Detta dokument är endast avsett som dokumentationshjälpmedel och institutionerna ansvarar inte för innehållet  
►B KOMMISSIONENS FÖRORDNING (EG) nr 440/2008  
av den 30 maj 2008  
om testmetoder enligt Europaparlamentets och rådets förordning (EG) nr 1907/2006 om 
registrering, utvärdering, godkännande och begränsning av kemikalier (Reach)  
(Text av betydelse för EES)  
(EUT L 142, 31.5.2008, s. 1)  
Ändrad genom:  
Officiella tidningen  
nr sida  datum  
►M1 Kommissionens förordning (EG) nr 761/2009 av den 23 juli 2009  L 220  1  24.8.2009  
►M2 Kommissionens förordning (EU) nr 1152/2010 av den 8 december 
2010  L 324  13  9.12.2010  
►M3 Kommissionens förordning (EU) nr 640/2012 av den 6 juli 2012  L 193  1  20.7.2012  
►M4 Kommissionens förordning (EU) nr 260/2014 av den 24 januari 2014  L 81  1  19.3.2014  
►M5 Kommissionens förordning (EU) nr 900/2014 av den 15 juli 2014  L 247  1  21.8.2014  2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1
KOMMISSIONENS FÖRORDNING (EG) nr 440/2008  
av den 30 maj 2008  
om testmetoder enligt Europaparlamentets och rådets förordning 
(EG) nr 1907/2006 om registrering, utvärdering, godkännande och 
begränsning av kemikalier (Reach)  
(Text av betydelse för EES)  
EUROPEISKA GEMENSKAPERNAS KOMMISSION HAR ANTAGIT 
DENNA FÖRORDNING  
med beaktande av fördraget om upprättandet av Europeiska gemenskapen, med beaktande av Europaparlamentets och rådets förordning nr 1907/2006 
av den 18 december 2006 om registrering, utvärdering, godkännande och begränsning av kemikalier (Reach), inrättande av en europeisk kemikalie ­
myndighet, ändring av direktiv 1999/45/EG och upphävande av rådets förordning (EEG) nr 793/93 och kommissionens förordning (EG) nr 1488/94 samt rådets direktiv 76/769/EEG och kommissionens direktiv 91/155/EEG, 93/67/EEG, 93/105/EG och 2000/21/EG (
 1 ), särskilt 
artikel 13.3, och 
av följande skäl:  
(1) Enligt förordning (EG) nr 1907/2006 ska testmetoder antas på 
gemenskapsnivå för ämnestestsyften om sådana tester krävs för 
att generera information om ämnenas inneboende egenskaper.  
(2) I bilaga V till rådets direktiv 67/548/EEG av den 27 juni 1967 
om tillnärmning av lagar och andra författningar om klassifice ­
ring, förpackning och märkning av farliga ämnen (  2 ) fastställs 
metoder för ämnens och preparats (beredningars) fysikalisk-kemi ­
kaliska egenskaper, toxicitet och ekotoxicitet. Bilaga V till direk ­
tiv 67/548/EEG har upphävts genom direktiv 2006/121/EG, med verkan från och med den 1 juni 2008.
 
(3) De testmetoder som ingår i bilaga V till direktiv 67/548/EEG bör 
tas med i denna förordning.  
(4) Denna förordning hindrar inte användning av andra testmetoder, 
förutsatt att användningen av dessa är i enlighet med artikel 13(3) i förordning (EG) nr 1907/2006.  ▼
B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 2  
( 1 ) EUT L 396, 30.12.2006, s. 1. Rättad i EUT L 136, 29.5.2007, s. 3. 
( 2 ) EGT 196, 16.8.1967, s. 1. Direktivet senast ändrat genom Europaparlamen ­
tets och rådets direktiv 2006/121/EG (EUT L 396, 30.12.2006, s. 850. Rättat i EUT L 136, 29.5.2007, s. 281) –  uppdateras med lämpliga referenser så 
snart den 30:e anpassningen offentliggjorts.
 (5) Principerna för att ersätta, minska och förbättra användningen av 
djur i provningsförfaranden bör till fullo beaktas när testmetoder utarbetas, särskilt när lämpliga validerade metoder för att ersätta, minska eller förbättra djurförsök blir tillgängliga.
 
(6) De åtgärder som föreskrivs i denna förordning är förenliga med 
yttrandet från den kommitté som inrättats genom artikel 133 i förordning (EG) nr 1907/2006.
 
HÄRIGENOM FÖRESKRIVS FÖLJANDE.  
Artikel 1  
De testmetoder som ska tillämpas för de syften som avses i förordning 
(EG) nr 1907/2006 fastställs i bilagan till denna förordning.  
Artikel 2  
Kommissionen ska där så är lämpligt se över de testmetoder som ingår i 
denna förordning i syfte att ersätta, minska eller förfina testning på 
ryggradsdjur.  
Artikel 3  
Hänvisningar till bilaga V till direktiv 67/548/EEG ska läsas som hän ­
visningar till denna förordning.  
Artikel 4  
Denna förordning träder i kraft dagen efter det att den har offentliggjorts 
i Europeiska unionens officiella tidning . 
Den ska tillämpas från och med den 1 juni 2008.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 3
 
BILAGA  
DEL A: METODER FÖR BESTÄMNING AV FYSIKALISK-KEMISKA 
EGENSKAPER  
INNEHÅLLSFÖRTECKNING 
A.1 SMÄLT-/FRYSPUNKT 
A.2 KOKPUNKT 
A.3 RELATIV DENSITET A.4 ÅNGTRYCK A.5 YTSPÄNNING 
A.6 VATTENLÖSLIGHET 
A.8 FÖRDELNINGSKOEFFICIENT A.9 FLAMPUNKT 
A.10 ANTÄNDLIGHET (FASTA ÄMNEN) 
A.11 ANTÄNDLIGHET (GASER) A.12 ANTÄNDLIGHET (KONTAKT MED VATTEN) 
A.13 PYROFORISKA EGENSKAPER HOS FASTA OCH FLY ­
TANDE ÄMNEN 
A.14 EXPLOSIVA GASER 
A.15 SJALVANTÄNDNINGSTEMPERATUR (VÄTSKOR OCH GA ­
SER) 
A.16 RELATIV SJALVANTÄNDNINGSTEMPERATUR (FASTA 
ÄMNEN) 
A.17 OXIDERANDE EGENSKAPER (FASTA ÄMNEN) A.18 MOLEKYLÄR MEDEL VIKT OCH MOLEKYLÄR VIKTFÖR ­
DELNING AV POLYMERER 
A.19 INNEHÅLL AV LÅGMOLEKYLVIKTSPOLYMERER 
A.20 POLYMERERS BETEENDE I VATTEN VID LÖSNING/EX ­
TRAKTION 
A.21 OXIDERANDE EGENSKAPER (VÄTSKOR) 
A.22. BESTÄMNING AV FIBRERS LÄNGDVIKTADE GEOMET ­
RISKA MEDELDIAMETER
 
▼M4 
A.23. FÖRDELNINGSKOEFFICIENT (1-OKTANOL/VATTEN): ME ­
TOD MED LÅNGSAM OMRÖRNING  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 4
 
A.1 SMÄLT-/FRYSPUNKT  
1. METOD  
De flesta av de beskrivna metoderna är baserade på OECD:s riktlin ­
jer för undersökning av kemikalier (se hänvisning 1). Grundprinci ­
perna anges i hänvisningarna 2 och 3.  
1.1 INLEDNING 
De beskrivna metoderna och apparaterna kan användas för bestäm ­
ning av ämnens smältpunkt, utan någon begränsning beträffande deras renhetsgrad. 
Valet av metod beror på arten av det ämne som ska undersökas. Det 
är följaktligen avgörande om ämnet lätt, med svårighet eller inte alls 
kan pulvriseras. 
För vissa ämnen är det mer ändamålsenligt att bestämma frys- eller 
stelningspunkten, och i denna metod inbegrips standarder för sådana bestämningar. 
Om det till följd av ämnets särskilda egenskaper inte går att korrekt 
bestämma ovan nämnda parametrar kan det vara ändamålsenligt att 
bestämma den lägsta flytpunkten.
 
1.2 DEFINITIONER OCH ENHETER 
Smältpunkten definieras som den temperatur vid vilken fasöver ­
gången från fast till flytande tillstånd sker vid normalt atmosfäriskt tryck, och denna temperatur motsvarar idealt fryspunkten. 
Eftersom fasövergången för många ämnen sker under ett punktinter ­
vall beskrivs den ofta som smäkintervallet. 
Omvandling av enheter (K till
 o C): 
t = T – 273,15 t: temperaturen i grader Celsius (
 o C) 
T: termodynamiska temperaturen Kelvin (K)  
1.3 REFERENSÄMNEN 
Man behöver inte använda referensämnen varje gång ett nytt ämne 
ska undersökas. Referensämnen ska först och främst användas för att 
då och då kontrollera metoden och för jämförelse med resultat som 
uppnåtts med andra metoder. 
Vissa referensämnen anges i hänvisningarna (se hänvisning 4).  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 5
 
1.4 TESTMETODSPRINCIP 
Temperaturen (temperarurintervallet) för fasövergången från fast till 
flytande tillstånd eller från flytande till fast tillstånd bestäms. I prak ­
tiken bestäms temperaturen vid begynnande smältning/frysning och 
vid slutlig smältning/frysning under uppvärmning/avkylning av ett 
prov av testämnet vid atmosfäriskt tryck. Fem typer av metoder beskrivs, nämligen kapillärmetoder, varmebordsmetoder, fryspunkts ­
bestämning, metoder för termisk analys och bestämning av lägsta 
flytpunkt (utvecklad för petroleumoljor). 
I vissa fall kan det vara praktiskt att mäta fryspunkten i stället för 
smältpunkten.
 
1.4.1  Kapillärmetoder  
1.4.1.1  Smältpunktsanordningar med vätskebad  
Ett kapillärrör fylls med en liten, tätt packad mängd av det finmalda 
ämnet. Röret uppvärms tillsammans med en termometer och tempe ­
raturstegringen ställs in till mindre än ca 1 K/min under själva smält ­
ningen. Temperaturen vid begynnande och slutlig smältning bestäms.  
1.4.1.2  Srnältpunktsanordningar med metallblock  
Enligt beskrivningen under 1.4.1.1, bortsett från att kapillärröret och 
termometern är placerade i ett uppvärmt metallblock och kan iakttas 
genom hål i blocket.  
1.4.1.3  Bestämmng med fotocell  
Provet i kapillärröret uppvärms automatiskt i en metallcylinder. En 
ljusstråle riktas genom ämnet via ett hål i cylindern på en exakt 
inställd fotocell. Vid smältningen ändras de flesta ämnens optiska 
egenskaper från ogenomskinligt till genomskinligt. Ljusstyrkan som når fotocellen ökar, varvid en stoppsignal sänds till en digital indi ­
kator som visar temperaturen hos en platinamotståndstermometer 
som är placerad i värmekammaren. Denna metod kan inte användas 
för vissa starkt färgade ämnen.
 
1.4.2  Värmebord  
1.4.2.1  Koflers värmebänk  
Koflers värmebänk består av två elektriskt uppvärmda metallstycken 
med olika värmeledningsförmåga och är så utformad att dess tem ­
peraturgradient i längdriktningen nästan är linjär. Värmebänkens temperaturområde kan spänna från 283 K till 543 K och är försedd med en särskild anordning för temperaturavläsning som består av en 
löpare med visare och en flagga, och som är särskilt utformad för 
den aktuella bänken. Smältpunkten bestäms genom att det aktuella ämnet läggs i ett tunt lager direkt på värmebänkens ovansida. Efter några sekunder utvecklas en skarp skiljelinje mellan den flytande och 
den fasta fasen. Skiljelinjens temperatur avläses genom att visaren 
ställs in på linjen.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 6
 
1.4.2.2  Smältmikroskop  
Flera värmebord med mikroskop används vid bestämning av smält ­
punkten på mycket små provmängder. I de flesta värmeborden mäts temperaturen med ett känsligt termoelement, men ibland används 
även kvicksilvertermometrar. En typisk smältpunktsanordning, bestå ­
ende av värmebord med mikroskop, är utrustad med en värmekam ­
mare som innehåller en metallplatta på vilken proven placeras på ett objektglas. I mitten av metallplattan finns ett hål genom vilket ljus 
kan sändas från mikroskopets belysningsspegel. När anordningen 
används är kammaren stängd med en glasplatta för att förhindra tillträde av luft till provet. 
Uppvärmningen av provet regleras med en reostat. Om det krävs 
mycket exakta mätningar kan polariserat ljus användas för optiskt anisotropa ämnen.
 
1.4.2.3  Meniskmetoden  
Denna metod används endast för polyamiden 
Den temperatur vid vilken en silikonoljemenisk, som är innesluten 
mellan ett värmebord och ett täckglas som vilar på polyamidproväm ­
net, förskjuts iakttas visuellt.  
1.4.3  Metod för bestämning av fryspunkt  
Provet placeras i ett särskilt provrör och sätts i en apparat för be ­
stämning av fryspunkten. Provet avkyls under försiktig och oavbru ­
ten omrörning och temperaturen mäts med passande mellanrum. När 
temperaturen är konstant vid flera avläsningar registreras denna tem ­
peratur (korrigerad för termometerfel) som fryspunkten. 
Underkylning ska undvikas genom att man upprättar jämvikt mellan 
den fasta fasen och vätskefasen.  
1.4.4  Termisk analys  
1.4.4.1  Differentiell termisk analys (DTA)  
Genom denna metod registreras temperaturskillnaden mellan ämnet 
och ett referensämne som en funktion av temperaturen medan ämnet och referensämnet utsätts för samma kontrollerade temperaturpro ­
gram. En fasövergång i provet som åtföljs av en entalpiändring visar 
sig genom en endoterm (smältning) eller exoterm (frysning) avvi ­
kelse från den registrerade baslinjen.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 7
 
1.4.4.2  Differentiell scanningkalorimetri (DSC)  
Genom denna metod registreras skillnaden i den energimängd som 
tillförs ett ämne och ett referensmaterial som en funktion av tempera ­
turen medan ämnet och referensämnet utsätts för samma kontrolle ­
rade temperaturprogram. Denna skillnad motsvarar den energi som är 
nödvändig för att upprätthålla en temperaturskillnad på noll mellan ämnet och referensmaterialet. En fasövergång i provet ledsagad av en entalpiändring visar sig genom en endoterm (smältning) eller ex ­
oterm (frysning) avvikelse från den registrerade baslinjen.
 
1.4.5  Flytpunkt  
Denna metod har utvecklats för petroleumoljor och är lämplig för 
oljeaktiga ämnen med låg smältpunkt. 
Efter att provet först har värmts upp kyls det ned med en bestämd 
hastighet, och dess flytegenskaper undersöks med 3K:s mellanrum. Den lägsta temperaturen vid vilken rörelse av ämnet kan iakttas 
registreras som flytpunkten.
 
1.5 KVALITETSKRITERIER 
I följande tabell anges de olika metodernas lämplighet och noggrann ­
het vid bestämning av smältpunkt/smältpunktsintervall.  
TABELL: METODERNAS LÄMPLIGHET  
A. Kapillärmetoder  
Mätmetod Ämnen som kan 
pulvriseras Ämnen som inte 
lätt pulvriseras Temperatur 
område Uppskattad 
exakthet (  1 ) Befintlig standard  
Smältpunktsanord ­
ning med väts ­
kebad ja några få 273 till 573 K ± 0,3 K JIS K 0064 
Smältpunkts-an ­
ordning med me ­
tallblock ja några få 293 till 
>573K ± 0,5 K ISO 1218 (E) 
Bestämning med 
fotocell ja flera med hjälp 
av särskild ut ­
rustning 253 till 573 K ± 0,5 K  
( 1 ) Beroende på typ av instrument och ämnets renhetsgrad.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 8
 
B. Värmebord och frysmetoder  
Mätmetod Ämnen som kan 
pulvriseras Ämnen som inte 
latt pulvriseras Temperatu ­
rområde Uppskattad 
exakthet (  1 ) Befintlig standard  
Koflers värme ­
bank ja nej 283 till 
> 573 K ± 1,0 K ANSI/ASTM D 
3451-76 
Smältmikroskop ja några få 273 till 
> 573 K ± 0,5 K DIN 53736 
Meniskmetod nej endast för po ­
lyamider 293 till 
> 573 K ± 0,5 K ISO 1218 (E) 
Fryspunkt-metoder ja ja 223 till 573 K ± 0,5 K t.ex. BS 4695  
( 1 ) Beroende på typ av instrument och ämnets renhetsgrad.  
C. Termisk analys  
Mätmetod Ämnen som kan 
pulvriseras Ämnen som inte 
lätt pulvriseras Temperatu ­
rområde Uppskattad 
cxakthet (  1 ) Befintlig standard  
Differentiell ter ­
misk analys ja nej 173 till 
1 273 K upp till 
600 K ± 
0,5 K upp till 
1 273 K ± 
2,0 K ASTM E 537-76 
Differentiell kalo ­
rimetri ja ja 173 till 
1 273 K upp till 
600 K ± 
0,5 K upp till 
1 273 K ± 
2,0 K ASTM E 537-76  
( 1 ) Beroende på typ av instrument och ämnets renhetsgrad.  
D. Flytpunkt  
Matmetod Ämnen som kan 
pulvriseras Ämnen som inte 
lätt pulvriseras Temperatu ­
rområde Uppskattad 
exakthet (  1 ) Befintlig standard  
Flytpunkt för petroleum- 
oljor och ol ­
jeaktiga äm ­
nen för petroleum- 
oljor och olje ­
aktiga ämnen 223 till 323 K ± 3,0 K ASTM D 97-66  
( 1 ) Beroende på typ av instrument och ämnets renhetsgrad.  
1.6 METODBESKRIVNING 
Tillvägagångssättet för nästan alla testmetoderna beskrivs i interna ­
tionella och nationella standarder (se tillägg 1).  
1.6.1  Kapillärrörsmetoder  
Fint pulvriserade ämnen uppvisar vid långsam uppvärmning vanligt ­
vis ett smältningsförlopp enligt figur 1.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 9
 
Figur 1
  
Vid bestämning av smältpunkten antecknas temperaturerna vid be ­
gynnande och slutlig smältning.  
1.6.1.1  Smältpunktsanordningar med vätskebad  
Figur 2 visar ett exempel på en standardiserad smältpunktsapparat 
(JIS K 0064) av glas. Alla mått är angivna i mm.  
Figur 2
  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 10
 
Badvätska:  
En lämplig vätska väljs. Valet beror på den smältpunkt som ska 
bestämmas, t.ex. paraffinolja för smältpunkter upp till 473 K och 
silikonolja för smältpunkter upp till 573 K. 
För smältpunkter över 523 K kan en blandning bestående av 3 delar 
svavelsyra och 2 delar kaliumsulfat (viktförhållande) användas. Vid användning av denna blandning ska lämpliga försiktighetsåtgärder 
vidtas.
 
Termometer:  
Endast termometrar som uppfyller kraven i följande eller likvärdiga 
standarder bör användas: 
ASTM E 1-71, DIN 12770, JIS K 8001.  
Förfarande:  
Det torra ämnet pulvriseras fint i en mortel och fylls i kapillärröret, 
som är tillslutet i den ena änden, till en höjd av ungefär 3 mm efter tät packning. För att få ett jämnt packat prov låter man kapillärröret falla från en höjd av ungefär 700 mm genom ett lodrätt glasrör ned 
på ett urglas. 
Det fyllda kapillärröret placeras i badet så att den mittersta delen av 
termometerns kvicksilverkula berör den del av kapillärröret där pro ­
vet finns. Normalt placeras kapillärröret i apparaten när badets tem ­
peratur är ungefär 10 K under smältpunkten. 
Badvätskan uppvärms med en temperaturstegring av ungefar 
3 K/min under omrörning av vätskan. När temperaturen är ungefär 
10 K under den förväntade smältpunkten ställs temperaturstegringen in till högst 1 K/min.
 
Beräkning:  
Smältpunkten beräknas enligt följande: 
T-T  D + 0,00016(T  D – T  E ) n 
där: T = korrigerad smältpunkt i K 
T
 D = temperaturavläsning av termometer D i K 
T E = temperaturavläsning av termometer E i K 
n = antal gradindelningar av den utstående delen av termometer 
D:s kvicksilverpelare.  
1.6.1.2  Smältpunktsanordning med metallblock  
Apparatur: 
Denna består av  
— ett cylindriskt metallblock, vars översta del är ihålig och bildar en 
kammare (se figur 3), 
— en metallpropp med två eller flera hål som gör det möjligt att 
föra in rör i metallblocket,  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 11
 
— ett uppvärmningssystem för metallblocket, t.ex. i form av ett 
elektriskt motstånd inneslutet i blocket, 
— en reostat för reglering av energitillförseln, om elektrisk upp ­
värmning används, 
— fyra fönster av värmebeständigt glas på kammarens sidovägg, 
placerade diametralt och vinkelrätt mot varandra. Framför ett av dessa fönster finns en lupp monterad för iakttagelse av kapil ­
lärröret. De tre andra fönstren används för att belysa kammarens 
insida med hjälp av lampor, 
— ett kapillärrör av värmebeständigt glas, tillslutet i ena änden (se 
1.6.1.1).
 
Termometer:  
Se standarderna i punkt 1.6.1.1. Även termoelektriska instrument 
med jämförbar noggrannhet kan användas.  
Figur 3
  
1.6.1.3  Bestämning med fotocell 
Apparatur och förfarande:  
Apparaturen består av en metallkammare med ett automatiskt upp ­
värmningssystem. Tre kapillärrör fylls enligt 1.6.1.1 och placeras i 
ugnen.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 12
 
Flera linjära temperaturstegringar kan användas för att kalibrera ap ­
paraturen och lämplig temperaturstegring justeras elektriskt med en 
förvald konstant och linjär hastighet. Skrivare visar den faktiska ugnstemperaturen och temperaturen för ämnet i kapillärrören.
 
1.6.2  Värmebord  
1.6.2.1  Koflers värmebänk  
Se tillägg.  
1.6.2.2  Smältmikroskop  
Se tillägg.  
1.6.2.3  Meniskmetoden (polyamider)  
Se tillägg. 
Uppvärmningshastigheten vid smältpunkten ska vara lägre än 1 
K/min.  
1.6.3  Metoder för bestämning av fryspunkt  
Se tillägg.  
1.6.4  Termisk analys  
1.6.4.1  Differentiell termisk analys  
Se tillägg.  
1.6.4.2  Differentiell scanningkalorimetri  
Se tillägg.  
1.6.5  Bestämning av flytpunkt  
Se tillägg.  
2. DATA  
I vissa fall är termometerkorrektion nödvändigt.  
3. RAPPORTERING  
Testrapporten ska, om möjligt, innehålla följande uppgifter: 
— Använd testmetod. 
— Noggrann beskrivning av substansen (beteckning och orenheter) 
och eventuella inledande reningsåtgärder. 
— Den uppskattade noggrannheten. 
Som smältpunkt anges medelvärdet av minst två mätningar, som 
ligger inom gränserna för den uppskattade noggrannheten (se tabel ­
lerna).  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 13
 
Om skillnaden mellan temperaturen vid begynnande och slutlig 
smältning ligger inom gränsvardena för metodens noggrannhet, 
anges temperaturen vid den slutliga smältningen som smältpunkten. I motsatt fall anges båda temperaturerna. 
Om ämnet upplöses eller sublimeras innan smältpunkten nås anges 
den temperatur där detta fenomen iakttas. 
Alla uppgifter och upplysningar av betydelse för tolkningen av re ­
sultaten måste anges, i synnerhet vad gäller orenheter och ämnets 
fysiska tillstånd.
 
4. HÄNVISNINGAR  
1. OECD, Paris, ”Test Guideline 102”, rådets beslut K(81) 30 slut ­
ligt, 1981. 
2. IUPAC, B. Le Neindre, B. Vodar, eds, ”Experimental thermody ­
namics”, Butterworths, London1975, vol. II, 803–834. 
3. R. Weissberg ed., ”Technique of organic Chemistry, Physical 
Methods of Organic Chemistry”, 3rd ed., Interscience Publ., New York, 1959,, vol. I del I kapitel VII. 
4. IUPAC, ”Physiochemical measurements: Catalogue of reference 
materials from national laboratories, Pure and applied chemistry”, 
vol. 48, 1976, 505–515.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 14
 
Tillägg  
Kompletterande tekniska upplysningar finns i följande standarder:  
1. Kapillärmetoder  
1.1 Smältpunktsanordningar med vätskebad 
ASTM E 324-69 Standard test method for relative initial 
and final melting points and the mel ­
ting range of organic chemicals 
BS 4634 Method for determination of melting 
point and/or melting range 
DIN 53181 Bestimmung des Schmelzintervalles 
von Harzen nach Kapillarverfahren 
JIS K 00-64 Testing methods for melting point of 
chemical products  
1.2 Smältpunktsanordningar med metallblock 
DIN 53736 Visuelle Bestimmung der Schmelztem ­
peratur von teilkristallinen Kunststoffen 
ISO 1218 (E) Plastics – polyamides – determination 
of ”melting point”  
2. Värmebord  
2.1 Koflers värmebänk 
ANSI/ASTM D 3451 76 Standard recommended practices 
for testing polymeric powder coatings  
2.2 Smältmikroskop 
DIN 53736 Visuelle Bestimmung der Schmelztem ­
peratur von teilkristallinen Kunststoffen  
2.3 Meniskmetoden (polyamider) 
ISO 1218 (E) Plastics – polyamides – determination 
of ”melting point”  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 15
 
ANSI/ASTM D 2133-66 Standard specification for acetal resin 
injection moulding and extrusion ma ­
terials 
NF T 51-050 Résines de polyamides. Determination 
du ”point de fusion” Methode du mé ­
nisque  
3. Metoder för bestämning av fryspunkt  
BS 4633 Method for the determination of crys ­
tallizing point 
BS 4695 Method for Determination of Melting 
Point of petroleum wax (Cooling Curve) 
DIN 51421 Bestimmung des Gefrierpunktes von 
Flugkraftstoffen, Ottokraftstoffen und 
Motorenbenzolen 
ISO 2207 Cires de pétrole: détermination de la 
température de figeage 
DIN 53175 Bestimmung des Erstarrungspunktes 
von Fettsäuren 
NF T 60-114 Point de fusion des paraffines 
NF T 20-051 Méthode de détermination du point de 
cristallisation (point de congélation) 
ISO 1392 Method for the determination of the 
freezing point  
4. Termisk analys  
4.1 Differentiell termisk analys 
ASTM E 537-76 Standard method for asseying the ther ­
mal stability of chemicals by methods of differential thermal analysis 
ASTM E 473-85 Standard definitions of terms relating 
to thermal analysis
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 16
 
ASTM E 472-86 Standard practice for reporting ther ­
moanalytical data 
DIN 51005 Thermisches Analyse, Begriffe  
4.2 Differentiell scanningkalorimetri 
ASTM E 537-76 Standard method for asseying the ther ­
mal stability of chemicals by methods 
of differential thermal analysis 
ASTM E 473-85 Standard definitions of terms relating 
to thermal analysis 
ASTM E 472-86 Standard practice for reporting ther ­
moanalytical data 
DIN 51005 Thermisches Analyse, Begriffe  
5. Bestämning av flytpunkt  
NBN 52014 Echantillonnage et analyse des pro ­
duits du pétrole: Point de trouble et 
point d'écoulement limite – Monsterne ­
ming en ontleding van aardolieproduc ­
ten: Troebelingspunt en vloeipunt 
ASTM D 97-66 Standard test method for pour point of 
petroleum oils 
ISO 3016 Petroleum oils – Determination of pour 
point.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 17
 
A.2 KOKPUNKT  
1. METOD  
De flesta av de beskrivna metoderna är baserade på OECD:s riktlin ­
jer för undersökning av kemikalier (se hänvisning 1). Grundprinci ­
perna anges i hänvisningarna 2 och 3.  
1.1. INLEDNING 
De metoder och anordningar som beskrivs här kan användas för alla 
vätskor och ämnen med låg smältpunkt, förutsatt att det inte inträffar någon kemisk reaktion under kokpunkten (t.ex. autooxidation, om ­
ordning, nedbrytning). Metoderna kan användas för alla vätskor, 
oavsett renhetsgrad. 
De metoder där man använder bestämning med fotocell och de som 
är baserade på termisk analys framhävs särskilt eftersom de kan 
användas för bestämning av både smält- och kokpunkter. Dessutom 
kan dessa mätningar utföras automatiskt. 
Den ”dynamiska metoden” har den fördelen att den också kan an ­
vändas för bestämning av ångtryck, och det är inte nödvändigt att 
korrigera kokpunkten till standardtryck (101,325 kPa) eftersom stan ­
dardtrycket kan ställas in med en manostat under mätningen.  
Anmärkningar:  
Orenheters inflytande på kokpunktsbestämningen beror i hög grad på 
arten av orenhet. Om provet innehåller flyktiga orenheter, som kan 
påverka resultaten, kan ämnet eventuellt lenas.
 
1.2. DEFINITIONER OCH ENHETER 
Standardkokpunkten definieras som den temperatur vid vilken en 
vätskas ångtryck är 101,325 kPa. 
Om kokpunkten inte mäts vid normalt atmosfäriskt tryck kan ång ­
tryckets beroende av temperaturen beskrivas genom Clausius-Cla ­
peyrons ekvation:  
log p ¼ Δ H v 
2; 3 RT þ konst : 
där: 
p = ämnets ångtryck i pascal A H
 v = ämnets förångningsvärme i J mol  -1 
R = den universella gaskonstanten = 8,314 J mol  -1 K -1 
T = termodynamisk temperatur i K 
Kokpunkten anges i förhållande till det aktuella trycket under mät ­
ningen.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 18
 
Omvandling  
Tryck (enhet: kPa) 100 kPa = bar = 0,1 MPa 
(enheten ”bar” är fortfarande tillåten men rekommende ­
ras inte). 
133 Pa = 1 mm Hg = 1 Torr 
(enheterna ”mm Hg” och ”Torr” är inte tillåtna). 
1 atm = standardatmosfär = 101 325 Pa 
(enheten ”atm” är inte tillåten). 
Temperatur (enhet: K) t = T – 273,15 t: temperatur i grader Celsius (
 o C) 
T: termodynamisk temperatur i kelvin (K)  
1.3 REFERENSÄMNEN 
Man behöver inte använda referensämnen varje gång ett nytt ämne 
ska undersökas. Referensämnen ska först och främst användas för att då och då kontrollera metoden och för jämförelse med resultat som uppnåtts med andra metoder. 
I de metoder som anges i tillägget anges vissa referensämnen.
 
1.4 TESTMETODSPRINCIP 
Det finns fem metoder för bestämning av kokpunkten (kokpunktsin ­
tervallet) som är baserade på mätning av den temperatur vid vilken 
proven kokar, och två metoder som är baserade på termisk analys.  
1.4.1  Bestämning med hjälp av ebulliometer  
Ebulliometern utvecklades ursprungligen för molekylviktsbestämning 
via kokpunktshöjningar, men de lämpar sig även för exakt bestäm ­
ning av kokpunkter. En mycket enkel apparat beskrivs i ASTM D 1120-72 (se tillägg). I denna apparat uppvärms vätskan under jäm ­
viktsbetingelser i atmosfäriskt tryck tills den kokar.
 
1.4.2  Dynamisk metod  
Genom denna metod mäts ångans förtätningstemperatur med hjälp av 
en lämplig termometer i återloppet vid kokning. Med denna metod 
kan trycket varieras.  
1.4.3  Destillationsmetod för bestämning av kokpunkt  
Genom denna metod destilleras vätskan, och ångans förtätningstem ­
peratur och destillatmängden mäts.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 19
 
1.4.4  Siwoloboffs metod  
Ett prov uppvärms i ett provrör som är nedsänkt i vätska i ett 
värmebad. Ett sammangjutet kapillärrör med en luftbubbla i den nedre änden sänks ned i provröret.
 
1.4.5  Bestämning med fotocell  
Vid användning av Siwoloboffs princip sker automatisk fotoelektrisk 
mätning av uppstigande bubblor.  
1.4.6  Differentiell termisk analys  
Genom denna metod registrerar temperaturskillnaden mellan ämnet 
och ett referensämne som en funktion av temperaturen medan ämnet och referensämnet utsätts för samma kontrollerade temperaturpro ­
gram. En fasöver-gång i provet som åtföljs av en entalpiändring visar 
sig genom en endoterm (smältning) eller exoterm (frysning) avvi ­
kelse från den registrerade baslinjen.
 
1.4.7  Differentiell scanningkalorimetri  
Genom denna metod registreras skillnaden i den energimängd som 
tillförs ett ämne och ett referensmaterial som en funktion av tempera ­
turen medan ämnet och referensämnet utsätts för samma kontrolle ­
rade temperaturprogram. Denna skillnad motsvarar den energi som är 
nödvändig för att upprätthålla en temperaturskillnad på noll mellan ämnet och referensmaterialet. En fasövergång i provet som åtföljs av en entalpiändring visar sig genom en endoterm (smältning) eller 
exoterm (frysning) avvikelse från den registrerade baslinjen.
 
1.5 KVALITETSKRITERIER 
I tabell 1 anges de olika metodernas lämplighet och noggrannhet vid 
bestämning av kokpunkt/kokpunktsintervall.  
Tabell 1  
Jämförelse av metoderna  
Mätmetod Uppskattad noggrannhet Befintliga standarder  
Ebulliometer ± 1,4 K (upp till 373 K) (  1 ) ( 2 ) 
± 2,5 K (upp till 600 K) (  1 ) ( 2 ) ASTM D 1120-72 (  1 ) 
Dynamisk metod ± 0,5 K (upp till 600 K) (  2 ) 
Destillationsprocess (kokpunktsin ­
tervall) ± 0,5 K (upp till 600 K) ISO/R 918, DIN 53171, BS 
4591/71 
Siwoloboffs metod ± 2 K (upp till 600 K) (  2 ) 
Bestämning med fotocell ± 0,3 K (vid 373 K) (  2 ) 
Differentiell termisk kalorimetri ± 0,5 K (upp till 600 K) 
± 2,0 K (upp till 1 273 K) ASTM E 537-76 
Differentiell scanningkalorimetn ± 0,5 K (upp till 600 K) 
± 2,0 K (upp till 1 273 K) ASTM E 537-76  
( 1 ) Denna noggrannhet gäller endast för den enkla anordning som beskrivs i t.ex. ASTM D 1120-72; den kan förbättras 
med mer avancerade ebulliometeranordningar. 
( 2 ) Gäller endast för rena ämnen. Användning under andra omständigheter ska motiveras.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 20
 
1.6 METODBESKRIVNING 
Tillvägagångssättet för vissa metoder beskrivs i internationella och 
nationella standarder (se tillägg).  
1.6.1  Ebulliometer  
Se tillägg.  
1.6.2  Dynamisk metod  
Se testmetod A.4 för bestämning av ångtrycket. 
Den kokpunkt, som iakttas vid ett tryck av 101,325 kPa, antecknas.  
1.6.3  Destillationsförlopp (kokpunktsintervall)  
Se tillägg.  
1.6.4  Siwoloboffs metod  
Provet uppvärms i en smältpunktsapparat i ett provrör med en dia ­
meter på ungefär 5 mm (se figur 1). 
Figur 1 visar en typ av en standardiserad smält- och kokpunktsap ­
parat (JIS K 0064) (gjord av glas, alla mått i mm).  
Figur 1
  
Ett kapillärrör, som är tillslutet ungefär 1 cm ovanför den nedre 
änden, placeras i provröret. Provet fylls så högt upp att den tillslutna delen av kapillärröret befinner sig under vattenytan. Provröret med 
kapillärröret fästs vid termometern med ett gummiband eller med ett 
stöd från sidan (se figur 2).
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 21
 
Figur 2  
Siwoloboffs princip  Figur 3  
Modifierad princip
  
Badvätskan väljs med hänsyn till kokpunkten. Vid temperaturer upp 
till 573 K kan silikonolja användas. Paraf-finolja kan endast använ ­
das upp till 473 K. Uppvärmningen av badvätskan ska i början regleras till en temperaturstegring av 3 K/min, under omrörning. 
Vid ungefär 10 K under den förväntade kokpunkten sänks värmetill ­
förseln så att temperaturstegringen blir mindre än 1 K/min. När temperaturen närmar sig kokpunkten börjar bubblor strömma ut från kapillärröret. 
Kokpunkten är den temperatur då bubbelströmmen under en kort ­
varig temperaturminskning upphör och vätskan börjar stiga upp i kapillärröret. Termometeravläsningen visar ämnets kokpunkt. 
I den modifierade principen (se figur 3) bestäms kokpunkten i ett 
kapillärrör avsett för smältpunktsbestämning. Det sträcks till en fins ­
petsig tråd, ungefär 2 cm lång (a), och en liten provmängd sugs upp. Den öppna änden av det fina kapillärröret tillsluts genom smältning på så vis att en liten luftbubbla blir kvar i änden. Vid uppvärmning i 
smältpunktsapparaten (b) utvidgar sig luftbubblan. Kokpunkten är 
den temperatur vid vilken ämnesproppen når upp till ytan av bad ­
vätskan.
 
1.6.5  Bestämning med fotocell  
Provet uppvärms i ett kapillärrör i ett uppvärmt metallblock. 
En ljusstråle riktas via lämpliga hål i blocket genom ämnet mot en 
exakt inställd fotocell. 
Medan provets temperatur stiger utvecklas enstaka luftbubblor från 
kapillärröret. När kokpunkten är nådd ökar antalet bubblor kraftigt. 
Detta leder till att styrkan ändras på det ljus som är riktat mot 
fotocellen och en stoppsignal sänds till en indikator som visar tem ­
peraturen på en motståndstermometer av platina som är placerad i blocket. 
Denna metod är särskilt användbar eftersom den kan användas för 
bestämningar under rumstemperatur ned till 253,15 K (- 20
 o C) utan 
ändringar av apparaturen. Instrumentet ska endast placeras i ett kylbad.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 22
 
1.6.6  Termisk analys  
1.6.6.1  Differentiell termisk analys  
Se tillägg.  
1.6.6.2  Differentiell scanningkalorimetri  
Se tillägg.  
2. DATA  
Vid små avvikelser från normalt tryck (högst ± 5 kPa) korrigeras 
kokpunktstemperaturer till Tn med användning av följande Sidney Young ekvation: 
T
 n = T + (f  T x Δp) 
där: 
Δ p = (101,325 – p) [observera förtecknet] 
P = ptrycket mätt i kPa f
 T = kokpunktens ändring med trycket i K/kPa 
T = uppmätt kokpunkt i K T
 n = kokpunkt korrigerad till normalt tryck i K 
I ovannämnda internationella och nationella standarder finns tempe ­
raturkorrektionsfaktorer f  T för ett flertal ämnen och ekvationer för 
approximation av dem. 
Exempelvis anges i DIN 53171 följande grova korrektioner för lös ­
ningsmedel som ingår i färger:  
Tabell 2:  
Temperaturkorrektionsfaktorer f  t 
Temperatur T (K) Korrektionsfaktor f  T (K/kPa)  
323,15 0,26 
348,15 0,28 
373,15 0,31 
398,15 0,33 
423,15 0,35 448,15 0,37 473,15 0,39 498,15 0,41 523,15 0,44 548,15 0,45 573,15 0,47
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 23
 
3. RAPPORTERING  
Testrapporten ska, om möjligt, innehålla följande uppgifter: 
— Använd testmetod. — Noggrann beskrivning av substansen (beteckning och orenheter) 
och eventuella inledande reningsåtgärder. 
— Den uppskattade noggrannheten. 
Som kokpunkt anges medelvärdet av minst två mätningar, som ligger 
mom gränserna för den uppskattade noggrannheten (se tabell 1). 
De uppmätta kokpunkterna och medelvärdet av dessa ska anges, och 
det tryck vid vilket mätningarna gjordes ska anges i kPa. Trycket bör helst ligga i närheten av normalt atmosfäriskt tryck. 
Alla uppgifter och upplysningar av betydelse för tolkningen av re ­
sultaten ska anges, i synnerhet vad gäller orenheter och ämnets fy ­
siska tillstånd.
 
4. HÄNVISNINGAR  
1. OECD, Paris, 1981, Test Guideline 103, rådets beslut K(81) 30 
slutligt. 
2. IUPAC, B. Le Neindre, B. Vodar, eds. Experimental thermody ­
namics, Butterworths, London 1975, vol. II. 
3. R. Weissberg ed.: Technique of organic Chemistry, Physical 
Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Inter-science Publ., New York, 1959, vol. I, del I, kapitel VII.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 24
 
Tillägg  
Kompletterande tekniska uppgifter finns, i följande standarder:  
1. Ebulliometer  
ASTM D 1120-72 Standard test method for boiling point of 
engine anti-freezes  
2. Destillationsprocess (kokpunktsintervall)  
ISO/R 918 Test Method for Distillation (Distillation 
Field and Distillation Range) 
BS 4349/68 Method for determination of distillation of 
petroleum products 
BS 4591/71 Method for the determination of distill ­
lation characteristics 
DIN 53171 Lösungsmittel fur Anstrichstoffe, Bestim ­
mung des Siederverlaufes 
NF T 20-608 Distillation: determination du rendement 
et de l'intervalle de distillation  
3. Differentiell termisk analys och differentiell scanningkalorimetri  
ASTM E 537-76 Standard method for assessine the thermal 
stability of chemicals by methods or dif ­
ferential thermal analysis 
ASTM E 473-85 Standard definitions of terms relating to 
thermal analysis 
ASTM E 472-86 Standard practice for reporting thermoana ­
lytical data 
DIN 51005 Thermisches Analyse, Begriffe  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 25
 
A.3 RELATIV DENSITET  
1. METOD  
De flesta av de beskrivna metoderna är baserade på OECD:s riktlin ­
jer för undersökning av kemikalier (se hänvisning 1). Grundprinci ­
perna anges i hänvisning 2.  
1.1 INLEDNING 
De beskrivna metoderna för bestämning av relativ densitet kan an ­
vändas för fasta ämnen och vätskor, oavsett renhetsgrad. De olika 
metoder som får användas anges i tabell 1.  
1.2 DEFINITIONER OCH ENHETER 
Fasta ämnens och vätskors relativa densitet (D  4 20 ) är förhållandet 
mellan det undersökta ämnets vikt per volymenhet, bestämd vid 20
 o C och vikten per samma volymenhet vatten, bestämd vid 
4 o C. Den relativa densiteten har ingen dimension. 
Ett ämnes densitet, Q, är kvoten av vikten, m, och dess volym, v. Densiteten, Q, anges, i SI-enheter, i kg/m
 3 . 
1.3 REFERENSÄMNEN (SE HÄNVISNING 1 OCH 3) 
Referensämnen behöver inte användas varje gång ett nytt ämne ska 
undersökas. De ska först och främst användas för att då och då kontrollera metoden och för jämförelse med resultat som uppnåtts med andra metoder.
 
1.4 TESTMETODSPRINCIP 
Fyra metoder används.  
1.4.1  Flottörmetoder  
1.4.1.1  Hydrometer (för vätskor)  
Tillräckligt noggranna och snabba densitetsbestämningar kan göras 
med flytande hydrometrar, med vilka en vätskas densitet kan härle ­
das från nedsänkningsgraden som avläses på en skala.  
1.4.1.2  Hydrostatisk balans (för vätskor och fasta ämnen)  
Skillnaden mellan provets vikt mätt i luft och i en lämplig vätska 
(t.ex. vatten) kan användas för att bestämma dess densitet. 
För fasta ämnen är den mätta densiteten endast representativ för just 
det prov som har använts vid bestämningen. När densiteten hos 
vätskor ska bestämmas vägs först en kropp med känd volym, v, i 
luft och sedan i vätskan.  
1.4.1.3  Metod med nedsänkt kula (för vätskor) (se hänvisning 4)  
Med denna metod bestäms en vätskas densitet utifrån skillnaden 
mellan vätskans vikt före och efter nedsänkning av en kula med 
känd volym i testvätskan.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 26
 
1.4.2  Pyknometermetoder  
Pyknometrar av olika utformning och med kända volymer kan an ­
vändas till fasta ämnen och vätskor. Densiteten beräknas utifrån viktskillnaden mellan den fulla och den tomma pyknometern och 
dess kända volym.
 
1.4.3  Luftjämförelsepyknometer (för fasta ämnen)  
Densiteten hos ett fast ämne, oavsett form, kan bestämmas vid rums ­
temperatur med en gasjämförelsepyknometer. Ämnets volym mäts i 
luft eller en inert gas i en cylinder med varierbar kalibrerad volym. Densiteten beräknas genom att vikten mäts efter volymbestämningen.
 
1.4.4  Oscillerande densitometer (se hänvisning 5, 6 och 7)  
En vätskas densitet kan bestämmas med en oscillerande densitome ­
ter. En mekanisk oscillator i form av ett U-rör sätts i vibration vid en viss frekvens som är beroende på oscillatorns vikt. När ett prov införs ändras oscillatorns resonansfrekvens. Apparaturen ska kalibre ­
ras med två vätskor med känd densitet. Dessa vätskor ska helst väljas 
så att deras densiteter spänner över hela det område som ska mätas.
 
1.5 KVALITETSKRITERIER 
I tabellen anges de olika metodernas lämplighet för bestämning av 
densitet.  
1.6 METODBESKRIVNING 
Tillägget innehåller en lista över några standarder, från vilka ytterli ­
gare tekniska uppgifter kan inhämtas. 
Mätningarna ska utföras vid 20  o C, och minst två mätningar ska 
göras.  
2. DATA  
Se standarder.  
3. RAPPORTERING  
Testrapporten ska, om möjligt, innehålla följande uppgifter: 
— Använd testmetod. 
— Exakt specificering av ämnet (beteckning och orenheter) och 
eventuella inledande reningsåtgärder. 
Den relativa densiteten  D 20 
4 ska anges enligt definitionen i 1.2 till ­
sammans med det undersökta ämnets fysiska tillstånd. 
Alla uppgifter och anmärkningar av betydelse för tolkningen av 
resultaten ska rapporteras, i synnerhet vad gäller orenheter och äm ­
nets fysiska tillstånd.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 27
 
Tabell  
Metodernas lämplighet  
Mätmetod Densitet Maximal dynamisk 
viskositet Befintliga standarder 
Fasta Vätskor  
1.4.1.1. Hydrometer ja 5 Pa s ISO 387, 
ISO 649-2, 
NF T 20-050 
1.4.1.2 Hydrostatisk balans a) fasta ämnen ja ISO 1183 (A) b) vätskor ja 5 Pa s ISO 901 and 758 
1.4.1.3 Metod med nedsänkt kula ja 20 Pa s DIN 53217 
1.4.2 Pyknometer ISO 3507 a) fasta ämnen ja ISO 1183(B), 
NF T 20-053 
b) vätskor ja 500 Pa s ISO 758 1.4.3 Luftjämförelsepyknometer ja DIN 55990 Teil 3, 
DIN 53243 
1.4.4 Oscillerande densitometer yes 5 Pa s
 
4. HÄNVISNINGAR  
1. OECD, Paris, 1981, Test Guideline 109, rådets beslut K(81) 30 
slutligt. 
2. R. Weissberger ed., Technique of Organic Chemistry, Physical 
Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., kapitel IV, Interscience 
Publ., New York, 1959, vol. I, del 1. 
3. IUPAC, Recommended reference materials for realization of phy ­
sico-chemical properties, Pure and applied chemistry, 1976, vol. 48, s. 508. 
4. Wagenbreth, H., Die Tauchkugel zur Bestimmung der Dichte 
von Fliüssigkeiten, Technisches Messen tm, 1979, vol. 11, s. 427–430. 
5. Leopold, H., Die digitale Messung von Flussigkeiten, Elektronik, 
1970, vol. 19, s. 297–302. 
6. Baumgarten, D., Füllmengenkontrolle bei vorgepackten Erzeug ­
nissen – Verfahren zur Dichtebestimmung bei fliüssigen Produk ­
ten und ihre praktische Anwendung, Die Pharmazeutische Indu ­
strie, 1975, vol. 37, s. 717–726. 
7. Riemann, J., Der Einsatz der digitalen Dichtemessung im Braue ­
reilaboratorium, Brauwissenschaft, 1976, vol. 9, s. 253–255.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 28
 
Tillägg  
Kompletterande tekniska uppgifter finns i följande standarder:  
1. Flottörmetoder  
1.1 Hydrometer 
DIN 12790, ISO 3S7 Hydrometer, general instructions 
DIN 12791 Part I: Density hydrometers; construction, 
admjustment and use; 
Part II: Density hydrometers; standardized 
sizes, designation 
Part III: Use and test 
ISO 649-2 Laboratory glassware: Density hydrome ­
ters for general purpose 
NF T 20-050 Chemical products for industrial use – 
Determination of density of liquids Aero ­
metric method 
DIN 12793 Laboratory glassware: range find hydro ­
meters  
1.2 Hydrostatisk balans  
För fasta ämnen  
ISO 1183 Method A: Methods för determining the 
density and relative density of plastics 
excluding cellular plastics 
NF T 20-049 Chemical products for industrial use – 
Determination of the density of solids ot ­
her than powders and cellular products – 
Hydrostatic balance method 
ASTM-D-792 Specific gravity and density of plastics by 
displacement 
DIN 53479 Testing of plastics and elastometers; de ­
termination of density  
För vätskor  
ISO 901 ISO 758  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 29
 
DIN 51757 Testing of mineral oils and related mate ­
rials; determination of density 
ASTM D 941-55, ASTM D 1296-67 och ASTM D 1481-62 
ASTM D 1298 Density, specific gravity or API gravity of 
crude petroleum and liquid petroleum pro ­
ducts by hydrometer method 
BS 4714 Density, specific gravity or API gravity of 
crude petroleum and liquid petro-leum products by hydrometer method
 
1.3 Metod med nedsänkt kula 
DIN 53217 Testing of paints, varnishes and similar 
coating materials; determination of densi ­
ty; lmmersed body method  
2. Pyknometermetoder  
2.1 För vätskor 
ISO 3507 Pycnometers 
ISO 758 Liquid chemical products; determination 
of density at 20  o C 
DIN 12797 Gay-Lussac pycnometer (för icke-flyktiga 
vätskor som inte är för viskösa) 
DIN 12798 Lipkin pycnometer (för vätskor med kine ­
matisk viskositet under 100 × 10  -6 m 2 s -1 
vid 15  o C) 
DIN 12800 Sprengel pycnometer (för vätskor enligt 
DIN 12798) 
DIN 12801 Reischauer pycnometer (för vätskor 
med kinematisk viskositet under 100 × 10
 -6 m 2 s -1 vid 20  o C, särskilt lämp ­
lig även för kolväten och vattenlösningar 
samt för vätskor med högre ångtryck, 
cirka 1 bar vid 90  o C) ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 30
 
DIN 12806 Hubbard pycnometer (för alla typer av 
viskösa vätskor som inte har för högt ång ­
tryck, särskilt även för färg, lacker och 
bitumen) 
DIN 12807 Bingham pycnometer (för vätskor enligt 
DIN 12801) 
DIN 12808 Jaulmes pycnometer (särskilt för etanol- 
vattenblandningar) 
DIN 12809 Pycnometer with ground-in thermometer 
and capillary side tubes (för väts-kor 
som inte är för tjockflytande) 
DIN 53217 Testing of paints, varnishes and similar 
products; determination of density by pyc ­
nometer 
DIN 51757 Point 7: Testing of mineral oils and rela ­
ted materials; determination of density 
ASTM D 297 Section 15: Rubber products – chemical 
analysis 
ASTM D 2111 Method C: Halogenated organic com ­
pounds 
BS 4699 Method for determination of specific gra ­
vity and density of petroleum products (graduated bicapillary pycnometer method) 
BS 5903 Method for determination of relative den ­
sity of petroleum products by the capilla ­
ry-stoppered pycnometer method 
NF T 20-053 Chemical products for industrial use – De ­
termination of density of solids in powder 
and liquids – Pykonometric method
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 31
 
2.2 För fasta ämnen 
ISO 1183 Metod B i Method for Determining the 
Density and Relative Density of Plastics excluding Cellular Plastics 
NF T 20-053 Chemical products for industrial use – 
Determination of density of solids in 
powder and liquids – Pycnometric method 
DIN 19683 Determination of the density of soils
 
3. Luftjämförelsepyknometer  
N Part 3: Prüfung von Anstrichstoffen und 
ähnlichen Beschichtungsstoffen: Pulver ­
lack; Bestimmung der Dichte 
DIN 53243 Anstrichstoffe; Chlorhaltige Polymere; 
Prüfung  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 32
 
A.4 ÅNGTRYCK  
1. METOD  
Den här metoden motsvarar OECD TG 104 (2004).  
1.1 INLEDNING 
Den här ändrade versionen av metod A.4 (1) omfattar ytterligare ett 
sätt att bestämma ångtrycket: Effusionsmetod: isoterm termogravi ­
metri, avsedd för ämnen med mycket lågt ångtryck (ned till 10  –10 
Pa). Med tanke på behovet av metoder, i synnerhet för att bestämma 
ångtrycket hos ämnen med lågt ångtryck, pågår en förnyad utvär ­
dering av andra varianter av denna metod för att se inom vilka ångtrycksintervall de kan användas. 
Vid termodynamisk jämvikt beror ångtrycket hos ett rent ämne en ­
dast på temperaturen. De grundläggande principerna beskrivs i refe ­
renslitteraturen (2)(3). 
Det finns inte någon mätmetod som kan användas inom hela ång ­
trycksintervallet, dvs. från mindre än 10
 –10 upp till 10  5 Pa. I det här 
dokumentet beskrivs därför åtta olika metoder för mätning av ång ­
trycket som kan användas inom olika ångtrycksintervall. I tabell 1 jämförs de olika metodernas tillämpnings- och mätområde. Meto ­
derna kan endast användas för föreningar som inte sönderdelas under 
de rådande försöksbetingelserna. Om det av tekniska skäl inte är möjligt att använda någon av de experimentella metoderna är det också möjligt att uppskatta ångtrycket. En lämplig uppskattnings ­
metod beskrivs i tillägget.
 
1.2 DEFINITIONER OCH ENHETER 
Ett ämnes ångtryck definieras som mättnadstrycket över ett fast eller 
flytande ämne. 
SI-enheten för tryck, som är pascal (Pa), ska användas. Nedan anges 
andra enheter, som använts tidigare, samt deras omvandlingsfaktorer: 
1 Torr = 1 mm Hg = 1,333 × 10  2 Pa 
1 atmosfär = 1,013 × 10  5 Pa 
1 bar = 10  5 Pa 
SI-enheten för temperatur är kelvin (K). För att omvandla tempera ­
turen i celsiusgrader till kelvin används följande formel: 
T = t + 273,15 där T är temperaturen i kelvin (den termodynamiska temperaturen) 
och t är temperaturen i celsiusgrader.
 ▼M1 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 33
 
Tabell 1  
Mätmetod Ämnen Uppskattad 
repeterbarhet Uppskattad 
reproducerbarhet Rekommenderat 
intervall Fasta Flytande  
Dynamisk metod Lågsmältande Ja upp till 25 % 
1–5 % upp till 25 % 
1–5 % 10 3 Pa till 2 
× 10  3 Pa 
2 × 10  3 till 10  5 Pa 
Statisk metod Ja Ja 5–10 % 5–10 % 10 Pa till 10  5 Pa 
10 –2 Pa 
till 10  5 Pa (  1 ) 
Isoteniskopisk me ­
tod Ja Ja 5–10 % 5–10 % 10  2 Pa till 10  5 Pa 
Effusionsmetod: 
ångtrycksjämvikt Ja Ja 5–20 % upp till 50 % 10  –3 till 1 Pa 
Effusionsmetod: 
Knudsencell Ja Ja 10–30 % — 10  –10 till 1 P 
Effusionsmetod: 
isoterm termogravi ­
metri Ja Ja 5–30 % upp till 50 % 10  –10 till 1 Pa 
Gasmättnadsmetod Ja Ja 10–30 % upp till 50 % 10  –10 till 10  3 Pa 
Rotormetod Ja Ja 10–20 % — 10  –4 till 0,5 Pa  
( 1 ) Vid användning av en kapacitansmanometer.  
1.3 TESTPRINCIP 
Ångtrycket bestäms vanligen vid olika temperaturer. Enligt den för ­
enklade Clapeyron-Clausius-ekvationen är logaritmen av ångtrycket för ett rent ämne en linjär funktion av den inverterade termodyna ­
miska temperaturen inom ett begränsat temperaturintervall.
 
log p ¼ ΔHv 
2; 3RT þ konstant  
där: 
p = ångtrycket i pascal ΔHv = ångbildningsvärmet i J mol
 –1 
R = den allmänna gaskonstanten, dvs. 8,314 J mol  –1 K –1 
T = temperaturen i K  ▼M1 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 34
 
1.4 REFERENSSUBSTANSER 
Det är i regel inte nödvändigt att använda referenssubstanser. De 
behöver endast användas då och då för att kontrollera metodens prestanda och för att möjliggöra resultatjämförelser mellan olika me ­
toder.
 
1.5 METODBESKRIVNING  
1.5.1  Dynamisk metod (Cottrells metod)  
1.5.1.1  Princip  
Ångtrycket bestäms genom att ämnets kokpunkt mäts vid flera kända 
tryck mellan ca 10  3 och 10  5 Pa. Den här metoden rekommenderas 
också för bestämning av kokpunkten. Den kan användas för kok ­
punkter på upp till 600 K. Beroende på vätskepelarens hydrostatiska tryck är vätskors kokpunkt omkring 0,1 °C högre på ett djup av 3–4 cm än på ytan. I Cottrells metod (4) placeras termometern i 
ångan över vätskeytan så att den kokande vätskan hela tiden sköljer 
över termometerkulan. Denna täcks då av ett tunt vätskeskikt som vid atmosfärstryck står i jämvikt med ångfasen. Termometern anger således den verkliga kokpunkten utan fel som beror på överhettning 
eller hydrostatiskt tryck. Den pump som ursprungligen användes av 
Cottrell visas i figur 1. Rör A innehåller den kokande vätskan. En platinatråd B som är fäst på rörets botten ger en jämn kokning. Sidoröret C leder till en kylare och manteln D förhindrar att det 
kylda kondensatet når termometern E. När vätskan i A kokar kom ­
mer bubblor och vätska som fångats upp av tratten att skölja över termometerkulan via pumpens F båda armar.  
Figur 1
 Figur 2
  ▼M1 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 35
 
Cottrellpump (4) 
A: Termoelement B: Vakuumbuffertvolym C: Tryckmätare D: Vakuum E: Mätpunkt F: Värmeelement (ca 150 W)
 
1.5.1.2  Utrustning  
I figur 2 visas en mycket noggrann mätutrustning som tillämpar 
Cottrells princip. Den består av ett rör med en sektion som är avsedd 
för kokning i nedre delen, en kylare i mitten samt ett utlopp och en fläns i den övre delen. Cottrellpumpen placeras i den rörsektion som är avsedd för kokning och denna del av röret värms upp med hjälp 
av en elpatron. Temperaturen mäts med ett mantlat termoelement 
eller en resistanstermometer som förs in genom flänsen i rörets övre del. Utloppet ansluts till tryckregleringssystemet, som består av en vakuumpump, en buffertvolym, en manostat för tillförsel av 
kvävgas (för tryckreglering) och en manometer.
 
1.5.1.3  Förfarande  
Ämnet placeras i den rörsektion som är avsedd för kokning. Det kan 
uppstå problem med fasta ämnen som inte är i pulverform, men detta 
kan ibland undvikas genom att man värmer kylmanteln. Utrustningen försluts vid flänsen och gaser drivs av. Skummande ämnens ångtryck kan inte mätas med denna metod. 
Det lägsta önskade trycket ställs in och värmen slås på. Samtidigt 
ansluts temperaturgivaren till en skrivare. 
Jämvikt har nåtts när en konstant kokpunkt registreras vid konstant 
tryck. Det är viktigt att undvika stötkokning. Dessutom måste ämnet kondenseras helt på kylaren. Vid bestämning av ångtrycket för låg ­
smältande fasta ämnen är det viktigt att se till att kylaren inte täpps till. 
När jämviktspunkten har registrerats ställs ett högre tryck in. Man 
fortsätter på samma sätt tills ett tryck på 10
 5 Pa nås (totalt omkring 
5–10 mätpunkter). För att kontrollera mätvärdena måste man upprepa 
mätningarna vid stegvis lägre tryck.  
1.5.2  Statisk metod  
1.5.2.1  Princip  
I den statiska metoden (5) bestäms ångtrycket vid termodynamisk 
jämvikt vid en viss temperatur. Den här metoden lämpar sig för ämnen och flerkomponentblandningar i flytande eller fast form 
med ett ångtryck från 10
 –1 till 10  5 Pa. Om man är försiktig kan 
den också användas i intervallet 1 till 10 Pa.  ▼M1 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 36
 
1.5.2.2  Utrustning  
Utrustningen består av ett bad som hålls vid konstant temperatur 
(precision på ± 0,2 K), en provbehållare ansluten till en vakuumled ­
ning, en manometer och ett tryckregleringssystem. Provkärlet (figur 
3 a) ansluts till vakuumledningen via en ventil och en differential ­
manometer (U-rör innehållande en lämplig manometervätska) som fungerar som nollindikator. Beroende på tryckintervallet och det tes ­
tade ämnets kemiska egenskaper kan kvicksilver, silikoner eller fta ­
later användas i differentialmanometern. Av miljöskäl bör man emel ­
lertid om möjligt undvika att använda kvicksilver. Testsubstansen bör inte vara märkbart löslig i eller reagera med vätskan i U-röret. 
En tryckmätare kan användas i stället för ett U-rör (figur 3 b). 
Kvicksilver kan användas i manometern från normaltryck ned till 10
 2 Pa, medan silikoner och ftalater lämpar sig i tryckintervallet 
10 Pa till 10  2 Pa. Det finns andra tryckmätare som kan användas vid 
lägre tryck än 10  2 Pa, och manometrar med uppvärmningsbara mem ­
bran kan till och med användas under 10  –1 Pa. Temperaturen mäts på 
provbehållarens yttre vägg eller i själva kärlet.  
1.5.2.3  Förfarande  
Vid användning av den utrustning som beskrivs i figur 3 a fylls U- 
röret med den valda vätskan och gaser drivs av vid hög temperatur innan några avläsningar görs. Testsubstansen placeras i provkärlet och gaser drivs av vid lägre temperatur. Om provet består av flera 
komponenter måste temperaturen vara så låg att provets sammansätt ­
ning inte förändras. Jämvikt nås snabbare vid omrörning. Provet kan kylas ned med flytande kväve eller kolsyreis, men det är då viktigt att undvika att luft eller pumpvätska kondenserar. Ventilen över 
provkärlet öppnas och luften sugs ut under flera minuter. Om det 
behövs kan avdrivningen av gaser upprepas flera gånger.  
Figur 3 a
 Figur 3 b
  ▼M1 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 37
 
När provet värms upp med ventilen stängd ökar ångtrycket. Därmed 
rubbas jämvikten hos vätskan i U-röret. För att kompensera för detta 
tillförs kvävgas eller luft tills tryckskillnadsindikatorn åter visar noll. Det tryck som behövs för att återställa jämvikten kan avläsas på manometern eller på ett instrument med högre precision. Detta tryck 
motsvarar ämnets ångtryck vid den temperatur där mätningen äger 
rum. Vid användning av den utrustning som visas i figur 3 b kan ångtrycket avläsas direkt. 
Ångtrycket bestäms med tillräckligt små temperaturintervall (totalt 
omkring 5–10 mätpunkter) upp till den önskade högsta temperaturen. 
Avläsningar vid låga temperaturer måste upprepas för att kontrollera 
att samma värde erhålls. Om de värden som erhålls vid sådana upp ­
repade avläsningar inte överensstämmer med den kurva som erhölls 
vid stigande temperaturer kan detta bero på att 
i) provet fortfarande innehåller luft (detta kan till exempel vara 
fallet med mycket viskösa ämnen) eller på att lågkokande ämnen 
avges under uppvärmningen, 
ii) ämnet undergår en kemisk reaktion i det undersökta temperaturin ­
tervallet (t.ex. sönderdelning eller polymerisering).
 
1.5.3  Isoteniskopisk metod  
1.5.3.1  Princip  
Den isoteniskopiska metoden (6) grundas på samma princip som den 
statiska metoden. Metoden går ut på att ett prov placeras i en kolv som hålls vid konstant temperatur och som ansluts till en manometer och en vakuumpump. Föroreningar som är mer flyktiga än provet 
avlägsnas genom att gaserna drivs av vid sänkt tryck. Provets ång ­
tryck vid en viss temperatur balanseras av ett känt tryck av inert gas. Metoden utvecklades för att mäta ångtrycket hos vissa flytande kol ­
väten, men kan även användas för att undersöka fasta ämnen. Den är 
i allmänhet inte lämplig för flerkomponentsystem. Resultaten är en ­
dast behäftade med små fel för prov som innehåller icke-flyktiga föroreningar. Det rekommenderade tryckintervallet är 10
 2 till 10  5 Pa. 
1.5.3.2  Utrustning  
Ett exempel på mätutrustning visas i figur 4. En fullständig beskriv ­
ning återfinns i ASTM D 2879-86 (6).  ▼M1 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 38
 
1.5.3.3  Förfarande  
Om provet är en vätska är det själva ämnet som används som vätska 
i differentialmanometern. En vätskemängd som är tillräckligt stor för 
att fylla kolven och manometerns kortare rör tillsätts isoteniskopet. Isoteniskopet, som är anslutet till ett vakuumsystem, evakueras och fylls därefter med kvävgas. Evakueringen och genomblåsningen av 
systemet med kvävgas upprepas två gånger för att avlägsna kvarva ­
rande syre. Det fyllda isoteniskopet placeras horisontellt så att provet sprids ut i ett tunt skikt i provkolven och manometern. Systemets 
tryck minskas till 133 Pa och provet värms försiktigt tills det precis 
börjar koka (avdrivning av lösta gaser). Isoteniskopet placeras där ­
efter så att provet återgår till kolven och fyller manometerns kortare rör. Trycket bibehålls vid 133 Pa. Provkolvens utdragna spets värms 
med en liten låga tills den ånga som avges från provet utvidgas så 
mycket att en del av provet pressas ut ur kolvens övre del och manometerröret in i manometern och skapar ett ångfyllt, kvävgasfritt utrymme. Isoteniskopet placeras sedan i ett bad med konstant tem ­
peratur och kvävgastrycket justeras tills det är lika högt som provets 
tryck. Vid jämvikt är kvävgastrycket lika högt som ämnets ångtryck.
 
Figur 4
  
För fasta ämnen används manometervätskor som silikoner och ftala ­
ter. Valet av manometervätska beror på de aktuella tryck- och tem ­
peraturintervallen. Manometervätskan, från vilken gaser drivits av, placeras i en utbuktning på isoteniskopets längre arm. Det fasta ämne som ska undersökas placeras sedan i provkolven och gaser 
drivs av vid hög temperatur. Därefter lutas isoteniskopet så att ma ­
nometervätskan kan flöda in i U-röret.
 ▼M1 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 39
 
1.5.4  Effusionsmetod: ångtrycksjämvikt  (7) 
1.5.4.1  Princip  
Ett prov av det ämne som ska testas värms upp i en liten ugn och 
placeras i en evakuerad glaskupa. Ugnen täcks med ett lock med små 
hål av kända diametrar. Den ånga som avges från ämnet och som 
sipprar ut genom ett av hålen riktas mot vågskålen på en ytterst känslig våg som också befinner sig i den evakuerade glaskupan. I vissa försöksuppställningar omges vågskålen av en kyllåda, varifrån 
värme avleds till utsidan genom värmeledning, och kyls genom 
strålning så att den ånga som sipprar ut kondenserar på vågskålen. Ångstrålens rörelsemängd agerar som en kraft på 
vågen. Ångtrycket kan bestämmas på två sätt: antingen direkt från 
den kraft som utövas på vågskålen eller från avdunstningshastigheten enligt Hertz-Knudsens ekvation (2):
 
p ¼ G ﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃ  
2πRT Ü 10  3 
M s 
där: 
G = avdunstningshastigheten (kg s  –1 m –2 ) 
M = molmassan (g mol  –1 ) 
T = temperaturen (K) 
R = den allmänna gaskonstanten (J mol  –1 K –1 ) 
P = ångtrycket (Pa) 
Det rekommenderade tryckintervallet är 10  –3 till 1 Pa.  
1.5.4.2  Utrustning  
Den allmänna principen för utrustningen illustreras i figur 5.  
Figur 5
  
A: Bottenplatta F: Kyllåda och kylstav 
B: Vridspoleinstrument G: Förångningsugn 
C: Glaskupa H: Termos med flytande kväve D: Våg med vågskål I: Mätning av provets temperatur 
E: Vakuummätare J: Testsubstans
 ▼M1 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 40
 
1.5.5  Effusionsmetod: Knudsencell  
1.5.5.1  Princip  
Metoden grundas på en uppskattning av den massa av testsubstansen 
som per tidsenhet strömmar ut från en Knudsencell (8) i form av ånga genom en ytterst liten mynning under ultrahögt vakuum. Den avgivna ångans massa kan erhållas antingen genom att man bestäm ­
mer cellens massförlust eller genom att ångan kondenseras vid låg 
temperatur, varefter mängden förångat ämne bestäms med kromato ­
grafi. Ångtrycket beräknas med hjälp av Hertz-Knudsens ekvation (se avsnitt 1.5.4.1) med korrektionsfaktorer som beror på 
utrustningens parametrar (9). Det rekommenderade ångtrycksinterval ­
let är 10
 –10 till 1 Pa (10)(11)(12)(13)(14).  
1.5.5.2  Utrustning  
Den allmänna principen för utrustningen illustreras i figur 6.  
Figur 6
  
1: Anslutning till vakuum 7: Skruvlock 
2: Öppningar för resistanstermometer av 
platina eller för mätning och kontroll av temperatur 8: Vingmuttrar 
3: Lock till vakuumbehållare 9: Bultar 
4: O-ring 10: Effusionsceller av rostfritt stål 
5: Vakuumbehållare av aluminium 11: Värmepatron 6: Anordning för införande och borttagande 
av effusionsceller
 ▼M1 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 41
 
1.5.6  Effusionsmetod: isoterm termogravimetri  
1.5.6.1  Princip  
Metoden går ut på att testsubstansens påskyndade avdunstningshas ­
tigheter bestäms vid höga temperaturer och omgivningstryck med 
hjälp av termogravimetri (10)(15)(16)(17)(18)(19)(20). Avdunst ­
ningshastigheterna v  T är en följd av att man exponerar det valda 
ämnet för en långsamt strömmande inert gasatmosfär och registrerar viktförlusten vid kända isotermiska temperaturer T (i Kelvin) under 
lämpliga tidsperioder. Ångtrycket p
 T kan beräknas utifrån v  T -värdena 
genom att man utnyttjar det linjära förhållandet mellan logaritmen av ångtrycket och logaritmen av avdunstningshastigheten. Vid behov 
kan resultaten extrapoleras till temperaturer på 20 och 25 °C genom 
regressionsanalys av log p
 T som en funktion av 1/T. Den här meto ­
den lämpar sig för ämnen med ångtryck som är så låga som 10  –10 Pa 
(10 –12 mbar) och med en renhet på nära 100 % för att undvika 
feltolkning av de uppmätta viktförlusterna.  
1.5.6.2  Utrustning  
Den allmänna principen för försöksuppställningen visas i figur 7.  
Figur 7
  
Provplattan, som hänger på en mikrovåg i en temperaturkontrollerad 
kammare, spolas med en kvävgasström som för bort förångade mo ­
lekyler av testsubstansen. När gasströmmen kommer ut från kamma ­
ren renas den i en sorptionsenhet.  
1.5.6.3  Förfarande  
Testsubstansen appliceras i ett jämnt skikt på en uppruggad glasplat ­
ta. Fasta ämnen löses i lämpligt lösningsmedel och lösningen appli ­
ceras i ett jämnt skikt på plattan, som sedan får torka i en inert atmosfär. Vid mätningen hängs den belagda plattan upp i den ter ­
mogravimetriska analysatorn och viktförlusten mäts kontinuerligt 
som en funktion av tiden.
 ▼M1 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 42
 
Avdunstningshastigheten v  T vid en given temperatur beräknas utifrån 
provplattans viktförlust Δm enligt följande formel:  
v T ¼ Δm 
F Ö t gcm  –2 h –1 Ê Ì  
där F är det applicerade testsubstansens ytarea (normalt densamma 
som provplattans ytarea) och t är den tid under vilken viktförlusten Δm registreras. 
Ångtrycket p
 T kan sedan beräknas som en funktion av avdunstnings ­
hastigheten v  T : 
Log p  T = C + D log v  T 
där C och D är konstanter som är specifika för den använda försöks ­
uppställningen och som beror på mätkammarens temperatur och på 
gasflödeshastigheten. Dessa konstanter måste bestämmas genom mät ­
ning av ett antal föreningar med känt ångtryck och regression av log p
 T som en funktion av log v  T (11)(21)(22). 
Förhållandet mellan ångtrycket p  T och temperaturen T i Kelvin er ­
hålls genom följande formel: 
Log p  T = A + B 1/T 
där A och B är konstanter som erhålls genom regression av log p  T 
som en funktion av 1/T. Med hjälp av denna formel kan ångtrycket 
beräknas för vilken annan temperatur som helst genom extrapolering.  
1.5.7  Gasmättnadsmetod  (23)  
1.5.7.1  Princip  
Inert gas vid rumstemperatur och med känd flödeshastighet leds 
genom eller över ett prov av testsubstansen, så långsamt att gasen mättas. Det är ytterst viktigt att uppnå mättnad i gasfasen. Den sub ­
stans som transporteras med gasen samlas upp, vanligen med hjälp 
av en adsorbent, och mängden bestäms. Som ett alternativ till upp ­
samling av ånga och efterföljande analys kan en metod för direkt ­
analys, t.ex. gaskromatografi, användas för kvantitativ bestämning av den mängd ämne som transporteras. Beräkningen av ångtrycket grun ­
das på antagandet att allmänna gaslagen gäller och att det totala 
trycket i en gasblandning är lika med summan av de ingående ga ­
sernas tryck. Testsubstansens deltryck, dvs. ångtryck, beräknas ut ­
ifrån den kända totala gasvolymen och utifrån det transporterade 
materialets vikt. 
Gasmättnadsmetoden kan användas för både fasta och flytande äm ­
nen. Den kan användas för ångtryck ned till 10
 –10 Pa (10)(11)(12) ­
(13)(14), men är mest tillförlitlig för ångtryck under 10  3 Pa. Vid 
högre tryck än 10  3 Pa överskattas vanligen ångtrycket, troligen be ­
roende på aerosolbildning. Eftersom ångtrycket mäts vid rumstem ­
peratur är det inte nödvändigt att extrapolera data från mätningar som görs vid höga temperaturer. Sådan extrapolering kan annars ge upphov till stora fel.
 
1.5.7.2  Utrustning  
I den här metoden används en behållare med konstant temperatur. 
Teckningen i figur 8 visar en behållare innehållande sex provhållare – tre för fasta prover och tre för flytande prover – så att man sam ­
tidigt kan göra tre analyser av antingen ett fast eller flytande prov. 
Temperaturvariationen får vara högst ± 0,5 °C.
 ▼M1 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 43
 
Figur 8
  
Vanligen används kväve som inert bärgas, men ibland kan det vara 
nödvändigt att använda en annan gas (24). Bärgasen måste vara torr. Gasströmmen delas upp i sex delströmmar med hjälp av nålventiler 
(med en öppning på ca 0,79 mm) och leds in i behållaren genom ett 
kopparrör med 3,8 mm innerdiameter. När en jämn temperatur upp ­
nåtts leds gasen genom provet och adsorbentfällan och därefter ut ur behållaren. 
Fasta prover laddas i glasrör med 5 mm innerdiameter som försluts 
med glasull i båda ändarna (se figur 9). I figur 10 visas en hållare 
och ett adsorbentsystem för flytande prover. Den mest reproducer ­
bara metoden för att mäta vätskors ångtryck är att belägga glaspärlor eller en inert adsorbent såsom kiseldioxid med vätskan och att packa 
hållaren med dessa kulor eller denna adsorbent. Alternativt kan man 
låta bärgasen passera genom grov fritta och bubbla genom en kolonn av den flytande testsubstansen.  
Figur 9
 Figur 10
  ▼M1 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 44
 
Adsorbentröret har två delar som är fyllda med adsorbent – en 
främre del och en bakre del som fungerar som reserv. Vid mycket 
låga ångtryck fångas endast små mängder av testsubstansen upp på adsorbenten. Adsorptionen i glasullen och på glasrörets väggar mel ­
lan provet och adsorbenten kan då utgöra ett stort problem. 
Fällor som kyls med kolsyreis är ett annat effektivt sätt att samla upp 
förångad substans. De ger inte något baktryck på mättningskolonnen och det är också lättare att avlägsna det uppfångade materialet kvan ­
titativt från kylfällan.
 
1.5.7.3  Förfarande  
Den utgående bärgasens flödeshastighet mäts vid rumstemperatur. 
Flödeshastighten måste kontrolleras ofta under försökets gång för att säkerställa att det finns ett korrekt värde för hela bärgasvolymen. 
Kontinuerlig mätning med en massflödesmätare är att föredra. Det 
kan krävas en lång kontakttid och följaktligen relativt låga flödes ­
hastigheter för att uppnå mättnadskoncentration i gasfasen (25). 
I slutet av försöket analyseras de båda delarna av adsorbenten var för 
sig. Den adsorberade substansen i vardera delen av adsorbentröret desorberas genom extraktion med lösningsmedel. De resulterande lösningarna analyseras kvantitativt för att bestämma vikten på den 
substans som desorberas från varje del av röret. Valet av analys ­
metod (liksom valet av adsorbent och lösningsmedel för extraktio ­
nen) beror på vilken typ av testsubstans det är fråga om. Desorp ­
tionseffektiviteten bestäms genom att man injicerar en känd mängd 
av testsubstans på adsorbenten, desorberar den och analyserar den 
desorberade mängden. Det är viktigt att kontrollera desorptionseffek ­
tiviteten vid samma eller liknande koncentration som provets kon ­
centration och under samma försöksbetingelser. 
För att försäkra sig om att bärgasen är mättad med testsubstansen 
används tre olika gasflödeshastigheter. Om det beräknade ångtrycket är konstant vid olika flödeshastigheter antas gasen vara mättad. 
Ångtrycket beräknas enligt följande formel:
 
p ¼ W 
V Ü RT 
M 
där: 
p = ångtrycket (Pa) 
W = den avdunstade testsubstansens massa (g) 
V = den mättade gasens volym (m  3 ) 
R = den allmänna gaskonstanten, dvs. 8,314 (J mol  –1 K –1 ) 
T = temperaturen (K) 
M = testsubstansens molmassa (g mol  –1 ) 
De uppmätta volymerna måste korrigeras för tryck- och temperatur ­
skillnader mellan flödesmätaren och mättningskolonnen.  ▼M1 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 45
 
1.5.8  Rotormetod  
1.5.8.1  Princip  
I den här metoden används en viskositetsmätare bestående av en 
rotor, där mätelementet utgörs av en liten stålkula som svävar i ett 
magnetfält och sätts i rörelse genom roterande fält (26)(27)(28). Kulans rotationshastighet kan mätas med hjälp av detektorspolar. När kulan har nått en viss rotationshastighet, vanligen omkring 
400 varv per sekund, avbryts energitillförseln och gasfriktionen bör ­
jar bromsa kulans rotation. Minskningen av rotationshastigheten mäts som en funktion av tiden. Ångtrycket bestäms utifrån stålkulans 
tryckberoende avsaktning. Det rekommenderade ångtrycksintervallet 
är 10
 –4 till 0,5 Pa.  
1.5.8.2  Utrustning  
En schematisk ritning av försöksuppställningen visas i 
figur 11. Mäthuvudet placeras i en inneslutning som hålls vid kon ­
stant temperatur, reglerad inom 0,1 °C. Provbehållaren placeras i en separat inneslutning, även den reglerad inom 0,1 °C. För att för ­
hindra kondensation hålls alla andra delar av försöksuppställningen 
vid högre temperatur. Hela utrustningen ansluts till ett vakuum ­
system.
 
Figur 11
  
2. DATA OCH RAPPORTERING  
2.1 DATA 
Ångtrycket ska bestämmas med en av de ovan beskrivna metoderna 
och vid minst två temperaturer. För att kontrollera ångtryckskurvans linjäritet är det önskvärt med tre eller fler bestämningar i intervallet 
0–50 °C. För effusionsmetoden (Knudsencell och isoterm termogra ­
vimetri) och gasmättnadsmetoden rekommenderas att temperaturen varieras inom intervallet 120–150 °C i stället för 0–50 °C.
 
2.2 TESTRAPPORT 
Testrapporten ska omfatta följande information: 
— Använd metod.  ▼M1 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 46
 
— Exakt angivelse av ämnet (beteckning och orenheter) och even ­
tuella inledande reningssteg. 
— Minst två ångtrycks- och temperaturvärden – helst tre eller fler – 
i området 0–50 °C (eller 120–150 °C), 
— Minst ett av temperaturvärdena bör vara 25 °C eller lägre om 
detta är tekniskt möjligt med den valda metoden. 
— Alla rådata. 
— En kurva över log p som funktion av 1/T. 
— En uppskattning av ångtrycket vid 20 eller 25 °C. 
Om en förändring (ändring av aggregationstillstånd eller nedbryt ­
ning) noteras ska följande uppgifter anges: 
— Förändringens art. 
— Temperatur vid vilken förändringen inträffar vid atmosfäriskt 
tryck. 
— Ångtryck 10 och 20 °C under den temperatur där förändringen 
inträffar samt 10 och 20 °C över denna temperatur (såvida över ­
gången inte sker från fast form till gasform). 
Alla uppgifter och anmärkningar som kan ha betydelse för tolk ­
ningen av resultaten ska rapporteras, särskilt vad gäller orenheter 
och ämnets aggregationstillstånd.  
3. LITTERATUR  
1. Europeiska gemenskapernas officiella tidning  L 383 A, s. 
26–47 (1992). 
2. Ambrose, D. (1975). Experimental Thermodynamics, Vol. II, 
Le Neindre, B. och Vodar, B., red., Butterworths, London. 
3. Weissberger R., red. (1959). Technique of Organic Chemistry, 
Physical Methods of Organic Chemistry, 3.e uppl., vol. I, del I. 
kapitel IX, Interscience Publ., New York. 
4. Glasstone, S. (1946). Textbook of Physical Chemistry, 2:a 
uppl., Van Nostrand Company, New York. 
5. NF T 20–048 AFNOR (september 1985). Chemical products 
for industrial use – Determination of vapour pressure of solids 
and liquids within a range from 10  –1 to 10  5 Pa – Static met ­
hod. 
6. ASTM D 2879–86, Standard test method for vapour pressure – 
temperature relationship and initial decomposition temperature 
of liquids by isoteniscope. 
7. NF T 20–048 AFNOR (september 1985). Chemical products 
for industrial use – Determination of vapour pressure of solids 
and liquids within range from 10  –3 to 1 Pa – Vapour pressure 
balance method.  ▼M1 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 47
 
8. Knudsen, M. (1909). Ann. Phys. Lpz., 29, s. 1979; (1911), 34, 
s. 593. 
9. Ambrose, D., Lawrenson, I.J., Sprake, C.H.S. (1975). J. Chem. 
Thermodynamics 7, s. 1173. 
10. Schmuckler, M.E., Barefoot, A.C., Kleier, D.A., Cobranchi, 
D.P. (2000), Vapor pressures of sulfonylurea herbicides; Pest 
Management Science 56, s. 521–532. 
11. Tomlin, C.D.S. (red.), The Pesticide Manual, 12:e uppl. 
(2000). 
12. Friedrich, K., Stammbach, K., Gas chromatographic determi ­
nation of small vapour pressures determination of the vapour 
pressures of some triazine herbicides. J. Chromatog. 16 (1964), 
s. 22–28. 
13. Grayson, B.T., Fosbraey, L.A., Pesticide Science 16 (1982), s. 
269–278. 
14. Rordorf, B.F., Prediction of vapor pressures, boiling points and 
enthalpies of fusion for twenty-nine halogenated dibenzo-p-di ­
oxins, Thermochimia Acta 112 Issue 1 (1987), s. 117–122. 
15. Gückel, W., Synnatschke, G., Ritttig, R., A Method for Deter ­
mining the Volatility of Active Ingredients Used in Plant Pro ­
tection; Pesticide Science 4 (1973) s. 137–147. 
16. Gückel, W., Synnatschke, G., Ritttig, R., A Method for Deter ­
mining the Volatility of Active Ingredients Used in Plant Pro ­
tection II. Application to Formulated Products; Pesticide Sci ­
ence 5 (1974), s. 393–400. 
17. Gückel, W., Kaestel, R., Lewerenz, J., Synnatschke, G., A 
Method for Determining the Volatility of Active Ingredients 
Used in Plant Protection. Del III: The Temperature Relations ­
hip between Vapour Pressure and Evaporation Rate; Pesticide Science 13 (1982) s. 161–168. 
18. Gückel, W., Kaestel, R., Kroehl, T., Parg, A., Methods for 
Determining the Vapour Pressure of Active Ingredients Used in Crop Protection. Del IV: An Improved Thermogravimetric Determination Based on Evaporation Rate; Pesticide Science 
45 (1995) s. 27–31. 
19. Kroehl, T., Kaestel, R., Koenig, W., Ziegler, H., Koehle, H., 
Parg, A., Methods for Determining the Vapour Pressure of Active Ingredients Used in Crop Protection. Del V: Thermog ­
ravimetry Combined with Solid Phase MicroExtraction 
(SPME); Pesticide Science 53 (1998) s. 300–310. 
20. Tesconi, M., Yalkowsky, S.H., A Novel Thermogravimetric 
Method for Estimating the Saturated Vapor Pressure of Low- Volatility Compounds; Journal of Pharmaceutical Science 87 ­
(12) (1998) s. 1512–1520. 
21. Lide, D.R. (ed.), CRC Handbook of Chemistry and Physics, 
81:a uppl. (2000), Vapour Pressure in the Range -25 °C to 150 °C. 
22. Meister, R.T. (red.), Farm Chemicals Handbook, vol. 
88 (2002) 
23. 40 CFR, 796. (1993). s 148–153, Office of the Federal Register, 
Washington DC.
 ▼M1 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 48
 
24. Rordorf B.F. (1985). Thermochimica Acta 85, s. 435. 
25. Westcott m.fl. (1981). Environ. Sci. Technol. 15, s. 1375. 26. Messer G., Röhl, P., Grosse G., och Jitschin W. (1987). J. Vac. 
Sci. Technol. (A), 5(4), s. 2440. 
27. Comsa G., Fremerey J.K. och Lindenau, B. (1980). J. Vac. Sci. 
Technol. 17(2), s. 642. 
28. Fremerey, J.K. (1985). J. Vac. Sci. Technol. (A), 3(3), s. 1715.
 ▼M1 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 49
 
Tillägg  
Uppskattningsmetod  
INLEDNING 
Uppskattade värden på ångtrycket kan användas för att 
— bestämma vilken försöksmetod som är lämplig, — göra en uppskattning eller fastställa ett gränsvärde när det av tekniska skäl 
inte är möjligt att använda någon av försöksmetoderna.
 
UPPSKATTNINGSMETOD 
Vätskors och fasta ämnens ångtryck kan uppskattas genom användning av den 
modifierade Watson-korrelationen (a). De enda experimentella data som behövs är den normala kokpunkten. Metoden kan användas i ett tryckintervall från 10
 5 Pa till 10  –5 Pa. 
Närmare information om metoden finns i ”Handbook of Chemical Property 
Estimation Methods” (b). Se även OECD Environmental Monograph nr 67 (c).  
BERÄKNINGSFÖRFARANDE 
Ångtrycket beräknas enligt följande formel:  
lnP vp ≈ ΔH vb 
ΔZ b RT b 1 – 3 – 2  T 
T b Í Î  m 
T 
T b – 2m 3 – 2  T 
T b Í Î  m – 1 
ln T 
T b 2 
6 6 4 3 
7 7 5
 
där: 
T = den aktuella temperaturen T
 b = den normala kokpunkten 
P VP = ångtrycket vid temperaturen T 
ΔH Vb = ångbildningsvärmet 
ΔZ b = kompressionsfaktor (uppskattad till 0,97) 
m = empirisk faktor som beror på ämnets aggregationstillstånd och på den 
aktuella temperaturen. 
Dessutom gäller att  
ΔH vb 
T b ¼ K F ð8; 75 þ R ln T b Þ 
där K  F är en empirisk faktor som tar hänsyn till ämnets polaritet. I hänvisning b 
finns det en förteckning med K  F -faktorer för olika typer av föreningar.  ▼M1 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 50
 
Det är ganska vanligt med data som anger kokpunkten vid sänkt tryck. I sådana 
fall beräknas ångtrycket enligt följande formel:  
ln P vp ≈ lnP 1 þ ΔH v1 
ΔZ b RT 1 1 – 3 – 2  T 
T 1 Í Î  m T 1 
T – 2m 3 – 2  T 
T 1 Í Î  m – 1 
ln T 
T 1 " #  
där T  1 är kokpunkten vid det lägre trycket P  1 . 
RAPPORT 
När uppskattningsmetoden används ska rapporten omfatta en detaljerad redovis ­
ning av beräkningen.  
LITTERATUR 
a) Watson, K.M. (1943). Ind. Eng. Chem, 35, s. 398. 
b) Lyman, W.J., Reehl, W.F., Rosenblatt, D.H. (1982). Handbook of Chemical 
Property Estimation Methods, McGraw-Hill. 
c) OECD Environmental Monograph nr. 67. Application of Structure-Activity 
Relationships to the Estimation of Properties Important in Exposure Assess ­
ment (1993).  ▼M1 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 51
 
A.5 YTSPÄNNING  
1. METOD  
De beskrivna metoderna är baserade på OECD:s riktlinjer för under ­
sökning av kemikalier (se hänvisning 1). Grundprinciperna anges i 
hänvisning 2.  
1.1 INLEDNING 
De beskrivna metoderna används för matning av ytspänningen hos 
vattniga lösningar. 
Vid utförande av dessa test är det värdefullt att ha förhandskunskap 
om ämnets löslighet i vatten, dess struktur, hydrolysegenskaper och kritiska koncentrationer för micellbildning. 
Följande metoder kan tillämpas på de flesta kemiska ämnen, oavsett 
renhetsgrad. 
Mätning av ytspänning med ringtensiometermetoden är begränsad 
till vattniga lösningar med en dynamisk viskositet på mindre än 
200 m Pa s.
 
1.2 DEFINITIONER OCH ENHETER 
Den fria entalpinytan per ytareaenhet betecknas som ytspänning. 
Ytspänningen anges som: 
N/m (SI-enhet) eller 
mN/m (SI-underenhet). 1 N/m = 10
 3 dyn/cm 
1 mN/m = dyn/cm i det gamla cgs-systemet.  
1.3 REFERENSÄMNEN 
Man behöver inte använda referensämnen varje gång ett nytt ämne 
ska undersökas. Referensämnen ska först och främst användas för att 
då och då kontrollera metoden och för jämförelse med resultat som 
uppnåtts med andra metoder. 
I hänvisningarna 1 och 3 anges referensämnen som täcker ett stort 
antal ytspänningar.  
1.4 TESTMETODSPRINCIPER 
Metoderna är baserade på mätning av den största kraft som ska 
utövas vertikalt på en bygel eller ring i kontakt med vätskeytan av ett prov som ska undersökas i ett mätkärl för att bryta denna kontakt, 
eller den vertikala kraft som behöver utövas på en platta vars ena 
kant har kontakt med vätskeytan, för att lösgöra film som har bildats. 
Ämnen vars löslighet i vatten är minst 1 mg/liter testas i en vattnig 
lösning vid en enda koncentration.
 
1.5 KVALITETSKRITERIER 
Dessa metoder kan ge större noggrannhet än vad som kan förväntas 
krävas vid miljöbetingade undersökningar.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 52
 
1.6 METODBESKRIVNING 
En lösning av ämnet framställs i destillerat vatten. Koncentrationen 
av denna lösning ska vara 90 % av ämnets mättnadskoncentration i vatten. Om denna koncentration är större än 1 g/1 används en kon ­
centration av 1 g/l för testet. Ämnen med en löslighet i vatten på 
mindre än 1 mg/l behöver inte testas.
 
1.6.1  Plattmetoden  
Se ISO-304 och NF T 73-060 (Surface active agents – determination 
of surface tension by drawing up liquid films).  
1.6.2  Bygelmetoden  
Se ISO 304 och NF T 73-060 (Surface active agents – determination 
of surface tension by drawing up liquid films).  
1.6.3  Ringmetoden  
Se ISO 304 och NF T 73-060 (Surface active agents – determination 
of surface tension by drawing up liquid films).  
1.6.4  OECD-harmoniserad ringmetod  
1.6.4.1  Apparatur  
Denna mätning kan göras med kommersiellt tillgängliga tensiometrar 
och består av följande delar: 
— flyttbart provbord, 
— kraftmätningssystem, — mätkropp (ring), 
— mätkärl.
 
1.6.4.1.1 F l y t t b a r t p r o v b o r d 
Det flyttbara provbordet används som stöd till det temperaturregle ­
rade mätkärl som innehåller den vätska som ska undersökas. Det är 
monterat på ett stativ tillsammans med kraftmätningssystemet.  
1.6.4.1.2 K r a f t m ä t n i n g s s y s t e m 
Kraftmätningssystemet (se figur) är placerat över provbordet. Osä ­
kerheten vid kraftmätningen får inte vara större än ± 10-  6 N, mot­
svarande en felmarginal på ± 0,1 mg viktmätning. Oftast är mät ­
skalan på kommersiellt tillgängliga tensiometrar indelad i mN/m så 
att ytspänningen kan avläsas direkt i mN/m med en noggrannhet på 
0,1 mN/m.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 53
 
1.6.4.1.3 M ä t k r o p p ( r i n g ) 
Ringen är vanligtvis gjord av en tråd av platina-indium, ungefär 
0,4 mm tjock och med en medelomkrets på 60 mm. Trådringen är 
upphängd horisontellt på en metallstång och en bärarm av tråd, som utgör anslutningen till kraftmätningssystemet (se figur).
 
Figur  
Mätkropp  
(Alla mått är angivna i mm)
  
1.6.4.1.4 M ä t k ä r l 
Mätkärlet som innehåller den testlösning som ska mätas ska vara ett 
temperaturreglerat glaskärl. Det ska vara så utformat att temperaturen på provlösningen och på gasfasen ovanför dess yta förblir konstant 
under mätningen så att provet inte kan avdunsta. Cylindriska glaskärl 
med en innerdiameter på minst 45 mm kan användas.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 54
 
1.6.4.2  Iordningställande av apparaturen  
1.6.4.2.1 R e n g ö r i n g 
Glaskärl ska rengöras noggrant. Vid behov ska de diskas med varm 
kromsvavelsyra och därefter med tjockflytande fosforsyrelösning (83–98 % per vikt H
 3 PO 4 ), sedan noggrant sköljas i kranvatten 
och slutligen diskas i omdestillerat vatten tills en neutral reaktion 
erhålls. Slutligen ska de torkas eller sköljas med en del av den 
provvätska som ska mätas. 
Ringen ska först sköljas noggrant i vatten för att avlägsna eventuella 
vattenlösliga ämnen. Därefter ska den nedsänkas hastigt i kroms ­
vavelsyra, tvättas i omdestillerat vatten tills en neutral reaktion er ­
hålls och slutligen upphettas hastigt över en metanollåga.  
Anmärkning:  
Förorening med ämnen som inte löses eller förstörs av kromsvavel ­
syra eller fosforsyra, t.ex. silikonpreparat, ska avlägsnas med hjälp av 
lämpligt organiskt lösningsmedel.  
1.6.4.2.2 K a l i b r e r i n g a v a p p a r a t e n 
Kalibreringen av apparaten består i att nollpunkten kontrolleras och 
justeras så att instrumentets indikering medger en tillförlitlig avläs ­
ning i mN/m.  
Montering;  
Apparaten ska planriktas, t.ex med användning av ett vattenpass på 
tensiometerns fot, varefter nivåskruvarna på foten justeras.  
Nollpunktsjustering:  
När ringen har monterats på apparaten men innan den nedsänks i 
vätskan, ska tensiometerindikeringen justeras till noll och ringen 
kontrolleras så att den är parallell med vätskeytan. För detta ändamål kan vätskeytan användas som spegel.
 
Kalibreringar:  
Själva provkalibreringen kan utföras genom en av följande två me ­
toder: 
a) Användning av en vikt: detta är ett förfarande där ryttare av känd 
vikt mellan 0,1 och 1,0 g placeras på ringen. Kalibreringsfaktorn Φ
 a , med vilken alla instrumentavläsningar ska multipliceras, be ­
stäms enligt följande ekvation (se hänvisning 1):  
Φ a ¼ σ r 
σ a (1) 
där: 
σ r ¼ mg 
2b (mN/m) 
m = ryttarens vikt (g) 
g = tyngdaccelerationen (981 cm s-  2 vid havsytan) 
b = ringens medelomkrets (cm) σ
 4 = tensiometeravläsningen efter placering av ryttaren på 
ringen (mN/m).  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 55
 
b) Användning av vatten: detta är ett förfarande där det används rent 
vatten vars ytspänning vid, t.ex. 23  o C, är lika med 72,3 mN/m. 
Denna metod är snabbare att utföra än viktkalibreringen men risken finns alltid att vattnets ytspänning har ändrats genom fö ­
rorening av ytaktiva substanser. 
Kalibreringsfaktorn Φ
 b med vilken alla instrumentavläsningar ska 
multipliceras, bestäms enligt följande ekvation (2):  
Φ b ¼ σ o 
σ g (2) 
där: 
σ o = i litteraturen angivet värde för vattens ytspänning (mN/m) 
σ g = mätt värde för vattnets ytspänning (mN/m) båda vid 
samma temperatur.  
1.6.4.3  Iordningställande av prov  
Vattniga lösningar framställs med passande koncentrationer av de 
ämnen som ska undersökas. Lösningarna får inte innehålla några olösta ämnen. 
Lösningarna ska hållas vid en konstant temperatur (± 0,5
 o C). Efter­
som en lösnings ytspänning i mätkärlet ändras med tiden ska flera mätningar göras vid olika tidpunkter och en kurva ritas över yts ­
pänning som en funktion av tiden. När ytspänningen inte längre 
ändras har ett jämviktstillstånd uppnåtts. 
Damm och gasformig förorening av andra ämnen påverkar mätning ­
en. Arbetet ska därför utföras under en skyddskåpa.
 
1.6.5  Testbetingelser  
Mätningen ska göras vid ungefär 20  o C och hållas inom ± 0,5  o C. 
1.6.6  Testförfarande  
De lösningar som ska mätas fylls i det noggrant rengjorda kärlet 
varvid skumbildning ska undvikas. Mätkärlet placeras på apparatens provbord. Bordsytan med mätkärlet ska höjas tills ringen är helt 
nedsänkt i den lösning som ska mätas. Därefter ska bordsytan sänkas 
gradvis och jämt (med en hastighet av ungefär 0,5 cm/min) för att lösgöra ringen från ytan tills den största kraften har uppnåtts. Det vätskelager som vidhäftar ringen får inte avlägsnas från ringen. När 
mätningen är gjord ska ringen åter nedsänkas helt i lösningen och 
mätningen upprepas till dess att ett konstant ytspänningsvärde er ­
hålls. Den tid som går åt från överföring av lösningen till mätkärlet och tills mätningen görs ska antecknas för varje bestämning. Avläs ­
ningar ska göras vid den största kraft som behövs för att lösgöra 
ringen från vätskans yta.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 56
 
2. DATA  
För att beräkna ytspänningen ska det på apparaten i mN/m avlästa 
värdet först multipliceras med kalibreringsfaktor Φ a , eller Φ b (bero­
ende på vilken kalibreringsmetod som används). Detta ger endast ett 
ungefärligt värde som ska korrigeras. 
Harkins och Jordan (se hänvisning 4) har empiriskt bestämt korrek ­
tionsfaktorer för ytspänningsvärden som är bestämda med ringmeto ­
den. Dessa faktorer är beroende av ringens mått, vätskans densitet 
och dess ytspänning. 
Eftersom det är besvärligt att för varje enskild mätning bestämma 
korrektionsfaktorn utifrån Harkins och Jordans tabeller, kan man vid 
beräkning av ytspänningen hos vattenlösningar använda den förenk ­
lade metoden att avläsa de korrigerade ytspänningsvärdena direkt i tabellen. (Interpolation ska användas för avläsningar som ligger mel ­
lan tabellvärdena.)
 
Tabell  
Korrektion av den mätta ytspänningen  
Endast för vattniga lösningar, ρ = 1 g/cm  3 
r 9,55 mm (genomsnittlig ringradie) 
r 0,185 mm (ringtrådens radie)  
Experimentellt värde (mN/m) Korrigerat värde (mN/m) 
Viktkalibrering (se 1.6.4.2.2 a) Vattenkalibrering (se 1.6.4.2.2 b)  
20 16,9 18,1 
22 18,7 20,1 24 20,6 22,1 
26 22,4 24,1 
28 24,3 26,1 30 26,2 28,1 32 28,1 30,1 34 29,9 32,1 36 31,8 34,1 38 33,7 36,1 40 35,6 38,2 42 37,6 40,3 44 39,5 42,3 46 41,4 44,4 48 43,4 46,5 
50 45,3 48,6 
52 47,3 50,7 54 49,3 52,8 56 51,2 54,9
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 57
 
Experimentellt värde (mN/m) Korrigerat värde (mN/m) 
Viktkalibrering (se 1.6.4.2.2 a) Vattenkalibrering (se 1.6.4.2.2 b)  
58 53,2 57,0 
60 55,2 59,1 62 57,2 61,3 64 59,2 63,4 
66 61,2 65,5 
68 63,2 67,7 70 65,2 69,9 72 67,2 72,0 74 69,2 — 76 71,2 — 78 73,2 — 
Denna tabell är utarbetat efter Harkins-Jordans korrektion och liknar 
den som finns i DIN-standarden (DIN 53914) för vatten och vattniga 
lösningar (densitet p = 1 g/cm
 3 ) och är avsedd för en kommersiellt 
tillgänglig ring med mitten R = 9,55 mm (genomsnittlig ringradie) och r = 0,185 mm (ringtrådens radie). Tabellen ger korrigerade värden för ytspänning som mätts efter kalibrering med vikt eller 
vatten. 
Alternativt kan ytspänningen utan föregående kalibrering beräknas 
enligt följande formel:
 
σ ¼ f Ü F 
4πR 
där: 
F = kraften mätt på dynamometern när hinnan bryts 
R = ringens radie f = korrektionsfaktorn (se hänvisning 1)
 
3. RAPPORTERING  
3.1 TESTRAPPORT 
Testrapporten ska om möjligt innehålla minst följande uppgifter: 
— Använd metod. — Använd typ av vatten eller lösning. 
— Exakt specificering av ämnet (beteckning och orenheter). 
— Mätresultat: ytspänning (avläsning) med uppgift om både en ­
skilda avläsningar och deras aritmetiska medelvärde och det kor ­
rigerade medelvärdet (med hänsyn tagen till apparaturfaktorn och 
korrektionstabellen).
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 58
 
— Lösningens koncentration. 
— Testtemperaturen. — Den använda lösningens ålder, särskilt tidsåtgången mellan fram ­
ställning och mätning av lösningen. 
— Beskrivning av ytspänningens tidsberoende efter överföring av 
lösningen till mätkärlet. 
— Alla uppgifter och upplysningar som är av betydelse för tolk ­
ningen av resultaten ska rapporteras, i synnerhet med avseende 
på orenheter och ämnets fysiska tillstånd.
 
3.2 TOLKNING AV RESULTAT 
Med tanke på att destillerat vatten har en ytspänning av 72,75 mN/m 
vid 20  o C anses ämnen med en ytspänning på mindre än 60 mN/m 
bestämd genom denna metod vara ytspänningsaktiva ämnen.  
4. HÄNVISNINGAR  
1. OECD, Paris, 1981, Test Guideline 115, rådets beslut K(S1) 30 
slutligt. 
2. R. Weissberg ed.: Technique of Organic Chemistry, Physical 
Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Inter-science Publ., 
New York, 1959, vol. I, del I, kapitel XIV. 
3. Pure Appl. Chem., 1976, vol. 48, s. 511. 4. Harkins, W. D., Jordan, H. R, J. Amer. Chem. Soc, 1930, 
vol. 52, s. 1751.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 59
 
A.6 VATTENLÖSLIGHET  
INLEDNING 
1. Den här testmetoden motsvarar OECD:s testriktlinje (TG) 105 (1995). Den 
här testmetoden är en reviderad version av den ursprungliga TG 105 vilken antogs 1981. Det finns ingen skillnad i sak mellan nuvarande version och 
den från 1981. Huvudsakligen har utformningen ändrats. Ändringen basera ­
des på EU:s testmetod ”Vattenlöslighet” (
 1 ). 
INLEDANDE ÖVERVÄGANDEN 
2. Ett ämnes vattenlöslighet kan påverkas avsevärt av förekomsten av orenhe ­
ter. Den här testmetoden behandlar bestämningen av löslighet i vatten av i 
huvudsak rena ämnen som är stabila i vatten och inte flyktiga. Innan man kan göra en bestämning av vattenlöslighet är det användbart med några preliminära uppgifter om testämnet, såsom strukturformel, ångtryck, dissoca ­
tionskonstant och hydrolys som en funktion av pH. 
3. Två metoder finns beskrivna här: kolonnelueringsmetoden och kolvmetoden 
som täcker respektive löslighet under och över 10
 –2 g/l. Ett enkelt inledande 
test finns också beskrivet. Det anger det ungefärliga lämpliga antalet prov ­
tagningar för det slutliga testet, liksom den tid som åtgår för att uppnå 
mättnad.  
DEFINITIONER OCH ENHETER 
4. Ett ämnes löslighet i vatten är mättnadskoncentrationen av det ämnet i 
vatten vid en given temperatur. 
5. Vattenlöslighet uttrycks i mängden löst ämne per volym av lösningen. 
SI-enheten är kg/m  3 , men g/l kan också användas.  
REFERENSKEMIKALIER 
6. Referenskemikalier behöver inte användas vid undersökning av ett testämne.  
BESKRIVNING AV METODER  
Testbetingelser  
7. Testet ska helst utföras vid temperaturen 20 ± 0,5 °C. Den valda tempera ­
turen ska hållas konstant i utrustningens alla relevanta delar.  
Inledande test  
8. I ett stegvist förfarande ska ökande volymer vatten vid rumstemperatur till ­
sättas till ca 0,1 g av provet (fasta testämnen måste pulvriseras) i ett 10 ml mätglas med glaspropp. Blandningen skakas i 10 minuter efter varje tillsats av vatten och avsynas för eventuella oupplösta delar av provet. Om provet 
eller delar av det fortfarande inte är upplöst efter tillsats av 10 ml vatten ska 
försöket fortgå i ett 100 ml mätglas. Den ungefärliga lösligheten anges i
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 60
 
tabell 1 för den volym vatten där fullständig upplösning av provet sker. Det 
kan ta lång tid att lösa upp ett testämne när lösligheten är låg och minst 24 
timmar bör avsättas för det. Om testämnet efter 24 timmar fortfarande inte är upplöst bör man avsätta längre tid (upp till 96 timmar), eller mer späda ut mer för att kunna fastställa om kolonnelueringsmetoden eller kolvmetoden 
bör användas.
 
Tabell 1  
ml vatten för 0,1 g löslig 0,1 0,5 1 2 10 100 > 100 
Ungefärlig löslighet i g/l > 1 000 1 000 till 
200 200 till 
100 100 till 
50 50 till 10 10 till 1 < 1  
Kolonnelueringsmetoden  
Principen  
9. Den här metoden bygger på elueringen av ett testämne med vatten från en 
mikrokolonn laddad med ett inert bärämne, som tidigare belagts med ett överskott av testämnet (2). Vattenlösligheten ges av eluatets masskoncent ­
ration när denna har nått en platå som en funktion av tiden.
 
Utrustning  
10. Utrustningen består av en mikrokolonn (figur 1), som hålls i konstant tem ­
peratur. Den är antingen ansluten till en cirkulationspump (figur 2) eller ett nivåkärl (figur 3). Mikrokolonnen innehåller en inert bärare som hålls på plats av en liten plugg av glasull som också används för att filtrera partiklar. 
Material som kan användas som bärare är glaspärlor, kiselgur eller andra 
inerta material. 
11. Mikrokolonnen som visas i figur 1 är lämplig för uppställningen av cirku ­
lationspumpen. Den har ett gasutrymme för fem bäddvolymer (kasseras i början av försöket) och volym för fem prover (som tas bort för analys under 
försöket). Ett annat alternativ är att minska storleken om vatten kan tillsättas 
under försöket som ersättning för de fem första bäddvolymerna med or ­
enheter som har avlägsnats. Kolonnen är ansluten till cirkulationspumpen med ett rör tillverkat i ett inert material med en kapacitet på ca 25 ml/tim. 
Cirkulationspumpen kan t.ex. vara en peristaltisk pump eller en membran ­
pump. Försiktighet måste iakttas så att ingen förorening och/eller adsorption uppstår i rörmaterialet. 
12. Ett schematiskt arrangemang med ett nivåkärl visas i figur 3. I detta arran ­
gemang är mikrokolonnen försedd med en envägsventil. Anslutningen till 
nivåkärlet består av inslipad hals och rör tillverkat i ett inert material. 
Flödeshastigheten från nivåkärlet bör vara ca 25 ml/tim.
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 61
 
Figur 1
  
Dimensioner i mm 
A. Anslutning för inslipad hals 
B. Gasutrymme C. Inner 5 D. Ytter 19 
E. Plugg av glasull 
F. Envägsventil
 
Figur 2
  
A. Atmosfärisk jämvikt 
B. Flödesmätare 
C. Mikrokolonn D. Termostatreglerad cirkulationspump 
E. Cirkulationspump 
F. Tvåvägsventil för provtagning
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 62
 
Figur 3
  
A. Nivåkärl (t.ex. 2,5 liter kemisk kolv) 
B. Kolonn 
C. Fraktionsackumulator 
D. Termostat 
E. Teflonrör 
F. Inslipad hals 
G. Vattenlinje (mellan termostat och kolonn, innerdiameter ca 8 mm) 
13. Ca 600 mg bärämne överförs till en 50 ml rundbottnad kolv. En lämplig 
mängd av testämnet upplöses i ett flyktigt lösningsmedel av analytisk rea ­
genskvalitet och en lämplig volym av denna lösning tillsätts bärämnet. Lös ­
ningsmedlet avdunstas fullständigt, t.ex. med hjälp av en rotationsförångare, 
i annat fall uppnår bäraren ingen vattenmättnad under elueringssteget på 
grund av uppdelning på ytan. Det laddade bärämnet blötläggs två timmar i ca 5 ml vatten och suspensionen hälls i mikrokolonnen. Alternativt kan 
torrt laddat bärämne hällas i den vattenfyllda mikrokolonnen, och två tim ­
mar avsätts för ekvilibrering. 
14. Laddning av bärämnet kan ge problem som leder till felaktiga resultat, t.ex. 
om testämnet utfälls som en olja. Man bör se närmare på dessa problem och 
rapportera detaljerna.
 
Procedur vid användning av en cirkulationspump  
15. Flödet genom kolonnen startas. En flödeshastighet på ca 25 ml/tim rekom ­
menderas vilket motsvarar 10 bäddvolymer i timmen för den beskrivna kolonnen. För borttagning av vattenlösliga orenheter ska minst de fem första 
bäddvolymerna kasseras. Efter detta ska pumpen vara på tills jämvikt upp ­
nås, vilket definieras som fem successiva prov vilkas koncentrationer inte skiljer sig åt med mer än ± 30 % på ett slumpmässigt sätt. Proven bör vara skilda från varandra med ett tidsintervall som motsvarar genomströmningen 
av minst tio bäddvolymer. Beroende på den analysmetod som används upp ­
rättas en koncentrations-/tidskurva för att visa att jämvikt har uppnåtts.
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 63
 
Procedur vid användning av ett nivåkärl  
16. Successiva fraktioner av eluatet samlas in och analyseras med den valda 
metoden. Fraktioner av eluatet från mellanintervallet, där koncentrationerna 
är konstanta inom ± 30 % av minst fem successiva fraktioner, används för 
att fastställa lösligheten. 
17. Det föredragna eluatet är dubbeldestillerat vatten. Avjoniserat vatten med en 
resistivitet på över 10 megaohm/cm och ett totalt innehåll av organiskt kol lägre än 0,01 % kan också användas. 
18. För båda procedurerna utförs en andra omgång, med halverad flödeshastig ­
het jämfört med den första. Testet är lyckat om resultatet från de två om ­
gångarna överensstämmer. Om den uppmätta lösligheten är högre med den 
lägre flödeshastigheten, måste halveringen av flödeshastigheten fortsätta tills 
två successiva omgångar ger samma löslighet. 
19. I båda förfarandena ska fraktionerna kontrolleras beträffande förekomsten av 
kolloidalt material genom undersökning av Tyndalleffekten. Förekomsten av partiklar gör testet ogiltigt, och testet ska upprepas efter förbättringar av kolonnens filtrering. 
20. Varje provs pH mäts med särskilda indikatorremsor.
 
Kolvmetoden  
Principen  
21. Testämnet (fasta ämnen måste pulvriseras) löses upp i vatten vid en tempe ­
ratur som ligger strax över testtemperaturen. När mättnad har uppnåtts kyls 
blandningen och hålls vid testtemperaturen. Om man genom lämplig prov ­
tagning säkerställer att mättnadsjämvikt har uppnåtts kan mätningen utföras direkt vid testtemperaturen. Därefter bestäms masskoncentrationen av tes ­
tämnet i vattenlösningen, vilken inte får innehålla några olösta partiklar, 
genom en lämplig analysmetod (3).
 
Utrustning  
22. Följande material behövs: 
— Vanliga laboratorieglas och instrument. 
— En anordning för omskakning av lösningar vid kontrollerad, konstant 
temperatur. 
— En centrifug (företrädesvis termostatreglerad) om det behövs. — Analysutrustning.
 
Procedur  
23. Efter det inledande testet bestäms den nödvändiga mängden testämne som 
behövs för att mätta den önskade volymen vatten. Ungefär fem gånger den 
mängden vägs in i var och en av de tre glaskärlen utrustade med glasprop ­
par (t.ex. centrifugrör, kolvar). En volym vatten, som valts efter analysmetod och löslighetsintervall, tillsätts varje kärl. Kärlen försluts och skakas sedan vid 30 °C. Man bör använda en skak- eller omrörningsutrustning som kan 
hålla en konstant temperatur, t.ex. magnetisk omrörning i ett termostatregle ­
rat vattenbad. Efter en dag ekvilibreras ett av kärlen under 24 timmar vid testtemperaturen, med enstaka skakningar. Kärlets innehåll centrifugeras vid testtemperaturen, och koncentrationen av testämnet i den klara vattenfasen 
bestäms genom en lämplig analysmetod. De andra bägge kolvarna behandlas 
likartat efter en initial ekvilibrering vid 30 °C i två, respektive tre, dagar.
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 64
 
Testet är lyckat om den uppmätta koncentrationen i åtminstone två av de 
sista kärlen inte avviker med mer än 15 %. Om resultaten från kärl 1, 2 och 
3 visar ökande värden, bör hela testet göras om med längre ekvilibrerings ­
tider. 
24. Testet kan också utföras utan föregående inkubation vid 30 °C. För att 
uppskatta graden av etablering av mättnadsjämvikten tas prover tills omrör ­
ning inte längre påverkar de uppmätta koncentrationerna. 
25. Varje provs pH mäts med särskilda indikatorremsor.  
Analytiska bestämningar  
26. En ämnesspecifik metod är att föredra eftersom små mängder lösliga or ­
enheter kan orsaka stora fel i den uppmätta lösligheten. Exempel på sådana metoder är gas- eller vätskekromatografi, titrering, fotometri och voltametri.
 
DATA OCH RAPPORTERING  
Data  
Kolonnelueringsmetoden  
27. För varje omgång ska medelvärde och standardavvikelse beräknas från 
minst fem på varandra följande prov som tas från mättnadsplatån. De medel ­
värden som erhållits från två tester med olika flöden bör inte avvika med 
mer än 30 %.  
Kolvmetoden  
28. Medelvärdet beräknas för de individuella resultaten från var och en av de tre 
kolvarna, vilka inte bör avvika med mer än 15 %.  
Testrapport  
Kolonnelueringsmetoden  
29. Testrapporten måste innehålla följande information: 
— Resultat från det inledande testet. 
— Kemisk beteckning och orenheter (eventuellt inledande reningssteg). 
— Koncentrationer, flödeshastigheter och pH för varje prov. 
— Medelvärden och standardavvikelser från minst fem prov från mättnads ­
platån för varje omgång. 
— Medelvärdet av minst två successiva omgångar. 
— Temperaturen på vattnet under mättnadsförloppet. 
— Analysmetod. 
— Typ av bärämne. 
— Laddning av bärämnet. 
— Lösningsmedel som används. 
— Tecken på eventuell kemisk instabilitet hos ämnet under testet. 
— All information som är relevant för tolkningen av resultaten, särskilt med 
avseende på orenheter och fysikaliskt tillstånd hos testämnet.  ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 65
 
Kolvmetoden  
30. Testrapporten måste innehålla följande information: 
— Resultat från det inledande testet. — Kemisk beteckning och orenheter (eventuellt inledande reningssteg). — Enskilda analytiska bestämningar och medelvärde, om fler än ett värde 
fastställdes för varje kolv. 
— pH för varje prov. 
— Medelvärdet för olika kolvar vilka var i överensstämmelse. — Testtemperatur. — Analysmetod. — Tecken på eventuell kemisk instabilitet hos ämnet under testet. — All information som är relevant för tolkningen av resultaten, särskilt med 
avseende på orenheter och fysikaliskt tillstånd hos testämnet.
 
LITTERATUR  
(1) Kommissionens direktiv 92/69/EEG av den 31 juli 1992 om anpassning till 
tekniska framsteg för sjuttonde gången av rådets direktiv 67/548/EEG om 
tillnärmning av lagar och andra författningar om klassificering, förpackning 
och märkning av farliga ämnen, EGT L 383, 29.12.1992, s. 113–114. 
(2) NF T 20-045 (AFNOR) (september 1985). Kemiska produkter för industriell 
användning – Fastställande av vattenlöslighet för fasta ämnen och vätskor med låg löslighet – kolonnelueringsmetoden. 
(3) NF T 20-046 (AFNOR) (september 1985). Kemiska produkter för industriell 
användning – Fastställande av vattenlöslighet av fasta ämnen och vätskor med hög löslighet – kolvmetoden.
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 66
 
A.8 FÖRDELNINGSKOEFFICIENT  
1. METOD  
Den beskrivna ”skakkolvmetoden” är baserade på OECD:s riktlinjer 
för undersökning av kemikalier (se hänvisning 1).  
1.1 INLEDNING 
Vid utförande av detta test är det värdefullt att ha förhandskunskap 
om ämnets strukturformel, dissociationskonstant, hydrolys, löslighet i 
n-oktansyra och ytspänning. 
Mätningar på joniserbara ämnen utförs på den icke-joniserade for ­
men (fri syra eller fri bas), dvs. genom användning av en passande 
buffert med ett pH-värde av minst 1 enhet under (fri syra) eller över (fri bas) ämnets pK-värde. 
Testmetoden omfattar två särskilda förfaranden: skakkolvmetoden 
och högpresterande vätskekromatografi (HPLC). Den första metoden är användbar när värden av log P
 ow (se definitionerna nedan) ligger 
mellan - 2 och 4, och den andra metoden i området mellan 0 och 
6. Innan endera försöksmetoden inleds ska en preliminär uppskatt ­
ning av fördelningskoefficienten erhållas. 
Skakkolvmetoden kan endast användas för väsentligen rena ämnen 
som är lösliga i vatten och n-oktan. Den kan inte användas för ytaktiva ämnen (för vilka ett beräknat värde eller en uppskattning 
grundad på lösligheten i vatten respektive n-oktan bör finnas). 
HPLC-metoden kan inte användas för starka syror och baser, metall ­
komplexer, ytaktiva ämnen och ämnen som reagerar med eluerings ­
medlet. För sådana material används ett beräknat eller uppskattat 
värde på grundval av lösligheten i n-oktan respektive vatten. 
HPLC-metoden är mindre känslig än skakkolvmetoden för närvaron 
av orenheter i ämnet. Trots detta kan orenheter i vissa tillfällen göra det svårt att tolka resultaten eftersom toppvärden blir osäkra. För blandningar med ett oupplöst band anges en övre och nedre gräns 
för log P.
 
1.2 DEFINITIONER OCH ENHETER 
Fördelningskoefficienten (P) definieras som förhållandet mellan jäm ­
viktskoncentrationerna (c  i ) för ett ämne som lösts i ett tvåfassystem 
bestående av två i stort sett icke blandbara lösningsmedel. För n- oktansyra och vatten är
 
p ow ¼ c nÄoctanol  
c water 
Fördelningskoefficienten (P) är således ett förhållande mellan två 
koncentrationer och uttrycks vanligtvis i form av dess logaritm för 
basen 10 (log P).  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 67
 
1.3 REFERENSÄMNEN  
Skakkolvmetoden  
Man behöver inte använda referensämnen varje gång ett nytt ämne 
ska undersökas. Referensämnen ska först och främst användas för att då och då kontrollera metoden och för jämförelse med resultat som 
uppnåtts med andra metoder.
 
HPLC-metoden  
För att kunna korrelera uppmätta HPLC-data för ett ämne med dess 
P-värde måste en kalibreringskurva för log P mot kromatografiska data fastställas med användning av minst 6 referenspunkter. Det är upp till användaren att välja lämpliga referensämnen. När så är möj ­
ligt ska minst ett referensämne ha en P
 ow -värde som ligger över 
testämnets, och minst ett med ett P  ow -värde under testämnets. För 
värden av log P under 4 kan kalibreringen baseras på data som 
erhållits genom skakkolvmetoden. För värden av log P över 4 kan 
kalibreringen baseras på validerade hänvisningsvärden om dessa motsvarar beräknade värden. För bättre noggrannhet är det att före ­
dra att välja referensämnen som strukturmässigt liknar testämnet. 
Det finns omfattande listor av värden av log P
 ow för många grupper 
av kemikalier (se hänvisningar 2 och 3). Om det inte finns data om 
fördelningskoefficienter för strukturmässigt besläktade ämnen kan en 
mer allmän kalibrering, upprättad med andra referensföreningar, an ­
vändas. 
I tillägg 2 finns en lista med rekommenderade referensämnen och 
deras P  ow -värden.  
1.4 TESTMETODSPRINCIPER  
1.4.1  Skakkolvmetoden  
För att kunna bestämma fördelningskoefficienten måste jämvikt upp ­
nås mellan alla samverkande komponenter i systemet, och koncent ­
rationerna av de ämnen som lösts i de två faserna måste bestämmas. 
En genomgång av litteraturen i detta ämne visar att man kan använda flera olika tekniker för att lösa detta problem, dvs. noggrann bland ­
ning av två faserna för bestämning av det undersökta ämnets jäm ­
viktskoncentration efter separation av faserna.
 
1.4.2  HPLC-metoden  
HPLC utförs på analytiska kolonner packade med en kommersiellt 
tillgänglig fast fas innehållande långa kedjor av kolväte (t.ex. C  8 , 
C 18 ) kemiskt bundna till kisel. Om kemikalier insprutas på en sådan 
kolonn kommer de att vandra genom den med olika hastigheter, eftersom deras fördelning mellan den mobila och den stationära fasen inte är densamma. Kemikalieblandningar elueras i ordningsföljd efter 
hydrofobicitet, varvid de vattenlösliga kemikalierna elueras först och 
de oljeupplösliga sist, i proportion till deras kolväte-/vattenfördel ­
ningskoefficient. Därefter kan sammanhanget mellan retentionstiden på en sådan kolonn (med omvänd fas) och n-oktan/vattenfördelnings ­
koefficienten fastställas. Fördelningskoefficienten utleds av kapaci ­
tetsfaktorn k, som fås genom
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 68
 
k ¼ t R Ä t o 
t o 
där t  R är testämnets retentionstid och t  o den genomsnittliga tid det tar 
för en lösningsmedelsmolekyl att komma igenom kolonnen (kolon ­
nens dödtid). 
Det krävs inga kvantitativa analysmetoder och det är endast nödvän ­
digt att bestämma retentionstiden.  
1.5 KVALITETSKRITERIER  
1.5.1  Repeterbarhet  
Skakkolvmetoden  
För att säkerställa en exakt fördelningskoefficient ska dubbla bestäm ­
ningar göras under tre olika testbetingelser, varvid såväl mängden av 
det angivna ämnet som förhållandet mellan lösningsmedlens volymer kan varieras. Bestämningen av fördelningskoefficientens värden ut ­
tryckta som deras allmänna logaritmer ska ligga inom ± 0,3 logarit ­
menheter.
 
HPCL-metoden  
För att öka tilltron till mätningen görs dubbla bestämningar. Värdena 
av log P beräknade på grundval av de individuella mätningarna ska 
ligga inom ett intervall av ± 0,1.  
1.5.2  Sensitivitet  
Skakkolvmetoden  
Metodens mätområde bestäms av analysförfarandets detektionsgräns. 
Denna bör vara tillräcklig för att medge bestämning av värden för log P
 ow i området - 2 till 4 (under vissa omständigheter kan detta 
område ökas till log P  ow upp till 5) när koncentrationen av det lösta 
ämnet i endera fasen inte är större än 0,01 mol per liter.  
HPLC-metoden  
Med HPLC-metoden kan man uppskatta fördelningskoefficienter i 
log P  ow -området från 0 till 6. 
Normalt kan en förenings fördelningskoefficient uppskattas med en 
avvikelse av mindre än ± 1 från det värde som uppnås med skak ­
kolvmetoden. Typiska korrelationer framgår i hänvisningarna (4, 5, 6, 7 och 8). Man upnår normalt större noggrannhet om man använ ­
der korrelationskurvor baserade på strukturmässigt besläktade refe ­
rensämnen {se hänvisning 9).
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 69
 
1.5.3  Specificitet  
Skakkolvmetoden  
Nernsts fördelningslag gäller endast för utspädda lösningar vid kon ­
stant temperatur, tryck och pH-värde. Den gäller endast för ett rent ämne som fördelats mellan två rena lösningsmedel. Om flera olika 
lösta ämnen förekommer i den ena eller i båda faserna samtidigt, kan 
detta påverka resultaten. 
Dissociation eller association av de lösta molekylerna resulterar i 
avvikelser från Nernsts fördelningslag. Sådana avvikelser framgår av det faktum att fördelningskoefficienten blir beroende av lösning ­
ens koncentration. 
På grund av de många inblandade jämvikterna ska denna metod inte 
användas på joniserbara föreningar utan korrektion. För sådana för ­
eningar kan man överväga att använda buffertlösningar i stället för vatten. I så fall ska buffertlösningens pH-värde ligga minst 1 enhet från ämnets pKa och detta pH-värdes inverkan på miljön ska beaktas.
 
1.6 METODBESKRIVNING  
1.6.1  Preliminär uppskattning av fördelningskoefficienten.  
Fördelningskoefficientens värde kan företrädesvis uppskattas genom 
en enkel beräkning (se tillägg 1) eller, vid behov, på grundval av testämnenas löslighet i de rena lösningsmedlen (se hänvisning 10).
 
1.6.2  Skakkolvmetoden  
1.6.2.1  Förberedelser  
n-oktansyra: Fördelningskoefficienten ska bestämmas med använd ­
ning av reagenser med mycket hög analytisk renhetsgrad. 
Vatten: Destillerat eller omdestillerat vatten från glas- eller kvarts ­
apparat ska användas. För joniserbara föreningar används buffert ­
lösmngar i stället för vatten, om detta är motiverat.  
Anmärkning:  
Vatten som hämtats direkt från en jonbytare får inte användas.  
1.6.2.1.1 F ö r m ä t t n a d a v l ö s n i n g s m e d l e n 
Innan en fördelningskoefficient bestäms mättas var och en av de 
faser som ingår i lösningsmedelssystemet ömsesidigt genom omskak ­
ning vid testtemperatur. För detta är det praktiskt att använda en 
mekanisk skakapparat, och låta den i 24 timmar skaka två stora stamkolvar med n-oktansyra med mycket hög analytisk renhetsgrad eller vatten, vardera innehållande tillräcklig mängd av det andra lös ­
ningsmedlet, varefter flaskorna får stå tillräckligt länge för att medge 
separation av faserna och för att uppnå ett mättnadstillstånd.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 70
 
1.6.2.1.2 T e s t f ö r b e r e d e l s e 
Testkärlet ska vara nästan helt fyllt av tvåfassystemet. Detta förhind ­
rar materialförlust till följd av avdunstning. Förhållandet mellan vo ­
lym och mängder ämne fastställs på grundval av följande: 
— Den preliminära uppskattningen av fördelningskoefficienten (se 
ovan). 
— Den minsta mängden testämne som behövs för analysförfarandet. — Begränsningen av en högsta koncentration i endera fasen på 0,01 
mol per liter. 
Tre test ska göras. I det första tillsätts det beräknade volymförhål ­
landet av n-oktansyra till vatten; i det andra tillsätts dubbla volymen n-oktansyra; och i det tredje tillsätts halva volymen n-oktansyra (dvs. 
1:1, 1:2, 2:1).
 
1.6.2.1.3 T e s t ä m n e 
En stamlösning framställs i n-oktansyra förmättad med vatten. Innan 
stamlösningen används för bestämning av fördelningskoefficienten ska dess faktiska koncentration bestämmas exakt. Denna lösning 
ska förvaras under stabila betingelser.
 
1.6.2.2  Testbetingelser  
Testtemperaturen ska hållas konstant (± 1  o C) och ligga i området 
20–25  o C. 
1.6.2.3  Mätförfarande  
1.6.2.3.1 U p p n å e n d e a v f ö r d e l n i n g s j ä m v i k t 
För varje testbetingelse används två testkärl som vart och ett inne ­
håller erforderliga, exakt mätta mängder av de två lösningsmedlen 
och den erforderliga mängden stamlösning. 
Delarna n-oktansyra ska mätas per volym. Testkärlen ska antingen 
placeras i en lämplig skakapparat eller skakas för hand. Nar ett 
centrifugeringsglas används rekommenderas att snabbt vrida centri ­
fugglaset 180  o kring dess tväraxel så att all instängd luft stiger upp 
genom de två faserna. Erfarenheten visar att 50 sådana vridningar normalt är tillräckligt för att erhålla fördelningsjämvikt. För att vara 
säker på detta rekommenderas 100 vridningar under fem minuter.
 
1.6.2.3.2 F a s s e p a r a t i o n 
Vid behov kan blandningen centrifugeras för att separera faserna. 
Detta görs i en laboratoriecentrifug som hålls vid rumstemperatur, eller, om en centrifug utan temperaturreglering används, ska centri ­
fugglasen minst en timme före analysen bringas i jämvikt med test ­
temperaturen.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 71
 
1.6.2.4  Analys  
För bestämningen av fördelningskoefficienten är det nödvändigt att 
bestämma koncentrationerna av testämnet i båda faserna. Detta kan man göra genom att för varje testbetingelse ta ett delprov av varje fas 
från varje glas och analysera dessa enligt det valda förfarandet. Den 
totala mängden ämne i båda faserna beräknas och jämförs med den mängd ämne som ursprungligen tillsattes. 
Proven från vattenfasen ska tas på så sätt att risken att den innehåller 
spår av n-oktansyra minimeras: en glasspruta med avtagbar kanyl 
kan användas till att ta prov från vattenfasen. Sprutan ska först fyllas delvis med luft. Luften ska försiktigt pressas ut medan kanylen förs genom n-oktansyrafasen. En lämplig volym av vattenfasen dras upp i 
sprutan. Sprutan dras snabbt bort från lösningen och kanylen avlägs ­
nas. Innehållet i sprutan kan sedan användas som vattenprovet. Kon ­
centrationen i de två separerade faserna ska helst bestämmas med en ämnesspecifik metod. Exempel på fysisk-kemiska bestämningar som 
kan vara lämpliga är 
— fotometriska metoder, — gaskromatografi, — högpresterande vätskekromatografi (HPLC).
 
1.6.3  HPLC-metoden  
1.6.3.1  Förberedelser  
Apparatur  
Det krävs en vätskekromatograf med pulsfri pump och passande 
detektionssystem. Användning av insprutningsventil med insprut ­
ningsspole rekommenderas. Närvaro av polära grupper i den statio ­
nära fasen kan väsentligt nedsätta HPLC-kolonnernas prestation. Till 
följd av detta måste de stationära faserna ha lägsta möjliga procen ­
tuella innehåll av polära grupper (se hänvisning 11). Ett kommersiellt mikroniserat fyllningsmaterial med omvänd fas eller färdigfyllda ko ­
lonner kan användas. Eventuellt kan en förkolonn placeras mellan 
insprutnings-systemet och den analyskolonnen.
 
Mobil fas  
Metanol och vatten av HPLC-kvalitet används för att framställa 
elueringsvätskan, vilken avgasas innan användning. Isokratisk elue ­
ring används. Den använda metanol/vattenblandningen ska innehålla minst 25 % vatten. För eluering av föreningar med ett log P av 6 på en timme med en flödeshastighet av 1 ml/m räcker det vanligtvis 
med en blandning av metanol och vatten i förhållandet 3:1 (v/v). För 
föreningar med ett högt log P-värde kan det vara nödvändigt att minska elueringstiden (även för referensämnena) genom att utnyttja en mindre polär mobil fas eller en kortare kolonn. 
Ämnen med mycket låg löslighet i n-oktan har en tendens att ge 
onormalt låga värden för log P
 ow med HPLC-metoden. Ibland följer 
sådana föreningars toppar lösningsmedelsfronten. Detta beror sanno ­
likt på att fördelningsprocessen är för långsam för att jämvikt ska kunna uppnås inom tiden för en HPLC-separation. I detta fall kan en 
minskning av flödeshastigheten och/eller en minskning av metanol/ 
vattenförhållandet vara effektivt för att erhålla ett pålitligt värde.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 72
 
Både testämnet och referensämnen ska vara lösliga i den mobila 
fasen i en så hög koncentration att detta kan påvisas. Endast i un ­
dantagsfall får tillsättningsämnen användas till metanol/vattenbland ­
ningen, eftersom tillsättningsämnen kommer att ändra kolonnens egenskaper. För kromatografer med tillsättningsämnen ska man alltid 
använda en separat kolonn av samma slag. Om metanol/vatten inte är 
lämpligt kan man använda andra blandningar av vatten och orga ­
niska lösningsmedel, t.ex. etanol/vatten eller acetonitril/vatten. 
För joniserbara ämnen är elueringsvätskans pH-värde kritiskt. Det 
ska ligga innanför kolonnens driftsområde, vilket normalt är från 2 till 8. Användning av buffert rekommenderas. Det är viktigt att undvika saltutfällning och försämring av kolonnen, vilket kan före ­
komma med vissa blandningar av organisk fas och buffert. HPLC- 
mätningar med kiselbaserade faser med pH över 8 rekommenderas inte eftersom alkalisk mobil fas kan leda till att kolonnens prestation hastigt försämras.
 
Lösningar  
Referensämnen ska vara av renast möjliga kvalitet. För testning och 
kalibrering ska ämnena om möjligt lösas i den mobila fasen.  
Försöksbetingelser  
Temperaturen under mätningarna bör inte variera med mer än 2 K.  
1.6.3.2  Mätningar  
Beräkning av dödtiden t  0 
Dödtiden t  0 kan bestämmas antingen med en homolog serie (t.ex. n- 
alkylmetylketoner) eller med organiska ämnen som inte hålls kvar (t.ex. thiourea eller formamid). För att beräkna dödtiden t
 0 pä grund­
val av en homolog serie insprutas minst sju element av en homolog 
serie, och retentionstiderna bestäms. Bruttoretentionstiderna t  r (n c +1) 
avbildas mot t  r (n c ), och i regressionsekvationen 
t r(n c + 1) = a + b t  r(n c ) 
bestäms avskärningen a och hållningskoefficienten b (n  c = antalet 
kolatomer). Dödtiden ges då genom 
t o = a/(l – b)  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 73
 
Kalibreringskurva  
Nästa steg består i att konstruera en korrelationskurva av log k mot 
log P för passande referensämnen. I praktiken insprutas det samtidigt mellan fem och tio standardreferensämnen, om log P ligger i det förväntade området, och retentionstiderna bestäms, helst med en in ­
tegrationsskrivare som är kopplad till detektionssystemet. Motsva ­
rande logaritmer för kapacitetsfaktorerna, log k, beräknas och avsätts mot den log P som är bestämd genom skakkolvmetoden. Kalibre ­
ringen företas regelbundet, minst en gång om dagen, för att ta hän ­
syn till för eventuella ändringar i kolonnens prestation.
 
Bestämning av testämnets kapacitetsfaktor  
Testämnet sprutas in som en så liten mängd mobil fas som möjligt. 
Retentionstiden bestäms (dubbla bestämningar), varefter kapacitets ­
faktorn k kan beräknas. På grundval av korrelationskurvan över 
referensämnena kan testämnets fördelningskoefficient interpoleras. Vid mycket låga och mycket höga fördelningskoefficienter är det nödvändigt att extrapolera. I sådana fall måste man vara särskilt 
uppmärksam på regressionslinjens konfidens-gränser.
 
2. DATA  
Skakkolvmetoden  
Tillförlitligheten av de bestämda P-värdena kan prövas genom en 
jämförelse mellan medelvärdena för de dubbla bestämningarna och det totala medelvärdet.
 
3. RAPPORTERING  
Testrapporten ska om möjligt innehålla följande uppgifter: 
— Exakt specificering av ämnet (beteckning och orenheter). — Om metoderna inte kan användas (t.ex. ytaktiva material), en 
beräknat värde eller en uppskattning på grundval av individuella 
n-oktan och vattenlöslighet. 
— Alla uppgifter och upplysningar av betydelse för tolkningen av 
resultaten, särskild i fråga om orenheter i ämnet och ämnets 
fysiska tillstånd.
 
För skakkolvmetoden:  
— Resultatet från en eventuell preliminär uppskattning. 
— Temperatur vid bestämningen. 
— Data om de analysförfaranden som används vid bestämning av 
koncentrationerna. 
— Eventuell centrifugeringstid och -hastighet.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 74
 
— De mätta koncentrationerna i båda faserna för varje bestämning. 
(Detta innebär att totalt 12 koncentrationer ska anges.) 
— Vikten på testämnet, den använda volymen av varje fas i varje 
testkärl och den totala beräknade mängden testämne som finns i varje fas efter uppnående av jämvikt. 
— De beräknade värdena för fördelningskoefficienten (P) och me ­
delvärdet för varje uppsättning testbetingelser, liksom medelvär ­
det för alla bestämningar. Eventuella tecken på att fördelnings ­
koefficienten är koncentrationsberoende ska anges i rapporten. 
— De enskilda P-värdenas standardavvikelse från genomsnittet. — Genomsnittsvärdet för P från alla bestämningar anges också som 
dess logaritm (bas 10). 
— Det beräknade teoretiska värdet av P
 ow , när detta värde är be ­
stämt eller när det mätta värdet är > 10  4 . 
— pH-värdet i vattnet som har använts och i vattenfasen under 
testet. 
— Motivering för användning av buffertlösningar i stället för vatten, 
deras sammansättning, koncentration och pH-värde samt vatten ­
fasens pH-värde före och efter testet.  
För HPLC-metoden:  
— Resultatet av en eventuell preliminär uppskattning. 
— Test- och referensämnen, och deras renhetsgrad. — Temperaturområde vid bestämningen. — Det pH-värde vid vilket bestämningarna gjorts. — Detaljerade uppgifter om analys- och förkolonn, rörlig fas och 
detektionssystem. 
— Retentionsdata och hänvisningsvärden för log P för referens ­
ämnen som använts vid kalibrering. 
— Detaljerade uppgifter om anpassning av retentionslinjen (log k 
mot log P). 
— Genomsnittliga retentionsdata och interpolerat log P-värde för 
testämnet. 
— Beskrivning av utrustning och driftsbetingelser. — Elueringsprofiler. — Den mängd test- och referensämne som tillförts kolonnen. — Dödtiden och hur den är uppmätt.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 75
 
4. HÄNVISNINGAR  
1. OECD, Paris, 1981, Test Guideline 107, rådets beslut K(81) 30 
slutligt. 
2. C. Hansch och A. j. Leo, Substituent Constants for Correlation 
Analysis in Chemistry and Biology, John Wiley, New York, 1979. 
3. Log P and Parameter Database, A took for the quantitative 
prediction of bioactivity (C. Hasch, chairman, A. J. Leo, dir.) – Tillgänglig från Pomona College Medical Chemistry Project 1982, Pornona College, Claremont, California 91711. 
4. L. Renberg, G. Sundström och K. Sundh-Nygård, Chemosphe ­
re, 1980, vol. 80, s. 683. 
5. H. Ellgehausen, C. D'Hondt och R. Fuerer, Pestic. Sci., 1981, 
vol, 12, s. 219. 
6. B. McDuffie, Chemosphere, 1981, vol. 10, s. 73. 
7. W. E. Hammers et al., J. Chromatogr., 1982, vol. 247, s. 1. 
8. J. E. Haky och A. M. Youg, J. Liq. Chromat., 1984, vol. 7, 
s. 675. 
9. S. Fujisawa och E. Masuhara, J. Biomed. Mat. Res., 1981, vol. 
15, s. 787. 
10. O. Jubermann, Verteilen und Extrahieren, in Methoden der 
Organischen Chemie (Houben Weyl), Allgemeine Laboratori ­
umpraxis (editerad av E. Muller), Georg Thieme Verlag, Stutt ­
gart, 1958, band I/l, s. 223–339. 
11. R. F. Rekker och H. M. de Kort, Euro. J. Med. Chem,. 1979, 
vol. 14., s. 479. 
12. A. Leo, C. Hansch och D. Elkins, artition coefficients and their 
uses. Chem. Rev. 1971, vol. 71, s. 525. 
13. R. F. Rekker, The Hydrophobic Fragmental Constant, Elsevier, 
Amsterdam, 1977. 
14. NF T 20-043 AFNOR (1985). Chemical products for industrial 
use – Determination of partition coefficient – Flask shake method. 
15. C. V. Eadsforth och P. Moser, Chemosphere, 1983, vol. 12, 
s. 1459. 
16. A. Leo, C. Hansch och D. Elkins, Chem. Rev., 1971, vol. 71, 
s. 525. 
17. C. Hansch, A. Leo, S. H. Unger, K. H. Dim, D. Nikaitani och 
E. J. Lien, J. Med. Chem, 1973, vol. 16, s. 1207. 
18. W. B. Neely, D. R. Branson och G. E. Blau, Environ. Sci. 
Technol., 1974, vol. 8, s. 1113. 
19. D. S. Brown och E. W. Flagg, J. Environ. Qual., 1981, vol. 10, 
s. 382. 
20. J. K. Seydel och K. J. Schaper, Chemische Struktur und bio ­
logische Aktivität von Wirkstoffen, Verlag Chemiw, Weinhe ­
im, New York, 1979.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 76
 
21. R. Franke, Theoretical Drug Design Methods, Elsevier, Ams ­
terdam, 1984. 
22. Y. C. Martin, Quantitative Drug Design, Marcel Dekker, New 
York, Basel, 1978. 
23. N. S. Nirrlees, S. J. Noulton, C. T. Murphy, P. J. Taylor; J. 
Med. Chem., 1976, vol. 19, s. 615.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 77
 
Tillägg 1  
Metoder för beräkning/uppskattning  
INLEDNING  
I Handbook of Chemical Property Estimation Methods finns en allmän introduk ­
tion till beräkningsmetoder, data och exempel (se hänvisning a). 
Beräknade värden av P  ow kan användas 
— för att bestämma vilken testmetod som är lämplig (skakkolvområde: log P  ow : 
2 till 4, HPLC-område: log P  ow : 0 till 6), 
— för val av lämpliga testbetingelser (t.ex. referensämnen för HPLC-förfaran ­
den, volymratio n-oktanol/vatten för skakkolvmetoden), 
— som en intern laboratoriekontroll vid eventuella försöksfel, — för att få en uppskattning av P
 ow i fall där testmetoderna inte kan tillämpas av 
tekniska skäl.  
UPPSKATTNINGSMETOD  
Preliminär uppskattning av fördelningskoefficient.  
Fördelningskoefficientens värde kan uppskattas med hjälp av testsubstansens lös ­
lighet i rena lösningsmedel. För detta används:  
P uppskattning ¼ mättnad c  nÄoctanol  
mättnad c  vatten 
BERÄKNINGSMETODER  
Principen för beräkningsmetoderna  
Alla beräkningsmetoder är baserade på formell fragmentering av molekylen i 
lämpliga understrukturer för vilka man har pålitlig kännedom om log P  ow -inkre­
menter. Log P  ow för hela molekylen beräknas sedan som summan av dess mot ­
svarande fragmentvärden plus summan av korrektionsuttrycken för intramoleky ­
lär växelverkan. 
En lista med fragmentkonstanter och korrektionsuttryck finns i hänvisningarna b, 
c, d och e. Vissa av dem uppdateras regelbundet (hänvisning b).  
Kvalitetskriteria  
Normalt avtar beräkningsmetodens pålitlighet i takt med komplexiteten hos den 
testade föreningen. För enkla molekyler med låg molekylvikt och en eller två funktionsgrupper kan en avvikelse av 0,1 till 0,3 förväntas mellan resultatet av olika fragmenteringsmetoder och det mätta värdet för log P
 ow . Felmarginalen kan 
vara ännu större för mer komplexa molekyler. Detta beror på pålitligheten och 
förekomsten av fragmentkonstanter, liksom möjligheten att känna igen intramo ­
lekylära växelverkningar (t.ex. väteförbindelser) och om korrektionstermen an ­
vänds korrekt (detta är inte ett lika stort problem med programvaran CLOGP-3). 
1 fråga om joniserbara föreningar är det av stor betydelse att laddningen eller 
joniseringsgraden bedöms korrekt.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 78
 
Beräkningsmetoder  
Hansch Π-metoden  
Den ursprungliga konstanten för hydrofoba substituenter, π, som införts av Fujita 
m.fl. (se hänvisning f) definieras genom 
π x = log P  ow (PhX) - log P  ow (PhH) 
I enlighet med dess definition är -metoden lämplig för aromatisk substitution. Det 
finns tabeller med -värden för ett stort antal substitutioner (se hänvisningar b, c och d). De används för beräkning av log P
 ow för aromatiska molekyler och 
understrukturer. 
(e.g. π Cl = log P  ow (C 6 H 5 Cl) - log P  ow (C 6 H 6 ) = 2,84 - 2,13 = 0,71). 
där Pow (PhX) är fördelningskoefficienten av ett aromatiskt derivat och Pow 
(PhH) är moderföreningens fördelningskoefficient  
Rekkers metod  
I enlighet med Rekker (se hänvisning g) beräknas värdet av log P  ow på följande 
sätt: 
log P  ow ¼ X 
i a i f i þ X 
j 
där f  i representerar olika molekylfragmentkonstanter och a  i är den frekvens med 
vilken de förekommer i den molekyl som testas. Korrektionstermerna kan uttryc ­
kas som en integral multipel av en enda konstant C  m (den s.k. magiska kon ­
stanten). Fragmentkonstanterna f  i ch C  m bestäms på grundval av en tabell med 
1 054 experimentellt bestämda värden av P  ow (825 föreningar) med användning 
av flerdimensionell regressionsanalys (se hänvisningar c och h). Växelverknings ­
uttrycken bestäms efter fastställda regler som beskrivs i hänvisningslitteraturen (se hänvisningar e, h och i).
 
Hansch-Leos metod  
I enlighet med Hansch och Leo (se hänvisning c) beräknas värden av log P  ow på 
följande sätt:  
log P  ow ¼ P 
i a i f i þ P 
j b j F j 
där f  i representerar de olika molekylfragmentkonstanterna, F  i är korrektions ­
uttrycken och a  i och b  j är de motsvarande uppträdandefrekvenserna. På grundval 
av experimentellt bestämda värden av P  ow har man genom att prova sig fram 
kunnat ställa upp en lista över atom- och gruppfragmentvärden och en lista över 
korrektionsuttryck F  j (s.k. faktorer). Korrektionsuttrycken har delats in i olika 
klasser (se hänvisningar a och c). Det är relativt komplicerat och tidsödande att ta hänsyn till alla regler och korrektionsuttryck. Programvarupaket har utvecklats för detta (se hänvisning b).
 
Kombinerad metod  
Beräkningen av log P  ow för komplexa molekyler kan förbättras betydligt om 
molekylen delas upp i större delstrukturer för vilka pålitliga log P  ow -värden finns 
tillgängliga, antingen från tabeller (se hänvisningar b och c) eller från egna mätningar. Sådana fragment (t.ex. heterocykler, anthraquinon, azobensen) kan sedan kombineras med Hanschs Π-värden eller med Rekkers eller Leos fragment ­
konstanter.
 
Anmärkningar  
i) Beräkningsmetoderna kan endast användas på helt eller delvis joniserade 
föreningar om det är möjligt att beakta de nödvändiga korrektionsfaktorerna.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 79
 
ii) Om intramolekylära väteförbindelser kan antas förekomma måste motsva ­
rande korrektionstermer (ca +0,6 till +1,0 log P  ow -enheter) läggas till (se 
hänvisning a). Indikationer av närvaron av sådana förbindelser kan erhållas från stereomodeller eller spektroskopiska data av molekylen. 
iii) Om flera tautomeriska former är möjliga används den mest sannolika formen 
som bas för beräkningen. 
iv) Revisioner av listor med fragmentkonstanter ska följas noggrant.
 
Rapportering  
Vid användning av beräknings-/uppskattningsmetoder ska testrapporten om möj ­
ligt innehålla följande information: 
— Beskrivning av ämnet (blandning, orenheter etc). — Indikation av eventuella intramolekylära väteförbindelser, dissociation, ladd ­
ning och andra eventuella särskilda förhållanden (t.ex. tautomeri). 
— Beskrivning av beräkningsmetoden. — Identifiering eller tillhandahållande av databas. — Särskilda val av fragment. — Fullständig dokumentation av beräkningen.
 
HÄNVISNINGAR  
1. W. J. Lyman, W. F. Reehl och D. H. Rosenblatt (ed.), Handbook of Chemical 
Property Estimation Methods, McGraw-Hill, New York, 1983. 
2. Pomona College, Medicinal Chemistry Project, Claremont, California 92711, 
USA, Log P Database och Med. Chem. Software (Program CLOGP - 3). 
3. C. Hansch och A. J. Leo, Substituent Constants for Correlation Analysis in 
Chemistry and Biology, John Wiley, New York, 1979. 
4. A. Leo, C. Hansch, D. Elkins, Chem. Rev, 1971, vol. 71, s. 525. 
5. R. F. Rekker och H. M. de Kort, Euro. J. Med. Chem,. 1979, vol. 14, s. 479. 6. 6. T. Fujita, J. Iwasa och C. Hansch, J. Amer. Chem. Soc, 1964, vol. 86, 
s. 5175. 
7. R. F. Rekker, The Hydrophobic Fragmental Constant, Pharmacochemistry 
Library, Elsevier, New York, 1977, vol. 1. 
8. C. V. Eadsforth, P. Moser, Chemosphere, 1983, vol. 12, s. 1459. 
9. R. A. Scherrer, ACS, American Chemical Sociery, Washington D. C, 19S4, 
Symposium Senes 255, s. 225.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 80
 
Tillägg 2  
Rekommenderade referensämnen för HPLC-metoden  
Nr Referensämne Log P  ow pKa 
1 2-butanon 0,3 
2 4-acetylpyndin 0,5 
3 Anilin 0,9 
4 Acetanilid 1,0 
5 Bensylalkohol 1,1 6 p meloxilenol 1,3 pKa = 10,26 
7 Fenoxyättiksyra 1,4 pKa = 3,12 
8 Fenol 1,5 pKa = 9,92 
9 2,4-dinitrofenol 1,5 pKa = 3,96 
10 Bensonitril 1,6 11 Fenylättiknitril 1,6 
12 4-metylbensenalkohol 1,6 
13 Acetonfenon 1,7 
14 2-nitrofenol 1,8 pKa = 7,17 
15 3-nitrobcnsoesyra 1,8 pKa = 3,47 16 4-kloranilin 1,8 pKa = 4,15 
17 Nitrobensen 1,9 
18 Kanelalkohol 1,9 
19 Bensoesyra 1,9 pKa = 4,19 
20 p-kresol 1,9 pKa = 10,17 21 Kanelsyra 2,1 pKa = 3,89 cis 4,44 träns 
22 Anisol 2,1 
23 Metylbensoat 2,1 
24 Bensen 2,1 
25 3-metylbensoesyra 2,4 pKa = 4,27 26 4-klorfenol 2,4 pKa = 9,1 
27 Trikloretylen 2,4 
28 Atrazin 2,6 
29 Etylbensoat 2,6 
30 2,6-diklorbensonitril 2,6 31 3-klorbensoesyra 2,7 pKa = 3,82 
32 Toluen 2,7 
33 1-naftol 2,7 pKa = 9,34 34 2,3-dikloranilin 2,8 
35 Monoklorbensen 2,8 
36 Allyl-fenyleter 2,9 
37 Bromobensen 3,0
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 81
 
Nr Referensämne Log P  ow pKa 
38 Etylbensen 3,2 
39 Bensofenon 3,2 40 4-fenylfenol 3,2 pKa = 9,54 41 Tymol 3,3 
42 1,4-diklorbensen 3,4 
43 Difenylamin 3,4 pKa = 0,79 44 Naftalen 3,6 45 Fenylbensoat 3,6 46 Isopropylbensen 3,7 47 2,4,6-triklorfenol 3,7
 P Ka = 6 
48 Bifenyl 4,0 49 Bensylbensoat 4,0 50 2,4-dinitro-6 sec. butylfenol 4,1 51 1,2,4-triklorbensen 4,2 52 Dodekansyra 4,2 53 Difenyleter 4,2 
54 n-butylbensen 4,5 
55 Fenantren 4,5 56 Fluoranten 4,7 57 Dibensyl 4,8 58 2,6-difenylpyridin 4,9 59 Tnfenylamin 5,7 60 DDT 6,2 
Andra referensämnen med låg log P
 ow 
1 Nikotinsyra - 0,07  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 82
 
A.9 FLAMPUNKT  
1. METOD  
1.1 INLEDNING 
Vid utförande av detta test är det värdefullt att ha förhandskunskap 
om ämnets brandfarlighet. Testförfarandet kan tillämpas på flytande 
ämnen vars ångor kan antändas av antändningskällor. De testmetoder som beskrivs i denna text är endast tillförlitliga för de flam ­
punktsområden som anges för de enskilda metoderna. 
Vid val av försöksmetod ska man ta hänsyn till en eventuell kemisk 
reaktion mellan ämnet och provbehållaren.
 
1.2 DEFINITIONER OCH ENHETER 
Flampunkten är den lägsta temperatur, korrigerad vid ett tryck av 
101,325 kPa, vid vilken testvätskan i ett slutet testkärl, under de betingelser som definieras för testmetoden, utvecklar ånga i sådan mängd att en brandfarlig ång-luftblandning bildas i testkärlet. 
Enheter:
 o C 
t = T – 273,15 
(t i o C och T i K)  
1.3 REFERENSÄMNEN 
Man behöver inte använda referensämnen varje gång ett nytt ämne 
ska undersökas. Referensämnen ska först och främst användas för att 
då och då kontrollera metoden och för jämförelse med resultat som 
uppnåtts med andra metoder.  
1.4 TESTMETODSPRINCIPER 
Ämnet placeras i ett testkärl och värms upp eller kyls ned till test ­
temperaturen i enlighet med det beskrivna förfarandet för de indi ­
viduella testmetoderna. Antändningsförsök utförs för att fastställa om 
provet antänds vid testtemperaturen.  
1.5 KVALITETSKRITERIER  
1.5.1  Repeterbarhet  
Repeterbarheten varierar med flampunktsområde och använd test ­
metod: högst ± 2  o C. 
1.5.2  Sensitivitet  
Sensitiviteten är beroende av använd testmetod.  
1.5.3  Specificitet  
Vissa testmetoders specificitet är begränsad till vissa flampunktsom ­
råden och avhängiga av ämnesrelaterade egenskaper (t.ex. hög vis ­
kositet).  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 83
 
1.6 METODBESKRIVNING  
1.6.1  Förberedelser  
Ett prov av testämnet placeras i en testapparat enligt 1.6.3.1 och/eller 
1.6.3.2. 
Av säkerhetsskäl rekommenderas att man för energiska eller toxiska 
ämnen endast använder en metod med en liten provstorlek, ca 2 cm  3 . 
1.6.2  Testbetingelser  
Apparaten ska, såvida detta är förenligt med säkerhetskraven, place ­
ras fritt från drag.  
1.6.3  Testförfarande  
1.6.3.1  Jämviktsmetoden  
Se ISO 1516, ISO 3680, ISO 1523, ISO 3679.  
1.6.3.2  Icke-jämviktsmetoden  
Abel-apparat:  
Se BS 2000 del 170, NF M07-011, NF T66-009.  
Abel-Pensky-apparat:  
Se (EN 57), DIN 51755 del 1 (för temperaturer från 5 till 65  o C), 
DIN 51755 del 2 (för temperaturer under 5  o C), NF M07-036.  
Tag-apparat:  
Se ASTM D 56.  
Pensky-Mårtens-apparat:  
Se ISO 2719, EN 11, DIN 51758, ASTM D 93, BS 2000-34, NF 
M07-019.  
Anmärkningar:  
Om flampunkten, bestämd med en icke-jämviktsmetod enligt 1.6.3.2, 
konstateras vara 0 ± 2  o C, 21 ± 2  o C eller 55 ± 2  o C, ska den 
bekräftas med en jämviktsmetod med samma apparat. 
Endast de metoder som kan utvisa flampunktstemperaturen får an ­
vändas till en anmälan. 
För att bestämma flampunkten för viskösa vätskor (färger, lim och 
liknande) som innehåller lösningsmedel, får endast apparatur och testmetoder som lämpar sig för bestämning av flampunkten för vi ­
skösa vätskor användas. 
Se ISO 3679, ISO 3680, ISO 1523, DIN 53213 del 1.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 84
 
2. DATA  
3. RAPPORTERING  
Testrapporten ska, om möjligt, innehålla följande uppgifter: 
— Exakt specificering av ämnet (beteckning och orenheter). — Den använda metoden ska anges liksom eventuella avvikelser. — Resultaten och kompletterande uppgifter av betydelse för tolk ­
ningen av resultaten.
 
4. HÄNVISNINGAR  
Inga. ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 85
 
A.10  ANTÄNDLIGHET (FASTA ÄMNEN)  
1. METOD  
1.1 INLEDNING 
Vid utförande av detta test är det värdefullt att ha förhandskunskap 
om ämnets eventuella explosiva egenskaper. Testet utförs endast på 
pulverformiga, granulära och pastaaktiga ämnen. 
För att inte ta med alla ämnen som kan antändas, utan endast de som 
brinner snabbt eller de som på ett eller annat sätt har särskilt farliga egenskaper vid förbränning, anses endast de ämnen vars förbrän ­
ningshastighet överstiger ett visst gränsvärde vara lättantändliga. 
Det kan vara särskilt farligt om glödningen fortsätter genom metall ­
pulver eftersom en brand är mycket svår att släcka. 
Metallpulver anses lättantändliga om glödningen kan breda ut sig i 
provet inom en viss tid.
 
1.2 DEFINITIONER OCH ENHETER 
Förbränningstiden uttrycks i sekunder.  
1.3 REFERENSÄMNEN 
Inte angivna.  
1.4 TESTMETODSPRINCIP 
Ämnet formas till ett 250 mm långt obrutet band och det företas ett 
preliminärt screeningtest för att bestämma om det, efter antändning 
med en gaslåga, sker en förbränning som breder ut sig med öppen 
låga eller genom glödning. Om glödningen breder ut sig mer än 200 mm av bandet inom en bestämd tid ska ett fullständigt testpro ­
gram utföras för bestämning av förbränningshastigheten.
 
1.5 KVALITETSKRITERIER 
Inte angivna.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 86
 
1.6 METODBESKRIVNING  
1.6.1  Preliminärt screeningtest  
Ämnet formas till ett obrutet band som är omkring 250 mm långt, 
20 mm brett och 10 mm högt på en ickebrännbar, icke-porös dåligt 
värmeledande plats. En gaslåga (minsta diameter 5 mm) hålls vid 
den ena änden av pulverbandet tills pulvret fattar eld, dock högst 2 minuter (5 minuter för metallpulver och metallegeringar). Man noterar om förbränningen breder ut sig 200 mm över bandet under 
testperiodens 4 minuter (40 minuter för metallpulver). Om ämnet inte 
fattar eld eller förbränning med öppen låga eller genom glödning inte breder ut sig 200 mm över bandet under testperiodens 4 minuter 
(40 minuter) anses ämnet inte vara lättantändligt och ytterligare för ­
sök är inte nödvändiga. Om förbränningen i ämnet breder ut sig 200 mm över bandet på mindre än 4 minuter eller mindre än 40 minuter för metallpulver utförs nedanstående test (1.6.2).
 
1.6.2  Test för förbränningshastighet  
1.6.2.1  Förberedelse  
Pulverformiga eller granulära ämnen fylls löst packat i en form som 
har en längd av 250 mm och en triangelformad tvärsnittssektion med 
en invändig höjd av 10 mm och en invändig bredd av 20 mm. På 
ömse sidor om formen monteras i längdriktningen en sidoavgrän ­
sande metallplatta, som skjuter ut 2 mm ovanför den triangelformade tvärsnittssektionen (se figuren). Därefter låter man formen falla tre 
gånger från 2 cm höjd på ett fast underlag. Om så behövs fylls 
formen på igen. Därefter tas de sidoavgränsande metallplattorna bort och överskottsämne skrapas bort. En icke-brännbar, icke-porös dåligt värmeledande platta läggs över formen, apparaten vänds upp 
och ned och formen avlägsnas. 
Pastaaktiga ämnen breds ut på en icke-brännbar, icke-porös dåligt 
värmeledande platta som en 250 mm lång korv med ett tvärsnitt av ungefär 1 cm
 2 . 
1.6.2.2  Testbetingelser  
Om ämnet är fuktkänsligt ska testet utföras sä snabbt som möjligt 
efter det att ämnet har avlägsnats från behållaren.  
1.6.2.3  Testförfarande  
Anordna testhögen längs draget i ett dragskåp. 
Luftdraget ska vara tillräckligt för att förhindra rök från att ta sig in i 
laboratoriet och ska inte ändras under testet. Ett dragskydd bör ställas 
upp runt apparaten. 
En het flamma från en gasbrännare (minsta diameter 5 mm) används 
för att antända ena änden av högen.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 87
 
När 80 mm av högen har bränts ska förbränningshastigheten över de 
nästa 100 mm mätas. Testet ska utföras sex gånger, varje gång på ett 
rent kallt underlag, såvida inte ett positivt resultat erhållits tidigare.  
2. DATA  
Bränntiden från det preliminära screeningtestet (1.6.1) och den kor ­
taste förbränningstiden som bestämts i upp till sex test (1.6.2.3) är nödvändiga för utvärderingen.
 
3. RAPPORTERING  
3.1 TESTRAPPORT 
Testrapporten ska om möjligt innehålla minst följande uppgifter: 
— Exakt specificering av ämnet (identifiering och orenheter). 
— En beskrivning av ämnet som ska undersökas, dess fysiska till ­
stånd, inklusive fukthalt. 
— Resultat från det preliminära screeningtestet och från test av 
brännhastighet om sådant utförts. 
— Alla ytterligare upplysningar som är av betydelse för tolkningen 
av resultaten.  
3.2 TOLKNING AV RESULTATEN 
Pulverformiga, granulära eller pastaaktiga ämnen ska anses vara 
mycket brandfarliga om bränntiden vid en av testerna, som utförts enligt det i 1.6 beskrivna testförfarandet, är kortare än 45 sekunder. Metallpulver eller metallegeringar anses mycket lättantändliga om de 
kan antändas och lågan eller reaktionszonen breder ut sig över hela 
provet inom 10 minuter.
 
4. HÄNVISNINGAR  
NF T 20-042 (Sept. 85). Chemical products for industrial use. De ­
termination of the flammability of solids.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 88
 
Tillägg  
Figur  
Form och tillbehör för anordning av testhögen  
(Alla mått i mm)
  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 89
 
A.11  ANTÄNDLIGHET (GASER)  
1. METOD  
1.1 INLEDNING 
Denna metod gör det möjligt att bestämma om en gas blandad med 
luft vid rumstemperatur (cirka 20  o C) och atmosfäriskt tryck kan 
antändas och i så fall i vilket koncentrationsområde. Blandningar med ökande koncentrationer av testgasen i luft utsätts för en elektrisk gnista varvid iakttas om antändning sker.
 
1.2 DEFINITIONER OCH ENHETER 
Området för antändlighet är koncentrationsområdet mellan den nedre 
och övre explosionsgränsen. De nedre och övre explosionsgränserna är de koncentrationsgränser för den brandfarliga gasen i en blandning 
med luft vid vilken en flamma inte breder ut sig.
 
1.3 REFERENSÄMNEN 
Inte angivet.  
1.4 TESTMETODSPRINCIP 
Koncentrationen av gasen i luft ökas stegvis och för varje steg utsätts 
blandningen för en elektrisk gnista.  
1.5 KVALITETSKRITERIER 
Inte angivna.  
1.6 METODBESKRIVNING  
1.6.1  Apparatur  
Testkärlet består av en upprättstående glascylinder med en inre dia ­
meter på minst 50 mm och en höjd på minst 300 mm. Antändnings ­
elektroderna är placerade 3–5 mm från varandra och 60 mm ovanför 
cylinderns botten. Cylindern är utrustad med en tryckutlösningsöpp ­
ning. Apparaten ska avskärmas för att begränsa eventuell explosions ­
skada. 
Som antändningskälla används en stående induktionsgnista med en 
varaktighet på 0,5 sek. Denna gnista genereras av en högspännings ­
transformator med en utgångsspänning på 10–15 kV (högsta in ­
gångseffekt 300 W). I hänvisning 2 visas ett exempel på en lämplig 
apparat.  
1.6.2  Testbetingelser  
Detta test ska utföras vid rumstemperatur (cirka 20  o C). ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 90
 
1.6.3  Testförfarande  
Med användning av doseringspumpar införs en känd koncentration 
av gas i luft i glascylindern. En gnista förs genom blandningen och därvid iakttas om en flamma lösgör sig från antändningskällan och 
självständigt breder ut sig. Gaskoncentrationen varieras i steg på 1 % 
volym tills antändning sker enligt beskrivningen ovan. 
Om man utifrån kännedom om gasens kemiska struktur kan förmoda 
att gasen inte kan antändas och att sammansättningen av den stökio ­
metriska blandningen med luft kan beräknas, behöver man endast 
testa blandningar från 10 % under till 10 % över det stökiometriska blandningsförhållandet.
 
2. DATA  
Förekomsten av flamutbredning är den enda datauppgiften av bety ­
delse för bestämning av denna egenskap.  
3. RAPPORTERING  
Testrapporten ska om möjligt innehålla följande uppgifter: 
— Exakt specificering av ämnet (beteckning och orenheter). — En beskrivning av den använda apparaturen med måttangivelser. 
— Temperaturen vid vilken testet gjordes. 
— Undersökta koncentrationer och erhållna resultat. — Testresultaten: inte antändlig gas eller lättantändlig gas. — Om slutsatsen blir ”inte antändlig”, ska man ange det koncent ­
rationsområde inom vilket provning med 1 % intervaller har skett. 
— Alla uppgifter och upplysningar som är av betydelse för tolk ­
ningen av resultaten ska rapporteras.
 
4. HÄNVISNINGAR  
1. NF T 20-041 (Sept. 85), Chemical products for industrial use. 
Determination of flammability of gases. 
2. W. Berthold, D. Conrad, T. Grewser, H. Grosse-Wortmann, T. 
Redeker och H. Schake. ”Entwicklung einer Standard-Apparatur zur Messung von Explosionsgrenzen”. Chem.-Ing.-Tech., 1984, 
vol. 56, 2, s. 126–127.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 91
 
A.12  ANTÄNDLIGHET (KONTAKT MED VATTEN)  
1. METOD  
1.1 INLEDNING 
Denna testmetod kan användas till att bestämma om ett ämne vid 
reaktion med vatten eller fuktig luft utvecklar farliga mängder gas 
som eventuellt är lättantändliga. 
Testmetoden kan tillämpas på både fasta och flytande ämnen. Denna 
metod kan inte tillämpas på ämnen som antänds spontant i kontakt 
med luft.  
1.2 DEFINITIONER OCH ENHETER 
Lättantändliga: Ämnen som vid kontakt med vatten eller fuktig luft 
utvecklar lättantändliga gaser i farliga mängder med en lägsta has ­
tighet på 1 liter/kg per timme.  
1.3 TESTMETODSPRINCIP 
Ämnet testas enligt det stegförfarande som beskrivs nedan. Testet 
kan avbrytas vid antändning. Om man vet att ämnet inte reagerar våldsamt med vatten kan man börja med steg 4 (1.3.4).
 
1.3.1  Steg 1  
Testämnet placeras i ett tråg innehållande destillerat vatten vid 20  o C 
och därvid iakttas om den utvecklade gasen antänds eller inte.  
1.3.2  Steg 2  
Testämnet placeras på ett filtrerpapper som flyter på ytan av en skål 
innehållande destillerat vatten vid 20  o C, och man iakttar om den 
utvecklade gasen antänds eller inte. Filtrerpapperet fyller endast funktionen att hålla ämnet kvar på plats för att öka möjligheten till 
antändning.
 
1.3.3  Steg 3  
Testämnet formas till en hög, ungefär 2 cm hög och med 3 cm 
diameter. Ett par droppar vatten tillförs högen och man iakttar om den utvecklade gasen antänds eller inte.
 
1.3.4  Steg 4  
Testämnet blandas med destillerat vatten vid 20  o C och gasutveck ­
lingshastigheten mäts varje timme under sju timmar. Om utveck ­
lingshastigheten efter sju timmar är oregelbunden eller ökande ska 
mättiden förlängas till högst fem dagar. Testet kan avbrytas om has ­
tigheten vid något tillfälle överstiger 1 liter/kg per timme.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 92
 
1.4 REFERENSÄMNE 
Inte angivet.  
1.5 KVALITETSKRITERIER 
Inte angivna.  
1.6 METODBESKRIVNING  
1.6.1  Steg 1  
1.6.1.1  Testbetingelser  
Testet utförs vid rumstemperatur (ca 20  o C). 
1.6.1.2  Testförfarande  
En liten mängd (ungefär 2 mm diameter) av testämnet ska placeras i 
ett tråg innehållande destillerat vatten. Det iakttas om a) gas utveck ­
las och b) om gasen antänds. Om gasen antänds behöver ämnet inte undersökas ytterligare eftersom ämnet betraktas som farligt.
 
1.6.2  Steg 2  
1.6.2.1  Apparatur  
Ett filtrerpapper placeras flytande på ytan av destillerat vatten i 
lämpligt kärl, t.ex. en avdunstningsskål med 100 mm diameter.  
1.6.2.2  Testbetingelser  
Testet utförs vid rumstemperatur (ca 20  o C). 
1.6.2.3  Testförfarande  
En liten mängd av testämnet (ungefär 2 mm diameter) placeras i 
mitten av ett filtrerpapper. Det iakttas om a) gas utvecklas och b) om gasen antänds. Om gasen antänds behöver ämnet inte undersökas 
ytterligare eftersom ämnet betraktas som farligt.
 
1.6.3  Steg 3  
1.6.3.1  Testbetingelser  
Testet utförs vid rumstemperatur.  
1.6.3.2  Testförfarande  
Testämnet formas till en hög, ungefär 2 cm hög och med 3 cm 
diameter, med en liten fördjupning i toppen. Ett par droppar vatten tillsätts i fördjupningen och man iakttar om a) gas utvecklas och b) 
om gasen antänds. Om gasen antänds behöver ämnet inte undersökas 
ytterligare eftersom ämnet betraktas som farligt.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 93
 
1.6.4  Steg 4  
1.6.4.1  Apparatur  
Apparaturen monteras enligt figuren.  
1.6.4.2  Testbetingelser  
Undersök om behållaren, i vilken testämnet finns, innehåller pulver < 
500 μm (partikelstorlek). Om pulvret utgör mer än 1 % viktprocent 
av den totala mängden, eller om provet är sprött, ska hela ämnet 
malas till pulver innan det undersöks för att medge en minskning av 
partikelstorleken under lagring och hantering. I övrigt ska ämnet användas i det tillstånd det togs emot. Testet ska utföras vid rums ­
temperatur (20
 o C) och atmosfäriskt tryck.  
1.6.4.3  Testförfarande  
10 till 20 ml vatten tillsätts i apparatens dropptratt, och 10 g av 
ämnet placeras i den koniska kolven. Den gasvolym som utvecklas 
kan mätas med lämplig metod. Kranen på dropptratten öppnas för att 
släppa in vattnet i den koniska kolven och ett stoppur startas. Gas ­
utvecklingen mäts varje timme under en sjutimmarsperiod. Om gas ­
utvecklingen är oregelbunden under denna period, eller om hastig ­
heten för gasutvecklingen ökar vid slutet av denna period, fortsätter 
mätningarna i upp till fem dagar. Om gasutvecklingen vid någon tidpunkt överstiger 1 liter/timme kan testet avbrytas. Detta test ska utföras tre gånger. 
Om gasens kemiska identitet är okänd ska gasen analyseras. Om 
gasen innehåller mycket brandfarliga komponenter och det är okänt 
om hela blandningen är mycket farlig, ska en blandning med samma sammansättning framställas och undersökas enligt testmetod A.11.
 
2. DATA  
Ämnet anses farligt om 
— spontan antändning sker under testförfarandet, 
eller 
— brandfarlig gas utvecklas i högre mängd än 1 liter/kg substans 
per timme.  
3. RAPPORTERING  
Testrapporten ska om möjligt innehålla följande uppgifter: 
— Exakt specificering av ämnet (beteckning och orenheter). — Uppgifter om eventuell inledande behandling av testämnet.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 94
 
— Testresultaten (steg 1, 2, 3 och 4). 
— Den utvecklade gasens kemiska sammansättning. — Gasens utvecklingshastighet och steg 4 (1.6.4) utfördes. 
— Eventuella ytterligare upplysningar som är av betydelse för tolk ­
ningen av resultaten.
 
4. HÄNVISNINGAR  
1. Recommendations on the transport of dangerous goods, test and 
criteria, 1990, United Nations, New York. 
2. NF T 20-040 (Sept. 85). Chemical products for industrial use. 
Determination of the flammability of gases formed by the hydro ­
lysis of solid and liquid products.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 95
 
Tillägg  
Figur  
Apparatur
  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 96
 
A.13  PYROFORISKA EGENSKAPER HOS FASTA OCH FLYTANDE 
ÄMNEN  
1. METOD  
1.1 INLEDNING 
Testförfarandet kan tillämpas på fasta och flytande ämnen som i små 
mängder antänds spontant kort tid efter det att de har kommit kon ­
takt med luft vid rumstemperatur (cirka 20  o C). 
Ämnen som kräver timmar eller dagar vid rumstemperatur eller för ­
höjd temperatur innan de självantänds omfattas inte av denna test ­
metod.  
1.2 DEFINITIONER OCH ENHETER 
Ämnen anses vara mycket brandfarliga om de antänds eller förkolnar 
under de betingelser som beskrivs i 1.6. 
Det kan även vara nödvändigt att undersöka vätskors självantändlig ­
het med metod A.15: Självantändlighetstemperatur (vätskor och ga ­
ser). 
1.3 REFERENSÄMNEN 
Inte angivna.  
1.4 TESTMETODSPRINCIP 
Ämnet, fast eller flytande, blandas med en inaktiv bärare och får 
under fem minuter vara i kontakt med luften vid rumstemperatur. Flytande ämnen som inte fattar eld absorberas sedan de på filterpap ­
per och utsätts under fem minuter för luftens påverkan vid rums ­
temperatur (cirka 20
 o C). Fasta och flytande ämnen som fattar eld 
och vätskor som fattar eld eller får filterpappret att förkolna anses vara självantändliga.
 
1.5 KVALITETSKRITERIER 
Repeterbarhet: Av säkerhetsskäl räcker det med ett positivt resultat 
för att ämnet ska bedömas vara självantändligt.  
1.6 METODBESKRIVNING  
1.6.1  Apparatur  
En porslinskopp, diameter ca 10 cm, fylls med kiselgur upp till 
ungefär 5 mm höjd vid rumstemperatur (ca 20  o C). 
Anmärkning: 
Kiselgur eller annat jämförbart inert ämne som är allmänt tillgängligt 
ska anses vara representativt för jord på vilken testämnet kan spillas ut vid en olyckshändelse. 
Det behövs ett torrt filterpapper för att testa vätskor som inte fattar 
eld vid kontakt med luften när de blandas med en inaktiv bärare.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 97
 
1.6.2  Testförfarande  
a) Pulverformiga fasta ämnen  
1–2 cm  3 av det pulverformiga testämnet hälls från cirka 1 m höjd på 
en icke brännbar yta, varvid iakttas om ämnet antänds under fallet 
eller innan det har gått fem minuter efter det att det har lagt sig. 
Testet utförs sex gånger såvida inte antändning sker.  
b) Vätskor  
Cirka 5 cm  3 av testvätskan hälls i den förberedda porslinskoppen, 
varvid iakttas om ämnet antänds inom fem minuter. 
Orn inte antändning sker i något av de sex testerna utförs följande 
test: 
Med en injektionsspruta sprutas 0,5 ml av provet på ett böjt filter ­
papper och det observeras om antändning eller förkolning av filter ­
pappret sker inom fem minuter. Testet utförs tre gånger såvida inte antändning eller förkolning sker.
 
2. DATA  
2.1 TOLKNING AV RESULTAT 
Testet kan avbrytas så snart som ett av testen ger positivt resultat.  
2.2 UTVÄRDERING 
Om ämnet fattar eld inom fem minuter efter det har tillsatts till en 
inaktiv bärare och exponeras för luft, eller en vätska får en bit 
filterpapper att förkolna eller fatta eld inom fem minuter efter det att ämnet tillsatts och utsatts för luftens påverkan anses ämnet själ ­
vantändligt.
 
3. RAPPORTERING  
Testrapporten ska om möjligt innehålla följande uppgifter: 
— Exakt specificering av ämnet (beteckning och orenheter). 
— Testresultaten. 
— Eventuella ytterligare upplysningar som är av betydelse för tolk ­
ningen av resultaten.  
4. HÄNVISNINGAR  
1. NF T 20-039 (Sept. 85). Chemical products for industrial use. 
Determination of the spontaneous flammability of solids and liquids. 
2. Recommendations on the Transport of Dangerous Goods, Test 
and Criteria, 1990, United Nations, New York.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 98
 
A.14  EXPLOSIVA EGENSKAPER  
1. METOD  
1.1 INLEDNING 
Metoden innefattar ett testschema för att bestämma om ett fast, fly ­
tande eller pastaaktigt ämne eller preparat utgör en explosionsfara 
om det utsätts för påverkan av en öppen låga (värmesensitivitet) eller slag- eller friktionspåverkan (sensitivitet för mekanisk påverkan) och om ett flytande ämne utgör en explosionsfara om det utsätts för 
påverkan av en öppen låga eller slag. 
Metoden består av tre delar: 
a) test av värmesensitiviteten (se hänvisning 1), 
b) test av mekanisk sensitivitet avseende slagpåverkan (se hänvis ­
ning 1), 
c) test av mekanisk sensitivitet avseende friktionspåverkan (se hän ­
visning 1). 
Metoden ger data för att utvärdera sannolikheten att det vid vissa 
ovanliga påverkningar framkallas en explosion. Metoden är inte av ­
sedd att säkerställa om ett ämne över huvud taget kan explodera. 
Metoden är lämplig för att bestämma om ett ämne innebär en ex ­
plosionsfara (värme- och mekanisk känslighet) under de särskilda 
betingelser som anges i direktivet. Metoden grundas på ett antal apparater som är allmänt använda internationellt (se hänvisning 1) och som vanligtvis ger användbara resultat. Det erkänns att metoden 
inte är definitiv. Alternativ apparatur kan användas förutsatt att den 
är internationellt erkänd och att de erhållna resultaten kan korreleras med de resultat som erhållits med den angivna apparaturen. 
Testen behöver inte utföras om det enligt föreliggande termodyna ­
miska uppgifter (t.ex. bildningsvärme, nedbrytningsvärme) och/eller 
frånvaro av vissa reaktiva grupper (se hänvisning 2) i strukturformeln 
är ställt utom rimligt tvivel att ämnet inte kan brytas ned, bilda gaser och frigöra värme mycket snabbt (dvs. materialet utgör inte någon explosionsrisk). Ett test av mekanisk sensitivitet avseende friktion 
krävs inte för flytande ämnen.
 
1.2 DEFINITIONER OCH ENHETER 
Explosiva: 
Ämnen som kan explodera när de utsätts för en öppen låga eller som 
är känsliga för slag och friktion i den angivna apparaturen (eller är 
mer mekaniskt känsliga än 1,3-dinitrobensen i alternativ apparatur).  
1.3 REFERENSÄMNE 
1,3-dinitrobensen, teknisk kristallinprodukt som siktats genom 
0,5 mm, för friktions- och slagpåverkanmetoden. 
Perhydro-l,3,5-trinitro-l,3,5-triazin (RXD, hexogen, cyclonit – CAS 
121-82-4), omkristalliserad från vattnigt cyclohexanon, våtsiktad ge ­
nom en 250 μm och bibehållen i en 150 μm sil, torkad vid 103 ± 
2 o C (i 4 timmar) för den andra serien av friktions- och slagtester.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 99
 
1.4 TESTMETODSPRINCIP 
Förberedande tester är nödvändigt för att fastställa säkra betingelser 
för utförandet av de tre sensitivitetstestet:  
1.4.1  Test för säkerhet vid hantering (se hänvisning 3)  
Av säkerhetsskäl ska, innan huvudtestet inleds, mycket små prov 
(cirka 10 mg) av ämnet utsättas för upphettning, utan att vara inne ­
slutna, med en gaslåga, för slagpåverkan i lämplig typ av apparatur 
och friktionspåverkan genom användning av en hammare mot ett städ eller någon typ av friktionsmaskin. Syftet är att fastställa om ämnet är så sensitivt och explosivt att de föreskrivna sensitivitets ­
testerna, särskilt test av värmekänsligheten, ska utföras med särskilda 
försiktighetsåtgärder för att undvika att den som utför testen skadas.
 
1.4.2  Värmekänslighet  
Metoden innebär att ämnet värms upp i ett stålrör som stängs med en 
strypfläns med olika håldiametrar. På detta sätt kan man bestämma om ämnet är benäget att explodera under intensiv värmepåverkan vid väl definierad inneslutning.
 
1.4.3  Mekanisk känslighet (slagpåverkan)  
Metoden innebär att ämnet utsätts för slagpåverkan från en bestämd 
massa från en bestämd höjd.  
1.4.4  Mekanisk känslighet (friktion)  
Metoden innebär att ämnet eller preparatet utsätts för friktion mellan 
standardytor under specificerade betingelser för belastning och relativ 
rörelse.  
1.5 KVALITETSKRITERIER 
Inte angivna.  
1.6 METODBESKRIVNING  
1.6.1  Värmekänslighet (effekt av öppen liga)  
1.6.1.1  Apparatur  
Apparaturen består av ett engångsstålrör med en återanvändbar 
stängningsanordning (se figur 1) som placeras i en uppvärmnings- 
och skyddsanordning. Röret är tillverkat av djupdragen stålplåt (se 
tillägg) och har en innerdiameter av 24 mm, en längd av 75 mm och en väggtjocklek av 0,5 mm. I den öppna änden är röret flänsat så att det kan slutas med strypflänsanordningen (figur 1). Detta består av 
en tryckmotståndskraftig skyddsfläns med ett hål i mitten, som är 
stadigt förankrad till ett rör genom ett tvådelat skruvförband (mutter och gängad krage). Muttern och den gängade kragen är tillverkade av krom-manganstål (se tillägg), vilket är gnistfritt upp till 800
 o C. 
Det finns strypflänsar med en rad olika håldiametrar, som är gjorda 
av 6 mm tjockt värmebeständigt stål (se tillägg).  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 100
 
1.6.1.2  Testbetingelser  
Normalt testas ämnet i den form det är mottaget, men i vissa fall, 
t.ex. om det är pressat, gjutet eller på annat sätt sammanpressat, kan det vara nödvändigt att testa ämnet efter sönderdelning. 
För fasta ämnen bestäms den mängd material som ska användas för 
varje test genom ett förfarande i två steg. I det första steget fylls ett tarterat rör med 9 cm
 3 av ämnet som sammanpressas med en kraft av 
80 N fördelat över hela rörtvärsnittet. Av säkerhetsskäl, eller om 
ämnet kan ändra fysisk form vid kompression, kan andrapåfyllnings ­
förfaranden användas. Sammanpressning är t.ex. inte lämpligt om ämnet är mycket friktionskänsligt. Om materialet kan komprimeras 
tillsätts och sammanpressas mera tills röret är fyllt till en höjd av 
55 mm från överkanten. Den totala mängd som har använts för att fylla röret till denna höjd bestäms och ytterligare 2 portioner som sammanpressas med en kraft av 80 N tillsätts. Därefter tillsätts ma ­
terial genom sammanpressning eller så avlägsnas material tills röret 
är fyllt till 15 mm från överkanten. Det andra steget består i att en tredjedel av den samlade mängd som användes i det första steget tillsätts och sammanpressas. Därefter tillsätts ytterligare 2 portioner 
som sammanpressas med en kraft av 80 N och materialets höjd i 
röret justeras till 15 mm från överkanten genom tillsättning eller avlägsnande av material. Vid varje försök används den mängd fast ämne som har fastställts i detta andra steg. Påfyllningen sker i tre 
lika stora portioner som var och en komprimeras till 9 cm
 3 med den 
kraft som krävs. (Detta är lättast att göra genom användning av avståndsringar.) 
Vätskor och geléaktiga ämnen fylls i röret till en höjd av 60 mm 
varvid försiktighet iakttas med geléaktiga ämnen för att undvika 
luftbubblor under påfyllning. Den gängade kragen förs upp på röret underifrån, den valda strypflänsen sätts in och muttern åtstramas efter smörjning med ett molybdensulfidbaserat smörjmedel. Det är viktigt 
att kontrollera att inget ämne har fastnat mellan flänsen och plattan 
eller i gängorna. 
Uppvärmningen sker med propan, som från en industriell cylinder 
med tryckreglator (60–70 mbar) leds genom en mätare och fördelas 
jämnt till fyra brännare genom en anslutning (vilket kontrolleras 
genom visuell inspektion av brännarnas lågor).
 
1.6.1.3  Testförfarande  
Varje test pågår tills röret antingen sönderdelas eller har varit upp ­
värmt i 5 minuter. Ett test vid vilket röret sönderdelas i tre eller flera fragment, som eventuellt hänger ihop med smala metallstrimlor en ­
ligt figur 2, betraktas som en explosion. Ett test som leder till färre 
fragment eller ingen fragmentering betraktas inte som en explosion.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 101
 
Först utförs tre tester med en strypfläns med ett 6 mm hål, och om 
ingen explosion sker utförs ytterligare tre test med en strypfläns med 
ett 2 mm hål. Om explosion sker under ett av dessa tester är ytter ­
ligare testning inte nödvändig.  
1.6.1.4  Utvärdering  
Testresultatet anses positivt om en explosion inträffar i en av ovan 
nämnda testserier.  
1.6.2  Mekanisk sensitivitet (slagpåverkan)  
1.6.2.1  Apparatur (figur 4)  
En typisk fallhammarapparatur består i huvudsak av ett gjuts ­
tålsblock med fot, städ, pelare, gejder, fallvikter, utlösningsmekanism 
och provhållare. Stålstädet, 100 mm (diameter) × 70 mm (höjd) är fastskruvat ovanpå ett stålblock, 230 mm (längd) × 250 mm (bredd) × 200 mm (höjd) med gjuten fot, 450 mm (längd) × 450 mm (bredd) 
× 60 mm (höjd). En pelare bestående av en heldraget stålrör är 
fastsatt i en hållare som är fastskruvad bak på stålblocket. Apparaten är förankrad i ett massivt betongblock, 60 x 60 x 60 cm med fyra 
skruvar, så att gejderna är fullständigt lodräta och fallvikterna kan 
falla fritt. Det finns fallvikter på 5 och 10 kg framställda i massivt stål. Slagvikternas slagyta är av härdat stål, HRC 60–63, och har en diameter av minst 25 mm. 
Provet placeras i en slaganordning som består av två massiva stål ­
cylindrar som är placerade koaxialt ovanför varandra i en ihålig 
cylindrisk styrring av stål. Stålcylindrarna ska ha en diameter av 10 (–0,003, –0,005) mm och en höjd av 10 mm och ha polerade ytor, rundade kanter (kurvradie 0,5 mm) och en hårdhet av HRC 
58–65. Den ihåliga cylindern ska ha en utvändig diameter av 16 mm, 
en polerad urborrning av 10 (+0,005, +0,010) mm och en höjd av 13 mm. Slaganordningen samlas på ett mellanstäd (diameter 26 mm, höjd 26 mm) av stål och centreras med en ring i vilken det finns 
perforeringar för att leda bort rökgaser.
 
1.6.2.2  Testbetingelser  
Provet ska ha en volym på 40 mm  3 eller en volym som passar till en 
alternativ apparatur. Fasta ämnen testas i torrt tillstånd och förbereds enligt följande: 
a) Pulverformiga ämnen siktas (siktstorlek 0,5 mm); allt som har 
passerat sikten används till testet. 
b) Pressade, gjutna eller på annat sätt sammanpressade ämnen sön ­
derdelas och siktas, siktfraktioner från 0,5–1 mm i diameter an ­
vänds vid testet. 
Ämnen som normalt förekommer i pastaform bör om möjligt testas i 
torrt tillstånd och under alla omständigheter efter borttagning av så 
mycket upplösningsmedel som möjligt. Vätskor testas med ett av ­
stånd av 1 mm mellan den översta och den nedersta stålcylindern.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 102
 
1.6.2.3  Testförfarande  
En serie av sex tester utförs i vilka den 10 kg tunga massan får falla 
från 0,40 m (40 J). Om en explosion erhålls under de sex testerna vid 40 J måste en andra serie bestående av sex tester utföras i vilka 
en 5 kg tung massa får falla från 0,15 m (7,5 J). I andra apparaturer 
jämförs provet med det valda referensämnet med användning av ett fastställt förfarande (tvåslagsteknik osv.).
 
1.6.2.4  Utvärdering  
Testresultatet anses positivt om en explosion (eldutveckling och knall 
är likvärdiga med explosion) inträffar minst en gång i ett av testerna 
med den beskrivna slagapparaturen eller provet är mer sensitivt än 1,3-dinitrobensen eller RXD i en alternativt slagpåverkantest.
 
1.6.3  Mekanisk sensitivitet (friktion)  
1.6.3.1  Apparatur (figur 5)  
Friktionsapparaturen består av en bottenplatta av gjuten stål på vil ­
ken själva friktionsanordningen är monterad. Denna består av en fast 
porslinspinne och rörliga porslinsplåtar. Porslinsplåten är fäst i en glidbar vagga som rör sig mellan två skenor. Vaggan drivs via en 
drivstång, en excentrisk trissa och en överföringsväxel av en elekt ­
risk motor på sådant sätt att porslinsplåten rörs under porslinspinnen med en bakåt- och framåtgående rörelse på 10 mm. Porslinspinnen ska belastas med t.ex. 120 eller 360 newton. 
Porslinsplattorna är tillverkade av vitt tekniskt porslin (upprugg ­
ningsdjup 9–32 μm) och har dimensionerna 25 mm (längd) × 
25 mm (bredd) × 5 mm (höjd). Även den cylindriska porslinspinnen är tillverkad av vitt tekniskt porslin, är 15 mm lång, har en inner ­
diameter på 10 mm och uppruggade sfäriska ändytor med en rund ­
ningsradie på 10 mm.
 
1.6.3.2  Testbetingelser  
Provet ska ha en volym av 10 mm  3 eller en volym som passar till en 
alternativ apparatur. 
Fasta ämnen testas i torrt tillstånd och förbereds enligt följande: 
a) Pulverformiga ämnen siktas (siktstorlek 0,5 mm); allt som har 
passerat sikten används till testet. 
b) Pressade, gjutna eller på annat sätt sammanpressade ämnen sön ­
derdelas och siktas, siktfraktioner < 0,5 mm i diameter används 
vid testet. 
Ämnen som normalt förekommer i pastaform bör om möjligt testas i 
torrt tillstånd. Om ämnet inte kan testas i torrt tillstånd ska pastan (efter borttagning av så mycket upplösningsmedel som möjligt) testas 
som en 0,5 mm tjock, 2 mm bred och 10 mm lång film, som fram ­
ställs med en speciell form.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 103
 
1.6.3.3  Testförfarande  
Porslinspinnen anbringas på testprovet och vikten hängs på. När 
testet utförs ska slipmärkena på porslinsplattan ligga tvärs emot rö ­
relseriktningen. Kontrollera noggrant att pinnen vilar på provet, att 
tillräckligt med testämne ligger under pinnen och att plattan rör sig 
korrekt under pinnen. För pastaaktiga ämnen används en 0,5 mm tjock form med en hål av 2 × 10 för att anbringa ämnet på plattan. Porslinsplattan ska flytta sig 10 mm fram och tillbaka under pors ­
linspinnen under 0,44 sekunder. Varje del av porslinsplattan och 
porslinspinnen får endast användas en gång. Varje pinnes två ändar räcker till två försök och de två ytorna på en platta räcker vardera för 
tre försök. 
Sex försök med en belastning av 360 N utförs. Om en explosion 
förekommer i ett av dessa sex försök utförs en ny serie med sex 
försök med en belastning av 120 N. I andra apparater jämförs proven med det valda referensämnet med hjälp av ett fastställt förfarande 
(t.ex. up- and down-teknik).
 
1.6.3.4  Utvärdering  
Testresultatet anses positivt om en explosion (krepitation, eldutveck ­
ling och knall är likvärdiga med explosion) inträffar minst en gång i 
ett av testerna med den beskrivna friktionsapparaturen eller de mot ­
svarande kriterierna i ett alternativ friktionstest är uppfyllda.  
2. DATA  
Ett ämne anses i princip vara explosionsfarligt i direktivets bemär ­
kelse om ett positivt resultat erhålls i testet av värmesensitivitet, slagpåverkantest eller friktionspåverkantest.
 
3. RAPPORTERING  
3.1 TESTRAPPORT 
Testrapporten ska om möjligt innehålla minst följande uppgifter: 
— Testämnets beteckning, sammansättning, renhet, fukthalt osv. — Provets fysiska form och om det har krossats, brutits eller siktats. — Iakttagelser under värmesensitivitetstestet (t.ex. provmassa, antal 
fragment). 
— Iakttagelser under testet av mekanisk känslighet (t.ex. avsevärd 
rökutveckling eller fullständig nedbrytning utan knall, lågor, gnistor, sprakning). 
— Resultat för varje test. — Vetenskapliga grunder för eventuell användning av alternativ ap ­
paratur, samt tecken på korrelation mellan resultat som erhållits 
med beskriven apparatur och de som erhållits med likvärdig 
apparatur.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 104
 
— Alla relevanta kommentarer, t.ex. hänvisning till test med lik ­
nande produkter, som kan vara av betydelse för en korrekt tolk ­
ning av resultaten. 
— Alla ytterligare kommentarer som är relevanta för tolkning av 
resultaten.  
3.2 TOLKNING OCH UTVÄRDERING AV RESULTAT 
I testrapporten ska alla resultat som anses vara falska, avvikande 
eller icke representativa anges. Om något resultat ska bortses från 
ska en förklaring ges och resultaten av ett alternativt eller komplet ­
terande test anges. Om ett avvikande resultat inte kan förklaras på detta sätt ska det godtas för vad det är och i enlighet därmed an ­
vändas vid klassificering av ämnet.
 
4. HÄNVISNINGAR  
1. Recommendations on the Transport of Dangerous Goods: Test 
and criteria., 1990, Förenta nationerna, New York. 
2. Bretherick, L., Handbook of Reactive Chemical Hazards, 4th 
edition, Butterworths, London, ISBN 0-750- 60103-5, 1990. 
3. Koenen, H., Ide, K. och Swart, K. H., Explosivstoffe, 1961, 
vol. 3, s. 6–13 och 30–42. 
4. NF T 20-038 (Sept. 85), Chemical products for industrial use – 
Determination of explosion risk.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 105
 
Tillägg  
Exempel på materialspecifikation för värmesensitivitetstestet (se DIN 1623)  
1. Rör: Materialspecifikation nr 1.0336.505 g. 
2. Strypfläns: materialspecifikation nr 1.4873. 3. Gängad krage och mutter: materialspecifikation nr 1.3817.
 
Figur 1  
Apparatur för värmesensitivitetstest  
(Alla mått i mm)
  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 106
 
Figur 2  
Värmesensitivitetstest  
Exempel på fragmentering
  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 107
 
Figur 3  
Kalibrering av uppvärmningshastigheten vid test av värmesensitivitet
  
Kurvan över temperaturförloppet mot tiden vid uppvärmning av dibutylftalat (27 cm  3 ) i ett 
stängt rör (strypfläns med 1,5 mm hål) med ett propanflöde av 3,2 liter/minut. Temperaturen är 
mätt med kromel/alumel-termoelement med 1 mm inkapsling i rostfritt stil, placerat centralt 
43 mm under rörens överkant. Mellan 135  o C och 285  o C ska uppvärmningshastigheten vara 
185–215 K/minut.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 108
 
Figur 4  
Slagpåverkanapparatur 
(Alla mått i mm)
  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 109
 
Figur 4  
Fortsättning
  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 110
 
Figur 5  
Apparatur för friktionssensitivitet
  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 111
 
A.15  SJÄLVANTÄNDNINGSTEMPERATUR (VÄTSKOR OCH GASER)  
1. METOD  
1.1 INLEDNING 
Explosiva ämnen och ämnen som antänds spontant vid kontakt med 
luft vid omgivningstemperatur, ska inte användas vid detta test. Test ­
förfarandet får tillämpas på gaser, vätskor och ångor som i närvaro av luft kan antändas av en varm yta. 
Självantändningstemperaturen kan sänkas avsevärt vid förekomst av 
katalytiska orenheter, av ytmaterialet eller av en större volym på 
testkärlet.
 
1.2 DEFINITIONER OCH ENHETER 
Graden av självantändlighet uttrycks som självantändningstempera ­
turen. Självantändningstemperaturen är den lägsta temperatur vid vilken testämnet antänds när det blandas med luft under de beting ­
elser som definierats för testmetoden.
 
1.3 REFERENSÄMNEN 
Referensämnen återges i standarderna (1.6.3). De ska först och 
främst användas till att emellanåt kalibrera metoden och till att möj ­
liggöra en jämförelse av resultaten från andra metoder.  
1.4 TESTMETODSPRINCIP 
Med denna metod bestäms den lägsta temperaturen hos den invän ­
diga ytan i ett slutet rum, vid vilken en gas, ånga eller vätska som sprutas in i rummet, fattar eld.
 
1.5 KVALITETSKRITERIER 
Repeterbarheten varierar beroende på självantändlighetens tempera ­
turområde och den använda testmetoden. 
Sensitiviteten och specificiteten beror på den använda testmetoden.  
1.6 METODBESKRIVNING  
1.6.1  Apparatur  
Apparaturen finns beskriven i den metod som avses i 1.6.3.  
1.6.2  Testbetingelser  
Ett prov av testämnet undersöks enligt den metod som avses i 1.6.3.  
1.6.3  Testförfarande  
Se IEC 79-4, DIN 51794, ASTM-E 659-78, BS 4056, NF T 20-037.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 112
 
2. DATA  
Testtemperaturen, atmosfäriskt tryck, mängden använt prov och tids ­
intervall registreras innan antändning sker.  
3. RAPPORTERING  
Testrapporten ska om möjligt innehålla följande uppgifter: 
— Exakt specifikation av ämnet (beteckning och orenheter). — Mängden använt prov, atmosfäriskt tryck. — Använd apparatur. 
— Mätresultaten (testtemperaturer, resultat beträffande antändning, 
motsvarande tidsintervall). 
— Alla ytterligare upplysningar som är av betydelse för tolkningen 
av resultaten.
 
4. HÄNVISNINGAR  
Inga. ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 113
 
A.16  RELATIV SJÄLVANTÄNDNINGSTEMPERATUR (FASTA 
ÄMNEN)  
1. METOD  
1.1 INLEDNING 
Explosiva ämnen och ämnen som antänds spontant vid kontakt med 
luft vid omgivningstemperatur ska inte användas vid detta test. 
Syftet med detta test är att få preliminära uppgifter om fasta ämnens 
självantändlighet vid förhöjda temperaturer. 
Om den värme som utvecklas, antingen genom ämnets reaktion med 
syre eller genom exoterm nedbrytning, inte avges tillräckligt snabbt 
till omgivningen inträffar en självuppvärmning som leder till självan ­
tändning. Självantändning inträffar således när värmeproduktionens hastighet överstiger värmeförlustens hastighet. 
Tcstförfarandet är värdefullt som ett förberedande screentest för fasta 
ämnen. Med tanke på det komplicerade förhållandet vid antändning och förbränning av fasta ämnen, ska självantändningstemperaturen 
som bestäms enligt denna metod endast användas i jämförande syfte.
 
1.2 DEFINITIONER OCH ENHETER 
Den självantändningstemperatur som erhållits med denna metod är 
den lägsta omgivningstemperatur, uttryckt i  o C, vid vilken en viss 
volym av ett ämne självantänds under definierade betingelser.  
1.3 REFERENSÄMNEN 
Inga.  
1.4 TESTMETODSPRINCIP 
En viss volym av testämnet placeras i en ugn vid rumstemperatur; 
temperatur-/tidskurvan avseende betingelserna i provets mitt registre ­
ras medan temperaturen i ugnen ökas till 400  o C, eller till smält ­
ningspunkten om denna är lägre, med en hastighet av 0,5  o C per 
minut. Den ugnstemperatur vid vilken provets temperatur uppnår 
400  o C genom självuppvärmning kallas i detta test självantändnings ­
temperaturen.  
1.5 KVALITETSKRITERIER 
Inga.  
1.6 METODBESKRIVNING  
1.6.1  Apparatur  
1.6.1.1  Ugn  
En temperaturprogrammerad laboratorieugn (volym ca 2 liter) utrus ­
tad med naturlig luftcirkulation och explosionssäkring. För att und ­
vika eventuell explosionsrisk ska det säkerställas att nedbrytnings ­
gaser inte kan komma i kontakt med de elektriska värmeelementen.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 114
 
1.6.1.2  Kub av ståltrådsnät  
En bit rostfritt ståltrådsnät med 0,045 mm maskor skärs till enligt 
mallen i figur 1. Nätet viks och fästs ihop med tråd till kuber som är öppna på ovansidan.
 
1.6.1.3  Termoelement  
Passande termoelement.  
1.6.1.4  Skrivare  
Valfri tvåkanalsskrivare som ar kalibrerad från 0 till 600  o C eller 
motsvarande spänning.  
1.6.2  Testbetingelser  
Ämnen testas i sin kommersiella form.  
1.6.3  Testförfarande  
Kuben fylls med testämnet och slås med lätta slag varefter ytterligare 
ämne tillsätts tills kuben är helt fylld. Provet hängs därefter upp i mitten av ugnen vid rumstemperatur. Ugnstemperaturen registreras 
med ett termoelement som är placerat mitt i kuben och ett annat som 
är placerat mellan kuben och ugnsväggen. 
Ugnens och provets temperaturer avläses fortlöpande medan ugn ­
stemperaturen ökas till 400
 o C eller till smältpunkten, om denna är 
lägre, med en hastighet av 0,5  o C per minut. 
När ämnet antänds visar termoelementet i provet en mycket kraftig 
temperaturhöjning över ugnstemperaturen.  
2. DATA  
Den ugnstemperatur vid vilken provets temperatur uppnår 400  o C ge­
nom självuppvärmning är av betydelse för utvärderingen (se figur 2).  
3. RAPPORTERING  
Testrapporten ska om möjligt innehålla följande uppgifter: 
— En beskrivning av testämnet. 
— Mätresultaten inklusive temperatur/tidskurvor. — Alla ytterligare upplysningar som är av betydelse för tolkningen 
av resultaten.
 
4. HÄNVISNINGAR  
NF T 20-036 (September 1985). Chemical products for industrial 
use. Determination of the relative tempe-rature of the spontaneous 
flammability of solids.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 115
 
Figur 1  
Mall till 20 mm testkub
  
Figur 2  
Typisk temperatur/tidskurva
  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 116
 
A.17  OXIDERANDE EGENSKAPER (FASTA ÄMNEN)  
1. METOD  
1.1 INLEDNING 
Vid utförande av detta test är det värdefullt att ha förhandskunskap 
om ämnets potentiellt explosiva egenskaper och toxicitet. 
Testet får inte tillämpas på vätskor och gaser, explosiva eller mycket 
brandfarliga ämnen eller organiska peroxider. 
Detta test behöver inte utföras om en undersökning av strukturfor ­
meln fastslår utom rimligt tvivel att ämnet inte kan reagera exotermt 
med ett brännbart material. 
För att säkerställa om testet ska utföras med iakttagande av särskilda 
försiktighetsåtgärder, ska ett förberedande test utföras.  
1.2 DEFINITIONER OCH ENHETER 
Bränntid: Den reaktionstid, i sekunder, som krävs för att reaktionszonen 
breder ut sig längs en hög, enligt det förfarande som beskrivs i 1.6. 
Brännhastighet: Uttrycks i mm per sekund. Maximal brännhastighet: det högsta värdet för brännhastigheter som 
erhållits för blandningar innehållande 10–90 viktprocent av det ox ­
iderande ämnet.
 
1.3 REFERENSÄMNE 
Bariumnitrat (analytisk kvalitet) används som referensämne för testet 
och det inledande screeningtestet. 
Referensblandningen är den blandning av bariumnitrat och cellulo ­
sapulver som framställts enligt 1.6 och som har den maximala bränn ­
hastigheten (vanligtvis en blandning med 60 viktprocent barium ­
nitrat).  
1.4 TESTMETODSPRINCIP 
Av säkerhetsskäl utförs ett inledande screeningtest. Detta test är till ­
räckligt om det klart utvisar att testämnet eller testpreparatet har oxiderande egenskaper. Om så inte är fallet ska ämnet eller prepa ­
ratet underkastas ett fullständigt test. 
Vid det fullständiga testet ska testämnet och en definierat brännbart 
ämne blandas i olika proportioner. Varje blandning formas sedan till 
en hög som antänds i ena änden. Den maximala brännhastigheten bestäms därefter och jämförs med referensblandningens maximala brännhastighet.
 
1.5 KVALITETSKRITERIER 
Om så behövs kan valfri malnings- och blandningsmetod användas, 
förutsatt att skillnaden mellan den maximala brännhastigheten i de 
sex separata testen inte avviker mer än 10 % från det aritmetiska 
medelvärdet.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 117
 
1.6 METODBESKRIVNING  
1.6.1  Förberedelser  
1.6.1.1  Testämne  
Testprovet reduceras till en partikelstorlek < 0,125 mm enligt föl ­
jande förfarande: Sikta testämnet; mal återstående fraktion, upprepa 
förfarandet tills hela testfraktionen har passerat sikten. 
Valfri malnings- och siktningsmetod som uppfyller kvalitetskriteri ­
erna får användas. 
Innan blandningen framställs ska ämnet torkas vid 105  o C tills kon ­
stant vikt har uppnåtts. Om testämnets nedbrytningstemperatur är 
lägre än 105  o C ska ämnet torkas vid en passande lägre temperatur.  
1.6.1.2  Brännbart ämne  
Cellulosapulver används som brännbart ämne. Cellulosan ska vara av 
den typ som används vid tunnskiktskromatografi eller kolonnkro ­
matografi. En typ där mer än 85 % av fiberlängderna ligger mellan 
0,020 och 0,075 mm har visat sig vara lämplig. Cellulosapulvret 
passerar genom en sikt med en maskstorlek på 0,125 mm. Samma blandning ska användas i hela testet. 
Innan blandningen framställs ska ämnet torkas vid 105
 o C tills kon ­
stant vikt har uppnåtts. 
Om trämjöl används i det förberedande testet ska ett barrvedsmjöl 
tillredas genom att den del som passerar en sikt med maskstorleken 
1,6 mm insamlas, blandas noggrant och sedan torkas vid 105  o C i 
fyra timmar i ett högst 25 mm tjockt lager. Efter avkylning ska det förvaras i en lufttät behållare, fylld till brädden, tills det ska använ ­
das, helst inom 24 timmar efter torkning.
 
1.6.1.3  Antändningskälla  
Som antändningskälla används lågan från en gasbrännare (minsta 
diameter 5 mm). Om en annan antändningskälla används (t.ex. vid testning i en inert atmosfär) ska en beskrivning och en motivering bifogas.
 
1.6.2  Testförfarande  
Anmärkning:  
Blandningar av oxiderande ämnen med cellulosa eller trämjöl ska 
behandlas som potentiellt explosiva och hanteras med vederbörlig försiktighet.
 
1.6.2.1  Förberedande test  
Det torkade ämnet blandas med det torkade cellulosapulvret eller 
trämjöl i proportionerna 2 viktdelar av testämnet till 1 viktdel cellu ­
losa eller träm)öl och blandningen formas till en liten konformad hög med måtten 3,5 cm (basens diameter) × 2,5 cm (höjd) genom att en 
konliknande form (t.ex. ett laboratorieglastratt vars pip är tillsluten) 
fylls, utan att packas.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 118
 
Högen placeras på en kall, icke ledande, ogenomtränglig basplatta. 
Testet ska utföras i ett dragskåp som i 1.6.2.2. 
Antändningskällan sätts i kontakt med konen. Kraften och varaktig ­
heten av den påföljande reaktionen iakttas och registreras. 
Ämnet anses vara oxiderande om reaktionen är kraftfull. 
Om resultaten på något sätt är tvetydiga ska det nedan beskrivna 
fullständiga testförfarandet utföras.  
1.6.2.2  Fullständigt test  
En blandning av oxiderande ämne och cellulosa, innehållande 10–90 
viktprocent oxiderande ämne, framställs i steg om 10 viktprocent. I 
gränsfall ska mellanblandningar av oxiderande ämne och cellulosa användas för att få fram en noggrannare maximal brännhastighet. 
Högen byggs upp med användning av en form. Formen är tillverkad 
av metall, har en längd på 250 mm, och en triangelformad tvärsnitts ­
sektion med en inre höjd på 10 mm och en inre bredd på 20 mm. På 
båda sidor om formen monteras i längdriktningen två sidoavgrän ­
sande metallplåtar som skjuter upp 2 mm ovanför den triangelfor ­
made tvärsnittssektionens övre kant (se figuren). Denna anordning 
fylls löst och med råge av blandningen. Efter det att formen har fatt 
falla en gång från 2 cm höjd på en fast yta skrapas återstående överskottsämne bort med en skråställd platta. Därefter avlägsnas sidoavgränsningarna och resterande pulver slätas ut med en kavel. 
En icke-brännbar plåt placeras sedan ovanpå formen, apparaturen 
vänds och formen avlägsnas. 
Högen placeras i dragskåpet tvärs över luftdragets riktning. Lufthastigheten ska vara så hög att den förhindrar att rökgaser släpps 
ut till laboratoriet och ska inte varieras under testet. En dragskärm ska placeras runt apparaturen. 
Eftersom cellulosan och testämnena är hygroskopiska ska testet ut ­
föras så snabbt som möjligt. 
Ena änden av högen tänds på genom beröring av lågan. När reaktionszonen har förflyttat sig de första 30 mm mäts reaktions ­
tiden över följande 200 mm. 
Testet utförs med referensämnet och minst en gång med varje serie 
av blandningar av testämnet och cellulosa. 
Om den maximala brännhastigheten konstateras vara signifikant 
högre än referensämnets, kan testet avbrytas. I annat fall ska testet 
upprepas fem gånger med de tre blandningar som gav de högsta 
brännhastigheterna.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 119
 
Om man misstänker att resultatet är felaktigt positivt upprepas testet 
med ett inert ämne med motsvarande partikelstorlek, t.ex. kiselgur, i 
stället för cellulosa. Alternativt kan den blandning av testämne och cellulosa som har den snabbaste reaktionshastigheten testas i inert atmosfär (< 2 % v/v syreinnehåll).
 
2. DATA  
Av säkerhetsskäl ska den maximala brännhastigheten – inte medel ­
värdet – anses vara testämnets karakteristiska oxiderande egenskap. 
Det högsta värdet för brännhastighet som erhålls vid en testomgång 
med sex test av en given blandning är relevant for utvärderingen. 
Rita en kurva över det högsta värdet för brännhastighet för varje 
blandning som en funktion av dess innehåll av oxiderande medel. Bestäm den maximala brännhastigheten utifrån kurvan. 
De sex matta värdena för brännhastighet, som vid en testomgång 
erhållits för blandningen med den maximala brännhastigheten, får 
inte avvika mer än 10 % från det aritmetiska medelvärdet. I annat fall ska malnings- och blandningsmetoderna förbättras. 
Jämför den erhållna maximala brännhastigheten med referensbland ­
ningens maximala brännhastighet (se 1.3). 
Om testen utförs i en inert atmosfär jämförs den maximala bränn ­
hastigheten med den från referensblandningen i en inert atmosfär.
 
3. RAPPORTERING  
3.1 TESTRAPPORT 
Testrapporten ska om möjligt innehålla följande uppgifter: 
— Testämnets beteckning, sammansättning, renhet, fukthalt osv. — Eventuell behandling av testprovet (t.ex. malning eller torkning). — Använd antändningskälla. — Mätresultaten. — Reaktionssättet (t.ex. brinnande låga vid ytan, genombränning av 
hela massan och alla uppgifter om för bränningsprodukter). 
— Alla ytterligare upplysningar som är av betydelse för tolkningen 
av resultaten, inbegripet en beskrivning av kraften (lågor, gnistor, rök, långsamt pyrande glöd osv.) och ungefärlig varaktighet som 
iakttagits vid det för beredande säkerhets-screeningtestet för både 
test- och referensämne. 
— Resultat av eventuella tester med ett inert ämne. — Resultat av eventuella tester i inert atmosfär.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 120
 
3.2 TOLKNING AV RESULTATEN 
Ett ämne ska anses vara ett oxiderande ämne om 
a) en kraftig reaktion inträffar under det inledande screeningtestet 
b) den maximala brännhastighet av de blandningar som undersökts 
vid fullständig testning är högre än eller lika med den maximala 
brännhastigheten för referensblandningen av cellulosa och bari ­
umnitrat. 
För att undvika falska positiva resultat ska de resultat som erhålls vid 
test av ämnet med ett inert material och vid test i inert atmosfär 
också beaktas vid tolkning av resultaten.  
4. HÄNVISNINGAR  
NF T 20-035 (september 85), Chemical products for industrial use. 
Determination of the oxidizing properties of solids.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 121
 
Tillägg  
Figur  
Form och tillbehör för iordningställande av högen  
(Alla mått i mm)
  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 122
 
A.18  MOLEKYLÄR MEDEL VIKT OCH MOLEKYLÄR VIKTFÖR ­
DELNING AV POLYMERER  
1. METOD  
Denna kromatografiska metod (genomträngning i gelé) är en kopia 
på OECD TG 118 (1996). Grundläggande principer och annan tek ­
nisk information finns under hänvisning 1.  
1.1 INLEDNING 
Eftersom polymerernas egenskaper är så varierande är det omöjligt 
att beskriva en enda metod som ger exakta förhållanden för separa ­
tion och bedömning som täcker alla eventualiteter och särskilda företeelser vid separation av polymerer. Särskilt komplexa polymera 
system är ofta inte mottagliga för kromatografisk analys av genom ­
trängning i gelé (GPC). När GPC inte är praktiskt genomförbart kan den molekylära vikten fastställas med andra metoder (se bilaga). I sådana fall ska fullständig information om och motivering för den 
använda metoden anges. 
Den beskrivna metoden grundas på DIN-standard 55672 (1). Detal ­
jerad information om hur experimentet ska utföras och hur datan ska bedömas finns i denna DIN-standard. Om experimentförhållandena måste ändras, ska dessa förändringar motiveras. Andra standarder får 
tillämpas om full hänvisning därtill görs. I den beskrivna metoden 
används polystyrenprover med känd polydispertion för kalibrering, som kan behöva anpassas till vissa polymerer, t.ex. vattenlösliga och anpassade polymerer med långa molekylkedjor.
 
1.2 DEFINITIONER OCH ENHETER 
Den numerära medelmolekylvikten M  n och den viktmässigt moleky ­
lära medelvikten M  w fastställs med följande ekvationer: 
M n ¼ Σ n 
i ¼ 1 H i 
Σ n 
i ¼ 1 H i=M i M w ¼ Σ n 
i ¼ 1 H i Ü M i 
Σ n 
i ¼ 1 H i 
där: 
H i är nivån på detektorsignalen från baslinjen för den kvarhållna 
volymen V  i , 
M i är polymerfraktionens molekylvikt vid den kvarhållna volymen 
V i , och 
n är antalet datapunkter. Bredden på den molekylära viktfördelningen, som är ett mått på 
systemdispertionen, fås med förhållandet M
 w /M n . ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 123
 
1.3 REFERENSÄMNEN 
Eftersom GPC är en relativ metod måste kalibrering göras. Normalt 
används tätt fördelad, linjärt konstruerad standardpolystyren med känd medelmolekylvikt M
 n och M  w och en känd molekylviktfördelning för 
detta ändamål. Kalibreringskurvan kan bara användas för fastställande 
av molekylvikten för det okända provet om separationsförhållandena för provet och standardämnena valts på exakt samma sätt. 
Det fastställda förhållandet mellan molekylvikten och urlaknings ­
volymen gäller enbart under det aktuella experimentets specifika 
förhållanden. Dessa förhållanden omfattar framför allt temperatur, 
lösning eller lösningsblandning, kromatografiska förhållanden och separationskolonn eller kolonnsvstem. 
Den molekylvikt som fastställs för provet på detta sätt utgörs av 
relativa värden och beskrivs som polystyrenets molekylära ekviva ­
lensvikt. Detta innebär att molekylvikterna, beroende på struktur och 
kemisk skillnad mellan provet och standardämnet, kan avvika från de absoluta värdena i större eller mindre utsträckning. Om andra stan ­
dardämnen används, t.ex. polyetylenglykol, polyetylenoxid, poly-me ­
tylmetakrylat, polyakrylsyra, ska skälet därtill anges.
 
1.4 PRINCIPEN FÖR PROVNINGSMETODEN 
Både provets molekylviktfördelning och medelmolekylvikter (M  n , 
M w ) kan fastställas med hjälp av GPC. GPC är en särskild typ av 
vätskekromatografi där provet separeras beroende på de enskilda komponenternas hydrodynamiska volymer (2). 
Separationen utförs när provet passerar genom en kolonn fylld med 
poröst material, vanligtvis en organisk gelé. Små molekyler kan pas ­
sera igenom porerna medan stora molekyler kvarhålls. De stora mo ­
lekylernas passage blir därför kortare och dessa tas bort först. Me ­
delstora molekyler passerar genom en del av porerna och/eller elue ­
ras senare. De minsta molekylerna, med en hydrodynamisk medel ­
radie mindre än porerna i gelén, kan passera genom samtliga porer. Dessa elueras då sist. 
I idealsituationen styrs separeringen helt och hållet av molekylstor ­
leken, men i praktiken är det svårt att förhindra att åtminstone en viss absorbtionseffekt inverkar störande. Ojämn packning i kolonnen 
och döda volymer kan förvärra situationen (2). 
Detektionen utförs med t.ex. reflektionsindex eller UV-absorbtion 
och ger en enkel fördelningskurva. För att kunna tillskriva kurvan den faktiska molekylvikten måste kolonnen kalibreras, genom att polymerer med känd molekylvikt och helst i stort sett liknande struk ­
tur, t.ex. olika standardpolysterener, tillåts passera genom kolonnen. 
Normalt fås en typisk Gaus-kurva, ibland utdragen i en mindre svans på sidan för den låga molekylvikten, om de vertikala axlarna anger mängden, i förhållande till vikten, för de olika molekylvikter som 
elueras, och den horisontella axeln står för den logaritmiska mole ­
kylvikten.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 124
 
1.5 KVALITETSKRITERIER 
Repeterbarheten (relativ standardavvikelse: RSD) för elutionsvoly ­
men ska vara bättre än 0,3 %. Nödvändig repeterbarhet för analysen måste säkerställas genom korrigering enligt intern standard om ett 
kromatogram bedöms vara tidsberoende och inte omfattas av ovan ­
nämnda kriterier (1). Spridningen beror på standardämnets molekyl ­
vikt. Följande värden är typiska för standardpolystyren: 
M
 p < 2 000 M  w /M n < 1,20 
2 000 < M  p < 10  6 M w /M n < 1,05 
M p > 10  6 M w /M n < 1,20 
(M p är standardämnets molekylvikt vid toppvärdet.)  
1.6 BESKRIVNING AV PROVNINGSMETODEN  
1.6.1  Beredning av lösningar med standardpolystyren  
Standardpolystyrenen löses noggrant genom blandning i vald eluent. 
Hänsyn måste tas till tillverkarens rekommendationer vid beredning av lösningarna. 
Koncentrationen av de standardämnen som väljs beror på olika fak ­
torer, t.ex. injektionsvolym, lösningsviskositet och den analytiska detektorns känslighet. Maximal injektionsvolym måste anpassas till 
kolonnens längd för undvikande av överbelastning. Typiska injek ­
tionsvolymer för analytiska separationer med GPC och en kolonn på 30 cm × 7,8 mm ligger mellan 40 och 100 μl. Större volymer kan 
användas men bör inte överstiga 250 μl. Det optimala förhållandet 
mellan injektionsvolym och koncentration måste fastställas innan 
kolonnen kalibreras.
 
1.6.2  Beredning av provlösningen  
I princip gäller samma krav för beredning av provlösning. Provet 
löses upp i lämpligt lösningsmedel, t.ex. tetrahydrofuran (THF), ge ­
nom omsorgsfull skakning. Det får under inga omständigheter lösas upp i ultraljudsbad. Vid behov kan provlösningen renas genom ett membranfilter, med en finhet på mellan 0,2 och 2 μm. 
Förekomst av oupplösta partiklar måste registreras i slutrapporten, 
eftersom dessa kan bero på högviktsmolekyler. Lämplig metod ska 
användas för fastställande av viktandelen oupplösta partiklar. Lös ­
ningen bör användas inom 24 timmar.
 
1.6.3  Apparater  
— Lösningsbehållare. 
— Avluftningsapparat (när så krävs). 
— Pump.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 125
 
— Pulsdämpare (när så krävs). 
— Injektionssystem. — Kromatografikolonner. — Detektor. — Flödesmätare (när så krävs). 
— Apparat för registrering/bearbetning av data. 
— Avfallskärl. Det måste säkerställas att GPC-systemet är inert avseende använda 
lösningsmedel, t.ex. genom användning av stålkapilär för THF-lös ­
ningen.
 
1.6.4  Injektions- och lösningstillförselsystem  
En definierad volym av lösningsprovet fylls i kolonnen, antingen 
automatiskt eller manuellt, i en tydligt definierad zon. Alltför snabb 
utdragning eller intryckning av kolven i sprutan, om fyllningen sköts 
manuellt, kan förorsaka förändringar i den observerade molekyl ­
viktfördelningen. Systemet för tillförsel av lösning ska så långt möj ­
ligt vara pulsfritt, helst med inbyggd pulsdämpning. Flödeshastighe ­
ten ska vara ca 1 ml/min.  
1.6.5  Kolonn  
Polymeren kännetecknas, beroende på provet, antingen genom an ­
vändning av enkel kolonn eller genom flera kolonner kopplade i 
serie. Ett antal porösa kolonnmaterial med definierade egenskaper, t.ex. porstorlek, exklutionsgränser osv., finns kommersiellt tillgäng ­
liga. Val av separationsgelé och kolonnlängd beror både på provets 
egenskaper (hydrodynamisk volym, molekylviktfördelning) och spe ­
cifika förhållandena för separationen, som t.ex. lösning, temperatur och flödeshastighet (1) (2) (3).
 
1.6.6  Teoretiska plattor  
Den kolonn eller kolonnkombination som används för separationen 
måste karakteriseras av antalet teoretiska nivåer. Detta inkluderar, när THF används som elutionslösning, fyllning av en lösning av etyl ­
bensen eller annan lämplig icke-polär lösning i en kolonn med känd 
längd. Antalet teoretiska nivåer fås med följande ekvation: 
N ¼ 5; 54
 Í 
V e 
W 1=2 Î 2 
eller N ¼ 16 V e 
W Í Î  2 
där: 
N = är antalet teoretiska nivåer, V
 e = är elutionsvolymen vid toppvärdet,  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 126
 
W = är toppvärdets baslinjebredd, och 
W 1/2 = är toppbredden vid halva höjden.  
1.6.7  Separationseffektivitet  
Förutom antalet teoretiska nivåer som styr bandbredden, spelar också 
separationseffektiviteten, som bestäms av lutningen på kalibrerings ­
kurvan, en viss roll. Separationseffektiviteten för en kolonn fås med följande förhållande:
 
V e; M x Ä V e;ð10M  x Þ 
holonnens tvärsnittarea ≥ 6; 0 " 
cm 3 
cm 2 # 
där: 
V e, M x = är elutionsvolymen för polystyren med molekylvikten 
M x och 
V e,(10M x) = är elutionsvolymen för polystyren med en tio gånger 
större molekylvikt. 
Systemets upplösning definieras normalt som:  
R 1;2 ¼ 2 Ü V e1 Ä V e2 
W 1 þ W 2 Ü 1 
log 10 ðM 2=M 1 Þ 
där: 
V e1 och V  e2 = är elutionsvolymerna för de två standardpolystyre ­
nerna vid maximalt toppvärde, 
W 1 och W  2 = är baslinjebredden vid toppvärde och 
M 1 och M  2 = är molekylvikten vid maximalt toppvärde (bör 
skilja sig åt med en faktor på 10). 
R-värdet för kolonnsystemet bör vara större än 1,7 (4).  
1.6.8  Lösningsmedel  
Samtliga lösningsmedel måste ha hög renhet (för THF används en 
renhet på 99,5 %). Lösningsmedelsbehållaren (om nödvändigt i en 
inert gasatmosfär) ska vara tillräckligt stor för kalibrering av kolon ­
nen och flera provanalyser. Lösningsmedlet ska avgasas innan det via pumpen transporteras till kolonnen.
 
1.6.9  Temperaturövervakning  
Temperaturen i de kritiska interna komponenterna (injektionsslinga, 
kolonn, detektor och rörsystem) ska vara jämn och anpassad till valt 
lösningsmedel.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 127
 
1.6.10  Detektor  
Syftet med detektorn är att kvantitativt registrera koncentrationen i 
det prov som elueras från kolonnen. För att undvika onödig bredd ­
ning av toppvärden ska detektorcellens kuvettvolym hållas så liten 
som möjligt. Den bör inte vara större än 10 μl, utom för lättflyktiga 
och tunna detektorer Differentialrefraktometri används vanligtvis för detektion. Om provets eller elutionslösningens särskilda egenskaper så kräver kan emellertid andra detektortyper användas t.ex. UV/VIS, 
IR- eller viskositetsdetektorer.
 
2. DATA OCH RAPPORTERING  
2.1 DATA 
Detaljerade utvärderingskriterier och krav avseende insamling och 
bearbetning av data ska uppfylla kraven i DIN-standarden (1). 
Två sinsemellan oberoende experiment ska utföras för varje prov. 
Experimenten ska analyseras individuellt. 
M n , M  w , M  w /M n och M  p ska anges för varje mätning. Det är nöd ­
vändigt att uttryckligen ange att uppmätta värden är relativa värden, 
ekvivalenta mot molekylvikten för det standardämne som använts. 
Efter fastställande av retentionsvolymerna eller retentionstiderna 
(eventuellt korrigerade med en intern standard), plottas log M  p -vär­
dena (M  p är maximalt toppvärde för kalibreringsämnet) mot en av 
nämnda mängder. Minst två kalibreringspunkter krävs per tiotal mo ­
lekylvikter och minst fem mätpunkter för den totala kurvan, som ska täcka provets uppskattade molekylvikt. Kalibreringskurvans änd ­
punkt för den låga molekylvikten definieras av n-hexylbenzen eller 
annan lämplig icke-polär lösning. Medelantal och medelvikt för mo ­
lekylvikterna fastställs allmänt med elektronisk databearbetning, ba ­
serad på formlerna i avsnitt 1.2. Om manuell digitalisering används 
kan råd hämtas från ASTM D 3536-91 (3). 
Fördelningskurvan ska presenteras i tabellform eller som ett diagram 
(differentialfrekvens eller summa procentandel mot log M). I den 
grafiska presentationen ska varje tiotal molekylvikter normalt ha en 
bredd på 4 cm, och maximalt toppvärde ska ligga på ungefär 8 cm höjd. Vid intregralfördelningskurvor ska skillnaderna mellan 0 och 100 % vara ungefär 10 cm.
 
2.2 PROVNINGSRAPPORT 
Provningsrapporten ska innehålla följande information:  
2.2.1  Undersökt ämne  
— Tillgänglig information om det undersökta ämnet (identitet, till ­
satser, föroreningar).  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 128
 
— Beskrivning av hanteringen av provet, anmärkningar, problem.  
2.2.2  Instrument  
— Eluentbehållare, inertgas, avgasning av eluenten, eluentens sam ­
mansättning, föroreningar. 
— Pump, pulsdämpare, injektionssystem. — Separationskolonner (tillverkare, all information om kolonnernas 
karakteristika, som porstorlek, typ av separationsmaterial osv., antal, längd och inbördes ordning på använda kolonner). 
— Antal teoretiska nivåer i kolonnen eller kolonnkombinationen, 
separationseffektivitet (systemupplösning). 
— Information om topparnas symmetri. — Kolonntemperatur, typ av temperaturövervakning. — Detektor (mätprincip, typ, kuvettvolym). — Flödesmätare om sådan används (tillverkare, mätprincip). 
— System för registrering och bearbetning av data (hårdvara och 
mjukvara).
 
2.2.3  Systemkalibrering  
— Detaljerad beskrivning av den metod som används för konstruk ­
tion av kalibreringskurvan. 
— Information om kvalitetskriterier för den aktuella metoden (t.ex. 
koordinationskoefficient, kvadraternas summeringsfel osv.). 
— Information om all extrapolering, alla antaganden och approx ­
imeringar gjorda under experimentproceduren samt om bedöm ­
ning och bearbetning av data. 
— Alla mätningar som gjorts för konstruktion av kalibreringskurvan 
ska dokumenteras i en tabell som inkluderar följande information 
för varje kalibreringspunkt: 
— Provets namn. — Provets tillverkare. — Karakteristikvärden för standardämnena M
 p , M  n , M  w , M  w / 
M n , enligt tillverkaren eller från efterföljande mätningar, till ­
sammans med detaljerade uppgifter om bestämningsmetoden. 
— Insprutningsvolym och insprutningskoncentration.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 129
 
— M  p -värde för kalibrering. 
— Elueringsvolym eller korrigerad retentionstid mätt vid max ­
imalt toppvärde. 
— M  p beräknat vid maximalt toppvärde. 
— Procentfel för beräknat M  p och kalibreringsvärde.  
2.2.4  Bedömning  
— Bedömning på tidsbasis: metoder som används för att säkerställa 
önskad reproducerbarhet (korrektionsmetod, intern standard osv.). 
— Information om huruvida bedömningen gjorts på basis av elu ­
tionsvolymen eller retentionstiden. 
— Information om gränserna för bedömningen, om ett toppvärde 
inte analyserats fullständigt. 
— Beskrivning av utjämningsmetoder, om sådana används. — Beredning av och förbehandlingsprocedurer för provet. — Närvaro av oupplösta partiklar, om sådana förekommit. — Injektionsvolym ( μl) och injektionskoncentration (mg/ml). 
— Anmärkningar om effekter som lett till avvikelser från den ideala 
GPC-profilen. 
— Detaljerad beskrivning av alla ändringar i provningsförfarandet. 
— Detaljerade uppgifter om felområden. 
— All övrig information och anmärkningar relevanta för tolkningen 
av resultatet.
 
3. HÄNVISNINGAR  
1. DIN 55672 (1995), Gelégenomträngningskromatografi (GPC) 
med tetrahydrofuran (THF) som elutionsmedel, del 1. 
2. Yau, W.W., Kirkland, J.J., och Bly, D.D. eds. (1979), Modern 
Size Exclusion Liquid Chromatography, J. Wiley and Sons. 
(ung. Modern vätskeuteslutningskromatografi för uteslutning) 
3. ASTM D 3536-91, (1991), Standardmetod för analys av medel ­
molekylvikter och molekylviktfördelning med vätskeuteslut ­
ningskromatografi (gelégenomträngningskromatografi – GPC). 
American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Penn ­
sylvania. 
4. ASTM D 5296-92, (1992), Standardmetod för analys av medel ­
molekylvikter och molekylviktfördelning i polystyren med stor ­
leksseparationskromatografi. American Society for Testing and 
Materials, Philadelphia, Pennsylvania.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 130
 
Bilaga  
Exempel på andra metoder för fastställande av medelantalet molekylvikt 
(M n ) för polymerer  
Gelégenomträngningskromatografi (GPC) är den metod som är att föredra för 
fastställande av M  n , framför allt när en uppsättning standardämnen finns tillgäng ­
liga, vilkas struktur är jämförbar med polymerens struktur. När det föreligger 
praktiska svårigheter med användning av GPC eller det redan finns en förväntan att ämnet inte kommer att uppfylla ett vanligt M
 n -kriterium (och detta kräver 
bekräftelse) finns alternativa metoder, som t.ex.:  
1. Utnyttjande av kolligativa egenskaper  
1.1 Ebullioscopi/kryoscopi 
inkluderar mätning av kokpunktshöjning (ebullioscopi) eller frys ­
punktssänkning (cryoscopi) för ett lösningsmedel när polymeren till ­
sätts. Metoden grundas på det faktum att den upplösta polymerens 
effekt på vätskans kok- och/eller fryspunkt beror på polymerens molekylvikt (1) (2). 
Tillämpningsbarhet: M
 n < 20 000. 
1.2 Sänkning av ångtryck 
inkluderar mätning av ångtrycket för en vald referensvätska före och 
efter tillsats av kända mängder polymerer (1) (2). 
Tillämpningsbarhet: M  n < 20 000 (teoretiskt, i praktiken emellertid 
ett begränsat värde). 
1.3 Membranosmometri 
grundas på osmosprincipen, dvs. den naturliga tendensen för mole ­
kylerna i en lösning att passera genom ett halvgenomträngligt mem ­
bran från en lösning till en koncentrerad lösning för att uppnå balans. I detta prov har den uppblandade lösningen nollkoncentration, medan den koncentrerade lösningen innehåller polymeren. Lösningens pas ­
sage genom membranet förorsakar ett differenstryck som är avhäng ­
igt koncentrationen och polymerens molekylvikt (1) (3) (4). 
Tillämpningsbarhet: M
 n < 20 000–200 000. 
1.4 Ångfasosmometri 
inkluderar jämförelse av förångningshastigheten för en ren aerosol ­
lösning till minst tre aerosoler innehållande polymeren vid olika 
koncentrationer (1) (2) (4). 
Tillämpningsbarhet: M  n < 20 000.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 131
 
2. Ändgruppanalys  
För att kunna använda denna metod krävs kunskap både om poly ­
merens övergripande struktur och om den typ av kedja som avslutar ändgrupperna (som måste vara urskiljningsbar från huvudstrukturen med t.ex. NMR eller titrering/derivatisering) Fastställandet av mole ­
kylkoncentrationen i polymerens ändgrupper kan ge ett värde for 
rnolekylvikten (7) (8) (9). 
Tillämpningsbarhet: M
 n upp till 50 000 (med minskande tillförlitlighet).  
3. Hänvisningar  
1. Billmeyer, F.W. Jr., (1984), Textbook of Polymer Science (ung. 
Textbok om polymerforskning), tredje utg., John Wiley, New 
York. 
2. Glover, C.A., (1975), Absolute Colligative Property Methods 
(ung. Absoluta metoder för bestämning av kolligativa egenska ­
per), kapitel 4, In: Polymer Molecular Weights (ung. Polymerers 
molekylvikt), Part I P.E. Siade, Jr. ed., Marcel Dekker, New 
York. 
3. ASTM D 3750-79, (1979), Standard Practice for Determination 
of Number-Average Molecular Weight of Polymers by Mem ­
brane Osmometry (ung. Standardmetod för bestämning av nume ­
risk medelmolekylvikt med membranosmometri i polymerer). American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Penn ­
sylvania. 
4. Coll, H. (1989), Membrane Osmometry (Membranosmometri). 
In: Determination of Molecular Weight (Bestämning av molekyl ­
vikt), A.R. Cooper ed., J. Wiley and Sons, s. 25–52. 
5. ASTM 3592-77, (1977), Standard Recommended Practice for 
Determination of Molecular Weight by Vapour Pressure (ung. 
Rekommenderad standardmetod för bestämning av molekylvikt 
med hjälp av ångtryck), American Society for Testing and Ma ­
terials, Philadelphia, Pennsylvania. 
6. Morris, C.E.M., (1989), Vapour Pressure osmometry (Ångtryck ­
sosmometri). In: Determination of Molecular Weight (Bestäm ­
ning av molekylvikt), A.R. Cooper ed., John Wiley and Sons. 
7. Schröder, E., Muller, G., och Arndt, K-F., (1989), Polymer Cha ­
racterisation (Polymerkarakterisering), Carl Hanser Verlag, Mün ­
chen. 
8. Garmon, R.G., (1975), End-Group Determinations (ung. Bestäm ­
ning av ändgrupper) kapitel 3 In: Polymer Molecular Weights 
(Polymerers molekylvikt), Del 1, P.E. Siade, Jr. ed., Marcel Dekker, New York. 
9. Amiya, S., et al. (1990), Pure and Applied Chemistry (ung. Ren 
och tillämpad kemi), 62, 2139–2146.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 132
 
A.19  INNEHÅLL AV LÅGMOLEKYLVIKTSPOLYMERER  
1. METOD  
Denna kromatografiska metod (genomträngning i gelé) är en kopia 
på OECD TG 119 (1996). Grundläggande principer och annan tek ­
nisk information finns i hänvisningarna.  
1.1 INLEDNING 
Eftersom polymerernas egenskaper är så varierande är det omöjligt 
att beskriva en enda metod som ger exakta förhållanden för separa ­
tion och bedömning som täcker alla eventualiteter och särskilda företeelser vid separation av polymerer. Särskilt komplexa polymera 
system är ofta inte mottagliga för kromatografisk analys av genom ­
trängning i gelé (GPC). När GPC inte är praktiskt genomförbart kan den molekylära vikten fastställas med andra metoder (se bilaga). I sådana fall ska fullständig information om och motivering för den 
använda metoden anges. 
Den beskrivna metoden grundas på DIN-standard 55672 (1). Detal ­
jerad information om hur experimentet ska utföras och hur datan ska bedömas finns i denna DIN-standard. Om experimentförhållandena måste ändras, ska dessa förändringar motiveras. Andra standarder får 
tillämpas om full hänvisning därtill görs. I den beskrivna metoden 
används polystyrenprover med känd polydispertion för kalibrering, som kan behöva anpassas till vissa polymerer, t.ex. vattenlösliga och anpassade polymerer med långa molekylkedjor.
 
1.2 DEFINITIONER OCH ENHETER 
Låg molekylvikt definieras som en molekylvikt under 1 000 dalton. 
Den numerära medelmolekylvikten M  n och den viktmässigt moleky ­
lära medelvikten M  w fastställs med följande ekvationer: 
M n ¼ Σ n 
i ¼ 1 H i 
Σ n 
i ¼ 1 H i=M i M w ¼ Σ n 
i ¼ 1 H i Ü M i 
Σ n 
i ¼ 1 H i 
där: 
H i = är nivån på detektorsignalen från baslinjen för den kvarhållna 
volymen V  i , 
M i = är polymerfraktionens molekylvikt vid den kvarhållna voly ­
men V  i , och n är antalet datapunkter. 
Bredden på den molekylära viktfördelningen, som är ett mått på 
systemdispertionen, fås med förhållandet M  w /M n . ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 133
 
1.3 REFERENSÄMNEN 
Eftersom GPC är en relativ metod måste kalibrering göras. Normalt 
används tätt fördelad, linjärt konstruerad standardpolystyren med känd medelmolekylvikt M
 n och M  w och en känd molekylviktfördelning för 
detta ändamål. Kalibreringskurvan kan bara användas för fastställande 
av molekylvikten för det okända provet om separationsförhållandena för provet och standardämnena valts på exakt samma sätt. 
Det fastställda förhållandet mellan molekylvikten och urlaknings ­
volymen gäller enbart under det aktuella experimentets specifika 
förhållanden. Dessa förhållanden omfattar framför allt temperatur, 
lösning eller lösningsblandning, kromatografiska förhållanden och separationskolonn eller kolonnsystem. 
Den molekylvikt som fastställs för provet på detta sätt utgörs av 
relativa värden och beskrivs som polystyrenets molekylära ekviva ­
lensvikt. Detta innebär att molekylvikterna, beroende på struktur och 
kemisk skillnad mellan provet och standardämnet, kan avvika från absoluta värdena i större eller mindre utsträckning. Om andra stan ­
dardämnen används, t.ex. polyetylenglykol, polyetylenoxid, poly-me ­
tylmetakrylat, polyakrylsyra ska skälet därtill anges.
 
1.4 PRINCIPEN FÖR PROVNINGSMETODEN 
Både provets molekylviktfördelning och medelmolekylvikter (M  n , 
M w ) kan fastställas med hjälp av GPC. GPC är en särskild typ av 
vätskekromatografi där provet separeras beroende på de enskilda komponenternas hydrodynamiska volymer (2). 
Separationen utförs när provet passerar genom en kolonn fylld med 
poröst material, vanligtvis en organisk gelé. Små molekyler kan pas ­
sera igenom porerna medan stora molekyler kvarhålls. De stora mo ­
lekylernas passage blir därför kortare och dessa tas bort först. Me ­
delstora molekyler passerar genom en del av porerna och/eller elue ­
ras senare. De minsta molekylerna, med en hydrodynamisk medel ­
radie mindre än porerna i gelén, kan passera genom samtliga porer. Dessa elueras då sist. 
I idealsituationen styrs separeringen helt och hållet av molekylstor ­
leken, men i praktiken är det svårt att förhindra att åtminstone en viss absorbtionseffekt inverkar störande. Ojämn packning i kolonnen 
och döda volymer kan förvärra situationen (2). 
Detektionen utförs med t.ex. reflektionsindex eller UV-absorbtion 
och ger en enkel fördelningskurva. För att kunna tillskriva kurvan den faktiska molekylvikten måste kolonnen kalibreras genom att polymerer med känd molekylvikt och helst i stort sett liknande struk ­
tur, t.ex. olika standardpolysterener, tillåts passera genom kolonnen. 
Normalt fås en typisk Gaus-kurva, ibland utdragen i en mindre svans på sidan för den låga molekylvikten, om de vertikala axlarna anger mängden, i förhållande till vikten, för de olika molekylvikter som 
elueras, och den horisontella axeln står för den logaritmiska mole ­
kylvikten.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 134
 
Innehållet med låg molekylvikt härleds från denna kurva. Beräk ­
ningen kan bara bli korrekt om innehållet av lågmolekylviktarter är 
jämnt fördelat i polymermassan.  
1.5 KVALITETSKRITERIER 
Repeterbarheten (relativ standardavvikelse: RSD) för elutionsvoly ­
men ska vara bättre än 0,3 %. Nödvändig repeterbarhet för analysen måste säkerställas genom korrigering enligt intern standard om ett 
kromatogram bedöms vara tidsberoende och inte omfattas av ovan ­
nämnda kriterier (1). Spridningen beror på standardämnets molekyl ­
vikt. Följande värden är typiska för standardpolystyren: 
M
 p < 2 000 M  w /M n < 1,20 
2 000 < M  p < 10  6 M w /M n < 1,05 
M p > 10  6 M w /M n < 1,20 
(M p är standardämnets molekylvikt vid toppvärdet.)  
1.6 BESKRIVNING AV PROVNINGSMETODEN  
1.6.1  Beredning av lösningar med standardpolystyren  
Standardpolystyrenen löses noggrant genom blandning i vald eluent. 
Hänsyn måste tas till tillverkarens rekommendationer vid beredning av lösningarna. 
Koncentrationen av de standardämnen som väljs beror på olika fak ­
torer, t.ex. injektionsvolym, lösningsviskositet och den analytiska detektorns känslighet. Maximal injektionsvolym måste anpassas till 
kolonnens längd för undvikande av överbelastning. Typiska injek ­
tionsvolymer for analytiska separationer med GPC och en kolonn på 30 cm × 7,8 mm ligger mellan 40 och 100 μl. Större volymer kan 
användas men bör inte överstiga 250 μl. Det optimala förhållandet 
mellan injektionsvolvm och koncentration måste fastställas innan 
kolonnen kalibreras.
 
1.6.2  Beredning av provlösningen  
I princip gäller samma krav för beredning av provlösning. Provet 
löses upp i lämpligt lösningsmedel, t.ex. tetrahydrofuran (THF), ge ­
nom omsorgsfull skakning. Det får under inga omständigheter lösas 
upp i ultraljudsbad. Vid behov kan provlösningen renas genom ett 
membranfilter, med en finhet på mellan 0,2 och 2 μm. 
Förekomst av oupplösta partiklar måste registreras i slutrapporten, 
eftersom dessa kan bero på högviktsmolekyler. Lämplig metod ska 
användas för fastställande av viktandelen oupplösta partiklar. Lös ­
ningen bör användas inom 24 timmar.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 135
 
1.6.3  Korrigering för innehåll av föroreningar och tillsatser  
Korrigering av artinnehållet av M < 1 000 för bidraget från närva ­
rande icke-po! ymera specifika komponenter (t.ex. föroreningar och/ eller tillsatser) krävs normalt, med mindre det uppmätta innehållet 
redan är mindre än 1 %. Detta fås genom direkt analys av polymer ­
lösningen eller GPC-eluaten. 
När eluaten efter passage genom kolonnen ska spädas för ytterligare 
analys, ska den vara koncentrerad. Det kan vara nödvändigt att evapo ­
rera eluaten till torrhet och lösa upp den igen. Eluatkoncentrationen ska göras under förhållanden som garanterar att inga förändringar uppstår i 
eluaten. Hanteringen av eluaten efter GPC-steget är beroende av den 
analysmetod som används för mängdbestämningen.
 
1.6.4  Apparater  
GPC-apparater består av följande komponenter: 
— Lösningsbehållare. 
— Avluftningsapparat (när så krävs). 
— Pump. 
— Pulsdämpare (när så krävs). 
— Injektionssystem. — Kromatografikolonner. 
— Detektor. 
— Flödesmätare (när så krävs). 
— Apparat för registrering/bearbetning av data. 
— Avfallskärl. 
Det måste säkerställas att GPC-systemet är inert avseende använda 
lösningsmedel, t.ex. genom användning av stålkapilär för THF-lös ­
ningen.
 
1.6.5  Injektions- och lösningstillförselsystem  
En definierad volym av lösningsprovet fylls i kolonnen, antingen 
automatiskt eller manuellt, i en tydligt definierad zon. Alltför snabb 
utdragning eller intryckning av kolven i sprutan, om fyllningen sköts 
manuellt, kan förorsaka förändringar i den observerade molekyl ­
viktfördelningen. Systemet för tillförsel av lösning ska så långt möj ­
ligt vara pulsfritt, helst med inbyggd pulsdämpning. Flödeshastighe ­
ten ska vara ca 1 ml/min.  
1.6.6  Kolonn  
Polymeren kännetecknas, beroende på provet, antingen genom an ­
vändning av enkel kolonn eller flera kolonner kopplade i serie. Ett 
antal porösa kolonnmaterial med definierade egenskaper, t.ex. pors ­
torlek, exklutionsgränser osv. finns kommersiellt tillgängliga. Val av separationsgelé och kolonnlängd beror både på provets egenskaper (hydrodynamisk volym, molekylviktfördelning) och specifika förhål ­
landena för separationen, som t.ex. lösning, temperatur och flödes ­
hastighet (1) (2) (3).
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 136
 
1.6.7  Teoretiska nivåer  
Den kolonn eller kolonnkombination som används för separationen 
måste karakteriseras av antalet teoretiska nivåer. Detta inkluderar, när THF används som elutionslösning, fyllning av en lösning av etyl ­
bensen eller annan lämplig icke-polär lösning i en kolonn med känd 
längd. Antalet teoretiska nivåer fås med följande ekvation: 
N ¼ 5; 54
 Í 
V e 
W 1=2 Î 2 
där: N ¼ 16 V e 
W Í Î  2 
eller, 
N = är antalet teoretiska nivåer, 
V e = är elutionsvolymen vid toppvärdet, 
W = är toppvärdets baslinjebredd, och W
 1/2 = är toppbredden vid halva höjden.  
1.6.8  Separationseffektivitet  
Förutom antalet teoretiska nivåer, som styr bandbredden, spelar 
också separationseffektiviteten, som bestäms av lutningen på kalibre ­
ringskurvan, en viss roll. Separationseffektiviteten för en kolonn fås med följande förhållande:
 
V e;M x Ä V e;ð10M  x Þ 
kolonelės tvärsnittarea ≥ 6; 0 " 
cm 3 
cm 2 # 
där: 
Ve, M  x = är elutionsvolymen för polystyren med molekylvikten 
M x , och 
V e,(10M x) = är elutionsvolymen för polystyren med en tio gånger 
större molekylvikt. 
Systemets upplösning definieras normalt som:  
R 1;2 ¼ 2 Ü V e1 Ä V e2 
W 1 þ W 2 Ü 1 
log 10 ðM 2=M 1 Þ 
där: 
Ve1 och V  e2 = är elutionsvolymerna för de två standardpolystyre ­
nerna vid maximalt toppvärde, 
W 1 och W  2 = är baslinjebredden vid toppvärde, och 
M 1 och M  2 = är molekylvikten vid maximalt toppvärde (bör 
skilja sig åt med en faktor på 10). 
R-värdet för kolonnsystemet bör vara större än 1,7 (4)  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 137
 
1.6.9  Lösningsmedel  
Samtliga lösningsmedel måste ha hög renhet (för THF används en 
renhet på 99,5 %). Lösningsmedelsbehållaren, om nödvändigt i en inert gasatmosfär ska vara tillräckligt stor för kalibrering av kolonnen 
och flera provanalyser. Lösningsmedlet ska avgasas innan det via 
pumpen transporteras till kolonnen.
 
1.6.10  Temperaturövervakning  
Temperaturen i de kritiska, interna komponenterna (injektionsslinga, 
kolonn, detektor och rörsystem) ska vara jämn och anpassad till valt 
lösningsmedel.  
1.6.11  Detektor  
Syftet med detektorn är att kvantitativt registrera koncentrationen i 
det prov som elueras från kolonnnen. För att undvika onödig bredd ­
ning av toppvärden ska detektorcellens kuvettvolym hållas sä liten som möjligt. Den bör inte vara större än 10 μl, utom for lattffyktiga 
och tunna detektorer. Differentialrefraktometri används vanligtvis för 
detektion. Om provets eller elutionslösningens särskilda egenskaper så kräver kan emellertid andra detektortyper användas, t.ex. UV/VIS, 
IR- eller viskositetsdetektorer osv.
 
2. DATA OCH RAPPORTERING  
2.1 DATA 
Detaljerade utvärderingskriterier och krav avseende insamling och 
bearbetning av data ska uppfylla kraven i DIN-standarden (1). 
Två sinsemellan oberoende experiment ska utföras för varje prov. 
Experimenten ska analyseras individuellt. Det är alltid viktigt att 
också ta fram data från blankprover, behandlade på samma sätt som det verkliga provet. 
Det är nödvändigt att uttryckligen ange att uppmätta värden är rela ­
tiva värden, ekvivalenta mot molekylvikten för det standardämne 
som använts. 
Efter fastställande av retentionsvolymerna eller retentionstiderna 
(eventuellt korrigerade med en intern standard), plottas log M
 p -vär­
dena (M  p är maximalt toppvärde för kalibreringsämnet) mot en av 
nämnda mängder. Minst två kalibreringspunkter krävs per tiotal mo ­
lekylvikter och minst fem mätpunkter för den totala kurvan, som ska täcka provets uppskattade molekylvikt. Kalibreringskurvans änd ­
punkt för den låga molekylvikten definieras av n-hexylbenzen eller 
annan lämplig icke-polär lösning. Den del av kurvan som svarar mot molekylvikter under 1 000 bestäms och korrigeras för föroreningar och tillsatser efter behov. Elutionskurvorna bedöms i allmänhet med 
hjälp av elektronisk databehandling. Om manuell digitalisering an ­
vänds kan råd hämtas från ASTM D 3536-91 (3).
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 138
 
Om någon olöslig polymer blir kvar i kolonnen är dess molekylvikt 
troligen högre än den upplösta fraktionen och om hänsyn inte tas 
därtill kommer den; att ge en för hög bedömning av innehållet lågmolekylvikter. Riktlinjer för korrigering av innehållet av lågmo ­
lekylvikten för olöslig polymer ges i bilagan. 
Fördelningskurvan ska presenteras i tabellform eller som ett diagram 
(differentialfrekvens eller summa procentandel mot log M). I den 
grafiska presentationen ska varje tiotal molekylvikter normalt ha en 
bredd på 4 cm, och maximalt toppvärde ska ligga på ungefär 8 cm höjd. Vid intregralfördelningskurvor ska skillnaderna mellan 0 och 100 % vara ungefär 10 cm.
 
2.2 PROVNINGSRAPPORT 
Provningsrapporten ska innehålla följande information.  
2.2.1  Undersökt ämne  
— Tillgänglig information om det undersökta ämnet (identitet, till ­
satser, föroreningar). 
— Beskrivning av hanteringen av provet, anmärkningar, problem.  
2.2.2  Instrument  
— Eluentbehållare, inertgas, avgasning av eluenten, eluentens sam ­
mansättning, föroreningar. 
— Pump, pulsdämpare, injektionssystem. 
— Separationskolonner (tillverkare, all information om kolonnernas 
karakteristika, som porstorlek, typ av separationsmaterial osv., 
antal, längd och inbördes ordning på använda kolonner). 
— Antal teoretiska nivåer i kolonnen eller kolonnkombinationen, 
separationseffektivitet (systemupplösning). 
— Information om topparnas symmetri. 
— Kolonntemperatur, typ av temperaturövervakning. 
— Detektor (mätprincip, typ, kuvettvolym). — —Flödesmätare om sådan används (tillverkare, mätprincip). — System för registrering och bearbetning av data (hårdvara och 
mjukvara).
 
2.2.3  Systemkalibrering  
— Detaljerad beskrivning av den metod som används för konstruk ­
tion av kalibreringskurvan.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 139
 
— Information om kvalitetskriterier för den aktuella metoden (t.ex. 
koordinationskoefficient, kvadraternas summeringsfel osv.). 
— Information om all extrapolering, alla antaganden och approx ­
imeringar gjorda under experimentproceduren samt om bedöm ­
ning och bearbetning av data. 
— Alla mätningar som gjorts för konstruktion av kalibrenngskurvan 
ska dokumenteras i en tabell som inkluderar följande information 
för varje kalibreringspunkt: 
— Provets namn. — Provets tillverkare. — Karakteristikvärden för standardämnena M
 p, M n , M  w och 
M w /M n , enligt tillverkaren eller från efterföljande mätningar, 
tillsammans med detaljerade uppgifter om fastställandemetoden. 
— Injektionsvolym och insprutningskoncentration. — M
 p värde för kalibrering. 
— Elueringsvolym eller korrigerad retentionstid mätt vid max ­
imalt toppvärde. 
— M  p beräknat vid maximalt toppvärde. 
— Procentfel för beräknat M  p och kalibreringsvärde.  
2.2.4  Information om innehåll av lågmolekylvikt i polymer  
— Beskrivning av de metoder som används för analys och hur 
experimentet utfördes. 
— Information om andelen innehåll lågmolekylviktarter (w/w) för 
hela provet. 
— Information om föroreningar, tillsatser och andra icke-polymera 
arter, som viktandel i förhållande till hela provet.  
2.2.5  Bedömning  
— Bedömning på tidsbasis: metoder som används för att säkerställa 
önskad reproducerbarhet (korrek tionsmetod, intern standard osv.). 
— Information om huruvida bedömningen gjorts på basis av elu ­
tionsvolymen eller retentionstiden. 
— Information om gränserna för bedömningen, om ett toppvärde 
inte analyserats fullständigt. 
— Beskrivning av utjämningsmetoder, om sådana används. 
— Beredning av och förbehandlingsprocedurer för provet. — Närvaro av oupplösta partiklar, om sådana förekommit.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 140
 
— Injektionsvolym ( μ1) och injektionskoncentration (mg/ml). 
— Anmärkningar om effekter som lett till avvikelser från den ideala 
GPC-profilen. 
— Detaljerad beskrivning av alla ändringar i provningsförfarandet. — Detaljerade uppgifter om felområden. — All övrig information och anmärkningar relevanta för tolkningen 
av resultatet.
 
3. HÄNVISNINGAR  
1. DIN 55672 (1995), Gelégenomträngningskromatografi (GPC) 
med tetrahydrofuran (THF) som elutionsmedel, del 1. 
2. Yau, W.W., Kirkland, J.J., och Bly, D.D. eds. (1979), Modern 
Size Exclusion Liquid Chromato- graphy, J. Wiley och Sons. 
(ung. Modern vätskeuteslutningskromatografi för uteslutning). 
3. ASTM D 3536-91, (1991), Standardmetod för analys av medel ­
molekylvikter och molekylviktfördelning med vätskeuteslutnings ­
kromatografi (gelégenomträngningskromatografi – GPC). Amer ­
ican Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylva ­
nia. 
4. ASTM D 5296-92, (1992), Standardmetod för analys av medel ­
molekylvikter och molekylviktfördelning i polystyren med stor ­
leksseparationskromatografi. American Society for Testing and 
Materials, Philadelphia, Pennsylvania.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 141
 
Bilaga  
Riktlinjer för korrigering av lågmolekylärt innehåll beroende på närvaro av 
olöslig polymer  
När olösliga polymerer förekommer i ett prov, leder detta till massaförlust under 
GPC-analysen. Den olösliga polymeren kvarhålls definitivt i kolonnen eller prov ­
filtret, medan den lösbara delen av provet passerar genom kolonnen. När poly ­
merens refraktiva indexökning (dn/dc) kan uppskattas eller mätas, kan provets massaförlust i kolonnen uppskattas. I detta fall görs en korrigering med hjälp av en extern kalibrering med standardmaterial med känd koncentration och dn/dc för 
kalibrering av refraktometerns reaktion. I nedanstående exempel används en stan ­
dardpolymer (merylmetakrylat) (pMMA). 
Vid den externa kalibreringen för analys av akrylpolymerer analyseras en standard- 
pMMA med känd koncentration i terahydrofuran med GPC, och resulterande data används för att få fram refraktometerkonstanten med följande ekvation: 
K = R/(C × V × dn/dc) 
där: 
K = står för refraktometerkonstanten i μvs/ml, 
R = för reaktionen på standard-pMMA i μvs, 
C = för koncentrationen av standard-pMMA i mg/ml, V = för insprutningsvolymen i ml, och dn/dc = är ökningen av refrakdonsindexet för pMMA i tetrahydrofuran (i ml/mg). Följande data är normala för en standard-pMMA: 
R = 2 937 891 
C = 1,07 mg/ml V = 0,1 ml dn/dc = 9 × 10
 -5 ml/mg 
Resulterande K-värde, 3,05 × 10  11 , används därefter för att beräkna den teore ­
tiska detektorreaktionen, om 100 % av den insprutade polymeren hade eluerat genom detektorn.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 142
 
A.20  POLYMERERS BETEENDE I VATTEN VID LÖSNING/EX ­
TRAKTION  
1. METOD  
Den beskrivna metoden är en kopia av en reviderad version av 
OECD TG 120 (1997). Ytterligare teknisk information finns i 
hänvisning 1.  
1.1 INLEDNING 
För vissa polymerer, som t.ex. emultionspolymerer, kan visst inle ­
dande förberedande arbete krävas innan nedanstående metod kan 
användas. Metoden är inte tillämplig på flytande polymerer och på 
polymerer som under provningsförhållandena reagerar med vatten. 
När metoden inte är praktisk eller möjlig kan beteendet vid lösning/ 
extraktion undersökas med andra metoder. I så fall ska fullständiga 
detaljer och motivering för den använda metoden anges.  
1.2. REFERENSÄMNEN 
Inga.  
1.3. UNDERSÖKNINGSMETODENS PRINCIP 
Polymerernas beteende vid lösning/extraktion i vatten fastställs med 
flaskmetoden (se A.6 lösnings-barhet i vatten, flaskmetod) med ne ­
dan beskrivna ändringar.  
1.4. KVALITETSKRITERIER 
Inga,  
1.5. BESKRIVNING AV UNDERSÖKNINGSMETODEN  
1.5.1  Utrustning  
Följande utrustning krävs för denna metod: 
— Krossanordning, t.ex. kvarn för produktion av partiklar med känd 
storlek. 
— Apparater för skakning med möjlighet till temperaturövervak ­
ning. 
— Membranfiltersystem. — Lämplig analysutrustning. — Standardsil.
 
1.5.2  Beredning av prover  
Ett representativt prov ska först reduceras till en partikelstorlek på 
mellan 0,125 och 0,25 mm med lämplig sil. Kylning kan krävas för 
provets stabilitet eller för malningsprocessen. Material med gummi ­
liknande natur kan krossas vid temperaturen på flytande kvävgas (1). 
Om den önskade partikelstorleksfraktionen inte kan skapas ska åt ­
gärd vidtas för att i största utsträckning minska partikelstorleken och 
resultatet därav registreras. Det ska i rapporten anges på vilket sätt 
det krossade provet förvarats fram till undersökningen.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 143
 
1.5.3  Förfarande  
Tre prover på 10 g av det undersökta ämnet ska vägas i vart och ett 
av tre kärl försedda med glaspropp, och därefter ska 1 000 ml vatten tillsättas till varje kärl. Om hantering av 10 g polymer visar sig vara 
opraktiskt, ska den närmast högre mängd som kan hanteras användas 
och vattenvolymen justeras i enlighet därmed. 
Kärlen ska tillslutas noggrant och därefter upphettas till 20
 o C. En 
skak- eller omrörningsanordning som kan arbeta vid konstant tem ­
peratur ska användas. Efter en period på 24 timmar ska innehållet i 
varje kärl centrifugeras eller filtreras och polymerkoncentrationen i den klara vätskefasen fastställas med lämplig analysmetod. Om ingen lämplig analysmetod för vätskefasen finns kan den totala lösbarhe ­
ten/extraktionsbarheten uppskattas utifrån filterrestens eller centrifug ­
restens torra vikt. 
Det är vanligtvis nödvändigt att kvantitativt differentiera å ena sidan 
föroreningarna och tillsatserna och å andra sidan de med låg mole ­
kylvikt. Det är också viktigt att vid gravimetriskt fastställande göra 
ett blankprov utan undersökt ämne, för att kunna ta hänsyn till res ­
terna från experimentet. 
Polymerernas beteende vid lösning/extraktion i vatten vid 37
 o C och 
pH 2 samt pH 9 kan fastställas på samma sätt såsom beskrivet för 
utförandet av experimentet vid 20  o C. pH-värdena kan erhållas ge ­
nom tillsats av antingen lämplig buffert eller syra eller bas, som t.ex. saltsyra, ättiksyra, analytiskt natrium eller kaliumhydroxid eller NH
 3 . 
En eller två undersökningar ska göras, beroende på vilken analys ­
metod som används. När tillräckligt specifika metoder finns för di ­
rektanalys av vätskefasen avseende polymerkomponenten, är det till ­
räckligt med en sådan undersökning som beskrivits här ovan. När 
sådana metoder inte finns tillgängliga och fastställande av polyme ­
rens beteende vid lösning/extraktion begränsas till indirekt analys, genom fastställande enbart genom det totala innehållet organiskt kol (TOC) i vätskeextraktet, ska ytterligare en undersökning göras. 
Denna kompletterande undersökning ska också göras på tre prover, 
med tio gånger mindre polymer och samma mängd vatten som an ­
vänts vid den första undersökningen.
 
1.5.4  Analys  
1.5.4.1  Undersökningar utförda med en provstorlek  
Det kan finnas metoder tillgängliga för direktanalys av polymerkom ­
ponenter i vätskefasen. 
Alternativt kan eventuellt också indirekt analys av upplösta/extrahe ­
rade polymerkomponenter, genom fastställande av det totala innehål ­
let upplösningsbara delar och korrigering för ej polymerspecifika 
komponenter, göras. 
Analys av vätskefasen avseende totala polymeriska arter är möjlig 
antingen genom tillräckligt känslig metod, t.ex.: 
— TOC med hjälp av persulfat- eller dikromatupplösning för att 
producera CO  2 , följt av uppskattning med IR-analys eller kemisk 
analys,  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 144
 
— Atomabsorbtionsspektrometri (AAS) eller dess induktivt kopp ­
lade plasmautsläpp (ICP) motsvarande den för kisel- eller metall ­
innehållande polymerer, 
— UV-absorbtion eller spektrofluorimetri för akrylpolymerer, — LC-MS för lågmolekylviktsprover, eller genom vakuumevaporation till torrhet av vätskeextraktet och 
spektroskopisk analys IR, UV, osv.) eller AAS/ICP-analys av resten. 
Om analys av vätskefasen som sådan inte är praktiskt genomförbar, 
ska vätskeextraktet extraheras med ett vattenoupplösligt organiskt lösningsmedel, t.ex. klorerat kolväte. Lösningsmedlet evaporeras där ­
efter och resten analyseras enligt ovan avseende angivet polymer ­
innehåll. Komponenter i denna rest som identifieras som förore ­
ningar eller tillsatser ska subtraheras för bestämning av polymerens egen upplösning/extraktion. 
När förhållandevis stora mängder sådant material finns närvarande, 
kan det vara nödvändigt att analysera resterna, t.ex. HPLC- eller GC- analys för att differentiera föroreningarna från monomera och mono ­
merderiverade ämnen, så att det faktiska innehållet av det senare kan 
fastställas. 
I vissa fall kan vanlig evaporation av det organiska lösningsmedlet 
till torrhet och vägning av den torra resten vara tillräckligt.
 
1.5.4.2  Provning med två olika provstorlekar  
Alla vätskeextrakt analyseras avseende total mängd organiskt kol. 
Gravimetrisk bestämning ska göras på den oupplösta/ej extraherade 
delen av provet. Om polymer-resten, efter centrifugering eller filtre ­
ring av innehållet i varje kärl, sitter kvar på kärlväggen, ska kärlet sköljas med filtratet tills kärlet är rent från alla synliga rester. Där ­
efter ska filtratet återigen centrifugeras eller filtreras. Kvarvarande 
rester på filtret eller i centrifugröret torkas vid 40
 o C under vakuum 
och vägs. Torkningen ska fortsätta tills konstant vikt nås.  
2. DATA  
2.1 PROVNING MED EN ENDA PROVSTORLEK 
De enskilda resultaten för var och en av de tre flaskorna samt medel ­
värdena ska anges och uttryckas i enheter för massa/volym lösning 
(normalt mg/l) eller massa/massa av polymerprovet (normalt mg/g). 
Dessutom ska provets viktförlust anges, beräknad som lösningens vikt dividerad med det ursprungliga provets vikt. Den relativa stan ­
dardavvikelsen ska beräknas. Enskilda värden ska ges för hela ämnet 
(polymer plus väsentliga tillsatser osv.) och för polymeren ensam 
(dvs. efter subtraktion av bidraget från sådana tillsatser).
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 145
 
2.2 PROVNING MED TVÅ OLIKA PROVSTORLEKAR 
De enskilda värdena för total mängd organiskt kol i vätskeextrakten 
för de två trippelexperimenten och medelvärdet för varje experiment ska anges, uttryckt som massa per volym lösning (normalt mg C/l), 
samt som massa per vikt för det ursprungliga provet (normalt 
mg C/g). 
Om ingen skillnad föreligger mellan resultaten för stort respektive 
litet förhållande mellan prov och vatten, kan detta innebära att alla 
extraherbara komponenter faktiskt extraherats. I sådana fall krävs 
normalt ingen direkt analys. 
Resternas individuella vikter ska anges och uttryckas i procent av 
provernas initialvikt. Medelvärden ska beräknas för varje experiment. Skillnaderna mellan 100 och funnen procentandel representerar an ­
delen lösningsbart och extraherbart material i ursprungsprovet.
 
3. RAPPORT  
3.1 PROVNINGSRAPPORT 
Provningsrapporten ska innehålla följande information:  
3.1.1  Undersökt ämne  
— Tillgänglig information om ämnet, identitet, tillsatser, förorening ­
ar, innehåll av varianter med låg molekylvikt.  
3.1.2  Experimentella förhållanden  
— Beskrivning av tillämpat förfarande och experimentella förhållan ­
den. 
— Beskrivning av analys- och detektionsmetoder.  
3.1.3  Resultat  
— Resultatet avseende lösningsbarhet/extraktionsbarhet i mg/l, indi ­
viduella värden och medelvärden för extraktionsprovet för de 
olika lösningarna, uppdelat i polymerinnehåll och föroreningar, tillsatser osv. 
— Resultatet av upplösningen/extraktionen av polymeren i mg/g. — Värden för det totala innehållet organiskt kol i vätskeextrakten, 
lösningens vikt och beräknade andel, om denna mäts. 
— pH-värde för varje prov. — Information om blankvärden. — Vid behov hänvisningar till det undersökta ämnets kemiska insta ­
bilitet, både under provnings- och analysprocessen. 
— All information som är viktig för tolkningen av resultaten.
 
4. HÄNVISNINGAR  
1. DIN 53733 (1976), Provtagning från plastprodukter för prov ­
ningsändamål.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 146
 
A.21  OXIDERANDE EGENSKAPER (VÄTSKOR)  
1. METOD  
1.1 INLEDNING 
Denna provningsmetod är utformad för att mäta ett flytande ämnes 
potential att öka förbränningshastigheten eller förbränningsintensite ­
ten hos ett brännbart ämne, eller att bilda en blandning med ett brännbart ämne som självantänds när de två blandas noggrant. Me ­
toden är baserad på FN:s provningsmetod Provning för oxiderande 
vätskor (1) och är likvärdig med den. Då denna metod A.21 emeller ­
tid i första hand är utformad för att uppfylla kraven i förordning (EG) nr 1907/2006, krävs endast jämförelse med ett referensämne. 
Provning och jämförelse med ytterligare referensämnen kan bli nöd ­
vändiga om provningsresultaten förväntas användas för andra syften (
 1 ). 
Denna provning behöver inte utföras när en undersökning av struk ­
turformeln kan fastställa att ämnet utan rimligt tvivel är oförmöget 
att reagera exotermiskt med ett brännbart material. 
Det är värdefullt att ha förhandsinformation om ämnets alla möjliga 
explosiva egenskaper innan denna provning utförs. 
Denna provning är inte tillämplig på fasta ämnen, gaser, explosiva 
eller mycket brandfarliga ämnen, eller peroxider. 
Denna provning behöver eventuellt inte utföras, om resultat för prov ­
substansen ifråga från provning enligt FN:s Provning för oxiderande 
vätskor (1) redan finns tillgängliga.  
1.2 DEFINITIONER OCH ENHETER 
Med ”medeltid för tryckstegring” avses medelvärdet av de uppmätta 
tiderna för att en blandning vid provning ska åstadkomma en tryc ­
kökning från 690 kPa till 2 070 kPa över det atmosfäriska trycket.  
1.3 REFERENSÄMNE 
65 % (viktprocent) salpetersyra (analysgrad) ska användas som 
referensämne. (  2 ) ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 147  
( 1 ) Såsom, till exempel, inom ramen för FN:s transportföreskrifter. 
( 2 ) Såsom, till exempel, inom ramen för FN:s transportföreskrifter.
 Om den som utför försöken förutser att resultaten från denna prov ­
ning eventuellt kommer att användas för andra syften (  1 ), kan även 
provning med ytterligare referensämnen vara lämpligt (  2 ). 
1.4 PRINCIPEN FÖR PROVNINGSMETODEN 
Vätskan som ska provas blandas med fibercellulosa, i ett viktförhål ­
lande 1 till 1, och införs i ett tryckkärl. Om vid blandning eller 
fyllning självantändning inträffar krävs ingen ytterligare provning. 
Om självantändning inte inträffar ska hela provningen utföras. 
Blandningen upphettas i ett tryckkärl och medelvärdet fastställs för den tid det tar för trycket att stiga från 690 kPa till 2 070 kPa över det atmosfäriska trycket. Denna medeltid jämförs med medeltiden för 
trycket att stiga för en 1:1-blandning av referensämnet (-ämnena) och 
cellulosa.
 
1.5 KVALITETSKRITERIER 
I en serie om fem försök med ett och samma ämne ska inget resultat 
avvika med mer än 30 % från det aritmetiska medelvärdet. Resultat 
som avviker med mer än 30 % från medelvärdet ska förkastas, till ­
vägagångssättet för blandning och fyllning förbättras och provningen 
upprepas.  
1.6 BESKRIVNING AV METODEN  
1.6.1  Preparering  
1.6.1.1  Brännbart ämne  
Torkad fibercellulosa med en fiberlängd mellan 50 och 250 μm och 
en medeldiameter av 25 μm (  3 ), används som brännbart material. 
Den torkas tills vikten inte ändras, i ett lager som är högst 25 mm tjockt vid 105
 o C under fyra timmar, och förvaras i en exikator med 
torkmedel tills den svalnat och ska användas. Vattenhalten i den 
torkade cellulosan ska vara mindre än 0,5 % av torrsubstansen (  4 ). 
Om det behövs ska torktiden förlängas för att uppnå detta (  5 ). 
Samma parti cellulosa ska användas under hela provningen.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 148  
( 1 ) Såsom, till exempel, inom ramen för FN:s transportföreskrifter. 
( 2 ) I hänvisning 1 används t.ex. 50 % (viktprocent) perklorsyra och 40 % (viktprocent) 
natriumklorat. 
( 3 ) T.ex. Whatmans kolonn kromatografiska cellulosapulver CF 11, katalognummer 4021 
050. 
( 4 ) Bekräftad genom (t.ex.) Karl-Fisher titrering. 
( 5 ) Denna vattenhalt kan alternativt åstadkommas genom (t.ex.) uppvärmning vid 105  o C i 
vakuum under 24 timmar.
 1.6.1.2  Apparat  
1.6.1.2.1 T r y c k k ä r l 
Ett tryckkärl krävs. Kärlet består av ett cylindriskt tryckkärl som är 
89 mm långt med en ytterdiameter av 60 mm (se figur 1). Två plana ytor bearbetas fram på motstående sidor (minskar kärlets tvärsnitt till 50 mm) för att underlätta fasthållning när tändstift och urluftnings ­
plugg monteras. Kärlet som har en urborrning med en diameter av 
20 mm har falsats på insidan i båda ändar till ett djup av 19 mm och gängats till 1”British Standard Pipe (BSP) eller metrisk motsvarighet. En tryckavlastare, i form av ett sidostycke, är inskruvad i den run ­
dade delen av tryckkärlet 35 mm från ena änden och vinkelrätt mot 
de plana ytorna. Uttaget för detta borras till ett djup av 12 mm och gängas till 1/2” BSB (eller metrisk motsvarighet) för att passa till gängan på sidostyckets ände. Om så behövs kan en inert tätning 
anbringas för att se till att anslutningen blir gastät. Sidostycket stic ­
ker ut 55 mm från tryckkärlets huvuddel och har ett hål med en diameter av 6 mm. Sidostyckets ände är falsad och gängad för att passa en tryckgivare av membrantyp. Alla tryckmätningsanordningar 
kan användas under förutsättning att de inte påverkas av de heta 
gaserna eller upplösningsprodukterna och klarar att svara på tryck ­
höjningshastigheter motsvarande 690–2 070 kPa på mindre än 5 ms. 
Tryckkärlets ände som är längst från sidostycket är förseglad med ett 
tändstift som är utrustat med två elektroder, den ena isolerad från och den andra ansluten till tändstiftets huvuddel. Den andra änden av 
tryckkärlet är förseglad med ett sprängbleck (sprängtryck cirka 2 200 
kPa) som hålls på plats av en fästplugg med ett hål med en diameter av 20 mm. Om så behövs kan en inert tätning användas tillsammans med tändstiftet för att garantera en gastät anslutning. En stödställning 
(figur 2) håller enheten i rätt läge vid användning. Denna omfattar 
vanligen en gjutstålsplatta med måtten 235 mm × 184 mm × 6 mm och ett 185 mm långt fyrkantsrör 70 mm × 70 mm × 4 mm. 
En sektion är bortskuren från motstående sidor i ena änden av fyr ­
kantsrörets längd så att en struktur med två plansidiga ben som sticker ut från ett 86 mm långt helt fyrkantrör återstår. Ändarna på dessa plana sidor kapas av med en vinkel av 60
 o mot horisontal ­
planet och svetsas fast på bottenplattan. Ett urtag som är 22 mm brett 
och 46 mm djupt bearbetas fram på den ena sidan av den övre änden av fyrkantsröret, på så sätt att sidostycket passar in i urtaget när tryckkärlsenheten – med tändstiftsänden först – sänks ned i stödställ ­
ningen. En stålbit som är 30 mm bred och 6 mm tjock svetsas fast på 
den undre inre sidan av fyrkantsröret för att fungera som en distans. Två 7 mm tumskruvar, gängade i motsatta sidor, håller tryckkärlet stadigt på plats. Två 12 mm breda band av 6 mm tjockt stål, svetsade 
på de sidobitar som sitter på fyrkantsrörets undre del, stödjer tryck ­
kärlet från undersidan.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 149
 
1.6.1.2.2 T ä n d s y s t e m 
Tändsystemet består av en 25 cm lång Ni/Cr-tråd med en diameter 
av 0,6 mm och ett motstånd av 3,85 ohm/m. Tråden är lindad, med 
hjälp av en 5 mm tjock stång, till formen av en spiral och är fastsatt vid tändstiftets elektroder. Spiralen ska ha ett av de utseenden som visas i figur 3. Avståndet mellan tryckkärlets undersida och under ­
sidan av tändspiralen ska vara 20 mm. Om elektroderna inte går att 
justera ska tändtrådens ändar mellan spiralen och kärlets undersida isoleras med ett keramiskt överdrag. Tråden värms upp av en kraft ­
källa med konstant spänning som kan ge minst 10 A.
 
1.6.2  Provningens utförande  ( 1 ) 
Apparaten, helt monterad med tryckgivare och uppvärmningssystem 
men utan sprängblecket på plats, stöds med tändstiftsänden nedåt. 2,5 g 
av den vätska som ska provas blandas med 2,5 g torkad cellulosa i 
dekanteringsglas med hjälp av en omrörningsstav av glas (  2 ). För 
säkerhets skull ska blandningen utföras med en skyddsskärm mellan operatören och blandningen. Om vid blandning eller fyllning självan ­
tändning uppstår krävs ingen ytterligare provning. Blandningen tillsätts 
tryckkärlet i små portioner under knackning, så att blandningen säkert packas runt tändspiralen och är i god kontakt med den. Det är viktigt att spiralen inte förvrids under packningsprocessen då detta kan leda till 
oriktiga resultat (
 3 ). Sprängblecket sätts på plats och fästpluggen skru ­
vas åt ordentligt. Det fyllda kärlet placeras, med sprängblecket överst, i stödställningen vilken ska stå i ett lämpligt, förstärkt dragskåp eller eldningsutrymme. Kraftförsörjningen ansluts till tändstiftets yttre 
anslutningar och 10 A läggs på. Tiden mellan det att blandningen 
påbörjas och inkopplingen av strömmen får inte överstiga 10 minuter. 
Signalen som avges av tryckgivaren registreras med ett lämpligt 
system som möjliggör både utvärdering och alstring av en permanent dokumentering av den tidtrycksprofil som erhålls (t.ex. en transi ­
entregistrerare kopplad till en skrivare). Blandningen upphettas tills 
sprängblecket går sönder eller tills minst 60 s har gått. Om spräng ­
blecket inte går sönder, ska man låta blandningen svalna innan man försiktigt demonterar apparaten, med vidtagande av försiktighets ­
åtgärder för att hantera eventuellt övertryck. Fem försök utförs 
med provämnet och referensämnet (-ämnena). Den tid det tar för 
trycket att stiga från 690 kPa till 2 070 kPa över det atmosfäriska trycket noteras. Medelvärdet för tryckstegringstiden beräknas. 
I vissa fall kan ämnen alstra en tryckstegring (alltför snabb eller 
alltför långsam) som orsakas av kemiska reaktioner och som inte 
är relaterad till ämnets oxiderande egenskaper. I dessa fall kan det 
vara nödvändigt att upprepa provningen med ett inert ämne, t.ex. diatomit (kiselgur), i stället för cellulosa för att klargöra reaktionens natur.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 150  
( 1 ) Blandningar av oxidationsmedel och cellulosa ska behandlas som potentiellt explosiva 
och hanteras med försiktighet. 
( 2 ) I praktiken kan detta åstadkommas genom att göra i ordning en 1:1-blandning av väts ­
kan, som ska provas, och cellulosa i en större mängd än vad som behövs för försöket och 
överföra 5 ± 0,1 g till tryckkärlet. Blandningen måste vara nygjord för varje försök. 
( 3 ) Framför allt måste kontakt mellan spiralens på varandra följande varv undvikas.
 2. DATA  
Tryckstegringstiderna både för provämnet och referensämnet (-ämne ­
na). Tryckstegringstiderna för provningarna med ett inert ämne, om sådana utförts.
 
2.1 BEHANDLING AV RESULTAT 
Tryckstegringstiderna både för provämnet och referensämnet (-ämne ­
na) beräknas. 
Medelvärdet för tryckstegringstiderna för provningarna med ett inert 
ämne (om sådana utförts) beräknas. 
I tabell 1 visas några exempel på resultat.  
Tabell 1  
Exempel på resultat  ( a ) 
Ämne (  b ) Medeltryckstegringstid för en 1:1-blandning med cellulosa 
(ms) 
Ammoniumdikromat, mättad vattenlösning 20 800 
Kalciumnitrat, mättad vattenlösning 6 700 Järn(III)nitrat, mättad vattenlösning 4 133 Litiumperklorat, mättad vattenlösning 1 686 Magnesiumperklorat, mättad vattenlösning 777 
Nickelnitrat, mättad vattenlösning 6 250 
Salpetersyra, 65 % 4 767 (
 c ) 
Perklorsyra, 55 % 121 (  c ) 
Perchloric acid, 55 % 59 Kaliumnitrat, 30 % vattenlösning 26 690 
Silvernitrat, mättad vattenlösning (
 d ) 
Natriumklorat, 40 % vattenlösning 2 555 (  c ) 
Natriumnitrat, 45 % vattenlösning 4 133  
Inert ämne  
Vatten: cellulosa (  d ) 
( a ) Se hänvisning (1) för klassificering enligt FN:s transportsystem 
( b ) Mättade lösningar ska iordningställas vid 20  o C. 
( c ) Medelvärde från jämförande försök från flera laboratorier 
( d ) Det maximala trycket 2 070 kPa uppnåddes ej.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 151
 
3. RAPPORT  
3.1 PROVNINGSRAPPORT 
Provningsrapporten ska omfatta följande information: 
— Identiteten, sammansättningen, renheten, etc. för det ämne som 
provas. 
— Provämnets koncentration. — Torkprocessen för använd cellulosa. 
— Vattenhalten för använd cellulosa. 
— Resultatet av mätningarna. — Resultatet från provningar med ett inert ämne, om sådana utförts. 
— Det beräknade medelvärdet för tryckstegringstiden. 
— Alla avvikelser från denna metod och orsaken till dem. — All ytterligare information eller kommentarer som har betydelse 
för resultatets tolkning.
 
3.2 TOLKNING AV RESULTATET (  1 ) 
Provningsresultaten har bedömts på grundval av 
a) huruvida blandningen av provämne och cellulosa självantänder, 
och jämförelse av medelvärdet för den tid det tar för trycket att 
stiga från 690 kPa till 2 070 kPa 
b) med respektive referensämne (-ämnen). 
Ett flytande ämne anses vara ett oxidationsmedel om 
a) en 1:1-blandning, i viktdelar, av ämnet och cellulosa självantän ­
der, eller 
b) en 1:1-blandning, i viktdelar, av ämnet och cellulosa uppvisar ett 
medelvärde för tryckstegringstiden som är mindre än eller lika 
med medelvärdet för tryckstegringstiden för en 1:1-blandning, i 
viktdelar, av 65 % (viktprocent) salpetersyra och cellulosa. 
För att undvika falska positiva resultat ska, om så behövs, även de 
resultat som erhålls vid provning av ämnet med ett inert material beaktas då resultaten tolkas.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 152  
( 1 ) Se referens 1 för tolkning av resultaten enligt FN:s transportföreskrifter med användning 
av flera referensämnen.
 4. HÄNVISNINGAR  
1. FN:s rekommendationer om transport av farligt gods, manual för 
provningar och kriterier. 3:e reviderade utgåvan. FN:s publikation nr: ST/SG/AC.10/1 l/rev. 3, 1999, sid. 342. Provning O.2: Prov ­
ning för oxiderande vätskor.
 
Figur 1  
Tryckkärl
  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 153
 
Figur 2  
Stödställning
  
Figur 3  
Tändsystem
  
Anm.:  Endera av de här systemen kan användas.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 154
 
A.22.  BESTÄMNING AV FIBRERS LÄNGDVIKTADE 
GEOMETRISKA MEDELDIAMETER  
1. METOD  
1.1 INLEDNING 
I det här dokumentet beskrivs en metod för bestämning av den 
längdviktade geometriska medeldiametern (nedan ”medeldiametern”) 
hos syntetiska oorganiska fibrer som bulkmaterial. Eftersom medel ­
diametern i populationen med 95 procents sannolikhet ligger mellan konfidensgränserna i ett 95-procentigt konfidensintervall (medeldia ­
metern ± 2 medelfel) i stickprovet, kommer det rapporterade värdet 
(testvärdet) att bli den undre gränsen i konfidensintervallet (dvs. medeldiametern minus 2 medelfel). Metoden grundas på en uppdate ­
ring (från juni 1994) av ett metodförslag (HSE industry procedure) 
som antogs vid ett möte mellan ECFIA (European Ceramic Fibres 
Industry Association) och den brittiska arbetsmiljömyndigheten HSE (Health and Safety Executive) i Chester den 26 september 1993. Den har utvecklats för och utifrån en andra provningsjämförelse mellan 
laboratorier (1) (2). Mätmetoden kan användas för att bestämma 
fiberdiametern hos ämnen eller produkter i bulk som innehåller syn ­
tetiska oorganiska fibrer, t.ex. eldfasta keramiska fibrer, syntetiska 
glasartade fibrer eller kristallina och polykristallina fibrer. 
Längdviktning är ett sätt att kompensera för den effekt på diameter ­
fördelningen som uppkommer genom att långa fibrer bryts vid prov ­
tagning eller hantering av materialet. Det geometriska medelvärdet 
används för att beskriva diameterfördelningen för syntetiska oorga ­
niska fibrer, eftersom dessa diametrar vanligen kan approximeras med en log-normalfördelning. 
Att mäta såväl längden som diametern är både omständligt och tid ­
skrävande, men om man endast mäter de fibrer som korsas eller tangeras av en oändligt tunn linje i ett SEM-synfält är sannolikheten för att man väljer en viss fiber proportionell mot dess längd. Efter ­
som längden i längdviktade beräkningar kan hanteras på detta sätt är 
det endast diametern som behöver mätas. Medeldiametern minus 2 medelfel kan sedan beräknas enligt nedan.
 
1.2 DEFINITIONER  
Partikel : Ett föremål med ett längdbreddförhållande som är mindre 
än 3:1.  
Fiber : Ett föremål med ett längdbreddförhållande på minst 3:1.  
1.3 TILLÄMPNINGSOMRÅDE OCH BEGRÄNSNINGAR 
Metoden är utformad för bestämning av diameterfördelningar med 
mediandiametrar från 0,5 till 6 μm. Vid mätning av större diametrar 
kan man använda mindre SEM-förstoringar, men metoden blir allt ­
mer begränsad när man bestämmer storleksfördelningen hos finare 
fibrer. Om mediandiametern är mindre än 0,5 μm rekommenderas 
därför att ett transmissionselektronmikroskop (TEM) används.  ▼M1 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 155
 
1.4 PRINCIP FÖR TESTMETODEN 
Ett antal representativa kärnprov tas från fiberduken eller det löst 
bundna fibermaterialet. Fibrernas längd minskas genom krossning och ett representativt delprov dispergeras i vatten. Alikvoter extrahe ­
ras och filtreras genom ett polykarbonatfilter med en porstorlek på 
0,2 μm och bereds för undersökning med svepelektronmikroskop 
(SEM). Fibrernas diametrar mäts vid minst 10 000 gångers skärmförstoring (
 1 ) med hjälp av en ”linjeskärningsmetod”, vilket 
ger en objektiv uppskattning av mediandiametern. Den undre grän ­
sen i ett 95-procentigt konfidensintervall (baserat på ett ensidigt test) beräknas för att få en uppfattning om det lägsta värdet på fibermate ­
rialets geometriska medeldiameter.
 
1.5 BESKRIVNING AV TESTMETODEN  
1.5.1  Säkerhetsåtgärder  
För att begränsa exponeringen för luftburna fibrer till ett minimum 
bör torra fibrer hanteras i ett dragskåp eller en handskbox. Periodisk 
kontroll av exponeringen bör göras för att säkerställa att säkerhets ­
åtgärderna är effektiva. Vid hantering av syntetiska oorganiska fibrer bör engångshandskar användas för att minska hudirritationen och 
förhindra kontaminering.
 
1.5.2  Apparatur och utrustning  
— Press (med en kapacitet på 10 MPa). 
— Polykarbonatfilter med en porstorlek på 0,2 μm (25 mm diameter). 
— Membranfilter av cellulosaester med en porstorlek på 5 μm som 
används som stödfilter. 
— Filtreringsutrustning av glas (eller filtreringssystem för engångs ­
bruk) för 25 mm filter (t.ex. Millipores glasutrustning för mikro ­
analys, artikelnr XX10 025 00). 
— Nydestillerat vatten som filtrerats genom ett filter med en pors ­
torlek på 0,2 μm för att avlägsna mikroorganismer. 
— Sputter som belägger provet med en tunn film av guld eller 
guld/palladium. 
— Svepelektronmikroskop med en upplösning på 10 nm som an ­
vänds vid 10 000 gångers förstoring. 
— Spatlar, skalpellblad (nr 24), pincett, SEM-rör, kollim eller kol ­
tejp och silverlim. 
— Ultraljudsstav eller ultraljudsbad. — Kärnprovtagare eller korkborr för att ta prover tvärsigenom du ­
ken av syntetiska oorganiska fibrer.
 ▼M1 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 156  
( 1 ) Denna förstoring används för 3 μm fibrer. För 6 μm fibrer är det lämpligare att använda 
5 000 gångers förstoring.
 1.5.3  Testförfarande  
1.5.3.1  Provtagning  
För duk, filt och matta används en 25 mm kärnprovtagare eller 
korkborr för att ta tvärsnittsprover (rätt genom materialet). Om en ­
dast en liten längd av duken är tillgänglig ska proverna vara jämnt 
fördelade längs dukens kortsida. Om större längder är tillgängliga ska proverna tas från slumpmässigt valda ställen. Samma utrustning kan användas för att ta stickprover från lösa fibrer. Om möjligt ska 
sex prover tas för att spegla variationen i bulkmaterialet. 
De sex kärnproverna krossas vid 10 MPa i en press med 50 mm 
diameter. Materialet blandas därefter med en spatel och pressas igen 
vid 10 MPa. Materialet avlägsnas sedan från pressen och lagras i förslutna glasflaskor.
 
1.5.3.2  Provberedning  
Om nödvändigt kan fiberproverna placeras i ugn vid 450 °C i en 
timme för att avlägsna organiskt bindemedel. 
Dela upp provet i fyra lika stora delar med ”cone and quarter”- 
metoden (detta bör göras i ett dragskåp eller liknande). 
Tillsätt med hjälp av en spatel en liten mängd (< 0,5 g) av provet 
till 100 ml nydestillerat vatten som har filtrerats genom ett 0,2 μm 
membranfilter (ultrarent vatten kan även framställas på annat sätt om 
det kan styrkas att det håller tillfredsställande kvalitet). Blanda om 
ordentligt med hjälp av en ultraljudsstav som körs vid 100 W och som ställts in så att en virvel uppkommer. (Gör på följande sätt om en ultraljudsstav inte finns att tillgå: skaka och vänd provbehållaren 
upprepade gånger i 30 sekunder, placera den därefter i ett ultraljuds ­
bad i 5 minuter och skada och vänd sedan provbehållaren i ytterli ­
gare 30 sekunder.) 
Ta omedelbart efter det att fibermaterialet dispergerats ett antal alik ­
voter av provet (t.ex. tre alikvoter på 3, 6 respektive 10 ml) med hjälp av en pipett med stor mynning (2–5 ml volym). 
Vakuumfiltrera fibrerna från varje alikvot genom ett 0,2 μm poly­
karbonatfilter med ett 5 μm cellulosaesterfilter som stödfilter med 
hjälp av en filtrertratt av glas med cylindrisk behållare. Ca 5 ml filtrerat destillerat vatten tillsätts i tratten och alikvoten pipetteras 
långsamt ned i vattnet med pipettspetsen under vätskeytan. Pipett 
och behållare måste sköljas noga efter pipetteringen, eftersom fina fibrer har en tendens att ansamlas på ytan. 
Avlägsna filtret försiktigt, skilj det från stödfiltret och lägg det i en 
behållare för att torka.
 ▼M1 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 157
 
Använd ett skalpellblad (nr 24) för att skära ut en fjärdedel eller 
hälften av filterkakan med en ”sågande rörelse”. Fäst försiktigt det 
utskurna partiet på svepelektronmikroskopets provhållare (stubbe) med hjälp av koltejp eller kollim. Stryk på silverlim på åtminstone tre ställen för att förbättra den elektriska kontakten vid filtrets och 
provhållarens kanter. Låt limmet torka. Sputtra därefter ca 50 nm 
guld eller guld/palladium på filterkakans yta.
 
1.5.3.3  Kalibrering och användning av svepelektronmikroskopet  
1.5.3.3.1 K a l i b r e r i n g 
Svepelektronmikroskopets kalibrering måste kontrolleras minst en 
gång i veckan (helst varje dag) med hjälp av ett certifierat kalibre ­
ringsgrid. Kalibreringen ska kontrolleras med hjälp av en certifierad 
standard. Om det uppmätta värdet inte ligger inom ± 2 % av det 
certifierade värdet måste svepelektronmikroskopets kalibrering juste ­
ras och kontrolleras igen. 
Svepelektronmikroskopets ska ha en sådan upplösning att en diame ­
ter på 0,2 μm kan urskiljas vid en förstoring på 2 000 gånger i en 
matris av reella prov.  
1.5.3.3.2 A n v ä n d n i n g 
Svepelektronmikroskopet ska användas vid 10 000 gångers 
förstoring (  1 ) och vid betingelser som ger goda resultat och en godtagbar 
bild vid låga svephastigheter, t.ex. 5 sekunder per bild. Även om inställ ­
ningarna kan variera mellan olika svepelektronmikroskop bör man för att erhålla bästa skärpa och upplösning vid undersökning av material med låg atomvikt i allmänhet använda accelerationsspänningar på 5–10 keV, 
ett lågt värde på ”spot size” och ett kort arbetsavstånd. Vid användning 
av den linjära traversmetoden ska lutningen vara 0 grader för att mini ­
mera behovet av omfokusering. Om svepelektronmikroskopet har ett eucentriskt läge ska arbetsavståndet för detta användas. En lägre förs ­
toring kan användas om materialet inte innehåller några små fibrer, dvs. 
om fiberdiametrarna är större än 5 μm.
 
1.5.3.4  Storleksbestämning  
1.5.3.4.1 U n d e r s ö k n i n g a v p r o v e t v i d l å g f ö r s t o r i n g 
Provet bör först undersökas vid låg förstoring för att se om det finns 
några tecken på att stora fibrer klumpat ihop sig och för att be ­
stämma fibrernas täthet. Vid omfattande ihopklumpning rekommen ­
deras att ett nytt prov bereds. 
För att uppnå god statistisk noggrannhet är det nödvändigt att mäta 
ett visst minsta antal fibrer. Hög fibertäthet kan vara önskvärt, efter ­
som det är tidskrävande att undersöka tomma synfält och detta inte bidrar till analysen. Om filtrets fibertäthet är för hög blir det emeller ­
tid svårt att mäta alla mätbara fibrer och det finns risk för att man 
missar små fibrer, eftersom de kan döljas av större fibrer.
 ▼M1 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 158  
( 1 ) För 3 μm fibrer, se föregående fotnot.
 Om fibertätheten överstiger 150 fibrer per millimeter linjär travers 
kan det finnas risk för att medeldiametern överskattas. En låg fiber ­
koncentration ökar å andra sidan analystiden och det är därför ofta kostnadseffektivt att bereda ett prov vars fibertäthet ligger närmare den optimala tätheten än att fortsätta räkningen på filter med låg 
fiberkoncentration. Den optimala fibertätheten bör ge ett genomsnitt 
på en eller två räkningsbara fibrer per synfält vid 5 000 gångers förstoring. Den optimala tätheten beror emellertid på fibrernas storlek (diameter), så den som utför testet måste använda sin omdömesför ­
måga för att avgöra om fibertätheten ligger nära den optimala eller 
inte.
 
1.5.3.4.2 L ä n g d v i k t n i n g a v f i b e r d i a m e t r a r n a 
Endast de fibrer som tangerar (eller korsar) en (oändligt) fin linje 
som dras på svepelektronmikroskopets skärm ska räknas. Av denna 
anledning dras en horisontell (eller vertikal) linje över skärmens mitt. 
Alternativt kan en punkt placeras mitt på skärmen, varefter man 
inleder en kontinuerlig svepning i en riktning över filtret. Diametern 
mäts på alla fibrer med ett längdbreddförhållande som är större än 
3:1 och som tangerar eller korsar denna punkt.  
1.5.3.4.3 S t o r l e k s b e s t ä m n i n g a v f i b r e r n a 
Det rekommenderas att minst 300 fibrer mäts. Varje fiber ska endast 
mätas en gång, i den punkt där den skär den linje eller punkt som 
placerats på skärmen (eller nära skärningspunkten om fiberkanterna inte syns). För eventuella fibrer som inte har enhetliga tvärsnitt används en mätning motsvarande fiberns genomsnittliga diameter. 
Det är viktigt att noga bestämma var kanten befinner sig och mäta 
det kortaste avståndet mellan fiberkanterna. Storleksbestämningen kan göras antingen direkt eller på lagrade bilder eller foton. Använd ­
ning av halvautomatiska mätsystem som laddar ned data direkt till ett 
kalkylprogram rekommenderas, eftersom man därigenom sparar tid 
och eliminerar risken för felskrivningar. Dessutom sker beräkning ­
arna automatiskt. 
Ändarna på långa fibrer bör undersökas vid låg förstoring för att 
kontrollera att de endast mäts en gång och inte kröker sig och 
kommer tillbaka in i synfältet.
 
2. DATA  
2.1 BEHANDLING AV RESULTATEN 
Fibrers diametrar är vanligen inte normalfördelade. Genom en loga ­
ritmisk transformation är det emellertid möjligt att erhålla en fördel ­
ning som närmar sig normalfördelningen. 
Beräkna det aritmetiska medelvärdet (mean lnD) och standard ­
avvikelsen (SD  lnD ) för den naturliga logaritmen (lnD) av n fi ­
berdiametrar (D). 
mean lnD ¼ P 
lnD 
n (1) ▼M1 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 159
 
SD lnD ¼ ﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃ  
∑ ðlnD – mean lnDÞ 2 
n – 1 s 
(2) 
Medelfelet (SE  lnD ) beräknas genom att standardavvikelsen divideras 
med kvadratroten ur antalet mätningar (n). 
SE lnD ¼ SD 
ﬃﬃﬃ n p (3) 
Beräkna det geometriska medelvärdet minus två geometriska 
medelfel (LWGMD – 2SE) genom att subtrahera två medelfel från 
medelvärdet och upphöja e till detta värde (medelvärdet minus två 
medelfel). 
LWGMD – 2SE ¼ e ðmean lnD – 2SE  lnd Þ (4) 
3. RAPPORTERING  
TESTRAPPORT 
Testrapporten ska innehålla åtminstone följande information: 
— Värdet på den längdviktade geometriska medeldiametern minus 
två medelfel. 
— Eventuella avvikelser från metoden (särskilt sådana som kan på ­
verka resultatens precision eller noggrannhet) samt skälen för dessa.
 
4. LITTERATUR  
1. B. Tylee SOP MF 240. Health and Safety Executive. Februari 
1999. 
2. G. Burdett och G. Revell. Development of a standard method to 
measure the length-weigthed geometric mean fibre diameter: Results of the Second inter-laboratory exchange. IR/L/MF/94/07. Project R42.75 HPD. Health and Safety Executive. Research and Laboratory 
Services Division. 1994.
 ▼M1 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 160
 
A.23  FÖRDELNINGSKOEFFICIENT (1-OKTANOL/VATTEN): METOD 
MED LÅNGSAM OMRÖRNING  
INLEDNING 
1. Den här testmetoden motsvarar OECD:s testriktlinje (TG) 123 (2006). För ­
delningskoefficient 1-oktanol/vatten (P  OW ) med log P  OW -värden upp till 8,2 
har noggrant bestämts genom metoden med långsam omrörning (1). Den 
lämpar sig därför för direkt bestämning av P  OW för mycket hydrofoba 
ämnen. 
2. Andra metoder för bestämning av fördelningskoefficienten 1-oktanol/vatten 
(P OW ) är ”skakkolvmetoden” (2), där P  OW bestäms utifrån retentionstiden 
vid HPLC-analys med omvänd fas (3). Skakkolvmetoden ger ofta upphov 
till artefakter beroende på att mikroskopiska droppar av oktanol övergår i 
vattenfasen. Med ökande värden på P  OW leder närvaron av dessa droppar i 
allt högre grad till att testämnets koncentration i vattnet överskattas. Meto ­
den kan därför bara användas för ämnen med log P  OW < 4. Den andra 
metoden bygger på en tillförlitlig uppsättning direktbestämda P  OW -värden 
som används för att kalibrera förhållandet mellan retentionstiden med HPLC och de uppmätta P
 OW -värdena. Det har funnits ett utkast till OECD-riktlinjer 
tillgängligt för bestämning av fördelningskoefficienten 1-oktanol/vatten för 
joniserbara ämnen (4), men detta ska inte längre användas. 
3. Den här testmetoden har utvecklats i Nederländerna. Precisionen för de 
förfaranden som beskrivs här har validerats och optimerats genom interka ­
librering med 15 deltagande laboratorier (5).  
INLEDANDE ÖVERVÄGANDEN  
Betydelse och användning  
4. För inerta organiska ämnen har man funnit att det finns ett mycket tydligt 
samband mellan deras fördelningskoefficient 1-oktanol/vatten (P  OW ) och 
deras bioackumulering i fisk. Det har dessutom konstaterats att det finns 
ett samband mellan kemikaliers P  OW och deras toxicitet för fisk samt mellan 
deras P  OW och förmåga att bindas till fasta material som jord och sediment. 
För en utförlig översikt över dessa samband, se hänvisning (6). 
5. Det har fastställts en rad samband mellan fördelningskoefficienten 1-oktanol/ 
vatten och andra ämnesegenskaper som är av betydelse inom miljötoxiko ­
logi och miljökemi. Fördelningskoefficienten 1-oktanol/vatten har därför 
kommit att bli en mycket viktig parameter vid bedömning av miljörisker med kemikalier och för att förutsäga hur de kommer att uppföra sig i miljön.
 
Tillämpningsområde  
6. Metoden med långsam omrörning är tänkt att minska bildningen av mik ­
rodroppar av 1-oktanol i vattenfasen. Detta torde minska risken för att kon ­
centrationen i vattnet överskattas på grund av att molekyler av testämnet binds till sådana droppar. Metoden lämpar sig därför särskilt väl för bestäm ­
ning av P
 OW för ämnen som antas ha log P  OW -värden på 5 och högre, för 
vilka skakkolvmetoden (2) lätt kan ge felaktiga resultat.  ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 161
 
DEFINITIONER OCH ENHETER 
7. Ett ämnes fördelningskoefficient mellan vatten och ett lipofilt lösningsmedel 
(1-oktanol) beskriver dess jämviktsfördelning mellan de båda faserna. För ­
delningskoefficienten 1-oktanol (P  OW ) definieras som förhållandet mellan 
testämnets jämviktskoncentrationer i 1-oktanol mättad med vatten (C  O ) 
och i vatten mättat med 1-oktanol (C  W ). 
P OW ¼ C O=C W 
Fördelningskoefficienten är en dimensionslös storhet eftersom den beskriver 
förhållandet mellan två koncentrationer. Den uttrycks vanligen som tiologa ­
ritmen (log P  OW ). P  OW är temperaturberoende, och rapporterade data måste 
därför omfatta en angivelse av temperaturen vid mätningen.  
PRINCIP FÖR METODEN 
8. Vid bestämning av fördelningskoefficienten bringas vatten, 1-oktanol och 
testämnet i jämvikt med varandra vid konstant temperatur. Därefter bestäms 
testämnets koncentration i de båda faserna. 
9. Man kan minska problemet med bildning av mikroskopiska droppar under 
skakkolvförsöket genom att använda metoden med långsam omrörning som beskrivs här. Metoden går ut på att vatten, 1-oktanol och testämnet bringas i jämvikt i ett termostatreglerat reaktionskärl under omrörning. Utbytet mellan 
faserna påskyndas genom omrörning. Omrörningen gör också att det upp ­
kommer viss turbulens som ökar utbytet mellan 1-oktanol och vatten utan att mikroskopiska droppar bildas (1).
 
TILLÄMPBARHET FÖR TESTMETODEN 
10. Eftersom förekomsten av andra ämnen än testämnet kan påverka testämnets 
aktivitetskoefficient, bör testämnet testas som ett rent ämne. Den högsta 
renhet som är kommersiellt tillgänglig ska användas för fördelningsförsöket med 1-oktanol/vatten. 
11. Den aktuella metoden gäller rena ämnen som inte upplöses eller förenas, 
och som inte visar någon signifikant gränsskiktsaktivitet. Den kan tillämpas för att bestämma fördelningsförhållandet för 1-oktanol/vatten för sådana 
ämnen och blandningar. När metoden används för blandningar, är fördel ­
ningsförhållandena som fastställs för 1-oktanol/vatten villkorade och bero ­
ende av den testade blandningens kemiska sammansättning och på elekt ­
rolytens sammansättning som används som vattenfas. Vidtas ytterligare åt ­
gärder är metoden också tillämplig för dissocierings- eller associeringsför ­
eningar (punkt 12). 
12. På grund av att multipel jämvikt i vatten och 1-oktanol inblandad i fördel ­
ningen 1-oktanol/vatten av dissocierade ämnen såsom organiska syror och 
fenoler, organiska baser och metallorganiska ämnen, är fördelningsförhål ­
landet 1-oktanol/vatten en villkorad konstant starkt beroende av elektrolyt ­
sammansättning (7) (8). Bestämningen av fördelningsförhållandet för 1-ok ­
tanol/vatten kräver därför att pH och elektrolytsammansättning kontrolleras i 
försöket och rapporteras. En sakkunnig bedömning måste användas vid utvärderingen av dessa fördelningsförhållanden. När värdet för dissociations ­
konstant(er) används måste lämpliga pH-värden väljas så att ett fördelnings ­
förhållande fastställs för varje joniseringstillstånd. Icke-komplexbildande 
buffertar måste användas vid testning av metallorganiska föreningar (8). Med beaktande av befintlig kunskap om vattenkemi (komplexbildningskon ­
stanter, dissociationskonstanter) bör testbetingelserna väljas på ett sådant sätt 
att specificeringen av testämnet i vattenfasen kan beräknas. Jonstyrkan bör 
vara identisk i alla försök genom användning av en bakgrundselektrolyt.
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 162
 
13. Under testet kan svårigheter uppstå för ämnen med låg vattenlöslighet eller 
högt P  OW, på grund av att halterna i vattnet blir så låga att det blir svårt att 
göra en noggrann bestämning. Den här testmetoden ger vägledning i hur man hanterar detta problem.
 
INFORMATION OM TESTÄMNET 
14. Kemiska reagenser bör vara av analytisk renhetsgrad eller renare. För detta 
test rekommenderas omärkta testämnen med känd kemisk sammansättning och en renhet som helst uppgår till minst 99 %, eller radioaktivt märkta ämnen med känd kemisk sammansättning och radiokemisk renhet. När äm ­
nen med kort halveringstid används för märkningen är det nödvändigt att 
korrigera för sönderfallet. För radioaktivt märkta testämnen bör man an ­
vända en analysmetod som är specifik för kemikalien i fråga, så att man kan vara säker på att den uppmätta radioaktiviteten härrör direkt från tes ­
tämnet. 
15. Värdet på log P
 OW kan uppskattas med hjälp av kommersiellt tillgänglig 
programvara eller genom att man jämför testämnets löslighet i de båda 
lösningsmedlen. 
16. Innan P  OW bestäms med den här metoden bör man ha tillgång till följande 
information om testämnet: 
a) Strukturformel. 
b) Analysmetoder som lämpar sig för att bestämma ämnets koncentration i 
vatten och 1-oktanol. 
c) Dissociationskonstant(er) för joniserbara ämnen (OECD:s riktlinje 
112 (9)). 
d) Vattenlöslighet (10). 
e) Abiotisk hydrolys) (11). 
f) Biologisk nedbrytbarhet (12). 
g) Ångtryck (13).  
METODBESKRIVNING  
Utrustning  
17. Vanlig laboratorieutrustning behövs, i synnerhet följande: 
— Magnetomrörare och teflonbelagda magnetstavar används för omrörning 
i vattenfasen. 
— Analysinstrument som lämpar sig för att bestämma testämnets koncent ­
ration i det förväntade koncentrationsintervallet. 
— Omrörningskärl med en kran i botten. Beroende på testämnets uppskat ­
tade log P  OW -värde och den använda analysmetodens 
detektionsgräns (LOD) kan det vara nödvändigt att använda ett kärl 
med samma geometri som är större än en liter, så att vattenvolymen är tillräckligt stor för att möjliggöra kemisk extraktion och analys. På så 
sätt erhålls högre koncentrationer i vattenextraktet och därmed en mer 
tillförlitlig analytisk bestämning. I tillägg 1 finns en tabell med upp ­
skattade minsta volymer, detektionsgränsen för testämnet, dess uppskat ­
tade log P
 OW och dess vattenlöslighet. Tabellen baseras på förhållandet 
mellan log P  OW och kvoten mellan ämnets löslighet i oktanol och vatten, 
såsom beskrivits av Pinsuwan m.fl. (14): 
log P  OW ¼ 0; 88 log SR þ 0; 41 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 163
 
där 
SR ¼ S okt=S w (i molaritet) 
samt på det förhållande för att uppskatta vattenlöslighet som beskrivits 
av Lyman (15). Vattenlösligheten enligt den formel som anges i tillägg 1 ska ses som en första uppskattning. Observera att det står användaren fritt att uppskatta vattenlösligheten genom samband som bättre anses 
representera förhållandet mellan hydrofobicitet och löslighet. För fasta 
föreningar rekommenderas exempelvis att man vid uppskattning av lös ­
ligheten tar hänsyn till smältpunkten. När en modifierad ekvation an ­
vänds bör man förvissa sig om att ekvationen för beräkning av löslig ­
heten i oktanol fortfarande är giltig. En schematisk ritning av ett glas ­
mantlat omrörningskärl med en volym på ca en liter finns i tillägg 2. Proportionerna på kärlet som visas i tillägg 2 har visat sig vara gynn ­
samma och bör bibehållas när utrustning av annan storlek används. 
— Under försöket med långsam omrörning är det nödvändigt att hålla 
temperaturen konstant. 
18. Kärlet bör vara tillverkat av ett inert material så att adsorptionen på kärlets 
väggar och botten är försumbar.
 
Beredning av testlösningar  
19. Bestämningen av P  OW bör göras med den renaste 1-oktanol som finns i 
handeln (minst + 99 %). Det rekommenderas att 1-oktanol renas genom 
extraktion med syra, bas och vatten samt efterföljande torkning. 1-oktanol 
kan också renas genom destillation. Renad 1-oktanol används för att bereda standardlösningar av testämnena. Det vatten som används för bestämningen av P
 OW ska vara destillerat i utrustning av glas eller kvarts, eller ska komma 
från ett reningssystem. Vatten av HPLC-kvalitet kan också användas. Des ­
tillerat vatten måste filtreras genom ett 0,22 μm filter, och för att kontrollera 
att de koncentrerade extrakten inte innehåller några föroreningar som kan reagera med testämnet måste blankprover ingå. Om ett glasfiberfilter an ­
vänds ska det rengöras genom upphettning vid 400 °C i minst tre timmar. 
20. Innan försöket inleds mättas de båda lösningsmedlen med varandra genom 
att bringas i jämvikt i ett tillräckligt stort kärl. Detta åstadkoms genom långsam omrörning av tvåfassystemet i två dagar. 
21. En lämplig koncentration av testämnet väljs och löses i 1-oktanol (mättad 
med vatten). Fördelningskoefficienten 1-oktanol/vatten ska bestämmas i ut ­
spädda lösningar i 1-oktanol och vatten. Testämnets koncentration bör därför inte överstiga 70 % av dess löslighet med en högsta koncentration på 0,1 M i endera fasen (1). De lösningar i 1-oktanol som används för försöket får 
inte innehålla något uppslammat testämne i fast form. 
22. En lämplig mängd av testämnet löses i 1-oktanol (mättad med vatten). Om 
den uppskattade log P
 OW är större än fem måste man se till att de lösningar i 
1-oktanol som används för försöket inte innehåller något uppslammat tes ­
tämne i fast form. För att undvika detta ska följande metod användas för 
kemikalier vars uppskattade log P  OW -värde är > 5: 
— Lös testämnet i 1-oktanol (mättad med vatten).  ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 164
 
— Vänta tills det uppslammade fasta ämnet har sjunkit till botten. Kont ­
rollera testämnets koncentration under väntetiden. 
— Vänta tills testämnets koncentration i 1-oktanol har stabiliserats och späd 
därefter stamlösningen med en lämplig volym 1-oktanol. 
— Mät den utspädda stamlösningens koncentration. Om den uppmätta kon ­
centrationen stämmer med utspädningen kan stamlösningen användas för 
försöket.  
Extraktion och analys av prover  
23. En validerad analysmetod ska användas för bestämning av testämnet. De 
som utför försöket måste kunna styrka att koncentrationerna både i den vattenmättade 1-oktanolen och i den 1-oktanol-mättade vattenfasen ligger 
över den använda analysmetodens kvantifieringsgräns. Om det är nödvän ­
digt att extrahera testämnet från vattenfasen och 1-oktanolfasen måste utby ­
tet vid extraktion från respektive fas fastställas innan försöket inleds. Sig ­
nalen måste korrigeras för blankvärden och det är viktigt att se till att ingen 
analyt överförs från ett prov till ett annat. 
24. För hydrofoba testämnen som har relativt låga koncentrationer i vattenfasen 
är det troligen nödvändigt att extrahera vattenfasen med ett organiskt lös ­
ningsmedel och att koncentrera extraktet före analys. Av samma anledning 
är det också nödvändigt att blankproverna har en mycket låg koncentration. Därför måste mycket rena lösningsmedel användas, helst lösningsmedel för spårämnesanalys. Risken för att föroreningar överförs mellan proverna kan 
också minskas genom att man använder noggrant rengjord glasutrustning 
(den kan t.ex. sköljas i lösningsmedel eller upphettas vid hög temperatur). 
25. Värdet på log P
 OW kan uppskattas med hjälp av ett uppskattningsprogram 
eller genom sakkunnig bedömning. Om det är högre än 6 är det viktigt att 
korrigera för blankvärdena och kontrollera att det inte sker någon överföring 
av analyt mellan proverna. Om det uppskattade log P  OW -värdet överskrider 
6 måste man använda en surrogatstandard för att korrigera för utbytet så att provet kan koncentras så mycket som möjligt före analys. Ett antal program 
för uppskattningen av log P
 OW finns kommersiellt tillgängliga (  1 ), t.ex. Clog 
P (16), KOWWIN (17), ProLogP (18) och ACD log P (19). I hänvisning ­
arna (20–22) beskrivs olika metoder för att uppskatta log P  OW . 
26. Kvantifieringsgränserna för bestämning av testämnet i 1-oktanol och vatten 
ska fastställas med vedertagna metoder. Som en tumregel kan kvantifierings ­
gränsen anses vara den koncentration i vatten eller 1-oktanol som ger ett signal-brusförhållande på tio. En lämplig extraktions- och förkoncentrations ­
metod ska väljas, och utbytet vid analysen ska också anges. En lämplig grad 
av förkoncentrering väljs så att en signal av erforderlig storlek erhålls vid den analytiska bestämningen.
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 165  
( 1 ) Denna information ges endast som information till användarna. Andra motsvarande 
datorprogram kan användas om man kan visa att de ger samma resultat.
 27. På grundval av analysmetodens parametrar och de förväntade koncentratio ­
nerna bestäms den ungefärliga provstorlek som krävs för en korrekt bestäm ­
ning av ämnets koncentration. Man bör undvika att använda vattenprover som är så små att man inte erhåller en tillräcklig signal. Man bör likaså undvika alltför stora vattenprover, eftersom det annars kan hända att det inte 
finns tillräckligt mycket vatten kvar för att göra det erforderliga antalet 
analyser (n = 5). I tillägg 1 anges den minsta provvolymen som en funktion av kärlets volym, testämnets detektionsgräns och dess löslighet. 
28. Testämnena kvantifieras genom jämförelser av kalibreringskurvorna för re ­
spektive ämne. De analyserade provernas koncentrationer måste ligga i 
samma intervall som standardlösningarnas koncentrationer. 
29. För testämnen vars uppskattade log P
 OW är högre än 6 måste vattenprovet 
spikas med en surrogatstandard före extraktionen, så att förlusterna vid extraktion och förkoncentrering av vattenproverna kan bedömas. För att utbytet ska kunna korrigeras så exakt som möjligt måste surrogatstandardens 
egenskaper vara mycket lika eller identiska med testämnets egenskaper. 
Helst ska (stabila) isotopmärkta analoger av testämnet (t.ex. deuterium- eller
 
13 C-märkta) användas. Om det inte är möjligt att använda stabila isotop ­
märkta analoger såsom  13 C eller  2 H ska det genom tillförlitliga litteraturupp ­
gifter visas att surrogatstandardens fysikalisk-kemiska egenskaper ligger 
mycket nära testämnets. Vid vätske-vätskeextraktionen av vattenfasen kan emulsioner bildas. Detta problem kan minskas genom tillsats av salt och genom att man låter emulsionen klarna över natten. I rapporten ska det 
anges vilka metoder som används för extraktion och förkoncentrering av 
proverna. 
30. Prover som tas från 1-oktanolfasen kan vid behov spädas med ett lämpligt 
lösningsmedel före analys. Dessutom rekommenderas att utbytet korrigeras genom användning av surrogatstandarder om det vid försök visat sig att 
utbytet varierar mycket (relativ standardavvikelse > 10 %). 
31. Rapporten ska omfatta detaljerade uppgifter om den använda analysmeto ­
den. Hit hör extraktions- och förkoncentrationsmetoder, utspädningsfaktorer, instrumentparametrar, kalibreringsrutin, kalibreringsområde, analytisk utbyte av testämnet från vatten, tillsats av surrogatstandarder för korrigering av 
utbytet, blankvärden, detektionsgränser och kvantifieringsgränser.
 
Testförfarande  
Optimala volymförhållanden för 1-oktanol och vatten  
32. När man väljer volymerna av 1-oktanol och vatten bör man beakta kvan ­
tifieringsgränserna i 1-oktanol och vatten, graden av förkoncentration av 
vattenproverna, provtagningsvolymerna i 1-oktanol och vatten och de för ­
väntade koncentrationerna. Av experimentella skäl bör volymen av 1-okta ­
nol väljas så att skiktet av 1-oktanol blir så tjockt (> 0,5 cm) att det är möjligt att ta prover från 1-oktanolfasen utan att den störs. 
33. Vid bestämning av fördelningskoefficienten för ämnen med log P
 OW på 4,5 
och högre används typiskt 20 till 50 ml 1-oktanol och 950 till 980 ml vatten 
i ett enliterskärl.  ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 166
 
Testbetingelser  
34. Reaktionskärlet ska vara termostatreglerat så att temperaturvariationen under 
försöket är mindre än 1 °C. Försöket ska utföras vid 25 °C. 
35. Försökssystemet måste skyddas från dagsljus, antingen genom att försöket 
utförs i ett mörkt rum eller genom att reaktionskärlet täcks med aluminium ­
folie. 
36. Försöket ska utföras i en så dammfri miljö som möjligt. 37. Blandningen av 1-oktanol och vatten rörs om tills jämvikt inställer sig. Hur 
lång tid det tar att uppnå jämvikt bestäms i ett pilotförsök där prover på vatten och 1-oktanol tas med jämna mellanrum. Det ska gå minst fem timmar mellan provtagningstillfällena. 
38. Varje bestämning av P
 OW ska bygga på minst tre oberoende omrörnings ­
försök.  
Bestämning av jämviktstiden  
39. Jämvikt antas ha inställt sig när man vid regression av koncentrationsför ­
hållandet mellan 1-oktanol och vatten som en funktion av tiden, över en 
tidsrymd som omfattar fyra punkter, får en lutning som inte avviker nämn ­
värt från 0 vid en p-nivå på 0,05. Systemet måste bringas i jämvikt under minst en dag innan provtagningen inleds. Som en tumregel kan provtagning 
av ämnen med ett uppskattat log P
 OW mindre än 5 göras under dag två och 
tre. För mer hydrofoba ämnen kan det ta längre tid att uppnå jämvikt. För ett ämne med ett log P
 OW på 8,23 (dekaklorbifenyl) krävdes 144 timmar för 
att nå jämvikt. För att avgöra om jämvikt inställt sig tas upprepade prover 
från ett och samma kärl.  
Försökets inledning  
40. Försöket inleds genom att reaktionskärlet fylls med vatten mättat med 1- 
oktanol. Kärlet får sedan stå tills den temperatur som termostaten är inställd 
på nås. 
41. Därefter tillsätts försiktigt önskad mängd av testämnet (löst i erforderlig 
volym 1-oktanol mättad med vatten) till reaktionskärlet. Detta är ett kritiskt steg i försöket, eftersom man måste undvika turbulent blandning av de båda faserna. 1-oktanolfasen kan därför långsamt pipetteras mot reaktionskärlets 
vägg, nära vattenfasen. Den kommer att rinna längs glasväggen och bilda en 
film ovanpå vattenfasen. 1-oktanol får aldrig hällas direkt i reaktionskärlet och det är viktigt att se till att droppar av 1-oktanol inte faller direkt i vattnet. 
42. Omröraren startas och omrörningshastigheten ökas långsamt. Om omrörar ­
motorn inte kan justeras ordentligt bör man överväga att använda en trans ­
formator. Omrörningshastigheten justeras så att strömvirveln i kontaktytan mellan vattnet och 1-oktanolen är 0,5 till högst 2,5 cm djup. Om strömvir ­
veln är djupare än 2,5 cm ska omrörningshastigheten minskas. I annat fall 
kan det bildas mikrodroppar av 1-oktanol i vattenfasen, som leder till att 
testämnets koncentration i vattenfasen överskattas. Rekommendationen att omrörningshastigheten ska ge en virvel på högst 2,5 cm grundas på resul ­
taten av den utförda interkalibreringen (5). Det är en kompromiss mellan 
önskan att snabbt uppnå jämvikt och att begränsa bildningen av mikrosko ­
piska droppar av 1-oktanol.
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 167
 
Provtagning och provberedning  
43. Omröraren stängs av före provtagningen och man väntar sedan tills väts ­
korna slutat röra sig. När provtagningen är avslutad startas omröraren igen, först långsamt och sedan gradvis snabbare såsom beskrivs ovan. 
44. Prover på vattenfasen tas från en kran i botten av reaktionskärlet. Släng 
alltid bort den dödvolym vatten som finns i kranen (ca 5 ml i det kärl som visas i tillägg 2). Vattnet i kranen är inte omrört och är därför inte i 
jämvikt med resten av vätskan i kärlet. Anteckna vattenprovernas volym och 
se till att testämnet som finns i det slängda vattnet beaktas när massbalansen upprättas. Avdunstningsförlusterna minimeras genom att vattnet sakta får rinna in i separertratten, utan att vatten- och 1-oktanolfaserna störs. 
45. Prover av 1-oktanol tas genom att små alikvoter (ca 100 μl) avlägsnas från 
1-oktanolfasen med en 100 mikrolitersspruta helt av glas och metall. Det är viktigt att de båda vätskorna inte blandas i kontaktytan. Den provtagna vätskans volym antecknas. Det räcker med små alikvoter eftersom 1-okta ­
nol-provet späds ut. 
46. Onödiga provöverföringssteg bör undvikas. Provvolymen bör därför bestäm ­
mas gravimetriskt. För vattenprover kan detta åstadkommas genom att man samlar upp vattenprovet i en separertratt som redan innehåller den erforder ­
liga mängden lösningsmedel.
 
DATA OCH RAPPORTERING 
47. Enligt den här metoden bestäms P  OW genom att man utför tre omrörnings ­
försök med det ämne som ska undersökas under identiska betingelser. Den regressionsanalys som används för visa att jämvikt uppnåtts ska grundas på resultaten av minst fyra på varandra bestämningar av C
 O /C W vid olika 
tidpunkter. På så sätt kan man beräkna variansen som ett mått på osäker ­
heten för det medelvärde som erhålls från varje försöksenhet. 
48. P  OW kan beskrivas genom den varians i data som erhålls i varje försöks ­
enhet. Denna information används för att beräkna P  OW som det vägda 
medelvärdet för resultaten i de enskilda försöksenheterna. Det inverterade 
värdet på variansen hos resultaten från försöksenheterna används som vikt. Detta leder till att data som uppvisar en stor variation (uttryckt som varians) och som därför är mindre tillförlitliga inte påverkar resultaten lika mycket 
som data med liten varians. 
49. Den vägda standardavvikelsen beräknas på samma sätt. Den beskriver P
 OW - 
mätningens repeterbarhet. Ett lågt värde på den vägda standardavvikelsen visar att bestämningen av P
 OW har en mycket god repeterbarhet inom ett och 
samma laboratorium. Den formella statistiska behandlingen av erhållna data 
beskrivs nedan.  ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 168
 
Behandling av resultaten  
Demonstration av att jämvikt uppnåtts  
50. Logaritmen för förhållandet mellan testämnets koncentrationer i 1-oktanol 
och vatten (log (C  O /C w )) beräknas för varje provtagningstidpunkt. För att 
visa att jämvikt uppnåtts plottas detta förhållande som en funktion av tiden. En platå i kurvan, som ska omfatta minst fyra på varandra följande mät ­
punkter, tyder på att jämvikt har uppnåtts och att ämnet verkligen är löst i 1- 
oktanol. Om så inte är fallet måste försöket fortgå tills fyra på varandra följande mätpunkter ger en lutning som inte avviker nämnvärt från 0 vid en p-nivå på 0,05, vilket anger att log C
 o /C w är oberoende av tid.  
Beräkning av log P  OW 
51. Värdet på log P  OW i försöksenheten beräknas som det vägda medelvärdet 
för log C  o /C w för den del av kurvan (log C  o /C w som en funktion av tiden) 
där det har visats att jämvikt uppnåtts. Det vägda medelvärdet beräknas 
genom att data vägs med det inverterade värdet på variansen så att deras påverkan på slutresultatet är omvänt proportionell mot deras osäkerhet.
 
Genomsnittligt log P  OW 
52. Medelvärdet av log P  OW för olika försöksenheter beräknas som medelvärdet 
av resultaten från de enskilda försöken viktade med sina respektive varian ­
ser. 
Beräkningen utförs med hjälp av följande formel: 
log P  OW ;Av ¼ ðΣw i Ü log P  OW ;i Þ Ü ðΣw i Þ –1 
där 
log P  OW,i = log P  OW -värdet för den enskilda försöksenheten i 
log P  OW,Av  = det vägda medelvärdet för de enskilda bestämningarna av 
log P  OW 
w i = den statistiska vikt som tilldelats log P  OW -värdet för försöks ­
enhet i. 
Den inverterade variansen för log P  OW,i används som w  i 
(w i ¼ varðlogP  OW ;i Þ –1 ). 
53. Medelfelet av log P  OW uppskattas som den repeterbarhet för log C  o /C w som 
bestäms under jämviktsfasen i varje enskild försöksenhet. Det uttrycks som 
den vägda standardavvikelsen för log P  OW,Av  (σ log Pow,Av  ) som i sin tur är 
ett mått på det fel som hänger samman med P  OW,Av  . Den vägda standard ­
avvikelsen kan beräknas från den viktade variansen (var  log Pow,Av  ) enligt 
följande formel: 
var log Pow ;Av ¼ ðΣw i Ü ðlog P  OW ;i Ä log P  OW ;Av Þ 2 Þ Ü ðΣw i Ü ðn Ä 1ÞÞ –1 
σ log Pow ;Av ¼ ðvar log Pow ;Av Þ 0;5 
Symbolen n står för antalet försöksenheter.  ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 169
 
Testrapport  
54. Testrapporten ska omfatta följande information:  
Testämne:  
— Trivialnamn, kemiskt namn, CAS-nummer, strukturformel (med angi ­
vande av den radioaktiva isotopens position för märkta ämnen) och relevanta fysikalisk-kemiska egenskaper (se punkt 17). 
— Testämnets renhet (föroreningar). 
— Renhet och aktivitet per mol hos den isotop som använts för märkning (i 
förekommande fall). 
— Preliminär uppskattning av log P
 ow samt angivande av den metod som 
används för att komma fram till detta värde.  
Försöksbetingelser:  
— Datum för utförandet av studierna. 
— Temperatur under försöket. 
— Volymer av 1-oktanol och vatten i början av testet. — Borttagna provvolymer av 1-oktanol och vatten. 
— Volymer 1-oktanol och vatten som återstår i testkärlen. 
— Beskrivning av reaktionskärl och omrörningsparametrar (omrörarmagne ­
tens och reaktionskärlets form, strömvirvelns djup i mm samt omrör ­
ningshastigheten om denna är känd). 
— Metoder som använts för att analysera testämnet och dess kvantifierings ­
gräns. 
— Provtagningstider. — Vattenfasens pH-värde och eventuella buffertar som använts för att ju ­
stera pH-värdet hos joniserbara molekyler. 
— Antal replikat.  
Resultat:  
— De använda analysmetodernas repeterbarhet och känslighet. 
— Koncentrationer av testämnet i 1-oktanol och vatten som funktion av tid. — Demonstration av massbalans. 
— Temperatur och standardavvikelse eller temperaturintervallet under för ­
söket. 
— En kurva som visar förhållandet mellan koncentrationer som funktion av 
tid. 
— Medelvärdet för log P
 ow,Av  och dess standardfel. 
— Diskussion och tolkning av resultaten.  ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 170
 
— Exempel på rådata från en representativ analys (i enlighet med god 
laboratoriesed ska alla rådata sparas) som omfattar uppgifter om utbyten 
för surrogatstandarder, antal punkter på kalibreringskurvan (med angi ­
vande av kriterier för kalibreringskurvans korrelationskoefficient) samt resultat av kvalitetssäkring och kvalitetskontroll (QA/QC). 
— Samt när det finns tillgängligt: Valideringsrapport för analysmetoden 
(ska tas upp i litteraturhänvisningarna).
 
LITTERATUR  
(1) De Bruijn JHM, Busser F, Seinen W, Hermens J. (1989). Determination of 
octanol/water partition coefficients with the ”slow-stirring” method. Envi ­
ron. Toxicol. Chem. 8: 499–512. 
(2) Kapitel A.8 i denna bilaga, fördelningskoefficient. 
(3) Kapitel A.8 i denna bilaga, fördelningskoefficient. 
(4) OECD (2000). OECD Draft Guideline for the Testing of Chemicals: 122 
Partition Coefficient (n-Octanol/Water): pH-Metric Method for Ionisable 
Substances. Paris. 
(5) Tolls J (2002). Partition Coefficient 1-Octanol/Water (Pow) Slow-Stirring 
Method for Highly Hydrophobic Chemicals, Validation Report. RIVM 
contract-Nrs 602730 M/602700/01. 
(6) Boethling RS, Mackay D (eds.) (2000). Handbook of property estimation 
methods for chemicals. Lewis Publishers Boca Raton, FL, Förenta staterna. 
(7) Schwarzenbach RP, Gschwend PM, Imboden DM (1993). Environmental 
Organic Chemistry. Wiley, New York, NY. 
(8) Arnold CG, Widenhaupt A, David MM, Müller SR, Haderlein SB, Schwar ­
zenbach RP (1997). Aqueous speciation and 1-octanol-water partitioning of tributyl- and triphenyltin: effect of pH and ion composition.  Environ. Sci. 
Technol.  31: 2596–2602. 
(9) OECD (1981) OECD Guidelines for the Testing of Chemicals: 112 Dis ­
sociation Constants in Water. Paris. 
(10) Kapitel A.6 i denna bilaga, vattenlöslighet. (11) Kapitel C.7 i denna bilaga, nedbrytning – abiotisk nedbrytning: hydrolys 
som funktion av pH. 
(12) Kapitel C.4 – del II–VII (Metod A till F) i denna bilaga, bestämning av 
”lätt” bionedbrytbarhet. 
(13) Kapitel A.4 i denna bilaga, ångtryck. 
(14) Pinsuwan S, Li A and Yalkowsky S.H. (1995). Correlation of octanol/water 
solubility ratios and partition coefficients,  J. Chem. Eng. Data.  40: 
623–626. 
(15) Lyman WJ (1990). Solubility in water. I: Handbook of Chemical Property 
Estimation Methods: Environmental Behavior of Organic Compounds, Ly ­
man WJ, Reehl WF, Rosenblatt DH, Eds. American Chemical Society, Washington, DC, 2-1 to 2-52. 
(16) Leo A, Weininger D (1989). Medchem Software Manual. Daylight Chem ­
ical Information Systems, Irvine, CA. 
(17) Meylan W (1993). SRC-LOGKOW for Windows. SRC, Syracuse, N.Y. 
(18) Compudrug L (1992). ProLogP. Compudrug, Ltd, Budapest. 
(19) ACD. ACD logP; Advanced Chemistry Development: Toronto, Ontario 
M5H 3V9, Kanada, 2001.
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 171
 
(20) Lyman WJ (1990). Octanol/water partition coefficient. I Lyman WJ, Reehl 
WF, Rosenblatt DH, eds,  Handbook of chemical property estimation , Amer­
ican Chemical Society, Washington, D.C. 
(21) Rekker RF, de Kort HM (1979). The hydrophobic fragmental constant: An 
extension to a 1 000 data point set.  Eur. J. Med. Chem. Chim. Ther.  14: 
479–488. 
(22) Jübermann O (1958). Houben-Weyl, ed,  Methoden der Organischen Che ­
mie: 386–390.  ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 172
 
Tillägg 1  
Kalkylblad för beräkning av de minsta vattenvolymer som krävs för 
detektion av testämnen med olika log P  OW -värden i vattenfasen  
Antaganden: 
— Maximal volym av enskilda alikvoter = 10 % av den totala volymen; 5 
alikvoter = 50 % av den totala volymen. 
— Testämnens koncentration  ¼ 0; 7 Ü löslighet i endera fasen. Vid lägre kon ­
centrationer krävs större volymer. 
— Volym som används för bestämning av detektionsgräns = 100 ml. 
— log P  ow som en funktion av log S  w och log P  ow som en funktion av SR 
(S okt /S w ) åskådliggör testämnenas förhållanden på ett rimligt sätt.  
Uppskattning av S  w 
log P  ow Formel log S  w S w (mg/l)  
4 ð –Þ0; 922 Ü log P  ow þ 4; 184 0,496 3,133E+00 
4,5 ð –Þ0; 922 Ü log P  ow þ 4; 184 0,035 1,084E+00 
5 ð –Þ0; 922 Ü log P  ow þ 4; 184 – 0,426 3,750E-01 
5,5 ð –Þ0; 922 Ü log P  ow þ 4; 184 – 0,887 1,297E-01 
6 ð –Þ0; 922 Ü log P  ow þ 4; 184 – 1,348 4,487E-02 
6,5 ð –Þ0; 922 Ü log P  ow þ 4; 184 – 1,809 1,552E-02 
7 ð –Þ0; 922 Ü log P  ow þ 4; 184 – 2,270 5,370E-03 
7,5 ð –Þ0; 922 Ü log P  ow þ 4; 184 – 2,731 1,858E-03 
8 ð –Þ0; 922 Ü log P  ow þ 4; 184 – 3,192 6,427E-04  
Uppskattning av S  oct 
log P  ow Formel S  okt (mg/l)  
4 log P  ow ¼ 0; 88log SR þ 0; 41 3,763E+04 
4,5 log P  ow ¼ 0; 88log SR þ 0; 42 4,816E+04 
5 log P  ow ¼ 0; 88log SR þ 0; 43 6,165E+04 
5,5 log P  ow ¼ 0; 88log SR þ 0; 44 7,890E+04 
6 log P  ow ¼ 0; 88log SR þ 0; 45 1,010E+05 
6,5 log P  ow ¼ 0; 88log SR þ 0; 46 1,293E+05 
7 log P  ow ¼ 0; 88log SR þ 0; 47 1,654E+05 
7,5 log P  ow ¼ 0; 88log SR þ 0; 48 2,117E+05 
8 log P  ow ¼ 0; 88log SR þ 0; 49 2,710E+05  ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 173
 
Testämnets totala 
massa 
(mg) Massa  oct /Massa  vat­
ten Massa  H2O 
(mg) Konc  H2O 
(mg/l) Massa  oct 
(mg) Konc  okt 
(mg/l)  
1 319 526 2,5017 2,6333 1 317 26 333 
1 686 1 664 1,0127 1,0660 1 685 33 709 2 158 5 263 0,4099 0,4315 2 157 43 149 2 762 16 644 0,1659 0,1747 2 762 55 230 
3 535 52 632 0,0672 0,0707 3 535 70 691 
4 524 1664 36 0,0272 0,0286 4 524 90 480 5 790 5263 16 0,0110 0,0116 5 790 115 807 7 411 1 664 357 0,0045 0,0047 7 411 148 223 9 486 5 263 158 0,0018 0,0019 9 486 189 713
 
Beräkning av volymer  
Minsta volym som krävs för H  2 O-fasen vid olika detektionsgränser (uttryckta som 
koncentration)  
log K  ow Detektionsgräns 
(mikrogram/l) 0,001 0,01 0,10 1,00 10  
4 0,04 0,38 3,80 38 380 
4,5 0,09 0,94 9,38 94 938 
5 0,23 2,32 23,18 232 2 318 
5,5 0,57 5,73 57,26 573 5 726 
6 1,41 14,15 141 1 415 14 146 
6,5 3,50 34,95 350 3 495 34 950 
7 8,64 86,35 864 8 635 86 351 
7,5 21,33 213 2 133 21 335 213 346 
8 52,71 527 5 271 52 711 527 111 
Använd 
volym vid detektionsgrän ­
sen (I) 0,1
 
Beräkningsnyckel  
Utgör < 10 % av vattenfasens totala volym, 1 liters jämviktskärl. 
Utgör < 10 % av vattenfasens totala volym, 2 liters jämviktskärl. 
Utgör < 10 % av vattenfasens totala volym, 5 liters jämviktskärl. 
Utgör < 10 % av vattenfasens totala volym, 10 liters jämviktskärl. Överskrider 10 % även av ett 10 liters jämviktskärl.
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 174
 
Översikt över erforderliga volymer som en funktion av vattenlösligheten och log P  ow 
Minsta volym som krävs för H  2 O-fasen vid olika detektionsgränser (ml)  
log P  ow S w (mg/l) Detektionsgräns 
(mikrogram/l) 0,001 0,01 0,10 1,00 10  
4 10 0,01 0,12 1,19 11,90 118,99 
5 0,02 0,24 2,38 23,80 237,97 3 0,04 0,40 3,97 39,66 396,62 1 0,12 1,19 11,90 118,99 1 189,86 
4,5 5 0,02 0,20 2,03 20,34 203,37 
2 0,05 0,51 5,08 50,84 508,42 1 0,10 1,02 10,17 101,68 1 016,83 
0,5 0,20 2,03 20,34 203,37 2 033,67 
5 1 0,09 0,87 8,69 86,90 869,01 
0,5 0,17 1,74 17,38 173,80 1 738,02 
0,375 0,23 2,32 23,18 231,75 2 317,53 
0,2 0,43 4,35 43,45 434,51 4 345,05 
5,5 0,4 0,19 1,86 18,57 185,68 1 856,79 
0,2 0,37 3,71 37,14 371,36 3 713,59 0,1 0,74 7,43 74,27 742,72 7 427,17 
0,05 1,49 14,85 148,54 1 485,43 14 854,35 
6 0,1 0,63 6,35 63,48 634,80 6 347,95 
0,05 1,27 12,70 126,96 1 269,59 12 695,91 
0,025 2,54 25,39 253,92 2 539,18 25 391,82 
0,0125 5,08 50,78 507,84 5 078,36 50 783,64 
6,5 0,025 2,17 21,70 217,02 2 170,25 21 702,46 
0,0125 4,34 43,40 434,05 4 340,49 43 404,93 
0,006 9,04 90,43 904,27 9 042,69 90 426,93 0,003 18,09 180,85 1 808,54 18 085,39 180 853,86 
7 0,006 7,73 77,29 772,89 7 728,85 77 288,50 
0,003 15,46 154,58 1 545,77 15 457,70 154 577,01 
0,0015 23,19 231,87 2 318,66 23 186,55 231 865,51 
0,001 46,37 463,73 4 637,31 46 373,10 463 731,03 
7,5 0,002 19,82 198,18 1 981,77 19 817,73 198 177,33 
0,001 39,64 396,35 3 963,55 39 635,47 396 354,66 
0,0005 79,27 792,71 7 927,09 79 270,93 792 709,32
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 175
 
log P  ow S w (mg/l) Detektionsgräns 
(mikrogram/l) 0,001 0,01 0,10 1,00 10  
0,00025 158,54 1 585,42 15 854,19 158 541,86 1 585 418,63 
8 0,001 33,88 338,77 3 387,68 33 876,77 338 767,72 
0,0005 67,75 677,54 6 775,35 67 753,54 677 535,44 
0,00025 135,51 1 355,07 13 550,71 135 507,09 1 355 070,89 
0,000125 271,01 2 710,14 27 101,42 271 014,18 2 710 141,77 
Använd volym vid detek ­
tionsgränsen (l) 0,1 
Tillägg 2  
Exempel på glasmantlat reaktionskärl för det försök med långsam 
omrörning som används för att bestämma P  OW
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 176
 
DEL B: METODER FÖR BESTÄMNING AV TOXICITET OCH ANDRA 
HÄLSOEFFEKTER  
INNEHÅLLSFÖRTECKNING 
ALLMÄN INLEDNING 
B.1a AKUT TOXICITET (ORALT) – METOD MED FASTA SÄR ­
SKILJANDE DOSER 
B.1b AKUT TOXICITET ORALT – METOD FÖR BESTÄMNING 
AV AKUT TOXICITETSKLASS 
B.2 AKUT INHALATIONSTOXICITET B.3 AKUT TOXICITET (DERMALT) B.4 AKUT TOXICITET: HUDIRRITATION/HUDKORROSION B.5 AKUT TOXICITET: ÖGONIRRITATION/ÖGONKORROSION B.6 HUDSENSIBILISERING B.7 28-DAGARS TOXICITETSSTUDIE MED UPPREPAD ORAL 
DOSERING PÅ GNAGARE 
B.8 SUBAKUT INHALATIONSTOXICITET: 28-DAGARS STUDIE B.9 TOXICITET VID UPPREPAD DOSERING (28 DAGAR, DER ­
MALT) 
B.10 MUTAGENICITET – TEST  IN VITRO  AV KROMOSOMAVVI ­
KELSER HOS DÄGGDJUR 
B.11 MUTAGENICITET – TEST  IN VIVO  AV KROMOSOMAVVI ­
KELSER I BENMÄRG HOS DÄGGDJUR 
B.12 MUTAGENICITET – TEST AV MIKROKÄRNOR  IN VIVO  I 
ERYTROCYTER HOS DÄGGDJUR 
B.13/14 MUTAGENICITET – TEST AV ÅTERMUTATION HOS BAK ­
TERIER 
B.15 MUTAGENICITETSTEST OCH SVREENING FÖR CANCER ­
GENICITET 
B.16 MITOTISK REKOMBINATION – SACCHAROMYCES CERE ­
VISIAE 
B.17 MUTAGENICITET – TEST AV GENMUTATIONER HOS 
DÄGGDJURSCELLER IN VITRO 
B.18 DNA-SKADA OCH DNS-REPARATION – FELAKTIG DNA- 
SYNTES – DÄGGDJURSCELLER  IN VITRO  
B.19 TEST AVSEENDE SYSTERKROMATIDSBYTEN  IN VITRO  
B.20 KÖNSBUNDEN RECESSIV LETAL TEST PÅ  DROSOPHILA 
MELANOGASTER
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 177
 
B.21 CELLTRANSFORMATIONSTEST PÅ DÄGGDJURSCELLER  
IN VITRO  
B.22 DOMINANT LETAL TEST PÅ GNAGARE B.23 SPERMATOGENIAL TEST AV KROMOSOMAVVIKELSER 
HOS DÄGGDJUR 
B.24 FLÄCKTEST PÅ MUS 
B.25 TEST AVSEENDE ÄRFTLIG TRANSLOKATION PÅ MUS 
B.26 TEST AVSEENDE SUBKRONISK ORAL TOXICITET (90-DA ­
GARS UPPREPAT ORALTEST PÅ GNAGARE) 
B.27 TEST AVSEENDE SUBKRONISK ORAL TOXICITET (90-DA ­
GARS UPPREPAT ORALTEST PÅ ICKE-GNAGARE) 
B.28 TEST AVSEENDE SUBKRONISK DERMAL TOXICITET (90- 
DAGARS REPETERAD DERMALTEST PÅ GNAGARE) 
B.29 SUBKRONISK INHALATIONSTOXICITET: 90-DAGARSSTU ­
DIE 
B.30 STUDIER AV KRONISK TOXICITET B.31 TEST AVSEENDE PRENATAL UTVECKLINGSTOXICITET 
B.32 KARCINOGENICITETSSTUDIER 
B.33 KOMBINERAD KRONISK TOXICITETS-/KARCINOGENICI ­
TETSSTUDIE 
B.34 REPRODUKTIONSTOXICITETSTEST PÅ EN GENERATION B.35 TEST AVSEENDE REPRODUKTIONSTOXICITET PÅ TVÅ 
GENERATIONER 
B.36 TOXIKOKINETIK B.37 FÖRDRÖJD NEUROTOXICITET ORSAKAD AV ORGA ­
NISKA FOSFORFÖRENINGAR TILL FÖLJD AV AKUT EX ­
PONERING 
B.38 FÖRDRÖJD NEUROTOXICITET ORSAKAD AV ORGA ­
NISKA FOSFORFÖRENINGAR (28 DAGARS UPPREPAD DOSUNDERSÖKNING) 
B.39 TEST AV REPARATIONSSYNTES (uds) HOS LEVERCELLER 
FRÅN DÄGGDJUR  IN VIVO  
B.40  IN VITRO -TEST AV HUDKORROSIVITET: BESTÄMNING AV 
TRANSKUTANT ELEKTRISKT MOTSTÅND (TER) 
B.40a  IN VITRO -TEST AV HUDKORROSIVITET: TEST MED MO ­
DELL AV HUMAN HUD
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 178
 
B.41 3T3 NRU-FOTOTOXICITETSTEST  IN VITRO  
B.42 HUDSENSIBILISERING: LLNA-METODEN (LOCAL LYMPH 
NODE ASSAY) 
B.43 TEST AVSEENDE NEUROTOXICITET PÅ GNAGARE B.44 HUDABSORPTION:  IN VIVO -METOD 
B.45 HUDABSORPTION:  IN VITRO -METOD 
B.46  IN VITRO -HUDIRRITATION: TESTMETOD MED REKON ­
STRUERAD HUMAN HUD 
B.47. TESTMETODEN BCOP (BOVINE CORNEAL OPACITY AND 
PERMEABILITY) FÖR KLASSIFICERING AV ÄMNEN SOM FRÄTANDE ELLER KRAFTIGT IRRITERANDE FÖR ÖGO ­
NEN 
B.48. TESTMETODEN ICE (ISOLATED CHICKEN EYE TEST) FÖR 
IDENTIFIERING AV ÄMNEN SOM ÄR FRÄTANDE OCH KRAFTIGT IRRITERANDE FÖR ÖGONEN 
B.49 MIKRONUKLEUSTEST AV DÄGGDJURSCELLER  IN VITRO  
B.50 HUDSENSIBILISERING: LLNA-METODEN (LOCAL LYMPH 
NODE ASSAY): DA 
B.51 HUDSENSIBILISERING: LLNA-METODEN (LOCAL LYMPH 
NODE ASSAY): BrdU-ELISA
 
▼M4 
B.52 AKUT INHALATIONSTOXICITET – AKUT TOXICITETS ­
KLASS  
▼M5 
B.53 STUDIE AV UTVECKLINGSNEUROTOXICITET B.54 UTEROTROF BIOASSAY PÅ GNAGARE: ETT KORTTIDS ­
SCREENINGTEST FÖR ÖSTROGENA EGENSKAPER 
B.55 HERSHBERGERS BIOASSAY PÅ RÅTTA: ETT KORTTIDS ­
SCREENINGTEST FÖR (ANTI)ANDROGENA EGENSKAPER 
B.56 UTÖKAD ENGENERATIONSSTUDIE AV REPRODUKTIONS ­
TOXICITET 
B.57 H295R STEROIDOGENESTEST 
B.58 GENMUTATIONSTESTER I SOMATISKA CELLER OCH 
KÖNSCELLER HOS TRANSGENA GNAGARE
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 179
 
ALLMÄN INLEDNING  
A. BESKRIVNING AV TESTSUBSTANSEN  
Testsubstansens sammansättning, inbegripet de viktigaste orenheter ­
na, och dess relevanta fysikaliskt-kemiska egenskaper, inbegripet 
ämnets stabilitet, ska vara kända innan en toxicitetsundersökning 
inleds. 
Testsubstansens fysikaliskt-kemiska egenskaper ger viktig vägled ­
ning vid val av tillförselväg, utformning av varje enskild undersök ­
ning samt hantering och lagring av testsubstansen. 
En analysmetod för kvalitativ och kvantitativ bestämning av testsub ­
stansen (om möjligt inbegripet viktiga orenheter) i doseringsmediet 
och i biologiska material bör utvecklas innan en undersökning inleds. 
Alla uppgifter om identifiering av testsubstansen, dess fysikaliskt-ke ­
miska egenskaper, renhet och beteende bör omfattas av testrapporten.  
B. DJURVÅRD  
En strikt kontroll av miljöförhållandena samt tillämpliga djurvårds ­
metoder är grundläggande i fråga om toxicitetstester.  
i) Förvaltningsförhållanden  
Miljön i försöksdjurens rum eller burar ska vara avpassade efter 
djurarten. Lämpliga betingelser för råttor, möss och marsvin är en rumstemperatur på 22 ±3
 o C med en relativ luftfuktighet på 30 – 
70 %. För kaniner och marsvin bör temperaturen hållas vid 20 ±3  o C 
med en relativ luftfuktighet på 30 – 70 %. 
Vissa testmetoder är särskilt känsliga för temperatureffekter och i 
dessa fall ingår detaljuppgifter om lämpliga betingelser i metodbe ­
skrivningen. I alla undersökningar av toxiska effekter ska tempera ­
turen och luftfuktigheten kontrolleras, registreras och anges i den 
slutliga testrapporten. 
Artificiell belysning bör användas, med en dygnsrytm på 12 timmar 
ljus, 12 timmar mörker. Detaljuppgifter om belysningsrytmen ska registreras och anges i den slutliga testrapporten. 
Om inte annat anges för metoden får djuren inhysas individuellt eller 
i små grupper av samma kön; i fråga om grupper bör högst fem djur 
inhysas i varje bur. 
I rapporter om djurförsök är det viktigt att ange vilken typ av bur 
som används och antalet djur i varje bur, både under exponering för 
det kemiska ämnet och under en påföljande observationstid.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 180
 
ii) Utfodring  
Fodret ska uppfylla alla näringsmässiga krav som kan ställas för den 
djurart som används i försöket. Om testsubstansen tillförs djuren via fodret kan näringsvärdet sjunka till följd av en samverkan mellan 
ämnet och någon beståndsdel i fodret. Möjligheten av en sådan re ­
aktion ska övervägas vid tolkningen av testresultaten. Konventionellt laboratoriefoder får användas tillsammans med obegränsade mängder vatten. Valet av foder kan påverkas av behovet av att säkerställa en 
lämplig blandning med testsubstansen när denna tillförs enligt denna 
metod. 
I fodret får inte finnas störande koncentrationer av föroreningar som 
man vet påverkar toxiciteten.
 
C. ALTERNATIVA TESTER  
För Europeiska unionen är det ett åtagande att främja utvecklandet 
och valideringen av alternativa metoder som kan ge samma infor ­
mationsnivå som nuvarande djurförsök, men som använder färre djur, orsakar mindre lidande eller undviker användning av djur full ­
ständigt. 
När sådana metoder blir tillgängliga ska de om möjligt beaktas för 
riskbedömning och efterföljande klassificering och märkning av 
eventuella risker.
 
D. UTVÄRDERING OCH TOLKNING  
När tester utvärderas och tolkas ska begränsningarna för i vilken 
utsträckning resultaten av djurförsök och  in vitro -undersökningar 
går att tillämpa på människor beaktas och därför får bevis för nega ­
tiva effekter på människor i förekommande fall användas som be ­
kräftelse av testresultaten.  
E. LITTERATURHÄNVISNINGAR  
De flesta av dessa metoder har utvecklats inom ramen för OECD:s 
program för riktlinjer för tester och bör utföras i enlighet med prin ­
ciperna för god laboratoriepraxis, i syfte att så långt möjligt säker ­
ställa ”ömsesidigt godtagande av uppgifter”. 
Ytterligare information finns i de hänvisningar som görs i OECD:s 
riktlinjer och relevant litteratur som publicerats på annat håll.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 181
 
B.1a AKUT TOXICITET (ORALT) – METOD MED FASTA 
SÄRSKILJANDE DOSER  
1. METOD  
Denna testmetod motsvarar OECD TG 420 (2001).  
1.1 INLEDNING 
Vid traditionella metoder för bedömning av akut toxicitet används 
djurens död som slutpunkt. 1984 föreslog British Toxicology Society 
en ny metod för test avseende akut toxicitet. Den nya metoden 
bygger på att djuren ges en serie doser på definierade nivåer (se hänvisning 1). Då behöver djurens död inte användas som slutpunkt, eftersom metoden bygger på observationer av klara tecken på tox ­
icitet vid någon av de definierade dosnivåerna. Efter brittiska och 
internationella (se hänvisning 2 respektive 3) valideringsstudier  in 
vivo 1992 detta förfarande som en testmetod. Därefter har metodens 
statistiska egenskaper utvärderats med hjälp av matematiska modeller 
i en serie studier (se hänvisning 4, 5, och 6). Med hjälp av dessa  in 
vivo-  och modelleringsstudier har man kunnat demonstrera att meto ­
den är reproducerbar, kräver ett mindre antal djur och orsakar mindre lidande än de traditionella metoderna, och att metoden även gör det 
möjligt att klassificera ämnen på ett liknande sätt som med de övriga 
testmetoderna för akut toxicitet. 
Riktlinjer för valet av den lämpligaste testmetoden för ett visst än ­
damål finns i vägledningen om testning av akut toxicitet oralt (se hänvisning 7). I vägledningen finns även tilläggsinformation rörande 
utförandet av testmetod B.1b och tolkningen av resultaten. 
Metoden bygger på principen om att endast skäligen toxiska doser 
används i huvudtestet, och att doser som förväntas vara dödliga ska 
undvikas. Doser som, på grund av frätande eller allvarligt irriterande verkningar, är kända att orsaka klar smärta och svårt lidande behöver inte användas. Döende djur eller djur som uppvisar klara tecken på 
smärta eller allvarligt och ihållande lidande ska avlivas skonsamt, 
och vid tolkningen av testresultaten ska dessa djur beaktas på samma sätt som djur som har dött under testets gång. Kriterierna för beslut rörande avlivning av döende eller svårt lidande djur, liksom även 
riktlinjer för tecknen på förutsägbar eller annalkande död, behandlas 
i en separat vägledning (se hänvisning 8). 
Metoden ger information om ett ämnes farliga egenskaper och möj ­
liggör klassificering av ämnet enligt det globala harmoniserade sy ­
stemet (GHS) för klassificering av kemikalier som orsakar akut tox ­
icitet (se hänvisning 9). 
Testningslaboratoriet bör analysera all tillgänglig information om 
testämnet innan själva testningen genomförs. Sådan information in ­
begriper ämnets identitet och kemiska struktur, fysikalkemiska egen ­
skaper, resultaten från andra eventuella  in vitro-  eller  in vivo-test 
avseende toxicitet, toxikologiska data om strukturellt närbesläktade ämnen och ämnets tilltänkta användningsändamål. Denna infor ­
mation behövs för att avgöra huruvida testet är relevant för skyddet 
av människors hälsa, och hjälper vid valet av en optimal startdos.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 182
 
1.2 DEFINITIONER  
Akut toxicitet (oralt):  De skadliga verkningar som uppträder efter 
oral tillförsel av en engångsdos av ett ämne eller upprepade doser som ges inom 24 timmar.  
Fördröjd död:  Det att ett djur inte dör eller är döende inom 48 
timmar, men dör senare under den 14 dagar långa observationsperio ­
den. 
Dos:  Den mängd testämne som tillförs. Dosen uttrycks som vikten 
testämne per viktenhet försöksdjur (exempelvis mg/kg).  
Uppenbar toxicitet:  En allmän term för att beskriva klara tecken på 
toxicitet efter tillförsel av testämnet (exempel finns i hänvisning 3). 
Verkningarna är då så allvarliga att närmaste högre dos troligen leder till att största delen av djuren utsätts för svår smärta eller uppvisar ihållande tecken på allvarligt lidande, är döende (kriterierna anges i 
vägledningen om konsekvenser för människor, se hänvisning 8) eller 
sannolikt dör.  
GHS:  Globala harmoniserade systemet för klassificering och märk ­
ning av kemikalier och blandningar. Systemet utarbetas gemensamt 
inom OECD (människors hälsa och miljö), FN:s expertkommitté om transport av farligt gods (fysikalkemiska egenskaper) och ILO (var ­
ningar). Samordningen sker genom det gemensamma programmet för 
sund kemikaliehantering (IOMC).  
Annalkande död:  När ett djur troligen är döende eller har dött före 
den nästa planenliga observationstidpunkten. Hos gnagare kan teck ­
nen på annalkande död inbegripa konvulsioner, lateral kroppsställ ­
ning, halvliggande ställning och tremor (närmare uppgifter finns i 
vägledning om konsekvenserna för människor, se hänvisning 8).  
LD
 50 (median letal dos):  En statistiskt fastställd engångsdos som 
kan förväntas leda till döden för 50 % av de djur som har tillförts 
dosen oralt. LD  50 -värdet uttrycks som vikten testämne per viktenhet 
försöksdjur (mg/kg).  
Gränsdos:  En dos på den övre gränsnivån (2 000 eller 5 000 mg/kg).  
Döende djur:  Ett djur som håller på att dö eller som har små 
chanser att överleva, även om det får behandling (närmare uppgifter finns i vägledningen om konsekvenserna för människors hälsa, se 
hänvisning 8).  
Förutsägbar död:  Förekomsten av kliniska tecken som tyder på död 
vid en känd framtida tidpunkt som infaller före försökets planerade avslutningstidpunkt, exempelvis oförmåga att nå vatten eller föda 
(närmare uppgifter finns i vägledningen om konsekvenserna för män ­
niskors hälsa, se hänvisning 8).
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 183
 
man når den dos som orsakar uppenbar toxicitet eller ett 
dödsfall, eller tills inga verkningar kan iakttas på den högsta 
dosnivån eller dödsfall inträffar på den lägsta dosnivån.  
1.4 BESKRIVNING AV TESTMETODEN  
1.4.1  Val av djurart  
Rekommenderad gnagare är råtta, även om testet kan utföras med 
andra gnagare. I regel används hondjur (se hänvisning 7). Detta beror på att litteraturstudier av konventionella LD
 50 -test indikerar 
att känslighetsskillnaderna mellan könen är små, men att honorna i 
förekommande fall ofta är en aning mer känsliga (se hänvisning 10). 
Om däremot kunskaperna om strukturellt närbesläktade ämnens tox ­
ikologiska eller toxiko-kinetiska egenskaper tyder på att hanarna sannolikt är känsligare än honorna bör hanar användas. Om testet 
görs på hanar bör tillbörlig motivering ges. 
Djuren bör vara unga och friska vuxna exemplar som härrör från 
normala laboratoriestammar. Hondjuren får inte ha fött ungar och får 
inte vara dräktiga. När dostillförseln inleds ska djuret vara mellan 8 och 12 veckor gammalt, och variationerna i vikt får vara högst ± 20 % av medelvikten för alla tidigare djur som har doserats.
 
1.4.2  Förvarings- och utfodringsbetingelser  
Temperaturen i testdjurens utrymmen bör vara 22  o C (± 3  o C). Den 
relativa fuktigheten bör vara minst 30 % och ska helst inte överstiga 70 %, utom när rummet rengörs. Målvärdet bör dock vara 50–60 %. 
Belysningen bör vara artificiell med omväxlande 12 timmar ljus och 
12 timmar mörker. För utfodringen kan konventionellt laboratorie ­
foder användas, och djuren bör ha obegränsad tillgång till dricks ­
vatten. Djur som tillförs doser på samma nivå kan inhysas i samma 
bur, men antalet djur per bur får inte vara högre än att klara obser ­
vationer kan göras av varje djur.
 
1.4.3  Förberedelse av djuren  
Djuren väljs ut slumpmässigt och förses med märkning så att de kan 
identifieras individuellt Därefter får djuren acklimatisera sig till la ­
boratoriets betingelser i sina burar i minst 5 dagar före doseringsstart.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 184
 
1.4.4  Förberedelse av doserna  
I regel ska de olika doserna av testämnet tillföras i en konstant 
volym, vilket innebär att doserna har varierande koncentration. När en slutprodukt i vätskeform eller en blandning testas, kan det med 
tanke på riskbedömningen vara mer relevant att använda testämnet i 
outspädd form (konstant koncentration), vilket även förutsätts av vissa tillsynsmyndigheter. Den maximala dosvolymen för tillförsel får aldrig överskridas. Den största mängd vätska som kan tillföras 
vid ett och samma tillfälle beror på testdjurets storlek. För gnagare 
bör denna volym i regel inte överskrida 1 ml per 100 g kroppsvikt. I fråga om vattenlösningar får dock 2 ml per 100 g kroppsvikt använ ­
das. För tillförsel av dosen rekommenderas alltid i första hand lös ­
ning, suspension eller emulsion i vatten, sedan lösning, suspension eller emulsion i olja (exempelvis majsolja) och därefter eventuella andra vehiklar. I fråga om andra vehiklar än vatten måste de tox ­
ikologiska egenskaperna vara kända. Doserna måste beredas strax 
före tillförseln, utom i fall där preparatets stabilitet är känd och har påvisats vara godtagbar över hela användningsperioden.
 
1.5 FÖRFARANDE  
1.5.1  Tillförsel av doser  
Testämnet tillförs som en engångsdos genom sondmatning med hjälp 
av magsond eller lämplig intubationskanyl. I det sällsynta fallet att 
det inte är möjligt med en engångsdos, kan dosen tillföras i mindre 
delar över en period som inte överskrider 24 timmar. 
Före dostillförseln hålls djuren fastande (utan föda och med tillgång 
till vatten, för råttor över natten och för möss i 3–4 timmar). Efter fasteperioden vägs djuren och testämnet tillförs. Efter tillförsel av 
ämnet kan djuren hållas utan föda i ytterligare 3–4 timmar (råttor) 
respektive 1–2 timmar (möss). Om dosen tillförs i delar över en tidsperiod kan det vara nödvändigt att ge djuren föda och vatten, beroende på periodens längd.
 
1.5.2  Inledande test  
Avsikten med ett inledande test är att få en grund för valet av 
optimal startdos för huvudtestet. Testämnet tillförs enskilda djur en ­
ligt den sekvens som anges i flödesschemat i bilaga 1. Det inledande 
testet kan avslutas när sekvensen når fram till ett utfall om en start ­
dos för huvudtestet (eller om ett djur dör på den lägsta angivna 
dosnivån). 
Som startdos för det inledande testet väljs en av de angivna dosnivå ­
erna 5, 50, 300 och 2 000 mg/kg. Startdosen väljs så att den troligen 
ger tecken på uppenbar toxicitet, och den ska i mån av möjlighet grunda sig på resultat från  in vivo-  och in vitro-test av samma ke ­
mikalie och strukturellt närbesläktade kemikalier. Om sådan infor ­
mation inte finns att tillgå, används startdosen 300 mg/kg. 
Det bör gå minst 24 timmar från doseringen av att djur till dose ­
ringen av följande djur. Alla djur bör observeras i minst 14 dagar.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 185
 
Undantagsvis, och endast när det kan motiveras med specifika till ­
synskrav, får en ytterligare högre dosnivå på 5 000 mg/kg användas 
(se bilaga 3). Med hänsyn till djurens välbefinnande avråds testning på djur när det gäller GHS-kategori 5 (2 000–5 000 mg/kg). Sådan testning får endast göras när det finns en stark sannolikhet för att 
resultaten har en direkt relevans för skyddet av djurs eller männi ­
skors hälsa eller av miljön. 
I ett inledande test där ett djur dör vid den lägsta dosnivån 
(5 mg/kg), bör förfarandet i regel avslutas och ämnet klassificeras som tillhörande GHS-kategori 1 (se bilaga 1). Om det ändå behövs 
ytterligare bekräftelse av klassificeringen kan ett valfritt tilläggsför ­
farande genomföras. Detta går ut på att ett andra djur doseras vid nivån 5 mg/kg. Om detta andra djur dör, anses GHS-kategorin 1 vara bekräftad och testet avslutas omedelbart. Om det andra djuret över ­
lever doseras högst tre tilläggsdjur vid nivån 5 mg/kg. Eftersom 
mortalitetsrisken är hög bör dessa djur av hänsyn till djurens välbe ­
finnande doseras sekventiellt. Efter doseringen av ett djur får föl ­
jande djur inte doseras förrän det är klart att det tidigare djuret 
sannolikt överlever. Om något av dessa djur dör ska doserings ­
sekvensen omedelbart avslutas, och inga ytterligare djur ska doseras. Eftersom förekomsten av ett dödsfall till (oavsett hur många djur 
som har testats vid testets slut) leder till utfall A (två eller flera 
dödsfall), ska klassificeringen enligt bilaga 2 göras för dosen 5 mg/kg (kategori 1 om det förekommit två eller flera dödsfall eller kategori 2 om det inte förekommit fler än ett dödsfall). Dessutom 
innehåller bilaga 4 vägledning om klassificeringen enligt EU-syste ­
met, som gäller tills det att det nya GHS-systemet har genomförts.
 
1.5.3  Huvudtest  
1.5.3.1  Antalet djur och dosnivåer  
I flödesschemat i bilaga 2 anges de steg som bör följas efter testning 
vid startdosnivå. Ett av tre steg måste tas – avsluta testet och risk ­
klassificera ämnet på grundval av utfallet, testa vid en högre dosnivå 
eller testa vid en lägre dosnivå. Med hänsyn till djurens välbefin ­
nande bör dosnivåer som har orsakat dödsfall i det inledande testet inte användas i huvudtestet (se bilaga 2). Erfarenheterna tyder på att 
det mest sannolika utfallet vid startdosnivån är att ämnet kan klas ­
sificeras och att ingen ytterligare testning behövs. 
I regel används totalt fem djur av samma kön vid varje dosnivå. 
Dessa fem djur inbegriper det djur som i det inledande testet dose ­
rades vid den valda nivån och därutöver fyra djur (utom, i undan ­
tagsfall, om en dosnivå som används i huvudtestet inte har ingått i det inledande testet). 
Tidsintervallet mellan doseringen vid varje nivå bestäms av start, 
varaktighet och allvarlighetsgrad för de toxiska tecknen. Doseringen 
av djuren på följande dosnivå bör inte inledas förrän det råder sä ­
kerhet om de tidigare doserade djurens överlevnad. I förekommande fall rekommenderas ett intervall på 3–4 dagar mellan doseringen vid de olika nivåerna, så att eventuella tecken på fördröjd toxicitet kan 
observeras. Tidsintervallet kan anpassas på tillbörligt sätt, exempelvis 
i fall där responsen är tvetydig.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 186
 
I fall där man överväger att använda en övre dos på 5 000 mg/kg bör 
förfarandet enligt bilaga 3 följas (se även avsnitt 1.6.2).  
1.5.3.2  Gränstest (limit test)  
Gränstest används primärt i situationer där laboratoriet har infor ­
mation som tyder på att testämnet sannolikt inte är toxiskt (toxiskt 
endast ovanför de gränsdoser som anges i bestämmelser). Infor ­
mation om testämnets toxicitet kan härledas från kunskaperna om liknande testade ämnen eller liknande testade blandningar eller pro ­
dukter, med hänsyn tagen till identiteten och halten av de komponen ­
ter som har känd toxikologisk signifikans. Om informationen om 
ämnets toxicitet är bristfällig eller saknas, eller om ämnet troligen är toxiskt, bör huvudtestet genomföras. 
Som gränstest för den metod som beskrivs här kan man använda ett 
inledande test med en startdos på 2 000 mg/kg (eller undantagsvis 
5 000 mg/kg) som åtföljs av dosering av ytterligare fyra djur vid 
denna nivå.
 
1.6 OBSERVATIONER 
Efter doseringen observeras djuren individuellt minst en gång under 
de första 30 minuterna, periodiskt under de första 24 timmarna (med särskild uppmärksamhet under de första 4 timmarna) och därefter dagligen under totalt 14 dagar. Detta gäller inte för djur som av 
hänsyn till djurens välbefinnande måste avlivas skonsamt eller för 
djur som hittas döda. Observationsperiodens längd bör dock ha en anpassningsmån. Längden bör bestämmas enligt de toxiska reaktio ­
nerna, tidpunkten för när de sätter in och återhämtningsperiodens 
längd. Observationsperioden kan således förlängas om det anses 
vara nödvändigt. Tidpunkten då tecken på toxicitet uppträder och försvinner är viktig, särskilt om de toxiska tecknen tenderar att vara fördröjda (se hänvisning 11). Alla observationer registreras sy ­
stematiskt, med individuella registreringar för varje djur. 
Tilläggsobservationer behövs om djuren fortsätter att uppvisa tecken 
på toxicitet. Observationerna bör omfatta ändringar i hud och päls, 
ögon och slemhinnor samt även andningsorganen, cirkulationsorga ­
nen och det autonoma och centrala nervsystemet. Likaså bör den somatomotoriska aktiviteten och beteendemönstret observeras. Upp ­
märksamhet bör fästas vid observationer av tremor, konvulsioner, 
salivutsöndring, diarré, letargi, sömn och koma. Hänsyn bör tas till de principer och kriterier som anges i vägledningen om konsekven ­
serna för människor (se hänvisning 8). Djur som befinns vara döende 
och djur som visar tecken på svår smärta eller ihållande lidande bör 
avlivas skonsamt. I fall där djur avlivas av hänsyn till djurens väl ­
befinnande eller hittas döda, bör tidpunkten för dödsfallet registreras 
så exakt som möjligt.
 
1.6.1  Kroppsvikt  
Djurens individuella vikter bör registreras strax innan testämnet till ­
förs och därefter minst en gång per vecka. Alla viktändringar bör 
bestämmas och registreras. Vid testets slut vägs alla överlevande djur 
och därefter avlivas de skonsamt.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 187
 
1.6.2  Patologi  
Alla försöksdjur (inbegripet de som dött under testet eller som har 
avlivats av hänsyn till djurens välbefinnande) bör obduceras. Alla betydande patologiska förändringar bör registreras för varje djur. 
Användbar information kan även fås genom mikroskopundersökning 
av organ som uppvisar betydande skador och som härrör från djur som överlevt minst 24 timmar efter tillförsel av startdosen.
 
2. DATA  
Data bör rapporteras individuellt per djur. Dessutom bör alla data 
sammanställas i tabellform. Tabellen ska för varje testgrupp visa antalet djur som använts, antalet djur som uppvisat tecken på tox ­
icitet, antalet djur som under testets gång har dött eller avlivats av 
hänsyn till djurens välbefinnande, tidpunkterna för alla individuella dödsfall, en beskrivning av och förloppet för de toxiska verkningarna 
och deras reversibilitet samt obduktionsfynd.
 
3. RAPPORTERING  
3.1 TESTRAPPORT 
Testrapporten ska innehålla nedan angivna uppgifter, enligt det som 
är relevant: 
Testämne: 
— Fysikalisk natur, renhet och, där det är relevant, fysikalkemiska 
egenskaper (inbegripet isomerisering). 
— Identifieringsdata, inbegripet CAS-nummer. 
Vehikel (i förekommande fall). 
— Motivering för val av vehikel, om annan än vatten. Försöksdjur: — Art och stam som använts. — Mikrobiologiska data för djuren, om dessa data är kända. — Antalet djur, deras ålder och kön (och i förekommande fall en 
motivering för användning av hanar i stället för honor). 
— Ursprung, förvaringsförhållanden, foder och dylikt. Testbetingelser: — Detaljerade uppgifter om testämnets sammansättning, inbegripet 
uppgifter om den tillförda dosens fysikaliska form. 
— Uppgifter om hur testämnet har tillförts, inbegripet dosens volym 
och doseringstidpunkt. 
— Detaljerade uppgifter om foder- och vattenkvalitet (inbegripet 
diettyp/källa, vattenkälla). 
— Motivering för valet av startdos.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 188
 
Resultat: 
— En tabell med responsdata och dosnivå för varje djur (djur som 
uppvisat tecken på toxicitet samt mortalitet, verkningarnas art, 
allvarlighetsgrad och varaktighet). 
— Tabell med kroppsvikt och förändringar av kroppsvikt. — Djurens individuella vikt på doseringsdagen och därefter med en 
veckas intervall, samt tidpunkten för dödsfall eller avlivning. 
— Datum och tidpunkt för dödsfall som inträffat före den planenliga 
avlivningen. 
— Tidsförloppet för när tecken på toxicitet sätter in och huruvida 
tecknen är reversibla, för varje djur. 
— Obduktionsfynd och histopatologiska fynd för varje djur, i före ­
kommande fall. 
Diskussion och tolkning av resultaten. Slutsatser.
 
4. HÄNVISNINGAR  
1. British Toxicology Society Working Party on Toxicity (1984), 
”Special report: a new approach to the classification of sub ­
stances and preparations on the basis of their acute toxicity”,  
Human Toxicol.,  3, 85–92. 
2. M. J. Van den Heuvel, A.D. Dayan och R.O. Shillaker (1987), 
”Evaluation of the BTS approach to the testing of substances 
and preparations for their acute toxicity”,  Human Toxicol.,  6, 
279–291. 
3. M. J. Van den Heuvel, D.G. Clark, R.J. Fielder, P.P. Koundak ­
jian, G.J.A. Oliver, D. Pelling, N.J. Tomlinson och A.P. Walker 
(1990), ”The international validation of a fixed-dose procedure 
as an alternative to the classical LD  50 test”,  Fd. Chem. Toxicol.,  
28, 469–482. 
4. A. Whitehead och R.N. Curnow (1992), ”Statistical evaluation 
of the fixed-dose procedure”,  Fd. Chem. Toxicol.,  30, 313–324. 
5. N. Stallard och A. Whitehead (1995), ”Reducing numbers in the 
fixed-dose procedure”,  Human Exptl. Toxicol.,  14, 315–323. 
6. Stallard, N., Whitehead, A. and Ridgeway, P. (2002), Statistical 
evaluation of the revised fixed dose pro cedure. Hum. Exp. Toxicol., 21, 183–196. 
7. OECD (2001), ”Guidance Document on Acute Oral Toxicity 
Testing”,  Environmental Health and Safety Monograph Series 
on Testing and Assessment,  24, Paris. 
8. OECD (2000), ”Guidance Document on the Recognition”, As ­
sessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety  Evaluation, Environmen ­
tal Health and Safety Monograph Series on Testing and 
Assesment,  19.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 189
 
9. OECD (1998), ”Harmonised Integrated Hazard Classification 
for Human Health and Environmental Effects of Chemical Sub ­
stances as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals in November 1998, Part 2”, s. 11 (http://webnet1.oecd.org/oecd/ pages/home/ 
displaygeneral/0,3380,EN-documents-521-14-no-24-no- 
0,FF.html). 
10. R.L. Lipnick, J.A. Cotruvo, R.N. Hill, R.D. Bruce, K.A. Stitzel, 
A.P. Walker, I. Chu, M. Goddard, L. Segal, J.A. Springer och R.C. Myers (1995), ”Comparison of the Up-and-Down, Con ­
ventional LD
 50 , and Fixed-Dose Acute Toxicity Procedures”,  
Fd. Chem. Toxicol.,  33, 223–231. 
11. P.K Chan och A.W. Hayes (1994), ”Chapter 16 Acute Toxicity 
and Eye Irritation,  Principles and Methods of Toxicology ”, 3  rd 
Edition, red. A.W. Hayes, Raven Press, Ltd. New York, USA.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 190
 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 191
 ▼B 
BILAGA 1  
FLÖDESSCHEMA FÖR INLEDANDE TEST

 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 192
 ▼B

 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 193
 ▼B 
BILAGA 2  
FLÖDESSCHEMA FÖR HUVUDTEST

 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 194
 ▼B

 
Bilaga 3  
KRITERIER FÖR HUR TESTÄMNEN MED FÖRVÄNTADE LD  50 - 
VÄRDEN ÖVER 2 000 MG/KG KAN KLASSIFICERAS UTAN 
TESTNING  
Med hjälp av kriterierna för riskkategori 5 kan man identifiera testämnen som har 
en relativt låg risk för akut toxicitet men som under vissa omständigheter kan 
utgöra en risk för sårbara populationer. Dessa ämnen förväntas ha ett LD  50 -värde 
(oralt eller via huden) inom området 2 000–5 000 mg/kg eller motsvarande doser i fråga om andra tillförselvägar. Ett testämne kan klassificeras enligt riskkategorin 
2 000 mg/kg < LD
 50 < 5 000 mg/kg (GHS-kategori 5) i följande fall: 
a) Om ämnet hänförs till denna kategori enligt utfallet i något av de testnings ­
scheman som finns i bilaga 2, på grundval av mortalitet. 
b) Om det redan finns tillförlitliga bevis för att LD  50 -värdet ligger inom det 
intervall som motsvarar kategori 5 eller om tidigare djurförsök eller toxiska 
verkningar hos människor tyder på akut fara för människors hälsa. 
c) På grundval av extrapolering, uppskattning eller mätning av data, om det inte 
är motiverat att placera ämnet i en högre riskklass. 
— Om det finns tillförlitlig information som tyder på betydande toxiska 
verkningar hos människor, eller något av följande: 
— Mortalitet kan observeras vid testning med värden upp till kategori 4. — En bedömning av sakkunniga bekräftar betydande kliniska tecken på tox ­
icitet vid testning upp till värden för kategori 4, med undantag av diarré, 
upprest päls eller ovårdat utseende. 
— En bedömning av sakkunniga bekräftar tillförlitlig information från andra 
djurförsök som tyder på förmågan till betydande akuta verkningar.
 
TESTNING PÅ DOSNIVÅER ÖVER 2 000 MG/KG  
Undantagsvis, och endast när det kan motiveras med specifika tillsynskrav, får en 
ytterligare övre dosnivå på 5 000 mg/kg användas. Med hänsyn till djurens 
välbefinnande avråds testning på djur vid dosnivån 5 000 mg/kg. Sådan testning 
bör endast övervägas när det finns en stark sannolikhet för att resultaten har en direkt relevans för skyddet av djurs eller människors hälsa (9).
 
Inledande test  
De beslutsregler som styr det sekventiella förfarandet enligt bilaga 1 utökas till 
att innefatta en dosnivå på 5 000 mg/kg. När en startdos på 5 000 mg/kg används vid ett inledande test och utfallet blir A (död) måste således ytterligare ett djur testas vid nivån 2 000 mg/kg, medan utfallen B och C (uppenbar toxicitet eller 
ingen toxicitet) gör det möjligt att använda 5 000 mg/kg som startdos i huvud ­
testet. På samma sätt gäller att om en startdos annan än 5 000 mg/kg används i ett test där man går vidare till 5 000 mg/kg efter att ha fått utfall B eller C vid nivån 2 000 mg/kg, leder ett utfall A på nivån 5 000 mg/kg till att huvudtestets 
startnivå blir 2 000 mg/kg medan utfallen B och C leder till 5 000 mg/kg som 
startnivå.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 195
 
Huvudtest  
De beslutsregler som styr det sekventiella förfarandet enligt bilaga 2 utökas till 
att innefatta en dosnivå på 5 000 mg/kg. Detta innebär att utfallet A ( ≥ 2 döds­
fall) i ett huvudtest med startdosen 5 000 mg/kg leder till att en ytterligare grupp måste testas vid nivån 2 000 mg/kg, medan utfallet B (uppenbar toxicitet och/ 
eller ≤ 1 dödsfall) eller C (ingen toxicitet) leder till att ämnet inte får någon 
klassificering enligt GHS. På liknande sätt gäller att om en startdos annan än 5 000 mg/kg används i ett test och man har gått vidare till dosnivån 5 000 mg/kg efter att ha fått utfall C vid dosnivån 2 000 mg/kg, leder utfallet A vid dosnivån 
5 000 mg/kg till att ämnet anses tillhöra GHS-kategorin 5 medan utfall B eller C 
leder till att ämnet inte får någon klassificering.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 196
 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 197
 ▼B 
Bilaga 4  
TESTMETOD B.l b  
– Vägledning för klassificering enligt EU-Systemet, som gäller under övergängsperioden tills det globala harmoniserade systemet  (GHS) för kassificering har genomförts helt 
(ur hänvisning 8)

 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 198
 ▼B

 
B.1b  AKUT TOXICITET ORALT – METOD FÖR BESTÄMNING AV 
AKUT TOXICITETSKLASS  
1. METOD  
Denna testmetod motsvarar OECD TG 423 (2001).  
1.1 INLEDNING 
Denna metod för bestämning av akut toxicitetsklass (se hänvisning 
1) är ett stegvis förfarande där tre djur av samma kön används per 
steg. Beroende på mortaliteten och/eller förekomsten av döende djur 
behövs det i genomsnitt 2–4 steg för bedömningen av testämnets akuta toxicitet. Förfarandet är reproducerbart, kräver mycket få djur och ger en möjlighet att klassificera ämnen på ett liknande 
sätt som med de övriga metoderna för testning av akut toxicitet. 
Metoden för bestämning av akut toxicitetsklass baserar sig på bio ­
metriska bedömningar (se hänvisningarna 2, 3, 4 och 5) och fast definierade doser på tillräckligt separerade nivåer för att testämnet 
ska kunna kategoriseras för klassificering och riskbedömning. Meto ­
den antogs 1996 och har validerats omfattande  in vivo  mot LD
 50 -data 
som erhållits vid litteraturstudier, både nationellt (se hänvisning 6) och internationellt (se hänvisning 7). 
Riktlinjer för valet av den lämpligaste testmetoden för ett bestämt 
ändamål finns i vägledningen för testning av akut oral toxicitet (se 
hänvisning 8). I vägledningsdokumentet finns även tilläggsinfor ­
mation rörande utförandet av testmetod B.1b och tolkningen av re ­
sultaten. 
Testämnesdoser som, på grund av frätande eller allvarligt irriterande 
verkningar, är kända att orsaka klar smärta och svårt lidande behöver 
inte ges. Döende djur eller djur som uppvisar klara tecken på smärta 
eller allvarligt och ihållande lidande ska avlivas skonsamt, och vid tolkningen av testresultaten ska dessa djur beaktas på samma sätt som djur som har dött under testets gång. Kriterierna för beslut 
rörande avlivning av döende eller svårt lidande djur, liksom även 
vägledning om igenkänning av förutsägbar eller annalkande död, behandlas i en separat vägledning (se hänvisning 9). 
Metoden bygger på användning av fast definierade doser, och resultatet 
ger en möjlighet att kategorisera och klassificera ett ämne enligt det globala harmoniserade systemet (GHS) för klassificering och märkning 
av kemikalier som orsakar akut toxicitet (se hänvisning 10). 
Även om metoden i princip inte är avsedd att användas för beräkning 
av exakta LD
 50 -värden ger den ändå en möjlighet att bestämma 
exponeringsområden där ämnets verkan sannolikt är dödlig, eftersom den viktigaste ändpunkten för detta test fortfarande är andelen djur som dör. Bestämning av ett LD
 50 -värde med denna metod kan endast 
göras när minst två doser leder till en mortalitet som är högre än 0 % 
och lägre än 100 %. Eftersom testningen alltid utförs med fast de ­
finierade doser, oavsett vilket ämne som testas, och klassificeringen uttryckligen är bunden till antalet djur som reagerar på ett visst sätt, 
ökas möjligheterna till enhetliga testrapporter och repeterbarhet mel ­
lan olika laboratorier.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 199
 
Testningslaboratoriet bör analysera all tillgänglig information om 
testämnet innan själva testningen genomförs. Sådan information in ­
begriper ämnets identitet och kemiska struktur, fysikalkemiska egen ­
skaper, resultaten från andra eventuella  in vivo-  eller  in vitro-test 
avseende toxicitet, toxikologiska data om strukturellt närbesläktade 
ämnen och ämnets förutsedda användningsändamål. Denna infor ­
mation behövs för att avgöra huruvida testet är relevant för skyddet av människors hälsa, och utgör en hjälp vid valet av en optimal startdos.
 
1.2 DEFINITIONER  
Akut toxicitet (oralt):  De skadliga verkningar som uppträder efter 
oral tillförsel av en engångsdos av ett ämne eller upprepade doser 
som ges inom 24 timmar.  
Fördröjd död:  Det att ett djur inte dör eller är döende inom 48 timmar, 
men dör senare under den 14 dagar långa observationsperioden.  
Dos:  Den mängd testämne som tillförs. Dosen uttrycks som vikten 
testämne per viktenhet försöksdjur (exempelvis mg/kg).  
GHS:  Globala harmoniserade systemet för klassificering och märk ­
ning av kemikalier och blandningar. Systemet utarbetas gemensamt 
inom OECD (människors hälsa och miljö), FN:s expertkommitté om 
transport av farligt gods (fysikalkemiska egenskaper) och ILO (var ­
ningar). Samordningen sker genom det gemensamma programmet för sund kemikaliehantering (IOMC).  
Annalkande död:  När ett djur troligen är döende eller har dött före 
den nästa planenliga observationstidpunkten. Tecken som tyder på 
detta tillstånd kan hos gnagare inbegripa konvulsioner, kroppsställ ­
ning på sidan, bakåtlutad kroppsställning och tremor (närmare upp ­
gifter finns i vägledningen om konsekvenser för människor, se hän ­
visning 9).  
LD
 50 (median letal dos, oralt):  En statistiskt fastställd engångsdos 
som troligen leder till döden för 50 % av de djur som har tillförts dosen oralt. LD
 50 -värdet uttrycks som vikten testämne per viktenhet 
försöksdjur (mg/kg).  
Gränsdos:  En testdos vid den övre gränsnivån (2 000 eller 5 000 mg/kg).  
Döende djur:  Ett djur som håller på att dö eller som har små chanser 
att överleva, även om det får behandling (närmare uppgifter finns i 
vägledningen om konsekvenser för människor, se hänvisning 9).  
Förutsägbar död:  Förekomsten av kliniska tecken som tyder på död 
vid en känd framtida tidpunkt som infaller före försökets planerade avslutningstidpunkt, exempelvis oförmåga att nå vatten eller föda 
(närmare uppgifter finns i vägledningen om konsekvenser för männi ­
skor, se hänvisning 9).
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 200
 
1.3 PRINCIP FÖR TESTMETODEN 
Testmetoden bygger på principen om att man genom ett stegvis 
förfarande med ett minimalt antal djur per steg kan få tillräcklig information om testämnets akuta toxicitet för att det ska vara möjligt 
att klassificera ämnet. Ämnet tillförs oralt till en grupp försöksdjur 
vid en av de definierade dosnivåerna. Ämnet testas genom ett stegvis förfarande med tre djur av samma kön (i regel honor) per steg. Avsaknaden eller förekomsten av ämnesrelaterad mortalitet hos de 
djur som doserats på ett visst steg avgör vilket av följande som blir 
nästa steg: 
— Ingen ytterligare testning behövs. — Ytterligare tre djur tillförs en lika stor dos. — Ytterligare tre djur tillförs en dos på nästa högre eller lägre dos ­
nivå. 
Testningsförfarandet beskrivs närmare i bilaga 1. När denna metod 
används kan testämnet genom de olika utfallen placeras i en av de toxicitetsklasser som definieras genom fasta LD
 50 -gränsvärden.  
1.4 BESKRIVNING AV TESTMETODEN  
1.4.1  Val av djurart  
Rekommenderad gnagare är råtta, även om testet kan utföras med 
andra gnagare. I regel används hondjur (se hänvisning 9). Skälet till 
detta är att litteraturundersökningar av konventionella LD  50 -test tyder 
på att känslighetsskillnaderna mellan könen är små, men att honorna i förekommande fall ofta är en aning mer känsliga (se hänvisning 
11). Om däremot kunskaperna om strukturellt närbesläktade ämnens 
toxikologiska eller toxikokinetiska egenskaper tyder på att hanarna sannolikt är känsligare än honorna bör hanar användas. Om testet görs på hanar bör tillbörlig motivering ges. 
Djuren bör vara unga och friska vuxna exemplar som härrör från 
normala laboratoriestammar. Hondjuren får inte ha fött ungar och får 
inte vara dräktiga. När dostillförseln inleds ska djuret vara mellan 8 
och 12 veckor gammalt, och variationerna i vikt får vara högst ± 20 % av medelvikten för alla tidigare djur som har doserats.
 
1.4.2  Förvarings- och utfodringsbetingelser  
Temperaturen i testdjurens utrymmen bör vara 22  o C (± 3  o C). Den 
relativa fuktigheten bör vara minst 30 % och ska helst inte överstiga 70 %, utom när rummet rengörs. Målvärdet bör dock vara 50–60 %. 
Belysningen bör vara artificiell med omväxlande 12 timmar ljus och 
12 timmar mörker. För utfodringen kan konventionellt laboratorie ­
foder användas, och djuren bör ha obegränsad tillgång till dricks ­
vatten. Djur som tillförs doser på samma nivå kan inhysas i samma 
bur, men antalet djur per bur får inte vara högre än att klara obser ­
vationer kan göras av varje djur.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 201
 
1.4.3  Förberedelse av djuren  
Djuren väljs ut slumpmässigt och förses med märkning så att de kan 
identifieras individuellt Därefter får djuren acklimatisera sig till la ­
boratoriets betingelser i sina burar i minst 5 dagar före doseringsstart.  
1.4.4  Förberedelse av doserna  
I regel ska de olika doserna av testämnet tillföras i en konstant 
volym, vilket innebär att doserna har varierande koncentration. När 
slutprodukter i vätskeform eller blandningar testas, kan det med tanke på riskbedömningen vara mer relevant att använda testämnet i outspädd form (konstant koncentration), vilket även förutsätts av 
vissa tillsynsmyndigheter. Den maximala dosvolymen för tillförsel 
får aldrig överskridas. Den största mängd vätska som kan tillföras vid ett och samma tillfälle beror på testdjurets storlek. För gnagare bör denna volym i regel inte överskrida 1 ml per 100 g kroppsvikt. I 
fråga om vattenlösningar får dock 2 ml per 100 g kroppsvikt använ ­
das. För tillförsel av dosen rekommenderas alltid i första hand lös ­
ning, suspension eller emulsion i vatten, sedan lösning, suspension eller emulsion i olja (exempelvis majsolja) och därefter eventuella 
andra vehiklar. I fråga om andra vehiklar än vatten måste de tox ­
ikologiska egenskaperna vara kända. Doserna måste beredas strax före tillförseln, om inte preparatets stabilitet är känd och har påvisats vara godtagbar över hela användningsperioden.
 
1.5 FÖRFARANDE  
1.5.1  Tillförsel av doser  
Testämnet tillförs som en engångsdos genom sondmatning med hjälp 
av magsond eller lämplig intubationskanyl. I det sällsynta fall det 
inte är möjligt med en engångsdos, kan dosen tillföras i mindre delar över en period som inte överskrider 24 timmar. 
Före dostillförseln hålls djuren fastande (utan föda och med tillgång 
till vatten, för råttor över natten och för möss i 3–4 timmar). Efter 
fasteperioden vägs djuren och testämnet tillförs. Efter tillförsel av 
ämnet kan djuren hållas utan föda i ytterligare 3–4 timmar (råttor) respektive 1–2 timmar (möss). Om dosen tillförs i delar över en tidsperiod kan det vara nödvändigt att ge djuren föda och vatten, 
beroende på tidsperiodens längd.
 
1.5.2  Antalet djur och dosnivåer  
Tre djur används per steg. För startdosen väljs en av fyra fast defi ­
nierade nivåer (5, 50, 300 eller 2 000 mg per kg kroppsvikt). För 
startdosen väljs den nivå som högst sannolikt leder till att ett antal av de doserade djuren dör. I flödesschemat i bilaga 1 beskrivs de för ­
faranden som gäller för de olika startdoserna. Dessutom innehåller 
bilaga 4 vägledning om klassificeringen enligt EU-systemet, som 
gäller tills det att det nya GHS-systemet har genomförts.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 202
 
Om den tillgängliga informationen tyder på att inga djur dör vid den 
högsta startdosnivån (2 000 mg per kg kroppsvikt) bör ett gränstest 
utföras. Om det inte finns någon information tillgänglig om testäm ­
net, rekommenderas med hänsyn till djurens välbefinnande att start ­
dosen 300 mg per kg kroppsvikt används. 
Tidsintervallet mellan dostillförseln till de olika grupperna bestäms 
av start, varaktighet och allvarlighets-grad för de toxiska tecknen. 
Doseringen av djuren på nästa dosnivå bör inte inledas förrän det 
råder säkerhet om de tidigare doserade djurens överlevnad. 
Undantagsvis, och endast när det kan motiveras med specifika till ­
synskrav, får en ytterligare övre dosnivå på 5 000 mg per kg kropps ­
vikt användas (se bilaga 2). Med hänsyn till djurens välbefinnande 
avråds testning på djur när det gäller GHS-kategori 5 (2 000–5 000 
mg per kg kroppsvikt). Sådan testning bör endast övervägas när det finns en stark sannolikhet för att resultaten har direkt relevans för skyddet av människors eller djurs hälsa eller av miljön.
 
1.5.3  Gränstest  
Gränstest används primärt i situationer där laboratoriet har infor ­
mation som tyder på att testämnet sannolikt inte är toxiskt (toxiskt 
endast ovanför de gränsdoser som anges i gällande föreskrifter). 
Information om testämnets toxicitet kan härledas från kunskaperna om liknande testade ämnen eller liknande testade blandningar eller produkter, med hänsyn tagen till identiteten och halten av de kom ­
ponenter som har känd toxikologisk signifikans. Om informationen 
om ämnets toxicitet är bristfällig eller saknas, eller om ämnet troligen är toxiskt, bör huvudtestet genomföras. 
Ett gränstest vid en dosnivå 2 000 mg per kg kroppsvikt kan utföras 
med sex djur (tre djur per steg). Undantagsvis kan ett gränstest på 
dosnivån 5 000 mg per kg kroppsvikt utföras med tre djur (se 
bilaga 2). Om testämnet orsakar dödsfall måste eventuellt ytterligare testning utföras på närmaste lägre nivå.
 
1.6 OBSERVATIONER 
Efter doseringen observeras djuren individuellt minst en gång under 
de första 30 minuterna, periodiskt under de första 24 timmarna (med särskild uppmärksamhet under de första 4 timmarna) och därefter 
dagligen under totalt 14 dagar. Detta gäller inte för djur som av 
hänsyn till djurens välbefinnande måste avlivas skonsamt eller för djur som hittas döda. Observationsperiodens längd bör dock ha en anpassningsmån. Längden bör bestämmas enligt de toxiska reaktio ­
nerna, tidpunkten för när de sätter in och återhämtningsperiodens 
längd. Observationsperioden kan således förlängas om det anses vara nödvändigt. Tidpunkten då tecken på toxicitet uppträder och försvinner är viktig, särskilt om de toxiska tecknen tenderar att 
vara fördröjda (se hänvisning 12). Alla observationer registreras sy ­
stematiskt, med individuella registreringar för varje djur.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 203
 
Tilläggsobservationer behövs om djuren fortsätter att uppvisa tecken 
på toxicitet. Observationerna bör omfatta förändringar i hud och päls, 
ögon och slemhinnor samt även andningsorganen, cirkulationsorga ­
nen och det autonoma och centrala nervsystemet. Likaså bör den somatomotoriska aktiviteten och beteendemönstret observeras. Upp ­
märksamhet bör fästas vid observationer av tremor, konvulsioner, 
salivutsöndring, diarré, letargi, sömn och koma. Hänsyn bör tas till de principer och kriterier som anges i vägledningen om konsekvenser för människor (se hänvisning 8). Djur som befinns vara döende och 
djur som visar tecken på svår smärta eller ihållande lidande bör 
avlivas skonsamt. I fall där djur avlivas av hänsyn till djurens väl ­
befinnande eller hittas döda, bör tidpunkten för dödsfallet registreras så exakt som möjligt.
 
1.6.1  Kroppsvikt  
Djurens vikt bör registreras individuellt strax före testämnet tillförs 
och därefter minst en gång per vecka. Alla viktändringar bör bestäm ­
mas och registreras. Vid testets slut vägs alla överlevande djur och 
avlivas därefter skonsamt.  
1.6.2  Patologi  
Alla försöksdjur (inbegripet de som dött under testet eller som har 
avlivats av hänsyn till djurens välbefinnande) bör obduceras. Alla betydande patologiska förändringar bör registreras för varje djur. Användbar information kan även fås genom mikroskopundersökning 
av organ som uppvisar betydande skador och som härrör från djur 
som överlevt minst 24 timmar efter tillförsel av startdosen.
 
2. DATA  
Data bör rapporteras individuellt per djur. Dessutom bör alla data 
sammanställas i tabellform. Tabellen ska för varje testgrupp visa antalet djur som använts, antalet djur som uppvisat tecken på tox ­
icitet, antalet djur som under testets gång har dött eller avlivats av 
hänsyn till djurens välbefinnande, tidpunkterna för alla individuella 
dödsfall, en beskrivning av och förloppet för de toxiska verkningarna och deras reversibili-tet samt obduktionsfynd.
 
3. RAPPORTERING  
3.1 Testrapport  
Testrapporten ska innehålla nedan angivna uppgifter, enligt det som 
är relevant: 
Testämne: — Fysikalisk natur, renhet och, där det är relevant, fysikalkemiska 
egenskaper (inbegripet isomerisering). 
— Identifieringsdata, inbegripet CAS-nummer. 
Vehikel (i förekommande fall). — Motivering för val av vehikel, om annan än vatten. Försöksdjur: — Art och stam som använts.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 204
 
— Mikrobiologiska data för djuren, om dessa data är kända. 
— Antalet djur, deras ålder och kön (och i förekommande fall en 
motivering för användning av hanar i stället för honor). 
— Ursprung, förvaringsförhållanden, foder och dylikt. Testbetingelser: — Detaljerade uppgifter om testämnets sammansättning, inbegripet 
uppgifter om den tillförda dosens fysikaliska form. 
— Uppgifter om hur testämnet har tillförts, inbegripet dosens volym 
och doseringstidpunkten. 
— Detaljerade uppgifter om foder- och vattenkvalitet (inbegripet 
diettyp/källa, vattenkälla). 
— Motivering för valet av startdos. 
Resultat: 
— En tabell med responsdata och dosnivå för varje djur (djur som 
uppvisat tecken på toxicitet samt mortalitet, verkningarnas natur, allvarlighetsgrad och varaktighet). 
— Tabell med kroppsvikt och förändringar av kroppsvikt. 
— Djurens individuella vikt på doseringsdagen och därefter med en 
veckas intervall, samt tidpunkten för dödsfall eller avlivning. 
— Datum och tidpunkt för dödsfall som inträffat före den planenliga 
avlivningen. 
— Tidsförloppet för när tecken på toxicitet sätter in och huruvida 
dessa är reversibla, för varje djur. 
— Obduktionsfynd och histopatologiska fynd för varje djur, i före ­
kommande fall. 
Diskussion och tolkning av resultaten. Slutsatser.
 
4. HÄNVISNINGAR  
1. Roll R., Höfer-Bosse T. and Kayser D. (1986), New Perspecti ­
ves in Acute Toxicity Testing of Chemicals. Toxicol. Lett., 
Suppl. 31, 86. 
2. Roll R., Riebschläger M., Mischke U. and Kayser D. (1989), 
Neue Wege zur Bestimmung der akuten Toxizität von Chemi ­
kalien. Bundesgesundheitsblatt 32, 336–341. 
3. Diener W., Sichha L., Mischke U., Kayser D. and Schlede E. 
(1994), The Biometric Evaluation of the Acute-Toxic-Class Method (Oral), Arch. Toxicol. 68, 559–610. 
4. Diener W., Mischke U., Kayser D. and Schlede E. (1995), The 
Biometric Evaluation of the OECD Modified Version of the 
Acute-Toxic-Class Method (Oral). Arch. Toxicol. 69, 729–734. 
5. Diener W. and Schlede E. (1999), Acute Toxicity Class Met ­
hods: Alterations to LD/LC
 50 Tests. ALTEX 16, 129–134. 
6. Schlede E., Mischke U., Roll R. and Kayser D. (1992), A 
National Validation Study of the Acute-Toxic- Class Method 
– An Alternative to the LD  50 Test. Arch. Toxicol. 66, 455–470.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 205
 
7. Schlede E., Mischke U., Diener W. and Kayser D. (1994), The 
International Validation Study of the Acute-Toxic-Class Method 
(Oral). Arch. Toxicol. 69, 659–670. 
8. OECD (2001), Guidance Document on Acute Oral Toxicity 
Testing. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment N. 24. Paris. 
9. OECD (2000), Guidance Document on the Recognition, Assess ­
ment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Ex ­
perimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assess ­
ment N. 19. 
10. OECD (1998), Harmonized Integrated Hazard Classification Sy ­
stem For Human Health And Environ mental Effects Of Chem ­
ical Substances as endorsed by the 28
 th Joint Meeting of the 
Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals in 
November 1998, Part 2, p. 11 [http://webnet1. oecd.org/oecd/ 
pages/home/displaygeneral/0,3380, EN-documents-521-14-no- 24-no-0,FF.html]. 
11. Lipnick R.L., Cotruvo J.A., Hill R.N., Bruce R.D., Stitzel K.A., 
Walker A.P., Chu I., Goddard M., Segal L., Springer J.A. and 
Myers R.C. (1995), Comparison of the Up-and Down, Conven ­
tional LD
 50 , and Fixed Dose Acute Toxicity Procedures. Fd. 
Chem. Toxicol. 33, 223–231. 
12. Chan P.K. and Hayes A.W. (1994), Chap. 16. Acute Toxicity and 
Eye Irritancy.  Principles and Methods of Toxicology.  Third Edi ­
tion. A.W. Hayes, Editor. Raven Press, Ltd., New York, USA.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 206
 
Bilaga 1  
FÖRFARANDEN SOM BÖR FÖLJAS BEROENDE PÅ STARTDOS  
ALLMÄNNA ANMÄRKNINGAR  
För de olika startdoserna finns det olika testningsscheman som bör följas, enligt 
beskrivningen i denna bilaga. 
— Bilaga 1 a: Startdosen är 5 mg per kg kroppsvikt. — Bilaga 1 b: Startdosen är 50 mg per kg kroppsvikt. 
— Bilaga 1 c: Startdosen är 300 mg per kg kroppsvikt. 
— Bilaga 1 d: Startdosen är 2 000 mg per kg kroppsvikt. Testningens förlopp anges av pilarna och beror på antalet avlivade djur eller djur 
som dött.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 207
 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 208
 ▼B 
Bilaga 1 A  
TESTFÖRFARANDE MED STARTDOSEN 5 MG PER KG KROPPSVIKT

 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 209
 ▼B 
Bilaga 1 B  
TESTFÖRFARANDE MED STARTDOSEN 50 MG PER KG KROPPSVIKT

 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 210
 ▼B 
Bilaga 1 C  
TESTFÖRFARANDE MED STARTDOSEN 300 MG PER KG KROPPSVIKT

 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 211
 ▼B 
Bilaga 1 D  
TESTFÖRFARANDE MED STARTDOSEN 2 000 MG PER KG KROPPSVIKT

 Bilaga 2  
KRITERIER FÖR HUR TESTÄMNEN MED FÖRVÄNTADE LD  50 - 
VÄRDEN ÖVER 2 000 MG/KG KAN KLASSIFICERAS UTAN 
TESTNING  
Med hjälp av kriterierna för riskkategori 5 kan man identifiera testämnen som har 
en relativt låg risk för akut toxicitet men som under vissa omständigheter kan 
utgöra en risk för sårbara populationer. Dessa ämnen förväntas ha ett LD  50 -värde 
(oralt eller via huden) inom området 2 000–5 000 mg/kg eller motsvarande doser i fråga om andra tillförselvägar. Ett testämne kan klassificeras enligt riskkategorin 
2 000 mg/kg < LD
 50 < 5 000 mg/kg (GHS-kategori 5) i följande fall: 
a) Om ämnet hänförs till denna kategori enligt utfallet i något av de testnings ­
scheman som finns i bilaga 1A–1 D, på grundval av mortalitet. 
b) Om det redan finns tillförlitliga bevis för att LD  50 -värdet ligger inom det 
intervall som motsvarar kategori 5 eller om tidigare djurförsök eller toxiska verkningar hos människor tyder på akut fara för människors hälsa. 
c) På grundval av extrapolering, uppskattning eller mätning av data, om det inte 
är motiverat att placera ämnet i en högre riskklass. 
— Om det finns tillförlitlig information som tyder på betydande toxiska 
verkningar hos människor, eller något av följande: 
— Mortalitet kan observeras vid testning med värden upp till kategori 4 via 
oral tillförsel. 
— Om en bedömning av sakkunniga bekräftar signifikanta kliniska tecken på 
toxicitet vid testning med värden upp till kategori 4, med undantag av diarré, upprest päls eller ett ovårdat utseende. 
— Om en bedömning av sakkunniga bekräftar tillförlitlig information från 
andra djurförsök som tyder på förmåga till signifikanta akuta verkningar.
 
TESTNING PÅ DOSNIVÅER ÖVER 2 000 MG/KG  
Med hänsyn till djurens välbefinnande avråds testning på djur när det gäller 
kategori 5 (5 000 mg/kg). Sådan testning bör endast övervägas när det finns en hög sannolikhet för att resultaten har direkt relevans för skyddet av djurens 
eller människors hälsa (se hänvisning 10). Ingen ytterligare testning bör utföras 
vid högre dosnivåer. 
I nödvändiga fall används en dos på 5 000 mg/kg i ett enda steg (tre djur). Om 
det först doserade djuret dör, fortsätts doseringen till 2 000 mg/kg i enlighet med 
flödesschemat i bilaga 1. Om det första djuret överlever, doseras ytterligare två 
djur. Om endast ett av de tre djuren dör antas LD
 50 -värdet överskrida 5 000 
mg/kg. Om de två djuren dör fortsätts doseringen med 2 000 mg/kg.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 212
 
Bilaga 3  
TESTMETOD B.1b: Vägledning för klassificering enligt EU-systemet, som gäller tills det 
globala harmoniserade systemet för klassificering och märkning av kemikalier (GHS) har 
genomförts helt (ur hänvisning 8)
  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 213
 
▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 214
 
▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 215
 
▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 216
 
B.2 AKUT INHALATIONSTOXICITET  
INLEDNING 
1. Den här testmetoden motsvarar OECD:s testriktlinje 403 (2009) (1). Den 
ursprungliga testriktlinjen för akut inhalation 403 (TG 403) antogs 1981. Denna reviderade testmetod B.2 (som motsvarar den reviderade TG 403) har 
utformats för att vara mer flexibel, för att minska användningen av djur, och 
för att uppfylla regulatoriska behov. Den reviderade testmetoden presenterar två studietyper: Ett traditionellt LC
 50 -protokoll och ett koncentration × 
tid-protokoll (k × t). Den här testmetodens visar primärt förhållandet mellan 
koncentration-respons vars räckvidd sträcker sig från icke-dödlig till dödlig 
utgång så att man kan komma fram till en genomsnittlig dödlig koncent ­
ration (LC  50 ), icke-dödlig tröskelkoncentration (t.ex. LC01), och kurva, och 
för att identifiera en möjlig könsberoende mottaglighet. K × t-protokollet 
ska användas om det finns ett specifikt rättsligt eller vetenskapligt behov 
som kräver testning av djur som sträcker sig över flera tidsperioder, såsom katastrofhanteringsplanering (värden för att t.ex. komma fram till riktnivåer för akut exponering (AEGL), riktlinjer för katastrofhanteringsplanering 
(ERPG) eller tröskelvärden för akut exponering (AETL)), eller markanvänd ­
ningsplanering. 
2. I vägledningsdokumentet om akut inhalationstoxicitet (GD 39) (2) kan man 
få vägledning om den här beskrivna metodens genomförande och tolkning 
vid studier. 
3. Definitioner som används inom ramen för den här metoden finns i slutet av 
det här kapitlet och i GD 39 (2). 
4. Den här testmetoden möjliggör karakterisering och kvantitativ riskbedöm ­
ning av testkemikalierna och gör det möjligt att rangordna och klassificera testkemikalierna i enlighet med förordning (EG) nr 1272/2008 (3). GD 39 (2) ger en vägledning om valet av en lämplig testmetod vid akuttestning. 
Om endast information om klassificering och märkning krävs, rekommen ­
deras rent allmänt kapitel B.52 i denna bilaga (4) (se GD 39 (2)). Den här testmetoden B.2 är inte specifikt avsedd för testning av specialmaterial såsom svårlösliga isometriska eller fibrösa material, eller avsiktligt tillver ­
kade nanomaterial.
 
INLEDANDE ÖVERVÄGANDEN 
5. Innan man överväger ett test i enlighet med den här testmetoden bör test ­
laboratoriet överväga all information avseende testkemikalien, inklusive be ­
fintliga studier (t.ex. kapitel B.52 i denna bilaga (4)) vars data visar att man inte behöver göra fler tester för att därmed minska djuranvändningen. Infor ­
mation som kan underlätta val av lämplig art, stam, kön, exponeringssätt 
och lämplig testkoncentration är ämnets identitet och kemiska struktur, fysikalisk-kemiska egenskaper, resultat från andra eventuella in vitro- eller in vivo-tester avseende toxicitet; förväntad användning och risken för 
mänsklig exponering, tillgängliga (Q)SAR-data samt toxikologiska data 
om strukturellt närbesläktade ämnen (se GD 39 (2)).
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 217
 
6. Testning av frätande och/eller irriterande kemikalier vid koncentrationer som 
förväntas orsaka svår smärta och/eller lidande bör undvikas så vitt det är 
möjligt. Eventuell frätning/irritation bör utvärderas genom en sakkunnig bedömning som grundas på erfarenheter från människa och djur (t.ex. ge ­
nom upprepade doseringsstudier utförda med doser som inte är frätande/ 
irriterande), befintliga in vitro-data (t.ex. från kapitel B.40, (5), B.40a (6) 
i denna bilaga eller OECD TG 435 (7)), pH-värden, information om lik ­
nande ämnen eller eventuellt andra relevanta data i syfte att undersöka om man kan undvika ytterligare testning. För specifika regulatoriska behov 
(t.ex. i beredskapsplaneringssyften), kan den här testmetoden användas för 
att exponera djur för dessa ämnen, eftersom det ger försöksledaren eller den ansvarige prövaren kontroll över valet av målkoncentrationer. I vilket fall som helst ska målkoncentrationer inte medföra allvarlig irritation/frätning, 
men ändå vara tillräckliga för att utvidga koncentrations-responskurvan till 
nivåer som gör att testets regulatoriska och vetenskapliga mål kan uppfyllas. Dessa koncentrationer ska väljas från fall till fall och det ska finnas en motivering för valet av koncentration (se GD 39 (2)).
 
PRINCIP FÖR TESTMETODEN 
7. Den här reviderade testmetoden B.2 har utformats för att man ska erhålla 
tillräcklig information om en testkemikalies akuta toxicitet för att klassifi ­
cera den och tillhandahålla dödlighetsdata (t.ex. LC  50, LC 01 och lutning) för 
ett eller båda könen efter behov för kvantitativ riskbedömning. Den här testmetoden erbjuder två metoder. Den första metoden är ett traditionellt protokoll i vilka grupper av djur exponeras för en begränsad koncentration 
(toleranstest) eller en serie koncentrationer i ett stegvist förfarande under en 
förutbestämd period på normalt 4 timmar. Andra exponeringstider kan gälla för specifika regulatoriska ändamål. Den andra metoden är ett (k × t) pro ­
tokoll i vilka grupper av djur exponeras för en (gränskoncentration) eller en 
serie av koncentrationer som sträcker sig över flera perioder. 
8. Döende djur eller djur som visar tecken på uppenbar smärta eller svårt och 
ihållande lidande ska avlivas skonsamt och medtas i tolkningen av testresul ­
taten på samma sätt som de som avled under testet. Kriterier för att ta 
beslutet att avliva döende eller svårt lidande djur, och vägledning om hur 
man känner igen tecknen på förutsägbar eller annalkande död, omfattas i OECD:s vägledningsdokument nr 19 om humana endpoints (8).
 
METODBESKRIVNING  
Val av djurart  
9. I testet används friska unga vuxna djur av stammar som vanligtvis används 
på laboratorier. För detta test används råtta och det ska motiveras om annan art används.
 
Förberedelse av djuren  
10. Honorna ska inte ha fått ungar och inte vara dräktiga. På exponeringsdagen 
bör djuren vara unga vuxna 8 till 12 veckor gamla och kroppsvikten bör ligga inom ± 20 % av medelvikten för vardera könet av eventuella tidigare 
exponerade djur i samma ålder. Djuren väljs ut slumpmässigt och förses 
med märkning så att de kan identifieras individuellt. Därefter får djuren acklimatisera sig till laboratoriets betingelser i sina burar i minst fem dagar före teststarten. Djuren bör också acklimatisera sig till testutrustningen en 
kort period före testet, eftersom detta minskar den stress som en ny miljö 
innebär.
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 218
 
Djurhållning  
11. Temperaturen i försöksdjurens utrymmen bör vara 22 ± 3 °C. Den relativa 
fuktigheten bör ligga mellan 30 och 70 %, även om detta kanske inte är möjligt när vatten används som vehikel. Före och efter exponeringen bör 
djuren inhysas i grupper avhängigt kön och koncentration, dock får antalet 
djur per bur inte hindra en tydlig observation av varje enskilt djur, och förluster genom kannibalism och slagsmål bör minimeras. Om endast dju ­
rens nosar ska exponeras kan det vara nödvändigt att de får acklimatisera sig 
till fasthållningsrören. Fasthållningsrören ska inte medföra onödig fysisk, 
termisk eller fasthållningsstress för djuren. Fasthållning kan påverka fysio ­
logiska endpoints såsom kroppstemperatur (hypotermi) och/eller minimala 
respiratoriska volymer. Om det finns generiska data tillgängliga som inte 
pekar på sådana förändringar i någon nämnvärd omfattning är det inte nödvändigt med anpassningen till rören före exponeringen. Djur vars hela kroppar ska exponeras för en aerosol ska inhysas individuellt under expo ­
neringen för att förhindra att de andra djuren i buren filtrerar aerosolen 
genom sina pälsar. För utfodringen kan konventionellt laboratoriefoder an ­
vändas, utom under exponeringen, tillsammans med en obegränsad tillgång till vatten. Belysningen bör vara artificiell med omväxlande 12 timmar ljus 
och 12 timmar mörker.
 
Inhalationskammare  
12. Vid val av inhalationskammare bör man beakta kemikaliens beskaffenhet 
och testets ändamål. Det föredragna exponeringssättet är enbart nos (termen inkluderar även enbart huvud, enbart nos eller enbart tryne). Exponering av 
enbart nos föredras i allmänhet vid studier av vätskor och fasta aerosoler och 
ånga som kan kondenseras och bilda aerosoler. Vissa av undersökningens mål kan bättre uppnås genom exponering av hela kroppen, men detta ska motiveras i undersökningsrapporten. För att säkerställa atmosfärisk stabilitet 
vid användningen av en helkroppskammare ska den totala volymen av för ­
söksdjuren inte överskrida 5 % av kammarens volym. Teknikerna för enbart nos och helkroppsexponeringen, deras principer och särskilda för- och nack ­
delar finns beskrivna i GD 39 (2).
 
EXPONERINGSBETINGELSER  
Administration av koncentrationer  
13. Enbart nos-exponering kan för råttor vara av vilken längd som helst upp till 
6 timmar. Om möss exponeras enbart nos överskrider exponeringen i all ­
mänhet inte 4 timmar. Motivering bör ges om längre tidsperioder för studier behövs (se GD 39 (2)). Djur som exponeras för aerosoler i helkroppskam ­
mare ska inhysas individuellt för att hindra intagandet av testkemikalien vid 
skötsel av de andra djuren i buren. Inget foder ska ges under exponerings ­
perioden. Vatten kan tillhandahållas under en helkroppsexponering. 
14. Djur exponeras för testkemikalien som en gas, ånga, aerosol eller en bland ­
ning av dem. Det fysikaliska tillstånd som ska testas beror på testkemika ­
liens fysikalisk-kemiska egenskaper, vald koncentration och/eller dess mest sannolika fysikaliska form vid hanteringen och användningen. Hygrosko ­
piska och kemiskt reaktiva testkemikalier ska testas i torr luft. Det är viktigt 
att se till att inga explosiva koncentrationer skapas.
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 219
 
Partikelstorleksfördelning  
15. Partikeldimensionering bör utföras för alla aerosoler och ångor som kan 
kondenseras och bilda aerosoler. För att möjliggöra exponering av alla relevanta områden i luftvägarna, rekommenderas aerosoler med en aero ­
dynamisk diameter (MMAD) i intervallet 1 till 4 μm med en geometrisk 
standardavvikelse ( σ
 g ) i intervallet 1,5 till 3,0 (2) (9) (10). Även om en 
rimlig ansträngning krävs för att uppfylla denna standard bör en sakkunnig bedömning göras om detta inte kan uppnås. Till exempel kan metalldimma 
understiga denna standard, och laddade partiklar, fibrer och hygroskopiska 
material (som ökar i storlek i den fuktiga miljön i andningsvägarna) kan överstiga denna standard.
 
Beredning av testkemikalie i en vehikel  
16. En vehikel kan användas för att generera en lämplig koncentration och 
partikelstorlek av testkemikalien i atmosfären. I regel bör vatten ha företrä ­
de. För att uppnå den erfordrade partikelstorleksfördelningen bör partikel ­
materialet utsättas för mekaniska processer, emellertid bör man iaktta för ­
siktighet så att inte testkemikalien sönderdelas eller förändras. I de fall där mekaniska processer tros ha förändrat testkemikaliens sammansättning (t.ex. 
extrema temperaturer från friktionen vid överdriven fräsning), bör testkemi ­
kaliens sammansättning verifieras analytiskt. Det är viktigt att testkemikalien inte förorenas. Det är inte nödvändigt att testa icke-spröda granulära material som avsiktligt är sammansatta så att de inte kan inhaleras. Ett friktionstest 
ska användas för att visa att inga inandningsbara partiklar bildas när det 
granulära materialet hanteras. Om ett friktionstest bildar inandningsbara äm ­
nen ska ett test utföras avseende inhalationstoxicitet.
 
Kontrolldjur  
17. Det är inte nödvändigt med en parallell negativ (luft-) kontrollgrupp. Om en 
annan vehikel än vatten används för att skapa testatmosfären ska en vehikel ­
kontrollgrupp endast användas när historiska data om inhalationstoxicitet 
inte är tillgängliga. Om en toxicitetsstudie av en testkemikalie som har 
beretts i en vehikel inte påvisar någon toxicitet, framgår det att vehikeln är icke-toxisk vid den testade koncentrationen, och därmed finns det inget behov av en vehikelkontroll.
 
ÖVERVAKNING AV EXPONERINGSFÖRHÅLLANDEN  
Kammarens luftflöde  
18. Luftflödet genom kammaren ska omsorgsfullt kontrolleras, kontinuerligt 
övervakas och registreras minst en gång i timmen under varje exponering. Övervakningen av testatmosfärens koncentration (eller stabilitet) är en inte ­
grerad mätning av samtliga dynamiska parametrar och ett indirekt sätt att 
kontrollera alla relevanta atmosfärsskapande dynamiska parametrar. Särskild hänsyn bör tas för att undvika återandning i enbart nos-kammare i de fall där luftflödet genom exponeringssystemet är otillräckligt för att ge ett dy ­
namiskt flöde i testkemikalieatmosfären. Det finns föreskrivna metoder som 
kan användas för att visa att återandning inte sker under de valda process ­
förhållandena (2) (11). Syrehalten bör vara minst 19 % och koncentrationen av koldioxid bör inte överstiga 1 %. Om det finns anledning att tro att dessa 
standarder inte kan uppfyllas bör man mäta koncentrationen av syre och 
koldioxid.
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 220
 
Kammarens temperatur och relativa fuktighet  
19. Kammarens temperatur bör upprätthållas vid 22 ± 3 °C. Relativ fuktighet i 
djurens andningsområden, gäller både enbart nos och helkroppsexponering, bör övervakas och registreras minst tre gånger under tidsperioder på upp till 
4 timmar, och varje timme för kortare tidsperioder. Den relativa fuktigheten 
bör företrädesvis upprätthållas inom intervallet 30 till 70 %, men detta kan ­
ske inte är möjligt (t.ex. vid testning av vattenbaserade blandningar) eller inte mätbart på grund av att testkemikalien stör själva testmetoden.
 
Testkemikalie: Nominell koncentration  
20. När det är möjligt bör den nominella koncentrationen i exponeringskamma ­
ren beräknas och registreras. Den nominella koncentrationen är massan av den genererade testkemikalien dividerad med den totala volymen av luft som passerade genom kammarsystemet. Den nominella koncentrationen an ­
vänds inte för att karakterisera djurens exponering, men en jämförelse mel ­
lan den nominella koncentrationen och den faktiska koncentrationen ger en indikation på testsystemets genereringsprestanda, och kan därmed användas för att upptäcka genereringsproblem.
 
Testkemikalie: Faktisk koncentration  
21. Den faktiska koncentrationen är testkemikaliens koncentration i djurets and ­
ningsområde i en inhalationskammare. Faktiska koncentrationer kan erhållas genom särskilda metoder (t.ex. direkt provtagning, adsorptiva eller kemiskt reaktiva metoder, och efterföljande analytisk karakterisering) eller av 
icke-specifika metoder såsom gravimetrisk filteranalys. Användningen av 
gravimetrisk analys är endast acceptabel för pulveraerosoler bestående av en enda komponent eller aerosoler bestående av vätskor med låg flyktighet, och bör stödjas av en lämplig preklinisk studie med kemikaliespecifik ka ­
rakterisering. Koncentrationen i pulveraerosoler bestående av flera kom ­
ponenter kan också bestämmas genom gravimetrisk analys. Detta kräver dock analysresultat som visar att sammansättningen av luftburet material liknar startmaterialet. Om denna information inte finns tillgänglig kan det 
vara nödvändigt med en ny analys av testkemikalien (helst i sitt luftburna 
tillstånd) under loppet av studien. För medel i aerosolform som kan förångas eller sublimeras bör man kunna visa att samtliga faser uppsamlades med den valda metoden. 
22. Målkoncentrationerna och de nominella och faktiska koncentrationerna ska 
finnas med i undersökningsrapporten, men endast de faktiska koncentratio ­
nerna används i de statistiska analyserna för att beräkna värdena för dödlig 
koncentration. En sats av testkemikalien ska användas, om möjligt, och 
provet ska lagras under sådana förhållanden att det bibehåller sin renhet, homogenitet och stabilitet. Inför starten av studien bör det finnas en be ­
skrivning av testkemikalien som inbegriper dess renhet och, om det är 
tekniskt genomförbart, identitet, och kvantiteterna av identifierade förore ­
ningar och orenheter. Detta kan visas genom, men är inte begränsat till, följande data: Retentionstid och relativ topparea, molekylvikt från masspek ­
troskopi eller gaskromatografianalys, eller andra uppskattningar. Även om 
testlaboratoriet inte ansvarar för provets identitet kan det vara klokt att man i 
stora drag bekräftar karakteriseringen (t.ex. färg, fysisk natur etc.). 
23. Exponeringsatmosfären ska hållas så konstant som möjligt och övervakas 
kontinuerligt och/eller intermittent beroende på analysmetoden. När intermit ­
tent provtagning används bör prover på kammaratmosfären tas minst två gånger under en fyratimmarsstudie. Om det inte är möjligt på grund av begränsade luftflöden eller låga koncentrationer, kan ett prov tas under 
hela exponeringsperioden. Om märkta prov-till-prov-fluktationer förekom ­
mer, bör man för de påföljande koncentrationerna som ska testas ta
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 221
 
fyra prover per exponering. Provtagning av koncentrationer från individuella 
kammare bör inte avvika från den genomsnittliga koncentrationen med mer 
än ± 10 % för gaser och ångor eller ± 20 % för flytande eller fasta aero ­
soler. Tiden tills kammaren når jämvikt (t  95 ) bör beräknas och registreras. 
Varaktigheten för en exponering spänner sig över den tid som testkemika ­
lien genereras och tar hänsyn till den tid som krävs för att uppnå t  95 . 
Riktlinjer för att uppskatta t  95 finns i GD 39 (2). 
24. För mycket komplexa blandningar bestående av gaser/ångor och aerosoler 
(t.ex. förbränningsatmosfärer och testkemikalier framdrivna från därför av ­
sedd slutanvändningsprodukt/-utrustning). Varje fas kan bete sig annorlunda i en inhalationskammare så minst en indikatorsubstans ska väljas (analyt), 
vanligtvis den huvudsakliga aktiva substansen i blandningen för varje fas 
(gas/ånga och aerosol). När testkemikalien är en blandning ska den analy ­
tiska koncentrationen i blandningen rapporteras, inte bara den aktiva sub ­
stansen eller komponenten (analyten). Ytterligare information om faktisk 
koncentration finns i GD 39 (2).
 
Testkemikalie: Partikelstorleksfördelning  
25. Aerosolers partikelstorleksfördelning bör fastställas minst två gånger under 
varje 4-timmarsexponering med hjälp av en kaskadimpaktor eller ett alter ­
nativt instrument såsom en aerodynamisk partikelsorterare. Om man kan 
visa ett likvärdigt resultat från en kaskadimpaktor eller det alternativa in ­
strumentet, kan man använda det sistnämnda under hela försöket. En andra enhet, till exempel ett gravimetriskt filter eller en impinger/gasbubblare, bör 
användas parallellt med det primära instrumentet för att bekräfta uppsam ­
lingsprestandan hos det primära instrumentet. Masskoncentrationen som er ­
hållits genom analys av partikelstorleken ska ligga inom rimliga gränser för den masskoncentration som erhållits genom filteranalys (se GD 39 (2)). Om 
likvärdigheten kan påvisas i ett tidigt skede av försöket kan ytterligare 
bekräftande mätningar utelämnas. Av djurskyddsskäl bör åtgärder vidtas för att minimera ofullständiga uppgifter som kan leda till en upprepning av exponeringen. Partikeldimensionering bör utföras för ångorna, om det 
finns en möjlighet att kondensen kan bilda en aerosol, eller om partiklar 
upptäcks i ångatmosfären som kan göra så att faserna blandas (se punkt 15).
 
PROCEDUR 
26. Två studietyper beskrivs nedan: det traditionella protokollet och k × 
t-protokollet. Båda protokollen kan inkludera en inledande studie, en huvud ­
studie och/eller ett toleranstest (traditionellt protokoll), eller testning av en gränskoncentration (k × t). Om det ena könet är känt för att vara mer mottagligt kan försöksledaren välja att utföra studierna med enbart det mot ­
tagliga könet. Om andra gnagare än råttor utsätts för enbart nos, kan de 
maximala exponeringstiderna justeras för att minska artspecifikt lidande. Innan försöket påbörjas ska alla tillgängliga data beaktas för att minimera djuranvändningen. Till exempel kan data som genereras genom användning 
av kapitel B.52 i denna bilaga (4) eliminera behovet av en inledande studie, 
och kan också visa om ett kön är mer mottagligt (se GD 39 (2)).
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 222
 
TRADITIONELLT PROTOKOLL  
Allmänna överväganden: Traditionellt protokoll  
27. I en traditionell studie exponeras grupper av djur för testkemikalier under en 
fast tidsperiod (vanligtvis 4 timmar) i antingen en exponeringskammare för enbart nos eller en helkroppskammare. Djuren exponeras antingen för en begränsad koncentration (toleranstest) eller för minst tre koncentrationer i ett 
stegvist förfarande (huvudstudie). En inledande studie kan föregå en huvud ­
studie om det inte redan finns någon information om testkemikalien, såsom en tidigare utförd B.52-studie (se GD 39 (2)).
 
Inledande studie: Traditionellt protokoll  
28. En inledande studie används för att uppskatta testkemikaliens potens, iden ­
tifiera könsskillnader beträffande mottaglighet, och för att välja nivå på 
exponeringskoncentrationen för huvudstudien eller toleranstestet. När man väljer nivå på koncentrationen för den inledande studien ska alla tillgängliga data användas, inklusive tillgängliga (Q)SAR-data och data för liknande 
kemikalier. Inte fler än tre hanar och tre honor ska exponeras för varje 
koncentration (3 djur per kön kan behövas för att fastställa en könsskillnad). En inledande studie kan bestå av en engångskoncentration, men fler kon ­
centrationer kan testas vid behov. En inledande studie ska inte testa så 
många djur och koncentrationer att det liknar en huvudstudie. En tidigare 
utförd B.52-studie (4) kan användas i stället för en inledande studie (se GD 39 (2)).
 
