Ещё недавно, в 2016 году, бесспорное лидерство на рынке геномного секвенирования принадлежало США. Точнее – американской компании Illumina, разработавшей модельный ряд флуоресцентных секвенаторов. Рис. 1. Флуоресцентные секвенаторы компании Illumina
(Illumina Investor Presentation, August 18, 2017) Совершенствование этих приборов и используемой ими флуоресцентной технологии позволило к середине 2016 года уменьшить стоимость секвенирования генома человека до $1000.
Второе место в 2016 году занимала американская компания Thermo Fisher Scientific, развивающая полупроводниковую технологию секвенирования ДНК. Их секвенатор Ion S5, несмотря на сравнительно скромную производительность (до 12 Gb), вполне достойно конкурировал с настольными секвенаторами компании Illumina в нише таргетного (клинического) секвенирования. Рис. 2. Полупроводниковый секвенатор Ion S5 В сентябре 2017 года компания BGI объявила о начале приёма заявок на секвенирование геномов по $600, что сразу же вывело Китай в лидеры геномных гонок. Этот прорыв стал возможен благодаря созданию CNGB (China National GeneBank) — крупного центра, располагающего 150 флуоресцентными китайскими секвенаторами BGISEQ-500. Рис. 3. В «машинном зале» CNGB
http://www.presstv.com/Detail/2016/09/22/485893/China-national-gene-bank Правда, производительность одного американского NovaSeq 6000 равна производительности 50…60 китайских BGISEQ-500. Поэтому самым крупным центром секвенирования на сегодняшний день можно считать китайскую же компанию Novogene, которая в начале этого года приобрела сразу 25 NovaSeq 6000. Их суммарная производительность составляет около четверти миллиона геномов в год. Цифра впечатляющая, но если ежегодно секвенировать по 0,3 миллиона геномов (~0,05 млн. в CNGB плюс ~0,25 млн. в Novоgene), то на секвенирование 100 миллионов геномов в рамках стартовавшей в прошлом году программы «China Precision Medicine Initiative» (2016…2030 г.г., $9,2 млрд.) потребуется больше 300 лет. И чтобы уложиться в отведённые сроки (до конца 2030 года) китайцам придётся построить и оснастить секвенаторами ещё несколько десятков подобных центров. В начале 2017 года в продаже появились миниатюрные нанопоровые секвенаторы MinION, а в мае – GridION X5, разработанные компанией Oxford Nanopore Technologies (ONT, UK). Наиболее производительная модель (PrometION) проходит бета-тестирование в нескольких геномных центрах и должна появиться в продаже в ближайшие месяцы. Рис. 4. Нанопоровые секвенаторы компании ONT Сравнительно низкая точность нанопорового секвенирования (~90% при однократном чтении) не позволяет этим приборам конкурировать с флуоресцентными секвенаторами (точность ~99,9% при однократном чтении) при определении точечных мутаций (Single Nucleotide Polymorphisms, SNPs), но большая длина ридов (>10 000 п.о.) делает их незаменимыми при картировании полиморфизмов типа Copy Number Variations (CNVs). Кроме того, нанопоровые секвенаторы неплохо справляются с идентификацией вирусов и бактерий, оценкой их лекарственной устойчивости, анализом транскриптомов, HLA-типированием, установлением отцовства и со многими другими задачами таргетного секвенирования, что позволяет им успешно бороться за эти ниши рынка NGS (Next Generation Sequencing). Вмешательство в геномные гонки Китая и Великобритании обострило конкурентную борьбу. Это ещё не отразилось на ценах таргетного секвенирования, но стоимость секвенирования генома человека за последний год уменьшилась на 40% (с $1000 до $600). Стоит ли России участвовать в геномных гонках, или проще подождать появления дешёвых китайских, английских или американских секвенаторов? Но такое ожидание может сильно затянуться. Да и за державу обидно. Этим определяется актуальность рассмотрения вопроса о возможности разработки отечественного секвенатора и его обеспечения расходными материалами и реагентами. Основная цель такой разработки — «догнать и перегнать Америку» (а также Китай, Великобританию, Южную Корею, Австралию, Саудовскую Аравию и т.д.). Или хотя бы только догнать. Или даже не догнать, а просто постараться сделать секвенирование в России более доступным. В первую очередь – добиться импортозамещения хотя бы части расходных материалов и реагентов. Сложнее будет скопировать секвенаторы. Но можно не просто копировать зарубежные разработки, а попытаться их улучшить. А если не улучшить, то хотя бы удешевить. Задача не слишком амбициозная, зато выполнимая. Один из проектов подобного рода прорабатывался четырьмя институтами Сибирского отделения РАН (2012…2014 г.г.), которые безуспешно пытались освоить технологию секвенирования SMRT (Pacific Bioscience, USA). Ещё можно упомянуть о двух попытках разработать мономолекулярную технологию секвенирования, основанную на рамановской спектроскопии – в Черноголовке (ООО «ИнСпектр», 2010…2012 г.г.) и в Зеленограде (ООО «Нано Вижин», 2013…2014 г.