entretanto, permite a realizacao da tecnica de maneira simples.Como parece nao ser possivel ligar a flowcell (placa de vidro) sequencias muito grandes de DNA, os gurus da Illumina inventaram uma tecnica eficiente para selecionar extremidades de clones grandes e liga-los de forma a permitir o sequenciamento de suas extremidades.O truque de biologia molecular realizado pelos tecnicos da Illumina consiste nos seguintes passos:Corta-se o DNA e purifica-se moleculas do tamanho desejadoLiga-se biotina na extremidade das moleculasCirculariza-se o DNARealiza-se a purificacao do DNA circularizadoCorta-se o DNA circular em fragmentos de 400-600bp (esse tamanho de fragmento ja pode ser ligado a flowcell)Seleciona-se entre os fragmentos cortados, aqueles que possuem biotinaLiga-se os adaptadores nas sequencias com biotinaSequencia-se a partir dos dois lados (paired-end sequencing)O que se faz, portanto, e reunir as extremidades que se deseja sequenciar atraves da circularizacao do genoma e entao retirar as partes que nao correspondam as extremidades. Apenas as regioes da extremidade serao sequenciadas. E uma tecnica interessante e elegante, embora exija mais trabalho tecnico na bancada.A tecnica de sequenciamento das extremidades de um inserto contendo entre 2-5Kb e chamada de mated-pair sequencing pela empresa Illumina.: E como sequenciamos extremidades de clones entre 500bp-2Kb ou maiores do que 5Kb? :.No sitio da Illumina nao esta claro o que fazer caso se deseje sequenciar clones que tenham um tamanho intermediario entre 500bp e 2Kb. E teoricamente possivel que o sequenciamento mais simples por paired-ends funcione, embora talvez nao de resultados muito satisfatorios devido a problemas na bridge-PCR. E teoricamente possivel supor tambem que insertos maiores do que 5Kb poderiam funcionar atraves da tecnica de mated-pairs para produzir as sequencias contendo apenas as extremidades das sequencias. Entretanto talvez seja preciso entrar em contato direto com a empresa para verificar mais informacoes a respeito destes detalhes.====[1] Adams MD, Dubnick M, Kerlavage AR, Moreno R, Kelley JM, Utterback TR, Nagle JW, Fields C, Venter JC. Sequence identification of 2,375 human brain genes. Nature. 1992 Feb 13;355(6361):632-4.[2] Fleischmann RD, Adams MD, White O, Clayton RA, Kirkness EF, Kerlavage AR, Bult CJ, Tomb JF, Dougherty BA, Merrick JM, et al. Whole-genome random sequencing and assembly of Haemophilus influenzae Rd. Science. 1995 Jul 28;269(5223):496-512.[3] Adams MD, Celniker SE, Holt RA, Evans CA, Gocayne JD, Amanatides PG, Scherer SE, Li PW, Hoskins RA, Galle RF, George RA, Lewis SE, Richards S, Ashburner M, Henderson SN, Sutton GG, Wortman JR, Yandell MD, Zhang Q, Chen LX, Brandon RC, Rogers YH, Blazej RG, Champe M, Pfeiffer BD, Wan KH, Doyle C, Baxter EG, Helt G, Nelson CR, Gabor GL, Abril JF, Agbayani A, An HJ, Andrews-Pfannkoch C, Baldwin D, Ballew RM, Basu A, Baxendale J, Bayraktaroglu L, Beasley EM, Beeson KY, Benos PV, Berman BP, Bhandari D, Bolshakov S, Borkova D, Botchan MR, Bouck J, Brokstein P, Brottier P, Burtis KC, Busam DA, Butler H, Cadieu E, Center A, Chandra I, Cherry JM, Cawley S, Dahlke C, Davenport LB, Davies P, de Pablos B, Delcher A, Deng Z, Mays AD, Dew I, Dietz SM, Dodson K, Doup LE, Downes M, Dugan-Rocha S, Dunkov BC, Dunn P, Durbin KJ, Evangelista CC, Ferraz C,