RNAs pequenos, que normalmentechamamos de miRNoma, um RIN de 6 7seria o minimo aceitavel.Fig. 2 Eletroferograma mostrando amostras de RNA total integro (RIN 10) e extremamentedegradado (RIN 2). Fonte: https://www.chem.agilent.com/Library/applications/5989-1165EN.pdf.Neste ponto voce podese perguntar: Bem, se eu preciso fragmentar o RNA durante o preparo dabiblioteca, por que eu nao posso usar um RNA ja fragmentado?. A resposta podeate parecer simples demais, mas e algo querealmente precisa ser levado em consideracao. Um RNA que ja esta naturamentedegradado dificilmente sofreu uma degradacao inteiramente aleatoria e,certamente, isso se refletira em um vies de analise no final do processo, comuma representacao alterada dos diferentes RNAs presentes na amostra inicial.Ha ainda um outroponto bastante critico relacionado a amostra inicial, que e a quantificacao doRNA. Enquanto a praticidade e o custo reduzido nos tendenciam a usar o Nanodrop(ou equipamento similar), e preciso ter em mente que os espectofotometros, deforma geral, extrapolam as quantificacao, pois mensuram nao apenas o RNA, mastambem o DNA e outras moleculas presentes na solucao. Nao e raro vermos umasuperestimativa de ate 10X em muitas amostras. Tendo isso em mente, a melhoralternativa para quantificacao do RNA, assim como do DNA e Proteinas, e afluorometria, como o Qubit, que usa um corante especifico para cada tipo de moleculaa ser quantificada (RNA, DNA e Proteina), garantindo a especificidade daquantificacao. Por outro lado, o uso do Nanodrop nao esta dispensado, com ele epossivel avaliar a qualidade da amostra atraves das relacoes 260/230 e 260/230,que podem indicar a presenca de proteinas e solventes organicos. Estatriangulacao - Bioanalyzer x Nanodrop x Qubit - e peca chave para os trabalhoscom RNA.Tendo analisado aqualidade do RNA total, e preciso agora depletar o RNA-ribossomal, que representade 90 a 95% de todo o RNA presente nas celulas humanas, por exemplo. Aquantidade de rRNA e muito grande, e, sem um tratamento para elimina-las, seraoproduzidos apenas resultados desses rRNAs. A deplecao do RNA ribossomal podeser feita atraves de kits como o Ribominus . Outra estrategia e isolar apenas o mRNA, usando, por exemplo, kits do tipo poli-A. A Life Technologies tem otimas solucoes para varios tipos de amostras. Independente de usar um kit para deplecao do rRNA ou um kit que isola os mRNAs a partir da sua cauda poli-A, ou mesmo ter interesse apenas nos microRNAs, e sempre recomendado fazer a extracao do RNA total inicialmente, pois e apenas com o RNA total que podemos acessar o RIN. Depois desta analise inicial do RIN podemos seguir com o protocolo de deplecao ou enriquecimento dos mRNAs ou microRNAs e quantificar com o Qubit para iniciar o preparo da biblioteca, observando atentamente todos os passos do protocolo, que ja foi extensivamentevalidado.Para mais informacoes sobreRNA-seq, veja as publicacoes abaixo e acesse a pagina da LifeTechnologies. Voce pode escolher entre as plataformas IonTorrent PGM e Ion Proton, de acordo coma complexidade do seu organismo modelo.RNA sequencing - advances, challenges and opportunities - 2010.pdfTranscriptome analysis using next-generation sequencing - 2013.pdf