Toleranstest: Traditionellt protokoll  
29. Ett toleranstest används när testkemikalien är känd eller förväntas vara 
praktiskt taget icke-toxisk, dvs. framkalla en toxisk reaktion endast över 
den regulatoriska gränskoncentrationen. I ett toleranstest exponeras en 
enda grupp bestående av tre hanar och tre honor för testkemikalien vid en koncentrationsgräns. Information om testkemikaliens toxicitet kan erhållas genom kunskap om liknande testade kemikalier, med beaktande av identitet 
och procentandel av komponenter kända för en signifikant toxicitet. I situa ­
tioner när det finns lite eller ingen information om dess toxicitet, eller testkemikalien förväntas vara toxisk, ska huvudtestet utföras. 
30. Valet av koncentrationsgräns är vanligtvis beroende av regulatoriska krav. 
När förordning (EG) nr 1272/2008 används, är respektive koncentrations ­
gräns för gaser, ångor och aerosoler 20 000 ppm, 20 mg/l och 5 mg/l (eller den maximalt uppnåeliga koncentrationen) (3). Det kan vara tekniskt utma ­
nande att generera koncentrationsgränser för vissa kemikalier, särskilt ångor 
och aerosoler. När man testar aerosoler bör det primära målet vara att uppnå en andningsbar partikelstorlek (MMAD av 1–4 μm). Det är möjligt för de 
flesta kemikalier med en koncentration på 2 mg/l. Testning av aerosoler med 
högre än 2 mg/l ska endast göras om en andningsbar partikelstorlek kan 
uppnås (se GD 39 (2)). Förordning (EG) nr 1272/2008 avråder från testning över koncentrationsgränsen av djurskyddsskäl (3). Koncentrationsgränsen ska endast övervägas om ett sådant test har en direkt relevans för skyddet 
av människors hälsa (3), och motivering angiven i undersökningsrapporten. 
När det gäller potentiellt explosiva testkemikalier bör man vara noga med att undvika förhållanden som är gynnsamma för en explosion. För att undvika onödig användning av djur ska ett test genomföras utan djur före tolerans ­
testet, för att se till att förhållandena i kammaren kan uppnås för ett tolerans ­
test.
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 223
 
31. Om mortalitet eller döende observeras vid koncentrationsgränsen kan resul ­
taten från toleranstestet tjäna som ett inledande test för ytterligare tester vid 
andra koncentrationer (se huvudstudie). Om en testkemikalies fysikaliska eller kemiska egenskaper gör det omöjligt att nå koncentrationsgränsen ska den maximalt uppnåeliga koncentrationen testas. Om dödligheten är 
lägre än 50 % vid den maximalt uppnåeliga koncentrationen behöver inga 
fler tester utföras. Om koncentrationsgränsen inte kunde uppnås ska under ­
sökningsrapporten ge en förklaring och understödjande data. Om den max ­
imalt nåbara koncentrationen för en ånga inte framkallar toxicitet kan det bli 
nödvändigt att generera testkemikalien som en flytande aerosol.
 
Huvudstudie: Traditionellt protokoll  
32. En huvudstudie utförs normalt med fem hanar och fem honor (eller 5 djur 
av det mottagliga könet, om detta är känt) per koncentrationsnivå, med 
minst tre koncentrationsnivåer. För att uppnå en gedigen statistisk analys ska tillräckliga koncentrationsnivåer användas. Tidsintervallet mellan expo ­
neringsgrupperna fastställs genom start, varaktighet och allvarlighetsgrad för 
tecknen på toxicitet. Exponering av djur vid nästa koncentrationsnivå ska fördröjas tills det finns rimlig anledning att anta att tidigare testade djur överlever. Detta gör att försöksledaren kan justera målkoncentrationen för 
nästa exponeringsgrupp. På grund av att man behöver sofistikerad teknik är 
detta inte alltid praktiskt genomförbart i inhalationsstudier, därför bör dju ­
rens exponering baseras på tidigare erfarenheter och vetenskapliga bedöm ­
ningar. Man bör konsultera GD 39 (2) vid testning av blandningar.
 
PROTOKOLL FÖR KONCENTRATION × TID (K × T)  
Allmänna överväganden: k × t-protokoll  
33. En stegvis k × t-studie kan övervägas som ett alternativ till ett traditionellt 
protokoll vid bedömning av inhalationstoxicitet (12) (13) (14). Detta till ­
vägagångssätt låter djuren exponeras för en testkemikalie på flera koncent ­
rationsnivåer och med olika varaktigheter. Samtliga tester utförs i en enbart 
nos-kammare (helkroppskammare är inte praktiska för detta protokoll). Ett flödesdiagram i tillägg 1 belyser detta protokoll. En simuleringsanalys har visat att det traditionella protokollet och k × t-protokollet båda är kapabla att 
ge gedigna LC
 50 -värden, men k × t-protokollet är generellt bättre på att ge 
gedigna LC  01 - och LC  10 -värden (15). 
34. En simuleringsanalys har visat att användningen av två djur per k × 
t-intervall (ett per kön vid användning av båda könen eller två av det mer 
mottagliga könet) i allmänhet kan vara tillräckligt när man testar 4 kon ­
centrationer och 5 exponeringsvaraktigheter i en huvudstudie. Under vissa omständigheter kan försöksledaren välja att använda två råttor per kön per k × t-intervall (15). Att använda 2 djur per kön per koncentration och tidpunkt 
kan minska förutfattade meningar angående uppskattningarnas variation, öka 
framgångsgraden och förbättra konfidensintervallets täckning. I händelse av att resultatet inte ligger tillräckligt nära uppskattningsdatan (vid användning av ett djur per kön eller två av det mer mottagliga könet) kan dock även en 
5:e koncentrationsexponering räcka. Ytterligare vägledning om antalet djur 
och koncentrationer som ska användas i en k × t-studie finns i GD 39 (2).
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 224
 
Inledande studie: k × t-protokoll  
35. En inledande studie används för att uppskatta testkemikaliens potens och 
underlätta valet av exponeringens koncentrationsnivåer för huvudstudien. En inledande studie som använder upp till tre djur per kön och koncentration 
(beträffande detaljer se tillägg III till GD 39 (2)) kan behöva välja en 
lämplig startkoncentration till huvudstudien för att minimera antalet djur som används. Det kan vara nödvändigt att använda tre djur per kön för att fastställa en könsskillnad. Dessa ska exponeras för en enstaka tidsperiod, 
vanligtvis 240 min. Möjligheten att generera adekvata testatmosfärer bör 
utvärderas vid tekniska förtester utan djur. Vanligtvis behöver man inte genomföra en inledande studie om det finns tillgängliga mortalitetsdata 
från en B.52-studie (4). När man väljer den inledande målkoncentrationen 
i en B.2-studie bör försöksledaren beakta mortalitetsmönstret som observe ­
rats i eventuella tillgängliga B.52-studier (4) för båda könen och för alla testade koncentrationer (se GD 39 (2)).
 
Inledande koncentration: k × t-protokoll  
36. Den inledande koncentrationen (exponeringssession 1) (tillägg 1) är antingen 
en gränskoncentration eller en koncentration vald av försöksledaren baserad på den inledande studien. Grupper om 1 djur per kön exponeras för den här 
koncentrationen under flera tidsperioder (t.ex. 15, 30, 60, 120 eller 240 
minuter) vilket resulterar i ett totalt antal av 10 djur (vilket kallas expone ­
ringssession I) (tillägg 1). 
37. Valet av koncentrationsgräns är vanligtvis beroende av regulatoriska krav. 
När förordning (EG) nr 1272/2008 används, är respektive koncentrations ­
gräns för gaser, ångor och aerosoler 20 000 ppm, 20 mg/l och 5 mg/l (eller 
den maximalt uppnåeliga koncentrationen) (3). Det kan vara tekniskt utma ­
nande att generera koncentrationsgränser för vissa kemikalier, särskilt ångor och aerosoler. Vid testning av aerosoler bör målet vara att uppnå en inand ­
ningsbar partikelstorlek (dvs. en MMAD på 1–4 μm) vid en koncentrations ­
gräns på 2 mg/l. Detta är möjligt för de flesta testkemikalier. Testning av aerosoler med mer än 2 mg/l bör endast utföras om en andningsbar par ­
tikelstorlek kan uppnås (se GD 39 (2)). Förordning (EG) nr 1272/2008 
avråder från testning över koncentrationsgränsen av djurskyddsskäl (3). 
Testning över koncentrationsgränsen ska endast övervägas när ett sådant test har en direkt relevans för skyddet av människors hälsa (3), motiveringen ska anges i undersökningsrapporten. När det gäller potentiellt explosiva 
testkemikalier bör man vara noga med att undvika förhållanden som är 
gynnsamma för en explosion. För att undvika onödig djuranvändning ska ett test genomföras utan djur före testningen med den inledande koncent ­
rationen för att säkerställa att förhållandena i kammaren kan uppnås för 
denna koncentration. 
38. Om mortalitet eller döende observeras vid den inledande koncentrationen 
kan resultaten från denna koncentration tjäna som en inledande studie för 
ytterligare tester vid andra koncentrationer (se huvudstudie). När en test ­
kemikalies fysikaliska eller kemiska egenskaper gör det omöjligt att nå koncentrationsgränsen ska den maximalt uppnåeliga koncentrationen testas. 
Om dödligheten är lägre än 50 % vid den maximalt uppnåeliga koncent ­
rationen behöver inga fler tester utföras. Om koncentrationsgränsen inte kunde uppnås ska undersökningsrapporten ge en förklaring och understöd ­
jande data. Om den maximalt nåbara koncentrationen för en ånga inte fram ­
kallar toxicitet kan det bli nödvändigt att generera testkemikalien som en 
flytande aerosol.
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 225
 
Huvudstudie: k × t-protokoll  
39. Den inledande koncentrationen (exponeringssession 1) (tillägg 1) som testas 
i huvudstudien är antingen en gränskoncentration eller en koncentration vald av försöksledaren baserad på den inledande studien. Om mortalitet har 
observerats under eller efter exponeringssession 1 kommer den minsta ex ­
ponering (k × t) som leder till mortalitet att användas som riktlinje för fastställande av koncentration och exponeringsperiod för exponeringssession II. Varje efterföljande exponeringssession bygger på den föregående (se till ­
lägg 1). 
40. För många testkemikalier är det resultat som erhålls vid den initiala kon ­
centrationen, tillsammans med ytterligare tre exponeringssessioner med ett 
mindre tidsrutsystem (dvs. det geometriska mellanrummet för exponerings ­
perioder som anges av faktorn mellan på varandra följande perioder, i all ­
mänhet √2), tillräckligt för att fastslå k × t-dödlighetsförhållandet (15), men 
det kan finnas vissa fördelar med att använda en 5:e exponeringskoncent ­
ration (se tillägg 1 och GD 39 (2)). För matematisk behandling av resultaten 
från k × t-protokollet, se tillägg 1.
 
IAKTTAGELSER 
41. Djuren bör ofta observeras kliniskt under exponeringsperioden. Efter expo ­
neringen ska kliniska observationer göras minst två gånger på dagen för 
exponeringen, eller oftare om djurens respons på behandlingen indikerar det, 
och därefter minst en gång per dag under en period av 14 dagar. Observa ­
tionstidens längd är inte fast, utan bör bestämmas utifrån art och tidpunkt för de första kliniska tecknen samt längden på återhämtningsperioden. De till ­
fällen då tecken på toxicitet uppträder och försvinner är viktig, särskilt om 
tecknen på toxicitet visar en tendens att fördröjas. Alla observationer regi ­
streras systematiskt med individuella registreringar för varje djur. Djur som påträffas döende och djur som visar tecken på uppenbar smärta och/eller 
svårt ihållande lidande ska avlivas skonsamt av djurskyddsskäl. Försiktighet 
bör iakttas vid utförande av undersökningar för kliniska tecken på toxicitet, så att djur som ser dåliga ut och har övergående respiratoriska förändringar till följd av exponeringsförfarandet, inte misstas för testkemikalierelaterad 
toxicitet som kräver förtida avlivande av djuren. Principerna och kriterierna 
som finns sammanfattade i vägledningsdokumentet om humana endpoints (GD 19) bör tas i beaktande (7). När djur avlivas av humanitära skäl eller 
påträffas döda, ska tidpunkten för dödsfallet registreras så noggrant som 
möjligt. 
42. Observationer vid buren bör omfatta förändringar i bur och päls, ögon och 
slemhinnor, samt även andningsorganen, cirkulationsorganen och det auto ­
noma och centrala nervsystemet, samt kroppsmotorik och beteendemönster. 
Om möjligt bör eventuella skillnader mellan lokala och systematiska effekter noteras. Uppmärksamhet bör fästas vid observationer av tremor, konvulsio ­
ner, salivutsöndring, diarré, letargi, sömn och koma. Mätningen av rektal 
temperatur kan ge belägg för bradypnéreflex eller hypo/hypertermi relaterat till behandling eller inspärrning.
 
Kroppsvikt  
43. Vikten på individuella djur bör registreras en gång under acklimatiserings ­
perioden på exponeringsdagen före exponeringen (dag 0), och åtminstone 
dag 1, 3 och 7 (och därefter varje vecka), och vid tidpunkten då döden eller 
avlivningen inträffar om dag 1 överskrids. Kroppsvikt är en erkänt viktig indikator på toxicitet, så djur som uppvisar en fortsatt minskning på ≥ 20 % 
jämfört med värdena i förstudien bör noggrant övervakas. Djur som över ­
lever vägs och avlivas skonsamt i slutet av perioden efter exponeringsperio ­
den.
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 226
 
Patologi  
44. Alla försöksdjur, inklusive de som avlider under testet eller avlivas och tas 
bort från undersökningen av djurskyddsskäl bör obduceras. Om en obduk ­
tion inte kan utföras omedelbart efter att ett dött djur har upptäckts, bör 
djuret kylas (inte frysas) vid en temperatur som är tillräckligt låg för att 
minimera autolys. Obduktioner ska utföras så snart som möjligt, vanligtvis inom en dag eller två. Alla betydande patologiska förändringar bör registre ­
ras för varje djur med särskild uppmärksamhet på eventuella förändringar i 
luftvägarna. 
45. Ytterligare undersökningar inklusive a priori genom beräkning kan anses 
utöka studiens tolkningsvärde, såsom mätning av lungvikt hos överlevande 
råttor, och/eller ge prov på irritation genom den mikroskopiska undersök ­
ningen av luftvägarna. Undersökta organ kan också innefatta sådana som uppvisar betydande skador och som härrör från djur som överlevt 24 timmar eller mer, och organ kända för, eller som förväntas, att påverkas. Mikrosko ­
pisk undersökning av hela luftvägarna kan ge användbar information om 
testkemikalier som är reaktiva med vatten, såsom syror och hygroskopiska testkemikalier.
 
DATA OCH RAPPORTERING  
Data  
46. Individuella data om kroppsvikt och obduktionsfynd bör tillhandahållas. 
Kliniska observationsdata bör sammanfattas i tabellform, som för varje test ­
grupp visar antalet djur som använts, antalet djur som visar tecken på tox ­
icitet, antalet djur som avlidit under testet eller som avlivats av humanitära 
skäl, tidpunkten då det enskilda djuret har avlidit, beskrivning och tidsför ­
lopp för toxiska verkningar och reversibilitet, samt obduktionsfynd.  
Testrapport  
47. Testrapporten ska omfatta följande information, när så är lämpligt:  
Försöksdjur och djurhållning  
— Beskrivning av burförhållanden, inklusive antal (eller förändring av an ­
tal) djur per bur, strö, omgivningstemperatur och relativ fuktighet, ljus ­
period och identifiering av kost. 
— Art/stam som används och motivering för användning av andra arter än 
råtta. 
— Djurens antal, ålder och kön. 
— Metod för randomisering. 
— Uppgifter om foder- och vattenkvalitet (inbegripet kosttyp/-källa och 
vattenförsörjning). 
— Beskrivning av eventuella förtestbetingelser inbegripet kost, karantän 
och behandling av sjukdomar.  ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 227
 
Testkemikalie  
— Fysikalisk natur, renhet och, i förekommande fall, fysikalisk-kemiska 
egenskaper (inbegripet isomerisering). 
— Identifieringsdata och CAS-nummer (Chemical Abstract Services), om 
detta är känt.  
Vehikel  
— Motivering för användning av vehikel och valet av vehikel (om annat än 
vatten). 
— Historiska eller parallella data som visar att vehikeln inte påverkar stud ­
iens slutresultat.  
Inhalationskammare  
— Beskrivning av inhalationskammaren inklusive mått och volym. — Ursprung och beskrivning av utrustning som används för exponering av 
djur så väl som generering av atmosfär. 
— Utrustning för mätning av temperatur, fuktighet, partikelstorlek och fak ­
tisk koncentration. 
— Luftkälla och behandling av luft som tillförs/extraheras och system som 
används för luftkonditionering. 
— Metoder som används för kalibrering av utrustning för att säkerställa en 
homogen testatmosfär. 
— Tryckskillnad (positiv eller negativ). — Exponeringsportar per kammare (enbart nos), placering av djur i syste ­
met (helkropp). 
— Temporal homogenitet/stabilitet för testatmosfären. — Placering av temperatur- och fuktighetsgivare och provtagning av tes ­
tatmosfären i kammaren. 
— Luftflödeshastigheter, port för luftflöde och exponering (enbart nos), 
eller djurbelastning och kammare (helkropp). 
— Information om utrustningen som används för att mäta syre och kol ­
dioxid, i förekommande fall. 
— Tid som krävs för att uppnå jämvikt i inhalationskammaren (t
 95). 
— Antal volymutbyten per timme. 
— Mätutrustning (i förekommande fall).  
Exponeringsdata  
— Grunden för valet av målkoncentration i huvudstudien. — Nominella koncentrationer (den totala massan av testkemikalien som 
genereras i inhalationskammaren dividerad med luftvolymen som pas ­
serar genom kammaren). 
— Faktiska koncentrationer av testkemikalier som uppsamlats från djurens 
andningsapparat, för blandningar som bildar heterogena fysikaliska for ­
mer (gaser, ångor, aerosoler), där var och en analyseras separat.
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 228
 
— Alla luftkoncentrationer ska rapporteras i viktenheter (t.ex. mg/l, mg/m  3 , 
etc.). Enheter för volym (t.ex. ppm, ppb etc.) kan också redovisas inom 
parantes. 
— Partikelstorleksfördelning, aerodynamisk massmediandiameter (MMAD) 
och geometrisk standardavvikelse ( σg), inklusive metoderna för deras 
beräkning. Individuella partikelstorleksanalyser bör rapporteras.  
Testbetingelser  
— Uppgifter om beredning av testkemikalien, inklusive uppgifter om even ­
tuella procedurer som använts för att minska partikelstorleken hos fasta material eller för att bereda testlösningar. I de fall där mekaniska pro ­
cesser kan ha förändrat testkemikaliens sammansättning ska analysresul ­
taten inkluderas för att bekräfta dess sammansättning. 
— En beskrivning (helst med ett diagram) av utrustningen som används för 
att generera testatmosfären och exponera djuren för denna atmosfär. 
— Uppgifter om den kemiska analysmetod som använts och metodvalide ­
ring (inklusive effektiviteten för återvinningen av testkemikalien från 
provtagningsmediet). 
— Grunden för valet av testkoncentration.  
Resultat  
— Tabelluppställning av kammarens temperatur, fuktighet och luftflöde. 
— Tabelluppställning av kammarens nominella och faktiska koncentrations ­
data. 
— Tabelluppställning av partikelstorleksdata som omfattar provtagnings ­
data, partikelstorleksfördelning och beräkning av MMAD och σ
 g. 
— Tabelluppställning av responsdata och koncentrationsnivåer för varje 
djur (dvs. djur som uppvisar tecken på toxicitet inklusive mortalitet, 
natur, allvarlighetsgrad, tidpunkt för första tecknet och effekternas var ­
aktighet). 
— Djurens individuella kroppsvikt som samlats in under studien, datum och 
tid för dödsfall som inträffat före planerad avlivning, tidsförlopp för första tecknen på toxicitet och om dessa var reversibla för varje enskilt djur. 
— Obduktionsfynd och histopatologiska fynd för varje djur, om detta finns 
tillgängligt. 
— Dödlighetsuppskattning (t.ex. LC
 50 , LD  01 ) inklusive 95 % kon ­
fidensgräns, och lutning (om det tillhandahålls av utvärderingsmetoden). 
— Statistisk relation, inklusive uppskattningen av exponenten n (k × 
t-protokoll). Namnet på den statistiska programvara som används bör 
tillhandahållas.  ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 229
 
Diskussion och tolkning av resultaten  
— Särskild uppmärksamhet bör ges till beskrivningen av använda metoder 
för att uppfylla kriterierna för den här testmetoden, t.ex. koncentrations ­
gräns eller partikelstorlek. 
— Partiklarnas andningsbarhet i ljuset av de övergripande resultaten bör 
åtgärdas, särskilt om kriterierna för partikelstorlek inte kunde uppfyllas. 
— En förklaring bör ges om det fanns ett behov av att avliva djur av 
humanitära skäl som visade tecken på uppenbar smärta eller svårt och 
ihållande lidande, på grundval av kriterierna i OECD:s vägledningsdoku ­
ment om humana endpoints (8). 
— Om testning enligt kapitel B.52 i denna bilaga (4) avbröts till förmån för 
testmetod B.2, bör motivering för detta lämnas. 
— Överensstämmelsen mellan metoderna som används för att bestämma 
nominell och faktisk koncentration, och förhållandet mellan faktisk och nominell koncentration bör ingå i den samlade bedömningen av 
studien. 
— Den sannolika dödsorsaken och dominerande verkningsmekanism (syste ­
matisk mot lokal) bör behandlas.
 
LITTERATUR  
(1) OECD (2009). Acute Inhalation Toxicity Testing. OECD Guideline for 
Testing of Chemicals No. 403, OECD, Paris. Finns på http://www.oecd.org/ 
env/testguidelines. 
(2) OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing. 
Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assess ­
ment No. 39, OECD, Paris. Finns på http://www.oecd.org/env/ testguidelines. 
(3) Europaparlamentets och rådets förordning (EG) nr 1272/2008 av den 
16 december 2008 om klassificering, märkning och förpackning av ämnen och blandningar, ändring och upphävande av direktiven 67/548/EEG och 
1999/45/EG samt ändring av förordning (EG) nr 1907/2006 (EUT L 353, 
31.12.2008, s. 1). 
(4) Kapitel B.52 i denna bilaga, akut inhalationstoxicitet – akut toxicitetsklass. 
(5) Kapitel B.40 i denna bilaga, in vitro-test av hudkorrosivitet: bestämning av 
transkutant elektriskt motstånd (TER). 
(6) Kapitel B.40a i denna bilaga, in vitro-test av hudkorrosivitet: test med 
modell av human hud. 
(7) OECD (2005). In Vitro Membrane Barrier Test Method for Skin Corrosion. 
OECD Guideline for Testing of Chemicals No. 435, OECD, Paris. Finns på 
http://www.oecd.org/env/testguidelines. 
(8) OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and 
Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 19, OECD, Paris. Finns på http:// 
www.oecd.org/env/testguidelines. 
(9) SOT (1992). Technical Committee of the Inhalation Specialty Section, So ­
ciety of Toxicology (SOT). Recommendations for the Conduct of Acute 
Inhalation Limit Tests. Fund. Appl. Toxicol. 18: 321–327. 
(10) Phalen RF (2009). Inhalation studies: Foundations and Techniques. (2nd 
Edition) Informa Healthcare, New York.
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 230
 
(11) Pauluhn J and Thiel A (2007). A Simple Approach to Validation of 
Directed-Flow Nose-Only Inhalation Chambers. J. Appl. Toxicol. 27: 
160–167. 
(12) Zwart JHE, Arts JM, ten Berge WF, Appelman LM (1992). Alternative 
Acute Inhalation Toxicity Testing by Determination of the Concentration-Time-Mortality Relationship: Experimental Comparison 
with Standard LC50 Testing. Reg. Toxicol. Pharmacol. 15: 278–290. 
(13) Zwart JHE, Arts JM, Klokman-Houweling ED, Schoen ED (1990). Deter ­
mination of Concentration-Time-Mortality Relationships to Replace LC50 Values. Inhal. Toxicol. 2: 105–117. 
(14) Ten Berge WF and Zwart A (1989). More Efficient Use of Animals in 
Acute Inhalation Toxicity Testing. J. Haz. Mat. 21: 65–71. 
(15) OECD (2009). Performance Assessment: Comparison of 403 and C × t 
Protocols via Simulation and for Selected Real Data Sets. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 104, OECD, Paris. Finns på http://www.oecd.org/env/testguidelines. 
(16) Finney DJ (1977). Probit Analysis, 3rd ed. Cambridge University Press, 
London/New York.
 
DEFINITION  
Testkemikalie:  Alla ämnen eller blandningar som testas med denna testmetod.  ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 231
 
Tillägg 1  
K × t-protokoll  
1. En stegvis koncentration × tid-studie (k × t) kan övervägas som ett alter ­
nativ till det traditionella protokollet för bedömning av inhalationstoxicitet (12) (13) (14). Den bör företrädesvis utföras när det finns ett specifikt regelverk eller vetenskapligt behov som kräver testning av djur under flera 
tidsperioder, såsom katastrofhanterings- eller markanvändningsplanering. 
Detta tillvägagångssätt börjar med ett test vid en koncentrationsgräns (ex ­
poneringssession 1) i vilka djuren exponeras för en testkemikalie under fem tidsperioder (t.ex. 15, 30, 60, 120 och 240 minuter) så att flera löptider 
kommer att erhållas inom en exponeringssession (se figur 1). När 
förordning (EG) nr 1272/2008 används, är respektive koncentrationsgräns för gaser, ångor och aerosoler 20 000 ppm, 20 mg/l och 5 mg/l. Dessa nivåer kan endast överskridas om det finns ett specifikt regelverk eller 
vetenskapligt behov som kräver testning vid dessa nivåer (se punkt 37 i 
B.2 i huvudtexten). 
2. I situationer där det finns lite eller ingen information om en testkemikalies 
toxicitet, bör en inledande studie utföras, i vilken grupper om maximalt 3 djur per kön exponeras för de målkoncentrationer som försöksledaren har 
valt, vanligtvis i 240 minuter. 
3. Om en koncentrationsgräns testas under exponeringssession 1 och lägre 
mortalitet än 50 % observeras, behövs inga ytterligare tester utföras. Om 
det finns ett regelverk eller vetenskapligt behov av att fastställa förhållandet koncentration/tid/respons för högre nivåer än den angivna koncentrations ­
gränsen bör nästa exponering utföras vid en högre nivå som t.ex. två gånger 
koncentrationsgränsen (dvs. 2 L i figur 1). 
4. Om toxicitet observeras vid koncentrationsgränsen behöver ytterligare tester 
utföras (huvudstudie). Dessa exponeringar utförs antingen vid lägre kon ­
centrationer (i figur 1: exponeringssession II, III eller IV) eller högre kon ­
centrationer med kortare varaktigheter (i figur 1: exponeringssession IV) 
med anpassade tidsperioder som inte är så vitt åtskilda. 
5. Testet (inledande koncentration och ytterligare koncentrationer) utförs med 
1 djur/kön per koncentration/tidpunkt eller med 2 djur av det mer mottag ­
liga könet per koncentration/tidpunkt. Under vissa omständigheter kan för ­
söksledaren välja att använda 2 råttor per kön per koncentration/tidpunkt (eller 4 djur av det mer mottagliga könet per koncentration/tidpunkt) (15). 
Att använda 2 djur per kön per koncentration och tidpunkt kan generellt 
minska förutfattade meningar angående uppskattningarnas variation, öka framgångsgraden och förbättra konfidensintervallets täckning i förhållande till det protokoll som beskrivs här. Mer information finns i GD 39 (2). 
6. Helst ska varje exponeringssession genomföras på en dag. Detta ger möj ­
lighet att fördröja nästa exponering tills det finns en rimlig garanti för 
överlevnad, och det gör att försöksledaren kan justera målkoncentrationen 
och tidsperioden för nästa exponeringssession. Det rekommenderas att börja varje exponeringssession med den grupp som kommer att exponeras längst, t.ex. gruppen för exponering i 240 minuter följt av den som exponeras i 
120 minuter, och så vidare. Om, till exempel, djur i 240-minutersgruppen 
dör efter 90 minuter eller uppvisar allvarliga tecken på toxicitet (t.ex. ex ­
trema förändringar i andningsmönster såsom ansträngd andning) är det inte meningsfullt att utsätta en grupp för 120 minuter eftersom dödligheten 
sannolikt skulle vara 100 %. Därför bör försöksledaren välja kortare expo ­
neringstider för den koncentrationen (t.ex. 90, 65, 45, 33 och 25 minuter).
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 232
 
7. Kammarens koncentration bör mätas ofta för att bestämma den tidsviktade 
genomsnittskoncentrationen för varje exponeringsvaraktighet. När det är 
möjligt bör tidpunkten för dödsfallet för varje djur (snarare än exponerings ­
varaktighet) användas för den statistiska analysen. 
8. Man bör se närmare på resultaten från de fyra första exponeringssessionerna 
för att identifiera luckor i koncentration-tidskurvan (se figur 1). Vid en 
otillräcklig tillpassning bör en ytterligare exponering (5:e koncentration) 
genomföras. Koncentrations- och exponeringsvaraktigheter för den 5:e ex ­
poneringen bör väljas för att täcka denna lucka. 
9. Alla exponeringssessioner (inklusive den första exponeringssessionen) an ­
vänds för att beräkna förhållandet koncentration-tid-respons med hjälp av 
statistisk analys (16). Om det är möjligt ska för varje k × t-intervall det tidsviktade medelvärdet och exponeringsvaraktigheten fram till döden an ­
vändas (om dödsfallet inträffar under exponeringen).
 
Figur 1  
Hypotetisk illustration av förhållandet koncentration-tid-mortalitet för 
råttor
  
Ofyllda symboler = överlevande; fyllda symboler = döda djur 
Trianglar = honor; cirklar = hanar 
Heldragen linje = LC  50 -värden (7,5–240 min) för hanar med n = 1 
Streckad linje = LC  50 -värden (7,5–240 min) för honor med n = 1 
Prickad linje = hypotetiska LC  50 -värdeslinjer för hanar och honor om n hade 
varit lika med 2 (12). 
Ordförklaringar 
Koncentration: Exponeringstid:
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 233
 
10. Nedan finns ett exempel på ett stegvist förfarande:  
Exponeringssession 1 – testning vid koncentrationsgräns (se figur 1)  
— 1 djur/kön per koncentration/tidpunkt, totalt (  a ) 
— Målkoncentration (  b ) = koncentrationsgräns. 
— Exponera fem grupper av djur för denna målkoncentration för respek ­
tive varaktighet 15, 30, 60, 120 och 240 minuter.  
↓ 
Exponeringssession II  ( c ) – huvudstudie  
— 1 djur/kön per koncentration/tidpunkt, totalt 10 djur. 
— Exponera fem grupper av djur vid en lägre koncentration (  d ) (1/2 l) med 
något längre exponeringsvaraktigheter (faktor √2 utspritt; se figur 1).  
↓ 
Exponeringssession III – huvudstudie  
— 1 djur/kön per koncentration/tidpunkt, totalt 10 djur. 
— Exponera fem grupper av djur vid en lägre koncentration (  d ) (1/4 l) med 
något längre exponeringsvaraktigheter (faktor √2 utspritt; se figur 1).  
↓ 
Exponeringssession IV ′ – huvudstudie  
— 1 djur/kön per koncentration/tidpunkt, totalt 10 djur. 
— Exponera fem grupper av djur vid en lägre koncentration (  d ) (1/8 l) med 
något längre exponeringsvaraktigheter (faktor √2 utspritt; se figur 1).  
↓ eller  ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 234  
( a ) Om det inte finns någon information tillgänglig om könsmottaglighet används råttor av 
båda könen, dvs. 1 djur/kön per koncentration. Baserat på befintlig information eller om 
det blir uppenbart under denna exponeringssession att ett kön är mer mottagligt, används 
10 djur av det mer mottagliga könet (2 djur per koncentration/tidpunkt) för varje kon ­
centrationsnivå under efterföljande testning.10 djur 
( b ) När förordning (EG) nr 1272/2008 används, är respektive koncentrationsgräns för gaser, 
ångor och aerosoler 20 000 ppm, 20 mg/l och 5 mg/l. Vid förväntad toxicitet, eller 
baserat på resultaten från det inledande testet, bör lägre startkoncentrationer väljas. I 
fall av regulatoriska eller vetenskapliga behov kan högre koncentrationer användas. 
( c ) Helst ska exponering av djur vid nästa koncentrationsnivå fördröjas tills det finns rimlig 
anledning att anta att de tidigare testade djuren överlever. Detta gör att försöksledaren 
kan justera målkoncentration och varaktighet för nästa exponeringssession. 
( d ) Den minsta dosering (koncentration × tid) som resulterade i mortalitet vid den inledande 
koncentrationen (första exponeringssessionen) gäller som vägledning för att fastställa 
nästa kombination av koncentration och exponeringsvaraktighet. Normalt minskas kon ­
centrationen tvåfaldigt (1/2 l) och djuren exponeras under ett nytt tidsintervall med ett 
finare rutnät av geometrisk uppdelning av exponeringsperioder med faktor 1,4 ( √2; se 
hänvisning 11) runt tiden för den minsta letala dosnivån (tid × koncentration) som 
observerades under den första exponeringen. I denna figur (figur 1), observerades mor ­
talitet först i exponeringssession I efter 15 min., varaktigheterna under session II cent ­
reras därför omkring 30 min., och är 15, 21 30, 42 och 60 min. Efter de första två 
exponeringarna rekommenderas att plotta datan i en liknande figur som visas ovan, och 
att kontrollera att förhållandet mellan koncentration och tid har en vinkel på 45 grader (n 
= 1), eller om förhållandet koncentration-tid-respons är mindre brant (t.ex. n = 2) eller 
brantare (t.ex. n = 0,8). I de senare fallen rekommenderas det att anpassa efterföljande 
koncentrationer och varaktigheter enligt detta.
 Exponeringssession IV – huvudstudie  
— 1 djur/kön per koncentration/tidpunkt, totalt 10 djur. 
— Exponera fem grupper av djur vid en högre koncentration (  e ) (2 l) med 
något kortare exponeringsvaraktigheter (faktor √2 utspritt; se figur 1).  
Matematisk behandling av resultaten för k × t-protokollet  
11. Ett k × t-förfarande med 4 eller 5 exponeringskoncentrationer och fem 
varaktigheter ger 20 respektive 25 datapunkter. Med dessa datapunkter 
kan k × t-förhållandet beräknas med hjälp av statistisk analys (16):  
Ekvation 1: 
ProbitðPÞ ¼ b 0 þ b 1 ln C þ b 2 ln t 
där C = koncentration; t = exponeringstid, eller  
Ekvation 2: 
Response ¼ ƒðC n tÞ 
där n ¼ b 1=b 2: 
Med hjälp av ekvation 1 kan LC  50 -värdet beräknas för en given tidsperiod 
(t.ex. 4 timmar, 1 timme, 30 minuter eller valfri tidsperiod inom intervallet 
för testets tidsperioder) med P = 5 (50 % respons). Observera att Habers lag endast är tillämplig när n = 1. LC
 01 kan beräknas med hjälp av P = 2,67.  ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 235  
( e ) I vissa fall kan det vara nödvändigt att öka koncentrationen (2 l) under ett nytt tids ­
intervall med ett ännu finare rutnät av geometrisk uppdelning av exponeringsperioder 
med faktor 1,4 ( √2) omkring tiden för den minsta letala koncentrationsnivån som obser ­
verades under den första exponeringen. Den minsta exponeringstiden bör helst överstiga 
5 minuter, den maximala exponeringstiden bör inte överstiga 8 timmar.
 B.3 AKUT TOXICITET (DERMALT)  
1. METOD  
1.1 INLEDNING 
Se allmän inledning till del B (A).  
1.2 DEFINITIONER 
Se allmän inledning till del B (B).  
1.3 REFERENSÄMNEN 
Inga.  
1.4 TESTMETODSPRINCIP 
Testämnet appliceras i graderade doser på huden till flera grupper av 
försöksdjur, en bestämd dos per grupp. Därefter observeras effekter 
och dödsfall. Djur som dör under försöket ska obduceras och i slutet av försöket obduceras överlevande djur. 
Det kan vara nödvändigt att på ett humant sätt avliva djur som 
uppvisar ihållande tecken på stark smärta och lidande. Undersök ­
ningar av ämnen på ett sätt som på grund av deras frätande eller 
irriterade egenskaper vållar avsevärd smärta och lidande behöver inte 
utföras.
 
1.5 KVALITETSKRITERIER 
Inga.  
1.6 METODBESKRIVNING  
1.6.1  Förberedelser  
I minst fem dagar före försöket ska djuren hållas under testbeting ­
elserna vad beträffar miljö och utfodring. Före försöket fördelas friska 
könsmogna djur slumpmässigt i behandlingsgrupper. Ungefär 24 tim ­
mar före testet ska päls avlägsnas från djurens rygg genom klippning eller rakning. Vid klippning eller rakning ska försiktighet iakttas så att 
huden inte skadas, eftersom det kan ändra dess genomtränglighet. 
Minst 10 % av kroppsytan ska göras klar för applicering av testämnet. Vid test av fasta ämnen, som får pulvriseras om det är lämpligt, ska testämnet fuktas tillräckligt med vatten eller, vid behov med lämplig 
vehikel, för att säkerställa god kontakt med huden. När vehikel används 
ska hänsyn tas till vehikelns inverkan på testämnets penetrering av huden. Flytande testämnen används vanligen outspädda.
 
1.6.2  Testbetingelser  
1.6.2.1  Försöksdjur  
Könsmogna råttor eller kaniner får användas. Andra arter kan an ­
vändas men i så fall ska detta motiveras. De vanligen nyttjade labo ­
ratoriestammarna ska användas. För både han- och honkön gäller att 
vikten hos djur som används i ett försök inte får avvika mer än ± 
20 % från en rimlig genomsnittsvikt.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 236
 
1.6.2.2  Antal och kön  
Minst 5 djur ska användas på varje dosnivå. De ska alla vara av 
samma kön. Om hondjur används får de inte ha fött ungar och får inte vara dräktiga. Om det finns information som visar att ett kön är 
väsentligt mer känsligt ska djur av detta kön användas.  
Anmärkning:  Vid användning av djur som är högre upp i närings ­
kedjan än gnagare vid tester av akut toxicitet ska man överväga 
användning av ett mindre antal djur. Doserna ska fastställas med 
omsorg och man ska anstränga sig för att inte utnyttja högre doser än moderat toxiska doser. Vid sådana undersökningar bör tillförsel av dödliga doser av testämnet undvikas.
 
1.6.2.3  Dosnivåer  
Till försöket ska användas ett tillräckligt antal dosnivåer, minst tre, 
som ska vara så valda att man får en gra-dering av de toxiska verk ­
ningarna och av dödligheten i behandlingsgrupperna. När dosnivå ­
erna bestäms ska hänsyn tas till eventuellt irriterande eller trätande 
effekter. Datauppgifterna ska vara tillräckliga för framställning av en 
dos-/responskurva och, om möjligt, för att medge en rimlig bestäm ­
ning av LD  50 . 
1.6.2.4  Gränstest  
Ett gränstest med en dosnivå av minst 2 000 mg/kg kroppsvikt kan 
utföras med en grupp av fem djur av varje kön enligt ovan beskrivna 
förfarande. Om ämnesrelaterade dödsfall inträffar bör en fullständig 
undersökning övervägas.  
1.6.2.5  Observationsperiod  
Observationstiden ska vara minst 14 dagar. Observationstiden ska 
emellertid inte vara strikt fastställd utan ska bestämmas utifrån de 
toxiska reaktionerna, tidpunkten för deras uppträdande och återhämt ­
ningsperiodens längd. Den kan följaktligen förlängas när detta anses nödvändigt. Tidpunkten vid vilken tecken på toxicitet uppträder re ­
spektive försvinner och tidpunkten för dödsfall är viktiga, särskilt om 
det finns en tendens till att sena dödsfall inträffar.
 
1.6.3  Förfarande  
Djuren ska hållas i var sin bur. Testämnet ska appliceras jämnt över 
ett område som motsvarar ungefär 10 % av den totala kroppsytan. Vid användning av kraftigt toxiska ämnen kan en mindre yta täckas, men ämnet ska appliceras på ytan i ett så tunt och jämnt lager som 
möjligt. 
Testämnen ska hållas i kontakt med huden med en porös gaskom ­
press och icke hudirriterande tejp under en 24 timmar lång expone ­
ringstid. Testytan ska vidare täckas på lämpligt sätt för att säkerställa 
att gaskompressen och testämnet hålls på plats så att djuren inte kan 
svälja testämnet. För att förhindra att djuren intar testämnet kan
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 237
 
rörelsehindrande anordningar användas, men total immobilisering re ­
kommenderas inte. 
I slutet av exponeringsperioden ska resterande testämne avlägsnas, i 
lämpliga fall med vatten eller med annan lämplig metod för rengör ­
ing av huden. Observationer ska registreras systematiskt när de görs. Varje enskilt djur ska registreras separat. Den första dagen ska täta 
observationer göras. En grundlig klinisk undersökning ska göras 
minst en gång varje arbetsdag, andra observationer ska göras dag ­
ligen och lämpliga åtgärder ska vidtas för att minimera förlust av djur som ingår i studien, t.ex. ska djur som hittas döda obduceras 
eller nedfrysas och svaga eller döende djur ska isoleras eller avlivas. 
Observation av djuren i burarna ska omfatta pälsförändringar, be ­
handlad hud, ögon och slemhinnor, respirations- och cirkulations ­
system, autonoma och centrala nervsystemet samt kroppsmotorik 
och beteendemönster. Särskilt uppmärksamhet ska ägnas åt observa ­
tion av skälvningar, kramper, salivavsöndring, diarré, letargi, sömn och koma. Tidpunkten för dödsfall ska registreras så noggrant som möjligt. Djur som dör under försöket ska obduceras och i slutet av 
försöket ska överlevande djur obduceras. Alla makroskopiska pato ­
logiska förändringar ska registreras. När det är indicerat ska vävnads ­
prov tas för histopatologisk undersökning.
 
Bedömning av toxicitet bos det motsatta könet  
Sedan en undersökning av det ena könet avslutats ska minst en 
grupp med fem djur av det motsatta könet testas för att fastställa om djur av detta kön är avsevärt mer känsliga för testämnet. I vissa 
fall kan användning av färre djur vara motiverat. Om det finns till ­
räckligt med information om att djur av det kön som har testats är avsevärt mer känsliga, behöver djur av det motsatta könet inte testas.
 
2. DATA  
Data ska ställas upp i tabellform och för varje behandlingsgrupp ska 
anges antal djur i början av försöket, tidpunkten för enskilda djurs 
dödsfall, antal djur som visar andra tecken på toxicitet, beskrivning 
av toxiska effekter och obduktionsfynd. De enskilda försöksdjurens vikt ska bestämmas och registreras omedelbart innan testämnet ap ­
pliceras, därefter varje vecka och vid dödsfall. Viktförändringar ska 
beräknas och registreras om överlevnaden överstiger en dag efter 
applicering av testämnet. Avlivning av djur på ett humant sätt till följd av ämnesrelaterat lidande och smärta ska registreras som äm ­
nesrelaterade dödsfall. LD
 50 ska bestämmas enligt en erkänd metod. 
Utvärderingen av data ska omfatta eventuellt samband mellan dju ­
rens exponering för testämnet och omfattningen och svårighetsgraden av alla abnormiteter, inklusive beteendemässiga och kliniska abnor ­
miteter, makro-skopiska lesioner, ändringar av kroppsvikt, dödlighet 
och eventuella andra toxikologiska effekter.
 
3. RAPPORTERING  
3.1 TESTRAPPORT 
Testrapporten ska om möjligt innehålla följande uppgifter:  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 238
 
— Djurart, stam, härkomst, miljöbetingelser, foder osv. 
— Testbetingelser (inklusive metod för hudrengöring och slag av 
bandage: med eller utan ocklusion). 
— Dosnivåer (med angivande av vehikel, om sådan används, och 
koncentrationer). 
— Försöksdjurens kön. — Tabelluppställning av responsdata efter kön och dosnivå (dvs. 
antal döda djur, antal djur som uppvisar tecken på toxicitet, antal 
exponerade djur). 
— Dödstidpunkt efter dosering, motivering och kriterier för human 
avlivning av djur. 
— Alla observationer. — LD
 50 -värde för det kön som har varit föremål för en fullständig 
undersökning bestämt efter 14 dagar med angivande av bestäm ­
ningsmetod. 
— 95 % tillförlitlighetsintervall för LD  50 (där detta är möjligt). 
— Dos-dödlighetskurva och lutning (om bestämningsmetoden med ­
ger detta). 
— Obduktionsfynd. — Eventuella histopatologiska fynd. — Resultat av försök med motsatt kön. — Diskussion av resultaten (med särskild uppmärksamhet på om 
human avlivning av djur under försöket kan ha inverkat på det 
beräknade LD
 50 -värdet). 
— Tolkning av resultaten.  
3.2 UTVÄRDERING OCH TOLKNING 
Se allmän inledning till del B (D).  
4. HÄNVISNINGAR  
Se allmän inledning till del B (E).  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 239
 
B.4 AKUT TOXICITET: HUDIRRITATION/HUDKORROSION  
1. METOD  
Denna testmetod motsvarar OECD TG 404 (2002).  
1.1 INLEDNING 
Vid utarbetandet av denna uppdaterade metod lades särskilt stor vikt 
vid möjligheterna till bättre testningsförfaranden, där djurskyddsfrå ­
gor beaktas så väl som möjligt. Sådana förfaranden innebär att all existerande information om testämnet utvärderas i syfte att undvika onödiga djurförsök. Metoden inbegriper en rekommendation om att 
laboratoriet, innan det beskrivna  in vivo-testet för hudkorrosion/hu ­
dirritation utförs, gör en  weight-of-the-evidence-analys  av existerande 
relevanta data. Om de data som finns att tillgå inte är tillräckliga, kan behövliga data genereras med hjälp av stegvis testning (1). Den 
rekommenderade testningsstrategin inbegriper validerade och god ­
kända  in vitro-test (se bilagan till denna metod). Dessutom rekom ­
menderas att de tre testkompresserna, där det är lämpligt, appliceras på djuret i följd, i stället för samtidigt, vid det inledande  in vivo - 
testet. 
Med hänsyn till sund vetenskaplig praxis och djurens välbefinnande 
bör in vivo -testning inte genomföras förrän alla tillgängliga data som är 
relevanta för ämnets förmåga att framkalla hudkorrosion/hudirritation 
har utvärderats genom en  weight-of-the-evidence-analys.  Sådana data 
är belägg från gjorda undersökningar på människor och/eller försöks ­
djur, belägg på korrosion/irritation i fråga om ett eller flera strukturellt besläktade ämnen eller blandningar av sådana ämnen, data som demon ­
strerar att ämnet är stark surt eller alkaliskt (2), (3) samt resultat från 
validerade och godkända  in vitro-  eller  ex vivo -test (4), (5), (5a). 
Genom analysen bör man kunna minska behovet av  in vivo-testning 
med avseende på hudkorrosion/hudirritation när det gäller ämnen för 
vilka det redan finns tillräckliga belägg från andra undersökningar av 
dessa två end points. 
En rekommenderad strategi för stegvis testning, som inbegriper va ­
liderade och godkända  in vitro-  eller  ex vivo -test med avseende på 
korrosion/irritation finns som bilaga till denna metod. Strategin ut ­
vecklades av och rekommenderades enhälligt av deltagarna i en OECD-arbetsgrupp (6). Strategin har antagits som den rekommende ­
rade testningsstrategin i Globally Harmonised System for the Clas ­
sification of Chemical Sub-stances (GHS) (7). Strategin för stegvis 
testning ingår inte i testmetod B.4, men användning av den rekom ­
menderas ändå innan man går in för  in vivo -testning. För nya ämnen 
rekommenderas den som ett stegvis testningsförfarande för genere ­
ring av vetenskapligt sunda data om ett ämnes förmåga att framkalla 
korrosion/irritation. För befintliga ämnen med otillräckliga data om hudkorrosion/hudirritation bör strategin användas för att fylla upp luckor i tillgängliga data. Om en annan testningsstrategi eller en 
annan procedur används, eller om man beslutar att inte använda ett 
stegvis testningsförfarande, bör detta motiveras. 
Om bestämningen av korrosivitet eller irritationsförmåga inte kan 
göras med hjälp av en  weight-of-the-evi dence-analys som står i över ­
ensstämmelse med strategin för stegvis testning, bör ett  in vivo -test 
övervägas (se bilagan).
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 240
 
1.2 DEFINITIONER  
Hudirritation:  Uppkomsten av reversibel skada på huden efter att 
testämnet har applicerats i upp till 4 timmar.  
Hudkorrosion (hudfrätning):  Uppkomsten av irreversibel skada på 
huden i form av synlig nekros genom epidermis och in i dermis, efter att ett testämne har applicerats i upp till fyra timmar. Frätnings ­
reaktioner karakteriseras av sår, blödning, blodiga sårskorpor och, 
vid slutet av observationsperioden på 14 dagar, avfärgning genom blekning av huden, hela områden med alopeci (håravfall) och ärr. Histopatologi bör övervägas för utvärdering av skador som inte är 
entydiga.
 
1.3 PRINCIP FÖR TESTMETODEN 
Testämnet appliceras som en engångsdos på försöksdjurets hud. Dju ­
rets obehandlade hudområden används som referens. Graden av ir ­
ritation eller korrosion granskas och poängsätts med specifierade 
intervall, och beskrivs närmare i syfte att få en fullständig utvär ­
dering av verkningarna. Testet bör pågå tillräckligt länge för att ge möjlighet att utvärdera om de observerade verkningarna är reversibla eller irreversibla. 
Djur som uppvisar ihållande tecken på allvarligt lidande eller smärta 
vid något skede av testningen bör avlivas på ett skonsamt sätt, och detta bör beaktas vid utvärderingen av ämnet. Kriterier för att fatta beslut om skonsam avlivning av döende eller svårt lidande djur finns 
i hänvisning (8).
 
1.4 BESKRIVNING AV TESTMETODEN  
1.4.1  Förberedelser för  in vivo-test  
1.4.1.1  Val av djurart  
Rekommenderat försöksdjur är albinokanin. Friska, unga vuxna ex ­
emplar bör användas. Om andra arter används bör detta motiveras.  
1.4.1.2  Förberedelse av djuren  
Cirka 24 timmar före testet bör djurens päls avlägsnas genom kort ­
klippning av flankens ryggsida. Varsamhet bör iakttas för att inte repa huden, och endast djur med frisk och intakt hud bör användas. 
Kaniner från vissa stammar har områden med speciellt tät päls, sär ­
skilt under vissa årstider. Sådana områden bör inte användas för testning.
 
1.4.1.3  Förvarings- och utfodringsbetingelser  
Djuren ska inhysas individuellt. Temperaturen i försöksdjurens ut ­
rymmen bör vara 20  o C (± 3  o C) för kaniner. Den relativa fuktighe ­
ten bör vara minst 30 % och ska helst inte överstiga 70 %, utom när rummet rengörs. Målvärdet bör dock vara 50–60 %. Belysningen bör vara artificiell med omväxlande 12 timmar ljus och 12 timmar mör ­
ker. Konventionellt laboratoriefoder kan användas för utfodringen, 
och djuren bör ha obegränsad tillgång till dricksvatten.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 241
 
1.4.2  Testförfarande  
1.4.2.1  Applicering av testämnet  
Testämnet appliceras på en liten yta (cirka 6 cm  2 ) av huden och 
täcks med en kompress som hålls på plats med ett icke-irriterande 
häftförband. Om det inte är möjligt att applicera ämnet direkt (ex ­
empelvis vätskor eller vissa pastor) bör ämnet först appliceras på kompressen, som därefter placeras på huden. Kompressen ska under exponeringsperioden hållas i lös kontakt med huden med hjälp av ett 
lämpligt halvocklusivt förband. Om testämnet appliceras på kompres ­
sen bör denna fästas vid huden på sådant sätt att det finns god kontakt och en jämn fördelning av ämnet på huden. Man bör se 
till att djuret inte når kompressen, eller kan äta eller andas in ämnet. 
Ämnen i vätskeform används i regel outspädda. Vid testning av fasta 
ämnen (som vid behov kan pulverise-ras) ska ämnet vätas med minsta möjliga mängd vatten (eller vid behov någon annan lämplig vehikel), som behövs för att säkerställa god hudkontakt. Om annan 
vehikel än vatten används bör vehikelns potentiella inverkan på den 
hudirritation som testämnet framkallar vara minimal eller noll. 
I slutet av exponeringsperioden (som i regel varar fyra timmar) ska 
överskottsämne om möjligt avlägsnas med vatten eller ett lämpligt 
lösningsmedel, utan att störa existerande respons eller skada huden.
 
1.4.2.2  Dosnivå  
En dos på 0,5 ml vätska eller 0,5 g fast ämne eller pasta appliceras 
på huden.  
1.4.2.3  Inledande test (test avseende hudirritation/hudkorrosion  in vivo  på 
ett enskilt djur)  
Det rekommenderas starkt att ett första  in vivo-test görs på ett enskilt 
djur, särskilt om det föreligger misstanke om att ämnet kan vara 
korrosivt. Detta är i enlighet med strategin för stegvis testning (se 
bilaga 1). 
Om ett ämne har bedömts vara korrosivt på grundval av en  weight- 
of-the-evidence- analys, behövs ingen ytterligare testning på djur. För 
de flesta ämnen som misstänks vara korrosiva, behövs i regel ingen 
ytterligare  in vivo-testning. I fall där det på grund av otillräckliga 
bevis är motiverat att generera ytterligare data, kan begränsade test på djur genomföras enligt följande princip: Upp till tre testkompres ­
ser appliceras sekventiellt på djuret. Den första kompressen tas bort 
efter tre minuter. Om ingen allvarlig hudreaktion kan observeras, appliceras en andra kompress, som i sin tur tas bort efter en timme. Om observationerna i detta skede tyder på att exponeringen kan 
förlängas till fyra timmar utan lidande för testdjuret, appliceras en 
tredje kompress, som tas bort efter fyra timmar. Därefter kan respon ­
sen graderas. 
Om korrositivitet kan observeras efter någon av de tre sekventiella 
exponeringarna, avslutas testet omedelbart. Om ingen korrosion ob ­
serveras efter att den sista kompressen har tagits bort, hålls djuret 
under observation i 14 dagar, utom om korrosion framkallas tidigare.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 242
 
I fall där testämnet inte förväntas framkalla korrosion men där det 
kan vara irriterande, appliceras en enstaka kompress på ett djur i fyra 
timmar.  
1.4.2.4  Bekräftande test ( in vivo -test avseende hudirritation med ytterligare 
djur)  
Om ingen korrosion observeras vid det inledande testet bör irrita ­
tionsrespons eller negativ respons bekräftas med hjälp av ytterligare två djur. En kompress appliceras på vardera djuret för en expone ­
ringsperiod på fyra timmar. Om irritation har observerats vid det 
inledande testet, kan bekräftelsetestet göras enligt det sekventiella förfarandet eller genom samtidig exponering på ytterligare två djur. Om inledande test i undantagsfall inte utförs, kan två eller tre djur 
behandlas med en enskild kompress som tas bort efter fyra timmar. 
Om två djur används, och samma respons observeras hos båda, behövs ingen ytterligare testning. I annat fall testas även det tredje 
djuret. Om den respons som observeras inte är entydig, kan det vara 
nödvändigt att klargöra responsen med hjälp av ytterligare djur.
 
1.4.2.5  Observationsperiod  
Observationsperioden bör vara tillräckligt lång för att man till fullo 
ska kunna utvärdera om de observerade verkningarna är reversibla eller inte. Försöket bör dock avslutas omedelbart, oavsett hur länge det pågått, om ett djur uppvisar tecken på svåra smärtor eller lidande. 
För utvärderingen av om verkningarna är reversibla, bör djuren ob ­
serveras i upp till 14 dagar efter att kompresserna har tagits bort. Om reversibilitet kan observeras innan 14 dagar har gått kan försöket omedelbart avslutas.
 
1.4.2.6  Kliniska observationer och gradering av hudreaktionerna  
Alla djur bör undersökas för tecken på erytem och ödem, och den 
respons som erhållits vid 60 minuter och därefter vid 24, 48 och 72 
timmar efter borttagning av kompresserna registreras. Vid inledande test på ett enskilt djur undersöks applikationsstället omedelbart efter att kompressen har tagits bort. Hudreaktionerna graderas och regi ­
streras enligt klassificeringsskalan i tabellen nedan. Om djuret har 
fått en hudskada som vid 72 timmar inte kan identifieras som irri ­
tation eller korrosion, kan observationer behövas fram till dag 14 för att avgöra om verkningarna är reversibla. Utöver observationerna av 
irritation, bör alla lokala toxiska effekter, såsom avfettning av huden 
och alla eventuella systemiska skadliga verkningar (exempelvis kli ­
niska tecken på toxicitet eller verkningar på kroppsvikten) till fullo beskrivas och registreras. I fall av tvetydig respons bör en histopa ­
tologisk undersökning övervägas i klargörande syfte. 
Graderingen av hudrespons är oundgängligen subjektiv. För att 
främja en harmonisering i fråga om graderingen av hudrespons och som stöd för testningslaboratorier och alla som är med om att utföra 
och tolka observationer, bör den personal som gör observationsarbe ­
tet få tillbörlig utbildning i det poängsättnings-system som används (se tabellen nedan). En illustrerad vägledning för gradering av hu ­
dirritation och andra hudskador kan vara till hjälp (9).
 
2. DATA  
2.1 PRESENTATION AV RESULTATEN 
Undersökningens resultat bör sammanställas i tabellform i den slut ­
liga testrapporten. Resultaten bör omfatta alla aspekter som uppräk ­
nas i avsnitt 3.1.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 243
 
2.2 UTVÄRDERING AV RESULTATEN 
Graderna av hudirritation bör bedömas med hänsyn till skadornas natur 
och allvarlighetsgrad samt till om skadorna är reversibla eller irrever ­
sibla. Individuella resultat av graderingen representerar ingen absolut 
standard för ett ämnes förmåga att framkalla irritation, eftersom även 
andra verkningar av testämnet utvärderas. De enskilda bedömningarna bör däremot ses som referensvärden, som bör utvärderas i kombination med alla andra observationer från undersökningen. 
Reversibiliteten hos hudskador bör beaktas när man utvärderar re ­
spons med avseende på irriterande egenskaper. Om verkningar av 
typen alopeci (begränsat område), hyperkeratos, hyperplasi och flag ­
ning håller i till slutet av den 14 dagar långa observationsperioden, bör testämnet betraktas som irriterande.
 
3. RAPPORTERING  
3.1 TESTRAPPORT 
Testrapporten ska innehålla nedan angivna uppgifter. 
Motivering för  in vivo -testning:  weight-of-evidence-analys  av tidigare 
existerande data, inbegripet resultat från stegvis testning enligt den 
rekommenderade strategin, enligt följande: 
— Beskrivning av relevanta data som erhållits före testningen. — Data som erhållits från de enskilda stegen enligt testningsstrategin. — Beskrivning av utförda  in vitro -test, inbegripet detaljerade upp ­
gifter om förfaranden och resultat som erhållits med test- och referensämnen. 
— Weight-of-the-evidence -analys för utförandet av  in vivo -test. 
Testämne: — Identifieringsdata (t.ex. CAS-nummer, källa, renhet, kända or ­
enheter, satsnummer), 
— Fysikalisk natur och fysikalkemiska egenskaper (till exempel pH, 
flyktighet, löslighet, stabilitet). 
— För blandningar anges sammansättning och beståndsdelarnas re ­
lativa andelar (i procent). 
Vehikel: — Identifieringsdata, koncentration (om tillämpligt), volym som har 
använts. 
— Motivering för valet av vehikel. Testdjur: — Art och stam som har använts, motivering om albinokanin inte 
har använts. 
— Antalet djur per kön. — De enskilda djurens vikt vid testets start och slut. — Djurens ålder vid testets start. — Ursprung, förvarsförhållanden, foder och dylikt.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 244
 
Testbetingelser: 
— Teknik som använts för att förbereda appliceringsstället. — Detaljerade uppgifter om de kompressmaterial som har använts 
och om förbandstekniken. 
— Detaljerade uppgifter om beredning, applicering och borttagning 
av testämnet. 
Resultat: — En tabell med graderad irritations-/korrosionsrespons för varje 
djur vid alla observationspunkter. 
— Beskrivningar av alla observerade skador. — Beskrivande redogörelse av naturen och graden av den irritation 
eller korrosion som har observe rats samt eventuella histopatolo ­
giska fynd. 
— Beskrivning av övriga skadliga lokala (till exempel avfettning av 
huden) och systemiska verkningar utöver hudirritation eller hud ­
korrosion. 
Diskussion om resultaten.
 
4. HÄNVISNINGAR  
1. Barratt, M.D., Castell, J.V., Chamberlain, M., Combes, R.D., 
Dearden, J.C., Fentem, J.H., Gerner, I., Giuliani, A., Gray 
T.J.B., Livingston, D.J., Provan, W.M., Rutten, F.A.J.J.L., Ve ­
rhaar, H.J.M., Zbinden, P. (1995), The Integrated Use of Alter ­
native Approaches for Predicting Toxic Hazard. ECVAM Workshop Report 8. ATLA 23, 410–429. 
2. Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P., Worth W.M.H. (1988), 
Classification as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations 
Containing Acidic or Alkaline Substance Without Testing on 
Animals. Toxicol.  In Vitro,  2, 19–26. 
3. Worth, A.P., Fentem, J.H., Balls, M., Botham, P.A., Curren, 
R.D., Earl, L.K., Esdaile, D.J., Liebsch, M. (1998), Evaluation of the proposed OECD Testing Strategy for skin corrosion. 
ATLA 26, 709–720. 
4. ECETOC (1990), Monograph No. 15, Skin Irritation, European 
Chemical Industry, Ecology and Toxicology Centre, Brussels. 
5. Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, 
R.D., Earl, L.K., Edsail, D.J., Holzhutter, H.G. and Liebsch, M. 
(1998), The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the Man ­
agement Team. Toxicology in Vitro 12, pp.483–524. 
5a. Testing Method B.40 Skin Corrosion. 6. OECD (1996), OECD Test Guidelines Programme: Final Report 
of the OECD Workshop on Harmonization of Validation and 
Acceptance Criteria for Alternative Toxicological Test Methods. 
Held in Solna, Sweden, 22–24 January 1996 (http:// www.oecd1.org/ehs/test/background.htm). 
7. OECD (1998), Harmonized Integrated Hazard Classification Sy ­
stem for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances, as endorsed by the 28
 th Joint Meeting of the Chem ­
icals Committee and the Working Party on Chemicals, Novem ­
ber 1998 (http://www.oecd1.org/ehs/Class/HCL6.htm).  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 245
 
8. OECD (2000), Guidance Document on the Recognition, Assess ­
ment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Ex ­
perimental Animals Used in Safety Evaluation. OECD Environ ­
mental Health and Safety Publications. Series on Testing and Assessment No. 19 (http://www.oecd1.org/ehs/test/ monos.htm). 
9. EPA (1990), Atlas of Dermal Lesions,  (20T-2004).  United Sta ­
tes Environmental Protection Agency, Office of Pesticides and 
Toxic Substances, Washington, DC, August 1990. 
(Available from OECD Secretariat upon request.)
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 246
 
Tabell 1  
GRADERING AV HUDREAKTIONER  
Rodnad och sårskorpebildning  
Ingen rodnad . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0 
Mycket svag rodnad (knappt skönjbart) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 Väldefinierad rodnad . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 Moderat till svår rodnad . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 Svår rodnad (köttrodnad) till sårskorpebildning som utgör hinder för 
gradering av rodnaden . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 
Maximum: 4
 
Ödembildning  
Inget ödem . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0 
Mycket svagt ödem (knappt skönjbart) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 Milt ödem (området är väl avgränsat genom klar svullnad) . . . . . . . . . . 2 Moderat ödem (svullnadens höjd cirka 1 mm) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 Svårt ödem (höjd över 1 mm och svullnaden sträcker sig utöver expo ­
neringsområdet) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 
Maximum: 4 
I fall av tvetydig respons kan en histopatologisk undersökning utföras i klargö ­
rande syfte.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 247
 
Bilaga  
Strategi för stegvis testning med avseende på hudirritation och hudkorrosion  
ALLMÄNT  
Även om denna strategi för stegvis testning inte ingår som en del av testmetod 
B.4, är den ett uttryck för det tillvägagångssätt som rekommenderas för bestäm ­
ning av hudirriterande eller hudkorrosiva egenskaper. Detta tillvägagångssätt 
representerar både bästa praxis och etiska riktlinjer för  in vivo -testning med 
avseende på hudirritation/hudkorrosion. Testmetoden utgör en vägledning för utförandet av  in vivo -test och en sammanfattning av de faktorer som bör beaktas 
innan ett sådant test påbörjas. Strategin utgör ett tillvägagångssätt för utvär ­
deringen av existerande data om olika testämnens egenskaper med avseende på hudirritation/hudkorrosion. Den utgör också ett stegvis förfarande för generering av relevanta data om ämnen för vilka det krävs ytterligare testning eller för 
ämnen som ännu inte har testats. Enligt strategin rekommenderas även validerade 
och godkända test  in vitro  eller  ex vivo  med avseende på hudkorrosion/hudirri ­
tation under specifika betingelser. 
Med hänsyn till sund vetenskaplig praxis och djurens välbefinnande är det viktigt 
att undvika onödig användning av djur, och att minimera all testning som san ­
nolikt framkallas allvarlig respons hos djuren. All information som är relevant för 
ämnets förmåga att framkalla hudkorrosion/hudirritation bör utvärderas innan man överväger  in vivo -testning. Det kan eventuellt redan finnas tillräckliga bevis 
för att klassificera ett testämne med avseende på dess förmåga att framkalla 
hudkorrosion eller hudirritation, utan att för den skull behöva utföra testning 
på laboratoriedjur. När man använder en  weight-of-the-evidence- analys och en 
strategi för stegvis testning minimeras behovet av  in vivo -testning, särskilt för 
ämnen som sannolikt framkallar allvarliga reaktioner. 
Det rekommenderas att en  weight-of-the-evidence- analys används för att utvär ­
dera existerande information om olika ämnens förmåga att framkalla hudirritation eller hudkorrosion för att avgöra om det behövs ytterligare testningar, andra än hudtestningar  in vivo,  som hjälp för att karakterisera en sådan egenskap. I fall där 
ytterligare undersökningar behövs, rekommenderas strategin för stegvis testning 
när det gäller att generera relevanta försöksdata. För ämnen som inte har testats tidigare bör strategin för stegvis testning användas för att generera de data som behövs för att utvärdera ämnets förmåga att framkalla hudkorrosion eller hudir ­
ritation. Den testningsstrategi som beskrivs i denna bilaga har utarbetats inom 
ramen för en OECD-arbetsgrupp (1). Strategin bekräftades och utvidgades senare i Harmonised Integrated Hazard Classification System for Human Health and 
Environmental Effects of Chemical Substances,  i den form det godkändes vid 
28
 th Joint Meeting ofthe Chemicals Committee and the Working Party on Chem ­
icals,  i november 1998 (2).  
BESKRIVNING AV UTVÄRDERINGS- OCH TESTNINGSSTRATEGIN  
Innan testning utförs som en del av strategin för stegvis testning (se schemat), 
bör all tillgänglig information utvärderas i syfte att fastställa behovet av  in vivo- 
testning. Trots att signifikant information kan fås genom utvärdering av enskilda parametrar (till exempel extrema pH-värden), bör den tillgängliga informationen utvärderas som en helhet. Alla relevanta data om det berörda ämnets (eller 
analoga ämnens) verkningar bör utvärderas genom beslut som grundas på en  
weight-of-the- evidence-analys, och en motivering för beslutet bör anges. Huvud ­
vikten bör läggas vid existerande data om ämnet (både i fråga om människor och djur). Därefter följer resultatet av testning  in vitro  eller  ex vivo. In vivo -testning 
av korrosiva ämnen bör alltid undvikas när det är möjligt. Till de faktorer som 
bör beaktas inom ramen för testningsstrategin hör följande:
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 248
 
Utvärdering av existerande data rörande människor och djur (steg 1).  Existe­
rande data rörande människor, till exempel kliniska undersökningar eller under ­
sökningar inom arbetslivet och fallstuder och/eller data om testning på djur, såsom data från toxicitetsundersökningar med enstaka eller upprepadhudexpone ­
ring, bör beaktas först, eftersom de ger tillgång till information som direkt hör 
samman med verkningarna på huden. Ämnen med kända irriterande eller korro ­
siva egenskaper, samt ämnen med klara bevis om att de inte har sådana egen ­
skaper, behöver inte testas  in vivo. 
Analys av strukturaktivitetssamband (SAR) (steg 2).  I mån av tillgänglighet bör 
resultaten från testning av strukturellt närbesläktade ämnen beaktas. Om det finns tillgång till data rörande människa och/eller djur för strukturellt närbesläktade 
ämnen eller blandningar av sådana ämnen, och dessa data är tillräckliga för att 
indikera att dessa ämnen har förmåga att framkalla hudkorrosion/hudirritation, kan man anta att det ämne som utvärderas kommer att framkalla samma respons. 
I sådana fall behöver ämnet eventuellt inte testas. Negativa data från undersök ­
ningar med strukturellt närbesläktade ämnen eller blandningar av sådana ämnen utgör inte, inom ramen för strategin för stegvis testning, tillräckliga bevis på att ett ämne inte skulle ha korrosiva eller irriterande egenskaper. Validerade och 
godkända metoder för bestämning av strukturaktivitetssamband bör användas 
för att identifiera förmågan att framkalla hudkorrosion och hudirritation.  
Fysikalkemiska egenskaper och kemisk reaktivitet (steg 3).  Ämnen med extrema 
pH-värden, till exempel ≤ 2,0 eller ≥ 11,5 kan ha kraftiga lokala verkningar. Om 
ett extremt pH-värde används som grund för att konstatera att ett ämne är korrosivt eller irriterande för huden, behöver eventuellt också ämnets syra/bas- 
reserv (buffertkapacitet) beaktas (3), (4). Om buffertkapaciteten tyder på att äm ­
net eventuellt inte är korrosivt för huden, bör ytterligare testning utföras för att bekräfta detta. Härvid bör man helst använda validerade och godkända  in vitro-  
eller ex vivo -tester (se stegen 5 och 6).  
Toxicitet för huden (steg 4).  Om ett ämne har konstaterats vara mycket toxiskt 
när det tillförs via huden, kan en  in vivo- undersökning med avseende på hudir ­
ritation/hudkorrosion eventuellt inte utföras på grund av att den normalt applice ­
rade mängden testämne skulle överskrida den mycket toxiska dosen, vilket skulle leda till att djuren dör eller utsätts för svårt lidande. Om dessutom undersök ­
ningar med avseende på toxicitet för huden har gjorts på albinokanin med doser 
upp till gränsnivån på 2 000 mg/kg kroppsvikt eller högre, och ingen hudirrita ­
tion eller hudkorrosion har observerats, behövs sannolikt ingen ytterligare test ­
ning för hudirritation eller hudkorrosion. Ett antal faktorer bör beaktas vid ut ­
värderingen av resultaten från tidigare utförda undersökningar med avseende på 
akut toxicitet för huden. Som exempel kan nämnas att den rapporterade infor ­
mationen om hudskador kan vara ofullständig. Testningen och observationerna 
kan ha gjorts på en annan art än kanin, och arterna kan vara mycket olika när det 
gäller responskänsligheten. Testämnet kan också ha applicerats på djuren i en form som inte är lämplig när det gäller bedömning av hudirritation/hudkorrosion, till exempel utspädda ämnen för testning av toxicitet för huden (5). I fall där 
välplanerade och välutförda undersökningar med avseende på toxicitet för huden 
har gjorts på kanin, kan dock negativa fynd anses vara tillräckligt bevis på att ämnet i fråga inte är korrosivt eller irriterande.  
Resultat från in vitro- eller ex vivo-test (steg  5 och 6).  Ämnen som har uppvisat 
korrosiva eller starkt irriterande egenskaper i ett validerat och godkänt test  in 
vitro eller ex vivo  (6), (7) avsett för utvärdering av dessa specifika verkningar, 
behöver inte testas på djur. Man kan anta att sådana ämnen framkallar liknande 
allvarliga verkningar  in vivo.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 249
 
In vivo-test på kanin (steg 7 och 8).  Om ett beslut grundat på en  weight-of the- 
evidence- analys fattats för  in vivo -testning, bör man börja med ett inledande test 
där ett enskilt djur används. Om resultatet av ett sådant test tyder på att ämnet framkallar korrosion på huden, bör ingen ytterligare testning utföras. Om ingen korrosion observeras vid det inledande testet bör irritationsrespons eller negativ 
respons bekräftas med hjälp av ytterligare två djur och en exponeringsperiod på 
fyra timmar. Om irritation har observerats vid det inledande testet, kan bekräf ­
telsetestet göras enligt den stegvisa principen eller genom samtidig exponering på ytterligare två djur.
 
HÄNVISNINGAR  
1. OECD (1996), ”Test Guidelines Programme: Final Report on the OECD 
Workshop on Harmonization of Validation and Acceptance Criteria for Al ­
ternative Toxicological Test Methods”, Solna, Sverige, den 22–24 januari 
1996 (http://www1.oecd.org/ehs/test/background.htm). 
2. OECD (1998), Harmonized Integrated Hazard Classification System for Hu ­
man Health and Environmental Effects of Chemical Substances, as endorsed by the 28
 th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working 
Party on Chemicals, november 1998 (http://www1.oecd.org/ehs/Class/ 
HCL6.htm). 
3. A.P. Worth, J.H. Fentem, M. Balls, P.A. Botham, R.D. Curren, L.K. Earl, J. 
Esdaile, M. Liebsch (1998), ”An Evaluation of the Proposed OECD Testing Strategy for Skin Corrosion”,  ATLA.  26, 709–720. 
4. J.R. Young, M.J. How, A.P. Walker, W.M.H.Worth (1988), ”Classification 
as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or Alka ­
line Substances, Without Testing on Animals”,  Toxic In Vitro, 2  (1) 19–26. 
5. S.M. Patil, E. Patrick, H.I. Maibach (1996), ”Animal, Human, and In Vitro 
Test Methods for Predicting Skin Irritation”, Francis N. Marzulli och Ho ­
ward I. Maibach (red.),  Dermatotoxicology,  femte utgåvan ISBN 1-56032- 
356-6, kapitel 31, 411–436. 
6. Testmetod B.40. 7. J.H. Fentem, G.E.B. Archer, M. Balls, P.A. Botham, R.D. Curren, L.K. Earl, 
D.J. Esdaile, H.G. Holzhutter och M. Liebsch (1998), ”The ECVAM inter ­
national validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and 
evaluation by the Management Team”,  Toxicology in Vitro,  12, 483–524.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 250
 
Schema  
TESTNINGS- OCH UTVÄRDERINGSSTRATEGI FÖR HUDIRRITATION/HUDKORRO ­
SION
  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 251
 
B.5 AKUT TOXICITET: ÖGONIRRITATION/ÖGONKORROSION  
1. METOD  
Denna testmetod motsvarar OECD TG 405 (2002).  
1.1 INLEDNING 
Vid utarbetandet av denna uppdaterade metod lades särskilt stor vikt 
vid möjligheterna till bättre testningsförfaranden, där djurskyddsfrå ­
gor beaktas så väl som möjligt. Sådana förfaranden innebär att all existerande information om testämnet utvärderas i syfte att undvika onödiga djurförsök. Metoden innehåller en rekommendation om att 
laboratoriet, innan det beskrivna  in vivo -testet för akut ögonkorro ­
sion/ögonirritation inleds, gör en  weight-of-the-evidence -analys av 
existerande relevanta data. Om de data som finns att tillgå inte är tillräckliga, kan behövliga data genereras med hjälp av stegvis test ­
ning (2) (3). Den rekommenderade testningsstrategin inbegriper va ­
liderade och godkända  in vitro -test (se bilagan till denna metod). 
Likaså rekommenderas, innan  in vivo -ögontest övervägs, utförandet 
av ett  in vivo -test med avseende på hudirritation/hudkorrosion i syfte 
att förutsäga eventuell ögonkorrosion. 
Med hänsyn till sund vetenskaplig praxis och djurens välbefinnande 
bör in vivo -testning inte övervägas förrän alla tillgängliga data som 
är relevanta för ämnets förmåga att framkalla ögonkorrosion/ögon ­
irritation har utvärderats genom en  weight-of-the-evidence -analys. 
Till sådana data hör bevis från gjorda undersökningar på människor 
och/eller försöksdjur, bevis på förmåga att framkalla korrosion/irrita ­
tion som finns hos ett eller flera strukturellt närbesläktade ämnen 
eller blandningar av sådana ämnen, data om att ämnet är starkt 
surt eller alkaliskt (4) (5) samt resultat från validerade och godkända  
in vitro-  eller  ex vivo -test med avseende på hudkorrosion och hudir ­
ritation (6) (6a). Sådana undersökningar kan ha gjorts före, eller 
motiverade av,  weight-of-the-evidence-analys.  
För vissa ämnen kan en sådan analys peka på att det behövs  in vivo - 
testning av ämnets förmåga att framkalla hudkorrosion/hudirritation. I alla sådana fall bör man, innan ett  in vivo -ögontest övervägs, helst 
göra ett  in vivo -test (testmetod B.4) för utvärdering av ämnets verk ­
ningar på huden (7). Med hjälp av  weight-of-the-evidence -analys och 
strategin för stegvis testning bör man kunna minska behovet av  in 
vivo-testning med avseende på ögonkorrosion/ögonirritation när det gäller ämnen för vilka det redan finns tillräckliga bevis från andra 
undersökningar. Om det inte går att fastställa ett ämnes förmåga att 
framkalla ögonkorrosion eller ögonirritation i enlighet med strategin för stegvis testning, inte ens efter det att man utfört en  in vivo-  
undersökning med avseende på hudkorrosion och hudirritation, kan 
ett in vivo -test med avseende på ögonkorrosion och ögonirritation 
genomföras.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 252
 
En rekommenderad strategi för stegvis testning, som inbegriper va ­
liderade och godkända  in vitro-  eller  ex vivo -test med avseende på 
korrosion/irritation, finns som bilaga till denna metod. Strategin ut ­
vecklades av och rekommenderades enhälligt av deltagarna i en OECD-arbetsgrupp (8). Strategin har antagits som den rekommende ­
rade testningsstrategin i  Globally Harmonised System for the Clas ­
sification of Chemical Substances  (GHS) (9). Denna strategi för 
stegvis testning ingår inte i testmetod B.4, men användning av den rekommenderas ändå innan man går in för  in vivo -testning. För nya 
ämnen rekommenderas den som en stegvis testningsmetod för gene ­
rering av vetenskapligt sunda data om ett ämnes korrosion/irritation. För befintliga ämnen med otillräckliga data om korrosion/irritation för hud och ögon bör strategin användas för att fylla upp luckor i 
tillgängliga data. Om en annan testningsstrategi eller ett annat för ­
farande används, eller om man beslutar att inte använda ett för ­
farande med stegvis testning, bör detta motiveras.
 
1.2 DEFINITIONER  
Ögonirritation : Ändringar som uppstår i ögat efter applicering av ett 
testämne på ögats främre yta och som inte är fullt reversibla inom 21 dagar från appliceringen.  
Ögonkorrosion (ögonfrätning) : Vävnadsskador som uppstår i ögat, 
eller allvarlig fysisk synnedsättning, efter applicering av ett testämne 
på ögats främre yta, och som inte är fullt reversibla inom 21 dagar 
från appliceringen.
 
1.3 PRINCIP FÖR TESTMETODEN 
Testämnet appliceras som en engångsdos i försöksdjurets ena öga. 
Det obehandlade ögat används som referens. Graden av ögonirrita ­
tion eller ögonkorrosion utvärderas genom klassificering av skadorna på konjunktiva, hornhinnan och iris med specifika intervall. Likaså bör övriga verkningar i ögat och skadliga systemiska verkningar 
beskrivas för att en fullständig utvärdering av verkningarna ska 
fås. Testet bör pågå tillräckligt länge för att ge möjlighet att utvär ­
dera om de observerade verkningarna är reversibla eller irreversibla. 
Djur som uppvisar ihållande tecken på allvarligt lidande eller smärta 
vid något skede av testningen bör avlivas på ett skonsamt sätt, och detta bör beaktas vid utvärderingen av ämnet. Kriterier för att fatta 
beslut om skonsam avlivning av döende eller allvarligt lidande djur 
finns i hänvisning (10).
 
1.4 BESKRIVNING AV TESTMETODEN  
1.4.1  Förberedelser för  in vivo -test 
1.4.1.1  Val av art  
Rekommenderat försöksdjur är albinokanin. Friska, unga vuxna ex ­
emplar bör användas. Om andra arter eller stammar används bör 
detta motiveras.  
1.4.1.2  Förberedelse av djuren  
De djur som preliminärt har valts ut för testning bör undersökas med 
avseende på båda ögonen inom 24 timmar före testets början. Djur 
som har irriterade ögon, okulära defekter eller existerande skada på 
hornhinnan bör inte användas.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 253
 
1.4.1.3  Förvarings- och utfodringsbetingelser  
Djuren ska inhysas individuellt. Temperaturen i försöksdjurens ut ­
rymmen bör vara 20  o C (±3  o C) för kaniner. Den relativa fuktigheten 
bör vara minst 30 % och ska helst inte överstiga 70 %, utom när 
rummet rengörs. Målvärdet bör dock vara 50–60 %. Belysningen bör 
vara artificiell med omväxlande 12 timmar ljus och 12 timmar mör ­
ker. Konventionellt laboratoriefoder kan användas för utfodringen, och djuren bör ha obegränsad tillgång till dricksvatten.
 
1.4.2  Testförfarande  
1.4.2.1  Applicering av testämnet  
Testämnet tillförs i ena ögats konjunktivasäck (alla djur). Före till ­
förseln bör det undre ögonlocket varsamt dras ut en bit ut från 
ögongloben. Ögonlocken förs därefter samman för cirka en sekund 
för att förhindra att ämnet kommer ut. Det andra, obehandlade ögat används som referens.
 
1.4.2.2  Sköljning  
Försöksdjurens ögon bör inte sköljas under minst 24 efter tillförseln 
av testämnet, utom när det gäller fasta ämnen (se avsnitt 1.4.2.3.2) eller om det uppstår omedelbara korrosiva eller irriterande verkning ­
ar. Efter 24 timmar kan ögonen sköljas, om detta bedöms vara 
lämpligt. 
Användningen av en satellitgrupp för att undersöka inverkan av 
sköljningen rekommenderas inte, utom om det är vetenskapligt mo ­
tiverat. Om en satellitgrupp används, ska den bestå av två kaniner. 
Sköljningsbetingelserna bör dokumenteras omsorgsfullt, till exempel sköljningstidpunkten, lösningens sammansättning och temperatur samt sköljningstiden, applicerad volym och sköljningsintensitet (vo ­
lymström).
 
1.4.2.3  Dosnivå  
1.4.2.3.1  Testning av vätskor  
Vid testning av vätskor används en dos på 0,1 ml. Pumpsprej bör 
inte användas för att tillföra ämnet direkt i ögat. I stället bör vätskan sprejas in i en behållare, som används för att tillföra 0,1 ml i ögat.
 
1.4.2.3.2  Testning av fasta ämnen  
Vid testning av fasta ämnen, pastor och ämnen i partikelform, bör 
den tillförda mängden ha en volym på 0,1 ml eller en medelvikt på högst 100 mg. Testämnet bör malas ned till fint stoft. Det fasta 
materialets volym bör mätas efter en varsam kompaktering, som 
görs till exempel genom att klappa mätbehållaren. Om ett fast tes ­
tämne inte har tagis bort ur försöksdjurets öga med hjälp av fysio ­
logiska mekanismer vid den första observationstidpunkten (en timme 
efter behandlingen), kan ögat sköljas med saltslösning eller destillerat 
vatten.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 254
 
1.4.2.3.3  Testning av aerosoler  
Det rekommenderas att material i form av pumpsprej eller aerosol 
sprejas i en behållare, som sedan används för tillförsel i ögat. Det 
enda undantaget är aerosoler i tryckbehållare som inte går att samla in på grund av förångning. I sådana fall hålls djurets öga öppet och testämnet sprutas in i ögat under cirka en sekund, på cirka 10 cm 
avstånd direkt framför ögat. Avståndet kan variera beroende på be ­
hållarens tryck och innehåll. Det är viktigt att se till att ögat inte skadas av sprejtrycket. I tillämpliga fall kan det vara nödvändigt att utvärdera om sprejstyrkan kan framkalla ’mekanisk’ skada i ögat. 
En uppskattning av dosen från en aerosol kan göras genom en si ­
mulering på följande sätt: Ämnet sprejas på ett vägningspapper ge ­
nom en öppning som har storleken av ett kaninöga och som hålls strax framför papperet. Papperets viktökning används som grund för att uppskatta den mängd som har sprejats i ögat. För flyktiga ämnen 
kan dosen uppskattas genom att väga en mottagningsbehållare före 
och efter borttagning av testämnet.
 
1.4.2.4  Inledande test ( in vivo -test avseende ögonirritation/ögonkorrosion 
på ett enskilt djur)  
I enlighet med det som anges i strategin för stegvis testning (se 
bilaga 1), rekommenderas starkt att  in vivo- testet först görs på ett 
enskilt djur. 
Om resultatet av ett sådant test tyder på att ämnet är korrosivt eller 
framkallar allvarlig irritation i ögat när man använder det beskrivna 
förfarandet, bör ingen ytterligare testning utföras.  
1.4.2.5  Lokalbedövning  
Lokalbedömning kan användas beroende på fall. Om  weight-of-the- 
evidence -analysen tyder på att ämnet kan framkalla smärta, eller om 
en inledande testning tyder på att en smärtsam reaktion kommer att 
ske, kan djuret få lokalbedövning innan testämnet tillförs. Typen, 
koncentrationen och dosen för lokalbedövningsmedlet bör väljas om ­
sorgsfullt för att säkerställa att lokalbedövningen inte påverkar den reaktion som testämnet framkallar. Lokalbedövning bör även ges i 
det andra ögat (referensögat).
 
1.4.2.6  Bekräftande test ( in vivo -test avseende ögonirritation med ytterligare 
djur)  
Om ingen korrosiv verkan observeras vid det inledande testet, bör 
responsen (irriterande eller negativ) bekräftas med hjälp av högst två ytterligare djur. Om en allvarlig irritation har observerats vid det inledande testet, vilket tyder på en eventuell stark (irreversibel) ver ­
kan vid den bekräftande testningen, rekommenderas bekräftande test 
som görs stegvis på ett djur i taget, i stället för samtidigt test på båda tilläggsdjuren. Om frätning eller kraftig irritation kan observeras på det tilläggsdjur som först används, bör testningen avbrytas. Om irri ­
tationsresponsen är mild till moderat behövs eventuellt även det 
andra tilläggsdjuret för bekräftelse.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 255
 
1.4.2.7  Observationsperiod  
Observationsperioden bör vara tillräckligt lång för att det till fullo 
ska gå att utvärdera omfattningen och reversibiliteten hos de obser ­
verade verkningarna. Försöket bör dock avslutas omedelbart, oavsett 
hur länge det pågått, om det berörda djuret uppvisar tecken på svåra 
smärtor eller lidande (9). För fastställandet av verkningarnas reversi ­
bilitet bör djuren i regel observeras i 21 dagar efter tillförsel av testämnet. Om reversibilitet kan observeras innan 21 dagar har gått 
kan försöket omedelbart avslutas.
 
1.4.2.7.1  Kliniska observationer och gradering av ögonreaktionerna  
Ögonen bör undersökas 1, 24, 48 och 72 timmar efter tillförsel av 
testämnet. Djuren bör inte utsättas för testning längre än det är nödvändigt för att få definitiv information. Djur som uppvisar all ­
varliga och ihållande tecken på smärta eller lidande bör omedelbart 
avlivas på ett skonsamt sätt, och detta bör beaktas vid utvärderingen av ämnet. Djur som fått följande ögonskador efter tillförsel av ämnet bör avlivas på ett skonsamt sätt: perforering eller signifikant ulcera ­
tion av kornea inklusive stafylom, blod i främre ögonkammaren, 
korneaopacitet av grad 4 som varar i 48 timmar; ingen ljusreaktion (irisreaktion av grad 2) som varar i 72 timmar, ulceration av kon ­
juktivamembran, nekros i konjunktiva- eller blinkhinna eller bildning 
av sårskorpa. Skälet till avlivningen är att dessa skador i regel är 
irreversibla. 
Djur som inte utvecklar okulära skador ska inte avlivas förrän det har 
gått tre dagar från tillförsel av ämnet. Djur med milda till moderata skador bör observeras tills skadorna läks, eller under 21 dagar. Efter 
det avslutas undersökningen. Observationer bör göras på dag 7, 14 
och 21 i syfte att fastställa skadornas status och huruvida de är reversibla eller inte. 
Graderna av okulär reaktion (konjunktiva, kornea och iris) bör regi ­
streras vid varje undersökning (se tabell 1). Likaså bör alla andra 
ögonskador (till exempel pannus, missfärgning) eller skadliga syste ­
miska verkningar även rapporteras. 
Som hjälpmedel vid undersökningen av reaktionerna kan användas 
en binokulärlupp, ficklampa, biomikroskop eller annan lämplig ut ­
rustning. Efter det att observationerna har registrerats vid 24 timmar 
efter tillförseln, kan ögonen undersökas ytterligare med hjälp av 
fluorescein. 
Graderingen av okulär respons är oundgängligen subjektiv. För att 
främja en tillnärmning av graderingen av okulär respons, och som stöd för testningslaboratorier och alla som är med om att utföra och 
tolka observationer, bör den personal som gör observationsarbetet få 
tillbörlig utbildning om klassificeringssystemet. Graderingen av oku ­
lär respons bör göras i blindo.
 
2. DATA  
2.2 UTVÄRDERING AV RESULTATEN 
Klassificeringen av okulär respons bör göras med hänsyn till skador ­
nas natur och allvarlighetsgrad samt deras reversibilitet eller irrever ­
sibilitet. Individuella klassificeringsresultat representerar ingen abso ­
lut standard för ett ämnes förmåga att framkalla irritation, eftersom även andra verkningar av testämnet utvärderas. Enskilda klassifice ­
ringsresultat bör i stället ses som referensvärden, och de är menings ­
fulla endast när de åtföljs av en fullständig beskrivning och utvär ­
dering av alla observationer.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 256
 
3. RAPPORTERING  
3.1 TESTRAPPORT 
Testrapporten ska innehålla nedan angivna uppgifter. 
Motivering för  in vivo -testning:  weight-of-evidence -analys av tidigare 
existerande data, inbegripet resultat från ett förfarande enligt strategin 
för stegvis testning, enligt följande: 
— Beskrivning av relevanta data som erhållits före testningen. 
— Data som erhållits vid de olika stegen enligt testningsstrategin. — Beskrivning av utförda  in vitro -test, inbegripet detaljerade upp ­
gifter om förfaranden och resultat som erhållits med test- och 
referensämnen. 
— Beskrivning av utförda  in vivo -test med avseende på hudirrita ­
tion/hudkorrosion, inbegripet de resultat som erhållits. 
— Weight-of-the-evidence -analys för utförandet av  in vivo -test. 
Testämne: — Identifieringsdata (till exempel CAS-nummer, källa, renhet, 
kända orenheter, satsnummer). 
— Fysikalisk natur och fysikalkemiska egenskaper (till exempel pH, 
flyktighet, löslighet, stabilitet, reaktivitet med vatten). 
— För blandningar anges sammansättning och beståndsdelarnas re ­
lativa andelar (i procent). 
— Om lokalbedövning används, anges identifieringsdata, renhet, 
typ, dos och potentiell växelverkan med testämnet. 
Vehikel: — Identifieringsdata, koncentration (om tillämpligt), volym som har 
använts. 
— Motivering för valet av vehikel. Testdjur: — Art och stam som har använts, motivering om albinokanin inte 
har använts. 
— Djurens ålder, enskilt för varje djur vid testets start. — Antalet djur per kön i test- och kontrollgrupperna (vid behov). — De enskilda djurens vikt vid testets start och slut. — Ursprung, förvaringsbetingelser, foder och dylikt. Resultat: 
— Beskrivning av den metod som har använts för att klassificera 
irritationen vid varje observationstidpunkt (till exempel ficklam ­
pa, biomikroskop, fluorescein),
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 257
 
— En sammanställning i tabellform av responsdata rörande irrita ­
tion/korrosion för varje djur vid varje observationstidpunkt fram 
till dess att testningen avslutas för det djurets del. 
— Narrativ beskrivning av graden och naturen hos den irritation 
eller korrosion som har observerats. 
— Beskrivning av alla andra eventuella ögonskador som har obser ­
verats (till exempel vaskularisering, pannusbildning, adhesioner, missfärgning). 
— Beskrivning av icke-okulära lokala och systemiska skadliga verk ­
ningar och, i förekommande fall, histopatologiska fynd. 
Diskussion om resultaten.
 
3.2 TOLKNING AV RESULTATEN 
En extrapolering av resultaten från undersökningar av ögonirritation 
som gjorts på försöksdjur är valid endast till en begränsad utsträck ­
ning. I många fall är albinokaniner mycket känsligare än människor i fråga om ämnen som är irriterande eller korrosiva för ögat. 
Särskild noggrannhet bör iakttas vid tolkning av resultaten i syfte att 
utesluta irritation som beror på en sekundär infektion.
 
4. HÄNVISNINGAR  
1. Barratt, M.D., Castell, J.V., Chamberlain, M., Combes, R.D., 
Dearden, J.C., Fentem, J.H., Gerner, I., Giuliani, A., Gray, T.J.B., Livingston, D.J., Provan, W.M., Rutten, F.A.J.J.L., Ve ­
rhaar, H.J.M., Zbinden, P. (1995), The Integrated Use of Alter ­
native Approaches for Predicting Toxic Hazard. ECVAM Workshop Report 8. ATLA 23, 410–429. 
2. de Silva, O., Cottin, M., Dami, N., Roguet, R., Catroux, P., 
Toufic, A., Sicard, C., Dossou, K.G., Gerner, I., Schlede, E., Spielmann, H., Gupta, K.C., Hill, R.N. (1997), Evaluation of 
Eye Irritation Potential: Statistical Analysis and Tier Testing 
Strategies. Food Chem. Toxicol 35, 159–164. 
3. Worth, A.P. och Fentem, J.H. (1999), A general approach for 
evaluating stepwise testing strategies ATLA 27, 161–177. 
4. Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P., Worth, W.M.H. (1988), 
Classification as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or Alkaline Substances Without Testing on 
Animals. Toxicol.  In Vitro,  2, 19–26. 
5. Neun, D.J. (1993), Effects of Alkalinity on the Eye Irritation 
Potential of Solutions Prepared at a Single pH. J. Toxicol. Cut. 
Ocular Toxicol. 12, 227–231. 
6. Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, 
R.D., Earl, L.K., Esdaile, D.J., Holzhutter, H.G. och Liebsch, M. (1998), The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the 
Management Team. Toxicology in Vitro 12, s. 483–524. 
(6a) Testmetod B.40 Hudkorrosion. 
(7) Testmetod B.4. Akut toxicitet: hudirriation/hudkorrosion. (8) OECD (1996), OECD Test Guidelines Programme: Final Report 
of the OECD Workshop on Harmonization of Validation and Acceptance Criteria for Alternative Toxicological Test Methods, 
Solna, Sverige, den 22–24 januari 1996 (http://www.oecd.org/ 
ehs/test/background.htm).
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 258
 
(9) OECD (1998), Harmonized Integrated Hazard Classification Sy ­
stem for Human Health and Environmental Effects of Chemical 
Substances, as endorsed by the 28  th Joint Meeting of the Chem ­
icals Committee and the Working Party on Chemicals, novem ­
ber 1998 (http://www.oecd.org/ehs/Class/HCL6.htm). 
(10) OECD (2000), Guidance Document on the Recognition, Assess ­
ment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Ex ­
perimental Animals Used in Safety Evaluation, OECD Environ ­
mental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment, No. 19 (http://www.oecd.org/ehs/test/monos.htm).
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 259
 
Tabell 1  
GRADERING AV OKULÄRA SKADOR  
Hornhinna (kornea)  
Opacitet: graden av densitet (avläsningarna bör göras på området med den högsta 
densiteten) (*) 
Ingen ulceration eller opacitet . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0 
Spridda eller diffusa områden med opacitet (annan än svag avmattning 
av den normala lystern), iris alla detaljer är klart synliga . . . . . . . . . . . . 1 
Enkelt skönjbart translucent område, detaljerna i iris är lätt förmörkade 2 Pärlemorliknande område, inga detaljer i iris synliga, pupillens storlek 
kan knappt skönjas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 
Opak hornhinna, iris kan inte skönjas genom opaciteten . . . . . . . . . . . . . 4 
Maximum: 4 
ANMÄRKNINGAR 
NOTER 
(*) Området för hornhinneopacitet bör noteras
 
Iris 
Normal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0 
Märkbart fördjupade rugae, blodstockning, svullnad, moderate hyperemi 
kring kornea eller injektion; iris reagerar för ljus (en långsam reaktion bedöms som en verkning) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 
Blödning, kraftig destruktion eller ingen reaktion för ljus . . . . . . . . . . . . 2 
Maximum: 2
 
Konjunktiva  
Rodnad (hänför sig till palpebral och bulbär konjunktiva, exklusive hornhinnan 
och iris) 
Normal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0 
Vissa blodkärl är hyperemiska (injekterade) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 Diffus, blodröd färg; individuella blodkärl kan inte skönjas med lätthet 2 Diffust köttröd . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 
Maximum: 3
 
Chemos  
Svullnad (hänför sig till ögonlocken och/eller blinkhinnor) 
Normalt . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  . 0 
En viss svullnad över det normala . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 Klar svullnad, delvis eversion av ögonlocken . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 Svullnad, ögonlocken ungefär halvstängda . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 Svullnad, ögonlocken mer än halvstängda . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 
Maximum: 4
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 260
 
Bilaga  
Strategi för stegvis testning med avseende på ögonirritation och 
ögonkorrosion  
ALLMÄNT  
För en sund vetenskaplig praxis och för djurens välbefinnande är det viktigt att 
undvika onödig användning av djur, och minimera all testning som sannolikt 
framkallar allvarlig respons hos djuren. All information som är relevant för ett ämnes förmåga att framkalla ögonkorrosion/ögonirritation bör utvärderas innan  in 
vivo-testning övervägs. Det finns eventuellt redan tillräckliga bevis för att klas ­
sificera ett testämne med avseende på dess förmåga att framkalla ögonkorrossion 
eller ögonirritation, utan behov av testning på laboratoriedjur. Man kan därför, genom att använda en  weight-of-the-evidence -analys och följa strategin för steg ­
vis testning, minimera behovet av  in vivo -testning, särskilt i fråga om ämnen som 
sannolikt framkallar allvarliga reaktioner. 
Det rekommenderas att en  weight-of-the-evidence -analys används för att utvär ­
dera existerande information om olika ämnens förmåga att framkalla ögonirrita ­
tion eller ögonkorrosion. Därefter kan man avgöra om det behövs ytterligare undersökningar, andra än  in vivo -test, som hjälp för att karakterisera sådan egen ­
skap. I fall där ytterligare undersökningar behövs, rekommenderas ett förfarande 
enligt strategin för stegvis testning för att få fram relevanta försöksdata. För ämnen som inte har testats tidigare bör strategin för stegvis testning följas för att få fram de data som behövs för att utvärdera ämnets förmåga att framkalla 
ögonkorrosion eller ögonirritation. Testningsstrategin som beskrivs i denna bilaga 
har utarbetats inom ramen för en OECD-arbetsgrupp (1). Strategin bekräftades och utvidgades senare i  Harmonised Integrated Hazard Clas-sification System for 
Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances , i den form 
systemet godkändes av vid det 28:e gemensamma mötet för kemikaliekommittén 
och kemikaliearbetsgruppen ( Chemicals Committee  och Working Party on Chem ­
icals ), i november 1998 (2). 
Även om denna strategi för stegvis testning inte ingår som en del av testmetod 
B.5, är den ett uttryck för de rekommenderade principerna för bestämning av ett 
ämnes förmåga att framkalla ögonirritation eller ögonkorrosion. Dessa principer representerar både bästa praxis och etiska riktlinjer för  in vivo -testning med 
avseende på ögonirritation/ögonkorrosion. Testmetoden är en vägledning för ut ­
förandet av test  in vivo , och utgör en sammanfattning av de faktorer som bör 
beaktas innan ett sådant test övervägs. Inom ramen för strategin för stegvis testning används  weight-of-the-evidence -analyser för utvärderingen av existerande 
data om olika testämnens egenskaper med avseende på ögonirritation/ögonkorro ­
sion. Samtidigt fås tillgång till en stegvis metod för generering av relevanta data 
om ämnen för vilka det krävs ytterligare testning eller för ämnen som ännu inte har testats. Enligt strategin utför man först validerade och godkända  in vitro-  eller  
ex vivo -tester, och därefter görs testning enligt testmetod B.4 (hudirritation/hud ­
korrosion) under specifika omständigheter (3) (4).
 
BESKRIVNING AV DEN STEGVISA TESTNINGSSTRATEGIN  
Innan testning utförs som en del av förfarandet enligt strategin för stegvis test ­
ning (se figuren), bör all tillgänglig information utvärderas i syfte att fastställa 
behovet av  in vivo -test på ögonen. Trots att signifikant information kan fås 
genom utvärdering av enskilda parametrar (till exempel extrema pH-värden), bör den tillgängliga informationen utvärderas som en helhet. Alla relevanta data om det berörda ämnets verkningar och strukturellt närbesläktade ämnen 
bör utvärderas när man fattar ett beslut grundat på en  weight-of-the-evidence - 
analys, och en motivering för beslutet bör anges. Huvudvikten bör läggas vid existerande data om ämnet (både i fråga om människor och djur). Därefter följer resultatet av testning  in vitro  eller  ex vivo . Testning  in vivo  av korrosiva ämnen 
bör undvikas alltid när det är möjligt. Till de faktorer som bör beaktas inom 
ramen för testningsstrategin hör följande:
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 261
 
Utvärdering av existerande data rörande människor och djur (steg 1).  Existe­
rande data rörande människor, till exempel kliniska undersökningar eller under ­
sökningar inom arbetslivet och fallstudier och/eller data från undersökningar med avseende på ögon bör beaktas först, eftersom de ger tillgång till information som direkt hör samman med verkningarna på ögonen. Därefter bör tillgängliga data 
från human- och/eller djurstudier rörande hudkorrosion/hudirritation utvärderas. 
Ämnen som veterligen har förmåga att framkalla korrosion eller allvarlig irrita ­
tion i ögat bör inte tillföras i djurögon. Samma gäller för ämnen som har kor ­
rosiva eller irriterande egenskaper för huden, eftersom sådana ämnen kan anses 
vara korrosiva och/eller irriterande även för ögonen. Om resultaten från tidigare 
utförda okulära undersökningar visar att ett ämne inte är korrosivt eller irriteran ­
de, bör det inte heller testas på ögonen  in vivo . 
Analys av strukturaktivitetssamband (SAR) (steg 2).  I mån av tillgänglighet bör 
resultaten från testning av strukturellt närbesläktade ämnen beaktas. Om det finns tillgång till data rörande människa och/eller djur för strukturellt närbesläktade 
ämnen eller blandningar av sådana ämnen, och dessa data är tillräckliga för att 
indikera att dessa ämnen har förmåga att framkalla ögonkorrosion/ögonirritation, kan man anta att testämnet kommer att framkalla samma respons. I sådana fall behöver ämnet eventuellt inte testas. Negativa data från undersökningar med 
strukturellt närbesläktade ämnen eller blandningar av sådana ämnen utgör inte, 
inom ramen för strategin för stegvis testning, tillräckliga bevis på att ett ämne skulle sakna korrosiva eller irriterande egenskaper. Validerade och godkända 
metoder som bygger på strukturellt aktivitetssamband bör användas för att iden ­
tifiera förmågan att framkalla korrosion och irritation på huden och ögonen.  
Fysikalkemiska egenskaper och kemisk reaktivitet (steg 3).  Ämnen med extrema 
pH-värden, till exempel ≤2,0 eller ≥11,5 kan ha kraftiga lokala verkningar. Om 
ett extremt pH-värde används som grund för att konstatera att ett ämne är korrosivt eller irriterande för ögonen, behöver eventuellt också ämnets syra/ 
bas-reserv (buffertkapacitet) beaktas (5) (6). Om buffertkapaciteten tyder på att 
ämnet eventuellt inte är korrosivt för ögonen, bör ytterligare testning utföras för att bekräfta detta. Härvid bör man helst använda validerade och godkända  in 
vitro-  eller  ex vivo -tester (se steg 5 och 6).  
Beaktande av annan existerande information (steg 4).  På detta steg bör man 
beakta all tillgänglig information om systemisk toxicitet när ett ämne tillförs 
via huden. Även testämnets akuta toxicitet för huden bör beaktas. Om testämnet har konstaterats vara mycket toxiskt när det tillförs via huden, behöver det eventuellt inte testas på ögonen. Även om det inte nödvändigt finns ett förhål ­
lande mellan akut toxicitet för huden och förmåga att framkalla ögonirritation/ 
ögonkorrosion, kan man anta att ett ämne som har hög toxicitet vid tillförsel via huden, även har hög toxicitet när ämnet tillförs i ögonen. Sådana data kan även beaktas mellan steg 2 och steg 3.  
Resultat från  in vitro - eller  ex vivo -test (steg  5 och 6).  Ämnen som har visat sig 
framkalla korrosion eller allvarlig irritation i ett  in vitro-  eller  ex vivo -test (7) (8) 
som har validerats och godkänts specifikt för utvärdering av korrosion eller irritation på huden eller ögonen, behöver inte testas på djur. Man kan anta att sådana ämnen framkallar liknande allvarliga verkningar  in vivo . Om det inte finns 
tillgång till resultat från validerade och godkända  in vitro-  eller  ex vivo -test, ska 
man hoppa över stegen 5 och 6 och fortsätta förfarandet direkt från steg 7.  
Utvärdering  in vivo  av ämnets irriterande eller korrosiva egenskaper för huden 
(steg 7).  Om det på grundval av data från de undersökningar som uppräknas ovan 
inte finns tillräckliga bevis för en avgörande  weight-of-the-evidence -analys av ett 
ämnes förmåga att framkalla ögonirritation/ögonkorrosion, bör förmågan att fram ­
kalla hudirritation/hudkorrosion  in vivo  utvärderas först, med användning av 
testmetod B.4 (4) och dess bilaga (9). Om ämnet veterligen framkallar korrosion eller allvarlig hudirritation, bör det betraktas som ett korrosivt ögonirriterande ämne, utom om det finns någon annan information som stöd för en alternativ 
slutsats. Då behöver ögontestning  in vivo  inte utföras. Om ämnet inte är korrosivt 
eller allvarligt irriterande för huden, bör ögontest  in vivo  utföras.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 262
 
In vivo -test på kanin (steg 8 och 9):  In vivo -ögontest ska börja med ett inledande 
test på ett enskilt djur. Om resultatet av ett sådant test tyder på att ämnet fram ­
kallar korrosion eller allvarlig irritation i ögat, bör ingen ytterligare testning utföras. Om testresultatet tyder på att ämnet inte framkallar korrosion eller all ­
varlig irritation, utförs ett bekräftande test med ytterligare två djur.
 
HÄNVISNINGAR  
1. OECD (1996), OECD Test Guidelines Programme: Final Report of the 
OECD Workshop on Harmonization of Validation and Acceptance Criteria for Alternative Toxicological Test Methods, Solna, Sverige, den 
22–24 januari 1996 (http://www1.oecd.org/ehs/test/background.htm). 
2. OECD (1998), Harmonized Integrated Hazard Classification System for Hu ­
man Health and Environmental Effects of Chemical Substances, as endorsed by the 28
 th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working 
Party on Chemicals, november 1998 (http://www1.oecd.org/ehs/Class/ 
HCL6.htm). 
3. A.P. Worth och J.H. Fentem (1999), A General Approach for Evaluating 
Stepwise Testing Strategies, ATLA, 27, 161–177. 
4. Testmetod B.4. Akut toxicitet: Hudirritation/hudkorrosion. 5. Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P., Worth W.M.H. (1988), Classification 
as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or Alka ­
line Substances Without Testing on Animals. Toxicol.  In Vitro,  2, 19–26. 
6. Neun, D.J. (1993), Effects of Alkalinity on the Eye Irritation Potential 
of Solutions Prepared at a Single pH. J. Toxicol. Cut. Ocular Toxicol. 12, 227–231. 
7. Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., 
Earl, L.K., Esdaile, D.J., Holzhutter, H.G. och Liebsch, M. (1998), The 
ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the Management Team. Toxicology in Vitro 12, s. 483–524. 
8. Testmetod B.40 Hudkorrosion. 
9. Bilaga till testmetod B.4: En strategi för stegvis testning med avseende på 
hudirritation och hudkorrosion.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 263
 
Schema  
TESTNINGS- OCH UTVÄRDERINGSSTRATEGI FÖR ÖGONIRRITATION/ÖGONKOR ­
ROSION
  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 264
 
▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 265
 
B.6 HUDSENSIBILISERING  
1. METOD  
1.1 INLEDNING  
Kommentarer:  
Testers noggrannhet och förmåga att spåra sådana ämnen som kan 
orsaka hudallergi hos människan anses betydelsefulla i ett klassifi ­
ceringssystem för toxicitet som avser folkhälsan. 
Det finns ingen enstaka testmetod som på ett lämpligt sätt kan iden ­
tifiera samtliga de ämnen som kan vara sensibiliserande och som är relevant för alla ämnen. 
Faktorer som ett ämnes fysikaliska egenskaper, inbegripet dess för ­
måga att penetrera huden, ska beaktas vid valet av test. 
Två typer av test på marsvin har utvecklats: Ett test av adjuvanstyp i 
vilket man åstadkommer ett allergiskt tillstånd genom att upplösa 
eller suspendera (blanda) testsubstansen i Freunds Complete Adju ­
vant (FCA), och test av icke-adjuvanstyp. 
Adjuvanstester är sannolikt mer precisa vad gäller att förutsäga äm ­
nets eventuella kapacitet att orsaka hudsensibilisering hos människan än metoder där inte Freunds Complete Adjuvant används och de är därför att föredra. 
Maximeringstest på marsvin (GPMT) används ofta som adjuvanstest. 
Trots att flera andra metoder kan användas för att upptäcka ett ämnes potentiella förmåga att orsaka hudsensibilisering anses maximerings ­
försöket på marsvin vara den bästa metoden. 
Icke-adjuvanstester (av vilka Buehler-testet föredras) med många 
kemiska klasser anses mindre känsliga. 
I vissa fall anses det finnas goda skäl att välja Buehler-testet, som 
innebär lokal applicering i stället för den intradermala injektion som 
används i GPMT. Då Buehler-testet används ska detta vara veten ­
skapligt välmotiverat. 
Här beskrivs GPMT och Buehler-testet. Andra metoder får användas, 
förutsatt att de är väldokumenterade och vetenskapligt motiverade. 
Om en erkänd kontrollundersökning ger positiva resultat, kan tes ­
tämnet betecknas som potentiellt sensibiliserande, och det behöver 
inte vara nödvändigt att genomföra ytterligare test på marsvin. Om en sådan kontrollundersökning dock ger negativt resultat ska ett test på marsvin genomföras enligt det förfarande som beskrivs i denna 
testmetod. 
Se även Allmän inledning, del B.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 266
 
1.2 DEFINITIONER  
Hudsensibilisering  (allergisk kontaktdermatit): En immunologiskt 
utlöst kutan reaktion på ett ämne. Hos människan kan reaktionerna kännetecknas av klåda, hudrodnad, ödem, blemmor och blåsor eller 
en kombination av dessa. Andra arter kan reagera annorlunda så att 
endast hudrodnad och ödem observeras.  
Induktionsexponering : En försöksexponering av ett försöksobjekt 
för en testsubstans i syfte att inducera hypersensibilitet.  
Induktionsperiod : En period på minst en vecka som följer efter 
induktionsexponering då hypersensibilitet kan utvecklas.  
Provokationsexponering : En försöksexponering av ett tidigare be ­
handlat objekt för att testa ämnet efter en induktionsperiod i syfte att 
bestämma om objektet reagerar med hypersensibilitet.
 
1.3 REFERENSÄMNEN 
Den tillämpade försöksmetodens noggrannhet och tillförlitlighet bör 
utvärderas var sjätte månad genom användning av ämnen som är kända för att ha milda till moderata hudsensibiliseringsegenskaper. 
I ett korrekt utfört test bör en reaktion på minst 30 % i adjuvanstest 
och minst 15 % i icke-adjuvanstest förväntas för milda/moderata 
sensibiliserande ämnen. 
Följande ämnen är att föredra:
 
CAS-nummer EINECS-nummer EINECS-namn Vanliga namn  
101-86-0 202-983-3 α-hexylcinnamaldehyd α-hexylcinnamaldehyd 
149-30-4 205-736-8 benzotiasol-2-tiol (merkapto 
benzotiasol) kaptax 
94-09-7 202-303-5 benzokain norkain 
Då det är motiverat på grund av vissa omständigheter får andra 
kontrollämnen som uppfyller ovan angivna kriterier användas.  
1.4 PRINCIP FÖR TESTMETODEN 
Försöksdjuren exponeras inledningsvis för testsubstansen genom in ­
tradermala injektioner och/eller epidermal applicering (induktions ­
exponering). Efter en paus på 10–14 dagar (induktionsperiod) under 
vilken en immunreaktion kan utvecklas exponeras djuren för en pro ­
vokationsdos. Omfattningen och graden av hudens reaktion på pro ­
vokationsexponeringen hos försöksdjuren jämförs med den som upp ­
träder hos kontrollgruppens djur som under induktionsexponeringen 
får skenbehandling och därefter utsätts för provokationsexponering.  
1.5 BESKRIVNING AV TESTMETODERNA 
Om det anses nödvändigt att avlägsna testsubstansen görs det med 
vatten eller en lämplig lösning utan att befintlig reaktion eller hudens 
tillstånd ändras.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 267
 
1.5.1  Maximeringstest på marsvin (GPMT)  
1.5.1.1 F ö r b e r e d e l s e r 
Friska unga vuxna albinomarsvin acklimatiseras till laboratoriemiljö 
under minst fem dagar före försöket. Före försöket väljs djuren ut 
slumpvis och fördelas i behandlingsgrupper. Pälsen avlägsnas genom 
klippning, rakning eller eventuellt kemiskt, beroende på vilken test ­
metod som används. Försiktighet ska iakttas för att inte skada huden. Djuren vägs innan försöket påbörjas och då det avslutas.
 
1.5.1.2 F ö r s ö k s f ö r h å l l a n d e n  
1.5.1.2.1 Försöksdjur 
Vanliga stammar av albinomarsvin används.  
1.5.1.2.2 Antal och kön 
Hannar och/eller honor kan användas. Om honor används ska de inte 
ha fått ungar och inte vara dräktiga. 
Minst 10 djur används i behandlingsgruppen och minst 5 djur i 
kontrollgruppen. Om färre än 20 testdjur och 10 kontrolldjur har använts och det inte är möjligt att konstatera att testsubstansen är 
hudsensibiliserande, rekommenderas starkt tester med ytterligare djur 
upp till totalt 20 testdjur och 10 kontrolldjur.
 
1.5.1.2.3 Dosnivåer 
Den testsubstanskoncentration som används vid varje induktions ­
exponering ska tolereras väl av hela organismen och vara den högsta 
nivå som orsakar mild till måttlig hudirritation. Den koncentration som används vid provokationsexponering ska vara den högsta icke-irriterande dosen. Om nödvändigt, kan de lämpliga koncent ­
rationerna fastställas med hjälp av en pilotundersökning med två eller 
tre djur. För detta ändamål bör användningen av FCA-behandlade djur beaktas.
 
1.5.1.3 F ö r f a r a n d e  
1.5.1.3.1 Induktion 
Dag 0-behandlingsgrupp 
Tre par intradermala injektioner på 0,1 ml ges i skuldertrakten, där 
pälsen avlägsnats, så att varje par injektioner görs på var sida om mittlinjen. 
Injektion l: en 1:1-blandning (viktprocent) FCA/vatten eller fysiolo ­
gisk saltlösning. 
Injektion 2: Testsubstansen i lämplig vehikel i vald koncentration. 
Injektion 3: Testsubstansen i vald koncentration i en 1:1-blandning 
(viktprocent) FCA/vatten eller fysiologisk saltlösning. 
I injektion 3 löses de vattenlösliga ämnena i vattenfasen innan de 
blandas med FCA. Fettlösliga eller olösliga ämnen suspenderas 
(blandas) i FCA innan de blandas med vattenfasen. Testsubstansens 
slutliga koncentration ska vara densamma som den i injektion 2.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 268
 
Injektionerna 1 och 2 ges med ett kort intervall och närmast huvudet 
medan injektion 3 ges i testområdets nedersta del. 
Dag 0-kontrollgrupp 
Tre par intradermala injektioner på 0,1 ml ges i samma område som 
på djuren i behandlingsgruppen. 
Injektion l: en 1:1-blandning (viktprocent) FCA/vatten eller fysiolo ­
gisk saltlösning. 
Injektion 2: Outspädd vehikel. 
Injektion 3: En 50 % blandning av vehikeln i en 1:1-blandning 
(viktprocent) FCA/vatten eller fysiologisk saltlösning. 
Dag 5–7-behandlings- och kontrollgrupp 
Om ämnet inte är hudirriterande behandlas testområdet, efter 
klippning eller rakning, ungefär 24 timmar före lokal applicering 
med 0,5 ml 10 % natriumlaurylsulfat i vaselin i syfte att orsaka lokal irritation. 
Dag 6–8-behandlingsgrupp 
Pälsen avlägsnas på nytt från testområdet. Testsubstansen i lämplig 
vehikel fördelas på ett filterpapper (2 × 4 cm), appliceras på tes ­
tområdet och hålls i kontakt med huden genom täckande förband 
under 48 timmar. Valet av vehikel ska vara välmotiverat. Fasta ämnen pulveriseras och införlivas i en lämplig vehikel. Vätskor kan om det är lämpligt appliceras outspädda. 
Dag 6–8-kontrollgrupp Pälsen avlägsnas på nytt från testområdet. Vehikeln appliceras på 
liknande sätt på testområdet och hålls i kontakt med huden genom täckande förband under 48 timmar.
 
1.5.1.3.2 Provokation 
Dag 20–22-behandlings- och kontrollgrupp 
Pälsen avlägsnas frän behandlings- och kontrolldjurens flanker. En 
kompress eller kammare innehållande testsubstansen appliceras på djurens ena flank och, om relevant, en kompress eller kammare innehållande enbart vehikel på den andra flanken. Kompresserna 
hålls i kontakt med huden genom täckande förband under 24 timmar.
 
1.5.1.3.3 Observation och gradering: Behandlings- och kontrollgrupp 
— Cirka 21 timmar efter det att kompressen avlägsnats rengörs det 
provocerade området och klipps eller rakas och vid behov avlägs ­
nas pälsen med hårborttagningsmedel. 
— Cirka tre timmar senare (ungefär 48 timmar från det att provoka ­
tionsexponeringen påbörjats) observeras hudreaktionen och note ­
ras i enlighet med graderingen i tillägget. 
— Cirka 24 timmar efter föregående observation görs en andra ob ­
servation (72 timmar) och resultaten noteras. 
Blindläsning av test- och kontrolldjur rekommenderas. 
Om det är nödvändigt för att klargöra resultaten från den första 
provokationen bör en andra provokation (dvs. en omprovokation) övervägas en vecka efter den första, i tillämpliga fall med en ny 
kontrollgrupp. En omprovokation får också göras på den ursprung ­
liga kontrollgruppen.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 269
 
Alla hudreaktioner och ovanliga resultat, inbegripet systematiska re ­
aktioner, som orsakas av induktions- och provokationsförfarandena 
bör observeras och noteras i enlighet med graderingsskalan enligt Magnusson/Kligman (se tillägget), övriga förfaranden t.ex. histopa ­
tologisk undersökning eller mätning av hudvecks tjocklek, bör utfö ­
ras för att klargöra tveksamma reaktioner.
 
1.5.2  Buehler-test  
1.5.2.1 F ö r b e r e d e l s e r 
Friska unga vuxna albinomarsvins acklimatiseras till laboratoriemil ­
jön under minst fem dagar före försöket. Före försöket väljs djuren ut slumpvis och fördelas i behandlingsgrupper. Pälsen avlägsnas genom klippning, rakning eller eventuellt kemiskt, beroende på 
den testmetod som används. Försiktighet ska iakttas för att inte skada 
huden. Djuren vägs innan försöket påbörjas och då det avslutas.
 
1.5.2.2 F ö r s ö k s f ö r h å l l a n d e n  
1.5.2.2.1 Försöksdjur 
Vanliga laboratoriestammar av albinomarsvin används.  
1.5.2.2.2 Antal och kön 
Hannar och/eller honor kan användas. Om honor används ska de inte 
ha fått ungar och inte vara dräktiga. 
Minst 20 djur används i behandlingsgruppen och minst 10 djur i 
kontrollgruppen.  
1.5.2.2.3 Dosnivåer 
Testsubstansens koncentration anpassas till den högsta nivå som 
djuren har tolererat väl i varje induktionsstadium och ska vara den högsta nivå som orsakar mild till uthärdlig hudirritation. Den kon ­
centration som används vid provokationsexponering ska vara den 
högsta icke-irriterade dosen. Om nödvändigt, kan de lämpliga kon ­
centrationerna fastställas med hjälp av en pilotundersökning med två eller tre djur. 
I fråga om vattenlösliga testmaterial är det lämpligt att använda 
vatten eller en icke-irriterande lösning av anjon-ytaktiva ämnen 
som vehikel. I fråga om övriga testmaterial är 80 % etanol/vatten att föredra för induktion och aceton för provokation.
 
1.5.2.3 F ö r f a r a n d e  
1.5.2.3.1 Induktion 
Dag 0-behandlingsgrupp 
Pälsen avlägsnas från ena flanken (klipps). Testkompressystemet dränks in med testsubstansen i lämplig vehikel 
(valet av vehikel ska vara välmotiverat; om lämpligt får testsubstan ­
ser i vätskeform appliceras outspädda). Testkompressystemet appli ­
ceras på testområdet och hålls i kontakt med huden med ocklusiv ­
kompress eller -kammare och lämpligt förband under sex timmar.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 270
 
Testkompressystemet ska vara ocklusivt. En bomullskompress är 
lämplig och kan vara fyrkantig eller rund och cirka 4–6 cm  2 . Fast­
hållning medelst lämpligt förband är lämpligt för att säkerställa oc ­
klusion. Om omslag används kan ytterligare exponering krävas. 
Dag 0-kontrollgrupp Pälsen avlägsnas från ena flanken (klipps). Endast vehikeln applice ­
ras på liknande sätt som för behandlingsgruppen. Testkompressyste ­
met hålls i kontakt med huden genom ocklusivkompress eller -kam ­
mare och lämpligt förband under sex timmar. Om det kan visas att 
en simulerad kontrollgrupp inte krävs kan en oexponerad kontroll ­
grupp användas. 
Dag 6–8- och 13–15-behandlings- och kontrollgrupp Samma applicering som dag 0 utförs på samma testområde (vid 
behov efter avlägsnande av päls) på samma flank dag 6–8 och åter 
dag 13–15.
 
1.5.2.3.2 Provokation 
Dag 27–29- behandlings- och kontrollgrupp 
Pälsen avlägsnas från den obehandlade flanken på behandlings- och 
kontrolldjuren (klippning). En ocklusivkompress eller -kammare in ­
nehållande lämplig mängd testsubstans appliceras vid maximal icke- 
irriterande koncentration, på den bakre obehandlade flanken på be ­
handlings- och kontrolldjuren. 
I relevanta fall appliceras också en ocklusivkompress eller -kammare 
på den främre obehandlade flanken på både behandlings- och kon ­
trolldjur. Kompresserna eller kamrarna hålls i kontakt med huden 
genom lämpligt förband under sex timmar.  
1.5.2.3.3 Observation och gradering 
— Cirka 21 timmar efter det att kompressen tagits bort avlägsnas 
pälsen från provokationsområdet. 
— Cirka tre timmar senare (ungefär 30 timmar efter det att provoka ­
tionskompressen applicerades) observeras hudreaktionerna och 
noteras i enlighet med graderingen i tillägget. 
— Cirka 24 timmar efter 30-timmarsobservationen (ungefär 54 tim ­
mar efter det att provokationskompressen applicerades) observe ­
ras hudreaktionerna på nytt och noteras. 
Blindläsning av test och kontrolldjur rekommenderas. Om det är nödvändigt för att klargöra resultaten från den första 
provokationen bör en andra provokation (dvs. en förnyad provoka ­
tion) övervägas en vecka efter den första, i tillämpliga fall med en ny 
kontrollgrupp. En förnyad provokation får också göras på den ur ­
sprungliga kontrollgruppen.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 271
 
Alla hudreaktioner och ovanliga resultat, inbegripet systemiska re ­
aktioner, som följer av induktions- och provokationsförfarandena bör 
observeras och noteras i enlighet med graderingsskalan enligt Mag ­
nusson/Kligman (se tillägget), övriga förfaranden, t.ex. histopatolo ­
gisk undersökning eller mätning av hudvecks tjocklek, får utföras för 
att klargöra tveksamma reaktioner.  
2. DATA (GPMT och Buehler-test)  
Uppgifterna bör sammanfattas i tabellform som i fråga om varje djur 
visar hudreaktioner vid varje observation.  
3. RAPPORTERING (GPMT och Buehler-test)  
Om ett screeningsförsök utförs före marsvinsförsöket ska en beskriv ­
ning av eller hänvisning till försöket (t.ex. Local Lymph Node Essay 
(LLNA), Mouse Ear Swelling Test (MEST), inbegripet uppgifter om förfarandet, lämnas tillsammans med de resultat som erhållits genom försöket och referensämnena.
 
Försöksrapport (GPMT och Buehler-test)  
Försöksrapporten ska om möjligt innehålla följande uppgifter: 
Försöksdjur: — Art/stam för använda marsvin. — Djurens antal, ålder och kön. — Härkomst, miljöbetingelser, foder etc. — Djurens individuella vikt vid försökets inledning. Försöksförhållanden: — Metod för förberedelse av kompressområde. — Uppgift om använt kompressmaterial och kompressmetod. — Resultat av förundersökning med slutsatser om de induktions- 
och provokationskoncentrationer som ska användas i försöket. 
— Uppgift om förberedelse av testsubstans, applicering och borttag ­
ning. 
— Motivering för val av vehikel. — Vehikel- och testsubstanskoncentrationer som används vid induk ­
tions- och provokationsexponering och den totala mängd ämne 
som appliceras vid induktion och provokation. 
Resultat: 
— En sammanfattning av resultaten av den senaste kontrollen av 
känslighet och tillförlitlighet (se 1.3), inbegripet uppgift om äm ­
ne, koncentration och använd vehikel.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 272
 
— Resultatet för varje djur inklusive graderingssystem. 
— Redogörelse för arten och graden av observerade effekter. — Eventuella histopatologiska resultat. 
Diskussion om resultaten. 
Slutsatser.
 
4. HÄNVISNINGAR  
Denna metod motsvarar OECD TG 406.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 273
 
Tillägg  
TABELL  
Graderingsskala enligt Magnusson/Kligman för utvärdering av reaktioner 
på provokationskompresstest  
0 = ingen synbar förändring 1 = lätt eller måttlig hudrodnad 2 = måttlig till stark hudrodnad 3 = intensiv hudrodnad och svullnad
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 274
 
B.7 28-DAGARS TOXICITETSSTUDIE MED UPPREPAD ORAL 
DOSERING PÅ GNAGARE  
INLEDNING 
1. Den här testmetoden motsvarar OECD:s testriktlinje 407 (2008). Den ur ­
sprungliga testriktlinjen 407 antogs 19.81.1995 antogs en reviderad version 
för att erhålla ytterligare information från djuret som används i studien, i 
synnerhet om neurotoxicitet och immunotoxicitet. 
2. 1998 inledde OECD en högprioriterad verksamhet för att se över befintliga 
testriktlinjer och utveckla nya riktlinjer för undersökning och testning av 
potentiellt endokrinstörande ämnen (8). Ett inslag i verksamheten var att 
uppdatera befintlig OECD-riktlinje för ”28-dagars toxicitetsstudie med upp ­
repad oral dosering på gnagare” (TG407) med parametrar lämpliga för att upptäcka endokrin aktivitet för testkemikalier. Denna procedur genomgick 
ett omfattande internationellt program för att testa relevansen och tillämp ­
barheten av de kompletterande parametrarna, utförandet av dessa parametrar för kemikalier med (anti) östrogen-, (anti) androgen- och (anti) köldkörtel ­
aktivitet och reproducerbarhet inom och mellan laboratorier samt de nya 
parametrarnas interferens med de som krävdes i den tidigare TG 407. 
Den stora mängden data som därvid erhölls har sammanställts och utvär ­
derats i detalj i en omfattande OECD-rapport (9). Den här uppdaterade testmetoden B.7 (som är likvärdig med TG 407) är resultatet av de erfaren ­
heter och resultat som uppnåddes under det internationella testprogrammet. 
Med den här testmetoden kan vissa endokrina indirekta verkningar sättas i samband med andra toxikologiska verkningar.
 
INLEDANDE ÖVERVÄGANDEN OCH BEGRÄNSNINGAR 
3. Vid bedömningen och utvärderingen av de toxiska egenskaperna hos en 
kemikalie kan bestämningen av toxicitet med upprepad oral dosering ge ­
nomföras efter att inledande information om toxicitet har erhållits genom 
testning av akut toxicitet. Avsikten med den här testmetoden är att under ­
söka effekterna på ett mycket brett spektrum av potentiella måltavlor för toxicitet. Den ger information om eventuella hälsorisker som kan uppstå vid upprepad exponering under en relativt begränsad tidsperiod, inklusive effek ­
terna på nervsystemet, immunsystemet och det endokrina systemet. Vad 
beträffar dessa speciella endpoints, bör den identifiera kemikalier med neu ­
rotoxisk verkan, vilket kan motivera mer ingående undersökningar av denna aspekt, samt kemikalier som påverkar sköldkörtelns fysiologi. Den kan 
också tillhandahålla data om kemikalier som påverkar de manliga och/eller 
kvinnliga könsorganen hos unga vuxna djur samt ge indikationer på immu ­
nologiska effekter. 
4. Resultaten från denna testmetod B.7 bör användas för faroidentifiering och 
riskbedömning. Resultaten som erhölls genom de endokrinrelaterade para ­
metrarna bör sättas i samband med ”OECD:s ramverk för testning och 
bedömning av endokrinstörande kemikalier” (11). Metoden innefattar den grundläggande toxicitetsstudien med upprepad dosering som kan användas för kemikalier för vilka en 90-dagarsstudie inte är motiverad (t.ex. när 
produktionsvolymen inte överskrider vissa gränser) eller som en inledning 
till en långtidsstudie. Varaktigheten för exponeringen bör vara 28 dagar.
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 275
 
5. Det internationella programmet som genomfördes om validering av para ­
metrar lämpliga för upptäckt av en testkemikalies eventuella endokrina ak ­
tivitet visade att kvaliteten på datan som erhölls genom denna testmetod B.7 beror mycket på testlaboratoriets erfarenheter. Detta hänför sig särskilt till histopatologisk bestämning av cykliska förändringar i de kvinnliga fortplant ­
ningsorganen och viktbestämning av de små hormonberoende organen som 
är svåra att dissekera. Vägledning för histopatologi har utvecklats (19). Den finns på OECD:s offentliga webbplats om riktlinjer för testning. Den är avsedd för att hjälpa patologer i deras undersökningar och bidra till att öka 
analysens känslighet. En mängd olika parametrar befanns vara indikativa för 
endokrinrelaterad toxicitet och har införlivats i testmetoden. Parametrar för vilka det fanns tillräckliga data tillgängliga för att visa nyttan eller vilka visade svaga bevis i valideringsprogrammet för deras förmåga att detektera 
endokrinstörande ämnen föreslås som valfria endpoints (se tillägg 2). 
6. På grundval av datan som genereras i valideringsprocessen, måste det fram ­
hållas att känsligheten hos denna analys inte är tillräcklig för att identifiera alla ämnen med (anti) androgena eller (anti) östrogena verkningssätt (9). 
Testmetoden genomförs inte i ett livsskede som är mest känslig för endo ­
krina störningar. Dock har testmetoden under valideringsprocessen identifie ­
rat ämnen som svagt eller starkt påverkar sköldkörtelns funktion, och starka eller måttliga endokrina aktiva ämnen som verkar genom östrogena eller 
androgena receptorer, men som i de flesta fall misslyckades med att iden ­
tifiera endokrina aktiva ämnen som svagt påverkar östrogena eller androgena receptorer. Därför kan den inte beskrivas som en screeninganalys av endo ­
krin aktivitet. 
7. Följaktligen kan avsaknaden av verkningar relaterade till dessa verknings ­
mekanismer inte tas som bevis på bristen av verkningar på det endokrina 
systemet. Beträffande indirekta endokrina verkningar bör därför inte ämnets karakterisering baseras enbart på resultaten från denna testmetod, men bör användas i en sammanvägd bedömning som omfattar alla befintliga data om 
en kemikalie för att karakterisera eventuell endokrin aktivitet. Av denna 
anledning bör regulatoriskt beslutsfattande om endokrin aktivitet (ämnes ­
karakterisering) vara en bred strategi, inte enbart beroende av resultaten från tillämpningen av denna testmetod. 
8. Det är erkänt att alla djurbaserade förfaranden kommer att överensstämma 
med lokala normer för djurvård; beskrivningarna av vård och behandling som anges nedan är miniminormer för prestanda som kommer att ersättas av strängare lokala bestämmelser. Ytterligare vägledning om human behandling 
av djur finns i OECD (14). 
9. Definitioner som används finns i tillägg 1.
 
PRINCIP FÖR TESTMETODEN 
10. Testkemikalien tillförs oralt dagligen i graderade doser till flera grupper av 
försöksdjur, en dosnivå per grupp för en period på 28 dagar. Under ad ­
ministreringsperioden observeras djuren varje dag noggrant för tecken på toxicitet. Djur som dör eller avlivas under testet obduceras, och i slutet av 
testet avlivas överlevande djur och obduceras. En 28-dagarsstudie ger infor ­
mation om effekterna av upprepad oral exponering och kan indikera behovet
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 276
 
av ytterligare långtidsstudier. Den kan också ge information om valet av 
koncentrationer för långtidsstudier. Datan som härrör från användningen av 
testmetoden ska göra det möjligt att karakterisera teskemikaliens toxicitet som en indikation på förhållandet dos-respons och bestämningen av nivån där ingen skadlig effekt observeras (NOAEL).
 
METODBESKRIVNING  
Val av djurart  
11. Rekommenderad gnagare är råtta, även om andra gnagare kan användas. En 
utförlig motivering ska ges om de parametrar som anges i denna testmetod 
B.7 undersöks i andra gnagare. Även om det är biologiskt sannolikt att andra arter bör svara på gifter på liknande sätt som råttan, kan användningen av mindre arter resultera i ökad variabilitet på grund av tekniska utmaningar 
att dissekera mindre organ. I det internationella valideringsprogrammet för 
att detektera endokrinstörande ämnen, var råttan den enda art som användes. I testet bör unga friska vuxna djur användas av stammar som vanligtvis används på laboratorier. Honorna ska inte ha fått ungar och inte vara dräk ­
tiga. Doseringen bör inledas snarast möjligt efter avvänjningen, och under 
alla förhållanden innan djuren är nio veckor gamla. Vid inledningen av studien bör viktskillnaden hos de använda djuren vara minimal och inte överstiga ± 20 % av medelvikten för varje kön. När en upprepad oral dos 
utförs som inledning till en långtidsstudie, är det att föredra att djur från 
samma stam och ursprung används för båda studierna.
 
Inhysning och utfodring  
12. Alla förfaranden bör överensstämma med lokala normer för laboratoriedjur ­
vård. Temperaturen i försöksdjurens utrymmen bör vara 22 °C (± 3 °C). 
Den relativa fuktigheten bör vara minst 30 % och ska helst inte överstiga 70 % utom när rummet rengörs, bör målet vara 50–60 %. Belysningen bör vara artificiell med ljusperioden 12 timmar ljus och 12 timmar mörker. För 
utfodringen kan konventionellt laboratoriefoder användas med ett obegränsat 
utbud av dricksvatten. Valet av foder kan påverkas av behovet av att säker ­
ställa en lämplig blandning av en testkemikalie när den administreras genom denna metod. Djuren bör vara inrymda i små grupper av samma kön. Djuren 
kan inhysas individuellt om det är vetenskapligt motiverat. Vid grupplace ­
ring i bur bör inte fler än fem djur inhysas per bur. 
13. Fodret bör regelbundet analyseras beträffande föroreningar. Ett prov av 
fodret bör sparas tills rapporten är slutförd.
 
Förberedelse av djuren  
14. Friska unga vuxna djur väljs slumpvis ut till kontroll- och behandlingsgrup ­
perna. Burarna bör placeras så att en möjlig påverkan beroende på deras 
placering minimeras. Därefter identifieras djuren individuellt och får ackli ­
matisera sig till laboratoriets betingelser i sina burar i minst fem dagar före behandlingsstudien.
 
Beredning av doser  
15. Testkemikalien tillförs genom sondmatning eller via fodret eller dricksvatt ­
net. Metoden för oral tillförsel är beroende av syftet med studien och de 
fysikaliska/kemiska/toxikologisk-kinetiska egenskaperna hos testkemikalien.  ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 277
 
16. Vid behov kan testkemikalien upplösas eller suspenderas i en lämplig ve ­
hikel. Det rekommenderas, när så är möjligt, att man först använder en 
vattenbaserad lösning/suspension följt av en lösning/suspension i olja (t.ex. majsolja) och därefter eventuell lösning i andra vehiklar. För vehiklar annat än vatten måste de toxiska egenskaperna hos vehikeln vara kända. Test ­
kemikaliens stabilitet i vehikeln bör bestämmas.
 
PROCEDUR  
Djurens antal och kön  
17. Minst 10 djur (fem honor och fem hanar) bör användas för varje doserings ­
nivå. Om interimistisk avlivning planeras bör antalet djur ökas med det antal som man planerar att avliva innan studien slutförs. Man bör överväga en 
extra satellitgrupp på tio djur (fem per kön) i kontroll- och i toppdosgruppen 
för observation beträffande reversibilitet, persistens eller fördröjda toxiska verkningar under minst 14 dagar efter behandlingen.
 
Dosering  
18. I allmänhet bör minst tre testgrupper och en kontrollgrupp användas, men ett 
toleranstest kan utföras om man efter utvärderingen av andra data inte för ­
väntar sig några verkningar efter en dos på 1 000 mg/kg kroppsvikt/dag. Om 
det inte finns några lämpliga data tillgängliga kan en pilotstudie (djur av samma stam och ursprung) utföras för att underlätta bestämningen av de doser som ska användas. Med undantag av behandlingen med testkemikalien 
bör djuren i kontrollgruppen hanteras på exakt samma sätt som testgruppen. 
Om en vehikel används för att tillföra testkemikalien bör kontrollgruppen tillföras vehikeln i den största volym som används. 
19. Nivåerna på doserna bör väljas med hänsyn till eventuell toxicitetsdata och 
(toxikologisk-) kinetiska data som finns tillgängliga om testkemikalien eller 
liknande kemikalier. Den högsta nivån på dosen bör väljas i syfte att indu ­
cera toxiska verkningar, men inte leda till döden eller orsaka svåra lidanden. Därefter bör en fallande nivå på doserna väljas i syfte att påvisa en dos ­
relaterad respons och ingen påvisbar skadlig effekt vid den lägsta 
dosnivån (NOAEL). Två- till fyrfaldiga dosintervall är ofta optimala för 
de fallande dosnivåerna, och att lägga till en fjärde testgrupp är att föredra framför att använda mycket stora intervall (t.ex. mer än faktor 10) mellan doseringarna. 
20. Om allmän toxicitet observeras (t.ex. minskad kroppsvikt, verkningar på 
lever, hjärta eller njurar) eller andra förändringar som har observerats som 
kanske inte är toxiska reaktioner (t.ex. nedsatt födointag, leverförstoring), ska observerade effekter på immunförsvaret, neurologiska eller endokrint känsliga endpoints bör tolkas med försiktighet.
 
Toleranstest  
21. Om ett test vid en dosnivå på minst 1 000 mg/kg kroppsvikt/dag eller, vid 
tillförsel via foder eller dricksvatten, en motsvarande procentandel i fodret 
eller dricksvattnet (baserad på fastställd kroppsvikt) genom användning av 
de förfaranden som beskrivs för denna studie, inte ger några observerbara toxiska verkningar och om ingen toxicitet förväntas på grundval av data från strukturellt närbesläktade kemikalier är det inte nödvändigt att genomföra en 
fullständig studie med tre doseringsnivåer. Toleranstestet tillämpas, utom när 
mänsklig exponering anger att en högre dosnivå ska användas.
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 278
 
Administrering av doser  
22. Djuren doseras dagligen med testkemikalier, 7 dagar per vecka under en 
period av 28 dagar. När testkemikalien tillförs genom sondmatning bör detta ske i en engångsdos via magsond eller lämplig intubationskanyl. Den största 
mängd vätska som kan administreras vid ett tillfälle beror på försöksdjurets 
storlek. Volymen bör inte överskrida 1 ml per 100 g kroppsvikt utom i de fall när vattenlösningar används, då kan 2 ml per 100 g kroppsvikt använ ­
das. Med undantag för irriterande eller frätande kemikalier, som normalt 
kommer att visa stegrade verkningar vid högre koncentrationer, bör varia ­
tioner av testvolymen minimeras genom justering av koncentrationen, för att säkerställa en konstant volym vid alla dosnivåer. 
23. För kemikalier som tillförs via foder eller dricksvatten är det viktigt att 
säkerställa att kvantiteterna av den berörda testkemikalien inte påverkar normal närings- eller vattenbalans. När testkemikalien tillförs via kosten kan antingen en konstant foderkoncentration (PPM) eller en konstant dos ­
nivå i förhållande till djurens kroppsvikt användas; valet måste anges. När 
en kemikalie tillförs genom sondmatning bör dosen ges vid samma tidpunkt varje dag, och justeras vid behov för att upprätthålla en konstant dosnivå i förhållande till djurets kroppsvikt. Om en upprepad doseringsstudie används 
som inledning till en långtidsstudie ska ett liknande foder användas i båda 
studierna.
 
Observationer  
24. Observationsperioden ska vara 28 dagar. Djuren i en satellitgrupp där upp ­
följande observationer planeras, ska hållas i minst 14 dagar utan behandling 
för att fördröjda eller kvarstående verkningar eller återhämtning från toxiska 
effekter ska kunna upptäckas. 
25. Allmänna kliniska observationer bör göras minst en gång per dag, helst vid 
samma tidpunkt(er) med hänsyn till maximalt förväntade effekter efter do ­
seringen. Djurens hälsotillstånd bör registreras. Minst två gånger dagligen 
bör djuren observeras beträffande morbiditet och mortalitet. 
26. En gång före den första exponeringen (för att möjliggöra individuella jäm ­
förelser), och därefter minst en gång per vecka, ska ingående kliniska ob ­
servationer göras av samtliga djur. Dessa observationer bör göras utanför buren på avsedd plats och helst vid samma tidpunkt varje gång. De bör noggrant registreras, helst med hjälp av ett poängsystem som utförligt defi ­
nierats av testlaboratoriet. Ansträngningar bör göras för att säkerställa att 
testbetingelsernas variationer är minimala, och att observationerna utförs av någon som inte känner till behandlingen. Observationerna bör omfatta, men inte begränsas till, förändringar i hud, päls, ögon, slemhinnor, förekomst av 
sekret och utsöndringar samt autonom aktivitet (t.ex. tårflöde, upprest hår ­
rem, pupillstorlek, ovanligt andningsmönster). Förändringar i gång, hållning och reaktion på hantering liksom eventuella kramper eller spasmer, stereo ­
typier (t.ex. överdrivet putsande, repetitivt cirklande) eller bisarrt beteende 
(t.ex. självstympning, baklängesgång) ska också registreras (2). 
27. Under fjärde exponeringsveckan bör bedömningar göras av sensoriska re ­
aktioner på stimuli av olika slag (2) (t.ex. hörsel, syn och djupsensorisk stimuli) (3) (4) (5), bedömning av greppstyrka (6) och motorisk aktivitet (7). 
Ytterligare uppgifter om de procedurer som kan följas finns i respektive 
hänvisningar. Dock kan andra procedurer än de som hänvisats till användas.
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 279
 
28. Funktionella observationer som görs under fjärde exponeringsveckan kan 
utelämnas om studien utförs som inledning till en subkronisk studie (90- 
dagars). I så fall bör de funktionella observationerna tas med i denna upp ­
följningsstudie. Å andra sidan kan tillgången på data om funktionella ob ­
servationer från studien med upprepad dosering öka möjligheten att välja 
dosnivåer för en efterföljande subkronisk studie. 
29. I undantagsfall kan funktionella observationer utlämnas för grupper som 
annars skulle uppvisa tecken på toxicitet i sådan utsträckning att det väsent ­
ligen skulle påverka funktionstestets prestanda. 
30. Vid obduktion kan östruscykeln för alla honor bestämmas (valfritt) genom 
ett vaginalt utstryksprov. Dessa observationer ger information beträffande östruscykelns stadium vid tiden för avlivandet och hjälper till med den 
histologiska utvärderingen av östrogenkänsliga vävnader (se vägledning 
om histopatologi (19)).
 
Kroppsvikt och foder-/vattenkonsumtion  
31. Alla djur bör vägas minst en gång i veckan. Mätning av foderkonsumtion 
bör göras minst en gång i veckan. Om testkemikalien tillförs via dricks ­
vattnet bör även vattenkonsumtionen mätas minst en gång i veckan.  
Hematologi  
32. Följande hematologiska undersökningar bör göras i slutet av testperioden: 
hematokrit, hemoglobin koncentration, erytrocyträkning, retikulocyter, total och differential räkning av leukocyter, trombocyter och en mätning av blo ­
dets koaguleringstid/-potential. Andra bestämningar som bör utföras, om 
testkemikalien eller dess förmodade metaboliteter har eller misstänkas ha 
oxiderande egenskaper, inkluderar methemoglobinkoncentration och Heinz-kroppar. 
33. Blodprover bör tas från ett angivet ställe strax före eller som ett led i 
förfarandet för avlivning av djuren, och förvaras under lämpliga förhållan ­
den. Djuren bör fasta över natten före avlivandet (
 1 ). 
Klinisk biokemi  
34. Kliniska biokemiska bestämningar för att undersöka betydande toxiska ef ­
fekter på vävnader, särskilt påverkan på lever och njurar, bör utföras på 
blodprov tagna på samtliga djur strax före, eller som ett led i, avlivnings ­
proceduren (bortsett från de döende och/eller de som avlivats före studiens upphörande). Undersökningar av plasma eller serum ska omfatta natrium, 
kalium, glukos, totalkolesterol, urinämne, kreatinin, totalprotein och albu ­
min, minst två enzymer som indikerar effekter på leverceller (såsom alani ­
naminotransferas, aspartataminotransferas, alkaliskt fosfatas, γ-glutamyl ­
transpeptidas och glutamatdehydrogenas), samt gallsyror. Mätningar av yt ­
terligare enzymer (från lever eller annat ursprung) och bilirubin kan under 
vissa omständigheter ge användbar information. 
35. Eventuellt kan också följande urinanalyser utföras under studiens sista vecka 
med klockad uppsamling av urinvolym: utseende, volym, osmolalitet eller 
specifik vikt, pH, protein, glukos och blod/blodceller.
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 280  
( 1 ) För en rad olika mätningar i serum och plasma, särskilt för glukos, är nattlig fasta att 
föredra. Huvudorsaken till denna preferens är att den ökade variabilitet som oundvikligen 
följer av utebliven fasta skulle tendera att maskera subtilare effekter och försvåra tolk ­
ningen. Å andra sidan kan dock den nattliga fastan inkräkta på djurens allmänna meta ­
bolism och kan, särskilt under foderstudier, störa den dagliga exponeringen för testkemi ­
kalien. Om nattlig fasta används ska klinisk biokemisk bestämning utföras efter utföran ­
det av funktionella observationer under vecka 4 i studien.
 36. Dessutom bör man överväga studier för att undersöka plasma- eller serum ­
markörer för allmänna vävnadsskador. Andra bestämningar som bör utföras, 
om kända egenskaper hos testkemikalien kan, eller misstänks, påverka rela ­
terade metaboliska profiler, inkluderar kalcium, fosfat, triglycerider, speci ­
fika hormoner och kolinesteras. Dessa bör identifieras för kemikalier i vissa 
klasser, eller från fall till fall. 
37. Även om man i den internationella utvärderingen av endokrinrelaterade 
endpoints inte kunde påvisa en klar fördel för bestämning av sköldkörtel ­
hormoner (T3, T4) och TSH, kan det vara till hjälp att bevara plasma- eller serumprover för att mäta T3, T4 och TSH (valfritt), om det finns indikation på påverkan av hypofys-sköldkörtelaxeln. För att lagra proverna kan de 
frysas vid – 20 °. Följande faktorer kan påverka variationen och de absoluta 
koncentrationerna för hormonbestämningarna: 
— Tidpunkt för avlivningen beroende på hormonkoncentrationernas dygn ­
svariation. 
— Avlivningsmetod för att undvika onödig stress hos djuren som kan på ­
verka hormonkoncentrationerna. 
— Testsatser för hormonbestämningar som kan skilja sig åt genom sina 
standardkurvor. 
En slutgiltig identifiering av sköldkörtelaktiva kemikalier är mer tillförlitlig 
genom histopatologisk analys snarare än hormonnivåer. 
38. Plasmaprover särskilt avsedda för hormonbestämning bör tas vid en jäm ­
förbar tid på dagen. Det rekommenderas att man bör överväga om bestäm ­
ningar av T3, T4 och TSH utlöstes på grund av förändringar av sköldkör ­
telns histopatologi. De numeriska värden som erhölls vid analys av hormon ­
koncentrationer skiljer sig åt mellan de olika analyssatser som finns i han ­
deln. Därför är det kanske inte möjligt att tillhandahålla prestandakriterier baserade på enhetliga historiska data. Alternativt bör laboratorierna sträva efter att hålla variationskoefficienterna under 25 för T3 och T4, och under 
35 för TSH. Alla koncentrationer ska anges i ng/ml. 
39. Om historiska basdata är otillräckliga bör hänsyn tas till hematologiska och 
kliniska biokemiska variabler innan doseringen påbörjas eller företrädesvis för en uppsättning djur som inte ingår i försöksgrupperna.
 
PATOLOGI  
Obduktion  
40. Samtliga djur i studien bör underkastas en fullständig obduktion, som om ­
fattar omsorgsfull granskning av kroppens yttre ytor, alla kroppsöppningar 
samt kranium, bröst- och bukhåla och deras innehåll.  Lever, njurar, binjurar,  
testiklar, bitestiklar, prostata + sädesblåsor med koagulerade körtlar i sin helhet,
 bräss, mjälte, hjärna och hjärta från samtliga djur (med undantag 
av de döende och/eller de som har avlivats före studiens upphörande) ska 
putsas från angränsande vävnad vid behov, och deras våtvikt ska bestämmas så snart som möjligt efter dissektionen för att undvika uttorkning. Försik ­
tighet måste iakttas vid putsning av prostatakomplexet för att undvika punk ­
tion av de vätskefyllda blåsorna. Alternativt kan sädesblåsor och prostata 
trimmas och vägas efter fixering.
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 281
 
41. Dessutom skulle två andra vävnader eventuellt kunna vägas så snart som 
möjligt efter dissektionen, för att undvika uttorkning: parade äggstockar 
(våtvikt) och livmodern, inklusive livmoderhalsen (vägledning om borttag ­
ning och beredning av livmodervävnad för viktmätning finns i OECD:s TG 440 (18)). 
42. Sköldkörtelns vikt (valfritt) kan bestämmas efter fixering. Putsning ska 
också göras väldigt försiktigt, och först efter fixeringen för att undvika vävnadsskador. Vävnadsskador kan äventyra den histopatologiska analysen. 
43. Följande vävnader bör bevaras i det mest lämpade fixeringsmedlet för både 
vävnadstypen och den planerade efterföljande histopatologiska undersök ­
ningen (se punkt 47): Alla
 större skador, hjärna (representativa områden 
omfattande cerebrum, cerebellum och pons),  ryggmärg, ögon, mage, tunn-  
och tjocktarm (inklusive Peyers plack),  lever, njurar, binjurar, mjälte, hjärta,  
bräss, sköldkörtel, luftstrupe och  lungor (konserverade genom uppumpning 
med fixermedel och därefter nedsänkning),  könskörtlar ( testiklar och äggs ­ 
tockar),  accessoriska könsorgan (uterus och cervix, epididymes, prostata + 
sädesblåsor med koaguleringskörtlar),  vagina, urinblåsa, lymfkörtlar (vid 
sidan av den mest proximala dräneringsnoden bör en annan lymfnod tas i 
enlighet med laboratoriets erfarenheter (15)),  perifer nerv (ischias eller tibia) 
helst nära muskeln,  skelettmuskel och  ben med  benmärg (sektion eller, 
alternativt, ett nymonterat benmärgsaspirat). Det rekommenderas att testik ­
larna fixeras genom nedsänkning i Bouins fixativ eller modifierat Davidsons 
fixativ (16) (17). Tunica albuginea måste försiktigt och ytligt punkteras med en nål på organets båda poler för en snabb inträngning av fixativet. Kliniska och andra fynd kan indikera behovet av att undersöka ytterligare vävnader. 
Också alla organ som sannolikt är målorgan, baserat på kunskap om test ­
kemikaliens egenskaper, ska konserveras. 
44. Följande vävnader kan ge värdefulla tecken på endokrinrelaterade effekter: 
Könskörtlar (äggstockar och testiklar), accessoriska könsorgan (uterus inklu ­
sive cervix, epididymis, sädesblåsor med koaguleringskörtlar, dorsolaterala 
och ventrala prostata), vagina, hypofys, manliga bröstkörtlar, sköldkörtel och binjurar). Förändringar i manliga bröstkörtlar är inte tillräckligt väl doku ­
menterade, men denna parameter kan vara väldigt känslig för ämnen med 
östrogen verkan. Observation av organ/vävnader som inte nämns i avsnitt 43 
är valfria (se tillägg 2). 
45. Vägledning om histopatologi (19) omfattar detaljerad information om dis ­
sektion, fixering, sektionering och histopatologi av endokrina vävnader. 
46. I det internationella testprogrammet erhölls vissa belägg för att subtila en ­
dokrina verkningar av kemikalier med en låg potens för att påverka köns ­
hormonhomeostas, kan identifieras genom störning av östruscykelns synkro ­
nisering i olika vävnader, och inte så mycket genom franka histopatologiska 
förändringar i kvinnliga könsorgan. Även om inga direkta bevis erhölls för 
sådana effekter, rekommenderas att bevis för eventuell asynkroni i östrus ­
cykeln ska tas med i beräkningen vid tolkningen av äggstockarnas histopa ­
tologi (follikulära, thecala och granulosa celler), uterus, cervix och vagina. 
Om utvärderat kan det skede av cykeln som bestämts genom vaginala ut ­
stryk också ingå i denna jämförelse.
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 282
 
Histopatologi  
47. En fullständig histopatologisk undersökning bör utföras på bevarade organ 
och vävnader från samtliga djur i kontroll- och högdosgrupperna. Dessa undersökningar bör utsträckas till djur i alla andra doseringsgrupper, om 
behandlingsrelaterade förändringar observeras i högdosgruppen. 
48. Alla större skador ska undersökas. 
49. Om en satellitgrupp används bör en histopatologisk undersökning utföras på 
de vävnader och organ på vilka effekter har visats i de behandlade grup ­
perna.
 
DATA OCH RAPPORTERING  
Data  
50. Individuella data ska lämnas. Därutöver bör alla data sammanfattas i tabell ­
form, som för varje testgrupp visar antal djur vid testets början, antal djur som påfanns döda under testet eller som avlivats av humanitära skäl och 
tidpunkten för dödsfallen eller eutanasin, antal djur som visar tecken på 
toxicitet, en beskrivning av de tecken på toxicitet som observerats, inklusive tidpunkt för de första tecknen, varaktighet och hur allvarliga de toxiska 
verkningarna är, antal djur som uppvisar skador, typ av skador, deras svå ­
righetsgrad och procentandelen djur som uppvisar varje typ av skada. 
51. Om möjligt bör numeriska resultat utvärderas genom en lämplig och allmänt 
vedertagen statistisk metod. Vid jämförelser av effekten längs ett dosinter ­
vall bör man undvika användningen av multipla t-tester. Statistiska metoder 
ska väljas vid utformningen av studien. 
52. Som kvalitetskontroll föreslås att historiska kontrolldata samlas in för nume ­
riska data, och med dem beräknas variationskoefficienter, särskilt för de 
parametrar som kopplas till endokrinstörande upptäckt. Dessa data kan se ­
dan användas för jämförelseändamål när aktuella studier utvärderas.
 
Testrapport  
53. Testrapporten måste innehålla följande information:  
Testkemikalie:  
— Fysikalisk natur, renhet och fysikalisk-kemiska egenskaper. 
— Identifikationsuppgifter.  
Vehikel (i förekommande fall):  
— Motivering för val av vehikel, om annan än vatten.  
Försöksdjur:  
— Art och stam som används. 
— Djurens antal, ålder och kön. 
— Ursprung, inhysning, kost etc. 
— Djurens individuella vikt vid testets början. — Motivering för val av art, om inte råtta.  
Försöksbetingelser:  
— Grund för valet av dosnivå. 
— Uppgifter om testkemikaliens sammansättning/foderberedning, uppnådd 
koncentration, preparatets stabilitet och homogenitet.
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 283
 
— Uppgifter om administreringen av testkemikalien. 
— Omvandling från fodrets/dricksvattnets testkemikaliekoncentration (ppm) 
till faktisk dos (mg/kg kroppsvikt/dag), i förekommande fall. 
— Uppgifter om foder- och vattenkvalitet.  
Valfria endpoints som undersöktes  
— Lista över valfria endpoints som undersöktes.  
Resultat:  
— Kroppsvikt/kroppsviktsförändringar. — Foderkonsumtion och vattenkonsumtion, i förekommande fall. — Uppgifter om toxiska reaktioner efter kön och dosnivå, inklusive tecken 
på toxicitet. 
— Art, allvarlighetsgrad och varaktighet för kliniska observationer (huru ­
vida de är reversibla eller ej). 
— Bedömning av sensorisk aktivitet, greppstyrka och motorisk aktivitet. — Blodundersökningar med relevanta basvärden. — Kliniska biokemiska undersökningar med relevanta basvärden. — Uppgifter om kroppsvikt vid avlivning och organvikt. — Obduktionsfynd. — En detaljerad beskrivning av samtliga histopatologiska fynd. — Absorptionsdata, i förekommande fall. 
— Statistisk bearbetning av resultaten, i tillämpliga fall.  
Diskussion av resultaten. Slutsatser.
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 284
 
Tillägg 1  
DEFINITIONER  
Androgenicitet  är förmågan hos en kemikalie att agera som ett naturligt an ­
drogent hormon (t.ex. testosteron) i en däggdjursorganism.  
Antiandrogenicitet  är förmågan hos en kemikalie att undertrycka verkan av ett 
naturligt androgent hormon (t.ex. testosteron) i en däggdjursorganism.  
Anti-östrogenicitet  är förmågan hos en kemikalie att undertrycka verkan av ett 
naturligt östrogent hormon (t.ex. 17ß-östradiol) i en däggdjursorganism.  
Antityreoid aktivitet  är förmågan hos en kemikalie att undertrycka verkan av ett 
naturligt sköldkörtelhormon (t.ex. T  3 ) i en däggdjursorganism.  
Dosering  är en allmän term som omfattar dos, dess frekvens och doseringens 
varaktighet.  
Dos är den mängd testkemikalie som administreras. Dosen uttrycks som test ­
kemikaliens vikt per enhet kroppsvikt av försöksdjur per dag (t.ex. mg/kg 
kroppsvikt/dag), eller som en konstant kostkoncentration.  
Uppenbar toxicitet  är en allmän term som beskriver tydliga tecken på toxicitet 
efter tillförsel av testkemikalien. Dessa bör vara tillräckliga för en riskbedömning och bör vara sådana att en ökning av den tillförda dosen kan förväntas resultera i 
utvecklingen av allvarliga toxicitetssymptom och sannolikt leda till mortalitet.  
NOAEL  är förkortningen för nivån där ingen skadlig effekt observeras. Detta är 
den högsta dosnivå där inga behandlingsrelaterade fynd observerats på grund av behandling.  
Östrogenicitet  är förmågan hos en kemikalie att agera som ett naturligt östrogent 
hormon (t.ex. 17ß-östradiol) i en däggdjursorganism.  
Testkemikalie:  Alla ämnen eller blandningar som testas med denna testmetod.  
Tyreoid aktivitet  är förmågan hos en kemikalie att agera som ett naturligt 
sköldkörtelhormon (t.ex. T
 3 ) i en däggdjursorganism.  
Validering  är en vetenskaplig process utformad för att karakterisera de operativa 
kraven och begränsningarna hos en testmetod och visa dess tillförlitlighet och 
relevans för ett visst ändamål.  ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 285
 
Tillägg 2  
Endpoints rekommenderade för upptäckt av endokrinstörande ämnen (EDS) 
i denna B.7-testmetod  
Obligatoriska endpoints Valfria endpoints 
Vikt 
— Testiklar 
— Epididymis 
— Binjurar 
— Prostata + sädesblåsor med koagu ­
lerande körtlar — Äggstockar 
— Uterus, inklusive cervix 
— Sköldkörtel  
Histopatologi  
— Könskörtlar: 
— Testiklar och 
— Äggstockar 
— Accessoriska könsorgan: 
— Epididymis, 
— Prostata + sädesblåsa med koagu ­
lerande körtlar 
— Uterus, inklusive cervix 
— Binjure 
— Sköldkörtel 
— Vagina — Vaginala utstryk 
— Manliga bröstkörtlar 
— Hypofys  
Hormonmätningar  
— Cirkulerande T3- och T4-ni ­
våer 
— Cirkulerande TSH-nivåer  
LITTERATUR  
(1) OECD (Paris, 1992). Chairman’s Report of the Meeting of the ad hoc 
Working Group of Experts on Systemic Short-term and (Delayed) Neuro ­
toxicity. 
(2) IPCS (1986). Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity 
Associated with Exposure to Chemicals. Environmental Health Criteria Do ­
cument No. 60 
(3) Tupper DE, Wallace RB (1980). Utility of the Neurologic Examination in 
Rats. Acta Neurobiol. Exp. 40: 999–1003. 
(4) Gad SC (1982). A Neuromuscular Screen for Use in Industrial Toxicology. 
J. Toxicol Environ. Health 9: 691–704. 
(5) Moser VC, McDaniel KM, Phillips PM (1991). Rat Strain and Stock Com ­
parisons Using a Functional Observational Battery: Baseline Values and 
Effects of Amitraz. Toxicol. Appl. Pharmacol. 108: 267–283. 
(6) Meyer OA, Tilson HA, Byrd WC, Riley MT (1979). A Method for the 
Routine Assessment of Fore- and Hindlimb Grip Strength of Rats and Mice. 
Neurobehav. Toxicol. 1: 233–236.  ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 286
 
(7) Crofton KM, Howard JL, Moser VC, Gill MW, Reiter LW, Tilson HA, 
MacPhail RC (1991). Interlaboratory Comparison of Motor Activity Experi ­
ments: Implication for Neurotoxicological Assessments. Neurotoxicol. Te ­
ratol. 13: 599–609. 
(8) OECD (1998). Report of the First Meeting of the OECD Endocrine Dis ­
rupter Testing and Assessment (EDTA) Task Force, 10th-11th March 1998, 
ENV/MC/CHEM/RA(98)5. 
(9) OECD. (2006). Report of the Validation of the Updated Test Guideline 407: 
Repeat Dose 28-day Oral Toxicity Study in Laboratory Rats. Series on Testing and Assessment No 59, ENV/JM/MONO(2006)26. 
(10) OECD (2002). Detailed Review Paper on the Appraisal of Test Methods for 
Sex Hormone Disrupting Chemicals. Series on Testing and Assessment 
No 21, ENV/JM/MONO(2002)8. 
(11) OECD (2012).Conceptual Framework for Testing and Assessment of En ­
docrine Disrupting Chemicals. http://www.oecd.org/document/58/ 0,3343,fr_2649_37407_2348794_ 1_1_1_37407,00.html 
(12) OECD (2006). Final Summary report of the meeting of the Validation 
Management Group for mammalian testing. ENV/JM/TG/EDTA/M(2006)2. 
(13) OECD. Draft Summary record of the meeting of the Task Force on Endoc ­
rine Disrupters Testing and Assessment. ENV/JM/TG/EDTA/M(2006)3. 
(14) OECD (2000). Guidance document on the recognition, assessment and use 
of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in 
safety evaluation. Series on Testing and Assessment No 19. ENV/JM/MO ­
NO(2000)7. 
(15) Haley P, Perry R, Ennulat D, Frame S, Johnson C, Lapointe J-M, Nyska A, 
Snyder PW, Walker D, Walter G (2005). STP Position Paper: Best Practice 
Guideline for the Routine Pathology Evaluation of the Immune System. 
Toxicol Pathol 33: 404–407. 
(16) Hess RA, Moore BJ (1993). Histological Methods for the Evaluation of the 
Testis. I: Methods in Reproductive Toxicology, Chapin RE and Heindel JJ (eds). Academic Press: San Diego, CA, s. 52–85. 
(17) Latendresse JR, Warbrittion AR, Jonassen H, Creasy DM.(2002) Fixation of 
testes and eyes using a modified Davidson’s fluid: comparison with Bouin’s fluid and conventional Davidson’s fluid. Toxicol. Pathol. 30, 524–533. 
(18) OECD (2007). OECD Guideline for Testing of Chemicals N°440: Uterot ­
rophic Bioassay in Rodents: A short-term screening test for oestrogenic 
properties. 
(19) OECD (2009). Guidance Document 106 on Histologic evaluation of Endoc ­
rine and Reproductive Tests in Rodents ENV/JM/Mono(2009)11.
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 287
 
B.8 SUBAKUT INHALATIONSTOXICITET: 28-DAGARS STUDIE  
SAMMANFATTNING 
Denna reviderade B.8-testmetod har utformats för att fullständigt karakterisera 
testkemikaliens inhalationstoxicitet vid upprepade exponeringar under en begrän ­
sad tidsperiod (28 dagar), och för att tillhandahålla data för kvantitativa risk ­
bedömningar. Grupper om minst 5 hangnagare och 5 hongnagare exponeras 6 
timmar per dag under 28 dagar för a) testkemikalien vid tre eller fler koncent ­
rationsnivåer, b) filtrerad luft (negativ kontroll, och/eller c) vehikeln (vehikel ­
kontroll). Djur exponeras i allmänhet 5 dagar per vecka, men exponering 7 dagar per vecka är också tillåten. Hanar och honor testas alltid, men de kan exponeras 
vid olika koncentrationsnivåer om det är känt att ett kön är mer mottagligt för en 
viss testkemikalie. Denna metod ger försöksledaren flexibilitet att inkludera sa ­
tellitgrupper (reversibilitet), lungsköljning (BAL), neurologiska tester och ytterli ­
gare klinisk patologi och histopatologiska utvärderingar för att bättre kunna 
karakterisera en testkemikalies toxicitet.
 
INLEDNING 
1. Den här testmetoden motsvarar OECD:s testriktlinje 412 (2009). Den ur ­
sprungliga testriktlinjen 412 (TG 412) för subakut inhalation antogs 1981 
(1). Den här testmetoden B.8 (som motsvarar den reviderade testriktlinjen 412) har uppdaterats för att återspegla vetenskapen och möta nuvarande och framtida lagstiftningsbehov. 
2. Den här testmetoden medger karakterisering av negativa effekter efter upp ­
repad daglig exponering genom inhalation av en testkemikalie under 28 dagar. Uppgifterna som kommer från en 28-dagars substudie av akut inha ­
lationstoxicitet kan användas för kvantitativa riskbedömningar (om den inte 
följs av en 90-dagars studie av subkronisk inhalationstoxicitet (kapitel B.29 i denna bilaga)). Uppgifterna kan också ge information om valet av kon ­
centrationer för långtidsstudier såsom 90-dagarsstudien av subkronisk inha ­
lationstoxicitet. Den här testmetoden är inte specifikt avsedd för testning av 
nanomaterial. Definitioner som används inom ramen för den här metoden finns i slutet av det här kapitlet och i vägledningsdokumentet 39 (2).
 
INLEDANDE ÖVERVÄGANDEN 
3. All tillgänglig information om testkemikalien bör beaktas av laboratoriet 
innan studien genomförs i syfte att höja studiens kvalitet och minimera djuranvändningen. Information som underlättar valet av lämpliga testkon ­
centrationer kan inkludera identitet, kemisk struktur, och fysikalisk-kemiska 
egenskaper hos testkemikalien, resultat från eventuella in vitro- eller in 
vivo-toxicitetstester, förväntad användning(ar) och risken för mänsklig ex ­
ponering, tillgängliga (Q)SAR-data och toxikologiska data om strukturellt närbesläktade kemikalier och data från testning av akut inhalationstoxicitet. 
Om neurotoxicitet förväntas eller observeras under studiens gång, kan för ­
söksledaren välja att inkludera lämpliga utvärderingar såsom en funktionell samlingsstudie (FOB) och mätning av motorisk aktivitet. Även om tidpunk ­
ter för exponeringar i förhållande till specifika undersökningar kan vara 
kritiska, bör resultaten från dessa extra aktiviteter inte störa studiens grund ­
läggande utformning.
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 288
 
4. Utspädning av korrosiva eller irriterande testkemikalier kan testas vid kon ­
centrationer som kommer att ge den önskade graden av toxicitet (se GD 39 
(2)). När djur utsätts för dessa material bör målkoncentrationerna vara till ­
räckligt låga för att inte orsaka avsevärd smärta och lidande, men ändå tillräckliga för att utsträcka koncentration-respons-kurvan till nivåer som 
gör att testets regulatoriska och vetenskapliga mål kan uppnås. Dessa kon ­
centrationer bör väljas från fall till fall, företrädesvis baserade på en adekvat utformad undersökning av spännvidden som ger information om den kri ­
tiska endpointen, eventuellt tröskelvärde för irritation och tiden för de första 
tecknen (se punkterna 11–13). Motivering för valet av koncentration ska 
anges. 
5. Döende djur eller djur som visar tecken på uppenbar smärta eller svårt och 
ihållande lidande ska avlivas skonsamt. Döende djur betraktas på samma 
sätt som de som dör under testet. Kriterier för att ta beslutet att avliva 
döende eller svårt lidande djur, och vägledning om hur man känner igen tecken på förutsägbar eller annalkande död, omfattas i OECD:s vägled ­
ningsdokument om humana endpoints (3).
 
METODBESKRIVNING  
Val av djurart  
6. I testet bör friska unga vuxna gnagare användas av stammar som vanligtvis 
används på laboratorier. För detta test används råtta. Motivering ska ges om 
annan art används.  
Förberedelse av djuren  
7. Honorna ska inte ha fått ungar och inte vara dräktiga. På dagen för rando ­
miseringen bör djuren vara unga vuxna 7 till 9 veckor gamla. Kroppsvikten 
bör ligga inom ± 20 % av medelvikten för vardera könet. Djuren väljs ut 
slumpvis och märks för individuell identifikation, och får därefter ackli ­
matisera sig till laboratoriets betingelser i sina burar i minst fem dagar före teststarten.
 
Djurhållning  
8. Djuren bör identifieras individuellt, om möjligt med subkutana transpondrar 
för att underlätta observationer och undvika förvirring. Temperaturen i för ­
söksdjurens utrymmen bör vara 22 ± 3 °C. Den relativa fuktigheten bör 
ligga mellan 30 och 70 %, även om detta kanske inte är möjligt när vatten 
används som vehikel. Före och efter exponeringen bör djuren inhysas i grupper avhängigt kön och koncentration, dock får antalet djur per bur inte hindra en tydlig observation av varje enskilt djur, och förluster genom 
kannibalism och slagsmål bör minimeras. Om endast djurens nosar ska 
exponeras kan det vara nödvändigt att de får acklimatisera sig till fasthåll ­
ningsrören. Fasthållningsrören ska inte medföra onödig fysisk, termisk eller fasthållningsstress för djuren. Fasthållning kan påverka fysiologiska endpo ­
ints såsom kroppstemperatur (hypotermi) och/eller minimala respiratoriska 
volymer. Om det finns generiska data tillgängliga som inte pekar på sådana förändringar i någon nämnvärd omfattning är det inte nödvändigt med anpassningen till rören före exponeringen. Djur vars hela kroppar ska ex ­
poneras för en aerosol ska inhysas individuellt under exponeringen för att 
förhindra att de andra djuren i buren filtrerar aerosolen genom sina pälsar. För utfodringen kan konventionellt laboratoriefoder användas, utom under exponeringen, tillsammans med en obegränsad tillgång till vatten. Belys ­
ningen bör vara artificiell med omväxlande 12 timmar ljus och 12 timmar 
mörker.
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 289
 
Inhalationskammare  
9. Vid val av inhalationskammare bör man beakta kemikaliens beskaffenhet 
och ändamålet med testet. Det föredragna exponeringssättet är enbart nos 
(termen inkluderar även enbart huvud, enbart nos eller enbart tryne). Ex ­
ponering av enbart nos föredras i allmänhet vid studier av vätskor och fasta aerosoler och ånga som kan kondenseras och bilda aerosoler. Vissa av 
undersökningens mål kan bättre uppnås genom exponering av hela kroppen, 
men detta ska motiveras i undersökningsrapporten. För att säkerställa atmo ­
sfärisk stabilitet vid användningen av en helkroppskammare ska den totala ”volymen” försöksdjur inte överskrida 5 % av kammarens volym. Tek ­
nikerna för enbart nos och helkroppsexponeringens deras principer och sär ­
skilda för- och nackdelar behandlas i GD 39 (2).
 
TOXICITETSSTUDIER  
Koncentrationsgränser  
10. Till skillnad från akuta studier finns det inga fastställda koncentrationsgrän ­
ser i 28-dagarsstudier av subakut inhalationstoxicitet. För den högsta testade koncentrationen bör man beakta: 1) högsta möjliga koncentration, 2) värsta tänkbara fall av mänsklig exponering, 3) behovet av att ge en tillräcklig 
syretillförsel och/eller 4) djurskyddsskäl. I avsaknad av databaserade grän ­
svärden får de akuta gränsvärdena i förordning (EG) nr 1272/2008 (13) användas (dvs. upp till en högsta koncentration av 5 mg/l för aerosoler, 20 mg/l för ångor och 20 000 ppm för gaser), se GD 39 (2). Motivering ska 
ges om det är nödvändigt att överskrida dessa gränsvärden vid testning av 
gaser eller mycket flyktiga testkemikalier (t.ex. köldmedier). Koncent ­
rationsgränsen bör framkalla tydlig toxicitet utan att utsätta djuren för onö ­
dig stress eller påverka deras livslängd (3).
 
Spännviddsstudie  
11. Innan huvudstudien påbörjas kan det vara nödvändigt att genomföra en 
spännviddsstudie. En spännviddsstudie är mer omfattande än en inledande 
studie eftersom den inte är begränsad till valet av koncentration. Kunskap 
från en spännviddsstudie kan leda till en lyckad huvudstudie. En spänn ­
viddsstudie kan till exempel ge teknisk information om analysmetoder, partikeldimensionering, upptäckt av toxiska mekanismer, klinisk patologi- 
och histopatologidata, och en uppskattning av vad som kan vara NOAEL- 
och MTC-koncentrationer i en huvudstudie. Försöksledaren kan välja att använda en spännviddsstudie för att identifiera tröskelvärdet för irritation i luftvägarna (t.ex. med histopatologi i luftvägarna, lungfunktionstest eller 
lungsköljning), den övre koncentration som tolereras utan att djuren utsätts 
för onödig stress och parametrarna som bäst kännetecknar en testkemikalies toxicitet. 
12. En spännviddsstudie kan bestå av en eller flera koncentrationsnivåer. Inte 
fler än tre hanar och tre honor ska exponeras vid varje koncentrationsnivå. En spännviddsstudie ska pågå under minst 5 dagar och vanligtvis inte mer än i 14 dagar. Motiveringen för valet av koncentrationer till huvudstudien 
ska ges i undersökningsrapporten. Syftet med huvudstudien är att påvisa ett 
koncentration-respons-förhållande baserat på vad som förväntas vara den mest känsliga endpointen. Den låga koncentrationen bör helst vara en kon ­
centration utan en påvisbar skadlig effekt medan den höga koncentrationen 
bör framkalla tydlig toxicitet utan att utsätta djuren för onödig stress eller 
påverka deras livslängd (3).
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 290
 
13. Vid valet av koncentrationsnivåer för spännviddsstudien bör all tillgänglig 
information beaktas, inklusive struktur-aktivitetsförhållanden samt data för 
liknande kemikalier (se punkt 3). En spännviddsstudie kan verifiera/motbe ­
visa vad som anses vara de endpoints som är mest mekanistiskt baserade, t.ex. kolinesterasinhibition av organiska fosforföreningar, methemoglobin ­
bildning av erytrocytotoxiska agens, sköldkörtelhormoner (T
 3 , T 4 ) för ty­
reotoxiska ämnen, protein, LDH eller neutrofiler i bronkialsköljning för ofarliga svårlösliga partiklar eller lungretande aerosoler.
 
Huvudstudie  
14. Huvudstudien för subakut toxicitet består i allmänhet av tre koncentrations ­
nivåer och även samtidiga negativa (luft) och/eller vehikelkontroller efter 
behov (se punkt 17). Alla tillgängliga data bör användas för att underlätta valet av lämpliga exponeringsnivåer, inklusive resultaten från de syste ­
matiska toxicitetsstudierna, metabolism och kinetik (särskild vikt bör läggas 
vid att undvika höga koncentrationsnivåer som mättar kinetiska processer). Varje testgrupp består av minst 10 gnagare (5 hanar och 5 honor) som exponeras för testkemikalien 6 timmar per dag 5 dagar per vecka under 
en period på 4 veckor (total studielängd 28 dagar). Djuren kan också 
exponeras 7 dagar per vecka (t.ex. vid testning av läkemedel som inhaleras. Om ett kön är känt för att vara mer mottagligt för en viss testkemikalie kan könen exponeras vid olika koncentrationsnivåer för att optimera koncent ­
rationsresponsen enligt beskrivningen i punkt 15. Om andra gnagare än 
råttor exponeras enbart nos, får maximala exponeringstider justeras för att minska artspecifikt lidande. En motivering bör ges när man använder en kortare exponeringstid än 6 timmar/dag, eller när det är nödvändigt att 
utföra en helkroppsexponeringsstudie med lång varaktighet (t.ex. 22 timmar/ 
dag) (se GD 39 (2)). Inget foder ska ges under exponeringsperioden, om den inte överskrider 6 timmar. Vatten kan tillhandahållas under en hel ­
kroppsexponering. 
15. Den målkoncentration som valts ska identifiera målorgan(en) och påvisa en 
tydlig koncentrationsrespons: 
— Den höga koncentrationsnivån bör leda till toxiska effekter, men inte 
orsaka kvardröjande tecken eller dödlighet, vilket kan förhindra en me ­
ningsfull utvärdering. 
— Den mellanliggande koncentrationsnivån(erna) bör spridas ut för grade ­
ring av toxiska effekter mellan den låga och höga koncentrationen. 
— Den låga koncentrationsnivån bör frambringa få eller inga belägg för 
toxicitet.
 
Satellitstudie (reversibilitet)  
16. En satellitstudie (reversibilitet) kan användas för att observera reversibilitet, 
persistens eller fördröjd toxicitet för en efterbehandlingsperiod av lämplig 
längd, dock inte mindre än 14 dagar. Satellitgrupper (reversibilitet) består av fem hanar och fem honor som exponeras samtidigt med försöksdjuren i huvudstudien. Satellitstudiegrupper bör exponeras för testkemikalien vid 
den högsta koncentrationsnivån och det bör finnas samtidiga luft- och/eller 
vehikelkontroller efter behov (se punkt 17).
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 291
 
Kontrolldjur  
17. Samtidiga negativa (luft-) kontrolldjur bör hanteras på ett sätt som är iden ­
tiskt med djuren i testgruppen, förutom att de exponeras för filtrerad luft i 
stället för testkemikalien. När vatten eller annat ämne används för att ge ­
nerera testatmosfären bör en vehikelkontrollgrupp i stället för en negativ (luft-) kontrollgrupp ingå i studien. Vatten bör användas som vehikel när ­
helst det är möjligt. När vatten används som vehikel bör kontrolldjuren 
exponeras för luft med samma relativa fuktighet som de exponerade grup ­
perna. Valet av en lämplig vehikel bör grunda sig på en lämpligt utförd förstudie eller historiska data. Om en vehikels toxicitet inte är känd kan 
försöksledaren välja att använda både en negativ (luft-) kontroll och en 
vehikelkontroll, men det rekommenderas inte. Om historiska data visar att en vehikel inte är toxisk finns det inget behov av en negativ (luft-) kontroll ­
grupp och då bör endast en vehikelkontroll användas. Om en förstudie av 
en testkemikalie som beretts i en vehikel inte visar någon toxicitet, framgår 
det att vehikeln inte är toxisk vid den testade koncentrationen och att denna vehikelkontroll bör användas.
 
EXPONERINGSBETINGELSER  
Administration av koncentrationer  
18. Djur exponeras för testkemikalien som en gas, ånga, aerosol eller en bland ­
ning av dem. Det fysikaliska tillstånd som ska testas beror på testkemika ­
liens fysikalisk-kemiska egenskaper, vald koncentration och/eller dess mest 
sannolika fysikaliska form vid hanteringen och användningen. Hygrosko ­
piska och kemiskt reaktiva testkemikalier ska testas i torr luft. Det är viktigt att se till att inga explosiva koncentrationer skapas. För att minska partikels ­
torleken kan partikelmaterialet utsättas för mekaniska processer. Mer väg ­
ledning finns i GD 39 (2).
 
Partikelstorleksfördelning  
19. Partikeldimensionering bör utföras för alla aerosoler och ångor som kan 
kondenseras och bilda aerosoler. För att möjliggöra exponering av alla 
relevanta områden i luftvägarna, rekommenderas aerosoler med en aero ­
dynamisk diameter (MMAD) i intervallet 1 till 3 μm med en geometrisk 
standardavvikelse ( σ g ) i intervallet 1,5 till 3,0 (4). Även om en rimlig 
ansträngning krävs för att uppfylla denna standard, bör en sakkunnig be ­
dömning ges om detta inte kan uppnås. Till exempel kan rökpartiklar av metall vara mindre än denna standard, och laddade partiklar och fibrer kan överstiga den.
 
Beredning av testkemikalie i en vehikel  
20. Testkemikalien ska helst testas utan en vehikel. Om det är nödvändigt att 
använda en vehikel för att generera en lämplig koncentration och partikels ­
torlek av testkemikalien, bör vatten ges företräde. Närhelst en testkemikalie 
är upplöst i en vehikel ska dess stabilitet påvisas.  
ÖVERVAKNING AV EXPONERINGSFÖRHÅLLANDEN  
Kammarens luftflöde  
21. Luftflödet genom exponeringskammaren ska omsorgsfullt kontrolleras, kon ­
tinuerligt övervakas och registreras minst en gång i timmen under varje 
exponering. Övervakningen i realtid av testatmosfärens koncentration (eller temporal stabilitet) är en integrerad mätning av samtliga dynamiska para ­
metrar och ger ett indirekt sätt att kontrollera alla relevanta dynamiska 
inhalationsparametrar. Om koncentrationen övervakas i realtid kan mätfre ­
kvensen för luftflöden minskas till en enda mätning per exponeringsdag.
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 292
 
Särskild hänsyn bör tas för att undvika återandning i enbart nos-kammare. 
Syrehalten bör vara minst 19 % och koncentrationen av koldioxid bör inte 
överstiga 1 %. Om det finns anledning att tro att denna standard inte kan uppfyllas bör man mäta koncentrationen av syre och koldioxid. Om mät ­
ningar under den första exponeringsdagen visar att dessa gaser har korrekta 
nivåer behöver inga fler mätningar utföras.
 
Kammarens temperatur och relativa fuktighet  
22. Kammarens temperatur bör upprätthållas vid 22 ± 3 °C. Relativ fuktighet i 
djurens andningszoner, för både enbart nos och helkroppsexponering, bör om möjligt övervakas kontinuerligt och registreras varje timme för varje exponering. Den relativa fuktigheten bör helst upprätthållas inom intervallet 
30 till 70 %, men detta kanske inte är möjligt (t.ex. vid testning av vatten ­
baserade blandningar), eller inte mätbart på grund av att testkemikalien stör själva testmetoden.
 
Testkemikalie: nominell koncentration  
23. När det är möjligt bör den nominella koncentrationen i exponeringskamma ­
ren beräknas och registreras. Den nominella koncentrationen är massan av 
den genererade testkemikalien dividerad med den totala volymen av luft 
som passerade genom inhalationskammarsystemet. Den nominella koncent ­
rationen används inte för att karakterisera djurens exponering, men en jäm ­
förelse mellan den nominella koncentrationen och den faktiska koncentratio ­
nen ger en indikation på testsystemets genereringsprestanda, och kan där ­
med användas för att upptäcka genereringsproblem.  
Testkemikalie: faktisk koncentration  
24. Den faktiska koncentrationen är testkemikaliekoncentrationen som samlats 
in i djurets andningsområde i en inhalationskammare. Faktiska koncentratio ­
ner kan erhållas antingen genom särskilda metoder (t.ex. direkt provtagning, 
adsorptiva eller kemiskt reaktiva metoder, och efterföljande analytisk karak ­
terisering) eller genom icke-specifika metoder såsom gravimetrisk filterana ­
lys. Användningen av gravimetrisk analys är endast acceptabel för pulver ­
aerosoler bestående av en enda komponent eller aerosoler bestående av 
vätskor med låg flyktighet, och bör stödjas av en lämplig preklinisk studie 
med kemikaliespecifik karakterisering. Koncentrationen i pulveraerosoler bestående av flera komponenter kan också bestämmas genom gravimetrisk analys. Detta kräver dock analysresultat som visar att sammansättningen av 
luftburet material liknar startmaterialet. Om denna information inte finns 
tillgänglig kan det vara nödvändigt med en ny analys av testkemikalien (helst i sitt luftburna tillstånd) under loppet av studien. För medel i aero ­
solform som kan förångas eller sublimeras bör man kunna visa att samtliga 
faser uppsamlades med den valda metoden. 
25. En sats av testkemikalien ska användas genom hela studien, om möjligt, 
och provet ska lagras under sådana förhållanden att det bibehåller sin ren ­
het, homogenitet och stabilitet. Inför starten av studien bör det finnas en beskrivning av testkemikalien som inbegriper dess renhet och, om det är 
tekniskt genomförbart, identitet, och kvantiteterna av identifierade förore ­
ningar och orenheter. Detta kan visas genom, men är inte begränsat till, följande data: retentionstid och relativ topparea, molekylvikt från masspek ­
troskopi eller gaskromatografianalys, eller andra uppskattningar. Även om 
testlaboratoriet inte ansvarar för provets identitet kan det vara klokt att man 
i stora drag bekräftar karakteriseringen (t.ex. färg, fysisk natur etc.).
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 293
 
26. Exponeringsatmosfären ska hållas så konstant som möjligt. En enhet för 
realtidsövervakning, såsom en aerosolfotometer för aerosoler eller en ana ­
lysator för totalkolväte för ångor kan användas för att påvisa stabilitet hos exponeringsförhållandena. Faktisk kammarkoncentration bör mätas minst 3 gånger varje exponeringsdag vid varje exponeringsnivå. Om det inte är 
möjligt på grund av begränsade luftflöden eller låga koncentrationer, är 
det acceptabelt med ett prov per exponeringsperiod. Helst ska detta prov sedan samlas in under hela exponeringsperioden. Provtagning av kammark ­
oncentrationer från individuella kammare bör inte avvika från den genom ­
snittliga koncentrationen med mer än ± 10 % för gaser och ångor, och inte 
med mer än ± 20 % för flytande eller fasta aerosoler. Tid för att uppnå kammarjämvikt (t
 95 ) bör beräknas och rapporteras. Varaktigheten för en 
exponering sträcker sig över den tid som testkemikalien genereras. Detta 
tar hänsyn till den tid som krävs för att uppnå kammarens jämvikt (t  95 ) och 
sönderfall. Riktlinjer för att uppskatta t  95 finns i GD 39 (2). 
27. För mycket komplexa blandningar bestående av gaser/ångor och aerosoler 
(t.ex. förbränningsatmosfärer och testkemikalier framdrivna från därför av ­
sedd slutanvändningsprodukt/-utrustning) kan varje fas bete sig olika i en inhalationskammare. Därför ska minst ett indikatorämne väljas (analyt), vanligtvis det huvudsakliga aktiva ämnet i blandningen för varje fas (gas/ 
ånga och aerosol). När testkemikalien är en blandning ska den analytiska 
koncentrationen i totalblandningen rapporteras, inte bara den aktiva ingre ­
diensen eller indikatorämnet (analyten). Ytterligare information om faktisk koncentration finns i GD 39 (2).
 
Testkemikalie: partikelstorleksfördelning  
28. Aerosolers partikelstorleksfördelning bör fastställas minst en gång i veckan 
för varje koncentrationsnivå med hjälp av en kaskadimpaktor eller ett al ­
ternativt instrument såsom en aerodynamisk partikelsorterare (APS). Om 
man kan visa ett likvärdigt resultat från en kaskadimpaktor och det alter ­
nativa instrumentet, kan man använda det sistnämnda under hela studien. 
29. En andra enhet, till exempel ett gravimetriskt filter eller en impinger/gas ­
bubblare, bör användas parallellt med det primära instrumentet för att be ­
kräfta uppsamlingsprestandan hos det primära instrumentet. Masskoncent ­
rationen som erhållits genom analys av partikelstorleken ska ligga inom 
rimliga gränser för den masskoncentration som erhållits genom filteranalys 
(se GD 39 (2)). Om likvärdigheten kan påvisas för alla koncentrationer som testats i ett tidigt skede av försöket, kan ytterligare bekräftande mätningar utelämnas. Av hänsyn till djurskyddsskäl bör åtgärder vidtas för att mini ­
mera ofullständiga uppgifter som kan leda till att studien måste upprepas. 
30. Partikeldimensionering bör utföras för ångor om det finns en möjlighet att 
kondensen kan bilda en aerosol, eller om partiklar upptäcks i ångatmosfären 
som kan göra så att faserna blandas.
 
IAKTTAGELSER 
31. Djuren bör observeras kliniskt före, under och efter exponeringsperioden. 
Mer frekventa iakttagelser kan indikeras beroende på djurens respons under 
exponeringen. När iakttagelser av djuren hindras genom användning av fasthållningsrör, dåligt upplysta kroppskammare eller ogenomskinlig atmo ­
sfär, bör djuren noga observeras efter exponeringen. Observationer före 
nästa dags exponering kan utvärdera eventuell reversibilitet eller stegrande 
toxiska effekter.
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 294
 
32. Alla observationer registreras med individuell registrering för varje djur. När 
djur avlivas av humanitära skäl eller påträffas döda, ska tidpunkten för 
dödsfallet registreras så noggrant som möjligt. 
33. Observationer vid buren bör omfatta förändringar i hud och päls, ögon och 
slemhinnor, förändringar i andnings- och cirkulationssystemen, förändringar i nervsystemet, samt förändringar i kroppsmotorik och beteendemönster. Uppmärksamhet bör fästas vid iakttagelser av tremor, konvulsioner, salivut ­
söndring, diarré, letargi, sömn och koma. Mätningen av rektala temperaturer 
kan ge belägg för bradypnéreflex eller hypo/hypertermi relaterat till behand ­
ling eller inspärrning. Ytterligare utvärderingar kan inkluderas i studiens protokoll såsom kinetik, biologisk övervakning, lungfunktion, retention av 
svårlösliga ämnen som ackumuleras i lungvävnad, samt beteendeförändring ­
ar.
 
KROPPSVIKT 
34. De enskilda djurens vikt bör registreras strax före den första exponeringen 
(dag 0), därefter två gånger i veckan (till exempel på fredagar och måndagar för att påvisa återhämtning över ett exponeringsfritt veckoslut eller under ett 
tidsintervall för bedömning av systematisk toxicitet), och vid tidpunkten för 
dödsfallet eller avlivningen. Visas inga effekter under de två första veckorna kan kroppsvikterna mätas en gång i veckan för återstoden av studien. Sa ­
tellitdjur (reversibilitet) (om det används) ska fortsätta vägas varje vecka 
under hela återhämtningsperioden. Vid studiens upphörande bör samtliga 
djur vägas strax före avlivningen för en objektiv beräkning av förhållandet organ-kroppsvikt.
 
FÖDO- OCH VATTENINTAG 
35. Födointaget bör mätas varje vecka. Vattenintaget bör också mätas.  
KLINISK PATOLOGI 
36. Kliniska patologiska bedömningar bör göras av samtliga djur, inklusive 
kontroll- och satellitdjur (reversibilitet) när de avlivas. Tidsintervallet mellan exponeringens upphörande och insamlingen av blod ska registreras, i syn ­
nerhet när rekonstitueringen av endpointen är snabb. Provtagning efter att 
exponeringen har upphört indikeras för dessa parametrar med ett kort plas ­
maprov halvtid (t.ex. COHb, CHE och MetHb). 
37. Tabell 1 listar de kliniska patologiska parametrar som i allmänhet krävs för 
alla toxikologiska studier. Urinanalys krävs inte rutinmässigt, men kan ut ­
föras när det bedöms lämpligt utifrån förväntad eller observerad toxicitet. 
Försöksledaren kan välja att bedöma ytterligare parametrar för att bättre 
kunna karakterisera en testkemikalies toxicitet (t.ex. kolinesteras, lipider, hormoner, syra/bas-balans, methemoglobin eller Heinz-kroppar, kreatinki ­
nas, myeloid/erytroid-förhållande, troponiner, arteriella blodgaser, laktatde ­
hydrogenas, sorbitoldehydrogenas, glutamatdehydrogenas och gamma-gluta ­
myltranspeptidas).
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 295
 
Tabell 1  
Standardiserade parametrar för klinisk patologi  
Hematologi  
Erytrocytantal 
Hematokrit Hemoglobinkoncentration Medelvärde för korpuskulärt hemoglo ­
bin 
Medelvärde för korpuskulär volym Medelvärde för korpuskulär hemoglo ­
binkoncentration 
Retikulocyter Totalt antal leukocyter 
Differentalt leukocytantal Trombocytantal Koaguleringsförmåga (välj ett al ­
ternativ): 
— Protrobintid — Koagulationstid — Partiell tromboplastintid
 
Klinisk kemi  
Glukos (*) 
Totalkolesterol Triglycerider 
Blodureakväve 
Total bilirubin Kreatinin Totalprotein 
Albumin 
Globulin Alaninaminotransferas 
Aspartataminotransferas Alkaliskt fosfatas 
Kalium 
Natrium Kalcium Fosfor 
Klorid
 
Urinalys (valfritt)  
Utseende (färg och grumlighet) 
Volym 
Specifik vikt eller osmolalitet 
pH Totalprotein 
Glukos 
Blod/blodceller  
(*) Eftersom en lång fasteperiod kan införa partiskhet i glukosmätningar för de be ­
handlade djuren jämfört med kontrolldjuren, bör försöksledaren avgöra om det är 
lämpligt att djuren fastar. Om man använder en fasteperiod bör den vara avpassad 
för den art som används, för råtta kan det vara 16 timmar (fastande över natten). 
Bestämning av fasteglukos kan utföras efter en natts fasta under den sista expo ­
neringsveckan, eller efter en natts fasta innan obduktionen (i det senare fallet 
tillsammans med alla andra kliniska patologiska parametrar).  
38. När det finns bevis på att de nedre luftvägarna (dvs. alveolerna) är den 
främsta platsen för deponering och lagring, då kan lungsköljning vara det 
tekniska valet för att kvantitativt analysera hypotesbaserade doseffektpara ­
metrar med fokus på alveolit, lunginflammation och fosfolipidos. Detta gör att dosrespons och tidsförloppsförändringar för alveolär skada grundligt kan undersökas. BAL-vätskan kan analyseras för totalt och differentiellt leuko ­
cytantal, totalprotein och laktatdehydrogenas. Andra parametrar som kan 
beaktas är de som tyder på lysosomal skada, fosfolipidos, fibros, och irri ­
terande eller allergisk inflammation som kan innefatta bestämning av pro-inflammatoriska cytokiner/kemokiner. BAL-mätningar kompletterar i 
allmänhet resultaten från histopatologiska undersökningar, men kan dock 
inte ersätta dem. Vägledning om hur man utför lungsköljning finns i GD 39 (2).
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 296
MAKROSKOPISK PATOLOGI OCH ORGANVIKTER 
39. Samtliga försöksdjur, inklusive de som avlider under testet eller avlivas och 
tas bort från undersökningen av djurskyddsskäl, bör underkastas fullständig 
blodtömning (om möjligt) och obduceras. Tidsperioden mellan slutfasen av varje djurs exponering och avlivandet av dem ska registreras. Om en ob ­
duktion inte kan utföras omedelbart efter att ett dött djur påfunnits, bör 
djuret kylas (inte frysas) vid en temperatur som är tillräckligt låg för att 
minimera autolys. Obduktioner ska utföras så snart som möjligt, vanligtvis inom en dag eller två. Alla betydande patologiska förändringar bör registre ­
ras för varje djur med särskild uppmärksamhet på eventuella förändringar i 
luftvägarna. 
40. Tabell 2 visar de organ och vävnader som bör bevaras i ett lämpligt me ­
dium under obduktion för histopatologisk undersökning. Bevarandet av organ och vävnader [inom hakparentes] och eventuellt andra organ och vävnader avgörs av försöksledaren. Organen i  fetstil  ska putsas och vägas 
våta så snart som möjligt efter dissektionen för att undvika uttorkning. 
Sköldkörteln och bitestiklarna bör endast vägas om det behövs, eftersom trimning av artefakter kan hindra en histopatologisk utvärdering. Vävnader och organ bör fixeras i 10 % buffrad formalin eller annat lämpligt fixativ så 
snart obduktionen utförts, och inte mindre än 24–48 timmar före trimning 
beroende på det fixativ som ska användas.
 
Tabell 2  
Organ och vävnader som bevaras vid obduktion 
Binjurar  
Benmärg (och/eller färskt aspirat)  
Hjärna  (inklusive delar av cerebrum, cere ­
bellum och medulla/pons) 
(Ögon [retina, synnerv] och ögonlock)  
Hjärta 
Njurar  
Larynx (3 nivåer, 1 nivå för att inkludera 
basen på epiglottis)  
Lever 
Lungor  (alla lober på en nivå, inklusive hu ­
vudbronker) 
Lymfkörtlar från lungans hilarregion, särskilt 
beträffande svårlösliga partikeltestkemikalier. För mer ingående undersökningar och/eller studier med immunologi i fokus kan ytterli ­
gare lymfkörtlar beaktas, t.ex. de från de me ­
diastinala, cervikala/submandibulära och/eller aurikulära regionerna. 
Nasofaryngeala vävnader (minst 4 nivåer; 1 
nivå för att inkludera den nasofaryngeala ka ­
nalen och den nasalassocierade 
lymfvävnaden (NALT) Esofagus 
[Luktbulb] 
Äggstockar Sädesblåsor Ryggmärg (cervikala, mitt på bröstkorgen 
och ländryggen)  
Mjälte  
Mage  
Testiklar Tymus  
Sköldkörtel Luftstrupe (minst 2 nivåer inklusive 1 längd ­
snitt genom carina och 1 tvärsnitt) 
[Urinblåsa] Uterus Alla större skador
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 297
 
41. Lungorna bör avlägsnas intakta, vägas och indränkas med lämpligt fixativ 
vid ett tryck på 20–30 cm vatten för att säkerställa att lungstrukturen bibe ­
hålls (5). Sektioner bör samlas in för alla lober på en nivå, inklusive huvud ­
bronker, men om lungsköljning utförs ska den osköljda loben sektioneras på tre nivåer (ej seriella sektioner). 
42. Minst 4 nivåer av de nasofaryngeala vävnaderna bör undersökas, varav en 
ska innehålla den nasofaryngeala kanalen, (5, 6, 7, 8, 9) för en adekvat 
undersökning av den skvamösa, mellanliggande (icke-cilierade respiratoris ­
ka), respiratoriska (cilierade respiratoriska) och luktepitelet, samt den drä ­
nerade lymfvävnaden (NALT; 10, 11). Tre nivåer av struphuvudet bör 
undersökas, och en av dessa nivåer bör inkludera struplockets bas (12). Minst två nivåer av luftstrupen bör undersökas, inklusive ett längdsnitt genom förgreningen av carinan för de extrapulmonella bronkerna, samt 
ett tvärsnitt.
 
HISTOPATOLOGI 
43. En histopatologisk utvärdering av alla organ och vävnader som räknas upp i 
tabell 2 bör utformas för kontroll- och högkoncentrationsgrupperna och för alla djur som dör eller avlivas under studien. Särskild uppmärksamhet bör 
ges åt luftvägarna, målorganen och större skador. Organ och vävnader som 
har skador i högkoncentrationsgruppen bör undersökas i alla grupper. För ­
söksledaren kan välja att utföra histopatologiska utvärderingar av flera grup ­
per för att påvisa en tydlig koncentrationsrespons. Om en satellitgrupp 
(reversibilitet) används bör en histopatologisk utvärdering göras av samtliga 
vävnader och organ där effekter visats i de behandlade grupperna. Om det finns alltför många tidiga dödsfall eller andra problem i högkoncentrations ­
gruppen som äventyrar datans signifikans, bör nästa lägre koncentration 
undersökas histopatologiskt. Ett försök bör göras att korrelera större obser ­
vationer i relation till mikroskopiska fynd.
 
DATA OCH RAPPORTERING  
Data  
44. Individuella data om djurens kroppsvikt, födointag, klinisk patologi, mak ­
roskopisk patologi, organvikter och histopatologi ska lämnas. Kliniska ob ­
servationsdata bör sammanfattas i tabellform, som för varje testgrupp visar antalet djur som använts, antalet djur som visar tecken på toxicitet, antalet djur som avlidit under testet eller som avlivats av humanitära skäl, tidpunk ­
ten då det enskilda djuret har avlidit, beskrivning och tidsförlopp för toxiska 
verkningar och reversibilitet, samt obduktionsfynd. Samtliga resultat, kvan ­
titativa och tillfälliga, ska utvärderas genom en lämplig statistisk metod. En allmänt vedertagen statistisk metod kan användas, och statistiska metoderna 
bör väljas under studiens utformning.
 
Testrapport  
45. Testrapporten ska omfatta följande information, när så är lämpligt:  
Försöksdjur och djurhållning  
— Beskrivning av burförhållanden, inklusive antal (eller förändring av an ­
tal) djur per bur, strö, omgivningstemperatur och relativ fuktighet, ljus ­
period och identifiering av kost.  ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 298
 
— Art/stam som används och motivering för att använda andra arter än 
råtta. Källor och historiska data kan ges om de kommer från djur som 
har exponerats under liknande exponering, inhysning och fastebeting ­
elser. 
— Djurens antal, ålder och kön. 
— Metod för randomisering. 
— Beskrivning av eventuella förtestbetingelser inbegripet kost, karantän 
och behandling av sjukdomar.  
Testkemikalie  
— Fysikalisk natur, renhet och, i förekommande fall, fysikalisk-kemiska 
egenskaper (inbegripet isomerisering). 
— Identifieringsdata och CAS-nummer (Chemical Abstract Services), om 
detta är känt.  
Vehikel  
— Motivering för användning av vehikel och valet av vehikel (om annat än 
vatten). 
— Historiska eller parallella data som visar att vehikeln inte påverkar stud ­
iens slutresultat.  
Inhalationskammare  
— Detaljerad beskrivning av inhalationskammaren inklusive volym och ett 
diagram. 
— Ursprung och beskrivning av utrustning som används för exponering av 
djur så väl som generering av atmosfären. 
— Utrustning för mätning av temperatur, fuktighet, partikelstorlek och fak ­
tisk koncentration. 
— Luftkälla och system som används för konditionering. 
— Metoder som används för kalibrering av utrustning för att säkerställa en 
homogen testatmosfär. 
— Tryckskillnad (positiv eller negativ). — Exponeringsportar per kammare (enbart nos), placering av djur i kam ­
maren (helkropp). 
— Testatmosfärens stabilitet. 
— Placering av temperatur- och fuktighetsgivare och provtagning av tes ­
tatmosfären i kammaren. 
— Behandling av luft som tillförs/extraheras. — Luftflödeshastigheter, port för luftflöde och exponering (enbart nos), 
eller djurbelastning och kammare (helkropp). 
— Tid tills inhalationskammaren har nått jämvikt (t95). 
— Antal volymutbyten per timme. 
— Mätutrustning (i förekommande fall).  
Exponeringsdata  
— Grund för valet av målkoncentration i huvudstudien.
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 299
 
— Nominella koncentrationer (den totala massan av testkemikalien som 
genereras i inhalationskammaren dividerad med luftvolymen som pas ­
serar genom kammaren). 
— Faktiska koncentrationer av testkemikalien som uppsamlats från djurens 
andningsapparat, för blandningar som bildar heterogena fysikaliska for ­
mer (gaser, ångor, aerosoler), där var och en analyseras separat. 
— Alla luftkoncentrationer bör redovisas i massenheter (mg/l mg/m  3 , etc.) 
snarare än volymenheter (ppm, ppb, etc.). 
— Partikelstorleksfördelning, aerodynamisk massmediandiameter (MMAD) 
och geometrisk standardavvikelse ( σ g ), inklusive metoderna för deras 
beräkning. Individuella partikelstorleksanalyser bör rapporteras.  
Testbetingelser  
— Uppgifter om testkemikalieberedning, inklusive uppgifter om eventuella 
procedurer som använts för att minska partikelstorlekarna hos fasta ämnen eller för att bereda testlösningar. 
— En beskrivning (helst med ett diagram) av utrustningen som används för 
att generera testatmosfären och för att exponera djuren för denna atmo ­
sfär. 
— Uppgifter om den utrustning som används för att övervaka kammarens 
temperatur, fuktighet och luftflöde (dvs. utarbetningen av en kalibre ­
ringskurva). 
— Uppgifter om den utrustning som används för att samla in prover för 
bestämning av kammarens koncentration och partikelstorleksfördelning. 
— Uppgifter om den kemiska analysmetod som används och metodvalide ­
ring (inklusive effektiviteten för återvinningen av testkemikalien från provtagningsmediet). 
— Metod för randomisering av djur till test- och kontrollgrupper. 
— Uppgifter om foder- och vattenkvalitet (inbegripet kosttyp/-källa och 
vattenförsörjning). 
— Grunden för valet av testkoncentration.  
Resultat  
— Tabelluppställning av kammarens temperatur, fuktighet och luftflöde. 
— Tabelluppställning av kammarens nominella och faktiska koncent ­
rationsdata. 
— Tabelluppställning av partikelstorleksdata som omfattar provtagnings ­
data, partikelstorleksfördelning och beräkning av MMAD och σ
 g. 
— Tabelluppställning av responsdata och koncentrationsnivåer för varje 
djur (dvs. djur som uppvisar tecken på toxicitet inklusive mortalitet, 
natur, allvarlighetsgrad, tidpunkt för första tecknet och effekternas var ­
aktighet).  ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 300
 
— Tabelluppställning av de enskilda djurens vikt. 
— Tabelluppställning av födointag. 
— Tabelluppställning av kliniska patologiska data. 
— Obduktionsfynd och histopatologiska fynd för varje djur, om detta finns 
tillgängligt. 
— Tabelluppställning av eventuella andra uppmätta parametrar.  
Diskussion och tolkning av resultaten  
— Särskild uppmärksamhet bör ges till beskrivningen av metoderna som 
används för att uppfylla kriterierna för denna testmetod t.ex. koncent ­
rationsgräns eller partikelstorlek. 
— Partiklarnas andningsbarhet i ljuset av de övergripande resultaten bör 
behandlas, särskilt om kriterierna för partikelstorlek inte kunde uppfyl ­
las. 
— Överensstämmelsen mellan metoderna som används för att bestämma 
nominell och faktisk koncentration, och förhållandet mellan faktisk och 
nominell koncentration bör ingå i den samlade bedömningen av studien. 
— Den sannolika dödsorsaken och dominerande verkningsmekanism (sy ­
stematisk mot lokal) bör behandlas. 
— En förklaring bör ges om det fanns behov av att avliva djur, som visade 
tecken på uppenbar smärta eller svårt och ihållande lidande, av huma ­
nitära skäl på grundval av kriterierna i OECD:s vägledningsdokument om humana endpoints (3). 
— Målorganet(en) bör identifieras. 
— NOAEL och LOAEL bör bestämmas.
 
LITTERATUR  
(1) OECD (1981). Subchronic Inhalation Toxicity Testing, Original Test Gui ­
deline No 412, Environment Directorate, OECD, Paris. 
(2) OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing, 
Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assess ­
ment No. 39, ENV/JM/MONO(2009)28, OECD, Paris. 
(3) OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and 
Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used 
in Safety Evaluation, Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Paris. 
(4) Whalan JE and Redden JC (1994). Interim Policy for Particle Size and 
Limit Concentration Issues in Inhalation Toxicity Studies. Office of Pes ­
ticide Programs, United States Environmental Protection Agency. 
(5) Dungworth DL, Tyler WS, Plopper CE (1985). Morphological Methods for 
Gross and Microscopic Pathology (Chapter 9) in Toxicology of Inhaled Material, Witschi, H.P. and Brain, J.D. (eds), Springer Verlag Heidelberg, s. 229–258. 
(6) Young JT (1981). Histopathological examination of the rat nasal cavity. 
Fundam. Appl. Toxicol. 1: 309–312. 
(7) Harkema JR (1990). Comparative pathology of the nasal mucosa in lab ­
oratory animals exposed to inhaled irritants. Environ. Health Perspect. 85: 
231–238.
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 301
 
(8) Woutersen RA, Garderen-Hoetmer A, van Slootweg PJ, Feron VJ (1994). 
Upper respiratory tract carcinogenesis in experimental animals and in hu ­
mans. I: Waalkes MP and Ward JM (eds) Carcinogenesis. Target Organ Toxicology Series, Raven Press, New York, 215–263. 
(9) Mery S, Gross EA, Joyner DR, Godo M, Morgan KT (1994). Nasala 
diagram: A tool for recording the distribution of nasal lesions in rats and 
mice. Toxicol. Pathol. 22: 353–372. 
(10) Kuper CF, Koornstra PJ, Hameleers DMH, Biewenga J, Spit BJ, Duijvestijn 
AM, Breda Vriesman van PJC, Sminia T (1992). The role of nasopha ­
ryngeal lymphoid tissue. Immunol. Today 13: 219–224. 
(11) Kuper CF, Arts JHE, Feron VJ (2003). Toxicity to nasal-associated lymp ­
hoid tissue. Toxicol. Lett. 140–141: 281–285. 
(12) Lewis DJ (1981). Mitotic Indices of Rat Laryngeal Epithelia. Journal of 
Anatomy 132(3): 419–428. 
(13) Europaparlamentets och rådets förordning (EG) nr 1272/2008 av den 
16 december 2008 om klassificering, märkning och förpackning av ämnen 
och blandningar, ändring och upphävande av direktiven 67/548/EEG och 
1999/45/EG samt ändring av förordning (EG) nr 1907/2006 (Text av bety ­
delse för EES), EUT L 353, 31.12.2008, s. 1.
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 302
 
Tillägg 1  
DEFINITION  
Testkemikalie:  Alla ämnen eller blandningar som testas med denna testmetod.  ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 303
 
B.9 TOXICITET VID UPPREPAD DOSERING (28 DAGAR, 
DERMALT)  
1. METOD  
1.1 INLEDNING 
Se allmän inledning till del B (A).  
1.2 DEFINITIONER 
Se allmän inledning till del B (B).  
1.3 REFERENSÄMNEN 
Inga.  
1.4 TESTMETODSPRINCIP 
Testämnet appliceras dagligen i graderade doser på huden till flera 
grupper av försöksdjur, varvid varje grupp ges en bestämd dos i 28 
dagar. Under appliceringsperioden observeras djuren dagligen för 
tecken på toxicitet. Djur som dör under testet obduceras, och i slutet av testet avlivas och obduceras de överlevande djuren.
 
1.5 KVALITETSKRITERIER 
Inga.  
1.6 METODBESKRIVNING  
1.6.1  Förberedelser  
I minst fem dagar före testet ska djuren hållas under testbetingelser 
med hänsyn till miljö och utfodring. Före testet fördelas friska unga djur slumpmässigt i behandlings- och kontrollgrupper. Omedelbart 
innan testet inleds ska päls klippas bort från försöksdjurens rygg. 
Om pälsen rakas bort ska detta göras ungefär 24 timmar före testet. Klippning eller rakning behöver vanligtvis upprepas ungefär en gång i veckan. När pälsen klipps eller rakas bort ska försiktighet iakttas så 
att huden inte skadas. Minst 10 % av kroppsytan ska göras klar för 
applicering av testämnet. Vid fastställande av vilket och hur stort område som ska förberedas ska hänsyn tas till djurets kroppsvikt. Vid test av fasta ämnen, som får pulvriseras om det är lämpligt, ska 
testämnet fuktas tillräckligt med vatten eller, vid behov med lämplig 
vehikel, för att säkerställa god kontakt med huden. Flytande testäm ­
nen används vanligen outspädda. Testämnet appliceras dagligen fem till sju dagar i veckan.
 
1.6.2  Testbetingelser  
1.6.2.1  Försöksdjur  
Könsmogna råttor, kaniner eller marsvin får användas. Andra arter 
kan användas men i så fall ska detta motiveras.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 304
 
Vid testets början får vikten hos de aktuella djuren inte avvika mer 
än ± 20 % från en rimlig genomsnittsvikt.  
1.6.2.2  Antal och kön  
Minst 10 djur (fem honor och fem hanar) med frisk hud ska använ ­
das på varje dosnivå. Honorna får inte ha fött ungar och får inte vara dräktiga. Vid planenligt avlivande av djur under testet ska det ur ­
sprungliga antalet djur ökas med det antal djur som planenligt ska 
avlivas innan studien slutförs. Dessutom kan en satellitgrupp bestå ­
ende av 10 djur (fem av vardera könet) tillföras den högsta dosnivån i 28 dagar och därefter observeras i 14 dagar efter testet för reversi ­
bilitet, persistens eller fördröjt uppträdande av toxiska effekter. Även 
en satellitgrupp bestående av 10 kontrolldjur (fem av vardera könet) 
ska användas.
 
1.6.2.3  Dosnivåer  
Till testet ska användas minst tre dosnivåer samt en kontrollgrupp 
eller en vehikelkontroll, om vehikel används. Testämnet ska appli ­
ceras vid samma tid varje dag och dosnivåerna ska justeras med 
jämna mellanrum (varje eller varannan vecka) så att dosnivån hålls konstant i förhållande till djurens kroppsvikt. Djuren i kontrollgrup ­
pen ska behandlas på samma sätt som djuren i behandlingsgruppen, 
bortsett från att de inte ska tillföras testämnet. Om vehikel används 
för att underlätta dosering ska kontrollgruppen tillföras vehikeln på samma sätt som behandlingsgrupperna. Vidare ska vehikeln tillföras kontrollgruppen i samma mängd som till de försöksdjur i gruppen 
som ges den högsta dosnivån. Den högsta dosnivån ska ge toxiska 
effekter men inga eller få dödsfall. Den lägsta dosnivån ska inte ge några tecken på toxicitet. Om det finns en användbar uppskattning av människans exponering för ämnet ska den lägsta nivån vara högre än 
denna. Helst ska medeldosen ge minsta möjliga observerbara toxiska 
effekter. Om fler än en medeldos används ska dosnivåerna väljas på ett sådant sätt att en gradering av de toxiska effekterna erhålls. I 
grupperna som utsätts för låg- och medeldoser och i kontrollgruppen 
ska antalet dödsfall hållas på en låg nivå för att utvärderingen av resultaten ska vara meningsfylld. 
Om appliceringen av testämnet ger allvarlig hudirritation ska kon ­
centrationerna sänkas, vilket kan medföra att andra toxiska effekter 
minskar eller uteblir på högsta dosnivån. Om huden har skadats allvarligt kan det bli nödvändigt att avsluta det pågående testet och påbörja en ny med lägre koncentrationer.
 
1.6.2.4  Gränstest  
Om det vid ett förberedande test fastställs att en dosnivå på 1 000 
mg/kg, eller en högre dosnivå om detta motiveras av kunskap om människans möjliga exponering, inte ger några toxiska effekter kan ytterligare test anses vara överflödiga.
 
1.6.2.5  Observationsperiod  
Försöksdjuren ska observeras dagligen för tecken på toxicitet. Tid ­
punkten för dödsfall och tidpunkten då tecken på toxicitet uppträder 
ska registreras.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 305
 
1.6.3  Förfarande  
Djuren ska hållas i var sin bur. Den ideala doseringen är att djuren 
utsätts för testämnet sju dagar i veckan i 28 dagar. Djur i en even ­
tuell satellitgrupp som planerats för uppföljning ska observeras i 
ytterligare 14 dagar utan tillförsel av testämnet så att det kan fast ­
ställas om de toxiska effekterna försvinner eller om de håller i sig. Exponeringstiden ska vara minst sex timmar per dag. 
Testämnet ska appliceras jämnt över ett område som motsvarar un ­
gefär 10 % av den totala kroppsytan. Med starkt toxiska ämnen kan 
testområdet vara mindre men så stor del av området som möjligt ska täckas med ett så tunt och jämnt fördelat lager som möjligt. 
Under exponeringen ska testämnet hållas i kontakt med huden med 
en porös kompress och icke hudirriterande tejp. Testområdet ska vidare täckas på lämpligt sätt så att gaskompressen och testämnet hålls på plats och djuren inte kan inta testämnet. För att förhindra 
intag av testämnet kan rörelsehindrande anordningar användas men 
total immobilisering rekommenderas inte. Alternativt kan en ’s ­
kyddskrage’ användas. 
I slutet av exponeringsperioden ska kvarvarande testämne avlägsnas, 
om så är lämpligt med användning av vatten eller någon annan 
passande metod att rengöra huden. 
Alla djuren ska observeras dagligen och tecken på toxicitet ska 
registreras tillsammans med tidpunkten då de uppträdde samt graden 
och varaktigheten av toxiciteten. Observationer ska omfatta hud- och 
pälsförändringar, ögon och slemhinnor och även respirations- och cirkulationssystem, autonoma och centrala nervsystemet samt kroppsmotorik och beteendemönster. Djurens ska vägas varje vecka 
och vidare rekommenderas att foderförbrukningen mäts per vecka. 
Det är nödvändigt att observera djuren regelbundet för att säkerställa att så få djur som möjligt faller bort från studien till följd av kanni ­
balism, autolys av vävnader eller förväxling. I slutet av testet avlivas 
och obduceras alla överlevande djur utom djuren i satellitgruppen. 
Djur som dör under testet obduceras, och i slutet av testet avlivas och obduceras de överlevande djuren. 
I slutet av testet ska alla djur inklusive kontrollgruppen genomgå 
följande undersökning: 
1. Hematologi omfattande minst hematokrit, hemoglobinkoncent ­
ration, erytrocyträkning, total och differential räkning av leukocy ­
ter samt mätning av koaguleringsförmågan. 
2. Klinisk biokemisk analys av blodet omfattande minst en lever- 
och njurfunktionsparameter: alanin-aminotransferas (tidigare kallat glutaminsyra-pyrodruvsyra-transaminas, GPT), serum-aspartat- aminotransferas (tidigare kallat glutaminsyra-oxalättiksyra-trans ­
aminas, GOT), och urinäkväve, äggviteämnen, blod-kreatinin, to ­
talt bilirubin och totalt serumprotein. 
Andra bestämningar som kan vara nödvändiga för en adekvat tox ­
ikologisk utvärdering är kalcium, fosfor, klorid, natrium, kalium, 
glukos efter fasta, lipidanalys, hormoner, syra/basbalansen, metahe ­
moglobin och kolinesterasaktivitet.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 306
 
Ytterligare kliniska biokemiska analyser kan vid behov utföras för att 
vidare utreda de observerade effekterna.  
1.6.4  Makroskopisk undersökning  
Alla försöksdjur ska genomgå en fullständig makroskopisk under ­
sökning. Lever, njurar, binjurar och testiklar ska vägas våta så snart 
som möjligt efter dissektion för att undvika uttorkning. Organ och vävnader, dvs. obehandlad och behandlad hud, lever, njure, mjälte, testiklar, binjurar, hjärta och målorgan (de organ som företer allvar ­
liga skador eller storleksförändringar) ska förvaras i lämpligt medium 
för eventuell senare histopatologisk undersökning.
 
1.6.5  Histopatologisk undersökning  
Histologisk undersökning ska göras av bevarade organ och vävnader 
från högdosgruppen och kontrollgruppen. Organ och vävnader, häm ­
tade från gruppen som fått den högsta dosnivån, som uppvisar de ­
fekter som kan tillskrivas testämnet, ska undersökas i alla grupper 
som fått lägre dos. Djur i satellitgruppen ska genomgå histologisk 
undersökning, särskilt de organ och vävnader som har utvisat effek ­
ter i de övriga behandlingsgrupperna.  
2. DATA  
Data ska ställas upp i tabellform och för varje behandlingsgrupp 
anges antal djur i början av testet och antal djur som företer varje typ av skada. 
Alla observerade resultat ska utvärderas med lämplig statistisk me ­
tod. Alla vedertagna statistiska metoder kan användas.
 
3. RAPPORTERING  
3.1 TESTRAPPORT 
Testrapporten ska om möjligt innehålla följande uppgifter: 
— Data om djuren (art, stam, härkomst, miljöbetingelser, foder osv.). — Testbetingelser (inklusive slag av bandage: med eller utan ocklusion). — Dosnivåer (inklusive vehikel, om sådan använts) och koncent ­
rationer. 
— Uppgifter om toxisk reaktion uppdelade efter kön och dos. — Icke toxisk dos, om sådan har fastställts. — Tidpunkten för dödsfall under testet eller överlevnad till slutet av 
testet. 
— Toxiska och andra effekter. — Tidpunkten för observation av varje abnormt tecken och dess 
senare utveckling 
— Uppgifter om foder och kroppsvikt. — Hematologiska undersökningar och alla resultat.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 307
 
— Kliniska biokemiska analyser och alla resultat. 
— Obduktionsfynd. — Detaljerad beskrivning av alla histopatologiska fynd. 
— Statistisk behandling av resultaten i lämpliga fall. 
— Diskussion om resultaten. — Tolkning av resultaten.
 
3.2 UTVÄRDERING OCH TOLKNING 
Se allmän inledning till del B (D).  
4. HÄNVISNINGAR  
Se allmän inledning till del B (E).  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 308
 
B.10  MUTAGENICITET – TEST  IN VITRO  AV KROMOSOMAVVI ­
KELSER HOS DÄGGDJUR  
1. METOD  
Denna metod är en kopia av metoden OECD TG 47 3, Test  In Vitro  
av kromosomavvikelser hos däggdjur (1997).  
1.1 INLEDNING 
Avsikten med testen av kromosomavvikelser  in vitro  är att identifiera 
ämnen som orsakar strukturella kromosomavvikelser hos odlade 
däggdjursceller (1) (2) (3). Strukturella avvikelser kan vara av två typer, kromosomala eller kromatida. Majoriteten av de kemiska mu ­
tagenerna inducerar avvikelser av kromatidtyp, men även avvikelser 
av kromosomtyp förekommer. En ökning av polyploidin kan indi ­
kera att ett kemiskt ämne har potential att inducera numeriska av ­
vikelser. Denna metod är dock inte utformad för att mäta numeriska avvikelser och används inte rutinmässigt för det ändamålet. Kromo ­
sommutationer och liknande händelser är orsaken till många gene ­
tiska sjukdomar och det finns påtagliga bevis för att kromosommu ­
tationer och liknande händelser som ger upphov till förändringar i onkogener och tumörsuppressorgener i somatiska celler är inblan ­
dade i cancerinduktion hos människa och hos försöksdjur. 
Test av kromosomavvikelser  in vitro  kan göras med kulturer av 
etablerade cellinjer, cellstammar eller primära cellkulturer. De celler 
som används väljs ut på grundval av tillväxtförmåga vid odling, karyotypens stabilitet, antalet kromosomer, kromosomernas mångfald och den spontana frekvensen av kromosomavvikelser. 
Tester som utförs  in vitro  kräver i allmänhet att en exogen källa för 
metabolisk aktivering används. Detta metaboliska system för aktive ­
ring kan inte helt och hållet efterlikna de förhållanden som råder i 
däggdjuret in  vitro.  Man bör se till att undvika sådana förhållanden 
som skulle leda till positiva resultat som inte återspeglar den verkliga mutageniciteten och kan ha sin orsak i pH-förändringar, osmolalitet 
eller hög cytotoxicitet (4) (5). 
Detta test används för att söka efter möjliga mutagener och karcino ­
gener hos däggdjur. Många ämnen som är positiva i detta test är 
karcinogena hos däggdjur, men det finns ingen perfekt korrelation mellan detta test och karcinogenicitet. Korrelationen är beroende på den kemiska klassen och det finns allt starkare bevis för att det finns 
karcinogener som inte detekteras med detta test, eftersom det ser ut 
som om de verkar genom andra mekanismer än direkta DNA-skador. 
Se även Allmän inledning, del B.
 
1.2 DEFINITIONER  
avvikelser av kromatidtyp : en strukturell kromosomskada, uttryckt 
i form av brott på enstaka kromatider eller brott och återförening 
mellan kromatider.  
avvikelser av kromosomtyp : en strukturell kromosomskada, ut ­
tryckt som brott, eller brott och återförening, hos båda kromatiderna 
pä samma ställe.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 309
 
endoreduplikation : en process där kärnan efter den S-fas under 
DNA-replikationen inte övergår i mitos utan inleder ännu en S-fas. 
Resultatet är kromosomer med 4, 8, 16, ... kromatider.  
lucka : en akromatisk skada som är mindre än bredden hos en kro ­
matid, och med ett minimum av misspassning hos kromatiderna.  
mitotiskt index : den andel celler som är i metafas delat med det 
totala antalet celler som kan observeras i en cellpopulation; en in ­
dikation på graden av tillväxt hos den populationen.  
numerisk avvikelse : en förändring av antalet kromosomer jämfört 
med det normala antalet karakteristika hos de celler som används.  
polyploidi : en multipel av det haploida antalet kromosomer (n) som 
skiljer sig från det diploida antalet (dvs. 3n, 4n och så vidare).  
strukturell avvikelse : en förändring i kromosomstrukturen som kan 
detekteras genom en mikroskopisk undersökning av celldelningens 
metafasstadium, och som uppträder i form av deletioner och frag ­
ment, interna eller externa utbyten.  
1.3 TESTMETODENS PRINCIP 
Cellodlingar exponeras för testsubstansen både med och utan meta ­
bolisk aktivering. Vid förutbestämda intervall, efter det att cell ­
odlingen har exponerats för testsubstansen, utförs behandling med ett ämne som stoppar celldelningen i metafas (t.ex. Colcemid® eller colchicin). Därefter skördas cellerna och färgas in, varpå närvaro av 
kromosomavvikelser i metafascellerna analyseras mikroskopiskt.
 
1.4 BESKRIVNING AV TESTMETODEN  
1.4.1  Förberedelser  
1.4.1.1  Celler  
Ett antal olika cellinjer, stammar eller primära cellkulturer, inklusive 
humanceller, kan användas (t.ex. fibroblaster från kinesisk hamster, 
perifera blodlymfocyter från människor eller andra däggdjur).  
1.4.1.2  Typ av medium och kultur  
Lämpliga odlingsmedier och inkubationsförhållanden (odlingskärl, 
CO 2 -koncentration, temperatur och luftfuktighet) bör väljas för od ­
lingarna. Etablerade cellinjer och stammar bör rutinmässigt kontrol ­
leras med avseende på stabilitet hos det modala kromosomantalet och frånvaro av kontaminerad mykoplasma. Om kontaminering har 
skett bör de inte användas. Cellernas normala cellcykeltid och de 
odlingsförhållanden som används bör vara kända.
 
1.4.1.3  Förberedelse av kulturer  
Etablerade cellinjer och stammar: celler dras upp från stamkulturer, 
inokuleras i ett odlingsmedium som har en sådan densitet att kul ­
turerna inte kommer att växa samman innan det är dags att skörda, 
och inkuberas vid 37  o C. ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 310
 
Lymfocyter: helblod, behandlat med en antikoagulant (t.ex. heparin} 
eller separerade lymfocyter som erhållits från friska individer, tillsätts 
till odlingsmediet, vilket innehåller en mitogen substans (t.ex. fyto ­
hemaglutinin), varpå inkubering sker vid 37  o C. 
1.4.1.4  Metabolisk aktivering  
Celler bör exponeras för testsubstansen både i närvaro och frånvaro 
av ett lämpligt metaboliskt system för aktivering. Det mest använda systemet är en kofaktorstödd post-mitokondriell fraktion (S9) beredd 
ur lever från gnagare vilka behandlats med enzyminducerande ämnen 
såsom Aroclor 1254 (6) (7) (8) (9) eller en blandning av fenobarbi ­
ton och β-naftoflavon (10) (11) (12). 
Den postmitokondriella fraktionen används vanligen vid koncent ­
rationer i området 1 till 10 % v/v i det slutliga testmediet. Tillståndet 
hos ett system för metabolisk aktivering kan bero på den klass av 
kemikalier som testas. I vissa fall kan det vara lämpligt att använda mer än en koncentration av den post-mitokondriella fraktionen. 
Ett antal vidareutvecklingar, inklusive skapandet av genetiskt modi ­
fierade cellinjer som uttrycker specifika aktiverande enzymer, kan 
erbjuda en potential för endogen aktivering. Valet av de cellinjer 
som ska användas bör vara vetenskapligt underbyggt (t.ex. genom relevansen av cytokrom P450 isoenzym för metabolismen hos test ­
substansen).
 
1.4.1.5  Beredning av testsubstansen  
Fasta testsubstanser bör lösas upp i eller blandas med lämpligt lös ­
ningsmedel eller vehikel och spädas ut om detta är lämpligt före det 
att cellerna behandlas. Flytande testsubstanser kan tillsättas direkt till 
testsystemen och/eller spädas ut innan behandlingen startas. Ny ­
gjorda beredningar av testsubstansen bör användas om inte stabili ­
tetsdata påvisar att lagring är acceptabelt.  
1.4.2  Försöksbetingelser  
1.4.2.1  Lösningsmedel/vehikel  
Lösningsmedlet/vehikeln bör inte kunna misstänkas för att reagera 
kemiskt med testsubstansen och bör vara förenlig med överlevnaden 
för cellerna samt S9-aktiviteten. Om andra lösningsmedel/vehiklar än gängse brukliga används bör det finnas data som visar att de är kompatibla. Det rekommenderas att vattenbaserade lösningsmedel/ 
vehiklar i första hand bör övervägas närhelst det är möjligt. När 
substanser som är instabila i vatten testas, bör de organiska lösnings ­
medel som används vara fria från vatten. Vatten kan avlägsnas ge ­
nom tillsats av en molekylsikt.
 
1.4.2.2  Exponeringskoncentrationer  
Bland de kriterier som ska övervägas när den högsta koncentrationen 
ska fastställas är cytotoxicitet, löslighet i testsystemet och föränd ­
ringar i pH eller osmolalitet. 
Cytotoxicitet bör fastställas, såväl med som utan metabolisk aktive ­
ring i huvudexperiment, med hjälp av en lämplig indikation på cel ­
lernas integritet och tillväxt, såsom graden av sammanväxning, via ­
bilitetsräkning av cellerna, eller ett mitotiskt index. Det kan vara 
lämpligt att fastställa cytotoxicitet och löslighet i ett förberedande 
experiment.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 311
 
Minst tre analyserbara koncentrationer bör användas. Där cytotox ­
icitet uppträder bör dessa koncentrationer täcka in ett område som 
sträcker sig från maximal toxicitet ner till liten eller ingen toxicitet. Detta innebär normalt att koncentrationerna bör separeras av minst en faktor mellan 2 och 10. Vid tiden för skörd av cellerna bör den 
högsta koncentrationen visa en signifikant reduktion i graden av 
konfluens, cellräkning eller mitotiskt index (alla större än 50 %). Det mitotiska indexet är endast ett indirekt mått på cytotoxiska/cy ­
tosta-tiska effekter och är beroende av tiden efter behandlingen. Det 
mitotiska indexet är dock acceptabelt för suspensionskulturer där 
andra toxicitetsmätningar kan vara besvärliga och opraktiska. Infor ­
mation om kinetiken för cellcykler, såsom medelgenerationstid (AGT), kan användas som extra information. AGT är dock ett över ­
gripande medelvärde som inte alltid avslöjar existensen av försenade 
subpopulationer, och även små ökningar av medelgenerationstiden kan associeras med en mycket påtaglig senareläggning av tiden för optimalt utbyte av avvikelser. 
För substanser som är relativt icke-cytotoxiska bör den maximala 
testkoncentrationen vara 5 μl/ml, 5 mg/ml eller 0,01 M, beroende 
på vilket av dessa värden som är det lägsta. 
För relativt olösliga substanser, som inte är toxiska vid koncentratio ­
ner som är lägre än koncentrationen där olöslighet inträder, bör den 
högsta använda dosen vara en koncentration som ligger över lös ­
lighetsgränsen i det avslutande odlingsmediet mot slutet av behand ­
lingsperioden. I vissa fall (t.ex. när toxicitet endast uppträder vid 
koncentrationer som är högre än den lägsta olösliga koncentrationen) 
är det lämpligt att testa vid mer än en koncentration med synlig fällning. Det kan vara lämpligt att fastställa lösligheten vid början och slutet av behandlingen, eftersom lösligheten kan ändras under 
det att exponeringen i testsystemet pågår, beroende på närvaro av 
celler, S9, serum, etc. Löslighet kan detekteras med blotta ögat. Fällningen torde inte störa bestämningen.
 
1.4.2.3  Negativa och positiva kontroller  
Samtidiga positiva och negativa kontroller (lösningsmedel eller ve ­
hikel), både med och utan metabolisk aktivering, bör inkluderas i varje experiment. När metabolisk aktivering används, bör den posi ­
tiva kontrollkemikalien vara av en sådan typ att aktivering krävs för 
att ge ett mutagent svar. 
Positiva kontroller bör utnyttja en känd klastogen vid exponerings ­
nivåer som förväntas ge en reproducerbar och detekterbar ökning jämfört med bakgrunden och som demonstrerar känsligheten hos testsystemet. 
Positiva kontrollkoncentrationer bör väljas på ett sådant sätt att ef ­
fekterna är tydliga men inte omedelbart avslöjar identiteten hos ko ­
dade utstryksglas för läsaren. I tabellen nedan ges några exempel på 
positiva kontrollsubstanser.
 
Betingelser för metabolisk aktivering Substans CAS-nummer EINECS-nummer  
Frånvaro av exogen metabolit 
Aktivering Metylmetansulfonat 66-27-3 200-625-0 
Etylmetansulfonat 62-50-0 200-536-7  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 312
 
Betingelser för metabolisk aktivering Substans CAS-nummer EINECS-nummer  
Etylnitrosourea 759-73-9 212-072-2 
Mitomycin C 50-07-7 200-008-6 
4-Nitroquinolin-N-oxid 56-57-5 200-281-1 
Närvaro av exogen metabolit 
Aktivering Bens[a]pyren 50-32-8 200-028-5 
Cyklofosfamid 
Cyklofosfamidmonohydrat 50-18-0 
6055-19-2 200-015-4 
Andra lämpliga positiva kontrollsubstanser kan användas. Använd ­
ning av kemiska klassrelaterade positiva kontrollkemikalier bör över ­
vägas när sådana finns att tillgå. 
Negativa kontroller, bestående av lösningsmedel eller enbart en ve ­
hikel i behandlingsmediet, och hanterade på samma sätt som behand ­
lingsodlingarna, bör inkluderas var gång som odlingen skördas. Des ­
sutom bör obehandlade kontroller också användas om det inte finns 
historiska kontrolldata som påvisar att inga skadliga eller mutagena 
effekter induceras av det valda lösningsmedlet.  
1.4.3  Förfarande  
1.4.3.1  Behandling med en testsubstans  
Prolifererande celler behandlas med testsubstansen i såväl närvaro 
som frånvaro av ett system för metabolisk aktivering. Behandling av lymfocyter bör inledas när cirka 48 timmar gått efter den mito ­
gena stimuleringen. 
1.4.3.2 Två kulturer bör normalt användas för varje koncentration, och re ­
kommenderas varmt för negativa kontrollkulturer eller kontrollkul ­
turer för lösningsmedel. Där minimala variationer mellan två kulturer kan påvisas (13) (14) ur historiska data, kan det vara acceptabelt att en enda kultur används för varje koncentration. 
Gasformiga eller flyktiga substanser bör testas med hjälp av lämpliga 
metoder, t.ex. test i slutna odlingskärl (15) (16).
 
1.4.3.3  Tid för skörd av odlingen  
I det första experimentet bör cellerna exponeras för testsubstansen, 
både med och utan metabolisk aktivering, under 3–6 timmar och prov bör tas ut vid en tid som motsvarar cirka 1,5 gånger den normala 
cellcykelns längd efter det att behandlingen har påbörjats (12). 
Om detta protokoll ger negativa resultat både med och utan aktivering, bör ytterligare ett experiment utan aktivering utföras, med kontinuerlig behandling fram till dess att provtagning sker vid en tidpunkt som 
motsvarar cirka 1,5 gånger den normala cellcyklens längd. Vissa 
kemikalier kan vara enklare att detektera vid behandlings-/provtag ­
ningstider som är längre är 1,5 cykellängder. Negativa resultat med metabolisk aktivering måste bekräftas från fall till fall. I de fall där 
det inte anses nödvändigt att bekräfta negativa resultat bör detta 
cmotiveras.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 313
 
1.4.3.4  Kromosomberedning  
Cellkulturer behandlas vanligtvis med Colcemid® eller colchicin un ­
der 1–3 timmar innan skördning sker. Varje cellkultur skördas och behandlas separat för preparationen av kromosomer. Kromosombe ­
redning innefattar hypoton behandling av cellerna, fixering och in ­
färgning.
 
1.4.3.5  Analys  
Alla utstryksglas, inklusive de med positiva och negativa kontroller, 
bör kodas upp oberoende av varandra innan den mikroskopiska ana ­
lysen utförs. Eftersom fixeringen ofta ger upphov till brott på en del 
av de celler som är i metafas, med åtföljande förlust av kromosomer, bör de celler som påträffas därför innehålla ett centromerantal som är ekvivalent med det modala antalet ± 2 för alla celltyper. Åtminstone 
200 väl spridda metafaser bör förekomma per koncentration och 
kontroll, med lika fördelning mellan dubbelproven, om det är till ­
lämpligt. Detta antal kan reduceras när ett stort antal avvikelser observeras. 
Även om syftet med testet är att detektera strukturella kromosom ­
avvikelser, är det viktigt att notera polyploidi och endoreduplikation när dessa händelser observeras.
 
2. DATA  
2.1 BEHANDLING AV RESULTATEN 
Den experimentella enheten utgörs av cellen, och därför bör den 
procentandel av cellerna som uppvisar strukturella kromosomavvikel ­
ser utvärderas. Olika typer av strukturella kromosomavvikelser bör listas med antal och frekvenser för experimentella kulturer samt 
kontrollkulturer. Luckor i DNA-strängen noteras separat och rappor ­
teras men inkluderas inte generellt i den totala frekvensen för avvi ­
kelser. 
Samtidiga mätningar av cytotoxicitet för alla behandlade och nega ­
tiva kontrollkulturer i huvudexperimenten avseende avvikelser bör 
även samlas in. 
Individuella data för kulturen bör tas fram. Dessutom bör alla data 
sammanställas i form av en tabell.
 
2.2 UTVÄRDERING OCH TOLKNING AV RESULTATEN 
Det finns ett flertal kriterier som används för att bestämma om ett 
resultat är positivt, t.ex. en koncentrationsrelaterad ökning eller en 
reproducerbar ökning av antalet celler med kromosomavvikelser. Man bör i första hand överväga resultatets biologiska relevans. Sta ­
tistiska metoder kan användas som en hjälp vid utvärderingen av 
testresultaten (3) (13). Statistisk signifikans bör dock inte vara den 
enda faktor som bestämmer om resultatet är positivt.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 314
 
En ökning av antalet polyploida celler kan utgöra en indikation på att 
testsubstansen har potential att inhibera mitotiska processer och att 
inducera numeriska kromosomavvikelser. En ökning av antalet celler med endoreduplicerade kromosomer kan utgöra en indikation på att testsubstansen har potential att inhibera cellcykelns förlopp (17) (18). 
En testsubstans för vilken resultatet inte uppfyller ovanstående kri ­
terier bedöms såsom icke-mutagen i detta system. 
Även om de flesta experiment kommer att ge tydligt positiva eller 
negativa resultat, så kan i sällsynta fall uppsättningen av data göra det omöjligt att utföra en otvetydig bedömning med avseende på 
testsubstansens aktivitet. Resultatet kan förbli tvetydigt eller tvek ­
samt, oavsett hur många experiment som utförs. 
Positiva resultat från testet av kromosomavvikelser  in vitro  indikerar 
att testsubstansen inducerar strukturella kromosomavvikelser hos od ­
lade somatiska däggdjursceller. Negativa resultat indikerar att test ­
substansen inte inducerar kromosomavvikelser hos odlade somatiska däggdjursceller under de betingelser som rådde under testet.
 
3. RAPPORTERING  
TESTRAPPORT 
Testrapporten måste innehålla följande information: 
Lösningsmedel/vehikel: — Motivering av valet av vehikel. — Testsubstansens stabilitet och löslighet i lösningsmedlet/vehikeln, 
om detta är känt. 
Celler: — Cellernas typ och ursprung. — Den använda celltypens karyotypegenskaper och lämplighet. — Frånvaro av mykoplasma, om detta är tillämpligt. 
— Information om cellcykelns längd. 
— Bloddonatorernas kön, helblod eller separerade lymfocyter, an ­
vänd mitogen substans 
— Antal passager, om detta är tillämpligt. — Metoder för underhåll av cellkulturen, om detta är tillämpligt. — Det normala antalet kromosomer. 
Försöksbetingelser: 
— Identitet hos det ämne som stoppar celldelningen i metafasen, 
dess koncentration och cellexponeringens varaktighet. 
— Grund för val av koncentrationer och antalet kulturer som ingår, 
t.ex. data för cytotoxicitet och begränsningar i löslighet, om detta 
finns tillgängligt. 
— Mediets sammansättning, CO
 2 -koncentration, om detta är tillämpligt.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 315
 
— Testsubstansens koncentration. 
— Den tillsatta vehikelns och testsubstansens volym. — Inkubationstemperatur. 
— Inkubationstid. 
— Behandlingens varaktighet. — Celldensitet vid inokulering, om detta är tillämpligt. — Typ och sammansättning hos det system som används för meta ­
bolisk aktivering, inklusive acceptabilitetskriterier. 
— Positiva och negativa kontroller. 
— Metoder för preparation av utstryksglas. 
— Kriterier för bedömning av avvikelser. — Antal metafaser som analyserats. — Metoder för toxicitetsmätningarna. 
— Kriterier för när studierna ska anses vara positiva, negativa eller 
osäkra. 
Resultat: 
— Tecken på toxicitet, t.ex. grad av sammanväxning, cellcykeldata, 
cellräkningar, mitotiskt index. 
— Tecken på utfällning. — Data om behandlingsmcediets pH och osmolalitet, om detta har 
uppmätts. 
— Definition av avvikelser, inklusive luckor i DNA-strängen. — Antalet celler med kromosomavvikelser och typ av sådana avvi ­
kelser, angivna separat för varje behandlad kultur samt kontroll ­
kultur. 
— Förändringar i ploiditet, om detta observerats. — Dos/respons-förhållande, där det är möjligt. 
— Statistiska analyser, om sådana finns. 
— Samtidiga negativa (lösningsmedel/vehikel) och positiva kontroll ­
data. 
— Historiska negativa (lösningsmedel/vehikel) och positiva kontroll ­
data, med variationer, medelvärden och standardavvikelser. 
Diskussion av resultaten. Slutsatser.
 
4. HÄNVISNINGAR  
1. Evans, H. J. (1976), Cytological Methods for Detecting Chem ­
ical Mutagens. In: Chemical mutagens, Principles and Melhods 
for their Detection, Vol. 4, Hollaender, A. (ed) Plenum Press, New York and London, s. 1–29. 
2. Ishidate, M. Jr. och Sofuni, T. (1985), The  In Vitro  Chromo­
somal Aberration Test Using Chinese Hamster Lung (CHL) Fibroblast Cells in Culture. In: Progress in Mutation Research, 
Vol. 5, Ashby, J. et al., (eds) Elsevier Science Publishers, Ams ­
terdam-New York-Oxford, s. 427–432.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 316
 
3. Galloway, S. M, Armstrong, M. J., Reuben, C, Colman, S., 
Brown, B., Cannon, C, Bloom, A. D., Nakamura, K, Ahmed, 
M., Duk, S., Rimpo, J., Margolin, G.H., Resnick, M. A, An ­
derson, G. och Zeiger, E. (1978), Chromosome aberration and sister chromatic exchanges in Chinese hamster ovary cells: Eva ­
luation of 108 chemicals. Environs. Molec. Mutagen 10 
(suppl.10), s. 1–175. 
4. Scott, D., Galloway, S. M, Marshall, R. R., Ishidate, M. Jr., 
Brusick, D., Ashby, J. och Myhr, B. C. (1991), Genotoxicity under Extreme Culture Conditions. A report from ICPEMC Task Group 9. Mutation Res., 257, s. 147–204. 
5. Morita, T., Nagaki, T., Fukuda, I. och Okumura, K., (1992), 
Clastogenicity of low pH to Various Cultured Mammalian 
Cells. Mutation Res., 268, s. 297–305. 
6. Arnes, B. N., McCann, J. och Yamasaki, E. (1975), Methods 
for Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/ 
Mammalian Microsome Mutagenicity Test. Mutation Res., 31, s. 347–364. 
7. Maron, D. M. och Arnes, B. N. (1983), Revised Methods 
for the Salmonella Mutagenicity Test. Mutation Res., 113, s. 173–215. 
8. Natarajan. A. T., Tates, A. D., van Buul, P. P. W., Meijers, M. 
och de Vogel, N. (1976), Cytogenetic Effects of Mutagen/Car ­
cinogens after Activation in a Microsomal System  In Vitro,  I. 
Induction of Chromosome Aberrations and Sister Chromatid Exchange by Diethylnitrosamine (DEN) and Dimethylnitro ­
samine (DMN) in CHO Cells in the Presence of Rat-Liver 
Microsomes.  Mutation  Res., 37, s. 83–90. 
9. Matsuoka, A., Hayashi, M. och Ishidate, M. Jr. (1979), Chro ­
mosomal Aberration Tests on 29 Chemicals Combined with S9 
Mix In Vitro . Mutation Res., 66, s. 277–290. 
10. Elliot, B. M., Combes, R. D., Elcombe, C. R., Gatehouse, D. 
G., Gibson, G. G., Mackay, J. M. och Wolf, R. C. (1992), Report of UK Environmental Mutagen Society Working Party. Alternatives to Aroclor 1254-induced S9 in  In Vitro  Genotox ­
icity Assays. Mutagenesis, 7, s. 175–177. 
11. Matsushima, T., Sawamura, M, Hara, K. och Sugimura, T. 
(1976), A Safe Substitute for Polychlorinated Biphenyls as an 
Inducer of Metabolic Activation Systems. In: de Serres, F. J., Fouts, J. R., Bend, J. R. och Philpot, R. M. (eds)  In Vitro  
Metabolic Activation in Mutagenesis Testing, Elsevier, North- 
Holland, s. 85–88. 
12. Galloway, S. M., Aardema. M. J., Ishidate, M. Jr., Ivett, J. L., 
Kirkland, D. J., Morita, T., Mosesso, P, Sofuni, T. (1994), 
Report from Working Group on in  In Vitro  Tests for Chromo ­
somal Aberrations. Mutation Res., 312, s. 241–261. 
13. Richardson, C, Williams, D. A., Allen, J. A., Amphlett, G., 
Chanter, D. O. och Phillips, B. (1989), Analysis of Data from  
In Vitro  Cytogenetic Assays. In Statistical Evaluation of Muta ­
genicity Test Data. Kirkland, D. J., (ed) Cambridge University 
Press, Cambridge, s. 141–154. 
14. Soper, K. A. och Galloway, S. M. (1994), Replicate Flasks are 
not Necessary for  In Vitro  Chromosome Aberration Assays in 
CHO Cells. Mutation Res., 312, s. 139–149. 
15. Krahn, D. F, Barsky, F. C. och McCooey, K. T. (1982), CHO/ 
HGPRT Mutation Assay: Evaluation of Gases and Volatile Li ­
quids. In: Tice, R. R., Costa, D. L., Schaich, K. M. (eds). 
Genotoxic Effects oj Airborne Agents. New York, Plenum, 
s. 91–103.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 317
 
16. Zamora, P. O., Beson, J. M., Li, A. P. och Brooks, A. L. 
(1983), Evaluation of an Exposure System Using Cells Grown 
on Collagen Gels of Detecting Highly Volatile Mutagens in the CHO/HGPRT Mutation Assay. Environmental Mutagenesis, 5, s. 795–801. 
17. Locke-Huhle, C. (1983), Endoreduplication in Chinese hamster 
cells during alpha-radiation induced G2 arrest. Mutation Res., 
119, s. 403–413. 
18. Huang, Y., Change, C. och Trosko, J. E. (1983), Aphidicolin- 
induced endoreduplication in Chinese hamster cells. Cancer Res., 43, s. 1362–1364.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 318
 
B.11  MUTAGENICITET – TEST  IN VIVO  AV KROMOSOMAVVI ­
KELSER I BENMÄRG HOS DÄGGDJUR  
1. METOD  
Denna metod är en kopia av OECD TG 475, Test av kromosom ­
avvikelser i benmärg hos däggdjur (Mammalian Bone Marrow Chro ­
mosome Aberration Test (1997)).  
1.1 INLEDNING 
Testet  in vivo  avseende kromosomavvikelser hos däggdjur används 
för att detektera strukturella kromosomavvikelser inducerade av test ­
substansen i benmärgsceller hos djur, vanligen hos gnagare (1) (2) (3) (4). Strukturella kromosomavvikelser kan vara av två typer, kro ­
mosomala eller kromatida. En ökning av polyploidin kan indikera att 
en kemikalie har potential att inducera numeriska avvikelser. För 
huvuddelen av de kemiska mutagenerna utgörs de inducerade avvi ­
kelserna av kromatidtypen, men även avvikelser av kromosomtyp kan förekomma. Kromosommutationer och liknande händelser är 
orsaken till många genetiska sjukdomar hos människa och det finns 
omfattande bevis för att kromosommutationer och liknande händelser som ger upphov till förändringar i onkogener samt att tumörsupp ­
ressorgener är inblandade i cancer hos människa och i experimentella 
system. 
Gnagare används rutinmässigt i detta test. Benmärg är målvävnaden i 
detta test, eftersom det är en mycket kärlrik vävnad som innehåller 
en cellpopulation med en snabb cellcykel, och där cellerna enkelt kan isoleras och bearbetas. Andra arter och målvävnader används inte med denna metod. 
Detta test av kromosomavvikelser är särskilt relevant för att fastställa 
mutagena risker, eftersom det medger överväganden av faktorer  in 
vivo för metabolism, farmakokinetik och processer för DNA-repara ­
tioner, även om dessa faktorer kan variera mellan olika arter och 
vävnader. Ett test  in vivo  är även användbart för fortsatta undersök ­
ningar av en mutagen effekt, med detektion genom tester  in vitro . 
Om det finns bevis för att testsubstansen, eller en reaktiv metabolit, 
inte kommer att nå målvävnaden, är det inte lämpligt att använda detta test. 
Se även Allmän inledning, del B.
 
1.2 DEFINITIONER  
avvikelser av kromatidtyp : en strukturell kromosomskada, uttryckt i 
form av brott på enstaka kromatider eller brott och återförening 
mellan kromatider.  
avvikelser av kromosomtyp : en strukturell kromosomskada, uttryckt 
som brott, eller brott och återförening, hos båda kromatiderna på 
samma ställe.  
endoreduplikation : en process där kärnan efter den S-fas under 
DNA-replikationen inte övergår i mitos utan inleder ännu en S-fas. Resultatet är kromosomer med 4, 8, 16, ... kromatider.  
lucka : en akromatisk skada som är mindre än bredden hos en kro ­
matid, och med ett minimum av misspassning hos kromatiderna.  
numerisk avvikelse : en förändring av antalet kromosomer jämfört 
med det normala antalet karakteristika hos de celler som används.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 319
 
polyploidi : en multipel av det haploida antalet kromosomer (n) som 
skiljer sig från det diploida antalet (dvs. 3n, 4n.).  
strukturell avvikelse : en förändring i kromosomstrukturen som kan 
detekteras genom en mikroskopisk undersökning av celldelningens metafasstadium, och som uppträder i form av deletioner och frag ­
ment, interna eller externa utbyten.
 
1.3 TESTMETODENS PRINCIP 
Djur exponeras för testsubstansen genom en lämplig metod för ex ­
ponering och de avlivas på lämpliga tider efter behandlingen. Innan de avlivas behandlas djuren med ett ämne som gör att celler stannar 
upp i metafas (t.ex. colchicin eller Colcemid®). Kromosombered ­
ningar görs sedan från benmärgscellerna och färgas in, varpå celler i metafas analyseras med avseende på kromosomavvikelser.
 
1.4 BESKRIVNING AV TESTMETODEN  
1.4.1 Förberedelser  
1.4.1.1  Val av djurarter  
Vanligen används råttor, möss och kinesiska hamstrar, även om 
vilket lämpligt däggdjur som helst kan utnyttjas. Man bör välja de stammar av unga, friska vuxna djur som vanligen används på labo ­
ratorier. När undersökningen ska påbörjas, är det lämpligt att vikt ­
skillnaden mellan djuren är så liten som möjligt och den bör inte 
överstiga ± 20 % av medelvikten för varje kön.
 
1.4.1.2  Förhållanden vid förvaring och utfodring  
De generella förhållanden som anges i den Allmänna inledningen till 
del B gäller. Man bör dock sträva efter en relativ luftfuktighet på 
50–60 %.  
1.4.1.3  Förberedelse av djuren  
Friska, unga vuxna djur väljs ut slumpartat för placering i kontroll- 
och behandlingsgrupperna. Burar bör arrangeras på ett sådant sätt att möjliga effekter beroende på placeringen av burarna blir så små som möjligt. Djuren ska ha en unik identifiering. De bör vänjas vid för ­
hållandena i laboratoriet under minst fem dagar.
 
1.4.1.4  Beredning av doser  
Fasta testsubstanser bör lösas upp i eller blandas med lämpliga lös ­
ningsmedel eller vehiklar och spädas ut, om så är lämpligt, innan dosen administreras till djuren. Testsubstanser i flytande form kan 
doseras direkt eller spädas ut före dosering. Nygjorda beredningar av 
testsubstansen bör användas, om inte stabilitetsdata visar att lagring är acceptabel.
 
1.4.2 Försöksbetingelser  
1.4.2.1  Lösningsmedel/vehikel  
Lösningsmedlet/vehikeln bör inte ge upphov till toxiska effekter vid 
de dosnivåer som används och bör inte kunna misstänkas för att 
reagera kemiskt med testsubstansen. Om andra lösningsmedel/vehik ­
lar än gängse brukliga används, bör användningen av dem ha stöd från data som visar på deras kompatibilitet. Därhelst det är möjligt 
rekommenderas att man i första hand överväger att använda vatten ­
baserade lösningsmedel/vehiklar.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 320
 
1.4.2.2  Kontroller  
Samtidiga positiva och negativa kontroller (lösningsmedel/vehikel) 
bör ingå för varje kön i varje test. Förutom behandling med testsub ­
stansen, bör djuren i kontrollgrupperna hanteras på ett identiskt sätt i 
förhållande till djuren i de grupper där behandling skett. 
Positiva kontroller bör ge strukturella avvikelser  in vivo  vid expone ­
ringsnivåer som förväntas ge en detekterbar ökning i förhållande till 
bakgrunden. Positiva kontrolldoser bör väljas på ett sådant sätt att effekterna är tydliga men att identiteten hos kodade utstryksglas inte omedelbart avslöjas för läsaren. Det är acceptabelt att den positiva 
kontrollen administreras via en annan tillförselväg än testsubstansen 
och att provtagning endast sker vid ett enstaka tillfälle. Användning av kemiska klassrelaterade positiva kontrollkemikalier kan dessutom övervägas när dessa finns tillgängliga. I tabellen nedan ges några 
exempel på positiva kontrollsubstanser.
 
Substans CAS-nummer EINECS-nummer  
Etylmetansulfonat 62-50-0 200-536-7 
Etylnitrosourea 759-73-9 212-072-2 Mitomycin C 50-07-7 200-008-6 
Cyklofosfamid 
Cyklofosfamidmonohydrat 50-18-0 
6055-19-2 200-015-4 
Trietylenmelamin 51-18-3 200-083-5 
Negativa kontroller, behandlade enbart med lösningsmedel eller ve ­
hikel, och i övrigt behandlade på samma sätt som behandlingsgrup ­
perna, bör inkluderas för varje provtagningstillfälle, om inte accep ­
tabel variabilitet och frekvens hos celler med kromosomavvikelser 
hos djuren kan erhållas från historiska kontrolldata. Om enstaka 
provtagning används för negativa kontroller, är den lämpligast tiden det första provtagningstillfället. Dessutom bör obehandlade kontroller även användas om det inte finns historiska eller publicerade kontroll ­
data som visar att inga skadliga eller mutagena effekter induceras av 
det valda lösningsmedlet/vehikeln.
 
1.5 FÖRFARANDE  
1.5.1  Försöksdjurens antal och kön  
Varje behandlad grupp samt kontrollgruppen måste bestå av minst 5 
analyserbara djur av varje kön. Det räcker med att testa enbart det 
ena könet, om det vid tiden för undersökningens genomförande finns data tillgängliga från undersökningar av samma art och där man har 
använt sig av samma exponeringssätt, så att det går att visa att det 
inte finns några substantiella skillnader i toxicitet mellan könen. I de fall där exponering för kemikalier hos människa kan vara könsspe ­
cifik, vilket t.ex. kan vara fallet för vissa läkemedel, bör testet ut ­
föras med försöksdjur av lämpligt kön.
 
1.5.2  Behandlingsschema  
Testsubstanser administreras med fördel som en enstaka behandling. 
Testsubstanser kan även administreras i form av en delad dos, två behandlingar under samma dag med högst några timmars intervall, 
för att underlätta administrering av en stor volym. Andra doserings ­
scheman bör vara vetenskapligt motiverade.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 321
 
Prover bör tas vid två separata tillfällen efter behandling under en 
dag. Det första provtagningstillfället för gnagare ligger på 1,5 gånger 
den normala cellcykelns längd (den senare är normalt 12–18 timmar) efter behandling. Eftersom den tid som går åt för upptag och meta ­
bolism av testsubstansen, likväl som dess effekt på cellcykelns kine ­
tik, kan påverka den optimala tiden för detektion av kromosomavvi ­
kelser, så rekommenderas att provtagningen senareläggs till 24 tim ­
mar efter det första provtagningstillfället. Om doseringsscheman på mer än en dag används, bör man använda en provtagningstid på 1,5 
gånger den normala cellcykelns längd efter den slutliga behandlingen. 
Innan djuren avlivas bör de injiceras intraperitonealt med en lämplig 
dos av ett ämne som stoppar celldelningen i metafas (t.ex. Colce ­
mid® eller colchicin). Prov på försöksdjur bör därefter tas vid lämp ­
liga intervall. För möss är detta intervall ca 3–4 timmar; för kinesiska 
hamstrar ligger intervallet på ca 4–5 timmar. Celler skördas från 
benmärgen och analyseras med avseende på kromosomavvikelser.
 
1.5.3  Dosnivåer  
Om det inte finns några lämpliga data tillgängliga och en undersök ­
ning därför utförs för att fastställa omfattningen, bör denna under ­
sökning utföras i samma laboratorium, och med samma arter, stam ­
mar, kön och behandlingsschema som senare ska användas i huvud ­
undersökningen (5). Vid toxicitet används tre dosnivåer för det första provtagningstillfället. Dessa dosnivåer bör täcka in ett område som sträcker sig från maximal till liten eller ingen toxicitet. Vid senare 
provtagningstillfällen räcker det med att endast den högsta dosen 
används. Den högsta dosen definieras som den dos som producerar tecken på toxicitet och så att högre dosnivåer baserade på samma doseringsschema skulle förväntas leda till att försöksdjuret dör. Sub ­
stanser med specifika biologiska verkningar vid låga icke-toxiska 
doser (såsom hormoner och mitogena substanser) kan utgöra undan ­
tag från kriterier som är dosbestämmande och bör utvärderas från fall till fall. Den högsta dosen kan även definieras som en dos vilken ger 
upphov till någon indikation på toxicitet i benmärgen (t.ex. mer än 
50 % reduktion av mitotiskt index).
 
1.5.4  ”Limit-test”  
En fullständig undersökning med tre dosnivåer kan inte anses vara 
nödvändig om ett test på en dosnivå på minst 2 000 mg/kg kropps ­
vikt och med en enstaka behandling, eller i form av två behandlingar 
under samma dag, inte ger upphov till observerbara toxiska effekter, 
och om ingen genotoxicitet kan förväntas utifrån data om strukturellt relaterade substanser. För undersökningar med en längre varaktighet ligger gränsdosen på 2 000 mg/kg/kroppsvikt/dag vid behandlingar 
upp till 14 dagar, och 1 000 mg/kg/kroppsvikt/dag för behandlingar 
som varar längre än 14 dagar. Förväntad exponering av människor kan utgöra en indikation på behovet av att använda en högre dosnivå i ett ’limit-test’.
 
1.5.5  Administrering av doser  
Testsubstansen administreras normalt genom sondmatning med hjälp 
av en magsond, en lämplig intuberingskanyl eller genom en intrape ­
ritoneal injektion. Andra vägar för exponering kan vara acceptabla 
där de kan motiveras. Den maximala vätskevolymen som kan ad ­
ministreras med hjälp av sondmatning eller injektion vid ett tillfälle beror på försöksdjurets storlek. Volymen bör inte överstiga 
2 ml/100 g kroppsvikt. Användning av volymer som är högre än 
dessa måste motiveras. Förutom för irriterande eller korrosiva sub ­
stanser, som normalt kommer att visa på stegrade effekter med högre koncentrationer, bör variationer av testvolymen minimeras genom en 
justering av koncentrationen för att säkerställa att volymen är kon ­
stant vid alla dosnivåer.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 322
 
1.5.6  Kromosomberedning  
Omedelbart efter avlivningen tas benmärgen ut, tillsätts hypoton 
lösning och fixeras. Cellerna sprids sedan ut på utstryksglas och färgas in.
 
1.5.7  Analys  
Det mitotiska indexet bör fastställas om ett mått på cytotoxicitet hos 
minst 1 000 celler per djur för alla behandlade försöksdjur (inklusive positiva kontroller) och obehandlade försöksdjur för negativ kontroll. 
Minst 100 celler bör analyseras för varje försöksdjur. Detta antal kan 
reduceras när ett stort antal avvikelser observeras. Alla utstryksglas, 
inklusive de för positiva och negativa kontroller, bör kodas obero ­
ende av varandra innan de analyseras i mikroskop. Eftersom bered ­
ningen av utstryksglas ofta resulterar i brott på en del av de celler som är i metafas med förlust av kromosomer som följd, bör de celler 
som påträffas därför innehålla ett centromererantal som är lika med 
antalet 2n ± 2.
 
2. DATA  
2.1 BEHANDLING AV RESULTATEN 
Individuella data för försöksdjuren bör presenteras i tabellform. Den 
experimentella enheten utgörs av djuret. För varje försöksdjur bör antalet celler som påträffas, antalet avvikelser per cell och procen ­
tandelen celler med strukturella kromosomavvikelser utvärderas. An ­
talet och frekvensen av olika typer av strukturella kromosomavvikel ­
ser bör listas för behandlade grupper och kontrollgrupper. Luckor i DNA-strängen noteras separat och rapporteras men inkluderas inte generellt i den totala frekvensen av avvikelser. Om det inte finns 
några bevis för en skillnad i resultaten mellan könen, kan data från 
båda könen kombineras för statistisk analys.
 
2.2 UTVÄRDERING OCH TOLKNING AV RESULTATEN 
Det finns ett flertal kriterier som används för att bestämma om ett 
resultat är positivt, t.ex. en dosrelaterad ökning i det relativa antalet 
celler med kromosomavvikelser eller en tydlig ökning av antalet celler som uppvisar avvikelser i en grupp som fått en enstaka dos vid ett enstaka provtagningstillfälle. Man bör i första hand överväga 
resultatets biologiska relevans. Statistiska metoder kan vara till hjälp 
vid utvärdering av testresultatet (6). Statistisk signifikans bör dock inte vara den enda faktor som bestämmer om resultatet är positivt. Tvetydiga resultat bör klarläggas genom fortsatta tester, lämpligen 
vid ändrade experimentella betingelser. 
En ökning av polyploidin kan utgöra en indikation på att testsub ­
stansen har potential att inducera numeriska kromosomavvikelser. En 
ökning av endoreduplikationen kan utgöra en indikation på att test ­
substansen har potential att inhibera cellcykelns förlopp (7) (8). 
En testsubstans för vilken resultatet inte uppfyller ovanstående kri ­
terier anses vara icke-mutagen i detta test.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 323
 
Även om de flesta experiment kommer att ge tydligt positiva eller 
negativa resultat, så kan i sällsynta fall uppsättningen av data göra 
det omöjligt att utföra en otvetydig bedömning med avseende på testsubstansens aktivitet. Resultatet kan förbli tvetydigt eller tvek ­
samt, oavsett hur många experiment som utförs. 
Positiva resultat från testet av kromosomavvikelser  in vitro,  indikerar 
att en substans inducerar kromosomavvikelser i benmärgen hos de arter som testades. Negativa resultat indikerar att testsubstansen, un ­
der dessa försöksbetingelser, inte inducerar kromosomavvikelser i 
benmärgen hos de arter som testades. 
Sannolikheten för att testsubstansen eller dess metaboliter når ut till 
det stora kretsloppet eller specifikt till målvävnaden (t.ex. systemisk 
toxicitet) bör diskuteras.
 
3. RAPPORTERING  
TESTRAPPORT 
Testrapporten måste innehålla följande information: 
Lösningsmedel/vehikel: 
— Motivering av valet av vehikel. 
— Testsubstansens stabilitet och löslighet i lösningsmedlet/vehikeln, 
om detta är känt. 
Försöksdjur: 
— Art/stam som används. 
— Försöksdjurens antal, ålder och kön. 
— Källa, förhållanden vid förvaring, diet, etc. 
— Individuell vikt hos försöksdjuren vid försökets början, inklusive 
kroppsviktsintervallet, medelvärde och standardavvikelse för 
varje grupp. 
Försöksbetingelser: 
— Positiva och negativa kontroller (vehikel/lösningsmedel). 
— Data frän en undersökning av lämpligt intervall, om en sådan har 
utförts. 
— Grund för valet av dosnivå. 
— Uppgifter om beredningen av testsubstansen. 
— Uppgifter om administreringen av testsubstansen. 
— Grund för administreringens tillförselväg. 
— Metoder för att verifiera att testsubstansen nådde det stora krets ­
loppet eller målvävnaden, om detta är tillämpbart. 
— Omvandling från koncentration av testsubstansen i diet/dricks ­
vatten (ppm) till den verkliga dosen (mg/kg/kroppsvikt/dag), om detta är tillämpbart. 
— Uppgifter om fodrets och vattnets kvalitet. 
— Detaljerad beskrivning av behandlings- och provtagningssche ­
man. 
— Metoder för mätningar av toxicitet.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 324
 
— Identiteten hos substanser som stoppar cellcykeln i metafas, deras 
koncentration och behandlingens varaktighet. 
— Metoder för preparation av utstryksglas. 
— Kriterier för hur avvikelser påvisas. 
— Antalet celler som analyserats per försöksdjur. 
— Kriterier för bedömning av om undersökningarna är positiva, 
negativa eller tvetydiga. 
Resultat: 
— Tecken på toxicitet. 
— Mitotiskt index. 
— Typ av och antal avvikelser, angivna separat för varje försöks ­
djur. 
— Det totala antalet avvikelser per grupp med medelvärden och 
standardavvikelser. 
— Antal celler med avvikelser per grupp med medelvärden och 
standardavvikelser. 
— Förändringar i ploiditet, om några sådana har observerats. 
— Dos/responsförhållande, där så är möjligt. 
— Statistiska analyser, om några sådana förekommer. 
— Samtidiga negativa kontrolldata. 
— Historiska negativa kontrolldata med områden, medelvärden och 
standardavvikelser. 
— Samtidiga positiva kontrolldata. 
Diskussion av resultaten. 
Slutsatser.  
4. HÄNVISNINGAR  
1. Adler, I. D. (1984), Cytogenetic tests in Mammals. In: Mutage ­
nicity Testing: a Practical Approach. S. Venitt och J. M. Parry 
(eds). IRL Press, Oxford, Washington D.C., s. 275–306. 
2. Preston, R. J., Dean, B. J., Galloway, S., Holden, H., McFee, A. 
K. och Shelby, M. (1987), Mammalian  In Vivo  Cytogenetic As ­
says: Analysis of Chromosome Aberrations in Bone Marrow Cells. Mutation Res., 189. s. 157–165. 
3. Richold, M., Chandley, A., Ashby, J., Gatehouse, D. G., Boot ­
man, J. och Henderson, L. (1990),  In Vivo  Cytogenetic Assays. 
In: D. J. Kirkland (ed.) Basic Mutagenicity Tests, UKEMS Re ­
commended Procedures. UKEMS Sub-Committee on Guidelines 
for Mutagenicity Testing. Report. Part I revised. Cambridge Uni ­
versity Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, s. 115–141. 
4. Tice, R. R., Hayashi, M., MacGregor, J. T., Anderson, D., Bla ­
key, D. H. Holden, H. E., Kirsch-Volders, M., Oleson Jr., F. B., Pacchierotti, F., Preston, R. J., Romagna, F., Simada, H., Sutou, 
S. och Vannier, B. (1994), Report from the Working Group on 
the In Vivo  Mammalian Bone Marrow Chromosomal Aberration 
Test. Mutation Res., 312, s. 305–312. 
5. Fielder, R. J., Allen, J. A., Boobis, A. R., Botham, P. A., Doe, J., 
Esdaile, D. J., Gatehouse, D. G., Hodson-Walker. G., Morton, D. B., Kirkland, D. J. och Richold, M. (1992), Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society Wor ­
king Group: Dose setting in  In Vivo  Mutagenicity Assays. Mu ­
tagenesis, 7, s. 313–319.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 325
 
6. Lovell, D. P., Anderson, D., Albanese, R., Amphlett, G. E., 
Clare, G., Ferguson, R., Richold, M., Papworth, D. G. och Sa ­
vage, J. R. K. (1989), Statistical Analysis of  In Vivo  Cytogenetic 
Assays. In: UKEMS Sub-Comntittee on Guidelines for Mutage ­
nicity Testing. Report Part. III. Statistical Evaluation of Mutage ­
nicity Test Data. D. J. Kirkland, (ed.) Cambridge University 
Press, Cambridge, s. 184–232. 
7. Locke-Huhle, C. (1983), Endoreduplication in Chinese hamster 
cells during alpha-radiation induced G2 arrest. Mutation Res., 119, s. 403–413. 
8. Huang, Y., Change, C. and Trosko, J. E. (1983), Aphidicolin- 
induced endoreduplication in Chinese hamster cells. Cancer Res., 
43, s. 1362–1364.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 326
 
B.12  MUTAGENICITET – TEST AV MIKROKÄRNOR  IN VIVO  I 
ERYTROCYTER HOS DÄGGDJUR  
1. METOD  
Denna metod är en kopia av testet OECD TG 474, Test av mikro ­
kämor i erytrocyter hos däggdjur (Mammalian Erythrocyte Micro ­
nucleus Test [1997]).  
1.1 INLEDNING 
Testet av mikrokärnor  in vivo  hos däggdjur används för detektion av 
sådana skador på kromosomer eller på den mitotiska apparaten hos erytroblaster som induceras av testsubstansen, genom analys av eryt ­
rocyter från provtagning på benmärg och/eller perifert blod från 
djurceller, vanligtvis gnagare. 
Avsikten med testet av mikrokärnor är att identifiera substanser som 
orsakar cytogen skada, vilket resulterar i bildning av mikrokärnor 
som innehåller isolerade kromosomfragment eller hela kromosomer. 
När en erytroblast från benmärg utvecklas till en polykromatisk 
erytrocyt stöts huvudkärnan ut. Varje mikrokärna som har bildats kan bli kvar i den annars kärnfria cytoplasman. Visualisering av mikrokärnor underlättas i dessa celler eftersom de saknar en huvud ­
kärna. En ökning av frekvensen av polykromatiska erytrocyter med 
mikrokärnor hos behandlade försöksdjur utgör en indikation på in ­
ducerade kromosomskador. 
Benmärg från gnagare används rutinmässigt i detta test eftersom 
polykromatiska erytrocyter produceras i sådan vävnad. Mätningen 
av omogna (polykromatiska) erytrocyter med mikrokärnor i perifert 
blod är lika acceptabelt hos alla arter där oförmågan hos mjälten att avlägsna erytrocyter med mikrokärnor har kunnat påvisas, eller som har uppvisat en adekvat sensitivitet för att detektera ämnen som 
orsakar strukturella eller numeriska kromosomavvikelser. Mikrokär ­
nor kan särskiljas genom ett antal olika kriterier. Dessa innefattar identifiering av närvaron eller frånvaron av en kinetochor eller av centromer-DNA i mikrokärnor. Frekvensen av omogna (polykro ­
matiska) erytrocyter med mikrokärnor utgör den huvudsakliga slut ­
punkten. Antalet mogna (normokromatiska) erytrocyter i perifert blod som innehåller mikrokärnor bland ett givet antal mogna erytro ­
cyter kan även användas som slutpunkt på undersökningen, när för ­
söksdjur behandlas kontinuerligt under fyra veckor eller längre. 
Detta test av mikrokärnor  in vivo  på däggdjur är särskilt relevant för 
att fastställa mutagena risker, eftersom det möjliggör överväganden av faktorer för  in vivo  metabolism, farmakokinetik och processer för 
DNA-reparationer, även om sådana faktorer kan variera mellan olika 
arter, vävnader och genetiska slutpunkter. Ett test  in vivo  är även 
användbart för fortsatta undersökningar av en mutagen effekt, med detektion i ett  in vitro -system. 
Om det finns bevis för att testsubstansen eller en reaktiv metabolit 
inte kommer att nå målvävnaden, är det inte lämpligt att använda 
detta test. 
Se även Allmän inledning, del B.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 327
 
1.2 DEFINITIONER  
centromer (Kinetochor) : delar av en kromosom till vilka spindel ­
fibrer är fästa under celldelning, vilket ger upphov till en ordnad rörelse av dotterkromosomerna mot dottercellernas poler.  
mikrokärnor : små extra kärnor som är separata från cellernas huvud ­
kärna, och som produceras under mitosens telofas (meios) från iso ­
lerade kromosomfragment eller hela kromosomer.  
normokromatisk erytrocyt : mogna erytrocyter som saknar ribosomer 
och som kan särskiljas från omogna polykromatiska erytrocyter ge ­
nom infärgning som är selektiv för ribosomer.  
pofykromalisk erytrocyt : omogen erytrocyt, i ett intermediärt utveck ­
lingsstadium, vilken fortfarande innehåller ribosomer och därför kan särskiljas från mogna, normokromatiska erytrocyter genom infärg ­
ning som är selektiv för ribosomer.
 
1.3 TESTMETODENS PRINCIP 
Försöksdjur bör exponeras för testsubstansen på ett lämpligt sätt. Om 
benmärg används, bör försöksdjuren avlivas vid lämpliga tider efter 
behandling, varvid benmärg extraheras, preparationer görs och färgas in (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7). När perifert blod används, samlas blodet upp vid lämpliga tidpunkter efter behandling och utstrykspreparatio ­
ner görs, vilka sedan färgas in (4) (8) (9) (10). Vid undersökningar 
med perifert blod, bör det gå så kort tid som möjligt mellan den sista exponeringen och skörden av cellerna. Preparationerna analyseras 
med avseende på närvaron av mikrokärnor.
 
1.4 BESKRIVNING AV TESTMETODEN  
1.4.1  Förberedelser  
1.4.1.1  Val av djurarter  
Råttor, möss och kinesiska hamstrar används vanligen, även om 
vilket lämpligt däggdjur som helst kan användas. Vid användning 
av perifert blod rekommenderas möss. Det är emellertid även möjligt 
att använda andra däggdjursarter, förutsatt att det är en art där mjäl ­
ten inte avlägsnar erytrocyter med mikrokärnor eller en art som har uppvisat en adekvat känslighet när det gäller att detektera ämnen 
som kan orsaka strukturella eller numeriska kromosomavvikelser. 
Vanligt använda laboratoriestammar av unga, friska försöksdjur bör komma i fråga. Vid undersökningens början bör viktskillnaden mel ­
lan försöksdjuren vara minimal och inte överskrida + 20 % av me ­
delvikten för varje kön.
 
1.4.1.2  Förhållanden vid förvaring och utfodring  
De generella förhållanden som anges i den allmänna inledningen till del 
B gäller. Man bör dock sträva efter en relativ luftfuktighet på 50-60 %.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 328
 
1.4.1.3  Förberedelse av djuren  
Friska, unga vuxna djur väljs ut slumpartat för placering i kontroll- 
och behandlingsgrupperna. Burar bör arrangeras på ett sådant sätt att möjliga effekter beroende på placeringen av burarna blir så små som 
möjligt. Djuren ska ha en unik identifiering. De bör vänjas vid för ­
hållandena i laboratoriet under minst fem dagar.
 
1.4.1.4  Beredning av doser  
Fasta testsubstanser bör lösas upp i eller blandas med lämpliga lös ­
ningsmedel eller vehiklar och spädas ut, om så är lämpligt, innan dosen administreras till djuren. Testsubstanser i flytande form kan 
doseras direkt eller spädas ut före dosering. Nygjorda beredningar av 
testsubstansen bör användas om inte stabilitetsdata visar att lagring är acceptabel.
 
1.4.2  Försöksbetingelser  
1.4.2.1  Lösningsmedel/vehikel  
Lösningsmedlet/vehikeln bör inte ge upphov till toxiska effekter vid 
de dosnivåer som används och bör inte kunna misstänkas för att 
reagera kemiskt med testsubstansen. Om andra lösningsmedel/vehik ­
lar än gängse brukliga används, bör användningen av dem ha stöd från data som visar på deras kompatibilitet. Det rekommenderas att, därhelst det är möjligt, man i första hand överväger vattenbaserade 
lösningsmedel/vehiklar.
 
1.4.2.2  Kontroller  
Samtidiga positiva och negativa kontroller (lösningsmedel/vehikel) 
bör ingå för varje test. Förutom behandling med testsubstansen, bör djuren i kontrollgrupperna hanteras på ett identiskt sätt i förhål ­
lande till djuren i de grupper där behandling skett. 
Positiva kontroller bör ge mikrokärnor  in vivo  vid de exponerings ­
nivåer som förväntas ge en detekterbar ökning i förhållande till bak ­
grunden. Positiva kontrolldoser bör väljas på ett sådant sätt att ef ­
fekterna är tydliga, men att identiteten hos kodade utstryksglas inte omedelbart avslöjas för läsaren. Det är acceptabelt att den positiva 
kontrollen administreras via en annan tillförselväg än testsubstansen 
och att provtagning endast sker vid ett enstaka tillfälle. Användning av kemiska klassrelaterade positiva kontrollkemikalier kan dessutom övervägas när dessa finns tillgängliga. I tabellen nedan ges några 
exempel på positiva kontrollsubstanser.
 
Substans CAS-nummer EINECS-nummer  
Etylmetansulfonat 62-50-0 200-536-7 
N-etyl-N-nitrosourea 759-73-9 212-072-2 Mitomycin C 50-07-7 200-008-6 Cyklofosfoamid 
Cyklofosfoamidmonohydrat 50-18-0 
6055-19-2 200-015-4 
Trietylenmelamin 51-18-3 200-083-5
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 329
 
Negativa kontroller, behandlade enbart med lösningsmedel eller ve ­
hiklar, och i övrigt behandlade på samma sätt som behandlingsgrup ­
perna, bör inkluderas för varje provtagningstillfälle, om inte accep ­
tabel variabilitet och frekvens hos celler med kromosomavvikelser hos djuren kan erhållas ur historiska kontrolldata. Om enstaka prov ­
tagningar används för negativa kontroller, är den lämpligaste tiden 
det första provtagningstillfället. Dessutom bör obehandlade kontroller även användas om det inte finns historiska eller publicerade kontroll ­
data som visar att inga skadliga eller mutagena effekter induceras av 
det valda lösningsmedlet/vehikeln. 
Om perifert blod används, kan även ett prov taget innan behand ­
lingen påbörjas vara acceptabelt som en samtidig negativ kontroll, men endast för de korta perifera undersökningarna av blod (t.ex. 1–3 
behandling(ar)) när resulterande data ligger inom det förväntade om ­
rådet för den historiska kontrollen.
 
1.5 FÖRFARANDE  
1.5.1  Försöksdjurens antal och kön  
Varje behandlad grupp samt kontrollgruppen måste bestå av minst 5 
analyserbara djur av varje kön. Det räcker med att testa enbart det 
ena könet, om det vid tiden för undersökningens genomförande finns 
data tillgängliga från undersökningar av samma art och där man har använt sig av samma exponeringssätt, så att det går att visa att det inte finns några substantiella skillnader i toxicitet mellan könen. I de 
fall där exponering för kemikalier hos människa kan vara könsspe ­
cifik, vilket t.ex. kan vara fallet för vissa läkemedel, bör testet ut ­
föras med försöksdjur av lämpligt kön.
 
1.5.2  Behandlingsschema  
Inget standardiserat behandlingsschema (t.ex en, två eller flera be ­
handlingar med 24 timmars intervall) kan rekommenderas. Proverna 
från utökade doseringsscheman är acceptabla så länge som en positiv 
effekt har demonstrerats för denna typ av undersökning eller, för en negativ undersökning, så länge som toxicitet har påvisats eller grän ­
svärdesdosen har använts, och doseringen fortsatte tills det var dags 
för provtagning. Testsubstanser kan även administreras i form av en delad dos, dvs. två behandlingar under en och samma dag med högst några timmars intervall, för att på så sätt underlätta administrering av 
stora volymer med material. 
Testet kan utföras på två sätt 
a) Försöksdjur behandlas en gång med testsubstansen. Prover på 
benmärg tas ut minst två gånger, med början tidigast 24 timmar och senast 48 timmar efter behandling, och med lämpliga inter ­
vall mellan proven. Om prover tas tidigare än 24 timmar efter 
behandling bör detta motiveras. Prover på perifert blod tas ut minst två gånger, med början tidigast 36 timmar efter behandling, och i lämpliga intervall efter det första provet, men inte senare än 
efter 11 timmar. När ett positivt svar identifieras vid ett prov ­
tagningstillfälle, så är ytterligare provtagning inte nödvändig.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 330
 
b) Om två eller flera dagliga behandlingar utförs (t.ex. två eller flera 
behandlingar med 24 timmars intervall), bör prover tas ut en gång 
mellan 18 och 24 timmar efter den slutliga behandlingen av benmärgen och en gång mellan 36 och 48 timmar efter den slutliga behandlingen av det perifera blodet (12). 
Prover kan dessutom tas vid andra tidpunkter när detta är lämpligt.
 
1.5.3  Dosnivåer  
Om det inte finns några lämpliga data tillgängliga och en undersök ­
ning därför utförs för att fastställa omfattningen, bör denna under ­
sökning utföras i samma laboratorium, och med samma arter, stam ­
mar, kön och behandlingsschema som senare ska användas i huvud ­
undersökningen (13). Vid toxicitet används tre dosnivåer för det första provtagningstillfället. Dessa dosnivåer bör täcka in ett område som sträcker sig från maximal till liten eller ingen toxicitet. Vid 
senare provtagningstillfällen räcker det med att endast den högsta 
dosen används. Den högsta dosen definieras som den dos som pro ­
ducerar tecken på toxicitet och så att högre dosnivåer baserade på samma doseringsschema skulle förväntas leda till att försöksdjuret 
dör. Substanser med specifika biologiska verkningar vid låga icke- 
toxiska doser (såsom hormoner och mitogena substanser) kan utgöra undantag från kriterier som är dosbestämmande och bör utvärderas från fall till fall. Den högsta dosen kan även definieras som en dos 
vilken ger upphov till någon indikation på toxicitet i benmärgen 
(t.ex. en reduktion av andelen omogna erytrocyter jämfört med det totala antalet erytrocyter i benmärgen eller i perifert blod).
 
1.5.4  ”Limit-test”  
En fullständig undersökning med tre dosnivåer kan inte anses vara 
nödvändig om ett test på en dosnivå på minst 2 000 mg/kg kropps ­
vikt och med en enstaka behandling, eller i form av två behandlingar 
under samma dag, inte ger upphov till observerbara toxiska effekter, 
och om ingen genotoxicitet kan förväntas utifrån data om strukturellt relaterade substanser. För undersökningar med en längre varaktighet ligger gränsdosen på 2 000 mg/kg/kroppsvikt/dag vid behandlingar 
upp till 14 dagar, och på 1 000 mg/kg/kroppsvikt/dag för behand ­
lingar som varar längre än 14 dagar. Förväntad exponering av män ­
niskor kan utgöra en indikation på behovet av att använda en högre dosnivå i ett ”limit-test”.
 
1.5.5  Administrering av doser  
Testsubstansen administreras normalt genom sondmatning med hjälp 
av en magsond, en lämplig intuberingskanyl eller genom en intrape ­
ritoneal injektion. Andra tillförselvägar för exponering kan vara ac ­
ceptabla där de kan motiveras. Den maximala vätskevolymen som kan administreras med hjälp av sondmatning eller injektion vid ett tillfälle beror på försöksdjurets storlek. Volymen bör inte överstiga 
2 ml/100 g kroppsvikt. Användning av volymer som är högre än 
dessa måste motiveras. Förutom för irriterande eller korrosiva sub ­
stanser, som normalt kommer att visa på stegrade effekter med högre koncentrationer, bör variationer av testvolymen minimeras genom en 
justering av koncentrationen för att säkerställa att volymen är kon ­
stant vid alla dosnivåer.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 331
 
1.5.6  Beredning av benmärg/blod  
Benmärgsceller erhålls vanligen från lårbenet eller skenbenet ome ­
delbart efter det att djuret avlivats. Normalt avlägsnas cellerna från lårbenet eller skenbenet, prepareras och färgas in med hjälp av eta ­
blerade metoder. Perifert blod erhålls från svansvenen eller någon 
annan lämplig blodåder. Blodceller färgas omedelbart in supravitalt (8) (9) (10) eller så görs utstrykspreparationer vilka sedan färgas in. Användningen av ett DNA-specifikt färgämne (t.ex. akridinorange 
(14) eller Hoechst 33258 plus pyronin-Y (15)) kan eliminera några 
av de artefakter som ar associerade med användning av ett färgämne som inte är DNA-specifikt. Denna fördel utesluter inte användningen 
av konventionella färgämnen (t.ex. Giemsa). Ytterligare system (t.ex. 
cellulosakolonner för att avlägsna celler med kärnor (16)) kan även användas, förutsatt att dessa system har visat sig fungera på ett adekvat sätt vid preparation av mikrokärnor i laboratoriet.
 
1.5.7  Analys  
Andelen omogna erytrocyter bland det totala antalet erytrocyter 
(omogna + mogna) bestäms för varje djur genom att totalt räkna minst 200 erytrocyter för benmärg och 1 000 erytrocyter för perifert blod (17). Alla utstryksglas, inklusive de från positiva och negativa 
kontroller, bör ges en oberoende kodning innan analys i mikroskop 
utförs. Minst 2 000 omogna erytrocyter per djur undersöks med avseende på förekomst av omogna erytrocyter med mikrokärnor. Ytterligare information kan erhållas genom att söka efter mogna 
erytrocyter med mikrokärnor. Vid analys av utstryksglas bör antalet 
omogna erytrocyter jämfört med det totala antalet erytrocyter inte vara mindre än 20 % av kontrollvärdet. När djur behandlas kontinu ­
erligt under fyra veckor eller mer kan även minst 2 000 mogna 
erytrocyter per djur undersökas med avseende på förekomst av mik ­
rokärnor. System för automatiserad analys (bildanalys och flödes ­
cytometri av cellsuspensioner) är acceptabla alternativ till manuell 
utvärdering om lämplig verifiering och validering sker.
 
2. DATA  
2.1 BEHANDLING AV RESULTATEN 
Individuella data från försöksdjur bör presenteras i tabellform. Den 
experimentella enheten utgörs av försöksdjuret. Antalet omogna eryt ­
rocyter som påträffas, antalet omogna erytrocyter med mikrokärnor, 
och antalet omogna bland det totala antalet erytrocyter bör listas separat för varje djur som analyseras. När försöksdjur behandlas kontinuerligt under fyra veckor eller mer, bör data över mogna eryt ­
rocyter också presenteras, om dessa har samlats in. Andelen omogna 
erytrocyter bland det totala antalet erytrocyter och, om det anses tilllämpligt, procentandelen av erytrocyter med mikrokärnor, bör anges för varje försöksdjur. Om det inte finns några bevis för en 
skillnad i resultaten mellan könen, kan data från båda könen kom ­
bineras för statistisk analys.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 332
 
2.2 UTVÄRDERING OCH TOLKNING AV RESULTATEN 
Det finns ett flertal kriterier som används för att bestämma om ett 
resultat är positivt, t.ex. en dosrelaterad ökning av antalet celler med mikrokärnor eller en tydlig ökning av antalet celler med mikrokärnor 
hos en grupp som fått en enstaka dos vid ett enstaka provtagnings ­
tillfälle. Man bör i första hand överväga resultatets biologiska rele ­
vans. Statistiska metoder kan användas som en hjälp vid utvärdering av testresultatet (18) (19). Statistisk signifikans bör dock inte vara 
den enda faktor som bestämmer om resultatet är positivt. Tvetydiga 
resultat bör klarläggas genom fortsatta tester, lämpligen vid ändrade experimentella betingelser. 
En testsubstans för vilken resultatet inte uppfyller ovanstående kri ­
terier anses vara icke-mutagen i detta test. 
Även om de flesta experiment kommer att ge tydligt positiva eller 
negativa resultat, kan i sällsynta fall uppsättningen av data göra det 
omöjligt att utföra en otvetydig bedömning med avseende på test ­
substansens aktivitet. Resultatet kan förbli tvetydigt eller tveksamt, oavsett hur många gånger experimentet upprepas. 
Positiva resultat i testet av mikrokärnor tyder på att substansen in ­
ducerar mikrokärnor som är ett resultat av en kromosomal skada 
eller skada på den mitotiska apparaten i erytroblasterna hos den art som testas. Negativa resultat indikerar att testsubstansen, under dessa försöksbetingelser, inte ger upphov till mikrokärnor i de omogna 
erytrocyterna hos den art som testas. 
Sannolikheten för att testsubstansen eller någon av dess metaboliter 
ska nå ut i det stora kretsloppet eller specifikt till målvävnaden (t.ex. systemisk toxicitet) bör diskuteras.
 
3. RAPPORTERING  
TESTRAPPORT 
Testrapporten måste innehålla följande information: 
Lösningsmedel/vehikel: — motivering för valet av vehikel 
— testsubstansens löslighet och stabilitet i lösningsmedlet/vehikeln, 
om detta är känt 
Försöksdjur: — art/stam som används — försöksdjurens antal, ålder och kön 
— källa, förhållanden vid förvaring, diet, etc. 
— individuell vikt hos försöksdjuren vid försökets början, inklusive 
kroppsviktsintervallet, medelvärde och standardavvikelse för 
varje grupp 
Försöksbetingelser: — positiva och negativa kontrolldata (vehikel/lösningsmedel) — data från en undersökning av spännvidden, om en sådan har 
utförts
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 333
 
— grund för valet av dosnivå 
— uppgifter om beredningen av testsubstansen — uppgifter om administreringen av testsubstansen 
— grund för det sätt administreringen sker på 
— metoder för att verifiera att testsubstansen nådde det stora krets ­
loppet eller målvävnaden, om detta är tillämpbart 
— omvandling av koncentrationen för testsubstansen i diet/dricks ­
vatten (ppm) till den verkliga dosen (mg/kg/kroppsvikt/dag), om 
detta är tillämpbart 
— fodrets och vattnets kvalitet 
— detaljerad beskrivning av behandlings- och provtagningsscheman — metoder för preparation av utstryksglas — metoder för mätningar av toxicitet 
— kriterier för bestämning av omogna erytrocyter med mikrokärnor 
— antalet analyserade celler per djur — kriterier för bedömning av om undersökningarna är positiva, ne ­
gativa eller tvetydiga 
Resultat: — tecken på toxicitet 
— andelen omogna erytrocyter av det totala antalet erytrocyter 
— antalet omogna erytrocyter med mikrokärnor, angett separat för 
varje djur 
— medelvärde ± standardavvikelse för omogna erytrocyter med 
mikrokärnor per grupp 
— dos/responsförhållande, närhelst detta är möjligt — statistiska analyser och metoder som används — samtidiga och historiska negativa kontrolldata 
— samtidiga positiva kontrolldata 
Diskussion av resultaten. Slutsatser.
 
4. HÄNVISNINGAR  
1. Heddle, J. A. (1973), A Rapid  In Vivo  Test for Chromosomal 
Damage, Mutation  Res.,  18, s. 187–190. 
2. Schmid, W. (1975), The micronucleus Test, Mutation Res., 31, 
s. 9–15. 
3. Heddle, J. A., Salamone, M. F., Hite, M., Kirkhart, B., Mavour ­
nin, K., MacGregor, J. G. and Newell, G. W. (1983), The 
Induction of Micronuclei as a Measure of Genotoxicity. Muta ­
tion Res. 123. s. 61–118. 
4. Mavourmin, K. H., Blakey, D. H., Cimino, M. C, Salamone, M. 
F. and Heddle, J. A. (1990), The  In Vivo  micronucleus Assay in 
Mammalian Bone Marrow and Peripheral Blood. A report of 
the U.S. Environmental Protection Agency Gene-Tox Program, 
Mutation Res., 239, s. 29–80.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 334
 
5. MacGregor, J. T., Schlegel, R. Choy, W. N., and Wehr, C. M. 
(1983), Micronuclei in Circulating Erythrocytes: A Rapid 
Screen for Chromosomal Damage During Routine Toxicity Tes ­
ting in Mice. in: ’Developments in Science and Practice of Toxicology’, ed. A. W. Hayes, R. C. Schnell and T. S. Miya, 
Elsevier, Amsterdam, s. 555–558. 
6. MacGregor,). T., Heddle, J. A. Hite, M., Margolin, G. H., Ra ­
mel, C, Salamone, M. F., Tice, R. R., and Wild, D. (1987), 
Guidelines for the Conduct of micronucleus Assays in Mammalian Bone Marrow Erythrocytes. Mutation Res., 189: s. 103–112. 
7. MacGregor, J. T., Wehr, C. M., Henika, P. R., and Selby, M. E. 
(1990), the  In vivo  Erythrocyte Micronuc- leus Test: Measure ­
ment at Steady State Increases Assay Efficiency and Permits Integration with Toxicity Studies.  Fund. Appl . Toxicol.  14, 
s. 513–522. 
8. Hayashi, M., Morita, T., Kodarna, Y., Sofuni, T. and Ishidate, 
M. Jr. (1990), The Micronucleus Assay with Mouse Peripheral 
Blood Reticulocytes Using Acridine Orange-Coated Slides. Mu ­
tation  Res.,  245, s. 245–249. 
9. The Collaborative Study Group for the Micronucleus Test 
(1992), Micronucleus Test Wirth Morse Perip heral Blood Erythrocytes by Acridine Orange supravital Staining: The Sum ­
mary Report of the 5th Col laborative Study by CSGMT/ 
JEMMS. MMS.  Mutation Res.  278, s. 83–98. 
10. The Collaborative Study Group for the Micronucleus Test 
(CSGMT/JEMMS. MMS: The Mammalian Mutagenesis Study Group of the Environmental Mutagen Society of Japan) (1995), Protocol recommended for the short-term mouse peripheral 
blood micronucleus test.  Mutagenesis , 10, s. 153–159. 
11. Hayashi, M., Tice, R. R., MacGregor, J. T., Anderson, D., 
Blackey, D. H., Kirsch-Volders, M., Oleson, Jr. F. B., Pacchie ­
rotti, F., Romagna, F., Shimada, H., Sutou, S. and Vannier, B. (1994),  In vivo  Rodent Eryth rocyte Micronucleus Assay. Mu ­
tation Res., 312, s. 293–304. 
12. Higashikuni, N. and Sutou, S. (1995), An optimal, generalized 
sampling time of 30 ± 6 h after double dosing in the mouse 
peripheral blood micronucleus test.  Mutagenesis,  10, 
s. 313–319. 
13. Fielder, R. J., Allen, J. A., Boobis, A. R., Botham, P. A., Doc, 
J., Esdaile, D.]., Gatehouse, D. G., Hodson- Walker, G., Mor ­
ton, D. B.. Kirkland. D. J. and Rochold, M. (1992), Report of 
British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society Working Group: Dose Setting in  In Vivo  Mutagenicity Assays. 
Mutagenesis, 7, s. 313–319. 
14. Hayashi, M., Sofuni, T. and Ishidate, M. Jr. (1983), An Appli ­
cation of Acridine Orange Fluorescent Stai ning to the micro ­
nucleus Test. Mutation Res. 120, s. 241–247. 
15. MacGregor, J. T., Wehr, C. M. and Langlois, R. G. (1983), A 
Simple Fluorescent Staining Procedure for Micronuclei and 
RNA in Erythrocytes Using Hoechst 33258 and Pyronin Y. Mutation Res., 120, s. 269–275. 
16. Romagna, F. and Staniforth, C. D. (1989), The automated bone 
marrow micronucleus test. Mutation Res. 213, s. 91–104. 
17. Gollapudi, B. and McFadden, L. G. (1995), Sample size for the 
estimation of polychromatic to normochromatic erythrocyte ra ­
tio in the bone marrow micronucleus test.  Mutation Res ., 347, 
s. 97–99.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 335
 
18. Richold, M., Ashby, J., Bootman, J., Chandley, A., Gatehouse, 
D. G. and Henderson, L. (1990),  In Vivo  Cytogenetics Assay. 
In: D. J. Kirkland (ed)  Basic Mutagenicity tests. UKEMS Re ­
commended Procedures. UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity testing.  Report,  Part I, revised.  Cambridge 
University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Sydney, 
s. 115–141. 
19. Loveli, D. P., Anderson, D., Albanese, R., Amphlett, G. E., 
Clare, G., Ferguson, R., Richold, M., Papworth, D. G. and Savage, J. R. K. (1989), Statistical Analysis of  In Vivo  Cyto­
genetic Assays. In: D. J. Kirkland (cd)  Statistical Evaluation oj 
Mutagenicity Test Dala. UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report, Part III.  Cambridge Univer ­
sity Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, 
Sydney, s. 184–232.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 336
 
B.13/14  MUTAGENICITET – TEST AV ÅTERMUTATION HOS 
BAKTERIER  
1. METOD  
Denna metod är en kopia av OECD TG 471, Omvänt bakteriellt 
mutationstest (Bakterial Reserve Mutation Test (1997)).  
1.1 INLEDNING 
1 detta test av återmutation hos bakterier används aminosyraberoende 
stammar av  Salmonelle typhimurium  och  Escherichia coli  för att 
detektera punktmutationer, vilka innefattar substitution, addition eller 
deletion av ett eller några DNA-baspar (1) (2) (3). Testet bygger på principen att man detekterar mutationer som gör att redan existerande mutationer i teststammarna går tillbaka varvid den funktionella för ­
mågan hos bakterierna att syntetisera en essentiell aminosyra åter ­
ställs. De återmuterade bakterierna detekteras på grundval av sin förmåga att växa i frånvaro av den aminosyra som krävs hos den ursprungliga teststammen. 
Punktmutationer är orsaken till många genetiska sjukdomar hos män ­
niskor och mycket tyder på att punktmutationer i onkogener och suppressorgener för tumörer i somatiska celler är inblandade i bild ­
ning av tumörer hos människor och försöksdjur. Testet av återmuta ­
tion hos bakterier är snabbt, billigt och relativt enkelt att utföra. Många av testarterna har ett flertal egenskaper som gör dem mera känsliga för detektion av mutationer inklusive responsiva DNA-se ­
kvenser vid reversionssäten, ökad cellerpermeabilitet för stora mole ­
kyler och eliminering av reparationssystem för DNA eller förstärk ­
ning av felbenägna reparationsprocesser för DNA. Specificiteten hos teststammarna kan erbjuda en del nyttig information om de typer av 
mutationer som induceras av genotoxiska ämnen. En mycket stor 
databas med resultat för ett stort antal olika strukturer finns tillgäng ­
lig för tester av återmutation hos bakterier och väletablerade metoder har utvecklats för testning av kemikaler med olika fysisk-kemiska 
egenskaper, inklusive flyktiga ämnen. 
Se även Allmän inledning, del B.
 
1.2 DEFINITIONER 
ett test av  återmutation  hos antingen  Salmonella  typhimurium eller  
Escherichia coli  detekterar mutation i en aminosyraberoende stam 
(histidin respektive tryptofan), vilket ger en stam som är oberoende av en extern tillförsel av aminosyror.  
mutagener som ger basparsubstitutioner  är ämnen som orsakar en 
basförändring i DNA. I ett test av återmutation kan denna förändring 
uppträda vid sätet för den ursprungliga mutationen eller på ett andra 
säte i det bakteriella genomet.  
mutagener som ger förskjutningar (frameshift)  är ämnen som orsakar 
addition eller deletion av ett eller flera baspar i DNA, vilket då ger 
en ändrad avläsningsordning i RNA.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 337
 
1.3 INLEDANDE ÖVERVÄGANDEN 
Testet av återmutation hos bakterier utnyttjar prokaryota celler, vilka 
skiljer sig från däggdjursceller med avseende på sådana faktorer som upptag, metabolism, kromosomstruktur och processer för DNA-repa ­
ration. Tester som utförs in vitro kräver i allmänhet att det finns en 
yttre källa för metabolisk aktivering. Hos system för metabolisk aktivering in  vitro  kan inte förhållandena för däggdjur  in vivo  efter­
liknas helt och hållet. Testet ger därför ingen direkt information om 
den mutagena och den karcinogena potensen hos en substans i dägg ­
djur. 
Testet av återmutation hos bakterier används vanligen som en inle ­
dande undersökning av genotoxisk aktivitet och, i synnerhet, av 
aktivitet som inducerar punktmutationer. En omfattande databas har 
demonstrerat att många kemikalier som ger positiva resultat i detta test även uppvisar mutagen aktivitet i andra tester. Det finns exempel på mutagena ämnen som inte kan detekteras med hjälp av detta test. 
Skälen till dessa tillkortakommanden kan tillskrivas den specifika 
naturen hos den detekterade slutpunkten, skillnader i metabolisk ak ­
tivering, eller skillnader i biotillgänglighet. Å andra sidan kan fak ­
torer som höjer känsligheten hos testet leda till en överskattning av 
den mutagena aktiviteten. 
Testet av återmutation hos bakterier kan visa sig olämpligt för ut ­
värdering av vissa klasser av kemikalier såsom starkt baktericida ämnen (t.ex. vissa antibiotika) och de som anses (eller är kända för att) interferera specifikt med systemet för cellreplikation hos 
däggdjur (t.ex. vissa inhibitorer av topoisomeras och vissa nukleosi ­
danaloger). 1 sådana fall kan mutationstester på däggdjur vara mera lämpliga. 
Även om många ämnen som ger positiva resultat i detta test är 
karcinogena för däggdjur, är korrelationen inte absolut. Den är be ­
roende på kemisk klass och det finns karcinogener som inte kan detekteras med hjälp av detta test, eftersom de verkar genom andra, icke-genotoxiska mekanismer eller mekanismer som saknas i bakte ­
rieceller.
 
1.4 TESTMETODENS PRINCIP 
Suspensioner med bakterieceller exponeras för testsubstansen i när ­
varo och i frånvaro av ett exogent system för metabolisk aktivering. 1 plattinkorporeringsmetoden blandas dessa suspensioner med en toppskiktsagar varpå plattor omedelbart görs på minimalmedium. I 
preinkubationsmetoden inkuberas behandlingsblandningen och sedan 
blandas denna med en toppskiktsagar innan plattor görs på minimal ­
medium. I båda metoderna räknas återmuterade kolonier efter två eller tre dagars inkubering och jämförs med antalet spontant återmu ­
terade kolonier på kontrollplattor med lösningsmedel. 
Ett flertal procedurer för att utföra testet av återmutation hos bakte ­
rier har beskrivits. Bland de som vanligtvis används ingår plattinkor ­
poreringsmetoden (1) (2) (3) (4), preinkubationsmetoden (2) (3) (5) (6) (7) (8), fluktue-ringsmetoden (9) (10) och suspensionsmetoden 
(11). Modifikationer för testning av gaser eller ångor har tidigare 
beskrivits (12).
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 338
 
De procedurer som beskrivs i metoden hänför sig primärt till plat ­
tinkorporerings- och preinkubationsmetoder. Inga av dem är accep ­
tabla för att genomföra experiment både med och utan metabolisk aktivering. Vissa substanser kan detekteras mer effektivt med hjälp av preinkubationsmetoden. Dessa substanser tillhör kemiska klasser 
som innefattar korta kedjor med alifatiska nitrosaminer, tvåvärda 
metaller, aldehyder, azofärger och diazoföreningar, pyrolizidinalko ­
loider, allylföreningar och nitroföreningar (3). Det är även känt att vissa klasser av mutanter inte alltid detekteras med hjälp av standard ­
procedurer såsom plattinkorporeringsmetoden eller preinkubations ­
metoden. Dessa bör uppfattas som ’speciella fall’ och det rekom ­
menderas varmt att alternativa procedurer används för detektionen av dem. De följande ’speciella fallen’ bör identifieras (tillsammans med 
exempel på procedurer som kan användas för detektionen av dem): 
azofärger och diazoföreningar (3) (5) (6) (13), gaser och flyktiga kemikaler (12) (14) (15) (16) samt glykosider (17) (18). En avvikelse från standardproceduren måste vara vetenskapligt motiverad.
 
1.5 BESKRIVNING AV TESTMETODEN  
1.5.1  Förberedelser  
1.5.1.1  Bakterier  
Nya kulturer med bakterier bör få växa till sig fram till den sena 
exponentiella eller tidiga stationära tillväxtfasen (ungefär 10  9 celler 
per ml). Kulturer som befinner sig i sen stationär fas bör inte an ­
vändas. Det är viktigt att de kulturer som används i experimentet har 
en hög tider med livsdugliga bakterier. Titern kan fås fram antingen ur tillväxtkurvor från historiska kontrolldata, eller ur varje försök genom att bestämma antalet livsdugliga celler med hjälp av ett ut ­
strykningsexperiment. 
Den rekommenderade inkubationstemparaturen är 37
 o C. 
Minst fem bakteriestammar bör användas. Dessa bör inkludera fyra 
av S. typhimurium  (TA 1535; Ta 1537 eller TA97a eller TA97; 
TA9S; och TA100) som har visat sig vara tillförlitliga och ge en 
reproducerbar respons i olika laboratorier. Dessa fyra stammar av  S, 
typhimurium  har GC-baspar vid det primära återmutationsstället och 
det är känt att de inte kan detektera vissa oxiderande mutagener, tvärbindande ämnen och hydraziner. Sådana substanser kan detekte ­
ras med hjälp av E.  coli WP2-stammar eller  S. typhimurium TA 102 
(19) som har ett AT-baspar vid det primära återmutationsstället. Den rekommenderade kombinationen av stammar är därför: 
— S.  lyphimurium  TA 1535, 
— S. typhimurium  TA1537 eller TA97 eller TA97a, 
— 5.  typhimuriurn  TA98, 
— S. typhimurium  TA100, och 
— E. coli  WP2 uvrA, eller C.  coli  WP2 uvrA (pKM101), eller S.  
typhimurium  TA102. 
Fär att kunna detektera tvärbindande mutagener kan det vara lämp ­
ligt att inkludera TA102 eller att också använda en DNA-reparations ­
duglig stam av  E. coli  (t.ex.  E.coli  WP2 eller E. coli WP2 
(pKM101)).
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 339
 
Etablerade procedurer för beredning av baskulturer, markörverifie ­
ring och lagring bör användas. Behovet av aminosyror för tillväxten 
bör påvisas för varje frusen preparation av baskulturer (histidin för stammar av  S. typhimurium  och tryptofan för stammar av  E. coli).  
Andra fenotypiska karakteristika bör kontrolleras på liknande sätt, 
nämligen närvaron eller frånvaron av R-faktorplasmider där detta 
är lämpligt (dvs. ampicillin-resi-stens i stammarna TA98, TA100 och TA97a eller TA97, WP2 uvrA och WP2 uvrA (pKM101) och ampicillin + tetracyklinreststens i stammen TA102); närvaron av 
karakteristiska mutationer (dvs. rfa-mutation i  S. typhimurium  genom 
känslighet för kristallviolett och uvrA-mutation i  E. coli  eller uvrB- 
mutation i  S. typhimurium  genom känslighet för ultraviolett ljus) (2) 
(3). Stammarna bör även ge spontant återmuterande platträkningar av 
kolonier inom de frekvensområden som kan förväntas från laborato ­
riets historiska kontrolldata och helst inom det område som rappor ­
teras i litteraturen.
 
1.5.1.2  Medium  
Använd en lämplig minimalagar (t.ex. innehållande Vogel-Bonner 
minimalmedium E och glukos) och ett agartoppskikt som innehåller 
histindin och biotin eller tryptofan, så att några stycken celldelningar 
ska kunna ske (1) (2) (9).  
1.5.1.3  Melabolisk aktivering  
Bakterier bör exponeras för testsubstansen både i närvaro och frånvaro 
av ett lämpligt system för metabolisk aktivering. Det vanligaste syste ­
met som används är en post-mitokondriell fraktion där en kofaktor 
tillsatts (S9) vilken beretts ur lever från gnagare vilka behandlats 
med enzyminducerande ämnen såsom Aroclor 1254 (1) (2) eller en kombination av fenobarbiton och  β-naftoflavon (18) (20) (21). Den 
post-mitokondriella fraktionen används vanligen vid koncentrationer 
i området från 5 till 30 % v/v i S9-blandningen. Valet av och beting ­
elserna hos ett system för metabolisk aktivering kan bero på den klass av kemikalier som testas. I vissa fall kan det vara lämpligt att använda mer än en koncentration av den postmitokondriella fraktionen. För 
azofärger och diazoämnen, kan användning av ett reduktivt system 
för metabolisk aktivering vara lämpligare (6) (13).
 
1.5.1.4  Beredning av testsubstansen  
Fasta testsubstanser bör lösas upp i eller blandas med lämpliga lös ­
ningsmedel eller vehiklar och spädas ut, om detta är lämpligt, före 
det att bakterierna behandlas. Flytande testsubstanser kan tillsättas 
direkt till testsystemen och/eller spädas ut före behandling. Nygjorda beredningar bör användas om inte stabilitetsdata visar att lagring kan accepteras. 
Lösningsmedel/vehiklar bör inte kunna misstänkas för att reagera 
kemiskt med testsubstansen och bör vara förenliga med bakteriernas 
överlevnad samt S9-aktivitet (22). Om man använder andra lösnings ­
medel/vehiklar än gängse brukliga, bör användningen av dem ha stöd från data som visar på deras kompatibilitet. Därhelst det är möjligt, 
rekommenderas att man i första hand överväger vattenbaserade lös ­
ningsmedel/vehiklar.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 340
 
1.5.2  Försöksbetingelser  
1.5.2.1  Teststammar (se 1.5.1.1)  
1.5.2.2  Exponeringskoncentration  
Cytotoxiciteteri och lösligheten i den slutliga behandlingsbland ­
ningen är några av de kriterier som man måste ta hänsyn till vid 
bestämningen av den högsta mängd av testsubstansen som ska an ­
vändas. 
Det kan vara bra att bestämma toxicitet och löslighet i ett förbere ­
dande experiment. Cytotoxicitet kan detekteras genom en minskning 
av antalet återmuterande kolonier, en uttunning eller minskning av bakgrundstillväxten, eller graden av överlevnad hos de behandlade kulturerna. Cytotoxiciteten hos en substans kan ändras i närvaro av 
system för metabolisk aktivering. Olöslighet bör fastställas som en 
utfällning i den slutliga blandningen, under de verkliga försöks ­
betingelserna och ska vara synlig för blotta ögat. 
Den maximala rekommenderade testkoncentrationen för lösliga icke- 
cytotoxiska substanser är 5 mg/platta eller 5 μl/platta. För icke-cy ­
totoxiska substanser som inte är lösliga vid 5 mg/platta eller 5 μl/ 
platta, bör en eller flera av de koncentrationer som testas vara olös ­
liga i den slutliga behandlingsblandningen. Testsubstanser som är cytotoxiska redan under 5 mg/platta eller 5 μl/platta bör testas upp 
till en cytotoxisk koncentration. Fällningen torde inte störa bestäm ­
ningen. 
Minst fem olika analyserbara koncentrationer av testsubstansen bör 
användas, med ungefär halva log-intervall (dvs. √10) mellan test ­
punkterna för ett inledande experiment. Mindre intervall kan vara 
lämpliga när ett koncentrationssvar håller på att undersökas. Testning 
över en koncentration på 5 mg/platta eller 5 μl/platta kan övervägas 
vid utvärdering av substanser som innehåller avsevärda mängder av potentiellt mutagena föroreningar.
 
1.5.2.3  Negativa och positiva kontroller  
Samtidiga stamspecifika positiva och negativa kontroller (lösnings ­
medel eller vehikel), både med och utan metabolisk aktivering, bör 
inkluderas i varje försök. Positiva kontrollkoncentrationer som visar på det effektiva utfallet för varje försök bör väljas. 
För försök där ett system för metabolisk aktivering används, bör den 
positiva kontrollreferenssubstansen väljas på basis av de typer av 
bakteriestammar som används. 
De följande substanserna utgör exempel på lämpliga positiva kont ­
roller för försök med metabolisk aktivering:
 
Substans CAS-nummer EINECS-nummer  
9,10-dimetylantracen 781-43-1 212-308-4 
7,12-dimetylbensantracen 57-97-6 200-359-5 
bens[a]pyren 50-32-8 200-028-5 
2-aminoantracen 613-13-8 210-330-9  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 341
 
Substans CAS-nummer EINECS-nummer  
Cyklofosfoamid 50-18-0 200-015-4 
Cyklofosfoamidmonohydrat 6055-19-2 
Höljande substans är en lämplig positiv kontroll for den reduktiva 
metaboliska aktiveringsmetoden:  
Substans CAS-nummer EINECS-nummer  
kongorött 573-58-0 209-358-4 
2-aminoantracen bör inte användas som den enda indikatorn på ef ­
fektiviteten hos S9-blandningen. Om 2-aminoanracen används, bör varje sats av S9 även karakteriseras med en mutagen som kräver metabolisk aktivering med hjälp av mikrosomala enzymer, t.ex. ben ­
s[a]pyren, dimetylbensantracen. 
Följande substanser utgör exempel på sortspecifika positiva kontrol ­
ler för försök som utförs utan exogena system för metabolisk akti ­
vering:
 
Substans CAS-nummer EINECS-nummer Stam  
Natriumazid 26628-22-8 247-852-1 TA 1535 och TA 100 
2-nitrofluoren 607-57-8 210-138-5 TA 98 
9-aminoakridin 90-45-9 201-995-6 TA 15 37, TA 97 och TA 97a 
ICR 191 17070-45-0 241-129-4 TA 1537, TA 97 och TA 97a 
Kumenhydrope ­
roxid 80-15-9 201-254-7 TA 102 
Mitomycin C 50-07-7 200-008-6 WP2uvrA och TA 102 
N-etyl-N-nitro-N- 
nitrosoguanidin 70-25-7 200-730-1 WP2, WP2uvrA och WP2uvrA 
(pKM101) 
4-nitroquinolin-1 
-oxid 56-57-5 200-281-1 WP2, WP2uvrA och WP2uvrA 
(pKM101) 
Furylfuramid 
(AF2) 3688-53-7 plasmidinnehållande stammar 
Andra lämpliga positiva kontrollreferenssubstanser kan användas. 
Användningen av kemiska klassrelaterade positiva kontrollkemikalier bör övervägas när sådana finns att tillgå. 
Negativa kontroller, bestående av enbart lösningsmedel eller vehikel, 
utan testsubstans, och i övrigt hanterade på samma sätt som för de behandlade grupperna, bör inkluderas. Obehandlade kontroller bör dessutom även användas, om det inte finns historiska kontrolldata 
som visar att inga farliga eller mutagena effekter induceras av det 
valda lösningsmedlet.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 342
 
1.5.3  Förfarande  
Vid plattinkorporeringsmetoden (1) (2) (3) (4), utan metabolisk ak ­
tivering, blandas vanligen 0,05 ml eller 0,1 ml av testlösningarna, 0,1 ml av färsk bakteriekultur (innehållande ungefär 10
 8 livsdugliga cel ­
ler) och 0,5 ml av steril buffert med 2,0 ml av toppskiktsagar. För ett 
försök med metabolisk aktivering blandas vanligen 0,5 ml av en metabolisk aktiveringsblandning, vilken innehåller en adekvat mängd postmitokondriell fraktion (i området från 5 till 30 % v/v i den 
metaboliska aktiveringsblandningen) med toppskiktsagar (2,0 ml), 
tillsammans med bakterierna och testsubstansen/testlösningen. Inne ­
hållet i varje rör blandas och hälls över ytan på en minimalagarplatta. 
Toppskiktsagarn tillåts att stelna innan inkubering sker. 
För förinkubationsmetoden (2) (3) (5) (6), förinkuberas testsubstan ­
sen/testlösningen med teststamman (innehållande ungefär 10
 8 livs­
dugliga celler) och steril buffert eller med system för metabolisk 
aktivering (0,5 ml), vanligen under 20 minuter eller längre vid 
30–37  o C, innan den blandas med toppskiktsagarn och hälls uppå 
ytan på en minimalagarplatta. Vanligen blandas 0,05 eller 0,1 ml av testsubstansen/testlösningen, 0,1 ml bakterier och 0,5 ml av 
S9-blandningen eller steril buffert blandat med 2,0 ml av topps ­
kiktsagar. Rören bör luftas under förinkubationen med hjälp av en skakmaskin. 
För att möjliggöra en rimlig uppskattning av variationen bör tre 
plattor användas vid varje dosnivå. Användning av två plattor är 
acceptabelt när detta är vetenskapligt motiverat. Förlust av en en ­
staka platta innebär inte nödvändigtvis att ett försök blir ogiltigt. 
Gasformiga eller flyktiga substanser bör testas med lämpliga meto ­
der, såsom i slutna kärl (12) (14) (15) (16).
 
1.5.4  Inkubering  
Alla plattor i en given assay bör inkuberas vid 37  o C under 48–72 
timmar. Efter inkubationsperioden räknas antalet återmuterande ko ­
lonier per plattor.  
2. DATA  
2.1 BEHANDLING AV RESULTATEN 
Data bör presenteras som antalet återmuterande kolonier per platta. 
Antalet återmuterande kolonier på såväl negativa (lösningsmedels ­
kontroll och obehandlad kontroll, om en sådan används) och positiva 
kontrollplattor bör även anges. Individuella platträkningar, medelan ­
talet för de återmuterande kolonierna per platta och standardavvikel ­
sen bör uppges för såväl testsubstansen som för positiva och nega ­
tiva (obehandlade och/eller (lösningsmedels) kontroller). 
Der finns inget krav på verifiering av ett tydligt positivt svar. Tve ­
tydiga resultat bör klarläggas genom fortsatta tester, lämpligen vid ändrade experimentella betingelser. Negativa resultat måste bekräftas från fall till fall. I de fall där det inte anses nödvändigt att bekräfta 
negativa resultat bör detta motiveras. Vid uppföljningsexperiment bör 
man överväga att ändra parametrarna i undersökningen för att ut ­
vidga de bedömda försöksbetingelserna. De försöksparametrar som skulle kunna modifieras innefattar koncentrationsindelningen, meto ­
den för behandling (plattinkorporering eller förinkubation i vätska), 
och betingelser för metabolisk aktivering.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 343
 
2.2 UTVÄRDERING OCH TOLKNING AV RESULTATEN 
Det finns ett flertal kriterier som används för att bestämma om ett resultat 
är positivt, t.ex. en koncentrationsrelaterad ökning över hela det testade området och/eller en reproducerbar ökning, vid en eller flera koncent ­
rationer, av antalet återmuterande kolonier per platta för minst en stam, 
med eller utan ett system för metabolisk aktivering (23). Man bör i första hand överväga resultatets biologiska relevans. Statistiska metoder kan användas som en hjälp vid utvärdering av testresultatet (24). Statistisk 
signifikans bör dock inte vara den enda faktor som bestämmer om svaret 
är positivt 
En testsubstans för vilken resultatet inte uppfyller ovanstående kri ­
terier anses vara icke-mutagen i detta test. 
Även om de flesta experiment kommer att ge tydligt positiva eller 
negativa resultat, kan uppsättningen av data i sällsynta fall göra det omöjligt att utföra en otvetydig bedömning med avseende på test ­
substansens aktivitet. Resultatet kan förbli tvetydigt eller tveksamt, 
oavsett hur många gånger experimentet upprepas. 
Positiva resultat från testet av återmutation hos bakterier indikerar att 
substansen inducerar punktmutationer genom bassubstitutioner eller förskjutningar i genomet hos antingen  Salmonella typhimurium  och/ 
eller Escheri-chia coli.  Negativa resultat indikerar att testsubstansen 
inte är mutagen hos den testade sorten under dessa försöksbeting ­
elser.
 
3. RAPPORTERING  
TESTRAPPORT 
Följande information måste ingå i testrapporten: 
Lösningsmedel/vehikel: — motivering för valet av lösningsmedel/vehikel — testsubstansens löslighet och stabilitet i lösningsmedlet/vehikeln, 
om detta är känt, 
Stammar: — stammar som används 
— antalet celler per kultur 
— karakteristika för stammen Försöksbetingelser: — mängd av testsubstansen per platta (mg/platta eller μl/platta) med 
grund för val av dos och antal plattor per koncentration 
— använda medier — typ och sammansättning hos det system som används för meta ­
bolisk aktivering, inklusive acceptabilitetskriterier 
— behandlingsprocedurer Resultat: 
— tecken på toxicitet 
— tecken på utfällning — individuella platträkningar
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 344
 
— medelantalet återmuterande kolonier per platta och standardavvi ­
kelse 
— dos/respons-förhållande, där detta är möjligt — statistiska analyser, om några sådana finns 
— samtidiga negativa (lösningsmedel/vehikel) och positiva kontroll ­
data, med omfattning, medelvärden och standardavvikelser 
— historiska negativa (lösningsmedel/vehikel) och positiva kontroll ­
data, med omfattning, medelvärden och standardavvikelser 
Diskussion av resultaten. 
Slutsatser.
 
4. HÄNVISNINGAR  
1. Ames, B. N., McCann,). and Yamasaki E. (1975), Metods for 
Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/ 
Mammalian-Microsome Mutagenitic Test.  Mutation Res.,  31, 
s. 347–364. 
2. Maron, D. M. and Ames, B. N. (1983), Revised Methods for 
the Salmonella Mutagenicity Test.  Mutation Res.  113, 
s. 173–215. 
3. Gatehouse, D., Haworth, S., Cebula, T., Gocke. E., Kier, L. 
Matsushima, T. Melcion, C, Nohmi, T., Venitt, S. and Zeiger, 
E. (1994), Recommendations for the Performance of Bacterial 
Mutation Assays. Mutation  Res.  312, s. 217–23 3. 
4. Kier, L. D. , Brusick I., Auletta, A. E., Von Halle, E. S., 
Brown, M. M, Simmon, V. R, dunkel, V., McCann, J., Mortel ­
mans, K., Prival, M., Rao, T.K. and Ray V. (1986), The  Sal­
monella  typhimurium/Mam malian Microsomal Assay: A Re ­
port of the U.S. Environmental Protection Agency Gene-Tox 
Program.  Mutation Res.  168, s. 69–240. 
5. Yahagi, T., Degawa, M., Seino, Y. Y. , Matsushima, T., Nagao, 
M., Sugimura, T. and Hashimoto, Y. (1975), Mutagenicity of 
Carcinogen Azo Dyes and their Derivatives,  Cancer Letters,  1, 
s. 91–96. 
6. Matsushima, M., Sugimura, T., Nagao, M., Yahagi, T., Shirai, 
A. and Sawamura, M. (1980), Factors Modulating Mutagenicity 
Microbial Tests, in:  Short-term Test Systems for Detecting Car ­
cinogens,  ed. Norpoth K. H. and Garner, R. C, Springer, Berlin- 
Heidelberg-New York, s. 273–285. 
7. Gatehouse, D. G., Rowland, 1. R., Wilcox. P., Callender, R. D. 
and Foster, R. (1980), Bacterial Mutation Assays, in:  Basic 
Mutagenicily Tests: UKEMS Part I Revised.  ed. D.). Kirkland, 
Cambridge University Press, s. 13–61. 
8. Aeschacher, H. U., Wolleb. U. and Porchet, L. (1987), Liquid 
Preincubation Mutagenicity Test for Foods.  J. l:ood Safety,  8, 
s. 167–177. 
9. Green, M. H. L., Muriel, W. J. and Bridges, B. A. (1976), Use 
of a simplified fluctuation test to detect low levels of mutagens,  
Mutation Res.,  38, s. 33–42. 
10. Hubbard, S. A., Green, M. H. L, Gatehouse, D. and Bridges,]. 
W. (1984), The Fluctuation Test in Bacteria, in:  Handbook of 
Mutagenicity Test Procedures,  2nd Edition, cd. Kilbey, B. J., 
Legator, M., Nichols, W. and Ramel, C, Elsevier, Amsterdam- 
New York-Oxford, s. 141–161.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 345
 
11. Thompson, E. D. and Melampy, P. J. (1981), An Examination 
of the Quantitative Suspension Assay for Mutagenesis with 
Strains of  Salmonella lyphimuriurn, Environmental Mutagene ­
sis. 3, s. 453–465. 
12. Araki, A., Noguchi, T., Kato, F. and Matsushima, T. (1994), 
Improved Method for Mutagenicity Testing of Gaseous Com ­
pounds by Using a Gas Sampling Bag,  Mutation Res.,  307, 
s. 335–344. 
13. Prival, M. J., Bell, S. J., Mitchell, V. D., Reipert, M. D. and 
Vaughan, V. L. (1984), Mutagenicity of Benzidine and Benzi ­
dine-Congener Dyes and Selected Monoazo Dyes in a Modified Salmonella Assay,  Muta tion Res.,  136, s. 33–47. 
14. Zeiger, E., Anderson. B. E., Haworth, S., Lawlor, T. and Mor ­
telmans, K. (1992), Salmonella Mutagenicity Tests. V. Results from the Testing of 311 Chemicals,  Environ . Mol. Mutagen.,  
19, s. 2–141. 
15. Simmon, V., Kauhanen, K. and Tardiff, R. G. (1977), Mutage ­
nic Activity of Chemicals Identified in Drinking Water,  In Pro­
gress in Genetic Toxicology,  D. Scott, B. Bridges and F., Sobels 
(eds.) Elsevier, Ams terdam, s. 249–258. 
16. Hughes, T.)., Simmons, D. M, Monteith, I. G. and Claxton, L. 
D. (1987), Vaporization Technique to Measure Mutagenic Ac ­
tivity of Volatile Organic Chemicals in the Ames/Salmonella 
Assay,  Environmenlal Mutagenesis,  9, s. 421–441. 
17. Matsushima, T., Matsumoto, A., Shirai, M., Sawamura, M., and 
Sugimura, T. (1979), Mutagenicity of the Naturally Occurring 
Carcinogen Cycasin and Synthetic Methylazoxy Methane Con ­
jugates in  Salmo nella  typhimurium,  Cancer Res.,  39, 
s. 3780–3782. 
18. Tamura, G., Gold, C, Ferro-Luzzi, A. and Arnes, B. N. (1980), 
Fecalase: A Model for Activation of Dietary Glycosides to 
Mutagens by Intestinal Flora,  Proc. Natl. Acad. Sci,.  USA, 
77, s. 4961–4965. 
19. Wilcox, P., Naidoo, A., Wedd, D.). and Gatehouse, D. G. 
(1990), Comparison of  Salmonella  typhimurium TA 102 with  
Escherichia coli  WP2 Tester strains,  Mutagenesis,  5, 
s. 285–291. 
20. Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. and Sugimura, T. 
(1976), A Safe Substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer or Metabolic Activation Systems, in: in vitro  Metabolic 
Activation in  Mutagenesis  Testing,  eds. F. (. de Serres et al. 
Elsevier, North Holland, s. 85–88. 
21. Elliot, B. M., Combes, R. D., Elcombe, C. R., Gatehouse, D. 
G., Gibson, G. G., Mackay, J. M. and Wolf, R. C. (1992), 
Alternatives to Aroclor 1254-induced S9 in  in vitro  Genotox ­
icity Assays, Mutagenesis, 7, s. 175–177. 
22. Maron, D., Katzenellenbogen, J. and Arnes, B. N. (1981), Com ­
patibility of Organic Solvents with the Salmonella/Microsome 
Test, Mutation  Res.,  88, s. 343–350. 
23. Claxton, L. D., Allen, J., Auletta, A., Mortelmans, K., Nest ­
mann, E. and Zeiger, E. (1987), Guide for the  Salmonella  typ­
himurium/Mammalian Microsome Tests for Bacterial Mutageni ­
city, Mutation  Res.,
 189, s. 83–91.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 346
 
24. Mahon, G. A. T., Green, M. H. L, Middleton, B., Mitchel. I., 
Robinson, W. D. and Tweats, D. J. (1989), Analysis of Data 
from Microbial Colony Assays, in:  UKEMS Sub-Committee on 
Guidelines for Mutagenicity Testing. Part  II. Statistical Evalua ­
tion of Mutagenicity Test Dala,  ed. Kirkland, D.]., Cambridge 
University Press, s. 28–65.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 347
 
B. 15  MUTAGENICITETSTEST OCH SCREENING FÖR CANCE ­
ROGENICITET GENMUTATION –  SACCHAROMYCES CERE ­
VISIAE  
1. METOD  
1.1 INLEDNING 
Se allmän inledning till del B  
1.2 DEFINITION 
Se allmän inledning till del B.  
1.3 REFERENSÄMNEN 
Inga.  
1.4 TESTMETODSPRINCIP 
En rad olika haploida och diploida stammar av jästen  Saccaromyces 
cerevisiae  kan användas vid undersökning av genmutationer, som 
induceras av kemiska ämnen med och utan metabolisk aktivering. 
Man har använt framåtmutationssystem med haploida stammar vid 
t.ex. bestämning av mutation från röda, adeninberoende mutanter  
(ade- 1, ade- 2) till dubbelt adeinberoende vita mutanter och selektiva 
system t.ex. induktion av canavanin-resistens och cycloheximid-resi ­
stens. 
De bäst validerade tillbakamutationssystemen bygger på användning 
av den haploida stammen XV 185-14C, som är bärare av de ockra nonsensmutationerna  ade  2-1,  arg 4-17,  lys 1-1 och  trp 5-48, som 
tillbakamuterar med basparsubstitutionsmutagener, som inducerar 
punktmutationer eller ockra suppressormutationer. XV 185-14C är 
också bärare av  bis 1-7 markören som är en missensemutation 
som huvudsakligen tillbakamuterar vid mutationer i andra loci, och markören  bom  3-10 som tillbakamuterar med frameshift-mutagener. 
I diploida stammar av  Saccaromyces cerevisiae  är D
 7 som är ho ­
mozygot för  ilv 1-92, den enda med omfattande användning.  
1.5 KVALITETSKRITERIER 
Inga.  
1.6 METODBESKRIVNING  
Förberedelser  
Lösningar av testämne och kontrollämne framställs omedelbart före 
försöket med hjälp av en passande vehikel. Om organiska kemiska 
förbindelser som inte går att lösa i vatten används, bör organiska lösningsmedel som etanol, aceton eller dimetylsulfoxid (DMSO) an ­
vändas i koncentrationer på upp till 2 % v/v. Koncentrationen av 
vehiklen bör inte orsaka någon ändring av cellers livskraft eller 
växtegenskaper.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 348
 
M e t a b o l i s k a k t i v e r i n g 
Cellerna exponeras för testämnet både i närvaro och i frånvaro av ett 
lämpligt exogent metaboliskt aktiveringssystem. 
Det mest använda systemet består av en post-mitokondrial fraktion 
som kompletterats med en co-faktor, framställd från lever av gnagare 
som förbehandlats med enzyminducerande medel. Användningen av andra arter, vävnader, post-mitokondriala faktorer, eller förfarande kan också vara lämplig för metabolisk aktivering.
 
Testbetingelser  
T e s t s t a m m a r 
Den haploida stammen XV 185-14C och den diploida stammen D, är 
de mest vanligen använda i genmutationstester. Även andra stammar kan vara lämpliga.
 
M e d i a 
Vid bestämning av överlevnadsgrad och antal mutanter används 
lämpliga kulturmedier.  
A n v ä n d n i n g a v n e g a t i v a o c h p o s i t i v a k o n t r o l l e r 
Positiva kontroller, obehandlade kontroller och kontroller med lös ­
ningsmedel ska användas jämsides. Lämpliga positiva kontrollämnen 
ska användas för varje enskild genetisk endpoint.  
E x p o n e r i n g s k o n c e n t r a t i o n 
Minst fem olika koncentrationer av testämnet med passande interval ­
ler mellan koncentrationerna ska användas. För toxiska ämnen ska den högsta koncentrationen som testas inte minska överlevnadsgra ­
den till mindre än 5–10 %. Ämnen som är relativt oupplösliga i 
vatten testas på lämpligt sätt upp till gränsen för löslighet med an ­
vändning av lämliga förfaranden. De högsta koncentrationerna av icke-toxiska testämnen som är fritt lösliga i vatten fastställs från 
test till test.
 
I n k u b a t i o n s b e t i n g e l s e r 
Plattorna inkuberas i 4–7 dagar vid 28–30  o C i mörker.  
S p o n t a n a m u t a t i o n s f r e k v e n s e r 
Subkulturer bör användas med spontana mutationsfrekvenser inom 
allmänt accepterade gränser.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 349
 
A n t a l p a r a l l e l l a p l a t t o r 
Minst tre parallella plattor används för varje koncentration vid be ­
stämning av prototrofer som framkommit vid genmutation, och av cellernas livskraft. När man testar markörer med, som t.ex.  horn  
3–10, en låg mutationsfrekvens, kan antalet plattor ökas så att en 
statistiskt relevant mängd data erhålls.
 
Testförfarande  
Stammar av  Saccaromyces cerevisiae  exponeras normalt genom ett 
test i vätska som inbegriper antingen celler i stationär fas eller celler 
i växtfas. Inledande undersökningar bör utföras med celler i växtfas. 
1-5 x 10  7 celler per ml exponeras för testämnet i upp till 18 timmar 
vid 28–37  o C under skakning. Om det behövs tillsätts en passande 
mängd metabolisk aktiveringssystem under exponeringen. Efter be ­
handlingen centrifugeras och tvättas cellerna varefter de utsås på ett 
lämpligt kulturmedium. Efter inkubationen registreras induktionen av genmutationer och antal överlevande per platta. Om det första testet utfaller negativt bör ett andra utföras med användning av celler i 
stationär fas. Om det första testet utfaller positivt ska det bekräftas 
genom ett oberoende test.
 
2. DATA  
Data ska ställas upp i tabellform och ange antal räknade kolonier, 
antal mutanter, överlevnadsfrekvens och mutationsfrekvens. Alla re ­
sultat ska bekräftas genom ett oberoende test. Utvärderingen av re ­
sultaten bör ske på grundval av en lämplig statistisk metod.  
3. RAPPORTERING  
3.1 TESTRAPPORTEN 
Testrapporten ska om möjligt innehålla minst följande uppgifter: 
— Använda stammar. — Testbetingelser: stationär fas eller växtceller, sammansättning av 
media, inkubationstemperatur och inkubationsperiod, metaboliskt aktiveringssystem. 
— Exponeringsbetingelser, exponeringskoncentrationer, förfarande 
och varaktighet, exponeringstemperatur positiva och negativa kontroller. 
— Antal räknade kolonier, antal mutanter, Överlevnadsfrekvens och 
mutationsfrekvens, förhållandet mellan dos och effekt när detta är 
möjligt, statistisk utvärdering av data. 
— Diskussion om resultaten. — Tolkning av resultaten.
 
3.2 UTVÄRDERING OCH TOLKNING 
Se allmän inledning till del B.  
4. HÄNVISNINGAR  
Se allmän inledning till del B.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 350
 
B.16  MITOTISK. REKOMBINATION —  SACCHAROMYCES 
CEREVISIAE  
1. METOD  
1.1 INLEDNING 
Se allmän inledning till del B.  
1.2 DEFINITION 
Se allmän inledning till del B.  
1.3 REFERENSÄMNEN 
Inga.  
1.4 TESTMETODSPRINCIP 
Hos Saccaromyces cerevisiae  kan mitotisk rekombination mellan 
gener (eller mer generellt mellan en gen och dess centromer) och inom samma gen konstateras. Den förstnämnda formen kallas mito ­
tisk överkorsning och framkallar reciproka produkter medan den 
andra formen för det mesta inte är reciprok och kallas 
genkonversion. Överkorsning bestäms normalt genom framkallande av recessiva homozygotiska kolonier eller sektorer i en heterozygo ­
tisk stam, medan genkonversion bestäms genom framkallande av 
prototrofa revertanter i en auxotrof heteroallelisk stam, som är bärare 
till olika, defekta alleler av samma gen. De mest använda stammarna vid undersökning av mitotisk genkonversion är D
 4 (med heteroallel  
ade 2  och trp 5), D  7 (med heteroallel  trp 5), BZ  34 (med heteroallel  
arg 4) och JD  1 (med heteroallel  bis 4 och  trp 5). Mitotisk överkors ­
ning som framkallar röda och ljusröda homozygotiska sektorer kan undersökas i D
 5 eller i D  7 (som även mäter mitotisk genkonversion 
och omvänd mutation av  ilv 1-92), eftersom bägge stammar är he ­
teroalleliska för att komplettera alleler av  ade 2.  
1.5 KVALITETSKRITERIER 
Inga.  
1.6 METODBESKRIVNING  
Förberedelser  
Lösningar av testämne och kontroll- eller referensämne framställs 
omedelbart före försöket med hjälp av passande vehikel. Om orga ­
niska kemiska förbindelser som inte går att lösa i vatten används, bör organiska lösningsmedel som etanol, aceton eller dimetylsulfoxid (DMSO) användas i koncentrationer på upp till 2 % v/v. Koncent ­
rationen av vehiklen bör inte orsaka någon ändring av cellers livs ­
kraft eller växtegenskaper.
 
M e t a b o l i s k a k t i v e r i n g 
Cellerna exponeras för testämnet både i närvaro och i frånvaro av ett 
lämpligt exogent metaboliskt aktiveringssystem. Det vanligen an ­
vända systemet består av en post-mitokondrial fraktion som kom ­
pletterats med en co-faktor, framställd från lever av gnagare som förbehandlats med enzyminducerande medel. Användningen av an ­
dra arter, vävnader, post-mitokondriala faktorer, eller förfaranden kan 
också vara lämplig för metabolisk aktivering.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 351
 
Testbetingelser  
T e s t s t a m m a r 
De mest vanligen använda stammarna är de diploida D  4 , D 5 , D 7 och 
JD 1 . Även andra stammar kan vara lämpliga.  
M e d i a 
Vid bestämning av överlevnadsgrad och mitotisk rekombination an ­
vänds lämpliga kulturmedier.  
A n v ä n d n i n g a v n e g a t i v a o c h p o s i t i v a k o n t r o l l e r 
Positiva kontroller, obehandlade kontroller och kontroller med lös ­
ningsmedel ska användas jämsides. Lämpliga positiva kontrollämnen 
ska användas för varje enskild genetisk endpoint.  
E x p o n e r i n g s k o n c e n t r a t i o n 
Minst fem olika koncentrationer av testämnet med passande interval ­
ler mellan koncentrationerna ska användas. Här måste man ta hänsyn till faktorer som cytotoxicitet och löslighet. De lägsta koncentratio ­
nerna bör inte ha någon verkan på cellernas överlevnadsfrekvens. 
För toxiska ämnen ska den högsta koncentrationen som testas inte 
minska överlevnadsgraden till mindre än 5–10 %. Ämnen som är relativt oupplösliga i vatten testas på lämpligt sätt upp till gränsen för löslighet. Den högsta koncentrationen av icke-toxiska testämnen, 
som är fritt lösliga i vatten, fastställs från test till test. 
Celler i stationär fas eller växtfas kan exponeras för testämnet i upp 
till 18 timmar. Om långa exponeringsperioder används bör dock 
kulturerna undersökas mikroskopiskt för sporbildning vars närvaro 
gör testet värdelöst.
 
I n k u b a t i o n s b e t i n g e l s e r 
Plattorna inkuberas i 4–7 dagar vid 28–30  o C i mörker. Plattor som 
används för bestämning av röda och ljusröda homozygota sektorer, som framkallats genom mitotisk överkorsning, förvaras i kylskåp 
(ca 4
 o C) i ytterligare 1-2 dagar innan räkning för att möjliggöra 
utveckling av lämpliga pigmenterade kolonier.  
S p o n t a n a m i t o t i s k a r e k o m b i n a t i o n s f r e k v e n s e r 
Subkulturer bör användas med spontana mutationsfrekvenser inom 
allmänt accepterade gränser.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 352
 
A n t a l p a r a l l e l l a p l a t t o r 
Minst tre parallella plattor används för varje koncentration vid be ­
stämning av prototrofer som framkommit vid genmutation, och av cellernas livskraft. När man testar recessiva homozygoter, som fram ­
kallats genom mitotisk överkorsning, ökas antalet plattor så att ett 
lämpligt antal kolonier erhålls.
 
Testförfarande  
Stammar av  Saccaromyces cerevisiae  exponeras normalt genom test i 
vätska som inbegriper antingen celler i stationär fas eller celler i 
växtfas. Inledande undersökningar bör utföras med celler i växtfas. 
1-5 x 10  7 celler per ml exponeras för testämnet i upp till 18 timmar 
vid 28–37  o C under skakning. Om det behövs tillsätts en passande 
mängd metabolisk aktiveringssystem under exponeringen. 
Efter behandlingen centrifugeras och tvättas cellerna varefter de utsås 
på ett lämpligt kulturmedium. I slutet av inkubationen registreras 
induktionen av genmutationer och antal överlevande per platta. 
Om det första testet utfaller negativt bör ett andra utföras med an ­
vändning av celler i stationär fas. Om det första testet utfaller positivt ska det bekräftas genom ett oberoende test.
 
2. DATA  
Data ska ställas upp i tabellform och ange antal räknade kolonier, 
antal rekombinanter samt rekombinationsfrekvens. 
Alla resultat ska bekräftas genom ett oberoende test. Utvärderingen av resultaten bör ske på grundval av en lämplig sta ­
tistisk metod.
 
3. RAPPORTERING  
3.1 TESTRAPPORT 
Testrapporten ska om möjligt innehålla minst följande uppgifter: 
— Använda stammar. — Testbetingelser: stationär fas eller växtceller, sammansättning av 
medier, inkubationstemperatur och inkubationsperiod, metabo ­
liskt aktiveringssystem. 
— Exponeringsbetingelser, exponeringskoncentrationer, förfarande 
och varaktighet, exponeringstemperatur positiva och negativa kontroller. 
— Antal räknade kolonier, antal mutanter, överlevnadsfrekvens och 
mutationsfrekvens, förhållandet mellan dos och effekt när detta är 
möjligt, statistisk utvärdering av data. 
— Diskussion om resultaten. — Tolkning av resultaten.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 353
 
3.2 UTVÄRDERING OCH TOLKNING 
Se allmän inledning till del B.  
4. HÄNVISNINGAR  
Se allmän inledning till del B.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 354
 
B.17  MUTAGENICITET – TEST AV GENMUTATIONER HOS 
DÄGGDJURSCELLER  IN VITRO  
1. METOD  
Denna metod är en kopia av OECD TG 476, Test av genmutationer 
hos däggdjursceller in vitro ( In Vitro  Mammalian Cell Gene Muta ­
tion Test (1997)).  
1.1 INLEDNING 
Genmutationstestet  in vitro  för däggdjursceller kan användas för att 
detektera genmutationer som inducerats med hjälp av kemiska sub ­
stanser. Lämpliga cellinjer innefattar L5178Y muslymfomceller, 
CHO-, CHO-AS52-och V79-linjerna från kinesiska hamsterceller och TK6 lymfoblastoidceller från människa (1). 1 dessa cellinjer mäter de vanligast använda genetiska slutpunkterna mutation av ty ­
midinkinas (TK) och hypoxanthinguanin fosforibosyltransferas 
(HPRT), och en transgen av xanthin-guanin fosforibosyltransferas (XPRT). Mutationstesterna TK, HPRT och XPRT detekterar olika spektra av genetiska händelser. Den autosomala lokaliseringen av TK 
och XPRT kan göra det möjligt att detektera genetiska händelser 
(t.ex. stora deletioner) som inte detekteras vid HPRT-lokuset på X- kromosomer (2) (3) (4) (5) (6). 
I genmutationstestet  in vitro  för däggdjursceller kan kulturer med 
etablerade cellinjer eller celltyper användas. De celler som används 
väljs ut på basis av tillväxtförmåga vid odling och stabilitet med 
avseende på spontan mutationsfrekvens. 
Tester som utförs  in vitro  kräver i allmänhet att en exogen källa för 
metabolisk aktivering används. Detta system för metabolisk aktive ­
ring kan inte fullt ut efterlikna förhållandena in  vivo  hos däggdjur. 
Försiktighet bör iakttagas så att man undviker förhållanden som skulle kunna leda till resultat som inte avspeglar den verkliga muta ­
geniciteten. Positiva resultat som inte avspeglar den verkliga muta ­
geniciteten kan uppkomma från förändringar i pH, osmolalitet eller 
hög cytotoxicitet (7). 
Detta test används för att undersöka möjliga mutagener och karci ­
nogener i däggdjur. Många ämnen som är positiva i detta test är 
karcinogena i däggdjur. Det föreligger dock ingen perfekt korrelation 
mellan detta test och karcinogenicitet. Korrelationen är beroende på den kemiska klassen och det finns allt fler bevis för att det finns karcinogener som inte detekteras med hjälp av detta test, eftersom de 
verkar uppträda genom andra, icke-genotoxiska mekanismer eller 
mekanismer som är frånvarande i bakterieceller (6). 
Se även Allmän inledning, del B.
 
1.2 DEFINITIONER  
framåtmutation:  en genmutation från den parentala typen till den 
mutanta formen, vilket ger upphov till en förändring eller en förlust 
av den enzymatiska aktiviteten i funktionen hos det protein som 
bildas.  
mulagener som ger basparsubstitutioner : substanser som orsakar 
substitution av ett eller flera baspar i DNA.  
förskjutnings (frameshift)-mutagene:  substanser som orsakar addition 
eller deletion av ett eller flera baspar i DNA-molekylen.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 355
 
fenotypisk expressionslid:  en period under vilken celler som nyligen 
muterat töms på oförändrade genprodukter.  mutantfrekvens:  antalet 
mutanta celler som observerats, delat med antalet livskraftiga celler.  
relativ total tillväxt : ökningen av antalet celler över tiden jämfört med 
en kontrollpopulation av celler, beräknat som produkten av suspen ­
sionstillväxten i förhållande till den negativa kontrollen, gånger 
kloningseffektiviteten i förhållande till den negativa kontrollen.  
relativ suspensionstillväxt : ökning av cellantalet delat med expres ­
sionsperioden i relation till den negativa kontrollen.  
viabilitel : kloningens effektivitet hos de behandlade cellerna vid ti ­
den för utstryk på platta, under selektiva betingelser efter expres ­
sionsperioden.  
överlevnad:  kloningens effektivitet hos de behandlade cellerna när 
utstryk på platta sker vid behandlingsperiodens slut. 
Överlevnaden uttrycks vanligen i förhållande till överlevnaden hos 
kontrollens cellpopulation.  
1.3 TESTMETODENS PRINCIP 
Celler som lider brist pä tymidinkinas (TK), beroende på mutationen 
TK ± —> TK  +/- , är resistenta mot de cytotoxiska effekterna av pyri ­
midinanalogen trifluortymidin (TFT). Celler med väl fungerande ty ­
midinkinas är känsliga för TFT, eftersom TFT ger upphov till inhi ­
bering av cellmetabolismen och stoppar fortsatt celldelning. Mutanta celler kan således utvecklas i närvaro av TFT, medan däremot nor ­
mala celler, som innehåller tymidinkinas, inte klarar detta. Celler 
som lider brist på HPRT eller XPRT kan på liknande sätt väljas ut 
genom resistens mot 6-tioguanin (TG) eller 8-azaguanin (AG). Egen ­
skaperna hos testsubstansen bör noggrant gås igenom om en basa ­
nalog eller ett ämne som är relaterat till det selektiva ämnet testas i 
något av testerna för genmutationer i däggdjursceller. Exempelvis bör varje misstänkt selektiv toxicitet hos testsubstansen mot mutanta och icke-mutanta celler undersökas. Det sätt som det selekterande 
systemet/ämnet fungerar på, måste således bekräftas när man testar 
kemikalier som är strukturellt relaterade med det selektiva ämnet (8). 
Celler i suspension eller kulturer i form av ett enkelskikt exponeras 
för testsubstansen, både med och utan metabolisk aktivering, under en lämplig tidsperiod och subkultiveras för att bestämma cytotox ­
iciteten och för att tillåta fenotypisk expression innan mutantvalet 
sker (9) (10) (11) (12) (13). Cytotoxiciteten bestäms i vanliga fall genom att mäta den relativa kloningseffektiviteten (överlevnad) eller den relativa totala tillväxten för kulturerna efter behandlingsperioden. 
De behandlade kulturerna bibehålls i ett tillväxtmedium under en 
tillräckligt lång tid, karakteristisk för varje selekterat lokus och cell ­
typ, för att tillåta i det närmaste optimal fenotypisk expression av inducerade mutationer. Mutationsfrekvensen bestäms genom att inoc ­
kulera ett känt antal celler i ett medium som innehåller det selektiva 
ämnet för detektion av mutanta celler, och i ett medium utan selek ­
tivt ämne för bestämning av kloningseffektiviteten (viabiliteten). Ef ­
ter en lämplig inkubationstid räknas cellerna. Mutationsfrekvensen 
erhålls från antalet mutanta kolonier i selektivt medium och antalet 
kolonier i icke-selektivt medium.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 356
 
1.4 BESKRIVNING AV TESTMETODEN  
1.4.1  Förberedelser  
1.4.1.1  Celler  
Det finns ett antal olika celltyper som kan användas i detta test, 
inklusive subkloner från L5178Y, CHO, CHO-AS52, V79 eller 
TK6-celler. De celltyper som används i detta test bör ha en demon ­
strerad känslighet mot kemiska mutagener, en hög kloningseffektivi ­
tet och en stabil spontan mutationsfrekvens. Cellerna bör kontrolleras 
med avseende på kontaminering från mykoplasma och bör inte an ­
vändas om kontaminering skett. 
Testet bör utformas på ett sådant sätt att det har en förutbestämd 
känslighet och styrka. Antalet celler, kulturer och koncentrationer av 
testsubstansen som används bör reflektera dessa definierade paramet ­
rar (14). Det minsta antalet livskraftiga celler som överlever behand ­
lingen och används vid varje stadium av testet bör baseras på den 
spontana mutationsfrekvensen. En generell regel är att använda ett 
cellantal som är minst tio gånger det inverterade värdet av den spontana mutationsfrekvensen. Det rekommenderas dock att minst 10
 6 celler används. Adekvata historiska data för det cellsystem 
som används bör vara tillgängliga för att kontrollera att testet ger 
reproducerbara resultat.  
1.4.1.2  Betingelser för media och kulturer  
Lämpliga kulturmedia och inkubationsbetingelser (odlingskärl, tem ­
peratur, CO  2 -koncentration och luftfuktighet) bör användas. Mediet 
bör väljas ut i enighet med de selektiva system och celltyper som används i testet. Det är särskilt viktigt att betingelserna för kulturerna väljs på ett sådant sätt att man säkrar en optimal celltillväxt under 
expressionsperioden och en förmåga till bildning av kolonier för 
både mutanta och icke-mutanta celler.
 
1.4.1.3  Förberedelse av kulturer  
Celler dras upp från stamkulturer, inokuleras i ett odlingsmedium 
och inkuberas vid 37  o C. Innan de används i detta test kan kulturerna 
behöva tvättas rena från redan existerande mutanta celler.  
1.4.1.4  Metabolisk aktivering  
Celler bör exponeras för testsubstansen både i närvaro och frånvaro 
av ett lämpligt system för metabolisk aktivering. Det system som 
vanligen används är en postmitokondriell fraktion som tillsatts en 
kofaktor (S9), beredd ur levern från gnagare vilka behandlats med enzyminducerande ämnen såsom Aroclor 1254 (15) (16) (17) (18) eller en kombination av fenobarbiton och β-naftoflavon (19) (20). 
Den postmitokondriella fraktionen används vanligen vid koncent ­
rationer i området 1–10 % v/v i det slutliga testmediet. Valet av och betingelserna för ett system för metabolisk aktivering kan vara beroende av klassen av kemikalier som testas. I vissa fall kan det 
vara lämpligt att använda mer än en koncentration av den postmito ­
kondriella fraktionen.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 357
 
Ett antal vidareutvecklingar, inklusive konstruktion av genetiskt mo ­
difierade cellinjer som uttrycker specifika aktiverande enzymer, kan 
ge en potential för endogen aktivering. Valet av de cellinjer som används bör vara vetenskapligt motiverat (t.ex. genom relevansen av cytokrom P450 isoenzym för metabolismen av testsubstansen).
 
1.4.1.5  Beredning av testsubstansen  
Fasta testsubstanser bör lösas upp i eller blandas med lämpliga lös ­
ningsmedel eller vehiklar och spädas ut innan cellerna behandlas, om 
detta är lämpligt. Flytande testsubstanser kan tillsättas direkt till test ­
systemen och/eller spädas ut innan behandlingen startas. Nygjorda beredningar av testsubstansen bör användas om inte stabilitetsdata tyder på att lagring kan accepteras.
 
1.4.2  Försöksbetingelser  
1.4.2.1  Lösningsmedel/vehikel  
Lösningsmedlet/vehikeln bör inte kunna misstänkas för att reagera 
kemiskt med testsubstansen och bör vara förenlig med överlevnaden 
för cellerna samt S9-aktiviteten. Om andra lösningsmedel/vehiklar än gängse brukliga används bör det finnas data som visar att de är kompatibla. Det rekommenderas att vattenbaserade lösningsmedel/ 
vehiklar i första hand bör övervägas närhelst det är möjligt. När 
substanser som är instabila i vatten testas, bör de organiska lösnings ­
medel som används vara fria från vatten. Vatten kan avlägsnas ge ­
nom tillsats av en molekylsikt.
 
1.4.2.2  Exponeringskoncentrationer  
Bland de kriterier som ska övervägas när den högsta koncentrationen 
ska fastställas är cytotoxicitet, löslighet i testsystemet och föränd ­
ringar i pH eller osmolalitet. 
Cytotoxicitet bör fastställas såväl med som utan metabolisk aktive ­
ring i huvudexperimentet med hjälp av lämplig indikation på celler ­
nas integritet och tillväxt, såsom relativ kloningseffektivitet (överlev ­
nad) eller relativ total tillväxt. Det kan vara lämpligt att fastställa 
cytotoxicitet och löslighet i ett förberedande experiment. 
Minst fyra analyserbara koncentrationer bör användas. Där cytotox ­
icitet uppträder bör dessa koncentrationer täcka in ett område som sträcker sig från maximal toxicitet ner till liten eller ingen toxicitet. Detta innebär normalt att koncentrationsnivåerna bör separeras av 
minst en faktor mellan 2 och \10. Om den maximala koncentrationen 
är baserad på cytotoxicitet bör detta då resultera i ungefär 10–20 % (men inte mindre än 10 %) relativ överlevnad (relativ kloningseffek ­
tivitet) eller relativ total tillväxt. För relativt icke-cytotoxiska sub ­
stanser, bör den maximala testkoncentrationen vara 5 mg/ml, 5 μl/ml 
eller 0,01 M, beroende på vilket som är det lägsta.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 358
 
Relativt olösliga substanser bör testas upp till eller över sin löslig ­
hetsgräns under odlingsbetingelserna för kulturen. Bevis för olöslig ­
het bör bestämmas i det slutliga behandlingsmediet för vilket cellerna exponeras. Det kan vara lämpligt att fastställa lösligheten vid be ­
handlingens början och slutpunkt, eftersom lösligheten kan förändras 
under exponeringsförloppet i testsystemet beroende på närvaron av 
celler, S9, serum, etc. Olöslighet kan detekteras med hjälp av blotta ögat. Fällningen torde inte störa bestämningen.
 
1.4.2.3  Kontroller  
Samtidiga positiva och negativa kontroller (lösningsmedel eller ve ­
hikel), både med och utan metabolisk aktivering, bör inkluderas i varje experiment. När metabolisk aktivering används, bör den posi ­
tiva kontrollkemikalien vara av sådant slag att den kräver aktivering 
för att ge ett mutagent svar. 
I tabellen nedan ges några exempel på positiva kontrollsubstanser.
 
Betingelser för 
metabolisk 
akti-vering Lokus Substans CAS-nummer EINECS-nummer  
Frånvaro av exo ­
gen metabolisk aktivering HPRT Etylmetansulfonat 62-50-0 200-536-7 
Etylnitrosourea 759-73-9 212-072-2 
TK (små och 
stora koloni ­
er) Metylmetansulfonat 66-27-3 200-62 5-0 
XPRT Etylmetansulfonat 62-50-0 200-536-7 
Etylnitrosourea 759-73-9 212-072-2 
Närvaro av exo ­
gen metabolisk aktivering HPRT 3-Metylkolantren 56-49-5 200-276-4 
N-Nitrosodimetylamin 62-75-9 200-549-8 
7,12-Dimetylbensantraccn 57-97-6 200-359-5 
TK (små och 
stora koloni ­
er) Cyklofosfoamid 50-18-0 200-015-4 
Cyklofosfoamidmonohydrat 6055-19-2 Bcns[a]pyrcn 50-32-8 200-028-5 3-Metylkolantren 56-49-5 200-276-5 
XPRT N-Nitrosodimetylamin (för höga 
nivåer av S-9) 62-75-9 200-549-8 
Bens[ a]pyren 50-32-8 200-028-5 
Andra lämpliga referenssubstanser för positiv kontroll kan användas, 
t.ex. om ett laboratorium har en historisk databas med 5-brom-2'- deoxiuridin [CAS-nummer 59-14-3, ElNECS-nummer 200-415-9] skulle även denna referenssubstans kunna användas. Användning 
av kemiska klassrelaterade positiva kontrollkemikalier bör övervägas 
när sådana finns att tillgå.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 359
 
Negativa kontroller, bestående av enbart ett lösningsmedel eller en 
vehikel i behandlingsmediet och behandlade på samma sätt som 
behandlingsgrupperna bör inkluderas. Dessutom bör även obehand ­
lade kontroller användas, om det inte finns historiska kontrolldata som visar att inga skadliga eller mutagena effekter induceras av det 
valda lösningsmedlet.
 
1.4.3  Förfarande  
1.4.3.1  Behandling med testsubstansen  
Prolifererande celler bör exponeras för testsubstansen både med och 
utan metabolisk aktivering. Exponering bör ske under en lämplig 
tidsperiod (normalt är 3–6 timmar effektivt). Exponeringstiden kan utsträckas över en eller flera cellcykler. 
Antingen en eller två behandlade kulturer kan användas vid varje 
koncentration som testas. När enstaka kulturer används, bör antalet koncentrationer ökas så att ett adekvat antal kulturer säkerställs för 
analys (t.ex. minst åtta analyserbara koncentrationer). Två negativa 
(lösningsmedels-) kontrollkulturer bör användas. 
Gasformiga eller flyktiga substanser bör testas med hjälp av lämpliga 
metoder, såsom slutna odlingskärl (21) (22).
 
1.4.3.2  Mätning av överlevnad, viabilitet och mutantfrekvens  
Mot slutet av exponeringsperioden tvättas cellerna och odlas för att 
bestämma överlevnad och för att medge att den mutanta fenotypen 
uttrycks. Mätning av cytotoxicitet, genom en bestämning av den relativa kloningseffektiviteten (överlevnad) eller relativa totala till ­
växten för kulturerna, initieras normalt efter behandlingsperioden. 
Varje lokus har definierade krav på minimitid, så att närmast optimal 
fenotypisk expression av nyligen inducerade mutanter medges (HPRT och XPRT kräver minst 6–8 dagar och TK minst två dagar). 
Celler odlas ofta i ett medium med och utan selektiva ämnen för att 
såväl antalet mutanter som kloningens effektivitet ska kunna bestäm ­
mas. Mätningen av viabiliteten (används för att beräkna mutantfre ­
kvensen) initieras vid slutet av expressionstiden genom utstryk på 
platta i ett icke-selektivt medium. 
Om testsubstansen är positiv i testet L5178Y TK+/-, bör storleks ­
mätning av kolonierna utföras på åtminstone en av testkulturerna 
(den högsta positiva koncentrationen) och på de negativa och posi ­
tiva kontrollerna. Om testsubstansen är negativ i testet L5178Y TK+/-, bör storleksmätning av kolonierna utföras på de negativa 
och positiva kontrollerna. I undersökningar där TK6TK+/- används, 
kan storleksmätning av kolonierna utföras även där.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 360
 
2. DATA  
2.1 BEHANDLING AV RESULTATEN 
Data bör inkludera en bestämning av cytotoxicitet och viabilitet, 
räkning av kolonier och mutantfrekvenser för de behandlade kul ­
turerna och kontrollkulturerna. Om testet L5178Y TK+/- ger ett 
positivt svar, påvisas kolonier utifrån kriterier för små och stora kolonier för åtminstone en koncentration av testsubstansen (högsta positiva koncentrationen) och för de negativa och positiva kontrol ­
lerna. Den molekylära och cytogenetiska naturen hos både stora och 
små mutanta kolonier har undersökts mycket ingående (23) (24). I testet TK+/-påvisas kolonier utifrån kriterier för normal tillväxt 
(stora) och långsam tillväxt (små) av kolonier (25). Mutanta celler 
som har utsatts för den mest omfattande genetiska skadan uppvisar förlängda dubbleringstider och bildar därför små kolonier. Denna skada sträcker sig typiskt i en skala från förlust av hela genen till 
karyotypiskt synliga kromosomavvikelser. Induktion av mutanter 
som ger små kolonier har associerats med kemikalier som inducerar omfattande kromosomavvikelser (26). Mutanta celler som är mindre allvarligt påverkade växer med hastigheter liknande de som parentala 
celler uppvisar och bildar stora kolonier. 
Överlevnad (relativa kloningseffektiviteter) eller relativ total tillväxt 
bör anges. Mutantfrekvensen bör uttryckas som antalet mutanta cel ­
ler per antalet celler som överlever. 
Individuella data för kulturerna bör anges. Alla data bör dessutom 
sammanfattas i tabellform. 
Det finns inget krav på verifiering av ett tydligt positivt svar. Tve ­
tydiga resultat bör klarläggas genom fortsatta tester, lämpligen vid ändrade experimentella betingelser. Negativa resultat måste bekräftas 
från fall till fall. 1 de fall där det inte anses nödvändigt att bekräfta 
ett negativt resultat bör detta motiveras. Vid tvetydiga eller negativa resultat bör man vid uppföljningsexperiment överväga att ändra para ­
metrarna i undersökningen för att utvidga de bedömda försöksbeting ­
elserna. Försöksparametrar som kan behöva modifieras inkluderar 
koncentrationsstegen och villkoren för metabolisk aktivering.
 
2.2 UTVÄRDERING OCH TOLKNING AV RESULTATET 
Det finns ett flertal kriterier som används för att bestämma om ett 
resultat är positivt, t.ex. en koncentrationsrelaterad ökning eller en 
reproducerbar ökning i mutationsfrekvensen. Man bör i första hand 
överväga resultatets biologiska relevans. Statistiska metoder kan vara till hjälp vid utvärdering av testresultatet. Statistisk signifikans bör dock inte vara den enda faktor som bestämmer om resultatet är 
positivt. 
En testsubstans för vilken resultatet inte uppfyller ovanstående kri ­
terier anses vara icke-mutagen i detta test.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 361
 
Även om de flesta experiment kommer att ge tydligt positiva eller 
negativa resultat, kan i sällsynta fall uppsättningen av data göra det 
omöjligt att utföra en otvetydig bedömning med avseende på test ­
substansens aktivitet. Resultatet kan förbli tvetydigt eller tveksamt, oavsett hur många gånger som experimentet upprepas. 
Positiva resultat från testet av genmutationen  in vitro  hos däggdjurs ­
celler indikerar att testsubstansen inducerar genmutationer i de od ­
lade däggdjursceller som används. Ett positivt koncentrationssvar 
som är reproducerbart är mycket meningsfullt. Negativa resultat in ­
dikerar att testsubstansen, under försöksbetingelserna, inte inducerar genmutationer i de odlade däggdjursceller som används.
 
3. RAPPORTERING  
TESTRAPPORT 
Följande information måste ingå i testrapporten: 
Lösningsmedel/vehikel: 
— motivering för valet av vehikel/lösningsmedel 
— testsubstansens stabilitet och löslighet i lösningsmedlet/vehikeln, 
om detta är känt 
Celler: 
— cellernas typ och källa 
— antalet cellkulturer 
— antalet cellpassager, om detta är tillämpligt 
— metoder för bibehållande av cellkulturen, om detta är tillämpligt 
— frånvaro av mykoplasma 
Försöksbetingelser: 
— grund för val av koncentrationer och antalet kulturer inklusive 
t.ex. data för cytotoxicitet och löslighetsbegränsningar, om dessa 
finns att tillgå 
— mediernas sammansättning, CO  2 -koncentration 
— testsubstansens koncentration 
— den tillsatta vehikelns och testsubstansens volym 
— inkubationstemperatur — inkubationstid 
— behandlingens varaktighet 
— celldensitet under behandlingen 
— typ och sammansättning hos det system som används för meta ­
bolisk aktivering, inklusive acceptabilitetskriterier 
— positiva och negativa kontroller
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 362
 
— expressionsperiodens varaktighet (inklusive antalet celler som 
inokulerats, samt subkulturer och scheman för näringstillförsel, 
om detta är tillämpligt) 
— selektiva ämnen — kriterier för när tester ska anses som positiva, negativa eller 
tvetydiga 
— metoder som används för att räkna antalet livskraftiga och mu ­
terade celler 
— definition av kolonier vars storlek och typ ska beaktas (inklusive 
kriterier för ”små” och ”stora” kolonier, där detta är tillämpligt) 
Resultat: 
— tecken på toxicitet — tecken pä utfällning — data för pH och osmolalitet under det att exponering för testsub ­
stansen sker, om sådana data har upp mätts 
— koloniernas storlek (i de fall de räknats) för åtminstone negativa 
och positiva kontroller 
— laboratoriets möjligheter att detektera mutanter som ger små ko ­
lonier med L5178Y TK+/–systemet, där detta är tillämpligt 
— dos/respons-förhållande, där detta är möjligt — statistiska analyser, om sådana finns — samtidiga negativa (lösningsmedel/vehikel) och positiva kontroll ­
data 
— historiska negativa (lösningsmedel/vehikel) och positiva kontroll ­
data med intervall, medelvärden och stan dardavvikelser 
— mutationsfrekvens Diskussion av resultaten. 
Slutsatser.
 
4. HÄNVISNINGAR  
1. Moore, M. M., DeMarini, D. M. DeSerres, F. J. and Tindal, K. 
R. (eds.) (1987),  Banbury  Report  28; Mam -malian Cell Muta ­
genesis,  Cold Spring Harbor Laboratory, New York. 
2. Chu, E. H. Y. and Malling H. V. (1968), Mammalian Cell 
Genetics. II. Chemical Induction of Specific Locus Mutations 
in Chinese Hamster Cells  In Vitro, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 
61, s. 1306–1312. 
3. Liber, H. L. and Thilly, W. G. (1982), Mutation Assay at the 
Thymidine Kinase Locus in Diploid Human Lymphoblasts,  Mu­
tation Res.,  94, s. 467–485. 
4. Moore, M. M.. Harington-Brock, K., Doerr, C. L. and Dearfi ­
eld, K. L. (1989), Differential Mutant Quanti tation at the 
Mouse Lymphoma TK and CHO HGPRT Loci.  Mutagenesis,  
s. 394–403.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 363
 
5. Aaron, C. S., and Stankowski, Jr. L. F., (1989), Comparison of 
the AS52/XPRT and the CHO/HPRT Assays: Evaluation of the 
Six Drug Candidates,  Mutation Res.,  223, s. 121–128. 
6. Aaron, C. S., Bolcsfoldi, G., Glatt, H. R., Moore, M., Nishi, Y., 
Stankowski, Jr. L. F., Theiss, J. and Thompson, E. (1994), Mammalian Cell Gene Mutation Assays Working Group Re ­
port. Report of the International Workshop on Standardisation 
of Genotoxicity Test Procedures.  Mutation Res.,  312, s. 
235–239. 
7. Scott, D., Galloway, S. M., Marshall, R. R., Ishidate, M., Bru ­
sick, D., Ashby, J. and Myhr, B. C. (1991) Genotoxicity Under 
Extreme Culture Conditions. A report from ICPEMC Task Group 9, Mutation Res., 25 7. s. 147–204. 
8. Clive, D., McCuen, R., Spector, J. F. S., Piper, C. and Mavour ­
nin, K. H. (1983), Specific Gene Mutations in L5178Y Cells in 
Culture. A Report of the U.S. Environmental Protection Agency Gene-Tox Program. Mutation Res., 115, s. 225–251. 
9. Li, A. P., Gupta, R. S., Heflich, R. H. and Wasson, J. S. (1988), 
A Review and Analysis of the Chinese Hamster Ovary/Hyp ­
oxanthine Guanine Phosphoribosyl Transferase System to De ­
termine the Mutagenicity of Chemical Agents: A Report of Phase III of the U.S. Environmental Protections Agency Ge ­
ne-Tox Program, Mutation Res,, 196, s. 17–36. 
10. Li, A. P., Carver, J. H., Choy, W. N., Hsie, A. W., Gupta, R. 
S., Loveday, K. S., O'Neill, J. P., Riddle, J. C, Stankowski, L. F. Jr. and Yang, L. L. (1987), A Guide for the Performance of 
the Chinese Hamster Ovary Cell/Hypoxanthine-Guanine 
Phosphoribosyl Transferase Gene Mutation Assay,  Mutation 
Res.,  189, s. 135–141. 
11. Liber, H. L, Yandell, D. W. and Little, J. B. (1989), A Com ­
parison of Mutation Induction at the TK and HPRT Loci in 
Human Lymphoblastoid Cells: Quantitative Differences are 
Due to an Additional Class of Mutations at the Autosomal TK Locus,  Mutation Res.,  216, s. 9–17. 
12. Stankowski, L. F. Jr., Tindal,, K. R., and Hsie, A. W. (1986), 
Quantitative and Molecular Analyses of Ethyl Methanosulpho ­
nate and ICR 191-Induced Molecular Analyses of Ethyl Metha ­
nosulphonate and 1CR 191 Induced Mutation in AS52 Cells,  
Mutation Res..  160, s. 133–147. 
13. Turner, N. T., Balton, A. G. and Clive, D. (1984), Procedure for 
the L51 78Y/TK
 +/- – TK  +/- Mouse Lymphoma Cell Mutageni ­
city Assay, in: Kilbey, B.J. et all (eds.)  Handbook oj Mutage ­
nicity Test Procedures,  Else-vier Science Publishers, New York, 
s. 239–268. 
14. Arlett, C. F.. Smith, D. M., Clarke, G. M., Green, M. H. L., 
Cole, J., McGregor, D. B. and Asquith S. C. (1989), Mamma ­
lian Cell Gene Mutation Assays Based upon Colony Formation, 
in: Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data,  Kirkland, 
D. J., ed., Cambirdge University Press, s. 66–101. 
15. Abbondandolo, A., Bonatti, S., Corti, G., Fiorio, R., Loprieno, 
N. and Mazzaccaro, A. (1977), Induction of 6-Thioguanine-Re ­
sistant Mutants in V79 Chinese Hamster Cells by Mouse-Liver 
Microsome- Activated Dimethyllnitrosamine,  Mutation Res.,  46, 
s. 365–373. 
16. Ames, B. N., McCann, J. and Yamasaki, E. (1975), Methods 
for Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/ 
Mammalian-Microsome Mutagenicity Test,  Mutation Res.,  31, 
s. 347–364.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 364
 
17. Clive, D., Johnson, K. O., Spector, J. F. S., Batson A. G. and 
Brown M. M. M. (1979), Validation and Characterization of the 
L5178Y/TK+/- – Mouse Lymphoma Mutagen Assay System.  
Mutat. Res.,  59, s. 61–108. 
18. Maron, D. M. and Arnes, B. N. (1983), Revised Methods 
for the Salmonella Mutagenicity Test,  Mutuation Res..  113, 
s. 173–215. 
19. Elliott, E. M., Combes, R. D., Elcombe, C. R., Gatehouse, D. 
G., Gibson, G. G., Mackay, J. M. and Wolf, R. C. (1992), Alternatives to Aroclor 1254-Induced S9 in:  In Vitro  Genotox ­
icity Assays,  Mutagenesis  7, s. 175–177. 
20. Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. and Sugimura, T. 
(1976), A Safe Substitute for Polycholrinated Biphenyls as an Inducer of Metabolic Activation Systems, in:In  Vitro Metabolic 
Activation in Mutagenesis Testing,  de Serres, F. J., Fouts, J. R., 
Bend, J. R. and Philpot, R. M. (eds), Elsevier, North-Holland, s. 
85–88. 
21. Krahn, D. F., Barsky, F. C. and McCooey, K. T. (1982), CHO/ 
HGPRT Mutation Assay: Evaluation of Gases and Volatile Liquids, in: Tice, R. R., Costa, D. L, Schaich, K. M. (eds),  
Genotoxic Effects of Airborne Agents,  New York, Plenum, 
s. 91–103. 
22. Zamora, P. O., Benson, J. M., Li, A. P. and Brooks, A. L. 
(1983), Evaluation of an Exposure System Using Cells Grown 
on Gollagen Gels tor Detecting Highly Volatile Mutagens in the 
CHO/HGPRT Mutation Assay,  Environmental Mutagenesis,  5, 
s. 795–801. 
23. Applegate, M. L., Moore, M. M., Broder, C. B., Burrell, A. and 
Hozier. J. C. (1990), Molecular Dissection of Mutations at the 
Heterozygous Thymidine Kinase Locus in Mouse Lymphoma 
Cells,  Proc. Natl. Acad. Sci. USA,  87, s. 51–55. 
24. Moore, M. M., Clive, D. Hozier, J. C, Howard, B. E., Batson, 
A. G., Turner, N. T. and Sawyer, J. (1985), Analysis of 
Trifluoronthymidine, Resistant (TFT) Mutants of L5178Y/ 
TK+/- – Mouse Lymphoma Cells,  Mutation Res. , 151, 
s. 161–174. 
25. Yandell, D. W., Dryja, T. P. and Little, J. B. (1990), 
Molecular Genetic Analysis of Recessive Mutations at a Hete ­
rozygous Autosomal Locus in Human Cells,  Mutation Res.,  
229, s. 89–102. 
26. Moore, M. M. and Doerr, C. L. (1990), Comparison of Chro ­
mosome Aberration Frequency and Small Colony TK-Deficient Mutant Frequency in L5178Y/TK+/- – 3.7.2C Mouse Lymp ­
homa Cells,  Mutagenesis,  5, s. 609–614.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 365
 
B.18  DNA-SKADA OCH DNA-REPARAT1ON – FELAKTIG DNA- 
SYNTES –DÄGGDJURSCELLER  IN VITRO  
1. METOD  
1.1 INLEDNING 
Se allmän inledning till del B.  
1.2 DEFINITION 
Se allmän inledning till del B.  
1.3 REFERENSÄMNEN 
Inga.  
1.4 TESTMETODSPRINCIP 
Vid test av sporadisk DNA-syntes (UDS) mäts DNA-reparationssyn ­
tesen efter bortskärning och avlägsnade av det avsnitt av DNA- strängen som innehåller det skadade område som inducerats av ke ­
miska eller fysiska agenser. Testen bygger på inkorporering av triti ­
ummarkerat thymidin (
 3 H-TdR) i däggdjurscellers DNA när dessa 
celler inte är i S-fasen av cellcykeln. Upptaget av  3 H-TdR kan be ­
sämmas genom autoradiografi eller genom vätskescintillationsräking 
(LSC) av DNA från de exponerade cellerna. Såvida inte primärkul ­
turer av råtthepatocyter används, exponeras odlade däggdjursceller för testämnet med och utan ett exogent metaboliskt aktiverings ­
system. UDS-test kan också företas i  in vivo-system.
 
1.5 KVALITETSKRITERIER 
Inga.  
1.6 METODBESKRIVNING  
Förberedelser 
Testämne samt kontroll- och referensämnen tillsätts i ett kultur ­
medium eller upplöses eller suspenderas i lämpliga vehiklar innan 
cellerna exponeras. Koncentrationen av vehikeln bör inte orsaka nå ­
gon ändring av cellers livskraft. 
Primärkulturer av råtthepatocyter, humana lymfocyter eller etablerade 
cellinjer (t.ex. humana diploida fibroblaster) kan användas. 
Cellerna exponeras för testämnet både i närvaro och i frånvaro av ett 
lämpligt metaboliskt aktiveringssystem.  
Försöksbetingelser  
A n t a l k u l t u r e r 
Vid autoradiografisk bestämning av UDS används minst två och vid 
LSC sex kulturer (eller mindre om det är vetenskapligt berättigat) för 
varje experimentpunkt.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 366
 
A n v ä n d n i n g a v n e g a t i v a o c h p o s i t i v a k o n t r o l l e r 
Positiva och negativa (obehandlade och/eller vehikel) kontroller ska 
användas jämsides med och utan metabolisk aktivering i varje försök. 
Som positiv kontroll vid användning av råtthepatocyter kan t.ex. 
7,12-DMBA (7,12-dimetylbenzanthracen) eller 2-AAF (2-acetylami ­
nofluoren) användas. Som positiv kontroll vid användning av etable ­
rade cellinjer kan t.ex. 4-NQO (4-nitrouinloin-N-oxid) användas både i samband med autoradiografisk registering och LSC utan rnetabolisk aktivering. När metaboliska aktiveringssystem används kan t.ex. N- 
dimetylnitrosamin användas för positiv kontroll.
 
E x p o n e r i n g s k o n c e n t r a t i o n 
En rad olika koncentrationer av testämnet med passande intervaller 
mellan koncentrationerna som täcker alla verkningar ska användas. Den högsta koncentrationen bör ha en viss cytotoxisk verkan. Ämnen som är relativt oupplösliga i vatten testas på lämpligt 
sätt upp till gränsen för löslighet. Den högsta koncentrationen av 
icke-toxiska testämnen, som är fritt lösliga i vatten, fastställs från test till test.
 
C e l l e r 
Lämpligt växtmedium, CO  2 -koncentration, temperatur och fuktighet 
för att bibehålla kulturerna ska användas. Etablerade cellinjer ska kontrolleras regelbundet för mykoplasma-förorening.
 
M e t a b o l i s k a k t i v e r i n g 
I samband med primärkulturer av hepatocyter används inte metabo ­
liska aktiveringssystem. Etablerade cellinjer och lymfocyter expone ­
ras för testämnet både i närvaro och i frånvaro av ett lämpligt me ­
taboliskt aktiveringssystem.  
Förfarande  
F ö r b e r e d e l s e a v k u l t u r e r 
Etablerade cellinjer framställs på grundval av stamkulturer (t.ex. ge ­
nom trypsinering eller skakning) och utsås med passande täthet i 
odlingskärl, varefter de inkuberas vid 37  o C. 
Primärkulturer av råtthepatocyter etableras när hepatocyter omedel ­
bart efter isolering förs över i ett passande medium och tillåts att 
häfta sig vid den växande ytan. 
Humana lymfocytkulturer odlas genom därtill lämpade metoder.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 367
 
E x p o n e r i n g a v k u l t u r e r n a f ö r t e s t ä m n e t  
Primärkulturer av råtthepatocyter  
Färskt isolerade råtthepatocyter exponeras för testämnet under lämp ­
lig tid i ett medium som innehåller  3 H-TdR. Efter exponering avlägs ­
nas cellerna från mediet och tvättas, fixeras och torkas. Objektglasen 
bör doppas i autoradiografisk emulsion (alternativt kan ”stripping” 
film användas) och belyses, framkallas, färgas och räknas.  
Etablerade cellinjer och lymfocyter 
Autoradiografisk teknik:  Cellkulturerna exponeras först för testämnet 
under en passande tid och därefter för  3 H-TdR. Exponeringsperio ­
derna beror på ämnena, de metaboliska aktiveringssystemen och cell ­
typerna. Exponering för  3 H-TdR bör ske samtidigt eller inom några 
minuter efter exponering för testämnet så att UDS mäts vid den tid 
då aktiviteten är störst. Valet mellan dessa två förfaranden beror på 
risken för interaktion mellan testämnet och  3 H-TdR. För att skilja 
mellan UDS och semi-konservativ DNA-replikation kan den senare inhiberas genom användning av t.ex. argininfattiga medier, ett lågt 
seruminnehåll eller tillsättning av hydroxyurinämne till kulturmediet.  
LSC-mätning av UDS:  Före exponering för testämnet blockeras cel ­
lernas övergång till S-fasen som beskrivits ovan. Därefter exponeras cellerna på samma sätt som vid den autoradiografiska tekniken. 
Omedelbart efter inkubationen extraheras cellernas DNA och det 
totala DNA-innehållet samt mängden av inkorporerat
 3 H-TdR mäts. 
När de nämnda teknikerna används på humana lymfocyter är det inte 
nödvändigt att hämma den semi-konservativa DNA-replikationen, såvida det inte rör sig om stimulerade kulturer.
 
Analys  
A u t o r a d i o g r a f i s k b e s t ä m n i n g  
Vid mätning av UDS i odlade celler medräknas inte kärnor i S-fasen. 
Minst 50 celler per koncentration ska räknas. Objektglasen bör kod ­
märkas innan räkning. På varje platta bör flera olika slumpmässigt 
valda områden med stort inbördes avstånd räknas. Mängden av in ­
korporerat  3 H-TdR i cytoplasman bestäms genom räkning i tre om ­
råden i kärnstorlek i varje räknad cells cytoplasma.  
L S C - m ä t n i n g 
Vid LSC-mätning av UDS används ett passande antal kulturer per 
koncentration och per kontrollförsök.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 368
 
Alla resultat ska bekräftas genom ett oberoende test.  
2. DATA  
Data ställs upp i tabellform.  
2.1 AUTORADIOGRAFISK MÄTNING 
Mängden av inkorporerat  3 H-TdR i cytoplasman och antalet korn 
som registreras i cellkärnområdet anges separat. 
Fördelning av mängden av inkorporerat  3 H-TdR i cytoplasman och 
antalet korn per kärna kan beskrivas genom användning av medel, 
median eller modus.  
2.2 LSC-MÄTNING 
Vid LSC-mätning anges inkorporeringen av  3 H-TdR som dpm/ μg 
DNA. Distributionen av inkorporeringen kan beskrivas genom an ­
vändning av medel dpm/ μg DNA med tillhörande standardavvikelse. 
Utvärderingen av resultaten ska grundas på en lämplig statistisk 
metod.  
3. RAPPORTERING  
3.1 TESTRAPPORT 
Testrapporten ska om möjligt innehålla minst följande uppgifter: 
— Använda celler, täthet och antal passager på exponeringstidpunk ­
ten, antal cellkulturer. 
— Metoder för bibehållande av cellkulturer, inbegripet medium, 
temperatur och CO  2 – koncentration. 
— Testämne, vehikel, koncentrationer och motivering för val av 
använda koncentrationer. 
— Detaljerad information om de metaboliska aktiveringssystemen. 
— Exponeringsschema. 
— Positiva och negativa kontroller. — Använd autoradiografisk teknik. 
— Förfarande vid blockering av cellernas övergång till S-fasen. 
— Förfarande vid extraktion av DNA och bestämning av det totala 
DNA-innehållet vid LSC- mätningen. 
— Förhållandet mellan dos och reaktion när detta är möjligt. — Statistisk utvärdering. 
— Diskussion om resultaten. 
— Tolkning av resultaten.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 369
 
3.2 UTVÄRDERING OCH TOLKNING 
Se allmän inledning till del B.  
4. HÄNVISNINGAR  
Se allmän inledning till del B.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 370
 
B.19  TEST AVSEENDE SYSTERK ROMATIDBYTEN  IN VITRO  
1. METOD  
1.1 INLEDNING 
Se allmän inledning till del B.  
1.2 DEFINITION 
Se allmän inledning till del B.  
1.3 REFERENSÄMNEN 
Inga.  
1.4 TESTMETODSPRINCIP 
Test av systerkromaidbyten (SCE) är ett korttidstest för bestämning 
av reciprok utväxling av DNA mellan två systerkromatider i en 
kromosom under replikation. Vid SCE sker en utväxling av DNA- replikationsprodukter vid skenbart homolog loci. Man tror att utväx ­
lingsprocessen sannolikt omfattar brytning och återförening av DNA- 
koder, men det finns nästan ingen kännedom om dess molekylbas. 
För att kunna upptäcka SCE är det nödvändigt att differentialmärka systerkromatiderna, vilket kan göras genom att inkorporera bromde ­
oxyuridin (BrdU) i kromosomernas DNA under två cellcykler. 
Däggdjursceller exponeras  in vitro  för testämnet med och utan ett 
exogent metaboliskt aktiveringssystem från däggdjur, om detta anses relevant, och odlas under två cellcykler i ett medium som innehåller BrdU. Sedan cellerna behandlats med en spindelfiberinhibitor (t.ex. 
kolchicin) för att cellerna ska ackumuleras i ett metafasliknande 
stadium av mitosen (c-metafas), skördas de och prepareras för kro ­
mosomanalys.
 
1.5 KVALITETSKRITERIER 
Inga.  
1.6 METODBESKRIVNING  
Förberedelser  
— För detta test kan primärkulturer (t.ex. humana lymfocyter) eller 
etablerade cellinjer (t.ex. äggstocksceller från kinesisk hamster) användas. Cellinjer bör kontrolleras för mykoplasmaförorening. 
— Lämpligt kulturmedium och lämpliga inkubationsbetingelser 
(t.ex. temperatur, odlingskärl, CO
 2 -koncentrationer och fuktighet) 
ska användas. 
— Testämnet tillsätts i ett kulturmedium eller upplöses eller suspen ­
deras i lämpliga vehiklar innan cellerna exponeras. Koncentratio ­
nen av vehiklen bör inte orsaka någon ändring av cellers livskraft 
eller växtegenskaper. En eventuell påverkan av SCE-frekvensen 
kontrolleras genom odling av en kontrollkultur i lösningsmedlet.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 371
 
— Cellerna exponeras för testämnet både i närvaro och i frånvaro av 
ett lämpligt exogent metaboliskt aktiveringssystem från dägg ­
djursceller. Om celltyper med endogen metabolisk aktivering ­
används bör det vara bevisat att aktiveringsform och -hastighet är lämpliga för den kemiska klass som testas.
 
Testbetingelser  
A n t a l k u l t u r e r 
För varje experimentell punkt används minst två parallella kulturer.  
A n v ä n d n i n g a v n e g a t i v a o c h p o s i t i v a k o n t r o l l e r 
Som positiv kontroll används vid varje enskilt försök både en direkt 
verkande kemisk förbindelse och en förbindelse som kräver metabo ­
lisk aktivering. Dessutom företas vehikelkontroll. 
Följande kemiska förbindelser kan t.ex. användas till positiv kontroll: — direktverkande förbindelser: 
— etylmetansulfonat, 
— indirekt verkande förbindelser: 
— cyclofosfamid, 
Vid behov kan en supplerande positiv kontroll göras med använd ­
ning av en kemisk förbindelse av samma typ som testämnet.
 
E x p o n e r i n g s k o n c e n t r a t i o n 
Minst tre koncentrationer av testämnet med passande intervaller mel ­
lan koncentrationerna ska användas. Den högsta koncentrationen bör ha en tydlig cytotoxisk verkan men får inte förhindra den nödvän ­
diga celldelningen. Ämnen som är relativt oupplösliga i vatten testas 
på lämpligt sätt upp till gränsen for löslighet. Den högsta koncent ­
rationen av icke-toxiska testämnen, som är fritt lösliga i vatten, fast ­
ställs från test till test.
 
Testförfarande  
O d l i n g 
Etablerade cellinjer framställs på grundval av stamkulturer (t.ex. ge ­
nom trypsinering eller skakning) och utsås med passande täthet i 
odlingskärl, varefter de inkuberas vid 37  o C. För monolagskulturer 
justeras antalet celler per kulturkärl så att kulturerna vid tidpunkten för skörden högst täcker 50 % av växtarealen. Cellerna kan också odlas i suspension. Humana lymfocytkulturer odlas med användning 
av därtill lämpliga metoder på grundval av hepariniserat blod och 
inkuberas vid 37
 o C. ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 372
 
E x p o n e r i n g 
Celler i den exponentiella växtfasen exponeras för testämnet under en 
passande period. I de flesta fall räcker det med 1–2 timmar men i vissa fall kan exponeringsperioden förlängas till att omfatta två hela cell ­
cykler. Celler vars endogena metaboliska aktivering är otillräcklig ex ­
poneras både med och utan tillsättning av ett lämpligt metaboliskt 
aktiveringssystem. Efter exponeringen tvättas cellerna fria från testäm ­
ne. Därefter odlas de under två replikationscykler i ett medium som innehåller BrdU. Alternativt kan cellerna exponeras för testämnet och 
BrdU samtidigt under en period som motsvarar två cellcykler. 
Kulturer från humana lymfocyter exponeras medan de befinner sig i 
semisynkront tillstånd. 
Cellerna analyseras under deras andra delning efter exponering vilket 
säkerställer att exponeringsperioden täcker den största delen av de följ ­
samma faserna i cellcykeln. Alla kulturer som tillsatts BrdU bevaras 
och manipuleras i mörker eller i svagt ljus från glödlampor till dess att cellerna skördas för att minimiera fotolysen av BrdU-haltigt DNA.
 
S k ö r d a v c e l l e r 
Cellkulturerna behandlas med en spindelfiberinhibitor (t.ex. kolchi ­
cin) i 1–4 timmar innan de skördas. Varje kultur skördas för sig och behandlas separat för kromosompreparering
 
K r o m o s o m p r e p a r a t i o n o c h f ä r g n i n g 
Vid kromosompreparation används cytogeniska standardtekniker. 
Färgning på objektglas för att visa SCE kan ske på flera olika sätt (t.ex. fluorescens plus Giemsametoden).
 
A n a l y s 
Antalet av de celler som ska analyseras grundas på den spontana 
SCE-frekvensen i kontrolltest. Normalt analyseras minst 25 väl utspridda metafaser per kultur för SCE. Objektglas kodas före ana ­
lys. Vid analys av humana lymfocyter analyseras endast metafaser 
med 46 centromerer. Vid analys av etablerade cellinjer analyseras 
endast metafaser med det modala antal centromerer ± 2. Det bör anges huruvida omväxling i märkningen omkring centromeret betrak ­
tas som SCE. Resultaten bör bekräftas genom ett oberoende test.
 
2. DATA  
Data ställs upp i tabellform. Antal SCE för varje metafas samt antalet 
SCE per kromosom för varje metafas bör anges separat för alla 
exponerade kulturer och kontrollkulturer. 
Utvärderingen av data grundas på lämpliga statistiska metoder.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 373
 
3. RAPPORTERING  
3.1 TESTRAPPORT 
Testrapporten ska om möjligt innehålla följande uppgifter: 
— Använda celler, metoder för bibehållande av cellkulturer. — Testbetingelser: Sammansättning av mediet, CO
 2 -koncentration, 
testämnekoncentration, använd vehikel, inkubationstemperatur, 
exponeringsperiod, använd spindelfiberinhibitor plus upplys ­
ningar och dess koncentration och behandlingens varaktighet, använt metaboliskt aktiveringssystem, positiva och negativa kont ­
roller. 
— Antal cellkulturer per experimentell punkt. — Detaljerade upplysningar om objektprepareringstekniken. — Antal analyserade metafaser (data anges separat för varje kultur). — Genomsnittligt antal SCE per cell och per kromosom (data anges 
separat för varje kultur). 
— Kriterier för utvärdering av SCE. — Motivering för val av doser. 
— Förhållandet mellan dos och reaktion när detta är möjligt. 
— Statistisk utvärdering. — Diskussion om resultaten. — Tolkning av resultaten.
 
3.2 UTVÄRDERING OCH TOLKNING 
Se allmän inledning till del B.  
4. HÄNVISNINGAR  
Se allmän inledning till del B.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 374
 
B.20  KÖNSBUNDEN RECESSIV LETAL TEST PÅ  DROSOPHILA 
MELANOGASTER  
1. METOD  
1.1 INLEDNING 
Se allmän inledning till del B.  
1.2 DEFINITION 
Se allmän inledning till del B.  
1.3 REFERENSÄMNEN 
Inga.  
1.4 TESTMETODSPRINCIP 
Vid könsbunden recessiv letal test (SLRL) på  Drosophila melano ­
gaster  undersöks förekomsten av både punktmutationer och mindre 
deletioner hos insektens avkomma. Det är en framåtmutationstest 
genom vilken det är möjligt att undersöka ca 800 loci på X-kromo ­
somen i syfte att registrera mutationer. Detta antal utgör ca 80 % av alla X-kromosomens loci. X-kromosomen utgör omkring en femtedel 
av den samlade haploida kromosommängden. 
Mutationer i  Drosophila melanogasters  X-kromosom kommer till 
fenotypiskt uttryck hos handjur som är bärare av den muterade ge ­
nen. När mutationen under hemizygota betingelse är letal konstateras 
detta genom frånvaron av en av de två typer av handjur som normalt 
finns i ett meterozy-gotiskt hondjurs avkomma. I SLRL-testet utnytt ­
jas detta förhållande med hjälp av speciellt märkta och arrangerade kromosomer.
 
1.5 KVALITETSKRITERIER 
Inga.  
1.6 METODBESKRIVNING  
Förberedelser  
S t a m m a r 
Handjur av väldefinierade vildtypstammar och hondjur från Muller- 
5-stammen kan användas. Lämpligt märkta hondjur från andra stam ­
mar och multipelt inverterade X-kromosomer kan också användas.  
T e s t ä m n e 
Testämnet upplöses i vatten. Ämnen som är oupplösliga i vatten kan 
upplösas eller suspenderas i lämpliga vehikler (t.ex. en blandning av etanol och Tween-60 eller - 80) och därefter spädas ut i vatten eller 
salin före tillförsel. Dimetylsulfoxid (DMSO) bör undvikas som ve ­
hikel.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 375
 
A n t a l 
Testet bör utformas så att följsamheten och betydelsen av testet är 
fastställt på förhand. Den spontana mutationsfrekvens som registreras i kontrollförsök är av stor betydelse för bestämning av det antal exponerade kromosomer som ska analyseras.
 
T i l l f ö r s e l v ä g 
Exponeringen kan ske genom oral tillförsel, injektion eller genom 
exponering för gaser eller ångor. Testämnet kan eventuellt tillföras i en sockerlösning. Vid behov kan den upplösas i en 0,7 % NaCl- 
lösning och injiceras i bröstkorgen eller buken.
 
A n v ä n d n i n g a v n e g a t i v a o c h p o s i t i v a k o n t r o l l e r 
En negativ (vehikel) och en positiv kontroll ska utföras. Om det 
finns data från tidigare laboratorieförsök är det dock inte nödvändigt 
att utföra sidlöpande kontroll.  
E x p o n e r i n g s k o n c e n t r a t i o n 
Tre koncentrationsnivåer ska användas. För en preliminär undersök ­
ning kan en enkel koncentration användas som antingen kan vara den 
högsta koncentration som insekterna tål eller en koncentration som orsakar en viss grad av toxisk verkan. Vid icke-toxiska testämnen exponeras insekterna för de största möjliga koncentrationerna.
 
T e s t f ö r f a r a n d e 
Vildtyphandjur (3–5 dagar gamla) exponeras för testämnet och paras 
individuellt med flera jungfruliga hondjur från Muller-5-stammen eller från andra lämpligt märkta stammar (med multipelt inverterade 
X-kromosomer). Hondjuren byts ut mot nya jungfruliga hondjur va ­
rannan eller var tredje dag tills hela könscellcykeln är täckt. Hon ­
djurens avkomma registreras för att konstatera letala verkningar som motsvarar exponeringens verkan på mogen sperma, spermatider i 
sena stadier eller medelstadier, spermatider i tidiga stadier, spermato ­
cyter och spermatogonia. 
Heterozygota F
 1 -hondjur från de ovan nämnda korsningarna paras 
individuellt (dvs. ett hondjur per flaska) med sina bröder. I F  2 -ge­
nerationen registreras varje kultur för bestämning av frånvaron av 
vildtyphandjur. Om en kultur har uppstått från ett F  1 -hondjur som 
bär en letal gen i den parentala X-kromosomen (dvs. det finns inga handjur med  den  exponerade kromosomen) testas döttrar till detta 
hondjur med samma genotyp för att konstatera om den letala verkan 
upprepas i nästa generation.
 
2. DATA  
Data ska ställas upp i tabellform och ange antal testade X-kromosomer, 
antal ofruktsamma handjur, antal letala kromosomer för varje expone ­
ringskoncentration och för var och en av de exonerade handjurens 
parningsperioder. Dessutom anges antalet klungor av olika storlek 
per handjur. Resultaten bör bekräftas genom ett oberoende test.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 376
 
Utvärderingen av en könsbunden recessiv letal test ska grundas på 
lämpliga statistiska metoder. Kluster av generationer med recessiva 
letala gener som stammar från ett enda handjur ska registreras och utvärderas på grundval av en lämpligt statistisk metod.
 
3. RAPPORTERING  
3.1 TESTRAPPORT 
Testrapporten ska om möjligt innehålla minst följande uppgifter: 
— Stammar: Använda  drosophila-stammar,  insekternas ålder, antal 
exponerade handjur, antal sterila handjur, antal etablerade F  2 -be­
stånd, antal F  2 -bestånd utan avkomma, antal kromosomer med 
letala gener i varje könscellstadium. 
— Kriterier för fastställande av storleken av de exponerade grupperna. — Testbetingelser: Detaljerade beskrivning av exponerings- och 
stickprovsschema, exponeringskoncentrationer, toxicitetsdata, ne ­
gativ (lösningsmedel) och eventuella positiva kontroller. 
— Kriterier för registrering av letala mutationer. — Förhållandet mellan dos och reaktion när detta är möjligt. — Statistisk utvärdering. — Diskussion om resultaten. — Tolkning av resultaten.
 
3.2 UTVÄRDERING OCH TOLKNING 
Se allmän inledning till del B.  
4. HÄNVISNINGAR  
Se allmän inledning till del B.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 377
 
B.21  CELLTRANSFORMATIONSTEST PÅ DÄGGDJURSCELLER  
IN VITRO  
1. METOD  
1.1 INLEDNING 
Se allmän inledning till del B.  
1.2 DEFINITION 
Se allmän inledning till del B.  
1.3 REFERENSÄMNEN 
Inga.  
1.4 TESTMETODSPRINCIP 
Kulturer av däggdjursceller kan användas för upptäckt av feno ­
typiska förändringar  in vitro  som inducerats av kemiska förbindelser 
i samband med maligna transformationer  in vivo.  De mest använda 
celltyperna är C3H10TlVi, 3T3, SHE, Fischer-råtta, och testerna 
bygger på förändringar i cellmorfologin, fokusbildning eller egen ­
skapen att kunna växa i mjuk agar. Det finns också mindre vanligt använda stammar som används för undersökning av andra fysiolo ­
giska eller morfologiska förändringar i celler till följd av exponering 
för cancerogena kemiska förbindelser. Inga direkta verkningsmeka ­
nismförbindelser mellan cancer och de genetiska endpoints som an ­
vänds i dessa tester  in vitro  finns beskrivna. Några av testsystemen 
kan användas för upptäckt av tumörpromotorer. Den cytotoxiska 
effekten kan bestämmas genom mätning av testämnets verkan på 
kolonibildande (kloniseringseffektiviteten) eller kulturernas växtfre ­
kvens. Syftet med mätningen av den cytotoxiska effekten är att kon ­
statera om exponering för testämnet är toxikologiskt relevant, men 
kan inte användas för beräkning av transformationsfrekvensen i alla 
tester, eftersom vissa kräver lång inkubationstid och/eller överföring till nya plattor.
 
1.5 KVALITETSKRITERIER 
Inga.  
1.6 METODBESKRIVNING  
Förberedelser  
C e l l e r 
En rad olika cellinjer eller primärlinjer kan användas beroende på 
vilken transformationstest som görs. Försöksledaren måste säkerställa att använda celler genomgår relevanta fenotypiska förändringar efter 
exponering för kända cancerogener, och försöksledarens eget labo ­
ratorium måste ha bevisat och dokumenterat det använda testets validitet och trovärdighet.
 
M e d i u m 
Medium och försöksbetingelser som är lämpliga för transformations ­
test ska användas.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 378
 
T e s t ä m n e 
Testämnet tillsätts i ett kulturmedium eller upplöses eller suspenderas 
i lämpliga vehiklar innan cellerna exponeras. Koncentrationen av vehikeln bör inte orsaka någon ändring av cellers livskraft eller växtegenskaper.
 
M e t a b o l i s k a k t i v e r i n g 
Cellerna exponeras för testämnet både i närvaro och i frånvaro av ett 
lämpligt exogent metaboliskt aktiveringssystem. Om celltyper med 
endogen metabolisk aktivering används bör det vara bevisat att ak ­
tiveringsform och -hastighet är lämpligt för den kemiska klass som 
testas.  
Testbetingelser  
A n v ä n d n i n g a v n e g a t i v a o c h p o s i t i v a k o n t r o l l e r 
Som positiva kontroll används vid varje enskilt försök både en direkt 
verkande kemisk förbindelse och en förbindelse som kräver metabo ­
lisk aktivering. Dessutom företas negativ (vehikel) kontroll. 
Följande kemiska förbindelser kan t.ex. användas till positiv kontroll: 
— direktverkande förbindelser: 
— etylmetansulfonat, — H-propiolacton, 
— förbindelser som kräver metabolisk aktivering: 
— 2 -acetylaminofluoren, 
— 4-dimetylaminoazobenzen, — 7,12-dimetylbenzanthracen. 
Vid behov kan en supplerande positiv kontroll göras med använd ­
ning av en kemisk förbindelse av samma typ som testämnet.
 
E x p o n e r i n g s k o n c e n t r a t i o n 
Flera koncentrationer av testämnet ska användas. Dessa koncentratio ­
ner bör framkalla en koncentrationsrelaterad toxisk verkan. Den 
högsta koncentrationen bör medföra en låg överlevnadsgrad och 
överlevnadsgraden vid den lägsta koncentrationen bör vara av samma storlek som vid det negativa kontrollförsöket. Ämnen som är relativt oupplösliga i vatten testas på lämpligt sätt upp till gränsen 
för löslighet. Den högsta koncentrationen av icke-toxiska testämnen, 
som är fritt lösliga i vatten, fastställs från test till test.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 379
 
Testförfarande  
Cellerna bör exponeras under för det använda testsystemet passande 
period. Detta kan inbegripa upprepad dosering åtföljt av en ändring av medium (och vid behov ny metabolisk aktivering) om det är fråga om långvarig exponering. Celler vars endogena metaboliska aktive ­
ring är otillräcklig testas både med och utan ett lämpligt metaboliskt 
aktiveringssystem. Efter exponeringen tvättas cellerna fria från tes ­
tämne. Därefter odlas de i syfte att låta den transformerade fenotyp som testet bygger på komma till uttryck och i syfte att bestämma 
transformationsfrekvensen. Alla resultat ska bekräftas genom ett obe ­
roende test.
 
2. DATA  
Data ska ställs upp i tabellform och kan ta sig olika uttryck beroende 
på använt testsystem. Det kan t.ex. röra sig om räkning av plattor, positiva plattor eller antal transformerade celler. Vid behov anges 
överlevnadsgraden som en procentdel av överlevnaden i kontrollför ­
söken, och transformationsfrekvensen uttrycks som antal transforme ­
rade celler per överlevande. Utvärderingen av data grundas på lämp ­
liga statistiska metoder.
 
3. RAPPORTERING  
3.1 TESTRAPPORT 
Testrapporten ska om möjligt innehålla minst följande uppgifter: 
— Använd celltyp, antal cellkulturer, metoder för bibehållande av 
cellkulturer. 
— Testbetingelser: Testämnekoncentration, använd vehikel, inkuba ­
tionstid, testets varaktighet och frekvens, celltäthet under expo ­
neringen, använt exogent metaboliskt aktiveringssystem, positiva 
och negativa kontroller, specifikation av den fenotyp som testet 
bygger på, använt selektivt system (om sådant har använts), mo ­
tivering för val av doser. 
— Metoder för registrering av livskraftiga och transformerade celler. — Statistisk utvärdering. — Diskussion om resultaten. 
— Tolkning av resultaten.
 
3.2 UTVÄRDERING OCH TOLKNING 
Se allmän inledning till del B.  
4. HÄNVISNINGAR  
Se allmän inledning till del B.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 380
 
B.22  DOMINANT LETAL TEST PÅ GNAGARE  
1. METOD  
1.1 INLEDNING 
Se allmän inledning till del B.  
1.2 DEFINITIONER 
Se allmän inledning till del B.  
1.3 REFERENSÄMNEN 
Inga.  
1.4 TESTMETODSPRINCIP 
Dominanta letala verkningar leder till att embryot eller fostret dör. 
När dominanta letala mutationer framkallas genom exponering för en kemisk ämne är det ett tecken på att försöksdjurartens könscellväv ­
nader har skadats. Det råder bred enighet om att dominanta letala 
gener uppstår till följd av kromosomskador (strukturella och nume ­
riska anomalier). Om exponerade handjurs avkomma dör på det embryonala stadiet kan även detta skyllas på toxiska verkningar. 
Normalt exponeras handjur för testämnet och paras med jungfruliga 
hondjur. Könscellernas olika stadier kan undersökas separat genom 
att använda på varandra följande parningsperioder. Ökningen av an ­
talet döda implantater per hondjur i den exponerade gruppen i för ­
hållande till antalet döda implantater per hondjur i kontrollgruppen 
visar den letala verkan efter implantation. Det letala verkan före 
implantation kan bedömas på grundlag av räkning av corpora lutea eller genom sammanslagning av det totala antalet implantater per hondjur i de exponerade grupperna och kontrollgruppen. Den totala 
dominanta letala verkan är summan av de letala verkningar före och 
efter implantation. Beräkningen av den totala dominanta letala ver ­
kan grundas på sammanräkning av antalet levande implantater per hondjur i försöksgruppen och antalet levande implantater per hondjur 
i kontrollgruppen. En minskning av antalet implantater under be ­
stämda tidsperioder kan skyllas på celldöd (av spermacyter och/eller spermatogoner).
 
1.5 KVALITETSKRITERIER 
Inga.  
1.6 METODBESKRIVNING  
Förberedelser  
Testämnet upplöses eller suspenderas i fysiologisk saltlösning. Ke ­
miska förbindelser som inte är lösliga i saltlösning ska lösas eller suspenderas i lämplig vehikel. Den vehikel som används får inte 
inverka på testämnet eller framkalla toxiska effekter. Nyligen fram ­
ställda lösningar av testämnet ska användas.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 381
 
Försöksbetingelser  
T i l l f ö r s e l v ä g 
Testämnet ska vanligen endast tillföras en gång. På grundval av 
toxikologisk information kan upprepad behandling användas. Van ­
ligtvis tillförs testämnet genom oral intubering eller intraperitoneal 
injicering. Även andra tillförselvägar kan användas  
F ö r s ö k s d j u r 
Råttor och möss rekommenderas som försöksdjur. Friska könsmogna 
djur fördelas slumpmässigt i behandlings- och kontrollgrupper.  
A n t a l o c h k ö n 
Ett lämpligt antal handjur bör användas, med hänsyn tagen till den 
spontana variationen i den biologiska egenskap som utvärderas. Be ­
slutet om hur många djur som ska användas bör grundas på den på förhand fastställda känsligheten för upptäckt och betydelsegrad. Vid ett typiskt försök ska det finnas tillräckligt med handjur för att uppnå 
30–50 dräktiga hondjur varje parningsperiod.
 
A n v ä n d n i n g a v n e g a t i v a o c h p o s i t i v a k o n t r o l l e r 
Normalt görs sidlöpande positiva och negativa (vehikel) kontroller 
för varje försök. Om det finns godtagbara positiva kontrollresultat från nyligen genomförda försök i samma laboratorium kan dock 
dessa användas i stället för sidlöpande positiv kontroll. Positiva kont ­
rollämnen används i tillräcklig låga doser (t.ex. MMS i. p., 10 mg/kg) för att visa testens känslighet.
 
D o s n i v å e r 
Normalt används tre olika dosnivåer. Den högsta dosnivån bör or ­
saka tecken på toxiska verkningar eller minskad fertilitet hos de 
exponerade djuren. I vissa fall räcker det med en enda hög dosnivå.  
G r ä n s t e s t 
Icke-toxiska ämnen testas vid 5 g/kg i en enda dos eller vid upp ­
repad tillförsel av 1 g/kg/dag.  
Förfarande  
Flera olika doseringsscheman kan användas. Normalt ges hela dosen 
på en gång men andra behandlingsscheman kan också användas. 
Efter behandling paras handjuren med lämpliga intervaller individu ­
ellt med 1–2 jungfruliga hondjur. Hondjuren placeras hos handjuren under en period som motsvarar minst en äggcykel, eller tills parning 
har skett, vilket konstateras genom närvaron av sperma i vaginan 
eller närvaron av en vaginalpropp.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 382
 
Antal parningar efter behandlingen fastställs på grundval av dose ­
ringsschemat och bör säkerställa att alla könscellsstadier är represen ­
terade efter doseringen. 
Hondjuren avlivas under den andra hälften av dräktigheten och in ­
nehållet i livmodern undersöks för bestämning av antalet levande och 
döda implantat. Äggstockarna undersöks för bestämning av antalet corpora lutea.
 
2. DATA  
Data ska ställas upp i tabellform och ange antal handjur samt antal 
dräktiga och icke dräktiga hondjur. Resultaten av varje enskild par ­
ning, inbegripet identifiering av varje han- och hondjur, ska anges 
separat. För varje hondjur anges parningsvecka, handjurets dos och 
antalet levande och döda implantat. 
Beräkningen av den totala dominanta letala verkan grundas på jäm ­
förelse av antal levande implantat per hondjur hondjur i försöks ­
gruppen och antalet levande implantat per hondjur i kontrollgruppen. Förhållandet mellan döda och levande implantat i försöksgruppen i jämförelse med förhållandet i kontrollgruppen analyseras för bestäm ­
ning av den letala verkan efter implantation. 
Om data registreras som tidiga eller sena dödsfall ska detta framgå 
av tabellerna. Om en utvärdering av den letala verkan sker före 
implantation ska denna anges. Den letala verkan före implantation kan beräknas som skillnaden mellan antalet  corpora lutea  och antalet 
implantater eller som en minskning av det genomsnittliga antalet 
implantat per livmoder i jämförelse med kontrollparningarna. 
Utvärderingen av resultat ska grundas på en lämplig statistisk metod.
 
3. RAPPORTERING  
3.1 TESTRAPPORT 
Testrapporten ska om möjligt innehålla minst följande uppgifter: 
— Djurart, stam, de använda djurens ålder och vikt, antal djur av 
varje kön i försöks- och kontrollgrupperna. 
— Testämne, vehikel, testade dosnivåer och motivering för val av 
doser, negativa och positiva kontroller. 
— Tillförselväg och dosens varaktighet. 
— Parningsschema. 
— Metod för bestämning av om parning skett. — Tidpunkt för avlivning. 
— Kriterier för registrering av dominanta letala gener. 
— Förhållandet mellan dos och reaktion när detta är möjligt.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 383
 
— Statistisk utvärdering. 
— Diskussion om resultaten. — Tolkning av resultaten.
 
3.2 UTVÄRDERING OCH TOLKNING 
Se allmän inledning till del B.  
4. HÄNVISNINGAR  
Se allmän inledning till del B.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 384
 
B.23  SPERMATOGONIAL TEST AV KROMOSOMAVVIKELSER 
HOS DÄGGDJUR  
1. METOD  
Denna metod är en kopia av testet OECD TG 483, Spermatogonial 
test av kromosomavvikelser hos däggdjur (Mammalian Spermatogo ­
nial Chromosomc Aberration Test (1997)).  
1.1 INLEDNING 
Ändamålet med testet av spermatogoniala avvikelser  in vivo  hos 
däggdjur, är att identifiera de substanser som orsakar strukturella 
kromosomavvikelser i spermatogoniala celler hos däggdjur (1) (2) 
(3) (4) (5). Strukturella avvikelser kan vara av två typer, kromoso ­
mala eller kromatida. Majoriteten av de kemiska mutagenerna indu ­
cerar avvikelser av kromatidtyp, men även avvikelser av kromosom ­
typ förekommer. Denna metod är inte utformad för att mäta nume ­
riska avvikelser och används inte rutinmässigt för detta ändamål. Kromosommutationer och relaterade händelser är orsaken till många genetiska sjukdomar hos människor. 
Detta test mäter kromosomhändelser i spermatogoniala könsceller 
och förväntas därför utgöra en förutsägelse på induktion av ärftliga mutationer i könsceller. 
Gnagare används rutinmässigt i detta test. Detta cytogenetiska test  in 
vivo detekterar kromosomavvikelser i spermatogoniala mitoser. An ­
dra målceller omfattas inte av denna metod. 
För att detektera avvikelser av kromatidtyp i spermatogoniala celler, 
bör den första mitotiska celldelningen efter behandlingen undersökas 
innan dessa skador förloras i de påföljande celldelningarna. Ytterli ­
gare information från behandlade spermatogoniala stamceller kan erhållas genom meiotisk kromosomanalys av avvikelser av kromo ­
somtyp vid diakinesmetafas I, när de behandlade cellerna förvandlas 
till spermatocyter. 
Detta  in vivo -test är utformat för att undersöka om mutagener för 
somatiska celler även är aktiva i könsceller. Det spermatogoniala testet är dessutom relevant för att fastställa risken för mutagenicitet, 
eftersom det medger att faktorer för  in vivo  metabolism, farmakoki ­
netik och reparationsprocesser för DNA beaktas. 
Ett antal generationer av spermatogonier finns närvarande i testikeln 
med ett spektrum av känslighet för kemisk behandling. De avvikelser 
som detekteras representerar alltså ett samlat svar på behandlade 
spermatogoniala cellpopulationer, där de mera talrika differentierade spermatogoniala cellerna överväger. Olika generationer av spermato ­
gonier kan där komma i kontakt med det stora kretsloppet. Om detta 
sker eller ej avgörs av deras position inne i testikeln, beroende på 
den fysiska och fysiologiska Sertoli-cellbarriären och på blod/tes ­
tikelbarriären. 
Om det finns bevis för att testsubstansen, eller en reaktiv metabolit, 
inte kommer att nå fram till målvävnaden, är det inte lämpligt att 
använda detta test. 
Se även Allmän inledning, del B.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 385
 
1.2 DEFINITIONER  
avvikelse av kromatidtyp:  strukturell kromosomskada uttryckt som 
brott på enstaka kromatider eller brott och återförening mellan kro ­
matider.  
avvikelse av kromosomtyp:  strukturell kromosomskada uttryckt som 
brott och återförening, på båda kromatiderna på samma ställe.  
lucka:  en akromatisk skada som är mindre än bredden på en kro ­
matid, och med ett minimum av misspassning hos kromatiderna.  
numerisk avvikelse:  en förändring av antalet kromosomer från det 
normala antalet karakteristiskt för det försöksdjur som används.  
polyploidi:  en multipel av det haploida kromosomantalet (n) som 
skiljer sig från det diploida (dvs. 3n, 4n osv.).  
strukturell avvikelse:  en förändring av kromosomstrukturen som är 
detekterbar med hjälp av en mikroskopisk undersökning av metafas ­
stadiet vid celldelning, observerad i form av deletioner, interna eller 
externa utbyten.  
1.3 TESTMETODENS PRINCIP 
Försöksdjur exponeras för testsubstansen genom ett lämpligt expo ­
neringssätt och avlivas sedan vid en lämplig tid efter behandling. Innan avlivningen sker, behandlas försöksdjuren med en substans 
som gör att celldelningen stannar upp i metafas (t.ex. colchicin eller 
Colcemid®). Kromosomberedninger görs sedan från könsceller och färgas in, varpå de celler som är i metafas analyseras med avseende på kromosomavvikelser.
 
1.4 BESKRIVNING AV TESTMETODEN  
1.4.1  Förberedelser  
1.4.1.1  Val av djurarter  
Handjur av kinesiska hamstrar och möss används i stor utsträckning. 
Det är även möjligt att använda hanar från andra lämpliga däggdjurs ­
arter. Man bör välja de stammar av unga, friska vuxna djur som 
vanligen används på laboratorier. När undersökningen ska påbörjas 
är det lämpligt att viktskillnaden mellan djuren är så liten som möj ­
ligt och den bör inte överstiga ± 20 % av medelvikten.  
1.4.1.2  Förhållanden vid förvaring och utfodring  
De generella förhållanden som anges i den Allmänna inledningen till 
del B gäller. Man bör dock sträva efter en relativ luftfuktighet på 
50–60 %.  
1.4.1.3  Förberedelse av djuren  
Friska, unga vuxna djur väljs ut slumpartat för placering i kontroll- 
och behandlingsgrupperna. Burar bör arrangeras på ett sådant sätt att möjliga effekter beroende på placeringen av burarna blir så små som möjligt. Djuren ska ha en unik identifiering. De bör vänjas vid för ­
hållandena i laboratoriet under minst fem dagar innan undersök ­
ningen börjar.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 386
 
1.4.1.4  Beredning av doser  
Festa testsubstanser bör lösas upp i eller blandas med lämpliga lös ­
ningsmedel eller vehiklar och spädas ut, om så är lämpligt, innan dosen administreras till djuren. Testsubstanser i flytande form kan 
doseras direkt eller spädas ut före dosering. Nygjorda beredningar av 
testsubstansen bör användas, om inte stabilitetsdata visar att lagring är acceptabel.
 
1.4.2  Försöksbetingelser  
1.4.2.1  Lösningsmedel/vehikel  
Lösningsmedlet/vehikeln bör inte ge upphov till toxiska effekter vid 
de dosnivåer som används och bör inte kunna misstänkas för att reagera kemiskt med testsubstansen. Om andra lösningsmedel/vehik ­
lar än gängse brukliga används, bör användningen av dem ha stöd 
från data som visar på deras kompatibilitet. När det är möjligt, re ­
kommenderas att man i första hand överväger att använda vattenba ­
serade lösningsmedel/vehiklar.
 
1.4.2.2  Kontroller  
Samtidiga positiva och negativa (lösningsmedel/vehikel) kontroller 
bör inkluderas i varje test. Utom vid behandling med testsubstansen, bör försöksdjuren i kontrollgrupperna hanteras på ett sätt om är 
identiskt med sättet för försöksdjuren i de grupper som behandlas. 
Positiva kontroller bör de strukturella kromosomavvikelser  in vivo  i 
spermatogoniala celler när administrering sker vid exponeringsnivåer 
som förväntas ge en detekterbar ökning i förhållande till bakgrunden. 
Positiva kontrolldoser bör väljas på ett sådant sätt att effekterna är 
tydliga men inte omedelbart avslöjar identiteten hos kodade ut ­
stryksglas för läsaren. Det är acceptabelt att den positiva kontrollen administreras via en annan tillförselväg än testsubstansen och att provtagningen endast sker vid ett tillfälle. Dessutom kan använd ­
ningen av kemiska klassrelaterade positiva kontrollkemikalier över ­
vägas när sådana finns att tillgå. 1 tabellen nedan ges några exempel på positiva kontrollsubstanser.
 
Substans CAS-nummer Einecs-nummer  
Cyklofosfoamid 
Cyklofosfoamidmonohydrat 50-18-0 
6055-19-2 200-015-4 
Cyclohexylamin 108-91-8 203-629-0 
Mitomycin C 50-07-7 200-008-6 
Monomer akrylamid 79-06-1 201-173-7 Trietylenmelamin 51-18-3 200-083-5 
Negativa kontroller, behandlade med enbart ett lösningsmedel eller 
en vehikel, och i övrigt behandlade på samma sätt som behandlings ­
grupperna, bör inkluderas för varje provtagningstillfälle, om inte 
acceptabel variabilitet och frekvens för celler med kromosomavvikel ­
ser mellan försöksdjuren kan påvisas från historiska kontrolldata. Dessutom bör obehandlade kontroller även användas, om det inte finns historiska eller publicerade kontrolldata som visar att inga 
skadliga eller mutagena effekter induceras av det valda lösningsmed ­
let/vehikeln.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 387
 
1.5 FÖRFARANDE  
1.5.1  Antal försöksdjur  
Varje behandlad grupp och kontrollgrupp måste inkludera minst fem 
analyserbara hanar.  
1.5.2  Behandlingsschema  
Testsubstanser bör lämpligen administreras en eller två gånger (dvs. 
som en enstaka behandling eller som två behandlingar). Testsubstan ­
ser kan även administreras i form av en delad dos, dvs. två behand ­
lingar under samma dag med högst några timmars intervall, för att 
underlätta administrering av stora volymer. Andra doseringsscheman bör vara vetenskapligt motiverade. 
I den högsta dosgruppen används två provtagningstider efter behand ­
lingen. Eftersom cellcykelns kinetik kan påverkas av testsubstansen, används en tidig och en sen provtagningstid vid ungefär 24 och 48 
timmar efter behandlingen. För andra doser än den högsta dosen bör 
en provtagningstid vid 24 timmar eller 1,5 cellcyklers längd efter behandlingen användas, om inte andra provtagningstider är kända för att vara lämpligare för detektion av effekter (6). 
Dessutom kan andra provtagningstider användas. När det t.ex. gäller 
fall där kemikalier kan inducera kromosom-”lagging”, eller när de kan ge upphov till S-oberoende effekter, kan tidigare provtagnings ­
tider visa sig vara lämpligare (1). 
Man måste i varje enskilt fall fastställa om det är lämpligt att an ­
vända ett upprepat behandlingsschema. Efter ett upprepat behand ­
lingsschema bör försöksdjuren avlivas 24 timmar (1,5 gånger cell ­
cykelns längd) efter den sista behandlingen. Ytterligare provtagnings ­
tider kan användas där så är lämpligt. 
Innan avlivningen sker, injiceras försöksdjuren intraperitonealt med 
en lämplig dos av en substans som stoppar celldelningen i metafas (t.ex. Colcemid
 ® eller colchicin). Provtagning på försöksdjur sker 
därefter med lämpliga intervall. För möss ligger detta intervall på 
ungefär 3–5 timmar och för kinesiska hamstrar ligger intervallet pä 
ungefär 4–5 timmar.  
1.5.3  Dosnivåer  
Om det inte finns några lämpliga data tillgängliga och en undersök ­
ning därför utförs för att fastställa omfattningen, bör denna under ­
sökning utföras i samma laboratorium, och med samma arter, stam ­
mar och behandlingsschema som senare ska användas i huvudunder ­
sökningen. Vid toxicitet används tre dosnivåer för det första prov ­
tagningstillfället. Dessa dosnivåer bör täcka in ett intervall som sträc ­
ker sig från maximal till liten eller ingen toxicitet. Vid senare prov ­
tagningstillfällen räcker det med att endast den högsta dosen an ­
vänds. Den högsta dosen definieras som den dos som producerar 
tecken på toxicitet och så att högre dosnivåer baserade på samma 
doseringsschema skulle förväntas leda till att försöksdjuret dör.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 388
 
Substanser med specifika biologiska verkningar vid låga icke-toxiska 
doser (såsom hormoner och mitogena substanser) kan utgöra undan ­
tag från kriterier som är dosbestämmande och bör utvärderas ifrån fall till fall. Den högsta dosen kan även definieras som en dos vilken ger upphov till någon indikation på toxicitet i den spermatogoniala 
cellerna (t.ex. en reduktion i kvoten av spermatogoniala mitoser hos 
de första och andra meiotiska metafaserna; denna reduktion bör inte överskrida 50 %).
 
1.5.4  ”Limit-test”  
En fullständig undersökning med tre dosnivåer kan inte anses vara 
nödvändig om ett test på en dosnivå vid minst 2 000 mg/kg kropps ­
vikt och med en enstaka behandling, eller i form av två behandlingar under samma dag, inte per upphov till observerbara toxiska effekter, och om ingen genotoxicitet kan förväntas utifrån data om strukturellt 
relaterade substanser. En förväntad exponering av människor kan 
visa på behovet av att en högre dosnivå används i ’limit-testen’.
 
1.5.5  Administrering av doser  
Testsubstansen administreras normalt genom sondmatning med hjälp 
av en magsond, en lämplig intuberingskanyl eller genom en intrape ­
ritoneal injektion. Andra tillförselvägar för exponering kan vara ac ­
ceptabla där de kan motiveras. Den maximala vätskevolymen som kan administreras med hjälp av sondmatning eller injektion vid ett 
tillfälle beror på försöksdjurets storlek. Volymen bör inte överstiga 
2 ml/100 g kroppsvikt. Användning av volymer som är större än dessa måste motiveras. Förutom för irriterande eller korrosiva sub ­
stanser, som normalt kommer att visa på stegrade effekter med högre 
koncentrationer, bör variationer av testvolymen minimeras genom att 
en justering av koncentrationen sker för att säkerställa att volymen är konstant vid alla dosnivåer.
 
1.5.6  Kromosomberedning  
Omedelbart efter avlivning, tas cellsuspensioner ut från en eller båda 
testiklarna, exponeras för en hypoton lösning och fixeras. Cellerna stryks sedan ut på utstryksglas och färgas in.
 
1.5.7  Analys  
För varje försöksdjur bör minst 100 väl spridda metafaser analyseras 
(dvs. ett minimum på 500 metafaser per grupp). Detta antal skulle kunna reduceras när ett stort antal avvikelser observeras. Alla ut ­
stryksglas, inklusive de från positiva och negativa kontroller, bör 
få en oberoende kodning innan den mikroskopiska analysen utförs. 
Eftersom fixeringsprocedurerena ofta resulterar i brott på en del av de celler som är i metafas, med förlust av kromosomer som följd, bör de celler som påvisas innehålla ett antal centromerer som mot ­
svarar antalet 2 N ± 2.
 
2. DATA  
2.1 BEHANDLING AV RESULTATEN 
Individuella data från försöksdjur bör presenteras i tabellform. Den 
experimentella enheten utgörs av försöksdjuret. För varje individuellt 
försöksdjur bör antalet celler med strukturella kromosomavvikelser 
och antalet kromosomavvikelser per cell utvärderas. Olika typer av strukturella kromosomavvikelser bör listas med antal och frekvenser för behandlade grupper och kontrollgrupper. Luckor i DNA-strängen 
registreras separat och rapporteras men inkluderas i allmänhet inte i 
den totala avvikelse frekvensen.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 389
 
Om såväl mitos som meios observeras, bör förhållandet mellan sper ­
matogoniala mitoser och de första och andra meiotiska metafaserna 
fastställas som ett mått på cytotoxicitet för alla behandlade och ne ­
gativa kontrollförsöksdjur vid ett totalt prov pä 100 celler som delar sig per djur för att etablera en möjligt cytotoxisk effekt. Om endast 
mitos kan observeras, bör mitosindexet bestämmas i minst 1 000 
celler för varje försöksdjur.
 
2.2 UTVÄRDERING OCH TOLKNING AV RESULTATEN 
Det finns ett flertal kriterier som används för att bestämma om ett 
resultat är positivt, t.ex. en dosrelaterad ökning av det relativa antalet 
celler med kromosomavvikelser eller en tydlig ökning av antalet 
celler hos en grupp som fått en enstaka dos vid ett enstaka prov ­
tagningstillfälle. Man bör i första hand överväga resultatets bio ­
logiska relevans. Statistiska metoder kan användas som en hjälp 
vid utvärdering av testresultatet (8). Tvetydiga resultat bör klarläggas 
genom fortsatta tester, lämpligen vid ändrade experimentella beting ­
elser. 
En testsubstans för vilken resultatet inte uppfyller ovanstående kri ­
terier anses vara icke-mutagen i detta test. 
Även om de flesta experiment kommer att ge tydligt positiva eller 
negativa resultat, så kan i sällsynta fall uppsättningen av data göra 
det omöjligt att utföra en otvetydig bedömning med avseende på 
testsubstansens aktivitet. Resultatet kan förbli tvetydigt eller tvek ­
samt, oavsett hur många gånger som experimentet upprepas. 
Positiva resultat från  in vivo -test för spermatogoniala kromosomavvi ­
kelser indikerar att testsubstansen inducerar strukturella kromosom ­
avvikelser i könscellerna hos den art som testas. Negativa resultat indikerar att testsubstansen, under försöksbetingelserna, inte induce ­
rar kromosomavvikelser i könscellerna på den art som testas. 
Sannolikheten för att testsubstansen eller dess metaboliter når mål ­
vävnaden bör diskuteras.
 
