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sobre a sela de um lado para ele cair do outro logo em seguida." Martinho Lutero"uando um homem tem forca de vontade, os deuses dao uma ajuda." Esquilo"e os homens sao assim tao maus apesar da ajuda da religiao, como seriam eles sem ela?" Benjamim Franklin"Nao temos tanta necessidade da ajuda dos amigos quanto da certeza da sua ajuda." Epicuro
O inoculo bacteriano padronizado (30 mL) foi vertida sobre os tubos, homogeneizada e incubou-se a 36,5 C durante 24 h. As amostras retiradas dos tubos foram inoculados em placas de Petri contendo agar nutriente para verificar o crescimento bacteriano. A inibicao do crescimento bacteriano era visivel como um caldo claro e a presenca de crescimento foi detectada pela presenca de turbidez. O controlo positivo foi o tubo contendo o caldo de cultura e o inoculo bacteriano, o controlo negativo continha o caldo de cultura e a amostra de mel. A experiencia foi repetida tres vezes.Concentracao bactericida minima (CBM) de melO MBC e a concentracao mais baixa de mel capaz de matar uma populacao bacteriana. Foi determinado utilizando os tubos incubados a partir do ensaio de macrodiluicao, onde uma amostra de 100 ul de cada tubo foi inoculado em placas de Petri contendo agar nutriente. As placas foram incubadas a 36,5 C durante 24 h.A MBC foi considerada a concentracao mais baixa de mel onde nenhum crescimento bacteriano foi observado na superficie do agar (99,9% de morte bacteriana) [ 11 ].Todos os testes foram repetidos tres vezes.A analise estatisticaTodos os resultados experimentais foram expressos como media desvio padrao (DP) de tres determinacoes. A presenca de uma diferenca significativa entre as amostras de mel foi determinada por one-way ANOVA seguido pelo teste de Tukey (p 0,05) comparacao utilizando BioStat 5.3.5.Extracao de compostos fenolicos de melExtraccao liquido-liquido com acetato de etilo, foi usado, de acordo com a metodologia descrita por Wahdan [ 12 ]. Uma solucao de estoque de 20% de mel foi preparada em agua destilada, e depois de se separar de 50 ml desta solucao, o pH foi ajustado a 3,5. Para esta 50 ml de aliquota de 50 ml de acetato de etilo e 1 g de cloreto de sodio foi adicionado num funil de separacao. O funil foi agitada durante 5 min, para a extraccao de compostos fenolicos. A fraccao de acetato de etilo foi, entao, retirado e armazenado num tubo de ensaio. Este procedimento foi repetido tres vezes. Apos a extraccao, a 150 ml de extracto de acetato de etilo mel, foi obtido e submetido a evaporacao sob vacuo a 30 C. O extracto concentrado foi armazenado a -18 C.Preparacao de amostras para cromatografiaUma aliquota (2 ml) de cada amostra concentrada foi recolher com uma seringa de 5 ml esteril e filtrados atraves de membranas de Teflon de 0,45 um. As amostras filtradas foram armazenadas em frascos esterilizados de 2 mL. Antes da injeccao na coluna de cromatografo, 400 uL das amostras foram adicionadas a 600 mL de metanol previamente filtrada.Preparacao de padroesA apigenina (5 mg) e pinocembrin (25 mg) foram adquiridos da Sigma-Aldrich Co. O padrao rutina foi gentilmente doado pelo Laboratorio de Fitoquimica da Universidade Federal do Amazonas (UFAM). As solucoes concentradas foram preparadas por dissolucao de cada composto no metanol de grau HPLC. A apigenina e rutina, foram diluidos em 10 ml de metanol e pinocembrina foi dissolvido em 50 ml do solvente. As solucoes-padrao foram filtradas atraves de membranas de Teflon de 0,45 e injectado no
