C 43/1

Förteckning över och beskrivning av de analysmetoder som avses i artikel 120g första stycket i rådets förordning (EG) nr 1234/2007 (1)

(offentliggjord i enlighet med artikel 15.2 i kommissionens förordning (EG) nr 606/2009 av den 10 juli 2009 (2) )

2010/C 43/01

I tabellen nedan ges en förteckning över de analysmetoder som ska tillämpas för kontroll av de gränsvärden och krav som fastställs i gemenskapslagstiftningen för framställning av vinprodukter. I den tredje kolumnen finns för varje berörd parameter en hänvisning till motsvarande analysmetod enligt beskrivningen i OIV:s sammanställning av internationella metoder för analys av vin och druvmust, i den senaste utgåva (2009) som finns tillgänglig vid offentliggörandet av detta meddelande. För varje parameter beskrivs endast referensmetoderna (metoder av ”typ I” eller ”typ II” enligt OIV:s klassificering) med undantag för de parametrar för vilka det för närvarande inte finns några validerade metoder av typ I eller II. Beskrivningen av metoderna finns i bilagan till detta meddelande.

Anmärkning:

I avsnitt I i bilaga A till OIV:s sammanställning ges en definition av de olika typerna av analysmetoder, däribland typ I (kriteriespecifik referensmetod), typ II (referensmetod) och typ IV (provisorisk metod).

Analysmetoderna för bly och kadmium finns numera beskrivna i kommissionens förordning (EG) nr 333/2007 av den 28 mars 2007 (bilaga C-3) (3). Vidare fastställs i bilaga II.4 till förordning (EG) nr 401/2006 av den 23 februari 2006 (4) allmänna kriterier för analysmetoder för ochratoxin A, och det är därmed inte nödvändigt att beskriva en särskild metod för analys av vinprodukter med avseende på det ämnet.

FÖRTECKNING ÖVER ANALYSMETODER

AS311-05-ENRRMN (under revidering)

Beskrivningarna av vissa analysmetoder håller på att revideras av OIV. Dessa beskrivningar kommer att offentliggöras i ett meddelande från kommissionen så snart den uppdaterade texten publiceras i 2010 års utgåva av OIV:s sammanställning av internationella analysmetoder.

(1) EUT L 299, 16.11.2007.

(2) EUT L 193, 24.7.2009, s. 1.

(3) EUT L 88, 29.3.2007, s. 29.

(4) EUT L 70, 9.3.2006, s. 12.

BILAGA

INNEHÅLL

1 DENSITET OCH SPECIFIK VIKT VID 20 °C (OIV – AS2-01-MASVOL) – Metod av typ I

2 BESTÄMNING AV SOCKERHALTEN I DRUVMUST, KONCENTRERAD DRUVMUST OCH REKTIFIERAD KONCENTRERAD DRUVMUST MED REFRAKTOMETRI (OIV-AS2-02-SUCREF) – Metod av typ I

3 TOTALT TORREXTRAKT (OIV-AS2-03-EXTSEC) Totala mängden torrsubstans – Metod av typ I

4 BESTÄMNING AV ISOTOPFÖRHÅLLANDET 18 O/ 16 O I VATTEN I VIN (OIV-AS2-09-MOUO18) – Metod av typ II

5 FOLIN-CIOCALTEU-INDEX (OIV-AS2-10-INDFOL) – Metod av typ IV

6 GLUKOS OCH FRUKTOS (OIV-AS311-02-GLUFRU) – Metod av typ II

7 BESTÄMNING AV SOCKERHALT MED HJÄLP AV HPLC (SACKAROS) (OIV-AS311-03-SUCRES) – Metod av typ II

8 DETEKTION AV BERIKNING AV MUST, KONCENTRERAD MUST, REKTIFIERAD KONCENTRERAD MUST OCH AV VIN MED HJÄLP AV KÄRNMAGNETISK RESONANS HOS DEUTERIUM (SNIF-NMR) (OIV-AS311-05-ENRRMN) – Metod av typ I

9 ALKOHOLHALT I VOLYMPROCENT (OIV-AS312-01-TALVOL) – Metod av typ I

10 BESTÄMNING AV ISOTOPKVOTEN 13 C/ 12 C GENOM ISOTOPKVOTSMASSPEKTROMETRI AV VINETANOL ELLER ETANOL SOM ERHÅLLITS GENOM JÄSNING AV MUST, KONCENTRERAD MUST ELLER REKTIFIERAD KONCENTRERAD MUST (OIV-AS312-06-ETHANO) – Metod av typ II

11 TOTAL SYRAHALT (OIV-AS313-01-ACITOT) – Metod av typ I

12 FLYKTIGA SYROR (OIV-AS313-02-ACIVOL) – Metod av typ I

13 CITRONSYRA (OIV-AS313-09-ACIENZ) – Metod av typ II

14 SORBINSYRA (OIV-AS313-14-ACISOR) – Metod av typ IV

15 PH-VÄRDE (OIV-AS313-15-PH) – Metod av typ I

16 SAMTIDIG BESTÄMNING AV L-ASKORBINSYRA OCH D-ISOASKORBINSYRA MED HJÄLP AV HPLC OCH UV-DETEKTION (OIV-AS313-22-ACASCO) – Metod av typ II

17 KOLDIOXID (OIV-AS314-01-DIOCAR) – Metod av typ II

18 BESTÄMNING AV KOLDIOXID I VIN MED MANOMETRISK METOD (OIV-AS314-04-CO2MAN) – Metod av typ II

19 MÄTNING AV ÖVERTRYCKET I MOUSSERANDE OCH PÄRLANDE VINER (OIV-AS314-02-SURPRES) – Metod av typ I

20 BESTÄMNING AV LYSOZYM I VIN MED HJÄLP AV HPLC (OIV-AS315-14) – Metod av typ IV

21 SULFATER (OIV-AS321-05-SULFAT) – Metod av typ II

22 JÄRN (OIV-AS322-05-FER) – Metod av typ IV

23 KOPPAR (OIV-AS 322-06) – Metod av typ IV

24 SVAVELDIOXID (OIV-AS323-04-DIOSOU) – Metod av typ II

1. DENSITET OCH SPECIFIK VIKT VID 20 °C (OIV – AS2-01-MASVOL) – METOD AV TYP I

1. DEFINITIONER

Med densitet avses massan per volymenhet vin eller must vid 20 °C. Den uttrycks i gram per milliliter och betecknas med symbolen ρ20 °C.

Med specifik vikt vid 20 °C (eller relativ densitet 20 °C/20 °C) avses förhållandet, uttryckt som decimalbråk, mellan densiteten hos en viss volym vin eller must vid 20 °C och densiteten hos samma volym vatten vid samma temperatur. Den betecknas med symbolen

2. PRINCIP FÖR METODERNA

Densiteten och den specifika vikten vid 20 °C bestäms på ett analysprov

antingen genom pyknometri: referensmetod,

eller genom densiometri med hydrostatisk våg eller elektronisk densitetsmätare.

Anmärkning:

För mycket noggrann bestämning ska densiteten korrigeras för effekten av svaveldioxid enligt följande formel:

ρ20 °C = ρ′20 °C – 0,0006 × S där ρ20 °C = den korrigerade densiteten, ρ′20 °C = den observerade densiteten, S = total svaveldioxid i g/l.

3. FÖRBEHANDLING AV PROVET

Om vinet eller musten innehåller betydande mängder koldioxid avlägsnas merparten genom att 250 ml av vinet skakas om i en 1-literskolv eller genom filtrering under reducerat tryck genom 2 g bomull som placerats i ett förlängningsrör.

4. REFERENSMETOD

4.1. Utrustning

Vanlig laboratorieutrustning, däribland följande:

4.1.1. Pyknometer av pyrexglas (1) på cirka 100 ml, med en löstagbar termometer med slipad glaskoppling med en skala i tiondels grader från 10 till 30 °C (figur 1). Termometern ska vara kalibrerad.

Pyknometern har ett 25 mm långt sidorör med en innerdiameter på högst 1 mm som avslutas med en konisk koppling av slipat glas. Sidoröret kan tillslutas med en ”uppsamlingspropp” bestående av en slipad glaskon som utmynnar i ett smalt rör. Proppen fungerar som en expansionskammare.

Apparatens båda slipade kopplingar ska vara mycket noggrant utförda.

4.1.2. En tareringsflaska, bestående av ett kärl med samma yttre volym som pyknometern (mindre än 1 ml avvikelse) och med samma massa som pyknometern när den är fylld med en vätska med en specifik vikt av 1,01 (koksaltlösning 2,0 % vikt/volym).

En värmeisolerad behållare som är exakt avpassad för pyknometern.

4.1.3. Våg med två vågskålar med minst 300 g kapacitet och 0,1 mg noggrannhet,

eller

våg med en vågskål med minst 200 g kapacitet och 0,1 mg noggrannhet.

4.2. Kalibrering av pyknometern

Kalibrering av pyknometern innebär bestämning av följande faktorer:

— Tara (tom pyknometer).

— Pyknometerns volym vid 20 °C.

— Den vattenfyllda pyknometerns massa vid 20 °C.

4.2.1. Metod vid användning av en våg med två vågskålar

Placera tareringsflaskan i vågens vänstra vågskål och den torra och rena pyknometern med ”uppsamlingsproppen” i den högra vågskålen. Placera vikter i vågskålen med pyknometern och notera den vikt där vågskålarna väger jämnt. Benämn denna p gram.

Fyll försiktigt pyknometern med destillerat, rumstempererat vatten och sätt i termometern. Torka av pyknometern omsorgsfullt och placera den i den värmeisolerade behållaren. Blanda genom att vända behållaren flera gånger till dess att en konstant temperatur kan avläsas på termometern. Justera vätskenivån tills att den når sidorörets övre kant. Torka sidoröret torrt och anbringa uppsamlingsproppen. Läs av temperaturen t °C noggrant och korrigera eventuellt för temperaturskalans bristande noggrannhet. Väg den vattenfyllda pyknometern mot taran och anteckna den vikt p' i gram som ger jämvikt.

Beräkning

Tarering av den tomma pyknometern: Taran för den tomma pyknometern= p + m där m= massan av luften i pyknometern, m= 0,0012 (p – p′).

Volym vid 20 °C: V20 °C= (p + m – p′) × Ft där Ft= en faktor som hämtas från tabell 1 för temperaturen t °C. V20 °C ska vara känd med noggrannheten ± 0,001 ml.

Vattnets massa vid 20 °C: M20 °C= V20 °C × 0,998203 där 0,998203= vattnets densitet vid 20 °C.

4.2.2. Metod vid användning av en våg med en vågskål

Bestäm

— den torra och rena pyknometerns massa, P,

— den vattenfyllda pyknometerns massa när vattnet har temperaturen t °C, P1; följ anvisningarna i punkt 4.2.1 ovan,

— tarans massa, T0.

Beräkning

Tarering av den tomma pyknometern:

Taran för den tomma pyknometern= p – m där m= massan av luften i pyknometern, m= 0,0012 × (P1 – P).

Volym vid 20 °C: V20 °C= [P1 – (P – m)] × Ft där Ft= en faktor som hämtas från tabell 1 för temperaturen t °C.

Volymen vid 20 °C ska vara känd med noggrannheten ± 0,001 ml.

Vattnets massa vid 20 °C: M20 °C= V20 °C × 0,998203 där 0,998203= vattnets densitet vid 20 °C.

4.3. Mätmetod

4.3.1. Metod vid användning av en våg med två vågskålar

Fyll pyknometern med det färdiga analysprovet (ev. förbehandlat enligt punkt 3) och väg den enligt anvisningarna i punkt 4.2.1 ovan.

Den massa i gram som krävs för att uppnå jämvikt vid t °C benämns p″.

Massan av vätskan i pyknometern = p + m – p″.

Skenbar densitet vid t °C:

ρt °C = (p + m – p″)/V20 °C

Beräkna densiteten vid 20 °C med hjälp av någon av följande tabeller, beroende på vilken vätska som ska analyseras: torrt vin (tabell 2), naturlig eller koncentrerad must (tabell 3), sött vin (tabell 4).

Vinets relativa densitet 20 °C/20 °C beräknas genom att densiteten vid 20 °C divideras med 0,998203.

4.3.2. Metod vid användning av en våg med en vågskål

Väg tareringsflaskan och benämn dess massa T1.

Beräkna dT = T1 – T0.

Den tomma pyknometerns massa vid tidpunkten för mätningen = P – m + dT.

Fyll pyknometern med det färdiga analysprovet (ev. förbehandlat enligt punkt 3) och väg den enligt anvisningarna i punkt 4.2.2 ovan. Massan vid t °C benämns P2.

Massan av vätskan i pyknometern vid t °C = P2 – (P – m + dT).

Skenbar densitet vid t °C:

ρt °C = (P2 – (P – m + dT))/V20 °C

Beräkna provvätskans densitet vid 20 °C (torrt vin, naturlig eller koncentrerad must eller sött vin) enligt punkt 4.3.1 ovan.

Den relativa densiteten 20 °C/20 °C beräknas genom att densiteten vid 20 °C divideras med 0,998203.

4.3.3. Densitetsbestämningarnas repeterbarhet

För torra och halvsöta viner: r = 0,00010.

För söta viner: r = 0,00018.

4.3.4. Densitetsbestämningarnas reproducerbarhet

För torra och halvsöta viner: R = 0,00037.

För söta viner: R = 0,00045.

TABELL I

F-faktorer

med vilka massan av vattnet i pyrexpyknometern vid t °C ska multipliceras för att beräkna pyknometerns volym vid 20 °C

[Med hänvisning till tabell I i bilaga II till beskrivningen av metoden AS2-01 i OIV:s sammanställning av internationella analysmetoder]

TABELL II

Temperaturkorrektionen c för densiteten hos torra och alkoholfria torra viner, bestämd med en pyknometer av pyrexglas vid t °C, för att erhålla resultatet vid 20 °C

[Med hänvisning till tabell II i bilaga II till beskrivningen av metoden AS2-01 i OIV:s sammanställning av internationella analysmetoder]

ρ20 = ρ t ± (c/1 000) – om t °C är lägre än 20 °C + om t °C är högre än 20 °C

TABELL III

Temperaturkorrektionen c för densiteten hos naturlig must och koncentrerad must, bestämd med en pyrexpyknometer vid t °C, för att erhålla resultatet vid 20 °C

[Med hänvisning till tabell III i bilaga II till beskrivningen av metoden AS2-01 i OIV:s sammanställning av internationella analysmetoder]

ρ20 = ρ t ± (c/1 000) – om t °C är lägre än 20 °C + om t °C är högre än 20 °C

TABELL IV

Temperaturkorrektionen c för densiteten hos vin med en alkoholhalt av lägst 13 volymprocent som innehåller restsocker, bestämd med en pyrexpyknometer vid t °C, för att erhålla resultatet vid 20 °C

[Med hänvisning till tabell IV i bilaga II till beskrivningen av metoden AS2-01 i OIV:s sammanställning av internationella analysmetoder]

ρ20 = ρ t ± (c/1 000) – om t °C är lägre än 20 °C + om t °C är högre än 20 °C

2 BESTÄMNING AV SOCKERHALTEN I DRUVMUST, KONCENTRERAD DRUVMUST OCH REKTIFIERAD KONCENTRERAD DRUVMUST MED REFRAKTOMETRI (OIV – AS2-02-SUCREF) – METOD AV TYP I

1. PRINCIP FÖR METODEN

Brytningsindex vid 20 °C, uttryckt antingen som absolut värde eller som viktprocent sackaros, söks i respektive tabeller för bestämning av sockerhalten i g/l och i g/kg för druvmust, koncentrerad druvmust och rektifierad koncentrerad druvmust.

