1973L0046 — SV — 10.11.1992 — 002.001 — 1
Detta dokument är endast avsett som dokumentationshjälpmedel och institutionerna ansvarar inte för innehållet
►B KOMMISSIONENS FJÄRDE DIREKTIV
av den 5 december 1972
om gemenskapsmetoder för analys vid den officiella foderkontrollen
(73/46/EEG)
(EGT L 83, 30.3.1973, s. 21)
Ändrat genom:
Officiella tidningen
nr sida datum
►M1Kommissionens direktiv 81/680/EEG av den 30 juli 1981 L 246 32 29.8.1981
►M2Kommissionens direktiv 92/89/EEG av den 3 november 1992 L 344 35 26.11.1992
▼B
KOMMISSIONENS FJÄRDE DIREKTIV
av den 5 december 1972
om gemenskapsmetoder för analys vid den officiella foderkon-
trollen
(73/46/EEG)
EUROPEISKA GEMENSKAPERNAS KOMMISSION HAR ANTAGIT
DETTA DIREKTIV
med beaktande av Fördraget om upprättandet av Europeiska ekono-
miska gemenskapen,
med beaktande av rådetsdirektiv av den 20 juli 1970(1) om införande
av gemenskapsmetoder för provtagning och analys vid den officiella
foderkontrollen, senast ändrad genom direktiv 72/275/EEG av den 20juli 1972(
2), särskilt artikel 2 i detta, och
med beaktande av följande:
I det nämnda direktivet krävsatt den officiella foderkontrollen s kall
utföras med gemenskapsmetoder för provtagning och analys i syfte att
kontrollera att produkterna uppfyller de krav som framgår avbestämmelser i lagar och andra författningar som gäller kvalitet ochsammansättning på foder.
I direktiv 71/250/EEG av den 15 juni 1971(
3), 71/393/EEG av den 18
november 1971(4) och 72/199/EEG av den 27 april 1972(5) har redan
ett antal gemenskapsmetoder för analys fastställts. Mot bakgrund avden utveckling som därefter skett på området är det lämpligt att nu
anta en fjärde metodsamling.
De åtgärder som beslutas i detta direktiv är förenliga med Ständiga
foderkommitténsyttande.
HÄRIGENOM FÖRESKRIVS FÖLJANDE.
Artikel 1
Medlemsstaterna skall kräva att analyser vid den officiella foderkon-
trollen då det gäller animaliska och vegetabiliska oljors och fettersvattenhalt samt halten av magnesium och råfibrer i foder skall utförasmed de metoder som föreskrivs i bilaga 1 till detta direktiv.
Artikel 2
Medlemsstaterna skall kräva att analyser vid den officiella foderkon-
trollen då det gäller halter av retinol (vitamin A), tiamin (aneurin,
vitamin B1), askorbinsyra och dehydroaskorbinsyra (vitamin C) skall
utföras med de metoder som föreskrivs i bilaga 2 till detta direktiv.
Artikel 3
Medlemsstaterna skall senast den 1 januari 1974 sätta i kraft de lagar
och andra författningar som är nödvändiga för att följa detta direktiv.De skall genast underrätta kommissionen om detta.1973L0046 — SV — 10.11.1992 — 002.001 — 2
(1) EGT nr L 170, 3.8.1970,
(2) EGT nr L 171, 29.7.1972, s. 39.
(3) EGT nr L 155, 12.7.1971, s. 13.
(4) EGT nr L 279, 20.12.1971, s. 7.
(5) EGT nr L 123, 29.5.1972, s. 6.▼M1
▼B
▼M1
▼B
▼B
Artikel 4
Detta direktiv riktar sig till medlemsstaterna.1973L0046 — SV — 10.11.1992 — 002.001 — 3
▼B
BILAGA 1
1.BESTÄMNING AV ANIMALISKA OCH VEGETABILISKA OLJORS
OCH FETTERS VATTENHALT
1.Syfte och räckvidd
Med denna metod är det möjligt att bestämma halter av vatten och flyktiga
ämnen i animaliska och vegetabiliska oljor och fetter.
2.Princip
Provet torkas till konstant vikt vid 103 ºC. Massaförlusten bestäms genom
vägning.
3.Utrustning
3.1 Flatbottnad skål av korrosionsresistent material, 8-9 cm i diameter och
cirka 3 cm hög
3.2 Kvicksilvertermometer med förstärkt kula och expansionsrör i överdelen,
graderad från cirka 80 ºC till minst 110 ºC och cirka 10 cm lång
3.3 Sandbad eller elektrisk värmeplatta
3.4 Exsickator med ett effektivt torkmedel3.5 Analysvåg
4.Utförande
Väg med 1 mg noggrannhet upp cirka 20 g av det homogeniserade provet på
den torra, vägda skålen (3.1) där termometern (3.2) placerats. Upphetta på
sandbadet eller värmeplattan (3.3) under ständig omrörning med termometern
så att temperaturen stiger till 90 ºC på cirka sju minuter.
Sänk värmen och iaktta med vilken frekvens bubblor stiger från skålens
botten. Temperaturen får inte överstiga 105 ºC. Fortsätt att röra om så att
skålens botten berörs tills det inte längre bildas några bubblor.
För att försäkra sig om att vattnet helt har avlägsnats upphettar man uppre-
pade gånger till 103 ºC ± 2 ºC och kyler till 93 ºC mellan upphettningarna.
Därefter får provet svalna till rumstemperatur i exsickatorn (3.4) varefter det
vägs. Detta upprepas tills massaförlusten mellan två på varandra följande
vägningar inte längre överstiger 2 mg.
OBS!Om provets massa ökar efter förnyad upphettning är detta ett tecken på
att fettet har oxiderats och i detta fall skall beräkningen ske med
värdet från den vägning som utfördes omedelbart innan massan
började öka.
