Yuqori samarali suyuqlik xromatografiya

Yuqori samarali suyuqlik xromatografiyasi (HPLC;ilgari yuqori bosimli suyuqlik xromatografiyasi) -aralashmadagi komponentlarni ajratish, aniqlash va dozalash uchun analitik kimyoda qo'llaniladigan usuldir. Uning asosiy konstruktiv xususiyati qattiq adsorbent materialdan tayyorlangan statsionar faza bo'ylab mobil fazani yuqori bosim bilan siqib chiqaradigan nasoslardir.Namunadagi har bir komponent adsorbent moddasi bilan turlicha reaksiyaga kirishadi, shuning uchun ular ustun boʻylab turli tezlikda harakatlanib,aralashmaning ajralishiga olib keladi.

HPLC ko'p maqsadlarda qo'llaniladi:sanoatda (masalan,dori va oziq-ovqat mahsulotlarini o'rganish uchun), qonunchilikda (masalan,dopingni aniqlash uchun), tadqiqotda (masalan,murakkab biologik materialning tarkibiy qismlarini ajratish uchun) va tibbiyot uchun (masalan, qon testlari).

Xromatografiya-bu massa o'tkazuvchanligi bilan adsorbsiya. HPLC ning asosiy qismi namuna va erituvchi aralashmasini qattiq adsorbent bilan to'ldirilgan ustun orqali siqib chiqaradigan nasoslar bo'lib,bu ularning turli tezliklarda harakatlanishi va ajralishiga olib keladi.Ustunning faol komponenti adsorbent,statsionar faza va qattiq,donador materialdir (masalan,kremniy yoki polimerlar),ko'pincha o'lchami 2-50 mkm.Komponentlarning ajralish sababi ularning adsorbent moddasi bilan turlicha o'zaro ta'siridir.Bosim ostidagi suyuqlik ko'pincha erituvchilar aralashmasidir (masalan, suv, asetonitril, metanol, suyultirilgan mineral kislotalarning suvli eritmalari), namuna va erituvchi birgalikda harakatlanuvchi faza deb ataladi. Mobil fazaning tarkibi va harorati ajratish jarayonida juda muhim rol o'ynaydi, chunki u komponentlarning adsorbsiya jarayoniga ta'sir qiladi. Ushbu o'zaro ta'sirlarning ko'pchiligining tabiati fizik, masalan, hidrofobik, dipol-dipol, ionli o'zaro ta'sirlar yoki ularning kombinatsiyasi.

HPLC an'anaviy past bosimli suyuqlik xromatografiyasidan uning bosimi juda yuqori (50-350 atm gacha) bo'lishi bilan farq qiladi va an'anaviy ustunli suyuqlik xromatografiyasida asosiy harakatlantiruvchi kuch tortishish hisoblanadi.HPLC tomonidan tahlil qilingan namunaning o'lchami juda kichik bo'lgani uchun uning ustun o'lchami ham kichik (diametri 2,1-4,6 mikron,uzunligi 30-250 mm).HPLC ustunlarining adsorbent zarralari ham juda kichik (2-50 mkm).Bunday o'lchovlar HPLC ning aralashmalarni parchalash qobiliyatini ko'paytiradi va bu hozirgi kunga qadar eng ko'p qo'llaniladigan usuldir.

HPLC qurilmasi odatda degasser,namuna oluvchi,nasos va detektordan iborat.Namuna oluvchi namunani harakatlanuvchi faza oqimiga yuboradi.Nasoslar harakatlanuvchi fazaning tarkibi va tezligini saqlab turadi.Va detektor ustundan chiqadigan oqimdagi ajratilgan komponentlar miqdoriga mutanosib signal beradi.Qurilma tahlil natijalarini chiqarish uchun raqamli mikroprotsessordan foydalanadi.Ba'zi HPLC modellarida nasoslar vaqt o'tishi bilan harakatlanuvchi fazaning tarkibini o'zgartirishi mumkin, bunday oqimlarning tarkibi gradient oqimi deb ataladi. Eng ko'p ishlatiladigan detektorlar UV-Vis, yorug'lik chiqaradigan detektorlar (DAD) va massa-spektrometriya (MS) detektorlari. Ko'pgina HPLC qurilmalari ham haroratni o'zgartirishga imkon beradi.