2. UTRUSTNING

2.1. Refraktometer enligt Abbé

Refraktometern ska vara försedd med en skala som visar

— viktprocent sackaros, med 0,1 % noggrannhet, eller

— brytningsindex, med fyra decimaler.

Refraktometern ska vara försedd med en termometer med en skala från minst + 15 °C till + 25 °C samt med en anordning för att cirkulera vatten så att bestämning kan göras vid en temperatur av 20 ± 5 °C.

Bruksanvisningen för denna apparat ska följas noggrant, i synnerhet vad gäller kalibrering och ljuskälla.

3. BEREDNING AV PROVET

3.1 Must och koncentrerad must

Passera vid behov musten genom fyra lager med torr gasväv. Kassera de första filtrerade dropparna och utför bestämningen på den filtrerade produkten.

3.2 Rektifierad koncentrerad must

Beroende på koncentrationen används antingen den rektifierade koncentrerade musten eller en lösning som erhålls genom att 200 g rektifierad koncentrerad must späds med vatten till 500 g. All vägning ska utföras noggrant.

4. UTFÖRANDE

Värm provet till en temperatur av omkring 20 °C. Placera ett litet analysprov på refraktometerns nedre prisma och se till att analysprovet fördelas enhetligt över glasytan när prismorna pressas hårt mot varandra. Utför mätningen i enlighet med anvisningarna för det mätinstrument som används.

Läs av viktprocenten sackaros med en noggrannhet av 0,1 % eller brytningsindex med fyra decimaler.

Utför minst två bestämningar på samma prov. Notera temperaturen t °C.

5. BERÄKNINGAR

5.1. Temperaturkorrektion

5.1.1. Vid användning av instrument med skala för viktprocent sackaros: tabell I används för temperaturkorrektion.

5.1.2. Vid användning av instrument med skala för brytningsindex: index mätt vid t °C i tabell II används för att finna motsvarande värde för viktprocenten sackaros vid t °C (spalt 1). Använd tabell I för att korrigera värdet och räkna fram koncentrationen vid 20 °C.

5.2. Sockerhalt i must och koncentrerad must

Sök viktprocenten sackaros vid 20 °C i tabell II och läs på samma rad av sockerhalten i g/l och g/kg. Sockerhalten uttrycks som invertsocker med en decimal.

5.3. Sockerhalt i rektifierad koncentrerad must

Sök viktprocenten sackaros vid 20 °C i tabell III och läs på samma rad av sockerhalten i g/l och g/kg. Sockerhalten uttrycks som invertsocker med en decimal.

Om mätningen görs på utspädd rektifierad koncentrerad must multipliceras resultatet med spädningsfaktorn.

5.4 Brytningsindex för must, koncentrerad must och rektifierad koncentrerad must

Sök viktprocenten sackaros vid 20 °C i tabell II och läs på samma rad av brytningsindex vid 20 °C. Index uttrycks med fyra decimaler.

Anmärkning: Den potentiella alkoholhalten i druvmust, koncentrerad druvmust och rektifierad koncentrerad druvmust kan bestämmas med användning av den jämförande tabellen i bilaga I till kommissionens förordning (EG) nr 1623/2000 av den 25 juli 2000 (EGT L 194, 31.7.2000).

TABELL I

Korrektion som ska göras när viktprocenten sackaros har bestämts vid en annan temperatur än 20 °C

[Med hänvisning till tabell I i bilagan till beskrivningen av metoden AS2-02 i OIV:s sammanställning av internationella analysmetoder]

TABELL II

Tabell som visar sockerhalten i rektifierad koncentrerad must i g/l och g/kg, bestämd med en refraktometer som visar antingen viktprocenten sackaros vid 20 °C eller brytningsindexet vid 20 °C. Densititeten vid 20 °C visas också.

[Med hänvisning till tabell II i bilagan till beskrivningen av metoden AS2-02 i OIV:s sammanställning av internationella analysmetoder]

TABELL III

Tabell som visar sockerhalten i rektifierad koncentrerad must i g/l och g/kg, bestämd med en refraktometer som visar antingen viktprocenten sackaros vid 20 °C eller brytningsindexet vid 20 °C. Densititeten vid 20 °C visas också.

[Med hänvisning till tabell III i bilagan till beskrivningen av metoden AS2-02 i OIV:s sammanställning av internationella analysmetoder]

3 TOTALT TORREXTRAKT (OIV – AS2-03-EXTSEC) TOTALA MÄNGDEN TORRSUBSTANS – METOD AV TYP I

1. DEFINITION

Det totala torrextraktet är mängden av alla ämnen som inte förflyktigas under givna fysikaliska betingelser. De fysikaliska betingelserna ska vara sådana att de ämnen som utgör torrsubstans förändras så lite som möjligt under förfarandet.

Det sockerfria extraktet är skillnaden mellan det totala torrextraktet och den totala mängden socker.

Det reducerade extraktet är skillnaden mellan det totala torrextraktet och den totala mängden socker som överskrider 1 g/l, den totala mängden kaliumsulfat som överskrider 1 g/l samt eventuellt förekommande mannitol och andra kemiska ämnen som kan ha tillsatts vinet.

Restextraktet är det sockerfria extraktet minus icke-flyktiga syror uttryckta som vinsyra.

Extraktet uttrycks i gram per liter och ska bestämmas med en noggrannhet av 0,5 g.

2. PRINCIP FÖR METODEN

[Beskrivningen av denna analysmetod håller på att revideras av OIV. Den kommer att offentliggöras i ett meddelande från kommissionen så snart den uppdaterade texten publiceras i 2010 års utgåva av OIV:s sammanställning av internationella analysmetoder. Som vägledning i väntan på detta offentliggörande hänvisas till kapitel 4 i bilagan till kommissionens förordning (EEG) nr 2676/90.]

4 BESTÄMNING AV ISOTOPFÖRHÅLLANDET 18O/16O I VATTEN I VIN (OIV – AS2-09-MOUO18) – METOD AV TYP II

(p.m.)

[Beskrivningen av denna analysmetod håller på att revideras av OIV. Den kommer att offentliggöras i ett meddelande från kommissionen så snart den uppdaterade texten publiceras i 2010 års utgåva av OIV:s sammanställning av internationella analysmetoder. Som vägledning i väntan på detta offentliggörande hänvisas till kapitel 43 i bilagan till kommissionens förordning (EEG) nr 2676/90.]

5 FOLIN-CIOCALTEU-INDEX (OIV – AS2-10-INDFOL) – METOD AV TYP IV

1. DEFINITION

Folin-Ciocalteu-index erhålls med den metod som beskrivs nedan.

2. PRINCIP

Samtliga fenolföreningar i vinet oxideras av Folin-Ciocalteu-reagens, som består av en blandning av fosforvolframsyra (H3PW12O40) och fosformolybdensyra (H3PMo12O40), som efter oxidering av fenolerna reduceras till en blandning av blå volframoxider (W8O23) och molybdenoxider (Mo8O23).

Den blå nyans som erhålls har maximal absorption omkring 750 nm och är proportionell mot den totala halten fenolföreningar som ursprungligen fanns i vinet.

3. REAGENSER

Reagenserna ska vara av analytisk kvalitet och det vatten som används ska vara destillerat eller av likvärdig renhetsgrad.

3.1. Folin-Ciocalteu-reagens

Detta reagens finns i handeln i en form som är färdig att använda. Det kan beredas på följande sätt: Lös 100 g natriumvolframat (Na2WO4 · 2H2O) och 25 g natriummolybdat (Na2MoO4 · 2H2O) i 700 ml destillerat vatten. Tillsätt 50 ml 85-procentig fosforsyra (ρ20 = 1,71 g/ml) och 100 ml koncentrerad saltsyra (ρ20 = 1,19 g/ml). Låt koka upp och koka i 10 timmar under återflöde. Tillsätt därefter 150 g litiumsulfat (Li2SO4 · H2O) och några droppar brom. Koka därefter igen i 15 minuter. Låt svalna och späd till 1 liter med destillerat vatten.

3.2. Vattenfritt natriumkarbonat (Na2CO3) som späds till en 20-procentig lösning (vikt/volym).

4. UTRUSTNING

Vanlig laboratorieutrustning, däribland följande:

4.1. 100 ml mätkolvar.

4.2. Spektrofotometer som kan användas vid 750 nm.

5. UTFÖRANDE

5.1. Rödvin

Häll följande i en 100 ml mätkolv (punkt 4.1) i den ordningsföljd som anges här:

1 ml av vinet som har spätts i förväg 1:5.

50 ml destillerat vatten.

5 ml Folin-Ciocalteu-reagens (3.1).

20 ml natriumkarbonatlösning (3.2).

Späd till 100 ml med destillerat vatten.

Skaka om för att homogenisera. Vänta i 30 minuter så att reaktionen stabiliseras. Bestäm absorbansen vid 750 nm genom en optisk väglängd av 1 cm i förhållande till ett nollprov som har beretts med destillerat vatten istället för vin.

Om absorbansen inte ligger omkring 0,3 ska lösningen spädas på lämpligt sätt.

5.2. Vitvin

Använd samma metod med 1 ml outspätt vin.

5.3. Rektifierad koncentrerad must

5.3.1. Beredning av provet

Använd lösningen med en sockerhalt på 25 % (vikt/vikt) (25o Brix) som har beretts enligt anvisningarna i punkt 4.1.2 i kapitlet ”pH-värde”.

5.3.2. Mätning

Förfar enligt anvisningarna för rödvin (punkt 5.1) och använd ett 5 ml prov som har beretts enligt anvisningarna i punkt 5.3.1. Bestäm absorbansen i förhållande till ett referensprov som har beretts med 5 ml av en 25-procentig invertsockerlösning (vikt/vikt).

6. REDOVISNING AV RESULTATEN

6.1. Beräkningsmetod

Resultatet redovisas i form av ett index som erhålls genom att absorbansen multipliceras med 100 för röda viner spädda 1:5 (eller med motsvarande faktor för andra spädningar) och med 20 för vita viner. För rektifierad koncentrerad must multipliceras absorbansen med 16.

6.2. Repeterbarhet

Differensen mellan resultaten från två bestämningar som utförts samtidigt eller omedelbart efter varandra av samma person får inte vara större än 1.

God repeterbarhet uppnås om väl rengjord apparatur används (mätkolvar och spektrofotometerkyvetter).

6 GLUKOS OCH FRUKTOS (OIV – AS311-02-GLUFRU) – METOD AV TYP II

1. DEFINITION

Glukos och fruktos kan bestämmas var för sig med en enzymatisk metod när syftet är att enbart beräkna förhållandet glukos/fruktos.

2. PRINCIP

Glukos och fruktos fosforyleras med adenosintrifosfat (ATP) under en enzymreaktion som katalyseras av hexokinas (HK) och ger då glukos-6-fosfat (G6P) och fruktos-6-fosfat (F6P):

glukos + ATP←→G6P + ADP

fruktos + ATP←→F6P + ADP

Glukos-6-fosfat oxideras först till glukonat-6-fosfat med nikotinamid-adenin-dinukleotidfosfat (NADP) i närvaro av enzymet glukos-6-fosfatdehydrogenas (G6PDH). Den mängd reducerat nikotinamid-adenin-dinukleotidfosfat (NADPH) som erhålls motsvarar mängden glukos-6-fosfat och därmed också mängden glukos.

G6P + NADP+←→glukonat-6-fosfat + NADPH + H+

Det reducerade nikotinamid-adenin-dinukleotidfosfatet bestäms utifrån dess absorption vid 340 nm.

I slutet av reaktionsförloppet omvandlas fruktos-6-fosfat till glukos-6-fosfat under påverkan av fosfoglukosisomeras (PGI):

F6P←→G6P

Glukos-6-fosfat reagerar i sin tur med nikotinamid-adenin-dinukleotid-fosfatet och producerar glukonat-6-fosfat och reducerat nikotinamid-adenin-dinukleotidfosfat, som därefter bestäms.

3. UTRUSTNING

— Spektrofotometer för mätning vid 340 nm, den våglängd där NADPH har maximal absorption. Eftersom mätningarna är absoluta (dvs. kalibreringskurvor används inte utan standardisering görs med hjälp av extinktionskoefficienten för NADPH), måste apparatens våglängdsskalor och absorptionsvärden kontrolleras. Om ovanstående utrustning inte finns tillgänglig kan en spektrofotometer med diskontinuerligt spektrum användas, för mätning vid 334 nm eller 365 nm.

— Glaskyvetter med en optisk väglängd av 1 cm eller engångskyvetter.

— Pipetter för de enzymatiska provlösningarna, 0,02; 0,05; 0,1 och 0,2 ml.

4. REAGENSER

4.1. Lösning 1: buffertlösning (0,3 M trietanolamin, pH = 7,6; 4 × 10-3 M Mg2+). Lös 11,2 g trietanolaminhydroklorid ((C2H5)3N · HCl) och 0,2 g MgSO4 · 7H2O i 150 ml dubbeldestillerat vatten. Tillsätt cirka 4 ml 5 M natriumhydroxidlösning (NaOH) för att uppnå pH 7,6. Späd till 200 ml.

Denna buffertlösning kan förvaras i fyra veckor vid +4 °C.

4.2. Lösning 2: nikotinamid-adenin-dinukleotidfosfatlösning (ca 11,5 × 10-3 M). Lös 50 mg dinatrium-nikotinamid-adenin-dinukleotidfosfat i 5 ml dubbeldestillerat vatten.

Denna lösning kan förvaras i fyra veckor vid +4 °C.

4.3. Lösning 3: adenosin-5'-trifosfatlösning (ca 81 × 10-3 M). Lös 250 mg dinatrium-adenosin-5'-trifosfat och 250 mg natriumhydrogenkarbonat (NaHCO3) i 5 ml dubbeldestillerat vatten.

Denna lösning kan förvaras i fyra veckor vid +4 °C.

4.4. Lösning 4: hexokinas/glukos-6-fosfatdehydrogenas: Blanda 0,5 ml hexokinas (2 mg protein/ml eller 280 E/ml) med 0,5 ml glukos-6- fosfatdehydrogenas (1 mg protein/ml).

Denna lösning kan förvaras i ett år vid +4 °C.

4.5. Lösning 5: fosfoglukosisomeras (2 mg protein/ml eller 700 E/ml). Suspensionen används outspädd.

Denna lösning kan förvaras i ett år vid +4 °C.

Anmärkning:

Samtliga ovan nämnda reagenser finns i handeln.

5. UTFÖRANDE

5.1. Beredning av provet

Beroende på den uppskattade mängden glukos + fruktos per liter ska provet spädas enligt följande:

Mätning vid 340 och 334 nm Mätning vid 365 nm Spädning med vatten Spädningsfaktor F t.o.m. 0,4 g/l t.o.m. 0,8 g/l — — t.o.m. 4,0 g/l t.o.m. 8,0 g/l 1 + 9 10 t.o.m. 10,0 g/l t.o.m. 20,0 g/l 1 + 24 25 t.o.m. 20,0 g/l t.o.m. 40,0 g/l 1 + 49 50 t.o.m. 40,0 g/l t.o.m. 80,0 g/l 1 + 99 100 > 40,0 g/l > 80,0 g/l 1 + 999 1 000

5.2. Bestämning

Ställ in spektrofotometern på våglängden 340 nm och utför bestämningarna i förhållande till luft (ingen kyvett i strålgången) eller till vatten.