5.Resultatberäkning
Vattenhalten i procent av provet erhållsmed följande formel:
M
1/C0M2 ðÞ /C1100
M0
där
M0= provets massa i gram
M1= skålens massa inklusive innehåll före upphettning
M2= skålens massa inklusive innehåll efter upphettning
Om resultatet är lägre än 0,05 % skall detta redovisas som ”lägre än 0,05 %”.
Repeterbarhet
Skillnaden i vattenhalt mellan resultaten av två parallella bestämningar som
utförts på samma prov får inte överstiga 0,05 %, absolutvärde.
2.BESTÄMNING AV MAGNESIUM
- genom atomabsorptionsspektrometri -
1.Syfte och räckvidd
Med denna metod kan mängden magnesium i foder bestämmas. Den lämpar
sig särskilt för bestämning av magnesiumhalter under 5 %.1973L0046 — SV — 10.11.1992 — 002.001 — 4
▼B
2.Princip
Provet föraskas och löses upp i utspädd saltsyra. Om det inte innehåller
någon organisk substans löses det upp direkt i utspädd saltsyra. Lösningen
späds ut och magnesiumhalten bestäms med atomabsorptionsspektrometri
vid 285,2 nm genom jämförelse med standardlösningar.
3.Reagens
3.1 Saltsyra pa, d: 1,163.2 Koncentrerad saltsyra pa, d: 1,19
3.3 Magnesiumband eller -tråd eller magnesiumsulfatheptahydrat som torkats
vid rumstemperatur
3.4 Strontiumsaltlösning (klorid eller nitrat) med 2,5 % strontium (vikt/
volym) (= 76,08 g SrCl
2·6 H2O pa eller 60,38 g Sr (NO3)2pa)
3.5 Standardmagnesiumlösning: väg med 1 mg noggrannhet upp 1 g magne-
sium (3.3), vars oxidskikt först noggrant avlägsnats, eller motsvarande
kvantitet (10,143 g) magnesiumsulfatheptahydrat (3.3). Överför detta till
en 1000 ml mätkolv, tillsätt 80 ml saltsyra (3.1), låt magnesiumet lösas
upp och fyll på vatten till 1000 ml. 1 ml av denna lösning innehåller
1,000 mg magnesium.
4.Utrustning
4.1 Föraskningsdeglar av platina, kisel eller porslin4.2 Elektrisk muffelugn med termostat4.3 Atomabsorptionsspektrometer.
5.Utförande
5.1Beredning av provlösningen
5.1.1Foder som uteslutande består av mineralämnen
Väg med 1 mg noggrannhet upp 5 g av provet i en 500 ml mätkolv
med 250-300 ml vatten. Tillsätt 40 ml saltsyra (3.1), koka upp och
låt koka sakta under 30 minuter. Låt svalna, fyll på vatten till full
volym, blanda och filtrera över till en torr bägare genom ett torrt
veckat filter. Avlägsna de första 30 millilitrarna av filtratet. Om
kisel förekommer behandlas 5 g av provet med en tillräcklig kvan-
titet (15-30 ml) saltsyra (3.2), varefter det indunstas i vattenbad
tillsdet torkat varefter det överförsför en timmestorkning till en
ugn som är inställd på 105 ºC. Fortsätt därefter enligt anvisning-
arna i 5.1.2 (från och med tredje meningen).
5.1.2Foder som till övervägande del består av mineralämnen
Väg med 1 mg noggrannhet upp 5 g av provet i en degel och
föraska vid 550 ºC i muffelugnen tills den aska som erhålls är fri
från kolpartiklar och låt därefter svalna. För att avlägsna kisel
tillsätts en tillräcklig kvantitet (15-30 ml) saltsyra (3.2) till askan,
varpå provet får indunsta i vattenbad tills det torkat och därefter
placerasi ugn vid 105 ºC under en timme. Behandla åters toden
med 10 ml saltsyra (3.1) och överför detta med varmvatten till en
500 ml mätkolv. Låt svalna och fyll på vatten till full volym.
Blanda och filtrera över till en torr bägare genom ett torrt veckat
filter. Avlägsna de första 30 millilitrarna av filtratet.
5.1.3Foder som till övervägande del består av organiska ämnen
Väg med 1 mg noggrannhet upp 5 g av provet i en degel och
föraska vid 550 ºC i muffelugnen tills den aska som erhålls är fri
från kolpartiklar. Behandla askan med 5 ml saltsyra (3.2), indunsta
i vattenbad tillsprovet har torkat och torka därefter under en
timme i ugnen vid 105 ºC så att kiseln blir olöslig. Behandla askan
med 5 ml saltsyra (3.1), flytta den med varmvatten till en 250 ml
mätkolv, koka upp, låt svalna och fyll på vatten till full volym.
Blanda och filtrera över till en torr bägare genom ett torrt veckat
filter. Avlägsna de första 30 millilitrarna av filtratet.
5.2Mätning genom atomabsorption
Späd ut standardlösningen (3.5) med vatten så att åtminsone fem refe-
renslösningar erhålls med stigande koncentrationer som motsvarar
spektrometerns optimala mätintervall. Tillsätt 10 ml strontiumsaltlösning
(3.4) till varje lösning och fyll därefter på vatten till 100 ml. Späd ut en1973L0046 — SV — 10.11.1992 — 002.001 — 5
▼B
uppmätt del av det filtrat som erhållits enligt 5.1.1, 5.1.2 eller 5.1.3 med
vatten så att en magnesiumkoncentration erhålls som ligger inom inter-
vallet för referenslösningarnas koncentrationer. Koncentrationen av
saltsyra i denna lösning får inte överstiga 0,4 N. Tillsätt 10 ml strontium-
saltlösning (3.4) och fyll sedan på vatten till 100 ml. Mät absorptionen
hos den lösning som skall bestämmas samt hos referenslösningarna vid
285,2 nm.
6.Resultatberäkning
Beräkna kvantiteten magnesium i provet genom jämförelse med referenslös-
ningarna. Uttryck resultatet i procent av provet.
