2002D0657 — SV — 17.08.2002 — 000.001 — 1
Detta dokument är endast avsett som dokumentationshjälpmedel och institutionerna ansvarar inte för innehållet
►B KOMMISSIONENS BESLUT
av►C1 den 14 augusti 2002 ◄
om genomförande av rådets direktiv 96/23/EG avseende analysmetoder och tolkning av resultat
[delgivet med nr K(2002) 3044]
(Text av betydelse för EES)
(2002/657/EG)
(EGT L 221, 17.8.2002, s. 8)
Rättat genom:
►C1Rättelse, EGT L 239, 6.9.2002, s. 66 (2002/657/EG)
▼B
KOMMISSIONENS BESLUT
av►C1 den 14 augusti 2002 ◄
om genomförande av rådets direktiv 96/23/EG avseende analysme-
toder och tolkning av resultat
[delgivet med nr K(2002) 3044]
(Text av betydelse för EES)
(2002/657/EG)
EUROPEISKA GEMENSKAPERNAS KOMMISSION HAR FATTAT DETTA
BESLUT
med beaktande av Fördraget om upprättandet av Europeiska gemenska-
pen,
med beaktande av rådetsdirektiv 96/23/EG av den 29 april 1996 om
införande av kontrollåtgärder för vissa ämnen och restsubstanser somkan finnasi levande djur och i produkter frams tällda därav och omupphävande av direktiv 85/358/EEG och 86/469/EEG samt beslut 89/
187/EEG och 91/664/EEG(
1), särskilt artikel 15.1 andra stycket i detta,
och
av följande skäl:
(1)Förekomsten av restsubstanser i produkter av animaliskt
ursprung är ett folkhälsoproblem.
(2)I kommissionens beslut 98/179/EG av den 23 februari 1998, ivilket tillämpningsföreskrifter avseende officiell provtagning förkontroll av vissa ämnen och resthalter av dessa i levande djuroch animaliska produkter(
2) fastställs, anges att analysen av
proverna endast får utföras av de laboratorier som den behöriga
nationella myndigheten har godkänt för officiella kontroller av
restsubstanser.
(3)Det är nödvändigt att säkerställa kvaliteten på, och jämförbar-heten för, de analysresultat som lämnas av laboratorier som ärgodkända för kontroll av restsubstanser. Detta bör uppnås genom
användning av kvalitetssäkringssystem och särskilt genom
användning av metoder som är validerade enligt allmänna förfa-randen och prestationskriterier och genom säkerställandet avspårbarheten till allmänna standarder eller standarder om vilkaöverenskommelse träffats.
(4)Rådetsdirektiv 93/99/EEG av den 29 oktober 1993 om ytterli-gare åtgärder för offentlig kontroll av livsmedel(
3) och
kommissionens beslut 98/179/EG kräver att officiella kontrolla-boratorier ackrediterasenligt ISO 17025 (1) från och medjanuari 2002. Enligt beslut 98/179/EG skall de godkända labora-
torierna delta i ett internationellt godkänt system för extern
kvalitetskontroll och ackreditering. Därutöver måste de godkändalaboratorierna visa sin kompetens genom att regelbundet ochmed godkänt resultat delta i lämpliga kvalifikationstest somerkänts eller organiserats av nationella eller gemenskapens refe-renslaboratorier.
(5)Ett nätverk av gemenskapens referenslaboratorier, nationellareferenslaboratorier och nationella kontrollaboratorier verkarenligt direktiv 96/23/EG för att öka samordningen.
(6)Som ett resultat av framsteg som gjorts inom analytisk kemiefter antagandet av direktiv 96/23/EG har användningen av rutin-och referensmetoder trängts undan av ett kriteriebaserat till-vägagångssätt, i vilket prestationskriterier och förfaranden förvalidering av undersökande metoder och konfirmeringsmetoderetableras.2002D0657 — SV — 17.08.2002 — 000.001 — 2
(1) EGT L 125, 23.5.1996, s. 10.
(2) EGT L 65, 5.3.1998, s. 31.
(3) EGT L 290, 24.11.1993, s. 14.
▼B
(7)Det är nödvändigt att fastställa gemensamma kriterier för tolk-
ningen av de officiella kontrollaboratoriernasprovres ultat för att
garantera ett harmoniserat genomförande av rådets direktiv 96/23/EG.
(8)Det är nödvändigt att göra det möjligt att fortlöpande fastställaden lägsta funktionsgräns som krävs (MRPL) för de analytiskametoderna för substanser för vilka ingen tillåten gräns har angi-vits och särskilt för de substanser vilkas användning inte ärtillåten eller är specifikt förbjuden inom gemenskapen för att
säkerställa ett harmoniserat genomförande av direktiv 96/23/EG.
(9)Kommissionens beslut 90/515/EEG av den 26 september 1990
om fastställande av referensmetoder för att påvisa rester av tung-metaller och arsenik(
1), kommissionens beslut 93/256/EEG av
den 14 maj 1993 om metoder för att spåra resthalter av ämnenmed hormonell eller tyreostatisk verkan(
2) samt kommissionens
beslut 93/257/EEG av den 15 april 1993 om referensmetoder
och förteckning över nationella referenslaboratorier för
påvisande av restämnen(3), senast ändrat genom beslut 98/536/
EG(4), har tidigare setts över mot bakgrund av den vetenskapliga
och tekniska utvecklingen, varvid deras räckvidd ochbestämmelser har ansetts vara otillräckliga, och bör följaktligen
upphävasgenom detta bes lut.
(10)För att tillåta att metoder för analyser av officiella proveranpassas till detta beslut, skall en övergångsperiod anges.
(11)De åtgärder som föreskrivs i detta beslut är förenliga med denuppfattning som Ständiga kommittén för livsmedelskedjan och
djurhälsa har.
HÄRIGENOM FÖRESKRIVS FÖLJANDE.
Artikel 1
Ämnesområde och omfattning
I detta beslut anges tillämpningsföreskrifter för de analytiska metoder
som skall användas för kontroll av officiella prover som tagits enligt
artikel 15.1 andra meningen i direktiv 96/23/EG och specificeras
allmänna kriterier för tolkningen av analytiska resultat från officiellakontrollaboratorier för sådana prover.
Detta beslut gäller inte för substanser för vilka mera specifika regler
har fastställts i annan gemenskapslagstiftning.
Artikel 2
Definitioner
I detta beslut skall definitionerna i direktiv 96/23/EG och i bilagan till
detta beslut tillämpas.
Artikel 3
Analysmetoder
Medlemsstaterna skall se till att officiella prover som tas enligt direktiv
96/23/EG analyseras med metoder som
a) är dokumenterade i provinstruktioner, företrädesvis enligt ISO 78-2
(6),
b) är förenliga med del 2 i bilagan till detta beslut,
c) har validerats enligt de förfaranden som beskrivs i del 3 i bilagan,2002D0657 — SV — 17.08.2002 — 000.001 — 3
(1) EGT L 286, 18.10.1990, s. 33.
(2) EGT L 118, 14.5.1993, s. 64.
(3) EGT L 118, 14.5.1993, s. 75.
(4) EGT L 251, 11.9.1998, s. 39.
▼B
d) är förenliga med den relevanta lägsta funktionsgräns som krävs och
som skall fastställas enligt artikel 4.
Artikel 4
Lägsta funktionsgräns som krävs (MRPL)
Detta beslut skall ses över för att fortlöpande fastställa den lägsta funk-
tionsgräns som krävs för analytiska metoder som skall användas för
substanser för vilka ingen tillåten gräns har fastställts.
Artikel 5
Kvalitetskontroll
Medlemsstaterna skall säkerställa kvaliteten på analysresultaten av prov
som tagits enligt direktiv 96/23/EG, särskilt genom att övervaka prov-
tagning och/eller kalibrering av resultat enligt kapitel 5.9 i ISO 17025(1).
Artikel 6
Tolkning av resultaten
1. Det skall anses att analysresultatet inte uppfyller kraven om
beslutsgränsen för konfirmeringsmetoden för analyten överskrids.
2. När ett tillåtet gränsvärde fastställts för en substans, är
beslutsgränsen den koncentration över vilken man med en statistisksäkerhet av 1 – αkan avgöra att det tillåtna gränsvärdet verkligen
överskridits.
3. När inget tillåtet gränsvärde fastställts för en substans, är
beslutsgränsen den lägsta koncentrationsnivå vid vilken en metod meden statistisk säkerhet av 1 – αkan urskilja förekomsten av en viss
analyt.
4. För substanser som anges i grupp A i bilaga I till direktiv 96/23/
EG får α-felet vara högst 1 procent. För alla andra substanser får α-
felet vara högst 5 procent.
Artikel 7
Upphävande
Besluten 90/515/EEG, 93/256/EEG och 93/257/EEG skall upphöra att
gälla.
Artikel 8
Övergångsbestämmelser
Metoder för analys av officiella prover av substanser som anges i grupp
A i bilaga I till direktiv 96/23/EG, vilka uppfyller kriterierna i besluten
90/515/EEG, 93/256/EEG och 93/257/EEG, får användasupp till två årefter det att detta beslut har trätt i kraft. Metoder som för närvarandegäller för substanser som anges i grupp B i bilaga I till direktiv 96/23/EG skall överensstämma med detta beslut senast fem år efter beslutets
tillämpningsdatum.
Artikel 9
Datum för tillämpning
Detta beslut skall tillämpas från och med den 1 september 2002.
Artikel 10
Mottagare
Detta beslut riktar sig till medlemsstaterna.2002D0657 — SV — 17.08.2002 — 000.001 — 4
▼B
BILAGA
PRESTATIONSKRITERIER, ÖVRIGA KRAV OCH FÖRFARANDEN
FÖR ANALYTISKA METODER
1.DEFINITIONER
I detta beslut används följande beteckningar med de betydelser som här
anges:
1.1noggrannhet : hur nära ett provresultat överensstämmer med ett
accepterat referensvärde (2). Noggrannheten bestäms genom att
man bestämmer riktighet och precision.
1.2alfa ( α)-fel: sannolikheten för att det undersökta provet uppfyller
kraven, trots att mätningen visar det motsatta (”oriktigt positivt
beslut”).
1.3analyt: den substans som skall påvisas, identifieras och/eller kvan-
tifieras samt derivat som uppdagas under analysen.
1.4beta ( β)-fel: sannolikheten för att det undersökta provet faktiskt
inte uppfyller kraven, trots att mätresultatet visar det motsatta
(”oriktigt negativt beslut”).
1.5systematiskt fel : skillnaden mellan ett förväntat provresultat och ett
accepterat referensvärde (2).
1.6kalibreringsstandard : ett hjälpmedel för mätningar, som represen-
terar kvantiteten av den aktuella substansen på ett sätt som knyter
dess värde till en referensbas.
1.7certifierat referensmaterial (CRM) : ett material som har ett speci-
ficerat analytinnehåll.
1.8standardadditionskromatografi : ett förfarande där extraktet delas
upp i två delar före kromatografisteget eller -stegen. Den första
delen kromatograferasi befintligt s kick. Den andra delen blandas
med den standardanalyt som skall mätas. Därefter kromatograferas
även blandningen. Mängden tillsatt standardanalyt skall motsvara
den förväntade mängden analyt i extraktet. Denna metod är
utformad för att förbättra identifieringen av en analyt vid använd-
ning av kromatografimetoder, särskilt när ingen lämplig inre
standard kan användas.
1.9kollaborativ avprovning : analys av samma prov med samma metod
för att bestämma metodens prestationskarakteristika. Studien täcker
slumpvisa mätfel och laboratoriets systematiska mätfel.
1.10konfirmeringsmetod : sådana metoder som används för att få full-
ständig eller kompletterande information som gör det möjligt att
entydigt identifiera analyten och, om nödvändigt, kvantifieraspå
den givna nivån.
1.11beslutsgräns (CC α): den gränsvid och över vilken man med en
felsannolikhet av αkan avgöra om ett prov inte uppfyller kraven.
1.12detektionsförmåga (CC β): den minsta mängd av en substans som
kan upptäckas, identifieras och/eller kvantifieras i ett prov med en
felsannolikhet om β.För substanser som saknar fastställt tillåtet
gränsvärde, avser detektionsförmågan den lägsta koncentration vid
vilken en metod har förmåga att upptäcka faktiskt förorenade
prover med en statistisk sannolikhet om 1 – β.För substanser
med fastställt gränsvärde, betyder detta att detektionsförmågan är
den koncentration vid vilken metoden med en statistisk sannolikhet
om 1 – βkan upptäcka tillåtna koncentrationer.