3. RAPPORTERING  
TESTRAPPORT 
Testrapporten måste innehålla följande information: 
Lösningsmedel/vehikel: 
— motivering av valet av vehikel — testsubstansens löslighet och stabilitet i lösningsmedlet/vehikeln, 
om detta är känt 
Försöksdjur: — art/stam som används 
— försöksdjurens antal och ålder 
— ursprung, förhållanden vid förvaring, diet, etc. — individuell vikt hos försöksdjuren vid försökets början, inklusive 
kroppsviktsintervallet, medelvärde och standardavvikelse för 
varje grupp
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 390
 
Försöksbetingelser: 
— data från en omfångsundersökning, om en sådan genomförts 
— grund för valet av dosnivå 
— grund för administrationsvägen — uppgifter om beredningen av testsubstansen — uppgifter om administreringen av testsubstansen — grund för avlivningstiderna — omvandling från koncentration av testsubstansen i diet/dricksvat ­
ten (ppm) till den verkliga dosen (mg/kg kroppsvikt/dag), om 
detta är tillämpbart 
— uppgifter om fodrets och vattnets kvalitet — detaljerad beskrivning av behandlings- och provtagningsscheman — metoder för mätningar av toxicitet 
— identiteten hos substanser som stoppar cellcykeln i metafas, deras 
koncentration och behandlingens varaktighet 
— metoder för preparation av utstryksglas — kriterier för hur avvikelser påvisas — antalet celler som analyserats per försöksdjur 
— kriterier för bedömning av om undersökningarna är positiva, ne ­
gativa eller tvetydiga 
Resultat: — tecken på toxicitet — mitotiskt index 
— förhållandet mellan spermatogoniala mitosceller och de första och 
andra meiotiska metafaserna 
— typ av och antal avvikelser, angivna separat för varje försöksdjur — det totala antalet avvikelser per grupp — antalet celler med avvikelser per grupp — dos/respons-förhållande, där så är möjligt 
— statistiska analyser, om några sådana förekommer 
— samtidiga negativa kontrolldata — historiska negativa kontrolldata med omfång, medelvärden och 
standardavvikelser 
— samtidiga positiva kontrolldata 
— förändringar i ploiditet, om sådana har observerats 
Diskussion av resultaten. Slutsatser.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 391
 
4. HÄNVISNINGAR  
1. Adler, 1. D., (1986), Clastogenic Potential in Mouse Spermato ­
gonia of Chemical Mutagens Related to their Cell-Cycle Speci ­
fications, in: Genetic Toxicology of Environmental Chemicals, 
Part B: Genetic Effects and Applied Mutagenesis, Ramel, C, 
Lambert, B. and Magnusson, J. (eds) Liss, New York, s. 477–484. 
2. Adler, I. D., (1984), Cytogenetic tests in Mammals, in: Mutage ­
nicity Testing: a Practical Approach, (ed.) S. Venitt and J. M. 
Parry, 1RL Press, Oxford, Washington DC, s. 275–306. 
3. Evans, E. P., Breckon, G. and Ford, C. E. (1964), An Air-drying 
Method for Meiotic Preparations from Mammalian Testes, Cyto ­
genetics and Cell Genetics, 3, s. 289–294. 
4. Richold, M., Ashby, J., Chandley, A., Gatehouse, D. G. and 
Henderson, L. (1990),  In Vivo  Cytogenetic Assays, in: D. J. 
Kirkland (ed.), Basic Mutagenicity Tests, UKEMS Recommen ­
ded Procedures. UKEMS Subcommittee on Guidelines for Mu ­
tagenicity Testing. Report. Part I revised, Cambridge University 
Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, s. 115–141. 
5. Yamamoto, K. and Kikuchi, Y. (1978), A New Method for 
Preparation of Mammalian Spermatogonial Chromosomes, Muta ­
tion Res. 52, s. 207–209. 
6. Adler, 1. D., Shelby M. D., Bootman, J., Favor, J., Generoso, 
W., Pacchierotti, F.. Shibuya, T. and Tanaka N. (1994), Interna ­
tional Workshop on Standardisation of Genotoxicity Test Pro ­
cedures. Summary Report of the Working Group on Mammalian 
Germ Cell Tests, Mutation Res. 312, s. 313–318. 
7. Fielder, R. J., Allen, J. A., Boobis, A. R., Botham, P. A., Doe, J., 
Esdaile, D. J., Gatehouse, D. G., Hodson- Walker, G.. Morton, D. B., Kirkland, D. J. and Richold, M. (1992), Report of British 
Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society Wor ­
king Group: Dose setting in  In Vivo  Mutagenicity Assays, Mu ­
tagenesis, 7, s. 313–319. 
8. Lovell, D. P., Anderson, D., Albanese, R., Amphlett, G. E., 
Clarc, G., Ferguson, R., Richold, M., Papworth, D. G. and Sa ­
vage, J. R. K. (1989), Statistical Analysis of  In Vivo Cytogenetic 
Assays, in: D. J. Kirkland (ed.), Statistical Evaluation of Muta ­
genicity Test Data. UKEMS Subcommittee on Guidelines for Mutagenicity Testing, report, Part 111. Cambridge University 
Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, 
s. 184–232.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 392
 
B.24  FLÄCKTEST PÅ MUS  
1. METOD  
1.1 INLEDNING 
Se allmän inledning till del B.  
1.2 DEFINITIONER 
Se allmän inledning till del B.  
1.3 REFERENSÄMNEN 
Inga.  
1.4 TESTMETODSPRINCIP 
Fläcktestet är ett  in vivo-test  på mus där musfoster på det embryonala 
stadiet exponeras för kemiska förbindelser. Målcellerna i fostren är 
melanoblasterna, och målgenerna är de gener som bestämmer päls ­
hårens pigmentering. Fostren är heterozygota i ett antal av dessa pälsfärger. Vid mutation eller förlust av det dominanta allele i en 
melanoblaster genom en rad genetiska händelser kommer den reces ­
siva fenotypen till uttryck i de celler som bildas från denna cellstam, vilket medför en annorlunda färgade fläckar i musens päls. Mängden av avkommor med sådana fläckar, dvs. mutationer, registreras och 
jämförs med motsvarande mängd blandad avkomma av hondjur som 
har exponerats för lösningsmedlet. Vid fläcktest på mus bestäms förmodade somatiska mutationer i fosterceller.
 
1.5 KVALITETSKRITERIER 
Inga.  
1.6 METODBESKRIVNING  
Förberedelser  
Testämnet upplöses eller suspenderas i isotonisk saltlösning. Ke ­
miska förbindelser som inte är lösliga i vatten ska lösas eller sus ­
penderas i lämplig vehikel. Vehikel som används för att underlätta dosering får inte inverka på testämnet eller framkalla toxiska effek ­
ter. Nyligen framställda lösningar av testämnet ska användas.
 
F ö r s ö k s d j u r 
Mus av stammen T-stock (nonagouti, a/a; chinchilla, pink eye c  ch p/ 
c ch p; brown, b/b; dilute, short ear, d se/d se; piebald spotting, s/s) 
paras med antingen HT-stock (pallid, nonagouti, brachypody, pa a bp/pa a bp; leaden fuzzy, In fz/In fz; pearl pe/pe) eller C57 BL (nonagouti, a/a). Andra lämpliga korsningar såsom NMRI (nonagou ­
ti, a/a; albino, c/c) och DBA (nonagouti, a/a; brown b/b; dilute, d/d) 
kan användas under förutsättning att avkomman är nonagouti.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 393
 
A n t a l o c h k ö n 
Tillräckligt många dräktiga hondjur för att producera en passande 
mängd avkomma för var och en av de använda doserna används. Det antal som är lämpligt kan fastställas på grundval av antalet observerade fläckar hos de exponerade mössen och kontrolldatas 
storleksordning. Ett negativt resultat är acceptabelt först sedan minst 
300 ungar av hondjur som exponerats för den största dosen har undersökts.
 
A n v ä n d n i n g a v n e g a t i v a o c h p o s i t i v a k o n t r o l l e r 
Sidlöpande kontrolldata från möss som endast exponerats för vehikel 
(negativa kontroller) bör finnas tillgängliga. Kontrolldata från tidi ­
gare försök vid samma laboratorium kan räknas med för att höja 
testets känslighet, under förutsättning att de är homogena. Positiva 
kontrolldata bör finnas tillgängliga från försök som nyligen genom ­
förts i samma laboratorium med en kemisk förbindelse som är känd för att visa mutagenicitet vid denna test, om det inte konstateras 
någon mutagenicitet av testämnet.
 
T i l l f ö r s e l v ä g 
Normalt tillförs testämnet genom oral intubering eller intraperitoneal 
injicering i de dräktiga hondjuren. Inhalation och andra tillförselvä ­
gar kan vara lämpliga.  
D o s n i v å e r 
Minst två dosnivåer används, av vilka den ena ska medföra tecken 
på toxisk verkan eller minskad kullstorlek. Icke-toxiska ämnen testas genom användning av så höga doser som möjligt.
 
Förfarande  
Vanligen ges försöksdjuren hela dosen på en gång under dräktighets ­
periodens dag 8, 9 eller 10, varvid dag 1 räknas som den dag vaginalproppen observeras för första gången. Dessa dagar motsvarar 
dag 7,25, 8,25 och dag 9,25 efter befruktning. Upprepad behandling 
kan behövas på dessa dagar.
 
A n a l y s 
Avkomman blindkodas och eventuella pigmenterade fläckar registre ­
ras 3–4 veckor efter födseln. Man skiljer på tre typer av fläckar: 
a) Vita fläckar inom ett avstånd av 5 mm från den ventrala mitt ­
linjen. Dessa fläckar antas vara ett resultat av celldöd (WMVS). 
b) Gula agouti-aktiga fläckar på eller omkring spene, genitalia, stru ­
pe, axillär- och inguinalområden, och mitt i pannan. Dessa fläckar antas vara ett resultat av feldifferentiering (MDS). 
c) Pigmenterade och vita fläckar slumpmässigt fördelade i pälsen. 
Dessa fläckar antas vara ett resultat av somatiska mutationer (RS).
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 394
 
Alla tre typer registreras men endast den sistnämnda, RS, är gene ­
tiskt relevant. Om det är svårt att skilja mellan MDS och RS kan 
fluorecensmikroskopi av hårprover användas. 
Synliga morfologiska abnormiteter hos avkomman registreras också.  
2. DATA  
Det totala antalet undersökta ungar och antal ungar med en eller flera 
fläckar som antas vara ett resultat av somatisk mutation anges. Data från försöksgrupper och negativ kontrollgrupp jämförs med hjälp av 
lämpliga statistiska metoder. Data anges även per kull.
 
3. RAPPORTERING  
3.1 TESTRAPPORT 
Testrapporten ska om möjligt innehålla minst följande uppgifter: 
— Korsning av använda stammar. — Antal dräktiga hondjur i försöks- och kontrollgrupperna. — Den genomsnittliga kullstorleken i försöks- och kontrollgrup ­
perna vid födseln, och när ungarna är avvanda. 
— Dosnivåer. 
— Använt lösningsmedel. 
— Den dag i dräktighetsperioden då dosering sker. — Tillförselväg. — Det totala antal undersökta ungar och antal ungar med WMVS, 
MDS och RS i försöks- och kontrollgrupperna. 
— Makroskopiska morfologiska abnormiteter. — Förhållandet mellan dos och reaktion för RS när detta är möjligt. — Statistisk utvärdering. — Diskussion om resultaten. — Tolkning av resultaten.
 
3.2 UTVÄRDERING OCH TOLKNING 
Se allmän inledning till del B.  
4. HÄNVISNINGAR  
Se allmän inledning till del B.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 395
 
B.25  TEST AVSEENDE ÄRFTLIG TRANSLOKATION PÅ MUS  
1. METOD  
1.1 INLEDNING 
Se allmän inledning till del B.  
1.2 DEFINITIONER 
Se allmän inledning till del B.  
1.3 REFERENSÄMNEN 
Inga.  
1.4 TESTMETODSPRINCIP 
Vid test av ärftlig translokation hos mus konstateras strukturella och 
numeriska kromosomförändringar i däggdjursceller uttryckt i förs ­
tagenerationens avkomma. De kromosomförändringar som mäts är reciproka translokationer och, när avkomman även omfattar hondjur, 
förlust av en X-kromosom. Bärare av translokationer och XO-hon ­
djur har nedsatt fertilitet, vilket utnyttjas vid valet av F
 1 -avkomma 
för cytogenetisk analys. Vissa typer av translokationer (X-autosome och c-t-typen) orsakar fullständig sterilitet. Translokationer konstate ­
ras cytogenetiskt i meiosens diakines-metafas hos handjur, som an ­
tingen kan vara av F
 1 -generationen eller söner till F,-hondjur. XO- 
hondjur identifieras cytogenetiskt genom att kromosomtalet i ben ­
märgsmitoser endast är 39.  
1.5 KVALITETSKRITERIER 
Inga.  
1.6 METODBESKRIVNING  
Förberedelser  
Testämnet upplöses i isotonisk saltlösning. Ämnen som inte är lös ­
liga i saltlösning ska lösas eller uppslammas i lämplig vehikel. Ny ­
ligen framställda lösningar av testämnet ska användas. Vehikel som används för att underlätta dosering får inte inverka på testämnet eller 
framkalla toxiska effekter.
 
T i l l f ö r s e l v ä g 
Vanligen tillförs testämnet genom oral intubering eller intraperitoneal 
injicering. Även andra tillförselvägar kan användas.  
F ö r s ö k s d j u r 
Som försöksdjur används mus eftersom det är enklast med hänsyn 
till uppfödning och cytologisk verifikation. Ingen särskild stam 
krävs. Om man planerar att testa fertiliteten bör den använda stam ­
mens genomsnittliga kullstorlek vara över åtta och relativt konstant. 
Friska könsmogna djur används.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 396
 
A n t a l d j u r 
Det antal djur som behövs beror på den spontana translokationsfre ­
kvensen och den induktionsfrekvens som är nödvändig för att uppnå ett positivt resultat. 
Normalt görs testet genom undersökning av F
 1 -handjur. Minst 500 
F 1 -handjur undersöks per dos. Om även kvinnlig F  1 -avkomma an ­
vänds undersöks 300 av varje kön.  
A n v ä n d n i n g a v n e g a t i v a o c h p o s i t i v a k o n t r o l l e r 
Tilllräckliga kontrolldata från sidlöpande och tidigare, kontrollförsök 
ska finnas tillgängliga. Om det finns godtagbara positiva kontroll ­
resultat från tidigare försök vid samma laboratorium kan dessa an ­
vändas istället för en sidlöpande positiv kontroll.  
D o s n i v å e r 
En dos testas, normalt den högsta dosen med minimal toxisk verkan, 
men utan inflytande på reproduktion eller överlevnad. Om förhål ­
landet mellan dos och reaktion ska bestämmas används ytterligare 
två lägre doser. Icke-toxiska ämnen testas genom användning av så höga doser som möjligt.
 
Förfarande  
E x p o n e r i n g e f t e r p a r n i n g 
Två olika behandlingsscheman kan användas. I det mest använda 
schemat ges hela dosen på en gång. Testämnet kan också ges 7 dagar i veckan i 35 dagar. Antalet parningar efter exponeringen beror 
på exponeringsschemat och ska vara tillräckligt stort för att säker ­
ställa att alla exponerade könscellstadier kan undersökas. Efter par ­
ningen placeras hondjuren i var sin bur. Vid födseln registreras datumet, kullstorleken och avkommans kön. Alla handjuren bland 
avkomman avvänjs och hondjuren avlägsnas såvida de inte inbegrips 
i försöket
 
T e s t a v h e t e r o z y g o t i e f t e r t r a n s l o k a t i o n 
En av två möjliga metoder används: 
— Fertilitetsundersökning av F  1 -generationen med efterföljande ve ­
rifikation av eventuella translokationsbärare genom cytologisk 
analys. 
— Cytogenetisk analys av alla F  1 -handjur utan föregående urval på 
grundval av fertilitetsundersökningar. 
a) Fertilitetsundersökning 
Nedsatt fertilitet hos F  1 -generationens medlemmar kan konstate ­
ras vid observation av kullstorleken och/eller analys av de parade 
hondjurens livmoderinnehåll. 
Kriterier för bestämning av normal och nedsatt fertilitet måste 
fastställas innan fläcktestet på mus inleds.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 397
 
Observation av kullstorlek:  De F  1 -handjur som ska undersökas 
placeras i var sin bur tillsammans med hondjur från samma 
försök eller från bestånden. Från och med den 18:e dagen efter parning iakttas burarna dagligen. Kullstorleken och kön i F
 2 - 
generationen registreras vid födseln, varefter kullarna avlägsnas. 
Om F  1 -hondjur testas bevaras de små F  2 -kullarna för ytterligare 
undersökningar. Konstatering av om hondjur är translokations ­
bärare sker genom cytogenetisk analys av translokation hos nå ­
gon av deras manliga avkomma. XO-hondjur identifieras genom 
ändring av förhållandet mellan han- och hondjur i deras av ­
komma från 1:1 till 1:2. Vid ett sekvensiellt ordnat förfarande elimineras normalt F
 1 -djur från den vidare undersökningen om 
storleken av den första F  2 -kullen är lika med eller större än ett på 
förhand fastställt normalvärde. I motsatt fall observeras den andra 
eller tredje F  2 -kullen. 
F 1 -djur som inte kan klassificeras som normala efter observation 
av upp till tre F  2 -kullar underkastas antingen ytterligare under ­
sökning genom analys av de parade hondjurens livmoderinnehåll 
eller direkt cytogenetisk analys.  
Analys av innehållet i livmodern:  Den mindre kullstorleken hos 
translokationsbärare skylls på att fostren dör på det embryonala 
stadiet vilket innebär att ett stort antal döda implantat tyder på translokation hos försöksdjuret. De F
 1 -handjur som ska undersö ­
kas paras vart och ett separat med upp till tre hondjur. Vid daglig 
undersökning mellan kl. 10 och kl. 12 på förmiddagen av före ­
komsten av vaginalpropp, konstateras om befruktning har skett. Hondjuren avlivas 14–16 dagar senare och antalet levande och döda implantat i livmodern registreras. 
b) Cytogenetisk analys 
Testpreparat framställs genom lufttorkningsteknik. Transloka ­
tionsbärarna identifieras på grundval av multivalenta konfigura ­
tioner i primärar spermatocyters diakines-metafas I. Om det ob ­
serveras minst två celler med multivalenta konfigurationer anses 
det bevisat att försöksdjuret är translokationsbärare. 
När inget urval görs på grundval av fertilitetsundersökningar 
undersöks alla F
 1 -handjur cytogene-tiskt. Mikroskopisk under ­
sökning görs av minst 25 diakines-metafaser I per handjur. F  1 - 
handjur med små testiklar och defekt meiose innan diakines, samt F
 1 ,-hondjur som förmodas vara XO-bärare, underkastas un ­
dersökning av mitotiska metafaser i spermatogoner eller ben ­
märg. Om ovanligt långa och/eller korta kromosomer observeras i tio celler anses det bevisat att det är tal om en translokation som gör handjur sterila (c-typen). Vissa X-automsoma translokationer 
som gör handjur sterila kan endast identifieras genom bandanalys 
av mitosekromosomer. Om 39 kromosomer observeras i tio mi ­
toser anses det bevisat att det är tal om ett XO-hondjur.
 
2. DATA  
Data ställs upp i tabellform. 
Den genomsnittliga kullstorleken och könsfördelningen i föräldrage ­
nerationens avkomma vid födseln och vid avvänjning anges för varje 
parningsperiod.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 398
 
För bedömning av F  1 -djurens fertilitet anges den genomsnittliga 
kullstorleken efter de normala parningarna och varje enskild kulls ­
torlek efter parning av F  1 -translokationsbärare. Efter analys av liv ­
moderinnehåll anges det genomsnittliga antalet levande och döda implantat efter normala parningar och antalet levande och döda im ­
plantat efter varje enskild parning av F
 1 -translokationsbärare. 
Efter cytogenetisk analys av diakines-metafaser I anges antalet multi ­
valenta konfigurationer och det totala antalet undersökta celler för 
varje enskild translokationsbärare. 
Det totala antalet parningar och parningsperiodernas längd anges för 
sterila F  1 -djur. Detaljerade upplysningar lämnas om testikelvikt och 
cytogenetisk analys. 
Den genomsnittliga kullstorleken, F  2 -avkommans könsfördelning och 
resultaten av den cytogenetiska analysen anges för XO-hondjur. 
Om eventuella F  1 -translokationsbärare väljs ut vid fertilitetsundersök ­
ningar ska tabellerna innehålla upplysningar om hur många av de utvalda djuren som senare visade sig vara heterozygota efter trans ­
lokation. 
Data från negativa och positiva kontrollförsök rapporteras på lik ­
nande sätt.
 
3. RAPPORTERING  
3.1 TESTRAPPORT 
Testrapporten ska om möjligt innehålla minst följande uppgifter: 
— Musstam, djurens ålder, de doserade djurens vikt, antal djur av 
varje kön i försöks- och kon trollgrupperna i föräldrageneratio ­
nen. 
— Antal föräldradjur av varje kön i försöks- och kontrollgrupperna. 
— Försöksbetingelser, detaljerad beskrivning av behandlingen av 
djuren, dosnivå, lösningsmedel, parningsschema. 
— Avkommans antal och kön för varje enskilt hondjur, antal och 
kön av avkomma som föds upp för translokationsanalys. 
— Tidpunkt och kriterier för translokationsanalys. 
— Antal translokationsbärare samt detaljerad beskrivning av dessa, 
inbegripet avlivningsdata och upplysningar om livmoderinnehåll, 
om sådana finns. 
— Cytogenetiska förfaranden och detaljerade upplysningar om den 
mikroskopiska analysen, helt med bilder. 
— Statistisk utvärdering. 
— Diskussion om resultaten. — Tolkning av resultaten.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 399
 
3.2 UTVÄRDERING OCH TOLKNING 
Se allmän inledning till del B.  
4. HÄNVISNINGAR  
Se allmän inledning till del B.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 400
 
B.26  TEST AVSEENDE SUBKRONISK ORAL TOXICITET 90 
DAGARS UPPREPAT ORALTEST PÅ GNAGARE  
1. METOD  
Denna testmetod för subkronisk oral toxicitet motsvarar OECD 
TG 408 (1998).  
1.1 INLEDNING 
Vid bedömning och utvärdering av en kemikalies toxiska egenskaper 
kan bestämningen av subkronisk oral toxicitet med användning av upprepade doser genomföras efter det att man har fått preliminär toxicitetsinformation från test avseende akut toxicitet eller från test 
med upprepad dosering (28 dagar). Från 90-dagarstestet fås infor ­
mation om eventuella hälsoskador som kan uppstå till följd av upp ­
repad exponering under en lång tidsperiod som täcker mognaden efter avvänjning och uppväxten ända in i vuxenstadiet. Genom testet 
fås information om de mest betydande toxiska verkningarna, indika ­
tion om vilka organ som påverkas och huruvida det finns en risk för ackumulering. Likaså kan man få en uppskattning om en expone ­
ringsnivå vid vilken inga skadliga verkningar observeras. Denna 
information kan användas för att välja dosnivåer för test avseende 
kronisk toxicitet och för att fastställa säkerhetskriterier gällande ex ­
ponering på människor. 
Metoden innebär starkare betoning av neurologiska slutpunkter (end ­
points) och ger indikationer om immunologiska och reproduktions ­
toxiska verkningar. Likaså betonas behovet av noggranna kliniska observationer av djuren i syfte att få fram så mycket information som möjligt. Testets syfte är att möjliggöra identifiering av kemika ­
lier som har potential att framkalla sådana neurotoxiska, immunolo ­
giska eller reproduktionstoxiska verkningar som kan motivera när ­
mare undersökningar. 
Se även Allmän inledning, del B.
 
1.2 DEFINITIONER  
Dos: Den mängd testämne som tillförs. Dosen uttrycks som vikt (g, mg), 
som vikten testämne per viktenhet försöksdjur (t.ex. mg/kg) eller som en 
konstant utfodringskoncentration (ppm).  
Dosering : Ett allmänt begrepp som inbegriper dos, dess frekvens och 
varaktighet.  
NOAEL : Förkortning för ’no-observed-adverse-effect level’ (nivå 
vid vilken inga skadliga verkningar observeras). Avser den högsta 
dosnivån vid vilken inga skadliga behandlingsrelaterade verkningar 
kan observeras.  
1.3 PRINCIP FÖR TESTMETODEN 
Testämnet tillförs oralt dagligen under 90 dagar i stegvis ökande 
doser till flera grupper försöksdjur, en dosnivå per grupp. Under denna period observeras djuren noggrant för att se om de uppvisar några tecken som tyder på att testämnet är toxiskt. Djur som dör eller 
avlivas under testet obduceras och vid testets slut avlivas de över ­
levande djuren och obduceras.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 401
 
1.4 BESKRIVNING AV TESTMETODEN  
1.4.1  Förberedelse av djuren  
För testet används friska djur som har acklimatiserats till laborato ­
riemiljön under minst fem dagar och som inte har använts för tidi ­
gare test. Försöksdjuren bör karakteriseras enligt art, stam, ursprung, 
kön, vikt och ålder. Djuren fördelas slumpvis i kontroll- och behand ­
lingsgrupper. Burarna placeras på sådant sätt att eventuella verk ­
ningar på grund av placeringen minimeras. Varje djur tilldelas ett 
unikt identifieringsnummer.  
1.4.2  Förberedelse av doserna  
Testämnet tillförs via sondmatning, foder eller dricksvatten. Den 
metod som väljs för oral tillförsel beror på testets syfte och testäm ­
nets fysikalisk-kemiska egenskaper. 
Vid behov kan testämnet lösas upp eller suspenderas i en lämplig 
vehikel. Om möjligt bör man i första hand överväga vattenlösning eller vattensuspension, sedan oljelösning eller oljeemulsion (t.ex. majsolja) och därefter eventuella övriga vehiklar. I fråga om andra 
vehiklar än vatten måste de toxiska egenskaperna vara kända. Tes ­
tämnets stabilitet vid tillförselförhållandena bör fastställas.
 
1.4.3  Testförhållanden  
1.4.3.1  Försöksdjur  
Rekommenderat försöksdjur är råtta, även om testet kan utföras med 
andra gnagare (t.ex. mus). Djuren bör vara unga och friska vuxna exemplar som härrör från normala laboratoriestammar. Hondjuren får 
inte ha fött ungar och får inte vara dräktiga. Doseringen bör inledas 
snarast möjligt efter avvänjningen och under alla förhållanden innan djuren är nio veckor gamla. Vid testets början bör variationen i vikt mellan de använda djuren vara minimal och får inte överstiga ± 
20 % av vardera könets medelvikt. Om testet utförs som inledning 
till ett långtidstest avseende kronisk toxicitet måste djur från samma stam och ursprung användas för båda testen.
 
1.4.3.2  Antal och kön  
Minst 20 djur (tio honor och tio hanar) bör användas för varje dos ­
nivå. Om avlivningar är inplanerade under testets gång bör antalet djur ökas med det antal djur som avlivas innan testet har slutförts. Beroende på tidigare kunskaper om kemikalien eller en nära besläk ­
tad kemikalie bör man överväga att ta med ytterligare en satellit ­
grupp på tio djur (fem per kön) för kontrollgruppen och toppdos ­
gruppen. Efter behandlingsperioden observeras satellitgruppen med avseende på reversibla eller kvarstående toxiska verkningar. Längden 
för denna period fastställs med beaktande av de observerade verk ­
ningarna.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 402
 
1.4.3.3  Dosnivåer  
Minst tre dosgrupper och en parallell kontrollgrupp bör användas, 
utom om gränstest utförs (se 1.4.3.4). Dosnivåerna kan basera sig på resultaten från test med upprepad dos eller från preliminära test för 
dosbestämning, och de bör fastställas med beaktande av alla tox ­
ikokinetiska data som finns tillgängliga för testämnet eller närbesläk ­
tade ämnen. Den högsta dosnivån väljs så att den framkallar toxiska verkningar utan att orsaka dödsfall eller svårt lidande, förutsatt att 
det inte finns begränsningar som beror på testämnets fysikalisk-ke ­
miska natur eller biologiska verkningar. Därefter väljs dosnivåerna i fallande skala så att en dosrelaterad respons kan påvisas, och sam ­
tidigt så att inga påvisbara skadliga verkningar (NOAEL) kan obser ­
veras vid den lägsta dosnivån. Två- till fyrfaldiga dosintervall är ofta optimala för de fallande dosnivåerna. Tillägg av en fjärde testgrupp är att föredra framför användning av mycket breda intervall mellan 
dosnivåerna (t.ex. en faktor som är större än cirka 6–10). 
Kontrollgruppen är en obehandlad grupp, eller en vehikelkontroll ­
grupp om vehikel används för tillförsel av testämnet. Förutom att djuren i kontrollgruppen inte behandlas med testämnet bör de han ­
teras på exakt samma sätt som djuren i dosgrupperna. Om en vehikel 
används bör kontrollgruppen tillföras vehikeln i den största volym som används. Om testämnet tillförs via fodret och man märker att foderintaget minskar, kan det vara till fördel med en parallellt utfod ­
rad kontrollgrupp för att kunna avgöra huruvida minskningen beror 
på att testämnet påverkar fodrets smak eller på att det förekommer toxikologiska förändringar i testmodellen. 
Följande egenskaper hos vehikeln och övriga eventuella tillsats ­
ämnen bör beaktas: verkningarna på absorption, distribution, meta ­
bolism eller kvarhållande av testämnet; verkningarna på testämnets kemiska egenskaper i den utsträckning dessa verkningar kan påverka 
testämnets toxiska egenskaper samt verkningarna på försöksdjurens 
foder- eller vattenintag eller deras näringstillstånd.
 
1.4.3.4  Gränstest (Limit-test)  
Om ett test med en dosnivå om minst 1 000 mg per kg kroppsvikt 
och dag genomförs på det sätt som beskrivs här och inga toxiska 
verkningar kan observeras, och om toxicitet inte förväntas på grund ­
val av uppgifter om strukturellt närbesläktade ämnen, kan ett full ­
ständigt test med tre dosnivåer anses vara överflödigt. Gränstest till ­
lämpas utom när exponering på människor indikerar att en högre 
dosnivå behövs.  
1.5 FÖRFARANDE  
1.5.1  Tillförsel av doser  
Djuren ges dagliga doser av testämnet under 90 dagar. Varje annat 
doseringsschema, t.ex. dosering fem dagar per vecka, måste motive ­
ras. Om testämnet tillförs genom sondmatning bör hela dosen till ­
föras på en gång via magsond eller lämplig intubationskanyl. Den största mängd vätska som kan tillföras vid ett och samma tillfälle beror på försöksdjurets storlek. Volymen får inte överstiga 1 ml per 
100 g kroppsvikt utom i fråga om vattenlösningar för vilka 2 ml per 
100 g kroppsvikt får användas. Med undantag för irriterande eller frätande ämnen som normalt ger kraftigare verkan med högre kon ­
centration bör variationer i testvolym minimeras genom justering av 
koncentrationen, för att säkerställa en konstant volym på alla dos ­
nivåer.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 403
 
För ämnen som tillförs via foder eller dricksvatten är det viktigt att 
försäkra sig om att testämnet ges i kvantiteter som inte stör det 
normala näringsupptaget eller den normala vattenbalansen. När tes ­
tämnet tillförs via fodret kan man använda en konstant koncentration (ppm) eller en konstant dosnivå i förhållande till djurens kroppsvikt. 
Det använda alternativet måste anges. När ett ämne tillförs genom 
sondmatning bör dosen ges vid samma tid varje dag och vid behov justeras dosen så att dosnivån hålls konstant i förhållande till djurens kroppsvikt. Om ett 90-dagarstest används som inledning till ett lång ­
tidstest avseende kronisk toxicitet måste samma foder användas i 
båda testen.
 
1.5.2  Observationer  
Observationsperioden bör vara minst 90 dagar. Djur i en satellitgrupp 
avsedd för fortsatta observationer hålls obehandlade under en lämplig 
period så att man kan upptäcka kvarstående verkningar eller åter ­
hämtning från toxiska verkningar. 
Generella kliniska observationer bör göras minst en gång per dag, 
helst vid samma tid(er) varje dag och med beaktande av perioden för när maximala verkningar förväntas efter dosering. Djurens hälsosta ­
tus bör registreras. Minst två gånger per dag, i regel i början och 
slutet av varje dag, undersöks alla djur i syfte att hitta döende eller 
döda djur. 
Noggranna kliniska observationer görs minst en gång av alla djur 
före den första exponeringen (för att möjliggöra jämförelser på 
samma objekt) och därefter minst en gång i veckan. Dessa observa ­
tioner bör göras utanför buren, helst på en ’standardarena’ och vid samma tid på dagen varje gång. Observationerna bör noteras nog ­
grant, helst genom ett poängsystem som testlaboratoriet har definierat 
exakt. Man bör eftersträva minimala variationer i observationsbeting ­
elserna. Observationerna bör omfatta, men inte begränsas till, för ­
ändringar av hud, päls, ögon och slemhinnor, förekomst av sekret 
och utsöndringar samt autonom aktivitet (tårflöde, upprest päls, pu ­
pillstorlek, ovanligt andningsmönster). Förändringar i gång, hållning och reaktion på hantering liksom eventuella kramper eller spasmer, stereotypt beteende (t.ex. överdrivet putsande, eller att djuren 
springer runt i cirklar) eller bisarrt beteende (t.ex. självstympning, 
baklängesgång) bör också noteras (1). 
Innan testämnet tillförs och efter avslutat test undersöks djuren of ­
talmologiskt med ett oftalmoskop eller motsvarande utrustning. Denna undersökning bör helst omfatta alla djur men åtminstone djuren i högdos- och kontrollgrupperna. Om ögonförändringar upp ­
täcks bör alla djur undersökas. 
Mot slutet av exponeringsperioden, och under alla förhållanden inte 
tidigare än vecka 11, görs en bedömning av den sensoriska reaktio ­
nen på stimuli (1) (t.ex. hörsel-, syn- och djupsensoriska stimuli) (2), 
(3), (4), samt bedömning av greppstyrka (5) och motorisk aktivitet (6). Närmare uppgifter om de förfaranden som kan följas finns i respektive hänvisning. Alternativt kan även andra förfaranden än 
de som nämns i hänvisningarna användas. 
Mot slutet av testet kan funktionsobservationerna utelämnas om det 
finns uppgifter om motsvarande observationer tillgängliga från öv ­
riga test och man inte har kunnat konstatera några funktionsstör ­
ningar vid de dagliga kliniska observationerna.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 404
 
I undantagsfall kan funktionsobservationerna också utelämnas för 
grupper vars djur i övrigt uppvisar tecken på toxicitet i en sådan 
utsträckning att det väsentligt skulle påverka funktionstestet.  
1.5.2.1  Kroppsvikt samt foder- och vattenkonsumtion  
Alla djur bör vägas minst en gång i veckan. Foder- och vattenkon ­
sumtion bör mätas minst en gång varje vecka. Om testämnet tillförs via dricksvattnet bör även vattenkonsumtionen mätas minst en gång i 
veckan. Mätning av vattenkonsumtionen kan också övervägas för 
foder- eller sondmatningstest under vilka vattendrickandet kan för ­
ändras.
 
1.5.2.2  Hematologi och klinisk biokemi  
Blodprov bör tas från ett angivet ställe och förvaras under lämpliga 
förhållanden. I slutet av testperioden tas blodprov strax före eller 
som ett led i avlivningsförfarandet. 
Följande hematologiska undersökningar bör göras då testperioden 
avslutas och varje gång eventuella blodprover tas under testperiodens gång: hematokrit, hemoglobinkoncentration, räkning av röda blod ­
kroppar, total-och differentialräkning av vita blodkroppar, blodplätts ­
räkning samt mätning av koaguleringstid och koaguleringsförmåga. 
Kliniska biokemiska bestämningar för att undersöka större toxiska 
effekter i vävnader, särskilt verkningar på lever och njurar, bör ut ­
föras på de blodprov som tas från alla djur strax före eller som ett 
led i avlivningsförfarandet (med undantag för de djur som hittas 
döende eller avlivas under testets gång). På samma sätt som för hematologiska undersökningar kan blodprover för kliniska bio ­
kemiska undersökningar tas under testets gång. Det rekommenderas 
att djuren fastar natten före blodprovstagningen (
 1 ). Undersökning ­
arna av plasma eller serum bör omfatta natrium, kalium, glukos, totalkolesterol, urinämne, urinämneskväve, kreatinin, totalprotein och albumin, minst två enzymer som indikerar verkningar på lever ­
celler (t.ex. alaninaminotransferas, aspartataminotransferas, alkaliskt 
fosfatas, gamma-glutamyltranspeptidas och sorbitoldehydrogenas). Mätningar av ytterligare enzymer (från lever eller av annat ursprung) och gallsyror kan under vissa förhållanden ge användbar information. 
Eventuellt kan dessutom följande urinanalyser utföras under sista 
veckan av testet med uppsamling av urin på fasta tider: utseende, 
volym, osmolalitet eller specifik vikt, pH, protein, glukos och blod eller blodceller. 
Dessutom bör undersökning av serummarkörer av allmänna vävnads ­
skador övervägas. Ytterligare bestämningar som bör utföras, i det fall 
att testämnets kända egenskaper kan eller misstänks påverka när ­
besläktade metaboliska profiler, omfattar kalcium, fosfor, fastevärden av triglycerider, specifika hormoner, metahemoglobin och kolines ­
teras. Dessa bestämningar behövs för kemikalier inom vissa klasser 
eller från fall till fall.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 405  
( 1 ) För vissa matningar som görs på serum och plasma, särskilt i fråga om glukos, är fasta 
över natten att föredra. Den viktigaste orsaken till detta är att resultaten annars oundvik ­
ligen uppvisar större variationer, vilket tenderar att maskera svaga verkningar och göra 
det svårare att tolka resultaten. Å andra sidan kan fasta över natten leda till störningar i 
djurens allmänna metabolism och särskilt i fråga om exponeringstest störa den dagliga 
exponeringen för testämnet. Om fasta över natten tillämpas bör de kliniska biokemiska 
bestämningarna göras efter funktionsobservationerna.
 Överlag krävs en viss flexibilitet i fråga om tillvägagångssätt, bero ­
ende på djurart och på de observerade eller förväntade verkningarna 
av ett givet ämne. 
Om historiska basdata är otillräckliga bör man överväga bestämning 
av hematologiska och kliniska biokemiska variabler innan doseringen 
påbörjas. I allmänhet rekommenderas inte att dessa uppgifter gene ­
reras före behandlingen (7).  
1.5.2.3  Obduktion  
Alla försöksdjur bör genomgå en fullständig obduktion som omfattar 
omsorgsfull yttre granskning av kroppen, alla kroppsöppningar samt 
kranium, bröst- och bukhåla och deras innehåll. Lever, njurar, bi ­
njurar, testiklar, bitestiklar, livmoder, äggstockar, bräss, mjälte, hjärna och hjärta från alla djur (med undantag för de djur som hittas 
döende eller avlivas under testets gång) putsas från angränsande 
vävnad och deras våtvikt bestäms så snart möjligt efter dissekering för att undvika uttorkning. 
Följande vävnader och organ bör bevaras i det mest lämpade mediet 
med hänsyn till typen av vävnad och planerade efterföljande his ­
topatologiska undersökningar: alla organ och vävnader med stora skador, hjärnan (representativa regioner inbegripet storhjärna, 
lillhjärna och hjärnbrygga), ryggrad (på tre nivåer: cervikal, thorakal 
(mellersta) och lumbal), hypofys, sköldkörtel, bisköldkörtel, bräss, matstrupe, salivkörtlar, magsäck, tunntarm och tjocktarm (inklusive 
Peyers plack), lever, bukspottkörtel, njurar, binjurar, mjälte, hjärta, 
luftstrupe och lungor (konserverade genom inflation med fixermedel och därefter immersion), aorta, könskörtlar, livmoder, accessoriska könsorgan, honornas bröstkörtlar, prostata, urinblåsa, gallblåsa (mus), 
lymfkörtlar (helst en lymfkörtel som omfattar tillförselvägen och en 
annan långt från tillförselvägen för att täcka systematiska effekter), perifer nerv (ischias- eller tibialnerven), helst nära muskeln, ett snitt av ryggmärgen (alternativt färskt benmärgsaspirat), hud och ögon 
(om förändringar har observerats under oftalmologiska undersök ­
ningar). Kliniska eller övriga fynd kan indikera att ytterligare väv ­
nader behöver undersökas. Dessutom bör man bevara alla organ som på grund av testämnets kända egenskaper förmodas vara målorgan.
 
1.5.2.4  Histopatologi  
En fullständig histopatologisk undersökning bör utföras på bevarade 
organ och vävnader från alla djur i kontroll- och högdosgrupperna. Om behandlingsrelaterade förändringar observeras i högdosgruppen bör undersökningarna utsträckas till djuren i alla övriga dosgrupper. 
Alla stora skador bör undersökas. 
Om en satellitgrupp används bör histopatologisk undersökning utfö ­
ras på de vävnader och organ på vilka verkningar har konstaterats i 
dosgrupperna.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 406
 
2. DATA OCH RAPPORTERING  
2.1 DATA 
Uppgifter bör rapporteras individuellt. Därutöver bör alla uppgifter 
sammanställas i en tabell över antalet djur i varje testgrupp vid tes ­
tets början, antalet djur som hittats döda under testet eller som av ­
livats av humanitära skäl samt tidpunkten för avlivning, antalet djur som uppvisat tecken som tyder på att testämnet är toxiskt, en be ­
skrivning av observerade tecken på toxicitet, inbegripet tidpunkten 
då sådana första gången upptäcktes, varaktighet och hur allvarliga de 
toxiska verkningarna är, antalet djur som har skador, typ av skada och procentandelen djur för varje typ av skada. 
Om möjligt bör numeriska resultat utvärderas genom en tillämplig 
och allmänt godtagbar statistisk metod. De statistiska metoderna och 
data för vilka analys planeras bör väljas när testet utformas.
 
2.2 TESTRAPPORT 
Testrapporten ska innehålla nedan angivna uppgifter.  
2.2.1  Testämne  
— Aggregationstillstånd, renhet och fysikalisk-kemiska egenskaper. 
— Identifieringsdata. — Vehikel (i förekommande fall). Motivering för val av vehikel, om 
annan än vatten.
 
2.2.2  Försöksdjur  
— Art och stam som använts. 
— Djurens antal, ålder och kön. — Ursprung, förvaringsförhållanden, foder osv. — Djurens individuella vikter vid testets början.
 
2.2.3  Testförhållanden  
— Motivering för val av dosnivåer. 
— Utförliga uppgifter om testämnets formulering och beredning av 
fodret, uppnådd koncentration, prepara tets stabilitet och homo ­
genitet. 
— Utförliga uppgifter om hur testämnet har tillförts. 
— Faktiska doser (mg per kg kroppsvikt och dag) och omräknings ­
faktor från testämneskoncentrationen i foder eller vatten (ppm) till faktisk dos, om tillämpligt. 
— Uppgifter om foder- och vattenkvalitet.
 
2.2.4  Resultat  
— Kroppsvikt och förändringar av kroppsvikt. 
— Foderkonsumtion och i tillämpliga fall vattenkonsumtion. 
— Uppgifter om toxiska reaktioner per kön och dosnivå, inklusive 
tecken på toxicitet.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 407
 
— Art, grad och varaktighet för kliniska observationer (oavsett om 
de är reversibla eller inte). 
— Resultat av oftalmologisk undersökning. — Bedömning av sensorisk aktivitet, greppstyrka och motorisk ak ­
tivitet (i mån av tillgänglighet). 
— Blodundersökningar med relevanta basvärden. — Kliniska biokemiska undersökningar med relevanta basvärden. — Kroppsvikt vid avlivning, organvikt och förhållandena mellan 
organ- och kroppsvikt. 
— Obduktionsfynd. 
— En detaljerad beskrivning av alla histopatologiska fynd. — Absorptionsdata om de finns tillgängliga. — Statistisk bearbetning av resultaten, i tillämpliga fall. Diskussion om resultaten. Slutsatser.
 
3. HÄNVISNINGAR  
1. IPCS (1986). Principles and Methods for the Assessment of 
Neurotoxicity Associated with Exposure to Chemicals. Environ ­
mental Health Criteria Document No 60. 
2. Tupper, D. E., Wallace, R.B. (1980). Utility of the Neurologic 
Examination in Rats. Acta Neurobiol. Exp., 40, pp. 999–1003. 
3. Gad, S. C. (1982). A Neuromuscular Screen for Use in Industrial 
Toxicology. J. Toxicol. Environ. Health, 9, pp. 691–704. 
4. Moser, V. C, Mc Daniel, K. M., Phillips, P. M. (1991). Rat 
Strain and Stock Comparisons Using a Functional Observational 
Battery: Baseline Values and Effects of Amitraz. Toxicol. Appl. Pharmacol., 108, pp. 267–283. 
5. Meyer O. A., Tilson H. A., Byrd W. C, Riley M. T. (1979). A 
Method for the Routine Assessment of Fore- and Hindlimb grip 
Strength of Rats and Mice. Neurobehav. Toxivol., 1, pp. 
233–236. 
6. Crofton K. M., Howard J. L., Moser V. C, Gill M. W., Reiter L. W., 
Tilson H. A., MacPhail R. C. (1991). Interlaboratory Comparison of Motor Activity Experiments: Implication for Neurotoxicological 
Assessments. Neurotoxicol. Teratol., 13, pp. 599–609. 
7. Weingand K., Brown G., Hall R. et al. (1996). ’Harmonisation of 
Animal Clinic Pathology Testing in Toxicity and Safety Studies’, Fundam. & Appl. Toxicol., 29, pp. 198–201.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 408
 
B.27  TEST AVSEENDE SUBKRONISK ORAL TOXICITET 90 
DAGARS UPPREPAT ORALTEST PÅ ICKE-GNAGARE  
1. METOD  
Denna testmetod för subkronisk oral toxicitet motsvarar OECD TG 
409 (1998).  
1.1 INLEDNING 
Vid bedömning och utvärdering av en kemikalies toxiska egenskaper 
kan bestämningen av subkronisk oral toxicitet med användning av 
upprepade doser genomföras efter det att man har fått preliminär 
toxicitetsinformation från test avseende akut toxicitet eller från test med upprepad dosering (28 dagar). Genom 90-dagarsstestet fås infor ­
mation om eventuella hälsoskador som kan uppstå till följd av upp ­
repad exponering under en period av snabb tillväxt och in i ungt 
vuxenstadium. Genom testet fås information om de mest betydande toxiska verkningarna, indikation om vilka organ som påverkas och huruvida det finns en risk för ackumulering. Likaså kan man få en 
uppskattning om en exponeringsnivå vid vilken inga skadliga verk ­
ningar observeras. Denna information kan användas för att välja dosnivåer för test avseende kronisk toxicitet och för att fastställa säkerhetskriterier gällande exponering på människor. 
Testmetoden kan användas för identifiering av skadliga verkningar 
hos icke-gnagare som utsätts för exponering av en kemikalie och den bör endast användas i följande fall: 
— Verkningar som har observerats i övriga test indikerar att det 
finns ett behov av förtydligande eller karakterisering med hjälp av en art som inte är gnagare. 
— Toxikokinetiska test indikerar att en specifik art av icke-gnagare 
är det mest relevanta alternativet för valet av försöksdjur. 
— Andra särskilda orsaker motiverar att en art som inte är gnagare 
används. 
Se även Allmän inledning, del B.
 
1.2 DEFINITIONER  
Dos: Den mängd testämne som tillförs. Dosen uttrycks som vikt (g, 
mg), som vikten testämne per viktenhet försöksdjur (t.ex. mg/kg) eller som en konstant utfodringskoncentration (ppm).  
Dosering : Ett allmänt begrepp som inbegriper dos, dess frekvens och 
varaktighet.  
NOAEL : Förkortning för ”no-observed-adverse-effect level” (nivå 
vid vilken inga skadliga verkningar observeras). Avser den högsta dosnivån vid vilken inga skadliga behandlingsrelaterade verkningar kan observeras.
 
1.3 PRINCIP FÖR TESTMETODEN 
Testämnet tillförs oralt dagligen under 90 dagar i stegvis ökande 
doser till flera grupper försöksdjur, en dosnivå per grupp. Under denna period observeras djuren noggrant för att se om de uppvisar några tecken som tyder på att testämnet är toxiskt. Djur som dör eller 
avlivas under testet obduceras och vid testets slut avlivas de över ­
levande djuren och obduceras.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 409
 
1.4 BESKRIVNING AV TESTMETODEN  
1.4.1  Val av djurart  
En ofta använd icke-gnagare är hund. Hunden bör vara av definierad 
ras, ofta används beagle. Även andra arter, t.ex. svin eller minigrisar, 
kan användas. Primater rekommenderas inte och användning av dem 
måste motiveras. Djuren bör vara unga och friska. När det gäller hund bör doseringen helst inledas vid 4–6 månaders ålder och aldrig senare än vid 9 månaders ålder. Om testet utförs som inledning till 
ett långtidstest avseende kronisk toxicitet måste djur av samma art 
och ras användas för båda testen.
 
1.4.2  Förberedelse av djuren  
För testet används unga och friska djur som har acklimatiserats till 
laboratoriemiljön och som inte har använts för tidigare test. Ackli ­
matiseringsperiodens längd beror på djurarterna och deras ursprung. 
För hund eller för ändamålet uppfödda svin från en resident koloni rekommenderas minst fem dagar och för djur av externt ursprung rekommenderas minst två veckor. Försöksdjuren bör karakteriseras 
enligt art, stam, ursprung, kön, vikt och ålder. Djuren fördelas 
slumpvis i kontroll- och behandlingsgrupper. Burarna placeras på sådant sätt att eventuella verkningar på grund av placeringen mini ­
meras. Varje djur tilldelas ett unikt identifieringsnummer.
 
1.4.3  Beredning av doserna  
Testämnet kan tillföras via foder eller dricksvatten, genom sondmat ­
ning eller i kapslar. Den metod som väljs för oral tillförsel beror på 
testets syfte och testämnets fysikalisk-kemiska egenskaper. 
Vid behov kan testämnet lösas upp eller suspenderas i en lämplig 
vehikel. Om möjligt bör man i första hand överväga vattenlösning eller vattensuspension, sedan oljelösning eller oljeemulsion (t.ex. 
majsolja) och därefter eventuellt andra vehiklar. I fråga om andra 
vehiklar än vatten måste de toxiska egenskaperna vara kända. Tes ­
tämnets stabilitet vid tillförselförhållandena bör fastställas.
 
1.5 FÖRFARANDE  
1.5.1  Djurens antal och kön  
Minst åtta djur (fyra honor och fyra hanar) bör användas för varje 
dosnivå. Om avlivningar är inplanerade under testets gång bör antalet 
djur ökas med det antal djur som avlivas under testets gång. Antalet djur vid testets slut måste vara tillräckligt med tanke på en menings ­
fylld utvärdering av de toxiska verkningarna. Beroende på tidigare 
kunskaper om ämnet eller en nära besläktad kemikalie bör man 
överväga att ta med ytterligare en satellitgrupp på åtta djur (fyra per kön) för kontrollgruppen och toppdosgruppen. Efter behandlings ­
perioden observeras satellitgruppen med avseende på reversibla eller 
kvarstående toxiska verkningar. Längden för denna period fastställs 
med beaktande av de observerade verkningarna.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 410
 
1.5.2  Dosering  
Minst tre dosgrupper och en parallell kontrollgrupp bör användas, 
utom om gränstest utförs (se 1.5.3). Dosnivåerna kan basera sig på resultaten från test med upprepad dos eller från preliminära test för 
dosbestämning och de fastställs med beaktande av alla toxikokine ­
tiska data som finns tillgängliga för testämnet eller närbesläktade ämnen. Den högsta dosnivån väljs så att den framkallar toxiska verkningar utan att orsaka dödsfall eller svårt lidande, förutsatt att 
det inte finns begränsningar som beror på testämnets fysikalisk-ke ­
miska natur eller biologiska verkningar. Därefter väljs dosnivåerna i fallande skala så att en dosrelaterad reaktion kan påvisas, medan inga 
påvisbara skadliga verkningar (NOAEL) bör uppstå vid den lägsta 
dosnivån. Två- till fyrfaldiga dosintervall är ofta optimala för de fallande dosnivåerna. Tillägg av en fjärde testgrupp är att föredra framför användning av mycket breda intervall mellan dosnivåerna 
(t.ex. över en faktor på cirka 6–10). 
Kontrollgruppen är en obehandlad grupp, eller en vehikelkontroll ­
grupp om vehikel används för tillförsel av testämnet. Förutom att 
djuren i kontrollgruppen inte behandlas med testämnet bör de han ­
teras på exakt samma sätt som djuren i dosgrupperna. Om en vehikel används bör kontrollgruppen tillföras vehikeln i den största volym 
som används. Om testämnet tillförs via fodret och man märker att 
foderintaget minskar, kan det vara till fördel med en parallellt utfod ­
rad kontrollgrupp for att kunna avgöra huruvida minskningen beror på att testämnet påverkar fodrets smak eller på att det förekommer 
toxikologiska förändringar i test-modellen. 
Följande egenskaper hos vehikeln och övriga eventuella tillsats ­
ämnen bör beaktas: verkningarna på absorption, distribution, meta ­
bolism eller kvarhållande av testämnet; verkningarna på testämnets kemiska egenskaper i den utsträckning dessa verkningar kan påverka 
testämnets toxiska egenskaper samt verkningarna på försöksdjurens 
foder- eller vattenintag eller deras näringstillstånd.
 
1.5.3  Gränstest (Limit-test)  
Om ett test med en dosnivå om minst 1 000 mg per kg kroppsvikt 
och dag genomförs på det sätt som beskrivs här och inga toxiska 
verkningar kan observeras, och om toxicitet inte förväntas på grund ­
val av uppgifter om strukturellt närbesläktade ämnen, kan ett full ­
ständigt test med tre dosnivåer anses vara överflödigt. Gränstest till ­
lämpas utom när exponering på människor indikerar att en högre 
dosnivå behövs.  
1.5.4  Tillförsel av doser  
Djuren ges dagliga doser av testämnet under 90 dagar. Varje annat 
doseringsschema, t.ex. dosering fem dagar per vecka, måste motive ­
ras. Om testämnet tillförs genom sondmatning bör hela dosen till ­
föras på en gång via magsond eller lämplig intubationskanyl. Den 
största mängd vätska som kan tillföras vid ett och samma tillfälle 
beror på försöksdjurets storlek. I regel bör volymen hållas så låg som möjligt. Med undantag för irriterande eller frätande ämnen som nor ­
malt ger kraftigare verkan med högre koncentration bör variationer i 
testvolym minimeras genom justering av koncentrationen, för att 
säkerställa en konstant volym på alla dosnivåer.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 411
 
För ämnen som tillförs via foder eller dricksvatten är det viktigt att 
försäkra sig om att testämnet ges i kvantiteter som inte stör det 
normala näringsupptaget eller den normala vattenbalansen. När tes ­
tämnet tillförs via fodret kan man använda en konstant koncentration (ppm) eller en konstant dosnivå i förhållande till djurens kroppsvikt. 
Det använda alternativet måste anges. För ett ämne som tillförs 
genom sondmatning eller kapslar bör dosen ges vid samma tid varje dag och vid behov justeras så att dosnivån hålls konstant i förhål ­
lande till djurens kroppsvikt. Om ett 90-dagarstest används som 
inledning till ett långtidstest avseende kronisk toxicitet måste samma 
foder användas i båda testen.
 
1.5.5  Observationer  
Observationsperioden bör vara minst 90 dagar. Djur i en satellitgrupp 
avsedd för fortsatta observationer hålls obehandlade under en lamplig 
period så att man kan upptäcka kvarstående verkningar eller åter ­
hämtning från toxiska verkningar. 
Generella kliniska observationer bör göras minst en gång per dag, 
helst vid samma tid(er) varje dag och med beaktande av perioden för 
när maximala verkningar förväntas efter dosering. Djurens hälsosta ­
tus bör registreras. Minst två gånger per dag, i regel i början och slutet av varje dag, undersöks alla djur i syfte att hitta döende eller 
döda djur. 
Noggranna kliniska observationer görs minst en gång av alla djur 
före den första exponeringen (för att möjliggöra jämförelser på 
samma objekt) och därefter minst en gång i veckan. Dessa observa ­
tioner bör göras, när det är genomförbart, utanför buren, helst på en ”standardarena” och vid samma tidpunkt varje gång. Man bör efter ­
sträva minimala variationer i observationsbetingelserna. Alla tecken 
på toxicitet bör registreras i detalj, inklusive tidpunkt för första upp ­
täckt, svårighetsgrad och varaktighet. Observationerna bör omfatta, men inte begränsas till, förändringar av hud, päls, ögon och slem ­
hinnor, förekomst av sekret och utsöndringar samt autonom aktivitet 
(tårflöde, upprest päls, pupillstorlek, ovanligt andningsmönster). För ­
ändringar i gång, hållning och reaktion på hantering liksom eventu ­
ella kramper eller spasmer, stereotypt beteende (t.ex. överdrivet put ­
sande, eller att djuren springer runt i cirklar) eller eventuellt bisarrt 
beteende (t.ex. självstympning, baklängesgång) bör också noteras. 
Innan testämnet tillförs och efter avslutat test undersöks djuren of ­
talmologiskt med ett oftalmoskop eller motsvarande utrustning. 
Denna undersökning bör helst omfatta alla djur men åtminstone djuren i högdos-och kontrollgrupperna. Om behandlingsrelaterade ögonförändringar upptäcks bör alla djur undersökas.
 
1.5.5.1  Kroppsvikt samt foder- och vattenkonsumtion  
Alla djur bör vägas minst en gång i veckan. Foder- och vattenkon ­
sumtion bör mätas minst en gång varje vecka. Om testämnet tillförs via dricksvattnet bör även vattenkonsumtionen mätas minst en gång i veckan. Mätning av vattenkonsumtionen kan också övervägas för 
test med tillförsel via foder eller sond under vilka vattendrickandet 
kan förändras.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 412
 
1.5.5.2  Hematologi och klinisk biokemi  
Blodprov bör tas från ett angivet ställe och förvaras under lämpliga 
förhållanden. I slutet av testperioden tas blodprov strax före eller som ett led i avlivningsförfarandet. 
Blodprov, omfattande hematokrit, hemoglobinkoncentration, räkning 
av röda blodkroppar, total- och differentialräkning av vita blodkrop ­
par, blodplättsräkning samt mätning av koaguleringstid och koagule ­
ringsförmåga, protrombintid eller tromboplastintid tas vid testets bör ­
jan och därefter varje månad eller när halva testperioden gått, och när testet avslutas. 
Kliniska biokemiska bestämningar för undersökning av betydande 
toxiska verkningar i vävnader, särskilt verkningar på njurar och le ­
ver, görs på blodprov som tagits från alla djur när testets inleds, 
varje månad eller när halva testperioden har gått, och när testet 
avslutas. Undersökning kan även övervägas i fråga om elektrolytba ­
lans, kolhydratmetabolism samt lever- och njurfunktion. De specifika undersökningar som väljs beror på observationerna av hur testämnet 
agerar. Innan blodprov tas bör djuren fasta under en för arten lämplig 
period. Till de bestämningar som föreslås hör mätningar av kalcium, fosfor, klorid, natrium, kalium, fasteglukos, alaninaminotransferas, aspartataminotransferas, ornitindekarboxylas, gammaglutamyltrans ­
pep-tidas, urinämneskväve, albumin, blodkreatinin, totalbilirubin 
och totalserumprotein. 
Urinanalyser bör göras minst när testet inleds, när halva testperioden 
gått och när testet avslutas, med uppsamling av urin på fasta tider. 
Urinanalyserna omfattar utseende, volym, osmolalitet eller specifik vikt, pH, protein, glukos och blod eller blodceller. Ytterligare para ­
metrar kan vid behov användas för att utvidga undersökningen av 
observerade verkningar. 
Dessutom bör undersökning av markörer för allmänna vävnadsska ­
dor övervägas. För en tillräcklig toxikologisk bedömning kan även 
behövas analys av lipider, hormoner, syra-basbalans, metahemoglo ­
bin och kolinesterasinhibition. Ytterligare klinisk biokemi kan vid behov användas för att utvidga undersökningen av observerade verk ­
ningar. Dessa bestämningar behövs för kemikalier inom vissa klasser 
eller från fall till fall. 
Överlag krävs en viss flexibilitet i fråga om tillvägagångssätt, bero ­
ende på djurart och på de observerade eller förväntade verkningarna 
av ett givet ämne.
 
1.5.5.3  Obduktion  
Alla försöksdjur bör genomgå en fullständig obduktion som omfattar 
omsorgsfull yttre granskning av kroppen, alla kroppsöppningar samt 
kranium, bröst- och bukhåla och deras innehåll. Lever med gallblåsa, 
njurar, binjurar, testiklar, bitestiklar, äggstockar, livmoder, sköldkörtel (med bisköldkörtlar), bräss, mjälte, hjärna och hjärta från alla djur (med undantag för de djur som hittas döende eller avlivas under testets gång) 
putsas från angränsande vävnad och deras våtvikt bestäms så snart som 
möjligt efter dissekering för att undvika uttorkning.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 413
 
Följande vävnader och organ bör bevaras i det mest lämpade mediet 
med hänsyn till typen av vävnad och planerade efterföljande his ­
topatologiska undersökningar: alla organ och vävnader med stora skador, hjärnan (representativa regioner inbegripet storhjärna, lillhjärna och hjärnbrygga), ryggrad (på tre nivåer: cervikal, thorakal 
(mellersta) och lumbal), hypofys, ögon, sköldkörtel, bisköldkörtel, 
bräss, matstrupe, salivkörtlar, magsäck, tunntarm och tjocktarm (in ­
klusive Peyers plack), lever, gallblåsa, bukspottkörtel, njurar, binju ­
rar, mjälte, hjärta, luftstrupe och lungor, aorta, könskörtlar, livmoder, 
accessoriska könsorgan, honornas bröstkörtlar, prostata, urinblåsa, 
lymfkörtlar (helst en lymfkörtel som omfattar tillförselvägen och en annan långt från tillförselvägen för att täcka systematiska effek ­
ter), perifer nerv (ischias- eller tibialnerven), helst nära muskeln, ett 
snitt av ryggmärgen (alternativt färskt benmärgsaspirat) och hud. 
Kliniska eller övriga fynd kan indikera att ytterligare vävnader be ­
höver undersökas. Dessutom bör man bevara alla organ som på grund av testämnets kända egenskaper förmodas vara målorgan.
 
1.5.5.4  Histopatologi  
En fullständig histopatologisk undersökning bör utföras på bevarade 
organ och vävnader från åtminstone alla djur i kontroll- och högdos ­
gruppen. Undersökningarna bör utsträckas till djur i alla andra dos ­
grupper om behandlingsrelaterade förändringar observeras i högdos ­
gruppen. 
Alla stora skador bör undersökas. 
Om en satellitgrupp används bör histopatologisk undersökning utfö ­
ras på de vävnader och organ på vilka verkningar har konstaterats i dosgrupperna.
 
2. DATA OCH RAPPORTERING  
2.1 DATA 
Uppgifter bör rapporteras individuellt. Därutöver bör alla uppgifter 
sammanställas i en tabell över antalet djur i varje testgrupp vid tes ­
tets början, antalet djur som hittats döda under testet eller som av ­
livats av humanitära skäl samt tidpunkten för avlivning, antalet djur som uppvisat tecken som tyder på att testämnet är toxiskt, en be ­
skrivning av observerade tecken på toxicitet, inbegripet tidpunkten 
då sådana första gången upptäcktes, varaktighet och hur allvarliga de toxiska verkningarna är, antalet djur som har skador, typ av skada och procentandelen djur för varje typ av skada. 
Om möjligt bör numeriska resultat utvärderas genom en tillämplig 
och allmänt godtagbar statistisk metod. De statistiska metoderna och data för vilka analys planeras bör väljas när testet utformas.
 
2.2 TESTRAPPORT 
Testrapporten ska innehålla nedan angivna uppgifter.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 414
 
2.2.1  Testämne  
— Aggregationstillstånd, renhet och fysikalisk-kemiska egenskaper. 
— Identifieringsdata. — Vehikel (i förekommande fall). Motivering för val av vehikel, om 
annan än vatten.
 
2.2.2  Försöksdjur  
— Art och stam som använts. 
— Djurens antal, ålder och kön. 
— Ursprung, förvaringsförhållanden, foder osv. 
— Djurens individuella vikter vid testets början.  
2.2.3  Testförhållanden  
— Motivering för val av dosnivåer. 
— Utförliga uppgifter om testämnets formulering och beredning av 
fodret, uppnådd koncentration, prepa ratets stabilitet och homo ­
genitet. 
— Utförliga uppgifter om hur testämnet har tillförts. — Faktiska doser (mg per kg kroppsvikt och dag) och omräknings ­
faktor från testämneskoncentrationen i foder eller vatten (ppm) 
till faktisk dos, om tillämpligt. 
— Uppgifter om foder- och vattenkvalitet.
 
2.2.4  Resultat  
— Kroppsvikt och förändringar av kroppsvikt. 
— Foderkonsumtion och i tillämpliga fall vattenkonsumtion. — Uppgifter om toxiska reaktioner per kön och dosnivå, inklusive 
tecken på toxicitet. 
— Art, grad och varaktighet för kliniska observationer (oavsett om 
de är reversibla eller inte). 
— Oftalmologisk undersökning. — Blodundersökningar med relevanta basvärden. — Kliniska biokemiska undersökningar med relevanta basvärden. — Kroppsvikt vid avlivning, organvikt och förhållandena mellan 
organ- och kroppsvikt. 
— Obduktionsfynd. 
— En detaljerad beskrivning av alla histopatologiska fynd. 
— Absorptionsdata om de finns tillgängliga. — Statistisk bearbetning av resultaten, i tillämpliga fall. Diskussion om resultaten. Slutsatser.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 415
 
B.28  TEST AVSEENDE SUBKRONISK DERMAL TOXICITET 90 
DAGARS REPETERAD DERMALTEST PÅ GNAGARE  
1. METOD  
1.1 INLEDNING 
Se allmän inledning till del B.  
1.2 DEFINITIONER 
Se allmän inledning till del B.  
1.3 REFERENSÄMNEN 
Inga.  
1.4 TESTMETODSPRINCIP 
Testämnet appliceras dagligen på huden i graderade doser till flera 
grupper av försöksdjur, en bestämd dos per grupp i 90 dagar. Under 
försöksperioden ska djuren observeras dagligen för tecken på tox ­
icitet. Djur som dör under försöket obduceras och i slutet av försöket avlivas och obduceras överlevande djur,
 
1.5 KVALITETSKRITERIER 
Inga.  
1.6 METODBESKRIVNING  
Förberedelser  
I minst fem dagar före försöket ska djuren hållas under testbeting ­
elserna vad beträffar miljö och utfodring. Före försöket fördelas unga 
friska djur slumpmässigt i behandlings- och kontrollgrupper. Kort 
innan försöket klipps ryggpälsen bort på försöksdjuren. Om pälsen rakas bort bör detta ske ca 24 timmar innan försöket inleds. Klipp ­
ning och rakning måste normalt upprepas varje vecka. Vid klippning 
eller rakning ska försiktighet iakttas så att huden inte skadas. Minst 
10 % av djurets kroppsyta ska göras klar för applicering av tes ­
tämnet. Djurets vikt måste beaktas vid bestämning av hur stort om ­
råde som ska klippas. Vid test av fasta ämnen, vilka vid behov kan 
pulveriseras, ska testämnet fuktas tillräckligt med vatten eller, vid 
behov, med lämplig vehikel, för att säkerställa god kontakt med huden. Flytande testämnen används vanligen outspädda. Daglig ap ­
plicering fem till sju dagar i veckan ska ske.
 
Försöksbetingelser  
F ö r s ö k s d j u r 
Vuxna råttor eller kaniner får användas. Andra djurarter kan använ ­
das men detta måste motiveras. Djur av vanligen nyttjade laborato ­
riestammar ska användas. Vid inledning av försöket får vikten hos de djur som används inte avvika mer än ± 20 % från genomsnittsvikten. Om ett test av subkronisk toxicitet med dermal tillförsel utförs som 
en förundersökning till en långtidsundersökning ska samma djurart 
och stam användas i båda undersökningarna.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 416
 
A n t a l o c h k ö n 
Minst 20 djur (10 hondjur och 10 handjur) med frisk hud ska an ­
vändas på varje doseringsnivå. Hondjuren får inte ha fött ungar och får inte vara dräktiga. Vid planenligt avlivande av försöksdjur under försöket ska det ursprungliga antalet djur ökas med det antal djur 
som planenligt ska avlivas innan försöket slutförs. Dessutom kan en 
satellitgrupp bestående av 20 djur (10 av vardera kön) behandlas med den högsta dosen i 90 dagar och därefter observeras i 28 dagar för reversibilitet, per-sistens eller fördröjt uppträdande av toxiska 
verkningar.
 
D o s n i v å e r 
Minst tre dosnivågrupper och en kontrollgrupp ska användas. Om 
vehikel används ska, förutom kontrollgruppen, en vehikelkontroll ­
grupp användas. Exponeringsperioden bör vara minst sex timmar per dag. Applicering av testämnet bör ske vid samma tidpunkt varje 
dag och den mängd ämne som används ska justeras regelbundet 
(varje eller varannan vecka) för att säkerställa att den hålls konstant i förhållande till djurets kroppsvikt. Djuren i kontrollgrupen ska behandlas på samma sätt som försöksdjuren, bortsett från applicering 
av testämnet. Om vehikel används för att underlätta doseringen ska 
vehikelkontrollgruppen doseras på samma sätt som försöksgrupperna och ges samma mängd ämne som den som appliceras på djuren i den försöksgrupp med den högsta doseringsnivån. Den högsta doserings ­
nivån bör medföra toxiska verkningar men inte leda till någon, eller 
endast begränsad, dödlighet. Den lägsta doseringsninvån bör inte ha någon toxisk verkan. Om det finns en användbar uppskattning av människors högsta exponering för ämnet bör den lägsta dosnivån 
vara högre än denna. Idealt ska medeldosen medföra minsta möjliga 
observerbara toxiska verkningar. Om flera medeldosnivåer används ska de väljas på ett sätt att en gradering av de toxiska verkningarna, erhålls. I lågdos-, medeldos- och kontrollgrupperna bör antalet döds ­
fall vara få för att möjliggöra en meningsfull utvärdering av resul ­
taten. 
Om testämnet medför allvarlig hudirritation bör koncentrationen sän ­
kas, vilket kan leda till en minskning eller ett fullständigt bortfall av de övriga toxiska verkningarna vid den högsta doseringsnivån. Om huden har skadats allvarligt kan det vara nödvändigt att avbryta 
försöket och utföra ett nytt försök med en lägre koncentration.
 
G r ä n s t e s t 
Om en dos av 1 000 mg/kg kroppsvikt och dag eller en högre dos ­
nivå som fastställts på grundval av kännedom om exponering för människor, inte medför någon toxisk verkan kan ytterligare testning anses överflödig.
 
O b s e r v a t i o n s p e r i o d 
Samtliga djur ska observeras dagligen och tecken på toxicitet regi ­
streras. Tidpunkten för dödsfall och tidpunkten vid vilken tecken på 
toxicitet uppträder respektive försvinner ska registreras.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 417
 
F ö r f a r a n d e 
Djuren ska hållas i var sin bur. Idealt appliceras testämnet varje dag i 
90 dagar. 
Djur i en eventuell satellitgrupp som planerats för uppföljning bör 
hållas under observation i ytterligare 28 dagar utan applicering av testämne för att fastställa om de toxiska verkningarna försvinner eller 
håller i sig. Exponeringsperioden bör vara sex timmar per dag. 
Testämnet ska appliceras jämnt över ett område som motsvarar ca 
10 % av den totala kroppsytan. Vid användning av kraftigt toxiska 
ämnen kan en mindre yta täckas, men ämnet ska appliceras på ytan i ett så tunt och jämnt lager som möjligt. 
Testämnet hållas i kontakt med huden med en porös gaskompress 
och icke hudirriterande tejp. Testytan ska vidare täckas på lämpligt 
sätt för att säkerställa att gaskompressen och testämnet hålls på plats 
och att djuren inte kan svälja testämnet. För att förhindra att djuren intar testämnet kan rörelsehindrande anordningar användas, men total immobilisering rekommenderas inte. 
I slutet av exponeringsperiodens ska resterande testämne avlägsnas, i 
lämpliga fall med vatten eller med annan lämplig metod för rengör ­
ing av huden. 
Samtliga djur ska observeras dagligen och tecken på toxicitet ska 
registreras tillsammans med tidpunkten då de uppträdde för första gången samt graden och varaktigheten av toxiciteten. Observationer 
av djuren i burarna ska omfatta hud- och pälsförändringar, ögon, 
slemhinnor, respirations-och cirkulationssystem, autonoma och cen ­
trala nervsystemet, kroppsmotorik samt beteendemönster. Foderintag och djurens vikt ska registreras en gång i veckan. Det är nödvändigt 
att observera djuren regelbundet för att säkerställa att så få djur som 
möjligt faller bort från studien till följd av kannibalism, autolys av vävnader eller förväxling. I slutet av testperioden avlivas och obdu ­
ceras alla överlevande djur, utom djuren i satellitgruppen. Så snart 
döende djur upptäcks ska dessa avlägsnas, avlivas och obduceras. 
Följande undersökningar utförs normalt på alla djur, inbegripet kon ­
trollgruppen: 
a) Innan testämnet appliceras samt sedan försöket avslutats utförs en 
oftamologisk undersökning med användning av ett oftalmoskop eller liknande lämplig utrustning, helst på alla djur men åtmin ­
stone på djuren i högdos- och kontrollgrupperna. Om föränd ­
ringar i ögonen observeras ska alla djur undersökas. 
b) Vid slutet av testperioden ska en hematologisk undersökning ut ­
föras, inbegripet hematokrit-och hemoglobinkoncentration, erytro ­
cyträkning, total och differentiell leukocyträkning, mätning av 
koagulationsnivån, t.ex. koagulationstid, protombintid, trombop ­
lastintid eller blodplättsräkning.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 418
 
c) Vid slutet av försöksperioden ska en klinisk-biokemisk blod ana ­
lys utföras. För denna undersökning är följande analysområden 
lämpliga: elektrolytbalans, kolhydratmetabolism, lever- och njur ­
funktion. Valet av specifika analyser kommer att påverkas av observationer av testämnets verkningssätt. Följande bestämningar 
föreslås: kalcium, fosfor, klorid, natrium, kalium, fasteglukos 
(fasteperioden beror på djurarten), glutaminsyra-pyrodruvsyra- transaminas (
 1 ), glutamin-syra-oxalättiksyra-transaminas (  2 ), orni­
tin dekarboxylas, gamma-glutamyl-transpeptidas, urinkväve, albu ­
min, blodkreatinin, totalt bilirubin och totalt serumprotein. Andra 
bestämningar som kan vara nödvändiga för en tillfredsställande toxikologisk bedömning inbegriper analyser av lipider, hormoner, syra/basbalans, methemoglobin och kolinesterasaktivitet. Ytterli ­
gare klinisk-biokemiska analyser kan utföras då sådana behövs 
för en vidare undersökning av observerade verkningar. 
d) En urinanalys krävs i regel inte, men kan dock vara nödvändig 
om en toxisk verkan förväntas eller observeras. 
Om tidigare insamlade basdata är otillräckliga bör man överväga att 
bestämma hematologiska och klinisk-biokemiska parametrar innan 
man inleder försöket.
 
M a k r o s k o p i s k u n d e r s ö k n i n g 
Alla djur bör underkastas en fullständig obduktion som inbegriper 
undersökning av alla externa kroppsytor, alla kroppsöppningar lik ­
som kranie-, bröstkorgs- och bukhålan samt deras innehåll. Lever, 
njurar, binjurar och testiklar ska vägas våta så snart som möjligt efter dissektion för att undgå uttorkning. Följande vävnader och organ bör bevaras i ett lämpligt medium för en eventuell framtida histopatolo ­
gisk undersökning: alla vävnader och organ som uppvisar lesioner, 
hjärnan –inbegripet snitt av medulla/pons, lillhjärnbarken och hjärn ­
barken, hypofysen, sköldkörteln/bisköldkörteln, thymusvävnad, (luft ­
strupe) och lungor, hjärta, stora kroppspulsådern, spottkörtlar, lever, 
mjälte, njurar, binjurar, bukspottskörtel, könskörtlar, livmoder, as ­
socierade könsorgan, gallblåsa (om sådan finns), matstrupe, magsäck, tolvfingertarm, tomtarmen, ileum, cekum, colon, ändtarm, urinblåsan, 
representativa lymfkörtlar, (kvinnliga bröstkörtlar), (lårmuskulatur), 
nerver från det perifera nervsystemet, (bröstbenet med benmärg), (ögon), (femur, inbegripet ledyta), (ryggmärg på tre nivåer – vid halsen, mitt för bröstkorgen och från landområdet), och (exorbitala 
tårkörtlar). De vävnader som anges inom parentes behöver endast 
undersökas om det finns tecken på toxicitet eller i samband med målorgan.
 
H i s t o p a t o l o g i s k u n d e r s ö k n i n g 
a) En fullständig histopatologisk undersökning ska utföras på obe ­
handlad och behandlad hud och på organ och vävnader frän alla djur i kontroll- och högdosegrupperna. 
b) Alla allvarliga lesioner ska undersökas.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 419  
( 1 ) Numera känt som serum alanine aminotransferase. 
( 2 ) Numera kant som serum aspartate aminotransferase.
 c) Målorgan i andra dosgrupper ska också undersökas. 
d) Om råttor används ska lungorna från djur i låg- och medeldos ­
grupperna undersökas histopatologiskt för tecken på infektion, eftersom detta ger en lämplig uppfattning om djurens hälsotill ­
stånd. Ytterligare histopatologiska undersökningar av djur i dessa 
grupper krävs inte rutinmässigt, men organ som har uppvisat tecken på lesioner i högdosgruppen ska alltid undersökas. 
e) Djur i en eventuell satellitgrupp bör underkastas en histopatolo ­
gisk undersökning av de organ och vävnader som har visat tecken på toxisk verkan hos djur i de behandlade grupperna.
 
2. DATA  
Data ska ställas upp i tabellform och för varje grupp ska anges antal 
djur i början av försöket, antal djur med lesioner och den procent djur som uppvisar varje slag av lesion. Resultaten ska utvärderas på grundval av en lämplig statistisk metod. Alla erkända statistiska 
metoder får användas.
 
3. RAPPORTERING  
3.1. TESTRAPPORT 
Testrapporten ska om möjligt innehålla följande: 
— Djurart, stam, härkomst, miljöbetingelser, foder. — Försöksbetingelser. 
— Dosnivåer (med angivande av vehikel om sådan använts) och 
koncentrationer. 
— Upplysningar om toxisk reaktion uppdelade efter kön och dos. — Icke-toxisk dos, om sådan har fastställts. 
— Tidpunkten för dödsfall under försöket eller överlevnad till slutet 
av försöket. 
— Beskrivning av toxiska och andra verkningar. — Tidpunkt för observation av varje abnormalt tecken och dess 
senare utveckling. 
— Uppgifter om foder och kroppsvikt. 
— Oftamologiska rön. — Hematologiska undersökningar och samtliga resultat. 
— Använda klinisk-biokemiska undersökningar och samtliga resul ­
tat (inbegripet resultat av en eventuell urinanalys). 
— Obduktionsrön.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 420
 
— Detaljerad beskrivning av alla histopatologiska rön. 
— Eventuell statistisk bearbetning av resultaten. — Diskussion av resultaten. 
— Tolkning av resultaten.
 
3.2. UTVÄRDERING OCH TOLKNING 
Se den allmänna inledningen till del B.  
4. HÄNVISNINGAR  
Se den allmänna inledningen till del B.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 421
 
B.29  SUBKRONISK INHALATIONSTOXICITET: 90-DAGARSSTUDIE  
SAMMANFATTNING 
Denna reviderade B.29-testmetod har utformats för att till fullo karakterisera 
testkemikaliens inhalationstoxicitet under en begränsad tidsperiod (90 dagar), och för att tillhandahålla stabila data för kvantitativa riskbedömningar. Grupper 
om 10 hangnagare och 10 hongnagare exponeras 6 timmar per dag under en 90- 
dagarsperiod (13 veckor) för a) testkemikalien vid tre eller fler koncentrations ­
nivåer, b) filtrerad luft (negativ kontroll, och/eller c) vehikeln (vehikelkontroll). Djur exponeras i allmänhet 5 dagar per vecka, men exponering 7 dagar per vecka 
är också tillåten. Hanar och honor testas alltid, men de kan exponeras vid olika 
koncentrationsnivåer om det är känt att ett kön är mer mottagligt för en viss testkemikalie. Denna metod ger försöksledaren flexibilitet att inkludera satellit ­
grupper (reversibilitet), avlivningar, lungsköljning (BAL), neurologiska tester och 
ytterligare utvärderingar av klinisk patologi och histopatologi för att bättre kunna 
karakterisera en testkemikalies toxicitet.
 
INLEDNING 
1. Den här testmetoden motsvarar OECD:s testriktlinje 413 (2009). Den ur ­
sprungliga testriktlinjen 413 (TG 413) för subkronisk inhalation antogs 1981 (1). Den här testmetoden B.29 (som motsvarar den reviderade testriktlinjen 
413 (2009)) har uppdaterats för att återspegla vetenskapen och möta nuva ­
rande och framtida lagstiftningsbehov. 
2. Studier av subkronisk inhalationstoxicitet används främst för att härleda 
regulatoriska koncentrationer för bedömning av risker i arbetsmiljöer. De 
används också för att bedöma människors bostäder, transportmedel och 
miljörisker. Den här testmetoden medger karakterisering av negativa effekter efter upprepad daglig exponering genom inhalation av en testkemikalie under 90 dagar (cirka 10 % av en råttas livslängd). Datan som härrör från 
studier om subkronisk inhalationstoxicitet kan användas för kvantitativa 
riskbedömningar och för valet av koncentrationer för kroniska studier. Den här testmetoden är inte specifikt avsedd för testning av nanomaterial. Definitioner som används inom ramen för den här metoden finns i slutet av 
det här kapitlet och i vägledningsdokumentet (GD) 39 (2).
 
INLEDANDE ÖVERVÄGANDEN 
3. All tillgänglig information om testkemikalien bör beaktas av laboratoriet 
innan studien genomförs i syfte att höja studiens kvalitet och minimera djuranvändningen. Information som underlättar valet av lämpliga testkon ­
centrationer kan inkludera identitet, kemisk struktur, och fysikalisk-kemiska 
egenskaper hos testkemikalien, resultat från eventuella in vitro- eller in 
vivo-toxicitetstester, förväntad användning(ar) och risken för mänsklig ex ­
ponering, tillgängliga (Q)SAR-data och toxikologiska data om strukturellt närbesläktade kemikalier samt data från andra studier av upprepad expone ­
ring. Om neurotoxicitet förväntas eller observeras under studiens gång, kan 
försöksledaren välja att inkludera lämpliga utvärderingar såsom en funktio ­
nell samlingsstudie (FOB) och mätning av motorisk aktivitet. Även om tidpunkter för exponeringar i förhållande till specifika undersökningar kan 
vara kritiska, bör resultaten från dessa extra aktiviteter inte störa studiens 
grundläggande utformning.
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 422
 
4. Utspädningar av korrosiva eller irriterande testkemikalier kan testas vid 
koncentrationer som kommer att ge den önskade graden av toxicitet. För 
ytterligare information se GD 39 (2). När djur utsätts för dessa material bör målkoncentrationerna vara tillräckligt låga för att inte orsaka avsevärd smärta och lidande, men ändå tillräckliga för att utsträcka 
koncentration-respons-kurvan till nivåer som gör att testets regulatoriska 
och vetenskapliga mål kan uppnås. Dessa koncentrationer bör väljas från fall till fall, företrädesvis baserade på en adekvat utformad undersökning av spännvidden som ger information om den kritiska endpointen, eventuellt 
tröskelvärde för irritation och tiden för de första tecknen (se punkterna 
11–13). Motivering för valet av koncentration ska anges. 
5. Döende djur eller djur som visar tecken på uppenbar smärta eller svårt och 
ihållande lidande ska avlivas skonsamt. Döende djur betraktas på samma sätt som de som dör under testet. Kriterier för att ta beslutet att avliva döende eller svårt lidande djur, och vägledning om hur man känner igen tecken på 
förutsägbar eller annalkande död, omfattas i OECD:s vägledningsdokument 
om humana endpoints (3).
 
METODBESKRIVNING  
Val av djurart  
6. I testet bör friska unga vuxna gnagare användas av stammar som vanligtvis 
används på laboratorier. För detta test används råtta. Motivering ska ges om 
annan art används.  
Förberedelse av djuren  
7. Honorna ska inte ha fått ungar och inte vara dräktiga. På dagen för rando ­
miseringen bör djuren vara unga vuxna 7 till 9 veckor gamla. Kroppsvikten 
bör ligga inom ± 20 % av medelvikten för vardera könet. Djuren väljs ut 
slumpvis och märks för individuell identifikation, och får därefter acklimati ­
sera sig till laboratoriets betingelser i sina burar i minst fem dagar före teststarten.
 
Djurhållning  
8. Djuren bör identifieras individuellt, företrädesvis med subkutana transpond ­
rar för att underlätta observationer och undvika förvirring. Temperaturen i försöksdjurens utrymmen bör vara 22 ± 3 °C. Den relativa fuktigheten bör 
ligga mellan 30 och 70 %, även om detta kanske inte är möjligt när vatten 
används som vehikel. Före och efter exponeringen bör djuren inhysas i grupper avhängigt kön och koncentration, dock får antalet djur per bur inte hindra en tydlig observation av varje enskilt djur, och förluster genom 
kannibalism och slagsmål bör minimeras. Om endast djurens nosar ska 
exponeras kan det vara nödvändigt att de får acklimatisera sig till fasthåll ­
ningsrören. Fasthållningsrören ska inte medföra onödig fysisk, termisk eller fasthållningsstress för djuren. Fasthållning kan påverka fysiologiska endpo ­
ints såsom kroppstemperatur (hypotermi) och/eller minimala respiratoriska 
volymer. Om det finns generiska data tillgängliga som inte pekar på sådana förändringar i någon nämnvärd omfattning är det inte nödvändigt med an ­
passningen till rören före exponeringen. Djur vars hela kroppar ska expo ­
neras för en aerosol ska inhysas individuellt under exponeringen för att 
förhindra att de andra djuren i buren filtrerar aerosolen genom sina pälsar. För utfodringen kan konventionellt laboratoriefoder användas, utom under exponeringen, tillsammans med en obegränsad tillgång till vatten. Belys ­
ningen bör vara artificiell med omväxlande 12 timmar ljus och 12 timmar 
mörker.
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 423
 
Inhalationskammare  
9. Vid val av inhalationskammare bör man beakta kemikaliens beskaffenhet 
och ändamålet med testet. Det föredragna exponeringssättet är enbart nos (termen inkluderar även enbart huvud, enbart nos eller enbart tryne). Expo ­
nering av enbart nos föredras i allmänhet vid studier av vätskor och fasta 
aerosoler och ånga som kan kondenseras och bilda aerosoler. Vissa av undersökningens mål kan bättre uppnås genom exponering av hela kroppen, men detta ska motiveras i undersökningsrapporten. För att säkerställa atmo ­
sfärisk stabilitet vid användningen av en helkroppskammare ska den totala 
volymen av försöksdjuren inte överskrida 5 % av kammarens volym. Tek ­
nikerna för enbart nos och helkroppsexponeringens principer och särskilda 
för- och nackdelar behandlas i GD 39 (2).
 
TOXICITETSSTUDIER  
Koncentrationsgränser  
10. Till skillnad från akuta studier finns det inga fastställda koncentrationsgrän ­
ser i studier av subkronisk inhalationstoxicitet. För den högsta testade kon ­
centrationen bör man beakta: 1) högsta möjliga koncentration, 2) värsta tänkbara fall av mänsklig exponering, 3) behovet av att ge en tillräcklig syretillförsel och/eller 4) djurskyddsskäl. I avsaknad av databaserade grän ­
svärden, får de akuta gränsvärdena i förordning (EG) nr 1272/2008 (13) 
användas (dvs. upp till en högsta koncentration av 5 mg/l för aerosoler, 20 mg/l för ångor och 20 000 ppm för gaser); se GD 39 (2). Motivering ska ges om det är nödvändigt att överskrida dessa gränsvärden vid testning 
av gaser eller mycket flyktiga testkemikalier (t.ex. köldmedier). Koncent ­
rationsgränsen bör framkalla tydlig toxicitet utan att utsätta djuren för onö ­
dig stress eller påverka deras livslängd (3).
 
Spännviddsstudie  
11. Innan huvudstudien påbörjas är det i allmänhet nödvändigt att genomföra en 
spännviddsstudie. En spännviddsstudie är mer omfattande än en inledande 
studie eftersom den inte är begränsad till valet av koncentration. Kunskap 
från en spännviddsstudie kan leda till en lyckad huvudstudie. En spänn ­
viddsstudie kan till exempel ge teknisk information om analysmetoder, par ­
tikeldimensionering, upptäckt av toxiska mekanismer, klinisk patologi- och 
histopatologidata, och en uppskattning av vad som kan vara NOAEL- och MTC-koncentrationer i en huvudstudie. Försöksledaren kan välja att an ­
vända en spännviddsstudie för att identifiera tröskelvärdet för irritation i 
luftvägarna (t.ex. med histopatologi i luftvägarna, lungfunktionstest eller 
lungsköljning), den övre koncentration som tolereras utan att djuren utsätts för onödig stress och de parametrar som bäst kännetecknar en testkemikalies toxicitet. 
12. En spännviddsstudie kan bestå av en eller flera koncentrationsnivåer. Bero ­
ende på de endpoints som valts bör 3 till 6 hanar och 3 till 6 honor exponeras vid varje koncentrationsnivå. En spännviddsstudie ska pågå under minst 5 dagar och vanligtvis inte mer än i 28 dagar. Motiveringen för valet 
av koncentrationer till huvudstudien ska ges i undersökningsrapporten. Syf ­
tet med huvudstudien är att påvisa ett koncentration-respons-förhållande baserat på vad som förväntas vara den mest känsliga endpointen. Den låga koncentrationen bör helst vara en koncentration utan en påvisbar skad ­
lig effekt medan den höga koncentrationen bör framkalla tydlig toxicitet 
utan att utsätta djuren för onödig stress eller påverka deras livslängd (3).
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 424
 
13. Vid valet av koncentrationsnivåer för spännviddsstudien bör all tillgänglig 
information beaktas, inklusive struktur-aktivitetsförhållanden samt data för 
liknande kemikalier (se punkt 3). En spännviddsstudie kan verifiera/motbe ­
visa vad som anses vara de endpoints som är mest mekanistiskt baserade, t.ex. kolinesterasinhibition av organiska fosforföreningar, methemoglobin ­
bildning av erytrocytotoxiska agens, sköldkörtelhormoner (T
 3 , T 4 ) för tyreo ­
toxiska ämnen, protein, LDH eller neutrofiler i bronkoalvelvolär sköljning för ofarliga svårlösliga partiklar eller lungretande aerosoler.
 
Huvudstudie  
14. Huvudstudien för subkronisk toxicitet består i allmänhet av tre koncent ­
rationsnivåer och även samtidiga negativa (luft) och/eller vehikelkontroller 
efter behov (se punkt 18). Alla tillgängliga data bör användas för att under ­
lätta valet av lämpliga exponeringsnivåer, inklusive resultaten från de syste ­
matiska toxicitetsstudierna, metabolism och kinetik (särskild vikt bör läggas vid att undvika höga koncentrationsnivåer som mättar kinetiska processer). 
Varje testgrupp består av 10 hangnagare och 10 hongnagare som exponeras 
för testkemikalien 6 timmar per dag 5 dagar per vecka under en period på 13 veckor (total studielängd minst 90 dagar). Djuren kan också exponeras 7 dagar per vecka (t.ex. vid testning av läkemedel som inhaleras. Om ett kön 
är känt för att vara mer mottagligt för en viss testkemikalie kan könen 
exponeras vid olika koncentrationsnivåer för att optimera koncentrations ­
responsen enligt beskrivningen i punkt 15. Om andra gnagare än råttor 
exponeras enbart nos, får maximala exponeringstider justeras för att minska 
artspecifikt lidande. En motivering bör ges när man använder kortare ex ­
poneringstid än 6 timmar/dag, eller när det är nödvändigt att utföra en helkroppsexponeringsstudie med lång varaktighet (t.ex. 22 timmar/dag) (se 
GD 39) (2). Inget foder ska ges under exponeringsperioden, om den inte 
överskrider 6 timmar. Vatten kan tillhandahållas under en helkroppsexpone ­
ring. 
15. Den målkoncentration som valts ska identifiera målorgan(en) och påvisa en 
tydlig koncentrationsrespons: 
— Den höga koncentrationsnivån bör leda till toxiska effekter, men inte 
orsaka kvardröjande tecken eller dödlighet, vilket kan förhindra en me ­
ningsfull utvärdering. 
— Den mellanliggande koncentrationsnivån(erna) bör spridas ut för grade ­
ring av toxiska effekter mellan den låga och höga koncentrationen. 
— Den låga koncentrationsnivån bör frambringa få eller inga belägg för 
toxicitet.
 
Avlivande  
16. Om avlivning planeras ska antalet djur vid varje exponeringsnivå ökas med 
det antal som ska avlivas före studiens avslutande. Motiveringen för att 
använda avlivningar bör tillhandahållas samt statistiska analyser som stöder 
dem. ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 425
 
Satellitstudie (reversibilitet)  
17. En satellitstudie (reversibilitet) kan användas för att observera reversibilitet, 
persistens eller fördröjd toxicitet för en efterbehandlingsperiod av lämplig längd, dock inte mindre än 14 dagar. Satellitgrupper (reversibilitet) består av 
10 hanar och 10 honor som exponeras samtidigt med försöksdjuren i huvud ­
studien. Satellitstudiegrupper bör exponeras för testkemikalien vid den högsta koncentrationsnivån och det bör finnas samtidiga luft- och/eller ve ­
hikelkontroller efter behov (se punkt 18).
 
Kontrolldjur  
18. Samtidiga negativa (luft-) kontrolldjur bör hanteras på ett sätt som är iden ­
tiskt med djuren i testgruppen, förutom att de exponeras för filtrerad luft i stället för testkemikalien. När vatten eller annat ämne används för att ge ­
nerera testatmosfären bör en vehikelkontrollgrupp i stället för en negativ 
(luft-) kontrollgrupp ingå i studien. Vatten bör användas som vehikel när ­
helst det är möjligt. När vatten används som vehikel bör kontrolldjuren exponeras för luft med samma relativa fuktighet som de exponerade grup ­
perna. Valet av en lämplig vehikel bör grunda sig på en lämpligt utförd 
förstudie eller historiska data. Om en vehikels toxicitet inte är känd kan 
försöksledaren välja att använda både en negativ (luft-) kontroll och en vehikelkontroll, men det rekommenderas inte. Om historiska data visar att en vehikel inte är toxisk finns det inget behov av en negativ (luft-) kontroll ­
grupp och då bör endast en vehikelkontroll användas. Om en förstudie av en 
testkemikalie som beretts i en vehikel inte visar någon toxicitet, framgår det att vehikeln inte är toxisk vid den testade koncentrationen och att denna vehikelkontroll bör användas.
 
EXPONERINGSBETINGELSER  
Administration av koncentrationer  
19. Djur exponeras för testkemikalien som en gas, ånga, aerosol eller en bland ­
ning av dem. Det fysikaliska tillstånd som ska testas beror på testkemika ­
liens fysikalisk-kemiska egenskaper, valda koncentrationer och/eller dess 
mest sannolika fysikaliska form vid hanteringen och användningen. Hygro ­
skopiska och kemiskt reaktiva testkemikalier ska testas i torr luft. Det är viktigt att se till att inga explosiva koncentrationer skapas. För att minska 
partikelstorleken kan partikelmaterialet utsättas för mekaniska processer. 
Mer vägledning finns i GD 39 (2).
 
Partikelstorleksfördelning  
20. Partikeldimensionering bör utföras för alla aerosoler och ångor som kan 
kondenseras och bilda aerosoler. För att möjliggöra exponering av alla relevanta områden i luftvägarna, rekommenderas aerosoler med en aero ­
dynamisk diameter (MMAD) i intervallet 1 till 3 μm med en geometrisk 
standardavvikelse ( σ
 g ) i intervallet 1,5 till 3,0 (4). Även om en rimlig an ­
strängning krävs för att uppfylla denna standard, bör en sakkunnig bedöm ­
ning ges om detta inte kan uppnås. Till exempel blir rökpartiklar av metall 
mindre än denna standard, och laddade partiklar och fibrer kan överstiga 
den. ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 426
 
Beredning av testkemikalie i en vehikel  
21. Testkemikalien ska helst testas utan en vehikel. Om det är nödvändigt att 
använda en vehikel för att generera en lämplig koncentration och partikels ­
torlek av testkemikalien, bör vatten ges företräde. Närhelst en testkemikalie 
är upplöst i en vehikel ska dess stabilitet påvisas.  
ÖVERVAKNING AV EXPONERINGSFÖRHÅLLANDEN  
Kammarens luftflöde  
22. Luftflödet genom exponeringskammaren ska omsorgsfullt kontrolleras, kon ­
tinuerligt övervakas och registreras minst en gång i timmen under varje 
exponering. Övervakningen i realtid av testatmosfärens koncentration (eller temporal stabilitet) är en integrerad mätning av samtliga dynamiska para ­
metrar och ger ett indirekt sätt att kontrollera alla relevanta dynamiska 
inhalationsparametrar. Om koncentrationen övervakas i realtid kan mätfre ­
kvensen för luftflöden minskas till en enda mätning per exponeringsdag. Särskild hänsyn bör tas för att undvika återandning i enbart nos-kammare. Syrehalten bör vara minst 19 % och koncentrationen av koldioxid bör inte 
överstiga 1 %. Om det finns anledning att tro att denna standard inte kan 
uppfyllas bör man mäta koncentrationen av syre och koldioxid. Om mät ­
ningar under den första exponeringsdagen visar att dessa gaser har korrekta nivåer behöver inga fler mätningar utföras.
 
Kammarens temperatur och relativa fuktighet  
23. Kammarens temperatur bör upprätthållas vid 22 ± 3 °C. Relativ fuktighet i 
djurens andningsapparater, för både enbart nos och helkroppsexponering, 
bör övervakas kontinuerligt och registreras varje timme vid varje expone ­
ring, om möjligt. Den relativa fuktigheten bör helst upprätthållas inom in ­
tervallet 30 till 70 %, men detta kanske inte är möjligt (t.ex. vid testning av 
vattenbaserade blandningar), eller inte mätbart på grund av att testkemika ­
lien stör själva testmetoden.  
Testkemikalie: Nominell koncentration  
24. När det är möjligt bör den nominella koncentrationen i exponeringskamma ­
ren beräknas och registreras. Den nominella koncentrationen är massan av den genererade testkemikalien dividerad med den totala volymen av luft 
som passerade genom inhalationskammarsystemet. Den nominella koncent ­
rationen används inte för att karakterisera djurens exponering, men en jäm ­
förelse mellan den nominella koncentrationen och den faktiska koncentratio ­
nen ger en indikation på testsystemets genereringsprestanda, och kan därmed 
användas för att upptäcka genereringsproblem.
 
Testkemikalie: Faktisk koncentration  
25. Den faktiska koncentrationen är testkemikaliekoncentrationen som samlats 
in i djurets andningsområde i en inhalationskammare. Faktiska koncentratio ­
ner kan erhållas antingen genom särskilda metoder (t.ex. direkt provtagning, adsorptiva eller kemiskt reaktiva metoder, och efterföljande analytisk karak ­
terisering) eller genom icke-specifika metoder såsom gravimetrisk filterana ­
lys. Användningen av gravimetrisk analys är endast acceptabel för pulver ­
aerosoler bestående av en enda komponent eller aerosoler bestående av vätskor med låg flyktighet, och bör stödjas av en lämplig preklinisk studie med kemikaliespecifik karakterisering. Koncentrationen i pulveraerosoler 
bestående av flera komponenter kan också bestämmas genom gravimetrisk 
analys. Detta kräver dock analysresultat som visar att sammansättningen av
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 427
 
luftburet material liknar startmaterialet. Om denna information inte finns 
tillgänglig kan det vara nödvändigt med en ny analys av testkemikalien 
(helst i sitt luftburna tillstånd) under loppet av studien. För medel i aero ­
solform som kan förångas eller sublimeras bör man kunna visa att samtliga faser uppsamlades med den valda metoden. 
26. En sats av testkemikalien ska användas genom hela studien, om möjligt, och 
provet ska lagras under sådana förhållanden att det bibehåller sin renhet, homogenitet och stabilitet. Inför starten av studien bör det finnas en be ­
skrivning av testkemikalien som inbegriper dess renhet och, om det är 
tekniskt genomförbart, identitet, och kvantiteterna av identifierade förore ­
ningar och orenheter. Detta kan visas genom, men är inte begränsat till, följande data: retentionstid och relativ topparea, molekylvikt från masspek ­
troskopi eller gaskromatografianalys, eller andra uppskattningar. Även om 
testlaboratoriet inte ansvarar för provets identitet, kan det vara klokt att man i stora drag bekräftar karakteriseringen (t.ex. färg, fysisk natur etc.). 
27. Exponeringsatmosfären ska hållas så konstant som möjligt. En enhet för 
realtidsövervakning, såsom en aerosolfotometer för aerosoler eller en analy ­
sator för totalkolväte för ångor kan användas för att påvisa stabiliteten för exponeringsförhållandena. Faktisk kammarkoncentration bör mätas minst 3 
gånger varje exponeringsdag vid varje exponeringsnivå. Om det inte är 
möjligt på grund av begränsade luftflöden eller låga koncentrationer, är det acceptabelt med ett prov per exponeringsperiod. Helst ska detta prov sedan samlas in under hela exponeringsperioden. Provtagning av kammark ­
oncentrationer från individuella kammare bör inte avvika från den genom ­
snittliga koncentrationen med mer än ± 10 % för gaser och ångor, och inte med mer än ± 20 % för flytande eller fasta aerosoler. Tid för att uppnå kammarjämvikt (t
 95 ) bör beräknas och rapporteras. Varaktigheten för en 
exponering sträcker sig över den tid som testkemikalien genereras. Detta 
tar hänsyn till den tid som krävs för att uppnå kammarens jämvikt (t  95 ) och 
sönderfall. Riktlinjer för att uppskatta t  95 finns i GD 39 (2). 
28. För mycket komplexa blandningar bestående av gaser/ångor och aerosoler 
(t.ex. förbränningsatmosfärer och testkemikalier framdrivna från därför av ­
sedd slutanvändningsprodukt/-utrustning) kan varje fas bete sig olika i en inhalationskammare. Därför ska minst ett indikatorämne väljas (analyt), 
vanligtvis den huvudsakliga aktiva ingrediensen i blandningen för varje 
fas (gas/ånga och aerosol). När testkemikalien är en blandning ska den analytiska koncentrationen i totalblandningen rapporteras, inte bara den ak ­
tiva ingrediensen eller indikatorämnet (analyten). Ytterligare information om 
faktisk koncentration finns i GD 39 (2).
 
Testkemikalie: Partikelstorleksfördelning  
29. Aerosolers partikelstorleksfördelning bör fastställas minst en gång i veckan 
vid varje koncentrationsnivå med hjälp av en kaskadimpaktor eller ett al ­
ternativt instrument såsom en aerodynamisk partikelsorterare APS). Om man 
kan visa ett likvärdigt resultat från en kaskadimpaktor och det alternativa 
instrumentet, kan man använda det sistnämnda under hela studien.  ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 428
 
30. En andra enhet, till exempel ett gravimetriskt filter eller en impinger/gas ­
bubblare, bör användas parallellt med det primära instrumentet för att be ­
kräfta uppsamlingsprestandan hos det primära instrumentet. Masskoncent ­
rationen som erhållits genom analys av partikelstorleken ska ligga inom rimliga gränser för den masskoncentration som erhållits genom filteranalys 
(se GD 39 (2)). Om likvärdigheten kan påvisas för alla koncentrationer som 
testats i ett tidigt skede av försöket, kan ytterligare bekräftande mätningar utelämnas. Av hänsyn till djurskyddsskäl bör åtgärder vidtas för att mini ­
mera ofullständiga uppgifter som kan leda till att studien måste upprepas. 
31. Partikeldimensionering bör utföras för ångor om det finns en möjlighet att 
kondensen kan bilda en aerosol, eller om partiklar upptäcks i ångatmosfären 
som kan göra så att faserna blandas.
 
IAKTTAGELSER 
32. Djuren bör observeras kliniskt före, under och efter exponeringsperioden. 
Mer frekventa iakttagelser kan indikeras beroende på djurens respons under 
exponeringen. När iakttagelser av djuren hindras genom användning av 
fasthållningsrör, dåligt upplysta kroppskammare eller ogenomskinlig atmo ­
sfär, bör djuren noga observeras efter exponeringen. Observationer före nästa dags exponering kan utvärdera eventuell reversibilitet eller stegrande 
toxiska effekter. 
33. Alla observationer registreras med individuell registrering för varje djur. När 
djur avlivas av humanitära skäl eller påträffas döda, ska tidpunkten för 
dödsfallet registreras så noggrant som möjligt. 
34. Observationer vid buren bör omfatta förändringar i hud och päls, ögon och 
slemhinnor, förändringar i andnings- och cirkulationssystemen, förändringar i nervsystemet, samt förändringar i kroppsmotorik och beteendemönster. Uppmärksamhet bör fästas vid iakttagelser av tremor, konvulsioner, salivut ­
söndring, diarré, letargi, sömn och koma. Mätningen av rektala temperaturer 
kan ge belägg för bradypnéreflex eller hypo/hypertermi relaterat till behand ­
ling eller inspärrning. Ytterligare utvärderingar kan inkluderas i studiens protokoll såsom kinetik, biologisk övervakning, lungfunktion, retention av 
svårlösliga ämnen som ackumuleras i lungvävnad, samt beteendeförändring ­
ar.
 
KROPPSVIKT 
35. De enskilda djurens vikt bör registreras strax före den första exponeringen 
(dag 0), därefter två gånger i veckan (till exempel på fredagar och måndagar 
för att påvisa återhämtning över ett exponeringsfritt veckoslut, eller under ett tidsintervall för bedömning av systematisk toxicitet), och vid tidpunkten för dödsfallet eller avlivningen. Om inga effekter visas under de 4 första vec ­
korna kan kroppsvikterna mätas en gång i veckan för återstoden av studien. 
Satellitdjur (reversibilitet) (om det används) ska fortsätta vägas varje vecka under hela återhämtningsperioden. Vid studiens upphörande bör samtliga djur vägas strax före avlivningen för en objektiv beräkning av förhållandet 
organ-kroppsvikt.
 
FÖDO- OCH VATTENINTAG 
36. Födointaget bör mätas varje vecka. Vattenintaget bör också mätas.  ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 429
 
KLINISK PATOLOGI 
37. Kliniska patologiska bedömningar bör göras av samtliga djur, inklusive 
kontroll- och satellitdjur (reversibilitet) när de avlivas. Tidsintervallet mellan exponeringens upphörande och insamlingen av blod ska registreras, i syn ­
nerhet när rekonstitueringen av endpointen är snabb. Provtagning efter att 
exponeringen har upphört indikeras för dessa parametrar med ett kort plas ­
maprov halvtid (t.ex. COHb, CHE och MetHb). 
38. Tabell 1 listar de kliniska patologiska parametrar som i allmänhet krävs för 
alla toxikologiska studier. Urinanalys krävs inte rutinmässigt, men kan ut ­
föras när det bedöms lämpligt utifrån förväntad eller observerad toxicitet. Försöksledaren kan välja att bedöma ytterligare parametrar för att bättre kunna karakterisera en testkemikalies toxicitet (t.ex. kolinesteras, lipider, 
hormoner, syra/bas-balans, methemoglobin eller Heinz-kroppar, kreatinki ­
nas, myeloid/erytroid-förhållande, troponiner, arteriella blodgaser, laktatde ­
hydrogenas, sorbitaldehydrogenas, glutamatdehydrogenas och gamma-gluta ­
myltranspeptidas).
 
Tabell 1  
Standardiserade parametrar för klinisk patologi  
Hematologi  
Erytrocytantal 
Hematokrit Hemoglobinkoncentration 
Medelvärde för korpuskulärt hemoglo ­
bin 
Medelvärde för korpuskulär volym Medelvärde för korpuskulär hemoglo ­
binkoncentration 
Retikulocyter Totalt antal leukocyter 
Differentalt leukocytantal Trombocytantal 
Koaguleringsförmåga (välj ett al ­
ternativ): 
— Protrobintid — Koagulationstid 
— Partiell tromboplastintid
 
Klinisk kemi  
Glukos (*) 
Totalkolesterol 
Triglycerider Blodureakväve Total bilirubin 
Kreatinin 
Totalprotein Albumin 
Globulin Alaninaminotransferas 
Aspartataminotransferas 
Alkaliskt fosfatas Kalium Natrium 
Kalcium 
Fosfor Klorid
 
Urinalys (valfritt)  
Utseende (färg och grumlighet) 
Volym Specifik vikt eller osmolalitet 
pH Totalprotein 
Glukos Blod/blodceller
 
(*) Eftersom en lång fasteperiod kan införa partiskhet i glukosmätningar för de be ­
handlade djuren jämfört med kontrolldjuren, bör försöksledaren avgöra om det är 
lämpligt att djuren fastar. Om man använder en fasteperiod bör den vara avpassad 
för den art som används, för råtta kan det vara 16 timmar (fastande över natten). 
Bestämning av fasteglukos kan utföras efter en natts fasta under den sista expo ­
neringsveckan, eller efter en natts fasta innan obduktionen (i det senare fallet 
tillsammans med alla andra kliniska patologiska parametrar).  ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 430
 
39. När det finns bevis på att de nedre luftvägarna (dvs. alveolerna) är den 
främsta platsen för deponering och lagring, då kan lungsköljning vara det 
tekniska valet för att kvantitativt analysera hypotesbaserade doseffektpara ­
metrar med fokus på alveolit, lunginflammation och fosfolipidos. Detta gör att dosrespons och tidsförloppsförändringar för alveolär skada grundligt kan 
undersökas. BAL-vätskan kan analyseras för totalt och differentiellt leuko ­
cytantal, totalprotein och laktatdehydrogenas. Andra parametrar som kan beaktas är de som tyder på lysosomal skada, fosfolipidos, fibros, och irri ­
terande eller allergisk inflammation som kan innefatta bestämning av 
pro-inflammatoriska cytokiner/kemokiner. BAL-mätningar kompletterar i 
allmänhet resultaten från histopatologiska undersökningar, men kan dock inte ersätta dem. Vägledning om hur man utför lungsköljning finns i GD 39 (2).
 
OFTALMOLOGISK UNDERSÖKNING 
40. Med ett oftalmoskop eller motsvarande anordning bör oftalmologiska under ­
sökningar av fundus, brytningsmedia, iris och konjunktival utföras på samt ­
liga djur före administreringen av testkemikalien, och för samtliga högkon ­
centrations- och kontrollgrupper vid avlivning. Om förändringar i ögonen 
upptäcks, ska samtliga djur i de andra grupperna undersökas, inklusive satellitgruppen (reversibilitet).
 
MAKROSKOPISK PATOLOGI OCH ORGANVIKTER 
41. Samtliga försöksdjur, inklusive de som avlider under testet eller avlivas och 
tas bort från undersökningen av djurskyddsskäl, bör underkastas fullständig blodtömning (om möjligt) och obduceras. Tidsperioden mellan slutfasen av 
varje djurs exponering och dess avlivning ska registreras. Om en obduktion 
inte kan utföras omedelbart efter att ett dött djur påfunnits, bör djuret kylas (inte frysas) vid en temperatur som är tillräckligt låg för att minimera auto ­
lys. Obduktioner ska utföras så snart som möjligt, vanligtvis inom en dag 
eller två. Alla betydande patologiska förändringar bör registreras för varje 
djur med särskild uppmärksamhet på eventuella förändringar i luftvägarna. 
42. Tabell 2 visar de organ och vävnader som bör bevaras i ett lämpligt medium 
under obduktion för histopatologisk undersökning. Bevarandet av organ och vävnader  [inom hakparentes ] och eventuellt andra organ och vävnader av ­
görs av försöksledaren. Organen i  fetstil  ska putsas och vägas våta så snart 
som möjligt efter dissektionen för att undvika uttorkning. Sköldkörteln och 
bitestiklarna bör endast vägas om det behövs, eftersom trimning av artefak ­
ter kan hindra en histopatologisk utvärdering. Vävnader och organ bör fix ­
eras i 10 % buffrad formalin eller annat lämpligt fixativ så snart obduktio ­
nen utförts, och inte mindre än 24–48 timmar före trimning beroende på det 
fixativ som ska användas.
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 431
Tabell 2  
Organ och vävnader som bevaras vid obduktion 
Binjurar  
Aorta Benmärg (och/eller färskt aspirat)  
Hjärna  (inklusive delar av cerebrum, cerebel ­
lum och medulla/pons) 
Cekum Kolon Tolvfingertarm [Epididymis ] 
(Ögon [retina, synnerv] och ögonlock) Lårbenet och knäleden Gallblåsa (i förekommande fall) [Harderiankörtlar]  
Hjärta  
Ileum Jejunum  
Njurar  
[Tårkörtlar (extraorbitala)] Larynx (3 nivåer inklusive struplockets bas)  
Lever Lungor  (alla lober på en nivå, inklusive hu ­
vudbronker) 
Lymkörtlar från lungans hilarregion, särskilt 
beträffande svårlösliga partikeltestkemikalier. För mer ingående undersökningar och/eller studier med immunologi i fokus kan ytterli ­
gare lymfkörtlar beaktas, t.ex. de från de me ­
diastinala, cervikala/submandibulära och/eller aurikulära regionerna 
Lymfkörtlar (distalt från ingångshålet) Mjölkkörtlar (honor) Muskel (lår) Nasofaryngeala vävnader (minst 4 nivåer; 1 
nivå för att inkludera den nasofaryngeala ka ­
nalen och den nasalassocierade lymfvävnaden (NALT)) Esofagus 
[Luktbulb]  
Äggstockar  
Pankreas Biköldkörtlar Perifer nerv (ischias eller tibia), helst nära 
muskeln) 
Hypofys Prostata 
Rektum 
Spottkörtlar Sädesblåsor Hud Ryggmärg (cervikala, mitt på bröstkorgen 
och ländryggen)  
Mjälte  
Bröstben Mage 
Tänder  
Testiklar Tymus Sköldkörtlar  
[Tunga] Luftstrupe (minst 2 nivåer inklusive 1 längd ­
snitt genom carina och 1 tvärsnitt) 
[Ureter] [Uretra] Urinblåsa  
Uterus  
Målorgan Alla större skador och massor
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 432
 
43. Lungorna bör avlägsnas intakta, vägas och indränkas med lämpligt fixativ 
vid ett tryck på 20–30 cm vatten för att säkerställa att lungstrukturen bibe ­
hålls (5). Sektioner bör samlas in för alla lober på en nivå, inklusive huvud ­
bronker, men om lungsköljning utförs ska den osköljda loben sektioneras på tre nivåer (ej seriella sektioner). 
44. Minst 4 nivåer av nasofaryngeala vävnader bör undersökas, varav en ska 
innehålla den nasofaryngeala kanalen (5) (6) (7) (8) (9) för en adekvat undersökning av den skvamösa, mellanliggande (icke-cilierade respiratoris ­
ka), respiratoriska (cilierade respiratoriska) och luktepitelet, och den dräne ­
rade lymfvävnaden (NALT((10) (11). Tre nivåer av struphuvudet bör un ­
dersökas, och en av dessa nivåer bör inkludera struplockets bas (12). Minst två nivåer av luftstrupen bör undersökas, inklusive ett längdsnitt genom förgreningen av carinan för de extrapulmonella bronkerna, samt ett tvärsnitt.
 
HISTOPATOLOGI 
45. En histopatologisk utvärdering av alla organ och vävnader som räknas upp i 
tabell 2 bör utformas för kontroll- och högkoncentrationsgrupperna och för 
alla djur som dör eller avlivas under studien. Särskild uppmärksamhet bör ges åt luftvägarna, målorganen och större skador. Organ och vävnader som har skador i högkoncentrationsgruppen bör undersökas i alla grupper. För ­
söksledaren kan välja att utföra histopatologiska utvärderingar av flera grup ­
per för att påvisa en tydlig koncentrationsrespons. Om en satellitgrupp (re ­
versibilitet) används bör en histopatologisk utvärdering göras av samtliga vävnader och organ där effekter visats i de behandlade grupperna. Om det 
finns alltför många tidiga dödsfall eller andra problem i högkoncentrations ­
gruppen som äventyrar datans signifikans, bör nästa lägre koncentration undersökas histopatologiskt. Ett försök bör göras att korrelera större obser ­
vationer i relation till mikroskopiska fynd.
 
DATA OCH RAPPORTERING  
Data  
46. Individuella data om djurens kroppsvikt, födointag, klinisk patologi, makro ­
skopisk patologi, organvikter och histopatologi ska lämnas. Kliniska obser ­
vationsdata bör sammanfattas i tabellform, som för varje testgrupp visar antalet djur som använts, antalet djur som visar tecken på toxicitet, antalet djur som avlidit under testet eller som avlivats av humanitära skäl, tidpunk ­
ten då det enskilda djuret har avlidit, beskrivning och tidsförlopp för toxiska 
verkningar och reversibilitet, samt obduktionsfynd. Samtliga resultat, kvan ­
titativa och tillfälliga, ska utvärderas genom en lämplig statistisk metod. En allmänt vedertagen statistisk metod kan användas, och statistiska metoderna 
bör väljas under studiens utformning.
 
Testrapport  
47. Testrapporten ska omfatta följande information, när så är lämpligt:  
Försöksdjur och djurhållning  
— Beskrivning av burförhållanden, inklusive antal (eller förändring av an ­
tal) djur per bur, strö, omgivningstemperatur och relativ fuktighet, ljus ­
period och identifiering av kost.  ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 433
 
— Art/stam som används och motivering för att använda andra arter än 
råtta. Källor och historiska data kan tillhandahållas om de är från djur 
som har exponerats under liknande exponering, inhysning och fastebe ­
tingelser. 
— Djurens antal, ålder och kön. 
— Metod för randomisering. 
— Beskrivning av eventuella förtestbetingelser inbegripet kost, karantän 
och behandling av sjukdomar.  
Testkemikalie  
— Fysikalisk natur, renhet och, i förekommande fall, fysikalisk-kemiska 
egenskaper (inbegripet isomerisering). 
— Identifieringsdata och CAS-nummer (Chemical Abstract Services), om 
detta är känt.  
Vehikel  
— Motivering för användning av vehikel och valet av vehikel (om annat än 
vatten). 
— Historiska eller parallella data som visar att vehikeln inte påverkar stud ­
iens slutresultat.  
Inhalationskammare  
— Detaljerad beskrivning av inhalationskammaren inklusive volym och ett 
diagram. 
— Ursprung och beskrivning av utrustning som används för exponering av 
djur så väl som generering av atmosfär. 
— Utrustning för mätning av temperatur, fuktighet, partikelstorlek och fak ­
tisk koncentration. 
— Luftkälla och system som används för konditionering. 
— Metoder som används för kalibrering av utrustning för att säkerställa en 
homogen testatmosfär. 
— Tryckskillnad (positiv eller negativ). — Exponeringsportar per kammare (enbart nos), placering av djur i kam ­
maren (helkropp). 
— Testatmosfärens stabilitet. 
— Placering av temperatur- och fuktighetsgivare och provtagning av tes ­
tatmosfären i kammaren. 
— Behandling av luft som tillförs/extraheras. — Luftflödeshastigheter, port för luftflöde och exponering (enbart nos), 
eller djurbelastning och kammare (helkropp). 
— Tid tills inhalationskammaren har nått jämvikt (t95). 
— Antal volymutbyten per timme. 
— Mätutrustning (i förekommande fall).  
Exponeringsdata  
— Grund för valet av målkoncentration i huvudstudien.
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 434
 
— Nominella koncentrationer (den totala massan av testkemikalien som 
genereras i inhalationskammaren dividerad med luftvolymen som pas ­
serar genom kammaren). 
— Faktiska koncentrationer av testkemikalien som uppsamlats från djurens 
andningsapparat, för blandningar som bildar heterogena fysikaliska for ­
mer (gaser, ångor, aerosoler), där var och en analyseras separat. 
— Alla luftkoncentrationer bör redovisas i massenheter (mg/l, mg/m  3 , etc.) 
snarare än volymenheter (ppm, ppb, etc.). 
— Partikelstorleksfördelning, aerodynamisk massmediandiameter (MMAD) 
och geometrisk standardavvikelse ( σ g ), inklusive metoderna för deras 
beräkning. Individuella partikelstorleksanalyser bör rapporteras.  
Testbetingelser  
— Uppgifter om beredning av testkemikalien, inklusive uppgifter om even ­
tuella procedurer som använts för att minska partikelstorleken hos fasta material eller för att bereda testlösningar. 
— En beskrivning (helst med ett diagram) av utrustningen som används för 
att generera testatmosfären och för att exponera djuren för denna atmo ­
sfär. 
— Uppgifter om den utrustning som används för att övervaka kammarens 
temperatur, fuktighet och luftflöde (dvs. utarbetningen av en kalibre ­
ringskurva). 
— Uppgifter om den utrustning som används för att samla in prover för 
bestämning av kammarens koncentration och partikelstorleksfördelning. 
— Uppgifter om den kemiska analysmetod som används och metodvalide ­
ring (inklusive effektiviteten för återvinningen av testkemikalien från provtagningsmediet). 
— Metod för randomisering av djur till test- och kontrollgrupper. 
— Uppgifter om foder- och vattenkvalitet (inbegripet kosttyp/-källa och 
vattenförsörjning). 
— Grunden för valet av testkoncentration.  
Resultat  
— Tabelluppställning av kammarens temperatur, fuktighet och luftflöde. 
— Tabelluppställning av kammarens nominella och faktiska koncentrations ­
data. 
— Tabelluppställning av partikelstorleksdata som omfattar provtagnings ­
data, partikelstorleksfördelning och beräkning av MMAD och σ
 g. 
— Tabelluppställning av responsdata och koncentrationsnivåer för varje 
djur (dvs. djur som uppvisar tecken på toxicitet inklusive mortalitet, 
natur, allvarlighetsgrad, tidpunkt för första tecknet och effekternas var ­
aktighet).  ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 435
 
— Tabelluppställning av de enskilda djurens vikt. 
— Tabelluppställning av födointag. — Tabelluppställning av kliniska patologiska data. — Obduktionsfynd och histopatologiska fynd för varje djur, om detta finns 
tillgängligt.  
Diskussion och tolkning av resultaten  
— Särskild uppmärksamhet bör ges till beskrivningen av metoderna som 
används för att uppfylla kriterierna för denna testmetod t.ex. koncent ­
rationsgräns eller partikelstorlek. 
— Partiklarnas andningsbarhet i ljuset av de övergripande resultaten bör 
behandlas, särskilt om kriterierna för partikelstorlek inte kunde uppfyl ­
las. 
— Överensstämmelsen mellan metoderna som används för att bestämma 
nominell och faktisk koncentration, och förhållandet mellan faktisk 
och nominell koncentration bör ingå i den samlade bedömningen av 
studien. 
— Den sannolika dödsorsaken och dominerande verkningsmekanism (syste ­
matisk mot lokal) bör behandlas. 
— En förklaring bör ges om det fanns behov av att avliva djur, som visade 
tecken på uppenbar smärta eller svårt och ihållande lidande, av huma ­
nitära skäl på grundval av kriterierna i OECD:s vägledningsdokument 
om humana endpoints (3). 
— Målorganet(en) bör identifieras. 
— NOAEL och LOAEL bör bestämmas.
 
LITTERATUR  
(1) OECD (1981).  Subchronic Inhalation Toxicity Testing , Original Test Gui ­
deline No 413, Environment Directorate, OECD, Paris. 
(2) OECD (2009).  Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing , 
Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assess ­
ment No. 39, ENV/JM/MONO(2009)28, OECD, Paris. 
(3) OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and 
Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation, Environmental Health and Safety Monograph Series 
on Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Paris. 
(4) Whalan E and Redden JC (1994). Interim Policy for Particle Size and Limit 
Concentration Issues in Inhalation Toxicity Studies. Office of Pesticide Programs, United States Environmental Protection Agency. 
(5) Dungworth DL, Tyler WS, Plopper CE (1985). Morphological Methods for 
Gross and Microscopic Pathology (Chapter 9) in  Toxicology of Inhaled 
Material , Witschi, H.P. and Brain, J.D. (eds), Springer Verlag Heidelberg, 
s. 229–258. 
(6) Young JT (1981). Histopathological examination of the rat nasal cavity. 
Fundam. Appl. Toxicol. 1: 309–312. 
(7) Harkema JR (1990). Comparative pathology of the nasal mucosa in lab ­
oratory animals exposed to inhaled irritants. Environ. Health Perspect. 85: 
231–238.
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 436
 
(8) Woutersen RA, Garderen-Hoetmer A, van Slootweg PJ, Feron VJ (1994). 
Upper respiratory tract carcinogenesis in experimental animals and in hu ­
mans. I: Waalkes MP and Ward JM (eds) Carcinogenesis. Target Organ Toxicology Series, Raven Press, New York, 215–263. 
(9) Mery S, Gross EA, Joyner DR, Godo M, Morgan KT (1994). Nasala 
diagram: A tool for recording the distribution of nasal lesions in rats and 
mice. Toxicol. Pathol. 22: 353–372. 
(10) Kuper CF, Koornstra PJ, Hameleers DMH, Biewenga J, Spit BJ, Duijvestijn 
AM, Breda Vriesman van PJC, Sminia T (1992). The role of nasopha ­
ryngeal lymphoid tissue. Immunol. Today 13: 219–224. 
(11) Kuper CF, Arts JHE, Feron VJ (2003). Toxicity to nasal-associated lymp ­
hoid tissue. Toxicol. Lett. 140–141: 281–285. 
(12) Lewis DJ (1981). Mitotic Indices of Rat Laryngeal Epithelia. Journal of 
Anatomy 132(3): 419–428. 
(13) Europaparlamentets och rådets förordning (EG) nr 1272/2008 av den 
16 december 2008 om klassificering, märkning och förpackning av ämnen 
och blandningar, ändring och upphävande av direktiven 67/548/EEG och 
1999/45/EG samt ändring av förordning (EG) nr 1907/2006 (Text av bety ­
delse för EES), EUT L 353, 31.12.2008, s. 1.
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 437
 
Tillägg 1  
DEFINITION  
Testkemikalie:  Alla ämnen eller blandningar som testas med denna testmetod.  ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 438
 
B.30  STUDIER AV KRONISK TOXICITET  
INLEDNING 
1. Den här testmetoden motsvarar OECD:s testriktlinje (TG) 452 (2009). Den 
ursprungliga TG 452 antogs 1981. Utvecklingen av denna reviderade test ­
metod B.30 ansågs nödvändig för att återspegla den senaste utvecklingen 
inom djurskydd och myndighetskrav (1) (2) (3) (4). Uppdateringen av denna testmetod B.30 har genomförts parallellt med revideringen av kapitel B.32 i denna bilaga, karcinogenicitetsstudier, och kapitel B.33 i denna bilaga, i 
syfte att erhålla ytterligare information om djuren som används i studien 
och ge ytterligare detaljer om val av dos. Den här testmetoden är avsedd att användas vid testning av ett brett spektrum av kemikalier, inklusive be ­
kämpningsmedel och industrikemikalier. 
2. Majoriteten av kroniska toxicitetsstudier genomförs med gnagare, och den 
här testmetoden är främst avsedd för studier som genomförs med dessa arter. 
Skulle sådana studier krävas för icke-gnagare gäller också de principer och förfaranden som beskrivs i denna testmetod, tillsammans med dem i kapitel B.27 i denna bilaga, 90-dagars oral toxicitetsstudie på icke-gnagare (5), med 
lämpliga ändringar som beskrivs i OECD:s vägledningsdokument nr 116 om 
utformning och genomförande av studier om kronisk toxicitet och karcino ­
genicitet (6). 
3. De tre huvudsakliga administreringssätten som används i kroniska toxicitets ­
studier är oral, dermal och inhalation. Valet av administreringssätt beror på 
de fysikaliska och kemiska egenskaperna hos testkemikalien och det domi ­
nerande exponeringssättet för människor. Ytterligare information om val av exponeringssätt ges i OECD:s vägledningsdokument nr 116 (6). 
4. Den här testmetoden fokuserar på exponering via den orala vägen, den väg 
som används mest i kroniska toxicitetsstudier. Även om långsiktiga kroniska 
toxicitetsstudier som medför exponering via hud eller inhalation kan vara 
nödvändiga för riskbedömning av människors hälsa och/eller kan krävas under vissa regelverk, så innebär båda exponeringsvägarna en betydande teknisk komplexitet. Sådana studier måste utformas från fall till fall, även 
om testmetoden som beskrivs här för bedömningen och utvärderingen av 
kronisk toxicitet skulle kunna utgöra grunden för ett protokoll för inhalations- och/eller hudstudier, med hänsyn tagen till rekommendationer om behandlingsperioder, kliniska eller patologiska parametrar etc. OECD:s 
vägledning finns tillgänglig om administrering av testkemikalier genom in ­
halation (6) (7) och via huden (6). Kapitel B.8 i denna bilaga (8) och kapitel B.29 i denna bilaga (9), tillsammans med OECD:s vägledningsdokument om testning av akut inhalation (7), bör särskilt rådfrågas vid utformningen av 
långsiktiga studier som inbegriper exponering via inhalation. Kapitel B.9 i 
denna bilaga (10) bör rådfrågas när det gäller testning som utförs via huden.
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 439
 
5. Studien om kronisk toxicitet ger information om möjliga hälsofaror som 
sannolikt kan uppstå vid upprepad exponering över en stor del av livsläng ­
den för de arter som används. Studien kommer att ge information om de toxiska effekterna hos testkemikalien, samt indikation om målorgan och möjlig ackumulering. Den kan också ge en uppskattning om de 
icke-observerade nivåerna för skadliga biverkningar som kan användas för 
att fastställa säkerhetskriterier för exponering av människor. Behovet av noggranna kliniska observationer av djuren i syfte att få fram så mycket information som möjligt betonas också. 
6. Målen för de studier som omfattas av denna testmetod inkluderar: 
— Identifieringen av den kroniska toxiciteten för en testkemikalie. 
— Identifieringen av målorganen. — Karakterisering av förhållandet dos-respons. — Identifieringen av nivån där ingen skadlig effekt observeras (NOAEL) 
eller utgångspunkten för upprättandet av en referensdos (BMD). 
— Förutsägelsen av kroniska toxicitetseffekter på nivåer för mänsklig ex ­
ponering. 
— Tillhandahållande av data för att testa hypoteser om verkningssätt (6).
 
INLEDANDE ÖVERVÄGANDEN 
7. Vid bedömningen och utvärderingen av de toxikologiska egenskaperna hos 
en testkemikalie bör all tillgänglig information om testkemikalien beaktas av testlaboratoriet innan studien genomförs, i syfte att fokusera på utform ­
ningen av studien för att mer effektivt testa den kroniska toxicitetspotentia ­
len och minimera användningen av djur. Information som underlättar stud ­
iens utformning inkluderar identitet, kemisk struktur, och fysikalisk-kemiska egenskaper hos testkemikalien, eventuell information om verkningssätt, re ­
sultat från eventuella in vitro- eller in vivo-toxicitetstester; förväntad an ­
vändning(ar) och risken för mänsklig exponering, tillgängliga (Q)SAR- 
data och toxikologiska data om strukturellt närbesläktade kemikalier, till ­
gängliga toxikokinetiska data (engångsdos- och upprepad dos-kinetik om det 
finns tillgängligt) och data från andra studier med upprepad exponering. 
Fastställandet av kronisk toxicitet bör endast utföras efter att inledande information om toxicitet har erhållits från 28-dagars och/eller 90-dagars tester med upprepad dosering. Ett stegvist förhållningssätt till testning av 
kronisk toxicitet bör betraktas som en del av den övergripande bedömningen 
av de potentiella hälsoeffekterna för en viss testkemikalie (11) (12) (13) (14). 
8. De statistiska metoder som är mest lämpade för analys av resultaten, med 
tanke på försöksutformningen och målen, bör fastställas innan studien på ­
börjas. Frågor att överväga kan inbegripa huruvida statistiken ska omfatta 
justeringar för överlevnad och analys i händelse av förtida avlivning av en eller flera grupper. Vägledning om lämpliga statistiska analyser och viktiga referenser till internationellt erkända statistiska metoder ges i väglednings ­
dokument nr 116 (6), samt i vägledningsdokument nr 35 om analys och 
utvärdering av studier över kronisk toxicitet och karcinogenicitet (15).
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 440
 
9. Vid genomförandet av en studie om kronisk toxicitet bör man alltid följa de 
vägledande principer och överväganden som beskrivs i OECD:s vägled ­
ningsdokument nr 19 om erkännande, bedömning och användning av kli ­
niska tecken som humana endpoints för försöksdjur som används i säker ­
hetsbedömningen (16). Se särskilt punkt 62. Detta avsnitt anger att ”I studier 
med upprepad dosering när ett djur visar kliniska tecken som är progressiva, 
vilket leder till ytterligare försämring av tillståndet, bör ett välgrundat beslut tas om man ska eller inte ska avliva djuret av humanitära skäl. Beslutet bör även omfatta övervägandet av värdet av informationen som fås genom fort ­
satt skötsel av det djuret i studien i förhållande till dess övergripande till ­
stånd. Om ett beslut har tagits att låta djuret kvarstå i testet, bör observa ­
tionsfrekvensen ökas vid behov. Det är också möjligt, utan att allvarligt påverka syftet med testet, att tillfälligt upphöra med doseringen om det 
kan minska smärtan eller lidandet, eller att minska testdosen.” 
10. Detaljerad vägledning om och diskussion om principerna för valet av dos 
för studier om kronisk toxicitet och karcinogenicitet finns i väglednings ­
dokument nr 116 (6) samt i två internationella publikationer från Life Sci ­
ences Institute (17) (18). Den centrala strategin för valet av dos är beroende av det primära målet eller målen med studien (punkt 6). Vid val av lämpliga dosnivåer bör en balans uppstå mellan faroundersökning å ena sidan och 
karakterisering av lågdosresponser och deras betydelse på den andra. Detta 
är särskilt relevant i en situation där en kombinerad studie av kronisk tox ­
icitet och karcinogenicitet (kapitel B.33 i denna bilaga) genomförs (punkt 
11). 
11. Man bör överväga att genomföra en kombinerad studie av kronisk toxicitet 
och karcinogenicitet (kapitel B.33 i denna bilaga), snarare än ett separat 
utförande av en studie av kronisk toxicitet (denna testmetod B.30) och en 
studie av karcinogenicitet (kapitel B.32 i denna bilaga). Det kombinerade testet ger större effektivitet vad gäller tid och kostnad jämfört med att jämföra två separata studier, utan att man kompromissar med datans kvalitet 
i antingen den kroniska eller karcinogena fasen. Noggrant övervägande bör 
dock ges för principerna av valet av dos (punkterna 9 och 20–25) vid en kombinerad studie av kronisk toxicitet och karcinogenicitet (kapitel B.33 i denna bilaga), och det är också erkänt att separata studier kan krävas under 
vissa regelverk. 
12. Definitioner som används inom ramen för den här metoden finns i slutet av 
det här kapitlet och i vägledningsdokumentet nr 116 (6).
 
PRINCIP FÖR TESTMETODEN 
13. Testkemikalien administreras dagligen i graderade doser till flera grupper 
försöksdjur, i allmänhet under en 12-månadersperiod, även om kortare eller längre varaktigheter kan väljas beroende på myndighetskrav (se punkt 33). 
Denna längd är vald för att vara tillräckligt lång för att eventuella effekter av 
kumulativ toxicitet blir uppenbara, utan de störande effekterna av geriatriska förändringar. Avvikelser från exponeringstider på 12 månader bör motiveras, särskilt när det gäller kortare varaktigheter. Testkemikalien administreras 
normalt oralt även om inhalation eller via huden också kan vara lämpligt. 
Studiens utformning kan även omfatta en eller flera avlivningar t.ex. vid 3 eller 6 månader, och ytterligare djur kan inkluderas för att tillgodose detta (se punkt 19). Under administreringsperioden observeras djuren noggrant 
efter tecken på toxicitet. Djur som dör eller avlivas under testet obduceras, 
och i slutet av testet avlivas överlevande djur och obduceras.
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 441
 
METODBESKRIVNING  
Val av djurart  
14. Den här testmetoden täcker främst bedömning och utvärdering av kronisk 
toxicitet hos gnagare (se punkt 2) även om liknande studier av icke-gnagare kan krävas under vissa regelverk. Valet av art bör motiveras. Utformning och genomförande av studier av kronisk toxicitet i icke-gnagare, när så 
krävs, bör baseras på de principer som beskrivs i denna testmetod tillsam ­
mans med dem i kapitel B.27 i denna bilaga, 90-dagars oral toxicitetsstudie på icke-gnagare (5). Ytterligare information om val av arter och stam ges i OECD:s vägledningsdokument nr 116 (6). 
15. I den här testmetoden används råtta, även om andra gnagare t.ex. mus kan 
användas. Råttor och möss har föredragits på grund av deras relativt korta livslängd, deras breda användning i farmakologiska och toxikologiska stud ­
ier, deras känslighet för tumörinduktion och tillgången på stammar som 
beskrivits tillräckligt ingående. Som en följd av dessa egenskaper finns en stor mängd information tillgänglig om deras fysiologi och patologi. I testet bör unga friska vuxna djur användas av stammar som vanligtvis används på 
laboratorier. Studien av kronisk toxicitet måste utföras med djur från samma 
stam och ursprung som de som användes i den inledande studien(rna) av toxicitet med kortare varaktighet. Honorna ska inte ha fått ungar och inte vara dräktiga.
 
Inhysnings- och utfodringsförhållanden  
16. Djuren kan inhysas individuellt, eller i små grupper av samma kön; indi ­
viduell inhysning ska endast övervägas om det är vetenskapligt motiverat (19) (20) (21). Burarna bör placeras så att en möjlig påverkan beroende på deras placering minimeras. Temperaturen i försöksdjurens utrymmen bör 
vara 22 °C (± 3 °C). Den relativa fuktigheten bör vara minst 30 % och 
helst inte överstiga 70 % utom när rummet rengörs, och målet bör vara 50–60 %. Belysningen bör vara artificiell, med omväxlande 12 timmar ljus och 12 timmar mörker. För utfodringen kan konventionellt laboratorie ­
foder användas med ett obegränsat utbud av dricksvatten. Kosten ska upp ­
fylla alla näringsmässiga krav för arterna som testas och innehållet av fö ­
roreningar i kosten som kan påverka testresultatet inkluderar, men är ej begränsade till, bekämpningsmedelsrester, långlivade organiska föroreningar, 
fytoöstrogener, tungmetaller och mykotoxiner, och bör vara så låga som 
möjligt. Analytisk information om närings- och kostföroreningsnivåer bör genereras periodiskt, åtminstone i början av studien och när det finns en förändring i det använda partiet, och bör ingå i den slutliga rapporten. 
Analytisk information om dricksvattnet som används i studien ska likaledes 
ingå. Valet av foder kan påverkas av behovet av att säkerställa en lämplig blandning av en testkemikalie och för att tillgodose djurens näringsbehov när testkemikalien tillförs genom kosten.
 
Förberedelse av djuren  
17. Friska djur, som har acklimatiserat sig till laboratoriets betingelser i minst 7 
dagar och inte tidigare har ingått i försök, ska användas. När det gäller 
gnagare bör doseringen av djuren påbörjas snarast möjligt efter avvänjning och acklimatisering, och helst innan djuren är 8 veckor gamla. Försöks ­
djuren bör karakteriseras efter art, stam, ursprung, kön, vikt och ålder. 
Vid undersökningens början bör viktvariationen hos varje kön vara minimal 
och inte överstiga ± 20 % av medelvikten för alla djur inom studien, separat
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 442
 
för varje kön. Djuren fördelas slumpvis i kontroll- och behandlingsgrupper ­
na. Efter randomiseringen bör det inte finnas några signifikanta skillnader i 
genomsnittliga kroppsvikter mellan grupper inom varje kön. Om det finns statistiskt signifikanta skillnader, bör randomiseringssteget upprepas, om möjligt. Varje djur bör tilldelas ett unikt identifikationsnummer, och märkas 
permanent med detta nummer genom tatuering, mikrochipimplantat, eller 
med annan lämplig metod.
 
PROCEDUR  
Djurens antal och kön  
18. Bägge könen ska användas. Ett tillräckligt antal djur ska användas, så att det 
i slutet av studien finns tillräckligt många djur i varje grupp för en grundlig biologisk och statistisk utvärdering. För gnagare ska minst 20 djur per kön 
och grupp normalt användas vid varje dosnivå, medan det för icke-gnagare 
rekommenderas ett minsta antal av 4 per kön och grupp. I studier där möss ingår behövs fler djur i varje dosgrupp för att genomföra alla nödvändiga hematologiska bestämningar.
 
Avsättningar för avlivningar, satellitgrupper och kontrolldjur  
19. Studien får föreskriva avlivningar (minst 10 djur/kön/grupp) t.ex. efter 6 
månader för information om utvecklingen av toxikologiska förändringar och mekanistisk information, om det är vetenskapligt motiverat. Om sådan 
information om testkemikalien redan finns tillgänglig från tidigare toxicitets ­
studier med upprepad dosering kanske inte avlivningar är vetenskapligt motiverade. Satellitgrupper kan också ingå för övervakning av reversibilite ­
ten av eventuella toxikologiska förändringar som orsakats av den testkemi ­
kalie som undersöks, dessa begränsas normalt till studiens högsta dosnivå 
plus kontroll. Ytterligare en grupp kontrolldjur (normalt 5 djur per kön) kan också ingå för övervakning av sjukdomsstatus under studien (22), om nöd ­
vändigt. Om avlivning eller införlivande av satellit- eller kontrollgrupper 
planeras, ska antalet djur som ingår i studien ökas med det antal djur som 
ska avlivas innan studien slutförts. Dessa djur bör normalt genomgå samma observationer, inklusive kroppsvikt, foder-/vattenkonsumtion, hematologiska 
och kliniska biokemiska mätningar och patologiska undersökningar, som 
djuren i den kroniska toxicitetsfasen i huvudstudien, även om avsättningar också kan göras (i avlivningsgruppen) för att mätningarna ska begränsas till vissa viktiga mätningar såsom neurotoxicitet eller immunotoxicitet.
 
Dosgrupper och dosering  
20. Vägledning över alla aspekter av valet av dos och dosnivå finns i vägled ­
ningsdokument nr 116 (6). Minst tre dosnivåer och en parallell kontroll ska användas, utom om ett toleranstest utförs (se punkt 27). Dosnivåer grundas i allmänhet på resultaten från en korttidsstudie med upprepad dosering eller 
en spännviddsstudie och bör beakta eventuella toxikokinetiska data som 
finns tillgängliga om testkemikalien eller närbesläktade kemikalier.
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 443
 
21. Såvida den inte är begränsad genom testkemikaliens fysikalisk-kemiska na ­
tur eller biologiska verkningar, bör den högsta dosnivån normalt väljas för 
att identifiera de viktigaste målorganen och de toxiska effekterna samtidigt som man undviker lidande, svår toxicitet, sjuklighet eller död. Samtidigt som man tar hänsyn till de faktorer som anges nedan i punkt 22, ska den 
högsta dosnivån väljas för att framkalla tecken på toxicitet, vilket framgår av 
till exempel en sänkning av kroppsviktsökningen (ca 10 %). 
22. Dock kan man beroende på målen för studien (se punkt 6), välja en toppdos 
lägre än den dos som ger tecken på toxicitet, t.ex. om en dos framkallar en 
negativ effekt som har liten eller ingen påverkan på livslängd eller kropps ­
vikt. Den övre dosen bör inte överskrida 1 000 mg/kg kroppsvikt/dag (gränsdos, se punkt 27). 
23. Dosnivåer och dosnivåspridning kan väljas för att etablera en dosrespons 
och en NOAEL eller andra avsedda resultat av studien, t.ex. en BMD (se 
punkt 25) för den lägsta dosnivån. Faktorer som bör beaktas i placeringen av lägre doser inkluderar den förväntade lutningen för dosrespons-kurvan, de doser vid vilka viktiga förändringar kan uppstå i metabolismen eller den 
toxiska verkningens art, där ett tröskelvärde förväntas eller där en utgångs ­
punkt för lågdosextrapolering förväntas. 
24. Den dosnivåspridning som väljs beror på testkemikaliens egenskaper och 
kan inte föreskrivas i denna testmetod, men två- till fyrfaldiga dosintervall 
ger ofta bra testprestanda för att fastställa fallande dosnivåer, och tillägg av 
en fjärde testgrupp är att föredra framför användningen av mycket stora intervall (t.ex. en faktor på mer än ca 6–10) mellan doseringarna. I all ­
mänhet bör användningen av faktorer som är större än 10 undvikas och 
motiveras om de används. 
25. Som beskrivs vidare i vägledningsdokument nr 116 (6), inkluderar punkter 
som ska beaktas vid val av dos: 
— Kända eller misstänkta olinjäriteter eller inflexionspunkter i dosrespon ­
sen. 
— Toxikokinetik och dosintervall där metabolisk induktion, mättnad eller 
olinjäritet mellan externa och interna doser uppträder eller ej. 
— Utgångsskador, markörer för verkan eller indikatorer för viktiga under ­
liggande biologiska processer. 
— Nyckelaspekter (eller misstänkta sådana) för verkningsmekanismer, så ­
som doser vid vilka cytotoxicitet börjar uppstå, hormonnivåerna störs, homeostatiska mekanismer är överväldigande etc. 
— Områden i dosrespons-kurvan där en särskilt stabil uppskattning behövs, 
t.ex. intervallet för förväntad BMD eller ett misstänkt tröskelvärde. 
— Beaktande av förväntade exponeringsnivåer för människor.
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 444
 
26. Kontrollgruppen ska vara en obehandlad grupp eller en vehikelkontroll ­
grupp, om en vehikel används för tillförsel av testkemikalien. Med undantag 
av behandlingen med testkemikalien, bör djuren i kontrollgruppen hanteras på exakt samma sätt som de i testgrupperna. Om en vehikel används ska kontrollgruppen tillföras vehikeln i den största volym som används bland 
dosgrupperna. Om en testkemikalie tillförs via kosten och förorsakar ett 
betydligt minskat intag på grund av mindre välsmakande kost, kan ytterli ­
gare en parutfodrad kontrollgrupp vara användbar för en lämpligare kontroll. 
27. Om det kan förväntas, baserat på information från inledande studier, att ett 
test med en dosnivå motsvarande minst 1 000 mg/kg kroppsvikt/dag med hjälp av de förfaranden som beskrivs här inte ger några skadliga effekter, och om toxicitet inte förväntas baserat på data från strukturellt besläktade 
kemikalier, anses en fullständig studie med tre dosnivåer inte vara nödvän ­
dig. En gräns på 1 000 mg/kg kroppsvikt/dag kan tillämpas, utom när mänsklig exponering anger att en högre dosnivå ska användas.
 
Beredning av doser och administrering av testkemikalie  
28. Testkemikalien tillförs vanligtvis oralt, via kosten eller dricksvattnet, eller 
genom sondmatning. Ytterligare information om vägar och metoder för administrering ges i OECD:s vägledningsdokument nr 116 (6). Vägen och metoden för administrering beror på syftet med studien, de fysikalisk/ke ­
miska egenskaperna hos testkemikalien, dess biotillgänglighet och domine ­
rande väg och metod för exponering av människor. En motivering bör ges för vald väg och metod för administrering. Med tanke på djurskydd bör oral sondmatning normalt väljas endast för de ämnen för vilka denna väg och 
metod för administrering representerar en potentiell mänsklig exponering 
(t.ex. läkemedel). För kost- eller miljökemikalier inklusive bekämpnings ­
medel, sker administrering vanligtvis via foder eller dricksvatten. För några situationer, t.ex. arbetsrelaterad exponering, kan administrering via andra 
vägar vara lämpligare. 
29. Vid behov kan testkemikalien upplösas eller suspenderas i en lämplig ve ­
hikel. Hänsyn bör tas till följande egenskaper hos vehikeln och andra till ­
satsämnen, i förekommande fall: Verkningar på absorption, distribution, metabolism eller retention av testkemikalien, verkningar på testkemikaliens kemiska egenskaper som kan förändra dess toxiska egenskaper samt påver ­
kan på foder- eller vattenkonsumtion, eller djurens nutritionsstatus. Det re ­
kommenderas, när så är möjligt, att man först använder en vattenbaserad lösning/suspension följt av en lösning/emulsion i olja (t.ex. majsolja) och därefter eventuell lösning i andra vehiklar. För andra vehiklar än vatten bör 
de toxiska egenskaperna hos vehikeln vara kända. Information om testkemi ­
kaliens stabilitet och doseringslösningarnas eller fodrets homogenitet (i före ­
kommande fall) enligt villkoren för administrering (t.ex. kost), bör finnas tillgängliga. 
30. För kemikalier som tillförs via foder eller dricksvatten är det viktigt att 
säkerställa att kvantiteterna av den berörda testkemikalien inte påverkar normal närings- eller vattenbalans. I långtidsstudier med kostadministrering 
bör koncentrationen av testkemikalien i fodret normalt inte överskrida en 
övre gräns på 5 % av den totala kosten, för att undvika näringsmässig obalans. När testkemikalien tillförs via kosten, kan antingen en konstant foderkoncentration (mg/kg foder eller ppm) eller en konstant dosnivå i för ­
hållande till djurens kroppsvikt (mg/kg kroppsvikt), beräknad på veckobasis, 
användas. Det alternativ som används ska anges.
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 445
 
31. Vad gäller oral administrering doseras djuren med testkemikalien dagligen 
(sju dagar i veckan), vanligtvis under en period på 12 månader (se också 
punkt 33), även om en längre varaktighet kan krävas beroende på myndig ­
hetskrav. Alla andra doseringsscheman, t.ex. fem dagar per vecka, måste motiveras. När det gäller dermal administrering, behandlas djuren normalt 
med testkemikalien minst 6 timmar per dag, 7 dagar per vecka, enligt kapitel 
B.9 i denna bilaga (10), under en period av 12 månader. Exponering genom inhalation utförs 6 timmar per dag, 7 dagar per vecka, men exponering 5 dagar per vecka kan också användas om detta är motiverat. Exponerings ­
perioden är normalt en period på 12 månader. Om andra gnagare än råttor 
utsätts för enbart nos, kan de maximala exponeringstiderna justeras för att minska artspecifikt lidande. En motivering bör ges när man använder en exponeringstid kortare än 6 timmar per dag. Se också kapitel B.8 i denna 
bilaga (8). 
32. När en testkemikalie administreras via sondmatning bör detta ske via en 
magsond eller en lämplig intubationskanyl vid ungefär samma tid varje dag. Normalt administreras en singeldos en gång per dag, men om en kemikalie 
är lokalt irriterande är det möjligt att upprätthålla den dagliga dosen genom 
delad dos (två gånger per dag). Den största mängd vätska som kan admini ­
streras vid ett tillfälle beror på försöksdjurets storlek. Volymen bör vara så liten som möjligt, och bör normalt inte överstiga 1 ml/100 g kroppsvikt för 
gnagare (22). Variationer i testvolym bör minimeras genom justering av 
koncentrationen för att säkerställa en konstant volym vid alla dosnivåer. Potentiellt frätande eller irriterande kemikalier är undantagna, och måste spädas ut för att allvarliga lokala verkningar ska kunna undvikas. Testning 
vid koncentrationer som sannolikt är frätande eller irriterande för magtarm ­
kanalen bör undvikas.
 
Studiens varaktighet  
33. Även om den här testmetoden främst är utformad som en 12-månaders 
kronisk toxicitetsstudie kan den tillämpas på antingen kortare (t.ex. 6 eller 
9 månader) eller längre (t.ex. 18 eller 24 månader) varaktighetsstudier, 
beroende på kraven för särskilda regelverk eller särskilda mekanistiska än ­
damål. Avvikelser från en exponeringstid på 12 månader bör motiveras, särskilt när det gäller kortare varaktigheter. Satellitgrupper som ingår för 
att övervaka reversibiliteten av eventuella toxikologiska förändringar som 
orsakats av den testkemikalie som undersöks, ska bibehållas utan dosering under en period som inte är kortare än 4 veckor och inte längre än en tredjedel av den totala studieperioden efter avslutad exponering. Ytterligare 
vägledning, inklusive en bedömning av överlevnaden i studien finns i väg ­
ledningsdokument nr 116 (6).
 
IAKTTAGELSER 
34. Samtliga djur bör observeras beträffande sjuklighet eller mortalitet, vanligt ­
vis i början och slutet av varje dag, inklusive helger och helgdagar. All ­
männa kliniska observationer bör göras minst en gång per dag, helst vid 
samma tidpunkt(er), och ta hänsyn till maximalt förväntade effekter efter 
doseringen när det gäller administrering via sondmatning.  ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 446
 
35. Detaljerade kliniska observationer bör göras på samtliga djur minst en gång 
före den första exponeringen (för jämförelser inom samma objekt), i slutet 
av studiens första vecka och därefter varje månad. Observationsprotokollet bör anordnas så att variationerna mellan enskilda observatörer minimeras och är oberoende av testgrupp. Dessa observationer bör göras utanför buren 
på avsedd plats, ungefär vid samma tidpunkter varje gång. De bör noggrant 
registreras, helst med hjälp av ett poängsystem som utförligt definierats av testlaboratoriet. Ansträngningar bör göras för att säkerställa att variationer i observationsbetingelserna är minimala. Observationerna bör omfatta, men 
inte begränsas till, förändringar av hud, päls, ögon, slemhinnor, förekomst 
av sekret och utsöndringar samt autonom aktivitet (t.ex. tårflöde, upprest hårrem, pupillstorlek och ovanligt andningsmönster). Förändringar i gång, hållning och reaktion på hantering liksom eventuella kramper eller spasmer, 
stereotypier (t.ex. överdrivet putsande, repetitivt cirklande) eller bisarrt be ­
teende (t.ex. självstympning, baklängesgång) bör också registreras (24). 
36. En oftalmologisk undersökning med ett oftalmoskop eller annan lämplig 
utrustning bör utföras på samtliga djur före den första administreringen av testkemikalien. Vid slutet av studien bör denna undersökning helst utföras på samtliga djur, men åtminstone på högdos- och kontrollgrupperna. Om 
behandlingsrelaterade ögonförändringar upptäcks bör samtliga djur undersö ­
kas. Om strukturell analys eller annan information tyder på okulär toxicitet bör frekvensen på okulära undersökningar höjas. 
37. För kemikalier där tidigare 28-dagars och/eller 90-dagars toxicitetstest med 
upprepad dosering indikerade en potential för att framkalla neurotoxiska 
effekter, bör sensorisk reaktion på stimuli av olika slag (24) (t.ex. hörsel, 
syn och djupsensorisk stimuli) (25), (26), (27), bedömning av greppstyrka (28) och bedömning av motorisk aktivitet (29) eventuellt utföras före studie ­
starten och vid 3-månadersperioder efter studiestarten till och med 12 må ­
nader, samt vid studiens upphörande (om längre än 12 månader). Ytterligare 
uppgifter om de procedurer som kan följas finns i respektive hänvisningar. Dock kan andra procedurer än de som hänvisats till också användas. 
38. För kemikalier där tidigare 28-dagars och/eller 90-dagars toxicitetstester med 
upprepad dosering indikerade en potential för att orsaka immunologiska effekter, kan ytterligare undersökningar av denna endpoint eventuell utföras 
vid avslutningen.
 
Kroppsvikt, foder-/vattenkonsumtion och fodereffektivitet  
39. Samtliga djur bör vägas vid behandlingens början, minst en gång i veckan 
de första 13 veckorna och därefter minst en gång per månad. Mätningar av 
foderkonsumtion och fodereffektivitet bör minst göras varje vecka de 13 
första veckorna och därefter minst en gång per månad. Vattenkonsumtionen bör mätas minst en gång per vecka de 13 första veckorna, och därefter minst varje månad, när kemikalien administreras via dricksvattnet. Mätningar av 
vattenkonsumtionen bör också övervägas för studier där vattendrickandet 
förändras.
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 447
 
Hematologi och klinisk biokemi  
40. I studier med gnagare bör hematologiska undersökningar utföras på minst 10 
handjur och 10 hondjur per grupp, vid 3, 6 och 12 månader, samt vid studiens slut (om längre än 12 månader), på samma djur hela tiden. Satellit ­
djur kan behövas när det gäller möss för att genomföra alla nödvändiga 
hematologiska bestämningar (se punkt 18). För icke-gnagare måste prover tas från ett mindre antal djur (t.ex. 4 djur per kön och per grupp för hund ­
studier) vid mellanliggande provtagningstillfällen och avslutandet enligt vad 
som beskrivits för gnagare. Mätningar vid 3 månader, antingen på gnagare 
eller icke-gnagare, behöver inte utföras om inga effekter syntes på hemato ­
logiska parametrar i en tidigare 90-dagars studie som genomfördes med 
jämförbara dosnivåer. Blodprover bör tas under narkos från angivet ställe, 
till exempel genom hjärtpunktering eller från retro-orbitalsinus. 
41. Följande lista över parametrar bör undersökas (30): total- och differential ­
räkning av vita blodkroppar, erytrocytantal, trombocytantal, hemoglobinkon ­
centration, hematokrit (packad cellvolym), medelvärde för korpuskulärvolym 
(MCV), medelvärde för korpuskulärt hemoglobin (MCH), medelvärde för korpuskulär hemoglobinkoncentration (MCHC), protrombintid och aktiverad partiell tromboplastintid. Övriga hematologiska parametrar såsom 
Heinz-kroppar eller annan atypisk erytrocytmorfologi eller methemoglobin 
kan mätas på lämpligt sätt beroende på testkemikaliens toxicitet. Samman ­
taget bör en flexibel strategi antas, beroende på den observerade och/eller förväntade verkningen av en given testkemikalie. Om testkemikalien har en 
effekt på det hematopoetiska systemet, kan retikulocytantal och benmärgs ­
cytologi också anges, men detta behöver inte utföras rutinmässigt. 
42. Kliniska biokemiska bestämningar för att undersöka större toxiska effekter i 
vävnader och, särskilt, effekter på lever och njurar bör utföras på blodprov 
från minst 10 handjur och 10 hondjur per grupp, vid samma tidsintervall 
som specificerades för den hematologiska undersökningen, med samma djur hela tiden. Satellitdjur kan behövas när det gäller möss för att genomföra alla nödvändiga kliniska biokemiska bestämningar. För icke-gnagare måste 
prover tas från ett mindre antal djur (t.ex. 4 djur per kön och per grupp för 
hundstudier) vid mellanliggande provtagningstillfällen och avslutandet enligt vad som beskrivits för gnagare. Mätningar vid 3 månader, antingen på gnagare eller icke-gnagare, behöver inte utföras om inga effekter syntes 
på kliniska biokemiska parametrar i en tidigare 90-dagars studie som ge ­
nomfördes med jämförbara dosnivåer. Det rekommenderas att djuren fastar över natten (med undantag av möss) före blodprovstagningen. Följande lista över parametrar bör undersökas (30): glukos, urea (ureakväve), kreatinin, 
totalprotein, albumin, kalcium, natrium, kalium, totalkolesterol, minst två 
lämpliga tester för hepatocellular utvärdering (alaninaminotransferas, aspar ­
tataminotransferas, glutamatdehydrogenas, totala gallsyror) (31), och minst två lämpliga tester för hepatobiliär utvärdering (alkaliskt fosfatas, gammag ­
lutamyl transferas, 5’-nukleotidas, totalt bilirubin, totala gallsyror) (31). An ­
dra kliniska kemiska parametrar såsom triglycerider vid fasta, specifika hormoner och kolinesteras kan mätas på lämpligt sätt, beroende på testkemi ­
kaliens toxicitet. Sammantaget finns det ett behov av en flexibel strategi, 
beroende på den observerade och/eller förväntade verkningen av en given 
testkemikalie.
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 448
 
43. Urinanalyserna bör utföras på minst 10 handjur och 10 hondjur per grupp, 
på prov som tagits vid samma intervaller som för hematologi och klinisk 
kemi. Mätningar vid 3 månader behöver inte utföras om ingen effekt syntes på urinanalysen i en tidigare 90-dagars studie som genomfördes med jäm ­
förbara dosnivåer. Följande lista över parametrar ingick i en sakkunnig 
rekommendation om kliniska patologiska studier (30): utseende, volym, os ­
molalitet eller specifik vikt, pH, totalprotein och glukos. Andra bestäm ­
ningar inkluderar keton, urobilinogen, bilirubin och ockult blödning. Ytter ­
ligare parametrar kan användas vid behov för att utvidga undersökningen av 
observerad(e) verkning(ar). 
44. Det anses allmänt att utgångsvärden för hematologiska och kliniska kemiska 
variabler behövs före behandlingen i hundstudier, men inte behöver bestäm ­
mas för studier i gnagare (30). Om historiska basdata (se punkt 50) är otillräckliga bör man överväga att generera sådana data.
 
Patologi  
Obduktion  
45. Samtliga djur i studien bör normalt underkastas en fullständig obduktion, 
som omfattar omsorgsfull granskning av kroppens yttre ytor, alla kropps ­
öppningar samt kranium, bröst- och bukhåla och deras innehåll. En bestäm ­
melse kan också göras (i avlivnings- eller satellitgrupperna) så att mätning ­
arna begränsas till vissa viktiga åtgärder, såsom neurotoxicitet eller immu ­
notoxicitet (se punkt 19). Dessa djur behöver inte obduceras och efterföl ­
jande procedurer beskrivs i nedanstående punkter. Obduktion kan från fall till fall krävas av indikatordjur, efter beslut av försöksledaren. 
46. Organvikter bör samlas från samtliga djur, förutom de som undantas genom 
den senare delen av punkt 45. Binjurar, hjärna, bitestiklar, hjärta, njurar, lever, äggstockar, mjälte, testiklar, sköldkörtel (vägda efter fixering, med 
bisköldkörtlar) och livmoder från samtliga djur (bortsett från de döende 
och/eller avlivade) putsas från angränsande vävnad, i förekommande fall, och deras våtvikt bestäms så snart som möjligt efter dissektionen för att undvika uttorkning. I studier med möss är det valfritt med vägning av 
binjurarna. 
47. Följande vävnader bör bevaras i det mest lämpade fixeringsmedlet för både 
vävnadstypen och den planerade efterföljande histopatologiska undersök ­
ningen (32) (vävnader inom hakparenteser är valfria): 
alla större skador hjärta pankreas mage (förmagen, 
glandulärmagen) 
binjure ileum bisköldkörtel [tänder] 
aorta jejunum perifer nerv testikel hjärna (inklusive delar av 
cerebrum, cerebellum och medulla/pons) njure hypofys tymus 
cekum tårkörtel (exorbital) prostata sköldkörtel 
cervix lever rektum [tunga]
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 449
 
koagulerande körtel lunga spottkörtel trakea 
kolon lymfkörtlar (både ytliga 
och djupa) sädesblåsa urinblåsa 
tolvfingertarm bröstkörtel (obligatorisk 
för honor, och om synlig 
och dissekeringsbar hos hanar) skelettmuskel uterus (inklusive cervix) 
bitestikel [övre luftvägarna, inklu ­
sive nos, turbinates och 
bihålorna] hud [ureter] 
öga (inklusive näthinna) esofagus ryggmärg (på tre nivåer: 
cervikal, mitt på bröst ­
korgen och ländryggen) [uretra] 
[lårben med led] [luktbulb] mjälte vagina 
gallblåsa (för andra arter än 
råtta) äggstock [bröstben], snitt av ryggmärgen och/eller 
ett färskt benmärgsaspirat 
Harderiankörtel 
När det gäller parvisa organ t.ex. njure, binjure, bör båda organen bevaras. 
Kliniska och andra fynd kan indikera behovet av att undersöka ytterligare vävnader. Också alla organ som sannolikt är målorgan, baserat på kunskap om testkemikaliens egenskaper, ska konserveras. I studier som inbegriper 
administrering via huden bör organen som anges för oralt intag bevaras, och 
det är viktigt med särskild provtagning och bevarande av huden där appli ­
ceringen har skett. I inhalationsstudier bör förteckningen över bevarade och undersökta vävnader från luftvägarna följa rekommendationerna i kapitel 
B.8 (8) och kapitel B.29 i denna bilaga (9). För andra organ/vävnader 
(och i tillägg till de specifikt bevarade vävnaderna från luftvägarna) bör de organ som finns i förteckningen som anges för den orala vägen under ­
sökas.
 
Histopatologi  
48. Vägledning finns tillgänglig om bästa praxis vid genomförande av studier 
gällande toxikologisk patologi (32). Den minsta histopatologiska undersök ­
ningen bör vara: 
— Alla vävnader från högdos- och kontrollgrupperna. — Alla vävnader från djur som dör eller avlivas under studien. — Alla vävnader som uppvisar makroskopiska abnormaliteter. — Målvävnader, eller vävnader som uppvisade behandlingsrelaterade för ­
ändringar i högdosgruppen, från samtliga djur i alla andra doserings ­
grupper. 
— När det gäller parvisa organ t.ex. njure, binjure, bör båda organen un ­
dersökas.
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 450
 
DATA OCH RAPPORTERING  
Data  
49. Individuella data för samtliga utvärderade parametrar bör ges. Därutöver bör 
alla data sammanfattas i tabellform, som för varje testgrupp visar antal djur vid testets början, antal djur som påfanns döda under testet eller som av ­
livats av humanitära skäl och tidpunkten för dödsfallen eller avlivningen, 
antal djur som visar tecken på toxicitet, en beskrivning av de tecken på 
toxicitet som observerats, inklusive tidpunkt för de första tecknen, varaktig ­
het och hur allvarliga de toxiska verkningarna är, antal djur som uppvisar skador, typ av skador och procentandelen djur för varje typ av skada. 
Sammanfattande tabeller bör ge medelvärden och standardavvikelser (för 
kontinuerliga testdata) för djur som uppvisar toxiska effekter eller skador, i tillägg till skadornas gradering. 
50. Historiska kontrolldata kan vara värdefulla vid tolkningen av studiens resul ­
tat, t.ex. i de fall då det finns indikationer på att de data som lämnats från de 
parallella kontrollerna i huvudsak avviker jämfört med aktuell data från 
kontrolldjuren från samma testanläggning/-koloni. Historiska kontrolldata, om de har utvärderats, bör lämnas in från samma laboratorium och relatera till djur i samma ålder och av samma stam som genererats under de fem år 
som föregick studien i fråga. 
51. När det är tillämpligt bör numeriska resultat utvärderas genom en lämplig 
och allmänt vedertagen statistisk metod. De statistiska metoderna och datan som ska analyseras bör väljas vid utformningen av studien (punkt 8). Valet bör innehålla bestämmelser om överlevnadsjusteringar, där så krävs.
 
Testrapport  
52. Testrapporten ska omfatta följande information:  
Testkemikalie:  
— Fysikalisk natur, renhet och fysikalisk-kemiska egenskaper. — Identifikationsuppgifter. — Kemikaliens källa. — Satsnummer. 
— Intyg om kemisk analys.  
Vehikel (i förekommande fall):  
— Motivering för val av vehikel (om annan än vatten).  
Försöksdjur:  
— Art/stam som används och motivering av valet. — Djurens antal, ålder och kön vid testets början.
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 451
 
— Ursprung, inhysning, kost etc. 
— Djurens individuella vikt vid testets början.  
Försöksbetingelser:  
— Grund för administreringssätt och dosval. — I förekommande fall, de statistiska metoderna som använts för att ana ­
lysera datan. 
— Uppgifter om testkemikaliens sammansättning/foderberedning. — Analysdata om beredningens uppnådda koncentration, stabilitet och ho ­
mogenitet. 
— Administreringssätt och uppgifter om testkemikaliens administrering. — Om enbart nos eller helkropp vid inhalationsstudier. — Faktiska doser (mg/kg kroppsvikt/dag) och omräkningsfaktor för ko ­
stens/dricksvattnets testkemikaliekoncentration (mg/kg eller ppm) till 
den faktiska dosen, om tillämpligt. 
— Uppgifter om foder- och vattenkvalitet.  
Resultat (sammanfattande data i tabellform och enskilda djurdata ska pre ­
senteras):  
— Överlevnadsdata. 
— Kroppsvikt/kroppsviktsförändringar. 
— Foderförbrukning, beräkningar av fodereffektivitet, om det har utförts, 
och vattenförbrukning, om tillämpligt. 
— Uppgifter om toxiska reaktioner efter kön och dosnivå, inklusive tecken 
på toxicitet. 
— Art, förekomst (och, om protokoll förts, allvarlighetsgrad) och de kli ­
niska observationernas varaktighet (om övergående eller permanenta). 
— Oftalmologiska undersökningar. — Hematologiska tester. — Kliniska biokemiska undersökningar. — Urinanalystester. 
— Resultaten från eventuella undersökningar av neurotoxicitet eller immu ­
notoxicitet. 
— Terminal kroppsvikt. — Organvikter (och deras kvoter, om tillämpligt). — Obduktionsfynd. 
— En detaljerad beskrivning av samtliga behandlingsrelaterade histopatolo ­
giska fynd. 
— Absorptionsdata, i förekommande fall.
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 452
 
Statistisk bearbetning av resultaten, när så är lämpligt 
Diskussion av resultaten, inklusive:  
— Dos: responssamband 
— Beaktande av eventuell information om verkningssätt. 
— Diskussion om eventuella modellstrategier. 
— BMD-, NOAEL- eller LOAEL-bestämning. 
— Historiska kontrolldata. 
— Relevans för människor.  
Slutsatser  
LITTERATUR  
(1) OECD (1995). Report of the Consultation Meeting on Sub-chronic and 
Chronic Toxicity/Carcinogenicity Testing (Rome, 1995), internal working document, Environment Directorate, OECD, Paris. 
(2) Combes RD, Gaunt I, Balls M (2004). A Scientific and Animal Welfare 
Assessment of the OECD Health Effects Test Guidelines for the Safety Testing of Chemicals under the European Union REACH System. ATLA 32: 163–208. 
(3) Barlow SM, Greig JB, Bridges JW  et al.  (2002). Hazard identification by 
methods of animal-based toxicology. Food. Chem. Toxicol. 40, 145–191. 
(4) Chhabra RS, Bucher JR, Wolfe M, Portier C (2003). Toxicity characteri ­
zation of environmental chemicals by the US National Toxicology Program ­
me: an overview. Int. J. Hyg. Environ. Health 206: 437–445. 
(5) Kapitel B.27 i denna bilaga, test avseende subkronisk oral toxicitet (90- 
dagars upprepat oraltest på icke-gnagare). 
(6) OECD (2012). Guidance Document on the Design and Conduct of Chronic 
Toxicity and Carcinogenicity Studies, Supporting Test Guidelines 451, 452 and 453 - Second edition. Series on Testing and Assessment No. 116, available on the OECD public website for Test Guideline at www.oecd.org/ 
env/testguidelines. 
(7) OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing, 
Series on Testing and Assessment N°39, ENV/JM/MONO (2009) 28, 
OECD, Paris. 
(8) Kapitel B.8 i denna bilaga, subakut inhalationstoxicitet: 28-dagars studie. 
(9) Kapitel B.29 i denna bilaga, subkronisk inhalationstoxicitet: 90-dagars stud ­
ie. 
(10) Kapitel B.9 i denna bilaga, toxicitet vid upprepad dosering (28 dagar, 
dermalt). 
(11) Carmichael NG, Barton HA, Boobis AR  et al.  (2006). Agricultural Chem ­
ical Safety Assessment: A Multisector Approach to the Modernization of 
Human Safety Requirements. Critical Reviews in Toxicology 36: 1–7. 
(12) Barton HA, Pastoor TP, Baetcke T  et al.  (2006). The Acquisition and 
Application of Absorption, Distribution, Metabolism, and 
Excretion (ADME) Data in Agricultural Chemical Safety Assessments. Crit ­
ical Reviews in Toxicology 36: 9–35. 
(13) Doe JE, Boobis AR, Blacker A  et al.  (2006). A Tiered Approach to Sys ­
temic Toxicity Testing for Agricultural Chemical Safety Assessment. Crit ­
ical Reviews in Toxicology 36: 37–68.
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 453
 
(14) Cooper RL, Lamb JS, Barlow SM  et al . (2006). A Tiered Approach to Life 
Stages Testing for Agricultural Chemical Safety Assessment. Critical Re ­
views in Toxicology 36: 69–98. 
(15) OECD (2002). Guidance Notes for Analysis and Evaluation of Chronic 
Toxicity and Carcinogenicity Studies, Series on Testing and Assessment 
No. 35 and Series on Pesticides No. 14, ENV/JM/MONO(2002)19, OECD, Paris. 
(16) OECD (2000). Guidance Document on the recognition, assessment, and use 
of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in safety evaluation, No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Paris. 
(17) Rhomberg LR, Baetcke K, Blancato J, Bus J, Cohen S, Conolly R, Dixit R, 
Doe J, Ekelman K, Fenner-Crisp P, Harvey P, Hattis D, Jacobs A, Jacobson-Kram D, Lewandowski T, Liteplo R, Pelkonen O, Rice J, Somers D, Turturro A, West W, Olin S (2007). Issues in the Design and Inter ­
pretation of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies in Rodents: App ­
roaches to Dose Selection Crit Rev. Toxicol. 37 (9): 729–837. 
(18) ILSI (International Life Sciences Institute) (1997). Principles for the Selec ­
tion of Doses in Chronic Rodent Bioassays. Foran JA (Ed.). ILSI Press, Washington, DC. 
(19) Europaparlamentets och rådets direktiv 2010/63/EU av den 22 september 
2010 om skydd av djur som används för vetenskapliga ändamål (EUT L 276, 20.10.2010, s. 33). 
(20) National Research Council, 1985. Guide for the care and use of laboratory 
animals. NIH Publication No. 86-23. Washington D.C., US. Dept. of Health and Human Services. 
(21) GV-SOLAS (Society for Laboratory Animal Science, Gesellschaft für Ver ­
suchstierkunde, 1988). Publication on the Planning and Structure of Animal Facilities for Institutes Performing Animal Experiments. ISBN 3-906255- 04-2. 
(22) GV-SOLAS (Society for Laboratory Animal Science, Gesellschaft für Ver ­
suchstierkunde, 2006). Microbiological monitoring of laboratory animals in 
various housing systems. 
(23) Diehl K-H, Hull R, Morton D, Pfister R, Rabemampianina Y, Smith D, 
Vidal J-M, van de Vorstenbosch C. 2001. A good practice guide to the 
administration of substances and removal of blood, including routes and 
volumes. Journal of Applied Toxicology 21:15–23. 
(24) IPCS (1986). Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity 
Associated with Exposure to Chemicals. Environmental Health Criteria Do ­
cument No. 60. 
(25) Tupper DE, Wallace RB (1980). Utility of the Neurologic Examination in 
Rats. Acta Neurobiol. Exp. 40: 999–1003. 
(26) Gad SC (1982). A Neuromuscular Screen for Use in Industrial Toxicology. 
J. Toxicol.Environ. Health 9: 691–704. 
(27) Moser VC, McDaniel KM, Phillips PM (1991). Rat Strain and Stock Com ­
parisons Using a Functional Observational Battery: Baseline Values and 
Effects of Amitraz. Toxicol. Appl. Pharmacol. 108: 267–283. 
(28) Meyer OA, Tilson HA, Byrd WC, Riley MT (1979). A Method for the 
RoutineAssessment of Fore- and Hind-limb Grip Strength of Rats and Mice. 
Neurobehav. Toxicol. 1: 233–236. 
(29) Crofton KM, Howard JL, Moser VC, Gill MW, Reiter LW, Tilson HA, 
MacPhail RC (1991). Interlaboratory Comparison of Motor Activity Experi ­
ments: Implication for Neurotoxicological Assessments. Neurotoxicol. Te ­
ratol. 13: 599–609.
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 454
 
(30) Weingand K, Brown G, Hall R  et al.  (1996). Harmonisation of Animal 
Clinical Pathology Testing in Toxicity and Safety Studies. Fundam. & 
Appl. Toxicol. 29: 198–201. 
(31) EMEA (draft) document ”Non-clinical guideline on drug-induced hepato ­
toxicity” (Doc. Ref. EMEA/CHMP/SWP/a50115/2006). 
(32) Crissman JW, Goodman DG, Hildebrandt PK et al. (2004). Best Practices 
Guideline: Toxicological Histopathology. Toxicologic Pathology 32: 
126–131.  ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 455
 
Tillägg 1  
DEFINITION  
Testkemikalie:  Alla ämnen eller blandningar som testas med denna testmetod.  ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 456
 
B.31  TEST AVSEENDE PRENATAL UTVECKLINGSTOXICITET  
1. METOD  
Denna metod är i stort sett identisk med OECD TG 414 (2001).  
1.1 INLEDNING 
Denna metod för test av utvecklingstoxicitet är avsedd att ge allmän 
information om verkningarna av prenatal exponering på dräktiga försöksdjur och på den organism som utvecklas i livmodern. Detta 
kan inbegripa utvärdering av verkningarna på såväl modern som på 
fostret (död, strukturella abnormaliteter eller avvikande tillväxt). Funktionsstörningar omfattas inte av denna testmetod, även om de utgör en viktig del av utvecklingen. Funktionsstörningar kan testas 
separat eller i kombination med detta test genom användning av 
metoden för test avseende utvecklingsneurotoxicitet. För information om testning av funktionsstörningar och andra postnatala verkningar 
hänvisas till testmetoden för reproduktionstoxicitet på två generatio ­
ner och till testmetoden för utvecklingsneurotoxicitet. 
Denna testmetod kan i enskilda fall behöva anpassas i enlighet med 
speciell kännedom om t.ex. de fysikalisk-kemiska eller toxikologiska egenskaperna hos det ämne som testas. Sådan anpassning kan godtas om det föreligger övertygande vetenskapliga bevis om att anpass ­
ningen leder till ett mer informativt test. I sådana fall bör testrappor ­
ten innehålla en detaljerad redogörelse för de vetenskapliga bevis som åberopas.
 
1.2 DEFINITIONER  
Utvecklingstoxikologi:  Undersökning av sådana skadliga verkningar 
på en organism under utveckling som kan uppstå till följd av expo ­
nering före befruktningen, under den prenatala utvecklingen eller 
postnatalt fram till könsmognaden. Utvecklingstoxiciteten tar sig 
främst uttryck som 1) organismens död, 2) strukturell abnormalitet, 3) avvikande tillväxt och 4) funktionsstörningar. Utvecklingstoxicitet benämndes tidigare ofta teratogenicitet.  
Skadlig verkning:  Varje sådan behandlingsrelaterad avvikelse från 
normaltillståndet som minskar organismens förmåga att överleva, 
föröka sig eller anpassa sig till omgivningen. Begreppet utvecklings ­
toxicitet i dess vidaste mening omfattar alla verkningar som stör den normala utvecklingen hos conceptus, både före och efter födseln.  
Avvikande tillväxt:  En vikt- eller storleksavvikelse hos avkommans 
organ eller kropp.  
Avvikelser (anomalier):  Strukturella utvecklingsavvikelser; här in ­
begrips både missbildningar och variationer (28).  
Missbildning/betydande abnormalitet:  En strukturell ändring som 
bedöms vara skadlig för djuret (kan också vara dödlig) och som i 
regel är sällsynt.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 457
 
Variation/mindre abnormalitet:  En strukturell ändring som bedöms 
vara endast lite eller inte alls skadlig för djuret; den kan vara över ­
gående och vara relativt vanlig hos kontrollpopulationen.  
Conceptus:  Summan av derivat från ett befruktat ägg vid varje 
utvecklingsstadium från befruktning till födsel; här inbegrips omgi ­
vande membran samt själva embryot eller fostret.  
Implantation (nidation):  Det förlopp då blastocyten fäster sig vid 
livmoderns epitelhinna; här ingår blastocytens penetrering av livmo ­
derepitelet och inbäddning i endometriet.  
Embryo:  Det tidiga utvecklingsstadiet hos en organism, särskilt den 
produkt som utvecklas till följd av befruktningen av ett ägg, från det att den långa axeln har framträtt tills alla viktiga strukturer finns 
närvarande.  
Embryotoxicitet:  Skadlig för den normala strukturen, utvecklingen, 
tillväxten eller livsdugligheten hos ett embryo.  
Foster:  Den ofödda avkomman under den postembryonala perioden.  
Fostertoxicitet:  Skadlig för den normala strukturen, utvecklingen, 
tillväxten eller livsdugligheten hos ett foster.  
Abort:  Prematur utstötning av befruktningsprodukterna (embryot el ­
ler ett icke-livsdugligt foster) ur livmodern.  
Resorption:  Conceptus som har dött efter implantationen i livmo ­
dern och som resorberas eller har resorberats.  
Tidig resorption:  Tecken på implantation utan ett igenkännbart em ­
bryo eller foster.  
Sen resorption:  Dött embryo eller foster med externa degenerativa 
förändringar.  
NOAEL:  Förkortning för ’no-observed-adverse-effect level’ (nivå 
där inga skadliga verkningar observeras), dvs. den högsta dos- eller 
exponeringsnivå vid vilken inga skadliga behandlingsrelaterade verk ­
ningar kan observeras.
 
1.3 REFERENSÄMNE 
Inga.  
1.4 PRINCIP FÖR TESTMETODEN 
Normalt tillförs testämnet till de dräktiga djuren minst från tidpunk ­
ten för implantationen till en dag före den planenliga avlivnings ­
dagen. Den senare bör ligga så nära den normala nedkomstdagen 
som möjligt utan att det finns risk för att testdata går förlorade på grund av prematur nedkomst. Testmetoden är inte avsedd för under ­
sökning enbart av organogenesperioden (t.ex. dag 5–15 hos gnagare 
och dag 6–18 hos kanin), utan även av verkningarna från tidpunkten 
för preimplantation (när det är tillämpligt) genom hela dräktighets ­
perioden fram till dagen före kejsarsnittet. Kort före kejsarsnittet avlivas hondjuren, livmoderinnehållet undersöks och fostren under ­
söks med avseende på externt observerbara anomalier och med av ­
seende på mjukvävnads- och skelettavvikelser.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 458
 
1.5 BESKRIVNING AV TESTMETODEN  
1.5.1  Val av djurart  
Det rekommenderas att testningen görs på de mest relevanta arterna, 
och att laboratoriearterna och stammarna är desamma som normalt 
används för testning av prenatal utvecklingstoxicitet. Rekommende ­
rad gnagare är råtta och rekommenderad icke-gnagare är kanin. Om andra arter används måste detta motiveras.
 
1.5.2  Förvarings- och utfodringsbetingelser  
Temperaturen i försöksdjurens rum bör vara 22  o C (± 3  o C) för 
gnagare och 18  o C (± 3  o C) för kaniner. Den relativa fuktigheten 
bör vara minst 30 % och helst inte överstiga 70 %, utom när rummet 
rengörs. Målvärdet bör dock vara 50–60 %. Belysningen bör vara 
artificiell med omväxlande 12 timmar ljus och 12 timmar mörker. För utfodringen kan konventionellt laboratoriefoder användas, och djuren bör ha obegränsad tillgång till dricksvatten. 
För parningsprocedurerna används burar som är lämpliga för ända ­
målet. Även om individuell inhysning av parade djur är att rekom ­
mendera, godtas även inhysning i små grupper.
 
1.5.3  Förberedelse av djuren  
För testet används friska djur som har acklimatiserats till laborato ­
riemiljön under minst fem dagar och som inte har använts för tidi ­
gare test. Försöksdjuren karakteriseras enligt art, stam, ursprung, kön, vikt och ålder. Djuren i alla testgrupper bör vara så lika som möjligt med avseende på vikt och ålder. För alla dosnivåer används 
unga vuxna hondjur som inte har fått ungar. Hondjuren bör paras 
med handjur av samma art och stam. Parning av syskon bör undvi ­
kas. För gnagare räknas dräktighetsdag 0 som den dag då en vaginal ­
propp eller sperma kan observeras. För kaniner räknas dag 0 i regel 
som dagen för coitus eller artificiell insemination, om sådan används. 
De parade hondjuren fördelas slumpmässigt i kontroll- och behand ­
lingsgrupper. Burarna placeras i sådan ordning att eventuella verk ­
ningar på grund av placeringen minimeras. Varje djur förses med ett 
unikt identifieringsnummer. De parade hondjuren fördelas slumpmäs ­
sigt i kontroll- och behandlingsgrupper. Om hondjuren paras i satser bör djuren i varje sats fördelas jämnt över grupperna. Likaså bör 
hondjur som har befruktats av samma handjur fördelas jämnt över 
grupperna.
 
1.6 FÖRFARANDE  
1.6.1  Djurens antal och kön  
Varje test- och kontrollgrupp bör innehålla ett tillräckligt antal hon ­
djur för att det vid obduktionen ska finnas cirka 20 hondjur som har implantation. Grupper där mindre än 16 djur har implantation kan vara olämpligt. Mortalitet hos moderdjuren leder inte nödvändigtvis 
till att testet blir ogiltigt, förutsatt att mortaliteten inte överskrider 
cirka 10 %.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 459
 
1.6.2  Förberedelse av doserna  
Om vehikel eller någon annan tillsats används för att underlätta till ­
förseln bör följande beaktas: Verkningarna på absorption, distribu ­
tion, metabolism och kvarhållande eller utsöndring av testämnet; 
verkningarna på testämnets kemiska egenskaper till den del dessa 
verkningar kan påverka testämnets toxiska egenskaper samt verk ­
ningarna på försöksdjurens foder- eller vattenintag eller deras nä ­
ringstillstånd. Den vehikel som används får inte vara utvecklingstox ­
isk eller påverka reproduktionen.  
1.6.3  Dosering  
Testämnet bör i regel ges dagligen från och med implantationen 
(t.ex. dag 5 efter parningen) fram till dagen före det planenliga 
kejsarsnittet. Om preliminära test, i den mån sådana har gjorts, inte 
indikerar en hög potential för förluster före implantationen kan be ­
handlingen förlängas till att omfatta hela dräktighets-perioden, från parningen till dagen före den planenliga avlivningen. Det är allmänt 
känt att olämplig hantering eller stress under dräktigheten kan leda 
till prenatala förluster. För att förebygga prenatala förluster på grund av faktorer som inte är behandlingsrelaterade bör onödig hantering av dräktiga djur undvikas. Likaså bör man undvika att utsätta sådana 
djur för stress på grund av externa faktorer såsom buller. 
Minst tre dosnivåer och en parallell kontrollgrupp bör användas. 
Friska djur fördelas slumpmässigt i kontroll- och behandlingsgrup ­
per. Dosnivåerna bör väljas så att en gradering av de toxiska effek ­
terna erhålls. Såvida det inte finns några begränsningar till följd av testämnets fysikalisk-kemiska eller biologiska egenskaper bör den högsta dosen väljas så att den förväntas förorsaka en viss utveck ­
lingstoxicitet och/eller toxiska verkningar på moderdjuret (kliniska 
tecken eller minskning av kroppsvikten), men inte död eller allvarligt lidande. Minst en av de mellanliggande dosnivåerna bör ge minsta möjliga observerbara toxiska verkningar. Den lägsta dosnivån bör 
inte ge några tecken på toxicitet hos moderdjuret eller utvecklings ­
toxicitet. Därefter väljs dosnivåerna i fallande skala så att en dos ­
relaterad reaktion kan påvisas. En nivå bör väljas så att inga påvis ­
bara skadliga verkningar (NOAEL) uppstår. För fallande dosnivåer 
är två- till fyrfaldiga dosintervall ofta optimala. Tillägg av en fjärde 
testgrupp är att föredra framför användning av mycket breda intervall mellan dosnivåerna (t.ex. en faktor som är högre än cirka 6–10). Även om fastställandet av en NOAEL-nivå för moderdjuret är ett 
mål, kan även test där en sådan nivå inte fastställs vara godtagbara 
Dosnivåerna bör väljas med hänsyn till alla kända toxicitetsuppgifter 
och all känd tilläggsinformation om metabolismen och de toxikoki ­
netiska egenskaperna hos testämnet eller närbesläktade material. 
Denna information är också till hjälp när det gäller att demonstrera lämpligheten hos dossystemet. 
En parallell kontrollgrupp bör användas. Kontrollgruppen ska vara en 
obehandlad grupp eller en vehikelkontrollgrupp, om vehikel används 
för tillförsel av testämnet. Alla grupper ges samma volym av tes ­
tämnet eller vehikeln. Djuren i kontrollgruppen (kontrollgrupperna) bör hanteras på samma sätt som testgruppsdjuren. Vehikelkontroll ­
grupperna bör få vehikel i den största mängd som används (samma 
mängd som ges till den grupp som får den lägsta dosen).
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 460
 
1.6.4  Gränstest (limit-test)  
Om ett test med en dosnivå om minst 1 000 mg oralt per kroppsvikt 
och dag genomförs på det sätt som beskrivs här, och inga toxiska verkningar kan observeras hos de dräktiga djuren eller deras avkom ­
ma, och om verkningar inte förväntas på grundval av kända data 
(t.ex. data om strukturellt eller metaboliskt närbesläktade ämnen), kan ett fullständigt test med tre dosnivåer bedömas vara överflödigt. Om det är sannolikt att människor kommer att utsättas för expone ­
ring måste eventuellt en högre oral dosnivå användas vid gränstestet. 
För andra former av tillförsel, såsom inandning eller applicering på huden, kan testämnets fysikalisk-kemiska egenskaper ofta indikera 
och begränsa den maximala exponeringsnivån (t.ex. applicering på 
huden får inte förorsaka allvarlig lokal toxicitet).
 
1.6.5  Tillförsel av doser  
Testämnet eller vehikeln tillförs i regel oralt via intubation. Om 
någon annan tillförselväg används bör detta motiveras och det kan vara nödvändigt med tillämpliga modifikationer (2)(3)(4). Testämnet bör tillföras vid ungefär samma tid varje dag. 
Dosen till individuella djur bör i regel basera sig på den senaste 
bestämningen av djurets kroppsvikt. Försiktighet bör dock iakttas 
när dosen justeras under dräktighetens sista tredjedel. Dosen bör 
väljas med hänsyn till kända data så att överdrivet kraftig toxicitet på moderdjuret kan undvikas. Om kraftig toxicitet ändå observeras på behandlade moderdjur bör dessa avlivas på ett humant sätt. Om 
flera dräktiga djur visar tecken på kraftig toxicitet bör man överväga 
att avsluta den dosgruppen. Om testämnet tillförs genom sondmat ­
ning rekommenderas att hela dosen tillförs på en gång via magsond eller lämplig intubationskanyl. Den största mängd vätska som kan 
tillföras vid ett och samma tillfälle beror på försöksdjurets storlek. 
Volymen får inte överstiga 1 ml per 100 g kroppsvikt, utom för vattenlösningar där volymen kan uppgå till 2 ml per 100 g kropps ­
vikt. Om majsolja används som vehikel får volymen inte överskrida 
0,4 ml per 100 g kroppsvikt. Variationerna i testvolym bör minime ­
ras genom att man justerar koncentrationerna så att en konstant volym kan säkerställas på alla dosnivåer.
 
1.6.6  Observationer av moderdjuren  
Kliniska observationer bör göras och registreras minst en gång per 
dag, helst vid samma tid(er) varje dag. Tidpunkterna bör väljas med beaktande av perioden för när maximala verkningar förväntas efter 
dosering. Vid observationerna registreras djurens tillstånd (mortalitet, 
döende djur, relevanta beteendeändringar och alla tecken på uppen ­
bar toxicitet).
 
1.6.7  Kroppsvikt och foderkonsumtion  
Djuren bör vägas på dräktighetsdag 0 (eller inte senare än dräktig ­
hetsdag 3 om djuren kommer från en utomstående uppfödare hos vilken djuren har parats vid en viss tidpunkt), på den första dose ­
ringsdagen, därefter minst var tredje dag under doseringsperioden 
och till slut på den planenliga avlivningsdagen.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 461
 
Foderkonsumtionen bör registreras med tre dagars intervall, på 
samma dagar som djuren vägs.  
1.6.8  Undersökning post-mortem  
Hondjuren avlivas en dag före den förväntade födslodagen. Hondjur 
som visar tecken på abort eller prematur födsel före den planenliga 
avlivningen bör avlivas och bli föremål för en grundlig makrosko ­
pisk undersökning. 
Vid testets slut eller om djur dör under pågående test ska moder ­
djuret undersökas makroskopiskt med avseende på strukturella 
abnormaliteter eller patologiska förändringar. För att få en så hög 
grad av objektivitet som möjligt bör utvärderingen av moderdjuren under kejsarsnittet och fosteranalyserna helst göras utan kännedom om behandlingsgrupp.
 
1.6.9  Undersökning av livmoderinnehåll  
Omedelbart efter testets slut eller så snart som möjligt efter ett döds ­
fall avlägsnas livmodern och djurens dräktighetsstatus fastställs. Om 
en livmoder inte har några tecken på dräktighet bör dess status bekräftas t.ex. genom ammoniumsulfidfärgning (för gnagare) eller Salewski-färgning eller någon annan lämplig metod (för kaniner) (5). 
Varje dräktig livmoder vägs inklusive livmoderhals. Livmodern 
behöver inte vägas för djur som har självdött under testets gång. 
För dräktiga djur fastställs antalet  corpora lutea . 
Livmoderinnehållet undersöks med avseende på eventuella döda em ­
bryon eller foster och antalet levande foster. Graden av resorption bör beskrivas i syfte att uppskatta den relativa tidpunkten för när conceptus har dött (se avsnitt 1.2).
 
1.6.10  Undersökning av foster  
För varje foster fastställs kön och kroppsvikt. 
Fostren undersöks för externa avvikelser (6). Fostren undersöks också för avvikelser i skelettet och mjukdelarna 
(t.ex. variationer och missbildningar eller anomalier) (7)(8)(9)(10)(11) 
(12)(13)(14)(15)(16)(17)(18)(19)(20)(21)(22)(23)(24). Kategorisering av fosteravvikelserna rekommenderas, men krävs inte. Om kategorise ­
ring görs, bör kriterierna för definition av de olika kategorierna klart 
anges. Särskild uppmärksamhet bör fästas vid reproduktionsorganen, 
som ska undersökas för tecken på avvikande utveckling. 
I fråga om gnagare förbereds cirka hälften av varje kull för under ­
sökningar avseende avvikelser i skelettet. Återstoden förbereds och undersöks för avvikelser i mjukdelarna. För detta används godkända 
eller lämpliga metoder för seriell sektionering eller tekniker för nog ­
grann dissektion.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 462
 
I fråga om icke-gnagare, t.ex. kaniner, bör alla foster undersökas för 
avvikelser i både mjukdelarna och skelettet. Fosterkropparna disseke ­
ras noggrant och utvärderas med avseende på avvikelser i mjukde ­
larna. Detta kan inbegripa procedurer för ytterligare utvärdering av den interna hjärtstrukturen (25). Från hälften av de foster som har 
undersökts på detta sätt avlägsnas huvudet och förbereds för utvär ­
dering av avvikelser i mjukvävnad (ögon, hjärna, nasalpassager och tunga) med användning av normala seriella sektioneringsme-toder (26) eller någon annan lika känslig metod. Kropparna hos dessa 
foster och återstående intakta foster förbereds och undersöks för 
avvikelser i skelettet, med användning av samma metoder som har beskrivits för gnagare.
 
2. DATA  
2.1 BEHANDLING AV RESULTATEN 
Data rapporteras individuellt för moderdjuren och deras avkomma 
och sammanställs i en tabell. Tabellen ska för varje testgrupp visa antalet djur vid testets början, antalet djur som under testets gång har 
dött eller avlivats av humana skäl, tidpunkten för alla dödsfall eller 
humana avlivningar, antalet dräktiga hondjur, antalet djur som visat tecken på toxicitet, en beskrivning av observerade toxicitetstecken (tidpunkten då sådana först upptäcktes, de toxiska verkningarnas 
varaktighet och allvarlighetsgrad), typerna av observationer om em ­
bryon/foster och alla relevanta data om kullarna. 
De numeriska resultaten utvärderas med en lämplig statistisk metod, 
med kullen som enhet för analysen av data. Den statistiska metod 
som används bör vara allmänt erkänd. Valet av statistiska metoder bör ingå som en del av testets utformning och bör motiveras. Rap ­
porten bör även omfatta data om djur som inte överlever fram till 
den planenliga avlivningen. Sådana data kan, när det är relevant, 
inkluderas i gruppens medelvärden. Relevansen hos data från sådana djur bör motiveras och bedömas på individuell grund. Detsamma gäller för avgöranden om huruvida dessa data ska ingå i en grupps 
medelvärden eller inte.
 
2.2 UTVÄRDERING AV RESULTATEN 
Resultaten från testet avseende prenatal utvecklingstoxicitet ska ut ­
värderas med avseende på de observerade verkningarna. Utvär ­
deringen bör omfatta följande information: 
— Resultaten från test på moderdjur och embryo/foster, inbegripet 
en utvärdering av förhållandet (eller avsaknaden av ett förhållan ­
de) mellan djurens exponering för testämnet och förekomsten av och allvarligheten hos alla fynd. 
— Kriterier som används för att kategorisera avvikelser på fostret 
(externt, mjukvävnad och skelett), om kategorisering har gjorts.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 463
 
— I tillämpliga fall historiska kontrolldata som stöd för tolkningen 
av resultaten. 
— De antal som har använts vid beräkning av procenttal eller index. 
— I tillämpliga fall adekvat statistisk analys av testresultaten. En 
sådan analys bör inbegripa tillräcklig information om analys ­
metoden så att en oberoende granskare eller statistiker kan göra en ny utvärdering och rekonstruera analysen. 
Om utfallet tyder på frånvaro av toxiska verkningar bör ytterligare 
undersökningar för att fastställa testämnets absorption och biotill ­
gänglighet övervägas.
 
2.3 TOLKNING AV RESULTATEN 
Ett test avseende prenatal utvecklingstoxicitet ger information om 
verkningarna av upprepad exponering för ett ämne på moderdjuren under dräktigheten och på avkommans utveckling inne i livmodern. 
Testresultaten ska tolkas tillsammans med resultaten från test avse ­
ende subkronisk toxicitet, reproduktionstoxi-citet, toxikokinetik och andra test. Eftersom betoning läggs både vid endpointen för allmän toxicitet uttryckt som toxicitet för moderdjuret och vid endpointen 
för utvecklingstoxicitet, ger testresultatet en viss möjlighet till dis ­
kriminering mellan verkningar på utvecklingen i frånvaron av allmän toxicitet och verkningar som endast induceras på nivåer som även är toxiska för moderdjuret (27).
 
3. RAPPORTERING  
3.1 TESTRAPPORT 
Testrapporten ska innehålla nedan angivna specifika uppgifter. 
Testämne: 
— Fysikalisk natur och, när det är relevant, fysikalisk-kemiska egen ­
skaper. 
— Identifikation inklusive CAS-nummer, om detta är känt/fastställt. 
— Renhetsgrad. 
Vehikel (i förekommande fall): 
— Motivering för val av vehikel, om annan än vatten. 
Försöksdjur: 
— Art och stam som använts. — Djurens antal och kön. 
— Ursprung, förvaringsbetingelser, foder osv. 
— Djurens individuella vikt vid testets början. 
Testbetingelser: 
— Motivering för val av dosnivåer. 
— Utförliga uppgifter om testämnets sammansättning och beredning 
av fodret, uppnådd koncentration, preparatets stabilitet och ho ­
mogenitet.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 464
 
— Utförliga uppgifter om hur testämnet har tillförts. 
— Omräkning av testämneskoncentrationen i foder eller vatten 
(ppm) till faktisk dos (mg per kg kroppsvikt och dag), om till ­
lämpligt. 
— Miljöbetingelser. 
— Uppgifter om foder- och vattenkvalitet. Resultat: 
Data om moderdjurens toxicitetsrespons, inklusive men inte begrän ­
sat till följande: 
— Antalet djur vid testets början, antalet överlevande djur, antalet 
dräktiga djur, antalet djur som haft abort och antalet djur med 
prematur födsel. 
— Tidpunkten (dag) för dödsfall under testets gång och huruvida 
djuren överlevde till testets slut. 
— Data om djur som inte överlevde till den planenliga avlivningen 
bör rapporteras, men inte inkluderas i de statistiska jämförelserna mellan grupper. 
— Dagen för observation av varje abnormalt kliniskt tecken och 
dess fortsatta förlopp. 
— Kroppsvikt, kroppsviktsförändringar och livmoderns dräktighets ­
vikt, inklusive (om så önskas) kroppsviktsförändringar justerade 
för livmoderns dräktighetsvikt. 
— Foderkonsumtion och, om uppmätt, vattenkonsumtion. 
— Obduktionsresultat, inklusive livmoderns vikt. 
— NOAEL-värden för verkningar på moderdjuren och på utveck ­
lingen bör rapporteras. 
”Endpoints” för utvecklingen per dos för kullar med implantation, 
inklusive följande: 
— Antalet  corpora lutea . 
— Antalet implantationer, antalet och procentandelen levande och 
döda foster samt antalet resorptioner. 
— Antalet och procentandelen förluster före och efter implantation. 
”Endpoints” för utvecklingen per dos för kullar med levande foster, 
inklusive följande: 
— Antalet och procentandelen levande avkomma. 
— Kvoten mellan könen. 
— Fostrens kroppsvikt, helst per kön och för båda könen kombinerat. — Missbildningar (externt, mjukvävnad och skelett) och andra rele ­
vanta avvikelser. 
— Kriterier för kategorisering, i tillämpliga fall.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 465
 
— Totalantalet och procentandelen foster och kullar med avvikelser 
(externa, mjukvävnad eller skelett) samt typen och förekomsten 
av individuella anomalier och andra relevanta avvikelser. 
Diskussion om resultaten. 
Slutsatser.  
4. HÄNVISNINGAR  
1. Kavlock R.J.  et al.  (1996) A Simulation Study of the Influence 
of Study Design on the Estimation of Benchmark Doses for 
Developmental Toxicity.  Risk Analysis  16; 399–410. 
2. Kimmel, C.A. and Francis, E.Z. (1990) Proceedings of the 
Workshop on the Acceptability and Interpretation of Dermal 
Developmental Toxicity Studies.  Fundamental and Applied 
Toxicology  14; 386–398. 
3. Wong, B.A.,  et al.  (1997) Developing Specialized Inhalation 
Exposure Systems to Address Toxicological Problems.  CIIT 
Activities  17; 1–8. 
4. US Environmental Protection Agency (1985) Subpart E-Specific 
Organ/Tissue Toxicity, 40 CFR 798.4350: Inhalation Devel ­
opmental Toxicity Study. 
5. Salewski, E. (1964) Faerbermethode zum Makroskopischen 
Nachweis von Implantations Stellen am Uterusder Ratte.  Nau­
nyn-Schmeidebergs Archiv fur Pharmakologie und Experimen ­
telle Pathologie  247:367. 
6. Edwards, J.A. (1968) The external Development of the Rabbit 
and Rat Embryo. In  Advances in Teratology.  D.H.M. Woolam 
(ed.) Vol. 3. Academic Press, NY. 
7. Inouye, M. (1976) Differential Staining of Cartilage and Bone 
in Fetal Mouse Skeleton by Alcian Blue and Alizarin Red S.  
Congenital Anomalies  16; 171–173. 
8. Igarashi, E.  et al.  (1992) Frequency Of Spontaneous Axial 
Skeletal Variations Detected by the Double Staining Tech ­
niquefor Ossified and Cartilaginous Skeleton in Rat Foetuses.  
Congenital Anomalies  32; 381–391. 
9. Kimmel, C.A.  et al.  (1993) Skeletal Development Following 
Heat Exposure in the Rat.  Teratology  47; 229–242. 
10. Marr, M.C.  et al.  (1988) Comparison of Single and Double 
Staining for Evaluation of Skeletal Development: The Effects of Ethylene Glycol (EG) in CD Rats.  Teratology  37; 476. 
11. Barrow, M.V. and Taylor, W.J. (1969) A Rapid Method for 
Detecting Malformations in Rat Foetuses.  Journal of Morphol ­
ogy 127:291–306. 
12. Fritz, H. (1974) Prenatal Ossification in Rabbits ss Indicative of 
Foetal Maturity.  Teratology  11; 313–320. 
13. Gibson, J.P.  et al . (1966) Use of the Rabbit in Teratogenicity 
Studies.  Toxicology and Applied Pharmacology  9; :398–408. 
14. Kimmel, C.A. and Wilson, J.G. (1973) Skeletal Deviation in 
Rats: Malformations or Variations?  Teratology  8; 309–316. 
15. Marr, M.C.  et al.  (1992) Developmental Stages of the CD 
(Sprague-Dawley) Rat Skeleton after Maternal Exposure to Et ­
hylene Glycol.  Teratology  46; 169–181.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 466
 
16. Monie, I.W.  et al.  (1965) Dissection Procedures for Rat Foetu ­
ses Permitting Alizarin Red Staining of Skeleton and Histolog ­
ical Study of Viscera.  Supplement to Teratology Workshop Ma ­
nual,  pp. 163–173. 
17. Spark, C. and Dawson, A.B. (1928) The Order and Time of 
appearance of Centers of Ossification in the Fore and Hind 
Limbs of the Albino Rat, with Special Reference to the Possible 
Influence of the Sex Factor.  American Journal of Anatomy  41; 
411–445. 
18. Staples, R.E. and Schnell, V.L. (1964) Refinements in Rapid 
Clearing Technique in the KOH-Alizarin Red S Method for 
Fetal Bone.  Stain Technology  39; 61–63. 
19. Strong, R.M. (1928) The Order Time and Rate of Ossification 
of the Albino Rat (Mus Norvegicus Albinus) Skeleton.  American Journal of Anatomy  36; 313–355. 
20. Stuckhardt, J.L. and Poppe, S.M. (1984) Fresh Visceral Exami ­
nation of Rat and Rabbit Foetuses Used in Teratogenicity Tes ­
ting. Teratogenesis, Carcinogenesis, and Mutagenesis  4; 
181–188. 
21. Walker, D.G. and Wirtschafter, Z.T. (1957)  The Genesis of the 
Rat Skeleton.  Thomas, Springfield, IL. 
22. Wilson, J.G. (1965) Embryological Considerations in Teratol ­
ogy. In  Teratology: Principles and Techniques,  Wilson J.G. and 
Warkany J. (eds). University of Chicago, Chicago, IL, pp 251–277. 
23. Wilson, J.G. and Fraser, F.C. (eds). (1977)  Handbook of 
Teratology,  Vol. 4. Plenum, NY. 
24. Varnagy, L. (1980) Use of Recent Fetal Bone Staining Tech ­
niques in the Evaluation of Pesticide Teratogenicity.  Acta Vet. 
Acad. Sci. Hung.  28; 233–239. 
25. Staples, R.E. (1974) Detection of visceral Alterations in Mam ­
malian Foetuses.  Teratology  9; 37–38. 
26. Van Julsingha, E.B. and C.G. Bennett (1977) A Dissecting 
Procedure for the Detection of Anomalies in the Rabbit Foetal Head. In:  Methods in Prenatal Toxicology  Neubert, D., Merker, 
H.J. and Kwasigroch, T.E. (eds.). University of Chicago, Chi ­
cago, IL, pp. 126–144. 
27. US Environmental Protection Agency (1991) Guidelines for 
Developmental Toxicity Risk Assessment.  Federal Register  
56; 63798–63826. 
28. Wise, D.L.  et al.  (1997) Terminology of Developmental Abnor ­
malities in Common Laboratory Mammals (Version 1) Teratol ­
ogy 55; 249–292.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 467
 
B.32  KARCINOGENICITETSSTUDIER  
INLEDNING 
1. Den här testmetoden motsvarar OECD:s testriktlinje (TG) 451 (2009). Den 
ursprungliga TG 451 om karcinogenicitetsstudier antogs 1981. Utvecklingen av denna reviderade testmetod B.32 ansågs nödvändig för att återspegla den 
senaste utvecklingen inom djurskydd och myndighetskrav (2) (3) (4) (5) (6). 
Uppdateringen av denna testmetod B.32 har genomförts parallellt med re ­
videringen av kapitel B.30 i denna bilaga, kroniska toxicitetsstudier, och kapitel B.33 i denna bilaga, kombinerad kronisk toxicitet/karcinogenicitets ­
studie i syfte att erhålla ytterligare information om djuren som används i 
studien och ge ytterligare detaljer om val av dos. Den här testmetoden B.32 är avsedd att användas vid testning av ett brett spektrum av kemikalier, inklusive bekämpningsmedel och industrikemikalier. Det bör påpekas att 
vissa detaljer och krav kan variera för läkemedel (se internationella kon ­
ferensen om harmonisering (ICH) vägledning S1B om testning av can ­
cerframkallande läkemedel). 
2. Majoriteten av karcinogenicitetsstudier genomförs med gnagare, och den här 
testmetoden är främst avsedd för studier som genomförs med dessa arter. 
Skulle sådana studier krävas för icke-gnagare, bör de principer och förfaran ­
den som beskrivs i denna testmetod tillsammans med dem som anges i kapitel B.27 i denna bilaga, 90-dagars toxicitetsstudie med upprepad oral 
dosering med icke-gnagare (6) tillämpas, med lämpliga modifieringar. Yt ­
terligare vägledning finns i OECD:s vägledningsdokument nr 116 om ut ­
formning och genomförande av kroniska toxicitets- och karcinogenicitets ­
studier (7). 
3. De tre huvudsakliga administreringssätten som används i karcinogenicitets ­
studier är oral, dermal och inhalation. Valet av administreringssätt beror på de fysikaliska och kemiska egenskaperna hos testkemikalien och det domi ­
nerande exponeringssättet för människor. Ytterligare information om val av 
exponeringssätt ges i vägledningsdokument nr 116 (7). 
4. Den här testmetoden fokuserar på exponering via oralt intag, det intag som 
används mest i karcinogenicitetsstudier. Även om karcinogenicitetsstudier 
som medför exponering via huden eller inhalation kan vara nödvändiga 
för riskbedömning av människors hälsa och/eller kan krävas under vissa regelverk, innebär båda exponeringsvägarna en betydande teknisk komplex ­
itet. Sådana studier måste utformas från fall till fall, även om testmetoden 
som beskrivs här för bedömningen och utvärderingen av karcinogenicitet 
skulle kunna utgöra grunden för ett protokoll för inhalations- och/eller hud ­
studier, med hänsyn tagen till rekommendationer om behandlingsperioder, kliniska eller patologiska parametrar etc. OECD:s vägledning finns tillgäng ­
lig om administrering av testkemikalier via huden (7) och genom inhalation 
(7) (8). Kapitel B.8 i denna bilaga (9) och kapitel B.29 i denna bilaga (10), tillsammans med OECD:s vägledningsdokument om akut inhalationstestning (8), bör särskilt rådfrågas vid utformningen av långsiktiga studier som in ­
begriper exponering via inhalation. Kapitel B.9 i denna bilaga (11) bör 
rådfrågas när det gäller testning som utförs via huden.
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 468
 
5. Studien om karcinogenicitet ger information om möjliga hälsofaror som 
sannolikt kan uppstå vid upprepad exponering under en period som varar 
upp till hela livslängden för de arter som används. Studien kommer att ge information om de toxiska effekterna hos testkemikalien inklusive potentiell karcinogenicitet, samt indikation om målorgan och möjlig ackumulering. 
Den kan ge en uppskattning av den icke-observerade nivån för skadliga 
biverkningar och, i fallet med icke-genotoxiska karcinogener, för tumör ­
responser som kan användas för att fastställa säkerhetskriterier för expone ­
ring av människor. Behovet av noggranna kliniska observationer av djuren i 
syfte att få fram så mycket information som möjligt betonas också. 
6. Målen för karcinogenicitetsstudier som omfattas av denna testmetod inklu ­
derar: 
— Identifieringen av de cancerframkallande egenskaperna hos en testkemi ­
kalie, vilket leder till en ökad incidens av tumörer, ökad andel av ma ­
ligna tumörer eller en minskning av tiden till uppkomsten av tumörer, 
jämfört med parallella kontrollgrupper. 
— Identifieringen av målorgan för karcinogenicitet. 
— Fastställandet av tiden till uppkomst av tumörer. 
— Karakterisering av förhållandet tumör-dosrespons. — Identifieringen av nivån där ingen skadlig effekt observeras (NOAEL) 
eller utgångspunkten för upprättandet av en referensdos (BMD). 
— Framtida konsekvenser av karcinogena effekter vid mänsklig exponering 
för lågdosnivåer. 
— Tillhandahållande av data för att testa hypoteser om verkningssätt (2) (7) 
(12) (13) (14) (15).
 
INLEDANDE ÖVERVÄGANDEN 
7. Vid bedömningen och utvärderingen av den potentiella karcinogeniciteten 
hos en testkemikalie bör all tillgänglig information om testkemikalien beak ­
tas av testlaboratoriet innan studien genomförs, i syfte att fokusera på ut ­
formningen av studien för att mer effektivt testa den karcinogena potentialen och minimera användningen av djur. Information om, och hänsyn till, verk ­
ningsmekanismen hos ett cancerframkallande ämne (2) (7) (12) (13) (14) 
(15) är särskilt viktig, eftersom den optimala utformningen kan variera beroende på om testkemikalien är en känd eller misstänkt genotoxisk kar ­
cinogen. Ytterligare vägledning om beaktande av verkningssätt finns i väg ­
ledningsdokument nr 116 (7). 
8. Information som underlättar studiens utformning inkluderar identitet, kemisk 
struktur, och fysikalisk-kemiska egenskaper hos testkemikalien, resultat från 
eventuella in vitro- eller in vivo-genotoxicitetstester; förväntad(e) använd ­
ning(ar) och risken för mänsklig exponering, tillgängliga (Q)SAR-data, mu ­
tagenicitet/genotoxicitet, karcinogenicitet och toxikologiska data om struk ­
turellt närbesläktade kemikalier, tillgängliga toxikokinetiska data (engångs ­
dos- och upprepad dos-kinetik om det finns tillgängligt) och data från andra 
studier med upprepad exponering. Bedömning av kronisk toxicitet bör
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 469
 
utföras efter att inledande information om toxicitet har erhållits från 28- 
dagars och/eller 90-dagars toxicitetstester med upprepad dosering. Kortsik ­
tiga initieringsfrämjande cancertester kan också ge användbar information. Ett stegvist förhållningssätt till testning av karcinogenicitet bör betraktas som en del av den övergripande bedömningen av de potentiella hälsoeffek ­
terna för en viss testkemikalie (16) (17) (18) (19). 
9. De statistiska metoder som är mest lämpade för analys av resultaten, med 
tanke på försöksutformningen och målen, bör fastställas innan studien på ­
börjas. Frågor att överväga inkluderar huruvida statistiken bör innefatta 
justering av överlevnad, analys av kumulativa tumörrisker i förhållande till överlevnadsvaraktighet, analys av tiden till tumören och analys i hän ­
delse av förtida terminering av en eller fler grupper. Vägledning om lämp ­
liga statistiska analyser och viktiga referenser till internationellt erkända 
statistiska metoder ges i vägledningsdokument nr 116 (7), samt i vägled ­
ningsdokument nr 35 om analys och utvärdering av studier över kronisk toxicitet och karcinogenicitet (20). 
10. Vid genomförandet av en studie om karcinogenicitet bör man alltid följa de 
vägledande principer och överväganden som beskrivs i OECD:s vägled ­
ningsdokument nr 19 om erkännande, bedömning och användning av kli ­
niska tecken som humana endpoints för försöksdjur som används i säker ­
hetsbedömningen (21). Se särskilt punkt 62. Detta avsnitt anger att ”I studier med upprepad dosering när ett djur visar kliniska tecken som är progressiva, vilket leder till ytterligare försämring av tillståndet, bör ett välgrundat beslut 
tas om man ska eller inte ska avliva djuret av humanitära skäl. Beslutet bör 
även omfatta övervägandet av värdet av informationen som fås genom fort ­
satt skötsel av det djuret i studien i förhållande till dess övergripande till ­
stånd. Om ett beslut har tagits att låta djuret kvarstå i testet, bör observa ­
tionsfrekvensen ökas vid behov. Det är också möjligt, utan att allvarligt påverka syftet med testet, att tillfälligt upphöra med doseringen om det kan minska smärtan eller lidandet, eller att minska testdosen.” 
11. Detaljerad vägledning om och diskussion av principerna för valet av dos för 
studier om kronisk toxicitet och karcinogenicitet finns i vägledningsdoku ­
ment nr 116 (7) samt i två internationella publikationer från Life Sciences 
Institute (22) (23). Den centrala strategin för valet av dos är beroende av det 
primära målet eller målen med studien (punkt 6). Vid val av lämpliga dos ­
nivåer bör en balans uppstå mellan faroundersökning å ena sidan och ka ­
rakterisering av lågdosresponser och deras betydelse på den andra. Detta är 
särskilt relevant i en situation där en kombinerad studie av kronisk toxicitet 
och karcinogenicitet (kapitel B.33 i denna bilaga) genomförs (punkt 12). 
12. Man bör överväga att genomföra en kombinerad studie av kronisk toxicitet 
och karcinogenicitet (kapitel B.33 i denna bilaga), snarare än ett separat 
utförande av en studie av kronisk toxicitet (kapitel B.30 i denna bilaga) och en studie av karcinogenicitet (denna testmetod B.32). Det kombinerade testet ger större effektivitet vad gäller tid och kostnad jämfört med att 
jämföra två separata studier, utan att man kompromissar med datans kvalitet 
i antingen den kroniska eller karcinogena fasen. Noggrant övervägande bör dock ges för principerna av valet av dos (punkterna 11 och 22–25) vid en kombinerad studie av kronisk toxicitet och karcinogenicitet (kapitel B.33 i 
denna bilaga), och det är också erkänt att separata studier kan krävas under 
vissa regelverk.
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 470
 
13. Definitioner som används inom ramen för den här metoden finns i slutet av 
det här kapitlet och i vägledningsdokumentet nr 116 (7).  
PRINCIP FÖR TESTMETODEN 
14. Testkemikalien administreras dagligen i graderade doser till flera grupper av 
försöksdjur för huvuddelen av deras livslängd, normalt via oralt intag. Test ­
ning genom inhalation eller via huden kan också vara lämpligt. Djuren observeras noggrant avseende tecken på toxicitet och för utvecklingen av neoplastiska skador. Djur som dör eller avlivas under testet obduceras, och i 
slutet av testet avlivas överlevande djur och obduceras.
 
BESKRIVNING AV METOD  
Val av djurart  
15. Den här testmetoden täcker främst bedömning och utvärdering av karcino ­
genicitet hos gnagare (punkt 2). Användningen av icke-gnagare kan över ­
vägas när tillgängliga data tyder på att de är mer relevanta för förutsägelser 
av hälsoeffekter på människor. Valet av art bör motiveras. Rekommenderad gnagare är råtta, även om andra gnagare t.ex. mus kan användas. Även om användningen av möss i karcinogenicitetstester kan ha begränsad använd ­
barhet (24) (25) (26), krävs fortfarande karcinogenicitetstester med möss 
under några aktuella regelverk såvida det inte kan fastställas att en sådan studie inte är vetenskapligt nödvändig. Råttor och möss har föredragits på grund av deras relativt korta livslängd, deras breda användning i farmako ­
logiska och toxikologiska studier, deras känslighet för tumörinduktion och 
tillgången på stammar som beskrivits tillräckligt ingående. Som en följd av dessa egenskaper finns en stor mängd information tillgänglig om deras fysiologi och patologi. Ytterligare information om val av arter och stam 
ges i OECD:s vägledningsdokument nr 116 (7). 
16. I testet bör unga friska vuxna djur användas av stammar som vanligtvis 
används på laboratorier. Karcinogenicitetsstudien bör helst utföras på djur från samma stam och ursprung som de som användes i den inledande tox ­
icitetsstudien(erna) med kortare varaktighet, dock, om djur från samma stam 
och ursprung är kända för att ge problem med att uppnå det normalt accep ­
terade kriteriet för överlevnad i långsiktiga studier (se vägledningsdokument nr 116 (7)), bör man överväga att använda en stam med acceptabel över ­
levnadsgrad för den långsiktiga studien. Honorna ska inte ha fått ungar och 
inte vara dräktiga.
 
Inhysning och utfodring  
17. Djuren kan inhysas individuellt, eller i små grupper av samma kön; indi ­
viduell inhysning ska endast övervägas om det är vetenskapligt motiverat 
(27) (28) (29). Burarna bör placeras så att en möjlig påverkan beroende på deras placering minimeras. Temperaturen i försöksdjurens utrymmen bör vara 22 °C (± 3 °C). Den relativa fuktigheten bör vara minst 30 % och 
helst inte överstiga 70 % utom när rummet rengörs, och målet bör vara 
50–60 %. Belysningen bör vara artificiell, med omväxlande 12 timmar ljus och 12 timmar mörker. För utfodringen kan konventionellt laboratorie ­
foder användas med ett obegränsat utbud av dricksvatten. Kosten ska upp ­
fylla alla näringsmässiga krav för arterna som testas och innehållet av fö ­
roreningar i kosten som kan påverka testresultatet inkluderar, men är ej
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 471
 
begränsade till, bekämpningsmedelsrester, långlivade organiska föroreningar, 
fytoöstrogener, tungmetaller och mykotoxiner, och bör vara så låga som 
möjligt. Analytisk information om närings- och kostföroreningsnivåer bör genereras periodiskt, åtminstone i början av studien och när det finns en förändring i det använda partiet, och bör ingå i den slutliga rapporten. 
Analytisk information om dricksvattnet som används i studien ska likaledes 
ingå. Valet av foder kan påverkas av behovet av att säkerställa en lämplig blandning av en testkemikalie och för att tillgodose djurens näringsbehov när testkemikalien tillförs genom kosten.
 
Förberedelse av djuren  
18. Friska djur, som har acklimatiserat sig till laboratoriets betingelser i minst 7 
dagar och inte tidigare har ingått i försök, ska användas. När det gäller gnagare bör doseringen av djuren påbörjas snarast möjligt efter avvänjning 
och acklimatisering, och helst innan djuren är 8 veckor gamla. Försöks ­
djuren bör karakteriseras efter art, stam, ursprung, kön, vikt och ålder. Vid undersökningens början bör viktvariationen hos varje kön vara minimal och inte överstiga ± 20 % av medelvikten för alla djur inom studien, separat 
för varje kön. Djuren fördelas slumpvis i kontroll- och behandlingsgrupper ­
na. Efter randomiseringen bör det inte finnas några signifikanta skillnader i genomsnittliga kroppsvikter mellan grupper inom varje kön. Om det finns statistiskt signifikanta skillnader, bör randomiseringssteget upprepas, om 
möjligt. Varje djur bör tilldelas ett unikt identifikationsnummer, och märkas 
permanent med detta nummer genom tatuering, mikrochipimplantat, eller med annan lämplig metod.
 
PROCEDUR  
Djurens antal och kön  
19. Bägge könen ska användas. Ett tillräckligt antal djur ska användas så att en 
grundlig biologisk och statistisk utvärdering är möjlig. Varje dosgrupp och 
parallell kontrollgrupp bör därför innehålla minst 50 djur av vardera könet. Beroende på syftet med studien finns det möjlighet att öka den statistiska giltigheten för de viktigaste uppskattningarna genom att fördela djuren 
ojämnt till de olika dosgrupperna, med t.ex. fler än 50 djur i lågdosgruppen, 
för att uppskatta den cancerframkallande potentialen vid låga doser. Det ska dock erkännas att en måttlig ökning av gruppstorlek ger en relativt liten ökning av den statistiska giltigheten för studien. Ytterligare information om 
statistisk utformning av studien och val av dosnivåer för att maximera den 
statistiska giltigheten finns i vägledningsdokument nr 116 (7).
 
Avsättningar för avlivningar och satellitgrupper (kontroll)  
20. Studien får föreskriva avlivningar t.ex. efter 12 månader för att få infor ­
mation om framskridandet av neoplastiska förändringar och mekanistisk 
information, om det är vetenskapligt motiverat. Om sådan information om testkemikalien redan finns tillgänglig från tidigare toxicitetsstudier med upp ­
repad dosering kanske inte avlivningar är vetenskapligt motiverade. Om 
avlivning är inkluderad i studien, kommer antalet djur i varje dosgrupp 
som planeras att avlivas normalt vara 10 djur per kön, och det totala antalet djur som ingår i studiens utformning ska ökas med det antal djur som avlivas innan studien slutförs. Ytterligare en grupp kontrolldjur (normalt 5 djur per 
kön) kan ingå för övervakning av sjukdomsstatus under studien (30), om 
nödvändigt. Mer vägledning finns i vägledningsdokument nr 116 (7).
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 472
 
Dosgrupper och dosering  
21. Vägledning över alla aspekter av valet av dos och dosnivå finns i vägled ­
ningsdokument nr 116 (7). Minst tre dosnivåer och en parallell kontroll ska användas. Dosnivåer grundas i allmänhet på resultaten från en korttidsstudie 
med upprepad dosering eller en spännviddsstudie och bör beakta eventuella 
toxikokinetiska data som finns tillgängliga om testkemikalien eller när ­
besläktade kemikalier. 
22. Såvida den inte är begränsad genom testkemikaliens fysikalisk-kemiska na ­
tur eller biologiska verkningar, bör den högsta dosnivån väljas för att iden ­
tifiera de viktigaste målorganen och de toxiska effekterna, samtidigt som man undviker lidande, svår toxicitet, sjuklighet eller död. Samtidigt som man tar hänsyn till de faktorer som anges nedan i punkt 23, ska den högsta 
dosnivån väljas för att framkalla tecken på toxicitet, vilket framgår av till 
exempel en sänkning av kroppsviktsökningen (ca 10 %). Dock kan man beroende på målen för studien (se punkt 6), välja en toppdos lägre än den dos som ger tecken på toxicitet, t.ex. om en dos framkallar en negativ 
effekt som har liten eller ingen påverkan på livslängd eller kroppsvikt. 
23. Dosnivåer och dosnivåspridning kan väljas för att etablera en dosrespons 
och, beroende på testkemikaliens verkningssätt, en NOAEL eller andra av ­
sedda resultat från studien t.ex. en BMD (se punkt 25) för den lägsta dos ­
nivån. Faktorer som bör beaktas i placeringen av lägre doser inkluderar den 
förväntade lutningen för dosrespons-kurvan, de doser vid vilka viktiga för ­
ändringar kan uppstå i metabolismen eller den toxiska verkningens art, där ett tröskelvärde förväntas eller där en utgångspunkt för lågdosextrapolering 
förväntas. 
24. Den dosnivåspridning som väljs beror på testkemikaliens egenskaper och 
kan inte föreskrivas i denna testmetod, men två- till fyrfaldiga dosintervall ger ofta bra testprestanda för att fastställa fallande dosnivåer, och tillägg av 
en fjärde testgrupp är att föredra framför användningen av mycket stora 
intervall (t.ex. mer än en faktor på ca 6–10) mellan doseringarna. I all ­
mänhet bör användningen av faktorer som är större än 10 undvikas, och ska motiveras om de används. 
25. Såsom diskuteras vidare i vägledningsdokument nr 116 (7), inkluderar punk ­
ter som ska beaktas vid val av dos: 
— Kända eller misstänkta olinjäriteter eller inflexionspunkter i dosrespon ­
sen. 
— Toxikokinetik och dosintervall där metabolisk induktion, mättnad eller 
olinjäritet mellan externa och interna doser uppträder eller ej. 
— Utgångsskador, markörer för verkan eller indikatorer för viktiga under ­
liggande biologiska processer. 
— Nyckelaspekter (eller misstänkta sådana) för verkningsmekanismer, så ­
som doser vid vilka cytotoxicitet börjar uppstå, hormonnivåerna störs, 
homeostatiska mekanismer är överväldigande etc.
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 473
 
— Områden i dosrespons-kurvan där en särskilt stabil uppskattning behövs, 
t.ex. intervallet för förväntad BMD eller ett misstänkt tröskelvärde. 
— Beaktande av förväntade exponeringsnivåer för människor. 
26. Kontrollgruppen ska vara en obehandlad grupp eller en vehikelkontroll ­
grupp, om en vehikel används för tillförsel av testkemikalien. Med undantag av behandlingen med testkemikalien, bör djuren i kontrollgruppen hanteras 
på exakt samma sätt som de i testgrupperna. Om en vehikel används ska 
kontrollgruppen tillföras vehikeln i den största volym som används bland dosgrupperna. Om en testkemikalie tillförs via kosten och förorsakar ett betydligt minskat intag på grund av mindre välsmakande kost, kan ytterli ­
gare en parutfodrad kontrollgrupp vara användbar för en lämpligare kontroll.
 
Beredning av doser och administrering av testkemikalie  
27. Testkemikalien tillförs vanligtvis oralt, via kosten eller dricksvattnet, eller 
genom sondmatning. Ytterligare information om vägar och metoder för 
administrering ges i OECD:s vägledningsdokument nr 116 (7). Vägen och metoden för administrering beror på syftet med studien, de 
fysikalisk-kemiska egenskaperna hos testkemikalien, dess biotillgänglighet 
och dominerande väg och metod för exponering av människor. En motive ­
ring bör ges för vald väg och metod för administrering. Med tanke på djurskydd bör oral sondmatning normalt väljas endast för de ämnen för 
vilka denna väg och metod för administrering representerar en potentiell 
mänsklig exponering (t.ex. läkemedel). För kost- eller miljökemikalier in ­
klusive bekämpningsmedel, sker administrering vanligtvis via foder eller dricksvatten. För några situationer, t.ex. arbetsrelaterad exponering, kan ad ­
ministrering via andra vägar vara lämpligare. 
28. Vid behov kan testkemikalien upplösas eller suspenderas i en lämplig ve ­
hikel. Hänsyn bör tas till följande egenskaper hos vehikeln och andra till ­
satsämnen, i förekommande fall: verkningar på absorption, distribution, me ­
tabolism eller retention av testkemikalien, verkningar på testkemikaliens 
kemiska egenskaper som kan förändra dess toxiska egenskaper samt påver ­
kan på foder- eller vattenkonsumtion, eller djurens nutritionsstatus. Det re ­
kommenderas, när så är möjligt, att man först använder en vattenbaserad 
lösning/suspension följt av en lösning/emulsion i olja (t.ex. majsolja) och 
därefter eventuell lösning i andra vehiklar. För andra vehiklar än vatten bör de toxiska egenskaperna hos vehikeln vara kända. Information om testkemi ­
kaliens stabilitet och doseringslösningarnas eller fodrets homogenitet (i före ­
kommande fall) enligt villkoren för administreringen (t.ex. kost), bör finnas 
tillgänglig. 
29. För kemikalier som tillförs via foder eller dricksvatten är det viktigt att 
säkerställa att kvantiteterna av den berörda testkemikalien inte påverkar normal närings- eller vattenbalans. I långtidsstudier med kostadministrering 
bör koncentrationen av testkemikalien i fodret normalt inte överskrida en 
övre gräns på 5 % av den totala kosten, för att undvika näringsmässig obalans. När testkemikalien tillförs via kosten, kan antingen en konstant foderkoncentration (mg/kg foder eller ppm) eller en konstant dosnivå i för ­
hållande till djurens kroppsvikt (mg/kg kroppsvikt), beräknad på veckobasis, 
användas. Det alternativ som används ska anges.
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 474
 
30. Vad gäller oral administrering doseras djuren med testkemikalien dagligen 
(sju dagar per vecka), vanligtvis under en period på 24 månader för gnagare 
(se också punkt 32). Alla andra doseringsscheman, t.ex. fem dagar per vecka, måste motiveras. När det gäller dermal administrering behandlas djuren normalt med testkemikalien minst 6 timmar per dag, 7 dagar per 
vecka enligt kapitel B.9 i denna bilaga (11) under en period av 24 månader. 
Exponering genom inhalation utförs 6 timmar per dag, 7 dagar per vecka, men exponering 5 dagar per vecka kan också användas om detta är moti ­
verat. Exponeringsperioden är normalt en period på 24 månader. Om andra 
gnagare än råttor utsätts för enbart nos, kan de maximala exponeringstiderna 
justeras för att minska artspecifikt lidande. En motivering bör ges när man använder en exponeringstid kortare än 6 timmar per dag. Se också kapitel B.8 i denna bilaga (9). 
31. När en testkemikalie administreras via sondmatning bör detta ske via en 
magsond eller en lämplig intubationskanyl vid ungefär samma tid varje dag. Normalt administreras en engångsdos en gång per dag, men om en kemi ­
kalie är lokalt irriterande är det möjligt att upprätthålla den dagliga dosen 
genom delad dos (två gånger per dag). Den största mängd vätska som kan 
administreras vid ett tillfälle beror på försöksdjurets storlek. Volymen bör vara så liten som möjligt, och bör normalt inte överstiga 1 ml/100 g kropps ­
vikt för gnagare (31). Variationer i testvolym bör minimeras genom juste ­
ring av koncentrationen för att säkerställa en konstant volym vid alla dos ­
nivåer. Potentiellt frätande eller irriterande kemikalier är undantagna, och måste spädas ut för att allvarliga lokala verkningar ska kunna undvikas. Testning vid koncentrationer som sannolikt är frätande eller irriterande för 
magtarmkanalen bör undvikas.
 
Studiens varaktighet  
32. Studiens varaktighet är normalt 24 månader för gnagare, vilket motsvarar 
huvuddelen av livslängden för de djur som används. Kortare eller längre varaktigheter kan användas, beroende på livslängden för djurarten i studien, men bör motiveras. För specifika stammar av möss t.ex. AKR/J-, C3H/J- 
eller C57BL/6J-stammar kan en varaktighet på 18 månader vara mer lämp ­
lig. Det följande ger viss vägledning avseende varaktighet, studiens upp ­
hörande och överlevnad, ytterligare riktlinjer som inbegriper en bedömning av huruvida en negativ karcinogenicitet förhåller sig till överlevnad i studien 
ges i OECD:s vägledningsdokument nr 116 om utformning och genom ­
förande av studier om kronisk toxicitet och karcinogenicitet (7). 
— Studiens upphörande bör beaktas när antalet överlevare i de lägre dos ­
grupperna understiger 25 procent. 
— I de fall där endast högdosgruppen dör i förtid på grund av toxicitet bör 
detta inte leda till upphörande av studien. 
— Överlevnad för vardera kön ska beaktas för sig. 
— Studien bör inte fortsätta över den punkt där tillgängliga data från stud ­
ien inte längre är tillräckliga för att ge en statistisk giltig utvärdering.
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 475
 
IAKTTAGELSER 
33. Samtliga djur bör observeras beträffande sjuklighet eller mortalitet, vanligt ­
vis i början och slutet av varje dag, inklusive helger och helgdagar. Djuren bör dessutom kontrolleras en gång per dag för särskilda tecken med tox ­
ikologisk relevans, med beaktande av maximalt förväntade effekter efter 
dosering med sondmatning. Särskild uppmärksamhet bör ges åt tumör ­
utveckling och tidpunkten för tumörens uppkomst, plats, mått, utseende, och utvecklingen av varje tydlig eller kännbar tumör ska registreras.
 
Kroppsvikt, foder-/vattenkonsumtion och fodereffektivitet  
34. Samtliga djur bör vägas vid behandlingens början, minst en gång i veckan 
de första 13 veckorna och därefter minst en gång per månad. Mätningar av foderkonsumtion och fodereffektivitet bör minst göras varje vecka de 13 första veckorna och därefter minst en gång per månad. Vattenkonsumtionen 
bör mätas minst en gång per vecka de 13 första veckorna, och därefter minst 
en gång per månad, när testkemikalien administreras via dricksvattnet. Mät ­
ningar av vattenkonsumtionen bör också övervägas för studier där vattend ­
rickandet förändras.
 
Hematologiska, kliniska biokemiska och andra mätningar  
35. För att maximera informationen som erhållits från studien, särskilt över ­
väganden gällande verkningssätt, kan blodprover tas för hematologi och 
klinisk biokemi, och detta efter bedömning av försöksledaren. Urinanalys kan även vara lämplig. Ytterligare vägledning om värdet med att ta sådana prov som en del av en karcinogenicitetsstudie finns i vägledningsdokument 
nr 116 (7). Om det anses lämpligt kan blodprov för hematologiska och 
kliniska biokemiska bestämningar och urinanalys utföras som en del i en avlivning (punkt 20) och vid studiens slut på minst 10 djur per kön och grupp. Blodprover bör tas under narkos från ett angivet ställe, till exempel 
genom hjärtpunktering eller från retro-orbitalsinus under narkos, och lagras, 
om tillämpligt, under lämpliga förhållanden. Blodutstryk kan också beredas för undersökning, särskilt om benmärgen verkar vara målorganet, även om värdet av en sådan undersökning för bestämning av karcinogen/onkogen 
potential har ifrågasatts (32).
 
PATOLOGI  
Obduktion  
36. Samtliga djur i studien med undantag av kontrolldjur (se punkt 20) och 
andra satellitgrupper, bör underkastas en fullständig obduktion som omfattar 
omsorgsfull granskning av kroppens yttre ytor, alla kroppsöppningar samt kranium, bröst- och bukhåla och deras innehåll. Obduktion kan från fall till fall krävas av indikatordjur och andra satellitdjur efter beslut av försöks ­
ledaren. Organvikter är normalt inte en del av en karcinogen studie, efter ­
som geriatriska förändringar och, i senare skeden, utvecklingen av tumörer förvirrar användbarheten av organviktsdatan. De kan dock vara avgörande för att göra en sammanvägd bedömning, och särskilt för överväganden 
beträffande verkningssätt. Om de är en del av en satellitstudie bör de inte 
samlas in senare än ett år efter studiens inledning.
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 476
 
37. Följande vävnader bör bevaras i det mest lämpade fixeringsmedlet för både 
vävnadstypen och den planerade efterföljande histopatologiska undersök ­
ningen (33) (vävnader inom hakparenteser är valfria): 
alla större skador hjärta pankreas mage (förmagen, 
glandulärmagen) 
binjure ileum bisköldkörtel [tänder] aorta jejunum perifer nerv testikel hjärna (inklusive delar av 
cerebrum, cerebellum och medulla/pons) njure hypofys tymus 
cekum tårkörtel (exorbital) prostata sköldkörtel 
cervix lever rektum [tunga] 
koagulerande körtel lunga spottkörtel trakea 
kolon lymfkörtlar (både ytliga 
och djupa) sädesblåsa urinblåsa 
tolvfingertarm bröstkörtel (obligatorisk 
för honor, och om synlig och dissekeringsbar hos 
hanar) skelettmuskel uterus (inklusive cervix) 
bitestikel [övre luftvägarna, inklu ­
sive nos, turbinates och bihålorna] hud [ureter] 
öga (inklusive näthinna) esofagus ryggmärg (på tre nivåer: 
cervikal, mitt på bröst ­
korgen och ländryggen) [uretra] 
[lårben med led] [luktbulb] mjälte vagina 
gallblåsa (för andra arter än 
råtta) äggstock [bröstben], snitt av ryggmärgen och/eller 
ett färskt benmärgsaspirat 
Harderiankörtel 
När det gäller parvisa organ t.ex. njure, binjure, bör båda organen bevaras. 
Kliniska och andra fynd kan indikera behovet av att undersöka ytterligare 
vävnader. Alla organ som sannolikt är målorgan, baserat på kunskap om testkemikaliens egenskaper, ska också konserveras. I studier som inbegriper administrering via huden bör organen som anges för oralt intag bevaras, och 
det är viktigt med särskild provtagning och bevarande av huden där appli ­
ceringen har skett. I inhalationsstudier bör förteckningen över bevarade och undersökta vävnader från luftvägarna följa rekommendationerna i kapitlen B.8 och B.29 i denna bilaga. För andra organ/vävnader (och i tillägg till de 
specifikt bevarade vävnaderna från luftvägarna) bör de organ som finns i 
förteckningen som anges för den orala vägen undersökas.
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 477
 
Histopatologi  
38. Vägledning finns tillgänglig om bästa praxis vid genomförande av studier 
gällande toxikologisk patologi (33). De vävnader som minst ska undersökas är: 
— Alla vävnader från högdos- och kontrollgrupperna. 
— Alla vävnader från djur som dör eller avlivas under studien. — Alla vävnader som uppvisar makroskopiska abnormaliteter, inklusive 
tumörer. 
— När behandlingsrelaterade histopatologiska förändringar observeras i 
högdosgruppen, ska samma vävnader från samtliga djur i alla andra 
dosgrupper undersökas. 
— När det gäller parvisa organ t.ex. njure, binjure, bör båda organen un ­
dersökas.
 
DATA OCH RAPPORTERING  
Data  
39. Individuella data för samtliga utvärderade parametrar bör ges. Därutöver bör 
alla data sammanfattas i tabellform, som för varje testgrupp visar antal djur vid testets början, antal djur som påfanns döda under testet eller som av ­
livats av humanitära skäl och tidpunkten för dödsfallen eller avlivningen, 
antal djur som visar tecken på toxicitet, en beskrivning av de tecken på 
toxicitet som observerats, inklusive tidpunkt för de första tecknen, varaktig ­
het och hur allvarliga de toxiska verkningarna är, antal djur som uppvisar skador, typ av skador och procentandelen djur för varje typ av skada. 
Sammanfattande tabeller bör ge medelvärden och standardavvikelser (för 
kontinuerliga testdata) för djur som uppvisar toxiska effekter eller skador, i tillägg till skadornas gradering. 
40. Historiska kontrolldata kan vara värdefulla vid tolkningen av studiens resul ­
tat, t.ex. i de fall då det finns indikationer på att de data som lämnats från de 
parallella kontrollerna i huvudsak avviker jämfört med aktuell data från kontrolldjuren från samma testanläggning/-koloni. Historiska kontrolldata, om de har utvärderats, bör lämnas in från samma laboratorium och relatera 
till djur i samma ålder och av samma stam som genererats under de fem år 
som föregick studien i fråga. 
41. När det är tillämpligt bör numeriska resultat utvärderas genom en lämplig 
och allmänt vedertagen statistisk metod. Vid utformningen av studien bör de statistiska metoderna och datan som ska analyseras väljas (punkt 9). Valet 
bör innehålla bestämmelser om överlevnadsjusteringar, där så krävs.
 
Testrapport  
42. Testrapporten ska omfatta följande information:  
Testkemikalie:  
— Fysikalisk natur, renhet och fysikalisk-kemiska egenskaper. — Identifikationsuppgifter.
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 478
 
— Kemikaliens källa. 
— Satsnummer. — Intyg om kemisk analys.  
Vehikel (i förekommande fall):  
— Motivering för val av vehikel (om annan än vatten).  
Försöksdjur:  
— Art/stam som används och motivering av valet. — Djurens antal, ålder och kön vid testets början. — Ursprung, inhysning, kost etc. — Djurens individuella vikt vid testets början.  
Försöksbetingelser:  
— Grund för administreringssätt och dosval. — I förekommande fall, de statistiska metoderna som använts för att ana ­
lysera datan. 
— Uppgifter om testkemikaliens sammansättning/foderberedning. 
— Analysdata om beredningens uppnådda koncentration, stabilitet och ho ­
mogenitet. 
— Administreringssätt och uppgifter om testkemikaliens administrering. — Om enbart nos eller helkropp vid inhalationsstudier. — Faktiska doser (mg/kg kroppsvikt/dag) och omräkningsfaktor för ko ­
stens/dricksvattnets testkemikaliekoncentration (mg/kg eller ppm) till 
den faktiska dosen, om tillämpligt. 
— Uppgifter om foder- och vattenkvalitet.  
Resultat (sammanfattande data i tabellform och enskilda djurdata ska pre ­
senteras) 
Allmänt  
— Överlevnadsdata. — Kroppsvikt/kroppsviktsförändringar. — Foderförbrukning, beräkningar av fodereffektivitet, om det har utförts, 
och vattenförbrukning, om tillämpligt. 
— Toxikokinetiska data (om tillgängligt). — Oftalmoskopi (om tillgängligt). — Hematologi (om tillgängligt). — Klinisk kemi (om tillgängligt).
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 479
 
Kliniska fynd  
— Tecken på toxicitet. — Förekomst (och allvarlighetsgrad) av eventuell abnormitet. — Art, allvarlighetsgrad och varaktighet för kliniska observationer (huru ­
vida de är övergående eller permanenta).  
Obduktionsdata  
— Terminal kroppsvikt. — Organvikter och deras förhållanden, om tillämpligt. — Obduktionsfynd, abnormaliteternas förekomst och allvarlighetsgrad.  
Histopatologi  
— Icke-neoplastiska histopatologiska fynd. 
— Neoplastiska histopatologiska fynd. 
— Sambandet mellan grova och mikroskopiska fynd. — Detaljerad beskrivning av alla behandlingsrelaterade histopatologiska 
fynd, inklusive allvarlighetsgradering. 
— Rapport om eventuell inbördes granskning av bilder.  
Statistisk bearbetning av resultaten, när så är lämpligt Diskussion av resultaten, inklusive:  
— Diskussion om eventuella modellstrategier. — Dos-responsförhållanden. — Historiska kontrolldata. — Beaktande av eventuell information om verkningssätt. — BMD-, NOAEL- eller LOAEL-bestämning. — Relevans för människor.  
Slutsatser
 
LITTERATUR  
(1) OECD (1995). Report of the Consultation Meeting on Sub-chronic and 
Chronic Toxicity/Carcinogenicity Testing (Rome, 1995), internal working 
document, Environment Directorate, OECD, Paris. 
(2) EPA (2005). Guidelines for Carcinogen Risk Assessment Risk Assessment 
Forum U.S. Environmental Protection Agency Washington, DC. 
(3) Combes RD, Gaunt, I, Balls M (2004). A Scientific and Animal Welfare 
Assessment of the OECD Health Effects Test Guidelines for the Safety Testing of Chemicals under the European Union REACH System. ATLA 32: 163–208. 
(4) Barlow SM, Greig JB, Bridges JW et al (2002). Hazard identification by 
methods of animal-based toxicology. Food. Chem. Toxicol. 40: 145–191. 
(5) Chhabra RS, Bucher JR, Wolfe M, Portier C (2003). Toxicity characteri ­
zation of environmental chemicals by the US National Toxicology Program ­
me: an overview. Int. J. Hyg. Environ. Health 206: 437–445.
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 480
 
(6) Kapitel B.27 i denna bilaga, test avseende subkronisk oral toxicitet (90- 
dagars upprepat oraltest på icke-gnagare). 
(7) OECD (2012). Guidance Document on the Design and Conduct of Chronic 
Toxicity and Carcinogenicity Studies, Supporting Test Guidelines 451, 452 and 453 - Second edition. Series on Testing and Assessment No. 116, 
available on the OECD public website for Test Guideline at www.oecd.org/ 
env/testguidelines. 
(8) OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing, 
Series on Testing and Assessment No. 39, ENV/JM/MONO (2009) 28, 
OECD, Paris. 
(9) Kapitel B.8 i denna bilaga, subakut inhalationstoxicitet: 28 dagars studie. 
(10) Kapitel B.29 i denna bilaga, subkronisk inhalationstoxicitet: 90-dagars stud ­
ie. 
(11) Kapitel B.9 i denna bilaga, toxicitet vid upprepad dosering (28 dagar, 
dermalt). 
(12) Boobis AR, Cohen SM, Dellarco V, McGregor D, Meek ME, Vickers C, 
Willcocks D, Farland W (2006). IPCS Framework for analyzing the Rele ­
vance of a Cancer Mode of Action for Humans. Crit. Rev. in Toxicol, 
36:793–801. 
(13) Cohen SM, Meek ME, Klaunig JE, Patton DE, and Fenner-Crisp PA 
(2003). The human relevance of information on carcinogenic Modes of 
Action: an overview. Crit. Rev. Toxicol. 33:581–589. 
(14) Holsapple MP, Pitot HC, Cohen SN, Boobis AR, Klaunig JE, Pastoor T, 
Dellarco VL, Dragan YP (2006). Mode of Action in Relevance of Rodent 
Liver Tumors to Human Cancer Risk. Toxicol. Sci. 89:51–56. 
(15) Meek EM, Bucher JR, Cohen SM, Dellarco V, Hill RN, 
Lehman-McKemmon LD, Longfellow DG, Pastoor T, Seed J, Patton DE (2003). A Framework for Human Relevance analysis of Information on 
Carcinogenic Modes of Action. Crit. Rev. Toxicol. 33:591–653. 
(16) Carmichael NG, Barton HA, Boobis AR et al (2006). Agricultural Chemical 
Safety Assessment: A Multisector Approach to the Modernization of Hu ­
man Safety Requirements. Critical Reviews in Toxicology 36: 1–7. 
(17) Barton HA, Pastoor TP, Baetcke T et al (2006). The Acquisition and 
Application of Absorption, Distribution, Metabolism, and 
Excretion (ADME) Data in Agricultural Chemical Safety Assessments. Crit ­
ical Reviews in Toxicology 36: 9–35. 
(18) Doe JE, Boobis AR, Blacker A et al (2006). A Tiered Approach to Sys ­
temic Toxicity Testing for Agricultural Chemical Safety Assessment. Crit ­
ical Reviews in Toxicology 36: 37–68. 
(19) Cooper RL, Lamb JS, Barlow SM et al (2006). A Tiered Approach to Life 
Stages Testing for Agricultural Chemical Safety Assessment. Critical Re ­
views in Toxicology 36: 69–98. 
(20) OECD (2002). Guidance Notes for Analysis and Evaluation of Chronic 
Toxicity and Carcinogenicity Studies, Series on Testing and Assessment 
No. 35 and Series on Pesticides No. 14, ENV/JM/MONO(2002)19, OECD, 
Paris. 
(21) OECD (2000). Guidance Document on the recognition, assessment, and use 
of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in 
safety evaluation, Series on Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MO ­
NO(2000)7, OECD, Paris.
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 481
 
(22) Rhomberg LR, Baetcke K, Blancato J, Bus J, Cohen S, Conolly R, Dixit R, 
Doe J, Ekelman K, Fenner-Crisp P, Harvey P, Hattis D, Jacobs A, 
Jacobson-Kram D, Lewandowski T, Liteplo R, Pelkonen O, Rice J, Somers D, Turturro A, West, W, Olin S(2007). Issues in the Design and Interpre ­
tation of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies in Rodents: App ­
roaches to Dose Selection Crit Rev. Toxicol. 37 (9): 729–837. 
(23) ILSI (International Life Sciences Institute) (1997). Principles for the Selec ­
tion of Doses in Chronic Rodent Bioassays. Foran JA (Ed.). ILSI Press, Washington, DC. 
(24) Griffiths SA, Parkinson C, McAuslane JAN and Lumley CE (1994). The 
utility of the second rodent species in the carcinogenicity testing of phar ­
maceuticals. The Toxicologist 14(1):214. 
(25) Usui T, Griffiths SA and Lumley CE (1996). The utility of the mouse for 
the assessment of the carcinogenic potential of pharmaceuticals. In D’Arcy POF & Harron DWG (eds). Proceedings of the Third International Confe ­
rence on Harmonisation. Queen’s University Press, Belfast. s. 279–284. 
(26) Carmichael NG, Enzmann H, Pate I, Waechter F (1997). The Significance 
of Mouse Liver Tumor Formation for Carcinogenic Risk Assessment: Re ­
sults and Conclusions from a Survey of Ten Years of Testing by the Agro ­
chemical Industry. Environ Health Perspect. 105:1196–1203. 
(27) Europaparlamentets och rådets direktiv 2010/63/EU av den 22 september 
2010 om skydd av djur som används för vetenskapliga ändamål, EUT L 276, 20.10.2010, s. 33–79. 
(28) National Research Council, 1985. Guide for the care and use of laboratory 
animals. NIH Publication No. 86–23. Washington, D.C., US Dept. of He ­
alth and Human Services. 
(29) GV-SOLAS (Society for Laboratory Animal Science, Gesellschaft für Ver ­
suchstierkunde, 1988). Publication on the Planning and Structure of Animal Facilities for Institutes Performing Animal Experiments. ISBN 3-906255- 04-2. 
(30) GV-SOLAS (Society for Laboratory Animal Science, Gesellschaft für Ver ­
suchstierkunde, 2006). Microbiological monitoring of laboratory animals in various housing systems. 
(31) Diehl K-H, Hull R, Morton D, Pfister R, Rabemampianina Y, Smith D, 
Vidal J-M, van de Vorstenbosch C. (2001). A good practice guide to the 
administration of substances and removal of blood, including routes and 
volumes. Journal of Applied Toxicology 21:15–23. 
(32) Weingand K,  et al.  (1996). Harmonization of Animal Clinical Pathology 
Testing in Toxicity and Safety Studies. Fund. Appl. Toxicol. 29: 198–201. 
(33) Crissman J, Goodman D, Hildebrandt P,  et al.  (2004). Best Practices Gui ­
deline: Toxicological Histopathology. Toxicologic Pathology 32: 126–131.
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 482
 
Tillägg 1  
DEFINITION  
Testkemikalie:  Alla ämnen eller blandningar som testas med denna testmetod.  ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 483
 
B. 33  KOMBINERAD KRONISK TOXICITETS-/KARCINOGENICI ­
TETSSTUDIE  
INLEDNING 
1. Den här testmetoden motsvarar OECD:s testriktlinje (TG) 453 (2009). Den 
ursprungliga TG 453 antogs 1981. Utvecklingen av denna uppdaterade test ­
metod B.33 ansågs nödvändig för att återspegla den senaste utvecklingen inom djurskydd och myndighetskrav (1) (2) (3) (4) (5). Uppdateringen av 
denna testmetod B.33 har genomförts parallellt med revideringen av kapitel 
B.32 i denna bilaga, karcinogenicitetsstudier, och kapitel B.30 i denna bi ­
laga, kroniska toxicitetsstudier, i syfte att erhålla ytterligare information om djuren som används i studien och ge ytterligare detaljer om val av dos. Den 
här testmetoden är avsedd att användas vid testning av ett brett spektrum av 
kemikalier, inklusive bekämpningsmedel och industrikemikalier. Det bör påpekas att vissa detaljer och krav kan variera för läkemedel (se internatio ­
nella konferensen om harmonisering (ICH) vägledning S1B om testning av 
cancerframkallande läkemedel). 
2. Majoriteten av kroniska toxicitetsstudier och karcinogenicitetsstudier genom ­
förs med gnagare, och den här testmetoden är främst avsedd för studier som genomförs med dessa arter. Skulle sådana studier krävas för icke-gnagare 
gäller också de principer och förfaranden som beskrivs i denna testmetod, 
med lämpliga modifieringar, tillsammans med dem i kapitel B.27 i denna bilaga, 90-dagars oral toxicitetsstudie på icke-gnagare (6), som beskrivs i OECD:s vägledningsdokument nr 116 om utformning och genomförande av 
studier om kronisk toxicitet och karcinogenicitet (7). 
3. De tre huvudsakliga administrationssätten som används i kroniska 
toxicitets-/karcinogenicitetsstudier är oral, dermal och inhalation. Valet av administreringssätt beror på de fysikaliska och kemiska egenskaperna hos testkemikalien och det dominerande exponeringssättet för människor. Ytter ­
ligare information om val av exponeringssätt ges i vägledningsdokument 
nr 116 (7). 
4. Den här testmetoden fokuserar på exponering via oralt intag, det intag som 
används mest i kroniska toxicitets- och karcinogenicitetsstudier. Även om långsiktiga studier som medför exponering via huden eller inhalation kan 
vara nödvändiga för riskbedömning av människors hälsa och/eller kan krä ­
vas under vissa regelverk, så innebär båda exponeringsvägarna en betydande teknisk komplexitet. Sådana studier måste utformas från fall till fall, även om testmetoden som beskrivs här för bedömningen och utvärderingen av 
kronisk toxicitet och karcinogenicitet skulle kunna utgöra grunden för ett 
protokoll för inhalations- och/eller hudstudier, med hänsyn tagen till rekom ­
mendationer om behandlingsperioder, kliniska eller patologiska parametrar etc. OECD:s vägledning finns tillgänglig om administrering av testkemika ­
lier via inhalation (7) (8) och genom huden (7). Kapitel B.8 i denna bilaga 
(9) och kapitel B.29 i denna bilaga (10), tillsammans med OECD:s vägled ­
ningsdokument om akut inhalationstestning (8), bör särskilt rådfrågas vid utformningen av långsiktiga studier som inbegriper exponering via inhala ­
tion. Kapitel B.9 i denna bilaga (11) bör rådfrågas när det gäller testning 
som utförs via huden.
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 484
 
5. Den kombinerade kronisk toxicitet/karcinogenicitetsstudien ger information 
om möjliga hälsofaror som sannolikt kan uppstå vid upprepad exponering 
under en period som varar upp till hela livslängden för de arter som an ­
vänds. Studien ger information om de toxiska effekterna hos testkemikalien, inklusive potentiell karcinogenicitet, indikation om målorgan och möjlig 
ackumulering. Den kan ge en uppskattning av den icke-observerade nivån 
för skadliga biverkningar och, i fallet med icke-genotoxiska karcinogener, för tumörresponser som kan användas för att fastställa säkerhetskriterier för exponering av människor. Behovet av noggranna kliniska observationer av 
djuren i syfte att få fram så mycket information som möjligt betonas också. 
6. Målen för kroniska toxicitets-/karcinogenicitetsstudier som omfattas av 
denna testmetod inkluderar: 
— Identifieringen av de cancerframkallande egenskaperna hos en testkemi ­
kalie, vilka leder till en ökad incidens av tumörer, ökad andel maligna 
tumörer eller en minskning av tiden till uppkomst av tumörer, jämfört 
med parallella kontrollgrupper. 
— Fastställandet av tiden till uppkomst av tumörer. 
— Identifieringen av den kroniska toxiciteten hos testkemikalien. — Identifieringen av målorgan(en) för kronisk toxicitet/karcinogenicitet. 
— Karakterisering av förhållandet dos:respons. 
— Identifieringen av nivån där ingen skadlig effekt observeras (NOAEL) 
eller utgångspunkten för upprättandet av en referensdos (BMD). 
— Framtida konsekvenser av karcinogena effekter vid mänsklig exponering 
av lågdosnivåer. 
— Förutsägelse av kroniska toxiska effekter på nivåer för mänsklig expo ­
nering. 
— Tillhandahållande av data för att testa hypoteser om verkningssätt (2) (7) 
(12) (13) (14) (15).
 
INLEDANDE ÖVERVÄGANDEN 
7. Vid bedömningen och utvärderingen av den potentiella karcinogeniciteten 
och den kroniska toxiciteten hos en testkemikalie bör all tillgänglig infor ­
mation om testkemikalien beaktas av testlaboratoriet innan studien genom ­
förs, i syfte att fokusera på utformningen av studien för att mer effektivt testa dess toxikologiska egenskaper och minimera användningen av djur. 
Information om, och hänsyn till, verkningsmekanismen hos ett cancerfram ­
kallande ämne (2) (7) (12) (13) (14) (15) är särskilt viktig, eftersom den optimala utformningen kan variera beroende på om testkemikalien är en känd eller misstänkt genotoxisk karcinogen. Ytterligare vägledning om be ­
aktande av verkningssätt finns i vägledningsdokument nr 116 (7). 
8. Information som underlättar studiens utformning inkluderar identitet, kemisk 
struktur, och fysikalisk-kemiska egenskaper hos testkemikalien, eventuell 
information om verkningssätt, resultat från eventuella in vitro- eller in 
vivo-genotoxicitetstester; förväntad(e) användning(ar) och risken för mänsk ­
lig exponering, tillgängliga (Q)SAR-data, mutagenicitet/genotoxicitet, karci ­
nogenicitet och toxikologiska data om strukturellt närbesläktade kemikalier, 
tillgängliga toxikokinetiska data (engångsdos- och upprepad dos-kinetik om 
det finns tillgängligt) och data från andra studier med upprepad exponering.
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 485
 
Fastställandet av kronisk toxicitet/karcinogenicitet bör endast utföras efter att 
inledande information om toxicitet har erhållits från 28-dagars och/eller 90- 
dagars tester med upprepad dosering. Kortsiktiga initieringsfrämjande can ­
certester kan också ge användbar information. Ett stegvist förhållningssätt till testning av karcinogenicitet bör betraktas som en del av den övergri ­
pande bedömningen av de potentiella hälsoeffekterna för en viss testkemi ­
kalie (16) (17) (18) (19). 
9. De statistiska metoder som är mest lämpade för analys av resultaten, med 
tanke på försöksutformningen och målen, bör fastställas innan studien på ­
börjas. Frågor att överväga inkluderar huruvida statistiken bör innefatta 
justering av överlevnad, analys av kumulativa tumörrisker i förhållande 
till överlevnadsvaraktighet, analys av tiden till tumören och analys i hän ­
delse av förtida terminering av en eller fler grupper. Vägledning om lämp ­
liga statistiska analyser och viktiga referenser till internationellt erkända 
statistiska metoder ges i vägledningsdokument nr 116 (7), samt i vägled ­
ningsdokument nr 35 om analys och utvärdering av studier över kronisk toxicitet och karcinogenicitet (20). 
10. Vid genomförandet av en studie om karcinogenicitet bör man alltid följa de 
vägledande principer och överväganden som beskrivs i OECD:s vägled ­
ningsdokument om erkännande, bedömning och användning av kliniska 
tecken som humana endpoints för försöksdjur som används i säkerhets ­
bedömningen (21). Se särskilt punkt 62. Detta avsnitt anger att ”I studier med upprepad dosering när ett djur visar kliniska tecken som är progressiva, 
vilket leder till ytterligare försämring av tillståndet, bör ett välgrundat beslut 
tas om man ska eller inte ska avliva djuret av humanitära skäl. Beslutet bör även omfatta övervägandet av värdet av informationen som fås genom fort ­
satt skötsel av det djuret i studien i förhållande till dess övergripande till ­
stånd. Om ett beslut har tagits att låta djuret kvarstå i testet, bör observa ­
tionsfrekvensen ökas vid behov. Det är också möjligt, utan att allvarligt påverka syftet med testet, att tillfälligt upphöra med doseringen om det kan minska smärtan eller lidandet, eller att minska testdosen.” 
11. Detaljerad vägledning om och diskussion om principerna för valet av dos 
för studier om kronisk toxicitet och karcinogenicitet finns i väglednings ­
dokument nr 116 (7) samt i två internationella publikationer från Life Sci ­
ences Institute (22) (23). Den centrala strategin för valet av dos är beroende av det primära målet eller målen med studien (punkt 6). Vid val av lämpliga 
dosnivåer bör en balans uppnås mellan faroundersökning å ena sidan och 
karakterisering av lågdosresponser och deras betydelse å andra sidan. Detta är särskilt relevant när det gäller denna kombinerade kroniska toxicitets- och karcinogenicitetsstudie. 
12. Man bör överväga att genomföra denna kombinerade studie av kronisk 
toxicitet och karcinogenicitet, snarare än ett separat utförande av en studie 
av kronisk toxicitet (kapitel B.30 i denna bilaga) och en studie av karcino ­
genicitet (kapitel B.32 i denna bilaga). Det kombinerade testet ger större effektivitet vad gäller tid och kostnad, och en viss minskning av djuranvänd ­
ning jämfört med att jämföra två separata studier, utan att man kompromis ­
sar med datakvaliteten i antingen den kroniska eller karcinogena fasen. Noggrant övervägande bör dock ges av principerna för valet av dos (punk ­
terna 11 och 22–26) vid en kombinerad studie av kronisk toxicitet och 
karcinogenicitet, och det är också erkänt att separata studier kan krävas 
under vissa regelverk. Ytterligare vägledning om utformningen av den kom ­
binerade kroniska toxicitets- och karcinogenicitetsstudien för att uppnå max ­
imal studieprestanda när det gäller möjligheterna att minska antalet djur som 
används, så väl som rationalisering av de olika försöksförfaranden finns i 
vägledningsdokument nr 116 (7).
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 486
 
13. Definitioner som används inom ramen för den här metoden finns i slutet av 
det här kapitlet och i vägledningsdokument nr 116 (7).  
PRINCIP FÖR TESTMETODEN 
14. Studien är utformad med två parallella faser, en kronisk fas och karcinoge ­
nicitetsfas (se respektive punkt 34 och 35 för varaktighet). Testkemikalien administreras normalt oralt även om inhalation eller via huden också kan 
vara lämpligt. För den kroniska fasen administreras testkemikalien dagligen i 
graderade doser till flera grupper försöksdjur, en dosnivå per grupp, i all ­
mänhet under en 12-månadersperiod, även om kortare eller längre varaktig ­
heter kan väljas beroende på myndighetskrav (se punkt 34). Denna längd är 
vald för att vara tillräckligt lång för att eventuella effekter av kumulativ 
toxicitet blir uppenbara, utan de störande effekterna av geriatriska föränd ­
ringar. Studiens utformning kan även omfatta en eller flera avlivningar t.ex. vid 3 eller 6 månader, och ytterligare djur kan inkluderas för att tillgodose 
detta (se punkt 20). För karcinogenicitetsfasen administreras testkemikalien 
dagligen till flera grupper av försöksdjur under en större del av deras livs ­
längd. Djuren observeras noggrant i båda faserna avseende tecken på tox ­
icitet och utvecklingen av neoplastiska skador. Djur som dör eller avlivas 
under testet obduceras, och i slutet av testet avlivas överlevande djur och 
obduceras.
 
METODBESKRIVNING  
Val av djurart  
15. Den här testmetoden täcker främst bedömning och utvärdering av kronisk 
toxicitet och karcinogenicitet hos gnagare (punkt 2). Användningen av 
icke-gnagare kan övervägas när tillgängliga data tyder på att de är mer 
relevanta för förutsägelser av hälsoeffekter på människor. Valet av art bör motiveras. Rekommenderad gnagare är råtta, även om andra gnagare t.ex. mus kan användas. Även om användningen av möss i karcinogenicitetstester 
kan ha begränsad användbarhet (24) (25) (26), krävs fortfarande karcinoge ­
nicitetstester med möss under några aktuella regelverk såvida det inte kan fastställas att en sådan studie inte är vetenskapligt nödvändig. Råttor och möss har föredragits på grund av deras relativt korta livslängd, deras breda 
användning i farmakologiska och toxikologiska studier, deras känslighet för 
tumörinduktion och tillgången på stammar som beskrivits tillräckligt ingå ­
ende. Som en följd av dessa egenskaper finns en stor mängd information 
tillgänglig om deras fysiologi och patologi. Utformning och genomförande 
av kroniska toxicitets-/karcinogenicitetsstudier i icke-gnagare, när så krävs, bör baseras på de principer som beskrivs i denna testmetod tillsammans med dem i kapitel B.27 i denna bilaga, 90-dagars oral toxicitetsstudie på 
icke-gnagare med upprepad dosering (6). Ytterligare information om val 
av arter och stam ges i OECD:s vägledningsdokument nr 116 (7). 
16. I testet bör unga friska vuxna djur användas av stammar som vanligtvis 
används på laboratorier. Den kombinerade kroniska toxicitets-/karcinogeni ­
citetsstudien bör utföras på djur från samma stam och ursprung som de som 
användes i den inledande toxicitetsstudien(erna) med kortare varaktighet, 
dock, om djur från samma stam och ursprung är kända för att ge problem med att uppnå det normalt accepterade kriteriet för överlevnad i långsiktiga studier (se vägledningsdokument nr 116 (7)), bör man bör överväga att 
använda en stam med acceptabel överlevnadsgrad för den långsiktiga stud ­
ien. Honorna ska inte ha fått ungar och inte vara dräktiga.
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 487
 
Inhysnings- och utfodringsförhållanden  
17. Djuren kan inhysas individuellt, eller i små grupper av samma kön; indi ­
viduell inhysning ska endast övervägas om det är vetenskapligt motiverat 
(27) (28) (29). Burarna bör placeras så att en möjlig påverkan beroende på deras placering minimeras. Temperaturen i försöksdjurens utrymmen bör vara 22 °C (± 3 °C). Den relativa fuktigheten bör vara minst 30 % och 
helst inte överstiga 70 % utom när rummet rengörs, och målet bör vara 
50–60 %. Belysningen bör vara artificiell, med omväxlande 12 timmar ljus och 12 timmar mörker. För utfodringen kan konventionellt laboratorie ­
foder användas med ett obegränsat utbud av dricksvatten. Kosten ska upp ­
fylla alla näringsmässiga krav för arterna som testas och innehållet av fö ­
roreningar i kosten som kan påverka testresultatet inkluderar, men är ej begränsade till, bekämpningsmedelsrester, långlivade organiska föroreningar, fytoöstrogener, tungmetaller och mykotoxiner, och bör vara så låga som 
möjligt. Analytisk information om närings- och kostföroreningsnivåer bör 
genereras periodiskt, åtminstone i början av studien och när det finns en förändring i det använda partiet, och bör ingå i den slutliga rapporten. Analytisk information om dricksvattnet som används i studien ska likaledes 
ingå. Valet av foder kan påverkas av behovet av att säkerställa en lämplig 
blandning av en testkemikalie och för att tillgodose djurens näringsbehov när testkemikalien tillförs genom kosten.
 
Förberedelse av djuren  
18. Friska djur, som har acklimatiserat sig till laboratoriets betingelser i minst 7 
dagar och inte tidigare har ingått i försök, ska användas. När det gäller 
gnagare bör doseringen av djuren påbörjas snarast möjligt efter avvänjning och acklimatisering, och helst innan djuren är 8 veckor gamla. Försöks ­
djuren bör karakteriseras efter art, stam, ursprung, kön, vikt och ålder. 
Vid undersökningens början bör viktvariationen hos varje kön vara minimal och inte överstiga ± 20 % av medelvikten för alla djur inom studien, separat för varje kön. Djuren fördelas slumpvis i kontroll- och behandlingsgrupper ­
na. Efter randomiseringen bör det inte finnas några signifikanta skillnader i 
genomsnittliga kroppsvikter mellan grupper inom varje kön. Om det finns statistiskt signifikanta skillnader, bör randomiseringssteget upprepas, om möjligt. Varje djur bör tilldelas ett unikt identifikationsnummer, och märkas 
permanent med detta nummer genom tatuering, mikrochipimplantat, eller 
med annan lämplig metod.
 
PROCEDUR  
Djurens antal och kön  
19. Bägge könen ska användas. Ett tillräckligt antal djur ska användas så att en 
grundlig biologisk och statistisk utvärdering är möjlig. För gnagare ska varje 
dosgrupp (som beskrivs i punkt 22) och parallell kontrollgrupp för studiens 
karcinogenicitetsfas innehålla minst 50 djur av varje kön. Beroende på syftet med studien finns det möjlighet att öka den statistiska giltigheten för de viktigaste uppskattningarna genom att fördela djuren ojämnt till de olika 
dosgrupperna, med t.ex. fler än 50 djur i lågdosgruppen, för att uppskatta 
den cancerframkallande potentialen i låga doser. Det ska dock erkännas att en måttlig ökning av gruppstorlek ger en relativt liten ökning av den sta ­
tistiska giltigheten för studien. Varje dosgrupp (som beskrivs i punkt 22) 
och parallell kontrollgrupp för studiens kroniska toxicitetsfas bör innehålla 
minst 10 djur av varje kön när det gäller gnagare. Det bör noteras att denna
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 488
 
siffra är lägre än i studien för kronisk toxicitet (kapitel B.30 i denna bilaga). 
Tolkningen av data från det minskade antalet djur per grupp i den kroniska 
toxicitetsfasen i denna kombinerade studie kommer dock att stödjas av data från det större antalet djur i studiens karcinogenicitetsfas. I studier där möss ingår behövs fler djur i varje dosgrupp för den kroniska toxicitetsfasen för 
att genomföra alla nödvändiga hematologiska bestämningar. Ytterligare in ­
formation om statistisk utformning av studien och val av dosnivåer för att maximera den statistiska giltigheten finns i vägledningsdokument nr 116 (7).
 
Avsättningar för avlivningar, satellitgrupp och kontrolldjur.  
20. Studien får föreskriva avlivningar efter t.ex. 6 månader för den kroniska 
toxicitetsfasen för att få information om framskridandet av icke-neoplastiska förändringar och mekanistisk information, om det är vetenskapligt motiverat. 
Om sådan information om testkemikalien redan finns tillgänglig från tidigare 
toxicitetsstudier med upprepad dosering kanske inte avlivningar är veten ­
skapligt motiverade. De djur som används i den kroniska toxicitetsfasen, normalt 12 månaders varaktighet (punkt 34) ger avlivningsdata för den 
karcinogena fasen i studien, på så sätt uppnås ett totalt minskat antal djur. 
Satellitgrupper kan också ingå i den kroniska toxicitetsfasen av studien, för att övervaka reversibiliteten av eventuella toxikologiska förändringar som orsakats av den testkemikalie som undersöks. Dessa kan begränsas till stud ­
iens högsta dosnivå plus kontroll. Ytterligare en grupp kontrolldjur (normalt 
5 djur per kön) kan ingå för övervakning av sjukdomsstatus under studien (30), om nödvändigt. Ytterligare vägledning om studiens utformning för att omfatta avlivningar, satellit- och kontrolldjur, samtidigt som antalet djur 
som används totalt minskas ges i vägledningsdokument nr 116 (7). 
21. Om satellitdjur och/eller avlivningar inkluderas i studien, kommer antalet 
djur i varje dosgrupp som inkluderas i detta syfte normalt vara 10 djur per 
kön, och det totala antalet djur som ingår i studiens utformning ska ökas med det antal djur som planeras att avlivas innan studien slutförs. Avliv ­
ningar och satellitdjur bör normalt genomgå samma observationer, inklusive 
kroppsvikt, foder-/vattenkonsumtion, hematologiska och kliniska biokemiska 
mätningar och patologiska undersökningar som djuren i den kroniska tox ­
icitetsfasen i huvudstudien, även om avsättningar också kan göras (i avliv ­
ningsgruppen) för att mätningar ska begränsas till vissa viktiga mätningar 
såsom neurotoxicitet eller immunotoxicitet.
 
Dosgrupper och dosering  
22. Vägledning över alla aspekter av valet av dos och dosnivå finns i vägled ­
ningsdokument nr 116 (7). Minst tre dosnivåer och en parallell kontroll ­
grupp ska användas, för både den kroniska fasen och karcinogenicitetsfasen. Dosnivåer grundas i allmänhet på resultaten från en korttidsstudie med upp ­
repad dosering eller en spännviddsstudie och bör beakta eventuella toxiko ­
kinetiska data som finns tillgängliga om testkemikalien eller närbesläktade 
kemikalier.
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 489
 
23. För den kroniska toxicitetsfasen, kan en fullständig studie med tre dosnivåer 
inte anses vara nödvändig om det är troligt att en studie med en dosnivå på 
motsvarande minst 1 000 mg/kg kroppsvikt/dag inte ger några skadliga effekter. Detta bör baseras på information från inledande studier och med hänsyn till att toxicitet inte förväntas baserat på data från strukturellt när ­
besläktade kemikalier. En gräns på 1 000 mg/kg kroppsvikt/dag kan till ­
lämpas, utom när mänsklig exponering anger att en högre dosnivå ska användas. 
24. Såvida den inte är begränsad genom testkemikaliens fysikalisk-kemiska na ­
tur eller biologiska verkningar, bör den högsta dosnivån väljas för att iden ­
tifiera de viktigaste målorganen och de toxiska effekterna, samtidigt som man undviker lidande, svår toxicitet, sjuklighet eller död. Den högsta dos ­
nivån ska normalt väljas för att framkalla tecken på toxicitet, vilket t.ex. 
framgår av en minskning av kroppens viktökning (ca 10 %). Dock kan 
beroende på målen för studien (se punkt 6), en övre dos lägre än den dos som ger tecken på toxicitet väljas, t.ex. om en dos framkallar en negativ effekt som har försumbar eller ingen påverkan på livslängd eller kroppsvikt. 
25. Dosnivåer och dosnivåspridning kan väljas för att etablera en dosrespons 
och, beroende av testkemikaliens verkningssätt, en NOAEL eller andra av ­
sedda resultat från studien t.ex. en BMD (se punkt 27). Faktorer som bör beaktas i placeringen av lägre doser inkluderar den förväntade lutningen för 
dosrespons-kurvan, de doser vid vilka viktiga förändringar kan uppstå i 
metabolismen eller den toxiska verkningens art, där ett tröskelvärde förvän ­
tas eller där en utgångspunkt för lågdosextrapolering förväntas. Vid genom ­
förandet av en kombinerad karcinogenicitets-/kronisk toxicitetsstudie, är det 
primära målet att erhålla information för riskbedömning beträffande karci ­
nogenicitet, och information om kronisk toxicitet är normalt ett delmål. Detta bör beaktas vid val av dosnivåer och dosnivåspridning för studien. 
26. Den dosnivåspridning som väljs beror på målen med studien och testkemi ­
kaliens egenskaper, och kan inte föreskrivas i detalj i denna testmetod, men 
två- till fyrfaldiga dosintervall ger ofta bra testprestanda för att fastställa fallande dosnivåer, och tillägg av en fjärde testgrupp är att föredra framför användningen av mycket stora intervall (t.ex. mer än en faktor på ca 6–10) 
mellan doseringarna. I allmänhet bör användningen av faktorer som är större 
än 10 undvikas och motiveras om de används. 
27. Såsom vidare beskrivits i vägledningsdokument nr 116 (7), inkluderar punk ­
ter som ska beaktas vid valet av dos: 
— Kända eller misstänkta olinjäriteter eller inflexionspunkter i dosrespon ­
sen. 
— Toxikokinetik och dosintervall där metabolisk induktion, mättnad eller 
olinjäritet mellan externa och interna doser uppträder eller ej. 
— Utgångsskador, markörer för verkan eller indikatorer för viktiga under ­
liggande biologiska processer.
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 490
 
— Nyckelaspekter (eller misstänkta sådana) för verkningsmekanismer, så ­
som doser vid vilka cytotoxicitet börjar uppstå, hormonnivåerna störs, 
homeostatiska mekanismer är överväldigande etc. 
— Områden i dosrespons-kurvan där en särskilt stabil uppskattning behövs, 
t.ex. intervallet för förväntad BMD eller ett misstänkt tröskelvärde. 
— Beaktande av förväntade exponeringsnivåer för människor, särskilt vid 
valet av mellan- och lågdoser. 
28. Kontrollgruppen ska vara en obehandlad grupp eller en vehikelkontroll ­
grupp, om en vehikel används för tillförsel av testkemikalien. Med undantag av behandlingen med testkemikalien, bör djuren i kontrollgruppen hanteras på exakt samma sätt som de i testgrupperna. Om en vehikel används ska 
kontrollgruppen tillföras vehikeln i den största volym som används bland 
dosgrupperna. Om en testkemikalie tillförs via kosten och förorsakar ett betydligt minskat intag på grund av mindre välsmakande kost, kan ytterli ­
gare en parutfodrad kontrollgrupp vara användbar för en lämpligare kontroll.
 
Beredning av doser och administrering av testkemikalie  
29. Testkemikalien tillförs vanligtvis oralt, via kosten eller dricksvattnet, eller 
genom sondmatning. Ytterligare information om vägar och metoder för administrering ges i OECD:s vägledningsdokument nr 116 (7). Vägen och metoden för administrering beror på syftet med studien, de fysikalisk/ke ­
miska egenskaperna hos testkemikalien, dess biotillgänglighet, och domine ­
rande väg och metod för exponering av människor. En motivering bör ges för vald väg och metod för administrering. Med tanke på djurskydd bör oral sondmatning normalt väljas endast för de ämnen för vilka denna väg och 
metod för administrering representerar en potentiell mänsklig exponering 
(t.ex. läkemedel). För kost- eller miljökemikalier inklusive bekämpnings ­
medel, sker administrering vanligtvis via foder eller dricksvatten. För några situationer, t.ex. arbetsrelaterad exponering, kan administrering via andra 
vägar vara lämpligare. 
30. Vid behov kan testkemikalien upplösas eller suspenderas i en lämplig ve ­
hikel. Hänsyn bör tas till följande egenskaper hos vehikeln och andra till ­
satsämnen, i förekommande fall: verkningar på absorption, distribution, me ­
tabolism eller retention av testkemikalien, verkningar på testkemikaliens 
kemiska egenskaper som kan förändra dess toxiska egenskaper samt påver ­
kan på foder- eller vattenkonsumtion, eller djurens nutritionsstatus. Det re ­
kommenderas, när så är möjligt, att man först använder en vattenbaserad 
lösning/suspension följt av en lösning/emulsion i olja (t.ex. majsolja) och 
därefter eventuell lösning i andra vehiklar. För andra vehiklar än vatten bör de toxiska egenskaperna hos vehikeln vara kända. Information om testkemi ­
kaliens stabilitet och doseringslösningarnas eller fodrets homogenitet (i före ­
kommande fall) enligt villkoren för administreringen (t.ex. kost), bör finnas 
tillgänglig. 
31. För kemikalier som tillförs via foder eller dricksvatten är det viktigt att 
säkerställa att kvantiteterna av den berörda testkemikalien inte påverkar normal närings- eller vattenbalans. I långtidsstudier med kostadministrering 
bör koncentrationen av testkemikalien i fodret normalt inte överskrida en 
övre gräns på 5 % av den totala kosten, för att undvika näringsmässig obalans. När testkemikalien tillförs via kosten kan antingen en konstant foderkoncentration (mg/kg foder eller ppm) eller en konstant dosnivå i för ­
hållande till djurens kroppsvikt (mg/kg kroppsvikt), beräknad på veckobasis, 
användas. Det alternativ som används ska anges.
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 491
 
32. När det gäller oral administrering doseras djuren dagligen med testkemika ­
lien (sju dagar i veckan) under en period på 12 månader (kronisk fas) eller 
24 månader (karcinogenicitetsfas), se också punkterna 33 och 34. Alla andra doseringsscheman t.ex. fem dagar per vecka måste motiveras. När det gäller dermal administrering, behandlas djuren normalt med testkemikalien minst 6 
timmar per dag, 7 dagar per vecka, enligt kapitel B.9 i denna bilaga (11), 
under en period av 12 månader (kronisk fas) eller 24 månader (karcinoge ­
nicitetsfas). Exponering genom inhalation utförs 6 timmar per dag, 7 dagar per vecka, men exponering 5 dagar per vecka kan också användas om detta 
är motiverat. Exponeringsperioden är normalt 12 månader (kronisk fas) eller 
24 månader (karcinogenicitetsfas). Om andra gnagare än råttor utsätts för enbart nos, kan de maximala exponeringstiderna justeras för att minska artspecifikt lidande. En motivering bör ges när man använder en expone ­
ringstid kortare än 6 timmar per dag. Se också kapitel B.8 i denna 
bilaga (9). 
33. När en testkemikalie administreras via sondmatning bör detta ske via en 
magsond eller en lämplig intubationskanyl vid ungefär samma tid varje dag. 
Normalt administreras en singeldos en gång per dag, men om en kemikalie är lokalt irriterande är det möjligt att upprätthålla den dagliga dosen genom delad dos (två gånger per dag). Den största mängd vätska som kan admini ­
streras vid ett tillfälle beror på försöksdjurets storlek. Volymen bör vara så 
liten som möjligt, och bör normalt inte överstiga 1 ml/100 g kroppsvikt för gnagare (31). Variationer i testvolym bör minimeras genom justering av koncentrationen för att säkerställa en konstant volym vid alla dosnivåer. 
Potentiellt frätande eller irriterande kemikalier är undantagna, och måste 
spädas ut för att allvarliga lokala verkningar ska kunna undvikas. Testning vid koncentrationer som sannolikt är frätande eller irriterande för magtarm ­
kanalen bör undvikas.
 
Studiens varaktighet  
34. Doseringsperioden och varaktigheten för den kroniska fasen i den här stud ­
ien är i allmänhet 12 månader, även om studiens utformning medger och 
kan tillämpas på antingen kortare (t.ex. 6 eller 9 månader) eller längre (t.ex. 
18 eller 24 månader) varaktighetsstudier, beroende på kraven från särskilda regelverk eller särskilda mekanistiska ändamål. Avvikelser från en expone ­
ringstid på 12 månader bör motiveras, särskilt när det gäller kortare var ­
aktigheter. Alla dosgrupper som tilldelats denna fas kommer att avslutas vid 
den utsatta tidpunkten för utvärdering av kronisk toxicitet och icke-neoplastisk patologi. Satellitgrupper som ingår för att övervaka reversi ­
biliteten av eventuella toxikologiska förändringar som orsakats av den test ­
kemikalie som undersöks, ska bibehållas utan dosering under en period som 
inte är kortare än 4 veckor och inte längre än en tredjedel av den totala studieperioden efter avslutad exponering. 
35. Studiens varaktighet för den karcinogenicitetiska fasen av studien är normalt 
24 månader för gnagare, vilket motsvarar huvuddelen av livslängden för de djur som används. Kortare eller längre varaktigheter kan användas, beroende på livslängden för djurarten i studien, men bör motiveras. För specifika 
stammar av möss t.ex. AKR/J-, C3H/J- eller C57BL/6J-stammar kan en 
varaktighet på 18 månader vara mer lämplig. Det följande ger viss vägled ­
ning om varaktighet, studiens upphörande och överlevnad, ytterligare väg ­
ledning, inbegripet en bedömning av huruvida en negativ karcinogenicitets ­
studie i förhållande till överlevnad är godtagbar, finns i vägledningsdoku ­
ment nr 116 (7).
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 492
 
— Studiens upphörande bör beaktas när antalet överlevare i de lägre dos ­
grupperna understiger 25 procent. 
— I de fall där endast högdosgruppen dör i förtid på grund av toxicitet bör 
detta inte leda till upphörande av studien. 
— Överlevnad för vardera kön ska beaktas för sig. — Studien bör inte fortsätta över den punkt där tillgängliga data från stud ­
ien inte längre är tillräckliga för att ge en statistisk giltig utvärdering.
 
OBSERVATIONER (KRONISK TOXICITETSFAS) 
36. Samtliga djur bör observeras beträffande sjuklighet eller mortalitet, vanligt ­
vis i början och slutet av varje dag, inklusive helger och helgdagar. All ­
männa kliniska observationer bör göras minst en gång per dag, helst vid 
samma tidpunkt(er), och ta hänsyn till maximalt förväntade effekter efter 
doseringen när det gäller administrering via sondmatning. 
37. Detaljerade kliniska observationer bör göras på samtliga djur minst en gång 
före den första exponeringen (för jämförelser inom samma objekt), i slutet av studiens första vecka och därefter varje månad. Observationsprotokollet 
bör anordnas så att variationerna mellan enskilda observatörer minimeras 
och är oberoende av testgrupp. Dessa observationer bör göras utanför buren på avsedd plats, ungefär vid samma tidpunkter varje gång. De bör noggrant registreras, helst med hjälp av ett poängsystem som utförligt definierats av 
testlaboratoriet. Ansträngningar bör göras för att säkerställa att variationer i 
observationsbetingelserna är minimala. Observationerna bör omfatta, men inte begränsas till, förändringar av hud, päls, ögon, slemhinnor, förekomst av sekret och utsöndringar samt autonom aktivitet (t.ex. tårflöde, upprest 
hårrem, pupillstorlek, ovanligt andningsmönster). Förändringar i gång, håll ­
ning och reaktion på hantering liksom eventuella kramper eller spasmer, stereotypier (t.ex. överdrivet putsande, repetitivt cirklande) eller bisarrt be ­
teende (t.ex. självstympning, baklängesgång) bör också registreras (32). 
38. En oftalmologisk undersökning med ett oftalmoskop eller annan lämplig 
utrustning bör utföras på samtliga djur före den första administreringen av 
testkemikalien. Vid slutet av studien bör denna undersökning helst utföras på samtliga djur, men åtminstone på högdos- och kontrollgrupperna. Om behandlingsrelaterade ögonförändringar upptäcks bör samtliga djur undersö ­
kas. Om strukturell analys eller annan information tyder på okulär toxicitet 
bör frekvensen på okulära undersökningar höjas. 
39. För kemikalier där tidigare 28-dagars och/eller 90-dagars toxicitetstest med 
upprepad dosering indikerade en potential för att framkalla neurotoxiska effekter, bör sensorisk reaktion på stimuli av olika slag (32) (t.ex. hörsel, 
syn och djupsensorisk stimuli) (33), (34), (35), bedömning av greppstyrka 
(36) och bedömning av motorisk aktivitet (37) eventuellt utföras före studie ­
starten och i 3-månadersperioder efter studiestarten till och med 12 månader, samt vid studiens upphörande (om längre än 12 månader). Ytterligare upp ­
gifter om de procedurer som kan följas finns i respektive hänvisningar. 
Dock kan andra procedurer än de som hänvisats till också användas.
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 493
 
40. För kemikalier där tidigare 28-dagars och/eller 90-dagars toxicitetstester med 
upprepad dosering indikerade en potential för att orsaka immunologiska 
effekter, kan ytterligare undersökningar av denna endpoint eventuellt utföras vid avslutningen.
 
Kroppsvikt, foder-/vattenkonsumtion och fodereffektivitet  
41. Samtliga djur bör vägas vid behandlingens början, minst en gång i veckan 
de första 13 veckorna och därefter minst en gång per månad. Mätningar av foderkonsumtion och fodereffektivitet bör minst göras varje vecka de 13 första veckorna och därefter minst en gång per månad. Vattenkonsumtionen 
bör mätas minst en gång per vecka de 13 första veckorna, och därefter minst 
en gång per månad, när testkemikalien administreras via dricksvattnet. Mät ­
ningar av vattenkonsumtionen bör också övervägas för studier där vattend ­
rickandet förändras.
 
Hematologi och klinisk biokemi  
42. I studier med gnagare bör hematologiska undersökningar utföras på samtliga 
djur (10 handjur och 10 hondjur per grupp), vid 3, 6 och 12 månader, samt vid studiens upphörande (om längre än 12 månader). Satellitdjur kan behö ­
vas när det gäller möss för att genomföra alla nödvändiga hematologiska 
bestämningar (se punkt 19). För icke-gnagare måste prover tas från ett mindre antal djur (t.ex. 4 djur per kön och per grupp för hundstudier) vid mellanliggande provtagningstillfällen och avslutandet enligt vad som beskri ­
vits för gnagare. Mätningar vid 3 månader, antingen på gnagare eller 
icke-gnagare, behöver inte utföras om inga effekter syntes på hematologiska parametrar i en tidigare 90-dagars studie som genomfördes med jämförbara dosnivåer. Blodprover bör tas under narkos från angivet ställe, till exempel 
genom hjärtpunktering eller från retro-orbitalsinus. 
43. Följande lista över parametrar bör undersökas (38): Total- och differential ­
räkning av vita blodkroppar, erytrocytantal, trombocytantal, hemoglobinkon ­
centration, hematokrit (packad cellvolym), medelvärde för korpuskulärvolym 
(MCV), medelvärde för korpuskulärt hemoglobin (MCH), medelvärde för korpuskulär hemoglobinkoncentration (MCHC), protrombintid och aktiverad partiell tromboplastintid. Övriga hematologiska parametrar såsom 
Heinz-kroppar eller annan atypisk erytrocytmorfologi eller methemoglobin 
kan mätas på lämpligt sätt beroende på testkemikaliens toxicitet. Samman ­
taget bör en flexibel strategi antas, beroende på den observerade och/eller förväntade verkningen av en given testkemikalie. Om testkemikalien har en 
effekt på det hematopoetiska systemet, kan retikulocytantal och benmärgs ­
cytologi också anges, men detta behöver inte utföras rutinmässigt. 
44. Kliniska biokemiska bestämningar för att undersöka större toxiska effekter i 
vävnader och, särskilt, effekter på lever och njurar bör utföras på blodprov 
från samtliga försöksdjur (10 handjur och 10 hondjur per grupp), vid samma tidsintervaller som specificerades för de hematologiska undersökningarna. Satellitdjur kan behövas när det gäller möss för att genomföra alla nödvän ­
diga kliniska biokemiska bestämningar. För icke-gnagare måste prover tas 
från ett mindre antal djur (t.ex. 4 djur per kön och per grupp för hund ­
studier) vid mellanliggande provtagningstillfällen och avslutandet enligt vad som beskrivits för gnagare. Mätningar vid 3 månader, antingen på gnagare 
eller icke-gnagare, behöver inte utföras om inga effekter syntes på kliniska 
biokemiska parametrar i en tidigare 90-dagars studie som genomfördes med
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 494
 
jämförbara dosnivåer. Det rekommenderas att djuren fastar över natten (med 
undantag av möss) före blodprovstagningen (  1 ). Följande lista över paramet ­
rar bör undersökas (38): Glukos, urea (ureakväve), kreatinin, totalprotein, albumin, kalcium, natrium, kalium, totalkolesterol, minst två lämpliga tester för hepatocellular utvärdering (alaninaminotransferas, aspartataminotrans ­
feras, glutamatdehydrogenas, totala gallsyror) (39), och minst två lämpliga 
tester för hepatobiliär utvärdering (alkaliskt fosfatas, gammaglutamyl trans ­
feras, 5’-nukleotidas, totalt bilirubin, totala gallsyror) (39). Andra kliniska kemiska parametrar såsom triglycerider vid fasta, specifika hormoner och 
kolinesteras kan mätas på lämpligt sätt, beroende på testkemikaliens tox ­
icitet. Sammantaget finns det ett behov av en flexibel strategi, beroende på den observerade och/eller förväntade verkningen av en given testkemikalie. 
45. Urinanalyserna bör utföras på samtliga försöksdjur (10 handjur och 10 hon ­
djur per grupp), på prov som tagits vid samma intervaller som för hemato ­
logi och klinisk kemi. Mätningar vid 3 månader behöver inte utföras om 
ingen effekt syntes på urinanalysen i en tidigare 90-dagars studie som genomfördes med jämförbara dosnivåer. Följande lista över parametrar ing ­
ick i en sakkunnig rekommendation om kliniska patologiska studier (38): 
Utseende, volym, osmolalitet eller specifik vikt, pH, totalprotein och glukos. 
Andra bestämningar inkluderar keton, urobilinogen, bilirubin och ockult blödning. Ytterligare parametrar kan användas vid behov för att utvidga undersökningen av observerad(e) verkning(ar). 
46. Det anses allmänt att utgångsvärden för hematologiska och kliniska kemiska 
variabler behöver bestämmas före behandlingen i hundstudier, men inte behöver bestämmas för studier i gnagare (38). Om historiska basdata (se punkt 58) är otillräckliga bör man överväga att generera sådana data.
 
PATOLOGI  
Obduktion  
47. Samtliga djur i studien bör normalt underkastas en fullständig obduktion, 
som omfattar omsorgsfull granskning av kroppens yttre ytor, alla kropps ­
öppningar samt kranium, bröst- och bukhåla samt deras innehåll. En be ­
stämmelse kan också göras (i avlivnings- eller satellitgrupperna) så att mät ­
ningarna begränsas till vissa viktiga åtgärder, såsom neurotoxicitet eller 
immunotoxicitet (se punkt 21). Dessa djur behöver inte obduceras och efter ­
följande procedurer beskrivs i nedanstående punkter. Obduktion kan från fall till fall krävas av indikatordjur, efter beslut av försöksledaren.
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 495  
( 1 ) För ett antal mätningar i serum och plasma, särskilt glukos, är det önskvärt med fasta 
över natten. Den största orsaken till detta är att den ökade variationen som oundvikligen 
resulterar från icke-fastande, tenderar att maskera mer subtila effekter och göra tolk ­
ningen svår. Dock bör det noteras att fastande över natten kan påverka djurens allmänna 
metabolism, särskilt beträffande utfodringsstudier, och kan störa den dagliga expone ­
ringen av testkemikalien. Samtliga djur bör bedömas i samma fysiologiska tillstånd 
och därför bör detaljerade eller neurologiska bedömningar planeras för annan dag än 
den kliniska biokemiska provtagningen.
 48. Organvikter bör samlas från samtliga djur, förutom de som undantas genom 
den senare delen av punkt 47. Binjurar, hjärna, bitestiklar, hjärta, njurar, 
lever, äggstockar, mjälte, testiklar, sköldkörtel (vägda efter fixering, med bisköldkörtlar) och livmoder från samtliga djur (bortsett från de döende och/eller avlivade) putsas från angränsande vävnad, i förekommande fall, 
och deras våtvikt bestäms så snart som möjligt efter dissektionen för att 
undvika uttorkning. 
49. Följande vävnader bör bevaras i det mest lämpade fixeringsmedlet för både 
vävnadstypen och den planerade efterföljande histopatologiska undersök ­
ningen (40) (vävnader inom hakparenteser är valfria): 
alla större skador hjärta pankreas mage (förmagen, 
glandulärmagen) 
binjure ileum bisköldkörtel [tänder] 
aorta jejunum perifer nerv testikel 
hjärna (inklusive delar av 
cerebrum, cerebellum och medulla/pons) njure hypofys tymus 
cekum tårkörtel (exorbital) prostata sköldkörtel 
cervix lever rektum [tunga] 
koagulerande körtel lunga spottkörtel trakea 
kolon lymfkörtlar (både ytliga 
och djupa) sädesblåsa urinblåsa 
tolvfingertarm bröstkörtel (obligatorisk 
för honor, och om synlig och dissekeringsbar hos 
hanar) skelettmuskel uterus (inklusive cervix) 
bitestikel [övre luftvägarna, inklu ­
sive nos, turbinates och bihålorna] hud [ureter] 
öga (inklusive näthinna) esofagus ryggmärg (på tre nivåer: 
cervikal, mitt på bröst ­
korgen och ländryggen) [uretra] 
[lårben med led] [luktbulb] mjälte vagina 
gallblåsa (för andra arter än 
råtta) äggstock [bröstben], snitt av ryggmärgen och/eller 
ett färskt benmärgsaspirat 
Harderiankörtel
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 496
 
När det gäller parvisa organ t.ex. njure, binjure, bör båda organen bevaras. 
Kliniska och andra fynd kan indikera behovet av att undersöka ytterligare 
vävnader. Också alla organ som sannolikt är målorgan, baserat på kunskap om testkemikaliens egenskaper, ska konserveras. I studier som inbegriper administrering via huden bör listan på organ som anges för oralt intag 
undersökas, och det är nödvändigt med särskild provtagning och bevarande 
av huden där appliceringen har skett. I inhalationsstudier bör förteckningen över bevarade och undersökta vävnader från luftvägarna följa rekommenda ­
tionerna i kapitel B.8 (9) och kapitel B.29 i denna bilaga (10). För andra 
organ/vävnader (och i tillägg till de specifikt bevarade vävnaderna från 
luftvägarna) bör de organ som finns i förteckningen som anges för den orala vägen undersökas.
 
Histopatologi  
50. Vägledning finns tillgänglig om bästa praxis vid genomförande av studier 
gällande toxikologisk patologi (40). Den minsta histopatologiska undersök ­
ningen bör vara: 
— Alla vävnader från högdos- och kontrollgrupperna. — Alla vävnader från djur som dör eller avlivas under studien. — Alla vävnader som uppvisar makroskopiska abnormaliteter. — Målvävnader, eller vävnader som uppvisade behandlingsrelaterade för ­
ändringar i högdosgruppen, från samtliga djur i alla andra doserings ­
grupper, 
— När det gäller parvisa organ t.ex. njure, binjure, bör båda organen un ­
dersökas.
 
OBSERVATIONER (KARCINOGENICITETSFAS) 
51. Samtliga djur bör observeras beträffande sjuklighet eller mortalitet, vanligt ­
vis i början och slutet av varje dag, inklusive helger och helgdagar. Djuren 
bör dessutom kontrolleras en gång per dag för särskilda tecken med tox ­
ikologisk relevans. När det gäller sondmatningsstudier bör djuren kontrolle ­
ras under perioden omedelbart efter dosering. Särskild uppmärksamhet bör 
ges åt tumörutveckling och tidpunkten för tumörens uppkomst, plats, mått, 
utseende, och utvecklingen av varje tydlig eller kännbar tumör ska registre ­
ras. 
52. Samtliga djur bör vägas vid behandlingens början, minst en gång i veckan 
de första 13 veckorna och därefter minst en gång per månad. Mätningar av 
foderkonsumtion och fodereffektivitet bör minst göras varje vecka de 13 
första veckorna och därefter minst en gång per månad. Vattenkonsumtionen bör mätas minst en gång per vecka de 13 första veckorna, och därefter minst en gång per månad, när testkemikalien administreras via dricksvattnet. Mät ­
ningar av vattenkonsumtionen bör också övervägas för studier där vattend ­
rickandet förändras.
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 497
 
Hematologiska, kliniska biokemiska och andra mätningar  
53. För att maximera informationen som erhållits från studien, särskilt över ­
väganden gällande verkningssätt, kan blodprover tas för hematologi och 
klinisk biokemi, även om detta avgörs av försöksledaren. Urinanalys kan även vara lämplig. Data om djuren som används i studiens kroniska tox ­
icitetsfas, vanligtvis efter en 12-månaders varaktighet (punkt 34) ger infor ­
mation om dessa parametrar. Ytterligare vägledning om värdet med att ta 
sådana prov som en del av en karcinogenicitetsstudie finns i väglednings ­
dokument nr 116 (7). Om blodprov tas så bör dessa samlas i slutet av testperioden, strax före eller som ett led i avlivningsförfarandet. De bör 
tas under narkos från angivet ställe, till exempel genom hjärtpunktering eller 
från retro-orbitalsinus. Blodutstryk kan också beredas för undersökning, sär ­
skilt om benmärgen verkar vara målorganet, även om värdet av en sådan undersökning av blodutstryk i karcinogenicitetsfasen för bestämning av kar ­
cinogen/onkogen potential har ifrågasatts (38).
 
PATOLOGI  
Obduktion  
54. Samtliga djur i studien med undantag av kontrolldjur och andra satellit ­
grupper (se punkt 20), ska underkastas en fullständig obduktion som om ­
fattar omsorgsfull granskning av kroppens yttre ytor, alla kroppsöppningar samt kranium, bröst- och bukhåla samt deras innehåll. Obduktion kan från 
fall till fall krävas av indikatordjur och andra satellitdjur efter beslut av 
försöksledaren. Organvikter är normalt inte en del av en karcinogen studie, eftersom geriatriska förändringar och, i senare skeden, utvecklingen av tu ­
mörer förvirrar användbarheten av organviktsdatan. De kan dock vara av ­
görande för att göra en sammanvägd bedömning, och särskilt för övervägan ­
den beträffande verkningssätt. Om de är en del av en satellitstudie bör de inte samlas in senare än ett år efter studiens inledning. 
55. Följande vävnader bör bevaras i det mest lämpade fixeringsmedlet för både 
vävnadstypen och den planerade efterföljande histopatologiska undersök ­
ningen (40) (vävnader inom hakparenteser är valfria): 
alla större skador hjärta pankreas mage (förmagen, 
glandulärmagen) 
binjure ileum bisköldkörtel [tänder] 
aorta jejunum perifer nerv testikel 
hjärna (inklusive delar av 
cerebrum, cerebellum och medulla/pons) njure hypofys tymus 
cekum tårkörtel (exorbital) prostata sköldkörtel 
cervix lever rektum [tunga] 
koagulerande körtel lunga spottkörtel trakea 
kolon lymfkörtlar (både ytliga 
och djupa) sädesblåsa urinblåsa
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 498
 
tolvfingertarm bröstkörtel (obligatorisk 
för honor, och om synlig 
och dissekeringsbar hos hanar) skelettmuskel uterus (inklusive cervix) 
bitestikel [övre luftvägarna, inklu ­
sive nos, turbinates och bihålorna] hud [ureter] 
öga (inklusive näthinna) esofagus ryggmärg (på tre nivåer: 
cervikal, mitt på bröst ­
korgen och ländryggen) [uretra] 
[lårben med led] [luktbulb] mjälte vagina 
gallblåsa (för andra arter än 
råtta) äggstock [bröstben], snitt av ryggmärgen och/eller 
ett färskt benmärgsaspirat 
Harderiankörtel 
När det gäller parvisa organ t.ex. njure, binjure, bör båda organen bevaras. 
Kliniska och andra fynd kan indikera behovet av att undersöka ytterligare 
vävnader. Alla organ som sannolikt är målorgan, baserat på kunskap om testkemikaliens egenskaper, ska också konserveras. I studier som inbegriper administrering via huden bör listan på organ som anges för oralt intag 
undersökas, och det är nödvändigt med särskild provtagning och bevarande 
av huden där appliceringen har skett. I inhalationsstudier bör förteckningen över bevarade och undersökta vävnader från luftvägarna följa rekommenda ­
tionerna i kapitel B.8 (8) och kapitel B.29 i denna bilaga (9). För andra 
organ/vävnader (och i tillägg till de specifikt bevarade vävnaderna från 
luftvägarna) bör de organ som finns i förteckningen som anges för den orala vägen undersökas.
 
Histopatologi  
56. Vägledning finns tillgänglig om bästa praxis vid genomförande av studier 
gällande toxikologisk patologi (40). De vävnader som minst ska undersökas 
är: 
— Alla vävnader från högdos- och kontrollgrupperna. — Alla vävnader från djur som dör eller avlivas under studien. 
— Alla vävnader som uppvisar makroskopiska abnormaliteter, inklusive 
tumörer. 
— När behandlingsrelaterade histopatologiska förändringar observeras i 
högdosgruppen, ska samma vävnader från samtliga djur i alla andra 
dosgrupper undersökas, 
— När det gäller parvisa organ t.ex. njure, binjure, bör båda organen un ­
dersökas.
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 499
 
DATA OCH RAPPORTERING (KARCINOGENICITET OCH KRONISK 
TOXICITET)  
Data  
57. Individuella data för samtliga utvärderade parametrar bör ges. Därutöver bör 
alla data sammanfattas i tabellform, som för varje testgrupp visar antal djur vid testets början, antal djur som påfanns döda under testet eller som av ­
livats av humanitära skäl och tidpunkten för dödsfallen eller avlivningen, 
antal djur som visar tecken på toxicitet, en beskrivning av de tecken på 
toxicitet som observerats, inklusive tidpunkt för de första tecknen, varaktig ­
het och hur allvarliga de toxiska verkningarna är, antal djur som uppvisar skador, typ av skador och procentandelen djur för varje typ av skada. 
Sammanfattande tabeller bör ge medelvärden och standardavvikelser (för 
kontinuerliga testdata) för djur som uppvisar toxiska effekter eller skador, i tillägg till skadornas gradering. 
58. Historiska kontrolldata kan vara värdefulla vid tolkningen av studiens resul ­
tat, t.ex. i de fall då det finns indikationer på att de data som lämnats från de 
parallella kontrollerna i huvudsak avviker jämfört med aktuell data från 
kontrolldjuren från samma testanläggning/-koloni. Historiska kontrolldata, om de har utvärderats, bör lämnas in från samma laboratorium och relatera till djur i samma ålder och av samma stam som genererats under de fem år 
som föregick studien i fråga. 
59. När det är tillämpligt bör numeriska resultat utvärderas genom en lämplig 
och allmänt vedertagen statistisk metod. Vid utformningen av studien bör de statistiska metoderna och datan som ska analyseras väljas (punkt 9). Valet bör innehålla bestämmelser om överlevnadsjusteringar, där så krävs. 
60. Testrapporten ska omfatta följande information:  
Testkemikalie:  
— Fysikalisk natur, renhet och fysikalisk-kemiska egenskaper. — Identifikationsuppgifter. — Kemikaliens källa. — Satsnummer. — Intyg om kemisk analys.  
Vehikel (i förekommande fall):  
— Motivering för val av vehikel (om annan än vatten).  
Försöksdjur:  
— Art/stam som används och motivering av valet. — Djurens antal, ålder och kön vid testets början. — Ursprung, inhysning, kost etc. — Djurens individuella vikt vid testets början.
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 500
 
Försöksbetingelser:  
— Grund för administreringssätt och dosval. — I förekommande fall, de statistiska metoderna som använts för att ana ­
lysera datan. 
— Uppgifter om testkemikaliens sammansättning/foderberedning. — Analysdata om beredningens uppnådda koncentration, stabilitet och ho ­
mogenitet. 
— Administreringssätt och uppgifter om testkemikaliens administrering. — Om enbart nos eller helkropp vid inhalationsstudier. — Faktiska doser (mg/kg kroppsvikt/dag) och omräkningsfaktor för ko ­
stens/dricksvattnets testkemikaliekoncentration (mg/kg eller ppm) till 
den faktiska dosen, om tillämpligt. 
— Uppgifter om foder- och vattenkvalitet.  
Resultat (sammanfattande data i tabellform och enskilda djurdata ska pre ­
senteras): 
Allmänt  
— Överlevnadsdata. — Kroppsvikt/kroppsviktsförändringar. — Foderförbrukning, beräkningar av fodereffektivitet, om det har utförts, 
och vattenförbrukning, om tillämpligt. 
— Toxikokinetiska data, i förekommande fall. — Oftalmoskopi (om tillgängligt). — Hematologi (om tillgängligt). — Klinisk kemi (om tillgängligt).  
Kliniska fynd  
— Tecken på toxicitet. — Förekomst (och allvarlighetsgrad) av eventuell abnormitet. — Art, allvarlighetsgrad och varaktighet för kliniska observationer (huru ­
vida de är övergående eller permanenta).  
Obduktionsdata  
— Terminal kroppsvikt. — Organvikter och deras förhållanden, om tillämpligt. — Obduktionsfynd, abnormaliteternas förekomst och allvarlighetsgrad.  
Histopatologi  
— Icke-neoplastiska histopatologiska fynd. — Neoplastiska histopatologiska fynd.
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 501
 
— Sambandet mellan grova och mikroskopiska fynd. 
— Detaljerad beskrivning av alla behandlingsrelaterade histopatologiska 
fynd, inklusive allvarlighetsgradering. 
— Rapport över eventuell inbördes granskning av bilder.  
Statistisk bearbetning av resultaten, när så är lämpligt 
Diskussion av resultaten, inklusive:  
— Diskussion om eventuella modellstrategier. 
— Dos:responsförhållanden. 
— Historiska kontrolldata. 
— Beaktande av eventuell information om verkningssätt. 
— BMD-, NOAEL- eller LOAEL-bestämning. 
— Relevans för människor.  
Slutsatser  
LITTERATUR  
(1) OECD (1995). Report of the Consultation Meeting on Sub-chronic and 
Chronic Toxicity/Carcinogenicity Testing (Rome, 1995), internal working 
document, Environment Directorate, OECD, Paris. 
(2) EPA (2005). Guidelines for Carcinogen Risk Assessment Risk Assessment 
Forum U.S. Environmental Protection Agency Washington, DC. 
(3) Combes RD, Gaunt I, Balls M (2004). A Scientific and Animal Welfare 
Assessment of the OECD Health Effects Test Guidelines for the Safety 
Testing of Chemicals under the European Union REACH System. ATLA 
32: 163–208. 
(4) Barlow SM, Greig JB, Bridges JW et al (2002). Hazard identification by 
methods of animal-based toxicology. Food. Chem. Toxicol. 40: 14–191. 
(5) Chhabra RS, Bucher JR, Wolfe M, Portier C (2003). Toxicity characteri ­
zation of environmental chemicals by the US National Toxicology Program ­
me: an overview. Int. J. Hyg. Environ. Health 206: 437–445. 
(6) Kapitel B.27 i denna bilaga, test avseende subkronisk oral toxicitet (90 
dagars upprepat oraltest på icke-gnagare). 
(7) OECD (2012). Guidance Document on the Design and Conduct of Chronic 
Toxicity and Carcinogenicity Studies, Supporting Test Guidelines 451, 452 and 453 – Second edition. Series on Testing and Assessment No. 116, 
tillgänglig på OECD:s offentliga webbplats för vägledningar för tester på 
www.oecd.org/env/testguidelines. 
(8) OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing. 
Series on Testing and Assessment No 39, ENV/JM/MONO(2009)28, 
OECD, Paris. 
(9) Kapitel B.8 i denna bilaga, subakut inhalationstoxicitet: 28-dagars studie. 
(10) Kapitel B.29 i denna bilaga, subkronisk inhalationstoxicitet: 90-dagars stud ­
ie. 
(11) Kapitel B.9 i denna bilaga, toxicitet vid upprepad dosering (28 dagar, 
dermalt).
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 502
 
(12) Boobis AR, Cohen SM, Dellarco V, McGregor D, Meek ME, Vickers C, 
Willcocks D, Farland W (2006). IPCS Framework for analyzing the Rele ­
vance of a Cancer Mode of Action for Humans. Crit. Rev. in Toxicol, 36:793–801. 
(13) Cohen SM, Meek ME, Klaunig JE, Patton DE, Fenner-Crisp PA (2003). 
The human relevance of information on carcinogenic Modes of Action: An 
overview. Crit. Rev. Toxicol. 33:581–589. 
(14) Holsapple MP, Pitot HC, Cohen SN, Boobis AR, Klaunig JE, Pastoor T, 
Dellarco VL, Dragan YP (2006). Mode of Action in Relevance of Rodent Liver Tumors to Human Cancer Risk. Toxicol. Sci. 89:51–56. 
(15) Meek EM, Bucher JR, Cohen SM, Dellarco V, Hill RN, 
Lehman-McKemmon LD, Longfellow DG, Pastoor T, Seed J, Patton DE (2003). A Framework for Human Relevance analysis of Information on Carcinogenic Modes of Action. Crit. Rev. Toxicol. 33:591–653. 
(16) Carmichael NG, Barton HA, Boobis AR  et al.  (2006). Agricultural Chem ­
ical Safety Assessment: A Multisector Approach to the Modernization of Human Safety Requirements. Crit. Rev. Toxicol. 36, 1–7. 
(17) Barton HA, Pastoor TP, Baetcke T  et al.  (2006). The Acquisition and 
Application of Absorption, Distribution, Metabolism, and 
Excretion (ADME) Data in Agricultural Chemical Safety Assessments. Crit. 
Rev. Toxicol. 36: 9–35. 
(18) Doe JE, Boobis AR, Blacker A  et al.  (2006). A Tiered Approach to Sys ­
temic Toxicity Testing for Agricultural Chemical Safety Assessment. Crit. 
Rev. Toxicol. 36: 37–68. 
(19) Cooper RL, Lamb JS, Barlow SM  et al . (2006). A Tiered Approach to Life 
Stages Testing for Agricultural Chemical Safety Assessment. Crit. Rev. Toxicol. 36: 69–98. 
(20) OECD (2002). Guidance Notes for Analysis and Evaluation of Chronic 
Toxicity and Carcinogenicity Studies, Series on Testing and Assessment No. 35 and Series on Pesticides No. 14, ENV/JM/MONO(2002)19, OECD, Paris. 
(21) OECD (2000). Guidance Document on the recognition, assessment, and use 
of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in 
safety evaluation, Series on Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MO ­
NO(2000)7, OECD, Paris. 
(22) Rhomberg LR, Baetcke K, Blancato J, Bus J, Cohen S, Conolly R, Dixit R, 
Doe J, Ekelman K, Fenner-Crisp P, Harvey P, Hattis D, Jacobs A, 
Jacobson-Kram D, Lewandowski T, Liteplo R, Pelkonen O, Rice J, Somers D, Turturro A, West W, Olin S (2007). Issues in the Design and Inter ­
pretation of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies in Rodents: App ­
roaches to Dose Selection Crit Rev. Toxicol. 37 (9): 729–837. 
(23) ILSI (International Life Sciences Institute) (1997). Principles for the Selec ­
tion of Doses in Chronic Rodent Bioassays. Foran JA (Ed.). ILSI Press, Washington, DC. 
(24) Griffiths SA, Parkinson C, McAuslane JAN and Lumley CE (1994). The 
utility of the second rodent species in the carcinogenicity testing of phar ­
maceuticals. The Toxicologist 14(1):214. 
(25) Usui T, Griffiths SA and Lumley CE (1996). The utility of the mouse for 
the assessment of the carcinogenic potential of pharmaceuticals. In D’Arcy 
POF & Harron DWG (eds). Proceedings of the Third International Confe ­
rence on Harmonisation. Queen’s University Press, Belfast. s. 279–284. 
(26) Carmichael NG, Enzmann H, Pate I, Waechter F (1997). The Significance 
of Mouse Liver Tumor Formation for Carcinogenic Risk Assessment: Re ­
sults and Conclusions from a Survey of Ten Years of Testing by the Agro ­
chemical Industry. Environ Health Perspect 105:1196–1203.
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 503
 
(27) Europaparlamentets och rådets direktiv 2010/63/EU av den 22 september 
2010 om skydd av djur som används för vetenskapliga ändamål, EUT 
L 276, 20.10.2010, s. 33–79. 
(28) National Research Council, 1985. Guide for the care and use of laboratory 
animals. NIH Publication No. 86-23. Washington D.C., US. Dept. of Health and Human Services. 
(29) GV-SOLAS (Society for Laboratory Animal Science, Gesellschaft für Ver ­
suchstierkunde, December, 1989). Publication on the Planning and Structure 
of Animal Facilities for Institutes Performing Animal Experiments. ISBN 3- 906255-06-9. 
(30) GV-SOLAS (Society for Laboratory Animal Science, Gesellschaft für Ver ­
suchstierkunde, 2006). Microbiological monitoring of laboratory animals in 
various housing systems. 
(31) Diehl K-H, Hull R, Morton D, Pfister R, Rabemampianina Y, Smith D, 
Vidal J-M, van de Vorstenbosch C. (2001). A good practice guide to the administration of substances and removal of blood, including routes and 
volumes. Journal of Applied Toxicology, 21:15–23. 
(32) IPCS (1986). Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity 
Associated with Exposure to Chemicals. Environmental Health Criteria Do ­
cument No. 60. 
(33) Tupper DE, Wallace RB (1980). Utility of the Neurologic Examination in 
Rats. Acta Neurobiol. Exp. 40: 999–1003. 
(34) Gad SC (1982). A Neuromuscular Screen for Use in Industrial Toxicology. 
J. Toxicol.Environ. Health 9: 691–704. 
(35) Moser VC, McDaniel KM, Phillips PM (1991). Rat Strain and Stock Com ­
parisons Using a Functional Observational Battery: Baseline Values and 
Effects of Amitraz. Toxicol. Appl. Pharmacol. 108: 267–283. 
(36) Meyer OA, Tilson HA, Byrd WC, Riley MT (1979). A Method for the 
RoutineAssessment of Fore- and Hind-limb Grip Strength of Rats and Mice. Neurobehav. Toxicol. 1: 233–236. 
(37) Crofton KM, Howard JL, Moser VC, Gill MW, Reiter LW, Tilson HA, 
MacPhail RC (1991). Interlaboratory Comparison of Motor Activity Experi ­
ments: Implication for Neurotoxicological Assessments. Neurotoxicol. Te ­
ratol. 13: 599–609. 
(38) Weingand K, Brown G, Hall R  et al.  (1996). Harmonisation of Animal 
Clinical Pathology Testing in Toxicity and Safety Studies. Fundam. & 
Appl. Toxicol. 29: 198–201. 
(39) EMEA (draft) document ”Non-clinical guideline on drug-induced hepato ­
toxicity” (Doc. Ref. EMEA/CHMP/SWP/a50115/2006). 
(40) Crissman JW, Goodman DG, Hildebrandt PK et al. (2004). Best Practices 
Guideline: Toxicological Histopathology. Toxicologic Pathology 32: 
126–131.
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 504
 
Tillägg 1  
DEFINITION  
Testkemikalie:  Alla ämnen eller blandningar som testas med denna testmetod.  ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 505
 
B.34  REPRODUKTIONSTOXICITETSTEST PÅ EN GENERATION  
1. METOD  
1.1 INLEDNING 
Se allmän inledning till del B.  
1.2 DEFINITIONER 
Se allmän inledning till del B.  
1.3. REFERENSÄMNEN 
Inga.  
1.4 TESTMETODSPRINCIP 
Testämnet tillförs i graderade doser till flera grupper av handjur och 
hondjur. Handjuren bör tillföras ämnet under tillväxtperioden och under minst en fullständig spermiebildande cykel (ca 56 dagar för mus och 70 dagar för råtta) för att framkalla eventuella hälsomässiga 
oönskade verkningar som testämnet kan ha på spermatogenes. 
Hondjur i föräldra(F
 o )generationen tillförs testämnet under minst två 
fullständiga brunstighetscykler för att framkalla eventuella skadliga 
verkningar som testämnet kan ha på brunsten. Därefter paras djuren. Båda kön tillförs testämnet under parningsperioden, och därefter till ­
förs endast hondjuren testämnet under dräktighetsperioden och dipe ­
rioden. Vid tillförsel genom inhalation måste metoden anpassas.
 
1.5 KVALITETSKRITERIER 
Inga.  
1.6 METODBESKRIVNING  
Förberedelser  
Före försöket fördelas friska unga djur slumpmässigt i behandlings- 
och kontrollgrupper. I minst fem dagar före försöket ska djuren hållas under testbetingelser vad beträffar miljö och utfodring. Det 
rekommenderas att testämnet tillförs via fodret eller dricksvattnet. 
Andra tillförselvägar är också godtagbara Samma tillförselmetod ska användas för alla djur under hela behandlingsperioden. Om ve ­
hikel eller annan tillsats används för att underlätta doseringen ska det 
vara fastställt att den inte framkallar några toxiska verkningar. Dju ­
ren bör tillföras testämnet sju dagar i veckan.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 506
 
F ö r s ö k s d j u r  
Val av djurart  
I första hand ska råttor och möss användas. Unga friska djur, som 
inte tidigare har använts i försök, ska användas. Stammar med låg fertilitet bör inte användas. Försöksdjuren bör vara representativa för 
sin art, stam, kön, vikt och/eller ålder. 
För att korrekt kunna bedöma fertiliteten ska både han- och hondjur 
testas. Alla försöks- och kontrolldjur ska vara avvanda innan dose ­
ring inleds.
 
Antal och kön  
Varje behandlings- och kontrollgrupp ska bestå av ett tillräckligt 
högt antal djur för att resultera i omkring 20 dräktiga hondjur som 
är nära eller vid födslotidpunkten. 
Syftet med detta är att säkerställa att det föds tillräckligt många 
ungar för att säkerställa en meningsfull utvärdering av hur testämnet 
kan påverka fertiliteten, dräktigheten och moderdjurens beteende i F
 0 -generationen samt diandet, tillväxten och utvecklingen i F  1 -gene­
rationen från nedkomsten till avvänjning.  
F ö r s ö k s b e t i n g e l s e r 
Foder och vatten ges ad libitum. När födslotidpunkten närmar sig 
placeras de dräktiga hondjuren i var sin födslo- eller dräktighetsbur och djuren kan eventuellt förses med material för att bygga bo.
 
D o s n i v å e r 
Minst tre olika dosnivågrupper samt en kontrollgrupp ska användas. 
Om vehikel används för tillförsel av testämnet ska kontrollgruppen 
tillföras samma mängd vehikel som högdosgruppen. Om ett testämne leder till ett minskat foderintag eller påverkar absorption eller meta ­
bolism kan det vara nödvändigt att använda en motsvarande restrik ­
tivt utfodrad kontrollgrupp. Såvida det inte finns någora begräns ­
ningar till följd av testämnets fysikaliska-kemiska eller biologiska egenskaper bör den högsta dosen idealt förorsaka toxiska verkningar, men inte dödsfall i föräldra(F
 0 )-generationen. Medeldosnivåerna 
(eventuellt flera) bör framkalla minsta möjliga observerbara toxiska 
verkningar som orsaktas av testämnet, och den lägsta dosen bör inte ha någon toxisk effekt på föräldragenerationen eller avkomman. Om ämnet tillförs via magsond eller i kapsel bör den dos som varje 
enskilt djur mottar beräknas på grundval av djurets kroppsvikt och 
varje vecka justeras med hänsyn till förändringar i kroppsvikt. Doser som tillförs dräktiga hondjur kan beräknas efter kroppsvikt vid dag 0 eller 6 av dräktigheten, om så önskas.
 
G r ä n s t e s t 
Om ett testämne med låg toxicitet i en dosnivå på 1 000 mg/kg 
kroppsvikt inte har någon påverkan på reproduktionen kan ytterligare tester anses vara överflödiga. Om en inledande undersökning, i vil ­
ken endast den högsta dosen används, klart visar på toxisk verkan på 
moderdjuren, men inte har någon skadlig verkan på fertiliteten, kan 
ytterligare tester anses vara överflödiga.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 507
 
Förfarande  
F ö r s ö k s s c h e m a 
Daglig dosering av föräldra(F  0 )-generationen inleds när djuren är 
mellan fem och nio veckor gamla, och efter det att de är avvanda och har acklimatiserat sig i minst fem dagar. Om råttor används 
fortsätter doseringen i tio veckor före parningsperioden (för möss 
åtta veckor). Handjuren bör avlivas och undersökas antingen vid slutet av parningsperioden eller så kan man fortsätta att tillföra dem testämnet fram till en eventuell produktion av en andra kull, 
varefter de avlivas och undersöks någongång före försökets avslut ­
ning. Dosering av föräldra(F
 0 )-generationens hondjur inleds efter 
minst fem dagars acklimatisering och fortsätter under minst två vec ­
kor före parning. Daglig dosering av föräldra(F  0 )-generationens hon ­
djur fortsätter under den tre veckor långa parningsperioden, under 
dräktighetsperioden och fram till det att F  1 -generationen är avvand. 
Man bör överväga eventuella justeringar av försöksschemat om det föreligger uppgifter om testämnet, t.ex. induktion av metabolism eller 
bioackumulering.
 
P a r n i n g 
Parning kan utföras i förhållandet 1:1 (ett handjur till ett hondjur) 
eller 1:2 (ett handjur till två hondjur) i undersökningar av reproduk ­
tionstoxicitet. 
Om parning i förhållandet 1:1 används förs ett handdjur och ett 
hondjur samman tills dräktighet inträffar eller tre veckor har förflutit. 
Varje morgon ska hondjuren undersökas för närvaron av spermier 
eller vaginalproppar. Som dag 0 i dräktighetsperioden räknas den dag då man observerar en vaginalpropp eller sperma. 
De par som inte parar sig bör undersökas för att fastställa orsaken till 
den påtagliga ofruktsamheten. 
Detta kan göras genom att djuren t.ex. får möjlighet att para sig med 
han- eller hondjur vars fruk-barhet är fastställd, genom mikroskopisk 
undersökning av reproduktionsorganen och genom undersökning av 
brunstighetsperioden eller speratogenes.
 
K u l l s t o r l e k a r 
De djur som doseras i fertilitetsundersökningen bör ha möjlighet att 
föda normalt och att behålla sin avkomma tills den är avvand utan 
standardisering av kullar. 
Om kullar standardiseras föreslås följande förfarande: Mellan dag 1 
och 4 efter födseln standardiseras varje kull genom att extra ungar 
avlägsnas så att varje kull så långt det är möjligt består av fyra handjur och fyra hondjur. 
Om det på grund av antalet han- och hondjur inte är möjligt att 
standardisera varje kulle att de innehåller fyra handjur och fyra hon ­
djur kan en delvis standardisering godkännas (t.ex. fem handjur och 
tre hondjur). Ingen standardisering ska ske på kullar som består av 
mindre än åtta ungar.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 508
 
O b s e r v a t i o n e r 
Djuren ska inspekteras minst en gång om dagen under hela försöket. 
Relevanta beteendeförändringar, tecken på svårartad eller förlängd födsel och alla toxicitetstecken, inbegripet dödlighet, ska registreras. Före och under parningstiden registreras foderintaget en gång i vec ­
kan. Efter födseln och under diperioden ska foderintaget (och vatten ­
konsumtionen om testämnet tillförs via dricksvattnet) mätas varje vecka. Han- och hondjur av F
 0 -generationen vägs den dag då dose ­
ringen inleds och därefter en gång i veckan. Dessa observationer bör 
rapporteras individuellt för varje enskilt djur. 
Dräktighetsperioden beräknas från dag 0. Varje kull undersöks så 
snart som möjligt efter födseln för att fastställa ungarnas antal och 
kön, antal dödfödda och levande ungar och förekomsten av mak- roskopiskt synliga abnormiteter. 
Döda ungar och ungar som avlivas dag 4 ska bevaras och undersö ­
kas för eventuella defekter. Levande ungar ska räknas och kullen 
vägas morgonen efter födseln, på dag 4 och dag 7 och därefter en 
gång i veckan tills försöket avslutats då djuren ska vägas individu ­
ellt. 
Fysiska eller beteendemässiga abnormiteter som observeras i hon ­
djuret eller avkomman ska registreras.
 
P a t o l o g i s k u n d e r s ö k n i n g  
M a k r o s k o p i s k u n d e r s ö k n i n g 
F 0 -generationsdjur som avlivas efter eller dör under försöket ska 
undersökas makroskopiskt för strukturella abnormiteter eller patolo ­
giska förändringar, med särskilt uppmärksamhet riktad mot organen i 
reproduktionssystemet. Döda eller döende ungar ska undersökas för 
defekter.  
H i s t o p a t o l o g i s k u n d e r s ö k n i n g 
Äggstockar, livmoder, livmoderhals, slida, testiklar, bitestiklar, sä ­
desblåsa, prostata, koagulerings-körtlar, hypofys och målorgan (even ­
tuellt flera) från alla djur i F  0 -generationen ska bevaras för mikro ­
skopisk undersökning. Om dessa organ inte har undersökts i andra försök med multipel dosering ska organen från djuren i högdos- och 
kontrollgrupperna, samt de djur som dör under försöket, undersökas 
mikroskopiskt om detta är praktiskt möjligt. 
De organ från dessa djur som uppvisar abnormiteter ska även un ­
dersökas hos alla andra djur i F
 0 -generationen. I dessa fall ska alla 
vävnader som uppvisar makroskopiska patologiska förändringar un ­
dersökas mikroskopiskt. Liksom det föreslås i parningsavsnittet kan 
även reproduktionsorganen från djur som antas vara ofruktsamma 
undersökas mikroskopiskt.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 509
 
2. DATA  
Data ska ställas upp i tabellform och för varje grupp anges antal djur 
i början av försöket, antal fertila handjur, antal dräktiga hondjur, slag av förändring och den procent djur som upvisar varje slag av för ­
ändring. 
Utvärderingen av resultaten ska om möjligt grundas på en lämplig 
statistisk metod. Alla erkända statistiska metoder får användas.
 
3. RAPPORTERING  
3.1 TESTRAPPORT 
Testrapporten ska om möjligt innehålla minst följande uppgifter: 
— Djurart, stam. — Uppgifter om toxisk reaktion uppdelade efter kön och dos, in ­
begripet fertilitet, dräktighet och avkommans livsduglighet. 
— Tidpunkten för dödsfall under försöket eller överlevnad till slutet 
av försöket eller tidpunkt för planenlig avlivning. 
— Tabell med angivelse av vikten för varje enskild kulle, ungarnas 
genomsnittsvikt och varje enskild unges vikt vid försökets av ­
slutning. 
— Toxiska och andra verkningar på reproduktion, avkomma, post ­
natal tillväxt. 
— Tidpunkten för observation av varje abnormalt tecken och dess 
senare utveckling. 
— Uppgifter om foder och kroppsvikt för F
 0 -generationen. 
— Obduktionsrön. 
— Detaljerad beskrivning av alla mikroskopiska rön. — Eventuell satistisk behandling av resultaten i lämpliga fall. — Diskussion om resultaten. — Tolkning av resultaten.
 
3.2 UTVÄRDERING OCH TOLKNING 
Se allmän inledning till del B.  
4. HÄNVISNINGAR  
Se allmän inledning till del B.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 510
 
B.35  TEST AVSEENDE REPRODUKTIONSTOXICITET PÅ TVÅ 
GENERATIONER  
1. METOD  
Denna metod är i stort sett identisk med OECD TG 416 (2001).  
1.1 INLEDNING 
Denna metod för test avseende reproduktionstoxicitet på två genera ­
tioner har som syfte att ge allmän information om ett testämnes verkningar på integriteten och prestanda hos hondjurs och handjurs 
reproduktionssystem, inklusive körtelfunktion, brunstighetscykel, 
parningsbeteende, befruktning, dräktighet, födsel, diperiod och av ­
vänjning samt avkommans tillväxt och utveckling. Testet kan också ge information om testämnets verkningar på neonatal morbiditet och 
mortalitet, preliminära data om prenatal och postnatal utvecklings ­
toxicitet samt vägledning för senare test. Utöver undersökning av tillväxt och utveckling hos F1-generationen är testmetoden också 
avsedd för bedömning av integritet och prestanda hos hondjurs och 
handjurs reproduktionssystem samt F2-generationens tillväxt och ut ­
veckling. För att erhålla ytterligare information om utvecklingstox ­
icitet och funktionsstörningar kan segment med tilläggstest införlivas 
i detta protokoll, där metoderna för utvecklingstoxicitet eller utveck ­
lingsneurotoxicitet används. Alternativt kan dessa endpoints under ­
sökas i separata test där lämpliga testmetoder används.
 
1.2 PRINCIP FÖR TESTMETODEN 
Testämnet tillförs i graderade doser till flera grupper av handjur och 
hondjur. Handjur i P-generationen bör tillföras ämnet under tillväxt ­
perioden och under minst en fullständig spermiebildande cykel (cirka 56 dagar för mus och 70 dagar för råtta) för att framkalla eventuella 
skadliga verkningar på spermatogenesen. Verkningarna på sperman 
bestäms genom ett antal spermaparametrar (t.ex. spermans morfologi och motilitet), genom undersökning av vävnadspreparat och genom detaljerad histopatologi. Om data om spermatogenesen finns att tillgå 
från tidigare tillräckligt långa test med upprepad dos, t.ex. ett 90- 
dagars test, behöver P-generationens handjur inte inkluderas i utvär ­
deringen. Det rekommenderas dock att prover eller digitala registre ­
ringar av P-generationens sperma bevaras, så att senare utvärderingar 
vid behov kan göras. P-gene-rationens hondjur bör ges doser under 
tillväxten och under flera fullständiga brunstighetscykler för att fram ­
kalla eventuella skadliga verkningar av testämnet på brunstighets ­
cykelns normalitet. Testämnet tillförs föräldradjuren (P) under par ­
ningsperioden, under dräktighetsperioden och under F1-avkommans 
hela avvänjningsperiod. Efter avvänjningen tillförs testämnet fortsätt ­
ningsvis till F1-avkomman under tillväxtperioden och under perioden för parning och produktion av en F2-generation, fram till det att F2- 
generatio-nen är avvand. 
Kliniska observationer och patologiska undersökningar görs på alla 
djur med avseende på toxicitetstecken, med särskild tonvikt på verk ­
ningarna på integriteten och prestanda hos hondjurens och handju ­
rens reproduktionssystem och på avkommans tillväxt och utveckling.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 511
 
1.3 BESKRIVNING AV TESTMETODEN  
1.3.1  Val av djurart  
Rekommenderat testdjur är råtta. Om andra arter används bör detta 
motiveras och testmetoden måste modifieras på tillbörligt sätt. Stam ­
mar med låg fertilitet eller välkänd hög incidens av utvecklingsdefek ­
ter ska inte användas. Vid testets början bör variationen i vikt mellan djuren vara minimal och får inte överstiga 20 % av vardera könets medelvikt.
 
1.3.2  Förvarings- och utfodringsbetingelser  
Temperaturen i testdjurens utrymmen bör vara 22  o C (± 3  o ). Den 
relativa fuktigheten bör vara minst 30 % och ska helst inte överstiga 70 %, utom när rummet rengörs. Målvärdet bör dock vara 50–60 %. 
Belys-ningen bör vara artificiell med omväxlande 12 timmar ljus och 
12 timmar mörker. För utfodringen kan konventionellt laboratorie ­
foder användas, och djuren bör ha obegränsad tillgång till dricks ­
vatten. Valet av foder kan påverkas av behovet att säkerställa att en 
lämplig blandning med testämnet fås, om man har valt denna till ­
förselmetod. 
Djuren kan inhysas individuellt eller i burar med små grupper av 
samma kön. För parningsprocedurerna används burar som är lämp ­
liga för ändamålet. Efter tecken på kopulation flyttas de parade hon ­
djuren till var sin födslo- eller maternitetsbur. Parade råttor kan också hållas i små grupper och separeras en eller två dagar före 
födseln. När tidpunkten för födsel närmar sig ska de parade djuren 
ges lämpliga och definierade material för beredning av ett bo.
 
1.3.3  Förberedelse av djuren  
För testet används unga friska djur som har acklimatiserats till labo ­
ratoriemiljön under minst fem dagar och som inte har använts för 
tidigare test. Testdjuren karakteriseras enligt art, stam, ursprung, kön, vikt och ålder. Alla syskonförhållanden mellan djuren bör vara kända så att parning mellan sådana djur kan undvikas. Djuren fördelas 
slumpmässigt i kontroll- och behandlingsgrupper (stratifiering enligt 
kroppsvikt rekommenderas). Burarna placeras i sådan ordning att eventuella verkningar på grund av placeringen mini-meras. Varje djur förses med ett unikt identifieringsnummer. För P-generationen 
bör detta göras innan tillförseln av testämnet inleds. För F1-genera ­
tionen bör detta göras efter avvänjningen av de djur som har valts för parning. För alla utvalda F1-djur bör uppgifter registreras om vilken kull de härstammar från. Dessutom rekommenderas att ungarna iden ­
tifieras individuellt så snart som möjligt efter födseln, i fall där indi ­
viduell vägning av ungar eller funktionstest övervägs. 
Föräldradjuren (P) bör vara 5–9 veckor gamla när tillförseln av tes ­
tämnet inleds. Djuren i alla testgrupper bör vara så lika som möjligt 
med avseende på vikt och ålder.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 512
 
1.4 FÖRFARANDE  
1.4.1  Djurens antal och kön  
Varje behandlings- och kontrollgrupp ska bestå av så många djur att 
det nära eller vid tidpunkten för födseln helst finns minst 20 dräktiga 
hondjur. I fråga om ämnen som förorsakar oönskade behandlings ­
relaterade verkningar (t.ex. sterilitet, övertoxicitet vid den höga do ­
sen) är detta kanske inte möjligt. Syftet är att få ett tillräckligt antal dräktigheter för att säkerställa en meningsfull utvärdering av testäm ­
nets potential att påverka fertiliteten, dräktigheten och moderdjurens 
beteende samt diandet, tillväxten och utvecklingen hos F1-avkom ­
man från befruktning till mognad och utvecklingen av dennas av ­
komma (F2) till avvänjning. Om det önskade antalet dräktiga djur 
(dvs. 20) inte erhålls, behöver testet således inte nödvändigtvis för ­
kastas, utan detta bör bedömas från fall till fall.
 
1.4.2  Förberedelse av doserna  
Det rekommenderas att testämnet tillförs oralt (med fodret, dricks ­
vattnet eller genom sondmatning), utom om någon annan tillförsel ­
väg (t.ex. via huden eller genom inandning) bedöms vara lämpligare. 
Vid behov kan testämnet upplösas eller suspenderas i en lämplig 
vehikel. Om möjligt bör man i första hand överväga vattenlösning eller vattensuspension, sedan oljelösning eller oljeemulsion (t.ex. 
majsolja) och därefter eventuellt andra vehiklar. I fråga om andra 
vehiklar än vatten måste de toxiska egenskaperna vara kända. Tes ­
tämnets stabilitet i vehikeln bör fastställas.
 
1.4.3  Dosering  
Minst tre dosnivåer och en parallell kontrollgrupp bör användas. Den 
högsta dosnivån väljs så att den framkallar toxiska verkningar men inte dödsfall eller allvarligt lidande, förutsatt att det inte finns be ­
gränsningar som beror på testämnets fysikalisk-kemiska natur eller 
biologiska verkningar. I fall av oväntad mortalitet kan testet i regel 
ändå godkännas, så länge som mortalitetsgraden är lägre än cirka 10 procent hos föräldradjuren (P). Därefter väljs dosnivåerna i fallande skala så att dosrelaterade verkningar kan påvisas. En nivå bör väljas 
så att inga påvisbara skadliga verkningar (NOAEL) uppstår. Två- till 
fyrfaldiga dosintervall är ofta optimala för de fallande dosnivåerna. Tillägg av en fjärde testgrupp är att föredra framför användning av mycket breda intervall mellan dosnivåerna (t.ex. en faktor som över ­
stiger cirka 10). För utfodringstest bör dosintervallet inte vara mer en 
trefaldigt. Dosnivåerna bör väljas med hänsyn till kända toxicitets ­
data, särskilt resultat från test med upprepad dos. Likaså bör hänsyn tas till känd information om metabolism och kinetik för testämnet 
eller närbesläktade material. Denna information är också till hjälp när 
det gäller att demonstrera lämpligheten hos dossystemet.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 513
 
Kontrollgruppen ska vara en obehandlad grupp eller en vehikelkon ­
trollgrupp, om vehikel används för tillförsel av testämnet. Med un ­
dantag för behandling med testämnet bör djuren i kontrollgruppen hanteras på exakt samma sätt som djuren i dosgrupperna. Om en vehikel används bör kontrollgruppen få vehikeln i den största volym 
som används. Om testämnet tillförs med fodret och detta leder till 
minskat foderintag eller minskad foderanvändning, kan det vara nöd ­
vändigt med en parallellt utfodrad kontrollgrupp. Alternativt kan man i stället för en sådan kontrollgrupp använda data från kontrollerade 
test för utvärdering av hur ett minskat foderintag påverkar reproduk ­
tionsparametrarna. 
Följande egenskaper hos vehikeln och övriga eventuella tillsats ­
ämnen bör i tillämplig mån beaktas: Verkningarna på absorption, 
distribution, metabolism eller kvarhållande av testämnet, verkning ­
arna på testämnets kemiska egenskaper till den del dessa verkningar kan påverka testämnets toxiska egenskaper samt verkningarna på testdjurens foder- eller vattenintag eller deras näringstillstånd.
 
1.4.4  Gränstest (Limit-test)  
Om ett oralt test med en dosnivå om minst 1 000 mg/kg kroppsvikt 
per dag (eller, om testämnet tillförs med foder eller dricksvatten, en 
motsvarande procenthalt i foder eller dricksvatten med användning av de förfaranden som beskrivs för detta test) inte leder till några observerbara toxiska verkningar varken hos för-äldradjuren eller de ­
ras avkomma, och om toxicitet inte kan förväntas på grundval av 
data från strukturellt eller metaboliskt närbesläktade ämnen, kan ett fullständigt test med flera dosnivåer bedömas vara överflödigt. Detta 
gränstestkriterium är tillämpligt förutom i fall där sannolik expone ­
ring på människor indikerar att en högre oral dosnivå behövs. För andra former av tillförsel, såsom inandning eller applicering på hu ­
den, kan testämnets fysikalisk-kemiska egenskaper, såsom löslighet, 
ofta indikera och begränsa den maximala exponeringsnivån.
 
1.4.5  Tillförsel av doser  
Djuren ska ges doser av testämnet alla dagar i veckan. Tillförsel på 
oral väg (foder, dricksvatten eller sond-matning) rekommenderas. Om någon annan tillförselväg används måste detta motiveras och tillbörliga justeringar kan vara nödvändiga. Samma tillförselmetod 
ska användas för alla djur under den valda testperioden. Om tes ­
tämnet tillförs genom sondmatning bör magsond användas. Den vo ­
lym vätska som tillförs på en och samma gång får inte överskrida 1 ml per l00 g kroppsvikt (0,4 ml per 100 g kroppsvikt om majsolja 
används), utom för vattenlösningar där volymen kan uppgå till 2 ml 
per 100 g kroppsvikt. Med undantag för irriterande eller frätande ämnen som normalt ger kraftigare verkan med högre koncentration bör variationer i testvolym minimeras genom justering av koncent ­
rationen, för att säkerställa en konstant volym på alla dosnivåer. Om 
tillförsel genom sondmatning används får ungarna normalt testämnet endast indirekt genom mjölken, tills direkt tillförsel inleds efter av ­
vänjningen. Om tillförsel via foder eller vatten används kommer 
ungarna dessutom att få testämnet direkt så snart de börjar äta själva 
under den sista veckan av diperioden.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 514
 
För ämnen som tillförs via fodret eller dricksvattnet är det viktigt att 
försäkra sig om att testämnet ges i mängder som inte stör det nor ­
mala näringsupptaget eller den normala vattenbalansen. Testämne som tillförs via fodret kan ges som en konstant koncentration (ppm) eller en konstant dosnivå i förhållande till djurens kroppsvikt. Det 
använda alternativet ska anges. Testämne som tillförs genom sond ­
matning bör ges vid samma tid varje dag, och justeras minst varje vecka så att dosnivån hålls konstant i förhållande till djurens kropps ­
vikt. Informationen om placentadistribution bör beaktas när sond ­
matade doser justeras enligt vikten.
 
1.4.6  Testschema  
Daglig dosering av föräldragenerationen (P) inleds när djuren är 
mellan fem och nio veckor gamla. Daglig dosering av F1-generatio ­
nens han- och hondjur inleds efter avvänjningen. Om testämnet till ­
förs med fodret eller dricksvattnet bör hänsyn tas till att F1-ungarna redan under diperioden kan utsättas för direkt exponering av tes ­
tämnet. Tillförseln ska fortsätta för båda könen (P och F1) under 
minst 10 veckor före parningsperioden. Tillförseln fortsätts för båda könen under den två veckor långa parningsperioden. Handjuren av ­
livas humant och undersöks när de inte längre behövs för bedöm ­
ningen av reproduktionstoxiska verkningar. Tillförseln till föräldrage ­
nerationens (P) hondjur fortsätts under hela dräktigheten och fram till det att F1-avkomman har avvants. Eventuella justeringar av testsche ­
mat bör övervägas om känd information om testämnet indikerar 
detta, t.ex. toxicitetsdata, induktion av metabolism eller bioackumu ­
lering. Dosen till varje djur bör i regel basera sig på den senaste bestämningen av djurets kroppsvikt. Försiktighet bör dock iakttas när 
dosen justeras under dräktighetens sista tredjedel. 
Behandlingen av P- och F1-generationens handjur och hondjur fort ­
sätts fram till det att testet avslutas. Alla P- och F1-generationens handjur och hondjur avlivas humant när de inte längre behövs för bedömningen av reproduktionstoxiska verkningar. F1-avkomma som 
inte väljs ut för parning och all F2-avkomma avlivas humant efter 
avvänjningen.
 
1.4.7  Parning  
1.4.7.1  Parning i föräldragenerationen (P)  
För parningen sammanförs ett hondjur med ett ensamt handjur från 
samma dosnivå (parning i förhållandet 1:1) tills kopulation inträffar eller 2 veckor har gått. Hondjuren undersöks varje dag för närvaron 
av sperma eller vaginalproppar. Som dräktighetens dag 0 räknas den 
dag då en vaginalpropp eller sperma observeras. Om parningen inte lyckas kan man överväga ett nytt parningsförsök där hondjuret sam ­
manförs med ett handjur med fastställd fertilitet från samma grupp. 
De djur som har parat sig bör identifieras entydigt i testets data. 
Parning av syskon bör undvikas.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 515
 
1.4.7.2  F1-parning  
För parning av F1-avkomman väljs minst ett handjur och ett hondjur 
från varje kull efter avvänjningen, vilka korsas med ungar ur en annan kull på samma dosnivå. På detta sätt produceras F2-genera ­
tionen. Ungarna väljs ut slumpmässigt ur varje kull i fall där inga 
signifikanta skillnader kan observeras rörande kroppsvikt eller utse ­
ende mellan ungarna i en kull. Om skillnader kan observeras bör de djur som bäst representerar kullen väljas ut. I praktiken görs detta 
bäst på grundval av kroppsvikt, även om det i vissa fall kan vara 
lämpligare att använda utseendet som grund. F1-avkomman ska inte paras förrän den har nått fullständig sexuell mognad. 
Par utan avkomma ska undersökas i syfte att fastställa uppenbara 
orsaker till infertiliteten. Detta kan göras t.ex. genom att djuren får möjlighet att para sig med han- eller hondjur vars fertilitet är fast ­
ställd, genom mikroskopisk undersökning av reproduktionsorganen 
eller genom undersökning av brunstighetspe-rioden eller spermatoge ­
nesen.
 
1.4.7.3  Andra parningen  
I vissa fall, t.ex. vid behandlingsrelaterade förändringar i kullstorlek 
eller om entydig effekt av den första parningen inte kan observeras, rekommenderas att vuxna P- eller F1-djur får para sig på nytt för att producera en ny kull. För denna andra parning rekommenderas kors ­
ning av djur som inte har producerat någon kull, med hondjur och 
handjur vars fertilitet är fastställd. Om en ny kull bedöms vara nödvändig i någondera generationen, bör den andra parningen ske cirka en vecka efter det att föregående kull har avvants.
 
1.4.7.4  Kullstorlek  
Djuren får föda normalt och hålla sin avkomma tills den är avvand. 
Standardisering av kullarna är inte obligatorisk. Om standardisering görs, bör den metod som används beskrivas i detalj.
 
1.5 OBSERVATIONER  
1.5.1  Kliniska observationer  
En allmän klinisk observation bör göras varje dag. Om testämnet 
tillförs genom sondmatning bör observationstidpunkten väljas med beaktande av perioden för när maximala verkningar förväntas efter 
tillförseln. Avvikande beteende, tecken på svår eller förlängd födsel 
och alla tecken på toxicitet bör registreras. Dessutom bör alla djur inspekteras närmare minst en gång per vecka, lämpligen i samband med vägningen. Två gånger per dag (under veckosluten en gång per 
dag, om lämpligt) bör alla djur inspekteras för morbiditet och mor ­
talitet.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 516
 
1.5.2  Föräldradjurens kroppsvikt samt foder- och vattenkonsumtion  
Föräldradjuren (P och Fl) ska vägas på den första doseringsdagen 
och därefter minst varje vecka. Föräldragenerationernas hondjur (P och F1) ska vägas minst på dräktighetsdagarna 0, 7, 14 och 20 eller 
21, under diperioden på samma dagar då kullarna vägs och slutligen 
på den dag då djuren avlivas. Dessa observationer bör rapporteras individuellt för varje vuxet djur. Före parningen och under diperio ­
den ska foderkonsumtionen mätas minst varje vecka. Vattenkonsum ­
tionen ska mäta minst varje vecka om testämnet tillförs med vattnet.
 
1.5.3  Brunstighetscykel  
Brunstighetscykelns längd och normalitet utvärderas hos P- och F1- 
hondjuren genom vaginala smear-test före parningen och eventuellt under parningsperioden fram till det att tecken på parning kan ob ­
serveras. Tagningen av vaginala eller cervikala celler bör göras med 
försiktighet för att undvika störningar på slemhinnan och induktion av skendräktighet (1).
 
1.5.4  Spermaparametrar  
Vid testets slut registreras för alla P- och F1-handjur vikten för tes ­
tiklar och bitestiklar. Ett exemplar av varje organ bör bevaras för 
histopatologisk undersökning (se avsnitt 1.5.7, 1.5.8.1). Återstående 
testiklar och bitestiklar från en undergrupp med minst tio handjur från varje grupp av P- och F1-handjur används för räkning av ho ­
mogeniseringsresistenta spermatider respektive cauda epididymala 
spermareserver. Från samma undergrupp av handdjur insamlas 
sperma från cauda epididymis eller vas deferens för utvärdering av spermans motilitet och morfologi. Om behandlingsrelaterade verk ­
ningar observeras eller om resultaten från andra test tyder på verk ­
ningar på spermatogenes, ska sperman utvärderas för alla handjur i 
varje dosgrupp. I annat fall kan räkningen begränsas till P- och F1- handjuren i kontroll- och högdosgruppen. 
Totalantalet homogeniseringsresistenta testikulära spermatider och 
cauda epididymala spermier bör räknas (2)(3). Cauda-spermareser ­
verna kan härledas från koncentrationen och volymen hos sperman i den suspension som används för de kvalitativa bedömningarna och från antalet spermier som räknats efter påföljande malning eller ho ­
mogenisering av återstående cauda-vävnad. Räkningen bör utföras 
omedelbart efter avlivningen för den valda undergruppen av handjur från alla dosgrupper. Undantag till detta är om man gör video- eller digitalregistreringar eller om proverna djupfryses och analyseras se ­
nare. I sådana fall kan kontroll- och högdosgruppen analyseras först. 
Om inga behandlingsrelaterade verkningar (t.ex. på spermiernas an ­
tal, motilitet eller morfologi) kan observeras, behöver de övriga dos ­
grupperna inte analyseras. Om behandlingsrelaterade verkningar kan 
observeras i högdosgruppen bör även grupperna med lägre doser 
utvärderas.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 517
 
Motiliteten hos epididymal sperma (eller ductus deferens-sperma) bör 
bedömas eller videofilmas omedelbart efter avlivningen. Sperman 
bör skördas på sådant sätt att skador minimeras. Utspädningen av sperman för motilitetsanalysen bör göras med användning av god ­
tagbara metoder (4). Procentandelen progressivt motila spermier be ­
stäms subjektivt eller objektivt. Om datorstödd motilitetsanalys an ­
vänds (5)(6)(7)(8)(9)(10) görs härledningen av den progressiva mo ­
tiliteten på grundval av användardefinierade trösklar för genomsnitt ­
lig banhastighet och linearitetsindex. Om proverna videofilmas (11) 
eller om bilderna registreras på annat sätt vid obduktionen, kan den 
efterföljande analysen begränsas till P- och F1-handjuren i kontroll- och högdosgruppen. Undantag till detta är om behandlingsrelaterade verkningar kan observeras, i vilket fall även grupperna med lägre 
doser bör utvärderas. Om det inte förekommer video-eller digital ­
bildsregistrering måste alla prover i alla behandlingsgrupper analy ­
seras vid obduktionen. 
Ett spermaprov från epididymis (eller vas deferens) utvärderas mor ­
fologiskt. Spermierna (minst 200 per prov) bör undersökas i form av 
fixerade våta preparat (12) och klassificeras som normala eller abnor ­
mala. Exempel på morfologiska abnormaliteter hos spermier är fu ­
sion, isolerade huvuden och missformade huvuden eller svansar. Ut ­
värderingen bör göras omedelbart efter avlivningen för den valda 
undergruppen av handjur från alla dosgrupper. Om det finns video- eller digitalregistreringar kan utvärderingen göras senare. Även cell ­
proverna från smear-test kan, om de fixeras, avläsas senare. I sådana 
fall kan kontroll- och högdosgruppen analyseras först. Om inga be ­
handlingsrelaterade verkningar (t.ex. på spermans morfologi) kan observeras behöver de övriga dosgrupperna inte analyseras. Om be ­
handlingsrelaterade verkningar kan observeras i högdosgruppen bör 
även grupperna med lägre doser utvärderas. 
Om någon av de ovan nämnda spermabedömningsparametrarna har 
undersökts tidigare som ett led i ett systematiskt toxicitetstest som 
varat minst 90 dagar, behöver bedömningen inte nödvändigtvis upp ­
repas i tvågenerationstestet. Det rekommenderas dock att prover eller digitala registreringar av P-generationens sperma bevaras, så att en utvärdering vid behov kan göras senare.
 
1.5.5  Avkomma  
Varje kull undersöks så snart som möjligt efter födseln (diperiodens 
dag 0) för att fastställa antalet ungar och deras kön, antalet dödfödda ungar, antalet levande ungar och förekomsten av betydande anoma ­
lier. Ungar som konstateras vara döda på dag 0 bör helst, om de är 
tillräckligt intakta, undersökas för eventuella defekter och dödsorsak, 
samt bevaras. De levande ungarna räknas och vägs individuellt efter födseln (diperiodens dag 0) eller på dag 1. Därefter vägs ungarna på de reguljära vägningsdagarna, t.ex. diperiodens dagar 4, 7, 14 och 
21. Fysiska eller beteendemässiga abnormaliteter hos moderdjuren 
eller avkomman bör registreras.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 518
 
Avkommans fysiska utveckling bör registreras, främst genom ök ­
ningen i kroppsvikt. Övriga fysiska parametrar (t.ex. öron- och ögon ­
öppningar, tandsprickning, hårväxt) kan ge tilläggsinformation, men dessa data bör helst utvärderas i samband med data om sexuell mog ­
nad (t.ex. ålder och kroppsvikt när vagina öppnas eller när balano- 
preputial separation sker) (13). Funktionella undersökningar (t.ex. 
motorisk aktivitet, sensorisk funktion, reflex ontogeni) hos F1-av ­
komman före och/eller efter avvänjningen, särskilt faktorer som hör samman med den sexuella mognaden, rekommenderas om så ­
dana undersökningar inte ingår i separata test. Åldern då vagina 
öppnas och preputial separation sker bör bestämmas för de avvanda F1-ungar som väljs ut för parning. Anogenitalt avstånd mäts på dag 0 efter födseln hos F2-ungar, om detta bedöms vara nödvändigt på 
grund av att F1-generationen har avvikelser rörande kvoten mellan 
könen eller tidpunkten för sexuell mognad. 
De funktionella observationerna kan utelämnas för grupper som på 
annat sätt uppvisar tecken på skadliga verkningar (t.ex. betydande minskning av viktökningen). Om funktionella undersökningar görs, 
ska de inte omfatta de ungar som har valts ut för parning.
 
1.5.6  Obduktion  
När testet avslutas eller om djur dör under testets gång, ska alla 
föräldradjur (P och F1), alla ungar med externa abnormaliteter eller kliniska tecken samt en slumpmässigt vald unge per kön och kull 
från både F1- och F2-generationen undersökas makroskopiskt för 
eventuella strukturella abnormaliteter eller patologiska avvikelser. Särskild uppmärksamhet bör fästas vid reproduktionssystemets or ­
gan. Döende ungar som avlivas humant eller döda ungar bör, för ­
utsatt att de är tillräckligt intakta, undersökas för eventuella defekter 
och dödsorsak, samt bevaras. 
Livmodern hos alla förstfödande hondjur ska undersökas på ett sätt 
som inte stör den histopatologiska utvärderingen, för förekomsten av implantationer och deras antal.
 
1.5.7  Organvikter  
Vid testets slut bestäms kroppsvikten och vikten hos följande organ 
för alla P- och F1-föräldradjur (pariga organ vägs individuellt): 
— Livmoder, äggstockar. — Testiklar, bitestiklar (totalt och cauda). — Prostata. — Sädesblåsa med koaguleringskörtlar och deras vätskor samt pros ­
tatan (som en enhet). 
— Hjärna, lever, njurar, mjälte, hypofys, sköldkörtel och adrenalin ­
körtel samt kända målorgan. 
Kroppsvikten vid testets slut bestäms för de F1- och F2-ungar som 
väljs ut för obduktion. Vikten bestäms även för följande organ från 
den slumpmässigt valda ungen per kön per kull (se avsnitt 1.5.6): 
hjärna, mjälte och bisköldkörtel.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 519
 
Resultaten från obduktionen och vägningen av organ bör i tillämplig 
mån bedömas med hänsyn till observationer från andra test med 
upprepad dos.  
1.5.8  Histopatologi  
1.5.8.1  Föräldradjur  
Följande organ och vävnader (eller representativa prover) från för ­
äldradjuren (P och F1) ska fixeras och förvaras i ett lämpligt medium för histopatologisk undersökning: 
— Vagina, livmoder med livmoderhals samt äggstockar (bevarade i 
adekvat fixervätska). 
— En testikel (bevarad i Bouins fixervätska eller motsvarande), en 
bitestikel, sädesblåsa, prostata och koaguleringskörtel. 
— Tidigare identifierade målorgan från alla P- och F1-djur som har 
valts ut för parning. 
Fullständig histopatologi görs av de ovan uppräknade bevarade or ­
ganen och vävnaderna för alla sådana P-och F1-djur i högdos- och kontrollgruppen som har valts ut för parning. Undersökning av äggs ­
tockarna hos P-djuren är inte obligatorisk. Organ som har behand ­
lingsrelaterade avvikelser bör även undersökas i låg- och medeldos ­
grupperna som stöd för bestämningen av NOAEL. Dessutom bör histopatologisk undersökning göras på reproduktionsorganen från 
sådana djur i låg- och medeldosgruppen som misstänks för reducerad 
fertilitet, t.ex. djur som inte parade sig, inte befruktades, inte avlade, eller djur som inte födde frisk avkomma. Alla betydande skador såsom atrofi eller tumörer bör undersökas. 
Detaljerad histopatologisk undersökning görs på testiklarna (t.ex. 
med användning av Bouins fixervätska, paraffininbäddning och 
transverssektioner av 4–5 μm tjocklek) för att identifiera behand ­
lingsrelaterade verkningar såsom tillbakabildade spermatider, ute ­
blivna germinalcellslager eller -typer, multinukleära jätteceller eller degraderingen av spermatogeniska celler in i lumen (14). Un ­
dersökning av den intakta bitesti-keln ska inbegripa caput, corpus 
och cauda, vilket kan åtföljas av en utvärdering av en longitudinell sektion. Bitestikeln utvärderas för leukocytinfiltration, förändringar i prevalensen av celltyper, avvikande celltyper och spermafagocytos. 
PAS och hematoxylinfärgning kan användas för undersökning av 
handjurens reproduktionsorgan. 
Äggstockarna efter diperioden bör innehålla primordiala och växande 
folliklar samt de stora corpora lutea från diperioden. Den histopato ­
logiska undersökningen bör detektera kvalitativ utarmning av den primordiala follikelpopulationen. En kvantitativ utvärdering av de 
primordiala folliklarna görs för F1-hondjuren. Antalet djur, valet av 
äggstockssektion och sektionens storlek bör vara statistiskt lämpliga för det utvärderingsförfarande som används. Utvärderingen bör in ­
begripa räkning av antalet primordiala folliklar, som kan kombineras 
med små växande folliklar, för jämförelse av äggstockarna hos be ­
handlinggruppernas och kontrollgruppens djur (15)(16)(17)(18)(19).
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 520
 
1.5.8.2  Avvanda ungar  
Grovt abnormala vävnader och målorgan från alla ungar med externa 
abnormaliteter eller kliniska tecken, samt från en slumpmässigt vald unge per kön och per kull i både F1- och F2-generationen (som inte 
valts ut för parning), ska fixeras och förvaras i ett lämpligt medium 
för histopatologisk undersökning. Fullständig histopatologisk karak ­
terisering av bevarade vävnader bör göras, med särskild tonvikt på reproduktionssystemets organ.
 
2. DATA  
2.1 BEHANDLING AV RESULTATEN 
Data rapporteras individuellt för moderdjuren och deras avkomma 
och sammanställs i en tabell. Tabellen ska för varje testgrupp och varje generation visa antalet djur vid testets början, antalet djur som under testets gång har dött eller avlivats av humana skäl, tidpunkten 
för alla dödsfall eller humana avlivningar, antalet fertila djur, antalet 
dräktiga hondjur, antalet djur som uppvisar tecken på toxicitet, en beskrivning av de toxicitetstecken som har observerats (tidpunkten då sådana först upptäcktes, de toxiska verkningarnas varaktighet och 
allvarlighetsgrad), typerna av observationer om föräldradjur och av ­
komma, typerna av histopatologiska avvikelser och alla relevanta data om kullarna. 
De numeriska resultaten ska utvärderas med en lämplig och allmänt 
erkänd statistisk metod. Valet av statistiska metoder bör ingå som en del av testets utformning och bör motiveras. Statistiska dos-respons ­
modeller kan vara användbara för analysen av data. Rapporten ska 
innehålla tillräckligt med information om analysmetoden och det datorprogram som används, så att en oberoende granskare eller sta ­
tistiker kan göra en ny utvärdering och rekonstruera analysen.
 
2.2 UTVÄRDERING AV RESULTATEN 
Resultaten från detta test för reproduktionstoxicitet på två generatio ­
ner ska utvärderas med avseende på de observerade verkningarna, 
inbegripet resultaten från obduktion och mikroskopiska undersök ­
ningar. Utvärderingen ska omfatta förhållandet mellan, eller avsak ­
naden därav, mellan testämnesdosen och närvaron eller frånvaron, 
incidensen och allvarlighetsgraden för abnormaliteter, inbegripet 
grova skador, identifierade målorgan, verkningar på fertiliteten, kli ­
niska abnormaliteter, verkningar på reproduktionsförmågan och kul ­
len, avvikelser rörande kroppsvikt, verkningar på mortaliteten samt 
alla andra toxiska verkningar. Vid utvärdering av testresultaten bör 
hänsyn tas till testämnets fysikalisk-kemiska egenskaper och de tox ­
ikokinetiska data som är kända. 
Ett korrekt genomfört test för reproduktionstoxicitet bör inbegripa en 
tillfredsställande uppskattning av den nivå där inga verkningar ob ­
serveras och ge en förståelse för de skadliga verkningarna på repro ­
duktion, födsel och digivning, samt på den postnatala utvecklingen 
inklusive tillväxt och sexuell utveckling.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 521
 
2.3 TOLKNING AV RESULTATEN 
Ett test för reproduktionstoxicitet på två generationer ska ge infor ­
mation om verkningarna av upprepad exponering för ett ämne under alla faser av reproduktionscykeln. Testet ska särskilt ge information 
om reproduktionsparametrarna samt om avkommans utveckling, till ­
växt, mognad och överlevnad. Testresultaten ska tolkas tillsammans med resultaten från test avseende subkronisk toxicitet, prenatal ut ­
vecklingstoxicitet och toxikokinetik samt andra kända testresultat. 
Resultaten från detta test kan användas för att bedöma behovet av 
ytterligare testning av en kemikalie. Extrapolering av testresultaten till att gälla för exponering på människor kan i viss utsträckning 
godtas. Resultaten kan bäst tillämpas på information om dosnivåer 
där inga verkningar kan observeras och information om tillåten ex ­
ponering på människor (20)(21)(22)(23).
 
3. RAPPORTERING  
3.1 TESTRAPPORT 
Testrapporten ska innehålla nedan angivna uppgifter. 
Testämne: 
— Fysikalisk natur och, när det är relevant, fysikalisk-kemiska egen ­
skaper. 
— Identifieringsdata. 
— Renhetsgrad. 
Vehikel (i förekommande fall). 
— Motivering för val av vehikel, om annan än vatten.  
Testdjur:  
— Art och stam som använts. 
— Djurens antal, ålder och kön. 
— Ursprung, förvaringsbetingelser, foder och dylikt. 
— Djurens individuella vikt vid testets början.  
Testbetingelser:  
— Motivering för val av dosnivåer. 
— Uppgifter om testämnets sammansättning och beredning av fod ­
ret, uppnådda halter. 
— Blandningens stabilitet och homogenitet. 
— Utförliga uppgifter om hur testämnet har tillförts. 
— Omräkning av testämneskoncentrationen i foder eller vatten 
(ppm) till faktisk dos (mg per kg kroppsvikt och dag), om till ­
lämpligt. 
— Uppgifter om foder- och vattenkvalitet.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 522
 
Resultat: 
— Foderkonsumtion och, i mån av tillgänglighet, vattenkonsumtion, 
fodereffektivitet (kroppsviktsökning per gram konsumerat foder) 
och testämneskonsumtionen för P- och F1-djuren, utom för pe ­
rioden för sammanlevnad och för minst den sista tredjedelen av diperioden. 
— Absorptionsdata, om sådana är kända. — Uppgifter om kroppsvikt för de P- och F1-djur som har valts ut 
för parning. 
— Kullens och ungarnas vikt. — Kroppsvikt vid avlivningen samt absolut och relativ organvikt för 
föräldradjuren. 
— Art, grad och varaktighet för kliniska observationer (om de är 
reversibla eller inte). 
— Tidpunkten (dag) för dödsfall under testets gång och huruvida 
djuren överlevde till testets slut. 
— Uppgifter om toxisk respons per kön och dos, inbegripet index 
för parning, fertilitet, dräktighet, födsel, livsduglighet och digiv ­
ning. Rapporten bör även innehålla de sifferuppgifter som har använts för beräkningen av dessa index. 
— Toxiska eller andra verkningar på reproduktion, avkomma, post ­
natal tillväxt och dylikt. 
— Obduktionsfynd. — En detaljerad beskrivning av alla histopatologiska fynd. — Antalet P- och F1-hondjur med normal cykel och cykelns längd. — Totalantalet spermier från cauda epididymis, procentandelen pro ­
gressivt motila spermier, procen tandelen morfologiskt normala spermier och procentandelen spermier per varje identifierad 
abnormalitet. 
— Tid till parning, inbegripet antalet dagar fram till dess att parning 
skett. 
— Dräktighetsperiodens längd. — Antalet implantationer, antalet corpora lutea och kullstorlek. — Antalet levande födda och antalet förluster efter implantation. — Antalet ungar med grova synliga abnormaliteter och, eventuellt, 
antalet onormalt små individer. 
— Fysiska kännetecken hos ungarna och andra uppgifter om den 
postnatala utvecklingen. Motivering bör ges för valet av vilka 
kännetecken som utvärderas. 
— Funktionsobservationer hos ungar och vuxna, om tillämpligt. — Statistisk bearbetning av resultaten, i tillämpliga fall.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 523
 
Diskussion om resultaten. 
Slutsatser, inbegripet värden för den lägsta nivå där inga verkningar 
kan observeras (NOAEL) hos moderdjur och avkomma.  
4. HÄNVISNINGAR  
1. Sadleir, R.M.F.S. (1979), ”Cycles and Seasons”,  Reproduction 
in Mammals,  I. Germ Cells and Fertilization, C.R. Auston och 
R.V. Short (red.), Cambridge, New York. 
2. Gray, L.E. et al. (1989), ”A Dose-Response Analysis of Met ­
hoxychlor-Induced Alterations of Reproductive Development and Function in the Rat”,  Fundamental and Applied Toxicology,  
12:92–108. 
3. Robb, G.W. et al. (1978), ”Daily Sperm Production and Epidi ­
dymal Sperm Reserves of Pubertal and Adult Rats”,  Journal of 
Reproduction and Fertility,  54:103–107. 
4. Klinefelter, G.R. et al. (1991), ”The Method of Sperm Collec ­
tion Significantly Influences Sperm Motion Parameters Follo ­
wing Ethane Dimethanesulfonate Administration in the Rat”,  
Reproductive Toxicology,  5:39–44. 
5. Seed, J. et al. (1996), ”Methods for Assessing Sperm Motility, 
Morphology, and Counts in the Rat, Rabbit, and Dog: a Con ­
sensus Report”,  Reproductive Toxicology,  10(3):237–244. 
6. Chapin, R.E. et al. (1992), ”Methods for Assessing Rat Sperm 
Motility”,  Reproductive Toxicology,  6:267–273. 
7. Klinefelter, G.R. et al. (1992), ”Direct Effects of Ethane Dimet ­
hanesulphonate on Epididymal Function in Adult Rats: an  In 
Vitro  Demonstration”,  Journal of Andrology  13:409–421. 
8. Slott, V.L. et al. (1991), ”Rat Sperm Motility Analysis: Metho ­
dologic Considerations”,  Reproductive Tox icology,  5:449–458. 
9. Slott, V.L. och Perreault, S.D. (1993), ”Computer-Assisted 
Sperm Analysis of Rodent Epididymal Sperm Motility Using the Hamilton-Thorn Motility Analyzer”,  Methods in Toxicology, 
Part A.,  Academic, Orlando, Florida, 319–333. 
10. Toth, G.P. et al. (1989), ”The Automated Analysis of Rat Sperm 
Motility Following Subchronic Epichlorhydrin Administration: Methodologic and Statistical Considerations”,  Journal of An ­
drology,  10:401–415. 
11. Working, P.K. och M. Hurtt (1987), ”Computerized Videomic ­
rographic Analysis of Rat Sperm Motility”,  Journal of Androl ­
ogy, 8:330–337. 
12. Linder, R.E. et al. (1992), ”Endpoints of Spermatoxicity in the 
Rat After Short Duration Exposures to Fourteen Reproductive Toxicants”,  Reproductive Toxicology,  6:491–505. 
13. Korenbrot, C.C. et al. (1977), ”Preputial Separation as an Ex ­
ternal Sign of Pubertal Development in the Male Rat”,  Biolog­
ical Reproduction,  17:298–303. 
14. Russell, L.D. et al. (1990), ”Histological and Histopathological 
Evaluation of the Testis”, Cache River Press, Clearwater, Flori ­
da. 
15. Heindel, J.J. och R.E. Chapin, (red.) (1993), ”Part B. Female 
Reproductive Systems, Methods in Toxico logy”, Academic, 
Orlando, Florida. 
16. Heindel, J.J. et al. (1989), ”Histological Assessment of Ovarian 
Follicle Number in Mice As a Screen of Ovarian Toxicity, Growth Factors and the Ovary”, A.N. Hirshfield (red.), Plenum, New York, 421–426. 
17. Manson, J.M. och Y.J. Kang, (1989), ”Test Methods for Asses ­
sing Female Reproductive and Developmental Toxicology”,  
Principles and Methods of Toxicology,  A.W. Hayes (red.), Ra ­
ven, New York.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 524
 
18. Smith, B.J. et al. (1991), ”Comparison of Random and Serial 
Sections in Assessment of Ovarian Toxicity”,  Reproductive Tox ­
icology,  5:379–383. 
19. Heindel, J.J. (1999), ”Oocyte Quantitation and Ovarian Histol ­
ogy. In: An Evaluation and Interpretation of Reproductive End ­
points for Human Health Risk Assessment”, G. Daston och C.A. 
Kimmel, (red.), ILSI Press, Washington, DC. 
20. Thomas, J. A. (1991), ”Toxic Responses of the Reproductive 
System”,  Casarett and Doull's Toxicology,  M.O. Amdur, J. 
Doull och C.D. Klaassen (red.), Pergamon, New York. 
21. Zenick, H. och E.D. Clegg (1989), ”Assessment of Male Re ­
productive Toxicity: A Risk Assessment Approach”,  Principles 
and Methods of Toxicology,  A.W. Hayes (red.), Raven Press, 
New York. 
22. Palmer, A.K. (1981),  Developmental Toxicology,  Kimmel, C.A. 
och J. Buelke-Sam (red.), Raven Press, New York. 
23. Palmer, A.K. (1978),  Handbook of Teratology,  Vol. 4, J.G. 
Wilson och F.C Fraser (red.), Plenum Press, New York.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 525
 
B.36  TOXIKOKINETIK  
INLEDNING 
1. Den här testmetoden motsvarar OECD:s TG 417 (2010). Studier som un ­
dersöker toxikokinetik (TK) i en testkemikalie utförs för att erhålla relevant information om dess absorption, distribution, biotransformering (dvs. meta ­
bolism) och exkretion, som hjälp för att relatera koncentration eller dos till 
den observerade toxiciteten, och för att underlätta förståelsen av dess tox ­
icitetsmekanism. TK kan hjälpa till med att förstå de toxikologiska studierna genom att visa att försöksdjuren systematiskt exponeras för testkemikalien 
och genom att visa vilka som är de cirkulerande delarna (ursprunglig kemi ­
kal/metaboliter). Grundläggande TK-parametrar som bestämts genom dessa studier ger också information om risken för ackumulering av testkemikalien i vävnader och/eller organ och potentialen för framkallande av biotransfor ­
mering som en följd av exponeringen av testkemikalien. 
2. TK-data kan bidra till bedömningen av lämpligheten och relevansen av 
djurtoxicitetsdata för extrapolering av fara för människor och/eller risk ­
bedömning. Dessutom kan toxikokinetiska studier ge användbar information för bestämning av dosnivåer för toxicitetsstudier (linjär kontra icke-linjär kinetik), administreringssättsverkningar, biotillgänglighet och frågor som 
rör studieutformning. Vissa typer av TK-data kan användas i fysiologiskt 
baserad toxikokinetisk (PBTK) modellutveckling. 
3. Det finns viktiga användningsområden för metabolit/TK-data såsom föresla ­
gen möjlig toxicitet och verkningssätt och deras relation till dosnivå och exponeringssätt. Dessutom kan metabolismdata ge användbar information 
för bedömning av den toxikologiska betydelsen av exponeringar till exogent 
frambringade metaboliter av testkemikalien. 
4. Adekvat toxikokinetisk data är till hjälp för att stödja den fortsatta accep ­
tansen och tillämpligheten av kvantitativa struktur-aktivitetssamband, jäm ­
förelse med strukturlika ämnen eller grupperingsstrategier i säkerhetsbedöm ­
ningen av kemikalier. Kinetiska data kan också användas för att utvärdera 
den toxikologiska relevansen av andra studier (t.ex. in vivo/in vitro). 
5. Om inget annat administreringssätt nämns (se särskilt punkterna 74–78) till ­
lämpas denna testmetod på oral tillförsel av testkemikalien.
 
INLEDANDE ÖVERVÄGANDEN 
6. Regelsystem har olika krav och behov vad gäller mätning av endpoints och 
parametrar relaterade till toxikokinetik för olika klasser av kemikalier (t.ex. 
bekämpningsmedel, biocider, industrikemikalier). Till skillnad från de flesta 
testmetoder beskriver denna testmetod toxikokinetisk testning, vilket omfat ­
tar ett flertal mätningar och endpoints. I framtiden kan flera nya testmetoder och/eller vägledningsdokument utvecklas för att beskriva varje endpoint 
enskilt och mer detaljerat. När det gäller denna testmetod, vars tester eller 
bedömningar specificeras av kraven och/eller behoven för varje regelsystem.
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 526
 
7. Det finns många studier som kan utföras för att utvärdera TK-beteendet hos 
en testkemikalie för regulatoriska ändamål. Dock är, beroende på särskilda 
regulatoriska behov eller situationer, inte alla dessa möjliga studier nödvän ­
diga för utvärderingen av en testkemikalie. Flexibilitet, med hänsyn till den undersökta testkemikaliens egenskaper, behövs vid utformningen av toxiko ­
kinetiska studier. I några fall kanske bara vissa frågor behöver utforskas för 
att ta itu med de testkemikalierelaterade faro- och riskfrågorna. I några sammanhang kan TK-data samlas som en del av utvärderingen i andra toxikologiska studier. I andra sammanhang kan ytterligare och/eller mer 
omfattande TK-studier vara nödvändiga beroende på behovet av regler och/ 
eller om nya frågor uppstår som en del av testkemikaliens utvärdering. 
8. All tillgänglig information om testkemikalien och relevanta metaboliter och 
analoger bör beaktas av laboratoriet innan studien genomförs i syfte att höja 
studiekvaliteten och undvika onödig djuranvändning. Detta kan omfatta data från andra relevanta testmetoder (in vivo-studier, in vitro-studier, och/eller in silico-utvärderingar). Fysikalisk-kemiska egenskaper, såsom en kemikalies 
fördelningskoefficient i oktanol-vatten (uttryckt som log P
 OW ), pKa, vatten ­
löslighet, ångtryck och molekylvikt kan vara användbara för planering av en studie och tolkning av resultat. De kan fastställas med lämpliga metoder som beskrivs i de relevanta testmetoderna.
 
BEGRÄNSNINGAR 
9. Denna testmetod är inte utformad för att hantera särskilda omständigheter, 
såsom dräktigt eller diande djur och avkomma, eller för att utvärdera po ­
tentiella resthalter i exponerade livsmedelproducerande djur. Däremot kan datan som erhålls från en B.36-studie ge bakgrundsinformation som en 
vägledning vid utformning av specifika studier för dessa undersökningar. 
Den här testmetoden är inte avsedd för testning av nanomaterial. En rapport om preliminär översyn av OECD:s testriktlinjer för deras tillämplighet för nanomaterial visar att TG 417 (motsvarande denna testmetod B.36) inte kan 
tillämpas på nanomaterial (1).
 
DEFINITIONER 
10. Definitioner som används för tillämpningen av denna testmetod finns i till ­
lägget.  
DJURSKYDDSÖVERVÄGANDEN 
11. Vägledning om human behandling av djur finns i OECD:s 
vägledningsdokument (GD) 19 (2). Det rekommenderas att OECD:s GD 
19 konsulteras för alla in vivo- och in vitro-studier beskrivna i denna test ­
metod.  
BESKRIVNING AV METODER  
Pilotstudier  
12. Användning av pilotstudier rekommenderas och uppmuntras vid valet av 
försöksparametrar till toxikokinetiska studier (t.ex. metabolism, massbalans, analysförfaranden, dosfinnande, utandning av CO
 2 , etc.). Karakteriseringen 
av vissa av dessa parametrar kräver inte användningen av radioaktivt märkta 
kemikalier.  ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 527
 
Val av djur  
Arter  
13. De djurarter (och den stam) som används för TK-testning bör helst vara 
densamma som användes i andra toxikologiska studier utförda med test ­
kemikalien av intresse. Normalt bör råtta användas då den har använts i stor utsträckning för toxikologiska studier. Användningen av andra eller 
ytterligare arter kan vara befogat om viktiga toxikologiska studier visar 
prov på signifikant toxicitet i dessa arter eller om deras toxicitet/toxikoki ­
netik visar sig vara mer relevant för människor. Motivering bör ges för val av djurart och dess stam. 
14. Om inte annat anges avser denna testmetod råttan som försöksart. Vissa 
aspekter för metoden kan behöva modifieras vid användningen av andra försöksarter.
 
Ålder och stam  
15. Unga friska vuxna djur (normalt 6–12 veckor vid tidpunkten för doseringen) 
bör användas (se också punkterna 13 och 14). Motivering bör ges för användningen av djur som inte är unga vuxna. Alla djur bör vara i samma ålder i början av studien. Viktskillnaden mellan enskilda djur bör inte över ­
stiga ± 20 % av medelvikten för testgruppen. Helst bör den stam som 
används vara samma som användes för härledning av den toxikologiska databasen för testkemikalien.
 
Djurens antal och kön  
16. Minst fyra djur av samma kön bör användas för varje dos som testas. 
Motivering bör ges för könet på de djur som används. Användningen av 
båda könen (fyra hanar och fyra honor) bör övervägas om det finns belägg för betydande könsrelaterade skillnader i toxicitet.
 
Inhysnings- och utfodringsförhållanden  
17. Djuren bör i regel inhysas individuellt under testperioden. Inhysning i grupp 
kan vara berättigad under särskilda omständigheter. Belysningen bör vara 
artificiell med omväxlande 12 timmra ljus och 12 timmar mörker. Tempera ­
turen i försöksdjurens utrymmen bör vara 22 °C (± 3 °C) och den relativa fuktigheten 30–70 %. För utfodringen kan konventionellt laboratoriefoder 
användas med ett obegränsat utbud av dricksvatten.
 
Testkemikalie  
18. En radioaktivt märkt testkemikalie med  14 C kan användas för alla 
massbalans- och metabolitidentifieringsaspekter av studien, men om det kan påvisas att: 
— Massbalans och metabolitidentifiering kan utvärderas tillräckligt med 
den omärkta testkemikalien. 
— Den analytiska specificiteten och sensitiviteten för metoden som används 
med en icke-radioaktiv testkemikalie är lika med eller större än det som 
kan uppnås med den radioaktivt märkta testkemikalien.
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 528
 
Då behöver man inte använda en radioaktivt märkt testkemikalie. Vidare kan 
andra radioaktiva och stabila isotoper användas, särskilt om ämnet svarar för 
eller är en del av testkemikaliens toxiska del. Om möjligt bör den radio ­
aktiva märkningen lokaliseras i en kärndel av molekylen som är metaboliskt stabil (den är inte utbytbar, avlägsnas inte metaboliskt som CO
 2 och blir inte 
del av en-kolreserven i organismen). Märkning av flera platser eller speci ­
fika områden i molekylen kan vara nödvändig för att se vad som händer med testkemikaliens metabolism. 
19. De radioaktivt märkta och omärkta testkemikalierna bör analyseras med 
lämpliga metoder för att upprätta renhet och identitet. Den radioaktiva ren ­
heten hos den radioaktiva testkemikalien bör vara den högst uppnåbara för en viss testkemikalie (helst mer än 95 %) och rimlig ansträngning bör göras 
för att identifiera föroreningar som förekommer i 2 % eller mer. Renheten 
tillsammans med identiteten och andelen eventuella orenheter som har iden ­
tifierats bör rapporteras. Enskilda reglerande program kan välja att ge ytter ­
ligare vägledning som hjälp för definitionen och specifikationerna av test ­
kemikalier som består av blandningar för bestämning av renhet.
 
Val av dos  
Pilotstudie  
20. Vanligtvis är en enkel oral dos tillräcklig för pilotstudien. Dosen bör vara 
icke-toxisk, men tillräckligt hög för att medge metabolisk identifiering i exkret (och plasma om tillämpligt) samt uppfylla det fastställda syftet med pilotstudien som nämns i punkt 12 i denna testmetod.
 
Huvudstudier  
21. För huvudstudierna är minst två doser att föredra eftersom samlad infor ­
mation från minst två dosgrupper kan vara behjälplig för dosinställning i andra toxicitetsstudier, och hjälpa till med dosrespons-bedömningen av re ­
dan tillgängliga toxicitetstester. 
22. Om två doser administreras bör båda doserna vara tillräckligt höga för att 
medge metabolisk identifiering i exkrement (och plasma om tillämpligt). Information från tillgängliga toxicitetsdata bör beaktas vid valet av dos. 
Om informationen inte är tillgänglig (t.ex. från akuta orala toxicitetsstudier 
med registrerade tecken på toxicitet eller från toxicitetsstudier med upprepad dosering) kan ett värde för den högre dosen som ligger under LD
 50 - (oralt 
och via huden) eller LC  50 -uppskattningen (inhalation), eller under det lägre 
värdet för akut toxicitetsintervall beaktas. Den lägre dosen bör vara en del 
av den högre dosen. 
23. Om endast en dosnivå undersöks bör helst dosen vara tillräckligt hög för att 
medge metabolitidentifiering i exkrement (och plasma om tillämpligt), utan 
att framkalla uppenbar toxicitet. En motivering bör ges till varför inte en andra dosnivå har inkluderats. 
24. Om doseffekten på de kinetiska processerna behöver upprättas kanske två 
doser inte räcker och minst en dos behöver vara tillräckligt hög för att mätta dessa processer. Om arean under plasmakoncentration-tidkurvan (AYC) inte är linjär mellan två dosnivåer som används i huvudstudien, är detta ett 
tydligt tecken på att mättnad av en eller flera kinetiska processer sker någon ­
stans mellan de två dosnivåerna.
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 529
 
25. För testkemikalier med låg toxicitet bör en maximal dos på 1 000 mg/kg 
kroppsvikt (oralt och via huden) användas (om administreringen sker via 
inhalation, se kapitel B.2 i denna bilaga för vägledning; vanligtvis över ­
skrider inte denna dos 2 mg/l). Kemisk-specifika överväganden kan kräva en högre dos beroende på regleringsbehoven. Valet av dos ska alltid motiveras. 
26. Engångsdostoxikokinetiska data och vävnadsdistributionsdata kan vara 
lämpliga för att fastställa potentialen för ackumulering och/eller persistens. 
I vissa fall kan dock administrering med upprepad dos behövas i) för att mer fullständigt hantera potentialen för ackumulering och/eller persistens eller 
förändringar i TK (t.ex. enzyminduktion och inhibition), eller ii) vad som 
krävs enligt tillämpliga regelsystem. I studier med upprepad dosering där administrering med upprepade låga doser vanligtvis räcker, kan under vissa omständigheter också vara nödvändiga (se även punkt 57).
 
Administrering av testkemikalie  
27. Testkemikalien ska upplösas eller suspenderas homogent i samma vehikel 
som används i andra toxicitetsstudier med oral sondmatning som utförs med 
testkemikalien, om sådan vehikelinformation finns tillgänglig. Grunden för 
valet av vehikel ska ges. Valet av vehikel och doseringsvolymen ska beaktas vid studiens utformning. Det sedvanliga administreringssättet är genom sondmatning, dock kan administrering via gelatinkapsel eller foderblandning 
vara fördelaktig i specifika situationer (i båda fallen bör detta motiveras). 
Verifiering av den faktiska dos som administreras till varje djur bör ges. 
28. Den maximala volymen vätska som ska administreras genom sondmatning 
vid ett tillfälle beror på försöksdjurens storlek, typen av dosvehikel, och 
huruvida fodret undanhålls eller ej före administreringen av testkemikalien. 
Motivering för administrering eller undanhållande av foder före dosering ska ges. I regel bör volymen hållas så låg som möjligt för antingen vattenbase ­
rade eller icke-vattenbaserade vehiklar. Dosvolymer bör normalt inte över ­
skrida 10 ml/kg kroppsvikt för gnagare. Vehikelvolymer som används för 
mer lipofila testkemikalier kan börja med 4 ml/kg kroppsvikt. Vid upprepad dosering, när dagligt fastandet kontraindiceras, bör lägre dosnivåer (t.ex. 2–4 ml/kg kroppsvikt) övervägas. Där så är möjligt kan man överväga att an ­
vända en dosvolym som överensstämmer med den som administrerats i 
andra sondmatningsstudier av en testkemikale. 
29. Intravenös (IV) administrering av testkemikalien och mätning av testkemi ­
kalien i blod och/eller exkrement kan användas för att fastställa biotillgäng ­
lighet eller relativ oral absorption. För IV-studien administreras en engångs ­
dos (vanligtvis lika med men inte överskridande den lägre orala dosen – se val av dos) av testkemikalien med en lämplig vehikel. Detta ämne bör administreras i lämplig volym (t.ex. 1 ml/kg kroppsvikt) på den valda plat ­
sen för administreringen till minst fyra djur av lämpligt kön (båda könen 
kan användas om det är befogat, se punkt 16). En fullt upplöst eller sus ­
penderad dosberedning är nödvändig för IV-administrering av testkemikali ­
en. Vehikeln för IV-administrering ska inte störa blodintegriteten eller 
blodflödet. Om testkemikalien infunderas bör infusionshastigheten rappor ­
teras och standardiseras mellan djuren, förutsatt att en infusionspump
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 530
 
används. Narkos bör användas om man för in en kanyl i halsvenen (för 
administrering av testkemikalie och/eller insamling av blod) eller om man 
använder den femorala artären för administreringen. Hänsyn bör tas till den typ av bedövning som kan påverka toxikokinetiken. Djuren bör få tillfälle att återhämta sig före administreringen av testkemikalien plus vehikeln. 
30. Andra administreringssätt, såsom hud och inhalation (se punkterna 74–78), 
kan vara tillämpliga för vissa testkemikalier med tanke på deras fysikalisk-kemiska egenskaper och den förväntade mänskliga användningen eller exponeringen.
 
Mätningar  
Massbalans  
31. Massbalans bestäms genom summering av procenten för den administrerade 
(radioaktiva) dosen som utsöndrats i urin, avföring och utandningsluft, och 
procentandelen som finns i vävnader, resterna av kroppen och burtvätt (se punkt 46). Generellt anses en total återvinning av den administrerade test ­
kemikalien (radioaktivitet) i storleksordningen > 90 % vara tillräcklig.
 
Absorption  
32. En initial uppskattning av absorption kan uppnås genom att utesluta den 
procentuella dosen i det gastrointestinala (GI) området och/eller avföringen 
från massbalansbestämningen. För procentberäkningen av absorption, se punkt 33. För undersökning av avföring, se punkterna 44–49. Om den exakta omfattningen av absorption efter oral dosering inte kan fastställas 
genom massbalansstudier (t.ex. där mer än 20 % av den administrerade 
dosen finns i avföringen) kan ytterligare undersökningar vara nödvändiga. Dessa studier kan antingen omfatta 1) oral administrering av testkemikalie och mätning av testkemikalie i galla eller 2) oral och intravenös administre ­
ring av testkemikalien och mätning av nettotestkemikalie i urin plus utand ­
ningsluft plus kadaver för var och en av de båda sätten. I båda studieutform ­
ningarna genomförs mätning av radioaktivitet som en surrogatmetod för kemikaliespecifik analys av testkemikalien plus metaboliter. 
33. Om en gallutsöndringsstudie genomförs används vanligtvis oral administre ­
ring. I denna studie bör kanyler föras in i gallgångarna hos minst fyra djur av lämpligt kön (eller av båda könen om det är befogat) och en engångsdos 
av testkemikalien ska administreras. Efter administreringen av testkemika ­
lien bör utsöndringen av radioaktivitet/testkemikalie i gallan övervakas så länge som krävs för att uppskatta procentandelen av den administrerade dosen som utsöndras via denna väg, som kan användas för att direkt beräkna 
omfattningen av oral absorption enligt följande: 
Procentandel absorption  ¼ ðmängd i galla þ urin þ utandningsluft þ 
kropp utanmatspjälkningskanalinnehåll Þ=administrerad mängd  Ü 100 
34. I några klasser av testkemikalien kan direkt utsöndring av den absorberade 
dosen uppträda i de intestinala membranen. I sådana fall anses inte mät ­
ningen av %-dosen i avföringen efter en oral dos i gallgången representativt 
för den icke-absorberade dosen. Det rekommenderas att då tarmsekretion 
tros ske baseras den absorberade %-dosen på absorptionen beräknad på utsöndringen efter den orala jämfört med den intravenösa (hel eller gallgång) (se punkt 35). Det rekommenderas också att om kvantifiering av tarmsek ­
retet anses nödvändig, mäts exkretionen i gallgången efter den intravenösa 
administreringen.
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 531
 
Biotillgänglighet  
35. Biotillgänglighet kan bestämmas genom plasma-/blodkinetik på de orala och 
intravenösa grupperna, såsom beskrivs i punkterna 50–52, genom särskilda kemiska analyser av testkemikalien och/eller relevant metabolit(er), därför 
krävs inte testkemikalier märkta med radioaktivitet. Beräkningen av test ­
kemikaliens biotillgänglighet (F) eller relevant metabolit(er) kan utföras en ­
ligt följande: 
F ¼ ðAUC
 exp=AUC  IV Þ Ü ðDos  IV=Dos  exp Þ 
Där AUC är arean under plasmakoncentration-tidkurvan, och exp är den 
experimentella vägen (oral, dermal eller via inhalation). 
36. Vid riskbedömning av systematiska effekter, föredras i allmänhet biotill ­
gänglighet framför procentuell absorption när man jämför systematiska kon ­
centrationer i djurstudier med analoga bioövervakningsdata från studier över 
arbetstagares exponering. Situationen kan bli mer komplicerad om doserna 
är i det icke-linjära området så det är viktigt att toxikokinetisk screening bestämmer doserna i det linjära området.
 
Vävnadsfördelning  
37. Kunskap om en testkemikalies vävnadsfördelning och/eller dess metaboliter 
är viktig för identifieringen av målvävnader och förståelsen för de underlig ­
gande mekanismerna för toxicitet, samt information om testkemikaliens po ­
tential och metabolitackumulering och persistens. Procentandelen av den 
totala (radioaktiva) dosen i vävnader samt rester i kroppen är det som minst som ska mätas vid exkretionsförsökets upphörande (t.ex. upp till 7 dagar 
efter dosering eller mindre beroende på testkemikaliens specifika beteende). 
När ingen testkemikalie detekteras i vävnaderna vid studiens upphörande (t.ex. för att testkemikalien kanske har eliminerats före studiens upphörande på grund av en kort halveringstid), bör man vara försiktig för att undvika 
feltolkning av datan. I denna typ av situation bör vävnadsfördelningen un ­
dersökas vid tidpunkten för testkemikaliens (och/eller metabolit) plasma-/blodtoppkoncentration (T
 max ) eller topphastighet för urinexkretion, 
när så är lämpligt (se punkt 38). Vidare kan vävnadsinsamlingar vid ytter ­
ligare tidpunkter vara nödvändiga för att bestämma vävnadsfördelningen av 
testkemikalien och/eller dess metaboliter, bedöma tidsberoendet (om till ­
lämpligt), underlätta upprättande av massbalansen och/eller det som krävs av en behörig myndighet. Vävnader som bör samlas in är lever, fett, mag ­
tarmkanalen, njurar, mjälte, helblod, rester av kroppen, målvävnadsorgan 
och eventuellt andra vävnader (t.ex. sköldkörtel, erytrocyter, reproduktions ­
organ, hud, öga (särskilt i pigmenterade djur) som har en potentiell bety ­
delse för den toxikologiska utvärderingen av testkemikalien. Analys av yt ­
terligare vävnader vid samma tidpunkter bör beaktas för att maximera ut ­
nyttjandet av djuren och i händelse av att målorgantoxicitet observeras i subkroniska eller kroniska toxicitetsstudier. Den (radioaktiva) restkoncent ­
rationen och förhållandet vävnad-blod bör också rapporteras. 
38. Utvärderingen av vävnadsfördelningen vid ytterligare tidpunkter såsom tid ­
punkten för plasma-/blodtoppkoncentrationen (t.ex. T
 max ) eller urinexkretio ­
nens topphastighet, kan också behövas eller krävas av en behörig myndig ­
het. Denna information kan underlätta förståelsen av toxicitet samt testkemi ­
kaliens potential och metabolitackumulering och persistens. Motivering för 
urvalet bör ges; prover för analys bör i allmänhet vara desamma som de 
ovan (se punkt 37).  ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 532
 
39. Kvantifiering av radioaktivitet i vävnadsfördelningsstudier kan utföras med 
organdissektion, homogenisering, förbränning och/eller löslighet, följt av 
vätskescintillationsräkning (LSC) av fångade rester. Vissa tekniker, för när ­
varande på olika utvecklingsstadier t.ex. kvantitativ helkroppsautoradiografi och receptormikroskopisk autoradiografi, kan vara användbara för att be ­
stämma fördelningen av en testkemikalie i organ och/eller vävnader (3) (4). 
40. För exponeringsvägar annat än orala, bör specifika vävnader samlas in och 
analyseras, såsom lungor i inhalationsstudier och hud i dermala studier. Se 
punkterna 74–78.
 
Metabolism  
41. Exkret (och plasma, i förekommande fall) bör samlas in för identifiering och 
kvantifiering av oförändrad testkemikalie och metaboliter som beskrivs i punkterna 44–49. Det är acceptabelt med sammanslagning av urin och 
avföring för att underlätta metabolitidentifiering inom en given dosgrupp. 
Profilering av metaboliter från varje tidsperiod rekommenderas. Om bristen på prov och/eller radioaktivitet utesluter detta, är det dock acceptabelt med sammanslagning av urin och avföring över flera tidpunkter, men samman ­
slagning mellan könen eller doser är inte acceptabelt. Lämpliga kvalitativa 
och kvantitativa metoder ska användas för att analysera urin, avföring, sön ­
derfallen radioaktivitet från behandlade djur samt galla vid behov. 
42. Rimliga ansträngningar bör göras för att identifiera alla metaboliter som 
finns i 5 % eller mer av den administrerade dosen och för att tillhanda ett metaboliskt system för testkemikalien. Testkemikalier som kännetecknas av 
exkrementer som innefattar 5 % eller mer av den administrerade dosen bör 
identifieras. Identifiering hänvisar till den exakta strukturella bestämningen av komponenter. Normalt utförs identifiering antingen genom co-kromatografi av metaboliten med kända standarder som använder två 
olika system eller tekniker för positiv strukturell identifiering, såsom mas ­
spektrometri, kärnmagnetisk resonans (NMR) etc. När det gäller co-kromatografi anses inte kromatografiska tekniker som använder samma stationära fas med två olika lösningsmedelsystem vara en lämplig tvåme ­
todsverifiering av metabolitidentitet, eftersom metoderna inte är självständi ­
ga. Identifiering genom co-kromatografi ska erhållas genom användning av två olika analytiskt oberoende system såsom omvänd och normal tunnskiktskromatografi (TLC) och vätskekromatografi (HPLC). Förutsatt 
att den kromatografiska separationen är av lämplig kvalitet är ytterligare 
bekräftelse genom spektroskopi inte nödvändig. Alternativt kan otvetydig identifiering även erhållas med metoder som ger strukturell information såsom vätskekromatografi/masspektrometri (LC-MS) eller vätskekromato ­
grafi/tandem-masspektrometri (LC-MS/MS), gaskromatografi/masspektro ­
metri (GC-MS), och NMR-spektrometri. 
43. Om det inte är möjligt med identifiering av metaboliter på 5 % eller mer av 
den administrerade dosen bör en motivering/förklaring lämnas i slutrappor ­
ten. Det kan vara lämpligt att identifiera metaboliter som utgör mindre än 5 % av den administrerade dosen för att få en bättre förståelse av metabo ­
lismen för faro- och/eller riskbedömning av testkemikalien. Strukturell be ­
kräftelse ska lämnas när det är möjligt. Detta kan inkludera profilering av 
plasma eller blod, eller andra vävnader.
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 533
 
Exkretion  
44. Hastigheten och omfattningen av exkretion av den administrerade dosen bör 
bestämmas genom mätning av procentandelen av den återvunna (radioakti ­
va) dosen från urin, avföring och utandningsluft. Dessa data hjälper också 
till att etablera massbalans. De kvantiteter av testkemikalien (radioaktivitet) 
som eliminerats i urin, avföring och utandningsluft bör bestämmas med lämpliga tidsintervall (se punkterna 47–49). Försök med upprepad dos ska utformas för att medge insamling av exkretionsdata för att uppfylla de mål 
som beskrivs i punkt 26. Detta kommer att möjliggöra jämförelse med 
försök med engångsdos. 
45. Om en pilotstudie har visat att ingen signifikant mängd av testkemikalien 
(radioaktivitet) (enligt punkt 49) utsöndras i utandningsluften, då behöver inte utandningsluften samlas in i den slutgiltiga studien. 
46. Varje djur ska placeras i en separat metabolisk enhet för uppsamling av urin 
och avföring (urin, avföring och utandningsluft). Vid slutet av varje upp ­
samlingsperiod (se punkterna 47–49), bör de metaboliska enheterna sköljas med lämpligt lösningsmedel (detta är känt som ”burtvätt”) för att säkerställa maximal återvinning av testkemikalien (radioaktivitet). Insamling av urin 
och avföring bör upphöra efter 7 dagar, eller efter att minst 90 % av den 
administrerade dosen har återvunnits, beroende på vilket som inträffar först. 
47. De totala mängderna av testkemikalien (radioaktivitet) i urin ska bestämmas 
vid minst två olika tidpunkter under dag 1 av uppsamlingen, varav en 24 timmar efter dosering, och därefter dagligen till dess studien upphör. Valet av mer än två provtagningstidpunkter under dag ett (t.ex. vid 6, 12 och 24 
timmar) uppmuntras. Resultaten från pilotstudier ska analyseras för infor ­
mation om alternativa eller kompletterande tidpunkter för insamling. En motivering ska ges för insamlingsschemana. 
48. Den totala mängden testkemikalie (radioaktivitet) i avföring ska fastställas 
på daglig basis med början 24 timmar efter dosering tills studien avslutas, 
såvida inte pilotstudier föreslår alternativa eller kompletterande tidpunkter 
för insamling. En motivering ska ges för de alternativa insamlingsschemana. 
49. Insamlingen av passerad CO
 2 och andra flyktiga material kan avbrytas i ett 
givet studieförsök när mindre än 1 % av den administrerade dosen återfinns i utandningsluften under en 24-timmars uppsamlingsperiod.
 
Tidpunktsstudier  
Plasma-/blodkinetik  
50. Syftet med dessa studier är att få en uppskattning av grundläggande 
TK-parametrar (t.ex. C  max , T max , halveringstid (t  1/2 ), AUC) för testkemika ­
lien. Dessa studier kan utföras med en dos eller, mer troligt med två eller fler doser. Dosinställning bör bestämmas av försökstypen och/eller frågan 
som behandlas. Kinetiska data kan behövas för att lösa frågor såsom test ­
kemikaliens biotillgänglighet och/eller för att klargöra doseffekten för god ­
kännande (t.ex. för att klargöra huruvida godkännandet är mättat på ett dosberoende sätt). 
51. För dessa studier ska minst fyra djur av samma kön per dosgrupp användas. 
Motivering bör ges för könet på de djur som används. Användningen av 
båda könen (fyra hanar och fyra honor) bör övervägas om det finns belägg 
för betydande könsrelaterade skillnader i toxicitet.
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 534
 
52. Efter administreringen av testkemikalien (radioaktiv) ska blodprov tas från 
varje djur vid lämpliga tidpunkter med hjälp av lämplig provtagningsmetod. 
Volymen och antal blodprov som kan erhållas per djur kan begränsas genom potentiella effekter från upprepad provtagning på djurhälsa/fysiologi och/el ­
ler analysmetodens känslighet. Proven ska analyseras för varje enskilt djur. I 
vissa fall (t.ex. metabolitkarakterisering) kan det vara nödvändigt att samla 
in prover från fler än ett djur. Samlingsprover bör identifieras och en för ­
klaring för sammanslagning bör ges. Om en radioaktiv märkt testkemikalie används kan en analys av den totala aktuella radioaktiviteten vara tillräcklig. 
Om så är fallet, bör den totala radioaktiviteten analyseras i helblod och 
plasma eller plasma och röda blodkroppar för möjliggöra en beräkning av blod-/plasmaförhållandet. Under andra omständigheter kan mer specifika undersökningar som kräver identifiering av modersubstans och/eller meta ­
boliter, eller bedömning av proteinbindning behövas.
 
Övrig vävnadskinetik  
53. Syftet med dessa studier är att få information om tidsförloppet för att be ­
handla frågor rörande toxisk verkningsmekanism, bioackumulering och bio ­
persistens genom bestämning av testkemikalienivåer i olika vävnader. Valet 
av vävnader och antal tidspunkter som utvärderas beror på frågan som ska behandlas och testkemikaliens toxikologiska databas. Utformningen av dessa ytterligare vävnadskinetiska studier bör ta hänsyn till den information som 
samlats in som beskrivs i punkterna 37–40. Dessa studier kan gälla engångs ­
dosering eller upprepad dosering. En detaljerad motivering för den använda strategin ska ges. 
54. Skäl för att utföra andra vävnadskinetiska studier kan omfatta: 
— Tecken på utökad blodhalveringstid tyder på möjlig ackumulering av 
testkemikalien i olika vävnader eller 
— intresse av om en stabil tillståndsnivå har uppnåtts i vissa vävnader 
(även om en stabil tillståndsnivå av en testkemikalie kan ha uppnåtts 
kan det finnas intresse av att veta att en stabil tillståndsnivå också har uppnåtts i målvävnader i t.ex. studier med upprepad dosering). 
55. För dessa typer av tidförloppsstudier bör en lämplig oral dos av testkemi ­
kalien administreras till minst fyra djur per dos per tidpunkt och tidsför ­
loppet för distributionen övervakas i utvalda vävnader. Endast ena könet får 
användas om inte könsspecifik toxicitet observeras. Om total radioaktivitet 
eller moderkemikalien och/eller metaboliter analyseras beror på den fråga som behandlas. Bedömning av vävnadsdistributionen bör göras med lämp ­
liga metoder.
 
Enzyminduktion/inhibition  
56. Studier som tar upp eventuella effekter av enzyminduktion/inhibition eller 
biotransformation av testkemikalien som studeras kan krävas i ett eller flera 
av följande fall: 
1) Tillgängliga uppgifter tyder på ett samband mellan biotransformering av 
testkemikalien och ökad toxicitet. 
2) Tillgängliga toxicitetsdata tyder på ett ickelinjärt förhållande mellan dos 
och metabolism.  ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 535
 
3) Resultatet av metabolitidentifieringsstudier visar identifiering av en po ­
tentiell toxisk metabolit som kan ha producerats av en enzymväg som 
inducerats av testkemikalien. 
4) För att förklara effekter som antas vara kopplade till enzyminducerade 
fenomen. 
5) Om toxikologiskt signifikanta förändringar i den metaboliska profilen 
hos testkemikalien observeras antingen  in vitro-  eller  in vivo -försök 
med olika arter eller villkor, kan karakteriseringen av involverad en ­
zym(er) behövas (t.ex. fas I-enzymer såsom isoenzymer av cytokrom 
P450-beroende mono-oxygenassystemet, fas II-enzymer såsom isoenzy ­
mer av sulfotransferas eller uridindifosfat glukuronosyltransferas, eller andra relevanta enzymer). Denna information kan användas för att utvär ­
dera relevansen av art till art extrapoleringar. 
57. Lämpliga studieprotokoll för att värdera testkemikalierelaterade förändringar 
i TK, lämpligt validerade och motiverade bör användas. Exempelstudie ­
utformning utgörs av upprepad dosering med omärkt testkemikalie, följt av en radioaktivt märkt engångsdos dag 14 eller upprepad dosering med 
radioaktivt märkt testkemikalie och provtagning dag 1, 7 och 14 för bestäm ­
ning av metabolita profiler. Upprepad dosering med radioaktivt märkta ke ­
mikalier kan också ge information om bioackumulering (se punkt 26).
 
KOMPLETTERANDE METODER 
58. Kompletterande metoder bortom in vivo-försök som beskrivs i denna test ­
metod kan ge nyttig information om absorption, distribution, metabolism eller eliminering av en testkemikalie i vissa arter.
 
Användning av  in vitro -information  
59. Flera frågor som rör metabolism av testkemikalien kan behandlas i in 
vitro-studier med lämpliga testsystem. Nyligen isolerade eller odlade hepa ­
tocyter och subcellulära fraktioner (t.ex. mikrosomer och cytosol eller S9- 
fraktioner) från levern kan användas för att studera eventuella metaboliter. 
Lokal metabolism i målorganet t.ex. lungan kan vara av intresse vid risk ­
bedömningen. För dessa ändamål kan mikrosomala fraktioner av målorgan vara användbara. Studier med mikrosomer kan vara användbara för att 
hantera potentiella kön- och livsetappsskillnader och karakterisera enzympa ­
rametrar (K
 m och V  max ) som kan hjälpa till vid bedömningen av dosbero ­
ende metabolism i förhållande till exponeringsnivåer. Dessutom kan mikro ­
somer vara användbara för att identifiera de specifika mikrosomala enzymer 
som är involverade i metabolismen av testkemikalien som kan vara relevanta 
i artextrapolering (se också punkt 56). Potentialen för induktion av metabo ­
lism kan också undersökas genom leversubcellulära fraktioner (t.ex. mikro ­
somer och cytosol) av djur som förbehandlats med testkemikalien i fråga, in 
vitro via hepatocytinduktionsstudier eller från specifika cellinjer som uttryc ­
ker relevanta enzymer. Under vissa omständigheter och under lämpliga för ­
hållanden kan subcellulära fraktioner som kommer från mänskliga vävnader övervägas för bestämning av potentiella artskillnader i biotransformation. 
Resultaten från in vitro-undersökningar kan också vara användbara i utveck ­
lingen av PBTK-modeller (5).
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 536
 
60. In vitro-hudabsorptionsstudier kan också ge kompletterande information för 
att karakterisera absorption (6). 
61. Primära cellkulturer från leverceller och färska vävnadsskivor kan användas 
för att behandla liknande frågor som med levermikrosomer. I vissa fall kan 
det vara möjligt att svara på specifika frågor med hjälp av cellinjer med definierade uttryck av det relevanta enzymet eller modifierade cellinjer. I vissa fall kan det vara användbart att studera inhiberingen och induktionen 
av specifika cytokrom P450-isozymer (t.ex. CYP1A1, 2E1, 1A2 och andra) 
och/eller fas II-enzymer av modersubstansen med hjälp av in vitro-studier. Informationen som erhålls kan användas för liknande strukturerade förening ­
ar.
 
Användning av toxikokinetiska data från toxicitetsstudier som komplet ­
terande information  
62. Analys av blod, vävnad och/eller avföringsprover som erhållits under ge ­
nomförandet av eventuella andra toxicitetsstudier kan ge data om biotill ­
gänglighet, förändringar i plasmakoncentration i tid (AUC, C  max ), bioacku ­
muleringspotential, nedbrytningshastighet och köns- eller livsskedesföränd ­
ringar i metabolism och kinetik. 
63. Övervägande av studiens utformning kan användas för att besvara frågor 
som rör mättad absorption, biotransformering eller utsöndringsvägar vid 
högre dosnivåer, hanteringen av nya metaboliska vägar vid högre doser och begränsningen av toxiska metaboliter för högre doser. 
64. Andra farobedömningsöverväganden kan omfatta frågor såsom: 
— Åldersrelaterad känslighet på grund av skillnader i statusen för 
blod-hjärnbarriären, njuren och/eller avgiftningskapaciteten. 
— Subpopulationskänslighet på grund av skillnader i biotransformerings ­
kapacitet eller andra TK-skillnader. 
— Omfattningen av exponeringen av fostret genom transplacental över ­
föring av kemikalier eller hos de nyfödda genom digivning.
 
Användning av toxikokinetisk modellering  
65. Toxikokinetiska modeller kan vara användbara för olika faro- och risk ­
bedömningsaspekter som till exempel förutsägelsen av systematisk expone ­
ring och intern vävnadsdos. Vidare kan specifika frågor om verkningsmeka ­
nism behandlas, och dessa modeller kan ge en grund för extrapolering mellan arter, exponeringsvägar, doseringsmönster och mänsklig riskbedöm ­
ning. Data som är användbara för utvecklandet av PBTK-modeller för en 
testkemikale för en given art inkluderar 1) fördelningskoefficienter, 2) bio ­
kemiska konstanter och fysiologiska parametrar, 3) vägspecifika absorp ­
tionsparametrar och 4) in vivo-kinetiska data för modellutvärdering (t.ex. nedbrytningsparametrar för relevanta (> 10 %) utsöndringsvägar, K
 m och 
V max för metabolism). Försöksdatan som används vid modellutvecklingen 
ska genereras med vetenskapligt sunda metoder och modellresultaten ska valideras. Testkemikalie och artspecifika parametrar såsom absorptionshas ­
tighet, blodvävnadspartitionering och metaboliska hastighetskonstanter be ­
stäms ofta för att underlätta utvecklingen av oberoende eller fysiologiskt 
baserade modeller (7).
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 537
 
DATA OCH RAPPORTERING 
66. Det rekommenderas att studierapporten innehåller en innehållsförteckning.  
Rapportens huvuddel  
67. Rapportens huvuddel ska innehålla information som omfattas av denna test ­
metod indelad i avsnitt och punkter enligt följande:  
Sammanfattning  
68. Denna del av studien ska innehålla en sammanfattning av studiens utform ­
ning och en beskrivning av metoderna som använts. Den bör också belysa de viktigaste resultaten avseende massbalans, arten och omfattningen av metaboliter, vävnadsrester, nedbrytningshastighet, bioackumuleringspotenti ­
al, könsskillnader etc. Sammanfattningen bör presenteras i tillräcklig detalj 
för att möjliggöra en bedömning av resultaten.
 
Inledning  
69. Denna del av rapporten ska omfatta studiens mål, motiv och utformning 
såväl som lämpliga referenser och eventuell bakgrundshistoria.  
Material och metoder  
70. Denna del av rapporten ska innehålla detaljerade beskrivningar av all rele ­
vant information, inklusive: 
a) Testkemikalie 
Denna underavdelning ska innehålla identifiering av testkemikalien: Ke ­
miskt namn, molekylstruktur, kvalitativ och kvantitativ bestämning av 
dess kemiska sammansättning, kemisk renhet och när det så möjligt, typ och mängd av eventuella orenheter. Den bör också innehålla infor ­
mation om fysikalisk/kemiska egenskaper, inklusive fysiskt tillstånd, 
färg, bruttolöslighet och/eller fördelningskoefficient, stabilitet, och om så är lämpligt, frätande egenskaper. Om tillämpligt ska information om isomerer lämnas. Om testämnet är radioaktivt bör information om föl ­
jande ingå i denna underavdelning: Typen av radionuklid, läge för märk ­
ning, specifik aktivitet och radiokemisk renhet. 
Typ eller beskrivning av eventuell vehikel, spädningsmedel, suspende ­
ringsmedel och emulgeringsmedel eller andra material som används vid administreringen av testkemikalien bör anges. 
b) Försöksdjur 
Denna underavdelning ska innehålla information om försöksdjuren, in ­
klusive val och motivering av art, stam, ålder vid studiens inledning, kön 
samt kroppsvikt, hälsotillstånd och djurhållning. 
c) Metoder 
Denna underavdelning ska innehålla detaljer om studiens utformning och 
metod som används. Den ska innehålla en beskrivning av: 
1) Motivering för varje ändring av exponeringsväg och exponerings ­
förhållanden, om tillämpligt.
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 538
 
2) Motivering för valet av dosnivåer. 
3) Beskrivning av pilotstudier som används i den experimentella ut ­
formningen av uppföljningsstudier, om tillämpligt. Pilotstudiens un ­
derlag ska lämnas in. 
4) Hur doseringslösningen bereddes och typen av lösningsmedel eller 
vehikel, om någon, som används. 
5) Antal behandlingsgrupper och antal djur per grupp. 
6) Doseringsnivåer och volym (och specifik dosaktivitet då radioakti ­
vitet används). 
7) Väg och metod för administrering. 
8) Doseringsfrekvens. 9) Fasteperiod (om sådan används). 
10) Total radioaktivitet per djur. 
11) Djurhantering. 
12) Provtagning och hantering. 
13) Analysmetoder som används för separering, kvantifiering och iden ­
tifiering av metaboliter. 
14) Detektionsgräns för de använda metoderna. 15) Andra experimentella mätningar och förfaranden som används (in ­
klusive validering av metoder för metabolitanalys). 
d) Statistisk analys. 
Om statistisk analys används för att analysera studieresultaten ska till ­
räcklig information om analysmetoden och de datorprogram som an ­
vänds ingå, så att en oberoende granskare/statistiker kan omvärdera och rekonstruera analysen. 
När det gäller systemmodellstudier såsom PBTK bör presentationen av 
modellerna innehålla en fullständig beskrivning av modellen för att tillåta en oberoende rekonstruktion och validering av modellen (se punkt 65 
och Tillägg: Definitioner).
 
Resultat  
71. All data ska sammanfattas i tabellform med lämplig statistisk utvärdering 
och beskrivas i texten i denna avdelning. Radioaktivitetsdata ska samman ­
fattas och presenteras på lämpligt sätt för studien, vanligtvis i mikrogram- 
eller milligramekvivalenter per massa för provet, även om andra enheter kan 
användas. Denna avdelning bör innehålla grafiska illustrationer, reproduk ­
tion av representativa kromatografiska och spektrometriska data, metaboli ­
tidentifiering/kvantifiering och föreslagna metaboliska vägar inklusive meta ­
boliternas molekylstruktur. Vidare ska följande information ingå i denna 
avdelning, om tillämpligt: 
1) Kvantitet och procentandel av återvinning i urin, avföring, utandnings ­
luft, samt urin och avföring i burtvätt. 
— För dermala studier ska även data inkluderas beträffande återvinning 
av testkemikalien från behandlad hud, hudtvätt och kvarvarande ra ­
dioaktivitet i huden vilket omfattar utrustning och metabolisk enhet 
samt resultaten från hudtvättsstudien. För fortsatt diskussion se punk ­
terna 74–77.  ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 539
 
— Inhalationsstudier ska även innehålla data om återvinning av test ­
kemikalien från lungor och nasala vävnader (8). För fortsatt diskus ­
sion se punkt 78. 
2) Vävnadsfördelning rapporteras som procent av administrerad dos och 
koncentration (mikrogramekvivalenter per gram vävnad), och vävnad- 
blod eller vävnad-plasma-förhållanden. 
3) Materialbalans utvecklad ur varje studie som inbegriper analys av 
kroppsvävnader och utsöndringar. 
4) Plasmakoncentrationer och toxikokinetiska parametrar (biotillgänglighet, 
AUC, Cmax, Tmax, nedbrytning, halveringstid) efter administrering ge ­
nom relevant väg(ar) för exponering. 
5) Hastighet och omfattning av absorption av testkemikalien efter admini ­
strering genom relevant väg(ar) för exponering. 
6) Mängden testkemikalie och metaboliter (rapporterad som en procentandel 
av den administrerade dosen) som uppsamlas från avföringen. 
7) Hänvisning till tilläggsdata som innehåller individuella djurdata från alla 
kvantitativa endpoints (t.ex. dosadministrering, procentandel återvinning, koncentrationer, TK-parametrar etc.). 
8) En figur med de föreslagna metaboliska vägarna och metaboliternas 
molekylära strukturer.
 
Diskussion och slutsatser  
72. I detta avsnitt bör författaren/författarna: 
1) Föreslå en metabolisk väg på grundval av resultaten från testkemikaliens 
metabolism och disposition. 
2) Diskutera eventuella art- och könskillnader när det gäller disposition 
och/eller biotransformering av testkemikalien. 
3) Ställa upp i tabellform och diskutera identifieringen och omfattningen av 
metaboliter, nedbrytningshastighet, bioackumuleringspotential och nivå 
på moderämne i vävnadsrester och/eller metabolit(er) såväl som möjliga dosberoende förändringar i TK-parametrar, i förekommande fall. 
4) I detta avsnitt integrera eventuella relevanta TK-data som erhållits i sam ­
band med genomförandet av toxicitetsstudier. 
5) Ge en kortfattad slutsats som kan stödjas av resultaten från studien. 6) Tillagda avsnitt (som behövs eller är lämpliga). 
73. Ytterligare avsnitt bör användas för att inkludera stöd för bibliografisk infor ­
mation, tabeller, figurer, tillägg etc.
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 540
 
ALTERNATIVA EXPONERINGSVÄGAR  
Hud  
Hudbehandling  
74. Det här avsnittet innehåller specifik information om undersökningen av 
testkemikaliens toxikokinetik vid administrering via huden. För hudabsorp ­
tion ska kapitel B.44 i denna bilaga (hudabsorption: in vivo-metod (9)) konsulteras. För andra endpoints såsom distribution och metabolism kan den här testmetoden B.36 användas. En eller flera dosnivåer för testkemi ­
kalien ska användas vid dermal behandling. Testkemikalien (t.ex. rent, ut ­
spätt eller berett material som innehåller testkemikalien vilken appliceras på huden) ska vara samma (eller ett realistiskt surrogat) som människor eller andra potentiella målarter kan exponeras för. Dosnivån(erna) ska väljas i 
enlighet med punkterna 20–26 i denna testmetod. Faktorer som kan tas i 
övervägande i dermalt dosval inkluderar förväntad mänsklig exponering och/eller doser vid vilka toxicitet observerades i andra dermala toxicitets ­
studier. Den dermala dosen(erna) bör upplösas, om nödvändigt, i en lämplig 
vehikel och appliceras i en tillräcklig volym för att leverera de doserna. 
Strax före testet ska pälsen klippas på ryggdelen på försöksdjurens bål. Rakning kan användas, men det bör göras cirka 24 timmar före testet. Vid klippning eller räkning av pälsen ska försiktighet iakttas så att huden 
inte skadas, vilket kan ändra dess genomtränglighet. Cirka 10 % av kropps ­
ytan bör göras ren för applicering av testkemikalien. Vid mycket toxiska kemikalier kan den yta som täcks vara mindre än 10 %, men en så stor del av området som möjligt ska täckas med en tunn och jämn film. Samma 
behandling av ytan ska användas för alla dermala testgrupper. De doserade 
områdena ska skyddas med lämpligt skydd som sitter på plats. Djuren bör inhysas separat. 
75. En dermal tvättstudie bör genomföras för att bedöma mängden applicerad 
dos av testkemikalien som kan avlägsnas från huden genom tvättning av den 
behandlade huden med en mild tvål och vatten. Denna studie kan också ge stöd i upprättandet av massbalans när testkemikalien administreras via hu ­
den. För denna dermala tvättstudie bör en engångsdos av testkemikalien 
appliceras på två djur. Val av dosnivå är i enlighet med punkt 23 i denna 
testmetod (se även punkt 76 för diskussion om hudkontakttid). Mängderna av testkemikalien som återvunnits i tvättarna bör fastställas för att bedöma 
effektiviteten vid borttagningen av testkemikalien genom tvättproceduren. 
76. Såvida den inte hindras av korrosionsverkan bör testkemikalien appliceras 
och hållas på huden i minst 6 timmar. Vid tidpunkten för borttagandet av skyddet bör det behandlade området tvättas enligt förfarandet i den dermala tvättstudien (se punkt 75). Både skyddet och tvättarna ska analyseras för 
kvarvarande testkemikalie. Vid studiens upphörande ska varje djur avlivas 
skonsamt i enlighet med (2) och den behandlade huden ska avlägsnas. En lämplig del av behandlad hud ska analyseras för att bestämma kvarvarande 
testkemikalie (radioaktivitet). 
77. För toxikokinetisk bedömning av läkemedel kan olika förfaranden i enlighet 
med lämpligt regelverk behövas.
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 541
 
Inhalation  
78. En engångskoncentration (eller mer vid behov) av testkemikalien bör an ­
vändas. Koncentrationen(erna) ska väljas i enlighet med punkterna 20–26 i denna testmetod. Inhalationsbehandlingar ska utföras med hjälp av utrust ­
ning för ”noskon” eller ”enbart huvud” för att förhindra absorption genom 
alternativa vägar för exponering (8). Om andra villkor för inhalationsexpo ­
nering används bör motiveringen för ändringen dokumenteras. Varaktighe ­
ten av exponering genom inhalation bör definieras, normalt är exponeringen 
4–6 timmar.
 
LITTERATUR  
(1) OECD (2009). Preliminary Review of OECD Test Guidelines for their 
Applicability to Manufactured Nanomaterials, Series on the Safety of Ma ­
nufactured Nanomaterials No. 15, ENV/JM/MONO(2009)21, OECD, Paris. 
(2) OECD (2000). Guidance Document on Recognition, Assessment and Use of 
Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in 
Safety Evaluation; Environmental Health and Safety Publications, Series 
on Testing and Assessment N°19, ENV/JM/MONO(2000), OECD, Paris. 
(3) Solon E G, Kraus L (2002). Quantitative whole-body autoradiography in 
the pharmaceutical industry; Survey results on study design, methods, and 
regulatory compliance, J Pharm and Tox Methods 46: 73–81. 
(4) Stumpf WE (2005). Drug localization and targeting with receptor micros ­
copic autoradiography. J. Pharmacological and Toxicological Methods 51: 25–40. 
(5) Loizou G, Spendiff M, Barton HA, Bessems J, Bois FY, d’Yvoire MB, 
Buist H, Clewell HJ 3rd, Meek B, Gundert-Remy U, Goerlitz G, Schmitt 
W. (2008). Development of good modelling practice for physiologically 
based pharmacokinetic models for use in risk assessment: The first steps. Regulatory Toxicology and Pharmacology 50: 400–411. 
(6) Kapitel B.45 i denna bilaga, hudabsorption: in vitro-metod. (7) IPCS (2010). Characterization and application of 
Physiologically-BasedPharmacokinetic Models in Risk Assessment. IPCS 
Harmonization Project Document No 9. Geneva, World Health Organiza ­
tion, International Programme on Chemical Safety. 
(8) OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing, 
Series on Testing and Assessment No. 39, ENV/JM/MONO (2009) 28, 
OECD, Paris. 
(9) Kapitel B.44 i denna bilaga, hudabsorption: in vivo-metod. 
(10) Barton HA,  et al.  (2006). The Acquisition and Application of Absorption, 
Distribution, Metabolism, and Excretion (ADME) Data in Agricultural Chemical Safety Assessments, Critical Reviews in Toxicology 36: 9–35. 
(11) Gibaldi M and Perrier D, (1982), Pharmacokinetics, 2nd edition, Marcel 
Dekker, Inc., New York.
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 542
 
Tillägg  
DEFINITIONER  
Absorption : Process(er) med upptag av kemikalier i eller genom vävnader. 
Absorption avser moderföreningen och alla dess metaboliter. Inte att förväxla med ”biotillgänglighet”.  
Ackumulering  (Bioackumulering): Ökning av mängden testkemikalie över tid i 
vävnader (vanligtvis fettvävnader, efter upprepad dosering); om tillförseln av en 
testkemikalie i kroppen är större än den hastighet med vilken den elimineras, ackumulerar organismen testkemikalien och toxiska koncentrationer av testkemi ­
kalien kan uppnås.  
ADME : Förkortning för absorption, distribution, metabolism och exkretion.  
AUC : (arean under plasmakoncentration-tid-kurvan): Arean under kurvan i ett 
diagram för koncentrationen av testkemikalien i plasma över tiden. Den repre ­
senterar den totala mängden testkemikalie som absorberas av kroppen inom en förutbestämd tidsperiod. Vid linjära förhållanden är AUC (från tiden noll till 
oändligheten) proportionell mot den totala mängden av en testkemikalie som 
absorberas av kroppen, oavsett graden av absorption.  
Autoradiografi (helkropps-autoradiografi) : Används för att avgöra kvalitativ 
och/eller kvantitativ vävnadslokalisering av en radioaktiv testkemikalie. Denna teknik använder röntgenfilm eller på senare tid digital fosforimaging för att 
visualisera radioaktivt märkta molekyler eller fragment av molekyler genom att 
registrera strålningen som emitteras i det objekt som studeras. Kvantitativ helkropps-autoradiografi kan, jämfört med organdissektion, ha vissa fördelar för utvärdering av testkemikaliens distribution och bedömningen av den totala 
återvinningen och upplösningen av radioaktivt material i vävnader. En betydande 
fördel är, till exempel, att den kan användas för en pigmenterad djurmodell för att utvärdera eventuell association av testkemikalien med melanin, som kan binda 
vissa molekyler. Medan det kan ge bekväma helkroppsöversikter av bindnings ­
ställen med hög kapacitet-låg affinitet, kan denna teknik dock vara begränsad i att känna igen specifika målställen såsom receptor-bindningsställen där relativ hög upplösning och hög känslighet behövs för detektering. När autoradiografi 
används bör försöket som syftar till att bestämma massbalansen för den admini ­
strerade föreningen utföras som en separat grupp eller i en separat studie från vävnadsfördelningsförsöket, där alla exkret (vilket även kan inkludera utand ­
ningsluft) och hela kroppen homogeniseras och analyseras genom vätskescintill ­
lationsräkning.  
Gallexkretion : Exkretion via gallgångarna.  
Bioackumulering : Se ”ackumulering”.  
Biotillgänglighet : Fraktion av en administrerad dos som når det stora kretsloppet 
eller görs tillgänglig på platsen för fysiologisk aktivitet. Normalt refererar test ­
kemikaliens biotillgänglighet till modersubstansen, men skulle kunna hänvisa till 
dess metabolit. Den anses endast ha en kemisk form.  Observera : Biotillgäng ­
lighet och absorption är inte detsamma. Skillnaden mellan t.ex. oral absorption (dvs. närvaron i tarmväggen och portal cirkulation) och biotillgänglighet (dvs. närvaron i systemblod och i vävnader) kan uppstå från kemisk nedbrytning på 
grund av metabolism i tarmväggen eller utflödestransport tillbaka till lumen i 
magsäcken eller presystemisk metabolism i levern, bland andra faktorer (10). Biotillgängligheten för den toxiska komponenten (modersubstans eller en meta ­
bolit) är en kritisk parameter i riskbedömningen för människor (hög till lågdos- 
extrapolering, väg till extrapolering) för härledning av ett internt värde från 
externa NOAEL eller BMD (tillämpad dos). Det är den orala absorptionen som räcker för leverpåverkan vid oral administrering. Dock för varje påverkan annat än vid portalen för inträde, är det biotillgängligheten som i allmänhet är en 
mer pålitlig parameter för vidare användning i riskbedömningen, inte absorptio ­
nen.
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 543
 
Biopersistens : Se ”persistens”.  
Biotransformation : (Vanligtvis enzymatisk) kemisk omvandling av testkemika ­
lien av intresse, till en annan kemikalie i kroppen. Synonymt med metabolism.  
C max : Antingen maximal (toppvärde) koncentration i blodet (plasma/serum) efter 
administrering eller maximal (toppvärde) utsöndring (i urin eller avföring) efter 
administrering.  
Nedbrytningshastighet : Kvantitativt mått på den hastighet vid vilken testkemi ­
kalien förs bort från blodet, plasman eller en viss vävnad per tidsenhet.  
Kammare : Strukturell eller biokemisk del (eller enhet) av ett organ, vävnad eller 
cell, som är skild från resten.  
Avgiftningsvägar : Serier av steg som leder till eliminering av toxiska kemikalier 
från kroppen, antingen genom metabolisk förändring eller exkretion.  
Distribution : Spridning av en testkemikalie och dess derivat i en organism.  
Enzymer/isozymer : Proteiner som katalyserar kemiska reaktioner. Isozymer är 
enzymer som katalyserar liknande kemiska reaktioner men skiljer sig i sin ami ­
nosyresekvens.  
Enzymatiska parametrar : K  m : Michaelis konstant och V  max : maximal hastig ­
het. 
Exkretion : Process(er) genom vilken en administrerad testkemikalie och/eller 
dess metaboliter avlägsnas från kroppen.  
Exogent : Införd från eller producerad utanför organismen eller systemet.  
Extrapolering : Slutledning av en eller flera okända värden på grundval av det 
som är känt eller har observerats.  
Halveringstid (t  1/2 ): Den tid det tar för koncentrationen av testkemikalien att 
minska med hälften i en kammare. Den refererar normalt till plasmakoncentratio ­
nen av testkemikalien i hela kroppen.  
Induktion/enzyminduktion : Enzymsyntes som svar på en miljömässig stimu ­
lans eller en inducermolekyl.  
Linjäritet/linjär kinetik : En process är linjär med avseende på kinetik när alla 
överföringshastigheter mellan kammare står i proportion till de mängder eller 
koncentrationer som är närvarande dvs. första ordningen. Följaktligen är 
nedbrytnings- och distributionsvolymerna konstanta såväl som halveringstiderna. De uppnådda koncentrationerna är proportionella med doseringshastigheten (ex ­
ponering), och ackumuleringen är lättare förutsägbar. Linjäritet/icke-linjäritet kan 
bedömas genom att jämföra relevanta parametrar t.ex. AUC efter olika doser eller 
efter engångsexponering och upprepad exponering. Avsaknad av dosberoende kan vara tecken på mättnad av enzymer involverade i metabolismen i föreningen, en ökning av AUC efter upprepad exponering jämfört med engångsexponering 
kan vara tecken på inhibering av metabolismen, och en minskning av AUC kan 
vara en indikation på induktion av metabolismen (se även (11))  
Massbalans : Redovisning av när testkemikalien inträder i och lämnar systemet.
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 544
 
Materialbalans : Se massbalans.  
Toxicitetsmekanism (sätt)/verkningsmekanism (sätt) : Verkningsmekanism av ­
ser specifika biokemiska interaktioner genom vilka en testkemikalie alstrar dess 
effekt. Verkningssätt hänvisar till mer allmänna vägar som leder till en testkemi ­
kalies toxicitet.  
Metabolism : Synonymt med biotransformering.  
Metaboliter : Produkter av metabolism eller metaboliska processer.  
Oral absorption : Den procentuella andelen testkemikaliedos absorberad från 
administreringsstället (dvs. matspjälkningskanalen). Denna kritiska parameter kan användas för att förstå fraktionen av den administrerade testkemikalien 
som når portvenen och därefter levern.  
Partialkoefficient : Även känd som fördelningskoefficienten som är ett mått på 
den differentiella lösligheten av en kemikalie i två lösningsmedel.  
Toppblodnivåer (plasma/serum) : Maximal (toppvärde) blodkoncentration 
(plasma/serum) efter administrering (se även ”C
 max ”). 
Persistens (biopersistens) : Långsiktig närvaro av en kemikalie (i ett biologiskt 
system) på grund av resistens mot nedbrytning/eliminering.  
Jämförelse : Endpointinformation för en eller flera kemikalier används för att 
göra en förutsägelse av endpointen för målkemikalien.  
Receptormikroskopisk autoradiografi  (eller receptor-mikroautoradiografi): 
Denna teknik kan användas för att sondera xenobiotisk interaktion med specifika vävnadsställen eller cellpopulationer såsom exempelvis för receptorbindning eller 
specifika verkningssättstudier som kan kräva hög upplösning och hög känslighet, 
vilket kanske inte är möjligt med andra tekniker såsom helkropps-autoradiografi.  
Administreringsväg  (oral, intravenös, dermal, inhalation etc.): Avser de sätt 
vilka kemikalien administreras till kroppen (t.ex. oralt genom sondmatning, oralt 
genom foder, dermal, genom inhalation, intravenöst etc.).  
Mättnad : Tillstånd där en eller flera av de kinetiska processerna (t.ex. absorp ­
tion, metabolism eller nedbrytning) är vid ett maximum (läs ”mättad”).  
Sensitivitet : Möjligheten för en metod eller instrument att diskriminera mellan 
mätningsresponser som representerar olika nivåer av en variabel av intresse.  
Stationärt tillstånd för blodnivåer (plasma) : Icke-jämviktstillstånd för ett öp ­
pet system där alla krafter som verkar på systemet exakt balanseras av motsatta krafter, på ett sådant sätt att alla dess komponenter är stationära i koncentrationen 
även om materia flödar genom systemet.  
Systemmodellering  (fysiologiskt baserad toxikokinetik, farmakokinetiskt base ­
rad, fysiologiskt baserad farmakokinetisk, biologiskt baserad etc.): Abstrakt mo ­
dell som använder matematiskt språk för att beskriva ett systems beteende.  
Målvävnad : Vävnad i vilken en huvudsaklig skadlig effekt av ett gift manifis ­
teras.
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 545
 
Testkemikalie : Alla kemikalier eller blandningar som testas med denna test ­
metod.  
Vävnadsfördelning : Reversibel rörelse av en testkemikalie från en plats i krop ­
pen till en annan. Vävnadsfördelning kan studeras genom organdissekering, ho ­
mogenisering, förbränning och vätskescintillationsräkning eller genom kvalitativ och/eller kvantitativ helkropps-autoradiografi. Den förstnämnda är användbar för 
att uppnå koncentration och procentandel av återvinning från vävnader och åter ­
stående kropp av samma djur, men kan sakna upplösning för alla vävnader och kan ha mindre än idealisk total återvinning (< 90 %). Se definition av den senare ovan.  
T
 max : Tid för att nå C  max . 
Toxikokinetik  (farmakokinetik): Studie av absorptionen, distributionen, metabo ­
lismen och exkretionen av kemikalier över tiden.  
Validering av modeller : Processen för att bedöma lämpligheten av en modell 
för att konsekvent beskriva tillgängliga toxikokinetiska data. Modellerna kan utvärderas via statistisk och visuell jämförelse av modellprognoser med experi ­
mentella värden mot en gemensam oberoende variabel (t.ex. tid). Omfattningen 
av utvärderingen bör motiveras i förhållande till den avsedda användningen av modellen.
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 546
 
B.37  FÖRDRÖJD NEUROTOXICITET ORSAKAD AV ORGANISKA 
FOSFORFÖRENINGAR TILL FÖLJD AV AKUT EXPONERING  
1. METOD  
1.1 INLEDNING 
Vid bedömning och utvärdering av ämnens toxiska effekter är det 
viktigt att beakta potentialen hos substanser i vissa ämnesgrupper att framkalla specifika typer av neurotoxicitet som kanske inte upptäcks vid andra toxicitetsundersökningar. Det har observerats att vissa or ­
ganiska fosforföreningar framkallar fördröjd neurotoxicitet och dessa 
ska beaktas för eventuell utvärdering. 
Screening-tester  in vitro  får tillämpas för att identifiera de ämnen 
som kan framkalla fördröjd polyneuropati; negativa resultat från  in 
vitro -undersökningar bevisar dock inte att testsubstansen inte skulle 
vara neurotoxisk. 
Se Allmän inledning, del B.
 