Repeterbarhet
Skillnaden mellan två parallella bestämningar som utförts på samma prov får
inte överstiga 5 %, relativvärde.
3.BESTÄMNING AV VÄXTTRÅD
1.Syfte och användningsområde
Metoden gör det möjligt att bestämma sådana fettfria organiska ämnen i
foder som är olösliga i sura och alkaliska media och som vanligen går under
beteckningen växttråd.
2.Princip
Provet, som vid behov avfettas, behandlas i tur och ordning med kokande
lösningar av svavelsyra och kaliumhydroxid i bestämda koncentrationer.
Återstoden separeras genom filtrering på ett filter av sintrat glas, tvättas,
vägs och föraskas vid en temperatur på 475-500 ºC. Viktförlusten efter
föraskningen motsvarar andelen växttråd i provet.
3.Reagens
3.1 Svavelsyra, c = 0,13 mol/l.
3.2 Skumdämpande medel (t.ex. n-oktanol).3.3 Filtreringshjälpmedel (Celite 545 eller motsvarande), som upphettats vid
500 ºC under fyra timmar (8.6).
3.4 Aceton.
3.5 Petroleumeter (kokpunkt 40-60 ºC).
3.6 Saltsyra, c = 0,5 mol/l.3.7 Kaliumhydroxidlösning, c = 0,23 mol/l.
4.Apparatur
4.1 Värmeenhet för kokning med svavelsyra eller kaliumhydroxidlösning,
utrustad med hållare för filterdegeln (4.2) och försedd med ett utloppsrör
med kran för utsläpp av vätska samt vakuumpump, eventuellt med tryck-
luft. Innan enheten tasi bruk s kall den varje dag förvärmasmed kokande
vatten under fem minuter.
4.2 Glasfilterdegel med filterskiva av sintrat glas, porositet 40-90 µm. Före
användning skall den upphettas till 500 ºC under några minuter och
därefter kylas(8.6).
4.3 Cylinder på minst 270 ml med återloppskylare, lämplig för kokning.
4.4 Torkugn med termostat.4.5 Muffelugn med termostat.
4.6 Extraktionsenhet, bestående av en hållare för filterdegeln (4.2) och med
ett utloppsrör med kran för utsläpp av vakuum och vätska.
4.7 Kopplingsringar för hopsättning av värmeenheten (4.1), filterdegeln (4.2)
och cylindern (4.3) samt för anslutning till extraktionsenheten (4.6) och
filterdegeln.1973L0046 — SV — 10.11.1992 — 002.001 — 6
▼M2
▼M2
5.Utförande
Väg upp 1 g av det beredda provet med högst 0,001 g avvikelse och placera
det i degeln (4.2), (se anmärkningarna 8.1, 8.2, 8.3) och tillsätt 1 g filtrering-
shjälpmedel (3.3).
Montera värmeenheten (4.1) och filterdegeln (4.2) och anslut därefter cylin-
dern (4.3) till degeln. Häll 150 ml kokande svavelsyra (3.1) i cylinder/
degeluppställningen och tillsätt vid behov några droppar skumdämpande
medel (3.2). Koka upp vätskan inom 5 ± 2 minuter och låt koka kraftigt
under exakt 30 minuter.
Öppna kranen till utloppsröret (4.1) och sugfiltrera svavelsyran genom filter-
degeln. Tvätta återstoden tre gånger i rad med 30 ml kokande vatten och se
till att återstoden sugfiltreras torr efter varje tvättning.
Stäng utloppskranen och häll 150 ml kokande kaliumhydroxidlösning (3.7) i
cylinder/degeluppställningen. Tillsätt några droppar skumdämpande medel
(3.2). Koka upp vätskan inom 5 ± 2 minuter och låt koka kraftigt under exakt
30 minuter. Filtrera och tvätta på samma sätt som vid behandlingen med
svavelsyra.
Efter den sista tvättningen och torkningen kopplas degeln med innehåll loss
och ansluts till extraktionsenheten (4.6). Tvätta återstoden i degeln tre gånger
i rad med 25 ml aceton (3.4) och se till att återstoden sugfiltreras torr efter
varje tvättning.
Torka degeln till konstant vikt i ugnen vid 130 ºC. Låt den svalna i
exsickator efter varje torkning och väg snabbt. Placera degeln i en muffelugn
och föraska till konstant vikt vid 475-500 ºC under minst 30 minuter.
Efter varje upphettning skall degeln först svalna i ugnen och sedan i exsick-
atorn innan den vägs.
Gör ett blankprov utan provet. Viktförlusten efter föraskningen får inte
överstiga 4 mg.
6.Resultatberäkning
Innehållet av växttråd räknat i procent av provet framgår av formeln:
b/C0c ðÞ /C2 100
a
där
a = prov i g
b = viktförlust i g efter föraskning vid bestämningen
c = viktförlust i g efter föraskning vid blankprov
7.Repeterbarhet
Skillnaden mellan två parallella bestämningar som utförts på samma prov får
inte överstiga
— 0,3 i absolut värde, om innehållet av växttråd är mindre än 10 %,
— 3 % i förhållande till det högre värdet, om innehållet av växttråd uppgår
till 10 % eller mer.
8.Anmärkningar
8.1 Foder som innehåller mer än 10 % råfett skall före analys avfettas med
petroleumeter (3.5). Anslut filterdegeln (4.2) med innehåll till extrak-
tionsenheten (4.6), tvätta återstoden tre gånger i rad med 30 ml
petroleumeter och se till att återstoden sugfiltreras torr. Anslut degeln
med innehåll till värmeenheten (4.1) och fortsätt enligt beskrivningen i 5.
8.2 Foder som innehåller fetter som inte kan extraheras direkt med petroleu-
meter (3.5) skall avfettas enligt beskrivningen i 8.1 och därefter avfettas
ännu en gång efter kokning med syra.
