במהלך המאה ה-16 התרחבה מלכות המשנה, ונוסדו בה ערים חדשות. בשנת 1573 נוסדה קורדובה (כיום בארגנטינה) ושנה לאחר מכן נוסדו קוצ'במבה וטריחה (Tarija). בין השנים 1580 ו-1640, בתקופת איחוד הכתרים האיבריים, במהלכה שלטה למעשה ספרד בפורטוגל, הפך חוזה טורדסיאס, שחילק את העולם החדש בין שתי המעצמות האיבריות, לחסר משמעות. בו בזמן חקרו הספרדים איים רבים באוקיינוס השקט, כגון גינאה החדשה (1545), איי שלמה (1568) ואיי מרקיז (1595), אולם לא יצרו קשרי מסחר או יישבו אותם.
בשנת 1609 החלה פעילותם המיסיונרית של הישועים בתחום מלכות המשנה עם הקמת המיסיון הראשון. אלו פעלו לניצור האינדיאנים ול"תירבותם". בראשית המאה ה-17 הוקם הקונסולאדו (גילדת הסוחרים) של לימה, שעסקה בכל ענייני הסחר של מלכות המשנה. משנים למלך אחרים עסקו גם הם בביצור מלכות המשנה וחיזוק עוצמתה הצבאית כנגד מעצמות זרות, כמו גם כנגד מרידות פנימיות וכיבוש חלקים נוספים, כגון מלחמת האראוקו שהתחוללה בדרומה של המושבה החדשה שבצ'ילה.
ביום 9 ביולי 1586, פגעה רעידת אדמה בלימה ובקייאו נמלה, וגל הצונאמי שבה בעקבותיה גרם לנזק בקייאו.
ימי בית הבסבורג האחרונים (1643–1713).
מלכות המשנה התמודדה באופן שוטף עם בעיות ביטחוניות רבות. המשנים למלך הגנו על חוף האוקיינוס השקט מפני סחר בלתי חוקי (בעיקר הברחות בשיתוף עם צרפתים) ומפני התקפות של שודדי ים, או פריבטירים אנגליים והולנדיים. מכיוון שכך בוצרו המבצרים החופיים של ואלדיביה, ולפראיסו, אריקה וקייאו וחומות נבנו סביב לימה (1686) וטרוחיו (Trujillo; 1685–1687). אף על פי כן הצליח הפרייבטיר האנגלי הנרי מורגן להסתער, לתפוס ולבזוז את פנמה סיטי בתחילת 1670. כוחות פרואנים הדפו את התקפותיהם של פרייבטירים אנגלים אחרים עד להסכם אוטרכט בשנת 1713, אשר אפשר לסוחרים אנגליים לסחור ביריד בפורטובלו.
בעיות ביטחון אימו על מלכות המשנה גם מבפנים, שכן מרידות רבות אירעו בתקופה זו. בשנת 1656 מרד פדרו בואורקס (Bohórquez), הכתיר עצמו כ"אינקה" של האינדיאנים בני הקלצ'אקי (Calchaquí) והצית מרידת אינדיאנים; בין השנים 1665 ו-1668 מרדו בעלי המכרות העשירים חוסה וגספר סלסדו (Salcedo) כנגד הממשלה הקולוניאלית; אנשי הכמורה התנגדו למינויים של הגמונים מספרד; מרידת עבדים פרצה באסיינדה של אואצ'יפה דה לימה (Huachipa de Lima), והמשנה למלך עצמו נדרש לדיכוייה. נוסף על כל אלו הכו במלכות המשנה שתי רעידות אדמה קשות (1655 ו-1687) והותירו אחריהן גל של מגיפות.
עם זאת הוסדרו הבטים שונים של מלכות המשנה. העבודה באוברחס (Obraje), מפעלים מקומיים שייצרו בעיקר, אך לא רק, מוצרי טקסטיל, הוסדרה בחוק בשנת 1664; המיטבעה של לימה הופעלה מחדש לאחר שנסגרה בשנת 1572; ייצור הכסף במכרות של פוטוסי סן ניקולאס (San Nicolás), קוחטאמבו (Cojatambo) ואואנקבליקה (Huancavelica) הואץ; הוטלה הגבלה על ייצורם של משקאות אלכוהוליים (Aguardiente) ואלו מוסו במס כבד.