1.2 DEFINITIONER  
Organiska fosforföreningar  omfattar icke joniserande organiska fos ­
forestar, tioestrar eller anhydrider av organofosfor-, organofosforo- 
eller organofosforamidsyror eller av besläktade fosfonthio-, fosfort ­
hio- eller fosforthioamidsyror eller andra ämnen som kan framkalla sådan fördröjd neurotoxicitet som ibland observeras i denna ämnes ­
grupp.  
Fördröjd neurotoxicitet  är ett syndrom som förknippas med förlängd 
fördröjd debut för ataxi, distala axonopatier i ryggmärgen och peri ­
fera nerver samt hämmande och åldrande av neurotoxiskt esteras (NTE) i nervvävnad.
 
1.3 REFERENSÄMNEN 
Ett referensämne ska testas i en positiv kontrollgrupp för att påvisa 
att den testade artens respons inte ändras väsentligt under försöks ­
förhållandena i laboratoriet. 
Ett exempel på en mycket använd neurotoxisk substans är trio-tolyl ­
fosfat (CAS 78-30-8, EINECS 201-103-5, CAS-namn: fosforsyra, 
tris(2-metyl-fenyl)ester), även kallad tris-o-kresylfosfat.  
1.4 PRINCIP FÖR TESTMETODEN 
Testsubstansen tillförs oralt i en enda dos till tamhöns som i till ­
lämpliga fall skyddats från akuta kolinerga effekter. Djuren observe ­
ras under 21 dagar i fråga om beteendestörningar, ataxi och förlam ­
ning. Biokemiska mätningar, särskilt inhibition av neurotoxiskt es ­
teras (NTE) utförs på höns som väljs slumpvis ur varje grupp, nor ­
malt 24–48 timmar efter doseringen. 21 dagar efter exponeringen 
avlivas resterande höns och en histopatologisk undersökning av 
valda nervvävnader genomförs.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 547
 
1.5 BESKRIVNING AV TESTMETODEN  
1.5.1  Förberedelse  
Friska unga vuxna höns som inte får medicin och som inte har 
virussjukdomar eller gångdefekter ska väljas slumpmässigt till be ­
handlings- respektive kontrollgrupper och acklimatiseras till labora ­
torieförhållandena under minst fem dagar före undersökningens skalljan. 
Burar eller inhängnader som är stora nog att ge hönsen fri rörlighet 
och som underlättar observation av hönsens gång ska användas. 
Dosering av testsubstansen ska normalt ske oralt genom sondmat ­
ning, gelatinkapslar eller motsvarande metod. Vätska kan ges out ­
spädd eller löst i en lämplig vehikel som majsolja; fasta ämnen ska 
om möjligt lösas eftersom stora doser fasta ämnen i gelatinkapslar 
kanske inte kan absorberas effektivt. I fråga om icke-flytande vehik ­
lar ska vehikelns toxiska egenskaper vara kända; i annat fall ska de bestämmas före försöket.
 
1.5.2  Försöksförhållanden  
1.5.2.1  Försöksdjur  
Unga vuxna värphöns  (Gallus gallus domesticus)  i åldern 
8–12 månader rekommenderas. Standardstora arter och stammar ska användas och hönsen ska normalt ha fötts upp under sådana förhållanden att de kunnat röra sig fritt.
 
1.5.2.2  Antal och kön  
Utöver behandlingsgruppen ska både en vehikelkontrollgrupp och en 
positiv kontrollgrupp användas. Vehikelkotrollgruppen ska behandlas 
på samma sätt som behandlingsgruppen med undantag för att till ­
försel av testsubstansen utesluts. 
Tillräckligt många höns ska användas i varje grupp för att minst sex 
fåglar ska kunna avlivas för biokemisk bestämning (tre stycken vid 
vardera av två tidpunkter) och sex överleva observationsperioden på 21 dagar för patologisk undersökning. 
Den positiva kontrollgruppen kan hållas parallellt eller vara en ak ­
tuell historisk kontrollgrupp. Den ska omfatta minst sex höns som 
behandlats med ett välkänt neurotoxiskt ämne som ger fördröjd po ­
lyneuropati, tre för biokemisk och tre för patologisk undersökning. Regelbunden uppdatering av historiska data rekommenderas. Nya positiva kontrolldata ska tas fram om någon viktig komponent (t.ex. 
stam, foder, förvaringsutrymmen) har ändrats av det berörda labora ­
toriet efter det att det tidigare försöket genomfördes.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 548
 
1.5.2.3  Dosnivåer  
En preliminär undersökning med ett lämpligt antal höns och dos ­
nivågrupper ska utföras för att fastställa vilken nivå som ska använ ­
das i huvudundersökningen. En viss dödlighet i den preliminära 
undersökningen är nödvändig för att fastställa en tillräcklig dos för 
huvudundersökningen. För att förhindra dödsfall beroende på akuta kolinerga effekter får atropin eller något annat skyddsämne, om vil ­
ket det är känt att det inte påverkar fördröjda neurotoxiska responser, 
användas. En variation av testmetoder får användas för att beräkna 
den maximala icke-dödliga dosen av testsubstans (se metod B.l a). 
Historiska data om hönsen eller annan toxikologisk information kan 
också vara till hjälp vid valet av dos. 
Testsubstansens dosnivå i huvudundersökningen ska vara den högsta 
möjliga med beaktande av resultaten från den preliminära undere ­
ökningen för dosval och den övre dosgränsen på 2 000 mg/kg kroppsvikt. Eventuella dödsfall ska inte vara fler än att tillräckligt 
många djur överlever för biokemi (sex stycken) och histologi (sex 
stycken) efter 21 dagar. Atropin eller andra skyddsämnen, om vilka det är känt att de inte påverkar fördröjda neurotoxiska responser, ska användas för att förhindra dödsfall till följd av akuta kolinerga effekter.
 
1.5.2.4  ”Limit-test”  
Om ett test vid en dosnivå på minst 2 000 mg/kg kroppsvikt och 
dag, med användning av de förfaranden som beskrivs för denna 
metod, inte framkallar några observerbara toxiska effekter och om toxicitet inte är att förvänta på grundval av data från strukturellt besläktade ämnen, kan en undersökning med användning av en 
högre dos anses överflödig. ”Limit-test” är tillämpligt, med undantag 
för om exponering på människor påvisar ett behov av att använda en högre dosnivå.
 
1.5.2.5  Observationsperiod  
Observationsperioden ska vara 21 dagar.  
1.5.3  Förfarande  
Efter tillförsel av ett skyddsämne för att förhindra dödsfall till följd 
av akuta kolinerga effekter tillförs testsubstansen som engångsdos.  
1.5.3.1 Allmänna observationer 
Observationerna ska påskalljas direkt efter exponeringen. Samtliga 
höns ska observeras noggrant flera gånger under de första två da ­
garna och därefter minst en gång dagligen under en period på 21 
dagar eller fram till planerad avlivning. Alla tecken på toxicitet ska noteras, inbegripet tid för beteendestörningarnas debut, deras typ, allvar och duration. Ataxi ska mätas enligt en ordningsskala pä minst 
fyra nivåer, och förlamning ska noteras. Minst två gånger per vecka 
ska de höns som valts ut för patologiska undersökningar tas ut från burarna och underkastas en period av påtvingad motorisk aktivitet, t.ex. klättring på stege, för att underlätta observation av minimala 
toxiska effekter. Döende djur och djur som lider av svår smärta ska 
tas bort när detta upptäcks, avlivas skonsamt och obduceras.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 549
 
1.5.3.2 Kroppsvikt 
Samtliga höns ska vägas just före tillförseln av testsubstansen och 
därefter minst en gång i veckan.  
1.5.3.3 Biokemi 
Sex höns väljs slumpvis från var och en av behandlings- respektive 
vehikelkontrollgrupperna och tre höns från den positiva kontrollgrup ­
pen (om denna grupp hålls parallellt.) Hönsen ska avlivas några dagar efter dosering, och hjärnan och lumbala delar av ryggmärgen 
prepareras och testas i fråga om inhibition av neurotoxiskt esteras. 
Därutöver kan det också vara lämpligt att preparera och testa ischias ­
nerwävnad i fråga om inhibition av neurotoxiskt esteras. Normalt ska tre fåglar från kontrollgruppen och varje behandlingsgrupp avlivas 
efter 24 timmar och tre efter 48 timmar, medan de tre hönsen från de 
positiva kontrollgrupperna ska avlivas efter 24 timmar. Om eventu ­
ella kliniska tecken på förgiftning (detta kan ofta bedömas genom observation vid debuten på kolinerga svar) indikerar att det toxiska 
ämnet kan tas upp mycket långsamt är det bättre att ta vävnadsprov 
från tre fåglar vid vardera av två tidpunkter mellan 24 och så sent som 72 timmar efter dosering. 
Om det bedöms lämpligt kan även analyser av acetylkolinesteras 
(AChE) utföras på dessa prover. Spontan reaktivering av AChE kan dock uppträda  in vivo  och därmed leda till en underskattning 
av ämnets potential som AChE-hämmare.
 
1.5.3.4 Obduktion 
Obduktion av samtliga djur (avlivade enligt planen och döende djur 
som avlivats) ska omfatta observation av hjärnans och ryggmärgens utseende.
 
1.5.3.5 Histopatologisk undersökning 
Nervvävnad från djur som överlevt observationsperioden och som 
inte används för biokemiska undersökningar ska underkastas mikro ­
skopisk undersökning. Vävnaderna ska fixeras  in situ  med använd ­
ning av perfusionsteknik. Snitten ska omfatta lillhjärnan (longitudi ­
ellt, medialt), förlängda märgen, ryggmärgen och perifera nerver. Ryggradssnitten ska tas från halsområdet, mitten av brösthålan och det lumbosakrala området. Snitt från tibialnervens distala region och 
dess förgreningar till  musculus gastrocnemius  och ischiasnerven ska 
tas. Snitten ska färgas med lämplig myelin- och axonspecifik färg.
 
2. DATA  
Negativa resultat i fråga om de sluteffekter som valts för denna 
metod (biokemi, histopatologi och beteendeobservationer) skulle nor ­
malt inte kräva ytterligare tester av fördröjd neurotoxicitet. Tvetydiga 
eller oklara resultat i fråga om dessa sluteffekter kan komma att kräva ytterligare utvärdering. 
Individuella data ska anges. Därutöver ska alla data sammanfattas i 
tabellform som för varje testgrupp visar antalet djur vid försökets skalljan, antalet djur som uppvisar skador, beteendeeffekter eller bio ­
kemiska effekter, typen och allvaret av dessa skador eller effekter 
och procentandelen djur som uppvisar respektive typ och grad av 
allvar av skada eller effekt.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 550
 
Resultaten av denna undersökningen ska utvärderas i fråga om för ­
delning, allvar och korrelation mellan beteendeeffekter, biokemiska 
och histopatologiska effekter och eventuellt andra observerade effek ­
ter i behandlings- och kontrollgrupperna. 
Numeriska resultat ska utvärderas genom lämpliga och allmänt er ­
kända statistiska metoder. De statistiska metoder som används ska 
väljas vid utformandet av undersökningen.  
3. RAPPORTERING  
FÖRSÖKSRAPPORT 
Försöksrapporten ska om möjligt innehålla följande uppgifter: 
Försöksdjur 
— Använd stam. 
— Antal djur och deras ålder. — Källa, förvaringsförhållanden etc. — Djurens individuella vikt vid försökets skalljan. Försöksförbållanden: — Uppgifter om testsubstansen, stabilitet och homogenitet i tillämp ­
liga fall. 
— Motivering av val av vehikel. — Uppgifter om tillförseln av testsubstansen. 
— Uppgifter om foder- och vattenkvalitet. 
— Grund för val av dos. — Specifikation av tillförda doser, inbegripet uppgifter om vehikel, 
volym och det tillförda mate rialets fysiska form. 
— Benämning på och uppgifter om tillförsel av eventuellt skydds ­
ämne. 
Resultat: 
— Uppgifter om kroppsvikt. — Uppgifter om toxisk respons per grupp, inbegripet dödsfall. — De kliniska observationernas art, allvar och duration (reversibili ­
tet ska anges). 
— En detaljerad redogörelse för biokemiska metoder och resultat. — Obduktionsresultat. — En detaljerad redogörelse för alla histopatologiska resultat. — Statistisk bearbetning av resultat i tillämpliga fall. 
Diskussion om resultaten. 
Slutsatser.
 
4. HÄNVISNINGAR  
Denna metod motsvarar OECD TG 418.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 551
 
B.38  FÖRDRÖJD NEUROTOXICITET ORSAKAD AV ORGANISKA 
FOSFORFÖRENINGAR 28 DAGARS UPPREPAD 
DOSUNDERSÖKNING  
1. METOD  
1.1 INLEDNING 
Vid bedömning och utvärdering av ämnens toxiska effekter är det 
viktigt att beakta potentialen hos substanser inom vissa ämnesgrup ­
per att framkalla vissa typer av neurotoxicitet som kanske inte upp ­
täcks vid andra toxicitetsundersökningar. Det har observerats att 
vissa organiska fosforföreningar framkallar fördröjd neurotoxicitet och dessa ska beaktas för eventuell utvärdering. 
Screening-tester  in vitro  får tillämpas för att identifiera de ämnen 
som kan framkalla fördröjd polyneuropati; negativa resultat från  in 
vitro -undersökningar bevisar dock inte att testsubstansen inte skulle 
vara neurotoxisk. 
Denna 28 dagars undersökning av fördröjd neurotoxicitet ger infor ­
mation om de tänkbara hälsorisker som troligen uppstår till följd av 
upprepad exponering under en begränsad tidsperiod. Den ger infor ­
mation om dosrespons och kan ge en beräkning av en NOAEL-nivå som kan vara användbar för att fastställa säkerhetsföreskrifter om exponering. 
Se även Allmän inledning, del B.
 
1.2 DEFINITIONER  
Organiska fosforföreningar  omfattar icke joniserande organiska fos ­
forestrar, tioestrar eller anhydnder av organofosfor-, organofosforo- 
eller organofosforamidsyror eller av besläktade fosfonthio-, fosfort ­
hio- eller fosforthioamidsyror eller andra ämnen som kan framkalla sådan fördröjd neurotoxitet som ibland observeras i denna ämnes ­
grupp.  
Fördröjd neurotoxicitet  är ett syndrom som förknippas med förlängd 
fördröjd debut för ataxi, di-stala axonopatier i ryggmärgen och peri ­
fera nerver samt hämmande och åldrande av neurotoxiskt esteras (NTE) i nervvävnad.
 
1.3 PRINCIP FÖR TESTMETODEN 
Testsubstansen tillförs dagligen oralt till tamhöns under 28 dagar. 
Djuren observeras minst en gång dagligen i fråga om beteendestör ­
ningar, ataxi och förlamning till dess det gått 14 dagar efter den sista 
dosen. Biokemiska mätningar, särskilt inhibition av neurotoxiskt es ­
teras (NTE) utförs på höns som väljs slumpvis ur varje grupp, nor ­
malt 24 – 48 timmar efter doseringen. Två veckor efter den sista 
dosen avlivas resterande höns och en histopatologisk undersökning 
av valda neuralvävnader genomförs.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 552
 
1.4 BESKRIVNING AV TESTMETODEN  
1.4.1  Förberedelser  
Friska unga vuxna höns som inte får medicin och som inte har 
virussjukdomar eller gångdefekter ska väljas slumpmässigt till be ­
handlings- respektive kontrollgrupper och acklimatiseras till labora ­
torieförhållandena under minst fem dagar före undersökningens skalljan. 
Burar eller inhängnader som är stora nog att ge hönsen fri rörlighet 
och som underlättar observation av hönsens gång ska användas. 
Oral dosering ska ske dagligen sju dagar i veckan, helst genom 
sondmatning eller tillförsel av gelatinkapslar. Vätska kan ges out ­
spädd eller löst i en lämplig vehikel som majsolja; fasta ämnen ska 
om möjligt lösas eftersom stora doser fasta ämnen i gelatinkapslar 
kanske inte kan absorberas effektivt. I fråga om icke-flytande vehik ­
lar ska vehikelns toxiska egenskaper vara kända; i annat fall ska de bestämmas före försöket.
 
1.4.2  Försöksförhållanden  
1.4.2.1  Försöksdjur  
Unga vuxna värphöns  (Gallus gallus domesticus)  i åldern 8 – 
12 månader rekommenderas. Standardstora arter och stammar ska användas och hönsen ska normalt ha fötts upp under sådana förhål ­
landen att de kunnat röra sig fritt.
 
1.4.2.2  Antal och kön  
Vanligen bör minst tre behandlingsgrupper och en vehikelkontroll ­
grupp användas. Vehikelkontrollgruppen ska behandlas på samma sätt som behandlingsgruppen med undantag för att tillförsel av test ­
substansen utesluts. 
Tillräckligt många höns ska användas i varje grupp för att minst sex 
fåglar ska kunna avlivas för biokemisk bestämning (tre stycken vid vardera två tidpunkter) och sex överleva en 14 dagar lång observa ­
tionsperiod efter behandlingen för patologisk undersökning.
 
1.4.2.3  Dosnivåer  
Dosnivåerna ska väljas med beaktande av resultaten från ett akut test 
av fördröjd neurotoxicitet eller andra befintliga toxicitets- eller kine ­
tiska data som finns tillgängliga i fråga om testsubstansen. Den högsta dosnivån ska väljas i syfte att inducera toxiska effekter, helst fördröjd toxicitet, men inte dödsfall eller svårt lidande. Därefter ska 
dosnivåer fastställas i en fallande skala i syfte att påvisa eventuella 
dos-responssamband och NOAEI. vid den lägsta dosnivån.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 553
 
1.4.2.4  ”Limit-test”  
Om ett test vid en dosnivå på minst 1 000 mg/kg kroppsvikt och 
dag, med användning av de förfaranden som beskrivs för denna undersökning, inte framkallar några observerbara toxiska effekter 
och om toxicitet inte är att förvänta på grundval av data om struk ­
turellt besläktade ämnen kan en undersökning med en högre dos anses överflödig. ”Limit-test” är tillämpligt, med undantag för om exponering på människor indikerar att det finns behov av att använda 
en högre dosnivå.
 
1.4.2.5  Observationsperiod  
Samtliga djur ska observeras minst en gång dagligen under expone ­
ringsperioden och därefter under 14 dagar, med undantag för plane ­
rad dissektion.  
1.4.3  Förfarande  
Djuren doseras med testsubstansen sju dagar i veckan under en 
period på 28 dagar.  
1.4.3.1  Allmänna observationer  
Observationerna ska påskalljas direkt efter exponeringen. Samtliga 
höns ska observeras minst en gång dagligen under de 28 behand ­
lingsdagarna och under minst 14 dagar efter dosering eller fram till planerad avlivning. Alla tecken på toxicitet ska noteras, inbegripet tid för beteendestörningarnas debut, deras typ, allvar och duration. 
Observationerna ska omfatta, men inte begränsas till, beteendeavvi ­
kelser. Ataxi ska mätas enligt en ordningsskala på minst fyra nivåer, och förlamning ska noteras. Minst två gånger per vecka ska hönsen tas ut från burarna och underkastas en period av påtvingad motorisk 
aktivitet, t.ex. klättring på stege, för att underlätta observation av 
minimala toxiska effekter. Döende djur och djur som lider av svår smärta ska tas bort när detta upptäcks, avlivas skonsamt och obdu ­
ceras.
 
1.4.3.2  Kroppsvikt  
Samtliga höns ska vägas just före tillförseln av testsubstansen och 
därefter minst en gång i veckan.  
1.4.3.3  Biokemi  
Sex höns väljs slumpvis från var och en av behandlings- respektive 
vehikelkontrollgrupperna och avlivas några dagar efter doseringen, 
och hjärnan och lumbala delar av ryggmärgen prepareras och testas i 
fråga om inhibition av neurotoxiskt esteras. Därutöver kan det också vara lämpligt att preparera och testa ischiasnervvävnad i fråga om inhibition av neurotoxiskt esteras. Normalt ska tre fåglar från kon ­
trollgruppen och var och en av behandlingsgrupperna avlivas efter 24 
timmar och tre 48 timmar efter den sista doseringen. Om data från den akuta undersökningen eller andra undersökningar (t.ex. toxiko ­
kinetik) indikerar att andra tidpunkter för avlivning är att föredra 
efter slutdosering så ska dessa tidpunkter tillämpas och grunden 
för detta dokumenteras. 
Om det bedöms lämpligt kan även analyser av acetylkolinesteras 
(AChE) utföras på dessa prover. Spontan reaktivering av AChE 
kan dock uppträda  in vivo  och därmed leda till en underskattning 
av ämnets potential som AChE-hämmare.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 554
 
1.4.3.4  Obduktion  
Obduktion av samtliga djur (avlivade enligt planen och döende djur 
som avlivats) ska omfatta observation av hjärnans och ryggmärgens utseende.
 
1.4.3.5  Histopatologisk undersökning  
Nervvävnad från djur som överlevt observationsperioden och som 
inte används för biokemiska undersökningar ska underkastas mikro ­
skopisk undersökning. Vävnaderna ska fixeras  in situ  med använd ­
ning av perfusionsteknik. Snitten ska omfatta lillhjärnan (longitudi ­
ellt, medialt), förlängda märgen, ryggmärgen och perifera nerver. Ryggradssnitten ska tas från halsområdet, mitten av brösthålan och 
det lumbosakrala området. Snitt från tibialnervens distala region och 
dess förgreningar till  musculus gastrocnemius  och ischiasnerven ska 
tas. Snitten ska färgas med lämplig myelin- och axonspecifik färg. Inledningsvis ska mikroskopundersökning utföras på de bevarade 
vävnaderna av samtliga djur i kontroll- respektive högdosgruppen. 
Om det finns bevis på effekter i högdosgruppen ska mikroskop ­
undersökning även utföras på hönsen från mellan- och lågdos-grup ­
perna.
 
2. DATA  
Negativa resultat i fråga om de sluteffekter som valts för denna 
metod (biokemi, histopatologi och beteendeobservationer) skulle nor ­
malt inte kräva ytterligare tester av fördröjd neurotoxicitet. Tvetydiga 
eller oklara resultat i fråga om dessa sluteffekter kan komma att kräva ytterligare utvärdering. 
Individuella data ska anges. Därutöver ska alla data sammanfattas i 
tabellform som för varje testgrupp visar antalet djur vid försökets skalljan, antalet djur som uppvisar skador, beteendeeffek-tcr eller 
biokemiska effekter, typen och allvaret av dessa skador eller effekter 
och procentandelen djur som uppvisar respektive typ och grad av allvar av skada eller effekt. 
Resultaten av denna undersökning ska utvärderas i fråga om fördel ­
ning, allvar och korrelation mellan beteendeeffekter, biokemiska och histopatologiska effekter och eventuellt andra observerade effekter i 
behandlings- och kontrollgrupperna. 
Numeriska resultat ska utvärderas genom lämpliga och allmänt er ­
kända statistiska metoder. De statistiska metoder som används ska 
väljas vid utformandet av undersökningen.
 
3. RAPPORTERING  
FÖRSÖKSRAPPORT 
Försöksrapporten skal! om möjligt innehålla följande uppgifter: 
Försöksdjur — Använd stam. 
— Antal djur och deras ålder. 
— Källa, förvaringsförhållanden etc. — Djurens individuella vikt vid försökets skalljan.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 555
 
Försöksförhållanden: 
— Uppgifter om testsubstansen, stabilitet och homogenitet i tillämp ­
liga fall. 
— Motivering för val av vehikel. — Uppgifter om tillförseln av testsubstansen. — Uppgifter om foder- och vattenkvalitet. — Grund för val av dos. — Specifikation av tillförda doser, inbegripet uppgifter om vehikel, 
volym och det tillförda mate rialets fysiska form. 
— Grund för att välja andra tidpunkter för biokemisk bestämning 
om de inte motsvarar 24 re spektive 48 timmar. 
Resultat: — Uppgifter om kroppsvikt. — Uppgifter om toxisk respons per grupp, inbegripet dödsfall. — Nivå för no-observed adverse effect. — De kliniska observationernas art, allvar och duration (reversibili ­
tet ska anges). 
— En detaljerad redogörelse för biokemiska metoder och resultat. 
— Obduktionsresultat. 
— En detaljerad redogörelse för alla histopatologiska resultat. — Statistisk bearbetning av resultat i tillämpliga fall. Diskussion om resultaten. Slutsatser.
 
HÄNVISNINGAR  
Denna metod motsvarar OECD TG 419.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 556
 
B.39  TEST AV REPARATIONSSYNTES (UDS) HOS LEVERCELLER 
FRÅN DÄGGDJUR IN-VIVO  
1. METOD  
Denna metod är en kopia av testet OECD TG 486, Test av reparations ­
syntes (UDS) hos leverceller från däggdjur  in vivo  (Unscheduled DNA 
Synthesys (UDS) Test with Mammalian Liver Celler  in Vivo  (1997)).  
1.1 INLEDNING 
Ändamålet med testet av reparationssyntes (UDS) hos leverceller från 
däggdjur in  vivo  är att identifiera testsubstanscr som inducerar DNA- 
reparation i leverceller från behandlade försöksdjur (se (1) (2) (3) (4). 
Detta in vivo-test erbjuder en metod för undersökning av genotox ­
iska effekter av kemikaler i levern. Slutpunktsmätning är indikativt för DNA-skador och påföljande reparation i leverceller. Levern är 
vanligen det huvudsakliga sätet för metabolismen av absorberade 
ämnen. Det är således ett lämpligt säte för att mäta DNA-skador  
in vivo.  
Om det finns bevis för att testsubstansen inte kommer att nå målväv ­
naden är det inte lämpligt att använda detta test. 
Reparationssyntesens slutpunkt mäts genom att bestämma upptaget 
av märkta nukleosider i celler som inte undergår reguljär DNA syn ­
tes (S-fas). Den teknik som är den mest använda är bestämning av upptag av triti-ummärkt tymidin (H-TdR) med hjälp av autoradio ­
grafi. Råttlever används med fördel för UDS-tester  in vivo.  Andra 
vävnader än lever kan användas, men omfattas inte av denna metod. 
Detektionen av ett UDS-svar är beroende av antalet DNA-baser som 
”klipps bort” och byts ut vid platsen för skadan. UDS-testet är därför 
särskilt värdefullt för att detektera substansinducerad ”longpatch”- 
reparation (20–30 baser). ”Shortpatch”-reparation (1–3 baser) detek ­
teras däremot med mycket lägre känslighet. Vidare kan mutagena händelser inträffa på grund av utebliven reparation, felreparation eller 
felreplikation av DNA-skador. Omfattningen av UDS-svaret ger 
ingen indikation på noggrannheten i reparationsprocessen. Dessutom är det möjligt att ett mutagen reagerar med DNA men att DNA- 
skadan inte repareras via en reparationsprocess där DNA-baser ”k ­
lipps bort” och byts ut. Bristen på specifik information rörande mu ­
tagen aktivitet, erhållen genom UDS-testet, kompenseras för genom dess potentiella känslighet, eftersom den mäts i hela genomet. 
Se även Allmän inledning, del B.
 
1.2 DEFINITIONER  
celler som repareras:  ett nettoantal korn i kärnan (net nuclear grain, 
NNG) som är större än ett förvalt värde, vilket ska verifieras av det laboratorium som utför testet.  
nettoantal korn i kärnan (NNG):  kvantitativ mätning av UDS-akti ­
vitet hos celler i autoradiografiska UDS-tester, beräknade genom att 
subtrahera medelantalet av de cytoplasmiska kornen i kärnekviva ­
lenta cytoplasmiska områden (CG) från antalet korn i kärnan (nuclear grains, NG): NNG = NG-CG. NNG-räkningar beräknas för individu ­
ella celler och slås sedan samman för celler i en kultur, i parallella 
kulturer, etc.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 557
 
reparationssyntes (UDS):  DNA-reparationssyntes efter ’bortklipp ­
ning’ och avlägsnande av en DNA-sträng som innehåller ett avsnitt 
med skador inducerats av kemiska substanser eller fysiska ämnen. (UDS)
 
1.3 TESTMETODENS PRINCIP 
UDS-testet med leverceller från däggdjur  in vivo indikerar DNA- 
reparationssyntes efter ”bortklippning” och avlägsnande av en sträng 
med DNA innehållande ett avsnitt med skador, vilka inducerats av 
kemiska substanser eller fysiska ämnen. Testet baseras i vanliga fall på en inkorporering av
 3 H-TdR i DNA hos leverceller, vilka har en 
låg frekvens av celler som befinner sig i cellcykelns S-fas. Upptaget 
av 3 H-TdR bestäms vanligen genom autoradiografi. eftersom denna 
teknik inte ar sä mottaglig för interferens frän celler i S-fas som, t.ex. vätske-scintillationsräkning
 
1.4 BESKRIVNING AV METODEN  
1.4.1  Förberedelser  
1.4.1.1  Val av djurarter  
Vanligen används råttor men det går även bra att använda ett annat 
lämpligt däggdjur. Man bör välja de stammar av unga, friska vuxna försöksdjur som vanligen används på laboratorier. När undersök ­
ningen ska påbörjas, är det lämpligt att viktskillnaden mellan djuren 
är så liten möjligt och den bör inte överstiga ±20 % av medelvikten för varje kön.
 
1.4.1.2  Förhållanden vid förvaring och utfodring  
De generella förhållanden som anges i den Allmänna inledningen till 
del B gäller. Man bör dock sträva efter en relativ luftfuktighet på 
50–60 %.  
1.4.1.3  Förberedelse av djuren  
Friska, unga och vuxna försöksdjur väljs ut slumpartat för placering i 
kontroll- och behandlingsgrupperna. Burar bör arrangeras på ett så ­
dant sätt att möjliga effekter beroende på placeringen av burarna blir 
så små som möjligt. Djuren ska ha en unik identifiering och hållas i sina burar under minst fem dagar innan undersökningen börjar, för att göra det möjligt för dem att acklimatiseras till förhållandena i 
laboratoriet.
 
1.4.1.4  Berdninq av testsubstansen  
Testsubstanser i fast form bör lösas upp i eller blandas med lämpliga 
lösningsmedel eller vehiklar och spädas ut, om så är lämpligt, innan dosen administreras till försöksdjuren. Testsubstanser i flytande form 
kan doseras direkt eller så späds de ut före dosering. Nygjorda bered ­
ningar av testsubstansen bör användas om inte stabilitetsdata visar att lagring är acceptabelt.
 
1.4.2  Försöksbetingelser  
1.4.2.1  Lösningsmedel/vehikel  
Lölsningsmedlet/vehikeln bör inte ge upphov till toxiska effekter vid 
de dosnivåer som används och bör inte kunna misstänkas för att 
reagera kemiskt med testsubstansen. Om andra lösningsmedel/vehik ­
lar än gängse brukliga används, bör användningen av dem ha stöd från data som visar på deras kompatibilitet. När det är möjligt, re ­
kommenderas att man i första hand överväger vattenbaserade lös ­
ningsmedel/vehiklar.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 558
 
1.4.2.2  Kontroller  
Samtidiga positiva och negativa kontroller (lösningsmedel/vehikel) 
bör ingå i varje oberoende utförd del av experimentet. Förutom vid behandling med testsubstansen, bör försöksdjuren i kontrollgrup ­
perna hanteras på ett identiskt sätt i förhållande till djuren i de 
grupper där behandling skett. 
Positiva kontroller bör utgöras av substanser som är kända för att ge 
UDS när de administreras vid exponeringsnivåer som kan förväntas att ge en detekterbar ökning jämfört med bakgrunden. Positiva kont ­
roller som kräver metabolisk aktivering bör användas vid doser som 
framkallar ett måttligt svar (4). Doserna kan väljas på ett sådant sätt att effekterna är tydliga men att de inte omedelbart avslöjar identi ­
teten hos kokade utstryksglas för läsaren. I tabellen nedan ges några 
exempel på positiva kontrollsubstanser.
 
Tider for provtagning Substans CA S-nummer EINECS-nummer  
Tidiga provtagningstider (2–4 tim.) N-Nitrosodimethylamin 62-75-9 200-249-8 
Sena provtagningstider (12–16 
tim.) N-2-Fluorenylacetamid (2-AAF) 53-96-3 200-188-6 
Andra lämpliga positiva kontrollsubstanser kan används. Det är ac ­
ceptabelt att den positiva kontrollen administreras via en annan till ­
förselväg än testsubstansen.  
1.5 FÖRFARANDE  
1.5.1  Försökdjurens antal och kön  
Ett lämpligt antal försöksdjur bör användas, för att man ska kunna ta 
hänsyn till den naturliga biologiska variationen hos testresultaten. 
Antalet försöksdjur bör utgöras av minst tre analyserbara försöksdjur per grupp. Där det finns en signifikant historiks databas som har ackumulerats, krävs det endast ett eller två försöksdjur för de sam ­
tidiga negativa och positiva kontrollgrupperna. 
Om det vid tiden för undersökningen visar sig att det finns data som 
är tillgängliga från undersökningar på samma stam och där samma tillförselväg för exponering har använts, samt att dessa visar att det inte finns några betydande skillnader i toxicitet mellan könen, kan 
testning på endast ett kön, helst på hanar, vara tillräckligt. I de fall 
där exponering av människa för kemikaler kan ge könsspecifika resultat, som t.ex. för vissa läkemedel, bör testet utföras med för ­
söksdjur av lämpligt kön.
 
1.5.2  Behandlingsschema  
Testsubstanser administreras i allmänhet i form av en enstaka be ­
handling.  
1.5.3  Dosnivåer  
Normalt används minst tvä olika dosnivåer. Den högsta dosen defi ­
nieras som dos vilken producerar tecken på toxicitet på ett sådant sätt att högre dosnivåer, baserade på en likadan doseringsregim, skulle 
förväntas leda till letalitet. 1 allmänhet bör den lägre dosen vara 
50 % till 25 % av den högre dosen.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 559
 
Substanser med specifika biologiska verkningar vid låga icke-toxiska 
doser (såsom hormoner och mitogena substanser) kan utgöra undan ­
tag med avseende pa de dosbestämmande kriterierna och bör utvär ­
deras från fall till fall. Om en undersökning för att bestämma inter ­
vallet utförs på grund av att det inte finns några lämpliga data till ­
gängliga, bör denna utföras i samma laboratorium, och där man 
använder samma arter, stammar, kön och behandlingsschema som i huvudundersökningen. 
Den högsta dosen kan även definieras som en dos vilken producerar 
en indikation på toxicitet i levern (t.ex. pyknotiska kärnor).
 
1.5.4  Limit-test  
En fullständig undersökning kan inte anses vara nödvändig om ett 
test på en dosnivå vid minst 2 000 mg/kg kroppsvikt och med en 
enstaka behandling, eller i form av två behandlingar under samma dag, inte ger upphov till observerbara toxiska effekter, och om ingen genotoxicitet kan förväntas utifrån data om strukturellt relaterade 
substanser. En förväntad exponering av människor kan visa på be ­
hovet av att en högre dosnivå används i ’limit-testen’.
 
1.5.5  Administrering av doser  
Testsubstansen administreras vanligen via sondmatning genom att 
använda en magsond eller en lämplig intubationskanyl. Andra till ­
förselvägar för exponering kan vara acceptabla, där de kan motive ­
ras. Den intraperitoneala vägen rekommenderas dock inte, eftersom 
den skulle kunna exponera levern direkt för testsubstansen snarare än via det cirkulatoriska systemet. Den maximala vätskevolymen som kan administreras genom sondmatning eller injektion vid ett tillfälle 
beror av försöksdjurets storlek. Volymen bör inte överskrida 
2 ml/100 g kroppsvikt. Användningen av större volymer måste mo ­
tiveras. Förutom när det gäller irriterande eller korro-.siva substanser, 
vilka normalt kommer att avslöja förvarade effekter vid högre kon ­
centrationer, bör variationer av testvolymen minimeras genom en justering av koncentrationen, så att konstant volym kan säkerställas vid alla dosnivåer.
 
1.5.6  Beredning av leverceller  
I normala fall bereds leverceller frän behandlade försöksdjur 12–16 
timmar efter dosering. Ytterligare en tidig provtagningstidpunkt (nor ­
malt 2–4 timmar efter behandlingen) är normalt nödvändig om inte det finns ett tydligt positivt svar efter 12–16 timmar. Alternativa provtagningstidpunkter kan används när det är motiverat utifrån tox ­
ikokinetiska data. 
Kortvariga kulturer med leverceller från däggdjur startas genom att 
skölja lever in situ med kollagenas och att låta nyligen dissocierade leverceller fästa sig på en lämplig yta. Leverceller från negativa kontrollförsöksdjur bör ha en viabilitet (5) på minst 50 %.
 
1.5.7  Bestämning av UDS  
Nyligen isolerade leverceller från däggdjur inkuberas normalt med 
ett medium som innehåller  3 H-TdR under en tid som är tillräckligt 
lång, t.ex. 3–8 timmar. När inkubationsperioden går mot sitt slut, bör mediet avlägsnas från cellerna, vilken sedan kan inkuberas i ett medium som innehåller ett överskott på omärkt tymidin för att för ­
svaga oinkorporerad radioaktivitet (’cold chase’). Cellerna tvättas 
sedan, fixeras och torkas. Vid längre inkubationstider, kan ’cold chase’ visa sig vara onödigt. Utstryksglas doppas sedan i en auto ­
radiografisk emulsion, exponeras i mörker (t.ex. nedkylda under 
7–14 dagar) framkallas och färgas in, varpå exponerade silverkorn 
sedan räknas. Två till tre utstryksglas bereds från varje försöksdjur.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 560
 
1.5.8  Analys  
Preparationerna av utstryksglas bör innehålla tillräckligt många celler 
med normal morfologi för att medge en meningsfull bestämning av UDS. Preparationer undersöks mikroskopiskt efter tecken på uppen ­
bar cytotoxicitct (t.ex. pyknos, reducerade nivåer av radioaktiv märk ­
ning). 
Utstryksglas bör kodas innan kornen räknas. Normalt påvisas 100 
celler från varje försöksdjur från minst två utstryksglas. om mindre än 100 celler/försöksdjur påvisas bör detta motiveras. Vid kornräk ­
ningar påvisas inte kärnor i S-fas, men proportionen av celler i S-fas 
kan registreras. 
Mängden av
 3 H-TdR som inkorporerats i kärnan och cytoplasman 
hos morfologiskt normala celler, som bevisats av upplagringen av 
silverkorn, bör bestämmas med hjälp av lämpliga metoder. 
Kornräkningar bestäms i kärnorna (nuclear grains, NG) och kärnek ­
vivalenta områden i cytoplasman (cytoplasmic grains, CG). CG-räk ­
ningar mäts genom att antingen ta det område av cytoplasman som har den mest omfattande märkningen, eller genom att ta ett medeltal av två eller tre slumpmässiga cytoplasmaräkningar nära kärnan. An ­
dra räknemetoder (t.ex. helcellsräkning) kan användas om de kan 
motiveras (6).
 
2. DATA  
2.1 BEHANDLING AV RESULTATEN 
Individuella utstryksglas och försöksdjursdata bör tas fram. Des ­
sutom bör alla data sammanfattas i tabellform. Räkningar av netto ­
antalet korn i kärnan (NNG) bör tas fram för varje cell, för varje försöksdjur och för varje dos och tid genom att subtrahera CG-räk ­
ningar från NG-räkningar. Om ’celler under reparation’ räknas in, 
bör kriterierna för definition av ’celler under reparation’ vara moti ­
verade och baserade på historiska eller samtidiga negativa kontroll ­
data. Numeriska resultat kan utvärderas utifrån statistiska metoder. 
Om statistiska tester används, bör de selekteras och motiveras innan 
undersökningen utförs.
 
2.2 UTVÄRDERING OCH TOLKNING AV RESULTATEN 
Exempel på kriterier för positiva/negativa svar innefattar: 
positiva i) NNG-värden över ett förvalt tröskelvärde som 
är motiverat på basis av historiska laboratorie ­
data 
eller ii) NNG-värden som är signifikant större än den 
samtidiga kontrollen 
negativa i) NNG-värden inom/under det historiska kon ­
trolltröskelvärdet 
eller ii) NNG-värden som inte är signifikant större än 
den samtidiga kontrollen  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 561
 
Den biologiska relevansen hos registrerade data bör uppmärksam ­
mas: d.v.s. parameter såsom variationer mellan olika försöksdjur, 
dos/respons-förhållanden och cytotoxicitetet bör också beaktas. Sta ­
tistiska metoder kan användas såsom en hjälp vid utvärderingen av testresultaten. Statistisk signifikans bör dock inte vara den enda fak ­
tor som bestämmer om resultatet är positivt. 
Även om de flesta experiment kommer att ge tydligt positiva eller 
negativa resultat, kan uppsättningen av data i sällsynta fall göra det 
omöjligt att utföra en otvetydig bedömning med avseende på test ­
substansens aktivitet. Resultatet kan förbli tvetydigt eller tveksamt, oavsett hur många gånger som experimentet upprepas. 
Ett positivt resultat från UDS-testet på leverceller från däggdjur  in 
vivo indikerar att testsubstansen inducerar DNA-skador i leverceller 
från däggdjur in vivo, vilka kan repareras av reparartionssyntes in 
vitro. Ett negativt resultat indikerar att testsubstansen, under försöks ­
betingelserna, inte inducerar skador på DNA som är detekterbara med hjälp av detta test. 
Sannolikheten för att testsubstansen eller dess metaboliter ska nå ut i 
det stora kretsloppet eller specifikt till målvävnaden (t.ex. systemisk 
toxicitet) bör diskuteras.
 
3. RAPPORTERING  
TESTRAPPORT 
Testrapporten måste innehålla följande information: 
Lösningsmedel/vehikel: — motivering för valet av vehikel — testsubstansens stabilitet och löslighet i lösningsmedel/vehikeln, 
om detta är känt 
Försöksdjur: 
— art/stam som används 
— försöksdjurens antal, ålder och kön — ursprung, förhållanden vid förvaring, diet, etc. — individuell vikt hos försöksdjuren vid försökets början, inklusive 
kroppsviktsintervallet, medelvärde och standardavvikelse för varje grupp 
Försöksbetingelser: — positiva och negativa kontroller (vehikel/lösningsmedel) — data från en undersökning av spännvidden, om en sådan har 
utförts 
— grund för valet av dosnivå 
— uppgifter om beredningen av testsubstansen 
— uppgifter om administreringen av testsubstansen — grund för det sätt administreringen sker på — metoder för att verifiera att testsubstansen nådde det stora krets ­
loppet eller målvävnaden, om detta är tilllämpbart
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 562
 
— omvandling från koncentration av testsubstansen i diet/dricksvat ­
ten (ppm) till den verkliga dosen (mg/kg kroppsvikt/dag), om 
detta är tillämpbart 
— uppgifter om fodrets och vattnets kvalitet — detaljerad beskrivning av behandlings- och provtagningsscheman — metoder för matning av toxicitet — metod för beredning och odling av leverceller — den autoradiografiska teknik som använts — antalet utstryksglas som preparerats och antalet celler som på ­
visats 
— kriterier för utvärdering 
— kriterier för att bedöma om undersökningarna är positiva, nega ­
tiva eller tvetydiga 
Resultat: — individuella utstryksglas, försöksdjurs- och gruppmedelvärden för 
antalet korn i kärnan, cytoplasmiska korn, och nettoantalet korn i 
kärnan (NNG) 
— dos/respons-förhållande, om detta är tillgängligt — statistisk utvärdering, om en sådan utförts — tecken på toxicitet — samtidiga negativa (lösningsmedel/vehikel) och positiva kontroll ­
data 
— historiska negativa och positiva kontrolldata (lösningsmedel/ve ­
hikel) med intervall, medelvärden och stan dardavvikelser 
— antalet ”celler under reparation”, om detta har fastställts 
— antalet celler i S-fas, om detta har bestämts 
— cellernas viabilitet Diskussion av resultaten. Slutsatser.
 
4. HÄNVISNINGAR  
1. Ashby, J., Lefevre, P. A., Burlison, B. and Penman, M. G. (1985). 
An Assessment of the In Vivo Rat Hepatocyte DNA Repair Assay.  
Mutation Res.,  156, s. 1–18. 
2. Buttervvorth, B. E., Ashby, J., Bermudez, E., Casciano, D., Mir ­
salis, J., Probst, G. and Williams, G. (1987). A Protocol and 
Guide for the In  Vivo  Rat Hepatocyte DNA-Repair Assay. Mu ­
tation  Res.,  189, s. 123–133. 
3. Kennelly, J. C, Waters, R., Ashby, J., Lefevre, P. A., Burlison, 
B., Benford, D. J., Dean, S. W. and Mitchell, I. de G. (1993). In 
Vivo Rat Liver UDS Assay, in Kirkland D. J. and Fox M., (eds)  
Supplementary Mutagenicity Tests: UKEM Recommended Pro ­
cedures. UKEMS Subcommitee on Guidelines for Mutagenicity Testing.  Report  Part II revised.  Cambridge University Press, 
Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney 
s. 52–77.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 563
 
4. Madle, S., Dean, S. W., Andrae, U., Brambilla, G., Burlinson, 
B., Doolittle, D. J., Furihata, C, Herner, T., McQueen, C. A. and 
Mori, H. (1993). Recommendations for the Performance of UDS Tests In Vitro and  In Vivo.  Mutation Res., 312, s. 263–285. 
5. Fautz, R., Hussain, B., Efstathiou, E. and Hechenberger-Freudl, 
C. (1993). Assesment of the Relation Between the Initial Viabi ­
lity and the Attachment of Freshly Isoladet Rat Hepatocytes Used 
for the  In Vivo/ln Vitro  DNA Repair Assay (UDS). Mutation 
Res., 291, s. 21–27. 
6. Mirsalis,). C, Tyson, C. K. and Butterworth, B. E. (1982). De ­
tection of Genotoxic Carcinogens in the  In Vivo/ln Vitro  Hepa­
tocyte DNA Repair Assay.  Environ. Mutagen,  4, s. 553–562.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 564
 
B.40  IN VITRO-TEST  AV HUDKORROSIVITET: BESTÄMNING AV 
TRANSKUTANT ELEKTRISKT MOTSTÅND (TER)  
1. METOD  
Denna testmetod motsvarar OECD TG 430 (2004).  
1.1 INLEDNING 
Hudkorrosivitet innebär att en irreversibel vävnadsskada uppstår i 
huden som en följd av att ett testmaterial [definierat enligt det in ­
ternationella systemet för klassificering och märkning av kemikalier (GHS)] (1) appliceras. Denna metod bygger på ett förfarande som innebär att testmaterialets hudkorrosivitet inte testas på levande djur. 
Bedömning av hudkorrosiviteten har normalt inneburit användning 
av försöksdjur (2). På grund av den smärta och det lidande som 
försöksdjuren utsätts för har översynen av testmetod B.4 gjorts på 
ett sådant sätt att bedömningen av hudkorrosiviteten går att göra med alternativa metoder  in vitro,  så att försöksdjur inte längre behöver 
användas. 
Ett första steg mot att definiera alternativa testmetoder som kunde 
användas för testning av hudkorrosiviteten var att genomföra förvali ­
deringsstudier (3). Efter detta gjordes en formell valideringsstudie (6)(7)(8) av  in vitro-metoder för att bedöma hudkorrosiviteten (4)(5). 
Utfallet av dessa studier sammantaget med annan publicerad litteratur 
ledde till rekommendationen att följande tester skulle användas för 
bedömning av hudkorrosiviteten  in vivo  (9)(10)(1 1): ett test där en 
modell av human hud används (se testmetod B.40b) och bestämning av transkutant elektriskt motstånd (denna metod). 
Från en valideringsstudie och andra publicerade studier rapporteras att 
prövningen av transkutant elektriskt motstånd (TER) på råtthud (12)(13) 
kan användas för en tillförlitlig särskiljning mellan ämnen som är kända för att vara hudkorrosiva och kända icke-korrosiva ämnen (5)(9). 
Testet enligt denna metod gör det möjligt att identifiera kemikalier och 
blandningar som är hudkorrosiva. Dessutom gör testet det möjligt att 
identifiera icke hudkorrosiva ämnen och blandningar med stöd av annan 
befintlig information (t.ex. pH, förhållandet mellan struktur och aktivitet, data som gäller människor och/eller djur) (1)(2)(11)(14). Testet ger ingen information om hudirritation, inte heller ger det möjlighet till den 
underklassificering som är möjlig enligt det internationella systemet 
för klassificering och märkning av kemikalier (GHS) (1). 
För en fullständig utvärdering av lokala hudeffekter efter en enda hud ­
exponering rekommenderas den sekventiella teststrategi som finns som tillägg till testmetod B.4 (2) och som anges i det internationella syste ­
met för klassificering och märkning (1). Denna teststrategi inbegriper  
in vitro-tester  av hudkorrosivitet (enligt den häri beskrivna metoden) 
och hudirritation innan tester på levande djur övervägs.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 565
 
1.2 DEFINITION  
Hudkorrosivitet  in vivo:  innebär att en irreversibel skada uppstår i 
huden, det vill säga synlig nekros genom epidermis och ner i dermis efter att ett testämne har applicerats och fått verka i upp till fyra 
timmar. Korrosiva reaktioner kännetecknas av sår, blödning, blodiga 
sårskorpor och i slutet av observationsperioden på 14 dagar av miss ­
färgning på grund av blekning av huden, håravfall på hela hudområ ­
den och ärrbildning. Histopatologi bör övervägas för att bedöma 
tveksamma skador.  
Transkutant elektriskt motstånd (TER):  är ett mått på hudens 
elektriska impedans, uttryckt i k Ω. Det är en enkel och robust metod 
för att bedöma hudens barriärfunktion genom att registrera jonflödet 
genom huden med en Wheatstonebrygga.
 
1.3 REFERENSÄMNEN  
Tabell 1  
Referenskemikalier  
Namn EINECS-nr CAS-nr  
1,2-Diaminopropan 201-155-9 78-90-0 Starkt korrosivt 
Akrylsyra 201-177-9 79-10-7 Starkt korrosivt 2-tert-butylfenol 201-807-2 88-18-6 Korrosivt 
Kaliumhydroxid (10 %) 215-181-3 1310-58-3 Korrosivt 
Svavelsyra (10 %) 231-639-5 7664-93-9 Korrosivt Oktansyra (kaprylsyra) 204-677-5 124-07-02 Korrosivt 
4-Amino-1,2,4-triazol 209-533-5 584-13-4 Icke-korrosivt 
Eugenol 202-589-1 97-53-0 Icke-korrosivt Fenetylbromid 203-130-8 103-63-9 Icke-korrosivt 
Tetrakloretylen 204-825-9 27-18-4 Icke-korrosivt 
Isostearinsyra 250-178-0 30399-84-9 Icke-korrosivt 4-(Metyltio)-bensaldehyd 222-365-7 3446-89-7 Icke-korrosivt 
De flesta av kemikalierna i förteckningen har tagits från den för ­
teckning över kemikalier som valdes för den internationella valide ­
ringsstudien ECVAM (4). Urvalet bygger på följande kriterier: 
i) Lika många korrosiva som icke-korrosiva ämnen.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 566
 
ii) Kommersiellt tillgängliga ämnen som täcker in de flesta rele ­
vanta kemiskalieklasser. 
iii) Medtagande av såväl starkt korrosiva som mindre korrosiva äm ­
nen för att göra det möjligt att särskilja ämnen på grundval av 
deras hudkorrosivitet. 
iv) Val av kemikalier som kan hanteras i ett laboratorium utan att 
utgöra någon annan allvarlig risk utöver hudkorrosiviteten.  
1.4 PRINCIPEN FÖR TESTMETODEN 
Testämnet appliceras och får verka i upp till 24 timmar på den 
epidermala ytan av hudbitar i ett testsystem med två kammare där hudbitarna fungerar som skiljemembran mellan kamrarna. Hudbi ­
tarna tas från humant avlivade, 28-30 dagar gamla råttor. Korrosivt 
material identifieras genom sin förmåga att framkalla skador på hu ­
dens hornlager och störningar i den normala barriärfunktionen, vilket kan fastställas som en sänkning av det transkutana elektriska mot ­
ståndet (TER) under ett tröskelvärde (12). För TER för råtthud har 
ett brytvärde på 5 k Ω valts, baserat på omfattande data för ett brett 
urval av kemikalier där den absoluta majoriteten av värden antingen låg klart över (ofta > 10 k Ω) eller klart under (ofta < 3 k Ω) detta 
värde (12). I allmänhet sänker material som inte har någon korrosiv 
verkan på djur inte TER under detta brytvärde, oavsett om de är hudirriterande eller inte. Vidare kan användning av andra hudbered ­
ningar eller annan utrustning ändra brytvärdet, vilket kräver ytterli ­
gare validering. 
Ett färgämnesbindningssteg ingår i testförfarandet för verifiering av 
positiva resultat vid TER-värden runt 5 k Ω. Färgämnesbindningsste ­
get visar om ökningen av jongenomsläpplighet beror på fysisk ned ­
brytning av hornlagret. TER-metoden med råtthud har visats ge för ­
utsägbarhet för korrosiv verkan  in vivo  på kanin, fastställd med 
testmetod B.4 (2). Det ska påpekas att  in vivo-kanintestet är mycket 
konservativt med avseende på hudkorrosiv verkan och hudirritation jämfört med lapptest på mänsklig hud (15).
 
1.5 BESKRIVNING AV TESTMETODEN  
1.5.1  Djur  
Råtta är den föredragna arten eftersom råttors hudkänslighet för ke ­
mikalier i detta test har visats tidigare (10). Åldern (då huden tas till 
vara) och råttstammen är av särskild betydelse för att säkerställa att 
hårsäckarna är i vilofas innan den vuxna hårtillväxten börjar.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 567
 
Rygg- och flankhår från unga, ungefär 22 dagar gamla han- eller 
honråttor (erhållna från Wistar eller en jämförbar stam) avlägsnas 
noggrant med en liten sax. Därefter tvättas djuren noga och torkas sedan omsorgsfullt medan det klippta området hålls ner i antibio ­
tikalösning (som innehåller t.ex. streptomycin, penicillin, kloramfe ­
nikol och amfotericin, i koncentrationer som hämmar bakterietill ­
växt). Djuren tvättas på nytt med antibiotika på tredje eller fjärde dagen efter den första tvätten och används inom 3 dagar från den andra tvätten, då hornlagret har återhämtat sig från hårborttagningen.
 
1.5.2  Beredning av hudbitar  
Djuren avlivas med en human metod när de är 28-30 dagar gamla. 
Åldern är av stor betydelse. Huden från rygg och flank från varje 
djur avlägsnas sedan och överflödet av underhudsfett skalas försiktigt 
bort från huden. Hudbitar med en diameter på ungefär 20 mm tas ut. Hudbitarna kan lagras innan de används om det kan visas att positiva och negativa kontrolldata är likvärdiga med dem som erhålls för 
färsk hud. 
Varje hudbit placeras över änden av ett PTFE-rör (polytetrafluoreten) 
så att överhuden är i kontakt med röret. En o-ring i gummi press ­
passas över rörets ände för att hålla huden på plats och överflödig vävnad putsas bort. Rörets och o-ringens mått visas i figur 2. O- 
ringen i gummi förseglas sedan till PTFE-rörets ände med vaselin. 
Röret fästs med en fjäderklämma i en kammare som innehåller MgSO
 4 -lösning (154 mM) (figur 1). Hudbiten ska vara helt nedsänkt 
i MgSO  4 -lösningen. Upp till 10–15 hudbitar kan erhållas från ett 
enda råttskinn. 
Innan testningen börjar mäts de båda hudbitarnas elektriska motstånd 
som ett kvalitetskontrollförfarande för varje djurhud. Båda bitarna 
ska ge värden för motståndet som är större än 10 k Ω för att åter ­
stoden av hudbitarna ska kunna användas för testet. Om motståndet är mindre än 10 k Ω ska återstående hudbitar från den aktuella huden 
kastas.
 
1.5.3  Applicering av test- och kontrollämnen  
Parallella positiva och negativa kontroller ska användas för varje 
studie för att säkerställa att försöksmodellen fungerar adekvat. Hud ­
bitar från ett enda djur ska användas. Förslag på ämnen för positiv och negativ kontroll är 10 M saltsyra respektive destillerat vatten. 
Testämnen i vätskeform (150 μl) appliceras på epidermisytan inuti 
röret. Vid testning av ämnen i fast form appliceras en tillräcklig 
mängd för att säkerställa att hela epidermisytan täcks. Därefter till ­
förs avjoniserat vatten (150 μl) på det fasta ämnet och röret omska ­
kas varsamt. Testämnet bör ha maximal kontakt med huden. För vissa fasta ämnen kan detta uppnås genom uppvärmning till 30
 o C 
så att testämnet smälter eller mjuknar. Alternativt kan ämnet finför ­
delas till granulat eller pulver.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 568
 
Varje testämne appliceras på tre hudbitar. Testämnet får verka i 24 
timmar vid 20-23  o C och avlägsnas därefter genom sköljning med 
kranvattenstråle (upp till 30  o C). Sköljningen bör pågå till dess att 
inget ämne längre fås bort.  
1.5.4  TER-mätningar  
Hudens elektriska impedans uttryckt som transkutant elektriskt mot ­
stånd, TER, mäts med hjälp av växelström med låg spänning med en 
Wheatstonebrygga (13). Allmänna tekniska data för bryggan är 1–3 V driftspänning, en sinusformad eller rektangulär växelström på 50–1 000 Hz och ett mätområde på minst 0,1–30 k Ω. Den brygga 
som användes i valideringsstudien mätte induktans, kapacitans och 
motstånd upp till värden på 2 000 H, 2 000 μF respektive 2 M ω vid 
frekvenser på 100 Hz eller 1 kHz med användning av seriella eller parallella värden. För mätningen av hudkorrosivitet genom TER-be ­
stämning registrerades motståndet vid frekvensen 100 Hz och seriella 
värden användes. För att sänka hudens ytspänning tillförs etanol (70 %) i tillräcklig mängd för att täcka epidermisytan. Etanolen får verka några sekunder och hälls sedan ur röret. Därefter behandlas 
huden med 3 ml MgSO4-lösning (154 mM). För motståndsmät ­
ningen (k Ω/hudbit) placeras mätutrustningens elektroder på hudbi ­
tens motstående båda ytor (figur 1). Elektrodernas mått och elektrod ­
längden under krokodilklämman framgår av figur 2. Den inre elek ­
trodklämman hålls uppe på PTFE-röret under motståndsmätningen 
för att säkerställa att elektrodlängden i magnesiumsulfatlösningen hålls konstant. Den yttre elektroden placeras innanför receptorkam ­
maren så att elektroden ligger mot kammarens botten. Avståndet 
mellan fjäderklämman och PTFE-rörets botten ska hållas konstant 
(figur 2) eftersom avståndet påverkar det erhållna motståndsvärdet. Följaktligen ska avståndet mellan den inre elektroden och hudbiten vara konstant och minimalt (1–2 mm). 
Om det uppmätta motståndsvärdet överstiger 20 k Ω kan detta bero 
på att hudbitens epidermisyta är täckt av testämne. För att få bort ämnet kan man t.ex. sluta till PTFE-röret med tummen (som bör 
skyddas med handske) och skaka om röret i cirka 10 sekunder, hälla 
ut magnesiumsulfatlösningen och upprepa mätningen med ny MgSO
 4 -lösning. 
Såväl testanordningens egenskaper och mått som försöksförfarandet 
kan påverka de TER-värden som erhålls. Tröskelvärdet på 5 k Ω för 
hudkorrosivitet togs fram utifrån data som erhållits med den speci ­
fika anordning och det specifika förfarande som beskrivs för denna metod. Andra tröskelvärden och kontrollvärden kan gälla om test ­
betingelserna ändras eller om en annan testanordning används. Där ­
för måste metoden och tröskelvärdena för motstånd kalibreras genom test av ett antal referensstandarder som väljs bland de kemikalier som användes i valideringsstudien (4) (5) eller från liknande kemikaliek ­
lasser som de kemikalier som undersöks. En uppsättning lämpliga 
referenskemikalier listas i tabell 1.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 569
 
1.5.5  Metoder som bygger på färgämnesbindning  
Exponering för vissa icke-korrosiva material kan sänka motståndet 
under tröskelvärdet 5 k Ω så att joner kan flöda genom hornlagret då 
det elektriska motståndet minskar (5). Exempelvis kan neutrala or ­
ganiska ämnen och kemikalier som har ytaktiva egenskaper (bland 
annat detergenter, emulgeringsmedel och andra ytaktiva ämnen) av ­
lägsna hudlipider och därmed försämra barriärfunktionen och göra huden mer genomsläpplig för joner. Om TER-värdena för testäm ­
nena är lägre än eller omkring 5 k Ω utan någon synlig skada bör en 
bestämning av färgämnespenetrationen göras i kontroll och behand ­
lad vävnad för att fastställa om de erhållna TER-värdena är en följd 
av ökad genomsläpplighet hos huden eller av hudkorrosivitet (3)(5). 
Om hudkorrosivitet föreligger och hornlagret är skadat kommer färg ­
ämnet sulforhodiamin B snabbt att tränga igenom hudytan och färga underliggande vävnad då det appliceras. Detta färgämne är stabilt 
mot ett brett urval av kemikalier och påverkas inte av det extrak ­
tionsförfarande som beskrivs nedan.
 
1.5.5.1  Applicering och avlägsnande av färgämnet sulforhodamin B  
Efter TER-testet hälls magnesiumsulfatet bort från röret och huden 
granskas noga med avseende på synlig skada. Om ingen tydlig och 
mer omfattande skada observeras appliceras 150 μL 10-procentig 
(vikt i volym) lösning av färgämnet sulforhodamine B (Acid Red 52; C.I. 45100; EINECS-nummer 222-529-8; CAS-nummer 3520- 
42-1) i destillerat vatten på epidermisytan av alla hudbitar. Lös ­
ningen får verka i 2 timmar. Därefter avlägsnas överskott (obundet färgämne) genom tvättning av hudbitarna med kranvattenstråle (upp till rumstemperatur) i ungefär 10 sekunder. Hudbitarna tas försiktigt 
bort från PTFE-rören och varje hudbit placeras i en burk (t.ex. en 
20 ml scintillationsburk i glas) som innehåller destillerat vatten (8 ml). Brukarna omskakas varsamt under 5 minuter för att avlägsna ytterligare överskott (obundet färgämne). Därefter upprepas skölj ­
ningen. Hudbitarna tas bort, placeras i burkar som innehåller 5 ml 
30-procentig (vikt i volym) natriumdodecylsulfat (SDS) i destillerat vatten och inkuberas över natten vid 60
 o C. 
Efter inkubationen avlägsnas hudbitarna och slängs. Den kvarva ­
rande lösningen centrifugeras under 8 minuter vid 21  o C (relativ 
centrifugalkraft cirka 175 x g). Ett 1 ml prov av supernatanten späds ut i volymförhållandet 1:5 (t.ex. 1 ml + 4 ml) med 30-procentig (vikt 
i volym) SDS i destillerat vatten. Lösningens optiska densitet (OD) 
mäts vid 565 nm.
 
1.5.5.2  Beräkning av färgämneshalten  
Halten av sulforhodamin B per hudbit beräknas utifrån OD-värdena (5) 
(färgämnets molära extinktionskoefficient vid 565 nm = 8,7 x l0  4 ; 
molekylvikt = 580). Färgämneshalten bestäms för varje hudbit med hjälp av en lämplig kalibreringskurva och därefter beräknas en medel ­
halt för alla hudbitarna.
 
2. DATA  
Motståndsvärden (k Ω) och medelhalter av färgämne ( μg/hudbit) ska 
där det lämpar sig för testämnet liksom för positiva och negativa kontroller rapporteras i tabellform (enskilda försöksdata och medel ­
värden ± standarddeviation), inbegripet data för replikat och upp ­
repade försök, medelvärden och enskilda värden.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 570
 
2.1 TOLKNING AV RESULTAT 
TER-medelvärdena godtas om parallella positiva och negativa kon ­
trollvärden faller inom de godtagbara intervallen för den metod som används på testlaboratoriet. De godtagbara motståndsintervallen för 
metoden och anordningen som beskrivs ovan ges i följande tabell:
 
Kontroll Ämne Motståndsinter ­
vall (kΩ) 
Positiv 10 M saltsyra 0,5–1,0 
Negativ Destillerat vatten 10–25 
Medelhalterna för färgämnesbindning godtas på villkor att värdena 
för de parallella kontrollerna ligger inom de godtagbara intervallen för metoden. Föreslagna intervall för färgämneshalt för kontrolläm ­
nena för den metod och den anordning som beskrivs ovan ges nedan:
 
Kontroll Ämne Intervall för 
färgämneshalt 
(μg/hudbit)  
Positiv 10 M saltsyra 40–100 
Negativ Destillerat vatten 15–35 
Testämnet anses vara icke-korrosivt 
i) om TER-medelvärdet för testämnet är högre än 5 k Ω eller 
ii) TER-medelvärdet är lägre än eller lika med 5 k Ω och 
— hudbiten inte har någon synlig skada och 
— medelhalten av färgämne i hudbitarna ligger väl under medel ­
halten av färgämne i den parallella positiva kontroll som behandlats med 10 M HCl. 
Testämnet anses vara korrosivt 
i) om TER-medelvärdet är mindre än eller lika med 5 k Ω och 
hudbiten är uppenbart skadad eller 
ii) TER-medelvärdet är lägre än eller lika med 5 k Ω och 
— hudbiten inte uppvisar någon synlig skada men 
— medelhalten av färgämne är större än eller lika med medel ­
halten av färgämne i den parallella positiva kontroll som 
behandlats med 10 M HCl.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 571
 
3. RAPPORTERING  
3.1 TESTRAPPORT 
Testrapporten måste innehålla följande information: 
Test- och kontrollämnen: 
— Kemiskt namn eller kemiska namn såsom IUPAC- eller CAS- 
namn och CAS-nummer, om dessa uppgifter är kända. 
— Renhet och sammansättning av ämnet eller beredningen (i vikt ­
procentandelar) och fysikaliskt tillstånd. 
— Fysikalkemiska egenskaper, t.ex. fysikaliskt tillstånd, pH, stabili ­
tet, vattenlöslighet, som är relevanta för studiens genomförande. 
— Behandling av test- och kontrollämnen före testning, om detta är 
tillämpligt (t.ex. uppvärmning, finfördelning. 
— Stabilitet, om denna är känd. 
Försöksdjur: 
— Stam och kön för använda djur. — Djurens ålder då de användes som donatordjur. — Ursprung, uppfödningsförhållanden, diet etc. 
— Uppgifter om hudberedningen. 
Försöksförhållanden: — Kalibreringskurvor för testanordningen. 
— Kalibreringskurvor för testet av färgämnesbindning. 
— Detaljerade uppgifter om försöksförfarandet för TER-mätningar. — Detaljerade uppgifter om försöksförfarandet för bestämning av 
färgämnesbindning, om detta är tillämpligt, om detta är tillämpligt. 
— Beskrivning av eventuella modifieringar av försöksförfarandena. — Beskrivning av eventuella utvärderingskriterier. 
Resultat: 
— Data i tabellform från TER- och färgämnesbindningsbestämning 
(om detta är tillämpligt) för enskilda djur och för enskilda hud ­
prover. 
— Beskrivning av observerade effekter. Diskussion av resultaten. Slutsatser.
 
4. HÄNVISNINGAR  
1. OECD (2001), Harmonised Integrated Classification System for 
Human Health and Environmental Hazards of Chemical Sub ­
stances and Mixtures. OECD Series on Testing and Assessment Number 33. ENV/JM/MONO(2001)6, Paris. http:// 
www.olis.oecd.org/olis/2001doc.nsf/LinkTo/env-jm-mo ­
no(2001)6.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 572
 
2. Testmethod B.4. Akut toxicitet: hudirriation/hudkorrosion. 
3. Botham, P.A., Chamberlain, M., Barratt, M.D., Curren, R.D., 
Esdaile, D.J., Gardner, J.R., Gordon, V.C., Hildebrand, B., Le ­
wis, R.W., Liebsch, M., Logemann, P., Osborne, R., Ponec, M., Regnier, J.F., Steiling, W., Walker, A.P., and Balls, M. (1995), A prevalidation study on  in vitro  skin corrosivity testing. The 
report and recommendations of ECVAM Workshop 6. ATLA 
23, 219–255. 
4. Barratt, M.D., Brantom, P.G., Fentem, J.H., Gerner, I., Walker, 
A.P., and Worth, A.P. (1998), The ECVAM international valida ­
tion study on  in vitro  tests for skin corrosivity. 1. Selection and 
distribution of the test chemicals. Toxic. in Vitro 12, 471–482. 
5. Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, 
R.D., Earl, L.K., Esdaile, D.J., Holzhütter, H.-G., and Liebsch, M. (1998), The ECVAM international validation study on  in 
vitro  tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the 
Management Team. Toxic. in Vitro 12, 483–524. 
6. OECD (1996), Final Report of the OECD Workshop on Har ­
monization of Validation and Acceptance Criteria for Alterna ­
tive Toxicological Test Methods, 62pp. 
7. Balls, M., Blaauboer, B.J., Fentem. J.H., Bruner. L., Combes, 
R.D., Ekwall, B., Fielder. R.J., Guillouzo, A., Lewis, R.W., Lovell, D.P., Reinhardt, C.A., Repetto, G., Sladowski. D., Spi ­
elmann, H., and Zucco, F. (1995), Practical aspects of the va ­
lidation of toxicity test procedures. The report and recommen ­
dations of ECVAM workshops. ATLA 23, s. 129–147. 
8. ICCVAM (Interagency Coordinating Committee on the Valida ­
tion of Alternative Methods). (1997), Validation and Regulatory 
Acceptance of Toxicological Test Methods. NIH Publication 
No. 97-3981. National Institute of Environmental Health Scien ­
ces, Research Triangle Park, NC, USA. http:// iccvam.niehs.nih.gov/docs/guidelines/validate.pdf 
9. ECVAM (1998). ECVAM News & Views. ATLA 26, 
s. 275–280. 
10. ICCVAM (Interagency Coordinating Committee on the Valida ­
tion of Alternative Methods). (2002), ICCVAM evaluation of EpiDermTM, EPISKINTM (EPI-200), and the Rat Skin Trans ­
cutaneous Electrical Resistance (TER) assay: In Vitro test met ­
hods for assessing dermal corrosivity potential of chemicals. NIH Publication No. 02-4502. National Toxicology Program Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicolo ­
gical Methods, National Institute of Environmental Health Sci ­
ences, Research Triangle Park, NC, USA. http:// iccvam.niehs.nih.gov/methods/epiddocs/epis_brd.pdf. 
11. OECD (2002), Extended Expert Consultation Meeting on The 
In Vitro Skin Corrosion Test Guideline Proposal, Berlin, 1st 
- 2nd November 2001, Secretariat's Final Summary Report, 27th March 2002, OECD ENV/EHS, available upon request from the Secretariat 
12. Oliver, G.J.A., Pemberton, M.A., and Rhodes, C. (1986), An  in 
vitro  skin corrosivity test -modificationsand validation. Fd. 
Chem. Toxicol. 24, s. 507–512.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 573
 
13. Botham, P.A., Hall, T.J., Dennett, R., McCall, J.C., Basketter, 
D.A., Whittle, E., Cheeseman, M., Esdaile, D.J., and Gardner, J. 
(1992), The skin corrosivity test  in vitro:  results of an interla ­
boratory trial. Toxic. in Vitro 6, s. 191–194. 
14. Worth AP, Fentem JH, Balls M, Botham PA, Curren RD, Earl 
LK, Esdaile DJ, Liebsch M (1998), An Evaluation of the Pro ­
posed OECD Testing Strategy for Skin Corrosion. ATLA 26, 
s. 709–720. 
15. Basketter, D.A., Chamberlain, M., Griffiths, H.A., Rowson, M., 
Whittle, E., York, M. (1997), The classification of skin irritants by human patch test. Fd. Chem. Toxicol. 35, s. 845–852. 
16. Oliver G.J.A, Pemberton M.A and Rhodes C. (1988), An In 
Vitro model for identifying skin-korrosivt chemicals. I. Initial Validation. Toxic. in Vitro. 2, s. 7–17.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 574
 
Figur 1  
Anordning för TER-analys av råtthud
  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 575
 
Figur 2  
Mått på polytetrafluoretenrör (PFTE-rör), mottagarrör och elektroder
  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 576
 
Kritiska faktorer för den anordning som visas ovan:  
— PTFE-rörets innerdiameter. — Elektrodernas längd jämfört med PTFE-rörets och mottagarrörets. 
Hudbiten ska inte vara i kontakt med elektroderna och en standard ­
längd av elektroden ska vara i kontakt med MgSO
 4 -lösningen. 
— Mängden MgSO  4 -lösning i mottagarröret ska ge ett visst djup i 
vätskan jämfört med nivån i PFTE-röret, såsom visas i figur 1. 
— Hudbiten ska vara ordentligt fäst vid PFTE-röret, så att det elekt ­
riska motståndet är ett verkligt mått på hudens egenskaper.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 577
 
B.40B  IN VITRO-TEST  AV HUDKORROSIVITET: TEST MED 
MODELL AV HUMAN HUD  
1. METOD  
Denna testmetod motsvarar OECD TG 431 (2004).  
1.1 INLEDNING 
Hudkorrosivitet innebär att en irreversibel vävnadsskada uppstår i 
huden som en följd av att ett testmaterial [definierat enligt det in ­
ternationella systemet för klassificering och märkning av kemikalier (GHS)] (1) appliceras. Denna metod bygger på ett förfarande som 
innebär att testmaterialets hudkorrosivitet inte testas på levande djur. 
Bedömning av hudkorrosiviteten har normalt inneburit användning 
av försöksdjur (2). På grund av den smärta och det lidande som försöksdjuren utsätts för har översynen av testmetod B.4 gjorts på 
ett sådant sätt att bedömningen av hudkorrosiviteten går att göra med 
alternativa metoder  in vitro,  så att försöksdjur inte längre behöver 
användas. 
Ett första steg mot att definiera alternativa testmetoder som kunde an ­
vändas för testning av hudkorrosiviteten var att genomföra förvalide ­
ringsstudier (3). Efter detta gjordes en formell valideringsstudie (6)(7)(8) av in vitro -metoder för att bedöma hudkorrosiviteten (4)(5). Utfallet av 
dessa studier sammantaget med annan publicerad litteratur (9) ledde till 
rekommendationen att följande tester kan användas för bedömning av hudkorrosiviteten  in vivo  (10)(11)(12)(13): ett test där en modell av 
human hud används (denna metod) och bestämning av transkutant elekt ­
riskt motstånd (se testmetod B.40). 
Enligt valideringsstudier gör tester med modeller av human hud (3) ­
(4)(5)(9) det möjligt att på ett tillförlitligt sätt skilja mellan kända hudkorrosiva ämnen och icke-korrosiva ämnen. Testprotokollet kan 
också ge en indikation för att skilja mellan mycket hudkorrosiva och 
mindre hudkorrosiva ämnen. 
Testet enligt denna metod gör det möjligt att identifiera kemikalier och 
blandningar som är hudkorrosiva. Dessutom gör testet det möjligt att 
identifiera icke hudkorrosiva ämnen och blandningar med stöd av an ­
nan befintlig information (t.ex. pH, förhållandet mellan struktur och aktivitet, data som gäller människor och/eller djur) (1)(2)(13)(14). Testet ger ingen tillräcklig information om hudirritation, inte heller 
ger det möjlighet till den underklassificering som är möjlig enligt det 
internationella systemet för klassificering och märkning av kemikalier (GHS) (1). 
För en fullständig utvärdering av lokala hudeffekter efter en enda 
hudexponering rekommenderas den sekventiella teststrategi som 
finns som tillägg till testmetod B.4 (2) och som anges i det interna ­
tionella systemet för klassificering och märkning (1). Denna teststra ­
tegi inbegriper  in vitro-tester  av hudkorrosiviteten (enligt den häri 
beskrivna metoden) och hudirritation innan tester på levande djur 
övervägs.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 578
 
1.2 DEFINITIONER  
Hudkorrosion in vivo:  innebär att en irreversibel skada uppstår i 
huden, det vill säga synlig nekros genom epidermis och ner i dermis efter att ett testämne har applicerats och fått verka i upp till fyra 
timmar. Korrosiva reaktioner kännetecknas av sår, blödning, blodiga 
sårskorpor och i slutet av observationsperioden på 14 dagar av miss ­
färgning på grund av blekning av huden, håravfall på hela hudområ ­
den och ärrbildning. Histopatologi bör övervägas för att bedöma 
tveksamma skador.  
Cellviabilitet:  en parameter som är ett mått på en cellpopulations 
totala aktivitet (t.ex. cellulära mitokondriska dehydrogenasers för ­
måga att reducera det vitala färgämnet MTT). Denna förmåga är 
korrelerad till det totala antalet celler och till cellernas viabilitet, 
beroende på vilken slutpunkt som mäts och på försöksdesignen.
 
1.3 REFERENSÄMNEN  
Tabell 1  
Referenskemikalier  
Namn EINECS-nr CAS-nr  
1,2-Diaminopropan 201-155-9 78-90-0 Starkt korrosiv 
Akrylsyra 201-177-9 79-10-7 Starkt korrosiv 
2-tert-butylfenol 201-807-2 88-18-6 Korrosiv Kaliumhydroxid (10 %) 215-181-3 1310-58-3 Korrosiv Svavelsyra (10 %) 231-639-5 7664-93-9 Korrosiv Oktansyra (kaprylsyra) 204-677-5 124-07-02 Korrosiv 4-Amino-1,2,4-triazol 209-533-5 584-13-4 Icke-korrosiv 
Eugenol 202-589-1 97-53-0 Icke-korrosiv 
Fenetylbromid 203-130-8 103-63-9 Icke-korrosiv Tetrakloretylen 204-825-9 27-18-4 Icke-korrosiv Isostearinsyra 250-178-0 30399-84-9 Icke-korrosiv 4-(Metyltio)-benzaldehyd 222-365-7 3446-89-7 Icke-korrosiv 
De flesta av kemikalierna i förteckningen har tagits från den för ­
teckning över kemikalier som valdes för den internationella valide ­
ringsstudien ECVAM (4). Urvalet bygger på följande kriterier: 
i) Lika många korrosiva som icke-korrosiva ämnen. 
ii) Kommersiellt tillgängliga ämnen som täcker de flesta relevanta 
kemikalieklasser. 
iii) Medtagande av såväl starkt korrosiva som mindre korrosiva äm ­
nen för att göra det möjligt att särskilja ämnen på grundval av 
hudkorrosiviteten.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 579
 
iv) Val av kemikalier som kan hanteras i ett laboratorium utan att 
utgöra någon annan allvarlig risk utöver hudkorrosiviteten.  
1.4 PRINCIPEN FÖR TESTMETODEN 
Testämnet appliceras på ytan av en tredimensionell modell av human 
hud som består minst av en rekonstruerad epidermis med funktionellt hornlager. Korrosiva ämnen identifieras genom sin förmåga att efter fastställda exponeringsperioder framkalla en sänkning av cellernas 
viabilitet (vilket kan fastställas t.ex. med MTT-reduktionsbestämning 
(15)) under definierade tröskelvärden. Principen för bestämningen följer hypotesen om att kemikalier är korrosiva om de kan penetrera hornlagret genom diffusion eller erosion och är tillräckligt cytotox ­
iska för att orsaka celldöd i underliggande cellskikt.
 
1.4.1  Förfarande  
1.4.1.1  Modeller av human hud  
Modeller av human hud kan konstrueras eller erhållas från kom ­
mersiella källor (t.ex. EpiDerm  TM - och EPISKIN  TM -modellerna) 
(16)(17)(18)(19) eller utvecklas eller konstrueras på försökslaborato ­
riet (20)(21). Det är vedertaget att användning av human hud är föremål för nationella och internationella etiska hänsyn och begräns ­
ningar. Alla nya modeller ska valideras (minst i den omfattning som 
beskrivs i 1.4.1.1.2). Modeller av human hud som används för detta 
test måste uppfylla följande villkor:
 
1.4.1.1.1 A l l m ä n n a v i l l k o r f ö r m o d e l l e n : 
Epitelet ska konstrueras av humana keratinocyter. Flera lager av 
viabla epitelceller ska finnas under ett fungerande hornlager. Hud ­
modellen kan också ha ett lager med en stromal komponent. Horn ­
lagret ska bestå av flera skikt och ha den lipidprofil som krävs för att barriärfunktionen ska räcka för att motstå snabb penetrering av cy ­
totoxiska markörer. Modellens inneslutningsegenskaper ska vara så ­
dana att ämnen inte ska kunna passera runt hornlagret till den viabla vävnaden. Om testkemikalier kan passera runt hornlagret blir model ­
leringen av hudexponering dålig. Hudmodellen får inte vara kontami ­
nerad med bakterier (inbegripet mykoplasma) eller svamp.
 
1.4.1.1.2 F u n k t i o n e l l a v i l l k o r f ö r m o d e l l e n : 
Viabiliteten kvantifieras normalt genom användning av MTT eller 
andra färgämnen som omvandlas metaboliskt. I dessa fall ska den 
optiska densiteten (OD) för extraherat (löst) färgämne från den ne ­
gativa kontrollvävnaden vara minst 20 gånger större än OD för enbart extraktionslösningsmedlet (se (22) för en översikt). Den ne ­
gativa kontrollvävnaden ska vara stabil i kultur (ge motsvarande 
resultat vid viabilitetsmätning) under hela exponeringstiden under 
försöket. Hornlagret ska vara tillräckligt robust för att stå emot snabb penetrering av vissa cytotoxiska markörer (t.ex. 1-procentig Triton X-100). Denna egenskap kan uppskattas på grundval av den expo ­
neringstid som krävs för att minska cellviabiliteten med 50 procent 
(ET
 50 ) (denna tid är t.ex. > 2 timmar för EpiDerm  TM - och EPIS ­
KIN  TM -modellerna). Vävnaden ska vara reproducerbar över tiden 
och helst mellan laboratorier. Dessutom ska den kunna användas 
för att förutsäga den korrosiva potentialen hos referenskemikalier 
(se tabell 1) då den används enligt det valda försöksprotokollet.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 580
 
1.4.1.2  Applicering av test- och kontrollämnen  
Två vävnadsreplikat används för varje behandling (exponeringstid), 
även för kontrollerna. Ämnen i vätskeform måste appliceras i till ­
räcklig mängd för att täcka hudens yta (minst 25 μl/cm  2 ). Ämnen i 
fast form måste appliceras i tillräcklig mängd för att täcka huden och 
därefter måste ämnet fuktas med avjoniserat eller destillerat vatten för att säkerställa god kontakt med huden. I vissa fall måste ämnen i fast form pulveriseras före appliceringen. Appliceringsmetoden måste 
vara lämplig för testämnet (se hänvisning 5). I slutet av exponerings ­
perioden ska testämnet omsorgsfullt tvättas bort från hudytan med en lämplig buffert eller med 0,9-procentig NaCl. 
Parallella positiva och negativa kontroller ska användas i varje studie 
för att säkerställa att försöksmodellen fungerar adekvat. Föreslagna 
ämnen för positiv kontroll är isättika eller 8N KOH. Föreslagna 
ämnen för negativ kontroll är 0,9-procentig NaCl eller vatten.
 
1.4.1.3  Mätning av cellernas viabilitet  
Endast kvantitativa, validerade metoder får användas för att mäta 
cellernas viabilitet. Vidare måste viabilitetsmåttet vara förenligt med användning av den tredimensionella vävnadskonstruktionen. 
Ospecifik bindning av färgämne får inte störa viabilitetsmätningen. 
Proteinbindande färgämnen och sådana som inte genomgår metabo ­
lisk omvandling (t.ex. neutralrött) är därför olämpliga. Den oftast använda bestämningsmetoden är MTT-reduktion [3-(4,5-dimetylthia ­
zol-2yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromid; EINECS-nummer 206-069-5, 
CAS-nummer 298-93-1)] , som har visat sig ge exakta och repro ­
ducerbara resultat (5), men även andra metoder kan användas (t.ex. 0,3-1 mg/ml) vid en lämplig inkubationstemperatur under 3 timmar. 
Den utfällda blå formazanprodukten extraheras sedan med lösnings ­
medel (isopropanol) och formazanhalten mäts genom OD-bestäm ­
ning vid en våglängd mellan 540 och 595 nm. 
Kemisk inverkan av testämnet på färgämnet kan likna inverkan av 
cellulär metabolism och leda till en falsk bedömning av viabiliteten. 
Detta har visats inträffa då ett testämne inte avlägsnas helt från 
huden genom sköljning (9). Om testämnet påverkar färgämnet direkt måste ytterligare kontroller användas för att upptäcka och korrigera för dessa testämnens störning av viabilitetsmätningarna (9)(23).
 
2. DATA  
För varje vävnad ska OD-värden och beräknade procentvärden för 
cellviabilitet rapporteras i tabellform såväl för testämne som för po ­
sitiva och negativa kontroller, inbegripet data för replikat och upp ­
repade försök, medelvärden och enskilda värden  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 581
 
2.1 TOLKNING AV RESULTAT 
De OD-värden som erhållits för varje testprov kan användas för att 
beräkna en procentuell viabilitet i förhållande till den negativa kont ­
rollen, som sätts till 100 %. Tröskelvärdet för cellviabilitet som 
skiljer korrosiva ämnen från icke-korrosiva (eller som skiljer mellan 
olika korrosiva klasser) eller det statistiska förfarande eller de sta ­
tistiska förfaranden som används för att utvärdera resultaten och för att identifiera korrosiva ämnen måste definieras klart och dokumen ­
teras. Dessutom ska lämpligheten visas. Generellt fastställs dessa 
tröskelvärden vid optimeringen av försöket under en förvaliderings ­
fas och bekräftas under en valideringsstudie. Ett exempel är förutsäg ­
barheten för korrosivitet associerad till EpiDerm
 TM -modellen (9). 
Testämnet anses vara korrosivt för huden 
i) om viabiliteten efter 3 minuters exponering är mindre än 50 % 
eller 
ii) om viabiliteten efter 3 minuters exponering är större än eller lika 
med 50 % och viabiliteten efter 1 timmes exponering är mindre än 15 %. 
Testämnet anses vara icke-korrosivt för huden 
i) om viabiliteten efter 3 minuters exponering är större än eller lika 
med 50 % och viabiliteten efter 1 timmes exponering är större än 
eller lika med 15 %.
 
3. RAPPORTERING  
3.1 TESTRAPPORT 
Testrapporten måste innehålla följande information: 
Test- och kontrollämne: 
— Kemiskt namn eller kemiska namn såsom IUPAC- eller CAS- 
namn och CAS nummer, om dessa uppgifter är kända. 
— Renhet och sammansättning av ämnet eller beredningen (i vikt ­
procentandelar) och fysikaliskt tillstånd. 
— Fysikalkemiska egenskaper, t.ex. fysikaliskt tillstånd, pH, stabili ­
tet, vattenlöslighet, som är relevanta för studiens genomförande. 
— Behandling av test- och kontrollämnen före testning, om detta är 
tillämpligt (t.ex. uppvärmning, finfördelning). 
— Stabilitet, om denna är känd. 
Motivering av hudmodellen och det använda försöksprotokollet. 
Försöksförhållanden: — Cellsystem 
— Kalibreringsinformation för mätanordningar som används för att 
mäta cellviabilitet (t.ex. spektrofotometer).
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 582
 
— Fullständiga underbyggande uppgifter om den specifika hudmo ­
dell som används, inbegripet validitet. 
— Detaljerade uppgifter om försöksförfarandet. 
— Testdoser — Beskrivning av eventuella modifieringar av försöksförfarandet. — Hänvisning till historiska uppgifter om modellen. 
— Beskrivning av utvärderingskriterier. 
Resultat: — Data i tabellform för enskilda testprover. — Beskrivning av övriga observerade effekter. 
Diskussion av resultaten. 
Slutsats.
 
4. HÄNVISNINGAR  
1. OECD (2001), Harmonised Integrated Classification System for 
Human Health and Environmental Hazards of Chemical Sub ­
stances and Mixtures. OECD Series on Testing and Assessment 
Number 33. ENV/JM/MONO(2001)6, Paris. http:// 
www.olis.oecd.org/olis/2001doc.nsf/LinkTo/env-jm-mo ­
no(2001)6. 
2. Testmetod B.4. Akut toxicitet: hudirriation/hudkorrosion. 3. Botham, P.A., Chamberlain, M., Barratt, M.D., Curren, R.D., 
Esdaile, D.J., Gardner, J.R., Gordon, V.C., Hildebrand, B., Le ­
wis, R.W., Liebsch, M., Logemann, P., Osborne, R., Ponec, M., Regnier, J.F., Steiling, W., Walker, A.P., and Balls, M. (1995), 
A prevalidation study on  in vitro  skin corrosivity testing. The 
report recommendations of ECVAM Workshop 6 ATLA 23, s. 219–255. 
4. Barratt, M.D., Brantom, P.G., Fentem, J.H., Gerner, I., Walker, 
A.P., and Worth, A.P. (1998), The ECVAM international vali ­
dation study on  in vitro  tests for skin corrosivity. 1. Selection 
and distribution of the test chemicals. Toxic. In Vitro 12, 
s. 471–482. 
5. Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, 
R.D., Earl, L.K., Esdaile, D.J., Holzhutter, H.G. and Liebsch, M. (1998), The ECVAM international validation study on  in 
vitro  tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the 
Management Team. Toxic. In Vitro 12, s. 483–524. 
6. OECD (1996), Final Report of the OECD Workshop on Har ­
monization of Validation and Acceptance Criteria for Alterna ­
tive Toxicological Test Methods, 62pp. 
7. Balls, M., Blaauboer, B.J., Fentem, J.H., Bruner, L., Combes, 
R.D., Ekwall, B., Fielder, R.J., Guillouzo, A., Lewis, R.W., Lovell, D.P., Reinhardt, C.A., Repetto, G., Sladowski, D., Spi ­
elmann, H., and Zucco, F. (1995), Practical aspects of the va ­
lidation of toxicity test procedures. Test report and recommen ­
dations of ECVAM workshops. ATLA 23, s. 129–147. 
8. ICCVAM (Interagency Coordinating Committee on the Valida ­
tion of Alternative Methods). (1997), Validation and Regulatory Acceptance of Toxicological Test Methods. NIH Publication No. 97-3981. National Institute of Environmental Health Scien ­
ces, Research Triangle Park, NC, USA. http:// 
iccvam.niehs.nih.gov/docs/guidelines/validate.pdf.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 583
 
9. Liebsch, M., Traue, D., Barrabas, C., Spielmann, H., Uphill, P., 
Wilkins, S., McPherson, J.P., Wiemann, C., Kaufmann, T., 
Remmele, M. and Holzhutter, H.G. (2000), The ECVAM pre ­
validation study on the use of EpiDerm for skin Corrosivity testing. ATLA 28, pp., s. 371–401. 
10. ECVAM (1998), ECVAM News & Views. ATLA 26, 
s. 275–280. 
11. ECVAM (2000), ECVAM News & Views. ATLA 28, 
s. 365–67. 
12. ICCVAM (Interagency Coordinating Committee on the Valida ­
tion of Alternative Methods), (2002), ICCVAM evaluation of 
EpiDerm
 TM , EPISKIN  TM (EPI-200), and the Rat Skin Trans ­
cutaneous Electrical Resistance (TER) assay: In Vitro test met ­
hods for assessing dermal corrosivity potential of chemicals. 
NIH Publication No. 02-4502. National Toxicology Program 
Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicolo ­
gical Methods, National Institute of Environmental Health Sci ­
ences, Research Triangle Park, NC, USA. http:// 
iccvam.niehs.nih.gov/methods/epiddocs/epis_brd.pdf. 
13. OECD (2002), Extended Expert Consultation Meeting on The 
In Vitro Skin Corrosion Test Guideline Proposal, Berlin, 1st — 2nd November 2001, Secretariat's Final Summary Report, 
27th March 2002, OECD ENV/EHS, available upon request 
from the Secretariat 
14. Worth AP, Fentem JH, Balls M, Botham PA, Curren RD, Earl 
LK, Esdaile DJ, Liebsch M (1998). An Evaluation of the Pro ­
posed OECD Testing Strategy for Skin Corrosion. ATLA 26: 
709-720. 
15. Mosmann, T. (1983), Rapid colorimetric assay for cellular 
growth and survival: application to proliferation and cytotox ­
icity asssays. J.Immunol. Meth. 65, s. 55–63. 
16. Cannon, C.L., Neal, P.J., Southee, J.A., Kubilus, J., and Klaus ­
ner, M., (1994), New epidermal model for dermal irritancy tes ­
ting. Toxic. In Vitro 8, s. 889–891. 
17. Ponec, M., Boelsma, E., Weerheim, A., Mulder, A., Boutwstra, 
J., and Mommaas, M., (2000), Lipid and ultrastructural charac ­
terization of reconstructed skin models. International Journal of 
Pharmaceutics. s. 203, 211–225. 
18. Tinois E, Gaetani Q, Gayraud B, Dupont D, Rougier A, Pou ­
radier DX (1994), The Episkin model: Successful reconstruction 
of human epidermis in vitro. In In vitro Skin Toxicology. Edi ­
ted by A Rougier, AM Goldberg and HI Maibach: s. 133–140 
19. Tinois E, Tiollier J, Gaucherand M, Dumas H, Tardy M, Thi ­
volet J (1991), In vitro and post -transplantation differentiation 
of human keratinocytes grown on the human type IV collagen 
film of a bilayered dermal substitute. Experimental Cell Rese ­
arch 193:310-319 
20. Parentau, N.L., Bilbo, P., Molte, C.J., Mason, V.S., and Rosen ­
berg, H. (1992), The organotypic culture of human skin kerati ­
nocytes and fibroblasts to achieve form and function. Cytotech ­
nology 9, s. 163–171. 
21. Wilkins, L.M., Watson, S.R., Prosky, S.J., Meunier, S.F., Pa ­
rentau, N.L. (1994), Development of a bilayered living skin 
construct for clinical applications. Biotechnology and Bioengi ­
neering 43/8, s. 747–756.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 584
 
22. Marshall, N.J., Goodwin, C.J., Holt, S.J. (1995), A critical as ­
sessment of the use of microculture tetrazolium assays to mea ­
sure cell growth and function. Growth Regulation 5, s. 69–84. 
23. Fentem, J.H., Briggs, D., Chesne, C., Elliot, G.R., Harbell, 
J.W., Heylings, J.R., Portes, P., Rouget, R., and van de Sandt, J.J.M., and Botham, P.A. (2001), A prevalidation study on  in 
vitro  tests for acute skin irritation: results and evaluation by the 
Management Team. Toxic. InVitro 15, s. 57–93.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 585
 
B.41  3T3 NRU-FOTOTOXICITETSTEST  IN VITRO  
1. METOD  
Denna testmetod motsvarar OECD TG 432 (2004).  
1.1 INLEDNING 
Fototoxicitet definieras såsom toxisk respons som framkallas när ett 
ämne appliceras på kroppen och responsen sedan antingen utlöses eller ökar (tydligt vid låga dosnivåer) efter exponering för ljus eller toxisk respons som framkallas genom hudbestrålning efter admini ­
strering av en kemikalie till organismen. 
3T3 NRU-fototoxicitetstestet  in vitro  används för att identifiera den 
fototoxiska potentialen hos ett testämne vilken induceras av den 
exciterade kemikalien efter exponering för ljus. Testet ger en utvär ­
dering av foto-cytotoxiciteten genom att mäta den relativa minsk ­
ningen av viabilitet hos celler som exponeras för kemikalien i när ­
varo respektive i frånvaro av ljus. Ämnen som identifieras med detta 
test är sannolikt fototoxiska  in vivo  efter administrering till organis ­
men och fördelning i huden eller efter applicering på hudens yta. 
Många typer av kemikalier har rapporterats ge upphov till fototox ­
iska effekter (1)(2)(3)(4). Deras gemensamma egenskap är förmågan att absorbera ljusenergi inom solljusets våglängdsområde. Enligt fo ­
tokemins första lag (Grotthaus-Drapers lag) är tillräcklig absorption 
av ljuskvanta förutsättningen för en fotoreaktion. Innan man planerar biologisk testning av en kemikalie bör man därför fastställa den berörda kemikaliens absorptionsspektrum avseende UV/synligt ljus 
enligt OECD:s testriktlinjer 101. Om den molära extinktions- eller 
absorptionskoefficienten ligger under 10 liter × mol-
 -1 × cm-1 har 
kemikalien troligen ingen fotoreaktiv potential och behöver sannolikt inte testas med 3T3 NRU-fototoxicitetstest  in vitro  eller annat bio ­
logiskt test av skadliga fotokemiska effekter (1)(5) (bilaga 1). 
3T3 NRU-fototoxicitetstest  in vitro  utvärderades nyligen med avse ­
ende på tillförlitlighet och relevans (6)(7)(8)(9). 3T3 NRU-fototox ­
icitetstestet  in vitro  visades ha förutsägbarhet vad gäller akuta foto ­
toxiska effekter på djur och människa  in vivo.  Testet är inte utformat 
för att förutsäga andra skadliga verkningar som kan uppstå genom 
kombinerad verkan av en kemikalie och ljus, t.ex. fotogenotoxicitet, 
fotoallergi eller fotokarcinogenitet. Testet är inte heller avsett att användas för bedömning av fototoxisk potential. Det har inte heller utformats för att förutsäga indirekta mekanismer kopplade till foto ­
toxicitet, effekter av metaboliter av testämnet eller effekten av bland ­
ningar. 
Metaboliserande system är ett allmänt krav för alla  in vitro-test  som 
används för förutsägelse av genotoxisk och karcinogen potential, 
men när det gäller fototoxicitet finns hittills bara några få exempel när metabolisk omvandling krävs för att ett fototoxin ska verka  in 
vivo eller  in vitro.  Det är därför varken nödvändigt eller vetenskap ­
ligt motiverat att det aktuella testet genomförs med ett system som 
har metabolisk aktivering.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 586
 
1.2 DEFINITIONER  
strålning:  Intensiteten hos ultraviolett (UV) eller synligt ljus som når 
en yta, uttryckt i W/m  2 eller mW/cm  2 . 
ljusdos:  Den mängd (= intensitet x tid) ultraviolett (UV) eller synlig 
strålning som når en yta, uttryckt i Joule (= W x s) per ytenhet, t.ex. 
J/m  2 eller J/cm  2 . 
uv-ljusets våglängdsområde:  Den uppdelning som rekommenderas 
av CIE (Commission Internationale de L'Eclairage) är: UVA (315- 
400 nm), UVB (280-315 nm) och UVC (100-280 nm). Även andra 
uppdelningar förekommer – gränsen mellan UVB och UVA sätts ofta vid 320 nm och UVA kan uppdelas i UV-A1 och UV- A2 med en gräns vid cirka 340 nm.  
cellviabilitet:  En parameter för att mäta en cellpopulations totala 
aktivitet (t.ex. upptag av det vitala färgämnet neutralrött i cellens 
lysosomer). Denna aktivitet korrelerar, beroende på den slutpunkt som uppmäts och den testutformning som används, med det totala 
antalet celler och deras vitalitet.  
relativ cellviabilitet:  Cellviabiliteten uttryckt i förhållande till nega ­
tiva kontroller (med lösningsmedel) som har tagits fortlöpande under hela testförfarandet (+ UV eller – UV), utan behandling med test ­
kemikalie.  
PIF (fotoirritationsfaktor):  En faktor som fås genom jämförelse mel ­
lan två cytotoxiska koncentrationer (EC
 50 ) av testkemikalien som ger 
samma effekt i frånvaro (- UV) respektive närvaro (+ UV) av icke- cytotoxisk bestrålning med UVA/synligt ljus.  
EC
 50 : Den koncentration av testkemikalien som minskar cellviabili ­
teten med 50 %.  
MPE (Mean Photo Effect):  Ett mått som har härletts från mate ­
matisk analys av de koncentrations-responskurvor som erhålls i från ­
varo (- UV) respektive närvaro (+ UV) av icke-cytotoxisk bestrål ­
ning med UVA/synligt ljus.  
fototoxicitet:  Akut toxisk respons som framkallas när huden först 
exponeras för vissa kemikalier och därefter för ljus, eller som fram ­
kallas på liknande sätt genom hudbestrålning efter administrering av 
en kemikalie till organismen.  
1.3 PRINCIP FÖR TESTMETODEN 
3T3 NRU-fototoxicitetstestet  in vitro  bygger på en jämförelse av en 
kemikalies toxicitet då den testas i närvaro och i frånvaro av en icke- cytotoxisk dos av simulerat solljus. Cytotoxiciteten i detta test ut ­
trycks som en koncentrationsberoende minskning av upptaget av det 
vitala färgämnet neutralrött vid mätning 24 timmar efter behandling 
med testkemikalien och påföljande bestrålning (10). Neutralrött är ett svagt katjoniskt färgämne som lätt tränger igenom cellmembranen genom icke-diffusion och ackumuleras intracellulärt i lysosomer. 
Förändringar i ytan av det känsliga lysosommembranet gör lysoso ­
merna sköra och ger andra förändringar som gradvis blir irreversibla. Sådana förändringar orsakade av verkan av xenobiotika ger minskat upptag och minskad bindning av neutralrött. Därmed går det att 
skilja mellan viabla, skadade och döda celler, vilket är grunden för 
detta test.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 587
 
Balb/c 3T3-celler hålls i kultur under 24 timmar för monolayerbild ­
ning. Två 96-hålsplattor per testkemikalie förinkuberas i en timme 
med åtta olika koncentrationer av testämnet. Därefter exponeras den ena av de två plattorna för en icke-cytotoxisk ljusdos medan den andra plattan hålls i mörker. Sedan byter man ut båda plattornas 
behandlingsmedium mot kulturmedium och efter ytterligare 24 tim ­
mars inkubering bestäms cellviabiliteten med neutralröttupptag. Cell ­
viabiliteten uttrycks som en procentandel jämfört med obehandlade kontroller med lösningsmedel och beräknas för varje testkoncent ­
ration. Därefter uppskattas den fototoxiska potentialen genom jäm ­
förelse av den koncentrationsrespons som erhålls i närvaro och i frånvaro av strålning, i regel på nivån EC
 50 , dvs. den koncentration 
som minskar cellviabiliteten med 50 % jämfört med de obehandlade 
kontrollproverna.  
1.4 BESKRIVNING AV TESTMETODEN  
1.4.1  Förberedelser  
1.4.1.1  Celler  
En etablerad musfibroblastcellinje, Balb/c 3T3, klon 31, antingen 
från ATCC (American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA) eller från ECACC (European Collection of Cell Cultures, Salisbury, Wiltshire, UK) användes för valideringsstudien, och det 
rekommenderas därför att sådana celler erhålls från en välrenomme ­
rad cellbank. Andra celler eller cellinjer kan användas med samma testförfarande, förutsatt att odlingsbetingelserna anpassas till celler ­
nas specifika behov, men motsvarigheten måste demonstreras. 
Cellerna ska regelbundet kontrolleras med avseende på mykoplas ­
maförorening och får endast användas om ingen sådan påvisas (11). 
Det är viktigt att Balb/c 3T3-cellernas UV-känslighet kontrolleras 
regelbundet enligt det kvalitetskontrollförfarande som beskrivs i 
denna metod. Eftersom cellernas UVA-känslighet kan öka med an ­
talet passager ska Balb/c 3T3-celler med lägsta möjliga passagenum ­
mer användas, helst under 100 (se avsnitt 1.4.2.2.2 och bilaga 2).
 
1.4.1.2  Media och odlingsbetingelser  
Lämpliga näringslösningar och inkuberingsbetingelser bör användas 
för vanliga cellpassager och under testförfarandet. För Balb/c 3T3- celler innebär detta t.ex. DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Me ­
dium) kompletterat med 10 % serum från nyfödd kalv, 4 mM glu ­
tamin, penicillin (100 IE) och streptomycin (100 μg/ml) samt inku ­
bering i fuktig atmosfär vid 37
 o C och 5–7,5 % CO  2 beroende på 
bufferten (se avsnitt 1.4.1.4, andra stycket.). Det är särskilt viktigt att man med cellodlingsbetingelserna kan säkerställa en cellcykeltid 
inom det normala historiska intervallet för de celler eller den cellinje 
som används.
 
1.4.1.3  Beredning av kulturer  
Celler från djupfrysta stamkulturer sås ut i näringslösningen i lämplig 
täthet och subkultiveras minst en gång innan de används i 3T3 NRU- 
fototoxicitetstestet  in vitro.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 588
 
För fototoxicitetstestet sås testcellerna ut i näringslösningen med 
sådan täthet att odlingarna inte växer samman före avslutat test, 
dvs. när cellviabiliteten bestäms 48 timmar efter utsådden. För Balb/c 3T3-celler som odlas på 96-hålsplattor rekommenderas tätheten 1 × 10
 4 celler per hål. 
För varje testkemikalie sås celler ut på samma sätt på två separata 
96-hålsplattor som därefter parallellt används genom hela testför ­
farandet under identiska odlingsförhållanden, med undantag av den tidsperiod då den ena plattan bestrålas (+ UVA/synligt ljus) och den andra hålls i mörker (– UVA/synligt ljus).
 
1.4.1.4  Beredning av testämne  
Testämnena måste ha beretts omedelbart före användningen, om man 
inte med stöd av stabilitetsdata kan visa att ämnena är lagrings ­
beständiga. Det rekommenderas att alla hantering och inledande be ­
handling av cellerna görs under ljusbetingelser som inte kan ge foto ­
aktivering eller nedbrytning av testämnet före bestrålning. 
Testkemikalierna ska lösas upp i buffrade saltlösningar, t.ex. EBSS 
(Earle's Balanced Salt Solution) eller fysiologiskt balanserade buf ­
fertlösningar som inte får innehålla proteinkomponenter, ljusaborbe ­
rande komponenter (t.ex. pH-indikatorfärger och vitaminer) som kan störa bestrålningsresultatet. Eftersom cellerna under bestrålningen 
hålls utanför CO
 2 -inkubatorn under cirka 50 minuter, är det viktigt 
att undvika alkalisering. Om svaga buffertar som EBSS används kan detta uppnås genom att cellerna inkuberas vid 7,5 % CO
 2 . Om 
cellerna inkuberas vid endast 5 % CO  2 bör en starkare buffert väljas. 
Testkemikalier med begränsad vattenlöslighet ska lösas upp i lämp ­
ligt lösningsmedel. Om lösningsmedel används måste detta före ­
komma i en konstant volymkoncentration i alla odlingar, dvs. både i de negativa kontrollerna och i alla koncentrationer av testkemika ­
lien, och lösningsmedlet måste vara icke-cytotoxiskt vid denna kon ­
centration. Testkemikalierna bör väljas så att utfällning och grumling i lösningarna undviks. 
Som lösningsmedel rekommenderas dimetylsulfoxid (DMSO) och 
etanol (ETOH). Andra lösningsmedel med låg cytotoxicitet kan 
vara lämpliga men måste före användning utvärderas med avseende 
på specifika egenskaper, t.ex. reaktionsbenägenhet med testkemika ­
lien, dämpning av den fototoxiska verkan eller benägenhet att fånga upp radikaler och/eller kemisk stabilitet i lösningsmedlet. 
Vortex-blandning och/eller ultraljudsbehandling och/eller uppvärm ­
ning till lämplig temperatur kan användas för att underlätta upplös ­
ningen, förutsatt att detta inte påverkar testkemikaliens stabilitet.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 589
 
1.4.1.5  Bestrålningsbetingelser  
1.4.1.5.1 L j u s k ä l l a 
Valet av lämplig ljuskälla i kombination med lämplig filtrering är 
den viktigaste faktorn vid testning av fototoxicitet. I regel förknippas UVA och de synliga våglängdsområdena med fototoxiska reaktioner  
in vivo  (3)(12), medan UVB har mindre relevans men är mycket 
cytotoxisk – cytotoxiciteten ökar 1 000-faldigt när våglängden mins ­
kar från 313 till 280 nm (13). Kriterierna för val av lämplig ljuskälla måste inbegripa kravet att ljuskällan emitterar våglängder som ab ­
sorberas av testkemikalien (absorptionsspektrum) och att ljusdosen 
(den dos som uppnås inom skälig tid) är tillräcklig för detektion av 
kända fotocytotoxiska kemikalier. Dessutom får de våglängder och doser som används inte vara otillbörligt skadliga för testsystemet, vilket inbegriper värmeemission (infraröda området). 
Det optimala är att använda simulerat solljus från en solsimulator. 
Fördelningen av stråldosen från den filterförsedda solsimulatorn ska 
vara nära den i utomhusljus som ges i (14). I solsimulatorer används både xenonbåglampor och (dopade) kvicksilver-metallhalidbåglam ­
por (15). Fördelen med de senare är att de emitterar mindre värme 
och är billigare, men ljusets likhet med solljus är mindre än för 
xenonbåglampor. Eftersom alla solsimulatorer emitterar betydande mängder UVB bör de förses med lämpliga filter för att minska de mycket cytotoxiska UVB-våglängderna. Alla plastmaterial för cell ­
odling innehåller UV-stabilisatorer. Därför bör spektret mätas genom 
samma typ av lock till 96-hålsplattor som de som används vid be ­
stämningen. Oavsett vilka åtgärder som vidtas för att dämpa delar av spektret genom filtrering eller genom ofrånkomlig inverkan från ut ­
rustningen får det spektrum som registreras under filtren inte avvika 
från standardiserat utomhusdagsljus (14). Ett exempel på bestrål ­
ningsfördelning för den filterförsedda solsimulator som användes i valideringsstudien av 3T3-NRU-fototoxicitetstestet  in vitro  ges i (8) ­
(16). Se även figur 1 i bilaga 2.
 
1.4.1.5.2 D o s i m e t r i 
Ljusets (strålningens) intensitet ska före varje fototoxicitetstest rutin ­
mässigt kontrolleras med hjälp av en lämplig bredbands-UV-mätare. Intensiteten ska mätas genom samma typ av lock som används för de 
96-hålsplattor som används för toxicitetsbestämningen. UV-mätaren 
måste ha kalibrerats mot källan och dess prestanda bör kontrolleras. För detta ändamål rekommenderas användning av en referensmätare, dvs. en annan, identiskt kalibrerad UV-mätare av samma typ. Helst 
ska man även då och då använda en spektroradiometer för att mäta 
den spektrala strålningen från den filtrerade ljuskällan och för att kontrollera bredbands-UV-mätarens kalibrering. 
En dos på 5 J/cm
 2 (UVA) fastställdes vara icke-toxisk för Balb/c 
3T3-celler men tillräckligt stark för att excitera kemikalier så att de utlöste fototoxiska reaktioner (6)(17). För att erhålla 5 J/cm
 2 inom 
50 minuter ställdes t.ex. strålningen in på 1,7 mW/cm  2 (figur 2, 
bilaga 2). Om en annan cellinje eller en annan ljuskälla används måste strålningsdosen eventuellt justeras så att en dosregim kan väljas som inte är skadlig för cellerna men som räcker för att excitera 
vanliga fototoxiska ämnen. Tiden för ljusexponeringen beräknas på 
följande sätt:
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 590
 
tðminÞ ¼ bestrålningsdos ðJ=cm 2 Þ Ü 1000 
bestrålning ðmW =cm 2 Þ Ü 60 (1J = 1 Ws)  
1.4.2  Försöksförhållanden  
1.4.2.1  Koncentrationer av testämne  
Koncentrationsområdena för en kemikalie som ska testas i närvaro (+ 
UVA) och i frånvaro (– UVA) av ljus ska först fastställas på lämpligt 
sätt i förberedande försök. Det kan vara lämpligt att testa lösligheten initialt och efter 60 minuter (eller den behandlingstid som ska an ­
vändas) eftersom lösligheten kan förändras med tiden eller under 
loppet av exponeringen. För att undvika toxicitet på grund av olämp ­
liga kulturbetingelser eller på grund av starkt sura eller basiska ke ­
mikalier ska pH för cellkulturerna med tillsatt testkemikalie ligga i området 6,5–7,8. 
Den högsta koncentrationen av testämne bör ligga inom fysiologiska 
testbetingelser, dvs. så att osmotisk stress och pH-stress undviks. 
Beroende på testkemikalien kan det vara nödvändigt att beakta andra 
fysikalkemiska egenskaper som faktorer som begränsar den högsta testkoncentrationen. För relativt svårlösliga ämnen som inte är tox ­
iska vid koncentrationer upp till mättnadspunkten ska den högsta 
möjliga koncentrationen testas. I regel ska utfällning av testkemika ­
lien vid någon testkoncentration undvikas. Den maximala koncent ­
rationen av ett testämne ska inte överstiga 1 000 μg/ml och osmola ­
riteten ska inte överstiga 10 mmolar. En geometrisk spädningsserie 
med 8 testämneskoncentrationer och konstant utspädningsfaktor ska 
användas (se avsnitt 2.1, andra stycket). 
Om information finns (från ett försök för att fastställa koncentrations ­
område) om att testkemikalien inte är cytotoxisk upp till gränskon ­
centrationen i mörkerförsöket (– UVA) men är starkt cytotoxisk vid bestrålning (+ UVA) kan de koncentrationsområden som ska väljas 
för ljusförsöket (+ UVA) skilja sig från dem som har valts för 
mörkerförsöket för att kravet på adekvat datakvalitet ska uppfyllas.
 
1.4.2.2  Kontroller  
1.4.2.2.1 C e l l e r n a s s t r å l n i n g s k ä n s l i g h e t , f a s t s t ä l l a n d e a v 
h i s t o r i s k a d a t a 
Cellerna bör rutinmässigt (ungefär vid var femte passage) kontrolle ­
ras med avseende på känslighet för ljuskällan genom att deras via ­
bilitet följs efter exponering för ökande stråldoser. Flera stråldoser, 
inbegripet nivåer betydligt över dem som används för 3T3 NRU- fototoxicitetstestet, ska användas för denna bestämning. Doserna kvantifieras lättast genom mätningar av ljuskällans UV-del. Cellerna 
sås med den täthet som används för 3T3 NRU-fototoxicitetstestet  in 
vitro  och bestrålas påföljande dag. Cellviabiliteten bestäms en dag 
senare med neutralröttupptag. Det ska visas att den resulterande högsta icke-cytotoxiska dosen (t.ex. vid 5 J/cm
 2 (UVA) vid valide ­
ringsstudien) räckte för att klassificera referenskemikalierna (tabell 1) 
korrekt.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 591
 
1.4.2.2.2 S t r å l n i n g s k ä n s l i g h e t , k o n t r o l l a v d e t a k t u e l l a 
t e s t e t 
Testet uppfyller kriterierna om de bestrålade negativkontrollerna med 
lösningsmedel uppvisar en viabilitet på över 80 % då de jämförs med obestrålade negativkontroller med lösningsmedel.
 
1.4.2.2.3 L ö s n i n g s m e d e l s k o n t r o l l e r n a s v i a b i l i t e t 
Den absoluta optiska densiteten (OD540 NRU) för neutralrött extra ­
herat från lösningsmedelskontrollerna visar om de 1×10  4 cellerna 
som såtts per hål har tillvuxit med normal fördubblingstid under de två dagar bestämningen pågått. Ett test uppfyller godtagbarhets ­
kriterierna om medelvärdet på OD540 NRU för de obehandlade 
kontrollerna är ≥ 0,4 (dvs. cirka tjugo gånger bakgrundsabsorbansen 
för lösningsmedlet).
 
1.4.2.2.4 P o s i t i v k o n t r o l l 
En känd fototoxisk kemikalie ska testas samtidigt med varje 3T3 
NRU-fototoxicitetstest  in vitro.  Klorpromazin (CPZ) rekommenderas. 
Följande godtagbarhetskriterier definierades för test av CPZ enligt standardprotokollet för 3T3 NRU-fototoxicitetstestet  in vitro:  bestrå­
lad CPZ (+ UVA): EC
 50 = 0,1 till 2,0 μg/ml, obestrålad CPZ (– 
UV): EC  50 = 7,0 till 90,0 μg/ml. Fotoirritationsfaktorn (PIF) ska vara 
> 6. Historisk prestanda för positivkontrollen ska följas. 
Andra fototoxiska kemikalier som är lämpliga med tanke på de tes ­
tade kemikaliernas kemikalieklass eller löslighetsegenskaper kan an ­
vändas som parallella positivkontroller i stället för klorpromazin.  
1.4.3  Testförfarande (6)(7)(8)(16)(17)  
1.4.3.1  Dag 1  
Dosera 100 μl näringslösning i de perifera hålen i en 96-håls mik ­
rotitterplatta för vävnadsodling (= blindprov). Dosera 100 μl cellsus­
pension med 1 x l0  5 celler/ml i näringslösning (= 1x104 celler/hål) i 
de återstående hålen. Två plattor ska beredas för varje serie av 
enskilda testämneskoncentrationer, för lösningsmedel och för positiv ­
kontroller. 
Inkubera cellerna i 24 timmar (se avsnitt 1.4.1.2) tills de bildar ett 
halvkonfluent monolayer. Denna inkuberingsperiod är tillräcklig för 
cellernas återhämtning och vidhäftning samt exponentiell tillväxt.  
1.4.3.2  Dag 2  
Dekantera näringslösningen från cellerna efter inkuberingen och 
tvätta två gånger med 150 μl av den buffertlösning som används 
för inkuberingen. Tillsätt 100 μl av buffertlösningen med lämplig 
koncentration av testkemikalie eller lösningsmedel (lösningsmedels ­
kontroll). Använd 8 olika koncentrationer av testkemikalien. Inku ­
bera cellerna med testämnet i mörker i 60 minuter (se avsnitt 1.4.1.2 och 1.4.1.4, andra stycket). 
Från de två plattor som beretts för varje koncentrationsserie av tes ­
tämne och kontroll väljs en, i regel slumpmässigt, för bestämning av 
cytotoxicitet (– UVA) (dvs. kontrollplattan), och en (behandlings ­
plattan) för bestämning av fotocytotoxicitet (+ UVA).
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 592
 
Utför bestämningens + UVA-del genom att bestråla cellerna vid 
rumstemperatur i 50 minuter genom locket på 96-hålsplattan med 
den högsta icke-cytotoxiska stråldosen (se även bilaga 2). Håll obe ­
strålade plattor (– UVA) i en mörk låda i 50 minuter (= UVA- exponeringstiden). 
Dekantera testlösningen och tvätta två gånger med 150 μl av den 
buffertlösning som används för inkuberingen, men utan testämnet. 
Ersätt bufferten med näringslösning och inkubera (se avsnitt 1.4.1.2) över natt (18–22 timmar).
 
1.4.3.3  Dag 3  
1.4.3.3.1 U t v ä r d e r i n g m e d m i k r o s k o p 
Cellerna ska undersökas i faskontrastmikroskop med avseende på 
tillväxt, morfologi och monolayerintegritet. Förändringar av cellernas morfologi och effekter på celltillväxten ska noteras.
 
1.4.3.3.2 T e s t m e d u p p t a g n i n g a v n e u t r a l r ö t t 
Tvätta cellerna med 150 μl föruppvärmd buffert. Avlägsna tvättlös ­
ningen genom att klappa försiktigt. Tillsätt 100 μl av 50 μg/ml 
neutralrött (NR) (3-amino-7-dimetylamino-2-metylfenazinhydroklo ­
rid, Einecs-nummer 209-035-8; CAS-nummer 553-24-2; C.I. 50040) 
i medium utan serum (16) och inkubera enligt beskrivningen i avsnitt 1.4.1.2 i tre timmar. Avlägsna NR-mediet efter inkuberingen och tvätta cellerna med 150 μl buffert. Dekantera och avlägsna över ­
skottet av buffert genom absorption eller centrifugering. 
Tillsätt exakt 150 μl NR-desorptionslösning (färsk lösning av 49 
delar vatten + 50 delar etanol + 1 del ättiksyra). 
Skaka mikrotiterplattan varsamt på en skakmaskin i 10 minuter tills 
NR har extraherats ur cellerna och en homogen lösning har bildats. 
Mät NR-extraktets optiska densitet vid 540 nm i en spektrofotometer 
och använd blindproven som referens. Spara data i lämpligt filformat för efterföljande analys.
 
2. DATA  
2.1 KVALITET OCH KVANTITET AV DATA 
Erhållna testdata bör ge möjlighet till meningsfull analys av den 
koncentrationsberoende respons som konstaterats i närvaro och i frånvaro av bestrålning och om möjligt den koncentration av test ­
kemikalien som minskar cellviabiliteten till 50 % (EC
 50 ). Om cyto ­
toxicitet detekteras ska både koncentrationsområdet och intervallet 
för enskilda koncentrationer anpassas så att försöksdata kan samman ­
ställas till en kurva. 
För både klart positiva och klart negativa resultat (se avsnitt 2.3, 
första stycket), kan det räcka med huvudförsöket, underbyggt med 
ett eller flera preliminära försök för bestämning av område.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 593
 
Om man får testresultat som är oklara eller kommer nära förutsäg ­
barhetsmodellens gräns måste resultaten verifieras genom upprepat 
test (se även avsnitt 2.4, andra stycket). I sådana fall bör man över ­
väga att variera försöksbetingelserna. Försöksbetingelser som kan varieras inbegriper koncentrationsområdet eller koncentrationsinter ­
vallet, förinkuberingstiden och bestrålningstiden. En kortare expone ­
ringstid kan vara lämplig för kemikalier som är instabila i vatten.
 
2.2 UTVÄRDERING AV RESULTATEN  
En fotoirritationsfaktor (PIF) eller ett MPE-värde (Mean Photo Ef ­
fect) kan beräknas för utvärderingen av data. 
Beräkning av måtten på fototoxicitet (se nedan) kräver att de diskreta 
värdena för koncentrationsrespons uppskattas med hjälp av en lämp ­
lig fullständig koncentrations-responskurva (försöksmodell). Kurv ­
anpassningen till data görs i regel med icke-linjär regression (18). 
För att bedöma datavariabilitetens inverkan på den anpassade kurvan rekommenderas bootstrap-metoden. 
En fotoirritationsfaktor (PIF) beräknas med hjälp av följande formel:
 
PIF ¼ EC 50 ðÄUVAÞ 
EC 50 ðþUVAÞ 
Om inget värde på EC  50 i närvaro eller frånvaro av ljus kan beräk ­
nas, går det inte att beräkna någon PIF för testämnet. MPE (Mean 
Photo Effect) bygger på en jämförelse mellan de fullständiga kon ­
centrations-responskurvorna (19). MPE definieras som det viktade medelvärdet över en representativ uppsättning fotoeffektvärden:
 
MPE ¼ Σ 
i ¼ 1 n 
w i PE c i 
Σ 
i ¼ 1 n 
w i 
Fotoeffekten PE  c vid koncentrationen C definieras som produkten av 
responseffekten RE  c och doseffekten DE  c dvs. PE  c = RE  c x DE  c . 
Responseffekten RE  c är skillnaden mellan observerade respons i 
frånvaro och i närvaro av ljus, dvs. RE  c = R  c (– UVA) –R  c 
(+ UVA). Doseffekten ges av  
DE  c ¼ C=C ä Ä 1 
C=C ä þ 1 Æ Æ Æ Æ Æ Æ Æ Æ 
där C* representerar ekvivalenskoncentrationen, dvs. den koncent ­
ration där + UVA-responsen är lika stor som – UVA-responsen 
vid koncentrationen C. Om C* inte kan bestämmas därför att svars ­
värdena på +UVA-kurvan systematiskt är högre eller lägre än R  C 
(– UVA) sätts doseffekten till 1. Viktningsfaktorerna w  i ges av det 
högsta responsvärdet, dvs. w  i = MAX {R  i (+ UVA), R  i (– UVA) }. 
Koncentrationsrastret C väljs så att samma antal punkter faller inom 
vart och ett av de koncentrationsintervall som definieras av de kon ­
centrationsvärden som användes i försöket. Beräkningen av MPE begränsas till det maximala koncentrationsvärde vid vilket minst en 
av de två kurvorna ännu uppvisar ett responsvärde på minst 10 %. 
Om denna maximala koncentration är högre än den högsta koncent ­
ration som användes i + UVA-försöket sätts den återstående delen av + UVA-kurvan till responsvärdet ”0”. Beroende på om MPE- 
värdet är större än ett korrekt valt tröskelvärde (MPE
 c =0,15) eller 
inte, klassificeras kemikalien som fototoxisk.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 594
 
Ett programpaket för beräkning av PIF och MPE finns tillgängligt 
från (20).  
2.3 TOLKNING AV RESULTATEN 
Baserat på valideringsstudien (8) förutsäger PIF < 2 eller MPE < 
0,1”ingen fototoxicitet”. PIF > 2 och <5 eller MPE > 0,1 och < 0,15 förutsäger ”sannolik fototoxicitet”. PIF > 5 eller MPE > 0,15 för ­
utsäger ”fototoxicitet”. 
Ett laboratorium som ska börja använda denna bestämningsmetod 
ska testa de referensmaterial som listas i tabell 1 innan man börjar testa ämnen för fototoxisk bestämning. PIF- eller MPE-värdena ska 
ligga nära dem som anges i tabell 1.
 
Tabell 1  
Kemiskt namn EINECS-nr CAS-nr PIF MPE Absorptions- 
topp Lösnings­
medel (  1 ) 
Amiodaron-HCl 243-293-2 [19774-82-4] > 3,25 0,27–0,54 242 nm 
300 nm 
(axel) etanol 
Kloropromazin- 
HCl 200-701-3 [69-09-0] > 14,4 0,33–0,63 309 nm etanol 
Norfloxacin 274-614-4 [70458-96-7] > 71,6 0,34–0,90 316nm acetonitril 
Antracen 204-371-1 [120-12-7] > 18,5 0,19–0,81 356 nm acetonitril 
Protoporfyrin 
IX, Dinatrium 256-815-9 [50865-01-5] >4 5,3 0,54–0,74 402 nm etanol 
L-Histidin [7006-35-1] no PIF 0,05–0,10 211nm vatten 
Hexaklorofen 200-733-8 [70-30-4] 1,1–1,7 0,00–0,05 299 nm 
317nm 
(axel) etanol 
Natriumlauryl ­
sulfat 205-788-1 [151-21-3] 1,0–1,9 0,00–0,05 Ingen 
absorption vatten  
( 1 ) Lösningsmedel som används vid absorptionsmätning.  
2.4 TOLKNING AV DATA 
Om fototoxisk verkan observeras endast vid den högsta testkoncent ­
rationen (särskilt för vattenlösliga testkemikalier), kan ytterligare fak ­
torer behöva beaktas för bestämning av skadligheten. Dessa faktorer kan inbegripa data om hudabsorption och ackumulering av kemika ­
lien i huden och/eller data från andra test, t.ex. test av kemikalien på 
djur- eller människohud  in vitro  eller på hudmodeller.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 595
 
Om ingen toxicitet påvisas (+ UVA och – UVA) och om dålig 
löslighet begränsade de koncentrationer som kunde testas bör tes ­
tämnets lämplighet för bestämningsmetoden ifrågasättas och verifie ­
rande testning bör övervägas, t.ex. en annan modell.  
3. RAPPORTERING  
TESTRAPPORT 
Testrapporten ska innehålla följande uppgifter: 
Testämne: — identifieringsdata, vanliga generiska namn och IUPAC- och 
CAS-nummer (i mån av tillgänglighet), 
— fysikalisk form och renhetsgrad, — fysikalisk-kemiska egenskaper av betydelse för studien, — absorptionsspektrum för UV/synligt ljus, — stabilitet och fotostabilitet (i mån av tillgänglighet). Lösningsmedel: 
— motivering av valet av lösningsmedel, 
— testkemikaliens löslighet i det valda lösningsmedlet, — procenthalten lösningsmedel i behandlingsmediet. Celler: — typ av celler och deras källa, 
— frånvaron av mykoplasma, 
— antalet cellpassager (i mån av tillgänglighet), — cellernas strålningskänslighet, bestämd med den bestrålnings ­
utrustning som använts för 3T3 NRU-fototoxicitetstestet  in vitro.  
Försöksförhållanden (1) –  inkubering före och efter behandlingen:  
— näringslösningens (kulturmediets) typ och sammansättning, 
— inkuberingsförhållanden (CO
 2 -koncentration, temperatur, fuktighet), 
— inkuberingens varaktighet (förbehandling, efterbehandling). Försöksförhållanden (2) –  behandling med kemikalien:  
— motivering för valet av de koncentrationer som använts i närvaro 
och i frånvaro av bestrålning med ljus, 
— om testkemikalien är begränsat löslig och om cytotoxicitet inte 
föreligger, motivering för den högsta koncentration som testats, 
— typ och sammansättning hos behandlingsmediet (buffrad saltlös ­
ning), 
— kemikaliebehandlingens varaktighet. 
Försöksförhållanden (3) –  bestrålning:  
— motivering för valet av den ljuskälla som använts,
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 596
 
— tillverkare och typ av ljuskälla och radiometer, 
— ljuskällans spektrala strålningsegenskaper, 
— transmissions- och absorptionsegenskaper hos de filter som an ­
vänts, 
— radiometerns egenskaper och närmare uppgifter om kalibreringen, 
— avstånd mellan ljuskälla och testsystem, 
— UVA-bestrålning på detta avstånd, uttryckt i mW/cm  2 , 
— varaktigheten hos bestrålningen med UV/synligt ljus, 
— UVA-dos (bestrålning x tid), uttryckt i J/cm  2 , 
— temperatur som använts för cellodlingarna under bestrålningen 
och för cellodlingar som parallellt hållits i mörker. 
Försöksförhållanden (4) –  viabilitetstest med neutralrött (NR):  
— sammansättning hos NR-mediet, 
— NR-inkuberingens varaktighet, 
— inkuberingsförhållanden (CO  2 -koncentration, temperatur, fuktighet), 
— NR-extraktionsbetingelser (extraktionsmedel, varaktighet), 
— våglängd som använts för spektrofotometrisk avläsning av optisk 
densitet för NR, 
— annan våglängd (referens), om sådan har använts, 
— spektrofotometerblindprovets innehåll, om blindprov har använts. 
Resultat: 
— cellviabilitet som erhållits vid varje koncentration av testkemika ­
lien uttryckt som genomsnittlig procentandel jämfört med lös ­
ningsmedelskontrollernas viabilitet, 
— koncentrations-responskurvor (testkemikaliekoncentration i för ­
hållande till relativ cellviabilitet) som erhållits i parallella försök med + UVA och – UVA, 
— analys av koncentrations-responskurvorna: om möjligt beräkning 
av EC
 50 (+ UVA) och EC  50 (– UVA), 
— jämförelse av de två koncentrations-responskurvorna som erhål ­
lits i närvaro och i frånvaro av bestrålning med UVA/synligt ljus, antingen genom beräkning av PIF (fotoirritationsfaktorn) eller genom beräkning av MPE (Mean-Photo-Effect) 
— kriterier för godkännande av testet – parallell lösningsmedels ­
kontroll: 
— absolut viabilitet (optisk densitet hos neutralröttsextraktet) hos 
bestrålade och obestrålade celler, 
— historiska data för negativ- och lösningsmedelskontroll – medel ­
värde och standardavvikelse, 
— kriterier för godkännande av testet – parallell positivkontroll:
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 597
 
— EC  50 (+ UVA) och EC  50 (– UVA) och PIF/MPE för positivkon ­
trollkemikalie, 
— historiska data för positivkontrollkemikalie: EC50 (+ UVA) och 
EC 50 (– UVA) och PIF/MPE, medelvärde och standardavvikelse. 
Diskussion av resultaten. Slutsatser.
 
4. HÄNVISNINGAR  
1. Lovell W.W. (1993). A scheme for  in vitro  screening of sub ­
stances for photoallergenic potential. Toxic. In Vitro 7: 95–102. 
2. Santamaria, L. and Prino, G. (1972). List of the photodynamic 
substances. In ”Research Progress in Organic, Biological and Medicinal Chemistry” Vol. 3 part 1. North Holland Publishing Co. Amsterdam. p XI–XXXV. 
3. Spielmann, H., Lovell, W.W., Hölzle, E., Johnson, B.E., 
Maurer, T., Miranda, M.A., Pape, W.J.W., Sapora, O., and 
Sladowski, D. (1994).  In vitro  phototoxicity testing: The report 
and recommendations of ECVAM Workshop 2. ATLA, 22, 314–348. 
4. Spikes, J.D. (1989). Photosensitization. In ”The science of Pho ­
tobiology” Edited by K.C. Smith. Plenum Press, New York. 2nd edition, p 79–110. 
5. OECD (1997) Environmental Health and Safety Publications, 
Series on Testing and Assessment No.7 ”Guidance Document on Direct Phototransformation of Chemicals in Water” Environ ­
ment Directorate, OECD, Paris. 
6. Spielmann, H., Balls, M., Döring, B., Holzhütter, H.G., Kalwe ­
it, S., Klecak, G., L'Eplattenier, H., Liebsch, M., Lovell, W.W., 
Maurer, T., Moldenhauer. F. Moore. L., Pape, W., Pfannbecker, U., Potthast, J., De Silva, O., Steiling, W., and Willshaw, A. (1994). EEC/COLIPA project on  in vitro  phototoxicity testing: 
First results obtained with a Balb/c 3T3 cell phototoxicity assay. 
Toxic. In Vitro 8, 793–796. 
7. Anon (1998). Statement on the scientific validity of the 3T3 
NRU PT test (an  in vitro  test for phototoxicity), European Com ­
mission, Joint Research Centre: ECVAM and DGXI/E/2, 3 November 1997, ATLA, 26, 7–8. 
8. Spielmann, H., Balls, M., Dupuis, J., Pape, W.J.W., Pechovitch, 
G. De Silva, O., Holzhütter, H.G., Clothier, R., Desolle, P., 
Gerberick, F., Liebsch, M., Lovell, W.W., Maurer, T., Pfannen ­
becker, U., Potthast, J. M., Csato, M., Sladowski, D., Steiling, W., and Brantom, P. (1998). The international EU/COLIPA  In 
vitro  phototoxicity validation study: results of phase II (blind 
trial), part 1: the 3T3 NRU phototoxicity test. Toxic. In Vitro 
12, 305–327. 
9. OECD (2002) Extended Expert Consultation Meeting on The In 
Vitro 3T3 NRU Phototoxicity Test Guideline Proposal, Berlin, 30
 th –31  th October 2001, Secretariat's Final Summary Report, 
15 th March 2002, OECD ENV/EHS, available upon request 
from the Secretariat. 
10. Borenfreund, E., and Puerner, J.A. (1985). Toxicity determina ­
tion in vitro  by morphological alterations and neutral red 
absorption. Toxicology Lett., 24, 119–124. 
11. Hay, R.J. (1988) The seed stock concept and quality control for 
cell lines. Analytical Biochemistry 171, 225–237.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 598
 
12. Lambert L.A, Warner W.G., and Kornhauser A. (1996) Animal 
models for phototoxicity testing. In ”Dermatotoxicology”, edi ­
ted by F.N. Marzulli and H.I. Maibach. Taylor & Francis, Was ­
hington DC. 5  th Edition, p 515–530. 
13. Tyrrell R.M., Pidoux M (1987) Action spectra for human skin 
cells: estimates of the relative cytotoxicity of the middle ultra ­
violet, near ultraviolet and violet regions of sunlight on epider ­
mal keratinocytes. Cancer Res., 47, 1825–1829. 
14. ISO 10977. (1993). Photography – Processed photographic col ­
our films and paper prints – Methods for measuring image stability. 
15. Sunscreen Testing (UV.B) TECHNICAL REPORT, CIE, Inter ­
national Commission on Illumnation, Publication No. 90, Vien ­
na, 1993, ISBN 3 900 734 275. 
16. ZEBET/ECVAM/COLIPA – Standard Operating Procedure:  In 
Vitro  3T3 NRU Phototoxicity Test. Final Version, 7 September, 
1998. 18 pgs. 
17. Spielmann, H., Balls, M., Dupuis, J., Pape, W.J.W., De Silva, 
O., Holzhütter, H.G., Gerberick, F., Liebsch, M., Lovell, W.W., and Pfannenbecker, U. (1998) A study on UV filter chemicals 
from Annex VII of the European Union  Directive 76/768/EEC,  
in the  in vitro  3T3 NRU phototoxicity test. ATLA 26, 679–708. 
18. Holzhütter, H.G., and Quedenau, J. (1995) Mathematical mode ­
ling of cellular responses to external signals. J. Biol. Systems 3, 127–138. 
19. Holzhütter, H.G. (1997). A general measure of  in vitro  photo­
toxicity derived from pairs of dose-response curves and its use 
for predicting the  in vivo  phototoxicity of chemicals. ATLA, 25, 
445–462. 
20. http://www.oecd.org/document/55/ 
0,2340,en_2649_34377_2349687_1_1 _1_1,00.html
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 599
 
Bilaga 1  
Rollen för 3T3 NRU-fototoxicitetstest vid ett sekventiellt tillvägagångssätt för 
fototoxicitetstestning av kemikalier
  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 600
 
Bilaga 2  
Figur 1  
Spektral strålningsdistribution från en filtrerad solsimulator
  
(se avsnitt 1.4.1.5, andra stycket) 
Figur 1 ger ett exempel på en godtagbar strålningsdistribution för en filtrerad solsimulator. Värdena 
kommer från den dopade metallhalidkälla som användes i valideringsstudien för 3T3 NRU-fototox ­
icitetstest (6)(8)(17). Effekten av två olika filter och den ytterligare filtreringsverkan från locket på 96-hålsplattan visas. H2-filtret användes endast med testsystem som tål en större mängd UVB (test 
med hudmodell och fotohemolystest med röda blodkroppar). I 3T3 NRU-fototoxicitetstestet använ ­
des H1-filtret. Figuren visar den ytterligare filtreringsverkan som plattlocket ger, huvudsakligen i UVB-området, som dock fortfarande lämnar tillräckligt med UVB i strålningsspektret för att ex ­
citera kemikalier som normalt absorberar i UVB-området, t.ex. amiodaron (se tabell 1).
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 601
 
Figur 2  
Strålningskänslighet hos Balb/c 3T3-celler (mätt i UVA-området)  
Cellviabilitet ( % NR-upptag hos mörkerkontroller)
  
(se avsnitt 1.4.1.5.2, andra stycket, 1.4.2.2.1, 1.4.2.2.2) 
Känslighet hos Balb/c 3T3-celler mot bestrålning med den solsimulator som användes i validerings ­
studien av 3T3 NRU-fototoxicitetstestet, mätt i UVA-området. Figuren visar resultat erhållna på 7 
olika laboratorier vid förvalideringsstudien (1). De två kurvorna med öppna symboler erhölls med 
åldrade celler (stort antal passager) som man hade varit tvungen att ersätta med nya celler. Kurvorna med symboler i fetstil visar celler med godtagbar strålningstolerans. 
Den högsta icke-cytotoxiska stråldosen på 5 J/cm
 2 erhölls från dessa data (vertikal streckad linje). 
Den horisontella streckade linjen visar dessutom den maximala godtagbara strålningseffekten som 
ges i stycke 1.4.2.2.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 602
 
B.42.  HUDSENSIBILISERING: LLNA-METODEN (LOCAL LYMPH 
NODE ASSAY)  
INLEDNING 
1. OECD:s riktlinjer för testning av kemikalier (OECD Guidelines for the 
Testing of Chemicals) och EU:s testmetoder baserade på dem ses regelbun ­
det över med hänsyn till den vetenskapliga utvecklingen, nya lagstiftnings ­
behov och djurens välbefinnande. Den ursprungliga testmetoden för bestäm ­
ning av hudsensibilisering hos möss, LLNA-metoden (OECD:s testriktlinje 
429, kapitel B.42 i denna bilaga), har antagits tidigare (1). Närmare upp ­
gifter om valideringen av LLNA-metoden och en granskning av arbetet i samband med denna har offentliggjorts (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9) (10) (11). Den uppdaterade LLNA-metoden grundar sig på utvärderingen av 
experimentella och vetenskapliga uppgifter (12). Detta är den andra test ­
metoden som tas fram för bedömning av kemikaliers (ämnens och bland ­
ningars) potential att framkalla hudsensibilisering hos djur. Den gamla test ­
metoden (dvs. OECD:s testriktlinje 406, kapitel B.6 i denna bilaga) omfattar 
test på marsvin, särskilt maximeringstest på marsvin och Buehler-test (13). Jämfört med B.6 och OECD:s testriktlinje 406 (13) har LLNA fördelar när det gäller djurens välbefinnande. Den uppdaterade LLNA-testmetoden om ­
fattar en uppsättning prestandastandarder (tillägg 1) som kan användas för 
att utvärdera valideringsstatus för nya och/eller modifierade testmetoder som är funktionellt och mekaniskt likartade med LLNA, enligt principerna i OECD:s riktlinjedokument nr 34 (14). 
2. LLNA används för att undersöka hudsensibiliseringens induktionsfas, vilket 
ger tillgång till kvantitativa data som är lämpliga för dos–responsbedöm ­
ning. Här bör noteras att de ämnen som har milda till moderata sensibili ­
seringsegenskaper och som anses vara lämpliga som positivt kontrollämne 
för testmetoder med marsvin (dvs. B.6, OECD:s testriktlinje 406) (13), även är lämpliga för LLNA-metoden (6) (8) (15). Inom denna testmetod beskrivs 
också en variant som kallas reducerat LLNA-test (rLLNA), med upp till 40 
procent färre djur (16) (17) (18). Denna variant kan användas när det finns lagstiftade krav på att bekräfta negativ förutsägelse för hudsensibiliserande potential, förutsatt att alla andra LLNA-protokollspecifikationer följs enligt 
beskrivningen av denna testmetod. Förutsägelsen av negativt resultat ska 
bygga på tillgänglig information enligt beskrivningen i punkt 4. För till ­
lämpning av rLLNA krävs klara motiveringar och vetenskapliga belägg. Om det mot förmodan uppstår positiva eller tvetydiga resultat med rLLNA kan 
det krävas ytterligare testning för att tolka eller förtydliga resultaten. Vari ­
anten rLLNA bör inte användas för faroidentifiering av hudsensibiliserande testämnen i fall där dos–responsinformation behövs, t.ex. vid underklassifi ­
cering för förordning (EG) nr 1272/2008 om klassificering, märkning och 
förpackning av ämnen och blandningar och Förenta nationernas globalt 
harmoniserade system för klassificering och märkning av kemikalier.
 
DEFINITIONER 
3. Definitioner av begreppen finns i tillägg 2.  
INLEDANDE ÖVERVÄGANDEN OCH BEGRÄNSNINGAR 
4. LLNA är en alternativ metod för identifiering av hudsensibiliserande kemika ­
lier. Detta betyder dock inte nödvändigtvis att LLNA alltid ska användas i 
stället för test på marsvin (dvs. B.6; OECD:s testriktlinje 406) (13), utan att LLNA-metoden är likvärdig och kan användas som ett alternativ i fall där positiva och negativa resultat i regel inte kräver någon ytterligare bekräftelse. 
Testningslaboratoriet bör analysera all tillgänglig information om testämnet 
innan själva testningen genomförs. Denna information omfattar ämnets
 ▼M3 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 603
 
identitet och kemiska struktur, fysikalisk-kemiska egenskaper, resultaten från 
andra eventuella  in vitro - eller  in vivo -test avseende toxicitet samt toxikolo ­
giska data om strukturellt närbesläktade kemikalier. Med stöd av denna infor ­
mation bör man överväga om LLNA-metoden är lämplig för ämnet (med tanke på att metoden inte kan användas för vissa typer av kemikalier, se punkt 5) och 
använda informationen som hjälp vid valet av dos. 
5. LLNA är en  in vivo -metod, och av detta följer att man måste använda djur 
för att bedöma sensibilisering genom allergisk kontakt. Metoden ger dock möjligheter att minska antalet djur. Dessutom ger LLNA möjlighet till bättre 
behandling av djuren (mindre smärta och lidande) vid test avseende sensi ­
bilisering genom allergisk kontakt. LLNA baserar sig på observationer av immunologiska händelser som stimuleras av kemikalier under sensibilise ­
ringens induktionsfas. Till skillnad från test på marsvin (dvs. B.6; OECD:s 
testriktlinje 406) (13) kräver LLNA inte framkallning av provokationsindu ­
cerade dermala hypersensitivitetsreaktioner. Dessutom behöver adjuvant inte användas, vilket är fallet vid maximeringstest på marsvin (13). LLNA är 
därför en mindre plågsam metod för djuren. Trots LLNA-metodens fördelar 
jämfört med B.6 och OECD:s testriktlinje 406 bör man vara medveten om att LLNA har vissa begränsningar. Det kan därför i vissa fall vara nödvän ­
digt att använda B.6 eller OECD:s testriktlinje 406 (13) (t.ex. falska negativa 
fynd med LLNA för vissa metaller eller falska positiva fynd för vissa 
hudirriterande ämnen [såsom vissa ytaktiva kemikalier] (19) (20) eller tes ­
tämnets löslighet). Därutöver gäller att kemiska klasser eller ämnen vars funktionella grupper har påvisats agera som potentiella störfaktorer (21) 
kan göra det nödvändigt att använda test på marsvin (dvs. B.6; OECD:s 
testriktlinje 406) (13). På grund av den begränsade valideringsdatabasen, som primärt bestod av växtskyddsmedelsformuleringar, är det mer sannolikt att LLNA i jämförelse med test på marsvin ger positivt resultat för dessa 
typer av testämnen (22). Vid testning av formuleringar kan man dock över ­
väga att även använda liknande ämnen med kända resultat som referens ­
ämnen för att påvisa att LLNA-metoden fungerar tillfredsställande (se punkt 16). När dessa identifierade begränsningar räknas bort bör LLNA gå att 
använda för testning av alla ämnen, utom om ett ämne förknippas med 
egenskaper som kan påverka LLNA-metodens exakthet.
 
PRINCIP FÖR TESTMETODEN 
6. LLNA bygger på principen om att sensibiliserande ämnen inducerar en 
primär proliferation av lymfocyter i de lymfnoder som dränerar det område 
där testämnet appliceras. Denna proliferation står i proportion till den ap ­
plicerade dosen och det allergiframkallande ämnets styrka, och är ett enkelt sätt att få en kvantitativ mätning av sensibiliseringen. Proliferationen mäts 
genom att jämföra medelproliferationen i varje testgrupp med medelprolife ­
rationen i den vehikelbehandlade kontrollgruppen. Förhållandet mellan me ­
delproliferationen i respektive behandlingsgrupp och den parallella vehikel ­
kontrollgruppen, kallat stimulationsindex (SI), bestäms och detta bör vara 
≥ 3 för att det ska vara motiverat att klassificera testämnet som potentiellt 
hudsensibiliserande ämne. De förfaranden som beskrivs här grundar sig på radioaktiv märkning  in vivo  för mätning av ett ökat antal prolifererande 
celler i de aurikulära dränerande lymfnoderna. Det går dock också att an ­
vända andra slutpunkter för bedömning av antalet prolifererande celler, för ­
utsatt att kraven enligt prestandastandarderna uppfylls till fullo (tillägg 1).
 ▼M3 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 604
 
TESTBESKRIVNING  
Val av djurart  
7. För detta test används mus. I testet används unga vuxna mushonor av 
stammen CBA/Cirka eller CBA/J som inte har fått ungar och som inte är 
dräktiga. När försöket inleds bör djuren vara 8–12 veckor gamla. Djurens viktvariation bör vara minimal och får inte överskrida 20 % av medelvikten. 
Övriga stammar eller hanar kan användas som alternativ förutsatt att det 
finns tillräckliga data som stöd för att det inte förekommer några betydande stam- eller könsberoende skillnader i LLNA-respons.
 
Inhysnings- och utfodringsförhållanden  
8. Mössen ska inhysas i grupper (23), utom om det finns tillbörlig vetenskaplig 
motivering för individuell inhysning. Temperaturen i testdjurens utrymmen 
bör vara 22 ± 3 °C. Den relativa fuktigheten bör vara minst 30 % och ska 
helst inte överstiga 70 %, utom när rummet rengörs. Målvärdet bör dock vara 50–60 %. Belysningen bör vara artificiell med omväxlande 12 timmar ljus och 12 timmar mörker. För utfodringen kan konventionellt laboratorie ­
foder användas och djuren bör ha obegränsad tillgång till dricksvatten.
 
Förberedelse av djuren  
9. Djuren väljs ut slumpmässigt och förses med märkning så att de kan iden ­
tifieras individuellt (öronmärkning får dock inte användas). Därefter får djuren acklimatisera sig till laboratoriets betingelser i sina burar i minst fem dagar före doseringsstart. Innan behandlingen inleds undersöks alla 
djur för att säkerställa att de inte har synliga hudskador.
 
Beredning av doseringslösningar  
10. Kemikalier i fast form ska upplösas eller suspenderas i lösningsmedel/vehi ­
kel och vid behov spädas ut före appliceringen på mössens öron. Kemikalier i vätskeform kan appliceras i ren eller utspädd form. Olösliga kemikalier, av den typ som ofta används i medicintekniska produkter, ska extraheras kraf ­
tigt i lämpligt lösningsmedel så att alla extraherbara beståndsdelar för test ­
ning fås ut före appliceringen på mössens öron. Testlösningarna ska beredas dagligen utom om stabilitetsdata visar att lagring kan accepteras.
 
Tillförlitlighetskontroll  
11. Positiva kontrollkemikalier används för att påvisa att testsystemet har till ­
räcklig och reproducerbar känslighet för ett sensibiliserande testämne och att 
responsen har välkarakteriserad styrka. Användning av en parallell positiv 
kontroll rekommenderas eftersom den påvisar laboratoriets kompetens att genomföra testningar på ett framgångsrikt sätt och ger möjlighet att bedöma reproducerbarhet och jämförbarhet inom laboratoriet och mellan laboratorier. 
Även vissa tillsynsmyndigheter kräver att positiv kontroll används för varje 
testning och därför uppmuntras användarna att tillfråga relevanta myndighe ­
ter innan testning med LLNA-metoden genomförs. Likaså uppmuntras rutin ­
användning av parallell positiv kontroll för att undvika tilläggstestning på 
djur i fall där myndigheterna inte godkänner periodiska positiva kontroller 
(se punkt 12). Den positiva kontrollen bör ge en positiv LLNA-respons på den exponeringsnivå som förväntas ge en ökning av stimulationsindex (SI) större än 3 jämfört med den negativa kontrollgruppen. Den positiva kontroll ­
kemikaliens dos ska väljas så att den inte orsakar särskilt kraftig hudirrita ­
tion eller systemisk toxicitet och att induktionen är reproducerbar men inte
 ▼M3 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 605
 
för kraftig (dvs. SI > 20 är ett för högt värde). Rekommenderade ämnen är 
25-procentig hexylkanelaldehyd (CAS nr 101-86-0) i aceton-olivoljebland ­
ning i förhållandet 4:1 (volym/volym) och 5-procentig merkaptobensotiazol (CAS nr 149-30-4) i  N,N -dimetylformamid (se tillägg 1, tabell 1). I vissa 
fall kan även andra positiva kontrollkemikalier som uppfyller ovan angivna 
kriterier användas, förutsatt att tillbörlig motivering ges. 
12. Trots att parallell positiv kontrollgrupp rekommenderas kan det finnas be ­
tingelser där det är tillräckligt med periodisk testning (dvs. minst var sjätte månad) av den positiva kontrollen – detta gäller laboratorier som regelbun ­
det genomför LLNA (dvs. minst en gång i månaden) och har en etablerad 
historisk databas över positiva kontroller som påvisar laboratoriets förmåga att få reproducerbara och exakta resultat från dem. Tillräcklig kvalitet hos LLNA kan framgångsrikt påvisas genom enhetliga positiva resultat med den 
positiva kontrollen vid minst tio oberoende testningar som genomförs inom 
en skälig tidsperiod (kortare än ett år). 
13. Parallell positiv kontrollgrupp ska alltid användas vid ändringar rörande 
testningsförfarandet (t.ex. ny personal, nya material och/eller reagenser, an ­
norlunda utrustning, byte av testdjurens ursprung), och sådana ändringar bör 
dokumenteras i laboratorierapporter. Man bör överväga om dessa ändringar påverkar den tidigare etablerade historiska databasens lämplighet, för att kunna avgöra om det behövs en ny historisk databas för dokumentering 
av den positiva kontrollens resultatenhetlighet. 
14. Man bör vara medveten om att beslut om att testa positiva kontroller med 
vissa intervaller i stället för parallellt har återverkningar på lämpligheten och godtagbarheten hos negativa undersökningsresultat som fås utan parallell 
positiv kontroll under den tid som löper mellan de periodiska testningarna 
av positiv kontroll. Om t.ex. falska negativa resultat fås vid ett periodiskt test av positiv kontroll, måste man kanske ifrågasätta resultat som erhållits mellan det sista godtagbara periodiska testet med positiv kontroll och ett 
icke-godtagbart periodiskt test med positiv kontroll. Följderna av dessa utfall 
bör övervägas noggrant när man avgör huruvida parallella positiva kontrol ­
ler ska användas eller om de positiva kontrollerna enbart ska vara perio ­
diska. Likaså bör man överväga att använda färre djur i den parallella 
positiva kontrollgruppen när detta är vetenskapligt motiverat och laboratoriet 
med stöd av laboratoriespecifika historiska data kan påvisa att detta är gångbart (12). 
15. Även om det positiva kontrollämnet bör testas i en vehikel som veterligen 
framkallar enhetlig respons (t.ex. aceton-olivoljeblandning i förhållandet 4:1 
[volym/volym]), kan det förekomma vissa föreskriftsreglerade situationer där det även krävs testning i en icke-standardmässig vehikel (kliniskt och ke ­
miskt relevant formulering) (24). Om det parallella positiva kontrollämnet 
testas i en annan vehikel än den som används för testämnet, bör en separat 
vehikelkontrollgrupp användas för den parallella positiva kontrollen. 
16. I fall där utvärdering görs av testämnen av en viss kemisk klass eller med en 
viss responsskala kan det också vara värdefullt med referensämnen för att 
påvisa att testmetoden fungerar tillfredsställande för bestämning av hudsen ­
sibiliseringspotentialen hos dessa typer av testämnen. Ett lämpligt referens ­
ämne ska ha följande egenskaper: 
— Strukturell och funktionell likhet med den ämnesklass som testas. 
— Kända fysikalisk-kemiska egenskaper. 
— Stödjande data från LLNA. — Stödjande data från andra djurmodeller och/eller från människor.
 ▼M3 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 606
 
TESTFÖRFARANDE  
Antalet djur och dosnivåer  
17. Det ska finnas minst fyra djur per dosgrupp och minst tre koncentrationer av 
testämnet. Det ska också finnas en parallell negativ kontrollgrupp som en ­
dast behandlas med samma vehikel som används för testämnet och en positiv kontroll (parallell eller nyligen gjord periodisk kontroll, i enlighet 
med laboratoriets principer rörande punkterna 11–14). Man bör överväga 
flera doser av det positiva kontrollämnet, särskilt när den positiva kontrollen testas periodiskt. Med undantag för behandling med testämnet bör djuren i kontrollgrupperna hanteras på exakt samma sätt som djuren i dosgrupperna. 
18. Doserna och vehikeln bör väljas på grundval av rekommendationerna i 
hänvisningarna (3) och (5). Doserna väljs i regel enligt en lämplig koncent ­
rationsserie såsom 100 %, 50 %, 25 %, 10 %, 5 %, 2,5 %, 1 %, 0,5 % osv. Valet av koncentrationsserie ska ges tillbörlig vetenskaplig motivering. All 
existerande tillgänglig och relevant toxikologisk information (t.ex. akut tox ­
icitet och hudirritation) samt strukturell och fysikalisk-kemisk information om testämnet (och/eller strukturellt besläktade ämnen) bör beaktas när man väljer de tre på varandra följande koncentrationerna så att den högsta kon ­
centrationen ger maximal exponering samtidigt som systemisk toxicitet och 
särskilt kraftig lokal hudirritation undviks (3) (25). Om sådan information inte finns kan det vara nödvändigt med ett preliminärt screeningtest (se punkterna 21–24). 
19. Vehikeln får inte störa eller snedvrida testresultaten och ska väljas med 
tanke på största möjliga löslighet och därmed högsta möjliga koncentration samtidigt som lösningen/suspensionen ska vara lämplig för applicering av testämnet. Som vehikel rekommenderas aceton-olivoljeblandning (4:1 vo ­
lym/volym),  N,N -dimetylformamid, metyletylketon, propylenglykol och di ­
metylsulfoxid (19) men även andra vehiklar kan användas förutsatt att till ­
räcklig vetenskaplig motivering kan ges. I vissa situationer kan det vara nödvändigt att som extra kontroll använda ett kliniskt relevant lösnings ­
medel eller en kommersiellt tillgänglig blandning där testämnet ingår. Sär ­
skild vikt bör fästas vid att se till att hydrofila testämnen inkorporeras i ett vehikelsystem som väter huden och som inte omedelbart rinner bort, genom att använda lämpliga solubiliserande ämnen (t.ex. 1-procentig Pluronic® 
L92). Det betyder att helt vattenbaserade vehiklar bör undvikas. 
20. Genom analys av lymfnoder från individuella möss kan man bestämma 
variationer djuren emellan och göra en statistisk jämförelse av skillnaden mellan mätningar för testämnet och mätningarna i vehikelkontrollgruppen 
(se punkt 35). Möjligheten att minska antalet möss i den positiva kontroll ­
gruppen finns endast när data samlas in individuellt per djur (12). Vidare gäller att vissa tillsynsmyndigheter kräver att data insamlas individuellt. 
Vissa tillsynsmyndigheter kan godkänna poolade djurdata och då kan man 
välja mellan att samla in djurdata individuellt eller poolat.
 
Preliminärt screeningtest  
21. Om det inte finns information som grund för att bestämma högsta testdosen 
(se punkt 18) bör man göra ett preliminärt screeningtest för att definiera den 
lämpliga dosnivån för LLNA. Syftet med det preliminära screeningtestet är 
att få vägledning för valet av högsta dosnivå i huvudundersökningen, i fall där information saknas om vilken koncentration som inducerar systemisk toxicitet (se punkt 24) och/eller särskilt kraftig lokal hudirritation (se punkt 
23). Den högsta dosnivå som testas ska vara 100 % testämne för vätskor 
eller högsta möjliga koncentration för fasta ämnen eller suspensioner.
 ▼M3 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 607
 
22. Det preliminära screeningtestet genomförs under identiska betingelser som 
huvudundersökningen, utom att proliferationen i lymfnoderna inte utvärderas 
och dosgruppen kan ha lägre antal djur. Ett eller två djur per dosgrupp föreslås. Alla möss observeras dagligen för kliniska tecken på systemisk toxicitet eller lokal irritation på appliceringsstället. Djurens kroppsvikt regi ­
streras före testningen och efter avslutad testning (dag 6). På varje mus 
observeras båda öronens hudrodnad och graderas enligt tabell 1 (25). Mät ­
ning av örontjocklek görs t.ex. med digital mikrometer eller Peacock Dial-instrument på dag 1 (före dosering), dag 3 (cirka 48 timmar efter 
den första dosen) och på dag 6. Dessutom kan örontjockleken bestämmas 
på dag 6 genom vägning av en öronbit som stansats ut efter skonsam avlivning. Särskilt kraftig lokal hudirritation indikeras genom gradering ≥ 3 för hudrodnad och/eller ökning av örontjockleken med ≥ 25 % på någon 
av mätningsdagarna (26) (27). Den högsta dos som väljs för huvudunder ­
sökningen blir nästa lägre dos i den preliminära screeningens koncent ­
rationsserie (se punkt 18) som inte inducerar systemisk toxicitet och/eller särskilt kraftig hudirritation.
 
Tabell 1  
Gradering av hudrodnad  
Observation Gradering  
Ingen hudrodnad 0 
Mycket svag hudrodnad (knappt skönjbar) 1 
Väldefinierad hudrodnad 2 Moderat till svår hudrodnad 3 
Svår hudrodnad (köttrodnad) till sårskorpebildning som utgör 
hinder för gradering av rodnaden 4 
23. För identifiering av irriterande ämnen med LLNA har man utöver en 25- 
procentig ökning av örontjocklek (26) (27) också använt statistiskt signifi ­
kant ökning av örontjockleken hos behandlingsgruppens möss i jämförelse 
med kontrollgruppens möss (28) (29) (30) (31) (32) (33) (34). Det kan dock uppstå statistiskt signifikanta ökningar av örontjocklek som är mindre än 25 %, men dessa har inte specifikt förknippats med särskilt kraftig irritation 
(30) (32) (33) (34). 
24. Följande kliniska observationer kan indikera systemisk toxicitet (35) (36) 
när de används som del av en helhetsbedömning och kan således ge indi ­
kation om den högsta dosnivå som ska användas i huvudundersökningen: 
ändringar av nervsystemets funktion (t.ex. upprest päls, ataxi, skälvningar 
och konvulsioner), ändringar av beteende (t.ex. aggressivitet, ändringar av putsningsbeteende, markerad ändring av aktivitetsnivå), ändringar av and ­
ningsmönster (dvs. ändringar av andningens frekvens och intensitet, såsom 
dyspné, gäspande och rassel) samt ändringar av födo- och vattenintag. Vid 
utvärderingen ska man också beakta tecken på letargi och/eller avsaknad av reaktioner, alla slags kliniska tecken på mer än lätt eller momentan smärta eller lidande, minskning av kroppsvikten med mer än 5 % från dag 1 till dag 
6 samt mortalitet. Döende djur och djur som visar tecken på uppenbar 
smärta eller svårt och ihållande lidande ska avlivas skonsamt (37).
 ▼M3 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 608
 
Huvudundersökningens försöksschema  
25. Försöksschemat är upplagt enligt följande: 
— Dag 1:  Djuren märks individuellt och vikt samt eventuella kliniska 
observationer registreras. Applicera 25 μl lämpligt utspätt testämne, 
ren vehikel eller positivt kontrollämne (parallell eller nyligen utförd positiv kontroll, i enlighet med laboratoriets principer när det gäller 
punkterna 11–15) på båda öronens baksida. 
— Dagarna 2 och 3:  Upprepa applicering enligt dag 1. 
— Dagarna 4 och 5:  Ingen behandling. 
— Dag 6:  Registrera varje djurs vikt. Injicera 250 μl steril fosfatbuffrad 
saltlösning (PBS) som innehåller 20 μCi (7,4 × 10
 5 Bq) tritierad (  3 H)- 
metyltymidin i alla test- och kontrolldjur via svansvenen. Alternativt kan 250 μl steril PBS som innehåller 2 μCi (7,4 × 10
 4 Bq)  125 I-jododeoxiu ­
ridin och 10  –5 M fluorodeoxiuridin injiceras i alla testdjur via svans ­
venen. Avliva djuren skonsamt efter fem timmar. Skär bort de aurikulära dränerande lymfnoderna från varje öra och behandla dem tillsammans i PBS för varje djur (metoden med individuellt djur), eller skär bort 
lymfnoderna från varje öra och poola dem i PBS för varje behandlings ­
grupp (metoden med poolad behandlingsgrupp). Närmare uppgifter och scheman för identifiering och dissekering av noder finns i hänvisning (12). För ytterligare kontroll av lokal hudrespons i huvudundersökningen 
kan tilläggsparametrar såsom gradering av örats hudrodnad eller mät ­
ningar av örats tjocklek (med tjockleksmätare eller genom vägning av utstansad bit vid obduceringen) införlivas i undersökningsprotokollet.
 
Beredning av cellsuspensioner  
26. En suspension med enskilda celler bestående av lymfnodsceller (LNC) bi ­
lateralt utskurna från individuella djur eller från poolade behandlingsgrupper bereds genom försiktig mekanisk sönderdelning med hjälp av ett nät av rostfritt stål (200 mesh) eller annan godkänd teknik för beredning av en 
suspension med enskilda celler. Lymfnodscellerna tvättas två gånger med ett 
överskott PBS och DNA fälls ut med 5-procentig triklorättiksyra (TCA) vid 4 °C under 18 timmar (3). Fällningen återupplöses i 1 ml TCA och överförs till skintillationskärl med 10 ml skintillationsvätska för
 3 H-räkning eller 
överförs direkt till gammaräkningsrör för  125 I-räkning.  
Bestämning av cellproliferationen (radioaktivt innehåll)  
27. Innehållet av  3 H-metyltymidin bestäms genom β-skintillationsräkning såsom 
sönderfallet per minut (DPM). Innehållet av  125 I-jododeoxiuridin bestäms 
genom  125 I-räkning och uttrycks även som DPM. Beroende på vilken metod 
som har valts uttrycks innehållet som DPM/djur (metod med individuella 
djur) eller DPM/behandlingsgrupp (metod med poolning).  
Reducerat LLNA (rLLNA)  
28. I situationer där det finns lagstiftade krav på att bekräfta negativ förutsägelse 
för hudsensibiliserande potential kan man använda rLLNA (16) (17) (18), 
dvs. ett protokoll med färre djur, förutsatt att alla andra LLNA-protokollspecifikationer följs enligt beskrivningen för denna test ­
metod. För användning av rLLNA krävs klara motiveringar och vetenskap ­
liga belägg. Om resultaten är positiva eller tvetydiga kan det krävas ytter ­
ligare testning för att tolka eller förtydliga dem.
 ▼M3 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 609
 
29. Minskningen av antalet dosgrupper är den enda skillnaden mellan LLNA 
och rLLNA och den medför att man inte får information om 
dos-responsförhållande. Därför ska rLLNA inte användas om sådan infor ­
mation krävs. På samma sätt som med flerdos-LLNA ska testämneskoncent ­
rationen för rLLNA vara den högsta koncentration som inte inducerar sy ­
stemisk toxicitet och/eller lokal hudirritation hos mössen (se punkt 18).  
OBSERVATIONER  
Kliniska observationer  
30. Varje mus bör observeras minst dagligen med tanke på eventuella kliniska 
tecken – lokal irritation vid appliceringsstället eller tecken på systemisk toxicitet. Alla observationer registreras systematiskt, med individuella regi ­
streringar för varje mus. Övervakningsplanerna bör inbegripa kriterier för 
omedelbar identifiering av tecken på systemisk toxicitet, särskilt kraftig hudirritation eller hudkorrosion så att berörda djur kan avlivas (37).
 
Kroppsvikt  
31. Enligt det som anges i punkt 25 ska de individuella djurens vikt registreras 
vid testets början och strax före den schemalagda avlivningen.  
BERÄKNING AV RESULTATEN 
32. Resultaten för varje behandlingsgrupp uttrycks som stimulationsindex. När 
metoden med individuella djur används erhålls stimulationsindex genom att 
genomsnittligt DPM/djur inom varje testämnesgrupp och den positiva kon ­
trollgruppen divideras med genomsnittligt DPM/djur för lösningsmedels-/ve ­
hikelkontrollgruppen. Värdet på genomsnittligt stimulationsindex för vehi ­
kelkontrollgrupperna är då 1. När poolning används erhålls stimulations ­
index genom att dividera det poolade radioaktiva innehållet för varje tes ­
tämnesgrupp med innehållet i den poolade vehikelkontrollgruppen, och re ­
sultatet är det genomsnittliga stimulationsindexet. 
33. Ett resultat anses vara positivt när stimulationsindex ≥ 3. Man kan dock 
även använda dosresponsens styrka samt den statistiska signifikansen och 
enhetligheten hos responsen i kontrollgruppen för lösningsmedel/vehikel och 
i den positiva kontrollen när man fastställer huruvida ett gränsresultat ska anses vara positivt (4)(5)(6). 
34. Vid behov kan de erhållna resultaten förtydligas ytterligare genom en 
granskning av testämnets olika egenskaper, inbegripet eventuell strukturell 
släktskap med kända hudsensibiliserande ämnen, huruvida ämnet orsakar särskilt kraftig lokal hudirritation hos mössen samt naturen hos det iakttagna dos–responsförhållandet. Dessa och andra aspekter diskuteras närmare i an ­
dra källor (7). 
35. När radioaktivitetsdata samlas in för enskilda möss kan dessa data användas 
för en statistisk analys rörande förekomsten av dosrespons och graden av dos–responsförhållande. Alla statistiska analyser kan inbegripa en utvär ­
dering av dos–responsförhållandet och en lämpligt anpassad jämförelse mel ­
lan testgrupper (t.ex. parvisa jämförelser mellan doseringsgrupp och parallell 
vehikelkontrollgrupp). De statistiska analyserna kan t.ex. innehålla linjär regression eller Williams test för utvärdering av dos–responstrender och Dunnetts test för parvisa jämförelser. Vid valet av lämplig metod för den 
statistiska analysen bör man vara medveten om eventuella olikheter hos 
varianserna och andra relaterade problem som kan göra det nödvändigt att göra en datatransformation eller en icke-parametrisk statistisk analys. Det kan också vara nödvändigt att genomföra beräkningar av stimulationsindex 
och statistiska analyser med och utan vissa datapunkter (s.k. outliers – utan ­
förliggande värden).
 ▼M3 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 610
 
DATA OCH RAPPORTERING  
Data  
36. Data ska sammanställas i tabellform. När metoden med individuella djur 
används anges DPM-värden per individuellt djur, gruppens medelvärde för 
DPM per djur, den associerade feltermen (t.ex. SD, SEM) och medelvärdet för stimulationsindex för varje dosgrupp jämfört med den parallella vehikel ­
kontrollgruppen. När metoden med poolning används anges 
medel-/medianvärdet för DPM och medelvärdet för stimulationsindex för varje dosgrupp jämfört med den parallella vehikelkontrollgruppen.
 
Testrapport  
37. Testrapporten ska innehålla nedan angivna uppgifter. 
Test- och kontrollämnen: 
— Identifieringsdata (t.ex. CAS-nummer och EG-nummer om dessa är kän ­
da, källa, renhet, kända orenheter, satsnummer). 
— Fysikalisk natur och fysikalisk-kemiska egenskaper (t.ex. flyktighet, sta ­
bilitet, löslighet). 
— För blandningar anges sammansättning och beståndsdelarnas relativa 
procentandelar. 
Lösningsmedel/vehikel: — Identifieringsdata (renhet, koncentration [om tillämpligt], volym som har 
använts). 
— Motivering för val av vehikel. Testdjur: 
— CBA-mössens ursprung. 
— Mikrobiologiska data för djuren, om dessa data är kända. — Antal djur och deras ålder. 
— Ursprung, inhysningsförhållanden, foder och dylikt. 
Testbetingelser: — Detaljerade uppgifter om beredning och applicering av testämnet. — Motivering för valet av dos (även resultat från preliminär screening om 
sådan har genomförts). 
— Koncentrationerna för vehikel och testämne samt totala mängden tes ­
tämne som applicerats. 
— Detaljerade uppgifter om foder- och vattenkvalitet (inbegripet diettyp/ 
källa, vattenkälla). 
— Detaljerad beskrivning av behandlings- och provtagningsscheman. 
— Metoder för mätningar av toxicitet. 
— Kriterier för att fastställa om resultatet är positivt eller negativt. — Uppgifter rörande eventuella avvikelser från protokollet och redogörelse 
för hur avvikelsen påverkar undersökningens utformning och resultat. 
Tillförlitlighetskontroll: 
— Sammanfattning av resultaten från senaste tillförlitlighetskontroll, inklu ­
sive information om testämne, koncentration och vehikel. 
— Testningslaboratoriets data från parallella och/eller historiska positiva 
kontroller och negativa kontroller.
 ▼M3 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 611
 
— Om försöket inte omfattade parallell positiv kontroll, ange datum och 
laboratorierapport för senaste periodiska positiva kontroll och en rapport 
med uppgifter om laboratoriets historiska data för positiva kontroller som motivering för varför parallell positiv kontroll inte har använts. 
Resultat: — Mössens individuella vikt vid doseringsstart och vid schemalagd avliv ­
ning, såväl som medelvärde och associerad felterm (t.ex. SD, SEM) för 
varje behandlingsgrupp. 
— Tidpunkten för första upptäckt av tecken på toxicitet, även eventuell 
hudirritation vid appliceringsstället, för varje försöksdjur. 
— En tabell med individuella värden per mus (metoden med individuella 
djur) eller medelvärde/medianvärde (metoden med poolning) och värden på stimulationsindex för varje behandlingsgrupp. 
— Medelvärde och associerad felterm (t.ex. SD, SEM) för DPM per mus 
för varje behandlingsgrupp och resultaten från analys av utanförliggande 
värden för varje behandlingsgrupp när metoden med individuella djur används. 
— Beräknat stimulationsindex och ett lämpligt mått på variabilitet som 
beaktar variationen djuren emellan både i testämnesgruppen och i kon ­
trollgruppen när metoden med individuella djur används. 
— Förhållandet mellan dos och respons. — Statistisk analys, om tillämpligt. Diskussion om resultaten: — En kort kommentar om resultaten, dos–responsanalys och statistiska 
analyser (i tillämpliga fall), med en slutsats om huruvida testämnet ska anses vara hudsensibiliserande.
 
HÄNVISNINGAR 
(1) OECD (2002), Skin Sensitisation: Local Lymph Node Assay. OECD 
Guideline for the Testing of Chemicals No 429, Paris. Finns på: 
http://www.oecd.org/env/testguidelines 
(2) Kimber, I. och Basketter, D.A. (1992), The murine local lymph node assay; 
collaborative studies and new directions: A commentary,  Food Chem. 
Toxicol ., 30, 165–169. 
(3) Kimber, I., Dearman, R.J., Scholes, E.W. och Basketter, D.A. (1994), The 
local lymph node assay: developments and applications,  Toxicol ., 93, 
13–31. 
(4) Kimber, I., Hilton, J., Dearman, R.J., Gerberick, G.F., Ryan, C.A., Basketter, 
D.A., Lea, L., House, R.V., Ladies, G.S., Loveless, S.E. och Hastings, K.L. (1998), Assessment of the skin sensitisation potential of topical medicaments using the local lymph node assay: An interlaboratory exercise,  J. Toxicol. 
Environ. Health , 53, 563–79. 
(5) Chamberlain, M. och Basketter, D.A. (1996), The local lymph node assay: 
status of validation,  Food Chem. Toxicol ., 34, 999–1002. 
(6) Basketter, D.A., Gerberick, G.F., Kimber, I. och Loveless, S.E. (1996), The 
local lymph node assay: A viable alternative to currently accepted skin sensitisation tests,  Food Chem. Toxicol ., 34, 985–997. 
(7) Basketter, D.A., Gerberick, G.F. och Kimber, I. (1998), Strategies for iden ­
tifying false positive responses in predictive sensitisation tests,  Food Chem. 
Toxicol ., 36, 327–33.
 ▼M3 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 612
 
(8) Van Och, F.M.M., Slob, W., De Jong, W.H., Vandebriel, R.J. och Van 
Loveren, H. (2000), A quantitative method for assessing the sensitising 
potency of low molecular weight chemicals using a local lymph node assay: employment of a regression method that includes determination of uncerta ­
inty margins,  Toxicol ., 146, 49–59. 
(9) Dean, J.H., Twerdok, L.E., Tice, R.R., Sailstad, D.M., Hattan, D.G., Stokes, 
W.S. (2001), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: II. Conclusions and recommendations of an independent scientific peer review 
panel,  Reg. Toxicol. Pharmacol , 34: 258–273. 
(10) Haneke, K.E., Tice, R.R., Carson, B.L., Margolin, B.H., Stokes, W.S. 
(2001), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: III. 
Data analyses completed by the national toxicology program interagency 
center for the evaluation of alternative toxicological methods,  Reg. Toxicol. 
Pharmacol , 34, 274–286. 
(11) Sailstad, D.M., Hattan, D., Hill, R.N., Stokes, W.S. (2001), ICCVAM eva ­
luation of the murine local lymph node assay: I. The ICCVAM review process,  Reg. Toxicol. Pharmacol , 34: 249–257. 
(12) ICCVAM (2009), Recommended Performance Standards: Murine Local 
Lymph Node Assay, NIH Publication Number 09–7357, Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Finns på: 
http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/llna-ps/LLNA ­
PerfStds.pdf 
(13) OECD (1992),  Skin Sensitisation . OECD Guideline for Testing of Chemicals 
No 406, OECD, Paris. Finns på: http://www.oecd.org/env/testguidelines 
(14) OECD (2005),  Guidance Document on the Validation and International 
Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment , 
Environment, Health and Safety Monograph, Series on Testing and Assess ­
ment No. 34, ENV/JM/MONO(2005)14, OECD, Paris. Finns på: http://www.oecd.org/env/testguidelines 
(15) Dearman, R.J., Hilton, J., Evans, P., Harvey, P., Basketter, D.A. och Kim ­
ber, I. (1998), Temporal stability of local lymph node assay responses to hexyl cinnamic aldehyde,  J. Appl. Toxicol ., 18, 281–284. 
(16) Kimber, I., Dearman, R.J., Betts, C.J., Gerberick, G.F., Ryan, C.A., Kern, 
P.S., Patlewicz, G.Y. och Basketter, D.A. (2006), The local lymph node assay and skin sensitisation: a cut-down screen to reduce animal require ­
ments?  Contact Dermatitis , 54, 181–185. 
(17) ESAC (2007), Statement on the Reduced Local Lymph Node Assay 
(rLLNA), European Commission Directorate General, Joint Research Cent ­
re, Institute for Health and Consumer Protection, European Centre for the Validation of Alternative Methods, april 2007. Finns på: http://ecvam.jrc.it/ ft_doc/ESAC26_statement_rLLNA_20070525-1.pdf 
(18) ICCVAM (2009), The Interagency Coordinating Committee on the Valida ­
tion of Alternative Methods (ICCVAM) Test Method Evaluation Report. The Reduced Murine Local Lymph Node Assay: An Alternative Test Met ­
hod Using Fewer Animals to Assess the Allergic Contact Dermatitis Poten ­
tial of Chemicals and Products, NIH Publication No 09–6439, Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Finns på: http://iccvam.niehs.nih.gov/ 
(19) ICCVAM (1999), The Murine Local Lymph Node Assay: A Test Method for 
Assessing the Allergic Contact Dermatitis Potential of Chemicals/Compounds, The Results of an Independent Peer Review Evaluation Coordinated by the 
Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative 
Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM), NIH Publication No. 99–4494, Research Triangle Park, NC: National Institute of 
Environmental Health Sciences. Finns på: http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/ 
immunotox_docs/llna/llnarep.pdf
 ▼M3 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 613
 
(20) Kreiling, R., Hollnagel, H.M., Hareng, L., Eigler, L., Lee, M.S., Griem, P., 
Dreessen, B., Kleber, M., Albrecht, A., Garcia, C. och Wendel, A. (2008), 
Comparison of the skin sensitising potential of unsaturated compounds as assessed by the murine local lymph node assay (LLNA) and the guinea pig maximization test (GPMT),  Food Chem. Toxicol ., 46, 1896–1904. 
(21) Basketter, D., Ball, N., Cagen, S., Carrilo, J.C., Certa, H., Eigler, D., Garcia, C., 
Esch, H., Graham, C., Haux, C., Kreiling, R. och Mehling, A. (2009), Appli ­
cation of a weight of evidence approach to assessing discordant sensitisation datasets: implications for REACH,  Reg. Toxicol. Pharmacol ., 55, 90–96. 
(22) ICCVAM (2009), ICCVAM Test Method Evaluation Report. Assessment of 
the Validity of the LLNA for Testing Pesticide Formulations and Other 
Products, Metals, and Substances in Aqueous Solutions, NIH Publication 
No 10–7512, Research Triangle Park, NC: National Institute of Environ ­
mental Health Sciences, Finns på: http://iccvam.niehs.nih.gov/ 
(23) ILAR (1996), Institute of Laboratory Animal Research (ILAR)  Guide for 
the Care and Use of Laboratory Animals , 7:e uppl. Washington, DC: 
National Academies Press. 
(24) McGarry, H.F. (2007), The murine local lymph node assay: regulatory and 
potency considerations under REACH, Toxicol., 238, 71–89. 
(25) OECD (2002), Acute Dermal Irritation/Corrosion. OECD Guideline for Tes ­
ting of Chemicals No. 404, Paris, France. Finns på: http://www.oecd.org/ document/40/0,3343,en_2649_34377 _37051368_1_1_1_1,00.html 
(26) Reeder, M.K., Broomhead, Y.L., DiDonato, L. och DeGeorge, G.L. (2007), 
Use of an enhanced local lymph node assay to correctly classify irritants 
and false positive substances, Toxicologist, 96, 235. 
(27) ICCVAM (2009), Non-radioactive Murine Local Lymph Node Assay: Flow 
Cytometry Test Method Protocol (LLNA: BrdU-FC) Revised Draft Background Review Document, Research Triangle Park, NC: National Insti ­
tute of Environmental Health Sciences. Finns på: http://iccvam.niehs.nih.gov/ 
methods/immunotox/fcLLNA/BRDcomplete.pdf 
(28) Hayes, B.B., Gerber, P.C., Griffey, S.S. och Meade, B.J. (1998), Contact 
hypersensitivity to dicyclohexylcarbodiimide and diisopropylcarbodiimide in female B6C3F1 mice, Drug. Chem.  Toxicol ., 21, 195–206. 
(29) Homey, B., von Schilling, C., Blumel, J., Schuppe, H.C., Ruzicka, T., Ahr, 
H.J., Lehmann, P. och Vohr, V.W. (1998), An integrated model for the 
differentiation of chemical-induced allergic and irritant skin reactions,  
Toxicol. Appl. Pharmacol ., 153, 83–94. 
(30) Woolhiser, M.R., Hayes, B.B. och Meade, B.J. (1998), A combined murine 
local lymph node and irritancy assay to predict sensitisation and irritancy 
potential of chemicals,  Toxicol. Meth ., 8, 245–256. 
(31) Hayes, B.B. och Meade, B.J. (1999), Contact sensitivity to selected acrylate 
compounds in B6C3F1 mice: relative potency, cross reactivity, and compa ­
rison of test methods,  Drug. Chem. Toxicol ., 22, 491–506. 
(32) Ehling, G., Hecht, M., Heusener, A., Huesler, J., Gamer, A.O., van Love ­
ren, H., Maurer, T., Riecke, K., Ullmann, L., Ulrich, P., Vandebriel, R. och Vohr, H.W. (2005), A European inter-laboratory validation of alternative 
endpoints of the murine local lymph node assay: first round.  Toxicol ., 212, 
60–68. 
(33) Vohr, H.W. and Ahr, H.J. (2005), The local lymph node assay being too 
sensitive?  Arch. Toxicol ., 79, 721–728. 
(34) Patterson, R.M., Noga, E. och Germolec, D. (2007), Lack of evidence for 
contact sensitisation by Pfiesteria extract,  Environ. Health Perspect ., 115, 
1023–1028. 
(35) OECD (1987),  Acute Dermal Toxicity , OECD Guideline for Testing of Chem ­
icals No 402, Paris, France. Finns på: http://www.oecd.org/env/testguidelines
 ▼M3 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 614
 
(36) ICCVAM (2009), Report on the ICCVAM-NICEATM/ECVAM/JaCVAM 
Scientific Workshop on Acute Chemical Safety Testing: Advancing In Vitro 
Approaches and Humane Endpoints for Systemic Toxicity Evaluations. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences, Finns på: http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/acutetox/ 
Tox_workshop.htm 
(37) OECD (2000),  Guidance Document on the Recognition, Assessment and 
Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation , Environmental Health and Safety Monograph, 
Series on Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, 
Paris. Finns på: http://www.oecd.org/env/testguidelines
 ▼M3 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 615
 
Tillägg 1  
Prestandastandarder för bedömning av föreslagna liknande eller 
modifierade LLNA-testmetoder för hudsensibilisering  
INLEDNING 
1. Syftet med prestandastandarder är att tillhandahålla en grund när man fast ­
ställer att nya testmetoder, både äganderättsligt skyddade (dvs. metoder med 
upphovsrätt, varumärke eller registrering) och allmänt tillgängliga metoder, är tillräckligt exakta och tillförlitliga för specifika testningsändamål. Dessa prestandastandarder, som grundar sig på validerade och godtagna testmeto ­
der, kan användas för att utvärdera tillförlitligheten och exaktheten hos 
andra liknande metoder (vardagligt kallade ”me too”-test) som grundar sig på liknande vetenskapliga principer och som mäter eller förutser samma biologiska eller toxikologiska effekt (14). 
2. Innan man antar modifierade metoder (dvs. föreslagna potentiella förbätt ­
ringar av en godkänd testmetod) krävs en utvärdering för att fastställa de föreslagna ändringarnas inverkan på testets prestanda och i vilken utsträck ­
ning sådana förändringar påverkar den tillgängliga informationen för de 
andra komponenterna i valideringsprocessen. Beroende på de föreslagna ändringarnas antal och karaktär, genererade data och stödjande dokumenta ­
tion för ändringarna, bör de antingen vara föremål för samma validerings ­
process som gäller för nya testmetoder eller, där det är lämpligt, för en 
begränsad bedömning av tillförlitlighet och relevans med användning av etablerade prestandastandarder (14). 
3. När liknande eller modifierade metoder föreslås för användning inom denna 
testmetod bör deras tillförlitlighet och exakthet utvärderas med hjälp av 
kemikalier som representerar hela skalan av LLNA-utfall. För att omotiverad användning av djur ska undvikas rekommenderas starkt att de som utvecklar 
modeller först konsulterar lämpliga myndigheter innan valideringsstudier 
inleds enligt de prestandastandarder och den vägledning som anges i denna testmetod. 
4. Dessa prestandastandarder baserar sig på de harmoniserade prestandastan ­
darderna, US-ICCVAM (Förenta staterna), EC ECVAM (EG) och JaCVAM 
(Japan) (12), för utvärdering av validiteten hos liknande eller modifierade versioner av LLNA. Prestandastandarderna består av testmetodens grund ­
läggande komponenter, rekommenderade referenskemikalier samt de stan ­
darder för exakthet och tillförlitlighet som en föreslagen metod minst måste 
uppfylla.
 
I. Testmetodens grundläggande komponenter  
5. För att se till att liknande eller modifierade LLNA-metoder är funktionellt 
och mekaniskt analoga med LLNA och mäter samma biologiska verkan, måste testmetodprotokollet innehålla följande komponenter: 
— Testämnet ska appliceras på mössens båda öron. 
— Proliferationen av lymfocyter ska mätas i de lymfnoder som dränerar det 
område där testämnet appliceras. 
— Proliferationen av lymfocyter ska mätas under hudsensibiliseringens in ­
duktionsfas.
 ▼M3 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 616
 
— Den högsta dosen som väljs för ett testämne ska vara den högsta kon ­
centrationen som inte inducerar systemisk toxicitet och/eller särskilt kraf ­
tig lokal hudirritation hos mössen. För positiva referenskemikalier ska den högsta dosen vara minst lika hög som LLNA EC3-värdena för motsvarande referenskemikalier (se tabell 1) utan att det uppstår syste ­
misk toxicitet och/eller särskilt kraftig hudirritation hos mössen. 
— Varje försök ska omfatta en parallell vehikelkontrollgrupp och, där det är 
lämpligt, en parallell positiv kontrollgrupp. 
— Varje dosgrupp ska omfatta minst fyra djur. — Insamlingen av data kan ske på individuell eller poolad grund. Om något av dessa kriterier inte uppfylls kan dessa prestandastandarder inte 
användas för validering av en liknande eller modifierad metod.
 
II. Minimiförteckning över referenskemikalier  
6. I de harmoniserade prestandastandarderna US-ICCVAM, EC-ECVAM och 
JaCVAM (12) anges 18 referenskemikalier som minst måste användas och 4 alternativa referenskemikalier (dvs. ämnen som ger antingen falska positiva eller falska negativa resultat i LLNA, jämfört med resultat från människor 
och marsvin [B.6 eller OECD:s testriktlinje 406] (13) och som därför ger 
möjlighet att påvisa samma eller bättre prestanda än LLNA) som ingår i prestandastandarderna för LLNA. För kemikalierna användes följande urval ­
skriterier: 
— Förteckningen över referenskemikalier representerar de typer av ämnen 
som typiskt testas för sin hudsensibiliseringspotential och den respons ­
skala som kan mätas eller förutses med LLNA. 
— Ämnena har en väldefinierad kemisk struktur. — LLNA-data från test på marsvin (dvs. B.6; OECD:s testriktlinje 406) 
(13) och (där det är möjligt) data från människor finns att tillgå för varje 
ämne. 
— Ämnena kan enkelt införskaffas på marknaden. De rekommenderade referenskemikalierna förtecknas i tabell 1. När de fö ­
reslagna referenskemikalierna används i ett försök ska de utvärderas i den vehikel som de förtecknas med i tabell 1. I situationer där ett förtecknat 
ämne inte finns att tillgå kan man använda andra ämnen som uppfyller 
urvalskriterierna, förutsatt att tillbörlig motivering kan ges.
 ▼M3 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 617
 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 618
 ▼M3 
Tabell 1  
Rekommenderade referenskemikalier för prestandastandarder för LLNA  
Nummer Kemikalie (  1 ) CAS-nummer Form Veh (  2 ) EC3 % (  3 ) N (  4 ) 0,5x – 2,0x 
EC3 Faktisk 
EC3-skala LLNA vs GP LLNA vs 
människa  
1 5-klor-2-metyl-4-isotiazolin-3-on (CMI)/2- 
metyl-4-isotiazolin-3-on (MI) (  5 ) 26172-55-4/2682-20-4 Vätska DMF 0,009 1 0,0045– 
0,018 NC +/+ +/+ 
2 DNCB 97-00-7 Fast AOO 0,049 15 0,025– 
0,099 0,02– 
0,094 +/+ +/+ 
3 4-fenylendiamin 106-50-3 Fast AOO 0,11 6 0,055– 
0,22 0,07–0,16 +/+ +/+ 
4 Koboltklorid 7646-79-9 Fast DMSO 0,6 2 0,3–1,2 0,4–0,8 +/+ +/+ 
5 Isoeugenol 97-54-1 Vätska AOO 1,5 47 0,77–3,1 0,5–3,3 +/+ +/+ 
6 2-merkaptobensotiazol 149-30-4 Fast DMF 1,7 1 0,85–3,4 NC +/+ +/+ 
7 Citral 5392-40-5 Vätska AOO 9,2 6 4,6–18,3 5,1–13 +/+ +/+ 
8 HCA 101-86-0 Vätska AOO 9,7 21 4,8–19,5 4,4–14,7 +/+ +/+ 9 Eugenol 97-53-0 Vätska AOO 10,1 11 5,05–20,2 4,9–15 +/+ +/+ 
10 Fenylbensoat 93-99-2 Fast AOO 13,6 3 6,8–27,2 1,2–20 +/+ +/+ 
11 Kanelalkohol 104-54-1 Fast AOO 21 1 10,5–42 NC +/+ +/+ 
12 Imidazolidinylurea 39236-46-9 Fast DMF 24 1 12–48 NC +/+ +/+ 
13 Metylmetakrylat 80-62-6 Vätska AOO 90 1 45–100 NC +/+ +/+ 
14 Klorbensen 108-90-7 Vätska AOO 25 1 NA NA –/– –/ (*) 
15 Isopropanol 67-63-0 Vätska AOO 50 1 NA NA –/– –/+
 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 619
 ▼M3 
Nummer Kemikalie (  1 ) CAS-nummer Form Veh (  2 ) EC3 % (  3 ) N (  4 ) 0,5x – 2,0x 
EC3 Faktisk 
EC3-skala LLNA vs GP LLNA vs 
människa  
16 Mjölksyra 50-21-5 Vätska DMSO 25 1 NA NA –/– –/ (*) 
17 Metylsalicylat 119-36-8 Vätska AOO 20 9 NA NA –/– –/– 18 Salicylsyra 69-72-7 Fast AOO 25 1 NA NA –/– –/– 
Alternativa ämnen för att påvisa bättre prestanda jämfört med LLNA 
19 Natriumlaurylsulfat 151-21-3 Fast DMF 8,1 5 4,05–16,2 1,5–17,1 +/– +/– 20 Etylenglykoldimetakrylat 97-90-5 Vätska MEK 28 1 14–56 NC +/– +/+ 21 Xylen 1330-20-7 Vätska AOO 95,8 1 47,9–100 NC +/ (**) +/– 22 Nickelklorid 7718-54-9 Vätska DMSO 5 2 NA NA –/+ –/+
 
Förkortningar: AOO = aceton:olivolja (4:1, volym/volym), CAS-nummer = Chemical Abstracts Service-nummer, DMF =  N,N -dimetylformamid, DMSO = dimetylsulfoxid, DNCB = 2,4-dinitroklorbensen, EC3 = uppskattad 
koncentration som krävs för att få stimulationsindex 3, Fast = fast ämne, GP = testresultat från marsvin (dvs. B.6 eller OECD:s  testriktlinje 406) (13), HCA = hexylkanelaldehyd, LLNA = resultat från murint lokalt lymfnodtest 
(dvs. B.42 eller OECD:s testriktlinje 429) (1), MEK = metyletylketon, NA = inte tillämpligt eftersom stimulationsindex < 3, NC = ej beräknat eftersom data erhölls från ett enskilt försök, Veh = testvehikel, Vätska = ämne i 
vätskeform. 
(*) Antas inte vara sensibiliserande för människor eftersom inga resultat från kliniska lapptest kunde fås fram, ämnet ingår in te som en allergen i lapptest och inga rapporter om sensibilisering hos människa kunde fås fram. 
(**) GP-data finns inte att tillgå. (
 1 ) Kemikalierna ska beredas dagligen utom om stabilitetsdata visar att lagring kan accepteras. 
( 2 ) Eftersom olika vehiklar potentiellt kan påverka LLNA-testprestanda bör endast den rekommenderade vehikeln för respektive refe renskemikalie användas (24) (32). 
( 3 ) Medelvärde i fall där flera EC3-värden fanns att tillgå. För negativa ämnen (dvs. med stimulationsindex < 3) anges den högsta  testade koncentrationen. 
( 4 ) Antalet LLNA-försök från vilka data erhållits. 
( 5 ) Kommersiellt tillgängligt som Kathon CG (CAS-nummer 55965-84-9), som är en 3:1-blandning av CMI and MI. De relativa koncentra tionerna för varje komponent varierar från 1,1 % till 1,25 % (CMI) och 0,3 % till 
0,45 % (MI). De inaktiva komponenterna är magnesiumsalter (21,5 % till 24 %) och kopparnitrat (0,15 % till 0,17 %), och den åte rstående formuleringen är 74–77 % vatten. Kathon CG fås från Sigma-Aldrich och Rohm 
and Haas (numera Dow Chemical Corporation).
 III. Definierad tillförlitlighet och standarder för exakthet  
7. Exaktheten hos en liknande eller modifierad LLNA-metod ska vara samma 
som eller högre än för prestandastandarderna för LLNA när utvärderingen 
görs med det minsta tillåtna antalet (18) referenskemikalier. Den nya eller modifierade metoden bör ge korrekt klassificering enligt en ja-/nej-besluts ­
väg. Det kan dock hända att den nya eller modifierade metoden inte ger 
korrekt klassificering av alla de kemikalier som minst måste användas. Om 
t.ex. ett av de svaga sensibiliserande ämnena klassificeras fel, kan en mo ­
tivering för felklassificeringen och lämpliga tilläggsuppgifter (t.ex. testresul ­
tat som ger korrekt klassificering för andra ämnen med liknande fysikaliska, 
kemiska och sensibiliserande egenskaper) anses påvisa likvärdiga prestanda. 
Under sådana omständigheter utvärderas valideringsstatus för den nya eller modifierade LLNA-testmetoden från fall till fall.
 
Reproducerbarhet inom laboratoriet  
8. För bestämning av reproducerbarheten inom ett laboratorium ska en ny eller 
modifierad LLNA-metod utvärderas med ett sensibiliserande ämne som är 
väl karakteriserat i LLNA. Prestandastandarderna för LLNA grundar sig därför på hur resultaten varierar mellan upprepade testningar av hexylkane ­
laldehyd. För bedömning av tillförlitligheten inom laboratoriet bör värden 
för uppskattad koncentrationströskel (ECt) för hexylkanelaldehyd härledas 
vid fyra separata tillfällen med minst en vecka mellan testningarna. Repro ­
ducerbarheten inom laboratoriet anses vara godtagbar om varje hexylkane ­
laldehydtest ger ECt-värden mellan 5 % och 20 %, vilket representerar 
skalan 0,5–2,0 gånger det medelvärde för EC3 som specificeras för hex ­
ylkanelaldehyd (10 %) i LLNA (se tabell 1).
 
Reproducerbarhet mellan laboratorier  
9. För bestämning av reproducerbarheten mellan laboratorier bör en ny eller 
modifierad LLNA-metod utvärderas med två sensibiliserande ämnen som är 
väl karakteriserade i LLNA. Prestandastandarderna för LLNA grundar sig på 
variationerna i resultat från testning av hexylkanelaldehyd och 2,4- dinitroklorbensen (DNCB) i olika laboratorier. ECt-värdena bör tas fram genom enskilda fristående försök i minst tre separata laboratorier. Repro ­
ducerbarheten mellan laboratorier anses vara godtagbar om varje laborato ­
rium får ECt-värden som är 5–20 % för hexylkanelaldehyd och 0,025–0,1 % för 2,4-dinitroklorbensen, vilket representerar skalan 0,5–2,0 gånger det EC3-medelvärde som specificeras för hexylkanelaldehyd (10 %) och 2,4- 
dinitroklorbensen (0,05 %) i LLNA (se tabell 1).
 ▼M3 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 620
Tillägg 2  
Definitioner  
Exakthet:  Mått på hur väl testmetodresultaten och de godtagna referensvärdena 
överensstämmer med varandra. Exakthet är ett mått på testmetodens prestanda och en relevansaspekt. Detta begrepp används ofta omväxlande med ”konkor ­
dans” för att beskriva andelen korrekta resultat med en testmetod (14).  
Referensämne:  Sensibiliserande eller icke-sensibiliserande ämne som används 
som standard för jämförelse med ett testämne. Ett referensämne ska ha följande 
egenskaper: i) En eller flera enhetliga och tillförlitliga källor. ii) Strukturell och 
funktionell likhet med den ämnesklass som testas. iii) Kända fysikalisk-kemiska egenskaper. iv) Stödjande data om kända effekter. v) Känd styrka inom det avsedda responsområdet.  
Uppskattad koncentrationströskel (ECt):  Uppskattad testämneskoncentration som 
krävs för att ge ett stimulationsindex som tyder på positiv respons.  
Uppskattad koncentration tre (EC3):  Uppskattad testämneskoncentration som 
krävs för att ge värdet tre för stimulationsindex.  
Falskt negativt:  Ett testämne som felaktigt har identifierats som negativt eller 
icke-aktivt genom en testmetod trots att ämnet i själva verket är positivt eller aktivt.  
Falskt positivt:  Ett testämne som felaktigt har identifierats som positivt eller 
aktivt genom en testmetod trots att ämnet i själva verket är negativt eller icke-aktivt.  
Fara:  Potentialen för skadliga verkningar på hälsa eller miljö. De skadliga verk ­
ningarna visar sig enbart om exponeringsnivån är tillräcklig.  
Reproducerbarhet mellan laboratorier:  Ett mått på i hur stor utsträckning olika 
kvalificerade laboratorier kan producera kvalitativt och kvantitativt liknande re ­
sultat, med användning av samma protokoll och samma testämnen. Reproducer ­
barheten mellan laboratorier fastställs under förvalideringen och valideringen och den indikerar i hur stor utsträckning ett test framgångsrikt kan överföras mellan laboratorier (14).  
Reproducerbarhet inom laboratoriet:  Ett mått på i vilken utsträckning kvalifice ­
rade personer inom samma laboratorium framgångsrikt kan upprepa resultat vid olika tidpunkter när de använder ett visst protokoll.  
Me too-test:  Ett vardagligt uttryck för en testmetod som strukturellt och funktionellt 
liknar en validerad och godtagen referenstestmetod. En sådan testmetod kan vara en kandidat för jämförande validering. Kallas även ”liknande testmetod” (14).  
Utanförliggande värde:  Ett utanförliggande värde (”outlier”) är en observation 
som markant skiljer sig från de övriga värdena i ett slumpmässigt urval från en 
population.  
Prestandastandarder (PS):  Standarder som baseras på en validerad testmetod 
och som utgör grunden för utvärdering av jämförbarheten för en föreslagen 
testmetod som är funktionellt och mekaniskt likartad. Dessa standarder omfattar i) testmetodens grundläggande komponenter, ii) en minimiförteckning med refe ­
renskemikalier som valts ut från de kemikalier som använts för att påvisa att den 
validerade testmetoden fungerar tillfredsställande och iii) de liknande nivåer av 
exakthet och tillförlitlighet, på grundval av vad som erhållits för den validerade testmetoden, som den föreslagna testmetoden bör påvisa när den utvärderas med användning av minimiförteckningen med referenskemikalier (14).  
Äganderättsligt skyddad testmetod:  En testmetod vars tillverkning och distribu ­
tion begränsas genom patent, upphovsrätter, varumärken och dylikt.
 ▼M3 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 621
 
Kvalitetssäkring:  En styrningsprocess där personer som är i oberoende ställning i 
förhållande till de personer som genomför testningen bedömer hur standarder, 
krav och registreringsförfaranden för laboratorietestning följs och hur exakt data förmedlas.  
Referenskemikalier:  Kemikalier som valts för användning i valideringsprocessen 
och för vilka responsen i  in vitro - eller  in vivo -referenstestsystem eller på de 
berörda arterna är känd. Kemikalierna bör vara representativa för de kemikaliek ­
lasser som testmetoden är avsedd för och bör representera hela skalan av respons som kan förväntas för de kemikalier som testas med metoden, från stark till svag till negativ. Det kan krävas olika uppsättningar referenskemikalier för valide ­
ringsprocessens olika skeden och för olika testmetoder och testanvändningar (14).  
Relevans:  Beskrivning av förhållandet mellan testet och den berörda effekten och 
huruvida detta förhållande är meningsfullt och användbart för ett visst ändamål. Relevansen är ett mått på hur väl man genom testet korrekt kan mäta och förutse den biologiska effekt det gäller. Relevans omfattar också överväganden om en 
testmetods exakthet (konkordans) (14).  
Tillförlitlighet:  Ett mått på i vilken utsträckning en testmetod kan reproduceras 
inom och mellan laboratorier över tiden när metoden utförs med samma pro ­
tokoll. Den bedöms genom att man beräknar reproducerbarheten inom och mel ­
lan laboratorier (14).  
Hudsensibilisering:  En immunologisk process som följer av att en mottaglig 
individ exponeras ytvägen för en inducerande kemisk allergen som provocerar en kutan immunrespons som kan leda till att det uppstår kontaktsensibilisering.  
Stimulationsindex (SI):  Ett värde som beräknas för att bedöma hudsensibilise ­
ringspotentialen hos ett testämne och som är förhållandet mellan proliferationen i 
behandlingsgrupperna och proliferationen i den parallella vehikelkontrollgruppen.  
Testämne (kallas också testkemikalie):  Alla ämnen eller blandningar som testas 
med denna testmetod.  
Validerad testmetod:  En testmetod för vilken valideringsstudier har genomförts 
för att fastställa relevans (inbegripet exakthet) och tillförlitlighet för ett specifikt 
ändamål. Det är viktigt att notera att en validerad testmetod kanske inte är till ­
räckligt exakt och tillförlitlig när det gäller ett visst föreslaget ändamål (14).
 ▼M3 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 622
 
B.43  TEST AVSEENDE NEUROTOXICITET PÅ GNAGARE  
1. METOD  
Denna metod motsvarar OECD TG 424 (1997). 
Med testmetoden fås information som bekräftar eller ytterligare ka ­
rakteriserar en kemikalies förmåga att framkalla neurotoxicitet hos 
vuxna djur. Testmetoden kan kombineras med tidigare metoder för 
toxicitetstest med upprepad dos eller den kan användas separat. Det rekommenderas att OECD:s vägledning om strategier och metoder rörande testning av neurotoxicitet (se hänvisning 1) används som 
hjälp när man utformar försök som baserar sig på denna testmetod. 
Detta är särskilt viktigt när man överväger modifikationer av test ­
metodens normala observationer och förfaranden. OECD:s vägled ­
ning är avsedd som hjälp vid valet av alternativa testförfaranden som 
kan behövas i specifika omständigheter. 
Metoden omfattar inte bedömningen av utvecklingsneurotoxicitet.
 
1.1 INLEDNING 
Vid bedömning och utvärdering av en kemikalies toxiska egenskaper 
är det viktigt att ta hänsyn till kemikaliens förmåga att framkalla 
neurotoxiska verkningar. Redan i metoden för test avseende syste ­
misk toxicitet med upprepad dos ingår observationer avsedda att påvisa förmågan att framkalla neurotoxicitet. Med hjälp av förelig ­
gande testmetod kan man få ytterligare information om eller bekräfta 
de neurotoxiska verkningar som har observerats vid undersökning av 
systemisk toxicitet med upprepad dos. För vissa klasser av kemika ­
lier kan en analys av förmågan att framkalla neurotoxicitet tyda på att det är lämpligare att använda föreliggande metod direkt, och inte 
bygga på indikationer på neurotoxicitet från undersökningar av sy ­
stemisk toxicitet med upprepad dos. En sådan analys kan omfatta exempelvis följande: 
— des signes de neurotoxicité ou des lésions neuropathologiques 
sont observés dans des études de toxicité autres que des études de toxicité systémique à dose répétée, ou 
— Strukturellt släktskap eller annan information som länkar kemi ­
kalien i fråga till ämnen med känd neurotoxicitet. 
Det kan även finnas andra tillfällen då det är lämpligt att använda 
föreliggande testmetod (se hänvisning 1). 
Metoden har utformats så att den kan anpassas till särskilda behov 
att bekräfta en kemikalies specifika histopatologiska och beteendere ­
laterade neurotoxicitet, eller ge en möjlighet att karakterisera och 
kvantifiera neurotoxisk respons.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 623
 
Tidigare likställdes neurotoxicitet med neuropati som inbegriper neu ­
ropatologiska skador eller neurologiska funktionsstörningar såsom 
förlamning, paralys eller tremor. Även om neuropati är en betydande manifestation av neurotoxicitet, vet man numera att det finns många andra tecken på nervsystemtoxicitet (förlust av motorisk koordina ­
tion, sensoriska brister, inlärnings- och minnesstörningar), vilka inte 
alltid kommer fram vid undersökning av neuropati eller andra slags studier. 
Syftet med föreliggande testmetod är att få fram betydande neurobe ­
teenderelaterade och neuropatologiska verkningar hos vuxna gnaga ­
re. Trots att beteenderubbningar, även i frånvaron av morfologiska 
ändringar, kan tyda på skadliga verkningar på organismen, är dock 
inte alla beteenderubbningar specifika för nervsystemet. Alla obser ­
verade ändringar bör därför utvärderas tillsammans med korrelativa histopatologiska, hematologiska eller biokemiska data samt data om 
andra typer av systemisk toxicitet. Den testmetod som beskrivs här 
och vars syfte är att karakterisera och kvantifiera neurotoxisk respons inbegriper specifika histopatologiska och beteenderelaterade förfaran ­
den som ytterligare kan kompletteras med elektrofysiologiska och/ 
eller biokemiska undersökningar (se hänvisning 1, 2, 3 och 4). 
Neurotoxiska ämnen kan verka på flera olika mål inom nervsystemet 
och genom flera olika mekanismer. Så länge som det inte finns ett 
enda system med vars hjälp alla ämnen kunde testas på djupet med avseende på neurotoxicitet, kan det vara nödvändigt att använda andra  in vivo-  eller  in vitro -test som är specifika för den typ av 
neurotoxicitet som observeras eller förväntas. 
Föreliggande testmetod kan även, i kombination med OECD:s väg ­
ledning om strategier och metoder rörande testning av neurotoxicitet 
(se hänvisning 1), användas som grund för test där man vill ytterli ­
gare karakterisera eller öka känsligheten hos dosresponskvantifiering ­
en, och på så sätt få en bättre uppskattning av nivån för inga påvis ­
bara skadliga verkningar eller bekräfta en kemikalies kända eller 
misstänkta skadliga verkningar. Man kan exempelvis utforma test för identifiering och utvärdering av de neurotoxiska mekanismerna eller test vars resultat kompletterar tillgängliga data från tidigare 
grundläggande observationer rörande neurobeteende och neuropato ­
logi. Sådana test behöver inte ge samma resultat som kan fås med de standardförfaranden som rekommenderas i föreliggande metod, till den del dessa data redan finns och inte kan anses vara nödvändiga 
för tolkning av resultaten. 
Detta neurotoxicitetstest ger, fristående eller som del av en kombina ­
tion, följande möjligheter: 
— Identifiera om nervsystemet påverkas permanent eller tillfälligt av 
den kemikalie som testas. 
— Bidra till karakteriseringen av de nervsystemrubbningar som hör 
samman med exponering för kemikalien, och skapa en förståelse 
för de underliggande mekanismerna.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 624
 
— Bestämma dos- och tid-responsförhållanden i syfte att uppskatta 
en nivå där inga verkningar kan påvisas (och som kan användas 
för att fastställa säkerhetskriterier för kemikalien). 
Vid test enligt denna metod används oral tillförsel av testämnet. Det 
kan vara lämpligare med andra tillförselvägar (exempelvis via huden 
eller inandning). I förekommande fall måste då eventuellt de rekom ­
menderade förfarandena modifieras. Överväganden om valet av till ­
förselväg ska basera sig på profilen för exponering på människor och tillgänglig toxikologisk eller kinetisk information.
 
1.2 DEFINITIONER  
Skadlig verkning : Varje sådan behandlingsrelaterad avvikelse från 
normaltillståndet som minskar organismens förmåga att överleva, föröka sig eller anpassa sig till omgivningen.  
Dos: Den mängd testämne som tillförs. Dosen uttrycks som vikt (g, 
mg), vikten testämne per viktenhet försöksdjur (exempelvis mg/kg) 
eller en konstant utfodringskoncentration (ppm).  
Dosering : Ett allmänt begrepp som inbegriper dos, dess frekvens och 
varaktighet.  
Neurotoxicitet : En skadlig förändring i nervsystemets struktur eller 
funktion till följd av exponering för ett kemiskt, biologiskt eller fysikaliskt ämne.  
Neurotoxiskt ämne : Varje kemiskt, biologiskt eller fysikaliskt ämne 
som har förmågan att framkalla neurotoxicitet.  
NOAEL : Förkortning för ”no-observed-adverse-effect level” (nivå 
vid vilken inga skadliga verkningar observeras). Detta är den högsta 
dosnivån vid vilken inga skadliga behandlingsrelaterade verkningar kan observeras.
 
1.3 PRINCIP FÖR TESTMETODEN 
Testämnet tillförs oralt i ett urval doser till flera grupper med labo ­
ratoriegnagare. I regel behövs upprepade doser. Doseringsschemat 
kan gälla subakut toxicitet (28 dagar), subkronisk toxicitet (90 dagar) eller kronisk toxicitet (1 år eller längre). Förfarandet som beskrivs här kan även användas för undersökning av akut neurotoxicitet. 
Djuren testas i syfte att få fram eller karakterisera beteenderelaterade 
och/eller neurologiska rubbningar. Under observationsperioderna görs bedömning av ett antal beteenden som kan påverkas av neuro ­
toxiska ämnen. Efter avslutat test tas en undergrupp per kön från 
varje grupp för perfusion  in situ,  och snitt av hjärna, ryggrad och 
perifera nerver prepareras och undersöks. 
Om testet görs fristående i syfte att påvisa neurotoxicitet eller karak ­
terisera neurotoxiska verkningar, kan de djur som inte har använts 
för perfusion och efterföljande histopatologi (se tabell 1) användas 
för specifika undersökningar av neurobeteende, neuropatologi, neu ­
rokemi eller elektrofysiologi. Resultaten från sådana undersökningar kan komplettera data som fås med den föreliggande metodens stan ­
dardundersökningar (se hänvisning 1). Tilläggsundersökningar kan 
vara till särskilt stor nytta i fall där empiriska observationer eller de förväntade verkningarna tyder på att en kemikalies neurotoxicitet är av en specifik typ eller har ett specifikt mål. Alternativt kan de 
återstående djuren användas för bedömningar som bygger på meto ­
derna för toxicitetstest med upprepad dos på gnagare.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 625
 
När test enligt denna metod kombineras med test enligt andra meto ­
der måste djurens antal vara tillräckligt för att observationskraven 
ska uppfyllas för båda testerna.  
1.4 BESKRIVNING AV TESTMETODEN  
1.4.1  Val av djurart  
Rekommenderad gnagare är råtta. Om testet utförs med andra gna ­
gare bör detta motiveras. Djuren bör vara unga och friska vuxna 
exemplar som härrör från normala laboratoriestammar. Hondjuren får inte ha fött ungar och får inte vara dräktiga. Doseringen bör i regel inledas så snart som möjligt efter avvänjningen, helst inte 
senare än vid sex veckors ålder och under alla omständigheter innan 
djuren fyllt nio veckor. När testet kombineras med andra test måste denna faktor eventuellt anpassas. Vid testets början får variationen i vikt mellan de använda djuren inte överstiga ±20 % av vardera 
könets medelvikt. Om ett kortvarigt test med upprepad dos utförs 
som inledning till ett långtidstest måste djur från samma stam och ursprung användas vid båda testerna.
 
1.4.2  Förvarings- och utfodringsbetingelser  
Temperaturen i försöksdjurens utrymmen bör vara 22  o C (± 3  o C). 
Den relativa fuktigheten bör vara minst 30 % och ska helst inte 
överstiga 70 %, utom när rummet rengörs. Målvärdet bör dock vara 50–60 %. Belysningen bör vara artificiell med omväxlande 12 timmar ljus och 12 timmar mörker. Periodiska höga ljud bör mini ­
meras. För utfodringen kan konventionellt laboratoriefoder användas, 
och djuren bör ha obegränsad tillgång till dricksvatten. Om tillförseln görs genom fodret, kan valet av foder kan påverkas av behovet att säkerställa en lämplig blandning med testämnet. Djuren kan inhysas 
individuellt eller i burar med små grupper av samma kön.
 
1.4.3  Förberedelse av djuren  
Friska unga djur fördelas slumpvis i behandlings- och kontrollgrup ­
per. Burarna placeras i sådan ordning att eventuella verkningar på grund av placeringen minimeras. Djuren förses med individuell 
märkning och hålls i sina burar under minst 5 dagar före försökets 
start så att de får acklimatisera sig till laboratoriets betingelser.
 
1.4.4  Tillförselväg och beredning av doserna  
Denna testmetod är särskilt avsedd för oral tillförsel av testämnet. 
Den orala tillförseln kan göras genom sond, foder, dricksvatten eller kapsyler. Om andra tillförselvägar används (exempelvis via huden 
eller inandning) måste eventuellt de förfaranden som rekommenderas 
enligt metoden modifieras. Överväganden om valet av tillförselväg ska basera sig på profilen för exponering på människor och tillgäng ­
lig toxikologisk eller kinetisk information. Motivering bör ges för 
valet av tillförselväg liksom även en redogörelse för eventuella mo ­
difikationer av testmetodens förfaranden.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 626
 
Vid behov kan testämnet upplösas eller suspenderas i en lämplig 
vehikel. Om möjligt bör man i första hand överväga vattenlösning 
eller vattensuspension, sedan oljelösning eller oljesuspension (ex ­
empelvis majsolja) och därefter eventuell lösning eller suspension i andra vehiklar. Vehikelns toxiska egenskaper måste vara kända. Des ­
sutom bör hänsyn tas till följande egenskaper hos vehikeln: Verk ­
ningarna på absorption, distribution, metabolism eller kvarhållande av testämnet till den del dessa verkningar kan påverka testämnets toxiska egenskaper samt verkningarna på testdjurens foder- eller 
vattenintag eller deras näringstillstånd.
 
1.5 FÖRFARANDEN  
1.5.1  Djurens antal och kön  
När testet utförs fristående bör minst 20 djur (10 honor och 10 
hanar) användas i varje dos- och kontrollgrupp med tanke på utvär ­
deringen av detaljerade kliniska och funktionella observationer. 
Minst fem hanar och fem honor som har valts ut bland dessa tio 
hanar och tio honor bör vid testets slut perfuseras  in situ  och an­
vändas för detaljerad neurohistopatologi. Om endast ett begränsat antal djur i en given dosgrupp observeras med avseende på tecken 
på neurotoxiska verkningar bör man överväga att införliva dessa djur 
i det urval som perfuseras. Om testet utförs i kombination med tox ­
icitetstest med upprepad dos, bör djurens antal vara tillräckligt för att båda testernas syfte ska uppnås. Minimiantalet djur per grupp för 
olika testkombinationer anges i bilaga 1. Om man planerar avliv ­
ningar under testets gång eller återhämtningsgrupper för observation av reversibilitet, varaktighet eller fördröjd start för de toxiska verk ­
ningarna efter doseringen, eller om man planerar tilläggsobservatio ­
ner, bör antalet djur ökas i syfte att säkerställa tillgången till nöd ­
vändigt antal djur för observation och histopatologi.
 
1.5.2  Doserings- och kontrollgrupp  
I regel bör minst tre dosgrupper och en parallell kontrollgrupp an ­
vändas. Om analys av tillgängliga data tyder på att inga verkningar förväntas vid en upprepad dos på 1 000 mg per kg kroppsvikt och 
dag, kan ett gränstest utföras. Om det inte finns lämpliga data att 
tillgå kan ett inledande test utföras som hjälp för bestämning av doserna. Med undantag för behandling med testämnet bör djuren i kontrollgruppen hanteras på exakt samma sätt som djuren i dosgrup ­
perna. Om en vehikel används för tillförsel av testämnet bör kontroll ­
gruppen få vehikeln i den största volym som används.
 
1.5.3  Tillförlitlighetskontroll  
Testningslaboratoriet bör redogöra för laboratoriets kompetens att 
utföra försöket samt för känsligheten hos de förfaranden som an ­
vänds. Redogörelsen bör ge belägg för förmågan att detektera och 
kvantifiera förändringar i de olika ändpunkter som rekommenderas 
för observation (autonoma tecken, sensorisk reaktivitet, greppstyrka och motorisk aktivitet). Information om kemikalier som orsakar olika typer av neurotoxisk respons och som kan användas som positiv ­
kontrollämnen finns i hänvisning 2–9. Historiska data kan användas 
förutsatt att testförfarandena till väsentliga delar förblir desamma. Periodisk uppdatering av historiska data rekommenderas. Om det testande laboratoriet gör ändringar av testförloppet eller testets för ­
faranden bör laboratoriet lägga fram nya data som ger belägg på 
förfarandenas fortsatta känslighet.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 627
 
1.5.4  Val av dos  
Dosnivåerna bör väljas med hänsyn tagen till alla tillgängliga tidigare 
data om observerad toxicitet och kinetik för testämnet och närbesläk ­
tade material. Den högsta dosnivån bör väljas så att den framkallar 
neurotoxiska verkningar eller tydliga systemiska toxiska verkningar. 
Därefter väljs dosnivåerna i fallande skala så att en dosrelaterad respons kan påvisas, och samtidigt så att inga påvisbara skadliga verkningar (NOAEL) kan observeras på den lägsta dosnivån. Dos ­
nivåerna bör väljas så att primära toxiska verkningar på nervsystemet 
kan särskiljas från verkningar som härrör från systemisk toxicitet. Det är ofta optimalt med 2–3 intervall, och tillägg av en fjärde test ­
grupp är ofta att föredra framför användning av mycket breda inter ­
vall (exempelvis mer än faktorn 10) mellan dosnivåerna. Hänsyn bör tas till en eventuellt existerande skälig uppskattning av exponering på människor.
 
1.5.5  Gränstest (limit test)  
Om ett test med en dosnivå på minst 1 000 mg per kroppsvikt och dag 
genomförs på det sätt som beskrivs här och inga neurotoxiska verk ­
ningar kan observeras, och om toxicitet inte förväntas på grundval av 
uppgifter om strukturellt närbesläktade ämnen, kan ett fullständigt test med tre dosnivåer anses vara överflödigt. Om det är sannolikt att män ­
niskor kommer att utsättas för exponering måste eventuellt en högre 
dosnivå (oralt) användas vid gränstestet. För andra former av tillförsel, 
såsom inandning eller applicering på huden, kan testämnets fysikalk ­
emiska egenskaper ofta utnyttjas för att indikera och begränsa den maximala exponeringsnivån. För ett test avseende akut toxicitet oralt 
bör gränstestets dos vara minst 2 000 mg/kg.
 
1.5.6  Tillförsel av doser  
Djuren doseras dagligen med testämnet, 7 dagar i veckan under 
minst 28 dagar. Om doseringen görs 5 dagar i veckan eller under 
en kortare period bör detta motiveras. Om testämnet tillförs genom sondmatning bör hela dosen tillföras på en gång via magsond eller lämplig intubationskanyl. Den största mängd vätska som kan tillföras 
vid ett och samma tillfälle beror på testdjurets storlek. Volymen bör 
inte överskrida 1 ml per 100 g kroppsvikt. I fråga om vattenlösningar får dock volymer på upp till 2 ml per 100 g kroppsvikt användas. Med undantag för irriterande eller frätande ämnen som normalt ger 
kraftigare verkningar vid högre koncentrationer bör variationer i test ­
volym minimeras genom justering av koncentrationen, för att säker ­
ställa en konstant volym på alla dosnivåer. 
För ämnen som tillförs via fodret eller dricksvattnet är det viktigt att 
försäkra sig om att testämnet ges i mängder som inte stör det nor ­
mala näringsupptaget eller den normala vattenbalansen. När testäm ­
net tillförs via fodret kan man använda en konstant koncentration 
(ppm) eller en konstant dosnivå i förhållande till djurens kroppsvikt. Det använda alternativet måste anges. När ett ämne tillförs genom sondmatning bör dosen ges vid samma tid varje dag, och vid behov 
justeras dosen så att dosnivån hålls konstant i förhållande till djurens 
kroppsvikt. Om ett test med upprepad dos används som inledning till ett långtidstest måste samma foder användas vid båda testningarna. Om det inte är möjligt med en engångsdos vid test avseende akut 
toxicitet, kan dosen tillföras i mindre delar över en period som inte 
överskrider 24 timmar.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 628
 
1.6 OBSERVATIONER  
1.6.1  Frekvens för observationer och tester  
Vid test med upprepad dos bör observationsperioden vara lika lång 
som doseringsperioden. Vid test avseende akut toxicitet bör djuren 
observeras i ytterligare 14 dagar efter doseringsperiodens slut. För 
djur i satellitgrupper som inte exponeras under en period efter be ­
handlingen, bör observationerna även täcka denna period. 
Observationerna bör göras tillräckligt ofta för att maximera sanno ­
likheten för upptäckt av beteenderelaterade och/eller neurologiska avvikelser. Observationerna bör helst göras vid samma tid varje dag, med hänsyn tagen till när man förväntar sig de starkaste verk ­
ningarna efter doseringen. En översikt av frekvensen för kliniska och 
funktionella observationer finns i tabell 2. Om kinetiska eller andra data från tidigare studier tyder på avvikande tidpunkter för observa ­
tioner, prov eller förlängda observationsperioder, bör schemat anpas ­
sas så att maximal information erhålls. Motivering bör ges för alla 
ändringar av schemat.
 
1.6.1.1  Observationer av allmänt hälsotillstånd och mortalitet/morbiditet  
Alla djur bör observeras omsorgsfullt minst en gång per dag med 
avseende på hälsotillstånd och minst två gånger per dag med avse ­
ende på morbiditet och mortalitet.  
1.6.1.2  Detaljerade kliniska observationer  
Detaljerade kliniska observationer bör göras på alla djur som har 
valts ut för detta ändamål (se tabell 1), en gång före den första exponeringen (för att få en jämförelsegrund per djur) och därefter med olika tidsintervall beroende på testets varaktighet (se tabell 2). 
Detaljerade kliniska observationer av återhämtningen i satellitgrupper 
bör göras i slutet återhämtningsperioden. De kliniska observationerna bör göras utanför buren på en standardarena. Observationerna bör registreras omsorgsfullt med hjälp av ett poängsystem som inbegriper 
kriterier eller poängskalor för varje mätning. Testningslaboratoriet 
bör tydligt ange vilka kriterier eller skalor som har använts. Det är viktigt att säkerställa att variationerna i testbetingelserna är minimala (inte systematiskt relaterade till behandlingen) och att observatio ­
nerna görs av en kompetent person som inte känner till den aktuella 
behandlingen. 
Det rekommenderas att observationerna genomförs på ett strukturerat 
sätt där väldefinierade kriterier (inbegripet definition av området för 
normal) systematiskt tillämpas på varje djur vid varje observations ­
tidpunkt. Området för normal bör dokumenteras på tillbörligt sätt. Alla observerade tecken bör registreras. I tillämplig mån bör även omfattningen av de observerade tecknen registreras. De kliniska ob ­
servationerna bör omfatta, men inte begränsas till, förändringar av 
hud, päls, ögon och slemhinnor, förekomst av sekret och utsönd ­
ringar samt autonom aktivitet (tårflöde, upprest päls, pupillstorlek, ovanligt andningsmönster och/eller andning genom munnen, alla 
ovanliga tecken rörande urinering eller defekation samt missfärgning 
av urinen).
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 629
 
Registreringarna bör även omfatta all ovanlig respons rörande 
kroppsställning, aktivitetsnivå (exempelvis minskad eller ökad ut ­
forskning av standardarenan) och rörelsekoordinationen. Föränd ­
ringar i gång (exempelvis vaggande gång, ataxi), kroppsställning (exempelvis kutad rygg) och respons på hantering, placering eller 
andra omgivningsstimuli, liksom eventuella kloniska eller toniska 
rörelser, konvulsioner eller skälvningar, stereotypier, (exempelvis överdrivet putsande, ovanliga huvudrörelser, upprepat cirklande) eller bisarrt beteende (exempelvis bitning eller överdrivet slickande, själv ­
stympning, bakåtgång, utstötning av ljud) eller aggressioner bör re ­
gistreras.
 
1.6.1.3  Funktionella observationer  
Liksom i fråga om de kliniska observationerna bör funktionella ob ­
servationer göras en gång före exponeringen och därefter med till ­
börlig frekvens på alla djur som har valts ut för detta ändamål (se 
tabell 1). Frekvensen för de funktionella observationerna beror även 
på testets varaktighet (se tabell 2). Utöver de observationsperioder som anges i tabell 2 bör satellitgrupper för återhämtning bli föremål för funktionella observationer så nära avlivningen som möjligt. De 
funktionella observationerna bör omfatta sensorisk reaktion på olika 
slags stimuli, exempelvis hörsel-, syn- och djupsensoriska stimuli (se hänvisning 5, 6 och 7), bedömning av greppstyrka (se hänvisning 8) och bedömning av motorisk aktivitet (se hänvisning 9). Den moto ­
riska aktiviteten bör mätas med automatiserad utrustning som kan 
detektera både minskningar och ökningar av aktiviteten. Om något annat definierat system används bör detta vara kvantitativt och dess 
känslighet och tillförlitlighet bör påvisas. Alla apparater bör testas 
med avseende på tillförlitlighet över tiden och enhetliga resultat från olika apparater. Närmare uppgifter om lämpliga förfaranden finns i respektive hänvisning. Om det inte finns några data (exempelvis 
struktur-aktivitet, epidemiologiska data, tidigare toxikologiska test) 
som tyder på förmågan att framkalla neurotoxiska verkningar, bör man överväga att införliva mer specialiserade observationer av sen ­
sorisk och motorisk funktion eller inlärning och minne, för att un ­
dersöka dessa eventuella verkningar närmare. Mer information om 
specialiserade observationer och hur de görs finns i hänvisning 1. 
Undantagsvis kan djur som uppvisar så svåra tecken på toxicitet att 
de i betydande mån skulle störa de funktionella observationerna 
utelämnas från dessa. Om djur utelämnas från de funktionella obser ­
vationerna bör detta motiveras.
 
1.6.2  Kroppsvikt samt foder- och vattenkonsumtion  
Vid test som varar upp till 90 dagar bör alla djur vägas minst en 
gång per vecka och foderkonsumtionen bör mätas (vattenkonsumtio ­
nen i de fall då testämnet tillförs i vattnet) minst varje vecka. Vid 
långtidstest bör alla djur vägas minst en gång per vecka under de 
första 13 veckorna och därefter minst var fjärde vecka. Foderkon ­
sumtionen (vattenkonsumtionen i de fall då testämnet tillförs i vatt ­
net) bör mätas minst varje vecka under de första 13 veckorna och 
därefter ungefär var tredje månad, utom om förändringar i hälsotill ­
stånd eller kroppsvikt motiverar ett annat schema.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 630
 
1.6.3  Oftalmologi  
Vi test som varar längre än 28 dagar bör djuren, innan testämnet 
tillförs och vid testets slut, undersökas oftalmologiskt med ett oftal ­
moskop eller motsvarande utrustning. Denna undersökning bör helst 
omfatta alla djur men minst djuren i högdos- och kontrollgrupperna. 
Om ögonförändringar upptäcks, eller om kliniska tecken motiverar det, bör alla djur undersökas. Vid långtidstest bör oftalmologisk undersökning göras även när testet varat 13 veckor. Oftalmologisk 
undersökning behöver inte göras om det redan finns tillgång till data 
från tidigare gjorda test av liknande varaktighet och vid liknande dosnivåer.
 
1.6.4  Hematologi och klinisk biokemi  
När testet avseende neurotoxicitet utförs i kombination med test 
avseende systemisk toxicitet med upprepad dos, bör hematologiska undersökningar och klinisk-biokemiska bestämningar göras enligt det som gäller för testet avseende systemisk toxicitet. Provtagningen bör 
göras på sådant sätt att alla potentiella verkningar på det neurolo ­
giska beteendet minimeras.
 
1.6.5  Histopatologi  
Den neuropatologiska undersökningen bör utformas så att den kom ­
pletterar och utökar de observationer som har gjorts under testets  in 
vivo-fas. Vävnad från minst fem djur per kön och grupp (se tabell 1 och 
nästa avsnitt) bör fixeras  in situ  med hjälp av allmänt erkänd perfu ­
sions- och fixeringsteknik (se kapitel 5 i hänvisning 3 och kapitel 50 i 
hänvisning 4). Alla observerade betydande förändringar bör registreras. 
Om testet utförs fristående i syfte att påvisa neurotoxicitet eller karak ­
terisera neurotoxiska verkningar, kan återstoden av djuren användas för specifika undersökningar av neurobeteende (se hänvisning 10 och 11), 
neuropatologi (se hänvisning 10, 11, 12 och 13), neurokemi (se hänvis ­
ning 10, 11, 14 och 15) eller elektrofysiologi (se hänvisning 10, 11, 16 och 17) i den mån sådana undersökningar kan komplettera de förfaran ­
den och undersökningar som beskrivs i denna metod. Återstoden kan 
även utnyttjas för att få fler djur för de histopatologiska undersökning ­
arna. Dessa tilläggsförfaranden kan vara särskilt motiverade i fall där empiriska observationer eller förväntade verkningar tyder på att en kemikalies neurotoxicitet är av en specifik typ eller har ett specifikt 
mål (se hänvisning 2 och 3). Alternativt kan återstoden av djuren 
användas för rutinmässiga patologiska bedömningar enligt det som beskrivs i metoden för test med upprepad dos. 
All vävnad som inbäddats i paraffin bör färgas med ett standard ­
förfarande (såsom hematoxylin och eosin), och därefter undersökas i mikroskop. Om tecken på perifer neuropati observeras eller miss ­
tänks, bör plastinbäddade prover av perifer nervvävnad undersökas. 
De kliniska tecknen kan också ge indikationer på ytterligare objekt 
som bör undersökas eller på behovet att använda speciella färgnings ­
förfaranden. Vägledning om ytterligare undersökningsobjekt finns i hänvisning 3 och 4. Det kan också vara motiverat med vissa special ­
färgmedel i syfte att påvisa specifika typer av patologiska föränd ­
ringar (se hänvisning 18).
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 631
 
Representativa snitt av centrala och perifera nervsystemet bör under ­
sökas histologiskt (se kapitel 5 i hänvisning 3 och kapitel 50 i 
hänvisning 4). De områden som i regel ska undersökas inbegriper framhjärnan, centrum av storhjärnan, inbegripet ett snitt genom hip ­
pocampus, mitthjärnan, lillhjärnan, hjärnbryggan, förlängda märgen, 
ögat med synnerv och näthinna, ryggraden vid nacken och ländryg ­
gen, dorsala rotganglier, dorsala och ventrala rotfibrer, proximala ischiasnerven, proximala tibialnerven (vid knät) och tibialnervens vadmuskelförgrening. De snitt som görs av ryggraden och perifera 
nerver bör inbegripa diagonala, transversala och längsgående snitt. 
Uppmärksamhet bör fästas vid nervsystemets vaskulatur. Likaså bör man undersöka ett skelettmuskelprov, särskilt vadmuskeln. Särskild uppmärksamhet bör fästas vid sådana punkter i centrala och perifera 
nervsystemet som har cellulär och fibrös struktur och mönster och 
som man vet att särskilt påverkas av neurotoxiska ämnen. 
Vägledning om neuropatologiska förändringar som typiskt uppstår 
efter exponering av toxiska ämnen finns i hänvisning 3 och 4. För 
vävnadsproverna rekommenderas en stegvis undersökning där snitt från djuren i högdosgruppen först jämförs med snitt från djuren i kontrollgruppen. Om inga neuropatologiska förändringar kan iakttas i 
proverna från dessa grupper behövs inga ytterligare analyser. Om 
neuropatologiska förändringar kan iakttas i högdosgruppen bör pro ­
ver av alla potentiellt påverkade vävnader från mellandos- och låg ­
dosgruppen kodas och undersökas. 
Om tecken på neuropatologiska förändringar kan iakttas vid den 
kvalitativa undersökningen bör en tillläggsundersökning göras på nervsystemets alla regioner som uppvisar sådana förändringar. Snitt 
från djuren i alla dosgrupper, från alla potentiellt påverkade regioner 
bör kodas och undersökas randomiserat av personer som inte känner till koden. Frekvens och allvarlighetsgrad bör registreras för alla skador. Efter bedömning av alla regioner från alla dosgruppers djur 
avtäcks koderna, och en statistisk analys genomförs för utvärdering 
av förhållandet mellan dos och respons. För varje skada bör man beskriva exempel på olika allvarlighetsgrader. 
De neuropatologiska fynden bör utvärderas med hänsyn tagen till 
resultaten från observationer och mätningar av beteende, liksom 
även till övriga data från tidigare och parallella tester av det berörda ämnets systemiska toxicitet.
 
2. DATA  
2.1 BEHANDLING AV RESULTATEN 
Data bör rapporteras individuellt. Därutöver bör alla data samman ­
fattas i en tabell över antalet djur i varje testgrupp eller kontrollgrupp vid testets början, antalet djur som hittats döda under testets gång 
eller som avlivats av hänsyn till djurens välbefinnande inbegripet 
avlivningstidpunkterna, antalet djur som visat tecken på toxicitet, en beskrivning av observerade tecken på toxicitet, inbegripet tid ­
punkten då sådana första gången upptäcktes, varaktighet och hur 
allvarliga de toxiska verkningarna är, antalet djur som har skador 
samt skadornas typ och allvarlighetsgrad.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 632
 
2.2 UTVÄRDERING OCH TOLKNING AV RESULTATEN 
Alla fynd bör utvärderas med avseende på förekomst, allvarlighets ­
grad och korrelationen mellan neurobeteenderelaterade och neuropa ­
tologiska verkningar (även neurokemiska eller elektrofysiologiska 
verkningar, om tilläggsundersökningar ingår) samt alla andra skad ­
liga verkningar som har observerats. Om möjligt bör de numeriska resultaten utvärderas genom en tillämplig och allmänt godtagbar sta ­
tistisk metod. De statistiska metoderna bör fastställas vid utform ­
ningen av testet.
 
3. RAPPORTERING  
3.1 TESTRAPPORT 
Testrapporten ska innehålla nedan angivna uppgifter. 
Testämne: 
— Fysikalisk natur (inbegripet isomerism, renhet och fysikalkemiska 
egenskaper). 
— Identifieringsdata. Vehikel (i förekommande fall): 
— Motivering för valet av vehikel. 
Försöksdjur: — Art och stam som använts. — Djurens antal, ålder och kön. 
— Ursprung, förvaringsbetingelser, acklimatisering, foder och dy ­
likt. 
— Djurens individuella vikt vid testets början. Testbetingelser: 
— Utförliga uppgifter om testämnets sammansättning och beredning 
av fodret, uppnådd koncentration, preparatets stabilitet och ho ­
mogenitet. 
— Specifikation av de tillförda doserna, inbegripet uppgifter om 
vehikel, volym och det tillförda materialets fysikaliska form. 
— Utförliga uppgifter om hur testämnet har tillförts. — Motivering för val av dosnivåer. — Motivering för tillförselväg och exponeringens varaktighet. 
— Omräkning av testämneskoncentrationen i foder eller vatten 
(ppm) till faktisk dos (mg per kg kroppsvikt och dag), om till ­
lämpligt. 
— Uppgifter om foder- och vattenkvalitet. 
Observation och testförfaranden: 
— Uppgifter om hur djuren i de olika grupperna varje grupp har 
valts ut för perfusionsundergrupperna. 
— Uppgifter om poängsättningssystem, inbegripet kriterier och 
poängskalor för varje mätning inom de detaljerade kliniska ob ­
servationerna.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 633
 
— Uppgifterna om de funktionella observationerna rörande senso ­
risk reaktivitet på olika slags sti muli (exempelvis hörsel, syn och 
djupsensoriska), bedömning av greppstyrka, bedömning av mo ­
torisk aktivitet (inbegripet uppgifter om den automatiska utrust ­
ning som använts) och övriga förfaranden som använts. 
— Uppgifter om oftalmologiska undersökningar och, i förekom ­
mande fall, hematologiska undersökningar och klinisk-bio ­
kemiska test med relevanta basvärden. 
— Uppgifter om specifika neurobeteenderelaterade, neuropatologis ­
ka, neurokemiska eller elektrofysiologiska förfaranden. 
Resultat: 
— Kroppsvikt och förändringar i kroppsvikt, inbegripet kroppsvik ­
ten vid avlivningen. 
— Foderkonsumtion och vattenkonsumtion, enligt det som är rele ­
vant. 
— Uppgifter om toxiska reaktioner per kön och dosnivå, inklusive 
tecken på toxicitet eller mortalitet. 
— Art, grad och varaktighet (tidpunkten för när de sätter in och hur 
de därefter utvecklas) för kliniska observationer (oavsett om de är reversibla eller inte). 
— En detaljerad beskrivning av resultaten från alla funktionella ob ­
servationer. 
— Obduktionsfynd. — En utförlig beskrivning av alla neurobeteenderelaterade, neuropa ­
tologiska, neurokemiska eller elektrofysiologiska fynd, i tillämp ­
liga fall. 
— Data om absorption och metabolism, om sådana finns tillgäng ­
liga. 
— Statistisk behandling av resultaten, i tillämpliga fall. Diskussion om resultaten: — Information om dosrespons. — Vilken betydelse eventuella andra toxiska verkningar har för en 
slutsats rörande testämnets neurotoxiska förmåga. 
— Nivå där inga skadliga verkningar observeras (NOAEL). Slutsatser: — Ett specifikt uttalande om testämnets övergripande neurotoxicitet 
kan gärna ingå.
 
4. HÄNVISNINGAR  
1. ”OECD Giudance Document on Neurotoxicity Testing Strate ­
gies and Test Methods”, OECD, Paris (under beredning). 
2. ”Test Guidline for a Developmental Neurotoxicitu Study, 
OECD Guidelines for the Testing of Chemicals” (under bered ­
ning). 
3. World Health Organization (WHO) (1986), ”Environmental He ­
alth Criteria document 60: Principles and Methods for the As ­
sessment of Neurotoxicity associated with Exposure to Chem ­
icals”. 
4. P.S. Spencer och H.H. Schaumburg (1980), ”Experimental and 
Clinical Neurotoxicology”, red. P.S. Spencer och H.H. Schaum ­
burg,  Williams and Wilkins,  Baltimore/London.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 634
 
5. D.E. och R.B. Wallace (1980), ”Utility of the Neurological 
Examination in Rats”,  Acta Neurobiol. Exp.,  40, 999–1003. 
6. S.C. Gad (1982), ”A Neuromuscular Screen for Use in Indu ­
strial Toxicology”, J.  Toxicol. Environ. Health,  9, 691–704. 
7. V.C. Moser, K.M. McDaniel och P.M. Phillips (1991), ”Rat 
Strain and Stock Comparisons Using a Functional Observational Battery: Baseline Values and Effects of amitraz”,  Toxic. Appl. 
Pharmacol.,  108, 267–283. 
8. O.A. Meyer, H.A. Tilson, W.C. Byrd och M.T. Riley (1979), 
”A Method for the Routine Assessment of Fore- and Hind-limb Grip Strength of Rats and Mice”,  Neurobehav. Toxicol., 1,  
233–236. 
9. K.M. Crofton, J.L. Haward, V.C. Moser, M.W. Gill, L.W. Rei ­
rer, H.A. Tilson och R.C. MacPhail (1991), ”Interlaboratory Comparison of Motor Activity Experiments: Implication for Neurotoxicological Assessments”,  Neurotoxicol. Teratol.,  13, 
599–609. 
10. H.A. Tilson och C.L. Mitchell (red.) (1992), ”Neurotoxicology 
Target Organ Toxicology Series”,  Raven Press,  New York. 
11. L.W. Chang (red.) (1995), ”Principles of Neurotoxicology”,  
Marcel Dekker,  New York. 
12. B. Broxup (1991), ”Neuropathology as a screen for Neurotox ­
icity Assessment”, J.  Amer. Coll. Toxicol.,  10, 689–695 
13. V.C. Moser, D.C. Anthony, W.F. Sette och R.C. MacPhail 
(1992), ”Comparison of Subchronic Neurotoxicity of 2-Hyd ­
roxyethyl Acrylate and Acrylamide in Rats”,  Fund. Appl.Tox ­
icol.,  18, 343–352. 
14. J.P. O'Callaghan (1988), ”Neurotypic and Gliotypic Proteins as 
Biochemical Markers of Neurotoxicity”,  Eurotoxicol. Teratol.,  
10, 445–452. 
15. J.P. O'Callaghan och D.B. (1988), ”Acute Exposure of the 
Neonatal Rat to Triethyltin Results in Persistent Changes in 
Neurotypic and Gliotypic Proteins”,J.  Pharmacol. Exp.  Ther., 
244, 368–378. 
16. D.A. Fox, H.E. Lowndes och G.G. Birkamper (1982), ”Electro ­
physiological Techniques in Neurotoxicology”,  Nervous System 
Toxicology,  red. C. L. Mitchell,  Raven Press,  New York, 299–335. 
17. B.L. Johnson (1980), ”Electrophysiological Methods in neuro ­
toxicity Testing”,  Experimental and Clinical Neurotoxicology.  
red. P.S. Spencer och H. H. Schaumburg,  Williams and Wilkins 
Co., Baltimore/London, 726–742. 
18. J.D. Bancroft och A. Steven (1990), ”Theory and Pratice of His ­
tological Techniques, Chapter 17”,  Neuropathological Techniques,  
red. Lowe, James och Cox, Gordon, Churchill Livingstone.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 635
 
Tabell 1  
Minimiantalet djur per grupp när test avseende neurotoxicitet utförs dels fristående, dels i kombination med 
andra test  
OLIKA UTFÖRANDEN AV TEST AVSEENDE NEUROTOXICITET 
Separat test I kombination med 28- 
dagarstest I kombination med 90- 
dagarstest I kombination med test 
avseende kronisk tox ­
icitet 
Sammanlagt antal djur per 
grupp 10 hanar och 10 
honor 10 hanar och 10 
honor 15 hanar och 15 
honor 25 hanar och 25 ho ­
nor 
Antalet djur som valts ut för 
funktionella observationer inbegripet detaljerade kli ­
niska observationer 10 hanar och 10 
honor 10 hanar och 10 
honor 10 hanar och 10 
honor 10 hanar och 10 ho ­
nor 
Antalet djur som valts ut för 
perfusion  in situ  och neu­
rohistopatologi 5 hanar och 5 ho ­
nor 5 hanar och 5 ho ­
nor 5 hanar och 5 ho ­
nor 5 hanar och 5 honor 
Antalet djur som valts ut för 
observationer vid toxicitets ­
test med upprepad dos, vid test av subkronisk eller 
kronisk toxicitet, för he ­
matologisk undersökning, klinisk-biokemisk undersök ­
ning, histopatologi och dy ­
likt, enligt respektive väg ­
ledning 5 hanar och 5 ho ­
nor 10 hanar † och 10 
honor † 20 hanar † och 20 
honor † 
Tilläggsobservationer, i fö ­
rekommande fall 5 hanar och 5 ho ­
nor
 
† Inbegriper 5 djur som valts ut för funktionella observationer och detaljerade kliniska observationer som en del av testet avs eende 
neurotoxicitet.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 636
 
Tabell 2  
Frekvens för kliniska och funktionella observationer  
Typ av observationer Testets varaktighet 
Akut 28-dagars 90-dagars Kronisk  
För alla djur Allmänt hälso ­
tillstånd Dagligen Dagligen Dagligen Dagligen 
Mortalitet/morbi ­
ditet Två gånger per 
dag Två gånger per 
dag Två gånger per 
dag Två gånger per 
dag 
I djur som valts ut 
för funktionella observationer Detaljerade kli ­
niska observatio ­
ner — Före den 
första expo ­
neringen 
— Inom 8 tim ­
mar från do ­
sering, vid uppskattad tidpunkt för 
högsta ver ­
kan 
— På dag 7 och 
14 efter do ­
sering — Före den 
första expo ­
neringen 
— Därefter en 
gång per 
vecka — Före den 
första expo ­
neringen 
— En gång un ­
der den 
första eller andra expo ­
neringsvec ­
kan 
— Därefter en 
gång per månad — Före den 
första expo ­
neringen 
— En gång vid 
den första ex ­
ponerings ­
månadens slut 
— Därefter var 
tredje månad 
Funktionella ob ­
servationer — Före den 
första expo ­
neringen 
— Inom 8 tim ­
mar från do ­
sering, vid uppskattad tidpunkt för 
högsta ver ­
kan 
— På dag 7 och 
14 efter do ­
sering — Före den 
första expo ­
neringen 
— Under den 
första be­
handlings ­
veckan, så 
nära expone ­
ringsperio ­
dens slut som möjligt — Före den 
första expo ­
neringen 
— En gång un ­
der den 
första eller andra expo ­
neringsvec ­
kan 
— Därefter en 
gång per månad — Före den 
första expo ­
neringen 
— En gång vid 
den första ex ­
ponerings ­
månadens slut 
— Därefter var 
tredje månad"
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 637
 
B.44  HUDABSORPTION:  IN VIVO -METOD  
1. METOD  
Denna testmetod motsvarar OECD TG 427 (2004).  
1.1 INLEDNING 
Exponering för många kemikalier sker i huvudsak genom huden, 
medan de flesta toxikologiska studier som görs med försöksdjur gäller oral administrering. Den  in vivo -studie av hudabsorption som 
beskrivs i dessa riktlinjer ger den koppling som behövs för att kunna 
extrapolera från orala studier vid säkerhetsbedömning efter dermal 
exponering. 
Ett ämne måste passera ett stort antal cellager i huden innan det når 
blodcirkulationen. För de flesta ämnen är  stratum corneum,  hornlag­
ret som består av döda celler, det hastighetsbestämmande lagret. Permeabiliteten genom huden beror både på hur lipofil kemikalien 
är och hur tjockt epidermis yttersta lager är samt på faktorer som 
ämnets molekylvikt och koncentration. I regel har rått- och kaninhud högre permeabilitet än human hud, medan hudpermeabiliteten hos marsvin och apor ligger närmare människans. 
Metoderna för att mäta perkutan absorption kan indelas i två kate ­
gorier,  in vivo  och in vitro. In vivo -metoden kan ge god information 
om hudabsorption hos olika arter av försöksdjur. Under senare tid 
har in vitro -metoder utvecklats. I dessa används transport över hela 
eller delar av tvärsnitt av djurhud eller human hud till en vätskere ­
servoar.  In vitro -metoden beskrivs i en separat testmetod (1). Man 
bör konsultera OECD:s riktlinjer för genomförande av hudabsorp ­
tionsstudier (2) som ett stöd för valet av lämpligaste metod under 
givna betingelser, eftersom de innehåller detaljerade uppgifter om lämpligheten hos både  in vivo-  och in vitro -metoder. 
Den in vivo -metod som beskrivs i denna metod gör det möjligt att 
bestämma testämnets penetration genom huden in till organismen. Tekniken har haft bred användning under många år (3)(4)(5)(6)(7). 
I många fall kan hudabsorptionsstudier  in vitro  vara lämpliga, men 
det kan finnas lägen där endast en  in vivo -studie kan ge de data som 
krävs. 
Fördelar med  in vivo -metoden är att den utnyttjar fysiologiskt och 
metaboliskt intakta system och en art som är vanlig i många tox ­
icitetsstudier samt att den kan modifieras för användning med andra arter. Nackdelarna är att levande djur används, behovet av att an ­
vända radioaktivmärkt material för att göra det lättare att få tillför ­
litliga resultat, svårigheter att fastställa den tidiga absorptionsfasen och skillnader i permeabilitet mellan den föredragna artens (råtta) hud och mänsklig hud. Djurhud är i regel mer permeabel och kan 
därför ge en överskattning av den humana hudabsorptionen (6)(8)(9). 
Frätande/korrosiva ämnen bör inte testas på levande djur.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 638
 
1.2 DEFINITIONER  
Oabsorberad dos : representerar det som tvättas bort från hudytan 
efter exponering och eventuellt finns kvar på det icke-tättslutande täckmaterialet, inbegripet eventuell dos som kan visas avdunsta 
från huden under exponeringen.  
Absorberad dos  (in vivo): innefattar det som finns i urinen, i tvätt ­
vatten från buren, i avföring, i utandningsluften (om detta mäts), i 
blod, i vävnader (om sådana tas till vara) och i det återstående kad ­
avret efter avlägsnande av huden på appliceringsstället.  
Absorberbar dos:  representerar det som finns på eller i huden efter tvätt.
 
1.3 PRINCIPEN FÖR TESTMETODEN 
Testämnet, som helst ska vara radioaktivmärkt, appliceras på djurets 
rakade hud i en eller flera lämpliga doser i form av en representativ beredning som är i bruk. Testberedningen får vara i kontakt med huden under en bestämd tidsperiod under ett lämpligt täckmaterial (icke-tätt ­
slutande, halvtättslutande eller tättslutande) för att förhindra att djuret 
äter av testberedningen. I slutet av exponeringstiden tas täckmaterialet bort och huden rengörs med lämpligt rengöringsmedel. Täckmaterial och tvättmaterial behålls för analys och ett nytt täckmaterial appliceras. 
Före, under och efter exponeringsperioden hålls djuren i individuella 
metabolismburar och exkrementer och utandningsluft från dessa perioder samlas upp för analys. Insamlingen av utandningsluft kan uteslutas om det finns tillräckliga data som visar att inga eller få flyk ­
tiga radioaktiva metaboliter bildas. Varje studie omfattar i regel flera 
grupper av djur som exponeras för testberedningen. En grupp avlivas i slutet av exponeringsperioden. Andra grupper avlivas efter fastställda 
tidsintervall därefter (2). I slutet av provtagningstiden avlivas de 
återstående djuren, blod samlas in för analys, huden på applikations ­
stället avlägsnas för analys och kadavret analyseras med avseende på outsöndrat material. Proverna analyseras med lämpliga medel och 
graden av hudabsorption uppskattas (6)(8)(9).
 
1.4 BESKRIVNING AV METODEN  
1.4.1  Val av djurart  
Råtta är den art som oftast används, men även hårlösa stammar och 
arter som har hudabsorptionhastigheter som mer liknar människans 
kan användas (3)(6)(7)(8)(9). Unga vuxna, friska djur av samma kön (hankön är standard) av rutinmässigt använda laboratoriestammar ska användas. I början av studien bör djurens viktvariation inte överstiga 
± 20 % av medelvikten. Exempelvis är hanråttor på 200 g – 250 g 
lämpliga, särskilt i övre delen av viktintervallet.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 639
 
1.4.2  Djurens antal och kön  
En grupp på minst fyra djur av ett kön ska användas för varje 
testberedning och varje schemalagd avslutningstid. Varje djurgrupp avlivas efter olika tidsintervall, t.ex. i slutet av exponeringstiden (i 
regel efter 6 eller 24 timmar) och vid de efterföljande tidpunkterna 
(t.ex. 48 och 72 timmar). Om data finns tillgängliga som visar be ­
tydande skillnader i dermal toxicitet mellan hanar och honor ska det känsligare könet väljas. Om inga sådana data finns kan någondera 
könet användas.
 
1.4.3  Inhysning och diet  
Temperaturen i försöksdjursrummet ska vara 22  o C (± 3  o C). Den 
relativa luftfuktigheten ska vara minst 30 % och ska helst inte över ­
stiga 70 % annat än vid rengöring, men målet ska vara att hålla 
50–60 %. Artificiell belysning ska användas, med en sekvens på 
12 timmar ljus och 12 timmar mörker. Konventionella laboratorie ­
dieter kan användas och föda ska finnas fritt tillgänglig tillsammans med obegränsat med dricksvatten. Under studien och helst även 
under acklimatiseringen ska djuren inhysas enskilt i metabolismbu ­
rar. Eftersom spill av föda och vatten skulle äventyra resultaten ska risken för spill minimeras.
 
1.4.4  Förberedelse av djuren  
Djuren märks för att möjliggöra identifiering av individerna och hålls 
i sina burar i minst fem dagar innan studien inleds för att de ska 
acklimatisera sig till laboratoriebetingelserna. 
Efter acklimatiseringsperioden, och ungefär 24 timmar före dosering, 
rakas ett hudområde på djuren runt hals och rygg. Eftersom permea ­
bilitetsegenskaperna för skadad hud skiljer sig från dem hos intakt 
hud bör man undvika att skada huden. Efter rakning och ungefär 24 
timmar innan testämnet appliceras på huden (se avsnitt 1.4.7) ska hudytan torkas av med aceton för att avlägsna sebum. En komplet ­
terande tvätt med tvål och vatten rekommenderas inte, eftersom 
eventuella tvålrester kan främja absorption av testämne. Området 
måste vara tillräckligt stort för att det ska gå att göra en tillförlitlig beräkning av den absorberade mängden testkemikalie per cm
 2 hud, 
helst minst 10 cm  2 . Detta område är praktiskt möjligt att ha på råttor 
med kroppsvikten 200–250 g. Efter förberedelsen återförs djuren till metabolismburarna.
 
1.4.5  Testämne  
Testämnet är den entitet vars penetrationsegenskaper ska studeras. 
Helst ska testämnet vara radioaktivmärkt.  
1.4.6  Testberedningen  
Beredningen av testämne (t.ex. rent, utspätt eller formulerat material 
innehållande testkemikalien som appliceras på huden) ska vara det ­
samma (eller en rimlig ersättning) som det som människor eller andra målarter kan exponeras för. Alla avvikelser från den beredning som ”är i bruk” måste motiveras. Vid behov löses eller suspenderas 
testämnet i en lämplig vehikel. För andra vehikler än vatten ska 
absorptionsegenskaper och potentiella interaktioner vara kända.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 640
 
1.4.7  Applicering på huden  
Ett appliceringsställe med en viss yta definieras på hudytan. En känd 
mängd av testberedningen appliceras sedan jämnt på detta ställe. Mängden ska normalt efterlikna den potentiella exponering männi ­
skor utsätts för, i regel 1–5 mg/cm
 2 för ett fast ämne och upp till 10 
μl/cm  2 för vätskor. Alla andra mängder ska motiveras av de förvän ­
tade användningsbetingelserna, studiens syfte eller testberedningens fysikaliska egenskaper. Efter applicering ska det behandlade stället 
skyddas från putsning. Ett exempel på en typisk anordning visas i 
figur 1. Normalt skyddas appliceringsstället med ett täckmaterial som inte är tättslutande (t.ex. ett permeabelt skydd av nylonväv). För 
mycket små mängder bör dock appliceringsstället täckas tätt. Om 
avdunstning av halvflyktiga testämnen minskar upptagshastigheten av testämnet i oacceptabel omfattning (se även avsnitt 1.4.10, första stycket) måste det avdunstade ämnet fångas i ett träkolsfilter som 
täcker appliceringsanordningen (se figur 1). Det är viktigt att anord ­
ningen inte skadar huden och inte heller absorberar eller reagerar med testberedningen. Djuren återförs till individuella metabolismbu ­
rar för uppsamling av exkrementer.
 
1.4.8  Varaktighet för exponering och provtagning  
Exponeringens varaktighet är tidsintervallet mellan applicering och 
avlägsnande av testberedningen genom tvätt av huden. Exponerings ­
perioden ska vara relevant, i regel 6 eller 24 timmar, i förhållande till 
den förväntade humana exponeringstiden. Efter exponeringsperioden 
hålls djuren i metabolismburarna fram till den schemalagda avslut ­
ningen. Djuren ska observeras med regelbundna intervall med avse ­
ende på tecken på toxicitet/onormala reaktioner under hela studiepe ­
rioden. I slutet av exponeringsperioden ska den behandlade huden 
granskas så att man kan hitta eventuella synliga tecken på irritation. 
Metabolismburarna ska tillåta separat uppsamling av urin och avfö ­
ring under hela studien. De ska också tillåta uppsamling av  14 C- 
koldioxid och flyktiga  14 C-kolföreningar för analys vid produktion 
som överstiger 5 %. Urin, avföring och infångningsvätskor (t.ex. 
med  14 C-koldioxid och flyktiga  14 C-föreningar) ska samlas upp en ­
skilt från varje grupp vid varje provtagningstillfälle. Om det finns tillräckliga data för att man ska kunna utgå ifrån att inga eller mycket 
lite flyktiga radioaktiva metaboliter bildas går det att använda öppna 
burar. 
Exkrementer samlas upp under exponeringsperioden, upp till 24 tim ­
mar efter den initiala hudkontakten och sedan dagligen till och med försökets sista dag. Tre extra uppsamlingsintervall räcker i regel, men syftet med testberedningen eller befintliga kinetiska data kan 
ge vid handen att andra eller ytterligare tidpunkter är lämpliga för 
studien. 
I slutet av exponeringsperioden tas skyddsanordningen bort från 
varje djur och sparas separat för analys. Den behandlade huden på alla djur ska tvättas minst 3 gånger med rengöringsmedel med lämp ­
liga svabbar. Det är viktigt att undvika att kontaminera andra delar 
av kroppen. Rengöringsmedlet ska vara representativt för normal 
hygien, t.ex. en tvållösning i vatten. Slutligen ska huden torkas. Alla svabbar och allt tvättvatten ska sparas för analys. Ett nytt täck ­
material appliceras för att skydda det behandlade stället på djur som 
ingår i grupper med senare provtagningstidpunkter innan de återförs 
till sina enskilda burar.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 641
 
1.4.9  Avslutningsförfaranden  
För varje grupp ska de enskilda djuren avlivas på den schemalagda 
tidpunkten och blodprov tas för analys. Skyddsanordningen eller täckmaterialet avlägsnas för analys. Huden från appliceringsstället 
och en motsvarande yta av odoserad, rakad hud tas från varje djur 
för separat analys. Appliceringsstället kan delas upp för att skilja hornlagret från underliggande epidermis så att mer information er ­
hålls om testkemikaliens fördelning. Bestämningen av fördelningen 
under en viss tid efter exponeringsperioden bör ge en indikation om 
vad som händer med eventuell testkemikalie i hornlagret. För att underlätta uppdelningen av huden (efter att djuret har genomgått 
sluttvätt och avlivats) tas alla skyddsanordningar bort. Huden på 
appliceringsstället, med en omgivande ring av hud, skärs ut från råttan och nålas upp på en platta. En remsa häftande tejp appliceras på hudytan med ett varsamt tryck och tejpen tas bort tillsammans 
med en del av hornlagret. Tejpremsor appliceras successivt tills tej ­
pen inte längre fäster vid hudytan, då hela hornlagret har avlägsnats. För varje djur kan remsorna slås samman i en enda behållare. Till denna behållare sätts en vävnadsnedbrytare för att lösa upp hornlag ­
ret. Eventuell potentiell målvävnad kan avlägsnas för separat mät ­
ning innan det återstående kadavret analyseras med avseende på absorberad kadaverdos. De enskilda kadavren ska sparas för analys. Vanligen räcker en analys av totalinnehållet. Målorgan kan avlägsnas 
för separat analys (om andra studier tyder på att detta bör göras). 
Urin i blåsan vid den schemalagda tidpunkten för avlivning ska läggas till de tidigare uppsamlade urinproven. Efter uppsamling av exkrementer från metabolismburarna vid den schemalagda avliv ­
ningstiden ska burarna och tillhörande infångningsanordningar tvät ­
tas med lämpligt lösningsmedel. Även annan potentiellt kontamine ­
rad utrustning ska analyseras.
 
1.4.10  Analys  
Adekvat återvinning av radioaktiviteten (dvs. ett medelvärde på 100 
± 10 % av all radioaktivitet) ska uppnås i alla studier. Återvinning 
utöver detta intervall måste motiveras. Mängden av den administrerade 
dosen i varje prov analyseras med lämpliga vedertagna förfaranden. 
De statistiska beräkningarna ska inbegripa ett mått på variansen för 
replikaten för varje applicering.  
2. DATA  
Följande mätningar ska göras för varje djur, vid varje provtagnings ­
tillfälle för testkemikalien och/eller metaboliter. Utöver individdata ska data grupperade efter provtagningstidpunkter rapporteras som medelvärden: 
— Kvantitet i skyddsanordningen. 
— Kvantitet som kan avlägsnas från huden. — Kvantitet i/på huden som inte kan tvättas bort från denna.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 642
 
— Kvantitet i blodprover. 
— Kvantitet i exkrementer och i utandningsluft (om sådana data 
finns). 
— Återstående kvantitet i kadavret och i eventuella organ som har 
avlägsnats för separat analys. 
Kvantiteten av testämnet och/eller metaboliter i exkrementer, utand ­
ningsluft, blod och kadaver gör det möjligt att bestämma den totala mängd som har absorberats vid varje tidpunkt. Även en beräkning av 
mängden testkemikalie som absorberats för varje cm
 2 hud som ex ­
ponerats för testämnet kan göras.  
3. RAPPORTERING  
3.1 FÖRSÖKSRAPPORT 
Testrapporten måste avspegla de krav som ställs enligt försökspro ­
tokollet, inbegripet en motivering för det använda testsystemet. Rap ­
porten ska innehålla följande information: 
Testämne: 
— Identifieringsdata (t.ex. CAS-nummer, om detta är känt; källa; 
renhet (radiokemisk renhet); kända orenheter; satsnummer). 
— Fysikaliskt tillstånd, fysikalkemiska egenskaper (t.ex. pH, flyk ­
tighet, löslighet, stabilitet, molekylvikt och log P  ow ). 
Testberedning: 
— Formulering och motivering av användning. — Detaljerade uppgifter om testberedningen, applicerad mängd, 
uppnådd koncentration, vehikel, stabilitet och homogenitet. 
Försöksdjur: 
— Använd stam/art. 
— Djurens antal, ålder och kön. — Källa för djuren, inhysningsbetingelser osv. 
— De enskilda djurens vikt då försöket påbörjas. 
Försöksförhållanden: — Detaljerade uppgifter om administrering av testberedningen (ap ­
pliceringsställe, bestämningsmetoder, tättslutande/icketättslutande täckmaterial, volym, extraktion, detektion). 
— Detaljerade uppgifter om födo- och vattenkvalitet. 
Resultat: 
— Eventuella tecken på toxicitet. — Absorptionsdata i tabellform (uttryckt som hastighet, mängd eller 
procentandel).
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 643
 
— Uppgifter om total återvinning från försöket. 
— Tolkning av resultaten, jämförelse med tillgängliga data för hu ­
dabsorption av testföreningen. 
Diskussion av resultaten. Slutsatser.
 
4. HÄNVISNINGAR  
1. Testing Method B.45. Skin Absorption:  In vitro  Method. 
2. OECD (2002). Guidance Document for the Conduct of Skin 
Absorption Studies. OECD, Paris. 
3. ECETOC (1993) Percutaneous Absorption. European Centre for 
Ecotoxicology and Toxicology of Chemicals, Monograph No. 20. 
4. Zendzian RP (1989) Skin Penetration Method suggested for En ­
vironmental Protection Agency Requirements.  J. Am. Coll. Tox ­
icol. 8(5), 829–835. 
5. Kemppainen BW, Reifenrath WG (1990) Methods for skin 
absorption. CRC Press Boca Raton, FL, USA. 
6. EPA (1992) Dermal Exposure Assessment: Principles and Appli ­
cations. Exposure Assessment Group, Office of Health and En ­
vironmental Assessment. 
7. EPA (1998) Health Effects Test Guidelines, OPPTS 870-7600, 
Dermal Penetration. Office of Prevention, Pedsticides and Toxic 
Substances. 
8. Bronaugh RL, Wester RC, Bucks D, Maibach HI and Sarason R 
(1990)  In vivo  percutaneous absorption of fragrance ingredients 
in reshus monkeys and humans.  Fd. Chem. Toxic.  28, 369–373. 
9. Feldman RJ and Maibach HI (1970) Absorption of some organic 
compounds through the skin in man.  J. Invest Dermatol.  54, 
399–404.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 644
 
Figur 1  
Ett exempel på en typisk anordning som används för att definiera och skydda 
appliceringsstället på huden vid hudabsorptionsstudier  in vivo .
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 645
 
B.45.  HUDABSORPTION:  in vitro- METOD  
1. METOD  
Denna testmetod motsvarar OECD TG 428 (2004).  
1.1 INLEDNING 
Denna metod har utformats för att ge information om absorption av 
ett testämne som appliceras på utskuren hud. Den kan antingen kombineras med metoden för hudabsorption  in vivo  (1) eller genom ­
föras separat. Det rekommenderas att OECD:s riktlinjedokument för 
genomförande av hudabsorptionsstudier (2) konsulteras som ett stöd 
för utformningen av studier som bygger på denna metod. Riktlinje ­
dokumentet har tagits fram för att underlätta urvalet av  in vitro-  
förfaranden för användning under särskilda betingelser, för att garan ­
tera att de resultat som erhålls med denna metod blir tillförlitliga. 
Metoderna för att mäta hudabsorption och dermal leverans kan in ­
delas i två kategorier:  in vivo  och  in vitro. In vivo- metoder för 
hudabsorption är väl etablerade och ger farmakokinetisk information 
i ett urval av djurarter. En  in vivo -metod beskrivs separat i en annan 
testmetod (1).  In vitro -metoder har också använts under många år för 
att testa hudabsorption. Formella valideringsstudier av  in vitro -meto­
der som omfattas av denna testmetod har inte gjorts, men OECD- 
experter enades 1999 om att tillräckligt med data hade utvärderats för att stödja  in vitro -metoden (3). Detaljerade uppgifter som ytter ­
ligare stödjer detta, inbegripet ett betydande antal direktjämförelser 
av in vitro-  och in vivo -metoder, finns i riktlinjedokumentet (2). Det 
finns ett antal monografier som innehåller översikter över detta ämne och ger en detaljerad bakgrund till användningen av en  in vitro - 
metod (4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12).  In vitro -metoder mäter diffusio ­
nen av kemikalier in i och genom huden till en vätskereservoar, och 
det går använda icke-viabel hud för att mäta endast diffusion eller färsk, metaboliskt aktiv hud för att samtidigt mäta diffusion och metabolism i huden. Sådana metoder har särskilt funnit användning 
för att jämföra leveransen av kemikalier in i och genom huden från 
olika formuleringar och kan också ge användbara modeller för hu ­
dabsorption hos människa.  
In vitro -metoden är inte alltid tillämplig för alla situationer och för 
alla kemikalieklasser. Den kan gå att använda för en initial kvalitativ utvärdering av hudpenetrationen. I vissa fall kan det vara nödvändigt 
att följa upp denna utvärdering med  in vivo -data. Riktlinjedokumen ­
tet (2) bör konsulteras för ytterligare information om situationer där  
in vitro -metoden skulle vara lämplig. Mer detaljerade uppgifter som 
stöd för beslutet finns i (3). 
Denna metod presenterar allmänna principer för att mäta hudabsorp ­
tion och leverans av ett testämne med hjälp av utskuren hud. Hud från många däggdjursarter, inbegripet människa, kan användas. Hu ­
dens permeabilitetsegenskaper bibehålls efter utskärning, eftersom 
den huvudsakliga diffusionsbarriären är det icke-viabla hornlagret,  
stratum corneum;  aktiv transport genom huden har inte påvisats. 
Huden har visats kunna metabolisera vissa kemikalier under hu ­
dabsorption (6), men denna process är inte hastighetsbegränsande 
med avseende på faktisk absorberad dos, även om den kan påverka 
naturen hos det material som kommer in i blodbanan.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 646
 
1.2 DEFINITIONER  
Oabsorberad dos : representerar det som tvättas bort från hudytan 
efter exponering och eventuellt finns kvar på det icke-tättslutande täckmaterialet, inbegripet eventuell dos som kan visas avdunsta 
från huden under exponeringen.  
Absorberad dos  (in vitro) : massan av testämne som når mottagar ­
vätskan eller den systemiska cirkulationen inom en given tidsperiod.  
Absorberbar dos  (in vitro) : representerar det som finns kvar på eller 
i huden efter tvättning.
 
1.3 PRINCIPEN FÖR TESTMETODEN 
Testämnet, som kan vara radioaktivmärkt, appliceras på ytan av ett 
hudprov som skiljer två kammare åt i en diffusionscell. Kemikalien 
finns kvar på huden under en fastställd tid och under fastställda betingelser innan den avlägsnas med ett lämpligt rengöringsförfaran ­
de. Mottagarvätskan provtas vid tidpunkter under hela försöket och 
analyseras med avseende på testkemikalie och/eller metaboliter. 
Om metaboliskt aktiva system används kan metaboliter av testkemi ­
kalien analyseras med lämpliga metoder. I slutet av försöket kvan ­
tifieras fördelningen av testkemikalien och dess metaboliter, om så ­
dana förekommer. 
Under lämpliga betingelser, såsom beskrivs i denna metod och i riktlin ­
jedokumentet (2), mäts absorptionen av en testkemikalie under en gi ­
ven tidsperiod genom analys av en mottagarvätska och av den behand ­
lade huden. Det testämne som återstår i huden ska betraktas som ab ­
sorberat om det inte kan visas att absorptionen kan bestämmas utifrån 
enbart värden för receptorvätskan. Analys av övriga komponenter (material som tvättas bort från huden och som finns kvar i hudlagren) gör ytterligare utvärdering av data möjlig, inbegripet total fördelning av 
testämne och procentandel återvunnet testämne. 
Resultat för relevanta referenskemikalier ska finnas tillgängliga och 
överensstämma med publicerad litteratur om den använda metoden för att visa testsystemets prestanda och tillförlitlighet på det labora ­
torium som genomför försöket. Detta krav kan uppfyllas genom att 
en lämplig referenskemikalie (helst ett ämne vars lipofilicitet ligger 
nära testämnets) testas samtidigt med testämnet eller genom att ade ­
kvata historiska data tillhandahålls för ett antal referensämnen med olika lipofilicitet (t.ex. koffein, bensoesyra och testosteron).
 
1.4 BESKRIVNING AV TESTMETODEN  
1.4.1  Diffusionscell  
En diffusionscell består av en givarkammare och en mottagarkam ­
mare mellan vilka huden placeras (ett exempel på en typisk utform ­
ning finns i figur 1). Cellen ska ge en god förslutning runt huden, möjliggöra enkel provtagning och en god blandning av den motta ­
garlösning som är i kontakt med hudens undersida samt god tempe ­
raturkontroll av cellen och dess innehåll. Diffusionsceller av både statisk typ och genomflödestyp är godtagbara. Normalt lämnas gi ­
varkammaren öppen under exponering för en begränsad dos av en 
testberedning. Vid applicering av en obegränsad dos och i vissa fall 
även av begränsade doser kan givarkammaren inneslutas.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 647
 
1.4.2  Mottagarvätska  
Föredraget används en fysiologiskt anpassad mottagarvätska, även 
om andra vätskor kan användas om detta är motiverat. Mottagarvät ­
skans exakta sammansättning ska anges. Det ska visas att testkemi ­
kaliens löslighet i mottagarvätskan är rimlig så att vätskan inte fun ­
gerar som en barriär för absorption. Mottagarvätskan får inte heller skada hudberedningen. I ett genomflödessystem får flödeshastigheten inte förhindra diffusion av testämnet in i mottagarvätskan. I ett sta ­
tiskt system ska vätskan vara under ständig omrörning och provtas 
regelbundet. Om metabolism studeras måste receptorvätskan kunna hålla huden viabel under hela försöket.
 
1.4.3  Hudberedningar  
Människo- eller djurhud kan användas. Användning av human hud 
begränsas är föremål för nationella och internationella etiska hänsyn ­
staganden och begränsningar. Viabel hud är att föredra, men icke- viabel hud kan användas om det kan visas att den inte är skadad. Både epidermala membran (separerade med hjälp av enzymer, värme 
eller kemikalier) eller hud med anpassad tjocklek (i regel 
200–400 μm tjock) preparerad med dermatom är godtagbara. Hud 
med full tjocklek kan användas, men alltför tjock hud (cirka > 1 mm) bör undvikas, om inte detta särskilt krävs för bestämning 
av testkemikalien i hudlagren. Valet av art, anatomisk placering 
och preparationsteknik måste motiveras. Godtagbara data för minst fyra replikat per testberedning krävs.
 
1.4.4  Hudberedningens integritet  
Huden måste prepareras korrekt. Olämplig hantering kan leda till att 
hornlagret skadas. Därför måste man kontrollera att den preparerade 
huden inte är skadad. När hudmetabolism undersöks ska den ny ­
utskurna huden användas så snart som möjligt och under betingelser som är kända för att främja metabolisk aktivitet. Som en allmän väg ­
ledning kan sägas att nyutskuren hud ska användas inom 24 timmar, 
men den godtagbara lagringsperioden kan variera beroende på vilket enzymsystem som är involverat i metaboliseringen och på lagrings ­
temperaturen (13). När hudberedningar har lagrats före användning 
ska det finnas belägg för att barriärfunktionen är bibehållen.
 
1.4.5  Testämne  
Testämnet är den entitet var penetrationsegenskaper studeras. Helst 
ska testämnet vara radioaktivmärkt.  
1.4.6  Testberedning  
Beredningen av testämne (t.ex. rent, utspätt eller formulerat material 
innehållande testkemikalien som appliceras på huden) ska vara det ­
samma (eller en rimlig ersättning) som det som människor eller 
andra målarter kan exponeras för. Alla avvikelser från den beredning 
som ”är i bruk” måste motiveras.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 648
 
1.4.7  Testämneskoncentration och testämnesformuleringar  
Normalt används mer än en koncentration av testämnet så att den 
övre gränsen för potentiell human exponering ligger inom koncent ­
rationsintervallet. Likaledes bör man överväga att testa ett urval av 
typiska formuleringar.  
1.4.8  Applicering på huden  
Under normala betingelser för human exponering för kemikalier är 
doserna vanligen begränsade. Därför ska en applicering som efter ­
liknar human exponering användas, normalt 1–5 mg/cm  2 hud för ett 
fast ämne och upp till 10 μl/cm  2 för en vätska. Mängden ska moti ­
veras av de förväntade användningsbetingelserna, studiens syften och 
testberedningens fysikaliska egenskaper. Exempelvis kan applice ­
ringen på hudytan vara obegränsad om stora volymer per enhetsyta appliceras.
 
1.4.9  Temperatur  
Passiv diffusion av kemikalier (och därmed deras hudabsorption) 
påverkas av temperaturen. Diffusionskammaren och huden ska hållas 
vid en konstant temperatur som ligger nära den normala hudtempera ­
turen på 32  o C ± 1  o C. Olika cellutföranden kräver olika temperatur 
på vattenbad eller uppvärmningsblock för att säkerställa att motta ­
garvätskan/huden hålls vid sin fysiologiska norm. Fuktigheten ska 
helst ligga mellan 30 och 70 %.  
1.4.10  Varaktighet för exponering och provtagning  
Huden kan exponeras för testberedningen under hela försökets gång 
eller under kortare tider (t.ex. för att efterlikna en särskild typ av human exponering). Överflödig testberedning ska tvättas bort från huden med lämpligt rengöringsmedel och tvättvattnet ska samlas 
upp för analys. Förfarandet för att avlägsna testberedningen beror 
på de förväntade användningsbetingelserna och ska motiveras. En provtagningsperiod på 24 timmar krävs normalt för att tillåta adekvat karakterisering av absorptionsprofilen. Eftersom hudens integritet 
kan börja försämras efter 24 timmar bör provtagningstidpunkterna 
normalt inte ligga efter 24 timmar. För testämnen som tränger ige ­
nom huden snabbt kan detta vara onödigt, men för testämnen som tränger igenom huden långsamt kan längre tider krävas. Provtag ­
ningsfrekvensen för mottagarvätska ska vara sådan att det går att 
återge testämnets absorptionsprofil grafiskt.
 
1.4.11  Avslutningsförfaranden  
Alla testsystemets komponenter ska analysers och återvinningen be ­
stämmas. Detta inbegriper givarkammaren, tvättvattnet från hudbe ­
redningen, hudberedningen samt mottagarvätska och mottagarkam ­
mare. I vissa fall kan huden delas upp i den exponerade hudytan 
och hudytan under cellens fläns samt i hornlager-, epidermis- och dermisfraktioner för separat analys.
 
1.4.12  Analys  
Adekvat återvinning av radioaktiviteten ska uppnås i alla studier 
(målet bör vara ett medelvärde på 100 ± 10 % av radioaktiviteten, och alla avvikelser ska motiveras). Mängden testämne i mottagar ­
vätskan och hudberedningen samt i tvättvätskan från hudyta och 
apparatur ska analyseras med lämplig teknik.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 649
 
2. DATA  
Analysen av mottagarvätskan, fördelningen av testkemikalien i test ­
systemet och absorptionsprofilen med tid ska presenteras. Då begrän ­
sade doser används ska den mängd som tvättas bort från huden, den 
mängd som finns i huden (och i de olika hudlagren om detta har 
analyserats) samt den mängd som finns i mottagarvätskan (hastighet samt mängd eller procentandel av applicerad dos) beräknas. Hu ­
dabsorption uttrycks ibland endast som data för mottagarvätskan. 
Om testämnet finns kvar i huden i slutet av försöket kan dock den 
mängden behöva inkluderas i den totala absorberade mängden (se stycke 66 i hänvisning 3). Om en obegränsad dos har använts vid 
exponeringen kan det gå att beräkna en permeabilitetskonstant (Kp) 
med hjälp av erhållna data. Under de senare betingelserna är pro ­
centandelen absorberat testämne inte av betydelse.
 
3. RAPPORTERING  
3.1 FÖRSÖKSRAPPORT 
Försöksrapporten måste avspegla de krav som ställs enligt försöks ­
protokollet, inbegripet en motivering för det använda testsystemet. 
Rapporten måste innehålla följande information: 
Testämne: 
— Fysikaliskt tillstånd, fysikalkemiska egenskaper (minst molekyl ­
vikt och log P  ow ) och renhet (radiokemisk renhet). 
— Identifieringsdata (t.ex. satsnummer). — Löslighet i mottagarvätskan. 
Testberedning: 
— Formulering och motivering för användningen. — Homogenitet. Försöksförhållanden: 
— Källor till huden och ursprungsplacering på kroppen, lagrings ­
betingelser före användning, eventuell förbehandling (rengöring, antibiotikabehandling osv.), mätningar av hudens integritet, me ­
tabolisk status, motivering av användningen. 
— Cellutformning, mottagarvätskans sammansättning, mottagarvät ­
skans flödeshastighet eller provtagningstider och provtagningsför ­
faranden. 
— Detaljerade uppgifter om testberedningen och kvantifiering av 
applicerad dos. 
— Exponeringens varaktighet. — Detaljerade uppgifter om avlägsnande av testberedningen från 
huden, t.ex. tvätt av huden. 
— Detaljerade uppgifter om analys av huden och eventuella del ­
ningsmetoder som har använts för att påvisa fördelning i huden.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 650
 
— Förfaranden för tvätt av cell och utrustning. 
— Analysmetoder, extraktionstekniker, detektionsgränser och vali ­
dering av analysmetoder. 
Resultat: — Total återvinning från försöket (applicerad dos ≡ tvättvatten från 
huden + huden + mottagarvätskan + tvättvatten från cellen). 
— Återvinning från varje cell och varje kammare i tabellform. — Absorptionsprofil. — Absorptionsdata i tabellform (uttryckt som hastighet, mängd eller 
procentandel). 
Diskussion av resultaten. 
Slutsatser.
 
4. HÄNVISNINGAR  
1. Testmetod B.44. Hudabsorption:  in vivo -metod. 
2. OECD (2002). Guidance Document for the Conduct of Skin 
Absorption Studies. OECD, Paris. 
3. OECD (2000). Report of the Meeting of the OECD Extended 
Steering Committee for Percutaneous Absorption Testing, An ­
nex 1 to ENV/JM/TG(2000)5. OECD, Paris. 
4. Kemppainen BW and Reifenrath WG. (1990). Methods for skin 
absorption. CRC Press, Boca Raton. 
5. Bronaugh RL and Collier, SW. (1991). Protocol for  In vitro  
Percutaneous Absorption Studies, in  In vitro Percutaneous 
Absorption: Principles, Fundamentals and Applications,  RL 
Bronaugh and HI Maibach, Eds., CRC Press, Boca Raton, pp. 237–241. 
6. Bronaugh RL and Maibach HI. (1991).  In vitro Percutaneous 
Absorption: Principles, Fundamentals and Applications.  CRC 
Press, Boca Raton. 
7. European Centre for Ecotoxicology and Toxicology of Chem ­
icals (1993). Monograph No. 20, Percutaneous Absorption, 
ECETOC, Brussels. 
8. Diembeck W, Beck H, Benech-Kieffer F, Courtellemont P, Du ­
puis J, Lovell W, Paye M, Spengler J, Steiling W (1999). Test Guidelines for  In Vitro  Assessment of Dermal Absorption and 
Percutaneous Penetration of Cosmetic Ingredients, Fd Chem 
Tox, 37, 191–205. 
9. Recommended Protocol for  In vitro  Percutaneous Absorption 
Rate Studies (1996). US Federal Register, Vol. 61, No. 65. 
10. Howes D, Guy R, Hadgraft J, Heylings JR  et al. (1996). Met ­
hods for assessing Percutaneous absorption. ECVAM Workshop 
Report ATLA 24, 81 R10.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 651
 
11. Schaefer H and Redelmeier TE. (1996). Skin barrier: principles 
of percutaneous absorption. Karger, Basel. 
12. Roberts MS and Walters KA. (1998). Dermal absorption and 
toxicity assessment. Marcel Dekker, New York. 
13. Jewell, C., Heylings, JR., Clowes, HM. And Williams, FM. 
(2000). Percutaneous absorption and metabolism of dinitroch ­
lorobenzene in vitro. Arch Toxicol 74: 356–365.  
Figur 1  
Ett exempel på en typisk utformning av en statisk diffusionscell för perkutana 
absorptionsstudier  in vitro.
  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 652
 
B.46.  IN VITRO -HUDIRRITATION: TESTMETOD MED REKON ­
STRUERAD HUMAN HUD  
INLEDNING 
1. Hudirritation betyder att det uppstår reversibel skada på huden efter appli ­
cering av en testkemikalie i upp till fyra timmar, enligt definitionen i Fö ­
renta nationernas globalt harmoniserade system för klassificering och märk ­
ning av kemikalier (FN:s GHS) och Europaparlamentets och rådets 
förordning (EG) nr 1272/2008 av den 16 december 2008 om klassificering, 
märkning och förpackning av ämnen och blandningar (CLP-förordningen) (1) (3). Denna testmetod innebär ett  in vitro -förfarande som kan användas 
för identifiering av faror med irriterande kemikalier (ämnen och blandning ­
ar) enligt FN:s GHS och EU:s CLP-kategori 2 (1) (2) (3). I EU och andra 
regioner som inte har antagit FN:s frivilliga GHS-kategori 3 (svagt irrite ­
rande ämnen) kan testmetoden även användas för att identifiera 
icke-klassificerade kemikalier, dvs. ”ingen kategori” enligt FN:s GHS och 
CLP-förordningen (1) (3). Testmetoden kan användas för att fastställa ke ­
mikaliers hudirriterande verkan som ett fristående ersättningstest för  in vivo - 
testning för hudirritation som en del av en strategi för stegvis testning (4 och 
kapitel B.4 i denna bilaga). 
2. Bedömningen av hudirritation har vanligtvis inneburit användning av labo ­
ratoriedjur (OECD:s testriktlinje 404, kapitel B.4 i denna bilaga) (4). På 
grund av frågor rörande djurens välbefinnande reviderades metod B.4 år 2004 och med den kan man fastställa hudkorrosion/hudirritation genom att tillämpa en stegvis teststrategi med validerade  in vitro - och  ex vivo -metoder, 
och på så sätt undvika smärta och lidande hos djur. Tre validerade  in vitro - 
testmetoder har antagits som OECD:s testriktlinjer 430, 431 och 435 (5) (6) (7) och två av dem som kapitel B.40 och B.40a i denna bilaga, för att användas för korrosivitetsdelen i den stegvisa teststrategin i B.4 eller 
OECD:s testriktlinje 404 (4). 
3. Denna testmetod gäller hudirritation som en slutpunkt för människa. Den 
baserar sig på rekonstruerad human hud (RhE) där produkten (användning 
av icke-transformerade keratinocyter i epidermis med humant ursprung som cellkälla och användning av representativ vävnad och cytoarkitektur) har mycket liknande biokemiska och fysiologiska egenskaper som den humana 
överhuden (epidermis). Denna testmetod omfattar också en uppsättning pre ­
standastandarder (tillägg 2) för bedömning av liknande och modifierade RhE-baserade metoder som utvecklats av EC-ECVAM (8), i enlighet med principerna i OECD:s riktlinjedokument nr 34 (9). 
4. Det finns tre validerade metoder som följer denna testmetod. Förvalidering, 
optimering och valideringsstudier har genomförts för en  in vitro -metod (10) 
(11) (12) (13) (14) (15) (16) (17) (18) (19) (20) med användning av en 
RhE-modell som finns kommersiellt tillgänglig som EpiSkin
 TM (utsedd till 
validerad referensmetod). Två andra kommersiellt tillgängliga  in vitro -hudir­
ritationsmetoder enligt RhE-modellen har enligt prestandastandardbaserad 
validering visat liknande resultat som den validerade referensmetoden (21) 
– metoderna är EpiDerm  TM SIT (EPI-200) och SkinEthic  TM RHE (22).  ▼M3 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 653
 
5. Innan en föreslagen liknande eller modifierad  in vitro -metod enligt 
RhE-modell annan än den validerade referensmetoden, EpiDerm  TM SIT 
(EPI-200) eller SkinEthic  TM RHE, kan användas för lagenliga ändamål 
bör metodens tillförlitlighet, relevans (exakthet) och begränsningar för den föreslagna användningen bestämmas för att säkerställa att metoden kan an ­
ses vara liknande den validerade referensmetoden, i enlighet med kraven i 
prestandastandarder som anges i denna testmetod (tillägg 2). Det är också rekommendabelt att studera OECD:s bakgrundsdokument rörande  in vitro - 
hudirritationstestning innan man utvecklar och validerar en liknande eller 
modifierad  in vitro -metod enligt RhE-modell och lämnar in den för godkän ­
nande (23).
 
DEFINITIONER 
6. Definitioner av begreppen finns i tillägg 1.  
INLEDANDE ÖVERVÄGANDEN OCH BEGRÄNSNINGAR 
7. En begränsning av testmetoden, såsom det påvisas i valideringsstudien (16), 
är att man inte kan klassificera kemikalier för FN:s frivilliga GHS-kategori 3 
(svagt irriterande ämnen) (1). När metoden används som ett partiellt ersätt ­
ningstest kan det krävas uppföljande  in vivo -testning för att få en fullständig 
bild av hudirritationspotentialen (4 och kapitel B.4 i denna bilaga). Använd ­
ningen av human hud är föremål för nationella och internationella etiska 
överväganden och begränsningar. 
8. Denna testmetod hänför sig till  in vitro -hudirritationskomponenten i den 
stegvisa testningsstrategin för B.4 (OECD:s testriktlinje 404) om hudkorro ­
sion/hudirritation (4). Den ger inte tillräcklig information om hudkorrosion, 
men här bör noteras att B.40a (OECD:s testriktlinje 431) om hudkorrosion baserar sig på samma RhE-testsystem, om än med användning av ett annat protokoll (kapitel B.40a). Denna metod baserar sig på RhE-modeller med 
användning av humana keratinocyter, som därför representerar  in vitro -mål­
organet hos den art det gäller. Metoden täcker dessutom direkt det inledande steget hos den inflammatoriska kaskaden/funktionsmekanismen (cellskada och vävnadsskada som leder till lokaliserat trauma) som inträffar vid irrita ­
tion in vivo . En omfattande mängd olika kemikalier har testats vid den 
validering som ligger till grund för denna testmetod och valideringsstudiens empiriska databas uppgick till totalt 58 kemikalier (16) (18) (23). Tillämp ­
ligheten omfattar fasta ämnen, vätskor, halvfasta ämnen och vaxer. Väts ­
korna kan vara vattenbaserade eller icke-vattenbaserade och de fasta ämnena 
kan vara vattenlösliga eller icke-vattenlösliga. Fasta ämnen ska alltid när det är möjligt malas ned till fint pulver före appliceringen, och ingen annan beredning behövs. Gaser och aerosoler har ännu inte bedömts genom vali ­
deringsstudier (24). Det är tänkbart att de kan testas med RhE-teknik, men 
den aktuella testmetoden ger inte möjlighet att testa gaser och aerosoler. Det bör också noteras att mycket färgstarka kemikalier kan störa cellviabilitets ­
mätningarna och för dem krävs användning av anpassade kontrollgrupper 
för korrigering (se punkterna 24–26). 
9. En enda testomgång med tre vävnadsbitar bör vara tillräcklig för en test ­
kemikalie förutsatt att klassificeringen är otvetydig. I fall av gränsresultat, såsom icke-konkordanta mätningar av vävnadsbitarna och/eller genomsnitt ­
lig procentuell viabilitet lika med 50 ± 5 %, bör man överväga en andra 
testomgång, och en tredje omgång om resultaten mellan de två första om ­
gångarna är diskordanta.
 ▼M3 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 654
 
PRINCIP FÖR TESTMETODEN 
10. Testkemikalien appliceras lokalt på en tredimensionell RhE-modell som 
består av icke-transformerade epidermala keratinocyter av humant ursprung 
som har odlats till att bilda en starkt differentierad modell av human hud i flera lager. Den består av ordnade lager: basalt lager, taggcellslager och granulärt lager samt ett hornlager i flera skikt som innehåller intercellulära 
lamellager som representerar de huvudsakliga lipidklasser som motsvarar 
dem som förekommer  in vivo . 
11. Kemiskt inducerad hudirritation, som manifesterar sig som hudrodnad och 
ödem, är resultatet av en rad händelser som börjar med penetration av hornlagret ( stratum corneum ) och skador på de underliggande lagren av 
keratinocyter. De döende keratinocyterna avger mediatorer som inleder 
den inflammatoriska kaskaden som påverkar cellerna i huden, särskilt 
stroma- och endotelceller. Utvidgningen och den ökade permeabiliteten hos endotelcellerna ger upphov till den observerade hudrodnaden och det 
observerade ödemet (24). Den RhE-baserade metoden mäter kaskadens ini ­
tierande händelser. 
12. I RhE-modeller mäts cellviabiliteten genom enzymatisk omvandling av det 
vitala färgämnet MTT [(3-(4,5-dimetyltiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbro ­
mid, tiazolylblått, CAS-nummer 298-93-1)], till ett blått formazansalt som mäts kvantitativt efter det att vävnaderna har extraherats (25). Irriterande 
kemikalier identifieras genom deras förmåga att minska cellviabiliteten un ­
der definierade gränsvärden (dvs. ≤ 50 % för kategori 2 enligt FN:s GHS 
och CLP-förordningen). Beroende på den rättsliga ram inom vilken resulta ­
ten från denna testmetod används, kan kemikalier som ger cellviabilitet 
ovanför den definierade tröskelnivån anses vara icke-irriterande (dvs. 
> 50 %, ingen kategori).
 
KVALITETSDEMONSTRATION 
13. Före rutinanvändning av någon av de tre validerade testmetoderna enligt 
denna testmetod bör laboratorierna påvisa sin tekniska kvalitet med använd ­
ning av de tio referenskemikalier som förtecknas i tabell 1. För liknande 
metoder som utvecklas enligt denna testmetod eller för modifikationer av 
någon av de tre validerade metoderna bör de prestandastandardskrav som beskrivs i tillägg 2 till denna testmetod uppfyllas innan metoden används för lagstadgad testning. 
14. Som en del av kvalitetsförfarandet rekommenderas att användarna efter 
mottagande av vävnaden verifierar dess barriäregenskaper enligt specifika ­
tionerna från RhE-modelltillverkaren. Detta är särskilt viktigt om vävnader transporteras över långa sträckor eller om transporten tar lång tid. När en metod har etablerats på ett framgångsrikt sätt och kvaliteten hos metod ­
användningen har påvisats, behöver sådana verifikationer inte göras rutin ­
mässigt. När en metod används rutinmässigt rekommenderas dock att be ­
dömningen av barriäregenskaperna görs med jämna mellanrum.
 
Tabell 1  
Referenskemikalier  ( 1 ) 
Kemikalie CAS-nummer  In vivo  
-gradering (  2 ) Fysikaliskt tillstånd Kategori enligt FN:s 
GHS eller 
CLP-förordningen  
naftalenättiksyra 86-87-3 0 Fast ämne Ingen kat. 
isopropanol 67-63-0 0,3 Vätska Ingen kat.  ▼M3 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 655
 
Kemikalie CAS-nummer  In vivo  
-gradering (  2 ) Fysikaliskt tillstånd Kategori enligt FN:s 
GHS eller 
CLP-förordningen  
metylstearat 112-61-8 1 Fast ämne Ingen kat. 
heptylbutyrat 5870-93-9 1,7 Vätska Ingen kat. 
(Valfri 
kat. 3 ) ( 3 ) ( 4 ) 
hexylsalicylat 6259-76-3 2 Vätska Ingen kat. 
(Valfri 
kat. 3 ) ( 3 ) ( 4 ) 
cyklamenaldehyd 103-95-7 2,3 Vätska Kat. 2 1-bromhexan 111-25-1 2,7 Vätska Kat. 2 
kaliumhydroxid (5 % vattenlösning) 1310-58-3 3 Vätska Kat. 2 
1-metyl-3-fenyl-1-piperazin 5271-27-2 3,3 Fast ämne Kat. 2 heptanal 111-71-7 3,4 Vätska Kat. 2
 
( 1 ) Dessa referenskemikalier är en underuppsättning av de referenskemikalier som användes i valideringsstudien. 
( 2 ) In vivo -gradering enligt B.4 och OECD:s testriktlinje 404 (4). 
( 3 ) I denna testmetod betraktas FN:s valfria GHS-kategori 3 (svagt irriterande ämnen) (1) som ”ingen kategori”. 
( 4 ) FN:s valfria GHS-kategori 3 är inte tillämplig enligt CLP-förordningen.  
FÖRFARANDE 
15. Nedan följer en beskrivning av komponenterna och förfarandena för en 
RhE-metod för bedömning av hudirritation. En RhE-modell bör rekonstrue ­
ras, och den kan beredas i laboratoriet eller anskaffas på kommersiell väg. 
Det finns operativa standardförfaranden för EpiSkin  TM , EpiDerm  TM SIT 
(EPI-200) och SkinEthic  TM RhE att tillgå (26) (27) (28). Testningen ska 
genomföras enligt nedan angivna beskrivning.  
RhE-testmetod, komponenter  
Allmänna betingelser  
16. Icke-transformerade humana keratinocyter ska användas för rekonstruktion 
av epitelvävnaden. Flera lager av viabla epitelceller (basala lager, taggcell ­
slager och granulära lager) ska finnas under ett funktionellt hornlager. Horn ­
lagret ska bestå av flera skikt och innehålla den väsentliga lipidprofilen för att ge en funktionell barriär som är tillräckligt robust för att stå emot snabb 
penetrering av cytotoxiska markörer (t.ex. natriumdodekylsulfat eller Triton 
X-100). Barriärfunktionen bör påvisas och kan bedömas antingen genom bestämning av den koncentration vid vilken markören minskar vävnadernas viabilitet med 50 % (IC
 50 ) efter en fast exponeringstid eller genom att 
bestämma den exponeringstid som krävs för att minska cellviabiliteten 
med 50 % (ET  50 ) vid applicering av en viss fastställd koncentration av 
markören. RhE-modellens inneslutningsegenskaper ska förhindra att material kan passera runt hornlagret till den viabla vävnaden, vilket kan leda till en 
bristande modellering av hudexponeringen. RhE-modellen får inte vara fö ­
rorenad med bakterier, virus, mykoplasma eller svamp.
 ▼M3 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 656
 
Funktionella betingelser  
Viabilitet 
17. För bestämning av viabiliteten används MTT-test (25). Användare av 
RhE-modellen bör se till att varje sats uppfyller de definierade kriterierna 
för negativ kontroll. Extraktionsmedlets optiska densitet (OD) bör vara till ­
räcklig låg, dvs. under 0,1. Godkända värden (inom en övre och en undre gräns) för den negativa kontrollens OD-värden (i betingelserna för testmeto ­
den för hudirritation) fastställs av RhE-modellens utvecklare/leverantör, och 
godkända värden för de tre validerade metoderna anges i tabell 2. Det bör finnas dokumenterat att de vävnader som behandlas med den negativa kont ­
rollen är stabila i odlingar (ger motsvarande resultat vid viabilitetsmätning) 
under testets hela exponeringsperiod.
 
Tabell 2  
Godkända OD-värden för den negativa kontrollen  
Nedre gräns för godkännande Övre gräns för godkännande  
EpiSkin  TM (SM) ≥ 0,6 ≤ 1,5 
EpiDerm  TM SIT (EPI-200) ≥ 1,0 ≤ 2,5 
SkinEthic  TM RHE ≥ 1,2 ≤ 2,5 
Barriärfunktion 
18. Hornlagret och dess lipida sammansättning ska vara tillräcklig för att stå 
emot snabb penetrering av cytotoxiska markörkemikalier, t.ex. SDS eller Triton X-100, enligt uppskattningar genom IC
 50 eller ET  50 (tabell 3).  
Morfologi 
19. Histologisk undersökning av RhE-modellen bör göras för att påvisa att 
strukturen motsvarar human hud (inklusive flerskiktat hornlager).  
Reproducerbarhet 
20. Resultaten av testning med positiv kontrollkemikalie och negativ kontroll 
bör påvisa reproducerbarhet över tiden.  
Kvalitetskontroll 
21. Utvecklaren/leverantören av RhE-modellen bör säkerställa och påvisa att 
varje sats RhE-modell som används uppfyller de fastställda produktkriteri ­
erna, där kriterierna för  viabilitet  (punkt 17),  barriärfunktion  (punkt 18) och  
morfologi  (punkt 19) är de viktigaste. Dessa data bör ges till metodanvän ­
darna så att de kan införliva informationen i testrapporten. Godkända värden 
(inom en övre och en undre gräns) för IC  50 eller ET  50 ska fastställas av 
utvecklaren/leverantören av RhE-modellen (eller en forskare om en intern modell används). Endast resultat som har producerats med kvalificerade vävnader kan godkännas för tillförlitlig beräkning av irritationsklassificering. 
Som exempel visas godkända värden för de tre validerade metoderna i 
tabell 3.
 ▼M3 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 657
 
Tabell 3  
Exempel på kriterier för kvalitetskontroll för leverans av en sats  
Nedre gräns för godkännande Övre gräns för godkännande  
EpiSkin  TM (SM) 
(18 timmars behandling med SDS) 
(26) IC 50 = 1,0 mg/ml IC  50 = 3,0 mg/ml 
EpiDerm  TM SIT (EPI-200) 
(1 % Triton X-100) (27) ET 50 = 4,8 timmar ET  50 = 8,7 timmar 
SkinEthic  TM RHE 
(1 % Triton X-100) (28) ET 50 = 4,0 timmar ET  50 = 9,0 timmar  
Applicering av test- och kontrollkemikalier  
22. Minst tre vävnadsbitar ska användas per testkemikalie och för kontrollerna i 
varje omgång. För vätskor och fasta ämnen appliceras en tillräcklig mängd av testkemikalien så att hudens yta täcks med ett jämnt lager så att en infinit dos undviks. Dosen ska vara minst 25 μl/cm
 2 eller 25 mg/cm  2 . För fasta 
ämnen fuktas hudens yta med avjoniserat eller destillerat vatten före appli ­
ceringen för att förbättra kontakten mellan testkemikalien och hudens yta. När det är möjligt ska fasta ämnen testas i form av ett fint pulver. Vid slutet av exponeringsperioden tvättas testämnet omsorgsfullt bort från hudens yta 
med buffrad vattenlösning eller 0,9-procentig NaCl. Beroende på vilken av 
de tre validerade RhE-metoderna som används varierar exponeringsperioden mellan 15 och 60 minuter och inkubationstemperaturen mellan 20 och 37 °C. Dessa exponeringsperioder och temperaturer optimeras för varje 
RhE-metod och beror på metodernas olika karaktär. Närmare beskrivning 
finns i de operativa standardförfarandena för metoderna (26) (27) (28). 
23. Negativa kontroller (NC) och positiva kontroller (PC) ska användas paral ­
lellt vid varje testomgång för att visa att viabiliteten (med NC), barriärfunk ­
tionen och den resulterande känsligheten (med PC) hos vävnaderna ligger 
inom fastställda godkända historiska värden. För den positiva kontrollen 
föreslås 5-procentig vattenlösning av natriumdodekylsulfat. För den negativa kontrollen föreslås vatten eller fosfatbuffrad saltlösning.
 
Mätning av cellernas viabilitet  
24. Den viktigaste faktorn i testningsförfarandet är att viabilitetsmätningarna inte 
utförs omedelbart efter exponeringen för testkemikalien, utan först efter att 
de sköljda vävnaderna har haft en tillräckligt lång inkubationstid i färskt 
medium efter behandlingen. Under denna period kan vävnaderna antingen återhämta sig från svagt irriterande effekter eller utveckla tydliga cytotoxiska effekter. Vid testoptimeringsfasen (11) (12) (13) (14) (15) påvisades att en 
inkubationstid på 42 timmar efter behandlingen är optimal. 
25. MTT-metoden är en validerad kvantitativ metod som ska användas i denna 
testmetod för att mäta cellviabiliteten. Den kan användas på en tredimensionell 
vävnadsmodell. Vävnadsprovet placeras i en MTT-lösning av lämplig kon ­
centration (t.ex. 0,3–1 mg/ml) i 3 timmar. Den kondenserade blå formazan ­
produkten extraheras sedan från vävnaden med ett lösningsmedel (t.ex. iso ­
propanol, sur isopropanol) och koncentrationen av formazan mäts genom be ­
stämning av OD vid 570 nm med ett filterbandpass på högst ± 30 nm.
 ▼M3 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 658
 
26. Testkemikaliens optiska egenskaper eller kemiska verkan på MTT kan störa 
bestämningen, vilket leder till en felaktig uppskattning av viabiliteten (test ­
kemikalien kan förhindra eller vända färgutvecklingen, men kan även vara orsaken till den). Detta kan ske när en specifik testkemikalie inte avlägsnas fullständigt från vävnaden genom sköljning eller när den penetrerar över ­
huden. Om testkemikalien reagerar direkt på MTT (dvs. MTT-reduktion 
sker), är naturfärgad eller färgas under behandlingen av vävnaden, bör yt ­
terligare kontroller göras så att man kan upptäcka och korrigera för test ­
kemikaliens störande inverkan på tekniken för mätning av viabiliteten. De ­
taljerad beskrivning hur direkt MTT-reduktion och störningar av färgämnen 
kan korrigeras finns i de operativa standardförfarandena för de tre validerade metoderna (26) (27) (28).
 
Kriterier för godkännande  
27. För varje metod där giltiga RhE-modellsatser används (se punkt 21) ska de 
vävnader som behandlats med negativ kontroll visa ett OD-värde som av ­
speglar kvaliteten på vävnader som har följt alla transport- och mottagnings ­
förfaranden och alla protokollprocesser. Kontrollernas OD-värden bör inte 
ligga under de historiskt fastställda gränserna. Likaså bör vävnader som behandlats med den positiva kontrollkemikalien (5-procentig vattenlösning av natriumdodekylsulfat) avspegla deras förmåga att ge respons på en irri ­
tationsframkallade kemikalie i testmetodens betingelser (26) (27) (28). 
Lämpliga mått för variationerna mellan vävnadsbitarna bör fastställas (om t.ex. standardavvikelser används bör de ligga inom det ensidiga tolerans ­
intervall på 95 % som beräknats enligt historiska data, och för den valide ­
rade referensmetoden bör standardavvikelsen ligga under 18 %).
 
Tolkning av resultaten och förutsägbarhetsmodell  
28. De OD-värden som erhålls för varje testkemikalie kan användas för att 
beräkna procentuell viabilitet jämfört med den negativa kontrollen, som 
fastställs till 100 %. Det procentuella viabilitetsgränsvärdet skiljer irriterande testkemikalier från icke-klassificerade testkemikalier, och det eller de sta ­
tistiska förfarande(n) som används för att utvärdera resultaten och identifiera 
irriterande ämnen ska vara klart definierade och dokumenterade och ska vara 
bevisat lämpliga. Gränsvärdena för förutsägelse av irritation anges nedan. 
— Testkemikalien anses vara irriterande för huden enligt kategori 2 i FN:s 
GHS eller CLP-förordningen om vävnadsviabiliteten efter exponering och efterföljande inkubation är mindre än eller lika med ( ≤) 50 %. 
— Beroende på den rättsliga ram inom vilken resultaten från denna test ­
metod används, kan testkemikalien anses vara icke-irriterande för huden enligt ”ingen kategori” enligt FN:s GHS eller CLP-förordningen om 
vävnadsviabiliteten efter exponeringen och efterföljande inkubation är 
mer än (>) 50 %.
 
DATA OCH RAPPORTERING  
Data  
29. För varje omgång ska data från enskilda vävnadsbitar (t.ex. OD-värden och 
data om beräknad procentuell cellviabilitet för varje testkemikalie, inklusive klassificering) rapporteras i tabellform, i tillämpliga fall även data från upp ­
repade försök. Dessutom ska medelvärden ± standardavvikelser för varje 
omgång rapporteras. Observerade interaktioner med MTT-reagenser och 
färgade testkemikalier ska rapporteras för varje testad kemikalie.
 ▼M3 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 659
 
Testrapport  
30. Testrapporten ska innehålla följande information: 
Test- och kontrollkemikalier: 
— Kemikaliens namn – CAS-namn och -nummer, EG-namn och -nummer, 
om kända. 
— Kemikaliens renhet och sammansättning (i procent per vikt). — Fysikaliska/kemiska egenskaper som är relevanta för utförandet av un ­
dersökningen (t.ex. fysiskt tillstånd, stabilitet och flyktighet, pH-värde och vattenlöslighet, om kända). 
— Behandling av test- och kontrollämnen före testning, om detta är till ­
lämpligt (t.ex. uppvärmning, finfördelning). 
— Lagringsförhållanden. Motivering för den RhE-modell och det protokoll som använts. Testbetingelser: — Cellsystem. — Fullständig stödjande information för den specifika RhE-modell som 
använts, inklusive modellens prestanda. Informationen ska omfatta 
men inte vara begränsad till följande: 
i) Viabilitet. 
ii) Barriärfunktion. 
iii) Morfologi. 
iv) Reproducerbarhet och förutsägbarhet. 
v) Kvalitetskontroller av modellen. 
— Detaljerade uppgifter om försöksförfarandet. — Använda testdoser, exponeringens varaktighet och inkubationstid efter 
behandlingen. 
— Beskrivning av eventuella modifieringar av försöksförfarandet. — Hänvisning till historiska uppgifter om modellen. Dessa ska omfatta men 
inte vara begränsade till följande: 
i) Uppgifter om huruvida kvalitetskontrolldata är godtagbara med av ­
seende på historiska uppgifter om respektive använd sats. 
ii) Uppgifter om huruvida de positiva och negativa kontrollvärdena är 
godtagbara med avseende på positiva och negativa medelvärden och 
värdeområden. 
— Beskrivning av använda utvärderingskriterier, inklusive motivering för 
valet av förutsägbarhetsmodellens gränsvärde(n). 
— Hänvisningar till historiska kontrolldata.
 ▼M3 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 660
 
Resultat: 
— Data i tabellform för enskilda testkemikalier för varje omgång och varje 
vävnadsmätning. 
— Uppgifter om kontroller som använts för direkt MTT-reduktion och/eller 
färgade testkemikalier. 
— Beskrivning av övriga observerade effekter. Diskussion om resultaten. Slutsatser.
 
HÄNVISNINGAR 
(1) UN (2009),  United Nations Globally Harmonized System of Classification 
and Labelling of Chemicals (GHS ), Third revised edition, UN New York 
and Geneva. Finns på: http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ ghs_rev03/03files_e.html 
(2) EC-ECVAM (2009), Statement on the ”Performance under UN GHS of three  
in vitro  assays for skin irritation testing and the adaptation of the Reference 
Chemicals and Defined Accuracy Values of the ECVAM skin irritation 
Performance Standards”, issued by the ECVAM Scientific Advisory Commit ­
tee (ESAC30), 9 April 2009. Finns på: http://ecvam.jrc.ec.europa.eu 
(3) Europaparlamentets och rådets förordning (EG) nr 1272/2008 av den 
16 december 2008 om klassificering, märkning och förpackning av ämnen och blandningar, ändring och upphävande av direktiven 67/548/EEG och 
1999/45/EG samt ändring av förordning (EG) nr 1907/2006 (EUT L 353, 
31.12.2008, s. 1). 
(4) OECD (2004), Acute Dermal Irritation/Corrosion, OECD Guideline for the 
Testing of Chemicals No. 404, OECD, Paris. Finns på: http://www.oecd.org/ env/testguidelines 
(5) OECD (2004),  In Vitro  Skin Corrosion: Transcutaneous Electrical 
Resistance (TER), OECD Guideline for the Testing of Chemicals No. 430, OECD, Paris. Finns på: http://www.oecd.org/env/testguidelines 
(6) OECD (2004),  In Vitro  Skin Corrosion: Human Skin Model Test, OECD 
Guideline for the Testing of Chemicals No. 431, OECD, Paris. Finns på: 
http://www.oecd.org/env/testguidelines 
(7) OECD (2006),  In Vitro  Membrane Barrier Test Method for Skin Corrosion, 
OECD Guideline for the Testing of Chemicals No. 435, OECD, Paris. Finns på: http://www.oecd.org/env/testguidelines 
(8) EC-ECVAM (2009), Performance Standards for  in vitro  skin irritation test 
methods based on Reconstructed human Epidermis (RhE)? Finns på: http://ecvam.jrc.ec.europa.eu 
(9) OECD (2005), Guidance Document on the Validation and International 
Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment, 
OECD Series on Testing and Assessment No. 34, OECD, Paris. Finns 
på: http://www.oecd.org/env/testguidelines 
(10) Fentem, J.H., Briggs, D., Chesné, C., Elliot, G.R., Harbell, J.W., Heylings, 
J.R., Portes, P., Roguet, R., van de Sandt, J.J. M. och Botham, P. (2001), A prevalidation study on  in vitro  tests for acute skin irritation, Results and 
evaluation by the Management Team,  Toxicol. in Vitro  15, 57–93. 
(11) Portes, P., Grandidier, M.-H., Cohen, C. och Roguet, R. (2002), Refinement 
of the EPISKIN protocol for the assessment of acute skin irritation of 
chemicals: follow-up to the ECVAM prevalidation study,  Toxicol. in Vitro  
16, 765–770.
 ▼M3 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 661
 
(12) Kandárová, H., Liebsch, M., Genschow, E., Gerner, I., Traue, D., Slawik, 
B. och Spielmann, H. (2004), Optimisation of the EpiDerm test protocol for 
the upcoming ECVAM validation study on  in vitro  skin irritation tests, 
ALTEX 21, 107–114. 
(13) Kandárová, H., Liebsch, M., Gerner, I., Schmidt, E., Genschow, E., Traue, 
D. och Spielmann, H. (2005), The EpiDerm test protocol for the upcoming ECVAM validation study on  in vitro  skin irritation tests – An assessment of 
the performance of the optimised test, ATLA 33, 351–367. 
(14) Cotovio, J., Grandidier, M.-H., Portes, P., Roguet, R. och Rubinsteen, G. 
(2005), The  in vitro  acute skin irritation of chemicals: optimisation of the 
EPISKIN prediction model within the framework of the ECVAM validation 
process, ATLA 33, 329–349. 
(15) Zuang, V., Balls, M., Botham, P.A., Coquette, A., Corsini, E., Curren, R.D., 
Elliot, G.R., Fentem, J.H., Heylings, J.R., Liebsch, M., Medina, J., Roguet, 
R., van De Sandt, J.J.M., Wiemann, C. och Worth, A. (2002), Follow-up to 
the ECVAM prevalidation study on  in vitro  tests for acute skin irritation, 
The European Centre for the Validation of Alternative Methods Skin Irritation Task Force report 2, ATLA 30, 109–129. 
(16) Spielmann, H., mailto: Hoffmann, S., Liebsch, M., Botham, P., Fentem, J., 
Eskes, C., Roguet, R., Cotovio, J., Cole, T., Worth, A., Heylings, J., Jones, P., Robles, C., Kandárová, H., mailto: Gamer, A., Remmele, M., Curren, R., 
Raabe, H., Cockshott, A., Gerner, I. och Zuang, V. (2007), The ECVAM 
international validation study on  in vitro  tests for acute skin irritation: Report 
on the validity of the EPISKIN and EpiDerm assays and on the skin integrity function test, ATLA 35, 559–601. 
(17) Hoffmann, S. (2006), ECVAM skin irritation validation study phase II: 
Analysis of the primary endpoint MTT and the secondary endpoint IL1- α. 
Finns på: http://ecvam.jrc.ec.europa.eu 
(18) Eskes, C., Cole, T., Hoffmann, S., Worth, A., Cockshott, A., Gerner, I. och 
Zuang, V. (2007), The ECVAM international validation study on  in vitro  
tests for acute skin irritation: selection of test chemicals, ATLA 35, 
603–619. 
(19) Cotovio, J., Grandidier, M.-H., Lelièvre, D., Roguet, R., 
Tinois-Tessonneaud, E. och Leclaire, J. (2007),  In vitro  acute skin irritancy 
of chemicals using the validated EPISKIN model in a tiered strategy – 
Results and performances with 184 cosmetic ingredients, AATEX, 14, 351–358. 
(20) EC-ECVAM (2007), Statement on the validity of  in vitro  tests for skin 
irritation, issued by the ECVAM Scientific Advisory Committee (ESAC26), 
27 April 2007. Finns på: http://ecvam.jrc.ec.europa.eu 
(21) EC-ECVAM (2007), Performance Standards for applying human skin models 
to in vitro  skin irritation testing. Finns på: http://ecvam.jrc.ec.europa.eu 
(22) EC-ECVAM (2008), Statement on the scientific validity of  in vitro  tests for 
skin irritation testing, issued by the ECVAM Scientific Advisory Committee 
(ESAC29), 5 November 2008. Finns på: http://ecvam.jrc.ec.europa.eu 
(23) OECD (2010), Explanatory background document to the OECD draft Test 
Guideline on  in vitro  skin irritation testing. OECD Series on Testing and 
Assessment, No. 137, OECD, Paris. Finns på: http://www.oecd.org/ 
document/24/0,3746,en_2649_34377 _47858904_1_1_1_1,00.html 
(24) Welss, T., Basketter, D.A. och Schröder, K.R. (2004),  In vitro  skin irrita ­
tion: fact and future. State of the art review of mechanisms and models,  
Toxicol. in Vitro  18, 231–243.
 ▼M3 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 662
 
(25) Mosmann, T. (1983), Rapid colorimetric assay for cellular growth and 
survival: application to proliferation and cytotoxicity assays,  J. Immunol. 
Methods  65, 55–63. 
(26) EpiSkin  TM SOP, Version 1.8 (February 2009), ECVAM Skin Irritation 
Validation Study: Validation of the EpiSkin  TM test method 15 min – 42 
hours for the prediction of acute skin irritation of chemicals. Finns på: 
http://ecvam.jrc.ec.europa.eu 
(27) EpiDerm  TM SOP, Version 7.0 (Revised March 2009), Protocol for:  In vitro  
EpiDerm  TM skin irritation test (EPI-200-SIT), For use with MatTek Corpo ­
ration's reconstructed human epidermal model EpiDerm (EPI-200). Finns på: http://ecvam.jrc.ec.europa.eu 
(28) SkinEthic
 TM RHE SOP, Version 2.0 (February 2009), SkinEthic skin irri ­
tation test-42bis test method for the prediction of acute skin irritation of chemicals: 42 minutes application + 42 hours post-incubation. Finns på: http://ecvam.jrc.ec.europa.eu 
(29) Harvell, J.D., Lamminstausta, K. och Maibach, H.I. (1995),  Irritant contact 
dermatitis, In: Practical Contact Dermatitis , sidorna 7–18, (Ed. Guin J. D.). 
Mc Graw-Hill, New York. 
(30) Kommissionens direktiv 2001/59/EG av den 6 augusti 2001 om anpassning 
till tekniska framsteg för tjugoåttonde gången av rådets direktiv 67/548/EEG 
om tillnärmning av lagar och andra författningar om klassificering, förpack ­
ning och märkning av farliga ämnen (EUT L 225, 21.8.2001, s. 1). 
(31) Basketter, D.A., York, M., McFadden, J.P. och Robinson, M.K. (2004), 
Determination of skin irritation potential in the human 4-h patch test.  
Contact Dermatitis  51, 1–4. 
(32) Jirova, D., Liebsch, M., Basketter, D., Spiller, E., Kejlova, K., Bendova, H., 
Marriott, M. och Kandarova, H. (2007), Comparison of human skin irrita ­
tion and photo-irritation patch test data with cellular  in vitro  assays and 
animal in vivo  data, ALTEX, 14, 359–365. 
(33) Jírová, D., Basketter, D., Liebsch, M., Bendová, H., Kejlová, K., Marriott, 
M. och Kandárová, H. (2010), Comparison of human skin irritation patch 
test data with  in vitro  skin irritation assays and animal data,  Contact 
Dermatitis , 62, 109–116.
 ▼M3 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 663
 
Tillägg 1  
Definitioner  
Exakthet:  Mått på hur väl testmetodresultaten och de godtagna referensvärdena 
överensstämmer med varandra. Exakthet är ett mått på testmetodens prestanda 
och en relevansaspekt. Detta begrepp används ofta omväxlande med ”konkor ­
dans” för att beskriva andelen korrekta resultat med en testmetod (9).  
Cellviabilitet:  En parameter för att mäta den totala aktiviteten hos en cellpopu ­
lation, t.ex. förmågan hos cellulära mitokondriella dehydrogenaser att reducera det vitala färgämnet MTT (3–(4,5-dimetyltiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbro ­
mid, tiazolylblått). Denna aktivitet korrelerar, beroende på den slutpunkt som 
uppmäts och den testutformning som används, med det totala antalet levande celler och/eller cellernas vitalitet.  
Konkordans:  Ett mått på testmetodens prestanda för sådana testmetoder som ger 
kategoriska resultat, och en aspekt av relevans. Termen används omväxlande med 
exakthet och definieras som andelen av alla testade kemikalier som klassificeras korrekt som positiva eller negativa (9).  
ET
 50 : Uppskattas genom bestämning av den exponeringstid som krävs för att 
minska cellviabiliteten med 50 % vid applicering av markörkemikalien vid en 
specificerad, fast koncentration; se även IC  50 . 
CLP-förordningen (Europaparlamentets och rådets förordning (EG) 
nr 1272/2008 av den 16 december 2008 om klassificering, märkning och för ­
packning av ämnen och blandningar):  Genom denna förordning genomförs i 
Europeiska unionen (EU) FN:s GHS-system för klassificering och märkning av 
kemikalier (ämnen och blandningar) (3).  
GHS (det globalt harmoniserade systemet för klassificering och märkning av 
kemikalier – Globally Harmonized System of Classification and Labelling of 
Chemicals):  Ett system för att klassificera ämnen och blandningar enligt stan ­
dardiserade typer och nivåer av fysiska risker, hälsorisker och miljörisker och informera om resultaten genom t.ex. piktogram, signalord, faroangivelser, skyddsangivelser och säkerhetsdatablad i syfte att informera om ämnenas skad ­
liga effekter för att skydda personer (inklusive arbetsgivare, arbetstagare, trans ­
portörer, konsumenter och personal inom räddningstjänsten) och miljön (1).  
IC
 50 : Kan uppskattas genom bestämning av den koncentration vid vilken en 
markörkemikalie minskar vävnadernas viabilitet med 50 % (IC  50 ) efter en fast 
exponeringstid; se även ET  50 . 
Infinit dos:  Den mängd applicerad testkemikalie som överstiger den mängd som 
krävs för att helt täcka hudens yta med ett jämnt lager.  
Me too-test:  Ett vardagligt uttryck för en testmetod som strukturellt och funk ­
tionellt liknar en validerad och godtagen referenstestmetod. En sådan testmetod 
kan vara en kandidat för jämförande validering. Kallas även ”liknande testmetod” 
(9). 
Prestandastandarder (PS):  Standarder som baseras på en validerad testmetod 
och som utgör grunden för utvärdering av jämförbarheten för en föreslagen testmetod som är mekaniskt och funktionellt likartad. Dessa standarder omfattar 
i) testmetodens grundläggande komponenter, ii) en minimiförteckning med refe ­
renskemikalier som valts ut från de kemikalier som använts för att påvisa att den validerade metoden fungerar tillfredsställande och iii) de jämförbara nivåer av exakthet och tillförlitlighet, på grundval av vad som erhållits för den validerade 
testmetoden, som man bör kunna påvisa för den föreslagna testmetoden när den 
utvärderas med användning av minimiförteckningen med referenskemikalier (9).
 ▼M3 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 664
 
Referenskemikalier:  Kemikalier som valts för användning i valideringsprocessen 
och för vilka responsen i  in vitro - eller  in vivo -referenstestsystem eller på de 
berörda arterna är känd. Kemikalierna bör vara representativa för de kemikaliek ­
lasser som testmetoden är avsedd för och bör representera hela skalan av respons som kan förväntas för de kemikalier som testas med metoden, från stark till svag 
till negativ. Det kan krävas olika uppsättningar referenskemikalier för valide ­
ringsprocessens olika skeden och för olika testmetoder och testanvändningar (9).  
Relevans:  Beskrivning av förhållandet mellan testet och den berörda effekten och 
huruvida detta förhållande är meningsfullt och användbart för ett visst ändamål. Relevansen är ett mått på hur väl man genom testet korrekt kan mäta och förutse 
den biologiska effekt det gäller. Relevans omfattar också överväganden om en 
testmetods exakthet (konkordans) (9).  
Tillförlitlighet:  Ett mått på i vilken utsträckning en testmetod kan reproduceras 
inom och mellan laboratorier över tiden när metoden utförs med samma pro ­
tokoll. Den bedöms genom att man beräknar reproducerbarheten inom och mel ­
lan laboratorier (9).  
Ersättningstest:  Ett test som är utformat att ersätta ett test som används rutinmäs ­
sigt och som är godkänt för faroidentifiering och/eller riskbedömning och som har konstaterats ge motsvarande eller bättre skydd av människors eller djurs hälsa 
eller miljön, enligt det som är tillämpligt, jämfört med det godkända testet, för 
alla tänkbara testningssituationer och kemikalier (9).  
Känslighet:  Den andel av alla positiva/aktiva testkemikalier som klassificeras 
korrekt i testet. Begreppet är ett mått på exaktheten hos sådana testmetoder som ger kategoriska resultat och är en viktig faktor vid bedömningen av en 
testmetods relevans (9).  
Hudirritation:  När en reversibel skada uppstår på huden i upp till fyra timmar 
efter applicering av en testkemikalie. Hudirritation är en lokal icke-immunogenisk reaktion som uppstår kort efter stimulans (29). Den mest 
utmärkande egenskapen är den reversibla processen som omfattar inflammato ­
riska reaktioner och de flesta av de kliniskt karakteristiska tecknen på irritation (hudrodnad, ödem, klåda och smärta) som hör samman med en inflammatorisk process.  
Specificitet:  Den andel av alla negativa/inaktiva testkemikalier som klassificeras 
korrekt i testet. Begreppet är ett mått på exaktheten hos sådana testmetoder som 
ger kategoriska resultat och är en viktig faktor vid bedömningen av en testmetods relevans (9).  
Stegvis testningsstrategi:  Testning där testmetoder används i serie så att de test ­
metoder som väljs på varje efterföljande nivå bestäms på grundval av föregående 
testningsnivå (9).  
Testkemikalie (kallas också testämne):  Alla ämnen eller blandningar som testas 
med denna testmetod.
 ▼M3 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 665
 
Tillägg 2  
Prestandastandarder för bedömning av föreslagna liknande eller 
modifierade  in vitro -metoder med rekonstruerad human hud (RhE) för att 
testa hudirritation  
INLEDNING 
1. Syftet med prestandastandarder är att tillhandahålla en grund för att fastställa 
att nya testmetoder, både äganderättsligt skyddade (dvs. metoder med upp ­
hovsrätt, varumärke, registrering) och allmänt tillgängliga metoder är till ­
räckligt exakta och tillförlitliga för specifika testningsändamål. Dessa pre ­
standastandarder, som grundar sig på validerade och godtagna testmetoder, kan användas för att utvärdera tillförlitligheten och exaktheten hos andra 
analoga metoder (vardagligt även kallade me too-test) som grundar sig på 
liknande vetenskapliga principer och som mäter eller förutser samma bio ­
logiska eller toxikologiska effekt (9). 
2. Innan man antar modifierade metoder (dvs. föreslagna potentiella förbätt ­
ringar av en godkänd metod) krävs en utvärdering för att fastställa de föreslagna ändringarnas inverkan på testets prestanda och i vilken utsträck ­
ning förändringarna påverkar den information som finns att tillgå för de 
andra komponenterna i valideringsprocessen. Beroende på de föreslagna 
ändringarnas antal och karaktär, genererade data och stödjande dokumenta ­
tion för ändringarna, bör de antingen vara föremål för samma validerings ­
process som gäller för nya testmetoder eller, där det är lämpligt, för en 
begränsad bedömning av tillförlitlighet och relevans med användning av 
etablerade prestandastandarder (9). 
3. Liknande (me too-metoder) eller modifierade metoder av någon av de tre 
validerade metoderna (EpiSkin™ [validerad referensmetod], EpiDerm™ SIT 
[EPI-200] och SkinEthic™ RHE) som föreslås för användning inom denna testmetod bör utvärderas för tillförlitlighet och exakthet när man använder kemikalier som representerar hela skalan av Draizes irritationspoäng. Vid 
utvärderingen med användning av de 20 rekommenderade referenskemika ­
lierna enligt prestandastandarden (tabell 1) bör de föreslagna liknande eller modifierade metodernas värden för tillförlitlighet och exakthet vara jämför ­
bara med eller bättre än de värden som fås med den validerade referens ­
metoden (tabell 2) (2) (16). De värden för tillförlitlighet och exakthet som 
bör nås anges i punkterna 8–12 i detta tillägg. Kemikalier i kategorin ”inte klassificerad” (”ingen kategori” enligt FN:s GHS eller CLP-förordningen) och kategorin ”klassificerad” (kategori 2 enligt FN:s GHS eller 
CLP-förordningen) (1) som representerar olika kemiska klasser ingår, så 
att den föreslagna metodens tillförlitlighet och exakthet (känslighet, specifi ­
citet och totala exakthet) kan jämföras med motsvarande värden för den validerade referensmetoden. Metodens tillförlitlighet, såväl som metodens 
förmåga att korrekt identifiera irriterande kemikalier i kategori 2 enligt 
FN:s GHS eller CLP-förordningen och, beroende på den rättsliga ram som gäller för de uppgifter som tas fram, även metodens förmåga att korrekt 
identifiera ”ingen kategori”-kemikalier enligt FN:s GHS eller 
CLP-förordningen, bör bestämmas innan metoden används för testning av nya kemikalier. 
4. Dessa prestandastandarder baserar sig på EC-ECVAM:s prestandastandarder 
(8) som uppdaterats enligt FN:s GHS eller CLP-förordningens system för klassificering och märkning (1) (3). De ursprungliga prestandastandarderna fastställdes efter att valideringsstudien hade slutförts (21) och baserade sig 
på EU-klassificeringssystemet enligt kommissionens direktiv 2001/59/EG av 
den 6 augusti 2001 om anpassning till tekniska framsteg för tjugoåttonde gången av rådets direktiv 67/548/EEG om tillnärmning av lagar och andra författningar om klassificering, förpackning och märkning av farliga 
ämnen (
 1 ). Till följd av att FN:s GHS-system för klassificering och märkning  ▼M3 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 666  
( 1 ) EGT L 225, 21.8.2001, s. 1.
 antogs i EU (CLP-förordningen) (3), vilket gjordes mellan slutförandet av 
valideringsstudien och slutförandet av denna testmetod (8), har prestanda ­
standarderna uppdaterats. Uppdateringen gäller främst ändringar av i) upp ­
sättningen referenskemikalier för prestandastandarderna och ii) de värden som fastställts för tillförlitlighet och exakthet (2) (23).
 
PRESTANDASTANDARDER FÖR IN VITRO-TESTMETODER MED RhE 
FÖR HUDIRRITATION 
5. Prestandastandarderna består av följande tre element (9): 
I. Testmetodens grundläggande komponenter 
II. En minimiförteckning med referenskemikalier. 
III. Definierade värden för tillförlitlighet och exakthet.  
I. Testmetodens grundläggande komponenter  
6. Dessa består av de grundläggande strukturella, funktionella och förfarande ­
mässiga delarna i en validerad metod som bör ingå i protokollet för en 
föreslagen mekaniskt och funktionellt liknande eller modifierad metod. Dessa komponenter omfattar metodens unika egenskaper, kritiska förfaran ­
demässiga detaljer och åtgärder för kvalitetskontroll. Att följa testmetodens 
grundläggande komponenter hjälper till att säkerställa att liknande eller 
modifierade metoder baserar sig på samma koncept som den motsvarande validerade referensmetoden (9). Testmetodens grundläggande komponenter beskrivs i detalj i punkterna 16–21 i testmetoden och testningen bör utföras 
enligt följande: 
— Allmänna villkor (punkt 16). — Funktionella villkor, som omfattar 
— viabilitet (punkt 17), 
— barriärfunktion (punkt 18), — morfologi (punkt 19), — reproducerbarhet (punkt 20), och 
— kvalitetskontroll (punkt 21).
 
II. Minimiförteckning över referenskemikalier  
7. Referenskemikalier används för att bestämma tillförlitligheten och exakthe ­
ten hos en föreslagen liknande eller modifierad metod som har påvisats vara 
strukturellt och funktionellt tillräckligt motsvarande den validerade referens ­
metoden eller som representerar en mindre modifiering av en av de tre validerade metoderna, är jämförbar med eller är bättre än den validerade referensmetoden (2) (8) (16) (23). De 20 rekommenderade referenskemika ­
lierna som förtecknas i tabell 1 omfattar kemikalier som representerar olika 
kemiska klasser (dvs. kemiska kategorier på grundval av funktionella grup ­
per) och är representativa för hela skalan av Draizes irritationspoäng (från icke-irriterande till kraftigt irriterande). Kemikalierna i denna förteckning 
består av tio kemikalier i kategori 2 enligt FN:s GHS eller 
CLP-förordningen och tio icke-kategoriserade kemikalier, av vilka tre är frivilliga kemikalier i kategori 3 enligt FN:s GHS. Enligt denna testmetod anses den valfria kategorin 3 som ”ingen kategori”. Kemikalierna som för ­
tecknas i tabell 1 är valda från de kemikalier som använts i optimeringsfasen 
som följde på förvalidering och i valideringsstudien för den validerade referensmetoden, med avseende på kemisk funktionalitet och fysikaliskt till ­
stånd (14) (18). Dessa referenskemikalier representerar det minsta antal 
kemikalier som bör användas för att utvärdera exaktheten och tillförlitlighe ­
ten för föreslagna liknande eller modifierade metoder, men bör inte
 ▼M3 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 667
 
användas när nya metoder tas fram. I situationer där en kemikalie enligt 
förteckningen inte finns att tillgå, kan man använda andra kemikalier för 
vilka det finns adekvata  in vivo -referensdata, primärt från de kemikalier som 
använts i optimeringsfasen som följt på förvalideringen eller validerings ­
studien för den validerade referensmetoden. Om man vill kan ytterligare 
kemikalier från andra kemiska klasser för vilka det finns adekvata  in vivo - 
referensdata läggas till minimiförteckningen över referenskemikalier för yt ­
terligare utvärdering av den föreslagna testmetodens exakthet.  
Tabell 1  
Minimiförteckning över referenskemikalier för bestämning av exakthet och tillförlitlighet för liknande eller 
modifierade RhE-metoder för hudirritation  ( 1 ) 
Kemikalie CAS-nummer Fysikaliskt 
tillstånd  In vivo- gradering Validerad 
referensmetod  in 
vitro -kat. FN:s GHS eller EU:s 
CLP in vivo -kat. 
1-brom-4-klorbutan 6940-78-9 Vätska 0 Kat. 2 Ingen kat. 
dietylftalat 84-66-2 Vätska 0 Ingen kat. Ingen kat. naftalenättiksyra 86-87-3 Fast ämne 0 Ingen kat. Ingen kat. 
allylfenoxiacetat 7493-74-5 Vätska 0,3 Ingen kat. Ingen kat. 
isopropanol 67-63-0 Vätska 0,3 Ingen kat. Ingen kat. 4-metyltiobensaldehyd 3446-89-7 Vätska 1 Kat. 2 Ingen kat. metylstearat 112-61-8 Fast ämne 1 Ingen kat. Ingen kat. 
heptylbutyrat 5870-93-9 Vätska 1,7 Ingen kat. Ingen kat. 
hexylsalicylat 6259-76-3 Vätska 2 Ingen kat. Ingen kat. kanelaldehyd 104-55-2 Vätska 2 Kat. 2 Ingen kat. 
(Valfri kat. 3 ) (
 3 ) 
1-dekanol  ( 2 ) 112-30-1 Vätska 2,3 Kat. 2 Kat. 2  
cyklamenaldehyd 103-95-7 Vätska 2,3 Kat. 2 Kat. 2 1-bromhexan 111-25-1 Vätska 2,7 Kat. 2 Kat. 2 2-klormetyl-3,5-dimetyl-4- 
metoxipyridin HCl 86604-75-3 Fast ämne 2,7 Kat. 2 Kat. 2  
di-n-propyldisulfid  (
 2 ) 629-19-6 Vätska 3 Ingen kat. Kat. 2  
kaliumhydroxid (5 % vatten ­
lösning) 1310-58-3 Vätska 3 Kat. 2 Kat. 2 
bensentiol, 5-(1,1-dimetyle ­
tyl)-2-metyl 7340-90-1 Vätska 3,3 Kat. 2 Kat. 2 
1-metyl-3-fenyl-1-piperazin 5271-27-2 Fast ämne 3,3 Kat. 2 Kat. 2  ▼M3 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 668
 
Kemikalie CAS-nummer Fysikaliskt 
tillstånd  In vivo- gradering Validerad 
referensmetod  in 
vitro -kat. FN:s GHS eller EU:s 
CLP in vivo -kat. 
heptanal 111-71-7 Vätska 3,4 Kat. 2 Kat. 2 
tetrakloretylen 127-18-4 Vätska 4 Kat. 2 Kat. 2  
( 1 ) Urvalet kemikalier baserar sig på följande kriterier: i) kemikalierna finns kommersiellt tillgängliga, ii) de är representati va för hela 
skalan av Draizes irritationspoäng (från icke-irriterande till kraftigt irriterande), iii) de har en väl definierad kemisk stru ktur, iv) de 
är representativa för den kemiska funktionalitet som används i valideringsprocessen och v) de är inte förknippade med någon 
extremt toxisk profil (t.ex. karcinogena eller toxiska för reproduktionssystemet) och de är inte förknippade med orimliga bort ­
skaffningskostnader. 
( 2 ) Kemikalier som är irriterande på kanin men för vilka det finns tillförlitliga belägg om att de inte är irriterande för männis kor (31) 
(32) (33). 
( 3 ) Enligt FN:s GHS, inte enligt CLP-förordningen.  
III. Definierade värden för tillförlitlighet och exakthet.  
8. För att etablera tillförlitligheten och relevansen för föreslagna liknande eller 
modifierade metoder som kan överföras mellan laboratorier bör alla 20 refe ­
renskemikalierna i tabell 1 testas i minst tre laboratorier. Om den föreslagna metoden endast ska användas i ett enskilt laboratorium krävs inte testning i flera 
laboratorier för valideringen. Det är ändå av största vikt att sådana validerings ­
studier bedöms fristående av internationellt erkända valideringsorgan, i enlighet med internationella riktlinjer (9). Alla 20 referenskemikalierna ska i varje la ­
boratorium testas vid tre oberoende omgångar som genomförs med olika väv ­
nadsuppsättningar och med tillräckliga tidsintervaller mellan varandra. Varje 
omgång ska minst bestå av tre parallellt testade vävnadsbitar för varje berörd testkemikalie, negativ kontroll och positiv kontroll. 
9. Vid beräkningen av värden för tillförlitlighet och exakthet för den föreslagna 
metoden bör alla de fyra nedan angivna kriterierna beaktas, för att garantera att 
tillförlitlighet och relevans bestäms på ett förhandsdefinierat och enhetligt sätt: 
1. Endast data från testomgångar som ingår i fullständiga sekvenser får 
användas för beräkning av metodens variabilitet inom och mellan labo ­
ratorier och förutsägande kapacitet (exakthet). 
2. Den slutliga klassificeringen för varje referenskemikalie i varje delta ­
gande laboratorium ska göras genom att använda viabilitetsmedelvärdet 
för de olika omgångarna som ingår i en fullständig sekvens. 
3. Endast data som erhållits för kemikalier för vilka det har gjorts full ­
ständiga sekvenser av testomgångar i alla deltagande laboratorier får användas för beräkning av metodens variabilitet mellan laboratorier. 
4. Värdena för exakthet ska beräknas på grundval av de enskilda laborato ­
riernas förutsägelser som erhållits för de 20 referenskemikalierna vid de olika deltagande laboratorierna. 
I detta sammanhang avses med  sekvens av omgångar  tre oberoende tes ­
tomgångar vid ett laboratorium för en testkemikalie. En  fullständig sekvens 
av omgångar  är en sekvens för en testkemikalie vid ett laboratorium där 
alla tre testomgångarna är giltiga. Det betyder att en enskild ogiltig omgång 
gör hela sekvensen på tre omgångar ogiltig.
 
Reproducerbarhet inom laboratorier  
10. En utvärdering av reproducerbarheten inom ett laboratorium bör ge en kon ­
kordans för klassificeringar (kategori 2 och ”ingen kategori” enligt FN:s GHS eller CLP-förordningen) som erhålls i olika och oberoende testom ­
gångar med de 20 referenskemikalierna vid ett enda laboratorium. Konkor ­
dansen ska vara lika med eller högre ( ≥) än 90 %.
 ▼M3 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 669
 
Reproducerbarhet mellan laboratorier  
11. En utvärdering av reproducerbarheten mellan laboratorier är inte nödvändig 
om den föreslagna metoden endast ska användas vid ett enskilt laboratori ­
um. För metoder som ska överföras mellan laboratorier ska den konkordans för klassificeringarna (kategori 2 och ”ingen kategori” enligt FN:s GHS eller CLP-förordningen) som erhålls i olika och oberoende testomgångar med de 
20 referenskemikalierna mellan helst minst tre laboratorier vara lika med 
eller högre ( ≥) än 80 %.
 
Förutsägande kapacitet (exakthet)  
12. Exaktheten (känslighet, specificitet och total exakthet) för den föreslagna 
liknande eller modifierade metoden bör vara jämförbar med eller bättre än 
exaktheten för den validerade referensmetoden, med beaktande av tilläggs ­
information rörande relevans hos arten i fråga (tabell 2). Känsligheten ska vara lika med eller högre ( ≥) än 80 % (2) (8) (23). Det finns också en 
ytterligare särskild begränsning som gäller för känsligheten hos den före ­
slagna  in vitro -metoden såtillvida att endast två  in vivo -kemikalier i kategori 
2, 1-dekanol  och  di-n-propyldisulfid,  får klassificeras felaktigt som ”ingen 
kategori” av fler än ett deltagande laboratorium. Specificiteten ska vara lika med eller högre ( ≥) än 70 % (2) (8) (23). Det finns inga ytterligare begräns ­
ningar rörande specificiteten för den föreslagna  in vitro- metoden, dvs. de 
deltagande laboratorierna får felklassificera  in vivo -kemikalier som ”ingen 
kategori” så länge som testmetodens slutliga specificitet ligger inom det godtagbara området. Den totala exaktheten ska vara lika med eller högre 
(≥) än 75 % (2) (8) (23). Även om den validerade referensmetodens käns ­
lighet beräknad för de 20 referenskemikalierna som förtecknas i tabell 1 är lika med 90 %, är det definierade minimivärdet för känsligheten som krävs för alla liknande eller modifierade metoder som övervägs satt till 80 %, 
eftersom både  1-dekanol  (en gränskemikalie) och  di-n-propyldisulfid  (falsk 
negativ i den validerade referensmetoden) är kända för att vara icke-irriterande för människa (31) (32) (33), även om de identifieras som irriterande ämnen i kanintest. Eftersom RhE-modellerna är baserade på cel ­
ler av mänskligt ursprung kan de förutsäga att dessa kemikalier inte är 
irriterande (”ingen kategori” enligt FN:s GHS eller CLP-förordningen).
 
Tabell 2  
Förutsägande värden för känslighet, specificitet och total exakthet som krävs för att en 
liknande eller modifierad metod ska anses vara giltig  
Känslighet Specificitet Total exakthet  
≥ 80 % ≥ 70 % ≥ 75 %  
Kriterier för godkännande av ett försök  
13. Det är möjligt att ett eller flera test som hör samman med en eller flera 
testkemikalier inte uppfyller kriterierna för godkänt för test- och kontroll ­
kemikalierna eller inte kan godkännas av andra orsaker. För att komplettera 
data som saknas är det tillåtet att för varje testkemikalie göra högst två till ­
läggstest (omtestning). Det betyder alltså att då även positiv kontroll och negativ kontroll måste testas parallellt vid omtestning får man genomföra högst två extra omgångar för varje testkemikalie. 
14. Det är möjligt, även efter omtestning, att det minimiantal på tre giltiga 
omgångar som krävs för varje testad kemikalie inte erhålls för varje refe ­
renskemikalie i varje deltagande laboratorium, och då är den resulterande datamatrisen ofullständig. I sådana fall bör alla följande tre kriterier upp ­
fyllas för att datauppsättningarna ska anses vara godtagbara: 
1. Det bör finnas minst en fullständig sekvens av omgångar för alla 20 
referenskemikalierna.
 ▼M3 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 670
 
2. I minst tre deltagande laboratorier måste minst 85 % av sekvenserna vara 
fullständiga (för 20 kemikalier, dvs. 3 ogiltiga sekvenser tillåts i ett 
enskilt laboratorium). 
3. Minst 90 % av alla möjliga sekvenser från minst tre laboratorier måste 
vara fullständiga (för 20 kemikalier som testats i tre laboratorier, dvs. totalt tillåts 6 ogiltiga sekvenser).
 ▼M3 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 671
 
B. 47  TESTMETODEN BCOP (BOVINE CORNEAL OPACITY AND 
PERMEABILITY) FÖR KLASSIFICERING AV ÄMNEN SOM FRÄTANDE ELLER KRAFTIGT IRRITERANDE FÖR ÖGONEN
 
INLEDNING 
1. BCOP-testmetoden är en  in vitro -testmetod som under vissa omständigheter 
och med vissa begränsningar kan användas för att klassificera ämnen och blandningar som frätande eller kraftigt irriterande för ögonen (1) (2) (3). 
Med kraftigt irriterande för ögonen avses här sådana ämnen som framkallar 
okulära skador som kvarstår hos kanin under minst 21 dagar efter applice ­
ring. Även om BCOP-testmetoden inte anses vara godtagbar som en fullständig ersättning för  in vivo -ögontest på kanin, rekommenderas test ­
metoden som en del av en strategi för stegvis testning när det gäller rättslig 
klassificering och märkning inom ett visst tillämpningsområde (4) (5). De ämnen och blandningar som testas (6) kan klassificeras som frätande eller kraftigt irriterande för ögonen utan ytterligare testning på kaniner. Ett ämne 
som ger negativt utslag behöver testas på kaniner med en stegvis testnings ­
strategi enligt OECD:s testriktlinjer 405 (7) (kapitel B.5 i denna bilaga). 
2. Syftet är att beskriva de förfaranden som används för att utvärdera poten ­
tiellt frätande eller kraftigt irriterande egenskaper hos ett testämne, upp ­
mätta som ämnets förmåga att framkalla opacitet och öka permeabiliteten i en isolerad hornhinna från nötkreatur. De toxiska effekterna på hornhinnan 
mäts med hjälp av i) minskad ljustransmission (opacitet) och ii) ökad 
passage av natriumfluorescein (permeabilitet). Bedömningen av hornhin ­
nans opacitet och permeabilitet efter exponeringen för testämnet kombine ­
ras till ett IVIS-värde ( In Vitro  Irritancy Score), som används för att klas ­
sificera testämnets förmåga att framkalla irritation. 
3. Ögonirriterande ämnen som framkallar skador som läker på mindre än 21 
dagar och icke-irriterande ämnen har också testats med 
BCOP-testmetoden. BCOP-testmetodens exakthet och tillförlitlighet i fråga om ämnen i dessa kategorier har dock inte utvärderats formellt. 
4. Definitioner av begreppen finns i tillägg 1.
 
INLEDANDE ÖVERVÄGANDEN OCH BEGRÄNSNINGAR 
5. Testmetoden baserar sig på BCOP-testmetodsprotokollet från amerikanska 
ICCVAM (Interagency Coordinating Committee on the Validation of Al ­
ternative Methods) (8), som har tagits fram efter en internationell valide ­
ringsstudie (4) (5) (9), med bidrag från Europeiska centret för bestämning av alternativa metoder (ECVAM) och det japanska centret för validering 
av alternativa metoder (JaCVAM). Protokollet baserar sig på uppgifter från 
IIVS (Institute for In Vitro Sciences) och INVITTOX-protokollet 124 (10), som representerar det protokoll som användes för den förvalideringsstudie av BCOP-test som genomfördes 1997–1998 och sponsrades av Europeiska 
gemenskapen. Båda dessa protokoll baserar sig på den BCOP-testmetod 
som först rapporterades av Gautheron m.fl. (11).
 ▼M2 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 672
 
6. De identifierade begränsningarna för denna testmetod baserar sig på höga 
falska positiva värden för alkoholer och ketoner och höga falska negativa 
värden för fasta ämnen som observerats i valideringsdatabasen (se punkt 44 (5)). När ämnen från dessa kemiska och fysikaliska klasser utesluts ur databasen får man en klart bättre exakthet för BCOP i EU-, EPA- och 
GHS-klassifikationssystemen (5). Om man ser till syftet med detta test 
(dvs. att enbart identifiera ämnen som är frätande eller kraftigt irriterande för ögonen) är falska negativa värden inte kritiska, eftersom sådana ämnen därefter testas på kaniner eller med andra väl validerade  in vitro -test, 
beroende på kraven i tillämpliga bestämmelser, med tillämpning av en 
strategi med stegvis testning enligt principen om sammanvägd bedömning. Dessutom gav den aktuella valideringsdatabasen ingen möjlighet till en tillfredsställande utvärdering av vissa kemiska klasser eller produktklasser 
(t.ex. blandningar). Man kan dock överväga användning av denna test ­
metod för alla typer av ämnen (inbegripet blandningar) och likaså kan ett positivt resultat godtas som på tecken på att ämnet är frätande eller kraftigt irriterande för ögonen. Positiva resultat från test med alkoholer 
eller ketoner bör dock tolkas försiktigt på grund av risken för överpredik ­
tion. 
7. Alla förfaranden som omfattar ögon och hornhinnor från nötkreatur bör 
respektera testningslaboratoriets tillämpliga regler och förfaranden för han ­
tering av material som kommer från djur, omfattande men inte begränsat 
till vävnader och vävnadsvätskor. Likaså rekommenderas allmänna försik ­
tighetsåtgärder för laboratorier (12). 
8. Testmetoden har som begränsning att även om den beaktar vissa av de 
okulära effekterna som framkallas vid test av ögonirritation hos kanin och i viss utsträckning effekternas allvarlighetsgrad, beaktar den inte skador på 
konjunktiva eller iris. Dessutom gäller att även om reversibiliteten hos 
hornhinneskador i sig inte kan utvärderas med BCOP-test, har det på grundval av studier av kaninögon föreslagits att en bedömning av det initiala djupet för hornhinneskada kan användas för att skilja mellan irre ­
versibla och reversibla effekter (13). Slutligen gäller att BCOP inte ger 
möjlighet att bedöma potentialen för systemisk toxicitet associerad med okulär exponering. 
9. Det pågår arbete för att ytterligare karakterisera BCOP-testmetodens an ­
vändbarhet och begränsningar när det gäller att identifiera ämnen som inte 
är kraftigt irriterande och inte irriterande (se också punkt 45). Användarna uppmuntras också att lämna uppgifter om prover och/eller data till valide ­
ringsorganisationer för formell utvärdering av eventuella framtida använd ­
ningar av BCOP-testmetoden, även när det gäller identifiering av ämnen 
som inte är kraftigt irriterande och inte irriterande. 
10. Laboratorier som tar testmetoden i bruk för första gången bör använda de 
kvalifikationskemikalier som förtecknas i tillägg 2. Ett laboratorium kan använda dessa kemikalier för att påvisa sin tekniska kompetens att genom ­
föra BCOP-test innan det lämnar in BCOP-testdata avsedda för lagenlig 
faroklassificering.
 
PRINCIP FÖR TESTMETODEN 
11. BCOP-testmetoden är en organotypisk modell enligt vilken hornhinnan 
från nötkreatur under kort tid bibehåller normal fysiologisk och biokemisk funktion  in vitro . Testmetoden innebär att skador framkallade av testämnet 
bedöms med kvantitativa mätningar av ändringar i korneal opacitet och 
permeabilitet med opacitetsmätare respektive spektrofotometer för synligt ljus. Med hjälp av resultaten från de två mätningarna beräknas ett IVIS-värde som används för att bestämma en  in vitro -klassificering av 
farokategori för prognos av testämnets potential att framkalla ögonirritation  
in vivo  (se beslutskriterierna).
 ▼M2 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 673
 
12. För BCOP-testmetoden används isolerade hornhinnor från ögon som till ­
varatagits från nyligen slaktade nötkreatur. Den korneala opaciteten mäts 
kvantitativt som ljustransmissionen genom hornhinnan. Permeabiliteten mäts kvantitativt som mängden natriumfluorescein som passerar genom hornhinnans hela djup enligt mätning i mediet i hornhinnehållarens bakre 
kammare. Testämnena appliceras på hornhinnans epitelyta via den främre 
kammaren. I tillägg 3 finns en beskrivning och en schematisk bild av den hornhinnehållare som används vid BCOP-testmetoden. Hornhinnehållare finns att köpa på marknaden hos olika leverantörer eller kan konstrueras 
i laboratoriet.
 
Källa och ålder för ögon från nötkreatur, val av djurart  
13. Nötkreatur som sänds till slakterier avlivas i regel för användning som 
livsmedel eller för andra kommersiella ändamål. Endast friska djur som anses vara lämpliga för användning i livsmedelskedjan får användas för tillvaratagande av hornhinnor som används vid BCOP-testmetoden. Efter ­
som nötkreaturens vikt kan variera stort beroende på ras, ålder och kön 
finns det ingen rekommenderad slaktvikt för de djur som används. 
14. Hornhinnornas dimensioner kan variera beroende på djurens ålder. Hornhinnor 
med en horisontell diameter > 30,5 mm och en central hornhinnetjocklek 
(CCT) ≥ 1 100 μm kommer i regel från nötkreatur som är äldre än åtta år, 
medan hornhinnor med en horisontell diameter < 28,5 mm och CCT < 900 μm 
i regel kommer från nötkreatur som är yngre än fem år (14). Därför används normalt inte ögon från nötkreatur som är äldre än 60 månader. Ögon från 
nötkreatur som är yngre än 12 månader används i regel inte eftersom ögonen 
fortfarande håller på att utvecklas och hornhinnans tjocklek och diameter är betydligt mindre än de värden som rapporteras för ögon från vuxna nötkreatur. Hornhinnor från unga djur (6–12 månader) får dock användas eftersom det 
medför vissa fördelar såsom bättre tillgänglighet, smalare åldersintervall och 
lägre risker för att de anställda exponeras för bovin spongiform encefalopati (15). Det vore värdefullt med ytterligare utvärdering av hur hornhinnans stor ­
lek eller tjocklek påverkar responsen från frätande och irriterande ämnen, och 
därför uppmanas användarna att rapportera uppskattad ålder och/eller vikt för 
de djur vars hornhinna använts för undersökningen.
 
Tillvaratagande och transport av ögon till laboratoriet  
15. Ögonen tas till vara av slakteriets personal. För att minimera mekaniska 
och andra typer av skador på ögonen bör dessa tas till vara så snart som 
möjligt efter slakten. För att hindra att ögonen exponeras för potentiellt 
irriterande ämnen bör rengöringsmedel inte användas vid sköljning av djurets huvud vid slakteriet. 
16. Ögonen bör hållas helt nedsänkta i HBSS (Hanks Balanced Salt Solution) i 
ett kärl av lämplig storlek, och transporteras till laboratoriet på sådant sätt 
att skador och/eller bakterieförorening minimeras. Eftersom ögonen tas till 
vara under slaktningen utsätts de eventuellt för blod och andra biologiska ämnen, inbegripet bakterier och andra mikroorganismer. Det är därför viktigt att minimera föroreningsrisken (t.ex. genom att hålla kärlet med 
ögonen på krossad is eller lägga till antibiotika i HBSS-förvaringslösning ­
en, t.ex. 100 IU/ml penicillin eller 100 μg/ml streptomycin).
 ▼M2 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 674
 
17. Tiden mellan tillvaratagande av ögonen och användningen av hornhinnorna i 
BCOP-test bör minimeras (normalt bör tillvaratagande och användning ske 
inom samma dag) och det måste påvisas att väntetiden inte stör analysresul ­
taten. Dessa baserar sig på urvalskriterierna för ögonen såväl som positiv och negativ kontrollrespons. Alla ögon som används för testning bör komma från 
samma grupp av ögon som har tillvaratagits en viss dag.
 
Urvalskriterier för ögon som används för BCOP-test  
18. När ögonen har tagits emot vid laboratoriet ska de undersökas omsorgsfullt 
för skador såsom ökad opacitet, repor och nykärlsbildning. Endast horn ­
hinnor från oskadade ögon får användas. 
19. De individuella hornhinnornas kvalitet utvärderas också i senare steg i 
testningen. Hornhinnor vars opacitet efter en inledande jämviktsperiod 
på en timme är högre än sju opacitetsenheter ska förkastas (OBS: opaci ­
tetsmätaren ska kalibreras med opacitetsstandarder för opacitetsenheter, se tillägg 3). 
20. Varje behandlingsgrupp (testämne, parallella negativa och positiva kont ­
roller) ska bestå av minst tre ögon. För den negativa kontrollen vid BCOP-testning ska tre hornhinnor användas. Eftersom hornhinnorna skärs 
ut från globen som helhet och därefter monteras i hornhinnekamrarna, 
finns det en risk för att de individuella värdena för korneal opacitet och permeabilitet (inbegripet negativ kontroll) påverkas av artefakter från han ­
teringen. Vidare används opacitets- och permeabilitetsvärden från de ne ­
gativa kontrollernas hornhinnor för att korrigera de opacitets- och permea ­
bilitetsvärden från testade och positivkontrollerade hornhinnor som an ­
vänds för IVIS-beräkningarna.
 
FÖRFARANDE  
Förberedning av ögonen  
21. Defektfria hornhinnor skärs ut med en 2–3 mm omgivande kant av sen ­
hinna som är avsedd att underlätta efterföljande hantering. Var noga med att undvika skador på hornhinnans epitel och endotel. Hornhinnorna mon ­
teras en och en i särskilt utformade hornhinnehållare som har en bakre och 
en främre kammare som angränsar mot hornhinnans epitelsida respektive endotelsida. Båda kamrarna fylls med förvärmt EMEM (Eagle's Minimum Essential Medium) i överskott (bakre kammaren först). Se till så att det 
inte bildas bubblor. Därefter hålls utrustningen vid 32 ± 1 °C i minst en 
timme så att jämvikt nås mellan mediet och hornhinnorna och normal metabolisk aktivitet uppstår i den mån det är möjligt (en hornhinna  in 
vivo har en ungefärlig temperatur på 32 °C). 
22. Efter jämviktsperioden tillsätts färskt förvärmt EMEM till båda kamrarna 
och grundvärden för opacitet mäts på varje hornhinna. Alla hornhinnor som uppvisar en makroskopisk vävnadsskada (t.ex. repor, pigmentering, 
kärlnybildning) eller opacitet över 7 opacitetsenheter ska förkastas. Opa ­
citetsmedelvärdet beräknas för alla jämviktsbehandlade hornhinnor. Minst tre hornhinnor med opacitetsvärden nära medianvärdet för alla hornhinnor väljs ut som exemplar för negativa kontroller (eller lösningsmedelskont ­
roller). Återstående hornhinnor delas upp i behandlingsgrupp och positiv 
kontrollgrupp.
 ▼M2 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 675
 
23. Eftersom vatten har en högre värmekapacitet än luft, ger vatten stabilare 
temperaturförhållanden för inkubation. Därför rekommenderas vattenbad 
för att hålla hornhinnehållaren och dess innehåll vid 32 ± 1 °C. Luftinku ­
batorer kan dock också användas under förutsättning att temperaturen hålls stabil (t.ex. genom förvärmning av hållare och media).
 
Applicering av testämnet  
24. Två olika behandlingsprotokoll används, ett för vätskor och ytaktiva äm ­
nen (fasta eller flytande) och ett för fasta ämnen som inte är ytaktiva. 
25. Vätskor testas i outspädd form, medan ytaktiva ämnen testas vid en kon ­
centration på 10 % vikt/volym i en 0,9 % natriumkloridlösning, destillerat 
vatten eller annat lösningsmedel som påvisbart inte har negativa effekter 
på testsystemet. Halvfasta ämnen, krämer och vaxer testas normalt som vätskor. Om andra utspädningskoncentrationer används bör detta motive ­
ras. Hornhinnorna exponeras för vätskor och ytaktiva ämnen under 10 
minuter. Om avvikande exponeringstider används bör tillbörlig vetenskap ­
lig motivering ges. 
26. Fasta ämnen som inte är ytaktiva testas normalt som lösningar eller sus ­
pensioner vid 20 % vikt/volym i en 0,9 % natriumkloridlösning, destillerat 
vatten eller annat lösningsmedel som påvisbart inte har negativa effekter på testsystemet. I vissa förhållanden och med angivande av tillbörlig ve ­
tenskaplig motivering kan fasta ämnen också testas i ren form med direkt 
applicering på hornhinnans yta med användning av metoden med öppen kammare (se punkt 29). Hornhinnorna exponeras för fasta ämnen under fyra timmar, och på samma sätt som med vätskor och ytaktiva ämnen 
måste avvikande exponeringstider motiveras med tillbörliga vetenskapliga 
grunder. 
27. Olika behandlingsmetoder kan användas, beroende på testämnets fysika ­
liska natur och kemiska egenskaper (t.ex. fasta ämnen, vätskor och viskösa 
respektive icke-viskösa vätskor). Den kritiska faktorn är att se till att tes ­
tämnet täcker epitelytan tillräckligt och att det avlägsnas effektivt under 
sköljningsstegen. Metoden med sluten kammare används normalt vid test ­
ning av icke-viskösa till lätt viskösa vätskor, medan metoden med öppen kammare normalt används för semiviskösa och viskösa vätskor och rena fasta ämnen. 
28. När sluten kammare används tillförs testämnet i den främre kammaren 
genom doseringshålen på kammarens övre yta i tillräcklig mängd (750 μl) för att täcka hornhinnans epitelsida och därefter hålls hålen förslutna 
med pluggar under exponeringen. Det är viktigt att varje hornhinna ex ­
poneras för testämnet under avsedd tidslängd. 
29. När öppen kammare används ska den främre kammarens fönsterlåsring och 
glasfönster avlägsnas före behandlingen. Kontroll- eller testämne (750 μl 
eller tillräckligt för att täcka hornhinnan helt) tillförs direkt på hornhinnans epitelyta med hjälp av en mikropipett. Om testämnet är svårt att pipettera 
kan det i stället appliceras med en s.k. positive displacement-pipett. Posi ­
tive displacement-pipettens spets införs i sprutans doseringsspets så att ämnet kan tryckas in i positive displacement-spetsen. Samtidigt dras sprut ­
kolven ut medan pipettens pistong dras uppåt. Om det uppstår bubblor i 
pipettspetsen ska testämnet avlägsnas (tryckas ut) och förfarandet upprepas 
till dess att spetsen fylls utan att det uppstår luftbubblor. Vid behov kan man använda en vanlig spruta (utan nål) eftersom den ger möjlighet att mäta en exakt volym av testämnet och underlättar appliceringen på horn ­
hinnans epitelyta. Efter doseringen monteras glasfönstret tillbaka på den 
främre kammaren så att systemet återförsluts.
 ▼M2 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 676
 
Inkubation efter exponering  
30. Efter exponeringsperioden avlägsnas testämnet, eller ämnet som används 
för negativ eller positiv kontroll, från den främre kammaren och epitelytan 
tvättas minst tre gånger (eller till dess att inget testämne kan observeras visuellt på ytan) med EMEM (med fenolrött). Medium innehållande fenol ­
rött används för sköljning eftersom färgändringen av fenolrött kan använ ­
das som indikator på effektiv sköljning av sura eller alkaliska material. 
Hornhinnorna ska tvättas mer än tre gånger om färgförändringen av fenol ­
rött kvarstår (gult eller purpurrött) eller om rester av testämnet kan obser ­
veras. När mediet är rent från testämne görs en slutsköljning av hornhin ­
norna med EMEM (utan fenolrött). EMEM (utan fenolrött) används som 
slutsköljning för att säkerställa att allt fenolrött avlägsnas från den främre kammaren före opacitetsmätningen. Därefter fylls den främre kammaren på nytt med färskt EMEM utan fenolrött. 
31. För vätskor och ytaktiva ämnen ska hornhinnorna efter sköljning inkuberas 
i ytterligare två timmar vid 32 ± 1 °C. Längre tider kan vara till fördel under vissa omständigheter och kan övervägas från fall till fall. Hornhin ­
nor som exponerats för fasta ämnen sköljs grundligt efter den fyra timmar 
långa exponeringen och kräver ingen efterföljande inkubation. 
32. Efter den inkubationsperiod som följer på exponeringen (vätskor och yt ­
aktiva ämnen) eller efter slutet av den fyra timmar långa exponerings ­
perioden (icke-ytaktiva fasta ämnen) görs mätningar av opaciteten och 
permeabiliteten för varje hornhinna. Varje hornhinna granskas också visu ­
ellt och relevanta observationer noteras (t.ex. avflagning av vävnad, rester 
av testämne, oenhetliga opacitetsmönster). Sådana observationer kan vara 
viktiga eftersom de också är kopplade till variationer av opacitetsmätarens avläsningar.
 
Kontrollämnen  
33. Parallella negativa kontroller eller lösningsmedels-/vehikelkontroller och 
positiva kontroller ingår i varje försök. 
34. Vid testning av ett vätskeformigt ämne vid 100 % ska BCOP-testmetoden 
inbegripa en parallell negativ kontroll (t.ex. 0,9 % natriumkloridlösning 
eller destillerat vatten) så att icke-specifika ändringar i testsystemet kan 
upptäckas och för att ge en bakgrundsnivå för testningens resultatmått. På så sätt säkerställs också att testningsförhållandena inte i onödan framkallar irritation. 
35. Vid testning av en utspädd vätska, ett ytaktivt ämne eller ett fast ämne ska 
BCOP-testmetoden omfatta en parallell kontrollgrupp med lösningsmedel/ vehikel så att icke-specifika ändringar i testsystemet kan upptäckas och för att 
ge en bakgrundsnivå för testningens resultatmått. Endast lösningsmedel/ve ­
hikel som påvisbart inte har negativa effekter på testsystemet får användas. 
36. Ett känt ögonirriterande ämne ska ingå som parallell positiv kontroll i 
varje försök för att bekräfta att rätt slags respons framkallas. Eftersom 
BCOP används i denna testmetod för att identifiera frätande eller kraftigt irriterande ämnen ska den positiva kontrollen helst göras med ett referens ­
ämne som framkallar kraftig respons. För att säkerställa att den positiva 
kontrollresponsen kan bedömas över tiden bör den irritation som fram ­
kallas inte vara för stark. 
37. Exempel på positiva kontrollämnen för testning av vätskor är dimetylfor ­
mamid eller 1 % natriumhydroxid. Exempel på ett positivt kontrollämne 
för testning av fasta ämnen är 20 % (vikt/volym) imidazol i 0,9 % natri ­
umkloridlösning.
 ▼M2 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 677
 
38. Referensämnen kan användas för utvärdering av förmågan att framkalla 
ögonirritation hos okända kemikalier tillhörande en specifik kemisk klass 
eller produktklass, eller för utvärdering av den relativa irritationspotentia ­
len hos ett ögonirriterande ämne inom ett specifikt responsområde.  
Mätning av resultatmått  
39. Opaciteten bestäms enligt ljustransmissionen genom hornhinnan. Hornhin ­
nans opacitet mäts kvantitativt med hjälp av en opacitetsmätare som mäter opacitetsvärden på en kontinuerlig skala. 
40. Permeabiliteten bestäms med hjälp av mängden natriumfluorescein som 
passerar hela hornhinnan (dvs. epitelet på hornhinnans yttre yta och genom hornhinnan till endotelet på hornhinnans inre yta). 1 ml natriumfluoresce ­
inlösning (4 eller 5 mg/ml vid testning av vätskor och ytaktiva ämnen 
respektive icke-ytaktiva fasta ämnen) tillförs hornhinnehållarens främre 
kammare (den som angränsar mot hornhinnans epitelsida) medan den bakre kammaren (den som angränsar mot hornhinnans endotelsida) fylls med färskt EMEM. Därefter inkuberas hållaren i horisontellt läge i 90 ± 5 
minuter vid 32 ± 1 °C. Mängden natriumfluorescein som kommer in i den 
bakre kammaren mäts kvantitativt med hjälp av UV/VIS-spektrofotometri. De spektrofotometriska mätningarna vid 490 nm noteras som optisk den ­
sitet (OD
 490 ) eller absorbansvärden som mäts på en kontinuerlig skala. 
Permeabilitetsvärdena för fluorescein bestäms genom OD  490 -värden med 
en spektrofotometer för synligt ljus och en standardväglängd på 1 cm. 
41. Alternativt kan man använda en 96-håls mikrotiterplatta förutsatt att i) det 
linjära området för avläsning av plattan när det gäller fluorescein OD  490 - 
värden kan fastställas och ii) korrekt volym fluoresceinprover används i mikrotiterplattan för att få OD
 490 -värden som motsvarar standardvägläng ­
den 1 cm (för detta krävs eventuellt att brunnen är helt full, i regel 360 l).  
DATA OCH RAPPORTERING  
Utvärdering av data  
42. När opacitetsvärdena och permeabilitetsmedelvärdena (OD  490 ) har korrige ­
rats för bakgrundsopacitet och den negativa kontrollens permeabilitetsvär ­
den OD  490 , ska varje behandlingsgrupps medelvärden för opacitet och 
permeabilitet OD  490 kombineras i en empiriskt härledd formel för beräk ­
ning av IVIS-värdet ( In Vitro Irritancy Score ) enligt följande: 
IVIS = medelvärdet för opacitet + (15 × medelvärdet för permeabilitet OD  490 ) 
Sina m.fl. (16) har rapporterat att denna formel härleddes under försök 
som utfördes inom och mellan laboratorier. Data som genererades för en 
serie med 36 föreningar i en undersökning som omfattade flera laboratorier användes som indata i en multivariat analys för bestämning av vilken ekvation som ger den bästa anpassningen mellan in vivo- och in 
vitro-data. Analysen genomfördes av forskare hos två separata företag 
och de resulterande ekvationerna var nästan identiska. 
43. Opacitets- och permeabilitetsvärdena bör också utvärderas fristående för att 
fastställa huruvida ett testämne har en frätande eller kraftigt irriterande 
verkan endast genom ett av de två resultatmåtten (se beslutskriterierna).
 ▼M2 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 678
 
Beslutskriterier  
44. Ett ämne som framkallar IVIS ≥ 55,1 definieras som ett frätande ämne 
eller kraftigt irriterande ämne. Som det konstateras i punkt 1 i fråga om 
testämnen som inte identifieras som frätande eller kraftigt irriterande för ögonen bör ytterligare testning genomföras för klassificerings- och märk ­
ningsändamål. BCOP-testmetoden har en övergripande exakthet på 79 % 
(113/143) till 81 % (119/147), falska positiva värden på 19 % (20/103) till 
21 % (22/103) och falska negativa värden på 16 % (7/43) till 25 % (10/40) jämfört med  in vivo -testning på kaninögon enligt klassifikationssystemen 
EPA (1), EU (2) eller GHS (3). När ämnen inom en viss kemikalieklass 
(t.ex. alkoholer eller ketoner) eller fysikalisk klass (t.ex. fasta ämnen) 
utesluts ur databasen, sträcker sig exaktheten hos BCOP inom klassifika ­
tionssystemen EU, EPA, och GHS från 87 % (72/83) till 92 % (78/85), falska positiva värden från 12 % (7/58) till 16 % (9/56) och falska nega ­
tiva värden från 0 % (0/27) till 12 % (3/26). 
45. Även om ett testämne inte klassificeras som frätande eller kraftigt irrite ­
rande för ögonen kan data från BCOP vara användbara i kombination med 
testdata från  in vivo -test på kaninögon eller tillbörligt validerade  in vitro - 
test, för vidare utvärdering av användbarheten och begränsningarna för BCOP-testmetoden när det gäller att identifiera ämnen som inte framkallar 
kraftig irritation eller som inte alls framkallar irritation (en vägledning om 
användning av  in vitro -test för ögontoxicitet håller på att utarbetas).
 
Kriterier för godkännande av ett försök  
46. Ett försök anses vara godkänt om den positiva kontrollen ger ett 
IVIS-värde som faller inom två standardavvikelser för det aktuella histo ­
riska medelvärdet, som måste uppdateras minst var tredje månad, eller varje gång ett godkänt test genomförs i laboratorier där försök genomförs 
oregelbundet (mindre än en gång per månad). Responsen från den negativa 
kontrollen eller lösningsmedels-/vehikelkontrollen bör ge opacitets- och permeabilitetsvärden som är lägre än de fastställda övre gränserna för 
bakgrundsvärden för opacitet och permeabilitet för nötkreaturshornhinnor 
behandlade med negativa kontrollämnen eller lösningsmedel/vehikler.
 
Testrapport  
47. Testrapporten ska innehålla följande uppgifter i den mån de är relevanta:  
Test- och kontrollämnen  
Kemiskt namn (kemiska namn) såsom det strukturella namn som används i 
Chemical Abstracts Service (CAS) och eventuella andra kända namn. 
CAS-registernummer (RN), om det är känt. 
Ämnets eller blandningens renhet och sammansättning (viktprocent) i den 
mån uppgifterna finns att tillgå. 
Fysikalisk-kemiska egenskaper, t.ex. fysikaliskt tillstånd, flyktighet, pH, 
stabilitet, kemisk klass och vattenlöslighet, i den mån de är relevanta. 
Behandling av test- och kontrollämnen före testning, om detta är tillämp ­
ligt (t.ex. uppvärmning, finfördelning). 
Stabilitet, om den är känd.  ▼M2 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 679
 
Uppgifter om sponsor och testanläggning  
Namn och adress för sponsor, testanläggning och försöksledare. 
Angivelse av ögonkällan (den anläggning där ögonen togs till vara). 
Förvarings- och transportförhållanden för ögonen (t.ex. datum och tidpunkt 
för tillvaratagande, tidsperiod före inledning av försöket, transportmedium 
och temperaturförhållanden, eventuella antibiotika som använts). 
Om möjligt specifika egenskaper för de djur från vilka ögonen togs till 
vara (t.ex. ålder, kön, vikt).  
Motivering för den testmetod och det protokoll som använts  
Testmetodens integritet  
Det förfarande som används för att säkerställa testmetodens integritet (dvs. 
exakthet och tillförlitlighet) över tiden (t.ex. periodisk testning av kvalifi ­
kationsämnen, användning av historiska data från negativa och positiva kontroller).
 
Kriterier för godtagbart försök  
Godtagbara intervaller för parallella positiva och negativa kontroller på 
grundval av historiska data. 
Om tillämpligt, godtagbara intervaller för parallella referenskontroller på 
grundval av historiska data.  
Försöksförhållanden  
Beskrivning av testsystemet. 
Typ av hornhinnebehållare. 
Kalibreringsinformation för utrustning som använts för mätning av opacitet 
och permeabilitet (t.ex. opacitetsmätare och spektrofotometer). 
Uppgifter om de nötkreaturshornhinnor som använts, inbegripet utlåtanden 
om deras kvalitet. 
Detaljerade uppgifter om försöksförfarandet. 
Testämneskoncentration(er). 
Beskrivning av eventuella modifieringar av försöksförfarandet. 
Hänvisningar till modellens historiska data (t.ex. negativa och positiva 
kontroller, kvalifikationsämnen, referensämnen). 
Beskrivning av utvärderingskriterierna.  
Resultat  
Data i tabellform för enskilda testprover (t.ex. opacitet och OD  490 -värden 
och beräknade IVIS-värden för testämnet och de positiva och negativa 
kontrollerna samt referenskontroller om sådana ingått, inbegripet data från replikat och upprepade försök, beroende på vad som är lämpligt, och medelvärden inklusive standardavvikelse för varje försök). 
Beskrivning av övriga observerade effekter.
 
Diskussion av resultaten  
Slutsatser  
LITTERATUR 
(1) U.S. EPA (1996), Label Review Manual, andra utgåvan, EPA737-B- 
96-001, Washington, DC, U.S. Environmental Protection Agency.  ▼M2 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 680
 
(2) Europaparlamentets och rådets förordning (EG) nr 1272/2008 av den 
16 december 2008 om klassificering, märkning och förpackning av 
ämnen och blandningar, ändring och upphävande av direktiven 67/548/EEG och 1999/45/EG samt ändring av förordning (EG) nr 1907/2006, EUT L 353, 31.12.2008, s. 1. 
(3) FN (2007), Globally Harmonized System of Classification and La ­
belling of Chemicals (GHS), andra reviderade utgåvan, New York och Genève, FN:s publikationer, 2007, finns på 
http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev02/02files_e.html 
(4) ESAC (2007), Statement on the conclusion of the ICCVAM retro ­
spective study on organotypic in vitro assays as screening tests to 
identify potential ocular corrosives and severe eye irritants, finns på 
http://ecvam.jrc.it/index.htm 
(5) ICCVAM (2007), Test Method Evaluation Report –  In Vitro  Ocular 
Toxicity Test Methods for Identifying Ocular Severe Irritants and 
Corrosives, Interagency Coordinating Committee on the Validation 
of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program (NTP) Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM), NIH:s publikation nr: 07-4517, 
finns på 
http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_tmer.htm 
(6) Europaparlamentets och rådets förordning (EG) nr 1907/2006 av den 
18 december 2006 om registrering, utvärdering, godkännande och begränsning av kemikalier (Reach), inrättande av en europeisk kemi ­
kaliemyndighet, ändring av direktiv 1999/45/EG och upphävande av 
rådets förordning (EEG) nr 793/93 och kommissionens 
förordning (EG) nr 1488/94 samt rådets direktiv 76/769/EEG och kommissionens direktiv 91/155/EEG, 93/67/EEG, 93/105/EG och 2000/21/EG, EUT L 396, 30.12.2006, s. 1. 
(7) OECD (2002), Test Guideline 405. OECD Guideline for Testing of 
Chemicals. Acute eye irritation/corrosion, finns på 
http://www.oecd.org/document/40/ 
0,2340,en_2649_34377_37051368_1_1_1_1,00.htm l 
(8) ICCVAM (2007), ICCVAM:s rekommenderade testprotokoll för 
BCOP-testmetoden, ”ICCVAM Test Method Evaluation Report – In Vitro Ocular Toxicity Test Methods for Identifying Ocular Severe Irritants and Corrosives”, Interagency Coordinating Committee on the 
Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Tox ­
icology Program (NTP) Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM), NIH:s publikation nr: 07-4517, finns på 
http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_tmer.htm 
(9) ICCVAM (2006), Current Status of  In Vitro  Test Methods for Iden ­
tifying Ocular Corrosives and Severe Irritants: Bovine Corneal Opa ­
city and Permeability Test Method, NIH:s publikation nr: 06-451, Research Triangle Park: National Toxicology Program, finns på 
http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_brd_ice.htm 
(10) INVITTOX (1999), Protocol 124: Bovine Corneal Opacity and Per ­
meability Assay – SOP of Microbiological Associates Ltd, Ispra, 
Italien: Europeiska centret för bestämning av alternativa 
metoder (ECVAM).
 ▼M2 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 681
 
(11) P. Gautheron, M. Dukic, D. Alix och J. F. Sina (1992), ”Bovine 
corneal opacity and permeability test: An  in vitro  assay of ocular 
irritancy”,  Fundam. Appl. Toxicol , 18:442–449. 
(12) J. D. Siegel, E. Rhinehart, M. Jackson, L. Chiarello och Healthcare 
Infection Control Practices Advisory Committee (2007), Guideline for Isolation Precautions: Preventing Transmission of Infectious 
Agents in Healthcare Settings, finns på 
http://www.cdc.gov/ncidod/dhqp/pdf 
(13) J. K. Maurer, R. D. Parker och J. V. Jester (2002), ”Extent of corneal 
injury as the mechanistic basis for ocular irritation: key findings and recommendations for the development of alternative assays”,  Reg. 
Tox. Pharmacol , 36:106–117. 
(14) M. J. Doughty, S. Petrou och H. Macmillan (1995), ”Anatomy and 
morphology of the cornea of bovine eyes from a slaughterhouse”,  
Can. J. Zool.  73:2159–2165. 
(15) J. Collee och R. Bradley (1997), ”BSE: A decade on – Part I”,  The 
Lancet  349: 636–641. 
(16) J. F. Sina, D. M. Galer, R. S. Sussman, P. D. Gautheron, E. V. 
Sargent, B. Leong, P. V. Shah, R. D. Curren och K. Miller (1995), ”A collaborative evaluation of seven alternatives to the Draize eye irritation test using pharmaceutical intermediates”,  Fundam Appl Tox ­
icol 26:20–31. 
(17) ICCVAM (2006), Background review document, Current Status of In 
Vitro Test Methods for Identifying Ocular Corrosives and Severe Irritants: Bovine Corneal Opacity and Permeability (BCOP) Test Method, finns på 
http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ 
ocu_brd_bcop.htm 
(18) ICCVAM (2006), Background review document, Current Status of In 
Vitro Test Methods for Identifying Ocular Corrosives and Severe Irritants: Isolated Chicken Eye (ICE) Test Method, finns på 
http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ 
ocu_brd_bcop.htm
 ▼M2 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 682
 
Tillägg 1  
DEFINITIONER  
exakthet:  mått på hur väl testmetodresultaten och de godtagna referensvärdena 
överensstämmer med varandra. Exakthet är ett mått på testmetodens prestanda 
och en relevansaspekt. Detta begrepp används ofta omväxlande med ”konkor ­
dans” för att beskriva andelen korrekta resultat som fås med en testmetod.  
referensämne:  ett ämne som används som standard för jämförelse med ett tes ­
tämne. Ett referensämne ska ha följande egenskaper: i) en eller flera enhetliga och tillförlitliga källor, ii) strukturell och funktionell likhet med den ämnesklass 
som testas, iii) kända fysikaliska/kemiska egenskaper, iv) stödjande data om 
kända effekter och v) känd styrka inom det önskade responsområdet.  
hornhinna (kornea):  den transparenta delen på ögonglobens framsida som täc ­
ker iris och pupillen och släpper igenom ljus in i ögat.  
korneal opacitet:  mått för den grad av opacitet som hornhinnan har efter ex ­
ponering för ett testämne. Ökad korneal opacitet tyder på skador på hornhinnan. 
Opaciteten kan utvärderas subjektivt (Draizes test på kaninögon) eller objektivt med ett instrument såsom en opacitetsmätare.  
korneal permeabilitet:  kvantitativt mått på skada på hornhinnans epitel genom 
bestämning av den mängd natriumfluorescein som passerar genom hornhinnans alla cellager.  
EPA-kategori 1:  frätande (irreversibel skada på okulär vävnad) eller korneal ­
påverkan eller irritation som varar mer än 21 dagar (1).  
EU-kategori R41:  vävnadsskada i ögat eller kraftig synnedsättning som uppstår 
efter applicering av ett testämne på ögats främre yta och som inte är fullt 
reversibel inom 21 dagar från appliceringen (2).  
falskt negativt värde:  den andel av alla positiva ämnen som av en testmetod 
felaktigt identifieras som negativa. Det är en indikator på testmetodens prestanda.  
falskt positivt värde:  den andel av alla negativa (icke-aktiva) ämnen som av en 
testmetod felaktigt identifieras som positiva. Det är en indikator på testmetodens 
prestanda.  
GHS (Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chem ­
icals):  ett system för att klassificera ämnen och blandningar enligt standardise ­
rade typer och nivåer av fysiska risker, hälsorisker och miljörisker och informera om resultaten genom t.ex. piktogram, signalord, faroangivelser, skyddsangivelser och säkerhetsdatablad i syfte att informera om ämnenas skadliga effekter för att 
skydda personer (inklusive arbetsgivare, arbetstagare, transportörer, konsumenter 
och personal inom räddningstjänsten) och miljön (3).
 ▼M2 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 683
 
GHS-kategori 1:  vävnadsskada i ögat eller kraftig synnedsättning som uppstår 
efter applicering av ett testämne på ögats främre yta och som inte är fullt 
reversibel inom 21 dagar från appliceringen (3).  
fara:  inneboende egenskap hos ett ämne eller en situation som har potential att 
orsaka skadliga effekter när en organism, ett system eller en (del)population exponeras för ämnet.  
In Vitro  Irritancy Score (IVIS):  en empiriskt härledd formel som används vid 
BCOP-test och där medelvärdet för opacitet och medelvärdet för permeabilitet för 
varje behandlingsgrupp kombineras till ett enda  in vitro -värde.  IVIS  = medel ­
värdet för opacitet + (15 x medelvärdet för permeabilitet)  
negativ kontroll:  ett obehandlat replikat som innehåller alla komponenter i ett 
testsystem. Detta prov hanteras parallellt med testämnesbehandlade prover och 
andra kontrollprover för att avgöra huruvida lösningsmedlet påverkar testsystemet.  
icke-irriterande:  ämnen som inte klassificeras som ögonirriterande ämnen enligt 
EPA-kategori I, II, eller III, EU-kategori R41 eller R36 eller GHS-kategori 1, 2A eller 2B.  
frätande för ögonen:  a) ett ämne som orsakar irreversibel vävnadsskada på 
ögat, b) ämnen som klassificeras som irriterande för ögonen enligt GHS-kategori 1, EPA-kategori I eller EU-kategori R41 (1) (2) (3).  
irriterande för ögonen:  a) ett ämne som orsakar en reversibel ändring på ögat 
efter applicering på ögats främre yta, b) ämnen som klassificeras som irriterande 
för ögonen enligt EPA-kategori II eller III, EU-kategori R36 eller GHS-kategori 
2A eller 2B (1) (2) (3).  
kraftigt irriterande för ögonen:  a) ett ämne som efter applicering på ögats 
främre yta orsakar vävnadsskada på ögat som inte har läkt inom 21 dagar efter appliceringen eller som orsakar kraftig synnedsättning, b) ämnen som klassifice ­
ras som irriterande för ögonen enligt GHS-kategori, EPA-kategori I eller 
EU-kategori R41 (1) (2) (3).  
opacitetsmätare:  ett instrument för mätning av korneal opacitet genom en kvan ­
titativ utvärdering av ljustransmissionen genom hornhinnan. Det har i regel två 
kamrar med var sin ljuskälla och var sin fotocell. Ena kammaren används för den 
behandlade hornhinnan och den andra används för kalibrering och nollställning av instrumentet. Ljus från en halogenlampa sänds genom kontrollkammaren (som är tom, utan fönster eller vätska) till en fotocell och jämförs med ljuset som sänds 
genom försökskammaren (i vilken hornhinnan finns) till en fotocell. Instrumentet 
mäter skillnaden mellan fotocellernas ljustransmission och visar ett numeriskt värde på en digital display.  
positiv kontroll:  ett replikat som innehåller testsystemets alla komponenter och 
behandlas med ett ämne som veterligen inducerar positiv respons. För att säker ­
ställa att den positiva kontrollresponsens variationer över tiden kan bedömas, bör 
den kraftiga irritation som framkallas inte vara för stark.
 ▼M2 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 684
 
tillförlitlighet:  mått på i vilken utsträckning en testmetod kan reproduceras inom 
och mellan laboratorier över tiden när den utförs med samma protokoll. Till ­
förlitligheten bedöms genom att man beräknar reproducerbarheten inom och mellan laboratorier och repeterbarheten inom laboratorier.  
lösningsmedels-/vehikelkontroll:  ett obehandlat prov som innehåller testsyste ­
mets alla komponenter, inbegripet lösningsmedlet eller vehikeln och som behand ­
las parallellt med testämnesbehandlade och andra kontrollprover i syfte att fast ­
ställa bakgrundsrespons för de prover som behandlats med testämnet upplöst i samma lösningsmedel eller vehikel. När detta prov testas med en parallell negativ kontroll, visar provet också huruvida lösningsmedlet eller vehikeln påverkar test ­
systemet.  
stegvis testning:  En strategi för stegvis testning där all befintlig information om 
ett testämne granskas i en angiven ordning, med användning av förfarandet med sammanvägd bedömning ( weight of evidence ) för att avgöra om det finns till ­
räckligt med information till hands för att besluta om faroklassificering innan 
man går vidare till nästa steg. Om testämnets förmåga att framkalla irritation kan 
fastställas på grundval av befintlig information behövs ingen ytterligare testning. Om testämnets förmåga att framkalla irritation inte kan fastställas på grundval av 
befintlig information genomförs ett stegvis sekventiellt djurförsöksförfarande tills 
det går att fastställa en otvetydig klassificering.  
validerad testmetod:  en testmetod för vilken valideringsstudier har genomförts 
för att fastställa relevans (inbegripet exakthet) och tillförlitlighet för ett specifikt ändamål. Det är viktigt att notera att en validerad testmetod kanske inte är till ­
räckligt exakt och tillförlitlig när det gäller ett visst föreslaget ändamål  
sammanvägd bedömning:  (weight of evidence) ett förfarande där man bedömer 
styrkor och svagheter hos flera uppgifter för att nå fram till och motivera en slutsats rörande ett ämnes faropotential.
 ▼M2 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 685
 
Tillägg 2  
Kvalifikationsämnen för BCOP-testmetoden  
Innan denna testmetod används rutinmässigt kan laboratoriet vilja påvisa den 
tekniska kvaliteten genom att korrekt identifiera klassificeringen av frätande ver ­
kan på ögonen för de tio ämnen som rekommenderas i tabell 1. Dessa ämnen har 
valts ut att representera responsskalan för lokal ögonirritation/frätande verkan 
enligt resultaten från  in vivo -test på kaninögon (TG 405), dvs. kategorierna 1, 
2A, 2B eller ingen klassificering och märkning enligt FN GHS (3) (7). Med beaktande av det validerade ändamålet för dessa test (endast för identifiering 
av ämnen som är frätande/kraftigt irriterande för ögonen) finns det dock bara 
två testutslag för klassificeringsändamål (frätande/kraftigt irriterande eller icke-frätande/icke kraftigt irriterande för ögonen) när det gäller att demonstrera kvalitet. Till övriga kriterier hör att ämnena ska vara kommersiellt tillgängliga, att 
det finns tillgång till  in vivo -referensdata av hög kvalitet och att det finns data av 
hög kvalitet från de två  in vitro -metoder för vilka testriktlinjer håller på att 
utarbetas. Därför valdes irriterande ämnen från ICCVAM:s förteckning med 122 referensämnen för validering av  in vitro -testmetoder för okulär toxicitet 
(se tillägg H). Referensdata finns i  ICCVAM Background Review Document  för 
testmetoderna BCOP och ICE (17) (18).
 
Tabell 1  
Rekommenderade ämnen för att påvisa teknisk kvalitet hos BCOP  
Ämne CASRN Kemisk klass (  1 ) Fysikalisk 
form  In vivo - 
klassificering (  2 ) In vitro -klassificering (  3 ) 
Bensalkoniumklo ­
rid (5 %) 8001-54-5 Oniumförening Vätska Kategori 1 Frätande/Kraftigt irriterande 
Klorhexidin 55-56-1 Amin, amidin Fast ämne Kategori 1 Frätande/Kraftigt irriterande 
Dibensoyl-L-tar ­
tarsyra 2743-38-6 Karboxylsyra, 
ester Fast ämne Kategori 1 Frätande/Kraftigt irriterande 
Imidazol 288-32-4 Heterocyklisk 
förening Fast ämne Kategori 1 Frätande/Kraftigt irriterande 
Triklorättiksyra 
(30 %) 76-03-9 Karboxylsyra Vätska Kategori 1 Frätande/Kraftigt irriterande 
2,6-Diklorbenso ­
ylklorid 4659-45-4 Acylhalid Vätska Kategori 2A Icke-frätande/Icke kraftigt ir ­
riterande 
Etyl-2-metylace ­
toacetat 609-14-3 Keton, ester Vätska Kategori 2B Icke-frätande/Icke kraftigt ir ­
riterande 
Ammoniumnitrat 6484-52-2 Oorganiskt salt Fast ämne Kategori 2A Icke-frätande/Icke kraftigt ir ­
riterande  ▼M2 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 686
 
Ämne CASRN Kemisk klass (  1 ) Fysikalisk 
form  In vivo - 
klassificering (  2 ) In vitro -klassificering (  3 ) 
Glycerol 56-81-5 Alkohol Vätska Ingen märk ­
ning Icke-frätande/Icke kraftigt ir ­
riterande 
n-hexan 110-54-3 Kolväte 
(acykliskt) Vätska Ingen märk ­
ning Icke-frätande/Icke kraftigt ir ­
riterande  
Förkortningar: CASRN = Chemical Abstracts Service Registry Number 
( 1 ) De kemiska klasserna tilldelades vart och ett testämne med användning av ett standardsystem baserat på klassificeringssysteme t 
National Library of Medicine Medical Subject Headings (MeSH) (finns på http//www.nlm.nih.gov/mesh). 
( 2 ) På grundval av  in vivo -test på kaninögon (OECD TG 405) och med användning av FN GHS (3) (7). 
( 3 ) På grundval av resultat i BCOP och ICE.  ▼M2 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 687
 
Tillägg 3  
HORNHINNEHÅLLARE FÖR BCOP-TESTMETODEN 
1. Hornhinnehållare för BCOP är gjorda av ett inert material (t.ex. polypro ­
pen). De består av två halvor (en främre och en bakre kammare) och har två likadana cylindriska inre kammare. Varje kammare rymmer 5 ml och har ett glasfönster genom vilket opacitetsmätningarna görs. De inre kamrarna mäter 
1,7 cm i diameter och 2,2 cm i djup (
 1 ). Den bakre kammaren har en o-ring 
för att förhindra läckor. Hornhinnorna placeras med endotelsidan nedåt på den bakre kammarens o-ring och den främre kammaren placeras på horn ­
hinnornas epitelsida. Kamrarna hålls på plats med hjälp av tre rostfria skru ­
var på kammarens ytterkanter. Varje kammare har ett glasfönster som kan 
tas bort för att enkelt nå hornhinnan. Det finns också en o-ring mellan glasfönstret och kammaren för att förhindra läckor. Upptill på varje kam ­
mare finns två hål för att tillsätta och ta bort medium och testämne. Hålen 
försluts med gummiproppar under behandlings- och inkubationsperioderna.
 
Ordlista  
Glass disc: Glasskiva 
PTFE-O-ring: O-ring av PTFE Refill: Påfyllning Hanger: Hängare Cap: Propp 
Nut: Låsring 
O-ring: O-ring Posterior compartment: Bakre kammare Anterior compartment: Främre kammare Fixing screws: Fästskruvar
 ▼M2 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 688  
( 1 ) De här måtten utgår från hållare för hornhinnor från nötkreatur som är 12–60 månader 
gamla. För hornhinnor från djur som är 6–12 månader ska hållarna utformas så att varje 
kammare rymmer en volym på 4 ml och innerkamrarnas diameter är 1,5 cm och djup 
2,2 cm. Vid utformningen av anpassade hornhinnehållare är det mycket viktigt att för ­
hållandet mellan exponerad hornhinneyta och bakre kammarens volym är samma som 
motsvarande förhållande i en traditionell hornhinnehållare. Detta är nödvändigt för att 
säkerställa att permeabilitetsvärdena fastställs korrekt för beräkningen av IVIS med hjälp 
av den angivna formeln.
 OPACITETSMÄTAREN 
2. Opacitetsmätaren används för mätning av ljustransmission. Ljus från en 
halogenlampa sänds genom kontrollkammaren (en tom kammare utan föns ­
ter eller vätska) till en fotocell och jämförs med ljuset som sänds genom försökskammaren (i vilken hornhinnan finns) till en fotocell. Instrumentet mäter skillnaden mellan fotocellernas ljustransmission och visar ett nume ­
riskt värde på en digital display. Opacitetsenheterna fastställs. 
3. Opacitetsmätaren bör ge en linjär respons genom ett område av opacitets ­
mätningar som omfattar de brytpunkter som används för de olika klassifi ­
kationerna som beskrivs i prognosmodellen (dvs. upp till brytpunkten för frätande verkan/kraftig irritation). För att säkerställa linjära och exakta avläs ­
ningar upp till 75–80 opacitetsenheter är det nödvändigt att kalibrera opa ­
citetsmätaren med en serie kalibratorer. Kalibratorerna (opaka polyesterark) placeras i kalibreringskammaren (en hornhinnekammare utformad för ka ­
libratorer) och avläsning görs på opacitetsmätaren. Kalibratorerna placeras 
i kalibreringskammaren med mer eller mindre det avstånd mellan ljus och 
fotocell som motsvarar hornhinnans placering vid opacitetsmätningarna. Opacitetsmätaren kalibreras först till 0 opacitetsenheter genom att göra en 
avläsning utan kalibrator. Därefter placeras tre olika kalibratorer en i sänder 
i kalibreringskammaren och avläsning görs av opacitetsvärdena. Kalibrato ­
rerna 1, 2 och 3 bör ge opacitetsavläsningar som motsvarar deras riktvärden på 75, 150 respektive 225 opacitetsenheter ± 5 %.
 ▼M2 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 689
 
B 48  TESTMETODEN ICE (ISOLATED CHICKEN EYE TEST) FÖR 
IDENTIFIERING AV ÄMNEN SOM ÄR FRÄTANDE OCH 
KRAFTIGT IRRITERANDE FÖR ÖGONEN  
INLEDNING 
1. ICE-testmetoden är en  in vitro -testmetod som under vissa omständigheter 
och med vissa begränsningar kan användas för att klassificera ämnen och 
blandningar som frätande eller kraftigt irriterande för ögonen (1) (2) (3). Med 
kraftigt irriterande för ögonen avses här sådana ämnen som framkallar oku ­
lära skador som kvarstår hos kanin under minst 21 dagar efter applicering. Även om ICE-testmetoden inte anses vara godtagbar som en fullständig 
ersättning för  in vivo -ögontest på kanin, rekommenderas testmetoden som 
en del av en strategi för stegvis testning när det gäller rättslig klassificering och märkning inom ett visst tillämpningsområde (4) (5). De testämnen och blandningar (6) som ger positiv respons med detta test kan klassificeras som 
frätande eller kraftigt irriterande för ögonen utan ytterligare testning på ka ­
niner. Ett ämne som ger negativt utslag behöver testas på kaniner med en stegvis testningsstrategi enligt OECD:s testriktlinjer 405 (7) (kapitel B.5 i denna bilaga). 
2. Syftet är att beskriva de förfaranden som används för att utvärdera potentiellt 
frätande eller kraftigt irriterande egenskaper hos ett testämne, uppmätta som 
ämnets förmåga att framkalla toxiska verkningar i ett isolerat kycklingöga. 
De toxiska verkningarna på hornhinnan mäts genom i) kvalitativ bedömning av opacitet, ii) kvalitativ bedömning av skadan på epitel efter applicering av fluorescein på ögat (fluoresceinfärgning), iii) kvantitativ mätning av ökad 
tjocklek (svullnad) och iv) kvalitativ utvärdering av makroskopisk morfolo ­
gisk skada på ytan. Korneal opacitet, svullnad och skadebedömning efter exponering för ett testämne utvärderas var för sig och kombineras till ett resultat som används för klassificering av ämnet med avseende på ögon ­
irritation. 
3. Ögonirriterande ämnen som framkallar skador som läker på mindre än 21 
dagar och icke-irriterande ämnen har också testats med ICE-testmetoden. 
ICE-testmetodens exakthet och tillförlitlighet i fråga om ämnen i dessa ka ­
tegorier har dock inte utvärderats formellt. 
4. Definitioner av begreppen finns i tillägg 1.
 
INLEDANDE ÖVERVÄGANDEN OCH BEGRÄNSNINGAR 
5. Testmetoden baserar sig på ICE-testmetodsprotokollet från amerikanska 
ICCVAM (Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alter ­
native Methods) (8) som har tagits fram efter en internationell validerings ­
studie (4) (5) (9), med bidrag från Europeiska centret för bestämning av 
alternativa metoder (ECVAM), det japanska centret för validering av alter ­
nativa metoder (JaCVAM) och TNO Quality of Life Department of Toxicol ­
ogy and Applied Pharmacology (Nederländerna). Protokollet grundar sig på 
uppgifter från offentliggjorda protokoll och från det protokoll som för när ­
varande används av TNO (10) (11) (12) (13) (14).  ▼M2 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 690
 
6. De identifierade begränsningarna för denna metod baserar sig på falska 
positiva värden för alkoholer och falska negativa värden för fasta och yt ­
aktiva ämnen (se punkt 47) (4). När ämnen från dessa kemiska och fysika ­
liska klasser utesluts ur databasen får man en klart bättre exakthet för ICE i EU-, EPA- och GHS-klassifikationssystemen (4). Om man ser till syftet med 
detta test (dvs. att enbart identifiera ämnen som är frätande eller kraftigt 
irriterande för ögonen) är falska negativa värden inte kritiska, eftersom så ­
dana ämnen därefter testas på kaniner eller med andra tillbörligt validerade  in 
vitro -test, beroende på kraven i tillämpliga bestämmelser, med tillämpning av 
en strategi med stegvis testning och enligt principen om sammanvägd be ­
dömning. Dessutom gav den aktuella valideringsdatabasen ingen möjlighet till en tillbörlig utvärdering av vissa kemiska klasser eller produktklasser (t.ex. blandningar). Man kan dock överväga användning av denna testmetod 
för alla typer av ämnen (inbegripet blandningar) och likaså kan ett positivt 
resultat godtas som på tecken på att ämnet är frätande eller kraftigt irrite ­
rande för ögonen. Positiva resultat från test med alkoholer bör dock tolkas försiktigt på grund av risken för överprediktion. 
7. Alla förfaranden som omfattar ögon från kycklingar bör respektera testnings ­
laboratoriets tillämpliga regler och förfaranden för hantering av material som 
kommer från människor eller djur, omfattande men inte begränsat till väv ­
nader och vävnadsvätskor. Likaså rekommenderas allmänna försiktighets ­
åtgärder för laboratorier (15). 
8. Testmetoden har som begränsning att även om den beaktar vissa av de okulära 
effekterna som framkallas vid test av ögonirritation hos kanin och i viss ut ­
sträckning effekternas allvarlighetsgrad, beaktar den inte skador på konjunktiva eller iris. Dessutom gäller att även om reversibiliteten hos hornhinneskador i sig inte kan utvärderas vid ICE-test, har det på grundval av studier av kaninögon 
föreslagits att en bedömning av det initiala djupet för hornhinneskada kan 
användas för att skilja mellan irreversibla och reversibla effekter (16). Slutligen gäller att ICE inte ger möjlighet att bedöma potentialen för systemisk toxicitet associerad med okulär exponering. 
9. Det pågår arbete för att ytterligare karakterisera ICE-metodens användbarhet 
och begränsningar när det gäller att identifiera ämnen som inte är kraftigt 
irriterande och inte irriterande (se också punkt 48). Användarna uppmuntras också att lämna uppgifter om arter och/eller data till valideringsorganisatio ­
ner för formell utvärdering av eventuella framtida användningar av 
ICE-testmetoden, även när det gäller identifiering av ämnen som inte är kraftigt irriterande och inte irriterande. 
10. Laboratorier som tar denna testmetod i bruk för första gången bör använda 
de kvalifikationskemikalier som förtecknas i bilaga 2. Ett laboratorium kan 
använda dessa kemikalier för att påvisa sin tekniska kompetens att genom ­
föra ICE-testmetoden innan laboratoriet lämnar in ICE-testdata avsedda för lagenlig faroklassificering.
 
PRINCIP FÖR TESTMETODEN 
11. ICE-testmetoden är en organotypisk modell enligt vilken kycklingögon under 
kort tid bibehåller normal fysiologisk och biokemisk funktion  in vitro . Med 
denna testmetod utvärderas den skada som framkallats av testämnet genom 
bestämning av hornhinnans svullnad, opacitet och fluoresceinfärgning. De två senare parametrarna bedöms kvalitativt medan analysen av hornhinnans svullnad görs kvantitativt. Varje mätning konverteras till ett kvantitativt 
värde som används för att kalkylera ett övergripande irritationsindex eller 
för att tilldela en kvalitativ kategorisering som används för att fastställa klassificeringen av frätande verkan och kraftig irritation för ögonen  in vitro . 
Ettdera resultatet kan därefter användas för att göra en prognos om testäm ­
nets potential att ge frätskador eller kraftig irritation på ögat  in vivo  (se 
beslutskriterierna).
 ▼M2 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 691
 
Källa och ålder för kycklingögon  
12. I regel används ögon tillvaratagna från kycklingar som kommer från ett 
slakteri där de avlivats för användning som livsmedel, vilket eliminerar 
behovet av försöksdjur. Endast ögon från friska djur som anses lämpliga för livsmedelkedjan får användas. 
13. Det har inte gjorts någon kontrollerad undersökning för att utvärdera optimal 
ålder för kycklingarna för testmetoden, men i regel används kycklingar som 
slaktats på vanligt sätt i ett fjäderfäslakteri (cirka 7 veckor gamla, 
1,5–2,5 kg).
 
Tillvaratagande och transport av ögon till laboratoriet  
14. Kycklingarnas huvuden ska avlägsnas omedelbart efter bedövning (i regel 
med elchock) med snitt i halsen för blödning. Kycklinghuvudena bör komma 
från en lokal källa nära laboratoriet så att de tillräckligt snabbt kan trans ­
porteras från slakteriet till laboratoriet för att minimera risken för skador och/eller bakterieförorening. Tidsintervallet mellan tillvaratagandet av kyck ­
linghuvudena och användningen av ögonen för ICE-test ska minimeras (i 
regel högst två timmar) och det bör påvisas att transporttiden inte stör test ­
resultaten. Dessa baserar sig på urvalskriterierna för ögonen såväl som på positiv och negativ kontrollrespons. Alla ögon som används för testning bör komma från samma grupp av ögon som har tillvaratagits på en viss dag. 
15. Ögonen avlägsnas i laboratoriet, och de orörda kycklinghuvudena ska därför 
transporteras från slakteriet vid rumstemperatur i plastlådor som fuktas med 
handdukar indränkta i fysiologisk saltlösning.
 
Urvalskriterier för ögon som används för ICE-test  
16. Ögon med högt grundvärde för fluoresceinfärgning (> 0,5) eller korneal 
opacitet (> 0,5) efter tillvaratagandet ska förkastas. 
17. Varje behandlingsgrupp med parallell positiv kontroll består av minst tre 
ögon. Den negativa kontrollgruppen eller lösningsmedelskontrollen (om an ­
nat lösningsmedel än saltlösning används) ska bestå av minst ett öga.  
FÖRFARANDE  
Förberedning av ögonen  
18. Ögonlocken skärs bort försiktigt med undvikande av skador på hornhinnan. 
Hornhinnans intakta skick kan utvärderas snabbt med en droppe 2 % natri ­
umfluorescein (vikt/volym) som appliceras på hornhinnans yta för några 
sekunder och därefter sköljs bort med fysiologisk saltlösning. De fluoresce ­
inbehandlade ögonen undersöks därefter med spaltlampa för att kontrollera att hornhinnan är intakt (värdet för fluoresceinfärgning och korneal opacitet ≤ 0,5). 
19. Förutsatt att hornhinnan är intakt skärs ögat ut från skallen med varsamhet så 
att hornhinnan inte skadas. Ögongloben dras ut ur ögonhålan med ett stadigt 
grepp om blinkhinnan med hjälp av kirurgisk tång och ögonmusklerna klipps av med en böjd trubbig sax. Det är viktigt att greppet om hornhinnan inte är så starkt att det uppstår skador (t.ex. kompressionsartefakter). 
20. När ögat har tagits ut ur hålan bör det finnas kvar en vidfäst synlig del av 
synnerven. Därefter placeras ögat på ett absorberande underlag och blinkhin ­
nan och annan bindvävnad skärs bort.
 ▼M2 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 692
 
21. Därefter monteras ögat i en klämma av rostfritt stål med hornhinnan i upprätt 
riktning. Klämman med ögat överförs till superfusionsapparaten (16). Kläm ­
morna ska placeras i superfusionsapparaten så att droppet med fysiologisk saltlösning når hela hornhinnan. Superfusionsapparatens kammare ska ha en kontrollerad temperatur på 32 ± 1,5 °C. I tillägg 3 finns en schematisk bild 
av en typisk superfusionsapparat med ögonklämmor. Utrustningen kan an ­
skaffas kommersiellt eller konstrueras i laboratoriet. Apparaten kan också anpassas efter behoven vid ett enskilt laboratorium (t.ex. för att hålla ett avvikande antal ögon). 
22. Efter att ögonen placerats i superfusionsapparaten granskas de på nytt med 
spaltlampa för att kontrollera att de inte har fått skador under dissektionen. Samtidigt ska även hornhinnans tjocklek mätas vid hornhinnans apex med 
hjälp av spaltlampans tillbehör för djupmätning. Ögon som har i) fluoresce ­
infärgningsvärde > 0,5, ii) värde för korneal opacitet > 0,5 eller iii) andra tecken på skada ska bytas ut. Ögon som inte har förkastats enligt något av dessa kriterier men där hornhinnans tjocklek avviker mer än 10 % från 
medelvärdet för alla ögon ska förkastas. Det är viktigt att vara medveten 
om att spaltlampan kan ge olika värden på hornhinnans tjocklek beroende på inställningen för spaltbredd. Spaltbredden ska ställas in på 0,095 mm. 
23. Undersökta och godkända ögon inkuberas i cirka 45–60 minuter för att få 
dem i jämvikt med testsystemet före doseringen. Efter jämviktsperioden görs en referensmätning av hornhinnans tjocklek och opacitet för att få ett grund ­
värde (tid = 0). Fluoresceinvärdet som uppmättes vid dissektionen används 
som grundvärde för det resultatmåttet.
 
Applicering av testämnet  
24. Omedelbart efter mätningarna av nollreferens tas ögonen (i sina hållare) bort 
ur superfusionsapparaten, placeras i liggande läge och testämnet appliceras 
på hornhinnan. 
25. Vätskeformiga testämnen används i regel i outspädd form men kan spädas ut 
om det bedöms vara nödvändigt (t.ex. som en del av försöksutformningen). 
Eventuell utspädning ska helst göras med fysiologisk saltlösning. Andra lös ­
ningsmedel än fysiologisk saltlösning kan användas under kontrollerade för ­
hållanden men då bör lämpligheten påvisas. 
26. Vätskeformiga testämnen appliceras på hornhinnan så att hela ytan är jämnt 
täckt med testämnet (standardvolymen är 0,03 ml). 
27. Fasta ämnen ska så långt det är möjligt finfördelas i mortel eller motsvarande 
redskap. Pulvret appliceras så att hornhinnan blir jämnt täckt med testämnet 
(standardmängden är 0,03 g). 
28. Testämnet (vätska eller fast ämne) får verka på hornhinnan i 10 sekunder och 
sköljs sedan bort från ögat med rumstempererad fysiologisk saltlösning 
(cirka 20 ml). Ögat (i sin hållare) återförs därefter till superfusionsapparaten i ursprunglig upprätt position.
 
Kontrollämnen  
29. Parallella negativa kontroller eller lösningsmedels-/vehikelkontroller och po ­
sitiva kontroller ska ingå i varje försök.  ▼M2 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 693
 
30. Vid testning av outspädda vätskor eller fasta ämnen med ICE-testmetoden 
ska fysiologisk saltlösning användas som parallell negativ kontroll för att 
upptäcka icke-specifika ändringar i testsystemet och för att säkerställa att testningsförhållandena inte i onödan framkallar irritation. 
31. Vid testning av utspädda vätskor ska en parallell negativ kontrollgrupp för 
lösningsmedel/vehikel inbegripas för att upptäcka icke-specifika ändringar i testsystemet och för att säkerställa att testningsförhållandena inte i onödan 
framkallar irritation. Som det konstateras i punkt 25 får endast lösnings ­
medel/vehikel som påvisbart inte har negativa effekter på testsystemet an ­
vändas. 
32. Ett känt ögonirriterande ämne ska ingå som parallell positiv kontroll i varje 
försök för att bekräfta att rätt slags respons framkallas. Eftersom ICE an ­
vänds i denna testmetod för att identifiera frätande eller kraftigt irriterande 
ämnen, ska den positiva kontrollen göras med ett referensämne som fram ­
kallar kraftig respons. För att säkerställa att den positiva kontrollresponsens variationer över tiden kan bedömas, bör den kraftiga irritation som fram ­
kallas inte vara för stark. Tillräckliga  in vitro -data bör genereras för den 
positiva kontrollen så att det går att beräkna ett godtagbart intervall för 
denna. Om det inte finns tillbörliga historiska ICE-testmetodsdata för en särskild positiv kontroll måste man eventuellt genomföra försök för att få fram denna information. 
33. Exempel på positiva kontroller för vätskeformiga testämnen är 10 % ättik ­
syra eller 5 % bensalkoniumklorid, och exempel på positiva kontroller för 
fasta testämnen är natriumhydroxid eller imidazol. 
34. Referensämnen kan användas för utvärdering av förmågan att framkalla 
ögonirritation hos okända kemikalier tillhörande en specifik kemisk klass 
eller produktklass, eller för utvärdering av den relativa irritationspotentialen hos ett ögonirriterande ämne inom ett specifikt responsområde.
 
Mätning av resultatmått  
35. Hornhinnorna utvärderas före behandlingen och vid 30, 75, 120, 180 och 
240 minuter (± 5 minuter) efter den sköljning som görs efter behandlingen. Dessa tidpunkter ger ett tillbörligt antal mätningar under den fyra timmar 
långa behandlingsperioden och ger tillräckligt med tid mellan mätningarna 
för att genomföra observationerna av alla ögon. 
36. De resultatmått som ska bedömas är korneal opacitet, svullnad, fluorescein ­
färgning och morfologiska effekter (t.ex. gropbildning eller avlossning av epitel). Alla resultatmått, med undantag av fluoresceinfärgning (som endast bestäms före behandlingen och 30 minuter efter exponering av testämnet) 
bestäms vid alla de ovan nämnda tidpunkterna. 
37. Fotografier rekommenderas för dokumentering av korneal opacitet, fluoresce ­
infärgning, morfologiska verkningar och, i förekommande fall, histopatologi. 
38. Efter den sista granskningen vid tidpunkten fyra timmar är det rekommen ­
dabelt att hålla ögonen i lämpligt konserveringsmedel (t.ex. neutralt formalin 
med buffert) med tanke på eventuell histopatologisk undersökning.
 ▼M2 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 694
 
39. Hornhinnans svullnad bestäms genom mätningar av hornhinnans tjocklek 
med en pachymeter eller spaltlampa. Svullnaden yttrycks som ett procenttal 
och beräknas på grundval av mätningarna enligt följande formel:  
8 
> > > : hornhinnans tjocklek vid tidpunkt t  Ä hornhinnans tjocklek vid tidpunkt 0 
hjornhinnans tjocklek vid tidpunkt  ¼ 0 9 
> > > ; Ü 100 
40. Medelvärdet för hornhinnans svullnad för alla testögon beräknas för alla 
observationstidpunkter. Det högsta medelvärdet för svullnad oavsett obser ­
vationstidpunkt används som grund för en övergripande kategorisering av 
testämnet. 
41. Den korneala opaciteten beräknas på grundval av mätningarna på det område 
av hornhinnan som har den tätaste opaciteten. Medelvärdet för den korneala opaciteten för alla testögon beräknas för alla observationstidpunkter. Det högsta medelvärdet för korneal opacitet oberoende av tidpunkt används 
som grund för en övergripande kategorisering av testämnet (tabell 1).
 
Tabell 1  
Värden för korneal opacitet  
Värde Observation  
0 Ingen opacitet 
0,5 Mycket svag opacitet 1 Spridda eller diffusa områden med opacitet, alla detaljer i iris är klart synliga 2 Enkelt skönjbart translucent område, detaljerna i iris är lätt förmörkade 3 Kraftig opacitet, inga detaljer i iris är synliga, pupillens storlek kan knappat 
urskiljas 
4 Fullständig korneal opacitet, iris syns inte 
42. Medelvärdet för fluoresceinfärgning för alla testögon beräknas endast för ob ­
servationstidpunkten 30 minuter och används för övergripande kategorivärde som ges för varje testämne (tabell 2).
 
Tabell 2  
Värden för fluoresceinfärgning  
Värde Observation  
0 Ingen fluoresceinfärgning 
0,5 Mycket svag färgning av enskilda celler 
1 Färgning av enskilda celler spridda över hornhinnans behandlade yta 2 Fokal eller konfluerande tät färgning av enskilda celler 3 Konfluenta stora områden av hornhinnan har färgats av fluorescein
 ▼M2 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 695
 
43. Till de morfologiska effekterna hör gropbildning i hornhinnans epitel, avloss ­
ning av epitel, uppruggning av hornhinnans yta och vidfästning av testämnet 
vid hornhinnan. Dessa observationer kan ha olika allvarlighetsgrad och kan förekomma samtidigt. Klassificeringen av observationerna är subjektiva och beror på personlig tolkning.
 
DATA OCH RAPPORTERING  
Utvärdering av data  
44. Resultaten för korneal opacitet, svullnad och fluoresceinfärgning bör utvär ­
deras separat för att ge en ICE-klass för varje resultatmått. ICE-klasserna för varje resultatmått kombineras därefter, så att man får en klassificering av 
varje testämne med avseende på irritationsframkallande egenskaper.
 
Beslutskriterier  
45. Efter att varje resultatmått har utvärderats kan ICE-klasser tilldelas i enlighet 
med en på förhand fastställd skala. Tolkningen av hornhinnans tjocklek (tabell 3), opacitet (tabell 4) och fluoresceinfärgning (tabell 5) med använd ­
ning av fyra ICE-klasser görs enligt följande:
 
Tabell 3  
ICE-klassificeringskriterier för hornhinnans tjocklek  
Medelvärde för svullnad (%) (*) ICE-klass  
0 till 5 I 
> 5 till 12 II 
> 12 till 18 (> 75 min. efter behandling) II 
> 12 till 18 ( ≤ 75 min. efter behandling) III 
> 18 till 26 III > 26 till 32 (> 75 min. efter behandling) III > 26 till 32 ( ≤ 75 min. efter behandling) IV 
> 32 IV
 
(*) Värdena för svullnad kan bara tillämpas när tjockleken mäts med Haag-Streit BP900 spaltlampa med 
tillbehör nr I för mätning av djup och spaltbreddsinställningen 9½, som motsvarar 0,095 mm. Det är viktigt att vara medveten om att spaltlampan kan ge olika resultat för hornhinnans tjocklek beroende på 
vilken spaltbredd som används.
 
Tabell 4  
ICE-klassificeringskriterier för opacitet  
Medelvärde för största opacitet (*) ICE-klass  
0,0–0,5 I 
0,6–1,5 II 1,6–2,5 III 2,6–4,0 IV
 
(*) Se tabell 1.  ▼M2 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 696
 
Tabell 5  
ICE-klassificeringskriterier för fluoresceinfärgning  
Medelvärde för fluoresceinfärgning 30 minuter efter 
behandlingen (*) ICE-klass  
0,0–0,5 I 
0,6–1,5 II 1,6–2,5 III 2,6–3,0 IV
 
(*) Se tabell 2.  
46. Testämnets övergripande klassificering för irritation  in vitro  bedöms genom 
avläsning av den klassificering för irritation som motsvarar kombinationen av kategorier för hornhinnan i fråga om svullnad, korneal opacitet och flu ­
oresceinfärgning, och genom tillämpning av schemat i tabell 6.
 
Tabell 6  
Övergripande klassificeringar för irritation  in vitro  
Klassificering Kombination av de tre resultatmåtten  
Frätande/Kraftigt irriterande 3 × IV 
2 × IV, 1 × III 
2 × IV, 1 × III (*) 
2 × IV, 1 × I (*) Korneal opacitet ≥ 3 vid 30 min. (minst två 
ögon) 
Korneal opacitet = 4 oavsett tidpunkt (minst två 
ögon) 
Kraftig avlossning av epitel (minst ett öga)
 
(*) Kombinationer som är mindre sannolika.  
47. Som det konstateras i punkt 1 i fråga om testämnen som inte identifieras som 
frätande eller kraftigt irriterande för ögonen, bör ytterligare testning genom ­
föras för klassificerings- och märkningsändamål. ICE-testmetoden har en övergripande exakthet på 83 % (120/144) till 87 % (134/154), falska positiva värden på 6 % (7/122) till 8 % (9/116) och falska negativa värden på 41 % 
(13/32) till 50 % (15/30) för identifiering av ämnen som är frätande och 
kraftigt irriterande för ögonen, jämfört med  in vivo -testning på kaninögon 
enligt klassifikationssystemen EPA (1), EU (2) eller GHS (3). När ämnen inom en viss kemikalieklass (t.ex. alkoholer och ytaktiva ämnen) eller fysi ­
kalisk klass (t.ex. fasta ämnen) utesluts ur databasen, sträcker sig exaktheten 
hos ICE inom klassifikationssystemen EU, EPA, och GHS från 91 % (75/82) till 92 % (69/75), falska positiva värden från 5 % (4/73) till 6 % (4/70) och falska negativa värden från 29 % (2/7) till 33 % (3/9) (4). 
48. Även om ett testämne inte klassificeras som frätande eller kraftigt irriterande 
för ögonen kan data från ICE vara användbara i kombination med testdata 
från in vivo -test på kaninögon eller  in vitro -test, för vidare utvärdering av 
användbarheten och begränsningarna för ICE-testmetoden när det gäller att identifiera ämnen som inte framkallar kraftig irritation eller som inte alls 
framkallar irritation (en vägledning om användning av  in vitro -test för ögon ­
toxicitet håller på att utarbetas).
 ▼M2 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 697
 
Kriterier för godkännande av ett försök  
49. Ett försök anses vara godtagbart om de parallella negativa kontrollerna eller 
vehikel-/lösningsmedelkontrollerna och de parallella positiva kontrollerna ger 
irritationsklassificeringar som faller inom klasserna icke-irriterande respektive kraftigt irriterande/frätande.
 
Testrapport  
50. Testrapporten ska innehålla följande uppgifter i den mån de är relevanta:  
Test- och kontrollämnen  
Kemiskt namn (kemiska namn) såsom det strukturella namn som används i 
Chemical Abstracts Service (CAS) och eventuella andra kända namn. 
CAS-registernummer (RN), om det är känt. Ämnets eller blandningens renhet och sammansättning (viktprocent) i den 
mån uppgifterna finns att tillgå. 
Fysikalisk-kemiska egenskaper, t.ex. fysikaliskt tillstånd, flyktighet, pH, sta ­
bilitet, kemisk klass och vattenlöslighet, i den mån de är relevanta. 
Behandling av test- och kontrollämnen före testning, om detta är tillämpligt 
(t.ex. uppvärmning, finfördelning). 
Stabilitet, om den är känd.
 
Uppgifter om sponsor och testanläggning  
Namn och adress för sponsor, testanläggning och försöksledare. 
Angivelse av ögonkällan (anläggning där ögonen togs till vara). Förvarings- och transportförhållanden för ögonen (t.ex. datum och tid för 
tillvaratagande, tidsintervall före försöksstart). 
Om möjligt specifika egenskaper för de djur från vilka ögonen togs till vara 
(t.ex. ålder, kön, vikt).
 
Motivering för den testmetod och det protokoll som använts  
Testmetodens integritet  
Det förfarande som används för att säkerställa testmetodens integritet (dvs. 
exakthet och tillförlitlighet) över tiden (t.ex. periodisk testning med kvalifi ­
kationsämnen, användning av historiska data från negativa och positiva kont ­
roller).  
Kriterier för godtagbart försök  
Om tillämpligt, godtagbara intervaller för parallella referenskontroller på 
grundval av historiska data.  
Försöksförhållanden  
Beskrivning av testsystemet. 
Spaltlampa som använts (t.ex. modell). Spaltlampans inställningar. 
Uppgifter om de kycklingögon som använts, inbegripet utlåtanden om deras 
kvalitet.
 ▼M2 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 698
 
Detaljerade uppgifter om försöksförfarandet. 
Testämneskoncentration(er). Beskrivning av eventuella modifieringar av försöksförfarandet. Hänvisningar till modellens historiska data (t.ex. negativa och positiva kont ­
roller, kvalifikationsämnen, referensämnen). 
Beskrivning av utvärderingskriterierna.
 
