02009R0152 — SV — 28.06.2022 — 008.001

Den här texten är endast avsedd som ett dokumentationshjälpmedel och har ingen rättslig verkan. EU-institutionerna tar inget ansvar för innehållet. De autentiska versionerna av motsvarande rättsakter, inklusive ingresserna, publiceras i Europeiska unionens officiella tidning och finns i EUR-Lex. De officiella texterna är direkt tillgängliga via länkarna i det här dokumentet

►B KOMMISSIONENS FÖRORDNING (EG) nr 152/2009 av den 27 januari 2009 om provtagnings- och analysmetoder för offentlig kontroll av foder (Text av betydelse för EES) (EGT L 054 26.2.2009, s. 1)

Ändrad genom:









▼B

KOMMISSIONENS FÖRORDNING (EG) nr 152/2009

av den 27 januari 2009

om provtagnings- och analysmetoder för offentlig kontroll av foder

(Text av betydelse för EES)







▼M3

Artikel 1

Provtagning för offentlig kontroll av foder, särskilt när det gäller bestämning av beståndsdelar, inbegripet material som innehåller eller består av eller har framställts av genetiskt modifierade organismer (GMO), fodertillsatser enligt definitionen i Europaparlamentets och rådets förordning (EG) nr 1831/2003 ( 1 ) och främmande ämnen enligt definitionen i Europaparlamentets och rådets direktiv 2002/32/EG ( 2 ) ska utföras enligt de metoder som anges i bilaga I.

Den provtagningsmetod som anges i bilaga I är tillämplig på kontroll av foder vad gäller bestämning av bekämpningsmedelsrester enligt definitionen i Europaparlamentets och rådets förordning (EG) nr 396/2005 ( 3 ) och kontrollen av efterlevnaden av förordning (EU) nr 619/2011.

▼B

Artikel 2

Beredning av analysprov och resultatangivelse ska följa metoderna i bilaga II.

Artikel 3

Analyser för offentlig kontroll av foder ska utföras enligt metoderna i bilaga III (Analysmetoder för kontroll av foderråvarors och foderblandningars sammansättning), bilaga IV (Analysmetoder för kontroll av halten godkända fodertillsatser), bilaga V (Analysmetoder för kontroll av främmande ämnen i foder) och bilaga VI (Analysmetoder för bestämning av beståndsdelar av animaliskt ursprung för offentlig kontroll av foder).

Artikel 4

Energivärdet i foderblandningar till fjäderfä ska beräknas i enlighet med bilaga VII.

Artikel 5

De analysmetoder för kontroll av förekomst av otillåtna fodertillsatser som anges i bilaga VIII ska användas som konfirmeringsmetoder.

Artikel 6

Direktiven 71/250/EEG, 71/393/EEG, 72/199/EEG, 73/46/EEG, 76/371/EEG, 76/372/EEG, 78/633/EEG, 81/715/EEG, 84/425/EEG, 86/174/EEG, 93/70/EEG, 93/117/EG, 98/64/EG, 1999/27/EG, 1999/76/EG, 2000/45/EG, 2002/70/EG och 2003/126/EG ska upphöra att gälla.

Hänvisningar till de upphävda direktiven ska anses som hänvisningar till denna förordning och ska läsas i enlighet med jämförelsetabellerna i bilaga IX.

Artikel 7

Denna förordning träder i kraft den tjugonde dagen efter det att den har offentliggjorts i Europeiska unionens officiella tidning.

Den ska tillämpas från och med den 26 augusti 2009.

Denna förordning är till alla delar bindande och direkt tillämplig i alla medlemsstater.

▼M3









BILAGA I

PROVTAGNINGSMETODER

1. SYFTE OCH TILLÄMPNINGSOMRÅDE

Prov som är avsedda för offentlig kontroll av foder ska tas med de metoder som beskrivs nedan. Prov som har tagits på detta sätt ska anses vara representativa för provmängderna.

Syftet med representativ provtagning är att ta ut en liten fraktion av ett parti på ett sådant sätt att bestämningen av en viss egenskap hos denna fraktion representerar medelvärdet av denna egenskap i partiet. Partiet ska provtas genom att det upprepade gånger tas delprov på olika enskilda positioner i partiet. Dessa delprov ska blandas så att det bildas ett enda samlingsprov, från vilket representativa slutliga prov ska beredas genom representativ delning.

Om det vid en okulärbesiktning visar sig att delar av det foder som ska provtas skiljer sig i kvalitet från resten av fodret från samma parti, ska sådana delar skiljas från resten av fodret och behandlas som ett separat delparti. Om det inte är möjligt att dela upp fodret i separata delpartier ska fodret provtas som ett parti. I sådana fall ska detta nämnas i provtagningsrapporten.

Om det har konstaterats att ett foder som provtagits i enlighet med bestämmelserna i denna förordning inte uppfyller EU-kraven, och detta ingår i ett foderparti av samma kategori eller varuslag, ska man anta att inget foder i detta parti uppfyller kraven, utom om man efter en utförlig bedömning kan konstatera att det inte finns några belägg för att resten av partiet inte uppfyller EU-kraven.

2. DEFINITIONER

— parti (eller sats) : en identifierad mängd foder som konstaterats ha gemensamma egenskaper som ursprung, sort, förpackningsmetod, förpackare, avsändare eller märkning; när det gäller en produktionsprocess: en produktionsenhet från ett och samma tillverkningsställe som framställts med samma produktionsparametrar, eller ett antal sådana enheter som producerats samtidigt och lagrats tillsammans.

— provmängd : ett parti eller en identifierad del av partiet eller delpartiet.

— förseglat prov : ett prov som förseglats på sådant sätt att det blir omöjligt att skaffa sig tillträde till provet om inte förseglingen bryts eller avlägsnas.

— delprov : en viss mängd som tagits från ett ställe i provmängden.

— samlingsprov : en blandning av delprov som tagits från samma provmängd.

— reducerat prov : en del av samlingsprovet som erhållits ur detta genom representativ reduktion.

— slutligt prov : en del av det reducerade provet eller av det homogeniserade samlingsprovet.

— laboratorieprov : ett prov som är avsett för laboratoriet (såsom det tagits emot av laboratoriet) och som kan vara det slutliga provet, det reducerade provet eller samlingsprovet.

3. ALLMÄNNA BESTÄMMELSER

— Provtagningspersonal: Proven ska tas av personer som den behöriga myndigheten har bemyndigat för detta.

— Provet ska förseglas på sådant sätt att det blir omöjligt att skaffa sig tillträde till provet om inte förseglingen bryts eller avlägsnas. Förseglingens märke bör vara klart identifierbart och synligt. Alternativt kan provet placeras i ett kärl som kan tillslutas på ett sådant sätt att det inte kan öppnas utan att kärlet eller behållaren oåterkalleligt skadas, och återanvändning av kärlet eller behållaren därigenom undviks.

— Identifiering av provet: provet ska vara märkt på ett outplånligt sätt och ska identifieras på ett sådant sätt att det finns en otvetydig koppling till provtagningsrapporten.

— Från varje samlingsprov ska minst två slutliga prov tas: minst ett för kontroll (genomförande) och ett för foderföretagaren (försvar). Slutligen får ett slutligt prov tas som referens. Om hela samlingsprovet homogeniseras, tas de slutliga proven från det homogeniserade samlingsprovet, såvida detta förfarande inte strider mot medlemsstaternas bestämmelser om foderföretagares rättigheter.

4. UTRUSTNING

4.1 Provtagningsutrustningen ska vara tillverkad av material som inte kan kontaminera de produkter som ska provtas. Utrustning som är avsedd att användas flera gånger ska vara lätt att rengöra för att undvika korskontaminering.

4.2 Utrustning som rekommenderas för provtagning på fast foder 4.2.1 Manuell provtagning 4.2.1.1 Flatbottnad skyffel med vertikala sidor 4.2.1.2 Provtagningsspjut med en lång skåra eller med olika fack. Provtagningsspjutets dimensioner måste lämpa sig för provmängdens egenskaper (behållarens djup, säckformat etc.) och fodrets partikelstorlek. Om provtagningsspjutet har flera öppningar som ska garantera att provet tas på de olika ställena utmed spjutet, bör öppningarna separeras av fack eller sekventiellt förskjutna öppningar. 4.2.2 Mekanisk provtagning Lämplig mekanisk utrustning får användas för provtagning på foder i rörelse. Lämplig betyder att prov tas på åtminstone hela sektionen av flödet. Provtagning på foder i rörelse (vid höga flödeshastigheter) kan utföras med automatiska provtagare. 4.2.3 Provdelare Om så är möjligt och lämpligt, bör utrustning avsedd att dela upp provet i ungefär lika stora delar användas för beredning av reducerade prov på ett representativt sätt.

5. KVANTITATIVA KRAV FÖR ANTALET DELPROV

— De kvantitativa kraven i punkterna 5.1 och 5.2 för antalet delprov är tillämpliga på provmängder i storleken högst 500 ton vilka kan tas på ett representativt sätt. Den beskrivna provtagningsmetoden gäller även större kvantiteter än den föreskrivna maximala provmängdsstorleken, under förutsättning att det högsta antalet delprov som anges i tabellerna nedan lämnas utan avseende och antalet delprov bestäms utifrån den kvadratrotsformel som anges i den relevanta delen av förfarandet (se punkt 5.3) och minimistorleken på samlingsprovet ökas proportionellt. Detta förhindrar inte att ett större parti delas upp i mindre delpartier och att varje delparti provas i enlighet med det förfarande som beskrivs i punkterna 5.1 och 5.2.

— Provmängden ska vara av sådan storlek att prov kan tas i var och en av dess beståndsdelar.

— För mycket stora partier eller delpartier (> 500 ton) och för partier som transporteras eller lagras på sådant sätt att provtagning inte kan ske enligt det provtagningsförfarande som anges i punkt 5.1 och 5.2 i detta kapitel ska det provtagningsförfarande som anges i punkt 5.3 användas.

— Om en foderföretagare enligt lag är skyldig att följa denna förordning inom ramen för ett obligatoriskt övervakningssystem, får foderföretagaren avvika från de kvantitativa krav som föreskrivs i detta kapitel för att ta hänsyn till operativa egenskaper, förutsatt att foderföretagaren på tillfredsställande sätt har visat för den behöriga myndigheten att provtagningsmetoden är likvärdig i fråga om representativitet och efter godkännande av den behöriga myndigheten.

— Om det inte är möjligt att använda den angivna provtagningsmetoden vad gäller de kvantitativa kraven beroende på oacceptabla kommersiella skador på partiet (på grund av förpackningstyper, transportmedel, lagring osv.) kan i undantagsfall en alternativ provtagningsmetod användas, förutsatt att den ger så representativa resultat som möjligt och att den beskrivs och dokumenteras till fullo.

5.1 Kvantitativa krav för delprov vid kontroll av ämnen eller produkter som är jämnt fördelade i fodret

5.1.1 Fast foder i lös vikt







Provmängdens storlek Minsta antal delprov ≤ 2,5 ton 7 > 2,5 ton √ 20 gånger det antal ton som utgör provmängden (*1), upp till 40 delprov ( *1 ) Om det erhållna talet inte är ett heltal ska det avrundas till närmaste högre heltal.

5.1.2 Löst flytande foder







Provmängdens storlek Minsta antal delprov ≤ 2,5 ton eller ≤ 2 500 liter 4 (*1) > 2,5 ton eller > 2 500 liter 7 (*1) ( *1 ) Om det inte är möjligt att göra vätskan homogen måste antalet delprov ökas.

5.1.3 Förpackat foder

Foder (fast och flytande) kan förpackas i påsar, säckar, burkar, tunnor etc. som i tabellen anges som enheter. Stora enheter (≥ 500 kg eller liter) ska provtas i enlighet med bestämmelserna för löst foder (se 5.1.1 och 5.1.2.)







Provmängdens storlek Minsta antal enheter från vilka (minst) ett delprov ska tas (*1) 1–20 enheter 1 enhet (*2) 21–150 enheter 3 enheter (*2) 151–400 enheter 5 enheter (*2) > 400 enheter ¼ av det √antal enheter som utgör provmängden (*3), upp till 40 enheter ( *1 ) Om öppnande av en enhet kan påverka analysen (t.ex. blötfoder som lätt fördärvas) ska ett delprov utgöras av den oöppnade enheten. ( *2 ) För enheter med ett innehåll på högst 1 kg eller 1 liter ska ett delprov utgöras av innehållet i den ursprungliga enheten. ( *3 ) Om det erhållna talet inte är ett heltal ska det avrundas till närmaste högre heltal.

5.1.4 Foderblock och saltstenar

Prov ska tas på minst ett block eller en sten per provmängd om 25 enheter, som mest fyra block eller stenar.

För block eller stenar på högst 1 kg styck ska ett delprov utgöras av innehållet i ett block eller en sten.

5.1.5 Grovfoder/vallfoder







Provmängdens storlek Minsta antal delprov (*1) ≤ 5 ton 5 > 5 ton √ 5 gånger det antal ton som utgör provmängden (*2), upp till 40 delprov ( *1 ) Faktum är att i vissa situationer (t.ex. beträffande ensilage) är det inte möjligt att ta de delprov som krävs utan att orsaka oacceptabel skada på partiet. En alternativ provtagningsmetod får användas i sådana situationer och en vägledning för provtagning på sådana partier kommer att utarbetas innan den här förordningen träder i kraft. ( *2 ) Om det erhållna talet inte är ett heltal ska det avrundas till närmaste högre heltal.

5.2 Kvantitativa krav för delprov vid kontroll av beståndsdelar eller ämnen som kan vara ojämnt fördelade i foder

Dessa kvantitativa krav för delprov ska användas i följande situationer:

— Kontroll av aflatoxiner, mjöldryga, andra mykotoxiner och skadliga botaniska orenheter i foderråvaror.

— Kontroll av korskontaminering genom en beståndsdel, inbegripet genetiskt modifierade material eller ett ämne för vilket en ojämn fördelning förväntas i foderråvaror.

Om kontrollmyndigheten har en stark misstanke om att det finns en sådan ojämn fördelning även vid korskontaminering av en beståndsdel eller ett ämne i en foderblandning kan de kvantitativa kraven enligt nedanstående tabell tillämpas.







Provmängdens storlek Minsta antal delprov < 80 ton Se de kvantitativa kraven i punkt 5.1. Antalet delprov som ska tas ska multipliceras med 2,5. ≥ 80 ton 100

5.3 Kvantitativa krav för delprov i fråga om mycket stora partier

När det gäller stora provmängder (provmängder > 500 ton) är antalet delprov som ska tas = 40 delprov + √ton vid kontroll av ämnen eller produkter som är jämnt fördelade i fodret eller 100 delprov + √ton vid kontroll av beståndsdelar eller ämnen som kan vara ojämnt fördelade i foderråvara.

