エンジン個数は、年間シーズンを通して、各ライダーは最大6基のエンジンを使用できる。カーボン製フロントディスクブレーキの直径は最大320mmとなる。MMC（金属基複合材料）とFRM（繊維強化金属）の使用は禁止となる。タイヤ温度センサーの使用も禁止される。ホイールのリム幅も制限され、ホイール直径は16.5インチのみとなる。可変排気システムの使用も禁止。可変バルブタイミングシステムと可変バルブ開閉システムでは、電子制御と油圧制御を使用するシステムは禁止される。コンロッドは、中空構造は禁止だが、オイル循環用の穴は直径2mmまで許可される。ツインクラッチシステムの使用は禁止。トランスミッションは、オートマチックは禁止されるが、マニュアルでは若干のパワーアシストが許可される。無段変速トランスミッションの使用は禁止。GPSの搭載は、DORNAがテレビ放送などを目的としたもののみ許可され、マシンの電子制御系システムとして使用することはできない。ステアリングダンパーの電子制御は禁止。
高騰し続ける参戦費用を抑えるため、2009年よりMotoGPの主催者であるDORNAやIRTAなどで構成されるグランプリ委員会によってレギュレーション改正が行われている。タイヤサプライヤーを一社に限定し、2009年から2011年まで3年契約でブリヂストンが供給。第11戦チェコGP以降は使用できるエンジン数が最大5基までに制限された。また、ブレーキの材料として、セラミック複合材料によるディスクとパッドの使用は禁止となった。エンジンオイルは潤滑油としてのみ使用可能であり、油圧制御システムへの使用は禁止される。電子制御サスペンションの使用も禁止された。EGR（排気ガス再循環装置）の使用も禁止。さらにこの年からルーキーライダーはサテライトチームからしかエントリーできなくなった（スズキのみサテライトチームを持たない為このルールの適応外となっている）。
2001年まで存在していた500ccクラスが、2002年に現在の名称となり発足した選手権の最高峰クラス。かつてはイルモア、WCMといったプライベーターがオリジナルマシンで参戦していたほか、カワサキがワークス・チームを送り込んでいたが、2017年現在出場しているのはヤマハ、ホンダ、スズキ、ドゥカティ、アプリリア、KTMの6メーカーと、ワークスマシンの貸与等を受けられるサテライトチームとなっている。使用されるシャシーおよびエンジンはプロトタイプ（レース専用）が原則であるが、2012年より実施されたCRTでは市販車ベースの物が認められた。なおタイヤは、2009年から2015年までブリヂストンのワンメイクであったが2016年よりミシュランのワンメイクになっている。。なお、レギュレーションは年とともに変化しており、細部については次項の「レギュレーションの変遷」を参照
原則としてMoto3 → Moto2 → MotoGPの順にレースが行われ、大会ごとの規定周回数を最も速く走ったものが勝者となる。レース走行距離は95 - 130km程度で、それぞれのクラスで45分ほどとなる。最初に搭載した燃料で走りきれるため、悪天候等の想定外のトラブルが発生しない限りピットインする事は無い。ただし、MotoGPクラスには2005年より“フラッグ・トゥ・フラッグ”と呼ばれるルールが定められ、降雨時にはスリックタイヤを履いたマシンでピットインし、ウェットタイヤを装着済みの別のマシンへの乗り換え（あるいはその逆）が見られることとなった。
定められた時間内にタイムアタックを行い、速いタイムを出したライダーの順にスタートグリッド位置が決まる。いわゆる107%ルールが存在するが、F1のそれとは異なり、予選でトップから107%超のタイムだったとしても、各フリー走行で1回でもトップから107%以内のタイムを出していれば予選通過となる。また悪天候等の影響で予選不通過者が多く出た場合は、主催者側の判断により救済措置が適用されることもある。
レース期間は3日、「初日：フリー走行（練習）、2日目：フリー走行→公式予選、3日目：ウォームアップ走行→決勝」という流れで行う。2010年シーズンから、初日のフリー走行が45分から60分へと増大。2日目の午前にも60分のフリー走行を行い、午後に1回のみの公式予選となる。
『北海道内の空飛ぶバス』として、ビーチクラフト1900D一機を使用し、2005年3月13日に1日2往復、片道運賃2万5,000円（片道割引運賃2万円、どさんこ割という地域住民割引があった）で函館空港 - 帯広空港の運航を開始。陸路で6時間以上を要する両地区間を約1時間で結んだ。2005年10月1日より函館空港 - 新千歳空港、新千歳空港 - 帯広空港の運航を開始。函館空港 - 帯広空港間を新千歳空港経由で搭乗する際は、新千歳空港で降りずに機内で待機する『バス方式』を採用した。バス方式は北海道エアシステムなど他社でも行っていたが、航空情勢の変化による保安上の理由で中止されている中での採用となった。2006年4月1日より北海道エアシステムが撤退した函館空港 - 女満別空港、同年6月20日よりすでに大手航空会社が就航している新千歳空港 - 女満別空港の運航を開始。しかし、2006年12月より新千歳空港 - 帯広空港、2007年2月より新千歳空港 - 函館空港・女満別空港が運休となり、新千歳空港から撤退となった。5路線が2路線に縮小される。同路線は2007年3月31日をもって廃止された。2007年2月6日までに、函館空港 - 女満別空港、函館空港 - 帯広空港路線を2007年3月中旬から運休し、定期航空事業から撤退することを決定した。路線そのものは、乗客が集まれば運航する不定期路線として継続する。一方、2007年3月中にも、那覇空港 - 周辺離島の不定期路線を開設し、収支改善を目指す予定とした。2007年3月6日に国土交通省へ3月13日を以っての定期便休止、3月14日からの不定期路線申請、4月1日からの那覇空港の運航整備基地申請および2～4路線の申請を行った。