Resultat  
Beskrivning av övriga observerade effekter. 
Fotografier av ögat, om det är lämpligt.  
Diskussion av resultaten  
Slutsatser  
LITTERATUR 
(1) U.S. EPA (1996), Label Review Manual, andra utgåvan, EPA737-B-96- 
001, Washington, DC, U.S. Environmental Protection Agency. 
(2) Europaparlamentets och rådets förordning (EG) nr 1272/2008 av den 
16 december 2008 om klassificering, märkning och förpackning av ämnen och blandningar, ändring och upphävande av direktiven 67/548/EEG och 1999/45/EG samt ändring av förordning (EG) 
nr 1907/2006, EUT L 353, 31.12.2008, s. 1. 
(3) Förenta nationerna (FN) (2007), Globally Harmonized System of Clas ­
sification and Labelling of Chemicals (GHS), andra reviderade upp ­
lagan, FN New York och Genève, 2007, finns på 
http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev02/02files_e.html 
(4) ICCVAM (2007), Test Method Evaluation Report –  In Vitro  Ocular 
Toxicity Test Methods for Identifying Ocular Severe Irritants and Cor ­
rosives, Interagency Coordinating Committee on the Validation of Al ­
ternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program (NTP) Interagency Centre for the Evaluation of Alternative 
Toxicological Methods (NICEATM), NIH:s publikation nr: 07-4517, 
finns på 
http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_tmer.htm 
(5) ESAC (2007), Statement on the conclusion of the ICCVAM retrospec ­
tive study on organotypic in vitro assays as screening tests to identify potential ocular corrosives and severe eye irritants, finns på 
http://ecvam.jrc.it/index.htm 
(6) Europaparlamentets och rådets förordning (EG) nr 1907/2006 av den 
18 december 2006 om registrering, utvärdering, godkännande och be ­
gränsning av kemikalier (Reach), inrättande av en europeisk kemikalie ­
myndighet, ändring av direktiv 1999/45/EG och upphävande av rådets 
förordning (EEG) nr 793/93 och kommissionens förordning (EG) 
nr 1488/94 samt rådets direktiv 76/769/EEG och kommissionens direk ­
tiv 91/155/EEG, 93/67/EEG, 93/105/EG och 2000/21/EG, EUT L 396, 30.12.2006, s. 1. 
(7) OECD (2002), Test Guideline 405. OECD Guideline for Testing of 
Chemicals. Acute eye irritation/corrosion, finns på 
[http://www.oecd.org/document/40/0, 2340,en_2649_34377_37051368 
_1_1_1_1,00.html]
 ▼M2 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 699
 
(8) ICCVAM (2007), ICCVAM:s rekommenderade testprotokoll för 
ICE-testmetoden, ingår i ”ICCVAM Test Method Evaluation Report - 
In Vitro Ocular Toxicity Test Methods for Identifying Ocular Severe Irritants and Corrosives”, Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National 
Toxicology Program (NTP) Interagency Centre for the Evaluation of 
Alternative Toxicological Methods (NICEATM), NIH:s publikation nr: 07-4517, finns på 
http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_tmer.htm 
(9) ICCVAM (2006), Current Status of  In Vitro  Test Methods for Identi ­
fying Ocular Corrosives and Severe Irritants: Isolated Chicken Eye Test 
Method, NIH:s publikation nr: 06-4513. Research Triangle Park: 
National Toxicology Program, finns på 
http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_brd_ice.htm 
(10) M. K. Prinsen och B. W. M. Koëter, (1993), ”Justification of the 
enucleated eye test with eyes of slaughterhouse animals as an alterna ­
tive to the Draize eye irritation test with rabbits”,  Fd. Chem. Toxicol.  
31:69-76. 
(11) INVITTOX (1994), Protocol 80: Chicken enucleated eye test (CEET), 
finns på 
http://ecvam.jrc.it/index.htm 
(12) M. Balls, P. A Botham, L. H. Bruner och H. Spielmann, (1995), ”The 
EC/HO international validation study on alternatives to the Draize eye irritation test”,  Toxicol. In Vitro  9:871–929. 
(13) M. K. Prinsen, (1996), ”The chicken enucleated eye test (CEET), A 
practical (pre)screen for the assessment of eye irritation/corrosion 
potential of test materials”,  Food Chem. Toxicol . 34:291–296. 
(14) M. Chamberlain, S. C. Gad, P. Gautheron och M. K. Prinsen, (1997), 
”IRAG Working Group I: Organotypic models for the assessment/ prediction of ocular irritation”,  Food Chem. Toxicol . 35:23–37. 
(15) J. D. Siegel, E. Rhinehart, M. Jackson, L. Chiarello och Healthcare 
Infection Control Practices Advisory Committee (2007), Guideline for 
Isolation Precautions: Preventing Transmission of Infectious Agents in 
Healthcare Settings, finns på 
http://www.cdc.gov/ncidod/dhqp/pdf/isolation2007.pdf 
(16) J. K. Maurer, R. D. Parker och J. V. Jester (2002), ”Extent of corneal 
injury as the mechanistic basis for ocular irritation: key findings and recommendations for the development of alternative assays”,  Reg. Tox. 
Pharmacol , 36:106–117. 
(17) A. B. G. Burton, M. York och R. S. Lawrence (1981), ”The  in vitro  
assessment of severe irritants”,  Fd. Cosmet. Toxicol.  19, 471–480.
 ▼M2 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 700
 
(18) ICCVAM (2006), Background review document, Current Status of In 
Vitro Test Methods for Identifying Ocular Corrosives and Severe 
Irritants: Bovine Corneal Opacity and Permeability (BCOP) Test Method, finns på 
[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_brd_bcop.htm] 
(19) ICCVAM (2006), Background review document, Current Status of  
In Vitro  Test Methods for Identifying Ocular Corrosives and Severe 
Irritants: Isolated Chicken Eye (ICE) Test Method, finns på 
http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_brd_bcop.htm
 ▼M2 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 701
 
Tillägg 1  
DEFINITIONER  
Exakthet:  mått på hur väl testmetodresultaten och de godtagna referensvärdena 
överensstämmer med varandra. Exakthet är ett mått på testmetodens prestanda 
och relevansaspekt. Detta begrepp används ofta omväxlande med ”konkordans” för att beskriva andelen korrekta resultat med en testmetod.  
Referensämne:  ett ämne som används som standard för jämförelse med ett 
testämne. Ett referensämne ska ha följande egenskaper: i) en eller flera enhetliga och tillförlitliga källor, ii) strukturell och funktionell likhet med den ämnesklass som testas, iii) kända fysikaliska/kemiska egenskaper, iv) stödjande data om 
kända effekter och v) känd styrka inom det önskade responsområdet.  
Hornhinna (kornea):  den transparenta delen på ögonglobens framsida som täc ­
ker iris och pupillen och släpper igenom ljus in i ögat.  
Korneal opacitet:  mått för den grad av opacitet som hornhinnan har efter ex ­
ponering för ett testämne. Ökad korneal opacitet tyder på skador på hornhinnan.  
Svullnad av hornhinnan:  en objektiv mätning vid ICE-försök av hur mycket 
hornhinnan sväller efter exponering för ett testämne. Den uttrycks som ett pro ­
centtal och beräknas utifrån ett grundvärde som fås vid mätning av hornhinnans tjocklek före exponering och den tjocklek som uppmäts med regelbundna inter ­
valler efter exponering för testämnet. Graden av svullnad är en indikation på 
skadan på hornhinnan.  
EPA-kategori 1:  frätande (irreversibel skada på okulär vävnad) eller korneal ­
påverkan eller irritation som varar mer än 21 dagar (1).  
EU-kategori R41:  vävnadsskada i ögat eller kraftig synnedsättning som uppstår 
efter applicering av ett testämne på ögats främre yta och som inte är fullt 
reversibel inom 21 dagar från appliceringen (2).  
Falskt negativt värde:  den andel av alla positiva ämnen som av en testmetod 
felaktigt identifieras som negativa. Det är en indikator på testmetodens prestanda.  
Falskt positivt värde:  den andel av alla negativa (icke-aktiva) ämnen som av en 
testmetod felaktigt identifieras som positiva. Det är en indikator på testmetodens 
prestanda.  
Fluoresceinfärgning:  en subjektiv mätning vid ICE-försök av den mängd nat ­
riumfluorescein som hornhinnans epitelceller håller kvar efter exponering för ett 
testämne. Mängden fluorescein som hålls kvar är en indikation på skada på 
hornhinnan.  
GHS (Globally Harmonized System of Classification and Labelling of 
Chemicals):  ett system för att klassificera ämnen och blandningar enligt stan ­
dardiserade typer och nivåer av fysiska risker, hälsorisker och miljörisker och informera om resultaten genom t.ex. piktogram, signalord, faroangivelser, skyddsangivelser och säkerhetsdatablad i syfte att informera om ämnenas skad ­
liga effekter för att skydda personer (inklusive arbetsgivare, arbetstagare, trans ­
portörer, konsumenter och personal inom räddningstjänsten) och miljön (3).
 ▼M2 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 702
 
GHS-kategori 1:  vävnadsskada i ögat eller kraftig synnedsättning som uppstår 
efter applicering av ett testämne på ögats främre yta och som inte är fullt 
reversibel inom 21 dagar från appliceringen (3).  
Fara:  inneboende egenskap hos ett ämne eller en situation som har potential att 
orsaka skadliga effekter när en organism, ett system eller en (del)population 
exponeras för ämnet.  
Negativ kontroll:  ett obehandlat replikat som innehåller alla komponenter i ett 
testsystem. Detta prov hanteras tillsammans med testämnesbehandlade prover och 
andra kontrollprover för att avgöra huruvida lösningsmedlet påverkar testsyste ­
met. 
Icke-irriterande:  ett ämne som inte klassificeras som ögonirriterande ämnen 
enligt EPA-kategori I, II, eller III, EU-kategori R41 eller R36 eller GHS-kategori 1, 2A eller 2B (1) (2) (3).  
Frätande för ögonen:  a) ett ämne som orsakar irreversibel vävnadsskada på 
ögat, b) ett ämne som klassificeras som irriterande för ögonen enligt GHS-kategori 1, EPA-kategori I eller EU-kategori R41 (1) (2) (3).  
Irriterande för ögonen:  a) ett ämne som orsakar en reversibel ändring på ögat 
efter applicering på ögats främre yta, b) ett ämne som klassificeras som irrite ­
rande för ögonen enligt EPA-kategori II eller III, EU-kategori R36 eller 
GHS-kategori 2A eller 2B (1) (2) (3).  
Kraftigt irriterande för ögonen:  a) ett ämne som efter applicering på ögats 
främre yta orsakar vävnadsskada på ögat som inte är reversibel inom 21 dagar 
efter appliceringen eller som orsakar kraftig synnedsättning, b) ett ämne som klassificeras som irriterande för ögonen enligt GHS-kategori 1, EPA-kategori I eller EU-kategori R41 (1) (2) (3).  
Positiv kontroll:  ett replikat som innehåller testsystemets alla komponenter och 
behandlas med ett ämne som veterligen inducerar positiv respons. För att säker ­
ställa att den positiva kontrollresponsens variationer kan bedömas över tiden, bör 
den kraftiga irritation som framkallas inte vara för stark.  
Tillförlitlighet:  mått på i vilken utsträckning en testmetod kan reproduceras 
inom och mellan laboratorier över tiden när den utförs med samma protokoll. 
Tillförlitligheten bedöms genom att man beräknar reproducerbarheten inom och mellan laboratorier och repeterbarheten inom laboratorier.  
Spaltlampa:  ett instrument som används för direkt undersökning av ögat under 
förstoring genom ett binokulärt mikroskop och som visar en stereoskopisk, topo ­
grafisk bild. Vid ICE-försök används instrumentet för att granska kycklingögats 
främre struktur och för objektiv mätning av hornhinnans tjocklek med tillbehöret 
för mätning av djup.  
Lösningsmedels-/vehikelkontroll:  ett obehandlat prov som innehåller testsyste ­
mets alla komponenter, inbegripet lösningsmedlet eller vehikeln som behandlas 
tillsammans med testämnesbehandlade och andra kontrollprover i syfte att fast ­
ställa bakgrundsrespons för de prover som behandlas med testämnet upplöst i samma lösningsmedel eller vehikel. När detta prov testas med en parallell negativ 
kontroll, visar provet också huruvida lösningsmedlet eller vehikeln påverkar test ­
systemet.
 ▼M2 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 703
 
Stegvis testning:  en strategi för stegvis testning där all befintlig information om 
ett testämne granskas i en angiven ordning, med användning av förfarandet med 
sammanvägd bedömning ( weight of evidence ) för att avgöra om det finns till ­
räckligt med information till hands för att besluta om faroklassificering innan man går vidare till nästa steg. Om testämnets förmåga att framkalla irritation kan 
fastställas på grundval av befintlig information behövs ingen ytterligare testning. 
Om testämnets förmåga att framkalla irritation inte kan fastställas på grundval av befintlig information genomförs ett stegvis sekventiellt djurförsöksförfarande tills att det går att fastställa en otvetydig klassificering.  
Validerad testmetod:  en testmetod för vilken valideringsstudier har genomförts 
för att fastställa relevans (inbegripet exakthet) och tillförlitlighet för ett specifikt 
ändamål. Det är viktigt att notera att en validerad testmetod kanske inte är till ­
räckligt exakt och tillförlitlig när det gäller ett visst föreslaget ändamål  
Sammanvägd bedömning:  (weight of evidence) ett förfarande där man bedömer 
styrkor och svagheter hos flera uppgifter för att nå fram till och motivera en 
slutsats rörande ett ämnes faropotential.
 ▼M2 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 704
 
Tillägg 2  
KVALIFIKATIONSÄMNEN FÖR ICE-TESTMETODEN 
Före rutinanvändning av en testmetod enligt denna testvägledning kan laborato ­
riet påvisa den tekniska kvaliteten genom att korrekt identifiera klassificeringen av frätande verkan på ögonen för de tio ämnen som rekommenderas i tabell 1. Dessa ämnen har valts ut att representera responsskalan för lokal ögonirritation/ 
frätande verkan enligt resultaten från  in vivo -test på kaninögon (TG 405) (dvs. 
kategorierna 1, 2A, 2B eller ingen klassificering och märkning enligt FN GHS (3) (7). Med beaktande av det validerade ändamålet för dessa testningar (endast för identifiering av ämnen som är frätande/kraftigt irriterande för ögonen) finns 
det dock bara två testutslag för klassificeringsändamål (frätande/kraftigt irrite ­
rande eller icke-frätande/icke kraftigt irriterande för ögonen) när det gäller att demonstrera kvalitet. Till övriga kriterier hör att ämnena ska vara kommersiellt tillgängliga, att det finns tillgång till  in vivo -referensdata av hög kvalitet och att 
det finns data av hög kvalitet från de två  in vitro -metoder för vilka testriktlinjer 
håller på att utarbetas. Därför valdes irriterande ämnen från ICCVAM:s förteck ­
ning med 122 rekommenderade referensämnen för validering av  in vitro -test­
metoder för okulär toxicitet (se tillägg H till ICCVAM:s förteckning med rekom ­
menderade referensämnen (4). Referensdata finns i  ICCVAM Background Review 
Documents  för testmetoderna BCOP och ICE (18) (19).
 
Tabell 1  
Rekommenderade ämnen för att påvisa teknisk kvalitet med ICE-testmetoden  
Kemikalie CASRN Kemisk klass (  1 ) Fysikalisk form  In vivo - 
klassificering (  2 ) In vitro -klassificering (  3 ) 
Bensalkoniumklorid 
(5 %) 8001-54-5 Oniumförening Vätska Kategori 1 Frätande/Kraftigt ir ­
riterande 
Klorhexidin 55-56-1 Amin, amidin Fast ämne Kategori 1 Frätande/Kraftigt ir ­
riterande 
Dibensoyl-L-tartar ­
syra 2743-38-6 Karboxylsyra, 
ester Fast ämne Kategori 1 Frätande/Kraftigt ir ­
riterande 
Imidazol 288-32-4 Heterocyklisk 
förening Fast ämne Kategori 1 Frätande/Kraftigt ir ­
riterande 
Triklorättiksyra 
(30 %) 76-03-9 Karboxylsyra Vätska Kategori 1 Frätande/Kraftigt ir ­
riterande 
2,6-Diklorbensoylk ­
lorid 4659-45-4 Acylhalid Vätska Kategori 2A Icke-frätande/Icke 
kraftigt irriterande 
Etyl-2-metylacetoace ­
tat 609-14-3 Keton, ester Vätska Kategori 2B Icke-frätande/Icke 
kraftigt irriterande 
Ammoniumnitrat 6484-52-2 Oorganiskt salt Fast ämne Kategori 2A Icke-frätande/Icke 
kraftigt irriterande  ▼M2 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 705
 
Kemikalie CASRN Kemisk klass (  1 ) Fysikalisk form  In vivo - 
klassificering (  2 ) In vitro -klassificering (  3 ) 
Glycerol 56-81-5 Alkohol Vätska Ingen märkning Icke-frätande/Icke 
kraftigt irriterande 
n-hexan 110-54-3 Kolväte 
(acykliskt) Vätska Ingen märkning Icke-frätande/Icke 
kraftigt irriterande  
Förkortningar: CASRN = Chemical Abstracts Service Registry Number 
( 1 ) De kemiska klasserna tilldelades vart och ett testämne med användning av ett standardsystem baserat på klassificeringssysteme t 
National Library of Medicine Medical Subject Headings (MeSH) (finns på http//www.nlm.nih.gov/mesh). 
( 2 ) På grundval av  in vivo -test på kaninögon (OECD TG 405) och med användning av FN GHS (3) (7). 
( 3 ) På grundval av resultat i BCOP och ICE.  ▼M2 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 706
 
Tillägg 3  
Superfusionsapparat och ögonklämmor för ICE-testmetoden  
(Se Burton m.fl. (17) för ytterligare allmänna beskrivningar av 
superfusionsapparat och ögonklämma)
  ▼M2 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 707
 
B.49.  MIKRONUKLEUSTEST AV DÄGGDJURSCELLER  IN VITRO  
INLEDNING 
1. Mikronukleustest  in vitro  (MNvit) är ett genotoxicitetstest för att upptäcka 
mikrokärnor i cytoplasmat i interfasceller. Mikrokärnor kan härröra från 
acentriska kromosomfragment (dvs. en centromer saknas) eller från hela 
kromosomer som inte kan migrera till polerna under det anafasa steget av celldelningen. Genom testet upptäcks aktiviteten hos klastogena och aneu ­
gena kemikalier (ämnen och blandningar) (1) (2) i celler som har genomgått 
celldelning under eller efter exponering för testämnet. Denna testmetod ger 
möjlighet att använda protokoll med och utan aktinpolymeriseringsinhibitorn cytokalasin B (cytoB). Tillsättning av cytoB före mitosen gör det möjligt att identifiera och selektivt analysera frekvensen mikrokärnor i celler som har 
slutfört en mitos eftersom sådana celler är binukleära (3) (4). Denna test ­
metod gör det också möjligt att använda protokoll utan blockering av cy ­
tokines, förutsatt att det finns belägg för att den analyserade cellpopulatio ­
nen har genomgått mitos. 
2. Utöver MNvit-metoden för att identifiera kemikalier (ämnen och blandning ­
ar) som inducerar mikrokärnor kan man även använda blockering av cyto ­
kines, immunokemisk märkning av kinetochorer eller hybridisering med 
centromeriska/telomeriska prober (FISH-teknik, Fluorescens  In Situ  Hybri­
disation) för att få information om mekanismerna för kromosomskador och bildningen av mikrokärnor (5) (6) (7) (8) (9) (10) (11) (12) (13) (14) (15) (16). Märknings- och hybridiseringsteknik kan användas när det förekommer 
ökad bildning av mikrokärnor och man vill slå fast om ökningen är resul ­
tatet av klastogena och/eller aneugena händelser. 
3. Mikrokärnorna representerar skador som har förmedlats till dotterceller, me ­
dan kromosomavvikelser som detekteras i metafasceller inte alltid förmedlas. 
Eftersom mikrokärnor i interfasceller kan bedömas relativt objektivt, behö ­
ver laboratoriepersonalen endast bestämma huruvida cellerna har genomgått delning eller inte och hur många celler som innehåller mikrokärna. Därför kan detekteringen göras relativt snabbt och analysen kan automatiseras. Då 
kan man detektera tusentals i stället för hundratals celler per behandling, 
vilket ökar försökets tyngd. Eftersom mikrokärnor kan uppstå från isolerade kromosomer finns det också möjlighet att detektera aneuploidiframkallande 
ämnen som är svåra att undersöka genom konventionella kromosomavvikel ­
setest, t.ex. OECD:s testriktlinje 473 (kapitel B.10 i denna bilaga) (17). MNvit-metoden ger dock inte möjlighet att utan särskilda tekniker såsom FISH enligt beskrivningen i punkt 2 skilja mellan kemikalier som inducerar 
polyploidi från sådana kemikalier som inducerar klastogenicitet. 
4. MNvit-metoden är en  in vitro -metod där man i regel använder odlade celler 
från människa eller gnagare. Metoden ger tillgång till en omfattande bas för undersökning av kromosomskadepotentialen  in vitro  eftersom både aneuge ­
ner och klastogener kan upptäckas. 
5. MNvit-metoden är robust och effektiv för ett flertal celltyper, med eller utan 
tillsats av cytoB. Det finns omfattande data som stöd för att MNvit-metoden är giltig för ett flertal gnagarcellinjer (CHO, V79, CHL/IU och L5178Y) och 
lymfocyter från människa (18) (19) (20) (21) (22) (23) (24) (25) (26) (27) 
(28) (29) (30) (31). Dessa data kommer bland annat från internationella valideringsstudier samordnade av Société Française de Toxicologie Génétique (SFTG) (18) (19) (20) (21) (22) och rapporter från International 
Workshop on Genotoxicity Testing (4) (16). Tillgängliga data har 
också omvaliderats i en retrospektiv sammanvägd (weight-of-evidence)
 ▼M3 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 708
 
valideringsstudie vid Europiska centret för bestämning av alternativa 
metoder (ECVAM), och testmetoden har erkänts som vetenskapligt giltig 
av ECVAM:s vetenskapliga rådgivande kommitté (ESAC) (32) (33) (34). Man har beskrivit användningen av TK6 lymfoblastoidceller från människa (35), HepG2-celler (36) (37) och embryoceller från syrisk hamster (38), 
även om de inte har använts i valideringsstudier.
 
DEFINITIONER 
6. Definitioner av begreppen finns i tillägg 1.  
INLEDANDE ÖVERVÄGANDEN 
7. För testning  in vitro  krävs i regel ett exogent system för metabolisk aktive ­
ring, om cellerna inte är metaboliskt kompetenta i fråga om de ämnen som 
testas. Det exogena metaboliska aktiveringssystemet efterliknar inte helt 
förhållandena  in vivo . Man bör också se till att undvika sådana förhållanden 
som leder till artefaktiska positiva resultat som inte återspeglar den verkliga mutageniciteten och kan ha sin orsak i faktorer såsom markerade ändringar 
av pH eller osmolalitet eller hög cytotoxicitet (39) (40) (41). Om testkemi ­
kalien orsakar ändring av pH i mediet vid tillsättningstidpunkten bör pH justeras, företrädesvis genom buffring av stamlösningen så att alla volymer hålls lika stora vid alla testkoncentrationer och för alla kontroller. 
8. För analysen av induktion av mikrokärnor är det av central betydelse att 
mitos har inträffat i både de behandlade och obehandlade odlingarna. Det mest informativa stadiet för detektering av mikrokärnor är när cellerna har slutfört en mitos under eller efter behandling med testämnet.
 
PRINCIP FÖR TESTMETODEN 
9. Cellodlingar från människa eller däggdjur exponeras för testämnet både med 
och utan exogent metaboliskt aktiveringssystem, utom om de celler som används har tillräcklig metaboliserande kapacitet. Parallella kontroller med lösningsmedel/vehikel och positiva kontrollkemikalier ska ingå i alla test. 
10. Under eller efter exponering för testämnet odlas cellerna tillräckligt länge för 
att kromosomskador eller spindelfiberskador ska leda till att mikrokärnor 
bildas i interfascellerna. För induktion av aneuploidi bör testämnet i regel finnas närvarande under mitosen. Interfascellerna skördas och färgas in och närvaron av mikrokärnor analyseras. Idealiskt sett bör man för detekteringen 
av mikrokärnor endast använda celler som har slutfört mitosen under ex ­
poneringen för testämnet eller under perioden efter exponeringen, om en sådan används. I odlingar som har behandlats med en cytokinesinhibitor uppnås detta genom att endast analysera binukleära celler. Om blockering 
av cytokines inte används är det viktigt att påvisa att de analyserade cellerna 
sannolikt har genomgått celldelning under eller efter exponeringen för tes ­
tämnet. Oavsett protokoll är det viktigt att påvisa att cellproliferation har skett både i kontrollodlingarna och de behandlade odlingarna, och omfatt ­
ningen av testämnesinducerad cytotoxicitet eller cytostas ska bedömas i de 
odlingar (eller parallella odlingar) som är föremål för analys av mikrokärnor.
 ▼M3 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 709
 
TESTBESKRIVNING  
Förberedelser  
11. Man kan använda odlade primära perifera blodlymfocyter från människa (5) 
(19) (42) (43) och celler från ett antal gnagarcellinjer såsom CHO, V79, 
CHL/IU och L5178Y (18) (19) (20) (21) (22) (25) (26) (27) (28) (30). Användning av andra cellinjer och celltyper bör motiveras på grundval av deras påvisade prestanda med denna metod, enligt det som anges i avsnittet 
om kriterier för godkännande. Eftersom bakgrundsförekomsten av mikrokär ­
nor påverkar försökets känslighet, rekommenderas att man använder cell ­
typer med en låg stabil bakgrundsförekomst av mikrokärnbildning. 
12. De humana perifera blodlymfocyterna ska tas från unga (cirka 18–35 år) 
rökfria individer utan tidigare känd exponering för genotoxiska kemikalier 
eller strålning. Om celler från fler än en givare poolas för användning bör 
antalet givare anges. Förekomsten av mikrokärnor ökar med åldern och denna trend är mera markerad hos kvinnor än hos män (44), vilket bör beaktas när man väljer celler för poolning.
 
Medier och odlingsbetingelser 
13. Lämpliga odlingsmedier och inkubationsförhållanden (odlingskärl, CO  2 -halt, 
temperatur och luftfuktighet) bör väljas för odlingarna. Etablerade cellinjer 
och stammar bör rutinmässigt kontrolleras med avseende på det modala kromosomantalets stabilitet och frånvaro av kontaminerad mykoplasma, och får inte användas om kontamination har skett eller om det modala 
kromosomantalet har ändrats. Den normala cellcykeltiden vid de odlings ­
betingelser som används i laboratoriet bör vara känd. Om blockering av cytokines används bör koncentrationen av cytokinesinhibitor vara optimerad för den berörda celltypen och bör även ha påvisats kunna ge en god skörd 
av binukleära celler för analys.
 
Beredning av odlingarna 
14. Etablerade cellinjer och stammar: celler dras upp från stamkulturer, inoku ­
leras i ett odlingsmedium vars densitet är sådan att det inte sker samman ­
växning i enkelskiktsodlingar och att suspensionsodlingar inte når för hög densitet före skörden, och inkuberas vid 37 °C. 
15. Lymfocyter: helblod behandlat med en antikoagulant (t.ex. heparin) eller 
separerade lymfocyter odlas i ett medium som innehåller en mitogen (t.ex. 
fytohemaglutinin) före exponering för testämnet och cytoB.
 
Metabolisk aktivering 
16. Exogena metaboliserande system bör användas när cellerna inte har tillräck ­
lig endogen metabolisk kapacitet. Det mest använda systemet är en kofak ­
torstödd post-mitokondriell fraktion (S9) beredd ur lever från gnagare som behandlats med enzyminducerande ämnen såsom Aroclor 1254 (45) (46) 
eller en kombination av fenobarbiton och β-naftoflavon (46) (47) (48) (49). 
Den senare kombinationen bryter inte mot Stockholmkonventionen om lång ­
livade organiska föroreningar (50) eller förordning (EG) nr 850/2004 om långlivade organiska föroreningar (66) och har visat sig vara lika effektiv 
som Aroclor 1254 när det gäller att inducera monooxygenaser (”mixed- 
function oxidases”) (46) (47) (48) (49). S9-fraktionen används typiskt i koncentrationer mellan 1–10 % (volym/volym) i det slutliga testmediet. Förhållandena i ett system för metabolisk aktivering kan bero på vilken 
klass av kemikalie som testas och i vissa fall kan det vara lämpligt att 
använda mer än en S9-koncentration.
 ▼M3 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 710
 
17. Genetiskt framställda cellinjer som uttrycker specifika aktiverande enzymer 
för människa eller gnagare kan eliminera behovet av ett exogent system för 
metabolisk aktivering och kan användas som testceller. I sådana fall bör valet av cellinjer underbyggas vetenskapligt, t.ex. genom monooxygenaser ­
nas relevans för testämnets metabolism (51) och deras respons på kända 
klastogener och aneugener (se avsnittet om kriterier för godkännande). Här 
bör konstateras att de ämnen som testas kanske inte metaboliseras av mo ­
nooxygenaser, och i sådana fall indikerar negativa resultat inte att testämnet inte kan inducera mikrokärnor.
 
Beredning av testämnet 
18. Fasta kemikalier bör lösas upp i eller blandas med lämpliga lösningsmedel 
eller vehiklar och vid behov spädas ut innan cellerna behandlas. Flytande 
kemikalier kan tillsättas direkt till testsystemen och/eller spädas ut före 
behandlingen. Gaser eller flyktiga kemikalier bör testas genom lämpliga modifikationer av standardprotokollen, såsom behandling i slutna kärl (52) (53). Testämnesberedningarna bör vara färska, utom om stabilitetsdata visar 
att lagring kan godkännas.
 
Försöksbetingelser  
Lösningsmedel/vehiklar 
19. Lösningsmedlet/vehikeln får inte reagera med testämnet, leda till att cellerna 
inte överlever eller att S9-aktiviteten inte kan upprätthållas vid den använda 
koncentrationen. Om andra än väletablerade lösningsmedel/vehiklar (t.ex. vatten, cellodlingsmedier, dimetylsulfoxid) används bör detta motiveras med data om deras förenlighet med testämnet och avsaknad av genetisk 
toxicitet. Det rekommenderas att man alltid när det är möjligt överväger 
vattenbaserade lösningsmedel/vehiklar som första alternativ.
 
Användning av cytoB som cytokinesinhibitor 
20. En av de viktigaste faktorerna när det gäller MNvit-metodens resultat är att 
se till att de celler som analyseras har slutfört mitosen under behandlingen eller under eventuell inkubationsperiod efter behandlingen. CytoB är det ämne som oftast används för blockering av cytokines eftersom det hindrar 
aktinbildning och således hindrar separationen av dotterceller efter mitosen 
så att binukleära celler kan bildas (5) (54) (55). Analysen av mikrokärnor kan då begränsas till celler som har genomgått mitos under eller efter behandlingen. Samtidigt kan man mäta testämnets effekt på cellprolifera ­
tionskinetiken. CytoB ska användas som cytokinesinhibitor när humana 
lymfocyter används eftersom cellcykeltiderna varierar mellan odlingar och mellan givare och eftersom inte alla lymfocyter ger respons på fytohemag ­
lutinin. Även andra metoder har använts vid testning av cellinjer för att 
bestämma om de celler som analyseras har delat sig; dessa metoder behand ­
las nedan (se punkt 26). 
21. Laboratoriet bör fastställa lämplig koncentration av cytoB för varje celltyp i 
syfte att nå optimal förekomst av binukleära celler i kontrollodlingarna för 
lösningsmedel/vehikel. Lämplig cytoB-koncentration är i regel 3–6 μg/ml.
 ▼M3 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 711
 
Mätning av cellproliferation och cytotoxicitet och val av exponeringskon ­
centrationer 
22. Vid bestämning av den högsta testämneskoncentrationen ska man undvika 
koncentrationer som kan ge artefaktiska positiva resultat, t.ex. för kraftig cytotoxicitet, utfällning i odlingsmediet och markerade ändringar av pH eller osmolalitet (39) (40) (41). 
23. Cellproliferationen bör mätas för att se till att de behandlade cellerna har 
genomgått mitos under försöket och att behandlingarna görs på lämpliga 
nivåer av cytotoxicitet (se punkt 29). Om cytoB inte används ska cytotox ­
iciteten bestämmas med och utan metabolisk aktivering i celler som kräver metabolisk aktivering, med användning av den relativa ökningen av antalet celler eller relativ populationsfördubbling (se tillägg 2 för formler). När 
cytoB används kan cytotoxiciteten bestämmas med användning av replike ­
ringsindex (se tillägg 2 för formel). 
24. Behandling av odlingarna med cytoB och mätning av de relativa förekoms ­
terna av mononukleära, binukleära och multinukleära celler i odlingen är en exakt metod för kvantifiering av effekten på cellproliferationen och behand ­
lingens cytotoxiska eller cytostatiska aktivitet (5) och säkerställer att endast 
celler som har delat sig under eller efter behandlingen analyseras. 
25. I försök där cytoB används kan cytostas/cytotoxicitet kvantifieras genom att 
bestämma proliferationsindex vid cytokinesinhibering (Cytokinesis-Block 
Proliferation Index, CBPI) (5) (26) (56) eller härledas från replikeringsindex (RI) från minst 500 celler per odling (se tillägg 2 för formler). När cytoB används för att bedöma cellproliferation bör CBPI eller 
RI bestämmas på grundval av minst 500 celler per odling. Dessa åtgärder 
och andra kan användas för att uppskatta cytotoxiciteten genom jämförelse av värden för behandlade odlingar och kontrollodlingar. Bedömning av andra markörer för cytotoxicitet (t.ex. sammanväxning, cellantal, apoptos, 
nekros, antalet metafaser) kan ge värdefull information. 
26. I studier utan cytoB är det nödvändigt att påvisa att de celler i odlingen som 
analyseras har genomgått delning under eller efter behandling med testäm ­
net. Annars kan man få falsk negativ respons. Till de metoder som har använts för att se till att cellerna som analyseras har delat sig hör tillsättning och därpå följande detektering av bromodeoxiuridin (BrdU) för att identi ­
fiera celler som har delat sig (57), bildning av kloner när celler från per ­
manenta cellinjer behandlas och analyseras  in situ  på ett objektglas 
(proliferationsindex (PI)) (25) (26) (27) (28) eller mätning av relativ populationsfördubbling (RPD) eller relativ ökning av celltal (RICC) eller 
andra prövade metoder (16) (56) (58) (59) (se tillägg 2 för formler). Be ­
dömning av andra markörer för cytotoxicitet eller cytostas (t.ex. samman ­
växning, celltal, apoptos, nekros, antal metafaser) kan ge värdefull infor ­
mation. 
27. Minst tre analyserbara testkoncentrationer bör utvärderas. För att uppnå detta 
kan det vara nödvändigt att genomföra försöket med ett större antal nära 
varandra liggande koncentrationer och analysera bildningen av mikrokärnor 
i de koncentrationer som ger en lämplig cytotoxicitetsskala. En alternativ strategi är att utföra ett preliminärt cytotoxicitetstest för att få ett snävare intervall för det definitiva testet. 
28. Den högsta koncentrationen ska vara avsedd att ge en cytotoxicitet på 
55 ± 5 %. Högre nivåer kan inducera kromosomskada som en bieffekt av cytotoxicitet (60). När det uppstår cytotoxicitet ska de valda testkoncent ­
rationerna täcka en skala som sträcker sig från den koncentration som ger 
55 ± 5 % cytotoxicitet till den som ger liten eller ingen cytotoxicitet.
 ▼M3 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 712
 
29. Om ingen cytotoxicitet eller utfällning observeras ska de högsta testkoncent ­
rationerna motsvara 0,01 M, 5 mg/ml eller 5 μl/ml, enligt det som är lägst. 
De koncentrationer som väljs för analys ska i regel vara separerade med högst 10. För testämnen som har en brant koncentration-responskurva kan det vara nödvändigt att använda närmare liggande testämneskoncentrationer 
så att odlingarna i intervallen för moderat och låg toxicitet också blir ana ­
lyserade. 
30. Om lösligheten är en begränsande faktor ska den högsta koncentrationen, 
förutsatt att denna inte begränsas av cytotoxicitet, vara den lägsta koncent ­
ration vid vilken minimal utfällning är synlig i odlingarna, förutsatt att 
analysen inte störs. Utvärdering av utfällning bör göras med metoder som 
ljusmikroskopi med detektering av utfällning som består eller uppstår under odlingen (vid slutet av behandlingen).
 
Kontrollgrupper 
31. Parallella positiva och negativa kontroller (lösningsmedel eller vehikel), 
både med och utan metabolisk aktivering, bör inkluderas i varje försök. 
32. Positiva kontroller behövs för att påvisa cellernas och testprotokollets för ­
måga att identifiera klastogener och aneugener och att bekräfta S9-prepara ­
tets metaboliska förmåga. För den positiva kontrollen bör man använda 
kända inducerare av mikrokärnbildning vid koncentrationer som förväntas 
ge små men reproducerbara ökningar över bakgrundsnivån och påvisa test ­
systemets känslighet. Koncentrationerna för de positiva kontrollerna bör väljas på ett sådant sätt att effekterna är tydliga men inte omedelbart avslöjar 
de kodade objektglasens identitet för den som gör avläsningarna. 
33. En klastogen som kräver metabolisk aktivering (t.ex. cyklofosfamid, ben ­
so(a)pyren) bör användas för att påvisa den metaboliska förmågan och test ­
systemets förmåga att detektera klastogener. Om det är motiverat kan andra 
positiva kontroller användas. Eftersom vissa positiva kontroller som kräver 
metabolisk aktivering i vissa behandlingsförhållanden eller för vissa cellinjer kan vara aktiva utan exogen metabolisk aktivering, bör behovet av metabo ­
lisk aktivering och aktiviteten hos S9-preparaten testas i de valda cellinjerna 
och vid de valda koncentrationerna. 
34. För närvarande känner man inte till några aneugener som kräver metabolisk 
aktivering för sin genotoxiska aktivitet (16). Positiva kontroller som för närvarande är godkända för aneugen aktivitet är t.ex. kolchicin och vinblas ­
tin. Andra kemikalier kan användas om de endast eller primärt inducerar 
mikrokärnor genom aneugen aktivitet. För att det inte ska behövas två positiva kontroller (för klastogenicitet och aneugenicitet) utan metabolisk aktivering, kan aneugenicitetskontrollen tjäna som positiv kontroll utan 
S9, och klastogenicitetskontrollen kan användas för att testa lämpligheten 
för det system som används för metabolisk aktivering. De positiva kont ­
rollerna för klastogenicitet och aneugenicitet bör användas för celler som inte kräver S9. Förslag på positiva kontroller finns i tillägg 3. 
35. Användning av positiva kontroller relaterade till kemisk klass kan också 
övervägas när lämpliga kemikalier finns att tillgå. Alla positiva kontroller 
bör vara lämpliga för celltypen och aktiveringsförhållandena.
 ▼M3 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 713
 
36. Lösningsmedels-/vehikelkontroller bör ingå för varje skördningstidpunkt. 
Dessutom bör man använda obehandlade negativa kontroller (utan lösnings ­
medel/vehikel), utom om det finns offentliggjorda data eller laboratoriet har historiska data som påvisar att det valda lösningsmedlet inte inducerar ge ­
notoxiska eller andra skadliga effekter vid de koncentrationer som används.
 
TESTFÖRFARANDE  
Behandlingsschema  
37. För att maximera sannolikheten för att detektera en aneugen eller klastogen 
som agerar i ett visst skede av cellcykeln är det viktigt att tillräckligt antal celler behandlas med testämnet under cellcykelns alla skeden. Behandlings ­
schemat för cellinjer och primära cellodlingar kan därför avvika något från 
behandlingsschemat för lymfocyter som kräver mitogen stimulering för att 
inleda sin cellcykel; dessa behandlas i punkterna 41–43 (16). 
38. Teoretiska överväganden och offentliggjorda data (18) tyder på att de flesta 
aneugener och klastogener detekteras med en kortvarig behandlingsperiod på 3–6 timmar med och utan tillsats av S9, åtföljd av borttagning av testämnet 
och en tillväxtperiod på 1,5–2,0 cellcykler (6). Cellerna skördas vid en 
tidpunkt som motsvarar cirka 1,5–2,0 gånger den normala (dvs. obehand ­
lade) cellcykelns längd efter att behandlingen inletts eller vid avslutad be ­
handling (se tabell 1). Provtagnings- eller skördningstidpunkterna kan sena ­
reläggas om det är känt eller man misstänker att testämnet påverkar cell ­
cykellängden (t.ex. vid testning av nukleosidanaloger). 
39. Eftersom S9-preparat är potentiellt cytotoxiska för odlade däggdjursceller 
används en förlängd exponeringsbehandling på 1,5–2,0 gånger normal cell ­
cykel endast när S9 inte ingår. Vid förlängd behandling finns det alternativ 
där man har möjlighet att behandla cellerna med testkemikalie utan eller med cytoB. Dessa alternativ gäller för situationer där det kan finnas tvivel rörande eventuell växelverkan mellan testämnet och cytoB. 
40. Förslag till cellbehandlingsscheman finns i tabell 1. Dessa allmänna behand ­
lingsscheman kan modifieras beroende på testämnets stabilitet eller reakti ­
vitet eller de särskilda tillväxtegenskaper som gäller för de celler som an ­
vänds. Alla behandlingar bör inledas och avslutas medan cellerna är i ex ­
ponentiell tillväxtfas. Dessa scheman presenteras i närmare detalj i punk ­
terna 41–47 nedan.
 
Tabell 1  
Tidpunkter för cellbehandling och skörd när MNvit-metoden används  
Lymfocyter, primära celler och cellinjer be ­
handlade med cytoB + S9 Behandla 3–6 timmar med tillsats av S9, 
avlägsna S9 och behandlingsmedium, tillsätt färskt medium och cytoB, skörda efter 1,5–2,0 normala cellcykler. 
– S9 
Kort exponering Behandla 3–6 timmar, 
avlägsna behandlingsmedium, 
tillsätt färskt medium och cytoB, skörda efter 1,5–2,0 normala cellcykler.
 ▼M3 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 714
 
– S9 
Förlängd exponering  Alternativ A:  Behandla under 1,5–2 normala 
cellcykler med tillsats av cytoB, 
skörda i slutet av exponeringsperioden.  
Alternativ B:  Behandla under 1,5–2,0 normala 
cellcykler, 
avlägsna testämnet, 
tillsätt färskt medium och cytoB, skörda efter 1,5–2,0 normala cellcykler. 
Cellinjer som behandlas utan cytoB 
(samma som de behandlingsscheman som anges ovan utom att cytoB inte tillsätts)
 
Lymfocyter, primära celler och cellinjer med cytoB  
41. För lymfocyter är det effektivast att starta exponeringen för testämnet 44–48 
timmar efter stimulering med fytohemaglutinin, när cykelsynkroniseringen 
har fallit bort (5). I det första försöket behandlas cellerna 3–6 timmar med 
testämnet med och utan tillsats av S9. Behandlingsmediet avlägsnas och ersätts med färskt medium som innehåller cytoB och cellerna skördas efter 1,5–2,0 normala cellcykler. 
42. Om båda de initiala försöken med kort (3–6 timmar) behandling är negativa 
eller tvetydiga görs en efterföljande förlängd exponeringsbehandling utan S9. Det finns två likvärdigt godkända behandlingsalternativ att tillgå. Det 
kan dock vara lämpligare att använda alternativ A för stimulerade lymfocy ­
ter i fall där den exponentiella tillväxten kan minska vid 96 timmar efter stimulering. Likaså ska cellodlingarna inte ha nått sammanväxning vid den slutliga skördningstiden i alternativ B. 
— Alternativ A: Cellerna behandlas med testämnet under 1,5–2,0 normala 
cellcykler och skördas vid behandlingstidens slut. 
— Alternativ B: Cellerna behandlas med testämnet under 1,5–2,0 normala 
cellcykler. Behandlingsmediet avlägsnas och ersätts med färskt medium och cellerna skördas efter ytterligare 1,5–2,0 normala cellcykler. 
43. Primära celler och cellinjer ska behandlas på liknande sätt som lymfocyter ­
na, utom att det inte är nödvändigt att stimulera dem med fytohemaglutinin 
under 44–48 timmar. Andra celler än lymfocyter ska exponeras så att cel ­
lerna vid försökets slut fortfarande är i logfas.
 
Cellinjer utan cytoB  
44. Cellerna behandlas 3–6 timmar med och utan tillsats av S9. Behandlings ­
mediet avlägsnas och ersätts med färskt medium och cellerna skördas efter 
1,5–2,0 normala cellcykler.  ▼M3 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 715
 
45. Om båda de initiala försöken med kort (3–6 timmar) behandling är negativa 
eller tvetydiga görs en efterföljande förlängd exponeringsbehandling (utan 
S9). Det finns två likvärdigt godkända behandlingsalternativ att tillgå. 
— Alternativ A: Cellerna behandlas med testämnet under 1,5–2,0 normala 
cellcykler och skördas vid behandlingstidens slut. 
— Alternativ B: Cellerna behandlas med testämnet under 1,5–2,0 normala 
cellcykler. Behandlingsmediet avlägsnas och ersätts med färskt medium och cellerna skördas efter ytterligare 1,5–2,0 normala cellcykler. 
46. I enkelskikt kan det finnas mitotiska celler (som identifieras genom att de är 
runda och lösgör sig från ytan) i slutet av behandlingen på 3–6 timmar. Eftersom dessa mitotiska celler enkelt lösgörs, kan de förloras när mediet som innehåller testämnet avlägsnas. Man bör vara uppmärksam på att samla 
in dem när odlingarna tvättas och återbörda dem till odlingarna, för att 
undvika förlust av celler som undergår mitos och är utsatta för risk för mikrokärnor vid tidpunkten för skörd.
 
Antal odlingar  
47. Dubbla odlingar bör användas för varje testämneskoncentration och för lös ­
ningsmedels-/vehikelodlingarna och de negativa kontrollerna. I fall där la ­
boratoriets historiska data kan påvisa minimala variationer mellan dubbla odlingar kan det vara godtagbart att endast använda en odling. I så fall 
rekommenderas analys av ett högre antal koncentrationer.
 
Skörd av celler och beredning av objektglas  
48. Varje odling skördas och hanteras separat. Förberedningen av cellerna kan 
inbegripa hypoton behandling, men detta steg är inte nödvändigt om till ­
räcklig cellspridning erhålls på annat sätt. Olika tekniker kan användas för 
preparering av objektglasen förutsatt att man får cellpreparat av hög kvalitet för analysen. Cellernas cytoplasma bör behållas för att ge möjlighet att detektera mikrokärnor och (vid metoden med blockering av cytokines) till ­
förlitlig identifiering av binukleära celler. 
49. Objektglasen kan färgas med olika metoder, såsom Giemsa eller fluoresce ­
rande DNA-specifika färgämnen (59). Användningen av ett DNA-specifikt färgämne (t.ex. akridinorange (61) eller Hoechst 33258 plus pyronin-Y (62)) 
kan eliminera några av de artefakter som är associerade med färgämnen som 
inte är DNA-specifika. Anti-kinetochor-antikroppar, FISH-teknik med pan ­
centromera DNA-prober eller primad  in situ -märkning med pancentromer ­
specifik primer, tillsammans med lämplig DNA-motfärgning kan användas 
för att identifiera innehållet (kromosom/kromosomfragment) av mikrokärnor 
om man är intresserad av mekanismer för hur de bildas (15) (16). Andra metoder för differentiering mellan klastogener och aneugener kan användas 
om de har visat sig vara effektiva.
 
Analys  
50. Alla objektglas, inklusive glasen från lösningsmedels-/vehikelkontrollerna 
och de positiva och negativa kontrollerna, bör ges en oberoende kodning före analysen med mikroskop. Alternativt kan kodade prover analyseras med 
användning av ett validerat och automatiskt system för flödescytometri eller 
bildanalys.
 ▼M3 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 716
 
51. I cytoB-behandlade odlingar bör förekomsten av mikrokärnor analyseras i 
minst 2 000 binukleära celler per koncentration (minst 1 000 binukleära 
celler per odling, två odlingar per koncentration). Om enkla odlingar an ­
vänds bör minst 2 000 binukleära celler per koncentration analyseras ur odlingen. Om betydligt mindre antal än 1 000 binukleära celler per odling, 
eller 2 000 om en enkel odling används, finns att tillgå för analys för varje 
koncentration och en väsentlig ökning av mikrokärnor inte upptäcks, bör testet upprepas med användning av flera celler eller vid mindre toxiska koncentrationer, enligt det som är lämpligt. Man bör se upp med att inte 
analysera binukleära celler med oregelbunden form eller celler där de två 
kärnorna avviker betydligt i storlek, inte heller ska binukleära celler för ­
växlas med dåligt spridda multinukleära celler. Celler som innehåller fler än två huvudkärnor ska inte analyseras för mikrokärnor, eftersom bakgrunds ­
förekomsten av mikrokärnor kan vara högre i dessa celler (63) (64). Analys 
av mononukleära celler kan godtas om testämnet påvisas störa cytoB-aktiviteten. 
52. För cellinjer som testas utan cytoB-behandling bör mikrokärnorna analyseras 
med minst 2 000 celler per koncentration (minst 1 000 celler per odling, två 
odlingar per koncentration). Om endast en odling per koncentration används 
bör minst 2 000 celler analyseras från odlingen. 
53. När cytoB används bör proliferationsindex vid cytokinesinhibering (CBPI) 
eller replikeringsindex (RI) bestämmas för bedömning av cellproliferationen 
(se tillägg 2) med användning av minst 500 celler per odling. När behandlingar 
görs utan tillsats av cytoB är det väsentligt att belägg ges för att de celler som analyseras har proliferat, enligt det som beskrivs i punkterna 24–27.
 
Kriterier för godkännande  
54. Ett laboratorium som vill använda MNvit-testning enligt beskrivningen i 
denna testmetod bör påvisa sin förmåga att på ett tillförlitligt och exakt 
sätt detektera kemikalier med känd aneugen och klastogen aktivitet, med och utan metabolisk aktivering, såväl som kända negativa kemikalier, med användning av referenskemikalierna enligt tillägg 3. För att påvisa sin för ­
måga att genomföra testmetoden korrekt bör laboratoriet tillhandahålla be ­
lägg för att de celler som analyseras för bildning av mikrokärnor har slutfört en kärndelning, om testningen genomförs utan användning av cytoB. 
55. De kemikalier som förtecknas i tillägg 3 rekommenderas som referenskemi ­
kalier. Ersättande eller ytterligare kemikalier kan ingå om deras aktivitet är 
känd och om de inducerar mikrokärnor enligt samma mekanismer och om de kan påvisas vara relevanta för de kemikalier som testas med MNvit-förfarandet. Motiveringen kan innehålla en valideringsstudie där 
man använt ett brett urval olika ämnen eller fokuserat på ett smalare 
spektrum baserat på testämnets kemiska klass eller mekanismen för den skada som undersöks. 
56. Lösningsmedels-/vehikelkontrollen och obehandlade odlingar bör ge repro ­
ducerbart låga och enhetliga förekomster av mikrokärnor (typiskt 5–25 mik ­
rokärnor per 1 000 celler för de celltyper som anges i punkt 11). Andra cell ­
typer kan ha annorlunda responsintervall, vilka bör bestämmas när celltyperna valideras för användning i ett MNvit-förfarande. Data från negativ kontroll, lösningsmedelskontroll och positiv kontroll bör användas för att etablera his ­
toriska kontrollintervall. Dessa värden bör användas för att bedöma den paral ­
lella negativa eller positiva kontrollens lämplighet för ett försök.
 ▼M3 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 717
 
57. Om det föreslås mindre ändringar av protokollet (t.ex. automatiska i stället 
för manuella analystekniker eller användning av en ny celltyp), bör ändring ­
ens effektivitet påvisas innan det modifierade protokollet kan anses vara godkänt för användning. När effektiviteten påvisas måste man också kunna visa att de centrala mekanismerna för kromosombrott och kromosomökning 
och -förlust kan detekteras och att lämpliga positiva och negativa resultat 
kan nås för klassen för det enskilda ämne eller för det breda urval av ämnen som ska testas.
 
DATA OCH RAPPORTERING  
Behandling av resultaten  
58. Om blockering av cytokines används ska endast förekomsten av binukleära 
celler med mikrokärnor (oavsett antalet mikrokärnor per cell) användas för 
utvärderingen av inducering av mikrokärnor. Analys av antalet celler med en, två eller flera mikrokärnor kan ge användbar information men är inte obligatorisk. 
59. Parallella mått på cytotoxicitet och/eller cytostas för alla behandlade od ­
lingar och kontrollodlingar med lösningsmedel/vehikel bör bestämmas (58). Proliferationsindex vid cytokinesinhibering (CBPI) eller replikeringsindex (RI) bör beräknas för alla behandlade odlingar och kont ­
rollodlingar som mått på cellcykelfördröjning när blockering av cytokines 
används. Om cytoB inte tillsätts bör relativ populationsfördubbling (RPD) eller relativ ökning av celltal (RICC) eller proliferationsindex (PI) användas (se tillägg 2). 
60. Data bör anges per enskild odling. Dessutom bör alla data sammanfattas i 
tabellform. 
61. Att kemikalier inducerar mikrokärnor i MNvit-metoden kan bero på att de 
inducerar kromosombrott, kromosomförlust eller en kombination av dessa två. Ytterligare analys med användning av anti-kinetochor-antikroppar, cent ­
romerspecifika  in situ -prober eller andra metoder kan göras för att avgöra 
huruvida mekanismen för inducering av mikrokärnor beror på klastogen och/eller aneugen aktivitet.
 
Utvärdering och tolkning av resultaten  
62. Det finns inget krav på verifiering genom ytterligare testning av ett tydligt 
positivt eller negativt svar. Tvetydiga resultat kan förtydligas genom analys av ytterligare 1 000 celler, som tas från alla odlingar för att bibehålla ka ­
raktären av blindförsök. Om detta inte klargör resultatet krävs ytterligare 
testning. Vid uppföljningstestning bör man överväga att modifiera under ­
sökningsparametrarna så att man får en bredare eller snävare skala av för ­
hållanden, enligt det som är lämpligt. Till de undersökningsparametrar som kanske måste ändras ingår koncentrationsintervall, tidpunkten för behandling 
och skörd av cellerna och/eller betingelserna för metabolisk aktivering. 
63. Det finns ett flertal kriterier för att fastställa ett positivt resultat, t.ex. en 
koncentrationsrelaterad ökning eller en statistiskt signifikant reproducerbar ökning av antalet celler som innehåller mikrokärnor. Man bör i första hand överväga resultatets biologiska relevans. Överväganden om huruvida de 
observerade värdena ligger inom eller utanför det historiska kontrollinterval ­
let kan ge vägledning för utvärderingen av svarets biologiska betydelse. Lämpliga statistiska metoder kan vara till hjälp vid utvärdering av testresul ­
taten (65). Resultaten från statistisk testning bör dock bedömas utifrån 
dos-responsförhållandet. Likaså bör reproducerbarhet och historiska data 
beaktas.
 ▼M3 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 718
 
64. Även om de flesta försök ger tydligt positiva eller negativa resultat, kan 
datauppsättningen i vissa fall inte ge möjlighet att göra en definitiv bedöm ­
ning av testämnets aktivitet. Sådana tvetydiga eller tveksamma resultat kan uppstå oavsett hur många gånger försöket upprepas. 
65. Positiva resultat från MNvit-testning tyder på att testämnet inducerar kro ­
mosombrott eller kromosomförlust i odlade däggdjursceller. Negativa resul ­
tat indikerar att testämnet under de gällande försöksbetingelserna inte indu ­
cerar kromosombrott och/eller kromosomökning eller -förlust i de odlade däggdjurscellerna.
 
Testrapport  
66. Testrapporten ska innehålla minst följande uppgifter i den mån de är rele ­
vanta:  
Testkemikalie  
— Identifieringsdata och CAS-nummer och EG-nummer. — Fysikalisk form och renhetsgrad. — Fysikalisk-kemiska egenskaper av betydelse för studien. — Testkemikaliens reaktionsbenägenhet med lösningsmedel/vehikel eller 
cellodlingsmedier.  
Lösningsmedel/vehikel  
— Motivering för valet av lösningsmedel/vehikel. — Testämnets stabilitet och löslighet i lösningsmedlet/vehikeln.  
Celler  
— Cellernas typ och källa. — Den använda celltypens lämplighet. — Frånvaro av mykoplasma, om detta är tillämpligt. — Uppgifter om cellcykelns längd, fördubblingstid eller proliferationsindex. 
— Om lymfocyter används, blodgivarnas kön, ålder och antal, om tillämpligt. 
— Om lymfocyter används, uppgift om huruvida helblod eller separata 
lymfocyter exponeras. 
— Antal passager, om detta är tillämpligt. — Metoder för underhållet av cellodlingar, om detta är tillämpligt. — Det modala antalet kromosomer. — Normal cellcykellängd (negativ kontroll).  
Testbetingelser  
— Identitet för cytokinesinhiberande ämne (t.ex. cytoB), om sådant an ­
vänds, och ämnets koncentration samt cellexponeringens varaktighet 
— Motivering för val av koncentrationer och antalet odlingar, även data om 
cytotoxicitet och löslighetsbegränsningar i den mån dessa data finns att 
tillgå. 
— Mediesammansättning, CO
 2 -koncentration, om tillämpligt. 
— Testämneskoncentrationer.  ▼M3 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 719
 
— Koncentration (och/eller volym) för vehikel och tillsatt testämne. 
— Inkubationstemperatur och tid. — Behandlingens varaktighet. 
— Tidpunkten för skörd efter behandlingen. 
— Celldensitet vid inokulering, om tillämpligt. — Typ och sammansättning hos det system som används för metabolisk 
aktivering, även kriterier för godkännande. 
— Positiva kontrollkemikalier och negativa kontroller. 
— Metoder för preparering av objektglas och färgningsteknik. — Kriterier för identifiering av mikrokärnor. 
— Antalet analyserade celler. 
— Metoder för mätning av cytotoxicitet. — All tilläggsinformation som är relevant rörande cytotoxicitet. 
— Kriterier för att bedöma om testresultaten är positiva, negativa eller 
tvetydiga. 
— Metod(er) för statistisk analys. 
— Metoder, såsom användning av kinetochor-antikropp, för att fastställa 
om mikrokärnorna innehåller hela eller fragmenterade mikrokärnor, om 
tillämpligt.  
Resultat  
— Mätningar av cytotoxicitet, t.ex. proliferationsindex (CBPI) eller 
replikeringsindex (RI) när cytokinesinhibering används, relativ ökning av celltal (RICC), relativ populationsfördubbling (RPD) eller 
proliferationsindex (PI) när cytokinesinhibering inte används, andra ob ­
servationer om tillämpligt, t.ex. cellsammanväxning, apoptos, nekros, antalet metafaser, frekvensen binukleära celler. 
— Tecken på utfällning. 
— Data om behandlingsmediets pH och osmolalitet, om uppmätt. 
— Definition av godkända celler för analys. — Fördelningen av mono-, bi- och multinukleära celler i fall där blockering 
av cytokines har använts. 
— Antalet celler med mikrokärnor angivet separat för varje behandlad od ­
ling och kontrollodling och, där det är lämpligt, angivelse av huruvida det gäller binukleära eller mononukleära celler. 
— Koncentration-responsförhållande, där det är möjligt. 
— Kemiska data om parallella negativa (lösningsmedel/vehikel) och posi ­
tiva kontroller (koncentrationer och lösningsmedel). 
— Historiska data om negativa (lösningsmedel/vehikel) och positiva kont ­
roller, med intervall, medelvärden och standardavvikelser samt tillförlit ­
lighetsintervall (t.ex. 95 %). 
— Statistisk analys, p-värden om sådana finns.  
Diskussion om resultaten 
Slutsatser
 ▼M3 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 720
 
HÄNVISNINGAR 
(1) Kirsch-Volders, M. (1997), Towards a validation of the micronucleus test.  
Mutation Res. , 392, 1–4. 
(2) Parry, J.M. och Sors, A. (1993), The detection and assessment of the 
aneugenic potential of environmental chemicals: the European Community 
aneuploidy project,  Mutation Res. , 287, 3–15. 
(3) Fenech, M. och Morley, A.A. (1985), Solutions to the kinetic problem in 
the micronucleus assay,  Cytobios. , 43, 233–246. 
(4) Kirsch-Volders, M., Sofuni, T., Aardema, M., Albertini, S., Eastmond, D., 
Fenech, M., Ishidate, M. Jr, Lorge, E., Norppa, H., Surralles, J., von der Hude, W. och Wakata, A. (2000), Report from the  In Vitro  Micronucleus 
Assay Working Group,  Environ. Mol. Mutagen ., 35, 167–172. 
(5) Fenech, M. (2007), Cytokinesis-block micronucleus cytome assay,  Nature 
Protocols , 2(5), 1084–1104. 
(6) Fenech, M. ochd Morley, A.A. (1986), Cytokinesis-block micronucleus 
method in human lymphocytes: effect of  in-vivo  ageing and low dose 
X-irradiation,  Mutation Res. , 161, 193–198. 
(7) Eastmond, D.A. och Tucker, J.D. (1989), Identification of 
aneuploidy-inducing agents using cytokinesis-blocked human lymphocytes and an antikinetochore antibody,  Environ. Mol. Mutagen. , 13, 34–43. 
(8) Eastmond, D.A. and Pinkel, D. (1990), Detection of aneuploidy and 
aneuploidy-inducing agents in human lymphocytes using fluorescence  
in-situ  hybridisation with chromosome-specific DNA probes,  Mutation Res. , 
234, 9–20. 
(9) Miller, B.M., Zitzelsberger, H.F., Weier, H.U. och Adler, I.D. (1991), Clas ­
sification of micronuclei in murine erythrocytes: immunofluorescent staining using CREST antibodies compared to  in situ  hybridization with biotinylated 
gamma satellite DNA,  Mutagenesis , 6, 297–302. 
(10) Farooqi, Z., Darroudi, F. och Natarajan, A.T. (1993), The use of fluore ­
scence  in-situ  hybridisation for the detection of aneugens in 
cytokinesis-blocked mouse splenocytes,  Mutagenesis , 8, 329–334. 
(11) Migliore, L., Bocciardi, R., Macri, C. och Lo Jacono, F. (1993), Cytoge ­
netic damage induced in human lymphocytes by four vanadium compounds 
and micronucleus analysis by fluorescence  in situ  hybridization with a 
centromeric probe,  Mutation Res. , 319, 205–213. 
(12) Norppa, H., Renzi, L. och Lindholm, C. (1993), Detection of whole chro ­
mosomes in micronuclei of cytokinesis-blocked human lymphocytes by 
antikinetochore staining and  in situ  hybridization,  Mutagenesis , 8, 519–525. 
(13) Eastmond, D.A, Rupa, D.S. och Hasegawa, L.S. (1994), Detection of 
hyperdiploidy and chromosome breakage in interphase human lymphocytes 
following exposure to the benzene metabolite hydroquinone using 
multicolor fluorescence  in situ  hybridization with DNA probes,  Mutation 
Res., 322, 9–20. 
(14) Marshall, R.R., Murphy, M., Kirkland, D.J. och Bentley, K.S. (1996), 
Fluorescence  in situ  hybridisation (FISH) with chromosome-specific 
centromeric probes: a sensitive method to detect aneuploidy,  Mutation Res. , 
372, 233–245. 
(15) Zijno, P., Leopardi, F., Marcon, R. och Crebelli, R. (1996), Analysis of 
chromosome segregation by means of fluorescence  in situ  hybridization: 
application to cytokinesis-blocked human lymphocytes,  Mutation Res.
, 
372, 211–219. 
(16) Kirsch-Volders, M., Sofuni, T., Aardema, M., Albertini, S., Eastmond, D., 
Fenech, M., Ishidate Jr., M., Lorge, E., Norppa, H., Surrallés, J., von der 
Hude, W. och Wakata, A. (2003), Report from the  in vitro  micronucleus 
assay working group.  Mutation Res. , 540, 153–163.  ▼M3 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 721
 
(17) OECD (1997),  In Vitro Mammalian Chromosome Aberration Test , Test 
Guideline No. 473, OECD Guidelines for Testing of Chemicals, OECD, 
Paris. Finns på: www.oecd.org/env/testguidelines 
(18) Lorge, E., Thybaud, V., Aardema, M.J., Oliver, J., Wakata, A., Lorenzon G. 
och Marzin, D. (2006), SFTG International collaborative Study on  in vitro  
micronucleus test. I. General conditions and overall conclusions of the study,  Mutation Res. , 607, 13–36. 
(19) Clare, G., Lorenzon, G., Akhurst, L.C., Marzin, D., van Delft, J., Montero, 
R., Botta, A., Bertens, A., Cinelli, S., Thybaud, V. och Lorge, E. (2006), SFTG International collaborative study on the  in vitro  micronucleus test. II. 
Using human lymphocytes,  Mutation Res. , 607, 37–60. 
(20) Aardema, M.J., Snyder, R.D., Spicer, C., Divi, K., Morita, T., Mauthe, R.J., 
Gibson, D.P., Soelter, S., Curry, P.T., Thybaud, V., Lorenzon, G., Marzin, 
D. och Lorge, E. (2006), SFTG International collaborative study on the  in 
vitro  micronucleus test, III. Using CHO cells,  Mutation Res. , 607, 61–87. 
(21) Wakata, A., Matsuoka, A., Yamakage, K., Yoshida, J., Kubo, K., Kobay ­
ashi, K., Senjyu, N., Itoh, S., Miyajima, H., Hamada, S., Nishida, S., Araki, H., Yamamura, E., Matsui, A., Thybaud, V., Lorenzon, G., Marzin, D. och 
Lorge, E. (2006), SFTG International collaborative study on the  in vitro  
micronucleus test, IV. Using CHO/IU cells,  Mutation Res. , 607, 88–124. 
(22) Oliver, J., Meunier, J.-R., Awogi, T., Elhajouji, A., Ouldelhkim, M.-C., 
Bichet, N., Thybaud, V., Lorenzon, G., Marzin, D. och Lorge, E. (2006), 
SFTG International collaborative study on the  in vitro  micronucleus test, V. 
Using L5178Y cells,  Mutation Res. , 607, 125–152. 
(23) Albertini, S., Miller, B., Chetelat, A.A. and Locher, F. (1997), Detailed data 
on in vitro  MNT och  in vitro  CA: industrial experience,  Mutation Res. , 392, 
187–208. 
(24) Miller, B., Albertini, S., Locher, F., Thybaud, V. och Lorge, E. (1997), 
Comparative evaluation of the  in vitro  micronucleus test and the  in vitro  
chromosome aberration test: industrial experience,  Mutation Res. , 392, 
45–59. 
(25) Miller, B., Potter-Locher, F., Seelbach, A., Stopper, H., Utesch, D. och 
Madle, S. (1998), Evaluation of the  in vitro  micronucleus test as an alter ­
native to the  in vitro  chromosomal aberration assay: position of the GUM 
Working Group on the  in vitro  micronucleus test. Gesellschaft fur 
Umwelt-Mutations-forschung,  Mutation Res. , 410, 81–116. 
(26) Kalweit, S., Utesch, U., von der Hude, W. och Madle, S. (1999), Chem ­
ically induced micronucleus formation in V79 cells – comparison of three 
different test approaches,  Mutation Res.  439, 183–190. 
(27) Kersten, B., Zhang, J., Brendler Schwaab, S.Y., Kasper, P. och Müller, L. 
(1999), The application of the micronucleus test in Chinese hamster V79 
cells to detect drug-induced photogenotoxicity,  Mutation Res.  445, 55–71. 
(28) von der Hude, W., Kalweit, S., Engelhardt, G., McKiernan, S., Kasper, P., 
Slacik-Erben, R., Miltenburger, H.G., Honarvar, N., Fahrig, R., Gorlitz, B., Albertini, S., Kirchner, S., Utesch, D., Potter-Locher, F., Stopper, H. och Madle, S. (2000),  In vitro  micronucleus assay with Chinese hamster V79 
cells - results of a collaborative study with  in situ  exposure to 26 chemical 
substances,  Mutation Res ., 468, 137–163. 
(29) Garriott, M.L., Phelps, J.B. och Hoffman, W.P. (2002), A protocol for the  
in vitro  micronucleus test, I. Contributions to the development of a protocol 
suitable for regulatory submissions from an examination of 16 chemicals with different mechanisms of action and different levels of activity,  
Mutation Res. , 517, 123–134. 
(30) Matsushima, T., Hayashi, M., Matsuoka, A., Ishidate, M. Jr., Miura, K.F., 
Shimizu, H., Suzuki, Y., Morimoto, K., Ogura, H., Mure, K., Koshi, K. och 
Sofuni, T. (1999), Validation study of the  in vitro  micronucleus test in a 
Chinese hamster lung cell line (CHL/IU),  Mutagenesis , 14, 569–580.
 ▼M3 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 722
 
(31) Elhajouji, A., och Lorge, E. (2006), Special Issue: SFTG International 
collaborative study on  in vitro  micronucleus test,  Mutation Res. , 607, 
1–152. 
(32) ECVAM (2006), Statement by the European Centre for the Validation of 
Alternative Methods (ECVAM) Scientific Advisory Committee (ESAC) on 
the scientific validity of the  in vitro  micronucleus test as an alternative to 
the in vitro  chromosome aberration assay for genotoxicity testing. ESAC 
25 th meeting, 16–17 November, 2006, Finns på: http://ecvam.jrc.it/ 
index.htm 
(33) ESAC (2006), ECVAM Scientific Advisory Committee (ESAC) Peer Re ­
view, Retrospective Validation of the  In Vitro  Micronucleus Test, Summary 
and Conclusions of the Peer Review Panel, Finns på: http://ecvam.jrc.it/ index.htm 
(34) Corvi, R., Albertini, S., Hartung, T., Hoffmann, S., Maurici, D., Pfuhler, S, 
van Benthem, J., Vanparys P. (2008), ECVAM Retrospective Validation of  
in vitro  Micronucleus Test (MNT),  Mutagenesis , 23, 271–283. 
(35) Zhang, L.S., Honma, M., Hayashi, M., Suzuki, T., Matsuoka, A. och So ­
funi, T. (1995), A comparative study of TK6 human lymphoblastoid and 
L5178Y mouse lymphoma cell lines in the  in vitro  micronucleus test,  
Mutation Res. , 347, 105–115. 
(36) Ehrlich, V., Darroudi, F., Uhl, M., Steinkellner, S., Zsivkovits, M. och 
Knasmeuller, S. (2002), Fumonisin B
 1 is genotoxic in human derived he ­
patoma (HepG2) cells,  Mutagenesis , 17, 257–260. 
(37) Knasmüller, S., Mersch-Sundermann, V., Kevekordes, S., Darroudi, F., 
Huber, W.W., Hoelzl, C., Bichler, J. och Majer, B.J. (2004), Use of human-derived liver cell lines for the detection of environmental and dietary genotoxicants; current state of knowledge,  Toxicol. , 198, 315–328. 
(38) Gibson, D.P., Brauninger, R., Shaffi, H.S., Kerckaert, G.A., LeBoeuf, R.A., 
Isfort, R.J. och Aardema, M.J. (1997), Induction of micronuclei in Syrian 
hamster embryo cells: comparison to results in the SHE cell transformation 
assay for National Toxicology Program test chemicals,  Mutation Res. , 392, 
61–70. 
(39) Scott, D., Galloway, S.M., Marshall, R.R., Ishidate, M. Jr., Brusick, D., 
Ashby, J. och Myhr, B.C. (1991), International Commission for Protection Against Environmental Mutagens and Carcinogens, Genotoxicity under ex ­
treme culture conditions. A report from ICPEMC Task Group 9,  Mutation 
Res., 257, 147–205. 
(40) Morita, T., Nagaki, T., Fukuda, I. och Okumura, K. (1992), Clastogenicity 
of low pH to various cultured mammalian cells,  Mutation Res. , 268, 
297–305. 
(41) Brusick, D. (1986), Genotoxic effects in cultured mammalian cells produced 
by low pH treatment conditions and increased ion concentrations,  Environ. 
Mutagen ., 8, 789–886. 
(42) Fenech, M. och Morley, A.A. (1985), Measurement of micronuclei in lymp ­
hocytes,  Mutation Res. , 147, 29–36. 
(43) Fenech, M. (1997), The advantages and disadvantages of cytokinesis-blood 
micronucleus method,  Mutation Res. , 392, 11–18. 
(44) Bonassi, S., Fenech, M., Lando, C., Lin, Y.P., Ceppi, M., Chang, W.P., 
Holland, N., Kirsch-Volders, M., Zeiger, E., Ban, S., Barale, R., Bigatti, M.P., Bolognesi, C., Jia, C., Di Giorgio, M., Ferguson, L.R., Fucic, A., Lima, O.G., Hrelia, P., Krishnaja, A.P., Lee, T.K., Migliore, L., Mikhale ­
vich, L., Mirkova, E., Mosesso, P., Muller, W.U., Odagiri, Y., Scarffi, 
M.R., Szabova, E., Vorobtsova, I., Vral, A. och Zijno, A. (2001), HUman MicroNucleus Project: international database comparison for results with the cytokinesis-block micronucleus assay in human lymphocytes, I. Effect of 
laboratory protocol, scoring criteria and host factors on the frequency of 
micronuclei,  Environ. Mol. Mutagen.  37, 31–45.
 ▼M3 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 723
 
(45) Maron, D.M. och Ames, B.N. (1983), Revised methods for the Salmonella 
mutagenicity test,  Mutation Res. , 113, 173–215. 
(46) Ong, T.-m., Mukhtar, M., Wolf, C.R. och Zeiger, E. (1980), Differential 
effects of cytochrome P450-inducers on promutagen activation capabilities and enzymatic activities of S-9 from rat liver,  J. Environ. Pathol. Toxicol. , 
4, 55–65. 
(47) Elliott, B.M., Combes, R.D., Elcombe, C.R., Gatehouse, D.G., Gibson, 
G.G., Mackay, J.M. och Wolf, R.C. (1992), Alternatives to Aroclor 1254- 
induced S9 in  in-vitro  genotoxicity assays.  Mutagenesis , 7, 175–177. 
(48) Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. och Sugimura, T. (1976), A safe 
substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer of Metabolic Acti ­
vation Systems,  In: de Serres, F.J., Fouts, J. R., Bend, J.R. and Philpot, 
R.M. (eds),  In Vitro  Metabolic Activation in Mutagenesis Testing, Elsevier, 
North-Holland, pp. 85–88. 
(49) Johnson, T.E., Umbenhauer, D.R. och Galloway, S.M. (1996), Human liver 
S-9 metabolic activation: proficiency in cytogenetic assays and comparison 
with phenobarbital/beta-naphthoflavone or Aroclor 1254 induced rat S-9,  
Environ. Mol. Mutagen. , 28, 51–59. 
(50) Unep (2001), Stockholm Convention on Persistent Organic Pollutants, Uni ­
ted Nations Environment Programme (Unep). Finns på: http://www.pops.int/ 
(51) Doherty, A.T., Ellard, S., Parry, E.M. och Parry, J.M. (1996), An investi ­
gation into the activation and deactivation of chlorinated hydrocarbons to 
genotoxins in metabolically competent human cells,  Mutagenesis , 11, 
247–274. 
(52) Krahn, D.F., Barsky, F.C. och McCooey, K.T. (1982), CHO/HGPRT Mu ­
tation Assay: Evaluation of Gases and Volatile Liquids,  In: Tice, R.R., 
Costa, D.L. and Schaich, K.M. (eds), Genotoxic Effects of Airborne Agents. New York, Plenum, sidorna 91–103. 
(53) Zamora, P.O., Benson, J.M., Li, A.P. och Brooks, A.L. (1983), Evaluation 
of an exposure system using cells grown on collagen gels for detecting highly volatile mutagens in the CHO/HGPRT mutation assay,  Environ. 
Mutagenesis  5, 795–801. 
(54) Fenech, M. (1993), The cytokinesis-block micronucleus technique: a detai ­
led description of the method and its application to genotoxicity studies in human populations,  Mutation Res. , 285, 35–44. 
(55) Phelps, J.B., Garriott, M.L., och Hoffman, W.P. (2002), A protocol for the  
in vitro  micronucleus test. II. Contributions to the validation of a protocol 
suitable for regulatory submissions from an examination of 10 chemicals 
with different mechanisms of action and different levels of activity,  Muta­
tion Res. , 521, 103–112. 
(56) Kirsch-Volders, M., Sofuni, T., Aardema, M., Albertini, S., Eastmond, D., 
Fenech, M., Ishidate, M. Jr., Kirchner, S., Lorge, E., Morita, T., Norppa, H., 
Surralles, J., Vanhauwaert, A. och Wakata, A. (2004), Corrigendum to 
”Report from the  in vitro  micronucleus assay working group”,  Mutation 
Res., 564, 97–100. 
(57) Pincu, M., Bass, D. och Norman, A. (1984), An improved micronuclear 
assay in lymphocytes,  Mutation Res. , 139, 61–65. 
(58) Lorge, E., Hayashi, M., Albertini, S. och Kirkland, D. (2008), Comparison 
of different methods for an accurate assessment of cytotoxicity in the  in 
vitro  micronucleus test. I. Theoretical aspects,  Mutation Res. , 655, 1–3. 
(59) Surralles, J., Xamena, N., Creus, A., Catalan, J., Norppa, H. och Marcos, R. 
(1995), Induction of micronuclei by five pyrethroid insecticides in 
whole-blood and isolated human lymphocyte cultures,  Mutation Res. , 341, 
169–184. 
(60) Galloway, S. (2000), Cytotoxicity and chromosome aberrations  in vitro : 
Experience in industry and the case for an upper limit on toxicity in the 
aberration assay, Environ. Molec.  Mutagenesis
 35, 191–201.  ▼M3 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 724
 
(61) Hayashi, M., Sofuni, T. och Ishidate, M. Jr. (1983), An Application of 
Acridine Orange Fluorescent Staining to the Micronucleus Test,  Mutation 
Res., 120, 241–247. 
(62) MacGregor, J. T., Wehr, C. M. och Langlois, R. G. (1983), A Simple 
Fluorescent Staining Procedure for Micronuclei and RNA in Erythrocytes Using Hoechst 33258 and Pyronin Y,  Mutation Res. , 120, 269–275. 
(63) Hayashi, M., Sofuni, T. och Ishidate, M. Jr. (1983), An application of 
acridine orange fluorescent staining to the micronucleus test,  Mutation Res. , 
120, 241–247. 
(64) Fenech, M., Chang, W.P., Kirsch-Volders, M., Holland, N., Bonassi, S. och 
Zeiger, E. (2003), HUMN project: detailed description of the scoring criteria 
for the cytokinesis-block micronucleus assay using isolated human lympho ­
cyte cultures,  Mutation Res. , 534, 65–75. 
(65) Hoffman, W.P., Garriott, M.L. och Lee, C. (2003),  In vitro  micronucleus 
test, In: Encyclopedia of Biopharmaceutical Statistics, Second edition. S. 
Chow (ed.), Marcel Dekker, Inc. New York, NY, sidorna 463–467. 
(66) Europaparlamentets och rådets förordning (EG) nr 850/2004 av den 29 april 
2004 om långlivade organiska föroreningar och om ändring av direktiv 79/117/EEG (EUT L 158, 30.4.2004, s. 7).
 ▼M3 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 725
 
Tillägg 1  
Definitioner  
Aneugen:  Ett ämne eller en process som genom växelverkan med komponen ­
terna i den mitotiska och meiotiska celldelningscykeln leder till aneuploidi i 
celler eller organismer.  
Aneuploidi:  Alla avvikelser från det normala antalet diploida (eller haploida) 
kromosomer med en eller flera kromosomer, men inte med hela uppsättningar 
kromosomer (polyploidi).  
Apoptos:  Programmerad celldöd som karakteriseras av en serie steg som leder 
till sönderfall av celler till membranbundna partiklar som därefter elimineras genom fagocytos eller avstötning.  
Cellproliferation:  Ökning av antalet celler som resultat av mitotisk celldelning.  
Centromer:  DNA-regionen i en kromosom där båda kromatiderna är samman ­
hållna och på vilken båda kinetochorerna är fästa sida vid sida.  
Klastogen:  Alla ämnen eller processer som orsakar strukturella kromosomavvi ­
kelser i populationer av celler eller organismer.  
Cytokines:  Den celldelning som följer omedelbart efter mitosen vid vilken två 
dotterceller bildas med var sin enskild kärna.  
Proliferationsindex vid cytokinesinhibering (CBPI):  Förhållandet mellan antalet 
celler efter två delningar i den behandlade populationen och motsvarande antal i 
den obehandlade kontrollen (se tillägg 2 för formel).  
Cytostas:  Inhibering av celltillväxt (se tillägg 2 för formel).  
Cytotoxicitet:  Skadliga effekter på cellens struktur eller funktion som i slutändan 
leder till celldöd.  
Genotoxisk:  En allmän term som omfattar alla typer av DNA- eller kromosom ­
skador, inklusive brott, adduktomfördelning, mutationer, kromosomavvikelser och aneuploidi. Inte alla typer av genotoxiska effekter leder till mutationer eller 
stabila kromosomskador.  
Interfasceller:  Celler som inte är i mitotisk fas.  
Kinetochor:  Ett protein som innehåller en struktur som fäster sig vid en kromo ­
somcentromer till vilken spindelfibrer associerar under celldelning och ger upp ­
hov till en ordnad rörelse av dotterkromosomerna mot dottercellernas poler.  
Mikrokärnor:  Små extra kärnor som är separata från cellernas huvudkärna och 
som produceras under mitosens eller meiosens telofas från isolerade kromosom ­
fragment eller hela kromosomer.  
Mitos:  Delning av cellkärnan, i regel bestående av profas, prometafas, metafas, 
anafas och telofas.  
Mitotiskt index:  Den andel celler som är i metafas dividerat med det totala 
antalet celler som kan observeras i en cellpopulation; en indikation på graden 
av cellproliferation hos den populationen.  
Mutagent ämne:  Ämne som producerar en ärftlig ändring av 
DNA-basparssekvensen (-sekvenserna) i gener eller i kromosomstrukturen (kro ­
mosomavvikelser).
 ▼M3 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 726
 
Icke-disjunktion:  När kromatidpar inte separeras och segregeras korrekt till dot ­
tercellerna under utveckling, vilket leder till dotterceller med abnormalt antal 
kromosomer.  
Polyploidi:  Numeriska kromosomavvikelser i celler eller organismer som in ­
begriper en eller flera hela kromosomuppsättningar, i motsats till en enskild kromosom eller kromosomer (aneuploidi).  
Proliferationsindex (PI):  Ett sätt att mäta cytotoxicitet när cytoB inte används (se 
tillägg 2 för formel).  
Relativ ökning av celltal (RICC):  Ett sätt att mäta cytotoxicitet när cytoB inte 
används (se tillägg 2 för formel).  
Relativ populationsfördubbling (RPD):  Ett sätt att mäta cytotoxicitet när cytoB 
inte används (se tillägg 2 för formel).  
Replikeringsindex (RI):  Andelen celldelningscykler som slutförts i en behandlad 
odling under exponeringsperioden och återhämtningen, i förhållande till den 
obehandlade kontrollen (se tillägg 2 för formel).  
Testkemikalie (kallas också testämne):  Alla ämnen eller blandningar som testas 
med denna testmetod.
 ▼M3 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 727
 
Tillägg 2  
Formler för bestämning av cytotoxicitet  
1. När cytoB används  ska bedömningen av cytotoxicitet basera sig på pro ­
liferationsindex vid cytokinesinhibering (CBPI) eller replikeringsindex (RI) (16) (58). Proliferationsindex vid cytokinesinhibering indikerar det genomsnittliga an ­
talet cellcykler per cell under exponeringsperioden för cytoB och kan användas 
för att beräkna cellproliferationen. Replikeringsindex indikerar det relativa antalet 
kärnor i behandlade odlingar i jämförelse med kontrollodlingar och kan användas för att beräkna procentandelen cytostas: 
% cytostas = 100 – 100{(CBPI
 T – 1) ÷ (CBPI  C – 1)} 
och T = odling behandlad med testkemikalie 
C = vehikelkontrollodling 
där 
CBPI ¼
 ððAntalet mononukleära celler Þ þ ð2 Ü Antalet binukleära celler Þ þ ð3 Ü Antalet multinukleära celler ÞÞ 
ðTotala antalet celler Þ 
Således gäller att ett CBPI-värde på 1 (alla celler är mononukleära) motsvarar 
100 % cytostas. 
Cytostas = 100 – RI 
RI ¼ ððAntalet binukleära celler Þ þ ð2 Ü Antalet multinukleära celler ÞÞ ö ðTotala antalet celler Þ T 
ððAntalet binukleära celler Þ þ ð2 Ü Antalet multinukleära celler ÞÞ ö ðTotala antalet celler Þ C Ü 100 
T = behandlade odlingar 
C = kontrollodlingar 
2. Således betyder ett RI-värde på 53 % att, jämfört med antalet celler som har 
delat sig till binukleära och multinukleära celler i kontrollodlingen, endast 53 % av detta antal har delat sig i den behandlade odlingen, dvs. 47 % cytostas. 
3. När cytoB inte används , rekommenderas att cytotoxiciteten utvärderas på 
grundval av relativ ökning av celltal (RICC) eller relativ populationsfördubbling (RPD) (58), eftersom den andel av cellpopulationen 
som har delat sig beaktas i båda metoderna. 
RICC ¼
 ðÖkning av cellantal i behandlade odlingar  ðslutlig – vid startÞÞ 
ðÖkning av cellantal i kontrollodlingar  ðslutlig – vid startÞÞ Ü 100 
RPD ¼ ðAntal populationsfördubblingar i behandlade odlingar Þ 
ðAntal populationsfördubblingar i kontrollodlingar Þ Ü 100 ▼M3 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 728
 
där 
Populationsfördubbling = [log (Cellantal efter behandling ÷ Ursprungligt cellan ­
tal)] ÷ log 2 
4. Således indikerar ett RICC-värde eller ett RPD-värde på 53 % att det före ­
kommer 47 % cytotoxicitet/cytostas. 
5. Genom att använda ett proliferationsindex (PI) kan cytotoxiciteten bestäm ­
mas genom att räkna antalet kloner som består av 1 cell (cl1), 2 celler (cl2), 3 till 
4 celler (cl4) och 5 till 8 celler (cl8) 
PI ¼ ðð1 Ü cl1Þ þ ð2 Ü cl2Þ þ ð3 Ü cl4Þ þ ð4 Ü cl8ÞÞ 
ðcl1 þ cl2 þ cl4 þ cl8Þ 
6. PI har använts som en värdefull och tillförlitlig cytotoxicitetsparameter även 
för cellinjer som har odlats  in situ  utan tillsats av cytoB (25) (26) (27) (28).  ▼M3 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 729
 
Tillägg 3  
Referenskemikalier som rekommenderas för bedömning av prestanda  ( 1 ) 
Kategori Kemikalie CAS-nummer EG-nummer  
1. Klastogener utan metabolisk aktivering 
Cytosinarabinosid 147-94-4 205-705-9 Mitomycin C 50-07-7 200-008-6 
2. Klastogener som kräver metabolisk aktivering 
Benso(a)pyren 50-32-8 200-028-5 
Cyklofosfamid 50-18-0 200-015-4 
3. Aneugener 
Kolchicin 64-86-8 200-598-5 Vinblastin 143-67-9 205-606-0 
4. Negativa ämnen 
Di(2-etylhexyl)ftalat 117-81-7 204-211-0 
Nalidixinsyra 389-08-2 206-864-7 
Pyren 129-00-0 204-927-3 Natriumklorid 7647-14-5 231-598-3
 
( 1 ) Referenskemikalierna är de kemikalier som rekommenderas. Ersättning eller tillägg av kemikalier till förteckningen över refer ens­
kemikalier kan göras om deras aktivitet är känd och de inducerar mikrokärnor enligt samma mekanismer, och om de kan påvisas 
vara relevanta för de kemikalier som ska testas med MNvit-förfarandet. Beroende på ändamålet kan motiveringen också innehålla en valideringsstudie där man använt ett brett urval olika ämnen eller fokuserat på ett smalare spektrum baserat på testämnets 
kemiska klass eller mekanismen för den skada som undersöks. ▼M3 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 730
 
B.50.  HUDSENSIBILISERING: LLNA-METODEN (LOCAL LYMPH 
NODE ASSAY): DA  
INLEDNING 
1. OECD:s riktlinjer för testning av kemikalier (OECD Guidelines for the Testing 
of Chemicals) och EU:s testmetoder ses regelbundet över med hänsyn till den vetenskapliga utvecklingen, nya lagstiftningsbehov och djurens välbefinnande. 
Den första testmetoden (B.42) för bestämning av hudsensibilisering hos möss 
(LLNA-metoden, OECD:s testriktlinje 429) har reviderats (1). Närmare upp ­
gifter om valideringen av LLNA-metoden och en granskning av arbetet i sam ­
band med denna har offentliggjorts (2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9). I LLNA-metoden 
används radioisotopiskt tymidin eller jod för att mäta lymfocytproliferation och 
metoden har därför begränsad användning när det förekommer problem med att anskaffa, använda eller bortskaffa radioaktivitet. LLNA: DA (som utvecklats av Daicel Chemical Industries, Ltd) är en icke-radioaktiv modifiering av LLNA 
enligt vilken mängden adenosintrifosfat (ATP) kvantifieras genom biolumini ­
scens som en indikator på lymfocytproliferation. LLNA: DA-testmetoden har validerats, granskats och rekommenderats av en internationell expertutvär ­
deringspanel som konstaterade att den kan användas för att identifiera hudsensi ­
biliserande och icke-hudsensibiliserande kemikalier, med vissa begränsningar 
(10)(11)(12)(13). Testmetoden är avsedd för bedömning av kemikaliers (äm ­
nens och blandningars) potential att framkalla hudsensibilisering hos djur. En ­
ligt kapitel B.6 i denna bilaga och i OECD:s testriktlinje 406 används test på 
marsvin, särskilt maximeringstest på marsvin och Buehler-test (14). LLNA 
(kapitel B.42 i denna bilaga, OECD:s testriktlinje 429) och de två icke-radioaktiva modifikationerna LLNA: DA (kapitel B.50 i denna bilaga, OECD:s testriktlinje 442 A) och LLNA: BrdU-ELISA (kapitel B.51 i denna 
bilaga, OECD:s testriktlinje 442 B) har fördelar jämfört med marsvinstestet 
enligt B.6 och OECD:s testriktlinje 406 (14) såtillvida att man kan minska antalet djur och använda dem på ett skonsammare sätt. 
2. I likhet med LLNA används LLNA: DA för att undersöka hudsensibilisering ­
ens induktionsfas, vilket ger tillgång till kvantitativa data som är lämpliga för dos-responsbedömning. Vidare gäller att de här metodernas förmåga att de ­
tektera hudsensibiliserande kemikalier utan att det behövs radiomärkning för 
DNA eliminerar risken för yrkesmässig exponering för radioaktivitet och 
problem rörande bortskaffning av avfall. Detta kan i sin tur ge möjlighet till ökad användning av möss för att upptäcka hudsensibiliserande ämnen, vilket ytterligare kan minska användningen av marsvin för att testa kemikaliers 
hudsensibiliserande potential (dvs. B.6; OECD:s testriktlinje 406) (14).
 
DEFINITIONER 
3. Definitioner av begreppen finns i tillägg 1.  
INLEDANDE ÖVERVÄGANDEN OCH BEGRÄNSNINGAR 
4. LLNA: DA är en modifierad LLNA-metod för identifiering av kemikalier 
med potential att framkalla hudsensibilisering, med specifika begränsningar. Detta betyder dock inte nödvändigtvis att LLNA: DA alltid ska användas i 
stället för LLNA eller test på marsvin (dvs. B.6; OECD:s testriktlinje 406) 
(14), utan att metoden är likvärdig och kan användas som ett alternativ i fall där positiva och negativa resultat i regel inte kräver någon ytterligare bekräftelse (10) (11). Testningslaboratoriet bör analysera all tillgänglig in ­
formation om testämnet innan själva testningen genomförs. Sådan infor ­
mation inbegriper ämnets identitet och kemiska struktur, fysikalisk-kemiska
 ▼M3 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 731
 
egenskaper, resultaten från andra eventuella  in vitro - eller  in vivo -test avseende 
testämnets toxicitet samt toxikologiska data om strukturellt närbesläktade ke ­
mikalier. Denna information bör övervägas för att kunna fastställa om LLNA-metoden är lämplig för testämnet (mot bakgrund av att LLNA-metoden inte kan användas för vissa typer av kemikalier, se punkt 5) 
och som stöd för valet av dos. 
5. LLNA: DA är en  in vivo -metod, och därför kan man inte undvika använd ­
ningen av djur för bedömning av sensibilisering genom allergisk kontakt. Detta test erbjuder dock möjligheter till att minska antalet djur i jämförelse med test på marsvin (B.6; OECD:s testriktlinje 406) (14). Dessutom ger 
LLNA: DA möjlighet till en betydligt skonsammare behandling (mindre 
smärta och lidande) av de djur som används för testning av sensibilisering genom allergisk kontakt, eftersom man med LLNA: DA, till skillnad från B.6 och OECD:s testriktlinje 406 inte behöver framkalla provokationsindu ­
cerade dermala hypersensitivitetsreaktioner. Trots fördelarna med LLNA: 
DA i jämförelse med B.6 och OECD:s testriktlinje 406 (14), finns det vissa begränsningar som gör att man kanske måste använda B.6 eller OECD:s 
testriktlinje 406 (t.ex. testning av vissa metaller, falska positiva resultat med 
vissa hudirriterande ämnen (såsom vissa ytaktiva ämnen (6) (1 och kapitel B.42 i denna bilaga), testämnets löslighet)). Dessutom kan det för kemiska klasser eller ämnen som har funktionella grupper som påvisats agera som 
potentiella störfaktorer (16) vara nödvändigt att använda test på marsvin 
(dvs. B.6; OECD:s testriktlinje 406 (14)). Det rekommenderas att de be ­
gränsningar som anges för LLNA (1 och kapitel B.42 i denna bilaga) även ska gälla för LLNA: DA (10). Dessutom är LLNA: DA eventuellt inte 
lämplig för testning av ämnen som påverkar ATP-nivåerna (t.ex. ämnen 
som fungerar som ATP-inhibitorer) eller ämnen som stör exakt mätning av intracellulärt ATP (t.ex. förekomsten av ATP-degraderande enzymer eller förekomst av extracellulärt ATP i lymfnoden). Utöver sådana identifierade 
begränsningar bör LLNA: DA gå att använda för testning av alla ämnen, 
utom om ett ämne förknippas med egenskaper som kan påverka LLNA: DA-metodens exakthet. Dessutom bör överväganden göras rörande risken för positiva gränsresultat när man får värden för stimulationsindex (SI) 
mellan 1,8 och 2,5 (se punkterna 31–32). Detta grundar sig på validerings ­
databasen med 44 ämnen med användning av SI ≥ 1,8 (se punkt 6) för 
vilka LLNA: DA ger korrekt identifiering av alla 32 sensibiliserande ämnen enligt LLNA men felaktig identifiering av 3 av 12 icke-sensibiliserande 
ämnen enligt LLNA med SI-värden mellan 1,8 och 2,5 (dvs. på gränsen 
till positivt) (10). Eftersom samma datauppsättning användes för att fast ­
ställa SI-värdena och beräkna testmetodens förutsägande egenskaper kan dock de angivna resultaten vara en överuppskattning av de faktiska för ­
utsägande egenskaperna.
 
PRINCIP FÖR TESTMETODEN 
6. LLNA: DA bygger på principen om att sensibiliserande ämnen inducerar en 
primär proliferation av lymfocyter i de lymfnoder som dränerar det område där testämnet appliceras. Denna proliferation står i proportion till den appli ­
cerade dosen och det allergiframkallande ämnets styrka, och är ett enkelt sätt 
att få en kvantitativ mätning av sensibiliseringen. Proliferationen mäts genom att jämföra medelproliferationen i varje testgrupp med medelproliferationen i den vehikelbehandlade kontrollgruppen. Förhållandet mellan medelprolifera ­
tionen i respektive behandlingsgrupp och den parallella vehikelkontrollgrup ­
pen, kallat stimulationsindex (SI), bestäms och detta bör vara ≥ 1,8 för att det
 ▼M3 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 732
 
ska vara motiverat att klassificera testämnet som potentiellt hudsensibilise ­
rande ämne. Det förfarande som beskrivs här grundar sig på mätning av 
ATP-innehållet (som korrelerar med antalet levande celler) genom biolumini ­
scens (17) i syfte att indikera ett ökat antal prolifererande celler i de aurikulära dränerande lymfnoderna (18) (19). I bioluminiscensmetoden används en ­
zymet luciferas för att katalysera ombildningen till ljus från ATP och lucife ­
ring enligt följande reaktion:  
ATP + luciferin  + O
 2
 oxiluciferin  + AMP  + PP  i + CO  2 + 
ljus 
Det emitterade ljusets intensitet är linjärt relaterat till ATP-koncentrationen 
och uppmäts med en luminometer. Luciferin-luciferas-förfarandet är en känslig metod för ATP-kvantifiering som används i en mängd olika till ­
lämpningar (20).
 
TESTBESKRIVNING  
Val av djurart  
7. För detta test används mus. Valideringsstudier för LLNA: DA genomfördes 
uteslutande med stammen CBA/J som därför anses vara den stam som är 
att föredra (12) (13). I testet används unga vuxna mushonor som inte har 
fött ungar och som inte är dräktiga. När försöket inleds bör djuren vara 8–12 veckor gamla. Djurens viktvariation bör vara minimal och får inte överskrida 20 % av medelvikten. Övriga stammar eller hanar kan användas 
som alternativ förutsatt att det finns tillräckliga data som stöd för att det 
inte förekommer några betydande stam- eller könsberoende skillnader i LLNA: DA-respons.
 
Inhysnings- och utfodringsförhållanden  
8. Mössen ska inhysas i grupper (21), utom om det finns tillbörlig veten ­
skaplig motivering för individuell inhysning. Temperaturen i djurens ut ­
rymmen bör vara 22 ± 3 °C. Den relativa fuktigheten bör vara minst 30 % och ska helst inte överstiga 70 %, utom när rummet rengörs. Mål ­
värdet bör dock vara 50–60 %. Belysningen bör vara artificiell med omväx ­
lande 12 timmar ljus och 12 timmar mörker. För utfodringen kan konven ­
tionellt laboratoriefoder användas, och djuren bör ha obegränsad tillgång till 
dricksvatten.
 
Förberedelse av djuren  
9. Djuren väljs ut slumpmässigt och förses med märkning så att de kan 
identifieras individuellt (öronmärkning får dock inte användas). Därefter får djuren acklimatisera sig till laboratoriets förhållanden i sina burar i 
minst fem dagar före doseringsstart. Innan behandlingen inleds undersöks 
alla djur för att säkerställa att de inte har några synliga hudskador.
 
Förberedelse av doseringslösningar  
10. Kemikalier i fast form ska upplösas eller suspenderas i lösningsmedel/ve ­
hikel och vid behov spädas ut före appliceringen på mössens öron. Kemi ­
kalier i vätskeform kan appliceras i ren eller utspädd form. Olösliga kemi ­
kalier, av den typ som ofta används i medicintekniska produkter, ska före applicering på mössens öron extraheras kraftigt i lämpligt lösningsmedel för 
att få ut alla extraherbara beståndsdelar för testning. Testlösningarna ska 
beredas dagligen utom om stabilitetsdata visar att lagring kan accepteras.
 ▼M3 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 733
 
Tillförlitlighetskontroll  
11. Positiva kontrollkemikalier används för att påvisa att testsystemet klarar av 
att ge respons med tillräcklig och reproducerbar känslighet för ett sensi ­
biliserande testämne för vilket responsen har en välkarakteriserad styrka. Användningen av en parallell positiv kontroll rekommenderas eftersom den påvisar laboratoriets kompetens att genomföra testningar på ett framgångs ­
rikt sätt och ger möjlighet att bedöma reproducerbarhet och jämförbarhet 
inom laboratoriet och mellan laboratorier. Vissa tillsynsmyndigheter kräver också att positiv kontroll används för varje försök, och därför rekommen ­
deras samråd med relevanta myndigheter innan testning med LLNA: DA 
inleds. Likaså uppmuntras rutinanvändning av parallell positiv kontroll för 
att undvika tilläggstestning på djur i fall där myndigheterna inte godkänner periodiska positiva kontroller (se punkt 12). Den positiva kontrollen bör ge en positiv LLNA: DA-respons på den exponeringsnivå som förväntas ge en 
ökning av stimulationsindex (SI) som är större eller lika med 1,8 i förhål ­
lande till den negativa kontrollgruppen. Dosen för den positiva kontroll ­
kemikalien ska väljas så att den inte orsakar särskilt kraftig hudirritation eller systemisk toxicitet och att induktionen är reproducerbar men inte för 
kraftig (t.ex. SI > 10 anses vara för högt värde). Rekommenderade ämnen 
för positiv kontroll är 25-procentig hexylkanelaldehyd (CAS-nummer 101- 86-0) och 25-procentig eugenol (CAS-nummer 97-53-0) i aceton-olivoljeblandning i förhållandet 4:1 (volym/volym). I vissa fall 
kan även andra positiva kontrollkemikalier som uppfyller de ovan angivna 
kriterierna användas, förutsatt att tillbörlig motivering kan ges. 
12. Även om användning av en parallell positiv kontrollgrupp rekommenderas 
kan det finnas betingelser där det är tillräckligt med periodisk testning (dvs. 
minst var sjätte månad) av den positiva kontrollen i laboratorier som re ­
gelbundet genomför LLNA: DA (dvs. minst en gång i månaden) och som har en etablerad historisk databas över positiv kontroll som påvisar labo ­
ratoriets förmåga att få reproducerbara och exakta resultat från positiva 
kontroller. Tillräcklig kvalitet hos LLNA: DA kan framgångsrikt påvisas genom att enhetliga positiva resultat erhålls från den positiva kontrollen vid minst tio oberoende testningar som genomförs inom en skälig tidsperiod 
(kortare än ett år). 
13. Parallell positiv kontrollgrupp ska alltid användas när det sker ändringar 
rörande testningsförfarandet (t.ex. ny personal, nya material och/eller rea ­
genser, annorlunda utrustning, byte av testdjurens ursprung), och sådana 
ändringar bör dokumenteras i laboratorierapporter. Man bör överväga om 
dessa ändringar påverkar den tidigare etablerade historiska databasens lämplighet, för att kunna avgöra om det behövs en ny historisk databas för dokumentering av den positiva kontrollens resultatenhetlighet. 
14. Man bör vara medveten om att beslut om att använda positiva kontroller 
med vissa intervaller i stället för parallellt har återverkningar på lämplig ­
heten och godtagbarheten hos negativa undersökningsresultat som fås utan parallell positiv kontroll under den tid som löper mellan de periodiska 
undersökningarna av positiv kontroll. Om t.ex. falska negativa resultat fås 
vid ett periodiskt test av positiv kontroll, måste man kanske ifrågasätta resultat som erhållits mellan det sista godtagbara periodiska testet av positiv kontroll och ett icke-godtagbart periodiskt test med positiv kontroll. Följ ­
derna av dessa utfall bör övervägas noggrant när man avgör huruvida 
parallella positiva kontroller ska användas eller om de positiva kontrollerna enbart ska vara periodiska. Likaså bör man överväga användning av färre djur i den parallella positiva kontrollgruppen när detta är vetenskapligt 
motiverat och laboratoriet med stöd av laboratoriespecifika historiska data 
kan påvisa att färre möss kan användas (22).
 ▼M3 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 734
 
15. Även om det positiva kontrollämnet bör testas i en vehikel som veterligen 
framkallar en enhetlig respons (t.ex. aceton-olivoljeblandning i förhållandet 
4:1 (volym/volym)), kan det förekomma vissa föreskriftsreglerade situatio ­
ner där det även behövs testning i en icke-standardmässig vehikel (kliniskt och kemiskt relevant formulering) (23). Om det parallella positiva kont ­
rollämnet testas i en annan vehikel än den som används för testämnet, bör 
en separat kontrollgrupp användas för den parallella positiva kontrollen. 
16. I fall där utvärdering görs av testämnen av en viss kemisk klass eller med 
en viss responsskala kan det också vara värdefullt med referensämnen för att påvisa att testmetoden fungerar tillfredsställande för bestämning av 
hudsensibiliseringspotentialen hos dessa typer av ämnen. Ett lämpligt refe ­
rensämne ska ha följande egenskaper: 
— Strukturell och funktionell likhet med den ämnesklass som testas. — Kända fysikalisk-kemiska egenskaper. — Stödjande data från LLNA: DA. — Stödjande data från andra djurmodeller och/eller från människor.
 
TESTFÖRFARANDE  
Antalet djur och dosnivåer  
17. Minst fyra djur per dosgrupp och minst tre koncentrationer av testämnet bör 
användas. Dessutom används en parallell negativ kontrollgrupp som endast 
behandlas med samma vehikel som används för testämnet och en positiv kontroll (parallell eller nyligen gjord, enligt laboratoriets principer för över ­
väganden enligt punkterna 11–15). Man bör överväga flera upprepade doser 
av det positiva kontrollämnet, särskilt när den positiva kontrollen testas 
periodiskt. Med undantag för behandling med testämnet bör djuren i kon ­
trollgrupperna hanteras på exakt samma sätt som djuren i dosgrupperna. 
18. Doserna och vehikeln bör väljas på grundval av rekommendationerna i 
hänvisningarna 0 och (24). Doserna väljs i regel enligt en lämplig kon ­
centrationsserie såsom 100 %, 50 %, 25 %, 10 %, 5 %, 2,5 %, 1 %, 0,5 %, 
osv. Valet av koncentrationsserie ska ges tillbörlig vetenskaplig motivering. All existerande tillgänglig och relevant toxikologisk information (t.ex. akut toxicitet och hudirritation) samt strukturell och fysikalisk-kemisk infor ­
mation om testämnet (och/eller strukturellt besläktade ämnen) bör över ­
vägas vid valet av de tre på varandra följande koncentrationerna så att den högsta koncentrationen ger maximal exponering samtidigt som syste ­
misk toxicitet och särskilt kraftig lokal hudirritation undviks (24) (25). Om 
sådan information inte finns kan det vara nödvändigt att först genomföra ett 
preliminärt screeningtest (se punkterna 21–24). 
19. Vehikeln får inte störa eller snedvrida testresultaten och ska väljas med 
tanke på största möjliga löslighet för att få högsta möjliga koncentration samtidigt som man får en lösning/suspension som är lämplig för applicering 
av testämnet. Som vehikel rekommenderas aceton-olivoljeblandning (4:1 
volym/volym),  N,N -dimetylformamid, metyletylketon, propylenglykol och 
dimetylsulfoxid (6) men även andra vehiklar kan användas förutsatt att tillräcklig vetenskaplig motivering kan ges. I vissa situationer kan det 
vara nödvändigt att som extra kontroll använda ett kliniskt relevant lös ­
ningsmedel eller en kommersiellt tillgänglig blandning där testämnet ingår. Särskild vikt bör fästas vid att säkerställa att hydrofila ämnen inkorporeras i ett vehikelsystem som väter huden och som inte omedelbart rinner bort, 
genom att använda lämpliga solubiliserande ämnen (t.ex. 1-procentig Plu ­
ronic® L92). Det betyder att helt vattenbaserade vehiklar bör undvikas.
 ▼M3 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 735
 
20. Genom analys av lymfnoder från individuella möss kan man bestämma 
variationer djuren emellan och göra en statistisk jämförelse av skillnaden 
mellan mätningar för testämnet och mätningarna i kontrollgruppen (se punkt 33). Dessutom kan möjligheten att minska antalet möss i den positiva kontrollgruppen endast övervägas utifrån att data samlas in individuellt per 
djur (22). Vidare gäller att vissa tillsynsmyndigheter kräver att data insam ­
las per individuellt djur. Regelbunden insamling av individuella data per djur ger en fördel rörande djurens välbefinnande eftersom man kan undvika upprepad testning som annars skulle behövas om testämnesresultat som 
ursprungligen har samlats in på ett visst sätt (t.ex. genom poolade djurdata) 
måste granskas senare av tillsynsmyndigheter som har avvikande krav (så ­
som data per individuellt djur).
 
Preliminärt screeningtest  
21. Om det inte finns tillgång till information för att bestämma högsta testdosen 
(se punkt 18) bör ett preliminärt screeningtest genomföras för att definiera 
den lämpliga dosnivån för test i LLNA: DA. Syftet med det preliminära screeningtestet är att ge vägledning för valet av högsta dosnivå som ska användas i den huvudsakliga LLNA: DA-undersökningen i fall där det inte 
finns tillgång till information om vilken koncentration som inducerar 
systemisk toxicitet (se punkt 24) och/eller särskilt kraftig lokal hudirritation (se punkt 23). Den högsta dosnivå som testas ska vara 100 % testämne för vätskor eller högsta möjliga koncentration för fasta ämnen eller suspensioner. 
22. Det preliminära screeningtestet genomförs under identiska betingelser som 
vid den huvudsakliga LLNA: DA-undersökningen, utom att man inte ut ­
värderar proliferationen i lymfnoderna och man kan använda färre djur i dosgruppen. Ett eller två djur per dosgrupp föreslås. Alla möss observeras 
dagligen för kliniska tecken på systemisk toxicitet eller lokal irritation på 
appliceringsstället. Djurens kroppsvikt registreras före testningen och efter avslutad testning (dag 8). På varje mus observeras båda öronen i fråga om hudrodnad och graderas enligt tabell 1 (25). Mätning av örontjocklek görs 
t.ex. med digital mikrometer eller Peacock Dial-instrument på dag 1 (före 
dosering), dag 3 (cirka 48 timmar efter den första dosen), dag 7 (24 timmar före avslut) och dag 8. Dessutom kan örontjockleken bestämmas på dag 8 genom vägning av en öronbit som stansats ut efter att djuren har avlivats 
skonsamt. Särskilt kraftig lokal hudirritation indikeras genom hudrodnads ­
gradering ≥ 3 och/eller ökning av örontjockleken med ≥ 25 % på någon av 
mätningsdagarna (26) (27). Den högsta dos som väljs för den huvudsakliga LLNA: DA-undersökningen blir nästa lägre dos i koncentrationsserien för 
den preliminära screeningen (se punkt 18) som inte inducerar systemisk 
toxicitet och/eller särskilt kraftig hudirritation.
 
Tabell 1  
Grader av hudrodnad  
Observation Gradering  
Ingen hudrodnad 0 
Mycket svag rodnad (knappt skönjbar) 1 Väldefinierad hudrodnad 2
 ▼M3 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 736
 
Observation Gradering  
Moderat till svår hudrodnad 3 
Svår hudrodnad (köttrodnad) till sårskorpebildning som utgör hinder för 
gradering av rodnaden 4 
23. Utöver en 25-procentig ökning av örontjocklek (26) (27) har en statistiskt 
signifikant ökning av örontjockleken hos behandlingsgruppens möss i jäm ­
förelse med kontrollgruppens möss också använts för att identifiera irrite ­
rande ämnen genom LLNA (28) (29) (30) (31) (32) (33) (34). Dock så 
gäller att även om statistiskt signifikanta ökningar kan inträffa när ökningen 
av örontjocklek är mindre än 25 %, har dessa inte specifikt förknippats med särskilt kraftig irritation (30) (31) (32) (33) (34). 
24. Följande kliniska observationer kan indikera systemisk toxicitet (35) när de 
används som del av en helhetsbedömning, och kan därför ge hänvisning om 
den högsta dosnivå som ska användas i det huvudsakliga LLNA: 
DA-försöket: ändringar av nervsystemets funktion (t.ex. upprest päls, ataxi, skälvningar och konvulsioner), ändringar av beteende (t.ex. aggressivitet, ändringar av putsningsbeteende, markerad ändring av aktivitetsnivå), änd ­
ringar av andningsmönster (dvs. ändringar av andningens frekvens och 
intensitet, såsom dyspné, gäspande och rassel) samt ändringar av födo- och vattenintag. Vid utvärderingen ska man också beakta tecken på letargi och/eller avsaknad av reaktioner, alla slags kliniska tecken på mer än lätt 
eller momentan smärta eller lidande, en minskning på mer än 5 % av 
kroppsvikten från dag 1 till dag 8 samt mortalitet. Döende djur och djur som visar tecken på svår smärta och lidande ska avlivas skonsamt (36).
 
Huvudundersökningens försöksschema  
25. För testet används följande försöksschema: 
— Dag 1:  Djuren märks individuellt och vikten samt eventuella kliniska 
observationer registreras. Applicera en 1-procentig vattenlösning av 
natriumlaurylsulfat (SLS) på baksidan av varje öra med en borste dop ­
pad i lösningen och täck örats hela baksida med fyra till fem stryk ­
ningar. En timme efter SLS-behandlingen appliceras 25 μl lämpligt 
utspätt testämne, enbart vehikel eller positivt kontrollämne (parallell 
eller nyligen gjord positiv kontroll, i enlighet med laboratoriets princi ­
per rörande punkterna 11–15) på båda öronens baksida. 
— Dagarna 2, 3 och 7:  Upprepa förbehandlingen med 1-procentig 
SLS-vattenlösning och applicera testämnet på samma sätt som på dag 1. 
— Dagarna 4, 5 och 6:  Ingen behandling. 
— Dag 8:  Registrera vikten för varje djur och eventuella kliniska obser ­
vationer. Avliva djuren skonsamt cirka 24–30 timmar efter applicerings ­
starten dag 7. Skär bort de aurikulära dränerande lymfnoderna från varje musöra och behandla separat i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) för varje 
djur. Närmare uppgifter och scheman för identifiering och dissekering 
av noder finns i hänvisning (22). För ytterligare kontroll av lokal hud ­
respons i huvudundersökningen kan tilläggsparametrar såsom gradering av örats hudrodnad eller mätningar av örats tjocklek (med tjockleks ­
mätare eller genom vägning av utstansad bit vid obduceringen) inför ­
livas i undersökningsprotokollet.
 ▼M3 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 737
 
Beredning av cellsuspensioner  
26. För varje mus bereds en suspension med enskilda celler av de bilateralt borts ­
kurna lymfnodscellerna (LNC) genom att placera lymfnoderna mellan två 
objektglas som trycks lätt samman för att krossa noderna. Kontrollera att vävnaden har spritt ut sig i ett tunt skikt och dra isär de två objektglasen. Bered en suspension av vävnaden på båda objektglasen genom att hålla dem 
ett i sänder i vinkel över en Petriskål och skölja med fosfatbuffrad saltlösning 
och skrapa samtidigt loss vävnaden med en cellskrapa. Observera att lymfno ­
derna i den negativa kontrollgruppens djur är små, och det är viktigt att iaktta stor försiktighet för att inte åstadkomma störande inverkan på SI-värdena. 
Totalt används 1 ml fosfatbuffrad saltlösning för sköljning av båda objektgla ­
sen. Gör en lätt homogenisering av LNC-suspensionen i Petriskålen med hjälp av cellskrapan. Dra upp en alikvot på 20 μl ur LNC-suspensionen med mik ­
ropipett och var försiktig med att inte ta upp membran som kan ses med blotta 
ögat, och blanda sedan med 1,98 ml fosfatbuffrad saltlösning till en provvo ­
lym på 2 ml. Bered sedan ett andra prov på 2 ml genom samma förfarande så att det finns två prov beredda per djur.
 
Bestämning av cellproliferation (mätning av lymfocyternas ATP-innehåll)  
27. Ökning av ATP-innehållet i lymfnoderna mäts genom luciferin-luciferas-me ­
toden med användning av ett system för ATP-mätning som mäter biolumini ­
scensen som relativa ljusenheter (Relative Luminescence Units, RLU). Tiden mellan avlivning av ett djur fram till mätning av ATP-innehållet bör vara 
enhetlig, inom cirka 30 minuter, eftersom man anser att ATP-innehållet grad ­
vis minskar med tiden efter avlivningen (12). Serien av förfaranden från bort ­
skärning av de aurikulära lymfnoderna fram till ATP-mätning bör därför slutföras inom 20 minuter enligt det på förhand fastställda tidsschemat som 
är samma för varje djur. ATP-luminiscensen bör mätas för varje 2 ml-prov så 
att totalt två ATP-mätningar görs per djur. Genomsnittet för ATP-luminiscens bestäms och används därefter för beräkningarna (se punkt 30).
 
OBSERVATIONER  
Kliniska observationer  
28. Varje mus bör observeras minst dagligen med tanke på eventuella kliniska 
tecken – lokal irritation vid appliceringsstället eller tecken på systemisk toxicitet. Alla observationer registreras systematiskt och individuellt per mus. Övervakningsplanerna bör inbegripa kriterier för omedelbar identifie ­
ring av möss som visar tecken på systemisk toxicitet, särskilt kraftig hu ­
dirritation eller hudkorrosion, så att de kan avlivas (36).
 
Kroppsvikt  
29. Såsom konstateras i punkt 25 ska de individuella djurens vikt registreras 
vid försökets början och strax före den schemalagda avlivningen.  
BERÄKNING AV RESULTATEN 
30. Resultaten för varje behandlingsgrupp uttrycks som genomsnittet för stimu ­
lationsindex. Stimulationsindex erhålls genom att genomsnittligt värde för RLU/djur inom varje testämnesgrupp och den positiva kontrollgruppen di ­
videras med genomsnittligt värde för RLU/djur för kontrollgruppen för 
lösningsmedel/vehikel. Genomsnittligt stimulationsindex för vehikelkon ­
trollgrupperna är då 1.
 ▼M3 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 738
 
31. Vid bedömning av resultaten anses ett resultat vara positivt när SI ≥ 1,8 
(10). Man kan dock även använda dos-responsförhållandets styrka samt den 
statistiska signifikansen och enhetligheten hos responsen i kontrollgruppen för lösningsmedel/vehikel och i den positiva kontrollen när man fastställer huruvida ett gränsresultat (dvs. SI-värde mellan 1,8 och 2,5) ska anses vara 
positivt 0 0 (37). 
32. För ett gränsresultat för positiv respons där SI-värdet ligger mellan 1,8 och 
2,5 vill man kanske beakta tilläggsinformation såsom 
dos-responsförhållandet, tecken på systemisk toxicitet eller särskilt kraftig irritation och, där det är lämpligt, statistisk signifikans tillsammans med SI-värden för att bekräfta att resultaten är positiva (10). Likaså bör man 
beakta testämnets olika egenskaper, inbegripet eventuell strukturell släkt ­
skap med kända hudsensibiliserande ämnen, huruvida ämnet orsakar sär ­
skilt kraftig hudirritation hos mössen samt naturen hos det iakttagna för ­
hållandet mellan dos och respons. Dessa och andra aspekter diskuteras 
närmare i andra källor (4). 
33. När data samlas in per enskild mus kan man göra en statistisk analys 
rörande förekomsten av dosrespons och graden för 
dos-responsförhållande. Alla statistiska analyser kan inbegripa en utvär ­
dering av dos-responsförhållandet och en lämpligt anpassad jämförelse mellan testgrupper (t.ex. parvisa jämförelser mellan doseringsgrupp och 
parallell kontrollgrupp för lösningsmedel/vehikel). De statistiska analyserna 
kan inbegripa t.ex. linjär regression eller Williams test för utvärdering av dos-responstrender och Dunnetts test för parvisa jämförelser. Vid valet av en lämplig metod för den statistiska analysen bör man vara medveten om 
eventuella olikheter hos varianserna och andra relaterade problem som kan 
göra det nödvändigt att göra en datatransformation eller en icke-parametrisk statistisk analys. Det kan också vara nödvändigt att genomföra beräkningar av stimulationsindex och statistiska analyser med och utan vissa datapunk ­
ter (s.k. outliers – utanförliggande värden).
 
DATA OCH RAPPORTERING  
Data  
34. Data sammanställs i tabellform med angivelse av RLU-värden per djur, 
gruppens medelvärde för RLU per djur, den associerade feltermen (t.ex. SD, SEM) och medelvärdet för stimulationsindex för varje dosgrupp jäm ­
fört med den parallella kontrollgruppen för lösningsmedel/vehikel.
 
Testrapport  
35. Testrapporten ska innehålla nedan angivna uppgifter. 
Test- och kontrollkemikalier 
— Identifieringsdata (t.ex. CAS-nummer och EG-nummer, om tillgängligt, 
källa, renhet, kända orenheter, satsnummer). 
— Fysikalisk natur och fysikalisk-kemiska egenskaper (t.ex. flyktighet, 
stabilitet, löslighet). 
— För blandningar anges sammansättning och beståndsdelarnas relativa 
procentandelar. 
Lösningsmedel/vehikel — Identifieringsdata (renhet, koncentration (om tillämpligt), volym som 
har använts). 
— Motivering för val av vehikel.
 ▼M3 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 739
 
Testdjur 
— CBA-mössens ursprung. — Mikrobiologiska data för djuren, om dessa data är kända. — Antal djur och deras ålder. — Ursprung, inhysningsförhållanden, foder och dylikt. Testbetingelser — Ursprung, satsnummer och tillverkarens kvalitetsintyg/kvalitetskontroll ­
data för ATP-kit. 
— Detaljerade uppgifter om beredning och applicering av testämnet. — Motivering för valet av dos (även resultat från preliminär screening om 
sådan har genomförts). 
— Koncentrationerna för vehikel och testämne samt totala mängden tes ­
tämne som applicerats. 
— Detaljerade uppgifter om foder- och vattenkvalitet (inbegripet diettyp/ 
källa, vattenkälla). 
— Detaljerad beskrivning av behandlings- och provtagningsscheman. — Metoder för mätningar av toxicitet. 
— Kriterier för att fastställa om resultatet är positivt eller negativt. 
— Uppgifter rörande eventuella avvikelser från protokollet och redogörelse 
för hur avvikelsen påverkar undersökningens utformning och resultat. 
Tillförlitlighetskontroll — Sammanfattning av resultaten från senaste tillförlitlighetskontroll, även 
information om testämne, koncentration och vehikel. 
— Data från parallella och/eller historiska positiva kontroller och parallella 
negativa kontroller (lösningsmedel/vehikel) för testningslaboratoriet. 
— Om försöket inte har omfattat parallell positiv kontroll, ange datum och 
laboratorierapport för senaste periodiska positiva kontroll och en rapport med uppgifter om laboratoriets historiska data för positiva kontroller 
som motivering för varför parallell positiv kontroll inte har använts. 
Resultat — Mössens individuella vikt vid doseringsstart och vid schemalagd avliv ­
ning samt medelvärde och associerad felterm (t.ex. SD, SEM) för varje behandlingsgrupp. 
— Tidpunkten för första upptäckt av tecken på toxicitet, även eventuell 
hudirritation vid appliceringsstället, för varje försöksdjur. 
— Tidpunkten för avlivning och tidpunkten för ATP-mätning per djur. — En tabell med RLU-värden och SI-värden per djur för varje dosbehand ­
lingsgrupp. 
— Medelvärde och associerad felterm (t.ex. SD, SEM) för RLU per mus 
för varje behandlingsgrupp och resultaten från analys av utanförlig ­
gande värden för varje behandlingsgrupp.
 ▼M3 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 740
 
— Beräknat stimulationsindex och ett lämpligt mått på variabilitet som 
beaktar variationen mellan djuren i testämnesgruppen och kontrollgrup ­
pen. 
— Förhållandet mellan dos och respons. — Statistisk analys, om tillämpligt. Diskussion om resultaten — En kort kommentar om resultaten, dos-responsanalys och statistiska 
analyser (i tillämpliga fall), med en slutsats om huruvida testämnet ska anses vara hudsensibiliserande.
 
HÄNVISNINGAR 
(1) OECD (2010),  Skin Sensitisation: Local Lymph Node Assay , Test Guideline 
No. 429, Guidelines for the Testing of Chemicals, OECD, Paris. Finns på: 
http://www.oecd.org/env/testguidelines 
(2) Chamberlain, M. och Basketter, D.A. (1996), The local lymph node assay: 
status of validation.  Food Chem, Toxicol ., 34, 999–1002. 
(3) Basketter, D.A., Gerberick, G.F., Kimber, I. och Loveless, S.E. (1996), The 
local lymph node assay: A viable alternative to currently accepted skin sensitisation tests.  Food Chem, Toxicol ., 34, 985–997. 
(4) Basketter, D.A., Gerberick, G.F. och Kimber, I. (1998), Strategies for iden ­
tifying false positive responses in predictive sensitisation tests.  Food Chem. 
Toxicol. , 36, 327–333. 
(5) Van Och, F.M.M., Slob, W., De Jong, W.H., Vandebriel, R.J. och Van 
Loveren, H. (2000), A quantitative method for assessing the sensitising potency of low molecular weight chemicals using a local lymph node assay: 
employment of a regression method that includes determination of uncerta ­
inty margins.  Toxicol ., 146, 49–59. 
(6) ICCVAM (1999), The murine local lymph node Assay: A test method for 
assessing the allergic contact dermatitis potential of chemicals/compounds: The results of an independent peer review evaluation coordinated by the 
Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative 
Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICETAM). NIH Publication No: 99–4494. Research Triangle Park, N.C. Finns på: 
http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/llna/llnarep.pdf 
(7) Dean, J.H., Twerdok, L.E., Tice, R.R., Sailstad, D.M., Hattan, D.G., Stokes, 
W.S. (2001), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: II. Conclusions and recommendations of an independent scientific peer review panel.  Reg. Toxicol. Pharmacol.  34, 258–273. 
(8) Haneke, K.E., Tice, R.R., Carson, B.L., Margolin, B.H., Stokes, W.S. 
(2001), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: III. 
Data analyses completed by the national toxicology program interagency 
center for the evaluation of alternative toxicological methods.  Reg. Toxicol. 
Pharmacol. 34 , 274–286. 
(9) Sailstad, D.M., Hattan, D., Hill, R.N., Stokes, W.S. (2001), ICCVAM 
evaluation of the murine local lymph node assay: I. The ICCVAM review 
process.  Reg. Toxicol. Pharmacol.  34, 249–257. 
(10) ICCVAM (2010), ICCVAM Test Method Evaluation Report. Nonradio ­
active local lymph node assay: modified by Daicel Chemical Industries, Ltd, based on ATP content test method protocol (LLNA: DA). NIH Pub ­
lication No. 10–7551A/B. Research Triangle Park, NC: National Institute of 
Environmental Health Sciences. Finns på: http://iccvam.niehs.nih.gov/ 
methods/immunotox/llna-DA/TMER.htm
 ▼M3 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 741
 
(11) ICCVAM (2009), Independent Scientific Peer Review Panel Report: Updated 
validation status of new versions and applications of the murine local lymph 
node assay: a test method for assessing the allergic contact dermatitis potential of chemicals and products. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Finns på: http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/ 
immunotox_docs/LLNAPRPRept2009.pdf. 
(12) Idehara, K., Yamagishi, G., Yamashita, K. och Ito, M. (2008), Characteriza ­
tion and evaluation of a modified local lymph node assay using ATP content as a non-radio isotopic endpoint.  J. Pharmacol. Toxicol. Meth. , 58, 1–10. 
(13) Omori, T., Idehara, K., Kojima, H., Sozu, T., Arima, K., Goto, H., Hanada, 
T., Ikarashi, Y., Inoda, T., Kanazawa, Y., Kosaka, T., Maki, E., Morimoto, 
T., Shinoda, S., Shinoda, N., Takeyoshi, M., Tanaka, M., Uratani, M., Usami, M., Yamanaka, A., Yoneda, T., Yoshimura, I. och Yuasa, A. (2008), Interlaboratory validation of the modified murine local lymph 
node assay based on adenosine triphosphate measurement.  J. Pharmacol. 
Toxicol. Meth. , 58, 11–26. 
(14) OECD (1992),  Skin Sensitisation , Test Guideline No. 406, Guidelines for 
Testing of Chemicals, OECD, Paris. Finns på: http://www.oecd.org/env/ 
testguidelines 
(15) Kreiling, R., Hollnagel, H.M., Hareng, L., Eigler, L., Lee, M.S., Griem, P., 
Dreessen, B., Kleber, M., Albrecht, A., Garcia, C. och Wendel, A. (2008), Comparison of the skin sensitising potential of unsaturated compounds as 
assessed by the murine local lymph node assay (LLNA) and the guinea pig 
maximization test (GPMT).  Food Chem. Toxicol ., 46, 1896–1904. 
(16) Basketter, D., Ball, N., Cagen, S., Carrillo, J.C., Certa, H., Eigler, D., 
Garcia, C., Esch, H., Graham, C., Haux, C., Kreiling, R. och Mehling, 
A. (2009), Application of a weight of evidence approach to assessing 
discordant sensitisation datasets: implications for REACH.  Reg. Toxicol. 
Pharmacol ., 55, 90–96. 
(17) Crouch, S.P., Kozlowski, R., Slater, K.J. och Fletcher J. (1993), The use of 
ATP bioluminescence as a measure of cell proliferation and cytotoxicity.  
J. Immunol. Meth ., 160, 81–88. 
(18) Ishizaka, A., Tono-oka, T. och Matsumoto, S. (1984), Evaluation of the 
proliferative response of lymphocytes by measurement of intracellular ATP.  
J. Immunol. Meth ., 72, 127–132. 
(19) Dexter, S.J., Cámara, M., Davies, M. och Shakesheff, K.M. (2003), 
Development of a bioluminescent ATP assay to quantify mammalian and bacterial cell number from a mixed population.  Biomat. , 24, 27–34. 
(20) Lundin A. (2000), Use of firefly luciferase in ATP-related assays of 
biomass, enzymes, and metabolites.  Meth. Enzymol ., 305, 346–370. 
(21) ILAR (1996), Institute of Laboratory Animal Research (ILAR)  Guide for 
the Care and Use of Laboratory Animals.  7th ed. Washington, DC: 
National Academies Press. 
(22) ICCVAM (2009), Recommended Performance Standards: Murine Local 
Lymph Node Assay, NIH Publication Number 09–7357, Research Triangle 
Park, NC: National Institute of Environmental Health Science. Finns på: http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/llna-ps/LLNAPerfStds.pdf 
(23) McGarry, H.F. (2007), The murine local lymph node assay: regulatory and 
potency considerations under REACH.  Toxicol ., 238, 71–89. 
(24) Kimber, I., Dearman, R.J., Scholes E.W. och Basketter, D.A. (1994), The 
local lymph node assay: developments and applications.  Toxicol ., 93, 
13–31. 
(25) OECD (2002),  Acute Dermal Irritation/Corrosion , Test Guideline No. 404, 
Guidelines for Testing of Chemicals, OECD, Paris. Finns på: 
http://www.oecd.org/env/testguidelines
 ▼M3 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 742
 
(26) Reeder, M.K., Broomhead, Y.L., DiDonato, L. och DeGeorge, G.L. (2007), 
Use of an enhanced local lymph node assay to correctly classify irritants 
and false positive substances.  Toxicologist , 96, 235. 
(27) ICCVAM (2009), Nonradioactive Murine Local Lymph Node Assay: Flow 
Cytometry Test Method Protocol (LLNA: BrdU-FC) Revised Draft Background Review Document. Research Triangle Park, NC: National Insti ­
tute of Environmental Health Sciences. Finns på: http://iccvam.niehs.nih.gov/ 
methods/immunotox/fcLLNA/BRDcomplete.pdf 
(28) Hayes, B.B., Gerber, P.C., Griffey, S.S. och Meade, B.J. (1998), Contact 
hypersensitivity to dicyclohexylcarbodiimide and diisopropylcarbodiimide in female B6C3F1 mice.  Drug. Chem. Toxicol ., 21, 195–206. 
(29) Homey, B., von Schilling, C., Blumel, J., Schuppe, H.C., Ruzicka, T., Ahr, 
H.J., Lehmann, P. och Vohr, V.W. (1998), An integrated model for the differentiation of chemical-induced allergic and irritant skin reactions.  
Toxicol. Appl. Pharmacol. , 153, 83–94. 
(30) Woolhiser, M.R., Hayes, B.B. and Meade, B.J. (1998), A combined murine 
local lymph node and irritancy assay to predict sensitisation and irritancy 
potential of chemicals.  Toxicol. Meth. , 8, 245–256. 
(31) Hayes, B.B. och Meade, B.J. (1999), Contact sensitivity to selected acrylate 
compounds in B6C3F1 mice: relative potency, cross reactivity, and compa ­
rison of test methods.  Drug Chem. Toxicol ., 22, 491–506. 
(32) Ehling, G., Hecht, M., Heusener, A., Huesler, J., Gamer, A.O., van Love ­
ren, H., Maurer, T., Riecke, K., Ullmann, L., Ulrich, P., Vandebriel, R. och Vohr, H.W. (2005), A European inter-laboratory validation of alternative endpoints of the murine local lymph node assay: first round.  Toxicol ., 212, 
60–68. 
(33) Vohr, H.W. och Ahr, H.J. (2005), The local lymph node assay being too 
sensitive?  Arch. Toxicol ., 79, 721–728. 
(34) Patterson, R.M., Noga, E. och Germolec, D. (2007), Lack of evidence for 
contact sensitisation by Pfiesteria extract.  Environ. Health Perspect ., 115, 
1023–1028. 
(35) ICCVAM (2009), Report on the ICCVAM-NICEATM/ECVAM/JaCVAM 
Scientific Workshop on Acute Chemical Safety Testing: Advancing  In Vitro  
Approaches and Humane Endpoints for Systemic Toxicity Evaluations. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health 
Sciences. Finns på: http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/acutetox/ 
Tox_workshop.htm 
(36) OECD (2000),  Guidance Document on the Recognition, Assessment and 
Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals 
Used in Safety Evaluation , Environmental Health and Safety Monograph 
Series on Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Paris. Finns på: http://www.oecd.org/env/testguidelines 
(37) Kimber, I., Hilton, J., Dearman, R.J., Gerberick, G.F., Ryan, C.A., 
Basketter, D.A., Lea, L., House, R.V., Ladies, G.S., Loveless, S.E. och 
Hastings, K.L. (1998), Assessment of the skin sensitisation potential of 
topical medicaments using the local lymph node assay: An interlaboratory exercise.  J. Toxicol. Environ. Health , 53 563–79. 
(38) OECD (2005),  Guidance Document on the Validation and International 
Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment , 
Environment, Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 34, ENV/JM/MONO(2005)14, OECD, Paris. Finns på: http://www.oecd.org/env/testguidelines
 ▼M3 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 743
 
Tillägg 1  
DEFINITIONER  
Exakthet:  Mått på hur väl testmetodresultaten och de godtagna referensvärdena 
överensstämmer med varandra. Exakthet är ett mått på testmetodens prestanda 
och en relevansaspekt. Detta begrepp används ofta omväxlande med ”konkor ­
dans” för att beskriva andelen korrekta resultat med en testmetod (38).  
Referensämne:  Sensibiliserande eller icke-sensibiliserande ämne som används 
som standard för jämförelse med ett testämne. Ett referensämne ska ha följande egenskaper: i) en eller flera enhetliga och tillförlitliga källor, ii) strukturell och 
funktionell likhet med den ämnesklass som testas, iii) kända fysikalisk-kemiska 
egenskaper, iv) stödjande data om kända effekter och v) känd styrka inom det önskade responsområdet.  
Falsk negativt:  Ett ämne som felaktigt har identifierats som negativt eller 
icke-aktivt genom en testmetod när ämnet i själva verket är positivt eller aktivt.  
Falskt positivt:  Ett ämne som felaktigt har identifierats som positivt eller aktivt 
genom en testmetod när ämnet i själva verket är negativt eller icke-aktivt.  
Fara:  Potentialen för skadliga verkningar på hälsa eller miljö. De skadliga verk ­
ningarna visar sig enbart om exponeringsnivån är tillräcklig.  
Reproducerbarhet mellan laboratorier:  Ett mått på i hur stor utsträckning olika 
kvalificerade laboratorier kan producera kvalitativt och kvantitativt liknande re ­
sultat, med användning av samma protokoll och samma testämnen. Reproducer ­
barheten mellan laboratorier fastställs under förvalideringen och valideringen och den indikerar i hur stor utsträckning ett test framgångsrikt kan överföras mellan 
laboratorier (38).  
Reproducerbarhet inom laboratoriet:  Ett mått på i vilken utsträckning kvalifice ­
rade personer inom samma laboratorium framgångsrikt kan upprepa resultat vid olika tidpunkter när de använder ett visst protokoll.  
Utanförliggande värde:  Ett utanförliggande värde (”outlier”) är en observation 
som markant skiljer sig från de övriga värdena i ett slumpmässigt urval från en 
population.  
Kvalitetssäkring:  En styrningsprocess där personer som är i oberoende ställning i 
förhållande till de personer som genomför testningen bedömer hur standarder, krav och registreringsförfaranden för laboratorietestning följs och hur exakt data 
förmedlas.  
Tillförlitlighet:  Ett mått på i vilken utsträckning en testmetod kan reproduceras 
inom och mellan laboratorier över tiden när metoden utförs med samma pro ­
tokoll. Den bedöms genom att man beräknar reproducerbarheten inom och mel ­
lan laboratorier (38).  
Hudsensibilisering:  En immunologisk process som följer av att en mottaglig 
individ exponeras ytvägen för en inducerande kemisk allergen som provocerar en kutan immunrespons som kan leda till att det uppstår kontaktsensibilisering.  
Stimulationsindex (SI):  Ett värde som beräknas för att bedöma hudsensibiliserings ­
potentialen hos ett testämne och som är förhållandet mellan proliferationen i 
behandlingsgrupperna och proliferationen i den parallella vehikelkontrollgruppen.  
Testämne (kallas också testkemikalie):  Alla ämnen eller blandningar som testas 
med denna testmetod.
 ▼M3 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 744
 
B.51.  HUDSENSIBILISERING: LLNA-METODEN (LOCAL LYMPH 
NODE ASSAY): BrdU-ELISA  
INLEDNING 
1. OECD:s riktlinjer för testning av kemikalier (OECD Guidelines for the 
Testing of Chemicals) och EU:s testmetoder ses regelbundet över med hän ­
syn till den vetenskapliga utvecklingen, nya lagstiftningsbehov och djurens 
välbefinnande. Den första testmetoden (B.42) för bestämning av hudsensi ­
bilisering hos möss (LLNA-metoden, OECD:s testriktlinje 429) har revide ­
rats (1 och kapitel B.42 i denna bilaga). Närmare uppgifter om valideringen av LLNA och en översikt av arbetet i samband med denna har offentligg ­
jorts (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9). I LLNA-metoden används radioisotopiskt 
tymidin eller jod för att mäta lymfocytproliferation och metoden har därför begränsad användning när det förekommer problem med att anskaffa, an ­
vända eller bortskaffa radioaktivitet. LLNA: BrdU-ELISA (Enzyme-Linked 
Immunosorbent Assay) är en icke-radioaktiv modifikation av 
LLNA-testmetoden och i den används icke-radiomärkt 5-bromo-2-deoxiuri ­
din (BrdU) (CAS-nummer 59-14-3) i ett ELISA-baserat testsystem för mät ­
ning av lymfocytproliferation. LLNA: BrdU-ELISA har validerats, granskats 
och rekommenderats av en internationell oberoende expertutvärderingspanel 
som konstaterade att den kan användas för att identifiera hudsensibiliserande och icke-hudsensibiliserande kemikalier, med vissa begränsningar (10) (11) (12). Testmetoden är avsedd för bedömning av kemikaliers (ämnens och 
blandningars) potential att framkalla hudsensibilisering hos djur. Enligt ka ­
pitel B.6 i denna bilaga och i OECD:s testriktlinje 406 används test på marsvin, särskilt maximeringstest på marsvin och Buehler-test (13). LLNA (kapitel B.42 i denna bilaga; OECD:s testriktlinje 429) och de två 
icke-radioaktiva modifikationerna LLNA: BrdU-ELISA (kapitel B.51 i 
denna bilaga; OECD:s testriktlinje 442 B) och LLNA: DA (kapitel B.50 i denna bilaga; OECD:s testriktlinje 442 A) ger fördelar jämfört med mars ­
vinstest enligt B.6 och OECD:s testriktlinje 406 (13) genom möjligheten att 
minska antalet djur och behandla dem på ett skonsammare sätt. 
2. I likhet med LLNA används LLNA: BrdU-ELISA för att undersöka hud ­
sensibiliseringens induktionsfas, vilket ger tillgång till kvantitativa data som är lämpliga för dos-responsbedömning. Vidare gäller att de här metodernas 
förmåga att upptäcka hudsensibiliserande kemikalier utan att det behövs 
radiomärkning för DNA eliminerar risken för yrkesmässig exponering för radioaktivitet och problem rörande bortskaffning av avfall. Detta kan i sin tur ge möjlighet till ökad användning av möss för att upptäcka hudsensi ­
biliserande ämnen, vilket ytterligare kan minska användningen av marsvin 
för att testa kemikaliers hudsensibiliserande potential (dvs. B.6; OECD:s testriktlinje 406) (13).
 
DEFINITIONER 
3. Definitioner av begreppen finns i tillägg 1.  
INLEDANDE ÖVERVÄGANDEN OCH BEGRÄNSNINGAR 
4. LLNA: BrdU-ELISA är en modifierad LLNA-metod för identifiering av 
kemikalier med potential att framkalla hudsensibilisering, med specifika begränsningar. Detta betyder dock inte nödvändigtvis att LLNA: 
BrdU-ELISA alltid ska användas i stället för LLNA eller test på marsvin 
(dvs. B.6; OECD:s testriktlinje 406) (13), utan att metoden är likvärdig och kan användas som ett alternativ i fall där positiva och negativa resultat i regel inte kräver någon ytterligare bekräftelse (10) (11). Testningslaborato ­
riet bör analysera all tillgänglig information om testämnet innan själva test ­
ningen genomförs. Sådan information inbegriper ämnets identitet och
 ▼M3 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 745
 
kemiska struktur, fysikalisk-kemiska egenskaper, resultaten från andra even ­
tuella  in vitro - eller  in vivo -test avseende toxicitet samt toxikologiska data 
om strukturellt närbesläktade kemikalier. Denna information bör övervägas för att kunna fastställa om LLNA: BrdU-ELISA-metoden är lämplig för testämnet (mot bakgrund av att metoden inte kan användas för vissa typer 
av kemikalier, se punkt 5) och som stöd för valet av dos. 
5. LLNA: BrdU-ELISA är en  in vivo -metod, och därför kan man inte undvika 
användningen av djur för bedömning av sensibilisering genom allergisk 
kontakt. Metoden ger dock möjligheter att använda färre djur för detta 
ändamål i jämförelse med test på marsvin (B.6; OECD:s testriktlinje 406) (13). Dessutom ger LLNA: BrdU-ELISA möjlighet till en betydligt skon ­
sammare behandling av djuren för testning av sensibilisering genom all ­
ergisk kontakt, eftersom man med LLNA: BrdU-ELISA, till skillnad från 
B.6 och OECD:s testriktlinje 406, inte behöver framkalla provokationsindu ­
cerade dermala hypersensitivitetsreaktioner. Dessutom behöver adjuvant inte användas, vilket är fallet vid maximeringstest på marsvin (kapitel B.6 i 
denna bilaga, 13). LLNA: BrdU-ELISA är därför en mindre plågsam metod 
för djuren. Trots fördelarna med LLNA: BrdU-ELISA i jämförelse med B.6 och OECD:s testriktlinje 406 (13) finns det vissa begränsningar som gör att man kanske måste använda B.6 eller OECD:s testriktlinje 406 (t.ex. testning 
av vissa metaller, falska positiva resultat med vissa hudirriterande ämnen 
(såsom vissa ytaktiva ämnen (6) (1 och kapitel B.42 i denna bilaga), tes ­
tämnets löslighet)). Dessutom kan det för kemiska klasser eller ämnen som har funktionella grupper som påvisats agera som potentiella störfaktorer (15) 
vara nödvändigt att använda test på marsvin (dvs. B.6; OECD:s testriktlinje 
406 (13)). Det rekommenderas att de begränsningar som anges för LLNA (1 och kapitel B.42 i denna bilaga) även ska gälla för LLNA: BrdU-ELISA (10). Utöver sådana identifierade begränsningar bör LLNA: BrdU-ELISA gå 
att använda för testning av alla kemikalier, utom om en kemikalie förknip ­
pas med egenskaper som kan påverka LLNA: BrdU-ELISA-metodens ex ­
akthet. Dessutom bör överväganden göras rörande möjligheten till positiva gränsresultat, när man erhåller värden för stimulationsindex mellan 1,6 och 
1,9 (se punkterna 31–32). Detta grundar sig på valideringsdatabasen med 43 
ämnen och användning av SI ≥ 1,6 (se punkt 6) för vilka LLNA: 
BrdU-ELISA ger korrekt identifiering av alla 32 sensibiliserande ämnen enligt LLNA men felaktig identifiering av 2 av 11 icke-sensibiliserande 
ämnen enligt LLNA med SI-värden mellan 1,6 och 1,9 (dvs. på gränsen 
till positivt) (10). Eftersom samma datauppsättning användes för att fastställa SI-värdena och beräkna testmetodens förutsägande egenskaper kan dock de angivna resultaten vara en överuppskattning av de faktiska förutsägande 
egenskaperna.
 
PRINCIP FÖR TESTMETODEN 
6. LLNA: BrdU-ELISA bygger på principen om att sensibiliserande ämnen 
inducerar en primär proliferation av lymfocyter i de lymfnoder som dränerar 
det område där testämnet appliceras. Denna proliferation står i proportion till den applicerade dosen och det allergiframkallande ämnets styrka, och är ett enkelt sätt att få en kvantitativ mätning av sensibiliseringen. Proliferationen 
mäts genom att jämföra medelproliferationen i varje testgrupp med medel ­
proliferationen i den vehikelbehandlade kontrollgruppen. Förhållandet mel ­
lan medelproliferationen i respektive behandlingsgrupp och den parallella vehikelkontrollgruppen, kallat stimulationsindex (SI), bestäms och detta 
bör vara ≥ 1,6 för att det ska vara motiverat att klassificera testämnet 
som potentiellt hudsensibiliserande ämne. De förfaranden som beskrivs
 ▼M3 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 746
 
här grundar sig på mätning av BrdU-innehållet för att indikera ett ökat antal 
prolifererande celler i de aurikulära dränerande lymfnoderna. BrdU är ett 
analogt ämne med tymidin och inkorporeras på liknande sätt in i DNA i prolifererande celler. Inkorporeringen av BrdU mäts med ELISA med hjälp av en antikropp som är specifik för BrdU som också märks med peroxidas. 
När substratet tillsätts reagerar peroxidas med detta och det uppstår en 
färgad produkt som kvantifieras vid en specifik absorbans genom avläsning av en mikrotiterplatta.
 
TESTBESKRIVNING  
Val av djurart  
7. För detta test används mus. Valideringsstudier för LLNA: BrdU-ELISA 
genomfördes uteslutande med stammen CBA/JN som därför anses vara den stam som är att föredra (10) (12). I testet används unga vuxna mushonor 
som inte har fött ungar och som inte är dräktiga. När försöket inleds bör 
djuren vara 8–12 veckor gamla. Djurens viktvariation bör vara minimal och får inte överskrida 20 % av medelvikten. Övriga stammar eller hanar kan 
användas som alternativ förutsatt att det finns tillräckliga data som stöd för 
att det inte förekommer några betydande stam- eller könsberoende skillnader i LLNA: BrdU-ELISA-respons.
 
Inhysnings- och utfodringsförhållanden  
8. Mössen ska inhysas i grupper (16), utom om det finns tillbörlig vetenskaplig 
motivering för individuell inhysning. Temperaturen i testdjurens utrymmen bör vara 22 ± 3 °C. Den relativa fuktigheten bör vara minst 30 % och ska 
helst inte överstiga 70 %, utom när rummet rengörs. Målvärdet bör dock 
vara 50–60 %. Belysningen bör vara artificiell med omväxlande 12 timmar ljus och 12 timmar mörker. För utfodringen kan konventionellt laboratorie ­
foder användas, och djuren bör ha obegränsad tillgång till dricksvatten.
 
Förberedelse av djuren  
9. Djuren väljs ut slumpmässigt och förses med märkning så att de kan iden ­
tifieras individuellt (öronmärkning får dock inte användas). Därefter får 
djuren acklimatisera sig till laboratoriets förhållanden i sina burar i minst 
fem dagar före doseringsstart. Innan behandlingen inleds undersöks alla djur för att säkerställa att de inte har några synliga hudskador.
 
Förberedelse av doseringslösningar  
10. Kemikalier i fast form ska upplösas eller suspenderas i lösningsmedel/vehi ­
kel och vid behov spädas ut före appliceringen på mössens öron. Kemikalier i vätskeform kan appliceras i ren eller utspädd form. Olösliga kemikalier, av 
den typ som ofta används i medicintekniska produkter, ska extraheras kraf ­
tigt i lämpligt lösningsmedel så att alla extraherbara beståndsdelar för test ­
ning fås ut. Testlösningarna ska beredas dagligen utom om stabilitetsdata visar att lagring kan accepteras.
 
Tillförlitlighetskontroll  
11. Positiva kontrollkemikalier används för att påvisa att testsystemet har till ­
räcklig och reproducerbar känslighet för ett sensibiliserande testämne och en 
respons med välkarakteriserad styrka. Användningen av en parallell positiv 
kontroll rekommenderas eftersom den påvisar laboratoriets kompetens att genomföra testningar på ett framgångsrikt sätt och ger möjlighet till bedöm ­
ning av reproducerbarhet och jämförbarhet inom laboratoriet och mellan 
laboratorier. Vissa tillsynsmyndigheter kräver också att positiv kontroll an ­
vänds för varje undersökning, och därför uppmuntras laboratorierna att
 ▼M3 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 747
 
samråda med relevanta myndigheter innan testning med LLNA: 
BrdU-ELISA inleds. Likaså uppmuntras rutinanvändning av parallell positiv 
kontroll för att undvika tilläggstestning på djur för att uppfylla krav som kan uppstå från användningen av periodisk positiv kontroll (se punkt 12). Den positiva kontrollen bör ge en positiv LLNA: BrdU-ELISA-respons på den 
exponeringsnivå som förväntas ge en ökning av stimulationsindex (SI) som 
är större eller lika med 1,6 i förhållande till negativa kontrollgruppen. Dosen av den positiva kontrollkemikalien ska väljas så att den inte orsakar särskilt kraftig hudirritation eller systemisk toxicitet och att induktionen är repro ­
ducerbar men inte för kraftig (t.ex. SI > 14 anses vara för högt värde). 
Rekommenderade ämnen för positiv kontroll är 25-procentig hexylkanelal ­
dehyd (CAS-nummer 101-86-0) och 25-procentig eugenol (CAS-nummer 97-53-0) i aceton-olivoljeblandning i förhållandet 4:1 (volym/volym). I vissa 
fall kan även andra positiva kontrollkemikalier som uppfyller de ovan an ­
givna kriterierna användas, förutsatt att tillbörlig motivering kan ges. 
12. Även om användning av en parallell positiv kontrollgrupp rekommenderas 
kan det finnas betingelser där det är tillräckligt med periodisk testning (dvs. 
minst var sjätte månad) av den positiva kontrollen i laboratorier som regel ­
bundet genomför LLNA: BrdU-ELISA (dvs. minst en gång i månaden) och som har en etablerad historisk databas över positiv kontroll som påvisar 
laboratoriets förmåga att få reproducerbara och exakta resultat från positiva 
kontroller. Tillräcklig kvalitet hos LLNA: BrdU-ELISA kan framgångsrikt påvisas genom att enhetliga positiva resultat erhålls från den positiva kont ­
rollen vid minst tio oberoende testningar som genomförs inom en skälig 
tidsperiod (dvs. kortare än ett år). 
13. Parallell positiv kontrollgrupp ska alltid användas när det sker ändringar 
rörande testningsförfarandet (t.ex. ny personal, nya material och/eller rea ­
genser, annorlunda utrustning, byte av testdjurens ursprung), och sådana ändringar bör dokumenteras i laboratorierapporter. Man bör överväga om dessa ändringar påverkar den tidigare etablerade historiska databasens lämp ­
lighet, för att kunna avgöra om det behövs en ny historisk databas för 
dokumentering av den positiva kontrollens resultatenhetlighet. 
14. Man bör vara medveten om att beslut om att använda positiva kontroller 
med vissa intervaller i stället för parallellt har återverkningar på lämplighe ­
ten och godtagbarheten hos negativa undersökningsresultat som fås utan parallell positiv kontroll under den tid som löper mellan de periodiska 
undersökningarna med positiv kontroll. Om man t.ex. får falska negativa 
resultat vid ett periodiskt test av positiv kontroll, måste man kanske ifrågas ­
ätta resultat som erhållits mellan det sista godtagbara periodiska testet med positiv kontroll och ett icke-godtagbart periodiskt test med positiv kontroll. 
Följderna av dessa utfall bör övervägas noggrant när man avgör huruvida 
parallella positiva kontroller ska användas eller om de positiva kontrollerna enbart ska vara periodiska. Likaså bör man överväga användning av färre djur i den parallella positiva kontrollgruppen när detta är vetenskapligt 
motiverat och laboratoriet med stöd av laboratoriespecifika historiska data 
kan påvisa att färre möss kan användas (17). 
15. Även om det positiva kontrollämnet bör testas i en vehikel som veterligen 
framkallar en enhetlig respons (t.ex. aceton-olivoljeblandning i förhållandet 
4:1 (volym/volym)), kan det förekomma vissa föreskriftsreglerade situationer där det även behövs testning i en icke-standardmässig vehikel (kliniskt och kemiskt relevant formulering) (18). Om det parallella positiva kontrollämnet 
testas i en annan vehikel än den som används för testämnet, bör en separat 
kontrollgrupp användas för den parallella positiva kontrollen.
 ▼M3 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 748
 
16. I fall där utvärdering görs av testämnen av en viss kemisk klass eller med en 
viss responsskala kan det också vara värdefullt med referensämnen för att 
påvisa att testmetoden fungerar tillfredsställande för bestämning av hudsen ­
sibiliseringspotentialen hos dessa typer av testämnen. Ett lämpligt referens ­
ämne ska ha följande egenskaper: 
— Strukturell och funktionell likhet med den ämnesklass som testas. — Kända fysikalisk-kemiska egenskaper. — Stödjande data från LLNA: BrdU-ELISA. 
— Stödjande data från andra djurmodeller och/eller från människor.
 
TESTFÖRFARANDE  
Antalet djur och dosnivåer  
17. Minst fyra djur per dosgrupp och minst tre koncentrationer av testämnet bör 
användas. Dessutom används en parallell negativ kontrollgrupp som endast 
behandlas med samma vehikel som används för testämnet och en grupp för positiv kontroll (parallell eller nyligen gjord, enligt laboratoriets principer 
för överväganden enligt punkterna 11–15). Man bör överväga flera upp ­
repade doser av det positiva kontrollämnet, särskilt när den positiva kont ­
rollen testas periodiskt. Med undantag för behandling med testämnet bör djuren i kontrollgrupperna hanteras på exakt samma sätt som djuren i dos ­
grupperna. 
18. Doser och vehikel väljs på grundval av rekommendationerna i hänvisning ­
arna 2 och 19. Doserna väljs i regel enligt en lämplig koncentrationsserie 
såsom 100 %, 50 %, 25 %, 10 %, 5 %, 2,5 %, 1 %, 0,5 %, osv. Valet av koncentrationsserie ska ges tillbörlig vetenskaplig motivering. All existe ­
rande tillgänglig och relevant toxikologisk information (t.ex. akut toxicitet 
och hudirritation) samt strukturell och fysikalisk-kemisk information om 
testämnet (och/eller strukturellt besläktade ämnen) bör övervägas vid valet av de tre på varandra följande koncentrationerna så att den högsta koncent ­
rationen ger maximal exponering samtidigt som systemisk toxicitet och sär ­
skilt kraftig lokal hudirritation undviks (19) (20 och kapitel B.4 i denna 
bilaga). Om sådan information inte finns kan det vara nödvändigt att först genomföra ett preliminärt screeningtest (se punkterna 21–24). 
19. Vehikeln får inte störa eller snedvrida testresultaten och ska väljas med 
tanke på största möjliga löslighet för att få högsta möjliga koncentration samtidigt som man får en lösning/suspension som är lämplig för applicering 
av testämnet. Som vehikel rekommenderas aceton-olivoljeblandning (4:1 
volym/volym),  N,N -dimetylformamid, metyletylketon, propylenglykol och 
dimetylsulfoxid (6) men även andra vehiklar kan användas förutsatt att till ­
räcklig vetenskaplig motivering kan ges. I vissa situationer kan det vara 
nödvändigt att som extra kontroll använda ett kliniskt relevant lösnings ­
medel eller en kommersiellt tillgänglig blandning där testämnet ingår. Sär ­
skild vikt bör fästas vid att se till att hydrofila testämnen inkorporeras i ett vehikelsystem som väter huden och som inte omedelbart rinner bort, genom 
att använda lämpliga solubiliserande ämnen (t.ex. 1-procentig Pluronic® 
L92). Det betyder att helt vattenbaserade vehiklar bör undvikas.
 ▼M3 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 749
 
20. Genom analys av lymfnoder från individuella möss kan man bestämma 
variationer djuren emellan och göra en statistisk jämförelse av skillnaden 
mellan mätningar för testämnet och mätningarna i vehikelkontrollgruppen (se punkt 33). Dessutom kan möjligheten att minska antalet möss i den positiva kontrollgruppen endast övervägas utifrån att data samlas in indi ­
viduellt per djur (17). Vidare gäller att vissa tillsynsmyndigheter kräver att 
data insamlas per individuellt djur. Regelbunden insamling av individuella data per djur ger en fördel rörande djurens välbefinnande eftersom upprepad testning undviks som annars skulle behövas om testämnesresultat som ur ­
sprungligen har samlats in på ett visst sätt (t.ex. genom poolade djurdata) 
måste granskas senare av tillsynsmyndigheter som har avvikande krav (så ­
som data per individuellt djur).
 
Preliminärt screeningtest  
21. Om det inte finns tillgång till information för att bestämma högsta testdosen 
(se punkt 18) bör ett preliminärt screeningtest genomföras för att definiera 
den lämpliga dosnivån för test i LLNA: BrdU-ELISA. Syftet med det pre ­
liminära screeningtestet är att få vägledning för valet av högsta dosnivå i huvudundersökningen, i fall där information saknas om vilken koncentration 
som inducerar systemisk toxicitet (se punkt 24) och/eller särskilt kraftig 
lokal hudirritation (se punkt 23). Den högsta dosnivå som testas ska vara 100 % testämne för vätskor eller högsta möjliga koncentration för fasta ämnen eller suspensioner. 
22. Det preliminära screeningtestet genomförs under identiska betingelser som 
vid den huvudsakliga LLNA: BrdU-ELISA-undersökningen, utom att man inte utvärderar proliferationen i lymfnoderna och man kan använda färre djur i dosgruppen. Ett eller två djur per dosgrupp föreslås. Alla möss ob ­
serveras dagligen för kliniska tecken på systemisk toxicitet eller lokal irri ­
tation på appliceringsstället. Djurens kroppsvikt registreras före testningen och efter avslutad testning (dag 6). För varje mus observeras båda öronen för hudrodnad och graderas enligt tabell 1 (20 och kapitel B.4 i denna 
bilaga). Mätning av örontjocklek görs t.ex. med digital mikrometer eller 
Peacock Dial-instrument på dag 1 (före dosering), dag 3 (cirka 48 timmar efter den första dosen) och på dag 6. Dessutom kan örontjockleken bestäm ­
mas på dag 6 genom vägning av en öronbit som stansas ut efter skonsam 
avlivning. Särskilt kraftig lokal hudirritation indikeras genom hudrodnads ­
gradering ≥ 3 och/eller ökning av örontjockleken med ≥ 25 % på någon av 
mätningsdagarna (21) (22). Den högsta dos som väljs för huvudundersök ­
ningen blir nästa lägre dos i den preliminära screeningens koncentrations ­
serie (se punkt 18) som inte inducerar systemisk toxicitet och/eller särskilt 
kraftig hudirritation.
 
Tabell 1  
Grader av hudrodnad  
Observation Gradering  
Ingen hudrodnad 0 
Mycket svag rodnad (knappt skönjbar) 1 Väldefinierad hudrodnad 2
 ▼M3 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 750
 
Observation Gradering  
Moderat till svår hudrodnad 3 
Svår hudrodnad (köttrodnad) till sårskorpebildning som utgör 
hinder för gradering av rodnaden 4 
23. För identifiering av irriterande ämnen med LLNA har man utöver en 25- 
procentig ökning av örontjocklek (21) (22) också använt statistiskt signifi ­
kant ökning av örontjockleken hos behandlingsgruppens möss i jämförelse med kontrollgruppens möss (22) (23) (24) (25) (26) (27) (28). Dock så 
gäller att även om statistiskt signifikanta ökningar kan inträffa när ökningen 
av örontjocklek är mindre än 25 %, har dessa inte specifikt förknippats med särskilt kraftig irritation (25) (26) (27) (28) (29). 
24. Följande kliniska observationer kan indikera systemisk toxicitet (30) när de 
används som del av en helhetsbedömning och kan således ge indikation om 
den högsta dosnivå som ska användas i huvudundersökningen: ändringar av nervsystemets funktion (t.ex. upprest päls, ataxi, skälvningar och konvulsio ­
ner), ändringar av beteende (t.ex. aggressivitet, ändringar av putsningsbete ­
ende, markerad ändring av aktivitetsnivå), ändringar av andningsmönster 
(dvs. ändringar av andningens frekvens och intensitet, såsom dyspné, gäs ­
pande och rassel) samt ändringar av födo- och vattenintag. Vid utvär ­
deringen ska man också beakta tecken på letargi och/eller avsaknad av 
reaktioner, alla slags kliniska tecken på mer än lätt eller momentan smärta 
eller lidande, minskning av kroppsvikten med mer än 5 % från dag 1 till dag 6 samt mortalitet. Döende djur och djur som visar tecken på svår smärta och lidande ska avlivas skonsamt (31).
 
Huvudundersökningens försöksschema  
25. För testet används följande försöksschema: 
— Dag 1:  Djuren märks individuellt och vikten samt eventuella kliniska 
observationer registreras. Applicera 25 μl lämpligt utspätt testämne, ren 
vehikel eller positivt kontrollämne (parallell eller nyligen utförd positiv 
kontroll, i enlighet med laboratoriets principer när det gäller punkterna 11–15) på båda öronens baksida. 
— Dagarna 2 och 3:  Upprepa appliceringen enligt dag 1. 
— Dag 4:  Ingen behandling. 
— Dag 5:  Injicera 0,5 ml (5 mg/mus) BrdU-lösning (10 mg/ml) intraperi ­
tonealt. 
— Dag 6:  Registrera vikten för varje djur och eventuella kliniska observa ­
tioner. Avliva djuren skonsamt cirka 24 timmar efter BrdU-injektionen. Skär bort de aurikulära dränerande lymfnoderna från varje musöra och behandla separat i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) för varje djur. När ­
mare uppgifter och scheman för identifiering och dissekering av noder 
finns i hänvisning (17). För ytterligare kontroll av lokal hudrespons i huvudundersökningen kan tilläggsparametrar såsom gradering av örats hudrodnad eller mätningar av örats tjocklek (med tjockleksmätare eller 
genom vägning av utstansad bit vid obduceringen) införlivas i under ­
sökningsprotokollet.
 ▼M3 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 751
 
Beredning av cellsuspensioner  
26. För varje mus bereds en suspension med enskilda celler av 
lymfnodsceller (LNC) från de bilateralt bortskurna lymfnoderna genom för ­
siktig mekanisk sönderdelning med hjälp av ett nät av rostfritt stål (200 mesh) eller annan godkänd teknik för beredning av en suspension med enskilda celler (t.ex. sönderdelning av lymfnoderna i en engångsmortel av 
plast åtföljt av passage genom ett nylonnät (70 mesh)). Förfarandet för 
beredning av LNC-suspensionen är kritiskt för detta test och därför bör varje laboratorium se till att färdigheterna övas in på förhand. Observera att lymfnoderna i den negativa kontrollgruppens djur är små, och det är 
viktigt att iaktta stor försiktighet för att undvika störande inverkan på 
SI-värdena. För varje fall ska målvolymen hos LNC-suspensionen justeras till en bestämd optimerad volym (cirka 15 ml). Den optimerade volymen baserar sig på att man för den negativa kontrollen ska få en genomsnitts ­
absorbans inom 0,1–0,2.
 
Bestämning av cellproliferation (mätning av BrdU-innehållet i lymfocyternas 
DNA)  
27. BrdU mäts i ELISA med hjälp av ett kommersiellt tillgängligt kit (t.ex. 
Roche Applied Science, Mannheim, Tyskland, katalognummer 11 647 229 
001). Mätningen går i huvuddrag ut på att 100 μl LNC-suspension överförs 
till brunnarna i en flatbottnad mikrotiterplatta i tre uppsättningar. Efter fix ­
ering och denaturering av LNC tillsätts anti-BrdU-antikropp till varje brunn och tillåts reagera. Därefter avlägsnas anti-BrdU-antikroppen genom tvätt ­
ning och substratlösning tillsätts så att kromogen kan bildas. Därefter mäts 
absorbansen vid 370 nm med en referensvåglängd på 492 nm. Under alla omständigheter gäller att testningsbetingelserna bör optimeras (se punkt 26).
 
OBSERVATIONER  
Kliniska observationer  
28. Varje mus bör observeras minst dagligen med tanke på eventuella kliniska 
tecken – lokal irritation vid appliceringsstället eller tecken på systemisk 
toxicitet. Alla observationer registreras systematiskt och individuellt per mus. Övervakningsplanerna bör inbegripa kriterier för omedelbar identifie ­
ring av tecken på systemisk toxicitet, särskilt kraftig hudirritation eller hud ­
korrosion så att berörda djur kan avlivas (31).
 
Kroppsvikt  
29. Enligt det som anges i punkt 25 ska de individuella djurens vikt registreras 
vid försökets början och strax före den schemalagda avlivningen.  
BERÄKNING AV RESULTATEN 
30. Resultaten för varje behandlingsgrupp uttrycks som genomsnittet för stimu ­
lationsindex. Stimulationsindex erhålls genom att genomsnittligt värde för 
BrdU-märkningsindex/djur inom varje testämnesgrupp och den positiva kon ­
trollgruppen divideras med genomsnittligt värde för BrdU-märkningsindex för kontrollgruppen för lösningsmedel/vehikel. Det genomsnittliga stimula ­
tionsindexet för vehikelkontrollgrupperna har då värdet 1. 
BrdU-märkningsindex definieras enligt följande: BrdU-märkningsindex = (ABS
 em – ABS blank  em ) – (ABS  ref – ABS blank  ref ) 
där em = emissionsvåglängd och ref = referensvåglängd.  ▼M3 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 752
 
31. Vid bedömning av resultaten anses ett resultat vara positivt när SI ≥ 1,6 
(10). Man kan dock även använda styrkan på dos-responsförhållandets samt 
den statistiska signifikansen och enhetligheten hos responsen i kontrollgrup ­
pen för lösningsmedel/vehikel och i den positiva kontrollen när man fast ­
ställer huruvida ett gränsresultat (dvs. SI-värde mellan 1,6 och 1,9) ska anses 
vara positivt (3) (6) (32). 
32. För ett gränsresultat för positiv respons där SI-värdet ligger mellan 1,6 och 1,9 
vill man kanske beakta tilläggsinformation såsom dos-responsförhållandet, 
tecken på systemisk toxicitet eller särskilt kraftig irritation och, där det är lämpligt, statistisk signifikans tillsammans med SI-värden för att bekräfta att resultaten är positiva (10). Likaså bör man beakta testämnets olika egenskaper, 
inbegripet eventuell strukturell släktskap med kända hudsensibiliserande äm ­
nen, huruvida ämnet orsakar särskilt kraftig hudirritation hos mössen samt naturen hos det iakttagna förhållandet mellan dos och respons. Dessa och andra aspekter diskuteras närmare i andra källor (4). 
33. När data samlas in per enskild mus kan man göra en statistisk analys 
rörande förekomsten av dosrespons och graden för dos-responsförhållande. 
Alla statistiska analyser kan inbegripa en utvärdering av 
dos-responsförhållandet och en lämpligt anpassad jämförelse mellan test ­
grupper (t.ex. parvisa jämförelser mellan doseringsgrupp och parallell kon ­
trollgrupp för lösningsmedel/vehikel). De statistiska analyserna kan in ­
begripa t.ex. linjär regression eller Williams test för utvärdering av 
dos-responstrender och Dunnetts test för parvisa jämförelser. Vid valet av en lämplig metod för den statistiska analysen bör man vara medveten om eventuella olikheter hos varianserna och andra relaterade problem som kan 
göra det nödvändigt att göra en datatransformation eller en icke-parametrisk 
statistisk analys. Det kan också vara nödvändigt att genomföra beräkningar av stimulationsindex och statistiska analyser med och utan vissa datapunkter (s.k. outliers – utanförliggande värden).
 
DATA OCH RAPPORTERING  
Data  
34. Data sammanställs i tabellform med angivelse av värdena för 
BrdU-märkningsindex per djur, gruppens medelvärde för 
BrdU-märkningsindex per djur, den associerade feltermen (t.ex. SD, SEM) och medelvärdet för stimulationsindex för varje dosgrupp jämfört med den parallella kontrollgruppen för lösningsmedel/vehikel.
 
Testrapport  
35. Testrapporten ska innehålla nedan angivna uppgifter. 
Test- och kontrollkemikalier: 
— Identifieringsdata (t.ex. CAS-nummer och EG-nummer, om tillgängligt, 
källa, renhet, kända orenheter, satsnummer). 
— Fysikalisk natur och fysikalisk-kemiska egenskaper (t.ex. flyktighet, sta ­
bilitet, löslighet). 
— För blandningar anges sammansättning och beståndsdelarnas relativa 
procentandelar. 
Lösningsmedel/vehikel: — Identifieringsdata (renhet, koncentration (om tillämpligt), volym som har 
använts). 
— Motivering för val av vehikel.
 ▼M3 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 753
 
Testdjur: 
— CBA-mössens ursprung. — Mikrobiologiska data för djuren, om dessa data är kända. — Antal djur och deras ålder. — Ursprung, inhysningsförhållanden, foder och dylikt. Testbetingelser: — ELISA-satsens ursprung, satsnummer och kvalitetsförsäkran/kvalitets ­
kontrolldata (antikroppskänslighet samt detektionsspecificitet och 
-gräns). 
— Detaljerade uppgifter om beredning och applicering av testämnet. — Motivering för valet av dos (även resultat från preliminär screening om 
sådan har genomförts). 
— Koncentrationerna för vehikel och testämne samt totala mängden tes ­
tämne som applicerats. 
— Detaljerade uppgifter om foder- och vattenkvalitet (inbegripet diettyp/ 
källa, vattenkälla). 
— Detaljerad beskrivning av behandlings- och provtagningsscheman. — Metoder för mätningar av toxicitet. — Kriterier för att fastställa om resultatet är positivt eller negativt. — Uppgifter rörande eventuella avvikelser från protokollet och redogörelse 
för hur avvikelsen påverkar undersökningens utformning och resultat. 
Tillförlitlighetskontroll: — Sammanfattning av resultaten från senaste tillförlitlighetskontroll, även 
information om testämne, koncentration och vehikel. 
— Data från parallella och/eller historiska positiva kontroller och parallella 
negativa kontroller (lösningsmedel/vehikel) för testningslaboratoriet. 
— Om försöket inte har omfattat parallell positiv kontroll, ange datum och 
laboratorierapport för senaste periodiska positiva kontroll och en rapport med uppgifter om laboratoriets historiska data för positiva kontroller som motivering för varför parallell positiv kontroll inte har använts. 
Resultat: — Mössens individuella vikt vid doseringsstart och vid schemalagd skon ­
sam avlivning samt medelvärde och associerad felterm (t.ex. SD, SEM) 
för varje behandlingsgrupp. 
— Tidpunkten för första upptäckt av tecken på toxicitet, även eventuell 
hudirritation vid appliceringsstället, för varje försöksdjur. 
— En tabell med BrdU-märkningsindex per mus och SI-värden per behand ­
lingsgrupp. 
— Medelvärde och associerad felterm (t.ex. SD, SEM) för 
BrdU-märkningsindex per mus för varje behandlingsgrupp och resultaten 
från analys av utanförliggande värden för varje behandlingsgrupp.
 ▼M3 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 754
 
— Beräknat stimulationsindex och ett lämpligt mått på variabilitet som 
beaktar variationen mellan djuren i testämnesgruppen och kontrollgrup ­
pen. 
— Förhållandet mellan dos och respons. — Statistisk analys, om tillämpligt. Diskussion om resultaten: — En kort kommentar om resultaten, dos-responsanalys och statistiska ana ­
lyser (i tillämpliga fall), med en slutsats om huruvida testämnet ska anses vara hudsensibiliserande.
 
HÄNVISNINGAR 
(1) OECD (2010), Skin Sensitisation: Local Lymph Node Assay, Test Guide ­
line No. 429, Guidelines for the Testing of Chemicals, OECD, Paris. Finns på: http://www.oecd.org/env/testguidelines 
(2) Chamberlain, M. och Basketter, D.A. (1996), The local lymph node assay: 
status of validation.  Food Chem. Toxicol ., 34, 999–1002. 
(3) Basketter, D.A., Gerberick, G.F., Kimber, I. och Loveless, S.E. (1996), The 
local lymph node assay: A viable alternative to currently accepted skin sensitisation tests.  Food Chem. Toxicol. , 34, 985–997. 
(4) Basketter, D.A., Gerberick, G.F. och Kimber, I. (1998), Strategies for iden ­
tifying false positive responses in predictive sensitisation tests.  Food Chem. 
Toxicol ., 36, 327–33. 
(5) Van Och, F.M.M., Slob, W., De Jong, W.H., Vandebriel, R.J. och Van 
Loveren, H. (2000), A quantitative method for assessing the sensitising potency of low molecular weight chemicals using a local lymph node assay: employment of a regression method that includes determination of uncerta ­
inty margins. Toxicol., 146, 49–59. 
(6) ICCVAM (1999), The murine local lymph node Assay: A test method for 
assessing the allergic contact dermatitis potential of chemicals/compounds: The results of an independent peer review evaluation coordinated by the Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative 
Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program Center for the 
Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICETAM). NIH Publication No: 99–4494. Research Triangle Park, N.C. Finns på: http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/llna/llnarep.pdf 
(7) Dean, J.H., Twerdok, L.E., Tice, R.R., Sailstad, D.M., Hattan, D.G., Stokes, 
W.S. (2001), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: II. Conclusions and recommendations of an independent scientific peer review panel. Reg. Toxicol. Pharmacol., 34(3), 258–273. 
(8) Haneke, K.E., Tice, R.R., Carson, B.L., Margolin, B.H., Stokes, W.S. 
(2001), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: III. 
Data analyses completed by the national toxicology program interagency center for the evaluation of alternative toxicological methods. Reg. Toxicol. Pharmacol., 34(3), 274–286. 
(9) Sailstad, D.M., Hattan, D., Hill, R.N., Stokes, W.S. (2001), ICCVAM eva ­
luation of the murine local lymph node assay: I. The ICCVAM review 
process. Reg. Toxicol. Pharmacol., 34(3), 249–257. 
(10) ICCVAM (2010), ICCVAM Test Method Evaluation Report. Nonradio ­
active local lymph node assay: BrdU-ELISA Test Method Protocol (LLNA: BrdU-ELISA). NIH Publication No. 10–7552A/B. Research Triangle Park, 
NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Finns på: 
http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/immunotox/llna-ELISA/TMER.htm
 ▼M3 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 755
 
(11) ICCVAM (2009), Independent Scientific Peer Review Panel Report: Updated 
validation status of new versions and applications of the murine local lymph 
node assay: a test method for assessing the allergic contact dermatitis potential of chemicals and products. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Finns på: http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/ 
immunotox_docs/LLNAPRPRept2009.pdf 
(12) Takeyoshi, M., Iida, K., Shiraishi, K. och Hoshuyama, S. (2005), Novel 
approach for classifying chemicals according to skin sensitising potency by non-radioisotopic modification of the local lymph node assay. J. Appl. Toxicol., 25, 129–134. 
(13) OECD (1992), Skin Sensitisation, Test Guideline No. 406, Guidelines for 
Testing of Chemicals, OECD, Paris. Finns på: http://www.oecd.org/env/ 
testguidelines 
(14) Kreiling, R., Hollnagel, H.M., Hareng, L., Eigler, L., Lee, M.S., Griem, P., 
Dreessen, B., Kleber, M., Albrecht, A., Garcia, C. och Wendel, A. (2008), Comparison of the skin sensitising potential of unsaturated compounds as 
assessed by the murine local lymph node assay (LLNA) and the guinea pig 
maximization test (GPMT). Food Chem. Toxicol., 46, 1896–1904. 
(15) Basketter, D., Ball, N., Cagen, S., Carrilo, J.C., Certa, H., Eigler, D., 
Garcia, C., Esch, H., Graham, C., Haux, C., Kreiling, R. och Mehling, A. (2009), Application of a weight of evidence approach to assessing 
discordant sensitisation datasets: implications for REACH. Reg. Toxicol. 
Pharmacol., 55, 90–96. 
(16) ILAR (1996), Institute of Laboratory Animal Research (ILAR)  Guide for 
the Care and Use of Laboratory Animals . 7th ed. Washington, DC: 
National Academies Press. 
(17) ICCVAM (2009), Recommended Performance Standards: Murine Local 
Lymph Node Assay. NIH Publication Number 09–7357. Research Triangle 
Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Finns på: http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/llna-ps/LLNA ­
PerfStds.pdf 
(18) McGarry, H.F. (2007), The murine local lymph node assay: regulatory and 
potency considerations under REACH. Toxicol., 238, 71–89. 
(19) Kimber, I., Dearman, R.J., Scholes E.W. och Basketter, D.A. (1994), The 
local lymph node assay: developments and applications. Toxicol., 93, 13–31. 
(20) OECD (2002), Acute Dermal Irritation/Corrosion, Test Guideline No. 404, 
Guidelines for Testing of Chemicals, OECD, Paris. Finns på: 
http://www.oecd.org/env/testguidelines 
(21) Reeder, M.K., Broomhead, Y.L., DiDonato, L. och DeGeorge, G.L. (2007), 
Use of an enhanced local lymph node assay to correctly classify irritants and false positive substances. Toxicologist, 96, 235. 
(22) ICCVAM (2009), Nonradioactive Murine Local Lymph Node Assay: Flow 
Cytometry Test Method Protocol (LLNA: BrdU-FC) Revised Draft 
Background Review Document. Research Triangle Park, NC: National Insti ­
tute of Environmental Health Sciences. Finns på: http://iccvam.niehs.nih.gov/ methods/immunotox/fcLLNA/BRDcomplete.pdf. 
(23) Hayes, B.B., Gerber, P.C., Griffey, S.S. och Meade, B.J. (1998), Contact 
hypersensitivity to dicyclohexylcarbodiimide and diisopropylcarbodiimide 
in female B6C3F1 mice. Drug Chem. Toxicol., 21, 195–206. 
(24) Homey, B., von Schilling, C., Blumel, J., Schuppe, H.C., Ruzicka, T., Ahr, 
H.J., Lehmann, P. och Vohr, V.W. (1998), An integrated model for the differentiation of chemical-induced allergic and irritant skin reactions. Toxicol. Appl. Pharmacol., 153, 83–94. 
(25) Woolhiser, M.R., Hayes, B.B. och Meade, B.J. (1998), A combined murine 
local lymph node and irritancy assay to predict sensitisation and irritancy 
potential of chemicals. Toxicol. Meth., 8, 245–256.
 ▼M3 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 756
 
(26) Hayes, B.B. och Meade, B.J. (1999), Contact sensitivity to selected acrylate 
compounds in B6C3F1 mice: relative potency, cross reactivity, and compari ­
son of test methods. Drug. Chem. Toxicol., 22, 491–506. 
(27) Ehling, G., Hecht, M., Heusener, A., Huesler, J., Gamer, A.O., van 
Loveren, H., Maurer, T., Riecke, K., Ullmann, L., Ulrich, P., Vandebriel, R. och Vohr, H.W. (2005), A European inter- laboratory validation of 
alternative endpoints of the murine local lymph node assay: first round. 
Toxicol., 212, 60–68. 
(28) Vohr, H.W. och Ahr, H.J. (2005), The local lymph node assay being too 
sensitive? Arch. Toxicol., 79, 721–728. 
(29) Patterson, R.M., Noga, E. och Germolec D. (2007), Lack of evidence for 
contact sensitisation by Pfiesteria extract. Environ. Health Perspect., 115, 
1023–1028. 
(30) ICCVAM (2009), Report on the ICCVAM-NICEATM/ECVAM/JaCVAM 
Scientific Workshop on Acute Chemical Safety Testing: Advancing  In Vitro  
Approaches and Humane Endpoints for Systemic Toxicity Evaluations. 
Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health 
Sciences. Finns på: http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/acutetox/ Tox_workshop.htm. 
(31) OECD (2000), Guidance Document on the Recognition, Assessment and 
Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used 
in Safety Evaluation, Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Paris. Finns på: http://www.oecd.org/env/testguidelines 
(32) Kimber, I., Hilton, J., Dearman, R.J., Gerberick, G.F., Ryan, C.A., Bas ­
ketter, D.A., Lea, L., House, R.V., Ladies, G.S., Loveless, S.E. och Has ­
tings, K.L. (1998), Assessment of the skin sensitisation potential of topical medicaments using the local lymph node assay: An interlaboratory exercise. J. Toxicol. Environ.l Health, 53, 563–79. 
(33) OECD (2005), Guidance Document on the Validation and International 
Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment, 
Environment, Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 34, ENV/JM/MONO(2005)14, OECD, Paris. Finns på: 
http://www.oecd.org/env/testguidelines
 ▼M3 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 757
 
Tillägg 1  
DEFINITIONER  
Exakthet:  Ett mått på hur väl testmetodresultaten och de godtagna referensvär ­
dena överensstämmer med varandra. Exakthet är ett mått på testmetodens pre ­
standa och en relevansaspekt. Detta begrepp används ofta omväxlande med ”kon ­
kordans” för att beskriva andelen korrekta resultat med en testmetod (33).  
Referensämne:  Ett sensibiliserande eller icke-sensibiliserande ämne som används 
som standard för jämförelse med ett testämne. Ett referensämne ska ha följande egenskaper: i) en eller flera enhetliga och tillförlitliga källor, ii) strukturell och funktionell likhet med den ämnesklass som testas, iii) kända fysikalisk-kemiska 
egenskaper, iv) stödjande data om kända effekter och v) känd styrka inom det 
önskade responsområdet.  
Falsk negativt:  Ett testämne som felaktigt har identifierats som negativt eller 
icke-aktivt genom en testmetod när ämne i själva verket är positivt eller aktivt 
(33).  
Falskt positivt:  Ett testämne som felaktigt har identifierats som positivt eller 
aktivt genom en testmetod när ämne i själva verket är negativt eller icke-aktivt (33).  
Fara:  Potentialen för skada på hälsa eller miljö. De skadliga verkningarna visar 
sig enbart om exponeringsnivån är tillräcklig.  
Reproducerbarhet mellan laboratorier:  Ett mått på i hur stor utsträckning olika 
kvalificerade laboratorier kan producera kvalitativt och kvantitativt liknande re ­
sultat, med användning av samma protokoll och samma testämne. Reproducer ­
barheten mellan laboratorier fastställs under förvalideringen och valideringen och 
den indikerar i hur stor utsträckning ett test framgångsrikt kan överföras mellan 
laboratorier (33).  
Reproducerbarhet inom laboratoriet:  Ett mått på i vilken utsträckning kvalifice ­
rade personer inom samma laboratorium framgångsrikt kan upprepa resultat vid olika tidpunkter när de använder ett visst protokoll (33).  
Utanförliggande värde:  Ett utanförliggande värde (”outlier”) är en observation 
som markant skiljer sig från de övriga värdena i ett slumpmässigt urval från en population.  
Kvalitetssäkring:  En styrningsprocess där personer som är i oberoende ställning i 
förhållande till de personer som genomför testningen bedömer hur standarder, krav och registreringsförfaranden för laboratorietestning följs och hur exakt data 
förmedlas.  
Tillförlitlighet:  Ett mått på i vilken utsträckning en testmetod kan reproduceras 
inom och mellan laboratorier över tiden när metoden utförs med samma pro ­
tokoll. Den bedöms genom att man beräknar reproducerbarheten inom och mel ­
lan laboratorier (33).  
Hudsensibilisering:  En immunologisk process som följer av att en mottaglig 
individ exponeras ytvägen för en inducerande kemisk allergen som provocerar en kutan immunrespons som kan leda till att det uppstår kontaktsensibilisering.  
Stimulationsindex (SI):  Ett värde som beräknas för att bedöma hudsensibiliserings ­
potentialen hos ett testämne och som är förhållandet mellan proliferationen i behandlingsgrupperna och proliferationen i den parallella vehikelkontrollgruppen.  
Testämne (kallas också testkemikalie):  Alla ämnen eller blandningar som testas 
med denna testmetod.
 ▼M3 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 758
 
B.52  AKUT INHALATIONSTOXICITET – AKUT TOXICITETSKLASS  
INLEDNING 
1. Den här testmetoden motsvarar OECD:s testriktlinje (TG) 436 (2009). Den 
första testriktlinjen för akut inhalation 403 antogs 1981, och har sedan dess 
reviderats (se kapitel B.2 i denna bilaga (1)). Utvecklingen av en inhala ­
tionsmetod för akut toxicitetsklass (ATC) (2) (3) (4) ansågs lämplig efter antagandet av den reviderade orala ATC-metoden (kapitel B.1 i denna bi ­
laga) (5). En retrospektiv resultatbedömning av ATC-testmetoden för akut 
toxicitet vid inhalation visade att metoden är lämplig för klassificerings- och 
märkningsändamål (6). ATC-testmetoden för inhalation medger använd ­
ningen av seriella steg med fasta målkoncentrationer för att rangordna en testkemikalies toxicitet. Dödlighet används som viktigaste endpoint, dock, 
bör djur med svår smärta och som lider, eller är döende avlivas skonsamt för 
att minska lidandet. Vägledning om humana endpoints finns i OECD:s vägledningsdokument nr 19 (7). 
2. I vägledningsdokumentet om akut inhalationstoxicitet (GD 39) (8) kan man 
få vägledning om den här beskrivna testmetodens genomförande och tolk ­
ning. 
3. Definitioner som används inom ramen för den här testmetoden finns i tillägg 
1 och i GD 39 (8). 
4. Testmetoden ger information om farliga egenskaper och låter testkemikalien 
rangordnas och klassificeras i enlighet med förordning (EG) nr 1272/2008 om klassificering av kemikalier som orsakar akut toxicitet (9). Om punkt ­
skattningar av LC50-värden eller koncentration-responsanalyser krävs, är 
kapitel B.2 i denna bilaga (1) den lämpligaste testmetoden. Ytterligare väg ­
ledning om val av testmetod finns i GD 39 (8). Den här testmetoden är inte specifikt avsedd för testning av specialmaterial såsom svårlösliga isomet ­
riska eller fibrösa material, eller avsiktligt tillverkade nanomaterial.
 
INLEDANDE ÖVERVÄGANDEN 
5. Innan man överväger ett test i enlighet med den här testmetoden bör test ­
laboratoriet överväga all information avseende testkemikalien, inklusive be ­
fintliga studier vars data visar att man inte behöver göra fler tester, för att minska användningen av djur. Information som kan underlätta val av lämp ­
lig art, stam, kön, exponeringssätt och lämplig testkoncentration är ämnets 
identitet och kemiska struktur, fysikalisk-kemiska egenskaper, resultat från 
andra eventuella in vitro- eller in vivo-studier avseende toxicitet; förvän ­
tad(e) användning(ar) och risken för mänsklig exponering, tillgängliga (Q)SAR-data samt toxikologiska data om strukturellt närbesläk ­
tade kemikalier. Koncentrationer som förväntas orsaka svår smärta eller 
lidande, beroende på frätande (
 1 ) eller allvarligt irriterande verkningar bör 
inte testas med denna testmetod (se GD 39 (8)).  ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 759  
( 1 ) Korrosivitetsbedömningen kan baseras på ett expertutlåtande på grundval av bevis såsom 
erfarenhet från människor eller djur, befintliga (in vitro) data, dvs. avsnitt B.40 (10), 
B.40 a (11) i denna bilaga eller OECD TG 435 (12), pH-värden, information från 
liknande kemikalier eller andra relevanta data.
 PRINCIP FÖR TESTMETODEN 
6. Testprincipen bygger på ett stegvist förfarande som ger tillräcklig infor ­
mation om akut toxicitet vid inhalation av testkemikalien under en expone ­
ringsperiod på 4 timmar för att möjliggöra dess klassificering. Andra expo ­
neringstider kan gälla för specifika regulatoriska ändamål. För varje definie ­
rat koncentrationssteg ska 3 djur av vardera kön testas. Beroende på mor ­
taliteten och/eller förekomsten av döende djur kan steg 2 vara tillräckligt för 
att möjliggöra bedömning av testkemikaliens akuta toxicitet. Om det saknas belägg för att det ena könet är mer mottagligt än det andra kan testet fortsätta med det mer mottagliga könet. Resultatet från det föregående steget 
kommer att bestämma det följande steget så att 
a) ingen ytterligare testning behövs, 
b) testning görs av tre djur per kön, eller 
c) testning görs av 6 djur av det mer mottagliga könet dvs. den undre 
gränsen för uppskattningar av toxisk klass som bör baseras på 6 djur per testkoncentrationsgrupp, oberoende av kön. 
7. Döende djur eller djur som visar tecken på uppenbar smärta eller svårt och 
ihållande lidande ska avlivas skonsamt och medtas i tolkningen av testresul ­
taten på samma sätt som de som avled under testet. Kriterier för att ta 
beslutet att avliva döende eller svårt lidande djur, och vägledning om hur man känner igen tecknen på förutsägbar eller annalkande död, omfattas i vägledningsdokument nr 19 om humana endpoints (7).
 
METODBESKRIVNING  
Val av djurart  
8. I testet används friska unga vuxna djur av stammar som vanligtvis används 
på laboratorier. För detta test används råtta och motiveringar ska ges om 
andra arter används.  
Förberedelse av djuren  
9. Honorna ska inte ha fått ungar och inte vara dräktiga. På exponeringsdagen 
bör djuren vara unga vuxna 8 till 12 veckor gamla och kroppsvikten bör ligga inom ± 20 % av medelvikten för vardera könet för eventuellt tidigare 
exponerade djur i samma ålder. Djuren väljs ut slumpmässigt, förses med 
märkning så att de kan identifieras individuellt. Därefter får djuren ackli ­
matisera sig till laboratoriets betingelser i sina burar i minst fem dagar före teststarten. Djuren bör också acklimatisera sig till testutrustningen en kort 
period före testet, eftersom detta minskar den stress som en ny miljö inne ­
bär.
 
Djurhållning  
10. Temperaturen i försöksdjurens utrymmen bör vara 22 ± 3 °C. Den relativa 
fuktigheten bör ligga mellan 30 och 70 %, även om detta kanske inte är möjligt när vatten används som vehikel. Före och efter exponeringen bör djuren inhysas i grupper avhängigt kön och koncentration, dock får antalet 
djur per bur inte hindra en tydlig observation av varje enskilt djur, och 
förluster genom kannibalism och slagsmål bör minimeras. Om endast dju ­
rens nosar ska exponeras kan det vara nödvändigt att de får acklimatisera sig till fasthållningsrören. Fasthållningsrören ska inte medföra onödig fysisk, 
termisk eller fasthållningsstress för djuren. Fasthållning kan påverka fysio ­
logiska endpoints såsom kroppstemperatur (hypotermi) och/eller minimala
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 760
 
respiratoriska volymer. Om det finns generiska data tillgängliga som inte 
pekar på sådana förändringar i någon nämnvärd omfattning är det inte 
nödvändigt med anpassningen till rören före exponeringen. Djur vars hela kroppar ska exponeras för en aerosol ska inhysas individuellt under expo ­
neringen för att förhindra att de andra djuren i buren filtrerar aerosolen 
genom sina pälsar. För utfodringen kan konventionellt laboratoriefoder an ­
vändas, utom under exponeringen, tillsammans med en obegränsad tillgång till vatten. Belysningen bör vara artificiell med omväxlande 12 timmar ljus och 12 timmar mörker.
 
Inhalationskammare  
11. Vid val av inhalationskammare bör man beakta kemikaliens beskaffenhet 
och testets ändamål. Det föredragna exponeringssättet är enbart nos (termen 
inkluderar även enbart huvud, enbart nos eller enbart tryne). Exponering av 
enbart nos föredras i allmänhet vid studier av vätskor och fasta aerosoler och ånga som kan kondenseras och bilda aerosoler. Vissa av undersökningens mål kan bättre uppnås genom exponering av hela kroppen, men detta ska 
motiveras i undersökningsrapporten. För att säkerställa atmosfärisk stabilitet 
vid användningen av en helkroppskammare ska den totala volymen av för ­
söksdjuren inte överskrida 5 % av kammarens volym. Teknikerna för enbart nos och helkroppsexponeringen, deras principer och särskilda för- och nack ­
delar finns beskrivna i GD 39 (8).
 
EXPONERINGSBETINGELSER  
Administrering av koncentrationer  
12. En fast exponeringstid på 4 timmar, exklusive jämviktstid, rekommenderas. 
Andra varaktigheter kan behövas för att uppfylla specifika krav, dock bör 
motivering ges i studierapporten (se GD 39 (8)). Djur som exponeras i helkroppskammare ska inhysas individuellt för att hindra intagandet av test ­
kemikalien på grund av skötsel av de andra djuren i buren. Inget foder ska 
ges under exponeringsperioden. Vatten kan tillhandahållas under en hel ­
kroppsexponering. 
13. Djur exponeras för testkemikalien som en gas, ånga, aerosol eller en bland ­
ning av dem. Det fysikaliska tillstånd som ska testas beror på testkemika ­
liens fysikalisk-kemiska egenskaper, vald koncentration och/eller dess mest sannolika fysikaliska form vid hanteringen och användningen. Hygrosko ­
piska och kemiskt reaktiva testkemikalier ska testas i torr luft. Det är viktigt 
att se till att inga explosiva koncentrationer skapas.
 
Partikelstorleksfördelning  
14. Partikeldimensionering bör utföras för alla aerosoler och ångor som kan 
kondenseras och bilda aerosoler. För att möjliggöra exponering av alla relevanta områden i luftvägarna, rekommenderas aerosoler med en aero ­
dynamisk diameter (MMAD) i intervallet 1 till 4 μm med en geometrisk 
standardavvikelse ( σ
 g ) i intervallet 1,5 till 3,0 (8) (13) (14). Även om en 
rimlig ansträngning krävs för att uppfylla denna standard bör en sakkunnig bedömning göras om detta inte kan uppnås. Till exempel kan metalldimma understiga denna standard, och laddade partiklar, fibrer och hygroskopiska 
material (som ökar i storlek i den fuktiga miljön i andningsvägarna) kan 
överstiga denna standard.
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 761
 
Beredning av testkemikalie i en vehikel  
15. En vehikel kan användas för att generera en lämplig koncentration och 
partikelstorlek av testkemikalien i atmosfären. I regel bör vatten ha företrä ­
de. För att uppnå den erfordrade partikelstorleksfördelningen bör partikel ­
materialet utsättas för mekaniska processer, emellertid bör försiktighet iakttas så att man inte sönderdelar eller förändrar testkemikalien. I de fall 
där mekaniska processer tros ha förändrat testkemikaliens sammansättning 
(t.ex. extrem temperatur från friktionen vid överdriven fräsning), bör test ­
kemikaliens sammansättning verifieras analytiskt. Det är viktigt att testkemi ­
kalien inte förorenas. Det är inte nödvändigt att testa icke-spröda granulära 
material som avsiktligt är sammansatta så att de inte kan inhaleras. Ett 
friktionstest ska användas för att visa att inga inandningsbara partiklar bildas när det granulära materialet hanteras. Om ett friktionstest bildar inandnings ­
bara partiklar ska ett test utföras avseende inhalationstoxicitet.
 
Kontrolldjur  
16. Det är inte nödvändigt med en parallell negativ (luft-) kontrollgrupp. Om en 
annan vehikel än vatten används för att skapa testatmosfären ska en vehikel ­
kontrollgrupp endast användas när historiska data om inhalationstoxicitet inte är tillgängliga. Om en toxicitetsstudie av en testkemikalie som har 
beretts i en vehikel inte påvisar någon toxicitet, framgår det att vehikeln 
är icke-toxisk vid den testade koncentrationen, och därmed finns det inget behov av en vehikelkontroll.
 
ÖVERVAKNING AV EXPONERINGSFÖRHÅLLANDEN  
Kammarens luftflöde  
17. Luftflödet genom kammaren ska omsorgsfullt kontrolleras, kontinuerligt 
övervakas och registreras minst en gång i timmen under varje exponering. 
Övervakningen av testatmosfärens koncentration (eller stabilitet) är en inte ­
grerad mätning av samtliga dynamiska parametrar och ett indirekt sätt att kontrollera alla relevanta atmosfärsskapande dynamiska parametrar. Särskild 
hänsyn bör tas för att undvika återandning i enbart nos-kammare i de fall 
där luftflödet genom exponeringssystemet är otillräckligt för att ge ett dy ­
namiskt flöde i testkemikalieatmosfären. Det finns föreskrivna metoder som kan användas för att visa att återandning inte sker under de valda process ­
förhållandena (8) (15). Syrehalten bör vara minst 19 % och koncentrationen 
av koldioxid bör inte överstiga 1 %. Om det finns anledning att tro att dessa standarder inte kan uppfyllas bör man mäta koncentrationen av syre och koldioxid.
 
Kammarens temperatur och relativa fuktighet  
18. Kammarens temperatur bör upprätthållas vid 22 ± 3 °C. Relativ fuktighet i 
djurens andningsområden, gäller både enbart nos och helkroppsexponering, 
bör övervakas och registreras minst tre gånger under tidsperioder upp till 4 timmar, och varje timme vid kortare tidsperioder. Den relativa fuktigheten bör företrädesvis upprätthållas inom intervallet 30 till 70 %, men detta kan ­
ske inte är möjligt (t.ex. vid testning av vattenbaserade blandningar) eller 
inte mätbart på grund av att testkemikalien stör själva testmetoden.
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 762
 
Testkemikalie: nominell koncentration  
19. När det är möjligt bör den nominella koncentrationen i exponeringskamma ­
ren beräknas och registreras. Den nominella koncentrationen är massan av 
den genererade testkemikalien dividerad med den totala volymen av luft som passerade genom kammarsystemet. Den nominella koncentrationen an ­
vänds inte för att karakterisera djurens exponering, men en jämförelse mel ­
lan den nominella och den faktiska koncentrationen ger en indikation på 
testsystemets genereringseffektivitet, och kan därmed användas för att upp ­
täcka genereringsproblem.
 
Testkemikalie: faktisk koncentration  
20. Den faktiska koncentrationen är testkemikaliens koncentration i djurets and ­
ningsområde i en inhalationskammare. Faktiska koncentrationer kan erhållas antingen genom särskilda metoder (t.ex. direkt provtagning, adsorptiva eller 
kemiskt reaktiva metoder, och efterföljande analytisk karakterisering) eller 
av icke-specifika metoder såsom gravimetrisk filteranalys. Användningen av gravimetrisk analys är endast acceptabel för pulveraerosoler bestående av en enda komponent eller aerosoler bestående av vätskor med låg flyktighet, och 
bör stödjas av en lämplig preklinisk studie med kemikaliespecifik karakte ­
risering. Koncentrationen i pulveraerosoler bestående av flera komponenter kan också bestämmas genom gravimetrisk analys. Detta kräver dock analys ­
resultat som visar att sammansättningen av luftburet material liknar start ­
materialet. Om denna information inte finns tillgänglig kan det vara nöd ­
vändigt med en ny analys av testkemikalien (helst i sitt luftburna tillstånd) under loppet av studien. För medel i aerosolform som kan förångas eller sublimeras bör man kunna visa att samtliga faser uppsamlades med den 
valda metoden. Målkoncentrationerna och de nominella och faktiska kon ­
centrationerna ska finnas med i undersökningsrapporten, men endast de faktiska koncentrationerna används i de statistiska analyserna för att beräkna värdena för dödlig koncentration. 
21. En sats av testkemikalien ska användas, om möjligt, och provet ska lagras 
under sådana förhållanden att det bibehåller sin renhet, homogenitet och stabilitet. Inför starten av studien bör det finnas en beskrivning av testkemi ­
kalien som inbegriper dess renhet och, om det är tekniskt genomförbart, 
identitet, och kvantiteterna av identifierade föroreningar och orenheter. Detta kan visas genom, men är inte begränsat till, följande data: retentionstid och relativ topparea, molekylvikt från masspektroskopi eller gaskromatografiana ­
lys, eller andra uppskattningar. Även om testlaboratoriet inte ansvarar för 
provets identitet kan det vara klokt att man i stora drag bekräftar karakte ­
riseringen (t.ex. färg, fysisk natur etc.). 
22. Exponeringsatmosfären ska hållas så konstant som möjligt och övervakas 
kontinuerligt och/eller intermittent beroende på analysmetoden. När intermit ­
tent provtagning används bör prover på kammaratmosfären tas minst två gånger under en fyratimmarsstudie. Om det inte är möjligt på grund av 
begränsade luftflöden eller låga koncentrationer, kan ett prov tas under 
hela exponeringsperioden. Om märkta prov-till-prov-fluktationer förekom ­
mer, bör man för de påföljande koncentrationerna som ska testas ta fyra prover per exponering. Provtagning av kammarkoncentrationer från indi ­
viduella kammare bör inte avvika från den genomsnittliga koncentrationen 
med mer än ± 10 % för gaser och ångor, och inte med mer än ± 20 % för flytande eller fasta aerosoler. Tiden tills kammaren når jämvikt (t
 95 ) bör 
beräknas och registreras. Varaktigheten för en exponering spänner sig 
över den tid som testkemikalien genereras och tar hänsyn till den tid som 
krävs för att uppnå t  95 . Riktlinjer för att uppskatta t  95 finns i GD 39 (8).  ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 763
 
23. För mycket komplexa blandningar bestående av ångor/gaser och aerosoler 
(t.ex. förbränningsatmosfärer och testkemikalier framdrivna från därför av ­
sedd slutanvändningsprodukt/-utrustning). Varje fas kan bete sig annorlunda i en inhalationskammare så åtminstone en indikatorsubstans ska väljas (ana ­
lyt), vanligtvis den huvudsakliga aktiva substansen i blandningen för varje 
fas (ånga/gas och aerosol). När testkemikalien är en blandning ska den 
analytiska koncentrationen i den totala blandningen rapporteras, inte bara för den aktiva ingrediensen eller komponenten (analyten). Ytterligare infor ­
mation om faktisk koncentration finns i GD 39 (8).
 
Testkemikalie: partikelstorleksfördelning  
24. Aerosolers partikelstorleksfördelning bör fastställas minst två gånger under 
varje 4-timmarsexponering med hjälp av en kaskadimpaktor eller ett alter ­
nativt instrument såsom en aerodynamisk partikelsorterare. Om man kan visa ett likvärdigt resultat från en kaskadimpaktor eller det alternativa in ­
strumentet, kan man använda det sistnämnda under hela försöket. En andra 
enhet, till exempel ett gravimetriskt filter eller en impinger/gasbubblare, bör användas parallellt med det primära instrumentet för att bekräfta uppsam ­
lingsprestandan hos det primära instrumentet. Masskoncentrationen som er ­
hållits genom analys av partikelstorleken ska ligga inom rimliga gränser för 
den masskoncentration som erhållits genom filteranalys (se GD 39 (8)). Om likvärdigheten kan påvisas i ett tidigt skede av försöket kan ytterligare bekräftande mätningar utelämnas. Av djurskyddsskäl bör åtgärder vidtas 
för att minimera ofullständiga uppgifter som kan leda till att exponeringen 
måste upprepas. Partikeldimensionering bör utföras för ångorna, om det finns en möjlighet att kondensen kan bilda en aerosol, eller om partiklar upptäcks i ångatmosfären som kan göra så att faserna blandas (se punkt 14).
 
PROCEDUR  
Huvudtest  
25. Tre djur per kön eller sex djur av det mer mottagliga könet används för 
varje steg. Om andra gnagare än råttor utsätts för enbart nos, kan de max ­
imala exponeringstiderna justeras för att minska artspecifikt lidande. Kon ­
centrationsnivån som ska användas som startdos väljs från en av fyra fasta 
nivåer, och nivån på utgångskoncentrationen bör vara den som mest sanno ­
likt producerar toxicitet hos vissa av de doserade djuren. Testprogrammet för gaser, ångor och aerosoler (inkluderad i tilläggen 2–4) representerar 
testningen med avslutningsvärdena för CLP-kategorierna 1–4 (9) för gaser 
(100, 500, 2 500, 20 000 ppm/4h) (tillägg 2), för ångor (0,5, 2, 10, 20 mg/l/4h) (tillägg 3) och för aerosoler (0,05, 0,5, 1, 5 mg/l/4h) (tillägg 4). Kategori 5, som inte är genomförd i förordning (EG) nr 1272/2008 (9) avser 
koncentrationer över respektive gränskoncentration. För varje startkoncent ­
ration gäller respektive testprogram. Beroende på antalet humant avlivade eller döda djur följer testproceduren de angivna pilarna tills en kategorise ­
ring kan göras. 
26. Tidsintervallet mellan exponeringsgrupperna fastställs genom start, varaktig ­
het och allvarlighetsgrad för tecknen på toxicitet. Exponering av djur vid 
nästa koncentrationsnivå ska fördröjas tills det finns rimlig anledning att anta att de tidigare testade djuren överlever. En period på tre eller fyra dagar mellan exponeringarna för varje koncentrationsnivå rekommenderas 
för observationen av fördröjd toxicitet. Tidsintervallet kan anpassas på lämp ­
ligt sätt, t.ex. i händelse av ofullständiga responser.
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 764
 
Toleranstest  
27. Toleranstestet används när testkemikalien är känd eller förväntas vara prak ­
tiskt taget icke-toxisk dvs. framkallar endast en toxisk reaktion över den 
reglerade gränskoncentrationen. Information om testkemikaliens toxicitet kan erhållas genom kunskap om liknande testade substanser eller liknande blandningar, med beaktande av identitet och procentandel av komponenter 
kända för att ha en signifikant toxicitet. I situationer när det finns lite eller 
ingen information om dess toxicitet, eller testkemikalien förväntas vara tox ­
isk, ska huvudtestet utföras (ytterligare vägledning finns i GD 39 (8)). 
28. Enligt det normala förfarandet exponeras tre djur per kön, eller sex djur av 
det mer mottagliga könet för en koncentration av respektive 20 000 ppm för gaser, 20 mg/l för ångor och 5 mg/l för damm/ånga (om möjligt), vilket fungerar som toleranstestet för denna testmetod. När man testar aerosoler 
bör det primära målet vara att uppnå en andningsbar partikelstorlek (dvs. en 
MMAD på 1–4 μm). Det är möjligt för de flesta kemikalier med en kon ­
centration på 2 mg/l. Testning av aerosoler med högre än 2 mg/l ska endast göras om en andningsbar partikelstorlek kan uppnås [se GD 39 (8)]. I 
enlighet med GHS (16), avrådes testning över en gränskoncentration på 
grund av djurskyddsskäl. Testning i GHS-kategori 5 (16), som inte är ge ­
nomförd i förordning (EG) nr 1272/2008 (9), ska endast övervägas om det finns en stor sannolikhet för att resultaten från ett sådant test har en direkt 
relevans för skydd av människors hälsa, och motivering lämnas i studierap ­
porten. När det gäller potentiellt explosiva testkemikalier bör man vara noga med att undvika förhållanden som är gynnsamma för en explosion. För att 
undvika onödig användning av djur ska ett test genomföras utan djur före 
toleranstestet, för att se till att förhållandena i kammaren kan uppnås för ett toleranstest.
 
OBSERVATIONER 
29. Djuren bör ofta observeras kliniskt under exponeringsperioden. Efter expo ­
neringen ska kliniska observationer göras minst två gånger på dagen för exponeringen, eller oftare om djurens respons på behandlingen indikerar det, och därefter minst en gång per dag under en period av 14 dagar. Observa ­
tionstidens längd är inte fast, utan bör bestämmas utifrån art och tidpunkt för 
de första kliniska tecknen samt längden på återhämtningsperioden. De till ­
fällen då tecken på toxicitet uppträder och försvinner är viktig, särskilt om tecknen på toxicitet visar en tendens att fördröjas. Alla observationer regi ­
streras systematiskt med individuella registreringar för varje djur. Djur som 
påträffas döende och djur som visar tecken på uppenbar smärta och/eller svårt ihållande lidande ska avlivas skonsamt av djurskyddsskäl. Försiktighet bör iakttas vid utförande av undersökningar för kliniska tecken på toxicitet 
med djur som ser dåliga ut och har övergående respiratoriska förändringar 
till följd av exponeringsförfarandet, inte misstas för behandlingsrelaterade verkningar. Principerna och kriterierna som finns sammanfattade i vägled ­
ningsdokumentet om humana endpoints bör tas i beaktande (7). När djur 
avlivas av humanitära skäl eller påträffas döda, ska tidpunkten för dödsfallet 
registreras så noggrant som möjligt.
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 765
 
30. Observationer vid buren bör omfatta förändringar i bur och päls, ögon och 
slemhinnor, samt även andningsorganen, cirkulationsorganen och det auto ­
noma och centrala nervsystemet, samt kroppsmotorik och beteendemönster. Om möjligt bör eventuella skillnader mellan lokala och systematiska effekter noteras. Uppmärksamhet bör fästas vid observationer av tremor, konvulsio ­
ner, salivutsöndring, diarré, letargi, sömn och koma. Mätningen av rektala 
temperaturer kan ge belägg för bradypnéreflex eller hypo/hypertermi relate ­
rat till behandling eller inspärrning.
 
Kroppsvikt  
31. Vikten hos individuella djur bör registreras en gång under acklimatiserings ­
perioden på exponeringsdagen innan exponeringen (dag 0), och åtminstone 
dag 1, 3 och 7 (och därefter varje vecka), och vid tidpunkten för när döden eller avlivningen inträffar om dag 1 överskrids. Kroppsvikt är en erkänt viktig indikator för toxicitet och djur som uppvisar en ihållande minskning 
på ≥ 20 % jämfört med värden från förstudien bör noggrant övervakas. Djur 
som överlever vägs och avlivas skonsamt i slutet av perioden efter expone ­
ringsperioden.
 
Patologi  
32. Alla försöksdjur, inklusive de som avlider under testet eller avlivas och tas 
bort från undersökningen av djurskyddsskäl bör obduceras. Om en obduk ­
tion inte kan utföras omedelbart efter att ett dött djur har upptäckts, bör djuret kylas (inte frysas) vid en temperatur som är tillräckligt låg för att 
minimera autolys. Obduktioner ska utföras så snart som möjligt, vanligtvis 
inom en dag eller två. Alla betydande patologiska förändringar bör registre ­
ras för varje djur med särskild uppmärksamhet på eventuella förändringar i luftvägarna. 
33. Ytterligare undersökningar inklusive a priori genom beräkning kan anses 
utöka studiens tolkningsvärde, såsom mätning av lungvikt hos överlevande råttor, och/eller ge prov på irritation genom mikroskopundersökningen av luftvägarna. Undersökta organ kan innefatta sådana som uppvisar betydande 
skador och som härrör från djur som överlevt 24 timmar eller mer, och 
organ kända för, eller som förväntas påverkas. Mikroskopisk undersökning av hela luftvägarna kan ge användbar information om testkemikalier som är reaktiva med vatten, såsom syror och hygroskopiska testkemikalier.
 
DATA OCH RAPPORTERING  
Data  
34. Individuella data om kroppsvikt och obduktionsfynd bör tillhandahållas. 
Kliniska observationsdata bör sammanfattas i tabellform, som för varje test ­
grupp visar antalet djur som använts, antalet djur som visar tecken på tox ­
icitet, antalet djur som avlidit under testet eller som avlivats av humanitära 
skäl, tidpunkten då det enskilda djuret har avlidit, beskrivning och tidsför ­
lopp för toxiska verkningar och reversibilitet, samt obduktionsfynd.  ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 766
 
Testrapport  
35. Testrapporten ska omfatta följande information, när så är lämpligt:  
Försöksdjur och djurhållning  
— Beskrivning av burförhållanden, inklusive antal (eller förändring av an ­
tal) djur per bur, strö, omgivningstemperatur och relativ fuktighet, ljus ­
period och identifiering av kost. 
— Art/stam som används och motivering för användning av andra arter än 
råtta. 
— Djurens antal, ålder och kön. — Metod för randomisering. — Uppgifter om foder- och vattenkvalitet (inbegripet kosttyp/-källa och 
vattenförsörjning). 
— Beskrivning av eventuella förtestbetingelser inbegripet kost, karantän 
och behandling av sjukdomar.  
Testkemikalie  
— Fysikalisk natur, renhet och, i förekommande fall, fysikalisk-kemiska 
egenskaper (inbegripet isomerisering). 
— Identifieringsdata och CAS-nummer (Chemical Abstract Services), om 
detta är känt.  
Vehikel  
— Motivering för användning av vehikel och valet av vehikel (om annat än 
vatten). 
— Historiska eller parallella data som visar att vehikeln inte påverkar stud ­
iens slutresultat.  
Inhalationskammare  
— Beskrivning av inhalationskammaren inklusive mått och volym. — Ursprung och beskrivning av utrustning som används för exponering av 
djur så väl som generering av atmosfär. 
— Utrustning för mätning av temperatur, fuktighet, partikelstorlek och fak ­
tisk koncentration. 
— Luftkälla, behandling av luft som tillförs/extraheras och system som 
används för luftkonditionering. 
— Metoder som används för kalibrering av utrustning för att säkerställa en 
homogen testatmosfär. 
— Tryckskillnad (positiv eller negativ). — Exponeringsportar per kammare (enbart nos), placering av djur i syste ­
met (helkropp). 
— Temporal homogenitet/stabilitet för testatmosfären. — Placering av temperatur- och fuktighetsgivare och provtagning av tes ­
tatmosfären i kammaren. 
— Luftflödeshastigheter, port för luftflöde och exponering (enbart nos), 
eller djurbelastning och kammare (helkropp). 
— Information om utrustningen som används för att mäta syre och kol ­
dioxid, i förekommande fall.
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 767
 
— Tid som krävs för att uppnå jämvikt i inhalationskammaren (t  95). 
— Antal volymutbyten per timme. 
— Mätutrustning (i förekommande fall).  
Exponeringsdata  
— Grunden för valet av målkoncentration i huvudstudien. — Nominella koncentrationer (den totala massan av testkemikalien som 
genereras i inhalationskammaren dividerad med luftvolymen som pas ­
serar genom kammaren). 
— Faktiska koncentrationer av testblandningar som insamlats från djurens 
andningsapparat, för blandningar som bildar heterogena fysikaliska for ­
mer (gaser, ångor, aerosoler), där var och en kan analyseras separat. 
— Alla luftkoncentrationer ska rapporteras i viktenheter (t.ex. mg/l, mg/m
 3 , 
etc.), enheter för volym (t.ex. ppm, ppb) kan också redovisas inom 
parantes. 
— Partikelstorleksfördelning, aerodynamisk massmediandiameter (MMAD) 
och geometrisk standardavvikelse ( σ g ), inklusive metoderna för deras 
beräkning. Individuella partikelstorleksanalyser bör rapporteras.  
Testbetingelser  
— Uppgifter om testkemikalieberedning, inklusive uppgifter om eventuella 
procedurer som använts för att minska partikelstorleken hos fasta sub ­
stanser eller för att bereda testlösningar. I de fall där mekaniska pro ­
cesser kan ha förändrat testkemikaliens sammansättning ska analysresul ­
taten inkluderas för att bekräfta dess sammansättning. 
— En beskrivning (helst med ett diagram) av utrustningen som används för 
att generera testatmosfären och exponera djuren för denna atmosfär. 
— Uppgifter om den kemiska analysmetod som använts och metodvalide ­
ring (inklusive effektiviteten för återvinningen av testkemikalien från provtagningsmediet). 
— Grunden för valet av testkoncentration.  
Resultat  
— Tabelluppställning av kammarens temperatur, fuktighet och luftflöde. — Tabelluppställning av kammarens nominella och faktiska koncentrations ­
data. 
— Tabelluppställning av partikelstorleksdata som omfattar provtagnings ­
data, partikelstorleksfördelning och beräkning av MMAD och σ
 g. 
— Tabelluppställning av responsdata och koncentrationsnivåer för varje 
djur (dvs. djur som uppvisar tecken på toxicitet inklusive mortalitet, natur, allvarlighetsgrad och effekternas varaktighet). 
— Den individuella kroppsvikten hos djuren som samlats in på studiedagar, 
datum och tid för dödsfall som inträffat före planerad avlivning, tids ­
förlopp för första tecken på toxicitet och om dessa var reversibla för 
varje enskilt djur.
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 768
 
— Obduktionsfynd och histopatologiska fynd för varje djur, om detta finns 
tillgängligt. 
— CLP-kategoriklassificering och LC  50 -avslutningsvärde;  
Diskussion och tolkning av resultaten  
— Särskild uppmärksamhet bör ges till beskrivningen av använda metoder 
för att uppfylla kriterierna för den här testmetoden, t.ex. koncentrations ­
gräns eller partikelstorlek. 
— Partiklarnas andningsbarhet i ljuset av de övergripande resultaten bör 
åtgärdas, särskilt om kriterierna för partikelstorlek inte kunde uppfyllas. 
— Överensstämmelsen mellan metoderna som används för att bestämma 
nominell och faktisk koncentration, och förhållandet mellan faktisk 
och nominell koncentration bör ingå i den samlade bedömningen av studien. 
— Den sannolika dödsorsaken och dominerande verkningsmekanism (syste ­
matisk mot lokal) bör behandlas. 
— En förklaring bör ges om det fanns behov av att offra djur, som visade 
tecken på uppenbar smärta eller svårt och ihållande lidande, av huma ­
nitära skäl på grundval av kriterierna i OECD:s vägledningsdokument om humana endpoints (7).
 
LITTERATUR  
(1) Kapitel B.2 i denna bilaga, akut toxicitet (inhalation). 
(2) Holzhütter H-G, Genschow E, Diener W, and Schlede E (2003). Dermal 
and Inhalation Acute Toxicity Class Methods: Test Procedures and Bio ­
metric Evaluations for the Globally Harmonized Classification System.  
Arch. Toxicol.  77: 243–254. 
(3) Diener W, Kayser D and Schlede E (1997). The Inhalation Acute-Toxic- 
Class Method; Test Procedures and Biometric Evaluations.  Arch. Toxicol.  
71: 537–549. 
(4) Diener W and Schlede E (1999). Acute Toxic Class Methods: Alternatives 
to LD/LC  50 Tests.  ALTEX  1: 129–134. 
(5) Chapter B.1 i denna bilaga, akut inhalationstoxicitet - metod för akut 
toxcicitesklass (ATC). 
(6) OECD (2009). Report on Biostatistical Performance Assessment of the 
Draft TG 436 Acute Toxic Class Testing Method for Acute Inhalation Toxicity. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 105, OECD, Paris. Finns på [http://www.oecd.org/env/ 
testguidelines] 
(7) OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and 
Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series 
on Testing and Assessment No. 19. Finns på [http://www.oecd.org/env/ 
testguidelines] 
(8) OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing. 
Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assess ­
ment No. 39, OECD, Paris. Finns på [http://www.oecd.org/env/ 
testguidelines] 
(9) Europaparlamentets och rådets förordning (EG) nr 1272/2008 av den 
16 december 2008 om klassificering, märkning och förpackning av ämnen och blandningar, ändring och upphävande av direktiven 67/548/EEG och 
1999/45/EG samt ändring av förordning (EG) nr 1907/2006 (EUT L 353, 
31.12.2008, s. 1).
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 769
 
(10) Kapitel B.40 i denna bilaga, in vitro-test av hudkorrosivitet: bestämning av 
transkutant elektriskt motstånd (TER). 
(11) Kapitel B.40 a i denna bilaga, in vitro-test av hudkorrosivitet: test med 
modell av human hud. 
(12) OECD (2005). In Vitro Membrane Barrier Test Method for Skin Corrosion. 
OECD Guideline for testing of chemicals No. 435, OECD, Paris. Finns på [http://www.oecd.org/env/testguidelines] 
(13) Phalen RF (2009). Inhalation Studies: Foundations and Techniques. (2
 nd 
Edition) Informa Healthcare, New York. 
(14) SOT (1992). Technical Committee of the Inhalation Specialty Section, So ­
ciety of Toxicology (SOT). Recommendations for the Conduct of Acute Inhalation Limit Tests.  Fund. Appl. Toxicol.  18: 321–327. 
(15) Pauluhn J and Thiel A (2007). A Simple Approach to Validation of 
Directed-Flow Nose-Only Inhalation Chambers. J. Appl. Toxicol.27: 
160–167. 
(16) UN (2007), United Nations Globally Harmonized System of Classification 
and Labelling of Chemicals (GHS), ST/SG/AC.10/30, UN New York and 
Geneva. Finns på [http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_ 
welcome_e.html]
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 770
 
Tillägg 1  
DEFINITION  
Testkemikalie:  Alla ämnen eller blandningar som testas med denna testmetod.  ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 771
 
Tillägg 2  
Förfarande för varje startkoncentration för gaser (ppm/4 h)  
Allmänna anmärkningar (  1 ) 
För varje startkoncentration ska förfarandet som är beskrivet i detta tillägg följas 
för respektive testprogram. 
Tillägg 2 a: Startkoncentration är 100 ppm Tillägg 2 b: Startkoncentration är 500 ppm Tillägg 2 c: Startkoncentration är 2 500 ppm Tillägg 2 d: Startkoncentration är 20 000 ppm Beroende på antalet humant avlivade eller döda djur ska testproceduren följa de 
angivna pilarna.
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 772  
( 1 ) I följande tabeller refereras till GHS (Globally Harmonised System of Classification and 
Labelling of Chemicals (GHS). EU-motsvarigheten är förordning (EG) nr 1272/2008. 
När det gäller akut inhalationstoxicitet, tillämpar inte förordning (EG) nr 1272/2008 (9) 
kategori 5.
 Tillägg 2a  
Akut inhalations toxicitet:  
Tes tförfarande med en s tartkoncentration av 100 ppm/4 h för gas er
  ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 773
 
Tillägg 2b  
Akut inhalationstoxicitet:  
Testförfarande med en startkoncentration av 500 ppm/4 h för gaser
  ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 774
 
Tillägg 2c  
Akut inhalationstoxicitet:  
Testförfarande med en startkoncentration av 2 500 ppm/4 h för gaser
  ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 775
 
Tillägg 2d  
Akut inhalationstoxicitet:  
Testförfarande med en startkoncentration av 20 000 ppm/4 h för gaser
  ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 776
 
Tillägg 3  
Förfarande för varje startkoncentration för ångor (mg/l/4 h)  
Allmänna anmärkningar (  1 ) 
För varje startkoncentration ska förfarandet som är beskrivet i detta tillägg följas 
för respektive testprogram. 
Tillägg 3 a: Startkoncentration är 0,5 mg/l Tillägg 3 b: Startkoncentration är 2,0 mg/l Tillägg 3 c: Startkoncentration är 10 mg/l Tillägg 3 d: Startkoncentration är 20 mg/l Beroende på antalet humant avlivade eller döda djur ska testproceduren följa de 
angivna pilarna.
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 777  
( 1 ) I följande tabeller refereras till GHS (Globally Harmonised System of Classification and 
Labelling of Chemicals (GHS). EU-motsvarigheten är förordning (EG) nr 1272/2008. 
När det gäller akut inhalationstoxicitet, tillämpar inte förordning (EG) nr 1272/2008 (9) 
kategori 5.
 Tillägg 3a  
Akut inhalationstoxicitet:  
Testförfarande med en startkoncentration av 0,5 mg/L/4 h för ångor
  ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 778
 
Tillägg 3b  
Akut Inhalationstoxicitet:  
Testförfarande med en startkoncentration av 2 mg/L/4 h för ångor
  ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 779
 
Tillägg 3c  
Akut Inhalationstoxicitet:  
Testförfarande med en startkoncentration av 10 mg/L/4 h för ångor
  ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 780
 
Tillägg 3d  
Akut Inhalationstoxicitet:  
Testförfarande med en startkoncentration av 20 mg/L/4 h för ångor
  ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 781
 
Tillägg 4  
Förfarande för varje startkoncentration för aerosoler (mg/l/4 h)  
Allmänna anmärkningar (  1 ) 
För varje startkoncentration ska förfarandet som är beskrivet i detta tillägg följas 
för respektive testprogram. 
Tillägg 4 a: Startkoncentration är 0,05 mg/l Tillägg 4 b: Startkoncentration är 0,5 mg/l Tillägg 4 c: Startkoncentration är 1 mg/l Tillägg 4 d: Startkoncentration är 5 mg/l Beroende på antalet humant avlivade eller döda djur ska testproceduren följa de 
angivna pilarna.
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 782  
( 1 ) I följande tabeller refereras till GHS (Globally Harmonised System of Classification and 
Labelling of Chemicals (GHS). EU-motsvarigheten är förordning (EG) nr 1272/2008. 
När det gäller akut inhalationstoxicitet, tillämpar inte förordning (EG) nr 1272/2008 (9) 
kategori 5.
 Tillägg 4a  
Akut Inhalationstoxicitet:  
Testförfarande med en startkoncentration av 0,05 mg/L/4h för ångor
  ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 783
 
Tillägg 4b  
Akut inhalationstoxicitet:  
Testförfarande med en startkoncentration av 0,5 mg/L/4h för aerosoler
  ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 784
 
Tillägg 4c  
Akut inhalationstoxicitet:  
Testförfarande med en startkoncentration av 1 mg/L/4h för aerosoler
  ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 785
 
Tillägg 4d  
Akut Inhalationstoxicitet:  
Testförfarande med en startkoncentration av 5 mg/L/4h för aerosoler
  ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 786
 
B.53  STUDIE AV UTVECKLINGSNEUROTOXICITET  
INLEDNING 
1. Denna testmetod motsvarar OECD:s testriktlinje (TG) 426 (2007). En 
OECD-arbetsgrupp för reproduktions- och utvecklingstoxicitet diskuterade 
i Köpenhamn i juni 1995 behovet av att uppdatera befintliga 
OECD-testriktlinjer för reproduktions- och utvecklingstoxicitet samt ut ­
arbeta nya riktlinjer för endpoints som ännu inte omfattas (se hänvisning 1). Arbetsgruppen rekommenderade att en testriktlinje för utvecklingsneu ­
rotoxicitet bör skrivas på grundval av en riktlinje från den amerikanska 
miljöskyddsmyndigheten, som sedan dess har reviderats (se hänvisning 2). I juni 1996 hölls ett andra samrådsmöte i Köpenhamn för att förse sek ­
retariatet med vägledning om utkast till en ny testriktlinje för utvecklings ­
neurotoxicitet, inklusive de viktigaste delarna som t.ex. uppgifter om val av 
djurart, doseringsperiod, testperiod, endpoints som ska bedömas och krite ­
rier för utvärdering av resultaten. En amerikansk riktlinje för riskbedömning av neurotoxicitet publicerades 1998 (se hänvisning 3). Ett 
OECD-expertmöte och en ILSI Risk Science Institute-workshop hölls direkt 
efter varandra i oktober 2000 och ett expertmöte hölls i Tokyo 2005. Dessa möten hölls för att diskutera vetenskapliga och tekniska frågor i samband med den aktuella testriktlinjen, och rekommendationerna från mötena (se 
hänvisning 4, 5, 6, 7) övervägdes vid utarbetandet av denna testmetod. 
Ytterligare information om genomförandet, tolkningen och terminologin som används för denna testmetod finns i OECD:s vägledning nr 43 om testning och utvärdering av reproduktionstoxicitet (se hänvisning 8) och 
nr 20 om testning av neurotoxicitet (se hänvisning 9).
 
INLEDANDE ÖVERVÄGANDEN 
2. Ett antal kemikalier är kända för att ge utvecklingsneurotoxiska effekter hos 
människor och andra arter (se hänvisning 10, 11, 12, 13). Bestämning av 
risken för utvecklingsneurotoxicitet kan behövas för att bedöma och utvär ­
dera de toxiska egenskaperna hos en kemikalie. Utvecklingsneurotoxiska studier är utformade för att tillhandahålla uppgifter, bland annat dos-responskarakterisering av de potentiella funktionella och morfologiska 
effekterna på utvecklingen av nervsystemet hos avkomman som kan uppstå 
vid exponering i livmodern och tidigt i livet. 
3. En studie om utvecklingsneurotoxicitet kan genomföras som en separat 
studie som ingår i en studie om reproduktionstoxicitet och/eller vuxenneu ­
rotoxicitet (t.ex. testmetoderna B.34 [se hänvisning 14], B.35 [se hänvisning 
15], B.43 [se hänvisning 16]), eller läggas till i en studie om prenatal 
utvecklingstoxicitet (t.ex.testmetod B.31 [se hänvisning 17]). När studien om utvecklingsneurotoxicitet införlivas i, eller ansluts till, en annan studie 
är det viktigt att bevara integriteten för båda studietyperna. Alla tester ska 
följa gällande lagstiftning eller statliga och institutionella riktlinjer för an ­
vändning av försöksdjur inom forskningen (se t.ex.hänvisning 18). 
4. Testlaboratoriet bör analysera all tillgänglig information om testkemikalien 
innan studien genomförs. Sådan information innehåller kemikaliens identitet 
och struktur, dess fysikalisk-kemiska egenskaper, resultaten från andra  in 
vitro - eller  in vivo -toxicitetsstudier av kemikalien, toxikologiska data om 
strukturellt närbesläktade kemikalier samt den förväntade användningen av kemikalien. Denna information är nödvändig för att förvissa alla berörda 
parter om att testet är relevant för skyddet av människors hälsa, och att det 
är behjälpligt vid valet av en lämplig startdos.
 ▼M5 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 787
 
PRINCIP FÖR TESTMETODEN 
5. Testkemikalien administreras till djuren under dräktighet och laktation. Mo ­
derdjur testas för att bedöma effekter hos dräktiga och lakterande honor och 
kan också ge jämförande information (moderdjur kontra avkomma). Av ­
komman är slumpmässigt utvald inom kullarna för utvärdering av neurotox ­
icitet. Utvärderingen består av observationer för att upptäcka grova neuro ­
logiska och beteendemässiga avvikelser, inklusive en bedömning av fysisk 
utveckling, beteendemässig ontogeni, motorik, motoriska och sensoriska funktioner och inlärning och minne, samt utvärderingen av hjärnvikter och neuropatologi under postnatal utveckling och vuxenliv. 
6. När testmetoden genomförs som en separat studie kan ytterligare tillgäng ­
liga djur i varje grupp användas för specifika neurobeteendemässiga, neu ­
ropatologiska, neurokemiska eller elektrofysiologiska förfaranden som kan komplettera uppgifterna från de undersökningar som rekommenderas i denna testmetod (se hänvisning 16, 19, 20, 21). De kompletterande för ­
farandena kan vara särskilt användbara när empirisk observation, förväntade 
effekter eller mekanism/tillvägagångssätt indikerar en viss typ av neurotox ­
icitet. Dessa kompletterande förfaranden kan användas för moderdjuren såväl som för avkomman. Dessutom kan  ex vivo-  eller  in 
vitro- förfaranden också användas, förutsatt att dessa förfaranden inte för ­
ändrar integriteten för  in vivo- förfarandena.
 
FÖRBEREDELSER FÖR TESTET  
Val av djurart  
7. Rekommenderad testart är råtta. Andra arter kan användas vid behov. Ob ­
servera dock att dräktighetsdagar (GD) och postnatala dagar (PND) som 
anges i denna testmetod är specifika för de råttstammar som vanligen an ­
vänds, och jämförbara dagar bör väljas om en annan art eller ovanlig stam används. Användningen av annan art bör motiveras utifrån toxikologiska, farmakokinetiska och/eller andra data. Motiveringen bör omfatta tillgäng ­
ligheten av artspecifika postnatala neurobeteendemässiga och neuropatolo ­
giska bedömningar. Om ett tidigare test föranlett problem, bör arten/stam ­
men som varit problematisk beaktas. På grund av de skilda prestandaattri ­
buten hos olika råttstammar, bör det finnas evidens för att den stam som ska 
användas har adekvat fruktsamhet och mottaglighet. Andra arters tillförlit ­
lighet och känslighet när det gäller att upptäcka utvecklingsneurotoxicitet bör dokumenteras.
 
Inhysnings- och utfodringsförhållanden  
8. Temperaturen i djurutrymmet bör vara 22 ± 3 °C. Den relativa fuktigheten 
bör vara minst 30 % och helst inte överstiga 70 %, utom när rummet 
rengörs då målet bör vara 50–60 %. Artificiell belysning bör användas, 
med en dygnsrytm på 12 timmar ljus och 12 timmar mörker. Det är också möjligt att vända ljuscykeln före parningen och under hela studien, för att utföra bedömningar av funktionella och beteendemässiga endpoints under 
mörkerperioden (vid rött ljus), dvs. under den tid som djuren normalt är 
aktiva (se hänvisning 22). Eventuella förändringar i ljus-mörkercykeln bör innefatta tillräcklig acklimatiseringstid för att låta djuren anpassa sig till den nya cykeln. För utfodringen kan konventionellt laboratoriefoder användas 
med fri tillgång till dricksvatten. Den typ av foder och vatten som används 
bör redovisas och båda bör analyseras beträffande föroreningar.
 ▼M5 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 788
 
9. Djuren kan inhysas individuellt eller i burar i små grupper av samma kön. 
Parningsförfarandena bör utföras i burar som är lämpliga för ändamålet. 
Efter tecken på parning, eller senast dag 15 av dräktigheten, bör parade djur inhysas separat i förlossnings- eller moderskapsburar. Burarna bör placeras så att eventuell påverkan beroende på deras placering blir så liten 
som möjligt. Parade honor bör förses med lämpliga och definierade material 
i redet när nedkomsten är nära. Det är allmänt känt att olämplig hantering eller stress under dräktigheten kan leda till motsatt resultat, inberäknat prenatal förlust samt förändrad fosterutveckling och postnatal utveckling. 
Som skydd mot förlust av foster genom faktorer som inte är behandlings ­
relaterade, bör djuren hanteras varsamt under dräktigheten och stress från yttre faktorer såsom högt buller bör undvikas.
 
Förberedelse av djuren  
10. Friska djur ska användas vilka har acklimatiserats till laboratoriemiljön och 
inte använts i tidigare försöksförfaranden, såvida inte studien ingår i en annan studie (se punkt 3). Försöksdjuren bör karakteriseras efter art, stam, 
ursprung, kön, vikt och ålder. Varje djur tilldelas och märks med ett unikt 
identifieringsnummer. Djuren i alla testgrupper bör, så vitt det är praktiskt möjligt, ha enhetlig vikt och ålder och ligga inom det normala intervallet för den art och stam som studeras. Unga vuxna honor utan avkomma bör 
användas vid varje dosnivå. Syskon ska inte paras och försiktighet bör 
iakttas för att säkerställa detta. Dräktighetsdagen (GD) 0 är den dag då en vaginalplugg och/eller sperma observeras. Adekvat acklimatiseringstid (t.ex.2–3 dagar) bör tillåtas vid köp av tidsdräktiga djur från en leverantör. 
Parade honor bör anvisas på ett opartiskt sätt till kontroll- och behandlings ­
grupperna och så vitt det är möjligt bör de fördelas jämnt mellan grupperna (t.ex.ett stratifierat slumpmässigt förfarande rekommenderas för att ge en jämn fördelning i alla grupper, exempelvis baserat på kroppsvikt). Honor 
som har befruktats av samma hane bör fördelas jämnt i grupperna.
 
FÖRFARANDE  
Djurens antal och kön  
11. Varje test- och kontrollgrupp bör innehålla ett tillräckligt antal dräktiga 
honor som ska exponeras för testkemikalien, för att säkerställa att ett till ­
räckligt antal avkommor produceras för utvärderingen av neurotoxicitet. Sammanlagt 20 kullar rekommenderas vid varje dosnivå. Doseringsutform ­
ningar med replikat och förskjutna grupper är tillåtna om det totala antalet 
kullar per grupp uppnås och om lämpliga statistiska modeller används för 
att redovisa replikat. 
12. Senast postnatal dag (PND) 4 (nedkomstdag är PND 0), bör storleken på 
varje kull justeras genom att extra ungar utesluts genom ett slumpmässigt 
urval för att ge en enhetlig kullstorlek för alla kullar (se hänvisning 23). Kullens storlek ska inte överstiga den genomsnittliga kullstorleken för den stam av gnagare som används (8–12). Kullen bör i möjligaste mån ha lika 
många han- och honungar. Selektiv uteslutning av ungar,t.ex.baserat på 
kroppsvikt, är inte lämpligt. Efter standardisering av kullarna (gallring) och före vidare testning av funktionella endpoints, bör enskilda ungar som är schemalagda för testning före eller efter avvänjningen identifieras 
unikt med hjälp av en lämplig human metod för identifiering (se t.ex. 
hänvisning24).
 ▼M5 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 789
 
Anvisning av djur till funktions- och beteendetester, hjärnvikter och 
neuropatologiska utvärderingar  
13. Testmetoden medger olika tillvägagångssätt när det gäller anvisning av djur 
som exponerats  in utero  och genom laktation till funktions- och beteende ­
tester, könsmognad, fastställande av hjärnvikt och neuropatologisk utvär ­
dering (se hänvisning 25). Andra tester av kognitiva funktioner (t.ex. socialt 
beteende), neurokemi eller neuropatologi kan läggas till i en bedömning 
från fall till fall, så länge integriteten hos de ursprungliga nödvändiga tes ­
terna inte äventyras. 
14. Ungar väljs ut från varje dosgrupp och anvisas till endpointbedömning på 
PND 4 eller senare. Urvalet av ungar bör utföras så att, i möjligaste mån, båda könen från varje kull i varje dosgrupp är lika representerade i alla test. För testning av motorisk aktivitet bör samma par av han- och honungar 
testas vid alla åldrar före avvänjningen (se punkt 35). För alla andra tester 
kan samma eller separata par av han- och hondjur anvisas till olika bete ­
endetester. Olika ungar kan behöva anvisas till tester av kognitiv funktion för avvanda djur kontra vuxna för att undvika störning av effekter från ålder 
och tidigare träning på dessa mätningar (se hänvisning 26, 27). Vid avvänj ­
ning (PND 21) kan ungar som inte valts ut för testning avlivas på ett humant sätt. Eventuella förändringar i anvisning av ungar ska redovisas. Den statistiska enheten bör vara kullen (eller moderdjuret), och inte ungen. 
15. Det finns olika sätt att anvisa avkommor till undersökningar före och efter 
avvänjning, kognitiva tester, patologiska undersökningar etc., (se figur 1 för allmän utformning, och tillägg 1 för exempel på anvisning). Rekommende ­
rat minsta antal djur i varje dosgrupp för undersökningar före och efter 
avvänjning är följande: 
Kliniska observationer och kroppsvikt Alla djur 
Detaljerade kliniska observationer 20/kön (1/kön/kull) 
Hjärnvikt (efter fixering) PND 11–22 10/kön (1/kull) Hjärnvikt (ej fixerad) ~ PND 70 10/kön (1/kull) Neuropatologi (immersions- eller perfu ­
sionsfixering) PND 11–22 10/kön (1/kull) 
Neuropatologi (perfusionsfixering) PND ~ 
70 10/kön (1/kull) 
Könsmognad 20/kön (1/kön/kull) 
Andra utvecklingsmarkörer (valfria) Alla djur Beteendeontogeni 20/kön (1/kön/kull) Motorisk aktivitet 20/kön (1/kön/kull) 
Motoriska och sensoriska funktioner 20/kön (1/kön/kull) 
Inlärning och minne 10/kön (
 a ) (1/kull)  
( a ) Beroende på hur känsliga de kognitiva funktionstesterna är, bör en undersökning 
med ett större antal djur övervägas, t.ex. upp till 1 hane och 1 hona per kull (för 
djurtilldelning, se tillägg 1) (ytterligare vägledning om urvalsstorlek finns i 
OECD:s vägledning 43 [se hänvisning 8]).  ▼M5 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 790
 
Dosering  
16. Minst tre dosnivåer och en jämsides behandlad kontroll ska användas. Dos ­
nivåerna bör spridas ut för att ge en gradering av de toxiska effekterna. Den 
högsta dosnivån ska väljas, om kemikalien inte har några begränsningar på grund av sina fysikalisk-kemiska eller biologiska egenskaper, i syfte att framkalla en viss maternell toxicitet (t.ex. kliniska tecken, minskad viktupp ­
gång (högst 10 %) och/eller tecken på dosbegränsande toxicitet i ett mål ­
organ). Den höga dosen kan begränsas till 1 000 mg/kg/dag kroppsvikt, med några undantag. Exempelvis kan förväntad exponering av människor indikera ett behov av att använda en högre dosnivå. Alternativt bör pilot ­
studier eller preliminära dosfinnande studier utföras för att fastställa den 
högsta dos som ska användas för att producera en minimal grad av mater ­
nell toxicitet. Om testkemikalien har visat sig vara utvecklingsmässigt tox ­
isk, antingen i en vanlig undersökning av fosterskadande effekter eller i en 
pilotstudie, bör den högsta dosnivån vara den högsta dos som inte fram ­
kallar alltför stor toxicitet i avkomman, eller  in utero  eller neonatal död eller 
missbildning, tillräckligt för att utesluta en meningsfull utvärdering av neu ­
rotoxicitet. Den lägsta dosen bör syfta till att inte ge några tecken på vare 
sig maternell eller utvecklingsmässig toxicitet, inklusive neurotoxicitet. En 
fallande dosnivå bör väljas i syfte att påvisa en eventuell dosrelaterad respons och en nivå där ingen skadlig effekt observeras (Noael) eller doser nära detektionsgränsen vilka gör det möjligt att fastställa en referensdos. 
Två- till fyrfaldiga dosintervall är ofta optimala för de fallande dosnivåerna, 
och att lägga till en fjärde dosgrupp är att föredra framför att använda mycket stora intervall (t.ex. mer än en faktor på 10) mellan doseringarna. 
17. Dosnivåerna bör väljas med hänsyn till alla befintliga toxicitetsdata samt 
ytterligare information om metabolism och toxikokinetik hos testkemikalien 
eller närbesläktade ämnen. Denna information kan också hjälpa till att visa 
doseringsschemats lämplighet. Direktdosering av ungar bör övervägas ba ­
serat på exponeringsinformation och farmakokinetisk information (se hän ­
visning 28, 29). Fördelar och nackdelar bör övervägas noga innan direkt ­
doseringsstudier utförs (se hänvisning 30). 
18. Den jämsides behandlade kontrollgruppen bör vara en kontrollgrupp som 
får en overksam behandling (placebo) eller en vehikelkontrollgrupp om en vehikel används för tillförsel av testkemikalien. Samtliga djur bör normalt ges samma volym av antingen testkemikalien eller vehikeln baserat på 
kroppsvikten. Om en vehikel eller annan tillsats används för att underlätta 
doseringen ska hänsyn tas till följande egenskaper: påverkan på absorption, distribution, metabolism eller lagring av testkemikalien; effekter på test ­
kemikaliens kemiska egenskaper som kan ändra dess toxiska egenskaper, 
samt påverkan på foder- eller vattenkonsumtionen eller djurens näringssta ­
tus. Vehikeln ska inte leda till effekter som kan störa tolkningen av studien, inte heller ska den vara neurobeteendetoxisk eller ha effekter på fortplant ­
ning eller utveckling. När det gäller nya vehiklar bör en placebobehandlad 
kontrollgrupp ingå förutom en vehikelkontrollgrupp. Djur i kontrollgrupper 
ska hanteras på samma sätt som djur i testgrupper.
 ▼M5 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 791
 
Administration av doser  
19. Testkemikalien eller vehikeln bör ges på det sätt som är mest relevant för 
potentiell exponering av människor och baserat på tillgänglig information 
om metabolism och spridning i försöksdjuren. Administrationsvägen är i allmänhet oral (t.ex.sondmatning, via föda, via dricksvatten) men andra vägar (t.ex.hud eller inandning) kan användas beroende på egenskaper 
och förväntade eller kända vägar för mänsklig exponering (ytterligare väg ­
ledning finns i vägledningsdokument 43 [se hänvisning 8]). Motivering bör ges för valet av administrationsväg. Testkemikalien bör ges vid ungefär samma tid varje dag. 
20. Den dos som ges till varje djur ska normalt baseras på den senaste bestäm ­
ningen av individuell kroppsvikt. Dock bör försiktighet iakttas vid justering 
av doser under sista tredjedelen av dräktigheten. Om överskottstoxicitet noteras i de behandlade moderdjuren bör dessa avlivas på ett humant sätt. 
21. Testkemikalien eller vehikeln bör, som ett minimum, administreras dagligen 
till parade honor från tiden för implanteringen (GD 6) och under laktationen 
(PND 21), så att avkomman är exponerad för testkemikalien under den pre- 
och postnatala neurologiska utvecklingen. Den ålder då doseringen startar, och doseringens varaktighet och frekvens, kan justeras om evidens stöder en experimentell utformning som är mer relevant för mänsklig exponering. 
Doseringsvaraktigheter bör justeras för andra arter för att säkerställa expo ­
nering under alla tidiga perioder av hjärnans utveckling (dvs., motsvarande prenatal och tidig postnatal tillväxt av den mänskliga hjärnan). Doseringen kan börja när dräktigheten inleds (GD 0), även om man bör överväga risken 
för att testkemikalien kan orsaka preimplantatorisk förlust. Administration 
som börjar på GD 6 skulle kunna undvika denna risk, men utvecklings ­
stadierna mellan GD 0 och GD 6 skulle då inte behandlas. När ett labora ­
torium köper tidsparade djur är det opraktiskt att börja dosera på GD 0, och 
därmed vore GD 6 en bra startdag. Testlaboratoriet bör ställa in doserings ­
schemat i enlighet med relevant information om testkemikaliens effekter, tidigare erfarenhet och logistiska faktorer; detta kan omfatta en förlängning av doseringen förbi avvänjningen. Doseringen bör inte ske på nedkomst ­
dagen hos de djur som inte har fött fram hela sin avkomma. I allmänhet 
antas det att exponering av ungarna sker via modersmjölken, dock ska direktdosering av ungar övervägas i de fall då det saknas evidens på fortsatt exponering av avkomman. Belägg för kontinuerlig exponering kan 
t.ex.hämtas från farmakokinetisk information, toxicitet hos avkomma eller 
förändringar av biologiska markörer (se hänvisning 28).
 
OBSERVATIONER  
Observation av moderdjur  
22. Alla moderdjur bör observeras noga minst en gång dagligen avseende deras 
hälsotillstånd, inbegripet sjuklighet och dödlighet. 
23. Under behandlings- och observationsperioderna bör mer detaljerade kliniska 
observationer utföras regelbundet (minst två gånger under dräktighetsdose ­
ringsperioden och två gånger under laktationsdoseringsperioden) med minst 
tio moderdjur per dosnivå. Djuren ska observeras utanför buren av utbildade tekniker som är omedvetna om djurens behandling, med hjälp av standar ­
diserade procedurer som minimerar djurens stress och observatörernas par ­
tiskhet och maximerar tillförlitligheten mellan observatörer. Om det är möj ­
ligt bör observationerna i en given studie göras av samma tekniker.
 ▼M5 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 792
 
24. Förekomst av observerade tecken ska registreras. När det är möjligt bör 
också de observerade tecknens omfattning registreras. Kliniska observatio ­
ner bör omfatta, men inte begränsas till, förändringar av hud, päls, ögon och slemhinnor, förekomst av sekret och autonom aktivitet (t.ex.tårflöde, piloe ­
rektion, pupillstorlek, ovanligt andningsmönster och/eller munandning, och 
eventuella ovanliga tecken på urinering eller avföring). 
25. Eventuella ovanliga reaktioner med avseende på kroppsställning, aktivitets ­
nivå (t.ex.minskad eller ökad utforskning av standardområdet) och samord ­
ning av rörelser bör också noteras. Förändringar i gång, (t.ex.vaggande, 
ataxi), kroppsställning (t.ex.krökt rygg) och reaktivitet mot hantering, pla ­
cering eller andra miljömässiga stimuli, liksom förekomst av kloniska eller toniska rörelser, konvulsioner, darrningar, stereotypier (t.ex.överdrivet put ­
sande, ovanliga huvudrörelser, repetitivt cirklande), bisarrt beteende (t.ex.bi ­
tande eller överdrivet slickande, självstympning, baklängesgång, vokalise ­
ring) eller aggressioner bör registreras. 
26. Tecken på toxicitet bör registreras, inklusive dag för första tecken, tid på 
dygnet, grad och varaktighet. 
27. Djuren bör vägas vid doseringstidpunkten minst en gång i veckan under 
hela studien, på eller nära nedkomstdagen, och på PND 21 (avvänjning). Vid sondmatningsstudier bör moderdjuren vägas minst två gånger per vec ­
ka. Doserna ska vid behov justeras i samband med varje bestämning av 
kroppsvikt. Foderkonsumtionen bör mätas minst en gång i veckan under 
dräktighet och laktation. Vattenförbrukningen bör mätas minst en gång i veckan om exponeringen sker via vattenförsörjningen.
 
Observationer av avkomma  
28. All avkomma bör observeras noggrant minst en gång per dag för att upp ­
täcka eventuella tecken på toxicitet, sjuklighet och dödlighet. 
29. Under behandlings- och observationsperioderna bör mer detaljerade kliniska 
observationer av avkomman genomföras. Avkomman (minst en unge per 
kön/kull) bör observeras av utbildade tekniker som är omedvetna om dju ­
rens behandling, med hjälp av standardiserade procedurer som minimerar partiskheten och maximerar tillförlitligheten mellan observatörer. Om möj ­
ligt bör observationerna göras av samma tekniker. Som ett minimum, bör de 
endpoints som beskrivs i punkterna 24 och 25 övervakas på lämpligt sätt 
för det utvecklingsstadium som observeras. 
30. Alla tecken på toxicitet hos avkomman bör registreras, inklusive dag för 
första tecken, tid på dygnet, grad och varaktighet.
 
Fysiska och utvecklingsmässiga markörer  
31. Förändringar i utvecklingsmarkörer före avvänjningen (t.ex.ytterörats utvik ­
ning, ögonöppning, tandsprickning) är starkt korrelerade med kroppsvikten (se hänvisning 30, 31). Kroppsvikten kan vara den bästa indikatorn på 
fysisk utveckling. Mätning av utvecklingsmarkörer rekommenderas därför 
endast när det finns tidigare belägg på att dessa endpoints kan ge ytterligare information. Tidpunkten för bedömningen av dessa parametrar anges i tabell 1. Beroende på de förväntade effekterna och resultaten av de inledande 
mätningarna, kan det vara lämpligt att lägga till ytterligare tidpunkter eller 
att utföra mätningarna under andra utvecklingsstadier.
 ▼M5 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 793
 
32. Det är lämpligt att använda postkoital ålder i stället för postnatal ålder vid 
bedömning av fysisk utveckling (se hänvisning 33). Om avkomman testas 
på dagen för avvänjningen, rekommenderas att detta test genomförs före själva avvänjningen för att undvika feltolkning på grund av stress i samband med avvänjningen. Dessutom bör inte något test av avkomman ske under 
två dagar efter avvänjningen.
 
Tabell 1  
Tidpunkt för bedömningen av fysiska och utvecklingsmässiga markörer och av 
funktionella/beteendemässiga endpoints  ( a ) 
Åldersperioder 
Endpoints Före avvänjning (  b ) Ungdjur (  b ) Unga vuxna (  b ) 
Fysiska och utvecklingsmässiga markörer  
Kroppsvikt samt kli ­
niska observationer en gång i veckan (  c ) minst varannan 
vecka minst varannan vecka 
Hjärnvikt PND 22 (  d ) vid avslutningen 
Neuropatologi PND 22 (  d ) vid avslutningen 
Könsmognad — i förekommande fall — 
Andra utvecklingsmar ­
körer (  e ) i förekommande fall — —  
Funktionella och beteendemässiga endpoints  
Beteendeontogeni Minst två mätningar 
Motorisk aktivitet (in ­
klusive tillvänjning) 1–3 gånger (  f ) — en gång 
Motoriska och senso ­
riska funktioner — en gång en gång 
Inlärning och minne — en gång en gång  
( a ) Denna tabell visar minsta antalet mättillfällen. Beroende på de förväntade effekterna och resultaten av de 
inledande mätningarna, kan det vara lämpligt att lägga till ytterligare tidpunkter (t.ex. äldre djur) eller 
utföra mätningarna under andra utvecklingsstadier. 
( b ) Det rekommenderas att avkomman inte testas under två dagar efter avvänjningen (se punkt 32). Re ­
kommenderade åldrar för testning av ungdjur är: lärande och minne = PND 25 ± 2, motoriska och 
sensoriska funktioner = PND 25 ± 2. Rekommenderade åldrar för att testa unga vuxna är PND 60–70. 
( c ) Kroppsvikten bör mätas minst två gånger i veckan vid direktdosering av ungarna för att justera doserna 
under perioder med snabb viktuppgång. 
( d ) Hjärnvikter och neuropatologi kan bedömas vid en tidigare tidpunkt (t.ex. PND 11), vid behov (se punkt 
39). 
( e ) Andra utvecklingsmarkörer utöver kroppsvikten (t.ex. öppna ögon) bör registreras vid behov (se punkt 
31). 
( f ) Se punkt 35.  
33. Levande avkomma ska räknas och könsbestämmas, t.ex.genom visuell in ­
spektion eller mätning av anogenitalt avstånd (se hänvisning 34, 35), och 
var och en av ungarna i en kull bör vägas individuellt vid födseln eller strax därefter, minst en gång i veckan under diandet, och minst en gång varannan vecka därefter. När könsmognad utvärderas bör djurets ålder och kroppsvikt 
bestämmas när vaginal öppning (se hänvisning 36) eller preputial separation 
(se hänvisning 37) förekommer, hos minst en hane och en hona per kull.
 ▼M5 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 794
 
Beteendeontogeni  
34. Ontogeni för utvalda beteenden bör mätas på minst en unge/kön/kull under 
lämplig åldersperiod med samma ungar som ska användas på alla testdagar 
för de beteenden som ska bedömas. Mätningsdagarna ska fördelas jämnt över denna period för att definiera antingen normal eller behandlingsrelate ­
rad förändring i ontogenesen för detta beteende (se hänvisning 38). Följande 
är några exempel på beteenden för vilka ontogenesen kunde bedömas: upp ­
rätningsreflex, negativ geotaxis och motorisk aktivitet (se hänvisning 38, 39, 40).
 
Motorisk aktivitet  
35. Motorisk aktivitet bör övervakas (se hänvisning 41, 42, 43, 44, 45) under 
perioden före avvänjningen och i vuxen ålder. För testning vid tidpunkten 
för avvänjningen, se punkt 32. Testperioden bör vara tillräckligt lång för att visa tillvänjning inom perioden för icke-behandlade kontroller. Att använda motorisk aktivitet för att bedöma beteendeontogeni rekommenderas bestämt. 
Om detta används som ett beteendeontogenitest, bör testningen nyttja 
samma djur för alla testsessioner före avvänjningen. Testning bör ske till ­
räckligt ofta för att man ska kunna bedöma ontogenin för tillvänjning inom 
sessionen (se hänvisning 44). Detta kan kräva tre eller flera tidsperioder 
före, och inklusive, dagen för avvänjningen (t.ex.PND 13, 17, 21). Test av samma djur eller kullsyskon bör även bör ske i vuxen ålder nära studiens avslutning (t.ex.PND 60–70). Tester på ytterligare dagar kan utföras vid 
behov. Motorisk aktivitet bör övervakas av en automatisk apparat för ak ­
tivitetsregistrering som bör kunna upptäcka både ökad och minskad aktivi ­
tet, (dvs. aktivitetsgrundvärdet som mäts av apparaten bör inte vara så låg att upptäckten av minskningar hindras och inte heller så hög att upptäckten 
av aktivitetsökningar hindras). Varje enhet bör testas genom standardför ­
faranden, för att så långt som möjligt säkerställa tillförlitlighet i driften mellan olika apparater och mellan olika dagar. I den mån det är möjligt, bör behandlingsgrupperna balanseras mellan enheterna. Varje djur bör testas 
individuellt. Behandlingsgrupperna bör fördelas jämnt över testtiderna för 
att undvika aktivitetsmönster kopplade till dygnsrytm stör resultaten. An ­
strängningar bör göras för att säkerställa att variationerna i testbetingelserna är minimala och inte systematiskt relaterade till behandlingen. Bland de 
variabler som kan påverka många beteendemätningar inklusive motorisk 
aktivitet, är ljudnivån, storlek och form på testburen, temperatur, relativ luftfuktighet, ljusförhållanden, lukter, användning av buren eller en ny prov ­
bur, samt miljömässiga störningar.
 
Motoriska och sensoriska funktioner  
36. Motoriska och sensoriska funktioner bör undersökas i detalj minst en gång 
under adolescensen och en gång under den tidiga vuxenperioden (t.ex.PND 60–70). För testning vid tidpunkten för avvänjningen, se punkt 32. Till ­
räcklig testning bör utföras för att säkerställa en lämplig kvantitativ prov ­
tagning av sensoriska modaliteter (t.ex. somato-sensoriska, vestibulära) och 
motoriska funktioner (t.ex. styrka, koordination). Några exempel på tester avseende motorisk och sensorisk funktion är extensorreflex (se hänvisning 46), upprätningsreflex (se hänvisning 47, 48), tillvänjning till plötsliga ljud 
(se hänvisning 40, 49, 50, 51, 52, 53, 54) och framkallade potentialer (se 
hänvisning 55).
 ▼M5 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 795
 
Tester av inlärning och minne  
37. Ett test av associativ inlärning och minne bör utföras efter avvänjningen 
(t.ex. 25 ± 2 dagar) och för unga vuxna (PND 60 och äldre). För testning 
vid tidpunkten för avvänjningen, se punkt 32. Samma eller separata tester kan användas för dessa två utvecklingsstadier. En viss flexibilitet är tillåten vid val av tester för inlärning och minne hos avvanda och vuxna råttor. 
Emellertid bör testerna vara utformade så att de uppfyller två kriterier. För 
det första bör inlärningen antingen bedömas som en förändring över flera upprepade inlärningsförsök eller sessioner, eller, i tester som involverar ett enda försök, med hänvisning till ett villkor som kontrollerar icke-associativa 
effekter av utbildningserfarenheten. För det andra bör testerna omfatta nå ­
gon mätning av minnet (korttids- eller långtidsminne), utöver den ursprung ­
liga inlärningen (tillägnandet), dock kan denna mätning av minnet inte rapporteras i avsaknad av måttet på tillägnande som erhållits från samma 
test. Om tester av inlärning och minne avslöjar en påverkan av testkemi ­
kalien, kan att ytterligare tester övervägas för att utesluta alternativa tolk ­
ningar som baseras på förändringar i sensorisk, motiverande och/eller mo ­
torisk kapacitet. Förutom ovanstående två kriterier rekommenderas det att 
testet av inlärning och minne väljs utifrån dess visade känslighet för den 
klass av kemikalier som utreds, om sådan information finns tillgänglig i litteraturen. I avsaknad av sådan information, inkluderar följande exempel tester som kan göras för att uppfylla ovanstående kriterier: passivt undvi ­
kande (se hänvisning 43, 56, 57), fördröjd-matchning-till-position för vuxen 
råtta (se hänvisning 58) och för råttungar (se hänvisning 59), olfaktorisk betingning (se hänvisning 43, 60), Morris vattenlabyrint (se hänvisning 61, 62, 63), Biel- eller Cincinnati-labyrint (se hänvisning 64, 65), ”radial arm 
maze” (se hänvisning 66), T-labyrint (se hänvisning 43), samt förvärv och 
upprätthållande av schemastyrt beteende (se hänvisning 26, 67, 68). Ytter ­
ligare tester beskrivs i litteraturen för avvanda (se hänvisning 26, 27) och för vuxna råttor (se hänvisning 19, 20).
 
Obduktion  
38. Honor kan avlivas efter avvänjning av avkomman. 
39. Neuropatologisk utvärdering av avkomman kan genomföras med hjälp av 
vävnad från djur som avlivats humant på PND 22 eller vid en tidigare 
tidpunkt mellan PND 11 och PND 22, samt vid studiens avslutning. För 
avkomma som avlivats från PND 22 bör hjärnvävnaden utvärderas, för djur som avlivats vid avslutningen, bör både centrala nervsystemets (CNS) och 
perifera nervsystemets (PNS) vävnader utvärderas. Djur som avlivas på 
PND 22 eller tidigare kan antingen fixeras genom immersion eller perfu ­
sion. Djur som avlivas vid studiens avslutning bör fixeras genom perfusion. Under alla moment i prepareringen av vävnadsprover, från perfusion av 
djuren till dissektion av vävnadsprover, vävnadsbehandling och färgning 
av utstryksglas bör man använda sig av en balanserad utformning, så att varje sats innehåller representativa prover från varje dosgrupp. Ytterligare vägledning om neuropatologi finns i OECD:s vägledning nr 20 (se hänvis ­
ning 9), se även (se hänvisning 103).
 
Beredning av vävnadsprover  
40. Alla större avvikelser som är uppenbara vid obduktionstidpunkten bör no ­
teras. De vävnadsprover som tas bör representera alla stora regioner i nerv ­
systemet. Vävnadsproverna bör bevaras i ett lämpligt fixativ och beredas 
enligt publicerade histologiska standardprotokoll (se hänvisning 69, 70, 71, 
103). Paraffininingjutning är acceptabelt för vävnader från CNS och PNS  ▼M5 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 796
 
men användning av osmium i efterfixeringen tillsammans med epoxiinbädd ­
ning kan vara lämplig när högre upplösning krävs (t.ex.för perifera nerver, 
när en perifer neuropati misstänks och/eller för morfometrisk analys av perifera nerver). Hjärnvävnad som samlas in för morfometrisk analys bör ingjutas i lämpligt medium för alla dosnivåer vid samma tidpunkt för att 
undvika krympning av artefakter, vilket kan förknippas med långvarig lag ­
ring i fixativ (se hänvisning 6).
 
Neuropatologiska undersökningar  
41. Syftet med den kvalitativa undersökningen är 
i) att identifiera regioner inom nervsystemet som uppvisar tecken på neu ­
ropatologiska förändringar, 
ii) identifiera olika typer av neuropatologiska förändringar till följd av 
exponering för testkemikalien och 
iii) fastställa allvarlighetsgraden för de neuropatologiska förändringarna. Representativa histologiska snitt från vävnadsproverna bör undersökas mik ­
roskopiskt av en lämpligt utbildad patolog avseende belägg på neuropato ­
logiska förändringar. Alla neuropatologiska förändringar bör tilldelas en subjektiv klass som anger allvarlighetsgraden. Ett hematoxylin- och eosin ­
färgämne kan vara tillräckligt för att utvärdera hjärnsnitt från djur som 
avlivats humant på PND 22, eller tidigare. Emellertid kan ett myelinfärg ­
ämne (t.ex.Luxol snabb blå/kresylviolett) och en silverfärg (t.ex.Bielschow ­
skys eller Bodians färgämnen) rekommenderas för snitt av CNS- och PNS-vävnader från djur som avlivas vid studiens avslutning. Med förbehåll 
för patologens yrkesmässiga bedömning och typen av förändringar som har 
observerats, kan andra färgämnen anses lämpliga för att identifiera och karakterisera vissa typer av förändringar (t.ex.surt gliafibrillärt protein [G ­
FAP], eller lektin histokemi för att bedöma glia- och mikrogliaförändringar 
[se hänvisning 72], fluoro-jade för att detektera nekros [se hänvisning 73, 
74], eller silverfärgämnen specifika för neural degenerering [se hänvisning 75]). 
42. Morfometrisk (kvantitativ) utvärdering bör utföras eftersom dessa uppgifter 
kan bidra till att upptäcka en behandlingsrelaterad effekt och är värdefulla 
vid tolkningen av behandlingsrelaterade skillnader i hjärnans vikt eller mor ­
fologi (se hänvisning 76, 77). Nervvävnad bör provtas och prepareras för en morfometrisk utvärdering. Morfometriska utvärderingar kan t.ex. omfatta linjära mätningar eller arealmätningar av specifika delar av hjärnan (se 
hänvisning 78). Linjära mätningar eller arealmätningar kräver att man an ­
vänder noggrant utvalda homologa snitt baserat på tillförlitliga mikrosko ­
piska markörer (se hänvisning 6). Stereologi kan användas för att identifiera behandlingsrelaterade verkningar på parametrar såsom volym eller cellantal 
för specifika neuroanatomiska områden (se hänvisning 79, 80, 81, 82, 83, 
84). 
43. Hjärnan bör undersökas avseende belägg på behandlingsrelaterade neuropa ­
tologiska förändringar och lämpliga prover bör tas från alla stora regioner av hjärnan (t.ex. luktbulben, hjärnbarken, hippocampus, basala ganglier, 
thalamus, hypothalamus, mitthjärnan (tectum, tegmentum och cerebrala pe ­
dunklar), pons, medulla oblongata, cerebellum) för att säkerställa en grund ­
lig undersökning. Det är viktigt att snitten tas i samma plan för alla djur. På vuxna djur, som avlivas humant vid studiens avslutning, bör prover tas från 
representativa delar av ryggmärgen och PNS. De undersökta områdena bör 
innehålla ögat med synnerv och näthinna, ryggmärgen vid cervikal och lumbal svullnad, dorsala och ventrala rotfibrer, proximala ischiasnerven, proximala tibialnerven (vid knät) och tibialnervens vadmuskelgrenar. Rygg ­
märgen och perifera nervsnitt bör omfatta diagonala, tvärgående och längs ­
gående snitt.
 ▼M5 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 797
 
44. Neuropatologiska utvärderingar bör innehålla en undersökning av tecken på 
utvecklingsskador på nervsystemet (se hänvisning 6, 85, 86, 87, 88, 89) 
utöver de cellulära förändringarna (t.ex.neuronal vakuolisering, degenera ­
tion, nekros), och vävnadsförändringar (t.ex.gliosis, leukocytisk inlagring, cystisk bildning). I detta avseende är det viktigt att behandlingsrelaterade 
effekter kan särskiljas från normala utvecklingshändelser kända för att in ­
träffa vid ett utvecklingsstadium som motsvarar tidpunkten för avlivningen (se hänvisning 90). Exempel på viktiga förändringar som indikerar utveck ­
lingsmässig skada inkluderar, men är inte begränsad till, följande: 
— Förändring av storlek eller form på luktbulberna, storhjärnan eller 
lillhjärnan. 
— Förändringar av relativ storlek på olika hjärnregioner, inklusive minsk ­
ning eller ökning av storlek på regioner till följd av förlust eller uthål ­
lighet hos vanligtvis tillfälliga cellpopulationer eller axonala projektioner (t.ex.externt germinalt lager hos lillhjärnan, hjärnbalken). 
— Förändringar i proliferation, migration och differentiering, vilket indike ­
ras av områden med överdriven apoptos eller nekros, grupper eller 
spridda populationer av ektopiska, desorienterade eller missbildade nerv ­
celler, eller förändringar i relativ storlek hos olika lager av kortikala strukturer. 
— Förändringar i myelinationsmönster, inklusive en generell minskning av 
storlek eller förändrad färgning av myeliniserade strukturer. 
— Tecken på hydrocefalus, särskilt utvidgning av kamrarna, cerebral ak ­
veduktstenos och förtunning av hjärnhalvorna.
 
Analys av sambandet mellan dos och respons hos neuropatologiska 
förändringar  
45. Följande stegvisa förfarande rekommenderas för de kvalitativa och kvan ­
titativa analyserna av neuropatologi. Först jämförs snitten från högdosgrup ­
pen med dem i kontrollgruppen. Om inga tecken på neuropatologiska för ­
ändringar påträffas hos djuren i högdosgruppen så krävs inga fler analyser. 
Om tecken på neuropatologiska förändringar påträffas i högdosgruppen så undersöks djuren i mellan- och lågdosgruppen. Om högdosgruppen faller bort på grund av dödsfall eller annan störande toxicitet, bör hög- och 
mellandosgruppen analyseras avseende neuropatologiska förändringar. Om 
det finns eventuella tecken på neurotoxicitet i lägre dosgrupper, bör neuro ­
patologisk analys utföras för dessa grupper. Om eventuella behandlings ­
relaterade neuropatologiska förändringar påträffas i den kvalitativa eller 
kvantitativa undersökningen, bör den dosberoende förekomsten, frekvensen 
och allvarlighetsgraden av skadorna eller de morfometriska ändringarna fastställas på grundval av en bedömning av samtliga djur i alla dosgrupper. Samtliga regioner i hjärnan som uppvisar tecken på neuropatologiska för ­
ändringar bör ingå i denna utvärdering. För varje typ av skada bör de 
egenskaper som används för att definiera varje allvarlighetsgrad beskrivas och de egenskaper som används för att åtskilja varje klass anges. Frekven ­
sen för varje typ av skada och dess allvarlighetsgrad bör registreras, och en 
statistisk analys bör utföras för att bedöma hur dos-responssambandet ser ut. 
Användning av kodade utstryksglas rekommenderas (se hänvisning 91).
 
DATA OCH RAPPORTERING  
Data  
46. Data bör rapporteras individuellt och sammanställas i tabellform, och för 
varje testgrupp visa förändringstyper och antalet moderdjur, avkomma efter kön och kullar för varje typ av förändring. Om direkt postnatal exponering 
av avkomman har utförts, bör sättet, varaktigheten och exponeringsperioden 
rapporteras.
 ▼M5 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 798
 
Utvärdering och tolkning av resultaten  
47. En studie av utvecklingsneurotoxicitet ger information om effekterna av 
upprepad exponering för en kemikalie under  in utero  och tidig postnatal 
utveckling. Eftersom vikten läggs på endpoints för både allmän toxicitet och utvecklingsneurotoxicitet, kommer resultaten från studien att möjliggöra en åtskillnad mellan neuroutvecklingseffekter som förekommer i frånvaron av 
allmän maternell toxicitet, och de som bara uttrycks på nivåer som också är 
giftiga för moderdjuret. På grund av de komplexa sambanden mellan studie ­
utformning, statistisk analys och biologisk signifikans för data, inbegriper en adekvat tolkning av data om utvecklingsneurotoxicitet en expertbedöm ­
ning (se hänvisning 107, 109). Vid tolkningen av testresultaten bör man 
använda en metod som bygger på evidensvärde (se hänvisning 20, 92, 93, 94). Mönster av beteendemässiga eller morfologiska fynd bör, om det finns, diskuteras, liksom belägg för dos-respons. Data från alla studier som är 
relevanta för bedömningen av utvecklingsneurotoxicitet, inklusive mänsk ­
liga epidemiologiska studier och fallrapporter, samt experimentella djurstu ­
dier (t.ex.toxikokinetiska data, struktur-aktivitetsinformation, data från andra toxicitetsstudier), bör ingå i denna karakterisering. Detta inkluderar relatio ­
nen mellan doser av testkemikalien och närvaron eller frånvaron, förekoms ­
ten och omfattningen av eventuell neurotoxisk effekt för varje kön (se hänvisning 20, 95). 
48. Utvärderingen av data bör omfatta en diskussion om både den biologiska 
och statistiska signifikansen. Statistisk analys bör ses som ett verktyg som vägleder, snarare än bestämmer, tolkningen av data. Avsaknad av statistisk 
signifikans bör inte vara den enda grunden för att fastslå en avsaknad av 
behandlingsrelaterad effekt, precis som statistisk signifikans inte bör vara den enda motiveringen för att fastslå en behandlingsrelaterad effekt. För att skydda sig mot eventuella falska negativa fynd och svårigheterna i att 
”bevisa ett negativt resultat” bör tillgängliga positiva resultat och historiska 
kontrolldata diskuteras, särskilt när det saknas behandlingsrelaterade effekter (se hänvisning 102, 106). Sannolikheten för falska positiva resultat bör diskuteras i ljuset av den totala statistiska utvärderingen av data (se hänvis ­
ning 96). Utvärderingen bör omfatta det eventuella sambandet mellan ob ­
serverade neuropatologiska och beteendemässiga förändringar. 
49. Samtliga resultat bör analyseras med hjälp av statistiska modeller som är 
lämpliga för försökets utformning (se hänvisning 108). Valet av en para ­
metrisk eller icke-parametrisk analys bör motiveras med tanke på faktorer 
såsom typen av data (transformerad eller ej) och fördelning, samt den 
relativa robustheten i den valda statistiska analysen. Syftet och utform ­
ningen av studien bör styra valet av statistiska analyser för att minimera fel av typ I (falskt positiva) och typ II (falskt negativa) (se hänvisning 96, 
97, 104, 105). Utvecklingsstudier med hjälp av multipara arter där flera 
ungar per kull testas, bör inkludera kullen i den statistiska modellen som skydd mot överdrivna felfrekvenser av typ I (se hänvisning 98, 99, 100, 101). Den statistiska enheten bör vara kullen, och inte ungen. Försök bör 
utformas så att kullsyskon inte behandlas som oberoende observationer. 
Varje endpoint som mäts upprepade gånger hos samma försöksdjur bör analyseras med hjälp av statistiska modeller som står för icke-oberoendet hos dessa mätningar.
 
Testrapport  
50. Testrapporten ska innehålla följande information:  
Testkemikalie:  
— Fysikalisk form och, när så är tillämpligt, fysikalisk-kemiska 
egenskaper. 
— Identifieringsdata, inklusive källa.  ▼M5 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 799
 
— Beredningens renhet, samt kända och/eller förväntade föroreningar.  
Vehikel (i förekommande fall):  
— Motivering för val av vehikel, om annan än vatten eller fysiologisk 
koksaltlösning.  
Försöksdjur:  
— Art och stam som används, samt en motivering om annat än råtta 
används. 
— Leverantör av försöksdjur. 
— Djurens antal, ålder vid start och kön. — Ursprung, inhysning, foder, vatten etc. — Djurens individuella vikt vid testets början.
 
Testbetingelser:  
— Grund för val av dosnivå. 
— Grund för doseringssätt och tidsperiod. 
— Specifikation av tillförda doser, inbegripet uppgifter om vehikel, volym 
och det tillförda ämnets fysikaliska form. 
— Uppgifter om testkemikaliens sammansättning/foderberedning, uppnådd 
koncentration, beredningens stabilitet och homogenitet. 
— Metod som används för att unikt identifiera moderdjur och avkomma. — En detaljerad beskrivning av de statistiska stickprovsmetoder som an ­
vänds för att anvisa moderdjur till behandlingsgrupperna, välja ungar för 
avlivning, samt anvisa ungar till testgrupper. 
— Uppgifter om administreringen av testkemikalien. 
— Omräkning av testkemikaliens koncentration (ppm) från foder/dricksvat ­
ten eller genom inhalation till faktisk dos (mg/kg kroppsvikt/dag), i 
förekommande fall. 
— Miljöförhållanden. 
— Uppgifter om kvalitet på foder och vatten (t.ex.kran, destillerat). — Datum för studiens start och slut.
 
Observationer och testförfaranden:  
— En detaljerad beskrivning av de förfaranden som används för att stan ­
dardisera observationer och förfaranden, samt operationella definitioner för att värdera observationer. 
— En förteckning över samtliga testförfaranden, samt motivering av deras 
användning. 
— Uppgifter om de beteendemässiga/funktionella, patologiska, neurok ­
emiska eller elektrofysiologiska metoder som används, inklusive infor ­
mation och detaljer om automatiserade enheter. 
— Rutiner för kalibrering och säkerställande av likvärdiga enheter, och 
balansen mellan behandlingsgrupper i testförfaranden. 
— En kort motivering som förklarar eventuella beslut som inbegriper en 
yrkesmässig bedömning.
 ▼M5 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 800
 
Resultat (enskilda och sammanfattande, inklusive medelvärde och varians i 
förekommande fall):  
— Antalet djur vid studiens början och i slutet av studien. 
— Antalet djur och kullar som används för varje testmetod. — Identifikationsnummer för varje djur och kullen som den kommer från. — Kullstorlek och medelvikt vid födseln för respektive kön. 
— Kroppsvikt och kroppsviktsförändringsdata, inklusive terminal kropps ­
vikt för moderdjur och avkomma. 
— Uppgifter om foderintag, och i tillämpliga fall uppgifter om vattenintag 
(t.ex.om testkemikalien tillförs via vatten). 
— Uppgifter om toxiska reaktioner för respektive kön och dosnivå, inklu ­
sive tecken på toxicitet eller dödlighet, inklusive tidpunkt för, och orsak till dödsfall, om detta är tillämpligt. 
— Natur, allvarlighetsgrad, varaktighet, dag för första tecken, tid på dyg ­
net, och efterföljande förlopp för de detaljerade kliniska observationerna. 
— Värde för varje utvecklingsmarkör (vikt, könsmognad och beteendeon ­
togeni) vid varje observationstidpunkt. 
— En detaljerad beskrivning av alla beteendemässiga, funktionella, neuro ­
patologiska, neurokemiska, elektrofysiologiska fynd för respektive kön, 
som omfattar både ökningar och minskningar från kontroller. 
— Obduktionsfynd. — Hjärnvikter. — Eventuella diagnoser som härrör från neurologiska symtom och skador, 
inklusive naturligt förekommande sjukdomar eller tillstånd. 
— Bilder på typiska exempel på fynd. — Lågupplösta bilder för att bedöma homologi i snitt som används för 
morfometri. 
— Absorptions- och metabolismdata, inklusive kompletterande uppgifter 
från en separat toxikokinetisk studie, om sådan finns. 
— Statistisk bearbetning av resultaten, inklusive statistiska modeller som 
används för att analysera data, och resultaten, oavsett om de var signi ­
fikanta eller ej. 
— Förteckning över personal som utför studien, inklusive deras 
yrkesutbildning.
 
Diskussion av resultaten:  
— Dos-respons-information, för respektive kön och grupp. 
— Eventuella toxiska effekters samband med en slutsats om testkemikali ­
ens neurotoxiska potential, för respektive kön och grupp. 
— Hur påverkas slutsatserna av eventuell toxikokinetisk information. 
— Likheter med effekter från alla kända neurotoxiska ämnen.  ▼M5 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 801
 
— Data som stöder testmetodens tillförlitlighet och känslighet (dvs. posi ­
tiva och historiska kontrolldata). 
— Eventuella samband mellan neuropatologiska och funktionella effekter. — Noael- eller referensdos för moderdjur och avkomma, för respektive kön 
och grupp.
 
Slutsatser:  
— En diskussion om den övergripande tolkningen av data baserad på 
resultaten, inklusive en slutsats om huruvida testkemikalien orsakat ut ­
vecklingsneurotoxicitet och Noael.  
HÄNVISNINGAR  
1. OECD (1995). Utkast till rapport från OECD:s  ad hoc- arbetsgrupp för 
reproduktion och utvecklingstoxicitet. Köpenhamn, Danmark, 13–14 juni 1995. 
2. US EPA (1998). U.S. Environmental Protection Agency Health Effects 
Test Guidelines. OPPTS 870.6300. Developmental Neurotoxicity Study. US EPA 712-C-98-239. Finns på: http://www.epa.gov/opptsfrs/ OPPTS_Harmonized/870_Health_Effects_Test_Guidelines/Series/ 
3. US EPA (1998). Guidelines for Neurotoxicity Risk Assessment. US EPA 
630/R-95/001F. Finns på: http://cfpub.epa.gov/ncea/cfm/recordis ­
play.cfm?PrintVersion=True&deid=12479 
4. Cory-Slechta, D.A., Crofton, K.M., Foran, J.A., Ross, J.F., Sheets, L.P., 
Weiss, B., Mileson, B. (2001). Methods to identify and characterize devel ­
opmental neurotoxicity for human health risk assessment: I. Behavioral effects. Environ. Health Perspect., 109:79–91. 
5. Dorman, D.C., Allen, S.L., Byczkowski, J.Z., Claudio, L., Fisher, J.E. Jr., 
Fisher, J.W., Harry, G.J., Li, A.A., Makris, S.L., Padilla, S., Sultatos, L.G., Mileson, B.E. (2001). Methods to identify and characterize developmental neurotoxicity for human health risk assessment: III. Pharmacokinetic and 
pharmacodynamic considerations. Environ. Health Perspect., 109:101–111. 
6. Garman, R.H., Fix,A.S., Jortner, B.S., Jensen, K.F., Hardisty, J.F., Clau ­
dio, L., Ferenc, S. (2001). Methods to identify and characterize devel ­
opmental neurotoxicity for human health risk assessment: II. Neuropathol ­
ogy. Environ. Health Perspect., 109:93–100. 
7. OECD (2003). Report of the OECD Expert Consultation Meeting on 
Developmental Neurotoxicity Testing. Washington D.C., US, 
23–25 October 2000. 
8. OECD (2008). OECD Environment, Health and Safety Publications Series 
on Testing and Assessment No. 43. Guidance Document on Mammalian Reproductive Toxicity Testing and Assessment. Environment Directorate, 
OECD, Paris. Juli 2008 finns på: http://search.oecd.org/officialdocuments/ 
displaydocumentpdf/?cote=env/jm/mono(2008)16&doclanguage = en 
9. OECD (2003). OECD Environment, Health and Safety Publications Series 
on Testing and Assessment No. 20. Guidance Document for Neurotoxicity 
Testing. Environment Directorate, OECD, Paris, september 2003. Finns på: http://www.oecd.org/document/22/0,2340,en_2649_34 377_1916054_ 1_1_1_1,00.html 
10. Kimmel, C.A., Rees, D.C., Francis, E.Z. (1990) Qualitative and quantit ­
ative comparability of human and animal developmental neurotoxicity. Neurotoxicol. Teratol., 12: 173–292. 
11. Spencer, P.S., Schaumburg, H.H., Ludolph, A.C. (2000)  Experimental and 
Clinical Neurotoxicology, 2nd Edition,  ISBN 0195084772, Oxford Uni ­
versity Press, New York.
 ▼M5 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 802
 
12. Mendola, P., Selevan, S.G., Gutter, S., Rice, D. (2002) Environmental 
factors associated with a spectrum of neurodevelopmental deficits. Ment. 
Retard. Dev. Disabil. Res. Rev. 8:188–197. 
13. Slikker, W.B., Chang, L.W. (1998)  Handbook of Developmental Neurotox ­
icology , 1:a utgåvan , ISBN 0126488606, Academic Press, New York. 
14. Kapitel B.34 i denna bilaga, reproduktionstoxicitetstest på en generation. 
15. Kapitel B.35 i denna bilaga, test avseende reproduktionstoxicitet på två 
generationer. 
16. Kapitel B.43 i denna bilaga, test avseende neurotoxicitet på gnagare. 
17. Kapitel B.31 i denna bilaga, test avseende prenatal utvecklingstoxicitet. 
18. Europaparlamentets och rådets direktiv 2010/63/EU av den 22 september 
2010 om skydd av djur som används för vetenskapliga ändamål (EUT L 276, 20.10.2010, s. 33). 
19. WHO (1986)  Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity 
Associated with Exposure to Chemicals , (Environmental Health Criteria 
60), Albany, New York: World Health Organization Publications Center, Förenta staterna. Finns på: http://www.inchem.org/documents/ehc/ehc/ 
ehc060.htm 
20. WHO (2001)  Neurotoxicity Risk Assessment for Human Health: Principles 
and Approaches,  (Environmental Health Criteria 223), World Health Or ­
ganization Publications, Geneva. Finns på: http://www.intox.org/databank/ 
documents/supplem/supp/ehc223.htm 
21. Chang, L.W., Slikker, W. (1995)  Neurotoxicology: Approaches and Met ­
hods , 1:a utgåvan, ISBN 012168055X, Academic Press, New York. 
22. De Cabo, C., Viveros, M.P. (1997) Effects of neonatal naltrexone on 
neurological and somatic development in rats of both genders. Neurotox ­
icol. Teratol., 19:499–509. 
23. Agnish, N.D., Keller, K.A. (1997) The rationale for culling of rodent 
litters. Fundam. Appl. Toxicol., 38:2–6. 
24. Avery, D.L., Spyker, J.M. (1977) Foot tattoo of neonatal mice. Lab. 
Animal Sci., 27:110–112. 
25. Wier, P.J., Guerriero, F.J., Walker, R.F. (1989) Implementation of a pri ­
mary screen for developmental neurotoxicity. Fundam. Appl. Toxicol., 
13:118–136. 
26. Spear, N.E., Campbell, B.A. (1979)  Ontogeny of Learning and Memory . 
ISBN 0470268492, Erlbaum Associates, New Jersey. 
27. Krasnegor, N.A., Blass, E.M., Hofer, M.A., Smotherman, W. (1987)  Pe­
rinatal Development: A Psychobiological Perspective.  Academic Press, 
Orlando. 
28. Zoetis, T., Walls, I. (2003)  Principles and Practices for Direct Dosing of 
Pre-Weaning Mammals in Toxicity Testing and Research . ILSI Press, 
Washington, DC. 
29. Moser, V., Walls, I., Zoetis, T. (2005) Direct dosing of preweaning ro ­
dents in toxicity testing and research: Deliberations of an ILSI RSI expert 
working group. Int. J. Toxicol., 24:87–94. 
30. Conolly, R.B., Beck, B.D., Goodman, J.I. (1999) Stimulating research to 
improve the scientific basis of risk assessment. Toxicol. Sci., 49: 1–4. 
31. ICH (1993) ICH Harmonised Tripartite Guideline: Detection of Toxicity to 
Reproduction for Medical Products (S5A). International Conference on 
Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Phamaceu ­
ticals for Human Use. 
32. Lochry, E.A. (1987) Concurrent use of behavioral/functional testing in 
existing reproductive and developmental toxicity screens: Practical consi ­
derations. J. Am. Coll. Toxicol., 6:433–439.
 ▼M5 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 803
 
33. Tachibana, T., Narita, H., Ogawa, T., Tanimura, T. (1998) Using postnatal 
age to determine test dates leads to misinterpretation when treatments alter 
gestation length, results from a collaborative behavioral teratology study in Japan. Neurotoxicol. Teratol., 20:449–457. 
34. Gallavan, R.H. Jr., Holson, J.F., Stump, D.G., Knapp, J.F., Reynolds, V.L. 
(1999) Interpreting the toxicologic significance of alterations in anogenital 
distance: potential for confounding effects of progeny body weights. Re ­
prod. Toxicol., 13:383–390. 
35. Gray, L.E. Jr., Ostby, J., Furr, J., Price, M., Veeramachaneni, D.N., 
Parks, L. (2000) Perinatal exposure to the phthalates DEHP, BBP, and 
DINP, but not DEP, DMP, or DOTP, alters sexual differentiation of the male rat. Toxicol. Sci., 58:350–365. 
36. Adams, J., Buelke-Sam, J., Kimmel, C.A., Nelson, C.J., Reiter, L.W., 
Sobotka, T.J., Tilson, H.A., Nelson, B.K. (1985) Collaborative behavioral teratology study: Protocol design and testing procedure. Neurobehav. Tox ­
icol. Teratol., 7:579–586. 
37. Korenbrot, C.C., Huhtaniemi, I.T., Weiner, R.W. (1977) Preputial separa ­
tion as an external sign of pubertal development in the male rat. Biol. Reprod., 17:298–303. 
38. Spear, L.P. (1990) Neurobehavioral assessment during the early postnatal 
period. Neurotoxicol. Teratol., 12:489–95. 
39. Altman, J., Sudarshan, K. (1975) Postnatal development of locomotion in 
the laboratory rat. Anim. Behav., 23:896–920. 
40. Adams, J. (1986) Methods in Behavioral Teratology. I:  Handbook of 
Behavioral Teratology.  Riley, E.P., Vorhees, C.V. (eds.) Plenum Press, 
New York, s. 67–100. 
41. Reiter, L.W., MacPhail, R.C. (1979) Motor activity: A survey of methods 
with potential use in toxicity testing. Neurobehav. Toxicol., 1:53–66. 
42. Robbins, T.W. (1977) A critique of the methods available for the meas ­
urement of spontaneous motor activity,  Handbook of Psychopharmacol ­
ogy, Vol. 7, Iverson, L.L., Iverson, D.S., Snyder, S.H., (eds.) Plenum 
Press, New York, s. 37–82. 
43. Crofton, K.M., Peele, D.B., Stanton, M.E. (1993) Developmental neuro ­
toxicity following neonatal exposure to 3,3 ′-iminodipropionitrile in the rat. 
Neurotoxicol. Teratol., 15:117–129. 
44. Ruppert, P.H., Dean, K.F., Reiter, L.W. (1985) Development of locomotor 
activity of rat pups in figure-eight mazes. Dev. Psychobiol., 18:247–260. 
45. Crofton, K.M., Howard, J.L., Moser, V.C., Gill, M.W., Reiter, L.W., 
Tilson, H.A., MacPhail, R.C. (1991) Interlaboratory comparison of motor 
activity experiments: Implications for neurotoxicological assessments. Neurotoxicol. Teratol., 13:599–609. 
46. Ross, J. F., Handley, D. E., Fix, A. S., Lawhorn, G. T., Carr, G. J. (1997) 
Quantification of the hind-limb extensor thrust response in rats. Neurotox ­
icol. Teratol., 19:1997. 405–411. 
47. Handley, D.E., Ross, J.F., Carr, G.J. (1998) A force plate system for 
measuring low-magnitude reaction forces in small laboratory animals.Phys ­
iol. Behav., 64:661–669. 
48. Edwards, P.M., Parker, V.H. (1977) A simple, sensitive, and objective 
method for early assessment of acrylamide neuropathy in rats. Toxicol. 
Appl. Pharmacol., 40:589–591. 
49. Davis, M. (1984) The mammalian startle response. I:  Neural Mechanisms 
of Startle Behavior , Eaton, R.C. (ed), Plenum Press, New York, pp. 
287–351 
50. Koch, M. (1999) The neurobiology of startle. Prog. Neurobiol., 
59:107–128. 
51. Crofton, K.M. (1992) Reflex modification and the assessment of sensory 
dysfunction. In  Target Organ Toxicology Series: Neurotoxicology , 
Tilson, H., Mitchell, C. (eds). Raven Press, New York, pp. 181–211.
 ▼M5 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 804
 
52. Crofton, K.M., Sheets, L.P. (1989) Evaluation of sensory system function 
using reflex modification of the startle response. J. Am. Coll. Toxicol., 
8:199–211. 
53. Crofton, K.M, Lassiter, T.L, Rebert, C.S. (1994) Solvent-induced ototox ­
icity in rats: An atypical selective mid-frequency hearing deficit. Hear. Res.,80:25–30. 
54. Ison, J.R. (1984) Reflex modification as an objective test for sensory 
processing following toxicant exposure. Neurobehav. Toxicol. Teratol., 
6:437–445. 
55. Mattsson, J.L., Boyes, W.K., Ross, J.F. (1992) Incorporating evoked po ­
tentials into neurotoxicity test schemes. I:  Target Organ Toxicology Series: 
Neurotoxicity , Tilson, H., Mitchell, C., (eds.), Raven Press, New York. pp. 
125–145. 
56. Peele, D.B., Allison, S.D., Crofton, K.M. (1990) Learning and memory 
deficits in rats following exposure to 3,3 ′-iminopropionitrile. Toxicol. 
Appl. Pharmacol., 105:321–332. 
57. Bammer, G. (1982) Pharmacological investigations of neurotransmitter 
involvement in passive avoidance responding: A review and some new results. Neurosci. Behav. Rev., 6:247–296. 
58. Bushnell, P.J. (1988) Effects of delay, intertrial interval, delay behavior 
and trimethyltin on spatial delayed response in rats. Neurotoxicol. Teratol., 
10:237–244. 
59. Green, R.J., Stanton, M.E. (1989) Differential ontogeny of working me ­
mory and reference memory in the rat. Behav. Neurosci., 103:98–105. 
60. Kucharski, D., Spear, N.E. (1984) Conditioning of aversion to an odor 
paired with peripheral shock in the developing rat. Develop. Psychobiol., 
17:465–479. 
61. Morris, R. (1984) Developments of a water-maze procedure for studying 
spatial learning in the rat. J. Neurosci. Methods, 11:47–60. 
62. Brandeis, R., Brandys, Y., Yehuda, S. (1989) The use of the Morris water 
maze in the study of memory and learning. Int. J. Neurosci., 48:29–69. 
63. D'Hooge, R., De Deyn, P.P. (2001) Applications of the Morris water maze 
in the study of learning and memory. Brain Res. Rev, 36:60–90. 
64. Vorhees, C.V. (1987) Maze learning in rats: A comparison of performance 
in two water mazes in progeny prenatally exposed to different doses of phenytoin. Neurotoxicol. Teratol., 9:235–241. 
65. Vorhees, C.V. (1997) Methods for detecting long-term CNS dysfunction 
after prenatal exposure to neurotoxins. Drug Chem. Toxicol., 20:387–399. 
66. Akaike, M., Tanaka, K., Goto, M., Sakaguchi, T. (1988) Impaired Biel and 
Radial arm maze learning in rats with methyl-nitrosurea induced micro ­
cephaly. Neurotoxicol. Teratol., 10:327–332. 
67. Cory-Slechta, D.A., Weiss, B., Cox, C. (1983) Delayed behavioral toxicity 
of lead with increasing exposure concentration. Toxicol. Appl. Pharmacol., 
71:342–352. 
68. Campbell, B.A., Haroutunian, V. (1981) Effects of age on long-term me ­
mory: Retention of fixed interval responding. J. Gerontol., 36:338–341. 
69. Fix, A.S, Garman, R.H. (2000) Practical aspects of neuropathology: A 
technical guide for working with the nervous system. Toxicol. Pathol., 
28: 122–131. 
70. Prophet, E.B., Mills, B., Arrington, J.B., Sobin, L.H. (1994)  Laboratory 
Methods in Histotechnology , American Registry of Pathology, Washing ­
ton, DC, s. 84–107. 
71. Bancroft, J.D., Gamble, M. (2002)  Theory and Practice of Histological 
Techniques , 5
 th edition, Churchill Livingstone, London.  ▼M5 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 805
 
72. Fix, A.S., Ross, J.F., Stitzel, S.R., Switzer, R.C. (1996) Integrated evalua ­
tion of central nervous system lesions: stains for neurons, astrocytes, and 
microglia reveal the spatial and temporal features of MK-801-induced neuronal necrosis in the rat cerebral cortex. Toxicol. Pathol., 24: 291–304. 
73. Schmued, L.C., Hopkins, K.J. (2000) Fluoro-Jade B: A high affinity tracer 
for the localization of neuronal degeneration. Brain Res., 874:123–130. 
74. Krinke, G.J., Classen, W., Vidotto, N., Suter, E., Wurmlin, C.H. (2001) 
Detecting necrotic neurons with fluoro-jade stain. Exp. Toxic. Pathol., 
53:365–372. 
75. De Olmos, I.S., Beltramino, C.A. och de Olmos de Lorenzo, S. (1994) Use 
of an amino-cupric-silver technique for the detection of early and semi ­
acute neuronal degeneration caused by neurotoxicants, hypoxia and phy ­
sical trauma. Neurotoxicol. Teratol., 16, 545–561. 
76. De Groot, D.M.G., Bos-Kuijpers, M.H.M., Kaufmann, W.S.H., Lammers, 
J.H.C.M., O'Callaghan, J.P., Pakkenberg, B., Pelgrim, M.T.M., Waalkens-Berendsen, I.D.H., Waanders, M.M., Gundersen, H.J. (2005a) Regulatory developmental neurotoxicity testing: A model study focusing 
on conventional neuropathology endpoints and other perspectives. Envi ­
ron. Toxicol. Pharmacol., 19:745–755. 
77. De Groot, D.M.G., Hartgring, S., van de Horst, L., Moerkens, M., 
Otto, M., Bos-Kuijpers, M.H.M., Kaufmann, W.S.H., Lammers, J.H.C.M., 
O'Callaghan, J.P., Waalkens-Berendsen, I.D.H., Pakkenberg, B., Gunder ­
sen, H.J. (2005b) 2D and 3D assessment of neuropathology in rat brain after prenatal exposure to methylazoxymethanol, a model for devel ­
opmental neurotoxicity. Reprod. Toxicol., 20:417–432. 
78. Rodier, P.M., Gramann, W.J. (1979) Morphologic effects of interference 
with cell proliferation in the early fetal period. Neurobehav. Toxicol., 
1:129–135. 
79. Howard, C.V., Reed, M.G. (1998)  Unbiased Stereology: 
Three-Dimensional Measurement in Microscopy , Springer-Verlag, New 
York. 
80. Hyman, B.T., Gomez-Isla, T., Irizarry, M.C. (1998) Stereology: A practi ­
cal primer for neuropathology. J. Neuropathol. Exp. Neurol., 57: 305–310. 
81. Korbo, L., Andersen, B.B., Ladefoged, O., Møller, A. (1993) Total num ­
bers of various cell types in rat cerebellar cortex estimated using an un ­
biased stereological method. Brain Res., 609: 262–268. 
82. Schmitz, C. (1997) Towards more readily comprehensible procedures in 
disector stereology. J. Neurocytol., 26:707–710. 
83. West, M.J. (1999) Stereological methods for estimating the total number of 
neurons and synapses: Issues of precision and bias. Trends Neurosci., 22:51–61. 
84. Schmitz, C., Hof, P.R. (2005) Design-based stereology in neuroscience. 
Neuroscience, 130: 813–831. 
85. Gavin, C.E., Kates, B., Gerken, L.A., Rodier, P.M. (1994) Patterns of 
growth deficiency in rats exposed  in utero  to undernutrition, ethanol, or 
the neuroteratogen methylazoxymethanol (MAM). Teratology, 
49:113–121. 
86. Ohno, M., Aotani, H., Shimada, M. (1995) Glial responses to hypoxic/ 
ischemic encephalopathy in neonatal rat cerebrum. Develop. Brain Res., 
84:294–298. 
87. Jensen KF, Catalano SM. (1998) Brain morphogenesis and developmental 
neurotoxicology. I:  Handbook of Developmental Neurotoxicology , Slikker, 
Jr. W., Chang, L.W. (eds) Academic Press, New York, s. 3–41. 
88. Ikonomidou, C., Bosch, F., Miksa, M., Bittigau, P., Vöckler, J., 
Dikranian, K., Tenkova, T.I., Stefovska, V., Turski, L., Olney, J.W. (1999) 
Blockade of NMDA receptors and apoptotic neurodegeneration in the 
developing brain. Science, 283:70–74.
 ▼M5 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 806
 
89. Ikonomidou, C., Bittigau, P., Ishimaru, M.J., Wozniak, D.F., Koch, C., 
Genz, K., Price, M.T., Sefovska, V., Hörster, F., Tenkova, T., Dikranian, 
K., Olney, J.W. (2000) Ethanol-induced apoptotic degeneration and fetal alcohol syndrome. Science, 287:1056–1060. 
90. Friede, R. L. (1989)  Developmental Neuropathology . Second edition. 
Springer-Verlag, Berlin. 
91. House, D.E., Berman, E., Seeley, J.C., Simmons, J.E. (1992) Comparison 
of open and blind histopathologic evaluation of hepatic lesions. Toxicol. Let., 63:127–133. 
92. Tilson, H.A., MacPhail, R.C., Crofton, K.M. (1996) Setting exposure stan ­
dards: a decision process. Environ. Health Perspect., 104:401–405. 
93. US EPA (2005) Guidelines for Carcinogen Risk Assessment. US EPA 
NCEA-F-0644A. 
94. US EPA (1996) Guidelines for Reproductive Toxicity Risk Assessment, 
Federal Register 61(212): 56274–56322. 
95. Danish Environmental Protection Agency (1995)  Neurotoxicology.  Review 
of Definitions, Methodology, and Criteria. Miljøprojekt nr. 282. Ladefo ­
ged, O., Lam, H.R., Østergaard, G., Nielsen, E., Arlien-Søborg, P. 
96. Muller, K.E., Barton, C.N., Benignus, V.A. (1984). Recommendations for 
appropriate statistical practice in toxicologic experiments. Neurotoxicol ­
ogy, 5:113–126. 
97. Gad, S.C. (1989) Principles of screening in toxicology with special emp ­
hasis on applications to Neurotoxicology. J. Am. Coll. Toxicol., 08:21–27. 
98. Abby, H., Howard, E. (1973) Statistical procedures in developmental stud ­
ies on a species with multiple offspring. Dev. Psychobiol., 6:329–335. 
99. Haseman, J.K., Hogan, M.D. (1975) Selection of the experimental unit in 
teratology studies. Teratology, 12:165–172. 
100. Holson, R.R., Pearce, B. (1992) Principles and pitfalls in the analysis of 
prenatal treatment effects in multiparous species. Neurotoxicol. Teratol., 
14: 221–228. 
101. Nelson, C.J., Felton, R.P., Kimmel, C.A., Buelke-Sam, J., Adams, J. 
(1985) Collaborative Behavioral Teratology Study: Statistical approach. Neurobehav. Toxicol. Teratol., 7:587–90. 
102. Crofton, K.M., Makris, S.L., Sette, W.F., Mendez, E., Raffaele, K.C. 
(2004) A qualitative retrospective analysis of positive control data in de ­
velopmental neurotoxicity studies. Neurotoxicol. Teratol., 26:345–352. 
103. Bolon, B., Garman, R., Jensen, K., Krinke, G., Stuart, B., and an  ad hoc  
working group of the STP Scientific and Regulatory Policy Committee. 
(2006) A ‘best practices’ approach to neuropathological assessment in 
developmental neurotoxicity testing – for today. Toxicol. Pathol. 34:296–313. 
104. Tamura, R.N., Buelke-Sam, J. (1992) The use of repeated measures ana ­
lysis in developmental toxicology studies. Neurotoxicol. Teratol., 14(3):205–210. 
105. Tukey, J.W., Ciminera, J.L., Heyse, J.F. (1985) Testing the statistical 
certainty of a response to increasing doses of a drug. Biometrics, 
41:295–301. 
106. Crofton, K.M., Foss, J.A., Haas, U., Jensen, K., Levin, E.D., and Parker, 
S.P. (2008) Undertaking positive control studies as part of developmental 
neurotoxicity testing: report from the ILSI Research Foundation/Risk Sci ­
ence Institute expert working group on neurodevelopmental endpoints.  
Neurotoxicology and Teratology , 30(4):266–287. 
107. Raffaele, K.C., Fisher, E., Hancock, S., Hazelden, K., and Sobrian, S.K. 
(2008) Determining normal variability in a developmental neurotoxicity test: report from the ILSI Research Foundation/Risk Science Institute ex ­
pert working group on neurodevelopmental endpoints.  Neurotoxicology 
and Teratology,  30(4):288–325.
 ▼M5 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 807
 
108. Holson, R.R., Freshwater, L., Maurissen, J.P.J., Moser, V.C., and Phang, 
W. (2008) Statistical issues and techniques appropriate for developmental 
neurotoxicity testing: a report from the ILSI Research Foundation/Risk Science Institute expert working group on neurodevelopmental endpoints.  
Neurotoxicology and Teratology , 30(4):326–348. 
109. Tyl, R.W., Crofton, K.M., Moretto, A., Moser, V.C., Sheets, L.P., and 
Sobotka, T.J. (2008) Identification and interpretation of developmental 
neurotoxicity effects: a report from the ILSI Research Foundation/Risk Science Institute expert working group on neurodevelopmental endpoints.  
Neurotoxicology and Teratology , 30(4):349–381.
 ▼M5 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 808
 
Figur 1  
Allmänt testschema för funktions- och beteendetester, neuropatologisk utvärdering samt 
hjärnvikter. Detta diagram baseras på beskrivningen i punkterna 13–15 (PND = postnatal 
dag). Exempel på anvisning av djur finns i tillägg 1
  ▼M5 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 809
 
Tillägg 1  
1. Exempel på möjliga anvisningar av försöksdjur beskrivs och visas i tabell ­
form nedan. Dessa exempel ges för att visa att anvisning av djur till olika 
testparadigm kan åstadkommas på flera olika sätt.  
Exempel 1  
2. En uppsättning av 20 ungar/kön/dosnivå (dvs. 1 hane och 1 hona per kull) 
används för testning av beetendeontogeni före avvänjningen. Av dessa djur avlivas 10 ungar/kön/dosnivå (dvs. 1 hane eller 1 hona per kull) humant på PND 22. Hjärnorna avlägsnas, vägs och bereds för histopatologisk utvär ­
dering. Dessutom samlas hjärnviktsdata in från de ej fixerade hjärnorna från 
de återstående 10 hanarna och 10 honorna per dosnivå. 
3. Ytterligare en uppsättning av 20 djur/kön/dosnivå (dvs. 1 hane och 1 hona 
per kull) används för funktions-/beteendetester efter avvänjningen (detalje ­
rade kliniska observationer, motorisk aktivitet, plötsliga ljud och kognitiv funktionstestning av unga djur) samt bedömning av ålder för könsmognad. 
Av dessa djur sövs och fixeras 10 djur/kön/dosnivå (dvs. 1 hane och 1 hona 
per kull) genom perfusion vid studiens avslutning (cirka PND 70). Efter ytterligare fixering in situ, tas hjärnan ut och bereds för en neuropatologisk utvärdering. 
4. För kognitiva funktionstester av unga vuxna (t.ex. PND 60–70) används en 
tredje uppsättning av 20 ungar/kön/dosnivå (dvs. 1 hane och 1 hona per kull). Av dessa djur avlivas 10 djur/kön/grupp (1 hane och 1 hona per kull) 
vid studiens avslutning och hjärnan avlägsnas och vägs. 
5. Återstående 20 djur/kön/grupp reserveras för eventuella ytterligare test.
 
Tabell 1  
Unge nr (  a ) Antal ungar anvisade till 
test Undersökning/test 
m f  
1 5 20 m + 20 f Beteendeontogeni 
10 m + 10 f PND 22 hjärnvikt/neuropatolo ­
gi/morfometri 
10 m + 10 f PND 22 hjärnvikt 
2 6 20 m + 20 f Detaljerade kliniska observatio ­
ner 
20 m + 20 f Motorisk aktivitet 20 m + 20 f Könsmognad 
20 m + 20 f Motoriska och sensoriska funk ­
tioner 
20 m + 20 f Inlärning och minne (PND 25) 
10 m + 10 f Unga vuxna hjärnvikt/neuropa ­
tologi/morfometri ~ PND 70
 ▼M5 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 810
 
Unge nr (  a ) 
Antal ungar anvisade till 
test Undersökning/test 
m f  
3 7 20 m + 20 f Inlärning och minne (unga vux ­
na) 
10 m + 10 f Unga vuxna hjärnvikt ~ PND 70 
4 8 — Reservdjur till utbyten eller yt ­
terligare tester  
( a ) I detta exempel gallras kullarna till 4 hanar + 4 honor, hanungarna numreras från 1 
till 4, honungarna från 5 till 8.  
Exempel 2  
6. En uppsättning av 20 ungar/kön/dosnivå (dvs. 1 hane och 1 hona per kull) 
används för testning av beetendeontogeni före avvänjningen. Av dessa djur 
avlivas 10 ungar/kön/dosnivå (1 hane eller 1 hona per kull) humant på PND 11. Hjärnorna avlägsnas, vägs och bereds för en histopatologisk utvär ­
dering. 
7. Ytterligare en uppsättning av 20 djur/kön/dosnivå (1 hane och 1 hona per 
kull) används för undersökningar efter avvänjningen (detaljerade kliniska 
observationer, motorisk aktivitet, åldersbedömning av könsmognad samt 
motoriska och sensoriska funktioner). Av dessa djur sövs och fixeras 10 djur/kön/dosnivå (dvs. 1 hane och 1 hona per kull) genom perfusion vid studiens avslutning (cirka PND 70). Efter ytterligare fixering  in situ , tas 
hjärnan ut, vägs och bereds för en neuropatologisk utvärdering. 
8. För kognitiv funktionstestning av ungdjur och unga vuxna används 10 
ungar/kön/dosnivå (dvs. 1 hane och 1 hona per kull). Olika djur används 
för kognitiva funktionstester på PND 23 och unga vuxna. Vid avslutningen 
avlivas de 10 djur/kön/ grupp som testades som vuxna, och hjärnan avlägs ­
nas och vägs. 
9. De återstående 20 djur/kön/grupp som inte valts ut för testning avlivas och 
kasseras vid avvänjningen.
 
Tabell 2  
Unge nr (  a ) Antal ungar anvisade till 
test Undersökning/test 
m f  
1 5 20 m + 20 f Beteendeontogeni 
10 m + 10 f PND 11 hjärnvikt/neuropatolo ­
gi/morfometri 
2 6 20 m + 20 f Detaljerade kliniska observatio ­
ner 
20 m + 20 f Motorisk aktivitet 
20 m + 20 f Könsmognad 
20 m + 20 f Motoriska och sensoriska funk ­
tioner 
10 m + 10 f Unga vuxna hjärnvikt/neuropa ­
tologi/morfometri ~ PND 70  ▼M5 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 811
 
Unge nr (  a ) 
Antal ungar anvisade till 
test Undersökning/test 
m f  
3 7 10 m + 10 f (  b ) Inlärning och minne (PND 23) 
3 7 10 m + 10 f (  b ) Inlärning och minne (unga vux ­
na) 
Unga vuxna hjärnvikt 
4 8 — Djur som avlivas och kasseras 
PND 21  
( a ) I detta exempel gallras kullarna till 4 hanar + 4 honor, hanungarna numreras från 1 
till 4, honungarna från 5 till 8. 
( b ) Olika ungar används för kognitiva tester på PND 23 och för unga vuxna (t.ex. 
jämna/udda kullar av totalt 20).  
Exempel 3  
10. En uppsättning av 20 ungar/kön/dosnivå (dvs. 1 hane och 1 hona per kull) 
används för bedömning av hjärnvikt och neuropatologi på PND 11. Av 
dessa djur avlivas 10 ungar/kön/dosnivå (dvs.1 hane och 1 hona per kull) 
humant på PND 11 och hjärnorna avlägsnas, vägs och bereds för en his ­
topatologisk utvärdering. Dessutom samlas hjärnviktsdata in från de ej fix ­
erade hjärnorna från de återstående 10 hanarna och 10 honorna per dosnivå. 
11. Ytterligare en uppsättning av 20 djur/kön/dosnivå (dvs. 1 hane och 1 hona 
per kull) används för undersökningar av beteendeontogeni (motorisk akti ­
vitet) efter avvänjningen (motorisk aktivitet och bedömning av ålder för 
könsmognad) samt testning av kognitiv funktion hos ungdjur. 
12. Ytterligare en uppsättning av 20 djur/kön/dosnivå (dvs. 1 hane och 1 hona 
per kull) används för motoriska och sensoriska funktionstester (plötsliga ljud) och detaljerade kliniska observationer. Av dessa djur sövs och fixeras 
10 djur/kön/dosnivå (dvs. 1 hane och 1 hona per kull) genom perfusion vid 
studiens avslutning (cirka PND 70). Efter ytterligare fixering  in situ , tas 
hjärnan bort, vägs och bereds för en neuropatologisk utvärdering. 
13. Ytterligare en uppsättning av 20 ungar/kön/dosnivå används för testning av 
kognitiv funktion hos unga vuxna (dvs. 1 hane och 1 hona per kull). Av 
dessa avlivas 10 djur/kön/grupp (dvs. 1 hane och 1 hona per kull) vid 
avslutningen, och hjärnan avlägsnas och vägs.
 
Tabell 3  
Unge nr (  a ) Antal ungar anvisade till 
test Undersökning/test 
m f  
1 5 10 m + 10 f PND 11 hjärnvikt/neuropatolo ­
gi/morfometri 
10 m + 10 f PND 11 hjärnvikt 
2 6 20 m + 20 f Beteendeontogeni (motorisk ak ­
tivitet) 
20 m + 20 f Motorisk aktivitet 
20 m + 20 f Könsmognad 
20 m + 20 f Inlärning och minne (PND 27)  ▼M5 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 812
 
Unge nr (  a ) 
Antal ungar anvisade till 
test Undersökning/test 
m f  
3 7 20 m + 20 f Plötsliga ljud (ungdjur och unga 
vuxna) 
20 m + 20 f Detaljerade kliniska observatio ­
ner 
10 m + 10 f Unga vuxna hjärnvikt/neuropa ­
tologi/morfometri ~ PND 70 
4 8 20 m + 20 f Inlärning och minne (unga vux ­
na) 
10 m + 10 f Unga vuxna hjärnvikt  
( a ) I detta exempel gallras kullarna till 4 hanar + 4 honor, hanungarna numreras från 1 
till 4, honungarna från 5 till 8.  ▼M5 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 813
 
Tillägg 2  
Definitioner  
kemikalie: Ett ämne eller en blandning. 
testkemikalie: Alla ämnen eller blandningar som testas med denna testmetod.  ▼M5 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 814
 
B.54  UTEROTROF BIOASSAY PÅ GNAGARE: ETT KORTTIDS ­
SCREENINGTEST FÖR ÖSTROGENA EGENSKAPER  
INLEDNING 
1. Denna testmetod motsvarar OECD:s testriktlinje (TG) 440 (2007). OECD 
inledde en högprioriterad verksamhet under 1998 för att se över befintliga riktlinjer och ta fram nya riktlinjer för screening och testning av potentiellt hormonstörande ämnen (se hänvisning 1). En del av verksamheten var att ta 
fram en riktlinje för den uterotrofa bioassayen på gnagare. Den uterotrofa 
bioassayen på gnagare undergick då ett omfattande valideringsprogram, inklusive sammanställandet av ett detaljerat bakgrundsdokument (se hänvis ­
ning 2, 3) och genomförandet av omfattande studier inom och mellan 
laboratorier för att visa testets relevans och reproducerbarhet med en potent 
referensöstrogen, svaga östrogenreceptoragonister, en stark östrogenrecepto ­
rantagonist och en negativ referenskemikalie (se hänvisning 4, 5, 6, 7, 8, 9). Denna testmetod B.54 är resultatet av de erfarenheter som vunnits under 
valideringen av testprogrammet och de resultat som erhållits därigenom med 
östrogena agonister. 
2. Den uterotrofa bioassayen är ett korttidsscreeningtest som har sitt ursprung 
på 1930-talet (se hänvisning 27, 28) och som först standardiserades för screening av en expertkommitté 1962 (se hänvisning 32, 35). Den baseras 
på ökningen av livmodervikt eller uterotrof respons (för översikt, se hänvis ­
ning 29). Den utvärderar en testkemikalies möjlighet att framkalla bio ­
logiska aktiviteter som är förenliga med agonister eller antagonister för naturliga östrogener (t.ex. 17-ß-östradiol), dock används den inte lika ofta 
för att upptäcka antagonister som för agonister. Livmodern svarar på östro ­
gen på två sätt. En första reaktion är viktökning på grund av vattenupptag. Detta följs av viktökning på grund av vävnadstillväxt (se hänvisning 30). Livmoderns reaktion hos råttor och möss är kvalitativt jämförbara. 
3. Denna bioassay tjänar som ett  in vivo -screeningtest och dess tillämpning bör 
ses mot bakgrund av ”OECD:s konceptuella ram för testning och bedöm ­
ning av endokrinstörande kemikalier” (tillägg 2). I denna konceptuella ram 
ingår den uterotrofa bioassayen i nivå 3 som ett  in vivo -test som ger data 
om en enda endokrin mekanism, dvs. östrogenicitet. 
4. Den uterotrofa bioassayen är avsedd att ingå i en serie  in vitro - och  in vivo - 
tester för att identifiera kemikalier med potential att interagera med det endokrina systemet, vilket slutligen leder till riskbedömningar för männi ­
skors hälsa eller miljön. OECD:s valideringsprogram använder både starka 
och svaga östrogenagonister för att utvärdera metodens prestanda att iden ­
tifiera östrogena kemikalier (se hänvisning 4, 5, 6, 7, 8). Därigenom visades att metodens känslighet när det gäller östrogenagonister var god, vid sidan 
av en god reproducerbarhet inom och mellan laboratorier. 
5. När det gäller negativa kemikalier, så ingick bara en enda ”negativ” refe ­
renskemikalie som redan rapporterats negativ genom uterotrof bioassay 
samt  in vitro -receptorbindning och receptortest i valideringsprogrammet, 
men ytterligare testdata, som inte är relaterade till OECD:s valideringspro ­
gram, har utvärderats, vilket ger ytterligare stöd till den särskilda karaktären 
hos den uterotrofa bioassayen för screening av östrogenagonister (se hänvis ­
ning 16).
 ▼M5 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 815
 
INLEDANDE ÖVERVÄGANDEN OCH BEGRÄNSNINGAR 
6. Östrogenagonister och -antagonister verkar som ligander för östrogenrecep ­
torerna a och b och kan aktivera respektive inhibera receptorernas tran ­
skriptionella verkan. Detta har potentialen att leda till negativa hälsorisker, inklusive reproduktions- och utvecklingseffekter. Därför föreligger behovet av att snabbt bedöma och utvärdera en kemikalie som en möjlig östrogen ­
agonist eller -antagonist. Affiniteten hos en ligand för en östrogenreceptor 
eller en transkriptionell aktivering av rapportörgener  in vitro  är informativ 
men den är bara en av flera faktorer som är avgörande för eventuella risker. Andra bestämningsfaktorer kan omfatta metabolisk aktivering och avaktive ­
ring vid införandet i kroppen, fördelning till målgruppsvävnader samt ut ­
träde ur kroppen, beroende, åtminstone delvis, på administreringsväg och kemikalien som testas. Detta medför att det är nödvändigt att granska en kemikalies möjliga aktivitet  in vivo  enligt tillämpliga villkor, såvida inte 
kemikaliens egenskaper vad gäller absorption, distribution, metabolism och 
eliminering (Adme) redan ger lämplig information. Livmodervävnader sva ­
rar med snabb och kraftig tillväxt vid östrogenstimulering, särskilt hos laboratoriegnagare då brunstcykeln varar cirka 4 dagar. Gnagare, framför 
allt råtta, är också vanliga i toxicitetsstudier för riskbedömning. Därför är 
gnagares livmoder ett lämpligt målorgan för  in vivo -screeningen av östro ­
genagonister och -antagonister. 
7. Denna testmetod baseras på de protokoll som används i OECD:s valide ­
ringsstudie som har visat sig vara tillförlitlig och repeterbar i studier inom och mellan laboratorier (se hänvisning 5, 7). För närvarande finns det två 
metoder tillgängliga, en metod med ovariektomerade vuxna honor (OVX- 
adultmetod) och en metod med ej ovariektomerade omogna honor (immat ­
urmetod). Det visades i OECD:s valideringstestprogram att båda metoderna har jämförbar känslighet och reproducerbarhet. Immaturmetoden är dock 
något mindre specifik eftersom den har en intakt hypotalamus-hypofys-go ­
nad-axel (HPG-axeln), men den täcker ett större undersökningsområde än ovariektomerade djur eftersom den kan reagera på kemikalier som intera ­
gerar med HPG-axeln och inte bara med östrogenreceptorn. Råttans 
HGP-axel är funktionell när djuret är ca 15 dygn gammalt. Dessförinnan 
kan puberteten inte påskyndas med behandlingar som GnRH. Allteftersom honorna börjar nå puberteten, före vaginal öppning, har honan flera tysta cykler som inte resulterar i vaginal öppning eller ägglossning men där det 
finns vissa hormonella svängningar. Om en kemikalie stimulerar HPG-axeln 
direkt eller indirekt leder det till tidig pubertet, tidig ägglossning och på ­
skyndad vaginal öppning. Det är inte bara kemikalier som verkar på HPG-axeln som leder till detta, utan vissa typer av föda med högre meta ­
boliserbara energinivåer än andra stimulerar tillväxten och påskyndar vagi ­
nal öppning utan att vara östrogena. Sådana kemikalier framkallar inte en uterotrof respons hos ovariektomerade vuxna djur eftersom deras HPG-axel 
inte fungerar. 
8. Av djurskyddsskäl bör företräde ges till den metod som använder omogna 
råttor, undviker kirurgisk förbehandling av djuren samt även undviker en 
eventuell icke-användning av de djur som visar eventuella tecken på brunst 
(se hänvisning 30).
 ▼M5 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 816
 
9. Den uterotrofa responsen är inte helt och hållet av östrogent ursprung, dvs. 
andra kemikalier än agonister eller antagonister av östrogener kan också ge 
en respons. Exempelvis kan relativt höga doser av progesteron, testosteron eller olika syntetiska progestiner alla leda till en stimulerande respons (se hänvisning 30). Eventuell respons kan analyseras histologiskt för keratini ­
sering och förhorning av vaginan (se hänvisning 30). Oavsett det möjliga 
ursprunget till responsen, bör ett positivt utfall av en uterotrof bioassay normalt initiera åtgärder för vidare utredning. Ytterligare bevis på östroge ­
nicitet kan komma från  in vitro -metoder, såsom ER-bindnings- och tran ­
skriptionsaktiveringstesterna, eller från andra  in vivo -metoder såsom honligt 
pubertetstest. 
10. Med beaktande av att den uterotrofa bioassayen tjänar som ett  in vivo - 
screeningtest, tog valideringsstrategin både hänsyn till djurens välbefin ­
nande och fungerade som en strategi för stegvis testning. För detta ändamål riktades ansträngningarna mot att noggrant validera reproducerbarheten och känsligheten hos östrogenicitet – det största problemet för många kemika ­
lier, medan liten ansträngning riktades mot antiöstrogenicitetskomponenten i 
testet. Endast ett antiöstrogen med kraftig aktivitet testades, eftersom antalet kemikalier med en tydlig antiöstrogen profil (som inte skyms av någon östrogen aktivitet) är mycket begränsad. Denna testmetod är således avsedd 
för det östrogena protokollet, medan protokollet som beskriver testets ant ­
agonistläge ingår i ett vägledningsdokument (se hänvisning 37). Testets reproducerbarhet och känslighet för kemikalier med uteslutande antiöstrogen aktivitet kommer att definieras tydligare längre fram, efter det att testför ­
farandet har använts rutinmässigt under en tid och fler kemikalier med detta 
verkningssätt har identifierats. 
11. Alla djurbaserade förfaranden ska uppfylla lokala normer för djurskötsel. De 
beskrivningar av vård och behandling som anges nedan är minimala pre ­
standakrav som kommer att ersättas av lokala föreskrifter som t.ex. Euro ­
paparlamentets och rådets direktiv 2010/63/EU av den 22 september 2010 
om skydd av djur som används för vetenskapliga ändamål (se hänvisning 
38). Ytterligare vägledning om human behandling av djur finns i OECD (se hänvisning 25). 
12. Som med alla tester som använder sig av levande djur är det viktigt att se 
till att uppgifterna verkligen är nödvändiga innan testet påbörjas. Två för ­
hållanden där data kan krävas är: 
— Hög exponeringspotential (nivå 1 i den konceptuella ramen, tillägg 2) 
eller indikationer på östrogenicitet (nivå 2) för att undersöka om sådana effekter kan uppstå  in vivo . 
— Effekter som indikerar östrogenicitet i  in vivo -tester på nivå 4 eller 5, för 
att styrka att effekterna var relaterade till en östrogen mekanism som inte kan belysas med hjälp av ett  in vitro -test. 
13. Definitioner som används i denna testmetod finns i tillägg 1.
 ▼M5 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 817
 
PRINCIP FÖR TESTMETODEN 
14. Den uterotrofa bioassayen förlitar sig på känsligheten hos ett djurtestsystem 
där hypotalamus-hypofys-ovarie-axeln inte är funktionell, vilket leder till 
låga endogena nivåer av cirkulerande östrogen. Detta säkerställer en låg livmoderreferensvikt och ett maximalt responsområde för administrerade östrogener. Två östrogenkänsliga tillstånd hos hongnagare uppfyller detta 
krav: 
i) Omogna honor efter avvänjning och före puberteten och 
ii) unga vuxna honor efter ovariektomi med tillräcklig tid för livmoderväv ­
naden att gå i regress. 
15. Testkemikalien tillförs dagligen via sondmatning eller subkutan injektion. 
Stegvisa testkemikaliedoser ges till minst två behandlingsgrupper av för ­
söksdjur (se punkt 33 för vägledning), med en dosnivå per grupp, och för immaturmetoden en administreringsperiod av tre på dagar i följd och för 
OVX-adultmetoden en administreringsperiod av minst tre dagar i följd. 
Djuren obduceras cirka 24 timmar efter sista dosen. För östrogenagonister utvärderas medelvärdet för livmodervikten hos de behandlade djurgrupperna i förhållande till vehikelgruppen avseende en statistiskt signifikant ökning. 
En statistiskt signifikant ökning av den genomsnittliga livmodervikten hos 
en testgrupp visar en positiv respons i denna bioassay.
 
BESKRIVNING AV METODEN  
Val av djurart  
16. Vanligen använda stammar av laboratoriegnagare kan användas. Till ex ­
empel användes Sprague-Dawley- och Wistar-råttstammar vid valideringen. Stammar med en livmoder som är eller misstänks vara mindre känslig bör inte användas. Laboratoriet bör påvisa känslighet hos den stam som an ­
vänds, enligt beskrivningen i punkt 26 och 27. 
17. Råtta och mus har rutinmässigt använts för den uterotrofa bioassayen sedan 
1930-talet. OECD:s valideringsstudier har endast utförts med råttor, grundat 
på en förståelse för att båda arterna bedöms vara likvärdiga och att det 
därmed bör räcka med en art för den världsomfattande valideringen för att spara resurser och djur. Råttan är den art som används i de flesta studier om reproduktions- och utvecklingstoxicitet. Med hänsyn till att det finns en 
stor historisk databas för möss och därmed möjlighet att bredda testmetoden 
för uterotrof bioassay på gnagare och använda möss som testart, har en begränsad uppföljande valideringsstudie genomförts på möss (se hänvisning 16). En överbryggande studie, med ett begränsat antal testkemikalier och 
deltagande laboratorier och utan kodad provtestning, har valts i enlighet 
med den ursprungliga avsikten att spara resurser och djur. Denna överbryg ­
gande valideringsstudie visar för den uterotrofa bioassayen på unga vuxna ovariektomerade möss att data som erhålls från råttor och möss överens ­
stämmer väl, både kvalitativt och kvantitativt. Resultatet från den uterotrofa 
bioassayen kan bli inledningen till en långsiktig studie, vilket gör att djur från samma stam och ursprung kan användas i båda försöken. Den över ­
bryggande studien begränsades till OVX-möss och rapporten ger inte en 
robust datauppsättning för att validera immaturmodellen, och därför beaktas 
inte immaturmodellen för möss i denna testmetod.
 ▼M5 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 818
 
18. Således kan, i vissa fall, möss användas i stället för råttor. En motivering 
bör ges för denna art baserat på toxikologiska, farmakokinetiska och/eller 
andra kriterier. Ändringar i protokollet kan bli nödvändigt för möss. Till exempel är foderkonsumtionen hos möss i förhållande till kroppsvikt högre än den hos råttor och därför bör innehållet av fytoöstrogen i fodret vara 
lägre för möss än för råttor (se hänvisning 9, 20, 22).
 
Inhysnings- och utfodringsförhållanden  
19. Alla förfaranden bör överensstämma med lokala normer för laboratoriedjur ­
vård. Dessa beskrivningar av vård och behandling är minimikrav och ersätts 
av lokala föreskrifter som t.ex. Europaparlamentets och rådets direktiv 2010/63/EU av den 22 september 2010 om skydd av djur som används för vetenskapliga ändamål (se hänvisning 38). Temperaturen i djurutrymmet 
bör vara 22 °C (med ett ungefärligt intervall på ± 3 °C). Den relativa 
fuktigheten bör vara minst 30 % och bör helst inte överstiga 70 %, utom när rummet rengörs. Målet bör vara relativ luftfuktighet på 50–60 %. Ar ­
tificiell belysning bör användas. Den dagliga belysningssekvensen bör vara 
12 timmar ljus, 12 timmar mörker. 
20. Djuren ska ha fri tillgång till laboratoriefoder och dricksvatten. Unga vuxna 
djur kan inhysas individuellt eller i burar om grupper på upp till tre djur. På 
grund av de omogna djurens låga ålder rekommenderas social gruppinhysning. 
21. Höga nivåer av fytoöstrogener i laboratoriefoder har varit kända för att öka 
livmodervikterna tillräckligt mycket hos gnagare för att störa den uterotrofa bioassayen (se hänvisning 13, 14, 15). Höga nivåer av fytoöstrogener och omsättbar energi i laboratoriefoder kan också leda till tidig pubertet om 
omogna djur används. Förekomsten av fytoöstrogener kommer främst från 
soja och alfalfaprodukter som tillförts laboratoriefodret, och koncentrationer av fytoöstrogener har visat sig variera mellan olika partier av standardlabo ­
ratoriefoder (se hänvisning 23). Kroppsvikt är en viktig variabel, eftersom 
den mängd livsmedel som konsumeras är relaterad till kroppsvikten. Därför 
kan den faktiska fytoöstrogendosen som konsumeras genom samma foder variera mellan arter och åldrar (se hänvisning 9). För omogna honråttor kan foderkonsumtionen på grundval av kroppsvikten vara ungefär dubbelt så 
stor som hos ovariektomerade unga vuxna honor. För unga vuxna möss 
kan foderkonsumtionen på grundval av kroppsvikten vara ungefär fyrdubb ­
lad som den för ovariektomerade unga vuxna honråttor. 
22. Resultat från den uterotrofa bioassayen (se hänvisning 9, 17, 18, 19) visar 
dock att begränsade mängder fytoöstrogener i fodret är acceptabla och minskar inte bioassayens känslighet. Som en vägledning bör nivåerna av 
fytoöstrogener i fodret inte överstiga 350 μg genisteinekvivalenter/gram 
laboratoriefoder för omogna Sprague Dawley- och Wistar-honråttor (se hän ­
visning 6, 9). Sådant foder bör också vara lämplig vid testning av unga vuxna ovariektomerade råttor, eftersom foderkonsumtionen på basis av 
kroppsvikten är mindre hos unga vuxna jämfört med omogna djur. Om 
vuxna ovariektomerade möss eller mer fytoöstrogenkänsliga råttor används, måste en proportionell minskning av fytoöstrogennivåerna i fodret över ­
vägas (se hänvisning 20). Dessutom kan skillnader i tillgänglig metabolisk 
energi för olika typer av föda leda till tidsförskjutning av pubertetsdebuten 
(se hänvisning 21, 22).
 ▼M5 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 819
 
23. Ett noggrant val av foder utan förhöjda nivåer av fytoöstrogener (för väg ­
ledning, se hänvisning 6, 9) eller omsättbar energi, som kan påverka resul ­
taten (se hänvisning 15, 17, 19, 22, 36), krävs före studien. Att säkerställa ett korrekt utförande av det testsystem som används på laboratoriet enligt punkterna 26 och 27 är en viktig kontroll av båda dessa faktorer. Som en 
säkerhetsåtgärd enligt god laboratoriesed (GLP) bör representativ provtag ­
ning av varje parti av foder som tillförs under studien utföras för eventuell analys av fytoöstrogeninnehållet (t.ex. vid hög livmoderkontrollvikt i för ­
hållande till historiska kontroller, eller en otillräcklig respons på referensö ­
strogen, 17-alfa-etinylestradiol). Alikvoter ska analyseras som en del av 
studien eller frysas vid – 20 °C eller på sådant sätt att provet inte bryts ned i väntan på analys. 
24. Vissa strömaterial kan innehålla naturligt förekommande östrogena eller 
antiöstrogena kemikalier (t.ex. är majskolvar kända för att påverka cyklici ­
teten hos råttor och förefaller vara antiöstrogena). Det valda ströet bör ha en 
minimal halt av fytoöstrogener.
 
Förberedelse av djuren  
25. Försöksdjur utan tecken på sjukdom eller fysiska abnormiteter väljs slump ­
mässigt ut för placering i kontroll- och behandlingsgrupperna. Burarna bör placeras så att eventuella effekter beroende på placering blir så små som 
möjligt. Djuren bör identifieras unikt. Helst bör omogna djur placeras i bur 
tillsammans med moderdjur eller fostermoderdjur fram till avvänjningen under acklimatiseringen. Acklimatiseringsperioden före studiens start bör vara ca 5 dagar för unga vuxna djur och omogna djur som levererats till ­
sammans med moderdjur eller fostermoderdjur. Om omogna djur erhålls 
som avvanda utan moderdjur kan det vara nödvändigt att förkorta ackli ­
matiseringsperioden eftersom doseringen bör inledas omedelbart efter av ­
vänjningen (se punkt 29).
 
FÖRFARANDE  
Kvalifikationsprövning av laboratorium  
26. Två olika alternativ kan användas för att kvalitetspröva laboratorier: 
— Återkommande kontroller eller förlita sig på en inledande positiv grund ­
kontrollstudie (se punkt 27). Minst var 6:e månad och varje gång det sker en förändring som kan påverka utförandet av testet (t.ex. en ny beredning av foder, byte av personal som utför dissektioner, föränd ­
ringar av djurstam eller leverantör, etc.), bör känsligheten hos testsyste ­
met (djurmodell) verifieras med en lämplig dos (baserat på den inle ­
dande positiva grundkontrollstudien beskriven i punkt 27) av ett refe ­
rensöstrogen: 17a-etinylestradiol (CAS-nr 57-63-6) (EE). 
— Användning av jämsides behandlade kontroller genom att inkludera en 
grupp som tillförs en lämplig dos av referensöstrogen i varje test. 
Om systemet inte svarar som förväntat bör försöksbetingelserna granskas 
och ändras i enlighet därmed. Det rekommenderas att dosen av referensö ­
strogen som används i båda fallen bör vara ungefär ED 70 till 80.
 ▼M5 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 820
 
27. Positiv grundkontrollstudie  – Innan ett laboratorium genomför en under ­
sökning enligt denna testmetod för första gången bör laboratoriets kom ­
petens visas i ett test av djurmodellens respons genom fastställande av dosresponsen för ett referensöstrogen: 17a-etinylestradiol (CAS-nr 57-63- 6) (EE) med minst fyra doser. Livmoderviktsresponsen kommer att jämföras 
med etablerade historiska data (se hänvisning 5). Om denna positiva grund ­
kontrollstudie inte ger förväntade resultat bör försöksbetingelserna granskas och ändras.
 
Djurens antal och skick  
28. Varje behandlad grupp och kontrollgrupp bör innehålla minst 6 djur (pro ­
tokoll för både immatur- och OVX-adultmetod).  
Ålder på omogna djur  
29. För den uterotrofa bioassayen med omogna djur måste födelsedatum anges. 
Doseringen bör starta tillräckligt tidigt för att säkerställa, i slutet av till ­
förseln av testkemikalien, att den fysiologiska ökningen av endogena östro ­
gener som sammanhänger med puberteten ännu inte har ägt rum. Å andra sidan finns det belägg för att mycket unga djur kan vara mindre känsliga. För att definiera optimal ålder bör varje laboratorium ta sina egna bak ­
grundsdata om mognad i beaktande. 
Som en allmän vägledning kan doseringen av råttor påbörjas omedelbart 
efter tidig avvänjning på postnatal dag 18 (postnatal dag 0 är födelsedatum). Doseringen av råttor bör helst vara avslutad på postnatal dag 21 men i alla 
händelser före postnatal dag 25, eftersom hypotalamus-hypofys-ovarie-axeln 
blir funktionell efter den åldern och endogena östrogennivåer kan börja stiga vilket leder till en ökning av referensmedelvärden för livmodervikt och gruppens standardavvikelser (se hänvisning 2, 3, 10, 11, 12).
 
Förfarande för ovariektomi  
30. För ovariektomerad honråtta och honmus (behandlings- och kontrollgrup ­
per) bör ovariektomin ske mellan 6 och 8 veckors ålder. För råttor bör minst 14 dagar förflyta mellan ovariektomin och den första dagen för till ­
förseln så att livmodern går i regress till en minimal, stabil referensnivå. För 
möss bör åtminstone 7 dagar förflyta mellan ovariektomin och tillförselns första dag. Eftersom små mängder av äggstocksvävnad är tillräckliga för att ge betydande cirkulerande nivåer av östrogen (se hänvisning 3), bör djuren 
testas före användningen genom att prov av epitelceller från vagina obser ­
veras minst fem dagar i följd (t.ex. dag 10–14 efter ovariektomin för råttor). Om djuren visar tecken på brunst bör de inte användas. Vid obduktionen bör äggstocksresterna undersökas avseende eventuella tecken på äggstocks ­
vävnad. Om så är fallet bör djuret inte tas med i beräkningarna (se hänvis ­
ning 3). 
31. Ovariektomiproceduren inleds med djuret placerat i ventral halvliggande 
ställning, efter att djuret har blivit ordentligt bedövat. Snittet som öppnar 
den dorsolaterala bukväggen bör vara ca 1 cm på längden vid mittpunkten 
mellan revbensbroskets undre kant och höftbenskammen, och några milli ­
meter i sidled fram till den laterala kanten på ryggmuskeln. Äggstockarna bör tas ut ur bukhålan till ett aseptiskt underlag. Äggstockarna bör lossas 
vid förbindelsen mellan äggledaren och livmodern. Efter att ha bekräftat att 
ingen massiv blödning sker, bör bukväggen tillslutas med en sutur och huden tillslutas med autoclips eller lämplig sutur. Ligaturpunkterna visas schematiskt i figur 1. Lämplig postoperativ smärtlindring bör användas i 
enlighet med rekommendationer från en veterinär med erfarenhet av gna ­
garvård.
 ▼M5 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 821
 
Kroppsvikt  
32. För OVX-adultmetoden är kroppsvikt och livmodervikt inte korrelerade 
eftersom livmodervikten påverkas av hormoner som östrogen, men inte 
av tillväxtfaktorer som reglerar kroppsstorleken. Däremot är kroppsvikten relaterad till livmoderns vikt i immaturmodellen, samtidigt som den mognar (se hänvisning 34). Således bör, vid början av studien, viktskillnaden mellan 
djuren som används i immaturmodellen vara minimal och inte överstiga 
± 20 % av medelvikten. Detta innebär att uppfödaren bör standardisera kullstorleken, för att säkerställa att avkomman från olika moderdjur kommer att matas ungefär likadant. Djuren bör anvisas till grupper (både kontroll- 
och behandlingsgrupper) genom slumpmässig viktfördelning, så att medel ­
värdet för kroppsvikten i varje grupp inte statistiskt skiljer sig åt från andra grupper. Man bör överväga att undvika anvisning av kullsyskon till samma behandlingsgrupp, så vitt det är möjligt, utan att öka antalet kullar som ska 
användas för undersökningen.
 
Dosering  
33. För att fastställa huruvida en testkemikalie kan ha östrogen aktivitet  in vivo  
är normalt två dosgrupper och en kontrollgrupp tillräckliga, och denna utformning är därför att föredra av djurskyddsskäl. Om syftet är att antingen erhålla en dos-responskurva eller att extrapolera till lägre doser, behövs 
minst 3 dosgrupper. Om information utöver identifiering av östrogen akti ­
vitet (t.ex. en uppskattning av potens) krävs, bör ett annat doseringsschema övervägas. Med undantag av behandlingen med testkemikalien bör djuren i kontrollgruppen hanteras på exakt samma sätt som i testgruppen. Om en 
vehikel används för tillförsel av testkemikalien bör kontrollgruppen tillföras 
samma mängd vehikel som används i de behandlade grupperna (eller den största volym som används i testgrupperna om detta skiljer sig åt mellan grupperna). 
34. Målet för den uterotrofa bioassayen är att välja doser som garanterar djurens 
överlevnad och som inte orsakar signifikant toxicitet eller lidande hos dju ­
ren, efter tre dagar i följd med tillförsel av kemikalien upp till en maximal 
dos på 1 000 mg/kg/dag. Alla dosnivåer bör väljas med hänsyn till even ­
tuella toxicitetsdata och (toxiko-)kinetiska data som finns tillgängliga om testkemikalien eller närbesläktade ämnen. Den högsta dosen bör ta hänsyn 
till LD 50 och/eller information om akut toxicitet för att undvika dödsfall, 
svår smärta och lidande hos djuren (se hänvisning 24, 25, 26). Den högsta dosen bör motsvara maximal tolererbar dos (MTD). En studie som genom ­
förs vid en dosnivå som framkallar en positiv uterotrof respons accepteras 
också. Som en screening är breda intervall (t.ex. halva logenheter som 
motsvarar en dosprogression på 3,2 eller till och med upp till en logenhet) mellan doseringarna i allmänhet godtagbara. Om det inte finns några lämp ­
liga data tillgängliga kan en dosfinnande studie genomföras som hjälp för 
att bestämma vilka doser som ska användas. 
35. Alternativt, om den östrogena potensen hos en agonist kan uppskattas ge ­
nom in vitro -data (eller datormodeller) kan dessa beaktas vid valet av dos. 
Exempelvis kan mängden testkemikalie som skulle framkalla en uterotrof respons som är likvärdig med referensagonisten (etinylestradiol) uppskattas genom dess relativa  in vitro -potens jämfört med etinylestradiol. Den högsta 
testdosen ges genom att multiplicera denna ekvivalentdos med en lämplig 
faktor, t.ex. 10 eller 100.
 ▼M5 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 822
 
Överväganden för dosfinnande studie  
36. Vid behov kan en preliminär dosfinnande studie genomföras med några få 
djur. För detta ändamål kan man använda OECD:s vägledning nr 19 (se 
hänvisning 25) som definierar kliniska tecken som tyder på toxicitet eller lidande för djuren. Om det är möjligt inom denna dosfinnande studie kan, efter tre dagars tillförsel, livmodern skäras ut och vägas ca 24 timmar efter 
att sista dosen getts. Dessa data kan sedan användas vid utformning av 
huvudstudien (val av en acceptabel största och minsta dos och rekommen ­
derat antal dosgrupper).
 
Tillförsel av doser  
37. Testkemikalien tillförs via sondmatning eller subkutan injektion. Djurskydd 
såväl som toxikologiska aspekter av betydelse för den mänskliga expone ­
ringsvägen för kemikalien (t.ex. oral sondmatning för att efterlikna för ­
täring, subkutan injektion för att efterlikna inandning eller hudabsorption), 
de fysikalisk-kemiska egenskaperna hos testmaterialet och i synnerhet gäl ­
lande toxikologisk information och data om metabolism och kinetik (t.ex. behovet att undvika första passage-metabolism, större effektivitet via en 
bestämd rutt) måste tas med i beräkningen när man väljer administrations ­
sätt. 
38. Det rekommenderas att i första hand överväga att använda en vattenbaserad 
lösning/suspension, om det är möjligt. Men eftersom de flesta östrogenli ­
gander eller deras metaboliska prekursorer tenderar att vara hydrofoba, är den vanligaste metoden att använda en lösning/suspension i olja (t.ex. 
majs-, jordnöts-, sesam- eller olivolja). Dessa oljor har olika kaloriinnehåll 
och fetthalt, sålunda kan vehikeln påverka det totala metaboliserbara energiintaget (ME) och därmed eventuellt förändra uppmätta endpoints så ­
som livmodervikten, i synnerhet för immaturmetoden (se hänvisning 33). 
Före studien bör därför alla vehiklar som ska användas testas mot kontroller 
utan vehiklar. Testkemikalier kan lösas upp i en minimal mängd av 95 % etanol eller annat lämpligt lösningsmedel, och spädas ut till slutliga kon ­
centrationer i testvehikeln. De toxiska egenskaperna hos lösningsmedlet 
måste vara kända, och bör testas med endast lösningsmedel i en separat 
kontrollgrupp. Om testkemikalien bedöms vara stabil kan försiktig upp ­
värmning och kraftig mekanisk påverkan användas för att hjälpa till att lösa upp testkemikalien. Testkemikaliens stabilitet i vehikeln bör bestäm ­
mas. Om testkemikalien är stabil under hela studien kan en startalikvot av 
testkemikalien beredas, och därefter kan de angivna doseringsutspädning ­
arna beredas dagligen. 
39. Doseringstidpunkterna beror på den modell som används (se punkt 29 för 
immaturmodellen och punkt 30 för OVX-adultmodellen). Omogna råttor av honkön doseras dagligen med testkemikalien tre dagar i följd. En tredagars 
behandling rekommenderas också för ovariektomerade honråttor, men 
längre exponeringar är acceptabla och kan förbättra upptäckten av svagt aktiva kemikalier. För ovariektomerade honmöss bör tre dagar vara tillräck ­
ligt, och det finns inte någon påvisbar fördel med en förlängning på upp till 
sju dagar för starka östrogenagonister, dock påvisades inte detta förhållande 
för svaga östrogener i valideringsstudien (se hänvisning 16), alltså bör doseringen förlängas upp till sju dagar i följd för ovariektomerade vuxna möss. Dosen bör ges vid samma tid varje dag. Doserna bör justeras vid 
behov för att bibehålla en konstant dosnivå i förhållande till djurens kropps ­
vikt (t.ex. mg av testkemikalien per kg kroppsvikt per dag). När det gäller testvolymen bör dess variationer på grundval av kroppsvikten minimeras, genom justering av koncentrationen i doseringslösningen, för att säkerställa 
en konstant volym på grundval av kroppsvikten, vid alla dosnivåer och för 
varje administrationsväg.
 ▼M5 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 823
 
40. När testkemikalien tillförs genom sondmatning bör detta ske i en daglig 
engångsdos via magsond eller lämplig intubationskanyl. Den största mängd 
vätska som kan administreras vid ett tillfälle beror på försöksdjurets storlek. Lokala djurvårdsriktlinjer bör följas, men volymen bör inte överstiga 5 ml/kg kroppsvikt, utom i fråga om vattenlösningar där 10 ml/kg kroppsvikt 
får användas. 
41. När testkemikalien administreras genom subkutan injektion, bör detta ske i 
en enda daglig dos. Doserna ska ges i dorsoscapular- eller lumbarregionen med en steril nål (t.ex. med grovleken 23 eller 25), och en tuberkulinspruta. 
Rakning av injektionsstället är valfritt. Eventuell förlust, läckage vid injek ­
tionsstället eller ofullständig dosering ska registreras. Den totala volymen som injiceras per råtta per dag bör inte överstiga 5 ml/kg kroppsvikt, upp ­
delat på 2 injektionsställen, utom i fråga om vattenhaltiga lösningar, där 10 
ml/kg kroppsvikt kan användas.
 
Observationer  
Allmänna och kliniska observationer  
42. Allmänna kliniska observationer bör göras minst en gång per dag och oftare 
när tecken på toxicitet observeras. Observationerna bör företrädesvis utföras 
vid samma tidpunkt varje dag och med hänsyn till förväntade toppeffekter 
efter doseringen. Alla djur ska observeras avseende dödlighet, sjuklighet och allmänna kliniska tecken, såsom förändringar i beteende, hud, päls, ögon, slemhinnor, förekomst av sekret och utsöndringar samt autonom ak ­
tivitet (t.ex. tårflöde, piloerektion, pupillstorlek och ovanligt andningsmöns ­
ter).
 
Kroppsvikt och foderkonsumtion  
43. Alla djur bör vägas dagligen med en noggrannhet på 0,1 g, med början 
strax före starten av behandlingen, dvs., när djuren fördelas i grupper. Som 
en valfri mätning, kan mängden foder som konsumeras under behandlings ­
perioden mätas per bur genom vägning av fodertrågen. Foderkonsumtions ­
resultaten bör uttryckas i gram per råtta per dag.  
Dissekering och mätning av livmodervikt  
44. Råttorna ska avlivas humant tjugofyra timmar efter den sista behandlingen. 
Helst ska obduktionsordningen randomiseras mellan grupperna för att und ­
vika progression direkt upp eller ner i dosgrupperna, vilket på ett subtilt sätt kan påverka data. Bioassayens mål är att mäta både våt och torr livmoder ­
vikt. Den våta vikten inkluderar livmodern och det luminala vätskeinnehål ­
let. Den torra vikten mäts efter att det luminala innehållet i livmodern har angivits och avlägsnats. 
45. Före dissektionen granskas vaginan beträffande öppningsstatus hos omogna 
djur. Dissektionsförfarandet inleds genom att öppna bukväggen med början 
vid blygdbenssammanfogningen. Sedan lossas livmoderhornet och äggstoc ­
karna, om de är kvar, från den dorsala bukväggen. Urinblåsan och urin ­
ledarna tas bort från den ventrala och laterala sidan av livmodern och 
vaginan. Fibrös vidhäftning mellan rektum och vaginan avskiljs tills över ­
gången mellan vaginalöppning och perineal hud kan identifieras. Livmodern och vaginan avskiljs från kroppen genom ett snitt i vaginalväggen precis ovanför förbindelsen mellan perineal hud såsom visas i figur 2. Livmodern 
avskiljs från kroppsväggen genom att livmoderbandet försiktigt skärs av vid 
fästpunkten, längs hela längden av den dorsolaterala aspekten av varje
 ▼M5 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 824
 
livmoderhorn. När livmodern tagits ut ur kroppen bör den hanteras tillräck ­
ligt snabbt för att undvika uttorkning av vävnaderna. Viktförluster på grund 
av uttorkning blir mer betydelsefulla med små vävnader såsom uterus (se hänvisning 23). Om äggstockarna finns kvar så tas äggstockarna bort från äggledarna för att undvika förlust av luminal vätska från livmoderhornet. 
Om djuret har ovariektomerats så bör resterna undersökas beträffande före ­
komsten av eventuell äggstocksvävnad. Överflödigt fett och bindväv ska putsas bort. Vaginan tas bort från livmodern precis under livmoderhalsen så att livmoderhalsen förblir i livmodern, såsom visas i figur 2. 
46. Varje livmoder bör överföras till en individuellt märkt och vägd behållare 
(t.ex. en petriskål eller ett vikttråg i plast) med fortsatt omsorg om att 
undvika uttorkning före vägningen (t.ex. så kan filterpapper som fuktats 
med saltlösning placeras i behållaren). Livmodern med luminal vätska vägs med en noggrannhet på 0,1 mg (våt livmodervikt). 
47. Varje livmoder bearbetas sedan enskilt för att avlägsna luminal vätska. Båda 
livmoderhornen genomborras eller skärs longitudinellt. Livmodern placeras 
på lätt fuktat filterpapper (t.ex. Whatman nr 3) och pressas försiktigt med ett 
andra stycke lätt fuktat filterpapper för att helt avlägsna den luminala väts ­
kan. Livmodern utan luminalt innehåll vägs med en noggrannhet på 0,1 mg (torr livmodervikt). 
48. Livmodervikten vid avslutningen kan användas för att säkerställa att lämplig 
ålder för den omogna intakta råttan inte överskreds, dock är de historiska 
uppgifterna om råttstammen som används på laboratoriet avgörande i detta 
hänseende (se punkt 56 för tolkning av resultaten).
 
Valfria undersökningar  
49. Efter vägningen kan livmodern fixeras i 10 % neutral buffrad formalin för 
att undersökas histopatologiskt efter haematoxylin-eosin-färgning (HE). Va ­
ginan kan undersökas i enlighet därmed (se punkt 9). Dessutom kan morfo ­
metriska mätningar av endometriets epitel utföras för en kvantitativ jäm ­
förelse.  
DATA OCH RAPPORTERING  
Data  
50. Studiedata bör omfatta 
— antalet djur vid testets början, — antalet och identiteten för de djur som påträffats döda under testet eller 
som avlivats av humana skäl, samt datum och tid för varje dödsfall eller avlivning, 
— antalet och identiteten för de djur som visar tecken på toxicitet och en 
beskrivning av de tecken på toxicitet som observerats, inklusive tid ­
punkt för första tecken, varaktighet och hur allvarliga de toxiska effek ­
terna är samt 
— antalet och identiteten hos de djur som visar eventuella skador och en 
beskrivning av typen av skador.
 ▼M5 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 825
 
51. Individuella försöksdjursdata ska registreras avseende kroppsvikt, våt liv ­
modervikt och torr livmodervikt. Ensidiga statistiska analyser av agonister 
bör användas för att bestämma huruvida administrering av en testkemikalie resulterade i en statistiskt signifikant (p < 0,05) ökning av livmodervikten. Lämpliga statistiska analyser bör utföras för testning avseende behandlings ­
relaterade förändringar av torr och våt livmodervikt. Exempelvis kan data 
utvärderas genom en kovariansanalys (Ancova), med kroppsvikten vid ob ­
duktionen som samvariabel. En variansstabiliserande logaritmisk transfor ­
mation kan utföras på livmoderdata före dataanalysen. Dunnett och Hsus 
test är lämpliga för att göra parvisa jämförelser mellan varje dosgrupp och 
vehikelkontroller och för att beräkna konfidensintervallet. Studentiserade residualer kan användas för att upptäcka eventuella avvikande värden och bedöma variansens homogenitet. Dessa förfaranden tillämpades i OECD:s 
valideringsprogram med hjälp av PROC GLM i Statistical Analysis System 
(SAS Institute, Cary, NC), version 8 (se hänvisning 6, 7). 
52. En slutrapport ska innehålla:
 
Testanläggning:  
— Ansvarig personal och deras studieansvar. 
— Data från utgångsvärdet för det positiva kontrolltestet och periodiska 
positiva kontrolldata (se punkterna 26 och 27)  
Testkemikalie:  
— Karakterisering av testkemikalier. 
— Fysikalisk form och om det är relevant, fysikalisk-kemikaliska 
egenskaper. 
— Metod och frekvens för beredning av utspädningar. 
— Eventuella stabilitetsdata som genererats. 
— Eventuella analyser av doseringslösningar.  
Vehikel:  
— Karakterisering av testvehikel (form, leverantör och parti) 
— Motivering för val av vehikel (om annan än vatten).  
Försöksdjur:  
— Art och stam, samt motivering av valet. 
— Leverantör och specifik leverantörsanläggning. 
— Leveransålder med födelsedatum. 
— För omogna djur: uppgift om huruvida de har levererats tillsammans 
med moderdjur eller fostermoderdjur, samt datum för avvänjningen. 
— Uppgifter om djuracklimatiseringsförfarande. 
— Antalet djur per bur. — Detaljer och metod för identifiering av enskilda djur och grupper.
 
Testbetingelser:  
— Uppgifter om randomiseringsprocess (dvs. metoden som använts) 
— Motivering för valet av dos.  ▼M5 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 826
 
— Uppgifter om testkemikaliens sammansättning, dess uppnådda koncent ­
rationer, stabilitet och homogenitet. 
— Uppgifter om tillförsel av testkemikalien samt motivering av valet av 
exponeringsväg. 
— Foder (namn, typ, leverantör, innehåll och, om möjligt, fytoöstrogen ­
nivåer). 
— Vattenkälla (t.ex. kranvatten eller filtrerat vatten) och tillförselsätt (ge ­
nom slang från en stor behållare, i flaskor, etc.). 
— Strö (namn, typ, leverantör, innehåll). 
— Registrering av burförhållanden, belysningsintervall, rumstemperatur 
och luftfuktighet, rengöring. 
— Detaljerad beskrivning av obduktion och livmodervägning. 
— Beskrivning av statistiska metoder.  
Resultat  
För enskilda djur:  
— Alla dagliga individuella kroppsvikter (från anvisningen till grupper och 
fram till obduktionen) (med en noggrannhet på 0,1 g). 
— Ålder på varje djur (räknat i dagar med födelsedatum som dag 0) när 
behandlingen med testkemikalien börjar. 
— Datum och tid för varje doseringstillfälle. 
— Beräknad volym och dos som administreras, samt observationer av 
eventuella doseringsförluster under eller efter administreringen. 
— Daglig dokumentation av djurens status, inklusive relevanta symtom och 
iakttagelser. 
— Misstänkt dödsorsak (om den hittas döende eller död under studien). 
— Datum och tid för human avlivning med tidsintervall till sista 
doseringen. 
— Våt livmodervikt (med en noggrannhet på 0,1 mg) och eventuella ob ­
servationer av förlust av luminal vätska vid dissekering och förberedel ­
ser för vägning. 
— Torr livmodervikt (med en noggrannhet på 0,1 mg).  
För varje grupp av djur:  
— Genomsnittliga dagliga kroppsvikter (med noggrannhet på 0,1 g) och 
standardavvikelser (från anvisningen till grupper till obduktionen). 
— Genomsnittlig våt livmodervikt och genomsnittlig torr livmodervikt 
(med en noggrannhet på 0,1 mg), samt standardavvikelser. 
— Daglig foderkonsumtion om den mäts (beräknat som gram foder som 
konsumeras per djur).  ▼M5 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 827
 
— Resultaten av statistiska analyser som jämför både våta och torra liv ­
modervikter i behandlade grupper i förhållande till samma mått i 
vehikelkontrollgrupperna. 
— Resultaten av statistisk analys som jämför den totala kroppsvikten och 
kroppsviktökning i behandlade grupper i förhållande till samma mått i vehikelkontrollgrupperna. 
53. Sammanfattning av de viktigaste vägledningsfakta för testmetoden.
 
Råtta Möss  
Djur  
Stam Vanlig laboratoriestam av gnagare 
Antal försöksdjur Minst 6 djur per dosgrupp Antal grupper Minst 2 testgrupper (se punkt 33 för vägledning) och en negativ 
kontrollgrupp 
För vägledning om positiva kontrollgrupper se punkterna 26 
och 27  
Inhysnings- och utfodringsförhållanden  
T
 o i djurutrymmet 22 °C ± 3 °C 
Relativ luftfuktighet 50–60 % och inte under 30 % eller över 70 % 
Daglig belysningssekvens 12 timmar ljus, 12 timmar mörker Foder och dricksvatten Fri tillgång Inhysning Individuellt eller i grupper på upp till tre djur (social gruppin ­
hysning rekommenderas för omogna djur) 
Foder och strö En låg halt av fytoöstrogener rekommenderas i foder och strö  
Protokoll  
Metod Ej ovariektomerad 
immatur-metoden (föredras) 
Ovariektomerad adult 
hona-metoden Ovariektomerad adult 
hona-metoden 
Ålder för dosering av 
omogna djur Tidigast PND 18. Doseringen 
bör vara avslutad före PND 25 Ej relevant inom tillämpnings ­
området för den aktuella test ­
metoden 
Ålder vid ovariektomi Mellan 6 och 8 veckors ålder Ålder för dosering av ova ­
riektomerade djur Minst 14 dagar bör förflyta 
mellan ovariektomin och 1:a administreringsdagen Minst 7 dagar bör förflyta mel ­
lan ovariektomin och 1:a ad ­
ministreringsdagen 
Kroppsvikt Kroppsviktsvariationen bör vara minimal och inte överstiga 
± 20 % av den genomsnittliga vikten
 ▼M5 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 828
 
Råtta Möss  
Dosering  
Administrationssätt Oral sondmatning eller subkutan injektion 
Administreringsfrekvens Daglig engångsdos Volym för sondmatning 
och insprutning ≤ 5ml/kg kroppsvikt (eller upp till 10 ml/kg kroppsvikt i fråga 
om vattenlösningar) (i 2 injektionsställen för subkutan admini ­
strering) 
Administreringens var ­
aktighet 3 dagar i följd för immaturmo ­
dellen 
Minst 3 dagar i följd för 
OVX-modellen 7 dagar i följd för 
OVX-modellen 
Tidpunkt för obduktion Ungefär 24 timmar efter den sista dosen  
Resultat  
Positiv respons Statistiskt signifikant ökning av medelvärdet för livmodervikt 
(våt och/eller torr) 
Referensöstrogen 17 α-etinylestradiol
 
RIKTLINJER FÖR TOLKNING OCH GODKÄNNANDE AV RESULTA ­
TEN 
54. I allmänhet bör ett test för östrogenicitet anses vara positivt om det finns en 
statistiskt signifikant ökning i livmodervikt (p < 0,05), åtminstone vid den 
höga dosnivån jämfört med lösningsmedelskontrollgruppen. Ett positivt re ­
sultat stöds också av en demonstration av ett biologiskt rimligt förhållande mellan dosen och responsens omfattning, med tanke på att överlappning av östrogena och antiöstrogena aktiviteter hos testkemikalien kan påverka 
dos-responskurvans form. 
55. Man måste vara försiktig med att inte överskrida den maximalt tolererbara 
dosen för en meningsfull tolkning av data. Minskning av kroppsvikt, kli ­
niska tecken och andra fynd bör noggrant utvärderas i detta hänseende. 
56. En viktig fråga för godkännandet av data från den uterotrofa bioassayen är 
livmodervikterna i vehikelkontrollgruppen. Höga kontrollvärden kan även ­
tyra responsen hos bioassayen och förmågan att upptäcka mycket svaga östrogenagonister. Litteraturstudier och data som genereras under valide ­
ringen av den uterotrofa bioassayen tyder på att höga kontrollmedelvärden 
kan förekomma spontant, i synnerhet hos omogna djur (se hänvisning 2, 3, 
6, 9). Eftersom livmodervikten hos omogna råttor beror på många variabler som stam eller kroppsvikt, kan ingen definitiv övre gräns för livmodervikten ges. Som en vägledning bör, om de torra livmodervikterna hos omogna 
kontrollråttor ligger mellan 40 och 45 mg, kan resultatet betraktas som 
misstänkt, och livmodervikter över 45 mg kan leda till att testet görs om igen. Dock måste detta beaktas från fall till fall (se hänvisning 3, 6, 8). Vid testning på vuxna råttor kan ofullständig ovariektomi som kvarlämnar äggs ­
tocksvävnad producera endogent östrogen och fördröja regressionen av liv ­
moderns vikt.
 ▼M5 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 829
 
57. Torra livmodervikter i vehikelkontroll som är mindre än 0,09 % av kropps ­
vikten för omogna honråttor, och mindre än 0,04 % för ovariektomerade 
unga vuxna honor tycks ge acceptabla resultat (se tabell 31 [hänvisning 2]). Om kontrollivmodervikterna är högre än dessa siffror, bör olika faktorer granskas, bland annat djurens ålder, korrekt ovariektomi, fytoöstrogener i 
foder, och så vidare, och ett negativt testresultat (ingen indikation på östro ­
gen aktivitet) bör användas med försiktighet. 
58. Historiska data för vehikelkontrollgrupperna bör bevaras i laboratoriet. His ­
toriska data för responser på positiva referensöstrogener, såsom 17a-etinyle ­
stradiol, bör också bevaras i laboratoriet. Laboratorier kan också testa re ­
sponsen på kända svaga östrogenagonister. Alla dessa data kan jämföras med tillgängliga data (se hänvisning 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8) för att säkerställa att 
laboratoriets metoder ger tillräcklig känslighet. 
59. De torra livmodervikterna visade mindre variabilitet i samband med 
OECD:s valideringsstudie än de våta livmodervikterna (se hänvisning 6, 
7). Däremot skulle en betydande respons i båda mätningarna tyda på att 
testkemikalien är positiv för östrogen aktivitet. 
60. Den uterotrofa responsen är inte helt av östrogen ursprung, dock bör ett 
positivt resultat från den uterotrofa bioassayen generellt tolkas som bevis för 
östrogen potential  in vivo , och bör normalt initiera åtgärder för vidare 
utredning (se punkt 9 och ”OECD:s ram för testning och bedömning av endokrinstörande kemikalier”, tillägg 2).
 
Figur 1  
Schematiskt diagram som visar det kirurgiska avlägsnandet av 
äggstockarna
  
Proceduren börjar med att den dorsolaterala bukväggen öppnas vid mitt ­
punkten mellan revbensbroskets nedre kant och höftbenskammen, och några 
millimeter i sidled till den laterala kanten på ryggmuskeln. I bukhålan lokaliseras äggstockarna. På ett aseptiskt underlag avlägsnas sedan äggs ­
tockarna fysiskt från bukhålan, en ligatur placeras mellan äggstocken och 
livmodern för att hindra blödning, och äggstocken lossas genom ett snitt 
ovanför ligaturen vid förbindelsen mellan äggledaren och varje livmoder ­
horn. Efter att det bekräftats att ingen signifikant blödning kvarstår bör bukväggen tillslutas med suturer och huden tillslutas, t.ex. med autoclips 
eller sutur. Djuren bör få återhämta sig och livmoderns vikt får gå i regress i 
minst 14 dagar före användning.
 ▼M5 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 830
 
Figur 2  
Borttagning och beredning av livmoderns vävnader för viktmätning
  
Proceduren börjar med att bukväggen öppnas vid blygdbenssammanfogningen. 
Sedan avlägsnas äggstockar, om de finns kvar, och livmoderhorn från den dor ­
sala bukväggen. Urinblåsan och urinledarna avlägsnas från den ventrala och laterala sidan av livmodern och vaginan. Fibrös vidhäftning mellan rektum och vaginan tas bort tills sammanfogningen av vaginalöppningen och perineal hud 
kan identifieras. Livmodern och vaginan avskiljs från kroppen genom ett snitt i 
vaginalväggen precis ovanför förbindelsen mellan perineal hud, såsom visas i figuren. Livmodern avskiljs från kroppsväggen genom att livmoderbandet för ­
siktigt skärs av vid fästpunkten, längs hela längden av den dorsolaterala aspekten 
av varje livmoderhorn. Efter uttagning ur kroppen putsas överflödigt fett och 
bindväv bort. Om äggstockarna finns kvar så tas äggstockarna bort från ägg ­
ledarna varvid förlust av luminal vätska från livmoderhornet undviks. Om djuret har ovariektomerats bör resterna undersökas avseende förekomst av eventuell 
äggstocksvävnad. Vaginan tas bort från livmodern precis under livmoderhalsen 
så att livmoderhalsen är kvar i livmodern, såsom visas i figuren. Livmodern kan sedan vägas.
 ▼M5 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 831
 
Tillägg 1  
DEFINITIONER  
Antiöstrogenicitet : förmågan hos en kemikalie att undertrycka verkan av östra ­
diol 17ß i en däggdjursorganism.  
Kemikalie : ett ämne eller en blandning.  
Födelsedatum : postnatal dag 0.  
Dosering : en allmän term som omfattar dos, dess frekvens och doseringens 
varaktighet.  
Dos: mängden testkemikalie som administreras. För uterotrof bioassay uttrycks 
dosen som vikten testkemikalie per enhet kroppsvikt hos försöksdjuret per dag 
(t.ex. mg/kg kroppsvikt/dag).  
Maximal tolererbar dos (MTD) : den största mängden av en kemikalie som, 
när den förs in i kroppen, inte dödar försöksdjuret (betecknas med LD  0 ) (IUPAC, 
1993).  
Östrogenicitet : förmågan hos en kemikalie att agera som östradiol 17ß i en 
däggdjursorganism.  
Postnatal dag X : den X:e dagen i livet efter födelsedatum.  
Känslighet : den andel av alla positiva/aktiva kemikalier som korrekt klassifice ­
ras genom testet. Detta är ett mått på noggrannhet för en testmetod som ger kategoriska resultat och är en viktig faktor vid bedömningen av en testmetods 
relevans.  
Specificitet : den andel av alla negativa/inaktiva kemikalier som korrekt klas ­
sificeras genom testet. Detta är ett mått på noggrannhet för en testmetod som ger kategoriska resultat och är en viktig faktor vid bedömningen av en testmetods 
relevans.  
Testkemikalie : varje ämne eller blandning som testas med denna testmetod.  
Uterotrof : en term som används för att beskriva en positiv inverkan på till ­
växten av livmodervävnad.  
Validering : en vetenskaplig process utformad för att karakterisera de operativa 
kraven och begränsningarna hos en testmetod och visa dess tillförlitlighet och 
relevans för ett visst ändamål.
 ▼M5 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 832
 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 833
 ▼M5 
Tillägg 2
  
VMG mamm: Validation Management Group on Mammalian Testing and Assessment.
 NOTER TILL RAMEN:  
Not 1:  Inmatning på alla nivåer och utmatning på alla nivåer är möjlig och 
beror på vilken typ av befintliga informationsbehov för fara och 
riskbedömningsändamål.  
Not 2:  På nivå 5 bör ekotoxikologi omfatta endpoints som anger mekanis ­
mer för biverkningar och potentiella populationsskador.  
Not 3:  När en multimodal modell täcker flera av de enskilda endpointtes ­
terna, ersätter denna modell användningen av de enskilda 
endpointtesterna.  
Not 4:  Bedömningen av varje kemikalie bör baseras på en bedömning från 
fall till fall, med beaktande av all tillgänglig information, med hän ­
syn till funktionen hos de övergripande nivåerna.  
Not 5:  Ramen bör inte betraktas som heltäckande för närvarande. På nivå 3, 
4 och 5 finns det tester som antingen är tillgängliga, eller för vilka 
ett godkännande pågår. När det gäller den senare, ingår dessa preli ­
minärt. När de väl har utvecklats och validerats, kommer de formellt 
att läggas till ramen.  
Not 6:  Nivå 5 bör inte betraktas som att den endast omfattar slutgiltiga 
tester. Tester som ingår på den nivån anses bidra till allmän faro- och riskbedömning.
 ▼M5 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 834
 
HÄNVISNINGAR  
1. OECD (1998). Report of the First Meeting of the OECD Endocrine Dis ­
rupter Testing and Assessment (EDTA) Task Force, 10–11 mars 1998, 
ENV/MC/CHEM/RA(98)5. 
2. OECD (2003). Detailed Background Review of the Uterotrophic Bioassay: 
Summary of the Available Literature in Support of the Project of the OECD Task Force on Endocrine Disrupters Testing and 
Assessment (EDTA) to Standardise and Validate the Uterotrophic Bio ­
assay. OECD Environmental Health and Safety Publication Series on Tes ­
ting and Assessment No. 38. ENV/JM/MONO(2003)1. 
3. Owens JW, Ashby J. (2002). Critical Review and Evaluation of the Ute ­
rotrophic Bioassay for the Identification of Possible Estrogen Agonists and 
Antagonists: In Support of the Validation of the OECD Uterotrophic Pro ­
tocols for the Laboratory Rodent. Crit. Rev. Toxicol. 32:445–520. 
4. OECD (2006). OECD Report of the Initial Work Towards the Validation 
of the Rodent Uterotrophic Assay – Phase 1. OECD Environmental Health 
and Safety Publication Series on Testing and Assessment No. 65. ENV/ JM/MONO(2006)33. 
5. Kanno, J, Onyon L, Haseman J, Fenner-Crisp P, Ashby J, Owens W. 
(2001). The OECD program to validate the rat uterotrophic bioassay to 
screen compounds for in vivo estrogenic responses: Phase 1. Environ 
Health Perspect. 109:785–94. 
6. OECD (2006). OECD Report of the Validation of the Rodent Uterotrophic 
Bioassay: Phase 2 – Testing of Potent and Weak Oestrogen Agonists by 
Multiple Laboratories. OECD Environmental Health and Safety Publica ­
tion Series on Testing and Assessment No. 66. ENV/JM/MONO(2006)34. 
7. Kanno J, Onyon L, Peddada S, Ashby J, Jacob E, Owens W. (2003). The 
OECD program to validate the rat uterotrophic bioassay: Phase Two – Dose Response Studies. Environ. Health Persp.111:1530–1549 
8. Kanno J, Onyon L, Peddada S, Ashby J, Jacob E, Owens W. (2003). The 
OECD program to validate the rat uterotrophic bioassay: Phase Two – Coded Single Dose Studies. Environ. Health Persp.111:1550–1558. 
9. Owens W, Ashby J, Odum J, Onyon L. (2003). The OECD program to 
validate the rat uterotrophic bioassay: Phase Two – Dietary phytoestrogen 
analyses. Environ. Health Persp. 111:1559–1567. 
10. Ogasawara Y, Okamoto S, Kitamura Y, Matsumoto K. (1983). Prolifer ­
ative pattern of uterine cells from birth to adulthood in intact, neonatally castrated, and/or adrenalectomized mice assayed by incorporation of 
[I
 125 ]iododeoxyuridine. Endocrinology 113:582–587. 
11. Branham WS, Sheehan DM, Zehr DR, Ridlon E, Nelson CJ. (1985). The 
postnatal ontogeny of rat uterine glands and age-related effects of 17b- estradiol. Endocrinology 117:2229–2237. 
12. Schlumpf M, Berger L, Cotton B, Conscience-Egli M, Durrer S, Fle ­
ischmann I, Haller V, Maerkel K, Lichtensteiger W. (2001). Estrogen 
active UV screens. SÖFW-J. 127:10–15. 
13. Zarrow MX, Lazo-Wasem EA, Shoger RL. (1953). Estrogenic activity in a 
commercial animal ration. Science 118:650–651. 
14. Drane HM, Patterson DSP, Roberts BA, Saba N. (1975). The chance 
discovery of oestrogenic activity in laboratory rat cake. Fd. Cosmet. Tox ­
icol. 13:425–427. 
15. Boettger-Tong H, Murphy L, Chiappetta C, Kirkland JL, Goodwin B, 
Adlercreutz H, Stancel GM, Makela S. (1998). A case of a laboratory animal feed with high estrogenic activity and its impact on  in vivo  respon­
ses to exogenously administered estrogens. Environ. Health Pers ­
pec.106:369–373.
 ▼M5 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 835
 
16. OECD (2007). Additional data supporting the Test Guideline on the Ute ­
rotrophic Bioassay in rodents. OECD Environmental Health and Safety 
Publication Series on Testing and Assessment No. 67. 
17. Degen GH, Janning P, Diel P, Bolt HM. (2002). Estrogenic isoflavones in 
rodent diets. Toxicol. Lett. 128:145–157. 
18. Wade MG, Lee A, McMahon A, Cooke G, Curran I. (2003). The influence 
of dietary isoflavone on the uterotrophic response in juvenile rats. Food Chem. Toxicol. 41:1517–1525. 
19. Yamasaki K, Sawaki M, Noda S, Wada T, Hara T, Takatsuki M. (2002). 
Immature uterotrophic assay of estrogenic compounds in rats given diffe ­
rent phytoestrogen content diets and the ovarian changes in the immature 
rat uterotrophic of estrogenic compounds with ICI 182,780 or antide. Arch. Toxicol. 76:613–620. 
20. Thigpen JE, Haseman JK, Saunders HE, Setchell KDR, Grant MF, For ­
sythe D. (2003). Dietary phytoestrogens accelerate the time of vaginal 
opening in immature CD-1 mice. Comp. Med. 53:477–485. 
21. Ashby J, Tinwell H, Odum J, Kimber I, Brooks AN, Pate I, Boyle CC. 
(2000). Diet and the aetiology of temporal advances in human and rodent 
sexual development. J. Appl. Toxicol.20:343–347. 
22. Thigpen JE, Lockear J, Haseman J, Saunders HE, Caviness G, Grant MF, 
Forsythe DB. (2002). Dietary factors affecting uterine weights of immature CD-1 mice used in uterotrophic bioassays. Cancer Detect. Prev. 
26:381–393. 
23. Thigpen JE, Li L-A, Richter CB, Lebetkin EH, Jameson CW. (1987). The 
mouse bioassay for the detection of estrogenic activity in rodent diets: I. A 
standardized method for conducting the mouse bioassay. Lab. Anim. Sci.37:596–601. 
24. OECD (2008). Acute oral toxicity – up-and-down procedure. OECD Gui ­
deline for the testing of chemicals No 425. 
25. OECD (2000). Guidance document on the recognition, assessment and use 
of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in 
safety evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on 
Testing and Assessment No 19. ENV/JM/MONO(2000)7. 
26. OECD (2001). Guidance document on acute oral toxicity. Environmental 
Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No 24. ENV/JM/MONO(2001)4. 
27. Bulbring, E., and Burn, J.H. (1935). The estimation of oestrin and of male 
hormone in oily solution. J. Physiol. 85: 320–333. 
28. Dorfman, R.I., Gallagher, T.F. och Koch, F.C (1936). The nature of the 
estrogenic substance in human male urine and bull testis. Endocrinology 
19: 33–41. 
29. Reel, J.R., Lamb IV, J.C. och Neal, B.H. (1996). Survey and assessment 
of mammalian estrogen biological assays for hazard characterization. Fun ­
dam. Appl. Toxicol. 34: 288–305. 
30. Jones, R.C. och Edgren, R.A. (1973). The effects of various steroid on the 
vaginal histology in the rat. Fertil. Steril. 24: 284–291. 
31. OECD (1982). Organization for Economic Co-operation and Development 
– Principles of Good Laboratory Practice, ISBN 92-64-12367-9, Paris. 
32. Dorfman R.I. (1962).  Methods in Hormone Research , Vol. II, Part IV: 
Standard Methods Adopted by Official Organization. New York, Acade ­
mic Press. 
33. Thigpen J. E. et al. (2004). Selecting the appropriate rodent diet for en ­
docrine disruptor research and testing studies. ILAR J 45(4): 401–416.
 ▼M5 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 836
 
34. Gray L.E. och Ostby J. (1998). Effects of pesticides and toxic substances 
on behavioral and morphological reproductive development: endocrine 
versus non-endocrine mechanism. Toxicol Ind Health. 14 (1–2): 159–184. 
35. Booth AN, Bickoff EM och Kohler GO. (1960). Estrogen-like activity in 
vegetable oils and mill by-products. Science 131:1807–1808. 
36. Kato H, Iwata T, Katsu Y, Watanabe H, Ohta Y, Iguchi T (2004). Eva ­
luation of estrogenic activity in diets for experimental animals using in 
vitro assay. J. Agric Food Chem. 52, 1410–1414. 
37. OECD (2007). Guidance Document on the Uterotrophic Bioassay Pro ­
cedure to Test for Antioestrogenicity. Series on Testing and Assessment. No. 71. 
38. Europaparlamentets och rådets direktiv 2010/63/EU av den 22 september 
2010 om skydd av djur som används för vetenskapliga ändamål (EUT 
L 276, 20.10.2010, s. 33).
 ▼M5 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 837
 
B.55  HERSHBERGERS BIOASSAY PÅ RÅTTA: ETT KORTTIDS ­
SCREENINGTEST FÖR (ANTI)ANDROGENA EGENSKAPER  
INLEDNING 
1. Denna testmetod motsvarar OECD:s testriktlinje (TG) 441 (2009). OECD 
inledde en högprioriterad verksamhet under 1998 för att se över befintliga riktlinjer och ta fram nya riktlinjer för screening och testning av potentiellt hormonstörande ämnen (se hänvisning 1). En del av verksamheten var att ta 
fram en riktlinje för Hershbergers bioassay på råtta. Efter att ha i flera 
decennier ha använts av läkemedelsindustrin, standardiserades detta test först av en officiell expertkommitté 1962 som ett screeningverktyg för androgena kemikalier (se hänvisning 2). Under 2001–2007 har Hershbergers 
bioassay på råtta genomgått ett omfattande valideringsprogram med fram ­
tagningen av ett bakgrundsgranskningsdokument (se hänvisning 23), sam ­
manställningen av ett detaljerat metoddokument (se hänvisning 3), utveck ­
lingen av en dissektionsvägledning (se hänvisning 21) och genomförandet 
av omfattande studier inom och mellan laboratorier för att visa tillförlitlig ­
heten och reproducerbarheten hos bioassayen. Dessa valideringsstudier har genomförts med en potent referensandrogen (testosteronpropionat [TP]), två 
potenta syntetiska androgener (trenbolonacetat och metyltestosteron), ett 
potent antiandrogent läkemedel (flutamid), en potent hämmare av syntesen (finasterid) hos det naturliga androgenet (dihydrotestosteron-DHT), flera svagt antiandrogena bekämpningsmedel (linuron, vinklozolin, procymidon, 
p,p'-DDE), en potent 5 α reduktashämmare (finasterid) och två kända nega ­
tiva kemikalier (dinitrofenol och nonylfenol) (se hänvisning 4, 5, 6, 7, 8). Denna testmetod är resultatet av lång historisk erfarenhet av bioassayen och de erfarenheter som vunnits under valideringstestprogrammet, samt de re ­
sultat som erhållits därifrån. 
2. Hershbergers bioassay är ett  in vivo -korttidsscreeningtest som använder till ­
hörande vävnader från hanliga könsorgan. Testet har sitt ursprung på 1930- talet och ändrades på 1940-talet till att omfatta androgenmottagliga muskler i hanliga könsorgan (se hänvisning 2, 9–15). På 1960-talet utvärderades 
över 700 möjliga androgener med hjälp av en standardiserad version av 
protokollet (se hänvisning 2, 14) och användningen av testet för både androgener och antiandrogener ansågs vara en standardmetod på 1960-talet 
(se hänvisning 2, 15). Den nuvarande bioassayen bygger på förändringar i 
vikten för fem androgenberoende vävnader hos den kastratperipubertala hanråttan. Den utvärderar förmågan hos en kemikalie att framkalla bio ­
logiska aktiviteter som är förenliga med androgena agonister, antagonister 
eller 5α-reduktashämmare. De fem androgenberoende målvävnaderna som 
ingår i denna testmetod är den ventrala prostatan (VP), sädesblåsor (SV) (plus vätskor och koagulerande körtlar), levator ani-bulbocavernosusmuskler (LABC), pariga Cowpers körtlar (COW) och ollonet (GP). Hos den kast ­
ratperipubertala hanråttan svarar dessa fem vävnader på androgener med en 
ökning i absolut vikt. När dessa samma vävnader stimuleras för att öka i vikt genom administrering av en potent referensandrogen svarar dessa fem vävnader på antiandrogener med en minskning av absolut vikt. Den primära 
modellen för Hershbergers bioassay har varit den kirurgiskt kastrerade pe ­
ripubertala hanen, som validerades i fas 1, 2 och 3 i Hershbergers valideringsprogram. 
3. Hershbergers bioassay fungerar som ett mekanistiskt  in vivo -screeningtest 
för androgena agonister, androgenantagonister och 5a-reduktashämmare och 
dess tillämpning bör ses mot bakgrund av ”OECD:s konceptuella ram för 
testning och bedömning av endokrinstörande kemikalier” (tillägg 2). I denna
 ▼M5 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 838
 
konceptuella ram ingår den uterotrofa bioassayen i nivå 3 som ett  in vivo - 
test som ger data om en enda endokrin mekanism, dvs. östrogenicitet. Den 
är avsedd att ingå i en serie  in vitro - och  in vivo -tester för att identifiera 
kemikalier med potential att interagera med det endokrina systemet, vilket slutligen leder till faro- och riskbedömningar av människors hälsa eller 
miljön. 
4. På grund av djurskyddsaspekter vad gäller kastrering undersöktes om den 
intakta (okastrerade) stimulerade avvanda hanen kunde vara en alternativ 
modell för Hershbergers bioassay för att undvika kastreringssteget. Test ­
metoden med stimulerade avvanda hanar validerades (se hänvisning 24), men i valideringsstudierna verkade inte denna version av Hershbergers bio ­
assay konsekvent kunna upptäcka effekter på androgenberoende organvikter 
från svaga antiandrogener vid de testade doserna. Därför har versionen med avvanda hanar inte inkluderats i den här testmetoden. Eftersom dess an ­
vändning inte bara ger djurskyddsfördelar utan också kan ge information 
om andra verkningssätt finns den dock beskriven i OECD:s vägledning 115 
(se hänvisning 25).
 
INLEDANDE ÖVERVÄGANDEN OCH BEGRÄNSNINGAR 
5. Androgena agonister och antagonister fungerar som ligander för androgen ­
receptorn och kan aktivera eller hämma respektive gentranskription som styrs av receptorn. Dessutom kan vissa kemikalier inhibera omvandlingen 
av testosteron till den mer potenta naturliga androgenen dihydrotestosteron i 
vissa androgena målvävnader (5a-reduktashämmare). Sådana kemikalier har potentialen att leda till negativa hälsorisker, inklusive reproduktions- och utvecklingseffekter. Därför finns regleringsbehovet av att snabbt bedöma 
och utvärdera en kemikalie som en möjlig androgen agonist eller antagonist, 
eller 5a-reduktashämmare. Även om den är informativ så är affiniteten hos en ligand för en androgen receptor mätt genom receptorbindning eller tran ­
skriptionsaktivering av reportergener  in vitro  inte den enda faktorn för 
möjlig fara. Andra avgörande faktorer inkluderar metabolisk aktivering 
och avaktivering vid införandet i kroppen, kemisk distribution till målväv ­
nader samt eliminering ur kroppen. Detta leder till behovet att screena den möjliga aktiviteten hos kemikalien  in vivo  under relevanta förhållanden och 
exponeringar.  In vivo -utvärdering är mindre kritisk om kemikaliens egen ­
skaper vad gäller absorption, distribution, metabolism och eliminering (Ad ­
me) är kända. Androgenberoende vävnader svarar med en snabb och kraftig tillväxt vid stimulering med androgener, framför allt i kastratperipubertala 
hanråttor. Gnagare, framför allt råtta, är också vanliga i toxicitetsstudier för 
riskbedömning. Därför är den version av testet som använder den kastrerade peripubertala råttan och de fem målvävnaderna i detta test lämplig för  in 
vivo-screening av androgena agonister och antagonister samt 5a-reduktas ­
hämmare. 
6. Denna testmetod baseras på de protokoll som användes i OECD:s valide ­
ringsstudie vilken har visat sig vara tillförlitlig och repeterbar i studier inom 
och mellan laboratorier (se hänvisning 4, 5, 6, 7, 8). Både androgen- och antiandrogenförfaranden presenteras i denna testmetod. 
7. Även om det fanns en viss variation i den dos TP som användes för att 
upptäcka antiandrogener i OECD:s valideringsprogram för Hershbergers bioassay i olika laboratorier (0,2 jämfört med 0,4 mg/kg/d, subkutan injek ­
tion) fanns det liten skillnad mellan dessa två protokollvariationer i för ­
mågan att detektera svag eller stark antiandrogen aktivitet. Det är emellertid klart att dosen av TP inte bör vara alltför hög för att blockera effekterna av svaga androgenreceptor (AR)-antagonister eller så låg att de androgena väv ­
naderna visar liten tillväxtrespons även utan antiandrogen 
samadministration.
 ▼M5 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 839
 
8. Tillväxtresponsen för de individuella androgenberoende vävnaderna är inte 
helt och hållet av androgent ursprung, dvs. andra kemikalier än androgena 
agonister kan förändra vikten hos vissa vävnader. Dock bestyrker tillväx ­
tresponsen för flera vävnader samtidigt en mer androgenspecifik mekanism. Exempelvis kan höga doser av potenta östrogener öka sädesblåsornas vikt, 
dock reagerar de andra androgenberoende vävnaderna i testet inte på ett 
liknande sätt. Antiandrogena kemikalier kan antingen fungera som andro ­
genreceptorantagonister eller som 5a-reduktashämmare. 5a-reduktashäm ­
mare har en varierbar effekt, eftersom omvandlingen till mer potent dihyd ­
rotestosteron varierar beroende på vävnad. Antiandrogener som hämmar 5 α- 
reduktas, såsom finasterid, har mer uttalade effekter i den ventrala prostatan än i övriga vävnader jämfört med en potent AR-antagonist, såsom flutamid. Denna skillnad i vävnadsrespons kan användas för att skilja mellan 
AR-medierade och 5 α-reduktasmedierade verkningsmekanismer. Dessutom 
är androgenreceptorn evolutionärt besläktad med den hos andra steroidhor ­
moner, och vissa andra hormoner, när de ges i höga suprafysiologiska doseringsnivåer, kan binda och motverka de tillväxtfrämjande effekterna 
av TP (se hänvisning 13). Vidare är det också troligt att ökad steroidmeta ­
bolism och en åtföljande sänkning av serumtestosteron kan minska andro ­
genberoende vävnadstillväxt. Därför bör varje positivt resultat i Hershber ­
gers bioassay normalt utvärderas med hjälp av en sammanvägd bedömning, 
inklusive  in vitro -tester, såsom AR- och östrogenreceptor (ER)-bindnings ­
tester och motsvarande transkriptionsaktiveringstester, eller från andra  in 
vivo-tester som undersöker liknande androgena målvävnader, såsom puber ­
tal hane-test, 15-dagarstest av vuxen intakt hane, eller 28-dagars- eller 90- 
dagarsstudie med upprepad dosering. 
9. Erfarenheten visar att xenobiotiska androgener är mer ovanliga än xeno ­
biotiska antiandrogener. Förhoppningen är att Hershbergers bioassay kan 
användas oftare för screeningen av antiandrogener. Förfarandet att testa för androgener kan ändå rekommenderas för steroida eller steroidliknande 
kemikalier, eller kemikalier för vilka en indikation på eventuella androgena 
effekter härrör från metoder som ingår i nivå 1 eller 2 i den konceptuella ramen (tillägg 2). På samma sätt kan negativa effekter i samband med (anti- )androgena profiler observeras i nivå 5-tester, vilket leder till behovet att 
bedöma om en kemikalie styrs av en endokrin verkningsmekanism. 
10. Alla djurbaserade förfaranden bör uppfylla lokala normer för djurvård. De 
beskrivningar av vård och behandling som anges nedan är minimala pre ­
standakrav som kommer att ersättas av lokala föreskrifter som t.ex. Euro ­
paparlamentets och rådets direktiv 2010/63/EU av den 22 september 2010 om skydd av djur som används för vetenskapliga ändamål (se hänvisning 
26). Ytterligare vägledning om human behandling av djur finns i OECD (se 
hänvisning 17). 
11. Som i alla bioassayer som använder sig av försöksdjur, bör noggranna 
överväganden göras om nödvändigheten av att genomföra denna studie. I princip kan det finnas två skäl till ett sådant beslut: 
— Hög exponeringspotential (nivå 1 i den konceptuella ramen) eller indi ­
kationer på (anti-)androgenicitet i  in vitro -tester (nivå 2) som stöder 
undersökningar huruvida sådana effekter kan uppstå  in vivo.  
— Effekter som överensstämmer med (anti-)androgenicitet på nivå 4 eller 5 
i in vivo-test  för undersökningar av särskilda verkningsmekanismer, t.ex. 
för att avgöra om effekterna berodde på en (anti-)androgen mekanism.
 ▼M5 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 840
 
12. Definitioner som används i denna testmetod finns i tillägg 1.  
PRINCIP FÖR TESTMETODEN 
13. Hershbergers bioassay uppnår sin känslighet genom att använda hanar med 
minimal endogen androgenproduktion. Detta uppnås genom användning av kastrerade hanar som ges tillräcklig tid efter kastreringen för att låta mål ­
vävnaderna gå i regress till en minimal och jämn utgångsvikt. Vid screen ­
ingen av potentiell androgen aktivitet, när det finns låga endogena nivåer av 
cirkulerande androgener och hypotalamus-hypofys-gonad-axeln inte kan återges för att kompensera via återkopplingsmekanismer, så maximeras väv ­
nadernas respons och vävnadernas utgångsviktsvariationer minimeras. Vid 
screening av potentiell antiandrogen aktivitet kan en mer enhetlig vävnads ­
viktökning uppnås när vävnaderna stimuleras av en referensandrogen. Som en följd kräver Hershbergers bioassay endast 6 djur per dosgrupp, medan andra tester med intakta pubertala eller vuxna hanar föreslår att man an ­
vänder15 hanar per dosgrupp. 
14. Kastrering av peripubertala hanråttor bör ske på lämpligt sätt med godkända 
bedövningsmedel och aseptisk teknik. Smärtstillande medel bör administre ­
ras de närmaste dagarna efter operationen för att eliminera postoperativa 
obehag. Kastrering förbättrar testets precision när det gäller att upptäcka svaga androgener och antiandrogener, genom att eliminera kompensatoriska endokrina återkopplingsmekanismer som finns hos intakta djur som kan 
dämpa effekterna av administrerade androgener och antiandrogener, och 
genom att eliminera de stora variationerna i serumtestosteronnivåer mellan individer. Följaktligen minskar kastreringen antalet djur som krävs för att screena för dessa endokrina aktiviteter. 
15. Vid screening för potentiell androgen aktivitet, administreras testkemikalien 
dagligen genom oral sondmatning eller subkutan injektion under en period av tio dagar i följd. Testkemikalier administreras till minst två behandlings ­
grupper av försöksdjur med en dosnivå per grupp. Djuren obduceras cirka 
24 timmar efter sista dosen. En statistiskt signifikant ökning av vikter för 
två eller flera målorgan i testkemikaliegrupperna jämfört med vehikelkon ­
trollgruppen, tyder på att testkemikalien är positiv för potentiell androgen aktivitet (se punkt 60). Androgener som trenbolon, som inte kan 5 α-redu­
ceras har mer uttalade effekter på LABC och GP kontra TP, men alla 
vävnader bör visa ökad tillväxt. 
16. Vid screening av potentiell antiandrogen aktivitet, administreras testkemi ­
kalien dagligen via oral sondmatning eller subkutan injektion under en 
period av tio dagar i följd tillsammans med dagliga TP-doser (0,2 eller 
0,4 mg/kg/d) genom subkutan injektion. Det fastställdes i valideringspro ­
grammet att endera 0,2 eller 0,4 mg/kg/d av TP kan användas eftersom båda är effektiva vid upptäckt av antiandrogener och därför bör man endast 
använda en dos i testet. Graderade testkemikaliedoser administreras till 
minst tre behandlingsgrupper av försöksdjur, med en dosnivå per grupp. Djuren obduceras cirka 24 timmar efter sista dosen. En statistiskt signifikant minskning av vikterna hos två eller flera målorgan i testkemikalie- plus 
TP-grupperna jämfört med endast TP-kontrollgruppen, tyder på att testkemi ­
kalien är positiv för potentiell antiandrogen aktivitet (se punkt 61).
 ▼M5 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 841
 
BESKRIVNING AV METODEN  
Val av art och stam  
17. Råttan har rutinmässigt använts i Hershbergers bioassay sedan 1930-talet. 
Det är biologiskt sannolikt att både råtta och mus visar liknande responser, 
men baserat på 70 års erfarenhet av råttmodellen är råttan den art som väljs för Hershbergers bioassay. Dessutom, eftersom data från Hershbergers bio ­
assay kan användas som förberedelse för en långtids flergenerationsstudie, 
möjliggör detta att djur från samma art, stam och ursprung används för båda 
studierna. 
18. Detta protokoll möjliggör för laboratorier att välja den stam av råtta som 
ska användas i testet, vilket i regel bör vara den som historiskt sett använts 
av det deltagande laboratoriet. Vanligen använda laboratorieråttstammar kan 
användas, men stammar som mognar betydligt senare än 42 dagar bör inte användas, eftersom kastrering av dessa hanar vid 42 dagars ålder kan hindra mätningar av ollonvikter, vilket endast kan göras efter det att förhuden 
separerats från penisskaftet. Därför bör stammar som härrör från Fisher 
344-råttan inte användas, utom i sällsynta fall. Fisher 344-råttan utvecklas sexuellt vid en annan tidpunkt jämfört med andra oftare använda stammar såsom Sprague Dawley- eller Wistar-stammar (se hänvisning 16). Om en 
sådan stam ska användas bör laboratoriet kastrera dem vid en något högre 
ålder och kunna påvisa känsligheten hos den stam som används. Laborato ­
riet bör tydligt ange motiveringen för valet av råttstam. När screeningtestet är inledningen till en upprepad oralstudie, en reproduktions- och utveck ­
lingsstudie eller en långtidsstudie ska helst djur från samma stam och ur ­
sprung användas till alla studierna.
 
Inhysnings- och utfodringsförhållanden  
19. Alla förfaranden bör överensstämma med samtliga lokala normer för labo ­
ratoriedjurvård. Dessa beskrivningar av vård och behandling är minimikrav 
och kommer att ersättas av mer stringenta lokala föreskrifter som t.ex. Europaparlamentets och rådets direktiv 2010/63/EU av den 22 september 2010 om skydd av djur som används för vetenskapliga ändamål (se hänvis ­
ning 26). Temperaturen i djurutrymmet bör vara 22 °C (med ett ungefärligt 
intervall på ± 3 °C). Den relativa fuktigheten bör vara minst 30 % och bör helst inte överstiga 70 %, utom när rummet rengörs. Målet bör vara relativ luftfuktighet på 50–60 %. Artificiell belysning bör användas. Den dagliga 
belysningssekvensen bör vara 12 timmar ljus, 12 timmar mörker. 
20. Gruppinhysning är att föredra framför isolering, på grund av djurens låga 
ålder och det faktum att råttor är sociala djur. Genom inhysning av två eller tre djur per bur undviks trängsel och åtföljande stress som kan störa den 
hormonella kontrollen av utvecklingen av de tillhörande könsvävnaderna. 
Burarna bör rengöras noggrant för att avlägsna eventuella föroreningar, och placeras på ett sådant sätt att eventuell påverkan på grund av placeringen minimeras. Burar av lämplig storlek (~ 2 000 kvadratcentimeter) förhindrar 
överbeläggning. 
21. Varje djur ska identifieras individuellt (t.ex. öronmärkning eller etikett) med 
en human metod. Identifieringsmetoden bör registreras.
 ▼M5 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 842
 
22. Djuren ska ha fri tillgång till laboratoriefoder och dricksvatten. Laboratorier 
som utför Hershbergers bioassay bör använda det laboratoriefoder som 
normalt används i deras kemikalietestningsarbete. I valideringsstudierna för bioassayen observerades inga effekter eller variationer som kan hänföras till fodret. Det foder som används registreras, och ett prov av laboratorie ­
fodret bör behållas för framtida analys.
 
Prestandakriterier för androgenberoende organvikter  
23. Under valideringsstudien fanns inga bevis för att en minskning av kropps ­
vikten påverkade ökningar eller minskningar av tillväxten av vävnadsvikter hos målvävnaderna (dvs. detta bör vägas in i denna studie). 
24. Bland de olika råttstammar som framgångsrikt använts i valideringspro ­
grammet, är de androgenberoende organvikterna större hos de tyngre rått ­
stammarna än hos de lättare stammarna. Därför inkluderar inte prestandak ­
riterierna för Hershbergers bioassay absoluta förväntade organvikter för 
positiva och negativa kontroller. 
25. Eftersom variationskoefficienten för en vävnad har ett omvänt förhållande 
till statistisk styrka, är prestationskriterierna för Hershbergers bioassay ba ­
serat på maximala CV-värden för varje vävnad (tabell 1). Variationskoeffi ­
cienterna härrör från OECD:s valideringsstudier. Vid negativa resultat bör laboratorierna granska variationskoefficienterna från kontrollgruppen och 
högdosbehandlingsgruppen för att avgöra om de maximala prestandakrite ­
rierna för variationskoefficienten har överskridits. 
26. Studien bör upprepas om 1) tre eller fler av tio möjliga individuella varia ­
tionskoefficienter i kontroll- och högdosbehandlingsgrupperna överstiger det 
maximum som utsetts för agonist- och antagoniststudier i tabell 1 och 2) 
minst två målvävnader var marginellt obetydliga, dvs. r-värden mellan 0,05 och 0,10.
 
Tabell 1  
Högsta tillåtna variationskoefficienter som fastställts för målkönets 
tillhörande vävnader i kastratmodellen i OECD:s valideringsstudier  ( 1 ). 
Vävnad Antiandrogena effekter Androgena effekter  
Sädesblåsor 40 % 40 % 
Ventral prostata 40 % 45 % 
LABC 20 % 30 % 
Cowpers körtlar 35 % 55 % 
Ollon 17 % 22 %  ▼M5 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 843  
( 1 ) Variationskoefficientens tröskelvärde för en given vävnad identifierades från en kurva 
över variationskoefficientvärden – ordnade från minsta sekventiella till största – för alla 
medelvärden från alla experiment under valideringsperioden med användning av en 
specifik modell (agonist eller antagonist). Variationskoefficientens tröskelvärde avlästes 
från den punkt vid vilken stegen mellan de näst högsta variationskoefficienterna i serien 
är dramatiskt större än de få föregående variationskoefficienterna – ”brytpunkten”. Det 
bör noteras att även om denna analys identifierade relativt pålitliga ”brytpunkter” för 
antagonistmodellen av testet, visade variationskoefficientkurvorna i agonisttestet en mer 
likformig ökning vilket gör identifieringen av ett tröskelvärde för variationskoefficienten 
med denna metod något godtycklig.
 FÖRFARANDE  
Regelefterlevnad och laboratoriekontroll  
27. Till skillnad från den uterotrofa assayen (kapitel B.54 i denna bilaga) är en 
demonstration av laboratoriets kompetens innan studien påbörjas inte nöd ­
vändig för Hershbergers bioassay eftersom jämsides behandlade positiva (testosteronpropionat och flutamid) och negativa kontroller körs som en integrerad del av testet.
 
Djurens antal och tillstånd  
28. Varje behandlad grupp och kontrollgrupp bör bestå av minst 6 djur. Detta 
gäller både det androgena och det antiandrogena protokollet.  
Kastrering  
29. Efter mottagandet av djuren bör de få en inledande acklimatiseringsperiod 
på flera dagar så att man ser att de är friska och trivs. Eftersom djur som kastreras före 42 dagars ålder eller postnatal dag (PND) 42 kanske inte uppvisar preputial separation, så bör djuren kastreras på PND 42 eller 
senare, inte tidigare. Djuren kastreras under bedövning genom att ett snitt 
görs i pungen, och både testiklarna och bitestiklarna avlägsnas med under ­
bindning av blodkärl och sädesledare. Efter att det bekräftats att ingen blödning uppstått bör pungen tillslutas med sutur eller autoclips. Djuren 
bör behandlas med smärtstillande medel under de närmaste dagarna efter 
operationen för att lindra eventuella postoperativa obehag. Om kastrerade djur köps från en djurleverantör så bör djurens ålder och könsmognad garanteras av leverantören.
 
Acklimatisering efter kastreringen  
30. Djuren bör fortsätta sin acklimatisering till laboratoriemiljön för att låta 
målvävnadsvikterna gå i regress under minst sju dagar efter kastreringen. 
Djuren bör observeras dagligen, och alla djur som visar tecken på sjukdom eller fysiska avvikelser bör tas bort. Således kan behandling med dosering (studie) påbörjas så tidigt som PND 49, dock inte senare än PND 60. Ålder 
vid obduktionen bör inte vara högre än PND 70. Denna flexibilitet gör det 
möjligt för ett laboratorium att effektivt schemalägga det experimentella arbetet.
 
Kroppsvikt och grupprandomisering  
31. Skillnader i individuella kroppsvikter är en källa till variabilitet i vävnads ­
vikterna både inom och mellan grupper av djur. Ökande vävnadsviktsvaria ­
bilitet resulterar i en ökad variationskoefficient (CV) och minskar den sta ­
tistiska styrkan i testet (ibland kallad testkänslighet). Därför bör variationer i kroppsvikt kontrolleras både experimentellt och statistiskt. 
32. Experimentell kontroll innebär små variationer i kroppsvikt inom och mel ­
lan studiegrupperna. För det första bör ovanligt små eller stora djur undvi ­
kas och inte placeras ut i studiekohorten. Vid studieinledningen bör vikt ­
skillnaden mellan djuren som används inte överstiga ± 20 % av medelvikten 
(t.ex. 175 g ± 35 g för kastrerade peripubertala råttor). För det andra bör djuren anvisas till grupper (både kontroll- och behandlingsgrupper) genom slumpmässig viktfördelning, så att medelvärdet för kroppsvikten i varje 
grupp inte statistiskt skiljer sig från andra grupper. Det förfarande som 
används för blockrandomisering bör registreras.
 ▼M5 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 844
 
33. Eftersom toxicitet kan minska kroppsvikten hos de behandlade grupperna 
jämfört med kontrollgruppen kan kroppsvikten på den första dagen för 
testkemikalieadministration användas som den statistiska kovariaten, och inte kroppsvikten vid obduktion.
 
Dosering  
34. För att fastställa huruvida en testkemikalie kan ha androgen verkan  in vivo , 
räcker det oftast med två dosgrupper av testkemikalien plus positiv kontroll 
och vehikelkontroll (negativ) (se punkt 43). Denna utformning är därför att föredra av djurskyddsskäl. Om syftet är att antingen erhålla en dos-responskurva eller att extrapolera till lägre doser, behövs minst 3 dos ­
grupper. Om information utöver identifiering av androgen aktivitet (t.ex. en 
uppskattning av potens) krävs, bör ett annat doseringsschema övervägas. För att testa för antiandrogener ges testkemikalien tillsammans med en referensandrogenagonist. Minst 3 testgrupper bör användas med olika doser 
av testkemikalien, samt en positiv och en negativ kontroll (se punkt 44). 
Med undantag av behandlingen med testkemikalien bör djuren i kontroll ­
gruppen hanteras på exakt samma sätt som testgruppen. Om en vehikel används för att tillföra testkemikalien bör kontrollgruppen tillföras vehikeln 
i den största volym som används för testgruppen. 
35. Alla dosnivåer bör väljas med hänsyn till eventuella toxicitetsdata och (tox ­
iko-)kinetiska data som finns tillgängliga om testkemikalien eller närbesläk ­
tade ämnen. Den högsta dosnivån bör först ta hänsyn till LD
 50 och/eller 
information som akut giftighet för att undvika dödsfall, svår smärta och 
lidande hos djuren (se hänvisning 17, 18, 19, 20), och för det andra ta hänsyn till tillgänglig information om de doser som använts i subkroniska och kroniska studier. I allmänhet bör högsta den dosen inte orsaka en 
minskning av den slutliga kroppsvikten hos djuren som är större än 10 % 
av kontrollvikten. Den högsta dosen bör antingen vara 1) den högsta dos som garanterar djurens överlevnad utan signifikant toxicitet eller lidande för djuren efter tio dagar i följd med administrering upp till en maximal dos på 
1 000 mg/kg/dag (se punkt 36) eller 2) en dosinducerande (anti-)androgen 
effekt, beroende på vilken som är lägre. Vid en screening är stora mellan ­
rum, t.ex. en halv log-enhet (motsvarande en dosprogression av 3,2) eller 
till och med en log-enhet mellan doseringarna acceptabla. Om det inte finns 
några lämpliga data tillgängliga, kan en dosfinnande studie (se punkt 37) genomföras som hjälp för att bestämma vilka doser som ska användas.
 
Dosnivågräns  
36. Om ett test vid dosgränsen 1 000 mg/kg kroppsvikt/dag och en lägre dos, 
med hjälp av de förfaranden som beskrivs för denna studie, inte leder till en 
statistiskt signifikant förändring av reproduktionsorganens vikter, anses yt ­
terligare dosnivåer vara onödiga. Dosgränsen tillämpas utom när human exponering anger att en högre dosnivå ska användas.
 
Överväganden för dosfinnande studie  
37. Vid behov kan en preliminär dosfinnande studie genomföras med några få 
djur för val av lämpliga dosgrupper (med hjälp av metoder för testning av akut toxicitet [kapitel B.1a, B.1b i denna bilaga (se hänvisning 27), OECD TG 425 (se hänvisning 19)]). Målet för Hershbergers bioassay är att välja 
doser som garanterar djurens överlevnad och som inte innebär signifikant 
toxicitet eller lidande för djuren efter tio dagar i följd med administrering av
 ▼M5 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 845
 
kemikalien upp till en gränsdos på 1 000 mg/kg/dag som angetts i punk ­
terna 35 och 36. För detta ändamål kan man använda OECD:s vägledning 
(se hänvisning 17) som definierar kliniska tecken som tyder på toxicitet eller lidande för djuren. Om det är möjligt inom denna dosfinnande studie kan, efter tio dagars tillförsel, målorganen skäras ut och vägas ca 24 timmar 
efter att sista dosen getts. Dessa data kan sedan användas som hjälp vid 
valet av doser i huvudstudien.
 
Referenskemikalier och vehikel  
38. Referensandrogenagonist bör vara testosteronpropionat (TP), CAS-nr 57-82- 
5. TP-referensdosen kan antingen vara 0,2 mg/kg kroppsvikt/d eller 0,4 
mg/kg kroppsvikt/d. Referensandrogenantagonist bör vara flutamid (FT), 
CAS-nr 1311-84-7. FT-referensdosen bör vara 3 mg/kg kroppsvikt/d och bör ges tillsammans med TP-referensdosen. 
39. Det rekommenderas att i första hand överväga att använda en vattenbaserad 
lösning/suspension, om det är möjligt. Men eftersom många androgenligan ­
der eller deras metaboliska prekursorer tenderar att vara hydrofoba, är den vanligaste metoden att använda en lösning/suspension i olja (t.ex. majs-, jordnöts-, sesam- eller olivolja). Testkemikalier kan lösas upp i en minimal 
mängd av 95 % etanol eller annat lämpligt lösningsmedel och spädas ut till 
slutliga koncentrationer i testvehikeln. De toxiska egenskaperna hos lös ­
ningsmedlet bör vara kända, och bör testas med endast lösningsmedel i en separat kontrollgrupp. Om testkemikalien bedöms vara stabil, kan för ­
siktig uppvärmning och kraftig mekanisk påverkan användas för att hjälpa 
till att lösa upp testkemikalien. Testkemikaliens stabilitet i vehikeln bör bestämmas. Om testkemikalien är stabil under hela studien, så kan en startalikvot av testkemikalien beredas, och de angivna doseringsutspädning ­
arna noggrant beredas dagligen för att undvika kontaminering och nedbryt ­
ning av proverna.
 
Tillförsel av doser  
40. TP ska tillföras genom subkutan injektion och FT genom oral sondmatning. 
41. Testkemikalien tillförs via sondmatning eller subkutan injektion. Djur ­
skyddsaspekter och testkemikalien fysikalisk-kemiska egenskaper måste be ­
aktas vid val av administreringsväg. Dessutom måste toxikologiska aspek ­
ter, som relevans till mänsklig exponeringsväg av kemikalien (t.ex. oral 
sondmatning till modellförtäring, subkutan injektion till inandningsmodell 
eller dermal adsorption) och befintlig toxikologisk information och data om metabolism och kinetik (t.ex. behovet av att undvika första passage-metabolism, bättre effektivitet via en bestämd väg) beaktas innan 
omfattande, långvariga tester påbörjas om positiva resultat erhålls genom 
injektion. 
42. Djuren bör doseras på samma sätt och tidssekvens under tio dagar i följd 
med ca 24 timmars mellanrum. Doseringsnivån bör justeras dagligen på 
basis av samtidiga dagliga mätningar av kroppsvikt. Dosvolymen och tid ­
punkten då den tillförs bör registreras varje exponeringsdag. Försiktighet bör iakttas så att inte den maximala dosen överskrids såsom beskrivs i punkt 35 för att möjliggöra en meningsfull tolkning av data. Minskning 
av kroppsvikt, kliniska tecken och andra fynd bör noggrant utvärderas i 
detta avseende. Vid oral sondmatning bör en magsond eller en lämplig
 ▼M5 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 846
 
intubationskanyl användas. Den största mängd vätska som kan administreras 
vid ett tillfälle beror på försöksdjurets storlek. Lokala djurvårdsriktlinjer bör 
följas, men volymen bör inte överstiga 5 ml/kg kroppsvikt, utom i fråga om vattenlösningar där 10 ml/kg kroppsvikt får användas. Vid subkutana injek ­
tioner bör doserna administreras till dorsoscapular- och/eller lumbarregionen 
via steril nål (t.ex. med grovleken 23 eller 25) och en tuberkulinspruta. 
Rakning av injektionsstället är valfritt. Eventuella förluster, läckage vid injektionsstället eller ofullständig dosering ska registreras. Den totala voly ­
men injicerad per råtta per dag bör inte överstiga 0,5 ml/kg kroppsvikt.
 
Särskilda förfaranden för androgena agonister  
43. För testet för androgena agonister är vehikeln den negativa kontrollen och 
den TP-behandlade gruppen den positiva kontrollen. Biologisk aktivitet i överensstämmelse med androgena agonister testas genom administration av en testkemikalie till behandlingsgrupper vid de valda doserna under 10 
dagar i följd. Vikterna för de fem tillhörande könsvävnaderna från testkemi ­
kaliegrupperna jämförs med vehikelgruppen för statistiskt signifikanta ök ­
ningar av vikterna.
 
Särskilda förfaranden för androgena antagonister och 5 α-reduktashäm ­
mare  
44. Vid testet för androgena antagonister och 5 α-reduktashämmare, är den 
TP-behandlade gruppen den negativa kontrollen, och gruppen som samtidigt tillförs TP- och FT-referensdoser den positiva kontrollen. Biologisk aktivitet 
i överensstämmelse med androgena antagonister och 5 α-reduktashämmare 
testas genom tillförsel av en TP-referensdos samt tillförsel av testkemikalien under tio dagar i följd. Vikterna hos de fem tillhörande könsvävnaderna från TP samt testkemikaliegrupperna jämförs med TP-referensgruppen (endast 
TP) avseende statistiskt signifikanta minskningar av vikterna.
 
OBSERVATIONER  
Kliniska observationer  
45. Allmänna kliniska observationer bör göras minst en gång per dag och oftare 
när tecken på toxicitet observeras. Observationerna bör företrädesvis utföras vid samma tidpunkt varje dag och med hänsyn till förväntade toppeffekter 
efter doseringen. Alla djur bör observeras avseende dödlighet, sjuklighet 
och allmänna kliniska tecken såsom förändringar i beteende, hud, päls, ögon, slemhinnor, förekomst av sekret och utsöndringar samt autonom ak ­
tivitet (t.ex. tårflöde, piloerektion, pupillstorlek, ovanligt andningsmönster). 
46. Alla djur som hittas döda ska avlägsnas och bortskaffas utan ytterligare 
dataanalys. All dödlighet hos djuren före obduktionen bör ingå i studiere ­
sultatet tillsammans med eventuella orsaker till dödligheten. Eventuella dö ­
ende djur bör avlivas på ett humant sätt. Eventuella döende och sedan 
avlivade djur bör ingå i studieresultatet med uppenbara orsaker till 
sjukligheten.
 ▼M5 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 847
 
Kroppsvikt och foderkonsumtion  
47. Alla djur bör vägas dagligen med en noggrannhet på 0,1 g, med början 
strax före starten av behandlingen, dvs. när djuren fördelas i grupper. Som 
en valfri mätning, kan mängden foder som konsumeras under behandlings ­
perioden mätas per bur genom vägning av fodertrågen. Foderkonsumtions ­
resultaten bör uttryckas i gram per råtta per dag.  
Dissekering och mätning av vävnads- och organvikter  
48. Cirka 24 timmar efter den sista administreringen av testkemikalien bör 
råttorna avlivas och tömmas på blod enligt de normala förfarandena på laboratoriet och obduktion utföras. Metoden för human avlivning bör regi ­
streras i laboratorierapporten. 
49. Helst ska obduktionsordningen randomiseras mellan grupperna för att und ­
vika progression direkt upp eller ner i dosgrupperna vilket kan påverka data. 
Alla fynd vid obduktionen, dvs. patologiska förändringar/synliga skador, bör noteras och rapporteras. 
50. De fem androgenberoende vävnaderna (VP, SV, LABC, COW, GP) ska 
vägas. Dessa vävnader bör skäras ut, noggrant putsas från överflödig an ­
gränsande vävnad och fett, och deras färska (ofixerade) vikter bestämmas. Varje vävnad bör hanteras med särskild omsorg för att undvika förlust av vätska och undvika uttorkning, vilket kan medföra väsentliga fel och varia ­
bilitet genom att minska de registrerade vikterna. Flera av vävnaderna kan 
vara mycket små eller svåra att dissekera, och detta kommer att medföra variabilitet. Därför är det viktigt att personer som utför dissektion av till ­
hörande könsvävnader är bekanta med standarddissektionsförfaranden för 
dessa vävnader. En handbok med standardförfaranden för genomförande 
(standard operation procedure , SOP) av dissektion finns tillgänglig från 
OECD (se hänvisning 21). Noggrann utbildning enligt SOP-vägledningen minimerar en potentiell källa till variation i studien. Helst bör samma person 
ansvara för dissektion av en given vävnad för att eliminera skillnader i 
vävnadsbehandling mellan olika personer. Om detta inte är möjligt bör obduktionen utformas så att varje person dissekerar en viss vävnad från alla behandlingsgrupper, i stället för att en person dissekerar alla vävnader 
från en kontrollgrupp medan någon annan är ansvarig för de behandlade 
grupperna. Varje tillhörande könsvävnad bör vägas utan torkning med en noggrannhet på 0,1 mg, och vikten registreras för varje djur. 
51. Flera av vävnaderna kan vara mycket små eller svåra att dissekera, och 
detta kommer att medföra variabilitet. Tidigare arbete har indikerat ett in ­
tervall för variationskoefficienter som förefaller skilja sig beroende på la ­
boratoriets skicklighet. I några få fall har stora skillnader i de absoluta vikterna av vävnader såsom VP och COW observerats inom ett visst 
laboratorium. 
52. Lever-, parvisa njur- och parvisa adrenalvikter är valfria mått. Återigen bör 
vävnaderna putsas från tillhörande bindvävshinnor och fett. Levern bör vägas och registreras med en noggrannhet på 0,1 g och de pariga njurarna och pariga binjurarna ska vägas och registreras med en noggrannhet på 0,1 
mg. Levern, njurarna och binjurarna påverkas inte bara av androgener, utan 
är också användbara mätare på systemisk toxicitet.
 ▼M5 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 848
 
53. Mätning av serumluteiniserande hormon (LH), follikelstimulerande 
hormon (FSH) och testosteron (T) är valfritt. T-serumnivåerna är använd ­
bara för att avgöra om testkemikalien orsakar levermetabolism av testoste ­
ron och sänker serumnivåerna. Utan T-data kan en sådan effekt verka vara en antiandrogen mekanism. LH-nivåer ger information om förmågan hos en 
antiandrogen att inte bara minska organvikterna, utan också påverka 
hypotalamus-hypofys-funktionen, vilket i långtidsstudier kan orsaka testikel ­
tumörer. FSH är ett viktigt hormon för spermatogenes. Serum T4 och T3 är också valfria mått som kan ge användbar kompletterande information om 
förmågan att störa sköldkörtelhormonbalansen. Om hormonmätningar ska 
göras bör råttorna bedövas före obduktionen och blod tas från hjärtat, och narkosmetoden väljas med omsorg så att den inte påverkar hormonmätning ­
en. Framställningsmetoden för serumet, källan till radioimmunanalys eller 
andra mätningsutrustningar, analysmetoder och resultat bör registreras. 
LH-nivåer ska rapporteras som ng per ml serum, och T bör också redovisas som ng per ml serum. 
54. Dissektionen av vävnaderna beskrivs enligt följande med en utförlig dis ­
sektionsvägledning med bilder som publiceras som kompletterande material 
som en del av valideringsprogrammet (se hänvisning 21). En dissektions ­
video finns också tillgänglig från webbsidan för  Korea Food and Drug 
Administration  (se hänvisning 22). 
— Med den ventrala ytan på djuret uppåt, fastställ om förhuden på penis 
har separerats från ollonet. Om så är fallet, dra tillbaka förhuden och avlägsna ollonet, väg (med en noggrannhet på 0,1 mg) och notera 
vikten. 
— Öppna bukens hud och vägg så att de inre organen exponeras. Om de 
valfria organen vägs, ta bort och väg levern med en noggrannhet på 0,1 
g, ta bort mage och tarmar, ta bort och väg de pariga njurarna och 
pariga binjurarna med en noggrannhet på 0,1 mg. Denna dissektion exponerar blåsan och påbörjar dissektionen av de hanliga tillhörande målvävnaderna. 
— För att dissekera VP, separera blåsan från det ventrala muskellagret 
genom att skära bindvävnaden längs mittlinjen. Förskjut blåsan anteriort mot sädesblåsorna (SV), så att vänster och höger lob på den ventrala 
prostatan visas (täckt med ett lager av fett). Ta försiktigt bort fettet från 
höger och vänster lob på den ventrala prostatan. Förskjut försiktigt den ventrala prostatans högra lob från urinröret och dissekera loben från urinröret. Fortsätt hålla den ventrala prostatans högra lob, förskjut för ­
siktigt den ventrala prostatans vänstra lob från urinröret och dissekera 
sedan, väg med en noggrannhet på 0,1 mg och notera vikten. 
— För att dissekera SVCG, förskjut blåsan kaudalt, exponera sädesledaren 
och sädesblåsornas högra och vänstra lob samt koagulerande 
körtlar (SVCG). Förhindra läckage av vätska genom att spänna fast 
en hemostat vid basen av SVCG där sädesledaren ansluter sig till urin ­
röret. Dissekera försiktigt SVCG, och med hemostaten på plats putsa bort fett och närliggande organ, placera i ett tarerat vikttråg, ta bort 
hemostaten och väg med en noggrannhet på 0,1 mg och registrera 
vikten.
 ▼M5 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 849
 
— För att dissekera levator ani samt bulbocavernosusmuskler (LABC), 
exponeras musklerna och penisbasen. LA-musklerna är lindade runt 
tjocktarmen, medan de främre LA- och BC-musklerna är fästade vid penislökarna. Huden och närliggande organ från den perianala regionen som sträcker sig från basen på penis till främre delen av anus tas bort. 
BC-musklerna dissekeras gradvis från penisbulberna och -vävnaderna. 
Grovtarmen skärs i två delar och hela LABC kan dissekeras och tas bort. LABC bör putsas från fett och närliggande organ, vägas med en noggrannhet på 0,1 mg, och vikten ska registreras. 
— Efter att LABC tagits bort, är de runda Cowpers körtlar (COW) synliga 
vid basen av, och något dorsal till, penisbulberna. Noggrann dissekering 
krävs för att undvika snitt i den tunna kapseln och förhindra vätskeläc ­
kage. Väg COW parvis med en noggrannhet på 0,1 mg, och registrera vikten. 
— Dessutom, om vätska förloras genom någon körtel under obduktion och 
dissektion bör detta registreras. 
55. Om utvärderingen av varje kemikalie kräver obduktion av fler djur än vad 
som är rimligt under en enda dag, kan studiens start delas upp på två på varandra följande dagar, så att obduktionen och arbetet fördelas på två 
dagar. Om de fördelas på detta sätt bör hälften av djuren per behandlings ­
grupp användas per dag. 
56. Kropparna ska omhändertas på lämpligt sätt efter obduktionen.
 
RAPPORTERING  
Data  
57. Data bör rapporteras individuellt (dvs. kroppsvikt, tillhörande könsväv ­
naders vikter, valfria mätningar samt andra responser och observationer) för varje grupp av djur (medelvärden och standardavvikelser beräknas för alla gjorda mätningar). Data bör sammanfattas i tabellform. Data ska visa 
antalet djur vid testets början, antal djur som hittats döda under testet eller 
som visat tecken på toxicitet, en beskrivning av de tecken på toxicitet som observerats, inklusive tidpunkt för första tecken, varaktighet och omfattning. 
58. En slutrapport bör innehålla:
 
Testanläggning  
— Namn på anläggning, adress. 
— Försöksledaren och annan personal samt deras studieansvar. 
— Respektive datum då studien började och slutade, dvs. den första dagen 
testkemikalien administrerades och den sista obduktionsdagen.  
Testkemikalie  
— Källa, parti-/batchnummer, identitet, renhet, leverantörens fullständiga 
adress och karakterisering av testkemikalien. 
— Fysikalisk form och, när så är tillämpligt, fysikalisk-kemikaliska 
egenskaper. 
— Förvaringsförhållanden samt metod och frekvens för framställning av 
utspädningar. 
— Eventuella stabilitetsdata som genererats. 
— Eventuella analyser av doseringslösningar/-suspensioner.  ▼M5 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 850
 
Vehikel  
— Karakterisering av vehikeln (identitet, leverantör och parti-#). 
— Motivering för val av vehikel (om annan än vatten).  
Försöksdjur och djurhållningsförfaranden  
— Art/stam som används samt motivering av val. 
— Ursprung eller leverantör av djuren, inklusive fullständig adress. 
— Försöksdjurens antal och ålder. 
— Inhysningsförhållanden (temperatur, belysning osv.). — Foder (namn, typ, leverantör, partinummer, innehåll och, om det är känt, 
fytoöstrogennivåer). 
— Strö (namn, typ, leverantör, innehåll). 
— Burförhållanden och antalet djur per bur.
 
Testbetingelser  
— Ålder vid kastrering och acklimatiseringens varaktighet efter kastrering. 
— De enskilda djurens vikt vid studiens början (med en noggrannhet på 
0,1 g). 
— Randomiseringsprocess och en dokumentation av anvisning till vehikel-, 
referens-, testkemikaliegrupper och burar. 
— Medelvärde och standardavvikelse för kroppsvikterna hos varje grupp 
varje vägningsdag under hela studien. 
— Motivering för valet av dos. 
— Administrering av testkemikalien samt motivering för valet av expone ­
ringsväg. 
— För test av antiandrogenicitet: TP-behandling (dos och volym). 
— Testkemikaliebehandling (dos och volym). 
— Tidpunkt för dosering. — Obduktionsförfaranden, inklusive blodtömningssätt och eventuell 
narkos. 
— Vid serumanalyser bör uppgifter om metoden lämnas. Om till exempel 
RIA används, ska RIA-förfarandet, RIA-satsernas ursprung, satsernas förfallodatum, förfarandet för scintillationsräkningen och standardise ­
ringen rapporteras.
 
Resultat  
— Dagliga observationer av varje djur under dosering, inklusive: 
— Kroppsvikter (med en noggrannhet på 0,1 g). — Kliniska tecken (om några). 
— Eventuella mätningar eller noteringar gällande födointag. 
— Obduktionsobservationer av varje djur, inklusive:
 ▼M5 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 851
 
— Datum för obduktion. 
— Djurbehandlingsgrupp. — Djur-ID. — Prosektor. 
— Tid på dagen då obduktion och dissektion utförs. 
— Djurens ålder. — Slutlig kroppsvikt vid obduktionen, notera eventuell statistisk signifikant 
ökning eller minskning. 
— Arbetsordning för djurens blodtömning och dissektion vid obduktionen. — Vikter hos de fem androgenberoende målvävnaderna: — Ventral prostata (med en noggrannhet på 0,1 mg). 
— Sädesblåsor samt koagulerande körtlar, inklusive vätska (parvis, med en 
noggrannhet på 0,1 mg). 
— Levator ani samt bulbocavernosus muskelkomplex (med en noggrannhet 
på 0,1 mg). 
— Cowpers körtlar (färsk vikt – parvis, med en noggrannhet på 0,1 mg). 
— Ollon (färsk vikt med en noggrannhet på 0,1 mg). — Vikter på valfria vävnader, om de utförs: — Lever (med en noggrannhet på 0,1 g). — Njure (parvis, med en noggrannhet på 0,1 mg). 
— Binjure (parvis, med en noggrannhet på 0,1 mg). 
— Allmänna synpunkter och kommentarer. — Analyser av serumhormoner, om de utförs. 
— LH-Serum (tillval – ng per ml serum), och — T-Serum T (tillval – ng per ml serum). 
— Allmänna synpunkter och kommentarer.
 
Sammanställning av data  
Data bör sammanställas i tabellform och innehålla urvalsstorlek för varje 
grupp, genomsnittliga värden, och standardfel för medelvärdet eller stan ­
dardavvikelsen. Tabeller bör innehålla obduktionskroppsvikter, kropps ­
viktförändringar från början av doseringen fram till obduktionen, vikter för accessoriska könsvävnader och eventuella vikter för valfria organ.
 
Diskussion av resultaten  
Analys av resultaten  
59. Kropps- och organvikter vid obduktionen bör analyseras statistiskt avseende 
egenskaper såsom homogen varians, med lämpliga dataomvandlingar vid 
behov. Behandlingsgrupperna bör jämföras med en kontrollgrupp med an ­
vändning av tekniker såsom ANOVA följt av parvisa jämförelser (t.ex. Dunnetts asymmetriska test) och kriteriet för statistisk skillnad, till exempel p ≤ 0,05. De grupper som uppnår statistisk signifikans bör identifieras. 
Dock bör ”relativa organ”-vikter undvikas på grund av de ogiltiga statistiska 
antaganden som ligger bakom denna datamanipulation.
 ▼M5 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 852
 
60. För androgena agonister ska kontrollen vara testgruppen för endast vehikel. 
Verkningsmekanismen hos en testkemikalie kan leda till olika relativa re ­
sponser bland vävnaderna, t.ex. trenbolon, vilken inte kan 5-alfa-reduceras, och som har mer uttalade effekter på LABC och GP än vad TP har. En statistiskt signifikant ökning (p ≤ 0,05) av två eller fler av de fem andro ­
genberoende målvävnadsvikterna (VP, LABC, GP, CG och SVCG) bör 
betraktas som ett positivt androgenagonistresultat, och alla målvävnader bör visa en viss grad av ökad tillväxt. Kombinerad utvärdering av vävnads ­
responser hos samtliga accessoriska könsorgans (ASO) kan uppnås med 
hjälp av en lämplig multivariat dataanalys. Detta skulle kunna förbättra 
analysen, speciellt i de fall där endast en enda vävnad ger ett statistiskt signifikant svar. 
61. För androgen antagonism bör kontrollen vara referensandrogentestgruppen 
(endast testosteronpropionat). Verkningssättet hos en testkemikalie kan leda 
till olika relativa responser bland vävnaderna, t.ex. 5 α-reduktashämmare, 
såsom finasterid, har mer uttalade effekter på den ventrala prostatan än andra vävnader jämfört med potenta AR-antagonister, såsom flutamid. En statistiskt signifikant minskning (p ≤ 0,05) i två eller flera av de fem 
androgenberoende målvävnadsvikterna (VP, LABC, GP, CG och SVCG) 
i förhållande till enbart TP-behandling bör betraktas som ett positivt andro ­
genantagonistresultat, och samtliga målvävnader bör visa en viss grad av minskad tillväxt. Kombinerad utvärdering av samtliga 
ASO-vävnadsresponser kan uppnås med hjälp av en lämplig multivariat 
dataanalys. Detta skulle kunna förbättra analysen, speciellt i de fall där endast en enda vävnad ger ett statistiskt signifikant svar. 
62. Data bör sammanställas i tabellform och innehålla medelvärde, standardfel 
för medelvärdet (standardavvikelse skulle också kunna accepteras) och ur ­
valsstorlek för varje grupp. Individuella datatabeller bör också ingå. De 
enskilda värdena, medelvärde, SE (SD) och CV-värden för kontrolldata bör undersökas, för att avgöra om de uppfyller acceptabla kriterier för överensstämmelse med förväntade historiska värden. För variationskoeffici ­
enter, som överstiger CV-värden som anges i tabell 1 (se punkterna 25 och 
26) för varje organvikt, bör man fastställa om det finns fel i dataregistre ­
ringen eller posten, eller om laboratoriet ännu inte behärskar en korrekt dissektion av androgenberoende vävnader, och om ytterligare utbildning/ 
praktik är motiverad. I allmänhet är variationskoefficienter (standardavvi ­
kelsen dividerad med medelvärdet för organvikten) repeterbara från labora ­
torium till laboratorium och studie till studie. Data som presenteras bör minst omfatta: ventrala prostatan, sädesblåsor, levator ani samt bulbocaver ­
nosus, Cowpers körtlar, ollon, lever, samt kroppsvikter och kroppsviktsför ­
ändringar från början av doseringen fram till obduktionen. Data kan även presenteras efter kovariansjustering av kroppsvikt, men bör inte ersätta pre ­
sentation av ej justerad data. Och om preputial separation (PPS) inte före ­
kommer i någon av grupperna, bör förekomsten av PPS registreras och 
jämföras statistiskt med kontrollgruppen med hjälp av Fishers exakta test.
 ▼M5 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 853
 
63. Vid kontroll av datorns dataposter med de ursprungliga databladen avseende 
noggrannhet, bör organviktsvärden som inte är biologiskt rimliga eller va ­
rierar med mer än tre standardavvikelser från behandlingsgruppen medel ­
värden, granskas noga och kan behöva uteslutas eftersom de sannolikt beror på registreringsfel. 
64. Jämförelse av studieresultaten med OECD:s CV-värden (i tabell 1) är ofta 
ett viktigt steg i tolkningen beträffande valideringen av studieresultaten. 
Historiska data för vehikelkontrollgrupperna bör bevaras i laboratoriet. His ­
toriska data för responser på positiva referenskemikalier, såsom TP och FT, bör också bevaras i laboratoriet. Laboratorier kan också regelbundet testa 
responsen på kända svaga androgena agonister och antagonister och bevara 
dessa uppgifter. Dessa uppgifter kan jämföras med tillgängliga OECD-data för att säkerställa att laboratoriets metoder ger tillräcklig statistisk precision och styrka.
 ▼M5 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 854
 
Tillägg 1  
DEFINITIONER  
Androgen : en term som används för att beskriva en positiv inverkan på till ­
växten av androgenberoende vävnader.  
Antiandrogenicitet : förmågan hos en kemikalie att undertrycka verkan av TP i 
en däggdjursorganism.  
Kemikalie : ett ämne eller en blandning.  
Födelsedatum : postnatal dag 0.  
Dos: den mängd testkemikalie som administreras. För Hershbergers bioassay 
uttrycks dosen som vikten testkemikalie per enhet kroppsvikt hos försöksdjuret 
per dag (t.ex. mg/kg kroppsvikt/dag).  
Dosering : en allmän term som omfattar dos, dess frekvens samt doseringens 
varaktighet.  
Döende : en term som används för att beskriva ett djur i döende tillstånd, dvs. 
nära döden.  
Postnatal dag X : den X:e dagen i livet efter födelsedatum.  
Känslighet : förmågan hos en testmetod att korrekt identifiera kemikalier som 
har den egenskap som de testas för.  
Specificitet : förmågan hos en testmetod att korrekt identifiera kemikalier som 
inte har den egenskap som de testas för.  
Testkemikalie : varje ämne eller blandning som testas med denna testmetod.  
Validering : en vetenskaplig process utformad för att karakterisera de operativa 
kraven och begränsningarna hos en testmetod och visa dess tillförlitlighet och 
relevans för ett visst ändamål.  ▼M5 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 855
 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 856
 ▼M5 
Tillägg 2
  
VMG mamm: Validation Management Group on Mammalian Testing and Assessment
 NOTER TILL RAMEN  
Not 1:  Inmatning på alla nivåer och utmatning på alla nivåer är möjlig och 
beror på typ av befintliga informationsbehov för fara och riskbedöm ­
ningsändamål.  
Not 2:  På nivå 5, bör ekotoxikologi omfatta endpoints som anger mekanis ­
mer för biverkningar och potentiella populationsskador.  
Not 3:  När en multimodal modell täcker flera av de enskilda endpointtes ­
terna, ersätter denna modell användningen av de enskilda endpointtesterna.  
Not 4:  Bedömningen av varje kemikalie bör baseras på en bedömning från 
fall till fall, med beaktande av all tillgänglig information, med hänsyn 
till funktionen hos de övergripande nivåerna.  
Not 5:  Ramen bör för närvarande inte betraktas som heltäckande. På nivå 3, 
4 och 5 finns det tester som antingen är tillgängliga, eller för vilken ett godkännande pågår. När det gäller den senare, ingår dessa preli ­
minärt. När de väl har utvecklats och validerats, kommer de formellt 
att läggas till ramen.  
Not 6:  Nivå 5 bör inte betraktas som att den endast omfattar slutgiltiga tester. 
Tester som ingår på den nivån anses bidra till allmän faro- och risk ­
bedömning.
 