cromatografo de coluna sob as mesmas condicoes de analise utilizadas para as amostras de mel.Cromatografia liquida de analise de alta performance (HPLC)A analise foi realizada num sistema de HPLC Varian equipado com um amostrador automatico. Para a separacao dos componentes fenolicos foi utilizado um de fase inversa C-18 de coluna (150 x 4,6 mm x 1/4). A fase movel consistiu de um sistema de gradiente isocratico como descrito por Ferreres et ai. [ 13 ], com algumas modificacoes. Agua e metanol foram usadas como o eluente a um caudal de 1,00 ml min -1 . Para conseguir uma melhor separacao, um gradiente de eluicao foi utilizado a partir de 30% de metanol, que permaneceu isocratico durante os primeiros 15 min, seguido de 40% de metanol em 20 min, 45% de metanol em 30 min, 60% de metanol em 50 min e 80% de metanol em 52 min antes de se tornar isocratica novamente ate ao final da analise, em 60 min. Cromatogramas foram registrados em 340 e 290 nm.Identificacao de flavonoidesOs flavonoides foram identificados atraves de duas tecnicas. Em primeiro lugar, a comparacao entre cromatografica os tempos de retencao de pico obtidos para as amostras e para os flavonoides padrao foi realizada. A tecnica de adicao de padrao foi tambem utilizado, o qual consiste na adicao de quantidades conhecidas de cada padrao de flavonoides na amostra. Se houver um aumento da altura do pico, e, assim, na zona de pico, sem o aparecimento de ombros ou distorcoes, isto e uma forte evidencia de que este pico representa o flavonoide de interesse. Uma comparacao dos tempos de retencao de pico foi tambem realizada.Resultados e discussaoOs ensaios de difusao em agarOs resultados para a atividade antibacteriana do mel de abelhas sem ferrao M. compressipes manaosensis (mel A) coletados durante as estacoes seca e chuvosa sao apresentados na Tabela 2 . Pode-se observar que ambos os Gram-positivas ( S. aureus ) e Gram negativas ( E. coli, S. sonnei, P. vulgaris e Klebsiella sp . bacterias) foram inibidos pelo mel coletadas durante a estacao seca. Muitos estudos tem demonstrado a atividade antibacteriana do mel contra bacterias Gram positivas e Gram, e S. aureus e E. coli estao entre os microrganismos mais estudados [ 2 , 14 ]. No entanto, a maioria desses estudos utilizaram o mel produzido por Apis mellifera abelhas, e apenas alguns estudos sobre a atividade antibacteriana do mel de abelhas sem ferrao da Amazonia tem sido relatados, incluindo a investigacao da influencia da sazonalidade tropical em atividade antibacteriana [ 15 ].Tabela 2. Diametro da zona de inibicao (mm) produzido por mel das abelhas sem ferrao Melipona compressipes manaosensis coletadas durante as estacoes seca e chuvosa para diferentes cepas de bacterias, usando ensaios de difusao em agarO mel coletado durante a estacao seca apresentou maior atividade, inibindo cinco dos seis microorganismos, em diferentes taxas de diluicao. Esta amostra de mel foi capaz de inibir as bacterias gram-positivas e gram negativas. O mel coletado durante a estacao chuvosa, por outro lado, apresentaram menor atividade, inibindo apenas dois microorganismos quando nao diluido. Estes resultados indicam
fatores mais importantes associados com atividade antimicrobiana no mel [ 18 ]. Dado que a presenca de peroxido de hidrogenio nao foi investigada no presente estudo, nao foi possivel verificar se a actividade, ou foi, na verdade, devido a este composto.Pode notar-se que alguns microrganismos patogenicos foram inibidos por mel diluida na proporcao de 1:4 (20,0% v / v), 1:6 (14,3% v / v) e 1:8 (11,1% v / v), que sao mais diluida do que a necessaria concentracao de 22%, de acordo com Chirife et ai. [ 19 ]. A concentracao minima de uma solucao de acucar necessaria para impedir o crescimento da maioria das bacterias patogenicas e de 29% (w / v) juntamente com um valor de actividade de agua ( W ) de entre 0,86 e 0,89. Estes valores para a concentracao de acucar e uma w sao equivalentes a uma concentracao de 22% de mel [ 4 ].Os resultados para a atividade antimicrobiana de tres diferentes meis produzidos pela Apis sp. abelhas (vendido comercialmente) sao apresentados na Tabela 3 .Pode-se observar que alguns microorganismos sao tambem inibidas por este tipo de mel e que mel B apresentou a actividade mais elevada, inibindo o crescimento de cinco dos seis organismos de ensaio.Tabela 3. Diametro da