1976L0372 — SV — 19.08.1981 — 001.001 — 1
Detta dokument är endast avsett som dokumentationshjälpmedel och institutionerna ansvarar inte för innehållet
►B KOMMISSIONENS SJUNDE DIREKTIV
av den 1 mars 1976
om gemenskapsmetoder för analys vid den officiella foderkontrollen
(76/372/EEG)
(EGT L 102, 15.4.1976, s. 8)
Ändrat genom:
Officiella tidningen
nr sida datum
►M1Kommissionens direktiv 81/680/EEG av den 30 juli 1981 L 246 32 29.8.1981
▼B
KOMMISSIONENS SJUNDE DIREKTIV
av den 1 mars 1976
om gemenskapsmetoder för analys vid den officiella foderkon-
trollen
(76/372/EEG)
EUROPEISKA GEMENSKAPERNAS KOMMISSION HAR ANTAGIT
DETTA DIREKTIV
med beaktande av Fördraget om upprättandet av Europeiska ekono-
miska gemenskapen,
med beaktande av rådetsdirektiv av den 20 juli 1970 om införande av
gemenskapsmetoder för provtagning och analys vid den officiellafoderkontrollen(
1), senast ändrat genom anslutningsakten(2), särskilt
artikel 2 i denna, och
med beaktande av följande:I det ovan nämnda direktivet krävsatt den officiella foderkontrollen
skall utföras med användning av gemenskapsmetoder för provtagning
och analys i syfte att kontrollera att fodret motsvarar de krav somframgår av bestämmelser i lagar och andra författningar beträffandefoders kvalitet och sammansättning.
I kommissionens direktiv 71/250/EEG av den 15 juni 1971(
3), 71/393/
EEG av den 18 november 1971(4), 72/199/EEG av den 27 april
1972(5), 73/46/EEG av den 5 december 1972(6), 74/203/EEG av den
25 mars1974(7) och 75/84/EEG av den 20 december 1974(8) har redan
ett antal gemenskapsmetoder för analys fastställts. Mot bakgrund avden utveckling som därefter skett på området är det lämpligt att nuanta en sjunde metodsamling.
De åtgärder som beslutas om i detta direktiv är förenliga med Ständiga
foderkommitténsyttrande.
HÄRIGENOM FÖRESKRIVS FÖLJANDE.
Artikel 1
Medlemsstaterna skall kräva att analyser vid den officiella foderkon-
trollen skall utföras med de metoder som beskrivs i bilagan till detta
direktiv då det gäller halter av aflatoxin B1.
Artikel 2
Medlemsstaterna skall senast den 1 oktober 1976 sätta i kraft de lagar
och andra författningar som är nödvändiga för att följa detta direktiv.De skall genast underrätta kommissionen om detta.
Artikel 3
Detta direktiv riktar sig till medlemsstaterna.1976L0372 — SV — 19.08.1981 — 001.001 — 2
(1) EGT nr L 170, 3.8.1970, s. 2.
(2) EGT nr L 73, 27.3.1972, s. 14.
(3) EGT nr L 155, 12.7.1971, s. 13.
(4) EGT nr L 279, 20.12.1971, s. 7.
(5) EGT nr L 123, 29.5.1972, s. 6.
(6) EGT nr L 83, 30.3.1973, s. 21.
(7) EGT nr L 108, 22.4.1974, s. 7.
(8) EGT nr L 32, 5.2.1975, s. 26.▼M1
▼B
▼B
BILAGA
BESTÄMNING AV AFLATOXIN B1
METOD A: ENDIMENSIONELL TUNNSKIKTSKROMATOGRAFI
1. Syfte och räckvidd
Med denna metod är det möjligt att bestämma halten aflatoxin B1i
följande foder: jordnötter, kopra, linfrö, soja, sesam, babassu- och
majsoljekakor, spannmål och kvarnprodukter, ärtmjöl, potatismos
och stärkelse. Lägsta gräns för bestämningen är 0,01 mg/kg
(10 ppb).
Om bestämningen förhindras genom närvaron av störande
substanser är det nödvändigt att påbörja en ny analys med metod
B (tvådimensionell tunnskiktskromatografi).