Efter kokning med syra och därpå följande tvättning ansluts degeln med
innehåll till extraktionsenheten (4.6) och tvättas tre gånger med 30 ml
aceton och därefter ytterligare tre gånger med 30 ml portioner petroleu-
meter. Sugfiltrera torrt och fortsätt analysen enligt beskrivningen i 5 och
börja med kaliumhydroxidbehandlingen.
8.3 Om fodret innehåller mer än 5 % karbonat, uttryckt som kalciumkar-
bonat, ansluts degeln (4.2) med det uppvägda provet till värmeenheten
(4.1). Tvätta provet tre gånger med 30 ml saltsyra (3.6). Låt provet vila1973L0046 — SV — 10.11.1992 — 002.001 — 7
▼M2
ca en minut efter varje tillsats innan det filtreras. Tvätta en gång med
30 ml vatten och fortsätt sedan enligt beskrivningen i 5.
8.4 Om den utrustning som används utgörs av ett stativ (flera deglar anslutna
till samma värmeenhet) får två enskilda bestämningar av samma analy-
sprov inte ingå i samma provserie.
8.5 Om det efter kokningen är svårt att filtrera de sura och basiska lösning-
arna användstryckluft genom värmeenhetensutlopps rör, varefter
filtreringen fullföljes.
8.6 Temperaturen vid föraskningen bör inte överstiga 500 ºC om glasfilter-
deglarna skall kunna hålla så länge som möjligt. Var noga med att
undvika alltför hastiga temperaturförändringar vid uppvärmning och
avkylning.1973L0046 — SV — 10.11.1992 — 002.001 — 8
▼B
BILAGA 2
1.BESTÄMNING AV RETINOL (VITAMIN A)
1.Syfte och räckvidd
Med denna metod är det möjligt att bestämma mängden retinol (vitamin A) i
foder, koncentrat och premixer. Den lägsta gränsen för bestämningen är10 000 IE/kg för starkt pigmenterade foder och 4 000 IE/kg för övriga
foder(
1). Produkterna indelasi två grupper efter s in antagna retinolhalt:
Grupp A: halter under 200 000 IE/kg,
Grupp B: halter på 200 000 IE/kg eller mer.
2.Princip
Det varma provet hydrolyseras med en kaliumhydroxidlösning i etanolme-
dium och i närvaro av ett antioxidationsmedel eller i kväveatmosfär.
Blandningen extraherasmed 1,2-dikloretan. Extraktet induns tastillsdet är
torrt och behandlasmed petroleumeter. Lös ningen kromatograferaspå enalu-
miniumoxidkolonn (för produkter i grupp B krävs kromatografi endast i vissa
fall). För produkter i grupp A bestäms retinolet genom spektralfotometri vid
610 nm efter att ett färgat komplex utvecklatsenligt Carr-Pricereaktionen; för
produkter i grupp B användss pektralfotometri i UV-området vid 325 nm.
3.Reagens
a)används vid analys av produkter i grupperna A och B
3.1 96-procentig etanol (volymprocent)3.2 10-procentig natriumaskorbatlösning (vikt/volym) pa, eller3.3 renat kväve3.4 50-procentig kaliumhydroxidlösning (vikt/volym) pa3.5 Kaliumhydroxidlösning 1 N pa3.6 Kaliumhydroxidlösning 0,5 N pa3.7 1,2-dikloretan pa
3.8 Petroleumeter, kokintervall 30-50 ºC. Rena, om så är nödvändigt, på
följande sätt: rör om 1000 ml petroleumeter med satser om 20 ml
koncentrerad svavelsyra tills syran förblir färglös. Avlägsna syran
och skölj petroleumetern i tur och ordning med 500 ml vatten, två
gånger med 10-procentig natriumhydroxidlösning (vikt/volym) och
tre gånger med 500 ml vatten. Avlägsna vattenskiktet, torka petro-
leumetern under en timme över aktivt kol och vattenfritt
natriumsulfat, filtrera och destillera.
3.9 Aluminiumoxid, standardiserad enligt Brockmann: föraska under
åtta timmar vid 750 ºC, kyl i exsickator och förvara i brun glasflaska
med propp av matterat glas. Fukta på följande sätt innan aluminiu-
moxiden användsför kromatografi: placera 10 g aluminiumoxid och
0,7 ml vatten i en brun glasflaska, tillslut med propp och upphetta
under fem minuter i kokande vattenbad samtidigt som flaskan
skakas om. Låt svalna. Kontrollera aktiviteten hos det på detta sätt
preparerade aluminiumet genom att låta en känd kvantitet retinol
(3.17) (cirka 500 IE) behandlasenligt 5.3 och 5.4 varefter återhämt-
ningen kontrolleras.
3.10 Basisk aluminiumoxid, aktivitetsgrad 1 (Woelm, Merck eller
motsvarande)
3.11 Ren dietyleter. Avlägsna peroxider och spår av vatten genom kroma-
tografi mot en kolonn basisk aluminiumoxid (3.10). (25 g
aluminiumoxid till 250 ml dietyleter)
3.12 Petroleumeterlösningar (3.8) med 4, 8, 12, 16 och 20 % (volympro-
cent) dietyleter (3.11)
3.13 Natriumsulfidlösning 0,5 molar i 70-procentig glycerin (volympro-
cent), beredd av natriumsulfid pa1973L0046 — SV — 10.11.1992 — 002.001 — 9
(1) IE = 0,3 µg retinol.
▼B
b)används uteslutande vid analys av produkter i grupp A
3.14 Kristalliserbar bensen pa3.15 Kloroform pa. Avlägsna etanol, fosgen och spår av vatten genom
kromatografi mot en kolonn basisk aluminiumoxid (3.10) (50 g
aluminiumoxid till 200 ml kloroform; de första 50 ml eluat bör
kromatograferasen andra gång).
3.16 Carr-Pricereagens: rör om cirka 25 g antimontriklorid pa (förvarad i
exsickator) med 100 ml kloroform (3.15) tills lösningen är mättad.