6. KVANTITATIVA KRAV FÖR SAMLINGSPROV







Det krävs ett samlingsprov per provmängd. Typ av foder Minsta storlek på samlingsprov (*1) (*2) 6.1 Löst foder 4 kg 6.2 Förpackat foder: 4 kg (*3) 6.3 Flytande eller halvflytande foder: 4 liter 6.4 Foderblock eller saltstenar: 6.4.1 Med en vikt på mer än 1 kg styck 4 kg 6.4.2 Med en vikt på högst 1 kg styck vikten av fyra block eller stenar i ursprunglig storlek 6.5 Grovfoder/vallfoder 4 kg (*4) ( *1 ) Om det provtagna fodret har ett högt värde kan en mindre mängd delprov tas, förutsatt att detta beskrivs och dokumenteras i provtagningsrapporten. ( *2 ) Enligt bestämmelserna i kommissionens förordning (EU) nr 619/2011 av den 24 juni 2011 om provtagnings- och analysmetoder för offentlig kontroll av foder vad gäller förekomst av genetiskt modifierat material där godkännandeförfarandet fortfarande pågår eller godkännandet har upphört att gälla (EGT L 166, 25.6.2011, s. 9) ska samlingsprovet för kontroll av förekomst av genetiskt modifierat material innehålla minst 35 000 korn/utsäde. Detta innebär för majs att storleken på samlingsprovet måste vara minst 10,5 kg och för sojabönor 7 kg. För andra utsäden och spannmål som korn, hirs, havre, ris, råg, vete och raps, motsvarar samlingsprovets storlek på 4 kg mer än 35 000 korn/utsäde. ( *3 ) I fråga om förpackat foder är det också möjligt att storleken 4 kg för samlingsprovet inte kan uppnås beroende på de enskilda enheternas storlek. ( *4 ) Om det är fråga om grovfoder eller vallfoder med låg densitet (t.ex. hö och halm) bör samlingsprovet vara minst 1 kg.

7. KVANTITATIVA KRAV FÖR SLUTLIGA PROV

Slutliga prov

Minst ett slutligt prov ska analyseras. Det slutliga prov som analyseras ska vara av minst följande mängd:







Fast foder 500 g (*1) (*2) (*3) Flytande eller halvflytande foder 500 ml (*1) ( *1 ) Enligt bestämmelserna i förordning (EU) nr 619/2011 ska det slutliga provet för kontroll av förekomst av genetiskt modifierat material innehålla minst 10 000 korn/utsäde. Detta innebär för majs att storleken på det slutliga provet ska vara minst 3 000 g och för sojabönor 2 000 g. För andra utsäden och spannmål som korn, hirs, havre, ris, råg, vete och raps, motsvarar det slutliga provet storlek på 500 g mer än 10 000 korn/utsäde. ( *2 ) Om samlingsprovet är betydligt mindre än 4 kg eller liter (se fotnoterna under punkt 6) kan också en mindre kvantitet av det slutliga provet tas, förutsatt att detta beskrivs och dokumenteras i provtagningsrapporten. ( *3 ) Vid provtagning på baljväxter, spannmål och trädnötter för bestämning av bekämpningsmedelsrester ska minimistorleken på det slutliga provet vara 1 kg enligt bestämmelserna i kommissionens direktiv 2002/63/EG (EGT L 187, 16.7.2002, s. 30).

8. PROVTAGNINGSMETOD FÖR MYCKET STORA PARTIER ELLER PARTIER SOM LAGRAS OCH TRANSPORTERAS PÅ ETT SÄTT SOM INNEBÄR ATT PROVTAGNING PÅ HELA PARTIET ÄR OMÖJLIG

8.1 Allmänna principer

Om det inte är möjligt att ta delprov på hela partiet på grund av det sätt som partiet transporteras eller lagras på bör provtagning på sådana partier helst ske när partiet är i flöde.

För stora lagerlokaler avsedda för lagring av foder bör företagarna uppmuntras att installera utrustning i lagerlokalen som möjliggör (automatisk) provtagning på hela det lagrade partiet.

Om man använder de provtagningsförfaranden som anges i detta kapitel, ska foderföretagaren eller dennes företrädare informeras om provtagningsförfarandet. Om detta provtagningsförfarande ifrågasätts av foderföretagaren eller dennes företrädare ska foderföretagaren eller dennes företrädare ge den behöriga myndigheten möjlighet att ta prov på hela partiet på dennes bekostnad.

8.2 Stora partier som transporteras med fartyg

8.2.1 Dynamisk provtagning på stora partier som transporteras med fartyg

Provtagning på stora partier på fartyg ska företrädesvis ske när produkten är i flöde (dynamisk provtagning).

Provtagningen ska göras per lastrum (enhet som kan separeras fysiskt). Lastrum töms dock delvis det ena efter det andra, vilket innebär att den ursprungliga fysiska separationen inte längre föreligger efter att lasten överförts till lagringsanläggningar. Provtagning kan därför ske i förhållande till den ursprungliga fysiska separationen eller i förhållande till separationen efter överföring till lagringsanläggningarna.

Lossning av ett fartyg kan pågå i flera dagar. Normalt ska provtagning ske med jämna mellanrum under hela lossningen. Det är dock inte alltid möjligt eller lämpligt att en officiell inspektör är närvarande för provtagning under hela lossningen. Därför får provtagning ske på en del (provmängd) av hela partiet. Antalet delprov bestäms med hänsyn till provmängdens storlek.

Om provtagning utförs på en del av ett foderparti som ingår i samma kategori eller varuslag och det har konstaterats att den delen av partiet inte uppfyller EU-kraven, ska man anta att inget foder i detta parti uppfyller kraven, utom om man efter en utförlig bedömning kan konstatera att det inte finns några belägg för att resten av partiet inte uppfyller EU-kraven.

Även om det officiella provet tas automatiskt är det nödvändigt att en inspektör är närvarande. Om den automatiska provtagningen utförs med förinställda parametrar som inte kan ändras under provtagningen och delproven samlas i ett förseglat kärl, varigenom eventuella bedrägerier förebyggs, krävs det enbart att en inspektör är närvarande i början av provtagningen, varje gång kärlet för proven behöver bytas och i slutet av provtagningen.

8.2.2 Provtagning på partier som transporteras med fartyg genom stationär provtagning

Om provtagningen utförs stationärt ska man tillämpa samma förfarande som föreskrivs för lagringsanläggningar (silor) som kan nås ovanifrån (se punkt 8.4.1).

Provtagningen ska utföras på den tillgängliga delen (ovanifrån) av partiet/rumslasten. Antalet delprov bestäms med hänsyn till provmängdens storlek. Om provtagning utförs på en del av ett foderparti som ingår i samma kategori eller varuslag, och det har konstaterats att den delen av partiet inte uppfyller EU-kraven, ska man anta att inget foder i detta parti uppfyller kraven, utom om man efter en utförlig bedömning kan konstatera att det inte finns några belägg för att resten av partiet inte uppfyller EU-kraven.

8.3 Provtagning på stora partier som förvaras i lager

Provtagningen ska utföras på den åtkomliga delen av partiet. Antalet delprov bestäms med hänsyn till provmängdens storlek. Om provtagning utförs på en del av ett foderparti som ingår i samma kategori eller varuslag, och det har konstaterats att den delen av partiet inte uppfyller EU-kraven, ska man anta att inget foder i detta parti uppfyller kraven, utom om man efter en utförlig bedömning kan konstatera att det inte finns några belägg för att resten av partiet inte uppfyller EU-kraven.

8.4 Provtagning på lagringsanläggningar (silor)

8.4.1 Provtagning på silor som (lätt) kan nås ovanifrån

Provtagningen ska utföras på den åtkomliga delen av partiet. Antalet delprov bestäms med hänsyn till provmängdens storlek. Om provtagning utförs på en del av ett foderparti som ingår i samma kategori eller varuslag, och det har konstaterats att den delen av partiet inte uppfyller EU-kraven, ska man anta att inget foder i detta parti uppfyller kraven, utom om man efter en utförlig bedömning kan konstatera att det inte finns några belägg för att resten av partiet inte uppfyller EU-kraven.

8.4.2 Provtagning på silor som inte kan nås ovanifrån (slutna silor)

8.4.2.1 Silor som inte kan nås ovanifrån (slutna silor) i storleken > 100 ton

Prov på foder som lagras i sådana silor kan inte tas statiskt. Om prov måste tas på fodret i silon och det inte finns någon möjlighet att flytta varupartiet ska det därför avtalas med företagaren att han eller hon ska informera inspektören om när silon kommer att tömmas för att göra det möjligt att ta prov på fodret när det är i flöde.

8.4.2.2 Silor som inte kan nås ovanifrån (slutna silor) i storleken < 100 ton

Provtagningsförfarandet innebär att en kvantitet av 50–100 kg överförs till ett kärl och att provet tas från detta. Storleken på samlingsprovet motsvarar hela partiet och antalet delprov står i relation till de kvantiteter i silon som överförs till ett kärl för provtagning. Om provtagning utförs på en del av ett foderparti som ingår i samma kategori eller varuslag, och det har konstaterats att den delen av partiet inte uppfyller EU-kraven, ska man anta att inget foder i detta parti uppfyller kraven, utom om man efter en utförlig bedömning kan konstatera att det inte finns några belägg för att resten av partiet inte uppfyller EU-kraven.

8.5 Provtagning på löst foder i stora slutna behållare

Prov på sådana partier kan ofta enbart tas när de lossas. Det är i vissa fall omöjligt att lossa vid importstället eller kontrollpunkten och därför bör provtagningen ske när sådana behållare lossas.

9. ANVISNINGAR OM UTTAGNING, BEREDNING OCH FÖRPACKNING AV PROVEN

9.1 Allmänt

Proven ska tas och beredas utan onödigt dröjsmål med beaktande av de försiktighetsåtgärder som krävs för att produkten varken ska förändras eller kontamineras. Instrument, ytor och behållare som kommer i kontakt med proven ska vara rena och torra.

9.2 Delprov

Delprov ska tas slumpvis i hela provmängden och ha ungefär samma storlek.

Delprovets storlek ska vara minst 100 gram eller, för grovfoder eller vallfoder med låg specifik vikt, 25 gram.

Om färre än 40 delprov ska uttas enligt bestämmelserna om provtagningsförfarande i punkt 8 ska delprovens storlek fastställas i förhållande till den storlek som krävs för samlingsprovet (se punkt 6).

Om det utförs provtagning på små partier av förpackat foder, där det enligt de kvantitativa kraven ska uttas ett begränsat antal delprov, ska ett delprov utgöras av innehållet i en ursprunglig enhet med ett innehåll på högst 1 kg eller 1 liter.

Om det utförs provtagning på förpackat foder som består av små enheter (t.ex. < 250 g) beror delprovets storlek på enhetens storlek.

9.2.1 Löst foder

Provtagningen kan, om så är lämpligt, göras medan provmängden är i rörelse (vid lastning eller lossning).

9.2.2 Förpackat foder

När det antal enheter som krävs för provtagning enligt kapitel 5 har valts ut ska en del av innehållet i varje enhet tas ut med spjut eller skyffel. Vid behov tas proven efter det att enheterna har tömts separat.

9.2.3 Flytande eller halvflytande foder som är homogent eller kan homogeniseras

När det antal enheter som krävs för provtagning enligt kapitel 5 har valts ut ska innehållet vid behov homogeniseras och en mängd tas från varje enhet.

Delproven får tas när innehållet lossas.

9.2.4 Flytande eller halvflytande foder som inte kan homogeniseras

När det antal enheter som krävs för provtagning enligt kapitel 5 har valts ut ska prov tas från olika nivåer.

Proven får också tas när innehållet lossas, men de första fraktionerna ska då kastas.

I båda fallen ska den totala volymen vara minst tio liter.

9.2.5 Foderblock och saltstenar

När det antal block eller stenar som krävs för provtagning enligt kapitel 5 har valts ut får en del av varje block eller sten tas ut. Om det finns en misstanke om att ett block eller en sten inte är homogen får hela blocket eller stenen tas ut som prov.

För block eller stenar på högst 1 kg styck ska ett delprov utgöras av innehållet i ett block eller en sten.

9.3 Beredning av samlingsprov

Delproven ska blandas till ett enda samlingsprov.

9.4 Beredning av slutliga prov

Materialet i samlingsprovet ska blandas omsorgsfullt ( 4 ):

— Varje prov ska placeras i en lämplig behållare/ett lämpligt kärl. Alla nödvändiga försiktighetsåtgärder ska vidtas för att undvika att provets sammansättning förändras eller att provet kontamineras eller förfalskas under transport och lagring.

— Vid kontroll av beståndsdelar eller ämnen som är jämnt fördelade i fodret, får samlingsprovet reduceras representativt till minst 2,0 kg eller 2,0 liter (reducerat prov) ( 5 ), helst med antingen mekanisk eller automatisk delare. Vid kontroll av förekomsten av bekämpningsmedelsrester i ärtväxter, sädeskorn och trädnötter ska det reducerade provet vara minst 3 kg. Om fodrets beskaffenhet inte medger användning av delare eller delaren inte är tillgänglig, får provet reduceras med kvarteringsmetoden. Av de reducerade proven ska de slutliga proven (för kontroll, försvar och referens) därefter beredas av ungefär samma mängd och ska därvid följa de kvantitativa kraven i kapitel 7. Vid kontroll av beståndsdelar, inklusive genetiskt modifierade material eller ämnen som kan vara ojämnt fördelade i foderråvaror, ska samlingsprovet vara: — helt homogeniserat och därefter delat i slutliga prov, eller — reducerat till minst 2 kg eller 2 liter ( 6 ) med mekanisk eller automatisk delare. Endast om fodrets beskaffenhet inte medger användning av delare får provet vid behov reduceras med kvarteringsmetoden. För kontroll av förekomst av genetiskt modifierat material enligt förordning (EU) nr 619/2011 ska det reducerade provet innehålla minst 35 000 korn/utsäde för att göra det möjligt att erhålla de slutliga proven för genomförande, försvar och referens på minst 10 000 korn/utsäde (se fotnot (**) i kapitel 6 och fotnot (*) i kapitel 7).

