1972L0199 — SV — 22.07.1993 — 003.001 — 1
Detta dokument är endast avsett som dokumentationshjälpmedel och institutionerna ansvarar inte för innehållet
►B KOMMISSIONENS TREDJE DIREKTIV
av den 27 april 1972
om gemenskapsmetoder för analys vid den officiella foderkontrollen
(72/199/EEG)
(EGT L 123, 29.5.1972, s. 6)
Ändrat genom:
Officiellatidningen
nr sidada tum
►M1Kommissionens direktiv 81/680/EEG av den 30 juli 1981 L 246 32 29.8.1981
►M2Kommissionens direktiv 84/4/EEG av den 20 december 1983 L 15 28 18.1.1984
►M3Kommissionens direktiv 93/28/EEG av den 4 juni 1993 L 179 8 22.7.1993
▼B
KOMMISSIONENS TREDJE DIREKTIV
av den 27 april 1972
om gemenskapsmetoder för analys vid den officiella foderkon-
trollen
(72/199/EEG)
EUROPEISKA GEMENSKAPERNAS KOMMISSION HAR ANTAGIT
DETTA DIREKTIV
med beaktande av Fördraget om upprättandet av Europeiska ekono-
miskagemenska pen,
med beaktande av rådets direktiv av den 20 juli 1970 (1) om införande
av gemenskapsmetoder för provtagning och analys vid den officiella
foderkontrollen, särskilt artikel 2 i detta, och
med beaktande av följande:I det nämnda direktivet krävs att den officiella foderkontrollen skall
utföras med gemenskapsmetoder för provtagning och analys i syfte attkontrollera att produkterna uppfyller de krav som framgår avbestämmelser i lagar och andra författningar som gäller foders kvalitet
och sammansättning.
I kommissionens direktiv 71/250/EEG (
2) av den 15 juni 1971 och 71/
393/EEG (3) av den 18 november 1971 har redan ett antal gemenskaps-
metoder för analys fastställts. Mot bakgrund av den utveckling somdärefter skett bör en tredje metodsamling antas.
De åtgärder som beslutas om i detta direktiv är förenliga med Ständiga
foderkommitténs yttrande.
HÄRIGENOM FÖRESKRIVS FÖLJANDE.
Artikel 1
Medlemsstaterna skall kräva att analyser vid den officiella foderkon-
trollen skall utföras med de metoder som beskrivs i bilaga 1 till dettadirektiv då det gäller halter av stärkelse, råprotein, råprotein som är
lösligt i pepsin och saltsyra, fri och total gossypol samt pepsinaktivitet.
Artikel 2
Medlemsstaterna skall kräva att analyser vid den officiella foderkon-
trollen skall utföras med de metoder som beskrivs i bilaga 2 till dettadirektiv då det gäller att upptäcka och identifiera antibiotika av tetra-cyklingruppen samt även vid bestämning av halter av klortetracyklin,
oxytetracyklin, tetracyklin, oleandomycin, tylosin och virginiamycin i
foder.
Artikel 3
Medlemsstaterna skall senast den 1 juli 1973 sätta i kraft de lagar och
andra författningar som är nödvändiga för att följa detta direktiv. Deskall genast underrätta kommissionen om detta.1972L0199 — SV — 22.07.1993 — 003.001 — 2
(1) EGT nr L 170, 3.8.1970, s. 2.
(2) EGT nr L 155, 12.7.1971, s. 13.
(3) EGT nr L 279, 20.12.1971, s. 7.▼M1
▼B
▼M1
▼B
▼B
Artikel 4
Detta direktiv riktar sig till medlemsstaterna.1972L0199 — SV — 22.07.1993 — 003.001 — 3
▼B
BILAGA 1
1.BESTÄMNING AV STÄRKELSE
Polarimetrisk metod
1.Syfte och räckvidd
Med denna metod kan halten av stärkelse samt av nedbrytningsprodukter av
stärkelse med hög molekylvikt bestämmas i foder med undantag av sådana
foder som innehåller betsnitsel, betmassa, torkad betblast eller torkade
betblad, potatismos, vattenfri jäst, inulinrika produkter (t.ex. snitsel och mjöl
av jordärtskockor) eller fettgrevar.
2.Princip
Metoden omfattar två bestämningar. I den första behandlas det varma provet
med utspädd saltsyra. Efter klarning och filtrering mäts lösningens optiska
rotation polarimetriskt.
I den andra extraheras provet med 40-procentig etanol. Efter att filtratet
surgjorts med saltsyra, klarats och filtrerats mäts den optiska rotationen på
samma sätt som vid den första bestämningen.
Genom att multiplicera skillnaden mellan de båda mätningarna med en känd
faktor erhålls provets stärkelsehalt.
3.Reagens
3.1 25-procentig (vikt/vikt) saltsyra, d: 1,1263.2 1,128-procentig (vikt/volym) saltsyra
Koncentrationen måste kontrolleras genom titrering med natriumhydro-
xidlösning 0,1 M och 0,1-procentigt metylrött (vikt/volym) i 94-
procentig etanol (volym/volym). 10 ml = 30,94 ml NaOH 0,1 M.
3.3 Carrez-lösning I: lös upp 21,9 g zinkacetat Zn(CH
3COO)2·2 H2O och 3 g
isättika i vatten. Fyll på vatten till 100 ml.
3.4 Carrez-lösning II: lös upp 10,6 g kaliumferrocyanid K4[Fe (CN)6]·3 H2O
i vatten. Fyll på vatten till 100 ml.
3.5 40-procentig etanol (volym/volym), d: 0,948 vid 20ºC.
4.Utrustning
4.1 250 ml Erlenmayerkolv med standardkoppling av matterat glas och
återloppskylare
4.2 Polarimeter eller sackarimeter
5.Utförande
5.1Beredning av provet
Krossa provet tills det är tillräckligt finfördelat för att helt kunna passera
genom ett såll med 0,5 mm rundama skor.
5.2Bestämning av den totala optiska rotationen (P eller S) (se anmärkning
7.1)
Väg upp 2,5 g av det krossade provet med 1 mg noggrannhet och placera
det i en 100 ml mätkolv. Tillsätt 25 ml saltsyra (3.2), skaka om så att
provet fördelas jämnt och tillsätt ytterligare 25 ml saltsyra (3.2). Sänk
ned kolven i kokande vattenbad under kraftig och jämn omskakning
under de tre första minuterna för att förhindra agglomeratbildning.
Vattenbadet måste innehålla så mycket vatten att det förblir vid
kokpunkten då kolven sänks ned i det. Kolven får inte tas upp ur vatten-
badet vid omskakningen. Ta upp kolven ur vattenbadet efter exakt 15
minuter, tillsätt 30 ml kallt vatten och kyl omedelbart till 20ºC.
Tillsätt 5 ml Carrez-lösning I (3.3) och skaka om under en minut. Tillsätt
därefter 5 ml Carrez-lösning II (3.4) och skaka på nytt om under en
minut. Fyll på vatten till full volym, homogenisera och filtrera. Om filt-
ratet inte är fullständigt klart (vilket är sällsynt) upprepas bestämningen
med en större kvantitet Carrez-lösning I och II, till exempel 10 ml.1972L0199 — SV — 22.07.1993 — 003.001 — 4
▼B
Mät lösningens optiska rotation i ett 200 mm rör med polarimetern eller
sackarimetern.
5.3Bestämning av den optiska rotationen (P ′eller S ′) hos ämnen som är
lösliga i 40-procentig etanol
Väg upp 5 g av provet med 1 mg noggrannhet, placera det i en 100 ml
mätkolv och tillsätt cirka 80 ml etanol (3.5) (se anmärkning 7.2). Låt
kolven stå en timme i rumstemperatur och skaka under denna tid om
kraftigt vid sex tillfällen så att provet blandas väl med etanolen. Fyll på
etanol (3.5) till full volym, homogenisera och filtrera.
Flytta med pipett 50 ml av filtratet (= 2,5 g av provet) till en 250 ml
Erlenmayerkolv, tillsätt 2,1 ml saltsyra (3.1) och skaka om kraftigt.
Anslut en återloppskylare till Erlenmayerkolven som därefter sänks ned
i kokande vattenbad. Ta efter exakt 15 minuter upp Erlenmayerkolven
ur vattenbadet, flytta innehållet till en 100 ml mätkolv (skölj med litet
kallt vatten) och kyl ned till 20ºC.
Klargör med Carrez-lösning I (3.3) och II (3.4), fyll på vatten till full
volym, homogenisera, filtrera och mät den optiska rotationen på det sätt
som anges i 5.2 andra och tredje styckena.
6.Resultatberäkning
Stärkelsehalten uttryckt i procent av provet beräknas på följande sätt:
6.1Polarimetrisk mätning
Procent st¨ arkelse ¼2000 P /C0P0ðÞ
α½/C13820º
D
där:
P = den totala optiska rotationen i grader
P′ = optisk rotation i grader för ämnen som är lösliga i
40-procentig etanol
α½/C13820º
D = ren stärkelses specifikaoptiskarota tion. De
konventionellt accepterade värdena för denna
faktor är:
+ 185,9º: risstärkelse
+ 195,4º: potatisstärkelse
+ 184,6º: majsstärkelse
+ 182,7º: vetestärkelse+ 181,5º: kornstärkelse+ 181,3º: havrestärkelse
+ 184,0º: andra typer av stärkelse och stärkelsemixer i foder-
blandningar.
6.2Sackarimetrisk mätning
Procent st¨ arkelse ¼
2000
α½/C13820º
D/C12N/C10;665 ðÞ S/C0S0ðÞ
100¼26;6N S /C0S0ðÞ
α½/C13820º
D
där:
S = total optisk rotation i sackarimetriska grader
S′= optisk rotation i sackarimetriska grader för ämnen som är
lösligai 40-procentig eta nol
N = sackarosvikt i gram i 100 ml vatten som ger en optisk rotation
på 100 sackarimetriska grader i ett 200 mm rör. Vikten varierar
på följande sätt beroende på vilken typ av sackarimeter som
används:
16,29 g för franska sackarimetrar,
26,00 g för tyska sackarimetrar,20,00 g för övriga sackarimetrar.
α½/C138
20º
D= ren stärkelses specifikaoptiskarota tion (se 6.1)1972L0199 — SV — 22.07.1993 — 003.001 — 5
▼B
6.3Repeterbarhet
Skillnaden mellan resultaten av två parallella bestämningar som utförts
på samma prov får inte överstiga 0,4, absolutvärde, om stärkelsehalten
är under 40 % och 1 %, relativvärde, om stärkelsehalten är 40 % eller
högre.
7.Anmärkningar
7.1 Om provet innehåller mer än 6 % karbonater, beräknat som kalciumkar-
bonat, måste dessa avlägsnas genom behandling med den exakt
beräknade mängd utspädd svavelsyra som krävs, innan den totala optiska
rotationen bestäms.
7.2 Då det gäller produkter med hög laktoshalt, som mjölkserum i pulver-
form och skummjölkspulver, förfar man på följande sätt efter att 80 ml
etanol (3.5) har tillsatts: Anslut en återloppskylare till kolven som
nedsänks i 50º C vattenbad under 30 minuter. Låt svalna och fortsätt
analysen enligt anvisningarna i 5.3.
2.BESTÄMNING AV RÅPROTEIN
1.Syfte och räckvidd
Med denna metod kan råproteinhalten i foder bestämmas på grundval av
kvävehalten som bestäms enligt Kjeldahlmetoden.
2.Princip
Provet bryts ned med svavelsyra i närvaro av en katalysator. Syralösningen
alkaliseras med natriumhydroxidlösning. Ammoniaken destilleras och
insamlas i en uppmätt mängd svavelsyra varefter överskottet svavelsyra
titreras med en standardlösning av natriumhydroxid.