1.13spetsat provmaterial : ett prov som har anrikats med en känd
mängd av den analyt som skall påvisas.
1.14mellanlaboratorieavprovning (jämförelse) : två eller flera laborato-
riersorganis ation, utförande och värdering av material från en och
samma provtagning i överensstämmelse med förutbestämda beting-
elser, för att fastställa provmetodens prestation. Beroende på syftet
kan studien klassificeras som en kollaborativ avprovning eller en
kvalifikationsprövning.
1.15inre standard : en substans som inte finns i provet och vars fysika-
lisk-kemiska egenskaper i så hög grad som möjligt liknar analyten
som skall identifieras. Den inre standarden tillsätts varje prov och
varje kalibreringsstandard.
1.16laboratorieprov : ett prov som har förberetts för att sändas till ett
laboratorium och som är avsett för kontroll eller undersökning.2002D0657 — SV — 17.08.2002 — 000.001 — 5
▼B
1.17given nivå : den koncentration av substans eller analyt i ett prov
som är signifikant för att avgöra dess förenlighet med lagstift-
ningen.
1.18lägsta funktionsgräns som krävs (MRPL) : den minsta mängd av en
analyt i ett prov som åtminstone måste detekteras och konfirmeras.
Avsikten är att harmonisera den analytiska prestandan för
substanser som saknar fastställt gränsvärde.
1.19prestationskarakteristika : funktionell kvalitet som kan tillskrivas
en analytisk metod. Detta kan t.ex. vara specificitet, noggrannhet,
riktighet, precision, repeterbarhet, reproducerbarhet, återvinning,
detektionsförmåga och motståndsförmåga.
1.20prestationskriterier : behovet av prestationskarakteristika, genom
vilka kan avgöras om den analytiska metoden är lämplig för sitt
ändamål och ger tillförlitliga resultat.
1.21tillåten gräns : maximalt värde för restsubstans, högsta gränsvärde
eller annan maximal tolerans för substanser som angivits på annan
plats i gemenskapslagstiftningen.
1.22precision : graden av överensstämmelse mellan oberoende testre-
sultat som erhållits under fastställda (förutbestämda) betingelser.
Måttet på precision uttrycks vanligen som brist på precision och
beräknas som standardavvikelse av provresultatet. Lägre precision
anges som en större standardavvikelse (2).
1.23kvalifikationsprövning : analysav ett och s amma prov för att ge
laboratorier möjlighet att välja sina egna metoder, förutsatt att
dessa metoder används under rutinmässiga förhållanden.
Prövningen måste genomföras enligt ISO-guide 43-1 (3) och 43-2
(4) och kan användas för att fastställa metodernas reproducer-
barhet.
1.24kvalitativ metod : en analytisk metod som identifierar en substans
på grundval av dess kemiska, biologiska eller fysiska egenskaper.
1.25kvantitativ metod : en analytisk metod som fastställer mängden eller
massfraktionen för en substans, så att den kan uttryckas som ett
numeriskt värde med lämplig enhet.
1.26bestämning av kemikalieblank : en fullständig analys som
utelämnar provportionen eller använder motsvarande mängd
lämpligt lösningsmedel i stället för provportionen.
1.27återvinning : den procentuella andelen av den faktiska koncentra-
tionen av en substans som återvinns under en analys. Den
bestäms under valideringen, om det inte finns något certifierat
referensmaterial.
1.28referensmaterial : ett material hosvilket en eller flera egens kaper
har bestämts med en validerad metod, så att det kan användas för
att kalibrera utrustning eller för att kontrollera en mätmetod.
1.29repeterbarhet : precision under repeterbarhetsbetingelser (2).
1.30repeterbarhetsbetingelser : betingelser när oberoende provresultat
fås med samma metod på identiskt provmaterial i samma laborato-
rium och av samma person som använder samma utrustning (2).
1.31reproducerbarhet : precision under reproducerbarhetsbetingelser
(2) (4).
1.32reproducerbarhetsbetingelser : betingelser under vilka provresultat
fås med samma metod på identiskt provmaterial i olika laboratorier
med olika personer som använder olika utrustning (2) (4).
1.33motståndsförmåga : en analytisk metods känslighet för ändringar av
försöksbetingelserna uttryckt som en förteckning över provmate-
rial, analyter, lagringsförhållanden, miljö- och/eller
provberedningsförhållanden, under vilka metoden kan tillämpas
som den beskrivs eller med specificerade mindre ändringar. För
alla de försöksbetingelser som i praktiken kan variera (t.ex. reage-
nsernas stabilitet, provsammansättning, pH, temperatur) skall alla
avvikelser som kan påverka analysresultatet anges.
1.34bestämning av blankprov : en fullständig analys av en provportion
som har tagits från ett prov som inte innehåller analyten.
1.35screeningmetod : metoder som används för att påvisa förekomsten
av en substans eller substansklass på den aktuella nivån. Dessa
metoder har en hög provkapacitet och användsför att unders öka
stora mängder prover för eventuella positiva resultat. De är utfor-
made för att undvika falskt negativa resultat.
1.36enskild laboratoriestudie (inomlaboratorievalidering) : en analytisk
undersökning som involverar ett enda laboratorium som använder2002D0657 — SV — 17.08.2002 — 000.001 — 6
▼B
en metod för att analysera samma eller olika provmaterial under
olika förhållanden och under berättigat långa tidsintervaller.
1.37specificitet : en metods förmåga att skilja mellan den analyt som
skall mätas och andra substanser. Denna egenskap är i huvudsak
en funktion av den mätteknik som används, men kan variera
beroende på förenings- eller matrisklass.
1.38standardtillsats : ett förfarande där provet delasupp i två (eller
flera) provportioner. En av portionerna analyseras som sådan och
de andra provportionerna tillsätts kända mängder av standardanalyt
före analysen. Mängden standardanalyt som tillsätts måste vara
mellan två och fem gånger större än den förväntade mängden
analyt i provet. Denna metod är utformad för att bestämma
mängden av en analyt i ett prov med beaktande av återvinningen
för analysmetoden.
1.39standardanalyt : en analyt varsinnehåll och renhet är kända och
bestyrkta och som skall användas som en referens vid analysen.
1.40substans : material med specifik eller klart avgränsad sammansätt-
ning samt dess metaboliter.
1.41provportion : den mängd material som hämtats från det prov på
vilket analysen eller observationen utförs.
1.42prov: ett prov som har beretts av ett laboratorieprov och från vilket
provportionen tas.
1.43riktighet : hur nära ett provresultat överensstämmer med ett genom-
snittligt värde som erhållits från ett stort antal provresultat och ett
accepterat referensvärde. Riktigheten uttrycks vanligen som syste-
matisk fel (2).
1.44enheter : de enheter som beskrivs i ISO 31 (20) och direktiv 71/
354/EEG (19).
1.45validering : konfirmation genom undersökning och tillhandahål-
lande av faktiska bevis att bestämda krav för ett specifikt
användningsområde uppfylls.
1.46inomlaboratoriereproducerbarhet : den precision som fås i samma
laboratorium under fastställda (förutbestämda) betingelser (avse-
ende t.ex. metod, provmaterial, personer, omgivning) under
berättigat långa tidsintervall.
2.PRESTATIONSKRITERIER FÖR OCH ÖVRIGA KRAV PÅ ANALY-
TISKA METODER
Analytiska metoder eller kombinationer av andra metoder än de som beskrivs
nedan får endast användas för screening eller konfirmation om det kan visas att
de uppfyller de relevanta krav som fastställs i detta beslut.
2.1 ALLMÄNNA KRAV
2.1.1Hantering av prover
Prover skall tas, hanteras och bearbetas så att sannolikheten för att en
eventuell analyt påvisas blir så stor som möjlig. Provhanteringen skall
förhindra eventuell oavsiktlig förorening eller förlust av analyt.
2.1.2Provens prestanda
2.1.2.1Återvinning
Under analysen av proverna, skall återvinningen bestämmas för varje
provsats om en fast återvinningskorrigeringsfaktor används. Om återvin-
ningsgraden ligger inom gränserna, kan den fasta korrigeringsfaktorn
användas. Annars skall återvinningsfaktorn som fastställts för den
enskilda satsen användas, om inte den specifika återvinningsfaktorn för
analyten i provet används, varvid förfarandet för standardtillsatser (se
punkt 3.5) eller en inre standard skall användas för den kvantitativa
bestämningen av en analyt i ett prov.
2.1.2.2Specificitet
En metod skall ha förmåga att skilja mellan analyten och de andra
substanserna under försöksbetingelserna. En uppskattning av i vilken
grad detta är möjligt skall göras. Strategier för att övervinna varje
förutsägbar interferens med substanser när den beskrivna mättekniken
används, t.ex. homologa och analoga ämnen eller metaboliter av den
restsubstans som undersöks, skall användas. Det är av största betydelse
att den interferens som kan orsakas av matriskomponenterna undersöks.2002D0657 — SV — 17.08.2002 — 000.001 — 7
▼B
2.2 SCREENINGMETODER
Endast sådana analysmetoder som bevisats vara validerade på ett dokumenterat,
spårbart sätt och som har en frekvens av falskt negativa resultat som är < 5 ( β-
fel) på den givna nivån, skall användas för screening i enlighet med direktiv 96/
23/EG. Vid ett misstänkt positivt resultat skall resultatet verifieras med hjälp av
en konfirmeringsmetod.
2.3 KONFIRMERINGSMETODER FÖR ORGANISKA RESTSUBSTANSER
OCH FÖRORENINGAR
Konfirmeringsmetoderna för organiska restsubstanser eller föroreningar skall ge
information om analytens kemiska struktur. Metoder som endast grundar sig på
kromatografisk analys utan användning av spektrometrisk detektion är således
olämpliga att användas som enda konfirmeringsmetod. Om en enskild teknik
saknar tillräcklig specificitet, skall den önskade specificiteten uppnås genom
analyser som består av en lämplig kombination av rening, kromatografisk sepa-
ration och spektrometrisk detektion.
Följande metoder eller kombinationer av metoder anses lämpliga för identifi-
ering av organiska restsubstanser eller föroreningar för substansgrupper enligt
tabellen nedan:
Tabell 1
Lämpliga konfirmeringsmetoder för organiska restsubstanser och föroreningar
MätteknikSubstanser bilaga I 96/
23/EGBegränsningar
Vätskekromatografi (LC)
eller gaskromatografi (GC)
med masspektrometriGrupperna A och B Endast efter online eller offline kromatografisk
separation
Endast om fullscantekniker används eller vid
användning av åtminstone 3 (grupp B) eller 4
(grupp A) identifieringspunkter för tekniker
som inte registrerar hela masspektrumet
LC eller GC med infraröd-
spektrometriGrupp A och B Specifika krav för absorption vid infraröd-
spektrometri skall tillgodoses
LC-fullscan DAD Grupp B Specifika krav för absorption vid infraröd-
spektrometri skall tillgodoses
LC-fluorescens Grupp B Endast för molekyler som uppvisar en naturlig
fluorescens och för molekyler som fluorescerar
antingen efter att de har omvandlatseller
bildat derivat
2-D TLC – full-scan UV/
VISGrupp B Tvådimensionell högpresterande tunnskiktskro-
matografi (HPTLC) och standardadditionskro-
matografi är obligatoriska
GC-elektroninfångningsde-
tektionGrupp B Endast om två kolumner med olika polaritet
används
LC-immunogram Grupp B Endast om minst två olika kromatografiska
system eller en annan, oberoende detekterings-metod används
LC-UV/VIS (en bestämd
våglängd)Grupp B Endast om minst två olika kromatografiska
system eller en annan, oberoende detekterings-
metod används
2.3.1Allmänna prestationskriterier och krav
Konfirmeringsmetoderna skall ge information om analytens kemiska
struktur. Om mer än en förening ger samma reaktion, innebär det att
metoden inte kan skilja mellan dessa föreningar. Metoder som endast
grundar sig på kromatografisk analys utan användning av spektrometrisk
detektion är olämpliga att användas som enda konfirmeringsmetoder.