Qo'llanishi 
Ajratilgan aralashmaning namunasi ustunning kichik hajmidan oqib o'tadigan mobil fazaning oqimiga kiritiladi.Namunadagi komponentlar adsorbent (statsionar faza) bilan boshqacha reaksiyaga kirishadi va shuning uchun ustun bo'ylab turli tezliklarda harakatlanadi.Har bir komponentning tezligi uning tabiatiga,statsionar fazaning tabiatiga va mobil fazaning tarkibiga bog'liq.Tahlil qiluvchi moddaning kolonnadan suzilishi (oqishi) uchun ketadigan vaqt sekinlashuv vaqti deyiladi.Agar bir xil analit bir xil sharoitlarda o'lchanadigan bo'lsa,u bir xil sekinlashuv vaqtini ko'rsatadi, shuning uchun undan analitni sifat jihatidan aniqlash uchun foydalanish mumkin.

Hozirgi vaqtda adsorbentning o'lchamlari va sirt xususiyatlariga ko'ra farq qiluvchi ko'plab turdagi ustunlar mavjud.To'ldiruvchi materialning zarralari qanchalik kichik bo'lsa,uning bo'ylab harakatlanuvchi fazani o'tkazish uchun zarur bo'lgan bosim shunchalik yuqori bo'ladi,ammo bu piksellar sonini oshiradi.Adsorbentlar ham hidrofobik,ham qutbli bo'lishi mumkin.

Ko'chma faza sifatida ko'pincha asetonitril,metanol kabi suvda eriydigan organik erituvchilarning aralashmalari ishlatiladi.Ba'zi HPLC usullari suvsiz mobil fazadan foydalanadi (normal fazali suyuqlik xromatografiyasi (NPLC)).Mobil fazaning suvli komponentida kislotalar (formik kislota,fosforik kislota,trifluoroasetik kislota,sirka kislotasi),tuzlar bo'lishi mumkin.Va mobil fazaning tarkibi tahlil (izokratik elyusiya) yoki o'zgarish (gradient elyusiya) vaqtida doimiy bo'lishi mumkin.Izokratik elyusiya ko'pincha juda boshqacha xususiyatlarga ega bo'lgan molekulalarni ajratish uchun ishlatiladi.Gravitatsion elutsiya jarayonida elutsiya ko'pincha past kuchli tarkibdan yuqori quvvatli tarkibga o'zgaradi.Harakatlanuvchi fazaning elutsiya kuchi uning tahlil qiluvchi moddalarni qanchalik tez harakatlanishini ko'rsatadi (ya'ni,sekinlashuv vaqti qisqa). Teskari fazali suyuqlik xromatografiyasida ishlatiladigan gradientli elyusiyaga misol sifatida 5% suv yoki suvli buferdagi asetonitril eritmasini 5-25 daqiqa ichida 95% gacha oshirish mumkin.Ba'zi gradient elyusiya dasturlarida harakatlanuvchi fazaning tarkibi ma'lum vaqt davomida doimiy bo'lib qolishi mumkin. Misol uchun, 5% li asetonitril eritmasini 1-3 daqiqa davomida infuzion qiling va keyin asta-sekin konsentratsiyani chiziqli funksiya bilan 95% eritmaga oshiring.

Harakatlanuvchi fazaning tarkibi (elyuent deb ham ataladi) tahlil qiluvchi moddalar va statsionar faza o'rtasidagi o'zaro ta'sir kuchiga qarab tanlanadi,chunki tahlil qiluvchi moddalarni ajratish ularning ikki fazaga yaqinligi sababli taqsimlanishiga asoslanadi.Bu jarayon suyuqlik-suyuqlik ekstraktsiyasiga o'xshaydi,ammo xromatografiya paytida bu jarayon uzluksizdir.Misoldagi suv/asetonitril gradientini ko'rib chiqaylik, bunda hidrofobik analizatorlar keyin elutsiya (kolonkadan oqib chiqish) sodir bo'ladi,chunki dastlab harakatlanuvchi fazadagi suv miqdori katta bo'ladi,keyin undagi organik erituvchi miqdori ortib borishi bilan hidrofobik analitlar mobil fazada ko'proq eriy boshlaydi

Ustun to'ldiruvchining tabiatiga va namunadagi tarkibiy qismlarga qarab,mobil fazaga turli xil qo'shimchalar (masalan,kislotalar,tuzlar) qo'shilishi mumkin.Ko'pincha eng yaxshi taqsimotni beradigan vaziyatni aniqlash uchun bir nechta tajribalar o'tkaziladi. Bu jarayon usul ishlab chiqish deb ataladi.