3.Reagens
3.1 Kaliumsulfat.
3.2 Katalysator: koppar(II)oxid CuO eller koppar(II)sulfat-pentahydrat
CuSO4·5H2O.
3.3 Zinkgranulat.
3.4 Svavelsyra, ρ20= 1,84 g/ml.
3.5 Svavelsyra c(½H2SO4) = 0,5 mol/l.
3.6 Svavelsyra c(½H2SO4) = 0,1 mol/l.
3.7 Metylröttindikator: lös upp 300 mg metylrött i 100 ml etanol, σ= 95-
96 % (v/v)
3.8 Natriumhydroxidlösning (teknisk kvalitet får användas) = 40 g/100 ml
(m/v: 40 %).
3.9 Natriumhydroxidlösning c = 0,25 ml/l.3.10 Natriumhydroxidlösning c = 0,1 mol/l.
3.11 Pimpstensgranulat som saltsyresköljts och föraskats.
3.12 Acetanilid (mp. = 114 ºC, N = 10,36 %).
3.13 Sackaros (kvävefri).
4.Utrustning
Utrustning avsedd för nedbrytning, destillering och titrering enligt Kjeldahl-
metoden.
5.Utförande
5.1Nedbrytning
Väg upp 1 g av provet med 0,001 g noggrannhet och överför det till
nedbrytningsapparatens kolv. Tillsätt 15 g kaliumsulfat (3.1), en lämplig
mängd katalysator (3.2) (0,30-0,4 g koppar (II) oxid eller 0,91-1,2 g
koppar(II)sulfat-pentahydrat, 25 ml svavelsyra (3.4) och något pimp-
stensgranulat (3.11). Blanda. Upphetta kolven, först måttligt och under
omskakning då och då tills massan har karboniserats och skummet1972L0199 — SV — 22.07.1993 — 003.001 — 6
▼M3
▼M3
försvunnit, därefter intensivare tills vätskan kommit i konstant kokning.
Upphettningen är tillräcklig om den kokande syran kondenserar på
kolvens vägg. Se till att kolvens väggar inte blir överhettade och att
organiska partiklar inte fastnar på dem. När lösningen har blivit klar
och ljusgrön fortsätts kokningen i ytterligare två timmar, varefter
lösningen får svalna.
5.2Destillering
Tillsätt försiktigt tillräckligt med vatten tills sulfaterna löses upp full-
ständigt. Låt svalna. Tillsätt något zinkgranulat (3.3).
Tillför, efter att mängden mätts upp exakt, 25 ml svavelsyra (3.5) eller
(3.6), beroende på den antagna kvävehalten, till destilleringsapparatens
uppsamlingskolv. Tillsätt några droppar metylröttindikator (3.7).
Förbind kolven med destilleringsapparatens kylare och sänk ned kylarens
slutstycke minst 1 cm (se anmärkning 8.3) i vätskan i uppsamlings-
kolven. Häll långsamt 100 ml natriumhydroxidlösning (3.8) i kolven
utan att ammoniak försvinner (se anmärkning 8.1).
Upphetta kolven tills ammoniaken har destillerats färdigt.
5.3Titrering
Överskottet svavelsyra titreras i uppsamlingskolven med natriumhydro-
xidlösning (3.9) eller (3.10), beroende på vilken koncentration av
svavelsyra som använts, tills ekvivalenspunkten är nådd.
5.4Blankprov
För att fastställa om reagensen är fri från kväve utförs ett blankprov
(nedbrytning, destillering och titrering) genom att använda 1 g sackaros
(3.13) i stället för provet.
6.Resultatberäkning
Råproteinhalten beräknas efter följande formel:
V0/C0V1 ðÞ /C2 c/C20;014/C2100/C26;25
m
där
Vo= Volymen (ml) av NaOH (3.9 eller 3.10) använd i blankprovet.
V1= Volymen (ml) av NaOH (3.9 eller 3.10) använd i titreringen av
provet.
c = Koncentration (mol/l) av natriumhydroxid (3.9 eller 3.10).m = provets massa (g).
7.Verifiering av metoden
7.1Repeterbarhet
Skillnaden mellan två parallella bestämningar som utförts på samma
prov får inte överstiga
— 0,2 % absolutvärde, för råproteinhalter under 20 %,
— 1,0 % relativvärde (av det högsta resultatet), för råproteinhalter på
lägst 20 % och högst 40 %,
— 0,4 % absolutvärde, för råproteinhalter över 40 %.
7.2Noggrannhet
Utför analysen (nedbrytning, destillering och titrering) på 1,5-2 g aceta-
nilid (3.12) i närvaro av 1 g sackaros (3.13). 1 g acetanilidkräver
14,80 ml svavelsyra (3.5). Utvinningsprocenten måste vara minst 99 %.
8.Anmärkningar
8.1 Apparaten kan vara manuell, halvautomatisk eller automatisk. Om appa-
raten kräver att materialet flyttas mellan nedbrytnings- och
destillationsstegen skall en sådan flyttning kunna ske utan förlust. Om
destilleringsapparaturens kolv inte är försedd med en dropptratt skall
natriumhydroxiden tillsättas omedelbart innan kolven ansluts till kylaren,
varvid vätskan långsamt hälls ned längst med kylarens väggar.1972L0199 — SV — 22.07.1993 — 003.001 — 7
▼M3
8.2 Om nedbrytningsmaterialet tjocknar görs bestämningen om med hjälp av
en större mängd svavelsyra (3.4) än den som angivits ovan.
8.3 Då det gäller produkter med låg kvävehalt kan volymen svavelsyra (3.6)
som skall placeras i uppsamlingskolven minskas till 10-15 ml, om så är
nödvändigt, varefter vatten fylls på till 25 ml.
3.BESTÄMNING AV RÅPROTEIN SOM LÖSES AV PEPSIN OCH
SALTSYRA
1.Syfte och räckvidd
Med denna metod kan man fastställa hur stor del råprotein som under vissa
definierade förhållanden löses av pepsin och saltsyra. Metoden kan tillämpas
på alla foder.
2.Princip
Provet upphettas under 48 timmar vid 40ºC i en lösning av pepsin och salt-
syra. Suspensionen filtreras och filtratets kvävehalt fastställs enligt metoden
för bestämning av råprotein.
3.Reagens
3.1 Saltsyra, d: 1,125
3.2 Saltsyra 0,075 M
3.3 2,0 E/mg pepsin. Pepsinaktiviteten definieras i metodbeskrivningen i del
4 av denna bilaga och måste fastställas enligt denna metod.
3.4 Cirka 0,02-procentig (vikt/volym) nyberedd lösning av pepsin i saltsyra
(3.2); aktivitet: 400 E/l
3.5 Skumhämmande emulsion (t.ex. silikon)
3.6 Samtliga reagens som upptas i förteckningen i punkt 3 av metoden för
bestämning av råprotein
4.Utrustning
4.1 Vattenbad eller inkubator inställd på 40ºC ± 1ºC
4.2 Kjeldahlapparatur för nedbrytning och destillering
5.Utförande
5.1Beredning av lösningen (se anmärkning 7.2)
Väg upp 2 g av provet med 1 mg noggrannhet och placera det i en
500 ml mätkolv. Tillsätt 450 ml lösning av pepsin i saltsyra (3.4) som i
förväg upphettats till 40ºC och skaka om för att förhindra agglomerat-
bildning. Kontrollera att suspensionens pH är lägre än 1,7. Placera
kolven i vattenbadet eller inkubatorn (4.1) och behåll den där under 48
timmar. Skaka om efter 8, 24 och 32 timmar. Tillsätt efter 48 timmar
15 ml saltsyra (3.1), kyl till 20ºC, fyll på vatten till full volym och filt-
rera.
5.2Nedbrytning
Ta 250 ml av filtratet och placera det i destilleringsapparatens (4.2) kolv.
Tillsätt de reagens som är nödvändiga för nedbrytningen enligt anvis-
ningarna i metoden för bestämning av råprotein(andra meningen i punkt
5.1). Homogeniseraoch kokaupp. Om det bilda s skum tillsätts några
droppar skumhämmande emulsion (3.5). Låt fortsätta att koka kraftigt
tills vattnet har förångats nästan fullständigt. Sänk värmen och avlägsna
noggrant de sista resterna av vatten.
När lösningen blivit klar och färglös (eller ljusgrön om en kopparbaserad
katalysator används) fortsätts kokningen under ytterligare en timme. Låt
svalna.
5.3Destillering och titrering
Utförs enligt anvisningarna i metoden för bestämning av råprotein (punkt
5.2 och 5.3).1972L0199 — SV — 22.07.1993 — 003.001 — 8
▼B
▼B
5.4Blankprov
Utför ett blankprov enligt samma metod men med uteslutande av analy-
sprovet.
6.Resultatberäkning
Subtrahera den volym svavelsyra som förbrukats i blankprovet från den som
förbrukats av analysprovet. 1 ml svavelsyra 0,1 M motsvarar 1,4 mg kväve.
Multiplicera kvävemängden med faktorn 6,25. Uttryck resultatet i procent av
provet.
Repeterbarhet
Skillnaden mellan två parallella bestämningar som utförts på samma prov får
inte överstiga:
— 0,4, absolutvärde, för halter under 20 %,
— 2,0 %, relativvärde, för halter på lägst 20 % och högst 40 %,
— 0,8, absolutvärde, för halter över 40 %.
7.Anmärkningar
7.1 De värden som erhålls med denna metod har inget direkt samband med
nedbrytbarhet in vivo.
7.2 Produkter med en olje- eller fetthalt över 10 % måste först avfettas
genom extraktion med petroleumeter (kokpunkt 40-60ºC).
4.BERÄKNING AV PEPSINAKTIVITET
1.Syfte och räckvidd
Med denna metod är det möjligt att fastställa aktiviteten hos det pepsin som
används vid bestämning av råprotein som löses av pepsin och saltsyra.
2.Princip
Hemoglobin behandlas med pepsin under definierade förhållanden i ett salt-
syremedium. Den del av proteinet som inte hydrolyseras fälls ut i
triklorättiksyra. Natriumhydroxid och Folin-Ciocalteureagens tillsätts till filt-
ratet. Den optiska densiteten hos denna lösning mäts vid 750 nm och den
motsvarande kvantiteten tyrosin avläses från en kalibreringskurva.
Definition: Definitionen av pepsinenheten är den kvantitet av detta enzym
som, under de förutsättningar som gäller för denna metod, per minut frigör
en kvantitet hydroxiarylgrupper som, efter att ha färgats av Folin-Ciocalteu-
reagensen, har en optisk densitet som motsvarar den optiska densiteten hos
en mikromol tyrosin som färgats på samma sätt.
3.Reagens
3.1 Saltsyra 0,2 M
3.2 Saltsyra 0,06 M
3.3 Saltsyra 0,025 M3.4 5-procentig triklorättiksyrelösning (vikt/volym)3.5 Natriumhydroxidlösning 0,5 M3.6 Folin-Ciocalteureagens. Placera 100 g natriumvolframit (Na
2WO4·2 H2O), 25 g natriummolybdat (Na2MoO4·2 H2O) och 700 ml vatten i
en tvåliters rundbottnad kolv som är försedd med standardanslutning av
matterat glas. Tillsätt 50 ml fosforsyra (d: 1,71) och 100 ml koncentrerad
saltsyra (d: 1,19), anslut en återloppskylare till kolven, koka upp och låt
koka sakta under 10 timmar. Låt svalna, avlägsna återloppskylaren,
tillsätt 175 g litiumsulfat (Li2SO4·2 H2O), 50 ml vatten och 1 ml brom.