9.5 Förpackning av prov

Behållarna eller förpackningarna ska förseglas och märkas på sådant sätt att de inte kan öppnas utan att förseglingen skadas. Hela märkningen ska ingå i förseglingen.

9.6 Sändning av proven till laboratoriet

Provet ska utan onödigt dröjsmål sändas till det utsedda analyslaboratoriet tillsammans med de upplysningar som den som utför analysen behöver.

10. REGISTRERING AV PROV

Alla prov ska registreras så att varje provmängd och dess storlek entydigt kan identifieras.

I registret ska också anges varje avvikelse från det provtagningsförfarande som anges i den här förordningen.

Förutom att registret ska hållas tillgängligt för det officiella kontrollaboratoriet, ska det hållas tillgängligt för foderföretagaren och/eller det laboratorium som utsetts av foderföretagaren.









BILAGA II

ALLMÄNNA BESTÄMMELSER OM ANALYSMETODER FÖR FODER

A. BEREDNING AV ANALYSPROV

1. Syfte

De metoder som beskrivs nedan gäller beredning för analys av prov som skickats till kontrollaboratorierna efter provtagning i enlighet med bilaga I.

Laboratorieproven ska beredas så att den uppvägda mängden enligt analysmetoden är homogen och representativ för de slutliga proven.

2. Försiktighetsåtgärder

Vilken provberedningsmetod som ska användas beror på analysmetoden och de beståndsdelar eller ämnen som ska kontrolleras. Det är därför viktigt att man ser till att provberedningsmetoden lämpar sig för den analysmetod som används och för de beståndsdelar eller ämnen som ska kontrolleras.

Alla nödvändiga moment ska utföras på ett sådant sätt att man i görligaste mån undviker att provet kontamineras eller att dess sammansättning ändras.

Malning, blandning och siktning bör göras utan dröjsmål så att provet i minsta möjliga utsträckning utsätts för luft och ljus. Kvarnar och rivare som avsevärt kan hetta upp provet bör inte användas.

Malning för hand rekommenderas för foder som är särskilt känsliga för värme. Man bör också se till att apparaten inte i sig själv är en källa till kontaminering.

Om provet inte kan beredas utan betydande förändringar av dess vattenhalt ska vattenhalten före och efter beredningen bestämmas med den metod som anges i bilaga III del A.

3. Förfarande

3.1 Allmänt förfarande

Testdelprovet tas från det slutliga provet. Koning och kvartering rekommenderas inte eftersom det kan ge testdelproven större neddelningsfel.

3.1.1 Foder som kan malas i befintligt tillstånd

— Blanda det siktade slutliga provet och placera det i en lämplig ren, torr behållare med lufttät förslutning. Blanda provet igen, för att garantera fullständig homogenisering, i direkt samband med invägning för analys (testdelprov).

3.1.2 Foder som kan malas efter torkning

— Om inte annat anges i metodbeskrivningen torkas det slutliga provet till en vattenhalt på 8–12 % genom den förberedande torkning som görs vid bestämning av vattenhalt enligt bilaga III del A punkt 4.3. Fortsätt sedan enligt anvisningarna i 3.1.1.

3.1.3 Flytande eller halvflytande foder

— Placera det slutliga provet i en lämplig ren, torr behållare med lufttät förslutning. Blanda provet omsorgsfullt, för att garantera fullständig homogenisering, i direkt anslutning till invägning för analys (testdelprov).

3.1.4 Öviga foder

— Slutliga prov som inte kan beredas enligt någon av de föregående metoderna ska behandlas med någon annan metod som garanterar att de provportioner som vägs in för analys (testdelprov) är homogena och representativa för det slutliga provet.

3.2 Särskilt förfarande vid undersökning genom okulärbesiktning eller genom mikroskopi eller om hela samlingsprovet homogeniserats

— Vid en undersökning genom okulärbesiktning (utan att använda mikroskop) används hela laboratorieprovet för undersökningen.

— Vid undersökning i mikroskop får laboratoriet reducera samlingsprovet eller ytterligare reducera det reducerade provet. De slutliga proven för försvars- och eventuellt referensändamål tas enligt ett förfarande som motsvarar förfarandet för det slutliga provet för genomförande.

— Om hela samlingsprovet homogeniseras ska de slutliga proven tas från det homogeniserade samlingsprovet.

4. Provförvaring

Proven ska förvaras vid en temperatur som inte påverkar deras sammansättning. Prov avsedda för analys av vitaminer eller ämnen som är särskilt ljuskänsliga ska förvaras under sådana förhållanden att provet inte påverkas negativt av ljus.

B. BESTÄMMELSER OM REAGENS OCH UTRUSTNING FÖR ANALYS

1. Om inget annat anges för analysmetoden ska alla reagens vara analysrena (p.a.). Vid spåranalys ska reagensens renhet kontrolleras mot ett blankprov. Beroende på resultatet kan det krävas ytterligare rening av reagensen.

2. Om det i metodbeskrivningen inte anges vilken typ av lösnings- eller spädningsmedel som ska användas för beredning av lösningar, spädning, sköljning eller tvättning ska vatten användas. I allmänhet ska vattnet vara demineraliserat eller destillerat. I särskilda fall, som anges i metodbeskrivningarna, ska vattnet behandlas med särskilda reningsmetoder.

3. Eftersom viss utrustning normalt sett förekommer på kontrollaboratorier, nämns i metodbeskrivningarna endast instrument och apparatur som är speciella eller som ska användas på ett speciellt sätt. Instrument och apparatur ska vara rena, särskilt när mycket små mängder ska bestämmas.

C. VAL AV ANALYSMETOD OCH RESULTATANGIVELSE

1. Extraktion

I flera fall anges en specifik extraktionsmetod för en viss analysmetod. I allmänhet kan andra extraktionsmetoder än den som finns i metodbeskrivningen användas om det kan visas att den använda extraktionsmetoden har samma extraktionseffektivitet för den analyserade matrisen som den metod som anges för analysmetoden.

2. Rening

I många fall anges en specifik reningsmetod för en viss analysmetod. I allmänhet kan andra reningsmetoder än den som finns i metodbeskrivningen användas om det kan visas att den använda reningsmetoden ger samma analysresultat för den analyserade matrisen som den metod som anges för analysmetoden.

3. Antal bestämningar

När det gäller analys av främmande ämnen gäller att om resultatet från den första bestämningen är betydligt (> 50 %) lägre än den specifikation som ska kontrolleras så behövs ingen ytterligare bestämning, förutsatt att lämpliga kvalitetsförfaranden används. I andra fall behövs två analyser (en andra bestämning) för att utesluta möjligheten till intern korskontaminering eller oavsiktlig hopblandning av prov. Medelvärdet av de två bestämningarna, där mätosäkerheten beaktas, används för kontroll av att kraven är uppfyllda.

I fråga om kontroll av det deklarerade innehållet av ett ämne eller en beståndsdel gäller att om resultatet från den första bestämningen bekräftar det deklarerade innehållet, dvs. analysresultatet hamnar inom ett intervall för acceptabel variation jämfört med det deklarerade innehållet, behövs ingen ytterligare bestämning, förutsatt att lämpliga kvalitetsförfaranden används. I andra fall behövs två analyser (en andra bestämning) för att utesluta möjligheten till intern korskontaminering eller oavsiktlig hopblandning av prov. Medelvärdet av de två bestämningarna, där mätosäkerheten beaktas, används för kontroll av att kraven är uppfyllda.

I en del fall definieras detta acceptabla variationsintervall, t.ex. i Europaparlamentets och rådets förordning (EG) nr 767/2009 av den 13 juli 2009 om utsläppande på marknaden och användning av foder, om ändring av Europaparlamentets och rådets förordning (EG) nr 1831/2003 och om upphävande av rådets direktiv 79/373/EEG, kommissionens direktiv 80/511/EEG, rådets direktiv 82/471/EEG, 83/228/EEG, 93/74/EEG, 93/113/EG och 96/25/EG samt kommissionens beslut 2004/217/EG ( 7 ).

4. Angivande av analysmetod som använts

I analysrapporten ska anges vilken analysmetod som använts.

5. Rapportering av analysresultat

Analysresultatet ska uttryckas med lämpligt antal värdesiffror på det sätt som anges i metodbeskrivningen och ska vid behov korrigeras för vattenhalten i det slutliga provet före beredning.

6. Mätosäkerhet och utbyte vid analys av främmande ämnen

I fråga om främmande ämnen enligt direktiv 2002/32/EG ska en produkt avsedd som foder inte anses uppfylla kraven på högsta tillåtna halt om analysresultatet, för foder med en vattenhalt på 12 %, bedöms överstiga högsta tillåtna halt med hänsyn tagen till den utvidgade mätosäkerheten och korrigering för utbytet. För att bedöma om kraven uppfylls använder man den analyserade halten, korrigerad för utbyte, minus den utvidgade mätosäkerheten. Denna metod kan bara användas om det går att uppskatta mätosäkerheten och korrigering för utbyte med hjälp av analysmetoden (den kan exempelvis inte användas för mikroskopisk analys).

Analysresultatet ska rapporteras enligt följande (om analysmetoden gör det möjligt att uppskatta mätosäkerhet och utbyte):

a) Korrigerat för utbyte, med uppgift om hur stort utbytet är. Korrigering är inte nödvändig om utbytet är 90–110 %.

b) Som x +/– U, där x är analysresultatet och U den utvidgade mätosäkerheten, beräknad med en täckningsfaktor på 2, vilket ger en konfidensgrad på ca 95 %.

Om analysresultatet är betydligt (> 50 %) lägre än den specifikation som ska kontrolleras, och förutsatt att lämpliga kvalitetsförfaranden använts och att analysen endast syftar till att kontrollera om fodret uppfyller kraven i lagstiftningen, får analysresultatet rapporteras utan korrigering för utbyte. Utbyte och mätosäkerhet behöver inte anges i dessa fall.

▼B









BILAGA III

ANALYSMETODER FÖR KONTROLL AV FODERRÅVARORS OCH FODERBLANDNINGARS SAMMANSÄTTNING

A. BESTÄMNING AV VATTENHALT

1. Syfte och tillämpningsområde

Med denna metod kan vattenhalten i foder bestämmas. Det bör framhållas att när det gäller foder som innehåller flyktiga ämnen, exempelvis organiska syror, bestäms också en betydande mängd flyktiga ämnen tillsammans med vatteninnehållet.

Metoden omfattar inte analys av mjölkprodukter som används som foderråvaror, analys av mineralämnen och blandningar som främst består av mineralämnen, analys av animaliska och vegetabiliska fetter och oljor eller analys av oljeväxtfrön och oljehaltiga frukter.

2. Princip

Provet torkas på angivet sätt, alltefter fodrets beskaffenhet. Viktförlusten bestäms genom vägning. När det gäller fast foder med hög vattenhalt är det nödvändigt att göra en förberedande torkning.

3. Utrustning

3.1 Kross av ej vattenabsorberande material som är lätt att rengöra, möjliggör snabb och jämn krossning utan nämnvärd värmeutveckling, så långt möjligt förhindrar kontakt med omgivande luft och som uppfyller kraven i 4.1.1 och 4.1.2 (t.ex. rivkvarnar med variabel malning, vattenkylda kvarnar eller liknande).

3.2 Analysvåg med en noggrannhet av 1 mg.

3.3 Torra behållare av korrosionsfri metall eller av glas och med lufttäta lock. Arbetsytan ska göra det möjligt att sprida ut provet till ca 0,3 g/cm2.

3.4 Elektrisk isotermisk ugn (± 2 oC) med god ventilation och möjlighet till snabb temperaturreglering ( 8 ).

3.5 Reglerbar elektrisk vakuumugn med oljepump och antingen en anordning för tillförsel av varm, torr luft eller ett torkmedel (t.ex. kalciumoxid).

3.6 Exsickator med tjock perforerad metall- eller porslinsplatta och med ett effektivt torkmedel.

4. Utförande

Observera: De moment som beskrivs i detta avsnitt måste utföras omedelbart efter det att provförpackningarna öppnats. Minst två parallella analyser ska utföras.

4.1 Beredning

4.1.1 Andra fodertyper än de som behandlas i 4.1.2 och 4.1.3

Ta minst 50 g av provet. Krossa eller sönderdela vid behov för att göra provet homogent med avseende på vattenhalt (se 6).

4.1.2 Spannmål och gröpe

Ta minst 50 g av provet. Mal till partiklar som till minst 50 % passerar genom en sikt med en maskvidd av 0,5 mm och som lämnar högst 10 % återstod på en rundmaskig sikt med en maskvidd av 1 mm.

4.1.3 Foder i flytande form eller pastaform samt foder som till större delen består av oljor och fetter

Ta ca 25 g av provet och väg med en noggrannhet av 10 mg. Tillsätt lämplig mängd vattenfri sand som vägts med en noggrannhet av 10 mg och blanda tills en homogen massa erhålls.

4.2 Torkning

4.2.1 Andra fodertyper än de som behandlas i 4.2.2 och 4.2.3

Väg en behållare (3.3) med lock med en noggrannhet av 1 mg. Väg upp ca 5 g av provet med en noggrannhet av 1 mg i den vägda behållaren och fördela det jämnt. Sätt in behållaren utan lock i ugnen som förvärmts till 103 oC. Sätt in behållaren i ugnen så snabbt som möjligt så att ugnstemperaturen inte sjunker alltför mycket. Låt torka i 4 timmar räknat från det att ugnstemperaturen åter stigit till 103 oC. Sätt på locket på behållaren, ta ut denna ur ugnen, låt svalna i 30–45 minuter i exsickatorn (3.6) och väg med en noggrannhet av 1 mg.

Foder som till större delen består av oljor och fetter torkas i ugnen i ytterligare 30 minuter vid 130 oC. Skillnaden i vattenhalt mellan de båda vägningarna får inte överstiga 0,1 %.

4.2.2 Spannmål, mjöl och gröpe

Väg en behållare (3.3) med lock med en noggrannhet av 0,5 mg. Väg upp ca 5 g av det krossade provet med en noggrannhet av 1 mg i den vägda behållaren och fördela det jämnt. Sätt in behållaren utan lock i ugnen som förvärmts till 130 oC. Sätt in behållaren i ugnen så snabbt som möjligt så att ugnstemperaturen inte sjunker alltför mycket. Låt torka i två timmar räknat från det att ugnstemperaturen åter stigit till 130 oC. Sätt på locket på behållaren, ta ut denna ur ugnen, låt svalna i 30–45 minuter i exsickatorn (3.6) och väg med en noggrannhet av 1 mg.