Temperatur mellan 20 och 25 °C.

Placera följande i två kyvetter med 1 cm optisk väglängd:

Referenskyvett Provkyvett Lösning 1 (4.1) (uppvärmd till 20 °C) 2,50 ml 2,50 ml Lösning 2 (4.2) 0,10 ml 0,10 ml Lösning 3 (4.3) 0,10 ml 0,10 ml Analysprov 0,20 ml Dubbeldestillerat vatten 0,20 ml

Blanda och läs av lösningarnas absorbans (A1) efter cirka tre minuter. Sätt igång reaktionen genom att tillsätta

lösning 4 (4.4) 0,02 ml 0,02 ml

Blanda. Vänta 15 minuter och läs av absorbansen. Kontrollera efter ytterligare 2 minuter (A2) att reaktionen har avstannat.

Tillsätt omedelbart

lösning 5 (4.5) 0,02 ml 0,02 ml

Blanda, läs av absorbansen (A3) efter 10 minuter och kontrollera efter ytterligare 2 minuter att reaktionen har avstannat.

Beräkna absorbansdifferenserna

A2 – A1, motsvarande glukos,

A3 – A2, motsvarande fruktos,

för såväl referens- som provvätskan.

Beräkna absorbansdifferenserna för referensvätskan (ΔAT) och provvätskan (ΔAD) och gör följande beräkningar:

För glukos: ΔAG = ΔAD – ΔAT

För fruktos: ΔAF = ΔAD – ΔAT

Anmärkning:

Den tid som krävs för enzymerna att verka kan variera mellan serierna och värdet ovan anges endast som vägledning. Värdet bör bestämmas för varje serie.

5.3. Redovisning av resultaten

5.3.1. Beräkning

Följande allmänna formel används för att beräkna koncentrationerna:

C= ((V × PM)/(ε × d × v × 1 000)) × ΔA (g/l)

där

V= provlösningens volym (ml)

v= provets volym (ml)

PM= molekylvikten för den substans som ska bestämmas

d= kyvettens optiska väglängd (cm)

ε= NADPH:s absorptionskoefficient vid 340 nm = 6,3 (mmol-1 × l × cm-1)

V= 2,92 ml vid bestämning av glukos

V= 2,94 ml vid bestämning av fruktos

v= 0,20 ml

PM= 180

d= 1

Då erhålls följande resultat:

För glukos: C g/l = 0,417 × ΔAG

För fruktos: C g/l = 0,420 × ΔAF

Om provet har spätts i samband med beredningen multipliceras resultatet med spädningsfaktorn F.

Anmärkning:

Om bestämningarna görs vid 334 eller 365 nm erhålls följande resultat:

— Bestämning vid 334 nm: ε = 6,2 (mmol-1 × l × cm-1) För glukos: C g/l = 0,425 × ΔAG För fruktos: C g/l = 0,428 × ΔAF

— Bestämning vid 365 nm: ε = 3,4 (mmol-1 × l × cm-1) För glukos: C g/l = 0,773 × ΔAG För fruktos: C g/l = 0,778 × ΔAF

5.3.2. Repeterbarhet (r)

r= 0,056 xi

5.3.3. Reproducerbarhet (R)

R= 0,12 + 0,076 xi

xi= halt av glukos eller fruktos i g/l

7 BESTÄMNING AV SOCKERHALT MED HJÄLP AV HPLC (SACKAROS) (OIV – AS311-03-SUCRES) – METOD AV TYP II

(p.m.)

[Beskrivningen av denna analysmetod håller på att revideras av OIV. Den kommer att offentliggöras i ett meddelande från kommissionen så snart den uppdaterade texten publiceras i 2010 års utgåva av OIV:s sammanställning av internationella analysmetoder. Som vägledning i väntan på detta offentliggörande hänvisas till kapitel 6.3 i bilagan till kommissionens förordning (EEG) nr 2676/90.]

8 DETEKTION AV BERIKNING AV MUST, KONCENTRERAD MUST, REKTIFIERAD KONCENTRERAD MUST OCH AV VIN MED HJÄLP AV KÄRNMAGNETISK RESONANS HOS DEUTERIUM (SNIF-NMR) (OIV – AS311-05-ENRRMN) – METOD AV TYP I

(p.m.)

[Beskrivningen av denna analysmetod håller på att revideras av OIV. Den kommer att offentliggöras i ett meddelande från kommissionen så snart den slutliga texten har antagits av OIV:s generalförsamling. Som vägledning i väntan på OIV:s beslut hänvisas till kapitel 8 i bilagan till kommissionens förordning (EEG) nr 2676/90.]

9 ALKOHOLHALT I VOLYMPROCENT (OIV – AS312-01-TALVOL) – METOD AV TYP I

(p.m.)

[Beskrivningarna av dessa analysmetoder håller på att revideras av OIV. De kommer att offentliggöras i ett meddelande från kommissionen så snart den uppdaterade texten publiceras i 2010 års utgåva av OIV:s sammanställning av internationella analysmetoder. Som vägledning i väntan på detta offentliggörande hänvisas till kapitel 3 i bilagan till kommissionens förordning (EEG) nr 2676/90.]

10 BESTÄMNING AV ISOTOPKVOTEN 13C/12C GENOM ISOTOPKVOTSMASSPEKTROMETRI AV VINETANOL ELLER ETANOL SOM ERHÅLLITS GENOM JÄSNING AV MUST, KONCENTRERAD MUST ELLER REKTIFIERAD KONCENTRERAD MUST (OIV-AS312-06-ETHANO) – METOD AV TYP II

1. TILLÄMPNINGSOMRÅDE

Metoden möjliggör mätning av isotopkvoten 13C/12C i vinetanol och i etanol som erhållits efter jäsning av produkter från vindruvor (must, koncentrerad must, rektifierad koncentrerad must).

2. STANDARDER

ISO: 5725:1994 Noggrannhet (riktighet och precision) för mätmetoder och mätresultat – Grundläggande metod för bestämning av en standardiserad mätmetods repeterbarhet och reproducerbarhet. V-PDB: Vienna-Pee-Dee Belemnite (RPDB = 0,0112372). Metod OIV AS311-O5-ENRRMN ”Detektion av berikning av must, koncentrerad must, rektifierad koncentrerad must och av vin med hjälp av kärnmagnetisk resonans hos deuterium (SNIF-NMR).”

3. TERMER OCH DEFINITIONER

13C/12C : Kvoten mellan isotoperna kol-13 (13C) och kol-12 (12C) i ett givet prov. δ13C : Halten av kol-13 (13C) uttryckt i promille (‰). SNIF-NMR : Site-Specific Natural Isotope Fractionation studied by Nuclear Magnetic Resonance (lokalitetsspecifik naturlig isotopfraktionering undersökt genom kärnmagnetisk resonans). V-PDB : Vienna-Pee-Dee Belemnite. PDB är primärstandard för mätning av naturliga variationer i halten av isotopen kol-13 och utgörs av kalciumkarbonat från rostrum hos belemniter från krita i formationen Pee-Dee i South Carolina (Förenta staterna). Dess isotopkvot 13C/12C eller RPDB är lika med 0,0112372. Reserverna av PDB är slut sedan länge men PDB är fortfarande primärstandard för att uttrycka naturliga variationer i halten av isotopen kol-13, och mot denna kalibreras de referensmaterial som finns tillgängliga vid Internationella atomenergiorganet (IAEA) i Wien (Österrike). Isotopbestämningar av naturlig förekomst av kol-13 uttrycks därför av konvention i förhållande till V-PDB. m/z : Kvoten mellan massa och laddning.

4. PRINCIP

Vid fotosyntesen sker växternas koldioxidassimilation genom två principiellt olika typer av metabolism, nämligen C3-metabolism (Calvincykeln) och C4-metabolism (Hatch och Slack). Dessa båda fotosyntesmekanismer har olika isotopfraktionering. De produkter som kommer från C4-växter, såsom sockerarter och alkohol som framställs genom jäsning, har högre halt av kol-13 än motsvarande produkter från C3-växter. De flesta växter, däribland vinranka och beta, hör till C3-gruppen. Sockerrör och majs hör till C4-gruppen. Genom att mäta halten kol-13 kan man alltså påvisa och uppskatta tillsatser av socker med C4-ursprung (rörsocker eller isoglukos från majs) i produkter som kommer från druvor (druvmust, vin etc.). Genom att kombinera uppgifter om halten kol-13 med uppgifter från SNIF-NMR är det också möjligt att bestämma hur stora kvantiteter som har tillsatts av blandningar av sockerarter eller alkoholer som kommer från C3- och C4-växter.

Halten av kol-13 bestäms på den koldioxid som bildas vid fullständig förbränning av provet. Förekomsten av de viktigaste isotopomererna med masstal 44 (12C16O2), 45 (13C16O2 och 12C17O16O) och 46 (12C16O18O), som kan bildas genom kombination av isotoperna 18O, 17O, 16O, 13C och 12C, bestäms utifrån de jonströmmar som mäts i tre olika kollektorer i en isotopkvotsmasspektrometer. Bidragen från isotopomererna 13C17O16O och 12C17O2 är mycket små och därmed försumbara. Jonströmmen för m/z = 45 korrigeras för bidraget från 12C17O16O som beräknas utifrån strömmens intensitet mätt för m/z = 46 med beaktande av de relativa förekomsterna av 18O och 17O (Craigs korrektion). Genom jämförelse med en standard som är kalibrerad mot den internationella standarden V-PDB kan halten kol-13 beräknas på den relativa δ13C-skalan.

5. REAGENSER

Material och förbrukningsartiklar hänger samman med vilken utrustning (6) laboratoriet använder. De mest använda systemen baseras på en elementaranalysator. Den kan vara utformad antingen för införing av prov i förseglade metallkapslar eller för insprutning av flytande prov genom ett membran med hjälp av en injektionsspruta.

Allt efter typ av instrument kan följande referensmaterial, reagens och förbrukningsartiklar användas:

— Referensmaterial:

— Tillgängliga hos IAEA: Namn Material δ13C i förhållande till V-PDB (9) — IAEA-CH-6 sackaros –10,4 ‰ — IAEA-CH-7 polyeten –31,8 ‰ — NBS22 olja –29,7 ‰ — USGS24 grafit –16,1 ‰

— Tillgängliga hos IRMM i Geel (Belgien) (Institutet för referensmaterial och referensmätningar): Namn Material δ13C i förhållande till V-PDB (9) — CRM/BCR 656 vinalkohol –26,93 ‰ — CRM/BCR 657 glukos –10,75 ‰ — CRM/BCR 660 vatten-alkohollösning (12 volymprocent alkohol) –26,72 ‰

— Standardprov med en känd 13C/12C-kvot kalibrerad mot internationella referensmaterial.

— För genomströmningssystem har följande vägledande förteckning upprättats: — Helium för analys (CAS 07440-59-7). — Syre för analys (CAS 07782-44-7). — Koldioxid för analys, använd som sekundär standard för halten kol-13 (CAS 00124-38-9). — Oxidationsreagens till ugnen i förbränningssystemet, t.ex. koppar(II)oxid för grundämnesanalys (CAS 1317-38-0). — Torkmedel för att avlägsna vatten som bildas vid förbränningen, t.ex. anhydron för grundämnesanalys (magnesiumperklorat) (CAS 10034-81-8). (Detta är inte nödvändigt för apparater med ett system som avlägsnar vatten med hjälp av en kylfälla eller ett kapillärrör med selektiv permeabilitet.)

6. UTRUSTNING OCH MATERIAL

6.1. Isotopkvotsmasspektrometer (IRMS)

Isotopkvotsmasspektrometer (IRMS) som kan bestämma det relativa innehållet av naturligt förekommande 13C i CO2-gas, med en intern noggrannhet på 0,05 ‰ eller bättre, uttryckt som ett relativt värde (punkt 9). Den interna noggrannheten definieras här som skillnaden mellan två mätningar av samma CO2-prov. En masspektrometer för mätning av isotopkvoter är i allmänhet försedd med en tredubbel kollektor för samtidig mätning av intensiteter för m/z = 44, 45 och 46. Isotopkvotsmasspektrometern ska antingen ha ett system med dubbla insläpp, för alternerande mätning av det okända provet och ett referensprov, eller ett integrerat system där proverna förbränns i sin helhet och där koldioxiden avskiljs från de övriga förbränningsprodukterna före mätningen i masspektrometern.

6.2. Förbränningsapparat

Förbränningsapparat som kan omvandla all etanol till koldioxid och avlägsna alla andra förbränningsprodukter, inbegripet vatten, utan någon isotopfraktionering. Apparaten kan vara antingen ett genomströmningssystem som är integrerat i masspektrometern (punkt 6.2.1) eller ett separat förbränningssystem (punkt 6.2.2). Förbränningsapparaten ska göra det möjligt att uppnå minst den noggrannhet som anges i punkt 11.

6.2.1. Genomströmningssystem

Ett genomströmningssystem utgörs antingen av en elementaranalysator eller av en gaskromatograf direkt ansluten till ett förbränningssystem.

För system som är utformade för införing av prov i metallkapslar behövs följande laboratorieutrustning:

— Kalibrerad mikrospruta eller mikropipett med lämpliga spetsar.

— Laboratorievåg med en noggrannhet på 1 μg eller bättre.

— Pincett för förslutning av kapslar.

— Tennkapslar för flytande provmaterial.

— Tennkapslar för fast provmaterial.

Anmärkning:

För att minska risken att etanolproverna avdunstar kan ett absorberande material (t.ex. Chromosorb W 45–60 mesh) placeras i kapslarna, efter ett blindprov kan genomföras för att kontrollera att proverna inte innehåller kol i så betydande mängd att det kan påverka mätresultaten.

Vid användning av en elementaranalysator försedd med insprutningsenhet för vätskor eller ett system med gaskromatograf och förbränningsenhet behövs följande laboratorieutrustning:

— Injektionsspruta för vätskor.

— Kolvar med tät förslutning och inerta membran.

Den laboratorieutrustning som anges ovan är endast exempel och kan ersättas med annan likvärdig utrustning beroende på vilken typ av förbränningsapparat och masspektrometer som används på laboratoriet.

6.2.2. Separat system för provberedning

Koldioxiden från förbränningen av analysproverna och referensprovet samlas upp i ampuller som sedan placeras i spektrometerns båda kanaler för isotopanalys. Flera olika typer av förbränningsapparater som finns beskrivna i litteraturen kan användas:

— Slutet förbränningssystem fyllt med cirkulerande syrgas.

— Elementaranalysator med helium- och syregenomströmning.

— Förseglad glasampull fylld med koppar(II)oxid som oxidationsmedel.

7. BEREDNING AV ANALYSPROV

Etanolen måste extraheras från vinet före isotopbestämningen. Detta görs genom destillation av vin enligt beskrivningen i punkt 3.1 i metoden SNIF-NMR (OIV - MA-E-AS311-05-ENRRMN).

När det gäller druvmust, koncentrerad druvmust och rektifierad koncentrerad druvmust måste sockret först jäsas till etanol enligt beskrivningen i punkt 3.2 i metoden SNIF-NMR (OIV - MA-E-AS311-05-ENRRMN).