En viss antimontrikloridfällning utgör inget problem. Tillsätt 2 ml
ättiksyraanhydrid pa. Förvara i kylskåp i brun glasflaska med propp
av matterat glas. Lösningen är hållbar i flera veckor.
3.17 Retinol, spektralfotometriskt standardiserad
c)används uteslutande vid analys av produkter i grupp B
3.18 Isopropanol till kromatografi
4.Utrustning
4.1 Vattenbad4.2 Vakuumindunstningsutrustning med runda kolvar med olika rymd4.3 Glasrör för kromatografi (längd: 300 mm; inre diameter: cirka 13 mm)4.4 Spektralfotometer med 10 mm celler. Vid mätningar inom UV-området
krävskis elceller.
4.5 UV-lampor som är lämpliga för 365 nm
5.Utförande
OBS!Samtliga operationer måste utföras skyddat från direkt ljus, om så är
nödvändigt med utrustning av brunt glas.
5.1Analysprov
Av det fint sönderdelade provet tas en del för analys i proportion till den
antagna retinolhalten enligt följande:
0,1-1,0 g av koncentrat (halter över 20 000 IE/g),3,0-5,0 g av premixer (halter mellan 400 och 20 000 IE/g),10-20 g av mineralblandningar,30 g av produkter i grupp A.Placera analysprovet omedelbart i en 500 ml kolv med propp av matterat
glas.
5.2Hydrolys och extraktion (
1)
Tillsätt i tur och ordning till analysprovet 40 ml etanol (3.1), 2 ml natriu-
maskorbatlösning (3.2)(2), 10 ml kaliumhydroxidlösning (3.4) och 2 ml
natriumsulfidlösning (3.13).
Upphetta under 30 minuter vid 70-80 ºC under återloppskylare och låt
sedan svalna under rinnande vatten. Tillsätt 50 ml etanol (3.1) och
100 ml 1,2-dikloretan (3.7) (använd pipett). Skaka om kraftigt och
dekantera därefter supernatanten i en dekanteringsbehållare. Tillsätt till
denna 150 ml kaliumhydroxidlösning (3.5), skaka om under 10 sekunder
och låt stå tills skikten är separerade. Samla in dikloretanskiktet (detlägsta skiktet) i en dekanteringsbehållare, tillsätt 40 ml kaliumhydro-
xidlösning (3.6), skaka om under 10 sekunder och låt stå tills skikten är
separerade. Samla in dikloretanskiktet i en dekanteringsbehållare och
skölj 6-8 gånger med 40 ml vatten per gång tills det är alkalifritt (fenolf-
taleintest). Samla in dikloretanskiktet och avlägsna de sista spåren av
vatten med remsor av filterpapper.
Indunsta en uppmätt del av lösningen under vakuum i vattenbad vid
40 ºC tills den är torr. Behandla skyndsamt återstoden med 5 ml petro-
leumeter (3.8).
Produkter i grupp A: kromatografera enligt anvisningarna i 5.3.1.1973L0046 — SV — 10.11.1992 — 002.001 — 10
(1) För mjölkfoder och produkter med tendens att agglomerera eller svälla, skall mängden
av de reagens som upptas i 5.2, första och andra stycket, dubbleras .
(2) Natriumaskorbat behöver inte tillsättas när hydrolysen utförs i kväveatmosfär.
▼B
Produkter i grupp B: flytta lösningen till en 50 ml mätkolv, fyll på
petroleumeter (3.8) till full volym, blanda och mät den optiska densiteten
enligt anvisningarna i 5.4.2.
5.3Kromatografi
5.3.1Produkter i grupp A
Fyll ett kromatografirör (4.3) till 200 mm höjd med 10 g alumi-
niumoxid (3.9) som dessförinnan uppslammats i petroleumeter
(3.8). Placera den lösning som erhållits enligt 5.2 i röret och tillsätt
omedelbart 20 ml petroleumeter (3.8). Eluera i tur och ordning
med10 ml-satser av lösningarna av petroleumeter i 4, 8, 12, 16
och 20 % dietyleter (3.12) under tryck eller partiellt vakuum med
en flödestakt på 2-3 droppar per sekund.
Karotinet eluerasförs t(1) Retinolen eluerasvanligen med
lösningen av petroleumeter i 20 % dietyleter (3.12). Elueringen
iakttas i UV-ljus (kort belysning av kolonnen med kvicksilver-
lampan). Den fluorescerande retinolzonen är klart skild från de
gula xantofyllzoner som följer efter den. Samla in den del av
eluatet som innehåller retinolen i en Erlenmayerkolv.
5.3.2Produkter i grupp B
Kromatografi är endast nödvändig om de mätvärden av den optiska
densiteten som erhålls enligt 5.4.2 inte motsvarar de krav som
angesdär.
Om det visar sig nödvändigt att använda kromatografi placeras en
uppmätt del av den lösning i petroleumeter som erhållits enligt 5.2
med en retinolhalt av cirka 500 IE i kromatografiröret varefter
kromatografin utförsenligt 5.3.1.
5.4Mätning av den optiska densiteten
5.4.1Produkter i grupp A
Indunsta under vakuum det eluat med retinolen som erhållits enligt
5.3.1 tills det är torrt. Behandla återstoden med 2 ml bensen (3.14).
Ta 0,3 ml av denna lösning och tillsätt 3 ml Carr-Pricereagens(3.16). En blå färgton utvecklas. Mät den optiska densiteten med
spektralfotometern vid 610 nm exakt 30 sekunder efter att reak-
tionen har börjat. Bestäm retinolhalten genom jämförelse med en
standardkurva som erhållits med bensenlösningar med ökande
koncentrationer av standardretinol som behandlats med Carr-Price-
reagens (2-16 IE standardretinol (3.17) till 0,3 ml bensen (3.14)
+ 3 ml Carr-Pricereagens(3.16)). Standardkurvan mås te kontrol-
lerasofta och regelbundet med hjälp av s tandardretinol och en
nyberedd Carr-Pricereagenslösning.