4.2.3 Foderblandningar som innehåller mer än 4 % sackaros eller laktos; foderråvaror som t.ex. johannesbrödsfrön, hydrolyserade spannmålsprodukter, malt, torkad betsnitsel, lösliga biprodukter från fisk- eller sockerindustrin; foderblandningar som innehåller mer än 25 % mineralsalter inklusive kristallvatten

Väg en behållare (3.3) med lock med en noggrannhet av 0,5 mg. Väg upp ca 5 g av provet med en noggrannhet av 1 mg i den vägda behållaren och fördela det jämnt. Sätt in behållaren utan lock i vakuumugnen (3.5) som förvärmts till 80–85 oC. Sätt in behållaren i ugnen så snabbt som möjligt så att ugnstemperaturen inte sjunker alltför mycket.

Ställ in trycket på 100 torr och låt torka vid detta tryck i 4 timmar, antingen med en torr varmluftsström eller med användning av torkmedel (ca 300 g till 20 prov). Om det senare alternativet väljs ska vakuumpumpen frånkopplas när det angivna trycket har uppnåtts. Räkna torkningstiden från det att ugnstemperaturen åter har nått 80–85 oC. Låt försiktigt ugnen återgå till atmosfärstryck. Öppna ugnen, sätt omedelbart lock på behållaren, ta ut den ur ugnen, låt svalna i 30–45 minuter i exsickatorn (3.6) och väg med en noggrannhet av 1 mg. Låt torka i ytterligare 30 minuter i vakuumugnen vid 80–85 oC och väg på nytt. Skillnaden i vattenhalt mellan de båda vägningarna får inte överstiga 0,1 %.

4.3 Förberedande torkning

4.3.1 Andra foder än de som behandlas i 4.3.2

Fasta foder med hög vattenhalt som försvårar krossning måste genomgå en förberedande torkning enligt följande:

Väg upp 50 g okrossat prov med en noggrannhet av 10 mg (pellets och briketter kan vid behov delas grovt) i en lämplig behållare (t.ex. en 20 × 12 cm aluminiumplåt med 0,5 cm upphöjd kant). Låt torka i ugn vid 60–70 oC tills vattenhalten har reducerats till 8–12 %. Ta ut provet ur ugnen, låt svalna utan lock i laboratoriet i 1 timme och väg med en noggrannhet av 10 mg. Krossa provet omedelbart enligt 4.1.1 och torka enligt 4.2.1 eller 4.2.3 beroende på fodrets beskaffenhet.

4.3.2 Spannmål

Spannmål med en vattenhalt över 17 % måste genomgå en förberedande torkning enligt följande:

Väg upp 50 g omalda spannmålskärnor med en noggrannhet av 10 mg i en lämplig behållare (t.ex. en 20 × 12 cm aluminiumplåt med 0,5 cm upphöjd kant). Låt torka i ugn i 5–7 minuter vid 130 oC. Ta ut provet ur ugnen, låt svalna utan lock i laboratoriet i två timmar och väg med en noggrannhet av 10 mg. Mal omedelbart enligt 4.1.2 och torka enligt 4.2.2.

5. Beräkning av resultat

Vattenhalten (X) i procent av provet beräknas med nedanstående formler.

5.1 Torkning utan förberedande torkning

där:

m = provets ursprungliga vikt i gram

m0 = det torkade provets vikt i gram.

5.2 Torkning med förberedande torkning

där:

m = provets ursprungliga vikt i gram

m1 = provets vikt i gram efter förberedande torkning

m2 = provets vikt i gram efter krossning eller malning

m0 = det torkade provets vikt i gram.

5.3 Repeterbarhet

Skillnaden mellan resultaten från två parallella bestämningar som utförs på samma prov får inte överstiga 0,2 % av den absoluta vattenhalten.

6. Anmärkning

Om det är nödvändigt att krossa provet och detta medför en iakttagbar förändring av vattenhalten, måste resultaten av analyserna av fodrets beståndsdelar korrigeras på grundval av provets ursprungliga vattenhalt.

B. BESTÄMNING AV VATTENHALT I ANIMALISKA OCH VEGETABILISKA OLJOR OCH FETTER

1. Syfte och tillämpningsområde

Med denna metod är det möjligt att bestämma halter av vatten och flyktiga ämnen i animaliska och vegetabiliska oljor och fetter.

2. Princip

Provet torkas till konstant vikt (viktförlusten mellan två på varandra följande vägningar får inte överstiga 1 mg) vid 103 oC. Viktförlusten bestäms genom vägning.

3. Utrustning

3.1 Flatbottnad skål av korrosionsresistent material, 8–9 cm i diameter och ca 3 cm hög.

3.2 Termometer med förstärkt kula och expansionsrör i överdelen, graderad från ca 80 oC till minst 110 oC och ca 10 cm lång.

3.3 Sandbad eller elektrisk värmeplatta.

3.4 Exsickator med ett effektivt torkmedel.

3.5 Analysvåg.

4. Utförande

Väg med 1 mg noggrannhet upp ca 20 g av det homogeniserade provet på den torra, vägda skålen (3.1) där termometern (3.2) placerats. Upphetta på sandbadet eller värmeplattan (3.3) under ständig omrörning med termometern så att temperaturen stiger till 90 oC på ca 7 minuter.

Sänk värmen och ge akt på mängden bubblor som stiger från skålens botten. Temperaturen får inte överstiga 105 oC. Fortsätt att röra om och skrapa skålens botten tills det inte längre bildas några bubblor.

För att försäkra sig om att vattnet helt har avlägsnats upphettar man upprepade gånger till 103 ± 2 oC och kyler till 93 oC mellan upphettningarna. Därefter får provet svalna till rumstemperatur i exsickatorn (3.4) varefter det vägs. Detta upprepas tills viktförlusten mellan två på varandra följande vägningar inte längre överstiger 2 mg.

Observera: Om provets vikt ökar efter flera upphettningar, tyder detta på att fettet har oxiderats. Resultatet beräknas då utifrån den vägning som gjordes omedelbart innan vikten började öka.

5. Beräkning av resultat

Provets vattenhalt X i procent beräknas med formeln

där:

m = provets vikt i gram

m1 = skålens vikt (i gram) inklusive innehåll före upphettning

m2 = skålens vikt (i gram) inklusive innehåll efter upphettning.

Resultat under 0,05 % ska redovisas som ”under 0,05 %”.

Repeterbarhet

Skillnaden mellan resultaten från två parallella bestämningar som utförs på samma prov får inte överstiga 0,05 % av den absoluta vattenhalten.

C. BESTÄMNING AV RÅPROTEINHALT

1. Syfte och tillämpningsområde

Med denna metod kan råproteinhalten i foder bestämmas på grundval av kvävehalten, bestämd med Kjeldahlmetoden.

2. Princip

Provet uppsluts med svavelsyra i närvaro av en katalysator. Syralösningen görs basisk med natriumhydroxidlösning. Ammoniaken destilleras av och samlas upp i en uppmätt kvantitet svavelsyra varefter syraöverskottet titreras med en standardlösning av natriumhydroxid.

Alternativt destilleras den frigjorda ammoniaken till ett överskott av borsyralösning, som sedan titreras med saltsyra eller svavelsyra.

3. Reagens

3.1 Kaliumsulfat.

3.2 Katalysator: koppar(II)oxid, CuO, eller koppar(II)sulfatpentahydrat, CuSO4 5H2O.

3.3 Zinkgranulat.

3.4 Svavelsyra, ρ20 = 1,84 g/ml.

3.5 Svavelsyra, standardlösning, c(H2SO4) = 0,25 mol/l.

3.6 Svavelsyra, standardlösning, c(H2SO4) = 0,10 mol/l.

3.7 Svavelsyra, standardlösning, c(H2SO4) = 0,05 mol/l.

3.8 Metylrött (indikator): lös 300 mg metylrött i 100 ml etanol, σ = 95–96 % (v/v).

3.9 Natriumhydroxidlösning (teknisk kvalitet kan användas) β = 40 g/100 ml (m/v: 40 %).

3.10 Natriumhydroxid, standardlösning, c(NaOH) = 0,25 mol/l.

3.11 Natriumhydroxid, standardlösning, c(NaOH) = 0,10 mol/l.

3.12 Pimpstensgranulat som saltsyresköljts och glödgats.

3.13 Acetanilid (smältpunkt = 114 oC, N-halt = 10,36 %).

3.14 Sackaros (kvävefri).

3.15 Borsyra (H3BO3).

3.16 Indikatorlösning av metylrött: lös 100 mg metylrött i 100 ml etanol eller metanol.

3.17 Lösning av bromkresolgrönt: lös 100 mg bromkresolgrönt i 100 ml etanol eller metanol.

3.18 Borsyralösning (10–40 g/l beroende på vilken utrustning som används).

Vid kolorimetrisk bestämning av ekvivalenspunkten ska indikatorerna metylrött och bromkresolgrönt tillsättas borsyralösningarna. För beredning av 1 liter borsyralösning tillsätts 7 ml lösning av metylrött (3.16) och 10 ml lösning av bromkresolgrönt (3.17) innan volymen justeras.

Beroende på det vatten som används kan borsyralösningens pH variera mellan olika satser. Det är ofta nödvändigt med en liten tillsats av bas för att få ett positivt blankprov.

Anmärkning: En tillsats av ca 3–4 ml NaOH (3.11) till 1 liter borsyra (10 g/l) ger vanligen en god justering. Lösningen förvaras i rumstemperatur skyddad från ljus och ammoniakångor.

3.19 Saltsyra, standardlösning, c(HCl) = 0,10 mol/l.

Anmärkning: Andra koncentrationer av lösningarna (3.5, 3.6, 3.7, 3.10, 3.11 och 3.19) kan användas om beräkningarna korrigeras för detta. Koncentrationerna bör alltid anges med fyra decimaler.

4. Utrustning

Lämplig utrustning för uppslutning, destillation och titrering enligt Kjeldahlmetoden.

5. Utförande

5.1 Uppslutning

Väg upp 1 g av provet med 0,001 g noggrannhet och överför detta till uppslutningsapparatens kolv. Tillsätt 15 g kaliumsulfat (3.1), en lämplig mängd katalysator (3.2) (0,3 –0,4 g koppar(II)oxid eller 0,9 –1,2 g koppar(II)sulfatpentahydrat), 25 ml svavelsyra (3.4) och vid behov några korn pimpsten (3.12). Blanda.

Upphetta kolven först måttligt, och rotera den vid behov då och då tills innehållet har förkolnat och skummet försvunnit. Upphetta sedan intensivare tills vätskan kommit i konstant kokning. Värmen är tillräcklig om den kokande syran kondenserar på kolvens väggar. Se till att kolvens väggar inte blir överhettade och att organiska partiklar inte fastnar på dem.

När lösningen har blivit klar och ljusgrön fortsätts kokningen i ytterligare två timmar, varefter lösningen får svalna.

5.2 Destillation

Tillsätt försiktigt tillräckligt med vatten för att sulfaterna ska lösas upp fullständigt. Låt svalna. Tillsätt sedan några korn zinkgranulat (3.3) om så behövs. Fortsätt enligt 5.2.1 eller 5.2.2.

5.2.1 Destillation till svavelsyra

Tillför en exakt uppmätt mängd av 25 ml svavelsyra (3.5) eller (3.7), beroende på den förmodade kvävehalten, till destillationsapparatens uppsamlingskolv. Tillsätt några droppar metylrött (3.8).

Förbind kolven med destillationsapparatens kylare och sänk ned kylarens ände minst 1 cm (se anmärkning 8.3) i vätskan i uppsamlingskolven. Häll långsamt 100 ml natriumhydroxidlösning (3.9) i kolven utan att ammoniak försvinner (se anmärkning 8.1). Upphetta kolven tills ammoniaken har destillerats färdigt.

5.2.2 Destillation till borsyra

Om destillatets ammoniakinnehåll titreras manuellt används nedanstående förfarande. Om destillationsenheten är helautomatisk och inkluderar titrering av destillatets ammoniakinnehåll, ska tillverkarens bruksanvisning följas.

Ställ en uppsamlingskolv innehållande 25–30 ml borsyralösning (3.18) under kylarens utlopp på ett sådant sätt att utloppsröret mynnar under ytan i ett överskott av borsyralösning. Ställ in destillationsenheten så att 50 ml natriumhydroxidlösning (3.9) tillsätts. Använd destillationsenheten enligt tillverkarens bruksanvisning och destillera av den ammoniak som frigjorts genom tillsatsen av natriumhydroxidlösning. Samla upp destillatet i borsyralösningen. Mängden destillat (tiden för ångdestillation) beror på mängden kväve i provet. Följ tillverkarens bruksanvisning.

Anmärkning: I en halvautomatisk destillationsenhet sker såväl tillsats av ett överskott av natriumhydroxid som ångdestillation automatiskt.

5.3 Titrering

Fortsätt enligt 5.3.1 eller 5.3.2.

5.3.1 Svavelsyra

Överskottet av svavelsyra titreras i uppsamlingskolven med natriumhydroxidlösning (3.10 eller 3.11), beroende på vilken koncentration av svavelsyra som använts, tills ekvivalenspunkten är nådd.

5.3.2 Borsyra

Uppsamlingskolvens innehåll titreras med standardlösning av saltsyra (3.19) eller med standardlösning av svavelsyra (3.6) med hjälp av en byrett. Den använda mängden titrator avläses.

Vid kolorimetrisk bestämning av ekvivalenspunkten nås denna så snart provet börjar skifta färg till rosa. Avläs byretten med 0,05 ml noggrannhet. En upplyst magnetomrörare eller en fotometer kan göra det lättare att påvisa färgomslaget.

Detta kan också göras automatiskt med hjälp av en ångdestillationsapparat med automatisk titrering.

Följ tillverkarens bruksanvisning för den använda destillationsapparaten eller destillations-/titreringsapparaten.

Anmärkning: Om automatisk titrering används, inleds titreringen omedelbart efter det att destillationen har börjat, och 1 % borsyralösning (3.18) används. Med en helautomatisk destillationsenhet kan man också göra en potentiometrisk titrering av ammoniak, där ekvivalenspunkten bestäms genom kontinuerlig pH-mätning. I så fall används en automatisk titreringsapparat med en pH-meter som med hjälp av standardmetoder är noggrant kalibrerad i intervallet pH 4–7. Ekvivalenspunkten nås vid pH 4,6 där titrerkurvan är som brantast (inflexionspunkten).

5.4 Blankprov

För att säkerställa att reagensen är fria från kväve utförs ett blankprov (uppslutning, destillation och titrering) med 1 g sackaros (3.14) i stället för provet.

