A construcao de moleculas de DNA recombinante, ou seja, a ligacao de segmentos especificos de moleculas de DNA de origens diferentes, e uma tecnica que pode ser desenvolvida gracas a descoberta das enzimas de restricao ou endonucleases.O que sao essas enzimas?As enzimas de restricao foram descobertas e isoladas de inumeras especies de bacterias as quais tem a funcao de protege-las de infeccoes virais. Os virus bacterianos, ou fagos, ao invadirem o interior da bacteria, tem seu DNA cortado em sitios especificos, causando assim a restricao de seu ciclo de replicacao que levaria a lise ou destruicao da bacteria.Como funcionam as enzimas de restricao?As enzimas de restricao sao proteinas que tem a capacidade de reconhecer, na dupla helice do DNA, sitios de clivagem, ou seja, sequencias especificas de 4 ou 6 bases. Uma vez reconhecido, e realizado um corte especifico em cada ponto ou sitio em que as moleculas da enzima se ligam.Esses sitios, alem de estarem presentes no virus, tambem existem no DNA de todos os outros organismos, inclusive na propria bacteria que produz a enzima.Para evitar que seu proprio DNA seja cortado e, portanto, tornado inativo na bacteria, esses sitios de restricao aparecem ligados a uma molecula do grupo metil (CH3) o que impede a acao da enzima.Uma das caracteristicas mais importantes dessas enzimas e a sua especificidade, ou seja, uma mesma molecula de DNA submetida a acao de uma enzima e sempre cortada nos mesmos pontos e gera um conjunto de fragmentos de mesmo tamanho. Essa caracteristica permite uma analise relativamente grosseira, porem bastante efetiva do ponto de vista pratico na identificacao de diferentes moleculas de DNA, permitindo o diagnostico de organismos contendo pequenas alteracoes nas bases do material genetico. E obvio que, quaisquer duas moleculas de DNA de mesmo tamanho, contendo os mesmos sitios de restricao nas mesmas posicoes, resultam em conjuntos de fragmentos de tamanho identico.Da mesma forma, porem, quaisquer alteracoes no DNA fora dos sitios digeridos pela enzima nao sao detectadas por esse metodo. Como esses sitios sao relativamente raros (em geral bem menos de 1 por 1000 pares de bases - pb), moleculas diferentes podem apresentar o mesmo padrao de fragmentos ao serem cortadas com enzimas.Enzimas de restricaoOrigem Sequencia de restricao Extremidade BamHIBacillus amyloliquefaciens-G-G-A-T-C-C--C-C-T-A-G-G-Sticky EcoRIEscherichia coli-G-A-A-T-T-C--C-T-T-A-A-G-StickyHindIIIHaemophilus influenzae-A-A-G-C-T-T--T-T-C-G-A-A-Sticky KpnIKlebsiella pneumonia-G-G-T-A-C-C--C-C-A-T-G-G-Sticky PstIProvidencia stuartii-C-T-G-C-A-G--G-A-C-G-T-C-StickySacIStreptomyces achromogenes-G-A-G-C-T-C--C-T-C-G-A-G-StickySalIStreptomyces albue-G-T-C-G-A-C--C-A-G-C-T-G-StickySmaISerratia marcescens-C-C-C-G-G-G-Blunt-G-G-G-C-C-C-SphIStreptomyces phaeochromogenes-G-C-A-T-G-C--C-G-T-A-C-G-StickyXbaIXanthomonas badrii-T-C-T-A-G-A- -A-G-A-T-C-T-StickyComo identificar os fragmentos cortados?A separacao de fragmentos de DNA de diferentes tamanhos pode ser feita atraves de um processo relativamente simples e rapido, a eletroforese em gel de agarose. Este gel representa, na verdade, uma peneira ou matriz capaz de retardar diferencialmente o movimento de moleculas de tamanhos variados. A molecula de DNA, devido a presenca do acido fosforico, apresenta carga negativa, de modo que, quando submetida a um campo eletrico, em pH neutro, e atraida para o polo positivo. A primeira etapa do processo da eletroforese consiste em se colocar numa cavidade ou poco, em uma das extremidades do gel, uma solucao contendo a molecula do DNA cortado. Em seguida, deve-se fazer uma corrente eletrica passar pelo gel colocando o polo positivo (anodo) na extremidade oposta. Desta forma,