2. Princip
Provet extraherasmed kloroform. Extraktet filterasoch en del av
filtratet renasgenom kolonnkromatografi på kis elgel. Eluatet indun-
stas och återstoden löses på nytt upp i en bestämd mängd kloroform
eller blandning av bensen och acetonitril. En del av denna lösning
undergår tunnskiktskromatografi (TK). Mängden aflatoxin B1bestäms under UV-bestrålning av kromatogrammet, antingenvisuellt eller genom fluorodensitometri, under jämförelse med
kända kvantiteter standardaflatoxin B
1. Identiteten hosdet aflatoxin
B1som extraheras ur fodret måste bekräftas med den metod som
angesnedan.
3. Reagens
OBS!Samtliga reagens måste vara av ”analytisk kvalitet”, om inte
annat anges.
3.1 Aceton.
3.2 Kloroform, stabiliserad med 0,5-1,0 % 96-procentig etanol
(volymprocent).
3.3 N-hexan.
3.4 Metanol.3.5 Vattenfri dietyleter, peroxidfri.3.6 Blandning av bensen och acetonitril: 98/2 (volym/volym).3.7 Blandning av kloroform (3.2) och metanol (3.4): 97/3 (volym/
volym).
3.8 Kiselgel för kolonnkromatografi, partikelstorlek 0,05-0,20 mm.3.9 Absorberande bomull, som avfettats med kloroform, eller glasull.
3.10 Natriumsulfat, vattenfri, i granulatform.
3.11 Inert gas, t.ex. kväve.3.12 Saltsyra 1 M.3.13 50-procentig svavelsyra (volymprocent).3.14 Kiselgur (hyflosupercel), syratvättad.
3.15 Kiselgel G-HR eller motsvarande, för TK.
3.16 Standardlösning av cirka 0,1 µg aflatoxin B
1per ml i kloroform
(3.2) eller i blandningen av bensen och acetonitril (3.6). Lösningen
skall beredas och kontrolleras enligt anvisningarna i punkt 7.
3.17 Standardlösning för kvalitativa prov med ett innehåll av cirka 0,1 µg
aflatoxin B1och B2per ml i kloroform (3.2) eller blandningen av
bensen och acetonitril (3.6). Dessa halter anges som riktvärde. De
måste justeras så att båda aflatoxinerna får samma fluorescensinten-
sitet.
3.18 Framkallningslösningar:3.18.1 Kloroform (3.2)/aceton (3.1): 9/1 (volymprocent), omättad vanna.1976L0372 — SV — 19.08.1981 — 001.001 — 3
▼B
3.18.2 Dietyleter (3.5)/metanol (3.4)/vatten: 96/3/1 (volym/volym/volym),
omättad vanna.
3.18.3 Dietyleter (3.5)/metanol (3.4)/vatten: 96/4,5/1,5 (volym/volym/
volym), mättad vanna.
3.18.4 Kloroform (3.2)/ metanol (3.4): 94/6 (volym/volym), mättad vanna.
3.18.5 Kloroform (3.2)/ metanol (3.4): 97/3 (volym/volym), mättad vanna.
4. Utrustning
4.1 Mixerkvarn.
4.2 Skakapparat eller magnetisk omrörare.
4.3 Veckfilterpapper, Schleicher och Schüll nr 588 eller motsvarande,
diameter: 24 cm.
4.4 Glasrör för kromatografi (inre diameter: 22 mm, längd: 300 mm),
med kran av polytetrafluoretylen och en 250 ml behållare.
4.5 Vakuumrotationsindunstare med 500 ml rundbottnad kolv.
4.6 500 ml koniska kolvar med proppar av matterat glas.
4.7 TK-utrustning.
4.8 Glasplattor för TK, 200 × 200 mm, behandlade på följande sätt (de
angivna kvantiteterna räcker för att täcka fem plattor): Lägg 30 gkiselgel G-HR (3.15) i en konisk kolv. Tillsätt 60 ml vatten, tillslut
och skaka om under en minut. Bred ut ett jämnt, 0,25 mm tjockt
lager av suspensionen på plattorna. Låt lufttorka och förvara
därefter plattorna i en exsickator som innehåller kiselgel. Aktivera
plattorna innan de skall användas genom att sätta dem i ugnen vid
110 ºC under en timme.
