרים חזקים כמעכב לא הפיך (ראו להלן); עם זאת, יכולה להתאפשר עדיין הערכה של ה-"K"i'‎ באופן קינטי אם "K"i נמדד באופן בלתי תלוי.
השפעות הסוגים השונים של מעכבים הפיכים על פעילות אנזימטית ניתנת להצגה באמצעות ייצוג גרפי של משוואת מיכאליס-מנטן, כדוגמת עקום Lineweaver-Burk או עקום Eadie-Hofstee. כך למשל, בעקומי Lineweaver-Burk המוצגים משמאל, קווי העיכוב התחרותי חותכים את ציר ה-y, דבר שממחיש שמעכבים אלו אינם משפיעים על ה-Vmax. באופן דומה, קווי העיכוב הלא תחרותי חותכים את ציר ה-x באותה נקודה, דבר שמראה שמעכבים אלו לא משפיעים על ה-Km. עם זאת, קשה לאמוד באופן מדויק את ה-"K"i וה-"K"i'‎ מהגרף, כך שבמחקר קבועים אלו מוערכים באמצעות שיטות רגרסיה לא ליניארית מהימנות יותר, כמתואר לעיל.
דוגמאות למעכבי אנזימים הפיכים.
משום שאנזימים התפתחו לקשור את הסובסטרט שלהם בחוזקה, ורוב מעכבי האנזימים ההפיכים נקשרים לאתר הפעיל של האנזימים, אין זה מפתיע כי יש דמיון בולט במבנה של חלק ממעכבים אלו למבנה הסובסטרטים של מטרתם. דוגמה ל"חקייני סובסטרט" אלו הם מעכבי פרוטאז, משפחה מוצלחת במיוחד של תרופות נוגדות רטרו וירוסים (Antiretroviral drugs) המשמשות לטיפול ב-HIV. ריטונאביר, מעכב פרוטאז המבוסס על פפטיד הכולל שלושה קשרים פפטידיים מוצג משמאל. מאחר שתרופה זו דומה לחלבון שהוא סובסטרט של פרוטאז ה-HIV, היא מתחרה עם סובסטרט זה באתר הפעיל של האנזים. מעכבי אנזימים בנויים לעיתים קרובות כדי להידמות למצב המעבר או מצב ביניים של תגובת קטליזת-אנזים. זה מבטיח שהמעכב מנצל את השפעת ייצוב אנזים של מצב המעבר ובכך לאפיניות קשירה טובה יותר (Ki נמוך יותר) מאשר המבנים מבוססי הסובסטרט. דוגמה למעכב מצב מעבר שכזה היא התרופה האנטיוויראלית אוסלטמיביר; תרופה זו מחקה את טבעה השטוח של טבעת יון האוקסוניום בתגובת האנזים הוויראלי נאורמינידז.
עם זאת, לא כל המעכבים מבוססים על מבנה של סובסטרטים. למשל, מבנהו של מעכב פרוטאז HIV אחר טיפרנאביר (Tipranavir) המוצג מימין. מולקולה זו אינה מבוססת על פפטיד ואין לה דמיון מבני ברור לסובסטרט חלבון. מעכבים לא פפטידים אלו יכולים להיות יציבים יותר ממעכבים הכוללים קשרים פפטידים, כיוון שלא יהוו סובסטרטים בעבור פפטידז ויש סיכוי נמוך יותר לכך שיופחתו בכמותם בתא.
בתכנון תרופות חשוב לשקול את ריכוזי הסובסטרטים שאליהם נחשפים אנזימי המטרה. לדוגמה, חלק מהמעכבים של חלבוני קינאז הם בעלי מבנים כימיים שדומים ל-ATP, אחד הסובסטרטים של אנזימים אלו. תרופות שהן מעכבים תחרותיים פשוטים יצטרכו להתחרות בריכוזים גבוהים של ATP בתא. חלבוני קינאז יכולים להיות מעוכבים גם על ידי תחרות באתרי הקישור שבהם הקינאזים פועלים עם חלבוני הסובסטרטים שלהם, ורוב החלבונים מצויים בתוך תאים בריכוזים נמוכים בהרבה מאשר ריכוז ה-ATP. כתוצאה מכך, אם שני מעכבים של חלבוני קינאז קשורים יחדיו באתר הפעיל עם אפיניות דומה, אך רק אחד מהם צריך להתחרות ב-ATP, אז המעכב התחרותי באתר הקישור של החלבון יעכב את האנזים בצורה יעילה יותר.
מעכבים בלתי הפיכים.
סוגים של עיכוב בלתי הפיך.
מעכבים בלתי הפיכים משנים בדרך כלל את האנזים מבחינה קוולנטית ובעקבות כך העיכוב הוא בלתי הפיך. מעכבים בלתי הפיכים כוללים לעיתים קרובות קבוצות פונקציונליות ראקטיביות כגון חרדל חנקן (nitrogen mustard), אלדהידים, הלואלקאנים או אלקנים. קבוצות אלקטרופיליות אלו מגיבות עם חומצות אמיניות של קבוצות צד ליצירת קשרים קוולנטים. הקבוצות המשתנות הן אלו עם קבוצות צד שכוללות נוקלאופיל כגון קבוצות הידרוקסיל וסולפהידריל, זה כולל את החומצות האמיניות סרין, ציסטאין, תראונין וטירוזין.
