1999年、活動を再開しようとした矢先、ポールが脱退。その後バンドは、かねてから親交のあった実力派ギタリスト、リッチー・コッツェンを新ギタリストとして迎え、スタジオ・アルバムとしては通算5枚目となる『Get Over It』をリリースする。新生ミスター・ビッグによる第1弾のアルバムは、新加入のリッチーの個性を前面に押し出した内容で、ポール時代のポップ性は影を潜め、よりブルージーな楽曲が中心となった。また、ソロシンガーとしてのキャリアを持つリッチーが、エリックとリードヴォーカルを分け合う「Static」で、バンドは新たなラインナップによる進化の可能性を主張している。この年の年末、久々の来日公演を行い、大晦日にはエアロスミス、バックチェリーと共に、ミレニアム・カウントダウン・コンサート（大阪ドーム）に参加。この時の模様は、WOWOWで生中継された。2000年、新曲入りバラード・ベスト・アルバム『Deep Cuts』をリリース。ポール在籍時代の曲の一部は、新ラインナップによってリメイクされている。このリメイク曲のうち1曲でビリーのベースソロが本人に許可なく削除されたほか、前述の「Goin' Where The Wind Blows」が収録されたことから、ビリーと他のメンバーとの人間関係が再び悪化した。2001年8月に、6作目のアルバム『Actual Size』をリリース。しかしリリース直前に、バンド側が「ビリーを解雇した」と公式発表する。自身のソロ活動のためレコーディングを一時離脱した際に、残りの3人とプロデューサーのリッチー・ズィトーによってアルバムの方向性が大幅に変更されたことに対する不満から、ビリーがバンドに対して非協力的な態度をとり続けたためとされる。アルバムのブックレットにはビリーのサンクスリストすら用意されず、作曲に関わった楽曲もわずか1曲に留まっている。しかし、協議の末、最後にビリーを含むメンバー4人でフェアウェルツアーを行い、その後解散するという結論に至る。千秋楽となった、2002年2月5日の東京国際フォーラムでのライブはレコーディングされ、『In Japan』としてCDとDVDでリリースされた。
日本では「MR.BIG」と、 全て大文字で、かつピリオドの後にスペースを入れない表記が多いが、これ以外の表記方法(MR. BIG、Mr. Big、ミスター・ビッグなど)も存在している。全て大文字(MR. BIG)にするか、あるいは小文字と組み合わせる(Mr. Big)かについては、「ERIC MARTIN」と書くか「Eric Martin」と書くかの違いなだけであり、どちらも間違いではない。また、英文的には、「Mr.」の後にスペースを入れるのが正しい。例えば「Mr.Sato」とは書かずに「Mr. Sato」と表記する。よって、「Mr.Big」よりも「Mr. Big」の方がどちらかと言えば正しく、現に公式サイトやCDには「MR. BIG」または「Mr. Big」等とスペースを入れた表記がされている。(CDに「MR.BIG」とピリオドの後にスペースが入っていないものもあるが、それらはほとんどの場合が日本で作成されたものである)そして、「Mr Big」とピリオド自体を入れない表記も英文的には間違いではない。「ミスター・ビッグ」と「ミスタービッグ」についても同様に、どちらも間違いではない。
Mr. Bigというバンド名はパット・トーピーが考えたものであり、Freeのアルバム『ファイアー・アンド・ウォーター』に収められた「Mr. Big」からきている。当初はジミ・ヘンドリックスの「Red House」をバンド名とする案もあった。しかし、当時既に存在していたクラウデッド・ハウスというバンド名と似てしまうので、バンドの目指していた方向性に最も近いFreeのレパートリーからバンド名を拝借した。1970年代にイギリスで活動していた全く同名のバンドが存在することをメンバーは知らなかった。また、パット・トーピーは、バンド名のみならず、バンドが発表した作品の多くのタイトルを考案している。
本作から鬼太郎と共に行動することは第2作までと比べ少なめになっているが、完全に全話登場で、もう一人の主人公的に鬼太郎と対を成して毎回事件に絡んでいる。天童夢子に惚れており、彼女の為ならば何でもしようとすることもあり、その為に身体を張ったシーンも見受けられた。だが夢子の歓心を買う為にした事が、結果として却って彼女や周囲の迷惑になった例も少なくない。「地獄編」で一度、夢子が鬼太郎を庇って死んだ時は誰よりも彼女の死を悲しみ、猫娘に泣きついた。アパートまたはテントに住んでおり、第2作までと異なり、金儲けをする際にもきちんとした店舗、事務所をかまえているシーンが見られるようになった。第2作までのマント姿以外に正装時など洋服を着ているシーンも比較的多くなり、その際には頭髪を中分けの金髪にしている。第8話や第27話など、悪事を働いた際に原作以上に鬼太郎に懲らしめられることもあり、後期ではラストで怒った人間たちに追い回されることもあった。風呂嫌いの設定は「自分で風呂を沸かすのが面倒くさい」という解釈らしく、温泉につかる場面は多い。本作からアニメで全身皮膚病が描かれるようになる。劇場版の第4作では、鬼太郎に次ぐ準主人公的な活躍を見せた。妖怪に襲われた電車の中で出会った少女カロリーヌを保護したねずみ男は、助けた自分を慕ってくれる彼女と心を通わせる。以降は彼女を救う為に、自らの危険を顧みずに行動するが、彼女は妖怪皇帝（正体はぬらりひょん）の部下である妖怪総理大臣ぐわごぜの娘であったという事実を知り、衝撃を受ける。だが、カロリーヌが知らなかったとはいえ鬼太郎を追い込んでしまった罪の意識に捕らわれていた事から、ねずみ男は彼女を優しく許す。その後、彼女と共に鬼太郎を救う為、朧車の涙を手に入れるが、カロリーヌは朧車に跳ねられて致命傷を負い、「また妖怪に生まれ変わったら、ねずみ男ちゃんのお嫁にして」という言葉を最後に、息を引き取った。ねずみ男は涙とともに絶叫、妖怪皇帝への怒りを燃やし、ぐわごぜにカロリーヌが死んだ事実と、彼女が最後まで父親を許してほしいと望んでいた思いをぶつけた。そして鬼太郎を復活させ、怪気象の原因が朧車にある事を彼に伝え、朧車を倒した鬼太郎は国会議事堂を中心とした自衛隊の爆撃作戦を中止させる事に成功する。事件後、ねずみ男はカロリーヌと妖怪皇帝に殺されたぐわごぜの墓を造り、親子の冥福を祈った。第10話では「日本有数の音痴ゆえ、音楽による妖術が効かない」という他の作品にはない設定があった（ただしオープニングの映像ではボーカルを担当している）。衣の色は濃い空色。