En lämplig inre standard som används i metoden skall tillsättas provpor-
tionen i början av extraktionsmetoden. Beroende på vad som finns
tillgängligt skall antingen stabila isotopmärkta former av analyten, vilka
är särskilt lämpliga för masspektrometrisk detektion, eller föreningar
vilkas struktur liknar analytens användas.
Om ingen lämplig inre standard kan användas, skall identifieringen av
analyten verifieras med standardadditionskromatografi. I detta fall skall
bara en topp erhållas. Toppens ökade höjd (eller area) skall motsvara
mängden tillsatt analyt. I samband med gaskromatografi (GC) eller2002D0657 — SV — 17.08.2002 — 000.001 — 8
▼B
vätskekromatografi (LC) skall toppens bredd vid halva maximihöjden
vara 90–110 % av den ursprungliga bredden och retentionstiderna skall
vara identiska med en marginal på 5 %. Vid tunnskiktskromatografiska
metoder (TLC) skall endast den fläck som antas tillhöra analyten bli
kraftigare. Det får inte uppstå någon ny fläck och utseendet får inte
ändras.
Referensmaterial eller spetsat material som innehåller kända mängder
analyt, som ligger vid eller nära antingen den högsta tillåtna gränsen
eller beslutsgränsen (positivt kontrollprov) samt negativt kontrollmate-
rial och reagensblankprov skall helst genomgå hela analysförfarandet
samtidigt som varje sats analysprover undersöks. Ordningen vid inji-
cering av extrakten i analysinstrumentet är följande: reagensblankprov,
negativt kontrollprov, prov(er) som skall konfirmeras, negativt kontroll-
prov på nytt och slutligen positivt kontrollprov. Alla avvikelser från
denna sekvens skall motiveras.
2.3.2Ytterligare prestationskriterier och övriga krav för kvantitativa
analysmetoder
2.3.2.1Riktigheten hos kvantitativa metoder
Vid upprepade analyser av ett certifierat referensmaterial får avvikel-
serna för den genomsnittliga massfraktionen, som har bestämts genom
experiment och korrigeratsför återvinningen, inte ligga utanför följande
riktvärden:
Tabell 2
Minsta riktighet hos kvantitativa metoder
Massfraktion Område
≤1µg/kg – 50 % till + 20 %
>1 µg/kg till 10 µg/kg – 30 % till + 10 %
≥10µg/kg – 20 % till + 10 %
När det inte finnsnågot certifierat referens material tillgängligt kan
riktigheten hos mätningarna fastställas genom återvinningen för tillsatser
av kända mängder av analyten eller analyterna till en blankmatris. Data
som korrigerats med medelvärdet av återvinningen godkänns endast om
de ligger inom de gränser som anges i tabell 2.
2.3.2.2Precision för kvantitativa metoder
Variationskoefficienten (CV) mellan och inom laboratorier för upprepad
analys av ett referensmaterial eller spetsat material under reproducerbar-
hetsbetingelser får inte överskrida det värde som beräknats enligt
Horwitz-ekvationen. Ekvationen lyder:
CV = 2(1 - 0,5 log C)
där C är massfraktionen uttryckt som tiopotens (t.ex. 1 mg/g = 10–3). Se
tabell 3 för exempel.
Tabell 3
Exempel på variationskoefficienter för reproducerbarheten för kvantitativa metoder för
ett antal massfraktioner av en analyt
Massfraktion CV för reproducerbarhet (%)
1µg/kg (*)
10µg/kg (*)
100 µg/kg 23
1 000 µg/kg (1 mg/kg) 16
(*) Vid massfraktioner lägre än 100 µg/kg fåsoacceptabelt höga värden då Horwitz-ekvationen används .
Variationskoefficienterna för koncentrationer som är lägre än 100 µg/kg skall därför vara så låga som
möjligt.
Vid analyser som utförs under repeterbarhetsbetingelser bör variations-
koefficienten inom laboratoriet i normala fall vara mellan en halv och2002D0657 — SV — 17.08.2002 — 000.001 — 9
▼B
två tredjedelar av värdena som anges ovan. Vid analyser som utförs
under inomlaboratoriereproducerbarhetsbetingelser får variationskoeffi-
cienten inom laboratoriet inte vara större än variationskoefficienten för
reproducerbarheten.
För substanser med ett fastställt tillåtet högsta gränsvärde skall metoden
inom laboratoriet uppnå en reproducerbarhet som inte är större än
motsvarande variationskoefficient för reproducerbarheten vid en koncen-
tration på 0,5 gånger det tillåtna gränsvärdet.
2.3.3Prestationskriterier och övriga krav för masspektrometrisk detek-
tion
Masspektrometrimetoder är lämpliga som konfirmerings- och/eller refe-
rensmetoder bara om de används efter en kromatografisk separation som
utförsonline eller offline.
2.3.3.1Kromatografisk separation
Vid GC-MS-förfaranden skall kapillärkolumner användas vid den gask-
romatografiska separationen. Vid LC-MS-förfaranden skall lämpliga
LC-kolumner användas vid den kromatografiska separationen. I båda
fallen är den minsta godkända retentionstiden för analyten som
undersöks två gånger den retentionstid som motsvarar hålrumsvolymen
för kolumnen. Retentionstiden (eller den relativa retentionstiden) för
analyten i provportionen skall motsvara kalibreringsstandarden inom ett
bestämt retentionstidsfönster. Retentionstidsfönstret skall stå i rimlig
proportion till det kromatografiska systemets upplösningsförmåga.
Analytens relativa retentionstid, dvs. förhållandet mellan analytens och
den inre standardens kromatografiska retentionstid, skall motsvara kalib-
reringslösningens med en tolerans på ± 0,5 % för gaskromatografi och
± 2,5 % för vätskekromatografi.
2.3.3.2Masspektrometrisk detektion
Masspektrometrisk detektion skall utföras genom användning av MS-
tekniker, såsom registrering av hela masspektra (fullscan) eller selektiv
jonanalys(SIM) och MS-MSn-tekniker som selektiv referensanalys
(SRM) eller andra lämpliga MS- eller MS-MSn-tekniker i kombination
med lämpliga joniseringsmetoder. Vid högupplösande masspektrografi
(HRMS), skall upplösningen normalt bli större än 10 000 för hela
massområdet vid 10 % ”valley”.
Fullscan: Om den masspektrometriska bestämningen utförs genom
registrering av fullscan-spektra är närvaron obligatorisk för alla
uppmätta diagnostiska jonen (molekyljonen, karaktäristiska addukter av
molekyljonen, karaktäristiska fragmentjoner och isotopjoner), som har
en relativ intensitet som är högre än 10 % i referensspektret för kalibrer-
ingsstandarden.
SIM: Om den masspektrometriska bestämningen utförs med hjälp av
massfragmentografi, skall molekyljonen helst vara en av de valda
diagnostiska jonerna (molekyljonen, karaktäristiska addukter av mole-
kyljonen, karaktäristiska fragmentjoner och alla deras isotopjoner). De
valda diagnostiska jonerna skall inte uteslutande härröra från samma
del av molekylen. Signal-brusförhållandet för varje diagnostisk jon skall
vara≥3:1.
Fullscan och SIM: De relativa intensiteterna för de påvisade jonerna,
uttryckta som procent av intensiteten av den starkaste jonen eller
övergången, skall stämma överens med intensiteterna för kalibrering-
sstandarden, antingen från kalibreringsstandardlösningarna eller från
spetsade prover, vid jämförbara koncentrationer, uppmätta under samma
betingelser. Intensiteterna skall ligga inom följande toleranser:
Tabell 4
Högsta tillåtna toleranser för relativa jonintensiteter vid användning av olika masspekt-
rometriska tekniker
Relativ intensitet
(% av bastoppen)EI-GC-MS
(relativ)CI-GC-MS, GC-MSn
LC-MS, LC-MSn
(relativ)
>5 0% ±1 0% ±2 0%
> 20 %–50 % ± 15 % ± 25 %
> 10 %–20 % ± 20 % ± 30 %
≤10 % ± 50 % ± 50 %2002D0657 — SV — 17.08.2002 — 000.001 — 10
▼B
Tolkning av masspektrala data: De relativa intensiteterna för de
diagnostiska jonerna och/eller moder-/dotterjonparen skall identifieras
genom jämförelse av spektra eller genom integrering av signalerna för
de enskilda massfragmenten. När bakgrundskorrigering används skall
denna användas på samma sätt för hela satsen (se 2.3.1 fjärde stycket)
och klart anges.
Fullscan: När fullscan-spektra registreras i en enda masspektrometri,
skall det finnas minst fyra joner med en relativ intensitet på ≥10
procent av bastoppen. Molekyljonen skall ingå om den finns med i refe-
rensspektret med en relativ intensitet på ≥10 procent. Minst fyra joner
skall ligga inom de högsta tillåtna toleranserna för de relativa joninten-
siteterna (tabell 5). Datorstödd sökning i databaser får användas. I detta
fall skall jämförelsen av masspektrala data i provet med kalibreringslös-
ningen överstiga en kritisk matchningsfaktor. Denna faktor skall under
valideringen bestämmas för varje enskild analyt på grundval av spektra
som uppfyller de kriterier som beskrivs nedan. Variationen i spektrat
som orsakas av provmatrisen och detektorns prestanda skall kontrolleras.
SIM: När massfragment mäts med andra än fullscan-tekniker, skall ett
system med identifieringspunkter användas för att tolka data. Vid konfir-
mering av ämnen i grupp A i bilaga I till direktiv 96/23/EG skall minst
fyra identifieringspunkter krävas. Vid konfirmation av ämnen i grupp B
i bilaga I till direktiv 96/23/EG krävs minst tre identifieringspunkter. I
tabellen nedan visas antalet identifieringspunkter som kan erhållas vid
var och en av de grundläggande masspektrometriska teknikerna. För att
uppfylla kraven för identifieringspunkterna som krävs för konfirmation
och för att beräkna summan av identifieringspunkterna skall emellertid
a) minst ett jonförhållande mätas,
b) alla relevanta uppmätta jonförhållanden uppfylla kriterierna som
beskrivs ovan, och
c) högst tre enskilda tekniker kombineras för att uppnå det minsta
antalet identifieringspunkter.
Tabell 5
Förhållandet mellan ett antal klasser av massfragment och identifieringspunkter som kan
fås
MS-teknik Identifieringspunkter per jon
Lågupplösande masspektrometri (LR) 1,0
LR-MSnmoderjon 1,0
LR-MSnövergångsprodukter 1,5
HRMS 2,0
HR- MSnmoderjon 2,0
HR-MSnövergångsprodukter 2,5
Anmärkningar:
(1) Varje jon får bara räknasen gång.
(2) GS-MS med elektronstötjonisation betraktas som en annan teknik än GC-MS med kemisk jonisering.(3) Olika kemiska derivat av en analyt kan bara användas för att öka antalet identifieringspunkter om deri-
vaten använder olika reaktionskemi.
(4) Beträffande substanser i grupp A i bilaga I till direktiv 96/23/EG när följande tekniker används vid
analysen: högpresterande vätskekromatografi (HPLC) kopplat med fullscan-spektrometri med diodarray-detektion (DAD); eller HPLC kopplat med fluorescensdetektion; eller HPLC kopplat till ettimmunogram; eller tvådimensionell tunnskiktskromatografi kopplad till spektrometrisk detektion; dekan bidra med högst en identifieringspunkt under förutsättning att de relevanta kriterierna för dessa
tekniker är uppfyllda.
(5) Övergångsprodukter omfattar både dotter- och dotterdotterprodukter.
Tabell 6
Exempel på antalet identifieringspunkter som fås för ett antal tekniker och kombina-
tioner av dessa (n = ett heltal)
Teknik(er) Antal joner Identifieringspoäng
GC-MS (EI eller CI) N n
GC-MS (EI och CI) 2 (EI) + 2 (CI) 4
GC-MS (EI eller CI) 2
derivat2 (derivat A) + 2 (derivat
B)42002D0657 — SV — 17.08.2002 — 000.001 — 11
▼B
Teknik(er) Antal joner Identifieringspoäng
LC-MS N n
GC-MS-MS 1 moderjon och 2 dotter-
joner4
LC-MS-MS 1 moderjon och 2 dotter-
joner4
GC-MS-MS 2 moderjoner, med vardera
1 dotterjon5
LC-MS-MS 2 moderjoner, med vardera
1 dotterjon5
LC-MS-MS-MS 1 moderjon, 1 dotterjon
och 2 dotterdotterjoner5,5
HRMS N 2 n
GC-MS och LC-MS 2 + 2 4
GC-MS och HRMS 2 + 1 4
2.3.4Prestationskriterier och övriga krav för kromatografi kopplad till
infraröd detektion
Lämpliga toppar: Med lämpliga toppar avses absorptionstoppar i en
kalibreringsstandards infraröda spektrum vilka uppfyller följande krav.