Koka under 15 minuter för att avlägsna överskottet brom.
Låt svalna, flytta lösningen till en enliters mätkolv, fyll på vatten till full
volym, homogenisera och filtrera. Ingen grönaktig färgton får finnas
kvar. Späd före användning ut en del reagens med två delar vatten.1972L0199 — SV — 22.07.1993 — 003.001 — 9
▼B
3.7 Hemoglobinlösning: Väg upp en mängd hemoglobin (cirka2 g protein-
substrat, bestämt enligt Anson) som motsvarar 354 mg kväve (1) och
placera detta i en 200 ml kolv som är försedd med standardanslutning
av matterat glas. Tillsätt några ml saltsyra (3.2), anslut kolven till vaku-
umpumpen och skaka om tills hemoglobinet har lösts fullständigt. Frigör
vakuumet och tillsätt under omskakning saltsyra (3.2) till 100 ml. Bered
denna lösning omedelbart före användandet .
3.8 Standardtyrosinlösning: lös upp 181,2 mg tyrosin i saltsyra (3.1) och fyll
på med samma syra till 1 liter (lagerhållen lösning). Ta 20,0 ml av denna
lösning och späd med saltsyra (3.1) till 100 ml. 1 ml av denna lösning
innehåller 0,2 mikromol tyrosin.
4.Utrustning
4.1 Vattenbad inställt på 25ºC ± 0,1ºC med ultratermostat
4.2 Spektrofotometer4.3 Kronometer, högstaa vvikelse: 1 sekund4.4 pH-mätare
5.Utförande
5.1Beredning av lösningen (se anmärkning 7.1)
Lös upp 150 mg pepsin i 100 ml saltsyra (3.2). Överför med pipett 2 ml
av lösningen till en 50 ml mätkolv och fyll på saltsyra (3.3) till full
volym. pH-mätaren måste visa ett värde på 1,6 ± 0,1. Sänk ned kolven
i vattenbadet (4.1).
5.2Hydrolys
Överför med pipett 5,0 ml hemoglobinlösning (3.7) till ett provrör,
upphetta till 25ºC i vattenbadet (4.1), tillsätt 1,0 ml av den pepsinlösning
som erhållits enligt punkt 5.1 och blanda med hjälp av en glasstav som
är tjockare i ena ändan med cirka 10 pendelrörelser. Lämna provröret i
vattenbadet vid 25ºC under exakt 10 minuter, räknat från den tid då
pepsinlösningen tillsattes (tidslängd och temperatur måste iakttas
noggrant). Tillsätt därefter 10,0 ml triklorättiksyrelösning (3.4) som i
förväg upphettats till 25ºC, homogenisera och filtrera genom ett torrt
filter.
5.3Färgutveckling och mätning av optisk densitet
Överför med pipett 5,0 ml av filtratet till en 50 ml Erlenmayerkolv,
tillsätt 10,0 ml natriumhydroxidlösning (3.5) samt, under ständig
omskakning, 3,0 ml utspätt Folin-Ciocalteureagens (3.6). Bestäm efter
5-10 minuter lösningens optiskadensitet mot va tten med spektrofoto-
meter vid 750 nm i celler som är 1 cm tjocka.
5.4Blankprov
Utför vid varje bestämning ett blankprov enligt följande:
Överför med pipett 5,0 ml hemoglobinlösning (3.7) till ett provrör,
upphetta till 25ºC i vattenbadet (4.1), tillsätt 10,0 ml triklorättiksyrelös-
ning (3.4) som i förväg upphettats till 25ºC, homogenisera och tillsätt
därefter 1,0 ml av den pepsinlösning som erhållits enligt punkt 5.1.
Blanda med en glasstav och lämna provröret i vattenbadet (4.1) vid
25ºC under exakt 10 minuter. Homogenisera och filtrera genom ett torrt
filter. Fortsätt enligt punkt 5.3.
5.5Kalibreringskurva
I 50 ml Erlenmayerkolvar placeras provmängder på 1,0, 2,0, 3,0, 4,0 och
5,0 ml standardtyrosinlösning (3.8), motsvarande 0,2, 0,4, 0,6, 0,8
respektive 1,0 mikromol tyrosin. Kompletteraserien med en tyrosinfri
referenslösning. Fyll på saltsyra (3.1) till 5,0 ml. Tillsätt 10,0 ml
natriumhydroxidlösning (3.5) samt, under ständig omskakning, 3,0 ml
utspätt Folin-Ciocalteureagens (3.6). Mät den optiska densiteten på det
sätt som anges i punkt 5.3 sista meningen. Rita kalibreringskurvan
genom att föra in värdena för optisk densitet vid respektive kvantitet
tyrosin.1972L0199 — SV — 22.07.1993 — 003.001 — 10
(1) Bestäm kvävehalten med halvmikro-Kjeldahlmetod (teoretisk halt: 17,7 % kväve).
▼B
6.Resultatberäkning
Avläs från kalibreringskurvan den kvantitet tyrosin i mikromol som
motsvarar den färgade lösningens optiska densitet efter korrigering med
blankvärdet.
Pepsinaktiviteten i mikromol hos tyrosin vid 25ºC, per mg och minut,
beräknas med följande formel:
Enheter per mg E =mgðÞ ¼0;32 a
p
där:
a = kvantitet tyrosin i mikromol avläst från kalibreringskurvan
p = vikt i mg av det pepsin som tillsatts enligt punkt 5.2
7.Anmärkningar
7.1 Den kvantitet pepsin som skall lösas upp måste vara sådan att en optisk
densitet av 0,35 ± 0,035 erhålls vid den slutliga fotometriska mätningen.
7.2 Två enheter per mg enligt denna metod motsvarar:
3,64 Anson-millienheter/mg (mikromol tyrosin/mg/min vid 35,5ºC),
eller36 400 handelsenheter/g (mikromol tyrosin/g/10 min vid 35,5ºC).
5.BESTÄMNING AV FRI OCH TOTAL GOSSYPOL
1.Syfte och räckvidd
Med denna metod kan halter av fri gossypol, total gossypol och kemiskt
besläktade ämnen bestämmas i bomullsfrö, bomullsfrömjöl och bomullsfrö-
kakor samt i foderblandningar som innehåller sådana ämnen, om halterna
överstiger 20 ppm.
2.Princip
Gossypolen extraheras under närvaro av 3-aminopropan-1-ol, antingen med
en blandning av propan-2-ol och hexan (vid bestämning av fri gossypol) eller
med dimetylformamid (vid bestämning av total gossypol). Gossypolen
omvandlas med anilin till gossypol-dianilin och detta ämnes optiska densitet
mäts vid 440 nm.
3.Reagens
3.1 Propan-2-ol/hexanblandning: blanda 60 (volym)delar propan-2-ol pa med
40 delar n-hexan.
3.2 Lösningsmedel A: placera i en enliters mätkolv cirka 500 ml propan-2-
ol/hexanblandning (3.1), 2 ml 3-aminopropan-1-ol, 8 ml isättika och
50 ml vatten. Fyll på med propan-2-ol/hexanblandningen (3.1) till full
volym. Detta reagens är hållbart i en vecka.
3.3 Lösningsmedel B: Överför med pipett 2 ml 3-aminopropan-1-ol och
10 ml isättiksyratill en 100 ml mätkolv. Kyl till rumstempera tur och
fyll på N,N-dimetylformamid till full volym. Detta reagens är hållbart i
en vecka.
3.4 Anilin pa: Om den optiska densiteten vid blankprovet överstiger 0,022 ,
destilleras anilinet över zinkpulver och de första och sista tio procenten
av destillatet avlägsnas. Om detta reagens kylförvaras i en brun,
proppförsluten glaskolv är det hållbart i flera månader.
3.5 Standardgossypollösning A: placera 27,9 mg gossypolacetat i en 250 ml
mätkolv. Lös upp och fyll på till full volym med lösningsmedel A (3.2).
Överför med pipett 50 ml av denna lösning till en 250 ml mätkolv och
fyll på lösningsmedel A till full volym. Gossypolhalten i denna lösning
är 0,02 mg per ml. Låt lösningen stå en timme i rumstemperatur innan
den används.
3.6 Standardgossypollösning B: placera 27,9 mg gossypolacetat i en 50 ml
mätkolv. Lös upp och fyll på till full volym med lösningsmedel B (3.3).
Gossypolhalten i denna lösning är 0,5 mg per ml.
Standardgossypollösningarna A och B förblir stabila under 24 timmar om
de skyddas från ljus.
4.Utrustning
4.1 Blandare (tumlare): cirka 35 varv per minut1972L0199 — SV — 22.07.1993 — 003.001 — 11
▼B
4.2 Spektrofotometer
5.Utförande
5.1Testprov
Hur stor mängd som skall användas för testprovet beror på den antagna
gossypolhalten hos provet. Det är fördelaktigt att arbeta med ett litet test-
prov och en relativt stor analysmängd av filtratet så att en så stor mängd
gossypol erhålls att en exakt fotometrisk mätning blir möjlig. Vid
bestämning av fri gossypol i bomullsfrö, bomullsfrömjöl och bomullsfrö-
kakor bör testprovet inte väga mer än 1 g; då det gäller foderblandningar
kan det gå upp till 5 g. I de flesta fall är det lämpligt att analysmängden
uppgår till 10 ml; den bör innehålla50-100 µg gossypol. Vid bestämning
av total gossypol bör testprovet väga mella 0,5 och 5 g så att 2 ml av
filtratet innehåller 40-200 µg gossypol.
Analysen skall utföras vid rumstemperatur, d.v.s. cirka 20ºC.
5.2Bestämning av fri gossypol
Placera testprovet i en 250 ml kolv med hals av matterat glas efter att
kolvens botten täckts med krossat glas. Tillsätt med pipett 50 ml
lösningsmedel A (3.2), tillslut kolven och blanda under en timme i blan-
daren. Filtrera genom torrt filter och samla upp filtratet i en liten kolv
med hals av matterat glas. Täck under filtreringen tratten med klockglas.
Överför med pipett identiska analysmängder av filtratet med en goss-
ypolhalt av 50-100 µg till två 25 ml mätkolvar (A och B). Fyll, om så
är nödvändigt, på lösningsmedel A (3.2) upp till 10 ml. Fyll därefter på
innehållet i kolv A upp till full volym med propan-2-ol/hexanbland-
ningen (3.1). Denna lösning skall användas som referenslösning för
mätvärdenaa v provlösningen.
Överför med pipett 10 ml lösningsmedel A (3.2) till två andra 25 ml
mätkolvar (C och D). Fyll på innehållet i kolv C till full volym med
propan-2-ol/hexanblandningen (3.1). Denna lösning skall användas som
referenslösning för mätvärdena av blankprovslösningen.
Tillsätt 2 ml anilin (3.4) till kolvarna D och B. Upphetta under 30
minuter över kokande vattenbad så att färgen framträder. Kyl till
rumstemperatur, fyll på propan-2-ol/hexanblandning (3.1) till full volym,
homogeniseraoch låt stå under en timme.
Fastställ blankprovlösningens (D) optiska densitet genom jämförelse med
referenslösningen (C) samt provlösningens (B) optiska densitet genom
jämförelse med referenslösningen (A) i spektrofotometern vid 440 nm
med 1 cm glasceller.
Subtrahera blankprovlösningens optiska densitet från provlösningens
(korrigerad optisk densitet). Beräkna utifrån det erhållna värdet halten
fri gossypol enligt anvisningarna i punkt 6.