עיכוב בלתי הפיך שונה מאינאקטיביזציה בלתי הפיכה של אנזים. מעכבים בלתי הפיכים הם ספציפיים בדרך כלל לסוג אחד של אנזים, ולא משביתים את כל החלבונים; הם לא פועלים באמצעות הרס מבנה החלבון אלא באמצעות שינוי ספציפי של האתר הפעיל של מטרתם. לדוגמה, מצבים קיצוניים של pH וטמפרטורה גורמים בדרך כלל לדנטורציה של כל מבנה החלבון, אך זוהי השפעה לא ספציפית. באופן דומה, כמה טיפולים כימיים לא ספציפיים הורסים את מבנה החלבון; למשל חומצה הידרוכלורית מרוכזת תגרום להידרוליזה של הקשרים הפפטידים שמחזיק את הפפטידים יחדיו, וישתחררו חומצות אמינו חופשיות.
אנליזה של עיכוב בלתי הפיך.
כמוצג באיור מימין, מעכבים בלתי הפיכים יוצרים תצמיד לא קוולנטי הפיך עם האנזים (EI) או עם תצמיד האנזים-סובסטרט (ESI) ואז גורמים לתגובה שבה נוצר תצמיד שעבר שינוי קוולנטי, תצמיד שלא מתפקד עוד - EI*. הקצב שבו נוצר EI* נקרא קצב האינאקטיביזציה או "k"inact. מאחר שהתהוות EI עשויה להתחרות עם ES, קשירה של מעכבים בלתי הפיכים ניתנת למניעה על ידי תחרות עם סובסטרט או בתחרות עם מעכב שני, הפיך. אפקט הגנה זה הוא הוכחה טובה לתגובה ספציפית של מעכב בלתי הפיך עם האתר הפעיל.
צעדי הקשירה והאינאקטיביזציה של תגובה זו נחקרים באמצעות השמת האנזים עם מעכב ובחינת כמות הפעילות שנותרת במהלך הזמן. הפעילות תפחת באופן תלוי בזמן, בדרך כלל על פי דעיכה אקספוננציאלית. התאמת נתונים אלו למשוואת הקצב נותנת את קצב האינקטיבציה בריכוז זה של מעכב. תהליך זה נעשה בריכוזים שונים של מעכב. אם תצמיד הפיך של EI מעורב, קצב האינקטיבציה יהיה בר רוויה ובהתאם לעקום שכזה יינתנו "k"inact ו-"K"i
שיטה נוספת שנמצאת בשימוש נפוץ באנליזות אלו היא ספקטרומטריית מסות. בשיטה זו, מדידה מדויקת של המסה של האנזים שלא עבר שינוי ושל האנזים הלא פעיל נותנת את העלייה במסה שנגרמת מתגובה עם מעכב ומראה את הסטוכיומטריה של התגובה. זה נעשה בדרך כלל באמצעות ספקטרומטר מסה MALDI-TOF. בשיטה משלימה, PMF (Peptide mass fingerprinting) מבוצע עיכול של החלבון במצב המקורי ובמצב שעבר שינוי, באמצעות פרוטאז כגון טריפסין. בסופו של התהליך נוצר מערך של פפטידים שניתן לבצע עליהם אנליזה באמצעות ספקטרומטר מסה. הפפטיד שהשתנה במסתו לאחר התגובה עם המעכב יהיה זה שבו יש את אתר השינוי.
מקרים מיוחדים.
לא כל מעכבי האנזימים הבלתי הפיכים יוצרים קשרים קוולנטים עם מטרות האנזים שלהם. ישנם מעכבים הפיכים שנקשרים כה חזק לאנזימי המטרה שלהם, עד כדי כך שניתן להתייחס אליהם כמעכבים בלתי הפיכים. המעכבים שנקשרים כה חזק יכולים להראות קינטיקה דומה לזו של מעכבים קוולנטים בלתי הפיכים. במקרים אלו, חלק מהמעכבים הללו נקשרים במהירות לאנזים בתצמיד EI עם אפיניות נמוכה ותצמיד זה עובר אז סידור איטי מחדש לתצמיד EI* עם קשר חזק (ראו איור לעיל). התנהגות קינטית זו קרויה קשירה-אטית (slow-binding). הסידור האיטי מחדש לאחר הקשירה לעיתים קרובות מערב שינויי קונפורמציה. בין הדוגמאות למעכבים שמבצעים קשירה-אטית נמנות כמה תרופות חשובות בהן מטוטרקסט, אלופורינול, וצורתו המשופעלת של אציקלוביר.
דוגמאות למעכבים בלתי הפיכים.
דיאיסופרופילפלורופוספט (DFP) מוצג בתרשים לעיל מצד שמאל כדוגמה למעכב פרוטאז בלתי הפיך. האנזים מבצע הידרוליזה של הקשר זרחן-פלואור ב-DFP, אך קבוצת הזרחן נותרת קשורה לסרין באתר הפעיל, ומשבשת את פעילותו. באופן דומה, ה-DFP מגיב גם עם האתר הפעיל של אצטילכולין אסטראז בסינפסה של הנוירונים, וכתוצאה מכך הוא נוירוטוקסין חזק, ומינונו הקטלני הוא פחות מ-100 מ"ג.
עיכוב "התאבדותי" (Suicide inhibition) הוא סוג לא נפוץ של עיכוב בלתי הפיך שבו האנזים הופך את המעכב לצורה ריאקטיבית באתר הפעיל שלו. דוגמה לכך היא המעכב של ביוסינתה של פוליאמין, α-דיפלורומתילאורניתין או DFMO, אשר דומה לחומצה האמינית אורניתין, ומשמש לטיפול במחלת השינה. האנזים אורניתין דהקרבוקסילאז יכול לזרז את הוצאת הקרבוקסילים של DFMO במקום אורניתין. ואולם, תגובת הוצאת הקרבוקסילים מובילה להסרת אטום הפלואור, שהופך את המתווך הקטליטי הזה לאימין, אלקטרופילי מאוד. צורה ריאקטיבית זו של DFMO מגיבה אז עם קבוצת ציסטין או ליזין באתר הפעיל להשבתה בלתי הפיכה של האנזים.