2.3.4.1Infraröd detektion
Absorptionsmaximum: Absorptionsmaximum skall ligga inom
vågtalsområde 4 000–500 cm–1.
Absorptionsintensiteten: Absorptionsintensiteten skall inte under-
stiga
a) antingen en specifik molabsorbans på 40 i förhållande till toppbas-
linjen, eller
b) en relativ absorbans på 12,5 procent av absorbansen hos toppen med
den högsta intensiteten inom området 4 000–500 cm–1
om båda mäts i förhållande till noll-linjen, och 5 procent av absorbansenhos toppen med den högsta intensiteten inom området 4 000–500 cm
–1,
om båda mäts i förhållande till sin toppbaslinje.
Anmärkning : Även om lämpliga toppar enligt alternativ a teoretiskt kan
vara att föredra, är lämpliga toppar enligt alternativ b lättare att
bestämma i praktiken.
Antalet toppar i analytens infraröda spektrum, vilkas frekvenser
motsvarar en lämplig topp inom kalibreringsstandardens spektrum,
bestäms med en marginal på ± 1 cm–1.
2.3.4.2Tolkning av infraröda spektraldata
Absorption skall förekomma i alla de områden inom analytens spektrum
som motsvarar en lämplig topp inom kalibreringsstandardens referens-
spektrum. Minst sex lämpliga toppar krävs inom
kalibreringsstandardens infraröda spektrum. Om det finns mindre än
sex lämpliga toppar (7) inom ett spektrum, kan detta inte användas
som referensspektrum. ”Överensstämmelsen”, dvs. den procentuella
andelen lämpliga toppar som påträffats inom analytens infraröda
spektrum, skall vara minst 50. Om det inte finns någon exakt motsva-
righet till en lämplig topp, skall det relevanta området i analytens
spektrum vara förenligt med förekomsten av en lämplig topp. Denna
metod kan endast tillämpas på absorptionstoppar i provets spektrum
med en intensitet på minst tre gånger bruset mellan topparna.
2.3.5Prestationskriterier och övriga krav för bestämning av en analyt
genom vätskekromatografi och andra detektionstekniker
2.3.5.1Kromatografisk separation
En inre standard skall användas om det finns lämpligt material till detta.
Det skall helst vara en relaterad standard med en retentionstid som är i
närheten av analytens. Analyten skall eluera vid den retentionstid som är
karakteristisk för motsvarande kalibreringsstandard under samma
försöksbetingelser. Den minsta tillåtna retentionstiden för en analyt skall
vara två gånger den retentionstid som motsvarar hålrumsvolymen för
kolonnen. Analytens relativa retentionstid, dvs. förhållandet mellan2002D0657 — SV — 17.08.2002 — 000.001 — 12
▼B
analytens och den inre standardens retentionstid, skall vara densamma
som kalibreringsstandardens i lämplig matris inom en marginal av
± 2,5 %.
2.3.5.2Fullscan UV/VIS-detektering
Prestationskriterierna för LC-metoder skall uppfyllas.Våglängden för maximal absorption i analytens spektrum skall vara
identisk med kalibreringsstandardens våglängd inom en marginal som
bestäms av detektionssystemets upplösning. Vid diod array-detektion
ligger den typiska marginalen inom ± 2 nm. Analytens spektrum över
220 nm får inte skilja sig utseendemässigt från kalibreringsstandardens
spektrum vad gäller de delar av dessa spektra som har en relativ absor-
banspå ≥10 %. Detta kriterium är uppfyllt om samma maxima
föreligger och skillnaden mellan de båda spektra inte på någon iakttagen
punkt överstiger 10 % av kalibreringsstandardens absorbans. Om
datorstödd sökning och matchning i databaser används, skall jämförelsen
av de spektrala data för provet med data för kalibreringslösningen
överstiga en kritisk matchningsfaktor. Denna faktor skall under valider-
ingen bestämmas för varje enskild analyt på grundval av spektra som
uppfyller de kriterier som beskrivs ovan. Variationen i spektrat som
orsakas av provmatrisen och detektorns prestanda skall kontrolleras.
2.3.5.3Prestationskriterier för fluorimetrisk detektion
Prestationskriterierna för LC-metoder skall uppfyllas.Metoden kan användas för molekyler som uppvisar en naturlig fluore-
scens och för molekyler som fluorescerar antingen efter att de har
omvandlats eller bildat derivat. Valet av exciterings- och emissions-
våglängderna i kombination med de kromatografiska betingelserna skall
göras så att förekomsten av interfererande komponenter i blankprovsex-
trakten minimeras.
Avståndet från den närmaste maximitoppen på kromatogrammet till den
markerade analyttoppen skall vara minst en full bredd vid 10 % av
maximihöjden för analyttoppen.
2.3.5.4Prestationskriterier förbestämning av en analyt genomLC-immunogram
LC-immunogram är olämplig att användass om enda konfirmering-
smetod.
Relevanta kriterier för LC-metoder skall uppfyllas.De på förhand definierade kvalitetskontrollparametrarna, t.ex. icke-
specifik bindning, den relativa bindningen för kontrollproverna, blank-
provets absorbansvärde, skall ligga inom de gränser som fastställs
under valideringen av undersökningen.
Immunogrammet skall bestå av minst fem fraktioner.Varje fraktion skall vara mindre än hälften av toppens bredd.Den fraktion som innehåller den högsta analytkoncentrationen skall vara
densamma för det misstänkta provet, det positiva kontrollprovet och
standarden.
2.3.5.5Kriterier för bestämning av en analyt genom vätskekromatografi med
UV/VIS-detektion (en våglängd)
Vätskekromatografi med UV/VIS-detektion (en våglängd) är olämplig
att användas som enda konfirmeringsmetod.
Avståndet från den närmaste maximitoppen på kromatogrammet till den
markerade analyttoppen skall vara minst en full bredd vid 10 % av
maximihöjden för analyttoppen.
2.3.6Prestationskriterier och övriga krav för bestämning av en analyt
genom 2-D TLC, kopplad till fullscan UV-spektrometridetektion
Tvådimensionell högpresterande tunnskiktskomatografi och standardad-
ditionskromatografi är obligatoriska.
Analytens RF-värden skall överensstämma med standardernas RF-
värden inom ± 5 %.
Analytens utseende skall inte kunna skiljas från standardens.Beträffande fläckar med samma färg skall avståndet mellan mittpunkten
för den punkt som ligger närmast och mittpunkten för analytfläcken vara
minst lika med hälften av summan av fläckarnas diameter.2002D0657 — SV — 17.08.2002 — 000.001 — 13
▼B
Analytens spektrum får inte skilja sig utseendemässigt från standardens
spektrum, enligt beskrivningen av fullscan UV/VIS-detektion.
Om datorstödd sökning och matchning i databaser används skall
jämförelsen av de spektrala data för provet med data för kalibreringslös-
ningen överstiga en kritisk matchningsfaktor. Denna faktor skall under
valideringen bestämmas för varje enskild analyt på grundval av spektra
som uppfyller de kriterier som beskrivs ovan. Variationen i spektrat som
orsakas av provmatrisen och detektorns prestanda skall kontrolleras.
2.3.7Prestationskriterier och övriga krav för bestämning av en analyt
genom gaskromatografi i kombination med elektroninfångningsde-
tektion (ECD)
En inre standard skall användas om det finns lämpligt material till detta.
Det skall helst vara ett relaterat ämne med en retentionstid som är i
närheten av analytens. Analyten skall eluera vid den retentionstid som
är karakteristisk för motsvarande kalibreringsstandard under samma
försöksbetingelser. Den minsta tillåtna retentionstiden för en analyt skall
vara två gånger den retentionstid som motsvarar hålrumsvolymen för
kolonnen. Analytens relativa retentionstid, dvs. förhållandet mellan
analytens och den inre standardens retentionstid, skall vara densamma
som kalibreringsstandardens i lämplig matris inom en marginal av
± 0,5 %. Avståndet från den närmaste maximitoppen på kromato-
grammet till den markerade analyttoppen skall vara minst en full bredd
vid 10 % av maximihöjden för analyttoppen. För ytterligare information
kan standardadditionskromatografi användas.
2.4 KONFIRMERINGSMETODER FÖR GRUNDÄMNEN
Konfirmeringsanalyser av kemiska grundämnen skall grunda sig på entydig
identifiering och korrekt, liksom preciserad, kvantifiering genom fysikalisk-
kemiska egenskaper som är unika för det aktuella grundämnet (t.ex. grundä-
mnestypisk våglängd för emitterad eller absorberad strålning, atomvikt) vid den
givna nivån.
Följande metoder eller kombinationer av metoder anses lämpliga för identifi-
ering av kemiska grundämnen:
Tabell 7
Lämpliga metoder för konfirmering av kemiska grundämnen
Teknik Parameter som mätts
Pulspolarografi Elektrisk signal
Atomabsorptionsspektrometri
Flamma Absorptionsvåglängd
Hydridgenerering Absorptionsvåglängd
Kall flamlös Absorptionsvåglängd
Elektrotermisk atomisering (grafitugn) Absorptionsvåglängd
Atomemissionsspektrometri
Induktivt kopplad plasma Emissionsvåglängd
Masspektrometri
Induktivt kopplad plasma Förhållandet massa/laddning
2.4.1Allmänna prestationskriterier och övriga krav för konfirmeringsme-
toder
Referensmaterial eller spetsat material som innehåller kända mängder
analyt, som ligger vid eller nära antingen den högsta tillåtna gränsen
eller beslutsgränsen (positivt kontrollprov) samt negativt kontrollmate-
rial och reagensblankprov skall helst genomgå hela analysförfarandet
med varje sats analysprover som undersöks. Den rekommenderade
ordningen vid injicering av extrakten i analysinstrumentet är följande:
reagensblankprov, negativt kontrollprov, prov(er) som skall konfirmeras,
negativt kontrollprov och slutligen positivt kontrollprov. Alla avvikelser
från denna sekvens skall motiveras.
I allmänhet kräver de flesta analysmetoderna fullständig nedbrytning av
den organiska matrisen för att lösningar skall fås före bestämningen av
analyten. Detta kan uppnås med hjälp av mikrovågsmineraliseringsme-
toder, vilka minimerar risken för förlust och/eller förorening av den2002D0657 — SV — 17.08.2002 — 000.001 — 14
▼B
givna analyten. Sanerade teflonkärl av god kvalitet skall användas. Om
andra våta eller torra nedbrytningsmetoder används, skall dokumente-
rade bevis finnas tillgängliga för att utesluta eventuella förlust- eller
föroreningsfenomen. Som ett alternativ till nedbrytning kan under vissa
förhållanden separationsmetoder (t.ex. extraktion) väljas för att separera
och/eller koncentrera analyterna från matrisbeståndsdelarna och för att
överföra proverna till analysutrustningen.
Vad beträffar kalibreringen, oberoende om den är extern eller baseras på
tillsatser av standardlösning, är det viktigt att arbetsområdet som
fastställts för analysmetoden inte överskrids. Vid externa kalibreringarär det obligatoriskt att kalibreringsstandarderna bereds i en lösning som
i så stor utsträckning som möjligt motsvarar provlösningens sammansätt-
ning. Bakgrundskorrigeringar skall också tillämpas om detta krävs med
hänsyn till specifika analytiska förhållanden.