Färdigtillverkade plattor är lämpliga om de ger liknande resultat
som plattor vilka behandlats på här angivet sätt.
4.9 Långvågslampa för UV-ljus (360 nm). Bestrålningsintensiteten
måste vara sådan att det är möjligt att klart urskilja en fläck av
1 ng aflatoxin B
1på en TK-platta på ett avstånd av 10 cm från
lampan.
4.10 10 ml mätcylindrar med proppar av polyetylen.
4.11 UV-spektralfotometer.
4.12 Fluorodensitometer (ej obligatoriskt).
5. Utförande
5.1 Preparering av provet (se Anmärkningar, del C, punkt 1)
Mal provet så att det i sin helhet passerar genom ett såll med 1 mm
maskor (enligt ISO R 565).
5.2 Extraktion
Placera 50 g av det malda och homogeniserade provet i en 500 ml
konisk kolv (4.6). Tillsätt 25 g kiselgur (3.14), 25 ml vatten och
250 ml kloroform (3.2). Tillslut kolven, skaka eller rör om under
30 minuter med apparat (4.2) och filtrera genom veckfilterpapper
(4.3). Avlägsna de första tio millilitrarna av filtratet och samla
därefter in 50 ml.
5.3 Rengöring i kolonn
Sätt en propp av bomull eller glasull (3.9) i nedre ändan av ett
kromatografirör (4.4), fyll röret till två tredjedelar med kloroform
(3.2) och tillsätt 5 g natriumsulfat (3.10).
Kontrollera att natriumsulfatskiktet upptill har en plan yta och
tillsätt därefter 10 g kiselgel (3.8) i småportioner. Rör om noggrant
efter varje tillsats så att alla luftbubblor avlägsnas. Låt stå under 15
minuter och tillsätt därefter försiktigt 15 g natriumsulfat (3.10). Låt
vätskan sjunka tills den är precis ovanför natriumsulfatskiktets
toppyta.
Blanda de 50 ml extrakt som insamlats enligt 5.2 med 100 ml n-
hexan (3.3) och överför hela blandningen utan förlust till kolonnen.
Låt vätskan sjunka tills den är precis ovanför natriumsulfatskiktets
toppyta. Avlägsna denna uppslamning. Tillsätt därefter 100 ml
dietyleter (3.5) och låt också detta sjunka till natriumsulfatskiktets1976L0372 — SV — 19.08.1981 — 001.001 — 4
▼B
toppyta. Se under dessa moment till att flödeshastigheten är 8-
12 ml/minut och att kolonnen inte tillåts torka. Avlägsna den vätska
som avskiljs. Eluera därefter med 150 ml kloroform/metanolbland-
ning (3.7) och samla in hela eluatet.
Indunsta eluatet tills det är nästan torrt med rotationsindunstaren
(4.5) vid högst 50 ºC i en ström inert gas (3.11). Överför hela
återstoden utan förlust i kloroform (3.2) eller en blandning av
bensen/acetonitril (3.6) till en 10 ml mätcylinder (4.10). Koncen-
trera lösningen i en ström inert gas (3.11) och justera därefter
volymen till 2 ml med kloroform (3.2) eller blandningen av bensen
och acetonitril (3.6).
5.4 Tunnskiktskromatografi
Placera fläckvis följande volymer av standardlösningen och
extraktet på en TK-platta (4.8) 2 cm från nedre kanten och med
2 cm mellanrum:
— 10, 15, 20, 30 och 40 µl standardlösning av aflatoxin B1(3.16),
— 10 µl av det extrakt som erhållits enligt 5.3 och ovanpå detta
20 µl standardlösning (3.16),
— 10 och 20 µl av det extrakt som erhållits enligt 5.3.
Framkalla kromatogrammet i mörker med någon av framkall-
ningslösningarna (3.18). Valet av lösning måste ske i förväg
genom att man placerar 25 µl av den kvalitativa standardlösningen
(3.17) på plattan och kontrollerar att aflatoxin B1och B2är full-
ständigt separerade efter framkallning.
Låt lösningarna indunsta i mörker och bestråla därefter med UV-
ljusmed plattan 10 cm från lampan (4.9). Fläckarna av aflatoxin
B1ger en blå fluorescens.
