ゲームシステムは『スーパーマリオブラザーズ』や『スーパーマリオブラザーズ3』のシステムを多く踏襲し、後のシリーズタイトルで採用されたヒップドロップや壁キックなどのアクションが新規に追加されている。また、シリーズを跨いで多くの要素がとり入れられているため過去の作品で登場したキャラクターも敵・味方含め数多く登場する。ステージ選択は『マリオワールド』から続くマップ式であるが、本作では左右に移動するだけなのでシリーズ中でも比較的簡素なマップとなっている。ゲームは上の画面でプレイ画面が、下の画面ではスコアやエリアの進度などが表示されるようになっており、土管を通って地下に行った時などは上下画面が入れ替わることがある。通常下画面に1個アイテムをストックすることができる（タッチすれば使用できる）が、上下画面が入れ替わっている時はストックを取り出すことができない。お化け屋敷ではエリア進度表示の部分に終始テレサのグラフィックが表示され、エリアの進度が確認できない。グラフィックは全体的に3Dで描かれているが、移動方法はそれまでの2Dマリオゲームとほぼ同じである（つまりキャラクターは3Dポリゴンで表現されるが奥行きの概念がない）。変身に関してはファイア以外のものが大幅にリニューアルされており、無敵マリオでは『スーパーマリオワールド』のように敵を連続して倒すと徐々に得点が増えて最終的に1UPする仕様となり、これ以外にも全く新たな変身が3つ登場したが、代わりに空を飛べる変身は全面的に廃止されている。
全27種類のゲームがあり、ソフトを持っていない人でも一緒に最大4人で対戦出来る。ソフトを持っていない人はDSダウンロードプレイで参加すればプレイでき、お互いがソフトを持っていれば持っていない人と対戦する場合よりも速く対戦が出来る。なお、一部のミニゲームは『スーパーマリオ64DS』から再録、または若干の仕様変更を加えて収録している。1PLAYERモードとVSバトルモードがあり、1PLAYERモードでは主に記録の更新を目的とし、VSバトルモードではミニゲームでプレイヤー同士で対戦しポイントを競い合い、先に200ポイントを取ることを目的とする。またVSバトルモードではプレイできるミニゲームやポイント数を自由に選択できるフリープレイと、全てランダムで行うシャッフルプレイの2つのモードがある。ミニゲームのジャンルはアクション、パズル、テーブル、バラエティ（VSバトルモードでは1VS1となり、3人以上ではプレイ不可能）の4種類がある。キャラクターは1Pがマリオ・2Pがルイージ・3Pがワリオ・4Pがヨッシーである。このミニゲームモードのみの登場であるが、ワリオが本作でスーパーマリオブラザーズシリーズに初めて登場した。
2人プレイ専用の対戦アクションゲーム。DS本体2台とソフト1本でもあれば対戦可能で、ソフト2本の場合はダウンロードせずにすぐに対戦できる。マリオとルイージでマップ上にランダムで現れるビッグスターを取り合い勝敗を決める。ビッグスターを持っている状態で相手に踏まれたりミスすると、ビッグスターを落とす。開始時に勝利回数、現れるビッグスターのクリア枚数、残り人数を設定できる。コースはオリジナルのものが5種類用意されている。
このゲームのメインモードである1Pのアクションゲーム。マリオでピーチ姫をさらって逃げるクッパJr.を追いかけながら、各ワールドのステージをクリアしてピーチ姫を救う事が目的。なお、セーブデータ選択時にL+Rボタンを押すとプレイヤーキャラがルイージに変わる。
マリオとピーチ姫はピクニックに出かけていた。すると、突如キノコ城に黒い雲が出現し、落雷が起こり共にキノピオたちも現れてしまう。びっくりしたマリオは、急いで城に戻った。しかし、その隙にこっそりとやってきたクッパJr.にピーチ姫が連れさらわれてしまう。巨大キノコの力を借りて、マリオの新たな冒険が始まった。
アメリカのウィネマッカでフェイ・フォレスターとヴィンス・ミラーの2人組は、集金していたマフィアの構成員2人を襲って金を奪おうと画策していた。だが反撃されそうになり、ヴィンスはその1人を射殺しフェイと共に金を奪って逃走する。大金を手に入れ喜びに浸る2人だったが、フェイがヴィンスの元を離れて遠くに飛ぶことを伝えると彼は激怒し、車のキーを奪って逃げられないようにしてこれからもずっと側にいるよう命令する。フェイは、ヴィンスが用を足している隙に彼を石で殴り倒し、キーを取って1人で逃げる。そのころリノで私立探偵をしているジャック・アンドリュースは、多額の借金の返済を滞納していたため貸主のビッグ・ジムの借金取りにいたぶられ小指を折られる。ヴィンスの元を去ったフェイは車でリノにたどり着き、そこの宿に一泊することにした。殴られ気絶させられたヴィンスは夜目を覚まし、フェイを見つけ出すため彼女の足取りを追う。宿に泊まったフェイは、電話帳から私立探偵を探してジャックの名前を見つけマッチ箱に名前と電話番号をメモする。翌日ジャックは、車が海に落下する事故で亡くした妻キャシーのことを考えていると、そこにフェイが現れ自分を殺して欲しいと偽装殺人を依頼してくる。法律に違反する行為のため最初は断ろうとしたジャックだが、彼女が提示した謝礼金と思いつめた彼女を見て依頼を受けることを決める。前金として謝礼の半分を受け取ったジャックは、友人のアラン・スエイジーに相談してフェイの新しい身分証を用意し、計画の準備を開始する。フェイの顔をモーテルの受付に覚えさせ、大男に変装したジャックは彼女とモーテルの部屋に入り、殺人の痕跡を偽装してフェイが殺されたように見せかける。そしてフェイを宿の部屋に送った後、彼女から金は後で渡すといわれたジャックは車の処分をして部屋に戻ると、そこに彼女はおらず騙されたことに気づく。騙されたことよりも残りの金が気がかりのジャックは、彼女がどこに行ったかを調べるが手がかりが得られない。そんななか、モーテルに残した彼女の持ち物の中にジャックの名前がメモされたマッチ箱があったため、彼は殺人容疑で警察に逮捕されヘンドリックス警部補らによる取調べを受けることになる。しかし変装していたことでジャックはモーテルの受付の面通しを乗り切り、警部補らに疑われながらも釈放される。だがそのことが新聞記事に載ったため、それを見たヴィンスがジャックの事務所に乗り込んできた。彼に脅されるジャックだったが、反撃して事務所から逃げ出す。一方金を奪われたジョンジーらは、ビッグ・ジムに連絡を取ってフェイとの関係が疑われるジャックを見つけ出すよう頼んでいた。フェイの居場所を突き止めたジャックは、彼女が泊まるホテルの部屋に連れて行き謝礼の残りを貰おうとしたとき、大金が入ったブリーフケースを発見する。そしてジャックは彼女がどうやってそれを手に入れたかを尋ねるが、そこにジョンジーと彼女らが金を奪ったマフィアの片割れが部屋に突入してきたため、フェイはとっさに持っていた銃で2人を射殺する。金を持ってホテルから逃亡した2人だったが、警察に手配されるのも時間の問題だと感じたフェイは、ジャックにもういちど自分を殺されたことにして欲しいと頼み込む。