Tarix va rivojlanish 
HPLC usuli paydo bo'lishidan oldin olimlar oddiy suyuqlik xromatografiyasidan foydalanganlar.Erituvchilarning tezligi faqat tortishish kuchiga bog'liq bo'lganligi sababli,bunday tizimlarning oqim tezligi juda past edi.Ba'zi topshiriqlar soatlab,ba'zan bir necha kun davom etdi.O'sha paytda gaz xromatografiyasi (GK) suyuq xromatografiyaga (LC) nisbatan kuchliroq usul hisoblangan,ammo yuqori qutbli,yuqori molekulyar og'irlikdagi biopolimerlarni gaz bilan ajratish mumkin emas edi.GC biokimyogarlar uchun juda samarasiz bo'ldi, chunki ko'plab tahlilchilar yuqori haroratga toqat qilmaydilar. Natijada, yangi usullar taklif qilindi va HPLC ning rivojlanishiga olib keldi.

1941-yilda Martin va Singxning fundamental ishlaridan so'ng,1960-yillarda Kal Giddins,Jozef Xuber va boshqalar zarrachalar hajmini (zarralar o'sha paytda taxminan 150 mkm edi) va yuqori bosim bilan oqim tezligini kamaytirish orqali LC samaradorligini oshirish mumkinligini taklif qilishdi..1960-yillarning oʻrtalarida boshlangan ushbu farazlarga asoslangan keng koʻlamli tajribalar 1970-yillargacha davom etdi.Dastlabki tadqiqotlar LC qismlarini yaxshilashga intildi, natijada HPLC qurilmalarini ishlab chiqishda katta rol o'ynagan yuqori gözenekli Zipax materiali paydo bo'ldi.

1970-yillarda ko'plab asboblar va qurilmalar ishlab chiqildi.Tadqiqotchilar turli xil nasoslar va injektorlar yordamida HPLC tizimlarining original dizaynlarini ishlab chiqdilar.Ushbu tadqiqotlarda gaz kuchaytirgich nasoslari tez-tez ishlatilgan,chunki ular doimiy bosimni saqlab turishga qodir va muhrlanish va nazorat valflarini talab qilmaydi.Qurilmaning rivojlanishiga eng katta hissa Dupont IPD sanoat polimerlari bo'limi tomonidan qo'shildi.Misol uchun,ular birinchi bo'lib past hajmli gradient qurilmalarini ishlab chiqdilar va septik injektorlarni pastadirli injektor klapanlari bilan almashtirdilar.

Asboblarni ishlab chiqish juda muhim bo'lsa-da,HPLC tizimlarining rivojlanishi ko'p jihatdan zarrachalar materiallarini ishlab chiqishga bog'liq.Gozenekli qatlamli zarrachalar paydo bo'lishi bilan,tadqiqotlar asosan mahsuldorlikni oshirish uchun ularning hajmini kamaytirishga qaratilgan.Biroq,xodimlarni qisqartirish ko'proq muammolarni keltirib chiqardi.Buning sababi shundaki,suyuqlik fazasini juda kichik zarrachalar bilan to'ldirilgan ustunlar orqali o'tkazish uchun katta bosim kerak va bunday ustunlarni bir tekisda to'ldirish katta muammo edi.Shuning uchun zarrachalar hajmi kamayganligi sababli u orqali harakatlanuvchi fazani o'tkaza oladigan qurilmani ixtiro qilish kerak edi

Ushbu muammolar ultra yuqori samarali suyuqlik xromatografiyasining (UHPLC) rivojlanishiga olib keldi.Ushbu usullarning zarracha hajmi 2 mikrondan kam,bosim esa 1200 atmosferaga yetishi mumkin

Manbalar