8. UTFÖRANDE

Alla moment i beredningen måste utföras utan att etanolförlusten genom avdunstning blir så stor att provets isotopsammansättning ändras.

Följande beskrivning bygger på förfaranden som allmänt används vid förbränning av etanolprov i kommersiellt tillgängliga automatiska förbränningssystem. Alla andra metoder som säkerställer en fullständig omvandling av provets etanol till koldioxid utan etanolförlust genom avdunstning kan användas för beredning av koldioxid för isotopanalys.

Tillvägagångssätt vid användning av en elementaranalysator:

a) Inkapsling av proven: — Kapslar, pincett och arbetsbord ska vara rena. — Ta en kapsel av lämplig storlek med hjälp av pincetten. — Tillsätt erforderlig mängd vätska i kapseln med hjälp av mikropipetten. — Anmärkning: För att få 2 mg kol krävs 3,84 mg absolut etanol eller 4,17 mg destillat med en alkoholhalt på 92 viktprocent. Den erforderliga mängden destillat beräknas på motsvarande sätt och med hänsyn till den mängd kol som masspektrometerns känslighet kräver. — Förslut kapseln med hjälp av pincetten. — Varje kapsel ska vara helt tätt försluten. I annat fall måste den kasseras och ersättas med en ny. — Bered två kapslar för varje prov. — Placera kapslarna på lämpligt ställe på arbetsbordet på elementaranalysatorns automatiska provväxlare. Varje kapsel ska vara noggrant märkt med ett löpnummer. — Placera kapslar med standardprov först och sist i varje provserie. — Gör kontrollprov med regelbundna mellanrum i provserien.

b) Kontroll och justering av instrument för grundämnesanalys och masspektrometri: — Ställ in temperaturen i elementaranalysatorns förbränningsenheter samt helium- och syrgasströmmen för optimal förbränning av provet. — Kontrollera att det inte finns några läckor i systemet för grundämnesanalys och masspektrometri (exempelvis genom att kontrollera jonströmmen för m/z = 28, vilket motsvarar N2). — Ställ in masspektrometern för mätning av jonströmsintensiteten för m/z = 44, 45 och 46. — Kontrollera systemet med hjälp av kända kontrollprover före mätning av analysproverna.

c) Genomförande av en mätserie: Proverna förs in ett i taget på elementaranalysatorns (eller kromatografens) automatiska provväxlare. Koldioxiden från förbränningen av de enskilda proverna leds vidare till masspektrometern som mäter jonströmmarna. Datorn som är kopplad till instrumentet registrerar jonströmmarnas intensitet och beräknar δ-värdena för varje enskilt prov (punkt 9).

9. BERÄKNING

Metodens syfte är att mäta isotopkvoten 13C/12C i etanol som har extraherats från vin eller från produkter framställda av druvor efter jäsning. Isotopkvoten 13C/12C kan anges som avvikelsen från ett standardprov. Avvikelsen för isotopen kol-13 (δ13C) beräknas sedan på en deltapromilleskala (δ/1 000) genom att resultaten för analysprovet jämförs mot resultaten för standardprovet, som dessförinnan har kalibrerats mot den internationella primärstandarden (V-PDB). δ13C-värdena uttrycks i förhållande till standardprovet enligt följande formel:

δ13Cprov/std ‰ = 1 000 × (Rprov – Rstd)/Rstd

där Rprov och Rstd är isotopkvoterna 13C/12C för provet respektive den koldioxid som används som standard.

δ13C-värdena uttrycks i förhållande till V-PDB enligt följande formel:

δ13Cprov/V-PDB ‰ = δ13Cprov/std + δ13Cstd/V-PDB + (δ13Cprov/std × δ13Cstd/V-PDB)/1 000

där δ13Cstd/V-PDB är den isotopavvikelse som tidigare bestämts för standardprovet i förhållande till V-PDB.

Under mätningens gång kan en viss drift förekomma till följd av ändrade förhållanden för instrumenten. I så fall måste δ13C-värdena för proverna korrigeras efter skillnaden mellan det δ13C-värde som uppmätts för standardprovet och det riktiga värdet som fastställts vid den föregående kalibreringen mot V-PDB genom jämförelse med ett internationellt referensmaterial. Mellan två mätningar på standardprovet kan driften, och därmed den korrigering som ska göras av provresultaten, antas vara linjär. Standardprovet ska mätas i början och i slutet av varje provserie. Utifrån detta kan en korrigering beräknas för varje prov genom linjär interpolation.

10. KVALITETSSÄKRING OCH KONTROLL

Kontrollera att 13C-värdet för standardprovet inte avviker mer än 0,5 ‰ från det tillåtna värdet. Om det gör det måste spektrometerns inställning kontrolleras och eventuellt justeras.

Kontrollera för varje enskilt prov att skillnaden i resultat mellan de två kapslar som har mätts efter varandra är mindre än 0,3 ‰. Det slutliga resultatet för ett givet prov är genomsnittet för de båda kapslarna. Om avvikelsen är större än 0,3 ‰ måste mätningen göras om.

Att mätningen fungerar korrekt kan kontrolleras utifrån jonströmmens intensitet för m/z = 44, som är proportionell mot den mängd kol som sprutas in i elementaranalysatorn. Under standardförhållanden kan man anta att intensiteten av denna jonström är praktiskt taget konstant för de analyserade proven. En betydande avvikelse kan tyda på avdunstning av etanol (t.ex. från en otät kapsel) eller instabilitet i elementaranalysatorn eller masspektrometern.

11. METODENS PRESTANDA (NOGGRANNHET)

Olika laboratorier har gjort ett första ringtest (punkt 11.1) av destillat som innehåller alkohol från vin, sockerrör och betor samt olika blandningar av dessa tre ursprung. Eftersom man vid denna undersökning inte tog hänsyn till destillationsprocessen, har kompletterande information från andra ringtest avseende vin (punkt 11.2) och särskilt provserier för bedömning av lämplighet att utföra isotopmätningar (punkt 11.3) också beaktats. Resultaten visar att olika destillationssystem som används under tillfredsställande förhållanden, i synnerhet de som tillämpas vid mätning med SNIF-NMR, inte ger upphov till någon betydande variation vid bestämning av δ13C-värdet hos vinetanol. Värdena på de parametrar för noggrannhet som har observerats för vin är nästan identiska med de värden som erhölls i ringtestet (punkt 11.1) av destillat.

11.1. Ringtest av destillat

År då interkalibreringen gjordes: 1996 Antal laboratorier: 20 Antal prover: 6 dubbla blindprov Analyt: δ13C för etanol





Provkod Alkohol från vin Alkohol från betor Alkohol från sockerrör A & G 80 % 10 % 10 % B & C 90 % 10 % 0 % D & F 0 % 100 % 0 % E & I 90 % 0 % 10 % H & K 100 % 0 % 0 % J & L 0 % 0 % 100 %





Prov A/G B/C D/F E/I H/K J/L Antal laboratorier efter eliminering av laboratorier med avvikande mätresultat 19 18 17 19 19 19 Antal godkända resultat 38 36 34 38 38 38 Medelvärde (δ13C) ‰ –25,32 –26,75 –27,79 –25,26 –26,63 –12,54 Sr2 0,0064 0,0077 0,0031 0,0127 0,0069 0,0041 Standardavvikelse för repeterbarhet (Sr) ‰ 0,08 0,09 0,06 0,11 0,08 0,06 Repeterbarhetsgräns r (2,8 × Sr) ‰ 0,22 0,25 0,16 0,32 0,23 0,18 SR2 0,0389 0,0309 0,0382 0,0459 0,0316 0,0584 Standardavvikelse för reproducerbarhet (SR) ‰ 0,20 0,18 0,20 0,21 0,18 0,24 Reproducerbarhetsgräns R (2,8 × SR) ‰ 0,55 0,49 0,55 0,60 0,50 0,68

11.2. Interkalibrering på två viner och en alkohol

År då interkalibreringen gjordes: 1996 Antal laboratorier: 14 för destillation av vin, varav 7 även för mätning av δ13C i vinetanol 8 för mätning av δ13C i alkoholprov Antal prover: 3 (vitt vin med 9,3 volymprocent alkohol, vitt vin med 9,6 volymprocent alkohol samt alkohol med styrkan 93 viktprocent) Analyt: δ13C för etanol





Prov Rött vin Vitt vin Alkohol Antal laboratorier 7 7 8 Antal godkända resultat 7 7 8 Medelvärde (δ13C) ‰ –26,20 –26,20 –25,08 Varians för reproducerbarhet SR2 : 0,0525 0,0740 0,0962 Standardavvikelse för reproducerbarhet (SR) ‰ 0,23 0,27 0,31 Reproducerbarhetsgräns R (2,8 × SR) ‰ 0,64 0,76 0,87

De deltagande laboratorierna använde olika system för destillation. De isotopbestämningar (δ13C) som ett enskilt laboratorium utfört på alla de destillat som deltagarna skickade tillbaka uppvisar varken avvikande värden eller värden som skiljer sig signifikant från medelvärdena. Resultatens varians (S2 = 0,0059) är jämförbar med variansen för repeterbarhet Sr 2 i ringtestet av destillat (11.1).

11.3. Resultat av undersökningar för bedömning av lämplighet för isotopanalyser

Sedan december 1994 anordnas regelbundet internationella undersökningar för att bedöma lämplighet att utföra isotopbestämningar på vin och alkohol (destillat med 96 volymprocent alkohol). Resultaten gör det möjligt för deltagande laboratorier att kontrollera sina analysers kvalitet. Genom en statistisk behandling av resultaten kan man göra en bedömning av bestämningarnas variation under reproducerbarhetsbetingelser och därigenom göra en uppskattning av parametrarna varians och reproducerbarhetsgräns. De erhållna resultaten för bestämningarna av δ13C i etanol från vin och destillat sammanfattas i följande tabell:

Datum Vin Destillat N SR SR2 R N SR SR2 R December 1994 6 0,210 0,044 0,59 6 0,151 0,023 0,42 Juni 1995 8 0,133 0,018 0,37 8 0,147 0,021 0,41 December 1995 7 0,075 0,006 0,21 8 0,115 0,013 0,32 Mars 1996 9 0,249 0,062 0,70 11 0,278 0,077 0,78 Juni 1996 8 0,127 0,016 0,36 8 0,189 0,036 0,53 September 1996 10 0,147 0,022 0,41 11 0,224 0,050 0,63 December 1996 10 0,330 0,109 0,92 9 0,057 0,003 0,16 Mars 1997 10 0,069 0,005 0,19 8 0,059 0,003 0,16 Juni 1997 11 0,280 0,079 0,78 11 0,175 0,031 0,49 September 1997 12 0,237 0,056 0,66 11 0,203 0,041 0,57 December 1997 11 0,127 0,016 0,36 12 0,156 0,024 0,44 Mars 1998 12 0,285 0,081 0,80 13 0,245 0,060 0,69 Juni 1998 12 0,182 0,033 0,51 12 0,263 0,069 0,74 September 1998 11 0,264 0,070 0,74 12 0,327 0,107 0,91 Vägt medelvärde 0,215 0,046 0,60 0,209 0,044 0,59 N : Antal deltagande laboratorier.

11.4. Repeterbarhets- och reproducerbarhetsgränser

På grundval av de uppgifter från olika interkalibreringar som presenteras i ovanstående tabeller kan följande repeterbarhets- och reproducerbarhetsgränser fastställas för denna metod, inbegripet destillationsstadiet:

Repeterbarhetsgräns r: 0,24.

Reproducerbarhetsgräns R: 0,6.

11 TOTAL SYRAHALT (OIV – AS313-01-ACITOT) – METOD AV TYP I

1. DEFINITION

Vinets totala syrahalt är summan av dess titrerbara syror när en alkalisk standardlösning tillsätts så att vinets pH blir 7.

Koldioxid ingår inte i den totala syrahalten.

2. PRINCIP FÖR METODEN

Potentiometrisk titrering eller titrering med bromtymolblått som indikator och jämförelse med färgstandard.

3. REAGENSER

3.1. Buffertlösning (pH 7,00) som bereds av

monokaliumfosfat (KH2PO4): 107,3 g,

1 M natriumhydroxidlösning (NaOH): 500 ml,

vatten till: 1 000 ml.

Alternativt kan man använda färdiga buffertlösningar som finns i handeln.

3.2. 0,1 M natriumhydroxidlösning (NaOH).

3.3. Indikatorlösning av bromtymolblått (4 g/l) som bereds enligt följande:

Bromtymolblått (C27H28Br2O5S) … 4 g Neutral etanol, 96 % (volym/volym) … 200 ml Ovanstående blandas till en lösning och därefter tillsätts följande: CO2-fritt vatten … 200 ml 1 M natriumhydroxidlösning tills att lösningen skiftar över till blågrön färg (pH 7) ca … 7,5 ml Vatten till … 1 000 ml

4. UTRUSTNING

4.1. Vattensug.

4.2. 500 ml vakuumsugkolv.

4.3. Potentiometer med skalindelning i pH-enheter och med elektroder. Glaselektroden ska förvaras i destillerat vatten. Kalomelelektroden ska förvaras i mättad kaliumkloridlösning. Oftast används en kombinerad elektrod, som ska förvaras i destillerat vatten.

4.4. Mätglas på 50 ml (vin) resp. 100 ml (rektifierad koncentrerad must).

5. UTFÖRANDE

5.1. Beredning av provet

5.1.1. Vin

Avlägsna koldioxiden. Häll cirka 50 ml av vinet i en vakuumsugkolv. Sug med vattensugen i 1–2 minuter under omskakning.

5.1.2. Rektifierad koncentrerad must

Häll i 200 g noggrant uppvägd rektifierad koncentrerad must i en 500 ml mätkolv. Fyll upp till märket med vatten. Homogenisera blandningen.

5.2. Potentiometrisk titrering

5.2.1. Kalibrering av pH-mätare

Kalibrering av pH-mätaren görs vid 20 °C med buffertlösning (pH 7,00) vid 20 °C enligt tillverkarens anvisningar.

5.2.2. Mätmetod

Häll ett prov (berett som i punkt 5.1) på 10 ml för vin och 50 ml för rektifierad koncentrerad must i en mätcylinder (punkt 4.4). Tillsätt cirka 10 ml destillerat vatten och därefter 0,1 M natriumhydroxidlösning (punkt 3.2) från byretten, till dess att pH är 7 vid 20 °C. Den alkaliska lösningen ska tillsättas långsamt under omskakning av lösningen. Det tillsatta antalet milliliter 0,1 M NaOH betecknas n.

5.3. Titrering med indikator (bromtymolblått)

5.3.1. Förberedande analys: färgbestämning

Häll 25 ml kokt destillerat vatten, 1 ml lösning av bromtymolblått (punkt 3.3) och ett prov (berett enligt punkt 5.1) på 10 ml för vin och 50 ml för rektifierad koncentrerad must i en mätcylinder (punkt 4.4). Tillsätt 0,1 M natriumhydroxidlösning (punkt 3.2) till dess att färgen slår om till blågrönt. Tillsätt därefter 5 ml av buffertlösningen med pH 7 (punkt 3.1).

5.3.2. Bestämning

Häll 30 ml kokt destillerat vatten, 1 ml lösning av bromtymolblått (punkt 3.3) och ett prov (berett enligt punkt 5.1), på 10 ml för vin och 50 ml för rektifierad koncentrerad must i en mätcylinder (punkt 4.4). Tillsätt 0,1 M natriumhydroxidlösning (punkt 3.2) till dess att färgen blir den samma som i det förberedande provet (punkt 5.3.1). Det tillsatta antalet milliliter natriumhydroxid betecknas n.