2.4.2Ytterligare prestationskriterier och övriga krav för kvantitativa
analysmetoder
2.4.2.1Riktigheten hos kvantitativa metoder
Vid upprepade analyser av ett certifierat referensmaterial för
grundämnen får avvikelsen för det genomsnittliga innehållet, som har
bestämts genom experiment, från det certifierade värdet inte ligga
utanför gränsen ± 10 %. När det inte finns något certifierat referensma-
terial tillgängligt kan riktigheten hos mätningarna fastställas genom
återvinning av tillsatser av kända mängder av grundämnet till det
okända provet. Lägg märke till att det tillsatta grundämnet inte är
kemiskt bundet i den verkliga matrisen, vilket är fallet för analyten,
och att resultaten som fås med denna metod därför har mindre giltighet
än i de fall då de fåsgenom användning av certifierade referens material.Återvinningsdata godkänns endast om de ligger inom ± 10 % av
målvärdet.
2.4.2.2Precision för kvantitativa metoder
Vid upprepad analys av ett prov som utförs under reproducerbarhetsbe-
tingelser inom laboratoriet, får variationskoefficienten (CV) inom
laboratoriet för medelvärdet inte överstiga följande värden:
Tabell 8
Variationskoefficienter för kvantitativa metoder för ett antal massfraktioner för ett
grundämne
Massfraktion CV (%)
≥10µg/kg till 100 µg/kg 20
> 100 µg/kg till 1 000 µg/kg 15
≥1 000 µg/kg 10
2.4.3Särskilda krav för pulspolarografi
Det är av största vikt att organiskt material i proverna bryts ned full-
ständigt innan pulspolarografibestämningar utförs. Inga breda utslag
som beror på förekomst av organiskt material får förekomma i voltam-
mogrammen. Höjden på topparna kan vid pulspolarografi påverkas av
oorganiska matrisbeståndsdelar. Därför skall kvantifieringen ske med
hjälp av tillsatser av standardlösning. Ett typexempel på ett voltammo-
gram av en provlösning skall bifogas metodbeskrivningen.
2.4.4Särskilda krav för atomabsorptionsspektrometri (AAS)
Denna teknik används i huvudsak för ett enskilt grundämne och kräver
därför optimering av de experimentella inställningarna beroende på
vilket grundämne som skall kvantifieras. När det är möjligt skall resul-
taten kontrollerasbåde kvalitativt och kvantitativt genom användning av
alternativa absorptionslinjer (helst skall två olika linjer väljas ut). Kalib-
reringsstandarderna skall beredas i en matrislösning som i så stor
utsträckning som möjligt motsvarar provlösningen (t.ex. syrakoncentra-
tion eller modifierarens sammansättning). För att minimera blankvärden
skall alla reagenser ha högsta möjliga renhetsgrad. Olika typer av
atomabsorptionsspektometri kan särskiljas beroende på vilken metod
som har valts för att förånga och/eller atomisera provet.
2.4.4.1Särskilda krav för flam-AAS
Instrumentinställningarna skall optimeras för varje grundämne. Särskilt
skall gassammansättningen och flödena kontrolleras. För att undvika2002D0657 — SV — 17.08.2002 — 000.001 — 15
▼B
interferenser som orsakas av bakgrundsabsorption skall en kontinuerlig
källkompensator användas. Vid okända matriser skall en kontroll göras
om korrigering för bakgrunden behövs.
2.4.4.2Särskilda rekommendationer för grafitugns-AAS
Föroreningar i laboratoriet påverkar ofta noggrannheten när man arbetar
med ultralåga halter i grafitugnen. Därför skall reagenser av hög
renhetsgrad, avjoniserat vatten och inerta plastartiklar för hanteringen
av prov och standard användas. Instrumentinställningarna skall opti-
meras för varje grundämne. Särskilt förbehandlings- och
atomiseringsbetingelserna (temperatur, tid) och matrismodifieringen
skall kontrolleras.
Genom att arbeta under isotermiska atomiseringsbetingelser (t.ex. trans-
versellt uppvärmd grafitugn med integrerad L'vov-plattform) (8) minskas
matrisens inverkan på atomiseringen av analyten. Kvantifiering med
hjälp av en kalibreringskurva baserad på mätningar av vattenlösningar
av standarder får användas i kombination med matrismodifiering och
Zeeman-bakgrundskorrektion (9).
2.4.5Särskilda krav för atomabsorptionsspektrometri genom hydridgene-
rering
Organiska föreningar som innehåller grundämnen som arsenik, vismut,
germanium, bly, antimon, selen, tenn och tellur kan vara mycket stabila
och kräva oxidativ nedbrytning för att korrekt resultat för det totala
grundämnesinnehållet skall fås. Därför rekommenderas mikrovågsned-
brytning eller högtrycksföraskning under starkt oxidativa betingelser.
Det är mycket viktigt att omvandlingen av grundämnena till motsva-
rande hydrider är fullständig och reproducerbar.
Bildningen av arsenikhydrid i saltsyralösning med NaBH4beror på arse-
nikens oxidationstillstånd (As III: snabb bildning, As V: längre
bildningsperiod). För att undvika förluster av känsligheten vid
bestämning av As V med ”flow injection”-tekniken, som beror på den
korta reaktionstiden i systemet, skall As V reduceras till As III efter
den oxidativa nedbrytningen. Kaliumjodid/citronsyra eller cystein är
lämpliga att använda till detta. Blankprover, kalibreringslösningar och
provlösningar skall behandlas på samma sätt. Genom att arbeta med ett
satssystem kan båda arseniktyperna bestämmas utan att noggrannheten
påverkas. På grund av den försenade bildningen av As V-hydrid skall
kalibreringen ske vid integreringen av topparean. Instrumentinställning-
arna skall optimeras. Gasflödet, som överför hydriden till
atomiseringsmunstycket, är särskilt viktigt och skall kontrolleras.
2.4.6Särskilda krav för atomabsorptionsspektrometri genom hydridgene-
rering
Kall flamlös AAS används endast för kvicksilver. På grund av
förångningen och adsorptionsförluster av elementärt kvicksilver skall
särskild försiktighet iakttagas under hela analysen. Förorening från
reagenser eller omgivningen skall omsorgsfullt undvikas.
Organiska föreningar som innehåller kvicksilver kräver oxidativ
nedbrytning för att rätt resultat för den totala mängden kvicksilver skall
fås. Vid nedbrytningen skall slutna system med mikrovågsnedbrytning
eller högtrycksföraskning användas. Särskild försiktighet krävs vid
rengöring av den utrustning som har varit i kontakt med kvicksilver.
Det är fördelaktigt att använda ”flow injection”-tekniken. Vid lägre
beslutsgränser rekommenderas adsorption av elementärt kvicksilver på
guld/platina-adsorbent följd av termisk nedbrytning. Mätningen störs
om adsorbenten eller cellen kommer i kontakt med fukt och detta skall
därför undvikas.
2.4.7Särskilda krav för ICP-atomemissionsspektrometri (ICP-AES)
Induktivt kopplad plasma-atomemissionsspektrometri (10) är en metod
för analysav flera grundämnen. Metoden medger s amtidiga mätningar
av flera olika grundämnen. Vid användning av ICP-atomemissionsspekt-
rometri skall en nedbrytning av proverna först ske för att sönderdelaorganiska matriser. Vid nedbrytningen skall slutna system med mikro-
vågsnedbrytning eller högtrycksföraskning användas.
Instrumentkalibreringen och valet av grundämne eller våglängd spelar
en avgörande roll för resultatet av en ICP-AES-analys. Vid instrument-
kalibreringen, då kalibreringskurvorna är linjära, krävs vanligtvis endast
mätning av kalibreringslösningarna vid fyra koncentrationer, eftersom
kalibreringskurvorna för ICP-atomemissionsspektrometri i allmänhet är
linjära över fyra till sex storleksordningar för koncentrationen. Kalibrer-
ingen av ICP-AES-system bör normalt utföras med en standard som2002D0657 — SV — 17.08.2002 — 000.001 — 16
▼B
innehåller flera grundämnen. Standarden skall beredas i en lösning som
har samma syrakoncentration som provlösningen. Grundämneskoncen-
trationerna skall kontrolleras för den linjära kurvan.
Valet av våglängder för mätning av analyternas emission är lämpligt för
koncentrationerna av de grundämnen som skall bestämmas. Om analyt-
koncentrationen hamnar utanför arbetsområdet för en emissionslinje
skall en annan emissionslinje väljas. Först och främst skall den känsli-
gaste emissionslinjen (utan störning) väljas, därefter en mindre känslig
linje. Om arbetsområdet ligger vid eller nära detektionsgränsen är den
känsligaste linjen för respektive analyt oftast det bästa valet. Spektral-
och bakgrundsinterferenser orsakar stora problem vid ICP-atomemis-
sionsspektrometri. Exempel på möjliga interferenser är enkel
bakgrundsdrift, lutande bakgrundsdrift, direkt spektral överlappning och
komplex bakgrundsdrift. Var och en av dessa interferenser har sina egna
orsaker och åtgärder. Beroende på matriserna skall korrigering av inter-
ferensen och optimering av driftparametrarna tillämpas. Vissa
interferenser kan undvikas genom utspädning eller anpassning av matri-
serna. För varje sats analysprover skall referensmaterialet och det
spetsade materialet som innehåller kända mängder av analyten eller
analyterna samt blankmaterial behandlas på samma sätt som analyspro-
verna. För att testa avdriften skall standarden kontrolleras efter
exempelvis tio prover. Alla reagenser och plasmagasen skall ha högsta
möjliga renhetsgrad.
2.4.8Särskilda krav för ICP-masspektrometri (ICP-MS) (11)
Vid bestämning av spårämnen med genomsnittlig atomvikt, exempelvis
krom, koppar och nickel, finnsdet ris k för kraftig interferensfrån andra
isobariska och mångatomiga joner. Detta kan undvikas endast när
tillgänglig upplösningsförmåga är åtminstone 7 000–8 000. Svårigheter i
samband med masspektrometriteknikerna omfattar instrumentdrift,
matriseffekter och molekyljonsinterferens (m/z < 80). Flera inre standar-
diseringar i samma massområde som grundämnena som skall bestämmas
krävs för att korrigera instrumentdrift och matriseffekter.
Fullständig nedbrytning av organiskt material i proverna krävs innan
mätningar med ICP-masspektrometri utförs. Liksom för atomabsorp-
tionsspektometri skall flyktiga grundämnen, exempelvis jod, överföras
till ett stabilt oxidationstillstånd efter nedbrytningen i slutna kärl. Den
svåraste interferensen kommer från molekyljonskombinationer av argon
(plasmagas), väte, kol, kväve och syre (upplösningssyror, föroreningar i
plasmagas och atmosfäriska gaser som kommer med flödet) och prov-
matrisen. För att undvika interferenser krävs fullständig nedbrytning,
bakgrundsmätningar, lämpligt val av analysmängder ibland förbundet
med en lägre förekomst (sämre detektionsgräns) och upplösningssyror,
t.ex. salpetersyra.
För de grundämnen som skall bestämmas skall interferenser undvikas
genom ett lämpligt val av specifika analysmängder inklusive kontroll
av isotopkvoter. Instrumentrespons med hänsyn till Fano-faktorer skall
kontrollerasinnan varje mätning med hjälp av inre s tandarder.
3.VALIDERING
Validering skall visa att den analytiska metoden är förenlig med de kriterier som
är tillämpliga på de aktuella prestationskarakteristika.
Olika kontrollsyften kräver olika metodkategorier. Följande tabell anger vilka
prestationskarakteristika som skall bestämmas för respektive metod.
Tabell 9
Klassificering av analysmetoder genom de prestationskarakteristika som skall bestämmas
Detek-
tionsförmå-
gan CCBBeslutsgrä-
nsCC αRiktighet/
återvinningPrecisionSelekti-
vitet/speci-
ficitetTillämp-
lighet/
motstånds-
förmåga/
Stabilitet
Kvalitativa
metoder:S+–––++
C++––++
Kvantita-
tiva
metoder:S+––+++
C++++++2002D0657 — SV — 17.08.2002 — 000.001 — 17
▼B
S = screeningmetoder; C = konfirmeringsmetoder; + = bestämningen är obligatorisk
3.1 VALIDERINGSFÖRFARANDEN
Detta kapitel ger exempel och/eller referenser på förfaranden vid validering av
analytiska metoder. Andra sätt att visa att den analytiska metoden är förenlig
med prestationskriterierna för prestationskarakteristika kan användas, förutsatt
att de ger information av samma grad och kvalitet.