HÄNVISNINGAR  
1. OECD (1998). Report of the First Meeting of the OECD Endocrine Dis ­
rupter Testing and Assessment (EDTA) Task Force, 10–11 mars 1998, 
ENV/MC/CHEM/RA(98)5. 
2. Dorfman RI (1962).  Standard methods adopted by official organization . 
Academic Press, NY. 
3. Gray LE Jr, Furr J och Ostby JS (2005). Hershberger assay to investigate 
the effects of endocrine disrupting compounds with androgenic and anti ­
androgenic activity in castrate-immature male rats. I:  Current Protocols in 
Toxicology  16.9.1–16.9.15. J Wiley and Sons Inc. 
4. OECD (2006). Final OECD report of the initial work towards the valida ­
tion of the rat Hershberger assay. Phase 1. Androgenic response to tes ­
tosterone propionate and anti-androgenic effects of flutamide. Environmen ­
tal Health and Safety, Monograph Series on Testing and Assessment N
 o 62. ENV/JM/MONO(2006)30. 
5. OECD (2008). Report of the OECD Validation of the Rat Hershberger 
Bioassay: Phase 2: Testing of Androgen Agonists, Androgen Antagonists 
and a 5a-Reductase Inhibitor in Dose Response Studies by Multiple La ­
boratories. Environmental Health and Safety, Monograph Series on Testing and Assessment N
 o 86. ENV/JM/MONO(2008)3. 
6. OECD (2007). Report of the Validation of the Rat Hershberger Assay: 
Phase 3: Coded Testing of Androgen Agonists, Androgen Antagonists and 
Negative Reference Chemicals by Multiple Laboratories. Surgical Castrate 
Model Protocol. Environmental Health and Safety, Monograph Series on Testing and Assessment N
 o 73. ENV/JM/MONO(2007)20. 
7. Owens, W, Zeiger E, Walker M, Ashby J, Onyon L, Gray, Jr, LE (2006). 
The OECD programme to validate the rat Hershberger bioassay to screen compounds for in vivo androgen and antiandrogen responses. Phase 1: Use 
of a potent agonist and a potent antagonist to test the standardized pro ­
tocol. Env. Health Persp. 114:1265–1269.
 ▼M5 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 857
 
8. Owens W, Gray LE, Zeiger E, Walker M, Yamasaki K, Ashby J, Jacob E 
(2007). The OECD program to validate the rat Hershberger bioassay to 
screen compounds for in vivo androgen and antiandrogen responses: phase 2 dose-response studies. Environ Health Perspect. 115(5):671–8. 
9. Korenchevsky V (1932). The assay of testicular hormone preparations. 
Biochem J26:413–422. 
10. Korenchevsky V, Dennison M, Schalit R (1932). The response of castrated 
male rats to the injection of the testicular hormone. Biochem 
J26:1306–1314. 
11. Eisenberg E, Gordan GS (1950). The levator ani muscle of the rat as an 
index of myotrophic activity of steroidal hormones. J Pharmacol Exp 
Therap 99:38–44. 
12. Eisenberg E, Gordan GS, Elliott HW (1949). Testosterone and tissue 
respiration of the castrate male rat with a possible test for mytrophic activity. Endocrinology 45:113–119. 
13. Hershberger L, Shipley E, Meyer R (1953). Myotrophic activity of 19- 
nortestosterone and other steroids determined by modified levator ani 
muscle method. Proc Soc Exp Biol Med 83:175–180. 
14. Hilgar AG, Vollmer EP (1964). Endocrine bioassay data: Androgenic and 
myogenic. Washington DC: United States Public Health Service. 
15. Dorfman RI (1969).  Androgens and anabolic agents. I: Methods in Hor ­
mone Research , volume IIA. (Dorfman RI, ed.) New York: Academic 
Press, 151–220. 
16. Massaro EJ (2002).  Handbook of Neurotoxicology , volume I. New York: 
Humana Press, s 38. 
17. OECD (2000). Guidance document on the recognition, assessment and use 
of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in 
safety evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on 
Testing and Assessment No 19. ENV/JM/MONO(2000)7. 
18. OECD (1982). Organization for Economic Co-operation and Development 
– Principles of Good Laboratory Practice, ISBN 92-64-12367–9, Paris. 
19. OECD (2008). Acute oral toxicity – up-and-down procedure. OECD Gui ­
deline for the testing of chemicals No 425. 
20. OECD (2001). Guidance document on acute oral toxicity. Environmental 
Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No 24. 
ENV/JM/MONO(2001)4. 
21. Supplemental materials for Owens et al. (2006). The OECD programme to 
validate the rat Hershberger bioassay to screen compounds for in vivo 
androgen and antiandrogen responses. Phase 1: Use of a potent agonist and a potent antagonist to test the standardized protocol. Env. Health Persp. 114:1265–1269. See, section II, The dissection guidance provided 
to the laboratories: http://www.ehponline.org/docs/2006/8751/suppl.pdf 
22. Korea Food and Drug Administration. Visual reference guide on Hershber ­
ger assay procedure, including a dissection video. http://rndmoa.kfda.go.kr/ endocrine/reference/education_fr.html 
23. OECD (2008). Background Review Document on the Rodent Hershberger 
Bioassay. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No 90. ENV/JM/MONO(2008)17. 
24. OECD (2008). Draft Validation report of the Intact, Stimulated, Weanling 
Male Rat Version of the Hershberger Bioassay. 
25. OECD (2009). Guidance Document on the Weanling Hershberger Bio ­
assay in rats: A shortterm screening assay for (anti)androgenic properties. 
Series on Testing and Assessment, Number 115.
 ▼M5 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 858
 
26. Europaparlamentets och rådets direktiv 2010/63/EU av den 22 september 
2010 om skydd av djur som används för vetenskapliga ändamål (EUT 
L 276, 20.10.2010, s. 33). 
27. Följande kapitel i denna bilaga: 
B.1a, Akut toxicitet (oralt) – metod med fasta särskiljande doser 
B.1b, Akut toxicitet (oralt) – metod för bestämning av akut toxicitetsklass  ▼M5 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 859
 
B.56  UTÖKAD ENGENERATIONSSTUDIE AV REPRODUKTIONSTOX ­
ICITET  
INLEDNING 
1. Denna testmetod motsvarar OECD:s testriktlinje (TG) 443 (2012). Den är 
baserad på förslaget från  Agricultural Chemical Safety Assessment (ACSA) 
Technical Committee  inom  ILSI Health and Environmental Sciences 
Institute (HESI)  om en utökad engenerationsstudie av reproduktion i livss ­
kede F  1 , publicerat i Cooper et al., 2006 (se hänvisning 1). Flera förbätt ­
ringar och förtydliganden har gjorts i studieutformningen för att ge flex ­
ibilitet och betona vikten av att börja med befintlig kunskap och använda observationer av levande djur för att styra och skräddarsy testningen. Denna 
testmetod ger en detaljerad beskrivning av det operativa genomförandet av 
en utökad engenerationsstudie av reproduktionstoxicitet. Testmetoden be ­
skriver tre kohorter för F
 1 -djur: 
Kohort 1: Bedömer reproduktiva/utvecklingsmässiga endpoints. Denna ko ­
hort kan utvidgas till att omfatta en F  2 -generation. 
Kohort 2: Bedömer eventuella effekter av kemisk exponering av ett nerv ­
system under utveckling. 
Kohort 3: Bedömer eventuella effekter av kemisk exponering av ett im ­
munsystem under utveckling. 
2. Beslut om bedömningen av andra generationen och utelämningen av den 
utvecklingsmässiga neurotoxicitetskohorten och/eller utvecklingsmässiga 
immunotoxicitetskohorten bör återspegla befintlig kunskap för den kemika ­
lie som utvärderas, liksom behoven av olika tillsynsmyndigheter. Syftet med testmetoden är att ge information om hur studien kan utföras och 
hur varje kohort ska utvärderas. 
3. Förfarande för beslutet om den interna triggningen för att producera en 
andra generation beskrivs i OECD:s vägledning 117 (se hänvisning 39) för de tillsynsmyndigheter som använder interna triggers.
 
INLEDANDE ÖVERVÄGANDEN OCH MÅL 
4. Huvudsyftet med den utökade engenerationsstudien av reproduktionstoxici ­
tet är att utvärdera specifika livsstadier som inte omfattas av andra typer av toxicitetsstudier, och tester av effekter som kan uppstå till följd av pre- och 
postnatal kemisk exponering. För reproduktiva endpoints är det tänkt att, 
som ett första steg och när det är tillgängligt, information från studier med upprepad dosering (inklusive screening av reproduktionstoxicitetsstudier, t.ex.OECD:s TG 422 [se hänvisning 32]), eller kortvariga screeningtester 
av endokrinstörande ämnen (t.ex.uterotrof assay – testmetod B.54 [se hän ­
visning 36] och Hershbergers bioassay – testmetod B.55 [se hänvisning 37]) används för att påvisa effekter på fortplantningsorganen hos hanar och honor. Detta kan inkludera spermatogenesen (testikelhistopatologi) för ha ­
nar, och brunstcykler, follikelantal/oocytmognad och äggstocksintegritet 
(histopatologi) för honor. Den utökade engenerationsstudien av reproduk ­
tionstoxicitet fungerar sedan som ett test för reproduktionsendpoints som kräver interaktion mellan hanar och honor, honor och befruktade ägg, honor 
och avkomma samt F
 1 -generationen tills efter könsmognaden (se OECD:s 
vägledning 151 som stöder denna testmetod [hänvisning 40]).  ▼M5 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 860
 
5. Testmetoden är utformad för att ge en utvärdering av kemikaliers pre- och 
postnatala effekter på utvecklingen, såväl som en grundlig utvärdering av 
systemisk toxicitet hos dräktiga och lakterande honor samt ung och vuxen avkomma. Detaljerad undersökning av viktiga utvecklingsendpoints, såsom avkommans levnadsduglighet, neonatala hälsa, utvecklingsstatus vid födseln 
samt fysisk och funktionell utveckling upp till vuxen ålder, förväntas iden ­
tifiera specifika målorgan hos avkomman. Vidare kommer studien att ge och/eller bekräfta information om en testkemikalies effekter på integritet och prestanda hos vuxna hanars och honors fortplantningssystem. Specifikt, 
men inte endast, beaktas följande parametrar: gonadfunktion, brunstcykel, 
epididymal spermiemognad, parningsbeteende, befruktning, dräktighet, för ­
lossning och laktation. Dessutom kommer information som erhålls från bedömningar av utvecklingsneurotoxicitet och immunotoxicitet att karakte ­
risera potentiella effekter på dessa system. Data som härrör från dessa tester 
bör göra det möjligt att bestämma nivåer där ingen skadlig effekt observeras (Noael), lägsta observerade effektnivåer (Loael) och/eller referensdoser för olika endpoints och/eller användas för att karakterisera effekter som upp ­
täckts i föregående studier med upprepad dosering, och/eller fungera som en 
vägledning för efterföljande testning. 
6. En översikt över protokollet presenteras i figur 1. Testkemikalien admini ­
streras kontinuerligt i graderade doser till flera grupper av könsmogna hanar och honor. Denna föräldrageneration (P) doseras under en bestämd period före parningen (väljs på basis av den information som finns tillgänglig om 
testkemikalien, men minst två veckor) samt en parningsperiod på två vec ­
kor. P-hanarna fortsätter att behandlas, åtminstone till avvänjningen av F
 1 . 
De bör behandlas i minst 10 veckor. De kan behandlas längre om det finns ett behov av att klargöra effekter på reproduktionen. Behandlingen av 
P-honorna fortsätter under dräktighet och laktation fram till avslutningen, 
efter avvänjningen av deras kullar (dvs.8–10 veckors behandling). F
 1 -av­
komman får ytterligare behandling med testkemikalien, från avvänjningen upp till vuxen ålder. Om en andra generation bedöms (se OECD:s vägled ­
ningsdokument 117 [hänvisning 39]), kommer F
 1 -avkomman att hållas kvar 
på behandling till avvänjningen av F  2 , eller fram till studiens avslutning. 
7. Kliniska observationer och patologiska undersökningar utförs på alla djur 
efter tecken på toxicitet, med särskild tonvikt på hos de hanliga och honliga fortplantningssystemens integritet och prestanda samt avkommans hälsa, tillväxt, utveckling och funktion. Vid avvänjningen tilldelas den valda av ­
komman till specifika undergrupper (kohorter 1–3, se punkterna 33 och 34 
samt figur 1) för ytterligare undersökningar, inklusive könsmognad, integ ­
ritet och funktion hos fortplantningsorganen, neurologiska och beteende ­
mässiga endpoints samt immunförsvaret. 
8. Vid genomförandet av cancerogenitetsstudien bör man alltid följa de väg ­
ledande principer och överväganden som beskrivs i OECD:s vägledning nr 19 om erkännandet, bedömningen och användningen av kliniska tecken 
som humana endpoints för försöksdjur som används för säkerhetsbedöm ­
ningar (se hänvisning 34).
 ▼M5 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 861
 
9. När tillräckligt många studier finns tillgängliga för att utröna effekterna av 
den nya studieutformningen, kommer testmetoden att ses över och vid 
behov revideras i ljuset av de erfarenheter som gjorts.  
Figur 1  
Schema för den utökade engenerationsstudien av reproduktionstoxicitet
  
BESKRIVNING AV METODEN OCH FÖRBEREDELSER FÖR TESTET  
Djur  
Val av djurart och stam  
10. Valet av art för testning av reproduktionstoxicitet bör noggrant övervägas i 
ljuset av all tillgänglig information. På grund av den stora mängden bak ­
grundsdata och jämförbarheten med allmänna toxicitetstester är dock råttan normalt sett den art som föredras, och kriterierna och rekommendationerna 
som ges i den här testmetoden avser denna art. Om en annan art används 
bör detta motiveras, och lämpliga ändringar av protokollet blir nödvändiga. Stammar med låg fertilitet eller välkänt höga förekomster av spontana ut ­
vecklingsdefekter ska inte användas.
 
Ålder, kroppsvikt och inklusionskriterier  
11. Friska föräldradjur som inte har utsatts för tidigare försökförfaranden bör 
användas. Både hanar och honor bör studeras, och honorna får inte ha fött ungar eller vara dräktiga. P-djuren bör vara könsmogna med liknande vikt 
(inom könet) vid doseringens inledning, liknande ålder (cirka 90 dagar) vid 
parningen, och representativa för den art och stam som studeras. Djur bör acklimatiseras under minst 5 dagar efter ankomsten. Djuren anvisas slump ­
vis till kontroll- och behandlingsgrupperna, på ett sätt som resulterar i jäm ­
förbara genomsnittliga kroppsviktsvärden bland grupperna (dvs.± 20 % av 
medelvärdet).
 ▼M5 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 862
 
Inhysnings- och utfodringsförhållanden  
12. Temperaturen i djurutrymmet bör vara 22 °C (± 3 °C). Den relativa fuktig ­
heten bör vara 30–70 %, med ett idealiskt intervall på 50–60 %. Artificiell 
belysning bör ställas in på 12 timmar ljus, 12 timmar mörker. Konventio ­
nellt laboratoriefoder kan användas med fri tillgång till dricksvatten. Fodrets innehåll av fytoöstrogener bör beaktas noga, eftersom en hög nivå av fy ­
toöstrogener i fodret kan påverka vissa reproduktiva endpoints. Standardise ­
rat ”open-formula”-foder där östrogena kemikalier har reducerats rekom ­
menderas (se hänvisning 2, 30). Valet av foder kan påverkas av behovet av att säkerställa en lämplig blandning av en testkemikalie när den admini ­
streras genom denna metod. Innehåll, homogenitet och stabilitet av test ­
kemikalien i fodret bör verifieras. Fodret och dricksvattnet bör analyseras regelbundet avseende föroreningar. Prover av varje fodersats som används under studien bör lagras under lämpliga förhållanden (t.ex.frysta vid – 20 
°C) tills rapporten färdigställs, om resultaten kräver en ytterligare analys av 
fodrets ingredienser. 
13. Djuren bör inhysas i burar, i små grupper bestående av samma kön och 
behandlingsgrupp. De kan inhysas individuellt för att undvika eventuella 
skador (t.ex. hanar efter parningsperioden). Parningsförfarandena bör utföras i lämpliga burar. Efter tecken på parning inhyses honorna, som antas vara dräktiga, separat i förlossnings- eller moderskapsburar som är försedda med 
lämpliga och definierade bomaterial. Kullarna är inhysta tillsammans med 
sina mödrar fram till avvänjningen. F
 1 -djur bör hållas i små grupper av 
samma kön och behandlingsgrupp från avvänjningen till studiens avslut ­
ning. Om det är vetenskapligt motiverat kan djuren inhysas individuellt. 
Det valda strömaterialets innehåll av fytoöstrogener ska vara minimalt.  
Djurens antal och identifiering  
14. Normalt bör varje test- och kontrollgrupp innehålla ett tillräckligt antal par 
som parar sig för att ge minst 20 dräktiga honor per dosgrupp. Målet är att 
producera tillräckligt med dräktiga honor för att säkerställa en meningsfull 
utvärdering av kemikaliens potential att påverka fertilitet, dräktighet och moderbeteende i P-generationen, samt F
 1 -avkommans tillväxt och utveck ­
ling från befruktning till mognad. Om det önskade antalet dräktiga djur inte 
uppnås behöver studien inte nödvändigtvis ogiltigförklaras, och bör utvär ­
deras från fall till fall med tanke på ett eventuellt orsakssamband med testkemikalien. 
15. Varje P-djur tilldelas ett unikt ID-nummer innan doseringen påbörjas. Om 
laboratoriets historiska data tyder på att en betydande andel honor inte kan uppvisa regelbundna (4 eller 5 dagar) brunstcykler, rekommenderas en be ­
dömning av brunstcykler före behandlingsstarten. Alternativt kan gruppens 
storlek ökas för att säkerställa att minst 20 honor i varje grupp ska ha 
regelbundna (4 eller 5 dagar) brunstcykler vid början av behandlingen. All F
 1 -avkomma identifieras unikt vid första undersökningen av nyfödda 
på postnatal dag (PND) 0 eller 1. Dokument indikerar att ursprungskullen 
bör bibehållas för alla F  1 -djur, och F  2 -djur i förekommande fall, genom hela 
studien.  ▼M5 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 863
 
Testkemikalie  
Tillgänglig information om testkemikalien  
16. Genomgång av befintlig information är viktig för beslut om administrations ­
ätt, val av vehikel, val av djurart, val av dos och potentiella ändringar av 
doseringsschemat. Följaktligen bör all relevant tillgänglig information om testkemikalien, dvs. fysikalisk-kemiska, toxikokinetiska (inklusive artspeci ­
fik metabolism), toxikodynamiska egenskaper, struktur-aktivitetssamband 
(SAR),  in vitro  metaboliska processer, resultat från tidigare studier om tox ­
icitet och relevant information om strukturella analoger beaktas i plane ­
ringen av den utökade engenerationsstudien av reproduktionstoxicitet. Pre ­
liminär information om absorption, distribution, metabolism och eliminering 
(Adme) och bioackumulerbarhet kan härröra från kemisk struktur, 
fysikalisk-kemiska data, grad av plasmaproteinbindning eller toxikokinetiska (TK) studier, medan resultat från toxicitetsstudier ger ytter ­
ligare information, t.ex.om Noael, metabolism eller induktion av 
metabolism.
 
Beaktande av toxikokinetiska data  
17. Även om det inte behövs så är TK-data från tidigare utförda dosfinnande 
studier eller andra studier mycket användbara i planeringen av studiens 
utformning, val av dosnivåer samt tolkning av resultaten. Av särskild nytta är uppgifter som 1) verifierar exponeringen av testkemikalien på foster under utveckling samt på ungar (eller relevanta metaboliter), 2) gör en 
uppskattning av intern dosimetri, och 3) utvärderar potentiell dosberoende 
mättnad av kinetiska processer. Ytterligare TK-data, t.ex. metabolitprofiler, koncentration-tidsförlopp etc. bör också övervägas, om de finns tillgängliga. Kompletterande TK-data kan också samlas in under huvudstudien, förutsatt 
att det inte stör insamlingen och tolkningen av huvudstudiens endpoints. 
Som en allmän vägledning kan följande TK-datauppsättning vara användbar 
i planeringen av den utökade engenerationsstudien av 
reproduktionstoxicitet: 
— Under sen dräktighet (t.ex. dräktighetsdag 20) – maternellt blod och 
foetalt blod. 
— Mitt i laktationen (PND 10) – maternellt blod, blod från ungar och/eller 
mjölk. 
— Strax efter avvänjningen (t.ex. PND 28) – blodprov från avvanda ungar. 
Flexibilitet bör användas för att fastställa de specifika analyterna (t.ex. 
överordnade kemikalier och/eller metaboliter), samt provtagningsschema. 
Till exempel så är antal och tidpunkt för provtagningar på en viss prov ­
tagningsdag beroende av exponeringsvägen och tidigare kunskap om TK-egenskaper hos icke-dräktiga djur. För födostudier är provtagning vid 
en bestämd tidpunkt under var och en av dessa dagar tillräcklig, medan 
dosering via sondmatning kan motivera ytterligare provtagningstidpunkter för att få en bättre uppskattning av antalet interna doser. Emellertid är det inte nödvändigt att generera ett fullständigt koncentrations-tidsförlopp på 
någon av provtagningsdagarna. Vid behov kan blod från djur av samma 
kön inom kullarna slås samman för fetala och neonatala analyser.
 ▼M5 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 864
 
Administrationssätt  
18. Valet av administrationssätt bör ta hänsyn till det som är mest relevant för 
människors exponering. Även om protokollet är avsett för administration av 
testkemikalien genom födan kan det modifieras för administration via andra vägar (dricksvatten, sondmatning, inandning, hudkontakt) beroende på ke ­
mikaliens egenskaper och den information som krävs.
 
Val av vehikel  
19. Vid behov kan testkemikalien upplösas eller suspenderas i en lämplig ve ­
hikel. Det rekommenderas att, om möjligt, användningen av en vattenhaltig 
lösning/suspension beaktas först, följt av övervägandet om att använda en 
lösning/suspension i olja (t.ex.majsolja). För andra vehiklar än vatten bör de toxiska egenskaperna vara kända. Användningen av en vehikel med poten ­
tiell inneboende toxicitet (t.ex.aceton, DMSO) bör undvikas. Testkemikali ­
ens stabilitet i vehikeln bör bestämmas. Följande egenskaper bör beaktas om 
en vehikel eller annan tillsats används för att underlätta dosering: effekter på absorption, distribution, metabolism eller kvarhållande av testkemikalien; effekter på de kemiska egenskaperna hos testkemikalien som kan förändra 
dess toxiska egenskaper och effekter på foder eller vatten, eller djurens 
näringsstatus.
 
Val av dos  
20. Normalt bör studien omfatta minst tre dosnivåer och en jämsides behandlad 
kontrollgrupp. Vid val av lämpliga dosnivåer bör utredaren analysera all tillgänglig information, inklusive doseringsinformation från tidigare studier, 
TK-data från dräktiga eller icke-dräktiga djur, omfattningen av överföring 
genom digivning och uppskattningar av människors exponering. Om TK-data finns tillgängliga som tyder på dosberoende mättnad av TK-processer, bör försiktighet iakttas för att undvika höga dosnivåer som 
tydligt uppvisar mättnad, förutsatt naturligtvis att mänsklig exponering för ­
väntas ligga väl under mättnadspunkten. I sådana fall bör den högsta dosen vara på, eller strax över, brytpunkten för övergången till olinjärt TK-beteende. 
21. I brist på relevanta TK-data bör dosnivåerna baseras på toxiska effekter, om 
de inte begränsas av testkemikalien fysikaliska/kemiska beskaffenhet. Om 
dosnivåerna baseras på toxicitet bör den högsta dosen väljas i syfte att 
inducera viss systemisk toxicitet, men inte dödsfall eller allvarligt lidande för djuren. 
22. Fallande dosnivåer bör väljas för att påvisa en eventuell dosrelaterad effekt 
och för att fastställa Noael eller doser nära detektionsgränsen som gör det möjligt att härleda en referensdos för den känsligaste endpointen. För att 
undvika stora dosavstånd mellan Noael och Loael är ofta två- eller fyrfal ­
diga dosintervall optimala. Tillägget av en fjärde testgrupp är att föredra framför användningen av ett mycket stort intervall (t.ex. mer än en faktor på 10) mellan doserna. 
23. Med undantag av behandlingen med testkemikalien hanteras djuren i kon ­
trollgruppen på exakt samma sätt som i testgruppen. Denna grupp bör vara obehandlad, placebobehandlad eller en vehikelkontrollgrupp, om en vehikel 
används för administrering av testkemikalien. Om en vehikel används bör 
kontrollgruppen tillföras vehikeln i den största volym som används.
 ▼M5 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 865
 
Toleranstest  
24. Om det inte finns några tecken på toxicitet vid en dos på minst 1 000 mg/kg 
kroppsvikt/dag i studier med upprepad dosering, eller om toxicitet inte 
förväntas baserat på data från strukturellt och/eller metaboliskt besläktade kemikalier, vilket indikerar likhet i metaboliska egenskaper  in vivo /in vitro , 
är en studie med flera dosnivåer inte nödvändig. I sådana fall kan den 
utökade engenerationsstudien av reproduktionstoxicitet genomföras med 
hjälp av en kontrollgrupp och en enda dos på minst 1 000 mg/kg kropps ­
vikt/dag. Dock, skulle evidens för reproduktions- eller utvecklingstoxicitet finnas vid denna gränsdos, kommer ytterligare studier vid lägre dosnivåer 
att krävas för att identifiera ett Noael-värde. Dessa toleranstestsövervägan ­
den gäller endast när mänsklig exponering inte indikerar ett behov av en högre dosnivå.
 
FÖRFARANDEN  
Exponering av avkomma  
25. Intag via föda är det föredragna administrationssättet. Om sondmatnings ­
studier utförs bör det noteras att ungarna normalt endast får testkemikalien 
indirekt via mjölken, tills direkt dosering startar vid deras avvänjning. I 
foder- eller dricksvattenstudier kommer ungarna dessutom att få testkemi ­
kalien direkt när de börjar äta själva under den sista veckan av laktations ­
perioden. Ändringar av studiens utformning bör övervägas när utsöndringen 
av testkemikalien i mjölk är dålig, och det saknas bevis för en kontinuerlig 
exponering av avkomman. I dessa fall bör man överväga direkt dosering av ungarna under laktationsperioden baserat på tillgänglig TK-information, tox ­
icitet hos avkomman eller förändringar i biologiska markörer (se hänvisning 
3, 4). Noggrant övervägande av fördelar och nackdelar bör göras före 
starten av direktdoseringsstudier av diande ungar (se hänvisning 5).
 
Doseringsschema och administrering av doser  
26. Viss information om brunstcykler, histopatologi i hanliga och honliga re ­
produktionsorgan och testikel-/epididymala spermieanalyser kan finnas till ­
gängliga från tidigare toxicitetsstudier av upprepade doser med tillräcklig varaktighet. Behandlingstiden före parning i den utökade engenerationsstu ­
dien av reproduktionstoxicitet är därför inriktad på att upptäcka effekter på 
funktionella förändringar som kan störa parningsbeteendet och fruktsamhe ­
ten. Behandlingen före parning bör pågå tillräckligt länge för att uppnå ett stabilt tillstånd vad gäller exponeringsförhållandena hos P-hanar och -honor. 
En 2-veckorsbehandling före parningen för båda könen anses vara tillräcklig 
i de flesta fall. För honor täcker detta 3–4 kompletta brunstcykler, vilket bör vara tillräckligt för att upptäcka eventuella negativa effekter på cykliciteten. För hanar motsvarar detta den tid som krävs för epididymal transitering av 
mognande spermier och bör göra det möjligt att upptäcka eftertestikeleffek ­
ter på spermier (under slutskedet av spermiation och epididymal spermie ­
mognad) vid parningen. Vid tidpunkten för avslutningen, då testikel- och epididymalhistopatologi och analys av spermieparametrar är planerade, ska 
P- och F
 1 -hanarna ha utsatts för minst en hel spermatogenesprocess (se 
hänvisning 6, 7, 8, 9 och OECD:s vägledning 151 [hänvisning 40]).  ▼M5 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 866
 
27. Exponeringsscenarier före parningen för hanar ska kunna anpassas, om 
testikeltoxicitet (nedsatt spermiebildning) eller effekter på spermieintegritet 
och -funktion tydligt har identifierats i tidigare studier. På samma sätt kan kända effekter av testkemikalien i brunstcykeln, och därmed sexuell mot ­
taglighet hos honor, motivera olika exponeringsscenarier före parningen. I 
speciella fall kan det vara acceptabelt att behandling av P-honor initieras 
först efter att spermiepositiva utstryk har erhållits (se OECD:s vägledning 151 [hänvisning 40]). 
28. När väl doseringsperioden före parningen är etablerad, bör djuren behandlas 
med testkemikalien kontinuerligt 7 dagar per vecka fram till obduktionen. 
Samtliga djur ska doseras med samma metod. Doseringen bör fortsätta 
under den 2 veckor långa parningsperioden, och för P-honor genom hela dräktigheten och laktationen fram till avslutningsdagen efter avvänjningen. Hanar bör behandlas på samma sätt fram till avslutningen, vid tidpunkten 
för F
 1 -djurens avvänjning. För obduktion bör honor prioriteras, och de bör 
obduceras på samma eller nästan samma laktationsdag. Obduktionen av hanar kan spridas över ett större antal dagar beroende på laboratorieanlägg ­
ning. Om direktdosering inte redan har inletts under laktationsperioden, bör 
direktdosering av de utvalda F
 1 -hanarna och -honorna börja vid avvänj ­
ningen och fortsätta fram till den planerade obduktionen, beroende på kohortanvisning. 
29. För kemikalier som tillförs via fodret eller dricksvattnet är det viktigt att 
säkerställa att kvantiteterna av den berörda testkemikalien inte påverkar 
normal närings- eller vattenbalans. När testkemikalien tillförs via födan kan antingen en konstant koncentration (ppm) eller en konstant dosnivå i förhållande till djurens kroppsvikt användas. Det valda alternativet bör 
anges. 
30. När testkemikalien tillförs genom sondmatning bör den vätskevolym som 
tillförs på en gång normalt inte överstiga 1 ml per 100 g kroppsvikt (0,4 ml per 100 g kroppsvikt är det maximala för olja, t.ex.majsolja). Med undantag för irriterande eller frätande kemikalier, som normalt ger starkare effekter 
vid högre koncentrationer, bör variationer av testvolymen minimeras genom 
justering av koncentrationen för att säkerställa en konstant volym vid alla dosnivåer. Behandlingen bör ges vid samma tid varje dag. Dosen till varje djur ska normalt baseras på den senast fastställda individuella kroppsvikten 
och bör justeras minst en gång i veckan för vuxna hanar och vuxna 
icke-dräktiga honor och varannan dag för dräktiga honor och F
 1 -djur, när 
de administreras före avvänjningen och under 2 veckor efter avvänjningen. Om TK-data indikerar en låg placentaöverföring av testkemikalien, måste 
kanske sondmatningsdosen under den sista veckan av dräktigheten justeras 
för att undvika tillförsel av en alltför toxisk dos till moderdjuret. Honor bör inte behandlas genom sondmatning eller någon annan behandlingsväg där djuret måste hanteras på dagen för nedkomsten, och att avstå från att ad ­
ministrera testkemikalien den dagen är att föredra framför att störa förloss ­
ningsprocessen.
 ▼M5 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 867
 
Parning  
31. Varje P-hona ska placeras med en enda, slumpmässigt utvald, obesläktad 
hane från samma dosgrupp (1:1-parning) tills tecken på kopulation obser ­
veras eller 2 veckor har gått. Om det inte finns tillräckligt med hanar, till exempel på grund av dödsfall hos hanarna före hopparning, då kan hanar som redan har parat sig paras ihop (1:1) med en andra hona, så att alla 
honor blir hopparade. Dag 0 av dräktigheten definieras som den dag då 
bevis på parning bekräftas (vaginalplugg eller sperma observeras). Djuren bör skiljas åt så snart som möjligt efter att tecken på parning har observe ­
rats. Om parning inte har inträffat efter 2 veckor, bör djuren separeras utan 
ytterligare möjlighet till parning. De par som har parat sig bör tydligt 
identifieras i data.
 
Kullstorlek  
32. På dag 4 efter födseln kan storleken på varje kull justeras genom att extra 
ungar elimineras genom slumpmässigt urval så att varje kull i möjligaste mån innehåller fem hanar och fem honor. Selektiv eliminering av ung ­
ar,t.ex.baserat på kroppsvikt är inte lämpligt. När antalet han- eller honungar 
inte medger fem av varje kön per kull, är partiell anpassning acceptabelt (t.ex. sex hanar och fyra honor).
 
Urval av ungar till studier efter avvänjningen (se figur 1)  
33. Vid avvänjningen (omkring PND 21) väljs ungar ut från alla tillgängliga 
kullar upp till 20 per dos- och kontrollgrupp för ytterligare undersökningar 
och bibehålls fram till den sexuella mognaden (om inte tidigare testning krävs). Ungarna väljs ut slumpmässigt, med undantag av uppenbart små ­
växta djur (djur med en kroppsvikt som ligger mer än två standardavvikel ­
ser under medelvikten för respektive kull) som inte bör ingå, eftersom de 
sannolikt inte är representativa för behandlingsgruppen. 
På PND 21 fördelas de valda F
 1 -ungarna slumpvis till en av tre kohorter av 
djur, enligt följande: 
Kohort 1 (1A och 1B) = testning av reproduktions-/utvecklingstoxicitet. Kohort 2 (2A och 2B) = testning av utvecklingsneurotoxicitet. Kohort 3 = testning av utvecklingsimmunotoxicitet. Kohort 1A: En hane och en hona/kull/grupp (20/kön/grupp): prioriterat val 
för primär bedömning av effekter på reproduktionssystem samt av allmän 
toxicitet. 
Kohort 1B: En hane och en hona/kull/grupp (20/kön/grupp): prioriterat val 
för uppföljande utvärdering av fortplantningsförmågan genom att para F1- 
djur vid bedömningen (se OECD:s vägledning 117 [hänvisning 39]), och för att erhålla ytterligare histopatologiska data vid misstanke om reproduk ­
tivt eller endokrint toxiska ämnen, eller när resultaten från kohort 1A är 
tvetydiga. 
Kohort 2A: Totalt 20 ungar per grupp (10 hanar och 10 honor per grupp, 
en hane eller en hona per kull) anvisas till neurobeetendemässig testning, följt av neurohistopatologisk bedömning som vuxna. 
Kohort 2B: Totalt 20 ungar per grupp (10 hanar och 10 honor per grupp, 
en hane eller en hona per kull) anvisas till neurohistopatologisk bedömning 
vid avvänjningen (PND 21 eller PND 22). Om det inte finns ett tillräckligt 
antal djur, bör man i första hand anvisa djur till kohort 2A.
 ▼M5 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 868
 
Kohort 3: Totalt 20 ungar per grupp (10 hanar och 10 honor per grupp, en 
per kull, där så är möjligt). Ytterligare ungar kan krävas från kontrollgrup ­
pen för att fungera som positiva kontrolldjur i det T-cellsberoende antikroppsresponstestet (TDAR) vid PND 56 ± 3. 
34. Om antalet ungar i en kull är tillräckligt för att fylla alla kohorter, har 
kohort 1 företräde eftersom den kan utvidgas till att producera en F
 2 -ge­
neration. Ytterligare ungar kan tilldelas till någon av kohorterna om det 
finns särskild anledning, t.ex.om man misstänker en kemikalie för att vara neurotoxisk, immunotoxisk eller reproduktionstoxisk. Dessa ungar kan an ­
vändas för undersökningar vid olika tidpunkter eller för utvärdering av 
kompletterande endpoints. Ungar som inte har anvisats till kohorter ska 
genomgå klinisk biokemi (punkt 55) och obduktion (punkt 68).
 
Andra parningen av P-djuren  
35. En andra parning rekommenderas normalt inte för P-djuren, eftersom det 
innebär förlust av viktig information om antal implantationsställen (och 
därmed data om efterimplantation och perinatal dödlighet, indikatorer på 
en möjlig teratogen potential) i den första kullen. Behovet av att verifiera eller belysa en effekt på exponerade honor kan förbättras genom att under ­
sökningen utvidgas till att omfatta en parning av F
 1 -generationen. Men en 
andra parning av P-hanar med obehandlade honor är alltid ett alternativ för 
att klargöra osäkra slutsatser, eller för att ytterligare karakterisera effekter på fertiliteten som observerats i den första parningen.
 
OBSERVATIONER AV LEVANDE DJUR  
Kliniska observationer  
36. För P- och utvalda F  1 -djur görs en allmän klinisk observation en gång per 
dag. Vid sondmatningsdosering, bör tidpunkten för de kliniska observatio ­
nerna vara före och efter doseringen (för eventuella tecken på toxicitet i samband med maximal plasmakoncentration). Relevanta beteendeföränd ­
ringar, tecken på svår eller utdragen förlossning och alla tecken på toxicitet 
registreras. Två gånger dagligen, under helgen en gång dagligen, observeras samtliga djur avseende allvarlig toxicitet, sjuklighet och dödlighet. 
37. Dessutom görs en mer ingående granskning av alla P- och F
 1 -djur (efter 
avvänjning) en gång i veckan, och kan då lämpligen utföras då djuret vägs 
för att minimera hanteringsstressen. Observationerna bör genomföras och 
registreras noggrant med hjälp av bedömningssystem som har fastställts av testlaboratoriet. Ansträngningar bör göras för att säkerställa att variationerna i testbetingelserna är minimala. Observationerna bör omfatta, men inte be ­
gränsas till, förändringar i hud, päls, ögon, slemhinnor, förekomst av sekret 
och utsöndringar samt autonom aktivitet (t.ex. tårflöde, piloerektion, pupills ­
torlek, ovanligt andningsmönster). Förändringar i gång, hållning, reaktion på hantering liksom förekomst av kloniska eller toniska rörelser, stereotypi 
(t.ex. överdrivet putsande, repetitivt cirklande) eller bisarrt beteende (t.ex. 
självstympning, baklängesgång) ska också registreras.
 ▼M5 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 869
 
Kroppsvikt och foder-/vattenkonsumtion  
38. P-djuren vägs på den första doseringsdagen och därefter minst en gång per 
vecka. Dessutom vägs P-honorna under laktationen på samma dagar som 
vägningen av ungarna i deras kullar (se punkt 44). Alla F  1 -djur vägs indi ­
viduellt vid avvänjningen (PND 21) och därefter minst en gång per vecka. Kroppsvikten registreras också på den dag då de når puberteten (avslutad 
preputial separation eller vaginal öppning). Alla djur vägs vid avlivningen. 
39. Under studien registreras foder- och vattenkonsumtionen (om testkemikalien 
administreras via dricksvatten) minst en gång i veckan på samma dagar som för djurens kroppsvikt (förutom under saminhysningen). Foderkonsumtion 
för varje bur med F
 1 -djur redovisas varje vecka med början vid urvalet till 
respektive kohort.  
Brunstcykler  
40. Preliminär information om testkemikalierelaterade effekter på brunstcykeln 
kan redan finnas tillgängliga genom tidigare toxicitetsstudier med upprepad 
dosering, och kan användas i utformningen av ett testkemikaliespecifikt 
protokoll för den utökade engenerationsstudien av reproduktionstoxicitet. Normalt startar bedömningen av brunstcykeln (vaginal cytologi) i början av behandlingsperioden och fortsätter tills bekräftelse på parning, eller i 
slutet av parningsperioden om 2 veckor. Om honorna har screenats för 
normala brunstcykler före behandlingen är det bra att fortsätta med utstryk när behandlingen påbörjas, men om det finns misstankar om icke-specifika effekter i början av behandlingen (till exempel en initial markant minskning 
av foderkonsumtion) kan djuren tillåtas att anpassa sig till behandlingen i 
upp till två veckor innan den två veckor långa utstryksperioden före hop ­
parning inleds. Om honans behandlingsperiod förlängs på detta sätt (dvs.till en 4-veckors behandling före parning) bör man överväga att köpa in yngre 
djur samt att förlänga hanens behandling före hopparning. När vaginala/ 
cervikala celler erhålls, bör försiktighet iakttas för att undvika skador på slemhinnan och följaktligen framkallande av skendräktighet (se hänvisning 10, 11). 
41. Vaginala utstryk bör undersökas dagligen för alla F
 1 -honor i kohort 1A, 
efter vaginal öppning tills det första förhornade utstryket registreras, för att bestämma tidsintervallet mellan dessa två händelser. Brunstcykler för alla F
 1 -honor i kohort 1A bör också övervakas under två veckor, med början 
runt PND 75. Om parning av F  1 -generationen blir nödvändig, kommer den 
vaginala cytologin i kohort 1B följas från tidpunkten för hopparning tills bevis på parning upptäcks.
 
Parning och dräktighet  
42. Utöver standardendpoints (t.ex.kroppsvikt, foderkonsumtion, kliniska iaktta ­
gelser, inklusive kontroller av dödlighet/sjuklighet), registreras datum för 
hopparning, datum för insemination och tidpunkt för förlossning och pre ­
coitalt intervall (hopparning till insemination) och dräktighetstid (insemina ­
tion till förlossning) beräknas. P-honorna bör undersökas noggrant i sam ­
band med förväntad nedkomst efter tecken på dystoki. Eventuella avvikelser 
i bobyggnad eller omvårdnad ska registreras.  ▼M5 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 870
 
43. Den dag då förlossning sker är laktationsdag 0 (LD 0) för moderdjuret och 
postnatal dag 0 (PND 0) för avkomman. Alternativt kan alla jämförelser 
också baseras på postkoital tid för att eliminera störning av postnatala utvecklingsdata genom skillnader i dräktighetstid, dock ska tidpunkten i förhållande till nedkomsten också registreras. Detta är särskilt viktigt när 
testkemikalien påverkar dräktighetstiden.
 
Parametrar för avkomman  
44. Varje kull bör undersökas så snart som möjligt efter nedkomsten (PND 0 
eller 1) för att fastställa ungarnas antal och kön, dödfödda, levande födda samt närvaron av grova anomalier (utvändigt synliga missbildningar, inklu ­
sive gomspalt, subkutana blödningar, onormal hudfärg eller -struktur, före ­
komst av navelsträng, brist på mjölk i magen, förekomst av torkat sekret). 
Vidare bör den första kliniska undersökningen av nyfödda omfatta en kva ­
litativ bedömning av kroppstemperatur, aktivitetstillstånd och reaktion på hantering. Ungar som påträffas döda på PND 0 bör undersökas, eller vid 
ett senare tillfälle undersökas avseende eventuella defekter och dödsorsak. 
Levande ungar räknas och vägs individuellt på PND 0 eller PND 1, och därefter regelbundet, t.ex.åtminstone PND 4, 7, 14 och 21. Kliniska under ­
sökningar som är lämpliga för djurens ålder bör upprepas när avkomman 
vägs, eller oftare om fallspecifika fynd har gjorts vid födseln. Tecken som noteras kan omfatta, men inte begränsas till, yttre missbildningar, föränd ­
ringar i hud, päls, ögon, slemhinnor, förekomst av sekret och utsöndringar 
samt autonom aktivitet. Förändringar i gång, hållning, reaktion på hantering 
liksom förekomst av kloniska eller toniska rörelser, stereotypi eller bisarrt beteende ska också registreras. 
45. Det anogenitala avståndet (AGD) hos varje unge bör mätas åtminstone vid 
ett tillfälle från PND 0 till PND 4. Ungarnas kroppsvikt bör samlas in under 
dagen för AGD-mätningen och AGD bör normaliseras till ett mått på ung ­
arnas storlek, företrädesvis kubikroten ur kroppsvikten (se hänvisning 12). Förekomsten av bröstvårtor/vårtgård bör kontrolleras på hanungarna PND 12 eller 13. 
46. För att upptäcka om könsmognad inträffar tidigt utvärderas alla utvalda F
 1 - 
djur dagligen avseende om balano-preputial separation eller vaginal öppning för hanar respektive honor inleds före den beräknade dagen för dessa end ­
points. Eventuella missbildningar i könsorganen, såsom långlivad vaginal 
tråd, hypospadi eller kluven penis, bör noteras. Könsmognad hos F
 1 -djur 
jämförs med fysisk utveckling genom bestämning av ålder och kroppsvikt vid balano-preputial separation eller vaginal öppning för hanar/honor var för sig (se hänvisning 13).
 
Bedömning av potentiell utvecklingsneurotoxicitet (kohorter 2A och 2B)  
47. 10 hanar och 10 honor i kohort 2A och 10 hanar och 10 honor i kohort 2B 
från varje behandlingsgrupp (för varje kohort: 1 hane eller 1 hona per kull; 
alla kullar representeras av minst 1 unge; slumpmässigt urval) ska användas för bedömning av neurotoxicitet. Kohort 2A-djur genomgår ett test med plötsliga ljud, ett testbatteri för funktionsobservation samt bedömningar av 
motorisk aktivitet (se punkterna 48–50) och neuropatologi (se punkterna 
74–75). Ansträngningar bör göras för att säkerställa att variationerna för
 ▼M5 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 871
 
samtliga testbetingelser är minimala och inte systematiskt relaterade till 
behandlingen. Bland de variabler som kan påverka beteendet är ljudnivån 
(t.ex. intermittent buller), temperatur, luftfuktighet, ljus, lukter, tid på dygnet och miljömässiga distraktioner. Resultaten från neurotoxicitetstesterna ska tolkas i förhållande till lämpliga historiska kontrollreferensintervall. Kohort 
2B-djur bör användas för neuropatologisk bedömning på PND 21 eller PND 
22 (se punkterna 74–75). 
48. Ett test med plötsliga ljud ska utföras på PND 24 (± 1 dag) med djur i 
kohort 2A. Dagen för testningen bör balanseras över behandlings- och kontrollgrupperna. Varje session består av 50 försök. Vid utförandet av 
test med plötsliga ljud, bör den genomsnittliga reaktionsamplituden på varje 
block med 10 försök (5 block med 10 försök) bestämmas, med optimerade testförhållanden för att ge tillvänjning inom sessionen. Dessa förfaranden bör vara förenliga med testmetod B.53 (se hänvisning 35). 
49. Vid en lämplig tidpunkt mellan PND 63 och PND 75 genomgår kohort 2A- 
djuren ett testbatteri för funktionsobservation samt ett automatiserat test av motorisk aktivitet. Dessa förfaranden bör vara förenliga med testmetoderna B.43 (se hänvisning 33) och B.53 (se hänvisning 35). Testbatteriet för 
funktionsobservation innehåller en noggrann beskrivning av djurets utseen ­
de, beteende samt funktionella integritet. Detta bedöms genom observatio ­
ner i buren, efter avlägsnande av en standardarena för observation (öppet fält) där djuret rör sig fritt och genom manipulativa tester. Testning bör 
utföras från den minst till den mest interaktiva. En lista med mått finns i 
tillägg 1. Alla djur bör observeras noga av utbildade observatörer som är omedvetna om djurens behandlingsstatus, med hjälp av standardiserade procedurer för att minimera variabiliteten mellan observatörer. Om möjligt 
är det lämpligt att samma observatör utvärderar djuren för ett givet test. Om 
detta inte är möjligt, krävs något bevis på tillförlitlighet mellan de olika observatörerna. För varje parameter i det beteendevetenskapliga testbatteriet ska explicita operativa definierade skalor och bedömningskriterier användas. 
Om möjligt bör objektiva kvantitativa mått utvecklas för observationsend ­
points som innebär subjektiv rangordning. Varje djur testas individuellt med avseende på motorisk aktivitet. Testperioden bör vara tillräckligt lång för att visa tillvänjning inom kontrollperioden. Motorisk aktivitet bör övervakas av 
en automatisk apparat för aktivitetsregistrering som bör kunna upptäcka 
både ökad och minskad aktivitet, (dvs. det referensvärde för aktivitet som mäts av apparaten bör inte vara så lågt att en upptäckt av minskning för ­
hindras och inte heller så högt att en upptäckt av ökning förhindras). Varje 
enhet bör testas genom standardförfaranden, för att så långt som möjligt säkerställa tillförlitlighet i driften mellan olika apparater och mellan olika dagar. I den mån det är möjligt bör behandlingsgrupperna balanseras mellan 
enheterna. Behandlingsgrupperna bör fördelas jämnt över testtiderna för att 
undvika störning av dygnsrytmer. 
50. Om befintlig information visar att det behövs andra typer av funktionstest ­
ning (t.ex. sensorisk, social, kognitiv) bör dessa integreras utan att äventyra integriteten för övriga utvärderingar som gjorts i studien. Om denna testning 
utförs på samma djur som använts för standardtest med plötsliga ljud, 
testbatteri för funktionsobservation och test av motorisk aktivitet, bör olika tester planeras för att minimera risken av att äventyra integriteten för dessa tester. Kompletterande förfaranden kan vara särskilt användbara när empi ­
risk observation, förväntade effekter eller mekanismer/tillvägagångssätt in ­
dikerar en viss typ av neurotoxicitet.
 ▼M5 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 872
 
Bedömning av potentiell utvecklingsimmunotoxicitet (kohort 3)  
51. På PND 56 (± 3 dagar) ska 10 hanar och 10 honor i kohort 3 från varje 
behandlingsgrupp (1 hane eller 1 hona per kull, alla kullar representerade av 
minst 1 unge, slumpmässigt utvald) användas i ett test av T-cellsberoende antikroppsresponser,dvs. den primära IgM-antikroppsresponsen på en T-cellsberoende antigen, såsom röda blodkroppar från får ( Sheep Red Blood 
Cells , SRBC) eller hemocyanin från nyckelhålssnäckor ( Keyhole Limpet 
Hemocyanin , KLH), i överensstämmelse med nuvarande immunanalysför ­
faranden (se hänvisning 14, 15). Responsen kan utvärderas genom att räkna särskilda plackbildande celler (PFC) i mjälten eller genom att bestämma 
titer av SRBC- eller KLH-specifika IgM-antikroppar i serum med Elisa, 
vid maximal respons. Maximala responser inträffar vanligtvis fyra (PFC- respons) eller fem (Elisa) dagar efter intravenös immunisering. Om den primära antikroppsresponsen analyseras genom räkning av plackbildande 
celler, är det tillåtet att utvärdera undergrupper av djur på olika dagar, 
förutsatt att undergruppsimmunisering och -avlivning är tidsinställda så att PFC räknas vid den maximala responsen, att undergrupperna innehåller lika många hanliga som honliga avkommor från alla dosgrupper, inklusive kont ­
roller, samt att undergrupperna utvärderas vid ungefär samma postnatala 
ålder.Exponering för testkemikalien ska fortsätta fram till dagen innan in ­
samlingen av mjältar för PFC-respons, eller serum för Elisa-test.
 
Uppföljande utvärdering av potentiell reproduktionstoxicitet (kohort 
1B) 
52. Kohort 1B-djur kan hållas på behandling efter PND 90 och avlas för att få 
fram en F  2 -generation, om det behövs. Hanar och honor i samma dosgrupp 
bör saminhysas (undvik att para ihop syskon) i upp till två veckor, med början på PND 90 eller senare, men senast PND 120. Förfarandena bör vara 
desamma som för P-djuren. Baserat på en sammanvägd bedömning kan det 
räcka med att avliva kullarna på PND 4, i stället för att följa dem fram till avvänjningen eller längre.
 
TERMINALA OBSERVATIONER  
Klinisk biokemi/hematologi  
53. Systemiska effekter bör övervakas hos P-djur. Blodprov från en definierad 
plats tas från tio slumpmässigt utvalda fastande P-hanar och -honor per 
dosgrupp vid avslutningen. De ska förvaras under lämpliga förhållanden och utsättas för partiell eller fullskalig hematologi, klinisk biokemi, test av T4 och TSH eller andra undersökningar som föranleds av testkemikali ­
ens kända biverkningsprofil (se OECD:s vägledning 151 [hänvisning 40]). 
Följande hematologiska parametrar bör undersökas: hematokrit, hemoglo ­
binkoncentration, erytrocytantal, totalt och differentierat leukocytantal, trom ­
bocytantal och blodkoagulationstid/-potential. Undersökningar av serum el ­
ler plasma bör omfatta glukos, totalkolesterol, urinämne, kreatinin, totalpro ­
tein och albumin, minst två enzymer som indikerar verkningar på leverceller (t.ex. alaninaminotransferas, aspartataminotransferas, alkaliskt fosfatas, gamma-glutamyltranspeptidas och sorbitoldehydrogenas). Mätningar av yt ­
terligare enzymer och gallsyror kan under vissa förhållanden ge användbar 
information. Dessutom kan man lagra blodet från samtliga djur för eventuell
 ▼M5 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 873
 
analys vid ett senare tillfälle för att klargöra tvetydiga effekter eller för att 
generera intern exponeringsdata. Om en andra parning av P-djur inte pla ­
neras ska blodprover tas strax innan, eller som en del av, förfarandet vid den planerade avlivningen. I de fall då djuren behålls bör blodprov samlas in några dagar innan djuren paras för andra gången. Om inte befintliga data 
från studier med upprepad dosering tyder på att parametern inte påverkas av 
testkemikalien, bör urinanalys genomföras före avslutningen och följande parametrar utvärderas: utseende, volym, osmolalitet eller specifik vikt, pH-värde, protein, glukos, blod och blodkroppar samt cellrester. Urin kan 
också samlas in för att övervaka utsöndring av testkemikalien och/eller 
metaboliter. 
54. Systemiska effekter bör också övervakas hos F
 1 -djur. Blodprov från en 
definierad plats tas från tio slumpvis utvalda fastande kohort 1A-hanar och -honor per dosgrupp vid avslutningen. De ska förvaras under lämpliga förhållanden och utsättas för vanlig klinisk biokemi, inklusive bedömning 
av serumnivåer för sköldkörtelhormon (T4 och TSH), bedömning av he ­
matologi (totalt och differentierat leukocytantal samt erytrocytantal) och urinanalys. 
55. På PND 4 obduceras överskottsungarna och man bör överväga mätning av 
koncentrationen av serumsköldkörtelhormon (T4). Vid behov kan neonatalt 
(PND 4) blod slås samman per kull för biokemiska analys och sköldkör ­
telhormonanalys. Blod samlas också in för T4- och TSH-analyser från avvanda djur som obduceras på PND 22 (F
 1 -ungar som inte valts ut till 
kohorter).  
Spermieparametrar  
56. Spermieparametrar bör mätas i alla P-generationshanar om det inte finns 
befintliga data som visar att spermieparametrar är opåverkade i en 90-da ­
garsstudie. Undersökning av spermieparametrar bör utföras på alla kohort 1A-hanar. 
57. Vid avslutningen registreras testikel- och bitestikelvikter för alla P- och F
 1 - 
hanar (kohort 1A). Minst en testikel och en bitestikel reserveras för en 
histopatologisk undersökning. Den återstående bitestikeln används för kvan ­
tifiering av spermiereserver från cauda epididymis (se hänvisning 16, 17). Dessutom samlas spermier från cauda epididymis (eller sädesledare) in med hjälp av metoder som minimerar skador för utvärdering av spermiemotilitet 
och -morfologi (se hänvisning 18). 
58. Spermiemotilitet kan antingen utvärderas omedelbart efter avlivningen eller 
registreras för senare analys. Den procentuella andelen av progressivt rörliga spermier kan antingen bestämmas subjektivt eller objektivt genom dators ­
tödd rörelseanalys (se hänvisning 19, 20, 21, 22, 23, 24). För utvärderingen 
av spermiemorfologi bör ett spermieprov från bitestikel (eller sädesledare) 
undersökas som fast eller vått preparat (se hänvisning 25), och minst 200 spermier per prov ska antingen klassificeras som normala (både huvud och mellanstycke/svans verkar vara normala) eller onormala. Exempel på mor ­
fologiska spermieavvikelser kan innefatta fusion, avskilda huvuden och 
defekta huvuden och/eller svansar (se hänvisning 26). Defekta eller stora spermiehuvuden kan tyda på brister i spermiation. 
59. Om spermieprover fryses, registreras analysen av fixerade utstryksprov och 
bilder av spermierörlighet vid tidpunkten för obduktionen (se hänvisning 27), efterföljande analys kan begränsas till kontroll- och högdoshanar. Om 
behandlingsrelaterade effekter observeras så bör också de lägre dosgrup ­
perna utvärderas.
 ▼M5 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 874
 
Obduktion  
60. Vid tidpunkten för avslutning eller förtida död obduceras P- och F  1 -djuren 
och undersöks makroskopiskt avseende eventuella strukturella abnormiteter 
eller patologiska förändringar. Särskild uppmärksamhet bör ägnas åt orga ­
nen i reproduktionssystemet. Ungar som avlivas humant i döende tillstånd och döda ungar ska registreras och, när de inte är utmärglade, undersökas 
avseende eventuella defekter och/eller dödsorsak samt bevaras. 
61. På vuxna P- och F
 1 -honor undersöks vaginala utstryk på dagen för obduk ­
tionen, för att fastställa brunstcykelns skede och möjliggöra korrelation med histopatologi i fortplantningsorganen. Livmodern hos alla P-honor (och F
 1 - 
honor, om tillämpligt) undersöks avseende förekomst och antal implanta ­
tionsställen på ett sätt som inte stör den histopatologiska utvärderingen.  
Organvikt och vävnadskonservering – vuxna P- och F  1 -djur  
62. Vid tidpunkten för avslutningen fastställs kroppsvikterna och organens våt ­
vikter som anges nedan från alla P-djur och alla F  1 -vuxna från relevanta 
kohorter (som beskrivs nedan), så snart som möjligt efter dissekeringen för 
att undvika uttorkning. Dessa organ bör därefter bevaras under lämpliga 
förhållanden. Om inte annat anges kan pariga organ vägas individuellt eller i kombination, i enlighet med det typiska utförandet för det berörda laboratoriet. 
— Livmoder (med äggledare och livmoderhals), äggstockar 
— Testiklar, bitestiklar (hela och cauda för de prover som används för 
spermieräkning) 
— Prostata (dorsolaterala och ventrala delar kombinerade). Försiktighet bör 
iakttas vid putsning av prostatakomplexet för att undvika punktion av de vätskefyllda blåsorna. I händelse av en behandlingsrelaterad effekt på 
total prostatavikt bör de dorsolaterala och ventrala segmenten noggrant 
dissekeras efter fixering och vägas separat. 
— Sädesblåsor med koagulerande körtlar och deras vätskor (som en enhet). — Hjärna, lever, njurar, hjärta, mjälte, tymus, hypofys, sköldkörtel (efter 
fixering), binjurarna och kända målorgan eller vävnader. 
63. Förutom de organ som anges ovan, bör prover av perifer nerv, muskel, 
ryggmärg, öga med synnerv, mag-tarmkanalen, urinblåsa, lunga, luftstrupe 
(med vidhängande sköldkörtel och bisköldkörtel), benmärg, sädesledaren (hanar), bröstkörtel (hanar och honor) och vagina bevaras under lämpliga förhållanden. 
64. För kohort 1A-djur vägs alla organ och bevaras för histopatologi. 
65. För utredning av pre- och postnatalt inducerade immunotoxiska effekter ska 
10 hanar och 10 honor i kohort 1A från varje behandlingsgrupp (1 hane eller 1 hona per kull, alla kullar representerade av minst 1 unge, slumpmäs ­
sigt utvald) genomgå följande vid avslutningen: 
— Vägning av lymfkörtlarna förknippade med och långt ifrån exponerings ­
vägen (förutom vikten på binjurar, tymus och mjälte, som redan utförts 
för alla kohort 1A-djur).
 ▼M5 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 875
 
— Analys av mjältlymfocytpopulationer (CD4+ och CD8+ T-lymfocyter, 
B-lymfocyter och naturliga mördarceller) genom att använda halva mjäl ­
ten, varvid den andra hälften av mjälten bevaras för histopatologisk utvärdering, 
Analys av mjältlymfocytsubpopulationer i icke-immuniserade (kohort 1A) 
djur kommer att avgöra om exponeringen är relaterad till en förändring i 
den immunologiska steady state-distribution av hjälparceller (CD4+) eller 
cytotoxiska (CD8+) tymus-härledda lymfocyter eller naturliga mördarceller (snabb respons på neoplastiska celler och patogener). 
66. Kohort 1B-djur bör få följande organ vägda och motsvarande vävnader 
bearbetade till blockstadiet: 
— Vagina (ej vägd). — Livmoder med livmoderhals. — Äggstockar. — Testiklar (minst en). 
— Bitestiklar. 
— Sädesblåsor och koagulerande körtlar. — Prostata. — Hypofys. — Identifierade målorgan. 
Histopatologi i kohort 1B ska genomföras om resultaten från kohort 1A är 
tvetydiga eller vid misstanke om reproduktions- eller endokrintoxiska äm ­
nen. 
67. Kohort 2A och 2B: Testning av utvecklingsneurotoxicitet (PND 21 eller 
PND 22 och vuxen avkomma). Kohort 2A-djur avlivas efter beteendetest ­
ning med registrering av hjärnvikter och en komplett neurohistopatologi i syfte att bedöma neurotoxicitet. Kohort 2B-djur avlivas på PND 21 eller PND 22 med registrering av hjärnvikter samt en mikroskopisk undersökning 
av hjärnan i syfte att bedöma neurotoxicitet. Perfusionsfixering krävs för 
kohort 2A-djur och finns som tillval för kohort 2B-djur, i enlighet med testmetod B.53 (se hänvisning 35).
 
Organvikt och vävnadskonservering – avvanda F  1 -djur  
68. Ungar som inte valts ut till kohorter, inklusive småväxta djur, avlivas efter 
avvänjningen på PND 22, om inte resultaten visar ett behov av ytterligare 
undersökningar i levande djur. Avlivade ungar obduceras vilket inkluderar en bedömning av reproduktionsorganen, såsom beskrivs i punkterna 62 och 63. På upp till 10 ungar per kön per grupp, från så många kullar som 
möjligt, bör hjärna, mjälte och tymus vägas och bevaras under lämpliga 
förhållanden. Dessutom kan bröstvävnaderna från dessa han- och honungar bevaras för ytterligare mikroskopisk analys (
 1 ) (se OECD:s vägledning 151 
[hänvisning 40]). Alla större avvikelser och målvävnader bör sparas för 
eventuell histologisk undersökning.  ▼M5 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 876  
( 1 ) Forskning har visat att bröstkörteln, framför allt i bröstkörtelns tidiga utveckling, är en 
känslig endpoint för östrogen verkan. Det rekommenderas att endpoints som involverar 
ungarnas mjölkkörtlar hos båda könen bör ingå i denna testmetod, när den har validerats.
 Histopatologi – P-djur  
69. En fullständig histopatologisk undersökning av de organ som anges i punk ­
terna 62 och 63 genomförs för alla högdos- och P-kontrolldjur. Organ som 
visar behandlingsrelaterade förändringar bör också undersökas hos alla djur i de lägre dosgrupperna för att hjälpa till att fastställa ett Noael-värde. Dessutom bör reproduktionsorganen hos alla djur som misstänks ha mins ­
kad fertilitet, t.ex. de som misslyckats med att para sig, bli dräktiga, be ­
frukta eller leverera frisk avkomma, eller för vilka brunstcykeln eller sper ­
mieantalet, rörligheten eller morfologin påverkats, samt alla större skador utvärderas histopatologiskt.
 
Histopatologi – F  1 -djur  
Kohort 1-djur  
70. En fullständig histopatologisk undersökning av de organ som anges i punk ­
terna 62 och 63 genomförs för alla högdos- och vuxna kohort 1A-kontroll ­
djur. Alla kullar bör representeras av minst 1 unge per kön. Organ och vävnader som visar behandlingsrelaterade förändringar samt alla större ska ­
dor bör också undersökas hos alla djur i de lägre dosgrupperna som hjälp 
för att fastställa ett Noael-värde. För utvärdering av pre- och postnatalt 
inducerade effekter på lymfoida organ bör också histopatologin på de in ­
samlade lymfkörtlarna och benmärgen utvärderas hos 10 hanar och 10 honor i kohort 1A vid sidan av en histopatologisk utvärdering av bräss, 
mjälte, och binjurar som redan har utförts för alla 1A-djur. 
71. Reproduktiva och endokrina vävnader från alla kohort 1B-djur bearbetade 
till blockstadiet som beskrivs i punkt 66, bör undersökas beträffande his ­
topatologi vid misstanke om reproduktions- eller endokrintoxiska ämnen. Även kohort 1B bör genomgå histologisk undersökning, om resultaten från 
kohort 1A är tvetydiga. 
72. Äggstockarna hos vuxna honor bör innehålla primordiala och växande fol ­
liklar samt gulkroppar, och därför bör en histopatologisk undersökning syfta till att göra en kvantitativ utvärdering av primordiala och små växande folliklar, liksom gulkroppar, hos F
 1 -honor. Antalet djur, äggstockssnittsval 
och snittprovstorlek ska vara statistiskt lämpliga för det utvärderingsför ­
farande som används. Follikelräkning kan först utföras på kontroll- och högdosdjur och i händelse av en negativ effekt på de senare bör lägre doser undersökas. Undersökningen bör innefatta räkning av antalet primordiala 
folliklar, vilken kan kombineras med små växande folliklar, för jämförelse 
av äggstockar från behandling och kontroll (se OECD:s vägledning 151 [hänvisning 40]). Gulkroppsbedömningen bör ske parallellt med brunst ­
cykeltestningen så att cykelns stadium kan tas i beaktande vid bedömning ­
en. Äggledare, livmoder och vagina undersöks för lämplig organtypisk 
utveckling. 
73. Detaljerade testikelhistopatologiska undersökningar genomförs på F
 1 -hanar 
för att identifiera behandlingsrelaterade effekter på testiklarnas differentie ­
ring och utveckling samt på spermatogenesen (se hänvisning 38). Om möj ­
ligt bör delar av rete testis undersökas. Bitestiklarnas caput, corpus och 
cauda samt sädesledaren undersöks för lämplig organtypisk utveckling, lik ­
som de parametrar som krävs för P-hanarna.  ▼M5 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 877
 
Kohort 2-djur  
74. Neurohistopatologi utförs för alla högdos- och kontrollkohort 2A-djur av 
varje kön efter avslutad neurobeteendetestning (efter PND 75, men inte efter 
PND 90). Hjärnhistopatologi utförs för alla högdos- och kontrollkohort 2B- djur av varje kön på PND 21 eller PND 22. Organ som visar behandlings ­
relaterade förändringar bör också undersökas hos alla djur i de lägre dos ­
grupperna som hjälp för att fastställa ett Noael-värde. För kohort 2A- och 
2B-djur granskas flera avsnitt från hjärnan för att möjliggöra undersökning av luktbulberna, hjärnbarken, hippocampus, basala ganglierna, talamus, hy ­
potalamus, mitthjärnan (thecum, tegmentum och hjärnstjälkarna), hjärnstam ­
men och lillhjärnan. Enbart för kohort 2A undersöks ögon (näthinnan och 
synnerven) och prover från perifer nerv, muskel och ryggmärg. Alla neu ­
rohistologiska förfaranden bör vara förenliga med testmetod B.53 (se hän ­
visning 35). 
75. Morfometriska (kvantitativa) utvärderingar bör utföras på representativa om ­
råden av hjärnan (homologa snitt väljs omsorgsfullt baserat på tillförlitliga 
mikroskopiska markörer) och kan inkludera linjära mätningar och/eller are ­
almätningar på specifika delar av hjärnan. Minst tre på varandra följande snitt bör tas vid varje markör (nivå) för att välja det mest homologa och 
representativa snittet för det specifika hjärnområde som ska utvärderas. 
Neuropatologen bör kunna bedöma om beredda snitt för mätning är homo ­
loga med andra i provuppsättningen, och därmed lämpar sig för integration, eftersom linjära mätningar i synnerhet kan förändras över en relativt kort 
sträcka (se hänvisning 28). Icke-homologa snitt bör inte användas. Även om 
målet är att ta prover från alla djur som är reserverade för detta ändamål (10/kön/dosnivå), kan ett mindre antal vara fullt tillräckligt. Dock anses prover från färre än 6 djur/kön/dosnivå generellt inte vara tillräckligt för 
tillämpning av denna testmetod. Stereologi kan användas för att identifiera 
behandlingsrelaterade effekter på parametrar såsom volym eller cellantal i specifika neuroanatomiska regioner. Under alla moment i prepareringen av vävnadsprover, från vävnadsfixering till dissektion av vävnadsprover, väv ­
nadsbehandling och färgning av utstryksglas bör man använda sig av en 
balanserad utformning, så att varje sats innehåller representativa prover från varje dosgrupp. När morfometriska eller stereologiska analyser används bör hjärnvävnaden ingjutas i lämpligt medium samtidigt på alla dosnivåer för att 
undvika krympning av artefakter i samband med långvarig förvaring i 
fixativ.
 
RAPPORTERING  
Data  
76. Data rapporteras individuellt och sammanfattas i tabellform. I förekom ­
mande fall bör, för varje testgrupp och varje generation, följande rappor ­
teras: antal djur i början av testet, antal djur som påträffats döda under testet 
eller som avlivats av humana skäl, tidpunkt för varje dödsfall eller avliv ­
ning, antal fertila djur, antal dräktiga honor, antal honor som föder en kull och antal djur som uppvisar tecken på toxicitet. En beskrivning av toxicitet, 
inklusive tidpunkt för första tecken, varaktighet och allvarlighetsgrad bör 
också rapporteras. 
77. Numeriska resultat ska utvärderas genom en lämplig och accepterad sta ­
tistisk metod. De statistiska metoderna bör väljas som en del av studie ­
utformningen och bör på lämpligt sätt hantera icke-normala data (t.ex.be ­
räkningsdata), censurerade data (t.ex.begränsad observationstid), 
icke-oberoende (t.ex. kulleffekter och upprepade mätningar) samt olika va ­
rianser. Generaliserade linjära blandade modeller och dos-responsmodeller
 ▼M5 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 878
 
täcker en bred klass av analytiska verktyg som kan vara lämpade för de data 
som genereras inom ramen för denna testmetod. Rapporten bör innehålla 
tillräckligt med information om analysmetoden och det datorprogram som används, så att en oberoende granskare/statistiker kan utvärdera/omvärdera analysen.
 
Utvärdering av resultaten  
78. Resultaten bör utvärderas i termer av de observerade effekterna, inklusive 
obduktion och mikroskopiska iakttagelser. Utvärderingen omfattar samban ­
det, eller brist på samband, mellan dosen och förekomst, frekvens och svårighetsgrad för missbildningar, inklusive större skador. Målorgan, ferti ­
litet, kliniska abnormiteter, reproduktions- och kullresultat, kroppsviktsför ­
ändringar, dödlighet och andra toxiska och utvecklingsmässiga effekter bör 
också bedömas. Särskild uppmärksamhet bör ägnas åt könsspecifika för ­
ändringar. Testkemikaliens fysikalisk-kemiska egenskaper och TK-data, 
när de är tillgängliga, inklusive överföring via placenta och mjölkutsönd ­
ring, bör beaktas vid utvärdering av testresultaten.
 
Testrapport  
79. Testrapporten bör innehålla följande information som erhålls i den nu ak ­
tuella studien från P-, F  1 - och F  2 -djur (i tillämpliga fall):  
Testkemikalie:  
— All relevant och tillgänglig information om testkemikaliens kemiska, 
toxikokinetiska och toxikodynamiska egenskaper. 
— Identifikationsuppgifter. — Renhetsgrad.
 
Vehikel (i förekommande fall):  
— Motivering för val av vehikel om annan än vatten.  
Försöksdjur:  
— Art och stam som används. 
— Djurens antal, ålder och kön. — Ursprung, inhysning, foder, bomaterial etc. 
— Djurens individuella vikt vid testets början. 
— Vaginalutstryksdata för P-honor innan behandlingen inleds (om uppgif ­
terna samlas in vid den tidpunkten). 
— Parningsregister för P-generationen som anger hanliga och honliga part ­
ner för en parning och parningens framgång. 
— Uppgift om ursprungskull för vuxna F
 1 -generationsdjur.  
Testbetingelser:  
— Grund för val av dosnivå. 
— Uppgifter om testkemikaliens sammansättning/foderberedning och upp ­
nådda koncentrationer.  ▼M5 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 879
 
— Beredningens stabilitet och homogenitet i vehikeln eller bäraren 
(t.ex.foder, dricksvatten) i blodet och/eller mjölken i enlighet med vill ­
koren för användning och förvaring mellan användningarna. 
— Uppgifter om administreringen av testkemikalien. — Omvandling från fodrets/dricksvattnets testkemikaliekoncentration 
(ppm) till uppnådd dos (mg/kg kroppsvikt/dag), om tillämpligt. 
— Uppgifter om foder- och vattenkvalitet (inbegripet fodersammansättning, 
om tillgängligt). 
— Detaljerad beskrivning av randomiseringsförfaranden för att välja ungar 
för avlivning och för att anvisa ungar till testgrupper. 
— Miljöförhållanden. 
— Förteckning över personal som utför undersökningen, inklusive 
yrkesutbildning.
 
Resultat (sammanfattning och individuella data för respektive kön och dos):  
— Foderkonsumtion, vattenförbrukning om tillgänglig, fodereffektivitet 
(kroppviktsökning per gram foder som konsumeras, med undantag av 
samhysningsperioden och under laktationen) samt testkemikalieförbruk ­
ning (för administration via foder/dricksvatten) för P- och F  1 -djur. 
— Absorptionsdata (om tillgängliga). — Kroppviktsdata för P-djur. — Kroppviktsdata för de valda F
 1 -djuren efter avvänjningen. 
— Tidpunkt för dödsfall under testet eller huruvida djuren överlevde fram 
till avslutningen. 
— Art, allvarlighetsgrad och varaktighet för kliniska observationer (huru ­
vida de är reversibla eller ej). 
— Hematologi, urinanalys och kliniska kemiska data inklusive TSH och 
T4. 
— Fenotypisk analys av celler från mjälte (T-, B-, NK-celler). — Benmärgens cellularitet. — Uppgifter om toxiska reaktioner. — Antal P- och F
 1 -honor med normal eller onormal brunstcykel samt 
cykelns varaktighet. 
— Tid för parning (precoitalt intervall, antal dagar mellan hopparning och 
parning). 
— Toxiska eller andra effekter på reproduktionen, inklusive antal och pro ­
centsatser för djur som parat sig, dräktighet, förlossning och laktation, 
för haninducerad dräktighet, för honor med tecken på dystoki/långvarig eller svår förlossning. 
— Dräktighetstid och, om uppgift finns, förlossningens varaktighet. — Antalet implantationer, kullstorlek och procentandelen hanungar. 
— Antal och procentandel av postimplantationsförlust, levande födda och 
dödfödda.
 ▼M5 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 880
 
— Data om kullvikt och ungvikt (hanar, honor och i kombination), antalet 
småväxta ungar om det fastställs. 
— Antal ungar med grava synliga missbildningar. — Toxiska eller andra effekter på avkomman, postnatal tillväxt, levnads ­
duglighet, etc. 
— Uppgifter om fysiska markörer hos ungar och andra postnatala 
utvecklingsdata. 
— Uppgifter om könsmognad hos F
 1 -djur. 
— Uppgifter om funktionsobservationer av ungar och vuxna, i tillämpliga 
fall. 
— Kroppsvikt vid avlivning och absoluta och relativa organviktsdata för P- 
och vuxna F  1 -djur. 
— Obduktionsfynd. 
— En detaljerad redogörelse av alla histopatologiska fynd. 
— Totalt spermieantal i cauda epididymis, procentandel progressivt rörliga 
spermier, procentandel morfologiskt normala spermier, och procentandel av spermier med varje identifierad abnormitet för P- och F
 1 -hanar. 
— Antal och mognadsstadier för de folliklar som finns i äggstockarna hos 
P- och F  1 -honor, i förekommande fall. 
— Uppräkning av gulkroppar i äggstockarna hos F  1 -honor. 
— Statistisk bearbetning av resultaten, i tillämpliga fall.  
Kohort 2 parametrar:  
— Detaljerad beskrivning av de förfaranden som används för att standar ­
disera observationer och förfaranden, samt operationella definitioner för att bedöma observationer. 
— Förteckning över samtliga testförfaranden, samt motivering för deras 
användning. 
— Närmare uppgifter om de beteendemässiga/funktionella, neuropatolo ­
giska och morfometriska förfaranden som används, inklusive infor ­
mation och detaljer om automatiserade enheter. 
— Rutiner för kalibrering och säkerställande av likvärdiga enheter och 
balansen mellan behandlingsgrupperna i testförfarandena. 
— Kort motivering som förklarar eventuella beslut som inbegriper en yr ­
kesmässig bedömning. 
— Detaljerad beskrivning av alla beteendemässiga/funktionella, neuropato ­
logiska och morfometriska resultat från respektive kön och dosgrupp, 
omfattande både ökningar och minskningar från kontroller. 
— Hjärnvikt. — Eventuella diagnoser som härrör från neurologiska symtom och skador, 
inklusive naturligt förekommande sjukdomar eller tillstånd. 
— Bilder på typiska exempel på fynd. 
— Lågupplösta bilder för att bedöma homologi i snitt som används för 
morfometri.
 ▼M5 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 881
 
— Statistisk bearbetning av resultaten, inklusive statistiska modeller som 
används för att analysera data, och resultaten, oavsett om de var signi ­
fikanta eller ej. 
— Samband med eventuella toxiska effekter till en slutsats om testkemika ­
liens neurotoxiska potential, efter kön och dosgrupp. 
— Påverkan av eventuell toxikokinetisk information på slutsatserna. 
— Data som stöder testmetodens tillförlitlighet och känslighet (dvs. posi ­
tiva och historiska kontrolldata). 
— Eventuella samband mellan neuropatologiska och funktionella effekter. 
— Noael eller referensdos för moderdjur och avkomma, för respektive kön 
och dosgrupp. 
— Diskussion om den övergripande tolkningen av data baserat på resulta ­
ten, inklusive en slutsats om huruvida kemikalien orsakat utvecklings ­
neurotoxicitet samt Noael.  
Kohort 3 parametrar:  
— IgM-antikroppstitrar i serum (sensibilisering mot SRBC eller KLH) eller 
IgM PFC-enheter i mjälte (sensibilisering mot SRBC). 
— TDAR-metodens prestanda bör därför bekräftas som en del av optime ­
ringsprocessen av laboratorier som inför testet för första gången, och 
med jämna mellanrum (t.ex. årligen) hos alla laboratorier. 
— Diskussion om den övergripande tolkningen av data baserat på resulta ­
ten, inklusive en slutsats om huruvida kemikalien orsakat utvecklings ­
immunotoxicitet samt Noael.  
Diskussion av resultaten  
Slutsatser, inbegripet Noael-värden för effekter på föräldrar och avkomma  
All information som inte erhållits under studien men som är användbara för 
tolkningen av resultaten (t.ex.likheter med effekter från alla kända neurotox ­
iska ämnen) bör också lämnas.  
Tolkning av resultaten  
80. En utökad engenerationsstudie av reproduktionstoxicitet ger information om 
verkningarna av upprepad exponering för en kemikalie under alla faser av reproduktionscykeln, vid behov. I synnerhet ger studien information om 
reproduktionssystemet och om utveckling, tillväxt, överlevnad och funktio ­
nella endpoints hos avkomma upp till PND 90. 
81. Tolkning av studiens resultat bör ta hänsyn till all tillgänglig information 
om kemikalien, inklusive fysikalisk-kemiska, TK och toxikodynamiska 
egenskaper, tillgängliga relevanta uppgifter om strukturella analoger, samt resultat från toxicitetsstudier som tidigare genomförts med testkemikalien (t.ex.akut toxicitet, toxicitet efter upprepad applikation, mekanistiska studier 
och studier som bedömer om det finns betydande kvalitativa och kvantita ­
tiva artskillnader för metaboliska egenskaper  in vivo /in vitro ). Obduktions- 
och organviktsresultat bör bedömas i samband med observationer gjorda i andra studier med upprepad dosering, när så är möjligt. Minskningar i 
avkommans tillväxt kan övervägas i relation till en påverkan av testkemi ­
kalien på mjölkens sammansättning (se hänvisning 29).
 ▼M5 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 882
 
Kohort 2 (utvecklingsneurotoxicitet)  
82. Neurobeteendemässiga och neuropatologiska resultat bör tolkas mot bak ­
grund av samtliga resultat, med hjälp av en metod som bygger på eviden ­
svärde och som involverar expertbedömning. Mönster hos beteendemässiga eller morfologiska fynd bör, om sådana finns, diskuteras, liksom belägg för dos-respons. Bedömningen av utvecklingsneurotoxicitet, inklusive mänsk ­
liga epidemiologiska studier eller fallrapporter, samt experimentella djur ­
studier (t.ex. toxikokinetiska data, struktur-aktivitetsinformation, data från andra toxicitetsstudier) bör ingå i denna karakterisering. Utvärderingen av data bör omfatta en diskussion om både den biologiska och statistiska 
signifikansen. Utvärderingen bör omfatta eventuella samband mellan obser ­
verade neuropatologiska och beteendemässiga förändringar. För vägledning om tolkningen av utvecklingsmässiga neurotoxiska resultat, se testmetod B.53 (se hänvisning 35) och Tyl et al., 2008 (se hänvisning 31).
 
Kohort 3 (utvecklingsimmunotoxicitet)  
83. Undertryckning eller förstärkning av immunfunktion bedömd genom TDAR 
(T-cellsberoende antikroppsrespons) bör utvärderas mot bakgrund av samt ­
liga iakttagelser som gjorts. Betydelsen av resultatet från TDAR kan stödjas av andra effekter på immunologiskt relaterade indikatorer (t.ex. benmärgens 
cellularitet, lymfvävnadens vikt och histopatologi, lymfocytdelmängdsför ­
delning). Effekter som fastställts genom TDAR kan vara mindre menings ­
fulla vid annan toxicitet som observerats vid lägre exponering. 
84. OECD:s vägledning 43 bör användas som stöd vid tolkningen av 
reproduktions- och neurotoxicitetsresultaten (se hänvisning 26).
 
HÄNVISNINGAR  
1. Cooper, R.L., J.C. Lamb, S.M. Barlow, K. Bentley, A.M. Brady, N. Doerr, 
D.L. Eisenbrandt, P.A. Fenner-Crisp, R.N. Hines, L.F.H. Irvine, C.A. 
Kimmel, H. Koeter, A.A. Li, S.L. Makris, L.P. Sheets, G.J.A. Speijers 
och K.E. Whitby (2006), ‘A Tiered Approach to Life Stages Testing for Agricultural Chemical Safety Assessment’,  Critical Reviews in Toxicology , 
36, 69–98. 
2. Thigpen, J.E., K.D.R. Setchell, K.B. Ahlmark, J. Locklear, T. Spahr, G.F. 
Leviness, M.F. Goelz, J.K. Haseman, R.R. Newbold, och D.B. Forsythe (1999), ‘Phytoestrogen Content of Purified Open and Closed Formula Laboratory Animal Diets’,  Lab. Anim. Sci. , 49, 530–536. 
3. Zoetis, T. and I. Walls (2003),  Principles and Practices for Direct Dosing 
of Pre-Weaning Mammals in Toxicity Testing and Research , ILSI Press, 
Washington, DC. 
4. Moser, V.C., I. Walls och T. Zoetis (2005), ‘Direct Dosing of Preweaning 
Rodents in Toxicity Testing and Research: Deliberations of an ILSI RSI 
Expert Working Group’,  International Journal of Toxicology , 24, 87–94. 
5. Conolly, R.B., B.D. Beck och J.I. Goodman (1999), ‘Stimulating Research 
to Improve the Scientific Basis of Risk Assessment’,  Toxicological Scien ­
ces, 49, 1–4. 
6. Ulbrich, B. och A.K. Palmer (1995), ‘Detection of Effects on Male Re ­
production – a Literature Survey’,  Journal of the American College of 
Toxicologists , 14, 293–327. 
7. Mangelsdorf, I., J. Buschmann and B. Orthen (2003), ‘Some Aspects 
Relating to the Evaluation of the Effects of Chemicals on Male Fertility’,  
Regulatory Toxicology and Pharmacology , 37, 356–369.
 ▼M5 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 883
 
8. Sakai, T., M. Takahashi, K. Mitsumori, K. Yasuhara, K. Kawashima, H. 
Mayahara och Y. Ohno (2000). ‘Collaborative work to evaluate toxicity on 
male reproductive organs by repeated dose studies in rats – overview of the studies’,  Journal of Toxicological Sciences , 25, 1–21. 
9. Creasy, D.M. (2003), ‘Evaluation of Testicular Toxicology: A Synopsis 
and Discussion of the Recommendations Proposed by the Society of Tox ­
icologic Pathology’,  Birth Defects Research , Part B, 68, 408–415. 
10. Goldman, J.M., A.S. Murr, A.R. Buckalew, J.M. Ferrell och R.L. Cooper 
(2007), ‘The Rodent Estrous Cycle: Characterization of Vaginal Cytology 
and its Utility in Toxicological Studies’,  Birth Defects Research , Part B, 
80 (2), 84–97. 
11. Sadleir, R.M.F.S. (1979), ‘Cycles and Seasons’, in C.R. Auston och R.V. 
Short (eds.),  Reproduction in Mammals: I. Germ Cells and Fertilization , 
Cambridge, New York. 
12. Gallavan, R.H. Jr, J.F. Holson, D.G. Stump, J.F. Knapp och V.L. Rey ­
nolds (1999), ‘Interpreting the Toxicologic Significance of Alterations in 
Anogenital Distance: Potential for Confounding Effects of Progeny Body Weights’,  Reproductive Toxicology,  13: 383–390. 
13. Korenbrot, C.C., I.T. Huhtaniemi och R.I. Weiner (1977), ‘Preputial Se ­
paration as an External Sign of Pubertal Development in the Male Rat’,  
Biological Reproduction , 17, 298–303. 
14. Ladics, G.S. (2007), ‘Use of SRBC Antibody Responses for Immunotox ­
icity Testing’,  Methods , 41, 9–19. 
15. Gore, E.R., J. Gower, E. Kurali, J.L. Sui, J. Bynum, D. Ennulat och D.J. 
Herzyk (2004), ‘Primary Antibody Response to Keyhole Limpet Hemo ­
cyanin in Rat as a Model for Immunotoxicity Evaluation’,  Toxicology , 
197, 23–35. 
16. Gray, L.E., J. Ostby, J. Ferrell, G. Rehnberg, R. Linder, R. Cooper, J. 
Goldman, V. Slott och J. Laskey (1989), ‘A Dose-Response Analysis of Methoxychlor-Induced Alterations of Reproductive Development and 
Function in the Rat’,  Fundamental and Applied Toxicology , 12, 92–108. 
17. Robb, G.W., R.P. Amann och G.J. Killian (1978), ‘Daily Sperm Produc ­
tion and Epididymal Sperm Reserves of Pubertal and Adult Rats’,  Journal 
of Reproduction and Fertility ,54, 103–107. 
18. Klinefelter, G.R., L.E. Jr Gray och J.D. Suarez (1991), ‘The Method of 
Sperm Collection Significantly Influences Sperm Motion Parameters Fol ­
lowing Ethane Dimethanesulfonate Administration in the Rat’.  Reproduc ­
tive Toxicology ,5, 39–44. 
19. Seed, J., R.E. Chapin, E.D. Clegg., L.A. Dostal, R.H. Foote, M.E. Hurtt, 
G.R. Klinefelter, S.L. Makris, S.D. Perreault, S. Schrader, D. Seyler, R. 
Sprando, K.A. Treinen, D.N. Veeramachaneni och L.D. Wise (1996), 
‘Methods for Assessing Sperm Motility, Morphology, and Counts in the Rat, Rabbit, and Dog: a Consensus Report’,  Reproductive Toxicology , 10, 
237–244. 
20. Chapin, R.E., R.S. Filler, D. Gulati, J.J. Heindel, D.F. Katz, C.A. Mebus, 
F. Obasaju, S.D. Perreault, S.R. Russell och S. Schrader (1992), ‘Methods for Assessing Rat Sperm Motility’,  Reproductive Toxicology , 6, 267–273. 
21. Klinefelter, G.R., N.L. Roberts och J.D. Suarez (1992), ‘Direct Effects of 
Ethane Dimethanesulphonate on Epididymal Function in Adult Rats: an  In 
Vitro  Demonstration’,  Journal of Andrology , 13, 409–421. 
22. Slott, V.L., J.D. Suarez och S.D. Perreault (1991), ‘Rat Sperm Motility 
Analysis: Methodologic Considerations’,  Reproductive Toxicology , 5, 
449–458.
 ▼M5 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 884
 
23. Slott, V.L. och S.D. Perreault (1993), ‘Computer-Assisted Sperm Analysis 
of Rodent Epididymal Sperm Motility Using the Hamilton-Thorn Motility 
Analyzer’,  Methods in Toxicology, Part A , Academic, Orlando, Florida. s. 
319–333. 
24. Toth, G.P., J.A. Stober, E.J. Read, H. Zenick och M.K. Smith (1989), ‘The 
Automated Analysis of Rat Sperm Motility Following Subchronic Epich ­
lorhydrin Administration: Methodologic and Statistical Considerations’,  
Journal of Andrology , 10, 401–415. 
25. Linder, R.E., L.F. Strader, V.L. Slott och J.D. Suarez (1992), ‘Endpoints 
of Spermatoxicity in the Rat After Short Duration Exposures to Fourteen 
Reproductive Toxicants’,  Reproductive Toxicology , 6, 491–505. 
26. OECD (2008),  Guidance Document on Mammalian Reproductive Toxicity 
Testing and Assessment , Series on Testing and Assessment, No. 43, ENV/ 
JM/MONO(2008)16, OECD, Paris. 
27. Working, P.K., M. Hurtt (1987), ‘Computerized Videomicrographic Ana ­
lysis of Rat Sperm Motility’,  Journal of Andrology , 8, 330–337. 
28. Bolin, B., R. Garman, K. Jensen, G. Krinke, B. Stuart, and an ad Hoc 
Working Group of the STP Scientific and Regulatory Policy Committee (2006), ‘A 'Best Practices' Approach to Neuropathologic Assessment in Developmental Neurotoxicity Testing – for Today’,  Toxicological Pathol ­
ogy, 34, 296–313. 
29. Stütz, N., B. Bongiovanni, M. Rassetto, A. Ferri, A.M. Evangelista de 
Duffard, och R. Duffard (2006), ‘Detection of 2,4-dichlorophenoxyacetic 
Acid in Rat Milk of Dams Exposed During Lactation and Milk Analysis of their Major Components’,  Food Chemicals Toxicology , 44, 8–16. 
30. Thigpen, JE, K.D.R. Setchell, J.K. Haseman, H.E. Saunders, G.F. Cavi ­
ness, G.E. Kissling, M.G. Grant och D.B. Forsythe (2007), ‘Variations in Phytoestrogen Content between Different Mill Dates of the Same Diet 
Produces Significant Differences in the Time of Vaginal Opening in 
CD-1 Mice and F344 Rats but not in CD Sprague Dawley Rats’,  Envi­
ronmental health perspectives,  115(12), 1717–1726. 
31. Tyl, R.W., K. Crofton, A. Moretto, V. Moser, L.P. Sheets och T.J. So ­
botka (2008), ‘Identification and Interpretation of Developmental Neuro ­
toxicity Effects: a Report from the ILSI Research Foundation/Risk Science 
Institute Expert Working Group on Neurodevelopmental Endpoints’,  Neu­
rotoxicology and Teratology , 30: 349–381. 
32. OECD (1996),  Combined Repeated Dose Toxicity Study with the Repro ­
duction/Developmental Toxicity Screening Test , OECD Guideline for Tes ­
ting of Chemicals, No. 422, OECD, Paris. 
33. Kapitel B.43 i denna bilaga, Test avseende neurotoxicitet på gnagare. 34. OECD (2000),  Guidance Document on the recognition, assessment, and 
use of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in safety evaluations , Series on Testing and Assessment, No. 19, ENV/JM/ 
MONO(2000)7, OECD, Paris. 
35. Kapitel B.53 i denna bilaga, Studie av utvecklingsneurotoxicitet. 36. Kapitel B.54 i denna bilaga, Uterotrof bioassay på gnagare: Ett korttids ­
screeningtest för östrogena egenskaper. 
37. Kapitel B.55 i denna bilaga, Hershbergers bioassay på råtta: Ett korttids ­
screeningtest för (anti-)androgena egenskaper.
 ▼M5 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 885
 
38. OECD (2009), Guidance Document for Histologic Evalution of Endocrine 
and Reproductive Test in Rodents, Series on Testing and Assessment, No. 
106, OECD, Paris. 
39. OECD (2011), Guidance Document on the Current Implementation of 
Internal Triggers in the Extended One Generation Reproductive Toxicity Study in the United States and Kanada, Series on Testing and Assessment, 
No. 117, ENV/JM/MONO(2011)21, OECD, Paris. 
40. OECD (2013), Guidance Document supporting TG 443: Extended One 
Generation Reproductive Toxicity Study, Series on Testing and Assess ­
ment, No. 151, OECD, Paris.
 ▼M5 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 886
 
Tillägg 1  
Mått och observationer som ingår i testbatteriet för funktionsobservation (kohort 2A)  
Bur & öppet område Manipulation Fysiologi  
Hållning Enkelt avlägsnande Temperatur 
Ofrivilliga kloniska & toniska rö ­
relser Lätthanterlighet Kroppsvikt 
Ögonlocksstängning Muskeltonus Pupillrespons 
Piloerektion Respons på närmande Pupillstorlek 
Salivavsöndring Respons på beröring Tårbildning Auditiv respons Läten Respons på nyp i svans Ungvårdnad Upprätningsrespons Gångrubbningar Fotspridning vid landning 
Upphetsning Frambensgreppstyrka 
Stereotypi Bakbensgreppstyrka Bisarrt beteende Fläckar Respiratoriska avvikelser
 ▼M5 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 887
 
Tillägg 2  
DEFINITIONER  
Kemikalie : Ett ämne eller en blandning.  
Testkemikalie : Alla ämnen eller blandningar som testas med denna testmetod.  ▼M5 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 888
 
B.57  H295R STEROIDOGENESTEST  
INLEDNING 
1. Denna testmetod motsvarar OECD:s testriktlinje (TG) 456 (2011). OECD 
inledde en högprioriterad verksamhet under 1998 för att se över befintliga, 
och ta fram nya, testriktlinjer för screening och testning av potentiellt hor ­
monstörande kemikalier. OECD:s konceptuella ram för testning och bedöm ­
ning av endokrinstörande kemikalier från 2002 består av fem nivåer, varje 
nivå motsvarar en annan nivå av biologisk komplexitet (se hänvisning 1). 
H295R steroidogenestestet  in vitro  (H295R) som beskrivs i denna testmetod 
använder en mänsklig adreno-karcinomcellinje (NCI-H295R-celler) och ut ­
gör ett  in vitro -test på nivå 2 som ger mekanistiska data och som ska 
användas för screenings- och prioriteringsändamål. Utvecklingen och stan ­
dardiseringen av testet som en screening av kemiska effekter på steroido ­
genes, särskilt produktionen av 17 β-östradiol (E2) och testosteron (T), ge ­
nomfördes i en flerstegsprocess. H295R- testet har optimerats och validerats 
(se hänvisning 2, 3, 4, 5). 
2. Syftet med H295R-steroidogenestestet är att upptäcka kemikalier som på ­
verkar produktionen av E2 och T. H295R-testet är avsedd att identifiera 
xenobiotika som har som sitt mål de endogena komponenter som utgör den intracellulära biokemiska väg som börjar med sekvensen av reaktioner från kolesterol till produktionen av E2 och/eller T. H295R-testet syftar inte till 
att identifiera kemikalier som påverkar steroidogenes beroende på effekter 
på hypotalamus-hypofys-gonad (HPG) axeln. Målet med testet är att ge svaret JA eller NEJ när det gäller en kemikalies potential att inducera eller hämma produktionen av T och E2, dock kan kvantitativa resultat erhållas i 
vissa fall (se punkterna 53 och 54). Testresultaten uttrycks som relativa 
förändringar i hormonproduktionen jämfört med kontroller med lösnings ­
medel. Testet syftar inte till att tillhandahålla specifik mekanistisk infor ­
mation om interaktionen av testkemikalien med det endokrina systemet. 
Forskning har bedrivits med användning av cellinjen för att identifiera 
effekter på specifika enzymer och intermediära hormoner såsom progesteron (se hänvisning 2). 
3. Definitioner och förkortningar som används i denna testmetod beskrivs i 
tillägget. Ett detaljerat protokoll, inklusive anvisningar om hur man bereder lösningar, odlar celler och utför olika aspekter av testet finns som tillägg 
I–III till OECD:s dokument  Multi-Laboratory Validation of the H295R 
Steroidogenesis Assay to Identify Modulators of Testosterone and Estradiol Production  (se hänvisning 4).
 
INLEDANDE ÖVERVÄGANDEN OCH BEGRÄNSNINGAR 
4. Fem olika enzymer som katalyserar sex olika reaktioner är involverade i 
biosyntesen för könssteroidhormon. Enzymatisk omvandling av kolesterol 
till pregnenolon med cytokrom P450 (CYP)-kolesterol-sidokedjeklyvnings ­
enzym (CYP11A) utgör det första steget i en serie av biokemiska reaktioner som kulminerar i syntesen av steroidslutprodukter. Beroende på ordnings ­
följden för de följande två reaktionerna klyvs den steroidogena syntesvägen 
i två banor, Δ
 5 -hydroxisteroidvägen och Δ 4 -ketosteroidvägen, som konver ­
gerar i produktionen av androstendion (figur 1). 
5. Androstendion omvandlas till testosteron (T) av 17 β-hydroxisteroid-dehyd ­
rogenas (17 β-HSD). Testosteron är både en intermediär och en hormonslut ­
produkt. Hos hanar kan T omvandlas till dihydrotestosteron (DHT) av 5 α- 
reduktas som finns i cellmembran, kärnhölje och endoplasmatiskt retikulum hos målvävnaderna för androgen verkan, såsom prostata och sädesblåsor. 
DHT är signifikant mer potent som en androgen än T och anses också vara 
en homonslutprodukt. H295R-testet mäter inte DHT (se punkt 10).
 ▼M5 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 889
 
6. Enzymet i den steroidogena vägen som omvandlar androgenkemikalier till 
östrogena kemikalier är aromatashämmare (CYP19). CYP19 konverterar T 
till 17β-östradiol (E2) och androstendion till östron. E2 och T anses vara 
hormonslutprodukter för den steroidogena vägen. 
7. Specificiteten hos CYP17:s lyasaktivitet skiljer sig för de intermediära sub ­
straten bland arterna. Hos människor gynnar enzymet substraten enligt Δ 5 - 
hydroxisteroid-reaktionsvägen (pregnenolon), medan substraten i Δ 4 -keto­
steroidvägen (progesteron) gynnas hos råttor (se hänvisning 19). Sådana skillnader i CYP17:s lyasaktivitet kan förklara vissa artberoende skillnader 
i reaktioner på kemikalier som förändrar steroidogenes  in vivo  (se hänvis ­
ning 6). H295-celler har visat sig bäst reflektera mänskliga vuxna adrena ­
lenzymuttryck och hormonproduktionsmönster (se hänvisning 20) men är 
kända för att uttrycka enzymer för både Δ
 5 -hydroxisteroid- och Δ 4 -keto­
steroidvägarna för androgensyntesen (se hänvisning 7, 11, 13, 15).  
Figur 1  
Steroidogen väg i H295R-celler
  
Anmärkning:  
Enzymer är kursiverade, hormoner i fetstil och pilar anger riktningen för 
syntesen. Grå bakgrund indikerar kortikosteroidvägar/-produkter. Könsstero ­
idvägar/-produkter är inringade. CYP = cytokrom P450, HSD = hydrox ­
isteroiddehydrogenas, DHEA = dehydroepiandrosteron. 
8. Den mänskliga H295R-adreno-karcinom-cellinjen är en användbar  in vitro - 
modell för undersökning av effekter på steroidhormonsyntesen (se hänvis ­
ning 2, 7, 8, 9, 10). H295R-cellinjen uttrycker gener som kodar för alla 
viktiga enzymer för steroidogenes som nämns ovan (se hänvisning 11, 15) (figur 1). Detta är en unik egenskap, eftersom  in vivo -uttryck hos dessa 
gener är vävnads- och utvecklingsstadiespecifika, och det är normalt ingen 
enskild vävnad eller enskilt utvecklingsstadium som uttrycker alla gener 
som är inblandade i steroidogenes (se hänvisning 2). H295R-celler har fysiologiska egenskaper som zonala odifferentierade humana fetala adrenala celler (se hänvisning 11). Cellerna representerar ett unikt  in vitro -system 
genom att de har förmågan att producera alla de steroidhormoner som finns 
i den vuxna binjurebarken och könskörtlarna, vilket medger testning av effekter på såväl kortikosteroidsyntesen och produktionen av könssteroid ­
hormoner såsom androgener och östrogener. Testet validerades dock endast 
för att detektera T och E2. Förändringar som registrerats av testsystemet i 
form av förändringar i produktionen av T och E2 kan vara resultatet av en
 ▼M5 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 890
 
mängd olika interaktioner av testkemikalier med steroidogena funktioner 
som uttrycks genom H295R-celler. Dessa inkluderar uttrycksmodulering, 
syntes eller funktion hos enzymer som är involverade i produktion, om ­
vandling eller eliminering av steroidhormoner (se hänvisning 12, 13, 14). Hämning av hormonproduktion kan bero på direkt konkurrerande bindning 
till ett enzym i syntesvägen, påverkan av samfaktorer som NADPH (niko ­
tinamidadenindinukleotidfosfat) och cAMP (cykliskt adenosinmonofosfat), och/eller ökning av steroidmetabolism eller undertryckande av genuttrycket hos vissa enzymer i steroidogenesens syntesväg. Även om inhibition kan 
vara en funktion av både direkta och indirekta processer involverade i 
hormonproduktionen, är induktion typiskt av en indirekt karaktär, genom att till exempel påverka samfaktorer såsom NADPH och cAMP (som i fallet med forskolin), minskande steroidmetabolism (se hänvisning 13) och eller 
uppreglering av ett steroidogent genuttryck. 
9. H295R-testet har flera fördelar: 
— Den möjliggör detektion av både ökningar och minskningar i produk ­
tionen av både T och E2. 
— Den gör det möjligt att direkt bedöma de potentiella effekterna av en 
kemikalie på cellviabilitet/cytotoxicitet. Detta är en viktig egenskap ef ­
tersom den gör det möjligt att skilja mellan effekter som beror på cytotoxicitet och effekter som beror på direkt interaktion av kemikalier 
via steroidogena syntesvägar, vilket inte är möjligt i vävnadsexplantat ­
system som består av flera celltyper med olika känslighet och funktioner. 
— Den kräver inte användning av djur. — H295R-cellinjen finns kommersiellt tillgänglig. 
10. De principiella begränsningarna för testet är följande: 
— Dess metaboliska kapacitet är okänd men förmodligen ganska begrän ­
sad. Därför kommer kemikalier som metaboliskt måste aktiveras troligen 
att saknas i detta test. 
— Eftersom H295R-enzymer härrör från adrenal vävnad har de förmågan 
att producera gluko- och mineralkortikoider såväl som könshormoner 
och därför kan effekter på produktionen av gluko- och mineralkortikoi ­
der påverka nivåerna av T-och E2 som observeras i testet. 
— Den mäter inte DHT och förväntas därför inte detektera kemikalier som 
hämmar 5 α-reduktas, i de fallen kan Hershbergers bioassay (se hänvis ­
ning 16) användas. 
— H295R-testet detekterar inte kemikalier som stör steroidogenes genom 
att påverka hypotalamus-hypofys-gonad-axeln (HPG) eftersom detta en ­
dast kan studeras hos intakta djur.
 
PRINCIP FÖR TESTMETODEN 
11. Syftet med testet är att upptäcka kemikalier som påverkar T- och E2-pro ­
duktionen. T är också en mellanprodukt i syntesvägen för E2. Testet kan 
detektera kemikalier som normalt hämmar eller inducerar enzymerna i ste ­
roidogenesens reaktionsväg.  ▼M5 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 891
 
12. Testet utförs vanligtvis under standardcellodlingsbetingelser i odlingsplattor 
med 24 hål. Alternativt kan andra plattstorlekar användas för att genomföra 
testet, men ympning och experimentella förhållanden bör justeras i enlighet därmed för att upprätthålla prestandakriteriernas efterlevnad. 
13. Efter en acklimatiseringsperiod på 24 timmar på flerhålsplattor exponeras 
cellerna under 48 timmar för sju koncentrationer av testkemikalien i minst tre replikat. Lösningsmedel och en känd inhibitor och inducerare av hor ­
monproduktion körs vid en bestämd koncentration som negativ och positiv 
kontroll. Vid slutet av exponeringsperioden avlägsnas mediet från varje hål. 
Cellviabiliteten i varje hål analyseras omedelbart efter att mediet tagits bort. Koncentrationer av hormoner i mediet kan mätas med många olika metoder inklusive kommersiellt tillgängliga hormonmätningsutrustningar och/eller 
instrumentella metoder, som till exempel vätskekromatografi-masspektro ­
metri (LC-MS). Data uttrycks som X-faldig förändring i förhållande till lösningsmedelskontrollen och den lägsta koncentrationen med observerad effekt (LOEC). Om testet är negativt, rapporteras den högsta testade kon ­
centrationen som nolleffektkoncentration (NOEC). Slutsatser om en kemi ­
kalies förmåga att påverka steroidogenes bör baseras på minst två obero ­
ende testomgångar. Den första testomgången kan användas för att bestämma dos med efterföljande justering av koncentrationer för omgång 2 och 3, i 
tillämpliga fall, om löslighets- eller cytotoxicitetsproblem påträffas eller 
kemikaliens aktivitet verkar vara i slutet av det testade koncentrationsintervallet.
 
ODLINGSFÖRFARANDE  
Cellinje  
14. NCI-H295R-celler finns kommersiellt tillgängliga från  American Type Cul ­
ture Collections  (ATCC) efter ett undertecknande av ett avtal om material ­
överföring ( Material Transfer Agreement , MTA) (  1 ). 
Inledning  
15. På grund av förändringar i den E2-producerande förmågan hos cellerna med 
ökande ålder/passager (se hänvisning 2) bör cellerna odlas efter ett särskilt protokoll innan de används och antalet passager sedan cellerna tinades såväl 
som passagenumret då cellerna frystes och placerades i förvaring i flytande 
kväve ska noteras. Den första siffran anger det faktiska cellpassagenumret och den andra siffran beskriver passagenumret då cellerna frystes och pla ­
cerades i lager. Till exempel ska celler som frysts efter passage fem och 
tinats och sedan delats tre gånger (4 passager om man räknar de nyligen upptinade cellerna som passage 1) efter att de odlats igen märkas passage 4.5. Ett exempel på ett numreringsschema återfinns i tillägg I till valide ­
ringsrapporten (se hänvisning 4). 
16. Lagringsmediet används som bas för det berikade mediet och frysmediet. 
Berikat medium är en nödvändig komponent för odling av celler. Frys ­
mediet är särskilt utformat för att medge opåverkad frysning av celler för 
långtidsförvaring. Före användning bör Nu-serum (eller ett jämförbart serum med samma egenskaper som har visat sig ge data som uppfyller testprestanda- och kvalitetskontrollkraven (QC)), som är en beståndsdel i 
berikade medier, analyseras för bakgrundskoncentrationer av T och E2. 
Beredningen av dessa lösningar beskrivs i tillägg II till valideringsrapporten (se hänvisning 4).
 ▼M5 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 892  
( 1 ) ATCC CRL-2128; ATCC, Manassas, VA, Förenta staterna, http://www.lgcstandards- 
atcc.org/
 17. Efter inledandet av en H295R-cellodling från en ursprunglig ATCC-sats, 
bör celler odlas i fem passager (dvs. cellerna delas 4 gånger). 
Passagefem-celler fryses sedan ner i flytande kväve för lagring. Innan cel ­
lerna fryses ner, körs ett urval av tidigare passagefyra-celler på en QC-platta (se punkt 36 och 37) för att kontrollera om den basala produktionen av 
hormoner och responsen på positiva kontrollkemikalier uppfyller kvalitets ­
kontrollkriterierna för testet enligt definitionen i tabell 5. 
18. H295R-celler måste odlas, frysas och lagras i flytande kväve för att säker ­
ställa att det alltid finns celler för lämplig passage/ålder för odling och 
användning. Det maximala antalet passager efter att ha tagit en ny (
 1 ) eller 
fryst (  2 ) sats av celler till odling som är godtagbart för användning i H295R- 
testet bör ej överstiga 10. Till exempel skulle godtagbara passager för odlingar av celler från ett parti fryst vid passage 5 vara 4.5 till 10.5. För 
celler som startades från dessa frysta partier bör det förfarande som beskrivs 
i punkt 19 följas. Dessa celler ska odlas i minst fyra (4) ytterligare passager (passage 4.5) innan de används för testning.
 
Utgångsceller från fryst lager  
19. Förfarandet för att starta celler från fryst lager ska användas när en ny sats 
av celler avlägsnas från lagringen i flytande kväve för odling och testning. Detaljer för detta förfarande framgår av tillägg III till valideringsrapporten 
(se hänvisning 4). Celler tas ut ur lagret med flytande kväve, tinas snabbt, 
placeras i berikat medium i ett centrifugrör, centrifugeras vid rumstempera ­
tur, återsuspenderas i berikat medium och överförs till en odlingskolv. Mediet bör bytas påföljande dag. H295R-cellerna odlas i en apparat för 
odling av bakterier vid 37 °C med 5 % CO
 2 i luftatmosfär och mediet 
förnyas 2–3 gånger per vecka. När cellerna når ca 85–90 % konfluens bör de delas. Uppdelning av cellerna är nödvändig för att säkerställa cel ­
lernas hälsa och tillväxt och för att bibehålla celler till bioassayer. Cellerna 
sköljs tre gånger med fosfatbuffrad saltlösning (PBS, utan Ca
 2+ Mg 2+. ) och 
släpps fria från odlingskolven genom tillsats av ett lämpligt lösgörande enzym, t.ex.trypsin i PBS (utan Ca
 2+ Mg 2+. ). Omedelbart efter att cellerna 
har lossats från odlingskolven bör enzymaktiviteten stoppas med tillsats av 
berikat medium med ett förhållande på 3 gånger den volym som använts vid 
enzymbehandlingen. Cellerna placeras i ett centrifugrör, centrifugeras vid rumstemperatur, supernatanten avlägsnas och pelleten av celler återsuspen ­
deras i berikat medium. Lämplig mängd av cellösningen placeras i den nya 
odlingskolven. Mängden cellösning bör justeras så att cellerna är utväxta 
inom 5–7 dagar. Det rekommenderade sub-odlingsförhållandet är 1:3 till 1:4. Plattan ska märkas noga. Cellerna är nu redo för att användas i testet och överskottet av celler bör frysas i flytande kväve, såsom beskrivs i 
punkt 20.
 ▼M5 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 893  
( 1 ) Med  ny sats  avses en ny sats av celler erhållna från ATCC. 
( 2 ) Med  fryst sats  avses celler som tidigare har odlats och sedan frysts vid ett annat labo ­
ratorium än ATCC.
 Frysning av H295R-celler (förberedning av celler för förvaring i fly ­
tande kväve)  
20. För att förbereda H295R-celler för frysning, bör det ovan beskrivna för ­
farandet för att dela celler följas fram till steget för återsuspendering av pelleten av celler i botten av centrifugröret. Här återsuspenderas pelleten av celler i frysmediet. Lösningen överförs till ett kryorör, märkt på lämpligt 
sätt, och fryses vid – 80 °C under 24 timmar, varefter kryoröret överförs till 
flytande kväve för lagring. Detaljer för detta förfarande framgår av tillägg III till valideringsrapporten (se hänvisning 4).
 
Utstrykning och förinkubation av celler för testning  
21. Antalet 24-hålsplattor, preparerade i enlighet med punkt 19, som kommer 
att behövas beror på hur många kemikalier som ska testas och cellernas konfluens i odlingsskålarna. Som en allmän regel, tillhandahåller en od ­
lingskolv (75 cm
 2 ) med 80–90 % konfluenta celler tillräckligt många celler 
för 1–1,5 (24-håls) platta med en måldensitet på 200 000 till 300 000 celler 
per ml medium som leder till cirka 50–60 % konfluens i hålen efter 24 timmar (figur 2). Detta är vanligtvis den optimala celldensiteten för hormon ­
produktion i testet. Vid högre densiteter förändras produktionsmönstret för 
T såväl som för E2. Innan man genomför testet för första gången, rekom ­
menderas det att man testar olika ympningsdensiteter på mellan 200 000 och 300 000 celler per ml och densiteten som resulterar i 50–60 % kon ­
fluens i hålen efter 24 timmar väljs för ytterligare försök.
 
Figur 2  
Mikrofoto av H295R-celler med en odlingstäthet på 50 % i en 24-håls odlingsplatta efter 
24 timmar som tagits vid kanten (A) och centrum (B) av ett hål
  
22. Mediet pipetteras från odlingskolven och cellerna sköljs 3 gånger med steril 
PBS (utan Ca  2+ Mg 2+ ). En enzymlösning (i PBS) tillsätts för att lösgöra 
cellerna från odlingskolven. När det gått en lämplig tid för cellerna att lossna bör enzymverkan stoppas med tillsats av berikat medium med ett förhållande på 3 gånger den volym som används för enzymbehandlingen. 
Cellerna placeras i ett centrifugrör, centrifugeras vid rumstemperatur, super ­
natanten avlägsnas och pelleten av celler återsuspenderas i berikat medium.
 ▼M5 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 894
 
Celldensiteten beräknas med t.ex. en hemocytometer eller cellräknare. Cel ­
lösningen späds till önskad plattodlingsdensitet och blandas noggrant för att 
säkerställa en homogen celltäthet. Cellerna sprids ut med 1 ml cellösning per hål och plattorna och hålen märks. De ympade plattorna inkuberas vid 37 °C med 5 % CO
 2 i luftatmosfär under 24 timmar för att tillåta cellerna 
att fästa i hålen.  
KRAV PÅ KVALITETSKONTROLL 
23. Det är viktigt att exakta volymer av lösningar och prover fördelas i hålen 
vid doseringen eftersom dessa volymer bestämmer de koncentrationer som används vid beräkningarna av testresultaten. 
24. Före inledning av cellodling och eventuell efterföljande testning, bör varje 
laboratorium visa känsligheten hos sitt hormonmätsystem (punkterna 29–31). 
25. Om antikroppsbaserade hormonmätningstester ska användas bör testkemi ­
kalierna, innan testningen inleds, analyseras för sin potential att störa det 
mätsystem som används för att kvantifiera T och E2 enligt beskrivningen i punkt 32. 
26. DMSO är det rekommenderade lösningsmedlet för testet. Om ett alternativt 
lösningsmedel används, ska följande fastställas: 
— Lösligheten av testkemikalien, forskolin och prokloraz i lösningsmedlet 
samt 
— cytotoxiciteten som en funktion av koncentrationen av lösningsmedlet. Det rekommenderas att den maximalt tillåtna koncentrationen lösningsmedel 
inte bör överskrida 10 gånger spädningen av den minst cytotoxiska kon ­
centrationen av lösningsmedlet. 
27. Innan testet genomförs för första gången, bör laboratoriet genomföra ett 
kvalificerande experiment som visar att laboratoriet kan bibehålla och uppnå lämpliga betingelser för cellodling och försök som krävs för kemisk prov ­
ning enligt punkterna 33–35. 
28. Vid inledning av testning med ett nytt parti, bör en kontrollodlingsplatta 
köras innan man använder en ny sats celler för att utvärdera prestandan hos 
de celler som beskrivs i punkterna 36 och 37.
 
Prestandan hos hormonmätsystemet  
Metodens känslighet, noggrannhet, precision och korsreaktivitet med prov ­
matris  
29. Varje laboratorium kan själva välja ett hormonmätsystem för analysen av 
produktionen av T och E2 med H295R-celler så länge det uppfyller pre ­
standakriterierna, inklusive kvantifieringsgränsen (LOQ). Nominellt är dessa 
100 pg/ml för T och 10 pg/ml för E2, vilket grundas på de basala hormon ­
nivåer som observerats i valideringsstudierna. Emellertid kan högre eller lägre nivåer vara lämpliga beroende på de basala hormonnivåer som upp ­
nåtts i det utförande laboratoriet. Innan starten av QC-platta och provom ­
gångar bör laboratoriet visa att hormontestet som ska användas kan mäta hormonhalter i berikat medium med tillräcklig noggrannhet och precision för att uppfylla de QC-kriterier som anges i tabellerna 1 och 5, genom att 
analysera berikat medium som spikats med en intern hormonkontroll. Be ­
rikat medium bör spikas med minst tre koncentrationer av varje hormon
 ▼M5 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 895
 
(t.ex.100, 500 och 2 500 pg/ml T; 10, 50 och 250 pg/ml av E2, eller de 
lägsta möjliga koncentrationerna baserade på detektionsgränserna för det 
valda hormonmätsystemet kan användas för de lägsta spikkoncentrationerna av T och E2) och analyseras. Uppmätta hormonkoncentrationer för icke-extraherade prover ska ligga inom 30 % av de nominella koncentratio ­
nerna, och variationen mellan upprepade mätningar av samma prov bör inte 
överstiga 25 % (se även tabell 8 för ytterligare QC-kriterier). Om dessa QC-kriterier uppfylls antas det att den valda hormonmätningstestet är till ­
räckligt noggrann och exakt och inte korsreagerar med komponenter i me ­
diet (provmatrisen) så att en betydande påverkan på testresultatet kan för ­
väntas. I detta fall krävs ingen extraktion av proverna före hormonmätning ­
arna. 
30. I fall QC-kriterierna i tabell 1 och 8 inte uppfylls, kan en betydande matris ­
effekt förekomma och ett experiment med extraherat spikat medium bör genomföras. Ett exempel på ett extraktionsförfarande beskrivs i tillägg II 
till valideringsrapporten (se hänvisning 4). Mätningar av hormonkoncent ­
rationer i de extraherade proverna bör göras med tre replikat (
 1 ). Om man 
efter extraktionen kan påvisa att komponenterna i mediet inte stör hormon ­
detekteringsmetoden såsom definieras av QC-kriterierna, bör alla ytterligare 
försök utföras med de extraherade proverna. Om QC-kriterierna inte kan uppfyllas efter extraktionen, är det använda hormonmätsystemet inte lämp ­
ligt för H295R-steroidogenestestet, och en alternativ hormondetekterings ­
metod bör användas.
 
Standardkurva  
31. Hormonkoncentrationerna i lösningskontrollerna (SC) bör ligga inom den 
linjära delen av standardkurvan. Företrädesvis bör SC-värdena ligga nära mitten av den linjära delen för att säkerställa att induktion och inhibering av hormonsyntesen kan mätas. Utspädningar av medium (eller extrakt) som ska 
mätas ska väljas i enlighet därmed. Det linjära förhållandet ska bestämmas 
med en lämplig statistisk metod.
 
Kemiskt interferenstest  
32. Om antikroppsbaserade analyser såsom enzymkopplade immunadsorberande 
analyser (Elisa) och radioimmunanalyser (RIA) ska användas för att mäta hormoner, bör varje kemikalie testas för potentiell störning av det hormon ­
mätsystem som ska användas före starten av den faktiska kemikalietest ­
ningen (tillägg III till valideringsrapporten [se hänvisning 4]), eftersom vissa kemikalier kan störa dessa tester (se hänvisning 17). Om störningar inträffar som är ≥ 20 % av den basala hormonproduktionen av T och/eller E2 som 
bestämts genom hormonanalys, bör  Chemical Hormone Assay Interference - 
testet (som beskrivs i tillägg III till valideringsrapporten [se hänvisning 4] avsnitt 5.0) utföras för alla utspädningar av testkemikaliestamlösning för att
 ▼M5 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 896  
( 1 ) Anm.:  Om extraktion krävs, utförs tre upprepade mätningar för varje extrakt. Varje prov 
extraheras endast en gång.
 identifiera den tröskeldos vid vilken betydande ( ≥ 20 %) interferens upp ­
träder. Om interferensen är mindre än 30 % kan resultaten korrigeras av ­
seende interferens. Om interferensen överstiger 30 % är data ogiltiga och ska kasseras vid dessa koncentrationer. Om betydande interferens av en testkemikalie med ett hormonmätsystem uppträder vid mer än en 
icke-cytotoxisk koncentration, bör ett annat hormonmätsystem användas. 
För att undvika störningar från förorenande kemikalier rekommenderas att hormoner extraheras från mediet med hjälp av ett lämpligt lösningsmedel, möjliga metoder finns i valideringsrapporten (se hänvisning 4).
 
Tabell 1  
Prestandakriterier för hormonmätsystem  
Parameter Kriterium  
Mätmetodens känslighet Kvantifieringsgränsen (LOQ) 
T: 100 pg/ml; E2: 10 pg/ml (  r ) 
Hormonextraktionseffektivitet (en ­
dast när extraktion behövs) De genomsnittliga återvinningsnivå ­
erna (baserat på mätning i tre repli ­
kat) för de spikade mängderna av hormon bör inte avvika mer än 
30 % från den mängd som tillsatts 
Kemisk interferens (endast anti ­
kroppsbaserade system) Ingen betydande ( ≥ 30 % av basal 
hormonproduktion av respektive hor ­
mon) korsreaktivitet med någon av 
de hormoner som produceras av cel ­
lerna ska inträffa (
 s ) ( t ) 
( r ) Anm.:  Metodens mätgränser baseras på de basala hormonproduktionsvärden som 
anges i tabell 5, och är prestationsbaserade. Om man kan uppnå ökad basal 
hormonproduktion så kan gränsen vara större. 
( s ) Vissa T- och E2-antikroppar kan korsreagera med androstendion och östron, re ­
spektive, vid en större procentandel. I sådana fall är det inte möjligt att exakt fastställa effekterna på 17 β-HSD. Däremot kan data fortfarande ge användbar infor ­
mation om effekterna på östrogen eller androgen produktion i allmänhet. I sådana 
fall bör data uttryckas som androgen/östrogen respons snarare än E2 och T. 
(
 t ) Dessa inkluderar: kolesterol, pregnenolon, progesteron, 11-deoxikortikosteron, 
kortikosteron, aldosteron, 17 α-pregnenolon, 17 α-progesteron, deoxikortisol, korti ­
sol, DHEA, androstendion, östron.  
Kvalifikationsprövning av laboratorium  
33. Före testning av okända kemikalier bör ett laboratorium visa att det kan 
uppnå och bibehålla de lämpliga cellodlings- och testbetingelser som krävs 
för ett framgångsrikt genomförande av testet, genom en kvalifikationspröv ­
ning av laboratoriet. Eftersom resultatet av ett test är direkt kopplat till den laboratoriepersonal som utför testet bör dessa förfaranden delvis upprepas 
om en förändring av laboratoriepersonal sker. 
34. Kvalifikationsprövningen ska genomföras med samma förutsättningar som 
anges i punkterna 38 till 40 genom att exponera celler för 7 ökande kon ­
centrationer av starka, måttliga och svaga inducerare och hämmare samt en negativ kemikalie (se tabell 2). Specifikt ska de kemikalier som testas 
inkludera den starka induceraren forskolin (CAS-nr 66575-29-9), den starka 
hämmaren prokloraz (CAS-nr 67747-09-5), den måttliga induceraren atrazin
 ▼M5 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 897
 
(CAS-nr 1912-24-9), den måttliga hämmaren aminoglutetimid (CAS-nr 125- 
84-8), den svaga induceraren (E2-produktion) och den svaga hämmaren (T- 
produktion) bisfenol A (CAS-nr 80-05-7) samt den negativa kemikalien mänskligt korioniskt gonadotropin (HCG) (CAS-nr 9002-61-3), såsom visas i tabell 2. Separata plattor odlas för alla kemikalier med användning av det 
format som visas i tabell 6. En QC-platta (tabell 4, punkterna 36–37) bör 
inkluderas vid varje daglig odling av kvalifikationskemikalierna.
 
Tabell 2  
Kvalifikationskemikalier och exponeringskoncentrationer  
Kvalifikationskemikalie Testkoncentrationer [ μM] 
Prokloraz 0 (  a ), 0,01, 0,03, 0,1, 0,3, 1, 3, 10 
Forskolin 0 (  a ), 0,03, 0,1, 0,3, 1, 3, 10, 30 
Atrazin 0 (  a ), 0,03, 0,1, 1, 3, 10, 30, 100 
Aminoglutetimid 0 (  a ), 0,03, 0,1, 1, 3, 10, 30, 100 
Bisfenol A 0 (  a ), 0,03, 0,1, 1, 3, 10, 30, 100 
HKG 0 (  a ), 0,03, 0,1, 1, 3, 10, 30, 100  
( a ) Lösningsmedel (DMSO)-kontroll (0), 1 μl DMSO/hål.  
Exponering av H295R för kvalifikationskemikalier bör utföras på 24-håls 
odlingsplattor vid laboratoriets kvalifikationsprövning. Doseringen är i μM 
för samtliga testkemikaliedoser. Doserna ska administreras i DMSO med 0,1 % v/v per hål. Alla testkoncentrationer bör testas i tre hål (tabell 6). Separata plattor odlas för varje kemikalie. En QC-platta inkluderas för varje 
daglig omgång. 
35. Cellviabilitets- och hormonanalys genomförs i enlighet med punkterna 42 
till 46. Tröskelvärdet (lägsta koncentration med observerad effekt, LOEC) 
och klassificeringsbeslut bör redovisas och jämföras med värdena i tabell 3. 
Uppgifterna anses godtagbara om de uppfyller LOEC och klassificerings ­
beslut i tabell 3.
 
Tabell 3  
Tröskelvärden (LOEC) och klassificeringsbeslut avseende kvalifikationskemikalier  
CAS-nr LOEC [μM] Klassificeringsbeslut 
T E2 T E2  
Prokloraz 67747-09-5 ≤ 0,1 ≤ 1,0 + (  a ) (inhibition) + (inhibition) 
Forskolin 66575-29-9 ≤ 10 ≤ 0,1 + (induktion) + (induktion) 
Atrazin 1912-24-9 ≤ 100 ≤ 10 + (induktion) + (induktion) 
Aminoglutetimid 125-84-8 ≤ 100 ≤ 100 + (inhibition) + (inhibition)  ▼M5 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 898
 
CAS-nr LOEC [μM] Klassificeringsbeslut 
T E2 T E2  
Bisfenol A 80-05-7 ≤ 10 ≤ 10 + (inhibition) + (induktion) 
HKG 9002-61-3 inte till ­
lämpligt inte till­
lämpligt Negativ Negativ  
( a ) +, positiv  
inte tillämpligt : inte tillämpligt eftersom inga ändringar inträffar efter exponering av icke-cytotoxiska kon ­
centrationer för negativ kontroll.  
Kvalitetskontrollplatta  
36. Kvalitetskontrollplattan (QC) används för att kontrollera prestanda hos 
H295R-celler under standardodlingsbetingelser, och för att upprätta en his ­
torisk databas för hormonkoncentrationer i lösningsmedelskontroller, posi ­
tiva och negativa kontroller, samt andra QC-mått över tiden. 
— H295R-cellprestandan bör bedömas med hjälp av en QC-platta för varje 
nytt ATCC-parti eller efter användningen av ett tidigare fryst lager av celler för första gången, om inte laboratoriets kvalifikationsprövning (punkterna 32–34) har genomförts med denna sats av celler. 
— En QC-platta ger en fullständig bedömning av de testförhållanden (t.ex. 
cellviabilitet, lösningsmedelkontroller, negativa och positiva kontroller, samt variation mellan och inom tester) när man testar kemikalier och bör ingå i varje testomgång. 
37. QC-provningen ska utföras på en 24-hålsplatta och följer samma förfaran ­
den som för inkubation, dosering, cellviabilitet/cytotoxicitet, hormonextrak ­
tion och hormonanalys som beskrivs i punkterna 38 till 46 för testning av kemikalier. QC-plattan innehåller blankämnen, lösningsmedelskontroller 
och två koncentrationer av en känd inducerare (forskolin, 1 μM, 10 μM) 
och hämmare (prokloraz, 0,1 μM, 1 μM) av E2- och T-syntes. Dessutom 
används MeOH i vissa hål som en positiv kontroll för viabilitets-/cytotoxicitetstestet. En detaljerad beskrivning av plattans utform ­
ning ges i tabell 4. De kriterier som ska uppfyllas för QC-plattan anges i 
tabell 5. Den minsta basala hormonproduktionen för T och E2 ska uppfyllas i både lösningsmedelskontrollen och blankhålen.
 
Tabell 4  
Kvalitetskontrollplattans utformning för att testa prestandan hos oexponerade H295R- 
celler och celler som utsätts för kända hämmare (PRO = prokloraz) och stimulatorer 
(FOR = forskolin) av E2- och T-produktion. Efter avslutning av exponeringsexperimentet och avlägsnande av mediet, tillsätts en 70 % metanollösning i samtliga MeOH-hål för att fungera som en positiv kontroll för cytotoxicitet (se cytotoxicitetstest i tillägg III till 
valideringsrapporten [hänvisning 4])
 
1 2 3 4 5 6  
A Blank (  a ) Blank (  a ) Blank (  a ) Blank (  a ) 
(+ MeOH) (  b ) Blank (  a ) 
(+ MeOH) (  b ) Blank (  a ) 
(+ MeOH) (  b ) 
B DMSO (  c ) 
1 μl DMSO (  c ) 
1 μl DMSO (  c ) 
1 μl DMSO (  c ) 
1 μl 
(+ MeOH) (  b ) DMSO (  c ) 
1 μl 
(+ MeOH) (  b ) DMSO (  c ) 
1 μl 
(+ MeOH) (  b ) ▼M5 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 899
 
1 2 3 4 5 6  
C FOR 1 
μM FOR 1 
μM FOR 1 
μM PRO 0,1 μM PRO 0,1 μM PRO 0,1 μM 
D FOR 10 
μM FOR 10 
μM FOR 10 
μM PRO 1 μM PRO 1 μM PRO 1 μM 
( a ) Celler i blankhål får endast medium (dvs. inget lösningsmedel). 
( b ) Metanol (MeOH) tillsätts efter att exponeringen har avslutats och mediet avlägsnas från dessa hål. 
( c ) DMSO-lösningsmedelskontroll (1 μl/hål).  
Tabell 5  
Prestandakriterier för kvalitetskontrollplatta  
T E2  
Basalproduktion av hor ­
monet i lösningsmedels ­
kontrollen (SC) ≥ 5 gånger LOQ ≥ 2,5 gånger LOQ 
Induktion (10 μM for­
skolin) ≥ 1,5 gånger SC ≥ 7,5 gånger SC 
Inhibition (1 μM proklo ­
raz) ≤ 0,5 gånger SC ≤ 0,5 gånger SC  
KEMISKT EXPONERINGSFÖRFARANDE 
38. De förinkuberade cellerna ska avlägsnas från inkubatorn (punkt 21) och 
kontrolleras i mikroskop för att säkerställa att de är i gott skick (fastsättning, 
morfologi) före doseringen. 
39. Cellerna placeras i ett biosäkerhetsskåp och det berikade mediet avlägsnas 
och ersätts med ett nytt berikat medium (1 ml/hål). DMSO är det lösnings ­
medel som föredras för denna testmetod. Men om det finns skäl att använda andra lösningsmedel bör den vetenskapliga grunden beskrivas. Cellerna 
exponeras för testkemikalien genom att 1 μl av lämplig stamlösning tillsätts 
DMSO (se tillägg II till valideringsrapporten [hänvisning 4]) per 1 ml berikat medium (hålvolym). Detta resulterar i en slutlig koncentration av 0,1 % DMSO i hålen. För att säkerställa adekvat blandning föredras i all ­
mänhet att den lämpliga stamlösningen av testkemikalien i DMSO blandas 
med berikat medium för erhållande av den önskade slutkoncentrationen för varje dos, och blandningen tillsätts varje hål omedelbart efter borttagandet av gammalt medium. Om detta alternativ används bör koncentrationen av 
DMSO (0,1 %) vara oförändrat för alla hål. De hål som innehåller de största 
två koncentrationerna bedöms visuellt, avseende bildning av fällningar eller grumlighet som en indikation på ofullständig löslighet av testkemikalien, med hjälp av ett stereomikroskop. Om sådana tillstånd (grumlighet, fäll ­
ningsformationer) observeras, granskas också de hål som innehåller de när ­
maste lägre koncentrationerna (och så vidare) och koncentrationer som inte helt löser sig undantas från vidare utvärdering och analys. Plattan återförs till inkubatorn vid 37 °C med 5 % CO
 2 i luftatmosfär under 48 timmar. 
Testkemikalieplattans utformning visas i tabell 6. Block 1–7 visar placering 
av ökande doser av testkemikalien.  ▼M5 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 900
 
Tabell 6  
Doseringsschema för exponeringen av H295R-celler för att testa kemikalier i en 24- 
hålsplatta  
1 2 3 4 5 6  
A DMSO DMSO DMSO Block 4 Block 4 Block 4 
B Block 1 Block1 Block 1 Block 5 Block 5 Block 5 
C Block 2 Block 2 Block 2 Block 6 Block 6 Block 6 
D Block 3 Block 3 Block 3 Block 7 Block 7 Block 7 
40. Efter 48 timmar tas exponeringsplattorna ut ur inkubatorn och varje hål 
kontrolleras i mikroskop avseende celltillstånd (fastsättning, morfologi, 
grad av konfluens) och tecken på cytotoxicitet. Mediet från varje hål delas 
i två lika stora mängder (cirka 490 μl vardera) och överförs till två separata 
rör märkta på lämpligt sätt (dvs. en alikvot för att ge ett extraprov för varje hål). För att förhindra cellerna från att torka ut, tas mediet bort en rad eller 
kolumn i taget och ersätts med mediet för cellviabilitets-/cytotoxicitetstestet. 
Om cellviabilitet/cytotoxicitet inte ska mätas direkt tillsätts 200 μl PBS med 
Ca
 2+ och Mg  2+ till varje hål. Mediet fryses vid – 80 °C tills vidare be ­
arbetning för analys av hormonkoncentrationer (se punkterna 44–46). Me ­
dan T och E2 i medium som lagras vid – 80 °C i allmänhet är stabila i 
minst 3 månader bör hormonstabiliteten under lagringen dokumenteras på varje laboratorium. 
41. Omedelbart efter avlägsnande av mediet bestäms cellviabilitet/cytotoxicitet 
för varje exponeringsplatta.
 
Cellviabilitetsbestämning  
42. Ett valfritt cellviabilitets-/cytotoxicitetstest kan användas för att bestämma 
den testkemikaliens potentiella effekt på cellernas livskraft. Testet bör kunna ge ett sant mått på andelen livsdugliga celler i ett hål eller det bör 
visas att det är direkt jämförbart med (en linjär funktion av) Live/Dead®- 
testet (se tillägg III till valideringsrapporten [hänvisning 4]). Ett alternativt test som har visat sig fungera lika bra är MTT [3-(4,5-dimetyltiazol-2-yl)- 2,5-difenyltetrazoliumbromid]-testet (se hänvisning 18). Bedömningen av 
cellviabiliteten med hjälp av ovanstående metoder är ett relativt mått som 
inte nödvändigtvis uppvisar linjära samband med det totala antalet celler i ett hål. Därför bör en subjektiv parallell visuell bedömning av varje hål genomföras av analytikern och digitala bilder av lösningsmedelskontroller 
och de två högsta icke-cytotoxiska koncentrationerna ska tas och arkiveras 
för att senare kunna bedöma sann celltäthet om det skulle krävas. Om det genom visuell inspektion eller om det framgår av viabilitets-/cytotoxicitetstestet att det tycks finnas en ökning av antalet celler 
måste den eventuella ökningen verifieras. Om en ökning av cellantalet 
verifieras bör detta anges i testrapporten. Cellernas livsduglighet uttrycks i förhållande till den genomsnittliga responsen i lösningsmedelskontroller, som anses vara 100 % viabla celler och beräknas som lämpliga för det 
cellviabilitets-/ cytotoxicitetstest som används. För MTT- testet kan följande 
formel användas:
 ▼M5 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 901
 
% viabla celler =  (respons i hål – genomsnittlig respons i 
MeOH-behandlade [= 100 % döda] hål) ÷ (genomsnittlig respons i 
SC-hål – genomsnittlig respons i MeOH-behandlade [= 100 % döda] hål) 
43. Hål med viabilitet lägre än 80 %, i förhållande till den genomsnittliga via ­
biliteten i SC (= 100 % viabilitet), bör inte ingå i den slutliga dataanalysen. 
Inhibering av steroidogenes som uppträder i närvaro av nästan 20 % cyto ­
toxicitet bör utvärderas noggrant för att säkerställa att cytotoxiciteten inte är orsaken till inhibitionen.
 
Hormonanalys  
44. Varje laboratorium kan använda ett valfritt hormonmätsystem för analysen 
av T och E2. Restalikvoter av medium från varje behandlingsgrupp kan 
användas för att bereda spädningar, för att hålla koncentrationen inom den linjära delen av standardkurvan. Som anges i punkt 29, bör varje laborato ­
rium påvisa överensstämmelsen mellan sitt hormonmätsystem (t.ex.Elisa, 
RIA, LC-MS, LC-MS/MS) och QC-kriterierna genom att analysera berikat 
medium spikat med en intern hormonkontroll innan QC-omgångarna eller testningen av kemikalierna genomförs. För att säkerställa att komponenterna i testsystemet inte stör mätningen av hormoner kan hormonerna behöva 
extraheras från mediet innan de mäts (se punkt 30 för de omständigheter 
under vilka en extraktion krävs eller ej). Det rekommenderas att man utför extraktion enligt förfarandena i tillägg III till valideringsrapporten (se hän ­
visning 4). 
45. Om ett kommersiellt testkit används för att mäta hormonproduktionen bör 
hormonanalysen utföras enligt de manualer som tillhandahålls av testkittill ­
verkaren. De flesta tillverkare har ett unikt förfarande för hur hormonana ­
lyserna ska genomföras. Spädning av prover behöver anpassas så att för ­
väntade hormonkoncentrationer för lösningsmedelskontroller ligger inom mitten i det linjära området för standardkurvan för det enskilda testet (till ­
lägg III till valideringsrapporten [se hänvisning 4]). Värden utanför den 
linjära delen av standardkurvan bör avvisas. 
46. Slutliga hormonkoncentrationer beräknas enligt följande: 
Exempel: 
Extraherat: 450 μl medium 
Beredd i: 250 μl testbuffert 
Utspädning i test: 1:10 (för att hålla provet inom det linjära 
området för standardkurvan) 
Hormonkoncentration i test: 150 pg/ml (redan justerad till koncent ­
ration per ml prov som testas) 
Återvinning: 89 % 
Slutlig hormonkoncentration = (Hormonkoncentration (per ml) ÷ åter ­
vinning) (spädningsfaktor) 
Slutlig hormonkoncentration = (150 pg/ml) ÷ (0,89) × (250 μl/450 μl) × 
10 = 936,3 pg/ml
 ▼M5 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 902
 
Val av testkoncentrationer  
47. Minst två oberoende omgångar av testet ska genomföras. Om det inte finns 
förhandsinformation, t.ex. om löslighetsgränser eller cytotoxicitet, som kan 
ligga till grund för valet av testkoncentrationer, rekommenderas att testkon ­
centrationerna för den inledande omgången fördelas med log  10 -intervaller 
med 10  –3 M som den högsta koncentrationen. Om kemikalien är löslig och 
inte är cytotoxisk vid någon av de testade koncentrationerna och den första 
omgången var negativ för alla koncentrationer, ska detta bekräftas i ytter ­
ligare en omgång med samma betingelser som i den första omgången (tabell 7). Om resultaten från den första omgången är  tvetydiga  (dvs. den X-faldiga 
förändringen är statistiskt signifikant från SC vid endast en koncentration) 
eller positiva (dvs. den X-faldiga förändringen för två eller flera intillig ­
gande koncentrationer är statistiskt säkerställd), ska testet upprepas enligt tabell 7 genom förfining av de valda testkoncentrationerna. Testkoncent ­
rationerna i omgång två och tre (i förekommande fall) ska justeras på 
grundval av resultaten från den inledande omgången, och intervallet ska inkludera de koncentrationer som gav en effekt varvid en 1/2-log koncent ­
rationsfördelning används (t.ex. om den ursprungliga omgången på 0,001 – 
0,01 – 0,1 – 1 – 10 – 100 – 1 000 μM resulterade i induktioner vid 1 och 
10 μM, bör de koncentrationer som testas i den andra omgången vara 0,1 – 
0,3 – 1 – 3 – 10 – 30 – 100 μM), såvida inte lägre koncentrationer måste 
användas för att fastställa ett LOEC-värde. I det senare fallet bör åtminstone 
fem koncentrationer under den lägsta testade koncentrationen i den första 
omgången ingå i den andra omgången, med användning av en 1/2-logskala. Om den andra omgången inte bekräftar den första omgången (dvs.statistisk signifikans inträffar inte vid den tidigare positivt testade koncentrationen 
± 1 koncentrationsökning), ska ett tredje försök utföras under de ursprung ­
liga testbetingelserna. Tvetydiga resultat i den första omgången betraktas som negativa om den observerade effekten inte kunde bekräftas i någon av de två efterföljande omgångarna. Tvetydiga resultat betraktas som positiva 
responser (effekt) när svaret kan bekräftas i ytterligare minst en omgång 
med en koncentrationsökning inom ± 1 (se avsnitt 55 beträffande datatolk ­
ning).
 
Tabell 7  
Beslutsmatris för möjliga utfallsscenarier  
Omgång 1 Omgång 2 Omgång 3 Beslut 
Scenario Beslut Scenario Beslut Scenario Positiv Negativ  
Negativ Bekräfta (  a ) Negativ Stoppa X 
Negativ Bekräfta (  a ) Positiv Förfina (  b ) Negativ X 
Tvetydig (  c ) Förfina (  b ) Negativ Bekräfta (  a ) Negativ X 
Tvetydig (  c ) Förfina (  b ) Negativ Bekräfta (  a ) Positiv X 
Tvetydig (  c ) Förfina (  b ) Positiv X 
Positiv Förfina (  b ) Negativ Bekräfta (  a ) Positiv X  ▼M5 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 903
 
Omgång 1 Omgång 2 Omgång 3 Beslut 
Scenario Beslut Scenario Beslut Scenario Positiv Negativ  
Negativ Bekräfta (  a ) Positiv Förfina (  b ) Positiv X 
Positiv Förfina (  b ) Positiv Stoppa X  
( a ) Bekräfta tidigare omgång med användning av samma experimentella upplägg. 
( b ) Ny testomgång med 1/2-log koncentrationsindelning (med ett intervall som inkluderar den koncentration som testades signi ­
fikant annorlunda i föregående experiment). 
( c ) X-faldig förändring vid en koncentration är statistiskt signifikant annorlunda jämfört med SC.  
Kvalitetskontroll av testplattan  
48. Förutom att uppfylla kriterierna för QC-plattan bör andra kvalitetskriterier 
som gäller för acceptabel variation mellan likadana hål, replikatexperiment, linjäritet och känslighet hos hormonmätsystem, variation mellan replikata hormonmätningar för samma prov samt procentuella utbyte av hormontop ­
par efter extraktion av medium (om tillämpligt, se punkt 30 om extraktions ­
krav) uppfyllas, och de anges i tabell 8. Data bör falla inom acceptabla gränser som definierats för varje parameter som ska beaktas för vidare utvärdering. Om dessa kriterier inte uppfylls, ska det på kalkylbladet noteras 
att QC-kriterierna inte uppfylldes för provet i fråga och provet ska analy ­
seras på nytt eller tas bort från datamängden.
 
Tabell 8  
Acceptabla områden och/eller variationer (%) för H295R-testplattans parametrar  
(LOQ : kvantifieringsgränsen för hormonmätsystemet. CV: Variationskoefficient. SC: 
Lösningsmedelskontroll. DPM: Sönderfall per minut)  
Jämförelse mellan T E2  
Basal hormonproduktion i 
SC X-faldig högre än LOQ ≥ 5-faldig ≥ 2,5-faldig 
Exponeringsexperiment – 
inom plattans CV för SC 
(replikathål) Absoluta koncentrationer ≤ 30 % ≤ 30 % 
Exponeringsexperiment – 
inom plattans CV för SC (replikathål) X-faldig förändring ≤ 30 % ≤ 30 % 
Hormonmätsystem – käns ­
lighet Detekterbar X-faldig 
minskning i förhållande 
till SC ≥ 5-faldig ≥ 2,5-faldig 
Hormonmätsystem – repli ­
kata mätningar CV för SC (
 a ) Absoluta koncentrationer ≤ 25 % ≤ 25 % 
Mediumextraktion – åter ­
vinning av intern 3H-stan ­
dard (om tillämpligt) DPM ≥ 65 % nominell  
( a ) Avser replikata mätningar för samma prov.  ▼M5 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 904
 
DATAANALYS OCH RAPPORTERING  
Dataanalys  
49. För att utvärdera den relativa ökningen/minskningen av en kemiskt föränd ­
rad hormonproduktion, bör resultaten normaliseras mot medelvärdet av 
SC-värdet för varje testplatta och resultaten bör uttryckas som förändringar i förhållande till SC för varje testplatta. All data är ska uttryckas som medelvärde ± 1 standardavvikelse (SD). 
50. Endast hormondata från hål där cytotoxiciteten var mindre än 20 % bör ingå 
i dataanalysen. Relativa förändringar bör beräknas på följande sätt:  
Relativ förändring =  (hormonkoncentration i varje hål) ÷ (medelvärde för 
hormonkoncentration i alla lösningsmedelskontrollhål). 
51. Om en visuell inspektion av hålet eller det viabilitets-/ cytotoxicitetstest som 
beskrivs i punkt 42 tyder på en ökning av antalet celler, måste den even ­
tuella ökningen verifieras. Om en ökning av cellantalet verifieras bör detta 
anges i testrapporten. 
52. Innan statistiska analyser genomförs, bör antaganden om normalitet och 
varianshomogenitet utvärderas. Normalitet bör utvärderas med hjälp av stan ­
dardsannolikhetsplotter eller annan lämplig statistisk metod (t.ex.Shapiro- 
Wilks-test). Om data (X-faldig förändring) inte är normalfördelade bör 
man pröva att transformera data för att approximera en normalfördelning. Om data är normalfördelade, eller approximerar en normalfördelning, bör skillnaderna mellan kemiska koncentrationsgrupper och SC analyseras med 
hjälp av ett parametriskt test (t.ex.Dunnetts test) med  koncentration  som den 
oberoende och  respons  (X-faldig förändring) som den beroende variabeln. 
Om data inte är normalfördelade bör ett lämpligt icke-parametriskt test 
användas (t.ex.Kruskal Wallis, Steel's Many-one rank test). Skillnaderna 
anses signifikanta vid  p ≤ 0,05. Statistiska utvärderingar görs baserade på 
medelvärden för varje hål som representerar oberoende replikata datapunk ­
ter. Det förväntas att, på grund av det stora mellanrummet mellan doserna i 
den första omgången (log
 10 -skala), det i många fall inte kommer att vara 
möjligt att beskriva tydliga koncentration-respons-samband där de två största doserna kommer att vara i den linjära delen av sigmoidkurvan. Därför kommer, för den första omgången eller andra datauppsättningar 
där detta inträffar (t.ex.där ingen maximal effekt kan uppskattas), fast rörlig 
statistik av typ I enligt ovan att tillämpas. 
53. Om fler än två datapunkter ligger på den linjära delen av kurvan och där 
maximal verkningsgrad kan beräknas – som förutses för några av de andra 
omgångarna som utförs med hjälp av ett semi-log avstånd mellan expone ­
ringskoncentrationer – bör en probit-, logit- eller annan lämplig regressions ­
modell användas för att beräkna effektiva koncentrationer (t.ex.EC50 och EC20). 
54. Resultaten bör ges både i grafiskt format (stapeldiagram som representerar 
medelvärdet ± 1 SD) och i tabellform (LOEC/NOEC, effektriktning och styrka för maximal respons som är en del av dos-responsdelen för data) (se figur 3 för ett exempel). Databedömning anses endast giltig om den har 
baserats på minst två oberoende genomförda omgångar. Försök eller om ­
gångar anses vara oberoende om de har genomförts på en annan dag med en ny uppsättning lösningar och kontroller. Det koncentrationsintervall som används i försök 2 och 3 (om det behövs) kan skräddarsys utifrån resultaten 
från försök 1 för att bättre definiera dos-responsområdet som innehåller 
LOEC (se punkt 47).
 ▼M5 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 905
 
Figur 3  
Exempel på presentation och utvärdering av data som erhållits under genomförandet av 
H295R-testet i grafisk form och i tabellform  
(Asterisker indikerar statistiskt signifikanta skillnader jämfört med lösningsmedelskontrollen 
(p < 0,05 ). LOEC: lägsta koncentration med observerad effekt. Maxförändring: maximal styrka 
hos responsen observerad vid någon koncentration i förhållande till den genomsnittliga 
SC-responsen (= 1))
  
Kemikalie LOEC Maxförändring  
Forskolin 0,01 0,15-faldig 
Letrozol 0,001 29-faldig  
Datatolkning  
55. En testkemikalie bedöms vara positiv om den X-faldiga induktionen är 
statistiskt skild ( p ≤ 0,05) från lösningsmedelskontrollen vid två intillig ­
gande koncentrationer i åtminstone två oberoende försök (tabell 7). En testkemikalie bedöms vara negativ efter två oberoende negativa försök, eller 
i tre försök, som består av två negativa försök och en tvetydig eller ett 
positiv försök. Om de data som genereras i tre oberoende försök inte upp ­
fyller de beslutskriterier som anges i tabell 7, är de experimentella resultaten inte tolkningsbara. Resultat från koncentrationer som överstiger gränserna 
för löslighet eller vid cytotoxiska koncentrationer bör inte ingå i tolkningen 
av resultaten.
 
Testrapport  
56. Testrapporten ska innehålla följande information:  
Testanläggning  
— Namn på anläggning och adress. 
— Försöksledaren och annan personal samt deras studieansvar. — Datum då studien började och slutade.
 ▼M5 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 906
 
Testkemikalie, reagens och kontroller  
— Identitet (namn/CAS-nr i förekommande fall), ursprung, partinummer, 
renhet, leverantör och karakterisering av testkemikalien, reagens och 
kontroller. 
— Testkemikaliens fysikaliska form och relevanta fysikalisk-kemiska 
egenskaper. 
— Förvaringsförhållanden samt metoden och frekvensen för beredningen 
av testkemikalier, reagenser och kontroller. 
— Testkemikaliens stabilitet.  
Celler  
— Ursprung och celltyper. 
— Antalet cellpassager (cellpassageidentifikator) för celler som används i 
testet. 
— Beskrivning av förfarandena för underhåll av cellkulturer.  
Förundersökningskrav (om tillämpligt)  
— Beskrivning av och resultat från den kemiska hormoninterferenstest. 
— Beskrivning av och resultat från mätningar av 
hormonextraktionseffektivitet. 
— Standard- och kalibreringskurvor för alla analystester som ska genom ­
föras. 
— Detektionsgränser för de valda analystesterna.  
Testbetingelser  
— Mediets sammansättning. 
— Testkemikaliens koncentration. 
— Celldensitet (beräknade eller uppmätta cellkoncentrationer vid 24 tim ­
mar och 48 timmar). 
— Testkemikaliens löslighet (löslighetsgräns, om fastställd). 
— Inkubationstid och villkor.  
Testresultat  
— Rådata för varje hål för kontroller och testkemikalier – varje mätresultat 
från replikat i form av de ursprungliga uppgifterna från det instrument 
som används för att mäta hormonproduktion (t.ex.OD, fluorescensenhe ­
ter, DPM, etc.). 
— Validering av normalitet eller beskrivning av datatransformation. — Responsmedelvärde ± 1 SD för varje hål som mätts. — Cytotoxicitetsdata (testkoncentrationer som orsakade cytotoxicitet). — Bekräftelse på att QC-kraven uppfylldes.
 ▼M5 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 907
 
— Relativ förändring jämfört med lösningsmedelskontroll korrigerad för 
cytotoxicitet. 
— Ett stapeldiagram som visar relativ (X-faldig förändring) vid varje kon ­
centration, SD och statistisk signifikans som anges i punkt 49–54.  
Tolkning av data  
— Tillämpa datatolkningsförfarandet på resultaten och diskutera 
iakttagelser.  
Diskussion  
— Finns det några indikationer i studien beträffande möjligheten att T/E2- 
data kan påverkas av indirekta effekter på gluko- och 
mineral-kortikosteroidbindande vägar?  
Slutsatser  
LITTERATUR  
1. OECD (2002), OECD Conceptual Framework for the Testing and Assess ­
ment of Endocrine Disrupting Chemicals, se tillägg 2 till kapitel B.54 i denna bilaga. 
2. Hecker, M., Newsted, J.L., Murphy, M.B., Higley, E.B., Jones, P.D., Wu, 
R. and Giesy, J.P. (2006), Human adrenocarcinoma (H295R) cells for 
rapid  in vitro  determination of effects on steroidogenesis: Hormone pro ­
duction,  Toxicol. Appl. Pharmacol.,  217, 114–124. 
3. Hecker, M., Hollert, H., Cooper, R., Vinggaard, A.-M., Akahori, Y., 
Murphy, M., Nellemann, C., Higley, E., Newsted, J., Wu, R., Lam, P., 
Laskey, J., Buckalew, A., Grund, S., Nakai, M., Timm, G., and Giesy, J. 
P. (2007), The OECD validation program of the H295R steroidgenesis assay for the identification of  in vitro  inhibitors or inducers of testosterone 
and estradiol production, Phase 2: inter laboratory pre-validation studies.  
Env. Sci. Pollut. Res ., 14, 23–30. 
4. OECD (2010),  Multi-Laboratory Validation of the H295R Steroidogenesis 
Assay to Identify Modulators of Testosterone and Estradiol Production , 
OECD Series of Testing and Assessment No. 132, ENV/JM/MO ­
NO(2010)31, Paris. Finns på: http://www.oecd.org/document/30/ 
0,3746,en_2649_34377_1916638_1_1_1 _1,00.html 
5. OECD (2010),  Peer Review Report of the H295R Cell-Based Assay for 
Steroidogenesis,  OECD Series of Testing and Assessment No. 133, ENV/ 
JM/MONO(2010)32, Paris. Finns på: http://www.oecd.org/document/30/ 0,3746,en_2649_34377_1916638_1_1_1 _1,00.html 
6. Battelle (2005), Detailed Review Paper on Steroidogenesis, finns på: http:// 
www.epa.gov/endo/pubs/edmvs/steroidogenesis_drp_final_3_29_05.pdf 
7. Hilscherova, K., Jones, P. D., Gracia, T., Newsted, J. L., Zhang, X., 
Sanderson, J. T., Yu, R. M. K., Wu, R. S. S. och Giesy, J. P. (2004), 
Assessment of the Effects of Chemicals on the Expression of Ten Steroi ­
dogenic Genes in the H295R Cell Line Using Real-Time PCR,  Toxicol. 
Sci., 81, 78–89. 
8. Sanderson, J. T., Boerma, J., Lansbergen, G. och Van den Berg, M. 
(2002), Induction and inhibition of aromatase (CYP19) activity by various 
classes of pesticides in H295R human adrenocortical carcinoma cells,  Tox­
icol. Appl. Pharmacol.,  182, 44–54. 
9. Breen, M.S., Breen, M., Terasaki, N., Yamazaki, M. och Conolly, R.B. 
(2010), Computational model of steroidogenesis in human H295R cells to 
predict biochemical response to endocrine-active chemicals: Model devel ­
opment for metyrapone,  Environ. Health Perspect.,  118: 265–272.
 ▼M5 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 908
 
10. Higley, E.B., Newsted, J.L., Zhang, X., Giesy, J.P. och Hecker, M. (2010), 
Assessment of chemical effects on aromatase activity using the H295R cell 
line, Environ. Sci. Poll. Res.,  17:1137–1148. 
11. Gazdar, A. F., Oie, H. K., Shackleton, C. H., Chen, T. R., Triche, T. J., 
Myers, C. E., Chrousos, G. P., Brennan, M. F., Stein, C. A. och La Rocca, R. V. (1990), Establishment and characterization of a human adrenocorti ­
cal carcinoma cell line that expresses Multiple pathways of steroid bio ­
synthesis,  Cancer Res.,  50, 5488–5496. 
12. He, Y.H., Wiseman, S.B., Zhang, X.W., Hecker, M., Jones, P.D., El-Din, 
M.G., Martin, J.W. och Giesy, J.P. (2010), Ozonation attenuates the ste ­
roidogenic disruptive effects of sediment free oil sands process water in 
the H295R cell line,  Chemosphere,  80:578–584. 
13. Zhang, X.W., Yu, R.M.K., Jones, P.D., Lam, G.K.W., Newsted, J.L., 
Gracia, T., Hecker, M., Hilscherova, K., Sanderson, J.T., Wu, R.S.S. och Giesy, J.P. (2005), Quantitative RT-PCR methods for evaluating 
toxicant-induced effects on steroidogenesis using the H295R cell line,  
Environ. Sci. Technol.,  39:2777–2785. 
14. Higley, E.B., Newsted, J.L., Zhang, X., Giesy, J.P. och Hecker, M. (2010), 
Differential assessment of chemical effects on aromatase activity, and E2 and T production using the H295R cell line,  Environ. Sci. Pol. Res.,  
17:1137–1148. 
15. Rainey, W. E., Bird, I. M., Sawetawan, C., Hanley, N. A., Mccarthy, J. L., 
Mcgee, E. A., Wester, R. och Mason, J. I. (1993), Regulation of human adrenal carcinoma cell (NCI-H295) production of C19 steroids,  J. Clin. 
Endocrinol. Metab.,  77, 731–737. 
16. Kapitel B.55 i denna bilaga: Hershbergers bioassay på råtta: Ett korttids ­
screeningtest för (anti)androgena egenskaper. 
17. Shapiro, R. och Page, L.B. (1976), Interference by 2,3-dimercapto-1- 
propanol (BAL) in angiotensin I radioimmunoassay,  J. Lab. Clin. Med.,  
2, 222–231. 
18. Mosmann, T. (1983), Rapid colorimetric assay for growth and survival: 
application to proliferation and cytotoxicity assays,  J. Immunol. Methods.,  
65, 55–63. 
19. Brock, B.J., Waterman, M.R. (1999). Biochemical differences between rat 
and human cytochrome P450c17 support the different steroidogenic needs 
of these two species, Biochemistry. 38:1598–1606. 
20. Oskarsson, A., Ulleras, E., Plant, K., Hinson, J. Goldfarb, P.S., (2006), 
Steroidogenic gene expression in H295R cells and the human adrenal gland: adrenotoxic effects of lindane in vitro, J. Appl. Toxicol., 
26:484–492.
 ▼M5 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 909
 
Tillägg  
DEFINITIONER  
Konfluens : avser täckningen eller spridningen för att cellerna tillåts över eller 
under hela odlingsmediet.  
Kemikalie : ett ämne eller en blandning.  
CV: avser variationskoefficienten, och definieras som kvoten mellan standard ­
avvikelsen för en distribution till sitt aritmetiska medelvärde.  
CYP : står för cytokrom P450 monooxygenaser, en familj av gener och enzymer 
som framställs från de som är involverade i katalysering av ett stort antal bio ­
kemiska reaktioner, inklusive syntes och metabolism av steroidhormoner.  
DPM : sönderfall per minut. Det är antalet atomer i en given mängd radioaktivt 
material som upptäcks ha avklingat under en minut.  
E2: 17β-östradiol, det viktigaste östrogenet hos däggdjur.  
H295R-celler : humana adreno-karcinomceller som har fysiologiska egenskaper 
som zonalt odifferentierade humana fetala adrenala celler och som uttrycker alla 
enzymer i steroidogenesens syntesväg. De är tillgängliga genom ATCC.  
Frysmedium : används för att frysa och lagra frysta celler. Det består av lager ­
medium samt BD NuSerum och dimetylsulfoxid.  
Linjärt område : det område inom den standardkurva för ett hormonmätsystem 
där resultaten är proportionella mot koncentrationen av analyten i provet.  
LOQ : står för  kvantifieringsgränsen , och är den lägsta mängd av en kemikalie 
som kan särskiljas från avsaknaden av denna kemikalie (ett tomt värde) inom ett 
angivet konfidensintervall. Vid tillämpning av denna metod definieras LOQ ty ­
piskt av tillverkaren av testsystemen, om inte annat anges.  
LOEC : lägsta koncentration med observerad effekt, den lägsta koncentrations ­
nivå vid vilken testsvaret är statistiskt skilt från det för lösningsmedelskontrollen.  
NOEC : nolleffektkoncentrationen, som är den högsta koncentration som testats 
om testet inte ger ett positivt svar.  
Passage : det antal gånger som cellerna uppdelas efter initiering av en kultur från 
fryst lager. Den inledande passagen som startades från det frysta lagret tilldelas 
nummer ett (1). Celler som delats 1 gång märks passage 2 etc.  
PBS: Dulbeccos fosfatbuffrade saltlösning.  
Kvalitetskontroll : förkortat QC, avser de mått som behövs för att säkerställa 
giltiga data.  
Kvalitetskontrollplatta : en 24-hålsplatta innehållande två koncentrationer av de 
positiva och negativa kontrollerna för att övervaka prestandan hos en ny sats celler, eller för att tillhandahålla positiva kontroller för testet vid testning av kemikalier.  
Omgång : ett oberoende experiment som kännetecknas av en ny uppsättning av 
lösningar och kontroller.
 ▼M5 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 910
 
Lagermedium : basen för beredning av andra reagenser. Den består av en 1:1- 
blandning av Dulbecco's Modified Eagle's Medium och Ham's F-12 Nutrient 
mixture (DMEM/F12) i 15 mM HEPES-buffert utan fenolrött eller natriumbikar ­
bonat. Natriumbikarbonat tillsätts som bufferten, se tillägg II till valideringsrap ­
porten (se hänvisning 4).  
Berikat medium : består av lagermedium samt BD Nu-Serum och ITS+ premi ­
ummix, se tillägg II till valideringsrapporten (se hänvisning 4).  
Steroidogenes : den syntetiska reaktionsvägen som leder från kolesterol till de 
olika steroidhormonerna. Flera mellanprodukter i steroidsyntesvägen, såsom pro ­
gesteron och testosteron, är viktiga hormoner i sig själva, men fungerar också som föregångare till hormoner senare i syntesvägen.  
T: står för testosteron, en av de två viktigaste androgenerna hos däggdjur.  
Testkemikalie : varje ämne eller blandning som testas med denna testmetod.  
Testplatta : den platta på vilken H295R-cellerna exponeras för testkemikalien. 
Testplattor innehåller lösningsmedelskontrollen och testkemikalien vid sju kon ­
centrationer i tre replikat.  
Trypsin 1X : en utspädd lösning av enzymet trypsin, ett pankreatiskt serinpro ­
teas, som används för att lossa celler från en cellodlingsplatta, se tillägg III till 
valideringsrapporten (se hänvisning 4).
 ▼M5 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 911
 
B.58  GENMUTATIONSTESTER I SOMATISKA CELLER OCH 
KÖNSCELLER HOS TRANSGENA GNAGARE  
INLEDNING 
1. Denna testmetod motsvarar OECD:s testriktlinje (TG) 488 (2013). 
EU-testmetoder finns tillgängliga för ett brett spektrum av  in vitro -muta­
tionstester som kan detektera kromosom- och/eller genmutationer. Det finns testmetoder för  in vivo -endpoints (dvs. kromosomförändringar och ej plan ­
enlig DNA-syntes) men dessa mäter inte genmutationer. Mutationstester 
med transgena gnagare (TGR) uppfyller behovet av praktiska och allmänt tillgängliga  in vivo -tester avseende genmutationer. 
2. TGR-mutationstesterna har granskats utförligt (se hänvisning 24, 33). De 
använder transgena råttor och möss som innehåller flera kopior av kromo ­
somalt integrerad plasmid- eller fagskyttelvektorer. Transgenerna innehåller 
reportergener för påvisande av olika typer av mutationer inducerade  in vivo  
av testkemikalier. 
3. Mutationer som uppstår hos en gnagare bedöms genom återvinning av 
transgenen och analys av reportergenens fenotyp i en värdbakterie som saknar reportergenen. TGR-genmutationstester mäter mutationer som indu ­
ceras i genetiskt neutrala gener återvunna från praktiskt taget alla vävnader 
hos gnagare. Dessa tester kringgår därför många av de befintliga begräns ­
ningarna i samband med studier av  in vivo -genmutation i endogena gener 
(t.ex. begränsade vävnader som är lämpliga för analys, negativ/positiv se ­
lektion mot mutationer). 
4. Den sammanvägda bedömningen tyder på att transgener svarar på mutagena 
ämnen på ett liknande sätt som endogena gener, särskilt när det gäller att 
upptäcka basparssubstitutioner, frameshift-mutationer och små deletioner och insertioner (se hänvisning 24). 
5. De internationella seminarierna om genotoxicitetstestning (IWGT) har ställt 
sig bakom införandet av TGR-genmutationstester för  in vivo -detektion av 
genmutationer, och har rekommenderat ett protokoll för deras genomförande 
(se hänvisning 15, 29). Denna testmetod baseras på dessa rekommendatio ­
ner. Ytterligare analys som stöder användningen av detta protokoll finns i (se hänvisning 16). 
6. I framtiden väntas det bli möjligt att kombinera ett TGR-genmutationstest 
med en toxikologisk studie med upprepad dosering (kapitel B.7 i denna bilaga). Men data som krävs för att säkerställa att känsligheten i 
TGR-genmutationstester inte påverkas av den kortare period (en dag) mel ­
lan administreringsperiodens slut och provtagningstiden som används i det toxikologiska testet med upprepad dosering, jämfört med de tre dagar som används i TGR-genmutationstester. Data krävs också för att visa att pre ­
standan hos analysen med upprepad dosering inte påverkas negativt av att 
använda en transgen gnagarstam snarare än traditionella gnagarstammar. När dessa uppgifter är tillgängliga kommer denna testmetod att uppdateras. 
7. Definitioner av centrala begrepp anges i tillägget.
 ▼M5 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 912
 
INLEDANDE ÖVERVÄGANDEN 
8. TGR-genmutationstester för vilka det finns tillräckliga data för att stödja 
användning i denna testmetod är:  lacZ  bakteriofag-mus (Muta™Mouse),  
lacZ plasmid-mus,  gpt- delta ( gpt och Spi  – )-mus och -råtta,  lacI -mus och 
-råtta (Big Blue®), som utförs under standardbetingelser. Dessutom kandet ­
positiva selektionstestet  cII användas för att utvärdera mutationer i Big 
Blue® och MutaäMouse-modeller. Mutagenes i TGR-modellerna bedöms 
normalt som mutantfrekvens om så krävs, dock kan molekylär analys av mutationer ge ytterligare information (se punkt 24). 
9. Dessa  in vivo -genmutationstest på gnagare är särskilt relevanta för att fast ­
ställa mutagena risker, eftersom testernas responser är beroende av  in vivo - 
metabolism, farmakokinetik, DNA-reparationsprocesser och 
DNA-translesionssyntes, även om dessa kan variera mellan olika arter, olika 
vävnader och olika typer av DNA-skador. Ett  in vivo -test för genmutationer 
är användbart för fortsatta undersökningar av en mutagen effekt detekterat av ett  in vitro -system, och för att följa upp resultaten från tester med andra  
in vivo -endpoints (se hänvisning 24). Förutom att vara kausalt förknippad 
med framkallandet av cancer, är genmutation en relevant endpoint för för ­
utsägelsen av mutationsbaserade icke-cancerogena sjukdomar i somatiska vävnader (se hänvisning 12, 13) samt sjukdomar som överförs via köns ­
celler. 
10. Om det finns bevis för att testkemikalien eller en relevant metabolit inte 
kommer att nå några av de aktuella vävnaderna, är det inte lämpligt att 
utföra ett TGR-genmutationstest.
 
PRINCIP FÖR TESTMETODEN 
11. I de tester som beskrivs i punkt 8 är målgenen av bakteriellt eller bakte ­
riofagt ursprung, och metoden för återvinning av genomiskt DNA från gnagare är via införlivande av transgenen in i en λ bakteriofag- eller 
plasmid-skyttelvektor. Proceduren involverar extraktion av genomiskt 
DNA från gnagarvävnaden,  in vitro -bearbetning av det genomiska DNA:t 
(dvs. packning av λ-vektorer eller ligering och elektroporering av plasmider 
för att återvinna skyttelvektorn) och efterföljande detektion av mutationer i bakterievärdar under lämpliga förhållanden. Testerna använder neutrala 
transgener som lätt kan återvinnas ur de flesta vävnader. 
12. Det grundläggande TGR-genmutationsexperimentet innebär behandling av 
gnagare med en kemikalie under en tidsperiod. Kemikalien kan administre ­
ras på varje sätt som är lämpligt, inklusive genom implantation (t.ex. me ­
dicinteknisk provning). Den totala tiden under vilken ett djur doseras kallas administreringsperioden. Administration följs vanligen av en period före 
avlivning då kemikalien inte administreras och då oreparerade 
DNA-skador fixeras till stabila mutationer. I litteraturen har denna period omväxlande kallats för manifestationstid, fixeringstid eller uttryckstid, och slutet av denna period är provtagningstiden (se hänvisning 15, 29). Då 
djuret har avlivats, isoleras genomiskt DNA från de berörda vävnaderna 
och renas.
 ▼M5 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 913
 
13. Data för en enstaka vävnad per djur från flera packningar/ligeringar är 
vanligtvis aggregerade och mutantfrekvensen utvärderas generellt med hjälp 
av sammanlagt mellan 10  5 och 10  7 plackbildande eller kolonibildande en ­
heter. Vid användning av positiva selektionsmetoder bestäms de totala plackbildande enheterna med en separat uppsättning icke-selektiva plattor. 
14. Positiva selektionsmetoder har utvecklats för att underlätta påvisande av 
mutationer i både  gpt- genen( gpt-deltamus och -råtta,  gpt
 – -fenotypen [se 
hänvisning 20, 22, 28]) och  lacZ- genen (Muta™Mouse eller  lacZ- plasmid­
mus [se hänvisning 3, 10, 11, 30]).  lacI- genmutationer hos Big Blue®-djur 
påvisas däremot med en icke-selektiv metod som identifierar mutanter ge ­
nom bildning av färgad (blå) plack. Positiva selektionsmetoder används också för att påvisa punktmutationer som uppstår i  cII-genen hos λ-bakte­
riofagskyttelvektorn (Big Blue®-mus eller -råtta, och Muta™Mouse [se 
hänvisning 17]) och deletionsmutationer i λ red-  och  gam -generna (Spi
 – - 
val i  gpt-deltamus och -råtta [se hänvisning 21, 22, 28]). Mutantfrekvens 
beräknas genom att antalet plack/plasmider som innehåller mutationer i 
transgenen divideras med det totala antalet utvunna plack/plasmider från 
samma DNA-prov. I TGR-genmutationsstudier är mutantfrekvensen den rapporterade parametern. Dessutom kan en mutationsfrekvens bestämmas 
som den fraktion av celler som bär oberoende mutationer. Denna beräkning 
kräver korrigering för klonal expansion genom sekvensering av de utvunna mutanterna (se hänvisning 24). 
15. De mutationer som bedöms i  lacI-, lacZ-, cII-  och gpt-punktmutationstes ­
terna består främst av basparssubstitutioner, frameshift-mutationer och små insertioner/deletioner. Den relativa andelen av dessa mutationstyper bland spontana mutationer liknar den som ses i den endogena  HPRT -genen. Stora 
deletioner påvisas endast med Spi
 – -selektionsanalys och  lacZ -plasmidtester 
(se hänvisning 24). Mutationer av intresse är  in vivo -mutationer som uppstår 
hos mus eller råtta.  In vitro-  och ex vivo -mutationer, som kan uppstå under 
fag-/plasmidåtervinning, replikation eller reparation, är relativt sällsynta och 
kan i vissa system identifieras specifikt, eller uteslutas av systemet med 
bakterievärd/positiv selektion.  
BESKRIVNING AV METODEN  
Förberedelser  
Val av djurart  
16. En mängd olika transgena genmutationsdetektionsmodeller för möss är till ­
gängliga och dessa system har i större utsträckning än transgena råttmodel ­
ler. Om råttan är en mer lämplig modell än musen (t.ex. när man undersöker 
mekanismen för carcinogenes för en tumör som endast ses hos råttor, för att 
korrelera med en toxicitetsstudie för råtta eller om råttmetabolism är känd för att vara mer representativ för människans ämnesomsättning) bör man överväga att använda transgena råttmodeller.
 
Inhysnings- och utfodringsförhållanden  
17. Den ideala temperaturen i djurutrymmet är 22 °C (± 3 °C). Den relativa 
fuktigheten bör vara minst 30 % och ska helst inte överstiga 70 % utom när 
rummet rengörs, målet är att upprätthålla en relativ luftfuktighet på 50–60 
%. Belysningen bör vara artificiell, med en daglig sekvens på 12 timmars  ▼M5 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 914
 
ljus, följt av 12 timmars mörker. För utfodring kan konventionellt labora ­
toriefoder användas med fri tillgång till dricksvatten. Valet av foder kan 
påverkas av behovet av att säkerställa en lämplig blandning av en testkemi ­
kalie när den administreras via fodret. Djur bör hållas i små grupper (högst fem) av samma kön, om inget aggressivt beteende kan förväntas. Djuren får 
hållas individuellt om det är vetenskapligt motiverat.
 
Förberedelse av djuren  
18. Friska, unga, sexuellt mogna vuxna djur (8–12 veckor gamla vid behand ­
lingsstarten) väljs slumpvis ut till kontroll- och behandlingsgrupperna. Dju ­
ren ska ha en unik identifiering. De bör vänjas vid förhållandena i labora ­
toriet under minst fem dagar. Burarna bör placeras så att eventuella effekter beroende på deras placering blir så små som möjligt. Vid studiens början bör viktskillnaderna mellan försöksdjuren vara minimal och inte överskrida 
± 20 % av medelvikten för varje kön.
 
Beredning av doser  
19. Fasta testkemikalier bör lösas upp eller suspenderas i lämpliga lösnings ­
medel eller vehiklar eller blandas i foder eller dricksvatten innan dosen 
administreras till djuren. Testkemikalier i flytande form kan doseras direkt 
eller spädas ut före doseringen. Vid inhalationsexponering kan testkemika ­
lier administreras som gas, ånga eller en fast/flytande aerosol, beroende på deras fysikalisk-kemiska egenskaper. Nygjorda beredningar av testkemika ­
lien bör användas om inte stabilitetsdata visar att lagringen är acceptabel.
 
Testbetingelser  
Lösningsmedel/vehikel  
20. Lösningsmedlet/vehikeln bör inte ge upphov till toxiska effekter vid de 
dosnivåer som används och bör inte kunna misstänkas för att reagera ke ­
miskt med testkemikalien. Om annat än välkända lösningsmedel/vehiklar 
används bör detta stödjas med referensdata som visar deras kompatibilitet. Det rekommenderas att i första hand använda vattenbaserade lösningsmedel/ vehiklar, om det är möjligt.
 
Positiva kontroller  
21. Jämsides behandlade positiva kontrolldjur bör normalt användas. För labo ­
ratorier som har visat kompetens (se punkt 23) och rutinmässigt använder dessa analyser kan dock DNA från djur som i tidigare experiment behand ­
lats som positiv kontroll ingå i varje studie för att bekräfta metodens fram ­
gång. Sådant DNA från tidigare experiment bör erhållas från samma art och vävnader av intresse, och bör förvaras på rätt sätt (se punkt 36). När jämsides behandlade positiva kontroller används, är det inte nödvändigt 
att administrera dem genom samma väg som testkemikalien, men de posi ­
tiva kontrollerna bör vara kända för att framkalla mutationer i en eller flera vävnader genom testkemikalien. Doserna med de positiva kontrollkemika ­
lierna bör väljas så att de ger svaga eller måttliga effekter som kritiskt 
bedömer resultaten och testets känslighet. Exempel på positiva kontroll ­
kemikalier och vissa av deras målvävnader finns i tabell 1.
 ▼M5 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 915
 
Tabell 1  
Exempel på positiva kontrollkemikalier och vissa av deras målvävnader  
Positiv kontrollkemikalie och 
CAS-nr Einecs-namn och Einecs-nr Egenskaper Mutationsmålvävnaden 
Råtta Mus  
N-etyl-N-nitrosourea 
[CAS-nr 759-73-9] N-etyl-N-nitrosourea 
[212-072-2] Direktverkande 
mutagen Lever, lunga Benmärg, kolon, ko ­
lonepitel, tarm, le ­
ver, lunga, mjälte, 
njure, ovariala gra ­
nulosa celler, han ­
liga könsceller 
Etylkarbamat (uretan) 
[CAS-nr 51-79-6] Uretan 
[200-123-1] Mutagen, kräver 
metabolism men producerar bara 
svaga effekter Benmärg, förmage, 
tunntarm, lever, lunga, mjälte 
2,4-diaminotoluen 
[CAS-nr 95-80-7] 4-metyl-m-fenylendia ­
min 
[202-453-1] Mutagen, kräver 
metabolism, även positiv i Spi
 - -testet Lever Lever 
Benso[a]pyren 
[CAS-nr 50-32-8] Benso[def]krysen 
[200-028-5] Mutagen, kräver 
metabolism Lever, buk ­
hinnenät, Benmärg, bröst, ko ­
lon, förmage, körtel ­
mage, hjärta, lever, 
lunga, hanliga köns ­
celler  
Negativa kontroller  
22. Negativa kontroller, behandlade med lösningsmedel eller endast vehikel, 
och i övrigt behandlade på samma sätt som behandlingsgrupperna, bör inkluderas för varje provtagningstillfälle. I avsaknad av historiska eller 
publicerade kontrolldata som visar att inga skadliga eller mutagena effekter 
induceras av det valda lösningsmedlet/vehikeln, bör obehandlade kontroller också inkluderas för varje provtagningstillfälle, för att fastställa acceptansen för vehikelkontrollen.
 
Kvalifikationsprövning av laboratorium  
23. Laboratoriets kompetens att utföra dessa tester bör fastställas genom demon ­
stration av förmågan att reproducera förväntade resultat från publicerade data (se hänvisning 24) för 1) mutantfrekvenser med positiva kontrollkemi ­
kalier (inklusive svaga responser) såsom de som anges i tabell 1, 
icke-mutagener, och vehikelkontroller samt 2) transgen återhämtning från 
genomiskt DNA (t.ex. packningseffektivitet).
 
Sekvensering av mutanter  
24. För regleringstillämpningar är DNA-sekvensering av mutanter inte nödvän ­
digt, i synnerhet där ett tydligt positivt eller negativt resultat erhålls. Dock 
kan sekvensdata vara användbara när hög interindividuell variation obser ­
veras. I dessa fall kan sekvensering användas för att utesluta möjligheten av jackpot eller klonala händelser, genom att identifiera andelen unika mutanter från en viss vävnad. Sekvensering av cirka 10 mutanter per vävnad per djur 
bör vara tillräckligt för att enkelt bestämma om klonala mutanter bidrar till 
mutantfrekvensen, sekvensering av så många som 25 mutanter kan vara
 ▼M5 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 916
 
nödvändig för att korrigera mutantfrekvensen matematiskt avseende klona ­
litet. Sekvensering av mutanter kan också övervägas när små ökningar i 
mutantfrekvens (dvs. som precis överskrider de obehandlade kontrollvär ­
dena) upptäcks. Skillnader i mutantspektrum mellan de mutanta kolonierna från behandlade och obehandlade djur kan ge stöd för en mutagen effekt (se 
hänvisning 29). Dessutom kan mutationsspektrum vara användbara för att 
utveckla hypoteser om mekanism. När sekvensering ska ingå som en del av studieprotokollet bör särskild försiktighet iakttas vid utformningen av så ­
dana studier, särskilt med avseende på antal mutanter som sekvenseras per 
prov, för att uppnå tillräcklig effekt enligt den statistiska modell som an ­
vänds (se punkt 43).
 
FÖRFARANDE  
Djurens antal och kön  
25. Antalet djur per grupp bör förutbestämmas så att det är tillräckligt för att ge 
den statistiska effekt som krävs för att upptäcka åtminstone en fördubbling i mutationsfrekvensen. Gruppstorlekarna bör vara på minst fem djur, men om den statistiska effekten är otillräcklig bör antalet djur ökas efter behov. 
Handjur bör normalt användas. Det kan finnas fall där enbart test av honor 
är motiverat, t.ex. vid provning av humana kvinnospecifika läkemedel eller vid utredning av specifikt kvinnlig metabolism. Om det finns betydande skillnader mellan könen i fråga om toxicitet eller ämnesomsättning måste 
både hanar och honor användas.
 
Administreringsperiod  
26. Baserat på observationer att mutationer ackumuleras för varje behandling 
krävs upprepad dosering med dagliga behandlingar under en period av 28 
dagar. Detta anses allmänt acceptabelt, både för att producera en tillräcklig 
ansamling av mutationer av svaga mutagener och för att ge en tillräcklig exponeringstid för att upptäcka mutationer i långsamt tillväxande organ. 
Alternativa behandlingsregimer kan vara lämpliga för vissa utvärderingar, 
och dessa alternativa doseringsscheman bör vara vetenskapligt motiverade i protokollet. Behandlingar bör inte vara kortare än den tid som krävs för fullständig induktion av alla relevanta metaboliserande enzymer, och kortare 
behandlingar kan göra det nödvändigt att ha flera olika provtagningstid ­
punkter som är lämpliga för organ med olika förökningshastigheter. I varje fall bör all tillgänglig information (t.ex. om allmän toxicitet eller metabo ­
lism och farmakokinetik) användas för att motivera ett protokoll, speciellt 
vid avvikelser från ovanstående standardrekommendationer. Även om det 
kan öka känsligheten bör behandlingstider längre än 8 veckor förklaras tydligt och motiveras, eftersom långa behandlingstider kan ge en påtaglig ökning i mutationsfrekvensen genom klonal expansion (se hänvisning 29).
 
Dosnivåer  
27. Dosnivåerna bör baseras på resultaten från en dosfinnande studie som mäter 
allmän toxicitet och som genomförts med samma exponeringsväg, eller på resultaten från befintliga subakuta toxicitetsstudier. Icke-transgena djur av 
samma gnagarstam kan användas för bestämning av dosintervall. I huvud ­
testet, för att få dosresponsinformation, bör en fullständig undersökning inkludera en negativ kontrollgrupp (se punkt 22) och minst tre, lämpligt fördelade dosnivåer, utom när gränsdosen har använts (se punkt 28). Den 
högsta dosen bör vara maximal tolererbar dos (MTD). Den högsta dosen 
definieras som den dos som framkallar tecken på toxicitet på ett sådant sätt
 ▼M5 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 917
 
att högre dosnivåer, baserade på en likadan doseringsregim, förväntas leda 
till dödsfall. Kemikalier med specifika biologiska verkningar vid låga 
icke-toxiska doser (såsom hormoner och mitogena substanser) och kemika ­
lier som uppvisar mättnad av toxikokinetiska egenskaper kan vara undantag från kriterierna för dosbestämning och bör utvärderas från fall till fall. Dessa 
dosnivåer bör täcka in ett intervall som sträcker sig från maximal till låg 
eller ingen toxicitet.
 
Gräns för högsta dos vid testning  
28. Om dosfinnande experiment eller befintliga data från besläktade gnagar ­
stammar tyder på att en behandlingsregim med minst gränsdosen (se nedan) 
inte ger några observerbara toxiska effekter, och om ingen genotoxicitet förväntas baserat på data från strukturellt besläktade kemikalier, anses det inte nödvändigt med ett fullständigt test med tre dosnivåer. För en admini ­
streringsperiod på 28 dagar (dvs. 28 dagliga behandlingar), ligger gräns ­
dosen på 1 000 mg/kg kroppsvikt/dag. För administreringsperioder på 14 dagar eller mindre, ligger gränsdosen på 2 000 mg/kg/kroppsvikt/dag (do ­
seringsscheman som skiljer sig från 28 dagliga behandlingar bör vara veten ­
skapligt motiverade i protokollet, se punkt 26).
 
Administrering av doser  
29. Testkemikalien administreras vanligtvis via sondmatning genom en mag ­
sond eller en lämplig intubationskanyl. I allmänhet bör den förväntade 
exponeringsvägen för människor beaktas vid utformningen av ett test. Där ­
för kan andra exponeringsvägar (t.ex. dricksvatten, subkutant, intravenöst, topiskt, inhalation, intratrakealt, foder eller implantation) vara acceptabla där de kan motiveras. Intraperitoneal injektion rekommenderas inte eftersom 
den inte är en fysiologiskt relevant exponeringsväg för människor. Den 
maximala vätskevolymen som kan administreras genom sondmatning eller injektion vid ett tillfälle beror på försöksdjurets storlek. Volymen bör inte överskrida 2 ml/100 g kroppsvikt. Användning av större volymer än så bör 
motiveras. Med undantag för irriterande eller frätande kemikalier, som nor ­
malt kommer att visa stegrade verkningar vid högre koncentrationer, bör variationer av testvolymen minimeras genom justering av koncentrationen för att säkerställa en konstant volym vid alla dosnivåer.
 
Provtagningstid  
Somatiska celler  
30. Provtagningstiden är en viktig variabel eftersom den bestäms av den period 
som krävs för att mutationer ska fixeras. Denna period är vävnadsspecifik och förefaller vara relaterad till cellpopulationens omsättningstid, där ben ­
märg och tarm ger en snabb respons och levern en mycket långsammare. En 
lämplig kompromiss för mätning av mutantfrekvenser på både snabbt och långsamt växande vävnader är dagliga behandlingar under 28 dagar i följd (såsom anges i punkt 26) och provtagning tre dagar efter den sista behand ­
lingen, även om den maximala mutantfrekvensen kanske inte visar sig i 
långsamt växande vävnader under dessa förhållanden. Om långsamt vä ­
xande vävnader är av särskild betydelse, kan en senare provtagningstid på 28 dagar efter 28 dagars administreringsperiod vara lämpligare (se hänvis ­
ning 16, 29). I sådana fall kan den senare provtagningstiden ersätta 3- 
dagarsprovtagningstiden och kräver vetenskaplig motivering.
 ▼M5 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 918
 
Könsceller  
31. TGR-tester är väl lämpade för studier av genmutationsinduktion i hanliga 
könsceller (se hänvisning 7, 8, 27), där tidpunkten och kinetiken för sper ­
matogenes är väldefinierade (se hänvisning 27). De låga antalet ägg till ­
gängliga för analys, även efter superovulation, och det faktum att det inte finns någon DNA-syntes i oocyten, utesluter bestämning av mutationer i 
honliga könsceller genom transgentester (se hänvisning 31). 
32. Provtagningstiderna för hanliga könsceller bör väljas så att alla exponerade 
celltyper under könscellsbildningen provtas och så att det stadium som 
provtagningen är inriktad på har fått tillräcklig exponering. Den tid det tar för könsceller att utvecklas från spermatogoniestamceller till mogna 
spermier som når sädesledare/cauda epididymis är ca 49 dagar för mus 
(se hänvisning 36) och ca 70 dagar för råtta (se hänvisning 34, 35). Efter en 28-dagars exponering med en efterföljande tredagars provtagningsperiod kommer de ackumulerade spermier som samlats in från sädesledaren/cauda 
epididymis (se hänvisning 7, 8) att utgöra en population av celler som 
exponerats under ungefär den senare hälften av spermatogenesen, vilket inkluderar den meiotiska och postmeiotiska perioden men inte den sper ­
matogonieperioden eller stamcellsperioden. För att adekvat ta prov på celler 
i sädesledaren/cauda epididymis som var spermatogoniestamceller under 
exponeringsperioden krävs ytterligare en provtagningstid på minst 7 veckor (möss) eller 10 veckor (råtta), efter avslutad behandling. 
33. Celler extruderade från sädeskanalerna efter en period på 28 + 3 dagar 
utgör en blandad population rik på alla utvecklingsstadier av könsceller (se hänvisning 7, 8). Provtagning av dessa celler för påvisande av genmu ­
tationer ger inte en lika exakt bedömning av de stadier där könscellsmuta ­
tioner induceras som den som kan erhållas genom provtagning av spermier från sädesledaren/cauda epididymis (eftersom det finns flera olika könscells ­
typer i prov från sädeskanalerna och dessutom somatiska celler som kon ­
taminerar denna cellpopulation). Emellertid ger provtagning av celler från 
sädeskanalerna utöver spermatozoer från sädesledaren/cauda epididymis ef ­
ter endast ett 28 + 3 dagars provtagningsschema viss täckning av celler som exponerats under flertalet faser i könscellsbildningen, vilket kan vara an ­
vändbart för att upptäcka vissa könscellsmutagener.
 
Observationer  
34. Allmänna kliniska observationer bör göras minst en gång per dag, helst vid 
samma tidpunkt varje dag med hänsyn till maximalt förväntade effekter efter doseringen. Djurens hälsotillstånd bör registreras. Minst två gånger dagligen bör djuren observeras med avseende på morbiditet och mortalitet. 
Alla djur bör vägas minst en gång i veckan. Mätning av foderkonsumtion 
bör göras minst en gång i veckan. Om testkemikalien tillförs via dricks ­
vattnet bör även vattenkonsumtionen mätas vid varje byte av vatten och minst en gång i veckan. Djur som uppvisar icke-dödliga indikatorer på 
överskottstoxicitet bör avlivas innan slutförandet av testperioden (se hänvis ­
ning 23).
 ▼M5 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 919
 
Vävnadsinsamling  
35. Den logiska grunden för vävnadsinsamlingen bör definieras tydligt. Efter ­
som det är möjligt att studera mutationsinduktion i praktiskt taget alla väv ­
nader, bör valet av vävnader som ska samlas in baseras på skälet för att genomföra studien och befintliga mutagenitets-, cancerogenitets- eller tox ­
icitetsdata för den undersökta kemikalien. Viktiga faktorer för övervägande 
bör omfatta administreringsväg (baserat på sannolika mänskliga expone ­
ringsvägar), den förutsagda vävnadsdistributionen och möjlig verknings ­
mekanism. I avsaknad av bakgrundsinformation, bör flera somatiska väv ­
nader som kan vara av intresse samlas in. Dessa bör representera snabb ­
växande och långsamt växande vävnader och vävnader på kontaktstället. 
Dessutom bör spermier från sädesledare/cauda epididymis och växande könsceller från sädeskanalerna (som beskrivs i punkterna 32 och 33) samlas in och lagras om framtida analyser av mutagenitet i könsceller krävs. Or ­
ganvikter bör inhämtas, och för större organ, bör samma område samlas in 
på alla djur.
 
Lagring av vävnader och DNA  
36. Vävnader (eller vävnadshomogenat) bör förvaras vid eller under – 70 °C 
och ska användas för DNA-isolering inom 5 år. Isolerat DNA, förvarat i 
kylskåp vid 4 °C i lämplig buffert, bör optimalt användas för mutationstest 
inom 1 år.  
Val av vävnader för mutantanalys  
37. Valet av vävnader bör baseras på överväganden såsom 1) administrations ­
sättet eller första kontaktstället (t.ex. glandulär magsäck om administratio ­
nen är oral, lunga om administrationen sker via inandning eller hud om 
lokal applikation har använts) och 2) farmakokinetiska parametrar som observerats i allmäntoxicitetsstudier, vilket indikerar vävnadsdisposition, bi ­
behållande eller ackumulation, eller målorgan för toxicitet. Om studier ut ­
förs för att följa upp cancerogenitetsstudier bör man överväga målväv ­
naderna för cancerogenitet. Valet av vävnader för analys bör maximera detekteringen av kemikalier som är direktverkande  in vitro -mutagena, me ­
taboliseras snabbt, mycket reaktiva eller absorberas dåligt, eller de för vilka 
målvävnaden bestäms genom administreringsvägen (se hänvisning 6). 
38. I brist på bakgrundsinformation och med beaktande av kontaktstället på 
grund av administreringsvägen, bör levern och minst en snabbt delande vävnad (t.ex. glandulär magsäck, benmärg) utvärderas för mutagenitet. I de flesta fall kan de ovan angivna kraven uppnås genom analyser av två 
noggrant utvalda vävnader, men i vissa fall skulle tre eller fler behövas. Om 
det finns särskilda skäl att misstänka könscellseffekter, inklusive positiva effekter på somatiska celler, bör könscellsvävnaderna utvärderas avseende 
mutationer.
 
Mätmetoder  
39. Standardlaboratoriemetoder eller publicerade metoder för detektion av mu ­
tanter finns tillgängliga för de rekommenderade transgena modellerna:  lacZ - 
lambdabakteriofag och -plasmid (se hänvisning 30);  lacI-mus (se hänvisning 
2, 18);  gpt-deltamus (se hänvisning 22);  gpt-deltaråtta (se hänvisning 28);  
cII (se hänvisning 17). Ändringar bör motiveras och dokumenteras noga. 
Data från flera packningar kan läggas samman och användas för att uppnå ett tillräckligt antal plack eller kolonier. Emellertid kan behovet av ett stort antal packningsreaktioner för att uppnå det lämpliga antalet plack vara en 
indikation på dålig DNA-kvalitet. I sådana fall ska data beaktas med för ­
siktighet eftersom den kan vara opålitlig. Det optimala antalet plack eller
 ▼M5 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 920
 
kolonier per DNA-prov styrs av den statistiska sannolikheten för att upp ­
täcka tillräckligt många mutanter vid en viss spontan mutationsfrekvens. I 
allmänhet krävs minst 125 000 till 300 000 plack om den spontana muta ­
tionsfrekvens är i storleksordningen 3 × 10  –5 (se hänvisning 15). För Big 
Blue®  lacI -testet är det viktigt att visa att hela skalan av mutanta färgfeno ­
typer kan detekteras genom införandet av lämpliga färgkontroller som be ­
handlas jämsides med varje plattodling. Vävnaderna och de resulterande proverna (objekt) bör bearbetas och analyseras med hjälp av ett blockut ­
förande, där objekt från vehikel-/lösningsmedelskontrollgruppen, den posi ­
tiva kontrollgruppen (om den används) eller positivt kontroll-DNA (i före ­
kommande fall) och varje behandlingsgrupp behandlas tillsammans.
 
DATA OCH RAPPORTERING  
Behandling av resultat  
40. Individuella djurdata bör presenteras i tabellform. Den experimentella en ­
heten utgörs av djuret. Rapporten bör omfatta det totala antalet plackbild ­
ande enheter (pfu) eller kolonibildande enheter (cfu), antal mutanter samt mutantfrekvensen för varje vävnad från varje djur. Om det finns flera 
packnings-/aktiveringsreaktioner, bör antalet reaktioner per DNA-prov rap ­
porteras. Även om data för varje enskild reaktion bör behållas behöver endast total pfu eller cfu rapporteras. Uppgifter om toxicitet och kliniska tecken enligt punkt 34 ska redovisas. Eventuella sekvenseringsresultat ska 
presenteras för varje mutant som analyseras, och resulterande mutations ­
frekvensberäkningar för varje djur och vävnad ska visas.
 
Statistisk utvärdering och tolkning av resultaten  
41. Det finns flera kriterier för att fastställa att ett resultat är positivt, t.ex. en 
dosrelaterad ökning av mutationsfrekvensen, eller en tydlig ökning av mu ­
tationsfrekvensen i enkeldosgruppen jämfört med lösningsmedels-/vehikel ­
kontrollgruppen. Minst tre behandlade dosgrupper bör analyseras för att ge 
tillräckligt med uppgifter för dos-responsanalysen. Medan den biologiska 
relevansen för resultaten ska komma i främsta rummet kan lämpliga sta ­
tistiska metoder användas som en hjälp vid utvärderingen av testresultateten (se hänvisning 4, 14, 15, 25, 26). Statistiska tester som används bör betrakta 
djuret som den experimentella enheten. 
42. En testkemikalie för vilken resultatet inte uppfyller ovanstående kriterier i 
någon vävnad anses vara icke-mutagen i detta test. För den biologiska 
betydelsen av ett negativt resultat ska vävnadsexponeringen bekräftas. 
43. För DNA-sekvensanalyser, finns ett antal statistiska metoder tillgängliga för 
att hjälpa till med tolkningen av resultaten (se hänvisning 1, 5, 9, 19). 
44. Prövning av om de observerade värdena ligger inom eller utanför det his ­
toriska kontrollområdet kan ge vägledning för att utvärdera responsens bio ­
logiska betydelse (se hänvisning 32).
 ▼M5 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 921
 
Testrapport  
45. Testrapporten ska innehålla följande information:  
Testkemikalie:  
— Identifieringsuppgifter och CAS-nr, om det är känt. 
— Ursprung, partinummer om sådant finns. 
— Fysikalisk form och renhetsgrad. 
— Fysikalisk-kemiska egenskaper som är relevanta för genomförandet av 
studien. 
— Testkemikaliens stabilitet, om den är känd.  
Lösningsmedel/vehikel:  
— Motivering för val av vehikel. 
— Löslighet och stabilitet av testkemikalien i lösningsmedlet/vehikeln, om 
detta är känt. 
— Sammansättning av foder-, dricksvatten- eller inandningsberedningar. 
— Analytiska bestämningar av beredningar (t.ex. stabilitet, homogenitet, 
nominella koncentrationer).  
Försöksdjur:  
— Art/stam som används och motivering av valet. 
— Djurens antal, ålder och kön. — Ursprung, inhysning, foder etc. 
— Individuell vikt hos försöksdjuren vid försökets början, inklusive 
kroppsviktsintervall, medelvärde och standardavvikelse för varje grupp.
 
Testbetingelser:  
— Positiva och negativa kontrolldata (vehikel/lösningsmedel). 
— Data från dosfinnande studie. 
— Motivering för valet av dosnivå. 
— Uppgifter om testkemikalieberedningen. 
— Uppgifter om administreringen av testkemikalien. 
— Motivering för administrationssätt. — Metoder för mätning av djurtoxicitet, inklusive, i förekommande fall, 
histopatologiska eller hematologiska analyser och frekvensen av djurob ­
servationer och mätningar av djurens kroppsvikt. 
— Metoder för att verifiera att testkemikalien nått målvävnaden eller den 
allmänna cirkulationen, om negativa resultat erhålls.
 ▼M5 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 922
 
— Faktisk dos (mg/kg kroppsvikt/dag) beräknad genom testkemikaliens 
koncentration (ppm) i foder/dricksvatten samt konsumtionen, i tillämp ­
liga fall. 
— Uppgifter om foder- och vattenkvalitet. 
— Detaljerad beskrivning av behandlings- och provtagningsscheman samt 
motivering av valen. 
— Metod för avlivning. 
— Förfaranden för att isolera och bevara vävnader. — Metoder för isolering av gnagares genomiska DNA, räddning av trans ­
genen från genomiskt DNA och överföring av transgent DNA till en bakterievärd. 
— Ursprungs- och partinummer för alla celler, satser och reagenser (i före ­
kommande fall). 
— Metoder för räkning av mutanter. — Metoder för molekylär analys av mutanter och användning för att kor ­
rigera klonalitet och/eller beräkna mutationsfrekvenser, i tillämpliga fall.
 
Resultat:  
— Djurens skick före och under hela testperioden, inklusive tecken på 
toxicitet. 
— Kropps- och organvikter vid avlivning. — För varje vävnad/djur utvärderas antalet mutanter, antalet plack eller 
kolonier samt mutantfrekvensen. 
— För varje vävnad/djurgrupp antalet packningsreaktioner per DNA-prov, 
totala antalet mutanter, medelvärdet för mutantfrekvensen, standardavvikelsen. 
— Dos-responssamband, där detta är möjligt. — För varje vävnad/djur, antalet oberoende mutanter och genomsnittmuta ­
tionsfrekvensen där molekylär analys av mutationer utfördes. 
— Data från jämsides behandlad och tidigare negativ kontroll med omfång, 
medelvärden och standardavvikelser. 
— Data från jämsides behandlad positiv kontroll (eller data om DNA från 
tidigare positiv kontroll). 
— Analytiska bestämningar, om det finns tillgängligt (t.ex. 
DNA-koncentrationer som används i packning, DNA-sekvenseringsdata); 
— De statistiska analyser och metoder som använts.
 
Diskussion av resultaten  
Slutsats  ▼M5 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 923
 
LITTERATUR  
1. Adams,  W.T. och T.R.  Skopek  (1987), ‘Statistical  Test  for the Comparison 
of Samples from Mutational Spectra’,  J. Mol. Biol ., 194: 391–396. 
2. Bielas, J.H. (2002), ‘A more Efficient Big Blue® Protocol Improves Trans ­
gene Rescue and Accuracy in an Adduct and Mutation Measurement’,  
Mutation Res. , 518: 107–112. 
3. Boerrigter, M.E., M-E. Dollé, H.-J. Martus, J.A. Gossen och J. Vijg (1995), 
‘Plasmid-based Transgenic Mouse Model for Studying  in vivo  Mutations’  
Nature , 377(6550): 657–659 
4. Carr, G.J. och N.J. Gorelick (1995), ‘Statistical Design and Analysis of 
Mutation Studies in Transgenic Mice’,  Environ. Mol. Mutagen , 25(3): 
246–255. 
5. Carr, G.J. och N.J. Gorelick (1996), ‘Mutational Spectra in Transgenic 
Animal Research: Data Analysis and Study Design Based upon the Mutant or Mutation Frequency’,  Environ. Mol. Mutagen,  28: 405–413. 
6. Dean, S.W., T.M. Brooks, B. Burlinson, J. Mirsalis, B. Myhr, L. Recio and 
V. Thybaud (1999), ‘Transgenic Mouse Mutation Assay Systems can Play 
an important Role in Regulatory Mutagenicity Testing  in vivo  for the De ­
tection of Site-of-contact Mutagens’,  Mutagenesis , 14(1): 141–151. 
7. Douglas, G.R., J. Jiao, J.D. Gingerich, J.A. Gossen och L.M. Soper(1995), 
‘Temporal and Molecular Characteristics of Mutations Induced by Ethyl ­
nitrosourea in Germ Cells Isolated from Seminiferous Tubules and in Sper ­
matozoa of  lacZ  Transgenic Mice’,  Proc. Natl. Acad. Sci. Förenta staterna , 
92: 7485–7489. 
8. Douglas, G.R., J.D. Gingerich, L.M. Soper och J. Jiao (1997), ‘Toward an 
Understanding of the Use of Transgenic Mice for the Detection of Gene Mutations in Germ Cells’,  Mutation Res. , 388(2–3): 197–212. 
9. Dunson, D.B. och K.R. Tindall (2000), ‘Bayesian Analysis of Mutational 
Spectra’,  Genetics , 156: 1411–1418. 
10. Gossen, J.A., W.J. de Leeuw, C.H. Tan, E.C. Zwarthoff, F. Berends, P.H. 
Lohman, D.L. Knook och J. Vijg(1989), ‘Efficient Rescue of Integrated Shuttle Vectors from Transgenic Mice: a Model for Studying Mutations  
in vivo’, Proc. Natl. Acad. Sci. Förenta staterna,  86(20): 7971–7975. 
11. Gossen, J.A. och J. Vijg (1993), ‘A Selective System for lacZ-Phage using 
a Galactose-sensitive  E. coli  Host’,  Biotechniques , 14(3): 326, 330. 
12. Erikson, R.P. (2003), ‘Somatic Gene Mutation and Human Disease other 
than Cancer’,  Mutation Res. , 543: 125–136. 
13. Erikson, R.P. (2010), ‘Somatic Gene Mutation and Human Disease other 
than Cancer: an Update’,  Mutation Res. , 705: 96–106. 
14. Fung, K.Y., G.R. Douglas och D. Krewski (1998), ‘Statistical Analysis of  
lacZ Mutant Frequency Data from Muta™Mouse Mutagenicity Assays’,  
Mutagenesis , 13(3): 249–255. 
15. Heddle, J.A., S. Dean, T. Nohmi, M. Boerrigter, D. Casciano, G.R. Doug ­
las, B.W. Glickman, N.J. Gorelick, J.C. Mirsalis, H.-J Martus, T.R. Skopek, V. Thybaud, K.R.Tindall och N. Yajima (2000), ‘In vivo Transgenic Mu ­
tation Assays’,  Environ. Mol. Mutagen ., 35: 253–259. 
16. Heddle, J.A., H.-J. Martus och G.R. Douglas (2003), ‘Treatment and Sam ­
pling Protocols for Transgenic Mutation Assays’,  Environ. Mol. Mutagen. , 
41: 1–6.  ▼M5 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 924
 
17. Jakubczak, J.L., G. Merlino, J.E. French, W.J. Muller, B. Paul, S. Adhya 
och S. Garges (1996), ‘Analysis of Genetic Instability during Mammary 
Tumor Progression using a novel Selection-based Assay for  in vivo  Muta­
tions in a Bacteriophage λ Transgene Target’,  Proc. Natl. Acad. Sci. Fö ­
renta staterna , 93(17): 9073–9078. 
18. Kohler, S.W., G.S. Provost, P.L. Kretz, A. Fieck, J.A. Sorge och J.M. Short 
(1990), ‘The Use of Transgenic Mice for Short-term,  in vivo  Mutagenicity 
Testing’, Genet. Anal. Tech. Appl., 7(8): 212–218. 
19. Lewis P.D., B. Manshian, M.N. Routledge, G.B. Scott och P.A. Burns 
(2008), ‘Comparison of Induced and Cancer-associated Mutational Spectra 
using Multivariate Data Analysis’, Carcinogenesis, 29(4): 772–778. 
20. Nohmi, T., M. Katoh, H. Suzuki, M. Matsui, M. Yamada, M. Watanabe, M. 
Suzuki, N. Horiya, O. Ueda, T. Shibuya, H. Ikeda och T. Sofuni (1996), ‘A 
new Transgenic Mouse Mutagenesis Test System using Spi – and 6-thio ­
guanine Selections’, Environ. Mol. Mutagen., 28(4): 465–470. 
21. Nohmi, T., M. Suzuki, K. Masumura, M. Yamada, K. Matsui, O. Ueda, H. 
Suzuki, M. Katoh, H. Ikeda och T. Sofuni (1999), ‘Spi  – Selection: an 
Efficient Method to Detect γ-ray-induced Deletions in Transgenic Mice’,  
Environ. Mol. Mutagen ., 34(1): 9–15. 
22. Nohmi, T., T. Suzuki och K.I. Masumura (2000), ‘Recent Advances in the 
Protocols of Transgenic Mouse Mutation Assays’,  Mutation Res. , 455(1–2): 
191–215. 
23. OECD (2000), Guidance Document on the Recognition, Assessment and 
Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used 
in Safety Evaluation, Series on Testing and Assessment, N°19, ENV/JM/ MONO(2000)7, OECD, Paris. 
24. OECD (2009), Detailed Review Paper on Transgenic Rodent Mutation As ­
says, Series on Testing and Assessment, N
 o 103, ENV/JM/MONO(2009)7, 
OECD, Paris. 
25. Piegorsch, W.W., B.H. Margolin, M.D. Shelby, A. Johnson, J.E. French, 
R.W. Tennant och K.R. Tindall (1995), ‘Study Design and Sample Sizes for 
a lacI Transgenic Mouse Mutation Assay’, Environ. Mol. Mutagen., 25(3): 
231–245. 
26. Piegorsch, W.W., A.C. Lockhart, G.J. Carr, B.H. Margolin, T. Brooks, ... 
G.R. Douglas, U.M. Liegibel, T. Suzuki, V. Thybaud, J.H. van Delft och 
N.J. Gorelick (1997), ‘Sources of Variability in Data from a Positive Se ­
lection lacZ Transgenic Mouse Mutation Assay: an Interlaboratory Study’, Mutation. Res., 388(2–3): 249–289. 
27. Singer, T.M., I.B. Lambert, A. Williams, G.R. Douglas och C.L. Yauk 
(2006), ‘Detection of Induced Male Germline Mutation: Correlations and 
Comparisons between Traditional Germline Mutation Assays, Transgenic 
Rodent Assays and Expanded Simple Tandem Repeat Instability Assays’, Mutation. Res., 598: 164–193. 
28. Toyoda-Hokaiwado, N., T. Inoue, K. Masumura, H. Hayashi, Y. Kawamu ­
ra, Y. Kurata, M. Takamune, M. Yamada, H. Sanada, T. Umemura, A. Nishikawa och T. Nohmi (2010), ‘Integration of in vivo Genotoxicity and 
Short-term Carcinogenicity Assays using F344 gpt delta Transgenic Rats: in 
vivo Mutagenicity of 2,4-diaminotoluene and 2,6-diaminotoluene Structural Isomers’, Toxicol. Sci., 114(1): 71–78. 
29. Thybaud, V., S. Dean, T. Nohmi, J. de Boer, G.R. Douglas, B.W. Glick ­
man, N.J. Gorelick, J.A. Heddle, R.H. Heflich, I. Lambert, H.-J. Martus, J.C. Mirsalis, T. Suzuki och N. Yajima (2003), ‘ In vivo  Transgenic Muta ­
tion Assays’,  Mutation Res ., 540: 141–151. 
30. Vijg, J. och G.R. Douglas (1996), ‘Bacteriophage λ and Plasmid  lacZ  
Transgenic Mice for studying Mutations  in vivo’  i: G. Pfeifer (ed.),  Tech­
nologies for Detection of DNA Damage and Mutations, Part II,  Plenum 
Press, New York, NY, Förenta staterna, s. 391–410.
 ▼M5 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 925
 
31. Yauk, C.L., J.D. Gingerich, L. Soper, A. MacMahon, W.G. Foster och G.R. 
Douglas (2005), ‘A  lacZ  Transgenic Mouse Assay for the Detection of 
Mutations in Follicular Granulosa Cells’,  Mutation Res ., 578(1–2): 
117–123. 
32. Hayashi, M., K. Dearfield, P. Kasper, D. Lovell, H.-J. Martus, V. Thybaud 
(2011), ‘Compilation and Use of Genetic Toxicity Historical Control Data’, 
Mutation Res., doi:10.1016/j.mrgentox.2010.09.007. 
33. OECD (2011),  Retrospective Performance Assessment of OECD Test Gui ­
deline on Transgenic Rodent Somatic and Germ Cell Gene Mutation As ­
says, Series on Testing and Assessment, N  o 145, ENV/JM/MONO(2011)20, 
OECD, Paris. 
34. Clermont, Y. (1972), ‘Kinetics of spermatogenesis in mammals seminife ­
rous epithelium cycle and spermatogonial renewal’. Physiol. Rev. 52: 198–236. 
35. Robaire, B., Hinton, B.T. och Oregbin-Crist, M.-C. (2006), ‘The Epididy ­
mis’, in Neil, J.D., Pfaff, D.W., Chalis, J.R.G., de Kretser, D.M., Richards, 
J.S., och P. M, Wassarman (eds.),  Physiology of Reproduction , Elsevier, 
Nederländerna, s. 1071–1148. 
36. Russell, L.B. (2004), ‘Effects of male germ-cell stage on the frequency, 
nature, and spectrum of induced specific-locus mutations in the mouse’,  
Genetica , 122: 25–36.
 ▼M5 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 926
 
Tillägg  
DEFINITIONER  
Administreringsperiod : Den totala perioden under vilken ett djur doseras.  
Basparssubstitution : En typ av mutation som orsakar ersättning av en enda 
DNA-nukleotidbas med en annan DNA-nukleotidbas.  
Kapsid : Proteinskalet som omger en viruspartikel.  
Kemikalie : Ett ämne eller en blandning.  
Klonal expansion : Produktionen av många celler från en enda (mutant) cell.  
Kolonibildande enhet (CFU) : Ett mått på livskraftigt bakterieantal.  
Konkatamer : En lång sammanhängande biomolekyl som består av flera iden ­
tiska kopior kopplade i serie.  
Cos-ställe : Ett 12-nukleotid-segment av enkelsträngat DNA som finns i båda 
ändarna av den bakteriofaga lambdans dubbelsträngade genom.  
Deletion : En mutation i vilken en eller flera (sekventiella) nukleotider går för ­
lorade genom genomet.  
Elektroporering : Tillämpning av elektriska pulser för att öka permeabiliteten 
hos cellmembran.  
Endogen gen : En gen med ursprung hos genomet.  
Extrabinomial variation : Större variationer i återkommande bedömningar av en 
populationsandel än vad som skulle förväntas om populationen hade en binomial ­
fördelning.  
Frameshift-mutation : En genetisk mutation som orsakas av insertioner eller 
deletioner av ett antal nukleotider som inte är jämnt delbara med tre inom en 
DNA-sekvens som kodar för ett protein/en peptid.  
Insertion : Tillägg av en eller flera nukleotid-baspar i en DNA-sekvens.  
Jackpot : Ett stort antal mutanter som uppstår genom klonal expansion av en 
enda mutation.  
Stora deletioner : Deletioner i DNA av mer än flera kilobaser (som effektivt 
påvisas med Spi  – -selektionsanalys och  lacZ -plasmidtester).  
Ligering : Den kovalenta kopplingen mellan två ändar av DNA-molekyler med 
hjälp av DNA-ligas.  
Mitogen : En kemikalie som stimulerar en cell att påbörja celldelning och utlöser 
mitos (dvs. celldelning).  
Neutral gen : En gen som inte påverkas av positiva eller negativa 
selektionstryck.  
Packning : Syntes av infektiösa fagpartiklar från en beredning av fagkapsid- och 
svansproteiner och en konkatamer av fag-DNA-molekyler. Används vanligen för att packa DNA klonad på en lambdavektor (åtskilda av cos-ställen) i infektiösa 
lambdapartiklar.  
Packningseffektivitet : Den effektivitet med vilken packade bakteriofager åter ­
vinns i värdbakterier.
 ▼M5 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 927
 
Plackbildande enhet (pfu) : Ett mått på livskraftigt bakteriofagantal.  
Punktmutation : En allmän term för en mutation som påverkar endast en liten 
sekvens av DNA inklusive små insertioner, deletioner och basparssubstitutioner.  
Positiv selektion : En metod som endast tillåter mutanter att överleva.  
Reportergen : En gen vars muterade genprodukt lätt upptäcks.  
Provtagningstid : I slutet av den tidsperiod, före avlivningen, under vilken ke ­
mikalien inte administreras och under vilka obearbetade DNA-skador fixeras till stabila mutationer.  
Skyttelvektor : En vektor som är konstruerad så att den kan breda ut sig i två 
olika värdarter, i enlighet därmed kan DNA införas i en skyttelvektor och testas 
eller manipuleras i två olika celltyper eller två olika organismer.  
Testkemikalie : Alla ämnen eller blandningar som testas med denna testmetod.  
Transgen : Avser en organism vars genom har förändrats genom överföring av 
en gen eller gener från en annan art.
 ▼M5 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 928
 
DEL C: METODER FÖR BESTÄMNING AV EKOTOXICITET  
INNEHÅLLSFÖRTECKNING 
C.1 AKUT TOXICITET FÖR FISK C.2 TEST AV AKUT IMMOBILISERING AV  DAPHNIA -ARTER 
C.3 BESTÄMNING AV TILLVÄXTHÄMNING HOS SÖTVATTEN ­
SALGER OCH CYANOBAKTERIER 
C.4 BESTÄMNING AV ”LÄTT” BIONEDBRYTBARHET DEL 1 ALLMÄNNA PRINCIPER DEL 2 DOC-ELIMINERING (DOC DIE-AWAY) (metod C.4-A) DEL 3 MODIFIERAT OECD-SCREENINGTEST (metod C.4-B) DEL 4 CO
 2 -UTVECKLING (metod C.4-C) 
DEL 5 MANOMETRISK RESPIROMETRITEST (metod C.4-D) DEL 6 CLOSED BOTTLE-TEST (metod C.4-E) 
DEL 7 MITI TEST (metod C.4-F) 
C.5 NEDBRYTNING – BIOKEMISK SYREFÖRBRUKNING C.6 NEDBRYTNING – KEMISK SYREFÖRBRUKNING C.7 NEDBRYTNING – ABIOTISK NEDBRYTNING: HYDROLYS 
SOM FUNKTION AV PH 
C.8 TOXICITET HOS DAGGMASKAR C.9 BIOLOGISK NEDBRYTBARHET: ZAHN-WELLENS TEST 
C.10 SIMULATIONSTEST AEROB AVLOPPSVATTENBEHAND ­
LING C.10-A: ENHETERNA FÖR AKTIVERAT SLAM – 
C.10-B BIOFILMER 
C.11 BIOLOGISK NEDBRYTBARHET: AKTIVERAT SLAM – RE ­
SPIRATIONSHÄMNINGSTEST 
C.12 BIOLOGISK NEDBRYTBARHET: MODIFIERAT SCAS-TEST C.13 BIOKONCENTRATION: GENOMFLÖDESPROVNING MED 
FISK 
C.14 TILLVÄXTTEST PÅ UNGA EXEMPLAR AV FISK C.15 FISK, KORTTIDSTEST AVSEENDE TOXICITET PÅ  EM­
BRYO -OCH SÄCKYNGELSTADIERNA 
C.16 HONUNGSBIN – TEST AVSEENDE AKUT TOXICITET 
(ORALT) 
C.17 HONUNGSBIN – TEST AVSEENDE AKUT TOXICITET 
(KONTAKT) 
C.18 BESTÄMNING AV ADSORPTION OCH DESORPTION I 
JORD VID JÄMVIKT I UPPSLAMMAT JORDPROV
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 929
 
C.19 UPPSKATTNING AV ADSORPTIONSKOEFFICIENT ( K OC ) I 
JORD OCH AVLOPPSSLAM MED ANVÄNDNING AV HÖG ­
TRYCKSVÄTSKEKROMATOGRAFI (HPLC) 
C.20 REPRODUKTIONSTEST PÅ  DAPHNIA MAGNA  
C.21 JORDLEVANDE MIKROORGANISMER: TEST RÖRANDE 
OMVANDLING AV KVÄVE 
C.22 JORDLEVANDE MIKROORGANISMER: TEST RÖRANDE 
OMVANDLING AV KOL 
C.23 AEROB OCH ANAEROB OMVANDLING I JORD 
C.24 AEROB OCH ANAEROB OMVANDLING I AKVATISKA SE ­
DIMENTSYSTEM 
C.25. AEROB MINERALISERING I YTVATTEN – SIMULERINGS ­
TEST AV BIOLOGISK NEDBRYTNING 
C.26. BESTÄMNING AV TILLVÄXTHÄMNING HOS FLYTBLADS ­
VÄXTEN  LEMNA  SP. (ANDMAT)  
▼M4 
C.27. TOXICITETSTEST I SEDIMENT- OCH VATTENFAS PÅ CHI ­
RONOMIDLARVER MED SPIKAT SEDIMENT 
C.28. TOXICITETSTEST I SEDIMENT- OCH VATTENFAS PÅ 
CHIRONOMID-LARVER MED SPIKAT VATTEN 
C.29. LÄTT BIONEDBRYTBARHET – CO  2 I FÖRSLUTNA KÄRL 
(Headspace-test) 
C.30. BIOACKUMULERING I JORDLEVANDE OLIGOCHAETER 
(FÅBORSTMASKAR)  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 930
 
C.1 AKUT TOXICITET FÖR FISK  
1. METOD  
1.1 INLEDNING 
Syftet med detta test är att bestämma ett ämnets akuta dödliga tox ­
icitet för sötvattenfisk. Det är värdefullt att känna till ämnets lös ­
lighet i vatten, ångtryck, kemiska stabilitet, dissociationskonstanter och bionedbrytbarhet när man ska välja den mest lämpliga testmeto ­
den (statisk, semistatisk eller genomströmning) för att säkerställa 
tillfredsställande konstanta koncentrationer av testämnet under hela 
testperioden. 
Vid planeringen av testet och tolkningen av testresultaten bör man ta 
hänsyn till andra uppgifter (t.ex. strukturformel, renhetsgrad, art och 
procentdel av signifikanta orenheter, förekomst och mängd av till ­
satser, samt n-oktanol/vattendelningskoefficienten).
 
1.2 DEFINITIONER OCH ENHETER 
Akut toxicitet är de märkbara skadliga verkningar som på kort tid 
(dagar) framkallas hos en organism som exponeras för ett ämne. I 
detta test uttrycks akut toxicitet som median letal koncentration 
(LC  50 ), dvs. den koncentration i vatten som medför att 50 % av 
fiskarna i en försöksgrupp dör under kontinuerlig exponering i en viss tid. Exponeringstiden ska anges. 
Alla koncentrationer av testämnet anges i vikt per volymenhet (milli ­
gram per liter). De kan också uttryckas som vikt per vikt (mg/kg
 -1 ). 
1.3 REFERENSÄMNEN 
Ett referensämne kan användas för att visa att försöksdjurens respons 
inte har ändrats signifikant under testbetingelserna i laboratoriet. 
Inga referensämnen finns angivna för detta test.  
1.4 TESTMETODSPRINCIP 
Ett gränstest kan utföras med 100 mg per liter för att konstatera om 
LC 50 är större än denna koncentration. 
Fisken exponeras för testämnet som i en rad koncentrationer tillsätts 
vattnet under 96 timmar. Dödligheten registreras med högst 24 tim ­
mars mellanrum och om så är möjligt beräknas de koncentrationer som vid varje observationstillfälle har medfört att 50 % av fisken (LC
 50 ) har dött.  
1.5 KVALITETSKRITERIER 
Kvalitetskriterierna gäller för såväl gränstestet som den fullständiga 
testmetoden. 
Dödligheten i kontrollgruppen får inte överstiga 10 % (eller 1 fisk 
om färre än 10 fiskar används) i slutet av testet. 
Under hela testet ska koncentrationen av upplöst syre vara högre än 
60 % av luftmättnadsvärdet.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 931
 
Koncentrationer av testämnet ska ligga över 80 % av startkoncent ­
rationen under hela testperioden. 
För ämnen som är lättlösliga i testmediet och ger stabila lösningar, 
dvs. ämnen som inte i hög grad förångas, bryts ned, hydrolyseras eller adsorberas, kan startkoncentrationen antas vara lika med den 
nominella koncentrationen. Man ska kunna bevisa att koncentratio ­
nen har bibehållits under hela testet och att kvalitetskriterierna är uppfyllda. 
För ämnen som är 
i) svårlösliga i testmediet, eller 
ii) kan skapa stabila emulsioner eller dispersioner, eller 
iii) är ostabila i vattniga lösningar 
ska man som värde för startkoncentrationen använda den koncent ­
ration som är uppmätt i lösningen (eller om detta inte är tekniskt möjligt, mätt i vattenkolonnen) vid testets inledning. Koncentrationen 
bestäms sedan jämvikt uppnåtts, men innan fisken släpps i. 
I alla dessa fall ska ytterligare mätningar göras under testets gång för 
att säkerställa att koncentrationen har bibehållits och att kvalitets ­
kriterierna har varit uppfyllda. 
pH-värdet får inte variera med mer än 1 enhet.
 
1.6. METODBESKRIVNING 
Tre typer av förfaranden kan användas:  
Statiskt test:  
Toxicitetstest utan något genomflöde av testlösningen. (Lösningarna 
förblir oförändrade under hela testet.)  
Semi-statiskt test:  
Test utan genomflöde av testlösningen men där hela testlösningar 
regelbundet byts ut helt efter längre perioder (t.ex. 24 timmar).  
Genomströmningstest:  
Toxicitetstest där vattnet i testkamrarna förnyas hela tiden och där 
testämnet transporteras med det vatten som används till att förnya testmediet.
 
1.6.1  Reagenser  
1.6.1.1  Lösningar av testämnen  
Stamlösningar av erforderlig styrka framställs genom att testämnet 
upplöses i avjoniserat vatten eller vatten enligt 1.6.1.2. 
De valda testkoncentrationerna framställs genom utspädning av stam ­
lösningen. Om höga koncentrationer testas kan ämnet lösas direkt i 
utspädningsvattnet.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 932
 
Ämnen testas normalt endast upp till gränsen för löslighet. För vissa 
ämnen (t.ex. ämnen som är svårlösliga i vatten, som har ett högt P  ow - 
värde, eller som bildar en stabil dipersion och inte en riktig lösning i vatten) accepteras att man har använt en testkoncentration som är större än lösligheten för att säkerställa att den högsta upplösta/stabila 
koncentration har nåtts. Det är dock viktigt att denna koncentration 
inte på annat sätt förstör testmetoden (t.ex. bildar en hinna av ämnet på vattenytan som förhindrar syrsättning av vattnet, etc.). 
Ultraljud, organiska lösningsmedel, emulgeringsmedel eller disperge ­
ringsmedel kan användas för att framställa stamlösningar av ämnen 
som är svårlösliga i vatten och för att dispergera sådan ämnen i 
testmediet. Om tillsatsämnen används ska alla testkoncentrationer innehålla samma mängd av tillsatsämnet och en extra kontrollgrupp ska användas som utsätts för samma koncentration av tillsatsämnet 
som den som används i testserien. Sådana tillsatsämnen används i 
lägsta möjliga koncentration och får aldrig vara större än 100 mg per liter i testmediet. 
Testet utförs utan justering av pH-värdet. Om det finns tecken på en 
markant förändring av pH-värdet rekommenderas att testet upprepas 
med pH-justering och att dessa resultat rapporteras. I detta fall ska pH-värdet i stamlösningen justeras efter pH-värdet i utspädningsvatt ­
net, om det inte finns särskilda skäl som talar mot detta. HC1 och 
NaOH är förstahandsvalen för justering av pH-värdet. Denna pH- 
justering ska göras på ett sådant sätt att testämnets koncentration i stamlösningen inte ändras i någon signifikant grad. Om justeringen medför någon kemisk reaktion eller fysisk utfällning av testämnet 
ska detta rapporteras.
 
1.6.1.2  Vatten till förvaring och utspädning  
Dricksvatten (som inte är förorenat av skadliga koncentrationer av 
klor, tungmetaller eller andra ämnen), råvatten av god kvalitet eller rekonstituerat vatten (se tillägg 1) kan användas. Vatten med en total hårdhet på mellan 10 och 250 mg per liter (som CaCO
 3 ) och med ett 
pH-värde av 6,0–8,5 är att föredra.  
1.6.2  Apparatur  
All apparatur ska vara tillverkad av kemiskt inert material: 
— Automatiskt utspädningssystem (till genomströmningstestet). — Syremätare. — Utrustning för bestämning av vattnets hårdhet. — Lämplig apparatur för temperaturkontroll. — pH-mätare.
 
1.6.3  Testfisk  
Fiskarna ska vara friska och utan synliga missbildningar.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 933
 
De arter som ska användas bör väljas på grundval av praktiska 
kriterier, t.ex. att de är lätt tillgängliga under hela året, enkla att 
hålla, lämpliga för testet, har en relativ känslighet, samt på grundval av ekonomiska, biologiska och ekologiska faktorer av betydelse. Nödvändigheten att kunna jämföra de data som erhålls och redan 
genomförd internationell harmonisering (hänvisning 1) bör också 
beaktas vid val av fiskart. 
I tillägg 2 förtecknas de fiskarter som rekommenderas för detta test. 
Sebrafisk och regnbåge är att föredra.
 
1.6.3.1  Förvaring  
Testfisk ska helst komma från ett enda bestånd och vara av ungefär 
samma längd och ålder. Fisken ska förvaras i minst 12 dagar under följande betingelser:  
Belastning:  
Anpassad efter systemet (cirkulation eller genomströmning) och fisk ­
arterna.  
Vatten:  
Se punkt 1.6.1.2.  
Ljus:  
12–16 timmars ljus per dag.  
Koncentration av upplöst syre:  
Minst 80 % av luftmättnadsvärdet.  
Utfodring:  
Dagligen eller tre gånger per vecka, sista gången 24 timmar innan 
testet inleds.
 
1.6.3.2  Dödlighet  
Efter 48 timmars acklimatisering registreras dödligheten och följande 
kriterier tillämpas: 
— Högre än 10 % av populationen på 7 dagar: 
hela partiet kasseras. 
— Mellan 5 och 10 % av populationen: 
observationsperioden förlängs med ytterligare 7 dagar. 
Om inga fler dödsfall inträffar kan partiet accepteras, i annat fall 
kasseras det. 
— Lägre än 5 % av populationen: 
partiet kan accepteras.  
1.6.4  Tillvänjning  
All fisk ska i minst 7 dagar före testet exponeras för vatten av den 
kvalitet och temperatur som ska användas i testet.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 934
 
1.6.5  Testförfarande  
Före det slutliga testet kan ett inledande test göras för att fastställa 
vilka koncentrationer som ska användas i huvudtestet. 
Förutom testserien inbegrips en kontrollgrupp som inte tillförs tes ­
tämnet och, i vissa fall, en kontrollgrupp som tillförs tillsatsämnet. 
Beroende på testämnets fysiska och kemiska egenskaper ska ett sta ­
tiskt test, ett semi-statiskt test eller ett genomströmningstest väljas så att kvalitetskriteriet uppfylls. 
Fisken exponeras för testämnet enligt följande: 
— Varaktighet: 96 timmar. 
— Antal djur: Minst 7 per koncentration. — Kar: Av passande storlek i förhållande till den rekommenderade 
belastningen. 
— Belastning: För statisk och semistatiska test rekommenderas 1,0 g 
per liter som maximal belastning. För genomströmningssystem 
kan större belastning accepteras. 
— Testkoncentrationer: Minst 5 koncentrationer med ett konstant 
inbördes förhållande av högst 2,2 som så långt det för täcker intervallet 0–100 % dödlighet. 
— Vatten: Se 1.6.1.2. 
— Ljus: 12–16 timmar ljus per dag. 
— Temperatur: Lämplig för arten (tillägg 2) men inom ±1
 o C i ett 
enskilt test. 
— Koncentration av upplöst syre: Inte mindre än 60 % av luftmätt ­
nadsvärdet vid den valda temperaturen. 
— Utfodring: Ingen. 
Fisken besiktas efter de första 2–4 timmarna och minst var 24:e 
timme. Fisk anses vara död om beröring av stjärtfenan inte fram ­
kallar någon reaktion och inga andningsrörelser kan iakttas. Död fisk avlägsnas när den upptäcks och dödsfall registreras. Register förs 
över synliga abnormiteter (t.ex. förlust av jämvikten, ändrat simbe ­
teende, andningsfunktion, pigmentering osv.). 
Mätningar av pH, upplöst syre och temperatur ska göras dagligen.
 
Gränstest  
Genom användning av förfarandena som beskrivs i denna testmetod 
kan ett gränstest utföras med 100 mg per liter för att konstatera om LC
 50 är större än denna koncentration. 
Om ämnet är av sådan art att man inte kan erhålla en koncentration 
av 100 ml per liter i testvattnet utförs gränstestet vid ämnets mätt ­
nadskoncentration (eller den högsta koncentrationen vid vilken det 
bildas en stabil disper-sion) i det använda mediet (se även 1.6.1.1).  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 935
 
Gränstestet utförs med 7–10 fiskar och en eller två kontrollgrupper 
av samma storlek. (Enligt binomialteorin är det vid användning av 
10 fiskar 99,9 % säkerhet för att LC  50 är större än den använda 
koncentrationen, om dödligheten är noll. Med 7, 8 eller 9 fiskar ger en dödlighet av noll 99 % säkerhet för att LC
 50 är större än 
den använda koncentrationen.) 
Om dödsfall sker måste en fullständig undersökning utföras. Even ­
tuella subletala verkningar registreras.  
2. DATA OCH UTVÄRDERING  
För var och en av de tidsperiod då observationer företas (efter 24, 
48, 72 och 96 timmar) avbildas den procentuella dödligheten mot 
koncentrationen på logaritmisk sannolikhetspapper. 
När så är möjligt och för varje observationstid ska LC  50 och dess 
konfidensgränser (p = 0,05) uppskattas genom standardförfaranden. 
Dessa värden ska avrundas till en (eller högst två) signifikanta siffror (exempel på avrundning till två siffror: 170 för 173,5, 0,13 för 0,127, 1,2 för 1,21). 
I de fall där koncentrations-procentresponskurvans lutning är för 
brant för att medge en beräkning av LC
 50 räcker det med en grafisk 
uppskattning av detta värde. 
Om två på varandra följande koncentrationer med ett förhållande på 
2,2 endast ger 0 och 100 % dödlighet, räcker dessa två värden för att 
ange inom vilket område LC  50 ligger. 
Om det framgår att det inte går att hålla testämnet stabilt eller ho ­
mogent ska detta rapporteras och försiktighet ska iakttas vid tolk ­
ningen av resultaten.  
3. RAPPORTERING  
Testrapporten ska om möjligt innehålla: 
— Uppgifter om testfisken (vetenskapligt namn, stam, leverantör, 
eventuell förbehandling, storlek och antal som använts for varje koncentration). 
— Källan till utspädningsvattnet och viktiga kemiska egenskaper 
(Ph, hårdhet, temperatur). 
— För ämnen med låg vattenlöslighet anges metod att framställa 
stam- och testlösning. 
— Koncentrationen av eventuella tillsatsämnen. — En lista över de koncentrationer som använts och alla tillgängliga 
uppgifter om testämnets stabilitet vid kon centrationerna i test ­
lösningen. 
— Om kemiska analyser görs ska metoder och resultat rapporteras. — Resultat från gränstest om sådant utförts. 
— Skälen till valet av och detaljer om använt testförfarande (t.ex. 
statisk, semi-statisk, doseringstakt, genomströmningstakt, eventu ­
ell syrsättning, antal fiskar osv.).
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 936
 
— Beskrivning av testutrustningen. 
— Ljusbetingelser. 
— Testlösningens koncentration av upplöst syre, pH-värden och 
temperatur var 24:e timme. 
— Bevis på att kvalitetskriterierna har uppfyllts. — Kumulativ dödlighet för varje koncentration och kontrollprov 
(eller kontroll med tillsatsämne om sådant behövs) vid de rekom ­
menderade observationstiderna. 
— Grafisk framställning av denna responskurva över koncentration/ 
procent i slutet av testet. 
— Om möjligt, LC
 50 -värden för varje rekommenderad observations ­
tid (med 95 % konfidensgränser). 
— Statistiska förfaranden som använts vid bestämning av LC  50 -vär­
dena. 
— Om referensämne har använts ska erhållna resultat anges. — Högsta testade koncentration som inte medför dödsfall inom test ­
perioden. 
— Lägsta testade koncentrationen som medför 100 % dödlighet 
inom testperioden.
 
4. HÄNVISNINGAR  
1. OECD, Paris, 1981, Test Guideline 203, rådets beslut K(81) 30 
slutligt och uppdaterat. 
2. AFNOR – Determination of the acute toxicity of a substance to  
Brachydanio rerio  – Static and Flow Through methods – NFT 
90-303 juni 1985. 
3. AFNOR – Determination of the acute toxicity of a substance to  
Salmo gairdneri –  Static and Flow Through methods – NFT 90- 
305 juni 1985. 
4. ISO 7346/1,/ 2 och/3 – Water Quality – Determination of the 
acute lethal toxicity of a substance to a fresh water fish  
(Brachydanio rerio  Hamilton-Buchanan –  Teleostei, Cyprini ­
dae).  Del 1: Static method. Del 2: Semi-static method. Del 3: 
Flow-through method. 
5. Eidgenössiches Departament des Innern, Schweiz: Richtlinien 
fur Probenahme und Normung von Wasseruntersuchungsmeto ­
den – Del II 1974. 
6. DIN Testverfahren mit Wasserorganismen, 38 412 (Ll) och L (15). 7. JIS K 0102, Acute toxicity test for fish. 8. NEN 6506 – Water – Bepailing van de akute toxiciteit met 
behulp van  Poecilia reticulata,  1980. 
9. Environmental Protection Agency, Methods for the acute tox ­
icity tests with fish, macroinvertebrates and amphibians, The committee on Methods for Toxicity Tests with Aquatic Orga ­
nisms, Ecological Research Series EPA-660-75-009, 1975. 
10. Environmental Protection Agency, Environmental monitoring 
and support laboratory, Office of Research and Development, 
EPA-600/4-78-012, January 1978.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 937
 
11. Environmental Protection Agency, Toxic Substance Control, 
del IV, 16 mars 1979. 
12. Standard methods for the examination of water and wastewater, 
14th edition, APHA-AWWA-WPCF, 1975. 
13. Commission of the European Communities, Inter-laboratory test 
programme concerning the study of the ecotoxicity of a chem ­
ical substance with respect to the fish, EEC Study D.8368, 
22 March 1979. 
14. Verfahrensvorschlag des Umweltsbundesamt zum akuten Fisch- 
Test. Rudolph, P. och Boje, R. Okotoxikologie, Grundlagen fur die okotoxikologische Bewertung von Umweltchemikalien nach 
dem Chemikalienge-setz, ecomed 1986. 
15. Litchfield, J. T. and Wilcoxon, E, A simplified method for 
evaluating dose effects experiments, J. Pharm, Exp. Therap., vol. 96, 1949, s. 99. 
16. Finney, D. J. Statistical Methods in biological Assay. Griffin, 
Weycombe, U. K., 1978. 
17. Sprague, J. B. Measurement of pollutant toxicity to fish. II 
Bioassay methods for acute toxicity. Water Res. 1969, vol. 3, s. 793–821. 
18. Sprague, J. B. Measurement of pollutant toxicity to fish. II 
Utilising and applying bioassay results. Water Res. 1970, vol. 
4, s. 3–32. 
19. Stephan, C. E. Methods for calculating an LC50. In Aquatic 
Toxicology and Hazard Evaluation (edited by F. I. Mayer och J. L. Hamelink). American Society for Testing and Materials, 
ASTM STP 634, 1977, s. 65–84. 
20. Stephan, C. E., Busch, K. A., Smith, R., Burke, J. och An ­
drews, R. W. A computer program for calculating an LC50. US EPA.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 938
 
Tillägg 1  
Rekonstituterat vatten  
Exempel på lämpligt utspädningsvatten  
Alla kemikalier ska vara av analytisk renhetsgrad. 
Vattnet ska vara destillerat vatten av god kvalitet eller avjoniserat vatten med en 
ledningsförmåga på mindre än 5 μScm  -1 . 
Apparatur för destillering av vatten får inte innehålla några delar gjorda av 
koppar.  
Stamlösningar  
CaCl  2 · 2H  2 O (kalciumklorid dihydrat) 
Upplöses i vatten så att 1 liter erhålls. 11,76 g 
MgSO  4 .7H  2 O (magnesiumsulfat heptahydrat): 
Upplöses i vatten så att 1 liter erhålls. 4,93 g 
NaHCO  3 (natriumvätekarbonat): 
Upplöses i vatten så att 1 liter erhålls. 2,59 g 
KCl (kaliumklond): 
Upplöses i vatten så att 1 liter erhålls. 0,23 g  
Rekonstituerat utspädningsvatten  
Blanda 25 ml av de fyra stamlösningarna med vatten så att 1 liter erhålls. 
Syrsätt tills koncentrationen av upplöst syre är lika med luftmättnadsvärdet. pH ska vara 7,8 ± 0,2. Justera vid behov pH-värdet med NaOH (natriumhydroxid) eller HCl (saltsyra). Det således framställda utspädningsvattnet sätts åt sidan i 12 timmar och ska inte 
syrsättas ytterligare. 
Summan av Ca- och Mg-jonerna i denna lösning är 2,5 mmol per liter. Förhål ­
landet mellan Ca- och Mg-jonerna är 4:1 och mellan Na- och K-jonerna 10:1. Den totala alkaliniteten hos denna lösning är 0,8 mmol per liter. 
Avvikelser vid framställningen av utspädningsvattnet får inte ändra vattnets sam ­
mansättning eller egenskaper.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 939
 
Tillägg 2  
Fiskarter som rekommenderas till test  
Rekommenderade arter Rekommenderad 
temperaturinter ­
vall (  o C) Rekommenderad 
total längd på 
testdjur (cm)  
Bracbydanio rerio (Teleostei, Cyprinidae)  
(Hamilton-Buchanan) Sebrafisk 20–24 3,0 ± 0,5  
Pimephales promelas (Teleostei, Cyprinidae)  
(Rafinesque) Fathead minnow 20–24 5,0 ± 2,0  
Cypnnus carpio (Teleostei, Cyprinidae)  
(Linné 1758) Karp 20–24 6,0 ± 2,0  
Oryzias latipes (Teleostei, Poeciliidae) Cyp ­
rinodontidae  (Tomminck och Schlegel 1850) 
Red killifish 20–24 3,0 ± 1,0  
Poecilia reticulata (Teleostei, Poeciliidae)  
(Peters 1859) Guppy 20–24 3,0 ± 1,0  
Lepomis macrochirus (Teleostei, Centrar ­
chidae)  (Rafinesque Linneaus 1758) Bluegill 20–24 5,0 ± 2,0  
Onchorhynchus mykiss (Teleostei, Salmoni ­
dae) (Walbaum 1988) Regnbågsforell 12–17 6,0 ± 2,0  
Leuciscus idus (Teleostei, Cyprinidae)  
(Linné 1758) Guldfisk 20–24 6,0 ± 2,0  
Odlingsbetingelser  
Ovan angivna fiskar är lätta att odla och/eller är lätt tillgängliga året runt. De kan 
förädlas och odlas i fiskdammar eller i laboratorier under sjukdoms- och parasit ­
kontrollerade betingelser så att testdjuren är friska och av känd härstamning. 
Dessa fiskar finns i många delar av världen.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 940
 
Tillägg 3  
Exempel på kurva över koncentration mot dödlighet  
Exempel på bestämning av LC  50 på log-probit-papper
  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 941
 
C.2 TEST AV AKUT IMMOBILISERING AV  DAPHNIA -ARTER  
1. METOD  
Denna testmetod för akut immobilisering motsvarar OECD TG 202 
(2004).  
1.1 INLEDNING 
Denna metod beskriver ett akut toxicitetstest för att bedöma effekten 
av kemikalier på hinnkräftor  (Daphnia).  Såvitt möjligt har befintliga 
testmetoder använts (1)(2)(3).  
1.2 DEFINITIONER 
För denna metods ändamål gäller följande definitioner:  
EC 50 : Den koncentration som beräknas immobilisera 50 % av hinnk ­
räftorna inom en given exponeringstid. Om någon annan definition 
används måste denna rapporteras tillsammans med en hänvisning.  
Immobilisering:  De djur som inte längre kan simma inom 15 se ­
kunder efter varsam skakning av testkärlet anses vara immobiliserade (även om de fortfarande kan röra på antennerna).
 
1.3 PRINCIP FÖR TESTMETODEN 
Unga havskräftor, yngre än 24 timmar då testet inleds, exponeras för 
testämnet i en serie koncentrationer under en period av 48 timmar. 
Immobilisering registreras vid 24 timmar och 48 timmar och jämförs 
med kontrollvärden. Resultaten analyseras för beräkning av EC  50 vid 
48 timmar (se avsnitt 1.2 för definitioner). Bestämning av EC  50 vid 
24 timmar är valfri.  
1.4 INFORMATION OM TESTÄMNET 
Testämnets vattenlöslighet och ångtryck ska vara kända och en till ­
förlitlig analysmetod ska finnas tillgänglig för kvantifiering av ämnet 
i testlösningen, med rapporterad återvinningseffektivitet samt analys ­
gräns. Användbar information inbegriper strukturformel, ämnets ren ­
het, stabiliteten i vatten och i ljus, P  ow och resultat från ett test för 
biologisk nedbrytbarhet (se metod C.4). 
Anmärkning: Vägledning för testämnen med fysikalkemiska egen ­
skaper som gör dem svåra att testa ges i (4).  
1.5 REFERENSÄMNEN 
Ett referensämne kan testas med avseende på EC  50 som ett sätt att 
garantera att försöksbetingelserna är tillförlitliga. Giftämnen som an ­
vänds vid internationell ringtestning (1)(5) rekommenderas för detta 
ändamål (  1 ). Försök med ett referensämne ska helst göras varje må ­
nad och minst två gånger per år.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 942  
( 1 ) Resultaten av dessa laboratorieförsök och en teknisk rättelse till ISO 6341 ger ett EC  50 – 
24 timmar för kaliumdikromat (K  2 Cr 2 O 7 ) i intervallet 0,6 mg/l till 1,7 mg/l.
 1.6 KVALITETSKRITERIER 
För att ett försök ska vara giltigt gäller följande kriterier för pre ­
standa: 
— I kontrollerna, inbegripet den kontroll som innehåller solubilise ­
ringsagenset, får inte mer än 10 % av hinnkräftorna immobiliseras. 
— Koncentrationen av löst syre i slutet av försöket ska vara 
> 3 mg/l i kontroll- och testkärl. 
Anmärkning: För det första kriteriet ska inte mer än 10 % av kon ­
trollhinnkräftorna uppvisa immobilisering eller andra tecken på sjuk ­
dom eller stress, t.ex. missfärgning eller ovanligt beteende såsom 
infångning vid vattenytan.  
1.7 BESKRIVNING AV TESTMETODEN  
1.7.1  Utrustning  
Försökskärl och annan apparatur som kommer i kontakt med test ­
lösningarna bör vara tillverkade helt i glas eller annat kemiskt inert material. I regel används glasprovrör eller glasbägare. Dessa bör rengöras före varje rutinmässigt laboratorieförfarande. Försökskärlen 
ska vara löst täckta för att minska vattenförlusten på grund av av ­
dunstning och för att förhindra att damm kommer ner i lösningarna. Flyktiga ämnen ska testas i helt fyllda, slutna kärl som är tillräckligt stora för att förhindra att syret blir begränsande eller att det blir 
syrebrist (se avsnitt 1.6 och första stycket i avsnitt 1.8.3). 
Dessutom behövs åtminstone en del av följande utrustning: syrgas ­
mätare (med mikroelektrod eller annan lämplig anordning för att mäta löst syre i lågvolymsprover), pH-meter, adekvat anordning för temperaturkontroll, utrustning för bestämning av totalt organiskt 
kol (TOC), utrustning för bestämning av kemisk syreförbrukning 
(COD), utrustning för bestämning av vattnets hårdhetsgrad.
 
1.7.2  Försöksorganism  
Daphnia magna  Straus är den föredragna testarten, även om andra 
lämpliga arter av hinnkräfta kan användas i detta test (t.ex.  Daphnia 
pulex).  Vid testets början måste djuren vara yngre än 24 timmar och 
för att minska variabiliteten är en stark rekommendation att de inte tillhör den första satsen avkomma. De ska komma från en frisk stam 
(dvs. inte visa tecken på stress, t.ex. hög dödlighet, förekomst av 
hanar och ephippia, fördröjd produktion av första satsen avkomma, missfärgade djur osv.). Alla organismer som används för ett visst försök ska ha sitt ursprung i odlingar som etablerats från samma 
stam av hinnkräftor. Stamdjuren måste hållas i samma odlingsbeting ­
elser (ljus, temperatur, medium) som används vid testet. Om annat än normalt odlingsmedium för hinnkräftor används vid testet är det tillrådligt med en acklimatiseringsperiod före testet. Under denna 
period ska Dapnia-avkomman hållas i utspädningsvatten vid testtem ­
peraturen under minst 48 timmar innan testet inleds.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 943
 
1.7.3  Förvarings- och utspädningsvatten  
Naturligt vatten (yt- eller grundvatten), rekonstituerat vatten eller 
avklorerat kranvatten är godtagbart som förvarings- och utspädnings ­
vatten om hinnkräftorna överlever i det under odling, acklimatisering 
och testning utan att uppvisa tecken på stress. Vatten som uppfyller 
de kemiska egenskaper som listas i bilaga 1 är lämpliga som test ­
vatten. Vattnet ska hålla konstant kvalitet under testperioden. Rekon ­
stituerat vatten kan framställas genom tillsats av specifika mängder 
reagens av vedertagen analysrenhetsgrad till avjonat eller destillerat 
vatten. Exempel på rekonstituerat vatten ges i (1) (6) och i bilaga 2. Observera att medier som innehåller kända kelaterings ­
medel, t.ex. M4- och M7-medium i bilaga 2, ska undvikas för tes ­
tämnen som innehåller metaller. pH ska ligga i området 6 till 9. En hårdhetsgrad på mellan 140 och 250 mg/l (i form av CaCO
 3 ) rekom­
menderas för  Daphnia Magna,  medan även lägre hårdhetsgrader kan 
vara lämpliga för andra  Daphnia -arter. Utspädningsvattnet kan luftas 
före testet så att koncentrationen av löst syre når mättnad. 
Om naturligt vatten används ska kvalitetsparametrarna mätas minst 
två gånger per år eller närhelst man kan misstänka att dessa egen ­
skaper kan ha ändrats väsentligt (se stycket ovan och bilaga 1). Mätningar av tungmetaller (t.ex. Cu, Pb, Zn, Hg, Cd, Ni) ska också 
göras. Om avklorerat kranvatten används är en daglig kloranalys 
önskvärd. Om utspädningsvattnet kommer från en yt- eller grundvat ­
tenkälla ska konduktivitet samt totalt organiskt kol (TOC) eller ke ­
misk syreförbrukning (COD) mätas.
 
1.7.4  Testlösningar  
Testlösningar av de valda koncentrationerna bereds i regel genom 
utspädning av en stamlösning. Stamlösningarna bör helst beredas genom upplösning av testämnet i utspädningsvattnet. Så långt det 
är möjligt bör bruk av lösningsmedel, emulgeringsmedel eller dis ­
pergeringsmedel undvikas. Sådana föreningar kan dock krävas i vissa fall för att få en stamlösning av lämplig koncentration. Vägledning när det gäller lämpliga lösningsmedel, emulgeringsmedel och disper ­
geringsmedel ges i (4). Testämnets halt i testlösningarna bör under 
inga omständigheter överskrida lösligheten i utspädningsvattnet. 
Testet ska göras utan pH-justering. Om pH inte ligger kvar i området 
6–9 görs ett andra test, med justering av stamlösningens pH till utspädningsvattnets före tillsats av testämne. pH-justeringen ska gö ­
ras på ett sådant sätt att stamlösningens koncentration inte förändras 
väsentligt och så att ingen kemisk reaktion eller utfällning av tes ­
tämnet orsakas. HC1 och NaOH är föredragna.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 944
 
1.8 FÖRFARANDE  
1.8.1  Exponeringsförhållanden  
1.8.1.1  Testgrupper och kontroller  
Testkärlen fylls med lämpliga volymer utspädningsvatten och lös ­
ningar av testämne. Kvoten luftvolym/vattenvolym i kärlet ska vara 
identisk för test- och kontrollgruppen. Hinnkräftorna placeras sedan i testkärlen. Minst 20 djur, helst indelade i fyra grupper om fem vardera, ska användas för varje testkoncentration och för kontroller ­
na. Minst 2 ml testlösning ska tillhandahållas för varje djur (dvs. en 
volym på l0 ml för fem hinnkräftor per testkärl). Testet kan utföras med halvstatisk förnyelse eller med genomflödessystem där koncent ­
rationen av testämne inte är stabil. 
En kontrollserie med utspädningsvatten och också, om detta är rele ­
vant, en kontrollserie som innehåller solubiliseringsagenset måste 
köras utöver behandlingsserierna.
 
1.8.1.2  Testkoncentrationer  
Ett test för att söka intervall kan genomföras för att bestämma kon ­
centrationsområdet för det egentliga testet om ingen information om testämnets toxicitet finns att tillgå. För detta ändamål exponeras hinnkräftorna för en serie koncentrationer av testämnet som ligger 
långt ifrån varandra. Fem hinnkräftor ska utsättas för varje testkon ­
centration i 48 timmar eller mindre, och inga replikat krävs. Expo ­
neringstiden kan förkortas (t.ex. 24 timmar eller mindre) om data lämpliga för intervalltestets ändamål kan erhållas på kortare tid. 
Minst fem testkoncentrationer ska användas. Dessa arrangeras i geo ­
metriska serier med en separationsfaktor som helst inte överskrider 
2,2. Om färre än fem koncentrationer används ska detta motiveras. 
Den högsta testade koncentrationen ska helst ge l00-procentig immo ­
bilisering, och den lägsta koncentrationen som testas ska helst inte ge någon observerbar effekt alls.
 
1.8.1.3  Inkuberingsförhållanden  
Temperaturen ska ligga i området 18  o C till 22  o C, och för varje 
enskilt test ska den vara konstant inom ± 1  o C. En dygnscykel med 
16 timmar ljus och 8 timmar mörker rekommenderas. Fullständigt 
mörker är också godtagbart, särskilt om testämnet är instabilt i ljus. 
Testkärlen måste luftas under testet. Testet genomförs utan pH-ju ­
stering. Hinnkräftorna ska inte utfodras under testet.  
1.8.1.4  Varaktighet  
Testets varaktighet är 48 timmar.  
1.8.2  Observationer  
Varje testkärl ska kontrolleras med avseende på immobiliserade 
hinnkräftor 24 och 48 timmar efter det att testet har påbörjats (se 
avsnitt 1.2 för definitioner). Utöver immobilisering ska alla onormala 
förändringar av beteende och utseende rapporteras.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 945
 
1.8.3  Analyser  
Löst syre och pH mäts i början och i slutet av testet i kontrollen eller 
i kontrollerna och i den högsta testämneskoncentrationen. Koncent ­
rationen av löst syre i kontrollerna ska överensstämma med giltig ­
hetskriteriet (se avsnitt 1.6). pH-värdet ska normalt inte variera med 
mer än 1,5 enheter i något enskilt test. Temperaturen mäts i regel i kontrollkärlen eller som omgivningstemperatur och ska helst registre ­
ras kontinuerligt under testet eller åtminstone i början och i slutet av 
testet. 
Koncentrationen av testämne ska mätas minst vid den högsta och 
den lägsta testkoncentrationen i början och i slutet av testet (4). Det 
rekommenderas att resultaten baseras på uppmätta koncentrationer. Om det finns belägg för att koncentrationen av testämnet har hållit sig inom ± 20 % av den nominella eller uppmätta initiala koncent ­
rationen genom hela testet kan resultaten dock baseras på nominella 
eller uppmätta initialvärden.
 
1.9 LIMIT-TEST 
Genom användning av de förfaranden som beskrivs i denna metod 
kan ett så kallat limit-test göras upp vid 100 mg/l testämne eller upp 
till ämnets löslighetsgräns i testmediet (den av dessa koncentration som är lägst) för att visa att EC
 50 är högre än denna koncentration. 
Limit-testet ska göras med 20 hinnkräftor (helst indelade i fyra 
grupper om fem), med samma antal i kontrollen eller kontrollerna. 
Om någon immobilisering sker ska en fullständig studie genomföras. Allt onormalt beteende som observeras ska registreras.
 
2. DATA  
Data ska sammanfattas i tabellform som för varje behandlingsgrupp 
och kontroll visar antalet hinnkräftor som använts och immobilise ­
ring vid varje observation. Procentandelen immobiliserade hinnkräf ­
tor vid 24 timmar och 48 timmar plottas mot testkoncentrationerna. 
Data analyseras med lämpliga statistiska metoder (t.ex. probitanalys 
osv.) för att beräkna kurvornas lutningar och EC  50 med 95 % kon ­
fidensintervall (p = 0,05) (7) (8). 
Om standardmetoderna för att beräkna EC  50 inte går att tillämpa på 
erhållna data ska den högsta koncentration som inte ger någon im ­
mobilisering och den lägsta koncentration som ger 100 % immo ­
bilisering användas som approximering för EC  50 (eftersom detta 
värde betraktas som det geometriska medelvärdet för dessa båda koncentrationer).
 
3. RAPPORTERING  
3.1 FÖRSÖKSRAPPORT 
Försöksrapporten måste innehålla följande information: 
Testämne: 
— Fysikaliskt tillstånd och relevanta fysikalkemiska egenskaper.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 946
 
— Kemiska identifieringsdata, inbegripet renhet. 
Försöksart: 
— Källa och art av  Daphnia,  leverantör av källan (om denna är 
känd) och odlingsbetingelser (inbegripet fodrets källa, typ och 
mängd samt utfodringsfrekvens). 
Försöksförhållanden: 
— Beskrivning av försökskärlen: typ av kärl, lösningsvolym, antal 
hinnkräftor per försökskärl (replikat) per koncentration. 
— Beredningsmetoder för stam- och testlösningar, inbegripet an ­
vändning av lösningsmedel eller dispergeringsmedel, använda 
koncentrationer. 
— Detaljerade uppgifter om utspädningsvattnet: källa och detalje ­
rade uppgifter om vattenkvalitet (pH, hårdhetsgrad, Ca/Mg-kvot, Na/K-kvot, alkalinitet, konduktivitet osv.) samt sammansättning om rekonstituerat vatten används. 
— Inkuberingsförhållanden: temperatur, ljusintensitet och periodici ­
tet, löst syre, pH osv. 
Resultat: 
— Antal och procentandel hinnkräftor som immobiliserats eller visat 
tecken på negativ inverkan (inbegripet onormalt beteende) i kont ­
rollerna och i varje behandlingsgrupp vid varje observationstid ­
punkt samt en beskrivning av de effekter som observerats. 
— Resultat och datum för tester som utförts med referensämnen, om 
detta finns att tillgå. 
— De nominella testkoncentrationerna och resultaten av alla analy ­
ser för bestämning av koncentrationen av testämne i 
försökskärlen. Även metodens återvinningseffektivitet och ana ­
lysgräns ska rapporteras. 
— Alla fysikalkemiska mätningar av temperatur, pH och löst syre 
som gjorts under testet. 
— EC
 50 vid 48 timmar för immobilisering med konfidensintervall 
och diagram över den anpassade modell som använts för att 
beräkna dessa värden, lutningarna för dos-responskurvorna och 
deras standardfel; statistiska förfaranden som använts för bestäm ­
ning av EC  50 ; (dessa data för immobiliseringen vid 24 timmar 
ska också rapporteras om de mäts). 
— Förklaring till eventuell avvikelse från testmetoden och uppgift 
om huruvida avvikelsen påverkade resultaten.  
4. HÄNVISNINGAR  
1. ISO 6341. (1996). Water quality – Determination of the inhibi ­
tion of the mobility of  Daphnia magna  Straus (Cladocera, Crus ­
tacea) – Acute toxicity test. Third edition, 1996. 
2. EPA OPPTS 850.1010. (1996). Ecological Effects Test Guideli ­
nes – Aquatic Invertebrate Acute Toxicity Test, Freshwater 
Daphnids.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 947
 
3. Environment Canada. (1996) Biological test method. Acute Let ­
hality Test Using  Daphnia  spp. EPS 1/RM/11, Environment Ca ­
nada, Ottawa, Ontario, Kanada. 
4. Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult 
Substances and Mixtures. OECD Environmental Health and Sa ­
fety Publication. Series on Testing and Assessment. No. 
23. Paris, 2000. 
5. Commission of the European Communities. Study D8369. 
(1979). Inter-laboratory Test Programme concerning the study of the ecotoxicity of a chemical substance with respect to  
Daphnia.  
6. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals. Guideline 211:  
Daphnia magna  Reproduction Test, adopted September 1998. 
7. Stephan C.E. (1977). Methods for calculating an LC
 50 . In Aqua ­
tic Toxicology and Hazard Evaluation (edited by F.I. Mayer and J.L. Hamelink). ASTM STP 634 – American Society for Testing 
and Materials. Pp65–84. 
8. Finney D.J. (1978). Statistical Methods in Biological Assay. 
3
 rd ed. London. Griffin, Weycombe, UK.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 948
 
Bilaga 1  
VISSA KEMISKA EGENSKAPER FÖR ETT GODTAGBART 
SPÄDNINGSVATTEN  
Ämne Koncentration  
Partiklar < 20 mg/l 
Totalt organiskt kol < 2 mg/l 
Icke-joniserat ammonium < 1 μg/l 
Restklor < 10 μg/l 
Total mängd pesticider med organiskt fosfat < 50 ng/l Total mängd pesticider med organiskt klor plus polyklore ­
rade bifenyler < 50 ng/1 
Totalt organiskt klor < 25 ng/1
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 949
 
Bilaga 2  
EXEMPEL PÅ LÄMPLIGT REKONSTITUERAT TESTVATTEN  
ISO för testvatten (1)  
Stamlösningar (enstaka ämnen) För framställning av rekonsti ­
tuerat vatten, sätt följande vo ­
lymer av stamlösningarna till 1 
liter vatten (*) Ämne Mängd tillsatt 1 liter 
vatten (*)  
Kalciumklorid 
CaCl  2 , 2H  2 O 11,76 g 25 ml 
Magnesiumsulfat 
MgSO  4 , 7H  2 O 4,93 g 25 ml 
Natriumbikarbonat 
NaHCO  3 2,59 g 25 ml 
Kaliumklorid 
K Cl 0,23 g 25 ml  
(*) Vatten av lämplig renhet, t.ex. avjonat, destillerat eller renat med omvänd osmos med 
en konduktivitet som inte överskrider l0 μS.cm  -1 . 
Elendt M7- och M4-medium  
Acklimatisering till Elendt M4- och M7-medium  
Vissa laboratorier för över hinnkräftorna direkt till M4- och M7-medier. En viss 
framgång har uppnåtts med gradvis acklimatisering, dvs. överflyttning från eget medium till 30 % Elendt, sedan till 60 % Elendt och slutligen till 100 % Elendt. Acklimatiseringsperioderna kan behöva vara upp till en månad långa.
 
Beredning  
Spårelement  
Separata stamlösningar (I) av enskilda spårelement bereds först i vatten av lämp ­
lig renhet, t.ex. avjoniserat, destillerat eller renat med omvänd osmos. Från dessa 
olika stamlösningar (I) bereds en andra stamlösning (II) som innehåller alla 
spårelement (kombinerad lösning), dvs.:  
Stamlösning(ar) I (enskilt ämne) Mängd satt till 1 1 
vatten (mg/l) Koncentration 
(relaterad till 
medium M4) För beredning av den kombinerade stamlösningen 
II tillsätts följande mängd av stamlösning I till 1 
1 vatten (ml/l) 
M4 M7  
H 3 BO 3 57 190 20 000-faldig 1,0 0,25 
MnCl  2 .4H  2 O 7 210 20 000-faldig 1,0 0,25 
LiCl 6 120 20 000-faldig 1,0 0,25  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 950
 
Stamlösning(ar) I (enskilt ämne) Mängd satt till 1 1 
vatten (mg/l) Koncentration 
(relaterad till 
medium M4) För beredning av den kombinerade stamlösningen 
II tillsätts följande mängd av stamlösning I till 1 
1 vatten (ml/l) 
M4 M7  
RbCl 1 420 20 000-faldig 1,0 0,25 
SrCl  2 .6H  2 O 3 040 20 000-faldig 1,0 0,25 
NaBr 320 20 000-faldig 1,0 0,25 Na
 2 MoO  4 .2H  2 O 1 230 20 000-faldig 1,0 0,25 
CuCl  2 .2H  2 O 335 20 000-faldig 1,0 0,25 
ZnCl  2 260 20 000-faldig 1,0 1,0 
CoCl  2 .6H  2 0 200 20 000-faldig 1,0 1,0 
KI 65 20 000-faldig 1,0 1,0 Na
 2 SeO  3 43,8 20 000-faldig 1,0 1,0 
NH  4 VO  3 11,5 20 000-faldig 1,0 1,0 
Na 2 EDTA.2H  2 O 5 000 2 000-faldig — — 
FeSO  4 .7H  2 O 1 991 2 000-faldig — — 
Både Na  2 EDTA- och FeSO  4 -lösningarna förbereds var för sig, hälls samman och autoklaveras omedelbart. 
Detta ger: 
21 Fe-EDTA-lösning 1 000-faldig 20,0 5,0  
M4- och M7-medier  
M4- och M7-medier bereds med stamlösning II, makro-näringsämnen och vita ­
miner enligt följande:  
Mängd tillsatt vatten 
(mg/l) Koncentration (relaterad 
till medium M4) Mängd stamlösning II som tillsätts för beredning 
av medium (ml/l) 
M4 M7  
Stamlösning II (kombine ­
rad med spårelement) 20-faldig 50 50 
Stamlösningar för makronä ­
ringsämnen (enskilt ämne) 
CaCl  2 . 2H  2 0 293 800 1 000-faldig 1,0 1,0 
MgSO  4 . 7H  2 O 246 600 2 000-faldig 0,5 0,5 
KC1 58 000 10 000-faldig 0,1 0,1 NaHCO
 3 64 800 1 000-faldig 1,0 1,0 
Na 2 SiO  3 . 9H  2 O 50 000 5 000-faldig 0,2 0,2 
NaNO  3 2 740 10 000-faldig 0,1 0,1 
KH  2 PO 4 1 430 10 000-faldig 0,1 0,1 
K 2 HPO  4 1 840 10 000-faldig 0,1 0,1  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 951
 
Mängd tillsatt vatten 
(mg/l) Koncentration (relaterad 
till medium M4) Mängd stamlösning II som tillsätts för beredning 
av medium (ml/l) 
M4 M7  
Kombinerad vitaminstam ­
lösning — 10 000-faldig 0,1 0,1 
Den kombinerade vitaminstamlösningen bereds genom tillsats av de tre vitaminerna till 1 1 vatten, såsom visas nedan: 
Tiaminhydroklorid 750 10 000-faldig 
Cyanokobalamin (B  12 ) 10 10 000-faldig 
Biotin 7,5 10 000-faldig 
Den kombinerade vitaminstamlösningen lagras fryst i små alikvoter. Vitaminer 
sätts till medierna strax före användning. 
Märk: För att undvika utfällning av salter vid beredning av kompletta medier 
ska alikvoter av stamlösningar sättas till cirka 500–800 ml avjonat 
vatten som sedan späds upp till 1 liter. 
Märk: Den första publiceringen av M4-mediet finns i Elendt, B. P. (1990). 
Selenium deficiency in crustacea; an ultrastructual approach to antennal damage in Daphnia magna Straus. Protoplasma, 154, 25–33.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 952
 
C.3 BESTÄMNING AV TILLVÄXTHÄMNING HOS SÖTVATTEN ­
SALGER OCH CYANOBAKTERIER  
1. METOD  
Metoden motsvarar OECD TG 201 (2006) (1).  
1.1 INLEDNING 
Testmetoder utvärderas och moderniseras med jämna mellanrum som 
en anpassning till den vetenskapliga utvecklingen. Det var nödvän ­
digt att revidera metoden C.3 för att ta med ytterligare arter och för 
att uppfylla kraven beträffande farobedömning och klassificering av 
kemikalier. Revideringen har gjorts på grundval av tre faktorer: en betydande praktisk erfarenhet, den vetenskapliga utvecklingen när 
det gäller toxicitetstester på alger, samt en omfattande användning 
av den tidigare versionen av dokumentet för normerande ändamål.
 
1.2 DEFINITIONER 
I denna metodbeskrivning används följande definitioner och förkort ­
ningar:  
biomassa : torrvikten av all levande substans i en population, uttryckt 
per volymenhet, t.ex. mg alger/liter testlösning. Biomassa definieras vanligen som en massa, men i det här testet används alltså i stället 
massa/volym. Begreppet biomassa används också i testet för att ange 
resultatet av alternativa mätmetoder, t.ex. cellräkning och mätning av fluorescens.  
variationskoefficient : dimensionslöst mått på en parameters varia ­
bilitet, definierat som förhållandet mellan standardavvikelsen och medelvärdet. Detta kan också uttryckas i procent. Variationskoeffi ­
cientens medelvärde för den genomsnittliga specifika tillväxthastig ­
heten i kontrollreplikaten beräknas enligt följande: 
1. Beräkna variationskoefficienten (i procent) för den genomsnittliga 
specifika tillväxthastigheten utifrån de dagliga sektionsvisa till ­
växthastigheterna för respektive replikat. 
2. Beräkna medelvärdet för alla värden som erhållits i punkt 1 för att 
få fram den genomsnittliga variationskoefficienten för den dagliga 
sektionsvisa specifika tillväxthastigheten i kontrollreplikaten.  
EC
 x : den koncentration av testsubstansen, löst i testmediet, som 
minskar testorganismens tillväxt med x % (t.ex. 50 %) inom en bestämd exponeringstid (som tydligt måste anges om man avviker 
från den fulla eller normala testperioden). För att man entydigt ska 
kunna skilja ett EC-värde som härletts ur tillväxthastigheten från ett som härletts ur den producerade mängden biomassa används symbo ­
lerna ”E
 r C” resp. ”E  y C”. 
odlingsmedium : det kompletta syntetiska medium som algerna växer 
i när de exponeras för testsubstansen. Testsubstansen är vanligen löst 
i testmediet.  
tillväxthastighet (genomsnittlig specifik tillväxthastighet) : den lo­
garitmiska ökningen av biomassan under exponeringstiden.  ▼M1 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 953
 
lägsta koncentration med observerad effekt (LOEC – ”Lowest 
Observed Effect Concentration”) : den lägsta testade koncentration 
vid vilken man kan fastställa att testsubstansen har en statistiskt signifikant hämmande effekt på tillväxten (vid p < 0,05) inom en given exponeringstid, jämfört med kontrollen. Alla koncentrationer 
av testsubstansen som överstiger LOEC måste dock ha en negativ 
effekt som är minst lika stor som den som observeras vid LOEC. Om dessa båda villkor inte är uppfyllda måste en fullständig redo ­
görelse lämnas för hur LOEC (och därmed NOEC) har valts.  
högsta koncentration utan observerad effekt (NOEC – 
”No Observed Effect Concentration”) : den koncentration av test ­
substansen som ligger omedelbart under LOEC.  
responsvariabel : variabel för bestämning av toxicitet. Variabeln fås 
fram genom att olika beräkningsmetoder tillämpas på uppmätta para ­
metrar för biomassa. I den aktuella testmetoden är tillväxthastighet och producerad mängd biomassa responsvariabler som erhålls genom att biomassan mäts antingen direkt eller genom någon av de angivna 
alternativa mätmetoderna.  
specifik tillväxthastighet : responsvariabel som definieras som kvo ­
ten av skillnaden mellan de naturliga logaritmerna för en observerad parameter (i den här testmetoden: biomassa) och motsvarande tids ­
period.  
producerad mängd biomassa : värdet på en mätvariabel i slutet av 
exponeringstiden minus motsvarande värde i början av exponerings ­
tiden, använt som ett mått på ökningen av biomassa under testet.
 
1.3 TESTETS TILLÄMPLIGHET 
Testmetoden är lättast att tillämpa på vattenlösliga ämnen som under 
testförhållandena sannolikt kommer att stanna kvar i vattnet. Om 
man i stället vill testa ämnen som är flyktiga, starkt adsorberande, färgade, svårlösliga i vatten eller som kan påverka tillgången på näringsämnen och mineraler i testmediet kan det krävas vissa modi ­
fieringar av den beskrivna metoden (t.ex. slutna system, andra typer 
av testkärl). Några exempel på lämpliga modifieringar ges i (2)(3) och (4).
 
1.4 TESTPRINCIP 
Syftet med testet är att bestämma vilka effekter ett visst ämne har på 
tillväxten hos sötvattenslevande mikroalger och cyanobakterier. De exponentiellt växande testorganismerna exponeras för testsubstansen 
i batchkulturer under en tidsperiod på vanligen 72 timmar. Trots att 
testperioden är relativt kort kan effekterna på flera generationer be ­
dömas. 
Systemets respons innebär att tillväxten i en serie algkulturer (tes ­
tenheter) som exponeras för olika koncentrationer av en testsubstans minskar. Responsen betraktas som en funktion av exponeringskon ­
centrationen jämfört med den genomsnittliga tillväxten för icke-ex ­
ponerade kontrollreplikat. För att testsystemet ska kunna ge full respons på en toxisk testsubstans (optimal känslighet) får kulturerna tillväxa exponentiellt utan några begränsningar, samt med tillräcklig 
näringstillgång och i kontinuerligt ljus, under den tid som krävs för 
att minskningen i specifik tillväxthastighet ska bli mätbar.
 ▼M1 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 954
 
Tillväxtens och tillväxtminskningens storlek bestäms genom mät ­
ningar av algbiomassans förändring över tiden. Algbiomassa definie ­
ras som torrvikten alger per volymenhet, t.ex. mg alger/liter testlös ­
ning. Torrvikt är dock svårt att mäta, varför man kan använda sig av olika alternativa parametrar. Bland dessa är celltal vanligast. Andra 
alternativa parametrar är cellvolym, fluorescens och absorbans. Om ­
räkningsfaktorn mellan uppmätt värde för den alternativa parametern och biomassa ska vara känd. 
Som effektmått för testet används tillväxtminskning, där tillväxt de ­
finieras som den logaritmiska ökningen av biomassan (genomsnittlig specifik tillväxthastighet) under exponeringstiden. Från de genom ­
snittliga specifika tillväxthastigheter som uppmätts i en serie testlös ­
ningar beräknar man den koncentration av testsubstansen som ger upphov till en viss, fastställd minskning av tillväxthastigheten, x % (t.ex. 50 %). Värdet uttrycks som E
 r C x (t.ex. E  r C 50 ). 
För tillämpning av denna metod inom ramen för EU-lagstiftningen 
bör resultatberäkningen baseras på en genomsnittlig specifik tillväxt ­
hastighet av de skäl som anges i avsnitt 2.2 nedan. I den här test ­
metoden används även producerad mängd biomassa som responsva ­
riabel, något som kan vara nödvändigt för att uppfylla gällande krav 
i vissa länder. Denna responsvariabel definieras som skillnaden i 
biomassa mellan exponeringstidens början och slut. Med utgångspunkt i den mängd biomassa som producerats i en serie testlösningar beräknar man den koncentration av testsubstansen 
som ger upphov till en viss, fastställd minskning av mängden pro ­
ducerad biomassa, x % (t.ex. 50 %). Detta värde uttrycks som E
 y C x 
(t.ex. E  y C 50 ). 
Den lägsta koncentrationen med observerad effekt (LOEC) och den 
högsta koncentrationen utan observerad effekt (NOEC) kan också 
bestämmas statistiskt.  
1.5 TESTSUBSTANS 
Uppgifter om testsubstansen kan vara av värde då man bestämmer 
testförhållandena. Exempel på sådana uppgifter är strukturformel, 
renhetsgrad, ljusbeständighet, stabilitet under testbetingelserna, ljus ­
absorberande förmåga, pKa, samt resultat från undersökningar av ämnets omvandling – bland annat genom biologisk nedbrytning – i 
vatten. 
Testsubstansens vattenlöslighet, fördelningskoefficient oktanol/vatten 
(P
 ow ) och ångtryck ska vara kända, och det ska finnas en validerad 
metod för kvantitativ bestämning av ämnet i testlösningarna. Meto ­
dens utbyte och detektionsgräns ska vara kända.  
1.6 REFERENSSUBSTANS 
Referenssubstanser, t.ex. 3,5-diklorfenol, som används i det interna ­
tionella ringtestet (4), kan testas för att kontrollera testförfarandet. 
För grönalger kan även kaliumdikromat användas som referenssub ­
stans. Referenssubstanser bör testas minst två gånger per år.  
1.7 RESULTATENS GILTIGHET 
För att testresultaten ska vara giltiga måste följande villkor vara 
uppfyllda:  ▼M1 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 955
 
— Biomassan i kontrollkulturerna ska ha ökat exponentiellt med 
minst en faktor 16 inom testperioden (72 timmar). Detta mot ­
svarar en specifik tillväxthastighet på 0,92/dygn. De mest an ­
vända arterna har vanligen en betydligt högre tillväxthastighet (se tillägg 1). Kravet kan dock inte alltid uppfyllas när man 
använder sig av arter som växer långsammare än de i 
tillägg 1. Testperioden ska då förlängas så att man erhåller en minst 16-faldig tillväxt i kontrollkulturerna, och tillväxten måste vara exponentiell under hela testperioden. Testperioden kan även 
förkortas ända ner till 48 timmar om detta krävs för att uppnå 
obegränsad exponentiell tillväxt under testet. Ett villkor för detta är dock att tillväxten är minst 16-faldig. 
— Variationskoefficientens medelvärde för sektionsvis specifika till ­
växthastigheter (dag 0–1, 1–2 och 2–3 för 72-timmarstester) i kontrollkulturerna (se avsnitt 1.2 under ”variationskoefficient”) 
får inte överskrida 35 %. I andra stycket i avsnitt 2.2.1 beskrivs 
hur man beräknar sektionsvis specifik tillväxthastighet. Detta kri ­
terium tillämpas på medelvärdet för de variationskoefficienter som räknats fram för kontrollreplikaten. 
— I tester med  Pseudokirchneriella subcapitata  och  Desmodesmus 
subspicatus  får variationskoefficienten för genomsnittlig specifik 
tillväxthastighet i kontrollreplikaten inte överskrida 7 % under 
hela testperioden. För arter som inte används så ofta i testsam ­
manhang får värdet inte överstiga 10 %.
 
1.8 METODBESKRIVNING  
1.8.1  Utrustning  
Testkärl och annan utrustning som kommer i kontakt med testlös ­
ningarna ska vara helt av glas eller annat kemiskt inert material. Utrustningen ska rengöras omsorgsfullt så att inga organiska eller 
oorganiska föroreningar påverkar algernas tillväxt eller testlösning ­
arnas sammansättning. 
Som testkärl används vanligen glaskolvar som rymmer en tillräckligt 
stor volym algkultur för att möjliggöra mätningar under testet. Kol ­
varna ska också medge ett tillräckligt högt utbyte av CO
 2 med den 
omgivande luften (se andra stycket i avsnitt 1.8.9). Observera att 
vätskevolymen måste vara tillräckligt stor för analytiska bestäm ­
ningar (se femte stycket i avsnitt 1.8.11). 
Följande utrustning krävs också (helt eller delvis): 
— Odlingsutrymme. Man bör använda ett odlingsskåp eller en od ­
lingskammare där inkuberingstemperaturen kan regleras med en 
noggrannhet av ± 2 °C. 
— Instrument för ljusmätning. Observera att mätvärdena för ljusin ­
tensitet påverkas av mätmetoden, särskilt typen av ljussensor. Mätningarna bör helst göras med en sfärisk (4 π) sensor (som 
mäter både direkt och reflekterat ljus från alla vinklar ovanför 
och under mätplanet), eller en 2 π-sensor (som mäter ljus från 
alla vinklar ovanför mätplanet).
 ▼M1 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 956
 
— Utrustning för att bestämma algbiomassa. Cellräkning, som är 
den oftast använda alternativa mätmetoden för algbiomassa, kan 
utföras med elektronisk partikelräknare, mikroskop utrustat med räknekammare eller flödescytometer. Andra alternativa paramet ­
rar för biomassa kan mätas med hjälp av flödescytometer, fluo ­
rimeter, spektrofotometer eller kolorimeter. Man bör helst ta reda 
på omräkningsfaktorn mellan celltal och torrvikt. När koncent ­
rationen av biomassa är låg kan det vid spektrofotometriska mät ­
ningar vara nödvändigt att använda sig av kyvetter med en strål ­
gång på minst 4 cm för att få fram användbara mätvärden.
 
1.8.2  Testorganismer  
Ett stort antal arter av icke-fastsittande mikroalger och cyanobakte ­
rier kan användas för testet. En förteckning över lämpliga stammar återfinns i tillägg 1. 
Om man använder sig av andra arter ska stammen och/eller ur ­
sprunget anges. Man måste också kunna visa att de alger som an ­
vänds kan tillväxa exponentiellt under hela testperioden vid rådande testförhållanden.
 
1.8.3  Odlingsmedium  
Det rekommenderas att man använder antingen OECD eller AAP 
som odlingsmedium. Sammansättningen av dessa medier framgår 
av tillägg 2. Observera att de två medierna har olika utgångsvärde 
för pH och olika buffringsförmåga (motverkar pH-ökningar), vilket gör att de kan ge olika testresultat. Detta gäller särskilt när man testar joniserande ämnen. 
Det kan ibland vara nödvändigt att modifiera odlingsmedierna, t.ex. 
då man testar metaller eller kelatbildare, eller då testerna görs vid skilda pH-värden. Man ska alltid ange skälen till en sådan modifie ­
ring, och det modifierade mediet ska beskrivas i detalj (3)(4).
 
1.8.4  Biomassans startkoncentration  
Biomassans startkoncentration ska vara densamma för alla testkul ­
turer. Den ska också vara tillräckligt låg för att möjliggöra exponen ­
tiell tillväxt under hela inkuberingen utan att några näringsämnen tar slut. Startvärdet får inte överskrida 0,5 mg/l, räknat på torrvikt. Föl ­
jande cellkoncentrationer bör användas:  
Pseudokirchneriella subcapitata  5 × 10
 3 –10  4 celler/ml  
Desmodesmus subspicatus  2–5 × 10  3 celler/ml  
Navicula pelliculosa  10  4 celler/ml  
Anabaena flos-aquae  10  4 celler/ml  
Synechococcus leopoliensis  5 × 10  4 –10  5 celler/ml  
1.8.5  Testsubstansens koncentration  
Det koncentrationsintervall där det är troligt att testsubstansen ger 
effekter kan bestämmas på grundval av resultat från särskilda tester 
(”range-finding tests”). För det slutliga testet används minst fem koncentrationer i en geometrisk serie vars faktor inte överstiger 3,2. För testsubstanser med plan dos-respons-kurva kan det vara 
befogat att använda en högre faktor. Koncentrationsserien bör helst 
omfatta ett intervall som minskar tillväxthastigheten med 5–75 %.
 ▼M1 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 957
 
1.8.6  Replikat och kontroller  
För varje koncentration av testsubstansen ska det finnas tre replikat. 
Om NOEC inte behöver bestämmas kan man ändra testupplägget så att antalet koncentrationer ökas medan antalet replikat per koncent ­
ration minskas. Minst tre kontrollreplikat ska användas, och helst bör 
de vara dubbelt så många som antalet replikat för varje koncentration av testsubstansen. 
En extra serie testlösningar kan beredas för analytisk bestämning av 
testsubstansens koncentration (se fjärde och sjätte stycket i 
avsnitt 1.8.11). 
Om ett lösningsmedel används för testsubstansen måste man ta med 
ytterligare kontroller där koncentrationen av lösningsmedel är den ­
samma som i testkulturerna.
 
1.8.7  Beredning av ympkultur  
En ympkultur bereds i testmedium 2–4 dagar innan testet påbörjas. 
Syftet med detta är att algerna ska kunna anpassa sig till testförhål ­
landena och befinna sig i exponentiell tillväxtfas när de senare ym ­
pas i testlösningarna. Algbiomassan regleras så att ympkulturen fort ­
sätter att tillväxa exponentiellt till dess att testet inleds. Ympkulturen inkuberas under samma förhållanden som testkulturerna. En mätning görs av ökningen av ympkulturens biomassa, så att man kan förvissa 
sig om att tillväxten befinner sig inom det normala intervallet för den 
använda stammen under rådande odlingsbetingelser. I tillägg 3 ges ett exempel på en metod för algodling. Det kan krävas ett andra förökningssteg för ympkulturen om man vill undvika att celldelning ­
arna under testet sker synkront.
 
1.8.8  Beredning av testlösningar  
Alla testlösningar ska innehålla samma koncentration av odlings ­
mediet, och samma startkoncentration av algbiomassan. Testlös ­
ningar av de valda koncentrationerna bereds vanligen genom att 
man blandar en stamlösning av testsubstansen med odlingsmedium 
och ympkultur. Stamlösningar brukar beredas genom att man löser ämnet i fråga i testmedium. 
Lösningsmedel som aceton, tert-butylalkohol och dimetylformamid 
kan användas som bärare när man tillsätter ämnen med låg vattenlös ­
lighet till testmediet (2)(3). Koncentrationen av lösningsmedel ska inte överstiga 100 μl/l, och det tillsatta lösningsmedlet ska vara av 
samma koncentration för alla kulturer (inklusive kontroller) i test ­
serien.
 
1.8.9  Inkubering  
Testkärlen försluts med luftgenomsläppliga proppar, skakas om, och 
placeras sedan i odlingsutrymmet. För att hålla algerna i suspension under hela testet och för att säkra ett tillräckligt stort utbyte av CO
 2 
måste kärlen hela tiden skakas eller innehållet röras om. Kulturerna 
inkuberas vid 21–24 °C, och temperaturen ska kunna regleras med 
en noggrannhet av ± 2 °C. När det gäller arter som inte förtecknas i tillägg 1 (t.ex. tropiska arter) kan det vara lämpligt med en högre temperatur. Detta förutsätter dock att kriterierna för testresultatens 
giltighet är uppfyllda. Kolvarna bör placeras slumpvis i inkubatorn 
och sedan flyttas om dagligen.
 ▼M1 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 958
 
Kontrollmediets pH får inte öka med mer än 1,5 enheter under testet. 
När det gäller metaller samt ämnen som delvis joniseras vid det 
använda pH-värdet, kan det vara nödvändigt att justera för pH-för ­
ändringar för att få fram reproducerbara och tydliga resultat. Det går att begränsa pH-svängningar till mindre än 0,5 enheter om man ser 
till att utbytet av CO
 2 mellan testlösningen och den omgivande luften 
är tillräckligt högt, t.ex. genom att öka skakapparatens hastighet. En annan möjlighet är att reducera behovet av CO
 2 genom att minska 
biomassans startkoncentration eller testets längd. 
Den yta där kulturerna inkuberas ska kontinuerligt belysas med flu ­
orescerande ljus av enhetligt slag, t.ex. kallt vitt ljus eller dagsljus. Olika stammar av alger och cyanobakterier kan ha olika ljuskrav, 
och ljusets intensitet ska anpassas efter den testorganism som an ­
vänds. För de rekommenderade grönalgsarterna ska intensiteten, mätt vid testlösningarna, ligga inom intervallet 60–120 μE·m
 –2 ·s –1 när 
mätningen görs i det fotosyntetiskt verksamma våglängdsområdet 
400–700 nm med lämplig sensor. Vissa arter, särskilt  Anabaena 
flos-aquae , tillväxer utan problem vid låga ljusintensiteter och kan 
även skadas av höga intensiteter. För sådana arter ska den genom ­
snittliga ljusintensiteten ligga på 40–60 μE·m  –2 ·s –1 . (För mätinstru ­
ment som kalibrerats i lux motsvarar den rekommenderade ljusinten ­
siteten 60–120 μE·m  –2 ·s –1 för kallt vitt ljus ungefär 
4 440–8 880 lux.) Ljusintensiteten över inkuberingsytan får inte va ­
riera mer än ± 15 % jämfört med genomsnittsvärdet.  
1.8.10  Testets varaktighet  
Testet ska normalt pågå i 72 timmar. Man kan dock använda kortare 
eller längre testperioder, förutsatt att samtliga kriterier för testresul ­
tatens giltighet i avsnitt 1.7 är uppfyllda.  
1.8.11  Mätningar och analytiska bestämningar  
Algbiomassan i varje kolv bestäms minst en gång per dag under 
testperioden. Om mätningarna görs på små volymer som pipetterats från testlösningarna ska dessa volymer inte ersättas. 
Biomassan bestäms genom manuell cellräkning i mikroskop eller 
med hjälp av en elektronisk partikelräknare (mätning av celltal eller biovolym). Alternativa metoder, t.ex. flödescytometri, klorofyll ­
fluorescens  in vitro  eller  in vivo  (6)(7) och absorbans kan också 
användas, förutsatt att man kan påvisa en tillfredsställande korrela ­
tion med biomassan för de värden på densamma som kan före ­
komma i testet. 
Lösningarnas pH mäts i början och slutet av testet. 
Om det finns en analytisk bestämningsmetod för testsubstansen i det 
valda koncentrationsintervallet ska testlösningarna analyseras för att 
kontrollera startkoncentrationerna och för att se till att exponerings ­
koncentrationerna inte förändras under testet.
 ▼M1 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 959
 
Om det är troligt att exponeringskoncentrationerna under testet kom ­
mer att variera med mindre än 20 % från de nominella värdena kan 
det räcka med att man i början och slutet av testet bestämmer test ­
substansens koncentration på tre nivåer: en hög koncentration, en låg koncentration, och en koncentration runt det förväntade EC
 50 -värdet. 
Om koncentrationerna av testsubstansen sannolikt inte kommer att 
hålla sig inom 80–120 % av de nominella värdena bör man i stället bestämma samtliga koncentrationer av testsubstansen vid testets bör ­
jan och slut. För flyktiga, instabila eller starkt adsorberande testsub ­
stanser bör ytterligare prov för analys tas med 24 timmars mellanrum 
under hela exponeringstiden. På så vis får man ett säkrare mått på hur mycket testsubstans som försvinner. Sådana ämnen kräver också att man använder extra replikat. Under alla omständigheter behöver 
bestämningar av testsubstansens koncentration bara göras på ett re ­
plikatkärl för varje koncentration (eller på det samlade innehållet från samtliga replikat). 
Testmedier som beretts särskilt för bestämning av exponeringskon ­
centrationer under testet ska behandlas på samma sätt som dem som 
används för tester, dvs. de ympas med alger och inkuberas under identiska förhållanden. Om den lösta testsubstansens koncentration måste bestämmas kan det vara nödvändigt att isolera algerna från 
mediet. Separeringen bör helst göras genom centrifugering vid lågt 
g-tal (men tillräckligt högt för att algerna ska kunna avskiljas). 
Om man kan visa att testsubstansens koncentration under hela testet 
på ett tillfredsställande sätt har hållits inom ± 20 % av den nominella 
eller uppmätta startkoncentrationen, kan analysen av resultaten base ­
ras på nominella eller uppmätta startvärden. Om avvikelsen från den nominella eller uppmätta startkoncentrationen är större än ± 20 % ska analysen i stället grunda sig på det geometriska medelvärdet för 
koncentrationen under exponeringen, eller på modeller som beskriver 
hur testsubstansens koncentration minskar (3)(8). 
Bestämning av tillväxthämning hos alger är en mer dynamisk metod 
än de flesta andra akvatiska toxicitetstester med kort testperiod. De 
faktiska exponeringskoncentrationerna kan därför vara svåra att be ­
stämma, särskilt för adsorberande ämnen som testas vid låga kon ­
centrationer. Om ämnet i sådana fall adsorberas till den ökande alg ­
biomassan och därför inte längre återfinns i lösningen, innebär detta 
dock inte att ämnet försvinner från testsystemet. Vid analysen av testresultat ska man undersöka om en minskad koncentration av ämnet under testperioden kan korreleras med en reducerad tillväxt ­
hämning. Om så är fallet bör man överväga att genom en lämplig 
modell beskriva testsubstansens minskande koncentration (8). I annat fall kan det vara motiverat att basera resultatanalysen på testsubstan ­
sens nominella eller uppmätta startkoncentration.
 
1.8.12  Övriga iakttagelser  
Kontrollera i mikroskop att ympkulturen ser normal och frisk ut. I slutet 
av testet ska man också notera eventuella avvikelser från normalt 
utseende (som kan ha orsakats av exponeringen för testsubstansen).  ▼M1 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 960
 
1.8.13  Gränstest  
Under vissa omständigheter, t.ex. när ett förberedande test tyder på 
att testsubstansen inte har några toxiska effekter vid koncentrationer upp till 100 mg/l – eller upp till dess löslighetsgräns i testmediet, om 
denna gräns är lägre – kan man utföra ett gränstest. Man jämför då 
responsen mellan en kontrollgrupp och en testgrupp (med en kon ­
centration på 100 mg/l eller lika med löslighetsgränsen). Det rekom ­
menderas starkt att jämförelsen kompletteras med en bestämning av 
exponeringskoncentrationen. Alla tidigare beskrivna testbetingelser 
och kriterier för provresultatens giltighet gäller även för gränstestet, sånär som på att testreplikaten ska vara minst sex till antalet. 
Responsvariablerna i kontroll- och testgruppen kan analyseras med 
hjälp av ett statistiskt test där man jämför medelvärden, t.ex. Students t-test. Om de två grupperna inte har samma varians måste t-testet anpassas efter detta.
 
1.8.14  Anpassning för starkt färgade ämnen  
Bestrålningen (ljusets intensitet) bör ligga i den övre delen av det 
intervall som beskrivs i denna testmetod, dvs. 120 μE m-2 s-1 eller 
högre. 
Strålgången bör kortas genom att lösningarnas volym minskas (med 
mellan 5 och 25 ml). 
Man bör sörja för tillräcklig omrörning (till exempel genom måttlig 
skakning) så att algerna frekvent utsätts för hög ljusbestrålning vid odlingens yta.
 
2. DATA  
2.1 PLOTTNING AV TILLVÄXTKURVOR 
Mängden biomassa i testkärlen kan uttryckas i enheten för den al ­
ternativa parameter som använts vid mätningen (t.ex. celltal, fluore ­
scens). 
De framräknade värdena för biomassans koncentration i testkulturer 
och kontroller förs in i en tabell, tillsammans med testmaterialets 
koncentrationer och mättidpunkterna (noterade med en upplösning 
på minst hela timmar). Tabellvärdena används sedan för att ta fram plottade tillväxtkurvor. Både logaritmiska och linjära skalor kan vara användbara på detta inledande stadium, men logaritmiska 
skalor är obligatoriska, och de ger också i allmänhet en bättre upp ­
fattning om variationer i tillväxtmönstret under testperioden. Obser ­
vera att exponentiellt ökande mätvärden ger en rak linje när de 
plottas på en logaritmisk skala, och att kurvans lutning anger den 
specifika tillväxthastigheten. 
Kontrollera med hjälp av plottarna om kontrollkulturerna har tillväxt 
exponentiellt och med förväntad hastighet under hela testet. Alla 
datapunkter och kurvor bör undersökas kritiskt, och rådata samt metoder bör kontrolleras med avseende på eventuella fel. Kontrollera särskilt alla datapunkter som verkar avvika på grund av systematiska 
fel. Om man konstaterar uppenbara eller mycket sannolika fel i tes ­
tutförandet ska de berörda datapunkterna markeras som avvikande värden (”outliers”) och inte tas med i den efterföljande statistiska analysen. (Om algkoncentrationen är noll i hälften eller en tredjedel 
av kärlen med replikat kan detta tyda på att kärlen inte ympats på 
rätt sätt eller inte rengjorts ordentligt.) Det ska tydligt framgå av testrapporten varför en datapunkt betraktats som avvikande och där ­
för inte använts. Det enda giltiga skälet är (enstaka) misstag i ut ­
förandet av testet. Dålig precision räknas däremot inte som ett giltigt 
skäl. Statistiska metoder för att identifiera avvikande värden är av begränsat värde när det gäller den här typen av problem, och de kan inte ersätta expertbedömningar. Avvikande värden (som markerats 
som sådana) bör helst behållas bland de datapunkter som visas i 
senare presentationer av data i grafisk form eller tabellform.
 ▼M1 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 961
 
2.2 RESPONSVARIABLER 
Syftet med testet är att bestämma testsubstansens effekt på tillväxten 
hos alger. Eftersom olika medlemsländer har olika prioriteringar och bestämmelser används två responsvariabler, a och b. Effekten ska 
bedömas med båda variablerna för att testresultaten ska kunna godtas 
i alla medlemsländer. 
a) Genomsnittlig specifik tillväxthastighet: responsvariabel som be ­
räknas utifrån den logaritmiska ökningen i biomassa under test ­
perioden, uttryckt per dygn. 
b) Producerad mängd biomassa: responsvariabel som motsvarar 
skillnaden mellan den ursprungliga mängden biomassa och bio ­
massan vid testets slut. 
För tillämpning av denna metod inom ramen för EU-lagstiftningen 
bör resultatberäkningen baseras på en genomsnittlig specifik tillväxt ­
hastighet av de skäl som anges nedan. Observera att toxicitetsvärden 
som beräknats utifrån de två responsvariablerna inte är jämförbara, 
och att denna skillnad måste framgå när man tillämpar testresultaten. Om testet utförts på det sätt som beskrivs i den här handledningen kommer EC
 x -värden baserade på genomsnittlig specifik tillväxthas ­
tighet (E  r C x ) vanligen att ligga högre än sådana värden som grundar 
sig på producerad mängd biomassa (E  y C x ). Detta ska dock inte 
tolkas som skillnader i känslighet mellan de två responsvariablerna; avvikelserna beror i stället på att de båda metoderna är olika mate ­
matiskt konstruerade. Variabeln genomsnittlig specifik tillväxthastig ­
het är baserad på den (vanligen exponentiella) tillväxten hos alger i obegränsade kulturer, där toxiciteten bestäms på grundval av dess effekter på tillväxthastigheten, utan att vara beroende av vare sig det 
absoluta värdet på kontrollens specifika tillväxthastighet, på dos-re ­
spons-kurvans lutning, eller på testets varaktighet. Resultat som i stället grundar sig på producerad mängd biomassa är däremot bero ­
ende av alla dessa övriga variabler. E
 y C x är beroende av den speci ­
fika tillväxthastigheten för den algart som används i varje enskilt test 
samt av den maximala specifika tillväxthastigheten – som kan variera mellan olika arter och t.o.m. mellan olika stammar av en och samma art. Denna responsvariabel ska därför inte användas för att jämföra 
känsligheten för toxiska ämnen mellan arter eller stammar. Det är ur 
vetenskaplig synvinkel att föredra om toxiciteten bestäms utifrån den genomsnittliga specifika tillväxthastigheten. På grund av gällande bestämmelser i vissa länder omfattar den här testmetoden dock även 
toxicitetsbestämningar baserade på producerad mängd biomassa.
 
2.2.1  Genomsnittlig tillväxthastighet  
Den genomsnittliga specifika tillväxthastigheten under en period be ­
räknas som den logaritmiska ökningen i biomassa för varje enskilt 
kärl med kontroller och testlösningar, enligt formeln:  
μ i-j ¼ ln X j – ln X i 
t j – t i (dygn  –1 ) 
där: 
μ i–j : genomsnittlig specifik tillväxthastighet under tidsperioden  i–j; 
X i : biomassa vid tidpunkten  i 
X j : biomassa vid tidpunkten  j ▼M1 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 962
 
För varje test- och kontrollgrupp ska ett medelvärde för tillväxthas ­
tigheten liksom en uppskattning av variansen räknas fram. 
Beräkna den genomsnittliga specifika tillväxthastigheten för hela 
testperioden, dvs. vanligen dag 0–3. Som startvärde används det 
nominella värdet för ympad biomassa. (Motsvarande uppmätta värde 
ska inte användas eftersom det minskar precisionen.) Om utrust ­
ningen för mätning av biomassa (t.ex. flödescytometer) ger ett till ­
räckligt noggrant värde på den lilla mängd som ympats, kan bio ­
massans uppmätta startkoncentration användas. Bestäm också den 
sektionsvisa tillväxthastigheten genom att beräkna den specifika till ­
växthastigheten för varje dag under hela testperioden (dag 0–1, 1–2 och 2–3), och undersök om kontrollens tillväxthastighet förblir kon ­
stant (se kriterierna för testresultatens giltighet i avsnitt 1.7). En 
påtagligt lägre specifik tillväxthastighet dag ett jämfört med total ­
värdet för genomsnittlig specifik tillväxthastighet kan tyda på att kulturen befinner sig i lagfas. I kontrollkulturer kan lagfasen prak ­
tiskt taget elimineras genom att förkulturen förökas på lämpligt sätt. I 
exponerade kulturer kan en lagfas däremot tyda på att algerna åter ­
hämtar sig efter inledande toxisk stress eller på att exponeringen minskat på grund av förlust av testsubstans (t.ex. genom adsorption 
till algbiomassan) efter den inledande exponeringen. Den sektions ­
visa tillväxthastigheten kan därför användas när man bestämmer test ­
substansens effekter under exponeringstiden. Stora skillnader mellan den sektionsvisa tillväxthastigheten och den genomsnittliga tillväxt ­
hastigheten tyder på att tillväxten inte varit konstant exponentiell. I 
sådana fall bör tillväxtkurvorna undersökas noggrant. 
Beräkna den procentuella minskningen av tillväxthastigheten för 
varje replikat med testlösning, genom formeln:
 
%I r ¼ μ C – μ T 
μ C Ü 100  
där: 
%I r : procentuell minskning av genomsnittlig specifik tillväxthastig ­
het, 
μ C : medelvärdet för genomsnittlig specifik tillväxthastighet ( μ) i 
kontrollgruppen, 
μ T : genomsnittlig specifik tillväxthastighet för replikatet med test ­
lösning. 
Om man använder sig av lösningsmedel vid beredning av testlös ­
ningarna ska man vid beräkningen av procentuell tillväxthämning 
jämföra de erhållna värdena med motsvarande värden för kontroller som också innehåller lösningsmedel.
 
2.2.2  Producerad mängd biomassa  
Den producerade mängden biomassa motsvarar biomassan i slutet av 
testet minus den ursprungliga biomassan. Beräkningen görs för varje enskilt kärl med kontroller och testlösningar. För varje koncentration av testsubstans och kontroll ska ett medelvärde för producerad 
mängd biomassa liksom en uppskattning av variansen räknas fram. 
Den procentuella minskningen av den producerade mängden bio ­
massa (%I
 y ) beräknas för varje replikat med testlösning genom for ­
meln:  
%I y ¼ ðY C – Y T Þ 
Y C Ü 100  ▼M1 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 963
 
där: 
% I  y : procentuell minskning av producerad mängd biomassa, 
Y C : medelvärdet för producerad mängd biomassa i kontrollgrup ­
pen, 
Y T : producerad mängd biomassa i replikatet med testlösning.  
2.3 PLOTTNING AV DOS-RESPONS-KURVA 
Plotta den procentuella tillväxthämningen mot logaritmen för testsub ­
stansens koncentration och undersök plotten noggrant. Datapunkter som konstaterats vara avvikande i den första fasen ska inte beaktas. För att man ska få en preliminär uppfattning om förhållandet mellan 
koncentration och respons sammanbinds datapunkterna genom en 
mjuk linje, antingen på fri hand eller med hjälp av datorbaserad interpolation. Använd därefter en mer ingående metod, helst en da ­
torbaserad statistisk sådan. Beroende på ett flertal faktorer – t.ex. 
avsett användningsområde för data, datakvalitet (precision), data ­
mängd, tillgängliga analysverktyg för data – kan man (ibland med goda skäl) bestämma sig för att avsluta utvärderingen av data på det här stadiet och enbart avläsa nyckelvärdena EC
 50 och EC  10 (och/eller 
EC 20 ) från den frihandsritade kurvan (se även avsnittet om tillväxt ­
stimulering nedan). Det finns flera giltiga skäl för att inte använda en statistisk metod, bland annat: 
— Det är inte troligt att man utifrån befintliga data får fram mer 
pålitliga resultat med hjälp av datorbaserade metoder än genom expertbedömningar. I sådana situationer kan det t.o.m. hända att vissa dataprogram ger ett helt opålitligt resultat (iterationer kan ­
ske inte konvergerar t.ex.). 
— Stimulerande tillväxtresponser kan inte hanteras på lämpligt sätt 
av programvaran (se nedan).
 
2.4 STATISTISK BEHANDLING 
Målet är att bestämma det kvantitativa förhållandet mellan koncent ­
ration och respons med hjälp av regressionsanalys. Man kan använda viktad linjär regression efter att ha gjort en linjär transformation av 
responsdata, t.ex. till probit-, logit- eller Weibullvärden (9). Icke- 
linjära regressionsmetoder är dock att föredra, eftersom de är bättre anpassade för att hantera oundvikliga oregelbundenheter i data och avvikelser från jämna fördelningskurvor. I närheten av nollpunkten 
(ingen tillväxthämning) och fullständig tillväxthämning kan sådana 
oregelbundenheter bli uppförstorade genom linjäriseringen och däri ­
genom störa analysen (9). Observera att standardmetoder för analys med probit-, logit-, eller Weibulltransformationer är avsedda för di ­
kotoma data (dvs. tvåpunktsfördelade data, t.ex. dödlighet–överlev ­
nad) och därför måste modifieras för att kunna användas för data om tillväxt eller producerad mängd biomassa. Speciella metoder för be ­
stämning av EC
 x -värden ur kontinuerliga data återfinns i (10)(11) 
och (12). Tillämpningen av icke-linjär regressionsanalys beskrivs 
utförligare i tillägg 4.  ▼M1 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 964
 
För varje analyserad responsvariabel används förhållandet mellan 
koncentration och respons för att göra punktskattningar av EC  x -vär­
den. Om möjligt ska den 95-procentiga konfidensgränsen bestämmas för varje skattning. Anpassningsgraden (”goodness of fit”) mellan responsdata och regressionsmodellen ska bestämmas antingen gra ­
fiskt eller statistiskt. Regressionsanalysen ska göras på responsvärden 
från enskilda replikat, inte på medelvärden från testgrupper. Om det är svårt eller omöjligt att göra en icke-linjär kurvanpassning på grund av alltför stor spridning i data kan man i stället göra regressionen 
utifrån gruppmedelvärden. Detta är en praktisk metod för att minska 
påverkan från misstänkta avvikande värden. Om man använder sig av denna möjlighet ska det tas med i testrapporten som en avvikelse från det normala förförandet, och motiveras med att kurvanpass ­
ningar med enskilda replikat inte gav tillfredsställande resultat. 
När tillgängliga regressionsmodeller eller regressionsmetoder inte 
lämpar sig för de aktuella dataserierna kan EC
 50 -skattningar och 
konfidensgränser också erhållas genom linjär interpolation med s.k. 
bootstrapping (13). 
För skattningar av LOEC (och därmed även av NOEC) och av 
testsubstansens inverkan på tillväxthastigheten jämförs medelvärden 
från testlösningarna med hjälp av variansanalysmetoder (ANOVA). 
Medelvärdet för varje koncentration jämförs sedan med medelvärdet för kontrollerna med hjälp av en lämplig metod för multipeljäm ­
förelse eller trendtest, t.ex. Dunnetts eller Williams test (14, 15, 
16, 17 och 18). Man måste avgöra om ANOVA-kriteriet om varians ­
homogenitet är uppfyllt. Detta kan göras grafiskt eller med ett eta ­
blerat test (18), t.ex. Levenes eller Bartletts test. Skulle kriteriet inte vara uppfyllt kan man ibland korrigera för detta genom logaritmisk 
transformation av data. Om heterogeniteten i variansen är extremt 
stor och inte kan korrigeras genom transformation, ska man överväga att göra analysen med t.ex. Jonkheeres trendtester av ”step-down”- typ. Mer information om bestämning av NOEC finns i (12). 
Nya forskningsrön har lett till att man avråder från användning av 
NOEC-värden. I stället rekommenderas att man använder punktskatt ­
ningar av EC
 x baserade på regressionsanalys. För detta algtest har 
ännu inget passande värde på x fastställts. Ett intervall på 10–20 % 
förefaller dock vara lämpligt, beroende på vilken responsvariabel som används. Både EC
 10 och EC  20 bör anges i testrapporten.  
2.5 TILLVÄXTSTIMULERING 
Ibland förekommer tillväxtstimulering (negativ hämning) vid låga 
koncentrationer. Detta kan antingen bero på hormesis (”toxisk stimu ­
lering”) eller på att stimulerande tillväxtfaktorer överförts från test ­
materialet till det minimalmedium som används. Observera att tillsats av oorganiska näringsämnen inte bör ha någon direkt effekt, eftersom 
testmediet innehåller ett överskott av näringsämnen i förhållande till 
algernas behov under testperioden. Vid beräkningen av EC
 50 kan 
man vanligen bortse från stimulering vid låga koncentrationer, såvida inte stimuleringen är extremt stor. I det senare fallet – samt då man 
beräknar EC
 x för låga värden på x – kan det krävas särskilda åtgär ­
der. Man ska så långt det är möjligt ta med stimulerande responser vid analysen av data, och om befintliga dataprogram för kurvanpass ­
ning inte kan hantera låggradig stimulering kan man i stället använda 
sig av linjär interpolation med bootstrapping. Om stimuleringen är 
extremt stor kan man överväga att använda en hormesis-modell (19).
 ▼M1 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 965
 
2.6 ICKE-TOXISK TILLVÄXTHÄMNING 
Ljusabsorberande testmaterial kan påverka tillväxthastigheten nega ­
tivt eftersom de minskar mängden tillgängligt ljus. Sådana fysika ­
liska effekter måste kunna särskiljas från toxiska effekter genom att 
man ändrar testförhållandena, och fysikaliska effekter ska rapporteras 
separat. Riktlinjer återfinns i (2) och (3).  
3. RAPPORTERING  
3.1 TESTRAPPORT 
Testrapporten ska innehålla följande uppgifter: 
Testsubstans: — fysikalisk form samt relevanta fysikalisk-kemiska egenskaper, in ­
begripet löslighetsgräns i vatten, 
— kemiska identifieringsuppgifter, inklusive renhetsgrad. Testart: 
— stam, leverantör eller ursprung, samt odlingsförhållanden. 
Testförhållanden: 
— datum då testet inleds samt dess varaktighet, 
— testets upplägg: testkärl, kulturernas volym, biomassans koncent ­
ration i början av testet, 
— mediets sammansättning, 
— testsubstansens koncentrationer, replikat (t.ex. antal replikat, antal 
koncentrationer av testsubstansen samt geometrisk serie), 
— metod för beredning av testlösningar, inbegripet användning av 
lösningsmedel m.m., 
— odlingsutrymme, 
— ljusets intensitet och kvalitet (ljuskälla, homogenitet), 
— temperatur, — koncentrationer som använts i testet: de nominella koncentratio ­
nerna av testsubstansen och samtliga resultat från bestämningar 
av testsubstansens koncentration i testkärlen; metodens utbyte och bestämningsgräns i matrisen, 
— alla avvikelser från testmetoden, 
— metod för bestämning av biomassa, samt belägg för att det finns 
en korrelation mellan den uppmätta parametern och biomassans 
torrvikt. 
Resultat: — pH-värden vid testets början och slut i alla testlösningar, 
— biomassa för varje kolv och varje mätpunkt, samt metod för att 
mäta biomassa,
 ▼M1 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 966
 
— tillväxtkurvor (plott där biomassan avsatts mot tiden), 
— responsvariabler som beräknats för varje replikat med testlösning, 
med medelvärden och variationskoefficient för replikat, 
— grafisk framställning av förhållandet mellan koncentration och 
effekt, 
— toxicitetsbestämningar för responsvariablerna, t.ex. EC  50 , EC  10 
och EC  20 samt dithörande konfidensintervall. Om man räknat 
fram LOEC- och NOEC-värden ska dessa anges, liksom de sta ­
tistiska metoder som använts vid beräkningen, 
— om ANOVA-metoder använts: storleken på observerad effekt 
(t.ex. minsta signifikanta skillnad), 
— alla belägg för tillväxtstimulering i någon av testlösningarna, — övriga observerade effekter, t.ex. morfologiska förändringar hos 
algerna, 
— analys av testresultaten, liksom en bedömning av hur de kan ha 
påverkats av eventuella avvikelser från testmetoden.
 
4. LITTERATUR  
1. OECD TG 201 (2006). Freshwater Alga and Cyanobacteria, 
Growth Inhibition Test. 
2. ISO 1998: Water quality – Guidance for algal growth inhibition 
tests with poorly soluble materials, volatile compounds, metals and waster water. ISO/DIS 14442. 
3. OECD 2000: Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing 
of Difficult Substances and mixtures. Environmental Health and 
Safety Publications. Series on Testing and Assessment, nr 23. 
4. ISO 1998: Water quality – Sampling – Del 16: General 
Guidance for Biotesting. ISO 5667-16. 
5. ISO 1993: Water quality – Algal growth inhibition test. 
ISO 8692. 
6. Mayer, P., Cuhel, R. och Nyholm, N. (1997). A simple in vitro 
fluorescence method for biomass measurements in algal growth 
inhibition tests. Water Research 31, 2525–2531. 
7. Slovacey, R.E. och Hanna, P.J. In vivo fluorescence determina ­
tions of phytoplancton chlorophyll, Limnology & Oceanog ­
raphy 22,5 (1977), 919–925. 
8. Simpson, S.L., Roland, M.G.E., Stauber, J.L. och Batley, G.E. 
(2003). Effect of declining toxicant concentrations on algal bio ­
assay endpoints. Environ. Toxicol. Chem. 22, 2073–2079. 
9. Christensen, E.R. och Nyholm, N. (1984). Ecotoxicological As ­
says with Algae: Weibull Dose-Response Curves. Env. Sci. 
Technol. 19, 713–718.
 ▼M1 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 967
 
10. Nyholm, N., Sørensen, P.S., Kusk, K.O. och Christensen, E.R. 
(1992). Statistical treatment of data from microbial toxicity 
tests. Environ. Toxicol. Chem. 11, 157–167. 
11. Bruce, R.D. och Versteeg, D.J. (1992). A statistical procedure 
for modelling continuous toxicity data. Env. Toxicol. Chem. 11, 1485–1494. 
12. OECD (2004). Guidance Document on Statistical Analysis of 
Ecotoxicity Data. 
13. Norberg-King T.J. (1988). An interpolation estimate for chronic 
toxicity: The ICp approach. National Effluent Toxicity Assess ­
ment Center Technical Report 05–88. USEPA, Duluth, MN. 
14. Dunnett, C.W. (1955). A multiple comparisons procedure for 
comparing several treatments with a control. J. Amer. Statist. 
Assoc. 50, 1096–1121. 
15. Dunnett, C.W. (1964). New tables for multiple comparisons 
with a control. Biometrics 20, 482–491. 
16. Williams, D.A. (1971). A test for differences between treatment 
means when several dose levels are compared with a zero dose 
control. Biometrics 27, 103–117. 
17. Williams, D.A. (1972). The comparison of several dose levels 
with a zero dose control. Biometrics 28, 510–531. 
18. Draper, N.R. och Smith, H. (1981). Applied Regression Analy ­
sis, 2:a uppl. Wiley, New York. 
19. Brain P. och Cousens R. (1989). An equation to describe dose- 
responses where there is stimulation of growth at low doses. Weed Research 29, 93–96.
 ▼M1 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 968
 
Tillägg 1  
Rekommenderade stammar  
Grönalger  
— Pseudokirchneriella subcapitata  (äldre namn:  Selenastrum capricornutum ), 
ATCC 22662, CCAP 278/4, 61.81 SAG 
— Desmodesmus subspicatus  (äldre namn:  Scenedesmus subspicatus ) 86.81 SAG  
Kiselalger  
— Navicula pelliculosa , UTEX 664  
Cyanobakterier  
— Anabaena flos-aquae , UTEX 1444, ATCC 29413, CCAP 1403/13A 
— Synechococcus leopoliensis , UTEX 625, CCAP 1405/1  
Stammarnas ursprung  
De rekommenderade stammarna finns att tillgå som monokulturer från följande 
samlingar (alfabetisk ordning): 
ATCC: American Type Culture Collection 
10801 University Boulevard 
Manassas, Virginia 20110–2209 
FÖRENTA STATERNA 
CCAP, Culture Collection of Algae and Protozoa 
Institute of Freshwater Ecology, Windermere Laboratory 
Far Sawrey, Amblerside 
Cumbria LA22 0LP 
STORBRITANNIEN 
SAG: Sammlung von Algenkulturen 
Albrecht-von-Haller-Institut 
Universität Göttingen 
Nikolausberger Weg 18 37073 Göttingen 
TYSKLAND 
UTEX Culture Collection of Algae 
Section of Molecular, Cellular and Developmental Biology 
School of Biological Sciences 
University of Texas at Austin 
Austin, Texas 78712 
FÖRENTA STATERNA
 ▼M1 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 969
 
Form och övriga egenskaper hos rekommenderade arter  
P. subcapitata D. subspicatus N. pelliculosa A. flos-aquae S. leopoliensis  
Form Böjda och 
vridna en ­
skilda celler Ovala, vanli ­
gen enskilda 
celler Stavar Kedjor av 
ovala celler Stavar 
Storlek (längd × bredd) μm 8–14 × 2–3 7–15 × 3–12 7,1 × 3,7 4,5 × 3 6 × 1 
Volym (μm 3 /cell) 40–60 (*) 60–80 (*) 40–50 (*) 30–40 (  1 ) 2,5 (  2 ) 
Torrvikt (mg/cell) 2–3 × 10  –8 3–4 × 10  –8 3–4 × 10  –8 1–2 × 10  –8 2–3 × 10  –9 
Tillväxthastighet (  3 ) (/dygn) 1,5–1,7 1,2–1,5 1,4 1,1–1,4 2,0–2,4  
( 1 ) Uppmätt med elektronisk partikelräknare. 
( 2 ) Beräknat på grundval av storleken. 
( 3 ) Den vanligast observerade tillväxthastigheten i OECD-medium vid en ljusintensitet på ungefär 70 μE·m  –2 ·s –1 och temperaturen 
21 °C.  
Särskilda rekommendationer om odling och hantering av rekommenderade 
testarter  
Pseudokirchneriella subcapitata  och Desmodesmus subspicatus  
Dessa grönalger brukar vara lätta att hålla i olika odlingsmedier. Råd om lämp ­
liga medier kan fås från de institutioner som ansvarar för algsamlingarna. Cel ­
lerna är vanligen enskilda, och celltätheten kan enkelt bestämmas med hjälp av elektronisk partikelräknare eller mikroskop.
 
Anabaena flos-aquae  
Olika odlingsmedier kan användas för stamkulturen. Det är mycket viktigt att 
batchkulturen fortfarande befinner sig i logfas då den förnyas, eftersom den annars har svårt att återhämta sig.  
Anabaena flos-aquae  bildar aggregat bestående av hopnystade kedjor av celler. 
Aggregatens storlek kan variera beroende på odlingsförhållandena. Om biomas ­
san bestäms genom räkning i mikroskop eller med hjälp av en elektronisk par ­
tikelräknare kan det vara nödvändigt att först bryta sönder aggregaten. 
Sonikering av prov kan användas för att bryta sönder kedjor av celler och däri ­
genom minska variabiliteten vid räkning. Längre sonikering än vad som krävs för att bryta sönder kedjorna i småfragment kan dock förstöra cellerna. Sonikering ­
ens intensitet och varaktighet ska vara densamma för varje testlösning. 
Räkna tillräckligt många fält på hemocytometern (minst 400 celler) för att kom ­
pensera för variabiliteten. På så vis ökar tillförlitligheten hos de mikroskopiska 
täthetsbestämningarna. 
Den totala cellvolymen för  Anabaena  kan bestämmas med hjälp av en elektro ­
nisk partikelräknare. Först måste dock cellkedjorna brytas sönder genom försiktig 
sonikering. Anpassa sonikeringsenergin så att cellerna inte sprängs. 
Använd vortexblandare eller liknande för att se till att den algsuspension som 
används för att ympa testkärlen är väl blandad och har homogen konsistens.
 ▼M1 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 970
 
Testkärlen placeras i ett skakbord med rund- eller längsgående rörelse, hastighet 
ca 150 rpm. Ett alternativ är att man med jämna mellanrum skakar kärlen för att 
undvika att  Anabaena  bildar klumpar. Om sådana ändå bildas måste man se till 
att de prov som tas för mätning av biomassa är representativa. Det kan vara nödvändigt att skaka kärlen kraftigt före provtagning för att klumparna ska lösas 
upp.
 
Synechococcus leopoliensis  
Olika odlingsmedier kan användas för stamkulturen. Råd om lämpliga medier 
kan fås från de institutioner som ansvarar för algsamlingarna.  
Synechococcus leopoliensis  växer som enskilda, stavformiga celler. Cellerna är 
mycket små, vilket försvårar bestämning av biomassan genom räkning av celler i mikroskop. Elektroniska partikelräknare anpassade för partiklar ned till ung. 1 μm kan användas, och man kan även göra fluorimetriska mätningar  in vitro .
 
Navicula pelliculosa  
Olika odlingsmedier kan användas för stamkulturen. Råd om lämpliga medier 
kan fås från de institutioner som ansvarar för algsamlingarna. Observera att mediet måste innehålla silikat.  
Navicula pelliculosa  kan under vissa odlingsförhållanden bilda aggregat. Detta 
beror på att fett som producerats av algerna ansamlas i en ytfilm till vilken de enskilda algcellerna lätt vidhäftas. När detta sker måste man se till att de prov som tas för bestämning av biomassa är representativa, t.ex. genom kraftig skak ­
ning i vortexblandare.
 ▼M1 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 971
 
Tillägg 2  
Odlingsmedier  
Man kan välja mellan två odlingsmedier: 
OECD-medium: originalmedium enligt OECD TG 201, samt enligt ISO 8692 
AAP-medium enligt amerikanska naturvårdsverket (EPA), samt enligt ASTM 
Medierna bereds med kemikalier av reagenskvalitet eller p.a.-kvalitet samt av ­
jonat vatten.  
Sammansättning av AAP-medium (enl. EPA) och OECD TG 201-medium  
Kemikalie AAP OECD 
mg/l mM mg/l mM  
NaHCO  3 15,0 0,179 50,0 0,595 
NaNO  3 25,5 0,300 
NH  4 Cl 15,0 0,280 
MgCl  2 ·6(H  2 O) 12,16 0,0598 12,0 0,0590 
CaCl  2 ·2(H  2 O) 4,41 0,0300 18,0 0,122 
MgSO  4 ·7(H  2 O) 14,6 0,0592 15,0 0,0609 
K 2 HPO  4 1,044 0,00599 
KH  2 PO 4 1,60 0,00919 
FeCl  3 ·6(H  2 O) 0,160 0,000591 0,0640 0,000237 
Na 2 EDTA·2(H  2 O) 0,300 0,000806 0,100 0,000269 (*) 
H 3 BO 3 0,186 0,00300 0,185 0,00299 
MnCl  2 ·4(H  2 O) 0,415 0,00201 0,415 0,00210 
ZnCl  2 0,00327 0,000024 0,00300 0,0000220 
CoCl  2 ·6(H  2 O) 0,00143 0,000006 0,00150 0,00000630 
Na 2 MoO  4 ·2(H  2 O) 0,00726 0,000030 0,00700 0,0000289 
CuCl  2 ·2(H  2 O) 0,000012 0,00000007 0,00001 0,00000006 
pH 7,5 8,1  
(*) Det molara förhållandet mellan EDTA och järn ska vara något större än 1. På så vis förhindras utfällning av 
järn samtidigt som kelateringen av tungmetalljoner minimeras.  
I testet med kiselalgen  Navicula pelliculosa  berikas båda medierna med 
Na 2 SiO  3 ·9H  2 0 så att koncentrationen av kisel (Si) blir 1,4 mg/l. 
Mediets pH hålls i jämvikt genom karbonatsystemet i mediet och partialtrycket 
för CO  2 i den omgivande luften. Ett ungefärligt förhållande mellan pH vid 25 °C 
och den molara koncentrationen av bikarbonat ges av formeln: 
PH eq = 11,30 + log [HCO  3 ] ▼M1 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 972
 
Med 15 mg NaHCO  3 /l är pH  eq = 7,5 (AAP-medium enl. EPA), och med 50 mg 
NaHCO  3 /l är pH  eq = 8,1 (OECD-medium).  
Testmediernas grundämnessammansättning  
Grundämne AAP OECD 
mg/l mg/l  
C 2,144 7,148 
N 4,202 3,927 
P 0,186 0,285 
K 0,469 0,459 
Na 11,044 13,704 
Ca 1,202 4,905 
Mg 2,909 2,913 
Fe 0,033 0,017 
Mn 0,115 0,115  
Beredning av OECD-medium  
Näringsämne Koncentration i stamlösningen 
Stamlösning 1: makronäringsämnen  
NH  4 Cl 
MgCl  2 ·6H  2 O 
CaCl  2 ·2H  2 O 
MgSO  4 ·7H  2 O 
KH  2 PO 4 1,5 g/l 
1,2 g/l 1,8 g/l 1,5 g/l 0,16 g/l
 
Stamlösning 2: järn  
FeCl  3 ·6H  2 O 
Na 2 EDTA·2H  2 O 64 mg/l 
100 mg/l  
Stamlösning 3: mikronäringsämnen  
H 3 BO 3 
MnCl  2 ·4H  2 O 
ZnCl  2 
CoCl  2 ·6H  2 O 
CuCl  2 ·2H  2 O 
Na 2 MoO  4 ·2H  2 O 185 mg/l 
415 mg/l 3 mg/l 
1,5 mg/l 
0,01 mg/l 7 mg/l
 
Stamlösning 4: bikarbonat  
NaHCO  3 50 g/l 
Na 2 SiO  3 ·9H  2 0 
Sterilisera stamlösningarna genom membranfiltrering (genomsnittlig pordiameter 
0,2 μm) eller autoklavering (120 °C, 15 min). Lösningarna förvaras i mörker 
vid 4 °C. 
Stamlösningarna 2 och 4 ska inte autoklaveras. De steriliseras i stället genom 
membranfiltrering.  ▼M1 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 973
 
Odlingsmediet bereds genom att man tillsätter lämpliga volymer av stamlösning ­
arna 1–4 till vatten. 
Till 500 ml sterilt vatten tillsätts: 
— 10 ml av stamlösning 1 — 1 ml av stamlösning 2 — 1 ml av stamlösning 3 
— 1 ml av stamlösning 4 
Späd till 1 000 ml med sterilt vatten. Vänta till dess att mediet befinner sig i jämvikt med den omgivande luften med 
avseende på CO
 2 . Vid behov kan processen påskyndas genom att mediet bubblas 
med steril, filtrerad luft i några timmar.  
Beredning av AAP-medium  
A1.1 Tillsätt 1 ml av var och en av stamlösningarna i A1.2.1–A1.2.7 till ung. 
900 ml avjonat eller destillerat vatten och späd till 1 liter. 
A1.2 Stamlösningar med makronäringsämnen bereds genom att kemikalierna 
nedan löses i 500 ml avjonat eller destillerat vatten. Reagenserna A1.2.1, A1.2.2, A1.2.3 och A1.2.4 kan kombineras till en stamlösning. 
A1.2.1  NaNO
 3 – 12,750 g 
A1.2.2  MgCl  2 · 6H 2 O – 6,082 g 
A1.2.3  CaCl  2 · 2H 2 O – 2,205 g 
A1.2.4  Stamlösning med mikronäringsämnen  – (se A1.3) 
A1.2.5  MgSO  4 ·7H  2 O – 7,350 g 
A1.2.6  K  2 HPO  4 – 0,522 g 
A1.2.7  NaHCO  3 – 7,500 g 
A1.2.8  Na  2 SiO  3 ·9H  2 O – se anm. A1.1  
Anm.;  A1.1 – Används bara för kiselalger. Kemikalien kan tillsättas 
direkt (202,4 mg) eller via en stamlösning. Slutkoncentrationen av kisel 
(Si) i mediet ska i båda fallen vara 20 mg/l. 
A1.3 Stamlösningen med mikronäringsämnen bereds genom att kemikalierna 
nedan löses i 500 ml avjonat eller destillerat vatten. 
A1.3.1  H  3 BO 3 – 92,760 mg 
A1.3.2  MnCl  2 ·4H  2 O – 207,690 mg 
A1.3.3  ZnCl  2 – 1,635 mg 
A1.3.4  FeCl  3 ·6H  2 O – 79,880 mg 
A1.3.5  CoCl  2 ·6H  2 O – 0,714 mg 
A1.3.6  Na  2 MoO  4 ·2H  2 O – 3,630 mg 
A1.3.7  CuCl  2 ·2H  2 O – 0,006 mg 
A1.3.8  Na  2 EDTA·2H  2 O – 150,000 mg 
[dinatrium(etylendinitril)tetraacetat]  ▼M1 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 974
 
A1.3.9  Na  2 SeO  4 ·5H  2 O – 0,005 mg. Se anm. A1.2.  
Anm.;  A1.2 – Används bara för stamkulturer av kiselalger. 
A1.4 Justera pH till 7,5 ± 0,1 med 0,1  N eller 1,0  N NaOH eller HCl. 
A1.5 Om man använder sig av en elektronisk partikelräknare ska mediet 
filtreras över till ett sterilt kärl genom ett membranfilter med en por ­
diameter på 0,22 μm. Om partikelräknare inte används ska filtrets 
pordiameter i stället vara 0,45 μm. 
A1.6 Mediet lagras i mörker vid ungefär 4 °C tills det används.  ▼M1 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 975
 
Tillägg 3  
Exempel på en metod för algodling  
Allmänna påpekanden  
Syftet med odlingen är att få fram algkulturer för toxicitetstester. 
Man måste vidta lämpliga åtgärder för att förhindra att algkulturerna kontamine ­
ras med bakterier. Utgångsmaterialet ska bestå av monokulturer, och helst ax ­
eniska sådana. 
Alla moment ska utföras under sterila förhållanden för att undvika kontaminering 
med bakterier eller andra alger.  
Utrustning och material  
Se avsnitt 1.8.1.  
Odling av algkulturer  
Beredning av näringslösningar (näringsmedier):  
Alla närsalter i mediet bereds som koncentrerade stamlösningar och lagras i 
mörker vid låg temperatur. Lösningarna steriliseras genom filtrering eller auto ­
klavering. 
Mediet bereds genom att man tillsätter angiven mängd stamlösning till sterilt 
destillerat vatten. Kontaminering med mikroorganismer måste undvikas. För fasta medier tillsätts 0,8 % agar.
 
Stamkultur:  
Stamkulturerna är små algkulturer som används som utgångsmaterial för tester. 
De ska med jämna mellanrum överföras till färskt odlingsmedium. Om kulturerna inte används regelbundet ska de strykas ut på böjda agarrör. Dessa överförs till 
färskt medium minst en gång varannan månad. 
Stamkulturerna odlas i E-kolvar med lämpligt medium (volym ca 100 ml). Om 
algerna inkuberas vid 20 °C i kontinuerligt ljus måste överföringar göras en gång i veckan. 
Vid detta moment överför man med hjälp av en steril pipett en viss mängd 
”gammal” kultur till en kolv med färskt medium. Startkoncentrationen för snabb ­
växande arter ska vara ungefär 100 gånger lägre än i den gamla kulturen. 
Tillväxthastigheten för en viss art kan bestämmas med hjälp av tillväxtkurvan. 
Med hjälp av detta värde kan man sedan räkna fram vid vilken celltäthet kulturen ska överföras till nytt medium. Detta måste göras innan kulturen når deklinations ­
fasen.
 
Förkultur:  
Avsikten med förkulturen är att få fram alger som är lämpliga för ympning av 
testkulturer. Förkulturen inkuberas under testbetingelser och används medan den 
ännu befinner sig i exponentiell tillväxtfas, vanligen efter en inkuberingstid på 
2–4 dagar. Algkulturer som innehåller deformerade eller avvikande celler slängs.  ▼M1 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 976
 
Tillägg 4  
Analys av data med icke-linjär regression  
Allmänna påpekanden  
Responsen i algtester och andra tester som gäller mikrobiologisk tillväxt (en typ 
av biomassetillväxt) är per definition en kontinuerlig, eller metrisk, variabel. Det 
rör sig om hastigheten hos en process i de fall man mäter tillväxthastighet, och 
integralen av motsvarande kurva om man i stället mäter biomassa. Båda vari ­
ablerna jämförs sedan med motsvarande genomsnittsrespons för icke-exponerade kontrollreplikat som uppvisar maximal respons under de rådande förhållandena – 
med ljus och temperatur som viktigaste faktorer i algtestet. Systemet kan vara 
uppdelat eller homogent, och biomassan kan anses utgöra en helhet där man inte behöver ta hänsyn till enskilda celler. Variansfördelningen för responsen i ett sådant system beror uteslutande på experimentella faktorer (där felen vanligen är 
lognormalfördelade eller normalfördelade). Detta ska jämföras med typiska re ­
sponser i biologiska tester med dikotoma data, där toleransen (som vanligen är binomialfördelad) hos enskilda organismer ofta antas vara det dominerande ele ­
mentet i variansen. Responsen i kontrollerna är i detta fall noll eller har samma 
värde som bakgrundsnivån. 
I det enklaste fallet minskar den normaliserade eller relativa responsen r mono ­
tont från värdet 1 (ingen tillväxthämning) till 0 (100 % tillväxthämning). Man 
bör vara medveten om att alla responser innehåller fel, och att uppenbar negativ hämning vid beräkningen uteslutande anses bero på slumpmässiga fel.
 
Regressionsanalys  
Modeller  
Syftet med en regressionsanalys är att kvantitativt beskriva dos-respons-kurvan i 
form av en matematisk regressionsfunktion, Y = f (C) eller – vanligare – F (Z), där Z = log C. Använd på motsatt sätt kan funktionen C = f
 –1 (Y) utnyttjas för 
beräkning av EC  x -värden, t.ex. EC  50 , EC  10 och EC  20 , samt motsvarande 95- 
procentiga konfidensgränser. Ett flertal enkla matematiska funktioner har visat sig vara lämpliga för att beskriva förhållandet mellan koncentration och respons vid bestämning av tillväxthämning hos alger, t.ex. den logistiska ekvationen, den 
icke-symmetriska Weibull-ekvationen samt funktionen för lognormalfördelning. 
De är alla sigmoida kurvor som asymptotiskt närmar sig värdet 1 då C → 0, och 
värdet 0 då C → oändligheten. 
Ett nyligen framlagt alternativ till asymptotiska modeller är modeller som bygger 
på kontinuerliga tröskelfunktioner (t.ex. Kooijman-modellen för tillväxthämning 
avseende populationer, se Kooijman et al. 1996). Modellen bygger på antagandet 
att effekten under ett visst tröskelvärde EC0+ är noll. Detta tröskelvärde bestäms genom extrapolation av dos-respons-kurvan till den punkt där den korsar kon ­
centrationsaxeln. Man använder sig då av en enkel kontinuerlig funktion som inte 
är differentierbar i startpunkten. 
Observera att analysen kan bestå av en enkel minimering av residualkvadratsum ­
mor (om man antar att variansen är konstant) eller av viktade kvadrater, om man 
kompenserar för variansens heterogenitet.
 ▼M1 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 977
 
Förfarande  
Förfarandet är i korthet följande: Välj en lämplig funktion, Y = f (C), och 
anpassa den till data genom icke-linjär regression. För att man ska kunna få ut så mycket information som möjligt från mätdata bör man använda mätvärden från varje enskild kolv i stället för medelvärden för samtliga replikat. Om vari ­
ansen å andra sidan är hög visar erfarenheten att medelvärden för replikaten 
troligen kan ge en matematisk uppskattning som är mer tillförlitlig och mindre påverkad av slumpmässiga fel i data, än en metod där man behåller varje enskild datapunkt. 
Plotta den anpassade kurvan och erhållna mätdata, och kontrollera att kurvans 
anpassning är godtagbar. Analys av residualer kan vara ett mycket värdefullt hjälpmedel i sammanhanget. Om den valda funktionen för anpassning av dos- respons-kurvan ger en otillfredsställande beskrivning av hela kurvan eller en 
väsentlig del av denna, t.ex. responsen vid låga koncentrationer, bör man välja 
en annan typ av kurvanpassning som inte är symmetrisk, t.ex. Weibull-funktio ­
nen. Negativ hämning kan ge problem då man använder sig av t.ex. funktionen 
för lognormalfördelning. Också i detta fall bör man välja en alternativ regres ­
sionsfunktion. Det är inte lämpligt att sådana negativa värden tilldelas värdet noll eller ett lågt positivt värde eftersom detta rubbar felfördelningen. Det kan vara befogat att göra separata anpassningar för olika delar av kurvan. Exempelvis kan 
värdet på EC
 low x uppskattas från den del av kurvan där tillväxthämningen är låg. 
Beräkna från den anpassade ekvationen (genom ”omvänd uppskattning”, C = f  –1 (Y)), 
karaktäristiska punktskattningar för EC  x -värden. I rapporten ska åtminstone 
EC 50 samt en eller två uppskattningar av EC  low x tas med. Den praktiska erfarenheten 
har visat att algtestet vanligen medger en rimligt noggrann uppskattning vid 10 % 
tillväxthämning, förutsatt att det finns tillräckligt många datapunkter. Undantaget är de fall är då tillväxtstimulering skett vid låga koncentrationer av testsubstansen. Upp ­
skattningar av EC
 20 brukar ha betydligt högre precision än uppskattningar av EC  10 , 
eftersom EC  20 vanligen befinner sig på den approximativt linjära delen av den cen ­
trala dos-respons-kurvan. Ibland kan EC  10 -värden vara svåra att tolka på grund av 
tillväxtstimulering, så trots att man vanligen får fram EC  10 med tillräckligt hög 
precision bör EC  20 också alltid rapporteras.  
Viktningsfaktorer  
Eftersom den experimentella variansen vanligen inte är konstant och normalt sett 
innehåller en proportionell komponent bör man rutinmässigt göra en viktad re ­
gression. Viktningsfaktorerna vid en sådan analys antas vanligen vara omvänt 
proportionella mot variansen: 
W i = 1/Var(r  i ) 
Många regressionsprogram har en funktion för viktad regressionsanalys där vikt ­
ningsfaktorerna tas från en tabell. Det är lämpligt att man normaliserar viktnings ­
faktorerna genom att multiplicera dem med n/ ∑ w i (där n är antalet datapunkter) 
så att summan av dem blir ett.  
Normalisering av responser  
Normalisering med genomsnittsresponsen för kontrollerna innebär vissa principi ­
ella problem, och leder också till en ganska komplicerad variansstruktur. Om man delar responsvärdena med medelvärdet för kontrollernas responser för att få fram den procentuella tillväxthämningen, inför man samtidigt ett nytt fel på 
grund av det fel som är kopplat till medelvärdet för kontrollerna. Om detta fel 
inte är att betrakta som försumbart måste viktningsfaktorerna för regression och konfidensgränser korrigeras för kovariansen med kontrollen (17). För att den totala variansen för den relativa responsen ska kunna minimeras är det viktigt 
att det uppskattade medelvärdet för kontrollernas respons har en hög precision. 
Variansen uttrycks på följande sätt:
 ▼M1 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 978
 
(Nedsänkt  i hänför sig till koncentrationsnivån i, och nedsänkt 0 till kontrollerna.) 
Y i = Relativ respons = r  i /r 0 = 1 – I = f (C  i ) 
med variansen 
Var (Y  i ) = Var (r  i /r 0 ) e¼ (∂Y i / ∂ r i ) 2 · Var(r  i ) + (∂ Y i / ∂ r 0 ) 2 · Var (r  0 ) 
och eftersom 
(∂ Y i / ∂ r i ) = 1/r  0 och (∂ Y i / ∂ r 0 ) = r  i /r 0 2 
med normalt fördelade data och replikaten m  i och m  0 
Var(r  i ) = σ 2 /m i 
blir den totala variansen hos den relativa responsen, Y  i 
Var(Y  i ) = σ 2 /(r 0 2 m i ) + r  i 2 · σ 2 /r 0 4 m 0 
Det fel som medelvärdet för kontrollerna är behäftat med är omvänt proportio ­
nellt mot kvadratroten av genomsnittsvärdet för antalet kontrollreplikat. Det kan ibland vara befogat att ta med historiska data för att kraftigt minska felet. En 
alternativ metod går ut på att man inte normaliserar data eller anpassar de 
absoluta responserna – inbegripet responsvärden för kontroller – utan i stället tar med responsvärdena för kontroller som en extra parameter som anpassas genom icke-linjär regression. Om man använder sig av en regressionsekvation 
av standardtyp med 2 parametrar kräver metoden anpassning av 3 parametrar, 
vilket innebär att det krävs fler datapunkter än vid icke-linjär regression av data som normaliserats med hjälp av en förvald kontrollrespons.
 
Omvända konfidensintervall  
Beräkningen av konfidensintervall vid icke-linjär regression genom omvänd upp ­
skattning är ganska komplex och förekommer inte som standardfunktion i nor ­
mala statistikprogram. Ungefärliga konfidensgränser kan erhållas med hjälp av standardprogram för icke-linjär regression med omparametrisering (Bruce och 
Versteeg, 1992), vilket innebär att den matematiska ekvationen skrivs om med 
önskade punktskattningar, t.ex. med EC
 10 - och EC  50 -värden som de parametrar 
som ska uppskattas. Låt funktionen vara I = f ( α, β, koncentration) och använd 
definitionsrelationerna f ( α, β, EC  10 ) = 0,1 och f ( α, β, EC  50 ) = 0,5 för att ersätta 
f (α, β, koncentration) med en likvärdig funktion g (EC  10 , EC  50 , koncentration). 
En mer direkt beräkning (Andersen et al, 1998) kan göras genom att man 
behåller den ursprungliga ekvationen och använder sig av en Taylorexpansion runt medelvärdena för r
 i och r  0 . 
Metoder med bootstrapping har blivit populära på senare tid. De går ut på 
att man uppskattar en empirisk variansfördelning med hjälp av erhållna mätdata 
i kombination med återkommande omsampling som styrs av en slumptalsgene ­
rator.  
Litteratur  
Kooijman, S.A.L.M.; Hanstveit, A.O., och Nyholm, N. (1996). No-effect con ­
centrations in algal growth inhibition tests. Water Research 30, 1625–1632. 
Bruce, R.D. och Versteeg, D.J. (1992). A Statistical Procedure for Modelling 
Continuous Ecotoxicity Data. Env. Toxicol. Chem. 11, 1485–1494. 
Andersen, J.S., Holst, H., Spliid, H., Andersen, H., Baun, A. och Nyholm, N. 
(1998). Continuous ecotoxicological data evaluated relative to a control response. 
Journal of Agricultural, Biological and Environmental Statistics 3, 405–420.  ▼M1 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 979
 
C.4 BESTÄMNING AV ”LÄTT” BIONEDBRYTBARHET  
DEL I.  ALLMÄNNA PRINCIPER  
I.1 INLEDNING 
Sex metoder för screening av kemikalier för lätt bionedbrytning i ett 
aerobt vattenmedium beskrivs: 
a) Eliminering av upplöst organiskt kol (DOC) (Metod C.4-A). 
b) Modifierat OECD-screeningtest – eliminering av DOC (Metod 
C.4-B). 
c) Koldioxid (CO  2 ) utvärdering (Modifierat Sturmtest) (Metod 
C.4-C). 
d) Manometrisk respiration (Metod C.4-D). 
e) Closed Bottle Test (Metod C.4-E). 
f) MITI (Ministry of International Trade and Industry – Japan) 
(Metod C.4-F). 
Del 1 innehåller allmänna och generella kommentarer till alla sex 
tester. I del II–VI1 finns det som är specifikt för de enskilda testerna. Tilläggen innehåller definitioner, formler och vägledande upplys ­
ningar. 
1988 genomförde OECD ett ringtest som visade att metoderna ger 
inbördes överensstämmande resultat. En bestämd metod kan dock föredras allt efter det undersökta ämnets fysiska egenskaper.
 
I.2 VAL AV METOD 
För att kunna välja den lämpligaste metoden är det viktigt att känna 
till kemikaliens löslighet, ångtryck och adsorptionsegenskaper. Den 
kemiska strukturen eller formeln bör vara känd för att kunna beräkna teoretiska värden och kontrollera uppmätta värden av parametrar, 
t.ex. ThOD, ThCO
 2 , DOC, TOC och COD (se bilagorna 1 och 2). 
Testkemikalier som är lösliga i vatten med 100 mg/liter kan utvär ­
deras genom samtliga metoder, under förutsättning att de är icke- flyktiga och icke adsorberande. Av tabell 1 framgår vilka metoder som är lämpliga för kemikalier som är svårlösliga i vatten, flyktiga 
eller adsorberande. I bilaga I beskrivs hur man ska göra med kemi ­
kalier som är svårupplösliga i vatten och flyktiga kemikalier. Mode ­
rat flyktiga kemiska ämnen kan testas genom DOC eliminerings ­
metoden om det finns tillräckligt med luftrum i testkärlet (som ska 
stängas på lämpligt sätt). 1 detta fall måste en abiotisk kontroll 
användas som tillåter eventuell fysisk förlust.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 980
 
Tabell 1  
Tillämpning av testmetoder  
Test Analytisk metod Lämplighet för ämnen som är 
svårlösliga flyktiga adsorberande  
DOC-eliminering Upplöst organiskt kol — — +/- 
Mod. OECD DOC-elim. Upplöst organiskt kol — — +/- CO
 2 utvärdering Respirometri: CO  2 bedöm­
ning + — + 
Manometrisk respirometri Manometrisk respirometri: 
syreförbrukning + +/- + 
Closed bottle Respirometri: upplöst syre +/- + + 
MITI Respirometri: syreförbruk ­
ning + +/- + 
Uppgifter om de relativa proportionerna av testmaterialets huvud ­
beståndsdelar är till nytta vid tolkningen av de erhållna resultaten, 
särskilt om resultaten är låga eller marginella. 
Uppgifter om testkemikaliens toxicitet för bakterier (bilaga IV) kan 
vara till nytta vid valet av lämpliga testkoncentrationer och vara 
avgörande vid tolkningen av låga bionedbrytbarhetsvärden.  
I.3 REFERENSÄMNEN 
För att kontrollera förfarandet används referensämnen som uppfyller 
kriterierna för lätt bionedbrytbarhet och som testas i en separat kolv 
parallellt med de övriga proverna. 
Anilin (färskt destillerat), natriumacetat och natriumbensoat är lämp ­
liga kemikalier. Alla dessa referenskemikalier bryts ned vid dessa 
metoder även när inget inokulat tillsätts. 
Det har föreslagits att man borde söka efter en referenskemikalie som 
är lätt nedbrytbar men som kräver tillsättning av inokulat. Kalium ­
hydrogenftalat har föreslagits men det behövs mer bevis innan detta ämne kan godtas som ett referensämne. 
I metoder som baseras på respirometri kan kvävehaltiga föreningar 
påverka syreupptagningen på grund av nitri-fikation (se bilagor II och V).
 
I.4 TESTMETODSPRINCIP 
Testämnet upplöses eller uppslammas i ett oorganiskt testmedium, 
inokuleras och inkuberas under aeroba förhållanden i mörker eller diffust ljus. Den del av DOC i lösningen som stammar från inokulat ska vara så lågt som möjligt i jämförelse med den del som stammar 
från testämnet. Man ska ta hänsyn till inokulatets endogena aktivi ­
teter genom att köra parallella blindprov med inokulat men utan testämne i lösningen, även om cellernas endogena aktivitet under närvaro av ämnet inte exakt motsvarar denna i den endogena kont ­
rollen. Ett referensämne används parallellt för att kontrollera hur 
förfarandena fungerar.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 981
 
I allmänhet följs nedbrytning genom bestämning av parametrar, så ­
som DOC, CO  2 -produktion och syreupptagning, och mätningar görs 
tillräckligt ofta för att möjliggöra identifiering av början och slutet av bionedbrytningen. Mätningarna görs kontinuerligt med automatiska respirometrer. Under tiden mäts både DOC och en annan parameter, 
men detta sker normalt endast i början och slutet av testet. Specifika 
kemiska analyser kan också användas för att bedöma primär ned ­
brytning av testämnet, och för bestämning av koncentrationen av eventuella mellanprodukter (obligatoriskt i MITI-testet). 
Testet vara normalt i 28 dagar. När bionedbrytningskurvan har nått 
en platå vid minst 3 mätningar kan dock testet avbrytas. Om kurvan visar att bionedbrytning har börjat men ännu inte nått en platå inom 28 dagar kan testet förlängas utöver denna period.
 
I.5 KVALITETSKRITERIER  
I.5.1 Repeterbarhet  
Till följd av bionedbrytningens natur och den blandade bakteriepo ­
pulationen i inokulat, bör minst dubbla bestämningar göras. 
Det är en allmän erfarenhet att variationen mellan replikat blir 
mindre ju större startkoncentrationer av mikroorganismer i testmediet 
är. Ringtester har dessutom visat att det kan finnas stora variationer mellan resultat som erhållits av olika laboratorier, men generellt upp ­
nås god överensstämmelse med lätt bionedbrytbara föreningar.
 
I.5.2 Testets giltighet  
Ett test anses giltigt om skillnaden mellan de två yttersta värdena för 
testämnets försvinnande vid en multibestämning i platåfasen, vid avslutning av testet eller vid avslutningen av 10-dagarsfönstret är mindre än 20 % och om den procentuella nedbrytbarheten av refe ­
rensämnet har nått nivån för lätt bionedbrytbarhet inom 14 dagar. 
Om inte båda villkoren uppfylls upprepas testet. På grund av strin ­
gensen i detta test behöver ett lågt resultat inte nödvändigtvis betyda att testämnet inte är bionedbrytbart under miljöbetingelser utan det 
pekar på att det krävs mer arbete för att fastställa detta. 
Om nedbrytningen i ett toxicitetstest med både testämne och refe ­
renskemikalie är mindre än 35 % (baserad på DOC) eller 25 % 
(baserad på ThOD eller ThCO
 2 ) inom 14 dagar måste man anta att 
testämnet är hämmande (se även bilaga 4). Testserien upprepas, om möjligt med lägre testämneskoncentrationer och högre inokulatkon ­
centration, dock högst 30 mg/fast ämne/liter.
 
I.6 ALLMÄNNA FÖRFARANDEN OCH FÖRBEREDELSER 
Allmänna villkor som gäller för testerna sammanfattas i tabell 
2. Apparatur och andra försöksbetingelser som gäller specifikt för 
ett individuellt test beskrivs senare under rubriken för det testet.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 982
 
Tabell 2  
Testbetingelser  
Test DOC- elimine ­
ring CO 2 -utveckling Manometrisk 
respirometri Modifierad 
OECD 
screening Closed bottle MITI(I)  
Koncentration 
av testämnet 
som mg/l 100 2–10 100 
mg/DOC/l 10–40 10–20 10–40 mg/TbOD/l 50–100 5–10 
Koncentration 
av inokulat (i 
celler/l, cirka) ≤ 30 mg/l SS 
eller ≤ 100 ml utflöde/l 
(10
 7 –10  8 ) 0,5 ml se ­
kundärt 
utflöde/l 
(I0 5 ) ≤ 5 ml av 
utflöde/l 
(10 4 –10  6 ) 30 mg/l SS 
(10 7 –10  8 ) 
Koncentration 
av element i mineralme ­
dium (i mg/l) 
P 116 11,6 29 
N 1,3 0,13 1,3 Na 86 8,6 17,2 
K 122 12,2 36,5 
Mg 2,2 2,2 6,6 Ca 9,9 9,9 29,7 
Fe 0,05–0,1 0,05–0,1 0,15 
pH-värde 7,4 ± 0,2 helst 7,0 
Temperatur 22 ± 2
 o C 25 ± 1  o C 
DOC = Upplöst organiskt kol ThOD = Teoretiskt syre ­
behov SS = Suspenderat fast 
ämne  
I.6.1 Utspädningsvatten  
Avjoniserat eller destillerat vatten utan innehåll av toxiska substanser 
(t.ex. Cu  ++ joner) används. Det får inte innehålla mer än 10 % av det 
organiska kol som tillförs med testämnet. Denna höga renhet är 
nödvändig för att undvika höga blindvärden. Föroreningar kan 
stamma från naturliga orenheter och från jonbyteshartser och material från bakterier och alger. Till en testserie får endast vatten från 
samma behållare användas och detta vatten ska kontrolleras i förväg 
genom DOC-analys. En sådan kontroll är inte nödvändig för Closed Bottle-test, men syreförbrukningen från vattnet ska vara låg.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 983
 
I.6.2 Stamlösningar av oorganiska medier  
Stamlösningar framställs av oorganiska medier med passande kon ­
centrationer av salt för användning vid framställning av testlösning ­
arna. Följande stamlösningar kan (med olika förtunningsförhållan ­
den) användas för DOC-eliminering, modifierad OECD-screening, 
CO 2 -utveckling, manometrisk respirometri och Closed Bottle-test.  
Stamlösningar:  
a) Monokaliumdiväteortofosfat, KH  2 PO 4 8,50 g 
Dikaliumväteortofosfat, K  2 HPO  4 21,75 g 
Dinatriumväteortofosfat-dihydrat, Na  2 HPO  4 • 2H  2 O 33,40 g 
Ammoniumklorid, NH  4 Cl 0,50 g 
Upplöses i vatten så att 1 000 ml erhålls. pH- 
värdet ska vara 7,4. 
b) Kalciumklorid CaCl  2 27,50 g 
eller kalciumklorid, dihydrat, CaCl  2 · 2H  2 O 36,40 g 
Upplöses i vatten så att 1 000 ml erhålls 
c) Magnesiumsulfat-heptahydrat, MgSO  4 · 7H  2 O 22,50 g 
Upplöses i vatten så att 1 000 ml erhålls 
d) Järn(III)klorid-hexahydrat FeCl  3 · 6H  2 O 0,25 g 
Upplöses i vatten så att 1 000 ml erhålls (1.6.1.1).  
Kommentar : För att undvika att behöva framställa denna lösning 
omedelbart före användning tillsätts 1 droppe koncentrerat HC1 eller 0,40 g etylendiaminotetraättiksyra (EDTA) per liter.
 
I.6.3 Stamlösningar av kemikalier  
Om lösligheten är större än 1 g/l upplöses t.ex. 1–10 g av test- eller 
referenskemikalien i avjoniserat vatten, och det förtunnas till 1 liter. I motsatt fall framställs stamlösningen i det oorganiska mediet, eller kemikalier tillsätts direkt till det oorganiska mediet. Jämför tillägg III 
för hantering av mindre lösliga kemikalier. I MITI-testet (metod C.4-F) 
får dock varken lösningsmedel eller emulgatorer användas.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 984
 
I.6.4 Inokulat  
Inokulat kan stamma från en rad olika källor, t.ex. aktivt slam, spill ­
vattensavlopp (ej klorerat), ytvvatten och ytjord eller en blandning av dessa. Aktivt slam för DOC-eliminering, CO
 2 -utveckling och mano ­
metrisk respirometri ska tas från ett reningsverk eller ett laboratori ­
um, som huvudsakligen behandlar avloppsvatten från hushåll. Ino ­
kulat från andra källor har visat sig leda till större spridning av resultaten. För modifierad OECD-screening och Closed Bottle-testet 
krävs ett mer utspätt inokulat utan slampartiklar, och som källa 
föredras sekundärt avloppsvatten från ett reningsverk som behandlar avloppsvatten från hushåll eller en anläggning i laboratorieskala. För 
MITI-testet framställs inokulat från en blandning av källor, vilket 
beskrivs under detta specifika test.
 
I.6.4.1  Inokulat från aktiverat slam  
Ett färskt prov av aktiverat slam tas från en luftningsbassäng vid ett 
reningsverk eller en laboratorieanläggning som huvudsakligen be ­
handlar avloppsvatten från hushåll. Vid behov avlägsnas grova par ­
tiklar genom filtrering genom en finmaskigt sikt och slammet hålls därefter aerobt. 
Alternativt utfälls eller centrifugeras slammet (t.ex. vid 1 100 g i 
10 minuter) sedan grova partiklar tagits bort. Supernatanten avlägs ­
nas. Slammet kan tvättas i oorganiskt medium. Det koncentrerade 
slammet uppslammas till en koncentration av 3–5 g uppslammat 
torrämne per liter, varefter det luftas fram till användning. 
Slammet ska tas från en ordentligt fungerande normal anläggning. 
Om det är nödvändigt att ta slammet från ett starkt belastat renings ­
verk, eller om man anser att det innehåller hämmande ämnen, måste det tvättas. Utfäll eller centrifugera det omsuspenderade slammet efter noggrann blandning, avlägsna supernatanten och slamma återi ­
gen upp det tvättade slammet i en ytterligare mängd oorganiskt 
medium. 
Strax före användning tas ett prov av det fullständigt uppslammade 
slammet eller av det obehandlade slammet, för bestämning av mäng ­
den uppslammat torrämne. 
Ett annat alternativ är att homogenisera aktiverat slam (3–5 g upp ­
slammat torrämne per liter). Slammet behandlas i en mekanisk blan ­
dare i 2 minuter vid medelhastighet. Det homogeniserade slammet får utfälla i 30 minuter eller vid behov längre, och vätskan dekan ­
teras för användning som inokulat i en mängd av 10 ml per liter 
oorganiskt medium.
 
I.6.4.2  Andra inokulatkällor  
Det kan framställas av sekundärt avloppsvatten från ett reningsverk 
eller en laboratorieanläggning som huvudsakligen behandlar avlopps ­
vatten från hushåll. Ett färskt prov tas och förvaras under aerobiska förhållanden under transporten. Detta får utfälla i 1 timma eller fil ­
treras genom ett grovt filterpapper och denna vätska förvaras under 
aeroba förhållanden fram till användning. Upp till 100 ml av detta 
slags inokulat kan användas per liter medium.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 985
 
Ytvatten är en ytterligare inokulatkälla. I detta fall tas ett prov av 
lämpligt ytvatten, t.ex. flod- eller sötvatten, som förvaras under 
aeroba förhållanden fram till användning. Vid behov kan inokulat koncentreras genom filtrering eller centrifugering.
 
I.6.5 Förbehandling av inokulat  
Det framställda inokulatet kan förbehandlas till försöksbetingelserna, 
men får inte tillvänjas till testkemikalien. Förbehandlingen består i luftning av aktivt slam i oorganiskt medium eller av sekundärt av ­
loppsvatten i 5–7 dagar vid rumstemperatur. Förbehandling för MI ­
TI-test anses onödigt.
 
I.6.6 Abiotisk kontroll  
Vid behov kontrolleras eventuell abiotisk nedbrytning av testämnet 
genom bestämning av DOC-förlust, syreupptagning och koldioxidut ­
veckling i sterila kontrollprover som inte innehåller okulat. Sterilise ­
ring sker genom membranfiltrering (0,2–0,45 um) eller genom till ­
sättning av ett passande toxiskt ämne i passande koncentration. Om membranfiltrering används ska proverna tas aseptiskt för att upprätt ­
hålla steriliteten. Såvida inte adsorption av testämnet har uteslutits på 
förhand ska test som mäter bionedbrytning som DOC-förlust inklu ­
dera en abiotisk kontroll som inokuleras och förgiftas. Detta gäller särskilt för inokulat med aktiverat slam.
 
I.6.7 Antal kolvar  
För varje test beskrivs antalet kolvar i en typisk försöksserie under 
rubriken för varje test. 
Följande kolvtyper kan användas: — Testuppslamning: innehåller testämne och inokulat. — Inokulatblind: innehåller endast inokulat. — Förfarandekontroll: innehåller referensämne och inokulat. 
— Abiotisk steril kontroll: sterilt, innehåller testämne (1.6.6). 
— Adsorptionskontroll: innehåller testämne, inokulat och steriliserat 
ämne. 
— Toxicitetskontroll: innehåller testämne, referensämne och inokulat. Bestämningar i testuppslamningen och inokulatblind ska obligato ­
riskt göras parallellt. Dessutom rekommenderas parallella bestäm ­
ningar i den andra kolven. 
Detta är dock inte alltid möjligt. Man måste se till att tillräckligt 
många prover tas eller att tillräckligt många avläsningar görs för att 
kunna värdera den procentuella elimineringen i 10-dagarsfönstret.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 986
 
1.7 DATA OCH UTVÄRDERING 
Vid beräkning av den procentuella nedbrytningen D  t används ge ­
nomsnittsvärdena av de dubbla bestämningarna av parametern i tes ­
tuppslamningen och inokulatblindproven. Formlerna ges i avsnitten 
om de enskilda testmetoderna. Nedbrytningens förlopp visas grafiskt 
med angivelse av 10-dagarsfönstret. Den procentuella elimineringen vid avslutningen av 10-dagarsfönstret och vid platån eller testets avslutning beräknas och rapporteras. 
I metoder som baseras på respirometri kan kvävehaltiga 
föreningar påverka syreupptagningen på grund av nitrifikation 
(se bilagor II och V).
 
I.7.1 Nedbrytning mätt genom DOC-bestämning  
Den procentuella nedbrytningen (D  t ) vid varje provtagningstillfälle 
ska beräknas särskilt för kolvarna som innehåller testämne varvid 
genomsnittsvärdena av de dubbla bestämningarna av DOC används för att kunna bedöma testets pålitlighet (se 1.5.2). Den beräknas genom användning av följande formel:
 
D t ¼ Í 
1 Ä C t Ä C bt 
C o Ä C b0 Î 
Ü 100  
där: 
D t = % nedbrytning vid tidpunkten t 
C o = genomsnittlig startkoncentration av DOC i kulturmediet 
med testämne och inokulat (mg DOC/l) 
C t = genomsnittskoncentrationen av DOC i kulturmediet med 
oorganiskt medium och inokulat mg DOC/l) 
C bo = genomsnittlig startkoncentration av DOC i blindprov med 
oorganiskt medium och inokulat (mg DOC/1) 
C bt = genomsnittskoncentration av DOC i blindprov med oorga ­
niskt medium och inokulat vid tidpunkten t (mg DOC/1) 
Alla koncentrationer bestäms experimentellt.  
I.7.2 Nedbrytning mätt genom specifik analys  
Om specifika analysdata föreligger beräknas den primära bionedbryt ­
ningen genom formeln  
D t ¼ S b Ä S a 
S b Ü 100  
där: 
D t = % nedbrytning vid tidpunkten t, normalt 28 dagar 
S a = restmängd testämne i medium med inokulat vid testets av ­
slutning (mg) 
S b = restmängd testämne i blindprov endast med vatten/medium 
och testämne (mg)  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 987
 
I.7.3 Abiotisk nedbrytning  
När abiotisk nedbrytning används beräknas den procentuella abio ­
tiska nedbrytningen med användning av 
% abiotic degradation  ¼ C sðoÞ Ä C sðtÞ 
C sðoÞ Ü 100 
där: 
C s(o) = DOC-koncentration, sterilkontrollen på dag 0 
C s(t) = DOC-koncentration, sterilkontrollen på dag t.  
I.8 RAPPORTERING 
Testrapporten ska om möjligt innehålla följande: 
— Test- och referenskemikalie och deras renhet. 
— Testbetingelser. 
— Inokulat: art och provtagningsställe, koncentration och eventuell 
förbehandling. 
— Art och andel av industriavloppsvatten i avloppsvattnet, om känt. — Testets varaktighet och temperatur. 
— I fråga om svårlösliga testkemikalier: genomförd behandling. 
— Använd testmetod; ändringar av förfarandet ska vara vetenskap ­
ligt motiverat. 
— Försöksresultaten uppställda i tabellform. — Eventuellt observerade hämningsfenomen. 
— Eventuellt observerad abiotisk nedbrytning. 
— Eventuella data från specifika kemiska analyser. — Om möjligt analytiska data om nedbrytningsprodukter. — Avbildning av den procentuella nedbrytningen mot tiden för både 
test- och referensämnen med tydlig angivelse av ”lag”-fas, ned ­
brytningstid, 10-dagarsfönster och lutning (se bilaga I). Om man 
i testet använder pålitlighetskriterier kan genomsnittet av nedbryt ­
ningsprocenten i kolvarna innehållande testämnet användas för framställning av grafen. 
— Procentuell eliminering efter 10-dagarsfönstret och vid platån 
eller testets avslutning.
 
DEL II.  DOC-ELIMINERING (DOC DIE-AWAY)  (Metod 
C.4-A)  
II.1 TESTMETODSPRINCIP 
En uppmätt mängd oorganiskt medium innehållande inokulat och, 
som nominella enda organiska kolkälla, testämne av känd koncent ­
ration (10–40 mg/l), luftas i mörker eller diffust ljus vid 22 ± 2  o C. ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 988
 
Nedbrytningen följs genom regelbunden DOC-analys i 28 dagar. 
Bionedbrytningen beräknas genom att uttrycka koncentrationen av 
avlägsnat DOC (korrigerat för koncentration i inokulatblindprovet) i procent av startkoncentrationen av DOC. Den primära bionedbryt ­
ningen kan också beräknas utifrån kompletterande kemisk analys vid 
inkubationsperiodens början och slut.
 
II.2 METODBESKRIVNING  
II.2.1  Apparatur  
a) Koniska kolvar, t.ex. från 250 ml till 2 liter, beroende på den 
volym som krävs för DOC-analysen. 
b) Skakapparatur för de koniska kolvarna, antingen med automatisk 
temperaturkontroll eller placerad i en lokal med konstant tempera ­
tur, och tillräckligt kraftig för att hålla förhållandena aeroba i alla kolvarna. 
c) Filtreringsapparatur med passande membran. 
d) DOC-analysator. 
e) Apparatur för bestämning av upplöst syre. 
f) Centrifug.
 
II.2.2  Framställning av oorganiskt medium  
Se 1.6.2 om framställning av stamlösning. 
10 ml av lösningen (a) blanda med 800 ml utspädningsvatten, och av 
lösning (b), (c) och (d) tillsätts 1 ml av varje, varefter det fylls upp 
till 1 liter med förtunningsvatten.  
II.2.3  Framställning och förbehandling av inokulat  
Inokulat kan stamma från en rad olika källor: aktiverat slam, av ­
loppsvatten, ytvatten och ytjord eller en blandning av dessa. 
Se 1.6.4, 1.6.4.1, 1.6.4.2 och 1.6.5.  
II.2.4  Förberedelse av kolvarna  
Som ett exempel kan 800 ml portioner av oorganiskt medium över ­
föras till koniska 2-literskolvar, varefter det tillsätts så mycket av 
stamlösningarna av test- och referensämne till de olika kolvarna att kemikaliekoncentrationen blir 10–40 mg DOC per liter. Kontrollera pH-värden och justera om nödvändigt till 7,4. Inokulat från aktiverat 
slam eller en annan källa tillsätts (se I.6.4) till en slutkoncentration 
av högst 30 mg uppslammat torrämne per liter. Inokulatprover för ­
bereds också i oorganiskt medium utan test- och referenskemikalier. 
Vid behov inkluderas även en kolv för kontroll av om testkemikalien 
har en hämmande verkan, genom tillsättning av jämförbart lika stora 
mängder test- och referenskemikalie till oorganiskt medium innehål ­
lande inokulat. 
Man kan också vid behov inkludera en steril kolv, dvs. en kolv 
utan inokulat för att undersöka om testkemikalien bryts ned abiotiskt 
(se 1.6.6).
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 989
 
Om man misstanker att testkemikalien i väsentlig grad kan adsorbe ­
ras till gas, slampartiklar eller liknande, företas dessutom en preli ­
minär värdering av denna adsorption och därmed av testens lämp ­
lighet för den berörda testkemikalien (se tabell 1). Använd en kolv innehållande testämnet, inokulat och det steriliserande ämnet. 
Alla kolvar fylls upp till 1 liter med oorganiskt medium, och efter 
blandning uttas ett prov från varje kolv för bestämning av startkon ­
centrationen av DOC (se bilaga II, punkt 4). Kolvarnas öppning sluts, t.ex. med aluminiumfolie, på ett sådant sätt att luften fritt 
kan passera in och ut ur kolvarna. Därefter inleds testet genom att 
kolvarna placeras i skakapparaturen.
 
II.2.5  Antal kolvar i en typisk testserie  
Kolv 1 och 2: testuppslamning 
Kolv 3 och 4: inokulatblind 
Kolv 5: förfarandekontroll 
Rekommenderas vid behov: 
Kolv 6: abiotisk steril kontroll Kolv 7: adsorptionskontroll 
Kolv 8: toxicitetskontroll 
Se I.6.7.
 
II.2.6  Utförande av testet  
Under testet görs dubbla bestämningar av DOC-koncentrationerna i 
alla kolvarna med bestämda tidsintervaller och så ofta att både 10- dagarsfönstret och den procentuella förlusten vid 10-dagarsfönstrets avslutning kan konstateras. Endast så mycket av testuppslamningen 
tas som är nödvändigt för analysen. 
Före provtagningen kompenseras för eventuell förångningsförlust 
från kolvarna genom tillsättning av vatten (1.6.1). Innan proven tas blandas kulturmediet noggrant och det säkerställs att materialet på 
kolvens sidor löses upp eller uppslammas före provtagning. Omedel ­
bart efter provtagningen membran-filtreras eller centrifugeras provet (se tillägg 4). Det filtrerade eller centrifugerade provet analyseras 
samma dag. Det kan förvaras i högst 48 timmar vid 2–4
 o C eller 
längre vid högst – 18  o C. 
II.3 DATA OCH RAPPORTERING  
II.3.1  Behandling av resultaten  
Den procentuella nedbrytningen vid tidpunkt t beräknas enligt 1.7.1 
(DOC-bestämning) och eventuellt enligt 1.7.2 (specifik analys). 
Alla resultat antecknas på tillhörande scheman.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 990
 
II.3.2  Resultatens giltighet  
Se I.5.2.  
II.3.3  Rapportering  
Se I.8.  
II.4 FORMULÄR 
Nedanför visas ett exempel på ett resultatschema.  
DOC-ELIMINERING 
1. LABORATORIUM  
2. DATUM VID INLEDNING AV TEST  
3. TESTÄMNE  
Namn: 
Stamlösningens koncentration: .... mg/l ämne 
Startkoncentration i mediet: t  0 : .... mg/l ämne  
4. INOKULAT  
Källa: 
Behandling: 
Eventuell förbehandling: 
Koncentration av uppslammat torrämne i reaktionsblandningen: 
... mg/l:  
5. KOLBESTÄMNINGAR  
Kolanalyser:  
Kolv nr DOC efter n dagar (mg/l) 
0 n  1 n 2 n 3 n x 
Testkemikalien 
med inokulat 
1 a 1 
a 2 
a, medel 
C a(t) 
2 b 1 
b 2 
b, medel 
C b(t) ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 991
 
Kolv nr DOC efter n dagar (mg/l) 
0 n  1 n 2 n 3 n x 
Inokulatblindpro ­
vet utan testkemi ­
kalie 3 c 1 
c 2 
c, medel C  c(t) 
4 d 1 
d 2 
d, medel 
C d(t) 
C blðtÞ ¼ C cðtÞ þ C dðtÞ 
2 
6. UTVÄRDERING AV RÅDATA  
Kolv nr. % nedbrytning efter n dagar 
Q n  1 n 2 n 3 n x 
1 D 1 ¼ Í 
1 Ä C aðtÞ Ä C blðtÞ 
C aðoÞ Ä C blðoÞ Î 
Ü 100 0 
2 D 2 ¼ Í 
1 Ä C bðtÞ Ä C blðtÞ 
C bðoÞ Ä C blðoÞ Î 
Ü 100 0 
medel (*) D ¼ D 1 Ä D 2 
2 0 
(*) Genomsnittet av D, och D  2 ska inte tas om det är en betydande skillnad.  
Anmärkning : Motsvarande formler kan användas för referenskemika ­
lien och toxicitetskontrollproverna.  
7. ABIOTISK KONTROLL (valfritt)  
Tid (dagar) 
0 t  
DOC-koncentration (mg/l) i sterilkontroll C s(0) C s(t) 
% abiotic degradation  ¼ C sðoÞ Ä C sðtÞ 
C sðoÞ Ü 100  
8. SPECIFIK KEMISK ANALYS (valfritt)  
Restmängd av testämne vid av ­
slutning av test (mg/l) % primär nedbrytning  
Sterilkontroll s  b ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 992
 
Restmängd av testämne vid av ­
slutning av test (mg/l) % primär nedbrytning  
Inokulerat testmedium s  a S b Ä S a 
S b Ü 100  
DEL III.  MODIFIERAT OECD-SCREEENINGTEST  (metod 
C.4-B)  
III.1 TESTMETODSPRINCIP 
En uppmätt mängd oorganiskt medium innehållande inokulat och, 
som nominella enda organiska kolkälla, testämne av känd koncent ­
ration (10–40 mg/l), luftas i mörker eller diffust ljus vid 22 ± 2  o C. 
Nedbrytningen följs genom regelbunden DOC-analys i 28 dagar. 
Bionedbrytningen beräknas genom att uttrycka koncentrationen av avlägsnat DOC (korrigerat för koncentration i inokulatblindprovet) 
i procent av startkoncentrationen av DOC. Den primära bionedbryt ­
ningen kan också beräknas utifrån kompletterande kemisk analys vid inkubationsperiodens början och slut.
 
III.2 METODBESKRIVNING  
III.2.1 Apparatur 
a) Koniska kolvar, t.ex. från 250 ml till 2 liter, beroende på den 
volym som krävs för DOC-analysen. 
b) Skakapparatur för de koniska kolvarna, antingen med automatisk 
temperaturkontroll eller placerad i en lokal med konstant tempera ­
tur, och tillräckligt kraftig för att hålla förhållandena aeroba i alla 
kolvarna. 
c) Filtreringsapparatur med passande membran. 
d) DOC-analysator. 
e) Apparatur för bestämning av upplöst syre. 
f) Centrifug.  
III.2.2  Framställning av oorganiskt medium  
Se I.6.2 om framställning av stamlösning. 
10 ml av lösningen (a) blandas med 80 ml utspädningsvatten, och av 
lösning (b), (c) och (d) tillsätts 1 ml av varje, varefter det fylls upp 
till 1 liter med förtunningsvatten. 
I denna metod används endast 0,5 liter spillvatten per liter som 
inokulat, och därför kan det vara nödvändigt att tillsätta ytterligare spårämnen och växtfaktorer till mediet. Detta görs genom tillsättning 
av 1 ml av var och en av följande lösningar per liter medium (slut ­
volymen):
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 993
 
Lösningar av spårämnen: 
Mangansulfat tetrahydrat, MnSO  4 . 4H  2 O 39,9 mg 
Borsyra, H  3 BO 3 57,2 mg 
Zinksulfat heptahydrat, ZnSO  4 .7H  2 O 42,8 mg 
Ammoniumheptamolybdat (NH  4 ) 6 M0 7 O 24 34,7 mg 
Järn-chelat (FeCl  3 etylendiamintetraättiksyra) 100,0 mg 
löses i vatten och förtunnas till 1 000 ml Vitaminlösning: Jästextrakt 15,0 mg 
löses i 100 ml vatten. Det steriliseras genom filtrering genom 0,2 μm 
membranfilter om lösningen framställs färsk varje gång.
 
III.2.3  Framställning och förbehandling av inokulat  
Inokulat kan stamma från en rad olika källor: aktiverat slam, av ­
loppsvatten, ytvatten och ytjord eller en blandning av dessa. Se 1.6.4.2 och 1.6.5. 
0,5 ml per liter oorganisk lösning används.
 
III.2.4  Förberedelse av kolvarna  
Som ett exempel kan 800 ml portioner av oorganiskt medium 
överföras till koniska 2-literskolvar, varefter det tillsätts så mycket av stamlösningarna av test- och referensämne till de olika kolvarna att kemikaliekoncentrationen blir 10–40 mg DOC per liter. Kontrol ­
lera pH-värden och justera till 7,4 om nödvändigt. 0,5 ml spillvatten 
tillsätts per liter (se I.6.4.2) till kolvarna som inokulat. Inokulatprover förbereds också i oorganiskt medium utan test- och referenskemika ­
lier. 
Vid behov inkluderas även en kolv för kontroll av om testkemikalien 
har en hämmande verkan, genom tillsättning av jämförbart lika stora 
mängder test- och referenskemikalie till oorganiskt medium innehål ­
lande inokulat. 
Man kan också vid behov inkludera en steril kolv, dvs. en kolv 
utan inokulat för att undersöka om testkemika-lien bryts ned abio ­
tiskt (se 1.6.6). 
Om man misstänker att testkemikalien i väsentlig grad kan adsorbe ­
ras till gas, slampartiklar eller liknande, företas dessutom en preli ­
minär värdering av denna adsorption och därmed av testens lämp ­
lighet för den berörda testkemikalien (se tabell 1). Använd en kolv 
innehållande testämnet, inokulat och det steriliserande ämnet. 
Alla kolvar fylls upp till 1 liter med oorganiskt medium, och efter 
blandning uttas ett prov från varje kolv för bestämning av startkon ­
centrationen av DOC (se bilaga II, punkt 4). Kolvarnas öppning sluts, t.ex. med aluminiumfolie, på ett sådant sätt att luften fritt 
kan passera in och ut ur kolvarna. Därefter inleds testet genom att 
kolvarna placeras i skakapparaturen.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 994
 
III.2.5  Antal kolvar i en typisk testserie  
Kolv 1 och 2: testuppslamning 
Kolv 3 och 4: inokulatblind 
Kolv 5: förfarandekontroll 
Rekommenderas vid behov: Kolv 6: abiotisk steril kontroll 
Kolv 7: adsorptionskontroll 
Kolv 8: toxicitetskontroll Se I.6.7.
 
III.2.6  Utförande av testet  
Under testet görs dubbla bestämningar av DOC-koncentrationerna 
i alla kolvarna med bestämda tidsintervaller och så ofta att både 
10-dagarsfönstret och den procentuella förlusten vid 10-dagarsfön ­
strets avslutning kan konstateras. Endast så mycket av testuppslam ­
ningen tas som är nödvändigt för analysen. 
Före provtagningen kompenseras för eventuell förångningsförlust 
från kolvarna genom tillsättning av förtunningsvatten (I.6.1). Innan proven tas blandas kulturmediet noggrant och det säkerställs att ma ­
terialet på kolvens sidor löses upp eller uppslammas innan provtag ­
ning. Omedelbart efter provtagningen membranfiltreras eller centrifugeras provet (se tillägg 4). Det filtrerade eller centrifugerade 
provet analyseras samma dag. Det kan förvaras i högst 48 timmar 
vid 2–4
 o C eller längre vid högst – 18  o C. 
III.3 DATA OCH RAPPORTERING  
III.3.1  Behandling av resultaten  
Den procentuella nedbrytningen vid tidpunkt t beräknas enligt 1.7.1 
(DOC-bestämning) och eventuellt enligt 1.7.2 (specifik analys). 
Alla resultat antecknas på tillhörande scheman.  
III.3.2 Resultatens giltighet 
Se. I.5.2.  
III.3.3 Rapportering 
Se I.8.  
III.4 FORMULÄR 
Nedan visas ett exempel på ett formulär.  
MODIFIERAT OECD-SCREENINGTEST 
1. LABORATORIUM  
2. DATUM VID INLEDNING AV TEST  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 995
 
3. TESTÄMNE  
Namn: 
Stamlösningens koncentration: .... mg/l ämne Startkoncentration i mediet, till: .... mg/l ämne
 
4. INOKULAT  
Källa: 
Behandling: Eventuell förbehandling: 
Koncentration av uppslammat torrämnen i reaktionsblandningen: 
... mg/l
 
5. KOLBESTÄMNINGAR  
Kolanalyser:  
Kolv nr DOC efter n dagar (mg/l) 
0 N  1 n 2 n 3 n x 
Testkemikalie med 
inokulat 
1 a 1 
a 2 
a, medel 
C a(t) 
2 b 1 
b 2 
b, medel 
C b(t) 
Inokulatblindprov 
utan testkemikalie 
3 c 1 
c 2 
c, medel C  c(t) 
4 d 1 
d 2 
d, 
medel C  d(t) 
C blðtÞ ¼ C cðtÞ þ C dðtÞ 
2 
6. UTVÄRDERING AV RÅDATA  
Kolv nr % nedbrytning efter n dagar 
0 n  1 n 2 n 3 n x 
1 D 1 ¼ Í 
1 Ä C aðtÞ Ä C blðtÞ 
C aðoÞ Ä C blðoÞ Î 
Ü 100 0 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 996
 
Kolv nr % nedbrytning efter n dagar 
0 n  1 n 2 n 3 n x 
2 D 2 ¼ Í 
1 Ä C bðtÞ Ä C blðtÞ 
C bðoÞ Ä C blðoÞ Î 
Ü 100 0 
medel (*) D ¼ D 1 Ä D 2 
2 0 
(*) Genomsnittet av D  1 och D  2 ska inte tas om det är en betydande skillnad.  
Anmärkning : Motsvarande formler kan användas för referenskemika ­
lie och toxicitetskontrollproverna.  
7. ABIOTISK KONTROLL  (valfritt)  
Tid (dagar) 
0 t  
DOC-koncentration (mg/l) i sterilkontroll C s(0) C s(t) 
% abiotic degradation =  C sðoÞ Ä C sðtÞ 
C sðoÞ Ü 100  
8. SPECIFIK KEMISK ANALYS  (valfritt)  
Restmängd av testämne vid av ­
slutning av test (mg/I) % primär nedbrytning  
Sterilkontroll s  b 
Inokulerat testmedium s  a S b Ä S a 
S b Ü 100 
DEL IV. CO  2 -UTVECKLING (metod C.4-C)  
IV.1 TESTMETODSPRINCIP 
En uppmätt mängd oorganiskt medium innehållande inokulat och, 
som nominella enda organiska kolkälla, testämne av känd koncent ­
ration (10–40 mg DOC eller TOC/l), luftas genom genomledning av 
koldioxidfri luft med kontrollerad hastighet i mörker eller diffust ljus. Nedbrytningen följs i 28 dagar genom bestämning av den bildade mängden koldioxid i det att det samlas upp i barium- eller natrium ­
hydroxid och mäts antingen genom titrering av resterade hydroxid 
eller som oorganiskt kol. Den mängd koldioxid som utvecklats av testkemikalien (korrigerat för inokulatblindvärden) uttrycks i procent av startkoncentrationen av ThCO
 2 . Graden av bionedbrytning kan 
också beräknas utifrån kompletterande DOC-analyser vid inkuba ­
tionsperiodens början och slut.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 997
 
IV.2 METODBESKRIVNING  
IV.2.1  Apparatur  
a) Kolvar 2–5 liter, alla försedda med luftningsrör, som nästan når 
ned till botten av behållaren, och avgångsöppning. 
b) Magnetomrörare, när svårlösliga kemikalier testas. 
c) Gasabsorptionskolvar. 
d) Utrustning för kontroll och mätning av luftgenomströmningen. 
e) Apparatur för tvättning av koldioxid, för framställning av kol ­
dioxidfri luft. Alternativt kan CO  2 -fri syre och CO  2 -fritt kväve 
användas i stålkolvar i det riktiga blandningsförhållandet (20 % 
O 2 och 80 % N  2 ). 
f) Utrustning för bestämning av koldioxid, antingen trimetriskt eller 
genom en annan form av analys för oorganiskt kol. 
g) Membranfiltreringsapparatur (valfritt). 
h) DOC-analysator (valfritt).  
IV.2.2  Framställning av oorganiskt medium  
Se 1.6.2 om framställning av stamlösning. 
10 ml av lösningen (a) blandas med 800 ml utspädningsvatten, och 
av lösning (b), (c) och (d) tillsätts 1 ml av varje, varefter det fylls upp till 1 liter med förtunningsvatten.
 
IV.2.3  Framställning och förbehandling av inokulat  
Inokulat kan stamma från en rad olika källor: aktiverat slam, av ­
loppsvatten, ytvatten och ytjord eller en blandning av dessa. 
Se I.6.4, I.6.4.1, I.6.4.2 och I.6.5.  
IV.2.4  Förberedelse av kolvarna  
Följande volym- och viktangivelser gäller som exempel för 5-liter ­
skolvar med 3 1 uppslamning. Om mindre volymer används anpas ­
sas värdena, dock ska den bildade mängden koldioxid kunna bestäm ­
mas korrekt. 
2 400 ml oorganiskt medium överförs till varje 5-literskolv. Man 
tillsätter så mycket förberett aktiverat slam (se I.6.4.1 och I.6.5) att koncentrationen av uppslammat torrämne blir högst 30 mg/l i 3 liter slutblandning. Alternativt kan det förberedda slammet först förtunnas 
med oorganiskt medium till en uppslamning innehållande 500–1 000 
mg/l, varefter en det av detta tillsätts till 5-literkolvens innehåll till en koncentration av 30 mg/l. Detta ger större precision. Andra ino ­
kulatkällor kan användas (se I.6.4.2). 
Dessa blandningar luftas över natten med CO
 2 -fri luft så all kol ­
dioxid drivs ut ur systemet.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 998
 
Test- och referensämne tillsätts var för sig som kända mängder av 
stamlösningar till replikatkolvarna så att man uppnår en koncent ­
ration av 10–20 mg DOC eller TOC per liter. Till vissa av kolvarna tillsätts inga kemikalier och dessa fungerar som inokulatkontrollpro ­
ver. Svårlösliga testämnen tillsätts direkt till kolvarna på vikt- eller 
volyrnbasis, eller hanteras i enlighet med bilaga III. 
Om det är nödvändigt används en kolv för att kontrollera om test ­
kemikalien verkar hämmande. Detta görs genom att tillsätta både 
test- och referenskemikalie av samma koncentration som i de andra 
kolvarna. 
Det kan vara nödvändigt att inkludera en steril kolv, dvs. en kolv 
utan inokulat för att undersöka om testkemikalien bryts ned abiotiskt (se 1.6.6). Sterilisera genom tillsättning av ett giftigt ämne i passande koncentration. 
Alla kolvarna fylls upp till en uppslamningsvolym av 3 liter genom 
tillsättning av oorganiskt medium, som i förväg har genomluftats med CO
 2 -fri luft. Eventuellt kan man ta prover för DOC-analys 
(se bilaga II.4) och specifik analys. Absorptionskolvarna förbinds 
till kolvarnas avgångsöppning. 
Om banumhydroxid används ansluts de 3 absorptionskolvarna, var 
och en innehållande 100 ml 0,0125 M bariumhydroxidlösning, i en serie till varje 5-literskolv. Lösningen ska vara fri från fällt sulfat och karbonat och dess styrka ska bestämmas omedelbart före använd ­
ning. Om natriumhydroxid används ansluts 2 kolvar varvid den sista 
fungerar som kontroll av att koldioxiden är absorberad i den första. Absorptionskolvar med serum-kolvstängning är lämpliga. 200 ml 0,05 natriumhydroxid placeras i varje kolv, vilket är tillräckligt för 
att absorbera hela den mängd koldioxid som utvecklas när testkemi ­
kalien bryts ned fullständigt. Natriumhydroxidlösning kommer, även om färskt framställd, dock att innehålla spår av karbonat. Detta korrigeras genom subtraktion av blindprovens karbonatinnehåll.
 
IV.2.5  Antal kolvar i en typisk testserie  
Kolv 1 och 2: testuppslamning 
Kolv 3 och 4: inokulatblind 
Kolv 5: förfarandekontroll Rekommenderas vid behov: 
Kolv 6: abiotisk steril kontroll 
Kolv 7: adsorptionskontroll Kolv 8: toxicitetskontroll 
Se I.6.7.
 
IV.2.6  Utförande av testet  
Testet inleds genom genombubbling av uppslamningarna med 
30–100 ml CO  2 -fri luft per minut. Prover tas regelbundet av kodiox ­
idabsorbenten för analys av CO  2 -innehåll. Det rekommenderas att 
man under de första 10 dagarna gör analyser varannan eller var 
tredje dag och därefter var femte dag fram till dag 28, så att 10- 
dagarsfönstret kan identifieras.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 999
 
Den 28:e dagen tas (eventuellt) prover för DOC-analys och specifik 
analys, uppslamningarnas pH mäts och 1 ml koncentrerad saltsyra 
tillsätts till varje kolv. Kolvarna luftas över natten så att all koldioxid drivs ut av testuppslamningarna. Dag 29 företas den sista analysen av utvecklad koldioxid. 
De dagar då CO
 2 bestäms avlägsnas den bariumhydroxidabsorbtions ­
kolv som är närmast kolven och innehåller titreras med 0,05 M HCl med fenoftalein som indikator. De övriga absorbtionskolvarna flyttas fram en plats närmare kolven och en ny kolv innehållande 100 ml 
färskt framställt 0,0125 M bariumhydroxid placeras längst bak i 
serien. Titreringarna görs enligt behov, t.ex. när betydande fällning syns i den första kolven men inget syns i den andra, dock minst en gång i månaden. Om NaOH används om absorbtionsmedel tas med 
en injektionsspruta ett litet prov (beroende på den använda koläm ­
nesanaiysatorn) av natriumhydroxidlösningen i den kolv som är när ­
mast kolven. Provet sprutas in i IC-delen av kolämnesanalysatorn för direkt analys av den utvecklade koldioxiden. 
Innehållet i den andra absorbtionskolven analyseras först vid testets 
avslutning så att man kan korrigera för eventuell överföring av kol ­
dioxid
 
IV.3 DATA OCH RAPPORTERING  
IV.3.1  Behandling av resultaten  
Den absorberade CO  2 -mängden är efter titrering given genom 
mgCO  2 = (100 × C  B -0,5 × V × C  A ) × 44 
där: 
V = den mängd HCl som förbrukas vid titrering av de 100 ml 
absorptionsmedel (ml) 
C B = bariumhydroxidlösningens koncentration (M) 
C A = saltsyreupplösningens koncentration (M) 
Om C  B = 0,0125 M och C  A = 0,05 M ska man använda 50 ml för 
titrering av 100 ml bariumhydroxid, och CO  2 -mängden är given 
genom:  
0; 05 
2 × 44 × ml HCI titrated = × ml HCI 
I detta fall ska man alltså använda en faktor på 1,1 vid omräkning av 
den volym HCl som går åt vid titrering, till det antal mg Cl  2 som 
utvecklats. 
Den viktmängd CO  2 som bildas av bara inokulat och av inokulat 
med testkemikalie, beräknas utifrån de gällande titreringsvärdena, 
och skillnaden är den viktmängd CO  2 som endast testkemikalien 
utvecklar. 
Om t.ex. enbart inokulat kräver 48 ml för titrering och inokulat plus 
testkemikalie kräver 45 ml fås 
CO 2 från inokulat = 1,1 × (50.48) = 2,2 mg  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1000
 
CO 2 från inokulat plus testkemikalie = 1,1 × (50-45) = 5,5 mg, 
och den viktmängd CO  2 som testkemikalien har utvecklat blir alltså 
3,3 mg. 
Den procentuella bionedbrytningen beräknas genom  
% nedbrytning ¼ mg CO  2 utvecklat Ü 100 
ThCO  2 Ü mg tillsatt testkemikalie; 
eller 
% nedbrytning ¼ mg CO  2 utvecklat Ü 100 
mg tillsatt TOC i testet  Ü 3; 67 
varvid 3,67 är omräkningsfaktorn (44/12) från kol till koldioxid. 
Den procentuella nedbrytningen efter en viss tid beräknas genom att 
lägga ihop de enskilda procentdelarna av ThCO  2 som är uppmätta 
fram till den gällande tidpunkten. 
Om natriumhydroxid används som absorptionsmedel beräknas den 
utvecklade CO  2 -mängden, uttryckt som IC (mg), genom att multi ­
plicera absorbtionsmedlets IC-koncentration med dess volym. 
Den procentuella nedbrytningen beräknas genom  
% of ThCO  2 ¼ mg IC i testkolv Ä mg IC i blindprov 
mg TOC tillsatt som testkemikalie  Ü 100 
IV.3.2  Resultatens giltighet  
IC-innehållet i testkemikalieuppslamningen i oorganiskt medium vid 
testets inledning ska vara mindre än 5 % av TC, och den utvecklade 
CO 2 -mängden i inokulatblindprovet får vid testets avslutning inte 
överstiga 40 mg per liter medium. Om det finns värden på över 70 mg CO
 2 per liter granskas data och försökstekniker noggrant. 
Se också I.5.2.  
IV.3.3  Rapportering  
Se I.8.  
IV.4 FORMULÄR 
Nedan visas ett exempel på ett formulär.  
KOLDIOXIDUTVECKLING 
1. LABORATORIUM  
2. DATUM VID INLEDNING AV TEST  
3. TESTÄMNE  
Namn: 
Stamlösningens koncentration: .... mg/l ämne  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1001
 
Startkoncentration i mediet: .... mg/l ämne 
Total C tillsatt till kolven: .... mg C 
ThCO  2 : ... mg CO  2 
4. INOKULAT  
Källa: 
Behandling: 
Eventuell förbehandling: 
Koncentration av uppslammat torrämne i reaktionsblandningen: 
... mg/l:  
5. KOLDIOXIDUTVECKLING OCH NEDBRYTBARHET  
Metod: Ba(OH)  2 /NaOH/annat  
Tid 
(dagar) Utvecklat CO  2 
test (mg) Utvecklat CO  2 
blind (mg) utvecklat CO  2 kumu­
lerat (mg) 
(test minus blindprov) % ThCO  2 
CO  2 
ThCO  2 Ü 100  
1 
2 medel 3 
4 medel 1 2 1 2 medel  
0 
n 1 
n 2 
n 3 
28 
Anmärkning : Motsvarande uppställning kan användas för referens ­
kemikalie och toxicitetskontrollproverna.  
6. KOLANALYS (valfritt)  
Kolanalysator:  
Tid (dagar) Blindprov mg/l Testkemikalie mg/l  
0 C  b(o) C o 
28 (*) C  b(t) c t 
(*) Eller vid inkuberingens avslutning.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1002
 
% DOC avlägsnat ¼ Í 
1 Ä C t Ä C bðtÞ 
C o Ä C bðoÞ Î 
Ü 100  
7. ABIOTISK NEDBRYTNING (valfritt)  
% abiotic degradation  ¼ CO  2 utveckling i steril kolv efter 28 dagar  ðmgÞ 
ThCO  2 ðmgÞ Ü 100 
DEL V.  MANOMETRISK RESPIROMETRITEST  (metod 
C.4-D)  
V.l TESTMETODSPRINCIP 
En uppmätt mängd oorganiskt medium innehållande inokulat och, 
som nominella enda organiska kolkälla, testämne av känd koncent ­
ration (100 mg testämne per liter motsvarande minst 50–100 mg ThOD per liter) rörs om i en stängd kolv vid konstant temperatur (± 1
 o C eller mindre) i upp till 20 dagar. Syreförbrukningen bestäms 
antingen genom mätning av den mängd syre (elektrolytiskt fram ­
ställt) som krävs för att upprätthålla konstant gasvolym i respirome ­
terkolven, eller utifrån volym- eller tryckändringen (eller en kom ­
bination av dessa) i apparaten. Utvecklat koldioxid absorberas i en 
kaliumhydroxidlösning eller annat lämpligt absorptionsmedel. Den 
syremängd som testkemikalien har tagit upp (korrigerat mot den parallella inokulatblindprovets upptagning) uttrycks i procent av ThOD eller COD. Frivilligt kan primär bionedbrytning också beräk ­
nas genom kompletterande specifik analys vid inkubationsperiodens 
början och slut, och fullständig bionedbrytning genom DOC-analys.
 
V.2 TESTMETODSBESKRIVNING  
V.2.1  Apparatur  
a) Lämplig respirator. 
b) Temperaturreglering inom ± 1  o C eller mindre. 
c) Membranfiltreringsapparatur (valfritt). 
d) Kolanalysator (valfritt).  
V.2.2  Framställning av oorganiskt medium  
Se I.6.2 om framställning av stamlösning. 
10 ml av lösningen a) blandas med 800 ml utspädningsvatten, och av 
lösning b), c) och d) tillsätts 1 ml av varje, varefter det fylls upp till 1 liter med utspädningsvatten.
 
V.2.3  Framställning och förbehandling av inokulat  
Inokulat kan stamma från en rad olika källor: aktiverat slam, av ­
loppsvatten, ytvatten och ytjord eller en blandning av dessa. 
Se I.6.4, I.6.4.1, I.6.4.2 och I.6.5.  
V.2.4  Förberedelse av kolvarna  
Utifrån stamlösningarna framställs det särskilda lösningar av test- 
och referensämne i oorganiskt medium med en kemikaliekoncent ­
ration av normalt 100 mg/l (motsvarande minst 50–100 mg ThOD 
per liter).  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1003
 
ThOD beräknas på grundval av ammoniumsalt, såvida inte nitrifika ­
tion förväntas, i vilket fall beräkningen baseras på nitratbildning (se 
bilaga II.2). 
pH justeras vid behov till 7,4± 0,2. Svårlösliga ämnen tillsätts vid en senare tidpunkt. Om testämnets toxicitet ska bestämmas framställs ytterligare en lös ­
ning i oorganiskt medium, som innehåller både test- och referens ­
ämne i samma koncentration som i de individuella lösningarna. 
Om det är nödvändigt att bestämma den fysiska-kemiska syreupp ­
tagningen framställs en lösning av testämne i en koncentration av normalt 100 mg ThOD per liter som steriliseras vid tillsättningen av ett passande giftigt ämne (se I.6.6). 
Den nödvändiga mängden av test- respektive referensämneslösning ­
arna överförs till minst två kolvar (dubbel bestämning). Ytterligare kolvar med enbart oorganiskt medium förbereds (inokulatblindpro ­
ver) och om det är nödvändigt med den blandade test- och referens ­
ämneslösningen och med den sterila lösningen. 
Om testämnet är svårlösligt tillsätts det direkt vid denna tidpunkt, 
antingen på grundval av vikt eller volym eller genom hanteringen enligt bilaga III. Dessutom tillsätts kaliumhydroxid, natriumhydrox ­
idparlor eller ett annat absorptionsmedel till CO
 2 -kamrarna.  
V.2.5  Antal kolvar i en typisk testserie  
Kolv 1 och 2: testuppslammning 
Kolv 3 och 4: inokulatblind 
Kolv 5: förfarandekontroll 
Rekommenderas, och vid behov: Kolv 6: abiotisk steril kontroll Kolv 7: adsorptionskontroll Kolv 8: toxicitetskontroll Se I.6.7.
 
V.2.6  Utförande av testet  
Låt behållarna stå tills de har nått den önskade temperaturen och 
tillsätt förberett aktiverat slam eller ett annat inokulat till de ifråga ­
varande behållarna så att en koncentration av uppslammat torrämne 
på högst 30 mg/l erhålls. Montera apparaturen, starta omrörningen, kontrollera lufttätheten och börja mäta syreupptagningen. Normalt krävs det ingen annan passning än de nödvändiga avlåsningarna 
och daglig kontroll av att temperaturen är korrekt och omrörningen 
tillräcklig. 
Syreupptagningen beräknas på grundval av ofta förekommande re ­
gelbundna avläsningar som görs enligt apparaturtillverkarens anvis ­
ningar. Vid inkubationstidens avslutning, normalt 28 dagar, mäts pH- 
värdet i kolvarna, särskilt om syreupptagningen har varit mycket låg 
eller större än ThOD
 NH4 (för kvävehaltiga föreningar).  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1004
 
Om det är nödvändigt tas prover från respirometerkolvarna före och 
efter inkuberingen för DOC-analys eller specifik kemisk analys (se 
bilaga II.4). Man ska se till att volymen av den testuppslamning som kvarstår i kolven efter den första provtagningen är känd. Om tes ­
tämnet är N-haltigt bestäms koncentrationsökningen av nitrit och 
nitrat under 28 dagar, och korrektionen för syreförbrukningen genom 
nitrifikation beräknas (bilaga V).
 
V.3 DATA OCH RAPPORTERING  
V.3.1  Behandling av resultaten  
Testkemikaliens syreupptagning (mg) efter en viss tid (korrigerad för 
inokulatblindprovens syreupptagning under samma tid) divideras med vikten av använd mängd testämne. Av detta framkommer 
BOD uttryckt i mg syre per mg testämne, dvs.
 
BOD ¼ ðmg O  2 upptaget av testämne  Ä mg O  2 upptaget av blindproven Þ 
ðmg testämne i kolven Þ 
= mg O  2 per mg testämne 
Den procentuella bionedbrytningen beräknas antingen genom  
% bionedbrytning ¼ % ThOD ¼ BODðmg O  2=mg kemikalieÞ 
ThODðmg O  2 kemikalieÞ Ü 100 
eller 
% COD ¼ BODðmg O  2=mg kemikalieÞ 
CODðmg O  2 kemikalieÞ Ü 100 
Det bör noteras att de två metoderna inte nödvändigtvis ger samma 
resultat. Den förstnämnda metoden föredras. 
För testämnen som innehåller kväve används passande ThOD 
(NH  4 eller NO  3 ) i enlighet med vad som är känt eller förväntas 
om förekomst av nitrifikation (bilaga II.2). Om ofullständig nitrifi ­
kation sker beräknas korrektionen för syreförbrukning till nitrifika ­
tion på grundval av ändringarna i nitrit- och nitratkoncentrationen 
(bilaga V). 
Om man beslutar sig för att göra bestämningar av organiskt kol och 
en specifik kemikalie beräknas den procentuella nedbrytningen i enlighet med punkt I.7. 
Alla resultat noteras på tillhörande formulär.
 
V.3.2  Resultatens giltighet  
Inokulatblindprovens syreupptagning är normalt 20–30 mg O  2 /l på 
28 dagar och bör inte vara större än 60 mg/l. Om det finns värden 
över 60 mg/l måste data och försökstekniker granskas noggrant. Om 
pH ligger utanför intervallet 6–8,5 och testämnets syreupptagning är mindre än 60 % upprepas testet med lägre testämneskoncentrationer. 
Se också I.5.2.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1005
 
V.3.3  Rapportering  
Se I.8.  
V.4 FORMULÄR  
Nedan visas ett exempel på ett formulär.  
MANOMETRISK RESPIROMETRI 
1. LABORATORIUM  
2. DATUM VID INLEDNING AV TEST  
3. TESTÄMNE  
Namn: 
Stamlösningens koncentration: .... mg/l ämne 
Startkoncentration i mediet: C  o : .... mg/l ämne 
Volymen i testkolv (V): .... ml 
ThOD eller COD: ... mg O  2 /mg testämne (NH  4 , NO  3 ). 
4. INOKULAT  
Källa: 
Behandling: 
Eventuell förbehandling: 
Koncentration av uppslammat torrämne i reaktionsblandningen: 
... mg/l:  
5. SYREUPPTAGNING: BIONEDBRYTNING  
Tid (dagar) 
0 7 14 21 28  
O 2 uppt. (mg) 
tescämne 1 
2 
a, medel 
O 2 uppt. (mg) 
blindprov 3 
4 
b, medel 
Korrigerat 
BOD (mg) (a 1 – b  m ) 
(a 2 – b  m ) 
BOD per mg 
testämne ða 1 Ä bÞ 
C o V 
ða 2 Ä bÞ 
C o V ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1006
 
Tid (dagar) 
0 7 14 21 28  
% nedbrytning  
BOD 
ThOD Ü 100  D 1 (a 1 ) 
D 2 (a 2 ) 
medel (*)  
V = volymen av medium i testkolven. 
(*) Genomsnittet av D  1 och D  2 ska inte tas om det föreligger en väsentlig skillnad.  
Anmärkning : En motsvarande uppställning kan användas för refe ­
renskemikalien och toxicitetskontrollproven.  
6. KORREKTION FÖR NITRIFIKATION (se bilaga V)  
Dag 0 28 skillnad  
i) Nitratkoncentration (mg N/l) (N) 
ii) Syreekvivalent (4,57 x N x V) (mg) — — iii) Nitritkoncentration (mg N/l) (N) iv) Syreekvivalent (3,43 x N x V) (mg) — — ii + iv) Total syreekvivalent — —
 
7. KOLBESTÄMNING  (valfritt) 
Kolanalysator:  
Tid (dagar) Blindprov mg/1 Testkemikalie mg/l  
0 (C  blo ) (C  0 ) 
28 (*) (C  blt ) (C  t ) 
(*) Eller vid inkuberingens slut.  
% DOC avlägsnat ¼ Í 
1 Ä C t Ä C blt 
C o Ä C blo Î 
Ü 100  
8. SPECIFIK KEMIKALIEBESTÄMNING (valfritt)  
S b = koncentrationen av testkemikalien i steril kontrollkolv 
efter 28 dagar 
S a = koncentrationen av testkemikalien i kolv med inokulat 
efter 28 dagar  
% bionedbrytning ¼ S b Ä S a 
S b Ü 100 
9. ABIOTISK NEDBRYTNING (valfritt)  
a = syreförbrukningen i sterila kolvar efter 28 dagar (mg) 
Syreförbrukning pr mg testämne =  a Ü 100 
C o V ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1007
 
(se avsnitt 1 och 3) 
% abiotisk nedbrytning =  a Ü 100 
C o V Ü ThOD  
DEL VI.  CLOSED BOTTLE-TEST (metod C.4-E)  
VI.1 TESTMETODSPRINCIP 
Till en normal 2–5 mg/l lösning av testämnet i oorganiskt medium 
tillsätts inokulat bestående av ett förhållandevis litet antal mikroorga ­
nismer från en blandad population, och lösningen förvaras i mörker 
vid konstant temperatur i helt fyllda slutna kolvar. Nedbrytningen följs under 28 dagar genom analys av upplöst syre. Den syremängd som testämnet har förbrukat korrigeras för den syremängd som har 
förbrukats i det parallella inokulatblindprovet, och uttrycks i procent 
av ThOD eller COD.
 
VI.2 TESTMETODSBESKRIVNING  
VI.2.1  Apparatur  
a) BOD-kolvar med glaspropp, t.ex. 250–300 ml. 
b) Vattenbad eller inkuberingsapparat, som kan hålla kolvarna vid 
konstant temperatur (± 1  o C eller mindre) i mörker. 
c) Stora glasflaskor (2–5 1) för framställning av medium och upp ­
fyllning av BOD-kolvarna. 
d) Syreelektrod och syremätare eller utrustning och reagenser för 
Winkler-titrering.  
VI.2.2  Framställning av oorganiskt medium  
Se I.6.2 om framställning av stamlösning. 
1 ml lösning a), b), c) och d) förtunnas till 1 liter med vatten.  
VI.2.3  Framställning av inokulat  
Inokulat tas normalt frän sekundärt avloppsvatten från ett renings ­
verk eller en laboratorieanläggning som huvudsakligen behandlar 
avloppsvatten frän hushåll. En alternativ inokulatkälla är ytvatten. Normalt används från en droppe (0,5 ml) till 5 ml filtrat per liter medium. Av-provningar kan vara nödvändiga för att klarlägga den 
optimala volymen för ett visst avloppsvatten (se I.6.4.2 och I.6.5).
 
VI.2.4  Förberedelse av kolvar  
Det oorganiska mediet luftas kraftigt i minst 20 minuter. En given 
försöksserie utförs med oorganiskt medium från samma sats. Normalt 
är mediet färdigt för användning efter att ha stått i 20 minuter vid testtemperaturen. Som kontroll bestäms koncentrationen av upplöst syre. Värdena ska ligga omkring 9 mg/l vid 20
 o C. All överföring 
och uppfyllning med det luftmättade mediet utförs utan att det bildas 
bubblor, t.ex. genom användning av hävert.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1008
 
Parallella grupper av BOD-kolvar förbereds för samtidiga försök 
med test- och referensämne. Minst så många BOD-kolvar, inbegripet 
inokulatblindprover, samlas så att minst dubbla bestämningar kan företas av syreförbrukningen med önskade regelbundenhet, t.ex. efter 0, 7, 14, 21 och 28 dagar. Det kan vara nödvändigt att använda flera 
kolvar om man säkert ska kunna identifiera 10-dagarsfönstret. 
De stora kolvarna fylls upp till en tredjedel med fullt luftat oorga ­
niskt medium. Därefter tillsätts så mycket stamlösning av test- och referensämne till olika kolvar att deras slutkoncentration normalt inte 
blir större än 10 ml/l. Till en särskild kolv med kontrollmedium 
tillsätts inga kemikalier. 
För att vara säker på att inokulataktiviteten inte begränsas får kon ­
centrationen av upplöst syre inte understiga 0,5 mg/l i BOD-kolvar ­
na, vilket begränsar testkemikaliens koncentration till ca 2 mg/l. Av svårt nedbrytbara ämnen och ämnen med lågt ThOD kan det dock användas 5–10 mg/l. I vissa fall rekommenderas parallella serier med 
testämne i två olika koncentrationer, t.ex. 2 och 5 mg/l. Normalt 
beräknas ThOD på grundval av bildandet av ammoniumsalt, men om nitrifikation förväntas beräknas värdena på grundval av nitrat ­
bildning (ThOD
 NO3 ; se bilaga II.2). Om ofullständig nitrifikation 
sker korrigeras det för ändringar i nitrit- och nitratkoncentrationen, 
som är bestämd genom analys (se bilaga V). 
Ytterligare en serie kolvar krävs om testämnets toxicitet ska under ­
sökas (t.ex. om ett lågt bionedbrytbarhetsvärde tidigare påvisats). 
För detta förbereds ytterligare en stor kolv med luftat oorganiskt 
medium (ca en tredjedel full) plus testämne och referensämne nor ­
malt i samma slutkoncentration som i de andra kolvarna. 
Inokulat tillsätts till kolvarna i form av sekundärt avloppsvatten (från 
1 droppe [0,5 ml] till 5 ml per liter) eller t.ex. flodvatten (se I.6.4.2). Slutligen fylls det upp med luftat oorganiskt medium med använd ­
ning av en slang som når ända ner till botten, så att tillräcklig 
omrörning säkerställs.
 
VI.2.5  Antal kolvar i en typisk testserie  
I en typisk testserie används följande antal kolvar: 
— minst 10 med testämne och inokulat (testuppslamning), 
— minst 10 med inokulat (inokulatblindprov), 
— minst 10 med referensämne och inokulat (procedurkontroll),  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1009
 
— och i vissa fall 6 kolvar med testämne, referensämne och inokulat 
(toxicitetskontroll). För att säkert kunna identifiera 10-dagars ­
fönstet krävs dock dubbelt antal kolvar.  
VI.2.6 Genomförande av testet 
De framställda lösningarna fördelas omedelbart i de berörda grup ­
perna av BOD-kolvar, i det att de sugs upp från den nedersta fjär ­
dedelen (inte botten) av den passande stora kolven med en slang, och således att alla BOD-kolvarna fylls helt. Eventuella luftbubblor av ­
lägsnas genom lätta slag på kolvens sida. Starttidskolvarna analyse ­
ras omedelbart för upplöst syre antingen genom Winkler-metoden eller med elektrod. Innehållet i kolvarna kan förvaras för senare analys med Winkler-metoden om man omedelbart tillsätter man ­
gan(II)sulfat och natriumhydroxid (den första Winkler-reagensen). 
De väl tillproppade kolvarna, där syret är fixerat som brunt hydrati ­
serat mangan(III)oxid kan förvaras i mörker vid 10–20
 o C i högst 24 
timmar innan Winkler-testet avslutas. Resterande kolvar tillproppas 
och man ser till att inga luftbubblor innesluts, och de inkuberas vid 
20 o C i mörker. Parallellt med varje serie ska det göras en fullständig 
serie för bestämning av inokulatblindvärden. Under de 28 dagarnas inkubering uttas med bestämda intervaller (minst en gång i veckan) 
minst 2 kolvar av varje serie för analys av upplöst syre. 
Med veckovis provtagning skulle det procentuella avlägsnandet 
kunna bedömas i ett 14-dagarfönster, medan det vid provtagning var 3–4 dag, vilket skulle kräva ca dubbelt så många kolvar, blir möjligt att identifiera 10-dagarfönstret. 
För N-haltiga ämnen måste det korrigeras för syreförbrukning vid 
eventuell nitrifikation. För detta används en O
 2 -elektrod för bestäm ­
ning av koncentrationen av upplöst syre, varefter det tas ett prov från BOD-kolven för analys av nitrit och nitrat. Den förbrukade syre ­
mängden beräknas på grundval av ökningen av nitrit- och nitrat- 
koncentrationen (se bilaga V).
 
VI.3 DATA OCH RAPPORTERING  
VI.3.1  Behandling av resultat  
Först beräknas BOD efter varje tidsintervall genom att dra ifrån 
syreförlusten (mg O  2 per liter) i inokulatblindproven från syreförlus ­
ten i kolven med testämne. Denna korrigerade syreförlust divideras med testämnets koncentration (mg/l), varefter den specifika BOD 
framkommer i mg syre per mg testämne. Den procentuella bioned ­
brytbarheten beräknas genom att dividera den specifika BOD med den specifika ThOD (beräknad i enlighet med bilaga II.2) eller COD (bestämt genom analys, se bilaga II.3), dvs.
 
BOD ¼ ðmg O  2 upttaget av testämne  Ä mg O  2 upttaget av blindproven Þ 
ðmg test chemical in flask Þ ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1010
 
= mg O  2 per mg testämne  
% nedbrytning ¼ BOD ðmg O  2=mg testämneÞ 
ThODðmg O  2=mg testämneÞ Ü 100 
eller 
% nedbrytning ¼ BOD ðmg O  2=mg testämneÞ 
CODðmg O  2=mg testämneÞ Ü 100 
Observera att dessa två metoder inte nödvändigtvis ger samma re ­
sultat. Den först nämnda metoden rekommenderas. 
Den ThOD (NH  4 eller NO  3 ) som motsvarar det föreliggande kän ­
nedomen om nitrifikation (bilaga II.2) används. Om ofullständig nitrifikation sker beräknas korrektionen för syreförbrukningen till 
nitrifikationen ut i från ändringarna i nitrit- och nitratkoncentrationen 
(bilaga V).
 
VI.3.2  Resultatens giltighet  
Inokulatblindprovens syreförlust bör inte vara större än 1,5 mg upp ­
löst syre per liter efter 28 dagar. Om det finns högre värden måste 
försöksteknikerna granskas kritiskt. Restkoncentrationen av syre i 
testkolvarna får inte understiga 0,5 mg/l vid något tillfälle. Mätningar av så lågt syreinnehåll är endast giltiga om den använda mätmetoden för upplöst syre tillåter noggrann mätning av så lågt innehåll. 
Se också I.5.2.
 
VI.3.3  Rapportering  
Se 1.8.  
VI.4 FORMULÄR 
Nedan visas ett exempel på ett formulär.  
CLOSED BOTTLE TEST 
1. LABORATORIUM  
2. DATUM VID INLEDNING AV TEST  
3. TESTÄMNE  
Namn: 
Stamlösningens koncentration: .... mg/l Startkoncentration i kolven: .... mg/l 
ThOD eller COD: ... mg O
 2 /mg testämne  
4. INOKULAT  
Källa: 
Behandling:  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1011
 
Eventuell förbehandling: 
Koncentration i reaktionsblandningen: ... mg/l:  
5. DOC-BESTÄMNING  
Metod: Winkler/elektrod  
Kolvanalys  
Inkuberingstid (dagar) DO (mg/l) 
0 n  1 n 2 
Blindprov (utan tes ­
tämne) 1 C  1 
2 C  2 
Genomsnitt 
m b ¼ C 1 þ C 2 
2 
Testämne 1 a  1 
2 a  2 
Genomsnitt 
m t ¼ a 1 þ a 2 
2 
Anmärkning : En motsvarande uppställning kan användas för refe ­
renskemikalien och toxicitetskontrollproverna.  
6. KORREKTION FÖR NITRIFIKATION (se bilaga V)  
Inkuberingstid (dagar) 0 n  1 n 2 n 3 
i) Nitratkoncentration (mg N/l) 
ii) Ändring i nitratkoncentration (mg N/l) — iii) Syreekvivalent (mg/l) — iv) Nitritkoncentration (mg N/l) v) Ändring i nitritkoncentration (mg N/l) — vi) Syreekvivalent (mg/l) — iii + vi) Total syreekvivalent (mg/l) —
 
7. FÖRLUST AV DO: % NEDBRYTNING  
Förlust efter n dagar (mg/l) 
n 1 n 2 n 3 
KOLV 1: (m  to – m  tx ) – (m  bo – m  bx ) 
KOLV 2: (m  to – m  tx ) – (m  bo – m  bx ) ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1012
 
Förlust efter n dagar (mg/l) 
n 1 n 2 n 3 
KOLV 1: 
% D  1 ¼ ½ðm to Ä m tx Þ Ä ðm bo Ä m bx Þâ Ü 100 
konc : av test Ü ThOD för ämne 
KOLV 2: 
% D  2 ¼ ½ðm to Ä m tx Þ Ä ðm bo Ä m bx Þâ Ü 100 
konc : av test Ü ThOD för ämne 
% D genomsn. (*) =  D 1 Ä D 2 
2 
(*) Ta inte genomsnittet om det föreligger väsentlig skillnad med replikaterna.  
m to = värde i testkolven vid tid 0 
m tx = värde i testkolven vid tid x 
m bo = genomsnittsblindvärde vid tid 0 
m bx = genomsnittsblindvärde vid tid x 
Dessutom företas korrektion för nitrifikation i enlighet med punkt 6.  
8. BLINDPROVER FÖR FÖRLUST AV DO  
Syreförbrukningen i blindprov: (m  bo – m  b28 ) mg/l. Denna för ­
brukning är av betydelse för testets giltighet och får högst vara 
1,5 mg/l.  
DEL VII.  MITI TEST (metod C.4-F)  
VII.1 TESTMETODSPRINCIP 
Syreupptagningen i en omrörd lösning eller uppslamning av testäm ­
net i oorganiskt medium, som är tillsatt inokulat i form av särskild 
odlade ej tillvanda mikroorganismer, mäts automatiskt under 28 da ­
gar i en mörklagd sluten respirometer vid 25 ± 1  o C. Den utvecklade 
koldioxiden absorberas i natriumhydroxid. Bionedbrytbarheten ut ­
trycks som den upptagna syremängden (korrigerat för blindprovens 
upptagning) i procent av den teoretiska syreupptagningen (ThOD). Även den procentuella primära bionedbrytbarheten beräknas, på grundval av kompletterande specifika kemiska analyser vid inkube ­
ringens början och slut och eventuellt genom DOC-analys.
 
VII.2 TESTMETODSBESKRIVNING  
VII.2.1  Apparatur  
a) Automatisk elektrolytisk BOD-mätare eller respirometer, normalt 
med 6 kolvar på vardera 300 ml och med skålar för CO  2 -absorb­
tionsmedel.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1013
 
b) Lokal med konstant temperatur och vattenbad på 25 ± 1  o C eller 
mindre. 
c) Membranfiltreringsutrustning (valfritt). 
d) Kolanalysator (valfritt).  
VII.2.2  Framställning av oorganiskt medium  
Följande stamlösningar framställs av reagenser av analyskvalitet och 
vatten (I.6.1): 
a) monokaliumdihydrogenorthofosfat, KH  2 PO 4 8,50 g 
dikaliummonohydrogenorthofosfat, K  2 HPO  4 21,75 g 
dinatriummonohydrogenorthofosfat dodecahydrat, 
Na 2 HPO  4 12 H  2 O 44,60 g 
ammoniumklorid, NH  4 CI 1,70 g 
Upplöses i vatten och förtunnas till 1 liter. Upplösningens pH ska vara 7,2. 
b) magnesiumsulfat heptahydrat, MgSO
 4 7 H  2 O 22,50 g 
Upplöses i vatten och förtunnas till 1 liter. 
c) Kalciumklorid, vattenfritt, CaCl  2 27,50 g 
Upplöses i vatten och förrunnas till 1 liter. 
d) Järn(III)klorid hexahydrat, FeCl  3 6 H  2 O 0,25 g 
Upplöses i vatten och förtunnas till 1 liter. 
3 ml tas av lösning a, b, c och d och förtunnas till 1 liter.  
VII.2.3  Framställning av inokulat  
Friska prover samlas in från minst 10 platser, huvudsakligen områ ­
den där det används och utleds olika kemikalier. Från sådana platser som reningsverk, floder, sjöar och havsområden insamlas 1-liters prover av slam, ytjord, vatten, etc. och allt blandas ordentligt. Ma ­
terial som flyter ovanpå avlägsnas och efter ett tag anpassas super ­
natanten till pH 7 ± 1 med natriumhydroxid och fosforsyra. 
En passande mängd filtrat används för att fylla en ”fill-and-draw” 
aktiv slambehållare, och vätskan luftas i ca 23 timmar 30 minuter. 
30 minuter efter det att luftningen avslutats hälls omkring en tredje ­
del av den samlade supernatant-volymen bort och det tillsätts en lika stor mängd av en lösning (med pH 7) som innehåller 0,1 % glukos, 
0,1 % pepton och 0,1 % monokaliumorthoforfat, och luftningen 
påbörjas. Detta sker varje dag. Slamenheten drivs efter god praxis: avloppsvattnet ska vara klart, temperaturen ska hållas vid 25 ± 2
 o C, 
pH ska vara 7 ± 1, slam ska bottenfällas bra, tillräcklig luftning ska 
upprätthållas för att hålla blandningen konstant aerob, protozoer ska 
finns till hands och slamaktiviteten ska testas mot referensämnet minst var tredje månad. Slammet får tidigast användas som inokulat efter en månads drift och inte senare än efter fyra månaders drift. 
Därefter uttas regelbundet prover från minst 10 platser var tredje 
månad.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1014
 
För att hålla det friska och det gamla slammet på samma aktivitet 
blandas den filtrerade supernatanten från aktivt slam genom använd ­
ning av lika mycket filtrerat supernatant från en färskt insamlat blandning från 10 källor, och denna vätska odlas i enlighet med ovan. 18–24 timmar efter det att enheten fyllts upp kan det tas 
slam för användning som inokulat.
 
VII.2.4  Förberedelse av kolvar  
Sex kolvar förbereds enligt följande: 
Nr 1: testämne i förtunningsvatten, 100 mg/l Nr 2, 3 och 4: testämne förtunnat med oorganiskt medium till 
100 mg/l 
Nr 5: referensämne (t.ex. anilin) förtunnat med oorganiskt medium 
till 100 mg/l 
Nr 6: rent oorganiskt medium 
Svårlösliga testämnen tillsätts direkt på vikt- eller volymbasis eller 
hanteras i enlighet med bilaga III, bortsett från att varken lösnings ­
medel eller emulgatorer får användas. CO
 2 -absorptionsmedel place ­
ras i alla kolvar i den särskilda skålen. pH i kolv nr 2, 3 och 4 
justeras till 7,0.  
VII.2.5  Genomförandet av testet  
En liten mängd inokulat tillsätts till kolv nr 2, 3 och 4 (testupps ­
lamningar), nr 5 (aktivitetskontroll) och nr 6 (inokulatblinprov) så att koncentrationen av uppslammat torrämne blir 30 mg/l. Inokulat till ­
sätts inte till kolv nr 1 som tjänar som abiotisk kontroll. Utrustningen 
samlas ihop, lufttätheten kontrolleras, omrörarna startas och syreupp ­
tagningsmätningen startas i mörker. Temperaturen, omrörningen och den coulometeriska syreupptagningsskrivaren kontrolleras dagligen 
och eventuella färgändringar i kolvarna noteras. Syreupptagningen i 
de 6 kolvarna avläses direkt med hjälp av en passande metod, t.ex. på sexkanalsskrivaren, som ger en BOD-kurva. Vid inkuberingens slut, normalt efter 28 dagar, mäts pH i kolvarna, och koncentrationen 
av resterande testämne och av eventuella biprodukter och, när det 
gäller vattenlösliga ämnen, eventuellt DOC-koncentrationen bestäms (bilaga II.4). Särskild försiktighet måste iakttas om det är tal om flyktiga kemikalier. Om nitrifikation förväntas bestäms om möjligt 
nitrat- och nitritkoncentrationen.
 
VII.3 DATA OCH RAPPORTERING  
VII.3.1  Behandling av resultat  
Testämnets syreförbrukning (mg) efter en viss tid, korrigerat för 
syreupptagningen i inokulatblinproven efter samma tid, divideras 
med den använda viktmängden testämne. Av detta framkommer 
BOD uttryck som mg syre per mg testämne, dvs.  
BOD ¼ ðmg O  2 upttaget av testämnet  Ä mg O  2 upttaget av blinproven Þ 
ðmg testämne i kolven Þ 
= mg O  2 per mg testämne  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1015
 
Den procentuella bionedbrytningen framkommer av:x  
% bionedbrytning ¼ % ThOD ¼ BOD ðmg O  2 per mg kemikalieÞ 
ThOD ðmg O  2 per mg kemikalieÞ Ü 100 
För blandningar beräknas ThOD på samma sätt som för enskilda 
ämnen, nämligen pä grundval av grundämnesanalysen. Det ThOD som används (ThOD
 NH4 eller ThOD  NO3 ) beror på om nitrifikationen 
är frånvarande eller fullständig (bilaga II.2). Om ofullständig nitrifi ­
kation sker beräknas korrektionen för syreförbrukningen till nitrifi ­
kationen utifrån ändringarna i nitrit- och nitratkoncentrationen (bilaga V). 
Den procentuella primära bionedbrytningen beräknas på grundval av 
den mängd av den specifika (ursprungliga) kemikalie som försvinner (se I.7.2).
 
D t ¼ S b Ä S a 
S b Ü 100 %  
Om förlust av testämne har skett i kolv nr 1, som mäter fysisk och 
kemisk nedbrytning, antecknas detta och testämnets koncentration (S
 b ) i denna kolv efter 28 dagar används för att beräkna den pro ­
centuella bionedbrytningen. 
Om (valfria) bestämningar görs av DOC beräknas den procentuella 
fullständiga bionedbrytningen genom:  
D t ¼ 1 Ä C t Ä C bt 
C o Ä C bo Í Î  
Ü 100 %  
i enlighet med punkt I.7.1. Om testämne (DOC) har försvunnit från 
kolv nr 1, som mäter fysisk och kemisk nedbrytning, används 
DOC-koncentrationen i denna kolv för att beräkna den procentuella bionedbrytningen. 
Alla resultat noteras på de tillhörande formulären.
 
VII.3.2  Resultatens giltighet  
Inokulatblinprovens syreförbrukning är normalt 20–30 mg O  2 /l efter 
28 dagar och bör inte vara större än 60 mg/l. Om det finns värden över 60 mg/l måste data och försöksteknikerna granskas kritiskt. Om 
pH ligger utanför intervallet 6–8,5 och testämnets syreförbrukning är 
mindre än 60 % upprepas testet med lägre testämneskoncentrationer. 
Se även I.5.2. 
Om den procentuella nedbrytningen av anilin, beräknat utifrån 
syreförbrukningen, inte är större än 40 % efter 7 dagar och 65 % efter 14 dagar anses testet vara ogiltigt.
 
VII.3.3  Rapportering  
Se I.8.  
VII.4 RESULTATFORMULÄR 
Nedan visas ett exempel på ett formulär.  
MITI (I) TEST 
1. LABORATORIUM  
2. DATUM VID INLEDNING AV TEST  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1016
 
3. TESTÄMNE  
Namn: Stamlösningens koncentration: .... mg/l ämne 
Startkoncentration i kolven, C
 0 : .... mg/l ämne 
Reaktionsblandningens volym, V: .... ml 
ThOD: ... mg O  2 /l 
4. INOKULAT  
Platser för provtagningen: 
1) .... 6) .... 
2) .... 7) .... 
3) .... 8) .... 
4) .... 9) .... 5) .... 10) .... 
Koncentrationen av uppslammat torrämne i det aktiva slammet 
efter acklimatisering med syntetiskt avloppsvatten: .... mg/l. 
Volym av aktivt slam per liter slutmedium: ... ml. 
Slamkoncentration i slutmedium: … mg/l
 
5. SYREUPPTAGNING: BIONEDBRYTBARHET  
Respirometertyp:  
Tid (dagar) 
0 7 14 21 28  
O 2 upptag. (mg) 
testämne a 1 
a 2 
a 3 
O 2 upptag. (mg) 
blindprov b 
Korrigerat O  2 
upptag. (mg) (a 1 – b  1 ) 
(a 1 – b  1 ) 
(a 1 – b  1 ) 
BOD per mg tes ­
tämne ða Ä bÞ 
C o V Kolv 1 
Kolv 2 Kolv 3 
% nedbrytning
 
BOD 
ThOD Ü 100 1 
2 3 
genomsn. (*)
 
(*) Ta inte genomsnittet om det föreligger en väsentlig skillnad mellan replikaterna.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1017
 
Anmärkning : En motsvarande uppställning kan användas för refe ­
renskemikalien och toxicitetskontrollproven.  
6. KOLANALYS  (valfritt) 
Kolanalysator:  
Kolv DOC 
% DOC avlägsnat Genomsnitt 
Mätt Korrigerat  
Vatten + testämne a — — 
Slam + testämne b  1 b 1 – c 
Slam + testämne b  2 b 2 – c 
Slam + testämne b  3 b 3 – c 
Kontrollblind c — — —  
% DOC removed :  a 1 Ä ðb Ä cÞ 
a Ü 100 
7. DATA FRÄN SPECIFIK KEMISK ANALYS  
Restmängd av testämne vid testets av ­
slutning % nedbrytning  
Blindprov med vatten S  b 
Medium med inokulat S a1 
S a2 
S a3 
% nedbrytning ¼ S b Ä S a 
S b Ü 100 
% nedbrytning beräknas för kolv a  1 , a 2 och a  3 . 
8. ANMÄRKNINGAR  
En kurva över BOD mot tiden ska bifogas, om sådan föreligger.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1018
 
Bilaga I  
FÖRKORTNINGAR OCH DEFINITIONER  
DO: Upplöst syre (mg/l) definieras som koncentrationen av upplöst syre i 
ett vattnigt prov. 
BOD: Biokemisk syreförbrukning (g) definieras som den mängd syre som 
mikroorganismer förbrukar vid metabolism av testämnet. Resultatet uttrycks också som gram upptaget syre per gram testat ämne (se metod C.5). 
COD: Kemisk syreförbrukning (g) definieras som den mängd syre som för ­
brukas vid oxidering av testämnet med varm dikromat i sur vätska. Det är ett mått på den motsvarande mängden oxiderbart ämne; ut ­
trycks också i g förbrukat syre per g testämne (se metod C.6). 
DOC: Upplöst organiskt kol definieras som den mängd organiskt kol som 
finns i lösningen, passerar genom ett 0,45 μm filter eller förblir i 
centrifugatet efter centrifugering vid 40 000 m • s
 -2 (± 4 000 g) i 
15 minuter. 
ThOD: Teoretisk syreförbrukning (mg) definieras som den samlade mängden 
syre som krävs för fullständig oxidering av ett kemiskt ämne. Det 
beräknas på grundval av bruttoformeln (se bilaga II, punkt 2) och uttrycks också i mg syre per mg testämne. 
ThCO
 2 : Teoretiskt koldioxid (mg) definieras som den mängd koldioxid som 
enligt beräkningar på grundval av testämnets kända eller mätta kol ­
innehåll skulle bildas vid fullständig nedbrytning av testämnet. Det uttrycks också i mg utvecklad koldioxid per mg testämne. 
TOC: Ett provs totala innehåll av organiskt kol definieras som summan av 
organiskt kol i lösning och uppslamning. 
IC: Oorganiskt kol. 
TC: Ett provs totala kolinnehåll definieras som summan av organiskt och 
oorganiskt kol.
 
Primär bionedbrytning  
definieras som en ändring av ett ämnes kemiska struktur, framkallad på biologisk 
väg, som resulterar i att ämnet mister sina specifika egenskaper.  
Fullständig bionedbrytning (aerob)  
definieras som den nedbrytningsgrad som har nåtts när mikroorganismer har 
förbrukat ett testämne fullständigt samtidigt som koldioxid, vatten, oorganiska salter och nya celldelar bildas (biomassa).
 
Lätt bionedbrytning  
kännetecknar en godtycklig klass kemikalier som har klarat vissa specifika 
screeningtester för fullständig bionedbrytning. Dessa tester är så krävande att 
sådana ämnen snabbt kommer att fullständigt brytas ned i vattnig miljö under 
aeroba förhållanden.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1019
 
Inherent (potentiell) bionedbrytbarhet  
karakteriserar en klass kemikalier för vilka det finns klara bevis på bionedbryt ­
ning (primär eller fullständig) vid varje erkänt test av bionedbrytbarhet.  
Behandlingsmöjlighet  
definieras som möjligheten av avlägsna ett ämne genom biologisk avloppsvat ­
tenrening utan att avloppsvattenreningsprocessernas normala förlopp påverkas. 
Generellt är alla lätt bionedbrytbara ämnen behandlingsbara, men inte alla inhe ­
rent bionedbrytbara ämnen. Abiotiska processer kan också inverka på detta.  
Lag-period  
definieras som den tid som går vid ett elimineringstest från inokuleringen tills 
dess att nedbrytningsprocenten är minst 10 %. Lag-perioden varierar ofta stort och är svår att reproducera.
 
Nedbrytningstid  
definieras som tiden mellan lagperiodens slut och den tid då nedbrytningen har 
nått 90 % av sitt maximala värde.  
10-dagarsfönstret  
definieras som den period på 10 dagar som börjar när nedbrytningen har nått upp 
till 10 %.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1020
 
Bilaga II  
BERÄKNING OCH BESTÄMNING AV LÄMPLIGA HUVUDPARAMET ­
RAR  
Beroende på den metod som väljs kan olika huvudparametrar behövas. I detta 
avsnitt beskrivs hur dessa värden utleds. Parametrarnas användning beskrivs i de 
individuella metoderna.  
1. Kolhalt  
Kolhalten kan antingen beräknas på grundval av testämnets grundämnes ­
sammansättning eller bestämmas genom elementäranalys.  
2. Teoretisk syreförbrukning (ThOD)  
Den teoretiska syreförbrukningen (ThOD) kan beräknas, om grundämnes ­
sammansättningen är känd, och annars bestämmas genom elementäranalys. 
För föreningen 
C c H h Cl cl N n Na na O o P p S s 
är det utan nitrifikation  
ThOD  NH4 ¼ 16 ½2 c þ 1=2 ðh Ä cl Ä 3 nÞ þ 3 s þ 5=2 p þ 1=2 na Ä oâ 
MW  mg/mg 
och med nitrifikation  
ThOD  NO3 ¼ 16 ½2 c þ 1=2 ðh Ä clÞ þ 5=2 n þ 3 s þ 5=2 p þ 1=2 na Ä oâ 
MW  mg/mg  
3. Kemisk syreförbrukning (COD)  
Den kemiska syreförbrukningen (COD) bestäms enligt metod C.6.  
4. Upplöst organiskt kol (DOC)  
Upplöst organiskt kol (DOC) definieras som den organiska mängd kol i en 
kemikalie eller en kemikalieblandning som i vattnig lösning kan passera 
genom ett 0,45 μm filter. 
Prover tas från testbehållarna och filtreras omedelbart genom filtrerings ­
utrustningen som är försedd med ett passande membranfilter. De första 
20 ml av filtratet kasseras (vid små filter kan denna mängd minskas). 
10–20 ml samlas upp för kolanalys (vid insprutning mindre, beroende på den använda kolanalysatorn). DOC-koncentrationen bestäms med hjälp av en organisk kolämnesanalysator som gör det möjligt att noggrant bestämma 
en kolkoncentration på mindre än 10 % av startkoncentrationen av DOC i 
testet. 
Om filtrerade prover inte kan analyseras samma arbetsdag kan de förvaras i 
högst 48 timmar i kylskåp vid 2–4
 o C eller längre tid vid – 18  o C. 
Anmärkningar: 
Membranfilter  är ofta behandlade med ytaktiva ämnen för att göra dem mer 
hydrofila. De kan därför innehålla upp till flera mg upplösligt organiskt kol 
som kommer att påverka bionedbrytbarhetsbestämningen. De ytaktiva äm ­
nena och andra upplösliga organiska ämnen avlägsnas från filtren genom kokning i avjoniserat vatten i tre gånger 1 timme. Om engångsfilter an ­
vänds måste varje parti kontrolleras för att bekräfta att de inte avger upp ­
lösligt organiskt kol.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1021
 
På vissa typer av membranfilter kan absorption av testämnet inträffa. Kont ­
roll av att testämnet inte hålls kvar på filtret rekommenderas därför.  
Centrifugering  vid 40 000 ms  -2 (4 000 g) i 15 minuter kan användas i 
stället för filtrering när man ska skilja mellan TOC och DOC. Metoden är inte pålitlig vid en startkoncentration av < 10 mg DOC per liter, då 
antingen inte alla bakterier avlägsnas eller något av kolet i bakteriernas 
cytoplasma återupplöses.
 