5.5 Kvantitativa bestämningar
Bestäm antingen visuellt eller genom fluorodensitometri enligt
följande anvisningar:
5.5.1 Visuell mätning
Bestäm mängden aflatoxin B1i extraktet genom att jämföra fluore-
scensintensiteten hos extraktfläckarna med
standardlösningsfläckarnas. Interpolera om så är nödvändigt. Den
fluorescens som uppnås då extrakt och standardlösning lagts på
varandra måste vara intensivare än vad 10 µl av extraktet ger och
det får inte finnasmer än en s ynlig fläck. Om 10 µl av extraktet ger
större fluorescensintensitet än 40 µl standardlösning skall extraktet
spädas 10 eller 100 gånger med kloroform (3.2) eller bensen/aceto-
nitrilblandning (3.6) innan det på nytt genomgår
tunnskiktskromatografi.
5.5.2 Mätning med fluorodensitometri
Mät fluorescensintensiteten hos aflatoxin B1-fläckarna med fluoro-
densitometern (4.12) exciteringsvåglängden 365 nm och
emissionsvåglängden 443 nm. Bestäm mängden aflatoxin B1i
fläckarna med extrakt genom att jämföra deras fluorescensintensitet
med den hosfläckarna med s tandardaflatoxin B1.
5.6 Bekräftelse av identiteten hos aflatoxin B1
Bekräfta identiteten hosdet aflatoxin B1som förekommer i
extraktet med de processer som anges nedan.
5.6.1 Behandling med svavelsyra
Spruta svavelsyra (3.13) på det kromatogram som erhållits enligt
5.4. Fluorescensen hos fläckarna med aflatoxin B1måste övergå
från blått till gult under UV-bestrålning.
5.6.2 Två dimensionell kromatografi med bildande av afla-
toxin B1-halvacetal (aflatoxin B1a)
OBS!Under de nedan beskrivna momenten måste diagrammet i
figur 3 följasnoggrant.
5.6.2.1 Applicering av lösningarna
Ritsa två räta linjer på plattan (4.8) parallellt med två angränsande
sidor (6 cm in från vardera sidan) för att begränsa lösningsmedels-1976L0372 — SV — 19.08.1981 — 001.001 — 5
▼B
fronternasmigrering. Anbringa fläckar av följande lös ningar på
plattan med kapillärpipetter eller mikrosprutor:
—på punkt A: en volym renat extrakt (enligt 5.3) av provet som
innehåller cirka 2,5 ng aflatoxin B1,
—på punkt B och C: 25 µl standardlösning (3.16).
5.6.2.2 Framkallning
Framkalla kromatogrammet i mörker i riktning I med framkall-
ningslösningen (3.18.1) (1 cm skikt i omättad vanna) tills
lösningens front når gränslinjen för lösningen.
Avlägsna plattan från vannan och låt den torka i mörker vid omgi-
vande temperatur under fem minuter. Spruta därefter saltsyra (3.12)
längs en 2,5 cm hög remsa som täcker punkterna A och B (det
skuggade området i figur 3) tills den mörknar och skydda samtidigt
resten av plattan med en glasskiva. Låt reaktionen fortgå i mörker
under 10 minuter och torka med en luftström vid omgivande
temperatur.
Framkalla därefter kromatogrammet i mörker i riktning II med
framkallningslösningen (3.18.1) (1 cm skikt i omättad vanna) tills
lösningens front når gränslinjen för lösningen. Avlägsna plattan
från vannan och låt den torka vid omgivande temperatur.
5.6.2.3 Tolkning av kromatogrammet
Granska kromatogrammet i UV-ljus (4.9) och kontrollera
förekomsten av följande:
a) En blå fluorescerande fläck aflatoxin B1framträder som
kommer från den standardlösning som applicerats på punkt C
(migrering i riktning I).
b) En blå fluorescerande fläck aflatoxin B1som inte reagerat med
saltsyran framträder samtidigt med en intensivare blå fluoresce-
rande fläck aflatoxin B1-halvacetal och båda fläckarna kommer
från den standardlösning som applicerats på punkt C (migrering
i riktning II).
c) Fläckar framträder som motsvarar dem som beskrivits i punkt b
och som kommer från provextraktet som applicerats på punkt A.