5.3Bestämning av total gossypol
Placera ett testprov som innehåller 1-5 mg gossypol i en 50 ml mätkolv
och tillsätt 10 ml lösningsmedel B (3.3). Förbered samtidigt ett blank-
prov genom att fylla 10 ml lösningsmedel B (3.3) i en annan 50 ml
mätkolv. Upphetta de två kolvarna under 30 minuter över kokande
vattenbad. Kyl till rumstemperatur och fyll på innehållet i de båda
kolvarna till full volym med propan-2-ol/hexanlösningen (3.1). Homoge-
niseraoch låt sedimenteraunder 10-15 minuter; filtreradärefter och
samla upp filtraten i kolvar med halsar av matterat glas.
Överför med pipett 2 ml av provfiltratet till var och en av två 25 ml
mätkolvar samt 2 ml av blankprovsfiltratet till var och en av två andra
25 ml kolvar. Fyll på innehållet i den ena kolven i varje par till 25 ml
med propan-2-ol/hexanblandningen (3.1). Dessa lösningar skall användas
som referenslösningar.
Tillsätt 2 ml anilin (3.4) till var och en av de båda andra kolvarna.
Upphetta under 30 minuter över kokande vattenbad så att färgen fram-
träder. Kyl till rumstemperatur, fyll på propan-2-ol/hexanblandning (3.1)
till 25 ml, homogeniseraoch låt stå under en timme.
Bestäm den optiska densiteten enligt anvisningarna i punkt 5.2 för fri
gossypol. Beräkna utifrån det erhållna värdet halten total gossypol enligt
anvisningarna i punkt 6.1972L0199 — SV — 22.07.1993 — 003.001 — 12
▼B
6.Resultatberäkning
Resultaten kan beräknas antingen utifrån den specifika optiska densiteten
(6.1) eller med utnyttjande av en kalibreringskurva (6.2).
6.1Utifrån specifik optisk densitet
De specifika optiska densiteterna är under de angivna förutsättningarna:
fri gossypol:E1%
1c m¼625
total gossypol:E1%
1c m¼600
Provets halt fri eller total gossypol beräknas med följande formel:
% gossypol ¼E/C11250
E1%
1c m/C1p/C1a
där:
E = korrigerad optisk densitet, bestämd enligt anvisningarna i punkt
5.2,
p = testprovets vikt i g,
a = analysmängd filtrat i ml.
6.2Utifrån kalibreringskurva
6.2.1 Fri gossypol
Förbered två serier om vardera fem 25 ml mätkolvar. Överför med
pipett mängder på 2,0, 4,0, 6,0, 8,0 och 10,0 ml standardgossy-
pollösning A (3.5) till vardera av de båda serierna. Fyll på
lösningsmedel A (3.2) till 10 ml. Kompletterava rje serie med en
25 ml mätkolv som endast innehåller 10 ml lösningsmedel A
(3.2) (blankprov).
Fyll på propan-2-ol/hexanblandning (3.1) till 25 ml i kolvarna i
den första serien (även i den kolv som är avsedd för blankprovet)
(referensserie).
Tillsätt 2 ml anilin (3.4) till varje kolv i den andra serien (även den
kolv som är avsedd för blankprovet). Upphetta under 30 minuter
över kokande vattenbad så att färgen framträder. Kyl till rumstem-
peratur, fyll på propan-2-ol/hexanblandning (3.1) till full volym,
homogenisera och låt stå under en timme (standardserie).
Bestäm, enligt anvisningarna i punkt 5.2, den optiska densiteten
hos lösningarna i standardserien genom jämförelse med motsva-
rande lösningar i referensserien. Rita kalibreringskurvan genomatt föra in de optiska densiteterna vid motsvarande kvantitet goss-
ypol (i µg).
6.2.2 Total gossypol
Förbered sex 50 ml mätkolvar. I den första kolven placeras 10 ml
lösningsmedel B (3.3) och i de övriga2,0, 4,0, 6,0, 8,0 respektive
10,0 ml standardgossypollösning B (3.6). Fyll på lösningsmedel B
(3.3) upp till 10 ml i varje kolv. Upphetta under 30 minuter över
kokande vattenbad. Kyl till rumstemperatur, fyll på propan-2-ol/
hexanblandning (3.1) till full volym och homogenisera.
Placera 2,0 ml av dessa lösningar vardera i två serier om sex 25 ml
mätkolvar. Fyll kolvarna i den första serien med propan-2-ol/
hexanblandning (3.1) till 25 ml (referensserie).
Tillsätt 2 ml anilin (3.4) till var och en av kolvarna i den andra
serien. Upphetta under 30 minuter över kokande vattenbad. Kyl
till rumstemperatur, fyll på propan-2-ol/hexanblandning (3.1) till
full volym, homogenisera och låt stå under en timme (standard-
serie).
Bestäm, enligt anvisningarna i punkt 5.2, den optiska densiteten
hos lösningarna i standardserien genom jämförelse med motsva-
rande lösningar i referensserien. Rita kalibreringskurvan genom
att föra in de optiska densiteterna vid motsvarande kvantitet goss-
ypol (i µg).1972L0199 — SV — 22.07.1993 — 003.001 — 13
▼B
6.3Repeterbarhet
Skillnaden mellan resultaten av två parallella bestämningar som utförts
på samma prov får inte överstiga:
— 15 %, relativvärde, för gossypolhalter under 500 ppm,
— 75 ppm, absolutvärde, för halter på minst 500 ppm och högst
750 ppm,
— 10 %, relativvärde, för halter över 750 ppm.1972L0199 — SV — 22.07.1993 — 003.001 — 14
▼B
BILAGA 2
1.PÅVISANDE OCH IDENTIFIERING AV ANTIBIOTIKA AV TETRA-
CYKLINGRUPPEN
1.Syfte och räckvidd
Med denna metod är det möjligt att påvisa och identifiera antibiotika av
tetracyklingruppen i foder som innehåller lägst 0,1 ppm antibiotika samt i
koncentrat och premixer.
2.Princip
Provet extraheras med en blandning av metanol och saltsyra. Extraktet och
referenslösningarna undergår stigande papperskromatografi. Antibiotikan
påvisas och identifieras genom att dess Rf-värden jämförs med standardsub-
stansernas, antingen genom fluorescens i UV-ljus (hög halt antibiotika) eller
genom bioautografi på ett agarsubstrat som inokulerats med B.cereus.
3.Reagens och odlingssubstrat
3.1 Buffertlösning, pH 3,5
Citronsyremonohydrat pa 10,256 g
Dinatriumvätefosfat Na2HPO4·2 H2O pa7,45 g
Aceton pa300 mlDestillerat vatten till 1000 ml
3.2 Fosfatbuffertlösning, pH 5,5
Kaliumdivätefosfat KH
2PO4pa130,86 g
Dinatriumvätefosfat Na2HPO4·2 H2O pa6,947 g
Destillerat vatten till 1000 ml
3.3 Eluant I: blandning av ren nitrometan/ren kloroform/1,3-diklorpropan-2-
ol; volymproportion: 20/10/1,5; bereds omedelbart före användning
3.4 Eluant II: blandning av ren nitrometan/ren kloroform/2-pikolin;
volymproportion: 20/10/3; bereds omedelbart före användning
3.5 Blandning ren metanol/saltsyra (d: 1,19): volymproportion 98/2
3.6 Saltsyra 0,1 M3.7 Ammoniak, d: 0,91
3.8 Standardsubstanser: klortetracyklin, oxytetracyklin, tetracyklin, vilkas
aktivitet uttrycks som väteklorid
3.9 Mikroorganism: B.cereus ATCC nr 11 778
Underhåll av parentalstammen, beredning av sporsuspensionen och
inokulering av odlingssubstratet: följ instruktionerna i punkt 3.1 och
3.2 i den metod för bestämning av klortetracyklin-, oxytetracyklin- och
tetracyklinhalt genom diffusion på agar som beskrivs i del 2 av denna
bilaga.
3.10 Odlingssubstrat (
1)
Glukos 1 gTryptisk pepton 10 g
Köttextrakt 1,5 g
Jästextrakt 3 gAgar 20 g
Destillerat vatten till 1000 ml1972L0199 — SV — 22.07.1993 — 003.001 — 15
(1) Samtliga kommersiellt tillverkade odlingssubstrat med liknande sammansättning, som
ger samma resultat, får användas.
▼B
Justera pH-värdet till 5,8 omedelbart före användning.
3.11 0,1-procentig (vikt/volym) 2,3,5-trifenyltetrazoliumkloridlösning och 5-
procentig (vikt/volym) glukoslösning.
4.Utrustning
4.1 Apparatur för stigande papperskromatografi (pappershöjd: 25 cm);
Schleicher och Schüllpapper (2040b eller 2043b) eller motsvarande
4.2 Centrifug4.3 Inkubator inställd på 30ºC4.4 UV-lampa för påvisande av fluorescens
4.5 Glasplattor, cirka 20 × 30 cm, för bioautografi
5.Standardlösningar
5.1Lagerhållna lösningar
Bered med saltsyra (3.6) lösningar av standardsubstanserna (3.8) med
koncentrationer motsvarande 500 µg per ml av klortetracyklin-HCl,
oxytetracyklin-HCl respektive tetracyklin-HCl.
5.2Referenslösningar för påvisande genom UV-ljus
Späd ut lösningarna (5.1) med fosfatbuffertlösning (3.2) för att erhålla
lösningar med koncentrationer motsvarande 100 µg per ml av klortetra-
cyklin-HCl, oxytetracyklin-HCl och tetracyklin-HCl.
5.3Referenslösningar för påvisande genom bioautografi
Späd ut lösningarna (5.1) med fosfatbuffertlösning (3.2) för att erhålla
lösningar med koncentrationer motsvarande 5 µg per ml av klortetra-
cyklin-HCl, oxytetracyklin-HCl och tetracyklin-HCl.
6.Extraktion
Om den antagna antibiotikahalten är lägre än 10 ppm kan antingen det homo-
geniserade provet eller den finaste delen som avskilts vid siktningen
användas, eftersom antibiotikan huvudsakligen påträffas i denna del.
Slamma provet i blandningen (3.5) och centrifugera. Samla upp dekanter-
ingsvätskan (supernatanten) och använd den antingen i ursprungligt skick
eller, om så är nödvändigt, utspädd med blandningen (3.5) så att antibiotika-
halterna blir cirka 100 µg per ml (6.1) och 5 µg per ml (6.2).
7.Påvisande och identifiering
7.1Kromatografi
Dränk in papperet med buffertlösningen, pH 3,5 (3.1). Avlägsna
överskottsvätskan genom att pressa papperet mellan torra ark filtrer-
papper. Placera därefter volymer på 0,01 ml av referenslösningarna(5.2
och 5.3) och extraktet (6.1 och 6.2) på papperet. För att uppnå en god
separering är det nödvändigt att papperet har korrekt vätskehalt; därför
bör man låta det torka en tid om så är nödvändigt.
Framkalla genom stigande kromatografi. Använd eluant I (3.3) för
påvisande genom bioautografi och eluant II (3.4) för påvisande genom
UV-ljus. När lösningsmedlets kant har stigit 15-20 cm (cirka 1 timme
och 30 minuter) avbryts kromatografin och papperet torkas.
7.2Påvisande genom UV-ljus
Om antibiotikahalten överstiger 1 µg per cm
2kommer, efter att kromato-
grammet har behandlats med ammoniakångor, guldgula fläckar att
framträda vid bestrålning under UV-lampan (4.4).