כמו כן הושלמה בנייתם של כנסיית לוס דסאמפאראדוס (Los Desamparados;1672), כנסיית לה בואנה מוארטה (La Buena Muerte) ומנזר מינימוס דה סן פרנסיסקו דה פאולה (Mínimos de San Francisco de Paula) והם נפתחו. כמו כן נבנו בתי החולים של אספיריטו סנטו (Espiritu Santo) וסן ברתולומה (San Bartolomé).
הרפורמות הבורבוניות (1713–1806).
לאחר מלחמת הירושה הספרדית החלו המלכים בני בית בורבון ברפורמות שונות בכל רחבי האימפריה הספרדית, אשר הקיפו את כל תחומי החיים ותכליתן הייתה לייעל את השליטה באימפריה ולהתאימה לרוח עידן האורות שנשבה באירופה. רפורמות אלו, שנודעו בשם "הרפורמות הבורבוניות", החלו תחילה בספרד עצמה, ולאחר מכן, בעיקר תחת שלטונו של קרלוס השלישי, ביתר שאת בנחלותיה הקולוניאליות באמריקה.
במסגרת הרפורמות המנהליות נקרעו בשנת 1717 האאודיינסיות של בוגוטה, קיטו ופנמה ממלכות המשנה של פרו ויצרו מלכות משנה חדשה: מלכות המשנה של גרנדה החדשה. מלכות המשנה החדשה לא החזיקה מעמד ופורקה בשנת 1724, אולם הוקמה מחדש בשנת 1739. כמה עשורים מאוחר יותר, בשנת 1776, נקרע חלקה הדרום מזרחי של מלכות המשנה על מנת להקים את מלכות המשנה של ריו דה לה פלטה, שהשתרעה על השטח המצוי כיום תחת המדינות המודרניות של בוליביה, פרגוואי, אורוגוואי וארגנטינה. חוזה טורדסיאס הוחלף בהסכם מדריד בשנת 1750 אשר העניק לאימפריה הפורטוגזית את השטחים בהם שלטה באמריקה הדרומית, גם ממערב לקו שנקבע בחוזה טורדסיאס. המשנים למלך בתקופה זו ארגנו מחדש את מלכות המשנה, ששטחה הצטמצם משמעותית בעקבות שינויים אלו, וחילקו אותה לשבע אינטנדנסייס, שטחי משנה מנהליים שבראשם עמד מנהלן, אינטנדנטה, שדיווח ישירות למלך, ולא למשנה למלך.
בו בזמן הוקמו מוסדות שונים שנועדו להבטיח מסחר יעיל ורווחי יותר, כגון ה-"Junta Superior de Comercio" וה-"Tribunal de Minería". גם בית המכס הראשון נבנה בקייאו באותה העת, וכן זירת השוורים הראשונה בלימה.
תגובות האינדיאנים המקומיים לרפורמות הבורבוניות לא פסחו על מלכות המשנה של פרו. במהלך המאה ה-18 לבדה התחוללו במלכות המשנה 14 מרידות רחבות היקף בהרי האנדים. על אלו ניתן למנות את מרידותיהם של חואן סנטוס אטאולפה (Juan Santos Atahualpa) בשנת 1742; שלוש המרידות של ראשית שנות השמונים של המאה ה-18, אלו של טופאק אמארו השני (Túpac Amaru), תומאס קטארי (Tomás Katari) וטופאק קטארי. אמנם היו חלק ממרידות אלו באופן רשמי בתחומי שיפוטה של מלכות המשנה של ריו דה לה פלטה, אך הן השפיעו עמוקות על זו של פרו גם כן. לאלה קדמו מרד הקומונרוס בפרגוואי, שהתחולל בין השנים 1721 ו-1732.
בשנת 1767 גורשו הישועים מכלל האימפריה הספרדית, ובכללה גם מלכות המשנה של פרו, שתחת שיפוטה נמצאו אז רוב המיסיונים של הישועים בקרב בני הגוואראני בפאראגוואי.
סופה של מלכות המשנה (1806–1824).
המשנה למלך שבחלקו נפלה ההתמודדות עם משבר המלוכה הספרדית היה חוסה פרננדו דה אבסקל אי סוסה (Abascal y Sousa). אבסקל הנהיג רפורמות חינוכיות במלכות המשנה, ארגן מחדש את הצבא והתמודד בהצלחה עם מספר מרידות וקנוניות מקומיות. עם פרוץ מלחמות העצמאות של אמריקה הלטינית הייתה מלכות המשנה של פרו למעוז תומכי המלוכה הספרדית באמריקה הדרומית. המרידות רחבות ההיקף של סוף המאה ה-18, להן היה אופי אתני מובהק, היוו תזכורת מתמדת לאליטה הספרדית המקומית לחולשתם בכל הסדר רפובליקני עתידי אחר. מלכות המשנה הצליחה לדכא מספר פרובינציות מורדות, וכן התמודדה עם שטחים שלא היו תחת סמכות שיפוטה, ואת חלק מהן כבשה מחדש, כגון את הקפיטנייה חנרל של צ'ילה, ואת הפרובינציות של אלטו פרו מידי מלבות המשנה של ריו דה לה פלטה.