г.) – и о зеленоградском же проекте RuSeq, нацеленном на совершенствование технологии tSMS (Helicos, USA). Понятно, что при выборе осваиваемых (копируемых/улучшаемых/"передираемых") технологий NGS нужно учитывать перспективы их развития. И, учитывая крайне ограниченные возможности, оценивать эти перспективы только для трёх наиболее совершенных технологий – флуоресцентной, полупроводниковой и нанопоровой. Секвенаторами в данном случае служат прецизионные сканирующие эпифлуоресцентные микроскопы, оснащённые системой подачи реагентов в проточные ячейки. Характерной особенностью последних моделей является упорядоченность расположения субмикронных кластеров ДНК (Illumina, NovaSeq 6000) или ДНК-наноболлов (BGI, BGISEQ-500) в одноразовых проточных ячейках. Собирать подобные микроскопы в России придётся в основном из импортных комплектующих, поэтому стоить они будут не дешевле китайских аналогов. Правда, аналоги эти пока не продаются, но через 2…3 года, скорее всего, будут доступны и у нас. Поэтому лучше ориентироваться не на разработку флуоресцентных секвенаторов, а на освоение производства их расходных комплектующих и реагентов — проточных ячеек и меченых нуклеотидов. Если, конечно, флуоресцентные технологии через несколько лет не будут заменены люминесцентными. Тем более что такая замена может начаться уже в 2018 году. Люминесценция уже использовалась в NGS – в технологии пиросеквенирования, позволившей компании 454 Life Sciences прочитать первый индивидуальный геном человека (“Project Jim”, 2005…2007 г.г.). Эта технология, построенная на биолюминесцентной (люциферазной) регистрации образования пирофосфата, сейчас уже устарела. Но определять люминесценцию проще, чем флуоресценцию. Поэтому компания Illumina уже давно разрабатывает технологию люминесцентного секвенирования (проект “Firefly”). Люминесцентный секвенатор может оказаться не хуже, но значительно дешевле флуоресцентных настольных секвенаторов MiniSeq и MiSeq, из-за чего его разработка продвигается очень медленно. Тем не менее, недавно на выставке ASHG 2017 (17…21.10.2017) был продемонстрирован готовый секвенатор Firefly, а также необходимые для его работы проточные ячейки (чипы) и картриджи с реагентами. Рис. 5. Люминесцентный секвенатор Firefly компании Illumina
https://twitter.com/illumina Основной проблемой в случае ориентации на люминесцентную технологию будет не столько разработка прибора, сколько освоение синтеза необходимых для его работы расходных реагентов – дезоксинуклеозидтрифосфатов (дНТФ) с метками, способными генерировать фотоны. Причём эти метки должны соединяться с нуклеозидами легко расщепляемыми линкерами, содержащими азидометильные группы. Важной особенностью азидометильных производных дНТФ, синтез которых был разработан российскими учёными (ИБХ РАН) в начале 90-х годов прошлого века, является их сравнительно высокая стабильность, сочетающаяся с простотой и быстротой деблокирования при обработке ДНК-кластеров (или ДНК-наноболлов) раствором трис(2-карбоксиэтил)фосфина (TCEP). Именно сложность синтеза таких реагентов до недавних пор защищала компанию Illumina от конкурентов, а освоение их производства позволило Китаю догнать и перегнать Америку.
Способны ли российские химики освоить синтез подобных реагентов? Судя по ссылкам в патентах компании Illumina, в 90-е годы прошлого века это сомнений не вызывало. Да и сейчас в России есть 3…4 группы химиков, способных справиться с такой задачей (ИХБФМ СО РАН, ООО «Синтол», ИБХ РАН, ИМБ РАН). Компания Thermo Fisher Scientific потратила на приобретение полупроводниковой технологии секвенирования миллиарды долларов. Теперь обострение конкурентной борьбы требует резкого снижения цен, и вернуть потраченные миллиарды, тем более с прибылью, ей вряд ли удастся. Сторонних разработчиков подобные проблемы не волнуют, поэтому для них полупроводниковая технология по-прежнему сохраняет привлекательность. Особенно если удастся воспользоваться готовыми pH-сенсорными чипами, на разработку которых были потрачены миллионы долларов. Рис. 6. pH-сенсорные чипы полупроводникового секвенатора S5 Стоимость этих чипов завышена, как минимум, на порядок. И использовать их можно (как утверждают разработчики) только однократно. Тем не менее, некоторым умельцам удавалось использовать их больше десяти раз, и это явно не предел. Поэтому первоочередной задачей для совершенствования (удешевления) полупроводниковой технологии секвенирования является освоение регенерации использованных pH-сенсорных чипов. Прототип необходимого для такой регенерации устройства уже разработан. Точнее – разработана электронная система, считывающая информацию с pH-сенсорных чипов и позволяющая контролировать их качество.  Рис. 7. Самодельный полупроводниковый секвенатор