7.3Påvisande genom bioautografi
Häll odlingssubstratet (3.10), som i förväg inokulerats med B.cereus
(3.9), på glasplattor (4.5) och placera papperet i odlingssubstratet. Efter
fem minuters kontakt med substratet avlägsnas papperet och placeras på
en annan plats i odlingssubstratet där det sedan förblir under inkubations-
perioden. Inkubera därefter över natten vid 30ºC. Om något antibiotikum1972L0199 — SV — 22.07.1993 — 003.001 — 16
▼B
av tetracyklingruppen finns i provet framträder ljushämningszoner i det
grumligaodlingssubstra tet.
För att fixera kromatogrammet förångas lösningen (3.11) på papperet
efter inkubering.
7.4Identifiering
De relativa Rf-värdena för antibiotika av tetracyklingruppen anges
nedan. Dessa värden kan variera något beroende på papperets kvalitet
och vätskehalt.
Klortetracyklin (CTC) 0,60
Tetracyklin (TC) 0,40Oxytetracyklin (OTC) 0,20
4-epi-CTC 0,15
4-epi-TC 0,134-epi-OTC 0,10
Den antibiotiska aktiviteten är lägre hos ”epi”-föreningar än hos normala
föreningar.
2.BESTÄMNING AV KLORTETRACYKLIN, OXYTETRACYKLIN
OCH TETRACYKLIN
A. GENOM AGARDIFFUSION
1.Syfte och omfattning
Med denna metod kan halter av klortetracyklin (CTC), oxytetracyklin (OTC)
och tetracyklin (TC) bestämmas i foder, koncentrat och premixer, om de
överstiger 5 ppm. Halter under 5 ppm kan bestämmas med grafisk interpola-
tion.
2.Princip
Då det gäller halter på 50 ppm eller lägre extraheras provet med utspädd
formamid. Om halterna överstiger 50 ppm extraheras provet med en bland-
ning av aceton, vatten och saltsyra vid bestämning av CTC och med en
blandning av metanol och saltsyra vid bestämning av OTC och TC.
Därefter späds extrakten ut och deras antibiotiska aktivitet bestäms genom att
man mäter CTC:s, OTC:s eller TC:s diffusion på ett agarsubstrat som tillförts
B.cereus . Diffusionen påvisas genom att hämningszoner bildas vid förekomst
av mikroorganismen. Dessa zoners diameter är direkt proportionell till loga-
ritmen på den antibiotiska koncentrationen.
3.Mikroorganism: B. cereus, ATCC nr 11 778
3.1Underhåll av parentalstammen
Inokulera B.cereus i ett rör med snedagar som tagits från ett odlings-
substrat (4.1), som är fritt från metylenblått och borsyra . Inkuberaöver
natten vid cirka 30ºC. Förvara odlingen i kylskåp och inokulera snedagar
på nytt med den var fjortonde dag.
3.2Beredning av sporsuspensionen
Samla in bakterierna från ett rör snedagar (3.1) med 2-3 ml fysiologisk
koksaltlösning (4.5). Tillför denna suspension till en Rouxkolv som
innehåller 300 ml odlingssubstrat (4.1) fritt från metylenblått och borsyra
och med en agarkoncentration av 3-4 %. Inkubera under 3-5 dagar vid
28-30ºC och samla därefter in sporerna i 15 ml etanol (4.6), efter att
sporbildning kontrollerats i mikroskop, samt homogenisera. Denna
suspension är hållbar minst 5 månader i kylskåp.
Fastställ genom förberedande prov på plattor med bassubstratet för
bestämningen (4.1) vilken kvantitet av inokulatet som, vid de olika anti-
biotikakoncentrationer som används, ger största möjliga hämningszoner
som fortfarande är tydliga. Vanligtvis ligger denna kvantitet mellan 0,2
och 0,3 ml per 1 000 ml. Odlingssubstratet inokuleras vid en temperatur
av mellan 50 och 60ºC.1972L0199 — SV — 22.07.1993 — 003.001 — 17
▼B
4.Odlingssubstrat och reagens
4.1 Bassubstrat för bestämningen (1)
Glukos 1 g
Tryptisk pepton 10 gKöttextrakt 1,5 g
Jästextrakt 3 g
Agar (beroende på kvalitet) 10-20 g”Tween 80” 1ml
Fosfatbuffertlösning, pH 5,5 (4.2) 10 ml
5-procentig borsyrelösning (vikt/volym) 15 ml0.5-procentig lösning av metylenblått i etanol 4 ml
Destillerat vatten till 1000 ml
Justera pH-värdet till 5,8 omedelbart före användning.
4.2 Fosfatbuffertlösning, pH 5,5
Kaliumdivätefosfat KH
2PO4pa130,86 g
Dinatriumvätefosfat Na2HPO4·2 H2O pa6,947 g
Destillerat vatten till 1000 ml
4.3 Fosfatbuffertlösning, pH 5,5, utspädd 1/10
4.4 Fosfatbuffertlösning, pH 8
Kaliumdivätefosfat KH2PO4pa1,407 g
Dinatriumvätefosfat Na2HPO4·2 H2O pa57,539 g
Destillerat vatten till 1000 ml
4.5 Steril fysiologisk koksaltlösning.
4.6 20-procentig etanol (volym/volym).
4.7 Saltsyra 0,1 M
4.8 70-procentig formamid (volym/volym): nybereds före användning; pH-
värdet justeras till 4,5 med svavelsyra, cirka 2 M.
4.9 Blandning av ren aceton/vatten/saltsyra (d: 1,19) i volymsproportio-
nerna65/33/2.
4.10 Blandning av ren metanol/saltsyra (d: 1,19) i volymsproportionerna 98/
2.
4.11 Standardsubstanser: CTC, OTC, TC. Dessas aktivitet uttrycks som
väteklorid.
5.Standardlösningar
5.1Klortetracyklin
Bered en lösning som skall hållas i lager med en koncentration motsva-
rande 500 µg per ml klortetracyklin-HCl genom att tillsätta saltsyra (4.7)
till standardlösningen (4.11). Denna lösning är hållbar en vecka i
kylskåp.
Av denna utgångslösning bereds en standardarbetslösning S8med en
koncentration motsvarande 0,2 µg per ml klortetracyklin-HCl. Utspäd-
ning sker med fosfatbuffertlösningen, pH 5,5, utspädd 1/10 (4.3), med
tillsats av 0,01 % amidsvart (2).
Bered därefter genom successiv utspädning (1 + 1) med buffertlösningen
(4.3) följande koncentrationer:
S40,1 µg/ml1972L0199 — SV — 22.07.1993 — 003.001 — 18
(1) Samtliga kommersiellt tillverkade odlingssubstrat med liknande sammansättning, som
ger samma resultat, får användas.
(2) Amidsvart används för att påvisa hämningszonerna i standardlösningen (blå ringar).
▼B
S20,05 µg/ml
S10,025 µg/ml
5.2Oxytetracyklin
Bered, enligt anvisningarna i 5.1, av en utgångslösning med en koncen-
tration motsvarande 400 µg per ml oxytetracyklin-HCl en
standardarbetslösning S8som innehåller 1,6 µg oxytetracyklin-HCl per
ml samt följande koncentrationer:
S40,8 µg/ml
S20,4 µg/ml
S10,2 µg/ml
5.3Tetracyklin
Bered, enligt anvisningarna i 5.1, av en utgångslösning med en koncen-
tration motsvarande 500 µg per ml tetracyklin-HCl en
standardarbetslösning S8som innehåller 1,0 µg tetracyklin-HCl per ml
samt följande koncentrationer:
S40,5 µg/ml
S20,25 µg/ml
S10,125 µg/ml
6.Extraktion
6.1Halter på högst 50 ppm
Tillsätt formamid (4.8) till analysprovet i de kvantiteter som anges i
nedanstående tabell. Skaka om på platta under 30 minuter. Späd därefter
omedelbart ut med fosfatbuffertlösning (4.3) enligt nedanstående tabell
så att koncentrationen U8erhålls. Denna lösnings formamidkoncentration
får inte överstiga40 %.
Centrifugera eller dekantera så att lösningen blir klar. Bered därefter
koncentrationerna U4,U2och U1genom successiv utspädning (1+1) med
fosfatbuffertlösningen (4.3).
Antibiotikum CTC OTC TC
Antagen halt i ppm 10 50 10 50 10 50
Analysprov (g) 10 10 24 9,6 20 10
ml formamid (4.8) 100 100 80 100 80 100
ml fosfatbuffertlösning
(4.3)utspädd
1:5
(a)utspädd
1:25
(b) 70 200 120utspädd
1:5
(a)
U8-koncentration (µg/ml) 0,2 0,2 1,6 1,6 1,0 1,0
(a) 20 ml extrakt späds med buffertlösning till 100 ml i mätkolv.
(b) 4 ml extrakt späds med buffertlösning till 100 ml i mätkolv.
6.2Halter över 50 ppm
6.2.1 Klortetracyklin
Tillsätt till ett analysprov på 2-10 g (beroende på provets antagna
halt av antibiotika eller tillverkarens garanti) blandning (4.9) i
proportionen 20 gånger provets volym. Skaka om på platta under
30 minuter. Under extraktionen måste pH-värdet konstant ligga
under 3; justera, om så är nödvändigt, till pH 3 med 10-procentig
ättiksyra för mineralblandningar. Ta en del av extraktet för analys
och justerapH-värdet till 5,5 med fosfa tbuffertlösning, pH 8 (4.4)
och tillsätt samtidigt bromkresolgrönt (som växlar färg från gult till
blått). Späd ut med fosfatbuffertlösning, pH 5,5, utspädd 1/10 (4.3)
så att koncentrationen U8uppnås (se 6.1).1972L0199 — SV — 22.07.1993 — 003.001 — 19
▼B
Förbered sedan koncentrationerna U4,U2och U1genom successiva
utspädningar (1: 1) med fosfatbuffertlösning (4.3).
6.2.2 Oxytetracyklin och tetracyklin
Följ anvisningarna i punkt 6.2.1, men använd blandning (4.10) i
stället för blandning (4.9).
7.Bestämningsmetod
7.1Inokulering av odlingssubstratet
Inokulera bassubstratet för bestämningen (4.1) i sporsuspensionen (3.2)
vid 50-60ºC.
7.2Preparering av brickorna
Diffusion på agar utförs på brickor med fyra koncentrationer av stan-
dardlösningen (S8,S4,S2,S1) och fyra koncentrationer av extraktet (U8,
U4,U2,U1). Samtliga fyra koncentrationer extrakt och standardlösning
måste placeras på varje bricka.
Välj därför brickor med en ytasom tillåter a tt minst åttahål, 10-13 mm i
diameter, görs i agarsubstratet. Beräkna vilken kvantitet inokulerat
odlingssubstrat (7.1) som krävs för att täcka brickorna med ett jämnt,
cirka 2 mm tjockt lager. Försöket bör helst utföras på brickor av planglassom är försedda med en helt jämn aluminium- eller plastring, 200 mm i
diameter och 20 mm hög.
Fyll med pipett noggrant uppmätta kvantiteter antibiotikalösning, mellan
0,10 och 0,15 ml beroende på hålens diameter.
Upprepa för varje prov diffusionen minst fyra gånger med varje koncen-
tration så att en utvärdering av 32 hämningszoner ingår i varje
bestämning.
7.3Inkubation
Inkuberabrickornaunder cirka18 timma r vid 28-30ºC.
8.Utvärdering
Mät hämningszonernas diameter, helst genom projektion. För in mätvärdena
på semilogaritmiskt papper så att logaritmen på koncentrationerna förs in vid
hämningszonernas diameter. Rita linjerna för standardlösningen respektive
extraktet. Förutsatt att ingen interferens förekommer skall de båda linjerna
vara parallella.