6. REDOVISNING AV RESULTATEN

6.1. Beräkningsmetod

6.1.1. Vin

Den totala syrahalten uttryckt i milliekvivalenter per liter blir

A = 10 × n

Mängden anges med en decimal.

Den totala syrahalten uttryckt i gram vinsyra per liter blir

A′ = 0,075 × A

Mängden anges med en decimal.

6.1.2. Rektifierad koncentrerad must

— Den totala syrahalten uttryckt i milliekvivalenter per kg rektifierad koncentrerad must blir a = 5 × n

— Den totala syrahalten uttryckt i milliekvivalenter per kg totalsocker blir — A = (500 × n)/P — där P = halten i % (vikt/vikt) av totalsocker

Halten anges med en decimal.

6.2. Repeterbarhet (r) för titrering med indikator (5.3)

r = 0,9 mval/l r = 0,07 g vinsyra/l

för vita viner, roséviner och röda viner.

6.3. Reproducerbarhet (R) för titrering med indikator (5.3)

För vita viner och rosévin: R = 3,6 mval/l. R = 0,3 g vinsyra/l.

För rödvin: R = 5,1 mval/l. R = 0,4 g vinsyra/l.

12 FLYKTIGA SYROR (OIV – AS313-02-ACIVOL) – METOD AV TYP I

1. DEFINITION

Flyktiga syror är de syror i ättiksyraserien som förekommer i vin i fri form och som salt.

2. PRINCIP FÖR METODEN

De flyktiga syrorna separeras från vinet genom ångdestillation och destillatet titreras.

Först avlägsnas koldioxid från vinet.

Syran i fri och bunden svaveldioxid som destillerats på detta sätt ska dras ifrån destillatets syrahalt.

Eventuell sorbinsyra som har tillsatts vinet ska också dras ifrån.

Anmärkning:

En del av den salicylsyra som används i vissa länder för att stabilisera viner före analys återfinns i destillatet. Denna måste bestämmas och dras ifrån syrahalten. Bestämningsmetoden anges i punkt 7 i detta kapitel.

3. REAGENSER

3.1. Kristalliserad vinsyra (C4H6O6).

3.2. 0,1 M natriumlösning (NaOH).

3.3. 1 % fenolftaleinlösning i 96 % (volym/volym) neutral alkohol.

3.4. Saltsyra (ρ20 = 1,18–1,19 g/ml), spädd 1:4 (volym/volym).

3.5. 0,005 M jodlösning (I2).

3.6. Kristalliserad kaliumjodid (KI).

3.7. Stärkelselösning 5 g/l.

Blanda 5 g stärkelse med cirka 500 ml vatten. Koka upp under omrörning och koka i tio minuter. Tillsätt 200 g natriumklorid, kyl och späd till 1 liter.

3.8. Mättad lösning av natriumborat (Na2B4O7 · 10 H2O), dvs. cirka 55 g/l vid 20 °C.

4. UTRUSTNING

4.1. Ångdestillationsapparat bestående av följande:

1) Ånggenerator. Ångan ska vara fri från koldioxid.

2) Kolv med ångrör.

3) Destillationskolonn.

4) Kylare.

Apparaturen ska uppfylla följande tre krav:

a) Häll 20 ml kokt vatten i kolven. Samla upp 250 ml av destillatet och tillsätt 0,1 ml 0,1 M natriumhydroxidlösning (punkt 3.2) och två droppar av fenolftaleinlösningen (punkt 3.3). Rosafärgningen ska vara stabil i minst tio sekunder (dvs. ångan ska vara fri från koldioxid).

b) Häll 20 ml av 0,1 M ättiksyralösning i kolven. Samla upp 250 ml av destillatet. Titrera med 0,1 M natriumhydroxidlösning (punkt 3.2). Den använda volymen ska vara minst 19,9 ml (dvs. minst 99,5 % av ättiksyran ska avlägsnas med ångan).

c) Häll 20 ml av 1 M mjölksyralösning i kolven. Samla upp 250 ml av destillatet och titrera syran med 0,1 M natriumhydroxidlösning (punkt 3.2).

Den volym natriumhydroxidlösning som tillsätts ska vara mindre än eller lika med 1,0 ml (dvs. inte mer än 0,5 % mjölksyra destilleras).

Apparater och metoder som klarar dessa prov med godkänt resultat uppfyller officiella, internationella krav på utrustning och metoder.

4.2. Vattenpump.

4.3. Vakuumkolv.

5. UTFÖRANDE

5.1. Beredning av provet: avlägsna koldioxiden.

Häll cirka 50 ml vin i en vakuumkolv. Sug med vattensugen i 1–2 minuter under omskakning.

5.2. Ångdestillation

Häll 20 ml vin från vilket koldioxiden avlägsnats enligt punkt 5.1 i kolven. Tillsätt cirka 0,5 g vinsyra (punkt 3.1). Samla upp minst 250 ml av destillatet.

5.3. Titrering

Titrera med 0,1 M natriumhydroxidlösning (punkt 3.2) som innehåller två droppar fenolftalein (punkt 3.3) som indikator. Det använda antalet milliliter betecknas n.

Tillsätt fyra droppar saltsyra, spädd 1:4 (punkt 3.4), 2 ml stärkelselösning (punkt 3.7) och några kristaller kaliumjodid (punkt 3.6). Titrera den fria svaveldioxiden med 0,005 M jodlösning (punkt 3.5). Det använda antalet milliliter betecknas n'.

Tillsätt mättad natriumboratlösning (punkt 3.8) till dess att den rosa färgen kommer tillbaka. Titrera den bundna svaveldioxiden med 0,005 M jodlösning (punkt 3.5). Det använda antalet milliliter betecknas n".

6. REDOVISNING AV RESULTATEN

6.1. Beräkningsmetod

Halten av flyktiga syror, uttryckt i milliekvivalenter/liter med en decimal, beräknas med följande formel:

A = 5 (n – 0,1 n′ – 0,05 n″)

Halten av flyktiga syror, uttryckt i gram ättiksyra/liter med två decimaler, beräknas med följande formel:

0,300 (n – 0,1 n′ – 0,05 n″)

6.2. Repeterbarhet (r)

r = 0,7 mval/l r = 0,04 g ättiksyra/l

6.3. Reproducerbarhet (R)

R = 1,3 mval/l R = 0,08 g ättiksyra/l

6.4. Vin med tillsats av sorbinsyra

Eftersom 96 % av sorbinsyran ångsdestilleras vid en destillatvolym på 250 ml måste denna syra dras ifrån de flyktiga syrorna. 100 mg sorbinsyra motsvarar en syrahalt av 0,89 milliekvivalenter eller 0,053 g ättiksyra; halten av sorbinsyra i mg/l bestäms med en annan metod.

7. BESTÄMNING AV SALICYLSYRA SOM FÖLJER MED DESTILLATET FÖR FLYKTIGA SYROR

7.1. Princip

Efter bestämning av flyktiga syror och korrektion för svaveldioxid kan förekomsten av salicylsyra konstateras, efter surgöring genom att provet lilafärgas när ett järn(III)salt tillsätts.

Bestämning av salicylsyra som följer med destillatet för de flyktiga syrorna utförs på ett andra destillat med samma volym som det första destillatet. I detta andra destillat bestäms salicylsyran med en jämförande kolorimetrisk metod. Den dras ifrån syrahalten i destillatet för flyktiga syror.

7.2. Reagenser

7.2.1. Saltsyra (HCl) (ρ20 = 1,18–1,19 g/ml).

7.2.2. Natriumtiosulfat (Na2S2O3 · 5H2O) i en 0,1 M lösning.

7.2.3. 10 % (vikt/volym) lösning av järn(III)ammoniumsulfat (Fe2(SO4)3 · (NH4)2SO4 · 24H2O).

7.2.4. 0,01 M lösning av natriumsalicylat. Lösningen ska innehålla 1,60 g natriumsalicylat (NaC7H5O3) per liter.

7.3. Utförande

7.3.1. Identifiering av salicylsyra i destillatet för flyktiga syror

Omedelbart efter bestämning av flyktiga syror och korrektion för fri och bunden svaveldioxid hälls 0,5 ml saltsyra (punkt 7.2.1), 3 ml 0,1 M natriumtiosulfatlösning (punkt 7.2.2) och 1 ml järn(III)ammoniumsulfatlösning (punkt 7.2.3) i en konisk kolv.

Om destillatet innehåller salicylsyra skiftar färgen över till lila.

7.3.2. Bestämning av salicylsyrahalt

Destillatets volym markeras på den koniska kolven. Töm och skölj kolven.

Ett nytt analysprov på 20 ml vin ångdestilleras och destillatet samlas upp i den koniska kolven till märket. Tillsätt 0,3 ml ren saltsyra (punkt 7.2.1) och 1 ml järn(III)ammoniumsulfatlösning (punkt 7.2.3). Innehållet i kolven blir lila.

Häll destillerat vatten i en konisk kolv, som är identisk med den kolv på vilken volymen har markerats, upp till samma nivå som destillatnivån. Tillsätt 0,3 ml ren saltsyra (punkt 7.2.1) och 1 ml järn(III)ammoniumsulfatlösning (punkt 7.2.3). Tillsätt 0,01 M natriumsalicylatlösning (punkt 7.2.4) via byretten till dess att den lila färgen har samma nyans som i kolven med vindestillatet.

Det antal milliliter lösning som tillsätts betecknas n′′′.

7.4. Korrektion av flyktiga syror

Dra av volymen 0,1 n′′′ ml från den volym n ml av 0,1 M natriumhydroxidlösning som använts för att titrera destillatets surhetsgrad vid bestämningen av flyktiga syror.

13 CITRONSYRA (OIV – AS313-09-ACIENZ) – METOD AV TYP II

1. PRINCIP FÖR METODEN

Citronsyra omvandlas till oxalacetat och acetat i en reaktion som katalyseras av citratlyas (CL):

Citrat ←→ oxalacetat + acetat

I närvaro av malatdehydrogenas (MDH) och laktatdehydrogenas (LDH) reduceras oxalacetatet och dess dekarbolyxeringsderivat, pyruvat, till L-malat och L-laktat med hjälp av reducerad nikotinamid-adenin-dinukleotid (NADH):

oxalacetat + NADH + H+ ←→ L-malat + NAD+

pyruvat + NADH + H+ ←→ L-laktat + NAD+

Mängden NADH som oxideras till NAD+ i dessa reaktioner är proportionerlig mot den mängd citrat som finns närvarande. Oxidationen av NADH bestäms med hjälp av den resulterande absorbansminskningen vid 340 nm våglängd.

2. REAGENSER

2.1. Buffertlösning, pH 7,8 (0,51 M glycylglycin, pH = 7,8; Zn2+: 0,6 × 10–3 M):

Lös 7,13 g glycylglycin i cirka 70 ml dubbeldestillerat vatten.

Justera pH till 7,8 med cirka 13 ml 5 M natriumhydroxidlösning, tillsätt 10 ml zinkkloridlösning (80 mg ZnCl2 i 100 ml H2O) och fyll upp till 100 ml med dubbeldestillerat vatten.

Lösningen är hållbar i minst fyra veckor vid 4 °C.

2.2. Reducerad nikotinamid-adenin-dinukleotidlösning (NADH) (ca 6 × 10–3 M): Lös upp 30 mg NADH och 60 mg NaHCO3 i 6 ml dubbeldestillerat vatten.

2.3. Lösning av malathydrogenas/laktathydrogenas (MDH/LDH) (0,5 mg MDH/ml; 2,5 mg LDH/ml):

Blanda 0,1 ml MDH (5 mg MDH/ml), 0,4 ml ammoniumsulfatlösning (3,2 M) och 0,5 ml LDH (5 mg/ml). Denna suspension är hållbar i minst ett år vid 4 °C.

2.4. Citratlyas (CL, 5 mg protein/ml): Lös upp 168 mg lyofilisat i 1 ml iskallt vatten. Denna lösning är hållbar i minst en vecka vid +4 °C och i minst fyra veckor i fruset tillstånd.

Enzymaktiviteten bör kontrolleras före bestämningen.

2.5. Polyvinylpolypyrrolidon (PVPP)

Anmärkning: Samtliga ovannämnda reagenser finns i handeln.

3. UTRUSTNING

3.1. Spektrofotometer som är anpassad för mätningar vid 340 nm, som är absorptionsmaximum för NADH.

Om sådan apparatur saknas går det att använda en spektrofotometer med diskontinuerligt spektrum som tillåter bestämning vid 334 eller 365 nm. Eftersom absorbansbestämningarna är absoluta (dvs. kalibreringskurvor används inte utan bestämning görs med hjälp av extinktionskoefficienten för NADH), måste apparatens våglängdsskalor och absorptionsvärden kontrolleras.

3.2. Glaskyvetter med en optisk väglängd av 1 cm eller engångskyvetter.

3.3. Mikropipetter för pipettering av volymer mellan 0,02 och 2 ml.

4. BEREDNING AV PROVET

Citratbestämning utförs normalt direkt i vinet utan föregående avfärgning och spädning, under förutsättning att citronsyrahalten är lägre än 400 mg/l. Om så inte är fallet späds vinet till dess att citrathalten är mellan 20 och 400 mg/l (dvs. mellan 5 och 80 μg citrat i provet).

För röda viner med höga halter av fenolföreningar rekommenderas förbehandling med PVPP:

Slamma upp cirka 0,2 g PVPP i vatten och låt stå i 15 minuter. Filtrera genom ett veckfilter.

Häll 10 ml vin i en 50 ml konisk kolv, tillsätt fuktad PVPP som skrapats av från filtret med en spatel. Skaka om i två till tre minuter. Filtrera.

5. UTFÖRANDE

Spektrofotometern ställs in på våglängden 340 nm. Bestämning sker med 1 cm kyvetter med luft som nollabsorbansstandard (ingen kyvett i strålgången). Sätt följande till kyvetterna:

Referenskyvett Provkyvett Lösning 2.1 1,00 ml 1,00 ml Lösning 2.2 0,10 ml 0,10 ml Prov — 0,20 ml Dubbeldestillerat vatten 2,00 ml 1,80 ml Lösning 2.3 0,02 ml 0,02 ml

Blanda och läs av absorbansen för lösningarna i referens- och provkyvetterna (A1) efter cirka fem minuter.

Tillsätt följande:

Lösning 2.4 0,02 ml 0,02 ml

Blanda och vänta till dess att reaktionen är avslutad (ca 5 minuter) och läs av absorbansen för lösningarna i referens- och provkyvetterna (A2).

Beräkna absorbansdifferensen (A1 – A2) för referens- och provkyvetterna.

Beräkna slutligen skillnaden mellan dessa differenser:

ΔA = ΔAD – ΔAT

Anmärkning: Den tid som krävs för enzymerna att verka kan variera mellan serierna och värdet ovan anges endast som vägledning. Värdet bör bestämmas för varje serie.

6. REDOVISNING AV RESULTATEN

Citronsyrahalten anges i milligram per liter (mg/l) och avrundas till närmaste heltal.