Dessa fläckars position definieras först genom migrering-
ssträckan för aflatoxin B1från punkt A i riktning I (samma
som för standardlösningen som applicerats på punkt C) och
därefter genom migreringssträckorna för aflatoxin B1-halvacetal
därifrån i riktning II (samma som för standardlösningen som
applicerats på punkt B). Fluorescensintensiteterna hos halvace-
talfläckarna från extraktet respektive den standardlösning som
applicerats på punkt B skall motsvara varandra.
6. Resultatberäkning
6.1 Med visuell mätning
Halten aflatoxin B1i mikrogram per kg av provet (ppb) erhållsmed
formeln:
S/C1Y/C1V
W /C1X
där
Y och X är de volymer i mikroliter av standardlösningen aflatoxin
B1(3.16) resp. extraktet som har liknande fluorescensintensitet,
S = standardlösningens (3.16) aflatoxin B1-koncentration i
mikrogram per ml,
V = extraktets slutliga volym i mikroliter, justerat efter eventu-
ella utspädningar som visat sig nödvändiga,
W = vikt i gram av det prov som motsvarar den volym av
extraktet som genomgått rengöring i kolonn.
6.2 Med fluorodensitometrisk mätning
Halten aflatoxin B1i mikrogram per kg av provet erhållsmed
formeln:1976L0372 — SV — 19.08.1981 — 001.001 — 6
▼B
S/C1V
W /C1Y
där
Y = volymen i mikroliter av det extrakt som har applicerats på
plattan (10 eller 20 µl),
S = den mängd aflatoxin B1i nanogram i extraktfläcken (i
proportion till värdet av Y), som framgår av beräkningarna,
V = extraktets slutliga volym i mikroliter, justerat efter eventu-
ella utspädningar som visat sig nödvändiga,
W = vikt i gram av det prov som motsvarar den volym av
extraktet som genomgått rengöring i kolonn.
7. Preparering och test av standardlösningen (3.16)
7.1 Bestämning av aflatoxin B1-koncentrationen
Bered en standardlösning av aflatoxin B1i kloroform (3.2) eller
bensen-acetonitrilblandning (3.6) med en koncentration av 8-10 µg/
ml. Bestäm absorptionsspektrum mellan 330 och 370 nm med
spektralfotometern (4.11).
Mät den optiska densiteten (A) vid 363 nm för kloroformlösning
och vid 348 nm för lösning med bensen-acetonitrilblandning.
Beräkna aflatoxin B1-koncentrationen i mikrogram per ml lösning
med följande formler:
312 /C1A/C11000
20600för kloroformlösning,
312 /C1A/C11000
19800för lösning med bensen-acetonitriblblandning.
Späd i skydd för dagsljus så att en arbetsstandardlösning med en
aflatoxin B1-koncentration av cirka 0,1 µg/ml erhålls. Denna
lösning är hållbar i två veckor om den förvaras i kylskåp vid 4 ºC.
7.2 Test av kromatografisk renhet
Applicera på en platta (4.8) en fläck av 5 µl standardlösning av
aflatoxin B1som innehåller 8-10 µg/ml (7.1). Framkalla kromato-
grammet enligt anvisningarna i 5.4. I UV-ljus skall
kromatogrammet endast uppvisa en fläck och ingen fluorescens
skall kunna iakttas i det område där lösningen applicerades.
8. Repeterbarhet
Skillnaden mellan resultaten av två parallella bestämningar som
utförts på samma prov av samma analytiker får inte överstiga:
— 25 % av det högre resultatet för aflatoxin B1-halter från 10 till
och med 20 µg/kg,
— 5 µg, absolutvärde, för halter på över 20 och högst 50 µg/kg,— 10 % av det högre resultatet för halter över 50 µg/kg.
9. Reproducerbarhet
Se Anmärkningar, del C, punkt 2.
METOD B: TVÅDIMENSIONELL TUNNSKIKTSKROMATOGRAFI
1. Syfte och räckvidd
Med denna metod är det möjligt att bestämma halten aflatoxin B
1i
foder för vilka metod A inte är avsedd. Lägsta gräns för
bestämningen är 0,01 mg/kg (10 ppb). Metoden kan inte användas
på foder som innehåller fruktkött av citrus.