zona de inibicao (mm) produzido por meis comerciais de Apis sp. abelhas para diferentes cepas bacterianas, utilizando ensaios de difusao em agarOs resultados apresentados nas Tabelas 2 e 3 indicam que a actividade antimicrobiana exibiu nao pode ser atribuido exclusivamente a pressao osmotica de acucares presentes no mel. Considerando-se que o mel das abelhas sem ferrao tem uma viscosidade mais baixa e apresenta uma cristalizacao mais lenta, quando comparadas com o mel produzido por A. mellifera abelhas [ 20 ], pode-se inferir que as solucoes preparadas com o mel de M. compressipes manaosensis poderia ser ainda mais diluida do que as solucoes preparadas com os meis comerciais obtidos a partir de Apis sp., submetidos as mesmas taxas de diluicao.E evidente que a pressao osmotica contribui para a accao de solucoes de elevada concentracao de acucar, mas os resultados aqui obtidos revelam que a actividade atribuida a osmose e exercida por estes meis nao e suficiente para inibir o crescimento de algumas especies bacterianas. Assim, estes resultados indicam que ha outros factores que contribuem para a actividade antimicrobiana observada.Portanto, os resultados apresentados aqui sugerem que esta actividade pode ser atribuida aos componentes de origem entomologica e / ou de origem fitoquimico, juntamente com a pressao osmotica. Alguns autores tem sugerido que a especie de abelha e o principal responsavel pela atividade antimicrobiana[ 21 ], enquanto outros tem verificado que a regiao fitogeografica e o principal fator responsavel pelas diferencas observadas na atividade antimicrobiana [ 15 ]. No entanto, Bogdanov [22 ] sugeriu que ambos as abelhas e as plantas influenciam a atividade, atuando de forma sinergica.Comparando os resultados para a actividade das amostras de mel (Tabelas 2 e 3 ), pode ser verificado que a bacteria S. aureus foi inibida apenas por mel A partir da estacao seca e mel D. Mel A partir de
estacao seca inibiu S. aureus de crescimento quando aplicados directamente e em duas taxas de diluicao (valor CIM de 33,3% v / v). A maior zona de inibicao foi observada quando as amostras foram aplicados sem diluicao. E. coli foi inibida por todos os cinco amostras de mel, e mel B era que a amostra promoveu a maior zona de inibicao (valor de CIM de 50,0% v / v). S. sonnei estava inibir em quatro das cinco amostras de mel e a amostra B era que promoveu a maior zona de inibicao, quando em comparacao com as outras amostras de mel testadas neste estudo (valor de CIM de 14,3% v / v). No entanto, vale ressaltar que a maior zona de inibicao observado quando se utiliza mel A foi a taxa de diluicao de 1/1. A bacteria P. vulgaris foi inibida por tres amostras de mel, e mel B foi o exemplo que conduz ao maior zona de inibicao (valor de CIM de 14,3% v / v). Salmonella paratyphi foi apenas susceptiveis de mel B, a ser inibido ate que a taxa de diluicao de 1: 6 (valor de CIM de 14,3% v / v). A bacteria Klebsiella sp. foi inibida por tres amostras de mel, e novamente mel B apresentou os resultados mais promissores (valor de CIM de 50,0% v / v).Em geral, as maiores foram observadas zonas de inibicao quando as amostras foram aplicadas sem diluicao, excepto para o mel A contra S. sonnei , mostraram que a maior susceptibly quando o mel foi utilizado a uma taxa de diluicao de 1/1 (50,0% v / v). Estes resultados permitem-nos informar que o mel comercial de eucalipto (Mel B), nao so inibe o maior numero de microorganismos patogenicos, mas tambem apresentou o maior efeito sobre as bacterias testadas, uma vez que foi capaz de impedir o crescimento de bacterias em cinco dos seis taxas de diluicao avaliada.Um mel de M. compressipes manaosensis demonstraram um espectro de boa qualidade de actividade antimicrobiana, sendo capaz de inibir o crescimento de microorganismos (cinco por S. aureus, E. coli, S. sonnei, P. vulgaris e Klebsiella sp.). Dentro dos meis comerciais, mel B produzido pela Apis abelha (floracao predominante de eucalipto) apresentou a maior actividade, tambem a inibicao do crescimento de cinco microorganismos ( E. coli, S. sonnei, P. vulgaris, S. paratyphi e Klebsiella sp. ).Ensaios macrodiluicao bacterianasOs resultados anti-bacterianos obtidos nos ensaios de amostras de mel macrodiluicao sao apresentados na Tabela 4 .Tabela 4. resultados Antimicrobianos (ensaios macrodiluicao) obtidos para o mel produzido por Melipona abelhas sem ferrao e de meis comerciais produzidos por Apis sp. abelhas para diferentes cepas bacterianasA in vitro em estudos sobre a inibicao de agentes patogenicos que infectam feridas confirmou o amplo espectro de actividade amostras de mel, no caso de tanto o metodo de macrodiluicao [ 21 ] e no ensaio de difusao em agar [ 15 , 18 ]. A maioria dos testes antimicrobianos aplicados ao mel que envolvem a diluicao em caldo empregar a tecnica de microdiluicao [ 12 ], a qual e realizada numa escala menor
para o mel B. (B) cromatograma HPLC a 340 nm para C. mel ( C ) cromatograma HPLC a 340 nm para o mel D.Ao analisar os cromatogramas obtidos a 290 e 340 nm, e comparando os tempos de retencao por meio da sobreposicao dos picos observados, foi possivel detectar varios picos na regiao de monitorizacao dos flavonoides para todas as amostras de mel. No entanto, o flavonoides pinocembrina apigenina e nao foram identificados em nenhuma das amostras, o que indica que estes flavonoides nao estavam presentes nos tipos de mel utilizados neste estudo. Este resultado foi inesperado, uma vez que tem relatado a presenca destes flavonoides no mel, principalmente no mel produzido por Apis abelhas sp. Isla et al. [ 26 ] encontraram pinocembrin em meis do Noroeste argentino que apresentaram efeito inibitorio contra S. aureus , E. faecalis , E. coli , P. aeruginosa , K. pneumoniae e M. morganii . Tenore et ai. [ 27 ] detectaram pinocembrin em diferentes amostras de mel monoflorais da Italia. A apigenina foi encontrado em amostras de mel da Croacia, de acordo com Kenjeric et al. [ 28 ] e em amostras de meis de origem botanica diferente de diferentes regioes do Sudao, de acordo com Makawi et al. [ 29 ].No entanto, um pico para um mel com um tempo de retencao de 21,844 minutos (Figura 3 A), que e extremamente perto do pico do padrao de rutina (tempo de retencao de 22,855 minutos), foi observado (Figura 3 B).Figura 3. analise de HPLC de amostras de mel. (A) cromatograma HPLC a 340 nm para o mel de abelhas sem ferrao Melipona compressipes manaosensis . (B) cromatograma HPLC a 340 nm para o padrao rutina. (C) cromatograma HPLC a 340 nm para o mel Um (a) ea mesma amostra apos a adicao padrao de rutina (b) .A grande semelhanca entre os tempos de retencao sugere fortemente que este pico corresponde ao flavonoide rutina, que foi identificado em 340 nm (Figura 3 B).Mesmo assim, este requer a confirmacao de outras tecnicas analiticas para reforcar a identificacao molecula.Assim, a fim de confirmar a hipotese de que o pico com um tempo de retencao de 21,844 minutos correspondia a rutina, a tecnica de adicao de padrao foi utilizado, adicionando-se 10 ul do padrao de rutina com o mel numa amostra. A amostra foi adicionada com rutina foi injectada na coluna de cromatografo e observou-se que o pico com um tempo de retencao de 22,844 minutos aumentadas, sem deformacoes significativas (Figura 3 C). Esta observacao sugere que o pico com um tempo de retencao de 22,844 min corresponde ao flavonoide rutina. Este procedimento foi repetido tres vezes, e os mesmos resultados foram observados.Rutina foi identificado na amostra de mel com a maior atividade antimicrobiana. Este flavonoide foi previamente identificado como o responsavel pela actividade antibacteriana. Os estudos realizados por Singh et al. [ 30 ] mostraram que a rutina de Pteris vittata L. apresentaram atividade potente contra B. cereus , P.aeruginosa e K. pneumoniae com os valores de MIC de 0,03 mg / ml. Basile et ai.