6. Beräkning av resultat

Beräkningarna görs enligt 6.1 eller 6.2.

6.1 Beräkning för titrering enligt 5.3.1

Råproteinhalten i viktprocent beräknas med formeln

där:

V0 = volymen (ml) NaOH (3.10 eller 3.11) i blankprovet

V1 = volymen (ml) NaOH (3.10 eller 3.11) vid titreringen av provet

c = koncentrationen (mol/l) av natriumhydroxid (3.10 eller 3.11)

m = provets vikt i gram.

6.2 Beräkning för titrering enligt 5.3.2

6.2.1 Titrering med saltsyra

Råproteinhalten i viktprocent beräknas med formeln

där:

m = provets vikt i gram

c = koncentrationen (mol/l) av saltsyra i standardlösningen (3.19)

V0 = volymen (ml) saltsyra i blankprovet

V1 = volymen (ml) saltsyra i provet.

6.2.2 Titrering med svavelsyra

Råproteinhalten i viktprocent beräknas med formeln

där:

m = provets vikt i gram

c = koncentrationen (mol/l) av svavelsyra i standardlösningen (3.6)

V0 = volymen (ml) svavelsyra (3.6) i blankprovet

V1 = volymen (ml) svavelsyra (3.6) i provet.

7. Verifiering av metoden

7.1 Repeterbarhet

Skillnaden mellan resultaten från två parallella bestämningar som utförs på samma prov får inte överstiga

— 0,2 % i absoluta tal för råproteinhalter under 20 %,

— 1,0 % av det högre värdet för råproteinhalter på 20–40 %,

— 0,4 % i absoluta tal för råproteinhalter över 40 %.

7.2 Noggrannhet

Utför analysen (uppslutning, destillation och titrering) på 1,5 –2,0 g acetanilid (3.13) i närvaro av 1 g sackaros (3.14). 1 g acetanilid förbrukar 14,80 ml svavelsyra (3.5). Utbytet ska vara minst 99 %.

8. Anmärkningar

8.1 Den använda apparaten kan vara manuell, halvautomatisk eller automatisk. Om apparaten kräver att materialet flyttas mellan uppslutnings- och destillationsstegen måste flyttningen ske utan förlust. Om destillationsapparaturens kolv inte är försedd med en dropptratt ska natriumhydroxiden tillsättas omedelbart innan kolven ansluts till kylaren, varvid vätskan långsamt hälls ned längs kolvens vägg.

8.2 Om det uppslutna materialet tjocknar görs bestämningen om med en större mängd svavelsyra (3.4) än den ovan angivna.

8.3 För produkter med låg kvävehalt kan volymen svavelsyra (3.7) som tillsätts i uppsamlingskolven vid behov minskas till 10–15 ml, varefter vatten fylls på till 25 ml.

8.4 För rutinanalyser kan alternativa metoder för bestämning av råprotein användas, men Kjeldahlmetoden som beskrivs i denna del C är referensmetoden. De resultat som erhålls med den alternativa metoden (t.ex. Dumas) måste för varje matris individuellt visas vara likvärdiga jämfört med referensmetoden. Resultaten kan dock skilja sig något från resultat erhållna med referensmetoden även om likvärdigheten har kontrollerats. Därför måste analysrapporten ange vilken metod som använts för bestämning av råprotein.

D. BESTÄMNING AV UREA

1. Syfte och tillämpningsområde

Med denna metod kan ureahalten i foder bestämmas.

2. Princip

Provet slammas upp i vatten med klarmedel. Suspensionen filtreras. Ureahalten i filtratet bestäms efter tillsats av 4-dimetylaminobensaldehyd (4-DMAB) genom mätning av absorbansen vid våglängden 420 nm.

3. Reagens

3.1 Lösning av 4-dimetylaminobensaldehyd: lös upp 1,6 g 4-DMAB i 100 ml 96 % etanol och tillsätt 10 ml saltsyra (ρ20 = 1,19 g/ml). Denna reagens håller sig i högst två veckor.

3.2 Carrez-lösning I: lös upp 21,9 g zinkacetat, Zn(CH3COO)2 2H2O, och 3 g isättika i vatten. Späd med vatten till 100 ml.

3.3 Carrez-lösning II: lös upp 10,6 g kaliumferrocyanid, K4Fe(CN)6 3H2O, i vatten. Späd med vatten till 100 ml.

3.4 Aktivt kol som inte absorberar urea (ska kontrolleras).

3.5 Urea, 0,1 % lösning (w/v).

4. Utrustning

4.1 Rotationsskakapparat: ca 35–40 varv per minut.

4.2 Provrör: 160 × 16 mm med slipade glasproppar.

4.3 Spektrofotometer.

5. Utförande

5.1 Analys av provet

Väg med en noggrannhet av 1 mg upp 2 g av provet i en 500 ml mätkolv tillsammans med 1 g aktivt kol (3.4). Tillsätt 400 ml vatten och 5 ml Carrez-lösning I (3.2), blanda i ca 30 sekunder och tillsätt 5 ml Carrez-lösning II (3.3). Blanda i 30 minuter på skakapparaten. Späd med vatten till full volym, skaka om och filtrera.

För över 5 ml av de transparenta, färglösa filtraten till provrör med slipade glasproppar, tillsätt 5 ml 4-DMAB-lösning (3.1) och blanda. Ställ provrören i ett vattenbad som håller 20 oC (+/– 4 oC). Mät efter 15 minuter provlösningens absorbans med spektrofotometer vid 420 nm. Jämför med blankprovslösningen av reagensen.

5.2 Kalibreringskurva

För över volymer på 1, 2, 4, 5 och 10 ml av urealösningen (3.5) till 100 ml mätkolvar och späd med vatten till full volym. Avlägsna 5 ml från varje lösning, tillsätt 5 ml 4-DMAB-lösning (3.1) till var och en av dem, homogenisera och mät absorbansen enligt ovan jämfört med en kontrollösning som innehåller 5 ml 4-DMAB-lösning och 5 ml ureafritt vatten. Konstruera kalibreringskurvan.

6. Beräkning av resultat

Bestäm ureamängden i provet med hjälp av kalibreringskurvan.

Uttryck resultatet i procent av provet.

7. Anmärkningar

7.1 Om ureahalten överstiger 3 %, reducera provet till 1 g eller späd den ursprungliga lösningen så att det inte finns mer än 50 mg urea per 500 ml.

7.2 Om ureahalten är låg, öka provmängden så mycket som kan ske med bibehållen transparens och färglöshet hos filtratet.

7.3 Om provet innehåller enkla kväveföreningar som aminosyror ska absorbansen mätas vid 435 nm.

E. BESTÄMNING AV FLYKTIGA KVÄVEFÖRENINGAR

I. GENOM MIKRODIFFUSION

1. Syfte och tillämpningsområde

Med denna metod kan halten flyktiga kväveföreningar, uttryckt som ammoniak, bestämmas i foder.

2. Princip

Provet extraheras med vatten och lösningen klaras och filtreras. De flyktiga kväveföreningarna avskiljs genom mikrodiffusion med kaliumkarbonatlösning, samlas upp i borsyrelösning och titreras med svavelsyra.

3. Reagens

3.1 Triklorättiksyra, lösning 20 % (w/v).

3.2 Indikator: lös 33 mg bromkresolgrönt och 65 mg metylrött i 100 ml etanol 95–96 % (v/v).

3.3 Borsyralösning: lös 10 g borsyra i en 1 000 ml mätkolv med 200 ml etanol 95–96 % (v/v) och 700 ml vatten. Tillsätt 10 ml indikator (3.2). Blanda och justera vid behov lösningens färg till ljusrött genom att tillsätta natriumhydroxidlösning. 1 ml av lösningen fixerar maximalt 300 μg NH3.

3.4 Mättad kaliumkarbonatlösning: lös 100 g kaliumkarbonat i 100 ml kokande vatten. Låt svalna och filtrera.

3.5 Svavelsyra, 0,01 mol/l.

4. Utrustning

4.1 Rotationsskakapparat: ca 35–40 varv per minut.

4.2 Conwayceller av glas eller plast (se diagram).

4.3 Mikrobyretter graderade i 1/100 ml.

5. Utförande

Väg upp 10 g av provet med en noggrannhet av 1 mg och överför det tillsammans med 100 ml vatten till en 200 ml mätkolv. Blanda på skakapparaten i 30 minuter. Tillsätt 50 ml triklorättiksyralösning (3.1), späd med vatten till full volym, skaka kraftigt och filtrera genom ett veckat filtrerpapper.

Tillsätt med pipett 1 ml borsyrelösning (3.3) i den inre delen av Conwaycellen och 1 ml av provfiltratet i cellens krona. Täck delvis med det infettade locket. Droppa snabbt 1 ml mättad kaliumkarbonatlösning (3.4) i kronan och tillslut locket lufttätt. Rotera försiktigt cellen i horisontellt läge så att de två reagensen blandas. Inkubera antingen vid rumstemperatur i minst fyra timmar eller vid 40 oC i en timme.

Titrera med hjälp av en mikrobyrett (4.3) de flyktiga föreningarna i borsyralösningen med svavelsyra (3.5).

Utför ett blankprov med samma metod men utan analysprov.

6. Beräkning av resultat

1 ml 0,01 M H2SO4 motsvarar 0,34 mg ammoniak.

Uttryck resultatet i procent av provet.

Repeterbarhet

Skillnaden mellan resultaten från två parallella bestämningar som utförs på samma prov får inte överstiga

— 10 % av det högre värdet för ammoniakhalter under 1,0 %,

— 0,1 % i absoluta tal för ammoniakhalter på 1,0 % eller högre.

7. Anmärkning

Om provets ammoniakhalt överstiger 0,6 % ska det ursprungliga filtratet spädas ut.

CONWAY CELL

Scale 1/1

II. GENOM DESTILLATION

1. Syfte och tillämpningsområde

Med denna metod kan halten flyktiga kväveföreningar, uttryckt som ammoniak, bestämmas i fiskmjöl som är i det närmaste ureafritt. Den kan endast användas vid ammoniakhalter under 0,25 %.

2. Princip

Provet extraheras med vatten och lösningen klaras och filtreras. De flyktiga kväveföreningarna avskiljs vid kokpunkten genom tillsats av magnesiumoxid och samlas upp i en bestämd mängd svavelsyra. Överskottet av svavelsyra återtitreras med natriumhydroxidlösning.

3. Reagens

3.1 Triklorättiksyra, lösning 20 % (w/v).

3.2 Magnesiumoxid.

3.3 Skumdämpande emulsion (t.ex. silikon).

3.4 Svavelsyra, 0,05 mol/l.

3.5 Natriumhydoxidlösning, 0,1 mol/l.

3.6 Metylröttlösning, 0,3 %, i 95–96 % (v/v) etanol.

4. Utrustning

4.1 Rotationsskakapparat: ca 35–40 varv per minut.

4.2 Destillationsapparat av Kjeldahltyp.

5. Utförande

Väg upp 10 g av provet med en noggrannhet av 1 mg och överför det tillsammans med 100 ml vatten till en 200 ml mätkolv. Blanda på skakapparaten i 30 minuter. Tillsätt 50 ml triklorättiksyralösning (3.1), späd med vatten till full volym, skaka om kraftigt och filtrera genom ett veckat filtrerpapper.

Ta ut klart filtrat i en volym avpassad för den förmodade halten flyktiga kväveföreningar (100 ml brukar vara lämpligt). Späd till 200 ml och tillsätt 2 g magnesiumoxid (3.2) och några droppar skumdämpande emulsion (3.3). Lösningen ska ge basisk reaktion med lackmuspapper; om så inte är fallet tillsätts lite magnesiumoxid (3.2). Fortsätt enligt 5.2 och 5.3 i analysmetoden för bestämning av råproteinhalten (del C i denna bilaga).

Utför ett blankprov med samma metod men utan analysprov.

6. Beräkning av resultat

1 ml 0,05 mol/l H2SO4 motsvarar 1,7 mg ammoniak.

Uttryck resultatet i procent av provet.

Repeterbarhet

Skillnaden mellan resultaten från två parallella bestämningar som utförs på samma prov får inte överstiga 10 % (relativt värde).

F. BESTÄMNING AV AMINOSYROR (UTOM TRYPTOFAN)

1. Syfte och tillämpningsområde

Med denna metod kan fria aminosyror (syntetiska och naturliga) och totalhalten aminosyror (peptidbundna och fria) i foder bestämmas med hjälp av en aminosyraanalysator. Den är tillämplig på följande aminosyror: cyst(e)in, metionin, lysin, treonin, alanin, arginin, asparaginsyra, glutaminsyra, glycin, histidin, isoleucin, leucin, fenylalanin, prolin, serin, tyrosin och valin.

Metoden skiljer inte mellan aminosyrornas salter och kan inte skilja mellan aminosyrornas D- och L-former. Den är inte användbar för bestämning av tryptofan eller hydroxyanaloger av aminosyror.

2. Princip

2.1 Fria aminosyror

De fria aminosyrorna extraheras med utspädd saltsyra. Samextraherade kvävehaltiga makromolekyler fälls ut med sulfosalicylsyra och avlägsnas genom filtrering. Den filtrerade lösningens pH justeras till 2,20 . Aminosyrorna separeras genom jonbyteskromatografi och bestäms fotometriskt vid 570 nm genom reaktion med ninhydrin.

2.2 Totalhalt aminosyror

Valet av förfarande beror på vilka aminosyror som ska bestämmas. Cyst(e)in och metionin måste oxideras till cysteinsyra respektive metioninsulfon före hydrolys. Tyrosin måste bestämmas i hydrolysat av ooxiderade prov. Alla övriga aminosyror som räknas upp i punkt 1 kan bestämmas i antingen det oxiderade eller ooxiderade provet.

Oxidation utförs vid 0 oC med en blandning av permyrsyra och fenol. Överskott av oxidationsreagens avlägsnas genom tillsats av dinatriumdisulfit. Det oxiderade eller ooxiderade provet hydrolyseras med saltsyra (3.20) i 23 timmar. Hydrolysatet justeras till pH 2,20 . Aminosyrorna separeras genom jonbyteskromatografi och bestäms fotometriskt vid 570 nm (440 nm för prolin) genom reaktion med ninhydrin.

3. Reagens

Dubbeldestillerat vatten eller vatten av likvärdig kvalitet ska användas (konduktivitet < 10 μS/cm).

3.1 Väteperoxid, w = 30 % (w/w).

3.2 Myrsyra, w = 98–100 % (w/w).

3.3 Fenol.

3.4 Dinatriumdisulfit

3.5 Natriumhydroxid.

3.6 5-sulfosalicylsyradihydrat.