5.4.2Produkter i grupp B
Ta en uppmätt del av den lösning i petroleumeter som erhållits
enligt 5.2 med en retinolhalt av cirka 200 IE. Indunsta under
vakuum tills lösningen blivit torr och behandla återstoden med25 ml isopropanol (3.18). Mät den optiska densiteten i spektralfo-
tometern vid 325, 310 och 334 nm. Absorptionsmaximum ligger
vid 325 nm. Lösningens retinolhalt beräknas på följande sätt:
E
325· 18,30 = IE retinol/ml
Kvoten av de optiska densiteterna
E310:E325och E334:E325
måste dock vara 6 : 7 = 0,857.Om någon av dessa kvoter skiljer sig väsentligt från detta värde
(< 0,830 eller > 0,880) måste mätningen av de optiska densiteterna
föregåsav kromatografi med den metod s om angesi 5.3.2. Om
den mätning av de optiska densiteterna som utförs efter kromato-
grafin visar att de ovannämnda kvoterna fortfarande skiljer sig
väsentligt från värdet 0,857 (< 0,830 eller > 0,880) måste
bestämningen utföras med den metod som angetts för produkter i
grupp A.1973L0046 — SV — 10.11.1992 — 002.001 — 11
(1) Karotinhalten kan beräknas genom mätning av den optiska densiteten vid 450 nm;
E1%
1c m¼2600 :
▼B
6.Resultatberäkning
Beräkna provetsretinolhalt med beaktande av analys provetsvikt och de
utspädningar som utförts under analysen. Uttryck resultaten i IE retinol per
kg foder, koncentrat eller premix.
Repeterbarhet
Skillnaden mellan resultaten av två parallella bestämningar som utförts på
samma prov får inte överstiga:
— 20 %, relativvärde, för retinolhalter under 75 000 IE/kg,
— 15 000 IE för halter mellan 75 000 och 150 000 IE/kg,— 10 %, relativvärde, för halter mellan 150 000 och 250 000 IE/kg,
— 25 000 IE för halter mellan 250 000 och 500 000 IE/kg,
— 5 %, relativvärde, för halter över 500 000 IE/kg.
2.BESTÄMNING AV TIAMIN (VITAMIN B
1, ANEURIN)
1.Syfte och räckvidd
Med denna metod är det möjligt att bestämma mängden tiamin (aneurin,
vitamin B1) i foder, koncentrat och premixer. Lägsta gräns för bestämningen
är 5 ppm.
2.Princip
Det varma provet behandlas med utspädd svavelsyra varefter det enzymhyd-
rolyseras. Den lösning som erhålls får genomgå basisk oxidation. Det
tiokrom som bildas extraheras med isobutanol och bestäms genom fluoro-
metri.
3.Reagens
3.1 100 µg/ml standardtiaminlösning: lös upp 112,3 mg tiaminhydroklorid,
som vakuumtorkats till konstant vikt, i 1 000 ml svavelsyra 0,2 N (3.2).
Om denna lösning förvaras svalt och i skydd för ljus är den hållbar i en
månad.
3.2 Svavelsyra 0,2 N
3.3 Ren natriumbisulfit
3.4 20-procentig kaliumferrocyanidlösning pa (vikt/volym)
3.5 25-procentig kaliumhydroxidlösning pa (vikt/volym)3.6 Oxiderande blandning: blanda 2 ml kaliumferrocyanidlösning (3.4) med
48 ml kaliumhydroxidlösning (3.5). Denna lösning är endast hållbar i
fyra timmar.
3.7 Isobutanol pa
3.8 Natriumacetatlösning 2,5 N
3.9 Flerenzymsberedning som innehåller proteas, fosfatas och amylas (t.ex.
Clarase)
3.10 96-procentig etanol (volymprocent)
4.Utrustning
4.1 Vattenbad
4.2 Centrifug (3 500 varv per minut) med 30-50 ml rör som är försedda med
proppar av matterat glas
4.3 Fluorometer
5.Utförande
5.1Enzymhydrolys
I två 250 ml mätkolvar, A och B, placerasidentis ka mängder av det fint
sönderdelade provet med ett innehåll av cirka 100 µg tiamin och 125 ml
svavelsyra (3.2). Tillsätt även, men endast till kolv A, 1,0 ml standardlös-
ning (3.1) (intern standard).
Skaka om kolvarna kraftigt, placera dem i kokande vattenbad under 15
minuter och skaka om några gånger under denna tid. Låt svalna till cirka
45 ºC. Tillsätt 20 ml natriumacetatlösning (3.8) och 0,5 g flerenzymsbe-
redning (3.9) till var och en av kolvarna och låt dem därefter stå 201973L0046 — SV — 10.11.1992 — 002.001 — 12
▼B
minuter i rumstemperatur. Tillsätt 20 ml natriumacetatlösning (3.8), fyll
på vatten till full volym, homogenisera och filtrera. Ta vara på filtraten
A och B efter att de första 15 millilitrarna avlägsnats. Bered följande
lösningar:
5.1.1Referenslösning T
Placera 5 ml filtrat A och cirka 10 mg natriumbisulfit (3.3) i ett
centrifugrör (4.2). Sänk ned röret i kokande vattenbad under 15
minuter och låt därefter svalna till rumstemperatur.
5.1.2Lösning A (intern standard) och B (prov)
Placera 5 ml filtrat A i ett centrifugrör (4.2) och 5 ml filtrat B i ett
centrifugrör (4.2).
5.2Oxidation
Tillsätt till lösningarna T, A och B 5 ml oxiderande blandning (3.6) och
en minut senare 10 ml isobutanol (3.7). Tillslut rören och skaka om kraf-
tigt under fem sekunder. Låt stå under en minut och centrifugera så att
skikten separeras. Överför från varje rör 5 ml av dekanteringsskiktet
isobutanol till var och en av 25 ml mätkolvarna, fyll på etanol (3.10)
till full volym och homogenisera (=extrakt T, A och B).
