Ib自体は、アミノ酸配列は炭疽菌防御抗原（PA）と34%、ボツリヌス菌C2毒素のC2Ⅱと41%の相同性を示す
立体構造から4つのドメインからなる
ドメイン1（1-84）が酵素成分との結合、ドメイン2(84-302)が膜侵入領域、ドメイン3(302-416)がオリゴマー形成、ドメイン4(416-664)が細胞への結合へ関与している
PAとIbのドメインごとのアミノ酸配列のそれぞれは41%、40%、35%、16%であり、ドメイン4の配列類似性が低い
これは両者の結合部位の違いと考えられている
またボツリヌスC2毒素のC2Ⅱとドメインごとのアミノ酸配列はドメイン1は34%、ドメイン2は38%、ドメイン3は36%と高い相同性があるが、ドメイン4は相同性が存在しない
イオタ毒素の受容体は、クロストリジウム・ディフィシルの二成分毒素毒素であるCDTと同様に、LSRである
LSRは肝臓、小腸、大腸、肺、腎臓、副腎、精巣、卵巣を含む多くの組織で高発現している
またLSR以外にCD44も受容体である可能性が示されている
Ibのドメイン4の一部である442-664アミノ酸残基からなるリコンビナント蛋白質Ib442-664は、LSRと相互作用する
angubindin-1と言われるようになった
LSRは脳微小血管内皮にも発現しているためangubindin-1を用いると分子量5000程度のアンチセンスオリゴヌクレオチドが血液脳関門を通過し中枢神経系に送達される
angubindin-1は細胞毒性を示さず、マウスにも安全に投与可能である

D型菌はヒツジやヤギやウシなど草食獣に感染し、腸性中毒症を起こすことが知られていた。この感染症は急激に衰弱し死にいたる。ボツリヌス毒素、破傷風毒素に次ぐ強力な致死活性を示す毒素である。病理学的には脳組織の軟化と壊死を招き、腎組織も破壊され、四肢の痙攣がおこることが特徴である。稀にヒトにも感染する。D型菌の病原因子がε毒素と考えられている。ε毒素の受容体はシアロ糖タンパクと脂質が関与すると推察されている。D型菌の感染症はε毒素が腸管において腸間膜の透過性を亢進させ、その結果本毒素が生体内に取り込まれ、脳血管の透過性を亢進させ四肢の痙攣や脳浮腫や痙攣を起こすと推察されている。
A型菌の主要毒素がα毒素である。A～E型菌の全てがα毒素を産出するが、A型菌で最も多く作られる。α毒素の本体はホスホリパーゼC（レシチナーゼC）である。細胞膜を構成するレシチン含有リポ蛋白に作用し膜に傷害を与えて細胞を破壊する。A型菌はヒトや腸管内に定常的にかなりの数が存在し、糞便や土壌中に栄養型、芽胞型のいずれでも多数存在している。
前作で捕まえた悪代官「あんどう」が脱獄して国外へと逃亡した。水戸黄門一行もあんどうを追いかけて世界各地を漫遊するが、渡った国々で事件が発生しており、一行は事件の解決に奔走するというストーリー。各ステージのスタート時に助さん・格さんのどちらかをプレイヤーが選ぶ方式で選んだキャラクターにより途中の展開が異なる場合があるが、事件解決の結果は全く変わらない。セレクトボタンで証拠品を町を歩いている人や、建物の中の人に見せるアクションが追加されている。黄門さまの裁きの時にお馴染みの印籠を見せるシーンもあるが、舞台が海外であるために当然通じず、二つ三つほど悪事の証拠品や弱点になる武器を突きつける必要があり、正解のアイテムを突きつけると相手が平伏し事件解決となる。一方で間違った証拠品を選ぶと事件が解決せず悪人に反撃されてゲームオーバーになる。世界が舞台のため、前作の的屋に代わりカジノが登場した。スロットマシーン、株、ルーレット、B&Wで遊べる。「そば屋」は「レストラン」となり、国によってメニューが違う。また、日記以外のアイテムもその国に応じたものがステージ毎に用意されている。呼び出せる仲間は弥七と八兵衛のみで、前作に出たお銀・又平・香織の3人は登場しない。敵の中には悪人以外にも動物が追加され、倒すと風車を落とす事がある。それに伴い、飛び道具を使う敵はお椀を落とすようになっている（前作では風車か三味線を落とした）。それ以外の敵を倒しても得点以外は手に入らない。お邪魔キャラのお石は登場せず、全てのステージではお民が登場しその国の衣装を纏って現れる（台詞は全ステージ共通）。時間切れによる事件未解決ではゲームオーバー扱いとなり、次のステージには進まないが旅日記があればコンティニューができる。取引屋が登場し、捜査に必要ないもしくは裁きの証拠品にならないなど手持ちの不要なアイテムを売ることができる。証拠品や捜査に必要な道具も売ることができ、売ると裁きに出向く前の証拠品チェックでゲームオーバーになってしまう。本作では屋外、屋内共にステージ毎の専用のBGMが用意されている。一方で、仲間を呼び出している最中も曲は変わらなくなった。また、前作に引き続き音声合成によるボイスが収録されている。市民のボイスは基本的に「ハロー」であり、国ごとの言語が収録されている訳ではないが中国だけは「你好（ニーハオ）」のボイスになっている。斜めに動けず、マップが全体的に小さい。ステージを1つクリアするとスコアと力の最大値以外リセットされ、アイテムやお金の持越しができずお金は200に戻ってしまう。旅日記でパスワードを聞くとき、現在のスコアと力最大値、手がかりメーターが保存される。