Validering kan också utföras genom en mellanlaboratorieavprovning som det är
fastställt i Codex Alimentarius, ISO eller IUPAC (12), eller enligt alternativa
metoder, såsom enskilda laboratoriestudier eller inomlaboratorievalidering
(13) (14). Denna del fokuserar på studier vid enskilda laboratorier (eller inom-
laboratorievalidering) genom användning av ett modulärt tillvägagångssätt.
Detta tillvägagångssätt består av:
1. ett antal allmänna prestationskarakteristika som är oberoende av vilken vali-
deringsmodell som används, och
2. mer specifika modellberoende förfaranden enligt beskrivning i tabell 10.
Tabell 10
Modelloberoende och modellberoende prestationsparametrar
Validering
Modelloberoende prestationspara-
metrarModellberoende prestationsparametrar
Allmänna prestationskarakteris-
tika (3.1.1)Konventionell validering-
smetod (3.1.2)Inomlaboratorievalidering-
smetod (3.1.3)
Specificitet Återvinning Återvinning
Riktighet Repeterbarhet Repeterbarhet
Motståndsförmåga: mindre
ändringarInomlaboratoriereproducer-
barhetInomlaboratoriereproducer-
barhet
Stabilitet Reproducerbarhet Reproducerbarhet
Beslutsgräns (CC α) Beslutsgräns (CC α)
Detektionsförmåga (CC β) Detektionsförmåga (CC β)
Kalibreringskurvor Kalibreringskurvor
Motståndsförmåga: större
ändringarMotståndsförmåga
3.1.1Modelloberoende prestationskarakteristika
Oberoende av vilken valideringsmetod som väljs, skall följande presta-
tionskarakteristika bestämmas. För att minska arbetsbördan kan ett
noggrant utformat och statistiskt sunt sätt användas för att kombinera
experimenten som utförs för bestämningen av de olika parametrarna.
3.1.1.1Specificitet
För analytiska metoder är det viktigt att kunna skilja mellan analyten
och nära relaterade substanser (isomerer, metaboliter, nedbrytningspro-
dukter, endogena substanser, matrisbeståndsdelar etc.). Det krävs två
metoder för att kontrollera om det finnsinterferens er.
Därför skall eventuella ämnen som kan interferera väljas och relevanta
blankprov analyseras för att påvisa förekomsten av eventuella interfe-
renser och för att uppskatta deras effekt.
— Välj ett antal kemiskt relaterade föreningar (metaboliter, derivat etc.)
eller andra ämnen som sannolikt förekommer i samband med
föreningen i fråga och som kan finnas i proverna.
— Analysera ett lämpligt antal representativa blankprov (n ≥20) och
kontrollera om det finns interferenser (signaler, toppar, jonspår) i
området ifråga där målanalyten förväntaseluera.
— Vidare skall representativa blankprover spetsas vid relevant koncen-
tration med ämnen som är benägna att interferera med
identifieringen och/eller kvantifieringen av analyten.2002D0657 — SV — 17.08.2002 — 000.001 — 18
▼B
— Undersök efter analysen huruvida
— förekomsten kan leda till falsk identifiering, eller
— identifieringen av målanalyten hindrasav förekoms ten av en
eller flera interferenser eller
— kvantifieringen märkbart påverkas.
3.1.1.2Riktighet
I detta avsnitt beskrivs bestämningen av riktighet (en del i begreppet
noggrannhet). Riktigheten kan endast fastställas med hjälp av certifierat
referensmaterial. Om det finns ett certifierat referensmaterial skall detta
användas. Metoden beskrivs i detalj i ISO 5725-4 (5). Nedan finns ett
exempel.
— Analysera sex replikat av certifierat referensmaterial i enlighet med
provinstruktionerna för metoden.
— Bestäm koncentrationen för analyten som finns i varje replikatprov.
— Beräkna medelvärdet, standardavvikelsen och variationskoefficienten
(procent) för dessa koncentrationer.
— Beräkna riktigheten genom att dividera den påvisade medelkoncen-
trationen med det certifierade värdet (mätt som koncentration) och
multiplicera med 100 för att uttrycka resultatet i procent.
Riktighet (procent) = påvisad genomsnittlig koncentration korrigerad
med avseende på återvinningen x 100/certifierat värde.
Om det inte finnsnågot certifierat referens material kan återvinningen
bestämmas enligt beskrivningen i 4.1.2.1.
3.1.1.3Tillämplighet/motståndsförmåga (mindre ändringar)
I dessa undersökningar används mindre, rimliga variationer som avsikt-
ligt införts av laboratoriet och observationen av konsekvenserna.
Förundersökningar utförs genom val av faktorer för förbehandling av
provet, rening och analys som kan påverka mätresultaten. Sådana
faktorer kan omfatta personen som utför analysen, reagensernas källa
och ålder, lösningsmedel, standarder och provextrakt, uppvärmningshas-
tigheten, temperaturen, pH-värdet samt många andra faktorer som kan
förekomma i laboratoriet. Dessa variationer skall modifieras i den
omfattning som motsvarar de avvikelser som vanligen uppkommer
mellan laboratorier.
— Identifiera möjliga faktorer som kan påverka resultaten.
— Variera varje faktor något.
— Genomför ett test av motståndsförmågan genom att använda
Youden-metoden (15) (16). (Andra godkända metoder kan användas
vid detta tillfälle. Youden-metoden minimerar dock tiden och arbets-
insatsen.) Youden-metoden är ett ofullständigt faktorförsök.
Interaktionen mellan olika faktorer kan inte påvisas.
— Om det konstateras att en faktor påverkar mätresultatet signifikant,
utförsytterligare experiment för att bes tämma de godtagbara
gränserna för denna faktor.
— Faktorer som signifikant inverkar på resultatet skall tydligt markeras
i försöksplanen.
Grundtanken är inte att undersöka en ändring åt gången utan att införa
flera variationer samtidigt. Exempel: Låt A, B, C, D, E, F, G beteckna
de nominella värdena för sju olika faktorer som skulle kunna påverka
resultaten om deras nominella värden ändrades något. Låt deras alterna-
tiva värden betecknas med de motsvarande gemena bokstäverna a, b, c,
d, e, f och g. Detta ger resultatet 27eller 128 olika möjliga kombina-
tioner.
Det är möjligt att välja en delmängd på åtta av dessa kombinationer som
är balanserad med avseende på versaler och gemener (tabell 11). Åtta
bestämningar skall göras, i vilka en kombination av de valda faktorerna
(A–G) används. Resultatet av dessa bestämningar visas som S–Z i tabell
11 nedan.2002D0657 — SV — 17.08.2002 — 000.001 — 19
▼B
Tabell 11
Experimentmodell för undersökning av motståndsförmåga (mindre ändringar)
Faktorvärde FKombination av bestämningar nr
12345678
A/a A A A A a a a a
B/b B B b b B B b b
C / c CcCcCcCc
D/d D D d d d d D D
E / e EeEeeEeE
F / f FffFFffF
G / g GggGgGGg
Observerade
resultat RSTUV W XYZ
För beräkningar, se exempel på test av motståndsförmåga i 3.3.
3.1.1.4Stabilitet
Man har kunnat iaktta att otillräcklig stabilitet hos analyten eller matri-
sens beståndsdelar under lagring eller analys av provet kan ge upphov
till signifikanta avvikelser hos analysresultatet. Vidare bör kalibrering-
sstandardens stabilitet i lösningen kontrolleras. Vanligtvis är analytens
stabilitet väl beskriven under olika lagringsförhållanden. Övervakning
av lagringsförhållandena utgör en del av det normala ackrediteringssys-
temet för laboratorier. Om förhållandena inte är kända, visar exemplen
nedan hur stabiliteten kan bestämmas.
Stabiliteten hosanalyten i lös ning— Bered nya stamlösningar för analyten eller analyterna och späd
enligt specifikation i provinstruktionerna för att få tillräckligt
många alikvoter (t.ex. 40) av varje vald koncentration (omkring den
lägsta funktionsgräns som krävs för ämnen som saknar fastställd
funktionsgräns eller omkring den tillåtna gränsen för andra ämnen.
Bered båda lösningarna för den analyt som används för spetsning
och i den slutliga analyslösningen och alla andra lösningar som ärav intresse (t.ex. standarder av derivat).
— Mät analytkoncentrationen i den nyberedda lösningen enligt
provinstruktionerna.
— Portionera lämpliga mängder i passande behållare, märk och lagra
enligt planen nedan:
Tabell 12
Plan för bestämning av analytstabilitet i lösning.
–2 0º C +4º C +2 0º C
Mörkt 10 alikvoter 10 alikvoter 10 alikvoter
Ljust 10 alikvoter
— Lagringstiden kan väljas till 1, 2, 3 och 4 veckor eller längre vid
behov, t.ex. tills de första nedbrytningsfenomenen kan observeras
under identifieringen och/eller kvantifieringen. Den maximala
lagringstiden och de optimala lagringsförhållandena skall registreras.
— Beräkningen av koncentrationen av analyt(er) i varje alikvot skall
göras genom att den nyberedda analyslösningen får anta värdet 100
procent vid tiden för analysen.
Resterande analyt (procent) = Ci × 100/Cny
Cikoncentration vid aktuell tidpunkt
Cnykoncentration för nyberedd lösning2002D0657 — SV — 17.08.2002 — 000.001 — 20
▼B
Stabilitet hosanalyt(er) i matris
— När det är möjligt skall förvärvade prover användas. Om det inte
finns något förvärvat material att tillgå, skall matris som spetsats
med analyten användas.
— Om det finnsförvärvat material att tillgå, s kall koncentrationen i
materialet bestämmas medan materialet fortfarande är nytt. Ytterli-
gare alikvoter av materialet skall tas ut efter 1, 2, 4 och 20 veckor
och koncentrationerna skall bestämmas. Vävnaden skall lagras vid
minus 20 ºC eller lägre temperatur om så krävs.
— Om det inte finnsnågot förvärvat material att tillgå, användsen liten
mängd blankmaterial som homogeniseras. Dela upp materialet i fem
alikvoter. Spetsa varje alikvot med analyten, som helst skall beredas
i en liten mängd vattenlösning. Analysera omedelbart en alikvot.
Spara resterande alikvoter vid minus 20 ºC eller lägre temperatur
och analysera dem efter 1, 2, 4 och 20 veckor.
3.1.1.5Kalibreringskurvor
Då kalibreringskurvor används för kvantifiering skall
— minst fem nivåer (inklusive noll) användas för att konstruera kurvan,
— kurvans arbetsområde beskrivas,
— kurvans matematiska formel och anpassningsgraden för data till
kurvan beskrivas,
— godtagbarhetsområden för kurvans parametrar beskrivas.
När seriell kalibrering baserad på en standardlösning behövs, skall
godtagbara områden angesför de parametrar för kalibrerings kurvan
som kan variera från serie till serie.
3.1.2Konventionell valideringsmetod
Beräkningen av parametrarna enligt konventionella metoder kräver att
flera enskilda experiment utförs. Varje prestationskarakteristik skall
bestämmas för varje större ändring (se under punkten ”tillämplighet/
motståndsförmåga” ovan). Vid metoder som använder flera analyter
kan många analyter analyseras samtidigt under förutsättning att eventu-
ella relevanta interferenser har uteslutits i förväg. Många
prestationskarakteristika kan bestämmas på liknande sätt. Därför
förordas att experimenten kombineras i så stor utsträckning som möjligt
(t.ex. repeterbarhet och inomlaboratoriereproducerbarhet med specifi-
citet, analys av blankprover för att bestämma detektionsgränsen och för
att testa specificiteten).
3.1.2.1Återvinning
Om det inte finnsnågot certifierat material att tillgå, s kall återvinningen
bestämmas experimentellt med hjälp av spetsade blankmatriser, exem-
pelvisenligt planen nedan:
— Välj 18 alikvoter av ett blankmaterial och spetsa 6 alikvoter på
vardera nivån som motsvarar 1, 1,5 och 2 gånger den lägsta funk-
tionsgräns som krävs eller 0,5, 1 och 1,5 gånger den tillåtna gränsen.
— Analysera proverna och beräkna koncentrationen för varje prov.
— Beräkna återvinningen för varje prov med hjälp av ekvationen
nedan.
— Beräkna den genomsnittliga återvinningen och variationskoeffi-
cienten för de sex resultaten på varje nivå.
— Procent återvinning = 100 × uppmätt innehåll/spetsningsmängd.
