A tendencia e de um aperfeicoamento cada vez maior da eficiencia da terapia genica. De uma forma generica, as etapas envolvidas em um experimento de terapia genica sao: o isolamento do gene, a construcao de um vetor, a transferencia para celulas no tecido-alvo, e a producao da proteina codificada e expressa pelo gene terapeutico nessas celulas. A transferencia do gene para celulas esta mostrada na figura ao lado.Para introducao de genes em organismos atraves de terapia genica, duas estrategias basicas podem ser utilizadas: in vivo e ex vivo. Na estrategia in vivo, vetores eficientes (como os adenovirus) podem levar o transgene diretamente ao orgao-alvo adequado (como o figado) por aplicacao direta no organismo (como a injecao endovenosa), levando a eficiente expressao do transgene. A estrategia ex vivo baseia-se na modificacao de celulas (como pela infeccao por um vetor retroviral) de um tecido-alvo (como os linfocitos), retiradas de um paciente e cultivadas in vitro. Essas celulas selecionadas, em geral atraves de uma marca de resistencia a antibioticos, que sao expandidas e reintroduzidas no paciente, irao expressar o gene exogeno desejado. A possibilidade de realizar protocolos ex vivo tem assumido perspectivas novas na associacao de protocolos de terapia genica e uso de terapia celular, atraves da modificacao genetica de celulas-tronco, que apresentam diferenciacao em varios tecidos potenciais. Basicamente, pequenas moleculas de RNA sao sintetizadas nas celulas, a partir do seu genoma, de modo a produzir estruturas similares a grampos, formando moleculas de RNA dupla-fita que controlam a expressao de genes celulares, seja a partir da degradacao do RNA mensageiro, seja a partir de um bloqueio da sintese proteica. Esse sistema interfere na expressao genica das celulas, e por isso recebeu o nome de RNA interferencia (RNAi). A descoberta do mecanismo de RNAi mudou completamente a forma como entendemos o metabolismo de controle genetico na celula humana, e tambem propiciou uma ferramenta poderosa para inibir genes especificos e assim de terminar sua funcao na celula. Isso pode ser obtido pela introducao de uma pequena molecula duplex de RNA (19 a 30 pares de base) diretamente nas celulas em cultura, visando a o silenciamento especifico do gene-alvo a ser estudado. Essas moleculas, conhecidas como si RNA (small interfering RNA), devem ser complementares a sequencia do gene-alvo e podem reduzir a expressao deste em ate 80%. Alternativamente, vetores (em geral derivados de virus, como adenovirus , retrovirus ou virus adenoassociados) podem tambem ser usados par a entregar, no interior das celulas, genes que expressam uma molecula de RNA palindromica, que pode gerar uma duplex de RNA na forma de grampo , conhecida como shRNA (do ingles short hairp in RNA). Como o siRNA, o shRNA tem como objetivo o silenciamento do gene-alvo em estudo, apresentando a possibilidade de um silenciamento permanente nas celulas, no caso de uso d e retrovirus. O mecanismo d e silenciamento genico por RNAi e ilustrado n a Figura abaixo. Em 1977, os pesquisadores Michael Wigler e Richard Axel conseguiram a primeira correcao genetica propriamente dita em celulas de mamifero cultivadas in vitro. Esses pesquisadores inseriram o gene que codifica a enzima timidina