6.1. Beräkningsmetod

Nedanstående allmänna formel används för beräkning av koncentrationen i mg/l:

C = ((V × PM)/(ε × d × v)) × ΔA

där V = provlösningens volym i ml (här 3,14 ml) v = provets volym i ml (här 0,2 ml) PM = molekylvikten av den substans som ska bestämmas (för vattenfri citronsyra är M = 192,1) d = kyvettens optiska väglängd i cm (här 1 cm) ε = absorptionskoefficienten för NADH (vid 340 nm: ε = 6,3 mmol–1 × l × cm–1.

Då erhålls följande resultat:

C = 479 × ΔA

Om provet har spätts vid beredning ska resultatet multipliceras med utspädningsfaktorn (F).

Anmärkning: Vid 334 nm: C = 488 × ΔA (ε = 6,2 mmol–1 × l × cm–1).

Vid 365 nm: C = 887 × ΔA (ε = 3,4 mmol–1 × l × cm–1)

6.2. Repeterbarhet (r)

Citronsyrahalt under 400 mg/l: r = 14 mg/l.

Citronsyrahalt över 400 mg/l: r = 28 mg/l.

6.3. Reproducerbarhet (R)

Citronsyrahalt under 400 mg/l: R = 39 mg/l.

Citronsyrahalt över 400 mg/l: R = 65 mg/l.

14 SORBINSYRA (OIV – AS313-14-ACISOR) – METOD AV TYP IV

1. PRINCIP FÖR METODERNA

1.1. Bestämning med ultraviolett absorptionsspektrofotometri

Sorbinsyra (trans-, trans-2,4-hexadiensyra) som extraherats genom ångdestillation bestäms i vindestillatet med ultraviolett absorptionsspektrofotometri. Substanser som stör absorptionsbestämningen i den ultravioletta delen av spektrum avlägsnas genom indunstning till torrhet med hjälp av lätt alkalisk kalciumhydroxid. Tunnskiktskromatografi (känslighet: 1 mg/l) används för identifiering av nivåer under 20 mg/l.

1.2. Bestämning med gaskromatografi

Sorbinsyra som extraheras i etyleter bestäms med gaskromatografi mot en intern standard.

1.3. Identifiering av spårmängder med tunnskiktskromatografi

Sorbinsyra som extraheras i etyleter separeras med tunnskiktskromatografi och koncentrationen bestäms semikvantitativt.

2. BESTÄMNING MED ULTRAVIOLETT ABSORPTIONSSPEKTROFOTOMETRI

2.1. Reagenser

2.1.1. Kristalliserad vinsyra, (C4H6O6).

2.1.2. Kalciumhydroxid, Ca(OH)2, cirka 0,02 M lösning.

2.1.3. Referenslösning av sorbinsyra, 20 mg/l, som bereds på följande sätt:

Lös 20 mg sorbinsyra, C6H8O2 i cirka 2 ml 0,1 M natriumhydroxidlösning. Häll lösningen i en 1 000 ml mätkolv och fyll upp till märket med vatten. Alternativt kan man lösa 26,8 mg kaliumsorbat, C6H7KO2, i vatten och späda lösningen till 1 000 ml med vatten.

2.2. Utrustning

2.2.1. Ångdestillationsapparat (se kapitlet ”Flyktiga syror”).

2.2.2. Vattenbad, 100 °C.

2.2.3. Spektrofotometer för absorbansbestämning vid 256 nm med en kyvett av kvarts med 1 cm optisk väglängd.

2.3. Utförande

2.3.1. Destillation:

Häll 10 ml vin i kolven i en ångdestillationsapparat och tillsätt 1–2 g vinsyra (punkt 2.1.1). Samla upp 250 ml av destillatet.

2.3.2. Rita upp en kalibreringskurva

Genom spädning av referenslösningen (punkt 2.1.3) bereds fyra spädda referenslösningar med 0,5; 1,0; 2,5 respektive 5 mg sorbinsyra/l. Bestäm deras absorbanser med spektrofotometern vid 256 nm, med lösningen med destillerat vatten som nollprov. Rita en graf som visar absorbansvariationen som en funktion av halten. Variationen är linjär.

2.3.3. Bestämning

Häll 5 ml av destillatet i en indunstningsskål med 55 mm diameter och tillsätt 1 ml kalciumhydroxidlösning (punkt 2.1.2). Indunsta över vattenbad tills destillatet är torrt.

Lös resten i flera ml destillerat vatten och överför helt till en 20 ml mätkolv. Fyll upp till märket med sköljvatten. Bestäm absorbansen vid 256 nm med en spektrofotometer i förhållande till en referenslösning som erhålls genom spädning av 1 ml kalciumhydroxidlösning (punkt 2.1.2) med vatten till 20 ml.

Rita in värdet för den bestämda absorbansen på kalibreringskurvan och läs av lösningens sorbinasyrakoncentration C.

Anmärkning: Med denna metod kan förlusten till följd av indunstning bortses ifrån. Absorbansbestämningen utförs direkt på destillatet som spätts 1:4 med destillerat vatten.

2.4. Redovisning av resultaten

2.4.1. Beräkningsmetod

Halten av sorbinsyra i det analyserade vinet uttryckt i mg/l erhålls med följande formel:

100 × C

där C = halten av sorbinsyra i den spektrofotometriskt analyserade lösningen uttryckt i mg/l.

3. BESTÄMNING MED GASKROMATOGRAFI

3.1. Reagenser

3.1.1. Etyleter, (C2H5)2O, destillerad omedelbart före användning.

3.1.2. Intern referenslösning: lösning av undekansyra, C11H22O2, i 95 % etanol (volym/volym) med en koncentration av 1 g/l.

3.1.3. Lösning av svavelsyra i vatten, H2SO4 (ρ20 = 1,84 g/ml) spädd 1:3 (volym/volym).

3.2. Utrustning

3.2.1. Gaskromatograf med flamjoniseringsdetektor och kolonn av rostfritt stål (4 m × 1/8 tum) som behandlats med dimetyldiklorsilan och packats med en stationär fas bestående av en blandning av dietylenglykolsuccinat (5 %) och fosforsyra (1 %) (DEGS – H3PO4) eller med en blandning av dietylenglykoladipat (7 %) och fosforsyra (1 %) (DEGA – H3PO4) på Gaschrome Q 80–100 mesh.

Häll en lösning innehållande 2–3 g DMDCS i toluen genom kolonnen. Skölj omedelbart med metanol, följt av kvävgas. Tvätta därefter med hexan och sedan mer kvävgas. Kolonnen är nu färdig att packas.

Driftsbetingelser:

Ugnstemperatur: 175 °C.

Injektorns och detektorns temperatur: 230 °C.

Bärargas: kvävgas (flödeshastighet = 200 ml/minut).

3.2.2. Mikrospruta, 10 μl, graderad i 0,1 μl.

Anmärkning: Andra typer av kolonner som ger god separation kan användas, särskilt kapillärkolonner (t.ex. FFAP).

Den metod som beskrivs här anges som exempel.

3.3. Utförande

3.3.1. Beredning av provet

Häll 20 ml vin i ett provrör av glas med cirka 40 ml volym och propp av slipat glas. Tillsätt 2 ml av den interna referenslösningen (punkt 3.1.2) och 1 ml svavelsyralösning (punkt 3.1.3).

Blanda om lösningen genom att vända röret upp och ner flera gånger och tillsätt 10 ml etyleter (punkt 3.1.1). Extrahera sorbinsyran i den organiska fasen genom att skaka röret i fem minuter. Låt sedimentera.

3.3.2. Beredning av referenslösningen

Välj ett vin för vilket kromatogrammet för eterextraktet inte visar någon topp som motsvarar eluering av sorbinsyra. Tillsätt sorbinsyra till vinet till en koncentration av 100 mg/l. Behandla 20 ml av det färdiga provet enligt den metod som beskrivs i punkt 3.3.1.

3.3.3. Kromatografi

Använd en mikrospruta för att spruta in följande i kromatografen: först 2 μl av eterextraktfasen som erhållits enligt punkt 3.3.2 och därefter 2 μl av eterextraktfasen som erhållits enligt punkt 3.3.1.

Skriv ut kromatogrammen. Fastställ retentionstiderna för sorbinsyra respektive intern standard. Bestäm höjden (eller arean) per topp.

3.4. Redovisning av resultaten

3.4.1. Beräkningsmetod

Halten av sorbinsyra i det analyserade vinet, uttryckt i mg/l, erhålls med följande formel:

100 × (h/H) × (l/i)

där

H= höjden på sorbinsyratoppen i referenslösningen,

h= höjden på sorbinsyratoppen i analysprovet,

l= höjden på den interna standardens topp i referenslösningen,

i= höjden på den interna standardens topp i analysprovet.

Anmärkning: Halten av sorbinsyra kan bestämmas på samma sätt genom att bestämma ytorna under respektive toppar.

15 PH-VÄRDE (OIV – AS313-15-PH) – METOD AV TYP I

1. PRINCIP

Bestämning av potentialskillnaden mellan två elektroder som är nedsänkta i provvätskan. En av dessa två elektroder har en potential som är en funktion av vätskans pH, medan den andra har en fast och känd potential och utgör referenselektrod.

2. UTRUSTNING

2.1. pH-mätare med en skala som tillåter bestämning med en noggrannhet på ± 0,05 pH-enheter eller bättre.

2.2. Elektroder:

2.2.1. Glaselektrod som förvaras i destillerat vatten.

2.2.2. Kalomelelektrod som referenselektrod som förvaras i en mättad lösning av kaliumklorid.

2.2.3. Alternativt används en kombinationselektrod som förvaras i destillerat vatten.

3. REAGENSER

3.1. Buffertlösningar:

3.1.1. Mättad lösning av kaliumvätetartrat med minst 5,7 g kaliumvätetartrat (C4H5KO6) per liter vid 20 °C. Denna lösning kan förvaras i minst 2 månader genom tillsats av 0,1 g tymol/200 ml.

pH 3,57 vid 20 °C 3,56 vid 25 °C 3,55 vid 30 °C

3.1.2. Lösning av 0,05 M kaliumväteftalat med 10,211 g kaliumväteftalat (C8H5KO4) per liter vid 20 °C. Denna lösning är hållbar i högst 2 månader.

pH 3,999 vid 15 °C 4,003 vid 20 °C 4,008 vid 25 °C 4,015 vid 30 °C

3.1.3. Lösning innehållande

monokaliumfosfat (KH2PO4) … 3,402 g dikaliumfosfat (K2HPO4) … 4,354 g vatten till … 1 000 ml

Denna lösning är hållbar i högst 2 månader.

pH 6,90 vid 15 °C 6,88 vid 20 °C 6,86 vid 25 °C 6,85 vid 30 °C

Anmärkning: Alternativt kan färdiga buffertlösningar som finns i handeln användas.

4. UTFÖRANDE

4.1 Beredning av provet

4.1.1. För must och vin

Använd musten eller vinet direkt.

4.1.2. För rektifierad koncentrerad must:

Späd den rektifierade koncentrerade musten med vatten till en total sockerhalt på 25 ± 0,5 % (vikt/vikt) (25 oBrix), enligt följande:

Om P är den totala sockerhalten i viktprocent i den rektifierade koncentrerade musten, väg upp en mängd som motsvarar 2 500/P

och fyll upp till 100 g med vatten. Vattnet ska ha en konduktivitet under 2 mikrosiemens/cm.

4.2 Nollställning av apparaturen

Innan bestämningar görs bör apparaturen nollställas enligt anvisningarna för utrustningen i fråga.

4.3. Kalibrering av pH-mätare

Kalibrera pH-mätaren vid 20 °C med hjälp av buffertlösningar med pH 6,88 och 3,57 vid 20 °C.

Använd buffertlösningen med pH 4,00 vid 20 °C för att kontrollera kalibreringen av skalan.

4.4. Mätning

Doppa ner elektroden i analysprovet som ska ha en temperatur mellan 20 och 25 °C, så nära 20 °C som möjligt. Läs av pH-värdet direkt på skalan.

Utför minst två bestämningar på samma prov.

Slutresultatet erhålls genom att man tar det aritmetiska medelvärdet av bestämningarna.

5. REDOVISNING AV RESULTATEN

pH-värdet för musten, vinet eller den 25-procentiga (vikt/vikt) (25 oBrix) lösningen av rektifierad koncentrerad must anges med två decimaler.

16 SAMTIDIG BESTÄMNING AV L-ASKORBINSYRA OCH D-ISOASKORBINSYRA MED HJÄLP AV HPLC OCH UV-DETEKTION (OIV – AS313-22-ACASCO) – METOD AV TYP II

1. INLEDNING

Askorbinsyra är en antioxidant som finns naturligt i en rad livsmedel. Den normala mängden askorbinsyra i vindruvor minskar vid framställningen av must och vin. Askorbinsyra kan tillsättas must och vin inom vissa gränser.

Den beskrivna metoden har validerats genom ringtest, där man analyserat prover av vin med tillsats av L-askorbinsyra och D-isoaskorbinsyra i kvantiteterna 30–150 mg/l respektive 10–100 mg/l.

2. TILLÄMPNINGSOMRÅDE

Denna metod är avsedd för samtidig bestämning av L-askorbinsyra och D-isoaskorbinsyra (erytorbinsyra) i vin med hjälp av högtrycksvätskekromatografi (HPLC) och UV-detektion i området 3–150 mg/l.

För högre halter än 150 mg/l krävs spädning av provet.

3. PRINCIP

Proverna sprutas in direkt i HPLC-systemet efter membranfiltrering. Analyterna separeras i en kolonn med omvänd fas och UV-detektion görs vid 266 nm. Bestämningen av L-askorbinsyra och D-isoaskorbinsyra kvantifieras i förhållande till extern standard.

Anmärkning: De kolonner och betingelser som beskrivs här anges som exempel. Andra typer av kolonner som ger god separation kan också användas.

4. REAGENSER OCH ANDRA KEMIKALIER

4.1 Reagenser

4.1.1 N-oktylamin, renhet ≥ 99,0 %.

4.1.2 Natriumacetat trihydrat, renhet ≥ 99,0 %.

4.1.3 Ren ättiksyra, 100 %.

4.1.4 Fosforsyra, cirka 25 %.

4.1.5 Oxalsyra, renhet ≥ 99,0 %.

4.1.6 Askorbatoxidas.

4.1.7 L-askorbinsyra, ultra ≥ 99,5 %.

4.1.8 D-isoaskorbinsyra, renhet ≥ 99,0 %.

4.1.9 Dubbeldestillerat vatten.

4.1.10 Metanol av analyskvalitet 99,8 %.

4.2 Beredning av den mobila fasen

4.2.1 Lösningar för den mobila fasen

Bered följande lösningar för den mobila fasen:

4.2.1.1 12,93 g n-oktylamin i 100 ml metanol.

4.2.1.2 68,05 g natriumacetat trihydrat i 500 ml dubbeldestillerat vatten.

4.2.1.3 12,01 g ren ättiksyra i 200 ml dubbeldestillerat vatten.

4.2.1.4 Buffertlösning (pH 5,4): 430 ml natriumacetatlösning (4.2.1.2) och 70 ml ättiksyralösning (4.2.1.3).

4.2.2 Beredning av den mobila fasen

Tillsätt 5 ml n-oktylaminlösning (4.2.1.1) till cirka 400 ml dubbeldestillerat vatten i en bägare. Justera denna lösning till ett pH-värde mellan 5,4 och 5,6, genom att droppvis tillsätta 25-procentig fosforsyra (4.1.4). Tillsätt 50 ml av buffertlösningen (4.2.1.4), häll över blandningen i en 1 000 ml mätkolv och fyll på med dubbeldestillerat vatten. Före användning måste den mobila fasen filtreras genom ett membran (regenererad cellulosa, 0,2 μm) och eventuellt avgasas med helium (under cirka 10 minuter) beroende på vad som krävs för det HPLC-system som används.