Denna konventionella metod för bestämningen av återvinningen är en
variant av metoden som beskrivs i punkt 3.5, med tillsatser av stan-
dardlösningar, då
— provet betraktas som ett blankprov i stället för ett prov som skall
analyseras,
— man anser att utbytet(1) och återvinningen(2) är lika för de två prov-
portionerna,
— proverna har samma massa och provportionen extraherar samma
volymer,2002D0657 — SV — 17.08.2002 — 000.001 — 21
(1) Utbyte: den del av analytens massa som finns i det prov som förekommer i slutext-
raktet.
(2) Återvinning (här): den del av analytens massa som tillsätts provet, som ingår i slutext-
raktet. I resten av dokumentet förutsätts det att utbytet och återvinningen är lika, varför
endast termen ”återvinning” används.
▼B
— mängden kalibreringsstandard som tillsätts den andra provportionen
(med tillsats) märks xADD, (xADD = ρA*VA),
— x1 är det uppmätta värdet av blankprovet och x2 är det uppmätta
värdet av den andra provportionen (med tillsats).
— Då fåsatt den procentuella återvinningen = 100 (x2 – x1)/xADD
Om något av ovanstående villkor inte kommer (eller antas komma) att
uppfyllas, skall hela förfarandet för bestämning av återvinningen med
hjälp av tillsatser av standardlösningar utföras enligt 3.5.
3.1.2.2Repeterbarhet
— Bered en uppsättning prover med identiska matriser, spetsade med
analyten till koncentrationer som motsvarar 1, 1,5 och 2 gånger den
funktionsgräns som krävs eller 0,5, 1 och 1,5 gånger den tillåtna
gränsen.
— På varje nivå skall analysen utföras med minst sex replikat.— Analysera proverna.
— Beräkna koncentrationerna som påvisas i varje prov.
— Beräkna medelvärdet, standardavvikelsen och variationskoefficienten
(procent) för de spetsade proverna.
— Upprepa dessa steg vid minst två andra tillfällen.— Beräkna de totala medelkoncentrationerna och variationskoeffi-
cienten för de spetsade proverna.
3.1.2.3Inomlaboratoriereproducerbarhet
— Bered en uppsättning prover av specificerat provmaterial (identiska
eller olika matriser), spetsade med analyten eller analyterna till
koncentrationer som motsvarar 1, 1,5 och 2 gånger den lägsta funk-
tionsgräns som krävs eller 0,5, 1 och 1,5 gånger den tillåtna gränsen.
— På varje nivå skall analysen utföras med minst sex replikat.
— Upprepa dessa steg vid minst två olika tillfällen med olika personer
och olika miljöbetingelser, t.ex. olika reagenssatser, lösningsmedel
etc., olika rumstemperaturer, olika instrument etc. om det är möjligt.
— Analysera proverna.— Beräkna koncentrationerna som påvisas i varje prov.— Beräkna medelvärdet, standardavvikelsen och variationskoefficienten
(procent) för de spetsade proverna.
3.1.2.4Reproducerbarhet
När reproducerbarhet skall verifieras, bör laboratorier delta i kollabora-
tiva undersökningar enligt ISO 5725-2 (5).
3.1.2.5Beslutsgräns (CC α)
Beslutsgränsen skall fastställas enligt kraven för identifiering eller iden-
tifiering och kvantifiering på det sätt som anges i ”Prestationskriterier
för och övriga krav på analytiska metoder” (avsnitt 2).
När det gäller ämnen som saknar fastställd gräns, kan CC αbestämmas:
— Genom kalibreringskurvsförfarandet i enlighet med ISO 11843 (17)
(här benämnt ”critical value of the net state variable”, ung. ”kritiska
värdet för nettotillståndsvariabeln”). I detta fall skall blankmaterial
användas som spetsats vid och över den lägsta funktionsgräns som
krävs i multipla steg med inbördes konstant avstånd. Analysera
proverna. Efter identifiering plottas signalen mot den tillsatta
koncentrationen. Motsvarande koncentration vid skärningen med y-
axeln plus 2,33 gånger standardavvikelsen för inomlaboratorierepro-
ducerbarheten för skärningen är lika med beslutsgränsen. Detta
gäller endast kvantitativa undersökningar ( α= 1 procent).
— Genom analysav mins t 20 blankmaterial per matrisför att beräkna
signal-brusförhållandet vid det tidsfönster som analyten förväntas
komma. Som beslutsgräns kan tre gånger signal-brusförhållandet
användas. Detta gäller kvantitativa och kvalitativa undersökningar.
När det gäller ämnen med en fastställd gräns, kan CC αbestämmas:
— Genom kalibreringskurvsförfarandet i enlighet med ISO 11843 (17)
(här benämnt ”critical value of the net state variable”, ung. ”kritiska
värdet för nettotillståndsvariabeln”). I detta fall skall blankmaterial
användas som spetsats vid och över den tillåtna gränsen i multipla
steg med konstant inbördes avstånd. Analysera proverna. Efter iden-
tifiering plottas signalen mot den tillsatta koncentrationen.
Motsvarande koncentration vid den tillåtna gränsen plus 1,64 gånger
standardavvikelsen för inomlaboratoriereproducerbarheten är lika
med beslutsgränsen ( α= 5 %).2002D0657 — SV — 17.08.2002 — 000.001 — 22
▼B
— Genom att analysera minst 20 blankmaterial per matris som spetsats
med analyt(er) vid beslutsgränsen. Koncentrationen vid den tillåtna
gränsen plus 1,64 gånger motsvarande standardavvikelse motsvarar
beslutsgränsen ( α= 5 %).
Se även artikel 5 och punkt 3.2.
3.1.2.6Detektionsförmåga (CC β)
Detektionsförmågan skall bestämmas enligt kraven för identifiering eller
identifiering pluskvantifiering enligt definitionen (s e del 2).
När det gäller ämnen som saknar fastställd gräns, kan CC βbestämmas:
— Genom kalibreringskurvsförfarandet i enlighet med ISO 11843 (17)
(här benämnt det minsta detekterbara värdet för nettotillståndsvaria-
beln). I detta fall skall blankmaterial användas som spetsats vid och
under den minsta funktionsgräns som krävs i multipla steg med
inbördes konstant avstånd. Analysera proverna. Efter identifiering
plottas signalen mot den tillsatta koncentrationen. Motsvarande
koncentration vid beslutsgränsen plus 1,64 gånger standardavvi-
kelsen för inomlaboratoriereproducerbarheten för det genomsnittligt
uppmätta innehållet vid beslutsgränsen är lika med detek-
tionsförmågan ( β= 5 %).
— Genom analys av minst 20 blankmaterial per matris som spetsats
med analyt(er) vid beslutsgränsen. Analysera proverna och identi-
fiera analyterna. Värdet för beslutsgränsen plus 1,64 gånger
standardavvikelsen för inomlaboratoriereproducerbarheten för det
uppmätta innehållet är lika med detektionsförmågan ( β= 5 %).
— Om det inte finnsnågra kvantitativa res ultat tillgängliga kan detek-
tionsförmågan bestämmas genom undersökning av spetsat
blankmaterial vid och över beslutsgränsen. I detta fall är koncentra-
tionsnivån, då endast ≤5 % falskt negativa resultat kvarstår, lika
med detektionsförmågan för metoden. Därför skall minst 20
undersökningar på minst en koncentrationsnivå utföras för att garan-
tera ett tillförlitligt underlag för denna bestämning.
När det gäller ämnen som har en fastställd gräns, kan CC βbestämmas:
— Genom kalibreringskurvsförfarandet i enlighet med ISO 11843 (17)
(här benämnt ”minimum detectable value of the net state variable”,
ung. ”det minsta detekterbara värdet för nettotillståndsvariabeln”). I
detta fall skall blankmaterial användas som spetsats vid och över den
tillåtna gränsen i multipla steg med konstant inbördes avstånd.
Analysera proverna och identifiera analyten eller analyterna.
Beräkna standardavvikelsen för det genomsnittligt uppmätta
innehållet vid beslutsgränsen. Motsvarande koncentration vid värdet
för beslutsgränsen plus 1,64 gånger standardavvikelsen för inomla-
boratoriereproducerbarheten är lika med detektionsförmågan
(β= 5 %).
— Genom att analysera minst 20 blankmaterial per matris som spetsats
med analyt(er) vid beslutsgränsen. Värdet för beslutsgränsen plus
1,64 gånger motsvarande standardavvikelse är lika med detek-
tionsförmågan ( β= 5 %).
Se även 3.2.
3.1.2.7Motståndsförmåga (större ändringar)
Den analytiska metoden skall testas under olika experimentella
förhållanden, som exempelvis omfattar olika arter, olika matriser eller
olika provtagningsbetingelser. De ändringar som införs bör vara bety-
dande. Betydelsen av dessa ändringar kan utvärderas exempelvis
genom användning av Youden-metoden (15) (16). Varje prestationska-
rakteristik skall bestämmas för alla större ändringar som har visat sig
ha en signifikant effekt på undersökningens prestanda.
3.1.3Validering enligt alternativa modeller
Om alternativa valideringar tillämpass kall den underliggande modellen
och strategin med respektive förutsättningar, antaganden och formler
fastställas i valideringsplanen eller åtminstone hänvisningar ges till var
de finnstillgängliga. Nedan gesett exempel på en alternativ metod.
Vid tillämpning av exempelvisden inomlaboratorievaliderings modellen,
bestäms prestationskarakteristika på ett sätt som tillåter validering av
större ändringar inom samma valideringsförfarande. Detta kräver att en
experimentell valideringsplan utformas.
3.1.3.1Experimentell plan
En experimentell plan skall utformas med hänsyn till antalet olika arter
och olika faktorer som skall undersökas. För att de viktigaste arterna och2002D0657 — SV — 17.08.2002 — 000.001 — 23
▼B
de faktorer som kan inverka på mätresultaten skall kunna väljas ut, skall
därför det första steget i hela valideringen gälla de provpopulationer som
skall analyseras i laboratoriet i framtiden. Därefter skall koncentrations-
området väljas ut på ett ändamålsenligt sätt med hänsyn till den givna
nivån.
Exempel:
— Flera analyter kan undersökas samtidigt med analysmetoden som
valideras.
— Två variationer av huvudfaktorn har identifierats(A och B). Huvud-
faktorerna utgör grunden för vilka faktornivåer som kombineras.
Dessa huvudfaktorer kan omfatta faktorer som exempelvis arter eller
matris. I detta exempel varierades huvudfaktorn på två nivåer, dvs.
två olika arter (art A och B) beaktades. I allmänhet kan man variera
huvudfaktorerna på mer än två nivåer, vilket dock endast ökar
antalet analyser som skall utföras.
— Dessa utvalda faktorer skall varieras på två nivåer (angivna som
antingen + eller -).
Tabell 13
Exempel på faktorer som anses viktiga för ett valideringsförfarande
Djuretskön (faktor 1)
Ras(faktor 2)
Transportförhållanden (faktor 3)Lagringsförhållanden (faktor 4)
Provetsfärs khet (faktor 5)
Uppfödningsförhållanden (faktor 6)Olika personer med olika erfarenheter (faktor 7)
Tabell 14
Möjlig experimentell plan för ovanstående exempel
Art Faktor 1 Faktor 2 Faktor 3 Faktor 4 Faktor 5 Faktor 6 Faktor 7 Prov nr
A+ + + + – + – 1
A+ + – – + – – 2
A +–+–––+ 3
A +––++++ 4
A –++–+++ 5
A– + – + – – + 6A ––+++–– 7
A –––––+– 8
B +++++–+ 9
B ++–––++ 1 0
B +–+–++–1 1
B +––+––– 1 2
B –++–––– 1 3
B –+–+++–1 4
B– – + + – + + 1 5
B ––––+–+ 1 6
Eftersom varje prov (varje kombination av faktornivå) skall spetsas med
fyra olika koncentrationer i närheten av den givna nivån och ett blank-
prov skall analyseras för varje nivå, skall 5 x 16 = 80 analyser utföras
för hela valideringsexperimentet.
Från dessa 80 mätresultat kan man beräkna (13) (14).2002D0657 — SV — 17.08.2002 — 000.001 — 24
▼B
Återvinning
— Repeterbarheten per koncentrationsnivå (sir).