Logaritmen på den relativa aktiviteten beräknas med följande formel:
U1þU2þU4þU8/C0S1/C0S2/C0S4/C0S8 ðÞ /C1 0;602
U4þU8þS4þS8/C0U1/C0U2/C0S1/C0S2
Reell aktivitet = antagen aktivitet × relativ aktivitet
9.Repeterbarhet
Skillnaden mellan resultaten av två parallella bestämningar som utförts på
samma prov får inte överstiga 10 % relativvärde.
B. GENOM TURBIDIMETRI
1.Syfte och räckvidd
Denna metod gör det möjligt att bestämma halter av klortetracyklin
(CTC), oxytetracyklin (OTC) och tetracyklin (TC) i högre koncentrationer
än 1 g per kg, förutsatt att ingen påverkan sker från andra substanser som
grumlar extrakten. Denna metod är snabbare än agardiffusion.
2.Princip
Provet extraheras vid bestämning av CTC med en blandning av aceton,
vatten och saltsyra och vid bestämning av OTC och TC med en blandning
av metanol och saltsyra.
Därefter späds extrakten ut och deras antibiotiska verkan bestäms genom
mätning av ljustransmissionen hos ett odlingssubstrat som har ympats med1972L0199 — SV — 22.07.1993 — 003.001 — 20
▼B
Staphylococcus aureus och tillsatts den antibiotiska substansen. Ljustran-
smissionen beror på antibiotikakoncentrationen.
3.Mikroorganism: Staphylococcus aureus K 141 (1)
3.1Underhåll av parentalstammen
Inokulera S.aureus i ett provrör med snedagar som tagits från
odlingssubstratet (4.1) och som tillsatts 1,5 till 3 % agar (beroende
på kvaliteten). Inkubera över natten vid 37ºC. Förvara odlingen i
kylskåp och inokulera den på nytt med snedagar var fjärde vecka.
Förbered samtidigt delodlingar för laboratoriebruk.
3.2Beredning av inokulatet 24 timmar före användning inokuleras
snedagar på nytt i en delodling och inkuberas över natten vid 37ºC.
Slamma hela den odling som finns i ett agarrör i cirka 2 ml
bassubstrat (4.1) och överför därefter suspensionen sterilt till cirka
100 ml av samma bassubstrat (4.1). Inkubera i vattenbad vid 37ºC tills
stammens tillväxt går in i sin logaritmiska fas (1½-2 timmar).
4.Odlingssubstrat och reagens
4.1Bassubstrat för bestämning2
Pepton 5 g
Jästextrakt 1,5 g
Köttextrakt 1,5 gNatriumklorid 3,5 g
Glukos 1,0 g
Kaliumdivätefosfat KH
2PO4pa1,32 g
diKaliumvätefosfat K2HPO4pa3,68 g
Destillerat vatten till 1 000 ml
pH efter sterilisering: 6,8-7,0
4.2Fosfatbuffertlösning, pH 4,5
Kaliumdivätefosfat KH2PO4pa13,6 g
Destillerat vatten till 1 000 ml
4.3 Saltsyra 0,1 M
4.4 Blandning rent aceton/vatten/saltsyra (d: 1,19) i volymsproportionerna 65/
33/2
4.5 Blandning ren metanol/saltsyra (d: 1,19) i volymsproportionerna 98/24.6 Cirka10-procentig (vikt/volym) forma ldehydlösning4.7 Standardsubstanser: CTC, OTC, TC, vilkas aktivitet uttrycks som vätek-
lorid.
5.Standardlösning
Bered genom tillsats av saltsyra (4.3) till standardsubstansen (4.7) en lösning
som hålls i lager med en koncentration motsvarande 400-500 µg/ml CTC/HCl,
OTC/HCl eller TC/HCl. I kylskåp är denna lösning hållbar i en vecka.
6.Extraktion
6.1Klortetracyklin
Placera 1-2 g av provet i en 200 eller 250 ml mätkolv. Tillsätt cirka 100 ml
av blandningen (4.4) och skaka om under 30 minuter på en platta. Fyll på
fosfatbuffertlösning, pH 4,5 (4.2) till full volym. Homogenisera och låt sedi-
mentera.1972L0199 — SV — 22.07.1993 — 003.001 — 21
(1) Denna stam som isolerats av LUFA i Kiel växer snabbare än S.aureus ATCC 6538 P .
(2) Samtliga kommersiellt tillverkade odlingssubstrat medliknande sammansättning, som
ger samma resultat, får användas.
▼B
6.2Oxytetracyklin och tetracyklin
Placera 1-2 g av provet i en 200 eller 250 ml mätkolv. Tillsätt cirka 100 ml
av blandningen (4.5) och skaka om under 30 minuter på en platta. Fyll på
fosfatbuffertlösning, pH 4,5 (4.2) till full volym. Homogenisera och låt sedi-
mentera.
7.Bestämningsmetod
7.1Beredning av standardserien och extraktet
Späd ut standardlösningen (5) och extraktet (6) med fosfatbuffertlösningen,
pH 4,5 (4.2) så att en serie koncentrationer erhålls. Vid varje bestämning
ritas en kalibreringskurva för respektive koncentration så att åtminstone två
värden för extraktet kan interpoleras. Utspädningsgraderna väljs beroende
på stammens växtförhållanden som kan variera mellan olika laboratorier.
Vanligtvis används följande metod:
7.1.1 Klortetracyklin
Späd ut standardlösningen (5) med fosfatbuffertlösningen (4.2) så att
en standardarbetslösning erhålls med en koncentration motsvarande
0,2 µg/ml CTC/HCl. Gör därefter i ordning provrör med sex
utspädningsgrader, var och en i dubbel uppsättning, genom att späda
med fosfatbuffertlösningen (4.2) enligt följande:
ml standardarbetslös-
ningml fosfatbuffertlösning
(4.2)koncentration CTC/HCl
(µg/ml)
0,7 0,3 0,14
0,6 0,4 0,12
0,55 0,45 0,11
0,45 0,55 0,09
0,4 0,6 0,08
0,3 0,7 0,06
Späd ut extraktet (6.1) med fosfatbuffertlösningen (4.2) så att en
antagen CTC/HCl-koncentration av 0,12 µg/ml erhålls. Placera 1 ml
vardera av denna lösning i två provrör och 0,75 ml (= 0,09 µg)
vardera i två andra provrör. Fyll på fosfatbuffertlösning (4.2) till 1 ml
i de två senare provrören.
7.1.2 Oxytetracyklin och tetracyklin
Späd ut standardlösningen (5) med fosfatbuffertlösningen (4.2) så att
en standardarbetslösning erhålls med en koncentration motsvarande
0,6 µg/ml OTC/HCl eller TC/HCl. Gör därefter i ordning provrör
med sju utspädningsgrader, var och en i dubbel uppsättning, genom
att späda med fosfatbuffertlösningen (4.2) enligt följande:
ml standardarbetslös-
ningml fosfatbuffertlösning
(4.2)koncentration OTC/HCl
eller TC/HCl
(µg/ml)
0,9 0,1 0,54
0,8 0,2 0,48
0,7 0,3 0,42
0,6 0,4 0,36
0,4 0,6 0,24
0,3 0,7 0,18
0,2 0,8 0,12
Späd ut extraktet (6.2) med fosfatbuffertlösningen (4.2) så att en
antagen OTC/HCl- eller TC/HCl-koncentration av 0,48 µg/ml erhålls.
Placera 1 ml vardera av denna lösning i två provrör och 0,5 ml
(= 0,24 µg) vardera i två andra provrör. Fyll på fosfatbuffertlösning
(4.2) till 1 ml i de två senare provrören.1972L0199 — SV — 22.07.1993 — 003.001 — 22
▼B
7.2Inokulering av odlingssubstratet
Inokulera bassubstratet för bestämningen (4.1) med inokulatet (3.2) så att,
med fotometer vid 590 nm, 85 % ljustransmission erhålls i en 5 cm cell,
respektive 92 % i en 2 cm cell, efter att apparaturen ställts in på 100 %
transmission på det ej inokulerade bassubstratet (4.1).
7.3Ympning
Placera 9 ml av det inokulerade odlingssubstratet (7.2) i varje provrör (7.1.1
eller 7.1.2). Vid ifyllningen måste utrustningen vara ren men inte
nödvändigtvis steriliserad.
7.4Inkubation
Inkubationen måste utföras i ett vattenbad som hela tiden håller 37ºC
± 0,1ºC under omrörning. Inkubationsperioden (vanligtvis 2 ∞-3 timmar)
måste vara så lång att det blir möjligt att rita transmissionskurvor med
gradienter som tillåter noggrann uppmätning. Stoppa därefter den fortsatta
tillväxten genom att snabbt injicera 1 ml formaldehydlösning (4.6) i varje
provrör.
7.5Mätning av tillväxten
Mät transmissionerna med fotometer vid 590 nm, varvid apparaturen ställs
in på 100 % transmission på den klaraste standardlösningen (vilket innebär
den högsta antibiotikahalten). Eftersom skillnaderna i grumlighet mellan de
olikaprovrören blir mycket små bör celler på minst 2 cm (helst 5 cm)
användas.
8.Resultatberäkning
Rita kalibreringskurvan på millimeterpapper genom att föra in de fotometriska
transmissionerna vid respektive antibiotikakoncentrationer. Interpolera extraktets
transmissionsvärden på kurvan. Beräkna provets antibiotikahalt.
9.Repeterbarhet
Skillnaden mellan två parallella bestämningar som utförts på samma prov får
inte överstiga10 %, rela tivvärde.
3.BESTÄMNING AV OLEANDOMYCIN
- genom agardiffusion -
1.Syfte och räckvidd
Med denna metod kan, också då tetracykliner förekommer i provet, oleando-
mycinhalter över 0,5 ppm bestämmas i foder, koncentrat och premixer.
2.Princip
Provet extraheras med en lösning av tri(hydroxymetylamino)metan i utspädd
metanol. Efter centrifugering späds extraktet ut och dess antibiotiska verkan
bestäms genom mätning av oleandomycinets diffusion i ett agarsubstrat som
ympats med B.cereus . Diffusionen påvisas genom att mikroorganismen
orsakar att det bildas hämningszoner. Dessa zoners diameter är direkt propor-
tionell till logaritmen på antibiotikakoncentrationen.
3.Mikroorganism: B. cereus K 250 TR (1) (resistent mot tetracykliner)
3.1Underhåll av parentalstammen
Inokulera B.cereus i ett provrör med snedagar som tagits från odlings-
substratet (4.1) till vilket 100 µg per 5 ml oxytetracyklin har tillsatts.
Inkubera över natten vid cirka 30ºC. Förvara odlingen i kylskåp och
inokulera snedagar på nytt var fjärde vecka.
3.2Beredning av sporsuspensionen
Samla in bakterierna från ett provrör med snedagar (3.1) med cirka 3 ml
fysiologisk koksaltlösning (4.3). Ympa med denna suspension en Roux-
kolv som innehåller 300 ml odlingssubstrat (4.1) med en
agarkoncentration av 3-4 % . Inkubera under 3-5 dagar vid 28-30ºC och
samla därefter upp sporerna i 15 ml etanol (4.4), efter att sporbildningen1972L0199 — SV — 22.07.1993 — 003.001 — 23
(1) Stammen har isolerats av LUFA i Kiel.
▼B
kontrollerats i mikroskop, och homogenisera. Denna suspension är
hållbar minst fem månader i kylskåp.
Fastställ genom förberedande prov på plattor med bassubstratet för
bestämningen (4.1) vilken kvantitet av inokulatet som, vid de olika
koncentrationer av oleandomycin som används, ger största möjliga
hämningszoner som fortfarande är tydliga. Vanligtvis ligger kvantiteten
mellan 0,1 och 0,2 ml per 1 000 ml. Odlingssubstratet inokuleras vid
60ºC.