HÄNVISNINGAR  
— Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater, 
12th ed., Am. Pub. Hlth. Ass., Am. Wat. Poll. Control Fed., Oxygen 
Demand, 1965, s. 65. 
— Wagner, R., Von Wasser, 1976, Vol. 46, s. 139. — DIN-Entwurf 38 409 Teil 412 – Deutsche Einheitsverfahren zur Wasser-, 
Abwasser- und Schlammuntersuchung, Summarisches Wirkungs- und Stoffkenngrö βen (Gruppe H). Bestimmung des Chemischen Sauer-stoff ­
bedarfs (CSB) (H 41), Normenausschü β Wasserwesen (NAW) in DINN 
Deutsche Institut für Normung e.V. 
— Gerike, P., The biodegradability testing of poorly water soluble com ­
pounds. Chemosphere, 1948, Vol. 13 (1), s. 169.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1022
 
Bilaga III  
BEDÖMNING AV SVÅRLÖSLIGA ÄMNENS BIONEDBRYTBARHET  
Vid test av svårlösliga ämnens bionedbrytbarhet bör särskild uppmärksamhet ges 
åt nedanstående. 
Trots att homogena vätskor sällan kommer att vålla problem vid provtagningen 
rekommenderas att homogenisera fasta material på lämpligt sätt, så att fel till 
följd av inhomogenitet undviks. Särskild omsorg ska ske vid uttagning av ett 
representativt prov på några få mg av blandningar av kemikalier och av ämnen som innehåller stora mängder orenheter. 
Under testet kan man använda olika metoder för omrörning. Omrörningen ska 
dock vara så kraftig att kemikalien hålls dispergerad, och att överhettning, stark 
skumning och våldsam förskjutning undviks. 
En emulgator kan användas för att framställa en stabil dispersion av kemikalien. 
Emulgatoren får inte vara toxisk för bakterier och får varken kunna brytas ned biologiskt eller vara skumbildande under testförhållandena. 
Samma kriterier som för emulgatorer gäller för lösningsmedel. 
Användning av fasta bärarmaterial till fasta testämnen rekommenderas inte, däre ­
mot kan de vara lämpliga till oljeaktiga ämnen. 
När tillsatsämnen såsom emulgatorer, lösningsmedel och bärarmaterial används 
utförs ett blindprov med tillsatsämnen. 
Alla tre respirometertesterna, CO
 2 , BOD och MITI kan användas för att under ­
söka svårlösliga ämnens bionedbrytbarhet.  
HÄNVISNINGAR  
— de Morsier, A. et al., Biodegradation tests for poorly-soluble compounds. 
Chemosphere, 1987, Vol. 16, s. 833. 
— Gerike, P., The Biodegradation of poorly water soluble compounds. Che ­
mosphere, 1984, Vol. 13, s. 169.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1023
 
Bilaga IV  
BEDÖMNING AV BIONEDBRYTBARHETEN HOS KEMISKA ÄMNEN 
SOM MISSTÄNKS VARA TOXISKA FÖR INOKULAT  
Om ett kemiskt ämne som underkastas ett test för lätt bionedbrytbarhet inte 
verkar vara bionedbrytbart rekommenderas följande förfarande om man vill skilja 
mellan hämning av bristande bionedbrytbarhet (Reynolds et al., 1987). 
Samma eller motsvarande inokulat används för toxicitetstest som för bionedbryt ­
barhetstest. 
För att kunna bedöma toxiciteten hos kemikalier som undersöks i test av lätt 
bionedbrytbarhet kan man använda en eller en kombination av följande metoder: Hämning av slammets respirationshastighet (aktiverat slam – respirationshäm ­
ningstest – direktiv 88/302/EEG); BOD och tillväxthämningstest. 
Om hämning till följd av toxicitet ska undvikas rekommenderas användning av 
testämneskoncentrationer i test av lätt bionedbrytbarhet, som högst är 1/10 av de EC
 50 -värden (eller högst de EC  20 -värden) som erhållits vid toxicitetstest. Ämnen 
vars EC  50 är större än 300 mg/l kommer troligtvis inte att ha toxiska verkningar i 
test för lätt bionedbrytbarhet. 
Ett EC  50 på mindre än 20 gl/l kommer troligtvis att skapa betydande svårigheter 
vid den efterföljande testningen. Testkoncentrationerna ska vara låga, vilket krä ­
ver användning av det strikta och känsliga Closed Bottle-testet eller av  14 C- 
markerat material. Alternativt kan det vid tillvänjning av inokulat bli möjligt 
att använda högre testämneskoncentrationer. I det sistnämnda fallet mister testet för lätt bionedbrytbarhet dock sin specifika karaktär.
 
HÄNVISNINGAR  
Reynolds, L. et al., Evaluation of the toxicity of substances to be assessed for 
biodegradability. Chemosphere, 1987, Vol. 16, s. 2259.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1024
 
Bilaga V  
KORREKTION AV NITRIFIKATIONENS INTERFERENS PÅ 
SYREUPPTAGNINGEN  
Fel till följd av att inte ta hänsyn til nitrifikation vid bedömning av bionedbryt ­
barheten hos testämnen, som inte innehåller N, är minimal (högst 5 %) även om 
oxidationen av mediets innehåll av ammonium-N sker sporadiskt från testprovet 
till blindprovet. För testämnen som innehåller N kan dock väsentliga fel uppstå. 
Om ofullständig nitrifikation sker kan reaktionsblandningens iakttagna syreupp ­
tagning korrigeras för den syremängd som har förbrukats för oxidation av am ­
monium till nitrit och nitrat om ändringarna i nitrit- och nitrat-koncentrationen 
under inkuberingen bestäms med hänsyn tagen till följande reaktionsutjämningar: 
2NH  4 C1 + 3 O  2 = 2 HNO  2 + 2 HC1 + 2 H  2 O (1) 
2 HNO  2 + O  2 = 2 HNO  3 (2) 
brutto: 2 NH
 4 Cl + 4 O  2 = 2 HNO  3 + 2 HCl + 2 H  2 O (3) 
Från ekvation (1) blir syreupptagningen vid oxidation av 28 g kväve i form av 
ammoniumklorid (NH  4 C1) till nitrit 96 g, dvs. en faktor av 3,43 (96/28). På 
motsvarande sätt blir syreupptagningen vid oxidation av 28 g kväve till nitrat (3) 
128 g, dvs. en faktor av 4,57 (128/28). 
Eftersom reaktionerna är  sekvensiella,  då de sker på grund av deras individuella 
bakteriearter, kan nitratkoncentrationen öka eller minska. I det sistnämnda fallet 
kommer en ekvivalent mängd nitrat att bildas. Till följd av detta blir syreförbruk ­
ningen vid nitratbildning 4,57 gånger ökningen i nitratkoncentrationen, men den syremängd som är involverad i nitritbildningen blir dock 3,43 gånger ökningen av nitritkoncentrationen, eller vid en minskning av nitritkoncentrationen, en syre ­
förlust av -3,43 gånger koncentrationsminskningen. 
Dvs. 
O
 2 -förbrukningen vid nitratbildning = 4,57 × N-nitratkoncent ­
rationsökningen (4) 
och 
O 2 -förbrukningen vid nitritbildning = 3,43 × N-nitritkoncent ­
rationsökningen (5) 
och 
O 2 -förlusten vid nitritförsvinnande = -3,43 × N-nitritkoncent ­
rationsminskningen (6) 
och därför blir 
O 2 -förbrukningen till nitrifikation = ± 3,43 × N- 
nitntkoncentrationsändringen + 4,57 × N-nitratkoncentrations ­
ökningen (7) 
och därmed 
O 2 -förbrukningen till C-oxidation = total iakttagen förbrukning – 
förbrukning till nitrifikation (8) 
Alternativt kan syreupptagningen till följd av nitrifikation som en första uppskatt ­
ning sättas till 4,57 × tillväxten av oxiderat N, om endast totalt oxiderat N 
bestäms. 
Det korrigerade värdet för syreförbrukningen till C-oxidation jämförs sedan med 
ThOD NH  3 , beräknat enligt bilaga II.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1025
 
C.5 NEDBRYTNING – BIOKEMISK SYREFÖRBRUKNING  
1. METOD  
1.1 INLEDNING 
Syftet med denna metod är att mäta den biokemiska syreförbruk ­
ningen (BOD) för fasta eller flytande organiska ämnen. 
Data som erhålls vid detta test avser vattenlösliga föreningar. Dock 
kan, åtminstone principiellt, även flyktiga föreningar undersökas. 
Metoden kan endast tillämpas pä organiska testämnen som vid de 
koncentrationer som används i testet inte inverkar hämmande på bakterier. Om testämnet inte är lösligt vid testkoncentrationen kan 
det vara nödvändigt att vidta särskilda åtgärder, t.ex. att använda 
ultraljudsdispersion, för att uppnå en god dispersion av testämnet. 
Uppgifter om testämnets toxicitet för mikroorganismer kan vara till 
nytta vid tolkningen av låga resultat och vid valet av lämpliga test ­
koncentrationer.
 
1.2 DEFINITIONER OCH ENHETER 
BOD definieras som den mängd upplöst syre som krävs för den 
biokemiska oxideringsprocessen för en angiven mängd lösning av testämnet under testbetingelser. 
Resultaten uttrycks som gram BOD per gram testat ämne.
 
1.3 REFERENSÄMNEN 
Det är önskvärt att lämpligt kontrollämne används för att kontrollera 
inokulatets aktivitet.  
1.4 TESTMETODSPRINCIP 
En förbestämd mängd av ämnet, upplöst eller dispergerat i ett väl 
syrsatt medium, inokuleras med mikroorganismer och inkuberas i 
mörker vid en konstant, definierad passande temperatur. 
BOD bestäms genom skillnaden mellan mängden upplöst syre i 
början och i slutet av testet. Testet ska pågå i minst fem dagar och högst 28 dagar. 
Parallellt med testet ska utföras ett blindprov utan innehåll av tes ­
tämnet.
 
1.5 KVALITETSKRITERIER 
BOD-bestämningen kan inte anses vara en giltig bestämning av ett 
ämnes bionedbrytbarhet. Detta test kan endast betraktas som ett screenmg-test.
 
1.6 METODBESKRIVNING 
En preliminär lösning eller dispersion av ämnet förbereds för att 
uppnå en BOD-koncentration som är förenlig med den använda 
metoden. BOD bestäms därefter enligt lämplig nationell eller inter ­
nationell standardmetod.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1026
 
2. DATA OCH UTVÄRDERING  
BOD-innehållet i lösningen beräknas enligt den valda standardmeto ­
den och omvandlas till gram BOD per gram testat ämne.  
3. RAPPORTERING  
Den använda metoden ska anges. 
Den biokemiska syreförbrukningen ska vara ett medeltal av minst tre 
giltiga mätningar. 
Alla uppgifter och upplysningar som är av betydelse för tolkningen 
av resultaten ska rapporteras, särskilt avseende ämnets sammansätt ­
ning, orenheter, fysiskt tillstånd och toxiska effekter som kan på ­
verka resultaten. 
Eventuella tillsatser som använts för att hämma biologisk nitrifika ­
tion ska rapporteras.  
4. HÄNVISNINGAR 
Lista över standardiserade metoder, t.ex.: 
NF T 90-103: Determination of the biochemical oxygen demand. NBN 407: Biochemical oxygen demand. NEN 3235 5.4: Bepaling van het biochemish zuurstofverbruik 
(BZV). 
The determination of biochemical oxygen demand, Methods for the 
examination of water and associated materials, HMSO, London. 
ISO 5815: Determination of biochemical oxygen demand after 
n days.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1027
 
C.6 NEDBRYTNING – KEMISK SYREFÖRBRUKNING  
1. METOD  
1.1 INLEDNING 
Syftet med denna metod är att mäta den kemiska syreförbrukningen 
(COD) för fasta eller flytande organiska ämnen på ett godtyckligt 
standardsätt under givna laboratoriebetingelser. 
Uppgifter om ämnets formel är till nytta vid utförandet av testet och 
tolkningen av resultaten (t.ex. halogensalter, ferrosalter av organiska föreningar, organiska klorföreningar).
 
1.2 DEFINITIONER OCH ENHETER 
Den kemiska syreförbrukningen är ett mått på ett ämnes förmåga att 
oxideras, uttryckt som den ekvivalenta mängden syre i en oxiderande 
reagens som förbrukas av ämnet under givna laboratoriebetingelser. 
Resultatet uttrycks i gram COD per gram testat ämne.  
1.3 REFERENSÄMNEN 
Referensämnen behöver inte användas i samtliga fall när ett nytt 
ämne ska undersökas. Referensämnen ska först och främst användas till att emellanåt kalibrera metoden och till att möjliggöra en jäm ­
förelse av resultaten när en annan metod tillämpas.
 
1.4 TESTMETODSPRINCIP 
En förbestämd mängd av ämnet, upplöst eller dispergerat i vatten, 
oxideras av kaliumbikromat i ett starkt svavelsyremedium med sil ­
versulfat som katalysator under återflöde i två timmar. Restmängden bikromat bestäms genom titrering med standard järnammoniumsulfat. 
Vid klorhaltiga ämnen tillsätts kvicksilversulfat (
 1 ) för att reducera 
inverkan av klor.  
1.5 KVALITETSKRITERIER 
Till följd av det godtyckliga sättet att bestämma COD ska resultatet 
mera betraktas som en ”indikator på oxideringsförmågan” än som ett 
mått på mängden organiskt ämne. 
Klorid kan inverka på detta test. Oorganiska reducerande eller ox ­
iderande ämnen kan också inverka på BOD-bestämningen. 
Vissa cykliska föreningar oxideras inte till fullo vid detta test.  
1.6 METODBESKRIVNING 
En inledande lösning eller dispersion av ämnet bereds så att ett COD 
mellan 250 och 600 mg per liter erhålls.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1028  
( 1 ) Efter användning ska lösningar som innehåller kvicksilversalt behandlas för att undvika 
spridning av kvicksilver i miljön.
 Anmärkningar:  
Vid svårlösliga ämnen och ämnen som inte dispergerar kan finpulv ­
riserat eller flytande ämne motsvarande ungefär 5 mg COD överföras 
till försöksapparaten tillsammans med vatten. 
Den kemiska syreförbrukningen (COD) bestäms ofta, och särskilt för 
svårlösliga ämnen, i förväg med en variant av metoden, nämligen ett slutet system med tryckutjämning (H. Kelkenberg, 1975). Med denna 
modifikation kan det ofta med framgång företas kvantitativ bestäm ­
ning av föreningar som endast med svårighet kan bestämmas genom konventionella metoder, t.ex. ättiksyra. Metoden duger dock inte för pyridin. Ökning av kaliumdikromatkoncentrationen till 0,25 N 
(0,0416 M) i enlighet med hänvisning 1 kan underlätta den direkta 
invägningen av 5–10 mg ämne, vilket är ett villkor för COD-bestäm ­
ning på ämnen som är svårlösliga i vatten (hänvisning 2). 
För övrig bestäms COD därefter med hjälp av en lämplig nationell 
eller internationell standardmetod.
 
2. DATA OCH UTVÄRDERING  
COD-innehållet i testkolven beräknas enligt den valda standardme ­
toden och omvandlas till gram COD per gram testat ämne.  
3. RAPPORTERING  
Den använda referensmetoden ska anges. 
Den kemiska syreförbrukningen ska vara ett medeltal av minst tre 
mätningar. Alla uppgifter och upplysningar som är av betydelse för tolkningen av resultaten ska rapporteras, särskilt avseende orenheter, 
ämnets fysiska tillstånd och egenskaper (om de är kända) som kan 
påverka resultaten. 
Om kvicksilversulfat har använts för att minimera inverkan av klor 
ska detta rapporteras.
 
4. HÄNVISNINGAR  
1. Kelkenberg, H. Z., von Wasser und Abwasserforschung, 1975, 
vol. 8., s. 146. 
2. Gerike, P. The biodegradability testing of poorly water soluble 
compounds. Chemosphere, 1984, vol. 13, s. 169. 
Lista över standardiserade metoder, t.ex.: 
NBN T 91-201: Determination of the oxygen demand. ISBN O 11 7512494: Chemical oxygen demand (dichromate 
value) of polluted and waste waters. 
NTF 90-101: Determination of the chemical oxygen demand. DS 217 = water analysis:Determination of the chemical oxy ­
gen demand. 
DIN 38409-H-41 Determination of the chemical oxygen de ­
mand (COD) within the range above 15 mg per litre. 
NEN 3235 5.3 Bepaling van het chemisch zuurstofverbruik. ISO 6060 Water quality: Chemical oxygen demand dichromate 
methods.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1029
 
C.7 Nedbrytning – ABIOTISK NEDBRYTNING: Hydrolys som 
funktion av pH  
1. METOD  
Denna testmetod motsvarar OECD TG 111 (2004).  
1.1 INLEDNING 
Kemikalier kan nå ytvatten genom direktutsläpp, vindavdrift, avrin ­
ning, dränering, avfallsdeponering, avloppsvatten från industrier, 
hushåll eller jordbruk och genom atmosfärisk deposition, och de 
kan där omvandlas genom kemiska (t.ex. hydrolys, oxidation), fotok ­
emiska och mikrobiella processer. I denna riktlinje beskrivs en test ­
metod för bedömning av abiotisk hydrolytisk omvandling av kemi ­
kalier i akvatiska system vid pH-värden som normalt förekommer i 
miljön (pH 4–9). Riktlinjen grundar sig på nuvarande riktlinjer (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7). 
Försöken utförs för att fastställa dels i) testsubstansens hydrolyshas ­
tighet som funktion av pH, dels ii) vilken typ av hydrolysprodukter som organismer kan exponeras för samt dessas bildnings- och ned ­
brytningshastighet. Sådana studier kan vara nödvändiga för kemika ­
lier som släpps ut direkt i vatten eller som kan komma att nå miljön genom de andra vägar som nämns ovan.
 
1.2 DEFINITIONER OCH ENHETER 
Se bilaga 2.  
1.3 METODENS ANVÄNDBARHET 
Metoden kan generellt användas för kemiska ämnen (omärkta eller 
märkta) för vilka det finns en tillräckligt noggrann och känslig ana ­
lysmetod. Den kan användas för halvflyktiga och ickeflyktiga ämnen som är tillräckligt vattenlösliga. Testet bör inte användas för kemi ­
kalier som är lättflyktiga från vatten (t.ex. gasningsmedel, organiska 
lösningsmedel) och som därför inte kan hållas i lösning under de 
förhållanden som råder under testet. Testet kan vara svårt att utföra med ämnen som har mycket låg löslighet i vatten (8).
 
1.4 PRINCIP FÖR TESTMETODEN 
Sterila vattenbaserade buffertlösningar med olika pH-värde (pH 4, 7 
och 9) behandlas med testsubstansen och inkuberas i mörker under kontrollerade försöksbetingelser (vid konstant temperatur). Med lämpliga tidsintervall bestäms halterna av testsubstansen och hydro ­
lysprodukter i buffertlösningarna. Om testsubstansen är märkt (t.ex. 
med
 14 C) så blir det lättare att upprätta en massbalans. 
I testet används en stegvis metod som visas och förklaras i bilaga 1. 
Varje teststeg utlöses av resultaten från föregående steg.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1030
 
1.5 INFORMATION OM TESTSUBSTANSEN 
Omärkta eller märkta testsubstanser kan användas vid mätning av 
hydrolyshastigheten. Märkt material är i regel att föredra vid studier av reaktionsvägar och för att upprätta massbalans. I vissa speciella 
fall är dock märkning inte helt nödvändig.
 14 C-märkning rekommen ­
deras, men andra isotoper, t.ex.  13 C, 15 N, 3 H, kan också vara an ­
vändbara. Om möjligt bör märkningen placeras i molekylens mest stabila del(ar). Om det undersökta ämnet exempelvis innehåller en 
ring så ska märkningen sitta på denna ring. Om ämnet innehåller två 
eller flera ringar kan det krävas särskilda studier för att utvärdera vad som händer med varje enskild märkt ring och för att få mer infor ­
mation om bildningen av hydrolysprodukter. Testsubstansens renhet 
bör vara minst 95 %. 
Innan ett hydrolystest utförs ska följande uppgifter om testsubstansen 
finnas tillgängliga: 
a) Löslighet i vatten (testmetod A.6) 
b) Löslighet i organiska lösningsmedel 
c) Ångtryck (testmetod A.4) och/eller Henrys konstant 
d) Fördelningskoefficient n-oktanol/vatten (testmetod A.8) 
e) Dissociationskonstant (pK
 a ) (OECD:s riktlinje 112) (9) 
f) Nedbrytningshastighet vid direkt och indirekt fotolys i vatten, i 
tillämpliga fall 
Analysmetoder för kvantifiering av testsubstansen och, om så be ­
hövs, för identifiering och kvantifiering av hydrolysprodukter i vat ­
tenlösningar ska finnas tillgängliga (se även avsnitt 1.7.2).  
1.6 REFERENSSUBSTANSER 
Om möjligt bör referenskemikalier användas för att identifiera och 
kvantifiera hydrolysprodukter med hjälp av spektroskopiska och kro ­
matografiska metoder eller andra metoder med lämplig känslighet.  
1.7 KVALITETSKRITERIER  
1.7.1  Utbyte  
Analys av minst två identiska prov med buffertlösning eller extrakt 
av dessa omedelbart efter tillsättning av testsubstansen ger en första indikation på analysmetodens repeterbarhet och på hur enhetligt sät ­
tet att tillföra testsubstansen är. Under försökens senare steg erhålls 
uppgifter om utbyte med hjälp av respektive massbalanser (om märkta material används). Utbytet bör ligga mellan 90 och 110 % för märkta och omärkta kemikalier (7). Om det är tekniskt svårt att få 
så högt utbyte så kan ett utbyte på 70 % godtas för omärkta kemi ­
kalier, men i så fall bör motivering ges.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1031
 
1.7.2  Analysmetodens repeterbarhet och känslighet  
Repeterbarheten hos de analysmetoder som används för att kvan ­
tifiera testsubstansen och hydrolysprodukterna i senare skeden kan bestämmas genom analys av dubbelprover av samma buffertlös ­
ningar (eller extrakt av dessa) efter det att hydrolysprodukter har 
bildats i tillräckliga mängder för kvantifiering. 
Analysmetoden bör vara så känslig att det är möjligt att kvantifiera 
testsubstansen i koncentrationer som är högst 10 % av den ursprung ­
liga koncentrationen. I tillämpliga fall bör analysmetoderna också 
vara så känsliga att det är möjligt att kvantifiera hydrolysprodukter som motsvarar minst 10 % av tillsatsen (i varje skede av undersök ­
ningen) och ned till högst 25 % av den högsta koncentrationen.
 
1.7.3  Konfidensintervall för kinetiska data för hydrolysen  
Konfidensintervall ska beräknas och redovisas för alla regressions ­
koefficienter, hastighetskonstanter, halveringstider och andra kine ­
tiska parametrar (t.ex. DT50).  
1.8 BESKRIVNING AV TESTMETODEN  
1.8.1  Utrustning  
Försöken bör göras i glaskärl (t.ex. provrör eller små kolvar) under 
mörka och sterila förhållanden om så krävs. Undantag görs om för ­
handsuppgifter (exempelvis fördelningskoefficienten n-oktanol/vat ­
ten) indikerar att testsubstansen kan fastna på glas. I sådana fall bör ett alternativt material (till exempel teflon) övervägas. Problemet 
med vidhäftning till glas kan eventuellt avhjälpas med en eller flera 
av följande metoder: 
— Bestämning av den massa av testsubstans och hydrolysprodukter 
som fastnar på provkärlet. 
— Användning av ultraljudsbad. 
— Alla glaskärl tvättas med lösningsmedel vid varje provtagnings ­
intervall. 
— Användning av bruksfärdiga produkter. 
— Användning av en större mängd hjälplösningsmedel för tillförsel 
av testsubstansen till systemet – hjälplösningsmedlet får dock inte leda till hydrolys av testsubstansen. 
Temperaturreglerade skakvattenbad eller termostatreglerade inkuba ­
torer för inkubation av de olika testlösningarna krävs i normala fall. 
Normal laboratorieutrustning krävs, och särskilt följande: — pH-mätare.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1032
 
— Analysinstrument såsom gaskromatograf, vätskekromatograf och 
utrustning för tunnskiktskromatografi samt lämpliga detektions ­
system för analys av radioaktivt märkta och omärkta ämnen eller metod för isotoputspädning. 
— Instrument för identifiering, t.ex. masspektrometer, gaskromatograf- 
masspektrometer, vätskekromatograf-masspektrometer, NMR- spektrometer. 
— Vätskescintillationsräknare. — Separertrattar för vätske-vätskeextraktion. — Instrument för att koncentrera lösningar och extrakt (t.ex. rota ­
tionsevaporator). 
— Utrustning för temperaturreglering (t.ex. vattenbad). 
Kemiska reagens, exempelvis följande: — Organiska lösningsmedel av analytisk renhetsgrad (p.a.), t.ex. 
hexan, diklormetan. 
— Scintillationsvätska. — Buffertlösningar (för närmare uppgifter se avsnitt 1.8.3). 
Alla glaskärl, vatten av analytisk renhetsgrad (p.a.) och buffertlös ­
ningar som används i hydrolystestet bör vara sterila.
 
1.8.2  Tillförsel av testsubstans  
Testsubstansen tillförs de olika buffertlösningarna i form av vatten ­
lösning (se bilaga 3). För att underlätta upplösningen kan om så krävs små mängder lösningsmedel som är blandbara med vatten (såsom acetonitril, aceton eller etanol) tillåtas för tillförsel och för ­
delning av testsubstansen. Koncentrationen bör dock i normala fall 
inte överskrida en volymprocent. Högre koncentrationer av lösnings ­
medel (t.ex. när det gäller svårlösliga testsubstanser) kan tillåtas endast om det kan visas att lösningsmedlet inte påverkar hydrolysen 
av testsubstanserna. 
Bruksfärdiga produkter bör inte användas rutinmässigt eftersom det 
inte kan uteslutas att de ingående beståndsdelarna kan påverka hyd ­
rolysprocessen. För testsubstanser som är svårlösliga i vatten eller binder till glas kan dock bruksfärdiga lösningar vara ett lämpligt 
alternativ. 
En och samma koncentration av testsubstansen ska användas, och 
den bör inte överskrida 0,01 M eller halva mättnadskoncentrationen 
(se bilaga 1).
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1033
 
1.8.3  Buffertlösningar  
Hydrolystestet utförs vid pH-värdena 4, 7 och 9. Buffertlösningar för 
testet bereds av kemikalier och vatten av analytisk renhetsgrad (p.a.). Några användbara buffertsystem beskrivs i bilaga 3. Det bör noteras 
att hydrolyshastigheten kan påverkas av det buffertsystem som an ­
vänds. Om sådan påverkan observeras bör ett alternativt buffert ­
system användas (
 1 ). 
I varje buffertlösning bör pH kontrolleras med en kalibrerad pH- 
mätare med en noggrannhet på ± 0,1 eller bättre vid relevant tem ­
peratur.  
1.8.4  Testförhållanden  
1.8.4.1  Testtemperatur  
Hydrolysförsöken ska utföras vid konstanta temperaturer. För extra ­
polering är det viktigt att temperaturen inte varierar mer än ± 0,5  o C. 
Ett inledande test (steg 1) utförs vid 50  o C om testsubstansens hydro ­
lysegenskaper inte är kända. Kinetiska test i senare steg utförs vid 
minst tre temperaturer (inbegripet testet vid 50  o C) om inte testet i 
steg 1 visar att testsubstansen är stabil mot hydrolys. Förslagsvis görs testen i temperaturintervallet 10–70
 o C (helst minst en tempera ­
tur under 25  o C), vilket omfattar rapporteringstemperaturen 25  o C 
och de flesta temperaturer som förekommer i miljön.  
1.8.4.2  Ljus och syre  
Alla hydrolystest bör utföras med en lämplig metod för att undvika 
fotolys. Alla lämpliga åtgärder bör vidtas för att avlägsna syrgas (t.ex. att bubbla med helium, kvävgas eller argon i fem minuter 
innan lösningen bereds.)
 
1.8.4.3  Testets varaktighet  
Det inledande testet bör pågå i fem dagar, medan testen i senare steg 
bör pågå tills 90 % av testsubstansen är hydrolyserad, dock inte längre än 30 dagar.
 
1.8.5  Testets utförande  
1.8.5.1  Inledande test (steg 1)  
Det inledande testet utförs vid 50 ± 0,5  o C och pH 4,0, 7,0 och 9,0. 
Om mindre än 10 % av hydrolysen har skett efter fem dagar (t  0,5 
25 o C > 1 år) så bedöms testsubstansen vara hydrolytiskt stabil och i 
normala fall krävs inga fortsatta tester. Om det är känt att ämnet är instabilt vid normala omgivningstemperaturer (
 2 ) så krävs inget inle ­
dande test. Analysmetoden måste ha tillräcklig precision och käns ­
lighet för att kunna påvisa en tioprocentig minskning av ursprungs ­
koncentrationen.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1034  
( 1 ) Mabey och Mill rekommenderar borat- eller acetatbuffert i stället för fosfatbuffert (11). 
( 2 ) Sådan information kan komma från andra källor, såsom litteraturuppgifter om hydrolys 
av strukturellt likartade föreningar, eller från andra preliminära, semikvantitativa hydro ­
lystest med testsubstansen på ett tidigare utvecklingsstadium.
 1.8.5.2  Hydrolys av instabila ämnen (steg 2)  
Testet i steg 2 utförs vid de pH-värden där testsubstansen var instabil 
enligt det inledande testet. Buffertlösningar av testsubstansen hålls vid de valda temperaturerna med hjälp av termostat. Vid test av 
reaktioner av första ordningen analyseras varje testlösning med tids ­
intervall som ger minst sex datapunkter som i normala fall är jämnt fördelade mellan 10 och 90 % hydrolys av testsubstansen. Individu ­
ella dubbelprov (minst två replikat, i separata reaktionskärl) tas ut 
och innehållet analyseras vid minst sex provtagningstillfällen (för att 
få minst tolv replikat av datapunkter). Det bedöms vara olämpligt att använda ett enda bulkprov från vilket enskilda alikvoter av testlös ­
ningen tas ut vid varje provtagningsintervall, eftersom detta för ­
farande inte gör det möjligt att analysera variationen i data och det dessutom kan medföra problem med kontaminering av testlösningen. Test för att bekräfta sterilitet bör utföras i slutet av steg 2 (dvs. vid 
90 % hydrolys eller 30 dagar). Om ingen nedbrytning (dvs. omvand ­
ling) observeras behöver dock inga sterilitetstest göras.
 
1.8.5.3  Identifiering av hydrolysprodukter (steg 3)  
Alla viktiga hydrolysprodukter, åtminstone de som motsvarar > 10 % 
av den tillförda dosen, bör identifieras med lämpliga analysmetoder.  
1.8.5.4  Valfria test  
Ytterligare test vid andra pH-värden än 4, 7 och 9 kan vara nödvän ­
diga för hydrolytiskt instabila testsubstanser. Exempelvis kan det, för 
fysiologiska ändamål, vara nödvändigt att göra ett test vid surare 
förhållanden (t.ex. pH 1,2) och vid en enda fysiologiskt relevant temperatur (37
 o C). 
2. DATA  
Mängderna av testsubstans och eventuella hydrolysprodukter bör 
anges i procent av den tillförda ursprungskoncentrationen eller om så är lämpligt i mg/l för varje provtagningsintervall och för varje pH- 
värde och testtemperatur. Dessutom bör en massbalans anges i pro ­
cent av den tillförda ursprungskoncentrationen om en märkt testsub ­
stans har använts. 
Testsubstansens koncentration som funktion av tiden bör redovisas 
grafiskt med logaritmerade värden. Alla viktiga hydrolysprodukter, åtminstone de som motsvarar ≥ 10 % av den tillförda dosen, bör 
identifieras, och logaritmerade värden av deras koncentrationer bör 
redovisas grafiskt på samma sätt som för modersubstansen för att 
visa bildnings- och nedbrytningshastighet.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1035
 
2.1 BEHANDLING AV RESULTATEN 
Mer exakta bestämningar av halveringstiderna eller DT50 bör göras 
med hjälp av lämpliga kinetiska modeller. Halveringstid och DT50- värden (inklusive konfidensintervall) rapporteras för varje pH-värde 
och temperatur tillsammans med en beskrivning av den modell som 
använts, kinetisk ordningsgrad och bestämningskoefficient (r
 2 ). Om 
så är lämpligt bör motsvarande beräkningar göras för hydrolyspro ­
dukterna. 
Om hastigheterna undersöks vid olika temperaturer bör hastighets ­
konstanterna (kobs) för hydrolys av pseudoförsta ordningen beskri ­
vas som funktion av temperaturen. Beräkningen bör grundas både på 
en uppdelning av kobs i hastighetskonstanter för syrakatalyserad, 
neutral och baskatalyserad hydrolys (k  H , k neutral  , respektive k  OH ) 
och på Arrhenius ekvation:  
k obs ¼ k H ½H þ â þ k neutral þ k OH ½OH Ä â ¼ Σ 
i ¼ H;neutral ;OH A i e ÄB i=T 
där A  i och B  i är regressionskonstanter från skärningspunkten respek ­
tive lutningen för en anpassad linje som har erhållits genom linjär regression av ln k
 i mot det reciproka värdet av den absoluta tempera ­
turen i Kelvin (T). Genom att använda Arrheniusrelationerna 
för syrakatalyserad, neutral och baskatalyserad hydrolys kan hastighetskonstanter av pseudo-första ordningen och därmed halve ­
ringstider beräknas för andra temperaturer för vilka en direkt expe ­
rimentell bestämning av hastighetskonstanten inte är praktiskt 
genomförbar (10).
 
2.2 UTVÄRDERING OCH TOLKNING AV RESULTATEN 
I de flesta hydrolysreaktioner är reaktionshastigheterna uppenbart av 
första ordningen och halveringstiderna är därför oberoende av kon ­
centrationen (se ekvation 4 i bilaga 2). Detta innebär att laboratorie ­
resultat som bestämts vid 10  -2 till 10  -3 M i allmänhet kan tillämpas 
på de förhållanden som råder i miljön ( ≤ 10 -6 M) (10). Mabey och 
Mill (11) har rapporterat flera exempel på god överensstämmelse 
mellan hydrolyshastigheter uppmätta i både rena och naturliga vatten 
för ett stort antal kemikalier, förutsatt att både pH och temperatur hade mätts.
 
3. RAPPORTERING  
3.1 TESTRAPPORT 
Testrapporten ska innehålla åtminstone följande information: 
Testsubstans: — Trivialnamn, kemiskt namn, CAS-nummer, strukturformel (med 
angivelse av märkningsposition om radioaktivt märkt material 
används) och relevanta fysikaliskkemiska egenskaper (se avsnitt 1.5). 
— Testsubstansens renhet och eventuella föroreningar. 
— Renhet och aktivitet per mol hos den isotop som används för 
märkning (i tillämpliga fall).
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1036
 
— Buffertlösningar. 
— Beredningsdag och andra uppgifter om beredningen. — Typ av buffertar och vatten. 
— Buffertlösningarnas molaritet och pH. 
Testförhållanden: — Försöksdag. 
— Mängd tillförd testsubstans. 
— Metod och lösningsmedel (typ och mängd) för tillförsel av test ­
substansen. 
— Inkuberad volym av buffertlösning med testsubstans. 
— Beskrivning av inkubationssystemet. 
— pH och temperatur under försöket. — Provtagningstidpunkter. 
— Extraktionsmetod(er). 
— Metoder för kvantifiering och identifiering av testsubstansen och 
hydrolysprodukter i buffertlösningarna. 
— Antal replikat. Resultat: 
— Analysmetodernas repeterbarhet och känslighet. 
— Utbyten (procentvärden för en godtagbar undersökning anges i 
avsnitt 1.7.1). 
— Tabeller över data och medelvärden för replikat. 
— Massbalans under och i slutet av försöken (om märkta testsub ­
stanser används). 
— Resultat av inledande test. 
— Diskussion och tolkning av resultaten. — Alla originaldata och siffror. 
Följande uppgifter krävs endast om hydrolyshastigheten har be ­
stämts: 
— Diagram över koncentration som funktion av tiden för testsub ­
stanserna och i tillämpliga fall för hydrolysprodukterna vid varje 
pH-värde och temperatur. 
— Tabeller över resultaten av Arrhenius ekvation för temperaturen 
20
 o C/25  o C, med pH, hastighetskonstant [h  -1 eller dag  -1 ], halve­
ringstid eller DT  50 , temperaturer (  o C) inklusive konfidensinter ­
vall samt korrelationskoefficienter (r  2 ) eller motsvarande infor ­
mation. 
— Föreslagna reaktionsvägar för hydrolysen.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1037
 
4. HÄNVISNINGAR  
1. OECD (1981), Hydrolysis as a Function of pH. OECD Guide ­
line for Testing of Chemicals no 111, adopted 12 May 1981. 
2. US-Environmental Protection Agency (1982), 40 CFR 
796.3500, Hydrolysis as a Function of pH at 25  o C. Pesticide 
Assessment Guidelines, Subdivision N. Chemistry: Environ ­
mental Fate. 
3. Agriculture Canada (1987), Environmental Chemistry and Fate 
Guidelines for registration of pesticides in Canada. 
4. Europeiska unionen (EU) (1995), kommissionens direktiv 
95/36/EG om ändring av rådets direktiv 91/414/EEG om utsläp ­
pande av växtskyddsmedel på marknaden. Bilaga V: Omvand ­
ling, spridning och fördelning i miljön. 
5. Dutch Commission for Registration of Pesticides (1991), Ap ­
plication for registration of a pesticide. Section G: Behaviour of 
the product and its metabolites in soil, water and air. 
6. BBA (1980), Merkblatt Nr. 55, Teil I und II: Prüfung des 
Verhaltens von Pflanzenbehandlungsmitteln im Wasser (oktober 1980). 
7. SETAC (1995), Procedures for Assessing the Environmental 
Fate and Ecotoxicity of Pesticides, Mark R. Lynch, Ed. 
8. OECD (2000), Guidance document on aquatic toxicity testing 
of difficult substances and mixtures, OECD Environmental He ­
alth and Safety Publications Series on Testing and Assessment 
no 23. 
9. OECD (1993), Guidelines for the Testing of Chemicals. Paris. 
OECD (1994–2000): Addenda 6–11 to Guidelines for the Tes ­
ting of Chemicals. 
10. Nelson, H, Laskowski D, Thermes S., and Hendley P. (1997), 
Recommended changes in pesticide fate study guidelines for 
improving input to computer models. (Text version of oral pre ­
sentation at the 14
 th Annual Meeting of the Society of Environ ­
mental Toxicology and Chemistry, Dallas TX, november 1993). 
11. Mabey, W. and Mill, T. (1978), Critical review of hydrolysis of 
organic compounds in water under environmental conditions. J. 
Phys. Chem. Ref. Data 7, 383–415.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1038
 
Bilaga 1  
Översikt över hydrolystestets olika steg
  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1039
 
Bilaga 2  
Definitioner och enheter  
SI-enheter  ska alltid användas.  
testsubstans:  alla ämnen, oavsett om det gäller den ursprungliga föreningen eller 
relevanta omvandlingsprodukter.  
omvandlingsprodukter:  omvandlingsprodukter: alla ämnen som uppstår till följd 
av biotiska eller abiotiska omvandlingsreaktioner av testsubstansen.  
hydrolysprodukter:  alla ämnen som uppstår till följd av hydrolytiska omvand ­
lingsreaktioner av testsubstansen.  
hydrolys:  en testsubstans RX reagerar med vatten varvid slutresultatet blir att 
gruppen X byts ut mot OH. 
RX + HOH → ROH +HX [1] 
I denna förenklade process minskar koncentrationen av RX med en hastighet 
enligt formeln 
hastighet = k [H  2 O] [RX] reaktion av andra ordningen 
eller 
hastighet = k [RX] reaktion av första ordningen 
beroende på det hastighetsbestämmande steget. Eftersom vatten finns i stort 
överskott jämfört med testsubstansen brukar denna typ av reaktion beskrivas som en reaktion av första ordningen där den observerade hastighetskonstanten erhålls genom förhållandet 
k
 obs = k [H  2 O] [2] 
och kan bestämmas med hjälp av uttrycket (*)  
k obs ¼ 1 
t ln C o 
C t [3] 
där 
t = tiden och C
 0 , C t = koncentrationerna av RX vid tiderna 0 och t. 
Enheten för denna konstant har dimensionen (tid)  -1 och reaktionens halveringstid 
(den tid det tar för 50 % av RX att reagera) erhålls genom  
t 0;5 ¼ ln2 
k obs [4] 
halveringstid:  betecknas med (t  0,5 ) – den tid det tar för en testsubstans att hydro ­
lyseras till 50 % när reaktionen kan beskrivas med kinetik av första ordningen; 
halveringstiden är oberoende av koncentrationen.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1040  
(*) Om diagrammet över logaritmerade data som funktion av tiden inte visar att funktionen 
är linjär (ekvivalent med en reaktionshastighet av första ordningen) så är ekvation 3 
olämplig för att bestämma hastighetskonstanten för hydrolys av testsubstansen.
 DT 50 (Disappearance Time 50):  Den tid inom vilken testsubstansens koncent ­
ration minskar med 50 %; den skiljer sig från halveringstiden t  0,5 om reaktionen 
inte följer en kinetik av första ordningen.  
Uppskattning av k vid olika temperaturer  
Om hastighetskonstanterna är kända för två temperaturer så kan hastighetskon ­
stanterna vid andra temperaturer beräknas med hjälp av Arrhenius ekvation:  
k ¼ A Ü e Ä E 
R Ü T eller ln k ¼ ÄE 
R Ü T þ ln A 
Ett diagram över ln k som funktion av 1/T ger en rät linje med lutningen -E/R 
där k = hastighetskonstanten mätt vid olika temperaturer E = aktiveringsenergin [kJ/mol] T = absolut temperatur [K] R = gaskonstanten [8,314 J/mol · K] 
Aktiveringsenergin beräknas genom regressionsanalys eller följande ekvation:
 
E ¼ R Ü ln k 2 Ä ln k 1 
1 
T 1 Ä 1 
T 2 Í Î  
där T  2 > T  1 . ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1041
 
Bilaga 3  
Buffertsystem  
A. CLARK OCH LUBS:  
Buffertblandningar enligt CLARK och LUBS  (*) 
Sammansättning pH  
0,2 N HCl OCH 0,2 N KCl VID 20  o C 
47,5 ml HCl + 25 ml KCl utspätt till 100 ml 1,0 
32,25 ml HCl + 25 ml KCl utspätt till 100 ml 1,2 
20,75 ml HCl + 25 ml KCl utspätt till 100 ml 1,4 
13,15 ml HCl + 25 ml KCl utspätt till 100 ml 1,6 
8,3 ml HCl + 25 ml KCl utspätt till 100 ml 1,8 5,3 ml HCl + 25 ml KCl utspätt till 100 ml 2,0 
3,35 ml HCl + 25 ml KCl utspätt till 100 ml 2,2  
0,1 M kaliumbiftalat +0,1 N HCl vid 20
 o C 
46,70 ml 0,1 N HCl + 50 ml biftalat utspätt till 100 ml 2,2 
39,60 ml 0,1 N HCl + 50 ml biftalat utspätt till 100 ml 2,4 
32,95 ml 0,1 N HCl + 50 ml biftalat utspätt till 100 ml 2,6 
26,42 ml 0,1 N HCl + 50 ml biftalat utspätt till 100 ml 2,8 
20,32 ml 0,1 N HCl + 50 ml biftalat utspätt till 100 ml 3,0 
14,70 ml 0,1 N HCl + 50 ml biftalat utspätt till 100 ml 3,2 
9,90 ml 0,1 N HCl + 50 ml biftalat utspätt till 100 ml 3,4 
5,97 ml 0,1 N HCl + 50 ml biftalat utspätt till 100 ml 3,6 2,63 ml 0,1 N HCl + 50 ml biftalat utspätt till 100 ml 3,8  
0,1 M kaliumbiftalat +0,1 N NaOH vid 20
 o C 
0,40 ml 0,1 N NaOH + 50 ml biftalat utspätt till 100 ml 4,0 
3,70 ml 0,1 N NaOH + 50 ml biftalat utspätt till 100 ml 4,2 
7,50 ml 0,1 N NaOH + 50 ml biftalat utspätt till 100 ml 4,4 
12,15 ml 0,1 N NaOH + 50 ml biftalat utspätt till 100 ml 4,6 
17,70 ml 0,1 N NaOH + 50 ml biftalat utspätt till 100 ml 4,8  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1042  
(*) De pH-värden som anges i dessa tabeller har beräknats från de potentiella mätningarna med hjälp av 
Sörensens standardekvationer (1909). Motsvarande pH-värden är 0,04 enheter högre än tabellvärdena.
 Sammansättning pH  
23,85 ml 0,1 N NaOH + 50 ml biftalat utspätt till 100 ml 5,0 
29,95 ml 0,1 N NaOH + 50 ml biftalat utspätt till 100 ml 5,2 35,45 ml 0,1 N NaOH + 50 ml biftalat utspätt till 100 ml 5,4 39,85 ml 0,1 N NaOH + 50 ml biftalat utspätt till 100 ml 5,6 43,00 ml 0,1 N NaOH + 50 ml biftalat utspätt till 100 ml 5,8 45,45 ml 0,1 N NaOH + 50 ml biftalat utspätt till 100 ml 6,0
 
Buffertblandningar enligt CLARK och LUBS (fortsättning) 
0,1 M monokaliumfosfat +0,1 N NaOH vid 20  o C 
5,70 ml 0,1 N NaOH + 50 ml fosfat utspätt till 100 ml 6,0 8,60 ml 0,1 N NaOH + 50 ml fosfat utspätt till 100 ml 6,2 
12,60 ml 0,1 N NaOH + 50 ml fosfat utspätt till 100 ml 6,4 17,80 ml 0,1 N NaOH + 50 ml fosfat utspätt till 100 ml 6,6 23,45 ml 0,1 N NaOH + 50 ml fosfat utspätt till 100 ml 6,8 29,63 ml 0,1 N NaOH + 50 ml fosfat utspätt till 100 ml 7,0 35,00 ml 0,1 N NaOH + 50 ml fosfat utspätt till 100 ml 7,2 
39,50 ml 0,1 N NaOH + 50 ml fosfat utspätt till 100 ml 7,4 
42,80 ml 0,1 N NaOH + 50 ml fosfat utspätt till 100 ml 7,6 45,20 ml 0,1 N NaOH + 50 ml fosfat utspätt till 100 ml 7,8 46,80 ml 0,1 N NaOH + 50 ml fosfat utspätt till 100 ml 8,0  
0,1 M H
 3 BO  3 i 0,1 M KCl +0,1 N NaOH vid 20  o C 
2,61 ml 0,1 N NaOH + 50 ml borsyra utspätt till 100 ml 7,8 3,97 ml 0,1 N NaOH + 50 ml borsyra utspätt till 100 ml 8,0 5,90 ml 0,1 N NaOH + 50 ml borsyra utspätt till 100 ml 8,2 
8,50 ml 0,1 N NaOH + 50 ml borsyra utspätt till 100 ml 8,4 
12,00 ml 0,1 N NaOH + 50 ml borsyra utspätt till 100 ml 8,6 16,30 ml 0,1 N NaOH + 50 ml borsyra utspätt till 100 ml 8,8 21,30 ml 0,1 N NaOH + 50 ml borsyra utspätt till 100 ml 9,0 26,70 ml 0,1 N NaOH + 50 ml borsyra utspätt till 100 ml 9,2
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1043
 
32,00 ml 0,1 N NaOH + 50 ml borsyra utspätt till 100 ml 9,4 
36,85 ml 0,1 N NaOH + 50 ml borsyra utspätt till 100 ml 9,6 
40,80 ml 0,1 N NaOH + 50 ml borsyra utspätt till 100 ml 9,8 
43,90 ml 0,1 N NaOH + 50 ml borsyra utspätt till 100 ml 10,0  
B. KOLTHOFF OCH VLEESCHHOUWER:  
Citratbuffertar enligt KOLTHOFF och VLEESCHHOUWER  (*) 
Sammansättning pH  
0,1 M monokaliumfosfat och 0,1 N HCl vid 18  o C (*) 
49,7 ml 0,1 N HCl + 50 ml citrat utspätt till 100 ml 2,2 
43,4 ml 0,1 N HCl + 50 ml citrat utspätt till 100 ml 2,4 36,8 ml 0,1 N HCl + 50 ml citrat utspätt till 100 ml 2,6 
30,2 ml 0,1 N HCl + 50 ml citrat utspätt till 100 ml 2,8 
23,6 ml 0,1 N HCl + 50 ml citrat utspätt till 100 ml 3,0 17,2 ml 0,1 N HCl + 50 ml citrat utspätt till 100 ml 3,2 10,7 ml 0,1 N HCl + 50 ml citrat utspätt till 100 ml 3,4 
4,2 ml 0,1 N HCl + 50 ml citrat utspätt till 100 ml 3,6  
0,1 M monokaliumfostat och 0,1 N NaOH vid 18
 o C (*) 
2,0 ml 0,1 N NaOH + 50 ml citrat utspätt till 100 ml 3,8 
9,0 ml 0,1 N NaOH + 50 ml citrat utspätt till 100 ml 4,0 
16,3 ml 0,1 N NaOH + 50 ml citrat utspätt till 100 ml 4,2 23,7 ml 0,1 N NaOH + 50 ml citrat utspätt till 100 ml 4,4 31,5 ml 0,1 N NaOH + 50 ml citrat utspätt till 100 ml 4,6 
39,2 ml 0,1 N NaOH + 50 ml citrat utspätt till 100 ml 4,8 
46,7 ml 0,1 N NaOH + 50 ml citrat utspätt till 100 ml 5,0 54,2 ml 0,1 N NaOH + 50 ml citrat utspätt till 100 ml 5,2 
61,0 ml 0,1 N NaOH + 50 ml citrat utspätt till 100 ml 5,4 
68,0 ml 0,1 N NaOH + 50 ml citrat utspätt till 100 ml 5,6 74,4 ml 0,1 N NaOH + 50 ml citrat utspätt till 100 ml 5,8 81,2 ml 0,1 N NaOH + 50 ml citrat utspätt till 100 ml 6,0
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1044  
(*) Tillsätt en liten kristall tymol eller liknande ämne för att förhindra svampangrepp.
 C. SÖRENSEN:  
Boratblandningar enligt SÖRENSEN  
Sammansättning Sörensen 
18 o C Walbum, pH vid 
ml borax ml HCl/NaO H 10  o C 40  o C 70  o C 
0,05 M borax +0,1 N HCl  
5,25 4,75 7,62 7,64 7,55 7,47 
5,50 4,50 7,94 7,98 7,86 7,76 
5,75 4,25 8,14 8,17 8,06 7,95 
6,00 4,00 8,29 8,32 8,19 8,08 
6,50 3,50 8,51 8,54 8,40 8,28 7,00 3,00 8,08 8,72 8,56 8,40 
7,50 2,50 8,80 8,84 8,67 8,50 
8,00 2,00 8,91 8,96 8,77 8,59 8,50 1,50 9,01 9,06 8,86 8,67 9,00 1,00 9,09 9,14 8,94 8,74 
9,50 0,50 9,17 9,22 9,01 8,80 
10,00 0,00 9,24 9,30 9,08 8,86  
0,05 M borax +0,1 N NaOH  
10,0 0,0 9,24 9,30 9,08 8,86 
9,0 1,0 9,36 9,42 9,18 8,94 
8,0 2,0 9,50 9,57 9,30 9,02 7,0 3,0 9,68 9,76 9,44 9,12 6,0 4,0 9,97 10,06 9,67 9,28
 
Fosfatblandningar enligt SÖRENSEN  
Sammansättning pH  
0,0667 M monokaliumfosfat + 0,0667 M dinatriumfosfat vid 20  o C 
99,2 ml KH  2 PO 4 + 0,8 ml Na  2 HPO  4 5,0 
98,4 ml KH  2 PO 4 + 1,6 ml Na  2 HPO  4 5,2 
97,3 ml KH  2 PO 4 + 2,7 ml Na  2 HPO  4 5,4 
95,5 ml KH  2 PO 4 + 4,5 ml Na  2 HPO  4 5,6 
92,8 ml KH  2 PO 4 + 7,2 ml Na  2 HPO  4 5,8 
88,9 ml KH  2 PO 4 + 11,1 ml Na  2 HPO  4 6,0 
83,0 ml KH  2 PO 4 + 17,0 ml Na  2 HPO  4 6,2 
75,4 ml KH  2 PO 4 + 24,6 ml Na  2 HPO  4 6,4 
65,3 ml KH  2 PO 4 + 34,7 ml Na  2 HPO  4 6,6 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1045
 
53,4 ml KH  2 PO 4 + 46,6 ml Na  2 HPO  4 6,8 
41,3 ml KH  2 PO 4 + 58,7 ml Na  2 HPO  4 7,0 
29,6 ml KH  2 PO 4 + 70,4 ml Na  2 HPO  4 7,2 
19,7 ml KH  2 PO 4 + 80,3 ml Na  2 HPO  4 7,4 
12,8 ml KH  2 PO 4 + 87,2 ml Na  2 HPO  4 7,6 
7,4 ml KH  2 PO 4 + 92,6 ml Na  2 HPO  4 7,8 
3,7 ml KH  2 PO 4 + 96,3 ml Na  2 HPO  4 8,0 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1046
 
C.8 TOXICITET HOS DAGGMASKAR  
TEST I SYNTETISK JORD  
1. METOD  
1.1 INLEDNING 
Vid detta laboratorietest tillsätts testämnet till syntetisk jord i vilken 
daggmaskar placeras i 14 dagar. Efter denna period (alternativt efter sju dagar) undersöks ämnetd dödliga verkan på daggmaskarna. Detta test är en metod för att under en relativt kort tid undersöka kemika ­
liers verkan på daggmaskar vid upptagning genom huden eller via 
fodret.
 
1.2 DEFINITIONER OCH ENHETER 
LC 50 : Koncentrationen av ett ämne som kan förväntas orsaka att 
50 % av försöksdjuren dör under testperioden.  
1.3 REFERENSÄMNE 
En referensämne används regelbundet för att visa att testsystemets 
känslighet inte har ändrats signifikant. 
Som referensämne rekommenderas analytiskt rent kloracetamid.  
1.4 TESTMETODSPRINCIP 
Eftersom jord är ett variabelt medium används en noggrant definie ­
rad syntetisk lerjord för detta test. Vuxna daggmaskar av arten  Ei­
senia foetida  (se anmärkningen i tillägget) hålls i en definierad syn ­
tetisk jord som behandlats med olika koncentrationer av testämnet. Behållarnas innehåll sprids ut på en bricka 14 dagar (alternativt sju 
dagar) efter inledningen av testet och det antal daggmaskar som 
överlever vid varje koncentration räknas.
 
1.5 KVALITETSKRITERIER 
Testet är beräknat att vara så reproducerbart som möjligt med hänsyn 
till testsubstrat och organism. Om dödligheten hos kontrolldjuren överstiger 10 % vid testets avslutning är testet ogiltigt.
 
1.6 METODBESKRIVNING  
1.6.1  Material  
1.6.1.1 T e s t s u b s t r a t 
Väldefinierad syntetisk jord används som bassubstrat. 
a) Bassubstrat (viktprocent torrämne) 
— 10 % sphagnum (så nära pH-värde 5,5–6 som möjligt utan 
synliga plantrester och finfördelat).  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1047
 
— 20 % kaolinhaltig lera, helst med över 50 % kaolinit. 
— Cirka 69 % industriell kvartssand (övervägande finsand med 
över 50 % med en partikel storlek av 0,05–0,2 mm). Om 
testämnet inte är tillräckligt lätt uppslammad i vatten sätts 
10 g per testbehållare åt sidan för senare blandning med tes ­
tämnet. 
— Cirka 1 % kalciumkarbonat (CaCO  3 ), pulvriserat, kemiskt 
rent, tillsatt för att få ett pH-värde av 6,0± 0,5. 
b) Testsubstrat 
Testsubstratet består av bassubstrat, testämne och avjoniserat vatten. Vatteninnehållet motsvarar ca 25–42 viktprocent av bassubstratets 
torrvikt. Substratets vatteninnehåll bestäms genom torkning av ett prov till konstant vikt vid 105
 o C. Ett viktigt kriterium är att den 
syntetiska jorden har fuktats så mycket det går, men det får inte 
finnas något stående vatten. Blandningen sker omedelbart så att 
det blir en jämn fördelning av testämnet och substratet. Den metod som används för att tillsätta testämnet till substratet ska rapporteras. 
c) Kontrollsubstrat 
Kontrollsubstratet består av bassubstrat, testämne och avjoniserat 
vatten. Om en tillsättningsämne används ska ett extra kontroll ­
substrat innehålla samma mängd tillsättningsämne.
 
1.6.1.2 T e s t b e h å l l a r e 
Glasbehållare med ett omfång av ca 1 liter (korrekt täckta med 
plastlock, plattor eller plastfolie med ventilationshål) fyllda med en 
mängd våt test- eller kontrollsubstrat motsvarande 500 g av substra ­
tets torrvikt.  
1.6.2  Testbetingelser  
Behållarna förvaras i klimatkammare vid en temperatur av 20  o C 
med en tolerans av ± 2  o C och i konstant ljus. Ljusintensiteten bör 
vara 400–800 lux. 
Testperioden varar i 14 dagar, men dödligheten kan eventuellt be ­
dömas sju dagar efter testets inledning.  
1.6.3  Förfarande  
T e s t k o n c e n t r a t i o n e r 
Testämnets koncentrationer uttrycks som ämnets vikt i förhållande 
till grundsubstratets torrsvikt (mg/kg).  
F ö r t e s t 
Det koncentrationsområde som orsakar 0–100 % dödlighet kan be ­
stämmas genom ett förtest för att få information om vidden av kon ­
centrationer som ska användas vid det definitiva testet.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1048
 
Ämnet bör testas i följande koncentrationer: 1 000, 100, 10, 1 och 
0,1 mg/ämne/kg testsubstrat (torrvikt). 
Om en fullständig definitiv test ska göras räcker det att för förtestet 
använda en uppsättning per koncentration och en för den obehand ­
lade kontrollen med vardera tio daggmaskar.  
D e f i n i t i v t t e s t 
Resultaten av förtestet används för att välja minst fem koncentratio ­
ner i en geometrisk serie som täcker 0–100 % dödlighet och där den 
konstanta faktorn inte får överstiga 1,8. 
Vid test med dessa koncentrationer bör det vara möjligt att med 
största möjhga exakthet bedöma LC  50 -värdet och dess kon ­
fidensgränser. 
Vid det definitiva testet används minst fyra testgrupper per koncent ­
ration och fyra obehandlade kontrollgrupper med vardera tio dagg ­
maskar. Resultaten av dessa parallellgrupper anges som ett medel ­
värde och en standardavvikelse. 
Om två på varandra följande koncentrationer, med ett förhållande av 
1,8, endast ger 0 och 100 % dödlighet är dessa två värden tillräckliga för att ange LC
 50 -interval! et.  
B l a n d n i n g a v b a s s u b s t r a t e t o c h t e s t ä m n e t 
Testämnet bereds, när så är möjligt, utan tillsättning av annat än 
vatten. Omdelbart före inledningen av testet blandas en emulsion eller dispersion av tesämnet i avjoniserat vatten eller annat lösnings ­
medel med bassubstratet eller sprayas ut jämnt över detta med en fin 
kromatografispruta eller liknande. 
Om testämnet inte går att lösa i vatten kan det lösas i minsta möjliga 
mängd av ett passande organiskt lösningsmedel (t.ex. hexan, aceton eller kloroform). 
Endast medel som inte går att lösa i vatten för användas för att 
upplösa, dispergera eller emulgera testämnet. Testsubstratet luftas 
innan användning. Den förångade vattenmängden ersätts. Kontroll ­
substratet får innehålla eventuella tillsättningsämnen i samma mängd. 
Om det inte går att lösa, dispergera eller emulgera testämnet i or ­
ganiska lösningsmedel blandas en blandning av finsand av malen 
kvarts och den kvantitet av testämnet som är nödvändig för att 
behandla 500 g torrvikt av syntetisk jord med 490 g torrvikt av testämnet. 
För varje testgrupp placeras en mängd våt testsubstrat motsvarande 
500 g torrvikt i varje glasbehållare och tio daggmaskar, som under 24 timmar har invänjts i ett liknande vått bassubstrat och därefter 
snabbt sköljts av och avdroppats på filterpapper innan användning, 
placeras på testsubstratets yta.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1049
 
Behållarna täcks med perforerade plastlock, plattor eller plastfolie för 
att förhindra att substratet torkar, och de förvaras under testbetingelse 
i 14 dagar. 
Utvärderingen sker 14 dagar (alternativt sju dagar) efter testets in ­
ledning. Substratet sprids ut på en platta av glas eller rostfritt stål. Daggmaskarna undersöks och antalet överlevande daggmaskar fast ­
ställs. Daggmaskar anses vara döda om de inte reagerar på en lätt 
mekanisk påverkan av framänden. 
När undersökningen sker efter sju dagar hälls substratet tillbaka i 
behållaren och överlevande daggmaskar läggs tillbaka pä testsubstra ­
tets yta.
 
1.6.4  Testorganismer  
Testorganismerna bör vara daggmaskar av arten  Eisenia foetida  (se 
anmärkningen i tillägget) (minst två månader gamla med clitellum) och väga (vått tillstånd) 300–600 mg. (För uppfödning se tillägget).
 
2. DATA  
2.1 BEHANDLING OCH UTVÄRDERING AV DATA 
De använda koncentrationerna av testämnet rapporteras med angi ­
velse av den procentuella dödligheten för varje koncentration. 
När erhållna data inte är tillräckliga kan LC  50 och dess kon ­
fidensgränser (p = 0,05) bestämmas genom användning av standard ­
metoder (Lichtfield and Wilcoxon, 1949, eller motsvarande metod). 
LC 50 anges som mg testämne per kg testsubstrat (torrvikt) 
Om koncentrationskurvans böjning vid ett förhållande av 1,8 endast 
ger 0 och 100 % dödlighet är dessa två värden tillräckliga för att ange LC
 50 -intervallet.  
3. RAPPORTERING  
3.1 TESTRAPPORT 
Testrapporten ska om möjligt innehålla: 
— Angivelse av att testet utförts i överensstämmelse med ovanstå ­
ende kvalitetskriterier. 
— Angivelse av det genomförda testet (förtest och/eller definitivt 
test). 
— Noggrann beskrivning av testbetingelserna eller angivelse av att 
testet utförts i överensstämmelse med metoden. Eventuella avvi ­
kelser ska rapporteras. 
— Noggrann beskrivning av hur testämnet blandats i bassubstratet. — Uppgifter om testorganismer (art, ålder, medelvikt samt lägsta 
och högsta vikt, betingelserna för uppfödning och hållning 
samt leverantör).
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1050
 
— Använd metod för bestämning av LC  50 . 
— Testresultaten, inbegripet alla använda data. — Beskrivning av observerade symptom eller beteendeförändringar 
hos testorganismerna. 
— Dödlighet i kontrollgrupperna. — LC
 50 eller högsta testkoncentration utan dödlighet och lägsta 
testkoncentration med en dödlig het av 100 % 14 dagar (alter ­
nativt sju dagar) efter testets inledning. 
— Ritning av koncentrations/reaktionskurvan. 
— Resultat som erhållits med referensämnet antingen i samband 
med det ifrågavarande testet eller vid tidigare kvalitetskontroll ­
undersökningar.  
4. HÄNVISNINGAR  
1. OECD (1981),  Test Guideline 207,  rådets beslut K(81) 30 slutlig. 
2. Edwards, C. A. och Lofty, (1977),  Biology of Earthworms.  London: 
Chapman and Hall, s. 331. 
3. Bouche, M. B. (1972),  Lombriciens de France, Écologie et Systé ­
matique.  Publ. Institut National de la Recherche Agronomique, 
s. 671. 
4. Litchfield, J. T. och Wilcoxon J.(1949), A simplified method of 
evaluating dose-effect experi ments, J.  Pharm. Esp. Therap.,  
vol. 96, s. 99–113. 
5. Europeiska gemenskapernas kommission,  Development of a stan ­
dard laboratory method for assaying the toxicity of chemical substances to earthworms,  Rapport EUR 8714 EN. 
6. Umweltsbundesamt/Biologische Bundesanstalt für Land- und 
Forstwirtschaft, Berlin (1984), Verfahrensvorschlag Toxizitätstest 
am Regenwurm Eisenia foetida in künstlichem Boden, i: Rudolph/ Boje:  Ökotoxikologie,  ecomed, Landsberg, 1986.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1051
 
Tillägg  
Uppfödning och hållning av daggmaskar före test  
Vid uppfödning av djuren placeras 30–50 vuxna daggmaskar i en avelsbur med 
färsk substrat och avlägsnas efter 14 dagar. Dessa djur kan användas för upp ­
födning av senare grupper. De daggmaskar som kläcks ur kokongerna används 
för test när de är könsmogna (under föreskrivna villkor efter 2–3 månader).  
Förhållanden för hållning och uppfödning  
Klimatkammare: Temperatur 20  o C med en tolerans av ± 2  o C, helst med 
konstant belysning (ljusintensitet 400–800 lux). 
Avelsburar: Lämpliga låga burar med en volym av 10–20 1. Substrat:  Eisennia foetida  kan födas upp i olika djurexkrement. Som 
uppfödningsmedium rekommenderas en blandning av lika 
delar av torv och ko- eller hästgödsel. Substratet bör ha ett pH-värde av 6–7 (reglerat med kalciumkarbonat) och låg jonledningsförmåga (under 6 mmhos eller 0,5 % salt ­
koncentration). 
Substratet bör vara fuktigt men inte för vått. Andra lämpliga metoder utöver ovan nämnda kan användas.  
Anmärkning:  Det finns två raser av  Eisenia foetida  som vissa systematiker har 
klassificerat som arter (Bouche, 1972). De är morfologiskt liknande men den ena,  
Eisenia foetida foetida  har typiskt tvärgående ränder på segmenten medan den 
andra,  Eisenia foetida andrei,  saknar dessa, och har en rödbrokig färg. Så långt 
det går bör  Eisenia foetida andrei  användas. Andra arter kan användas om den 
nödvändiga metodiken finns tillgänglig.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1052
 
C.9 BIOLOGISK NEDBRYTBARHET  
ZAHN-WELLENS TEST  
1. METOD  
1.1 INLEDNING 
Syftet med denna metod är att mäta bionedbrytbarheten hos vatten ­
lösliga, icke flyktiga organiska föreningar när de utsätts relativt höga koncentrationer av mikroorganismer under ett statiskt test. 
Fysikaliska-kemiska reaktioner kan förekomma på de uppslammade 
artiklarna vilket man måste ta hänsyn till vid tolkning av resultaten 
(se 3.2). 
De ämnen som ska undersökas används i koncentrationer motsva ­
rande DOC-värden av 50–400 mg/l (DOC = dissolved organic car ­
bon, dvs. upplöst organiskt kol), eller COD-värden motsvarande 
100–1 000 mg/l (COD = chemical oxygen demand, dvs. kemiskt 
syrebehov). Fördelen med dessa relativt höga koncentrationer är att de är pålitliga ur analyshänseende. 
Vid denna metod mäts koncentrationer av upplöst organiskt kol eller 
det kemiska syrebehovet i syfte att bedöma testämnets fullständiga 
bionedbrytbarhet. 
Samtidig användning av en specifik analysmetod kan möjliggöra 
värdering av ämnets primära bionedbrytbarhet (dvs. försvinnandet av den ursprungliga kemiska förbindelsen). 
Metoden kan endast tillämpas på organiska testämnen som vid den 
använda testkoncentrationen 
— är vattenlösliga inom ramen för testbetingelserna, — har försumbart ångtryck inom ramen för testbetingelserna, — inte hämmar bakterier, — endast absorberas i testsystemet i begränsad omfattning, — inte försvinner från testlösningen till följd av skumning. Uppgifter om de relativa proportionerna av testämnets huvud ­
beståndsdelar är till nytta vid tolkningen av de erhållna resultaten, särskilt om resultaten är låga eller marginella. 
Uppgifter om testämnets toxicitet för mikroorganismer kan vara till 
nytta vid tolkningen av låga resultat och vid valet av lämpliga test ­
koncentrationer.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1053
 
1.2 DEFINITIONER OCH ENHETER 
Nedbrytningen vid testets avslutning definieras som ”bionedbrytbar ­
het i Zahn-Wellens test”:  
D T ð%Þ ¼ " 
1 Ä ðC T Ä C B Þ 
ðC A Ä C BA Þ # 
Ü 100  
där: 
D T = Bionedbrytning i procent DOC som avgått vid tid T. 
C A = DOC (eller COD)-värdena i försöksblandningen, mätt tre 
timmar efter inledning av testet (mg/l) (DOC = dissolved 
organic carbon/upplöst organiskt kol, COD = chemical oxy ­
gen demand/kemiskt syrebehov). 
C T = DOC- eller COD-värdena i försöksblandningen vid tidpunk ­
ten för provtagningen (mg/l). 
C B = DOC- eller COD-värdena i blindprovet vid tidpunkten för 
provtagningen (mg/l). 
C BA = DOC- eller COD-värdena i blindprovet, mätt tre timmar 
efter inledning av testet (mg/l). 
Nedbrytningsgraden avrundas till närmaste hela procenttal. 
Den procentuella nedbrytningen anges som den procent DOC (eller 
COD) som försvunnit från testämnet. 
Skillnaden mellan det värde som mätts efter tre timmmar och det 
beräknade, helst uppmätta, initiala värdet kan ge nyttiga information 
om ämnets eliminiering (se 3.2 ”Tolkning av resultat”).  
1.3 REFERENSÄMNEN 
När ett nytt ämne ska undersökas kan referensämnen i vissa fall vara 
användbara. Det går dock ännu inte att rekommendera bestämda 
referensämnen.  
1.4 TESTMETODSPRINCIP 
Aktiverat slam, oorganiska näringsämnen och testämnet, som är den 
enda kolämnekällan i vattenlösning, placeras i en glasbehållare med 
en volym av 1–4 liter, som är försedd med omrörning och luftning. 
Blandningen rörs och luftas vid 20–25  o C i indirekt ljus eller i 
mörker i upp till 28 dagar. Nedbrytningen följs genom mätning av 
DOC-(eller COD-)värden i den filtrerade lösningen en gång om 
dagen eller regelbundet med en annan lämplig tidsintervall. Förhål ­
landet mellan eliminerat DOC (eller COD) efter varje tidsintervall och värden tre timmar efter testets inledning uttrycks som procentuell 
bionedbrytning och är ett värde för nedbrytningsgraden vid denna 
tidpunkt. 
Om en specifik analysmetod används kan ändringar av det ursprung ­
liga ämnets koncentration till följd av bionedbrytning mätas (primär 
bionedbrytning).
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1054
 
1.5 KVALITETSKRITERIER 
Metodens reproducerbarhet har fastställts genom ett ringtest. 
Metodens känslighet beror till största delen på variationer i blind ­
provet och till mindre del på noggrannheten vid bestämning av upp ­
löst organiskt kol och testämnekoncentration i vätskan.  
1.6 METODBESKRIVNING  
1.6.1  Förberedelser  
1.6.1.1 R e a g e n s e r 
Testvatten: Dricksvatten innehållande mindre än 5 mg organiskt kol 
per liter. Koncentrationen av kalcium- och magnesiumjoner får till ­
sammans inte överstiga 2,7 mmol per liter. I motsatt fall måste den 
förtunnas på passande sätt med avjoniserat eller destillerat vatten. 
Svavelsyra, analytisk reagens (AR.): 50 g/l. 
Natriumhydroxidlösning, AR.: 40 g/l. 
Lösning av oorganiska näringsämnen: i 1 liter avjoniserat 
vatten löses 
ammoniumklorid, NH  4 C1, AR: 38,5 g. 
natriumdihydrogenfosfat, NaH  2 PO 4 . 2H  2 O, AR: 33,4 g. 
kaliumdihydrogenfosfat, KH  2 PO 4 , AR: 8,5 g. 
dikaliumhydrogenfosfat, K  2 HPO  4 , AR: 21,75 g.  
1.6.1.2 A p p a r a t u r 
Glasbehållare med en volym av 1–4 liter (t.ex. cylindrisk behållare). 
Omrörare med rörhuvud av glas eller metall på en passande axel 
(omröraren bör rotera 5–10 cm över behållarens botten). Som ett alternativ kan en magnetomrörare med en 7–10 cm lång mangnetstav användas. 
Glasrör med en invändig diameter av 2–4 mm för luftning. Rörets 
öppning bör ligga ca 1 cm ovanför behållarens botten. 
Centrifug (ca 3 550 g). 
pH-mätare. 
Apparat för mätning av upplöst syre. 
Pappersfilter.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1055
 
Membranfiltreringsapparat. 
Membranfilter med en porstorlek av 0,45 μm. Membranfilter är en ­
dast lämpligt om det har säkerställts att de varken avger kolämne eller absorberar ämnet under filtreringen. 
Analysapparatur för bestämning av innehållet av organiskt kol och 
den kemiska syrebehovet.
 
1.6.1.3 F ö r b e r e d e l s e a v i n o k u l a t 
Aktiverat slam från ett biologiskt reningsverk tvättas (flera gånger) 
med testvatten (se ovan) genom centrifugering eller dekantering. 
Det aktiverade slammet ska vara i ett lämpligt tillstånd. Sådant slam 
kan fås från ett väl fungerande reningsverk som huvudsakligen be ­
handlar spillvatten. För att få så många olika bakteriestammar som möjligt kan det vara bättre att blanda inokulat från olika källor (t.ex. 
från olika reningsverk, från jord, från flodvatten, etc.). 
De aktiverade slammets livskraft kontrolleras, se. ”lämplighetskontroll”.
 
1.6.1.4 F r a m s t ä l l n i n g a v t e s t l ö s n i n g a r n a 
1 testbehållarna placeras 500 ml vatten, 2,5 ml lösning av oorganiska 
näringsämnen per liter samt en mängd aktiverat slam som motsvarar 0,2–1,0 g torrämne per liter färdig blandning. Tillsätt tillräckligt med 
stamlösning av testämnet så att den färdiga blandningen får en DOC- 
koncentration av 50–400 mg/l. Motsvarande COD-intervall är 100–1 000 mg/l. Fyll upp med testvatten till en total volym av 1–4 liter. Den totala volym som väljs beror på det antal prover 
som ska tas för DOC-eller COD-bestämning, och den nödvändiga 
analysvolymen. 
Normalt kan en volym av 2 1 anses tillräcklig. Minst en kontroll ­
behållare (blindprov) ska göras i ordning samtidigt med varje test ­
sene. Den innehåller endast aktiverat slam och lösning av oorganiska näringsämnen utspätt med vatten till samma totalvolym som i test ­
behållarna.
 
1.6.2  Testförfarande  
Testbehållarna omrörs med magnetomrörare eller propelleromrörare i 
indirekt belysning eller i mörker vid 20–25  o C. Luftning sker med 
komprimerad luft som om nödvändigt rensas med ett vadd-filter och 
en tvättflaska. Man måste se till att slammet inte sätter sig och att syrekoncentrationen inte sjunker under 2 mg/l. 
pH-värdet måste kontrolleras regelbundet (t.ex. dagligen) och vid 
behov justeras till pH 7–8.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1056
 
Strax före provtagning kompenseras vattenförlust på grund av fö ­
rångning genom tillsättning av avjoniserat eller destillerat vatten. 
Man kan t.ex. märka vätskehöjden i behållaren innan testet inleds. Nya markeringar ritas dit efter varje provtagning (utan luftning och omrörning). De första proverna tas alltid tre timmar efter testets 
inledning så att man kan konstatera om testmaterialet absorberas 
på det aktiverade slammet. 
Elimineringen av testämnet följs genom DOC- eller COD-bestäm ­
ningar antingen dagligen eller regelbundet med andra intervaller. Proverna från testbehållaren och blindprovet filtreras genom ett nog ­
grant tvättat pappersfilter. De första 5 ml av filtratet kasseras. Slam 
som är svårt att filtrera kan avlägsnas först genom centrifugering i tio minuter. Minst dubbla bestämningar av DOC och COD ska göras. Testet varar i upp till 28 dagar.  
Obs!  Prover som stadigt är grumliga filtreras genom ett membranfilter. 
Membranfiltren får varken frigöra eller absorbera organiska material.
 
F u n k t i o n s k o n t r o l l a v a k t i v e r a t s l a m 
I varje testserie bör det ingå en behållare som innehåller ett känt 
ämne så att man kan kontrollera funktionen av det aktiverade slam ­
met. 1 detta syfte är dietynglykol lämpligt.  
A d a p t i o n 
Om analyser utförs med relativt korta mellanrum (t.ex. dagligen) kom ­
mer adaption att framgå tydligt av nedbrytningskurvan (se figur 2). Testet bör därför inte inledas omedelbart före helgen. 
Om adaption förekommer i slutet av testet kan testet förlängas tills 
nedbrytningen är avslutad.  
Obs!  Om det finns behov av att veta mer om det adapterade slam ­
mets beteende utsätts samma aktiverade slam ytterligare en gång för samma testmaterial enligt följande förfarande: 
Stäng av omröraren och luftaren och låt det aktiverade slammet sätta 
sig. Avlägsna överstående vätska, fyll på upp till 2 liter med test ­
vatten och rör om i 15 minuter och låt sedan blandningen sätta sig igen. Sedan överstående vätska avlägsnats används det överblivande slammet för att upprepa testet i enlighet med 1.6.1.4 och 1.6.2 ovan. 
Det aktiverade slammet kan även isoleras genom centrifugering istäl ­
let för utfällning. 
Det adapterade slammet kan blandas med färskt slam till en kon ­
centration av 0,2–1,0 g torrvikt/l.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1057
 
A n a l y s 
Normalt filtreras prover genom ett noggrant tvättat pappersfilter (för 
tvättning används avjoniserat vatten). 
Prover som stadigt är oklara filtreras genom ett membranfilter 
(0,45 μm). 
En dubbelbestämning av DOC-koncentrationen i provfiltraten görs 
(de första 5 ml kasseras) med TOC-instrument. Om filtratet inte kan 
analyseras samma dag ska det förvaras i kylskåp till nästa dag. 
Längre tids förvaring rekommenderas inte. 
COD-koncentrationen bestäms i provfiltraten med COD-koncent ­
rationsutrustning i enlighet med det förfarande som beskrivs i hän ­
visning 2 nedan.  
2. DATA OCH UTVÄRDERING  
Minst dubbelbestämning av DOC- och COD-koncentrationerna i pro ­
verna görs i enlighet med 1.6.2. Nedbrytbarheten vid tidpunkten T 
beräknas med hjälp av den formel (med definitioner) som anges i 1.2. 
Nedbrytningsgraden beräknas till närmaste hela procenttal. De ned ­
brytning som erhålls vid slutet av testet anges som ”bionedbrytbar ­
heten vid Zahn-Wellens test”.  
Obs!  Om fullständig nedbrytning inte uppnås innan testperioden är 
slut och detta resultat bekräftas genom en ytterligare analys följande dag kan testet avslutas.
 
3. RAPPORTERING  
3.1 TESTRAPPORT 
Testrapporten ska om möjligt innehålla minst följande: 
— Testämnets initiala koncentration. 
— Alla andra upplysningar och försöksresultat i fråga om testämnet, 
en eventuell referensämne och blindförsöket. 
— Koncentrationen efter tre timmar. — Kurva över bionedbrytningen med förklaring. 
— När och var provorganismerna är tagna, adaptionsgrad, använd 
koncentration, etc. 
— Vetenskapliga motiveringar för eventuella ändringar av testför ­
farandet.
 
3.2 TOLKNING AV RESULTAT 
Den förlust av DOC (COD) som sker gradvis över dagar eller veckor 
är ett tecken på bionedbrytbarhet hos testämnet.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1058
 
Fysikalisk-kemisk absorption kan dock i vissa fall spela en viss roll 
och ett tecken på detta är att före de första tre timmarna sker full ­
ständig eller delvis förlust och att skillnaden mellan överstående vätska från kontroll- och testproverna förblir på en oväntat läg nivå. 
Det är nödvändigt att göra ytterligare tester om man ska kunna skilja 
på bionedbrytning (eller delvis bionedbrytning) och absorption. 
Detta kan göras på flera olika sätt, men det mest övertygande är att 
använda överstående vätska som inokulum i en bassettest (helst ett 
respirometriskt test). 
Testämnen som visar en hög förlust av DOC (COD), som inte beror 
på absorption, vid denna test bör betraktas som potentiellt bioned ­
brytbara. Delvis förlust som inte beror på absorption, betyder att 
kemikalien i varje fall i en viss omfattning bryts ned biologiskt. 
Låg eller ingen förlust av DOC (COD) kan bero på att testämnet 
hämmar mikroorganismerna. Detta kan med tiden också visa sig genom att slammet upplöses och försvinner, varvid överstående 
vätska blir grumlig. Testet bör upprepas med en lägre koncentration 
testämne. Användning av ett ämnesspecifik analysmetod eller
 14 C- 
markerat testämne kan ge större känslighet. Om  14 C-markerat tes ­
tämne används kommer återhämtning av  14 CO 2 bekräfta att det ror 
sig om bionedbrytbarhet. 
Om resultaten anges som primär bionedbrytbarhet bör det om möjligt 
anges en förklaring på den kemiska strukturförändringen som leder till avsaknaden av analysresultat för det ursprungliga testämnet. 
Valet av analysmetoder ska motiveras och analysresultaten för blind ­
proven ska anges.
 
4. HÄNVISNINGAR  
1. OECD, Paris (1981),  Test Guideline  302 B, rådets beslut K(81) 
30 slutlig. 
2. Bilaga V C.9 Nedbrytning – kemiskt syrebehov, kommissionens 
direktiv 84/449/EEG,  Europeiska gemenskapernas officiella tid ­
ning L 251, 19.9.1984.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1059
 
Tillägg  
EXEMPEL PÅ UTVÄRDERING 
Organisk förbindelse: 4-etoxybenzoesyra 
Teoretis testkoncentration: 600 mg/l Teoretisk DOC: 390 mg/l 
Inoculat: Reningsverk 
Koncentration: 1 g torrämne per liter Enventuell adaption: inte adapterat Analys: DOC-bestämning 
Testmängd: 3 ml 
Kontrollämne: Dietylenglykol Ämnets toxicitet: Ingen toxicitet under 1 000 
Använt test: fermenteringsglastestmg/l
 
Tidpunkt Kontrollämne Testämne 
Blindprov 
DOC (  1 ) 
(mg/l) DOC (  1 ) 
(mg/l) DOC netto 
(mg/l) Nedbryt­
ning 
( %) DOC (  1 ) 
(mg/l) DOC netto 
(mg/l) Nedbryt­
ning 
( %) 
0 — — 300,0 — — 390,0 — 
3 timmar 4,0 298,0 294,0 2 371,6 367,6 6 
1 dag 6,1 288,3 282,2 6 373,3 367,2 6 
2 dagar 5,0 281,2 276,2 8 360,0 355,0 9 5 dagar 6,3 270,5 264,2 12 193,8 187,5 52 6 dagar 7,4 253,3 245,9 18 143,9 136,5 65 7 dagar 11,3 212,5 201,2 33 104,5 93,2 76 8 dagar 7,8 142,5 134,7 55 58,9 51,1 87 9 dagar 7,0 35,0 28,0 91 18,1 11,1 97 10 dagar 18,0 37,0 19,0 94 20,0 2,0 99
 
( 1 ) Medelvärde av tre bestämningar.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1060
 
Figur 1  
Exempel på kurvor över bionedbrytning
  
Figur 2  
Exempel på slamadaption
  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1061
 
C.10  SIMULATIONSTEST AEROB AVLOPPSVATTENBEHANDLING 
C.10-A: ENHETERNA FÖR AKTIVERAT SLAM – C.10-B 
BIOFILMER  
C.10-A : Enheterna för aktiverat slam  
INLEDNING 
1. Denna testmetod motsvarar OECD:s testriktlinje 303 (2001). På 1950-talet 
insåg man att de ytaktiva ämnen som nyligen tagits i bruk orsakade kraftig skumbildning i avloppsreningsverk och i vattendrag. De avlägsnades inte 
helt under den aeroba behandlingen och i vissa fall kunde annat organiskt 
material inte avlägsnas. Detta föranledde många undersökningar om hur ytaktiva ämnen kunde avlägsnas från avloppsvatten och huruvida nya ke ­
mikalier producerade av industrin svarade på avloppsvattenrening. För detta 
användes modeller som representerar de två huvudtyperna av aerob bio ­
logisk avloppsvattenrening (aktiverat slam och perkolations- eller bakteri ­
efilter). Det hade varit mycket opraktiskt och dyrt att distribuera varje ny 
kemikalie och övervaka storskaliga reningsverk, även på lokal basis.
 
INLEDANDE ÖVERVÄGANDEN  
Enheterna för aktiverat slam  
2. I beskrivningarna har modellerna för enheterna för aktiverat slam varierat i 
storlek mellan 300 ml och cirka 2 000 ml. Vissa av modellerna hade stora likheter med storskaliga anläggningar, med slamsedimenteringstankar där 
det sedimenterade slammet pumpas tillbaka till luftningstanken, medan an ­
dra inte hade sedimenteringsutrustning, t.ex. Swisher (1). Apparaturens stor ­
lek är en kompromiss – å ena sidan måste den vara tillräckligt stor för att de mekaniska operationerna ska fungera väl och för att tillåta tillräcklig prov ­
tagningsvolym utan att påverka själva operationen och å andra sidan får den 
inte vara så stor att utrymmes- och materialbehoven blir för stora. 
3. Två typer av utrustning som har använts i omfattande utsträckning och med 
tillfredsställande resultat är Husmann-enheter (2) och Porous Pot-enheter (3) (4), som först användes för studier av ytaktiva ämnen; dessa beskrivs i 
denna testmetod. Även andra enheter har använts med framgång, t.ex. Ec ­
kenfelder (5). Detta simuleringstest är relativt dyrt och resurskrävande, och därför gjordes en parallell undersökning av enklare och förmånligare screen ­
ingtest (se kapitel C.4 A–F i denna bilaga) (6). Erfarenheterna med olika 
ytaktiva ämnen och andra kemikalier har visat att de som klarade screen ­
ingtest (lätt nedbrytbara) också bröts ned vid simuleringstestningen. Vissa av dem som inte klarade screeningtest klarade test för lättnedbrytbarhet (kapit ­
len C.12.7 och C.19.8 i denna bilaga), men endast en del i denna senare 
grupp bröts ned vid simuleringstest, medan de kemikalier som inte klarade 
test för lättnedbrytbarhet inte bröts ned i simuleringstest (9) (10) 11). 
4. För vissa ändamål kan simuleringstest som gjorts vid en enda uppsättning 
betingelser vara tillräckliga, och då uttrycks resultaten som en procentandel avlägsnad kemikalie eller upplöst organiskt kol (DOC). En beskrivning av 
ett sådant test ges i denna testmetod. Till skillnad från den tidigare versionen 
av detta kapitel, där endast en enda typ av apparatur för behandling av
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1062
 
syntetiskt avloppsvatten i kopplad utformning med användning av en relativt 
primitiv metod för kassering av slam beskrevs, erbjuder denna beskrivning 
ett antal variationer. Den innehåller beskrivningar av alternativa typer av apparatur, arbetssätt, avloppsvatten och avlägsnande av kasserat slam. Denna text följer nära texten till ISO 11733 (12), som granskades i detalj 
vid utarbetningen, även om metoden inte har varit föremål för ringtest. 
5. För andra ändamål krävs en mer exakt kännedom om testkemikaliens kon ­
centration i utflödet, vilket i sin tur kräver en mer omfattande metod. Som exempel kan nämnas att kasseringen av slam måste kontrolleras exaktare under varje dag och under hela testperioden, och enheterna måste köras med 
ett antal olika andelar kasserat slam. För en heltäckande metod bör tester 
även köras vid två eller tre olika temperaturer; en sådan metod beskrivs av Birch (13) (14) och sammanfattas i tillägg 6. De nuvarande kunskaperna är dock inte tillräckliga för att slå fast vilken av de kinetiska modellerna som 
kan tillämpas på biologisk nedbrytbarhet för kemikalier vid avloppsrening 
och allmänt taget i vattenmiljö. Tillämpningen av Monod-kinetik (exempel ges i tillägg 6) begränsas till kemikaliehalter på minst 1 mg/l, men det finns de som anser att även detta återstår att bevisa. I tillägg 7 anges tester vid 
koncentrationer som mer sanningsenligt återspeglar koncentrationerna i av ­
loppsvatten, men sådana tester och tester enligt tillägg 6 finns angivna i tilläggen, och inte som separata testmetoder.
 
Filter  
6. Modelleringen av perkolationsfilter har ägnats mycket mindre uppmärksam ­
het, kanske för att de är besvärliga och mindre kompakta än modellerna för aktivslamanläggningar. Gerike m.fl. utvecklade enheter med bakteriefilter 
(trickling filter) och använde enheterna i kopplat utförande (15). Dessa filter 
var relativt stora (höjd 2 m, volym 60 l) och varje filter krävde så mycket som 2 liter avloppsvatten i timmen. Baumann m.fl. (16) simulerade bakte ­
riefilter genom att fylla 1 m långa rör (14 mm innerdiameter) med remsor av 
polyesterfleece som först hade hållits i koncentrerat aktiverat slam i 30 
minuter. Testkemikalien i form av ensam kolkälla i en mineralsaltlösning matades ned i det vertikala röret och den biologiska nedbrytbarheten be ­
dömdes enligt mätningar av DOC i utflödet och CO
 2 i utkommande gas. 
7. Biofilter har även simulerats på annat sätt (15) – innerytorna i roterande rör 
som har en lätt horisontell lutning matas med avloppsvatten (cirka 250 
ml/timme) med och utan testkemikalie, och de uppsamlade utflödena ana ­
lyseras för DOC och/eller den berörda testkemikalien.  
PRINCIP FÖR TESTMETODEN 
8. Denna metod är avsedd för att bestämma eliminering samt primär och/eller 
slutlig biologisk nedbrytning av vattenlösliga organiska kemikalier som görs av aeroba mikroorganismer i ett kontinuerligt fungerande testsystem som simulerar aktivslamprocessen. Ett lättnedbrytbart organiskt medium och 
den organiska testkemikalien fungerar som kolkälla och energikälla för 
mikroorganismerna. 
9. Två kontinuerligt arbetande testenheter (aktivslamanläggningar eller Porous 
Pot-enheter körs parallellt under identiska betingelser som väljs enligt tes ­
tändamålet. Normalt är den hydrauliska medelretentionstiden 6 timmar och 
slammets medelålder (slamretentionstid) 6–10 dagar. Slam kasseras genom 
en av två metoder, testkemikalien tillsätts i regel i en koncentration mellan 10 mg/l upplöst organiskt kol (DOC) och 20 mg/l DOC till inflödet (or ­
ganiskt medium) endast till en av enheterna. Den andra enheten används 
som kontrollenhet för att bestämma den biologiska nedbrytbarheten för det 
organiska mediet.
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1063
 
10. Frekvent tagna prover av utflödet analyseras för DOC (helst) eller kemisk 
syreförbrukning (COD), samt koncentrationen av testkemikalie (om så krävs 
genom specifik analys) i utflödet från enheten som matas med testkemikalie. Skillnaden mellan utflödeskoncentrationerna DOC eller COD i test- och kontrollenheterna antas bero på testkemikalien eller dess organiska metabo ­
liter. Denna skillnad jämförs med inflödets koncentration DOC eller COD 
på grund av testkemikalien, för att bestämma elimineringen av testkemika ­
lien. 
11. Den biologiska nedbrytbarheten kan i regel särskiljas från biologisk adsorp ­
tion genom detaljerad analys av eliminering/tid-kurvan och kan ofta bekräf ­
tas genom test för biologisk lättnedbrytbarhet med användning av acklimati ­
serat inokulat från enheten som matas med testkemikalie.
 
INFORMATION OM TESTKEMIKALIEN 
12. Testkemikaliens renhet, vattenlöslighet, flyktighet och adsorptionsegenska ­
per bör vara kända, för att resultaten ska kunna tolkas korrekt. I regel kan flyktiga och olösliga kemikalier inte testas, om inte särskilda åtgärder vidtas 
(se tillägg 5). Likaså bör den kemiska strukturen eller minst den empiriska 
formeln vara känd, med tanke på kalkylering av teoretiska värden och/eller kontroll av uppmätta parametervärden, t.ex. teoretisk syreförbrukning (ThOD), upplöst organiskt kol (DOC) och kemisk syreförbrukning (COD). 
13. Information om testkemikaliens toxicitet för mikroorganismer (se tillägg 4) 
kan vara till nytta vid val av lämpliga testkoncentrationer och kan vara väsentlig för en korrekt tolkning av låga värden för biologisk nedbrytbarhet.
 
GODKÄNNANDENIVÅER 
14. Enligt den ursprungliga tillämpningen av detta simuleringstest (bekräftande 
test) på primär biologisk nedbrytning av ytaktiva ämnen krävs mer än 80 % 
eliminering av den berörda kemikalien för att det ytaktiva ämnet ska få 
släppas ut på marknaden. Om 80 % eliminering inte uppnås, kan detta simuleringstest (bekräftande test) tillämpas, och det ytaktiva ämnet får en ­
dast släppas ut på marknaden förutsatt att mer än 90 % av kemikalien 
elimineras. Generellt gäller för kemikalier inte frågan om godkänt/ej god ­
känt, och värdet på den procentuella eliminering som erhållits kan användas i uppskattningsberäkningar av den sannolika miljökoncentration som kan användas vid farobedömning för kemikalier. Resultaten tenderar att följa 
ett ”allt eller inget”-mönster. I ett antal studier av rena kemikalier konsta ­
terades att elimineringsprocenten för DOC var > 90 % i mer än tre fjärde ­
delar av fallen och > 80 % i över 90 % av fallen för kemikalier som över huvud taget visade betydande grad av biologisk nedbrytbarhet. 
15. Relativt få kemikalier (t.ex. ytaktiva ämnen) förekommer i avloppsvatten i 
de koncentrationer (cirka 10 mg C/l) som används i detta test. Vissa kemi ­
kalier kan vara hämmande vid dessa koncentrationer, medan eliminerings ­
kinetiken för andra kemikalier kan vara annorlunda vid låga koncentrationer. 
En exaktare bedömning av nedbrytningen kan göras med användning av 
modifierade metoder med realistiskt låga koncentrationer av testkemikalien, och erhållna data kan användas för att beräkna kinetiska konstanter. De nödvändiga försöksteknikerna har dock ännu inte utvärderats till fullo och 
de kinetiska modeller som beskriver reaktionerna vid biologisk nedbrytning 
har inte heller fastställts (se tillägg 7).
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1064
 
REFERENSKEMIKALIER 
16. För att säkerställa att försöksförfarandet genomförs korrekt är det lämpligt 
att med vissa mellanrum testa kemikalier med känt beteende samtidigt som testkemikalier undersöks. Sådana kemikalier är adipinsyra, 2-fenylfenol, 1- 
naftol, 2,2’-bifenyldikarboxylsyra, 1-naftoesyra osv. (9) (10) (11).
 
TESTRESULTATENS REPRODUCERBARHET 
17. Det finns betydligt färre rapporter från studier rörande simuleringstest än 
från test rörande lätt bionedbrytbarhet. Reproducerbarheten mellan (simulta ­
na) replikat är god (inom 10–15 %) för testkemikalier som bryts ner till 
minst 80 %, men för kemikalier som är mindre nedbrytbara är variationen 
större. Mycket varierande resultat (t.ex. 10 %, 90 %) har även noterats för vissa gränskemikalier vid olika tillfällen inom de nio veckor som gäller för testningen. 
18. Endast små skillnader har konstaterats i resultat som erhållits med de två 
typerna av apparatur, men vissa kemikalier har brutits ned i större omfatt ­
ning och mer genomgående vid användning av avloppsvatten från hushåll än 
vid användning av syntetiskt avloppsvatten enligt OECD.
 
METODBESKRIVNING  
Apparatur  
Testsystem  
19. Testsystemet för en testkemikalie består av en testenhet och en kontrollen ­
het, men när endast specifika analyser görs (primär biologisk nedbrytbarhet) 
behövs endast en testenhet. En och samma kontrollenhet kan användas för flera testenheter som matas med samma eller olika testkemikalier. Om kopp ­
ling används (tillägg 3) måste varje testenhet ha en separat kontrollenhet. 
Testsystemet kan vara en modell av aktivslamanläggning, Husmann-enhet 
(tillägg 1, figur 1) eller Porous Pot (tillägg 1, figur 2). I båda fallen behövs tillräckligt stora förvaringskärl för inflöde och utflöde, såväl som pumpar för att dosera inflödet, antingen blandat med testkemikalie eller separat. 
20. Varje aktivslamanläggning består av ett luftningskärl med en känd kapacitet 
på cirka 3 liter aktiverat slam och en separator (sekundärsedimentering) som rymmer cirka 1,5 liter. Volymerna kan i viss utsträckning få variera om 
separatorns höjd justeras. Kärl av olika storlek tillåts om de används med 
jämförbara hydrauliska belastningar. Om det inte är möjligt att hålla tempe ­
raturen i testningsrummet inom rätt intervall rekommenderas användning av mantlade kärl med temperaturkontrollerat vatten. En mammutpump (airlift 
pump) eller doseringspump används för att återföra aktivslammet från sepa ­
ratorn till luftningskärlet, antingen kontinuerligt eller intermittent. 
21. Porous Pot-systemet består av en inre porös cylinder med konisk botten 
innanför ett lite större kärl med samma form men gjort av ett ogenomträng ­
ligt plastmaterial. Lämpligt material för innerkärlet är poröst polyetylen med maximal porstorlek på 90 μm och 2 mm tjocklek. Slammet separeras från 
det behandlade organiska mediet genom differentierad passage genom den 
porösa väggen. Utflödet går till det omgivande utrymmet från vilket det 
flödar över till uppsamlingskärlet. Ingen sedimentering sker och därför ingen
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1065
 
återföring av slam. Hela systemet kan monteras in i ett termostatkontrollerat 
vattenbad. Porous Pots kan till en början blockeras och flöda över. Ersätt då 
den porösa fodringen med en ren fodring genom att först sifonera slammet från innerkärlet till ett rent kärl och ta ut den blockerade fodringen. När den ogenomträngliga yttre cylindern har rengjorts kan ett rent innerkärl sättas in 
och slammet tillsättas på nytt. Det slam som finns längs den blockerade 
fodringens väggar ska också skrapas loss omsorgsfullt och överföras. Ren ­
gör blockerade innerkärl genom att först avlägsna slamrester med en fin vattenstråle och därefter blötlägga i utspädd lösning av natriumhypoklorit, 
sedan i vatten, och därefter omsorgsfullt skölja med vatten. 
22. För luftning av slammet i luftningskärlen i båda systemen krävs lämpliga 
system, t.ex. sintrade kuber (diffusorstenar) och tryckluft. Vid behov ska 
luften rengöras genom passage genom lämpligt filter och tvätt. Systemet måste ha genomflöde av tillräckligt med luft för att aeroba betingelser ska bibehållas och slamflockarna hållas suspenderade under hela testningen.
 
Filtreringsapparatur eller centrifug  
23. Utrustning för filtrering av prover med membranfilter av lämplig porstorlek 
(nominell öppningsdiameter 0,45 μm) som adsorberar lösliga organiska ke ­
mikalier och har minimalt utsläpp av organiskt kol. Om de filter som an ­
vänds avger organiskt kol ska de tvättas försiktigt med hett vatten för att 
avlägsna detta kol. Alternativt kan man använda en centrifug som når upp till 40 000 m/s
 2 . 
Analysutrustning  
24. Apparatur som krävs för att bestämma 
— DOC (upplöst organiskt kol) eller COD (kemisk syreförbrukning), 
— specifik kemikalie, om så krävs, — suspenderade fasta ämnen, pH, syrehalten i vatten, — temperatur, surhet och alkalinitet, — ammonium, nitrit och nitrat, om testet genomförs under nitrifikations ­
förhållanden.
 
Vatten  
25. Kranvatten med mindre än 3 mg/l DOC. Bestäm alkaliniteten, om den inte 
redan är känd. 
26. Avjoniserat vatten med mindre än 2 mg/l DOC.  
Organiskt medium  
27. Syntetiskt avloppsvatten, avloppsvatten från hushåll eller en blandning av 
båda kan användas som organiskt medium. Det har visat sig (11) (14) att användning av enbart avloppsvatten från hushåll ofta ger ökad procentandel 
DOC-eliminering och t.o.m. möjliggör eliminering och biologisk nedbryt ­
ning av vissa kemikalier som inte bryts ned när syntetiskt avloppsvatten enligt OECD används. Det betyder att kontinuerlig eller intermittent tillsätt ­
ning av avloppsvatten från hushåll ofta stabiliserar det aktiva slammet och 
även förbättrar sedimenteringsegenskaperna, som är en central faktor. Därför 
rekommenderas användning av avloppsvatten från hushåll. Mät DOC- eller COD-koncentrationen i varje ny sats av organiskt medium. Det organiska mediets surhet eller alkalinitet ska vara känd. Om det organiska mediet har 
låg surhet eller alkalinitet kan det krävas tillsats av lämplig buffert (natri ­
umvätekarbonat eller kaliumdivätefosfat) för att pH i luftningskärlet ska hållas kring 7,5 ± 0,5 under testet. Mängden buffert och tillsättningstidpunk ­
ten måste fastställas separat i varje enskilt fall. Om blandningar används 
antingen kontinuerligt eller intermittent, måste blandningens DOC (eller 
COD) hållas på ungefär konstant nivå t.ex. genom utspädning med vatten.
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1066
 
Syntetiskt slam  
28. Per liter kranvatten upplöses följande: 160 mg pepton, 110 mg köttextrakt, 
30 mg urea, 28 mg vattenfritt dikaliumvätefosfat (K  2 HPO  4 ), 7 mg natri ­
umklorid (NaCl), 4 mg kalciumkloriddihydrat (CaCl  2 ·2H 2 O) och 2 mg mag ­
nesiumsulfatheptahydrat (Mg  2 SO 4 ·7H 2 O). Detta syntetiska avloppsvatten en ­
ligt OECD är ett exempel, och ger en medelkoncentration på cirka 100 mg/l DOC i inflödet. Alternativt kan man använda andra sammansättningar med ungefär samma DOC-koncentration, som ligger närmare verkligt avlopps ­
vatten. Om ett mindre koncentrerat inflöde krävs kan det syntetiska avlopps ­
vattnet spädas ut med kranvatten (t.ex. 1:1) för att få en koncentration på cirka 50 mg/l. En sådan lägre koncentration i inflödet ger bättre tillväxt av 
nitrifierande organismer, och denna modifiering bör användas om undersök ­
ningen gäller simulering av nitrifierande reningsverk. Detta syntetiska av ­
loppsvatten kan göras i destillerat vatten i en koncentrerad form och förvaras i 1 °C upp till en vecka. Späd vid behov ut med kranvatten. (Detta medium 
är dock inte tillfredsställande, kvävekoncentrationen är t.ex. mycket hög och 
kolhalten relativt låg, men det finns inga bättre förslag utom tillsättning av mera fosfat som buffert samt extra pepton).
 
Avloppsvatten från hushåll  
29. Använd färsk bottensats av avloppsvatten som samlas upp dagligen från 
reningsanläggningar som i huvudsak tar emot avloppsvatten från hushåll. Avloppsvattnet ska samlas upp före primär sedimentering, från primärsedi ­
menteringstankens överflödeskanal eller från matningen till aktivslamanlägg ­
ningen, och det ska till övervägande del vara fritt från grova partiklar. Avloppsvattnet kan lagras några dagar före användningen (i regel dock 
inte längre än sju dagar) vid cirka 4 °C, om det går att påvisa att DOC 
(eller COD) inte har sjunkit betydligt (mindre än 20 %) under lagringen. För att undvika systemstörningar ska DOC (eller COD) i varje ny sats justeras före användningen till ett lämpligt konstant värde, t.ex. genom utspädning 
med kranvatten.
 
Aktiverat slam  
30. Samla in aktiverat slam för inokulering från luftningstanken vid ett välskött 
reningsverk eller från en aktivslamenhet i laboratorieskala som i huvudsak 
tar emot avloppsvatten från hushåll.  
Stamlösningar av testkemikalien  
31. För kemikalier med rimlig löslighet bereds stamlösningar vid lämpliga kon ­
centrationer (t.ex. 1–5 g/l) i avjoniserat vatten eller i mineraldelen av syn ­
tetiskt avloppsvatten (för olösliga och flyktiga kemikalier, se tillägg 5). 
Bestäm DOC och totalt organiskt kol (TOC) för stamlösningen och upprepa 
mätningarna för varje ny sats. Om skillnaden mellan DOC och TOC är större än 20 % bör testkemikaliens vattenlöslighet kontrolleras. Jämför test ­
kemikaliens DOC eller koncentration uppmätt genom specifik analys av 
stamlösningen med det nominella värdet, för att kunna bedöma om utbytet 
är tillräckligt bra (i regel kan > 90 % förväntas). Särskilt för dispersioner bör man försäkra sig om att DOC kan användas som analytisk parameter; annars måste en analysteknik som är specifik för testkemikalien användas. För 
dispersioner krävs centrifugering av proverna. För varje ny sats bör mätning 
göras av DOC, COD eller testkemikalien med specifik analys.
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1067
 
32. Bestäm stamlösningens pH. Extremvärden tyder på att tillsats av kemikalien 
kan påverka pH-värdet för det aktiverade slammet i testsystemet. I så fall 
bör stamlösningen neutraliseras till pH 7 ± 0,5 med små mängder oorganisk syra eller bas, men utfällning av testkemikalien bör undvikas.
 
FÖRFARANDE 
33. Beskrivningen av förfarandet gäller för aktivslamenheter, och förfarandet 
måste i viss mån anpassas för Porous Pot-system.  
Förberedning av inokulat  
34. Inokulera testsystemet i början av testet med aktiverat slam eller ett inokulat 
med låg koncentration av mikroorganismer. Håll inokulatet luftat vid rums ­
temperatur fram tills det används (inom 24 timmar). Ta i det första fallet ett prov av aktiverat slam från luftningstanken vid ett välskött biologiskt re ­
ningsverk eller en laboratorieanläggning som i huvudsak tar emot avlopps ­
vatten från hushåll. Om nitrifikationsförhållanden ska simuleras, ta slam från 
ett reningsverk med nitrifikation. Bestäm halten suspenderade fasta ämnen och koncentrera vid behov slammet genom sedimentering så att den volym som tillsätts testsystemet är minimal. Se till att startkoncentrationen torrsub ­
stans är kring 2,5 g/l. 
35. Ta i det andra fallet 2–10 ml/l av utflödet från ett biologiskt reningsverk för 
avloppsvatten från hushåll som inokulat. För att få så många olika slags bakterier som möjligt kan inokulat tillsättas från flera olika källor, t.ex. 
ytvatten. I detta fall utvecklas och växer det aktiverade slammet i testsyste ­
met.
 
Dosering av organiskt medium  
36. Se till att inflödes- och utflödesbehållarna och rören från inflödeskärl och till 
utflödeskärl rengörs omsorgsfullt för att eliminera mikrobtillväxt initialt och under hela testet. Montera testsystemet i ett temperaturkontrollerat rum (i 
regel 20–25 °C) eller använd testenheter med mantel. Förbered en tillräcklig 
volym av det organiska medium som ska användas (punkterna 27–29). Fyll först luftningskärlet och separatorn med det organiska mediet och tillsätt sedan inokulat (punkterna 34, 35). Starta luftningen för att hålla slammet 
suspenderat och i aerob status och börja dosera inflöde och återföra sedi ­
menterat slam. Dosera organiskt medium ur lagringskärlen till test- och kontrollenheternas luftningskärl (punkterna 20, 21) och samla in utflödena i liknande lagringskärl. För att få den normala hydrauliska retentionstiden på 
6 timmar ska det organiska mediet pumpas med 0,5 l/tim. För att kontrollera 
detta mäts den dagliga mängden organiskt medium som doseras, genom att notera minskningen av volymen medium i lagringskärlen. För att bestämma effekterna av intermittent utsläpp och chockbelastning av kemikalier behövs 
andra doseringssätt. 
37. Om det organiska mediet förbereds för användning för en period längre än 1 
dag behövs kylning vid cirka 4 °C eller andra lämpliga konserveringsmeto ­
der för att förebygga mikrobtillväxt och biologisk nedbrytning utanför tes ­
tenheterna (punkt 29). Om syntetiskt avloppsvatten används kan detta för ­
beredas och förvaras vid cirka 4 °C som koncentrerad stamlösning (t.ex. 10- faldig koncentration jämfört med den normala, se punkt 28). Denna stamlös ­
ning kan sedan blandas omsorgsfullt med lämplig volym kranvatten före 
användning eller alternativt pumpas direkt medan lämplig mängd kranvatten 
pumpas separat.
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1068
 
Dosering av testkemikalie  
38. Tillsätt en lämplig volym stamlösning av testkemikalien (punkt 31) till lag ­
ringskärlet för inflöde eller dosera direkt med en separat pump till luftnings ­
kärlet. Den normala medelkoncentrationen av testkemikalie i inflödet ska 
vara mellan 10 och 20 mg/l DOC, och den högsta koncentrationen får inte 
överskrida 50 mg/l. Om testkemikalien har dålig vattenlöslighet eller om det sannolikt uppstår toxiska effekter, ska koncentrationen sänkas till 5 mg/l DOC eller lägre, men detta förutsätter att det finns en lämplig specifik 
analysmetod som kan användas (dispergerade testkemikalier som är dåligt 
vattenlösliga kan tillsättas med användning av speciella doseringstekniker, se tillägg 5). 
39. Tillsättning av testkemikalie inleds efter en period under vilken systemet 
stabiliseras och det organiska mediets DOC avlägsnas effektivt (cirka 80 %). 
Det är viktigt att före tillsättningen av testkemikalie kontrollera att alla 
enheter arbetar lika effektivt, och om de inte gör det kan detta i regel avhjälpas genom att blanda de enskilda slammen och återfördela lika stora volymer till enheterna. När inokulat med cirka 2,5 g/l (torrvikt) aktiverat 
slam används, kan testkemikalien tillsättas från testets början, eftersom di ­
rekt tillsats av ökande mängder från början ger den fördelen att det aktive ­
rade slammet bättre kan anpassa sig till testkemikalien. Oberoende av hur testkemikalien tillsätts, rekommenderas att relevant flödeshastighet och/eller 
volymerna i lagringskärl mäts regelbundet.
 
Hantering av aktiverat slam  
40. Koncentrationen av fasta ämnen i aktiverat slam stabiliseras i regel under 
testets gång oberoende av vilket inokulat som används, inom gränserna 1–3 
g/l (torrvikt), beroende på det organiska mediets kvalitet och koncentration, 
driftsbetingelserna, karaktären hos närvarande mikroorganismer och test ­
kemikaliens påverkan. 
41. Bestäm koncentrationen suspenderade fasta ämnen i luftningskärlen minst 
varje vecka och kassera överskottsslam för att bibehålla en koncentration på 1–3 g/l (torrvikt); alternativt se till att slammets medelålder hålls konstant, i 
regel 6–10 dagar. Om slamretentionstiden är t.ex. 8 dagar, bör varje dag 1/8 
av volymen aktiverat slam i luftningskärlet avlägsnas och kasseras. Detta bör göras dagligen eller helst med användning av en automatisk intermittent arbetande pump. Att hålla koncentrationen suspenderade fasta ämnen kon ­
stant eller inom snäva gränser upprätthåller inte en konstant slamretentions ­
tid, som är den variabel som avgör koncentrationen av testkemikalie i utflödet. 
42. Avlägsna minst dagligen under testets gång allt slam som fastnat på luft ­
ningskärlets och separatorns väggar för att återföra slammet till suspensio ­
nen. Kontrollera och rengör regelbundet alla rör för att förebygga tillväxt av 
biofilm. Återför sedimenterat slam från separatorn till luftningskärlet, helst 
genom intermittent pumpning. I ett Porous Pot-system sker ingen återföring, men se till att rena innerkärl sätts in innan volymen i kärlen stiger betydligt (punkt 21). 
43. I Husmann-enheter kan det förekomma dålig sedimentering och förlust av 
slam. Detta kan rättas till genom en eller flera av nedan förtecknade åtgär ­
der, parallellt i test- och kontrollenheterna: 
— Färskt slam eller flockningsmedel (t.ex. 2 ml/kärl med 50 g/l FeCl
 3 ) kan 
tillsättas regelbundet, t.ex. varje vecka, men se till att FeCl  3 inte reagerar 
med eller leder till utfällning av testkemikalien.  ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1069
 
— Mammutpumpen kan ersättas med en peristaltisk pump som ger ett 
slamåterföringsflöde som ungefär motsvarar det inflöde som ska använ ­
das och ger utveckling av en anaerob zon i det sedimenterade slammet (mammutpumpens geometri begränsar minimiflödet återfört slam till cirka 12-faldigt jämfört med inflödet). 
— Slammet kan pumpas intermittent från separatorn till luftningskärlet 
(t.ex. 5 minuter per 2,5 timmar för att återföra 1–1,5 l/tim. 
— Ett giftfritt skumhämmande medel (t.ex. silikonolja) i minimikon ­
centration kan användas för att förhindra förlust genom skumbild ­
ning. 
— Luft kan ledas genom slammet i separatorn i korta kraftiga strålar 
(t.ex. 10 sekunder per timme). 
— Det organiska mediet kan doseras intermittent till luftningskärlet 
(t.ex. 3–10 minuter per timme).
 
Provtagning och analys  
44. Mät regelbundet koncentrationen upplöst syre, temperatur och pH i det 
aktiverade slammet i luftningskärlen. Se till att det alltid finns tillräckligt med syre (> 2 mg/l) och att temperaturen hålls inom det rekommenderade 
intervallet (i regel 20–25 °C). Håll pH vid 7,5 ± 0,5 genom att dosera små 
mängder oorganisk bas eller syra till luftningskärlet eller till inflödet, eller genom att öka det organiska mediets buffertkapacitet (se punkt 27). Om nitrifikation inträffar produceras syra, och oxidationen av 1 mg N producerar 
cirka 7 mg CO
 3 – . Mätningsfrekvensen beror på vilka parametrar som mäts 
och på systemets stabilitet, och kan variera mellan dagliga och veckovisa mätningar. 
45. Mät DOC eller COD i inflödena till kontroll- och testkärlen. Mät testkemi ­
kaliens koncentration i testinflödet genom specifik analys eller uppskatta koncentrationen utifrån koncentrationen i stamlösningen (punkt 31), den använda volymen och mängden avloppsvatten som doseras in i testenheten. 
För att minska variationen hos koncentrationsdata rekommenderas att test ­
kemikaliens koncentration beräknas. 
46. Ta lämpliga prover från uppsamlat utflöde (t.ex. 24 timmars sammansatt 
prov) och filtrera genom ett membran med porstorlek 0,45 μm eller cen ­
trifugera vid cirka 40 000 m
 2 i cirka 15 minuter. Centrifugering bör använ ­
das om filtreringen är svår att utföra. Bestäm DOC eller COD minst i duplikat för att mäta slutlig biologisk nedbrytning och vid behov primär 
biologisk nedbrytning genom en specifik analys av testkemikalien. 
47. Bestämning av COD kan ge upphov till analysproblem vid låga koncent ­
rationer och rekommenderas därför endast om den använda testkoncentratio ­
nen är tillräckligt hög (cirka 30 mg/l). För starkt adsorberande kemikalier 
rekommenderas också att mängden adsorberad kemikalie i slammet mäts med en analysteknik som är specifik för testkemikalien. 
48. Provtagningsfrekvensen beror på testets förväntade tidslängd. Rekommende ­
rad frekvens är tre gånger per vecka. När enheterna har börjat fungera effektivt, vänta minst 1 vecka och högst 6 veckor efter tillförsel av test ­
kemikalien för att anpassningen ska nå stabila förhållanden (steady state). 
Försök få minst 15 giltiga värden från platåfasen (punkt 59), som normalt 
varar i 3 veckor, för utvärdering av testresultaten. Testet kan avslutas när tillräcklig elimineringsgrad nås (t.ex. > 90 %) och de 15 värden som repre ­
senterar analyser som genomförts varje veckodag under 3 veckor finns att 
tillgå. Normalt ska testet inte pågå längre än 12 veckor från tillsättning av 
testkemikalien.
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1070
 
49. Om slammet nitrifieras och testkemikaliens effekter på nitrifikationen ska 
undersökas, bör prover från utflödet från test- och kontrollenheterna analy ­
seras minst en gång per vecka 
50. Alla analyser bör utföras så snart som möjligt, särskilt kvävebestämningarna. 
Om analyser måste senareläggas bör proverna förvaras i mörker vid cirka 4 °C i helt fyllda och tätt förslutna flaskor. Om proverna måste förvaras längre än 48 timmar bör de konserveras genom djupfrysning, syrabehand ­
ling (t.ex. 10 ml/l av en 400 g/l-svavelsyralösning) eller genom tillsats av 
lämpligt gift (t.ex. 20 ml/l av en 10 g/l-lösning av kvicksilver(II) klorid). Se till att konserveringstekniken inte påverkar analysresultaten.
 
Koppling av testenheter  
51. Om koppling används (tillägg 3) bör samma mängd aktiverat slam 
(150–1 500 ml för luftningstankar som innehåller 3 liter vätska) dagligen bytas mellan testenhetens luftningskärl och kontrollenheten. Om testkemika ­
lien adsorberas starkt på slammet, bör endast separatorernas supernatant 
bytas. I båda fallen bör en korrektionsfaktor användas för beräkning av testresultaten (punkt 55).
 
DATA OCH RAPPORTERING  
Behandling av resultaten  
52. Beräkna procentandelen DOC- eller COD-eliminering av testkemikalien för 
varje tidpunktsrelaterad bedömning, genom följande ekvation: 
D t ¼ C s Ä ðE Ä E o Þ 
C s Ü 100 
där 
D t = % eliminering av DOC eller COD vid tidpunkten t, 
C s = DOC eller COD på grund av testkemikalien, helst uppskattat utifrån 
stamlösningen (mg/l), 
E = uppmätt DOC- eller COD-värde i testutflödet vid tidpunkten t (mg/l), E
 o = uppmätt DOC- eller COD-värde i kontrollutflödet vid tidpunkten t 
(mg/l). 
53. Graden av DOC- eller COD-eliminering i det organiska mediet i kontrol ­
lenheten bidrar till bedömningen av den biologiska nedbrytningsaktiviteten i 
det aktiverade slammet under testet. Den procentuella elimineringen kan beräknas genom följande ekvation: 
D
 B ¼ C M Ä E o 
C M Ü 100 
där 
D B = % eliminering av DOC eller COD i det organiska mediet i kont ­
rollenheten vid tidpunkten t, 
C M = DOC eller COD i det organiska mediet i kontrollenhetens inflöde 
(mg/l).  ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1071
 
Alternativt kan man beräkna procentuell eliminering av DOC eller COD 
som kan tillskrivas det organiska mediet plus testkemikalie i testenheten 
med följande ekvation: 
D T ¼ C T Ä E 
C T Ü 100 
där 
D T = % eliminering av DOC eller COD i totalt testinflöde, 
C T = DOC eller COD i totalt testinflöde eller beräknat utifrån stamlös ­
ningar (mg/l). 
54. Beräkna elimineringen av testkemikalie som uppmätts med en specifik ana ­
lysmetod vid varje bedömningstidpunkt, genom följande ekvation: 
D ST ¼ S i Ä S e 
S i Ü 100 
där 
D ST = % primär eliminering av testkemikalien vid tidpunkten t, 
S i = uppmätt eller uppskattad koncentration av testkemikalien i testinflö ­
det (mg/l), 
S e = uppmätt koncentration av testkemikalien i testutflödet vid tidpunk ­
ten t (mg/l). 
55. Om kopplingsmodellen har använts, kompensera utspädningen av testkemi ­
kalien i luftningskärlet genom slamutbytet med användning av en korrige ­
ringsfaktor (se tillägg 3). Om genomsnittlig retentionstid på 6 timmar och 
utbyte av halva volymen aktiverat slam i luftningskärlet har använts, måste de fastställda dagliga eliminationsvärdena (D
 t , punkt 52) korrigeras för att få 
den faktiska elimineringsgraden D  tc för testkemikalien genom följande ek ­
vation: 
D tc ¼ 4D t Ä 100 
3 
Presentation av testresultat  
56. Plotta en kurva med procentuell eliminering D  t (eller D  tc ) och D  st (om 
tillgänglig) mot tiden (se tillägg 2). Kurvan för eliminering av testkemika ­
lien (i sig eller som DOC) kan ge underlag för vissa slutsatser om elimi ­
neringsprocessen.  
Adsorption  
57. Om kraftig DOC-eliminering observeras från början av testet, är det sanno ­
likt att testkemikalien elimineras genom adsorption på det aktiva slammets fasta beståndsdelar. Detta kan påvisas genom att bestämma adsorberad test ­
kemikalie genom specifik analys. Det är inte vanligt att elimineringen av 
DOC för adsorberbara kemikalier förblir kraftig genom hela testet; elimine ­
ringen är i regel kraftig i början för att sedan minska gradvis till ett jämvikt ­
svärde. Om däremot den adsorberbara testkemikalien på ett eller annat sätt 
kan orsaka acklimatisering av den mikrobiella populationen, stiger testkemi ­
kaliens DOC-eliminering därefter och når ett högt platåvärde.
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1072
 
Lagfas  
58. På samma sätt som vid statiska screeningtest, kräver många testkemikalier 
en lagfas innan full biologisk nedbrytning inträffar. Under lagfasen sker acklimatisering eller anpassning av de nedbrytande bakterierna praktiskt 
taget utan eliminering av testkemikalien vid bakterietillväxtens inledande 
skede. Denna fas upphör och nedbrytningsfasen anses börja när cirka 10 % av den inledande mängden testkemikalie har eliminerats (efter att adsorption fått ske, i förekommande fall). Lagfasen är ofta mycket varie ­
rande och svår att reproducera.
 
Platåfas  
59. Platåfasen i en elimineringskurva för ett kontinuerligt test definieras som 
den fas då maximal nedbrytning sker. Platåfasen bör pågå minst 3 veckor 
och ska ge cirka 15 uppmätta valida värden.  
Genomsnittlig elimineringsgrad för testkemikalien  
60. Beräkna medelvärdet utifrån testkemikaliens elimineringsvärden (D  t ) under 
platåfasen. Avrundat till närmaste heltal (i %) är detta testkemikaliens eli ­
mineringsgrad. Likaså rekommenderas beräkning av medelvärdets 95 % 
konfidensintervall.  
Eliminering av organiskt medium  
61. Plotta det organiska mediets procentuella eliminering av DOC eller COD i 
kontrollenheten (D  B ) mot tid. Ange genomsnittlig elimineringsgrad på 
samma sätt som för testkemikalien (punkt 60).  
Indikation på biologisk nedbrytning  
62. Om testkemikalien inte adsorberas i betydlig grad på det aktiverade slammet 
och elimineringskurvan har den typiska formen för en biologisk nedbryt ­
ningskurva med lagfas, kan nedbrytnings- och platåfaserna (punkterna 58, 
59) med säkerhet tillskrivas biologisk nedbrytning. Om det har förekommit stark inledande eliminering kan simulationstestet inte användas för att skilja mellan biologiska och abiotiska elimineringsprocesser. I sådana fall, och i 
andra fall med tvivel rörande biologisk nedbrytning (t.ex. vid strippning), 
bör en analys göras rörande adsorberade testkemikalier eller ytterligare test med statisk biologisk nedbrytning genomföras baserade på parametrar som 
klart indikerar biologiska processer. Sådana test är syreupptagningsmetoder 
(kapitel C.4 D, E och F i denna bilaga (6)) eller test med mätning av koldioxidproduktion (kapitel C.4 C i denna bilaga (6)) eller ISO Headspace-metoden (18), med användning av förexponerat inokulat från 
simulationstestet. Om både DOC-eliminering och eliminering av specifik 
kemikalie har uppmätts och det finns betydande skillnader mellan elimine ­
ringsgraderna (DOC-elimineringen är lägre), tyder detta på att utflödena innehåller intermediära organiska produkter som kan vara svårare att bryta 
ned än den ursprungliga kemikalien.
 
Testresultatens giltighet  
63. Information om inokulatets normala bionedbrytningsmönster fås genom en 
bestämning av det organiska mediets elimineringsgrad (punkt 53) i kont ­
rollenheten. Testet kan anses vara giltigt om graden av DOC- eller 
COD-eliminering i kontrollenheten (-enheterna) är > 80 % efter två veckor 
och inget ovanligt har observerats.  ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1073
 
64. Om en lätt biologiskt nedbrytbar (referens)kemikalie har använts, bör graden 
av biologisk nedbrytning (D  t , punkt 52) vara > 90 %. 
65. Om testet genomförs under nitrifierande förhållanden bör medelkoncent ­
rationen i utflödena vara < 1 mg/l ammoniumkväve och < 2 mg/l nitrit ­
kväve. 
66. Om dessa kriterier (punkterna 63–65) inte uppfylls, upprepa testet med 
inokulat från en annan källa, testa en referenskemikalie och se över alla 
försöksförfaranden.  
Testrapport  
67. Testrapporten ska innehålla följande information:  
Testkemikalie:  
— Identifieringsdata. 
— Fysikalisk natur och, när det är relevant, fysikalkemiska egenskaper.  
Testbetingelser : 
— Typ av testsystem och eventuella modifikationer för testning av olösliga 
och flyktiga kemikalier. 
— Typ av organiskt medium. 
— Andel av och egenskaper hos industriellt avloppsvatten som ingår, om 
kända. 
— Inokulat, egenskaper och provtagningsplats(er), koncentration och even ­
tuell förbehandling. 
— Stamlösning av testkemikalien: DOC- och TOC-innehåll, i förekom ­
mande fall beredningssätt för suspension, använd testkoncentration, mo ­
tivering om denna ligger utanför området 10–20 mg/l DOC, tillsättnings ­
metod, datum för första tillsättning, eventuella ändringar. 
— Slammets medelålder och medelvärde för hydraulisk retentionstid, metod 
för kassering av slam, metoder för att undvika klumpbildning, förlust av 
slam osv. 
— Analystekniker som använts. 
— Testtemperatur. 
— Slammets klumpbildningsegenskaper, slammets volymindex (SVI), sus ­
penderad halt (MLSS). 
— Avvikelser från standardförfaranden och alla omständigheter som kan ha 
påverkat resultaten.  
Testresultat:  
— Alla uppmätta data (DOC, COD), specifika analyser, pH, temperatur, 
syrehalt, suspenderade fasta ämnen, kvävekemikalier om relevant. 
— Alla beräknade värden för D  t (eller D  tc ), D  B och D  St i tabellform samt 
elimineringskurvor. 
— Information om lag- och platåfaserna, testets tidslängd, elimineringsgrad 
för testkemikalien och för det organiska mediet i kontrollenheten, till ­
sammans med statistiska data och utlåtanden om biologisk nedbrytbarhet och testets giltighet. 
— Diskussion om resultaten.
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1074
 
LITTERATUR  
(1) Swisher R. D. (1987), ”Surfactant Biodegradation”, andra utgåvan, Marcel 
Dekker Inc. New York, s. 1085. 
(2) Tyska regeringen (1962). ”Ordinance of the degradability of detergents in 
washing and cleaning agents”,  Bundesgesetzblatt , Pt.1 nr 49, s. 698–706. 
(3) Painter H. A. och King E. F. (1978a), ”WRc porous-pot method for asses ­
sing biodegradability”,  Technical Report No.70 , Water Research Centre, 
Medmenham, UK. 
(4) Painter H. A. och King E. F. (1978b), ”The effect of phosphate and tem ­
perature on growth of activated sludge and on biodegradation of surfac ­
tants”,  Wat. Res.  12, s. 909–915. 
(5) Eckenfelder, W. W, (19), US EPA. (6) Kapitel C.4 i denna bilaga, Bestämning av ”lätt” bionedbrytbarhet. (7) Kapitel C.12 i denna bilaga, Biologisk nedbrytbarhet – Modifierat 
SCAS-test. 
(8) Kapitel C.19 i denna bilaga, Uppskattning av adsorptionskoefficienten (K
 oc ) 
i jord och avloppsslam med användning av 
högtrycksvätskekromatografi (HPLC). 
(9) Gerike P. och Fischer W. K. (1979), ”A correlation study of biodegrad ­
ability determinations with various chemicals in various tests”,  Ecotox. Env. 
Saf., 3, s. 157–173. 
(10) Gerike P. och Fischer W. K. (1981), som (9), ”II Additional results and 
conclusions”,  Ecotox. Env. Saf. , 5, s. 45–55. 
(11) Painter H. A. och Bealing D. (1989), ”Experience and data from the OECD 
activated sludge simulation test”, s. 113–138, ”Laboratory tests for simula ­
tion of water treatment processes”,  CEC Water Pollution Report 18 , Red. 
Jacobsen B. N., Muntau H., Angeletti G. 
(12) ISO 11733 (1995; reviderad 2004), ”Evaluation of the elimination and bio ­
degradability of organic substances in an aqueous medium – activated sludge simulation test”. 
(13) Birch R. R. (1982), ”The biodegradability of alcohol ethoxylates”, XIII 
Jornado Com. Espanol. Deterg., s. 33–48. 
(14) Birch R. R. (1984), ”Biodegradation of noniomic surfactants”,  J.A.O.C.S.  
61 (2), s. 340–343. 
(15) Gerike P., Fischer W. K. och Holtmann W. (1980), ”Biodegradability de ­
terminations in trickling filter units compared with the OECD confirmatory 
test”,  Wat.Res.  14, s. 753–758. 
(16) Baumann U., Kuhn G. och Benz M. (1998), ”Einfache Versuchsanordnung 
zur Gewinnung gewässerökologisch relevanter Daten, UWSF - Z”,  Umwelt­
chem. Ökotox , 10, s. 214–220. 
(17) Her Majesty’s Stationery Office (1982), ”Assessment of biodegradability. 
Methods for the examination of waters and associated materials”, s. 91–98, 
ISBN 011 751661 9. 
(18) ISO 14593 (1998), ”Water Quality - Evaluation in an aqueous medium of 
the ultimate biodegradability of organic compounds. Method by the analysis of inorganic carbon in sealed vessels”.
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1075
 
Tillägg 1  
Figur 1  
Utrustning för undersökning av biologisk nedbrytning  
Husmann-enhet
  
A. Förvaringskärl 
B. Doseringspump C. Luftningskammare (kapacitet 3 l) D. Sedimenteringskärl E. Mammutpump 
F. Uppsamlingskärl G. Luftningssystem H. Luftflödesmätare
 
Figur 2  
Utrustning för undersökning av biologisk nedbrytning  
Porous Pot-enhet
  
A. Förvaringskärl 
B. Doseringspump C. Poröst luftningskärl D. Yttre ogenomträngligt kärl E. Uppsamlingskärl 
F. Diffusör G. Luftflödesmätare
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1076
 
Figur 3  
Detaljbeskrivning av Porous Pot-enhetens luftningskärl (3 l)
  ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1077
 
Tillägg 2  
Exempel på en elimineringskurva
  ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1078
 
Tillägg 3  
[SOM INFORMATION]  
KOPPLING AV TESTENHETER 
För att försöka likställa de mikrobiella populationerna i testenheten som matas 
med avloppsvatten plus testkemikalie och kontrollenheten som endast matas med 
avloppsvatten, har man infört dagligt utbyte av slam (1). Förfarandet kallas koppling och metoden kallas kopplade enheter. Koppling gjordes till en början med Husmann-enheter för aktiverat slam men har också gjorts med Porous 
Pot-enheter (2) (3). Inga betydande skillnader i resultat erhölls mellan 
icke-kopplade och kopplade enheter (Husmann eller Porous Pots) och det är därför onödigt att använda tid och resurser på koppling av enheter. 
Utbyte av slam kan ge bilden av rätt betydande eliminering, eftersom en del av 
testkemikalien överförs och koncentrationen av testkemikalie i test- och kontrol ­
lutflödena blir nästan densamma. Därför måste korrigeringsfaktorer användas, vilka är beroende av den fraktion som utbyts och den genomsnittliga hydrauliska retentionstiden. Närmare detaljer om beräkningen har publicerats (1). 
Beräkna den korrigerade DOC- eller COD-elimineringsgrader med användning 
av följande allmänna formel:
 
D tc ¼ ðD t Ä 100 · a · r=12Þ=ð1 Ä a · r=12Þ % 
där D
 tc = korrigerad procentuell DOC- eller COD-eliminering, 
D t = fastställd procentuell DOC- eller COD-eliminering, 
a = utbytesfraktion av volymen i enheterna för aktiverat slam, r = genomsnittlig hydraulisk retentionstid (tim). Om t.ex. hälften av volymen i luftningskärlet byts ut (a = 0,5) och den genom ­
snittliga hydrauliska retentionstiden är 6 timmar, är den korrekta formeln följan ­
de: 
D
 tc ¼ 4D t Ä 100 
3 
LITTERATUR  
(1) Fischer W., Gerike P., Holtmann W (1975), ”Biodegradability Determina ­
tions via Unspecific Analyses (Chemical Oxygen Demand, DOC) in Coupled 
Units of the OECD Confirmatory Test. I The test”,  Wat. Res.  9, s. 
1131–1135. 
(2) Painter H. A. och Bealing D. J. (1989), ”Experience and data from the 
OECD Activated Sludge Simulation Test”, s. 113–138, ingår i Laboratory 
Tests for Simulation of Water Treatment Processes CEC Water Pollution 
Report 18, Red. Jacobsen B. N., Muntau H., Angeletti G. 
(3) Painter H. A., King E. F. (1978), ”Water Research Centre Porous Pot Met ­
hod for Assessing Biodegradability”, Technical Report TR70, Water Rese ­
arch Centre, Stevenage, UK.  ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1079
 
Tillägg 4  
UTVÄRDERING AV INHIBERING AV AKTIVERAT SLAM  
Förfarande med testkemikalier  
1. En kemikalie (eller ett avloppsvatten) bryts eventuellt inte ned eller elimine ­
ras i simuleringstest och kan t.o.m. ha en inhiberande effekt på slammets 
mikroorganismer. Övriga kemikalier är biologisk nedbrytbara i låga koncent ­
rationer men har inhiberande verkan i högre koncentrationer (hormesis). Inhiberande effekter har kanske framkommit på ett tidigare skede eller kan 
bestämmas med hjälp av toxicitetstest, med användning av liknande eller 
identiskt inokulat som används vid simuleringstest (1). Sådana metoder är inhibering av syreupptagning (kapitel C.11 i denna bilaga (2) och ISO 8192 (3)) eller inhibering av tillväxt av mikroorganismer i aktiverat slam (ISO 
15522 (4)). 
2. Vid simuleringstest framgår inhibering genom att skillnaden mellan upplöst 
organiskt kol (DOC) eller kemisk syreförbrukning (COD) mellan utflödet 
från testkärlet och utflödet från kontrollkärlet är större än det DOC som tillsatts i form av testkemikalie. Detta kan även uttryckas som att den pro ­
centuella elimineringen av DOC (och biokemisk syreförbrukning BOD, ke ­
misk syreförbrukning COD och/eller NH
 + 4 ) i det organiska mediet minskar 
när testkemikalie har tillsatts. Om detta inträffar bör testet upprepas med lägre koncentration av testkemikalien tills man når en nivå där ingen inhi ­
bering inträffar och därefter eventuellt ytterligare sänka koncentrationen tills 
testkemikalien har brutits ned biologiskt. Om däremot testkemikalien (eller 
avloppsvattnet) påverkar processen negativt vid alla testade koncentrationer, tyder detta på att kemikalien är svår eller omöjlig att behandla biologiskt, även om det kan vara värt att upprepa testet med aktiverat slam från en 
annan källa och/eller låta slammet acklimatisera sig mer gradvis. 
3. Omvänt gäller att om testkemikalien bryts ned biologiskt vid första försöket i 
ett simuleringstest bör koncentrationen ökas, om det är nödvändigt att få 
information om huruvida kemikalien fungerar inhiberande. 
4. Vid bestämning av inhiberingsgraden bör man komma ihåg att populationen i 
det aktiverade slammet kan ändras så att mikroorganismerna med tiden ut ­
vecklar tolerans mot en inhiberande kemikalie. 
5. Beräkning av inhiberingsgraden: 
Den totala procentuella elimineringen R
 o , av BOD, DOC, COD osv. för test- 
och kontrollenheterna kan beräknas genom följande: 
R o ¼ 100 ðI Ä EÞ=I % 
där: 
I = inflödeskoncentrationen för BOD, DOC, COD osv. för test- eller kon ­
trollkärl (mg/l), 
E = respektive utflödeskoncentrationer (mg/l). I och E måste korrigeras för DOC på grund av testkemikalien i testenheterna, 
annars får man inte rätt resultat från beräkningen av procentuell inhibering.
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1080
 
Graden av inhibering orsakad av testkemikalien kan beräknas genom 
följande:  
% inhibering ¼ 100 ðR c Ä R t Þ=R c 
där: 
R c = procentuell eliminering i kontrollkärlen, 
R t = procentuell eliminering i testkärlen.  
LITTERATUR  
(1) Reynolds L. m.fl. 1987), ”Evaluation of the toxicity of substances to be 
assessed for biodegradability”,  Chemosphere  16: 2259. 
(2) Kapitel C.11 i denna bilaga, Biologisk nedbrytbarhet – Aktiverat slam – 
respirationshämningstest. 
(3) ISO 8192 (2007), Water quality - Test for inhibition of oxygen consumption 
by activated sludge for carbonaceous and ammonium oxidation. 
(4) ISO 15522 (1999), Water Quality - Determination of the inhibitory effect of 
water constituents on activated sludge microorganisms.  ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1081
 
Tillägg 5  
Dåligt vattenlösliga kemikalier, flyktiga kemikalier  
Dåligt vattenlösliga kemikalier  
Det verkar finnas få publicerade rapporter rörande test som simulerar vattenre ­
ning och omfattar kemikalier med dålig eller ingen löslighet i vatten (1) (2) (3). 
Det finns ingen enskild metod för dispergering av testkemikalie som kan till ­
lämpas på alla olösliga kemikalier. Två av de fyra typer av metoder som beskrivs i ISO 10634 (4) verkar vara lämpliga för att dispergera testkemikalier för simu ­
leringstest – användning av emulgeringsmedel och/eller ultraljud. Den resulte ­
rande dispersionens stabilitet bör fastställas under minst 24 timmar. Lämpligt 
stabiliserade dispersioner i en behållare med kontinuerlig omrörning (punkt 38) kan därefter doseras till luftningskärlet separat från avloppsvatten från hushåll (eller syntetiskt avloppsvatten). 
Om en dispersion är stabil bör man undersöka hur testkemikalien kan bestämmas 
i den dispergerade formen. Det är sannolikt inte lämpligt med DOC, vilket betyder att en specifik analysmetod för testkemikalien bör etableras som kan användas på utflöde, utflödets fasta ämnen och aktiverat slam. Därefter fastställs 
vad som händer med testkemikalien vid simulering av aktivslamprocessen, i 
vätskeform och fast form. Då kan en ”massbalans” etableras för att fastställa huruvida det har skett biologisk nedbrytning av testkemikalien. Detta ger dock endast indikation på primär biologisk nedbrytning. Man bör försöka demonstrera 
slutlig biologisk nedbrytning genom att tillämpa respirometritest för lätt bioned ­
brytbarhet (kapitel C.4 i denna bilaga (5) C, F eller D) med inokulat i form av slam som exponerats för testkemikalien i simuleringstestet.
 
Flyktiga kemikalier  
Simulering av avloppsvattenrening på flyktiga kemikalier är både diskutabelt och 
problematiskt. På samma sätt som för dåligt vattenlösliga testkemikalier tycks det även för flyktiga kemikalier ha publicerats mycket få rapporter som beskriver 
simuleringstest. En konventionell typ av apparatur för fullständig blandning kan 
anpassas genom att försegla luftnings- och sedimenteringskärlen, och därefter mäta och kontrollera luftflödet med flödesmätare och låta utloppsgasen passera genom fällor för uppsamling av flyktigt organiskt material. I vissa fall används 
vakuumpump för att dra utloppsgasen genom en ”kall” fälla eller purge-trap som 
innehåller Tenax och silikagel för gaskromatografianalyser. Testkemikalien i fäl ­
lan kan bestämmas analytiskt. 
Testet genomförs i två delar. Först körs enheterna utan slam men med syntetiskt 
avloppsvatten plus testkemikalie som pumpas in i luftningskärlet. Prover tas av 
inflöde, utflöde och utloppsgas och analyseras för testkemikalien under några 
dagar. Utifrån insamlade data kan procentandelen testkemikalie (R
 vs ) som strip ­
pats ur systemet beräknas. 
Därefter genomförs normalt biologiskt test (med slam) under liknande förhållan ­
den som använts vid strippningen. Likaså mäts DOC eller COD för att kont ­
rollera att enheterna fungerar effektivt. Mängden testkemikalie i inflöde, utflöde 
och utloppsgas bestäms då och då under testets första fas, och efter acklimati ­
seringen mer frekvent. Utifrån de data som fås under steady state kan procen ­
tandelen eliminerad testkemikalie från vätskefasen i alla processer (R  T ) (fysisk 
och biologisk eliminering) beräknas, såväl som andelen (R  V ) som strippats från 
systemet.  ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1082
 
Beräkning: 
a) Vid icke-biologiskt test kan procentandelen (R  VP ) testmaterial som strippats 
från systemet beräknas genom följande: 
R VP ¼ S VP 
S IP · 100 
där 
R VP = eliminering av testkemikalie genom avdunstning (%), 
S VP = testkemikalie som uppsamlats i en fälla, uttryckt som ekvivalent kon ­
centration i vätskefasen (mg/l), 
S IP = testkemikaliens koncentration i inflödet (mg/l). 
b) Vid biologiskt test kan procentandelen (R  V ) testmaterial som strippats från 
systemet beräknas genom följande: 
R V ¼ S V 
S I · 100 
där 
R V = eliminering av testkemikalie genom avdunstning i biologiskt test (%), 
S V = testkemikalie som uppsamlats i en fälla i biologiskt test, uttryckt som 
ekvivalent koncentration i vätskeformigt inflöde (mg/l), 
S I = testkemikaliens koncentration i inflödet (mg/l). 
c) Vid biologiskt test beräknas procentandelen testkemikalie (R  T ) som elimine ­
rats genom alla processer genom följande: 
R T ¼ 1 Ä S E 
S I · 100 
där 
S E = koncentrationen testkemikalie i (vätskeformigt) utflöde (mg/l). 
d) Då kan procentandelen (R  BA ) som eliminerats genom bionedbrytning plus 
adsorption beräknas genom följande: 
R BA ¼ ðR T Ä R V Þ 
Separata test bör göras för att fastställa om testkemikalien har adsorberats och 
i så fall kan ytterligare korrigering göras. 
e) En jämförelse mellan andelen testkemikalie som strippats från systemen för 
biologiskt test (R  v ) och icke-biologiskt test (R  vp ) indikerar den totala effekt 
som den biologiska behandlingen har haft på utsläpp av testkemikalien i 
atmosfären.  
Exempel:  Bensen 
Slamretentionstid = 4 dagar 
Syntetiskt slam, retentionstid 8 timmar 
S IP = S  I = 150 mg/l 
S VP = 150 mg/l (S  EP = 0) 
S V = 22,5 mg/l 
S E = 50 μg/l ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1083
 
Således, 
R VP = 100 %, R  V = 15 % 
R T = 100 % och R  BA = 85 %. 
Det antas att bensen inte adsorberas på slammet.  
LITTERATUR  
(1) Horn J. A., Moyer J. E., Hale J.H. (1970), ”Biological degradation of tertiary 
butyl alcohol”, Proc. 25th Ind. Wastes Conference Purdue Univ., s. 939–854. 
(2) Pitter P., Chudoba J. (1990), ”Biodegradability of organic substances in the 
aquatic environment”, CRC Press, Boston, Förenta staterna. 
(3) Stover E. L., Kincannon D. F. (1983), ”Biological treatability of specific 
organic compounds found in chemical industry waste waters”,  J. Wat. Pollut. 
Control Fed.  55, 97, 
(4) ISO 10634 (1995),  Water Quality - Guidance for the preparation and treat ­
ment of poorly water-soluble organic compounds for the subsequent evalua ­
tion of their biodegradability in an aqueous medium.  
(5) Kapitel C.4 i denna bilaga, Bestämning av ”lätt” bionedbrytbarhet.  ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1084
 
Tillägg 6  
Slamretentionstidens (SRT) inverkan på reningsmöjligheterna för en 
kemikalie  
INLEDNING 
1. Den metod som beskrivs i huvudtexten syftar till att fastställa om de 
kemikalier som testas (i regel kemikalier som veterligen är inherent, men inte lätt, bionedbrytbara) kan brytas ned biologiskt inom de gränser som gäller i avloppsreningsverk. Resultaten uttrycks som procentandel elimine ­
ring och procentandel biologisk nedbrytning. Driftsbetingelserna i aktivs ­
lamenheterna och valet av inflöde kan ge rätt stora variationer vad gäller koncentrationen av testkemikalie i utflödet. Testerna genomförs vanligen med endast en nominell koncentration av fasta ämnen i slammet eller en 
nominell slamretentionstid (SRT) och de beskrivna systemen för slamkas ­
sering kan leda till att SRT-värdet varierar betydligt under testet, både från dag till dag och under en dag. 
2. I denna variant (1) (2) kontrolleras SRT med mycket snävare gränser under 
varje 24-timmarsperiod (på samma sätt som i full skala), vilket ger en mer konstant koncentration i utflödena. Avloppsvatten från hushåll rekommen ­
deras eftersom det ger enhetligare och högre procentandel eliminering. 
Dessutom undersöks verkningarna av ett antal SRT-värden och i en mer detaljerad studie kan verkningarna av ett urval temperaturer på utflödes ­
koncentrationen fastställas. 
3. Det finns fortfarande inget allmänt samförstånd om vilken kinetisk modell 
som gäller när kemikalier bryts ned biologiskt under de förhållanden som råder vid avloppsvattenrening. Monod-modellen för bakteriell tillväxt och 
substratanvändning valdes (1) (2) för behandling av insamlade data, efter ­
som metoden endast var avsedd att tillämpas på kemikalier tillverkade i stora volymer som leder till en koncentration över 1 mg/l i avloppsvattnet. Den förenklade modellens giltighet och de antaganden som gjordes fast ­
ställdes genom användning en serie alkoholetoxylat med varierande grader 
av primär bionedbrytbarhet (2) (3).  
Anmärkning:  Denna metodvariant påminner mycket om testmetod C.10-A 
och nedan anges endast de detaljer som avviker.
 
PRINCIP FÖR TESTMETODEN 
4. Porous Pot-enheter för aktiverat slam utformade för att ge (nästan) kon ­
tinuerlig kassering av blandad vätska, vilket möjliggör en mycket exakt kontroll av slamretentionstiden (SRT eller θ
 s ), körs i icke-kopplat läge 
med ett urval olika slamretentionstider och, alternativt, med ett urval olika 
temperaturer. Retentionstiden är i regel 2–10 dagar och temperaturen mel ­
lan 5 och 20 °C. Avloppsvattnet, helst från hushåll, och en lösning av testkemikalien doseras separat till enheterna med ett flöde som ger den 
önskade retentionstiden (3–6 timmar) och önskad koncentration av test ­
kemikalien i inflödet. Kontrollenheter som inte matas med testkemikalie körs parallellt för jämförande ändamål. 
5. Olika typer av apparatur kan användas, men stor vikt bör fästas vid att 
säkerställa god kontroll av slamretentionstiden. Om den utrustning som används t.ex. innehåller ett sedimenteringskärl, kan det vara nödvändigt att räkna med förlust av fasta ämnen via utflödet. Dessutom bör speciella 
försiktighetsmått vidtas för att undvika fel på grund av variationer av 
mängden slam i sedimenteringskärlet.
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1085
 
6. Enheterna körs vid var och en av de olika betingelser som har valts, och 
efter att jämvikt har nåtts fås genomsnittliga steady state-koncentrationer av 
testkemikalie i utflödena, och alternativt DOC, under en period som om ­
fattar cirka tre veckor. Utöver bedömning av procentandelen eliminering för testkemikalie, och alternativt DOC, fås förhållandet mellan driftsbeting ­
elserna och koncentrationen i utflödet uttryckt i grafisk form. Utifrån detta 
kan preliminära kinetiska konstanter beräknas och prognoser för de beting ­
elser under vilka testkemikalien kan behandlas.
 
INFORMATION OM TESTKEMIKALIEN 
7. Se kapitel C.10 A, punkterna 12 och 13.  
GODKÄNNANDENIVÅER 
8. Se kapitel C.10 A, punkterna 14 och 15.  
REFERENSKEMIKALIE 
9. Se kapitel C.10 A, punkt 16.  
TESTRESULTATENS REPRODUCERBARHET 
10. Se kapitel C.10 A, punkterna 17 och 18.  
METODBESKRIVNING  
Apparatur  
11. Lämplig enhet är ett modifierat Porous Pot-system (tillägg 6.1). Det består 
av ett inre kärl konstruerat av poröst polypropen med tjocklek på 3,2 mm och porstorlek på cirka 90 μm, med stumsvetsad söm (detta ger en robus ­
tare enhet än den som beskrivs i punkt 21 i detta kapitel C.10 A). Inner ­
kärlet omsluts av ett ogenomträngligt ytterkärl av polyetylen som består av två delar: en rund bas med hål för två luftkanaler och en slamkasserings ­
kanal, och en övre cylinder som är skruvad på basen och vars utlopp är 
placerat så att Porous Pot-kärlet får en känd volym på 3 liter. En av luft ­
kanalerna har en diffusör och den andra är öppen och placerad i rät vinkel till diffusörens utlopp. Detta system ger den turbulens som krävs för att 
säkerställa att innehållet blandas fullständigt och att koncentrationerna av 
löst syre hålls över 2 mg/l. 
12. Lämpligt antal enheter hålls vid kontrollerad temperatur mellan 5 och 20 
°C (± 1 °C), antingen i vattenbad eller i utrymmen med konstant tempera ­
tur. Pumpar krävs för att dosera lösning av testkemikalie och sedimenterat avloppsvatten med önskat flöde (0–1,0 ml/min och 0–25 ml/min) och en 
tredje pump för att avlägsna överloppsslam från luftningskärlen. Den myc ­
ket låga flödeshastighet som krävs för överskottsslam nås genom att an ­
vända en pump ställd på högre flödeshastighet som körs intermittent med 
hjälp av en timer, t.ex. 10 sekunder per minut, så att en pumpinställning på 
3 ml/min ger ett flöde på 0,5 ml/min.
 
Filtreringsapparatur eller centrifug  
13. Se kapitel C.10 A, punkt 23.  
Analysutrustning  
14. Se kapitel C.10 A, punkt 24.  
Vatten  ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1086
 
15. Se kapitel C.10 A, punkterna 25 och 26.  
Organiskt medium  
16. Se kapitel C.10 A, punkt 27.  
Syntetiskt slam  
17. Se kapitel C.10 A, punkt 28.  
Avloppsvatten från hushåll  
18. Se kapitel C.10 A, punkt 29.  
Aktiverat slam  
19. Se kapitel C.10 A, punkt 30.  
Stamlösningar av testkemikalien  
20. Se kapitel C.10 A, punkterna 31 och 32.  
FÖRFARANDE  
Förberedning av inokulat  
21. Se kapitel C.10 A, punkt 34 (endast denna gäller) – använd aktiverat slam 
(cirka 2,5 g/l).  
Antal testenheter  
22. För ett enkelt test, dvs. för att mäta procentandelen eliminering, behövs 
bara en slamretentionstid (SRT). För att få de data som behövs för beräk ­
ning av preliminära kinetiska konstanter behövs däremot 4 eller 5 SRT-värden. Vanligen används retentionstider mellan 2 och 10 dagar. Det är i regel praktiskt att göra ett test med 4 eller 5 SRT-värden samtidigt 
vid en och samma temperatur. I mer omfattande studier kan samma 
SRT-värden, eller eventuellt ett annat urval värden, användas vid andra temperaturer inom området 5–20 °C. För primär bionedbrytning (huvud ­
ändamål) behövs i regel bara en enhet per uppsättning testbetingelser. 
Vid test av slutlig bionedbrytbarhet behövs dock en kontrollenhet för varje 
uppsättning testbetingelser; denna matas med enbart slam, inte testkemika ­
lie. Om man tror att det finns testkemikalie i det slam som används, är det 
nödvändigt att använda kontrollenheter vid bedömning av primär biologisk 
nedbrytning och därefter göra nödvändiga korrigeringar i beräkningarna.
 
Dosering av organiskt medium och testkemikalie  
23. Se kapitel C.10 A, punkterna 36–39, men notera att testkemikalielösningen 
doseras separat och att flera olika slamkasseringsgrader används. Det be ­
hövs också regelbunden övervakning (t.ex. två gånger om dagen) och vid behov justering, inom ±10 %, av flödeshastigheterna för inflöden, utflöden 
och slamkassering. Om det uppstår svårigheter med analysmetoden när 
avloppsvatten från hushåll används, kan testet genomföras med syntetiskt avloppsvatten, men då måste man se till att olika media ger jämförbara kinetiska data.
 
Hantering av enheterna för aktiverat slam  
24. Se kapitel C.10 A, punkterna 40–43, men SRT ska endast kontrolleras 
genom ”konstant” kassering av slam.  
Provtagning och analys  
25. Se kapitel C.10 A, punkterna 44–50, med undantag för att testkemikaliens 
koncentration måste bestämmas och bestämning av DOC är frivillig. COD 
ska inte användas.  ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1087
 
DATA OCH RAPPORTERING  
Behandling av resultaten  
26. Se kapitel C.10 A, punkterna 52–54.  
Presentation av testresultat  
27. Se kapitel C.10 A, punkterna 56–62.  
Beräkning av kinetiska konstanter  
28. Det är mera realistiskt att ange genomsnittlig steady state-koncentration av 
testkemikalien i utflödet och beskriva hur denna varierar enligt driftsbeting ­
elserna än att ange procentuell primär bionedbrytning. Detta kan göras 
genom att beakta ekvation 6 i tillägg 6.2 som kan ge värden för K  S , μ m 
och θ SC , den kritiska slamretentionstiden. 
(Alternativt kan ungefärliga värden för K  S och μm fås med hjälp av ett 
enkelt datorprogram för att anpassa den teoretiska kurvan som beräknats 
med ekvation 2 (tillägg 6.2) till de experimentella värdena. Även om ingen given lösning är unik, går det att få en rimlig approximering av K
 S och 
μm.) 
Resultatvariation  
29. Den vanliga erfarenheten är att man får varierande värden för de kinetiska 
parametrarna för individuella kemikalier. Man tror att slammets odlings ­
betingelser och de betingelser som gäller i det test som används (som i 
punkt 5 och i andra test) har en stor effekt på de värden som erhålls. En aspekt av denna variation har diskuterats av Grady m.fl. (4) som har fö ­
reslagit att termerna ”extant” and ”intrinsic” ska användas för de två ex ­
trema betingelser som representerar gränserna för den fysiologiska status 
som en odling kan ha under ett kinetiskt experiment. Om odlingens status inte tillåts variera under testet, återspeglar de kinetiska parametervärdena betingelserna i den miljö från vilken mikroorganismerna har tagits – för 
dessa värden används benämningen ”extant”, dvs. något som fortsatt exi ­
sterar. Vid den andra yttersta gränsen är testbetingelserna sådana att de medger full utveckling av proteinsyntessystemet och därmed möjlighet till största möjliga tillväxt, och då används benämningen ”intrinsic” för de 
kinetiska parametrar som erhålls, dvs. de är endast beroende av substratets 
karaktär och typen av bakterier i odlingen. Som riktlinje kan sägas att ”extant”-värden fås när förhållandet mellan substratets koncentration och kompetenta mikroorganismer (S
 o /X o ) hålls lågt, t.ex. 0,025, och ”intrinsic”- 
värden fås när förhållandet är högt, t.ex. minst 20. I båda fallen gör S  o bör 
vara samma eller högre än det relevanta värdet för Ks, halvmättnadskon ­
stanten. 
30. Variationen och andra aspekter rörande bionedbrytningens kinetik diskute ­
rades nyligen vid en SETAC-workshop (5). Dessa studier, rapporterade och 
projekterade, bör ge en klarare uppfattning om den kinetik som fungerar i vattenreningsverk, och därmed en bättre tolkning av befintliga data och förslag till mer relevanta utformningar av nya testmetoder.
 
LITTERATUR:  
(1) Birch R. R. (1982), ”The biodegradability of alcohol ethoxylates”, XIII Jor ­
nado Com. Espanol Deterg., s. 33–48. 
(2) Birch R. R. (1984), ”Biodegradation of noniomic surfactants”,  J.A.O.C.S. , 
61(2), s. 340–343. 
(3) Birch R. R. (1991), ”Prediction of the fate of detergent chemicals during 
sewage treatment”,  J. Chem. Tech. Biotechnol ., 50, s. 411–422.  ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1088
 
(4) Grady C. P. L., Smets B. F. och Barbeau D. S. (1996), ”Variability in kinetic 
parameter estimates: A review of possible causes and a proposed terminol ­
ogy”,  Wat. Res ., 30 (3), s. 742–748. 
(5) ”Biodegradation kinetics: Generation and use of data for regulatory decision 
making (1997)”, Workshop at Port Sunlight, UK, red. Hales S. G., Feitjel T., King H., Fox K., Verstraete W., 4–6 september 1996. SETAC Europe, 
Bryssel.
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1089
 
Tillägg 6.1  
Porous Pot med SRT-kontroll
  ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1090
 
Tillägg 6.2  
Beräkning av kinetiska konstanter  
1. Utifrån antagandet att Monod-kinetik kan tillämpas och med beaktande av en 
massbalans av aktiva fasta ämnen och substrat över systemet med aktiverat slam (1), kan man få steady state-uttryck enligt följande:
 
1 
θ s ¼ μ m · S 1 
K s þ S 1 Ä K d (1) 
eller 
S 1 ¼ K s · ð1 þ K d · θ s Þ 
θ s · ðμ m Ä K d Þ Ä 1 (2) 
där 
S 1 = koncentrationen substrat i utflödet (mg/l) 
K S = halvmättnadskonstant, den koncentration vid vilken μ = μ m /2 (mg/l) 
μ = specifik tillväxthastighet (d  –1 ) 
μ m = maximivärde för μ m (d –1 ) 
K d = specifik sönderfallshastighet för aktiva fasta ämnen (d  –1 ) 
θ S = slammets medelretentionstid, SRT (d) 
Undersökning av denna ekvation leder till följande slutsatser: 
i) Koncentrationen i utflödet är oberoende av koncentrationen i inflödet 
(S 0 ); således varierar den procentuella bionedbrytningen enligt koncent ­
rationen i inflödet S  0 . 
ii) Den enda anläggningskontrollparameter som påverkar S  1 är slamreten ­
tionstiden θ S . 
iii) För en given koncentration i inflödet, S  0 , finns det en kritisk slamreten ­
tionstid, dvs.  
1 
θ SC ¼ μ s · S 0 
K s þ S 0 Ä K d (3) 
där 
θ SC = kritisk slamretentionstid, under vilken de kompetenta mikroorga ­
nismerna sköljs ut ur anläggningen. 
iv) Eftersom de övriga parametrarna i ekvation (2) är associerade med till ­
växtkinetik, är det sannolikt att temperaturen påverkar utflödets substrat ­
nivå och den kritiska slamåldern, dvs. den slamretentionstid som behövs 
för att få en viss grad av rening ökar med sjunkande temperatur. 
2. Utifrån en massbalans för fasta ämnen i Porous Pot-systemet och utifrån 
antagandet att koncentrationen fasta ämnen i anläggningens utflöde X  2 är 
lågt i jämförelse med luftningskärlets utflöde X  1 , är slamretentionstiden  
θ s ¼ V · X 1 
ðQ 0 Ä Q 1 Þ · X 2 þ Q 1 · X 1 (4) ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1091
 
och 
θ s ¼ V · X 1 
Q 1 · X 1 ¼ V 
Q 1 
där 
V = luftningskärlets volym (l) 
X 1 = koncentrationen fasta ämnen i luftningskärlet (mg/l) 
X 2 = koncentrationen fasta ämnen i utflödet (mg/l) 
Q 0 = inflödets flödeshastighet (l/d) 
Q 1 = avloppsslammets flödeshastighet (l/d) 
Det är således möjligt att hålla slamretentionstiden på ett förhandsvalt värde 
genom att kontrollera avloppsslammets flödeshastighet Q  1 . 
Slutsatser: 
3. Huvudsyftet med detta test är alltså att kunna förutse testkemikaliens kon ­
centration i utflödet, och därmed testkemikaliens nivåer i vattenrecipienten. 
4. Genom att plotta S  1 mot θ S kan den kritiska slamretentionstiden θ SC i vissa 
fall uppskattas på enkelt sätt, se t.ex. kurva 3 i figur 1. Om detta inte är möjligt kan θ
 SC beräknas med ungefärliga värden på μ m och K  S genom att 
plotta S  1 mot S  1 •θ S . 
Omordning av ekvation 1 ger följande:  
S 1 · θ s 
1 þ θ s · K d ¼ K s 
μ m þ S 1 
μ m (5) 
Om K  d är lågt blir 1 + θ s • K  d ~ 1 och ekvation 5 blir enligt följande:  
S 1 · θ s ¼ K s 
μ m þ S 1 
μ m (6) 
Då bör kurvan bli en rak linje (se figur 2) som har lutningen 1/ μ m och 
skärningspunkt med K  S /μ m ; likaså är θ S ~1/μ m . ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1092
 
Figur 1  
Tre temperaturer, fem SRT-värden
  
Figur 2  
Regressionslinje SRT · S 1 mot S  1 vid T = 5 °C
  
Ordlista : 
Koncentration i utflöde Kurva
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1093
 
Tillägg 7  
TEST VID LÅGA ( μg/l) KONCENTRATIONER 
1. Kemikalierna i vattenmiljön förekommer ofta i mycket låga koncentrationer 
(μg/l), även i avloppsvatten. Vid sådana koncentrationer fungerar de sanno ­
likt inte som primära substrat som resulterar i tillväxt, utan sönderfaller mer sannolikt som icke-växande sekundära substrat, parallellt med förekomsten 
av flera olika naturligt förekommande kolföreningar. Av det följer att sön ­
derfallet av sådana kemikalier inte följer modellen som beskrivs i tillägg 6. Det finns flera modeller som kan tillämpas och under de betingelser som råder i system för rening av avloppsvatten kan flera modeller vara samtidigt 
aktiva. Det kommer att behövas en hel del mera forskning för att få klarhet i 
detta problem. 
2. Fram till dess kan förfarandet som beskrivs i huvudtexten (kapitel C.10 A) 
följas, men endast för primär bionedbrytbarhet, med användning av lämpligt 
låga koncentrationer (< 100 μg/l) och ett validerat analysförfarande. Den 
procentuella bionedbrytningen kan beräknas (se punkt 54 i testmetoden) för ­
utsatt att de abiotiska processerna (adsorption, flyktighet osv.) beaktas. Som 
exempel kan nämnas en studie gjord av Nyholm m.fl. (1) (2) med använd ­
ning av en 4-timmarscykel i ett fill and draw-system. De rapporterade pseudo-första ordningens konstanter för 5 kemikalier som tillsatts till synte ­
tiskt avloppsvatten i koncentrationer på 5–100 μg/l. För slutlig bionedbryt ­
barhet kan
 14 C-märkta kemikalier användas. Beskrivning av detta går utöver 
räckvidden för denna testmetod eftersom det än så länge inte finns över ­
enskomna förfaranden, om än en föreslagen metod för ISO 14592 (3) inne ­
håller vägledning om användningen av  14 C-märkta kemikalier.  
SCAS-test  
3. Senare föreslogs ett enklare tvåstegstest (4) (5) (6) där SCAS-metoden (Semi 
Continous Activated Sludge) följs av ett kortvarigt kinetiskt test på prover tagna från SCAS-enheterna. SCAS-systemet körs med kända slamkasserings ­
grader (till åtskillnad från den ursprungliga C.12-testmetoden) och matas med 
modifierat syntetiskt avloppsvatten eller avloppsvatten från hushåll. Det syn ­
tetiska avloppsvattnet modifierades (på grund av föränderligt pH-värde och slammets dåliga sedimentering) genom tillsats av fosfat som buffert, jästex ­
trakt, järn(III)klorid och spårelementsalter, och COD höjdes till cirka 750 
mg/l genom ökad koncentration av pepton och köttextrakt. Enheterna kördes 
med en 24-timmarscykel: luftning under 23 timmar, kassering av slam, se ­
dimentering, borttagning av supernatant (utflöde) och därefter tillsats av syn ­
tetiskt avloppsvatten plus testkemikalie, upp till μg/l (dvs. ungefär samma 
koncentration som användes i korttidstestet). En gång i veckan ersattes 10 % av totalslammet med färskt slam för att upprätthålla balans i den mikrobiella populationen. 
4. Koncentrationen av testkemikalie i början och i slutet av luftningen uppmäts 
och testet fortsätts tills en konstant eliminering av testkemikalie erhålls, vilket tar från en vecka till flera månader.
 
Korttidstest  
5. Ett korttidstest (t.ex. 8 timmar) används för att bestämma (pseudo) första 
ordningens kinetiska konstant för sönderfall av testkemikalien i aktiverat 
slam med kända men olika ursprung och olika historia. Slamprover tas sär ­
skilt från SCAS-reaktorer – i slutet av luftningsperioden när koncentrationen organiskt substrat är låg – medan acklimatiseringsexperiment pågår (punk ­
terna 3, 4). För jämförelse kan slam också tas från en parallell SCAS-enhet 
som inte exponeras för testkemikalie. Blandningar av slam och testkemikalie
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1094
 
tillsatta i två eller flera koncentrationen i området 1–50 μg/l luftas, utan till ­
sats av syntetiskt avloppsvatten eller annat organiskt substrat. Kvarvarande 
testkemikalie i lösningen bestäms med regelbundna mellanrum, t.ex. varje timme, beroende på kemikaliens sönderfallsegenskaper, under högst 24 tim ­
mar. Proverna centrifugeras före själva analysen.
 
Beräkningar  
6. Data från SCAS-enheterna används för att beräkna procentandelen eliminerad 
testkemikalie (punkt 54). Likaså kan en konstant för genomsnittlig elimine ­
ring K  1 (normaliserad för koncentrationen suspenderade fasta ämnen) kalky ­
leras genom följande: 
K 1 ¼ 1=t · ln C e 
C i · 1=SSð1=g hÞ 
där 
t = luftningstiden (23 timmar) C
 e = koncentrationen vid luftningsperiodens slut ( μg/l) 
C i = koncentrationen vid luftningsperiodens början ( μg/l) 
SS = koncentrationen av fasta ämnen i aktiverat slam (g/l) 
7. För korttidstestet plottas logaritmen av procentuell återstående koncentration 
mot tiden och lutningen på den första delen (10–50 % sönderfall) av grafen 
motsvarar K  1 , (pseudo)första ordningens konstant. Konstanten normaliseras 
med hänsyn till koncentrationen fasta ämnen i slammet genom att dividera lutningen med koncentrationen fasta ämnen i slammet. De rapporterade re ­
sultaten måste också innehålla uppgifter om initialkoncentrationen för test ­
kemikalie och suspenderade fasta ämnen, slamretentionstiden, slammatning och slamkälla samt uppgifter om eventuell förhandsexponering för testkemi ­
kalien.
 
Resultatvariation  
8. Variationen och andra aspekter rörande bionedbrytningens kinetik diskutera ­
des nyligen vid en SETAC-workshop (7). Dessa studier bör, rapporterade och projekterade, ge en klarare uppfattning om den kinetik som fungerar i vat ­
tenreningsverk, och därmed en bättre tolkning av befintliga data och förslag 
till mer relevanta utformningar av nya testmetoder.
 
LITTERATUR  
(1) Nyholm N., Jacobsen B. N., Pedersen B. M., Poulsen O, Dambourg A. och 
Schultz B. (1992), ”Removal of micropollutants in laboratory activated 
sludge reactors. Biodegradability”,  Wat. Res.  26, s. 339–353. 
(2) Jacobsen B.N., Nyholm N., Pedersen B.M., Poulsen O. och Ostfeldt P. 
(1993), ”Removal of organic micropollutants in laboratory activated sludge reactors under various operating conditions: Sorption”,  Wat. Res.  27, s. 
1505–1510. 
(3) ISO 14592 (ISO/TC 147/ SC5/ WG4, N264) (1998),  Water Quality - Eva ­
luation of the aerobic biodegradability of organic compounds at low con ­
centrations in water .
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1095
 
(4) Nyholm N., Ingerslev F., Berg U. T., Pedersen J. P. och Frimer-Larsen H. 
(1996), ”Estimation of kinetic rate constants for biodegradation of chemicals 
in activated sludge waste water treatment plants using short-term batch ex ­
periments and μg/l range spiked concentrations”,  Chemosphere  33 (5), s. 
851–864. 
(5) Berg U. T. och Nyholm N. (1996), ”Biodegradability simulation Studies in 
semi-continuous activated sludge reactors with low ( μg/l range) and standard 
(ppm range) chemical concentrations”,  Chemosphere  33 (4), s. 711–735. 
(6) Danish Environmental Protection Agency 1996), ”Activated sludge bio ­
degradability simulation test”, Environmental Project, No. 337, Nyholm, N. Berg, UT, Ingerslev, F. Miljö- och energiministeriet, Köpenhamn. 
(7) ”Biodegradation kinetics: Generation and use of data for regulatory decision 
making (1997)”, Workshop at Port Sunlight, UK, Red. Hales S. G., Feitjel T., King H., Fox K. och Verstraete W., 4–6 september 1996, SETAC Eu ­
rope, Bryssel.
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1096
 
C.10-B: Biofilmer  
INLEDNING 
1. Simuleringstest används i regel på kemikalier som inte har klarat screen ­
ingtest för lätt bionedbrytbarhet (kapitel C.4 A till F i denna bilaga (9)) men som har klarat test för lätt bionedbrytbarhet. Undantagsvis används simuleringstest också för kemikalier där det krävs mer information, särskilt 
storvolymskemikalier, och i regel används test med aktiverat slam 
(C.10 A). Under vissa omständigheter krävs det dock specifik information om hur en kemikalie agerar när reningsmetoderna inbegriper biofilm (bio ­
logiska filter eller bakteriefilter, roterande biologiska kontaktorer, fluid ­
bädd). För att möta dessa behov har olika slags utrustning tagits fram. 
2. Gerike m.fl. (1) använde stora bakteriefilter i pilotskala enligt kopplad 
modell. Filtren var mycket utrymmeskrävande och krävde relativt stora 
mängder avloppsvatten eller syntetiskt avloppsvatten. Truesdale m.fl. (2) beskrev små filter (6 fot × 6 tum i diameter) som matades med naturligt avloppsvatten fritt från ytaktiva ämnen men som fortfarande krävde rätt 
stora volymer. Det krävs upp till 14 veckor för utveckling av en ”mogen” 
biofilm och ytterligare 4–8 veckor efter första tillförseln av det ytaktiva testämnet innan acklimatisering sker. 
3. Baumann m.fl. (3) utvecklade ett betydligt mindre filter med polyes ­
terfleece som först hade blötlagts i aktiverat slam såsom inert medium som underlag för biofilmen. Enda kolkälla var testkemikalien och bioned ­
brytbarheten bedömdes utifrån mätningar av upplöst organiskt kol (DOC) i 
inflöde och utflöde och utifrån mängden CO
 2 i utloppsgasen. 
4. Ett nytt sätt att närma sig frågan hade Gloyna m.fl. (4) som uppfann den 
roterande rörformiga reaktorn. På den inre ytan av ett roterande rör odlades en biofilm på känd ytareal genom passage av ett flöde som tillsattes i övre ändan av det svagt horisontellt lutande röret. Reaktorn har använts för att 
studera ytaktiva ämnens bionedbrytbarhet (5) samt för att undersöka bio ­
filmens optimala tjocklek och diffusionen genom filmen (6). Gloyna m.fl. utvecklade reaktorn ytterligare, bl.a. genom att göra en modifikation som ger möjlighet att bestämma CO
 2 i utloppsgasen. 
5. Den roterande rörformiga reaktorn har antagits av Standing Committee of 
Analysts (UK) som en standardmetod för bedömning av både kemikaliers 
bionedbrytbarhet (7) och avloppsvattens behandlingsmöjlighet och toxicitet 
(8). Fördelarna med den metod som beskrivs här är att den är enkel, kompakt, reproducerbar och att det krävs relativt små volymer organiskt medium.
 
PRINCIP FÖR TESTMETODEN 
6. Syntetiskt avloppsvatten eller avloppsvatten från hushåll, testkemikalien, i 
blandning eller för sig, appliceras på inre ytan av ett långsamt roterande lutande rör. Ett lager mikroorganismer, liknande dem som finns på bio ­
filtermedia, byggs upp på den inre ytan. Reaktorns driftsbetingelser väljs så 
att man får adekvat eliminering av organiskt material och, om så krävs, 
oxidation av ammonium.
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1097
 
7. Utflödet från röret samlas upp och får antingen sedimentera och/eller fil ­
treras före analys av upplöst organiskt kol (DOC) och/eller testkemikalien 
med en specifik metod. Som jämförelse körs kontrollenheter som inte matas med testkemikalie parallellt under samma betingelser. Skillnaden mellan koncentrationerna DOC i utflödet från test- och kontrollenheterna antas 
bero på testkemikalien och dess organiska metaboliter. Skillnaden jämförs 
med koncentrationen tillsatt testkemikalie (som DOC) i syfte att kunna beräkna elimineringen av testkemikalien. 
8. I regel kan bionedbrytning åtskiljas från bioadsorption genom detaljerad 
granskning av kurvan för eliminering mot tid. Bekräftelse fås vanligen genom ett test för lätt bionedbrytbarhet (syreupptagning eller koldioxidpro ­
duktion) där man använder ett acklimatiserat inokulat som tas i slutet av 
testet från de reaktorer som matas med testkemikalien.
 
INFORMATION OM TESTKEMIKALIEN 
9. Testkemikaliens renhet, vattenlöslighet, flyktighet och adsorptionsegenska ­
per bör vara kända för att resultaten ska kunna tolkas korrekt. 
10. I regel kan flyktiga och dåligt lösliga kemikalier inte testas om inte sär ­
skilda åtgärder vidtas (se tillägg 5 till kapitel C.10 A). Dessutom bör den 
kemiska strukturen eller minst den empiriska formeln vara känd för att kunna kalkylera teoretiska värden och/eller kontrollera uppmätta parameter ­
värden, t.ex. teoretisk syreförbrukning (ThOD) och DOC. 
11. Information om testkemikaliens toxicitet för mikroorganismer (se tillägg 4 
till kapitel C.10 A) kan vara till hjälp för valet av lämpliga testkoncent ­
rationer och kan även vara väsentlig för korrekt tolkning av låga värden för 
biologisk nedbrytbarhet.
 
GODKÄNNANDENIVÅER 
12. Ursprungligen krävdes att den primära biologiska nedbrytningen av yt ­
aktiva ämnen måste nå upp till minst 80 % för att kemikalien i fråga skulle 
få släppas ut på marknaden. Om 80 % eliminering inte uppnås, kan detta simuleringstest (bekräftande test) tillämpas, och det ytaktiva ämnet får en ­
dast släppas ut på marknaden förutsatt att mer än 90 % av kemikalien 
elimineras. Generellt gäller för kemikalier inte frågan om godkänt/ej god ­
känt, och värdet på den procentuella eliminering som erhållits kan användas i uppskattningsberäkningar av den sannolika miljökoncentration som kan användas vid farobedömning för kemikalier. I ett antal studier av rena 
kemikalier konstaterades att elimineringsprocenten för DOC var > 90 % i 
tre fjärdedelar av fallen och > 80 % i över 90 % av fallen för kemikalier som visade betydande grad av biologisk nedbrytbarhet.
 
REFERENSKEMIKALIER 
13. För att säkerställa att försöksförfarandet genomförs korrekt är det lämpligt 
att med vissa mellanrum testa referenskemikalier med känt beteende. Så ­
dana kemikalier är adipinsyra, 2-fenylfenol, 1-naftol, 2,2’-bifenyldikarbox ­
ylsyra och 1-naftoesyra.  
TESTRESULTATENS REPRODUCERBARHET 
14. Den relativa standardavvikelsen inom tester konstaterades i ett laboratorium 
i Storbritannien vara 3,5 % medan avvikelsen mellan test var 5 % (7).  ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1098
 
METODBESKRIVNING  
Apparatur  
Roterande rörformiga reaktorer  
15. Apparaturen (se figur 1 och 2 i tillägg 8) består av en grupp akrylrör med 
en längd på 30,5 cm och innerdiameter på 5 cm per rör, stödda på hjul med 
hjulring av gummi inom en stödram av metall. Varje rör har på utsidan en läpp med ett djup på cirka 0,5 cm för att hålla röret på hjulen, innerytan är uppruggad med grov stålull och det finns en inre läpp med 0,5 cm djup vid 
övre ändan (inmatningsändan) för att hålla kvar vätskan. Rören har en 
horisontell lutning på cirka en grad för att få önskad kontakttid när test ­
mediet appliceras i ett rent rör. De gummiklädda hjulens rotation drivs med en långsam motor med variabel hastighet. Rörets temperatur kontrolleras 
genom att det hålls i ett utrymme med konstant temperatur. 
16. Genom att innesluta varje rörreaktor i ett aningen större rör med lock och 
säkerställa att anslutningarna är gastäta, kan utgående CO
 2 -gas samlas upp i 
en alkalisk lösning för efterföljande mätning (6). 
17. För 24-timmarsmatning till varje teströr av organiskt medium med tillsatt 
testkemikalie, om tillämpligt, hålls mediet i ett 20-literskärl (A) (se figur 2). 
Om så krävs kan testkemikalielösningen doseras separat. Nära botten av varje lagringskärl finns ett utlopp som är kopplat med lämpliga rör, t.ex. av silikongummi, via en peristaltisk pump (B) till ett glas- eller akrylmatnings ­
rör som går 2–4 cm in i den högre (inmatnings)ändan av det lutade 
röret (C). Utflödet får droppa ut från det lutade rörets lägre ända för upp ­
samling i ett annat lagringskärl (D). Utflödet sedimenteras eller filtreras före analys.
 
Filtreringsapparatur, centrifug  
18. Utrustning för filtrering av prover med membranfilter av lämplig porstorlek 
(nominell öppningsdiameter 0,45 μm) som adsorberar organiska kemikalier 
eller har minimalt utsläpp av organiskt kol. Om filter som släpper ut or ­
ganiskt kol används, tvätta filtren försiktigt med hett vatten för att avlägsna detta kol. Alternativt kan man använda en centrifug som når upp till 40 000 m/s
 2 . 
19. Analytisk utrustning för bestämning av 
— DOC/totalt organiskt kol (TOC) eller kemisk syreförbrukning (COD), — specifik kemikalie (HPLC, GC osv.), om så krävs, — pH, temperatur, surhet, alkalinitet, — ammonium, nitrit och nitrat, om testerna genomförs under nitrifikations ­
förhållanden.
 
Vatten  
20. Kranvatten med mindre än 3 mg/l DOC. 
21. Destillerat eller avjoniserat vatten med mindre än 2 mg/l DOC.  ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1099
 
Organiskt medium  
22. Syntetiskt avloppsvatten, avloppsvatten från hushåll eller en blandning av 
båda kan användas som organiskt medium. Det har visat sig att användning av enbart avloppsvatten från hushåll ofta ger ökad procentandel 
DOC-eliminering (i enheter för aktiverat slam) och t.o.m. möjliggör bio ­
logisk nedbrytning av vissa kemikalier som inte bryts ned när syntetiskt avloppsvatten enligt OECD används. Därför rekommenderas användning av avloppsvatten från hushåll. Mät DOC- eller COD-koncentrationen i varje 
ny sats av organiskt medium. Det organiska mediets surhet eller alkalinitet 
ska vara känd. Om mediet har låg surhet eller alkalinitet kan det krävas tillsats av lämplig buffert (natriumvätekarbonat eller kaliumvätefosfat) för 
att pH i reaktorn ska hållas kring 7,5 ± 0,5 under testet. Mängden buffert 
och tillsättningstidpunkten måste fastställas separat i varje enskilt fall.
 
Syntetiskt slam  
23. Per liter kranvatten upplöses följande: 160 mg pepton, 110 mg köttextrakt, 
30 mg urea, 28 mg vattenfritt dikaliumvätefosfat (K  2 HPO  4 ), 7 mg natri ­
umklorid (NaCl), 4 mg kalciumkloriddihydrat (CaCl  2 ·2H 2 O), och 2 mg 
magnesiumsulfatheptahydrat (Mg  4 SO 2 ·7H 2 O). Detta syntetiska avloppsvat ­
ten enligt OECD är ett exempel, och ger en medelkoncentration på cirka 100 mg/l DOC i inflödet. Alternativt kan man använda andra sammansätt ­
ningar med ungefär samma DOC-koncentration, som ligger närmare verk ­
ligt avloppsvatten. Detta syntetiska avloppsvatten kan göras i destillerat vatten i en koncentrerad form och förvaras i cirka 1 C upp till en vecka. Späd vid behov ut med kranvatten (detta medium är inte tillfredsställande, 
kvävekoncentrationen är t.ex. mycket hög och kolhalten relativt låg, men 
det finns inga bättre förslag utom att tillsätta mera fosfat som buffert samt extra pepton).
 
Avloppsvatten från hushåll  
24. Använd färsk bottensats av avloppsvatten som samlas upp dagligen från 
reningsanläggningar som i huvudsak tar emot avloppsvatten från hushåll. 
Avloppsvattnet ska samlas upp från primärsedimenteringstankens överflö ­
deskanal eller från matningen till aktivslamanläggningen, och det ska till övervägande del vara fritt från grova partiklar. Avloppsvattnet kan använ ­
das efter ett antal dagars lagring vid cirka 4 °C, om det går att påvisa att 
DOC (eller COD) inte har sjunkit betydligt (mindre än 20 %) under lag ­
ringen. För att undvika systemstörningar ska DOC (eller COD) i varje ny sats justeras före användningen till ett lämpligt konstant värde, t.ex. genom 
utspädning med kranvatten.
 
Smörjmedel  
25. Glycerol eller olivolja kan användas för smörjning av den peristaltiska 
pumpens rullar; båda är lämpliga för användning på silikongummirör.  
Stamlösningar av testkemikalien  
26. För kemikalier med rimlig löslighet bereds stamlösningar med lämpliga 
koncentrationer (t.ex. 1–5 g/l) i avjoniserat vatten eller i mineraldelen av 
syntetiskt avloppsvatten. För olösliga kemikalier, se tillägg 5 till kapitel 
C.10 A. Denna metod är inte lämplig för flyktiga kemikalier utan modifie ­
ring av de rörformade reaktorerna (punkt 16). Bestäm DOC och TOC för stamlösningen och upprepa mätningarna för varje ny sats. Om skillnaden 
mellan DOC och TOC är större än 20 % bör testkemikaliens vattenlöslighet 
kontrolleras. Jämför testkemikaliens DOC eller koncentration uppmätt
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1100
 
genom specifik analys av stamlösningen med det nominella värdet, för att 
kunna bedöma om utbytet är tillräckligt bra (i regel kan > 90 % förväntas). 
Särskilt för dispersioner bör man försäkra sig om att DOC kan användas som analytisk parameter; annars måste en analysteknik som är specifik för testkemikalien användas. För dispersioner krävs centrifugering av proverna. 
För varje ny sats bör mätning göras av DOC, COD eller testkemikalien 
med specifik analys. 
27. Bestäm stamlösningens pH. Extremvärden tyder på att tillsats av kemika ­
lien kan påverka pH-värdet för det aktiverade slammet i testsystemet. I så fall bör stamlösningen neutraliseras till pH 7 ± 0,5 med små mängder 
oorganisk syra eller bas, men utfällning av testkemikalien bör undvikas.
 
FÖRFARANDE  
Förberedning av organiskt medium för dosering  
28. Se till att alla inflödes- och utflödesbehållare samt rören från inflödeskärl 
och till utflödeskärl rengörs omsorgsfullt för att eliminera mikrobtillväxt initialt och under hela testet. 
29. Förbered färskt syntetiskt avloppsvatten (punkt 23) varje dag, antingen från 
fasta ämnen eller från koncentrerad stamlösning genom lämplig utspädning 
med kranvatten. Mät upp den mängd som krävs i en cylinder och fyll på i ett rent inflödeskärl. Tillför vid behov också nödvändig mängd stamlösning av testkemikalie eller referenskemikalie till det syntetiska avloppsvattnet 
före utspädning. Om det är mera praktiskt eller nödvändigt för att undvika 
förlust av testkemikalien, förbered en separat utspädd lösning av testkemi ­
kalien i ett separat kärl och mata lösningen till de lutade rören via en skild doseringspump. 
30. Alternativt (och helst) bör sedimenterat avloppsvatten från hushåll användas 
(punkt 24) som uppsamlats färskt varje dag, om möjligt.
 
Användning av de roterande rörformade reaktorerna  
31. Två identiska rörformade reaktorer behövs för bedömning av en testkemi ­
kalie, och de monteras i ett utrymme med konstant temperatur, i regel 22 
± 2 °C. 
32. Justera de peristaltiska pumparna på 250 ± 25 ml/tim organiskt medium 
(utan testkemikalie) till de lutade rören, som ska ha en rotation på 18 ± 2 rpm. Tillsätt smörjmedel (punkt 25) på pumpens rör (till en början och 
därefter regelbundet under testets gång) för att säkerställa korrekt funktion 
och förlänga rörens livslängd. 
33. Justera rörens horisontella lutningsvinkel så att en uppehållstid på 125 
± 12,5 sekunder fås vid matning in i ett rent rör. Uppskatta retentionstiden genom att tillsätta en icke-biologisk markör (t.ex. NaCl, inert färgmedel) till matningen – den tid som krävs för att nå toppkoncentration i utflödet anses 
utgöra den genomsnittliga retentionstiden (när filmen är maximal kan re ­
tentionstiden öka till cirka 30 minuter). 
34. Dessa parametrar har konstaterats ge adekvat eliminering (> 80 %) av DOC 
(eller COD) och producera nitrifierade utflöden. Flödeshastigheten bör änd ­
ras om elimineringen är otillräcklig eller om simuleringen gäller ett speci ­
fikt reningsverk. I det senare fallet bör doseringen av det organiska mediet 
justeras tills reaktorns prestanda är samma som för reningsverket.
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1101
 
Inokulering  
35. Luftburen inokulering kan räcka för att starta tillväxt av mikroorganismer 
när syntetiskt avloppsvatten används; om så inte sker, tillsätt 1 ml/l sedi ­
menterat avloppsvatten till matningen under 3 dagar.  
Mätningar  
36. Kontrollera regelbundet att doseringen och roteringshastigheterna ligger 
inom satta gränser. Mät också utflödets pH, särskilt om nitrifikation för ­
väntas.  
Provtagning och analys  
37. Metod, mönster och frekvens väljs enligt testets ändamål. Ta t.ex. stickprov 
av inflöde och utflöde eller ta prover över en längre period, t.ex. 3–6 veckor. Under den första perioden, utan testkemikalie, tas prover två gånger 
i veckan. Filtrera proverna genom membraner eller centrifugera dem vid 
cirka 40 000 m/s
 2 i cirka 15 minuter (punkt 18). Det kan vara nödvändigt 
att sedimentera och/eller grovfiltrera proverna före membranfiltrering. Be ­
stäm DOC (eller COD) minst i duplikat och om så krävs BOD, ammonium 
och nitrit/nitrat. 
38. Alla analyser bör göras så snart som möjligt efter provtagning och bered ­
ning av proverna. Om analyser måste senareläggas bör proverna förvaras 
vid cirka 4 C i mörker i helt fyllda och tätt förslutna flaskor. Om proverna måste förvaras längre än 48 timmar bör de konserveras genom djupfrys ­
ning, syrabehandling eller genom tillsats av lämpligt gift (t.ex. 20 ml/l av 
en 10 g/l-lösning av kvicksilver(II) klorid). Se till att konserveringstekniken 
inte påverkar analysresultaten.
 
Inkörningsperiod  
39. Under inkörningsperioden växer ytans biofilm till optimal tjocklek, vilket i 
regel tar cirka 2 veckor men inte får överskrida 6 veckor. Elimineringen 
(punkt 44) av DOC (eller COD) ökar och når platåvärde. När platåvärdet har nått samma nivå i båda rören, väljs ena röret till kontrollrör för åter ­
stoden av testet, under vilken rören bör fungera på ett enhetligt sätt.
 
Tillsättning av testkemikalie  
40. I detta skede tillsätts testkemikalie till den andra reaktorn i lämplig kon ­
centration, i regel 10–20 mg C/l. Kontrollreaktorn matas fortsättningsvis endast med organiskt medium.
 
Acklimatiseringsperiod  
41. Fortsätt med analyserna av DOC (eller COD) två gånger i veckan och om 
även primär bionedbrytbarhet ska bedömas, ska även en mätning av test ­
kemikaliens koncentration göras genom specifik analys. Låt acklimatise ­
ringen pågå i 1–6 veckor (eller under speciella omständigheter längre) efter 
att testkemikalien tillsatts för första gången. När den procentuella elimine ­
ringen (punkterna 43–45) når ett maximivärde bestäms 12–15 giltiga vär ­
den från platåfasen över cirka 3 veckor för utvärdering av genomsnittlig procentuell eliminering. Testet anses vara slutfört när en tillräckligt hög 
grad av eliminering nås. Normalt ska testet inte pågå längre än 12 veckor 
från första tillsättning av testkemikalien.
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1102
 
Ömsning av film  
42. Plötsligt avlägsnande av stora mängder överskottsfilm från rören (”öms ­
ning”), sker med relativt regelbundna intervall. För att säkerställa att resul ­
tatens jämförbarhet inte påverkas bör testet täcka minst två fulla cykler av 
tillväxt och ömsning.  
DATA OCH RAPPORTERING  
Behandling av resultaten  
43. Beräkna procentandelen DOC- eller COD-eliminering av testkemikalie för 
varje bedömningstidpunkt genom följande ekvation: 
D t ¼ 100 ½C s Ä ðE Ä E o Þâ=C s % 
där 
D t = procentuell eliminering av DOC (eller COD) vid tidpunkten t, 
C s = koncentrationen DOC (eller COD) som kan tillskrivas testkemika ­
lien, helst uppskattad utifrån stamlösningens koncentration och till ­
satt volym (mg/l), 
E = uppmätt DOC (eller COD) i testutflödet vid tidpunkten t (mg/l), E
 o = uppmätt DOC (eller COD) i kontrollutflödet vid tidpunkten t (mg/l). 
Upprepa beräkningen för referenskemikalien, om sådan testas.  
Kontrollreaktorns funktion  
44. Graden av DOC- eller COD-eliminering (D  B ) i det organiska mediet i 
kontrollenheten bidrar till bedömningen av den biologiska nedbrytnings ­
aktiviteten i biofilmen under testet. Den procentuella elimineringen kan 
beräknas genom följande ekvation: 
D B ¼ 100 ð1 Ä E o=C m Þ % 
där 
C m = DOC (eller COD) i det organiska mediet i kontrollenhetens inflöde 
(mg/l). 
45. Elimineringen av testkemikalie (D  ST ) kan beräknas om den har uppmätts 
med en specifik analysmetod vid varje bedömningstidpunkt, genom föl ­
jande ekvation: 
DST ¼ 100 ð1 Ä S e=S i Þ % 
där 
S i = uppmätt eller helst uppskattad koncentration av testkemikalien i tes ­
tinflödet (mg/l), 
S e = uppmätt koncentration av testkemikalien i testutflödet vid tidpunkten 
t (mg/l).  ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1103
 
Om den analytiska metoden ger ett positivt värde i oförändrat avloppsvatten 
ekvivalent med S  c mg/l, kan den procentuella elimineringen (D  SC ) beräknas 
genom följande: 
DSC ¼ 100 ðS i Ä S e þ S c Þ=ðS i þ S c Þ % 
Presentation av testresultat  
46. Plotta den procentuella elimineringen D  t och D  ST (eller D  SC ), om tillgäng ­
lig, mot tiden (se tillägg 2 till kapitel C.10 A). Beräkna medelvärdet (ut ­
tryckt i nästa heltal) och standardavvikelsen för de 12–15 värden för D  T 
(och D  ST om tillgängligt) som erhållits för platåfasen, som procentandelen 
eliminering av testkemikalien. Elimineringskurvans form kan ge underlag 
för vissa slutsatser om elimineringsprocessen.  
Adsorption  
47. Om kraftig DOC-eliminering observeras från början av testet, är det san ­
nolikt att testkemikalien elimineras genom adsorption på biofilmen. Detta 
kan eventuellt påvisas genom att bestämma mängden testkemikalie som adsorberas på fasta ämnen som lossnat från filmen. Det är inte vanligt att elimineringen av DOC för adsorberbara kemikalier förblir kraftig genom 
hela testet; eliminering är i regel kraftig i början för att sedan gradvis 
minska till ett jämviktsvärde. Om däremot den adsorberade testkemikalien på ett eller annat sätt kan orsaka acklimatisering av den mikrobiella popu ­
lationen, stiger testkemikaliens DOC-eliminering därefter och når ett högt 
platåvärde.
 
Lagfas  
48. På samma sätt som vid statiska screeningtest, kräver många testkemikalier 
en lagfas innan full biologisk nedbrytning inträffar. Under lagfasen sker 
acklimatisering eller anpassning av de kompetenta bakterierna praktiskt taget utan eliminering av testkemikalien vid bakterietillväxtens inledande skede. Denna fas upphör och nedbrytningsfasen anses börja när cirka 10 % 
av den inledande mängden testkemikalie har eliminerats (efter att adsorp ­
tion har fått ske, i förekommande fall). Lagfasen är ofta mycket varierande och svår att reproducera.
 
Platåfas  
49. Platåfasen i en elimineringskurva för ett kontinuerligt test definieras som 
den fas då maximal nedbrytning sker. Platåfasen bör pågå minst 3 veckor och ska ge cirka 12–15 uppmätta giltiga värden.
 
Genomsnittlig elimineringsgrad för testkemikalien  
50. Beräkna medelvärdet utifrån testkemikaliens elimineringsvärden D  t (och 
D st ) under platåfasen. Avrundat till närmaste heltal (i %) är detta testkemi ­
kaliens elimineringsgrad. Dessutom rekommenderas en beräkning av me ­
delvärdets 95 % konfidensintervall. Beräkna på samma sätt genomsnittlig 
eliminering (D  B ) av det organiska mediet i kontrollkärlet.  ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1104
 
Indikation på biologisk nedbrytning  
51. Om testkemikalien inte adsorberas i betydlig grad på biofilmen och elimi ­
neringskurvan har den typiska formen för en biologisk nedbrytningskurva med lagfas, kan nedbrytnings- och platåfaserna (punkterna 48, 49) med 
säkerhet tillskrivas biologisk nedbrytning. Om det har förekommit stark 
inledande eliminering kan simulationstestet inte användas för att skilja mellan biologiska och abiotiska elimineringsprocesser. I sådana fall, och i andra fall där det kan finnas tvivel om biologisk nedbrytning (t.ex. vid 
strippning), bör en analys göras rörande adsorberad testkemikalie eller 
ytterligare (screening)test för biologisk nedbrytning genomföras på grund ­
val av parametrar som klart indikerar biologiska processer. Sådana test är 
syreupptagningsmetoder (kapitel C.4 i denna bilaga D, E och F (9)) eller 
test med mätning av koldioxidproduktion (kapitel C.4 C i denna bilaga) eller Headspace-metoden (10); som inokulat används förhandsexponerad biofilm från lämplig reaktor. 
52. Om både DOC-eliminering och eliminering av specifik kemikalie har upp ­
mätts och det finns betydande skillnader mellan elimineringsgraderna (DOC-elimineringen är lägre), tyder detta på att utflödena innehåller inter ­
mediära organiska produkter som kan vara svårare att bryta ned och som 
måste undersökas.
 
Testresultatens giltighet  
53. Testet kan anses vara giltigt om graden av DOC- eller COD-eliminering 
(D B ) i kontrollenheten är > 80 % efter 2 veckor och inget ovanligt har 
observerats. 
54. Om en lätt biologiskt nedbrytbar (referens)kemikalie har testats, bör graden 
av biologisk nedbrytbarhet vara > 90 % och skillnaden mellan duplikat ­
värden får inte vara större än 5 %. Om dessa två kriterier inte uppfylls bör försöksförfarandena ses över och/eller avloppsvatten från hushåll tas från en annan källa. 
55. Likaså gäller att skillnader mellan bionedbrytningsvärden från duplikaten ­
heter (om sådana används) för behandling av testkemikalie inte får avvika 
med mer än 5 %. Om detta kriterium inte uppfylls men elimineringen är 
stark, bör analysen fortsätta i ytterligare tre veckor. Om elimineringen är svag bör testkemikaliens inhiberande effekter undersökas, om de inte är kända, och testet upprepas med en lägre koncentration testkemikalie, om 
detta är genomförbart.
 
Testrapport  
56. Testrapporten ska innehålla följande information:  
Testkemikalie : 
— Identifieringsdata. 
— Fysikalisk natur och, när det är relevant, fysikalkemiska egenskaper.  
Testbetingelser : 
— Eventuella modifieringar av testsystemet, särskilt vid testning av olös ­
liga eller flyktiga kemikalier. 
— Typ av organiskt medium. 
— Andel och egenskaper hos industriellt avfall i avloppsvattnet, om sådant 
ingår, och om kända. 
— Inokuleringsmetod.  ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1105
 
— Stamlösningens DOC (upplöst organiskt kol) och TOC (totalt organiskt 
kol), i förekommande fall beredningssätt för suspension, använda test ­
koncentrationer, motivering för koncentrationer utanför intervallet 10–20 mg/l DOC, tillsättningsmetod, datum för första tillsättning, even ­
tuella koncentrationsändringar. 
— Genomsnittlig hydraulisk retentionstid (utan tillväxt), rörets rotations ­
hastighet, ungefärlig lutningsvinkel, om möjligt. 
— Uppgifter om lossning (ömsning), tid och intensitet. 
— Testtemperatur och temperaturområde. 
— Analystekniker som använts.  
Testresultat:  
— Alla uppmätta data (DOC, COD), specifika analyser, pH, temperatur, 
kvävekemikalier, om relevant. 
— Alla beräknade värden för D
 t (eller D  tc ), D  B och D  St i tabellform samt 
elimineringskurvor. 
— Information om lag- och platåfaserna, testets tidslängd, elimineringsgrad 
för testkemikalien och referenskemikalien (om testad) och för det or ­
ganiska mediet (i kontrollenheten), tillsammans med statistiska data och 
utlåtanden om biologisk nedbrytbarhet och testets giltighet. 
— Diskussion om resultaten.  
LITTERATUR  
(1) Gerike P., Fischer W., Holtmann W. (1980), ”Biodegradability determina ­
tions in trickling filter units compared with the OECD Confirmatory Test”,  
Wat. Res.  14, s. 753–758. 
(2) Truesdale G. A., Jones K., Vandyke K. G. (1959), ”Removal of synthetic 
detergents in sewage treatment processes: Trials of a new biologically at ­
tackable material”,  Wat. Waste Tr. J . 7, s. 441–444. 
(3) Baumann U., Kuhn G. och Benz M. (1998), ”Einfache Versuchsanordnung 
zur Gewinnung gewässerökologisch relevanter Daten”,  UWSF - Z. Umwelt ­
chem. Ökotox , 10, s. 214–220. 
(4) Gloyna E. F., Comstock R. F., Renn C. E. (1952), ”Rotary tubes as ex ­
perimental trickling filters”,  Sewage ind. Waste  24, s. 1355–1357. 
(5) Kumke G. W., Renn C.E. (1966), ”LAS removal across an institutional 
trickling filter”,  JAOCS  43, s. 92–94. 
(6) Tomlinson T. G., Snaddon D. H. M., (1966), ”Biological oxidation of 
sewage by films of micro-organisms”,  Int.J. Air Wat. Pollut.  10, s. 
865–881. 
(7) Her Majesty’s Stationery Office (1982), ”Methods for the examination of 
waters and associated materials. Assessment of biodegradability”, 1981, 
London. 
(8) Her Majesty’s Stationery Office (1984), ”Methods for the examination of 
waters and associated materials. Methods for assessing the treatability of 
chemicals and industrial waste waters and their toxicity to sewage treatment processes”, 1982, London. 
(9) Kapitel C.4 i denna bilaga, Bestämning av ”lätt” bionedbrytbarhet A–F. 
(10) ISO 14593 (1998),  Water Quality - Evaluation in an aqueous medium of 
the ultimate biodegradability of organic compounds. Method by the analysis 
of inorganic carbon in sealed vessels .
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1106
 
Tillägg 8  
Figur 1  
Roterande rör
  
Ordlista : 
Planvy Vy A/B Drivhjul Frirullande hjul Drivmotor Reduktionsväxel Inre läpp 
Lutningsmekanism 
Konisk växel
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1107
 
Figur 2  
Flödesschema
  
A: Matningskärl 
B: Peristaltisk pump 
C: Roterande rör 
D: Uppsamlingskärl för utflöde  
DEFINITIONER 
testkemikalie : alla ämnen eller blandningar som testas med denna testmetod.  
kemikalier : termen kemikalie används i vid bemärkelse i Unced-avtal (Unced, 
United Nations Conference on the Environment and Development, dvs. Förenta nationernas konferens om miljö och utveckling) och i dokument som grundar sig på dessa, och termen omfattar ämnen, produkter, blandningar, beredningar eller 
motsvarande som kan användas i befintliga system.
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1108
 
C.11  BIOLOGISK NEDBRYTBARHET  
AKTIVERAT SLAM – RESPIRATIONSHÄMNINGSTEST  
1. METOD  
1.1 INLEDNING 
Med denna metod bedöms ett testämnes verkan på mikroorganismer 
genom mätning av respirationshastigheten enligt bestämda villkor vid olika koncentrationer av testämnet. 
Syftet med metoden är att ge en snabb screening-metod för identi ­
fiering av ämnen som kan påverka ett aerobt mikrobiellt reningsverk, 
och att indikera lämpliga icke-hämmande koncentrationer av testäm ­
net som kan användas vid bionedbrytbarhetstest. 
Ett förtest kan utföras före det slutliga testet. Detta test ger upplys ­
ningar om den koncentrationsintervall som ska användas vid huvud ­
testet. 
1 testet ingår två kontrolltester, en vid början och en i slutet av 
testserierna. Dessutom bör varje parti aktiverat slam också kontrol ­
leras genom användning av en referensämne. 
Metoden är enklast att använda för ämnen som på grand av sin 
oupplöslighet i vatten och ringa flyktighet sannolikt kommer att 
förbli i vatten. 
För ämnen med begränsad löslighet i testämnet kan det visa sig 
omöjligt att bestämma EC
 50 . 
Resultat som grundas på syreupptagning kan leda till felaktiga slut ­
satser om ämnet har en tendens att avkoppla oxidativ fosforylering. 
Det är användbart att känna till följande när man utför testet: — Vattenlöslighet, — Ångtryck. 
— Strukturformel. 
— Testämnets renhet.
 
Rekommendation  
Aktiverat slam som innehåller potentiellt patogena organismer bör 
hanteras med försiktighet.  
1.2 DEFINITIONER OCH ENHETER 
Respirationshastigheten är syreförbrukningen hos mikroorganismer i 
aerobt spillvattenslam och uttrycks normalt i mg O  2 per mg slam per 
timme.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1109
 
För att beräkna ett testämnes hämmande verkan i en bestämd kon ­
centration uttrycks respirationshastigheten som en procentdel av ge ­
nomsnittet av de två kontrollrespirationshastigheterna.  
1 Ä 2R s 
Rc 1 þ Rc  2 Í Î  
× 100= % procentuellhämning 
där: 
R s = Syreförbrukning vid testade koncentrationer av testämnet. 
RC 1 = Syreförbrukningen, kontroll 1. 
RC 2 = Syreförbrukningen, kontroll 2. 
I samband med denna metod är EC  50 den koncentration av testämne 
där respirationen är 50 % av den som kontrolltestet visar under de förhållanden som beskrivs i denna metod.
 
1.3 REFERENSÄMNEN 
Det rekommenderas att använda 3,5-diklorfenol, som man vet häm ­
mar respirationen, som referensämne och att testa det för EC  50 för 
varje parti aktiverat slam för att kontrollera att slammets känslighet 
inte är onormal.  
1.4 TESTMETODSPRINCIP 
Respirationshastigheten i aktiverat slam tillfört en standardmängd 
syntetiskt spillvatten mäts efter en kontrolltid av 30 minuter och/eller 
tre timmar. Även respirationshastigheten i samma aktiverade slam vid olika koncentrationer av testämnet under i övrigt identiska för ­
hållanden mäts. Testämnets hämmande verkan vid en bestämd kon ­
centration uttrycks som en procentdel av medelrespirationshastighe ­
ten i två kontrolltester. Ett EC
 50 -värde beräknas ut i från bestäm ­
ningar vid olika koncentrationer.  
1.5 KVALITETSKRITERIER 
Testresultaten är giltiga om 
— respirationshastigheten i de två kontrolltesterna ligger inom 15 % 
av varandra, 
— EC  50 (30 minuter och/eller tre timmar) för 3,5-diklorfenol ligger 
inom det accepterade området av 5–30 mg/l.  
1.6 METODBESKRIVNING  
1.6.1  Reagenser  
1.6.1.1 L ö s n i n g a r a v t e s t ä m n e t 
Testämnekoncentrationerna nyframställs vid testets inledning genom 
användning av en stamlösning. En stamlösningskoncentration av 
0,5 g/l är lämpligt om nedanstående förfarande används.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1110
 
1.6.1.2 L ö s n i n g a r a v k o n t r o l l ä m n e t 
En lösning av 3,5-diklorfenollösning kan t.ex. framställas genom att 
lösa 0,5 g 3,5-diklorfenol i 10 ml 1 M NaOH vilket späds med destillerat vatten till ca 30 ml. Därefter tillsätts under omrörning 
0,5 M H
 2 SO 4 upp till den punkt då utfällning börjar – det krävs 
ca 8 ml 0,5 M H  2 SO 4 – och slutligen späds blandningen med des ­
tillerat vatten till 1 I. pH-värdet ska därefter vara omkring 7–8.  
1.6.1.3 S y n t e t i s k t s p i l l v a t t e n 
Syntetiskt spillvatten framställs genom att följande ämnen löses upp 
per liter vatten: 
— 16 g pepton, — 1 1 g köttextrakt, — 3 g urea, 
— 0,7 g NaCl, 
— 0,4 g CaCl
 2 .2H  2 O, 
— 0,2 g MgSO  4 .7H  2 O, 
— 2,8 g K  2 HPO  4 . 
Not 1:  Detta syntetiska spillvatten är 100 gånger så koncentrerat som 
det som beskrivs i OECD Technical Report ”Proposed method for the determination of the biodegradability of surfactants used in syn ­
thetic detergents” av den 11 juni 1976, med tillsättning av dikalium ­
vätefosfat.  
Not 2:  Om det framställda mediet inte används omedelbart ska det 
förvaras i mörker vid 0 — 4
 o C, dock högst en vecka och under 
förhållanden som inte ger anledningen till ändring i sammansättning ­
en. Mediet kan också steriliseras innan det förvaras, eller så kan man 
tillsätta pepton och köttextrakt strax innan testet utförs. Omedelbart före användningen blandar man noggrant och pH-värdet justeras.
 
1.6.2  Apparatur  
Mätapparatur: Den exakta utformingen är inte avgörande. Det får 
dock inte finnas luftmellanrum mellan vätska och propp, och sonden ska sluta tätt till kolvens hals. 
Normal laboratorieutrustning krävs, särskilt följande: — Mätapparatur, — Luftningsapparatur, — pH-elektrod och pH-mätutrustning, 
— O
 2 -elektrod.  
1.6.3  Förberedelse av inokulat  
Som mikrobiellt inokulat till testet används aktiverat slam från ett 
reningsverk som huvudsakligen behandlar spillvatten från hushåll. 
1 laboratoriet kan grövre partiklar om nödvändigt avlägsnas genom 
utfällning under en kort period, t.ex. 15 minuter, följt av dekantering 
av det översta laget med finare slampartiklar. Alternativt kan slam ­
met användas efter några få sekunders blandning i en blandare.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1111
 
Dessutom kan, om man misstänker närvaron av hämmande material, 
slammet tvättas med kranvatten eller en isotonisk lösning. Efter cen ­
trifugering dekanteras överstående lösning (detta förfarande upprepas tre gånger). 
En mindre mängd slam vägs och torkas. Utifrån detta kan man 
beräkna den mängd vått slam som måste suspenderas i vatten för att erhålla ett aktivt slam med ett innehåll av fasta beståndsdelar suspenderad i en blandad vätska på 2–4 g/l. Detta motsvarar en 
koncentration av 0,8–1,6 g/l i testmediet om nedan beskrivna för ­
farande följs. 
Om slammet inte kan användas samma dag som det insamlas tillsätts 
50 ml syntetiskt spillvatten till varje liter aktiverat slam som fram ­
ställts enligt beskrivningen ovan. Slammet luftas därefter under nat ­
ten vid 20 ± 2
 o C. Därefter hålls det luftat tills det används nästa 
dag. Före användningen kontrolleras pH-värdet som vid behov ju ­
steras till pH 6–8. De fasta beståndsdelarna som är suspenderade i 
den blandade vätskan bestäms i enlighet med beskrivningen i före ­
gående avsnitt. 
Om man måste använda samma parti slam under de följande dagarna 
(högst fyra dagar) tillsätts ytterligare 50 ml syntetiskt spillvatten vid varje arbetsdags slut.
 
1.6.4  Testförfarande  
Varaktighet/kontakttid: 30 minuter och/eller tre timmar under 
luftning 
Vatten: Dricksvatten (om nödvändigt befriat 
från klor) 
Lufttillförsel: Ren, oljefri luft. Luftgenomströmning 
0,5–1,0 l/min 
Mätapparatur: Flatbottnad kolv som t.ex. en BOD- 
kolv (se figur 1) 
Syremätning: Syreelektrod med tillhörande skrivare 
Näringslösning: Syntetiskt spillvatten (se ovan) Testämne: Testlösningen framställs kort innan tes ­
tets inledning 
Referensämne: T.ex. 3,5-diklorfenol (minst tre koncent ­
rationer) 
Kontrolltest: Inokulerat prov utan testämne 
Temperatur: 20 ± 2
 o C 
Nedan lämnas förslag till ett experimentförfarande som kan följas för 
både test- och referensämnet i tretimmars kontaktperioder. 
Flera kärl används (t.ex. 1-liters glasbägare). 
Minst fem koncentrationer med ett fast koncentrationsförhållande 
som helst inte överstiger 3,2 används. 
Vid tidpunkten ”0” späds 16 ml av det syntetiska spillvattnet med 
vatten till 300 ml. 200 ml av det mikrobiella inokulatet tillsätts och 
hela blandningen (500 ml) hälls i ett första kärl (första kontroll C  1 ). ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1112
 
Testkärlen ska genomluftas kontinuerligt för att säkerställa att det 
upplösta O  2 inte faller under 2,5 mg/l, och att O  2 -koncentrationen 
är i storleksordningen 6,5 mg/l omedelbart innan mätningen av re ­
spirationshastigheten. 
Vid tidpunkten ”15 minuter” (15 minuter är ett godtyckligt men 
bekvämt intervall) utförs ovanstående förfarande, bortsett från att det tillsätts 100 ml testämnestamlösning till de 16 ml syntetiskt spill ­
vatten, före det tillsätts vatten till 300 ml och mikrobiellt inokulat till 
totalt 500 ml. Denna blandning hälls sedan i en annan glasbägare 
och luftas enligt beskrivningen ovan. Detta förfarande repeteras med 15 minuters intervaller med olika mängder testämnestamlösning, så att man erhåller en rad kärl med olika koncentrationer av testämnet. 
Till slut framställs en andra kontroll (C
 2 ). 
Efter tre timmar registreras pH-värdet och efter en noggrann bland ­
ning hälls en del av innehållet i det första kärlet över i mätapparaten, 
och respirationshastigheten mäts under en period av upp till tio 
minuter. 
Denna bestämning upprepas på innehållet i varje kärl vid 15-minu ­
tersintervaller, på ett sådant sätt att kontakttiden för varje behållare 
blir tre timmar. 
Referensämnet testas med varje parti mikrobiellt inokulat på samma sätt. 
Ett annat system (t.ex. mer än en syremätare) kan vara nödvändigt 
när man ska utföra mätningar efter 30 minuters kontakt. 
Om det krävs mätning av den kemiska syreförbrukningen framställs 
ytterligare kärl som innehåller testämne, syntetiskt spillvatten och vatten, men inte aktiverat slam. Syreförbrukningen mäts och registre ­
ras efter luftning i 30 minuter och/eller tre timmar (kontakttid).
 
2. DATA OCH UTVÄRDERING 
Respirationshastigheten beräknas utifrån skrivkurvan som O  2 /l x h 
mellan ca 6,5 mg O  2 /l och 2,5 mg O  2 /l, eller under en tiominuters ­
period, om respirationshastigheten är låg. Den del av respirations ­
kurvan över vilken man mäter respirationshastigheten ska vara linjär. 
Om respirationshastigheterna i de två kontrolltesterna inte ligger 
inom 15 % av varandra, eller om referensämnets EC  50 (30 minuter 
och/eller tre timmar) inte ligger inom det accepterade området (5–30 mg/l för 3,5-diklorfenol), är testet ogiltigt och måste göras om. 
Hämningsprocenten beräknas vid varje testkoncentration (se 1.2). 
Hämningsprocenten avtecknas mot koncentrationen på semilogarit ­
miskt papper (eller probit), och ett EC
 50 -värde utläses. 
95 %-konfidensgränserna for EC  50 -värdena kan bestämmas genom 
standardförfaranden.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1113
 
3. RAPPORTERING  
3.1 TESTRAPPORT 
Testrapporten ska om möjligt innehålla följande: 
— Testämne: data för kemisk identifiering. — Testsystem: källa, koncentration och eventuell förbehandling av 
det aktiverade slammet. 
— Testbetingelser: 
— Reaktionsblandningens pH-värde före respirationsmätningen. — Testtemperatur. — Testets varaktighet. — Referensämne och dess uppmätta EC
 50 . 
— Eventuell abiotisk syreförbrukning. 
— Resultat: 
— Alla uppmätta data. — Hämningskurva och metod för beräkning av EC
 50 . 
— EC  50 och om möjligt 95 % konfidensgränser, EC  20 och EC  30 . 
— Alla observationer och eventuella avvikelser från denna test ­
metod, som kan ha inflytande på resultatet.  
3.2 TOLKNING AV RESULTAT 
EC 50 -värdet bör endast betraktas som vägledande för testämnets 
sannolika toxicitet för antingen behandling av spillvatten med akti ­
verat slam eller mikroorganismer i spillvatten, eftersom de komplexa 
växelverkningar som förekommer i miljön inte kan simuleras korrekt 
i ett laboratorietest. Dessutom kan testämnen som har en hämmande effekt på ammoniakoxidering även producera atypiska hämningskur ­
vor. Sådana kurvor måste därför tolkas med försiktighet.
 
4. HÄNVISNINGAR  
1. International Standard ISO 8192 – 1986. 
2. Broecker, B. och Zahn, R. (1977),  Water Research  11, s. 165. 
3. Brown, D., Hitz, H. R. och Schaefer, L. (1981),  Chemosphere  
10, s. 245. 
4. ETAD (Ecological and Toxicological Association and Dyestuffs 
Manufacturing Industries),  Recommended Method No. 103,  även 
beskriven av: 
5. B. Robra (1976),  Wasser/Abwasser  117, s. 80. 
6. W. Schaefer (1977),  Textilveredlung  6, s. 247. 
7. OECD (1981),  Test Guideline 209,  rådets beslut K(81) 30 slutlig.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1114
 
C.12  BIOLOGISK NEDBRYTBARHET  
MODIFIERAT SCAS-TEST  
1. METOD  
1.1 INLEDNING 
Syftet med denna metod är att bedöma den potentiella fullständiga 
bionedbrytbarheten av vattenlösliga, icke-flyktiga organiska ämnen när dessa utsätts för relativt höga koncentrationer av mikroorganis ­
mer under en längre perioder. Under denna period hålls mikroorga ­
nismerna vid liv genom daglig tillförsel av näring bestående av 
bottensatsen av spillvatten. (I samband med helgen kan spillvattnet förvaras vid 4
 o C. Alternativt kan det syntetiska spillvattnet till 
OECD Confirmatory test användas.) 
Fysikalisk-kemisk adsorbtion kan inträffa på de suspenderade fasta 
ämnena, vilket man måste ta hänsyn till vid tolkningen av resultaten 
(se 3.2). 
Till följd av den flytande fasens långa uppehållstid (36 timmar), och 
den med mellanrum tillförda näringen, simulerar testet inte de nor ­
mala villkoren i en spillvattenanläggning. De resultat som uppnås med olika testämnen visar att denna metod har en hög bionedbryt ­
ningspotential. 
De förhållanden som skapas i denna metod underlättar i hög grad val 
och/eller adaption av mikroorganismer som är i stånd till att bryta ned testämnet. (Detta förfarande kan dessutom användas för att fram ­
ställa acklimatiserade inokulat för användning i andra test.) 
I detta test bedöms testämnenas fullständiga bionedbrytbarhet genom 
mätning av koncentrationen av upplöst organiskt kol (DOC). Kon ­
centrationen av DOC bör hellre bestämmas efter upprensning av den sura lösningen än som skillnaden mellan total C och oorganiskt C. 
Vid samtidig användning av en specifik analysmetod kan testämnet 
primära nedbrytbarhet (nedbrytning av en ursprunglig kemisk för ­
bindelse) bedömas. 
Denna metod kan endast användas på organiska testämnen som vid 
den i analysen använda koncentrationen 
— är lösliga i vatten, 
— har ett obetydligt ångtryck, 
— inte hämmar bakterierna, — inte absorberas väsentligt i testsystemet, 
— inte förloras genom att testämnet skummar. 
Testämnet innehåll av organiskt kol ska vara känt.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1115
 
Upplysningar om de relativa mängder av testämnets huvudbestånds ­
delar kan vara till h)älp vid tolkningen av de uppnådda resultaten, 
särskilt när resultaten är låga eller marginella. 
Upplysningar om ämnets toxicitet för mikroorganismer kan vara 
användbar vid tolkningen av låga resultat och vid valet av en lämplig testkoncentration.
 
1.2 DEFINITIONER OCH ENHETER 
C T = Koncentration av organiskt kol i testämnet, i närvaro eller 
frånvaro av bottensats av spillvatten i början av luftnings ­
perioden (mg/l). 
C t = Koncentrationen av upplöst organiskt kol i den överstående 
vätskan vid avslutningen av luftningsperioden (mg/l). 
C c = Koncentrationen av upplöst organiskt kol i kontrollens över ­
stående vätska vid avslutning av luftningsperioden (mg/l). 
Bionedbrytbarheten definieras i detta test som förlusten av organiskt 
kol. Bionedbrytningen kan uttryckas som: 
1. Den procentuella förlusten av D  da av den mängd ämne som till ­
förs dagligen:  
D da ¼ C T Ä ðC T Ä C c Þ 
C T Ü 100  [1] 
där: 
D da = nedbrytning/daglig tillförsel. 
2. Den procentuella förlusten av D  ssd av den mängd somm finns 
närvarande vid varje dags början:  
D ssd ¼ 2C T þ C ti Ä C ci Ä 3C  tðiþ1Þ þ 3C  cðiþ1Þ 
2C T þ C ti Ä C ci Ü 100  [2(a)]  
≈ 2C T Ä 2ðC t Ä C c Þ 
2C T þ ðC t Ä C c Þ Ü 100  [2(b)] 
där: 
D ssd = nedbrytning/ämne vid dagens början. 
Indexen i och (i + 1) hänvisar till testdagen. Utjämning 2(a) rekommenderas om spillvattnets innehåll av upp ­
löst organiskt kol varierar från dag till dag medan utjämning 2(b) 
kan användas när mängden av upplöst organiskt kol är förhål ­
landevis konstant från dag till dag.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1116
 
1.3 REFERENSÄMNEN 
I vissa fall kan referensämnen vara användbara vid undersökning av 
ett nytt ämne. Ett bestämt referensämne kan dock inte rekommende ­
ras. 
Upplysningar om flera olika ämnen som är utvärderade i ringtester 
tillhandahålls (se tillägg 1) först och främst för att testmoden av och till kan kalibreras, men också för att resultaten kan jämföras om en annan metod används.
 
1.4 TESTMETODSPRINCIP 
Aktiverat slam från ett biologiskt reningsverk placeras i en semi- 
kontinuerlig slamenhet (SCAS = semi-continous activated sludge). 
Testämnet och bottensatsen av spillvatten från hushåll tillförs och blandningen luftas i 23 timmar. Luftningen stoppas sedan och slam ­
met ges tid att sätta sig och överstående vätska kasseras. 
I det slam som finns kvar i luftningskammaren blandas sedan en 
ytterligare passande mängd av testämnet, varefter cykeln upprepas. 
Bionedbrytning konstateras genom bestämning av innehållet av upp ­
löst organiskt kol i överstående vätska. Detta resultat jämförs med resultaten från analysen av vätskan från en kontrollenhet, som endast 
tillförts bottensats av spillvatten. 
Om en specifik analysmetod används kan änderingar av koncent ­
rationen av den ursprungliga ämnet till följd av bionedbrytning mätas (primär bionedbrytbarhet).
 
1.5 KVALITETSKRITERIER 
Denna metods reproducerbarhet, grundad på förlust av upplöst or ­
ganiskt kol, är ännu inte fastställd. (I fråga om primär bionedbrytning 
har mycket tillfredsställande data uppnåtts för lätt ned-brytliga äm ­
nen.) 
Metodens känslighet är avhängig i vilken utsträckning variabiliteten i 
blindproven och i mindre grad av den korrekthet med vilken inne ­
hållet av upplöst organiskt kol kan bestämmas, eller av vätskans 
innehåll av testämne vid inledningen av varje enskild cykel.  
1.6 METODBESKRIVNING  
1.6.1  Förberedelse  
Ett tillräckligt antal rena luftningsenheter, alternativt kan den ur ­
sprungliga 1,5 liters SCA-testenheten användas, och lufttillförsels ­
langar (figur 1) för varje enskild testämne och till kontrollen sätts 
ihop. Den komprimerade luft som tillförs testenheterna rensas med ett vaddfilter och bör vara fri från organiskt kol och vara mättat med vatten för att minska ångförlust. 
Ett prov av blandad vätska, innehållande 1–4 g suspenderat fast 
ämne/l, tas från en aktiverad slamanläggning. Cirka 150 ml av den 
blandade vätskan krävs för varje luftenhet.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1117
 
Stamlösningar av testämnet framställs i destillerat vatten. Normalt 
krävs en koncentration av 400 mg organiskt kol per liter, vilket 
ger en koncentration av testämnet av 20 mg/l vid inledningen av varje luftningscykel, såvida inte bionedbrytning inträffar. 
Högre koncentrationer kan användas om toxiciteten för mikroorga ­
nismer tillåter detta. 
Slamlösningarnas innehåll av organiskt kol mäts.
 
1.6.2  Testbetingelser  
Testet bör utföras vid 20–25  o C. 
En hög koncentration av aeroba mikroorganismer (1–4 g suspende ­
rad fast ämne per liter) används, och den effektiva uppehållstiden är 36 timmar. Det kolämneinnehållande materialet i det tillförda spill ­
vattnet oxideras grundligt, normalt inom åtta timmar efter inledning 
av varje enskild luftningscykel. Därefter respirerar slammet endogent under resten av luftningsperioden, under vilken det enda tillgängliga substratet är testämnet, om inte också detta metaboliseras snabbt. 
Dessa förhållanden, kombinerade med daglig återinokulation av pro ­
ven när spillvatten från hushåll används som medium, ger mycket goda förhållanden för såväl acklimatisering som en hög grad av bionedbrytning.
 
1.6.3  Genomförande av testet  
Man framställer ett prov av blandad vätska från en laboratorieenhet 
som övervägande behandlar spillvatten från hushåll eller från en 
lämplig aktiverad slamanläggning, varvid proven förvaras under aeroba förhållanden tills de används i laboratoriet. Varje luftnings ­
enhet samt kontrollenheten fylls på med 150 ml (om det ursprungliga 
SCAS-testet används multipliceras de angivna volymerna med 10) 
blandad vätska, och luftning inleds. Efter 23 timmar stoppas luft ­
ningen och slammet får sätta sig i 45 minuter. Hanen på varje kolv öppnas successivt och 100 ml överstående vätska uttas. Ett prov av 
bottensatsen av spillvatten från hushåll tas omedelbart före använd ­
ning och 100 ml av detta tillsätts det resterande slammet i varje luftningsenhet. Luftningen inleds på nytt. På detta stadium tillsätts inget testämne. Enheterna tillsätts dagligen spillvatten från hushåll 
men endast upp till den tidpunkt utfällningen resulterar i en klar 
överstående vätska. Detta tar normalt upp till två veckor, varefter det upplösta organiska kolet i den överstående vätskan vid avslut ­
ningen av varje luftningscykel närmar sig ett konstant värde. 
Vid avslutningen av denna tidsperiod blandas de olika bottensatserna 
av slamproverna och 50 ml av detta blandade slamprov tillsätts till varje enhet. 
95 ml bottensats av spillvatten och 5 ml vatten tillsätts till kontrol ­
lenheterna, och 95 ml av bottensatsen av spillvattnet plus 5 ml av 
den ifrågavarande stamlösningen av testämnet (400 mg/l) till testen ­
heterna. Luftningen påbörjas på nytt och fortsätter i 23 timmar. Slammet sätter sig i 45 minuter och överstående vätska avlägsnas 
och analyseras för upplöst organiskt kol. 
Ovanstående påfyllnings- och avtappningsförfarande upprepas dag ­
ligen under hela testet.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1118
 
Innan utfällning kan det vara nödvändigt att tvätta enheternas väggar 
för att förhindra ackumulering av fasta ämnen över vätskenivån. Lör 
att undvika korskontaminering används en separat skrapa eller borste för varje enskild enhet. 
Idealt bör innehållet av upplöst organiskt kol i överstående vätskor 
bestämmas dagligen, även om mindre regellbundna analyser kan till ­
låtas. Före analysen filtreras vätskorna genom tvättade membranfilter med en porstorlek av 0,45 μm, eller så centritugeras vätskorna. 
Membranfilter är lämpliga om det är fastställt att de varken avger 
kolämne eller adsorberar ämnet under filtrering. Provens temperatur 
får inte översiga 40
 o C så länge det är i centrifugen. 
Testens varaktighet är obestämd för ämnen som uppvisar obetydlig 
eller ingen bionedbrytning. Erfarenheten visar att detta bor vara 
minst tolv veckor, men inte längre än 26 veckor.  
2. DATA OCH UTVÄRDERING  
Värdena för innehållet av upplöst organiskt kol i de överstående 
vätskorna i kontrollenheten avbildas mot tiden i ett koordinatsystem. 
Efterhand som bionedbrytning sker närmare sig nivån i testenheten 
nivån i kontrollenheten. När skillnaden mellan de två nivåerna är 
konstant vid tre på varandra följande mätningar genomförs ett till ­
räckligt stort antal ytterligare mätningar för en statistisk behandling av data, och den procentuella bionedbrytningen av testämnet beräk ­
nas (D
 da eller D  ssd , se 1.2).  
3. RAPPORTERING  
3.1 TESTRAPPORT 
Testrapporten ska om möjligt innehålla följande: 
— Fullständiga uppgifter om slag av spillvatten, om vilken typ av 
enhet som har använts samt om försöksresultaten rörande tes ­
tämnet, ett eventuellt referensämne, och blindproven. 
— Temperatur. — Kurva för förlusten av organiskt kol, med beskrivning av beräk ­
ningsmetoden (se 1.2). 
— Datum och plats för provtagning av aktiverat slam och spillvat ­
ten, status angående adaption, koncentration, osv. 
— Vetenskapliga motiveringar för eventuella ändringar av testför ­
farandet. 
— Underskrift och datum.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1119
 
3.2 TOLKNING AV RESULTAT 
Eftersom det ämne som kan testas med denna metod inte kommer att 
vara lätt bionedbrytligt kommer förlusten av organiskt kol, som ute ­
slutande beror på bionedbrytning, normalt att ske gradvis över dagar 
eller veckor, undantaget sådana fall där acklimatiseringen är plötslig, 
vilket framgår av en abrupt förslut efter några veckor. 
Fysikalisk-kemisk adsorbtion kan emellertid i vissa fall spela en 
betydande roll. Detta är fallet när det vid inledningen inträder ett 
fullständigt eller ett delvist försvinnande av det tillsatta upplösta 
organiska kolet. Vad som därefter inträffar beror på olika faktorer, såsom adsorptionsgraden och koncentrationen av suspenderat fast ämne i det kasserade spillvattnet. Skillnaden mellan koncentrationen 
av upplöst organiskt kol i kontroll- och testenheternas överstående 
vätska ökar normalt gradvis från det först inträffade värdet, och denna skillnad förblir sedan vid det nya värdet under resten av testet, såvida inte acklimatisering sker. 
När man ska skilja mellan bionedbrytning (eller delvis bionedbryt ­
ning) och adsorption krävs ytterligare analyser. Detta kan göras på 
flera sätt, men den mest pålitliga metoden är att använda överstående vätska, eller slam, som inokulat i en basistest (helst ett respirometiskt test). 
Testämnen som resulterar i ett omfattande, icke-adsorptivt försvin ­
nande av upplöst organiskt kol bör i denna test betraktas som po ­
tentiellt bionedbrytbara. Delvist icke-adsorptivt försvinnande tyder på att ämnet i varje fall är bionedbrytbart till viss grad. 
Obetydligt eller inget försvinnande av upplöst organiskt kol kan bero 
på testämnets hämning av mikroorganismer. Detta kan också avslöja 
lysis och förlust av slam vilket ger oklara överstående vätskor. Testet bör i sådana fall göras om med användning av en lägre koncentration av testämnet. 
Användning av en specifik analysmetod eller C-14-markerat tes ­
tämne kan ge större känslighet. Om ett C-14-testämne används kom ­
mer återhämtning av
 14 CO 2 att bekräfta att bionedbrytning inträffat. 
Om det dessutom anges resultat för primär bionedbrytning bör det 
om möjligt ges en förklaring på den förändring av den kemiska 
strukturern som medför att det ursprungliga testämnet inte kan på ­
visas. 
Valideringen av analysmetoden ska anges tillsammans med värdena 
för blindprovmediet.  
4. HÄNVISNINGAR  
1. OECD (1981),  Test Guideline 302 A,  rådets beslut K(81) 30 slutlig.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1120
 
Tillägg 1  
SCAS-test: Exempel på resultat  
Ämne c T 
(mg/l) C t - C c 
(mg/l) Procent bioned ­
brytning Testets längd 
(dagar)  
4-acetylaminobensulfonat 17,2 2,0 85,0 40 
Tetrapropylenbenzensulfonat 17,3 8,4 51,4 40 4-nitrofenol 16,9 0,8 95,3 40 Dietylenglykol 16,5 0,2 98,8 40 Anilin 16,9 1,7 95,9 40 Cyklopentantetrakavoxylat 17,9 3,2 81,1 120
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1121
 
Tillägg 2  
Exempel på apparatur
  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1122
 
C.13  BIOKONCENTRATION: GENOMFLÖDESPROVNING MED 
FISK  
1. METOD  
Denna biokoncentrationsmetod är en kopia av OECD TG 305 (1996).  
1.1 INLEDNING 
Denna metod beskriver en procedur för karakterisering av potentialen 
för biokoncentration av ämnen i fisk vid genomflöde. Även om genomflödesprov är att föredra, kan halvstatiska metoder tillåtas, förutsatt att giltighetskriterierna uppfylls. 
Metoden ger tillräckliga upplysningar för genomförandet av provet, 
samtidigt som den ger lämplig frihet för experimentell utformning av 
förhållandena i vissa laboratorier och varierande karakteristik för de undersökta ämnena. Metoden gäller framför allt för stabila organiska 
kemikalier med värden på log P
 ow mellan 1,5 och 6,0 (1) men kan 
även gälla för superlipofila ämnen (med log P  ow större än 6,0). 
Förbedömningen av biokoncentrationsfaktorn (BCF) ibland benämnd K
 B för sådana superlipofila ämnen kommer sannolikt att vara högre 
än den biokoncentrationsfaktor vid stabilt tillstånd (BCF  SS ) som kan 
förväntas fås vid laboratorieexperiment. Uppskattningar av biokon ­
centrationsfaktorn för organiska kemikalier med värden för log P  ow 
upp till ungefär 9,0 kan fås med Bintein-ekvationen vid al (2). De 
parametrar som karakteriserar biokoncentrationspotentialen inklude ­
rar upptagningskonstanten (k  1 ), utsöndringskonstanten (k  2 ) och 
BCF  SS . 
Radioaktiv märkning av de ämnen som ska undersökas kan under ­
lätta analysen av vatten- och fiskprover och kan användas för att 
fastställa huruvida degraderingsidentifiering och kvantifiering ska göras. Om den totala radioaktiva resten mäts (t.ex. genom förbrän ­
ning eller vävnadsupplösning), grundas BCF på huvudblandningen, 
eventuella kvarvarande metaboliter och assimilerat kol. BCF-värden 
grundade på de totala radioaktiva resterna kan därför inte jämföras direkt med ett BCF från specifika analyser av enbart huvudbland ­
ningen. 
Rengöringsprocedurer kan användas i undersökningar där radioaktiv 
märkning förekommer, för fastställande av BCF grundat på huvud ­
blandningen, och de större metaboliterna kan vid behov karakterise ­
ras. Det är också möjligt att kombinera en fiskmetabolismstudie med 
en biokoncentrationsstudie genom analys och identifiering av väv ­
nadsrester.
 
1.2 DEFINITIONER OCH ENHETER  
Biokoncenrationen/bioackumulationen  är ökningen av koncentratio ­
nen av det undersökta ämnet i eller på en organism (specificerad vävnad därav) i förhållande till koncentrationen av det undersökta 
ämnet i omgivande medium.  
Biokoncentrationsfaktorn  (BCF eller K
 B ) vid varje tidpunkt under 
upptagningsfasen av ackumulationsprovet är det undersökta ämnets koncentration i/på fisken eller den specificerade vävnaden därav (C, i 
μg/g (ppm)), dividerat med det kemiska ämnets koncentration i om ­
givande medium (C
 a som μg/ml (ppm)).  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1123
 
Den stabila biokoncentrationsfaktorn  (BCF  SS eller K  B ) genomgår 
ingen väsentlig förändring under en längre tidsperiod, om koncent ­
rationen av det undersökta ämnet i omgivande medium är konstant under denna tidsperiod.  
Plattån eller stabiliteten  nås när mängden undersökt ämne i fisk (C
 f ) 
i den tidpunkt där kurvan blir parallell med tidsaxeln och tre på varandra följande C
 f -analyser, på prover tagna med intervaller på 
minst två dagar, ligger inom ± 20 % på de tre proverna och det 
inte är några betydande skillnader mellan de tre provningsperioderna. 
När kombinerade prover analyseras krävs minst fyra på varandra följande analyser. När de undersökta ämnena tas upp långsamt bör provtagningsintervallerna vara sju dagar.  
Biokoncentrationsfaktor  som beräknas direkt från förhållandet mellan 
kinetiska konstanter (k
 1 /k 2 ) kallas kin etisk koncentrationsfaktor, BCF  k . 
Fördelningskoeficienten oktanol/vatten  (P ow ) är förhållandet då det 
kemiska ämnet lösbarhet i n-oktanol och vatten nar balans (metod A.8), också uttryckt som K
 ow . Logaritmen för P  ow används som en 
indikering på det kemiska ämnets potential för biokoncentration i 
vattenorganismer.  
Exponerings- eller upptagningsfasen  är den tid under vilken fisken 
exponeras för det undersökta ämnet.  
Konstanten för upptagningsförhållandet  (K  1 ) är det numeriska värde 
som definierar ökningshastigheten av koncentrationen av det under ­
sökta ämnet i/på den undersökta fisken eller specificerad vävnad 
därav, när fisken exponeras för nämnda kemiska ämne (k  1 uttrycks 
som dag  -1 ). 
Efterexponerings- eller utsöndringsfasen (förlustfasen)  är den period, 
efter det att den undersökta fisken flyttats från ett medium innehål ­
lande det undersökta ämnet till ett medium fritt från detta ämne, under vilken utsöndringen (eller nettoförlusten) av det aktuella ämnet 
från den undersökta fisken eller specificerad vävnad därav studeras.  
Utsöndrings-konstanten (förlustkonstanten)  (k
 2 ) är det numeriska 
värdet för minskningshastigheten av koncentrationen av det under ­
sökta ämnet i den undersökta fisken eller i specificerad vävnad dä ­
rav, efter överföring av den undersökta fisken från ett medium in ­
nehållande det undersökta ämnet till ett medium fritt från detta ämne (k
 2 uttrycks som dag  -1 ). 
1.3 PROVNINGSMETODEN 
Provet består av två faser: exponerings-(upptagnings-)fasen och efter ­
exponerings-(utsöndrings-)fasen. Under upptagningsfasen exponeras separata grupper av en fiskart för minst två koncentrationer av det undersökta ämnet. Fiskarna överförs därefter till ett medium fritt från 
det undersökta ämnet för utsöndringsfasen. Utsöndringsfas krävs all ­
tid med mindre ämnesupptagningen under upptagningsfasen varit obetydlig, t.ex. om BCF är mindre än 10. Koncentrationen av det undersökta ämnet i/på fisken eller specificerad vävnad därav ska 
följas under de bägge provningsfaserna. Utöver de två provnings ­
koncentrationerna ska en kontrollgrupp fiskar hållas under identiska förhållanden, förutom frånvaron av det undersökta ämnet, för att kunna jämföra eventuella negativa effekter i biokoncentrationsprovet 
mot en jämförbar kontrollgrupp och för att få bakgrundskoncentratio ­
nen av det undersökta ämnet.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1124
 
Upptagningsfasen sträcker sig över 28 dagar, med mindre det kan 
visas att balans nås tidigare. Beräkning av upptagningsfasens längd 
fram till stabilitet kan göras med den ekvation som visas i bilaga 3. Utsöndringsperioden inleds därmed genom överföring av fisken till samma medium, men utan det undersökta ämnet, i ett 
annat rent kärl. När så är möjligt ska biokoncentrationsfaktorn 
beräknas helst både som koncentrationsförhållandet (BCF
 SS ) i 
fisken (C  f ) och i vattnet (C  w ) vid uppenbar stabilitet och som en 
kinetisk biokoncentrationsfaktor, BCF  K , som förhållandet mellan 
konstanterna för upptagningshastigheten (k  1 ) och utsöndringen (k  2 ), 
varvid första ordningens kinetik ska förutsättas. Om första ordning ­
ens kinetik uppenbarligen inte följs, ska mer komplexa modeller tillämpas (se bilaga 5). 
Om stabilitet inte uppnås inom 28 dagar ska upptagningsfasen för ­
längas tills stabilitet nås eller till 60 dagar, beroende på vilket som inträffar först, varefter utsöndringsfasen påbörjas. 
Konstanten för upptagningshastigheten, konstanten för utsöndrings ­
hastigheten (eller konstanterna om mer komplexa modeller används), 
biokoncentrationsfaktorn och när så är möjligt tillförlitlighetsgrän ­
serna för var och en av dessa parametrar beräknas med den modell som bäst beskriver den uppmätta koncentrationen av det undersökta 
ämnet i fisken och vattnet. 
BCF uttrycks som en funktion av fiskens totala, våta vikt. I speci ­
alfall kan emellertid specificerade vävnader eller organ, som t.ex. muskler, lever osv. användas, om fisken är tillräckligt stor eller 
den kan delas upp i ätbara (filé) och icke ätbara (inälvor) delar. 
Eftersom det för många organiska ämnen föreligger ett klart samband mellan potentialen för biokoncentrationen och fettupptagningsför ­
mågan, finns det också ett motsvarande förhållande för fettinnehållet 
i den undersökta fisken och observerade biokoncentrationen av så ­
dana ämnen. För att minska denna källa till variationer i provnings ­
resultaten för ämnen med hög fettupptagningsförmåga, dvs. med log 
P
 ow > 3, bör därför biokoncentrationen uttryckas i förhållande till 
fettinnehållet förutom i förhållande till hela kroppsvikten. 
Fettinnehållet ska fastställas för samma biologiska materia som an ­
vänds för fastställande av koncentrationen av det undersökta ämnet 
om så är genomförbart.  
1.4 INFORMATION OM DET UNDERSÖKTA ÄMNET 
Innan biokoncentrationsprovet utförs ska följande information om det 
undersökta ämnet finnas tillgänglig: 
a) Lösningsbarhet i vatten. 
b) Uppdelningskoefficienten P  ow för oktanol/vatten (också beteckand 
K ow fastställd med HPLC-metod i A.8). 
c) Hydrolys. 
d) Ljusöverföring i vatten fastställd vid solbestrålning eller simule ­
rad solstrålning och under de strålningsförhållanden som gäller 
för undersökningen av biokoncentrationen (3).  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1125
 
e) Ytspänning, dvs. för ämnen där log P  ow inte kan fastställas. 
f) Ångtryck. 
g) Biologisk nedbrytbarhet (när så är tillämpligt). 
Annan information som krävs är giftigheten för de fiskarter som ska 
användas under provet, företrädesvis det asymptotiska LC  50 , dvs. 
tidsoberoende. Det måste finnas lämplig analysmetod med känd nog ­
grannhet, precision och känslighet för fastställande av mängden un ­
dersökt ämne i provlösningar och biologisk materia, tillsammans 
med uppgifter om beredning och förvaring av proverna. Den analy ­
tiska detektionsgränsen för det undersökta ämnet ska också vara känd för både vatten och fiskvävnad. När
 14 C-märkta ämnen används 
ska procentandelen radioaktivitet kopplad till föroreningar vara känd.  
1.5 PROVETS GILTIGHET 
Följande omständigheter ska vara uppfyllda för att provet ska vara 
giltigt: 
— Temperaturvariationen ska vara mindre än ± 2  o C. 
— Koncentrationen av löst syre får inte falla under en mättnad på 60 %. — Koncentrationen av det undersökta ämnet i kärlen ska hållas 
inom ± 20 % av det medelvärde som mäts under upptagnings ­
fasen. 
— Dödligheten eller andra negativa effekter/sjukdomar i både kont ­
roll- och behandlingsgrupp ska vara mindre än 10 % vid slutet av försöket. Om försöket förlängs över flera veckor eller månader ska dödligheten eller andra negativa effekter i bägge fiskgrup ­
perna vara mindre än 5 % per månad och får inte överstiga 30 % 
totalt.
 
1.6 REFERENSBLANDNINGAR 
Användning av referensblandningar med känd biokoncentrations ­
potential kan vara lämpligt vid kontroll av experimentförfarandet när så krävs. Specifika ämnen kan emellertid ännu inte rekommen ­
deras.
 
1.7 BESKRIVNING AV PROVNINGSMETODEN  
1.7.1  Apparater  
Material som kan lösas upp, absorberas eller läcka och som har 
negativ effekt på fisken ska nogsamt undvikas i alla delar av utrust ­
ningen. Vanliga rektangulära eller cylindriska tankar, tillverkade av 
kemiskt beständigt material och med lämplig kapacitet vad gäller 
fyllningshastigheten ska användas. Användning av mjuka plaströr bör minimeras. Helst bör rör av teflon (R), rostfritt stål och/eller glas användas. Erfarenheter visar att kiselglas kan krävas för ämnen 
med hög absorptionskoefficient, som t.ex. syntetiska pyretroider. I 
dessa fall ska utrustningen slängas efter användningen.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1126
 
1.7.2  Vatten  
Naturligt vatten används vanligtvis vid undersökningen och bör tas 
från en oförorenad källa med jämn kvalitet. Lösningsvattnet måste hålla en kvalitet som möjliggör överlevnad för valda fiskarter under 
acklimatiserings- och provningsperioderna, utan att fiskarna uppvisar 
onormala förändringar eller beteende. I idealfallet ska det kunna visas att de arter som används kan överleva, växa och reproducera sig i vattenlösningen, t.ex. vid laboratorieodling eller en giftunder ­
sökning under livscykeln. Vattnet ska bestämmas avseende pH, hård ­
het, partikelförekomst, total mängd organiskt kol och helst även am ­
monium, nitrit och alkalitet, samt för havslevande arter även salthalt. 
De parametrar som är viktiga för fiskens optimala välstånd är fullt ut 
kända, men i bilaga 1 anges rekommenderade maximala koncentratio ­
ner för ett antal parametrar för söt- och havsvattenprover. 
Vattnet ska hälla jämn kvalitet under hela undersökningen. pH-värdet 
ska ligga mellan 6,0 och 8,5, men under pågående provning ska det 
ligga inom ± 0,5 enheter. För att säkerställa att vattnet inte påverkar undersökningsresultatet på oönskat sätt, t.ex. genom förändring av 
det undersökta ämnet, eller negativt påverkar fiskbeståndets förutsätt ­
ningar, ska prover tas med jämna mellanrum för analys. Tungmetal ­
ler, t.ex. Cu, Pb, Zn, Hg, Cd, Ni, viktigare an- och katjoner, t.ex. Ca, Mg, Na, K, Cl, SO
 4 , bekämpningsmedel, t.ex. medel som helt består 
av organisk fosfor eller organiska kloriner, totala mängden organiskt 
kol och utfällda fasta partiklar ska göras t.ex. var tredje månad när vattenlösningen är känd för att hålla en relativt jämn kvalitet. Om vattenkvaliteten har visat sig vara jämn under minst ett år kan dessa 
kontroller göras mer sällan och intervallerna utökas, till t.ex. var 
sjätte månad. 
Den naturliga partikelinnehållet samt den totala mängden organiskt 
kol (TOC) i vattenlösningen ska vara så låg som möjligt för undvi ­
kande av absorbtion av det undersökta ämnet i organisk materia, vilket skulle kunna minska dess biotillgänglighet (4). Det maximalt acceptabla värdet är 5 mg/l för partiklar (torr materia som inte pas ­
serar ett filter på 0,45 μm) och 2 mg/l för helorganiskt kol (se 
bilaga 1). Vattnet ska vid behov filtreras före användning. Bidraget till innehållet av organiskt kol i vattnet (exkrementer) från fisk och foderrester ska vara så litet som möjligt. Koncentrationen av orga ­
niskt kol i vattnet (exkrementer) från fisk och foderrester ska vara så 
litet som möjligt. Koncentrationen av organiskt kol i provningskärlet ska under undersökningen inte överstiga den koncentration av orga ­
niskt kol som härrör från det undersökta ämnet och om sådan an ­
vänds, från lösningsagenten med mer än 10 mg/l (± 20 %).
 
1.7.3  Provlösningar  
Det undersökta ämnet ska lösas upp vid lämplig koncentration för 
förvaring. Förrådslösningen ska helst beredas genom att det undersökta ämnet helt enkelt blandas eller rörs i vattenlösningen. Användningen av 
lösningsmedel eller dispersanter (lösningsagenter) rekommenderas in ­
te. Det kan emellertid i vissa fall vara nödvändigt för att få en lämpligt koncentrerad förrådslösning. Lösningsmedel som kan användas är eta ­
nol, metanol, etylenglykolmonometyleter, etylenglykoldimetyleter, di ­
metylformamid och trietylenglykol. Dispersanter som kan användas är 
kremofor RH40, Tween 80, metylcellulosa på 0,01 % och HCO- 40. Försiktighet ska iakttas vid användning av lätt biologiskt nedbryt ­
bara agenter, eftersom dessa kan förorsaka problem med bakterietill ­
växt vid genomflödesprovning. Det undersökta ämnet kan vara radio ­
aktivt märkt och ska hålla högsta renhet, företrädesvis > 98 %.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1127
 
Vid genomflödesprovet krävs ett system som kontinuerligt släpper ut 
och löser upp förrådslösningen av det undersökta ämnet, t.ex. med 
mätpump, proportionalitetslösningssystem, för att leverera provnings ­
koncentrationerna till provningskärlen. Helst ska minst fem volyms ­
ombyten per dag göras i provningskärlen. Genomflödessystemet är 
att föredra, men när detta inte är genomförbart, t.ex. om den under ­
sökta organismen påverkas negativt därav, kan en halvstatisk teknik användas, förutsatt att giltighetskriterierna uppfylls. Förrådslösning ­
ens och lösningsvattnets flöden ska kontrolleras både 48 timmar före 
och minst en gång dagligen under pågående provning, Denna kont ­
roll ska omfatta fastställande av flödeshastigheten genom varje prov ­
ningskammare, samt ska den garantera att flödeshastigheten inte va ­
rierar med mer än 20 % inom eller mellan kärlen.
 
1.7.4  Val av arter  
Viktiga kriterier vid val av arter är att de ska finnas enkelt tillgäng ­
liga, kan skaffas i lämpliga storlekar och kan hållas på ett tillfreds ­
ställande sätt i laboratoriemiljö. Andra kriterier vid val av fiskart är 
betydelsen för rekreation, handel och ekologi samt jämförbar käns ­
lighet, tidigare framgångsrik användning osv. 
Rekommenderade provarter anges i bilaga 2. Andra arter kan använ ­
das, men provningsförfarandet kan då behöva anpassas för att ge 
lämpliga provningsförhållanden. Underlaget för val av art och expe ­
rimentmetod ska i detta fall rapporteras.  
1.7.5  Hållande av fisk  
Fiskbeståndet ska acklimatiseras under minst två veckor i vatten med 
provningstemperaturen och hela tiden matas med tillräcklig diet av samma typ som ska användas under provet. 
Efter en anpassningsperiod på 48 timmar ska dödligheten registreras 
och följande kriterier tillämpas: 
— Större dödlighet än 10 % av beståndet under sju dagar – fisk ­
beståndet ska inte användas. 
— Dödlighet på mellan 5 och 10 % av beståndet på sju dagar – 
beståndet ska acklimatiseras under ytterligare sju dagar. 
— Dödlighet på mindre än 5 % av beståndet under sju dagar – 
acceptera beståndet, om mer än 5 % av beståndet dött under 
den andra sjudagarsperioden ska hela beståndet avlägsnas. 
Kontrollera att fisk som använts vid undersökningen inte har några 
synliga sjukdomar eller abnormaliteter. Bortskaffa eventuell sjuk 
fisk. Fisken ska inte behandlas mot sjukdomen under de två närmast 
på undersökningen följande veckorna.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1128
 
1.8 FÖRFARANDE VID UNDERSÖKNINGEN  
1.8.1  Preliminärt prov  
Det kan vara lämpligt att göra ett preliminärt experiment för att 
optimera provningsförhållandena för den slutgiltiga provningen, t.ex. 
val av koncentration för det undersökta ämnet och längd på upp ­
tagnings- och utsöndringsfaserna.  
1.8.2  Exponeringsförhållanden  
1.8.2.1 U p p t a g n i n g s f a s e n s l ä n g d 
Upptagningsfasens längd kan bedömas utifrån praktiska erfarenheter, 
t.ex. från tidigare undersökning eller en ackumulationsrelaterad ke ­
mikalie, eller från vissa empiriska förhållanden tillsammans med 
kunskap om antingen det undersökta ämnets vattenlöslighet eller 
partitionskoeffecient i oktanol/vatten (se bilaga 3). 
Upptagningsfasen ska vara 28 dagar, med mindre det kan visas att 
balans nås tidigare. Om stabilitet inte nåtts inom 28 dagar, ska upp ­
tagningsfasen förlängas med ytterligare mätningar, tills stabilitet nås eller 60 dagar, om detta inträffar först.
 
1.8.2.2 U t s ö n d r i n g s f a s e n s v a r a k t i g h e t 
En period motsvarande halva upptagningsfasen är normalt tillräcklig 
för att få tillräcklig minskning, t.ex. 95 %, av det undersökta ämnet i fiskkroppen (se bilaga 3 för förklaring av bedömningen). Om den tid 
som krävs för att få en 95-procentig minskning blir orimligt lång, 
dvs. att den överskrider dubbla normala varaktigheten för upptag ­
ningsfasen, dvs. mer än 56 dagar, kan en kortare period användas, dvs. tills koncentrationen av det undersökta ämnet är mindre an 
10 % av koncentrationen vid stabilitet. För ämnen med ett mer 
komplext mönster för upptagning och utsöndring än det som repre ­
senteras av en enstaka fiskmodell med första ordningens kinetik, krävs emellertid utsöndringsfas för fastställande av utsöndringshas ­
tigheten. Periodens längd bör emellertid styras utifrån längden på den 
period som koncentrationen av det undersökta ämnet i fisken ligger kvar över analytiskt mätbar gräns.
 
1.8.2.3 A n t a l f i s k a r 
Välj antalet fiskar per undersökt koncentration på ett sådant satt att 
minst fyra fiskar per prov finns tillgängliga för varje provtagning. Om större statistisk noggrannhet krävs, behövs fler fiskar per prov. 
Om vuxna fiskar användas ska det i rapporten anges huruvida han- 
eller honfiskar eller bägge sorter använts vid experimentet. Om bägge könen används ska skillnader avseende fettinnehåll mellan 
könen visas vara utan betydelse innan exponeringen påbörjas. Det 
kan vara nödvändigt att hålla han-och honfiskar var för sig.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1129
 
Vid denna typ av undersökningar ska fiskar med jämn vikt alltid 
väljas på ett sådant sätt att den minsta fisken inte väger mindre än 
2/3 av vad den största väger. Samtliga fiskar ska vara från samma årskull och från samma källa. Eftersom fiskens vikt och ålder ibland förefaller ha stor betydelse för BCF-värdena (1), ska dessa uppgifter 
registreras korrekt. Det rekommenderas att delar av fiskbeståndet 
vägs före undersökningen, för fastställande av medelvikten.
 
1.8.2.4 F i s k t ä t h e t 
En hög fisktäthet används för att minimera minskningen av C  w prov­
ningskärlet ska under undersökningen inte överstiga den koncent ­
ration av organiskt kol p.g.a. tillförsel av fiskar vid undersökningens början samt för att undvika en ökning av koncentrationen upplöst syre. Det är viktigt att fisktätheten är anpassad för den art som 
används. En täthet på 0,1–1,0 g fisk (våt vikt) per liter vatten och 
dag rekommenderas normalt. Hög täthet kan användas om det visar sig att önskad koncentration av det undersökta ämnet kan upprätt ­
hållas inom ± 20 % och att koncentrationen av upplöst syre inte 
faller under 60 % mättnad. 
Vid val av lämpliga system ska hänsyn tas till fiskartens normala 
beteende. Bottenlevande fisk kan således kräva en större bottenyta i 
ett akvarium för en viss vattenvolym i förhållande till ytlevande 
fiskarter.
 
1.8.2.5 U t f o d r i n g 
Under acklimatiserings- och provningsperioderna ska fisken utfodras 
med lämplig diet med känd fetthalt och totalt proteininnehåll, i sådan 
utsträckning att de hålls friska och behåller kroppsvikten, Fisken ska under acklimatiserins- och provningsperioderna utfodras med ungefär 1 — 2 % av kroppsvikten per dag. Detta håller fetthalten relativt 
konstant i de flesta fiskarter under provet. Fodermängden ska räknas 
om, t.ex. en gång per vecka, för att upprätthålla jämn kroppsvikt och fetthalt. Vid denna beräkning kan fiskens vikt i respektive provnings ­
kammare bedömas utifrån vikten på den fisk som senast tagits som 
prov från respektive kammare. Väg inte den fisk som lämnas kvar i 
kammaren. 
Kvarvarande foder och exkrementer ska sugas ut från provningskam ­
maren kort efter utfodringen (30 minuter till 1 timma). Kärlen ska hållas så rena som möjligt under provningen, så att koncent ­
rationen av organisk materia hålls så låg som möjligt, eftersom före ­
komst av organisk kol kan begränsa det undersökta ämnets biotill ­
gänglighet (1). 
Eftersom många foder tillverkas av fiskmjöl, ska fodret analyseras 
avseendes det undersökta ämnet. Det är också önskvärt att fodret 
analyseras avseede bekämpningsmedel och tungmetaller.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1130
 
1.8.2.6 L j u s o c h t e m p e r a t u r 
Ljusperioden är vanligtvis 12 till 16 timmar, och temperaturen (± 
2 o C) ska vara anpassad för den undesökta arten (ser bilaga 2). 
Belysningens typ och egenskaper ska vara kända. Hänsyn ska tas 
till det undersökta ämnets eventuella fototransformation under strål ­
ningsförhållanden vid försöket. Lämplig belysning ska användas för undvikande av exponering av fisken för onaturliga ljusprodukter. Det kan i vissa fall vara lämpligt att använda ett filter för bortfiltrering av 
UV-strålning under 290 nm.
 
1.8.2.7 P r o v n i n g s k o n c e n t r a t i o n e r 
Fisken exponeras under genomflödesförhållandena för minst två kon ­
centrationer av det undersökta ämnet i vatten. Normalt väljs den högre (eller högsta) koncentrationen av det undersökta ämnet till ungefär 1 % av dess akuta asymptotiska LC
 50 och så att den är 
minst tio gånger högre än den gräns som ska överskridas för detek ­
tion i vatten med den använda analysmetoden. 
Den högsta provningskoncentrationen kan också fastställas genom 
division av den akuta LC  50 under 96 timmar med lämpligt akut/kro ­
niskt förhållande (lämpliga förhållanden för vissa kemikalier kan vara från ungefär 3 upp till 100). Om möjligt bör andra koncent ­
rationer väljas på ett sådant sätt att de avviker från ovannämnda med 
en fartor på 10. Om detta inte är möjligt p.g.a. kravet på 1 % av LC
 5O och det analytiska gränsvärder, kan en lägre faktor än 10 till ­
lämpas eller  14 C-märkning av det undersökta ämnet beaktas. Ingen 
av använda koncentrationer får ligga över det undersökta ämnets 
lösningsbarhet. 
När lösningsagent avvänds ska dess koncentration inte vara större än 
0,1 ml/l och vara lika stor i samtliga kärl. Dess bidrag tillsammans med det undersökta ämnet till det totala innehållet av organsikt kol i 
provningsvattnet ska vara känt. Denna typ av ämne bör emellertid 
undvikas i största möjliga utsträckning.
 
1.8.2.8 K o n t r o l l e r 
Kontroll av lösningsvattnet eller, om så är tillämpligt, kontroll av 
lösningsagenten, ska göras utöver provningsserierna, förutsatt att det kunnat fastställas att agenten inte har någon effekt på fisken. Om så inte är fallet ska bägge kontrollerna göras.
 
1.8.3  Frekvens för mätning av vattenkvalitet  
Upplöst syre, TOC, pH och temperatur ska mätas i samtliga kärl 
under provningen. Den totala hårdheten och eventuellt salthalten 
ska mätas vid kontrollerna i ett kärl med högre (eller högst) kon ­
centration. Det upplösta syret och eventuellt salthalten ska mätas minst tre gånger – i början, ungefär i mitten och mot slutet av upp ­
tagningsperioden – och en gång i veckan under utsöndringsperioden. 
TOC ska mätas vid början av provet (24 och 48 timmar innan upp ­
tagningsfasen initieras) före det att fisken tillsätts och minst en gång i veckan under både upptagnings- och utsöndringsfaserna. Tempera ­
turen ska mätas dagligen, pH i början och slutet av varje period och 
hårdheten en gång under varje provning. Temperaturen ska helst 
avläsas kontinuerligt i åtminstone ett kärl.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1131
 
1.8.4  Provtagning och analys ar fisk och vatten  
1.8.4.1 S c h e m a f ö r p r o v t a g n i n g p å f i s k o c h v a t t e n 
Vatten frän provningskärlen ska tas både före det att fisken tillsätts 
samt under upptagnings- och utsöndringsfaserna, för fastställande av 
koncentrationen av det undersökta ämnet. Prover ska tas av vattnet 
åtminstone samtidigt som av fisken samt före utfodring. Under upp ­
tagningsfasen fastställs koncentrationen av det undersökta ämnet för kontroll av överensstämmelse med giltighetskriterierna. 
Prover ska tas på fisken minst fem gånger under upptagningsfasen 
och vid minst fyra tillfällen under utsöndringsfasen. Eftersom det i 
bland är svårt att göra en exakt uppskattning av BCF-värdet grundat på detta antal prover, framför allt när annan utsöndringskinetik än första ordningens kan påvisas, kan det vara tillrådligt att ta prover 
med tätare mellanrum under bägge perioderna (se bilaga 4). Extra ­
proverna ska lagras och bara analyseras om resultaten från första omgångens analyser visar sig vara otillräckliga för beräkning av BCF med önskad noggrannhet. 
I bilaga 4 ges ett exempel på ett acceptabelt provtagningsschema. 
Andra scheman kan lätt räknas ut med andra antagna värden för P
 ow , 
för beräkning av exponeringstiden för att få 95-procentig upptagning. 
Provtagningen ska försätta under upptagningsfasen tills stabil nivå 
uppnås, dock minst 28 dagar. Om stabil nivå inte nåtts inom 28 
dagar, ska provtagningen fortsätta tills stabil nivå nås, dock minst 60 dagar, om detta inträffar först. Innan utsöndringsfasen inleds ska fisken överföras till rena tankar.
 
1.8.4.2 P r o v t a g n i n g o c h b e r e d n i n g a v p r o v e r 
Vattenprover för analys tas genom en tät röranslutning i provnings ­
kammarens mittpunkt. Eftersom varken filtrering eller centrifugering 
alltid separerar den icke-biologiska fraktionen från det undersökta 
ämnet från den biotillgängliga delen (särskilt för superlipofila kemi ­
kalier, dvs. kemikalier med log P  ow > 5) (1) (5), ska proverna inte 
utsättas för sådan behandling. 
Åtgärder bör istället vidtas för att hålla tankarna så rena som möjligt 
och innehållet fullorganiskt kol ska övervakas under både upptag ­
nings- och utsöndringsfasen. 
Ett lämpligt antal fiskar, i normalfallet minst fyra, ska tas från prov ­
ningskammaren vid varje provtagning. Provtagningsfisken ska sköl ­
jas snabbt med vatten, torkas torr, dödas omedelbart på lämpligaste och humanaste sätt och därefter vägas. 
Det är lämpligt att under den tid som provet pågår analysera fisken 
och vattnet omedelbart efter provtagning, för att förhindra försämring eller andra förluster samt för beräkning av ungefärlig upptagnings- 
och utsöndringshastighet. Mellananalyser förhindrar också för ­
seningar vid fastställande av när en nivå har nåtts.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1132
 
Om mellananalyser inte görs ska proverna lagras pa lämpligt sätt. 
Innan undersökningen påbörjas ska information om lämplig för ­
varingsmetod för det aktuella ämnet, t.ex. djupfrysning, nedkylning vid 4
 o C, förvaringstid, extraktion osv., skaffas.  
1.8.4.3 A n a l y s m e t o d e n s k v a l i t e t 
Eftersom hela proceduren i huvudsak styrs av noggrannhet, precision 
och känslighet i den analysmetod som används för det undersökta 
ämnet, ska precision och reproduktionsbarhet för den kemiska ana ­
lysen kontrolleras experimentellt, vilket även gäller för återhämtning av det undersökta ämnet från både vatten och fisk, vilket ska vara tillfresställande med den aktuella metoden. Kontrollera också att det 
undersökta ämnet inte kan upptäckas i det lösningsvatten som an ­
vänds. 
Om så krävs ska C
 w - och C  f -värden som fås från undersökningen 
korrigeras för återhämtnings- och bakgrundsvärden från kontrollerna. 
Fisk- och vattenprover ska alltigenom hanteras på ett sådant sätt att 
förorening och förlust minimeras, t.ex. på grund av absorbtion från provtagningsanordningarna.
 
1.8.4.4 A n a l y s a v f i s k p r o v 
Om radioaktivt märkt material används vid undersökningen är det 
möjligt att analysera den totala radioaktiva märkningen, dvs. moderb ­
landning och metaboliter, eller kan proverna rengöras så att moderb ­
landningen kan analyseras separat. De viktigare metabohterna kan karakteriseras vid stabil nivå, dock senast vid upptagningsfasens slut. 
Om BCF som total radioaktivt märkt rest är ≥ 1 000 %, kan det vara 
lämpligt och för vissa kemikaliekategorier, som t.ex. bekämpnings ­
medel, starkt rekommendabelt att identifiera och mängdbestämma de rester dom uppgår till ≥ 10 % av den totala resten i fiskvävnaden vid 
stabil nivå. Om resterna representerar ≥ 10 % av den totala radio ­
aktivt märkta resten if fiskvävnaden identifieras och kvantifieras, är det också rekommendabelt att identifiera och mängdbestämma res ­
terna i provningsvattnet. 
Koncentrationen av det undersökta ämnet ska normalt fastsfällas för 
varje vägd fiskindivid. Om detta inte är möjligt kan sammanslagning av proverna vid varje provtagningstillfälle göras, men detta begränsar det statistiska förfarandet för erhållna data. Om ett visst statistiskt 
förfarande och dess funktion är viktiga, skal! ett tillräckligt antal 
fiskar för att tillfredsställa den önskade sammanslagningsproceduren och effekten införas i undersökningen (6) (7). 
BCF ska uttryckas både som en funktion av total våt vikt och, för 
kraftigt lipofila ämnen, som en funktion av fettinnehållet. Fettinne ­
hållet i fisken fastställs om möjligt vid varje provtagningstillfälle. Lämpliga metoder ska användas för fastställandet av fettinnehållet (punkterna 8 och 2 i bilaga 3). Extraktionstekniker med kloroform/ 
metanol kan vara att rekommendera som standardmetod (9). De olika 
metoderna ger inte identiska värden (10), varför det är viktigt att ange vilken metod som använts. När så är möjligt ska fettanalysen göras på samma extrakt som det som tagits fram för analys av det 
undesökta ämnet, eftersom fettet ofta måste tas bort frän extraktet 
innan kromatografisk analys kan göras. Fettinnehållet i fisken (som mg fett per kg våt vikt) får vid slutet av experimentet inte skilja sig frän innehållet vid experimentets början med mer än ± 25 %. An ­
delen fasta partiklar i vävnaden ska också registreras för att möjlig ­
göra omvandling av fettkoncentrationen från vått till torrt värde.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1133
 
2. DATA  
2.1 RESULTATBEARBETNING 
Upptagningskurvan för det undersökta ämnet fås genom plottning av 
dess koncentration i/på fisk (eller specificerad vävnad därav) under 
upptagningsfasen i förhållande till tiden på aritmetisk skala. Om 
kurvan när en platå, dvs. blir ungefär asymptotisk med tidsaxeln, beräknas BCF
 SS med följande formel:  
C f vid stabilitet ðmedelÞ 
C w vid stabilitet ðmedelÞ 
När stabilitet inte nås, kan BCF  SS beräknas med tillräcklig noggrann ­
het för riskbedömning från en stabilitet vid 80 % (l,6/k  2 ) eller 95 % 
(3,0/k  2 ) balans. 
Koncentrationsfaktorn (BCF  k ) fastställs också som förhållandet k  1 /k 2 
de två kinetiska konstanterna av första ordningen. Konstanten för 
utsöndringshastighet, k, fastsälls normalt ur utsöndringskurvan, dvs. 
en plottning av ökningen av det undersökta ämnets koncentration i fisken i tiden. Konstanten för upptagningshastigheten, k
 1 , beräknas 
utifrån konstanten k  2 och värdet på C  f som fås från upptagnings ­
kurvan (se också bilaga 5). Den bästa metoden för erhållande av 
BCF  k och hastighetskonstanterna k  1 och k  2 är att göra en icke-linjär 
parameterbedömning i en dator (11). I annat fall kan grafiska meto ­
der användas för beräkning av k  1 och k  2 . Om det är uppenbart att 
utsöndringskurvan inte är en kurva av första ordningen, ska mer 
komplexa modeller tillämpas (se referenser i bilaga 3) och råd in ­
hämtas från biostatistiker.  
2.2 TOLKNING AV RESULTAT 
Resultaten ska tolkas med försiktighet när uppmätta koncentrationer 
av den undersökta lösningen påträffas på nivåer nära den analytiska 
metodens gränsvärdet för detektion. 
Tydligt definierade upptagnings- och förlustkurvor är en indikation 
på att biokoncentrationsdatan är av god kvalitet. Skillnaden i upp ­
tagnings/utsöndringskonstanterna mellan de två provningskoncent ­
rationerna ska vara mindre än 20 %. Observera att väsentliga skill ­
nader i upptagnings-/utsöndringshas-tigheterna mellan de två tilläm ­
pade provningskoncentrationerna ska registreras och om möjligt för ­
klaras. Tillförlitlighetsgränsen för BCF kan för väl utformade studier sägs ligga runt ± 20 %.
 
3. RAPPORTERING  
Undersökningsrapporten måste innehålla följande information:  
3.1 UNDERSÖKT ÄMNE 
— Fysisk form och, när så är tillämpligt, fysiokemikaliska egenskaper. 
— Kemisk identifiering (inklusive eventuellt innehåll av organiskt kol). — Om ämnet är radioaktivt märkt ska den märkta atomens exakta 
position och andelen radioaktivitet kopplad till föroreningar anges.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1134
 
3.2 UNDERSÖKTA ARTER 
— Vetenskapligt namn, variant, källa, eventuell förbehandling, ac ­
klimatisering, ålder, storleksområde osv.  
3.3 PROVNINGSFÖRHÅLLANDEN 
— Tillämpat provningsförfarande, t.ex. genomflöde eller halvsta ­
tiskt. 
— Typ och karakteristik för använd belysning och ljusperiod. — Provets utformning, t.ex. antal och storlek på provningskammare, 
vattenväxlingshastighet, antal kopior, antal fiskar per kopia, antal provningskoncentrationer, upptagnings- och utsöndringsfasernas 
längd, provtagningsfrekvens för fisk och vatten. 
— Metod för beredning av förrådslösningar och förnyelsefrekvensen 
(lösningsagent, dess koncentration och bidrag till innehåll av orgnaiskt kol i provningsvattnet måste anges när sådan används). 
— Nominella provningsförhållanden, medelvärden för uppmätta vär ­
den samt deras standardavvikelser i provningskärlen och metod som använts för beräkning av dessa värden. 
— Vattenkälla, beskrivning av eventuell förbehandling, resultat från 
eventuell undersökning av fiskens förmåga att överleva i vattnet, 
samt vattnets karakteristik: pH, hårdhet, temperatur, syrehalt, 
klorrestvärde om detta mäts, total mängd organiskt kol, utfällda fasta partiklar, salthalt i det undersökta mediet, om tillämpligt, 
och eventuella andra gjorda mätningar. 
— Vattenkvalitet i provningskärlen, pH, hårdhet, TOC, temperatur 
och syrehalt. 
— Detaljerad information om utfodringen, t.ex. fodertyp, källa, sam ­
mansättning (åtminstone fett- och proteininnehåll) mängd och 
frekvens. 
— Information om behandlingen av fisk- och vattenprover, inklusive 
uppgifter om beredning, förvaring, extraktion och analytiska för ­
faranden, samt deras noggrannhet, för det undersökta ämnet och 
fettinnehället (om detta mäts).
 
3.4 RESULTAT 
— Resultat från eventuell preliminär studie. 
— Dödligheten för kontrollfisken och fisken i varje exponerat kärl, 
samt eventuellt observerat onormalt beteende. 
— Fettinnehållet i fisken (om detta fastställs vid provningen). — Kurvor, inklusive samtliga mätdata, över upptagningen och ut ­
söndringen av den undersökta kemikalien i fisken, tiden till sta ­
bilitet.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1135
 
— C  f en C  w (med standardavvikelse och område, om tillämpligt) för 
samtliga provtagningstillfällen (C, uttryckt som μg/g våt vikt 
(ppm) i hela kroppen eller den specificerade vävnaden därav, t.ex. fett, och C
 w som μg/ml (ppm)), C  w -värden för kontrollseri ­
erna (bakgrundsvärden ska också rapporteras). 
— Biokoncentrationsfaktorn vid stabilitet (BCF  ss ) och/eller den kine ­
tiska koncentrationsfaktorn (BCF  k ) och om tillämpligt den 95-pro ­
centiga tillförlitlighetsgränsen för upptagnings- och utsöndrings ­
hastighetskonstanterna (samtliga uttryckta i förhållande till hela 
kroppen och det totala fettinnehållet, om detta mäts, i djuret eller 
den specificerade vävnaden därav), tillförlitlighetsgränser och standardavvikelser (om tillgängliga) samt metoder för beräkning/ dataanalys av samtliga koncentrationer av det undersökta ämnet. 
— Om strålningsmarkerade ämnen används och om så krävs, kan 
ackumulationen av eventuella upptäckta metaboliter visas. 
— Eventuella anmärkningar avseende undersökning, eventuell avvi ­
kelse från förfarandet och annan relevant information. 
Undvik resultat som t.ex. ”ej upptäckt vid detektionsgränsen” vid 
framtagningen av undersökningsmetoden och dess experimentella 
utformning, eftersom sådana resultat inte kan användas för beräkning 
av hastighetskonstanter.
 
4. HÄNVISNINGAR  
1. Connell D.W. (1988), Bioaccumulation behaviour of persistent 
chemicals with aquatic organisms (ung. Bestående kemikaliers 
bioackumulationsheteende i vattenorganismer), Rev. Environ. 
Contam. Toxicol. 102, s. 117–156. 
2. Bintein S., Devillers, J. and Karcher W. (1993), Nonlinear de ­
pendence of fish bioconcentration on n-octanol/water partition 
coefficient. (Fiskbiokoncentrationens icke-linjära beroende av 
parti tionskoefficienten för non-oktanol/vatten). SAR and QSAR in Environmental Research, s. 29–390. 
3. OECD (1996), Direct Phototransformation of chemicals in wa ­
ter. Environmental Health and Safety Guidance Document Se ­
ries on Testing and Assessment of Chemicals (ung. Direkt ljust ­
ransformering av kemikalier i vatten. Riktlinjer för miljöskydd – 
provning och bedömning av kemikalier), nr 3. 
4. Kristensen P. (1991), Bioconcentration in fish: Comparison of 
bioconcentration factors derived from OECD and ASTM testing methods; influence of particulate organic matter to the bioavaila- 
bility of chemicals (ung. Biokoncentration i fisk: Jämförelse av 
biokoncentrationsfaktorer från OECD:s och ASTM:s provnings ­
metoder, partikelformigt organiskt materials påverkan på kemika ­
liers biotillänglighet), Water Quality Institute, Danmark. 
5. US EPA 822-R-94-002 (1994), Great Lake Water Quality Ini ­
tiative Technical Support Doc. for the Procedure to Determine Bioaccumulation Factors (ung. Tekniskt underlag för kvalitets ­
initiativet för vattnet i Stora sjöarna, för fastställande av bio ­
ackumulationsfaktorer), juli 1994. 
6. US FDA (Myndigheten för livsmedel och droger) Revision. 
Handbok för analys av bekämpningsmedel, 1, 5600 Fisher's 
Lane, Rockville, MD 20852, juli 1975. 
7. US EPA (1974), Avsnitt 5, A(l) Analysis of Human or Animal 
Adipose Tissue, in Analysis of Pesticide Residues in Human 
and Environmental Samples (ung. Analys av fettvävnad från 
människa eller djur vid analys av bekämpningsmedelsrester i prov från människa eller djur), Thompson J.F. (ed.) Research Triangle Park, N.C. 27711. 
8. Compaan H. (1980), in ”The determination of the possible effects 
of chemicals and wastes on the aquatic environment: degradation, toxicity, bioaccumulation” (ung. Fastställande av möjliga effekter från kemikalier och avfall på vattenmiljön: degradering, giftighet, 
bioackumulation), kap. 2.3, del 2. Government Publisching Office, 
The Hague, The Netherlands.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1136
 
9. Gardner et al. (1995), Limn. & Oceanogr. 30, 1099–1105. 
10. Randall R.C., Lee H., Ozretich R.J, Lake J.L. and Pruell R.J. 
(1991), Evaluation of selected lipid methods for normalising 
pollutant bioaccumulation. Envir. Toxicol. Chem (ung. Utvär ­
dering av vissa fettmetoder för oskadliggörande av förorenande bioackumulation) 10, s. 1431–1436. 
11. CEC. Bioconcentration of chemical substances in fish: the flow- 
through method-Ring Test Programme, 1984–1985 (ung. Bio ­
koncentration av kemikalier i fisk: genomflödesmetoden – Ringprovningsprogrammet 1984–1985), slutrapport 1987, för ­
fattare: P. Kristensen and N. Nyholm. 
12. ASTM E-l022-84 (Återantagen 1988), Standard Practice for 
conducting Bioconcentration Tests with Fisches and Saltwater Bivalve Molluscs (ung. Standardförfarande för biokoncent ­
rationsundersökning med fisk och saltvattenblötdjur med två 
kanaler).
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1137
 
Bilaga 1  
Kemisk karakteristik för acceptabelt lösningsvatten  
Ämne Koncentrations-gränsvärde  
1 Partiklar 5 mg/l 
2 Total mängd organiskt kol 2 mg/l 3 Ojoniserad ammonium l μg/l 
4 Klorrester 10 μg/l 
5 Total mängd fosfororganiska bekämpningsmedel 50 ng/l 6 Total mängd klororganiska bekämpningsmedel plus 
flerklorerade bifenyler 50 ng/1 
7 Total mängd organiskt klor 25 ng/1 
8 Aluminium 1 μg/l 
9 Arsenik 1 μg/l 
10 Krom 1 μg/l 
11 Kobolt 1 μg/l 
12 Koppar 1 μg/l 
13 Järn 1 μg/l 
14 Bly 1 μg/l 
15 Nickel 1 μg/l 
16 Zink 1 μg/1 
17 Kadmium 100 ng/1 18 Kvicksilver 100 ng/1 19 Silver 100 ng/1
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1138
 
Bilaga 2  
Fiskarter som rekommenderas för undersökning  
Rekommenderade arter Rekommenderat 
temperaturområde 
för undersök ­
ningen (  o C) Rekommenderad 
total längd på det 
undersökta djuret 
(cm) 
1 Danio rerio (  1 ) (Teleostei, Cyprinidae) (Hamilton- 
Buchanan) Zebrafisk 20–25 3,0 ± 0,5 
2 Pimephales promelas (Teleostei, Cyprinidae) (Rafi ­
nesque) Fathead minnow (art av kvidd) 20–25 5,0 ± 2,0 
3 Cyprinus carpio (Teleostei, Cyprinidae) 
(Linnaeus) Vanlig karp 20–25 5,0 ± 3,0 
4 Oryzias latipes (Teleostei, Poeciliidae) (Temminck 
and Schlegel) Ricefish (risfiskart) 20–25 4,0 ± 1,0 
5 Poecilia reticulata (Teleostei, Poeciliidae) (Peters) 
Guppy 20–25 3,0 ± 1,0 
6 Lepomis macrochirus (Teleostei, Centrarchidae) 
(Rafinesque) Bluegill (art av solabborre) 20–25 5,0 ± 2,0 
7 Oncorhynchus mykiss (Teleostei, Salmonidae) (Wal ­
baum) Regnbågslax 13–17 8,0 ± 4,0 
8 Gasterosteus aculeatus (Teleostei, Gasterosteidae) 
(Linnaeus) Stenspigg 18–20 3,0 ± 1,0  
( 1 ) Meyer A., Orti G. (1993), Proc. Royal Society of London, Series B., Vol. 2.52, s. 231.  
Flera söt- och saltvattenarter har använts i olika länder, t.ex: 
Spot Leiostomus xantburus  
Sheepshead minnow (art av tandkarp)  Cyprinodon variegatus  
Silverside  Menidia beryllina  
Shiner perch  Cymatogaster aggregata  
English sole  Parophrys vertulus  
Staghorn sculpin  Leptocottus armatus  
Stenspigg  Gasteroteus aculeatus  
Havsaborre  Dicentracus labrax  
Benlöja  Alburnus alburnus  
Insamling  
Den sötvattenfisk som anges i ovanstående tabell är lätt att skaffa och/eller finns lätt tillgänglig 
under hela aret, medan tillgängligheten for havs- och bräckvattenarterna delvis begränsas till re ­
spektive länder. De kan födas upp och odlas på fiskodlingar eller laboratorier under sjukdoms- och 
parasitkontrollerade förhållanden, så att det använda djuret är friskt och har känd stamtavla. Dessa 
fiskar finns tillgängliga i stora delar av världen.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1139
 
Bilaga 3  
Förbestämning av längden på upptagnings- och utsöndringsfaserna  
1. Förbestämning av upptagningsfasens längd  
Innan provet påbörjas ska en uppskattning av k  2 göras, och hänsyn till hur 
stor del av tiden som krävs för att nå stabilitet kan inhämtas från empiriska 
förhållanden mellan k  2 och n- oktanol/vattenfördelningskoeffecienten (P  ow ) 
eller k  2 , och vattenlösligheten (s). 
En uppskattning av k  2 (dag  -1 ) kan erhållas med t.ex. följande empiriska 
förhållande (1): 
log 10 k 2 = 0,414 log  10 (P ow ) + 1,47 (r  2 = 0,95) (ekvation 1) 
För andra förhållanden se hänvisning 2. 
Om partitionskoeffecienten (P  ow ) inte är känd, kan en bedömning göras (3) 
utifrån kunskapen om ämnets vatten löslighet (s) med följande formel: 
log 10 (P ow ) = 0,862 log  10 (s) + 0,710 (r  2 = 0,994) (ekvation 2) 
där: 
s står för lösligheten i mol/l: (n = 36). Dessa förhållanden gäller enbart för kemikalier med log P
 ow -värden mellan 
2 och 6,5 (4). 
Tiden för att nå en viss del av den stabila nivån kan fås genom tillämpning 
av så kallad k  2 -bedömning, med den allmänna kinetiska ekvationen för 
upptagning och utsöndring (första ordningens kinetik):  
dC f 
dt ¼ k 1 · C w Ä k 2 · C f 
eller om C  w är konstant:  
C f ¼ k 1 
k 2 · C w ð1 Ä e Äk 2 t Þ (ekvation 3) 
När stabiliteten börjar närma sig (t → ∞), kan ekvation 3 reduceras (5) (6) 
till: 
C f ¼ k 1 
k 2 · C w eller C f /C w = k  1 /k 2 = BCF 
(k 1 /k 2 ) C w närmar sig då koncentrationen i fisken vid stabilitet (C  f, s ). 
Ekvation 3 kan skrivas om på följande sätt:  
C f ¼ C f;s ð1 Ä e Äk 2 t Þ eller  C f 
C fs ¼ 1 Ä e Äk 2 t (ekvation 4) 
Vid användning av ekvation 4 kan tiden för att nå viss stabilitet förutsägas 
när k  2 förutbestäms med ekvation 1 eller 2.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1140
 
Som riktlinje kan sägas att den statistiskt optimala längden på upptagnings ­
fasen, för produktion av statistiskt acceptabla data (BCF  k ) är den period 
som krävs för att kurvan över koncentrationslogaritmen för det undersökta ämnet i fisken, plottad mot linjär tidsaxel, till medelpunkten är 1,6/k
 2 eller 
80 % av den stabila nivån, men inte mer än 3,0/k  2 eller 9.5 -procentig 
stabilitet (7). 
Tiden för att nå 80-procentig stabilitet är (ekvation 4)  
0;80 ¼ 1 Ä e Äk 2 t 80 eller t 80 ¼ 1;6 
k 2 (ekvation 5) 
95-procentig stabilitet fås på motsvarande sätt med ekvationen:  
t 95 ¼ 3;0 
k 2 (ekvation 6) 
Upptagningsfasens (upp) längd för ett undersökt ämne med log P  ow = 4 blir 
då (med ekvationerna 1,5 och 6): 
log 10 k 2 = -0,414.(4) + 1,47 k  2 = 0,652 dag  -1 
upp (80 %) = 1,6/0,652, t.ex. 2,45 dagar (59 timmar) 
eller upp (95 %) = 3,0/0,652, t.ex. 4,60 dagar (110 timmar) För ett undersökt ämne med s = 10
 -5 mol/l (log(s) = -5,0), är upptagnings ­
fasen (med ekvationerna 1,2,5 och 6): 
log 10 (P ow ) = -0,862 . (-5,0) + 0,710 = 5,02 
log 10 k 2 = -0,414 . (5,02) + 1,47 
k 2 = 0,246 dagar  -1 
upp (80 %) = 1,6/0,246, t.ex. 6,5 dagar (156 timmar) 
eller upp (95 %) = 3,0/0,246, t.ex. 12,2 dagar (293 timmar). Alternativt kan följande uttryck användas: 
t
 eq = 6,54 × 10  3 P ow + 55,31 (timmar) 
Detta uttryck används för beräkning av tiden till det att faktiskt stabilitet 
nås (4).  
2. Förutbestämning av utsöndringsfasens varaktighet  
Förutbestämning av den tid som krävs för att minska mängden ämne i 
kroppen, till en viss del av den ursprungliga koncentrationen, kan också göras med den allmänna ekvationen för upptagning och utsöndring (första ordningens kinetik) (1) (8). 
C
 w antas vara noll för utsöndringsfasen. Ekvationen kan reduceras till:  
dC f 
dt ¼ Ä k 2 C f eller C f ¼ C f;o · e Äk 2 t ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1141
 
där C f,0 är koncentrationen vid början av utsöndringsperioden. 50-procentig 
utsöndring nås då vid tiden (t  50 ): 
C f 
C f;o ¼ 1 
2 ¼ e Äk 2 t 50 eller t 50 ¼ 0;693 
k 2 
95-procentig utsöndring fås på motsvarande sätt med ekvationen:  
t 95 ¼ 3;0 
k 2 
Om en upptagning på 80 % används för den första perioden (1,6/k  2 ) och en 
95-procentig förlust i utsöndringsfasen (3,0/k  2 ), är utsöndringsfasen ungefär 
dubbelt så lång som utsöndringen i upptagningsfasen. 
Det är emellertid viktigt att observera att dessa beräkningar är grundade på 
förutsättningen att upptagnings-och utsöndringsmönstren följer första ord ­
ningens kinetik. Om det är uppenbart att första ordningens kinetik inte följs, 
ska mer komplexa beräkningsmodeller användas (se hänvisning 1).  
Hänvisningar  (för bilaga 3) 
l. Spacie A. and Hamelink J.L. (1982),  Alternative models for describing 
the bioconcentration of organics in fish. Environ. Toxicol. and Chem.  
(ung. Alternativa modeller för beskrivning av biokoncentrationen av organiska ämnen i fisk; miljö; gift; kemikalie) 1, s. 309–320. 
2. Kristensen P. (1991),  Bioconcentration in fish: comparison of BCF's 
derived from OECD and ASTM testing methods; influence of particu ­
late matter to the bioavailability of chemicals (ung.  Biokoncen tration i 
fisk: jämförelse av biokoncentrationsfaktorerna från OECD:s och ASTM:s provningsmetoder, partikelformiga ämnens påverkan på ke ­
mikaliernas biotillgänglighet). Danska vattenkvalitetsinstitutet. 
3. Chiou C.T. and Schmedding D.W. (1982),  Partitioning of organic 
compounds in octanol-water systems. Environ. Sci. Technol  (ung. För ­
delning av organiska blandningar i oktanol-vattensystem; miljö; forsk ning; teknik). 16 (1), s. 4–10. 
4. Hawker D.W. and Connell D.W. (1988),  Influence of partition coeffi ­
cient of lipophilic compounds on bioconcentration kinetics with fish  
(ung. Lipofila blandningars partitionskoefficients påverkan på biokon ­
centrationskinetiken med fisk). Wat. Res. 22 (6), s. 701–707. 
5. Branson D.R., Blau G.E., Alexander H.C. and Neely W.B. (1975),  
Transactions of the American Fisheries Society  (ung. Amerikanska 
fiskeförbundets transaktioner), 104 (4), s. 785–792. 
6. Ernst W. (1985),  Accumulation in aquatic organisms. In: Appraisal of 
tests to predict the environ mental behaviour of chemicals  (ung. Acku ­
mulering i vattenorganismer. In: Bedömning av provningar för att för ­
utsäga kemikaliers beteende i miljön). Författad av Sheehman P., Korte 
F., Klein W. och Bourdeau P.H., del 4.4 sid 243–255. SCOPE, John Wiley & Sons Ltd. N.Y. 
7. Reilly P.M., Bajramovic R., Blau G.E., Branson D.R. and Sauerhoff 
M.W. (1977),  Guidelines for the optimal design of experiments to 
estimate parameters in first order kenetic models  (ung. Riktlinjer för 
optimal utformning av experiment för bedömning av parametrar i mo ­
deller för första ordningens kinetik), Can. J. Chem. Eng.  SS, s. 614–622. 
8. Könemann H. and Van Leeuwen K. (1980), T oxicokinetics in fish: 
Accumulation and elimination of six chlorobenzenes by guppies. Che ­
mosphere  (ung. Toxicokinetik i fisk: Ackumulering och eliminerig av 
sex klorbenzener i guppy), 9, s. 3–19.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1142
 
Bilaga 4  
Teoretiskt exempel på provtagningsschema för biokoncentrationsundersökningar för ämnen med log P  ow = 4 
Provtagning av fisk Tidsschema för provtagning 
Antal vattenprover Antal fiskar per prov Längsta tänkbara 
provtagningsfrekvens 
(dagar) Tilläggsprover  
Upptagningsfas - 1 
0 2 (*) 
2 tillsätt 45–80 fiskar 
Första 0,3 0,4 2 
(2) 4 
(4) 
Andra 0,6 0,9 2 
(2) 4 
(4) 
Tredje 1,2 1,7 2 
(2) 4 
(4) 
Fjärde 2,4 3,3 2 
(2) 4 
(4) 
Femte 4,7 2 6 
Utsöndringsfas Flytta över fisken till 
vatten fritt från den 
undersökta kemikalien 
Sjätte 5,0 5,3 4 
(4) 
Sjunde 5,9 7,0 4 
(4) 
Ättonde 9,3 11,2 4 
(4) 
Nionde 14,0 17,5 6 
(4) 
(*) Ta prover på vattnet när minst tre kärlvolymer har levererats. 
Värden inom parentes står för antal prover (vatten, fisk} som ska tas om tilläggsprovtagning görs.  
Anmärkning : Föregående uppskattning för k, för log P  ow på 4,0 är 0,652 dagar . Experimentets totala varaktighet är fastställd till: 
3 x upp = 3 x 4,6 dagar, dvs. 14 dagar. För uppskattning av ”upp”, se bilaga 3.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1143
 
Bilaga 5  
Modellbeskrivning  
De flesta biokoncentrationsdata har förutsatts bli skäligen väl beskrivna med en 
enkel tvådelad modell eller tvåparametersmodell, på det sätt som visas med den räta kurva som närmar sig punkterna för koncentrationen i fisk under utsönd ­
ringsfasen, när dessa linjer plottas på halvlogaritmiskt papper. Om dessa punkter 
inte kan beskrivas av en rät kurva ska mer komplexa modeller användas, se t.ex Spacie och Hamelink, hänvisning 1 i bilaga 3.
 
Grafisk metod för bestämmning av konstanten k  2 för utsöndringshastigheten  
Plotta en koncentration av det undersökta ämne som återfinns i varje fiskprov 
mot provtagningstiden på halvlogaritmiskt papper. Linjens lutning är k  2 . 
k 2 ¼ ln ðC f1=C f2 Þ 
t 2 Ä t 1
 
Observera att avvikelser från rät linje kan vara ett tecken på ett mer komplext 
utsöndringsmönster än första ordningens kinetik. En grafisk metod kan användas för att särskilja utsöndringstyper som avviker från första ordningens kinetik.
 
Grafisk metod för fastställande av konstanten k  1 för upptagningshastigheten  
När k  2 tagits fram kan konstanten k  1 beräknas med följande formel:  
k 1 ¼ C f k 2 
C w Ü ð1 Ä e Äk 2 t Þ [ekvation 1] 
Värdet på C  f , avläses i mittpunkten på den jämna upptagningskurva som fås av 
datan när den logaritmiska koncentrationen plottas i förhållande till tiden på en 
aritmetrisk skala.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1144
 
Metod för beräkning av konstanterna för upptagnings- och 
utsöndringshastigheten  
De medel som föredras för erhållande av biokoncentrationsfaktorn och hastig ­
hetskonstanterna k  1 och k  2 är att använda en icke-linjär metod för parameter ­
uppskattning på dator. Dessa program hittar värdena på k  1 och k  2 utifrån en 
uppsättning koncentrationsdata sekventiella i tiden och med följande ekvationer:  
C f ¼ C w · k 1 
k 2 Ü 1 Ä e Äk 2 t Ê Ì  
0 < t < t  c [ekvation 2]  
C f ¼ C w · k 1 
k 2 Ü e Äk 2 ðtÄt c Þ Ä e Äk 2 t Ê Ì  
t > t  c [ekvation 3] 
där t  c står för tiden vid slutet av upptagningsfasen. 
Med denna metod kan vanliga avvikelsebedömningar göras för k  1 och k  2 . 
Eftersom k  2 i de flesta fall kan uppskattas i utsöndringskurvan med förhållande ­
vis hög precision och eftersom ett starkt samband finns mellan de två paramet ­
rarna k  1 och k  2 om de beräknas samtidigt, kan det vara tillrådligt att först beräkna 
k 2 från enbart utsöndringsdata och därefter beräkna k  1 från upptagningsdata med 
icke-linjär regression.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1145
 
C.14  TILLVÄXTTEST PÅ UNGA EXEMPLAR AV FISK  
1. METOD  
Denna metod för tillväxttest avseende toxicitet motsvarar OECD TG 
215 (2000).  
1.1 INLEDNING 
Testet är avsett för bestämning av vilka verkningar långvarig expo ­
nering för kemikalier har på tillväxten hos unga exemplar av fisk. Testet baserar sig på en metod för bestämning av verkningarna av kemikalier på tillväxten hos unga exemplar av regnbågslax  (Onco­
rynchus mykiss)  under genomflödesförhållanden, en metod som har 
utvecklats och ringtestats (1) (2) inom Europeiska unionen. Även andra väldokumenterade arter kan användas. Man har t.ex. erfaren ­
heter från tillväxttest med sebrafisk  (Danio rerio)  (
 1 ) (3) (4) och 
ricefish medaka  Oryzias  latipes) (5) (6) (7). 
Se också den allmänna inledningen, del C.  
1.2 DEFINITIONER 
Lägsta koncentration vid vilken verkningar observeras (Lowest ob ­
served effect concentration, LOEC): 
den lägsta testade koncentrationen av ett testämne vid vilken man 
kan observera signifikanta verkningar (vid p < 0,05) jämfört med 
kontrollgruppen. Alla testkoncentrationer ovanför LOEC måste fram ­
kalla skadliga verkningar som är lika stora eller större än de verk ­
ningar som kan observeras vid LOEC. 
Koncentration vid vilken inga verkningar observeras (No observed 
effect concentration, NOEC): test-koncentrationen omedelbart under LOEC. 
EC
 x : den koncentration av testämnet som orsakar en tillväxtvariation 
på x % hos testexemplaren jämfört med kontrollgruppen.  
Fisktäthet:  våtvikten fisk per vattenvolym.  Antalstäthet:  antalet ex ­
emplar per vattenvolym.  
Individuell specifik tillväxthastighet:  tillväxthastigheten hos en in ­
divid, uppmätt med startvikten som utgångspunkt.  
Kärlmedelvärdet för specifik tillväxthastighet:  medeltillväxthastig ­
heten hos en kärlpopulation vid en viss koncentration.  
Pseudospecifik tillväxthastighet:  den individuella tillväxthastighe ­
ten jämförd med kärlpopulationens medel-begynnelsevikt.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1146  
( 1 ) Meyer A.. Bierman C. H. och Orti G. (1993), The phylogenetic position of the Zebrafish  
(Danio rerio),  a model system in developmental biology – an invitation to the comper ­
ative methods. Proc. Royal Society of London, Series B, 252, s. 231-236.
 1.3 PRINICP FÖR TESTMETODEN 
Unga fiskexemplar i exponentiell tillväxtfas vägs och placeras i test ­
kärl där de exponeras för en serie subletala koncentrationer av tes ­
tämnet upplöst i vatten. Exponeringen ska helst ske under genom ­
flödesförhållanden eller, om detta inte är möjligt, under lämpliga 
halvstatiska förhållanden (statisk förnyelse). Testperiodens längd är 28 dagar. Fiskarna utfodras dagligen. Foderportionen baserar sig på fiskarnas begynnelsevikter och kan räknas om efter 14 dagar. Vid 
slutet av testet vägs fiskarna på nytt. Verkningarna på tillväxthas ­
tigheterna analyseras med en regressionsmodell för att bestämma den koncentration som leder till en variation på x % av tillväxthastighe ­
ten, dvs. EC
 x (t.ex. EC  10 , EC  20 eller EC  30 ). Alternativt kan testdata 
jämföras med kontrollgruppens värden för att bestämma den lägsta koncentration vid vilken verkningar observeras (LOEC) och den koncentration vid vilken inga verkningar observeras (NOEC).
 
1.4 INFORMATION OM TESTÄMNET 
Det bör finnas tillgäng till resultaten frän ett test avseende akut 
toxicitet (se metod Cl), som helst ska ha utförts med samma art 
som används för detta test. Testämnets vattenlöslighet och ångtryck 
måste vara kända. Det bör finnas tillgång till en tillförlitlig analys ­
metod for kvantifiering av ämnet i testlösningen och denna metod blir ha känd och rapporterad noggrannhet och detektionsgräns. 
Till information som bör anges hör bl.a. testämnets strukturformel, 
ämnets renhet, stabilitet i vatten och ljus, pK
 a , P ow och resultaten 
från test avseende biologisk lättnedbrytbarhet (se metod C.4).  
1.5 TESTETS GILTIGHET 
För att testet ska vara giltigt måste följande villkor uppfyllas: 
— Mortaliteten i kontrollgruppen (kontrollgrupperna) får inte över ­
skrida 10 % vid testets slut. 
— Medelvikten hos fiskarna i kontrollgruppen (kontrollgrupperna) 
måste ha ökat tillräckligt för att ge möjlighet att detektera den minsta variation som anses vara signifikant. Resultaten från ett ringtest (3) har visat att medelvikten för exemplar av regnbågslax 
i kontrollgrupperna under de 28 testdagarna måste ha ökat med 
minst hälften (50 %) av begynnelsevikten. Om t.ex. begynnelse ­
vikten är 1 g per fisk (= 100 %) bör slutvikten efter 28 dagar vara ≥ 1,5 g per fisk ( ≥ 150 %). 
— Koncentrationen upplöst syrgas måste under hela testet ha varit 
minst 60 % av luftmättnadsvärdet (ASV). 
— Under testet får vattentemperaturen inte vid någon tidpunkt va ­
riera med mer än ± 1
 o C mellan olika testkärl och den får variera 
med högst 2  o C från de temperaturgränser som specificerats för 
den art som används (se tillägg 1).  
1.6 BESKRIVNING AV TESTMETODEN  
1.6.1  Utrustning  
Normal laboratorieutrustning och särskilt 
a) syrgas- och pH-mätare,  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1147
 
b) utrustning för bestämning av hårdhet och alkalinitet hos vatten, 
c) lämplig utrustning för temperaturreglering, helst med kontinuerlig 
övervakning, 
d) kärl som är tillverkade av kemiskt inert material och tillräckligt 
stora med tanke på den rekommenderade fisktätheten och antals ­
tätheten (se avsnitt 1.8.5 och tillägg 1), 
e) lämplig precisionsvåg (t.ex. noggrannhet ± 0,5 %).  
1.6.2  Vatten  
Som testvatten kan användas allt vatten i vilket den berörda arten 
uppvisar lämplig överlevnad och tillväxt under en längre period. 
Testvattnet bör ha konstant kvalitet under hela testperioden. Vattnets pH bör ligga inom intervallet 6,5–8,5 men får dock under ett givet 
test variera med högst ± 0,5 pH-enheter. Hårdhet over 140 mg/l 
(räknat som CaCO
 3 ) rekommenderas. För att säkerställa att spädvatt ­
net inte påverkar testresultaten på oönskat sätt (t.ex. genom komplex ­
bildning med testämnet), bör vattenprover regelbundet tas för analys. 
Mätningar av tungmetaller (t.ex. Cu, Pb, Zn, Hg, Cd och Ni), viktiga 
anjoner och katjoner (t.ex. Ca, Mg, Na, K, Cl och SO  4 ), bekämp ­
ningsmedel (t.ex. total mängd organiska fosforföreningar eller total mängd organiska klorföreningar), totalt organiskt kol och uppslam ­
made partiklar bör göras t.ex. var tredje månad i fall där man vet att 
spädvattnet håller en relativt jämn kvalitet. Om vattenkvaliteten har visat sig vara jämn under minst ett år kan dessa kontroller göras med längre intervall (t.ex. var sjätte månad). I tillägg 2 anges ett antal 
kemiska egenskaper för godtagbart spädvatten.
 
1.6.3  Testlösningar  
Testlösningar med de valda koncentrationerna bereds genom utspäd ­
ning av en stamlösning. 
Stamlösningen bör helst beredas genom enkel blandning eller om ­
skakning av testämnet i spädvattnet på mekanisk väg (t.ex. omrör ­
ning och ultraljud). Mättnadskolonner (löslighetskolonner) kan an ­
vändas för att få stamlösning av lämplig koncentration. 
I vissa fall kan lösnings- eller dispergeringsmedel (lösningsagenter) 
behövas för att få en stamlösning av lämplig koncentration. Lämpliga 
lösningsmedel är t.ex. aceton, etanol, metanol, dimetylsulfoxid, di ­
metylformamid och trietylenglykol. Lämpliga dispergeringsmedel är t.ex. Cremophor RH40, Tween 80, metylcellulosa (0,01 %) och HCO-40. Om man använder agenter som är biologiskt lättnedbryt ­
bara (t.ex. aceton) eller agenter med hög flyktighet bör man iaktta 
särskild försiktighet eftersom sådana agenter kan orsaka problem med bakterieansamling vid genomflödestest. Om en lösningsagent används får den inte ha signifikant verkan på fisktillväxten eller 
framkalla synliga skadliga verkningar på de unga exemplaren (verk ­
ningar som framkommit vid test med rent lösningsmedel).
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1148
 
För genomflödestest behövs ett system som kontinuerligt portionerar 
och späder ut stamlösning av testämnet så att man får en tillförsel av 
en serie koncentrationer till testkärlen. Stamlösningens och spädvatt ­
nets flödeshastighet bör kontrolleras regelbundet, helst dagligen, och får inte variera med mer än 10 % under hela testet. Resultaten från 
ett ringtest (3) har visat att en vattenavlägsning på 6 liter per gram 
fisk och dag är godtagbar vid test på regnbågslax (se avsnitt 1.8.2.2.). 
För halvstatiskt test (statisk förnyelse) beror mediets förnyelsefre ­
kvens på testämnets stabilitet, men daglig förnyelse rekommenderas. 
Om resultaten från preliminära stabilitetstest (se avsnitt 1.4) visar att 
testämnet inte är stabilt (dvs. utanför området 80 — 120 % av nominell koncentration eller under 80 % av uppmätt startkoncent ­
ration) under ett helt förnyelseintervall måste genomflödestest över ­
vägas.
 
1.6.4  Val av fiskart  
De flesta erfarenheterna från ringtest (1) (3) gäller regnbågslax  (On­
corhynchus mykiss)  och därför rekommenderas denna art för testet. 
Även andra väldokumenterade arter kan användas, men då måste testförfarandet eventuellt anpassas så att lämpliga testförhållanden 
erhålls. Det finns t.ex. erfarenheter från test med sebrafisk (Da- nio 
rerio)  (4) (5) och ricefish (medaka, Oryzias  latipes)  (6) (7) (8). 1 ett 
sådant fall måste motiveringen för valet av art och testmetod rap ­
porteras.
 
1.6.5  Förvaring av fisk  
Testfiskarna ska tas från en population från en enda stam, helst från 
samma romläggning. Fiskarna bör, under minst två veckor före tes ­
tets början, hållas i vatten med samma kvalitet och ljusförhållanden som det som används under testet. Fiskarna bör utfodras med en minimiportion på 2 % kroppsvikt per dag, helst 4 % kroppsvikt 
per dag, under hela förvaringsperioden och under testet. 
Efter en inledande period på 48 timmar registreras mortaliteten och 
följande kriterier tillämpas: 
— Om mortaliteten under sju dagar är högre än 10 % av popula ­
tionen bör hela satsen förkastas. 
— Om mortaliteten ligger mellan 5 och 10 % av populationen fort ­
sätts acklimatiseringen under ytterligare sju dagar. Om mortalite ­
ten under den andra sjudagarsperioden är högre än 5 % bör hela satsen förkastas. 
— Om mortaliteten under sju dagar är lägre än 5 % av populationen 
kan satsen godtas. 
Fiskarna bör inte ges behandling mot sjukdomar under de två vec ­
korna före testet eller under testets gång.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1149
 
1.7 TESTUTFORMNING 
Begreppet ”testutformning” hänför sig till valet av antalet testkon ­
centrationer och deras inbördes nivåskillnad, antalet kärl vid varje koncentration och antalet fiskar per kärl. Vid testutformningen bör 
följande beaktas: 
a) Undersökningens syfte. 
b) Den statistiska analysmetod som kommer att användas. 
c) Tillgången till försöksresurser och deras kostnader. 
När det gäller undersökningens syfte bör man, om möjligt, specifi ­
cera de statistiska krav som gäller för detekteringen av en given 
skillnad (t.ex. avseende tillväxthastighet) eller, alternativt, den nog ­
grannhet med vilken EC
 x (t.ex. x = 10, 20 eller 30 och helst inte 
under 10) måste bestämmas. Utan detta kan en hållbar definition av 
undersökningens storlek inte ges. 
Det är viktigt att vara medveten om att en utformning som är optimal 
(bästa utnyttjande av resurser) för en viss metod för statistisk analys inte 
nödvändigtvis är optimal för en annan. Den utformning som rekommen ­
deras för uppskattning av LOEC/NOEC är därför inte densamma som den utformning som rekommenderas för regressionsanalys. 
1 de flesta fall är regressionsanalys att rekommendera framför varians ­
analys. Motiveringen till detta diskuteras av Stephan och Rogers (9). Om ingen lämplig regressionsmodell finns att tillgå (r
 2 < 0,9) bör 
NOEC/LOEC användas.  
1.7.1  Utformning för regressionsanalys  
Följande faktorer är viktiga vid utformningen av ett test som ska 
analyseras med regression: 
a) Den koncentration vid vilken verkningar observeras (t.ex. 
EC 10,20,30  ) och det koncentrationsområde som är av intresse med 
tanke på testämnets verkningar måste omfattas av de koncentratio ­
ner som används vid testet. Den noggrannhet med vilken man kan bestämma den koncentration vid vilken verkningar observeras är bäst när den berörda koncentrationen ligger i mitten av det testade 
koncentrationsområdet. Ett preliminärt orienterande försök kan vara 
till hjälp vid valet av lämpliga testkoncentrationer. 
b) För att göra det möjligt att uppnå en tillfredsställande statistisk 
modell bör testet inbegripa minst ett kontrollkärl och fem extra kärl vid olika koncentrationer. När en lösningsagent används och när det är lämpligt bör ett kontrollkärl som innehåller lösnings ­
agenten vid den högsta testade koncentrationen köras utöver test ­
serien (se avsnitten 1.8.3 och 1.8.4). 
c) En lämplig geometrisk eller logaritmisk serie (10) (se tillägg 3) 
kan användas. Fördelningen av testkoncentrationerna ska helst 
vara logaritmisk.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1150
 
d) Om man har tillgång till fler än sex kärl bör de extra kärlen 
användas för replikat eller fördelas över koncentrationsområdet i 
syfte att minska skillnaderna mellan de olika koncentrationsnivå ­
erna. Dessa båda alternativ är likvärdiga.  
1.7.2  Utformning för bestämning av NOEC/LOEC med variansanalys 
(ANOVA)  
Det ska helst finnas replikatkärl vid varje koncentration och den 
statistiska analysen bör göras på kärlnivå (10). Utan replikatkärl kan man inte beakta variabiliteten mellan kärl utöver den som beror på individuella skillnader mellan fiskar. Erfarenheterna har dock 
visat (11) att variabiliteten mellan kärl i de undersökta fallen har 
varit mycket liten jämförd med variabiliteten inom kärlet (dvs. mel ­
lan olika fiskar). Det är därför ett relativt godtagbart alternativ att göra den statistiska analysen pä nivån för individuella exemplar. 
I regel används minst fem testkoncentrationer i en geometrisk serie 
med en faktor som helst inte bör överskrida 3,2. 
När ett test utförs med replikatkärl bör antalet replikatkontrollkärl 
och därmed antalet fiskar i regel vara det dubbla jämfört med antalet vid testkoncentrationerna, och vid testkoncentrationerna bör antalet vara lika stort (13) (14) (15). Om däremot replikatkärl inte används 
bör antalet fiskar i kontrollgruppen vara lika stort som antalet vid 
varje testkoncentration. 
Om man utgår från att ANOVA ska grunda sig på kärl i stället för 
individuella fiskar (det senare fallet skulle innebära antingen individu ­
ell märkning av fiskarna eller användning av pseudospecifika tillväxt ­
hastigheter [se avsnitt 2.1.2]), måste man ha ett tillräckligt antal repli ­
katkärl för att möjliggöra bestämning av standardavvikelsen för kon ­
centrationerna inom kärlen. Det betyder att frihetsgraderna för fel i 
variansanalysen bör vara minst 5 (10). Om endast kontrollgrupperna har replikat föreligger det fara för att felvariabiliteten ökar med ökande medelvärde för den berörda tillväxthastigheten. Eftersom tillväxthas ­
tigheten sannolikt minskar med ökande koncentration tenderar detta att 
leda till en överskattning av variabiliteten.
 
1.8 FÖRFARANDE  
1.8.1  Val och vägning av testfisk  
Det är viktigt att minimera fiskarnas viktvariationer vid testets 
början. 1 tillägg 1 anges lämpliga storleksområden för de olika arter 
som rekommenderas för detta test. De individuella vikterna för hela den fisksats som används för testet bor helst ligga inom ± 10 % av den aritmetiska medelvikten, och får under inga omständig- heter 
överskrida 25 %. Det rekommenderas att ett delprov av fiskar vägs 
före testet i syfte att uppskatta medelvikten.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1151
 
Stampopulationen bör hållas utan foder under 24 timmar före testet. 
Därefter väljs fiskarna ut slumpmässigt. Fiskarna ges allmän bedöv ­
ning (t.ex. med en vattenlösning av 100 mg/l trikainmetansulfonat (MS 222) neutraliserad genom tillsats av två delar natriumbikarbonat per del MS 222) och deras våtvikt (avtorkad fisk) bestäms individu ­
ellt med den noggrannhet som anges i tillägg 1. Fiskar med vikter 
inom det planerade området väljs ut och fördelas sedan slumpmässigt mellan testkärlen. Den totala vårvikten för fiskarna i vart och ett testkärl bör registreras. Bedövningen och hanteringen av fiskarna 
(inbegripet avtorkning och vägning) kan orsaka stress och skador 
pä de unga exemplaren, särskilt när det gäller små arter. Därför bör unga exemplar hanteras ytterst försiktigt så att stress och skador på testdjuren undviks. 
Fiskarna vägs på nytt på testdag 28 (se avsnitt 1.8.6). Om det be ­
döms vara nödvändigt att räkna om foderportionen, kan fiskarna dock vägas på nytt på testdag 14 (se avsnitt 1.8.2.3). Det finns också andra metoder, t.ex. fotografiska metoder, för att bestämma om fis ­
karna har vuxit så mycket att portionerna behöver justeras.
 
1.8.2  Exponeringsförhållanden  
1.8.2.1  Varaktighet  
Testets varaktighet är ≥ 28 dagar.  
1.8.2.2  Fïsktäthet och antalstäthet  
Det är viktigt att fisktätheten och antalstätheten är anpassade för de 
arter som testas (se tillägg 1). Om fisktätheten är för hög uppstår 
trängselstress som leder till minskade tillväxthastigheter och eventuellt 
också till sjukdomar. Om fisktätheten är for låg kan det uppstå ett territorialt beteende som också kan påverka tillväxten. Fisktätheten ska under alla omständigheter vara så låg att koncentrationen upplöst 
syrgas kan hållas på minst 60 % ASV utan luftning. Resultaten från 
ringtest (3) har visat att det för regnbågslax är lämpligt med en fisk ­
täthet på 16 exemplar à 3 — 5 g i en 40-litersvolym. Rekommenderad vattenavlägsning under testet är 6 liter per fisk och dag.
 
1.8.2.3  Utfodring  
Fiskarna ska ges lämpligt foder (tillägg 1) i tillräcklig mängd för att 
möjliggöra en godtagbar tillväxthastighet. Det är viktigt att se till att 
det inte uppstår mikrobtillväxt och vattenturbiditet. För regnbågslax kan man utgå från att villkoren uppfylls om fiskarna ges en portion på 4 % av kroppsvikten per dag (3) (16) (17) (18). Den dagliga 
portionen kan delas upp i två lika delar och ges vid två utfodrings ­
tillfällen per dag med minst 5 timmars mellanrum. Portionen baserar sig på fiskarnas totala begynnelsevikt i vart och ett av testkärlen. Om fiskarna vägs på nytt på dag 14 kan portionen därefter räknas om. 
Fiskarna ska inte ges foder under de 24 timmar som föregår väg ­
ningen.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1152
 
Okonsumerat foder och fekalt material ska dagligen avlägsnas från 
testkärlen genom omsorgsfull rengöring av kärlets botten genom 
sugning.  
1.8.2.4  Ljus och temperatur  
Ljusperioden och vattentemperaturen bör vara anpassade för den art 
som testas (se tillägg 1).  
1.8.3  Testkoncentrationer  
I regel krävs fem koncentrationer av testämnet, oavsett vilken tes ­
tutformning som används (se avsnitt 1.7.2). Tidigare kunskaper om 
testämnets toxicitet (t.ex. från test av akut toxicitet eller preliminära 
orienterande undersökningar) ar till hjälp vid valet av lämpliga test ­
koncentrationer. Om färre än fem testkoncentrationer används måste detta motiveras. Den högsta testkoncentrationen får inte överskrida 
testämnets löslighetsgräns i vatten. 
Om en lösningsagent används för att underlätta beredningen av test ­
lösningar får agentens slutkoncentration i testkärlet inte överskrida 0,1 ml/l och samma slutkoncentration bör helst användas i alla test ­
kärl (se avsnitt 1.6.3). Man bör dock sträva efter att undvika använd ­
ning av lösningsagenter.
 
1.8.4  Kontrollsatser  
Antalet spädvattenskontrollsatser beror på testutformningen (se 
avsnitten 1.7–1.7.2). Om en lösningsagent används bör testet även omfatta lika stort antal kontrollsatser för lösningsagenten som för 
spädvattnet.
 
1.8.5  Frekvensen för analytiska bestämningar och mätningar  
Under testets gång bör testämnets koncentrationer bestämmas med 
regelbundna intervall (se nedan). 
Vid genomflödestest bör flödeshastigheterna för spädlösning och tes ­
tämnets stamlösning kontrolleras regelbundet, helst dagligen. Under 
testets förlopp får flödeshastigheterna inte variera med mer än 10 %. 
Om det förväntas att testämneskoncentrationerna kommer att hållas inom  ± 20 % av de nominella värdena (dvs. inom området 
80–120 %, se avsnitten 1.6.2 och 1.6.3) är det tillrådligt att analysera 
de högsta och lägsta testkoncentrationerna åtminstone vid testets 
början och därefter varje vecka. Vid test där det inte förväntas att testämnes-koncentrationen kommer att hållas inom  ± 20 % av de 
nominella värdena (med hänvisning till testämnets stabilitetsdata) 
är det nödvändigt att analysera alla testkoncentrationer, men enligt samma schema. 
Vid halvstatiska test (förnyelsetest) där det förväntas att testämnes ­
koncentrationen kommer att hållas inom ± 20 % av de nominella 
värdena är det tillrådligt att analysera de högsta och lägsta testkon ­
centrationerna åtminstone när de är nyberedda och strax före för ­
nyelsen. Detta görs vid testets början och därefter varje vecka. Vid test där det inte förväntas att testämneskoncentrationen kommer att 
hållas inom dessa gränser måste alla testkoncentrationer analyseras 
enligt samma schema som används för stabilare ämnen.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1153
 
Det rekommenderas att resultaten grundar sig på de uppmätta kon ­
centrationerna. Om det däremot finns bevis för att testämnets kon ­
centration i lösningen på ett tillfredsställande sätt har hållits inom ± 20 % av den nominella eller uppmätta startkoncentrationen under hela testperioden, kan resultaten grunda sig på nominella eller upp ­
mätta värden. 
Proverna kan behöva filtreras (t.ex. med porstorlek 0,45 μm) eller 
centrifugeras. Centrifugering rekommenderas. Om testmaterialet inte 
adsorberas på filter kan dock även filtrering godtas. 
Under testets gång mäts upplöst syrgas, pH och temperatur i alla 
testkärl. Totalhårdhet och salthalt (om relevant) mäts i kontrollsat ­
serna och i ett kärl med den högsta koncentrationen. Upplöst syrgas och salthalt (om relevant) mäts minst tre gånger (vid testets början, 
mitt och slut). Vid halvstatiskt test rekommenderas att upplöst syrgas 
mäts oftare, helst före och efter varje vattenförnyelse eller minst en gång i veckan. Vid halvstatiskt test mäts pH i början och i slutet av varje vattenförnyelse och vid genomflödestest minst varje vecka. 
Hårdheten och alkaliniteten mäts en gång per test. Temperaturen 
bör mätas dagligen och helst övervakas kontinuerligt i minst ett testkärl.
 
1.8.6  Observationer  
Vikt: Vid testets slut vägs alla fiskar (våtvikt, dvs. avtorkade ex ­
emplar) antingen i grupper per testkärl eller individuellt. Vägning per testkärl är att föredra eftersom individuell vägning förutsätter 
att fiskarna har märkts individuellt. Om man gör individuella väg ­
ningar för bestämning av individuell specifik tillväxthastighet bör den märkningsteknik som väljs stressa djuren minimalt (ett lämpligt alternativ till frysmärkning är t.ex. användning av färgad tunn fisk ­
lina). 
Under testperioden bör fiskarna inspekteras dagligen och alla yttre 
abnormaliteter (t.ex. blödningar eller avfärgning) och onormalt bete ­
ende bör registreras. Varje fall av fiskdöd bör registreras, och döda fiskar bör avlägsnas så snart som möjligt. Döda fiskar ska inte er ­
sättas eftersom fisktätheten och antalstätheten är tillräcklig för att 
tillväxten inte ska påverkas av ändringar i antalet fiskar per kärl. 
Mängden foder som ges måste dock justeras.
 
2. DATA OCH RAPPORTERING  
2.1 BEHANDLING AV RESULTATEN 
Det rekommenderas att en statistiker deltar i både utformning och 
analys av testet, eftersom metoden medger betydande variationer i fråga om testutformning, t.ex. antalet testkärl, antalet testkoncent ­
rationer, antalet fiskar osv. Med hänvisning till de många alternativen 
för testutformning ges inga specifika anvisningar om statistiska pro ­
cedurer.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1154
 
Tillväxthastigheterna bör inte beräknas för testkärl där mortaliteten 
överskrider 10 %. Mortaliteten bör dock anges för alla testkoncent ­
rationer. 
Oavsett vilken metod som väljs för analys av data består det centrala 
konceptet av den specifika tillväxthastigheten mellan tidpunkten t, och tidpunkten t,. Denna kan definieras på flera olika sätt, beroende på om fiskarna är individuellt märkta eller inte och om det krävs ett 
kärlmedelvärde.
 
r 1 ¼ log e W 2 Ä log  e W 1 
t 2 Ä t 1 Ü 100 
r 2 ¼ log e W 2 Ä log  e W 1 
t 2 Ä t 1 Ü 100 
r 3 ¼ log e W 2 Ä log  e W 1 
t 2 Ä t 1 Ü 100  
där: 
r 1 = individuell fiskspecifik tillväxthastighet 
r 2 = specifik medeltillväxthastighet i kärlet 
r 3 = pseudospecifik tillväxthastighet 
w 1 , w 2 = vikten hos en viss fisk vid tidpunkten t  1 respektive t  2 
log e w 1 = logaritmen av vikten hos en individuell fisk vid test ­
periodens början 
log e w 2 = logaritmen av vikten för en individuell fisk vid testperio ­
dens slut 
log e W 1 = medelvärdet för logaritmerna av värdena w  1 för fiskarna 
i kärlet vid testperiodens början 
log e W 2 = medelvärdet för logaritmerna av värdena w  2 för fiskarna 
i kärlet vid testperiodens slut 
t 1 , t 2 = tidpunkten (dagar) vid testperiodens början och slut 
r 1 , r 2 , r 3 kan beräknas för perioden dag 0–28 och i tillämpliga fall 
(t.ex. om mätning har gjorts dag 14) för perioderna dag 0–14 och dag 14–28.
 
2.1.1  Analys av resultaten genom regression (koncentration-respons- 
modellering)  
Denna analysmetod innebär att en lämplig matematisk modell anpas ­
sas till förhållandet mellan den specifika tillväxthastigheten och kon ­
centrationen. Genom modellen kan man uppskatta EC  X . dvs. önskat 
EC-värde. När denna metod används behöver r inte beräknas för individuella fiskar (r
 1 ), utan analysen kan i stället basera sig på 
kärlets medelvärde for r (r  1 ). Den senare metoden är att föredra. 
Den är också lämpligare när man använder de minsta arterna. 
Karlmedelvärdena för de specifika tillväxthastigheterna (r  2 ) plottas 
grafiskt mot koncentrationen, vilket ger möjlighet att granska förhål ­
landet mellan koncentration och respons.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1155
 
En lämplig modell bör väljas för att uttrycka förhållandet mellan r  2 
och koncentrationen. Valet måste motiveras på tillbörligt sätt. 
Om antalet fiskar som överlever inte är lika stort i varje kärl bör 
modellanpassningen, antingen den är enkel eller icke-linjär. viktas 
för att kompensera för de olika stora grupperna. 
Den metod som används för anpassning av modellen måste ge möj ­
lighet att uppskatta t.ex. EC  20 och få fram spridningen kring värdet 
(standardfel eller konfidensintervall). Kurvan för den anpassade mo ­
dellen bör visualiseras i förhållande till data så att det framgår i hur hög grad modellen stämmer (9) (19) (20) (21).
 
2.1.2  Analys av resultaten för uppskattning av LOEC  
Om testet har omfattat replikering av kärl vid alla koncentrations ­
nivåer kan uppskattningen av LOEC basera sig på en variansanalys (ANOVA) av kärlmedelvärdet för specifik tillväxthastighet (se 
avsnitt 2.1) åtföljd av en lämplig metod (t.ex. Dunnetts eller Willi ­
ams test (13) (14) (15 (22)) för jämförelse av medelvärdet r för varje koncentration med medelvärdet r för kontrollsatserna, i syfte att hitta den lägsta koncentration för vilken denna skillnad är signifikant vid 
en sannolikhetsnivå på 0,05. Om de antaganden som krävs för para ­
metriska metoder inte uppfylls – onormal fördelning (t.ex. Shapiro- Wilks test) eller variansen är heterogen (Bartletts test) – bör man överväga att homogenisera varianserna genom transformering av data 
före ANOVA. Alternativt kan viktad ANOVA övervägas. 
Om testet inte har omfattat replikering av kärl vid varje koncent ­
ration är kärlbaserad ANOVA okänslig eller omöjlig. I en sådan 
situation är det en godtagbar kompromiss att basera ANOVA på den pseudospecifika tillväxthastigheten r
 3 för individuella fiskar. 
Medelvärdet r  3 för varje testkoncentration kan sedan jämföras med 
medelvärdet r  3 för kontrollsatserna. LOEC kan därefter fås fram på 
ovan beskrivet sätt. Det bör konstateras att denna metod inte beaktar eller ger skydd mot variabiliteten mellan kärl, utöver den variabilitet 
som beaktas genom variabiliteten mellan individuella fiskar. Erfaren ­
heter har dock visat (9) att variabiliteten mellan kärl är mycket liten jämfört med variabiliteten inom ett kärl (dvs. mellan fiskar). Om individuella fiskar inte inkluderas i analysen bör metoden för iden ­
tifiering av utanförliggande värden anges tillsammans med en moti ­
vering.
 
2. TOLKNING AV RESULTATEN 
Resultaten bör tolkas med försiktighet när de uppmätta koncentratio ­
nerna av det toxiska ämnet i testlösningen ligger på nivåer nära 
analysmetodens detektionsgräns eller – vid halvstatiska test – när koncentrationen av testämnet minskar mellan nyss beredd lösning och lösningen före förnyelsen.
 
2.3 TESTRAPPORT 
Testrapporten ska innehålla nedan angivna uppgifter.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1156
 
2.3.1  Testämne:  
— Aggregationstillstånd och relevanta fysikalisk-kemiska egenskaper. 
— Kemiska identifieringsdata, inklusive renhet och i tillämpliga fall 
analysmetod för identifiering av testäm net.  
2.3.2  Testdjur:  
— Vetenskapligt namn. 
— Tillgängliga uppgifter om stam, storlek, leverantör, eventuella 
förbehandlingar osv.  
2.3.3  Testförhållanden:  
— Testförfarande som har använts (t.ex. halvstatiskt test eller ge ­
nomflödestest, fisktäthet, antalstäthet, osv.). 
— Testutformning (t.ex. antalet testkarl, testkoncentrationer och re ­
plikat, antalet fiskar per karl). 
— Metoden för beredning av stamlösningar och förnyelsefrekvensen 
(i förekommande fall bör även lösningsagenten och dess kon ­
centration anges). 
— Nominella testkoncentrationer, de uppmätta värdenas medelvär ­
den och standardavvikelser i testkärlen och den metod med vil ­
ken dessa erhölls samt bevis för att mätningarna hänför sig till 
testämnets koncentratio ner i lösningen. 
— Spädvattnets egenskaper: pH, hårdhet, alkalinitet, temperatur, 
koncentrationen upplöst syrgas, restklornivåer (om de har upp ­
mätts), totalt organiskt kol, partikelinnehåll, testmediets salthalt (om den har uppmätts) och resultatet av alla övriga mätningar. 
— Vattenkvaliteten i testkärlen: pH, hårdhet, temperatur och halten 
upplöst syrgas. 
— Detaljerade uppgifter om utfodringen (t.ex. typ av foder, källa, 
hur mycket fiskarna har fått och hur ofta).
 
2.3.4  Resultat:  
— Bevis för att kontrollgrupperna uppfyller validitetskriterierna för 
överlevnad. Data om varje förekomst av fiskdöd. 
— Statistiska analystekniker som har använts, statistik baserad på 
replikat eller fisk, behandlingen av data och motivering för de tekniker som har använts. 
— Data i tabellform över individuella fiskvikter och medeltal dag 0, 
dag 14 (om uppmätt) och dag 28, kärl medelvärde eller pseudo ­
specifika tillväxthastigheter (enligt det som är lämpligt) för pe ­
riodernadag 0–28, eller eventuellt dag 0–14 och dag 14–28. 
— Resultat av den statistiska analysen (regressionsanalys eller 
ANOVA), helst i tabellform och grafisk form samt LOEC 
(p=0,05) och NOEC eller EC
 X , om möjligt med standardfel (en ­
ligt det som är lämpligt).  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1157
 
— Förekomsten av eventuella ovanliga reaktioner hos fiskarna och 
eventuella synliga verkningar som har orsakats av testämnet.  
3. HÄNVISNINGAR 
1. Solbe J. K de LG (1987), Environmental Effects of Chemicals 
(CFM 9350 SLD). Report on a UK Ring Test of a Method for 
Studying the Effects of Chemicals on the Growth Rate of Fish. 
WRc Report No PRD 1388-M/2. 
2. Ashley S., Mallett M. J. and Grandy N.). (1990), EEC Ring 
Test of a Method for Determining the Effects of Chemicals on the Growth Rate of Fish. Final Report to the Commission of the European Communities. WRc Report No EEC 2600-M. 
3. Grossland N. O. (1985), A method to evaluate effects of toxic 
chemicals on fish growth. Chemosphere, 14, s. 1855–1870. 
4. Nagel R., Bresh H., Caspers N., Hansen P. D., Market M, 
Munk R., Scholz N. and Höfte B. B. (1991), Effect of 3,4- dichloroanilinc on the early life stages of the Zebrafish  (Brachy­
danio rerio):  results of a comparative laboratory study. Ecotox. 
Environ. Safety, 21, s. 157–164. 
5. Yamamoto, Tokio. (1975), Series of stock cultures in biological 
field. Medaka (killifish) biology and strains. Keigaku Publish. Tokio, Japan. 
6. Holcombe, G./V.. Benoit D. A., Hammermeister, D. E., Leo ­
nard, E. N. and Johnson, R. D. (1995), Acute and long-term effects of nine chemicals on the Japanese medaka  (Oryzias 
latipes ). Arch. Environ. Conta. Toxicol. 28, s. 287–297. 
7. Benoit, D. A., Holcombe, G. \V. and Spehar, R. L. (1991), 
Guidelines for conducting early life toxicity tests with Japanese 
medaka ( Oryzias latipes ). Ecological Research Series EPA- 
600/3-91-063. US Environmental Protection Agency, Duluth, Minnesota. 
8. Stephan C. E. and Rogers J. W. (1985), Advantages of using 
regression analysis to calculate results of chronic toxicity tests. Aquatic Toxicology and Hazard Assessment: Eighth Symposi ­
um, ASTM STP 891, R. C. Bahner and D. J. Hansen, eds., 
American Society for Testing and Materials, Philadelphia, s. 328–338. 
9. Environment Canada (1992), Biological test method: toxicity 
tests using early life stages of salmonid fish (rainbow trout, coho salmon, or atlantic salmon). Conservation and Protection, 
Ontario, Report EPS l/RM/28, 81 pp. 
10. Cox D. R. (1958), Planning of experiments. Wiley Edt. 
11. Pack S. (1991), Statistical issues concerning the design of tests for 
determining the effects of chemicals on the growth rate of fish. 
Room Document 4, OECD Ad Hoc Meeting of Experts on Aqua ­
tic Toxicology, WRc Medmenham, UK, 10–12 December 1991. 
12. Dunnett C. W. (1955), A Multiple Comparisons Procedure for 
Comparing Several Treatments with a Control,]. Amer. Statist. Assoc, 50, s. 1096–1121. 
13. Dunnett C. W. (1964), New tables for multiple comparisons 
with a control. Biometrics, 20, s. 482–491.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1158
 
14. Williams D. A. (1971), A test for differences between treatment 
means when several dose levels are compared with a zero dose 
control. Biometrics 27, s. 103–117. 
15. Johnston, W. L., Atkinson, J. L., Glanville N. T. (1994), A 
technique using sequential feedings of different coloured food to determine food intake by individual rainbow trout,  Oncor­
hynchus mykiss:  effect of feeding level. Aquaculture 120, 
s. 123–133. 
16. Quinton, J. C. and Blake, R. W. (1990), The effect of feed 
cycling and ration level on the compensatory growth response in rainbow trout,  Oncorhynchus  mykiss. Journal of Fish Bio ­
logy, 37, s. 33–41. 
17. Post, G. (1987), Nutrition and Nutritional Diseases of Fish. 
Chapter IX in Testbook of Fish Health. T.F.H. Publications, Inc. Neptune City, New Jersey, USA. 288 pp. 
18. Bruce, R. D. and Versteeg D. J. (1992), A statistical procedure 
for modelling continuous toxicity data . Environ. Toxicol. 
Chem. 11, s. 1485–1494. 
19. DeGraeve, G. M., Cooncy, |. M., Pollock, T. L, Reichenbach, J. 
H., Dean, Marcus, M. D. and Mclntyre, D. O. (1989), Precision 
of EPA seven-day fathead minnow larval survival and growth 
test; intra and interlaboratory study. Report EA-6189 (American Petroleum Institute Publication, No 4468). Electric Power Re ­
search Institute, Palo Alto, CA. 
20. Norbert-King T. J. (1988), An interpolation estimate for chronic 
toxicity: the ICp approach. US Environmental Protection Agen ­
cy. Environmental Research Lab., Duluth, Minnesota. Tech. Rep. No 05–88 of National Effluent Toxicity Assesment Center. Sept. 1988. 12 pp. 
21. Williams D. A. (1972), The comparison of several dose levels 
with a zero dose control. Biometrics 28, s. 510–531.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1159
 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1160
 ▼B 
Tillägg 1  
LÄMPLIGA TESTBETINGELSER OCH FISKARTER SOM REKOMMENDERAS FÖR TESTNING  
Art Rekommenderat 
temperaturområde  
o C) l.jusperiod 
(timmar) Rekommenderat 
intervall för fiskar ­
nas begynnelsevikt 
(fe) Mätningsnoggrann ­
het Fisktäthet 
(g/l) Antalstäthet 
(antal per liter) Foder Testets varaktighet 
(dagar)  
Rekommenderad art  
Oncorhynchus mykiss  
Regnbågslax 12,5–16,0 12–16 1–5 Närmaste 
100 mg 1,2–2,0 4 Torrfoder som är särskilt ägnat 
för laxyngel ≥ 28 
Andra väldokumenterade arter  
Danio rerio  
Sebrafisk 21–25 12–16 0,050–0,100 Närmaste 1 mg 0,2–1,0 5–10 Levande föda (B rachionus Ar ­
temia)  > 28  
Oryzias latipes  
”Ricefish” (Medaka) 21–25 12–16 0,050–0,100 Närmaste 1 mg 0,2–1,0 5–20 Levande föda  (Brachionus Ar ­
temia)  > 28
Tillägg 2  
NÅGRA KEMISKA EGENSKAPER FÖR GODTAGBART SPÄDVATTEN  
Ämne Koncentrationer  
Partikelinnehåll < 20 mg/l 
Totalt organiskt kol < 2 mg/l Ojoniserad ammoniak < 1 μg/l 
Restklor < 10 μg/l 
Total mängd bekämpningsmedel typ organiska fosfor ­
föreningar < 50 ng/1 
Total mängd bekämpningsmedel typ organiska klorför ­
eningar samt polyklorerade bifeny-er < 50 ng/1 
Total mängd organiskt bundet klor < 25 ng/1
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1161
 
Tillägg 3  
i logaritmisk serie av koncentrationer lämpliga för toxicitetstest (9)  
Kolumn (antalet koncentrationer mellan 100 och 10 eller mellan 10 och 1)(*) 
1 2 3 4 5 6 7  
100 100 100 100 100 100 100 
32 46 56 63 68 72 75 
10 22 32 40 46 52 56 
3,2 10 18 25 32 37 42 1,0 4,6 10 16 22 27 32 
2,2 5,6 10 15 19 24 1,0 3,2 6,3 10 14 18 
1,8 4,0 6,8 10 13 1,0 2,5 4,6 7,2 10 
1,6 3,2 5,2 7,5 
1,0 2,2 3,7 5,6 
1,5 2,7 4,2 1,0 1,9 3,2 
1,4 2,4 1,0 1,8 
1,3 
1,0
 
(*) En serie av fem (eller flera) på varandra följande koncentrationer kan väljas ur en kolumn, Mittpunkterna mellan koncentrat ionerna 
i kolumn (x) finns i kolumn (2x + 1). De listade värdena kan representera koncentrationer uttryckta som procenthalt per volym 
eller vikt (mg/l eller μg/l). Värdena kan om nödvändigt multipliceras eller divideras med en eller flera tiopotenser. Kolumn 1 kan 
användas om det råder betydande osäkerhet om toxicitetsnivån.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1162
 
C.15  FISK, KORTTIDSTEST AVSEENDE TOXICITET PA  EMBRYO - 
OCH SÄCKYNGELSTADIERNA  
1. Metod 
Denna metod för korttidstest avseende toxicitet motsvarar OECD TG 
212 (1998).  
1.1 INLEDNING 
Vid detta korttidstest avseende toxicitet på fiskembryon och säckyngel 
exponeras levnadsstadierna från nyligen befruktade ägg till slutet av säckyngelstadiet. Inget foder ges vid detta test, och testet avslutas medan säckynglen fortfarande får sin näring från gulesäcken. 
Testet är avsett för bestämning av de letala och, i begränsad utsträck ­
ning, subletala verkningarna av kemikalier på de specifika stadier 
och specifika arter som testas. Testet kan ge användbar information 
i flera avseenden: dels bildar det en brygga mellan test avseende letala verkningar och test avseende subletala verkningar, dels kan 
det användas som ett screeningtest inför ett komplett test av de tidiga 
levnadsstadierna eller för test avseende kronisk toxicitet. Dessutom kan det användas för test av arter för vilka uppfödningsteknikerna inte är tillräckligt utvecklade för att täcka perioden för övergång från 
endogen till exogen utfodring. 
Man bör beakta att endast tester som täcker alla stadier av fiskens 
livscykel i regel kan ge en tillförlitlig uppskattning om en kemikalies 
kroniska toxicitet för fisk, och att minskad exponering av levnads ­
faser kan medföra lägre känslighet och underskattning av den kro ­
niska toxiciteten. Man kan därför anta att ett test på embryon och 
säckyngel är mindre känsligt än ett komplett test av de tidiga lev ­
nadsstadierna, särskilt när det gäller kemikalier som är starkt lipofila (log P
 ow > 4) och kemikalier med ett specifikt toxiskt verkningssätt. 
Man kan dock förvänta sig mindre skillnader i känslighet mellan de 
två testerna när det gäller kemikalier som har ett icke-specifikt, narkotiskt verkningssätt (1). 
Fram till offentliggörandet av detta test har de flesta erfarenheterna 
från test på embryon och säckyngel erhållits med sötvattenfisken  
Danio rerio  Hamilton-Buchanan (Teleostei, Cyprinidae – sebrafisk). 
Närmare anvisningar om testförfarandet för denna art finns i tillägg 
1. Det finns dock inga hinder för att använda andra arter för vilka det finns erfarenheter att tillgå (tabell 1).
 
1.2 DEFINITIONER  
Lägsta koncentration vid vilken verkningar observeras (Lowest 
observed effect concentration, LOEC):  den lägsta testade koncent ­
rationen av ett testämne vid vilken man kan observera signifikanta 
verkningar (vid p < 0,05) jämfört med kontrollgruppen. Alla test ­
koncentrationer ovanför LOEC måste framkalla skadliga verkningar som är lika stora eller större än de verkningar som kan observeras 
vid LOEC.  
Koncentration vid vilken inga verkningar observeras 
(No observed effect concentration, NOEC):  testkoncentrationen 
omedelbart under LOEC.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1163
 
1.3 PRINCIP FÖR TESTMETODEN 
Fiskens embryo- och säckyngelstadier exponeras för en serie kon ­
centrationer av testämnet upplöst i vatten. Testprotokollet innehåller en möjlighet att välja mellan halvstatiskt test och genomflödestest. 
Det valda alternativet beror på testämnets egenskaper. Testet inleds 
med att befruktade ägg placeras i testkärl. Testet avslutas strax innan någon av gulesäckarna i något av testkärlen har absorberats helt eller innan ynglen i kontrollgrupperna börjar dö på grund av svält. De 
letala och subletala verkningarna bedöms och jämförs med kontroll ­
gruppernas värden i syfte att bestämma den lägsta koncentrationen vid vilken verkningar observeras och den koncentration vid vilken 
inga verkningar observeras. Alternativt kan verkningarna analyseras 
med hjälp av en regressionsmodell i syfte att uppskatta den kon ­
centration som framkallar en given procentuell verkan (t.ex. LC/EC
 x , 
där x är en definierad procentuell verkan).  
1.4 INFORMATION OM TESTÄMNET 
Man bör ha tillgång till resultaten från ett test avseende akut toxicitet 
(se metod C.1), som helst ska ha utförts med samma art som används 
för detta test. Sådana resultat kan vara till hjälp vid valet av lämpliga testkoncentrationer för testet på tidiga levnadsstadier. Testämnets vattenlöslighet (inbegripet lösligheten i testvattnet) och ångtryck 
måste vara kända. Man bör ha tillgång till en tillförlitlig analysmetod 
för kvantifiering av ämnet i testlösningen. Metoden bör ha känd och rapporterad noggrannhet och detektionsgräns. 
För definition av testförhållandena bör man ange bl.a. testämnets 
strukturformel, ämnets renhet, stabilitet i ljus, stabilitet i testförhål ­
landena. pKa, P
 ow och resultaten från test avseende biologisk lätt ­
nedbrytbarhet (se metod C. 4).  
1.5 TESTETS GILTIGHET 
För att testet ska vara giltigt måste följande villkor uppfyllas: 
— Den totala överlevnaden hos de befruktade äggen i kontrollgrup ­
perna, och i tillämpliga fall i kärlen med rent lösningsmedel, måste vara högre eller lika med de gränsnivåer som definieras i tilläggen 2 och 3. 
— Koncentrationen löst syrgas måste under hela testet ligga mellan 
60 och 100 % av luftmättnadsvärdet (ASV). 
— Under testet får vattentemperaturen inte variera med mer än ± 
1,5
 o C mellan olika testkärl eller mellan påföljande dagar. Vat ­
tentemperaturen bör hållas inom de temperaturgränser som spe ­
cificerats för den art som används (se bilagorna 2 och 3).  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1164
 
1.6 BESKRIVNING AV TESTMETODEN  
1.6.1  Testkärl  
Kärl av glas eller annat kemiskt inert material kan användas. Kärlen 
måste vara tillräckligt stora med tanke på lämplig fisktäthet (se 
avsnitt 1.7.1.2). Det rekommenderas att kärlen placeras slumpvis i 
testutrymmet. En randomiserad blockutformning med en behandling per block är att föredra framför en fullständigt randomiserad utform ­
ning, i de fall där det i laboratoriet förekommer sådana systematiska 
effekter som kan kontrolleras med hjälp av blockuppdelning. Even ­
tuell blockuppdelning måste beaktas i de efterföljande dataanalyser ­
na. Testkärlen bör avskärmas från oönskade störningar.
 
1.6.2  Val av fiskart  
I tabell 1A anges rekommenderade fiskarter. Det hindrar inte att 
andra arter används (se exemplen i tabell 1B), men då måste test ­
förfarandet eventuellt justeras så att lämpliga testförhållanden kan säkerställas. I ett sådant fall måste testrapporten innehålla en moti ­
vering för valet av art och testmetod.
 
1.6.3  Förvaring av fiskyngel  
Närmare uppgifter om lämplig förvaring av fiskyngelstammen finns i 
OECD TG 210 (  1 ) och i hänvisningarna (2), (3), (4), (5), (6).  
1.6.4  Hantering av embryon och yngel  
Embryon och yngel kan exponeras i mindre kärl, placerade i huvud ­
kärlet, med sidor eller ändar av nät som möjliggör ett flöde av testlösning genom kärlet. För att få ett icke-turbulent flöde genom dessa små kärl kan de hållas hängande från en arm som sänker och 
höjer kärlen (de får dock inte höjas över ytan). Ett sifonspolat system 
kan också användas. Befruktade ägg av laxfiskar kan hållas på ställ ­
ningar eller galler med så stora öppningar att ynglen kan falla ige ­
nom efter kläckningen. Om halvstatiskt testförfarande med fullstän ­
dig daglig förnyelse används rekommenderas pasteur-pipetter för 
avlägsnandet av embryon och yngel (se avsnitt 1.6.6). 
Om äggbehållare, galler eller nät har använts för att hålla äggen 
inom huvudkärlet tas dessa tillbehör bort efter att ynglen har 
kläckts (
 1 ), med undantag av nät som behövs för att hålla fiskarna 
på plats. Om yngel måste flyttas får de inte utsättas för luft, och nät får inte användas för att släppa ut fisk från äggbehållare (dessa 
säkerhetsåtgärder ar eventuellt inte nödvändiga om arten inte är så 
känslig, t.ex. när man använder karp). Överföringstidpunkten varierar beroende på art och det är inte alltid nödvändigt med en överföring. 
Vid halvstatiskt test kan man använda bägare eller grunda behållare, 
vid behov försedda med ett nät som finns en bit ovanför bägarens botten. Om bägarnas volym är tillräcklig med tanke på fisktätheten (se 1.7.1.2) är det eventuellt inte nödvändigt att överföra embryon 
eller yngel.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1165  
( 1 ) OECD. Paris. 1992,. Test Guideline 210. ”Fish. Early-life Stage Toxicity Test”.
 1.6.5  Vatten  
Som testvatten kan användas allt vatten som uppfyller de kemiska 
kraven för godtagbart spädvatten enligt tillägg 4 och i vilket tes ­
tarternas kontrollgrupper har minst den överlevnadsgrad som anges 
i tilläggen 2 och 3. Testvattnet bör ha konstant kvalitet under hela 
testperioden. Vattnets pH-värde får variera med högst ± 0,5 pH- enheter. För att säkerställa att spädvattnet inte påverkar testresultaten på oönskat sätt (t.ex. genom komplexbildning med testämnet) eller 
har skadliga verkningar på yngelstammens prestanda, tas vattenpro ­
ver regelbundet för analys. Mätningar av tungmetaller (t.ex. Cu, Pb, Zn, Hg, Cd och Ni), viktiga anjoner och katjoner (t.ex. Ca, Mg, Na, 
K, Cl och SO4), bekämpningsmedel (t.ex. total mängd organiska 
fosforföreningar eller total mängd organiska klorföreningar), totalt organiskt kol och uppslammade partiklar bör göras t.ex. var tredje månad i fall där man vet att spädvattnet håller en relativt jämn 
kvalitet. Om vattenkvaliteten har visat sig vara jämn under minst 
ett år kan dessa kontroller göras med längre intervall (t.ex. var sjätte månad).
 
1.6.6  Testlösningar  
Testlösningar med de valda koncentrationerna bereds genom utspäd ­
ning av en stamlösning. 
Stamlösningen bör helst beredas genom enkel blandning eller om ­
skakning av testämnet i spädvattnet på mekanisk väg (t.ex. omrör ­
ning och ultraljud). Mättnadskolonner (löslighetskolonner) kan an ­
vändas för att få stamlösning av lämplig koncentration. Man bör så långt som möjligt undvika att använda lösnings- eller disperge ­
ringsmedel (lösningsagenter). Sådana medel kan dock i vissa fall 
behövas för att få en stamlösning av lämplig koncentration. Lämpliga lösningsmedel är t.ex. aceton, etanol, metanol, dimetylformamid och trietylenglykol. Lämpliga dispergeringsmedel är t.ex. Cremophor 
RH40, Tween 80, metylcellulosa (0,01 %) och HCO-40. Om man 
använder agenter som är biologiskt lättnedbrytbara (t.ex. aceton) eller agenter med hög flyktighet bör man iaktta särskild försiktighet efter ­
som sådana agenter kan orsaka problem med bakterieansamling vid 
genomflödestest. Om en lösningsagent används får den inte ha sig ­
nifikant verkan på överlevnaden eller framkalla synliga skadliga verkningar på tidiga levnadsstadier (verkningar som framkommit 
vid test med rent lösningsmedel). Användningen av sådana ämnen 
bör undvikas med alla medel. 
Vid halvstatiskt test kan man välja mellan två olika förnyelseför ­
faranden. Det ena innebär att nya testlösningar bereds i rena kärl och överlevande ägg och yngel överförs försiktigt till de nya kärlen i 
en liten volym gammal lösning, samtidigt som man undviker expo ­
nering för luft. Det andra förfarandet innebär att organismerna hålls kvar i kärlen medan en andel (minst tre fjärdedelar) av testvattnet byts ut. Hur ofta mediet måste förnyas beror på testämnets stabilitet, 
men daglig förnyelse rekommenderas. Om resultaten från preliminära 
stabilitetstest (se avsnitt 1.4) visar att testämnet inte är stabilt (dvs. utanför området 80–120 % av nominell koncentration eller under 80 % av uppmätt startkoncentration) under ett helt förnyelseintervall, 
måste genomflödestest övervägas. Under alla omständigheter bör 
man undvika att stressa ynglen när man förnyar vattnet.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1166
 
För genomflödestest behövs ett system som kontinuerligt portionerar 
och späder ut stamlösning av testämnet, så att man får en tillförsel av 
en serie koncentrationer till testkärlen. Stamlösningens och spädvatt ­
nets flödeshastighet bör kontrolleras regelbundet, helst dagligen, och får inte variera med mer än 10 % under hela testet. En flödeshas ­
tighet som motsvarar minst fem testkärlsvolymer per 24 timmar har 
konstaterats vara lämplig (2).
 
1.7 FÖRFARANDE 
I litteraturen finns information om kapaciteten hos toxicitetstest på 
fiskembryon och säckyngel. Ett antal exempel på litteratur finns i hänvisningarna (7), (8), (9).
 
1.7.1  Exponeringsförhållanden  
1.7.1.1  Varaktighet  
Testet bör helst inledas inom 30 minuter efter befruktning av äggen. 
Embryona läggs i testlösningen före eller så snart som möjligt efter att blastocysten påbörjar klyvning, och under alla omständigheter 
innan gastrulastadiet inleds. Om äggen kommer från en kommersiell 
leverantör kan det hända att det inte är möjligt att starta testet strax efter befruktningen. Testets känslighet kan allvarligt påverkas av en försenad teststart. Testet måste inledas inom åtta timmar efter be ­
fruktningen. Eftersom ynglen inte utfodras under exponeringsperio ­
den, bör testet avslutas strax innan någon av gulesäckarna i något av testkarlen har absorberats helt eller innan ynglen i kontrollgrupperna börjar dö på grund av svält. Testperiodens längd beror på den art 
som används. Vissa rekommendationer gällande testperiodens längd 
finns i tilläggen 2 och 3.
 
1.7.1.2  Fisktäthet  
Antalet befruktade ägg vid testperiodens början bör vara tillräckligt 
med tanke på statistiska krav. Äggen fördelas slumpmässigt mellan 
behandlingsgrupperna. För varje koncentration används minst 30 be ­
fruktade ägg, jämnt fördelade (eller så jämnt det är möjligt – med vissa arter är det svårt att få likadana satser) mellan minst tre lika ­
dana testkärl. Fisktätheten (biomassa per volym testlösning) får inte 
vara högre än att man kan hålla koncentrationen löst syrgas på minst 
60 % ASV utan luftning. För genomflödestest rekommenderas en fisktäthet som inte överskrider 0,5 g/l per 24 timmar och som under inga omständigheter överskrider 5 g/l lösning (2).
 
1.7.1.3  Ljus och temperatur  
Ljusperioden och vattentemperaturen bör anpassas till den art som 
testas (tilläggen 2 och 3). Temperaturövervakningen kan gärna ord ­
nas med hjälp av ett extra testkärl.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1167
 
1.7.2  Testkoncentrationer  
I regel krävs fem koncentrationer av testämnet. Koncentrationerna 
bör ligga i en serie med en konstant faktor som inte överskrider 3,2. När man väljer testkoncentrationsområde är det viktigt att beakta 
kurvan som visar sambandet mellan LC
 50 och exponeringsperioden 
vid test avseende akut toxicitet. I vissa fall kan det vara motiverat med mindre än fem koncentrationer, t.ex. vid gränstest, och ett snä ­
vare koncentrationsintervall. Om mindre än fem koncentrationer an ­
vänds måste detta motiveras. Ämneskoncentrationer som är högre än 
LC
 50 under 96 timmar eller 100 mg/l, beroende på vilken som är 
lägre, behöver inte testas. Ämnen får inte testas ovanför sin löslig ­
hetsgräns i testvattnet. 
Om en lösningsagent används för att underlätta beredningen av test ­
lösningar (se avsnitt 1.6.6) får agentens slutkoncentration i testkärlet inte överskrida 0,1 ml/l och samma slutkoncentration bör användas i alla testkärl.
 
1.7.3  Kontrollsatser  
En kontrollsats med spädvatten (med tillämpliga replikat) och, om 
det är relevant, en kontrollsats med lösningsagenten (med tillämpliga replikat) bör köras utöver testserierna.
 
1.7.4  Frekvensen för analytiska bestämningar och mätningar  
Under testets gång bör testämnets koncentrationer bestämmas med 
regelbundna intervall. 
Vid halvstatiskt test, där testämnets koncentration bör hållas inom ± 
20 % av den nominella koncentrationen (dvs. inom området 80–120 %, se avsnitten 1.4 och 1.6.6), rekommenderas att de högsta och lägsta testkoncentrationerna åtminstone analyseras strax efter 
beredningen och strax före förnyandet vid minst tre tillfällen som 
är jämnt fördelade över testperioden (analyserna görs på ett prov av samma lösning – när den är nyberedd och när den förnyas). 
Om det är förväntat att testämnets koncentration inte kommer att 
hållas inom ± 20 % av den nominella koncentrationen (på grundval 
av stabilitetsdata om ämnet) måste alla testkoncentrationer analyse ­
ras, när de är nyberedda och när de förnyas, men enligt samma schema (dvs. vid minst tre tillfällen som är jämt fördelade över hela testperioden). Bestämning av testämnets koncentration före för ­
nyandet behöver bara göras på ett replikatkärl per testämneskoncent ­
ration. Intervallet mellan bestämningarna får inte vara längre än sju dagar. Det rekommenderas att resultaten grundar sig på de uppmätta 
koncentrationerna. Om det däremot finns bevis för att testämnets 
koncentration i lösningen på ett tillfredsställande sätt har hållits inom ± 20 % av den nominella eller uppmätta startkoncentrationen under hela testperioden, kan resultaten grunda sig på nominella eller 
uppmätta startvärden. 
Vid genomflödestest kan man lämpligen använda samma provtag ­
ningsschema som för halvstatiskt test (även om mätningen av ”gam ­
mal” lösning då inte är tillämplig). Om testperioden sträcker sig över mer än sju dagar kan det vara tillrådligt att utöka antalet provtag ­
ningstillfällen under den första veckan (t.ex. tre mätningsomgångar) 
för att kontrollera att testkoncentrationerna hålls stabila.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1168
 
Proverna kan behöva centrifugeras eller filtreras (t.ex. med porstorlek 
0,45 μm). Eftersom det inte alltid är möjligt att separera den icke- 
biotillgängliga fraktionen av testämnet från den biotillgängliga frak ­
tionen genom centrifugering eller filtrering bör emellertid dessa be ­
handlingar undvikas. 
Under testets förlopp mäts upplöst syrgas, pH och temperatur i alla 
testkärl. Totalhårdhet och salthalt (om relevant) mäts i kontrollsat ­
serna och i ett kärl med den högsta koncentrationen. Upplöst syrgas och salthalt (om relevant) mäts minst tre gånger (vid testets början, mitt och slut). Vid halvstatiskt test rekommenderas att upplöst syrgas 
mäts oftare, helst före och efter varje vattenförnyelse eller minst en 
gång i veckan. Vid halvstatiskt test mäts pH i början och i slutet av varje vattenförnyelse och vid genomflödestest minst varje vecka. Hårdheten mäts en gång per test. Temperaturen bör mätas dagligen 
och helst övervakas kontinuerligt i minst ett testkärl.
 
1.7.5  Observationer  
1.7.5.1  Stadiet för embryonal utveckling  
Det embryonala stadium (dvs. gastrulastadium) som råder när expo ­
neringen för testämnet inleds bör bekräftas så exakt som möjligt. Detta kan göras på ett representativt prov av ägg som har förvarats 
på lämpligt sätt. Även litteratur kan konsulteras i fråga om beskrivning 
och illustration av de embryonala stadierna (2), (5), (10) och (11).
 
1.7.5.2  Kläckning och överlevnad  
Observationer av kläckning och överlevnad bör göras minst en gång 
per dag. Alla antal bör registreras. Det kan vara önskvärt med tätare observationer i början av testperioden (t.ex. med 30 minuters inter ­
vall under de tre första timmarna) eftersom överlevnadstiderna i vissa 
fall kan ha större relevans än blotta antalet dödsfall (t.ex. när det förekommer akuta toxiska verkningar). Döda embryon och yngel bör avlägsnas så snart de observeras, eftersom förruttnelse kan ske 
snabbt. Yttersta försiktighet bör iakttas när döda individer avlägsnas 
så att man inte slår till eller orsakar fysiska skador på närliggande ägg eller yngel eftersom de är extremt sköra och känsliga. Kriterierna för död varierar beroende på levnadsstadium: 
— Ägg : särskilt i tidiga stadier en tydligt förlust av genomskinlighet 
och färgförändringar orsakade av koagulering eller utfällning av 
protein, vilket leder till ett vitt ogenomskinligt utseende. 
— Embryon : avsaknad av kroppsrörelse, avsaknad av hjärtslag eller 
ogenomskinlig missfärgning hos arter vars embryon normalt är genomskinliga. 
— Yngel : orörlighet, avsaknad av andningsrörelse, avsaknad av 
hjärtslag, vit ogenomskinlig färgning av centrala nervsystemet 
eller avsaknad av reaktion på mekanisk stimulering.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1169
 
1.7.5.3  Onormalt utseende  
Gulesäckens absorptionsstadium och antalet yngel som har onormal 
kroppsform eller pigmentering bör registreras med intervall vars längd bestäms enligt testperiodens längd och karaktären hos de 
abnormaliteter det gäller. Man bör beakta att onormala embryon 
och yngel även förekommer av naturliga skäl, och kan för vissa arter uppgå till flera procent i kontrollgruppen (kontrollgrupperna). Onor ­
mala djur bör inte avlägsnas från testkärlet förrän de har dött.
 
1.7.5.4  Onormalt beteende  
Abnormaliteter, t.ex. hyperventilation, okoordinerat simmande och 
atypisk passivitet bör registreras med intervall vars längd bestäms enligt testperiodens längd. Sådana verkningar kan vara svåra att 
kvantifiera men kan, när de observeras, vara till hjälp vid tolkningen 
av dödlighetsdata, dvs. ge upplysningar om ämnets toxiska verk ­
ningssätt.
 
1.7.5.5  Längd  
Vid testets slut rekommenderas matning av individuella längder. Om 
det förekommer röta pä stjärtfenan eller frätning av fenorna bör standardlängder användas. 1 ett väl utfört test bör variationskoeffici ­
enten med avseende på längden hos replikaten i kontrollgrupperna i 
regel vara ≤ 20 %.
 
1.7.5.6  Vikt  
Vid testets slut kan individuella vikter bestämmas. Härad är torrvikt 
(24 timmar vid 60  o C) att föredra framför våtvikt (avtorkning). I ett 
väl utfört test bör variationskoefficienten med avseende på vikt för 
replikaten i kontrollgrupperna i regel vara ≤ 20 %. 
Från dessa observationer fås följande data, till alla delar eller delvis, 
för statistisk analys: 
— Kumulativ mortalitet. 
— Antalet friska yngel vid försökets slut. 
— Tidpunkten för kläckningens början och slut (dvs. kläckning till 
90 % i varje replikat). 
— Antalet yngel som kläcks per dag. 
— Längd (och vikt) för överlevande djur vid testets slut. 
— Antalet yngel som är missbildade eller har onormalt utseende. 
— Antalet yngel som beter sig onormalt.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1170
 
2. DATA OCH RAPPORTERING  
2.1 BEHANDLING AV RESULTATEN 
Det rekommenderas att en statistiker deltar i både utformning och 
analys av testet, eftersom metoden medger betydande variationer i 
fråga om testutformning, t.ex. antalet testkärl, antalet testkoncent ­
rationer, ursprungligt antal befruktade ägg och vilka parametrar som mäts. Med hänvisning till de många alternativen för testutform ­
ning ges inga specifika anvisningar om statistiska procedurer. 
Om man avser att uppskatta LOEC- eller NOEC-värden är det nöd ­
vändigt att analysera variationerna inom varje replikatgrupp med 
hjälp av variansanalys (ANOVA) eller kontingenstabellprocedurer. För multipla jämförelser mellan resultaten vid enskilda koncentratio ­
ner och resultaten för kontrollgrupperna kan Dunnetts metod rekom ­
menderas (12), (13). Det finns också exempel på andra användbara 
metoder (14), (15). Storleken på den verkan som kan detekteras med hjälp av ANOVA eller andra procedurer (dvs. testets kapacitet) be ­
räknas och rapporteras. Anmärkningsvis kan konstateras att analys 
med ANOVA inte lämpar sig för alla observationer som uppräknas i 
avsnitt 1.7.5.6. Kumulativ mortalitet och antalet friska yngel i slutet av testet kan t.ex. analyseras med probitmetoder. 
Om man avser att uppskatta värden på LC eller EC
 x bör en eller 
flera kurvor, t.ex. logistisk kurva, anpassas till relevanta data med hjälp av en statistisk metod, t.ex. minsta kvadrat-metoden eller icke- 
linjär minsta kvadratmetod. Kurvan (kurvorna) parametriseras så att 
relevanta värden på LC eller EC
 x och motsvarande standardfel kan 
uppskattas direkt. Därigenom underlättas beräkningen av konfidens ­
intervallet kring LC eller EC  x betydligt. Tvåsidig konfidens på 95 % 
bör tillämpas, utom när det finns goda skäl för att föredra avvikande 
konfidensnivåer. Anpassningsproceduren bör helst ge tillgång till ett medel för bedömning av signifikansen eller bristen på signifikans. 
Grafiska metoder för kurvanpassning kan användas. Regressionsana ­
lys är lämplig för alla observationer som uppräknas i avsnitt 1.7.5.6.
 
2.2 TOLKNING AV RESULTATEN 
Resultaten bör tolkas med försiktighet när de uppmätta koncentratio ­
nerna av det toxiska ämnet i testlösningen ligger på nivåer nära 
analysmetodens detektionsgräns. Likaså bör man vara försiktig vid tolkning av resultaten när det galler koncentrationer ovanför ämnets vattenlöslighetsgräns.
 
2.3 TESTRAPPORT 
Testrapporten ska innehålla nedan angivna uppgifter.  
2.3.1  Testämne:  
— Aggregationstillstånd och relevanta fysikalisk-kemiska egenskaper. 
— Kemiska identifieringsdata, inklusive renhet och i tillämpliga fall 
analysmetod för kvantificering av testämnet.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1171
 
2.3.2  Testdjur:  
— Vetenskapligt namn, stam, antalet föräldrafiskar (dvs. hur många 
honor som behövdes för produktion av det antal ägg som använ ­
des i testet), ursprung, metoden för insamling av befruktade ägg 
och efterföljande behandling av äggen.  
2.3.3  Testförhållanden:  
— Testförfarande som har använts (t.ex. halvstatiskt test eller ge ­
nomflödestest, tiden mellan befruktningen och testets början, fisktäthet osv.). 
— Ljusperiod(er). — Testets utformning (t.ex. antalet testkärl och replikat, antalet em ­
bryon per replikat). 
— Metoden för beredning av stamlösningar och förnyelsefrekvensen 
(i förekommande fall bör även lösningsagenten och dess kon ­
centration anges). 
— Nominella testkoncentrationer, uppmätta värden, deras medelvär ­
den och standardavvikelser i testkärlen och den metod med vil ­
ken dessa erhölls. Om testämnet är vattenlösligt vid koncentratio ­
ner under de testade, måste man bevisa att mätningarna hänför 
sig till testämnets koncentrationer i lösningen. 
— Spädvattnets egenskaper: pH, hårdhet, koncentrationen upplöst 
syrgas, restklornivåer (om de har uppmätts), totalt organiskt kol, partikelinnehåll, testmediets salthalt (om den har uppmätts) och resultatet av alla övriga mätningar. 
— Vattenkvaliteten i testkärlen: pH, hårdhet, temperatur och halten 
upplöst syrgas.
 
2.3.4  Resultat:  
— Resultaten frän eventuella preliminära test gällande testämnets 
stabilitet. 
— Bevis för att kontrollgrupperna uppfyller normerna för total över ­
levnad för testdjur (tilläggen 2 och 3). 
— Data om mortalitet och överlevnad på embryo- och yngelstadiet 
och total mortalitet och överlevnad. 
— Antalet dagar fram till kläckning och antalet kläckta ägg. — Data om längd (och vikt). — Förekomst och beskrivning av morfologiska abnormaliteter 
(i förekommande fall). 
— Förekomst och beskrivning av verkningar pä beteendet (i förekom ­
mande fall). 
— Statistisk analys och behandling av data. — För test som analyseras med hjälp av ANOVA bör man rappor ­
tera den lägsta koncentration vid vilken verkningar observeras 
(LOEC) vid p = 0,05 och den koncentration vid vilken inga verkningar observeras (NOEC) för varje respons som har varit föremål för bedömning, tillsammans med en beskrivning av de 
statistiska procedurer som har använts och angivelse av hur stark 
verkan som kunde detekteras.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1172
 
— För test som har analyserats med hjälp av regressionstekniker bör 
man ange LC eller EC  x , konfidensintervall och en kurva med den 
anpassade modell som har använts för beräkningen. 
— Motiveringar för varje avvikelse från denna testmetod.  
3. HÄNVISNINGAR  
(1) Kristensen P. (1990), Evaluation of the Sensitivity of Short 
Term Fish Early Life Stage Tests in Relation to other EELS 
Test Methods. Final report to the Commission of the European Communities, 60 sidor, juni 1990. 
(2) ASTM (1988), Standard Guide for Conducting Early Life- 
Stage Toxicity Tests with Fishes. American Society for Testing and Materials. E 1241-88. 26 sidor. 
(3) Brauhn J. L. and Schoettger R. A. (1975), Acquisition and 
Culture of Research Fish: Rainbow trout, Fathead minnows, 
Channel Catfish and Bluegills. s. 54, Ecological Research Se ­
ries, EPA-660/3-75-011, Duluth, Minnesota. 
(4) Brungs W. A. and Jones B. R. (1977), Temperature Criteria for 
Freshwater Fish: Protocol and Procedures, p. 128, Ecological Research Series EPA-600/3-77-061, Duluth, Minnesota. 
(5) Laale H. W. (1977), The Biology and Use of the Zebrafish  
(Brachydanio rerio)  in Fisheries Research. A Literature Re ­
view. J. Biol. 10, s. 121–173. 
(6) Legault R. (1958), A Technique for Controlling the Time of 
Daily Spawning and Collecting Eggs of the Zebrafish,  Brachy­
danio rerio  (Hamilton-Buchanan) Copeia, 4, s. 328–330. 
(7) Dave G., Damgaard B., Grande M., Martelin J. E., Rosander 
B. and Viktor T. (1987), Ring Test of an Embryo-larval Tox ­
icity Test with Zebrafish  (Brachydanio rerio)  Using Chromium 
and Zinc as Toxicants. Environmental Toxicology and Chem ­
istry, 6, s. 61–71. 
(8) Birge J. W., Black J. A. and Westerman A. G. (1985), Short- 
term Fish and Amphibian Embryo-larval Tests for Determining the Effects of Toxicant Stress on Early Life Stages and Estimating Chronic Values for Single Compounds and Comp ­
lex Effluents. Environmental Toxicology and Chemistry 4, 
s. 807–821. 
(9) Van Leeuwen C. J., Espeldoorn A. and Mol F. (1986), Aquatic 
Toxicological Aspects of Dithiocarbamates and Related Com ­
pounds. III. Embryolarval Studies with Rainbow Trout  (Salmo 
gairdneri).  J. Aquatic Toxicology, 9, s. 129–145. 
(10) Kirchen R. V. and W. R. West (1969), Teleostean Devel ­
opment. Carolina Tips 32(4): 1–4. Carolina Biological Supply 
Company. 
(11) Kirchen R. V. and W. R. West (1976), The Japanese Medaka. 
Its care and Development. Carolina Biological Supply Compa ­
ny, North Carolina, 36 sidor. 
(12) Dunnett C. W. (1955), A Multiple Comparisons Procedure for 
Comparing Several Treatments with Control. J. Amer. Statist. Assoc, 50, s. 1096–1121. 
(13) Dunnett C. W. (1964), New Tables for Multiple Comparisons 
with a Control. Biometrics, 20, s. 482–491. 
(14) Mc Clave J. T., Sullivan J. H. and Pearson J.G. (1980), Sta ­
tistical Analysis of Fish Chronic Toxicity Test Data. Proceed ­
ings of 4th Aquatic Toxicology Symposium, ASTM, Phi ­
ladelphia.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1173
 
(15) Van Leeuwen C. J., Adema D. M. M. and Hermes J. (1990), 
Quantitative Structure-Activity Relationships for Fish Early 
Life Stage Toxicity. Aquatic Toxicology, 16, s. 321–334. 
(16) Environment Canada. (1992), Toxicity Tests Using Early Life 
Stages of Salmonid Fish (Rainbow Trout, Coho Salmon or Atlantic Salmon). Biological Test Method Series. Report EPS 
I/RM/28, December 1992, 81 sidor. 
(17) Dave G. and Xiu R. (1991), Toxicity of Mercury, Nickel, Lead 
and Cobalt to Embryos and Larvae of Zebrafish.  Brachydanio 
rerio.  Arch. of Environmental Contamination and Toxicology, 
21, s. 126–134. 
(18) Meyer A.. Bierman C. H. and Orti G. (1993), The phylogenetic 
position of the Zebrafish  (Danio rerio),  a model system 
in developmental biology – an invitation to the comperative met ­
hods. Proc. Royal Society of London, Series B, 252, s. 231–236. 
(19) Ghillebaert F., Chaillou C, Deschamps F. and Roubaud P. 
(1995), Toxic Effects, at Three pH Levels, of Two Reference 
Molecules on Common Carp Embryo. Ecotoxicology and En ­
vironmental Safety 32, s. 19–28. 
20. US EPA (1991), Guidelines for Culturing the Japanese Meda ­
ka, Oryzias  latipes. EPA report EPA/600/3-91/064, Dec. 1991, 
EPA, Duluth. 
21. US EPA (1991), Guidelines for Conducting Early Life Stage 
Toxicity Tests with Japanese Medaka, ( Oryzias  latipes). EPA 
report EPA/600/3-91/063, Dec. 1991, EPA, Duluth. 
22. De Graeve G. M., Cooney J. D., McIntyre D. O., Poccocic T. 
L, Reichenbach N. G., Dean J. H. and Marcus M. D. (1991), Validity in the performance of the seven-day Fathead minnow 
(Pimephales promelas ) larval survival and growth test: an in ­
tra- and interlaboratory study. Environ. Tox. Chem. 10, s. 1189–1203. 
23. Calow P. (1993), Handbook of Ecotoxicology, Blackwells, 
Oxford. Vol. 1, Chapter 10: Methods for spawning, culturing 
and conducting toxicity tests with Early Life stages of Estua ­
rine and Marine fish. 
24. Balon E. K. (1985), Early life history of fishes: New devel ­
opmental, ecological and evolutionary perspectives, Junk Publ., Dordrecht, 280 sidor. 
25. Blaxter J. H. S. (1988), Pattern and variety in development, in: 
W. S. Hoar and D. J. Randall eds., Fish Physiology, Vol. XIA, 
Academic press, s. 1–58.
 
Tabell 1A  
Fiskarter som rekommenderas för testning  
Sötvatten  
Oncorhynchus mykis  
Regnbågslax (9), (16)  
Danio rerio  
Sebrafisk (7), (17), (18)  
Cyprinus caprio  
Karp (8), (19)  
Oryzias latipes  
Japanese ricefish/Medaka (20), (21)  
Pimephales promelas  
Fathead minnow (8), (22)  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1174
 
Tabell 1B  
Exempel på övriga väldokumenterade arter som också har använts  
Sötvatten Saltvatten  
Carassius auratus  
Guldfisk (8)  Menidia peninsulae  
Tidewater silverside (23), (24), (25) 
Lepomis  macrochirus  
Solaborre (”Bluegill”) (8)  Clupea harengus  
Sill (24), (25)  
Gadus rnorhua  
Torsk (24), (25)  
Cyprinodon variegatus  
Sheepshead minnow (23), (24), (25)  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1175
 
Bilaga 1  
ANVISNINGAR FÖR TOXICITETSTEST PÅ EMBRYON OCH 
SÄCKYNGEL AV SEBRAFISK  (BRACHYDAMO RERIO)  
INLEDNING 
Sebrafisken härstammar från indiska Coromandel-kusten där den lever i snabb ­
strömmande vatten. Den är en vanlig akvariefisk som tillhör karpfamiljen. Infor ­
mation om vård och odling finns i allmänt tillgängliga referensböcker om tro ­
piska fiskar. En översikt över sebrafiskens biologi och användning för fiskforsk ­
ning har sammanställts av Laale (1). 
Fisken blir sällan längre än 45 mm. Den har en cylinderformad kropp med 
7–9 mörkblå silverskiftande strimmor. Strimmorna löper in i stjärt- och analfe ­
norna. Ryggen är olivgrön. Hanarna är slankare än honorna. Honorna är mer 
silverskiftande och har en svällande buk, särskilt före romläggningen. 
Vuxna exemplar klarar av stora variationer i temperatur, pH och vattenhårdhet. 
För att få friska exemplar som producerar ägg av god kvalitet bör man dock se till att betingelserna är optimala. 
Vid romläggningen följer hanen efter honan och trycker sig mot henne, och 
äggen befruktas efterhand som de kommer ut. Äggen, som är genomskinliga 
och icke-vidhäftande, faller till botten där de i vissa fall kan bli uppätna av föräldrarna. Romläggningen påverkas av ljus. Om morgonljuset är tillräckligt lägger fisken i regel sin rom under de första timmarna efter soluppgången. 
En hona kan producera satser om hundratals ägg med en veckas intervall.
 
BETINGELSER FÖR FÖRÄLDRAGENERATIONEN, REPRODUKTION OCH 
TIDIGA LEVNADSSTADIER 
Ett antal friska exemplar väljs ut och hålls i lämpligt vatten (se t.ex. tillägg 4) 
under minst två veckor före planerad romläggning. Fiskgruppen bör ha produce ­
rat minst en sats avkomma innan den producerar de ägg som används för testet. 
Fisktätheten under denna period får inte överskrida 1 gram fisk per liter. Om vattnet byts regelbundet eller om det finns ett reningssystem kan högre täthet tillåtas. Temperaturen i förvaringskärlen bör hållas på 25 ± 2
 o C. Fisken bör få 
varierande foder, såväl vanligt torrfoder som levande foder, t.ex. nyckläckta 
artemia, mygglarver, daphnia och vita maskar (enkyträer). 
Nedan beskrivs två förfaranden som i praktiken har gett tillräcklig mängd friska 
och befruktade ägg för testningsändamål: 
i) 8 hanar och 16 honor placeras i en behållare som innehåller 50 liter späd ­
vatten. Behållaren bör vara avskärmad från direkt ljus och lämnas så ostörd som möjligt i minst 48 timmar. På eftermiddagen till den dag som föregår 
testets böljan placeras en romläggningsbricka på akvariets botten. Romlägg ­
ningsbrickan består av en ram (plexiglas eller annat lämpligt material) som är 5–7 cm hög med ett grovt nät (2–5 mm) fäst upptill och ett fint nät (10–30 μm) nedtill. Ett antal ”romläggningsträd” av otvinnat nylonrep fästes 
vid det grova nätet. Efter att fiskarna har hållits i mörker i 12 timmar utsätts 
de för ett svagt ljus som stimulerar till romläggning. Två till fyra timmar efter romläggningen tas romläggningsbrickan bort och äggen samlas in. Romlägg ­
ningsbrickan hindrar fiskarna från att äta upp äggen och underlättar samtidigt 
insamling av äggen. Fiskgruppen bör ha lagt rom minst en gång innan den 
lägger den rom som används för testet.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1176
 
ii) 5–10 hanar och honor förvaras separat i minst två veckor före den planerade 
romläggningen. Efter 5–10 dagar har honorna uppsvälld buk och deras geni ­
talpapiller är synliga. Hanfiskarna har inga papiller. Romläggningen utförs i romläggningsbehållare med natförsedd botten (se ovan). Behållaren fylls med spädvatten så att vattendjupet ovanför nätet är 5–10 cm. En hona och två 
hanar placeras i behållaren två dagar före den planerade romläggningen. 
Vattentemperaturen ökas stegvis till ett värde som är en grad högre än ackli ­
matiseringstemperaturen. Ljuset släcks och behållarna lämnas så ostörda som möjligt. På morgonen tänds ett svagt ljus för att stimulera romläggningen. 
Efter 2–4 timmar tas fiskarna bort och äggen samlas in. Om det behövs större 
äggmängder än en hona kan producera kan man använda tillräckligt antal parallella romläggningsbehållare. De enskilda honornas reproduktionskapaci ­
tet registreras före testet (satsens storlek och kvalitet) för att ge möjlighet att 
välja ut honorna med de bästa reproduktionsegenskaperna för romläggningen. 
Äggen överförs till testkärlen med hjälp av glasrör (innerdiameter minst 4 mm) 
som är försedda med en mjuk sugboll. Vid överföring av äggen bör den med ­
följande vattenmängden vara så liten som möjligt. Äggen är tyngre än vatten och sjunker ut ur röret. Det är viktigt att se till att ägg (och yngel) inte kommer i 
kontakt med luft. Ett eller flera prover av satsen eller satserna undersöks i 
mikroskop för att kontrollera att det inte förekommer irregulariteter i de första utvecklingsstadierna. Det är inte tillåtet att desinfektera äggen. 
Mortaliteten för äggen är högst under de första 24 timmarna efter befruktningen. 
Under denna period är det vanligt med en mortalitet på 5–40 %. Äggen 
kan degenerera till följd av misslyckad befruktning eller utvecklingsstörningar. Äggens kvalitet verkar bero på fiskhonan, eftersom vissa honor genomgående producerar ägg av god kvalitet medan andra aldrig gör det. Även utvecklings ­
hastigheten och kläckningshastigheten varierar mellan olika satser. Framgångsrikt 
befruktade ägg och säckyngel överlever till stor del, i regel över 90 %. Vid 25
 o C 
kläcks äggen 3–5 dagar efter befruktningen och gulesäcken har absorberats cirka 13 dagar efter befruktningen. 
Den embryonala utvecklingen har definierats väl av Hisaoka och Battle (2). 
Äggen och nykläckta yngel är genomskinliga och därför kan man följa med fiskens utveckling och observera eventuella missbildningar. Cirka fyra timmar efter romläggningen kan man se skillnaden mellan obefruktade ägg och befruk ­
tade ägg (3). För denna undersökning placeras ägg och yngel i små testkärl och 
granskas under mikroskop. 
De testbetingelser som bör användas för de tidiga levnadsstaderna uppräknas i 
tillägg 2. Optimala värden för pH och spädvattnets hårdhet är 7.8 respektive 250 mg CaCO
 3 /l. 
BERÄKNINGAR OCH STATISTIK 
En tvåstegsmetod rekommenderas. Först görs en statistisk analys av data gällande 
mortalitet, onormal utveckling och kläckningstid. Därefter görs en statistisk ut ­
värdering av kroppslängden hos de exemplar som behandlats i koncentrationer 
vid vilka inga skadliga verkningar på någon av de nämnda parametrarna har 
detekterats. Denna metod rekommenderas eftersom ett toxiskt ämne selektivt kan döda mindre fisk, förlänga kläckningstiden och framkalla grova missbild ­
ningar, vilket leder till missvisande längdmätningsresultat. Dessutom mäts unge ­
fär samma antal fiskar per behandling, vilket säkerställer de statistiska resultatens 
giltighet.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1177
 
BESTÄMNING AV LC  50 OCH EC  50 
Procentandelen överlevande ägg och yngel beräknas och korrigeras för mortali ­
teten i kontrollgrupperna, enligt Abbotts formel (4):  
P ¼ 100 Ä C Ä P 0 
C Ü 100 Í Î  
där: 
P = korrigerad procentandel överlevande, P' = procentandel överlevande som observerats i testkoncentrationen, C = procentandelen överlevande i kontrollgruppen. 
I mån av möjlighet bestäms LC
 50 vid testets slut med en lämplig metod. 
Anvisningar för hur man kan få in morfologiska abnormaliteter i EC  50 -statistiken 
har publicerats av Stephan (5).  
UPPSKATTNING AV LOEC OCH NOEC 
Ett av syftena med testet på ägg och säckyngel är att jämföra koncentrationer 
över noll med kontrollgruppens koncentrationer, dvs. att bestämma värdet på 
LOEC. Därför bör förfaranden med multipeljämförelse användas (6), (7), (8), (9). (10).
 
HÄNVISNINGAR 
1. Laale FE W. (1977), The Biology and Use of the Zebrafish  (Brachydanio 
rerio)  in Fisheries Research. A Literature Review. J. Fish Biol. 10, 
s. 121–173. 
2. Hisaoka K. K. and Battle H. I. (1958), The Normal Development Stages of 
the Zebrafish  Brachydanio rerio  (Hamilton-Buchanan) J. Morph., 102, 311 
sidor. 
3. Nagel R. (1986), Untersuchungen zur Elproduktion beim Zebrabärbling  
(Brachydanio rerio  Hamilton-Buchanan). Journal of Applied Ichthyology, 
2, s. 173–181. 
4. Finney D. J. (1971), Probit Analysis, 3rd cd., Cambridge University Press, 
Great Britain, s. 1–333. 
5. Stephan C. E. (1982), Increasing the Usefulness of Acute Toxicity Tests. 
Aquatic Toxicology and Hazard Assessment: Fifth Conference, ASTM STP 766, J. G. Pearson, R. B, Foster and W. E. Bishop, Eds., American Society 
for Testing and Materials, s. 69–81. 
6. Dunnett C. W. (1955), A Multiple Comparisons Procedure for Comparing 
Several Treatments with a Control.). Amer. Statist. Assoc, 50, s. 1096–1121. 
7. Dunnett C. W. (1964), New Tables for Multiple Comparisons with a Con ­
trol. Biometrics, 20, s. 482–491. 
8. Williams D. A. (1971), A Test for Differences Between Treatment Means 
when Several Dose Levels are Compared with a Zero Dose Control. Bio ­
metrics, 27, s. 103–117. 
9. Williams D. A. (1972), The Comparison of Several Dose Levels with a 
Zero Dose Control. Biometrics 28, s. 519–531. 
10. Sokal R. R. and Rohlf F. J. (1981), Biometry, the Principles and Practice of 
Statistics in Biological Research, W. H. Freeman and Co., San Francisco.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1178
 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1179
 ▼B 
Bilaga 2  
TESTBETINGELSER, TESTPERIOD OCH ÖVERLEVNADSKRITERIER FÖR REKOMMENDERADE ARTER  
Arter Temperatur 
( o C) Salthalt 
(0/00) Ljusperiod 
(timmar) Stadierna s längd 
(dagar) 
Typisk testperiod Överlevnad i kontrollgrupper, 
(minimum %) 
Embryo Säckyngel Kläcknings- 
framgång Efter kläckning  
SÖTVATTEN  
Brachydanio rerio  
Sebrafisk 25 ± 1 — 12–16 3–5 8–10 Så snart som möjligt efter befruktning (ti ­
digt gastrula-stadium) till fem dagar efter kläckning (8–10 dagar) 80 90  
Oncorhvnchus mykiss  
Regnbågslax 10 ± 1 (
 1 ) 
12 ± 1 (  2 ) — 0 (  a ) 30–35 25–30 Så snart som möjligt efter befruktning (ti ­
digt gastrula-stadium) till 20 dagar efter 
kläckning (50–55 dagar) 66 70  
Cyprinus  
carpio Karp 21–25 — 12–16 5 > 4 Så snart som möjligt efter befruktning (ti ­
digt gastrula-stadium) till 4 dagar efter kläckning (8–9 dagar) 80 75 
Oryzias  latipes Japanese  
ricefish/Medaka 24 ± 1 (
 1 ) 
23 ± 1 (  2 ) — 12–16 8–11 4–8 Så snart som möjligt efter befruktning (ti ­
digt gastrula-stadium) till 5 dagar efter 
kläckning (13–16 dagar) 80 80 
Pimephales  promelas  
Fathead minnow 25 ± 2 — 16 4–5 5 Så snart som möjligt efter befruktning (ti ­
digt gastrula-stadium) till 4 dagar efter 
kläckning (8–9 dagar) 60 70  
( 1 ) För embryon. 
( 2 ) För yngel. 
( a ) Mörker for embryon och yngel tills att det gått en vecka efter kläckning, utom när de inspekteras. Därefter dämpad belysning till testets slut.
 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1180
 ▼B 
Bilaga 3  
Testsbetingelser, testperiod och överlevnadskriterier för andra väldokumenterade arter  
Arter Temperatur (  o C) Salthalt (0/00) Ljusperiod 
(timmar) Stadiernas längd (dagar) 
Typisk period för test på embryo och säckyngel Överlevnad i kontrollgrupper 
(minimum %) 
Embryo Test på 
säckyngel Kläcknings- 
framgång Efter kläckning  
SÖTVATTEN  
Carassius auratus  
Guldfisk 24 ± 1 — — 3–4 > 4 Så snart som möjligt efter befruktning (ti ­
digt gastrula-stadium) till 4 dagar efter 
kläckning (7 dagar) — 80  
Leopomis macrochirus  
Blugill sunfish 21 ± 1 — 16 3 > 4 Så snart som möjligt efter befruktning (ti ­
digt gastrula-stadium) till 4 dagar efter kläckning (7 dagar) — 75 
SALTVATTEN  
Menidia peninsulae  
Tidewater silverside 22–25 15–22 12 1,5 10 Så snart som möjligt efter befruktning (ti ­
digt gastrula-stadium) till 5 dagar efter 
kläckning (6–7 dagar) 80 60  
Clupea harengus  
Sill 10 ± 1 8–15 12 20–25 3–5 Så snart som möjligt efter befruktning (ti ­
digt gastrula-stadium) till 3 dagar efter 
kläckning (23–27 dagar) 60 80  
Gadus morhua  
Torsk 5 ± 1 5–30 12 14–16 3–5 Så snart som möjligt efter befruktning (ti ­
digt gastrula-stadium) till 3 dagar efter kläckning (18 dagar) 60 80  
Cyprinodon variegatus  
Sheepshead minnow 25 ± 1 15–30 12 — — Så snart som möjligt efter befruktning (ti ­
digt gastrula-staditim) till 4 eller 7 dagar 
efter kläckning (28 dagar) > 75 80
BILAGA 4  
NÅGRA KEMISKA EGENSKAPER FÖR GODTAGBART SPÄDVATTEN  
Ämne Koncentrationer  
Partikelinnehåll < 20 mg/l 
Totalt organiskt kol < 2 mg/l Ojoniserad ammoniak < 1 μg/l 
Restklor < 10 μg/l 
Total mängd bekämpningsmedel typ organiska fosfor ­
föreningar < 50 ng/l 
Total mängd bekämpningsmedel typ organiska klorför ­
eningar samt poly-klorerade bifenyler < 50 ng/l 
Total mängd organiskt bundet klor < 25 ng/l
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1181
 
C.16  HONUNGSBIN – TEST AVSEENDE AKUT TOXICITET 
(ORALT)  
1. METOD  
Denna testmetod för akut toxicitet motsvarar OECD TG 213 (1998).  
1.1 INLEDNING 
Detta test är en laboratoriemetod for bedömning av växtskyddspro ­
dukters och andra kemikaliers akuta toxicitet (oralt) på vuxna arbets ­
bin. 
Vid bedömning och utvärdering av olika ämnens toxiska egenskaper 
kan det vara nödvändigt att bestämma den akuta toxiciteten (oralt) på 
honungsbin, t.ex. när det är sannolikt att bin kommer att exponeras 
för en viss kemikalie. Testet för akut toxicitet (oralt) används för att bestämma bekämpningsmedels och kemikaliers toxicitet för bin. Re ­
sultatet av detta test används för att avgöra om det behövs ytterligare 
utvärderingar. Metoden kan särskilt användas i stegvisa program för 
bedömning av de risker som bekämpningsmedel kan medföra för bin. Dessa program bygger på en sekventiell arbetsgång från labo ­
ratorietoxicitetstest till semifält- och fältförsök (1). Bekämpnings ­
medel kan testas som verksamma ämnen eller som formulerade pro ­
dukter. 
En giftekvivalent bör användas för att fastställa binas känslighet och 
testförfarandets noggrannhet.
 
1.2 DEFINITIONER  
Akut toxicitet (oralt) : de skadliga verkningar som uppträder inom 
en period pä högst 96 timmar efter oral tillförsel av en engångsdos 
av testämnet.  
Dos: den mängd testämne som tillförs. Dosen uttrycks som vikten 
(μg) testämne per försöksdjur ( μg/bi). Den faktiska dosen per enskilt 
bi kan inte beräknas eftersom bina matas kollektivt, men det går att 
uppskatta en genomsnittsdos (total konsumtion av testämnet dividerat med antalet testbin i en bur).  
LD
 50 (median letal dose) oralt : en statistiskt fastställd engångsdos 
av ett ämne som kan förväntas leda till döden för 50 % av de djur 
som fått dosen på oral väg. LD  50 -värdet uttrycks som μg testämne 
per bi. När det gäller bekämpningsmedel kan testämnet vara ett verksamt ämne eller en formulerad produkt som innehåller ett eller 
flera verksamma ämnen.  
Mortalitet : ett djur registreras som dött när det är helt orörligt.
 
1.3 PRINCIP FÖR TESTMETODEN 
Vuxna arbetsbin honungsbi (Apis  mellifera)  exponeras för en serie 
doser av testämnet som dispergerats i sackaroslösning. Därefter ut ­
fodras bina med samma foder, men utan tillsats av testämne. Mor ­
taliteten registreras dagligen under minst 48 timmar och jämförs med 
kontrollgruppens värden. Om mortaliteten ökar under perioden 
24–48 timmar efter tillförseln, medan kontrollgruppens mortalitet hålls på en godtagbar nivå, dvs. < 10 %, bör testet förlängas till högst 96 timmar. Resultaten analyseras för beräkning av LD
 50 vid 24 
och 48 timmar och, om testet har förlängts, även vid 72 och 96 
timmar.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1182
 
1.4 TESTETS GILTIGHET 
För att testet ska vara giltigt måste följande villkor uppfyllas: 
— Genomsnittsmortaliteten för det totala antalet kontrolldjur får inte 
överskrida 10 % vid testets slut. 
— De värden som erhålls for LD  50 för giftekvivalenterna ska ligga 
inom det specificerade området.  
1.5 BESKRIVNING AV TESTMETODEN  
1.5.1  Insamling av bin  
För testet används unga vuxna arbetsbin av samma ras, ålder, nä ­
ringstillstånd osv. Bina tas från adekvat utfodrade, friska, så långt som möjligt sjukdomsfria samhällen med renrasiga drottningar med 
känd historia och fysiologisk status. Bina bör samlas in på testdagens 
morgon eller kvällen före testet och hållas i testförhållandena fram till följande dag. Bin som insamlats från yngelfria ramar rekommen ­
deras. Insamling tidigt på våren eller sent på hösten bör undvikas 
eftersom bina då har genomgått fysiologiska förändringar. Om ett test måste genomföras tidigt pä våren eller sent på hösten kan bina kläckas i en inkubator och födas upp med ”bibröd” (pollen som 
insamlats frän vaxkakan) och sackaroslösning under en vecka. Bin 
som har behandlats med kemiska ämnen såsom antibiotika, varroa ­
bekämpningsmedel osv. får inte användas för toxicitetstest förrän det har gått fyra veckor från att den sista behandlingen avslutades.
 
1.5.2  Förvarings- och utfodringsförhållanden  
Burarna bör vara enkla att rengöra och välventilerade. De kan vara 
tillverkade i t.ex. rostfritt stål, nät eller plast. Även träburar för engångsbruk kan användas. Grupper om tio bin per bur rekommen ­
deras. Burarnas storlek bör anpassas efter antalet bin och vara till ­
räckligt rymliga. 
Bina hålls i mörker i ett testrum med en temperatur på 25  ± 2
 o C. 
Den relativa fuktigheten, i regel kring 50–70 %, registreras under 
hela testförloppet. Hanteringen, såsom behandling och observationer, 
kan däremot genomföras i (dags)ljus. Som foder ges sackaroslösning i vatten med en slutkoncentration på 500 g/l (50 % vikt per volym). Efter tillförsel av testdoserna ges bina fri tillgång till foder. Utfod ­
ringssystemet bör vara utformat på sådant sätt att foderkonsumtionen 
per bur kan registreras (se avsnitt 1.6.3.1). För utfodringen kan ett cirka 50 mm långt och 10 mm brett glasrör användas, vars öppna ända smalnar av till en diameter på cirka 2 mm.
 
1.5.3  Förberedelse av bina  
De insamlade bina fördelas slumpvis i testburarna som placeras ut 
slumpvis i testrummet.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1183
 
Bina kan hållas utan foder i upp till 2 timmar före testets början. Det 
rekommenderas att bina inte ges foder före behandlingen för att alla 
bin ska ha jämförbart tarminnehåll vid testets början. Döende bin avlägsnas och ersätts med friska bin före testets början.
 
1.5.4  Förberedelse av doserna  
Om testämnet är vattenlösligt kan det dispergeras direkt i en 50 % 
sackaroslösning. För tekniska produkter och ämnen med låg vatten ­
löslighet kan ett organiskt lösningsmedel, emulgeringsämnen eller 
dispergeringsämnen med låg toxicitet användas som vehikel (t.ex. 
aceton, dimetylformamid eller dimetylsulfoxid). Vehikelkoncentratio ­
nen beror på testämnets löslighet och bör vara densamma för alla testkoncentrationer. I regel är en vehikelkoncentration på 1 % lämp ­
lig och denna koncentration bör inte överskridas. 
Det behövs också lämpliga kontrollösningar, dvs. om lösningsmedel 
eller dispergeringsmedel används för att lösa upp testämnet måste två separata kontrollgrupper användas: en som får vattenlösning och en som får sackaroslösning med lösningsmedlet eller vehikeln i samma 
koncentration som används för doseringslösningarna.
 
1.6 FÖRFARANDE  
1.6.1  Test- och kontrollgrupper  
Antalet doser och replikat som testas bör väljas så att de uppfyller de 
statistiska kraven för bestämning av LD  50 med 95 % konfidensinter ­
vall. I regel används fem doser i en geometrisk serie med en faktor på högst 2,2. Doserna bör täcka området för LD
 50 . Utspädningsfak ­
torn och antalet doskoncentrationer fastställs med beaktande av tox ­
icitetskurvans lutning (dos i förhållande till mortalitet) och den sta ­
tistiska metod som används för analys av resultaten. Ett preliminärt test kan användas som stöd för valet av lämpliga doskoncentrationer. 
Varje testkoncentration bör ges till minst tre likadana testgrupper 
med tio bin per grupp. Utöver själva testserierna bör minst tre kon ­
trollgrupper med tio bin per grupp också behandlas. Kontrollgrupper bör också användas för eventuella lösningsmedel eller vehiklar som används (se avsnitt 1.5.4).
 
1.6.2  Giftekvivalent  
Testserien bör även omfatta en giftekvivalent. Minst tre doser bör 
väljas på sådant sätt att de täcker det förväntade LD  50 -värdet. Minst 
tre likadana burar med tio bin per bur bör användas för varje testdos. 
Som giftekvivalent rekommenderas dimetoat, vars LD  50 -värde (oralt, 
24 timmar) enligt rapporterade uppgifter ligger inom området 0,10–0,35 μg verksamt ämne per bi (2). Även andra giftekvivalenter 
kan godtas förutsatt att man har tillgäng till tillräckliga data om 
förväntad dosrespons (t.ex. paration).
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1184
 
1.6.3  Exponering  
1.6.3.1  Tillförsel av doser  
Varje testgrupp med bin ges 100–200 μl 50 % sackaroslösning i 
vatten som innehåller den valda koncentrationen av testämnet. För 
ämnen som har låg löslighet, låg toxicitet eller låg koncentration i 
formuleringen krävs en större volym, eftersom större proportioner måste användas i sackaroslösningen. Mängden behandlat foder som konsumeras per grupp följs upp. När utfodringsbehållaren är tom (i 
regel inom 3–4 timmar) tas den ut ur buren och ersätts med en 
behållare som innehåller ren sackaroslösning. Bina får därefter fri tillgång till sackaroslösning. För vissa ämnen kan högre koncent ­
rationer i testdosen leda till att bina avvisar den och endast kon ­
sumerar lite eller inget alls. Efter en period på högst 6 timmar bör okonsumerat behandlat foder ersättas med ren sackaroslösning. Mängden konsumerat behandlat foder uppskattas (t.ex. genom mät ­
ning av återstodens volym eller vikt).
 
1.6.3.2  Testperiodens längd  
Testet fortsätts i regel i 48 timmar efter det att testlösningen har 
ersatts med ren sackaroslösning. Om mortaliteten fortsätter att stiga med mer än 10 % efter de första 24 timmarna bör testperioden förlängas (till högst 96 timmar), förutsatt att kontrollgruppens mor ­
talitet inte överskrider 10 %.
 
1.6.4  Observationer  
Mortaliteten registreras när det har gått 4 timmar från testets början 
och därefter vid 24 timmar och 48 timmar efter tillförsel av dosen. Om det behövs en förlängd testperiod görs efterföljande bedöm ­
ningar med 24 timmars intervall (upp till högst 96 timmar), förutsatt 
att kontrollgruppens mortalitet inte överskrider 10 %. 
En uppskattning görs av mängden behandlat foder som konsumeras 
per grupp. Genom att jämföra hur stor mängd behandlat och obe ­
handlat foder som har konsumerats inom de angivna 6 timmarna kan 
man få upplysningar om i vilken grad bina accepterar det behandlade 
fodret. 
Alla avvikelser i beteende som observeras under testperioden bör 
registreras.
 
1.6.5  Gränstest (Limit-test)  
1 vissa fall (t.ex. om ett testämne förväntas ha låg toxicitet) kan 
gränstest utföras med 100 μg verksamt ämne per bi, i syfte att 
demonstrera att LD  50 är högre än detta värde. Förfarandet bör vara 
detsamma, dvs. tre likadana testgrupper per testdos, relevanta kon ­
trollgrupper, uppskattning av mängden konsumerat behandlat foder och användning av giftekvivalent. Om det förekommer mortalitet bör 
ett fullständigt test genomföras. Alla eventuella observerade subletala 
verkningar bör registreras (se avsnitt 1.6.4).
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1185
 
2. DATA OCH RAPPORTERING  
2.1 DATA 
Alla uppgifter bör sammanställas i en tabell. Av tabellen ska framgå, 
för varje testgrupp samt för varje kontrollgrupp och varje giftekvi ­
valentgrupp, antalet bin som använts, mortaliteten vid varje observa ­
tionstidpunkt och antalet bin med ett beteende som tyder på skadliga verkningar. Mortalitetsdata bör analyseras med lämpliga statistiska metoder (t.ex. probit-analys, rörligt medelvärde eller binominal san ­
nolikhet} (3), (4). Dosresponskurvor uppritas för varje rekommende ­
rad observationstidpunkt. Kurvornas lutning och median letal dos (LD
 50 ) beräknas med 95 % konfidensintervall. Korrigeringar för 
kontrollgruppens mortalitet kan göras med hjälp av Abbott-korrige ­
ring (4), (5). Om det behandlade fodret inte har konsumerats helt bör man göra en uppskattning av hur stor dos av testämnet som har konsumerats per grupp. LD
 50 -värdet uttrycks som μg testämne per 
bi. 
2.2 TESTRAPPORT 
Testrapporten ska innehålla nedan angivna uppgifter.  
2.2.1  Testämne  
— Aggregationstillstånd och relevanta fysikalisk-kemiska egenska ­
per (t.ex. stabilitet i vatten, ångtryck). 
— Kemiska identifieringsdata, inklusive strukturformel, renhet (för 
bekämpningsmedel t.ex. identiteten och halten av verksamt ämne eller verksamma ämnen).
 
2.2.2  Försöksdjur  
— Vetenskapligt namn. ras, ungefärlig ålder (i veckor), insamlings ­
metod, insamlingsdatum. 
— Information om de samhällen som används för insamling av 
testbin, inklusive hälsa, eventuella vuxensjukdomar, eventuella förbehandlingar osv.
 
2.2.3  Testförhållanden  
— Temperatur och relativ fuktighet i testrummet. 
— Förvaringsförhållanden, inklusive burarnas typ, storlek och mate ­
rial. 
— Metoder för beredning av stam- och testlösningar (i förekom ­
mande fall anges även lösningsmedlet och dess koncentrationer). 
— Testets utformning, t.ex. antal testkoncentrationer och deras vär ­
den, antalet kontrollgrupper, samt för varje testkoncentration och 
kontrollgrupp även antalet replikatburar och antalet bin per bur. 
— Testdatum.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1186
 
2.2.4  Resultat  
— Resultaten från preliminära test (i förekommande fall). 
— Rådata: mortaliteten för varje testad dos vid varje observations ­
tidpunkt. 
— Dos-responskurvorna vid testets slut. — LD
 50 -värden med 95 % konfidensintervall, vid varje rekommen ­
derad observationstidpunkt, för testämnet och för giftekvivalen ­
ten. 
— Statistiska metoder som har använts för att bestämma LD  50 . 
— Mortaliteten i kontrollgrupperna. — Övriga biologiska verkningar som har observerats eller uppmätts, 
t.ex. om bina har betett sig onormalt (inklusive om de avvisat 
testdosen), konsumtionen av foder i behandlade och obehandlade grupper. 
— Varje avvikelse från de här beskrivna testförfarandena samt all 
annan relevant information.
 
3. HÄNVISNINGAR  
1. EPPO/Council of Europe (1993), Decision-Making Scheme for the 
Environmental Risk Assessment of Plant Protection Products – 
Honeybees. EPPO Bulletin, Vol. 23, N.l. s. 151–165, March 1993. 
2. Gough, H. j., McIndoe, EX., Lewis, G.B. (1994), The use of 
dimethoate as a reference compound in laboratory acute toxicity tests on honeybees (Apis  mellifera  L.) 1981–1992, Journal of 
Apicultural Research, 22, s. 119–125. 
3. Litchfield, J.T. and Wilcoxon, F. (1949), A simplified method of 
evaluating dose-effect experiments. Jour. Pharmacol. and Exper. Ther., 96, s. 99–113. 
4. Finney, D. J. (1971), Probit Analysis. 3rd ed., Cambridge, Lon ­
don and New York. 
5. Abbott, W. S. (1925), A method for computing the effectiveness 
of an insecticide, Jour. Econ. Entomol, 18, s. 265–267.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1187
 
C.17  HONUNGSBIN – TEST AVSEENDE AKUT TOXICITET 
(KONTAKT)  
1. METOD  
Denna testmetod för akut toxicitet motsvarar OECD TG 214 (1998).  
1.1 INLEDNING 
Detta test är en laboratoriemetod för bedömning av växtskyddspro ­
dukters och andra kemikaliers akuta toxicitet (kontakt) på vuxna arbetsbin. 
Vid bedömning och utvärdering av de toxiska egenskaperna hos 
ämnen kan det vara nödvändigt att bestämma den akuta toxiciteten 
(kontakt) på honungsbin, t.ex. när det är sannolikt att bin kommer att 
exponeras för en viss kemikalie. Testet för akut toxicitet (kontakt) används för att bestämma bekämpningsmedels och kemikaliers tox ­
icitet för bin. Resultatet av detta test används för att avgöra om det 
behövs ytterligare utvärderingar. Metoden kan särskilt användas i 
stegvisa program för bedömning av de risker som bekämpnings ­
medel kan medföra för bin. Dessa program bygger på en sekventiell arbetsgång från laboratorietoxicitetstest till semifält-och fältförsök 
(1). Bekämpningsmedel kan testas som verksamma ämnen eller 
som formulerade produkter. 
En giftekvivalent bör användas för att fastställa binas känslighet och 
testförfarandets noggrannhet.
 
1.2 DEFINITIONER  
Akut toxicitet (kontakt):  de skadliga verkningar som uppträder 
inom en period på högst 96 timmar efter lokal applicering av en 
engångsdos av testämnet.  
Dos:  den mängd testämne som appliceras. Dosen uttrycks som vik ­
ten (μg) testämne per försöksdjur ( μg/bi).  
LD 50 (median letal dose) kontakt:  en statistiskt fastställd engångs ­
dos av ett ämne som kan förväntas leda till döden för 50 % av de 
djur på vilka dosen har applicerats. LD  50 -värdet uttrycks som μg 
testämne per bi. När det gäller bekämpningsmedel kan testämnet vara ett verksamt ämne eller en formulerad produkt som innehåller 
ett eller flera verksamma ämnen.  
Mortalitet:  ett djur registreras som dött när der är helt orörligt.
 
1.3 PRINCIP FÖR TESTMETODEN 
Vuxna arbetsbin (honungsbin – Apis  mellifera)  exponeras för en 
serie doser av testämnet upplöst i lämplig vehikel. Exponeringen sker genom direkt applicering på bröstkorgen (droppar). Testperio ­
dens längd är 48 timmar. Om mortaliteten ökar under perioden 
24–48 timmar efter tillförseln, medan kontrollgruppens mortalitet 
hålls på en godtagbar nivå, dvs. < 10 %, bör testet förlängas till högst 96 timmar. Mortaliteten registreras dagligen och jämförs med kontrollgruppens värden. Resultaten analyseras för beräkning av 
LD
 50 vid 24 och 48 timmar, och om testet förlängs, vid 72 och 
96 timmar.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1188
 
1.4 TESTETS GILTIGHET 
För att testet ska vara giltigt måste följande villkor uppfyllas: 
— Genomsnittsmortaliteten för det totala antalet kontrolldjur får inte 
överskrida 10 % vid testets slut. 
— De värden som erhålls för LD  50 för giftekvivalenten ska ligga 
inom det specificerade området.  
1.5 BESKRIVNING AV TESTMETODEN  
1.5.1  Insamling av bin  
För testet används unga vuxna arbetsbin med samma ålder, närings ­
tillstånd, ras osv. Bina tas från adekvat utfodrade, friska, så långt som möjligt sjukdomsfria samhällen med renrasiga drottningar med 
känd historia och fysiologisk status. Bina bor samlas in pä testdagens 
morgon eller kvällen före testet och hällas i testförhållandena fram till följande dag. Bin som insamlats från yngelfria ramar rekommen ­
deras. Insamling tidigt på våren eller sent på hösten bör undvikas 
eftersom bina då har genomgått fysiologiska förändringar. Om test 
måste genomföras tidigt på våren eller sent på hösten kan bina kläckas i en inkubator och födas upp med ”bibröd” (pollen som insamlats från vaxkakan) och sackaroslösning under en vecka. Bin 
som har behandlats med kemiska ämnen såsom antibiotika, varroa ­
bekämpningsmedel osv. får inte användas för toxicitetstest förrän det har gått fyra veckor från det att den sista behandlingen avslutades.
 
1.5.2  Förvarings- och utfodringsförhållanden  
Burarna bör vara enkla att rengöra och välventilerade. Burarna kan 
vara tillverkade av t.ex. rostfritt stål, nät eller plast. Även träburar för 
engångsbruk kan användas. Burarnas storlek bör anpassas efter an ­
talet bin och vara tillräckligt rymliga. Grupper om tio bin per bur rekommenderas. 
Bina hålls i mörker i ett testrum med en temperatur på 25 ± 2
 o C. 
Den relativa fuktigheten, i regel kring 50–70 %, bör registreras under 
hela testförloppet. Hanteringen, såsom behandling och observationer, 
kan däremot genomföras i (dags)ljus. Sackaroslösning i vatten med en slutkoncentration på 500 g/l (50 % vikt per volym) används som 
foder och tillhandahålls fritt för bina med hjälp av en utfodrings ­
anordning. För utfodringen kan ett cirka 50 mm långt och 10 mm brett glasrör användas, vars öppna ända smalnar av till en diameter på cirka 2 mm.
 
1.5.3  Förberedelse av bina  
De insamlade bina kan bedövas med koldioxid eller kväve före 
appliceringen av testämnet. Mängden bedövningsmedel och expone ­
ringstiden för medlet bör minimeras. Döende bin avlägsnas och er ­
sätts med friska bin före testets början.  
1.5.4  Förberedelse av doserna  
Testämnet appliceras upplöst i en vehikel, t.ex. ett organiskt lös ­
ningsmedel eller vattenlösning med ett vätmedel. Som organiskt lös ­
ningsmedel rekommenderas aceton men även andra organiska lös ­
ningsmedel med låg toxicitet kan användas (t.ex. dimetylformamid, 
dimetylsulfoxid). I fråga om formulerade produkter som är disperge ­
rade i vatten och mycket polära organiska ämnen som inte är lösliga i organiska vehikellösningsmedel kan lösningarna vara enklare att 
applicera om de bereds i en svag lösning av ett vanligt vätmedel 
(t.ex. Agral, Cittowett, Lubrol, Triton eller Tween).
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1189
 
Lämpliga kontrollösningar bör beredas. I fall där ett lösningsmedel 
eller ett dispergeringsmedel används för att lösa upp testämnet bör 
två separata kontrollgrupper användas, en som behandlas med vatten och en som behandlas med lösningsmedlet eller dispergeringsmedlet.
 
1.6 FÖRFARANDE  
1.6.1  Test- och kontrollgrupper  
Antalet doser och replikat som testas bör väljas så att de uppfyller de 
statistiska kraven för bestämning av LD  50 med ett konfidensintervall 
på 95 %. För testet används i regel fem doser i en geometrisk serie vars faktor inte överskrider 2,2. Doserna bör täcka området för LD
 50 . 
Antalet doser fastställs med beaktande av toxicitetskurvans lutning 
(dos i förhållande till mortalitet) och den statistiska metod som an ­
vänds för analys av resultaten. Ett preliminärt test kan användas som stöd för valet av lämpliga doser. 
Varje testkoncentration bör ges till minst tre likadana testgrupper 
med tio bin per grupp. 
Utöver själva testserierna bör minst tre kontrollgrupper med tio bin 
per grupp också behandlas. Om ett organiskt lösningsmedel eller ett vätmedel används måste tre extra kontrollgrupper med tio bin per grupp användas för lösningsmedlet eller vätmedlet.
 
1.6.2  Giftekvivalent  
En giftekvivalent måste tas med i testserien. Minst tre doser bör 
väljas på sådant sätt att de täcker det förväntade LD  50 -värdet. Minst 
tre likadana burar med tio bin per bur bör användas för varje testdos. 
Som giftekvivalent rekommenderas dimetoat. vars LD  50 -värde (kon ­
takt) enligt rapporterade uppgifter ligger inom området 0,10–0,30 μg 
verksamt ämne per bi (2). Även andra giftekvivalenter kan godtas förutsatt att man har tillgäng till tillräckliga data om förväntad dos ­
respons (t.ex. paration).
 
1.6.3  Exponering  
1.6.3.1  Tillförsel av doser  
De bedövade bina behandlas individuellt genom lokal applicering. 
Bina väljs slumpmässigt ut för de olika testdoserna och kontroll ­
grupperna. En volym pä 1 μl lösning innehållande testämnet i lämp ­
lig koncentration appliceras med mikroapplikator på flanksidan på bröstkorgen av varje bi. Om det är motiverat kan andra volymer 
användas. Efter appliceringen fördelas bina i testburarna där de bör 
ha tillgång till sackaroslösning.
 
1.6.3.2  Testperiodens längd  
Rekommenderad testperiod är 48 timmar. Om mortaliteten ökar med 
mer än 10 % när det har gått 24–48 timmar från appliceringen bör 
testperioden förlängas (till högst 96 timmar), förutsatt att kontroll ­
gruppens mortalitet inte överskrider 10 %.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1190
 
1.6.4  Observationer  
Mortaliteten registreras vid 4 timmar efter doseringen och därefter 
vid 24 och 48 timmar. Om det behövs en längre testperiod görs efterföljande bedömningar med 24 timmars intervall (upp till högst 
96 timmar), förutsatt att kontrollgruppens mortalitet inte överskrider 
10 %. 
Allt avvikande uppförande som observeras under testperioden bör 
registreras.
 
1.6.5  Gränstest  
I vissa fall (t.ex. om ett testämne förväntas ha låg toxicitet) kan 
gränstest utföras med 100 μg verksamt ämne per bi, i syfte att 
demonstrera att LD  50 är högre än detta värde. Förfarandet bör vara 
detsamma, inklusive tre likadana testgrupper för testdosen, relevanta kontrollgrupper och användning av giftekvivalent. Om det förekom ­
mer mortalitet bör ett fullständigt test genomföras. Alla eventuella 
observerade subletala verkningar bör registreras (se avsnitt 1.6.4).
 
2. DATA OCH RAPPORTERING  
2.1 DATA 
Alla uppgifter bör sammanställas i en tabell. Av tabellen ska framgå, 
för varje testgrupp samt för varje kontrollgrupp och varje giftekvi ­
valentgrupp, antalet bin som använts, mortaliteten vid varje observa ­
tionstidpunkt och antalet bin med ett beteende som tyder på skadliga 
verkningar. Mortalitetsdata bör analyseras med lämpliga statistiska metoder (t.ex. probit-analys, rörligt medelvärde eller binominal san ­
nolikhet) (3), (4). Dos-responskurvor uppritas för varje rekommen ­
derad observationstidpunkt (24, 48 och i förekommande fall 72 och 
96 timmar) och kurvornas lutning och median letal dos (LD
 50 ) be­
räknas med 95 % konfidensintervall. Korrigeringar för kontrollgrup ­
pens mortalitet kan göras med hjälp av Abbott-korrigering (4), (5). 
LD 50 -värdet uttrycks som μg testämne per bi.  
2.2 TESTRAPPORT 
Testrapporten ska innehålla nedan angivna uppgifter.  
2.2.1  Testämne  
— Aggregationstillstånd och fysikalisk-kemiska egenskaper (t.ex. 
stabilitet i vatten, ångtryck). 
— Kemiska identifieringsdata, inklusive strukturformel, renhet (för 
bekämpningsmedel t.ex. identiteten och halten av verksamt ämne eller verksamma ämnen).
 
2.2.2  Försöksdjur  
— Vetenskapligt namn, ras, ungefärlig ålder (i veckor), insamlings ­
metod, insamlingsdatum. 
— Information om de samhällen som används for insamling av 
testbin, inklusive hälsa, eventuella vuxensjuk domar, eventuella 
förbehandlingar osv.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1191
 
2.2.3  Testförhållanden  
— Temperatur och relativ fuktighet i testrummet. 
— Förvaringsförhållanden, inklusive burarnas typ, storlek och mate ­
rial. 
— Metod för tillförsel av testamnet, t.ex. använt vehikellösnings ­
medel, tillförd volym testlösning och använd bedövning. 
— Testets utformning, t.ex. antal doser och deras storlek, antalet 
kontrollgrupper, för varje testdos och kon trollgrupp även antalet likadana burar och antalet bin per bur. 
— Testdatum.
 
2.2.4  Resultat  
— Resultaten från preliminära test (i förekommande fall). 
— Rådata: mortaliteten för varje koncentration som testats vid varje 
observationstidpunkt. 
— Dos-responskurvorna vid testets slut. — LD
 50 -värden med 95 % konfidensintervall, vid varje rekommende ­
rad observationstidpunkt, för testämnet och för giftekvivalenten. 
— Statistiska metoder som använts för att bestämma LD  50 . 
— Mortaliteten i kontrollgrupperna. — Övriga biologiska verkningar som observerats eller uppmätts och 
all onormal respons från bina. 
— Varje avvikelse från de testmetodförfaranden som beskrivs här 
samt all annan relevant information.
 
3. HÄNVISNINGAR  
1. EPPO/Council of Europe (1993), Decision-Making Scheme for 
the Environmental Risk Assessment of Plant Protection Products – Honeybees, EPPO bulletin, Vol. 23, N.l, s. 151–165. March 
1993. 
2. Gough, H. J., McIndoe, E. C, Lewis, G. B. (1994), The use of 
dimethoate as a reference compound in laboratory acute toxicity tests on honeybees (Apis  mellifera  L.), 1981–1992, Journal of 
Apicultural Research 22, s. 119–125. 
3. Litchfield, J. T. and Wilcoxon, F. (1949), A simplified method of 
evaluating dose-effect experiments, Jour. Pharmacol. and Exper. Ther., 96, s. 99–113. 
4. Finney, D. J. (1971), Probit Analysis. 3rd ed.. Cambridge, Lon ­
don and New York. 
5. Abbott, W. S. (1925), A method for computing the effectiveness 
of an insecticide. Jour. Econ. Entomol. 18, s. 265–267.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1192
 
C.18  BESTÄMNING AV ADSORPTION OCH DESORPTION I JORD 
VID JÄMVIKT I UPPSLAMMAT JORDPROV  
1. METOD  
Denna metod är i stort sett identisk med OECD TG 106 – Determi ­
nation of Soil Adsorption/Desorption, using a Batch Equilibrium 
Method (2000).  
1.1 INLEDNING 
Metoden bygger bland annat på ett ringprov och en workshop för val 
av jordar för adsorptionstest (1) (2) (3) (4) samt existerande riktlinjer 
på nationell nivå (5) (6) (7) (8) (9) (10) (11). 
Adsorptions- och desorptionstest används för att erhålla grundläg ­
gande uppgifter om kemiska ämnens rörlighet och deras fördelning 
i biosfärens jord, vatten och luft (12) (13) (14) (15) (16) (17) (18) (19) (20) (21). Uppgifterna kan utnyttjas för att förutspå eller upp ­
skatta t.ex. ett visst kemiskt ämnes tillgänglighet vid organismernas 
nedbrytningsprocesser (22) (23) samt, omvandlings- och upptag ­
ningsprocesser (24), ämnets urlakning genom jordprofilen (16) (18) (19) (21) (25) (26) (27) (28), ämnets flyktighet från jorden (21) (29) (30) eller ämnets avrinning från land och ytor in i naturliga vatten 
(18) (31) (32). Adsorptionsdata kan användas för jämförelser och för 
att skapa modeller (19) (33) (34) (35). 
Ett kemiskt ämnes fördelning mellan jord- och vattenfas är en kom ­
plex process som beror på flera olika faktorer: ämnets kemiska natur 
(12) (36) (37) (38) (39) (40), jordfasens egenskaper (4) (12) (13) (14) (41) (42) (43) (44) (45) (46) (47) (48) (49) och klimatbetingade faktorer såsom regn, temperatur, sol och vind. Den mångfald feno ­
men och mekanismer som deltar i ämnets adsorption i jord kan 
därför inte beskrivas fullständigt med hjälp av den aktuella testmeto ­
den, som utgör en förenklad laboratoriemodell. Även om detta test inte kan täcka alla tänkbara miljösituationer ger det ändå tillräckliga 
uppgifter om den betydelse för miljön som adsorptionen av det 
aktuella ämnet har. 
Se även den allmänna inledningen.
 
1.2 TILLÄMPNINGSOMRÅDE 
Syftet med metoden är att kunna uppskatta ett ämnes adsorptions- 
och desorptionsbeteende i jordar. Målet är att få ett sorptionsvärde som kan användas för att uppskatta fördelningen när miljöbeting ­
elserna varierar. För detta ändamål bestäms ämnets adsorptionskoef ­
ficient i jämvikt i olika jordar som funktion av jordens egenskaper (t.ex. halten av organiskt kol och lera samt jordens textur och pH). Olika jordtyper måste användas för att testet i så hög grad som 
möjligt ska täcka växelverkan mellan ett ämne och naturligt före ­
kommande jordarter. 
Inom ramen för denna metod avser man med begreppet adsorption 
den process när ett ämne binds till en jordyta, utan att i detta sam ­
manhang skilja mellan olika adsorptionsprocesser (fysikalisk eller kemisk adsorption) eller processer såsom ytkatalyserad nedbrytning, bulkadsorption eller kemisk reaktion. Adsorption, som sker på kol ­
loidala partiklar (diameter < 0,2 um) som har bildats av jordarterna, 
räknas inte.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1193
 
De viktigaste jordparametrarna med tanke på adsorptionen anses vara 
följande: halten av organiskt kol (3) (4) (12) (13) (14) (41) (43) (44) 
(45) (46) (47) (48), lerbaken och jordens textur (3) (4) (41) (42) (43) (44) (45) (46) (47) (48) samt joniserbara föreningars pH (3) (4) (42). Andra jordparametrar som kan ha inverkar på adsorption/desorption 
för ett särskilt ämne är den effektiva katjonbyteskapaciteten (ECEC), 
halten av amorft järn och aluminiumoxider, särskilt i fråga om vul ­
kaniska och tropiska jordar (4), samt den specifika ytan (49). 
Syftet med testet är att utvärdera ett ämnes adsorption i olika jord ­
typer för vilka halten av organiskt kol, 1er-halten och jordens textur 
och pH varierar. Testet omfattar tre skeden:  
Skede 1:  Förberedande undersökningar för att bestämma följande: 
— Jord-lösningsförhållandet. — Tiden för att nä adsorptionsjämvikt och mängden av 
adsorberat testämne vid jämvikt. 
— Testamnets adsorption på testkärlens yta och testäm ­
nets stabilitet under testningstiden.  
Skede 2 : Screeningtest: undersökning av adsorptionen i fem 
olika jordtyper genom adsorptionskinetik vid en vald kon ­
centration och bestämning av fordelningskoefficienterna K
 d och K  oc . 
Skede 3 : Bestämning av Freundlich-adsorptionsisotermer för att 
fastställa hur koncentrationen inverkar på adsorptionens omfattning i jordar. 
Undersökning av desorption genom desorptionskinetik och 
Freundlich-desorptionsisotermer (bilaga 1).
 
1.3 MATSTORHETER – DEFINITIONER OCH MATTENHETER  
Beteckning Definition Måttenhet  
A t i procentuell adsorption vid tidpunkten t  i % 
A eq procentuell adsorption vid adsorptionsjämvikt %  
m s ads ðt i Þ massan av testämne som adsorberats i jorden vid tid ­
punkten t  i μg 
m s ads ðΔt i Þ massan av testämne som adsorberats i jorden under tids ­
intervallet Δt i μg 
m s ads ðeqÞ massan av testämne som adsorberats i jorden vid adsorp ­
tionjämvikt μg 
m 0 massan av testämne i provröret vid adsorptionstestest 
början μg 
m m ads ðt i Þ massan av testämne uppmät i ett delprov ( v a A ) vid tid­
punkten t  i μg 
m aq ads ðeqÞ massan av testämne i lösningen vid adsorptionsjämvikt μg 
m jord mängd av jordfas, uttryckt som jordens torrmassa g  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1194
 
Beteckning Definition Måttenhet  
C st masskoncentrationen i ämnets stamlösning μg cm  -3 
C 0 ursprunglig masskoncentration i provlösningen som är i 
kontakt med jord μg cm  -3 
C aq ads ðt i Þ ämnets masskoncentration i vattenfasen vid tidpunkten t  i 
då analysen utförs μg cm  -3 
C s ads ðeqÞ halten av ämne som adsorberats i jord vid adsorptions ­
jämvikt μg g -1 
C aq ads ðeqÞ ämnets masskoncentration i vattenfasen vid adsorption ­
jämvikt μg cm  -3 
V 0 ursprunglig volym av vattenfas i kontakt med jord under 
adsorptionstestet cm 3 
v a A volymen för det delprov som används för att mätta tes ­
tämnet cm 3 
K d adsorptionens fördelningskoefficient cm  3 g -1 
K oc normaliserad adsorptionskoefficient cm  3 g -1 
K om normaliserad fördelningskoefficient cm  3 g -1 
K F ads Freundlich-adsorptionskoefficient μg 1-1/n (cm  3 ) 1/n g -1 
1/n Freundlich-exponent  
D t i procentuell desorption vid tidpunkten t  i % 
D Δt i procentuell desorption under intervallet Δt i % 
K des skenbar desorptionskoefficient cm  3 g -1 
K F des Freundlich-desorptionskoefficient μg 1-1/n (cm  3 ) 1/n g -1 
m aq des ðt i Þ massan av testämne som desorberats från jord vid tid ­
punkten t  i μg 
m m des ðΔt i Þ massan av testämne som desorberats från jord under tids ­
intervallet Δt i μg 
m m des ðeqÞ analytiskt bestämd ämnesmassa i vattenfasen vid desorp ­
tionsjämvikt μg 
m aq des ðeqÞ totala massan av testämne som desorberats vid desorp ­
tionsjämvikt μg 
m s des ðΔt i Þ massan av ämne som förblir adsorberat i jorden tidsinter ­
vallet Δt i μg 
m aq A massan av ämne som blivit över från adsorptionsjämvikten 
på grund av ofullständig volymersättning μg 
C s des ðeqÞ halten av testämne som förblir adsorberat i jorden vid 
desorptionsjämvikt μg g -1 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1195
 
Beteckning Definition Måttenhet  
C aq des ðeqÞ testämnets masskoncentration i vattenfasen vid desorp ­
tionsjämvikt μg cm  -3 
V T totala volymen vattenfas i kontakt med jord under de ­
sorptionskinetiktest enligt seriemetoden cm 3 
V R volymen supernatant som har avlägsnats ur röret efter 
uppnådd adsorptionsjämvikt och som har ersatts med 
samma volym av 0,01 M CaCl  2 -lösning cm 3 
v a D volymen delprov som tagits för analytiskt syfte under ett 
desorptionskinetiktest enligt seriemetoden cm 3 
V r r volymen lösning som tagits ur röret (i) för mättning av 
testämnet under desorptionskinetiktest (parallellmetod) cm 3 
V r F volymen lösning som vid jämvikt tagits ur röret för mätt ­
ning av testämnet cm 3 
MB massbalans % 
m E totala massan av testämne som extraherats ur jorden och 
provkärlets väggar i två steg μg 
V rec volymen supernatant som insamlats efter uppnådd ad ­
sorptionsjämvikt cm 3 
P ow fördelningskoefficient för oktanol-vatten 
pKa dissociationkoefficient 
S w vattenlöslighet g l  -1 
1.4 PRINCIPEN FOR TESTMETODEN 
Kända volymer av testämneslösning, omärkta eller radioaktivt märkta 
och med kända koncentrationer i 0,01 M CaCl  2 blandas med jord ­
prover av känd torrvikt som har bringats till jämvikt i 0,01 M CaCl  2 . 
Blandningen rörs om tillräckligt länge. Jordsuspensionerna separeras 
därefter genom centrifugering, och om så önskas kan filtratet och 
vattenfasen analyseras. Mängden av testämne som adsorberats i jord ­
provet bestäms som skillnaden mellan den ursprungliga mängden av testämne i lösningen och mängden av kvarvarande testämne i slutet 
av testet (indirekt metod). 
Alternativt kan mängden av adsorberat testämne bestämmas direkt 
genom jordanalys (direkt metod). Denna procedur, som inbegriper 
stegvis jordextraktion med lämpligt lösningsmedel, rekommenderas i fall dar skillnaden i lösningens halt av testämne inte kan bestämmas med tillräcklig noggrannhet. Detta kan förekomma om testämnet 
adsorberas pä provkärlens yta, om testämnet är instabilt inom den 
tidsskala testet sträcker sig över, om adsorptionen är så svag att halten bara ändras lite eller om adsorptionen är så stark att den resulterande halten ar for låg för att kunna bestämmas med tillräcklig 
noggrannhet. Om radioaktivt märkt ämne används kan man undvika 
jordextraktion genom att analysera jordfasen med förbränning och vätskescintilllationsräknare (LSC). LSC är dock en icke-specifik tek ­
nik som inte kan skilja mellan ursprungliga ämnen och omvandlings ­
produkter och som därför bara kan användas om testämnet är stabilt 
under hela testet.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1196
 
1.5 UPPGIFTER OM TESTÄMNET 
De kemiska reagenser som används ska ha hög analytisk renhets ­
grad. Rekommenderade testämnen är omärkta ämnen med känd sam ­
mansättning och en renhetsgrad på helst minst 95 % eller radioaktivt 
märkta ämnen med känd sammansättning och radioaktiv renhet. Om 
spårämnen med kort halveringstid används ska sönderfallskorrigering tillämpas. 
Innan adsorptions- och desorptionstestet utförs ska följande uppgifter 
finnas om testämnet: 
a) vattenlöslighet (A.6) 
b) ångtryck (A.4) eller Henrys lag-koefficient 
c) abiotisk nedbrytning: hydrolys som funktion av pH (C.7) 
d) fördelningskoefficient (A.8) 
e) ”lätt” biologisk nedbrytbarhet (C.4) eller aerobisk och anaerobisk 
omvandling i jord 
f) pKa för joniserbara ämnen 
g) direkt fotolys i vatten (t.ex. UV-Vis-absorptionsspektrum i vatten 
och kvantutbyte) och fotonedbrytning i jord.
 
1.6 TESTETS TILLÄMPBARHET 
Testet kan tillämpas på kemiska ämnen som kan analyseras med 
tillräcklig noggrannhet. En viktig parameter som kan påverka till ­
förlitligheten hos resultaten, särskilt när den indirekta metoden an ­
vänds, är testämnets stabilitet inom testets tidsskala. Ämnets stabilitet 
måste därför kontrolleras med en förhandsundersökning, och om den visar att det förekommer omvandling inom testets tidsskala är det 
tillrådligt att huvudundersökningen utförs med analys av både jord- 
och vattenfasen. 
Det kan vara svårt att genomföra testet med ämnen som har låg 
vattenlöslighet (S
 w , < 10  -4 g l -1 ) eller med ämnen som har hög 
elektrisk laddning, eftersom koncentrationen i vattenfasen då inte 
kan analyseras med tillräcklig noggrannhet. För sådana ämnen krävs vissa extra åtgärder. Närmare anvisningar finns i berörda avsnitt. 
Vid testning av flyktiga ämnen är det viktigt att se till att det inte 
uppstår hanteringsförluster.
 
1.7 METODBESKRIVNING  
1.7.1  Apparatur och kemiska reagenser  
Normal laboratorieutrustning, särskilt följande: 
a) Provrör eller andra kärl för testet. Det är viktigt att rören eller 
kärlen 
— passar direkt in i centrifugen så att hanterings- och över ­
föringsfel kan undvikas, 
— är gjorda av ett inert material så att adsorption av testämnet på 
rörets eller kärlets yta minimeras.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1197
 
b) Skakapparat: rotationsskak eller motsvarande, i ett utförande där 
jorden hålls i suspension under omrö ringen. 
c) Centrifug: helst i höghastighetsutförande, t.ex. med centrifugal ­
kraft > 3 000 g, temperaturkontrollerad och med kapacitet att från 
vattenlösning separera partiklar med diameter större än 0,2 μm. 
Under omröring och centrifugering ska behållarna vara täckta med lock så att flyktighets- och vattenförluster kan undvi kas. 
För att minimera adsorption på locken ska dessa vara deaktive ­
rade, t.ex. teflonbelagda skruvkorkar. 
d) Gärna även: filtreringsapparat som har sterila engångsfilter med 
porositeten 0,2 μm. Särskild vikt ska fäs tas vid valet av filtermate ­
rial så att förluster av testämne på filtret kan undvikas. För svårlös ­
liga testämnen avråds användning av organiska filtermaterial. 
e) Analysinstrument lämpliga för mätning av testämnets koncentration. 
f) Laboratorieugn som kan hålla en temperatur mellan 103
 o C och 
110  o C. 
1.7.2  Karakterisering av jordar och urval av jordar för test  
Jordarna karakteriseras med hjälp av tre parametrar som anses vara i 
hög grad avgörande för adsorptionskapaciteten: organiskt kol, lerbak och jordens textur samt pH. Såsom tidigare nämnts (se avsnittet Till ­
lämpningsområde) kan även andra fysikalisk-kemiska egenskaper 
hos jorden påverka adsorption och desorption av ett visst ämne, 
och de ska i så fall beaktas. 
Valet av metoder för jordkarakteriseringen är av stor vikt och kan ha 
betydande inverkan på resultaten. Det rekommenderas därför att jor ­
dens pH mäts i en lösning av 0,01 M CaCl
 2 (dvs. den lösning som 
används vid adsorptions- och desorptionstestet) enligt gällande ISO- 
metod (ISO-10390-1). Det rekommenderas också att övriga jord ­
egenskaper av betydelse bestäms enligt standardmetoder (ISO Hand ­
book of soil analysis) så att sorptionsdata kan analyseras på basis av globalt standardiserade jordparametrar. Arbetena (50–52) innehåller 
viss vägledning om existerande standardmetoder för jordanalys och 
jordkarakterisering. Det är tillrådligt att använda referensjordar för kalibrering av jordtestmetoderna. 
Tabell 1 innehåller anvisningar för valet av jordar för adsorptions- 
och desorptionstest. De sju utvalda jordarna spänner över jordtyper som finns i tempererade geografiska zoner. För joniserbara testämnen 
ska de utvalda jordarna sträcka sig över ett stort pH-område så att 
ämnets adsorption kan bestämmas i joniserad och ojoniserad form. Anvisningar för hur många olika jordar som ska användas i de olika teststegen finns i avsnitt 1.9 (Mätförfarande). 
Om andra jordtyper väljs ska de karakteriseras med användning av 
samma parametrar och ska ha liknande variationer i fråga om de 
egenskaper som beskrivs i tabell 1, även om de inte behöver mot ­
svara kriterierna fullständigt exakt.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1198
 
Tabell 1  
Anvisningar för val av jordprover för adsorption och desorption  
Jordtyp pH-område (i 0,01 M 
CaCl  2 ) Halt av organiskt kol 
( %) Lerhalt ( %) Jordtextur (  1 ) 
1 4,5–5,5 1,0–2,0 65–80 Clay 
2 > 7,5 3,5–5,0 20–40 clay loam 
3 5,5–7,0 1,5-3,0 15–25 silt loam 4 4,0–5,5 3,0–4,0 15–30 loam 5 < 4,0–6,0 (
 2 ) < 0,5–1,5 (  2 ) ( 3 ) < 10–15 (  2 ) loamy sand 
6 > 7,0  <  0,5–1,0 (  2 ) ( 3 ) 40–65 clay loam/clay 
7 < 4,5 > 10 < 10 sand/loamy sand  
( 1 ) Enligt FAO och det amerikanska systemet (85). 
( 2 ) Variablerna ska helst ha värden inom de angivna intervallen. Om det är svårt att hitta lämpligt jordmaterial kan värden 
under det angivna minimivärdet godtas. 
( 3 ) Jordar med mindre an 0,3 % organiskt kol kan störa korrelationen mellan halten av organiskt material och adsorption. 
Det är därför tillrådligt att använda jordar med en minimihalt av 0,3 % organiskt kol.  
1.7.3  Provtagning och förvaring av jordprover  
1.7.3.1  Provtagning  
Det finns inga särskilda rekommendationer om specifika metoder 
eller verktyg för provtagning. Provtagningsmetoden beror på under ­
sökningens syfte (53) (54) (55) (56) (57) (58). 
Följande aspekter ska beaktas: 
a) Platsen ska beskrivas i detalj, bl.a. genom läge, vegetationstäcke, 
behandlingar med bekämpnings- och gödningsmedel, biologiska 
tillsatser eller oavsiktlig förorening. Beskrivningen av provtag ­
ningsplatsen ska följa rekommendationerna i ISO-standarden för tagning av jordprover (ISO 10381-6). 
b) Provtagningsplatsen ska anges med UTM-koordinater (Universal 
Transversal Mercator-Projection/European Horizontal Datum) el ­
ler geografiska koordinater. På så sätt kan man längre fram ta nya prover av viss jord. Det kan också underlätta bestämningen av jorden enligt de olika ländernas klassificeringssystem. Vidare ska 
endast A-horisont tas, ned till ett maximidjup på 20 cm. För jord 
7 gäller särskilt att om det finns O
 h -horisont närvarande i jorden 
ska denna horisont tas med i provet. 
]ordproverna ska transporteras i behållare, och temperaturbeting ­
elserna ska vara sådana att jordprovernas ursprungliga egenskaper 
inte förändras i någon signifikant grad.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1199
 
1.7.3.2  Förvaring  
Jordproverna ska helst användas färska. Om detta inte är möjligt ska 
jorden förvaras lufttorkad i omgivningstemperatur. Det finns inga rekommenderade gränser för förvaringstiden, men om ett jordprov 
är äldre än tre år måste det analyseras pä nytt avseende halten av 
organiskt kol, pH och CEC.
 