3.7 Saltsyra, densitet ca 1,18 g/ml.

3.8 Trinatriumcitratdihydrat.

3.9 2,2 '-tiodietanol (tiodiglykol).

3.10 Natriumklorid.

3.11 Ninhydrin.

3.12 Petroleumeter, kokpunktsintervall 40–60 oC.

3.13 Norleucin eller annan förening lämplig som intern standard.

3.14 Kvävgas (< 10 ppm syrgas).

3.15 1-oktanol.

3.16 Aminosyror.

3.16.1 Referenssubstanser enligt listan i punkt 1. Rena substanser, fria från kristallvatten. Torka i vakuum över P2O5 eller H2SO4 i 1 vecka före användning.

3.16.2 Cysteinsyra.

3.16.3 Metioninsulfon.

3.17 Natriumhydroxidlösning, c = 7,5 mol/l:

Lös 300 g NaOH (3.5) i vatten och späd till 1 liter.

3.18 Natriumhydroxidlösning, c = 1 mol/l:

Lös 40 g NaOH (3.5) i vatten och späd till 1 liter.

3.19 Myrsyra-fenollösning:

Blanda 889 g myrsyra (3.2) med 111 g vatten och tillsätt 4,73 g fenol (3.3).

3.20 Hydrolysblandning, c = 6 mol HCl/l innehållande 1 g fenol/l:

Tillsätt 1 g fenol (3.3) till 492 ml HCl (3.7) och späd med vatten till 1 liter.

3.21 Extraktionsblandning, c = 0,1 mol HCl/l innehållande 2 % tiodiglykol: Ta 8,2 ml HCl (3.7), späd med ca 900 ml vatten, tillsätt 20 ml tiodiglykol (3.9) och späd med vatten till 1 liter (blanda inte 3.7 och 3.9 direkt).

3.22 5-sulfosalicylsyra, ß = 6 %:

Lös 60 g 5-sulfosalicylsyra (3.6) i vatten och späd till 1 liter.

3.23 Oxidationsblandning (permyrsyra-fenol):

Blanda 0,5 ml väteperoxid (3.1) med 4,5 ml myrsyra-fenollösning (3.19) i en liten bägare. Inkubera i 20–30 oC i 1 timme för att permyrsyra ska bildas, kyl sedan i isvattenbad (15 min.) före tillsats till provet.

Varning: Undvik hudkontakt, använd skyddskläder.

3.24 Citratbuffert, c = 0,2 mol Na+/l, pH 2,20 :

Lös 19,61 g natriumcitrat (3.8), 5 ml tiodiglykol (3.9), 1 g fenol (3.3) och 16,50 ml HCl (3.7) i ca 800 ml vatten. Justera pH till 2,20 . Späd med vatten till 1 liter.

3.25 Elueringsbuffertar som lämpar sig för den analysator som ska användas (4.9).

3.26 Ninhydrinreagens som lämpar sig för den analysator som ska användas (4.9).

3.27 Standardlösningar av aminosyror. Dessa lösningar ska lagras vid en temperatur under 5 oC.

3.27.1 Stamlösningar av aminosyror (3.16.1).

c = 2,5 μmol/ml av var och en i saltsyra.

Finns att köpa i handeln.

3.27.2 Stamlösning av cysteinsyra och metioninsulfon, c = 1,25 μmol/ml.

Lös 0,2115 g cysteinsyra (3.16.2) och 0,2265 g metioninsulfon (3.16.3) i citratbuffert (3.24) i en 1 000 ml mätkolv och späd till märket med citratbuffert. Kan lagras vid en temperatur under 5 oC i högst tolv månader. Denna lösning används ej om stamlösningen (3.27.1) innehåller cysteinsyra och metioninsulfon.

3.27.3 Stamlösning av intern standard, t.ex. norleucin, c = 20 μmol/ml.

Lös 0,6560 g norleucin (3.13) i citratbuffert (3.24) i en mätkolv och späd till 250 ml med citratbuffert. Kan lagras vid en temperatur under 5 oC i högst 6 månader.

3.27.4 Kalibreringslösning av standardaminosyror för användning med hydrolysater, c = 5 nmol/50 μl för cysteinsyra och metioninsulfon och c = 10 nmol/50 μl för övriga aminosyror. Lös 2,2 g natriumklorid (3.10) i en 100 ml bägare med 30 ml citratbuffert (3.24). Tillsätt 4,00 ml stamlösning av aminosyror (3.27.1), 4,00 ml stamlösning av cysteinsyra och metioninsulfon (3.27.2) och 0,50 ml stamlösning av intern standard (3.27.3) om sådan används. Justera pH till 2,20 med natriumhydroxid (3.18).

Överför kvantitativt till en 50 ml mätkolv, späd till märket med citratbuffert (3.24) och blanda.

Kan lagras vid en temperatur under 5 oC i högst 3 månader.

Se även punkt 9.1.

3.27.5 Kalibreringslösning av standardaminosyror för användning med hydrolysater beredda enligt 5.3.3.1 och för användning med extrakt (5.2). Kalibreringslösningen bereds enligt 3.27.4 men natriumkloriden utelämnas.

Kan lagras vid en temperatur under 5 oC i högst 3 månader.

4. Utrustning

4.1 100 eller 250 ml rundkolv med återloppskylare.

4.2 100 ml borosilikatglasflaska med skruvkork försedd med gummi/teflontätning (t.ex. Duran, Schott) för användning i ugn.

4.3 Ugn med fläktventilation och temperaturreglering med noggrannhet bättre än ± 2 oC.

4.4 pH-meter (tre decimalers noggrannhet).

4.5 Membranfilter (0,22 μm).

4.6 Centrifug.

4.7 Rotationsindunstare.

4.8 Mekanisk skakapparat eller magnetomrörare.

4.9 Aminosyraanlysator eller HPLC-utrustning med jonbytarkolonn, anordning för ninhydrin, derivatisering efter kolonnpassagen och fotometrisk detektor.

Kolonnen fylls med sulfonerad polystyrenharts som kan separera aminosyrorna från varandra och från andra ninhydrinpositiva material. Flödet i buffert- och ninhydrinledningarna ombesörjs av pumpar vars flödesstabilitet är ± 0,5 % under en period som täcker både standardkalibreringskörningen och analysen av provet.

Med vissa aminosyraanalysatorer kan man använda hydrolysmetoder där hydrolysatet har en natriumkoncentration på c = 0,8 mol/l och innehåller all överskottsmyrsyra från oxidationssteget. Andra ger inte en tillfredsställande separation av vissa aminosyror i hydrolysat med ett överskott av myrsyra och/eller hög natriumkoncentration. I detta fall reduceras syravolymen genom indunstning till ca 5 ml efter hydrolysen och före pH-justeringen. Indunstningen ska utföras i vakuum vid högst 40 oC.

5. Utförande

5.1 Provberedning

Provet mals så att det kan passera genom en 0,5 mm sikt. Prov med hög vattenhalt ska antingen lufttorkas vid en temperatur på högst 50 oC eller frystorkas före malningen. Prov med hög fetthalt ska extraheras med petroleumeter (3.12) före malningen.

5.2 Bestämning av fria aminosyror i foder och förblandningar

Väg med 0,2 mg noggrannhet upp en lämplig mängd (1–5 g) av det beredda provet (5.1) i en E-kolv och tillsätt 100,0 ml av extraktionsblandningen (3.21). Blanda i 60 minuter med en mekanisk skakapparat eller magnetomrörare (4.8). Låt sedimentera och pipettera över 10,0 ml av supernatanten till en 100 ml bägare.

Tillsätt 5,0 ml sulfosalicylsyralösning (3.22) under omrörning och fortsätt röra om med hjälp av en magnetomrörare i fem minuter. Filtrera eller centrifugera supernatanten för att avlägsna eventuella fällningar. Överför 10,0 ml av den kvarvarande lösningen till en 100 ml bägare och justera pH till 2,20 med natriumhydroxidlösning (3.18), överför till en mätkolv av lämplig volym med citratbuffert (3.24) och späd till märket med buffertlösningen (3.24).

Om en intern standard används, tillsätt 1,00 ml av denna (3.27.3) för varje 100 ml färdig lösning och späd till märket med buffertlösningen (3.24).

Gå vidare till kromatografin enligt 5.4.

Om extrakten inte kromatograferas samma dag måste de förvaras vid en temperatur under 5 oC.

5.3 Bestämning av totalhalt aminosyror.

5.3.1 Oxidation

Väg med 0,2 mg noggrannhet upp 0,1 –1 g av det beredda provet (5.1) i

— en 100 ml rundkolv (4.1) för öppen hydrolys (5.3.2.3) eller,

— en 250 ml rundkolv (4.1) om en låg natriumkoncentration är nödvändig (5.3.3.1) eller,

— en 100 ml flaska med skruvkork (4.2) för sluten hydrolys (5.3.2.4).

Det invägda provet ska innehålla ca 10 mg kväve, och vattenhalten får inte överstiga 100 mg.

Ställ kolven/flaskan i ett isvattenbad och kyl till 0 oC, tillsätt 5 ml oxidationsblandning (3.23) och blanda med hjälp av en glasspatel med böjd spets. Tillslut kolven/flaskan innehållande spateln med en lufttät folie, ställ isvattenbadet innehållande den tillslutna behållaren i ett kylskåp vid 0 oC och låt stå i 16 timmar. Avlägsna provet ur kylskåpet efter 16 timmar och avlägsna överskottet av oxidationsreagens genom tillsats av 0,84 g dinatriumdisulfit (3.4).

Fortsätt till 5.3.2.1.

5.3.2 Hydrolys

5.3.2.1 Hydrolys av oxiderade prov

Tillsätt 25 ml av hydrolysblandningen (3.20) till det oxiderade prov som beretts enligt 5.3.1. Skölj ned eventuella provrester som fastnat på kärlets sidor och på spateln.

Fortsätt enligt 5.3.2.3 eller 5.3.2.4, beroende på vilken hydrolysmetod som används.

5.3.2.2 Hydrolys av ooxiderade prov

Väg med 0,2 mg noggrannhet upp 0,1 –1 g av det beredda provet (5.1) i antingen en 100 ml eller 250 ml rundkolv (4.1) eller en 100 ml flaska med skruvkork (4.2). Det invägda provet ska innehålla ca 10 mg kväve. Tillsätt försiktigt 25 ml av hydrolysblandningen (3.20) och blanda med provet. Fortsätt enligt antingen 5.3.2.3 eller 5.3.2.4.

5.3.2.3 Öppen hydrolys

Tillsätt tre glaspärlor till blandningen i kolven (beredd enligt 5.3.2.1 eller 5.3.2.2) och återloppskoka i 23 timmar. Efter fullbordad hydrolys, skölj kylaren med 5 ml citratbuffert (3.24). Koppla bort kolven och kyl den i ett isvattenbad.

Fortsätt enligt 5.3.3.

5.3.2.4 Sluten hydrolys

Sätt in flaskan med blandningen, beredd enligt 5.3.2.1 eller 5.3.2.2, i en ugn (4.3) vid 110 oC. För att förhindra tryckökning (på grund av gasutveckling) och explosion bör skruvkorken sättas löst på flaskan under den första timmen. Tillslut inte flaskan med skruvkorken. Efter 1 timme dras skruvkorken åt och flaskan med får stå i ugnen (4.3) i 23 timmar. Efter fullbordad hydrolys, ta ut flaskan ur ugnen, öppna försiktigt skruvkorken och ställ flaskan i ett isvattenbad. Låt svalna.

Beroende på metod för pH-justering (5.3.3), överför flaskans innehåll kvantitativt till en 250 ml bägare eller till en 250 ml rundkolv med citratbuffert (3.24).

Fortsätt enligt 5.3.3.

5.3.3 Justering av pH

Beroende på aminosyraanalysatorns (4.9) natriumtolerans, fortsätt enligt 5.3.3.1 eller 5.3.3.2 för pH-justeringen.

5.3.3.1 Kromatografiska system (4.9) som kräver en låg natriumkoncentration

Det är tillrådligt att använda en stamlösning av intern standard (3.27.3) om aminosyraanalysatorn kräver en låg natriumkoncentration (om syravolymen måste reduceras).

Tillsätt i detta fall 2,00 ml stamlösning av intern standard (3.27.3) till hydrolysatet före indunstningen.

Tillsätt 2 droppar 1-oktanol (3.15) till det hydrolysat som erhållits enligt 5.3.2.3 eller 5.3.2.4.

Låt provet indunsta i rotationsindunstare (4.7) till 5–10 ml i vakuum vid 40 oC. Om volymen av någon anledning reduceras till mindre än 5 ml måste hydrolysatet kastas och analysen göras om.

Justera pH till 2,20 med natriumhydroxidlösning (3.18) och fortsätt till 5.3.4.

5.3.3.2 Alla övriga aminosyraanalysatorer (4.9)

Ta det hydrolysat som erhölls enligt 5.3.2.3 eller 5.3.2.4 och neutralisera det delvis genom att försiktigt och under omrörning tillsätta 17 ml natriumhydroxidlösning (3.17), och se till att temperaturen hålls under 40 oC.

Justera pH till 2,20 vid rumstemperatur med natriumhydroxidlösning (först 3.17 och sedan 3.18). Fortsätt till 5.3.4.

5.3.4 Provlösning för kromatografi

Överför kvantitativt det pH-justerade hydrolysatet (5.3.3.1 eller 5.3.3.2) med citratbuffert (3.24) till en 200 ml mätkolv och späd till märket med buffert (3.24).

Om en intern standard inte redan använts, tillsätt 2,00 ml av denna (3.27.3) och späd till märket med citratbuffert (3.24). Blanda omsorgsfullt.

Gå vidare till kromatografin enligt 5.4.

Om provlösningarna inte kromatograferas samma dag måste de förvaras vid en temperatur under 5 oC.

5.4 Kromatografi

Före kromatografin, låt extraktet (5.2) eller hydrolysatet (5.3.4) anta rumstemperatur. Skaka blandningen och filtrera en lämplig mängd genom ett 0,22 μm membranfilter (4.5). Den klara lösning som erhålls får genomgå jonbyteskromatografi i en aminosyraanalysator (4.9).

Injektionen kan utföras antingen manuellt eller automatiskt. Det är viktigt att samma mängd lösning ± 0,5 % alltid tillsätts kolonnen för analys av standardlösning och prov, utom när en intern standard används, och att kvoten natrium/aminosyra i standard- och provlösning är så lika som möjligt.