— Inomlaboratoriereproducerbarheten per koncentrationsnivå (siR).
— Beslutsgräns (CC α).
— Detektionsförmåga (CC β).
— Styrkefunktion ( β-feltäthet mot koncentration kapitel (se punkt
3.1.3.2).
— Motståndsförmåga mot större ändringar; motståndsförmåga mot
mindre ändringar kan bestämmas i enlighet med punkt 3.1.1.3.
— 16 provrelaterade kalibreringskurvor.— 1 generell kalibreringskurva.— Prediktionsintervall för den generella kalibreringskurvan.— Matrisinducerade avvikelser (s
mat).
— Körningsinducerade avvikelser (srun).
— Effekten av de individuella faktorerna på mätresultaten.
Dessa prestationskarakteristika möjliggör en övergripande utvärdering
av prestationsnivån för metoden, eftersom inte bara inverkan av de indi-
viduella faktorerna undersöks utan även de relevanta kombinationerna
av dessa faktorer. Med hjälp av denna experimentutformning kan man
bestämma om den ena eller den andra av de valda faktorerna skall
uteslutas från den totala kalibreringskurvan, eftersom faktorn avviker
signifikant från standardavvikelserna för de andra faktorerna.
3.1.3.2Styrkefunktion
Styrkefunktionen ger information om metodensdetektions förmåga inom
det valda koncentrationsområdet. Den hänför sig till risken för β-fel när
den tillämpas på den undersökta metoden. Med hjälp av styrkefunk-
tionen kan detektionsförmågan för respektive metodkategori (kontroll,
konfirmation) eller typ av metod (kvalitativ eller kvantitativ) beräknas
för ett bestämt β-fel (t.ex. 5 %).2002D0657 — SV — 17.08.2002 — 000.001 — 25
▼B
Figur 1:
Styrkefunktion
Figur 1 visar ett exempel på en grafisk bestämning av detek-
tionsförmågan (CCß). För just den här metoden är den återstående
risken att ta ett felaktigt negativt beslut 5 % vid en koncentration på
0,50 µg/kg. Vid koncentrationen 0,55 µg/kg har risken för ett falskt
negativt resultat minskat till 1 procent.
3.1.3.3Reproducerbarhet
Bestämningen av en metods reproducerbarhet med hjälp av inomlabora-
torievalideringsprincipen kräver deltagande i en kvalifikationsprövning i
enlighet med ISO Guide 43-1 (3) och 43-2 (4). Laboratorierna kan
själva välja metoder, förutsatt att dessa metoder används under
rutinförhållanden. Laboratoriets standardavvikelse kan användas för att
fastställa metodens reproducerbarhet.2002D0657 — SV — 17.08.2002 — 000.001 — 26
▼B
3.2 GRAFISK FRAMSTÄLLNING AV DE OLIKA ANALYTISKA
GRÄNSVÄRDENA
Figur 2:
Ämnen för vilka inga tillåtna gränser har fastställts
2002D0657 — SV — 17.08.2002 — 000.001 — 27
▼B
Figur 3:
Ämnen med en fastställd tillåten gräns
2002D0657 — SV — 17.08.2002 — 000.001 — 28
▼B
3.3 BERÄKNINGSEXEMPEL FÖR TEST AV MOTSTÅNDSFÖRMÅGA
MOT MINDRE ÄNDRINGAR I ENLIGHET MED YOUDENMETODEN
(16)
Jämförelse av medelvärden (A)
AA=Σ(Ai)/4
AB=Σ(Bi)/4
AC=Σ(Ci)/4
AD=Σ(Di)/4
AE=Σ(Ei)/4
AF=Σ(Fi)/4
AG=Σ(Gi)/4
Aa=Σ(ai)/4
Ab=Σ(bi)/4
Ac=Σ(ci)/4
Ad=Σ(di)/4
Ae=Σ(ei)/4
Af=Σ(fi)/4
Ag=Σ(gi)/4Jämför medelvärdena för versaler (AAtill AG) med medelvärdena för motsva-
rande gemener (Aatill Ag). Om en faktor har en effekt, kommer skillnaden att
vara signifikant större än skillnaderna för de andra faktorerna.
En metod med motståndsförmåga skall inte påverkas av ändringar som med
största sannolikhet förekommer mellan laboratorier.
Om det inte finns någon påfallande skillnad, fås det mest realistiska måttet på
det slumpvisa felet ur de sju differenserna.
Differenser (Di) Kvadraterna av differenserna (Di2)
Da=A–a= Σ(Ai)–Σ(ai)
Db=B–b= Σ(Bi)–Σ(bi)
Dc=C–c= Σ(Ci)–Σ(ci)
Dd=D–d= Σ(Di)–Σ(di)
De=E–e= Σ(Ei)–Σ(ei)
Df=F–f= Σ(Fi)–Σ(fi)
Dg=G–g= Σ(Gi)–Σ(gi)Da2= värdet a
Db2= värdet b
Dc2= värdet c
Dd2= värdet d
De2= värdet e
Df2= värdet f
Dg2= värdet g
Standardavvikelsen för differenserna Di(sDi):
Om sDisom fås på detta sätt är signifikant större än standardavvikelsen för
metoden som utförts under reproducerbarhetsbetingelser inom laboratoriet (se
ovan), är det på förhand givet att alla faktorerna tillsammans påverkar resultatet,
även om varje enskild faktor inte har någon signifikant inverkan, och attmetoden inte har tillräcklig motståndsförmåga gentemot valda modifieringar.
3.4 BERÄKNINGSEXEMPEL FÖR INOMLABORATORIEVALIDERINGEN
Exempel och beräkningar för inomlaboratorievalideringsplanen i enlighet med
vad som sägs om validering med alternativa modeller (punkt 3.1.3) (13) (14).
3.5 BERÄKNINGSEXEMPEL FÖR TILLSATS AV STANDARDLÖS-
NINGAR
Ett analysprov med innehållet T av analyten delas upp i två provportioner, 1 och
2, med de respektive massorna m1 och m2. Till provportion 2 tillsätts en volym
VA av lösningen med en analytkoncentration på ρA. Två extrakt av provportio-
nerna med de respektive volymerna V1 och V2 fås efter metodens extraktions-
och reningssteg. Återvinningen för analyten antas vara rc. Båda extrakten
undersöks med en mätmetod med känsligheten b och ger ett analyssvar på x1,
respektive x2.
Om man antar att rc och b är lika för analyten i det ursprungliga provet och i
provet med tillsats, kan innehållet T beräknas enligt följande:
T=x
1.V1.ρA.VA/(x2.V2.m1-x1.V1.m2)
Metoden gör det möjligt att bestämma återvinningen rc. Därefter, utöver
undersökningen som beskrivs ovan, tillsätts en känd mängd ρB.VBav analyten
till en del av extraktet av provportion 1 (volym V3) som därefter undersöks.
Det analytiska svaret är x3och återvinningen är:2002D0657 — SV — 17.08.2002 — 000.001 — 29
▼B
rc = x2.V1.V2.ρB.VB/[x3.V1.V3(T.m2+ρA.VA)-x2.V2.T.m1(V3-VB)]
Dessutom kan man beräkna känsligheten b som:b=x
1.V1/rc.T.m1
Alla tillämpningsvillkor och mer detaljerade uppgifter finns beskrivna (18).
4.FÖRKORTNINGAR SOM ANVÄNDS
AAS atomabsorptionsspektrometri
AES atomemissionsspektrometri
AOAC-I Association of Official Analytical Chemists InternationalB bunden fraktion (immunologiska undersökningar)CI kemisk jonisering
CRM certifierat referensmaterial
CV variationskoefficient2 D tvådimensionellDAD diod array-detektion
DPASV pulspolarografi
ECD elektroninfångningsdetektionEI elektronstötjonisationGC gaskromatografi
HPLC högpresterande vätskekromatografi
HPTLC högpresterande tunnskiktskromatografiHRMS högupplösande (masspektrometri)ICP-AES ICP-atomemissionsspektrometri
ICP-MS ICP-masspektrometri
IR infrarödISO Internationella standardiseringsorganisationenLC vätskekromatografi
LR(MS) lågupplösande (masspektrometri)
MRPL lägsta funktionsgräns som krävsMS masspektrometrim/z massa/laddningsförhållande
RF relativ vandring till lösningsmedelsfronten (TLC)
RSDL relativa standardavvikelser för laboratorietSIM selektiv jonanalysTLC tunnskiktskromatografi
UV ultraviolett ljus
VIS synligt ljus
5.REFERENSER
(1) ISO 17025: 1999 General requirement for the competence of calibration
and testing laboratories
(2) ISO 3534-1: 1993 Statistical Methods for quality control – Vol. 1 voca-
bulary and symbols
(3) ISO Guide 43-1: 1997 Proficiency testing by interlaboratory compari-
sons – Part 1: Development and operation of proficiency testing
schemes
(4) ISO Guide 43-2: 1997 Proficiency testing by interlaboratory compari-
sons – Part 2: Selection and use of proficiency testing schemes by
laboratory accreditation bodies
(5) ISO 5725: 1994 Accuracy (trueness and precision) of measurement
methods and results – Part 1: General principles and definitions; ISO
5725-2 Part 2: Basic method for the determination of repeatability and
reproducibility of a standard measurement method; Part 4: Basic
methods for the determination of the trueness of a standard measurement
method2002D0657 — SV — 17.08.2002 — 000.001 — 30
▼B
(6) ISO 78-2: 1999 Chemistry – Layouts for standards – Part 2: Methods of
chemical analysis
(7) W.G de Ruig and J.M Weseman ”A new approach to confirmation by
infrared spectrometry” J. Chemometrics 4 (1990) 61-77.
(8) Se t.ex. May, T.W., Brumbaugh, W.G., 1982, Matrix modifier and L'vov
platform for elimination of matrix interferences in the analysis of fish
tissues for lead by graphite furnace atomic absorption spectrometry:
Analytical Chemistry 54(7):1032-1037 (90353)
(9) Applicationsof Zeeman Graphite Furnace Atomic Abs orption Spectro-
metry in the Chemical Laboratory and in Toxicology, C. Minoia, S.
Caroli (Eds.), Pergamon Press (Oxford), 1992, pp. xxvi + 675
(10) Inductively Coupled Plasmas in Analytical Atomic Spectrometry, A.
Montaser, D. W. Golighty (Eds.), VCH Publishers, Inc. (New York),
1992
(11) Plasma Source Mass Spectrometry Developments and Applications, G.
Holland, S. D. Tanner (Eds.), The Royal Society of Chemistry, 1997,
pp. 329
(12) IUPAC (1995), Protocol for the design, conduct and interpretation of
method-performance studies, Pure & Applied Chem, 67, 331
(13) Jülicher, B., Gowik, P. und Uhlig, S. (1998) Assessment of detection
methods in trace analysis by means of a statistically based in-house vali-
dation concept. Analyst, 120, 173
(14) Gowik, P., Jülicher, B. und Uhlig, S. (1998) Multi-residue method for
non-steroidal anti-inflammatory drugs in plasma using high performance
liquid chromatography-photodiode-array detection. Method description
and comprehensive in-house validation. J. Chromatogr., 716, 221
(15) OAC-I Peer Verified Methods, Policies and Procedures, 1993, AOAC
International, 2200 Wilson Blvd., Suite 400, Arlington, Virginia 22201-
3301, USA
(16) W.J. Youden; Steiner, E.H.; ”Statistical Manual of the AOAC–Associa-
tion of Official Analytical Chemists”, AOAC-I, Washington DC: 1975,
p. 35 ff
(17) ISO 11843: 1997 Capability of detection – Part 1: Termsand defini-
tions, Part 2: Methodology in the linear calibration case
(18) R.W. Stephany & L.A. van Ginkel: ”Yield or recovery: a world of diffe-
rence”. Proceedings8th Euro Food Chem, Vienna, Aus tria September
18-20 (1995) Federation of European Chemical Societies, Event 206.
ISBN 3-900554-17X, page 2-9.
(19) Council Directive 71/354/EEC of 18 October 1971 on the approximation
of the lawsof the Member Statesrelating to unitsof meas urement Offi-
cial Journal L 243, 29/10/1971, p. 29
(20) ISO 31-0: 1992 Quantitiesand units– Part 0: General principles2002D0657 — SV — 17.08.2002 — 000.001 — 31