Faits:
A. C.Y._ est décédé le 13 juin 1977 en Corse. Il a laissé, comme héritières, sa fille D.Y._ et sa femme A.X._, qui a par la suite épousé B.X._.
B. Le 5 juin 2003, A.X._ a ouvert une action successorale contre D.Y._. Dans sa réponse du 27 avril 2004, cette dernière a notamment allégué ce qui suit:
"2.13 La mort soudaine de C.Y._ donna lieu à de nombreuses rumeurs et fit sensation dans le canton de Fribourg, d'une part, parce que le de cujus était l'un des habitants les plus fortunés du canton et, d'autre part, parce que, malgré l'ouverture d'une enquête pénale, les circonstances du drame n'ont jamais pu être totalement élucidées. A cela s'ajoutait le fait que la demanderesse entretenait, déjà avant le décès de son premier mari, une liaison extraconjugale avec B.X._, son mari actuel, à l'époque vendeur de véhicules d'occasion.
2.15 La défenderesse est ressortissante allemande. Elle est domiciliée à Darmstadt, en Allemagne, ville dans laquelle est également établi le groupe Wella. En raison des circonstances restées toujours très mystérieuses de la mort de son père, la défenderesse évite, dans toute la mesure du possible, tout contact personnel avec la demanderesse. En d'autres termes, ce n'est pas uniquement en raison de la présente procédure que les relations de la défenderesse avec sa "belle-mère" sont tendues."
C. Le 28 juillet 2004, A.X._ a déposé une plainte pénale pour diffamation contre D.Y._, représentée par les avocats E._ et F._, estimant que les allégués précités étaient attentatoires à son honneur.
C.a Le 30 décembre 2004, le Juge d'instruction du canton de Fribourg a clos par un non-lieu la procédure ouverte contre D.Y._. Par arrêt du 30 mai 2005 et statuant sur recours de la plaignante, la Chambre pénale du Tribunal cantonal fribourgeois a annulé cette décision et renvoyé l'affaire à l'instruction.
Le 15 septembre 2006, le Juge d'instruction a clos par un non-lieu la procédure pénale dirigée contre D.Y._ et ses mandataires, la plainte ayant également été dirigée contre ces derniers. Par arrêt du 2 mai 2007, la Chambre pénale du Tribunal cantonal fribourgeois a admis le recours de A.X._, annulé la décision précitée et renvoyé la cause au Juge d'instruction.
C.b Le 9 novembre 2007, le Juge d'instruction a rendu une ordonnance de renvoi à l'encontre de D.Y._, E._ et F._.
Par jugement du 22 février 2008, le Juge de police de la Sarine a admis l'exception d'irrecevabilité de la plainte pénale soulevée par les prévenus et les a par conséquent acquittés. Par arrêt du 15 avril 2008, la Cour d'appel pénal du Tribunal cantonal fribourgeois a admis le recours de A.X._, annulé le jugement précité et renvoyé la cause au Juge de police pour nouvelle décision.
C.c Par jugement du 28 août 2008, ce magistrat a classé la procédure pénale instruite à la charge de D.Y._, E._ et F._, la plainte déposée par A.X._ étant prescrite depuis le 28 avril 2008. Il a rejeté les conclusions civiles prises par la plaignante et les prévenus et mis les frais de justice à la charge de l'Etat.
Par arrêt du 19 décembre 2008, la Cour d'appel pénal du Tribunal cantonal fribourgeois a partiellement admis le recours de A.X._ en ce sens qu'elle l'a renvoyée à faire valoir ses conclusions civiles devant le juge civil. Elle a mis les frais pénaux de l'instance de recours, fixés à 1'334 fr., à la charge de cette dernière.
D. A.X._ dépose un recours en matière pénale au Tribunal fédéral. Invoquant une violation des art. 29 et 9 Cst., elle conteste sa condamnation au paiement des frais pénaux de l'instance de recours.
Le Tribunal cantonal n'a pas formulé d'observations au recours. Le Ministère public a en revanche conclu à son admission.
Considérant en droit:
1. Invoquant le principe de la bonne foi et une violation des art. 29 et 9 Cst., la recourante conteste sa condamnation au paiement des frais pénaux de l'instance de recours.