Hur ofta kalibreringsprov behöver köras beror i allmänhet på ninhydrinreagensens stabilitet och typen av analyssystem. Standarden eller provet späds med citratbuffert (3.24) för att ge en topparea för standarden på 30–200 % av provets aminosyratopparea.

Kromatografin av aminosyror varierar något beroende på typen av analysator och harts. Det valda systemet måste kunna separera aminosyrorna från varandra och från ninhydrinpositiva material. Kromatografisystemet bör i driftsområdet ge en linjär respons på förändringar i de aminsyramängder som tillförs kolonnen.

Under kromatografisteget gäller de botten/toppkvoter som anges nedan när en ekvimolär lösning (av de aminosyror som mäts) analyseras. Denna ekvimolära lösning måste innehålla minst 30 % av den maximala mängd av varje aminosyra som med noggrannhet kan bestämmas med analyssystemet (4.9).

För separering av treonin-serin bör botten/toppkvoten för den lägre av de två överlappande aminosyrorna på kromatogrammet inte överstiga 2:10. (Om endast cyst(e)in, metionin, treonin och lysin bestäms kommer otillräcklig separation från angränsande toppar att påverka bestämningen). För alla andra aminosyror måste separationen vara bättre än 1:10.

Systemet måste kunna separera lysin från ”lysinartefakter” och ornitin.

6. Beräkning av resultat

Arean för provets och standardens toppar mäts för varje enskild aminosyra, och mängden (X) i gram aminosyra per kg prov beräknas med formeln

Om intern standard används, multiplicera med

A = topparea, hydrolysat eller extrakt

B = topparea, kalibreringsstandardlösning

C = topparea, intern standard i hydrolysat eller extrakt

D = topparea, intern standard, kalibreringsstandardlösning

M = molvikt för den aminosyra som bestäms

c = standardlösningens koncentration i μmol/ml

m = provets vikt (g) (korrigerad till ursprungsvikten om provet torkats eller avfettats)

V = ml totalt hydrolysat (5.3.4) eller ml beräknad total spädningsvolym för extraktet (6.1).

Cystin och cystein bestäms båda som cysteinsyra i hydrolysat av oxiderat prov, men beräknas som cystin (C6H12N2O4S2, molvikt 240,30 g/mol) med hjälp av molvikten 120,15 g/mol (= 0,5 × 240,30 g/mol).

Metionin bestäms som metioninsulfon i hydrolysat av oxiderat prov, men beräknas som metionin med hjälp av molvikten för metionin: 149,21 g/mol.

Tillsatt fritt metionin bestäms efter extraktion som metionin, för beräkningen används samma molvikt.

6.1. Den totala spädningsvolymen för extrakten (F) för bestämning av fria aminosyror (5.2) beräknas med formeln

V = Det färdiga extraktets volym

7. Utvärderingen av metoden

Metoden testades i en internationell provningsjämförelse 1990 med fyra olika fodertyper (blandat grisfoder, foderblandning för slaktkycklingar, proteinkoncentrat, förblandning). Resultaten, efter eliminering av extremvärden, i form av medelvärden och standardavvikelser redovisas i nedanstående tabeller.







Medelvärden i g/kg Referensmaterial Aminosyra Treonin Cyst(e)in Metionin Lysin Grisfoder 6,94 n = 15 3,01 n = 17 3,27 n = 17 9,55 n = 13 Foderblandning för slaktkycklingar 9,31 n = 16 3,92 n = 18 5,08 n = 18 13,93 n = 16 Proteinkoncentrat 22,32 n = 16 5,06 n = 17 12,01 n = 17 47,74 n = 15 Förblandning 58,42 n= 16 — 90,21 n = 16 98,03 n = 16 n = Antal deltagande laboratorier.

7.1 Repeterbarhet

Repeterbarheten uttryckt som ”standardavvikelse inom laboratoriet” i ovannämnda provningsjämförelse redovisas i nedanstående tabell.







Standardavvikelse inom laboratoriet (Sr) i g/kg Referensmaterial Aminosyra Treonin Cyst(e)in Metionin Lysin Grisfoder 0,13 n = 15 0,10 n = 17 0,11 n = 17 0,26 n = 13 Foderblandning för slaktkycklingar 0,20 n = 16 0,11 n = 18 0,16 n = 18 0,28 n = 16 Proteinkoncentrat 0,48 n = 16 0,13 n = 17 0,27 n = 17 0,99 n = 15 Förblandning 1,30 n= 16 — 2,19 n = 16 2,06 n = 16 n = Antal deltagande laboratorier.







Variationskoefficient (%) för standardavvikelse inom laboratoriet (Sr) Referensmaterial Aminosyra Treonin Cyst(e)in Metionin Lysin Grisfoder 1,9 n = 15 3,3 n = 17 3,4 n = 17 2,8 n = 13 Foderblandning för slaktkycklingar 2,1 n = 16 2,8 n = 18 3,1 n = 18 2,1 n = 16 Proteinkoncentrat 2,7 n = 16 2,6 n = 17 2,2 n = 17 2,4 n = 15 Förblandning 2,2 n = 16 — 2,4 n = 16 2,1 n = 16 n = Antal deltagande laboratorier.

7.2 Reproducerbarhet

Standardavvikelsen mellan laboratorier i ovannämnda provningsjämförelse redovisas i nedanstående tabell.







Standardavvikelse mellan laboratorier (SR) i g/kg Referensmaterial Aminosyra Treonin Cyst(e)in Metionin Lysin Grisfoder 0,28 n = 15 0,30 n = 17 0,23 n = 17 0,30 n = 13 Foderblandning för slaktkycklingar 0,48 n = 16 0,34 n = 18 0,55 n = 18 0,75 n = 16 Proteinkoncentrat 0,85 n = 16 0,62 n = 17 1,57 n = 17 1,24 n = 15 Förblandning 2,49 n = 16 — 6,20 n = 16 6,62 n = 16 n = Antal deltagande laboratorier.







Variationskoefficient (%) för standardavvikelse mellan laboratorier (SR) Referensmaterial Aminosyra Treonin Cyst(e)in Metionin Lysin Grisfoder 4,1 n = 15 9,9 n = 17 7,0 n = 17 3,2 n = 13 Foderblandning för slaktkycklingar 5,2 n = 16 8,8 n = 18 10,9 n = 18 5,4 n = 16 Proteinkoncentrat 3,8 n = 16 12,3 n = 17 13,0 n = 17 3,0 n = 15 Förblandning 4,3 n = 16 — 6,9 n = 16 6,7 n = 16 n = Antal deltagande laboratorier.

8. Användning av referensmaterial

Korrekt tillämpning av metoden ska verifieras genom analys av certifierade referensmaterial om sådana finns tillgängliga. Kalibrering med godkända kalibreringslösningar för aminosyror rekommenderas.

9. Anmärkningar

9.1 På grund av skillnaderna mellan aminosyraanalysatorer bör de slutliga koncentrationerna hos kalibreringslösningarna för standardaminosyror (se 3.27.4 och 3.27.5) och hos hydrolysatet (se 5.3.4) användas som riktlinje.

Det intervall där sambandet mellan det verkliga värdet och det med apparaten uppmätta värdet är linjärt, måste kontrolleras för alla aminosyror.

Standardlösningen späds med citratbuffert så att man får toppar i mitten av intervallet.

9.2 I de fall HPLC används för att analysera hydrolysater måste försöksbetingelserna optimeras i enlighet med tillverkarens rekommendationer.

9.3 Om denna metod tillämpas på foder som innehåller mer än 1 % klorid (kraftfoder, mineralfoder eller tillskottsfoder) kan den uppmätta halten av metionin bli för låg. För att undvika detta måste provet behandlas på särskilt sätt.

G. BESTÄMNING AV TRYPTOFAN

1. Syfte och tillämpningsområde

Med denna metod kan totalhalten tryptofan och halten fritt tryptofan bestämmas i foder. Ingen åtskillnad görs mellan D- och L-formerna.

2. Princip

För bestämning av totalhalten tryptofan hydrolyseras provet i alkalisk miljö med mättad bariumhydroxidlösning och upphettas till 110 oC i 20 timmar. Efter hydrolysen tillsätts en intern standard.

För bestämning av halten fritt tryptofan extraheras provet i lätt sur miljö i närvaro av den interna standarden.

Halten av tryptofan och intern standard i hydrolysatet eller extraktet bestäms med HPLC med fluorescensdetektion.

3. Reagens

3.1 Dubbeldestillerat vatten eller vatten av likvärdig kvalitet ska användas (konduktivitet < 10 μS/cm).

3.2 Referenssubstans: tryptofan (renhet/halt ≥ 99 %) torkat under vakuum över fosforpentoxid.

3.3 Intern standard: α-metyltryptofan (renhet/halt ≥ 99 %) torkat under vakuum över fosforpentoxid.

3.4 Bariumhydroxidoktahydrat (undvik att exponera Ba(OH)2·8 H2O för större mängder luft, eftersom det då kan bildas BaCO3 som stör bestämningen) (jfr punkt 9.3).

3.5 Natriumhydroxid.

3.6 Ortofosforsyra, w = 85 % (w/w).

3.7 Saltsyra, ρ20 = 1,19 g/ml.

3.8 Metanol, HPLC-kvalitet.

3.9 Petroleumeter, kokpunktsintervall 40–60 oC.

3.10 Natriumhydroxidlösning, c = 1 mol/l:

Lös 40,0 g NaOH (3.5) i vatten och späd till 1 liter med vatten (3.1).

3.11 Saltsyra, c = 6 mol/l:

Späd 492 ml HCl (3.7) med vatten till slutvolymen 1 liter.

3.12 Saltsyra, c = 1 mol/l:

Späd 82 ml HCl (3.7) med vatten till slutvolymen 1 liter.

3.13 Saltsyra, c = 0,1 mol/l:

Späd 8,2 ml HCl (3.7) med vatten till slutvolymen 1 liter.

3.14 Ortofosforsyra, c = 0,5 mol/l:

Späd 34 ml ortofosforsyra (3.6) med vatten (3.1) till slutvolymen 1 liter.

3.15 Koncentrerad tryptofanlösning (3.2), c = 2,50 μmol/ml:

Lös 0,2553 g tryptofan (3.2) i saltsyra (3.13) i en 500 ml mätkolv och späd till märket med saltsyra (3.13). Lösningen kan lagras vid - 18 oC i högst 4 veckor.

3.16 Koncentrerad lösning av intern standard, c = 2,50 μmol/ml:

Lös 0,2728 g α-metyltryptofan (3.3) i saltsyra (3.13) i en 500 ml mätkolv och späd till märket med saltsyra (3.13). Lösningen kan lagras vid - 18 oC i högst 4 veckor.

3.17 Standardkalibreringslösning av tryptofan och intern standard:

Tag 2,00 ml koncentrerad tryptofanlösning (3.15) och 2,00 ml koncentrerad lösning av intern standard (α-metyltryptofan) (3.16). Späd med vatten (3.1) och metanol (3.8) till ungefär samma volym och metanolkoncentration (10–30 %) som det färdiga hydrolysatet.

Denna lösning ska vara nyberedd.

Den ska skyddas från direkt solljus under beredningen.

3.18 Ättiksyra.

3.19 1,1,1-triklor-2-metyl-2-propanol.

3.20 Etanolamin, w > 98 % (w/w).

3.21 Lösning av 1 gram 1,1,1-triklor-2-metyl-2-propanol (3.19) i 100 ml metanol (3.8).

3.22 Mobil fas för HPLC: 3,00 g ättiksyra (3.18) + 900 ml vatten (3.1) + 50,0 ml lösning (3.21) av 1,1,1-triklor-2-metyl-2-propanol (3.19) i metanol (3.8) (1 g/100 ml). Justera pH till 5,00 med etanolamin (3.20). Späd till 1 000 ml med vatten (3.1).

4. Utrustning

4.1 HPLC-utrustning med en spektrofluorometrisk detektor.

4.2 HPLC-kolonn, 125 × 4 mm, C18, 3 μm packning, eller motsvarande.

4.3 pH-meter.

4.4 Polypropylenflaska, 125 ml, med vid hals och skruvkork.

4.5 Membranfilter, 0,45 μm.

4.6 Autoklav, 110 (± 2) oC, 1,4 (±0,1 ) bar.

4.7 Mekanisk skakapparat eller magnetomrörare.

4.8 Vortexblandare.

5. Utförande

5.1 Provberedning

Provet mals så att det kan passera genom en 0,5 mm sikt. Prov med hög vattenhalt ska antingen lufttorkas vid en temperatur på högst 50 oC eller frystorkas före malningen. Prov med hög fetthalt ska extraheras med petroleumeter (3.9) före malning.

5.2 Bestämning av fritt tryptofan (extrakt)

Väg med en noggrannhet av 1 mg upp en lämplig mängd (1–5 g) av det beredda provet (5.1) i en E-kolv. Tillsätt 100,0 ml saltsyra (3.13) och 5,00 ml koncentrerad lösning av intern standard (3.16). Skaka eller blanda i 60 minuter med en mekanisk skakapparat eller magnetomrörare (4.7). Låt sedimentera och pipettera sedan över 10,0 ml av supernatanten till en bägare. Tillsätt 5 ml ortofosforsyra (3.14). Justera pH till 3 med natriumhydroxid (3.10). Tillsätt så mycket metanol (3.8) att koncentrationen blir 10–30 % i slutvolymen. Överför till en mätkolv av lämplig volym och späd med vatten till den volym som behövs för kromatografi (ungefär samma volym som standardkalibreringslösningen [3.17]).

Filtrera några ml av lösningen genom ett 0,45 μm membranfilter (4.5) före injektion i HPLC-kolonnen. Gå vidare till kromatografin enligt 5.4.

Skydda standardlösning och extrakt från direkt solljus. Om extrakten inte kan analyseras samma dag kan de lagras vid 5 oC i högst 3 dagar.

5.3 Bestämning av totalhalt tryptofan (hydrolysat)

Väg med en noggrannhet av 0,2 mg upp 0,1 –1 g av det beredda provet (5.1) i en polypropylenflaska (4.4). Det invägda provet ska innehålla ca 10 mg kväve. Tillsätt 8,4 g bariumhydroxidoktahydrat (3.4) och 10 ml vatten. Blanda på en vortexblandare (4.8) eller med magnetomrörare (4.7). Lämna kvar den teflonbelagda magneten i blandningen. Skölj kärlets väggar med 4 ml vatten. Sätt på skruvkorken och skruva åt den löst. Sätt kärlet i en autoklav (4.6) med kokande vatten och låt ånga i 30–60 minuter. Stäng autoklaven och autoklavera vid 110 (± 2) oC i 20 timmar.

