o sistema de recombinacao em bacterias CRE-loxP (Chambers, 1994). Nesse microorganismo, duas sequencias especificas de 38 pb, denominadas loxP, sao reconhecidas pela proteina CRE do bacteriofago P1. Por meio da recombinacao entre duas sequencias loxP, a proteina CRE promove a remocao da sequencia de DNA dentre estas sequencias,resultando em uma delecao. O sistema CRE-loxP pode ser usado junto com a recombinacao homologa para se criarem mutacoes no genoma do camundongo (Chambers,1994). Nesse caso, o vetor de recombinacao contem, alem da cassete de expressao neo, duas sequencias loxP delimitando a regiao a ser deletada (Figura 5). O primeiro evento de recombinacao homologa introduzira as sequencias loxP nos sitios especificos do gene alvo. Um segundo evento de recombinacao, mediado pela proteina CRE, levara a delecao a regiao do alelo recombinante flanqueada pelas sequencias loxP. A recombinacao mediada por CRE pode ser feita ainda nas celulas ES em cultura, atraves da expressao transiente de CRE que ha nelas. Uma vantagem desse sistema e que, com ele, o geneneo nao fica inserido no gene alvo. A presenca de neo em introns de genes pode introduzir sequencias que atrapalhem o splicing correto do gene alvo, ou que, de alguma ou outra forma, diminuam o nivel de expressao do alelo mutado ou de genes na sua proximidade. Esse tipo de efeito ja foi descrito em alguns genes (Pereira et al., 1997; Pereira et al., 1999). Alternativamente, o segundo evento de recombinacao pode ser realizado in vivo. Dessa forma, controlando-se o padrao temporal e o espacial da expressao de CRE, podese controlar o periodo de desenvolvimento e os tecidos onde a mutacao sera induzida, o que chamamos de mutacao condicional. Esse sistema e utilizado quando se deseja estudar o efeito de mutacoes que sao letais quando presentes desde a concepcao ou em todos os tecidos do animal. A combinacao dessas estrategias de manipulacao do genoma do camundongo, quando realizadas em celulas ES, permitem a criacao de linhagens de animais mutantes.Estabelecimento de novas linhagens de celulas ES:Um parametro critico para uso de celulas ES na geracao de modelos animais e a sua pluripotencia, que pode ser perdida durante o cultivo prolongado. O uso de linhagens envelhecidas dessas celulas pode levar a uma baixa frequencia de recombinacao homologa e a nao colonizacao da linhagem germinativa de animais quimericos (Nagy e Rossant, 1993).Celulas ES murinas comerciais saoUm parametro critico para uso de celulas ES na geracao de modelos animais e a sua pluripotencia, que pode ser perdida durante o cultivo prolongado. O uso de linhagens envelhecidas dessas celulas pode levar a uma baixa frequencia de recombinacao homologa e a nao colonizacao da linhagem germinativa de animais quimericos (Nagy e Rossant, 1993). Celulas ES murinas comerciais sao caras e podem ser usadas durante um tempo limitado, por ja estarem em cultivo ha a um periodo relativamente longo. Assim, para a producao a longo prazo de animais transgenicos e fundamental a obtencao de novas linhagens de celulas ES. Nos estabelecemos tres novas linhagens de celulasES a partir do botao embrionario de blastocistos de camundongos 129/Sv (pelagem agouti): USP-1, USP-2 e USP-3. Sua pluripotencia foi