2. Princip
Provet extraherasmed kloroform. Extraktet filterasoch en del av
filtratet renasgenom kolonnkromatografi på kis elgel. Eluatet indun-
stas och återstoden löses på nytt upp i en bestämd mängd kloroform
eller bensen-acetonitrilblandning. En del av denna lösning undergår1976L0372 — SV — 19.08.1981 — 001.001 — 7
▼B
tvådimensionell tunnskiktskromatografi (TK). Mängden aflatoxin
B1bestäms under UV-bestrålning av kromatogrammet, antingen
visuellt eller genom fluorodensitometri, under jämförelse med
kända kvantiteter standardaflatoxin B1. Identiteten hosdet aflatoxin
B1som extraheras ur fodret måste bekräftas med den metod som
angesnedan.
3. Reagens
OBS!Samtliga reagens måste vara av ”analytisk kvalitet”, om inte
annat anges.
3.1 Aceton.
3.2 Kloroform, stabiliserad med 0,5-1,0 % 96-procentig etanol (volym/
volym).
3.3 N-hexan.
3.4 Metanol.
3.5 Vattenfri dietyleter, peroxidfri.3.6 Blandning av bensen och acetonitril: 98/2 (volym/volym).
3.7 Blandning av kloroform (3.2) och metanol (3.4): 97/3 (volym/
volym).
3.8 Kiselgel för kolonnkromatografi, partikelstorlek 0,05-0,20 mm.
3.9 Absorberande bomull, som avfettats med kloroform, eller glasull.
3.10 Natriumsulfat, vattenfri, i granulatform.3.11 Inert gas, t.ex. kväve.3.12 Saltsyra 1 M.
3.13 Kiselgur (hyflosupercel), syratvättad.
3.14 Kiselgel G-HR eller motsvarande, för TK.3.15 Framkallningslösningar:
3.15.1 Dietyleter (3.5)/metanol (3.4)/vatten: 96/4,5/1,5 (volym/volym/
volym), mättad vanna.
3.15.2 Kloroform (3.2)/aceton (3.1): 9/1 (volym/volym), omättad vanna.
3.16 Standardlösning av cirka 0,1 µg aflatoxin B
1per ml i kloroform
(3.2) eller i bensen/acetonitrilblandning (3.6). Lösningen skall
beredasoch kontrollerasenligt anvis ningarna för metod A, punkt 7.
4. Utrustning
Se Metod A, punkt 4.
5. Utförande
5.1 Preparering av provet
Se metod A, punkterna 5.1, 5.2
och 5.3./C148/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C149/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C1505.2 Extraktion
5.3 Rengöring i kolonn
5.4 Tvådimensionell TK
5.4.1 Applicering av lösningarna (följ diagrammet i figur 1)
Ritsa två räta linjer på en platta (4.8) parallellt med två
angränsande sidor (5 resp. 6 cm in från vardera sidan) för att
begränsa lösningsmedelsfronternas migrering. Anbringa fläckar av
följande lösningar på plattan med kapillärpipetter eller mikro-
sprutor:
—på punkt A, 20 µl renat extrakt (enligt 5.3) av provet,
—på punkt B, 20 µl standardlösning (3.16),
—på punkt C, 10 µl standardlösning (3.16),
—på punkt D, 20 µl standardlösning (3.16),
—på punkt E, 40 µl standardlösning (3.16).
Torka i en långsam ström av luft eller inert gas (3.11). De fläckar
som erhålls måste vara cirka 5 mm i diameter.1976L0372 — SV — 19.08.1981 — 001.001 — 8
▼B
5.4.2 Framkallning (följ diagrammet i figur 1)
Framkalla kromatogrammet i mörker i riktning I med framkall-
ningslösningen (3.15.1) (1 cm skikt i mättad vanna) tills
lösningens front når gränslinjen för lösningen. Avlägsna plattan
från vannan och låt den torka i mörker vid omgivande temperatur
under 15 minuter.
Framkalla därefter kromatogrammet i mörker i riktning II med
framkallningslösningen (3.15.2) (1 cm skikt i omättad vanna) tills
lösningens front når gränslinjen för lösningen. Avlägsna plattan
från vannan och låt den torka i mörker vid omgivande temperatur.