4.Odlingssubstrat och reagens
4.1Bassubstrat för underhåll av parentalstammen (1)
Glukos 1 g
Tryptisk pepton 10 g
Köttextrakt 1,5 g
Jästextrakt 3 gAgar (beroende på kvalitet) 10-20 g
Destillerat vatten till 1000 ml
Justera pH-värdet till 6,5 omedelbart före användning.
4.2Bassubstrat för bestämningen (
1)
Substratet (4.1) med pH justerat till 8,8
4.3 Steril fysiologisk koksaltlösning4.4 20-procentig etanol (volym/volym)4.5 Ren metanol4.6 0,5-procentig tri(hydroxymetylamino)metanlösning pa (vikt/volym)
4.7Extraktionslösning
Ren metanol 50 ml
Destillerat vatten 50 ml
Tri(hydroxymetylamino)-
metan pa0,5 g
4.8 Standardsubstans: oleandomycin med känd aktivitet
5.Standardlösning
Lös upp en del av standardsubstansen (4.8) i 5 ml metanol (4.5) och späd
med lösningen (4.6) så att en oleandomycinkoncentration av 100 µg/ml
erhålls.
Av denna utgångslösning bereds en standardarbetslösning S
8som innehåller
0,1 µg/ml oleandomycin genom utspädning med lösningen (4.6). Bered
därefter genom successiv utspädning (1: 1) med lösningen (4.6) följande
koncentrationer:
S40,05 µg/ml
S20,025 µg/ml
S10,0125 µg/ml
6.Extraktion
Ta 2-10 g av provet, beroende på dess antagna oleandomycinhalt, tillsätt
100 ml lösning (4.7) och skaka om under 30 minuter på en platta.
Centrifugera, ta en del av extraktet och späd ut med lösningen (4.6) så att en
antagen oleandomycinkoncentration av 0,1 µg/ml (U8) erhålls. Bered därefter1972L0199 — SV — 22.07.1993 — 003.001 — 24
(1) Samtliga kommersiellt tillverkade odlingssubstrat med liknande sammansättning, som
ger samma resultat, får användas.
▼B
koncentrationerna U4,U2och U1genom successivautspädninga r (1: 1) med
lösningen (4.6).
7.Bestämningsmetod
7.1Inokulering av odlingssubstratet
Inokulera bassubstratet för bestämningen (4.2) i sporsuspensionen (3.2)
vid 60ºC.
7.2Preparering av brickorna
Diffusion på agar utförs på brickor med fyra koncentrationer av stan-
dardlösningen (S8,S4,S2,S1) och fyra koncentrationer av extraktet (U8,
U4,U2,U1). Samtliga fyra koncentrationer standardlösning och extrakt
måste placeras på varje bricka.
Välj därför brickor med en ytasom tillåter a tt minst åttahål, 10-13 mm i
diameter, görs i agarsubstratet. Beräkna vilken kvantitet inokulerat
odlingssubstrat (7.1) som krävs för att täcka brickorna med ett jämnt,
cirka 2 mm tjockt lager. Försöket bör helst utföras på brickor av planglas
som är försedda med en helt jämn aluminium- eller plastring, 200 mm i
diameter och 20 mm hög.
Fyll med pipett noggrant uppmätta kvantiteter antibiotikalösning, mellan
0,10 och 0,15 ml beroende på hålens diameter.
Upprepa för varje prov diffusionen minst fyra gånger med varje koncen-
tration så att en utvärdering av 32 hämningszoner ingår i varje
bestämning.
7.3Inkubation
Inkuberabrickornaunder cirka18 timma r vid 28-30ºC.
8.Utvärdering
Mät hämningszonernas diameter, helst genom projektion. För in mätvärdena
på semilogaritmiskt papper så att logaritmen på koncentrationerna förs in vid
hämningszonernas diameter. Rita linjerna för standardlösningen respektive
extraktet. Förutsatt att ingen interferens förekommer skall de båda linjerna
vara parallella.
Logaritmen på den relativa aktiviteten beräknas med följande formel:
U1þU2þU4þU8/C0S1/C0S2/C0S4/C0S8 ðÞ /C1 0;602
U4þU8þS4þS8/C0U1/C0U2/C0S1/C0S2
Reell aktivitet = antagen aktivitet × relativ aktivitet
9.Repeterbarhet
Skillnaden mellan resultaten av två parallella bestämningar som utförts på
samma prov får inte överstiga 10 % relativvärde.
4.BESTÄMNING AV TYLOSIN
- genom agardiffusion -
1.Syfte och räckvidd
Med denna metod kan tylosinhalter över 2 ppm bestämmas i foder, koncen-
trat och premixer.
2.Princip
Provet behandlas med en pH 8 fosfatbuffertlösning som i förväg upphettats
till 80ºC och sedan extraherats med metanol. Efter centrifugering späds
extraktet ut och dess antibiotiska verkan bestäms genom mätning av tylosi-
nets diffusion i ett agarsubstrat som ympats med Sarcina lutea . Diffusionen
påvisas genom att mikroorganismen orsakar att det bildas hämningszoner.
Dessa zoners diameter är direkt proportionell till logaritmen på antibiotika-
koncentrationen.1972L0199 — SV — 22.07.1993 — 003.001 — 25
▼B
3.Mikroorganism: Sarcina lutea ATCC nr 9341
3.1Underhåll av parentalstammen
Inokulera Sarcina lutea i ett provrör med snedagar som tagits från
odlingssubstratet (4.1) och justera pH-värdet till 7,0. Inkubera över
natten vid cirka 35ºC. Förvara odlingen i kylskåp och inokulera snedagar
på nytt varje månad.
3.2Beredning av bakteriesuspensionen
Samla in bakterierna från ett nyberett provrör med snedagar (3.1) med 2-
3 ml fysiologisk koksaltlösning (4.4). Ympa med denna suspension en
Rouxkolv som innehåller 250 ml odlingssubstrat (4.1) vars pH-värde
justerats till 7,0. Inkubera under 24 timmar vid 35ºC och samla därefter
upp bakterierna i 25 ml fysiologisk koksaltlösning (4.4). Homogenisera
och späd ut suspensionen så att ljustransmissionen blir cirka 75 % vid
650 nm.
Denna suspension kan användas under en vecka om den förvaras i
kylskåp.
Fastställ genom förberedande prov på plattor med bassubstratet för
bestämningen (4.1) vilken kvantitet av inokulatet som, vid de olika
koncentrationer av tylosin som används, ger största möjliga hämnings-
zoner som fortfarande är tydliga. Odlingssubstratet inokuleras vid 48-
50ºC.
4.Odlingssubstrat och reagens
4.1Bassubstrat för bestämningen (1)
Glukos 1 g
Tryptisk pepton 10 g
Köttextrakt 1,5 gJästextrakt 3 g
Agar (beroende på kvalitet) 10-20 g
Destillerat vatten till 1000 ml
Justera omedelbart före användning pH-värdet till 7,0 vid underhållet av
parentalstammen och beredningen av bakteriesuspensionen samt till 8,0
vid bestämningen.
4.2Fosfatbuffertlösning, pH 8
Kaliumdivätefosfat KH
2PO4pa0,523 g
diKaliumvätefosfat K2HPO4pa16,730 g
Destillerat vatten till 1000 ml
4.3Fosfatbuffertlösning, pH 7
Kaliumdivätefosfat KH2PO4pa5,5 g
diKaliumvätefosfat K2HPO4pa13,6 g
Destillerat vatten till 1000 ml
4.4 Steril fysiologisk koksaltlösning
4.5 Ren metanol4.6 10-procentig metanol (volym/volym)
4.7 Blandning fosfatbuffertlösning (4.2)/ren metanol i volymsproportionerna
60/40
4.8 Standardsubstans: tylosin med känd aktivitet1972L0199 — SV — 22.07.1993 — 003.001 — 26
(1) Samtliga kommersiellt tillverkade odlingssubstrat med liknande sammansättning, som
ger samma resultat, får användas.
▼B
5.Standardlösningar
Torka standardsubstansen (4.3) i vakuumugn (5 mm kvicksilver) under tre
timmar vid 60ºC. Väg upp 10-50 mg i mätkolv, lös upp detta i 5 ml metanol
(4.5) och späd ut lösningen med fosfatbuffertlösningen, pH 7 (4.3) så att en
tylosinbaskoncentration av 1000 µg/ml erhålls.
Av denna utgångslösning bereds en standardarbetslösning S8som innehåller
2 µg/ml tylosinbas genom utspädning med blandningen (4.7).
Bered därefter genom successiv utspädning (1: 1) med blandningen (4.7)
följande koncentrationer:
S41 µg/ml
S20,5 µg/ml
S10,25 µg/ml
6.Extraktion
Ta, för koncentrat, 10 g av provet och, för premixer och foder, 20 g. Tillsätt
60 ml fosfatbuffertlösning, pH 8 (4.2), som i förväg upphettats till 80ºC, och
homogenisera under 2 minuter (hushållsmixer, Ultra-turrax o.s.v.).
Låt stå under 10 minuter, tillsätt 40 ml metanol (4.5) och homogenisera
under 5 minuter. Centrifugera extraktet och späd ut en del av det med bland-
ningen (4.7) så att en antagen tylosinbaskoncentration av 2 µg/ml (U8)
erhålls. Bered därefter koncentrationerna U4,U2och U1genom successiva
utspädningar (1: 1) med blandningen (4.7).
Om halterna är mindre än 10 ppm indunstas extraktet tills det är torrt i rota-
tionsindunstare vid 35ºC och återstoden löses upp i 40-procentig metanol
(4.6).
7.Bestämningsmetod
7.1Inokulering av odlingssubstratet
Inokulera vid 48-50ºC bassubstratet för bestämningen (4.1) justerat till
pH 8,0 i bakteriesuspensionen (3.2).
7.2Preparering av brickorna
Diffusion på agar utförs på brickor med fyra koncentrationer av stan-
dardlösningen (S8,S4,S2,S1) och fyra koncentrationer av extraktet (U8,
U4,U2,U1). Samtliga fyra koncentrationer standardlösning och extrakt
måste placeras på varje bricka.
Välj därför brickor med en ytasom tillåter a tt minst åttahål, 10-13 mm i
diameter, görs i agarsubstratet. Beräkna vilken kvantitet inokulerat
odlingssubstrat (7.1) som krävs för att täcka brickorna med ett jämnt,
cirka 2 mm tjockt lager. Försöket bör helst utföras på brickor av planglas
som är försedda med en helt jämn aluminium- eller plastring, 200 mm i
diameter och 20 mm hög.
Fyll med pipett noggrant uppmätta kvantiteter antibiotikalösning, mellan
0,10 och 0,15 ml beroende på hålens diameter.
Upprepa för varje prov diffusionen minst fyra gånger med varje koncen-
tration så att en utvärdering av 32 hämningszoner ingår i varje
bestämning.
7.3Inkubation
Inkuberabrickornaöver na tten vid 35-37ºC.
8.Utvärdering
Mät hämningszonernas diameter, helst genom projektion. För in mätvärdena
på semilogaritmiskt papper så att logaritmen på koncentrationerna förs in vid
hämningszonernas diameter. Rita linjerna för standardlösningen respektive
extraktet. Förutsatt att ingen interferens förekommer skall de båda linjerna
vara parallella.