4.3 Beredning av standardlösning

Anmärkning:

Alla standardlösningar (stamlösning 4.3.1 och arbetslösningar 4.3.2) måste beredas varje dag och helst förvaras i kylskåp före injicering.

4.3.1 Beredning av stamlösningen (1 mg/ml).

Bered en 2-procentig vattenhaltig oxalsyralösning och avlägsna löst syre genom genomströmning med kvävgas.

Väg upp exakt 100 mg L-askorbinsyra och 100 mg D-isoaskorbinsyra i en 100 ml mätkolv och fyll den med 2-procentig lösning av oxalsyra i vatten.

4.3.2 Beredning av arbetslösningar

Bered arbetslösningarna genom att späda stamlösningen (4.3.1) till önskade koncentrationer med den 2-procentiga oxalsyralösningen. Koncentrationer mellan 10 mg/l och 120 mg/l rekommenderas. Till exempel 100 μl, 200 μl, 400 μl, 800 μl 1 200 μl till 10 ml, motsvarande 10, 20, 40, 80 och 120 mg/l.

5. UTRUSTNING

Vanlig laboratorieutrustning, däribland följande:

5.1 HPLC-pump

5.2 Injektor, 20 μl

5.3 UV-detektor

6. PROVBEREDNING

Filtrera vinproverna genom ett membran med en pordiameter på 0,2 μm före injicering.

För halter över 150 mg/l krävs spädning av provet.

7. UTFÖRANDE

7.1 Användningsförhållanden för HPLC-systemet

Injicera 20 μl av den membranfiltrerade provlösningen i kromatografen.

Förkolonn : till exempel Nucleosil 120 C18 (4 cm × 4 mm × 7 μm). Kolonn : till exempel Nucleosil 120 C18 (25 cm × 4 mm × 7 μm). Injektionsvolym : 20 μl. Mobil fas : se 4.2.2, isokratisk. Flödeshastighet : 1 ml/min. UV-detektion : mätning vid 266 nm. Sköljcykel : minst 30 ml dubbeldestillerat vatten följt av 30 ml metanol och 30 ml acetonitril.

7.2 Identifiering och bekräftelse

Topparna identifieras genom jämförelse av standardernas och provernas retentionstider. Med det kromatografisystem som beskrivs som exempel är retentionstiderna 7,7 min för L-askorbinsyra och 8,3 min för D-isoaskorbinsyra (se figur 1, kromatogram A).

För bekräftelse av positiva resultat måste proverna behandlas med en knivsudd askorbatoxidas och mätas på nytt (se figur 1, kromatogram B).

Eftersom L-askorbinsyra och D-isoaskorbinsyra bryts ned av askorbatoxidas bör det inte finnas någon signal vid retentionstiden för L-askorbinsyra eller D-isoaskorbinsyra. Om det finns störande toppar ska deras yta beaktas vid beräkningen av analyternas koncentration.

Anmärkning: Det rekommenderas att analysen av prover som behandlats med askorbatoxidas utförs i slutet av en provningssekvens följt av en sköljcykel som eliminerar alla rester av askorbatoxidas i kolonnen. Annars finns det risk för att rester av askorbatoxydas omvandlar L-askorbinsyra och D-isoaskorbinsyra vid HPLC-mätningen, vilket kan påverka resultaten.

8. BERÄKNING

Rita upp en kalibreringskurva med utgångspunkt från arbetslösningarna (4.3.2). Enligt metoden med extern standard bestäms mängden L-askorbinsyra och D-isoaskorbinsyra genom att topparnas ytor mäts och jämförs med motsvarande koncentration på kalibreringskurvan.

Redovisning av resultaten

Resultaten uttrycks med en decimals noggrannhet som mg/l L-askorbinsyra respektive D-isoaskorbinsyra (till exempel 51,3 mg/l).

För högre halter än 150 mg/l måste spädningen av provet beaktas vid beräkningen.

9. TILLFÖRLITLIGHET

Denna metod har testats inom ramen för ett ringtest som anordnades 1994 av den dåvarande tyska hälsovårdsmyndigheten (Bundesgesundheitsamt) där 27 laboratorier deltog. Ringtestet utfördes i enlighet med § 35 i den tyska livsmedelslagen, som accepterades av O.I.V fram till dess att det nya protokollet (OENO 6/2000) infördes.

Studien omfattade fyra olika vinprover – två vita viner och två röda – och fem repetitioner för vart och ett av proverna krävdes. Eftersom det inte var möjligt att bereda prover med en tillräckligt stabilitet hos analyterna (olika nedbrytningshastighet), beslöt man att definierade kvantiteter av rena standardsubstanser skulle skickas med till deltagarna tillsammans med vinproverna. Laboratorierna fick instruktion om att tillföra standardsubstanserna i bestämda kvantiteter till vinproverna och att analysera dessa omedelbart. Mängder mellan 30 och 150 mg/l för L-askorbinsyra och mellan 10 och 100 mg/l för D-isoaskorbinsyra analyserades. En detaljerad redovisning av studiens resultat finns i bilagan som offentliggjorts av O.I.V. Utvärderingen genomfördes enligt DIN/ISO 5725 (version 1988).

Standardavvikelserna för repeterbarhet (sr) och reproducerbarhet (sR) var adekvata i förhållande till koncentrationerna av L-askorbinsyra och D-isoaskorbinsyra. De faktiska precisionsparametrarna kan beräknas med hjälp av följande ekvationer:

L-askorbinsyra sr = 0,011 x + 0,31 sR = 0,064 x + 1,39 där x = koncentrationen av L-askorbinsyra (mg/l).

D-isoaskorbinsyra sr = 0,014 x + 0,31 sR = 0,079 x + 1,29 där x = koncentrationen av D-isoaskorbinsyra (mg/l).

Exempel:

50 mg/l D-isoaskorbinsyra sr = V1,0 mg/l

sR = 5,2 mg/l

10. ÖVRIGA KARAKTÄRISTIKA FÖR ANALYSEN

10.1 Detektionsgräns

Detektionsgränsen för denna metod har uppskattats till 3 mg/l för L-askorbinsyra och D-isoaskorbinsyra.

10.2 Korrekthet

Följande medelvärden för utbyte beräknades utifrån det ringtest som utfördes med fyra prover (se bilagan i OIV:s sammanställning):

— 100,6 % för L-askorbinsyra.

— 103,3 % för D-isoaskorbinsyra.

17 KOLDIOXID (OIV – AS314-01-DIOCAR) – METOD AV TYP II

1. PRINCIP FÖR METODEN

1.1. Icke mousserande viner (övertryck av CO2 ≤ 0,5 × 105 Pa) (2)

Den mängd vin som tas från provet kyls till cirka 0 °C och blandas med tillräcklig mängd natriumhydroxid för att pH-värdet ska bli 10–11. Titrering utförs med en sur lösning i närvaro av kolsyreanhydras. Halten koldioxid beräknas utifrån den mängd sur lösning som krävs för att ändra pH från 8,6 (bikarbonatform) till 4,0 (kolsyra). Nolltitrering utförs under samma betingelser på dekarboniserat vin för att korrigera för den volym natriumhydroxidlösning som förbrukas av vinsyrorna.

1.2. Mousserande och pärlande viner

Analysprovet kyls till nära fryspunkten. Efter uttagning av en mängd som ska användas som nollprov efter dekarbonisering görs resten av innehållet i flaskan alkaliskt för att binda all koldioxid som Na2CO3. Titrering utförs med en sur lösning i närvaro av kolsyreanhydras. Koldioxidhalten beräknas från den mängd sur lösning som krävs för att ändra pH från 8,6 (bikarbonatform) till 4,0 (kolsyra). Nolltitrering utförs under samma betingelser på dekarboniserat vin för att korrigera för den volym natriumhydroxidlösning som förbrukas av vinsyrorna.

2. BESKRIVNING AV METODEN

2.1. Icke mousserande viner (övertryck av CO2 ≤ 0,5 × 105 Pa)

2.1.1. Utrustning

2.1.1.1. Magnetomrörare.

2.1.1.2. pH-mätare.

2.1.2. Reagenser.

2.1.2.1. Natriumhydroxidlösning (NaOH), 0,1 M.

2.1.2.2. Svavelsyralösning (H2SO4), 0,05 M.

2.1.2.3. Kolsyreanhydraslösning, 1 g/l.

2.1.3. Utförande

Kyl vinprovet till cirka 0 °C tillsammans med den 10 ml pipett som används för provtagning.

Häll 25 ml av natriumhydroxidlösningen (punkt 2.1.2.1) i en 100 ml bägare. Tillsätt 2 droppar vattenhaltig kolsyreanhydraslösning (punkt 2.1.2.3). Häll i 10 ml av vinet med hjälp av pipetten som kylts till 0 °C.

Placera bägaren på magnetomröraren, anbringa pH-elektroden och rör om försiktigt.

När vätskan har rumstemperatur tillsätts svavelsyralösningen (2.1.2.2) långsamt till dess att pH-värdet är 8,6.

Tillsätt mer svavelsyra (punkt 2.1.2.2) till dess att pH-värdet är 4,0. Den mängd som används för att minska pH-värdet från 8,6 till 4,0 betecknas n ml.

Avlägsna CO2 från cirka 50 ml av vinprovet genom omrörning under vakuum i 3 minuter medan kolven värms i ett vattenbad till cirka 25 °C.

Utför förfarandet enligt ovan på 10 ml dekarboniserat vin. Den använda mängden betecknas n′ ml.

2.1.4. Redovisning av resultaten

1 ml av den titrerade 0,05 M svavelsyralösningen motsvarar 4,4 mg CO2.

Mängden CO2 uttryckt som g/l vin erhålls med följande formel:

0,44 × (n – n′)

Resultatet anges med två decimaler.

Anmärkning: För viner med låg koldioxidhalt (CO2 < 1 g/l) behöver kolsyreanhydras inte tillsättas för att katalysera hydratiseringen av CO2.

2.2. Mousserande och pärlande viner

2.2.1. Utrustning

2.2.1.1. Magnetomrörare.

2.2.1.2. pH-mätare.

2.2.2. Reagenser.

2.2.2.1. Natriumhydroxidlösning (NaOH), 50 % (vikt/vikt).

2.2.2.2. Svavelsyralösning (H2SO4), 0,05 M.

2.2.2.3. Kolsyreanhydraslösning, 1 g/l.

2.2.3. Utförande

Markera vinnivån i flaskan och kyl till fryspunkten.

Låt flaskan värmas upp något under omskakning till dess att iskristallerna försvinner.

Avlägsna korken snabbt och häll 45–50 ml av vinet i en mätkolv för nolltitrering. Den exakta volym som avlägsnas, v ml, bestäms genom avläsning på kolven när den återfått rumstemperatur.

Omedelbart efter att nollprovet har avlägsnats tillsätts 20 ml natriumhydroxidlösning (punkt 2.2.2.1) till flaskan (med volymen 750 ml).

Vänta till dess att vinet har rumstemperatur.

Häll 30 ml kokt destillerat vatten och 2 droppar kolsyreanhydraslösning (punkt 2.2.2.3) i en 100 ml bägare. Tillsätt 10 ml av vinet som har gjorts alkaliskt.

Placera bägaren på magnetomröraren, anbringa elektroden och magnetstaven och rör om försiktigt.

Titrera långsamt med svavelsyralösningen (punkt 2.2.2.2) till dess att pH är 8,6. Notera värdet på byretten.

Tillsätt mer svavelsyra (punkt 2.2.2.2) till dess att pH-värdet är 4,0. Den mängd som används för att minska pH-värdet från 8,6 till 4,0 betecknas n ml.

Avlägsna koldioxiden från de v ml av vinet som tagits undan för nolltitrering, genom omskakning under vakuum i 3 minuter, medan kolven värms i vattenbad till cirka 25 °C. Ta undan 10 ml dekarboniserat vin och tillsätt det till 30 ml kokt destillerat vatten. Tillsätt 2–3 droppar natriumhydroxidlösning (punkt 2.2.2.1) så att pH-värdet blir 10–11. Följ därefter förfarandet ovan. Den tillsatta mängden 0,05 M svavelsyra betecknas n′ ml.

2.2.4. Redovisning av resultaten

1 ml 0,05 M svavelsyra motsvarar 4,4 mg koldioxid.

Töm flaskan med vin som gjorts alkaliskt och bestäm den ursprungliga mängden vin med 1 ml noggrannhet genom att fylla upp till märket med vatten. Mängden betecknas V ml.

Mängden CO2 uttryckt som g/l vin erhålls med följande formel:

0,44 × (n – n′) × ((V – v + 20) / (V – v))

Resultatet anges med två decimaler.

2.3. Beräkning av det teoretiska övertrycket

Övertrycket vid 20 °C (Paph20) i pascal erhålls med följande formel:

Paph20 = (Q) / (1,951 × 10–5(0,86 – 0,01 A)(1 – 0,00144 S)) – Patm

där

Q : mängden CO2 i g/l vin, A : vinets alkoholhalt vid 20 °C, S : vinets sockerhalt i g/l, Patm : det atmosfäriska trycket i pascal,

18 BESTÄMNING AV KOLDIOXID I VIN MED MANOMETRISK METOD (OIV – AS314-04-CO2MAN) – METOD AV TYP II

(p.m.)

[Beskrivningen av denna analysmetod håller på att revideras av OIV. Den kommer att offentliggöras i ett meddelande från kommissionen så snart den uppdaterade texten publiceras i 2010 års utgåva av OIV:s sammanställning av internationella analysmetoder.]

19 MÄTNING AV ÖVERTRYCKET I MOUSSERANDE OCH PÄRLANDE VINER (OIV – AS314-02-SURPRES) – METOD AV TYP I

1. PRINCIP

Efter temperaturstabilisering och omskakning av flaskan bestäms övertrycket med hjälp av en afrometer (tryckmätare). Övertrycket uttrycks i pascal (Pa) (metod av typ I). Metoden är också tillämplig på mousserande viner med tillsatt koldioxid och pärlande viner med tillsatt koldioxid.

2. UTRUSTNING

Övertrycket i flaskor med mousserande eller pärlande vin mäts med en apparat som kallas afrometer. Den kan ha olika utformning beroende på flaskans förslutning (skruvkapsyl, kronkapsyl, kork eller plastpropp).

2.1. Flaskor med skruv- eller kronkapsyl

Apparaten består av tre delar (figur 1):

— Överdelen (snäckskruv med nål) består av en manometer, en ring för manuell iskruvning, en snäckskruv som skruvas in i den mellersta delen och en nål som sticks igenom kapsylen. I sidan på nålen finns ett hål som leder trycket till manometern. Apparaten hålls tätt mot kapsylen med hjälp av en packning.

— Mellandelen (muttern) används för att centrera överdelen. Mellandelen skruvas fast i nederdelen så att hela apparaten sitter stadigt på flaskan.

— Nederdelen (hållaren) är försedd med en fjäder som griper in under flaskans halsring och håller apparaten på plats. Det finns hållare för alla typer av flaskor.