1.1 Aux termes de l'art. 231 CPP/FR, celui qui, par un comportement irréfléchi, répréhensible ou incorrect, a donné lieu à la procédure ou en a rendu plus difficile le déroulement, peut être condamné à payer tout ou partie des frais (al. 1). Lorsqu'un moyen de droit est retiré, déclaré irrecevable ou rejeté, les frais sont, en principe, supportés par son auteur. En cas d'admission partielle, l'autorité statue selon sa libre appréciation (al. 2). Le sort des frais qui ne concernent que les prétentions civiles est réglé conformément au code de procédure civile (al. 3).
La bonne foi commande de ne pas mettre les frais et dépens d'une procédure de recours à la charge du recourant, lorsque ses conclusions ont été déclarées irrecevables à la suite d'un changement de jurisprudence (ATF 122 I 57 consid. 5d p. 61; 119 Ib 412 consid. 3 p. 415).
1.2 Dans sa décision du 15 avril 2008 (pièce n° 10076), la Cour d'appel pénal a énoncé qu'en application de l'art. 97 al. 3 CP l'action pénale ouverte pour diffamation par la recourante était imprescriptible, un jugement de première instance ayant été rendu le 22 février 2008 (cf. supra consid. C.b).
Dans son arrêt du 19 décembre 2008, statuant suite à l'appel déposé par la recourante en date du 1er octobre 2008, la même autorité, se référant à une nouvelle jurisprudence exposée dans l'ATF 134 IV 328 consid. 2.1 du 16 octobre 2008, a considéré que l'art. 97 al. 3 CP valait uniquement pour les jugements de condamnation et ne s'appliquaient pas aux verdicts d'acquittement ni aux décisions de non-lieu ou de classement de la procédure. Elle a constaté que la décision du 22 février 2008 n'était pas un jugement de condamnation et qu'il ne pouvait par conséquent empêcher la prescription de courir, conformément à l'ATF précité et contrairement à l'opinion qu'elle avait défendue dans sa décision du 15 avril 2008 avant que l'instance supérieure n'arbitrât cette controverse. Elle a donc jugé que la prescription de l'action pénale était en tout état de cause acquise depuis le 27 avril 2008 et que les autres griefs de la recourante n'avaient pas à être examinés.
Ainsi, la Cour d'appel pénal a modifié sa jurisprudence suite à l'ATF 134 IV 328 consid. 2.1, lequel a été rendu après le dépôt du recours cantonal de l'intéressée. Or, dans ce cas, il appartenait à l'autorité, au regard du principe de la bonne foi, de renoncer à mettre à la charge de la recourante un émolument judiciaire (ch. II du dispositif de l'arrêt attaqué). En effet, si cette dernière avait connu la nouvelle jurisprudence, elle aurait sans doute renoncé à recourir contre la décision du Juge de police et à encourir des frais. Dans ces circonstances particulières, la décision résultant d'un changement de jurisprudence ne doit pas lui causer de préjudice, de sorte que les frais de justice ne peuvent lui être imputés (cf. ATF 122 I 57 consid. 5d p. 61).
2. En conclusion, le recours est admis et l'arrêt attaqué réformé au chiffre II de son dispositif en ce sens que les frais de l'instance de recours sont laissés à la charge de l'Etat.
Vu l'issue du recours, il ne sera pas perçu de frais (cf. art. 66 al. 4 LTF) et le canton de Fribourg versera à la recourante une indemnité de dépens de 1500 fr. (cf. art. 68 al. 1 LTF).
Par ces motifs, le Tribunal fédéral prononce:
1. Le recours est admis et l'arrêt attaqué réformé au chiffre II de son dispositif en ce sens que les frais de l'instance de recours sont laissés à la charge de l'Etat.
2. Il n'est pas perçu de frais.
3. Le canton de Fribourg versera à la recourante une indemnité de dépens de 1500 fr.
4. Le présent arrêt est communiqué aux parties et au Tribunal cantonal de l'Etat de Fribourg, Cour d'appel pénal.
Lausanne, le 3 avril 2009
Au nom de la Cour de droit pénal
du Tribunal fédéral suisse
Le Président: La Greffière:
Favre Bendani