Logaritmen på den relativa aktiviteten beräknas med följande formel:1972L0199 — SV — 22.07.1993 — 003.001 — 27
▼B
U1þU2þU4þU8/C0S1/C0S2/C0S4/C0S8 ðÞ /C1 0;602
U4þU8þS4þS8/C0U1/C0U2/C0S1/C0S2
Reell aktivitet = antagen aktivitet × relativ aktivitet
9.Repeterbarhet
Skillnaden mellan resultaten av två parallella bestämningar som utförts på
samma prov får inte överstiga 10 % relativvärde.
5.BESTÄMNING AV VIRGINIAMYCIN
- genom agardiffusion -
1.Syfte och räckvidd
Denna metod är avsedd för bestämning av virginiamycin i foder och
premixer. Lägstagräns för bestämningen är 2 mg/kg (2 ppm) (1).
2.Princip
Provet extraheras med en lösning av Tween 80 i metanol. Extraktet dekan-
teras eller centrifugeras och späds ut. Dess antibiotiska verkan bestäms
genom mätning av virginiamycinets diffusion i ett agarmedium som inokule-
rats med Micrococcus luteus . Diffusionen kan påvisas genom att det bildas
hämningszoner för mikroorganismen. Dessa zoners diameter antas stå i direkt
proportion till logaritmen för den antibiotiska koncentrationen inom spekt-
rumet för de använda antibiotiska koncentrationerna.
3.Mikroorganism: micrococcus luteus ATCC 9341 (NCTC 8340, NCIB
8553)
3.1Skötsel av den lagerhållna odlingen
Inokuleraprovrör som innehåller skikt a v odlingsmedium (4.1) med
micrococcus luteus och låt inkubera under 24 timmar vid 30 ºC. Förvara
odlingen i kylskåp vid cirka 4 ºC. Upprepa inokuleringen varannan
vecka.
3.2Beredning av bakteriesuspensionen (a)
Samla in tillväxten från ett nypreparerat agarskikt (3.1) med 2-3 ml
koksaltlösning (4.3). Använd denna suspension till att inokulera 250 ml
odlingsmedium (4.1) som förvaras i en Rouxkolv och låt inkubera 18-20
timmar vid 30 ºC. Samla in tillväxten i 25 ml koksaltlösning (4.3) och
blanda.
Späd ut lösningen med koksaltlösning (4.3) i proportionen 1/10. Suspen-
sionens ljustransmission måste vara cirka 75 % uppmätt vid 650 nm i en
1 cm cell mot koksaltlösning (4.3). Denna suspension kan förvaras en
veckavid cirka4 ºC.
4.Odlingsmedium och reagens
4.1Odlings- och analysmedium (b)
Köttpepton 6,0 g
Trypton 4,0 g
Jästextrakt 3,0 g
Köttextrakt 1,5 g
Glukos 1,0 g
Agar 10,0-20,0 g
Vatten 1 000 ml
pH 6,5 (efter sterilisering)1972L0199 — SV — 22.07.1993 — 003.001 — 28
(1) 1 mg virginiamycin motsvarar 1 000 brittiska enheter.
(a) Andra metoder kan användas, förutsatt att det har fastställts att de ger liknande bakte-
riesuspensioner.
(b) Varje kommersiellt odlingsmedium med liknande sammansättning som ger samma
resultat kan användas.▼M2
▼M2
4.2Fosfatbuffert, pH 6
Kaliumvätefosfat, K2HPO42,0 g
Kaliumdivätefosfat, KH2PO48,0 g
Vatten till 1 000 ml
4.3 Koksaltlösning 0,8 % (vikt/volym): lös 8 g natriumklorid i vatten och
späd till 1 000 ml. Sterilisera.
4.4 Metanol.4.5 Blandning fosfatbuffert (4.2)/metanol (4.4): 80/20 (volym/volym).
4.6 Lösning av Tween 80 i metanol 0,5 % (vikt/volym): lös upp 5 g Tween
80 i metanol (4.4) och späd med metanol till 1 000 ml.
4.7 Standardsubstans: virginiamycin vars verkan är känd.
5.Standardlösningar
Lös upp en noggrant vägd kvantitet av standardsubstansen (4.7) i metanol
(4.4) och späd med metanol (4.4) så att en lösning som innehåller 1 000 µg
virginiamycin per ml erhålls. Denna lösning är stabil i upp till fem dagar om
den förvaras i en tillsluten kolv vid 4 ºC.
Av dennautgångslösning bereds genom successiv utspädning med bla nd-
ningen (4.5) följande lösningar:
s
81 µg/ml
s40,5 µg/ml
s20,25 µg/ml
s10,125 µg/ml
6.Beredning av extraktet och analyslösningarna
6.1Extraktion
6.1.1 Produkter med en virginiamycinhalt upp till 100 mg/kg
Väg upp 50 g av provet, tillsätt 200 ml av lösningen (4.6) och
skaka om under 30 minuter. Låt fällningen sjunka till botten eller
centrifugera, ta 20 ml av dekanteringslösningen (supernatanten)
och indunsta till cirka 5 ml i en rotationsindunstare vid en tempe-
ratur av högst 40 ºC. Späd ut återstoden med blandningen (4.5) så
att en förväntad virginiamycinhalt av 1 µg/ml (= u8) erhålls.
6.1.2 Produkter med en virginiamycinhalt över 100 mg/kg
Väg upp högst 10,0 g av provet med ett virginiamycininnehåll av
1-50 mg, tillsätt 100 ml av lösningen (4.6) och skaka om under 30
minuter. Låt fällningen sjunkatill botten eller centrifugeraoch
späd därefter ut dekanteringslösningen (supernatanten) med bland-
ningen (4.5) så att en förväntad virginiamycinhalt av 1 µg/ml (=
u8) erhålls.
6.2Analyslösningar
Av lösning u8bereds lösningarna u4(förväntad halt: 0,5 µg/ml), u2(förväntad halt: 0,25 µg/ml) och u1(förväntad halt: 0,125 µg/ml) genom
successiv utspädning (1 + 1) med blandningen (4.5).
7.Analysmetod
7.1Inokulering av analysmediet
Inokulera analysmediet (4.1) med bakteriesuspensionen (3.2) vid cirka
50 ºC. Bestäm genom preliminäraförsök på pla ttor med mediet (4.1)
vilken mängd av bakteriesuspensionen som krävs för att ge så stora och
tydliga hämningszoner som möjligt vid de olika koncentrationerna av
virginiamycin.
7.2Färdigställande av plattorna
Agardiffusionen utförs på plattor med de fyra koncentrationerna av stan-
dardlösningen (s8,s4,s2och s1) och av analyslösningen (u8,u4,u2och u1).
Det är nödvändigt att dessa fyra koncentrationer av extrakt och stan-
dardlösning placeras på varje platta. Välj därför plattor som är så stora
att minst åtta hål med en diameter av 10-13 mm och lägst 30 mm mellan1972L0199 — SV — 22.07.1993 — 003.001 — 29
▼M2
mittpunkterna kan göras i agarmediet. Provet kan utföras på glasplattor
med en övertäckt aluminium- eller plastring, 200 mm i diameter och
20 mm hög, placerad högst upp.
Täck plattorna med en så stor mängd av mediet (4.1), som inokulerats
enligt 7.1, att ett cirka 2 mm tjockt lager bildas (60 ml till en platta
med 200 mm diameter). Låt det jämnt fördelade lagret stelna, borra
hålen och placera de exakt uppmätta volymerna analys- och standardlös-
ning (mellan 0,10 och 0,15 ml i varje hål beroende på diameter) i hålen.
Anbringa varje koncentration minst fyra gånger så att varje bestämning
sker på grundval av en bedömning av 32 hämningszoner.
7.3Inkubation
Inkubera plattorna under 16-18 timmar vid 30 ± 2 ºC.
8.Utvärdering
Mät hämningszonernas diameter med en noggrannhet av 0,1 mm. För in
genomsnittsvärdena för varje koncentration på semilogaritmiskt rutat papper
så att logaritmen för koncentrationen i förhållande till hämningszonernas
diameter visas. Fastställ optimumlinjerna för såväl standardlösningen som
extraktet, t.ex. enligt följande:
Bestäm optimumpunkten för lägsta nivå standardlösning (SL) med formeln:
a)S L ¼7s1þ4s2þs4/C02s8
10
Bestäm optimumpunkten för högsta nivå standardlösning (SH) med formeln:
b) SH ¼7s8þ4s4þs2/C02s1
10
Beräkna på motsvarande sätt optimumpunkterna för lägsta nivå extrakt (UL)
och högsta nivå extrakt (UH) genom att byta ut s1,s2,s4och s8mot u1,u2,u4och u8i ovanstående formler.
För in de beräknade värdena för SL och SH på samma papper och förbind
dem så att optimumlinjen för standardlösningen erhålls. För på motsvarande
sätt in UL och UH och förbind dem så att optimumlinjen för extraktet
erhålls.
Om ingen interferens förekommer skall linjerna vara parallella. För praktiska
ändamål kan linjerna anses vara parallella om värdena (SH-SL) och (UH-UL)
inte avviker med mer än 10 % från sina medelvärden.
Om linjerna inte visar sig vara parallella kan antingen u1och s1eller u8och s8avlägsnas och SL, SH, UL och UH beräknas med alternativformlerna så att
alternativa optimumlinjer erhålls:
a′)S L=5s1þ2s2/C0s4
6eller5s2þ2s4/C0s8
6
b′)S H=5s4þ2s2/C0s1
6eller5s8þ2s4/C0s2
6
och på motsvarande sätt för UL och UH. Samma parallellitetskriterium måste
tillfredsställas.
Det skall anges på slutrapporten att resultatet har beräknats med tre nivåer.
När linjerna kan anses parallella beräknas logaritmen för den relativa aktivi-
teten (log A) med en av följande formler beroende på om tre eller fyra nivåer
har använts för att påvisa parallellitet.
För fyra nivåer
c) Log A ¼u1þu2þu4þu8/C0s1/C0s2/C0s4/C0s8 ðÞ /C2 0;602
u4þu8þs4þs8/C0u1/C0u2/C0s1/C0s2
För tre nivåer
d) Log A ¼u1þu2þu4/C0s1/C0s2/C0s4 ðÞ /C2 0;401
u4þs4/C0u1/C0s11972L0199 — SV — 22.07.1993 — 003.001 — 30
▼M2
eller
d′) Log A ¼u2þu4þu8/C0s2/C0s4/C0s8 ðÞ /C2 0;401
u8þs8/C0u2/C0s2
Provextraktets aktivitet = motsvarande standardlösnings aktivitet × A
(U8=S8×A )
Om den relativa aktiviteten befinns ligga utanför intervaller 0,5-2,0 upprepas
analysen med lämpliga justeringar av koncentrationerna av extraktet eller, om
detta inte är möjligt, av standardlösningarna. Om den relativa aktiviteten inte
kan bringas inom det föreskrivna intervaller måste varje erhållet resultat
anses vara approximativt och detta skall anges i slutrapporten.
Om linjerna inte befinns vara parallella upprepas bestämningen. Om parallel-
litet ändå inte uppstår måste bestämningen anses vara otillfredsställande.
Uttryck resultatet i milligram virginiamycin per kilo foder.
9.Repeterbarhet
Skillnaden mellan resultaten av två parallella bestämningar som utförts på
samma prov av samma analytiker får inte överstiga:
2 mg/kg, absolutvärde, för halter av virginiamycin upp till 10 mg/kg,
20 % i förhållande till det högsta värdet vid halter på 10-25 mg/kg,5 mg/kg, absolutvärde, för halter av virginiamycin mellan 25 och 50 mg/kg
och
10 % i förhållande till det högsta värdet vid halter över 50 mg/kg.1972L0199 — SV — 22.07.1993 — 003.001 — 31