https://www.youtube.com/watch?v=eojg02AUAxw Если повысить быстродействие и разрядность АЦП, то такое считывающее устройство можно будет использовать в качестве электронной подсистемы отечественного полупроводникового секвенатора. Правда, его ещё нужно будет оснастить системой подачи реагентов. И освоить производство этих самых реагентов. При большом желании (и хорошем финансировании) особых проблем с этим не предвидится.  Проблема в том, что на все подобные разработки и их доработки потребуется 2…3 года, а за это время многое может измениться. Например, может повыситься точность и производительность нанопорового секвенирования. В результате все усилия «полупроводниковых» конкурентов окажутся напрасными. Первый нанопоровый секвенатор MinION похож на первый блин — уже «съедобен», но следующие должны получиться намного лучше. Точность чтения у него не более чем удовлетворительная, да и то не для всех приложений. Что касается производительности, то для секвенирования геномов её явно недостаточно, поскольку на каждый геном приходится тратить не меньше пяти одноразовых ячеек стоимостью от $500 до $900 (в зависимости от их количества в заказе). В ячейках MinION встроены чипы, усиливающие и оцифровывающие сигналы (пикоамперные токи) от 512 нанопор. GridION X5 работает одновременно с пятью такими же ячейками, а вот в ячейках к PromethION количество анализируемых нанопор увеличено в 6 раз (до трёх тысяч). Это позволит секвенировать геном человека на одной ячейке. Правда, с низким качеством, но зато с длинными ридами, что облегчает их точную сборку. И хорошо дополняет короткие (2х150 или 2х100), но точные (>Q30) риды, получаемые флуоресцентными секвенаторами. Поэтому нанопоровое секвенирование на PomethION может дополнять флуоресцентное, но не может с ним конкурировать. Хотя если ячейки следующего поколения будут содержать не тысячи, а десятки или сотни тысяч нанопор, то их использование повысит кратность чтения ДНК, улучшит качество получаемых данных и позволит геномным нанопоровым секвенаторам успешно конкурировать на рынке NGS с флуоресцентными секвенаторами. Для большинства задач таргетного секвенирования производительность MinION (5…10 Gb) явно избыточна. Поэтому компания ONT планирует выпустить на рынок MinION Dx (или FLONGLE) – модификацию MinION с адапторной вставкой для ячеек на 128 или 256 пор.  Рис. 8. Секвенатор FLONGLE Одноразовые ячейки для FLONGLE могут быть намного дешевле, поскольку их электроника вынесена в многоразовую адапторную вставку, с которой они стыкуются контактной площадкой типа LGA (Land Greed Array). Ещё один компактный нанопоровый секвенатор (SmidgION), подключаемый к смартфону (iPhone 7...X), должен появиться в продаже в ближайшие месяцы. Рис. 9. Первый "гаджетный" секвенатор SmidgION Дешёвое и доступное для всех нанопоровое секвенирование способно изменить весь рынок NGS (а заодно и весь мир). Но эта способность проявится в полной мере только после появления достойных конкурентов. Одним из таких конкурентов может стать компания Roche Sequencing, разрабатывающая собственную технологию нанопорового секвенирования с 2014 года. Судя по некоторым публикациям и сообщениям в Интернете, скоро могут появиться и другие конкуренты. Было бы неплохо обзавестись подобными конкурентами и России, но разработка секвенаторов, тем более нанопоровых, не попала в перечень «Приоритетных направлений развития науки, технологий и техники в Российской Федерации», утверждённых Указом Президента Российской Федерации №899 от 7 июля 2011 года. Поэтому надеяться остаётся только на гиков, разрабатывающих полупроводниковые секвенаторы на собственной кухне или электронные микроскопы в личных гаражах. Не удастся обойтись и без хакеров, способных взломать программное обеспечение к MinION. Дело в том, что этот секвенатор может работать только при наличии подключения к Интернету. А каждый автономный запуск необходимо согласовывать с разработчиками. Но есть и более странные «заморочки». Например: • Каждый прибор и каждая проточная ячейка привязывается к конкретному пользователю, за которым стоит фактический адрес лаборатории, где он работает и проводит исследования. При этом компания Oxford Nanopore Technologies может получить информацию о местонахождении каждого прибора.
• Санкционная политика: перед поставкой продукции компания Oxford Nanopore Technologies проводит проверку каждой организации и новых конечных пользователей.
• Во избежание попадания в Список запрещенных к отгрузкам лабораторий запрещается передавать продукцию Oxford Nanopore Technologies третьим лицам. Интересно, что в соответствии вышеупомянутым «Списком запрещённых к отгрузкам лабораторий» компания ONT недавно отказалась продать MinION таким «военизированным» организациям как МГУ и СПбГУ. В связи с этим первоочередной задачей для России в области нанопорового секвенирования является взлом программного обеспечения, используемого секвенатором MinION.  Следующая задача – реверс-инжиниринг ячеек этого прибора. И напоследок — освоение формирования в них бислойных липидных мембран со встроенными ионными каналами, пригодными для нанопорового секвенирования ДНК. Искать биохакеров (биофизиков, молекулярных биологов, генных инженеров и т.п.) для такой работы лучше в другом месте, а здесь, на Geektimes, хотелось бы обсудить проблемы взлома ПО и реверс-инжиниринга с хакерами и гиками, хорошо ориентирующимися в электронике. Буду признателен за любые вопросы, замечания и предложения. Искренне Ваш, genseq