Apis mellifera e Melipona spp. meis de Venezuela.Z Lebensmittel-Untersuchung Forschung A 1997, 204 : 43-47. Editor Texto Completo Borchers AT, CL Keen, Gershwin ME: Cogumelos, tumores, e imunidade: uma atualizacao.Exp. Biol Med 2004, 229 : 393-406. Rauha JP, Remes S, Heinonen M, Hopia A, Kahkonen M, Kujala T, Pihlaja K, Vuorela H, Vuorela P: efeitos antimicrobiana de extratos de plantas finlandesas que contem flavonoides e outros compostos fenolicos.Int J Food Microbiol 2000, 56 : 3-12. PubMed Abstract | Editor Texto Completo
tradicional, o mel obtido das abelhas sem ferrao possui valor nutricional superior, o que eleva significativamente o seu preco.Enquanto o mel convencional e vendido por R$ 3 o litro, o mel das abelhas selvagens chega a ser comercializado entre R$ 40 e R$ 50. Isso para o produtor, nao no supermercado. Aqui em Manaus, em Sao Paulo ou em Brasilia tivemos produtores que conseguiram vender por ate R$ 200 o litro, relata Francisco Gilberto Feitosa Maia, gerente de Desenvolvimento Regional Sustentavel da Superintendencia de Negocios, Varejo e Governo do Banco do Brasil.Alem da producao do mel e do polen, o meliponicultor pode diversificar ainda mais as suas atividades com a reproducao e venda de colmeias para outros produtores rurais. Com o uso da tecnica adequada, uma nova colmeia pode ser constituida em tres meses e chega a ser vendida por ate R$ 250.De acordo com Villas Boas, a criacao das abelhas selvagens ainda colabora com a preservacao da floresta amazonica e com o equilibrio do seu ecossistema. Antes de a tecnologia social ser difundida entre os produtores rurais, eles buscavam o mel no seu ambiente natural, em areas de floresta. Para isso, muitas vezes derrubavam uma arvore centenaria para acessar a colmeia, mas diferentemente das abelhas africanizadas e europeias, quando uma colmeia e destruida, as abelhas selvagens nao tornam a criar uma nova e morrem. Dessa forma, a coleta do mel no ambiente natural prejudica a polinizacao da floresta e contribui para o desaparecimento de especies de abelhas selvagens. Hoje, 20% das especies de abelhas sem ferrao correm risco de extincao na Amazonia.Durante a florada, que vai de julho a novembro, uma colmeia pode produzir ate 7,5 litros de mel. No restante do ano, os meliponicultores nao recolhem o mel produzido nas colmeias, assim nao prejudicam o desenvolvimento das abelhas e a sua reproducao, o que garante uma boa producao na epoca adequada para a coleta. Villas Boas esclarece que o investimento feito pelos produtores rurais na producao de mel por abelhas sem ferrao tem retorno em ate dois anos.Segundo o gerente de Desenvolvimento Regional Sustentavel do Banco do Brasil, uma das maiores dificuldades para a producao e a comercializacao do mel produzido pelas abelhas nativas da Amazonia e a falta de uma legislacao que regule e crie parametros para o setor. Um dos grandes problemas da meliponicultura no Brasil e a legislacao. Existe legislacao para a Apis, que e uma abelha importada, europeia, e nao tem para as abelhas sem ferrao, nativas. Entao, existe uma luta muito grande, em todo o Brasil, para que seja criada essa legislacao. Como pasteurizar e colocar esse mel com seguranca no mercado. Porque pode existir contaminacao, ja que produtores fazem o processo de muitos jeitos diferentes. Essa regulamentacao depende principalmente do Mapa [Ministerio da Agricultura Pecuaria e Abastecimento] e do Congresso, esclarece Feitosa.Mesmo com a dificuldade de trabalhar em um mercado ainda nao totalmente regulamentado, os criadores de abelhas selvagens da Amazonia se articularam e criaram, em 2000, a Associacao dos Apicultores e Meliponicultores do Amazonas, que ja conta com 80 associados. Conforme o presidente
da entidade, Sergio Carvalho de Souza, alguns poucos produtores ja conseguem enxergar a producao desse mel como a sua principal atividade. Porem, ele afirma que a Associacao defende que a meliponicultura seja encarada sempre como uma atividade complementar. A gente tenta focar que a meliponicultura nao e a atividade numero 1 de qualquer produtor, e uma atividade complementar. A atividade principal e a sua producao normal e o mel e um complemento, assim como a venda de colmeias.O jornalista viajou ao Amazonas a convite da Fundacao Banco do Brasil (FBB).