5.3Fluorescensmätning
Utför mätningarna vid den våglängd där fluorometern ger optimalt utslag
för tiokromets fluorescens. Bestråla vid cirka 365 nm.
Nollställ instrumentet för extrakt T. Mät fluorescensintensiteten hos
extrakten A och B.
6.Resultatberäkning
Provetstiaminhalt i mg/kg erhållsmed formeln:
a/C1b
a/C0bðÞ c
där
a = fluorescensintensiteten hos extrakt A (intern standard),
b = fluorescensintensiteten hos extrakt B (prov),
c = analysprovets vikt i gram,
d = mängd tiamin i µg som tillsatts till analysprovet (intern standard).
RepeterbarhetSkillnaden mellan två parallella bestämningar som utförts på samma prov får
inte överstiga
10 %, relativvärde, för halter under 500 mg/kg, och
5 %, relativvärde, för halter på 500 mg/kg eller mer.
3.BESTÄMNING AV ASKORBINSYRA OCH DEHYDROASKORBIN-
SYRA (VITAMIN C)
1.Syfte och räckvidd
Med denna metod är det möjligt att bestämma den totala mängden askorbin-
syra och dehydroaskorbinsyra (vitamin C) i foder, koncentrat och premixer.
Den lägsta gränsen för bestämningen är 5 ppm. Produkterna indelas i två
grupper efter sin antagna C-vitaminhalt:
Grupp A: halter under 10 g/kg,
Grupp B: halter på 10 g/kg eller mer.
2.Princip
Provet slammas i utspädd metafosforsyralösning och extraheras med kloro-
form. Vattenfasen behandlas med 2,6-diklorfenol-indofenollösning för att
omvandla askorbinsyran till dehydroaskorbinsyra och därefter med 2,4-dini-
trofenylhydrazinlösning. Det hydrazon som bildas extraheras med en
blandning av etylacetat, isättiksyra och aceton. Lösningen kromatograferas
mot en kiselgelkolonn, eluatet indunstas tills det är torrt och återstoden
löses upp i utspädd svavelsyra. Lösningens optiska densitet mäts med spekt-
ralfotometer vid 509 nm.1973L0046 — SV — 10.11.1992 — 002.001 — 13
▼B
Då det gäller produkter i grupp A genomgår det eluat som bildas vid kroma-
tografi på kolonnen dessutom tunnskiktskromatografi för att isolera
hydrazonet.
3.Reagens
3.1 Standardlösning L-askorbinsyra, 0,05 %: lös upp 50 mg L-askorbinsyra
pa i cirka 20 ml metafosforsyralösning (3.2) och fyll på vatten till
100 ml. Bered lösningen omedelbart före användning.
3.2 10-procentig metafosforsyralösning (vikt/volym): mal 200 g metafos-
forsyra pa i mortel och lös därefter upp detta i vatten samt fyll på
vatten till 2 000 ml. Förvara vid 4 ºC. Lösningen är stabil i en vecka.
3.3 Kloroform pa.
3.4 0,5-procentig lösning av 2,6-diklorfenol-indofenol pa (vikt/volym).
Beredsomedelbart före användning.
3.5 Filtrermedel (S. och S. nr 121 eller motsvarande).
3.6 2-procentig syralösning av 2,4-dinitrofenylhydrazin (vikt/volym): lös
upp 2 g 2,4- dinitrofenylhydrazin i 100 ml utspädd svavelsyra (25 ml
svavelsyra pa, d: 1,84, utspädd genom att vatten fyllts på till 100 ml).
Om denna lösning förvaras svalt är den hållbar i en vecka.
3.7 Kväve, eller
3.8 koldioxid.
3.9 Blandning etylacetat pa/isättiksyra/aceton pa i volymproportionerna 96/
2/2.
3.10 Blandning diklormetan pa/isättiksyra i volymproportionerna 97/3.
3.11 Kiselgel, partikelstorlek: 0,05-0,2 mm.
3.12 Kiselgel H, Stahlkvalitet, för tunnskiktskromatografi.
3.13 Utspädd svavelsyra: fyll 105 ml vatten i en 200 ml mätkolv och fyll på
svavelsyra pa, d: 1,84, till full volym.
3.14 Eluerande lösningsmedel för tunnskiktskromatografi: blanda 75 ml
dietyleter pa, 25 ml etylacetat pa och 4,0 ml 96-procentig isättiksyra
pa (vikt/volym). Efter 2-3 kromatografier skall ny lösning användas.
4.Utrustning
4.1 Vattenbad med termostat inställd på 20 ºC.
4.2 Centrifug (3 500 varv per minut) med 40-50 millilitersrör med proppar
av matterat glas.
4.3 Vakuumrotationsindunstare med 250 ml kolvar.
4.4 Glasrör för kromatografi (längd: 100 mm, inre diameter: 20 mm) med
sintrad skiva (t.ex. Allihnrör).
4.5 Spektralfotometer eller kolorimeter med filter med 10 mm celler.
4.6 Apparatur för tunnskiktskromatografi med kiselgelplattor (3.12) täckta
med ett 0,5-0,6 mm tjockt lager. (Det är lämpligast att använda färdigtill-
verkade plattor.) Torka plattorna under 2½-3 timmar i torkugnen vid
120-130 ºC. Låt svalna och förvara dem därefter i exsickatorn under
minst 24 timmar före användning.
4.7 Torkugn inställd på 120-130 ºC.
5.Utförande
5.1Extraktion
I två 250 ml mätkolvar (med proppar av matterat glas), A och B,
placeras identiska mängder av det fint sönderdelade provet med ett C-
vitamininnehåll av cirka 200 µg. Tillsätt endast till kolv A 0,4 ml stan-
dardlösning (3.1) och blanda under försiktig omskakning (intern
standard).