5.4.3 Tolkning av kromatogrammet (följ diagrammet i figur
2)
Bestråla kromatogrammet med UV-ljus med plattan 10 cm från
lampan (4.9). Bestäm läget för de blå fluorescerande fläckarna B,
C, D och E av aflatoxin B1 från standardlösningen. Konstruera två
tänkta linjer som passerar genom dessa fläckar i rät vinkel mot
framkallningsriktningarna. Vid skärningspunkten, P, mellan dessa
linjer kan man förvänta sig att finna fläcken av det aflatoxin B1som kommer från det provextrakt som applicerats vid A (figur 1).Aflatoxin B
1-fläckensläge kan dock även vara en punkt Q i
skärningspunkten mellan två tänkta linjer som bildar en vinkel av
cirka 100º och passerar genom punkterna B resp. C. Bestäm
mängden aflatoxin B1i provextraktet enligt anvisningarna i 5.5.
5.4.4 Kompletterande kromatografi
Ritsa på en ny platta (4.8) två räta linjer som är parallella med två
angränsande sidor, enligt diagrammet i figur 1, och applicera på
punkt A (se figur 1) 20 µl av det renade provextrakt som erhållits
enligt 5.3 samt, ovanpå detta, 20 µl standardlösning (3.16). Fram-
kalla enligt anvisningarna i 5.4.2. Bestråla kromatogrammet med
UV-ljus(4.9) och kontrollera att:
— Aflatoxin B1-fläckarna från extraktet resp. standardlösningen
bildar två skikt med samma läge.
— Denna fläck har en intensivare fluorescens än den aflatoxin B1-
fläck som framkallades på punkten Q på den första plattan.
5.5 Kvantitativa bestämningar
Bestäm antingen visuellt eller genom fluorodensitometri enligt
följande anvisningar:
5.5.1 Visuell mätning
Bestäm mängden aflatoxin B1i extraktet genom att jämföra fluore-
scensintensiteten hos fläcken av extraktet med fläckarna C, D och
E med standardlösning. Interpolera om så är nödvändigt. Om 20 µl
av extraktet ger större fluorescensintensitet än 40 µl standardlös-
ningskall extraktet spädas 10 eller 100 gånger med kloroform (3.2)
eller bensen-acetonitrilblandning (3.6) innan det på nytt genomgår
tunnskiktskromatografi.
5.5.2 Mätning med fluorodensitometri
Mät fluorescensintensiteten hos aflatoxin B1-fläckarna med fluoro-
densitometern (4.12), exciteringsvåglängden 365 nm och
emissionsvåglängden 443 nm.
Bestäm mängden aflatoxin B1i fläcken av extraktet genom att
jämföra dess fluorescensintensitet med den hos fläckarna C, D och
E med standardlösning.
5.6 Bekräftelse av identiteten hos aflatoxin B1
Se Metod A, punkt 5.6.
6. Resultatberäkning
Se Metod A, punkt 6.
7. Repeterbarhet
Se Metod A, punkt 8.
8. Reproducerbarhet
Se Anmärkningar, del C, punkt 2.1976L0372 — SV — 19.08.1981 — 001.001 — 9
▼B
C. ANMÄRKNINGAR BETRÄFFANDE METODERNA A OCH B
1.Avfettning
Prover som innehåller mer än 5 % fetter måste avfettas med petroleumeter
(kokpunkt: 40-60 ºC) efter den beredning som beskrivs i 5.1.
I sådana fall måste analysresultaten uttryckas i det ej avfettade provets vikt.
2.Reproducerbarhet för resultaten
Reproducerbarheten för resultaten, d.v.s. variationen mellan de resultat som
erhålls av två eller flera laboratorier för samma prov har uppskattats till:
50 % av medelvärdet för medelvärden av aflatoxin B1från 10 till och med
20 µg/kg,
10 µg/kg på medelvärdet för medelvärden från mer än 20 till och med 50 µg/
kg,
20 % av medelvärdet för medelvärden över 50 µg/kg.1976L0372 — SV — 19.08.1981 — 001.001 — 10
▼B
TILLÄGG TILLBILAGAN
Figur 1
Figur 21976L0372 — SV — 19.08.1981 — 001.001 — 11
▼B
Figur 31976L0372 — SV — 19.08.1981 — 001.001 — 12