2.2. Flaskor med kork eller plastpropp

Apparaten består av två delar (figur 2):

— Överdelen är samma som i föregående apparat. Nålen är dock längre och utformad som ett långt, ihåligt rör med en vass spets som kan stickas igenom korken respektive plastproppen. Spetsen sitter löst och ramlar ned i vinet när den har stuckits in i flaskan.

— Nederdelen består av en mutter och en sockel som sätts på korken respektive plastproppen. Sockeln är försedd med fyra fästskruvar som håller apparaten på plats.

Anmärkningar om apparaternas manometrar:

— Manometern kan antingen vara en mekanisk Bourdon-manometer eller en digital piezoelektrisk manometer. I det första fallet måste Bourdon-röret vara tillverkat av rostfritt stål.

— Manometern ska vara skalindelad i pascal (Pa). För mousserande viner är det mest praktiskt att använda 105 Pa eller kilopascal (kPa) som enhet.

— Manometrar är indelade i olika klasser. Manometerns klass anger avläsningens noggrannhet i förhållande till hela mätområdet uttryckt i procent (t.ex. en 1 000 kPa manometer av klass 1 innebär att det maximala trycket är 1 000 kPa och att maxavvikelsen är ± 10 kPa). För en exakt mätning rekommenderas klass 1.

3. UTFÖRANDE

Före mätningen ska flaskornas temperatur ha stabiliserats under minst ett dygn. När kapsylen, korken eller plastproppen har genomborrats, ska flaskan skakas om kraftigt till dess att trycket är konstant. Först därefter avläses trycket.

3.1. Flaskor med skruv- eller kronkapsyl

Se till att hållaren hakar fast under flaskans halsring. Skruva i muttern så att båda delarna sitter fast på flaskan. Skruva på överdelen. För att undvika att gas läcker ut måste nålen stickas in och packningen fås att ligga an mot kapsylen så fort som möjligt. Läs av trycket efter att ha skakat om flaskan kraftigt till dess att trycket är konstant.

3.2. Flaskor med kork eller plastpropp

Sätt en spets i änden av nålen. Sätt hela apparaturen på korken respektive plastproppen. Dra åt de fyra skruvarna runt korken/plastproppen. Skruva på överdelen så att nålen sticker igenom korken/ plastproppen. Spetsen ramlar ner i flaskan och trycket når manometern. Läs av trycket efter att ha skakat om flaskan kraftigt till dess att trycket är konstant. Ta ut spetsen ur flaskan efter mätningen.

4. REDOVISNING AV RESULTATEN

Övertrycket vid 20 °C (Paph20) anges i pascal (Pa) eller kilopascal (kPa). Resultatet ska anges på ett sätt som överensstämmer med manometerns noggrannhet (t.ex. 6,3 × 105 Pa eller 630 kPa, men inte 6,33 × 105 Pa eller 633 kPa, med en 1 000 kPa fullskalemanometer av klass 1).

Om temperaturen vid mätningen avviker från 20 °C, ska värdet korrigeras genom att det uppmätta trycket multipliceras med tillämplig koefficient (se tabell 1).

Tabell 1

Förhållandet mellan övertrycket Paph20 i mousserande eller pärlande vin vid 20 °C och övertycket Paph t vid en temperatur t

°C 0 1,85 1 1,80 2 1,74 3 1,68 4 1,64 5 1,59 6 1,54 7 1,50 8 1,45 9 1,40 10 1,36 11 1,32 12 1,28 13 1,24 14 1,20 15 1,16 16 1,13 17 1,09 18 1,06 19 1,03 20 1,00 21 0,97 22 0,95 23 0,93 24 0,91 25 0,88

5. KONTROLL AV RESULTATEN

Metod för direktbestämning av de fysiska parametrarna (metod av typ I)

Afrometerkontroll

Afrometrar ska kontrolleras regelbundet (minst en gång om året).

Kontrollera manometern med hjälp av en kalibreringsbänk. I kalibreringsbänken jämförs den manometer som ska kontrolleras med en parallellmonterad referensmanometer som är av högre klass och som är kalibrerad mot nationella standarder. Avläs värdena på båda apparaterna först för ökat tryck, sedan för minskat tryck och jämför avläsningarna. Om värdena skiljer sig åt, använd justeringsskruven för att korrigera.

Alla auktoriserade laboratorier och institutioner är utrustade med kalibreringsbänkar. Även manometertillverkarna har sådana bänkar.

20 BESTÄMNING AV LYSOZYM I VIN MED HJÄLP AV HPLC (OIV – AS315-14) – METOD AV TYP IV

1. INLEDNING

För bestämning av lysozym rekommenderas en analysmetod som inte baseras på enzymatisk aktivitet.

2. TILLÄMPNINGSOMRÅDE

Med denna metod kan mängden av proteinet lysozym bestämmas (i mg/l) i vitt och rött vin, oberoende av den enzymatiska aktiviteten (som skulle kunna påverkas av en partiell denaturering eller av fenomen som komplexbildning eller medfällning) i testlösningen.

3. DEFINITION

Högtrycksvätskekromatografi (HPLC) är en analysmetod som bygger på sterisk, polär eller adsorptiv interaktion mellan den stationära fasen och analyten, och som följaktligen inte är kopplad till proteinets faktiska enzymatiska aktivitet.

4. PRINCIP

Analysen utförs med hjälp av högtrycksvätskekromatogfrafi (HPLC) med en spektrofotometrisk detektor i kombination med en spektrofluorometrisk detektor. Den okända halten i vinprovet beräknas som en funktion av ytan på kromatogrammets toppar genom användning av metoden med extern kalibrering.

5. REAGENSER

5.1. Lösningsmedel och arbetslösningar

Acetonitril (CH3CN) för HPLC-analys

Ren trifluorättiksyra (TFA)

Avjoniserat vatten för HPLC-analys

Standardlösning: vinsyra 1 g/l, etylalkohol 10 % (volym/volym) justerad till pH 3,2 med neutralt kaliumtartrat.

5.2. Eluenter

A : CH3CN 1 %, TFA 0,2 %, H2O 98,8 % B : CH3CN 70 %, TFA 0,2 %, H2O 29,8 %

5.3. Referenslösningar

Bered lösningar med lysozym i standardlösning från 1 till 250 mg/l, genom ständig omrörning under minst 12 timmar.

6. MATERIAL

6.1. HPLC-apparat med ett pumpsystem lämpligt för gradienteluering.

6.2. Termostatreglerad kammare för kolonn (kolonnugn).

6.3. Spektrofotometrisk detektor i kombination med en spektrofluorometrisk detektor.

6.4. Injektor, 20 μl.

6.5. Polymerkolonn med omvänd fas med fenyler som funktionella grupper (pordiameter = 1 000 Å, exklusionsgräns = 1 000 000 Da), Tosoh Bioscience TSK-gel Phényl 5PW RP 7,5 cm × 4,6 mm ID, till exempel.

6.6. Förkolonn av samma material som kolonnen, exempelvis Tosoh Bioscience TSK-gel Phényl 5PW RP Guardgel 1,5 cm × 3,2 mm ID.

7. BEREDNING AV PROVET

Vinproverna surgörs med HCl (10 M), spädd 1:10, och filtreras med ett polyamidfilter med en pordiameter på 0,22 μm, 5 minuter efter tillsatsen. Den kromatografiska analysen utförs direkt efter filtreringen.

8. DRIFTSBETINGELSER:

8.1. Eluentens flödeshastighet: 1 ml/min.

8.2. Kolonntemperatur: 30 °C.

8.3. Spektrofotometrisk detektion: mätning vid 280 nm.

8.4. Spektrofluorometrisk detektion: λex = 276 nm; λem = 345 nm; Gain = 10

8.5. Sekvens för gradienteluering

Tid (min) Lösn. A % Lösn. B % Gradient 0 100 0 isokratisk 3 100 0 linjär 10 65 35 isokratisk 15 65 35 linjär 27 40,5 59,5 linjär 29 0 100 isokratisk 34 0 100 linjär 36 100 0 isokratisk 40 100 0

8.6. Medelvärde på retentionstid för lysozym: 25,50 minuter.

9. BERÄKNING

Referenslösningar som innehåller följande koncentrationer av lysozym analyseras tre gånger: 1; 5; 10; 50; 100; 200; 250 mg/l. För varje kromatogram beräknas ytorna av de toppar som motsvarar lysozym och detta värde införs i ett diagram som en funktion av respektive koncentration, så att linjer erhålls för den linjära regressionen som svarar mot formeln Y = ax + b. Determinationskoefficienten r2 måste vara > 0,999.

10. METODENS KARAKTÄRISTIKA

För att utvärdera metodens lämplighet för det avsedda syftet har en valideringsstudie genomförts där man beaktat metodens linearitet, detektionsgränser, kvantifieringsgränser och precision. Den sista parametern har bestämts genom definition av metodens precision och riktighet.

Linearitetsområde (mg/l) Linjens lutning Determinationskoefficient (r2) LD (mg/l) LQ (mg/l) Repeterbarhet (n = 5) RSD % Reproducerbarhet (n = 5) RSD % Std1 V.R.2 V.B.3 Std1 UV 5–250 3,786 0,9993 1,86 6,20 4,67 5,54 0,62 1,93 FLD 1–250 52,037 0,9990 0,18 0,59 2,61 2,37 0,68 2,30

Tabell 1: Uppgifter relaterade till metodens egenskaper: Std1 standardlösning; V.R.2 rött vin; V.B.3 vitt vin.

10.1. Metodens linearitet

Med utgångspunkt från de resultat som erhållits med hjälp av linjär regressionsanalys har metoden visat sig vara linjär inom de områden som anges i tabell 1.

10.2. Detektionsgräns och kvantifieringsgräns

Detektionsgränsen (LD) och kvantifieringsgränsen (LQ) har beräknats som den signal som är ekvivalent mot 3 respektive 10 gånger det kromatografiska bakgrundsbruset vid arbete med en reell testlösning (tabell 1).

10.3. Metodens precision

De parametrar som beaktats är repeterbarhet och reproducerbarhet. I tabell 1 anges värden för dessa parametrar (uttryckt som % standardavvikelse vid upprepade mätningar med olika koncentrationer) som uppmätts för standardlösningen samt för vitt och rött vin.

10.4. Metodens riktighet

Utbytet i procent har beräknats för standardlösningar med ett lysozyminnehåll på 5 resp. 50 mg/l, med tillsats av en bestämd mängd lysozym så som framgår av följande tabell:

[C] Initial nominell konc. (mg/l) Tillsats (mg/l) [C] Teoretisk konc. (mg/l) [C] Påvisad konc. (mg/l) Standardavvikelse Utbyte % UV 280 nm 50 13,1 63,1 62,3 3,86 99 FD 50 13,1 63,1 64,5 5,36 102 UV 280 nm 5 14,4 19,4 17,9 1,49 92,1 FD 5 14,4 19,4 19,0 1,61 97,7

21 SULFATER (OIV – AS321-05-SULFAT) – METOD AV TYP II

1. PRINCIP FÖR METODERNA

1.1. Referensmetod

Utfällning av bariumsulfat och vägning. Det bariumfosfat som fällts ut under samma betingelser avlägsnas genom tvättning av fällningen i saltsyra.

För must och viner med höga halter av svaveldioxid rekommenderas att de först avsvavlas genom kokning i ett lufttätt kärl.

1.2. Snabb analysmetod

Klassificering av viner i kategorier med den så kallade gränsmetoden som baseras på utfällning av bariumsulfat med en titreringslösning med bariumjoner.

2. REFERENSMETOD

2.1. Reagenser

2.1.1. 2 M saltsyralösning.

2.1.2. Bariumkloridlösning, 200 g/l (BaCl2 × 2H2O).

2.2. Utförande

2.2.1. Allmän metod

Mät upp 40 ml av analysprovet i ett 50 ml centrifugrör. Tillsätt 2 ml 2 M saltsyra och 2 ml bariumkloridlösning (200 g/l). Rör om med en glasstav. Skölj staven med lite destillerat vatten och låt lösningen stå i 5 minuter. Centrifugera i 5 minuter och dekantera försiktigt centrifugatet.

Tvätta sedan bariumsulfatfällningen på följande sätt: tillsätt 10 ml 2 M saltsyra, slamma upp fällningen och centrifugera i 5 minuter. Dekantera försiktigt centrifugatet. Upprepa tvättningen två gånger under samma betingelser med 15 ml destillerat vatten varje gång.

Överför fällningen utan förluster genom sköljning med destillerat vatten till en tarerad platinakapsel. Placera över vattenbad vid 100 °C till dess att fullständig indunstning skett. Den torkade fällningen kalcineras flera gånger kortvarigt över en låga tills en vit rest erhålls. Låt svalna i exsickator och väg.

Den erhållna massan uttryckt i mg bariumsulfat betecknas m.

2.2.2. Specialmetod: svavlad must och svavlat vin med hög svaveldioxidhalt.

Först avlägsnas svaveldioxiden.

Mät upp 25 ml vatten och 1 ml ren saltsyra (ρ20 = 1,15–1,18 g/ml) i en 500 ml konisk kolv med dropptratt och utloppsrör. Koka lösningen för att avlägsna luften och tillsätt 100 ml vin genom dropptratten. Fortsätt att koka till dess att vätskevolymen i kolven har reducerats till cirka 75 ml och överför den utan förluster efter kylning till en 100 ml mätkolv. Fyll upp till märket med vatten. Bestäm sulfaterna i ett prov på 40 ml enligt punkt 2.2.1 ovan.

2.3. Redovisning av resultaten

2.3.1. Beräkning

Sulfathalten uttryckt i milligram per liter kaliumsulfat (K2SO4,) är

18,67 × m

Sulfathalten i must eller vin uttrycks i milligram per liter kaliumsulfat, utan decimaler.

2.3.2. Repeterbarhet

Upp till 1 000 mg/l: r = 27 mg/l.

Omkring 1 500 mg/l: r = 41 mg/l.

2.3.3. Reproducerbarhet

Upp till 1 000 mg/l: R = 51 mg/l.

Omkring 1 500 mg/l: R = 81 mg/l.

22 JÄRN (OIV – AS322-05-FER) – METOD AV TYP IV

1. PRINCIP FÖR METODERNA

REFERENSMETOD

Vinet späds ut på lämpligt sätt och alkoholen avlägsnas varefter järnet bestäms direkt med atomabsorptionsspektrofotometri.

RUTINMETOD

Efter uppslutning i 30 % väteperoxidlösning reduceras allt järn i form av Fe(III) till Fe(II) och bestäms på grundval av den röda färg som erhålls med ortofenantrolin.

2. REFERENSMETOD

2.1. Reagenser

2.1.1. Koncentrerad standardjärnlösning innehållande 1 gram Fe(III) per liter.

Använd en standardlösning på 1 g/l som finns i handeln. Lösningen kan även beredas genom att 8,6341 g järn(III)ammoniumsulfat (FeNH4(SO4)2 × 12H2O) löses i destillerat vatten som har gjorts svagt surt med 1 M saltsyra varefter lösningen späds till 1 liter.

2.1.2. Spädd standardjärnlösning innehållande 100 mg järn/l.

2.2. Utrustning

2.2.1. Roterande indunstningapparat med termostatreglerat vattenbad.

2.2.2. Atomabsorptionsspektrofotometer med luftacetylenbrännare.

2.2.3. Järnhålkatodlampa.

2.3. Utförande

2.3.1. Beredning av provet

Avlägsna alkoholen från vinet genom att reducera provets volym till hälften i en roterande indunstningsapparat (50