Sänk temperaturen till strax under 100 oC innan autoklaven öppnas. Tillsätt 30 ml rumstempererat vatten till den varma blandningen för att undvika kristallisering av Ba(OH)2·8 H2O. Skaka eller rör försiktigt. Tillsätt 2,00 ml koncentrerad lösning av intern standard (α-metyltryptofan) (3.16). Kyl kärlet i isvattenbad i 15 minuter.

Tillsätt 5 ml ortofosforsyra (3.14). Låt kärlet vara kvar i kylbadet och neutralisera lösningen med saltsyra (3.11) under omrörning. Justera pH till 3,0 med saltsyra (3.12). Tillsätt så mycket metanol att koncentrationen blir 10–30 % i slutvolymen. Överför till en mätkolv av lämplig volym och späd med vatten till den volym som behövs för kromatografi (t.ex. 100 ml). Tillsatsen av metanol bör göras utan att någon fällning bildas.

Filtrera några ml av lösningen genom ett 0,45 μm membranfilter (4.5) före injektion i HPLC-kolonnen. Gå vidare till kromatografin enligt 5.4.

Skydda standardlösning och hydrolysat mot direkt solljus. Om hydrolysaten inte kan analyseras samma dag kan de lagras vid 5 oC i högst tre dagar.

5.4 HPLC-bestämning

Följande betingelser för isokratisk eluering anges som vägledning. Andra betingelser kan väljas om de ger likvärdiga resultat (se även 9.1 och 9.2).







HPLC kolonn (4.2): 125 × 4 mm, C18, 3 μm packning eller motsvarande Kolonntemperatur: Rumstemperatur Mobil fas (3.22): 3,00 g ättiksyra (3.18) + 900 ml vatten (3.1) + 50,0 ml lösning (3.21) av 1,1,1-triklor-2-metyl-2-propanol (3.19) i metanol (3.8) (1 g/100 ml). Justera pH till 5,00 med etanolamin (3.20). Späd till 1 000 ml med vatten (3.1) Flödeshastighet: 1 ml/min Total körningstid: ca 34 minuter Detektionsvåglängd: excitation: 280 nm, emission: 356 nm. Injektionsvolym: 20 μl

6. Beräkning av resultat

Mängden tryptofan (X) i gram per 100 g prov beräknas med formeln

A = topparea för intern standard, kalibreringsstandardlösning (3.17)

B = topparea för tryptofan, extrakt (5.2) eller hydrolysat (5.3)

V1 = volym i ml (2 ml) av koncentrerad tryptofanlösning (3.15) som satts till kalibreringslösningen (3.17)

c = koncentration i μmol/ml (= 2,50 ) av koncentrerad tryptofanlösning (3.15) som satts till kalibreringslösningen (3.17)

V2 = volym i ml av koncentrerad lösning av intern standard (3.16) som satts till vid extraktionen (5.2) (= 5,00 ml) eller till hydrolysatet (5.3) (= 2,00 ml)

C = topparea för intern standard, extrakt (5.2) eller hydrolysat (5.3)

D = topparea för tryptofan, kalibreringsstandardlösning (3.17)

V3 = volym i ml (2,00 ml) av koncentrerad lösning av intern standard (3.16) som satts till kalibreringsstandardlösningen (3.17)

m = provets vikt i gram (korrigerad till den ursprungliga vikten om provet har torkats och/eller avfettats)

M = molvikt för tryptofan (= 204,23 g/mol).

7. Repeterbarhet

Skillnaden mellan resultaten från två parallella bestämningar som utförs på samma prov får inte överstiga 10 % av det högre värdet.

8. Resultat av en provningsjämförelse

I en provningsjämförelse inom EU (fjärde jämförelsen) analyserades tre prov av upp till tolv laboratorier för att hydrolysmetoden skulle kunna certifieras. Varje prov analyserades fem gånger. Resultaten redovisas i nedanstående tabell.







Prov 1 Grisfoder Prov 2 Grisfoder med tillsats av L-tryptofan Prov 3 Kraftfoder för grisar L 12 12 12 n 50 55 50 Medelvärde [g/kg] 2,42 3,40 4,22 sr [g/kg] 0,05 0,05 0,08 r [g/kg] 0,14 0,14 0,22 CVr [ %] 1,9 1,6 1,9 SR [g/kg] 0,15 0,20 0,09 R [g/kg] 0,42 0,56 0,25 CVR [ %] 6,3 6,0 2,2

L = antal laboratorier som lämnade in resultat

n = antal återstående enskilda resultat efter eliminering av extremvärden (enligt Cochran-Dixons extremvärdestest)

sr = standardavvikelse för repeterbarhet

SR = standardavvikelse för reproducerbarhet

r = repeterbarhet

R = reproducerbarhet

CVr = variationskoefficient för repeterbarhet, %

CVR = variationskoefficient för reproducerbarhet, %

I en annan provningsjämförelse inom EU (tredje jämförelsen) analyserades två prov av upp till tretton laboratorier för certifiering av extraktionsmetoden för fritt tryptofan. Varje prov analyserades fem gånger. Resultaten redovisas i nedanstående tabell.







Prov 4 Vete- och sojablandning Prov 5 Vete- och sojablandning (= prov 4) med tillsats av tryptofan (0,457 g/kg) L 12 12 n 55 60 Medelvärde [g/kg] 0,391 0,931 sr [g/kg] 0,005 0,012 r [g/kg] 0,014 0,034 CVr [ %] 1,34 1,34 SR [g/kg] 0,018 0,048 R [g/kg] 0,050 0,134 CVR [ %] 4,71 5,11

L = antal laboratorier som lämnade in resultat

n = antalet återstående enskilda resultat efter eliminering av extremvärden (enligt Cochran-Dixons extremvärdestest)

sr = standardavvikelse för repeterbarhet

SR = standardavvikelse för reproducerbarhet

r = repeterbarhet

R = reproducerbarhet

CVr = variationskoefficient för repeterbarhet, %

CVR = variationskoefficient för reproducerbarhet, %

I ytterligare en provningsjämförelse inom EU analyserades fyra prov av upp till sju laboratorier för certifiering av metoden för tryptofanhydrolys. Resultaten redovisas i nedanstående tabell. Varje prov analyserades fem gånger.







Prov 1 Blandat grisfoder (CRM 117) Prov 2 Fiskmjöl med låg fetthalt (CRM 118) Prov 3 Sojamjöl (CRM 119) Prov 4 Skummjölkspulver (CRM 120) L 7 7 7 7 n 25 30 30 30 Medelvärde [g/kg] 2,064 8,801 6,882 5,236 sr [g/kg] 0,021 0,101 0,089 0,040 r [g/kg] 0,059 0,283 0,249 0,112 CVr [ %] 1,04 1,15 1,30 0,76 SR [g/kg] 0,031 0,413 0,283 0,221 R [g/kg] 0,087 1,156 0,792 0,619 CVR [ %] 1,48 4,69 4,11 4,22

L = antal laboratorier som lämnade in resultat

n = antalet återstående enskilda resultat efter eliminering av extremvärden (enligt Cochran-Dixons extremvärdestest)

sr = standardavvikelse för repeterbarhet

SR = standardavvikelse för reproducerbarhet

r = repeterbarhet

R = reproducerbarhet

CVr = variationskoefficient för repeterbarhet, %

CVR = variationskoefficient för reproducerbarhet, %

9. Anmärkningar

9.1 För att få bättre separation mellan tryptofan och α-metyltryptofan kan man prova att använda följande kromatografiska parametrar:

Isokratisk eluering följt av gradientkolonnrening:







HPLC-kolonn: 125 × 4 mm, C18, 5 μm packning eller motsvarande Kolonntemperatur: 32 oC Mobil fas: A: 0,01 mol/l KH2PO4/metanol, 95+5 (v+v) B: metanol Gradientprogram: 0 min 100 % A 0 % B 15 min 100 % A 0 % B 17 min 60 % A 40 % B 19 min 60 % A 40 % B 21 min 100 % A 0 % B 33 min 100 % A 0 % B Flödeshastighet: 1,2 ml/min Total körningstid: ca 33 min

9.2 Kromatografin varierar beroende på typen av HPLC och vilket slags packning som används i kolonnen. Det valda systemet måste klara av att ge baslinjeseparation mellan tryptofan och intern standard. Det är också viktigt att nedbrytningsprodukter tydligt kan separeras från tryptofan och intern standard. Man bör köra hydrolysat utan intern standard för att kunna upptäcka eventuella orenheter på baslinjen under den interna standarden. Det är viktigt att körningstiden är så lång att alla nedbrytningsprodukter hinner elueras ut, annars kan sena elueringstoppar störa efterföljande körningar.

Kromatografisystemet måste ge linjär respons i driftsintervallet. Den linjära responsen ska mätas med en konstant koncentration (den normala) av intern standard och varierande koncentrationer av tryptofan. Det är viktigt att topparna för både tryptofan och intern standard ligger inom det linjära intervallet för HPLC-/fluorescenssystemet. Om topparna för tryptofan och/eller intern standard är för låga eller för höga bör bestämningen göras om med annan provstorlek och/eller slutvolym.

9.3 Bariumhydroxid

Bariumhydroxid blir mer svårlösligt när det åldras. Detta ger en grumlig lösning för HPLC-bestämning, vilket kan ge alltför låga värden för tryptofan.

H. BESTÄMNING AV RÅFETT

1. Syfte och tillämpningsområde

Med denna metod kan råfetthalten i foder bestämmas. Metoden omfattar inte analys av oljeväxtfrön och oljehaltiga frukter.

Beroende på fodrets egenskaper och sammansättning samt bestämningens syfte används en av nedanstående två metoder.

1.1 Metod A – direkt extraherbart råfett

Denna metod är tillämplig på foderråvaror av vegetabiliskt ursprung, utom dem som omfattas av metod B.

1.2 Metod B – total råfetthalt

Denna metod är tillämplig på foderråvaror av animaliskt ursprung och på alla foderblandningar. Den ska användas för alla råvaror från vilka fett inte kan extraheras helt utan föregående hydrolys, till exempel gluten, jäst, potatisprotein och produkter som genomgår processer såsom extrudering, bearbetning till flingor samt uppvärmning.

1.3 Tolkning av resultaten

I samtliga fall där ett högre resultat fås genom metod B än metod A, ska resultatet av metod B räknas som det sanna värdet.

2. Princip

2.1 Metod A

Provet extraheras med petroleumeter. Lösningsmedlet destilleras av och återstoden torkas och vägs.

2.2 Metod B

Provet behandlas under uppvärmning med saltsyra. Blandningen kyls och filtreras. Återstoden sköljs och torkas och bestäms enligt metod A.

3. Reagens

3.1 Petroleumeter, kokpunktsintervall 40–60 oC. Bromtalet måste vara lägre än 1 och återstoden efter förångning mindre än 2 mg/100 ml.

3.2 Vattenfritt natriumsulfat.

3.3 Saltsyra, c = 3 mol/l.

3.4 Filtreringshjälpmedel, till exempel kiselgur, Hyflo-supercel.

4. Utrustning

4.1 Extraktionsutrustning. Om denna är försedd med hävert (Soxhletapparat), ska förångningstakten vara sådan att ca tio kretslopp sker per timme. Om hävert saknas ska förångningstakten vara ca 10 ml per minut.

4.2 Extraktionshylsorna måste vara fria från ämnen som är lösliga i petroleumeter och ha en porositet som överensstämmer med kraven i 4.1.

4.3 Torkugn, antingen en vakuumtorkugn inställd på 75 ± 3 oC eller en varmluftsugn inställd på 100 ± 3 oC.

5. Utförande

5.1 Metod A (se punkt 8.1)

Väg 5 gram av provet med en noggrannhet av 1 mg, överför det till en extraktionshylsa (4.2) och täck med en fettfri bomullstuss.

Placera hylsan i en extraktionsapparat (4.1) och extrahera i sex timmar med petroleumeter (3.1). Samla upp petroleumeterextraktet i en torr, vägd kolv med pimpstensskärvor ( 9 ).

Destillera av lösningsmedlet. Torka återstoden i 1,5 timmar i torkugnen (4.3). Kyl i en exsickator och väg. Torka igen i 30 minuter för att säkerställa att fettets vikt är konstant (viktförlusten mellan två på varandra följande vägningar får inte överstiga 1 mg).

5.2 Metod B

Väg upp 2,5 gram av provet med en noggrannhet av 1 mg (se punkt 8.2) i en 400 ml bägare eller en 300 ml E-kolv. Tillsätt 100 ml saltsyra (3.3) och pimpstensskärvor. Täck över bägaren med ett urglas eller koppla E-kolven till en återloppskylare. Låt blandningen koka sakta i 1 timme över en svag låga eller värmeplatta. Låt inte produkten fastna på behållarens insida.

Kyl och tillsätt så mycket filtreringshjälpmedel (3.4) att inget fett förloras under filtreringen. Filtrera genom ett fuktat, fettfritt, dubbelt filtrerpapper. Skölj återstoden i kallt vatten tills ett neutralt filtrat erhålls. Kontrollera att filtratet inte innehåller något fett. Om så ändå är fallet ska provet extraheras med petroleumeter, enligt metod A, före hydrolys.

Lägg det dubbla filtrerpappret med återstoden på ett urglas och torka i 1,5 timmar i varmluftsugnen (4.3) vid 100 ± 3 oC.

Placera det dubbla filtrerpappret med den torra återstoden i en extraktionshylsa (4.2) och täck med en fettfri bomullstuss. Placera hylsan i en extraktionsapparat (4.1) och följ anvisningarna i punkt 5.1 andra och tredje styckena.

6. Resultatangivelse

Återstodens vikt uttrycks i procent av provet.

7. Repeterbarhet

Skillnaden mellan resultaten av två parallella bestämningar som utförs på samma prov av samma person får inte överstiga

— 0,2 % i absoluta tal för råfetthalter under 5 %,

— 4,0 % av det högre värdet för halter på 5–10 %,

— 0,4 % i absoluta tal för halter över 10 %.

8. Anmärkningar

8.1 För produkter med hög fetthalt, som är svåra att krossa eller från vilka det är svårt att få fram ett homogent reducerat prov, används följande förfarande.

Väg upp 20 gram av provet med en noggrannhet av 1 mg och blanda med minst 10 gram vattenfritt natriumsulfat (3.2). Extrahera med petroleumeter (3.1) enligt punkt 5.1. Späd extraktet med petroleu