Sabor de surpresaMel de abelhas sem ferrao conquista a alta gastronomia e vale ate 15 vezes mais que o de Apis melliferapor Janaina Fidalgo | Fotos Roberto SebaAbelhas nativas tem colonias menos populosas que as meliferas do genero Apis. Produzem, portanto, quantidades bem menores de mel. Seletivas, nao se adaptam facilmente a qualquer lugar, porque dependem intimamente do ambiente onde vivem, da variedade floral de sua regiao. Padecem ainda por serem praticamente desconhecidas pela maioria dos brasileiros. Seu produto nem sequer pode, legalmente, ser chamado de mel denominacao ainda restrita ao fabricado pela introduzida Apis mellifera. Mesmo com tantas adversidades, ha produtores que preferem a meliponicultura a apicultura. So e possivel entender a escolha pelas meliponineas, as abelhas sem ferrao, ao se provar o mel. Tanto que quem conhece nao se importa de pagar mais caro por ele (alguns custam ate 15 vezes o valor do mel de Apis). As diferencas de sabor e aroma sao enormes. E ficam ainda mais perceptiveis quando o das nativas e comparado ao das Apis, degustados lado a lado. Ainda que o ultimo tenha variacoes, de acordo com as floradas e a regiao de producao, sua alta concentracao de acucares (e, consequentemente, sua baixa umidade) faz dele um mel comum. Esse sabor ao qual todos nos estamos habituados. Mel de mandacaia (a esq.), tujuba (centro) e tujumirim (a dir.)Por ter composicao fisico-quimica diferente, o mel das meliponineas tem nuances capazes de surpreender o paladar. Sao meis complexos, com notas particulares de sabor e de aroma. A primeira vez que provei um mel de abelha nativa tive aquela sensacao de ter perdido uma parte da minha existencia: ate agora me esconderam isso?, diz o gastronomo Roberto Smeraldi, diretor da Oscip Amigos da Terra Amazonia Brasileira. Sem duvida e sua delicada acidez que o torna um ingrediente tao versatil, um verdadeiro amigo do cozinheiro. Das saladas as carnes, dos peixes as sobremesas, uma gotinha faz a diferenca. Abelhas de urucu-amarela em acaoATALA E FA A acidez presente em todos, certamente sua caracteristica mais marcante, torna esse mel um produto vivo, mutante com o decorrer do tempo, conforme seu estagio de maturacao. Isso porque a concentracao maior de agua favorece a fermentacao e abre espaco para usos ate entao impensados na cozinha. Essa desestabilidade, aliada ao apelo de ser um produto nativo, algo tao em voga hoje na gastronomia, e justamente o que fascina os chefs de cozinha brasileiros. Precursor na defesa do mel de nativas, o chef Alex Atala esporadicamente usa mel de jatai, de mandacaia ou de tiuba em pratos do menu-degustacao do restaurante D.O.M. O desejo, mesmo, e incluir variedades de meis de abelhas nativas na Retratos do Gosto, marca dedicada a ingredientes brasileiros de pequenos produtores, capitaneada pelo chef em parceria com a Mie Brasil. Adorariamos e um dia vamos trabalhar com mel de meliponineas. Mas agora, sem legislacao, nao ha como. Pensamos em colocar algum outro (de Apis), mas o Alex nao quis de jeito nenhum. Ele quer o de abelha nativa, diz o empresario Gustavo Succi, da Mie Brasil. O Brasil padece com
uma politica alimentar feita por sanitaristas, diz Atala a Globo Rural. Enquanto empecilhos burocraticos privam os brasileiros de comprar livremente o brasileirissimo mel, pequenos produtores comercializam informalmente o ingrediente. Em Sao Paulo, o mais comum, com maior oferta, e o de jatai, um dos mais adocicados e com menor acidez as colonias tambem se desenvolvem bem no Parana, Santa Catarina e Rio Grande do Sul. Nas regioes Sudeste e Sul, encontra-se o de guaraipo, que tem um toque de frutas secas. Liquido e claro, o de mandacaia ocorre principalmente no Nordeste e destaca-se por sua acidez elevada.