Tillsätt till vardera kolven 30 ml kloroform (3.3) och 25 ml metafosfors-
yralösning (3.2) med en temperatur av 4 ºC. Skaka om hastigt och låt
därefter stå under 10-15 minuter. Tillsätt 25 ml vatten, tillslut kolvarna,
skaka om kraftigt under 10 sekunder och placera dem i vattenbadet (4.1)
under 10-15 minuter. Centrifugera, så att vattenfasen skiljs från kloro-1973L0046 — SV — 10.11.1992 — 002.001 — 14
▼B
formfasen. Utför de operationer som beskrivs nedan samtidigt på de
vattenhaltiga extrakten A (intern standard) och B.
5.2Oxidation
Flytta med pipett 40 ml av den lätt grumliga vattenlösning som erhålls
som dekanteringsvätska (5.1) till ett reaktionsrör med propp av matterat
glas, tillsätt 0,5-1 ml 2,6-diklorfenol- indofenollösning (3.4) och blanda.
En röd färgton utvecklas som bör kvarstå i minst 15 minuter. Tillsätt
därefter cirka 300 mg filtrermedel (3.5), skaka om och filtrera genom
ett torrt veckat filter. Filtratet behöver inte nödvändigtvisvara klart.
5.3Reaktion med 2,4-dinitrofenylhydrazin och hydrazonextraktion
Flytta med pipett 10 ml av det filtrat som erhålls enligt 5.2 till ett cent-
rifugrör (4.2), tillsätt 2 ml 2,4-dinitrofenylhydrazinlösning (3.6) och
blanda. Sänd snabbt en ström kväve (3.7) eller koldioxid (3.8) in i
röret, tillslut det och sänk ned det under cirka 15 timmar (över natten) i
vattenbadet (4.1).
Tillsätt därefter 3 ml vatten, 20 ml etylacetat/isättiksyra/acetonblandning
(3.9) och cirka 800 mg filtrermedel (3.5). Tillslut röret, skaka om kraftigt
under 30 sekunder och centrifugera. Placera 15 ml av supernatantfasen i
en indunstningskolv och indunsta under reducerat tryck i rotationsindun-
staren (4.3) tills en oljig återstod erhålls. Lös upp återstoden i 2 ml
etylacetat/isättiksyra/acetonblandning (3.9) genom att på nytt värma till
50 ºC, låt svalna, tillsätt 10 ml diklormetan/isättiksyrablandning (3.10)
och blanda.
5.4Kromatografi mot kolonn
Fyll ett kromatografirör (4.4) till 30 mm-markeringen med diklormetan/
isättiksyrablandningen (3.10). Slamma (genom kraftig omskakning) 5 gkiselgel (3.11) i 30 ml diklormetan/isättiksyrablandning (3.10) och häll
suspensionen i röret. Låt stå och komprimera därefter med kväve (3.7)
vid lågt tryck. Dekantera den lösning som erhållits enligt 5.3 i röret,
skölj kolven med en liten kvantitet diklormetan/isättiksyrablandning
(3.10) och dekantera i röret och fyll därefter detta med blandningen
(3.10) varefter kolonnen sköljs med samma blandning (3-4 satser om
cirka 5 ml) tills ett färglöst eluat erhålls. Avlägsna den del av eluatet
som är gulfärgad.
Eluera den rödaktiga zonen högst upp på kolonnen med etylacetat/isättik-
syra/acetonblandningen (3.9), samla in eluatet och indunsta tills det är
torrt.
5.4.1Produkter i grupp A (C-vitaminhalter under 10 g/kg): lösupp
återstoden i 2,0 ml etylacetat/isättiksyra/acetonblandning (3.9) och
kromatografera omedelbart mot ett tunt skikt enligt 5.5.
5.4.2Produkter i grupp B (C-vitaminhalter på 10 g/kg eller mer):
behandla den oljiga återstoden med 4,0 ml utspädd svavelsyra
(3.13), skaka om kraftigt så att återstoden helt löses upp och mät
den optiska densiteten enligt 5.6.
5.5Tunnskiktskromatografi
De operationer som beskrivs i det följande skall utföras parallellt vid två
samtidiga försök. Placera 0,5 ml av den lösning som erhållits enligt 5.4.1
i en tunn linje på plattan (4.6). Använd det eluerande lösningsmedlet
(3.14) för att framkalla under minst 20 minuter i en vanna som är mättad
med ånga från lösningsmedlet tills den rosafärgade hydrazonzonen sepa-
rerats tydligt. Låt lufttorka. Markera gränsen för den rosafärgade zonen,
skrapa av den med spatel och flytta allt pulver utan spill till ett kromato-
grafirör (4.4).
Eluera i tur och ordning först en gång med 2 ml och därefter två gånger
med 1,5 ml etylacetat/isättiksyra/acetonblandning (3.9). Samla in eluatet
i en liten kolv (den sista delen måste vara färglös). Indunsta tills det är
torrt, behandla den oljiga återstoden med 4,0 ml utspädd svavelsyra(3.13), skaka om kraftigt så att återstoden löses upp fullständigt och
mät den optiska densiteten.
5.6Mätning av den optiska densiteten
Mät den optiska densiteten med spektralfotometer vid 509 nm 20-30
minuter efter att återstoden lösts upp i svavelsyra. Utför mätningarna
genom jämförelse med utspädd svavelsyra (3.13).
5.7Blankprov
Utför ett blankprov med samma metod men med uteslutande av provet.1973L0046 — SV — 10.11.1992 — 002.001 — 15
▼B
6.Resultatberäkning
ProvetsC-vitaminhalt i g per kg erhållsmed formeln:
c/C0aðÞ /C1 2
b/C0c ðÞ /C1 10d
där
a = blankprovets optiska densitet
b = den interna standardlösningens optiska densitet
c = provlösningens optiska densitetd = analysprovets vikt i gram.
Repeterbarhet
Skillnaden mellan resultaten av två parallella bestämningar som utförts på
samma prov får inte överstiga:
10 %, relativvärde, för C-vitaminhalter under 10 g/kg, och
5 %, relativvärde, för halter på 10 g/kg eller mer.1973L0046 — SV — 10.11.1992 — 002.001 — 16