בהדרגה הובסו צבאות מלכות המשנה בידי המורדים. בתחילת שנת 1817 חצה צבא האנדים את הרי האנדים וכבש את צ'ילה. ביום 8 בספטמבר 1820 נחתה בחוף פראקאס (Paracas), ליד העיר פיסקו (Pisco) שמדרום ללימה, משלחת שאורגנה בצ'ילה. ב-21 ביולי 1821 כבשה המשלחת את לימה, וחוסה דה סן מרטין אשר היה מפקדה של המשלחת, הכריז על עצמאותה של פרו ביום 28 ביולי אותה השנה. המשנה למלך חוסה דה לה סרנה אה אינוחוסה (Serna e Hinojosa) נסג לחאוחה (Jauja), ולאחר מכן לקוסקו.
ביום 26 ביולי 1822 נפגשו סן מרטין וסימון בוליבר לפגישתם ההיסטורית בגואיאקיל. פרטי אותה פגישה אינם ידועים, אולם לאחריה חזר סאן מרטין לארגנטינה, ואילו בוליבר המשיך והנהיג את תומכי העצמאות לניצחונותיהם הסופיים כנגד המלוכנים באלטו פרו. בספטמבר 1823 הגיע בוליבר ללימה, מלווה באנטוניו חוסה דה סוקרה, על מנת לתכנן את מתקפתם על המלוכנים.
בפברואר 1824 זכו המלוכנים להחזיק שנית בלימה, אם כי באופן זמני בלבד. בוליבר ארגן את צבאו בטרוחיו (Trujillo) ומשם צעד לקראת קרב עם המלוכנים תחת פיקודו של חוסה דה קנטראק (Canterac). הצבאות נפגשו ביום 6 באוגוסט 1824, במישורים שליד העיר חונין (Junín). המורדים ניצחו את המלוכנים ואלו פינו את לימה בשנית.
ב-7 באוקטובר 1824, עבר הפיקוד על המורדים לידיו של סוקרה, בעקבות צו של הקונגרס של הרפובליקה של קולומביה הגדולה. לעומתו התרכזו המלוכנים בסביבות העיר אייקוצ'ו (Ayacucho), בה נערך הקרב האחרון לעצמאות פרו. ב-9 בדצמבר 1824, התחולל קרב אייקוצ'ו במרחק כמה קילומטרים מהעיר במישור "לה קינואה" (Pampa de La Quinua), בקרבת העיירה קינואה. הכוחות המורדים יצאו וידם על העליונה, ובכך נחתמה עצמאותן של פרו ושל אמריקה הדרומית. סוקרה ניצח ולקח בשבי את המשנה למלך לה סרנה, שנפצע, וכן כ־3,000 שבויים נוספים. המלוכנים איבדו כ־2,000 מאנשיהם וצבאם נפוץ. סרנה חתם על כתב כניעה סופי, שוחרר, והפליג חזרה לאירופה.
אף על פי כן המשיכו הספרדים להחזיק באי צ'ילואה, שבדרום צ'ילה, עד 1826, וניסו לכבוש מחדש את נחלותיהם שמעבר לים מספר פעמים, כגון בקרב קייאו, אולם בשנת 1879 הכירו, לבסוף, בעצמאותה של פרו.
חלוקה מִנהלית.
מלכות המשנה של פרו הייתה מחולקת בחלוקה מנהלית פנימית למספר אאודיינסיות, יחידה מנהלית עליה הופקד מושל ואשר תאמה את שטח שיפוטה של האאודיינסיה המקומית – בית משפט בעל סמכויות משפטיות ומנהליות מעורבות יחדיו. בתקופת בית האבסבורג חולקה מלכות המשנה לשש אאודיינסיות: פנמה (1538), לימה (1543), סנטה פה דה בוגוטה (1548), צ'רקאס (1559), קיטו (1563) וצ'ילה (1563–1573, 1606). תחת בית בורבון נתווספו שלוש אאודיינסיות חדשות לאלו הקיימות: בואנוס איירס (1661–1672, 1776), קראקאס (1786), וקוסקו (1787).