1.7.3.3  Hantering och beredning av jordprover för test  
Jordproverna lufttorkas vid omgivningstemperatur (helst 20–25  o C). 
Finfördelningen ska göras så varsamt som möjligt för att minimera 
ändringarna i jordens ursprungliga textur. Jordarna sållas till en par ­
tikelstorlek < 2 mm med beaktande av rekommendationerna i ISO- standarden om tagning av jordprover (ISO 10381-6). Omsorgsfull homogenisering rekommenderas eftersom resultatens reproducerbar ­
het då förbättras. Fukthalten i varje jordprov bestäms i tre delprover 
genom torkning vid 105
 o C tills ingen signifikant viktändring längre 
kan registreras (cirka 12 timmar). Vid alla beräkningar som omfattar jordmassa avses ugnstorkad massa, dvs. jordens vikt korrigerad med 
en fukthaltsfaktor.
 
1.7.4  Beredning av testämnet före kontakten med jord  
Testämnet upplöses i en lösning av 0,01 M CaCl  2 i destillerat eller 
avjoniserat vatten. CaCl  2 -lösningen används som vattenlösningsfas 
för att förbättra centrifugeringen och minimera katjonbytet. Stamlös ­
ningens koncentration ska helst vara tre tiopotenser högre an analys ­
metodens detektionsgräns. Genom denna tröskel säkerställs tillräcklig mätnoggrannhet med den använda metoden. Dessutom ska stamlös ­
ningens koncentration vara lägre än testämnets vattenlöslighet. 
Stamlösningen ska helst beredas strax före kontakten med jordpro ­
verna och förvaras i stängd behållare vid 4
 o C. Förvaringstiden beror 
på testämnets stabilitet och dess koncentration i lösningen. 
Hjälplösningsmedel för upplösning av testämnet ska bara användas 
om ämnet är svårlösligt (S  w < 10  -4 g t -1 ). Hjälplösningsmedlet ska a) 
vara blandbart med vatten, t.ex. metanol eller acetonitril, ska b) ha en koncentration som inte överskrider 1 % av stamlösningens totalvo ­
lym och en koncentration som är under 1 % i den testämneslösning 
som kommer i kontakt med jorden (helst under 0,1 %) och får c) inte 
vara ett ytaktivt ämne eller genomgå solvolytiska reaktioner med testamnet. Användningen av ett hjälplösningsmedel måste vara före ­
skriven och ska motiveras i rapporten. 
Ett annat alternativ för att tillföra ett svårlösligt testämne i testsyste ­
met är att använda tillsats (spiking). Det innebär att testämnet upp ­
löses i ett organiskt lösningsmedel, och ett delprov av denna lösning tillsatts systemet bestående av jord och 0,01 M CaCl
 2 -lösning i des ­
tillerat eller avjoniserat vatten. Halten av organiskt lösningsmedel i 
vattenfasen ska hällas så låg som möjligt, normalt ska den inte över ­
skrida 0,1 %. Tillsats från en organisk lösning kan innebära att reproducerbarheten går förlorad i fråga om volymen, dvs. ett nytt 
fel kan komma in eftersom testämnets och hjälplösningsmedlets kon ­
centration inte är samma i alla test.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1200
 
1.8 FÖRUTSÄTTNINGAR FÖR UTFÖRANDE AV ADSORPTIONS- 
OCH DESORPT1ONSTEST  
1.8.1  Analysmetod  
Följande nyckelparametrar kan påverka sorptionsmätningarnas nog ­
grannhet: noggrannheten hos den metod som används för att analy ­
sera lösningen och de adsorberade faserna, testämnets stabilitet och renhet, uppnåendet av sorptionsjämvikt, storleksordningen på lösningens koncentrationsändring, förhållandet mellan jord och lös ­
ning samt ändringar i jordens struktur under jämviktsprocessen (35) 
(59–62). Noggrannheten tas upp i några av exemplen i tillägg 2. 
Analysmetodens tillförlitlighet måste kontrolleras inom testets sanno ­
lika koncentrationsområde. Det står laboratoriet fritt att utveckla en lämplig metod med lämpliga värden i fråga om noggrannhet, repro ­
ducerbarhet, detektionsgränser och utbyte. Anvisningar för hur ett 
sådant test kan utföras ges nedan. 
En lämplig volym av 0,01 M CaCl
 2 (t.ex. 100 cm  2 rörs om under 4 
timmar med en viktmängd (t.ex. 20 g) jord som har hög adsorptions ­
förmåga, dvs. hög halt av organiskt kol och lera. Dessa vikter och 
volymer kan variera beroende på analysbehoven, men ett jord-lös ­
ningsförhållande på 1:5 är en lämplig utgångspunkt. Blandningen centrifugeras och vattenfasen kan filtreras. En bestämd volym av testämnets stamlösning tillsätts till vattenfasen så att den nominella 
koncentrationen kommer inom testets sannolika koncentrationsområ ­
de. Volymen ska vara högst 10 % av vattenfasens slutliga volym, så att karaktären hos den jämviktade jordlösningen ändras så lite som möjligt. Lösningen analyseras. 
Ett blindprov bestående av systemet jord + CaCl
 2 -lösning (utan tes ­
tämne) måste ingå, för kontroll av falska indikationer i analysmeto ­
den och matriseffekter orsakade av jorden. 
Bland de analysmetoder som kan användas för sorptionsmätningar 
ingår gas-vätskekromatografi (GLC), högtrycksvätskekromatografi (HPLC), spektrometri (t.ex. GC-masspektrometri och HPLC-mas ­
spektrometri) och vätskescintillationsräknare (för radioaktivt märkta 
ämnen). Oavsett vilken metod som används gäller kriteriet att meto ­
den anses lämplig om utbytet är mellan 90 % och 110 % av det nominella värdet. För att möjliggöra detektion och utvärdering efter det att ämnet fördelats måste analysmetodens detektionsgränser vara 
minst två tiopotenser under den nominella koncentrationen. 
Egenskaper och detektionsgränser hos den analysmetod som används 
vid adsorptionstest spelar en viktig roll när det gäller att definiera 
testbetingelserna och testets totala provningsprestanda. Den förelig ­
gande metoden följer ett allmänt testförlopp och innehåller rekom ­
mendationer och anvisningar för alternativa tillvägagångssätt i fall 
där analysmetoden och laboratoriets betingelser kan medföra be ­
gränsningar.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1201
 
1.8.2  Val av optimalt förhållande mellan jord och lösning  
Valet av lämpligt jord-lösningsförhållande för sorptionsundersök ­
ningar är beroende av fördelningskoefficienten K  d och den önskade 
relativa adsorptionsgraden. Ämnets koncentrationsändring i lös ­
ningen avgör mätningens statistiska noggrannhet – grundat på ad ­
sorptionsekvationens form och analysmetodens gränser – vid detek ­
tion av ämnets koncentration i lösningen. För vanligt bruk är det därför praktiskt att bestämma sig för en uppsättning konstanta stan ­
dardförhållanden för vilka adsorptionen är över 20 %, och helst över 
50 % (62), samtidigt som man ska se till att testämnets koncentration i vattenfasen hålls så pass hög så att den kan mätas med tillräcklig 
noggrannhet. Detta är särskilt viktigt när adsorptionsprocenterna är 
höga. 
Ett lämpligt tillvägagångssätt för att välja lämpliga jord-lösningsför ­
hållanden grundar sig på estimering av K
 d -värdet, antingen genom 
förberedande undersökningar eller genom vedertagna estimerings ­
metoder (tillägg 3). Valet av lämpligt förhållande kan sedan göras 
med hjälp av ett diagram där jord-lösningsförhållandet har avsatts mot K
 d för konstanta adsorptionsprocenter (figur 1). Härvid antas att 
adsorptionsekvationen är linjär (  1 ). Det sökta sambandet erhålls ge ­
nom att bilda om ekvation 4 för K  d så att den får formen enligt 
ekvation 1:  
V 0 
m soil ¼ Í 
m 0 
m s ads ðeqÞ Ä 1 Î 
K d (1) 
eller logaritmisk form med antagande av att R = m  soil /V 0 and 
A eq %/100 =  m s ads ðeqÞ 
m 0 : 
logR ¼ ÄlogK  d þ log " 
ðA eq %=100Þ 
ð1 Ä A eq %=100Þ # 
(2)
 
Figur 1  Sambandet mellan jord-lösningsförhållande och K  d vid olika procenthalter 
av adsorberat testämne  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1202  
( 1 ) C s ads ðeqÞ ¼ K  d · C aq ads ðeqÞ:
 I figur 1 visas jord-lösningsförhållandet som funktion av K  d för olika 
adsorptionsnivåer. Exempel: För jord-lösningsförhållandet 1:5 och 
K d = 20 blir adsorptionen cirka 80 %. För att få en adsorption på 
50 % med samma K  d måste förhållandet 1:25 användas. Detta sätt att 
välja jord-lösningsförhållande ger möjlighet att anpassa till olika test ­
ningsbehov. 
Däremot är det svårare att hantera områden där ämnet adsorberas 
väldigt mycket eller väldigt litet. Vid låg adsorption rekommenderas 
jord-lösningsförhållandet 1:1, men för vissa mycket organiska jord ­
typer kan ännu lägre förhållanden behövas för att erhålla slurry. Analysmetoden måste ägnas stor uppmärksamhet när det gäller mat ­
ning av små ändringar i lösningens koncentration, annars blir adsorp ­
tionsmätningen inexakt. Å andra sidan kan man vid mycket höga värden på fördelningskoefficienten K
 d gå upp till ett jord-lösnings ­
förhållande på 1:100 för att lämna en signifikant mängd av ämnet i 
lösningen. Då är det viktigt med god omröring och att systemet får 
tillräcklig tid på sig för att uppnå jämvikt. Ett alternativt sätt är att uppskatta K
 d -värdet med hjälp av estimeringsmetoder som t.ex. grun ­
dar sig på P  ow -värden (tillägg 3). Detta kan vara särskilt användbart 
för lågadsorberande och polära ämnen med P  ow < 20 och för lipofila 
och starkt sorptiva ämnen med P  ow > 10  4 . 
1.9 MÄTFÖRFARANDE  
1.9.1  Testbetingelser  
Alla test ska göras i omgivningstemperatur och om möjligt vid en 
konstant temperatur mellan 20  o C och 25  o C. 
Centrifugeringsbetingelserna ska vara sådana att partiklar större än 
0,2 μm kan avlägsnas från lösningen. Detta värde anger den minsta 
partikelstorleken för fasta partiklar och bildar gränsen mellan fasta och kolloidala partiklar. Anvisningar om lämpliga centrifugerings ­
betingelser finns i bilaga 4. 
Om det inte går att säkerställa att partiklar större an 0,2 um avlägs ­
nas vid centrifugeringen, kan en kombination av centritugering och 
filtrering med 0,2 μm filter användas. Filtermaterialet ska vara inert 
så att det inte uppstår förluster av testamnet pä filtret. Under alla omständigheter måste det dokumenteras så att det inte uppstår för ­
luster av testämnet under filtreringen.
 
1.9.2  Skede 1 – Förberedande undersökning  
Syftet med den förberedande undersökningen beskrivs i avsnittet 
Tillämpningsområde. Anvisningar för hur en sådan förberedande un ­
dersökning kan läggas upp ges nedan.  
1.9.2.1  Val av optimala jord-lösningsförhållanden  
Två jordtyper och tre jord-lösningsförhållanden används (för sex 
tester). En av jordtyperna har hög halt av organiskt kol och låg 
lerhalt, och den andra typen har låg halt avorganiskt kol och hög lerhalt. Följande förhållanden föreslås: 
— 50 g jord och 50 cm
 3 vattenlösning av testämnet (förhållande 1:1),  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1203
 
— 10 g jord och 50 cm  3 vattenlösning av testämnet (förhållande 1:5), 
— 2 g jord och 50 cm  3 vattenlösning av testämnet (förhållande 1:25). 
Den minsta mängd jord som behövs för testet beror på laboratoriets 
utrustning och analysmetodernas prestanda. För tillförlitliga testresul ­
tat rekommenderas dock minst 1 g, helst 2 g. 
Ett kontrollprov med enbart testämnet i 0,01 M CaCl  2 -lösning (ingen 
jord) testas enligt exakt samma procedur som används för testsyste ­
met, för att kontrollera testämnets stabilitet i CaCl  2 -lösningen och 
dess eventuella adsorption på testkärlets ytor. 
Ett blindprov per jord, med samma mängd jord och en totalvolym på 
50 cm  3 0,01 M CaCl  2 -lösning (utan testämne) testas på samma sätt. 
Detta blindtest fungerar som bakgrundskontroll under analysen så att man kan detektera störande ämnen eller förorenade jordar. 
Alla test, även kontroll- och blindtest, ska utföras minst två gånger. 
Det totala antalet prover som ska beredas för undersökningen be ­
stäms utifrån den metod som används. 
Metoderna för den förberedande undersökningen och huvudunder ­
sökningen är i regel desamma. I förekommande fall nämns skillnader 
som är av betydelse. 
De lufttorkade jordproverna bringas till jämvikt genom omröring 
med en minimivolym på 45 cm
 3 0,01 M CaCl  2 över natten 
(12 timmar) dagen före testet. Därefter tillsätts en bestämd volym 
av testämnets stamlösning för att justera den slutliga volymen till 50 cm
 3 . Den tillsatta mängden av stamlösning ska a) vara högst 
10 % av vattenfasens slutliga volym på 50 cm  3 för att minimera 
ändringen av karaktären hos den jämviktade jordlösningen och b) 
helst ge en ursprunglig koncentration av testämnet som är i kontakt med jorden (C
 0 ) som är minst två tiopotenser högre än analysmeto ­
dens detektionsgräns. Med denna tröskel säkerställs möjligheten att 
utföra tillräckligt noggranna mätningar även när stark adsorption 
inträffar (> 90 %) och möjligheten att längre fram bestämma adsorp ­
tionsisotermerna. Helst ska också, om det är möjligt, ämnets ur ­
sprungliga koncentration (C  0 ) inte överskrida hälften av dess löslig ­
hetsgräns. 
Nedan ges ett exempel på beräkning av stamlösningens koncent ­
ration (C  M ). För beräkningen gäller antagandet att detektionsgränsen 
är 0,01 μg cm  -3 och adsorptionen 90 %. Sålunda ska den ursprung ­
liga koncentrationen av testämne i kontakt med jorden helst vara 
lug cm  3 (två tiopotenser högre än detektionsgränsen). Under anta ­
gandet att den maximala rekommenderade volymen stamlösning till ­
sätts, dvs. 5 cm  3 till 45 cm  3 0,01 M CaCl  2 -jämviktslösning (= 10 % 
stamlösning till 50 cm  3 total volym av vattenfas), bör stamlösningens 
koncentration vara 10 μg cm  3 , dvs. tre tiopotenser högre än analys ­
metodens detektionsgräns. 
Vattenfasens pH ska mätas före och efter kontakt med jorden efter ­
som pH-värdet spelar en viktig roll för hela adsorptionsprocessen, 
särskilt när det gäller joniserbara ämnen.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1204
 
Lösningen rörs om så länge att adsorptionsjämvikt uppnås. Tiden för 
att nå jämvikt varierar kraftigt beroende pä ämnet och jorden. I regel 
räcker 24 timmar (77). Vid den förberedande undersökningen kan sekventiella prover tas under en omröringstid på 48 timmar, t.ex. vid 4, 8, 24 och 48 timmar, men analystidpunkterna kan också anpassas 
till arbetsschemat på laboratoriet. 
Det finns två alternativ för analys av testämnet i vattenlösningen: a) 
parallellmetoden och b) seriemetoden. Det måste betonas att parallell ­
metoden, även om den tar längre tid att utföra, innebär enklare mate ­
matisk behandling av resultaten (tillägg 5). Valet av metod måste 
avgöras utifrån laboratoriets tillgängliga utrustning och resurser. 
a) Parallellmetoden: Prover med samma jord-lösningsförhållande be ­
reds. Antalet prover bestäms av antalet tidsintervall som används 
för undersökning av adsorptionskinetiken. Efter centrifugering och i förekommande fall filtrering tas det första rörets vattenfas till vara så fullständigt som möjligt och mäts efter t.ex. 4 timmar, 
det andra rörets vattenfas mäts efter 8 timmar, det tredje rörets 
efter 24 timmar osv. 
b) Seriemetoden: Endast två likadana prover bereds för varje jord- 
lösningsförhållande. Faserna separeras genom centrifugering med 
bestämda tidsintervall. Ett litet delprov av vattenfasen analyseras omedelbart med avseende på testämnet, och därefter fortsätts tes ­
tet med den ursprungliga blandningen. Om filtrering utförs efter 
centrifugeringen bör laboratoriet ha lämplig utrustning för filtre ­
ring av små delprover av vattenlösning. Det rekommenderas att den totala volymen delprover som tas inte överskrider 1 % av lösningens totalvolym, så att det inte uppstår signifikanta änd ­
ringar i jord-lösningsförhållandet och minskningar i den mängd 
av löst ämne som är tillgänglig för adsorption under testet. 
Den procentuella adsorptionen
 A t i beräknas för varje tidpunkt (t  i ) på 
grundval av den nominella ursprungskoncentrationen och den upp ­
mätta koncentrationen vid tidpunkten för provtagningen ( A t i ), med 
korrigering för blindprovets värde. En kurva där avsätts mot tiden (figur 1 i tillägg 5) ritas upp för uppskattning av jämviktsplatån (
 1 ). 
Likaså beräknas K  d -värdet vid jämvikt. Utifrån detta K  d -värde väljs 
lämpliga jord-lösningsförhållanden i figur 1 så att den procentuella adsorptionen hamnar över 20 %, och helst över 50 % (61). De till ­
lämpliga ekvationerna och principerna för uppritningen av kurvan 
ges i avsnittet ”Data och rapportering” och i bilaga 5.
 
1.9.2.2  Bestämning av adsorptionens jämviktstid och mängden av testämne 
som adsorberats vid jämvikt  
Kurvor där  A t i ellerhar  C aq ads avsatts mot tiden används, såsom tidi ­
gare nämnts, för att uppskatta när adsorptionsjämvikt inträtt och 
vilken mängd av testämne som adsorbcrats vid jämvikt. 1 figur 1 
och 2 i tillägg 5 finns exempel på sådana kurvor. Jämviktstiden är den tid som systemet behöver för att nå en platå.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1205  
( 1 ) Jämviktsplatån kan också uppskattas genom att i ett diagram avsätta testämnets kon ­
centration i vattenfasen (  C aq ads Ê Ì  
)mot tiden (se figur 2 i bilaga 5).
 Om en viss jord inte ger upphov till någon platå utan en oavbruten 
ökning, kan detta bero på komplicerande faktorer såsom biologisk 
nedbrytning eller långsam diffusion. Biologisk nedbrytning kan kon ­
stateras genom att man upprepar testet med ett steriliserat prov av jorden. Om man fortfarande inte uppnår någon platå är det skäl att 
forska efter andra tänkbara faktorer. Detta kan göras med lämpliga 
ändringar av testbetingelserna (temperatur, omröringstider, jord-lös ­
ningsförhållande etc.). Testledaren får avgöra om det är värt att fortsätta testet även om jämvikt inte kan uppnås.
 
1.9.2.3  Adsorption på testkärlets yta och testämnets stabilitet  
Vissa indikationer rörande testämnets adsorption på testkärlets yta 
och rörande testämnets stabilitet kan fås fram genom analys av kon ­
trollproverna. Om en minskning som är större än analysmetodens 
standardfel konstateras kan detta bero på abiotiskt sönderfall och/el ­
ler adsorption på testkärlets yta. För att avgöra vilket fenomen som är aktuellt tvättas testkärlets grundligt med en känd volym av lämp ­
ligt lösningsmedel, varefter tvättlösningen analyseras med avseende 
på testämnet. Om analysen visar att ingen adsorption på testkärlets yta har skett, beror minskningen på att testämnet är abiotiskt insta ­
bilt. Om adsorption kan konstateras, är det nödvändigt att byta till 
testkärl av annat material. Dessa resultat gällande adsorption på test ­
kärlets yta kan dock inte direkt extrapoleras till testet med jord och lösning, eftersom adsorptionen i det senare fallet påverkas av att jord ar närvarande. 
Ytterligare uppgifter om testämnets stabilitet kan fas fram genom att 
man gör upp en massbalans som funktion av tiden. Detta görs genom 
att vattenfasen, extrakt av jord samt testkärlets väggar analyseras med avseende pä testamnet. Skillnaden mellan massan av tillsatt ämne och summan av testämnesmassorna i vattenfasen, i jordextrak ­
ten och på testkärlets väggar är lika med den massa som brutits ned 
eller förflyktigats eller som inte har extraherats. En förutsättning för att massbalansen ska kunna bestämmas är att adsorptionsjämvikt uppnås inom den tid som går åt för testet. 
Massbalansen bestäms för båda jordarna och för ett jord-lösnings ­
förhällande för respektive jord som vid jämvikt ger en adsorption på 
över 20 %, och helst över 50 %. När proceduren för att få fram lämpliga jord-lösningsförhållanden har avslutats med analysen av det sista provet av vattenfas efter 48 timmar, separeras faserna genom 
centrifugering och, om så önskas, filtrering. Så mycket vattenfas som 
möjligt tas tillvara, och ett lämpligt extraktionslösningsmedel (med extraktionskoefficient på minst 95 %) tillsätts jorden för att testämnet ska extraheras. Minst två extraktioner i följd rekommenderas. Mäng ­
den av testämne i extrakten från jord och testkärl bestäms, och mass ­
balansen beräknas (se ekvation 10, Data och rapportering). Om massbalansen är under 90 % anses testämnet vara instabilt inom testets tidsskala. Undersökningarna kan emellertid fortsättas om 
man tar testämnets instabilitet med i beräkningen, och i sådana fall 
är det tillrådligt att vid huvudundersökningen analysera båda faserna.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1206
 
1.9.3  Skede 2 – Adsorptionskinetik vid en given koncentration av testämnet  
Fem jordar väljs enligt tabell 1. Det är till fördel om dessa fem jordar 
inbegriper en del eller alla av de jordar som använts för den för ­
beredande undersökningen. Då behöver skede 2 inte upprepas för 
den förberedande undersökningens jordar. 
Jämviktstiden, jord-lösningsförhållandet, jordprovets vikt, volymen 
av vattenfasen i kontakt med jord samt testämnets koncentration i 
lösningen väljs på grundval av resultaten från den förberedande un ­
dersökningen. Analys ska helst utföras efter en kontakttid på 2, 4, 6, 8 (eventuellt även 10) och 24 timmar. Omröringstiden kan vid behov 
förlängas till högst 48 timmar om ämnet kräver längre jämviktstid. 
Vid behov kan analystidpunkterna anpassas. 
Varje test (en jord och en lösning) görs minst två gånger för att man 
ska få en indikation på resultatens varians. För varje test görs också 
ett blindtest. Det görs på jord och 0,01 M CaCl
 2 -lösning utan tes ­
tämne och med samma vikt och volym som vid det riktiga testet. Som kontroll görs samma testprocedur på ett kontrollprov med en ­
bart testämnet i 0,01 M CaCl
 2 -lösning (utan jord) som ett sätt att 
skydda sig mot oförutsedda faktorer. 
Den procentuella adsorptionen beräknas för varje tidpunkt  A t i eller 
tidsintervall  A Δt i (efter behov) och avsätts mot tiden i ett diagram. 
Likaså beräknas fördelningskoefficienten K  d vid jämvikt samt den 
normaliserade adsorptionskoefficienten K  oc (för opolära organiska 
ämnen). 
Resultat av adsorptionskinetiktest 
Det linjära K  d -värdet duger i allmänhet till att med tillräcklig nog ­
grannhet beskriva sorptionsbeteendet i jord (35) (78), och det repre ­
senterar ett uttryck för ämnenas inherenta rörlighet i jord. Som ex ­
empel kan nämnas att allmänt förekommande kemiska ämnen med 
K d ≤ 1 cm  3 g -1 i regel anses vara kvalitativt rörliga. Ett system för 
rörlighetsklassificering enligt K  oc -värden har konstruerats av MacCall 
et al. (16). Det finns också system för urlakningsklassificering som 
bygger på ett samband mellan K  oc och DT-50 (  1 ) (32) (79). 
Enligt felanalyser (61) kan K  d -värden under 0,3 cm  3 g -1 inte upp­
skattas med tillräcklig noggrannhet på grundval av en koncent ­
rationsminskning i vattenfasen, inte ens när det (ur noggrannhets ­
synpunkt) gynnsammaste jordlösningsförhållandet används, dvs. 1:1. 1 detta fall rekommenderas analys av både jord- och lösnings ­
fasen.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1207  
( 1 ) DT-50: nedbrytningstiden för 50 % av testämnet.
 Med hänvisning till ovannämnda anmärkningar är det tillrådligt att 
undersökningen av ämnets adsorptionsbeteende i jord och dess po ­
tentiella rörlighet fortsätts genom bestämning av Freundlich-adsorp ­
tionsisotermer för sådana system där en tillräckligt noggrann bestäm ­
ning av K  d är möjlig enligt schemat för den föreliggande testmeto ­
den. En noggrann bestämning är möjlig om det värde som fås fram 
genom att multiplicera K  d med jordlösningsförhållandet är > 0,3 när 
mätningarna grundar sig på en koncentrationsminskning i vattenfasen (indirekt metod), eller > 0,1 när båda faserna analyseras (direkt 
metod) (61).
 
1.9.4  Skede 3 – Adsorptionsisotermer, desorptionskinetik och desorptions ­
isotermer  
1.9.4.1 A d s o r p t i o n s i s o t e r m e r 
Fem testämneskoncentrationer används, helst så att de sträcker sig 
över två tiopotenser. Vid valet av koncentrationer ska vattenlöslig ­
heten och de resulterande jämviktskoncentrationerna i vattenlösning tas med i beräkningen, jordarnas respektive jord-lösningsförhållanden ska hällas konstanta genom hela undersökningen. Adsorptionstestet 
utförs enligt beskrivningen ovan, med enda skillnaden att vattenfasen 
bara analyseras en gång. efter den tid som enligt skede 2 går åt för att uppnå jämvikt. Jämviktskoncentrationerna i lösningen bestäms, och den adsorberade mängden beräknas på grundval av minskningen 
av testämne i lösningen, eller med hjälp av den direkta metoden. Den 
adsorberade massan per enhet jordmassa avsätts mot testämnets jäm ­
viktskoncentration i ett diagram (se Data och rapportering). 
Resultat av adsorptionsisotermtest Av alla hittills framlagda matematiska adsorptionsmodeller är 
Freundlich-isotermerna en av de mest använda när det gäller att 
beskriva adsorptionsprocesser. För närmare uppgifter om hur man 
tolkar adsorptionsmodeller och om deras betydelse hänvisas till ar ­
betena (41) (45) (80) (81) (82).  
Anmärkning:  Det bör nämnas att jämförelse av K^-värden (Freund ­
lich-adsorptionskocfficienter) för olika ämnen bara är möjlig om K, 
-värdena är uttryckta i samma måttenhet (83).
 
1.9.4.2 D e s o r p t i o n s k i n e t i k 
Syftet med detta test är att undersöka om ett ämne adsorberas rever ­
sibelt eller irreversibelt i en jord. Denna upplysning är betydelsefull 
eftersom desorptionsprocessen också spelar en viktig roll för hur ett 
ämne beter sig i fältjord. Dessutom är desorptionsdata värdefulla som indata när man vill skapa datormodeller för simulering av urlakning och avrinning av lösta ämnen. Om även desorptionen ska undersökas 
är det tillrådligt att den nedan beskrivna undersökningen utförs på 
varje system för vilket man kunnat göra en noggrann bestämning av K
 d i det föregående adsorptionskinetiktestet. 
Desorptionskinetiken kan, på samma sätt som adsorptionskinetiken, 
undersökas på två alternativa sätt: a) parallellmetoden och b) serie ­
metoden. Vilken metod som används får avgöras utifrån laboratoriets 
utrustning och resurser.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1208
 
a) Parallellmetoden: För varje jord som har valts för desorptions ­
undersökning bereds ett antal prover med samma jord-lösnings ­
förhållande. Antalet prover är samma som antalet tidpunkter vid vilka man önskar undersöka adsorptionskinetiken. Helst ska man använda samma tidsintervall som vid adsorptionskinetiktestet, 
även om totaltiden kan förlängas efter behov så att desorptions ­
jämvikt uppnås. För varje test (en jord och en lösning) körs ett blindprov. Detta består av jorden och 0,1 M CaCl
 2 -lösning, utan 
testämne, med samma vikt respektive volym som vid det riktiga 
testet. Som kontroll utförs samma testprocedur på enbart testäm ­
net i 0,01 M CaCl  2 -lösning (utan jord). Alla blandningar av jord 
med lösning rörs om tills adsorptionsjämvikt uppnås (enligt re ­
sultaten från skede 2). Därefter separeras faserna med centrifuge ­
ring, och så mycket som möjligt av vattenfasen avlägsnas. Voly ­
men avlägsnad lösning ersätts med en lika stor volym av 0,01 M CaCl
 2 utan testämne, och den nya blandningen rörs om igen. 
Vattenfasen från det första röret tas till vara så fullständigt som 
möjligt och mäts efter t.ex. 2 timmar, vattenfasen från det andra 
röret efter 4 timmar, från det tredje efter 6 timmar osv., tills desorptionsjämvikt uppnås. 
b) Seriemetoden: Efter adsorptionskinetiktestet centrifugeras bland ­
ningen, och så mycket som möjligt av vattenfasen avlägsnas. Den 
borttagna lösningens volym ersätts med lika stor volym av 0,01 M CaCl
 2 utan testämne. Den nya blandningen rörs om tills de ­
sorptionsjämvikt uppnås. Under denna omröringstid centrifugeras 
blandningen med bestämda tidsintervall så att faserna separeras. 
Ett litet delprov av vattenfasen analyseras omedelbart med avse ­
ende på testämnet, och därefter fortsätts testet med den ursprung ­
liga blandningen. Volymen för varje enskilt delprov ska vara 
mindre än 1 % av totalvolymen. Samma mängd av färsk 0,01 
M CaCl  2 -lösning tillsätts blandningen för att bibehålla förhållan ­
det mellan jord och lösning, och omröringen fortsätts under nästa tidsintervall. 
Den procentuella desorptionen beräknas för varje tidpunkt (
ðD t i Þ) 
eller tidsintervall ( ðD Δt i Þ) (beroende pä vad som krävs för testet) 
och avsätts mot tiden i ett diagram. Likaså beräknas desorptions ­
koefficienten K  des vid jämvikt. De aktuella ekvationerna finns i av ­
snittet Data och rapportering och i tillägg 5. 
Resultat från desorptionskinetiktest Adsorptionsprocessens reversibilitet kan uppskattas med hjälp av ett 
diagram där den procentuella desorptionen
 D t i och adsorptionen  A t i har avsatts mot tiden (i samma diagram). Om desorptionsjämvikt 
uppnås inom två gånger tiden för adsorptionsjämvikt, och den totala desorptionen ar mer än 75 % av den adsorberade mängden, anses 
adsorptionen vara reversibel.
 
1.9.4.3 D e s o r p t i o n s i s o t e r m e r 
Freundlich-desorptionsisotermerna bestäms på de jordar som används 
i adsorptionsisotermtestet. Desorptionstestet utförs enligt beskriv ­
ningen i avsnittet Desorptionskinetik, med undantag av att vattenfa ­
sen bara analyseras en gång, vid desorptionsjämvikt. Mängden av desorberat testämne beräknas. Halten av kvarvarande adsorberat tes ­
tämne i jorden vid desorptionsjämvikt avsätts i ett diagram mot tes ­
tämnets jämviktskoncentration i lösningen (se Data och rapportering 
samt tillägg 5).
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1209
 
2. DATA OCH RAPPORTERING  
Data från analysen ska presenteras i tabellform (se bilaga 6). De 
enskilda mätningarna och beräknade medeltal ska anges. Adsorp ­
tionsisotermerna ska presenteras i diagramform. Beräkningarna ska 
göras på nedan beskrivet sätt. 
Vid beräkningarna antas att vikten av 1 cm  3 vattenlösning är 1 g. 
Därför kan jord-lösningsförhållandet uttryckas med samma värde 
oberoende av om vikt/vikt eller vikt/volym valts som måttenhet.  
2.1 ADSORPTION 
Adsorptionen ( A t i ) uttrycks i procent och definieras såsom förhål ­
landet mellan den mängd av ämne som under testbetingelserna har adsorberats i jorden och den mängd som fanns närvarande vid testets början. Om testämnet är stabilt och inte i någon signifikant grad 
adsorberas på kärlets väggar beräknas
 A t i vid varje tidpunkt t  i enligt 
följande ekvation:  
A t i ¼ m s ads ðt i Þ · 100 
m 0 ð%Þ (3) 
där: 
A t i = den procentuella adsorptionen vid tidpunkten t  i ( %),  
m s ads ðt i Þ = massan av testämne som adsorberats i jorden vid tid ­
punkten t  i (μg), 
m 0 = massan av testämne i provröret, vid testets början ( μg). 
Närmare anvisningar för hur den procentuella adsorptionen  A t i be­
räknas för parallell- respektive seriemetoden finns i tillägg 5. 
Fördelningskoefficienten K  d är förhållandet mellan ämnets halt i 
jordfasen och ämnets masskoncentration i vattenlösningen när ad ­
sorptionsjämvikt har inträtt, under testbetingelserna.  
K d ¼ C s ads ðeqÞ 
C aq ads ðeqÞ ¼ m s ads ðeqÞ 
m aq ads ðeqÞ · V 0 
m soil (cm  3 g -1 ) (4) 
där: 
C s ads ðeqÞ = halten av adsorberat ämne i jord vid adsorptionsjäm ­
vikt (μg g  -1 ), 
C aq ads ðeqÞ = ämnets masskoncentration i vattenfasen vid adsorp ­
tionsjämvikt ( μg cm  -3 ). Koncentrationen bestäms på 
analytisk väg med beaktande av värdet från blindpro ­
vet. 
m s ads ðeqÞ = massan av ämne som adsorberats i jord vid adsorp ­
tionsjämvikt ( μg), 
m aq ads ðeqÞ = ämnets massa i lösningen vid adsorptionsjämvikt ( μg), 
m jord = mängd av jordfas, uttryckt som torr jordmassa (g), 
v 0 = ursprunglig volym av vattenfas i kontakt med jord 
(cm  3 ). 
Sambandet mellan A  eq och K  d ges av:  
K d ¼ A eq 
100 Ä A eq · V 0 
m jord (cm  3 g -1 ) (5)  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1210
 
där: 
A eq = procentuell adsorption vid adsorptionsjämvikt, %. 
Den normaliserade adsorptionskoefficienten för organiskt kol 
K oc bestämmer sambandet mellan fördelningskoefficienten K  d och 
halten av organiskt kol i jordprovet:  
K oc ¼ K  d · 100 
%OC  (cm  3 g -1 ) (6) 
där: 
% oc = procentuell andel organiskt kol i jordprovet (g g  -1 ). 
Koefficienten K  oc representerar ett värde som beskriver hur 
huvudsakligen opolära organiska ämnen fördelas mellan a ena sidan 
jordens eller sedimentets organiska kol och å andra sidan vattnet. Sådana ämnens adsorption är beroende av den sorberande fasta fasens organiska innehåll (7), och därför beror K
 oc -värdet på de 
humösa fraktionernas specifika egenskaper, eftersom sorptions ­
kapaciteten hos dessa fraktioner kan variera kraftigt beroende på deras olika ursprung, uppkomst osv.
 
2.1.1  Adsorptionsisotermer  
Ekvationen för Freundlich-adsorptionsisotermer ger sambandet 
mellan mängden av adsorberat testämne och testämnets koncent ­
ration i lösningen vid jämvikt (ekvation 8). 
Data behandlas på samma sätt som i punkten ”Adsorption” ovan, 
och halten av adsorberat testämne i jorden efter adsorptionstestet  
C s ads ðeqÞ, på andra ställen betecknat som x/m) beräknas för varje 
provrör, under antagandet att jämvikt har inträtt och 
attC s ads ðeqÞrepresenterar jämviktsvärdet:  
C s ads ðeqÞ ¼ m s ads ðeqÞ 
m jord ¼ C 0 Ä C aq ads ðeqÞ h i
: V 0 
m jord (μg g  -1 ) (7) 
Freundlich-adsorptionsekvationen (8) ser ut så här:  
C s ads ðeqÞ ¼ K F ads Ö C aq ads ðeqÞ 1=n (μg g  -1 ) (8) 
eller i linjär form:  
logC  s ads ðeqÞ ¼ logK  F ads þ 1=n·logC  aq ads ðeqÞ (9) 
där: 
K F ads = Freundlich-adsorptionskoefficienten, som anges i 
dimensionen cm  3 g -1 bara om exponenten l/n = 1. 1 alla andra 
fall införs l/n i dimensionen för K F ads (μg 1-1/n (cm  3 ) 1/n g -1 ) 
n = regressionskoefficienten. l/n ligger i regel mellan 0,7 och 1,0 
som indikation på att sorptionsdata ofta är något olinjära. 
Ekvationerna (8) och (9) ritas upp i diagram, och värdena på  
K F ads och l/n beräknas med regressionsanalys med hjälp av ekvation 
9. Likaså beräknas den logaritmiska ekvationens korrelationskoeffi ­
cient r. Exempel på kurvor av detta slag finns i figur 2.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1211
 
Figur 2  Freundlich-adsorptionskurva (normal respektive linjanserad)  
2.1.2  Massbalans  
Massbalansen (MB) anges i procent och definieras som förhållandet 
mellan den mängd av ämnet som analytiskt kan tas till vara efter adsorptionstestet och den nominella mängden av ämnet vid testets 
början. 
Behandlingen av resultaten blir annorlunda om lösningsmedlet är 
fullständigt blandbart med vatten. Då kan man behandla resultaten 
på samma sätt som i punkten ”Desorption” för att bestämma den 
mängd av ämnet som tagits till vara genom extraktion av lösnings ­
medel. Om lösningsmedlet är mindre blandbart med vatten krävs en bestämning av den tillvaratagna mängden. 
Massbalansen MB för adsorptionen beräknas enligt följande ekva ­
tion, under antagandet att termen (m
 E ) motsvarar summan av de 
testämnesmassor som extraherats ur jorden och från testkärlets yta 
med hjälp av ett organiskt lösningsmedel:  
MB ¼ V rec ·C aq ads ðeqÞ þ m E Ê Ì  
·100 
V 0 ·C 0 ð%Þ (10) 
där: 
MB = massbalans ( %) 
m E = total massa av testämne som extraherats ur jorden och från 
testkärlets väggar i två steg ( μg), 
C 0 = ursprunglig masskoncentration i testlösningen som är i kon ­
takt med jord ( μg cm  3 ), 
V rec = volymen supernatant som tagits till vara efter adsorptions ­
jämvikt (cm  -3 ). 
2.2 DESORPTION 
Desorptionen (D) uttrycks i procent och definieras som förhållandet 
mellan den desorberade mängden av testämnet och den tidigare ad ­
sorberade mängden av ämnet, under testbetingelserna:  
D t i ¼ m aq des ðt i Þ 
m s ads ðeqÞ · 100ð%Þ (11) 
där: 
D t i = procentuell desorption vid tidpunkten t  i ( %),  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1212
 
m aq des ðt i Þ = massan av testämne som desorberats ur jorden vid tid ­
punkten t  i (μg), 
m s ads ðeqÞ = massan av testämne som adsorberats i jorden vid ad ­
sorptionsjämvikt ( μg). 
Närmare anvisningar för sättet att beräkna den procentuella desorp ­
tionen  D t i för parallell- och seriemetoden finns i bilaga 5. 
Den skenbara desorptionskoefficienten (K  des ) är, under de aktuella 
testbetingelserna, förhållandet mellan massan av ämne som finns 
kvar i jordfasen och massan av desorberat ämne i vattenlösningen, när desorptionsjämvikt har inträtt:
 
K des ¼ m s ads ðeqÞ Ä m aq des ðeqÞ 
m aq des ðeqÞ V T 
m soil (cm  3 g -1 ) (12) 
där: 
K des = desorptionskoefficient (cm  3 g -1 ): 
m aq des ðeqÞ = totala massan av testämne som desorberats ur jord vid 
desorptionsjämvikt ( μg), 
V r = totala volymen av vattenfas i kontakt med jord under 
desorptionskinetiktestet (cm  3 ). 
Anvisningar för beräkning av m aq des ðeqÞfinns i tillagg 5 under rubriken 
”Desorption”. 
Anmärkning: Om adsorptionstestet som föregår desorptionstestet utförts med pa ­
rallellmetoden, kan volymen V
 T i ekvation (12) sättas lika med V  o . 
2.2.1  Desorptionsisotermer  
Ekvationen för Frcundlich-desorptionsisotermer beskriver sambandet 
mellan mängden av testämne som förblir adsorberat i jorden och koncentrationen av testämne i lösningen vid desorptionsjämvikt (ek ­
vation 16). 
Halten av ämne som förblir adsorberat i jorden vid desorptionsjäm ­
vikt beräknas för varje provrör enligt följande:
 
C s des ðeqÞ ¼ m s ads ðeqÞ Ä m aq des ðeqÞ 
m soil (μg g  -1 ) (13)  
m aq des ðeqÞ definieras som:  
m aq des ðeqÞ ¼ m  m des ðeqÞ · V 0 
V r F Ä m  aq A (μg) (14) 
där: 
C s des ðeqÞ = balten av testämne som förblir adsorberat i jorden vid 
desorptionsjämvikt ( μg g  -1 ), 
m m des ðeqÞ = massan av ämne som bestämts analytiskt i vattenfa ­
sen vid desorptionsjämvikt ( μg), ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1213
 
m aq A = massan av testämne som blivit över (efter att adsorp ­
tionsjämvikt inträtt) på grund av ofullständig volym ­
ersättning ( μg), 
m aq des ðeqÞ = massan av ämne i lösningen vid adsorptionsjämvikt 
(μg), 
m aq A ¼ m  aq ads ðeqÞ · V 0 Ä V R 
V 0 Í Î  
(15) 
V r F = volymen av lösning som tagits ur röret för uppmätning av 
testämnet vid desorptionsjämvikt (cm  3 ), 
V R = volymen av supernatant som avlägsnats ur röret efter att 
adsorptionsjämvikt inträtt och som ersatts med samma vo ­
lym av 0,01 M CaCl  2 -lösning (cm  3 ). 
Freundlich-desorptionsekvationen (16) ser ut så här:  
C s des ðeqÞ ¼ K  F des · C aq des ðeqÞ 1=n (μg g -1 ) (16) 
eller i linjär form:  
log C  s des ðeqÞ ¼ log K  F des þ 1=n · log C  aq des ðeqÞ (17) 
där: 
K F des = Freundlich-desorptionskoefficienten. 
n = regressionskoefficienren,  
C aq des ðeqÞ = ämnets masskoncentration i vattenfasen vid desorp ­
tionsjämvikt ( μg cm  -3 ). 
Ekvationerna 16 och 17 kan ritas upp i diagram, och värdet på  K F des 
och l/n beräknas med regressionsanalys med hjälp av ekvation 17. 
Anmärkning: Om Freundlichs adsorptions- eller desorptionsexponent l/n är lika 
med 1, blir Freundlichs adsorptions- eller desorptionskoefficient (
K F ads respektive  K F des ) lika med adsorptionens respektive desorptio ­
nens jämviktskoefficient (K  d och K  des ), och kurvorna över C  s som 
funktion av C  aq blir linjära. Om exponenten är skild från 1, blir 
kurvorna över C  s som funktion av C  aq olinjära, och adsorptions- 
och desorptionskoefficienterna kommer att variera längs isotermerna.  
2.2.2  Rapport  
Testrapporten ska innehålla följande uppgifter: 
— Fullständiga uppgifter om jordproverna, inbegripet följande: — områdets geografiska läge (latitud och longitud), — provtagningsdatum,
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1214
 
— bruksändamål (t.ex. jordbruk, skog osv.), 
— provtagningsdjup, — halt av sand, silt och clay, — pH-värden (i 0,01 M CaCl
 2 ), 
— halt av organiskt kol, 
— halt av organiskt material, — kvävehalt, — kol-kväveförhållande, — katjonbyteskapacitet (mmol/kg), 
— alla uppgifter av betydelse som ror provtagning och förvaring av 
jordproverna, 
— i förekommande fall, alla uppgifter av betydelse för tolkning av 
testämnets adsorption och desorption, 
— uppgift om vilka metoder som använts för bestämning av en ­
skilda parametrar. 
— Relevanta uppgifter om testämnet 
— Testtemperaturen 
— Centrifugeringsbetingelser — Analysprocedurer som använts för analys av testämnet — I förekommande fall motivering för användning av hjälplösnings ­
medel för beredning av testämnets stam lösning 
— 1 förekommande fall förklaringar av korrigeringar som gjorts i 
beräkningarna 
— Data enligt blanketten (bilaga 6) och diagram — Alla uppgifter och observationer som kan vara till hjälp för att 
tolka testresultaten.
 
3. HÄNVISNINGAR  
1. Kukowski H. and Brummer C. (1987), Investigations on the 
Adsorption and Desorption of Selected Chemicals in Soils. UBA Report 106 02 04 5, Part II. 
2. Fränzle O., Kuhnt G. and Vetter L. (1987), Selection of Repre ­
sentative Soils in the LC-Territory. UBA Report 106 02045, Part I. 
3. Kuhnt G. and Muntau H. (Eds.), EURO-Soils: Identification, 
Collection, Treatment, Characterisation. Special Publication 
No 1.94.60, Joint Research Centre. European Commission, ISPRA, December 1994. 
4. OECD Test Guidelines Programme, Final Report of the OECD 
Workshop on Selection of Soils/Sediments, Belgirate, Italy, 18–20 January 1995 (June 1995). 
5. US Environment Protection Agency: Pesticide Assessment Gui ­
delines, Subdivision N, Chemistry: Environmental Fate. Series 
163-1, Leaching and Adsorption/Desorption Studies, Addendum 
6 on Data Reporting. 540/09-88-096, Date: 1/1988.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1215
 
6. US Environment Protection Agency: Prevention, Pesticides and 
Toxic Substances, OPPTS Harmonized Test Guidelines, Series 
835-Fate, Transport and Transformation Test Guidelines, OPPTS No: 835.1220 Sediment and Soil Adsorption/Desorption Isotherm. EPA No: 71 2-C-96-048, April 1996. 
7. ASTM Standards, E 1195-85, Standard Test Method for Deter ­
mining a Sorption Constant (K
 oc ) for an Organic Chemical in 
Soil and Sediments. 
8. Agriculture Canada: Environmental Chemistry and Fate. Guide ­
lines for registration of pesticides in Canada, 15 July 1987. 
9. Netherlands Commission Registration Pesticides (1995), Appli ­
cation for registration of a pesticide. Section G. Behaviour of 
the product and its metabolites in soil, water and air. 
10. Danish National Agency of Environmental Protection (October 
1988), Criteria for registration of pesticides as especially dang ­
erous to health or especially harmful to the environment. 
11. BBA (1990), Guidelines for the Official Testing of Plant Pro ­
tection Products, Biological Research Centre for Agriculture and Forestry, Braunschweig, Germany. 
12. Calvet R. (1989), ”Evaluation of adsorption coefficients and the 
prediction of the mobilities of pesticides in soils”, in Methodo ­
logical Aspects of the Study of Pesticide Behaviour in Soil (ed. P. Jamet), INRA, Paris, (Review). 
13. Calvet R. (1980), ”Adsorption-Desorption Phenomena” in Inte ­
ractions between herbicides and the soil. (R. J. Hance ed.), Academic Press, London, s. 83–122. 
14. Hasset J. J. and Banwart W.L. (1989), ”The sorption of nonpo ­
lar organics by soils and sediments” in Reactions and Move ­
ment of Organic Chemicals in Soils. Soil Science Society of America (S.S.S.A), Special Publication no. 22, s. 31–44. 
15. van Genuchten M. Th., Davidson J. M. and Wierenga P.J. 
(1974), ”An evaluation of kinetic and equilibrium equations for the prediction of pesticide movement through porous me ­
dia”. Soil Sci. Soc. Am. Proc, Vol. 38(1), s. 29–35. 
16. McCall P.]., Laskowski D. A., Swann R. L. and Dishburger H. J. 
(1981), ”Measurement of sorption coefficients of organic chemicals and their use, in environmental fate analysis”, in Test 
Protocols for Environmental Fate and Movement of Toxicants. 
Proceedings of AOAC Symposium, AOAC, Washington DC. 
17. Lambert S. M., Porter P. E. and Schieferrstein R. H. (1965), 
”Movement and sorption of chemicals applied to the soil”, We ­
eds, 13, s. 185–190. 
18. Rhodes R. C, Belasco I. J. and Pease H. L. (1970) ”Determi ­
nation of mobility and adsorption of agrochemicals in soils”. 
J.Agric.Food Chem., 18, s. 524–528. 
19. Russell M. H. (1995), ”Recommended approaches to assess 
pesticide mobility in soil” in Environmental Behavior of Agro ­
chemicals (ed. T. R. Roberts and P. C. Kearney). John Wiley & 
Sons Ltd. 
20. Esser H. O., Hemingway R. J., Klein W., Sharp D. B., Vonk J. 
W. and Holland P. T. (1988), ”Recommended approach to the 
evaluation of the environmental behavior of pesticides”, IUPAC 
Reports on Pesticides (24). Pure Appl. Chem., 60, s. 901–932.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1216
 
21. Guth J. A., Burkhard N. and D. O. Eberle (1976), ”Experimen ­
tal models for studying the persistence of pesticides in soils”. 
Proc. BCPC Symposium: Persistence of Insecticides and Herbi ­
cides, s. 137–157, BCPC, Surrey, UK. 
22. Furminge C. G. L. and Osgerby J. M. (1967), ”Persistence of 
herbicides in soil”. J. Sci. Fd Agric, 18, s. 269–273. 
23. Burkhard N. and Guth J. A. (1981), ”Chemical hydrolysis of 2- 
Chloro-4,6-bis(alkylamino)-l,3,5-triazine herbicides and their breakdown in soil under the influence of adsorption”. Pestic. 
Sci. 12, s. 45–52. 
24. Guth J. A., Gerber H. R. and Schlaepfer T. (1977), ”Effect of 
adsorption, movement and persistence on the biological avail ­
ability of soil-applied pesticides”. Proc. Br. Crop Prot. Conf., 3, s. 961–971. 
25. Osgerby J. M. (1973), ”Process affecting herbicide action in 
soil”. Pestic. Sci., 4, s. 247–258. 
26. Guth J. A. (1972), ”Adsorptions- und Einwascheverhalten von 
Pflanzenschutzmitteln in Böden”. Schr. Reihe Ver. Wass.-Bo ­
den-Lufthyg. Berlin-Dahlem, Heft 37, s. 143–154. 
27. Hamaker J. W. (1975), ”The interpretation of soil leaching 
experiments”, in Environmental Dynamics of Pesticides (eds R. Haque and V.H. freed), s. 135–172, Plenum Press, NY. 
28. Helling C. S. (1971). ”Pesticide mobility in soils”. Soil Sci. 
Soc. Amer. Proc., 35, s. 732–210. 
29. Hamaker J. W. (1972), ”Diffusion and volatilization” in Organic 
chemicals in the soil environment (C.A.I. Goring and J. W. 
Hamaker eds), Vol. I, s. 49–143. 
30. Burkhard N. and Guth J. A. (1981), ”Rate of volatilisation of 
pesticides from soil surfaces; Comparison of calculated results 
with those determined in a laboratory model system”. Pestic. Sci. 12, s. 37–44. 
31. Cohen S. Z., Creeger S. M., Carsel R.F. and Enfield CG. 
(1984), ”Potential pesticide contamination of groundwater from agricultural uses”, in Treatment and Disposal of Pesticide 
Wastes, s. 297–325, Acs Symp. Ser. 2 59, American Chemical 
Society, Washington, DC. 
32. Gustafson D. I. (1989), ”Groundwater ubiquity score: a simple 
method for assessing pesticide leachability”. J. Environ. Toxic. Chem., 8(4), s. 339–357. 
33. Leistra M. and Dekkers W. A. (1976). ”Computed effects of 
adsorption kinetics on pesticide movement in soils”. J. of Soil 
Sci., 28, s. 340–350. 
34. Bromilov R. H. and Leistra M. (1980), ”Measured and simula ­
ted behavior of aldicarb and its oxydation products in fallow soils”. Pest. Sei., 11, s. 389–395. 
35. Green R. E. and Karickoff S. W. (1990), ”Sorption estimates for 
modeling”, in Pesticides in the Soil Environment: Process, Im ­
pacts and Modeling (ed. H.H. Cheng). Soil Sci. Soc. Am., Book 
Series no. 2, s. 80–101, 
36. Lambert S. M. (1967), ”Functional relationship between sorp ­
tion in soil and chemical structure”. J. Agri. Food Chem., 15, 
s. 572–576.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1217
 
37. Hance R. J.(1969), ”An empirical relationship between chemical 
structure and the sorption of some herbicides by soils”, Agri. 
Food Chem., 17, s. 667–668. 
38. Briggs G. G. (1969), ”Molecular structure of herbicides and 
their sorption by soils”, Nature, 223, 1288. 
39. Briggs G. G. (1981), ”Theoretical and experimental relations ­
hips between soil adsorption, octanol-water partition coeffici ­
ents, water solubilities, bioconcentration factors, and the para ­
chor”, J. Agric. Food Chem., 29, s. 1050–1059. 
40. Sabljic A. (1984), ”Predictions of the nature and strength of soil 
sorption of organic polutance by molecular topology”. J. Agric. 
Food Chem., 32, s. 243–246. 
41. Bailey G. W. and White J. L. (1970), ”Factors influencing the 
adsorption, desorption, and movement of pesticides in soil”. Residue Rev., 32, s. 29–92. 
42. Bailey G. W., J. L. White and Y. Rothberg (1968), ”Adsorption 
of organic herbicides by montomorillonite: Role of pH and chemical character of adsorbate”, Soil Sci. Soc. Amer. Proc. 
32: s. 222–234. 
43. Karickhoff S. W. (1981), ”Semi-empirical estimation of sorption 
of hydrophobic pollutants on natural sediments and soils”, Che ­
mosphere 10, s. 833–846. 
44. Paya-Perez A., Riaz M. and I.arsen B. (1989), ”Soil Sorption of 
6 Chlorobenzenes and 20 PCB Congeners”. Environ. Toxicol. Safety 21, s. 1–17. 
45. Hamaker). W. and Thompson J. M. (1972), ”Adsorption in 
organic chemicals' in Organic Chemicals in the Soil Environ ­
ment” Goring C.A.I, and Hamaker J.W., eds., Vol I och II, Marcel Dekker, Inc., New York, NY, 1972, s. 49–143. 
46. Deli)., and Warren G. F. (1971), ”Adsorption, desorption and 
leaching of diphenamid in soils”. Weed Sci. 19: s. 67–69. 
47. Chu-Huang Wu, Buchring N., Davinson J. M. and Santelmann 
(1975), ”Napropamide Adsorption, desorption and Movement m soils”. Weed Science, Vol. 23, s. 454–457. 
48. Haues M. H. B., Stacey M. and Thompson J. M.. (1968), 
”Adsorption of s-triazine herbicides by soil organic prepara ­
tions” in Isotopes and Radiation in Soil Organic Studies, s. 75, International. Atomic Energy Agency, Wien. 
49. Pionke H. B. and Deangelis R. J. (1980), ”Methods for dis ­
tributing pesticide loss in field run-off between the solution and adsorbed phase”, CREAMS, in A Field Scale Model for Chem ­
icals, Run-off and Erosion from Agricultural Management Sy ­
stems, Chapter 19, Vol. III: Supporting Documentation, USDA Conservation Research report. 
50. ISO Standard Compendium Environment: Soil Quality – Gen ­
eral aspects: chemical and physical methods of analysis: biolog ­
ical methods of analysis. First Edition (1994). 
51. Scheffer F. and Schachtschabel. Lehrbuch der Bodenkunde, F, 
Enke Verlag, Stuttgart (1982), 11th edition. 
52. Black, Evans D. D., White J. L., Ensminger L.E. and Clark F. 
E., eds. ”Methods of Soil Analysis”, Vol 1 and 2, American 
Society of Agronomy, Madison, \VI, 1982.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1218
 
53. ISO/DIS 10381-1 Soil Quality – Sampling – Part 1: Guidance 
on the design of sampling programmes. 
54. ISO/DIS 10381-2 Soil Quality – Sampling – Part 2: Guidance 
on sampling techniques. 
55. ISO/DIS 10381-3 Soil Quality – Sampling – Part 3: Guidance 
on safety of sampling. 
56. ISO/DIS 10381-4 Soil Quality – Sampling – Part 4: Guidance 
on the investigation of natural and cultivated soils. 
57. ISO/DIS 10381-5 Soil Quality – Sampling – Part 5: Guidance 
on the investigation of soil contamination of urban and indu ­
strial sites. 
58. ISO 10381-6, 1993: Soil Quality – Sampling – Part 6: Guidance 
on the collection, handling and storage of soil for the assess ­
ment of aerobic microbial processes in the laboratory. 
59. Green R. E. and Yamane V. K. (1970), ”Precision in pesticide 
adsorption measurements”. Soil Sci. Am. Proc. 34, s. 353–354. 
60. Grover R. and Hance R. J. (1970), ”Effect of ratio of soil 
to water on adsorption of linuron and atrazine”, Soil Sci., s. 109–138. 
61. Boesten, J. J. T. I, ”Influence of soil/liquid ratio on the expe ­
rimental error of sorption coefficients in pesticide/soil system”, 
Pest. Sci. 1990, 30, s. 31–41. 
62. Boesten, J. J. T. I. ”Influence of soil/liquid ratio on the expe ­
rimental error of sorption coefficients in relation to OECD gui ­
deline 106”, Proceedings of 5th international workshop on en ­
vironmental behaviour of pesticides and regulatory aspects, Brussels, 26–29 April 1994. 
63. Bastide J., Cantier J. M., et Coste C (1980), ”Comportement de 
substances herbicides dans le sol en fonction de leur structure chimique”, Weed Res. 21, s. 227–231. 
64. Brown D. S. and Flagg E. W. (1981), ”Empirical prediction of 
organic pollutants sorption in natural sediments”, J. Envi ­
ron.Qual., 10(3), s. 382–386. 
65. Chiou C. T., Porter P. E., and Schmedding D. W. (1983), ”Par ­
tition equilibria of non-ionic organic compounds between soil organic matter and water”. Environ. Sci. Technol., 17(4), s. 227–231. 
66. Gerstl Z. and Mingelgrin U. (1984), ”Sorption of organic sub ­
stances by soils and sediments”, J. Environm. Sci. Health, B19 (3), s. 297–312. 
67. Vowles P. D. and Mantoura R. F. C (1987), ”Sediment-water 
partition coefficient and HPLC retention factors of aromatic hydrocarbons”, Chemosphere, 16(1), s. 109–116. 
68. Lyman W. J., Reehl W. F.and Rosenblatt D. H. (1990), Hand ­
book of Chemical Property Estimation Methods. Environmental Behaviour of Organic Compounds. American Chemical Society, 
Washington DC. 
69. Keniga E. E., and Goring, C. A. I. (1980), ”Relationship bet ­
ween water solubility, soil sorption, octanol-water partitioning and concentration of chemicals in the biota” in Aquatic Tox ­
icology (eds J.G. Eaton, et al.), s. 78–115, ASTM STP 707, 
Philadelphia.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1219
 
70. Chiou C. T., Peters L. J. and Freed V. H. (1979), ”A physical 
concept of soil-water equilibria for non-ionic organic com ­
pounds”, Science, Vol. 206, s. 831–832. 
71. Hassett). J., Banwart W. I., Wood S. G. and Means J. C. 
(1981), ”Sorption of/-Naphtol: implications concerning the li ­
mits of hydrophobic sorption”, Soil Sci. Soc. Am. J. 45, 
s. 38–42. 
72. Karickhoff S. W. (1981), ”Semi-empirical estimation of sorption 
of hydrophobic pollutants on natural sediments and soils”, Che ­
mosphere, Vol. 10(8), s. 833–846. 
73. Moreale A., van Bladel R. (1981), ”Adsorption de 13 herbicides 
et insecticides par le sol. Relation solubilité-reactivité”. Revue 
de l'Agric, 34 (4), s. 319–322. 
74. Müller M., Kordel W. (1996), ”Comparison of screening met ­
hods for the determination/estimation of adsorption coefficients on soil”. Chemosphere, 32(12), s. 2493–2504. 
75. Kordel W., Kotthoff G. Muller M. (1995), ”HPLC – screening 
method for the determination of the adsorption coefficient on soil – results of a ring test”. Chemosphere 30 (7), s. 1373–1384. 
76. Kördel W., Stutte J., Kotthoff C. (1993), ”HPLC – screening 
method for the determination of the adsorption coefficient on 
soil – comparison of different stationary phases”. Chemosphere 
27 (12), s. 2341–2352. 
77. Hance. R. J. (1967), ”The Speed of Attainment of Sorption 
Equilibria in Some Systems Involving Herbicides”, Weed Re ­
search, Vol. 7, s. 29–36. 
78. Koskinen W. C and Harper S. S. (1990), ”The retention pro ­
cesses: mechanisms” in Pesticides in the Soil Environment: Processes, Impacts and Modelling (ed. H.H. Cheng). Soil Sci. Soc. Am. Book Series, No. 2, Madison, Wisconsin. 
79. Cohen S. Z., Creeger S. M., Carsel R. F. and Enfield C. G. 
(1984), ”Potential pesticide contamination of groundwater from 
agricultural uses”, in Treatment and Disposal of Pesticide Was ­
tes, s. 297–325, ACS Symp. Ser. 2 59, American Chemical Society, Washington, DC. 
80. Giles C. H. (1970), ”Interpretation and use of sorption isot ­
herms” in Sorption and Transport Processes in Soils, S.C.I. Monograph No. 37, s. 14–32. 
81. Giles, C. H., McEwan J. H., Nakhwa, S.N. and Smith D. 
(1960), ”Studies in adsorption: XI. A system of classification 
of solution adsorption isotherms and its use in the diagnosis of 
adsorption mechanisms and in measurements of pesticides sur ­
face areas of soils”. J. Chem. Soo, s. 3973–3993. 
82. Calvet R., Tercé M. and Arvien J. C (1980), ”Adsorption des 
pesticides par les sols et leurs constituants: 3. Caractéristiques 
générales de l'adsorption”, Ann. Agron. 31, s. 239–251. 
83. Bedbur E. (1996), ”Anomalies in the Freundlich equation”, 
Proc. COST 66 Workshop, Pesticides in soil and the environ ­
ment, 13–15 May 1996, Stratford-upon-Avon, UK. 
84. Guth, J. A. (1985), ”Adsorption/desorption”, in Joint Interna ­
tional Symposium, Physicochemical Properties and their Role in 
Environmental Hazard Assessment, July 1–3, Canterbury, UK. 
85. Soil Texture Classification (US and FAO systems): Weed Sci ­
ence, 3 3, Suppl. 1 (1985) and Soil Sci. Soc. Amer. Proc. 
26:305 (1962).
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1220
 
Bilaga 1  
Testschema
  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1221
 
Bilaga 2  
ADSORPTIONSRESULTATENS NOGGRANNHET SOM FUNKTION AV 
ANALYSMETODENS NOGGRANNHET OCH KONCENTRATIONSÄND ­
RINGEN  
Av tabellen nedan (84) framgår klart att när skillnaden mellan massan vid testets 
början (m  0 = 110 μg) och testämnets massa  m aq ads ðeqÞ i lösningen vid jämvikt 
(=100 μg)är mycket liten, så leder ett fel på 5 % vid mätning av jämviktskon ­
centrationen till ett fel på 50 % i beräkningen av massan av ämne som adsor ­
berats i jorden ( m s ads ðeqÞ) och ett fel på 52,4 % i beräkningen av K  d . 
Mängd jord m  jord 10 g 
Lösningens volym V  0 100 cm  3 
m aq ads ðeqÞ 
(μg) C aq ads ðeqÞ 
(μg cm-  3 ) R m  s ads ðeqÞä 
(μg) C s ads ðeqÞä 
(μg g-  1 ) R‡ K  d * R‡  
FÖR A = 9 %
 m 0 ¼ 110 μg eller 
C 0 ¼ 1; 100 μg=cm3 
100 1,000 verkligt 
värde 10 1,00 verkligt 
värde 1 
101 1,010 1 % 9 0,90 10 % 0,891 10,9 % 
105 1,050 5 % 5 0,50 50 % 0,476 52,4 % 109 1,090 9 % 1 0,10 90 % 0,092 90,8 %  
FÖR A = 55 %
 m 0 ¼ 110 μg eller 
C 0 ¼ 1; 100 μg=cm3 
50,0 0,500 verkligt 
värde 60,0 6,00 verkligt 
värde 12,00 
50,5 0,505 1 % 59,5 5,95 0,8 % 11,78 1,8 % 
52,5 0,525 5 % 57,5 5,75 4,0 % 10,95 8,8 % 55,0 0,550 10 % 55,0 5,50 8,3 % 10,00 16,7 %  
FÖR A = 99 %
 m 0 ¼ 110 μg eller 
C 0 ¼ 1; 100 μg=cm3 
1,100 0,011 verkligt 
värde 108,9 10,89 verkligt 
värde 990 
1,111 0,01111 1 % 108,889 10,8889 0,01 % 980 1,0 % 
1,155 0,01155 5 % 108,845 10,8845 0,05 % 942 4,8 % 
1,21 0,0121 10 % 108,790 10,8790 0,10 % 899 9,2 %  
äm s ads ðeqÞ = m  0 Ä m aq ads ðeqÞ; C s ads ðeqÞ ¼ h 
C 0 Ä C aq ads ðeqÞ i 
V 0 
m soil: Kd ¼ m s ads ðeqÞ 
m aq ads ðeqÞ V 0 
m soil 
m s ads ðeqÞ = testämnets massa i jordfasen vid jämvikt, μg; 
m aq ads ðeqÞ = testämnets massa i vattenfasen vid jämvikt, μg; 
C s ads ðeqÞ = testämnets halt i jordfasen vid jämvikt, μg g -1 ; 
C aq ads ðeqÞ = testämnets masskoncentration i vattenfasen vid jämvikt, μg cm  -3 ; 
R = analysfel vid bestämning av  m aq ads ðeqÞ; 
R‡ = beräkningsfel på grund av analysfelet R.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1222
 
Bilaga 3  
ESTIMERINGSMETODER FÖR K  d 
1. Genom estimeringsmetoder kan K  d uppskattas på grundval av samband 
med t.ex. P  ow -värden (12) (39) (63–68), vattenlöslighetsdata (12) (19) 
(21) (39) (68–73) eller polaritetsdata som fåtts fram från HPLC-RP (om ­
vänd fas) (74–76). K  oc och K  om beräknas med hjälp av ekvationerna i tabell 
1 och 2, och sedan räknas K  d fram indirekt ur följande ekvationer:  
K oc ¼ K  d · 100 
%oc ðcm 3 g Ä1 Þ K  om ¼ K d 
1; 724 · 100 
%oc ðcm 3 g Ä1 Þ 
2. Principen för dessa samband grundar sig på två antaganden: 1) det är 
främst jordens organiska material som påverkar hur ett ämne adsorberas, 
och 2) de växelverkansprocesser som förekommer är i huvudsak opolära. Det innebär att dessa samband 1) inte, eller bara delvis, kan tillämpas på polära ämnen, och 2) inte kan tillämpas i fall där jordens halt av organiskt 
material är mycket låg (12). Vidare gälier att samma sak inte kan konsta ­
teras angående sambandet mellan vattenlöslighet och adsorptionens omfatt ­
ning (19) (21), även om man har funnit tillfredsställande korrelation mellan P
 ow och adsorption (19). Hittills gjorda undersökningar har gett motsägel ­
sefulla resultat. 
3. 1 tabell 1 ges några exempel på samband mellan adsorptionens fördelnings ­
koefficient och fördelningskoefficienten oktanol-vatten. I tabell 2 ges några exempel på samband mellan adsorptionens fördelningskoefficient och vat ­
tenlösligheten.
 
Tabell 1  
Exempel på samband mellan adsorptionens fördelningsskoefficient och fördelningskoefficienten oktanol- 
vatten. Ytterligare exempel finns i (12) (68).  
Ämne Samband Författare  
Substituerad urea log K  om = 0,69 + 0,52 log P  ow Briggs (1981) (39) 
Aromatiska klorerade ämnen log K  oc = -0,779 + 0,904 log P  ow Chiou  et al.  (1983) (65) 
Diverse bekämpningsmedel log K  om = 4,4 + 0,72 log P  ow Gerstl och Mingelgrin (1984) (66) 
Aromatiska kolväten log K  oc = -2,53 + 1,15 log P  ow Vowles och Mantoura (1987) (67)  
Tabell 2  
Exempel på samband mellan adsorptionens fördelningskoefficient och vattenlösligheten. Ytterligare exempel 
finns i (68) (69).  
Ämne Samband Författare  
Diverse bekämpningsmedel log K  om = 3,8 – 0,561 log S  w Gerstl och Mingelgrin (1984) (66) 
Alifatiska, aromatiska, klore ­
rade ämnen log K  om = (4,040 +/– 0,038) - (0,557 
+/– 0,012) log S  w Chiou  et al.  (1979) (70) 
u-naphtol log K  oc = 4,273 – 0,686 log S  w Hasset et al. (1981) (71) 
Cykliska, alifatiska aro ­
matiska ämnen logK  oc = -1,405 - 0,921 log S  w - 
0,00953 (mp-25) Karickhoff (1981) (72) 
Diverse föreningar log K  om = 2,75 – 0,45 log S  w Moreale van Blade (1982) (73)  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1223
 
Bilaga 4  
BERÄKNINGAR FÖR BESTÄMNING AV CENTRIFUGERINGS ­
BETINGELSER  
1. Centrifugeringstiden fås fram genom följande formel, under antagande att 
partiklama är sfäriska:  
t ¼ 9 
2 η 
ω 2 rp 2 ρ s Ä ρ aq Ä Ö " #  
ln ðR b=R t Þ (1) 
Av praktiska skäl ges parametrarna i måttenheterna g, cm etc. i stället för 
de normala SI-enheterna. 
där: 
ώ = rotationshastighet (=2 Ti rpm/60), rad s  -1 
rpm = varv per minut 
η = lösningens viskositet, g s  -1 cm -1 
r p = partikelradie, cm 
p s = jordens densitet, g cm  3 
p aq = lösningens densitet, g cm  -3 
R t = avstånd från centrifugrotorns centrum till lösningens övre yta i 
centrifugeringsröret, cm 
R b = avstånd från centrifugrotorns centrum till centrifugeringsrörets 
botten, cm 
R b -R t = jord-lösningsblandningens höjd i centrifugeringsröret, cm. 
För att säkerställa fullständig separation får centrifugen som regel gå två 
gånger den framräknade tiden. 
2. Ekvation 1 kan förenklas ytterligare om lösningens viskositet ( η) och den ­
sitet (p  aq ) kan anses vara samma som viskositeten och densiteten för vatten 
vid 25  o C, dvs. η = 8,95 × 10  -3 g s -1 cm -1 och p  aq = 1,0 g, cm  -3 . 
Då fås centrifugeringstiden genom ekvation 2:  
t ¼ 3:7 
rpmð Þ  2 · r p 2 ρ s Ä 1ð Þ  ln Rb 
Rt (2) 
3. Av ekvation 2 framgår tydligt att det är två faktorer som har stor betydelse 
när det gäller att bestämma de centrifugeringsbetingelser, dvs. tid (t) och varvtal (rpm), som behövs för att åstadkomma separation av partiklar av en viss storlek (i detta fall med radien 0,1 μm): 1) jordens densitet och 2) 
blandningens höjd i centrifugeringsröret (R
 b -R t ), dvs. det avstånd som en 
jordpartikel färdas från lösningens övre yta till rörets botten. För en given volym bestäms blandningens höjd självfallet av rörets radie. 
4. I figur 1 visas centrifugeringstiden (t) som funktion av varvtalet (rpm) för 
olika jorddensiteter (p
 s ) (figur 1 a) och för olika blandningshöjder i cen ­
trifugeringsröret (figur 2 a). Av figur 1 a framgår inverkan av jordens densitet tydligt – vid klassisk centrifugering med 3 000 rpm är centrifuge ­
ringstiden cirka 240 minuter när jordens densitet är 1,2 g cm
 3 , men bara 
50 minuter när densiteten är 2,0 g cm  3 . Likaså visar figur 1 b att centri ­
fugeringstiden vid klassisk centrifugering med 3 000 rpm är cirka 50 minuter om blandningens höjd är 10 cm men bara 7 minuter om höjden är 1 cm. Det är dock viktigt att finna en optimal avvägning mellan å ena 
sidan så liten blandningshöjd som möjligt för centrifugeringen och å andra 
sidan enkel hantering när det gäller att separera faserna efter centrifugering.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1224
 
5. När testbetingelserna för separering av jord- och lösningsfaserna ska be ­
stämmas är det också viktigt att beakta eventuell förekomst av en tredje 
”pseudofas”, dvs. kolloider. Dessa partiklar är mindre än 0,2 μm och kan 
ha viktig inverkan på hela adsorptionsmekanismen för ett ämne i en jord ­
suspension. När centrifugeringen utförs på ovan beskrivet sätt blir kolloi ­
derna kvar i vattenfasen och analyseras då tillsammans med den. Då går 
informationen om deras inverkan förlorad. 
Om laboratoriet har möjligheter till ultracentrifugering eller ultrafiltrering 
kan adsorptionen och desorptionen av ett ämne i jord studeras mer ingå ­
ende, även beträffande ämnets adsorption på kolloiderna. Då ska ultracent ­
rifugering med 60 000 rpm/min eller ultrafiltrering med filterporositeten 
100 000 dalton användas för att separera de tre faserna jord, kolloider och lösning. Då ska också testschemat ändras så att alla tre faserna tas med i ämnesanalysen.
 
Figur la.
  
Samband mellan centrifugeringstid (t) och centrifugeringsvarvtal (rpm) för 
olika jorddensiteter ( ρ s ). R  t = 10 cm, R  b -R t = 10 cm, q = 8,95 × 10  -3 
g s -1 cm -1 och ρ aq = 1,0 g cm  -3 vid 25  o C. 
Figur 1b.
  
Samband mellan centrifugeringstid (t) och ccntrifugeringsvarvtal (rpm) för 
olika höjder på blandningen i centrifugeringsröret (R  b – R  1 ) = L; R  t = 
10 cm, η = 8,95 × 10  -3 g s -1 cm -1 , ρ aq = 1,0 g cm  -3 vid 25  o C och ρ s = 
2,0 g cm  -3 . ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1225
 
Bilaga 5  
BERÄKNING AV ADSORPTION A ( %) OCH DESORPTION D ( %)  
Procedurens tidsschema är följande:
  
För samtliga beräkningar gäller antagandet att testämnet är stabilt och att det inte 
i någon signifikant grad adsorberas på kärlets väggar.  
ADSORPTION A (A %)  
a) Parallellmetoden  
Den procentuella adsorptionen beräknas för varje provrör (i) vid varje 
tidpunkt (t  i ), enligt följande ekvation:  
A t i ¼ m s ads ðt i Þ · 100 
m 0 (%) (1) 
Ekvationens termer beräknas enligt följande: 
m 0 = C  0 · V 0 (μg) (2)  
m s ads ðt i Þ ¼ m  0 Ä C aq ads ðt i Þ · V 0 (μg) (3) 
där: 
A t i den procentuella adsorptionen ( %) vid tidpunkten t  1 , 
m s ads ðt i Þ testämnets massa i jorden vid tidpunkten t  i då analysen utförs ( μg), 
m 0 testämnets massa i provröret vid testets början ( μg), 
C 0 ursprunglig masskoncentration i testlösningen som är i kontakt 
med jorden ( μg cm  -3 ). ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1226
 
C aq ads ðt i Þ ämnets masskoncentration i vattenfasen vid tidpunkten t  i då 
analysen utförs ( μg cm  -3 ), denna koncentration bestäms analy ­
tiskt med beaktande av värdena från blindproven. 
V 0 ursprunglig volym för den testlösning som är i kontakt med 
jorden (cm  3 ). 
Värdet på den procentuella adsorptionen  A t i eller C aq ads ðt i Þ avsätts mot tiden 
i ett diagram, och kurvan används för att bestämma tiden för när sorptions ­
jämvikt inträder. Exempel på sådana kurvor finns i figur 1 och figur 2.
  
Figur 1  
Kurva för bestämning av adsorptionsjämvikt
  
Figur 2  
Testämnets masskoncentration i vattenfasen (C  aq ) som funktion av tiden.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1227
 
b) Seriemetoden  
I ekvationerna som följer är utgångspunkten att adsorptionen undersöks 
genom mätning av testämnet i små delprover av vattenfasen med bestämda tidsintervall. 
— Den mängd ämne som adsorberats i jorden under varje tidsintervall 
beräknas på följande sätt: 
— för det första tidsintervallet Δt
 1 = t 1 - t 0 
m s ads ðΔt 1 Þ ¼ m  0 Ä m m ads ðt 1 Þ · Í 
V 0 
v a A Î 
(4) 
— för det andra tidsintervallet Δt 2 = t 2 – t 1 
m s ads ðΔt 2 Þ ¼ m  m ads ðt 1 Þ · Í 
V 0 
v a A Î 
Ä m  m ads ðt 2 Þ · Í 
V 0 Ä v a A 
v a A Î 
(5) 
— för det tredje tidsintervallet Δt 3 = t 3 – t 2 
m s ads ðΔt 3 Þ ¼ m m ads ðt 2 Þ · Í 
V 0 Ä v a A 
v a A Î 
Ä m  m ads ðt 3 Þ · Í 
V 0 Ä 2 · v a A 
v a A Î 
(6) 
— för det n:te tidsintervallet Δt n = t n – t n -1 
m s ads ðΔt n Þ ¼ m  m ads ðt nÄ1 Þ · Í 
V 0 Ä ðn Ä 2Þ · v a A 
v a A Î 
Ä m m ads ðt n Þ · V 0 Ä ðn Ä 1Þ · v a A Ê Ì  
v a A 0 
@ 1 
A (7) 
— Den procentuella adsorptionen under varje tidsintervall  A Δt i beräknas 
genom ekvationen  
A Δt i ¼ m s ads ðΔt i Þ 
m 0 · 100 ð%Þ (8) 
och den procentuella adsorptionen vid tidpunkten t  i (ðA t i Þ) fås genom 
ekvationen  
A t i ¼ Σ 
j ¼ Δt 1 Δt i 
m s ads ðjÞ 
m 0 · 100 ð%Þ (9) 
Adsorptionsvärdena  A t i eller A Δt i (beroende på vad som krävs i under ­
sökningen) ritas upp som funktion av tiden i ett diagram, och kurvan 
används för att bestämma tidpunkten för när sorptionsjämvikt inträder. 
— Vid jämviktstiden t  eq gäller följande: 
— massan av testämne som adsorberats i jorden:  
m s ads ðeqÞ ¼ Σ n 
Δt i ¼ 1 m s ads ðΔt i Þ (10)  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1228
 
— och den procentuella adsorptionen vid jämvikt:  
m aq ads ðeqÞ ¼ m  0 Ä Σ n 
Δt i ¼ 1 m s ads ðΔt i Þ (11) 
— massan av testämne i lösningen:  
A eq ¼ m s ads ðeqÞ 
m 0 · 100 ð%Þ (12) 
De ovan använda parametrarna definieras enligt följande:  
m s ads ðΔt 1 Þ; m s ads ðΔt 2 Þ; :::; m s ads ðΔt n Þ massan av ämne som adsorberats i 
jorden under tidsintervallen Δ t1 , 
Δ t2,… ,Δ tn (μg), 
m m ads ðt 1 Þ; m m ads ðt 2 Þ; :::; m n ads ðt n Þ massan av ämne som uppmätts i ett 
delprov  v a A vid tidpunkterna t  1 Δt 2 
..., t  n (μg), 
m s ads ðeqÞ massan av ämne som adsorberats i 
jorden vid adsorptionsjämvikt ( μg), 
m aq ads ðeqÞ massan av ämne i lösningen vid 
adsorptionsjämvikt ( μg), 
v a A volymen av det delprov i vilket tes ­
tämnet uppmäts (cm  3 ), 
A Δt i procentuell adsorption under tids ­
intervallet Δt i ( %),  
A eq procentuell adsorption vid adsorp ­
tionsjämvikt ( %).  
DESORPTION D (A %) 
Som starttid t  0 för desorptionskinetiktestet räknas den tidpunkt då den maximala 
tillvaratagna volymen av testämneslösning (efter att adsorptionsjämvikt har in ­
trätt) ersätts med en lika stor volym 0,01 M CaCl  2 -lösning.  
a) Parallellmetoden  
Vid tidpunkten t  i uppmäts massan av testämnet i volymen av den vattenfas 
som tagits ur rör i (  V  i 
r Ê Ì  
), och den desorberade massan beräknas enligt 
följande ekvation:  
m aq des ðt i Þ ¼ m  m des ðt i Þ · Í 
V 0 
v r i Î 
Ä m aq A (13) 
Vid desorptionsjämvikt är t  i = t eq och därför är  m aq des ðt i Þ = m aq des ðeqÞ. 
Massan av testämne som har desorberats under ett tidsintervall ( Δt i ) ges av 
ekvationen:  
m aq des ðΔt i Þ ¼ m  aq des ðt i Þ Ä Σ 
j ¼ 1 i ¼ 1 
m aq des ðjÞ (14) 
Den procentuella desorptionen 
beräknas för tidpunkten t  i enligt ekvationen  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1229
 
D t i ¼ m aq des ðt i Þ 
m s ads ðeqÞ · 100 ð%Þ (15) 
och för tidsintervallet ( Δt i ) enligt ekvationen  
D t i ¼ m aq des ðt i Þ 
m s ads ðeqÞ · 100 ð%Þ (16) 
där: 
D t i = procentuell desorption vid tidpunkten t  i ( %),  
D Δt i = procentuell desorption under tidsintervallet Δt i ( %),  
m aq des ðt 1 Þ = massan av testämne som desorberats vid tidpunkten t  i (μg), 
m aq des ðΔt 1 Þ = massan av testämne som desorberats under tidsintervallet Δt i 
(μg), 
m m des ðt i Þ = massan av testämne som uppmätts analytiskt vid tidpunkten 
t i i den lösningsvolym  V r i som har tagits för analysen ( μg), 
m aq A = massan av testämne som blivit över från adsorptionsjämvik ­
ten på grund av ofullständig volymersättning ( μg) 
m aq A ¼ m aq ads ðeqÞ · V 0 Ä V R 
V 0 Í Î  
(17) 
m aq ads ðeqÞ = massan av testämne i lösningen vid adsorptionsjämvikt ( μg), 
V R = volymen av supernatant som tagits ur röret efter uppnådd 
adsorptionsjämvikt och som ersatts med samma volym 0,01 M CaCl
 2 -lösning (cm  3 ), 
V r i = volymen av lösning som tagits ur rör nummer i för upp ­
mätning av testämnet i desorptionskinetiktestet (cm  3 ). 
Desorptionsvärdena  D t i eller D Δt i (beroende på vad som krävs i undersök ­
ningen) ritas upp som funktion av tiden i ett diagram, och kurvan används 
för att bestämma när desorptionsjämvikt inträder.  
b) Seriemetoden  
I ekvationerna som följer är utgångspunkten att den föregående adsorp ­
tionsundersökningen utförts genom att mäta testämnet i små delprovsvoly ­
mer v  a A Ê Ì  
av vattenfasen (seriemetoden, se avsnitt 1.9 ”Mätförfarande”). 
Härvid antas a) att volymen av den supernatant som avlägsnats ur röret 
efter adsorptionskinetiktestet har ersatts med en lika stor volym av 0,01 M 
CaCl  2 -lösning (V  R ) och b) att den totala volymen av vattenfasen som är i 
kontakt med jord (V  T ) under desorptionskinetiktestet förblir konstant och 
ges av följande ekvation:  
V T ¼ V  0 Ä Σ n 
i ¼ 1 v a A ðiÞ (18) ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1230
 
Vid tidpunkten t  i , gäller följande: 
— Massan av testämne mäts i ett litet delprov (  v a D Ê Ì  
) och den desorberade 
massan beräknas enligt följande ekvation:  
m aq des ðt i Þ ¼ m  m des ðt i Þ · Í 
V T 
v a D Î 
Ä m  aq A · V T Ä ði Ä 1Þ · v a D Ê Ì  
V T 0 
@ 1 
A (19) 
— Vid desorptionsjämvikt är t  i = t eq , och därför är  m aq des ðt i Þ = m aq des ðeqÞ 
— Den procentuella desorptionen  D t i beräknas enligt följande ekvation:  
D t i ¼ m aq des ðt i Þ 
m s ads ðeqÞ · 100 ð%Þ (20) 
För tidsintervallet ( Δt i ) gäller följande: 
Mängden desorberat ämne beräknas för varje tidsintervall, enligt följande: — för det första tidsintervallet Δt
 1 = t 1 -t 0 
m aq des ðΔt 1 Þ ¼ m  m des ðt 1 Þ · Í 
V T 
v a D Î 
Ä m  aq A och m  s des ðt 1 Þ ¼ m  s aq ðeqÞ Ä m aq des ðΔt 1 Þ (21) 
— för det andra Δt 2 = t 2 -t 1 
m aq des ðΔt 2 Þ ¼ m  m des ðt 2 Þ · Í 
V T 
v a D Î 
Ä m  aq des ðΔt 1 Þ · V T Ä v a D Ê Ì  
V T 0 
@ 1 
A Ä m  aq A · V T Ä v a D Ê Ì  
V T 0 
@ 1 
A 
och m s des ðt 2 Þ ¼ m  s ads ðeqÞ Ä m  aq des ðΔt 1 Þ þ m aq des ðΔt 2 Þ h i  
(22) 
— för det n:te tidsintervallet Δt n = t n -t n-1 
m aq des ðΔt n Þ ¼ Ï 
m m des ðt n Þ · Í 
V T 
v a D Î 
Ä m  aq A · V T Ä n Ä 1ð Þ  · v a D Ê Ì  
V T 0 
@ 1 
A 
Ä Σ 
i ¼ 1; n ≠ 1 nÄ1 V T Ä n Ä ið Þ  · v a D Ê Ì  
V T · m aq des ðΔt i Þ 0 
@ 1 
A # 
och m s des ðt n Þ ¼ m  s ads ðeqÞ Ä Σ 
i ¼ 1; n ≠ 1 n 
m aq des ðΔt i Þ (23) 
Till slut beräknas den procentuella desorptionen under varje tidsintervall  
D Δt i med hjälp av ekvationen  
D Δt i ¼ m aq des ðΔt i Þ 
m s ads ðeqÞ · 100 ð%Þ (24) 
och den procentuella desorptionen  D t i vid tidpunkten t  i ges av ekvationen  
D t i ¼ Σ 
j ¼ Δt 1 Δt i 
m aq des ðjÞ 
m s ads ðeqÞ · 100 ¼ m aq des ðt i Þ 
m s ads ðeqÞ · 100 ð%Þ (25)  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1231
 
där de ovan använda parametrarna definieras på följande sätt:  
m s des ðΔt 1 Þ, m s des ðΔt 2 Þ,... , m s des ðΔt n Þ = massan av testämne som desor ­
beras under tidsintervallen Δt 1 , 
Δ t 2 ,… Δt n (μg), 
m aq des ðΔt 1 Þ, m aq des ðΔt 2 Þ,... , m aq des ðΔt n Þ = massan av testämne som desor ­
beras under tidsintervallen Δt 1 , 
Δt 2 ,..., Δt n (μg); 
m m des ðt 1 Þ, m m des ðt 2 Þ,... , m m des ðt n Þ = = massan av ämne som uppmätts 
i ett delprov  v  D 
a Ê Ì  
vid tidpunk ­
terna t  1 ,t 2 ,..., t  n (Hg). 
V T = totala volymen av vattenfas som 
är i kontakt med jorden under 
desorptionskinetiktestet enligt se ­
riemetoden (cm  3 ), 
m A 
aq = massan av testämne som blivit 
över efter uppnådd adsorptions ­
jämvikt på grund av ofullständig volymersättning ( μg),
 
m A 
aq ¼ V 0 Ä Σ n 
i ¼ 1 v A 
a ið Þ Í Î 
Ä V R 
V 0 Ä Σ n 
i ¼ 1 v A 
a ið Þ Í Î 0 
B B B @ 1 
C C C A · m ads 
aq ðeqÞ (26) 
V R = volymen av supernatant som av ­
lägsnats ur röret efter att adsorp ­
tionsjämvikt inträtt och som er ­
satts med samma volym av 0,01 
M CaCl  2 -lösning (cm  3 ) 
v D 
a = volymen av det delprov som ta ­
gits för analys ur rör nummer i under desorptionskinetiktestet en ­
ligt seriemetoden (cm
 3 ). 
v D 
a ≤ 0; 02 · V T (27) ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1232
 
Bilaga 6  
TEST AV ADSORPTION OCH DESORPTION I JORDAR – RAPPORTBLANKETTER  
Testämne: 
Jord: Jordens torrhalt (105
 o C, 12 h): . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . % 
Temperatur: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  o C 
Analysmetodens lämplighet  
Uppvägt jordprov g 
Jordens torrmassa g 
CaCl  2 -lösningens volym cm  3 
Slutlösningens nominella koncentration μg cm  -3 
Slutlösningens analyserade koncentration μg cm  -3 
Princip för den använda analysmetoden: 
Kalibrering av analysmetoden: Testämne: Jord: Jordens torrhalt (105
 o C, 12 h): . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . % 
Temperatur: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  o C 
Analysmetod: Indirekt metod  □ Parallellmetod  □ Seriemetod  □ 
Direkt metod  □ 
Adsorptionstest: testprover  
Beteckning Måttenhet Jämviktstid Jämviktstid Jämviktstid Jämviktstid  
Rör nr 
Uppvägt jordprov — g Jordens torrmassa m
 jord g 
Uppvägda jordprovets vattenvo ­
lym (beräknat värde) V WS cm 3 
Volym av 0,01 M CaCl  2 -lösning 
för att få jorden i jämvikt cm 3 
Stamlösningens volym cm  3 
Totalvolym av vattenfas i kon ­
takt med jord V 0 cm -3 
Testlösningens ursprungliga 
koncentration C 0 μg cm  -3 
Testämnets massa vid testets 
början m 0 μg ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1233
 
Beteckning Måttenhet Jämviktstid Jämviktstid Jämviktstid Jämviktstid  
Efter omröring och centrifugering  
INDIREKT METOD 
Parallellmetod 
Testämnets koncentration i vat ­
tenfasen (med blindprovskorri ­
gering)  C aq ads ðt i Þ μg cm  -3 
Seriemetod 
Massan av testämne som upp ­
mätts i delprovet V  A a m m ads ðt i Þ μg 
DIREKT METOD 
Massan av testämne som adsor ­
berats i jord  m s ads ðt i Þ μg 
Beräkning av adsorptionen 
Adsorption  A  t i % 
A Δt i % 
Medelvärde Adsorptionskoefficient K
 d cm 3 g -1 
Medelvärde 
Adsorptionskoefficient K  OC cm 3 g -1 
Medelvärde 
Testämne: 
Jord: Jordens torrhalt (105
 o C, 12 h): . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . % 
Temperatur: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  o C 
Adsorptionstest: blind- och kontrollprov  
Beteckning Måttenhet Blindprov Blindprov Kontrollprov  
Rör nr 
Uppvägt jordprov g 0 0 Uppvägda jordprovets vattenvolym 
(beräknat värde) cm
 3 — — 
Tillsatt volym av 0,01 M CaCl  2 -lös­
ning cm 3 
Tillsatt volym av testämnets stamlös ­
ning cm 3 0 0 
Vattenfasens totalvolym (beräknat 
värde) cm 3 — —  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1234
 
Beteckning Måttenhet Blindprov Blindprov Kontrollprov  
Testämnets ursprungliga koncentration 
i vattenfasen μg cm  -3 
Efter omröring och centrifugering  
Koncentration i vattenfasen μg cm  -3 
Anm.: Lägg till kolumner efter behov. 
Testämne: Jord: Jordens torrhalt (105
 o C, 12 h): . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . % 
Temperatur: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  o C 
Massbalans  
Beteckning Måttenhet  
Rör nr 
Uppvägt jordprov — g 
Jordens torrmassa m  soil g 
Uppvägda jordprovets vattenvolym (be ­
räknat värde) V WS ml 
Volym av 0,01 M CaCl  2 -lösning för att 
få jorden i jämvikt ml 
Stamlösningens volym cm  3 
Total volym av vattenfas i kontakt med 
jord V 0 cm 3 
Testlösningens ursprungliga koncent ­
ration C 0 μg cm  -3 
Jämviktstid — h  
Efter omröring och centrifugering  
Testämnets koncentration i vattenfasen 
(med blindprovskorrigering)  C aq ads ðeqÞ μg cm  -3 
Jämviktstid t  eq h 
l:a utspädning med lösningsmedel 
Avlägsnad volym av vattenfas V  rec cm 3 
Tillsatt volym av lösningsmedel ΔV cm  3 
l:a extraktion med lösningsmedel 
Signalutslag vid analys av lösningsmedlet S  E1 varierande 
Testämnets koncentration i lösningsmedlet C  E1 μg cm  -3 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1235
 
Beteckning Måttenhet  
Massan av ämne som extraherats från 
jord och kärlets väggar m E1 μg 
2:a utspädning med lösningsmedel 
Avlägsnad volym av lösningsmedel ΔV s cm 3 
Tillsatt volym av lösningsmedel AV cm  3 
2:a extraktion med lösningsmedel 
Signalutslag vid analys av lösningsmed ­
let S E2 varierande 
Testämnets koncentration i lösningsmed ­
let C E2 μg cm  -3 
Massan av testämne som extraherats frän 
jord och kärlets väggar m E2 μg 
Total massa av testämne som extraherats 
i två steg M E Mg 
Massbalans MB % 
Testämne: 
Jord: Jordens torrhalt (105
 o C, 12 h): . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . % 
Temperatur: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  o C 
Adsorptionsisotermer  
Beteckning Måttenhet  
Rör nr 
Uppvägt jordprov — g 
Jordens torrmassa E g Uppvägda jordprovets vattenvo ­
lym (beräknat värde) V
 WS cm 3 
Volym av 0,01 M CaCl  2 -lösning 
för att få jorden i jämvikt cm 3 
Volym av tillsatt stamlösning cm  3 
Total volym av vattenfas i kon ­
takt med jord (beräknat värde V 0 cm 3 
Lösningens koncentration C  0 μg cm  -3 
Jämviktstid — h  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1236
 
Beteckning Måttenhet  
Efter omröring och centrifiigering  
Testämnets koncentration i vat ­
tenfasen (med blindprovskorri ­
gering)  C aq ads ðeqÞ μg cm  -3 
Temperatur  o C 
Adsorberad massa per enhet ord  C  s ads ðeqÞ μg g  -1 
Regressionsanalys: 
värdet på K  F ads : 
värdet på l/n: 
regressionskoefficient r  2 : 
Testämne: Jord: Jordens torrhalt (105
 o C, 12 h): . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . % 
Temperatur: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  o C 
Analysmetod: Indirekt me ­
tod □ Parallellme ­
tod □ Seriemetod  □ 
Desorptionstest  
Beteckning Måttenhet Tidsinter­
vall Tidsinter­
vall Tidsinter­
vall Tidsinter­
vall 
Numret på röret som kommer från ad ­
sorptionssteget 
Massan av testämne som adsorberats i 
jord vid adsorptionsjämvikt  m s ads ðeqÞ μg 
Avlägsnad volym av vattenfas, ersatt med 
0,01 M CaCl  2 V R cm 3 
Total volym av vattenfas i 
kontakt med jord PM V  0 cm 3 
SM V  T cm 3 
Massan av testämne som blivit över efter 
uppnådd adsorptionsjämvikt på grund av 
ofullständig volymersättning  m aq A μg 
Desorptionskinetik  
Uppmätt massa av testämne som desor ­
berats ur jorden vid tidpunkten t  i m m des ðt i Þ μg 
Volym av lösning som 
tagits ur rör nummer i för uppmätning av testämnet PM V
 f i cm 3 
SM v  a D cm 3 
Massan av testämne som desorberats ur 
jorden vid tiden t  i (beräknat värde)  m aq des ðt i Þ μg 
Massan av testämne som desorberats ur 
jorden under tidsintervallet Δt i (beräknat 
värde)  m aq des ðΔt i Þ μg ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1237
 
Beteckning Måttenhet Tidsinter­
vall Tidsinter­
vall Tidsinter­
vall Tidsinter­
vall 
Procentuell desorption  
Dcsorption vid tidpunkten t  i D ti % 
Desorption under tidsintervallet Δt i D Δt i % 
Skenbar desorptionskoefficient K  des 
PM: Parallellmetod 
SM: Seriemetod  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1238
 
C.19  UPPSKATTNING AV ADSORPTIONSKOEFFICIENTEN (K  OC ) I 
JORD OCH AVLOPPSSLAM MED ANVÄNDNING AV 
HÖGTRYCKSVÄTSKEKROMATOGRAFI (HPLC)  
1. METOD  
Denna metod är i stort sett identisk med OECD TG121 (2001).  
1.1 INLEDNING 
Sorptionsbeteendet hos ämnen i jord eller avloppsslam kan beskrivas 
med hjälp av parametrar som bestämts på experimentell väg med testmetod C.18. En viktig parameter är adsorptionskoefficienten. Den 
definieras som förhållandet mellan ämnets koncentration i 
jorden/slammet och ämnets koncentration i vattenfasen vid adsorp ­
tionsjämvikt. En adsorptionskoefficient som är normaliserad till jor ­
dens halt av organiskt bundet kol (K
 OC ) är en värdefull indikator på 
en kemikalies bindningsförmåga till det organiska materialet i jord och 
avloppsslam och ger möjlighet att jämföra olika kemikalier. Denna parameter kan uppskattas genom korrelationer med vattenlösligheten och fördelningskoefficienten n-oktanol/vatten (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7). 
Vid den försöksmetod som beskrivs här används HPLC för uppskatt ­
ning av adsorptionskoefficienten K
 OC i jord och avloppsslam (8). 
Dessa uppskattningar är tillförlitligare än resultaten från QSAR-be ­
räkningar (9). En uppskattningsmetod kan aldrig helt ersätta mät ­
ningar vid jämvikt i uppslammat prov (testmetod C.18). Det upp ­
skattade värdet på K  OC kan dock användas som stöd vid valet av 
lämpliga testparametrar för adsorptions-/desorptionsundersökningar enligt testmetod C.l8, genom beräkning av K
 d (distributionskoeffici ­
ent) eller K  f (Freundlich-adsorptionskoefficient) enligt ekvation 3 (se 
avsnitt 1.2).  
1.2 DEFINITIONER  
K d : Distributionskoefficienten definieras som förhållandet mellan 
jämviktkoncentrationerna C för ett upplöst testämne i ett tvåfas ­
system som består av sorbent (jord eller avloppsslam) och en vat ­
tenfas. Förhållandet har ingen måttenhet när koncentrationerna i båda faserna uttrycks som vikt per vikt. Om koncentrationen i vattenfasen ges som vikt per volym blir måttenheten ml-g
 -1 . K  d kan variera 
beroende på sorbentens egenskaper och kan vara koncentrationsbero ­
ende.  
K d ¼ C jord 
C vatten or C slam 
C vatten (1) 
där: 
C jord = testämnets koncentration i jord vid jämvikt ( μg· g -1 ) 
C slam = testämnets koncentration i slam vid jämvikt ( μg· g -1 ) 
C vatten = testämnets koncentration i vattenfasen vid jämvikt 
(ug· g -1 , μg· ml  -1 ) ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1239
 
K f : Freundlich-adsorptionskoefficienten definieras som testämnets 
koncentration i jord eller avloppsslam (x/m) nar jämviktskoncent ­
rationen C  vatten i vattenfasen har värdet ett. Måttenheten är μg· g -1 
sorbent. Värdet kan variera beroende på sorbentens egenskaper.  
log x 
m ¼ logK  f þ 1 
n ·logC  vatten (2) 
där: 
x/m = mängden testämne x ( μg) som adsorberats på mängden 
sorbent m (g) vid jämvikt 
l/n = lutningen hos Freundlich-adsorptionsisotermen C
 vatten = testämnets koncentration i vattenfasen vid jämvikt 
(μg· ml  -1 ) 
AtC vatten ¼ 1; logK  f ¼ log x 
m 
K oc : Distributionskoefficienten (K  d ) eller Freundlich-adsorptionskoef ­
ficienten (K  t ) normaliserad till sorbentens halt av organiskt kol (f  oc ). 
Särskilt för icke-joniserade kemikalier utgör den en ungefärlig indi ­
kator på omfattningen av adsorption mellan ett ämne och sorbenten 
och ger möjlighet att göra jämförelser mellan olika kemikalier. Be ­
roende på måttenheterna för K  d och K  f kan K  oc sakna måttenhet eller 
ha måttenheten ml g  -1 eller μg· g -1 organiskt material.  
Koc ¼ Kd 
foc utan måttenhet eller ml ·g Ä1 Ê Ì  
eller Kf 
foc μg · g Ä1 Ê Ì  
(3) 
Förhållandet mellan K  OC och K  d är inte alltid linjärt och därför kan 
K oc -värdena variera mellan olika typer av jord men värdenas varia ­
bilitet är betydligt mindre jämfört med K  d - eller K  f -värden. 
Adsorptionskoefficienten (K  oc ) härleds från kapacitetsfaktorn (k') 
med användning av en kalibreringskurva log k' mot log K  oc för valda 
referensföreningar.  
k 0 ¼ t R Ä t 0 
t 0 (4) 
där: 
t R = HPLC retentionstiden för test- och referensämne (minuter) 
t 0 = HPLC dödtid (minuter) (se avsnitt 1.8.2)  
P ow : Fördelningskoefficienten oktanol-vatten definieras som förhål ­
landet mellan koncentrationerna för upplösta ämnen i n-oktanol och 
vatten. Värdet har ingen måttenhet.  
Pow ¼ Coktanol 
Cvatten ð¼ KowÞ (5)  
1.3 REFERENSÄMNEN 
Strukturformeln, renheten och dissociationskonstanten (i tillämpliga 
fall) bör vara kända innan metoden används. Helst ska man också ha tillgång till information om lösligheten i vatten och organiska lös ­
ningsmedel, fördelningskoefficienten oktanol-vatten och hydrolys ­
egenskaperna.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1240
 
För att korrelera uppmätta HPLC-retentionsdata för ett testämne med 
ämnets adsorptionskoefficient K  oc behövs en kalibreringskurva för 
log K  oc . mot log k'. För kurvan krävs minst sex referenspunkter, 
av vilka minst en ligger ovanför och en under det förväntade värdet för testämnet. Metodens resultat blir betydligt mer exakt om man 
använder referensämnen som är strukturellt besläktade med testäm ­
net. Om sådana data inte finns tillgängliga ligger valet av lämpliga kalibreringsämnen hos användaren. Då bör en mer allmän uppsätt ­
ning av strukturellt heterogena ämnen väljas. I tabell 1 i bilagan görs 
en uppräkning av ämnen och K
 oc -värden som kan användas för 
avloppsslam och i tabell 3 ges motsvarande uppgifter för jord. Om andra kalibreringsämnen används måste detta motiveras.
 
1.4 PRINCIP FOR TESTMETODEN 
HPLC utförs med analytiska kolonner som är packade med kom ­
mersiellt tillgänglig stationär fas av cyanopropyl med lipofila och 
polära grupper. Den stationära fasen är måttligt polär och baserad 
på en silikamatris, enligt följande: 
–O – Si –CH  2 – CH  2 – CH  2 –CN 
silika icke-polär bulk polär grupp 
Principen för testmetoden är densamma som för testmetod A.8 (För ­
delningskoefficient, HPLC-metod). När testämnet passerar genom kolonnen tillsammans med den rörliga fasen växelverkar testämnet med den stationära fasen. Testämnet fördelas mellan den rörliga och 
stationära fasen och bromsas därför upp. I och med den stationära 
fasens sammansättning med både polära och icke-polära bindnings ­
ställen kan en molekyls polära och icke-polära grupper växelverka på liknande sätt som när det gäller organiskt material i jord eller i 
avloppsslam. Det betyder att man kan bestämma förhållandet mellan 
retentionstiden i kolonnen och adsorptionskoefficienten i organiskt material. 
pH-värdet har stor inverkan på sorptionsbeteendet, särskilt när det 
gäller polära ämnen. I jordbruksjord eller tankar i avloppsreningsverk 
varierar pH-värdet i regel mellan 5,5 och 7,5. För joniserbara ämnen bör man utföra två test i lämpliga buffertlösningar där det ena testet utförs med joniserad form och det andra med ickejoniserad form, 
men endast i fall där minst 10 % av testämnet dissocieras inom pH- 
intervallet 5,5–7,5. 
Eftersom endast förhållandet mellan retentionen i HPLC-kolonnen 
och adsorptionskoefficient används för utvärderingen behövs ingen 
kvantitativ analytisk metod och endast retentionstiden behöver 
bestämmas. Om en lämplig uppsättning referensämnen och standard ­
betingelser kan användas för testet ger denna metod tillgång till ett snabbt och effektivt sätt för bestämning av adsorptionskoefficien ­
ten K
 oc . 
1.5 TESTETS TILLÄMPBARHET 
HPLC-metoden kan användas på kemiska ämnen (märkta eller 
omärkta) för vilka det finns tillgång till ett lämpligt detektionssystem (t.ex. spektrofotometer, radioaktivitetsdetektor) och som är tillräckligt stabila under den tid testet varar. Testet kan vara särskilt användbart 
för kemikalier som är svåra att undersöka i andra försökssystem 
(t.ex. flyktiga ämnen, ämnen som inte är lösliga i vatten vid kon ­
centrationer som kan mätas analytiskt, ämnen med en hög affinitet till ytan i inkubationssystem). Metoden kan användas för blandningar 
som ger olösta elutionsband. I sådana fall bör man ange log K
 oc - 
värdenas övre och undre gränser för testblandningens föreningar.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1241
 
Orenheter kan i bland leda till problem vid tolkningen av HPLC- 
resultaten, men orenheterna har inte så stor betydelse så länge som 
testämnet klart kan identifieras analytiskt och separeras från orenhe ­
terna. 
Metoden är validerad för de ämnen som räknas upp i tabell 1 i 
bilagan och metoden har också tillämpats på ett antal andra kemika ­
lier i följande kemikalieklasser: 
— Aromatiska aminer (t.ex. trifluralin, 4-kloranilin, 3,5-dinitroanilin, 
4-metylanilin, N-metylanilin, 1-naftylamin). 
— Estrar av aromatiska karboxylsyror (t.ex. bensoesyrametylester, 
3,5-dinitrobensoesyraetylester). 
— Aromatiska kolväten (t.ex. toluen, xylen, etylbensen, nitrobensen). 
— Aryloxifenoxipropionsyraestrar (t.ex. diklofop-metyl, fenoxaprop- 
etyl, fenoxaprop-P-etyl). 
— Bensimidazol- och imidazol-fungicider (t.ex. karbendazim, fube ­
ridazol, triazoxid). 
— Karboxylsyraamider (t.ex. 2-klorbensamid, N,N-dimetylbcnsa ­
mid, 3,5-dinitrobensamid, N-metylbensamid, 2-nitrobensamid, 3-nitrobensamid). 
— Klorerade kolväten (t.ex. endosulfan, DDT, hexaklorbensen, 
quintozen, 1,2,3-triklorbensen). 
— Bekämpningsmedel typ organiska fosforföreningar (t.ex. azinfos ­
metyl, disulfoton, fenamifos, isofenfos, pyrazofos, sulprofos, triazofos). 
— Fenoler (t.ex. fenol, 2-nitrofenol, 4-nitrofenol, pentaklorofenol, 
2,4,6-triklorfenol, 1-naftol). 
— Fenylurcaderivat (t.e.x. isoproturon, monolmuron, pencycuron). — Pigmentfärgämnen (t.ex. Acid Yellow 219, Basic Blue 41, Direct 
Red 81). 
— Polyaromatiska kolväten (t.ex. acenaften, naftalen). 
— 1,3,5-triazin-herbicider (t.ex. prometryn, propazin, simazin, 
terbutryn). 
— Triazolderivat (t.ex. tebukonazol, triadimefon, tradimenol, 
triapentenol). 
Metoden kan inte tillämpas på ämnen som reagerar med eluenten 
eller den stationära fasen. Metoden är heller inte tillämplig på ämnen som har specifik växelverkan med oorganiska komponenter (t.ex. 
genom bildning av klusterkomplex med lermineraler). Metoden fun ­
gerar eventuellt inte för ytaktiva ämnen, oorganiska föreningar och måttliga eller starka organiska syror och baser. Log K
 oc -värden från 
1,5 till 5,0 kan bestämmas. Joniserbara ämnen måste mätas med 
hjälp av en buffrad rörlig fas, men stor vikt måste fästas vid att 
undvika utfällning av buffertkomponenter eller testämne.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1242
 
1.6 KVALITETSKRITERIER  
1.6.1  Noggrannhet  
I regel kan adsorptionskoefficient för ett testämne bestämmas inom ± 
0,5 logaritmiska enheter av det värde som kan bestämmas med mät ­
ningar vid jämvikt i uppslammat prov (se tabell 1 i bilagan). Nog ­
grannheten förbättras om det finns tillgång till referensämnen som är strukturellt besläktade med testämnet.
 
1.6.2  Repeterbarhet  
Bestämningarna bör köras minst två gånger. De log K  oc -värden som 
härletts från individuella mätningar bör ligga inom ett område på 
0,25 logaritmiska enheter.  
1.6.3  Reproducerbarhet  
De erfarenheter man hittills har från metoden ger belägg för metodens 
validitet. En undersökning av HPLC-metoden med 48 ämnen (i huvud ­
sak bekämpningsämnen) för vilka det fanns tillgång till tillförlitliga data om K
 oc i jord gav en korrelationskoefficient på R = 0,95 (10) (11). 
Ett jämförelsetest utfördes av elva deltagande laboratorier för att 
förbättra och validera metoden (12). Resultaten anges i tabell 2 i 
bilagan.  
1.7 BESKRIVNING AV TESTMETODEN  
1.7.1  Preliminär uppskattning av adsorptionskoefficienten  
Fördelningskoefficienten oktanol-vatten P  ow (= K  ow ) och, i viss ut ­
sträckning, vattenlösligheten kan användas som indikatorer för ad ­
sorptionens omfattning, särskilt för icke-joniserande ämnen. Det be ­
tyder att dessa indikatorer kan användas för preliminära orienterande 
test. Korrelationer för flera grupper av kemikalier finns angivna i ett 
antal publikationer (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7).  
1.7.2  Apparatur  
För testet krävs en vätskekromatograf försedd med en pulsfri pump 
och lämplig detekteringsutrustning. Det är tillrådligt att använda en injektionsventil med en injektionsslinga. Kolonnen ska vara packad med kommersiellt tillgängligt kemiskt bundet cyanopropylharts på 
silikabas (t.ex. Hypersil och Zorbax CN). En guardkolonn av samma 
material kan placeras mellan injektionssystemet och analyskolonnen. Kolonner från olika tillverkare kan vara mycket olika när det gäller 
separationseffektivitet. Som riktvärden för den kapacitetsfaktor k' 
som bör uppnås gäller följande: log k' > 0,0 för log K
 oc = 3,0 och 
log k' > 0,4 för log K  oc = 2,0 när man använder metanol/vatten 
55/45 % som rörlig fas.  
1.7.3  Rörlig fas  
Flera olika rörliga faser har testats och följande två rekommenderas: 
— metanol/vatten (55/45 % v/v) — methanol/0,01 M citratbuffert pH 6,0 (55/45 % v/v).
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1243
 
För beredning av det eluerande lösningsmedlet används HPLC-klas ­
sificerad metanol och destillerat vatten eller citratbuffert. Bland ­
ningen avgasas före användningen. Isokratisk eluering bör användas. Om blandningar av metanol och vatten inte är lämpliga kan man försöka med andra blandningar av organiskt lösningsmedel och vat ­
ten, t.ex. etanol och vatten eller acetonitril och vatten. För joniser ­
bara blandningar rekommenderas användning av buffertlösningar för stabilisering av pH. Stor vikt måste fästas vid att undvika saltutfäll ­
ning och kolonnförsämring, vilket kan inträffa med vissa blandningar 
av organisk fas/buffert. 
Inga tillsatser av typen jonparsreagenser bör användas, eftersom de kan 
påverka den stationära fasens sorptionsegenskaper. Sådana ändringar i 
den stationära fasen kan i vissa fall vara irreversibla. Därför måste alla 
försök där tillsatser används utföras med separata kolonner.
 
1.7.4  Upplösta ämnen  
Test- och referensämnen upplöses i den rörliga fasen.  
1.8 TESTETS UTFÖRANDE  
1.8.1  Testbetingelser  
Temperaturen under matningarna bör registreras. Det är högst till ­
rådligt att hålla kolonnen i temperaturkontrollerad miljö för att ga ­
rantera konstanta betingelser under kalibrerings- och bestämningskör ­
ningarna och vid mätning av testämnet.  
1.8.2  Bestämning av dödtiden t  0 
För bestämning av dödtiden t  0 kan två olika metoder användas (se 
även avsnitt 1.2).  
1.8.2.1  Bestämning av dödtiden t  0 med användning av en homolog serie  
Detta förfarande har visat sig ge tillförlitliga och standardiserade 
värden på t  0 . Närmare uppgifter finns i testmetod A.8 (Fördelnings ­
koefficient (n-oktanol/vatten), HPLC-metoden).  
1.8.2.2  Bestämning av dödtiden t  0 med användning av inerta ämnen som 
inte bromsas upp i kolonnen  
Denna teknik baserar sig på injicering av lösningar av formamid, 
urea eller natriumnitrat. Mätningarna bör utföras minst två gånger.  
1.8.3  Bestämning av retentionstiderna t  R 
Referensämnena bör väljas enligt beskrivningen i avsnitt 1.3. Vid 
bestämning av retentionstiderna kan de injiceras som en blandad 
standard, förutsatt att det finns belägg för att retentionstiden för varje referensstandard inte påverkas av närvaron av de andra referensstan ­
darderna. Kalibreringen bör utföras med regelbundna intervall minst 
två gånger dagligen så att man kan beakta inverkan av oväntade 
förändringar i kolonnens prestanda. Det bästa förfarandet är att göra injektionerna före och efter injektionerna av testämnet, för att bekräfta att retentionstiderna inte har förskjutits. Testämnena injice ­
ras i så små mängder som möjligt (för att undvika överbelastning på 
kolonnen) och deras retentionstider bestäms.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1244
 
Bestämningarna bör göras minst dubbelt för att öka mätningarnas 
tillförlitlighet. De värden på log K  oc som härletts från individuella 
mätningar bör falla inom ett område på 0,25 logaritmiska enheter.  
1.8.4  Utvärdering  
Kapacitetsfaktorerna k' beräknas utifrån dödtiden t  0 och retentions ­
tiderna t  R hos de valda referensämnena enligt ekvation 4 (se 
avsnitt 1.2). Referensämnenas värden på log k' plottas sedan mot deras värden på log K
 oc från mätningar vid jämvikt i uppslammat 
prov (se tabellerna 1 och 3 i bilagan). Med hjälp av den erhållna 
kurvan kan log k'-värdet för ett testämne därefter användas för att bestämma ämnets log K
 oc -värde. Om de aktuella resultaten visar att 
log K  oc för testämnet ligger utanför kalibreringsområdet måste testet 
upprepas med användning av andra, lämpligare referensämnen.  
2. DATA OCH RAPPORTERING  
Rapporten måste innehålla följande uppgifter: 
— Identifiering av test- och referensämnen och deras renhet samt, 
om det är relevant, pK  a -värden. 
— Beskrivning av utrustningen och testbetingelserna, t.ex. analys ­
kolonnens (och guardkolonnens) typ och mått, detekteringsmeto ­
den, den rörliga fasen (komponenternas förhållande, pH), tempe ­
raturområdet under matningarna. 
— Dödtid och den metod som har använts för att bestämma den. — Mängderna test- och referensämnen som har tillförts kolonnen. — Retentionstiderna för de referensämnen som har använts för ka ­
librering. 
— Närmare uppgifter om den anpassade regressionslinjen (log k' 
mot log K
 oc ) och en grafisk framställning av regressionslinjen. 
— Medelvärden för retentionsdata och uppskattat log K  oc -värde för 
testämnet. 
— Kromatogram.  
3. HÄNVISNINGAR  
1. W. J. Lyman, W. F. Reehl, D. H. Rosenblatt (ed). (1990), 
Handbook of chemical property estimation methods, Chap. 4, 
McGraw-Hill, New York. 
2. J. Hodson, N. A. Williams (1988), The estimation of the adsorp ­
tion coefficient (K  oc ) for soils by HPLC. Chemosphere, 17, 167. 
3. G. G. Briggs (1981), Theoretical and experimental relationships 
between soil adsorption, octanol-water partition coefficients, 
water solubilities, bioconcentration factors, and the parachor. 
J. Agric. Food Chem., 29, s. 1050–1059. 
4. C. T. Chiou, P. E. Porter, D.W. Schmedding (1983), Partition 
equilibria of nonionic organic compounds between soil organic matter and water. Environ. Sci. Technol., 17, s. 227–231. 
5. Z. Gerstl, U. Mingelgrin (1984), Sorption of organic substances 
by soils and sediment. J. Environm. Sci. Health, B19, 
s. 297–312.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1245
 
6. C. T. Chiou, L. J. Peters, V. H. Freed (1979), A physical 
concept of soil water equilibria for nonionic organic com ­
pounds, Science, 106, s. 831–832. 
7. S. W. Karickhoff (1981), Semi-empirical estimation of sorption 
of hydrophobic pollutants on natural sediments and soils. Chemosphere, 10, s. 833–846. 
8. W. Kördel, D. Hennecke, M. Herrmann (1997), Application of 
the HPLC-screening method for the determination of the 
adsorption coefficient on sewage sludges. Chemosphere, 35(1/2), s. 121–128. 
9. M. Mueller, W. Kördel (1996), Comparison of screening 
methods for the estimation of adsorption coefficients on soil. 
Chemosphere, 32(12), s. 2493–2504. 
10. W. Kördel, J. Stutte, G. Kotthoff (1993), HPLC-screening 
method for the determination of the adsorption coefficient in soil-comparison of different stationary phases, Chemosphere, 
27(12), s. 2341–2352. 
11. B. von Oepen, W. Kördel, W. Klein (1991), Sorption of non ­
polar and polar compounds to soils: Processes, measurements and experience with the applicability of the modified OECD 
Guideline 106, Chemosphere, 22, s. 285–304. 
12. W. Kördel, G. Kotthoff, J. Müller (1995), HPLC-screening 
method for the determination of the adsorption coefficient on soil-results of a ring test. Chemosphere, 30(7), s. 1373–1384.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1246
 
Bilaga  
Tabell 1  
Jämförelse av K  oc -värden för jord och avloppsslam och beräknade värden från HPLC-screeningmetoden  ( 1 ), ( 2 ) 
Ämne CAS-nr log K  oc av­
loppsslam log K  oc 
HPLC A log K  oc jord HPLC A  
Atrazin 1912-24-9 1,66 2,14 0,48 1,81 2,20 0,39 
Linuron 330-55-2 2,43 2,96 0,53 2,59 2,89 0,30 Fention 55-38-9 3,75 3,58 0,17 3,31 3,40 0,09 Monuron 150-68-5 1,46 2,21 0,75 1,99 2,26 0,27 Fenantren 85-01-8 4,35 3,72 0,63 4,09 3,52 0,57 Bensoesyrafenylester 93-99-2 3,26 3,03 0,23 2,87 2,94 0,07 Bensamid 55-21-0 1,60 1,00 0,60 1,26 1,25 0,01 4-nitrobensamid 619-80-7 1,52 1,49 0,03 1,93 1,66 0,27 
Acetanilid 103-84-4 1,52 1,53 0,01 1,26 1,69 0,08 
Anilin 62-53-3 1,74 1,47 0,27 2,07 1,64 0,43 2,5-dikloranilin 95-82-9 2,45 2,59 0,14 2,55 2,58 0,03
 
( 1 ) W. Kördel, D. Hennecke, M. Herrmann (1997). Application of the HPLC-screening method for the determination of the adsorption 
coefficient on sewage sludges. Chemosphere, 35(1/2), 121 — 128. 
( 2 ) W. Kördel, D. Hennecke, C. Franke (1997). Determination of the adsorption-coefficients of organic substances on sewage sludge s. 
Chemosphere, 35 (1/2), 107 — 119.  
Tabell 2  
Resultat av jämförelsetest mellan laboratorier (11 deltagande laboratorier) som har utförts för att förbättra och 
validera HPLC-metoden  ( 1 ) 
Ämne CAS-nr log K  oc K oc Log K  oc 
(OECD 106) (HPLC-metodcn)  
Atrazin 1912-24-9 1,81 78 ± 16 1,89 
Monuron 150-68-5 1,99 100 ± 8 2,00 Triapentenol 77608-88-3 2,37 292 ± 58 2,47 
Linuron 330-55-2 2,59 465 ± 62 2,67 
Fention 55-38-9 3,31 2062 ± 648 3,31
 
( 1 ) W. Kördel, G. Kotthoff, J. Müller (1995). HPLC-screening method for the determination of the adsorption coefficient on soil- 
results of a ring test. Chemosphere, 30(7), 1373-1384.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1247
 
Tabell 3  
Rekommenderade referensämnen för HPLC-screeningmetoden på grundval av jordadsorptionsdata  
Referensamne CAS-nr Log K  oc -medel­
vär-den från 
matningar vid 
jamvikt i 
uppslammat prov antal K  oc -data Log S.D. Källa  
Acetanilid 103-84-4 1,25 4 0,48 (  a ) 
Fenol 108-95-2 1,32 4 0,70 (  a ) 
2-nitrobensamid 610-15-1 1,45 3 0,90 (  b ) 
N, N-dimetylbensamid 611-74-5 1,52 2 0,45 (  a ) 
4-metylbensamid 619-55-6 1,78 3 1,76 (  a ) 
Metylbensoat 93-58-3 1,80 4 1,08 (  a ) 
Atrazin 1912-24-9 1,81 3 1,08 (  c ) 
Isoproturon 34123-59-6 1,86 5 1,53 (  c ) 
3-nitrobensamid 645-09-0 1,95 3 1,31 (  b ) 
Anilin 62-53-3 2,07 4 1,73 (  a ) 
3,5-dinitrobensamid 121-81-3 2,31 3 1,27 (  b ) 
Karbendazim 10605-21-7 2,35 3 1,37 (  c ) 
Triadimenol 55219-65-3 2,40 3 1,85 (  c ) 
Triazoxid 72459-58-6 2,44 3 1,66 (  c ) 
Triazofos 24017-47-8 2,55 3 1,78 (  c ) 
Linuron 330-55-2 2,59 3 1,97 (  c ) 
Naftalen 91-20-3 2,75 4 2,20 (  a ) 
Endosulfandiol 2157-19-9 3,02 5 2,29 (  c ) 
Metiokarb 2032-65-7 3,10 4 2,39 (  c ) 
Acid Yellow 219 63405-85-6 3,16 4 2,83 (  a ) 
1,2,3-triklorbensen 87-61-6 3,16 4 1,40 (  a ) 
γ-HCH 58-89-9 3,23 5 2,94 (  a ) 
Fention 55-38-9 3,31 3 2,49 (  c ) 
Direct Red 81 2610-11-9 3,43 4 2,68 (  a ) 
Pyrazofos 13457-18-6 3,65 3 2,70 (  c ) 
a-endosulfan 959-98-8 4,09 5 3,74 (  c ) 
Diklofop-metyl 51338-27-3 4,20 3 3,77 (  c ) 
benantren 85-01-8 4,09 4 3,83 (  a ) 
Basic Blue 41 (blandning) 26850-47-5 
12270-13-2 4,89 4 4,46 (  a ) 
DDT 50-29-3 5,63 — (  b ) 
( a ) W. Kördel, J. Müller (1994), Bestimmung des Adsorplionskoeffizienten organischer Chemikalien mit der HPLC, UBA R & D 
Report No. 106 01044 (1994). 
( b ) B.V. Oepen, \V. Kördel, W. Klein. (1991). Chemosphere, 22, s. 285–304. 
( c ) (C) Data från industrin.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1248
 
C.20  REPRODUKTIONSTEST PA  DAPHNIA MAGNA  
1. METOD  
Denna testmetod för reproduktionstoxicitet motsvarar OECD TG 211 
(1998).  
1.1 INLEDNING 
Det primära syftet med detta test är att bedöma kemikaliers verk ­
ningar på reproduktionskapaciteten hos  Daphnia magna . 
1.2 DEFINITIONER OCH ENHETER  
Föräldrageneration:  de Daphnia -honor som finns närvarande vid 
testets början och vars reproduktionskapacitet testas.  
Avkomma:  de unga  Daphnia  som produceras av föräldrageneratio ­
nen under testets gång.  
Lägsta koncentration vid vilken verkningar observeras (Lowest 
observed effect concentration, LOEC):  den lägsta testkoncentratio ­
nen vid vilken ämnet inom en fastställd exponeringsperiod framkallar 
statistiskt signifikanta verkningar på reproduktion och på föräldrage ­
nerationens mortalitet (vid p < 0,05) jämfört med kontrollgruppen. Alla testkoncentrationer ovanför LOEC måste framkalla skadliga verkningar som är lika stora eller större än de verkningar som ob ­
serveras vid LOEC. Om dessa två villkor inte uppfylls måste en 
fullständig förklaring ges till hur man har valt LOEC (och NOEC).  
Koncentration vid vilken inga verkningar observeras 
(No observed effect concentration, NOEC):  den testkoncentration 
omedelbart under LOEC som inom en fastställd exponeringsperiod 
inte framkallar några statistiskt signifikanta verkningar (p < 0,05) 
jämfört med kontrollgruppen. 
EC
 X : den koncentration av testämnet upplöst i vatten som inom en 
fastställd exponeringsperiod leder till en minskning på x % av re ­
produktionskapaciteten hos  Daphnia magna . 
Inneboende tillväxthastighet:  ett mått på populationens tillväxt vil ­
ket omfattar reproduktionskapacitet och åldersspecifik mortalitet (20) 
(21) (22). I steady state-populationer är värdet på detta mått noll. För växande populationer är värdet positivt och för minskande popula ­
tioner är värdet negativt. Det senare är inte hållbart och leder i 
slutändan till utrotning.  
Detektionsgräns:  den lägsta koncentration som kan detekteras men 
inte kvantifieras.  
Bestämningsgräns:  den lägsta koncentration som kan mätas kvan ­
titativt.  
Mortalitet:  ett djur registreras som dött när det är orörligt, dvs. när 
det inte kan simma eller om man inte kan observera rörelser hos bihang eller bakkropp inom 15 sekunder efter en försiktig omrörning 
i testkärlet. (Eventuell annan definition som används måste rappor ­
teras tillsammans med motsvarande hänvisning.)
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1249
 
1.3 PRINCIP FÖR TESTMETODEN 
Unga honor av  Daphnia  (föräldragenerationen) som är yngre än 24 
timmar vid testets början exponeras för testämnet som tillsätts vatten i en serie koncentrationer. Testperiodens längd är 21 dagar. Vid 
testets slut görs en bedömning av mängden levande avkomma per 
föräldrageneration. Sådan avkomma som producerats under testet men som dör under testets gång räknas inte med. Föräldrageneratio ­
nens reproduktionskapacitet kan uttryckas på andra sätt (t.ex. mäng ­
den avkomma som producerats per djur per dag från och med första 
dagen då avkomma observerades). Sådana andra sätt måste i före ­
kommande fall rapporteras separat, utöver varje föräldragenerations 
totala mängd levande avkomma vid testets slut. Reproduktionskapa ­
citeten hos djur som exponeras för testämnet jämförs med kontroll ­
gruppens (kontrollgruppernas) reproduktionskapacitet i syfte att fast ­
ställa den lägsta koncentration vid vilken verkningar observeras (LO ­
EC) och den koncentration vid vilken inga verkningar observeras 
(NOEC). Dessutom bör data i så stor utsträckning det är möjligt analyseras med en regressionsmodell i syfte att uppskatta den kon ­
centration som skulle leda till en minskning på x % av reproduk ­
tionskapaciteten (t.ex. EC
 50 , EC  20 eller EC  10 ). 
Föräldragenerationens överlevnad och tiden fram till produktion av 
den första satsen avkomma måste också rapporteras. Övriga testäm ­
nesrelaterade verkningar på parametrar såsom tillväxt (t.ex. längd) 
och eventuellt inneboende tillväxthastighet kan också undersökas.  
1.4 INFORMATION OM TESTÄMNET 
Resultat frän test avseende akut toxicitet (se metod C.2, del I) som 
utförts på  Daphnia magna  bör finnas tillgängliga. Resultaten kan 
vara användbara vid valet av lämpliga testkoncentrationer för repro ­
duktionstest. Data om testämnets vattenlöslighet och ångtryck bör 
vara kända och man bör ha tillgång till en tillförlitlig analysmetod 
för kvantifiering av ämnet i testlösningarna med rapporterad åter ­
hämtningsgrad och bestämningsgräns. 
För definition av testförhållandena bör man ange bl.a. testämnets 
strukturformel, renhet, stabilitet i ljus, stabilitet vid testförhållandena, pKa, P
 ow och resultaten frän test för biologisk lättnedbrytbarhet (se 
metod C.4).  
1.5 TESTETS GILTIGHET 
För att ett test ska vara giltigt måste följande kriterier uppfyllas för 
kontrollgruppen (kontrollgrupperna): 
— Föräldragenerationens mortalitet (honor av  Daphnia)  får inte 
överskrida 20 % vid testets slut. 
— Det genomsnittliga antalet avkommor som har producerats per 
föräldradjur och som lever vid testets slut måste vara  > 60. 
1.6 BESKRIVNING AV TESTMETODEN  
1.6.1  Utrustning  
Testkärl och annan apparatur som kommer i kontakt med testämnet 
bör vara tillverkade av glas eller annat kemiskt inert material. I regel används glasbägare. 
Dessutom behövs åtminstone en del av följande utrustning: — Syrgasmätare (med mikroelektrod eller annan lämplig anordning 
för mätning av löst syrgas i lågvolymsprover).
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1250
 
— Utrustning för temperaturreglering. 
— pH-meter. — Utrustning för bestämning av vattnets hårdhetsgrad. 
— Utrustning för bestämning av totalt organiskt kol (TOC) i vattnet 
eller utrustning för bestämning av kemisk syreförbrukning 
(COD). 
— Apparatur för reglering av belysningen och mätning av ljusets 
intensitet.
 
1.6.2  Testorganism  
Testet utförs på  Daphnia magna  Straus. Andra  Daphnia-arter  kan 
användas förutsatt att de uppfyller tillämpliga giltighetskriterier (ett relevant giltighetskriterium är reproduktionskapaciteten i kontroll ­
grupperna). Om andra arter av  Daphnia  används måste de identifie ­
ras ordentligt och det ska motiveras varför de används. 
Klonen ska helst identifieras med hjälp av genotypen. Forsknings ­
resultat (1) har visat att reproduktionskapaciteten hos klon A (som 
härrör från IRCHA i Frankrike) (3) genomgående uppfyller giltig ­
hetskriteriet som gäller ett genomsnitt på > 60 överlevande avkom ­
mor per föräldradjur vid odling i de betingelser som beskrivs i denna 
metod. Andra kloner kan godtas förutsatt att  Daphnia -odlingen kan 
påvisas uppfylla giltighetskriterierna för ett test. 
Vid testets början måste djuren vara yngre än 24 timmar och får inte 
tillhöra den första satsen avkomma. Djuren måste komma från en frisk stam (dvs. de får inte uppvisa tecken på stress, t.ex. hög mor ­
talitet, förekomst av hanar och ephippia. fördröjd produktion av 
första satsen avkomma, missfärgade djur osv.). Stamdjuren måste 
hållas vid samma odlingsbetingelser (ljus, temperatur, medium, ut ­
fodring och djur per volymenhet) som används vid testet. Om annat än normalt odlingsmedium för  Daphnia  används vid testet är det 
tillrådligt med en acklimatiseringsperiod på i regel cirka tre veckor 
(dvs. en generation) innan testets inleds, för att undvika stress på föräldragenerationen.
 
1.6.3  Testmedium  
För testet rekommenderas ett fullständigt definierat medium. Avsak ­
naden av tillsatser (t.ex. alger, jordextrakt osv.) som är svåra att karakterisera möjliggör bättre standardisering mellan laboratorier. Elendt M4- (4) och M7-medier (se bilaga 1) har konstaterats vara 
lämpliga för ändamålet. Andra medier (se t.ex. (5) och (6)) kan 
godtas förutsatt att det kan visas att  Daphnia -odlingen uppfyller 
giltighetskriterierna för testet. 
Vid användning av medier som innehåller icke definierade tillsatser 
ska dessa tillsatser klart specificeras och uppgifter om deras samman ­
sättning lämnas i testrapporten. Det är särskilt viktigt att ange kol ­
halten, eftersom kol kan utgöra ett fodertillskott. Det rekommenderas 
att totalt organiskt kol (TOC) och/eller kemisk syreförbrukning (COD) bestäms i en stamberedning av den organiska tillsatsen och att en uppskattning görs av hur denna påverkar TOC/COD i test ­
mediet. TOC-nivån i mediet (dvs. före tillsats av algerna) bör vara 
lägre än 2 mg/l (7).
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1251
 
Vid testning av ämnen som innehåller metaller är det viktigt att 
beakta det faktum att testmediets egenskaper (t.ex. hårdhet och ke ­
lateringsförmåga) kan ha inverkan på testämnets toxicitet. Därför rekommenderas ett fullständigt definierat medium. För närvarande är Elendt M4 och M7 de enda medier som veterligen är lämpliga 
för långtidsodling av  Daphnia magna.  Båda medierna innehåller 
kelatbildaren EDTA. Det finns resultat (2) som tyder på att toxici ­
teten hos kadmium i regel förefaller vara lägre när reproduktions ­
testet genomförs i M4- och M7-medier än i när det genomförs i 
medier som inte innehåller EDTA. M4 och M7 rekommenderas 
därför inte för testning av ämnen som innehåller metaller. Likaså bör andra medier som innehåller kända kelatbildare undvikas. I fråga om metallhaltiga ämnen kan det vara tillrådligt att använda ett al ­
ternativt medium såsom ASTM-rekonstruerat hårt sötvatten (7) som 
inte innehåller EDTA, med tillsats av algextrakt (8). Kombinationen av ASTM-rekonstruerat hårt sötvatten och algextrakt är också lämp ­
lig för långtidsodling och testning av  Daphnia magna  (2), även om 
det fortfarande förekommer en svag keleringseffekt på grund av den 
organiska komponenten i det tillförda algextraktet. 
Vid testets början och under testets gång bör halten upplöst syrgas 
ligga över 3 mg/l. pH-värdet bör ligga inom området 6–9 och bör i 
regel inte variera med mer än 1,5 enheter inom ett test. En vatten ­
hårdhet över 140 mg/l (som CaCO
 3 ) rekommenderas. Vid test med 
denna nivå och över har man kunnat observera en reproduktions ­
kapacitet som uppfyller giltighetskriterierna (9) (10).  
1.6.4  Testlösningar  
Testlösningar av de valda koncentrationerna bereds i regel genom 
utspädning av en stamlösning. Stamlösningarna bör helst beredas genom upplösning av ämnet i testmediet. 
I vissa fall behövs organiska lösningsmedel eller dispergeringsmedel 
för att få en stamlösning av lämplig koncentration, men använd ­
ningen av sådana hjälpämnen bör undvikas med alla medel. Lämp ­
liga lösningsmedel är t.ex. aceton, etanol, metanol, dimetylformamid 
och trietylenglykol. Exempel på lämpliga dispergeringsmedel är Cre ­
mophor RH40, metylcellulosa (0,01 %) och HCO-40. Testämnets halt i testlösningarna bör under inga omständigheter överskrida lös ­
ligheten i testmediet. 
Lösningsmedel används för att producera en stamlösning som kan 
doseras exakt i vatten. Vid den rekommenderade lösningsmedelskon ­
centrationen i det slutliga testmediet (< 0,1 ml/l) är de ovan uppräknade 
lösningsmedlen inte toxiska och ökar inte ämnets vattenlöslighet. 
Dispergeringsmedel kan underlätta dispergering och exakt dosering. 
Vid den rekommenderade koncentrationen i det slutliga testmediet ( ≤ 
0,1 ml/l) är de ovan uppräknade dispergeringsmedlen inte toxiska 
och ökar inte ämnets vattenlöslighet.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1252
 
1.7 TESTETS UTFORMNING 
Fördelningen av behandlingar och den efterföljande hanteringen av 
testkärlen bör vara slumpmässig. I annat fall kan man få missvisande resultat som kan tolkas som en koncentrationsrelaterad verkan. Sär ­
skilt om testenheterna hanteras i koncentrationsordning kan vissa 
tidsrelaterade faktorer, såsom trötthet hos personalen eller andra fel ­
faktorer, leda till större verkningar vid de högre koncentrationerna. Om testresultaten sannolikt kommer att påverkas av omständigheter i 
början av testet eller av miljöbetingelser, såsom placering i labora ­
toriet, bor man överväga blockuppdelning.
 
1.8 FÖRFARANDE  
1.8.1  Exponeringsförhållanden  
1.8.1.1  Testperiodens längd  
Testperiodens längd är 21 dagar.  
1.8.1.2  Djurtäthet  
Föräldradjuren hålls individuellt, ett djur per testkärl, med 50–100 ml 
medium per kärl. 
I vissa fall behövs större volymer med tanke på de krav som gäller 
för den analytiska procedur som används för bestämning av testäm ­
nets koncentration, även om det för den kemiska analysen är tillåtet 
med pooling av replikat. Om volymer över 100 ml används måste eventuellt den dos som ges till  Daphnia  ökas för att garantera till ­
räcklig tillgång på foder och förenlighet med giltighetskriterierna. 
Vid genomflödestest kan alternativ testutformning övervägas av tek ­
niska skäl (t.ex. fyra grupper med 10 djur per grupp i en större volym), men varje ändring av testutformningen måste rapporteras.
 
1.8.1.3  Antalet djur  
För halvstatiskt test behövs minst 10 djur per testkoncentration och 
minst 10 individuellt hållna djur i kontrollserierna. 
För genomflödestest har en uppdelning med 40 djur i fyra grupper 
om 10 djur per testkoncentration visat sig vara lämplig (1). Ett mindre antal testorganismer kan användas och man rekommenderar 
ett minimum på 20 djur per koncentration uppdelade i två eller flera 
replikat med samma antal djur (t.ex. fyra replikat med fem  Daphnia  
per replikat). I fråga om test där djuren hålls i grupper bör man dock beakta att reproduktionskapaciteten inte kan uttryckas som totalanta ­
let överlevande avkommor per föräldradjur om föräldradjur dör. I 
sådana fall måste reproduktionskapaciteten uttryckas som ”totalanta ­
let överlevande avkommor som har producerats per föräldradjur som fanns närvarande vid testets början”.
 
1.8.1.4  Utfodring  
Vid halvstatiskt test ges foder helst dagligen men minst tre gånger 
per vecka (vid byte av medium). Avvikelser från detta (t.ex. vid 
genomflödestest) måste rapporteras.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1253
 
Under testet bör föräldradjuren helst utfodras med levande algceller. En 
eller flera av följande arter kan användas:  Chlorella  sp. Selenaslrum 
capricornutum  (numera  Pseudokirchneriella subcapitata  (11)) 
och Scenedesmus subspicatus . Utfodringen bör grunda sig på mängden 
organiskt kol (C) som ges till varje föräldradjur. Forskningsresultat (12) 
för Daphnia magna  har visat att det är tillräckligt med dosnivåer mellan 
0,1 och 0,2 mg organiskt kol per  Daphnia  och dag för att nå upp till den 
mängd avkomma som behövs med tanke på giltighetskriterierna för testet. Dosen kan ges med konstant dosering under hela testet eller, 
om så önskas, med lägre dosering i början och därefter ökande dosering 
i takt med föräldradjurens tillväxt. I det senare fallet bör dosen ändå alltid hållas inom det rekommenderade området 0,1–0,2 mg organiskt kol per  Daphnia  och dag. 
Om andra matningssätt (t.ex. antalet algceller eller ljusabsorbans) 
används för att kontrollera utfodringens dosnivå (av bekvämlighets ­
skäl, eftersom mätning av kolhalten är tidskrävande) måste varje 
laboratorium upprätta egna nomogram för mätningarna av algodling ­
ens kolhalt (i bilaga 2 finns anvisningar för hur man upprättar nomogram). Nomogrammen måste ses över minst årligen, och oftare om algodlingsbetingelserna har förändrats. Ljusabsorbans har 
konstaterats vara en bättre metod än cellräkning när det gäller 
bestämning av kolhalten (13). 
Algsuspensionen som används för utfodring av  Daphnia  bör vara 
koncentrerad, så att minimal volym algodlingsmedium överförs till 
testkärlen. För att höja algkoncentrationen kan man använda centri ­
fugering med påföljande återsuspension i destillerat vatten, avjonise ­
rat vatten eller  Daphnia -odlingsmedium.
 
1.8.1.5  Ljus  
Ljuset hälls på i 16 timmar med en intensitet som inte överskrider 
15–20 μE· m -2 · s -1 . 
1.8.1.6  Temperatur  
Temperaturen i testmediet bör hållas inom området 18–22  o C. Inom 
ett och samma försök får temperaturen i mån av möjlighet inte 
variera med mer än 2  o C inom de angivna gränserna (t.ex. 18–20, 
19–21 eller 20–22  o C). Temperaturövervakningen kan gärna ordnas 
med hjälp av ett extra testkärl.  
1.8.1.7  Luftning  
Testkärlen får inte luftas under testet.  
1.8.2  Testkoncentrationer  
I regel används minst fem testkoncentrationer. Koncentrationerna bör 
ligga i en geometrisk serie med en separationsfaktor som helst inte bör överskrida 3,2. Dessutom bör ett lämpligt antal replikat användas för varje testkoncentration (se avsnitt 1.8.1.3). Om mindre än fem 
koncentrationer används måste detta motiveras. Ämnen får inte testas 
i koncentrationer som överskrider löslighetsgränsen i testmediet.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1254
 
Vid valet av koncentrationsområde bör man beakta följande: 
i) Om syftet är att få värden på LOEC eller NOEC måste den 
lägsta testkoncentrationen vara tillräckligt låg för att fertiliteten vid den koncentrationen inte ska vara signifikant lägre än i kon ­
trollgruppen. I annat fall måste testet upprepas med en lägre 
lägsta koncentration. 
ii) Om syftet är att få värden på LOEC eller NOEC måste den 
högsta testkoncentrationen vara tillräckligt hög för att fertiliteten vid den koncentrationen ska vara signifikant lägre än i kontroll ­
gruppen. I annat fall måste testet upprepas med en högre högsta 
koncentration. 
iii) Om man bestämmer EC
 X för verkningar på reproduktionskapa ­
citeten är det tillrådligt att använda tillräckligt antal koncentratio ­
ner för att möjliggöra bestämning av EC  x med tillräcklig kon ­
fidensnivå. Om man bestämmer EC  5() för verkningar på repro ­
duktionskapaciteten är det tillrådligt att den högsta testkoncent ­
rationen är högre än detta värde på EC  50 . I annat fall blir kon ­
fidensintervallet för EC  50 mycket brett, även om det fortfarande 
är möjligt att bestämma värdet på EC  50 , och då blir det kanske 
inte möjligt att få en tillfredsställande bedömning av den anpas ­
sade modellens lämplighet. 
iv) Testkoncentrationsområdet bör helst inte innehålla koncentratio ­
ner som framkallar en statistiskt signifikant verkan på vuxna exemplars överlevnad. I ett sådant fall övergår nämligen testets 
natur från ett enkelt reproduktionstest till ett kombinerat repro ­
duktions- och mortalitetstest, för vilket det krävs en mycket mer komplex statistisk analys. 
Tidigare kunskap om testämnets toxicitet (t.ex. från test avseende 
akut toxicitet eller preliminära test) är till hjälp vid valet av lämpliga 
testkoncentrationer. 
Om ett lösnings- eller dispergeringsmedel används för att underlätta 
beredningen av testlösningar (se avsnitt 1.6.4) får slutkoncentrationen 
i testkärlet inte överskrida 0,1 ml/l och samma slutkoncentration bör 
användas i alla testkärl.
 
1.8.3  Kontrollserier  
En kontrollserie för testmediet och i förekommande fall en kontroll ­
serie med lösnings- eller dispergeringsmedlet bör köras utöver test ­
serierna. Kontrollseriernas lösningsmedel eller dispergeringsmedel 
bör ha samma koncentration som i testserierna. Lämpligt antal re ­
plikat bör användas (se avsnitt 1.8.1.3). 
I ett väl utfört test bör variationskoefficienten kring det genomsnitt ­
liga antalet levande avkommor som i kontrollgrupperna produceras per föräldradjur i regel vara 25 %. Värdet måste rapporteras i tes ­
tutformningar där djuren hålls individuellt.
 
1.8.4  Förnyelse av testmediet  
Frekvensen för förnyelse av testmediet beror på testämnets stabilitet, 
men får inte underskrida tre gånger i veckan. Om resultaten från 
preliminära stabilitetstest (se avsnitt 1.4) visar att testämnet inte hålls stabilt (dvs. utanför området 80–120 % av nominell koncentration eller under 80 % av uppmätt startkoncentration) under det maximala 
förnyelseintervallet (dvs. tre dagar) bör man överväga förnyelse med 
kortare intervall eller användning av genomflödestest.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1255
 
Vid halvstatiskt test görs förnyelse av mediet genom att en ny serie 
testkärl ställs i ordning och föräldradjuren överförs till de nya kärlen 
t.ex. med en glaspipett av lämplig diameter. Volymen medium som överförs med  Daphnia  bör vara så liten som möjligt.
 
1.8.5  Observationer  
Resultaten av de observationer som görs under testet registreras på 
blanketter (se exempel i bilagorna 3 och 4). Om andra mätningar 
krävs (se 1.3 och 1.8.8) behövs eventuellt tilläggsobservationer.  
1.8.6  Avkomma  
Det rekommenderas att avkommorna från varje föräldradjur tas bort 
och räknas dagligen efter det att produktionen av avkomma har satt i 
gäng, för att hindra avkommorna från att konsumera foder som är 
avsett för vuxna exemplar. I test enligt denna metod behöver bara levande avkommor räknas, men förekomsten av aborterade ägg eller döda avkommor bör registreras.
 
1.8.7  Mortalitet  
Mortaliteten bland föräldradjuren bör registreras, helst dagligen och 
minst varje gång avkommorna räknas.  
1.8.8  Övriga parametrar  
Även om denna metod främst är avsedd för bedömning av verkning ­
arna på reproduktionskapaciteten är det möjligt att övriga verkningar 
kan kvantifieras i tillräcklig grad med tanke på statistisk analys. Tillväxtmätningar är mycket önskvärda eftersom de ger information om eventuella subletala verkningar. Sådan information kan vara mer 
användbar än informationen från rena reproduktionsmätningar. Mät ­
ning av föräldradjurens längd (t.ex. kroppslängd exklusive analfenan) vid testets slut rekommenderas. Övriga parametrar som kan mätas eller beräknas är tiden fram till att den första satsen avkomma (och 
efterföljande satser) produceras, satsernas antal och storlek per djur, 
antalet aborterade satser, förekomsten av hanar eller  ephippia  och 
den inneboende tillväxthastigheten.
 
1.8.9  Frekvensen för analytiska bestämningar och mätningar  
Syrgashalten, temperaturen, hårdheten och pH bör mätas minst en 
gång i veckan i färska och gamla medier, i kontrollsatserna och i den högsta testämneskoncentrationen. 
Under testets gång bor testämnets koncentrationer bestämmas med 
regelbundna intervall. 
Vid halvstatiskt test, där testämnets koncentration bör hållas inom 
20 % av den nominella koncentrationen (dvs. inom området 
80–120 %, se avsnitten 1.4 och 1.8.4), rekommenderas att de högsta 
och lägsta testkoncentrationerna analyseras minst en gång under tes ­
tets första vecka, strax efter beredningen och vid förnyelse (analy ­
serna görs alltså på ett prov av samma lösning – när den är nyberedd 
och när den förnyas). Dessa bestämningar upprepas därefter minst 
varje vecka.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1256
 
Vid test där testämnets koncentration inte förväntas hållas inom ± 
20 % av den nominella koncentrationen är det nödvändigt att ana ­
lysera alla testkoncentrationer, när de är nyberedda och när de för ­
nyas. Vid test där testämnets uppmätta startkoncentration inte ligger inom ± 20 % av den nominella koncentrationen men det finns till ­
räckliga bevis på att startkoncentrationerna är repeterbara och stabila 
(dvs. inom området 80–120 % av startkoncentrationerna), kan de kemiska bestämningarna under testets vecka 2 och 3 begränsas till de högsta och lägsta testkoncentrationerna. Under alla omständighe ­
ter behöver bestämning av testämnets koncentration före förnyandet 
bara göras för ett enda replikatkärl per testämneskoncentration. 
Vid genomflödestest kan man lämpligen använda samma provtag ­
ningsschema som vid halvstatiska test (även om mätningen av ”gam ­
mal” lösning då inte är tillämplig). Det kan dock vara tillrådligt att 
utöka antalet provtagningstillfallen under den första veckan (t.ex. tre 
mätningar) som kontroll på att testkoncentrationerna hålls stabila. Vid dessa typer av försök bör strömningshastigheten för spädnings ­
medel och testämne kontrolleras dagligen. 
Om det däremot finns bevis på att testämnets koncentration i lös ­
ningen har hållits tillfredsställande inom ± 20 % av den nominella eller uppmätta startkoncentrationen under hela testperioden, kan no ­
minella eller uppmätta startvärden användas som grund för resulta ­
ten. Om avvikelsen från nominell eller uppmätt startkoncentration är 
större än 20 % bör resultaten uttryckas i form av tidsvägda medel ­
värden (se bilaga 5).
 
2. DATA OCH RAPPORTERING  
2.1 BEHANDLING AV RESULTATEN 
Syftet med testet är att bestämma hur testämnet påverkar antalet 
levande avkommor som produceras av varje föräldradjur som har 
överlevt testet. Totalantalet avkommor per föräldradjur beräknas för varje testkärl (varje replikat). Om föräldradjuret i något av replikaten dör under testet eller visar sig vara en hane, tas replikatet i fråga inte 
med i analysen. I ett sådant fall baserar sig analysen på ett reducerat 
antal replikat. 
För uppskattning av LOEC och NOEC med avseende på kemikaliens 
verkan på reproduktionskapaciteten är det nödvändigt att beräkna 
den genomsnittliga reproduktionskapaciteten för replikaten per kon ­
centration och den resterande standardavvikelsen. Detta kan göras med variansanalys (ANOVA). Medelvärdet för varje koncentration bör därefter jämföras med kontrollsatsen med hjälp av en lämplig 
metod för multipeljämförelse. Dunnetts eller Williams test kan an ­
vändas för ändamålet (14) (15) (16) (17). Det är nödvändigt att kontrollera hållbarheten hos ANOVA:s antagande om variansens ho ­
mogenitet. Det är tillrådligt att detta görs grafiskt, hellre än genom 
ett test avseende formell signifikans (18). Ett lämpligt alternativ är att 
köra ett Bartlett-test. Om antagandet inte är hållbart måste man över ­
väga att transformera data för att homogenisera varianserna innan ANOVA utförs, eller att utföra viktad ANOVA. Storleken på den 
verkan som kan detekteras med ANOVA (dvs. den minst signifi ­
kanta skillnaden) beräknas och rapporteras.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1257
 
För uppskattningen av den koncentration som skulle orsaka en 
minskning på 50 % av reproduktionskapaciteten (dvs. EC  50 ) bör 
en lämplig kurva, t.ex. den logistiska kurvan, anpassas till data med hjälp av en statistisk metod. t.ex. minsta kvadrat-metoden. Kur ­
van bör parametriseras så att EC
 50 och standardfelet kan uppskattas 
direkt. Därigenom underlättas beräkningen av konfidensintervallen 
kring EC  50 . Tvåsidiga konfidensintervall på 95 % bör tillämpas, 
utom om det finns goda skäl för att välja andra konfidensnivåer. Anpassningsproceduren bör helst ge tillgång till ett medel för be ­
dömning av signifikansen eller bristen på signifikans. Detta kan 
göras grafiskt eller genom att dela kvadraternas restsumma i ”brist på passning” och ”rena felkomponenter” och utföra ett signifikanstest avseende brist på passning. När man jämför behandlingar som ger 
låg fertilitet med behandlingar som ger hög fertilitet är det mer 
sannolikt att de senare leder till en högre varians avseende antalet avkommor som produceras. Därför bör man överväga viktning av de observerade värdena så att de återspeglar de olika varianserna i de 
olika behandlingsgrupperna (bakgrundsinformation finns i hänvis ­
ning 18). 
Vid analysen av data från det slutliga ringtestet (2) anpassades en 
logistisk kurva med hjälp av följande modell (även andra lämpliga modeller kan användas):
 
Y ¼ c 
1 þ x 
x 0 Í Î  b 
där: 
Y = det totala antalet avkommor per föräldradjur som är vid liv 
vid testets slut (beräknat för varje testkärl). 
x = ämnets koncentration. 
c = det förväntade antalet avkommor när x = 0. x
 0 = EC  50 i populationen. 
b = lutningsparametern. 
Denna modell kan tillämpas i många situationer, även om den inte är 
lämplig för alla test. En kontroll av modellens giltighet bör göras på det sätt som föreslås ovan. I vissa fall kan det vara lämpligt med en 
hormesis-modell där låga koncentrationer ger ökade verkningar (19). 
Man kan även uppskatta koncentrationerna för övriga verkningar, 
t.ex. EC
 10 eller EC  20 . Det kan dock vara bättre att använda en annan 
parametrisering än den som används för uppskattning av EC  50 . 
2.2 TESTRAPPORT 
Testrapporten ska innehålla nedan angivna uppgifter.  
2.2.1  Testämne:  
— Aggregationstillstånd och relevanta fysikalisk-kemiska egenskaper.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1258
 
— Kemiska identifieringsdata, inbegripet renhet.  
2.2.2  Försöksdjur:  
— Klonen (om den har identifierats med genotypen eller inte), le ­
verantör eller ursprung (om uppgiften är känd) och de odlings ­
betingelser som har använts. Om annan art än  Daphnia magna  
har använts måste detta rapporteras och motiveras.  
2.2.3  Testförhållanden:  
— Använt testförfarande (t.ex. halvstatiskt test eller genomflödes ­
test, volym, antal  Daphnia  per liter). 
— Ljusperiod och ljusintensitet. — Testets utformning (t.ex. antalet replikat, antalet föräldradjur per 
replikat). 
— Detaljuppgifter om det odlingsmedium som har använts. — I förekommande fall uppgifter om tillsatser av organiskt material 
och information om sammansättning, ursprung, beredningsmetod, TOC och COD för stamberedningar, uppskattning av resulterande TOC och COD i testmediet. 
— Detaljerad information om utfodringen, inbegripet mängd (ut ­
tryckt som mg kol per  Daphnia  per dag) och schema (t.ex. typen 
av foder, och i fråga om alger specifikt namn (arter) och i den mån uppgifter finns, stam och odlingsbetingelser). 
— Metoden för beredning av stamlösningar och förnyelsefrekvensen 
(i förekommande fall måste även lösnings- eller dispergerings ­
medlet och dess koncentration anges).
 
2.2.4  Resultat:  
— Resultaten från eventuella preliminära test gällande testämnets 
stabilitet. 
— De nominella testkoncentrationerna och resultaten av alla analy ­
ser för att fastställa koncentrationen av testämnet i testkärlen 
(exempel på blanketter finns i bilaga 4). Metodens återhämt ­
ningsgrad och bestämningsgränsen måste även rapporteras. 
— Vattenkvaliteten i testkärlen (pH, temperatur och halten upplöst 
syrgas, i förekommande fall TOC eller COD och hårdhet) (ex ­
empel på blanketter finns i bilaga 3). 
— Fullständig registrering av levande avkommor från varje föräld ­
radjur (exempel på blankett finns i bilaga 3). 
— Antalet föräldradjur som dött och den dag de dött (exempel på 
blankett finns i bilaga 3). 
— Variationskoefficienten för kontrollgruppens fertilitet (baserad på 
det totala antalet levande avkommor per föräldradjur som är vid 
liv vid testets slut). 
— Kurva som visar det totala antalet levande avkommor per för ­
äldradjur (för varje replikat) som är vid liv vid testets slut som funktion av testämneskoncentrationen. 
— Den lägsta koncentrationen vid vilken verkan observeras på re ­
produktionskapaciteten (LOEC), inklusive en beskrivning av de 
statistiska metoder som har använts, en indikation om de obser ­
verade verkningarnas styrka och koncentrationen vid vilken ingen verkan på reproduktionen observeras (NOEC). I tillämpliga 
fall bör även LOEC och NOEC för föräldradjurens mortalitet 
rapporteras.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1259
 
— I tillämpliga fall EC  X för reproduktion, konfidensintervall och en 
kurva för den anpassade modell som har använts för beräkning ­
en, lutningen hos dos-responskurvan och dess standardavvikelse. 
— Övriga observerade biologiska verkningar eller mätningar: Varje 
observerad eller uppmätt biologisk verkan (t.ex. föräldradjurens tillväxt) tillsammans med alla tillbörliga motiveringar. 
— Motiveringar for varje avvikelse från testmetoden.
 
3. HÄNVISNINGAR  
1. OECD Test Guideline Programme, Report of the Workshop on 
the Daphnia magna  Pilot Ring Test, Sheffield University, UK, 
20 March 1993–21 March 1993. 
2. OECD Environmental Health and Safety Publications. Series on 
Testing and Assessment No. 6. Report of the Final Ring Test of 
the Daphnia magna  Reproduction Test Paris. 1997. 
3. Baird D. J., Barber J., Bradley M. C, Soares A.M.V.M. och 
Calow P. (1991), A comparative study of genotype sensitivity 
to acute toxic stress using clones of  Daphnia magna  Strauss. 
Ecotoxicology and Environmental Safety, 21, s. 257–265. 
4. Elendt B. P., (1990), Selenium deficiency in Crustacea; An 
ultrastructural approach to antennal damage in  Daphnia magna  
Straus. Protoplasma, 154, s. 25–33. 
5. EPA (1993), Methods for Measuring the Acute Toxicity of Eff ­
luents and Receiving Waters to Freshwater and Marine Orga ­
nisms. (Fourth ed.). EPA/600/4-90/027F. C. I. Weber (ed), USEPA, Cincinnati, Ohio. 
6. Vigano L., (1991), Suitability of commercially available spring 
waters as standard medium for culturing  Daphnia magna . Bull. 
Environ. Contam. Toxicol., 47, s. 775–782. 
7. ASTM (1988), Standard Guide for Conducting Acute Toxicity 
Tests with Fishes, Macroinvertebrates and Amphibians. E729- 
88a. American Society for Testing and Materials, Philadelphia P.A. 20 pp. 
8. Baird D. J., Soares A.M.V.M., Girling A., Barber J., Bradley 
M. C. och Calow P. (1989), The long term maintenance of  
Daphnia magna  Straus for use in ecotoxicological tests; pro ­
blems and prospects. In: Proceedings of the lst European Con ­
ference on Ecotoxicology. Copenhagen 1988 (H. Løkke, H. 
Tyle & F. Bro-Rasmussen. Eds.), s. 144–148. 
9. Parkhurst B. R., Forte J. L. och Wright G. P. (1981), Repro ­
ducibility of a life-cycle toxicity test with  Daphnia magna . Bull. 
Environ. Contam. and Toxicol., 26, s. 1–8. 
10. Cowgill U. M. och Milazzo D. P. (1990), The sensitivity of two 
cladocerans to water quality variables: salinity and hardness. 
Arch. Hydrobiol., 120(2). s. 185–196. 
11. Korshikov (1990),  Pseudokirchneriella subcapilala  Hindak, F- 
1990. Biologice Prace, 36, 209. 
12. Sims I. R., Watson S. och Holmes D. (1993), Toward a stan ­
dard Daphnia  juvenile production test. Environmental Toxicol ­
ogy and Chemistry, 12, sp. 2053–2058.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1260
 
13. Sims 1. (1993), Measuring the growth of phytoplankton: the 
relationship between total organic carbon with three commonly 
used parameters of algal growth. Arch. Hydrobiol., 128, s. 459–466. 
14. Dunnett C. W., (1955), A multiple comparisons procedure for 
comparing several treatments with a control. J. Amer. Statist. 
Assoc, 50, s. 1096–1121. 
15. Dunnett C. W., (1964), New tables for multiple comparisons 
with a control. Biometrics, 20, s. 482–491. 
16. Williams D. A. (1971), A test for differences between treatment 
means when several dose levels are compared with a zero dose 
control. Biometrics 27, s. 103–117. 
17. Williams D. A. (1972), The comparison of several dose levels 
with a zero dose control. Biometrics, 28, s. 510–531. 
18. Draper N. R. och Smith H. (1981), Applied Regression 
Analysis, second edition, Wiley, N.Y. 
19. Brain P. och Cousens R. (1989), An equation to describe dose 
responses where there is stimulation of growth at low doses. 
Weed Research, 29, s. 93–96. 
20. Wilson E. O. och Bossert, W. H. (1971), A Primer of Popula ­
tion Biology. Sinauer Associates Inc. Publishers. 
21. Poole R. W. (1974), An Introduction to quantitative Ecology. 
Mc Graw-Hill Series in Population Biology, New York, s. 532. 
22. Meyer J. S., Ingersoll C. G., McDonald L. L. och Boyce M. S. 
(1986), Estimating uncertainty in population growth rates: Jackknife vs bootstrap techniques. Ecology, 67, s. 1156–1166.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1261
 
Bilaga 1  
BEREDNING AV FULLSTÄNDIGT DEFINIERADE ELENDT M7- OCH 
M4-MEDIER  
Acklimatisering till Elendt M7- och M4-medier  
I vissa laboratorier har man stött på svårigheter vid direkt överföring av  Daphnia  
till M4- (1) och M7-medier. Man har haft vissa framgångar med stegvis ackli ­
matisering, dvs. först en överflyttning till 30 % Elendt, sedan till 60 % Elendt och därefter till 100 % Elendt. I vissa fall måste acklimatiseringsperioden ut ­
sträckas till en månad.
 
BEREDNING  
Spårelement  
Separata stamlösningar (1) av enskilda spårelement bereds först i vatten av 
lämplig renhet (renat t.ex. genom avjonisering, destillering eller omvänd osmos). 
Utifrån dessa stamlösningar (I) bereds en andra stamlösning (II) som innehåller 
alla spårelement (kombinerad lösning), enligt tabellen nedan.  
Stamlösningar I 
(enskilt ämne) Mängd som sätts 
till vallen 
(mg/l) Koncentration 
(i förhållande till 
medium M4) 
(faktor) För beredning av kombinerad 
stamlösning II tillsätts följande mängd 
stamlösning I till vatten 
(ml/1) 
M 4 M 7 
H 3 BO 3 57 190 20 000 1,0 0,25 
MnCl  2 * 4 H  2 O 7 210 20 000 1,0 0,25 
LiCl 6 120 20 000 1,0 0,25 
RbCl 1 420 20 000 1,0 0,25 
SrCl  2 * 6 H  2 0 3 040 20 000 1,0 0,25 
NaBr 320 20 000 1,0 0,25 Na
 2 MoO  4 * 2 H  2 O 1 260 20 000 1,0 0,25 
CuCl  2 * 2 H  2 O 335 20 000 1,0 0,25 
ZnCl  2 260 20 000 1,0 1,0 
CoCl  2 * 6 H  2 O 200 20 000 1,0 1,0 
Kl 65 20 000 1,0 1,0 
Na 2 SeO  3 43,8 20 000 1,0 1,0 
NH  4 VO  3 11,5 20 000 1,0 1,0 
Na 2 EDTA * 2 H  2 0 5 000 2 000 — — 
FeSO  4 * 7 H  2 O 1 991 2 000 — — 
Na 2 EDTA- och FeSO  4 -lösningarna bereds separat, hälls samman och sätts omedelbart i autoklav. Det ger följande: 
21 Fe-EDTA-lösning 1 000 20,0 5,0  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1262
 
M4- och M7-medier  
M4- och M7-medier bereds med användning av stamlösning II, makronärings ­
ämnen och vitaminer, enligt tabellen nedan.  
Mängd som sätts 
till vatten 
mg/l Koncentration 
(i förhållande till 
medium M4) 
(faktor) Mängd stamlösning som tillsätts för 
beredning av medium 
(m1/1) 
M 4 M 7 
Stamlösning II med kombination av spårele ­
ment 20 50 50 
Stamlösningar med makronäringsämnen 
CaCl  2 * 2 H  2 0 293 800 1 000 1,0 1,0 
MgSO  4 * 7 H  2 O 246 600 2 000 0,5 0,5 
KC1 58 000 10 000 0,1 0,1 NaHCO
 3 64 800 1 000 1,0 1,0 
Na 2 SiO  3 * 9 H  2 0 50 000 5 000 0,2 0,2 
NaNO  3 2 740 10 000 0,1 0,1 
KH  2 PO 4 1 430 10 000 0,1 0,1 
K 2 HPO  4 1 840 10 000 0,1 0,1 
Kombinerad vitaminstamlösning — 10 000 0,1 0,1 Den kombinerade vitaminstamlösningen bereds genom att sätta till de tre vitaminerna till en liter vatten enligt nedan. Tiaminhydroklorid 750 10 000 Cyanocobalamin (B
 12 ) 10 10 000 
Biotin 7,5 10 000  
Den kombinerade vitaminstamlösningen lagras nedfryst i små alikvoter. Vitaminerna sätts till medierna strax före användningen.  
Anm.  För att undvika utfällning av salter vid beredning av det kombinerade mediet ska man tillsätta stamlösningsalikvoterna till ci rka 
500–800 ml avjoniserat vatten och därefter fylla upp till en liter.  
Anm.  Den första offentliggjorda informationen om M4-medium finns i Elendt, B.P. (1990), Selenium deficiency in crustacea; an 
ultrastructural approach to antennal damage in  Daphnia magna  Straus. Protoplasma, 154, s. 25–33.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1263
 
Bilaga 2  
ANALYS AV TOTALT ORGANISKT KOL (TOC) OCH UPPRÄTTANDE 
AV NOMOGRAM FÖR TOC I ALGFODER  
Det är allmänt känt att kolhalten i algfodret i regel inte mäts direkt utan fås 
genom korrelationer (nomogram) med surrogatmätningar av t.ex. antalet algceller 
eller ljusabsorbans. 
För mätning av TOC är högtemperaturoxidation att föredra framför UV- eller 
persulfatmetoder. (Se  The Instrumental Determination of Total Organic Carbon. 
Total Oxygen Demand and Related Determinands,  1979, HMSO 1980; 49 High 
Holborn, London WC1V 6HB). 
Före mätningarna för nomogrammet separeras algerna från tillväxtmediet genom 
centrifugering med påföljande återsuspension i destillerat vatten. För varje prov mäts surrogatparametern och TOC tre gånger. Blindprov med destillerat vatten bör analyseras och TOC-värdet härledas från det TOC-värde som erhållits för 
algprovet. 
Nomogrammet bör vara linjärt över det avsedda kolhaltområdet. Nedan visas 
några exempel. 
Anm.: Dessa exempel bör inte användas för konversioner. Det är väsentligt att 
laboratorierna upprättar egna nomogram.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1264
 
▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1265
 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1266
 ▼B 
Bilaga 3  
EXEMPEL PÅ BLANKETT FÖR REGISTRERING AV MEDIUMFÖRNYELSE, FYSIKALISK-KEMISKA UPPFÖLJNINGSDATA, UTFODRING, DAPHNIA-REPRODUKTION O CH 
VUXENMORTALITET  
Försök nr: Data fr.o.m.: Klon: Medium: Typ av foder: Testämne: Nominell konc.: 
Dag 0 ] 2 ! 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21  
Mediumförnyelse 
bocka för) 
PH (  1 ) färsk 
gammal 
0 2 mg/l (  1 ) färsk 
gammal 
Temperatur (  o C) (  1 ) färsk 
gammal 
Utfordring (bocka 
för) 
Antal levande (  2 ) Total 
Kärl 1 2 
3 
4 5
 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1267
 ▼B 
Försök nr: Data fr.o.m.: Klon: Medium: Typ av foder: Testämne: Nominell konc.: 
Dag 0 ] 2 ! 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21  
6 
7 8 9 10 
Total 
Kumulativ 
vuxenmortalitet (
 3 ) 
( 1 ) Ange vilket kärl som användes för försöket. 
( 2 ) Markera varje dött provexemplar med ”M” i relevant ruta. 
( 3 ) Markera aborterade satser med ”AB” i relevant ruta.
 Bilaga 4  
EXEMPEL PÅ BLANKETT FÖR REGISTRERING AV RESULTAT FRÅN KEMISK ANALYS  
(a) Uppmätta koncentrationer  
Nominell konc. Prov från vecka 1 Prov från vecka 2 Prov från vecka 3 
Färsk Gammal Färsk Gammal Färsk Gammal  
(b) Uppmätta koncentrationer uttryckta som procent av nominella koncentrationer  
Nominell konc. Prov från vecka 1 Prov från vecka 2 Prov från vecka 3 
Färsk Gammal Färsk Gammal Färsk Gammal  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1268
 
Bilaga 5  
BERÄKNING AV TIDSVÄGT MEDEL VÄRDE  
Tidsvägt medelvärde  
Utifrån det faktum att testämnets koncentration kan sjunka under perioderna 
mellan mediumförnyelse är det nödvändigt att överväga vilken koncentration 
man ska anse utgöra representativ koncentration för det koncentrationsområde 
som föräldragenerationen av  Daphnia  exponeras för. Valet ska basera sig på både 
biologiska och statistiska faktorer. Om man t.ex. tror att fortplantningen mest påverkas av den högsta koncentrationen som förekommer ska den koncentratio ­
nen användas som representativ koncentration. Om däremot ackumulerade verk ­
ningar eller långtidsverkningar av det toxiska ämnet anses vara viktigare ska medelkoncentrationen användas. I det fallet är det lämpligt att använda tidsvägd medelkoncentration eftersom den beräknas med beaktande av de variationer som 
den momentana koncentrationen genomgår över tiden.
 
Figur 1:  
Exempel på tidsvägt medelvärde
  
I figur 1 visas ett exempel på ett (förenklat) test som omfattar 7 dagar och där 
mediumförnyelse görs dag 0, 2 och 4. 
Den tunna linjen som går upp och ned representerar momentana koncent ­
rationer. Koncentrationssänkningen antas följa en exponentiell sönderfallspro ­
cess. 
De sex punkterna representerar observerade koncentrationer som har upp ­
mätts vid början och slutet av varje förnyelseperiod. 
Den tjocka horisontella linjen indikerar nivån för det tidsvägda medelvärdet. 
Det tidsvägda medelvärdet beräknas så, att ytan under det tidsvägda medelvärdet 
är lika stor som ytan under koncentrationskurvan. Beräkningen för exemplet i 
figuren ovan illustreras i tabell 1.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1269
 
Tabell 1:  
Beräkning av tidsvägt medelvärde  
Förnyelse nr Dagar Konc0 Konc1 Ln(KoncO) Ln(Konc1) Yta  
1 2 10,000 4,493 2,303 1,503 13,767 
2 2 11,000 6,037 2,398 1,798 16,544 3 3 10,000 4,066 2,303 1,403 19,781 
Jagar totalt: 7 Totalyta 50,091 
Tidsvägt 
medeltal 7,156
 
Dagar  avser antalet dagar i förnyelseperioden.  
Konc0  är den uppmätta koncentrationen vid varje förnyelseperiods början.  
Konc1  är den uppmätta koncentrationen vid varje förnyelseperiods slut.  
Ln(konc0)  är den naturliga logaritmen av Konc0  
Ln(Konc1)  ar den naturliga logaritmen av Konc1  
Yta år ytan under den exponentiella kurvan för varje förnyelseperiod. Den beräknas enligt 
följande:  
Area ¼ Conc 0 Ä Conc 1 
LnðConc 0Þ Ä LnðConc 1Þ Ü dagar  
Det tidsvägda medelvärdet är värdet för Totalyta dividerat med värdet för Dagar 
totalt. 
För Daphnia -reproduktionstest måste tabellen självfallet utökas så att den sträcker 
sig över 21 dagar. 
När observationer görs endast i början och slutet av varje förnyelseperiod är det 
uppenbart att det inte ar möjligt att bekräfta att sönderfallsprocessen verkligen är 
exponentiell. En annorlunda kurva skulle resultera i en annorlunda beräkning av värdet för Yta. Det är dock inte osannolikt att sönderfallsprocessen är exponen ­
tiell och därför är en sådan kurva troligen det bästa alternativet, i brist på annan 
information. 
Däremot finns det anledning att se upp om man genom den kemiska analysen vid 
förnyelseperiodens slut inte lyckas få fram någon halt av ämnet. Om det inte är möjligt att uppskatta hur snabbt ämnet har försvunnit ur lösningen är det inte möjligt att få en realistisk yta under kurvan, och följaktligen inte heller möjligt att 
få ett meningsfullt tidsvägt medelvärde.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1270
 
C.21  JORDLEVANDE MIKROORGANISMER: TEST RÖRANDE 
OMVANDLING AV KVÄVE  
1. METOD  
Denna testmetod är i stort sett identisk med OECD TG 216 (2000).  
1.1 INLEDNING 
Den testmetod som beskrivs här är en laboratoriemetod för under ­
sökning av vilka långtidseffekter en engångsexponering av en kemi ­
kalie kan ha på jordlevande mikroorganismers omvandling av kväve. Testmetoden grundar sig i huvudsak på rekommendationerna från 
Växtskyddsorganisationen för Europa och Medelhavsområdet (EP ­
PO) (1). Även övriga riktlinjer har beaktats, till exempel riktlinjerna från Biologische Bundesanstalt i Tyskland (2), Environmental Pro ­
tection Agency i USA (3) SETAC (4) och Internationella standardi ­
seringsorganisationen (5). Vid en OECD-workshop om valet av jord 
och sediment i Belgirate, Italien, 1995 (6), kom man överens om hur många och vilka jordtyper som ska användas i detta test. Rekom ­
mendationerna för insamling, hantering och lagring av jordprover 
grundar sig på ISO-riktlinjer (7) och rekommendationer från works ­
hopen i Belgirate. Vid bedömning och utvärdering av olika ämnens toxiska egenskaper kan det vara nödvändigt att bestämma effekterna på den mikrobiella aktiviteten i jorden, till exempel när det behövs 
upplysningar om potentiella bieffekter som växtskyddsprodukter kan 
ha på mikrofloran i jorden, eller när det kan förväntas att de jord ­
levande mikroorganismerna exponeras för andra kemikalier än växt ­
skyddsprodukter. Testet rörande omvandling av kväve görs för att 
bestämma sådana kemikaliers effekter på mikrofloran i jorden. Vid 
testning av jordbrukskemikalier (till exempel växtskyddsprodukter, gödselmedel, skogskemikalier) bör testet omfatta både omvandling 
av kväve och omvandling av kol. För övriga kemikalier är det till ­
räckligt med test rörande omvandling av kväve. När sådana kemika ­
lier testas rörande omvandling av kväve och man får EC
 50 -värden 
som faller inom samma område som gäller för kommersiellt tillgäng ­
liga nitrifikationshämmande medel (till exempel nitrapyrin), kan man 
även göra test rörande omvandling av kol i syfte att få ytterligare upplysningar. 
Jord består av levande och icke-levande komponenter som förekom ­
mer i komplexa och heterogena sammansättningar. Mikroorganis ­
merna spelar en viktig roll för nedbrytning och omvandling av or ­
ganiskt material i fertila jordar. Det finns många olika arter av mik ­
roorganismer som inverkar på olika aspekter av jordens fertilitet. 
Långvariga störningar av dessa biokemiska processer kan även störa 
kretsloppet av näringsämnen, vilket i sin tur kan leda till förändringar av jordens fertilitet. Omvandling av kol och kväve sker i alla fertila jordar. Även om de mikrobsamhällen som utför dessa processer 
varierar från jord till jord, följer omvandlingen i huvudsak samma 
mönster. 
Syftet med den testmetod som beskrivs här är att upptäcka de skad ­
liga långtidseffekter som ett ämne kan ha på omvandlingen av kväve 
i aerob ytjord. Testmetoden kan också användas för att uppskatta 
olika ämnens effekter på den omvandling av kol som utförs av mikrofloran i jorden. Nitratbildning sker efter att kol-kvävebindning ­
arna har brutits. Om nitratproduktionen sker med samma hastighet i 
behandlad jord och kontrolljord, är det därför mycket sannolikt att de 
viktigaste kolnedbrytningsfunktionerna är intakta och välfungerande. Det substrat som har valts för testet (lusernmjöl) har en gynnsam kol/kväve-kvot (i regel mellan 12/1 och 16/1). Därigenom reduceras 
kolbristen under testets gång, och om ett mikrobsamhälle skadas av 
en kemikalie är det möjligt att det återhämtar sig inom 100 dagar.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1271
 
De test som har använts som grund för denna testmetod är primärt 
utformade för situationer där den mängd ämne som når jorden kan 
förutses. Så är fallet till exempel för växtskyddsprodukter där man känner till den mängd som har applicerats på en åker. För jordbruks ­
kemikalier räcker det med att testa två sådana doser som är relevanta 
med tanke på den förväntade dosen. Jordbrukskemikalier kan testas 
med avseende på aktiva ämnen eller produktsammansättningar. Tes ­
tet är dock inte begränsat till jordbrukskemikalier. Genom att ändra både mängderna testämne som tillförs jorden och metoderna för 
utvärdering av data, kan testet även användas för situationer där 
mängden kemikalie som förväntas nå jorden inte är känd. På så sätt kan man i fråga om andra kemikalier än jordbrukskemikalier bestämma effekterna av en serie koncentrationer på omvandlingen 
av kväve. Erhållna testdata används för att rita upp en dos-respons ­
kurva och beräkna EC
 x -värden, där x är den procentuella effekten.  
1.2 DEFINITIONER  
Omvandling av kväve:  Den slutliga nedbrytningen av kvävehaltigt 
material genom inverkan av mikroorganismer. Nedbrytningen sker 
via ammonifiering och nitrifiering, och utmynnar i den oorganiska 
slutprodukten nitrat.  
EC x (effektiv koncentration):  Den koncentration av testämnet i 
jorden som leder till att omvandlingen av kväve till nitrat hämmas 
till x procent.  
EC 50 (median effektiv koncentration):  Den koncentration av tes ­
tämnet i jorden som leder till att omvandlingen av kväve till nitrat 
hämmas till 50 procent.  
1.3 REFERENSÄMNEN 
Inga.  
1.4 PRINCIP FÖR TESTMETODEN 
Siktad jord förbättras med växtmjöl och behandlas med testämnet 
eller lämnas obehandlad (kontrollprov). Vid testning av jordbruks ­
kemikalier rekommenderas minst två testkoncentrationer, och dessa 
bör väljas med beaktande av den högsta koncentration som kan 
förväntas nå jorden. Efter 0, 7, 14 och 28 dagars inkubation behand ­
las jordproverna (behandlad jord och kontrolljord) med ett lämpligt lösningsmedel och extrakten analyseras med avseende på nitrat ­
mängd. Nitratbildningshastigheten i behandlade prover jämförs med 
den i kontrollproverna, och den procentuella avvikelsen mellan be ­
handlade prover och kontrollprover beräknas. Alla test bör omfatta minst 28 dagar. Om skillnaderna mellan behandlade och obehand ­
lade prover är minst 25 % dag 28, görs fortsatta bestämningar under 
en period som maximalt sträcker sig till dag 100. Vid testning av andra kemikalier än jordbrukskemikalier tillförs en serie koncent ­
rationer av testämnet till jordproverna och mängderna bildat nitrat i 
behandlade och obehandlade prover bestäms efter inkubation i 28 
dagar. Resultaten från test med flera koncentrationer analyseras med hjälp av en regressionsmodell och relevanta EC
 X -värden beräknas 
(till exempel EC  50 , EC  25 och/eller EC  10 ). Se definitionerna.  
1.5 TESTETS GILTIGHET 
Utvärderingen av testresultat rörande jordbrukskemikalier baserar sig 
på relativt små skillnader (till exempel medelvärde ± 25 %) mellan nitratkoncentrationerna i obehandlade och behandlade jordprover. Därför kan stora variationer i de obehandlade proverna leda till 
falska resultat. Variationen mellan obehandlade replikatprover bör 
därför vara mindre än ± 15 %.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1272
 
1.6 BESKRIVNING AV TESTMETODEN  
1.6.1  Utrustning  
Provbehållarna bör vara tillverkade av kemiskt inert material. Deras 
volym bör anpassas till det förfarande som används för inkubation av 
jorden, till exempel inkubation som bulk eller som en serie indi ­
viduella jordprover (se avsnitt 1.7.1.2). Det är viktigt att minimera vattenförlusterna och sörja för gasväxling under testets förlopp (prov ­
behållarna kan till exempel täckas med perforerad polyetylenfilm). 
Vid testning av flyktiga ämnen bör förseglingsbara och gastäta be ­
hållare användas. Behållarnas storlek bör anpassas så att jordprovet upptar cirka en fjärdedel av behållarens volym. 
Därutöver behövs normal laboratorieutrustning, enligt följande: — Omrörare: en mekanisk skakapparat eller motsvarande. — Centrifug (3 000 g) eller filtreringsutrustning (med nitratfritt fil ­
terpapper). 
— Instrument för nitratanalys, med adekvat känslighet och repro ­
ducerbarhet.
 
1.6.2  Valet av jord och antal jordtyper  
Endast en typ av jord används. Följande rekommendationer gäller för 
jorden: 
— Sandhalt: minst 50 % och högst 75 %. — pH: 5,5–7,5. — Halten organiskt kol: 0,5–1,5 %. — Den mikrobiella biomassan bör bestämmas (8), (9) och dess 
kolhalt bör vara minst 1 % av jordens totala organiska kol. 
I de flesta fall är jord med dessa egenskaper ett exempel på sämsta 
möjliga situation – adsorptionen av testämnet är minimal, medan 
mikrofloran har maximal tillgång till testämnet. Det betyder att det 
i regel inte behövs test med andra typer av jord. I vissa fall, till exempel där testämnet mestadels förväntas hamna i speciella jordar såsom sura skogsjordar eller om testämnet består av elektrostatiskt 
laddade kemikalier, kan det vara nödvändigt att använda en extra 
jordtyp.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1273
 
1.6.3  Insamling och lagring av jordprover  
1.6.3.1  Insamling  
Man bör ha tillgång till detaljerade upplysningar om historian för den 
plats där testjorden tas. Upplysningarna bör omfatta exakt läge, växt ­
lighetstäcke, datum för behandlingar med växtskyddsprodukter, be ­
handlingar med organiska och oorganiska gödselmedel, tillförsel av biologiska material eller oavsiktlig förorening. Den plats som väljs för provtagningen bör vara lämpad för långtidsanvändning. Lämpliga 
platser är flerårig ängsmark, åkrar med ettåriga spannmålsgrödor 
(utom majs) och tättsådda grönbeten. Vid provtagningstidpunkten måste det ha gått minst ett år från en eventuell behandling av prov ­
tagningsplatsen med växtskyddsprodukter. Det bör även ha gått 
minst sex månader från tillförsel av organiska gödselmedel. Använd ­
ning av mineralgödselmedel är godtagbar endast när detta sker med utgångspunkt från grödans behov. Jordprover får inte tas förrän det 
har gått minst tre månader från gödslingen. Jord som har behandlats 
med gödselmedel med kända biocideffekter (till exempel kalcium ­
cyanid) bör undvikas. 
Provtagning bör undvikas under eller strax efter långa perioder 
(längre än 30 dagar) av torka eller vattenmättnad. På plöjd mark 
ska jordproverna tas på ett djup mellan 0 och 20 cm. På gräsmark (ängar) eller annan mark som plöjs sällan (minst en växtsäsong mellan varje plöjning) kan maximidjupet för provtagningen vara 
lite mer än 20 cm (till exempel 25 cm). 
Jordproverna ska transporteras i behållare, och temperaturbeting ­
elserna bör vara sådana att det inte finns risk för signifikanta för ­
ändringar av jordens ursprungliga egenskaper.
 
1.6.3.2  Lagring  
De jordprover som används ska helst vara nytagna. Om lagring i 
laboratoriet inte kan undvikas kan jordproverna hållas i mörker vid 4 ±2
 o C under högst tre månader. Det är viktigt att lagringsbeting ­
elserna är aeroba. Om jordprover tas från områden där marken är 
frusen under minst tre månader per år kan proverna lagras vid 
- 18  o C till - 22  o C under högst sex månader. Den mikrobiella 
biomassan hos lagrade jordprover bestäms före varje försök. Biomas ­
sans kolhalt bör vara minst 1 % av jordens totala kolhalt (se 
avsnitt 1.6.2).  
1.6.4  Hantering och beredning av jordprover som testas  
1.6.4.1  Förinkubation  
För jordprover som har lagrats (se avsnitt 1.6.3.2) rekommenderas en 
förinkubation under 2–28 dagar. Under förinkubationen bör jordpro ­
vet ha samma temperatur och fukthalt som under själva testet (se 
avsnitten 1.6.4.2 och 1.7.1.3).  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1274
 
1.6.4.2  Fysikalisk-kemiska egenskaper  
Stora föremål (till exempel stenar och växtdelar) avlägsnas manuellt 
ur jorden, som därefter siktas fuktig, utan att torkas alltför mycket, till en partikelstorlek som är högst 2 mm. Jordprovets fukthalt ju ­
steras med destillerat eller avjoniserat vatten till ett värde mellan 
40 % och 60 % av den maximala vattenkapaciteten.
 
1.6.4.3  Förbättring med organiskt substrat  
Jorden ska förbättras med ett lämpligt organiskt substrat, till exempel 
lusern- och gräsmjöl (huvudbeståndsdel:  Medicago sativa  (blålusern) 
som har en kol/kväve-kvot mellan 12/1 och 16/1. Den rekommen ­
derade kvoten mellan lusern och jord är 5 g lusern per kilogram jord 
(torrvikt).  
1.6.5  Beredning av testämnet för applicering i jorden  
Testämnet appliceras i regel med hjälp av en vehikel. Som vehikel 
kan vatten användas (för vattenlösliga ämnen) eller ett inert fast 
material såsom fin kvartssand (partikelstorlek: 0,1–0,5 mm). Vätske ­
formiga vehiklar andra än vatten (till exempel organiska lösnings ­
medel såsom aceton och kloroform) bör undvikas eftersom de kan 
skada mikrofloran. Om sand används som vehikel kan den beläggas med testämnet upplöst eller suspenderat i ett lämpligt lösningsmedel. Lösningsmedlet avlägsnas därefter genom avdunstning innan den 
belagda sanden blandas i jorden. För en optimal fördelning av tes ­
tämnet i jorden rekommenderas 10 g sand per kilogram jord (torr ­
vikt). Kontrollproverna behandlas med lika stor mängd rent vatten eller ren kvartssand. 
Vid testning av flyktiga kemikalier bör förluster under behandlingen 
minimeras. Likaså bör en homogen fördelning i jorden säkerställas 
(testämnet bör exempelvis injiceras på flera ställen i jorden).
 
1.6.6  Testkoncentrationer  
Vid testning av jordbrukskemikalier bör minst två koncentrationer 
användas. Den lägre koncentrationen bör minst motsvara den max ­
imimängd som i praktiken förväntas nå jorden, och den högre kon ­
centrationen bör vara en multipel av den lägre koncentrationen. Vid beräkning av koncentrationerna för det testämne som tillförs jorden 
antas att upptaget är enhetligt ned till jorddjupet 5 cm och att bulk ­
densiteten är 1,5. Vid testning av jordbrukskemikalier som appliceras direkt i jorden eller kemikalier där den mängd som når jorden kan förutses, rekommenderas dels den maximala PEC-koncentrationen 
(Predicted Environmental Concentration), dels en femfaldig koncent ­
ration av denna. Ämnen som förväntas bli applicerade i jorden flera gånger under en säsong bör testas vid koncentrationer som fås ge ­
nom att multiplicera PEC-koncentrationen med det maximala antalet 
förväntade appliceringar. Den högsta testkoncentrationen bör dock 
inte överskrida mer än tio gånger den maximala koncentrationen vid en enskild applicering. Vid testning av andra kemikalier än jord ­
brukskemikalier används en geometrisk serie med minst fem kon ­
centrationer. Testkoncentrationerna bör täcka det område som behövs 
för att bestämma EC
 x -värden.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1275
 
1.7 TESTETS UTFÖRANDE  
1.7.1  Exponeringsbetingelser  
1.7.1.1  Behandlade prover och kontrollprover  
Vid testning av jordbrukskemikalier delas jorden i tre delar med lika 
vikt. Två delar blandas med vehikel plus produkt och den tredje 
blandas med ren vehikel (kontrollprov). Minst tre replikat rekom ­
menderas för behandlade respektive obehandlade jordprover. Vid testning av andra kemikalier än jordbrukskemikalier delas jorden i 
sex delar med lika vikt. Fem prover blandas med vehikel plus tes ­
tämne och det sjätte provet blandas med ren vehikel. Tre replikat rekommenderas för behandlade prover respektive kontrollprov. Det 
är viktigt att säkerställa en homogen fördelning av testämnet i de 
behandlade jordproverna. Vid inblandningen bör kompaktering eller klumpbildning av jorden undvikas.
 
1.7.1.2  Inkubation av jordprover  
Inkubationen av jordprover kan utföras på två olika sätt. Den kan 
göras med bulkprover av varje behandlat och obehandlat jordprov eller som en serie individuella och lika stora delprover av varje 
behandlat och obehandlat jordprov. Vid testning av flyktiga ämnen 
bör man dock alltid använda en serie individuella delprover. Vid inkubation i form av bulk bereds stora mängder av behandlade och obehandlade jordprover. Under testets gång tas behövligt antal del ­
prover för analys. De mängder som bereds för behandlade och obe ­
handlade jordprover beror på storleken hos de delprover som ingår, antalet replikat som används för analys och det förväntade antalet provtagningsgånger. Jordprover som inkuberas i form av bulk bör 
blandas grundligt innan delprover tas. När jordprover inkuberas i 
form av en serie individuella prover, delas varje behandlat och obe ­
handlat prov upp i det antal delprover som behövs och används därefter på planerat sätt. Om det är sannolikt med fler än två prov ­
tagningstillfällen bör tillräckligt antal delprover beredas med tanke på 
alla replikat och alla provtagningstillfällen. Minst tre replikatprover av testjorden bör inkuberas under aeroba betingelser (se 
avsnitt 1.7.1.1). Alla testbehållare som används bör ha ett tillräckligt 
utrymme ovanför vätskeytan för att anaeroba betingelser inte ska uppstå. Vid testning av flyktiga ämnen bör testet alltid göras med en serie individuella delprover.
 
1.7.1.3  Testbetingelser och testperiodens längd  
Testet genomförs i mörker vid en rumstemperatur på 20 ±2  o C. 
Under testets gång bör jordprovernas fukthalt hållas vid 40–60 % 
av jordens maximala vattenkapacitet (se avsnitt 1.6.4.2). Tillåten 
variation är ±5 %. Destillerat eller avjoniserat vatten kan tillföras vid behov. 
Testet bör omfatta en period på minst 28 dagar. Vid testning av 
jordbrukskemikalier jämförs nitratbildningshastigheten i behandlade 
prover och kontrollprover. Om avvikelsen är högre än 25 % dag 28, 
förlängs testet tills skillnaden är högst 25 % eller tills testet har varat 100 dagar, beroende på vilken gräns som nås först. För andra kemi ­
kalier än jordbrukskemikalier avslutas testet efter 28 dagar. På dag 
28 bestäms nitratmängderna i behandlade jordprover och kontroll ­
prover, och EC
 x -värden beräknas.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1276
 
1.7.2  Provtagning och analys av jordprover  
1.7.2.1  Provtagningsschema  
Vid testning av jordbrukskemikalier analyseras jordproverna med 
avseende på nitrat, dag 0, 7, 14 och 28. Om testperioden måste 
förlängas görs tilläggsbestämningarna med 14 dagars intervall efter 
dag 28. 
Vid testning av andra kemikalier än jordbrukskemikalier används 
minst fem testkoncentrationer, och nitratanalys görs på jordproverna 
i början (dag 0) och i slutet av exponeringsperioden (dag 28). En delbestämning kan göras till exempel dag 7 om det bedöms vara nödvändigt. De resultat som erhålls dag 28 används för att bestämma 
EC
 x -värdet för kemikalien. Om så önskas kan kontrollprovernas data 
från dag 0 användas för att rapportera jordens ursprungliga nitrathalt.  
1.7.2.2  Analys av jordprover  
Mängden nitrat som har bildats i vart och ett av de behandlade 
proverna och kontrollreplikat bestäms för varje provtagningstidpunkt. 
Nitratet extraheras ur jorden genom att proverna skakas med ett 
lämpligt lösningsmedel, till exempel 0,1 M kaliumkloridlösning. 5 ml KCl-lösning per gram jord (torrvikt) rekommenderas. För op ­
timal extraktion bör behållarna med jord och extraktionslösning inte 
vara fyllda mer än till hälften. Blandningarna skakas vid 150 rpm 
under 60 minuter. Blandningarna centrifugeras eller filtreras och vät ­
skefasens analyseras med avseende på nitrat. Partikelfria vätskeex ­
trakt kan lagras före analys vid - 20 ±5
 o C i högst sex månader.  
2. DATA  
2.1 BEHANDLING AV RESULTATEN 
Vid testning av jordbrukskemikalier registreras mängden nitrat som 
har bildats i varje replikatprov, och medelvärdena för alla replikat 
ges i tabellform. Kväveomvandlingshastigheterna utvärderas med 
lämpliga och allmänt accepterade statistiska metoder (till exempel F-test, 5 % signifikansnivå). Mängderna bildat nitrat uttrycks som mg nitrat/kg torrvikt jord/dag. Nitratbildningshastigheten i varje be ­
handlat prov jämförs med hastigheten i kontrollprovet, och den pro ­
centuella avvikelsen från kontrollprovet beräknas. 
Vid testning av andra kemikalier än jordbrukskemikalier bestäms 
mängden nitrat som har bildats i varje replikat, och en dos-respons ­
kurva ritas upp för uppskattningen av EC
 x -värden. Mängderna nitrat i 
de behandlade proverna (mg nitrat/kg torrvikt jord) dag 28 jämförs med mängderna i kontrollproverna. Resultatet används för beräkning av den 
procentuella hämningen för varje testkoncentration. Dessa procentvär ­
den ritas upp mot koncentrationen, och EC
 x -värden beräknas med hjälp 
av statistiska metoder. Konfidensgränserna (p = 0,95) för de beräknade EC
 x -värdena bestäms med standardmetoder (10) (11) (12). 
Om kvävehalterna i de ämnen som testas är höga kan detta påverka 
mängden nitrat som bildas under testet. Om sådana ämnen testas vid en hög koncentration (till exempel kemikalier som sannolikt kommer att appliceras vid upprepade tillfällen) måste testet omfatta tillbörliga kon ­
trollprover (jord med testämne men utan växtmjöl). De värden som fås 
för dessa kontrollprover måste beaktas vid beräkning av EC
 x . ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1277
 
2.2 TOLKNING AV RESULTATEN 
Om resultaten från test rörande jordbrukskemikalier tyder på att 
nitratbildningshastigheten vid den lägre behandlingsnivån (den max ­
imala förväntade koncentrationen) avviker från hastigheten vid kon ­
trollnivån med högst 25 % vid alla provtagningstidpunkter efter dag 
28, kan man anse att produkten inte har någon långtidseffekt på kväveomvandling i jord. Vid utvärdering av test rörande andra äm ­
nen än jordbrukskemikalier används värden för EC
 50 , EC  25 och/eller 
EC 10 . 
3. RAPPORTERING  
Testrapporten ska innehålla nedan angivna uppgifter. 
Fullständig identifiering av jorden, inbegripet — platsens geografiska data (latitud, longitud), 
— upplysningar om platsens historia (växtlighetstäcke, behandlingar 
med växtskyddsprodukter, behandlingar med gödselmedel, oav ­
siktlig förorening och dylikt), 
— användningsmönster (till exempel jordbruksmark eller skog), 
— provtagningsdjup (cm), 
— halten sand/slam/lera ( % torrvikt), — pH (i vatten), 
— halten organiskt kol ( % torrvikt), 
— halten kväve ( % torrvikt), — ursprunglig nitrathalt (mg nitrat/kg torrvikt), 
— katjonbyteskapacitet (mmol/kg), 
— mikrobiell biomassa angiven som procentandel av totalt organiskt 
kol, 
— vilka metoder som har använts för bestämning av varje parame ­
ter, 
— alla upplysningar som hör samman med insamling och lagring av 
jordproverna, 
— detaljupplysningar om eventuell förinkubation av jorden. Testämne: 
— fysikalisk natur och relevanta fysikalisk-kemiska egenskaper, 
— kemiska identifieringsdata med angivelse av, där det är relevant, 
strukturformel, renhetsgrad (för växtskyddsprodukter procentan ­
delen aktivt ämne), kvävehalt. 
Substrat: 
— källa, — sammansättning (till exempel lusernmjöl eller lusern- och gräsmjöl), 
— halten kol, kväve ( % torrvikt), 
— siktstorlek (mm).
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1278
 
Testbetingelser: 
— detaljupplysningar om förbättring av jorden med organiskt sub ­
strat, 
— antalet koncentrationer av testkemikalien och, där det är relevant, 
motivering för de valda koncentrationerna, 
— detaljupplysningar om hur testämnet har tillförts jorden, — inkubationstemperatur, — jordens fukthalt vid testets början och under testets gång, 
— inkubationsmetod (som bulk eller som en serie individuella del ­
prover), 
— antalet replikat, 
— provtagningstidpunkter, — metod för extraktion av nitrat ur jorden. Resultat: 
— analysförfarande och apparatur som har använts för analys av 
nitrat, 
— data i tabellform inbegripet individuella och genomsnittliga vär ­
den för nitratbestämningarna, 
— variationen mellan replikaten för behandlade prover och kontroll ­
prover, 
— redogörelse för justeringar som har gjorts vid beräkningarna (om 
relevant), 
— den procentuella variationen för nitratbildningshastigheterna vid 
varje provtagningstidpunkt eller, där det är relevant, EC
 50 -värde 
med 95 procents konfidensgräns, övriga EC  x -värden (till exempel 
EC 25 eller EC  10 ) med konfidensintervall och en dos-responskur ­
va, 
— statisk behandling av resultaten, 
— alla upplysningar och observationer som kan vara till nytta vid 
tolkningen av resultaten.  
4. HÄNVISNINGAR  
1. EPPO (1994), Decision-Making Scheme for the Environmental 
Risk Assessment of Plant Protection Chemicals. Chapter 7: Soil 
Microflora, EPPO Bulletin, 24: 1–16, 1994. 
2. BBA (1990), Effects on the Activity of the Soil Microflora, 
BBA Guidelines for the Official Testing of Plant Protection 
Products, VI, 1-1 (andra utgåvan, 1990). 
3. EPA (1987), Soil Microbial Community Toxicity Test. EPA 40 
CFR Part 797.3700. Toxic Substances Control Act Test Guide ­
lines; Proposed rule, den 28 september 1987. 
4. SETAC-Europe (1995), Procedures for assessing the environ ­
mental fate and ecotoxicity of pesticides, red. M. R. Lynch, Pub. SETAC-Europe, Bryssel. 
5. ISO/DIS 14238 (1995), Markundersökningar – Bestämning av 
kvävemineralisering och nitrifiering i jord och kemikaliers inver ­
kan på dessa processer, Technical Committee ISO/TC 190/SC 4: 
”Soil Quality – Biological Methods”.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1279
 
6. OECD (1995), Final Report of the OECD Workshop on Selec ­
tion of Soils/Sediments, Belgirate, Italien, den 18–20 januari 
1995. 
7. ISO 10381-6 (1993), Soil quality – Sampling. Guidance on the 
collection, handling and storage of soil for the assessment of aerobic microbial processes in the laboratory. 
8. ISO 14240-1 (1997), ”Markundersökningar – Bestämning av 
markens mikrobiella biomassa – Del 1: Sustratinducerad respi ­
rationsmetod”. 
9. ISO 14240-2 (1997), Markundersökningar – Bestämning av 
markens mikrobiella biomassa – Del 2: Fumigering – extrahe ­
ringsmetod. 
10. J. T. Litchfield, och F. Wilcoxon (1949), A simplified method 
of evaluating dose-effect experiments, Jour. Pharmacol. and Exper. Ther., 96, 99–113. 
11. D. J. Finney, (1971), Probit Analysis, tredje utgåvan, 
Cambridge, London och New York. 
12. D. J. Finney, (1978), Statistical Methods in biological Assay. 
Griffin, Weycombe, Förenade kungariket.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1280
 
C.22  JORDLEVANDE MIKROORGANISMER: TEST RÖRANDE 
OMVANDLING AV KOL  
1. METOD  
Denna metod är i stort sett identisk med OECD TG 217 (2000).  
1.1 INLEDNING 
Den testmetod som beskrivs här är en laboratoriemetod för under ­
sökning av de potentiella långtidseffekter som en engångsexponering av jordbruksprodukter, och eventuellt även andra kemikalier, kan ha på jordlevande mikroorganismers omvandling av kol. Testmetoden 
grundar sig i huvudsak på rekommendationerna från Växtskydds ­
organisationen för Europa och Medelhavsområdet (EPPO) (1). Även övriga riktlinjer har beaktats, till exempel riktlinjerna från Bio ­
logische Bundesanstalt i Tyskland (2), Environmental Protection 
Agency i USA (3) och SETAC (4). Vid en OECD-workshop om 
valet av jord och sediment i Belgirate, Italien, 1995 (5), kom man överens om hur många och vilka typer av jord som ska användas i detta test. Rekommendationerna för insamling, hantering och lagring 
av jordprover grundar sig på ISO-riktlinjer (6) och rekommendatio ­
ner från workshopen i Belgirate. 
Vid bedömning och utvärdering av olika ämnens toxiska egenskaper 
kan det vara nödvändigt att bestämma effekterna på den mikrobiella 
aktiviteten i jorden, till exempel när det behövs upplysningar om de potentiella bieffekter som växtskyddsprodukter kan ha på mikroflo ­
ran i jorden, eller när det är sannolikt att de jordlevande mikroorga ­
nismerna exponeras för andra kemikalier än växtskyddsprodukter. 
Testet rörande omvandling av kol görs för att bestämma sådana kemikaliers effekter på mikrofloran i jorden. Vid testning av jord ­
brukskemikalier (till exempel växtskyddsprodukter, gödselmedel och 
skogskemikalier) bör testet omfatta både omvandling av kol och 
omvandling av kväve. I fråga om övriga kemikalier räcker det att testa omvandling av kväve. När sådana kemikalier testas rörande omvandling av kväve och man får EC
 50 -värden som faller inom 
samma område som gäller för kommersiellt tillgängliga nitrifika ­
tionshämmande medel (till exempel nitrapyrin), kan man även göra test rörande omvandling av kol i syfte att få ytterligare upplysningar. 
Jord består av levande och icke-levande komponenter som förekom ­
mer i komplexa och heterogena sammansättningar. Mikroorganis ­
merna spelar en viktig roll för nedbrytning och omvandling av or ­
ganiskt material i fertila jordar. Det finns många olika arter och dessa bidrar till de olika aspekter som gäller för jordens fertilitet. Lång ­
variga störningar av dessa biokemikaliska processer kan även störa 
kretsloppet av näringsämnen, vilket i sin tur kan leda till förändringar av jordens fertilitet. Omvandling av kol och kväve sker i alla fertila jordar. Även om de mikrobsamhällen som utför dessa processer 
varierar från jord till jord, följer omvandlingen i huvudsak samma 
mönster.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1281
 
Syftet med den testmetod som beskrivs här är att upptäcka skadliga 
långtidseffekter som ett ämne kan ha på omvandlingen av kol i aerob 
ytjord. Testet är känsligt för förändringar i storlek och aktivitet hos de mikrobsamhällen som svarar för omvandlingen av kol, eftersom de genom testet utsätts för både kemisk stress och kolsvält. För testet 
används sandhaltig jord med låg halt organiskt material. Jorden be ­
handlas med testämnet och inkuberas under betingelser som möjlig ­
gör snabb mikrobiell metabolism. Under sådana betingelser sker en snabb utarmning av jordens innehåll av lättillgängligt kol. Detta leder 
till kolbrist som dödar mikrobcellerna och inducerar en viloperiod 
och/eller sporbildning. Om testet körs under en längre tid än 28 dagar kan summan av dessa reaktioner mätas i de obehandlade jord ­
provema som en progressiv minskning av metaboliskt aktiv mikro ­
biell biomassa (7). Om biomassan i en kolstressad jord påverkas av 
en kemikalie under de betingelser som råder under testet, återställs den eventuellt inte till samma nivå som i ett obehandlat jordprov. Störningar som testämnet har orsakat vid någon försökstidpunkt va ­
rar då ofta till slutet av testet. 
De test som har använts som grund för denna testmetod är primärt 
utformade för situationer där den mängd ämne som når jorden kan förutses. Så är fallet till exempel för växtskyddsprodukter där man känner till den mängd som har applicerats på en åker. För jordbruks ­
kemikalier räcker det med att testa två sådana doser som är relevanta 
med tanke på den förväntade applicerade mängden. Jordbrukskemi ­
kalier kan testas med avseende på aktiva ämnen eller produktsam ­
mansättningar. Testet är dock inte begränsat till kemikalier med för ­
utsägbara halter i miljön. Genom att ändra både mängderna testämne 
som tillförs jorden och metoderna för utvärdering av data, kan testet även användas för situationer där mängden kemikalie som förväntas nå jorden inte är känd. På så sätt kan man i fråga om andra kemi ­
kalier än jordbrukskemikalier bestämma effekterna av en serie kon ­
centrationer på omvandlingen av kol. Erhållna testdata används för att rita upp en dos-responskurva och beräkna EC
 x -värden, där x är 
den procentuella effekten.  
1.2 DEFINITIONER  
Omvandling av kol:  Nedbrytning av organiskt material genom in ­
verkan av mikroorganismer under bildning av slutprodukten kol ­
dioxid.  
EC X (effektiv koncentration):  Den koncentration av testämnet i 
jorden som leder till att omvandlingen av kol till koldioxid hämmas till x procent.  
EC
 50 (median effektiv koncentration):  Den koncentration av tes ­
tämnet i jorden som leder till att omvandlingen av kol till koldioxid hämmas till 50 procent.
 
1.3 REFERENSÄMNEN 
Inga. ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1282
 
1.4 PRINCIP FÖR TESTMETODEN 
Siktad jord behandlas med testämnet eller lämnas obehandlad (kon ­
trollprov). Vid testning av jordbrukskemikalier rekommenderas minst två testkoncentrationer, och dessa bör väljas med beaktande av den 
högsta koncentration som kan förväntas nå jorden. Efter inkubation 
under 0, 7, 14 och 28 dagar blandas de behandlade och obehandlade proverna med glukos, och den glukosinducerade respirationen i varje prov mäts under 12 på varandra följande timmar. Respirationen ut ­
trycks som mängden frigjord koldioxid (mg koldioxid/kg torrvikt 
jord/h) eller mängden förbrukat syre (mg syre/kg jord/h). Den ge ­
nomsnittliga respirationen i de behandlade jordproverna jämförs med 
situationen i kontrollproverna, och den procentuella avvikelsen från 
kontrollprovet beräknas. Alla test bör omfatta minst 28 dagar. Om skillnaderna mellan behandlade och obehandlade prover är minst 25 % dag 28 görs fortsatta bestämningar med 14 dagars intervall 
under en period som maximalt sträcker sig till dag 100. Vid testning 
av andra kemikalier än jordbrukskemikalier appliceras en serie kon ­
centrationer av testämnet i jordprover, och efter 28 dagar bestäms den glukosinducerade respirationen (de genomsnittliga mängderna 
bildad koldioxid eller förbrukat syre). Resultaten från test med en 
serie koncentrationer analyseras med hjälp av en regressionsmodell och relevanta EC
 x -värden beräknas (till exempel EC  50 , EC  25 och/ 
eller EC  10 ). Se definitionerna.  
1.5 TESTETS GILTIGHET 
Utvärderingen av testresultat rörande jordbrukskemikalier baserar sig 
på relativt små skillnader (till exempel medelvärde ±25 %) mellan 
frigjord koldioxid eller förbrukat syre i (eller av) obehandlade och 
behandlade jordprover. Därför kan stora variationer i de obehandlade proverna leda till falska resultat. Variationen mellan obehandlade replikatprover bör därför vara mindre än ± 15 %.
 
1.6 BESKRIVNING AV TESTMETODEN  
1.6.1  Utrustning  
Provbehållarna bör vara tillverkade av kemiskt inert material. Deras 
volym bör anpassas till det förfarande som används för inkubation av 
jorden, till exempel inkubation som bulk eller som en serie indi ­
viduella jordprover (se avsnitt 1.7.1.2). Det är viktigt att minimera vattenförlusterna och sörja för gasväxling under testets förlopp (prov ­
behållarna kan till exempel täckas med perforerad polyetylenfilm). 
Vid testning av flyktiga ämnen bör förseglingsbara och gastäta be ­
hållare användas. Behållarnas storlek bör anpassas så att jordprovet upptar cirka en fjärdedel av behållarens volym. 
För bestämning av glukosinducerad respiration krävs inkubations ­
system och instrument för mätning av producerad koldioxid eller 
förbrukat syre. Exempel på sådana system och instruments finns i litteraturen (8) (9) (10) (11).
 
1.6.2  Valet av jord och antal jordtyper  
Endast en typ av jord används. Följande rekommendationer gäller för 
jorden: 
— Sandhalt: minst 50 % och högst 75 %.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1283
 
— pH: 5,5–7,5. 
— Halten organiskt kol: 0,5–1,5 %. — Den mikrobiella biomassan bör bestämmas (12) (13) och dess 
kolhalt bör vara minst 1 % av jordens totala organiska kol. 
I de flesta fall utgör jord med dessa egenskaper ett exempel på 
sämsta möjliga situation – adsorptionen av testämnet är minimal, medan mikrofloran har maximal tillgång till testämnet. Det betyder att det i regel inte behövs test med andra typer av jord. I vissa fall, 
till exempel där testämnet mestadels förväntas hamna i särskilda 
jordar såsom sura skogsjordar eller om testämnet består av elektro ­
statiskt laddade kemikalier, kan det vara nödvändigt att använda en extra jordtyp.
 
1.6.3  Insamling och lagring av jordprover  
1.6.3.1  Insamling  
Man bör ha tillgång till detaljerade upplysningar om historian för den 
plats där testjorden tas. Upplysningarna bör omfatta exakt läge, växt ­
lighetstäcke, datum för behandlingar med växtskyddsprodukter, be ­
handlingar med organiska och oorganiska gödselmedel, tillförsel av biologiska material eller oavsiktlig förorening. Den plats som väljs 
för provtagningen bör vara lämpad för långtidsanvändning. Lämpliga 
platser är flerårig ängsmark, åkrar med ettåriga spannmålsgrödor (utom majs) och tättsådda grönbeten. Vid provtagningstidpunkten 
måste det ha gått minst ett år från en eventuell behandling av prov ­
tagningsplatsen med växtskyddsprodukter. Det bör även ha gått minst sex månader från tillförsel av organiska gödselmedel. Använd ­
ning av mineralgödselmedel är godtagbar endast när detta sker med 
utgångspunkt från grödans behov. Jordprover får inte tas förrän det 
har gått minst tre månader från gödslingen. Jord som har behandlats med gödselmedel med kända biocideffekter (till exempel kalcium ­
cyanid) bör undvikas. 
Provtagning bör undvikas under eller strax efter långa perioder 
(längre än 30 dagar) av torka eller vattenmättnad. På plöjd mark 
ska jordproverna tas på ett djup mellan 0 och 20 cm. På gräsmark (ängar) eller annan mark som plöjs sällan (minst en växtsäsong mellan varje plöjning) kan maximidjupet för provtagningen vara 
lite mer än 20 cm (till exempel 25 cm). Jordproverna ska transpor ­
teras i behållare, och temperaturbetingelser bör vara sådana att det inte finns risk för signifikanta förändringar av jordens ursprungliga egenskaper.
 
1.6.3.2  Lagring  
De jordprover som används ska helst vara nytagna. Om lagring i 
laboratoriet inte kan undvikas kan jordproverna hållas i mörker vid 4 
± 2  o C under högst tre månader. Det är viktigt att lagringsbeting ­
elserna är aeroba. Om jordprover tas från områden där marken är frusen under minst tre månader per år kan proverna lagras under högst sex månader vid –18
 o C. Den mikrobiella biomassan hos 
lagrade jordprover bestäms före varje försök. Biomassans kolhalt 
bör vara minst 1 % av jordens totala kolhalt (se avsnitt 1.6.2).  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1284
 
1.6.4  Hantering och beredning av jordprover som testas  
1.6.4.1  Förinkubation  
För jordprover som har lagrats (se avsnitten 1.6.4.2 och 1.7.1.3) 
rekommenderas en förinkubation under 2–28 dagar. Under förinku ­
bationen bör jordprovet ha samma temperatur och fukthalt som under 
själva testet (se avsnitten 1.6.4.2 och 1.7.1.3).  
1.6.4.2  Fysikalisk-kemiska egenskaper  
Stora föremål (till exempel stenar och växtdelar) avlägsnas manuellt 
ur jorden, som därefter siktas fuktig, utan att torkas alltför mycket, till en partikelstorlek som är högst 2 mm. Jordprovets fukthalt ju ­
steras med destillerat eller avjoniserat vatten till ett värde mellan 
40 % och 60 % av den maximala vattenkapaciteten.
 
1.6.5  Beredning av testämnet för applicering i jorden  
Testämnet appliceras i regel med hjälp av en vehikel. Som vehikel 
kan vatten användas (för vattenlösliga ämnen) eller ett inert fast material såsom fin kvartssand (partikelstorlek: 0,1–0,5 mm). Vätske ­
formiga vehiklar andra än vatten (till exempel organiska lösnings ­
medel såsom aceton och kloroform) bör undvikas eftersom de kan 
skada mikrofloran. Om sand används som vehikel kan den beläggas med testämnet upplöst eller suspenderat i ett lämpligt lösningsmedel. Lösningsmedlet avlägsnas därefter genom avdunstning innan den 
belagda sanden blandas i jorden. För en optimal fördelning av tes ­
tämnet i jorden rekommenderas 10 g sand per kilogram jord (torr ­
vikt). Kontrollproverna behandlas med lika stor mängd rent vatten eller ren kvartssand. 
Vid testning av flyktiga kemikalier bör förluster under behandlingen 
minimeras. Likaså bör en homogen fördelning i jorden säkerställas 
(testämnet bör exempelvis injiceras på flera ställen i jorden).
 
1.6.6  Testkoncentrationer  
Om testet gäller växtskyddsprodukter eller andra kemikalier med 
förutsägbara koncentrationer i miljön, bör minst två koncentrationer användas. Den lägre koncentrationen bör minst motsvara den max ­
imimängd som i praktiken förväntas nå jorden, och den högre kon ­
centrationen bör vara en multipel av den lägre koncentrationen. Vid 
beräkning av koncentrationerna för det testämne som tillförs jorden antas att upptaget är enhetligt ned till jorddjupet 5 cm och att bulk ­
densiteten är 1,5. Vid testning av jordbrukskemikalier som appliceras 
direkt på jorden eller kemikalier där den mängd som når jorden kan 
förutses, rekommenderas PEC-koncentrationen (Predicted Environ ­
mental Concentration) och en femfaldig koncentration av denna. Ämnen som förväntas bli applicerade i jorden flera gånger under 
en säsong bör testas vid koncentrationer som fås genom att multi ­
plicera PEC-koncentrationen med det maximala antalet förväntade appliceringar. Den högsta testkoncentrationen bör dock inte över ­
skrida mer än tiofaldigt den maximala koncentrationen vid en enskild 
applicering. 
Vid testning av andra kemikalier än jordbrukskemikalier används en 
geometrisk serie med minst fem koncentrationer. Testkoncentratio ­
nerna bör täcka det område som behövs för att bestämma EC
 x -värden.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1285
 
1.7 TESTETS UTFÖRANDE  
1.7.1  Exponeringsbetingelser  
1.7.1.1  Behandlade prover och kontrollprover  
Vid testning av jordbrukskemikalier delas jorden i tre delar med lika 
vikt. Två delar blandas med vehikel plus produkt och den tredje 
blandas med ren vehikel (kontrollprov). Minst tre replikat rekom ­
menderas för behandlade respektive obehandlade jordprover. Vid testning av andra kemikalier än jordbrukskemikalier delas jorden i 
sex delar med lika vikt. Fem prover blandas med vehikel plus tes ­
tämne och det sjätte provet blandas med ren vehikel. Tre replikat rekommenderas för behandlade prover respektive kontrollprov. Det 
är viktigt att säkerställa en homogen fördelning av testämnet i de 
behandlade jordproverna. Vid inblandningen bör kompaktering eller klumpbildning av jorden undvikas.
 
1.7.1.2  Inkubation av jordprover  
Inkubationen av jordprover kan utföras på två olika sätt. Den kan 
göras med bulkprover av varje behandlat och obehandlat jordprov 
eller som en serie individuella och lika stora delprover av varje behandlat och obehandlat jordprov. Vid testning av flyktiga ämnen 
bör man dock alltid använda en serie individuella delprover. Vid 
inkubation i form av bulk bereds stora mängder av behandlade och obehandlade jordprover. Under testets gång tas behövligt antal del ­
prover för analys. De mängder som bereds för behandlade och obe ­
handlade jordprover beror på storleken hos de delprover som ingår, 
antalet replikat som används för analys och det förväntade antalet provtagningstillfällen. Jordprover som inkuberas i form av bulk bör blandas grundligt innan delprover tas. När jordprover inkuberas i 
form av en serie individuella prover, delas varje behandlat och obe ­
handlat prov upp i behövligt antal delprover som därefter används på planerat sätt. Om det är sannolikt med fler än två provtagningstill ­
fällen bör tillräckligt antal delprover beredas med tanke på alla re ­
plikat och alla provtagningsgånger. Minst tre replikatprover av test ­
jorden bör inkuberas under aeroba betingelser (se avsnitt 1.7.1.1). Alla testbehållare som används bör ha ett tillräckligt utrymme ovan ­
för vätskeytan för att det inte ska uppstå anaeroba betingelser. Vid 
testning av flyktiga ämnen bör testet alltid göras med en serie indi ­
viduella delprover.
 
1.7.1.3  Testbetingelser och testperiodens längd  
Testet genomförs i mörker vid en rumstemperatur på 20 ± 2  o C. 
Under testets gång bör jordprovernas fukthalt upprätthållas vid 
40–60 % av jordens maximala vattenkapacitet (se avsnitt 1.6.4.2). Tillåten variation är ± 5 %. Destillerat eller avjoniserat vatten kan tillföras vid behov. 
Testet bör omfatta en period på minst 28 dagar. Vid testning av 
jordbrukskemikalier jämförs mängderna koldioxid som frigörs eller syre som förbrukas i behandlade och obehandlade prover. Om av ­
vikelsen är högre än 25 % dag 28, förlängs testet tills skillnaden är 
högst 25 % eller tills testet har varat 100 dagar, beroende på vilken gräns som nås först. För andra kemikalier än jordbrukskemikalier avslutas testet efter 28 dagar. Dag 28 bestäms mängderna frigjord 
koldioxid eller förbrukat syre i behandlade jordprover och kontroll ­
prover och EC
 X -värden beräknas.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1286
 
1.7.2  Provtagning och analys av jordprover  
1.7.2.1  Provtagningsschema  
Vid testning av jordbrukskemikalier analyseras jordproverna med 
avseende på glukosinducerad respiration dag 0, 7, 14 och 28. Om 
testperioden måste förlängas görs tilläggsbestämningarna med 14 
dagars intervall efter dag 28. 
Vid testning av andra kemikalier än jordbrukskemikalier används 
minst fem testkoncentrationer, och jordproverna analyseras med av ­
seende på glukosinducerad respiration i början (dag 0) och i slutet av exponeringsperioden (dag 28). En delbestämning kan göras till ex ­
empel dag 7 om det bedöms vara nödvändigt. De resultat som erhålls 
dag 28 används för att bestämma EC
 x -värdet för kemikalien. Enligt 
val kan data rörande kontrollproverna från dag 0 användas för att uppskatta de ursprungliga mängderna metaboliskt aktiv mikrobiell massa i jorden (12).
 
1.7.2.2  Bestämning av glukosinducerad respiration  
Den glukosinducerade respirationen bestäms för varje behandlat och 
obehandlat replikat och för varje provtagningstidpunkt. Jordproverna blandas med en glukosmängd som är tillräcklig för att framkalla en omedelbar och maximal respirationsrespons. Den mängd glukos som 
behövs för att framkalla en maximal respirationsrepons i en given 
jordtyp kan bestämmas genom ett preliminärt test som utförs med en serie glukoskoncentrationer (14). För sandhaltig jord med 0,5–1,5 % organiskt kol är det i regel tillräckligt med 2–4 g glukos per kg jord 
(torrvikt). Glukosen kan malas till pulver med ren kvartssand (10 g 
sand/kg torrvikt jord) och blandas sedan homogent in i jorden. 
Jordproverna med glukos inkuberas vid 20 ± 2
 o C i ett system som 
är lämpligt för bestämning av respirationen. Bestämningen kan göras 
kontinuerligt, varje timme eller var annan timme (se avsnitt 1.6.1). Den koldioxid som frigörs eller det syre som förbrukas mäts under 12 på varandra följande timmar och mätningarna bör inledas så snart 
som möjligt (1–2 timmar) efter glukostillförseln. De totala mäng ­
derna frigjord koldioxid eller förbrukat syre under de 12 timmarna uppmäts och den genomsnittliga respirationen bestäms.
 
2 DATA  
2.1 BEHANDLING AV RESULTATEN 
Vid testning av jordbrukskemikalier registreras mängden frigjord 
koldioxid eller förbrukat syre i varje replikatprov, och medelvärdena för alla replikat ges i tabellform. De värden som erhålls utvärderas med lämpliga och allmänt godtagna statistiska metoder (till exempel 
F-test, 5 % signifikansnivå). De värden som erhålls för den gluko ­
sinducerade respirationen uttrycks som mg koldioxid/kg torrvikt jord/h eller mg syre/torrvikt jord/h. Den genomsnittliga koldiox ­
idbildningen eller genomsnittliga syreförbrukningen jämförs med si ­
tuationen i kontrollprovet och den procentuella avvikelsen från kon ­
trollprovet beräknas.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1287
 
Vid testning av andra kemikalier än jordbrukskemikalier bestäms 
mängderna frigjord koldioxid eller förbrukat syre i varje replikat, 
och en dos-responskurva ritas upp för uppskattningen av EC  x -vär­
den. De värden som efter 28 dagar registreras för den glukosindu ­
cerade respirationen (mg koldioxid/kg torrvikt jord/h eller mg syre/ 
torrvikt jord/h) i de behandlade proverna jämförs med motsvarande 
värden för kontrollprovet. Resultatet används för beräkning av den procentuella hämningen för varje testkoncentration. Dessa procent ­
värden ritas upp mot koncentrationen, och EC
 x -värden beräknas där ­
efter med hjälp av statistiska metoder. Konfidensgränserna (p = 0,95) 
för de beräknade EC  X -värdena bestäms med standardmetoder (15), 
(16), (17).  
2.2 TOLKNING AV RESULTATEN 
Om utvärderingen av testresultaten rörande jordbrukskemikalier visar 
att respirationen vid den lägre behandlingsnivån (den maximala för ­
väntade koncentrationen) avviker från värdet vid kontrollnivån med högst 25 % vid alla provtagningstidpunkter efter dag 28, kan man 
anse att produkten inte har någon långtidseffekt på omvandlingen av 
kol i jord. Vid utvärdering av test rörande andra ämnen än jordbruks ­
kemikalier används värden för EC
 50 , EC  25 och/eller EC  10 . 
3. RAPPORTERING  
TESTRAPPORT 
Testrapporten ska innehålla nedan angivna uppgifter. 
Fullständig identifiering av jorden, inbegripet — platsens geografiska data (latitud, longitud), — upplysningar om platsens historia (växtlighetstäcke, behandlingar 
med växtskyddsprodukter, behandlingar med gödselmedel, oav ­
siktlig förorening och dylikt), 
— användningsmönster (till exempel jordbruksmark eller skog), 
— provtagningsdjup (cm), 
— halten sand/slam/lera ( % torrvikt), — pH (i vatten), 
— halten organiskt kol ( % torrvikt), 
— halten kväve ( % torrvikt), — katjonbyteskapacitet (mmol/kg), 
— mikrobiell biomassa angiven som procentandel av totalt organiskt 
kol, 
— vilka metoder som har använts för bestämning av varje parameter, 
— alla upplysningar som hör samman med insamling och lagring av 
jordproverna, 
— detaljupplysningar om eventuell förinkubation av jorden.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1288
 
Testämne: 
— fysikalisk natur och relevanta fysikalisk-kemiska egenskaper, — kemiska identifieringsdata med angivelse av, där det är relevant, 
strukturformel, renhetsgrad (för växtskyddsprodukter procentan ­
delen aktivt ämne), kvävehalt. 
Testbetingelser: — detaljupplysningar om förbättring av jorden med organiskt sub ­
strat, 
— antalet koncentrationer av testkemikalien och, där det är relevant, 
motivering för de valda koncentrationerna, 
— detaljupplysningar om hur testämnet har tillförts jorden, 
— inkubationstemperatur, — jordens fukthalt vid testets början och under testets gång, — inkubationsmetod (som bulk eller som en serie individuella del ­
prover), 
— antalet replikat, — provtagningstidpunkter. Resultat: — metod och utrustning som har använts för respirationsbestäm ­
ningar, 
— data i tabellform, inbegripet enskilda och genomsnittliga värden 
för mängderna koldioxid eller syre, 
— variationen mellan replikaten i behandlade prover och kontroll ­
prover, 
— redogörelse för justeringar som har gjorts vid beräkningarna (om 
relevant), 
— den procentuella variationen för glukosinducerad respiration vid 
varje provtagningstidpunkt eller, där det är relevant, EC
 50 -värde 
med 95 procents konfidensgräns, övriga EC  x -värden (till exempel 
EC 25 eller EC  10 ) med konfidensintervall och en dos-responskur ­
va, 
— statistisk bearbetning av resultaten, i tillämpliga fall, — alla upplysningar och observationer som kan vara till nytta vid 
tolkningen av resultaten.
 
4. HÄNVISNINGAR  
1. EPPO (1994), ”Decision-Making Scheme for the Environmen ­
tal Risk Assessment of Plant Protection Chemicals. Chapter 7: Soil Microflora”,  EPPO Bulletin, 24,  1–16, 1994. 
2. BBA (1990), ”Effects on the Activity of the Soil Microflora”,  
BBA Guidelines for the Official Testing of Plant Protection 
Products,  VI, 1-1 (andra utgåvan, 1990). 
3. EPA (1987), ”Soil Microbial Community Toxicity Test. EPA 
40 CFR Part 797.3700. Toxic Substances Control Act Test 
Guidelines; Proposed rule”, den 28 september 1987.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1289
 
4. SETAC-Europe (1995), ”Procedures for assessing the environ ­
mental fate and ecotoxicity of pesticides”, red. M. R. Lynch,  
Pub. SETAC-Europe,  Bryssel. 
5. OECD (1995), ”Final Report of the OECD Workshop on Se ­
lection of Soils/Sediments”, Belgirate, Italien, den 18–20 januari 1995. 
6. ISO 10381-6 (1993), ”Soil quality – Sampling. Guidance on 
the collection, handling and storage of soil for the assessment 
of aerobic microbial processes in the laboratory”. 
7. Anderson, J.P.E. (1987), ”Handling and Storage of Soils for 
Pesticide Experiments”, i ”Pesticide Effects on Soil Microflo ­
ra”, red. L. Somerville och M.P. Greaves, kap 3, 45–60. 
8. Anderson, J.P.E. (1982), ”Soil Respiration”, i ”Methods of Soil 
Analysis – Part 2: Chemical and Microbiological Properties”,  
Agronomy Monograph, 9,  red. A. L. Page, R. H. Miller och D. 
R. Keeney. 41, 831–871. 
9. ISO 11266-1 (1993), ”Soil Quality – Guidance on Laboratory 
Tests for Biodegradation in Soil: Part 1. Aerobic Conditions”. 
10. ISO 14239 (1997E), ”Markundersökningar – Inkubations ­
system för bestämning av mineraliseringen av organiska kemi ­
kalier i jord under aeroba förhållanden”. 
11. O. Heinemeyer, H. Insam, E.A. Kaiser, och G. Walenzik 
(1989), ”Soil microbial biomass and respiration measurements; 
an automated technique based on infrared gas analyses”,  Plant 
and Soil,  116, 77–81. 
12. ISO 14240-1 (1997), ”Markundersökningar – Bestämning av 
markens mikrobiella biomassa – Del 1: Sustratinducerad respi ­
rationsmetod”. 
13. ISO 14240-2 (1997), ”Markundersökningar – Bestämning av 
markens mikrobiella biomassa – Del 2: Fumigering – extrahe ­
ringsmetod”. 
14. H. P. Malkomes, (1986), ”Einflu β von Glukosemenge auf die 
Reaktion der Kurzzeit-Atmung im Boden Gegenüber Pflanzen ­
schutzmitteln, Dargestellt am Beispiel eines Herbizide”,  Nach­
richtenbl. Deut. Pflanzenschutzd., Braunschweig,  38, 113–120. 
15. J.T. Litchfield, och F. Wilcoxon (1949), ”A simplified method 
of evaluating dose-effect – experiments”,  Jour. Pharmacol. 
and Exper. Ther.,  96, 99–113. 
(16) D.J. Finney, (1971), ”Probit Analysis”, tredje utgåvan, Camb ­
ridge, London och New York. 
(17) D.J. Finney (1978), ”Statistical Methods in biological Assay”, 
Griffin, Weycombe, Förenade kungariket.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1290
 
C.23  AEROB OCH ANAEROB OMVANDLING I JORD  
1. METOD  
Denna testmetod är i stort sett identisk med OECD TG 307 (2002).  
1.1 INLEDNING 
Testmetoden baserar sig på befintliga riktlinjer (1), (2), (3), (4), (5), 
(6), (7), (8), (9). Den testmetod som beskrivs här är avsedd för utvärdering av aerob och anaerob omvandling av kemikalier i jord. Bestämningar görs av i) testämnets omvandlingshastighet och ii) 
karaktären och hastigheterna för bildning och minskning av de om ­
vandlingsprodukter som växter och jordlevande organismer kan ex ­
poneras för. Sådana undersökningar behövs för kemikalier som ap ­
pliceras direkt i jorden eller sannolikt kommer att nå jorden. Resul ­
taten kan också användas för att utarbeta provtagnings- och analys ­
protokoll för relaterade fältstudier. 
För bedömning av omvandlingsmönstren är det i regel tillräckligt 
med aeroba och anaeroba undersökningar av endast en jordtyp (8), (10), (11). Omvandlingshastigheterna bör bestämmas i minst tre yt ­
terligare jordtyper (8), (10). 
Vid en OECD-workshop om valet av jord och sediment som hölls i 
Belgirate, Italien, 1995 (10), kom man särskilt överens om hur 
många och vilka typer av jord som ska användas i detta test. De 
jordtyper som testas bör vara representativa för de miljöbetingelser där användning eller utsläpp förväntas ske. Exempelvis kemikalier som sannolikt kommer att släppas ut i subtropiska till tropiska klimat 
bör testas med jordmåner i klasserna Ferrasoler eller Nitosoler (FAO- 
systemet). Workshopen i Belgirate gav också rekommendationer rö ­
rande insamling, hantering och lagring av jordprover, baserade på ISO-riktlinjer (15). Även användningen av jord för risodling behand ­
las i denna metod.
 
1.2 DEFINITIONER  
Testämne : Alla ämnen, oavsett det gäller den ursprungliga förore ­
ningen eller relevanta omvandlingsprodukter.  
Omvandlingsprodukter : Alla ämnen som uppstår till följd av biotiska 
eller abiotiska omvandlingsreaktioner av testämnet, inbegripet CO  2 
och produkter i bundna rester.  
Bundna rester : Dessa är sådana föreningar i jorden, i växter eller i 
djur som blir kvar i matrisen i form av ursprungligt ämne eller dess 
metaboliter eller omvandlingsprodukter efter extraktion. Extraktions ­
metoden får inte i avsevärd grad leda till ändringar i själva förening ­
arna eller matrisens struktur. Bindningens karaktär kan delvis klar ­
läggas genom matrisstörande extraktionsmetoder och sofistikerade 
analysmetoder. Hittills har man på detta sätt kunnat identifiera till exempel kovalenta bindningar, jonbindningar och sorptiva bind ­
ningar samt inneslutning. Generellt sett innebär bildningen av 
bundna rester att biotillgängligheten blir signifikant mindre (12) (mo ­
difierat ur IUPAC 1984 (13)).  
Aerob omvandling : Reaktioner som sker i närvaro av molekylärt 
syre (14).
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1291
 
Anaerob omvandling : Reaktioner som sker utan närvaro av moleky ­
lärt syre (14).  
Jord: En blandning av mineraliska och organisk-kemiska bestånds ­
delar. De senare består av föreningar med hög kol- och kvävehalt samt hög molekylvikt. Dessa föreningar påverkas av små organismer 
(nästintill mikroorganismer). Jord kan hanteras i två olika tillstånd: 
a) Ostörd, såsom den har uppstått under tidens gång i karakteristiska 
skikt av ett flertal olika jordtyper. 
b) Störd, vilket normalt gäller för odlad mark eller fall där jord ­
prover tas genom grävning och därefter undersöks med denna 
testmetod (14).  
Mineralisering:  Det fullständiga sönderfallet av organiska föreningar 
till CO
 2 och H  2 O under aeroba betingelser samt till CH  4 , CO  2 och 
H 2 O under anaeroba betingelser. Med mineralisering avses här ett 
omfattande sönderfall som sker när en  14 C-märkt förening används 
och en märkt kolatom oxideras under frigörande av motsvarande mängd
 14 CO 2 (14).  
Halveringstid : Betecknas med t  0,5 – den tid det tar för ett testämne 
att omvandlas till 50 % när omvandlingen kan beskrivas med kinetik av första ordningen. Denna tid är oberoende av koncentrationen.  
DT
 50 (tid för försvinnande 50):  Den tid inom vilken testämnets kon ­
centration går ned med 50 %. Denna tid är inte samma som halve ­
ringstiden t  0,5 i fall där omvandlingen inte följer kinetik av första 
ordningen.  
DT 75 (tid för försvinnande 75):  Den tid inom vilken testämnets kon ­
centration går ned med 75 %.  
DT 90 (tid för försvinnande 90):  Den tid inom vilken testämnets kon ­
centration går ned med 90 %.  
1.3 REFERENSÄMNEN 
Referensämnen bör användas för karakterisering och/eller identifie ­
ring av omvandlingsprodukterna genom spektroskopiska och kro ­
matografiska metoder.  
1.4 TESTETS TILLÄMPBARHET 
Metoden kan tillämpas på alla kemiska ämnen (omärkta eller radio ­
aktivt märkta) för vilka det finns tillgång till en analysmetod som är 
tillräckligt exakt och känslig. Metoden kan tillämpas på föreningar 
som är i viss mån flyktiga, ickeflyktiga, vattenlösliga eller vatteno ­
lösliga. Testet bör inte tillämpas på kemikalier som är mycket flyk ­
tiga från jord (till exempel desinfektionsmedel, organiska lösnings ­
medel) och som därför inte hålls kvar i jorden under de försöks ­
betingelser som gäller för detta test.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1292
 
1.5 UPPLYSNINGAR OM TESTÄMNET 
Omärkta eller märkta testämnen kan användas för bestämning av om ­
vandlingshastigheten. Märkt material behövs för undersökning av om ­
vandlingsmönstret och för bestämning av en massbalans. C-märkning 
rekommenderas, även om andra isotoper, såsom  13 C, 15 N, 3 H och  32 P 
kan användas. Märkningen bör om möjligt finnas i molekylens mest stabila del(ar) (
 1 ). Testämnets renhetsgrad bör vara minst 95 %. 
Innan test rörande aerob och anaerob omvandling i jord utförs bör 
följande upplysningar om testämnet finnas tillgängliga: 
a) löslighet i vatten (metod A.6), 
b) löslighet i organiska lösningsmedel, 
c) ångtryck (metod A.4) och Henrys lag-konstant, 
d) fördelningskoefficient n-oktanol/vatten (metod A.8), 
e) kemisk stabilitet i mörker (hydrolys) (metod C.7), 
f) pK  a om en molekyl är benägen till protonering eller deprotone ­
ring (OECD-riktlinje 112) (16). 
Det kan även vara till nytta att känna till exempelvis testämnets 
toxicitet för jordlevande mikroorganismer (testmetoderna C.21 och C.22)(16). 
Det bör finnas tillgång till analysmetoder (inbegripet extraktions- och 
reningsmetoder) för kvantifiering och identifiering av testämnet och 
dess omvandlingsprodukter.
 
1.6 PRINCIP FÖR TESTMETODEN 
Jordproverna behandlas med testämnet och inkuberas i mörker i flas ­
kor av biometertyp eller i genomflödessystem under kontrollerade laboratoriebetingelser (konstant temperatur och jordfuktighet). Efter 
lämpliga tidsintervall extraheras jordproverna och analyseras med 
avseende på det ursprungliga ämnet och dess omvandlingsprodukter. Flyktiga produkter samlas upp med hjälp av lämplig absorptions ­
utrustning. Med hjälp av C-märkt material kan de olika mineralise ­
ringshastigheterna av testämnet bestämmas genom att den
 14 CO 2 
som bildas fångas upp. Därefter kan en massbalans som inbegriper 
bildningen av jordbundna rester upprättas.  
1.7 KVALITETSKRITERIER  
1.7.1  Utbyte  
Extraktion och analys av minst dubbla jordprover omedelbart 
efter tillförsel av testämnet ger en första indikation på analysmeto ­
dens repeterbarhet och enhetligheten hos det förfarande som har använts för tillförsel av testämnet. Utbyten för senare stadier 
av försöken erhålls genom massbalanserna. Utbytena bör vara 
90–110 % för radioaktivt märkta kemikalier (8) och 70–110 för omärkta kemikalier (3).
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1293  
( 1 ) Om testämnet till exempel innehåller en ring måste märkningen finnas på denna ring. 
Om testämnet innehåller två eller flera ringar kan det vara nödvändigt med separata 
undersökningar för utvärdering av vad som händer med de enskilda ringarna och för 
att få lämpliga upplysningar om bildningen av omvandlingsprodukter.
 1.7.2  Analysmetodens repeterbarhet och känslighet  
Analysmetodens repeterbarhet (med undantag av den initiala extrak ­
tionseffektiviteten) när det gäller att kvantifiera testämnet och om ­
vandlingsprodukterna kan kontrolleras genom en duplikatanalys av 
samma extrakt ur jorden, som bör ha inkuberats tillräckligt länge för 
att omvandlingsprodukter ska ha bildats. 
Analysmetodens detektionsgräns (LOD) för testämnet och för om ­
vandlingsprodukterna bör vara minst 0,01 mg · kg  -1 jord (som tes ­
tämne) eller 1 % av den tillförda dosen, beroende på vilket värde 
som är lägre. Likaså bör kvantifieringsgränsen (LOQ) anges.  
1.7.3  Noggrannheten hos omvandlingsdata  
Genom regressionsanalys av testämneskoncentrationerna som en 
funktion av tiden fås ungefärliga upplysningar om omvandlingskur ­
vans tillförlitlighet och en möjlighet att beräkna konfidensgränserna för halveringstiderna (när det gäller kinetik av pseudoförsta ordning ­
en) eller DT
 50 -värden och, om tillämpligt, värden för DT  75 och 
DT 90 . 
1.8 BESKRIVNING AV TESTMETODEN  
1.8.1  Utrustning och kemiska reagenser  
Inkubationssystemet kan vara ett statiskt slutet system eller ett lämp ­
ligt genomflödessystem (7), (17). Exempel på ett lämplig genomflö ­
dessystem för inkubation av jord och på flaskor av biometertyp finns i figur 1 respektive figur 2. Båda typerna av inkubationssystem har 
sina fördelar och begränsningar (7), (17). 
Dessutom behövs normal laboratorieutrustning, särskilt följande: — Instrument för analysmetoder såsom gas-vätskekromatografi 
(GLC), högtrycksvätskekromatografi (HPLC), tunnskiktskro ­
matografi (TLC), inbegripet tillbörliga detektionssystem för ana ­
lys av radioaktivt märkta eller omärkta ämnen eller metod med 
invers isotoputspädning. 
— Instrument för identifiering (till exempel genom masspektrometri, 
GC-masspektrometri, HPLC-masspektrometri, kärnmagnetisk re ­
sonans (NMR)). 
— Vätskeskintillationsräknare. — Oxidationsmedel för förbränning av radioaktivt material. — Centrifug. — Extraktionsapparatur (till exempel centrifugrör för kallextraktion 
och Soxhlet-apparatur för kontinuerlig extration med återflöde). 
— Utrustning för koncentrering av lösningar och extrakt (till ex ­
empel roterande evaporator). 
— Vattenbad. — Mekanisk blandare (till exempel knådningsmaskin eller roterande 
mixer).
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1294
 
Kemiska reagenser, till exempel följande: 
— NaOH, p.a. kvalitet, 2 mol dm  -3 eller annan lämplig bas (till 
exempel KOH, etanolamin). 
— H  2 SO 4 , p.a kvalitet, 0,05 mol dm  -3 . 
— Etylenglykol, p.a. kvalitet. — Fasta absorptionsmaterial såsom kalk- och polyuretanproppar. — Organiska lösningsmedel (p.a. kvalitet), exempelvis aceton eller 
metanol. 
— Skintillationsvätska.
 
1.8.2  Tillförsel av testämnet  
Innan testämnet tillförs och fördelas i jorden kan det lösas upp i 
vatten (avjoniserat eller destillerat) eller vid behov i minsta möjliga mängd aceton eller något annat organiskt lösningsmedel (6) i vilket testämnet är tillräckligt lösligt och stabilt. Den mängd lösningsmedel 
som används får dock inte ha betydande inverkan på jordens mikro ­
biella aktivitet (se avsnitten 1.5 samt 1.9.2 och 1.9.3). Lösningsmedel som hämmar den mikrobiella aktiviteten, såsom kloroform, diklor ­
metan och andra halogenerade lösningsmedel, bör undvikas. 
Testämnet kan också tillföras i fast form, till exempel inblandat i 
kvartssand (6) eller i ett litet delprov av testjorden som har lufttor ­
kats och steriliserats. Om testämnet tillförs med hjälp av lösnings ­
medel måste detta få avdunsta innan det spikade delprovet tillförs det ursprungliga icke-sterila jordprovet. 
För allmänna kemikalier, vars som huvudsakligen når jorden genom 
applicering av avloppsslam eller jordbruksprodukter, bör testämnet 
först tillföras slammet som därefter blandas i jordprovet (se 
avsnitten 1.9.2 och 1.9.3). 
Användningen av formulerade produkter rekommenderas i regel inte. 
För svårlösliga testämnen kan dock användningen av formulerat ma ­
terial vara ett lämpligt alternativ.
 
1.8.3  Jord  
1.8.3.1  Valet av jord  
För bestämning av omvandlingsmönstret används en representativ 
jordtyp – sandy loam, silty loam, loam eller loamy sand (enligt 
FAO- och USDA-klassificeringen (18)), pH 5,5–8,0, halten organiskt kol 0,5–2,5 % och en mikrobiell biomassa som utgör minst 1 % av totala mängden organiskt kol (10). 
Vid undersökning av omvandlingshastigheter behövs minst tre ytter ­
ligare jordtyper som representerar ett urval relevanta jordtyper. Jord ­
typerna bör vara sinsemellan olika i fråga om halten organiskt kol, 
pH, lerhalt och mikrobiell biomassa (10).
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1295
 
All jord bör karakteriseras minst med avseende på textur ( % 
sand, % silt, % clay) (enligt FAO- och USDA-klassificering (18)), 
pH, katjonbyteskapacitet, organiskt kol, bulktäthet, vattenretentions ­
egenskaper (  1 ) och mikrobiell biomassa (endast vid aeroba undersök ­
ningar). Tilläggsupplysningar om jordens egenskaper kan vara till 
nytta vid tolkning av resultaten. Jordens egenskaper kan bestämmas 
med de metoder som rekommenderas i hänvisningarna (19), (20), (21), (22), (23). Den mikrobiella biomassan bör bestämmas med SIR-metoden (substratinducerad respiration) (25), (26) eller alterna ­
tiva metoder (20).
 
1.8.3.2  Insamling, hantering och lagring ax jord  
Det bör finnas tillgång till detaljerade upplysningar om historian för 
den plats där testjorden tas. Upplysningarna bör omfatta exakt läge, växtlighetstäcke, behandlingar med kemikalier, behandlingar med 
organiska och oorganiska gödselmedel, tillförsel av biologiska mate ­
rial eller förorening. Om jorden har behandlats med testämnet eller ett strukturellt analogt ämne inom de fyra senaste åren bör den inte användas för undersökningar rörande omvandling (10), (15). 
Jordproverna bör vara nytagna (från A-horisonten eller det översta 
20 cm-skiktet) och ha en lämplig vattenhalt med tanke på siktning. För all annan jord än den från risfält bör provtagning undvikas under eller omedelbart efter långa perioder (mer än 30 dagar) av torka, 
frost eller översvämning (14). Proverna bör transporteras på sådant 
sätt att förändringar i vattenhalt minimeras. Under transporten bör proverna hållas i mörker med så fri tillgång till luft som det är 
möjligt. För detta ändamål är det i regel tillräckligt med en löst 
sluten polyetylenpåse. 
Jordproverna bör bearbetas så snart som möjligt efter provtagningen. 
Först avlägsnas vegetation, större fauna och stenar och därefter får 
jorden passera ett 2 mm-sikt som fångar upp små stenar, fauna och 
växtrester. Omfattande torkning eller krossning av jorden före sikt ­
ningen bör undvikas (15). 
Om provtagningen försvåras under vintern (jorden är frusen eller 
snötäckt) kan proverna tas från en sats jord som har lagrats i växthus under ett växttäcke (till exempel gräs eller gräs–klöverblandning). Alla prover som undersöks bör helst vara nytagna. Om lagring av 
bearbetade jordprover inte kan undvikas före undersökningen måste 
betingelserna vara lämpliga och lagringstiden begränsad (4 ± 2
 o C 
och högst tre månader) för att den mikrobiella aktiviteten ska upprätthållas (
 2 ). Närmare anvisningar om insamling, hantering och 
lagring av jordprover avsedda för undersökningar av bioomvandling 
finns i hänvisningarna (8), (10), (15), (26), (27).  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1296  
( 1 ) Vattenretentionsegenskaperna hos jord kan mätas som fältkapacitet, vattenkapacitet eller 
tension (pF). Begreppsförklaringar finns i bilaga 1. I testrapporten bör anges om vatten ­
retentionsegenskaperna och bulktätheten har bestämts i ostörda fältprover eller i störda 
(bearbetade) prover). 
( 2 ) Färska forskningsresultat tyder på att jordprover från tempererade zoner även kan lagras 
vid -20 C under mer än tre månader (28), (29) utan betydande minskningar av den 
mikrobiella aktiviteten.
 Innan ett bearbetat jordprov används för detta test bör provet förin ­
kuberas för att framkalla groning och avlägsnande av frön, och för 
att återställa jämvikten för den mikrobiella metabolismen efter den ändring av betingelser som sker mellan provtagning eller lagring och inkubation. Det är i regel tillräckligt med en förinkubationsperiod 
vars längd är 2–28 dagar och vars temperatur- och fuktbetingelser 
är ungefär desamma som under det egentliga försöket (15). Lagrings- och förinkubationsperioden bör tillsammans inte vara längre än tre månader.
 
1.9 TESTETS UTFÖRANDE  
1.9.1  Testbetingelser  
1.9.1.1  Testtemperatur  
Jordproverna bör under hela testperioden inkuberas i mörker vid en 
konstant temperatur som är representativ för de klimatförhållanden som råder på den plats där testämnet används eller släpps ut. Tem ­
peraturen 20 ± 2
 o C rekommenderas för testämnen som kan nå 
jorden i tempererade klimat. Temperaturen bör övervakas. 
För kemikalier som appliceras eller släpps ut i kallare klimat 
(till exempel i de nordiska länderna under hösten och vintern) bör extra jordprover även inkuberas vid en lägre temperatur (till exempel 10 ± 2
 o C). 
1.9.1.2  Fukthalt  
För omvandlingstest som görs under aeroba betingelser bör jordens 
fukthalt (  1 ) justeras till ett pF-värde mellan 2,0 och 2,5 och upprätt ­
hållas på denna nivå (3). Jordens fukthalt uttrycks som massan vatten 
per massan torr jord. Fukthalten bör regelbundet kontrolleras (till exempel med två veckors intervall) genom vägning av inkubations ­
flaskorna. Vattenförluster kompenseras genom att tillföra vatten 
(helst sterilfiltrerat kranvatten). När vatten tillförs är det viktigt att 
förebygga eller minimera förluster av testämnet eller omvandlings ­
produkter som kan ske genom avdunstning eller fotonedbrytning (i förekommande fall). 
Vid omvandlingstest som görs under anaeroba betingelser och ris ­
fältsbetingelser mättas jorden med vatten genom översvämning.
 
1.9.1.3  Aeroba inkubationsbetingelser  
I genomflödessystem upprätthålls de aeroba betingelserna genom 
periodisk spolning eller kontinuerlig ventilering med fuktad luft. I 
biometerflaskorna upprätthålls luftväxlingen genom diffusion.  
1.9.1.4  Sterila aeroba betingelser  
För att få upplysningar om relevansen hos ett testämnes abiotiska 
omvandling kan jordproverna steriliseras (steriliseringsmetoder be ­
skrivs i hänvisningarna 16 och 29), behandlas med sterilt testämne (till exempel så att lösningen tillförs genom ett sterilt filter) och 
luftas med fuktad steril luft (se avsnitt 1.9.1.3. När det gäller jord 
för risodling bör jord och vatten steriliseras, och inkubationen görs därefter enligt beskrivningen i avsnitt 1.9.1.6.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1297  
( 1 ) Jorden får inte vara för våt eller för torr med tanke på upprätthållande av tillbörlig 
luftning och näring för mikroflarn i jorden. De rekommenderade fukthalterna för optimal 
mikrobiell tillväxt är 40–60 % vattenkapacitet (WHC) och 0,1–0,33 bar (6). Det senare 
motsvarar pF-området 2,0–2,5. Typiska fukthalter för olika jordtyper anges i bilaga 2.
 1.9.1.5  Anaeroba inkubationsbetingelser  
För att etablera och upprätthålla anaeroba betingelser inkuberas 
jorden efter behandlingen med testämnet i aeroba betingelser under en period vars längd är 30 dagar, en halveringstid eller DT
 50 
(beroende på vilken tid som är kortast). Därefter mättas jorden 
med vatten (1–3 cm vattenskikt) och inkubationssystemet spolas med en inert gas (till exempel kväve eller argon (
 1 ). Testsystemet 
måste vara utformat så att pH, syrehalt och redoxpotential kan be ­
stämmas, och det måste innehålla uppfångare för flyktiga produkter. 
System av biometertyp måste vara slutna för att luftinträngning ge ­
nom diffusion ska undvikas.  
1.9.1.6  Inkubationsbetingelser för ris  
Vid undersökning av omvandlingen i jord för risodling översvämmas 
jorden med ett vattenskikt på 1–5 cm och testämnet tillförs vatten ­
fasen (9). Jorddjupet bör vara minst 5 cm. Systemet ventileras med luft på samma sätt som vid försök i aeroba betingelser. Vattenskik ­
tets pH, syrehalt och redoxpotential bör övervakas och rapporteras. 
Före det egentliga försöket behövs en förinkubationsperiod på minst två veckor (se avsnitt 1.8.3.2).
 
1.9.1.7  Testets varaktighet  
Försöken rörande hastighet och mönster bör normalt inte överskrida 
120 dagar (  2 ) (3), (6), (8). Det beror på att jordens mikrobiella ak ­
tivitet efter denna period sannolikt börjar minska med tiden, eftersom det gäller ett konstgjort laboratoriesystem som är isolerat och inte får 
naturlig påfyllning. Om det finns ett behov för att karakterisera 
minskningen av testämnet samt bildningen och minskningen av viktiga omvandlingsprodukter, kan försöksperioden förlängas 
(till exempel till 6 eller 12 månader) (8). Förlängda inkubationsperioder 
bör motiveras i testrapporten, som då även bör innehålla resultat från bestämningar av biomassa under och vid slutet av dessa perioder.
 
1.9.2  Testets utförande  
Omkring 50–200 g jord (torrvikt) placeras i varje inkubationsflaska 
(se figurerna 1 och 2 i bilaga 3), och jorden behandlas med testämnet 
genom en av de metoder som beskrivs i avsnitt 1.8.2. Om organiska lösningsmedel används för tillförsel av testämnet bör lösningsmedlet 
avlägsnas från jorden genom avdunstning. Jorden blandas grundligt 
med en spatel och/eller genom att skaka flaskan. Om försöket görs under risfältsbetingelser, bör jord och vatten blandas grundligt efter tillförseln av testämnet. Små delprover (till exempel 1 g) av den 
behandlade jorden bör analyseras med avseende på testämnet för 
att kontrollera att fördelningen är jämn. En alternativ metod beskrivs nedan.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1298  
( 1 ) Aeroba betingelser är dominerande i ytjord och även i jord under ytan, såsom visas i ett 
forskningsprojekt som fått stöd från EU (K. Takagi  et al.  (1992), ”Microbial diversity 
and activity in subsoils: Methods, field site, seasonal variation in subsoil temperatures 
and oxygen contents”,  Proc. Internat. Symp. Enxironm. Aspects Pesticides Microbiol.,  
270–277, den 17–21 augusti 1992, Sigtuna, Sverige). Anaeroba betingelser förekommer 
endast sporadiskt vid översvämningar efter skyfall eller när risfältsbetingelser etableras i 
risfält. 
( 2 ) Aeroba försök kan avslutas mycket tidigare, förutsatt att omvandlingsmönstret och mi ­
neraliseringen med säkerhet har nått sin absoluta slutpunkt vid försökets slut. Det är 
möjligt att avsluta testet efter 120 dagar eller när minst 90 % av testämnet har omvand ­
lats, dock endast om minst 5 % CO  2 har bildats.
 Tillförseln av testämne bör motsvara den högsta dosen som anges i 
bruksanvisningen för en växtskyddsprodukt, och en jämn tillförsel 
till ett lämpligt djup i åkern (till exempel 10 cm av det översta jordskiktet (
 1 ). Till exempel för kemikalier som appliceras på bladen 
eller på jorden, utan att blandas ned i jorden, är 2,5 cm ett lämpligt 
djup för beräkning av hur mycket kemikalie som bör tillföras varje 
flaska. För kemikalier som tillförs in i jorden används det djup som anges i produktens bruksanvisning. För allmänna kemikalier bör dosen uppskattas enligt den mest relevanta tillförselvägen. Om till 
exempel den viktigaste tillförselvägen till jorden är via avloppsslam, 
bör kemikalien doseras i slammet i sådan mängd att koncentrationen motsvarar den förväntade koncentrationen i det slam som används på åkern, och den mängd slam som tillförs testjorden ska motsvara det 
som normalt tillförs jordbruksjordar. Om denna koncentration inte är 
tillräckligt hög för att det ska vara möjligt att identifiera de viktigaste omvandlingsprodukterna kan man försöka med att inkubera separata jordprover som innehåller högre halter. Mycket höga halter som 
påverkar jordens mikrobiella funktioner bör dock undvikas (se 
avsnitten 1.5 och 1.8.2). 
Alternativt kan en större jordsats (till exempel 1–2 kg) behandlas 
med testämnet. Satsen blandas därefter omsorgsfullt i en lämplig blandare och överförs i mindre portioner (50–200 g) till inkubations ­
flaskorna (till exempel med hjälp av provfördelare). Små delprover 
(till exempel 1 g) av den behandlade jordsatsen bör analyseras med 
avseende på testämnet för att kontrollera att fördelningen är jämn. Detta förfarande rekommenderas eftersom det ger möjlighet till en jämnare fördelning av testämnet i jorden. 
Även obehandlade jordprover inkuberas under samma betingelser 
(aeroba) som de prover som har behandlats med testämnet. Proverna 
används för bestämningar av biomassa under och vid slutet av för ­
söken. 
När testämnet tillförs jorden upplöst i organiskt lösningsmedel bör 
jordprover som har behandlats med samma mängd lösningsmedel inkuberas under samma betingelser (aeroba) som gäller för de prover som har behandlats med testämnet. Dessa prover används för be ­
stämning av biomassan i början, under och i slutet av undersökning ­
en, i syfte att kontrollera lösningsmedlets inverkan på den mikrobi ­
ella massan. 
Behållarna som innehåller behandlat jordprov monteras i ett genom ­
flödessystem av det slag som beskrivs i figur 1 eller försluts med en absorptionskolonn av det slag som visas i figur 2 (se bilaga 3).
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1299  
( 1 ) Den ytbaserade initialkoncentrationen beräknas med följande ekvation:  
C soil mg =kg soil ½ â ¼ A½kg=haâ·10 6 ½mg =kgâ 
l½mâ·10 4 ½m 2=haâ·d kg  soil=m 3 h i  
C soil = Initialkoncentration i jorden (mg · kg -1 ) 
A = Dosering (kg · ha -1 ), 1 = jordskiktets tjocklek (m), d = bulktäthet för 
torr jord (kg · m -3 ). 
Som en tumregel gäller att en dosering som är 1 kg · ha -1 ger en koncentration i 
jorden som ligger kring 1 mg · kg -1 i ett 10 cm skikt (när bulktätheten är 1 g cm  -3 ).
 1.9.3  Provtagning och mätning  
Dubbla inkubationsflaskor tas ur systemet med lämpliga intervall, 
jordproverna extraheras med lämpliga lösningsmedel med olika po ­
laritet och analyseras därefter med avseende på testämnet och/eller 
omvandlingsprodukter. Ett välplanerat test ska omfatta så många 
flaskor att två flaskor kan tas ur systemet vid varje provtagningstill ­
fälle. Likaså avlägsnas absorptionslösningar eller fasta absorptions ­
material med olika intervall (7 dagars intervall under den första 
månaden och därefter 17 dagars intervall) under och i slutet av 
inkubationsperioden för varje jordprov, och analyseras med avseende på flyktiga produkter. Utöver ett jordprov som tas direkt efter till ­
förseln (dag 0) bör testet omfatta minst 5 ytterligare provtagnings ­
tillfällen. Tidsintervallerna bör väljas på sådant sätt att mönstret för minskningen av testämnet och mönstren för bildning och minskning av omvandlingsprodukter kan bestämmas (till exempel 0, 1, 3, 7 
dagar, 2, 3 veckor, 1, 2, 3 månader). 
Vid användning av
 14 C-märkt testämne kvantifieras icke-extraherbar 
radioaktivitet genom förbränning och en massbalans beräknas för 
varje provtagningsintervall. 
När det gäller anaerob inkubation och risfältsinkubation analyseras 
jord- och vattenfasema tillsammans med avseende på testämnet och omvandlingsprodukter, eller separeras genom filtrering eller centrifu ­
gering före extraktion och analys.
 
1.9.4  Valfria tilläggstest  
Aeroba, icke-sterila undersökningar vid ytterligare temperaturer och 
jordfukthalter kan vara till hjälp för uppskattningen av temperaturens 
och fukthaltens inverkan på omvandlingshastigheten i jord för ett testämne och/eller dess omvandlingsprodukter. 
Man kan även försöka få en närmare karakterisering av den icke- 
extraherbara radioaktiviteten till exempel med hjälp av superkritisk 
vätskeextraktion.
 
2. DATA  
2.1 BEHANDLING AV RESULTATEN 
Mängden testämne, omvandlingsprodukter, flyktiga ämnen (endast i %) 
och icke-extraherbara ämnen bör anges som procent av initialkoncent ­
rationen för det tillförda ämnet och, där det är lämpligt, som mg · kg -1 
jord (torrvikt) för varje provtagningsintervall. En massbalans bör anges 
som procent av initialkoncentrationen för det tillförda ämnet för varje provtagningsintervall. Med hjälp av en grafisk presentation av testämnets koncentration mot tiden kan halveringstiden för testämnets omvandling 
eller DT
 50 uppskattas. De viktigaste omvandlingsprodukterna bör iden ­
tifieras och deras koncentrationer bör plottas mot tiden så att bildnings- och minskningshastigheterna kan bestämmas. En viktig omvandlings ­
produkt är varje produkt som utgör > 10 % av den tillförda dosen vid 
varje tidpunkt medan undersökningen pågår. 
De uppfångade flyktiga produkterna ger en viss indikation om tes ­
tämnets och dess omvandlingsprodukters potentiella flyktighet ur 
jord.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1300
 
Mer exakta bestämningar av halveringstiderna eller DT  50 och, vid 
behov, DT  75 och DT  90 bör göras med hjälp av lämpliga beräkningar 
med kinetiska modeller. Värdena för halveringstid och DT  50 bör 
rapporteras tillsammans med en beskrivning av vilken modell som har använts, vilken ordning av kinetik som har tillämpats och be ­
stämningskoefficient (r
 2 . Första ordningens rekommenderas, utom 
om r  2 < 0,7. Vid behov bör beräkningar även göras för viktiga 
omvandlingsprodukter. Exempel på lämpliga modeller beskrivs i hänvisningarna 31–35. 
Om hastigheterna undersöks vid flera temperaturer bör omvandlings ­
hastigheterna beskrivas som en funktion av temperaturen inom för ­
sökstemperaturintervallet. För detta används Arrhenius-förhållandet 
enligt följande formel.
 
k ¼ A·e ÄB=T eller lnk ¼ 1nA Ä B 
T , 
där ln A och B är regressionskonstanter från skärningspunkten re ­
spektive lutningen för en anpassad linje som har erhållits genom linjär regression av ln k mot 1/T, där k är hastighetskonstanten vid temperaturen T och T är temperaturen uttryckt som grader Kelvin. 
Det är viktigt att notera att Arrhenius-förhållandet endast är giltigt 
inom ett begränsat temperaturområde i situationer där omvandlingen sker genom mikrobiell aktivitet.
 
2.2 UTVÄRDERING OCH TOLKNING AV RESULTATEN 
Trots att undersökningarna görs i ett konstgjort system i laboratorie ­
betingelser, ger resultatet ändå en möjlighet att uppskatta testämnets 
omvandlingshastighet och omvandlingsprodukternas bildnings- och 
minskningshastighet i fältbetingelser (36), (37). 
En undersökning av mönstret för omvandlingen av ett testämne ger 
upplysningar om hur ett ämne som tillförs jorden förändras struk ­
turellt genom kemiska och mikrobiella reaktioner.  
3. RAPPORTERING  
TESTRAPPORT 
Testrapporten ska innehålla följande: 
Testämne: 
— trivialnamn, kemiskt namn, CAS-nummer, strukturformel (med 
angivelse av märkningsposition om radioaktivt märkt material 
används) och relevanta fysikalkemiska egenskaper (se avsnitt 1.5), 
— testämnets renhet (orenheter), — strålningskemisk renhet hos märkta kemikalier och specifik ak ­
tivitet (vid behov). 
Referenstämnen: — kemiskt namn och struktur för referensämnen som används för 
karakterisering och/eller identifiering av omvandlingsprodukter. 
Testjord: — upplysningar om provtagningsstället, — provtagningsdatum och -förfarande,
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1301
 
— jordens egenskaper, såsom pH, halten organiskt kol, textur ( % 
sand, % silt, % clay), katjonbyteskapacitet, bulktäthet, vattenre ­
tentionsegenskaper och mikrobiell biomassa, 
— hur länge jorden har lagrats och lagringsbetingelserna (i förekom ­
mande fall). 
Testbetingelser: 
— undersökningsdatum, 
— mängden tillfört testämne, — lösningsmedel som har använts och hur testämnet har tillförts, — initialvikt hos det behandlade jordprovet och vikten hos varje 
prov som tas för analys, 
— beskrivning av inkubationssystemet, — luftflödeshastigheter (endast genomflödessystem), — försökstemperatur, — jordens fukthalt under inkubationen, 
— mikrobiell biomassa i början, under och i slutet av de aeroba 
försöken, 
— pH, syrehalt och redoxpotential i början, under och i slutet av 
anaeroba försök och risfältsförsök, 
— extraktionsmetod(er), 
— metoder för kvantifiering och identifiering av testämnet och vik ­
tiga omvandlingsprodukter i jorden och i absorptionsmaterial, 
— antalet replikat och antalet kontrollprover. Resultat: 
— resultaten från bestämning av mikrobiell aktivitet, 
— analysmetodens repeterbarhet och känslighet, — utbyten (procentvärden för en valid undersökning anges i 
avsnitt 1.7.1), 
— resultaten i tabellform, uttryckta som procentandel av initialdosen 
och, där det är lämpligt, som mg · kg
 -1 jord (torrvikt), 
— massbalans under och i slutet av försöken, — karakterisering av icke-extraherbar (bunden) radioaktivitet eller 
rester i jorden, 
— kvantifiering av frigjord CO
 2 och andra flyktiga föreningar, 
— kurvor där koncentrationerna av testämnet och, i tillämpliga fall, 
viktiga omvandlingsprodukter i jorden har avsatts mot tiden, 
— halveringstid eller DT  50 , DT  75 och DT  90 för testämnet och, i till ­
lämpliga fall, viktiga omvandlingsprodukter, inbegripet kon ­
fidensgränser,  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1302
 
— en uppskattning av abiotisk sönderfallshastighet under sterila be ­
tingelser, 
— en bedömning av omvandlingskinetiken för testämnet och, i till ­
lämpliga fall, för viktiga omvandlingsprodukter, 
— förslag till omvandlingsmönster, där det är lämpligt, 
— diskussion och tolkning av resultaten, — rådata (till exempel kromatogram för prover, beräkningar av pro ­
vernas omvandlingshastigheter och metoder som har använts för att identifiera omvandlingsprodukterna).
 
4. HÄNVISNINGAR  
1. US Environmental Protection Agency (1982), ”Pesticide As ­
sessment Guidelines, Subdivision N. Chemistry: Environmental 
Fate”. 
2. Agriculture Canada (1987), ”Environmental Chemistry and Fa ­
te. Guidelines for registration of pesticides in Canada”. 
3. Europeiska unionen (EU) (1995), ”Kommissionens direktiv 
95/36/EG av den 14 juli 1995 om ändring av rådets direktiv 
91/414/EEG om utsläppande av växtskyddsprodukter på mark ­
naden. Bilaga II, del A och bilaga III, del A: Omvandling, spridning och fördelning i miljön”. 
4. Dutch Commission for Registration of Pesticides (1995), ”Ap ­
plication for registration of a pesticide. Section G: Behaviour of 
the product and its metabolites in soil, water and air”. 
5. BBA (1986), ”Richtlinie fur die amtliche Prüfung von Pflanzen ­
schutzmitteln, Teil IV, 4-1. Verbleib von Pflanzenschutzmitteln 
im Boden – Abbau, Umwandlung und Metabolismus”. 
6. ISO/DIS 11266-1 (1994), ”Soil Quality – Guidance on lab ­
oratory tests for biodegradation of organic Chemicals in soil – Part 1: Aerobic conditions”. 
7. ISO 14239 (1997), ”Markundersökningar – Inkubationssystem 
för bestämning av mineraliseringen av organiska kemikalier i jord under aeroba förhållanden”. 
8. SETAC (1995), ”Procedures for Assessing the Environmental 
Fate and Ecotoxicity of Pesticides”, Mark R. Lynch, red. 
9. MAFF – Japan 2000, ”Draft Guidelines for transformation stud ­
ies of pesticides in soil – Aerobic metabolism study in soil 
under paddy field conditions (flooded)”. 
10. OECD (1995), ”Final Report of the OECD Workshop on Selection 
of Soils/Sediments”, Belgirate, Italien, den 18–20 januari 1995. 
11. J. A. Guth (1980), ”The study of transtbrmations. In Interactions 
between Herbicides and the Soil (R.J.Hance, red)”,  Academic 
Press,  123–157. 
12. DFG, ”Pesticide Bound Residues in Soil”, Wiley – VCH, (1998). 13. T.R. Roberts, ”Non-extractable pesticide residue in soils and 
plants”,  Pure Appl. Chem,  56, 945–956 (IUPAC 1984). 
14. OECD Test Guideline 304 A, ”Inherent Biodegradability in 
Soil” (antagen den 12 maj 1981).
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1303
 
15. ISO 10381-6 (1993), ”Soil Quality – Sampling – Part 6: Guid ­
ance on the collection, handling and storage of soil for the 
assessment of aerobic microbial processes in the laboratory”. 
16. Bilaga V till direktiv 67/548/EEG. 17. J. A. Guth (1981), ”Experimental approaches to studying the 
fate of pesticides in soil”,  Progress in Pesticide Biochemislry,  
(red. D. H. Hutson, T. R. Roberts), J. Wiley & Sons, Vol I, 
85–114. 
18. Soil Texture Classification (US and FAO systems),  Weed Sci ­
ence, 33,  Suppl. 1 (1985) och  Soil Sci. Soc. Amer. Proc,  26, 
305(1962). 
19. Methods of Soil Analysis (1986), ”Part 1, Physical and Mine ­
ralogical Methods” (red. A. Klute),  Agronomy Series, 9,  andra 
utgåvan. 
20. Methods of Soil Analysis (1982), ”Part 2, Chemical and Micro ­
biological Properties”, (red. A. L. Page, R. H. Miller och D.R. Kelney),  Agronomy Series,  9, andra utgåvan. 
21. ISO Standard Compendium Environment (1994), ”Soil Quality 
– General aspects; chemical and physical methods of analysis; 
biological methods of analysis”, första utgåvan. 
22. E. Muckenhausen (1975), ”Die Bodenkunde und ihre geologi ­
schen, geomorphologischen, mineralogischen und petrologi ­
schen Grundlagen”,  DLG-Verlag,  Frankfurt am Main. 
23. F. Scheffer, P. Schachtschabel (1975), ”Lehrbuch der Boden ­
kunde”, F. Enke Verlag, Stuttgart. 
24. J.P.E. Anderson, K. H. Domsch (1978), ”A physiological met ­
hod for the quantitative measurement of microbial biomass in 
soils”,  SoilBiol. Biochem.,  10, 215–221. 
25. ISO 14240-1 och 2 (1997). Markundersökningar – Bestämning 
av markens mikrobiella biomassa – Del 1: Sustratinducerad respirationsmetod. Del 2: Fumigering – extraheringsmetod. 
26. J.P.E. Anderson (1987), ”Handling and storage of soils for pes ­
ticide experiments”,  Pesticide Effects on Soil Microflora,  (red. 
M. P. Somerville och Greaves), Taylor & Francis, 45–60. 
27. Kato, Yasuhiro (1998), ”Mechanism of pesticide transformation 
in the environment: Aerobic and bio-transformation of pestici ­
des in aqueous environment”.  Proceedings of the 16
 th Sympo­
sium on Environmental Science of Pesticide,  105–120. 
28. O. Keuken, J.P.E. Anderson (1996), ”Influence of storage on 
biochemical processes in soil”,  Pesticides, Soil Microbiology 
and Soil Quality,  59–63 (SETAC-Europa). 
29. B. Stenberg, M. Johansson, M. Pel, K. Sjödahl-Svensson, J. 
Stenström, L. Torstensson (1996), ”Effect of freeze and cold 
storage of soil on microbial activities and biomass”,  Pesticides, 
Soil Microbiology and Soil Quality,  68–9 (SETAC-Europa). 
30. . Gennari, M. Negre, R. Ambrosoli (1987), ”Effects of ethylene 
oxide on soil microbial content and some chemical characteris ­
tics”,  Plant and Soil,  102, 197–200. 
31. J. P.E. Anderson (1975), ”Einfluss von Temperatur und Feuchte 
auf Verdampfung, Abbau und Festlegung von Diallat im Bo ­
den”, Z.  PflKrankh Pflschutz,  Sonderheft VII, 141–146.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1304
 
32. J.W. Hamaker (1976), ”The application of mathematical model ­
ling to the soil persistence and accumulation of pesticides”,  
Proc. BCPC Symposium: Persistence of Insecticides and Her ­
bicides,  181–199. 
33. C.A.I. Goring, D.A. Laskowski, J.W. Hamaker, R.W. Meikle 
(1975), ”Principles of pesticide degradation in soil”,  Environ­
mental Dynamics of Pesticides,  (red. R. Haque och V.H. Freed), 
135–172. 
34. G. Timme, H. Frehse, V. Laska (1986), ”Statistical interpreta ­
tion and graphic representation of the degradational behaviour of pesticide residues” II. Pflanzenschutz – Nachrichten Bayer,  
39, 188–204. 
35. G. Timme, H. Frehse (1980), ”Statistical interpretation and 
graphic representation of the degradational behaviour of pes ­
ticide residues”,  I. Pflanzenschutz  – Nachrichten Bayer,  33, 
47–60. 
36. D.I. Gustafson, L. R. Holden (1990), ”Non-linear pesticide dis ­
sipation in soil; a new model based on spatial variability”,  
Environm. Sci. Technol.,  24, 1032–1041. 
37. K. Hurle, A. Walker (1980), ”Persistence and its prediction”,  
Interactions between Herbicides and the Soil,  (red. R. J. Han ­
ce), Academic Press,  83–122.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1305
 
Bilaga 1  
TENSION, FÄLTKAPACITET (FC) OCH VATTENKAPACITET (WHC)  ( 1 ) 
Vattenpelarens höjd 
(cm) pF (  a ) bar (  b ) Anmärkningar  
10 7 7 10  4 Torr jord 
1,6 • 10  4 4,2 16 Permanent vissningsgräns 
10 4 4 10 
10 3 3 1 
6 • 10  2 2,8 0,6 
3,3 • 10  2 2,5 0,33 (  c ) 
Område för 
fältkapacitet (  d ) 10 2 2 0,1 
60 1,8 0,06 33 1,5  9 
> > > > > > = 
> > > > > > ; 0,033 
10 1 0,01 WHC (ungefärligt värde) 1 0 0,001 Vattenmättad jord
 
( a ) pF = logaritmen av cm vattenpelare. 
( b ) 1 bar= 10  5 Pa. 
( c ) Motsvarar en ungefärlig vattenhalt på 10 % i sand, 35 % i loam och 45 % i clay. 
( d ) Fältkapaciteten är inte konstant utan varierar enligt jordtyp mellan pF 1,5 och 2,5.  
Tensionen  mäts i cm vattenpelare eller i bar. På grund av det stora området för tensionen uttrycks 
den i praktiken som ett pF-värde som är ekvivalent med logaritmen av cm vattenpelare.  
Fältkapaciteten  definieras som den mängd vatten som en naturjord kan hålla mot gravitationen i två 
dagar efter en längre regnperiod eller efter tillräcklig bevattning. Den bestäms på platsen i ostörd 
jord. Denna bestämning kan således inte göras på störda jordprover i laboratorium. FC-värden som bestäms med störd jord kan uppvisa stora systematiska variationer  
Vattenkapaciteten  (WHC) bestäms i laboratoriet med ostörd och störd jord genom att mätta en 
jordkolonn med vatten genom transport genom kapillärkraft. WHC är särskilt användbar för störda 
jord och kan vara upp till 30 % högre än fältkapaciteten (1). Det är också försöksmässigt enklare att bestämma WHC än att få tillförlitliga FC-värden. 
Noter
 
( 1 ) E. Muckenhausen (1975), ”Die Bodenkunde und ihre geologischen, geomorphologischen, mineralogischen 
und petrologischen Grundlagen”, DLG-Verlag, Frankfurt am Main.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1306
 
Bilaga 2  
JORDENS FUKTHALT (g vatten per 100 g torr jord) I OLIKA JORDTYPER FRÅN 
OLIKA LÄNDER  
Jordens fukthalt vid 
Jordtyp Land 
WHC (  1 ) pF = 1,8 pF = 2,5  
Sand Tyskland 28,7 8,8 3,9 
Loamy sand Tyskland 50,4 17,9 12,1 
Loamy sand Schweiz 44,0 35,3 9,2 
Silt loam Schweiz 72,8 56,6 28,4 Clay loam Brasilien 69,7 38,4 27,3 Clay loam Japan 74,4 57,8 31,4 Sandy loam Japan 82,4 59,2 36,0 Silt loam USA 47,2 33,2 18,8 Sandy loam USA 40,4 25,2 13,3
 
( 1 ) Vattenkapacitet  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1307
 
Bilaga 3  
Figur I  
Exempel på genomflödesapparatur för undersökning av kemikaliers omvandling i jord  ( 1 ), ( 2 )
 
Figur 2  
Exempel på en flaska av biometertyp för undersökning av kemikaliers omvandling i jord  ( 3 )
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1308  
( 1 ) J.A. Guth, (1980), ”The study of transformations”,  Interactions between Herbicides and the Soil  (red. R. J. 
Hance.),  Academic Press,  s. 123–157. 
( 2 ) J .A. Guth, (1981), ”Experimental approaches to studying the fate of pesticides in soil”,  Progress in Pesticide 
Biochemistry,  (red. D.H. Hutson, T. R. Roberts),./.  Wiley & Sons,  Vol.  1, s. 85–114. 
( 3 ) J.P.E. Anderson, (1975), ”Einfluss von Temperatur und Feuchte auf Verdampfung, Abbau und Festlegung von 
Diallat im Boden”, Z.  PflKrankh Pflschutz,  Sonderheft VII, s. 141–146.
 C.24  AEROB OCH ANAEROB OMVANDLING I AKVATISKA 
SEDIMENTSYSTEM  
1. METOD  
Denna metod är i stort sett identisk med OECD TG 308 (2002).  
1.1 INLEDNING 
Kemikalier kan nå grunda eller djupa ytvatten exempelvis via direkt 
applicering, spridning med vinden, avrinning, dränering, bortskaf ­
fande av avfall eller utsläpp från industrin, hushåll, jordbruk och från atmosfären. Den testmetod som beskrivs här är en laboratorie ­
metod för bedömning av aerob och anaerob omvandling av orga ­
niska kemikalier i akvatiska sedimentsystem. Metoden grundar sig på 
existerande riktlinjer (1), (2), (3), (4), (5), (6). Vid en OECD-works ­
hop om valet av jord och sediment som hölls i Belgirate, Italien, 1995 (7), kom man särskilt överens om hur många och vilka typer av 
sediment som ska användas i detta test. Workshopen i Belgirate gav 
också rekommendationer rörande insamling, hantering och lagring av sedimentprover, baserade på ISO-riktlinjer (8). Sådana undersök ­
ningar behövs för kemikalier som tillsätts direkt i vatten eller som 
sannolikt når vattenmiljön på det sätt som beskrivs ovan. 
Betingelserna i naturliga akvatiska sedimentsystem är ofta aeroba i 
den övre vattenfasen. Sedimentets ytskikt kan vara aerobt eller anae ­
robt, medan djupare liggande sediment i regel är anaeroba. Med tanke på detta beskrivs både aerobt och anaerobt test i detta doku ­
ment. I det aeroba testet simuleras en aerob vattenpelare över ett 
aerobt sedimentskikt under vilket det finns en anaerob gradient. I det anaeroba testet simuleras ett fullständigt anaerobt vatten/sedi ­
ment-system. I situationer där det krävs betydande avvikelser från 
dessa rekommendationer, till exempel i fråga om intakta sediment ­
kärnor eller sediment som kan ha exponerats för testämnet, kan andra metoder användas (9).
 
1.2 DEFINITIONER 
Under alla omständigheter bör SI-enheter användas.  
Testämne:  Alla ämnen, oavsett det gäller en ursprunglig förorening 
eller relevanta omvandlingsprodukter.  
Omvandlingsprodukter:  Alla ämnen som uppstår till följd av bio ­
tiska eller abiotiska omvandlingsreaktioner av testämnet, inbegripet 
CO 2 och bundna rester.  
Bundna rester:  Sådana föreningar i jorden, i växter eller i djur som 
blir kvar i matrisen i form av ursprungligt ämne, dess metaboliter 
eller dess omvandlingsprodukter efter extraktion. Extraktionsmetoden får inte i avsevärd grad leda till förändringar i själva föreningarna eller matrisens struktur. Bindningens karaktär kan delvis klarläggas 
genom matrisstörande extraktionsmetoder och sofistikerade analys ­
metoder. Hittills har man på detta sätt kunnat identifiera till exempel kovalenta bindningar, jonbindningar och sorptiva bindningar samt inneslutning. Generellt sett innebär bildningen av bundna rester en 
betydande minskning av biotillgängligheten (10) (modifierat ur IU ­
PAC 1984 (11)).
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1309
 
Aerob omvandling  (oxidation): Reaktioner som sker i närvaro av 
molekylärt syre (12).  
Anaerob omvandling  (reduktion): Reaktioner som sker utan närvaro 
av molekylärt syre (12).  
Naturliga vatten:  Ytvatten som fås från dammar, floder, strömmar 
etc. 
Sediment:  En blandning av mineraliska och organisk-kemiska be ­
ståndsdelar. De senare består av föreningar med hög kol- och kvä ­
vehalt samt hög molekylvikt. Sediment deponeras genom inverkan 
av naturligt vatten och bildar ett gränssnitt med detta vatten.  
Mineralisering:  Det fullständiga sönderfallet av organiska för ­
eningar till CO  2 och H  2 O under aeroba betingelser, och till CH  4 , 
CO 2 och H  2 O under anaeroba betingelser. Med mineralisering avses 
här ett omfattande sönderfall som sker när en radioaktivt märkt för ­
ening används och en märkt kolatom oxideras eller reduceras kvan ­
titativt under frigörande av motsvarande mängd  14 CO 2 eller  14 CH 4 . 
Halveringstid,  t 0,5 – den tid det tar för ett testämne att omvandlas 
till 50 % när förloppet kan beskrivas med kinetik av första ordning ­
en. Halveringstiden är oberoende av koncentrationen.  
DT 50 (tid för försvinnande 50):  Den tid inom vilken testämnets 
koncentration minskar med 50 %.  
DT 75 (tid för försvinnande 75):  Den tid inom vilken testämnets 
koncentration minskar med 75 %.  
DT 90 (tid för försvinnande 90):  Den tid inom vilken testämnets 
koncentration minskar med 90 %.  
1.3 REFERENSÄMNEN 
Referensämnen bör användas för identifiering och kvantifiering av 
omvandlingsprodukterna genom spektroskopiska och kromatogra ­
fiska metoder.  
1.4 UPPLYSNINGAR OM TESTÄMNET 
Omärkta eller isotopmärkta testämnen kan användas för bestämning av 
omvandlingshastigheten. Helst bör dock märkta ämnen användas. Märkt material behövs för undersökning av omvandlingsmönstret och för bestämning av en massbalans.
 14 C-märkning rekommenderas, 
även om andra isotoper, såsom  13 C, 15 N, 3 H och  32 P kan användas. 
Märkningen bör om möjligt finnas i molekylens mest stabila del(ar) (  1 ). 
Kemikalien eller den radioaktiva kemikalien bör ha en renhetsgrad som är minst 95 %. 
Innan ett test utförs bör följande upplysningar om testämnet finnas 
tillgängliga: 
a) Vattenlöslighet (metod A.6). 
b) Löslighet i organiska lösningsmedel. 
c) Ångtryck (metod A.4) och Henrys lag-koefficient.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1310  
( 1 ) Om testämnet till exempel innehåller en ring måste märkningen finnas på denna ring. 
Om testämnet innehåller två eller flera ringar kan det vara nödvändigt med separata 
försök för utvärdering av vad som händer med de enskilda ringarna och för att få 
lämpliga upplysningar om bildningen av omvandlingsprodukter.
 d) fördelningskoefficient n-oktanol/vatten (metod A.8). 
e) Adsorptionskoefficient (K  d , K f eller K  oc , om lämpligt) (metod C.18). 
f) Hydrolys (metod C.7). 
g) Dissociationskonstant (pK  a (OECD-riktlinje 112) (13). 
h) Testämnets struktur och isotopens (isotopernas) placering, om till ­
lämpligt.  
Anmärkning:  Den temperatur vid vilken mätningarna görs bör rap ­
porteras. 
Övriga användbar information är till exempel upplysningar om tes ­
tämnets toxicitet för mikroorganismer, upplysningar om lätt eller 
inneboende bionedbrytbarhet och upplysningar om aerob och an ­
aerob omvandling i jord. 
Det bör finnas tillgång till analysmetoder (inbegripet extraktions- och 
reningsmetoder) för identifiering och kvantifiering av testämnet och 
dess omvandlingsprodukter i vatten och i sediment (se avsnitt 1.7.2).  
1.5 PRINCIP FÖR TESTMETODEN 
I den testmetod som beskrivs här används ett aerobt och ett anaerobt 
akvatiskt sedimentsystem (se bilaga 1). Det ger möjlighet till följan ­
de: 
i) bestämning av testämnets omvandlingshastighet i ett vatten/sedi ­
ment-system, 
ii) bestämning av testämnets omvandlingshastighet i sedimentet, 
iii) bestämning av testämnets och/eller omvandlingsprodukternas mi ­
neraliseringshastighet (när  14 C-märkta testämnen används), 
iv) identifiering och kvantifiering av omvandlingsprodukterna i vat ­
ten- och sedimentfaserna samt upprättandet av en massbalans (när radiomärkt testämne används), 
v) bestämning av testämnets och omvandlingsprodukternas fördel ­
ning mellan de två faserna under en inkubationsperiod i mörker 
(för att undvika till exempel algblomning) vid konstant tempera ­
tur. Halveringstiderna samt värden på DT50, DT75 och DT90 kan bestämmas i de fall där tillräckliga data erhålls, men bör inte 
extrapoleras till tidpunkter som ligger långt efter försöksperioden 
(se avsnitt 1.2). 
Minst två sedimenttyper och motsvarande vatten behövs för både den 
aeroba och anaeroba undersökningen (7). Det kan dock förekomma fall där fler än två akvatiska sediment bör används, till exempel om 
den kemikalie som testas kan förekomma i sötvattenmiljö och marin 
miljö.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1311
 
1.6 TESTETS T1LLÄMPBARHET 
Metoden kan allmänt tillämpas på alla kemiska ämnen (omärkta eller 
radioaktivt märkta) för vilka det finns tillgång till en analysmetod som är tillräckligt exakt och känslig. Metoden kan tillämpas på för ­
eningar som är i viss mån flyktiga, icke-flyktiga, lösliga i vatten eller 
svårlösliga i vatten. Testet bör inte tillämpas på kemikalier som är mycket flyktiga från vatten (till exempel desinfektionsmedel och organiska lösningsmedel) och som därför inte hålls kvar i vatten 
eller sediment under de försöksbetingelser som gäller för detta test. 
Metoden har hittills använts för att undersöka kemikaliers omvandling i 
sötvatten och sediment, men kan i princip även tillämpas på flodmyn ­
ning/havsystem. Metoden är inte lämplig för simulering av beting ­
elserna i strömmande vatten (till exempel floder) eller i öppet hav.
 
1.7 KVALITETSKRITERIER  
1.7.1  Utbyte  
Extraktion och analys som görs av minst dubbla vatten- och sedi ­
mentprover omedelbart efter tillförsel av testämnet ger en första indikation på analysmetodens repeterbarhet och enhetligheten hos 
det förfarande som använts för tillförsel av testämnet. Utbyten för 
senare stadier av försöken erhålls genom massbalanserna (när märkt material används). Utbytena bör vara 90–110 % för märkta kemika ­
lier (6) och 70–110 % för omärkta kemikalier.
 
1.7.2  Analysmetodens repeterbarhet och känslighet  
Analysmetodens repeterbarhet (med undantag av den initiala extrak ­
tionseffektiviteten) när det gäller att kvantifiera testämnet och om ­
vandlingsprodukterna, kan kontrolleras genom en duplikatanalys av 
samma extrakt ur vatten- eller sedimentprover som har inkuberats 
tillräckligt länge för att omvandlingsprodukter ska ha bildats. 
Analysmetodens detektionsgräns (LOD) för testämnet och för om ­
vandlingsprodukterna bör vara minst 0,01 mg · kg  -1 i vatten eller 
sediment (som testämne) eller 1 % av den dos som ursprungligen tillfördes testsystemet, beroende på vilket värde som är lägre. Likaså bör kvantifieringsgränsen (LOQ) anges.
 
1.7.3  Noggrannheten hos omvandlingsdata  
Genom regressionsanalys av testämnets koncentrationer som en 
funktion av tiden fås ungefärliga upplysningar om omvandlingskur ­
vans exakthet och en möjlighet att beräkna halveringstidernas kon ­
fidensgränser (när kinetik av pseudo-första ordningen tillämpas) eller 
DT 50 -värden och, om tillämpligt, DT  75 - och DT  90 -värden.  
1.8 BESKRIVNING AV METODEN  
1.8.1  Testsystem och utrustning  
Försöken bör utföras i glaskärl (till exempel flaskor eller centrifug ­
rör), utom om förhandsupplysningarna (såsom fördelningskoefficient n-oktanol-vatten eller sorptionsdata) indikerar att testämnet kan bin ­
das till glas, i vilket fall ett alternativt material (till exempel teflon) 
bör övervägas. Om det är känt att testämnet binds till glas kan 
problemet eventuellt lindras med en eller flera av följande metoder:
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1312
 
— bestämning av den massa testämne och omvandlingsprodukter 
som binds till glas, 
— säkerställande av att alla glaskärl tvättas med lösningsmedel i 
slutet av testet, 
— användning av formulerade produkter (se även avsnitt 1.9.2), 
— användning av en större mängd hjälplösningsmedel för tillförsel 
av testämnet till systemet – hjälplösningsmedlet får dock inte 
leda till så kallad solvolys av testämnet. 
Exempel på typisk testutrustning, till exempel genomflödessystem 
och system av biometertyp, visas i bilagorna 2 och 3 respektive (14). 
I hänvisning 15 beskrivs andra lämpliga inkubationssystem. Försöks ­
utrustningen bör vara utformad på sådant sätt att luft- eller kväve ­
växling kan ske och flyktiga produkter kan uppfångas. Utrustningen 
bör ha sådana mått att testvillkoren uppfylls (se avsnitt 1.9.1). Ven ­
tilation kan ordnas genom försiktig bubbling eller genom att låta luft eller kväve passera över vattenytan. I det senare fallet kan det vara rekommendabelt med en försiktig omblandning av vattnet för bättre 
fördelning av syre eller kväve i vattnet. CO
 2 -fri luft bör inte använ ­
das eftersom detta kan leda till att vattnets pH-värde stiger. Det är under alla omständigheter önskvärt att om möjligt undvika störningar av sedimentet. Kemikalier som är i viss mån flyktiga bör testas i ett 
system av biometertyp med försiktig omblandning av vattenytan. 
Man kan även använda stängda kärl där utrymmet ovanför vätskey ­
tan innehåller atmosfärsluft eller kväve och interna kärl för uppfång ­
ning av flyktiga produkter (16). Vid aeroba test behövs regelbunden 
växling av gasen i utrymmet ovanför vätskeytan för att kompensera 
för biomassans syreförbrukning. 
Lämpliga uppfångare för flyktiga omvandlingsprodukter är till ex ­
empel kalium- eller natriumhydroxidlösning (1 M) för koldioxid (
 1 ), 
och etylenglykol, etanolamin eller tvåprocentig paraffin i xylen för organiska föreningar. Flyktiga ämnen som bildas under anaeroba betingelser, såsom metan, kan uppfångas till exempel med molekyl ­
siktar. Sådana flyktiga ämnen kan förbrännas exempelvis till CO
 2 
genom att leda gasen genom ett kvartsrör fyllt med CuO vid 
900  o C och fånga upp den bildade CO  2 -gasen i en absorberare 
med alkali (17). 
Det behövs också laboratorieinstrument för kemisk analys av tes ­
tämnet och dess omvandlingsprodukter (till exempel gas-vätskekro ­
matografi (GLC), högtrycksvätskekromatografi (HPLC), tunnskikts ­
kromatografi (TLC), masspektrometri (MS), gaskromatografi-mas ­
spektrometri (GC-MS), vätskekromatografi-masspektrometri (LC- MS), kärnmagnetisk resonans (NMR)), inbegripet detektionssystem för radioaktivt märkta eller omärkta kemikalier enligt behov. När 
radioaktivt märkt material används krävs också en vätskeskintill ­
lationsräknare och ett oxidationsmedel (för förbränning av sediment ­
prover före analys med avseende på radioaktivitet). 
Likaså behövs övrig normal laboratorieutrustning för fysikalisk-ke ­
miska och biologiska bestämningar (se tabell 1, avsnitt 1.8.2.2), gla ­
svaror, kemikalier och reagenser, efter behov.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1313  
( 1 ) Eftersom dessa alkaliska absorptionslösningar även absorberar ventilationsluftens kol ­
dioxid och den koldioxid som bildas genom respiration vid aeroba försök, måste lös ­
ningarna regelbundet bytas ut för att de inte ska mättas och förlora sin absorptions ­
kapacitet.
 1.8.2  Valet av akvatiska sediment, antal sediment  
Provtagningsplatserna bör alltid väljas i enlighet med testets ända ­
mål. Vid valet av provtagningsplats måste hänsyn tas till eventuella utsläpp från jordbruk, industri eller hushåll till tillrinningsområden 
och till vatten som ligger uppströms. Sediment som inom de senaste 
fyra åren har förorenats med testämnet eller strukturellt analoga för ­
eningar får inte användas.
 
1.8.2.1  Valet av sediment  
För de aeroba försöken används i regel två sedimenttyper (7). De två 
sedimenttyper som väljs ut bör ha olika egenskaper med avseende på halten organiskt kol och textur. Ett av sedimenten bör ha en hög halt organiskt kol (2,5–7,5 %) och en fin textur, medan det andra sedi ­
mentet bör ha en låg halt organiskt kol (0,5–2,5 %) och en grov 
textur. Skillnaden mellan halterna organiskt kol bör i regel vara minst 2 %. Ett sediment har en fin textur när halten clay + silt (
 1 ) 
överstiger 50 % och en grov textur när halten clay + silt understiger 
50 %. Skillnaden mellan de två sedimenttyperna med avseende på 
halterna clay + silt bör i regel vara minst 20 %. I fall där en kemikalie också kan nå havsvatten måste minst det ena vatten/sedi ­
ment-systemet vara av marint ursprung. 
För strikt anaeroba försök bör två sedimenttyper (med motsvarande 
vatten) tas från de anaeroba zonerna i ytvattenförekomster (7). Både 
sediment- och vattenfaserna bör hanteras och transporteras varsamt i 
syrefria betingelser. 
Det kan även finnas andra parametrar som är viktiga vid valet av 
sediment, och dessa bör beaktas från fall till fall. Exempelvis sedi ­
mentens pH-område är en viktig faktor vid testning av kemikalier vars omvandling eller sorption kan vara pH-beroende. Ett sådant beroende kan framgå av testämnets pK
 a -värde.  
1.8.2.2  Karakterisering av vatten/sediment-prover  
I tabellen som följer finns en översikt av de nyckelparametrar som 
måste bestämmas och rapporteras (med angivelse av den metod som använts) för både vatten och sediment. Likaså anges i vilket skede av 
testet dessa parametrar bör bestämmas. Metoder för bestämning av 
dessa parametrar beskrivs i hänvisningarna (18), (19), (20), (21). 
Därutöver kan det, beroende på fall, vara nödvändigt att bestämma 
och rapportera andra parametrar (till exempel för sötvatten: partiklar, alkalinitet, hårdhet, konduktivitet, NO
 3 /PO  4 (förhållande och indi ­
viduella värden), för sediment: katjonbyteskapacitet, vattenkapacitet, 
karbonat, totalkväve och totalfosfor samt för marina system: salini ­
tet). Sediment och vatten behöver kanske också analyseras med av ­
seende på nitrat, sulfat, biotillgängligt järn och eventuellt andra elek ­
tronmottagare, i syfte att bedöma redoxbetingelserna, särskilt med 
tanke på den anaeroba omvandlingen.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1314  
( 1 ) Clay + silt är den mineralfraktion vars partikelstorlek är mindre än 50 μm.
 Bestämning av parametrar för karakterisering av vatten/sediment-prover (7), (22), (23)  
Parameter Skede av testförfarandet 
Fältprovtag ­
ning Efter-be­
handl. Start av ac ­
klimatis. Start av test Under test Slut av test  
Vatten  
Ursprung/källa X Temperatur X pH X X X X X 
TOC X X X 
Syrehalt
 2 X X X X X 
Redoxpntential* X X X X  
Sediment  
Ursprung/källa X Skiktets djup X pH X X X X X Partikelstorleksfördelning X TOC X X X X Mikrobiell biomassa (*) X X X Redoxpotential (**) Observa ­
tioner 
(färg/ 
lukt) X X X X
 
(*) Färska forskningsresultat tyder på att bestämningar av vattnets syrehalt och redoxpotential inte har något mekanistiskt 
eller prognostiskt värde när det gäller tillväxt och utveckling hos de mikrobiella populationerna i ytvatten (24), (25). 
Bestämning av den biokemiska syreförbrukningen (BOD, vid provtagning, start och slut av testet) och koncent ­
rationerna för mikro- och makronäringsämnena Ca, Mg och Mn (vid start och slut av testet) i vatten, och bestämning 
av totalt N och totalt P i sediment (vid provtagning och vid slut av testet) kan vara bättre metoder när det gäller att 
tolka och utvärdera hastigheter och rutter för den aeroba bioomvandlingen. 
(**) Metod för mikrobiell respiration (26), desinfektionsmetod (27) eller plate count-mätning (till exempel bakterier, 
aktinomyceter, svamp och kolonier totalt) för aeroba försök; metanogenes för anaeroba försök.  
1.8.3  Insamling, hantering och lagring  
1.8.3.1  Insamling  
Anvisningarna i utkastet till ISO-riktlinjer om provtagning av bot ­
tensediment (8) bör följas vid provtagning av sediment. Sediment ­
proverna bör tas från sedimentets hela övre skikt (5–10 cm). Till ­
hörande vatten bör tas från samma plats och vid samma tidpunkt 
som sedimentprovet tas. För det anaeroba försöket bör sediment- och 
tillhörande vattenprov tas och transporteras under syrefria betingelser (28) (se avsnitt 1.8.2.1). I litteraturen finns beskrivningar av ett antal olika provtagningsutrustningar (8), (23).
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1315
 
1.8.3.2  Hantering  
Sedimentet avskiljs från vatten genom filtrering och våtsiktas (2 mm) 
med användning av vattenöverskott (vatten från provtagningsplat ­
sen). Detta vatten slängs efter siktningen. Därefter blandas kända 
mängder sediment och vatten i önskat förhållande (se avsnitt 1.9.1) 
i inkubationsflaskor och bereds för acklimatiseringsperioden (se avsnitt 1.8.4). Alla hanteringssteg som hör till det anaeroba försöket bör göras under syrefria betingelser (29), (30), (31), (32), (33).
 
1.8.3.3  Lagring  
De sediment- och vattenprover som används ska allra helst vara 
nytagna. Om proverna ändå måste lagras bör sediment och vatten 
siktas enligt beskrivningen ovan och lagras tillsammans, med vatten ­
mättnad (6–10 cm vattenskikt) i mörker och vid 4 ± 2  o C 4 under 
högst fyra veckor (7), (8), (23). Proverna för aeroba försök bör lagras 
med fri tillgång till luft (till exempel i en öppen behållare), medan 
proverna för anaeroba försök bör lagras i syrefria betingelser. Under transport och lagring får sediment eller vatten inte frysa, och sedi ­
mentet får inte torka ut.
 
1.8.4  Beredning av sediment/vattenproverna för testet  
Innan testämnet tillförs bör proverna genomgå en acklimatiserings ­
period. För detta placeras varje sediment/vatten-prov i det inkuba ­
tionskärl som kommer att användas under själva testet, och ackli ­
matiseringen genomförs under exakt samma betingelser som gäller vid inkubationen under testet (se avsnitt 1.9.1). Acklimatiserings ­
perioden behövs för att systemet ska nå en tillräcklig stabilitet vad 
gäller pH, syrehalt i vatten, redoxpotential hos sediment och vatten 
samt makroskopisk separation av faserna. Acklimatiseringsperioden bör i regel omfatta en till två veckor, och bör inte överskrida fyra veckor. Resultaten från de bestämningar som görs under denna pe ­
riod bör rapporteras.
 
1.9 TESTETS UTFÖRANDE  
1.9.1  Testbetingelser  
Testet bör utföras i inkubationsutrustning (se avsnitt 1.8.1) med ett 
volymförhållande vatten/sediment mellan 3:1 och 4:1, och ett sedi ­
mentskikt med en tjocklek av 2,5 cm (± 0,5 cm) (  1 ). En minimi ­
mängd av 50 g sediment (baserat på torrvikt) per inkubationskärl är 
rekommenderad. 
Testet bör genomföras i mörker vid en konstant temperatur inom 
intervallet 10–30  o C. Lämplig temperatur är (20 ± 2)  o C. Vid behov 
kan ytterligare en lägre temperatur (till exempel 10  o C) övervägas 
från fall till fall, beroende på vilka upplysningar man vill få genom 
testet. Inkubationstemperaturen bör övervakas och rapporteras.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1316  
( 1 ) Färska undersökningar tyder på att lagring vid 4  o C kan leda till en minskning av 
sedimentets halt av organiskt kol, vilket eventuellt kan leda till en minskning av den 
mikrobiella aktiviteten (34).
 1.9.2  Behandling och tillförsel av testämnet  
En enda testkoncentration av kemikalien används (  1 ). För växt ­
skyddskemikalier som appliceras direkt i vattendrag används den maximidos som anges på etiketten, beräknad på grundval av vatte ­
nytan i testkärlet. I alla andra fall måste den koncentration som 
används basera sig på prognoser från utsläpp i miljön. Det är viktigt att säkerställa att den koncentration av testämnet som används är lämplig med tanke på karakterisering av omvandlingvägarna samt 
bildning och minskning av omvandlingsprodukter. Det kan vara nöd ­
vändigt att använda högre doser (till exempel 10-faldiga) i situationer där koncentrationerna av testämnet i början av försöket ligger nära 
detektionsgränserna, eller om viktiga omvandlingsprodukter inte utan 
svårighet kan detekteras när halterna är 10 % av testämnesdosen. Om högre testkoncentrationer används får de dock inte ha betydande negativa effekter på den mikrobiella aktiviteten i vatten/sediment- 
systemet. För att få en konstant koncentration av testämnet i kärl 
av varierande storlek kan det vara lämpligt med en justering enligt den mängd material som har tillförts. Justeringen görs på grundval av vattenpelarens djup i kärlet i förhållande till vattendjupet på prov ­
tagningsplatsen (vilket antas vara 100 cm, även om andra djup kan 
användas). I bilaga 4 finns ett exempel på en beräkning. 
Testämnet ska helst tillföras i form av vattenlösning i testsystemets 
vattenfas. 1 tvingande fall kan användningen av små mängder vat ­
tenlösliga lösningsmedel (såsom aceton eller etanol) tillåtas för till ­
försel och fördelning av testämnet. Lösningsmedlets halt får dock inte överskrida 1 % (v/v) och det får inte ha negativa verkningar 
på den mikrobiella aktiviteten i testsystemet. Vattenlösningen av tes ­
tämnet bör beredas med omsorg – det kan behövas genererings ­
kolumner och förblandare för att säkerställa fullständig homogenitet. Efter tillsats av vattenlösningen till testsystemet rekommenderas var ­
sam omblandning av vattenfasen, med så liten störning av sedimentet 
som möjligt. 
Användningen av formulerade produkter rekommenderas i regel inte, 
eftersom de ingående beståndsdelarna kan påverka fördelningen av testämnet eller omvandlingsprodukter mellan vatten- och sediment ­
faserna. För testämnen som är svårlösliga i vatten kan dock använd ­
ningen av formulerat material vara ett lämpligt alternativ. 
Antalet inkubationskärl beror på antalet provtagningstillfällen (se 
avsnitt 1.9.3). Testet bör omfatta tillräckligt många system så att 
två system kan tas ut vid varje provtagningstillfälle. Om testet om ­
fattar kontrollenheter för varje akvatiskt sedimentsystem bör dessa enheter inte behandlas med testämnet. Kontrollenheterna kan använ ­
das för att bestämma den mikrobiella biomassan i sedimentet och 
totalt organiskt kol i vatten och sediment vid testets försökets slut. Två kontrollenheter (en kontrollenhet för varje akvatiskt sediment) kan användas för att övervaka de behövliga parametrarna i sediment 
och vatten under acklimatiseringsperioden (se tabellen i 
avsnitt 1.8.2.2). Två extra kontrollenheter måste tas in i fall där testämnet tillförs med hjälp av ett lösningsmedel, för bedömning av de negativa verkningarna på den mikrobiella aktiviteten i test ­
systemet.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1317  
( 1 ) Test med en extra koncentration kan vara till nytta i fråga om kemikalier som når 
ytvatten via olika rutter (vilket leder till avsevärt varierande koncentrationer) förutsatt 
att den lägre koncentrationen kan analyseras med tillräcklig exakthet.
 1.9.3  Testets varaktighet, provtagning  
Försöksperioden ska i regel inte sträcka sig över 100 dagar (6), och 
den bör fortsätta tills nedbrytningvägen och fördelningsmönstret för vatten och sediment har fastställts eller när 90 % av testämnet har 
omvandlats eller förflyktigats. Antalet provtagningstillfällen bör vara 
minst sex (inbegripet tidpunkt noll), med en valfri förhandsunder ­
sökning (se avsnitt 1.9.4) som görs i syfte att fastställa ett lämpligt provtagningsschema och testets varaktighet, i fall där det inte finns 
tillgång till tillräckliga data om testämnet från tidigare undersökning ­
ar. För hydrofoba testämnen kan det under försökets inlednings ­
period behövas ytterligare provtagningstillfällen i syfte att bestämma 
hur fördelningen sker mellan vatten- och sedimentfaserna. 
Vid provtagningstidpunkterna avlägsnas inkubationskärlen i sin hel ­
het (med replikat) för analys. Sediment och ovanliggande vatten 
analyseras separat (
 1 ). Ytvattnet bör avlägsnas omsorgsfullt med 
minsta möjliga störning av sedimentet. Extraktionen och karakterise ­
ringen av testämnet och omvandlingsprodukterna bör följa tillbörliga analysförfaranden. Det är viktigt att avlägsna material som kan ha 
adsorberats till inkubationskärlet eller mellanliggande slangar som 
används för att fånga upp flyktiga ämnen.
 
1.9.4  Valfritt förförsök  
Om testets varaktighet och provtagningsschemat inte kan fastställas 
med stöd av andra relevanta undersökningar rörande testämnet kan det vara nödvändigt med ett valfritt förförsök. Detta bör utföras under samma betingelser som gäller för det slutliga försöket. 1 före ­
kommande fall bör testrapporten innehålla en översiktlig redogörelse 
för relevanta försöksbetingelser och resultat från förförsöket.
 
1.9.5  Mätningar och analys  
Vid varje provtagningstillfälle bör testämnets och omvandlingspro ­
dukternas koncentration bestämmas i vatten och sediment, samt rap ­
porteras (som en koncentration och som procentandel av den tillförda koncentrationen). Som allmän regel gäller att identifiering bör göras av alla omvandlingsprodukter som vid något provtagningstillfälle har 
detekterats med en andel som är ≥ 10 % av den radioaktivitet som 
tillförts det totala vatten/sediment-systemet, utom om det finns goda skäl för att låta bli. Likaså bör identifiering av omvandlingsprodukter vars koncentrationer kontinuerligt ökar under försökets gång över ­
vägas (även i fall där dessa koncentrationer inte går över de gränser 
som anges ovan), eftersom ökningen kan tyda på beständighet. Denna fråga bör övervägas från fall till fall, och motiveringarna bör anges i rapporten. 
Resultaten från system för uppfångning av gaser och flyktiga ämnen 
(CO
 2 och övriga, till exempel flyktiga organiska ämnen) bör rap ­
porteras för varje provtagningstillfälle. Mineraliseringshastigheterna 
bör rapporteras. Icke-extraherbara (bundna) rester i sediment bör rapporteras för varje provtagningstillfälle.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1318  
( 1 ) I fall där det förekommer en benägenhet till återoxidation av anaeroba omvandlings ­
produkter bör de anaeroba betingelserna upprätthållas under provtagning och analys.
 2 DATA  
2.1 BEHANDLING AV RESULTATEN 
Den totala massbalansen eller utbytet (se avsnitt 1.7.1) av tillförd 
radioaktivitet bör beräknas för varje provtagningstillfälle. Resultatet 
bör rapporteras som en procentandel av den tillförda radioaktiviteten. 
Fördelningen av radioaktivitet mellan vatten och sediment bör rap ­
porteras som koncentrationer och procentandelar, för varje provtag ­
ningstillfälle. 
Halveringstiden, DT  50 och, om tillämpligt, DT  75 och DT  90 för tes­
tämnet bör beräknas inbegripet konfidensgränser (se avsnitt 1.7.3). Upplysningar om den hastighet med vilken testämnet försvinner i vatten och sediment kan erhållas med hjälp av lämpliga utvärderings ­
metoder. Dessa kan omfatta tillämpning av kinetik av pseudoförsta 
ordningen, empiriska kurvanpassningstekniker där grafiska eller nu ­
meriska lösningar används och mer komplexa bedömningar där till exempel modeller med en eller flera behållare används. Närmare 
upplysningar finns i relevant litteratur (35), (36), (37). 
Alla metoder har sina för- och nackdelar samt stora variationer med 
avseende på komplexitet. Ett antagande om första ordningens kinetik kan innebära en för stark förenkling av nedbrytnings- och fördelnings ­
processerna, men ger – i fall där detta antagande kan tillämpas – en 
term (hastighetskonstanten eller halveringstiden) som är lättbegriplig 
och av värde vid simuleringsmodellering och beräkningar av förvän ­
tade koncentrationer i miljön. Empiriska metoder eller linjära transfor ­
mationer kan ge bättre anpassning av kurvorna till data, och därmed en 
bättre uppskattning av halveringstider, DT
 50 och, om tillämpligt, DT  75 
och DT  90 . Användningen av härledda konstanter är dock begränsad. 
Med modellen med behållare kan man få ett antal användbara kon ­
stanter av värde vid riskbedömning. Dessa beskriver nedbrytningshas ­
tigheten i olika behållare och fördelningen av kemikalien. De bör också 
användas för uppskattning av hastighetskonstanter för bildning och nedbrytning av viktiga omvandlingsprodukter. Under alla omständig ­
heter måste den metod som används motiveras, och anpassningsgraden 
bör demonstreras grafiskt eller statistiskt.
 
3 RAPPORTERING  
3.1 TESTRAPPORT 
Testrapporten ska innehålla nedan angivna uppgifter. 
Testämne: — trivialnamn, kemiskt namn, CAS-nummer, strukturformel (med 
angivelse av märkningsposition(er) om radioaktivt märkt material 
används) och relevanta fysikalisk-kemiska egenskaper, 
— testämnets renhet (orenheter), — strålningskemisk renhet hos märkta kemikalier och molär aktivi ­
tet (vid behov).
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1319
 
Referensämnen: 
— kemiskt namn och struktur för referensämnen som används för 
karakterisering och/eller identifiering av omvandlingsprodukter. 
Testsediment och -vatten: — platsangivelse och beskrivning av provtagningsplats(er) för akva ­
tiska sediment inklusive, om möjligt, föroreningshistoria, 
— alla upplysningar rörande insamling, lagring (i förekommande 
fall) och acklimatisering av vatten/sediment-system, 
— egenskaperna hos vatten/sediment-proverna (se tabellen i 
avsnitt 1.8.2.2). 
Testbetingelser: — testsystem (till exempel genomflöde, biometer, ventilationssätt, 
omblandningsmetod, vattenvolym, sedimentmassa, tjocklek hos 
vatten- respektive sedimentskikt, testkärlens mått) 
— tillförsel av testämnet till testsystemet: testkoncentration, antalet 
replikat och kontrollprover, hur testämnet har tillförts (till ex ­
empel om lösningsmedel har använts), 
— inkubationstemperatur, — provtagningstidpunkter, — exktraktionsmetoder och deras effektivitet samt analysmetoder 
och detektionsgränser, 
— metoder för karakterisering och identifiering av omvandlingspro ­
dukter, 
— avvikelser från testprotokollet eller testbetingelserna under för ­
sökets gång. 
Resultat: — rådata för representativa analyser (alla rådata måste arkiveras 
enligt principerna om god laboratoriesed), 
— analysmetodens repeterbarhet och känslighet, — utbyten (procentvärden för en valid undersökning anges i 
avsnitt 1.7.1), 
— tabeller med resultaten uttryckta som procentandel av den till ­
förda dosen och som mg · kg
 -1 i vatten, sediment och totalsyste ­
met (endast procent) för testämnet och, om tillämpligt, för om ­
vandlingsprodukter och icke-extraherbar radioaktivitet, 
— massbalans under och i slutet av försöken, 
— en grafisk presentation av omvandlingen i vatten, i sediment och 
i totalsystemet (inbegripet mineralisering), 
— mineraliseringshastigheter,  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1320
 
— halveringstid, DT  50 och, om tillämpligt, DT  75 och DT  90 för tes­
tämnet och, om tillämpligt, för viktiga omvandlingsprodukter, 
inbegripet konfidensgränser i vatten, sediment och totalsystemet, 
— en bedömning av omvandlingskinetiken för testämnet och, om 
tillämpligt, för viktiga omvandlingsprodukter, 
— förslag till omvandlingsmönster, om tillämpligt, 
— diskussion av resultaten.  
4. HÄNVISNINGAR  
1. BBA-Guidelines for the examination of plant protectors in the 
registration process. (1990), Part IV, Section 5-1: Degradability and fate of plant protectors in the water/sediment system, Germany. 
2. Commission for registration of pesticides: Application for regi ­
stration of a pesticide. (1991), Part G. Behaviour of the product and its metabolites in soil, water and air, Section G.2.1 (a), The 
Netherlands. 
3. MAFF Pesticides Safety Directorate. (1992), Preliminary guide ­
line for the conduct of biodegradability tests on pesticides in 
natural sediment/water systems. Ref No SC 9046, United-King ­
dom. 
4. Agriculture Canada: Environmental Chemistry and fate (1987), 
Guidelines for registration of pesticides in Canada. Aquatic (Laboratory) – Anaerobic and aerobic, Canada, s. 35–37. 
5. US-EPA: Pesticide assessment guidelines, Subdivision N. 
Chemistry: Environmental fate (1982), Section 162-3, Anaero ­
bic aquatic metabolism. 
6. SETAC-Europe publication. (1995), Procedures for assessing 
the environmental fate and ecotoxicity of pesticides. Ed. Dr 
Mark R. Lynch. SETAC-Europe, Bryssel. 
7. OECD Test Guidelines Programme. (1995), Final Report of the 
OECD Workshop on Selection of Soils/sediments, Belgirate, 
Italy, 18–20 januari 1995. 
8. ISO/DIS 5667-12 (1994), Water quality – Sampling – Part 12: 
Guidance on sampling of bottom sediments. 
9. US-EPA (1998a), Sediment/water microcosm biodegradation 
test. Harmonised Test Guidelines (OPPTS 835.3180), EPA 712-C-98-080. 
10. DFG: Pesticide Bound Residues in Soil. Wiley-VCH (1998). 
11. T.R. Roberts: Non-extractable pesticide residues in soils and 
plants. Pure Appl. Chem. 56, s. 945–956 (IUPAC 1984). 
12. OECD Test Guideline 304A: Inherent Biodegradability in Soil 
(adopted 12 May 1981). 
13. OECD (1993), Guidelines for Testing of Chemicals, Paris, 
OECD (1994–2000): Addenda 6-11 to Guidelines for the Tes ­
ting of Chemicals. 
14. Scholz, K., Fritz R., Anderson C. and Spiteller M. (1988), 
Degradation of pesticides in an aquatic model ecosystem. 
BCPC – Pests and Diseases, 3B-4, 149–158.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1321
 
15. Guth, J.A. (1981), Experimental approaches to studying the fate 
of pesticides in soil. In Progress in Pesticide Biochemistry (D.H. 
Hutson, T.R. Roberts, Eds.), Vol. 1, s. 85–114. J. Wiley & Sons. 
16. Madsen, T., Kristensen, P. (1997), Effects of bacterial inocula ­
tion and non-ionic surfactants on degradation of polycyclic aro ­
matic hydrocarbons in soil. Environ. Toxicol. Chem. 16, 
s. 631–637. 
17. Steber, J., Wierich, P. (1987), The anaerobic degradation of 
detergent range fatty alcohol ethoxylates. Studies with  14 C-la­
belled model surfactants. Water Research 21, s. 661–667. 
18. Black, CA. (1965), Methods of Soil Analysis. Agronomy Mo ­
nograph No. 9. American Society of Agronomy, Madison. 
19. APHA (1989), Standard Methods for Examination of Water and 
Wastewater (17  th edition). American Public Health Association, 
American Water Works Association and Water Pollution Con ­
trol Federation, Washington D.C. 
20. Rowell, D.L. (1994), Soil Science Methods and Applications. 
Longman. 
21. Light, T.S. (1972), Standard solution for redox potential meas ­
urements. Anal. Chemistry 44, s. 1038–1039. 
22. SETAC-Europe publication (1991), Guidance document on tes ­
ting Procedures for pesticides in freshwater mesocosms. From the Workshop ”A Meeting of Experts on Guidelines for Static Field Mesocosms Tests”, den 3–4 juli 1991. 
23. SETAC-Europe publication. (1993), Guidance document on se ­
diment toxicity tests and bioassays for freshwater and marine environments. From the Workshop On Sediment Toxicity As ­
sessment (WOSTA), 8–10 november 1993. Eds.: I.R. Hill, P. 
Matthiessen and F. Heimbach. 
24. Vink, J.P.M., van der Zee, S.E.A.T.M. (1997), Pesticide biotrans ­
formation in surface waters: multivariate analyses of environmen ­
tal factors at field sites. Water Research 31, s. 2858–2868. 
25. Vink, J.P.M., Schraa, G., van der Zee, S.E.A.T.M. (1999), 
Nutrient effects on microbial transformation of pesticides in 
nitrifying waters. Environ. Toxicol, s. 329–338. 
26. Anderson, T.H., Domsch, K.H. (1985), Maintenance carbon 
requirements of actively-metabolising microbial populations un ­
der in-situ  conditions. Soil Biol. Biochem. 17, s. 197–203. 
27. ISO-14240-2. (1997), Soil quality – Determination of soil mic ­
robial biomass – Part 2: Fumigation- extraction method. 
28. Beelen, P. Van and F. Van Keulen. (1990), The Kinetics of the 
Degradation of Chloroform and Benzene in Anaerobic Sediment from the River Rhine. Hydrobiol, Bull. 24 (1), s. 13–21. 
29. Shelton, D.R. and Tiedje, J.M. (1984), General method for 
determining anaerobic biodegradation potential. App. Environ. Microbiol. 47, s. 850–857. 
30. Birch, R.R., Biver, C, Campagna, R., Gledhill, W.E., Pagga, U., 
Steber, J., Reust, H. and Bontinck, W.J. (1989), Screening of Chemicals for anaerobic biodegradation. Chemosphere 19, s. 1527–1550. 
31. Pagga, U. and Beimborn, D.B. (1993), Anaerobic biodegradation 
tests for organic compounds. Chemoshpere 27, s. 1499–1509.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1322
 
32. Nuck, B.A. and Federle, T.W. (1986), A batch test for assessing 
the mineralisation of  14 C-radiolabelled compounds under realis ­
tic anaerobic conditions. Environ. Sci. Technol. 30, s. 3597–3603. 
33. US-EPA (1998b), Anaerobic biodegradability of organic Chem ­
icals. Harmonised Test Guidelines (OPPTS 835.3400). EPA 
712-C-98-090. 
34. Sijm, Haller and Schrap (1997), Influence of storage on sedi ­
ment characteristics and drying sediment on sorption coeffici ­
ents of organic contaminants. Bulletin Environ. Contam. Tox ­
icol. 58, s. 961–968. 
35. Timme, G., Frehse H. and Laska V. (1986), Statistical inter ­
pretation and graphic representation of the degradational beha ­
viour of pesticide residues 11. Pflanzenschutz – Nachrichten Bayer, 39, s. 187–203. 
36. Timme, G., Frehse, H. (1980), Statistical interpretation 
and graphic representation of the degradational behaviour of 
pesticide residues I. Pflanzenschutz – Nachrichten Bayer, 33, s. 47–60. 
37. Carlton, R.R. and Allen, R. (1994), The use of a compartment 
model for evaluating the fate of pesticides in sediment/water 
systems. Brighton Crop Protection Conference – Pest and Dis ­
eases, s. 1349–1354.
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1323
 
Bilaga 1  
VÄGLEDNING RÖRANDE AEROBA OCH ANAEROBA TESTSYSTEM  
Aerobt testsystem  
Det aeroba testsystem som beskrivs i denna testmetod består av ett aerobt vatten ­
skikt (typisk syrehalt är 7 – 10 mg · l -1 ) och ett sedimentskikt som är aerobt vid 
ytan och anaerobt under ytan (den typiska genomsnittliga redoxpotentialen (E  h ) i 
sedimentets anaeroba zon ligger mellan – 80 och – 190 mV). Fuktad luft leds över vattenytan i varje inkubationsenhet för att upprätthålla tillräcklig syrehalt i utrymmet ovanför vätskeytan.
 
Anaerobt testsystem  
Testförfarandet är till väsentliga delar samma i ett aerobt som i ett anaerobt 
testsystem, med undantag av att fuktad kvävgas leds över vattenytan i varje inkubationsenhet för att upprätthålla en kvävgasatmosfär. Sediment och vatten 
anses vara anaeroba när redoxpotentialen (E
 h ) är lägre än – 100 mV. 
I anaeroba test inbegriper bedömningen av mineraliseringen även bedömning av 
frigjord koldioxid och metan.  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1324
 
Bilaga 2  
EXEMPEL PÅ EN GENOMFLÖDESUTRUSTNING
  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1325
 
Bilaga 3  
EXEMPEL PÅ EN HIOMETERUTRUSTNING
  ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1326
 
Bilaga 4  
EXAMPELBERÄKNINGAR FÖR DEN DOS SOM TILLFÖRS 
TESTKÄRLEN  
Cylinderns innerdiameter: = 8 cm 
Vattenpelarens djup exklusive sediment: = 12 cm Yta: 3,142 × 4
 2 = 50,3 cm  2 
Dosering: 500 g testämne/ha motsvarar 5 μg/ 
cm 2 
Totalt i μg: 5 × 50,3 = 251,5 μg 
Justering av mängden till att motsvara djupet 
100 cm: 
12 × 251,5 ÷ 100 = 30,18 μg 
Vattenpelarens volym: 50,3 × 12 = 603 ml Koncentration i vatten: 30,18 ÷ 603 = 0,050 μg/ml eller 50 μg/l
 ▼B 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1327
 
C.25.  AEROB MINERALISERING I YTVATTEN – SIMULERINGS ­
TEST AV BIOLOGISK NEDBRYTNING  
1. METOD  
Denna metod motsvarar OECD TG 309 (2004) (1).  
1.1 INLEDNING 
Syftet med detta test är att mäta tiden för biologisk nedbrytning av 
en testsubstans vid låg koncentration i aerobt naturligt vatten, samt 
att kvantifiera observationerna i form av kinetiska hastighetsuttryck. Detta simuleringstest är ett batchvis skakflasktest för bestämning av hastigheten för aerob nedbrytning av organiska ämnen i prover av 
naturligt ytvatten (sött, bräckt eller salt). Det är grundat på ISO/DIS 
14592–1 (2) och innehåller också delar av testmetoderna C.23 och C.24 (3) (4). För att undvika att mikromiljön i testet försämras vid långa testperioder kan ett semikontinuerligt testförfarande använ ­
das i stället för batchtest. Simuleringstestet syftar i första hand till att 
fastställa testsubstansens mineralisering i ytvatten, och mineralisering utgör grunden för att kunna formulera nedbrytningskinetiken. I andra hand syftar testet emellertid också till att få fram uppgifter om primär 
nedbrytning och bildandet av viktiga nedbrytningsprodukter. Identi ­
fiering av nedbrytningsprodukter, och om möjligt kvantifiering av deras koncentration, är särskilt viktigt för ämnen som mineraliseras mycket långsamt (t.ex. sådana med en halveringstid för den totala 
mängden kvarvarande
 14 C på över 60 dygn). Högre koncentrationer 
av testsubstansen (t.ex. > 100 μg/l) bör med tanke på analytiska 
begränsningar normalt sett användas för identifiering och kvantifie ­
ring av viktiga nedbrytningsprodukter. 
I detta test innebär en låg koncentration (t.ex. mindre än 1 μg/l upp 
till 100 μg/l) att den är tillräckligt låg för att den biologiska nedbryt ­
ningskinetiken i testet ska spegla vad som kan förväntas i miljön. Jämfört med den sammanlagda massan av biologiskt nedbrytbara 
kolsubstrat i det naturliga vatten som används i testet ska den test ­
substans som förekommer i låg koncentration fungera som sekundärt substrat. Det innebär att den förväntade biologiska nedbrytningskine ­
tiken är av första ordningen (icke-tillväxt-kinetik) och att testsubstan ­
sen kan brytas ned genom s.k. co-metabolism. Första ordningens 
kinetik innebär att nedbrytningshastigheten (mg/l/dygn) är proportio ­
nell till substratkoncentrationen, som minskar med tiden. Vid verklig första ordningens kinetik är den specifika hastighetskonstanten (k) 
för nedbrytningen oberoende av tid och koncentration. Konstanten k 
varierar alltså inte märkbart under ett experiments gång, och ändras inte till följd av ökad koncentration mellan experimenten. Enligt definition är den specifika hastighetskonstanten för nedbrytningen 
lika med den relativa koncentrationsförändringen per tidsenhet: 
k = (1/C) · (dC/dt). Normalt sett förväntas första ordningens kinetik under de angivna villkoren, men det kan förekomma särskilda för ­
hållanden där annan kinetik är mer passande. Exempelvis kan avvi ­
kelser från första ordningens kinetik iakttas om den biologiska om ­
vandlingens hastighet begränsas av massöverföringsfenomen som diffusionshastighet, snarare än av den biologiska reaktionshastighe ­
ten. Data kan emellertid nästan alltid beskrivas med hjälp av pseudo- 
första ordningens kinetik där man accepterar en hastighetskonstant 
som är beroende av koncentrationen.
 ▼M1 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1328
 
Uppgifter om testsubstansens biologiska nedbrytbarhet vid högre 
koncentrationer (t.ex. från standard-screeningtest) och om abiotisk 
nedbrytbarhet, nedbrytningsprodukter och relevanta fysikalisk-ke ­
miska egenskaper bör finnas tillgängliga före testets genomförande för att underlätta planeringen av experimentet och tolkningen av 
resultaten. Genom att använda
 14 C-märkta testsubstanser och fast ­
ställa fasfördelningen av  14 C i slutet av testet blir det möjligt att 
bestämma fullständig biologisk nedbrytbarhet. Om omärkta testsub ­
stanser används kan fullständig biologisk nedbrytbarhet uppskattas 
endast om en högre koncentration testas och alla viktiga nedbryt ­
ningsprodukter är kända.  
1.2 DEFINITIONER  
Primär biologisk nedbrytning : Ett kemiskt ämnes strukturella för ­
ändring (omvandling) genom mikroorganismer, som leder till att den kemiska identiteten förloras.  
Funktionell biologisk nedbrytning : Ett kemiskt ämnes strukturella 
förändring (omvandling) genom mikroorganismer, som leder till att en viss egenskap förloras.  
Fullständig aerob biologisk nedbrytning : Ett kemiskt ämnes ned ­
brytning genom mikroorganismer i närvaro av syre till koldioxid, vatten och mineralsalter av förekommande grundämnen (mineralise ­
ring), och produktion av ny biomassa och organiska mikrobiella 
biosyntetiska produkter.  
Mineralisering : Ett kemiskt ämnes eller organisk materias nedbryt ­
ning genom mikroorganismer i närvaro av syre till koldioxid, vatten och mineralsalter av förekommande grundämnen.  
Lagfas : Tiden mellan ett tests början och den tidpunkt då de ned ­
brytande mikroorganismerna har adapterats och graden av biologisk nedbrytning för ett kemiskt ämne eller en organisk materia har nått mätbara nivåer (t.ex. 10 % av den maximala teoretiska biologiska 
nedbrytningen eller lägre, beroende på mätteknikens noggrannhet).  
Maximal biologisk nedbrytningsgrad : Ett kemiskt ämnes eller en 
organisk materias nedbrytningsgrad i ett test, uttryckt i procent, över 
vilken ingen ytterligare biologisk nedbrytning sker under testets 
gång.  
Primärt substrat : En samling av naturliga kol- och energikällor som 
gör att den mikrobiella biomassan kan upprätthållas och tillväxa.  
Sekundärt substrat : En substratkomponent som förekommer i så 
låg koncentration att dess nedbrytning endast förser de berörda mik ­
roorganismerna med obetydliga kol- och energimängder, till skillnad mot det kol och den energi som tillhandahålls vid nedbrytningen av 
de huvudsakliga substratkomponenterna (primärt substrat).  
Hastighetskonstant för nedbrytning : En konstant i första ordning ­
ens eller pseudo-första ordningens kinetik, k (d
 –1 ), som anger ned ­
brytningsprocessernas hastighet. För ett batchexperiment uppskattas 
k från den första delen av den nedbrytningskurva som erhålls efter 
lagfasens slut.  ▼M1 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1329
 
Halveringstid, t  1/2 (d): Term som används för att beskriva hastig ­
heten för en första ordningens reaktion. Den motsvarar den tid som 
krävs för en koncentrationsminskning med faktor 2. Förhållandet mellan halveringstiden och hastighetskonstanten för nedbrytningen kan uttryckas med ekvationen t
 1/2 = ln2/k.  
Halveringstid för nedbrytning, DT  50 (d): Term som används för att 
kvantifiera resultaten av test av biologisk nedbrytning. Den motsva ­
rar den tid, inbegripet lagfasen, som krävs för att uppnå en biologisk nedbrytning på 50 %.  
Detektionsgräns (LOD)och kvantifieringsgräns (LOQ)  : Detek ­
tionsgränsen (LOD) är den koncentration av ett ämne under vilken ämnet inte kan särskiljas från analytiska artefakter. Kvantifierings ­
gränsen (LOQ) är den koncentration av ett ämne under vilken kon ­
centrationen inte kan bestämmas med tillräcklig noggrannhet.  
Löst organiskt kol (DOC) : Den del av det organiska kolet i ett 
vattenprov som inte kan avlägsnas genom specificerad fasseparation, exempelvis genom centrifugering med 40 000 ms
 –2 i 15 minuter eller 
filtrering genom membran med en porstorlek på 0,2–0,45 μm. 
Total  14 C-aktivitet i organiskt kol (TOA) : Den totala  14 C-aktivitet 
som är kopplad till organiskt kol.  
14 C-aktivitet i löst organiskt kol (DOA) : Den totala  14 C-aktivitet 
som är kopplad till löst organiskt kol.  
14 C-aktivitet i partikulärt organiskt kol (POA) : Den totala  14 C- 
aktivitet som är kopplad till partikulärt organiskt kol.  
1.3 TESTMETODENS TILLÄMPLIGHET 
Simuleringstestet kan användas för icke-flyktiga eller halvflyktiga 
organiska ämnen som testas vid låga koncentrationer. Vid använd ­
ning av öppna flaskor (t.ex. med en propp av bomull) kan ämnen med Henrys konstant under ca 1 Pa·m
 3 /mol (ung. 10  –5 atm·m  3 /mol) i 
praktiken anses vara icke-flyktiga. Vid användning av förslutna flas ­
kor med en innesluten luftvolym kan halvflyktiga ämnen (med Hen ­
rys konstant < 100 Pa·m  3 /mol eller < 10  –3 atm·m  3 /mol) testas utan 
förluster från testsystemet. Förlust av  14 C-märkta ämnen kan ske när 
koldioxiden strippas av, om nödvändiga försiktighetsåtgärder inte 
vidtas. I sådana fall kan det vara nödvändigt att fånga upp koldiox ­
iden i ett internt absorptionsmedel med alkali eller att använda ett externt system för absorption av koldioxid (direkt
 14 CO 2 -bestämning, 
se tillägg 3). Om man vill bestämma den biologiska nedbrytnings ­
kinetiken måste testsubstansens koncentration vara lägre än dess 
vattenlöslighet. Det bör emellertid noteras att de värden som anges för vattenlöslighet i litteraturen kan vara avsevärt högre än testsub ­
stansens löslighet i naturliga vatten. Eventuellt kan lösligheten för 
testsubstanser med särskilt dålig vattenlöslighet fastställas genom 
användning av de naturliga vatten som ska testas. 
Denna metod kan användas för att simulera biologisk nedbrytning i 
ytvatten utan grova partiklar (pelagiskt test) eller i grumligt ytvatten 
som exempelvis kan förekomma i gränsskiktet mellan vatten och 
sediment (suspenderat sediment-test).
 ▼M1 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1330
 
1.4 TESTPRINCIP 
Testet genomförs i batch genom att testsubstansen inkuberas an ­
tingen endast med ytvatten (pelagiskt test) eller med vatten med tillsats av suspenderade fasta ämnen/sediment med en torrvikt på 
0,01–1 g/l (suspenderat sediment-test) för att simulera ett vattendrag 
med suspenderade fasta ämnen eller resuspenderat sediment. Kon ­
centrationer av suspenderade fasta ämnen/sediment i den lägre delen av detta intervall är utmärkande för de flesta ytvatten. Testflaskorna 
inkuberas i mörker vid omgivande temperatur under aeroba förhål ­
landen och omblandning. Minst två olika koncentrationer av testsub ­
stansen bör användas för bestämning av nedbrytningskinetiken. Kon ­
centrationerna bör skilja sig från varandra med en faktor 5 till 10 och 
bör motsvara den förväntade koncentrationsspridningen i miljön. Testsubstansens högsta koncentration bör inte överstiga 100 μg/l, 
men maximikoncentrationer under 10 μg/l eller lägre är att föredra 
för att man ska kunna vara säker på att den biologiska nedbrytningen 
följer första ordningens kinetik. De lägsta koncentrationerna bör inte överstiga 10 μg/L, men lägsta testkoncentrationer på 1–2 μg/l eller 
under 1 μg/l är att föredra. Normalt sett kan en adekvat analys av så 
låga koncentrationer göras med hjälp av
 14 C-märkta ämnen som 
finns i handeln. På grund av analytiska begränsningar är det inte alltid möjligt att mäta testsubstansens koncentration med tillräcklig noggrannhet om testsubstansen tillsätts i koncentrationer på 
≤ 100 μg/l (se andra stycket i avsnitt 1.7.2). Högre koncentrationer 
av testsubstansen (> 100 μg/l och ibland > 1 mg/l) kan användas för 
identifiering och kvantifiering av viktiga nedbrytningsprodukter eller om det inte finns en specifik analysmetod med låg detektionsgräns. 
Vid test av höga koncentrationer av en testsubstans kan det vara 
omöjligt att utnyttja resultaten för att uppskatta första ordningens nedbrytningskonstant och halveringstiden, eftersom nedbrytningen förmodligen inte följer första ordningens kinetik. 
Nedbrytningen följs vid lämpliga tillfällen genom mätning av kvar ­
varande
 14 C eller av testsubstansens restkoncentration vid använd ­
ning av specifika kemiska analyser.  14 C-märkning av molekylens 
stabilaste del gör att man kan bestämma den totala mineraliseringen, medan
 14 C-märkning av en mindre stabil del av molekylen eller 
användning av specifika analyser endast möjliggör bedömning av 
primär biologisk nedbrytning. Den stabilaste delen av en molekyl innehåller emellertid inte nödvändigtvis molekylens funktionella del (som kan kopplas till en specifik egenskap som toxicitet, bioacku ­
mulation o.d.). I sådana fall kan det vara lämpligt att använda en
 
14 C-märkt testsubstans i den funktionella delen, för att följa upp den 
specifika egenskapens eliminering.  
1.5 INFORMATION OM TESTSUBSTANSEN 
I detta test kan både radioaktivt märkta och omärkta testsubstanser 
användas. Det rekommenderas att  14 C-märkning används, och märk ­
ningen bör normalt sett göras i molekylens stabilaste del (se även 
avsnitt 1.4). För ämnen som innehåller mer än en aromatisk ring bör helst en eller flera kolatomer i varje ring
 14 C-märkas. Dessutom bör 
helst en eller flera kolatomer på båda sidor om bindningar som bryts 
lätt 14 C-märkas. Testsubstansens kemiska och radiokemiska renhet 
ska vara > 95 %. För radioaktivt märkta ämnen rekommenderas en specifik aktivitet på ca 50 μCi/mg (1,85 MBq) eller mer i syfte att 
underlätta
 14 C-mätning i test som genomförs med låg initial kon ­
centration. Följande uppgifter om testsubstansen bör finnas tillgäng ­
liga: ▼M1 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1331
 
— Löslighet i vatten [metod A.6]. 
— Löslighet i organiska lösningsmedel (ämnen som används med 
lösningsmedel eller har dålig löslighet i vatten). 
— Dissociationskonstant (pKa) om ämnet tenderar till protonering 
eller deprotonering [OECD TG 112] (5). 
— Ångtryck [metod A.4] och Henrys konstant. 
— Kemisk stabilitet i vatten och i mörker (hydrolys) [metod C.7]. Om ämnen med dålig vattenlöslighet testas i havsvatten kan det 
också vara bra att känna till utsaltningskonstanten (Setjenovs kon ­
stant) K
 s , som definieras genom formeln log (S/S') = K  s C m , där S 
och S' är ämnets löslighet i söt- respektive saltvatten och C  m är 
saltets molaritet. 
Om testet görs som ett ”suspenderat sediment-test” ska även följande 
uppgifter finnas tillgängliga: 
— Fördelningskoefficient n-oktanol/vatten [metod A.8]. — Adsorptionskoefficient [metod C.18]. Andra viktiga uppgifter, bl.a. följande: — Koncentration i miljön, såvida den är känd eller kan uppskattas. — Testsubstansens toxicitet för mikroorganismer [metod C.11]. — Lätt och/eller potentiell biologisk nedbrytbarhet [metoderna 
C.4 A–F, C.12, C.9, OECD TG 302 (5)]. 
— Aerob eller anaerob biologisk nedbrytbarhet vid omvandlingsstu ­
dier i jord och sediment/vatten [metoderna C.23 och C.24].
 
1.6 REFERENSSUBSTANS 
Ett ämne som normalt sett lätt bryts ned under aeroba förhållanden 
(t.ex. anilin eller natriumbensoat) bör användas som referenssubstans. Anilin och natriumbensoat kan vanligen förväntas brytas ned på mindre än två veckor. Referenssubstansen ska visa att den mikrobi ­
ella aktiviteten i testvattnet ligger inom vissa gränser, dvs. att vattnet 
innehåller en aktiv population av mikroorganismer.
 ▼M1 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1332
 
1.7 KVALITETSKRITERIER  
1.7.1  Utbyte  
Omedelbart efter det att testsubstansen tillförts ska alla initiala test ­
koncentrationer kontrolleras genom mätning av  14 C-aktivitet, eller 
genom kemisk analys om ämnena är omärkta, i minst två prover. 
Därigenom kan man få information om analysmetodens tillämplighet och repeterbarhet, och om testsubstansen är jämnt fördelad. Normalt sett används den uppmätta initiala
 14 C-aktiviteten eller testsubstan ­
sens koncentration vid de följande analyserna av data, snarare än de 
nominala koncentrationerna, eftersom man därigenom kompenserar för förluster genom sorption och doseringsfel. För
 14 C-märkta test ­
substanser anges utbytet vid experimentets slut genom massbalans 
(se sista stycket i avsnitt 1.8.9.4). Idealt sett ska den radioaktivt märkta massbalansen ligga inom intervallet 90 % till 110 %, medan analysnoggrannheten bör ge ett initialt utbyte på mellan 70 % 
och 110 % för omärkta testsubstanser. Dessa intervall ska ses som 
mål och bör inte användas som kriterier för huruvida testet ska accepteras. Eventuellt kan analysnoggrannheten för testsubstansen bestämmas vid lägre koncentrationer än den initiala koncentrationen 
och för viktiga nedbrytningsprodukter.
 
1.7.2  Analysmetodens repeterbarhet och känslighet  
Analysmetodens repeterbarhet (inbegripet den initiala extraktions ­
effektiviteten) när det gäller att kvantifiera testsubstansen och, i före ­
kommande fall, nedbrytningsprodukterna bör kontrolleras genom 
analys av fem prover av varje enskilt extrakt av ytvattnet. 
Analysmetodens detektionsgräns (LOD) för testsubstansen och för 
nedbrytningsprodukterna bör möjliggöra detektion av 1 % eller 
mindre av den initiala mängd som tillförts testsystemet. Kvantifie ­
ringsgränsen (LOQ) bör vara högst 10 % av den tillförda koncent ­
rationen. För kemisk analys av många organiska ämnen och deras nedbrytningsprodukter krävs ofta att testsubstansen tillförs i relativt 
hög koncentration, dvs. > 100 μg/l.
 
1.8 BESKRIVNING AV TESTMETODEN  
1.8.1  Utrustning  
Testet kan utföras i koniska eller cylindriska flaskor av lämplig 
storlek (t.ex. 0,5 eller 1,0 liter), som försluts med silikon- eller 
gummiproppar, eller i serumflaskor med koldioxidtäta lock (t.ex. 
butylgummimembran). En annan möjlighet är att utföra testet med olika flaskor och att ta ut hela flaskor, med minst två replikat, för varje provintervall (se sista stycket i avsnitt 1.8.9.1). För icke-flyk ­
tiga testsubstanser som inte är radioaktivt märkta krävs inga gastäta 
proppar eller lock. Lösa bomullsproppar som hindrar kontaminering från luften är lämpliga (se andra stycket i avsnitt 1.8.9.1). Halvflyk ­
tiga ämnen bör testas i system av biometertyp under lätt omrörning 
av vattenytan. För att undvika bakteriekontamination kan behållarna eventuellt steriliseras genom upphettning eller autoklavering före an ­
vändning. Dessutom används följande standardutrustning: 
— Skakbord eller magnetomrörare för kontinuerlig omblandning av 
testflaskorna.
 ▼M1 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1333
 
— Centrifug. 
— pH-mätare. 
— Turbidimeter för nefelometrisk mätning av grumlighet. 
— Ugn eller mikrovågsugn för torrviktsbestämning. 
— Utrustning för membranfiltrering. 
— Autoklav eller ugn för värmesterilisering av glas. 
— Utrustning för hantering av  14 C-märkta ämnen. 
— Utrustning för att kvantifiera  14 C-aktivitet i prover av lösningar 
från CO  2 -fälla och, vid behov, från sedimentprover. 
— Analysutrustning för bestämning av testsubstans (och referens ­
substans) vid specifik kemisk analys (t.ex. gaskromatograf, hög ­
trycksvätskekromatograf).  
1.8.2  Stamlösningar av testsubstansen  
Avjonat vatten används för att bereda stamlösningar av test- och 
referenssubstanserna (se första stycket i avsnitt 1.8.7). Det avjonade 
vattnet ska vara fritt från ämnen som kan vara toxiska för mikroorga ­
nismer, och får innehålla högst 1 mg löst organiskt kol (DOC) per liter (6).
 
1.8.3  Insamling och transport av ytvatten  
Valet av provtagningsplats för insamling av ytvatten beror på testets 
syfte i varje given situation. Vid val av provtagningsplatser ska eventuella tidigare utsläpp från jordbruk, industrier och hushåll be ­
aktas. Om det är känt att en akvatisk miljö har blivit kontaminerad 
med testsubstansen eller en strukturell analog till denna under de 
senaste fyra åren, bör miljön inte användas för insamling av test ­
vatten, såvida inte undersökningens uttalade syfte är att undersöka nedbrytningstakten på tidigare exponerade platser. Vattnets pH och 
temperatur bör mätas på provtagningsplatsen. Dessutom bör prov ­
tagningsdjupet och vattenprovets utseende (t.ex. färg och grumlighet) noteras (se avsnitt 3). Syrekoncentration och/eller redoxpotential i vatten och i sedimentytan bör mätas för att påvisa 
att aeroba förhållanden råder, såvida inte platsens utseende och tidi ­
gare erfarenheter därifrån gör detta uppenbart. Ytvattnet bör trans ­
porteras i en väl rengjord behållare. Provets temperatur under trans ­
porten bör inte avsevärt överstiga den temperatur som råder vid 
testet. Kylning till 4 °C rekommenderas om transporttiden är längre 
än 2–3 timmar. Vattenprovet får inte frysas.
 ▼M1 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1334
 
1.8.4  Lagring och beredning av ytvatten  
Testet bör helst påbörjas inom ett dygn efter provtagningen. Om det 
är nödvändigt att lagra vattnet bör lagringstiden vara så kort som möjligt. Den får under inga omständigheter överskrida fyra veckor. 
Vattenprovet bör hållas luftat vid 4 °C fram till användningen. Före 
användning bör grova partiklar avlägsnas, exempelvis med hjälp av ett nylonfilter med en maskstorlek på ca 100 μm eller ett grovt 
pappersfilter eller genom sedimentering.
 
1.8.5  Beredning av vatten tillsatt med sediment (frivilligt)  
För testet med suspenderat sediment tillsätts ytsediment till flaskorna 
med naturligt vatten (filtrerat för att avlägsna grova partiklar enligt 
beskrivning i avsnitt 1.8.4) så att en suspension erhålls. Koncent ­
rationen av suspenderade fasta ämnen bör ligga mellan 0,01 och 1 g/l. Ytsedimentet bör komma från samma plats som vattenprovet. 
Beroende på den specifika vattenmiljön kan ytsedimentet känneteck ­
nas antingen av en hög halt av organiskt kol (2,5–7,5 %) och fin textur eller en låg halt av organiskt kol (0,5–2,5 %) och grov textur (3). Ytsedimentet kan beredas på följande sätt: Flera sedimentkärnor 
tas med hjälp av en genomskinlig plastslang. De övre aeroba lagren 
(från ytan till högst 5 mm djup) skärs av genast efter provtagningen och blandas till ett samlingsprov. Detta sedimentprov bör transpor ­
teras i en behållare med en stor innesluten luftvolym för att hålla 
sedimentet under aeroba förhållanden (kyl till 4 °C om transporten 
varar mer än 2–3 timmar). Sedimentprovet bör suspenderas i test ­
vattnet i förhållandet 1:10 och hållas luftat vid 4 °C fram till använd ­
ningen. Om det är nödvändigt att lagra sedimentet bör lagringstiden 
vara så kort som möjligt. Den får under inga omständigheter över ­
skrida fyra veckor.
 
1.8.6  Semikontinuerligt förfarande (frivilligt)  
En förlängd inkubering (flera månader) kan vara nödvändig om det 
är en lång fördröjningstid innan en betydande nedbrytning av test ­
substansen kan mätas. Om detta är känt från tidigare test av ett 
ämne, kan testet redan från början göras med ett semikontinuerligt 
förfarande som möjliggör en regelbunden förnyelse av en del av testvattnet eller testsuspensionen (se tillägg 2). Alternativt kan ett 
normalt batchtest ändras till ett semikontinuerligt test, om ingen 
nedbrytning av testsubstansen kan påvisas under ca 60 dygns test med batchförfarande (se andra stycket i 1.8.8.3).
 
1.8.7  Tillsats av testsubstans eller referenssubstans  
För ämnen med hög vattenlöslighet (> 1 mg/l) och låg flyktighet 
(Henrys konstant < 1 Pa·m  3 /mol eller < 10  –5 atm·m  3 /mol) kan en 
stamlösning beredas i avjonat vatten (se avsnitt 1.8.2). Stamlösning 
tillsätts i testbehållarna i lämplig volym så att önskad koncentration 
uppnås. Den volym stamlösning som tillsätts bör vara så liten som det är praktiskt möjligt (helst < 10 % av den slutliga vätskevolymen). Ett annat förfarande är att lösa testsubstansen i en större volym 
testvatten, vilket kan vara ett alternativ till att använda organiska 
lösningsmedel.
 ▼M1 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1335
 
Om det är oundvikligt bör stamlösningar av icke-flyktiga ämnen med 
låg vattenlöslighet beredas med hjälp av ett flyktigt organiskt lösnings ­
medel, men den mängd lösningsmedel som sätts till testsystemet bör inte överstiga 1 volymprocent och får inte påverka den mikrobiella aktiviteten negativt. Lösningsmedlet får inte påverka testsubstansens 
stabilitet i vatten. Lösningsmedlet bör strippas av till en extremt liten 
kvantitet så att det inte ger en betydande ökning av halten löst organiskt kol i testvattnet eller testsuspensionen. Detta bör kontrolleras genom en ämnesspecifik analys eller om möjligt genom analys av löst organiskt 
kol (6). Det är viktigt att den tillförda mängden lösningsmedel inte är 
större än absolut nödvändigt och att mängden testsubstans kan lösas i den slutliga volymen testvatten. Andra metoder att tillsätta testsubstan ­
sen i testbehållarna beskrivs i (7) och (8). Om ett organiskt lösnings ­
medel används för att tillsätta testsubstansen, bör kontroller med 
lösningsmedel blandat med testvatten (utan tillsatser) och testvatten blandat med referenssubstans behandlas på samma sätt som aktiva testbehållare med testsubstans i lösningsmedel. Syftet med kontrollerna 
med lösningsmedel är att undersöka lösningsmedlets eventuella 
negativa effekter på populationen av mikroorganismer, vilka kan påvisas genom testsubstansens nedbrytning.
 
1.8.8  Testförhållanden  
1.8.8.1  Testtemperatur  
Inkubationen bör ske i mörker (att föredra) eller i diffust ljus vid en 
kontrollerad (± 2 °C) temperatur som kan vara antingen temperaturen 
i fält eller en standardtemperatur på 20–25 °C. Temperaturen i fält kan vara antingen provets faktiska temperatur vid provtagningstill ­
fället eller en genomsnittlig temperatur i fält på provtagningsplatsen.
 
1.8.8.2  Omblandning  
Omblandning genom kontinuerlig skakning eller omrörning måste 
ske för att hålla partiklar och mikroorganismer i suspension. Omb ­
landningen underlättar också syretransporten från den inneslutna luft ­
volymen till vätskan så att tillräckligt aeroba förhållanden kan upp ­
rätthållas. Flaskorna ställs på ett skakbord (ca 100 rpm) eller också 
används magnetomrörare. Omblandningen måste vara kontinuerlig. 
Skakning eller omrörning bör dock ske så försiktigt som möjligt samtidigt som en homogen suspension upprätthålls.
 
1.8.8.3  Testets varaktighet  
Testet bör normalt inte pågå i mer än 60 dygn om inte ett semi ­
kontinuerligt förfarande med regelbunden förnyelse av testsuspensio ­
nen används (se avsnitt 1.8.6 och tillägg 2). Testperioden för batch ­
test kan dock utsträckas till 90 dygn om testsubstansen har börjat 
brytas ned under de första 60 dygnen. Nedbrytningen följs med lämpliga tidsintervall genom bestämning av kvarvarande
 14 C-aktivi­
tet eller utvecklad  14 CO 2 (se avsnitt 1.8.9.4) och/eller genom kemisk 
analys (avsnitt 1.8.9.5). Inkubationstiden måste vara tillräckligt lång 
för att det ska vara möjligt att utvärdera nedbrytningsprocessen. Nedbrytningsgraden bör helst vara högre än 50 %. För ämnen som bryts ned långsamt måste nedbrytningsgraden vara tillräckligt hög 
(normalt över 20 %) för att det ska vara möjligt att uppskatta en 
kinetisk hastighetskonstant för nedbrytningen.
 ▼M1 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1336
 
pH och syrekoncentration i testsystemet ska mätas regelbundet om 
inte tidigare erfarenheter från liknande test med vatten- och sedi ­
mentprover tagna på samma plats gör sådana mätningar överflödiga. Under vissa förhållanden kan det hända att metabolism av primära substrat vid mycket högre koncentrationer i vattnet eller sedimentet 
ger tillräckligt stor koldioxidutveckling och syreförbrukning för att 
påtagligt ändra försöksbetingelserna under testet.
 
1.8.9  Förfarande  
1.8.9.1  Beredning av flaskor för pelagiskt test  
En lämplig volym testvatten förs över till testflaskorna, upp till en 
tredjedel av flaskvolymen och inte mindre än ca 100 ml. Även om 
flera flaskor används (för att kunna ta ut hela flaskor vid varje prov ­
tagningstidpunkt) är den lämpliga volymen testvatten ca 100 ml, eftersom en liten provvolym kan påverka lagfasens längd. Testsub ­
stansen tillsätts från en stamlösning enligt beskrivning i avsnitten 
1.8.2 och 1.8.7. Minst två olika koncentrationer av testsubstansen 
åtskilda med en faktor 5–10 bör användas för att bestämma nedbryt ­
ningens kinetik och beräkna hastighetskonstanten för nedbrytningen. Båda de valda koncentrationerna bör vara lägre än 100 μg/l och bör 
helst ligga i intervallet < 1–10 μg/l. 
Flaskorna försluts med proppar eller lock som inte släpper genom 
luft och koldioxid. För icke-flyktiga testsubstanser som inte är
 14 C- 
märkta är det lämpligt att använda lösa bomullspluggar som motver ­
kar kontaminering från luften (se avsnitt 1.8.1) under förutsättning att 
det är känt att alla viktiga nedbrytningsprodukter är icke-flyktiga, 
och om indirekt bestämning av koldioxid görs (se tillägg 3). 
Flaskorna inkuberas vid den valda temperaturen (se avsnitt 1.8.8.1). 
Prover för kemisk analys eller  14 C-mätning tas ut vid testets början 
(dvs. innan den biologiska nedbrytningen inleds, se avsnitt 1.7.1) och 
därefter med lämpliga tidsintervall under testets gång. Provtagningen kan göras genom att delprov (t.ex. alikvoter på 5 ml) tas från varje replikat eller genom att hela flaskor tas ut vid varje provtagnings ­
tidpunkt. Testsubstansens mineralisering kan bestämmas direkt eller 
indirekt (se tillägg 3). Vanligen krävs minst fem provtagningar under nedbrytningsfasen (dvs. efter lagfasens slut) för att göra en tillför ­
litlig bestämning av hastighetskonstanten. För vissa snabbt nedbryt ­
bara ämnen kan det dock vara motiverat att nöja sig med tre prov ­
tagningar. För ämnen som inte bryts ned snabbt kan flera mätningar lätt göras under nedbrytningsfasen och därför bör flera datapunkter användas för uppskattning av k. Det kan inte anges något bestämt 
tidsschema för provtagningen, eftersom den biologiska nedbrytnings ­
hastigheten varierar. Provtagning en gång i veckan kan dock rekom ­
menderas om nedbrytningen är långsam. Om testsubstansen är snabbt nedbrytbar, bör provtagning ske en gång per dag under de tre första 
dygnen och därefter varannan eller var tredje dag. Under vissa om ­
ständigheter, exempelvis med ämnen som hydrolyseras mycket snabbt, kan det vara nödvändigt att ta prover en gång i timmen. Det rekommenderas att en preliminär studie görs före testet för att 
bestämma lämpliga provtagningsintervall. Om prover måste finnas 
tillgängliga för vidare specifik analys, är det lämpligt att ta flera prover och sedan välja vilka som ska analyseras i slutet av experi ­
mentet genom att börja bakifrån, dvs. de sista proverna analyseras 
först (se andra stycket i avsnitt 1.8.9.5 för vägledning om provernas 
lagringsbeständighet).
 ▼M1 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1337
 
1.8.9.2  Antal flaskor och prover  
Gör i ordning så många flaskor att det räcker till följande: 
— Testflaskor: minst två flaskor för varje koncentration av testsub ­
stansen (helst minst tre) eller flera testflaskor för varje koncent ­
ration om hela flaskor ska tas ut vid varje provtagningstidpunkt (betecknas F
 T ). 
— Testflaskor för beräkning av massbalans: minst två flaskor för 
varje testkoncentration (betecknas F  M ). 
— Blankprov utan testsubstans: minst en flaska med blankprov in ­
nehållande endast testvatten (betecknas F  B ). 
— Referensprov: två flaskor med referenssubstans (t.ex. anilin eller 
natriumbensoat, 10 μg/l) (betecknas F  C ). Syftet med referenspro ­
vet är att fastställa lägsta nivån för mikrobiell aktivitet. Om det är 
lämpligt kan en radioaktivt märkt referenssubstans användas, även om nedbrytningen av testsubstansen följs genom kemiska analyser. 
— Sterilt kontrollprov: en eller två flaskor med steriliserat testvatten 
för att påvisa eventuell abiotisk nedbrytning och annan icke-bio ­
logisk förlust av testsubstansen (betecknade F
 S ). Den biologiska 
aktiviteten kan avbrytas genom autoklavering (121 °C, 20 min) 
av testvattnet eller genom tillsats av ett gift (t.ex. natriumazid (NaN
 3 ) 10–20 g/l, kvicksilverklorid (HgCl  2 ) 100 mg/l eller for ­
malin 100 mg/l) eller med hjälp av gammastrålning. Om HgCl  2 
används bör det behandlas som giftigt avfall. För vatten med stor 
tillsats av sediment är det inte lätt att åstadkomma sterila förhål ­
landen. I detta fall rekommenderas upprepad autoklavering (t.ex. tre gånger). Tänk på att autoklavering kan leda till att sedimentets 
sorptionsegenskaper ändras. 
— Kontroller med lösningsmedel, innehållande testvatten och test ­
vatten med referenssubstans: två flaskor behandlade med samma 
mängd lösningsmedel och med samma förfarande som används 
för att tillsätta testsubstansen. Syftet är att påvisa eventuella ne ­
gativa effekter av lösningsmedlet genom att bestämma nedbryt ­
ningen av referenssubstansen. 
Vid testets utformning bör försöksledaren beakta den relativa bety ­
delsen av flera replikat gentemot ett ökat antal provtagningstidpunk ­
ter. Det exakta antalet flaskor som behövs beror på vilken metod 
som används för att mäta nedbrytningen (se tredje stycket i 
avsnitt 1.8.9.1, avsnitt 1.8.9.4 och tillägg 3).
 ▼M1 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1338
 
Två delprov (t.ex. alikvoter på 5 ml) bör tas ut från varje flaska vid 
varje provtagningstidpunkt. Om flera flaskor används för att möjlig ­
göra uttag av hela flaskor, bör minst två flaskor offras vid varje provtagningstidpunkt (se första stycket i avsnitt 1.8.9.1).
 
1.8.9.3  Beredning av flaskor för suspenderat sediment-test [frivilligt]  
Lämpliga volymer av testvatten och sediment tillsätts i testkärlen (se 
avsnitt 1.8.5). Beredningen av flaskor för suspenderat sediment sker 
på samma sätt som för det pelagiska testet (se avsnitten 1.8.9.1 
och 1.8.9.2). Använd helst serumflaskor eller flaskor av liknande form. De förslutna flaskorna placeras horisontellt i en skakapparat. Öppna flaskor för icke-flyktiga ämnen som inte är
 14 C-märkta bör 
givetvis placeras upprätt. I detta fall rekommenderas magnetomrör ­
ning med glasbelagda magnetstavar. Vid behov luftas flaskorna för att upprätthålla lämpliga aeroba förhållanden.
 
1.8.9.4  Radiokemiska bestämningar  
Den utvecklade  14 CO 2 mäts indirekt och direkt (se tillägg 3).  14 CO 2 
bestäms indirekt genom skillnaden mellan den initiala  14 C-aktiviteten 
i testvattnet eller suspensionen och den totala kvarvarande aktiviteten vid provtagningstidpunkten mätt efter det att provet surgjorts till pH 2–3 och CO
 2 har strippats av. Därigenom avlägsnas organiskt kol 
och den kvarvarande aktivitet som uppmäts kommer från organiskt 
material. Indirekt bestämning av  14 CO 2 bör inte ske om viktiga flyk ­
tiga nedbrytningsprodukter bildas under testsubstansens omvandling (se tillägg 3). Om möjligt bör
 14 CO 2 -utvecklingen mätas direkt (se 
tillägg 3) i minst en flaska vid varje provtagningstidpunkt. Detta 
förfarande gör det möjligt att kontrollera både massbalans och bio ­
logisk nedbrytning, men det kan bara användas vid test som görs med förslutna flaskor. 
Om
 14 CO 2 -utvecklingen mäts direkt under testet, bör flera flaskor 
göras i ordning för detta syfte vid testets början. Direkt bestämning av
 14 CO 2 rekommenderas om viktiga flyktiga nedbrytningsprodukter 
bildas under testsubstansens omvandling. Vid varje mättillfälle sur ­
görs de extra testflaskorna till pH 2–3 och  14 CO 2 samlas in i ett 
internt eller externt absorptionsmedel (se tillägg 3). 
Eventuellt kan koncentrationerna av  14 C-märkt testsubstans och vik ­
tiga nedbrytningsprodukter bestämmas med hjälp av radiokromato ­
grafi (t.ex. tunnskiktskromatografi, RAD-TLC) eller HPLC med ra ­
diokemisk detektion. 
Eventuellt kan också fasfördelningen av den kvarvarande radioakti ­
viteten (se tillägg 1) och rester av testsubstansen och nedbrytnings ­
produkter bestämmas.  ▼M1 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1339
 
Vid testets slut bör massbalansen bestämmas genom direkt  14 CO 2 - 
mätning i separata testflaskor från vilka inga prover har tagits under 
testets gång (se tillägg 3).  
1.8.9.5  Specifik kemisk analys  
Om det finns en känslig specifik analysmetod kan den primära bio ­
logiska nedbrytningen uppskattas genom mätning av den totala rest ­
koncentrationen av testsubstansen i stället för genom radioaktiv märkning. Om en radioaktivt märkt testsubstans används (för att mäta total mineralisering), kan specifika kemiska analyser göras pa ­
rallellt för att få värdefull kompletterande information och kontrollera 
förfarandet. Specifika kemiska analyser kan också användas för att mäta nedbrytningsprodukter som bildas under testsubstansens ned ­
brytning, och detta rekommenderas för ämnen som mineraliseras 
med halveringstider över 60 dygn. Testsubstansens och nedbryt ­
ningsprodukternas koncentration vid varje provtagningstidpunkt bör mätas och rapporteras (som koncentration och som procentandel av 
den tillförda mängden). Detekterade nedbrytningsprodukter, som vid 
en viss provtagningstidpunkt har en koncentration ≥ 10 % av den 
tillförda koncentrationen, bör generellt sett identifieras om det inte finns rimlig anledning att avstå. Nedbrytningsprodukter vars kon ­
centrationer kontinuerligt ökar under studien bör helst också identi ­
fieras, även om koncentrationerna inte överskrider den ovan nämnda gränsen, eftersom ökningen kan tyda på svårnedbrytbarhet. Analys av nedbrytningsprodukter i sterila kontrollprov bör övervägas om 
snabb abiotisk omvandling av testsubstansen (t.ex. genom hydrolys) 
bedöms vara möjlig. Behovet av att kvantifiera och identifiera ned ­
brytningsprodukter bör bedömas från fall till fall, med motiveringar angivna i rapporten. Metoder som innebär extraktion med organiska 
lösningsmedel bör användas i enlighet med de riktlinjer som anges 
för respektive analysförfarande. 
Alla prover bör förvaras vid 2–4 °C och lufttätt om analysen utförs 
inom 24 timmar (att föredra). För längre lagring bör proverna frysas till lägre temperatur än –18 °C eller behandlas med ett kemiskt konserveringsmedel. Surgörning rekommenderas inte som metod att 
konservera proverna, eftersom surgjorda prover kan vara instabila. 
Om proverna inte analyseras inom 24 timmar och lagras under längre tid, bör lagringsbeständigheten undersökas för att visa att de intres ­
santa kemikalierna är stabila om de lagras vid lägre temperatur än 
–18 °C eller i konserverad form. Om analysmetoden innebär extrak ­
tion med lösningsmedel eller extraktion med fast fas (SPE), bör extraktionen göras omedelbart efter provtagningen eller efter för ­
varing av provet i kyla i högst 24 timmar. 
Beroende på analysmetodens känslighet, kan det vara nödvändigt 
med större provvolymer än de som anges i punkt 1.8.1. Testet kan 
lätt utföras med testvolymer på en liter i flaskor med en volym på 
2–3 liter, vilket gör det möjligt att ta ut prover på ca 100 ml.
 ▼M1 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1340
 
2. DATA OCH RAPPORTERING  
2.1 BEHANDLING AV RESULTATEN  
2.1.1  Diagram  
Provtagningstiderna avrundas till hela timmar (om inte ämnet bryts 
ned kraftigt inom minuter eller timmar) men inte till hela dygn. 
Testsubstansens kvarvarande aktivitet (för  14 C-märkta ämnen) eller 
restkoncentration (för omärkta ämnen) avsätts mot tiden både i ett linjärt och i ett halvlogaritmiskt diagram (se figur 1a och 1b). Om nedbrytning har skett, jämförs resultaten från flaskorna F
 T med dem 
från flaskorna F  S . Om medelvärdena av resultaten från flaskorna med 
testsubstans (F  T ) och de sterila flaskorna (F  S ) avviker med mindre än 
10 %, kan det antas att den iakttagna nedbrytningen huvudsakligen är abiotisk. Om nedbrytningen i flaskorna F
 S är lägre kan siffrorna 
användas för att korrigera de siffror som erhålls med flaskorna F  T 
(genom subtraktion) för att uppskatta den biologiska nedbrytningen. 
Om frivilliga analyser görs av viktiga nedbrytningsprodukter, bör diagram över deras bildning och minskning redovisas utöver di ­
agrammet över testsubstansens minskning. 
Uppskatta lagfasens längd t
 L utifrån nedbrytningskurvan (halvloga ­
ritmiskt diagram) genom att extrapolera dess linjära del till noll procents nedbrytning eller genom att bestämma tiden för ca 10 % nedbrytning (se figur 1a och 1b). Utifrån det halvlogaritmiska di ­
agrammet bestäms hastighetskonstanten k för första ordningens re ­
aktion, och dess standardfel bestäms genom linjär regression av ln (kvarvarande
 14 C-aktivitet eller testsubstansens restkoncentration) 
mot tiden. Särskilt när det gäller  14 C-mätningar bör man tänka på att 
bara använda data som tillhör den första linjära delen av kurvan efter 
avslutad lagfas, och hellre välja några få representativa data än flera mer osäkra data. En del av osäkerheten beror här på fel förknippade med den rekommenderade direkta användningen av uppmätt kvarva ­
rande
 14 C-aktivitet (se nedan). Det kan ibland vara lämpligt att be ­
räkna två olika hastighetskonstanter, om nedbrytningen sker i två faser. I så fall definieras två skilda faser på nedbrytningskurvan. Beräkning av hastighetskonstanten k och halveringstiden t
 ½ = ln2/k 
bör göras för var och en av de enskilda flaskor som är replikat, om 
delprov tas ut från samma flaska, eller med hjälp av medelvärden, om hela flaskor tas ut vid varje provtagningstidpunkt (se sista stycket i avsnitt 1.8.9.2). Om det förstnämnda förfarandet följs bör hastig ­
hetskonstanten och halveringstiden rapporteras dels för var och en av 
de enskilda flaskor som är replikat, dels som medelvärde och me ­
delfel. Om höga koncentrationer av testsubstansen har använts, kan nedbrytningskurvan avvika avsevärt från en rät linje (halvlogarit ­
miskt diagram) och det är möjligt att första ordningens reaktions ­
kinetik inte är giltig. Bestämning av halveringstid har då ingen me ­
ning. För ett begränsat dataintervall kan dock pseudo-första ordning ­
ens kinetik tillämpas och nedbrytningens halveringstid DT
 50 (tiden 
för att nå 50 % nedbrytning) uppskattas. Man måste dock komma 
ihåg att nedbrytningens förlopp utanför det valda dataintervallet inte kan förutsägas med hjälp av DT
 50 som endast är en deskriptor för en 
given uppsättning data. Det finns gott om analytiska verktyg som 
underlättar statistiska beräkningar och anpassning av kurvor, och 
användning av sådana program rekommenderas.  ▼M1 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1341
 
Om specifika kemiska analyser görs, uppskattas hastighetskonstanter 
och halveringstider för primär nedbrytning på det sätt som ovan 
beskrivits för total mineralisering. Om den primära nedbrytningen är den begränsande processen, kan i vissa fall datapunkter från hela nedbrytningsförloppet användas. Detta för att mätningarna är 
direkta till skillnad från mätningar av
 14 C-aktivitet. 
Om  14 C-märkta ämnen används, bör massbalans uttryckas i procent 
av den tillförda initiala koncentrationen, åtminstone vid testets slut.  
2.1.2  Kvarvarande aktivitet  
När en  14 C-märkt del av ett organiskt ämne bryts ned biologiskt, 
omvandlas större delen av  14 C till  14 CO 2 , medan en annan del an ­
vänds för uppbyggnad av biomassa och/eller syntes av extracellulära metaboliter. En fullständig biologisk nedbrytning av ett ämne innebär 
därför inte en hundraprocentig omvandling av dess kol till
 14 CO 2 . 
Det  14 C som byggs in i produkter som bildas genom biosyntes 
frigörs sedan långsamt som  14 CO 2 genom s.k. sekundär mineralise ­
ring. Diagram över kvarvarande  14 C-aktivitet (mätt efter det att CO  2 
har strippats av) eller över  14 CO 2 -utvecklingen avsatt mot tiden, 
kommer därför att uppvisa en ”svans” efter avslutad nedbrytning. Detta försvårar en kinetisk tolkning av data, och av denna anledning bör i normala fall endast den första delen av kurvan (efter avslutad 
lagfas och innan ca 50 % nedbrytning har uppnåtts) användas för att 
uppskatta hastighetskonstanten för nedbrytningen. Om testsubstansen bryts ned är den totala kvarvarande
 14 C-aktiviteten alltid högre än 
den  14 C-aktivitet som beror på återstående onedbruten testsubstans. 
Om testsubstansen bryts ned genom en första ordningens reaktion 
och en konstant andel α mineraliseras till CO  2 , kommer den initiala 
lutningen på den kurva som visar hur  14 C avtar (totalt organiskt  14 C 
avsatt mot tiden) att vara α gånger lutningen för testsubstansens 
koncentration (eller för att vara noggrann, den del av testsubstansen 
som är märkt med  14 C). Om okorrigerade mätvärden av den totala  
14 C-aktiviteten används, kommer därför den beräknade hastighets ­
konstanten för nedbrytningen att vara för låg. Metoder för att upp ­
skatta testsubstansens koncentration utifrån uppmätt radiokemisk ak ­
tivitet på grundval av olika förenklande antaganden har beskrivits i litteraturen (2) (9) (10) (11). Dessa metoder är lättast att använda för snabbt nedbrytbara ämnen.
 
2.2 TOLKNING AV RESULTAT 
Om hastighetskonstanten k konstateras vara oberoende av den till ­
förda koncentrationen (dvs. om k har ungefär samma värde vid olika koncentrationer av testsubstansen) kan det antas att första ordningens hastighetskonstant är representativ för rådande testförhållanden, dvs. 
testsubstans, vattenprov och testtemperatur. I vilken utsträckning re ­
sultaten kan generaliseras eller extrapoleras till andra system måste utvärderas genom en expertbedömning. Om en hög koncentration av testsubstansen används och nedbrytningen därför inte följer första 
ordningens kinetik, kan data inte användas för direkt uppskattning 
av första ordningens hastighetskonstant eller motsvarande halverings ­
tid. Data som erhålls från ett test med en hög koncentration av testsubstansen kan dock ändå vara användbara för att uppskatta 
den totala mineraliseringsgraden och för att påvisa och kvantifiera 
nedbrytningsprodukter.
 ▼M1 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1342
 
Om hastigheterna för andra förlustprocesser än biologisk nedbrytning 
är kända (t.ex. hydrolys eller avdunstning) kan dessa dras av från 
den nettoförlusthastighet som observerats under testet för att ge en ungefärlig uppskattning av den biologiska nedbrytningshastigheten. Data över hydrolys kan exempelvis erhållas från det sterila kontroll ­
provet eller från parallelltest med en högre koncentration av testsub ­
stansen. 
Indirekt och direkt bestämning av
 14 CO 2 (avsnitt 1.8.9.4 och tillägg 
3) kan bara användas för att mäta storleken av testsubstansens mi ­
neralisering till CO  2 . Radiokromatografi (RAD-TLC) eller HPLC 
kan användas för att analysera koncentrationerna av  14 C-märkt test ­
substans och bildning av viktiga nedbrytningsprodukter (tredje styc ­
ket i avsnitt 1.8.9.4). För att kunna göra en direkt uppskattning av 
halveringstiden är det nödvändigt att inga viktiga nedbrytningspro ­
dukter (definierat som ≥ 10 % av den tillförda mängden testsubstans) 
är närvarande. Om sådana viktiga nedbrytningsprodukter är närva ­
rande, krävs en noggrann utvärdering av data. Detta kan innebära 
upprepade test och/eller identifiering av nedbrytningsprodukter (se första stycket i avsnitt 1.8.9.5) om inte nedbrytningsprodukternas öde kan bedömas på ett rimligt sätt erfarenhetsmässigt (t.ex. med 
hjälp av information om reaktionsvägen för nedbrytningen). Eftersom 
den proportion av testsubstansens kol som omvandlas till CO
 2 varierar 
(till stor del beroende på koncentrationen av testsubstans och andra närvarande substrat, testförhållandena och mikroorganismsamhället), 
möjliggör detta test inte en direkt uppskattning av fullständig biologisk 
nedbrytning som i ett test av eliminering av löst organiskt kol, men resultatet liknar det som erhålls med ett respirometertest. Mineralise ­
ringsgraden kommer alltså att vara lägre än eller lika med den lägsta 
nivån av slutlig biologisk nedbrytning. För att få en mer fullständig bild 
av den slutliga biologiska nedbrytningen (mineralisering och inkorpore ­
ring i biomassa), bör analysen av fasfördelningen av
 14 C utföras i slutet 
av testet (se tillägg 1). Det  14 C som ingår i partikelfasen utgörs av  14 C 
inkorporerat i bakteriebiomassa och  14 C sorberat till organiska partiklar.  
2.3 TESTETS VALIDITET 
Om referenssubstansen inte bryts ned inom det förväntade tidsinter ­
vallet (för anilin och natriumbensoat vanligen mindre än två veckor), kan testets validitet betvivlas och måste verifieras ytterligare, eller 
också görs testet om med ett nytt vattenprov. I en ISO-interkalibre ­
ring av metoden, där sju laboratorier från olika delar av Europa deltog, låg de anpassade hastighetskonstanterna för nedbrytning av anilin i intervallet 0,3–1,7 dygn
 –1 med ett medelvärde på 0,8 dygn  –1 
vid 20 °C och ett standardfel på 0,4 dygn  –1 (t ½ = 0,9 dygn). Lag ­
fasen varade normalt mellan 1 och 7 dygn. De undersökta vattnen rapporterades ha en bakteriebiomassa motsvarande 10
 3 –10  4 koloni­
bildande enheter (CFU) per ml. Nedbrytningshastigheterna i närings ­
rika mellaneuropeiska vatten var högre än i nordiska näringsfattiga vatten, vilket kan bero på olikheten i näringsstatus eller tidigare exponering för kemiska ämnen. 
Det totala utbytet (massbalans) vid experimentets slut bör ligga mel ­
lan 90 % och 110 % för radioaktivt märkta ämnen, medan det initiala utbytet av experimentets början bör ligga mellan 70 % och 110 % för omärkta ämnen. Dessa intervall bör dock endast 
ses som mål och bör inte användas som kriterier för huruvida testet 
ska accepteras.
 ▼M1 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1343
 
3. TESTRAPPORT  
Typen av undersökning, dvs. pelagiskt test eller suspenderat sedi ­
ment-test, ska klart anges i testrapporten, som också ska innehålla åtminstone följande uppgifter: 
Testsubstans och referenssubstans(er): — Trivialnamn, kemiska namn (IUPAC-namn och/eller CAS-namn 
rekommenderas), CAS-nummer, strukturformler (med angivelse av positionen för
 14 C om radioaktivt märkta ämnen används) 
samt relevanta fysikalisk-kemiska egenskaper hos testsubstans 
och referenssubstans (se avsnitten 1.5 och 1.6). 
— Kemiska namn, CAS-nummer, strukturformler (med angivelse av 
positionen för  14 C om radioaktivt märkta ämnen används) samt 
relevanta fysikalisk-kemiska egenskaper hos ämnen som används som standard för identifiering och kvantifiering av nedbrytnings ­
produkter. 
— Test- och referenssubstansers renhet och eventuella föroreningar. 
— Radiokemisk renhet hos den märkta kemikalien och dess speci ­
fika aktivitet (i tillämpliga fall). 
Ytvatten: För de vattenprover som tas ska minst följande uppgifter anges: 
— Läge och beskrivning av provtagningsstället, om möjligt även 
dess föroreningshistoria. 
— Datum och tid för provtagning. 
— Näringsämnen (total-N, ammonium, nitrit, nitrat, total-P, löst or ­
tofosfat). 
— Provtagningsdjup. — Provets utseende (t.ex. färg och grumlighet). 
— DOC och TOC. 
— BOD. — Temperatur och pH på provtagningsplatsen vid provtagningstill ­
fället. 
— Syrehalt eller redoxpotential (obligatoriskt endast om det inte är 
uppenbart att aeroba förhållanden råder). 
— Salthalt eller konduktivitet (om det är fråga om saltvatten eller 
bräckt vatten). 
— Suspenderade fasta ämnen (om provet är grumligt). 
— Eventuellt annan relevant information om provtagningsplatsen 
vid provtagningstillfället (t.ex. aktuella eller historiska uppgifter 
om flödeshastighet i vattendrag eller havsströmmar, större utsläpp i närheten och utsläppstyp, väderförhållanden före provtagnings ­
tillfället). 
Frivilligt anges följande: — Mikrobiell biomassa (t.ex. direkt räkning med akridinorange eller 
kolonibildande enheter).
 ▼M1 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1344
 
— Oorganiskt kol. 
— Klorofyll-a-koncentration som ett specifikt mått på algbiomassa. 
Dessutom bör följande uppgifter om sediment lämnas om test med 
suspenderat sediment görs: 
— På vilket djup sedimentprovet tagits. — Sedimentets utseende (t.ex. färgat, lerigt, dyigt eller sandigt). — Textur (t.ex. % grovsand, finsand, mjäla och lera). 
— Torrvikt av suspenderade fasta ämnen i g/l, TOC-koncentration 
eller glödförlust som ett mått på innehåll av organiskt material. 
— pH. — Syrehalt eller redoxpotential (obligatoriskt endast om det inte är 
uppenbart att aeroba förhållanden råder. 
Testförhållanden: 
— Tid mellan provtagning och användning i laboratorietest, lagring 
och förbehandling av provet, datum då undersökningen gjordes. 
— Tillförd mängd testsubstans, testkoncentration och referenssubstans. — Metod för tillförsel av testsubstans med uppgift om eventuella 
lösningsmedel. 
— Använd volym ytvatten och sediment (i tillämpliga fall) samt 
provvolym som tagits ut för analys vid varje provtagningstid ­
punkt. 
— Beskrivning av det använda testsystemet. 
Om inkubationen inte sker i mörker, information om ”diffusa ljus ­
förhållanden”: 
— Information om metod(er) som används för att bereda sterila 
kontrollprover (t.ex. temperatur, tid och antal autoklaveringar). 
— Inkubationstemperatur. 
— Information om analysmetoder och metoder som används för 
radiokemiska mätningar, massbalanskontroll och mätningar av fasfördelning (om detta genomförs). 
— Antal replikat. Resultat: 
— Procentuellt utbyte (se avsnitt 1.7.1). 
— Repeterbarhet och känslighet hos de analysmetoder som används 
samt detektionsgräns och kvantifieringsgräns (se avsnitt 1.7.2).
 ▼M1 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1345
 
— Alla mätdata (även provtagningstidpunkter) och beräknade vär ­
den i tabellform och nedbrytningskurvor. För varje testkoncent ­
ration och för varje flaska som är replikat rapporteras den linjära korrelationskoefficienten för den logaritmiska kurvans lutning, uppskattad lagfas och första eller pseudo-första ordningens has ­
tighetskonstant (om möjligt) samt motsvarande halveringstid för 
nedbrytningen (eller halveringstiden t
 50 ). 
— Relevanta värden rapporteras som medelvärden av de resultat 
som observeras i enskilda replikat, t.ex. lagfasens längd, hastig ­
hetskonstanten och halveringstiden för nedbrytningen (eller t  50 ). 
— Systemet kategoriseras som antingen ej adapterat eller adapterat 
med utgångspunkt från nedbrytningskurvans utseende och even ­
tuell påverkan från testkoncentrationen. 
— Resultaten av den slutliga kontrollen av massbalans och av mät ­
ningar av fasfördelning (i tillämpliga fall). 
— Andelen mineraliserat  14 C och, om specifika analyser görs, slut ­
lig grad av primär nedbrytning. 
— Identifiering, molaritet och procentandel av tillförda och viktiga 
nedbrytningsprodukter (se första stycket i avsnitt 1.8.9.5), i till ­
lämpliga fall. 
— Föreslagen reaktionsväg för omvandlingen, i tillämpliga fall. 
— Diskussion av resultaten.  
4. LITTERATUR  
1. OECD TG 309 (2004). Aerobic Mineralisation in surface water 
– Simulation Biodegradation Test. 
2. ISO/DIS 14592–1 (1999). Water quality – Evaluation of the 
aerobic biodegradability of organic compounds at low concent ­
rations – Part 1: Shake flask batch test with surface water or 
surface water/sediment suspensions. 
3. Testing Method C.23. Aerobic and anaerobic transformation in 
soil. 
4. Testing Method C.24. Aerobic and anaerobic transformation in 
aquatic sediments. 
5. OECD (1993). Guidelines for the Testing of Chemicals. OECD, 
Paris. 
6. ISO 8245 (1999). Water quality – Guidelines on the determina ­
tion of total organic carbon (TOC) and dissolved organic carbon (DOC). 
7. ISO 10634 (1995). Water quality – Guidance for the preparation 
and treatment of poorly water-soluble organic compounds for the 
subsequent evaluation of their biodegradability in an aqueous 
medium. 
8. OECD draft (2000). Guidance Document on aquatic toxicity tes ­
ting of difficult substances and mixtures. Environmental Health 
and Safety Publications. Series on Testing and Assessment. No 22.
 ▼M1 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1346
 
9. Simkins, S. and Alexander, M. (1984). Models for mineraliza ­
tion kinetics with the variables of substrate concentration and 
population density. Appl. Environ. Microbiol. 47, 394–401. 
10. Ingerslev, F. and N. Nyholm. (2000). Shake-flask test for deter ­
mination of biodegradation rates of  14 C-labeled chemicals at low 
concentrations in surface water systems. Ecotoxicol. Environ. 
Saf. 45, 274–283. 
11. ISO/CD 14592–1 (1999). Ring test report: Water Quality – 
Evaluation of the aerobic biodegradability of organic compounds at low concentrations part 1 – report of 1998/1999 ring-test. Shake flask batch test with surface water or surface water/sedi ­
ment suspensions.
 ▼M1 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1347
 
Tillägg 1  
Fasfördelning av  14 C 
För att kontrollera förfarandet bör de rutinmässiga mätningarna av kvarvarande 
total  14 C-aktivitet i organiskt kol (TOA) kompletteras med mätningar av mass ­
balans, inklusive en direkt bestämning av utvecklad  14 CO 2 efter uppfångning i ett 
absorptionsmedel (se tillägg 3). En positiv bildning av  14 CO 2 är i sig själv ett 
direkt bevis på biologisk nedbrytning, i motsats till abiotisk nedbrytning och andra förlustmekanismer, exempelvis avdunstning och sorption. Ytterligare vär ­
defull information om den biologiska nedbrytningsprocessen kan erhållas genom 
mätningar av den totala
 14 C-aktivitetens fördelning mellan löst tillstånd (  14 C- 
aktivitet i löst organiskt kol, DOA) och partikeltillstånd (  14 C-aktivitet i partikulärt 
organiskt kol, POA) efter separation av partiklar genom membranfiltrering eller centrifugering. POA utgörs av testsubstans sorberad på den mikrobiella biomas ­
san och på andra partiklar utöver det kol i testsubstansen som har använts för 
syntes av nytt cellulärt material och därigenom inkorporerats i den partikulära biomassafraktionen. Bildningen av löst organiskt
 14 C-material kan uppskattas 
som DOA vid slutet av den biologiska nedbrytningen (platå på kurvan med 
nedbrytning avsatt mot tiden). 
Fasfördelningen av kvarvarande  14 C i utvalda prover uppskattas genom filtrering 
av prov på ett membranfilter med porstorleken 0,22 μm eller 0,45 μm av ett 
material som inte adsorberar betydande mängder av testsubstansen (polykarbo ­
natfilter kan vara lämpliga). Om testsubstansens sorption på filtret inte är för ­
sumbar (kontrolleras före experimentet), kan höghastighetscentrifugering (2 000 g 
i 10 minuter) användas i stället för filtrering. 
Filtratet eller centrifugatet behandlas på det sätt som beskrivs i tillägg 3 för 
ofiltrerade prover. Lös upp membranfiltret i en lämplig scintillationsvätska och 
räkna på vanligt sätt. Normalt används metoden med extern standardkvot för att 
korrigera för quenching, eller också behandlas provet med ett oxidationsmedel. Om centrifugering har använts, resuspenderas den pellet som bildats av par ­
tikelfraktionen i 1–2 ml destillerat vatten och överförs till en scintillationsflaska. 
Därefter sköljs två gånger med 1 ml destillerat vatten och sköljvattnet överförs 
till flaskan. Vid behov kan suspensionen läggas i en gel för vätske-scintillations ­
räkning.
 ▼M1 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1348
 
Tillägg 2  
Semikontinuerligt förfarande  
En förlängd inkubering upp till flera månader kan krävas för att få en tillräcklig 
nedbrytning av svårnedbrytbara ämnen. Testet bör normalt inte pågå i mer än 60 dygn om inte det ursprungliga vattenprovets egenskaper bibehålls genom för ­
nyelse av testsuspensionen. Testperioden kan dock utsträckas till högst 90 
dygn utan förnyelse av testsuspensionen om testsubstansen har börjat brytas ned under de första 60 dygnen. 
Om inkubationen varar lång tid kan mikroorganismsamhällets diversitet minska 
på grund av olika förlustmekanismer och på grund av att viktiga näringsämnen 
och primära kolsubstrat i vattenprovet förbrukas. Därför rekommenderas att ett 
semikontinuerligt test används för att på ett tillfredsställande sätt bestämma ned ­
brytningshastigheten för ämnen som bryts ned långsamt. Testet bör redan från början göras med ett semikontinuerligt förfarande om, på grundval av tidigare 
erfarenhet, en inkubationstid på tre månader bedöms vara nödvändig för att 
uppnå 20 % nedbrytning av ämnet. Alternativt kan ett normalt batchtest ändras till ett semikontinuerligt test, om ingen nedbrytning av testsubstansen kan påvisas under ca 60 dygns test med batchförfarande. Det semikontinuerliga förfarandet 
kan avbrytas och testet fortsättas som ett batchexperiment när en betydande 
nedbrytning har registrerats (t.ex. > 20 %). 
I det semikontinuerliga testet ersätts varannan vecka ca en tredjedel av testsus ­
pensionen med nytaget vatten med tillsats av testsubstans till initial 
koncentration. Även sediment tillsätts det nya vattnet till initial koncentration 
(mellan 0,01 och 1 g/l) om det frivilliga suspenderat sediment-testet görs. Vid utförande av test med suspenderat fast sediment är det viktigt att ett helt sus ­
penderat system upprätthålls även vid förnyelse av vatten, och att uppehållstiden 
är identisk för fasta ämnen och vatten. I annat fall kan den avsedda likheten med 
ett homogent vattensystem utan bestämda faser utebli. Av dessa skäl rekommen ­
deras att den initiala koncentrationen av suspenderat sediment ligger i den lägre delen av det angivna intervallet när det semikontinuerliga förfarandet används. 
Den föreskrivna tillsatsen av testsubstans innebär att den initiala koncentrationen 
inte överskrids genom den partiella förnyelsen av testsuspensionen och däri ­
genom undviks den adaptation som ofta ses vid höga koncentrationer av testsub ­
stansen. Eftersom förfarandet innebär både en förnyad ympning och en kom ­
pensation av förbrukade näringsämnen och primära substrat, återställs den ur ­
sprungliga mikrobiella diversiteten, och testet kan i princip pågå i oändlighet. När 
det semikontinuerliga förfarandet används är det viktigt att notera att den kvar ­
varande koncentrationen av testsubstansen måste korrigeras för de mängder test ­
substans som tillförs och avlägsnas vid varje förnyelse. För lågsorberande ämnen 
kan testsubstansens totala koncentration antas vara lika med den lösta koncent ­
rationen. Sorptionen är obetydlig (< 5 %) under angivna förhållanden (0,1–1 g fasta ämnen/l) för ämnen för vilka log K
 ow < 3 (gäller för neutrala, lipofila 
föreningar). Detta illustreras av följande beräkningsexempel: 0,1 g/l av fasta 
ämnen motsvarar ungefär 10 mg kol per liter (andelen kol f  C = 0,01). Antag att 
Log K  ow (för testsubstansen) = 3 
K oc = 0,42 × K  ow 
Fördelningskoefficienten K  d = f C x K  oc 
Då är den lösta delen av den totala koncentrationen (C-vatten (C  w )/C-total (C  t ): 
C w /C t = 1/(1 + K  d × SS) = 1(1 + K  oc × f C × SS) = 1/(1 + 0,42 × 10  3 × 0,01 
× 0,1 × 10  –3 ) = 0,999  ▼M1 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1349
 
Tillägg 3  
Bestämning av  14 CO  2 
Indirekt  14 CO  2 -bestämning  
För rutinmässiga mätningar är i normala fall den indirekta metoden den minst 
tidskrävande och noggrannaste metoden om testsubstansen är icke-flyktig och 
inte omvandlas till flyktiga nedbrytningsprodukter. Ofiltrerade prover på t.ex. 
5 ml förs över till scintillationsflaskor. Lämplig aktivitet i proverna är 5 000 dpm–10 000 dpm (80–170 Bq) initialt, med en lägsta initial aktivitet på ca 1 000 dpm. CO
 2 strippas av efter surgörning till pH 2–3 med 1–2 droppar 
koncentrerad H  3 PO 4 eller HCl. CO  2 kan strippas av genom bubbling med luft i 
ca ½–1 timme. Alternativt kan flaskorna skakas kraftigt i 1–2 timmar (t.ex. på ett skakbord för mikrotiterplattor) eller mer försiktigt över natten. Effektiviteten vid strippning av CO
 2 måste kontrolleras (genom att tiden för luftning eller skakning 
förlängs). Därefter tillsätts en scintillationsvätska som är lämplig för att räkna 
vattenprov, provet homogeniseras med en virvelblandare och radioaktiviteten bestäms genom vätske-scintillationsräkning, med avdrag för den bakgrundsakti ­
vitet som uppmäts i blankproverna (F
 B ). Om testvattnet inte är kraftigt färgat och 
inte har en hög partikelkoncentration, uppvisar proverna normalt sett en enhetlig 
quenching, och det räcker då att korrigera för quenching med hjälp av en extern standard. Om testvattnet är kraftigt färgat kan det vara nödvändigt att korrigera för quenching genom tillsats av en intern standard. Om partikelkoncentrationen är 
hög kan det vara omöjligt att åstadkomma en homogen lösning eller gel, eller 
också kan det vara stor variation i quenching mellan olika prover. I så fall kan den nedan beskrivna räknemetoden för testslam användas. Om testet utförs som ett suspenderat sediment-test, kan
 14 CO 2 mätning göras indirekt genom att ett 
homogent 10 ml prov av testvatten/suspension tas ut och faserna separeras ge ­
nom centrifugering vid lämplig hastighet (t.ex. 40 000 m/s  2 i 15 minuter). Vat ­
tenfasen behandlas sedan enligt beskrivningen nedan.  14 C-aktiviteten i partikel ­
fasen (POA) bestäms genom att sedimentet resuspenderas i en liten volym des ­
tillerat vatten, överförs till scintillationsflaskor och tillsätts scintillationsvätska så 
att en gel bildas (det finns särskilda scintillationsvätskor för det ändamålet). Beroende på partiklarnas karaktär (t.ex. deras innehåll av organiskt material) kan det vara lämpligt att låta provet sönderdelas över natten med ett vävnads ­
upplösande ämne och sedan homogeniseras med en virvelblandare före tillsats av 
scintillationsvätska. Alternativt kan POA bestämmas genom förbränning i syre ­
överskott med hjälp av en provoxiderare. Vid räkning bör interna standarder alltid ingå, och det kan vara nödvändigt att korrigera för quenching genom tillsats 
av en intern standard i varje enskilt prov.
 
Direkt  14 CO  2 -bestämning  
Om den utvecklade  14 CO 2 mäts direkt bör detta göras genom att flera flaskor 
görs i ordning vid testets början, och testflaskorna provtas vid varje mättidpunkt 
genom att surgöras till pH 2–3 och  14 CO 2 tas upp i ett internt (placerat i varje 
flaska vid testets början) eller externt absorptionsmedel. Som absorptionsmedel kan användas antingen alkali (t.ex. 1 N NaOH-lösning eller en NaOH-pellet), etanolamin eller ett etanolaminbaserat absorptionsmedel eller kommersiellt till ­
gängliga absorptionsmedel. För direkt mätning av
 14 CO 2 , bör flaskorna vara 
förslutna med exempelvis butylgummimembran.  ▼M1 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1350
 
Figur 1a  
Exempel på ett aritmetiskt diagram över data (kvarvarande aktivitet avsatt mot tid)
  
Figur 1b  
Exempel på ett halvlogaritmiskt diagram över data (ln kvarvarande aktivitet avsatt mot tid)
  ▼M1 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1351
 
C.26.  BESTÄMNING AV TILLVÄXTHÄMNING HOS FLYTBLADS ­
VÄXTEN  LEMNA  SP. (ANDMAT)  
1. METOD  
Metoden motsvarar OECD TG 221 (2006) (1). Det finns ett brett 
samförstånd hos EU:s myndigheter om att  Lemna -testet är ett lämp ­
ligt alternativ till ett algtest för kraftigt färgade substanser (2)(3).  
1.1 INLEDNING 
Metoden är avsedd för bestämning av substansers toxicitet mätt som 
tillväxthämning hos sötvattensväxter av släktet  Lemna  (andmat). Me ­
toden bygger på existerande standardmetoder (4, 5, 6, 7, 8 och 9) 
som har modifierats enligt nya forskningsrön och genom samråd, i 
regel mellan experter. Den föreslagna metoden har validerats genom ett internationellt ringtest, dvs. en provningsjämförelse mellan olika 
laboratorier i världen (10). 
Metoden används för toxicitetstest med hjälp av  Lemna gibba  och  
Lemna minor . Båda dessa arter har studerats ingående och har an ­
vänts i test med de standardmetoder som det hänvisas till ovan. 
Taxonomin för  Lemna  spp. är komplicerad på grund av mångfalden 
fenotyper. Hos  Lemna  kan responsen på toxiska substanser variera 
på grund av genetiska skillnader, men för närvarande saknas det tillräckligt med underlag om dessa orsaker för att man ska kunna 
rekommendera en bestämd klon för användning med den aktuella 
metoden. Observera att testet inte utförs axeniskt (dvs. med en- arts-kultur fri från infektion av mikroorganismer), men åtgärder vid ­
tas i skeden under testets gång för att hålla kontamination från andra 
organismer så låg som möjligt. 
Dokumentet innehåller ingående beskrivningar av semistatiskt test ­
förfarande (med regelbunden förnyelse av testlösningar), statiskt test ­
förfarande (utan förnyelse av testlösningar) och genomflödestest 
(med kontinuerligt byte av testlösning). Beroende på lagstadgade krav och syftet med testet kan semistatiskt testförfarande eller ge ­
nomflödestest komma i fråga i vissa fall, t.ex. för substanser som 
snabbt försvinner ur lösningen genom avdunstning, ljusnedbrytning, 
utfällning eller biologisk nedbrytning. Närmare riktlinjer finns i (11).
 
1.2 DEFINITIONER 
I denna metodbeskrivning används följande definitioner och förkort ­
ningar med de betydelser som här anges:  
biomassa : torrvikt av levande materia i en population. I detta test 
mäts vanligtvis ersättningsmått för vikten, som t.ex. antalet fronder (bladliknande del av planta) eller deras totala area. Termen ”biomas ­
sa” hänför sig således även till dessa ersättningsmått.  
EC
 x : beteckning på den koncentration av testsubstansen som är löst i 
testmediet och som reducerar tillväxten av  Lemna  med x % (t.ex. 
50 %) inom en bestämd exponeringstid, som måste specificeras om 
den avviker från den fullständiga eller normala tiden för testets ge ­
nomförande. För att entydigt ange om EC-värdet bygger på tillväxt ­
hastighet eller producerad mängd biomassa används beteckningen 
E r C för tillväxthastighet och E  y C för producerad mängd biomassa, 
åtföljt av mätvariabeln, t.ex. E  r C (n), där n = ”antal fronder”.  
effektmått (eng. ” endpoint ”): den allmänna faktor som genom in ­
verkan av en testsubstans i ett prov förändras jämfört med ett kon ­
trollprov utan testsubstans. I det aktuella testet är effektmåttet till ­
växthämning, som kan uttryckas med olika responsvariabler baserade på en eller flera mätvariabler.  
fenotyp : observerbara egenskaper hos en organism vilka bestäms av 
interaktionen mellan organismens gener och dess omgivning.
 ▼M1 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1352
 
frond : enskild bladliknande del av andmatsplantans struktur. Det är 
den minsta enhet, dvs. individ, som har förökningsförmåga.  
genomflödestest : testlösningen ersätts hela tiden kontinuerligt med 
färsk lösning.  
klon : organism eller cell som uppstått från en enskild individ genom 
asexuell (vegetativ) förökning. Individer från samma klon är därför 
genetiskt identiska.  
kloros : gulning av bladvävnad.  
koloni : samling av moder- och dotterfronder (vanligtvis 2–4 stycken) 
som sitter fast vid varandra. Ibland används termen ”planta”.  
koncentration utan observerad effekt (”NOEC – No Observed 
Effect Concentration”) : koncentration av testsubstansen som ligger 
omedelbart under LOEC.  
lägsta koncentration med observerad effekt (”LOEC – Lowest 
Observed Effect Concentration”) : den lägsta koncentration av test ­
substansen vid vilken man kan iaktta att den har en statistiskt sig ­
nifikant reducerande effekt på tillväxten (vid p < 0,05) inom en given exponeringstid, jämfört med ett kontrollprov (i fortsättningen kortfattat benämnt ”kontroll”). Ytterligare ett villkor är att alla kon ­
centrationer av testsubstansen vilka ligger över LOEC måste ha en 
skadlig effekt lika med eller större än den effekt som observeras vid LOEC. Om dessa båda dessa villkor inte är uppfyllda, måste en fullständig redogörelse lämnas för hur LOEC (och därmed NOEC) 
har valts.  
monokultur : kultur bestående av en enda art.  
mätvariabler : alla slags variabler som mäts för att uttrycka testets 
effektmått med hjälp av en eller flera responsvariabler. I den aktuella metoden är frondantal, total frondarea, färskvikt och torrvikt mätva ­
riabler.  
nekros : död bladvävnad. Syns på att den är vit eller vattenindränkt.  
producerad mängd biomassa : storleken på en mätvariabel för bio ­
massa vid exponeringstidens slut minskad med storleken på samma 
mätvariabel vid exponeringstidens början.  
responsvariabel : variabel för bestämning av toxicitet. Variabeln fås 
fram genom att man använder olika beräkningsmetoder på mätvari ­
abler som beskriver biomassa. I den aktuella metoden är tillväxthas ­
tighet och producerad mängd biomassa responsvariabler som beräk ­
nas med hjälp av mätvariabler såsom frondantal, total frondarea, 
färskvikt eller torrvikt.  
semistatiskt testförfarande (med regelbunden förnyelse av test ­
lösning) : testlösningen byts med bestämda intervall under testet, dvs. 
förbrukad lösning tas regelbundet bort och ersätts med färsk.  
statiskt testförfarande : testlösningen byts inte under testet.  
svullen frond : frond med ”buckligt” eller svullet utseende.
 ▼M1 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1353
 
testmedium : syntetiskt odlingsmedium där testplantorna befinner sig 
när de exponeras för testsubstansen. Testsubstansen är normalt löst i 
testmediet.  
tillväxt : ökning av en mätvariabel – t.ex. frondantal, torrvikt, våtvikt 
eller total frondarea – mätt över tiden för testets genomförande.  
tillväxthastighet (genomsnittlig specifik tillväxthastighet) : logarit­
misk ökning av mängden biomassa under exponeringstiden.  
1.3 PRINCIPER 
Exponentiellt växande växtkulturer av släktet  Lemna  får växa som 
monokulturer i olika koncentrationer av testsubstansen under loppet av sju dagar. Syftet är att genom bestämning av mätvariabler kvan ­
tifiera testsubstansens effekter på tillväxten under tiden för testets ge ­
nomförande. Antalet fronder är den primära mätvariabeln. Minst ytter ­
ligare en mätvariabel – total frondarea, torrvikt eller färskvikt – mäts, eftersom en del substanser kan påverka andra mätvariabler mer än de 
påverkar frondantalet. För att kvantifiera testsubstansens effekter jäm ­
förs tillväxten i testlösningarna med tillväxten i kontrollerna. Därefter bestäms den koncentration som åstadkommer en bestämd procent (x) av tillväxthämning, t.ex. 50 %. Denna koncentration betecknas som 
EC
 x , t.ex. EC  50 i fallet med 50 % tillväxthämning. 
Effektmåttet i testet är tillväxthämningen uttryckt som den logarit ­
miska ökningen av mätvariabeln – dvs. den genomsnittliga specifika 
tillväxthastigheten – under exponeringstiden. Med hjälp av de ge ­
nomsnittliga specifika tillväxthastigheter som registrerats i en serie testlösningar bestäms den koncentration som åstadkommer en be ­
stämd procent (x) av tillväxthämning, t.ex. 50 %. Denna koncent ­
ration betecknas som E
 r C x , t.ex. E  r C 50 i fallet 50 %. 
Ytterligare en responsvariabel som används i metoden är den pro ­
ducerade mängden biomassa, en variabel som i vissa länder är fö ­
reskriven i lagen. Den definieras som storleken på en mätvariabel för 
biomassa vid exponeringstidens slut minskad med storleken på 
samma mätvariabel vid exponeringstidens början. Med hjälp av den producerade mängd biomassa som registrerats i en serie testlös ­
ningar bestäms den koncentration som åstadkommer en bestämd 
procent (x) av tillväxthämning, t.ex. 50 %. Denna koncentration 
betecknas som E
 y C x , t.ex. E  y C 50 i fallet 50 %. 
Utöver detta kan man statistiskt bestämma den lägsta koncentratio ­
nen med observerad effekt (LOEC) och koncentrationen utan obser ­
verad effekt (NOEC).  
1.4 TESTSUBSTANS 
Man bör ha tillgång till en analysmetod som är tillräckligt känslig för 
kvantitetsbestämning av testsubstansen i testmediet.  ▼M1 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1354
 
Bland annat följande uppgifter om testsubstansen kan vara av värde 
när man fastställer testbetingelserna: strukturformel, renhetsgrad, vat ­
tenlöslighet, stabilitet i vatten och ljus, pK  a , K ow , ångtryck och bio ­
logisk nedbrytbarhet. Löslighet i vatten och ångtryck kan användas för att beräkna Henrys konstant. Storleken på denna konstant visar 
om det är sannolikt att förlusterna av testsubstansen under tiden för 
testets genomförande kommer att vara betydande, och om man be ­
höver vidta åtgärder för att behärska dessa förluster. Om uppgifterna om testsubstansens löslighet och stabilitet är osäkra, bör man bedöma 
dessa egenskaper under testbetingelserna, dvs. i det odlingsmedium, 
vid den temperatur och under de belysningsförhållanden som an ­
vänds i testet. 
När det är särskilt viktigt att reglera testmediets pH, t.ex. vid test av 
hydrolytiskt instabila metaller eller substanser (dvs. sådana som bryts ned i vatten), bör man tillsätta en buffert i odlingsmediet (se första 
stycket i avsnitt 1.7.4). Ytterligare vägledning för test av substanser 
med fysikalisk-kemiska egenskaper som gör dem besvärliga att testa finns i (11).
 
1.5 REFERENSSUBSTANS 
En eller flera referenssubstanser – t.ex. 3,5-diklorfenol som används i 
det internationella ringtestet (10) – bör testas för att kontrollera test ­
resultatens giltighet. En referenssubstans bör testas minst två gånger per år. Om testen utförs mer sällan bör referenssubstansen testas 
direkt i samband med respektive test.
 
1.6 KRITERIER FÖR TESTRESULTATENS GILTIGHET 
För att testresultaten ska vara giltiga måste fördubblingstiden för 
frondantalet i kontrollen vara mindre än 2,5 dagar (60 timmar). 
Det motsvarar en ökning på ca 700 % på 7 dagar och en genomsnitt ­
lig specifik tillväxthastighet på 0,275 d  –1 . Med de testmedier och 
testbetingelser som beskrivs för den aktuella metoden kan detta kri ­
terium uppfyllas med statiskt testförfarande (8). Kriteriet bör också 
kunna uppfyllas vid semistatiskt testförfarande och genomflödestest. Beräkningen av fördubblingstiden beskrivs i avsnitt 2.1.
 
1.7 METODBESKRIVNING  
1.7.1  Utrustning  
All utrustning som befinner sig i kontakt med testmedier ska vara av 
glas eller annat kemiskt inert material. Glasutrustning, som används för odling och test, ska vara rengjord från kemiska föroreningar som 
kan läcka in i testmediet, och glaset ska vara sterilt. Provkärlen ska 
vara så vida att fronderna från de olika kolonierna i kontrollerna kan växa utan att de täcker varandra i slutet av testet. Det gör inget om rötterna vidrör botten av provkärlen, men alla provkärl bör vara 
minst 20 mm djupa och ha en volym på minst 100 ml. Så länge 
dessa krav är uppfyllda har valet av provkärl ingen avgörande bety ­
delse. Glasbägare och kristalliseringsskålar samt Petriskålar av glas – alla med passande storlekar – har alla visat sig vara lämpliga. Prov ­
kärlen måste vara tillslutna för att avdunstning och oavsiktlig kon ­
tamination ska hållas så låg som möjlig, samtidigt som erforderlig luftväxling ska vara möjlig. Provkärlen – framför allt lock, proppar eller andra typer av förslutningar – måste vara sådana att det inte 
förekommer någon skuggverkan eller förändringar av ljusets spek ­
trala egenskaper.
 ▼M1 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1355
 
Odlingar och provkärl får inte förvaras tillsammans. Bäst är att an ­
vända separata klimatkammare, inkubatorer eller klimatrum. Belys ­
ning och temperatur måste kunna regleras och hållas på konstant nivå (se avsnitt 1.7.8).
 
1.7.2  Testorganism  
Som organism för testet används  Lemna gibba  eller  Lemna minor . 
Tillägg 1 innehåller kortfattade beskrivningar av andmatsarter som 
har använts för toxicitetstest. Växtmaterial kan tas från en kultur ­
samling, införskaffas från ett annat laboratorium eller samlas in i naturen. Plantor som samlas in i naturen ska under minst 8 veckor hållas i samma medium som används för testet. Det får inte finnas 
några uppenbara kontaminationskällor på platser som används för 
insamling i naturen. Växtmaterial som införskaffas från andra labo ­
ratorier eller från kultursamlingar ska förvaras under minst 3 veckor på samma sätt som för plantor från naturen. Man ska alltid redovisa 
ursprunget – om det är känt – för växtmaterialet, de arter och den 
klon som används för testet. 
Man ska använda monokulturer utan synliga föroreningar i form av 
andra organismer såsom alger och protozoer. Friska plantor av  L. 
minor  består av kolonier med 2–5 fronder, medan friska kolonier av  
L. gibba  kan omfatta upp till 7 fronder. 
Kvaliteten och enhetligheten hos plantorna som används för testet 
har ett stort inflytande på testresultatet, och de bör därför väljas ut med omsorg. Unga, snabbväxande plantor utan synliga skador eller 
missfärgningar (på grund av kloros) ska användas. Att en kultur är 
högvärdig syns på att den har en stor andel kolonier med minst 2 fronder. Ett stort antal enstaka fronder är ett tecken på miljöstress, t.ex. på grund av näringsbrist. Använd inte växtmaterial från sådana 
kulturer för test.
 
1.7.3  Odling  
För att göra odlingen mindre arbetskrävande – t.ex. när inga test av  
Lemna  är inplanerade under en längre tid – kan kulturerna förvaras 
under reducerad belysning och temperatur (4–10 °C). Närmare upp ­
gifter om detta och andra uppgifter om behandling av stamkulturer 
finns i tillägg 2. Om det märks tydliga tecken på föroreningar i form 
av alger eller andra organismer krävs ytsterilisering av ett delprov av fronder från  Lemna . Det förs sedan över till färskt medium (se 
tillägg 2). I detta fall måste den återstående delen av den kontami ­
nerade kulturen kasseras. 
Minst 7 dagar före testet förs en tillräcklig mängd kolonier aseptiskt 
över till färskt medium och odlas under 7–10 dagar under testbeting ­
elser.
 
1.7.4  Testmedier  
För Lemna minor  och Lemna gibba , rekommenderas olika medier (se 
nedan). Man bör noggrant överväga om man ska tillsätta en pH- 
buffert i testmediet: MOPS [(4-morfolino)propansulfonsyra, CAS- 
nr 1132–61–2; Einecs-nr 214–478–5] i mediet för  L. minor  och 
NaHCO  3 i mediet för  L. gibba  när man misstänker att mediet kan 
reagera med testsubstansen och påverka dess toxicitetseffekt. Stein ­
bergs medium (12) kan också användas förutsatt att kriterierna för 
testresultatens giltighet är uppfyllda.  ▼M1 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1356
 
En modifierad form av det odlingsmedium för  Lemna  som är stan ­
dardiserat av det svenska standardiseringsorganet SIS rekommende ­
ras för odling och test med  L. minor . Sammansättningen av detta 
medium återfinns i tillägg 3. 
Odlingsmediet 20X-AAP, som beskrivs i tillägg 3, rekommenderas 
för odling och test med  L. gibba . 
Steinbergs medium, som beskrivs i tillägg 3, passar också för  L. 
minor  men kan också användas för  L. gibba  så länge kriterierna 
för testresultatens giltighet är uppfyllda.  
1.7.5  Testlösningar  
Testlösningarna bereds vanligtvis genom utspädning av en stamlös ­
ning. Stamlösningar av testsubstansen bereds normalt genom att sub ­
stansen löses i ett odlingsmedium. 
Den högsta koncentrationen av testsubstansen bör normalt inte över ­
skrida dess vattenlöslighet under testbetingelserna. Observera dock 
att Lemna  spp. flyter på vätskeytan och kan exponeras för substanser 
som samlas i gränsytan mellan vatten och luft, t.ex. hydrofoba sub ­
stanser och substanser med låg vattenlöslighet. Under sådana om ­
ständigheter kommer plantan att exponeras för andra koncentrationer 
av substansen än de som förekommer i lösningen. Koncentrationerna 
kan därför – beroende på testsubstansens egenskaper – överskrida vattenlösligheten. För testsubstanser med låg vattenlöslighet kan det bli nödvändigt att bereda en koncentrerad stamlösning eller en dis ­
persion med hjälp av ett organiskt lösningsmedel eller dispergerings ­
medel för att underlätta tillsatsen av exakta mängder testsubstans i testmediet och bidra till dispergeringen och upplösningen av sub ­
stansen. Man ska därför så långt som möjligt undvika att använda 
sådana substanser. Det får inte uppstå fytotoxicitet genom att man 
tvingas använda lösnings- eller dispergeringsmedel för att bereda testlösningen. Exempel på vanliga lösningsmedel, som inte förorsa ­
kar fytotoxicitet vid koncentrationer upp till 100 μl/l, är aceton och 
dimetylformamid. Om ett lösnings- eller dispergeringsmedel an ­
vänds, bör dess slutkoncentration redovisas och hållas så låg som möjligt (≤ 100 μl/l). Alla test- och kontrollösningar bör ha samma 
koncentration av lösnings- eller dispergeringsmedel. Mer information 
om användningen av dispergeringsmedel finns i (11).
 
1.7.6  Test- och kontrollgrupper  
Förkunskap om testsubstansens toxicitet för  Lemna , t.ex. erhållen 
genom ett förberedande test av koncentrationsintervallet för toxicite ­
ten, underlättar valet av lämpliga testkoncentrationer. I det slutliga 
toxicitetstestet ska det normalt finnas minst 5 koncentrationer ord ­
nade i geometrisk serie. Separationsfaktorn mellan testkoncentratio ­
nerna bör inte överskrida 3,2, men om dos-respons-kurvan är flack, 
kan en större separationsfaktor användas. Om färre än 5 koncent ­
rationer används ska en motivering lämnas. Minst 3 replikat ska användas för respektive testkoncentration. 
När man fastställer intervallet av testkoncentrationer (för det förbere ­
dande testet eller för det slutliga toxicitetstestet), ska man beakta 
följande:
 ▼M1 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1357
 
— För att bestämma en EC  x -koncentration ska värdet på EC  x ligga 
innanför intervallet av testkoncentrationer för att man ska uppnå 
en lämplig konfidensgrad. Om man t.ex. ska bestämma EC  50 , ska 
den högsta testkoncentrationen vara högre än värdet på EC  50 . 
Om värdet på EC  50 ligger utanför intervallet av testkoncentratio ­
nerna, blir motsvarande konfidensintervall stora, och då är det 
svårt att bedöma om modellen är statistiskt lämplig. 
— Om syftet är att bestämma LOEC eller NOEC, ska den lägsta 
testkoncentrationen vara så låg att tillväxten inte är märkbart mindre än tillväxten i kontrollen. Den högsta testkoncentrationen 
ska vara så hög att tillväxten är märkbart lägre än i kontrollen. 
Om dessa villkor inte är uppfyllda måste testet göras om med ett annat koncentrationsintervall (såvida inte den högsta koncent ­
rationen ligger på löslighetsgränsen eller är lika med den högsta 
erforderliga gränskoncentrationen, t.ex. 100 mg/l). 
I varje test ska ingå kontroller med samma näringsmedium, frondan ­
tal, antal kolonier, miljöbetingelser och förfaranden som för provkär ­
len, men utan testsubstans. Om ett lösnings- eller dispergeringsmedel 
används som hjälpmedel i testet, krävs ytterligare ett kontrollprov, nu 
med samma koncentration av lösnings- eller dispergeringsmedlet som i provkärlen med testsubstansen. Antalet replikatkärl med kont ­
roller – och i tillämpliga fall kärl med lösnings- eller dispergerings ­
medel – ska vara minst lika med – eller helst dubbelt så många som 
– antalet kärl som används för respektive testkoncentration. 
Om NOEC inte behöver bestämmas, får testförfarandet modifieras 
genom att öka antalet koncentrationer och minska antalet replikat per 
koncentration. Antalet kontrollreplikat måste dock vara minst tre.
 
1.7.7  Exponering  
Kolonier med 2–4 synliga fronder förs över från ympkulturen och 
fördelas slumpmässigt i provkärlen under aseptiska förhållanden. Alla provkärl ska vardera innehålla sammanlagt 9–12 fronder. Anta ­
let fronder och kolonier ska vara detsamma i alla provkärl. Erfaren ­
heter från användning av denna metod och resultat från ringtest har 
visat att 3 replikat per testlösning (testkoncentration), där alla replikat från början innehåller 9–12 fronder, är tillräckligt för att man ska upptäcka skillnader i tillväxt mellan testlösningarna på cirka 
4–7 procents tillväxthämning (beräknad enligt tillväxthastighet) 
och 10–15 procents tillväxthämning (beräknad enligt producerad mängd biomassa) (10). 
Provkärlen måste placeras slumpmässigt i inkubatorn för att mini ­
mera inflytandet av rumsbetingade skillnader i ljusintensitet och tem ­
peratur. Det krävs också blockvis fördelning eller slumpmässig omp ­
lacering av kärlen vid varje mättillfälle, eller oftare.
 ▼M1 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1358
 
Om ett förberedande stabilitetstest visar att koncentrationen av test ­
substansen inte kan upprätthållas under tiden för testets genom ­
förande (7 dagar) – dvs. den uppmätta koncentrationen sjunker under 80 % av det uppmätta startvärdet – bör semistatiskt testförfarande användas. I det fallet exponeras kolonierna för nyberedda test- och 
kontrollösningar vid minst 2 tillfällen under testet, t.ex. på dag 3 
och 5. Intervallen för byte till färskt medium beror på stabiliteten hos testsubstansen – det kan krävas kortare intervall för att upprätt ­
hålla nära nog konstanta koncentrationer av mycket instabila eller 
flyktiga substanser. I visa fall måste man använda genomflödestest 
(se 11 och 13). 
Exponering genom besprutning av fronderna ingår inte i denna test ­
metod. Besprutningsmetoden beskrivs i 14.
 
1.7.8  Inkubationsbetingelser  
Kontinuerlig belysning med varmt eller kallt vitt ljus från lysrör 
används för att åstadkomma en ljusintensitet i intervallet 85–135 μE·m
 –2 ·s –1 , varvid intensiteten ska mätas inom ett fotosyn ­
tetiskt aktivt våglängdsområde (400–700 nm) i punkter på samma 
avstånd från ljuskällan som  Lemna -fronderna (denna intensitet mot ­
svarar en belysningsstyrka på 6 500–10 000 lux). Ljusintensiteten får inte variera mer än ± 15 % över testytan. Metoden för detektering 
och mätning av ljuset – framför allt typen av ljussensor – påverkar 
mätvärdet. Sfäriska sensorer – som mäter ljuset från alla vinklar ovanför och under mätplanet – och sensorer av solsensortyp (med cosinuskoefficient för infallsvinkeln) – som mäter ljuset från alla 
vinklar ovanför mätplanet – är att föredra framför riktade sensorer. 
De förstnämnda sensorerna ger större mätutslag för en diffus ljus ­
källa av den typ som beskrivits här. 
Temperaturen i provkärlen ska vara 24 ±2 °C. pH i kontrollmediet 
får inte öka mer än 1,5 under testets gång. En avvikelse på mer än 
1,5 gör dock inte testresultaten ogiltiga om det kan visas att kriteri ­
erna för testresultatens giltighet är uppfyllda. I speciella fall – t.ex. vid test av instabila substanser eller metaller – måste förskjutningen av pH kontrolleras extra noggrant. Se vidare (11).
 
1.7.9  Tid för testets genomförande  
Testet ska avslutas 7 dagar efter det att plantorna har placerats i 
provkärlen.  
1.7.10  Mätningar och analytiska bestämningar  
Räkna och registrera frondantalet i provkärlen vid testets början. Se 
noga till att ta med alla uppstickande, väl synliga fronder. Bestäm 
antalet fronder – både sådana som framstår som normala och sådana som framstår som onormala – vid början av testet och därefter minst var tredje dag under exponeringstiden (dvs. vid minst 2 tillfällen 
under 7-dagarsperioden), samt vid slutet av testet. Registrera föränd ­
ringar i plantutvecklingen. Det kan t.ex. gälla frondstorlek; utseende; tecken på nekros, kloros eller svullna fronder; kollaps av kolonier eller försämrad flytförmåga; rötternas längd och utseende. Registrera 
också betydelsefulla inslag i testmediet, t.ex. förekomst av oupplöst 
material och algtillväxt i provkärlet.
 ▼M1 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1359
 
Utöver bestämningar av frondantalet under testet ska de effekter 
testsubstansen har på en eller flera av följande mätvariabler bestäm ­
mas: 
i) Total frondarea. 
ii) Torrvikt. 
iii) Färskvikt. 
Fördelen med variabeln ”total frondarea” är att den kan bestämmas 
för alla prov- och kontrollkärl vid början, under och vid slutet av 
testet. Torr- eller färskvikt måste bestämmas vid början av testet med hjälp av ett prov från ympkulturen som är representativt för vad som används för att starta testet, och vid slutet av testet med hjälp av 
växtmaterial från alla prov- och kontrollkärl. Om frondarean inte 
bestäms, är mätning av torrvikten att föredra framför mätning av färskvikten. 
Total frondarea, torrvikt och färskvikt kan bestämmas på följande sätt: 
i) Total frondarea : Den sammanlagda frondarean hos alla kolonier 
bestäms genom bildanalys. Med en videokamera registrerar man 
en silhuett av provkärlet och plantorna (kärlet kan t.ex. vara 
placerat på en ljuslåda). Därefter digitaliseras bilderna. Genom kalibrering med plana former med känd area kan man sedan bestämma den totala frondarean i kärlet. Fel orsakade av inver ­
kan av provkärlets överkant måste undvikas. En annan, mer 
arbetskrävande metod är att ta en fotokopia av provkärlet och plantorna, klippa ut den silhuett som kolonierna bildar och sedan bestämma deras area med hjälp av en bladytemätare eller milli ­
meterpapper. Andra metoder – t.ex. bestämning av viktsförhål ­
landet mellan koloniernas silhuettyta och en ytenhet – kan också vara ändamålsenliga. 
ii) Torrvikt : Alla kolonier samlas in från respektive provkärl och 
sköljs med destillerat eller avjoniserat vatten. Överskottsvattnet avlägsnas från kolonierna, t.ex. genom uppsugning med filter ­
papper, och de torkas sedan vid 60 °C tills vikten inte längre 
minskar. Även rotfragment måste tas med. Torrvikten bestäms med en noggrannhet på minst 0,1 mg. 
iii) Färskvikt : Alla kolonier förs över till förvägda provrör av poly ­
styren (eller annat inert material) med små (1 mm) hål i de 
rundade bottnarna. Provrören centrifugeras vid 
3 000 varv/minut under 10 minuter vid rumstemperatur. Provrö ­
ren, som nu innehåller torra kolonier, vägs på nytt. Färskvikten fås fram genom att subtrahera det tomma provrörets vikt.
 
1.7.10.1  Mätfrekvens och analytiska bestämningar  
Vid statiskt testförfarande mäts pH i alla testlösningar (testkoncent ­
rationer) vid början och slutet av testet. Vid semistatiskt testför ­
farande mäts pH i varje färsk testlösning och motsvarande förbru ­
kade lösning.  ▼M1 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1360
 
Ljusintensiteten ska mätas i klimatkammaren, inkubatorn eller kli ­
matrummet i punkter på samma avstånd från ljuskällan som  Lemna - 
fronderna har. Mätningar ska göras minst 1 gång under testets ge ­
nomförande. Temperaturen hos mediet i ett särskilt kärl med enbart testmedium, som hålls under samma betingelser i klimatkammaren, 
inkubatorn eller klimatrummet, ska registreras minst 1 gång per dag. 
Under testets gång bestäms koncentrationerna av testsubstansen med 
lämpliga intervall. Vid statiskt testförfarande är minimikravet att kon ­
centrationerna ska bestämmas vid början och slutet av testet. 
Om man vid semistatiskt testförfarande bedömer att koncentrationen 
av testsubstansen inte kommer att ligga kvar inom ± 20 % av den nominella koncentrationen, måste man analysera alla nyberedda test ­
lösningar liksom alla förbrukade lösningar efter byte till ny färsk 
lösning (se tredje stycket i avsnitt 1.7.7). För test, där den uppmätta startkoncentrationen av testsubstansen inte ligger inom ± 20 % av det nominella värdet – dvs. det värde som bestäms vid beredningen – 
men där det på ett tillfredsställande sätt kan påvisas att startkoncent ­
rationerna är repeterbara och stabila – dvs. att de ligger inom inter ­
vallet 80–120 % av startkoncentrationen – räcker det med att ke ­
miska bestämningar utförs enbart för de högsta och lägsta testkon ­
centrationerna. I samtliga fall behöver bestämning av testsubstansens 
koncentrationer före byte till färsk testlösning bara utföras på ett enda replikatkärl för varje testkoncentration (eller på det samlade innehållet från samtliga replikat för respektive testkoncentration). 
Vid genomflödestest kan man använda ett liknande förfarande som 
vid semistatiskt testförfarande – inklusive analys vid början, halv ­
vägs igenom testet och vid slutet av testet – men i detta fall har mätning av förbrukade lösningar inte relevans. Vid genomflödestest ska daglig kontroll göras av flödeshastigheten hos spädningsmedlet 
och testsubstansen, eller stamlösningen av testsubstansen. 
Om man kan påvisa att koncentrationen av testsubstansen under hela 
testets gång på ett tillfredsställande sätt har hållit sig inom ± 20 % av den nominella eller uppmätta startkoncentrationen, kan analysen av resultaten baseras på nominella eller uppmätta startvärden. Om av ­
vikelsen från den nominella eller uppmätta startkoncentrationen är 
större än ± 20 %, ska analysen av resultaten baseras på det geo ­
metriska medelvärdet av koncentrationen under exponeringen, eller på modeller som beskriver den avtagande koncentrationen av test ­
substansen (11).
 
1.7.11  Gränstest  
Under vissa omständigheter – t.ex. när ett förberedande test tyder på 
att testsubstansen inte har några toxiska effekter vid koncentrationer 
upp till 100 mg/l – eller upp till dess löslighetsgräns i testmediet om den gränsen är lägre – kan man utföra ett gränstest. Man jämför då responsen mellan en kontrollgrupp och en testgrupp (med en kon ­
centration på 100 mg/l eller lika med löslighetsgränsen). Jämförelsen 
måste underbyggas med en analys av exponeringskoncentrationen, dvs. den verkliga koncentrationen som kan variera över tiden för testets genomförande. Det gör man för att se till att den nominella 
koncentrationen är lika med den faktiska testkoncentrationen. Alla 
testbetingelser samt kriterier för testresultatens giltighet som beskri ­
vits tidigare gäller även för gränstest, med undantaget att antalet testreplikat ska vara dubbelt så stort. Tillväxten i kontrollgruppen 
och testgruppen kan analyseras med en statistisk metod för jäm ­
förelse av medelvärden, t.ex. t-test (”Students t-test”).
 ▼M1 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1361
 
2. BERÄKNINGAR OCH STATISTISKA METODER  
2.1 FÖRDUBBLINGSTID 
Fördubblingstiden (T  d ) för frondantalet är ett kriterium på testresul ­
tatens giltighet (se avsnitt 1.6). Den bestäms med hjälp av värdet på 
den genomsnittliga specifika tillväxthastigheten i kontrollkärlen ( μ): 
T d = ln 2/μ 
Bestämningen av μ beskrivs i första och andra styckena i 
avsnitt 2.2.1 nedan.  
2.2 RESPONSVARIABLER 
Syftet med testet är att bestämma testsubstansens effekter på tillväx ­
ten av  Lemna . Två responsvariabler används eftersom lagbestämmel ­
ser och etablerade variabler skiljer sig åt mellan medlemsstaterna. 
För att testresultaten ska kunna godtas i samtliga medlemsstater ska effekterna bedömas med hjälp av båda de responsvariabler (a och b) 
som beskrivs nedan. 
a) Genomsnittlig specifik tillväxthastighet . Beräknas med hjälp av 
två tillväxtvariabler: 1) den tidsmässiga förändringen av det loga ­
ritmiska värdet av frondantalet, och 2) den tidsmässiga föränd ­
ringen av det logaritmiska värdet av en andra variabel, som kan 
vara total frondarea, torrvikt eller färskvikt. Variablerna bestäms i kontrollerna och respektive testgrupp, dvs. grupp av provkärl med samma testkoncentration. Tiden uttrycks i dagar. Denna respon ­
svariabel kallas ibland relativ tillväxthastighet (15). 
b) Producerad mängd biomassa . Beräknas med hjälp av förändring ­
arna av frondantalet och förändringarna av en andra variabel, som 
kan vara total frondarea, torrvikt eller färskvikt. Förändringarna 
bestäms i kontrollerna och respektive testgrupp ända till slutet av testet. 
Observera att de värden på toxiciteten som beräknas med hjälp av 
dessa två responsvariabler inte är jämförbara, och man måste ha 
denna skillnad i åtanke när man använder resultaten från testet. EC
 x -värden som grundar sig på den genomsnittliga specifika tillväxt ­
hastigheten (E  r C x ) är i allmänhet högre än de som grundar sig på den 
producerade mängden biomassa (E  y C x ) om de föreskrivna testbeting ­
elserna är uppfyllda. Detta ska inte tolkas som en skillnad i mätkäns ­
lighet mellan de två responsvariablerna – skillnaden beror bara på att värdena erhållits på två olika sätt. Responsvariabeln ”genomsnittlig 
specifik tillväxthastighet” grundar sig på den allmänna exponentiella 
tillväxtutvecklingen hos andmat i obegränsade kulturer, där toxicite ­
ten bestäms på basis av testsubstansens inverkan på tillväxthastighe ­
ten, oberoende av den absoluta nivån på den specifika tillväxthas ­
tigheten i kontrollen, responskurvans lutning och tiden för testets 
genomförande. Responsvariabeln ”producerad mängd biomassa” är däremot beroende av alla de tre sistnämnda variablerna. E
 y C x är 
beroende både av den specifika tillväxthastigheten hos de andmat ­
sarter som används i de enskilda testen och av den maximala spe ­
cifika tillväxthastigheten, som kan variera mellan olika arter, och till och med mellan olika kloner. Responsvariabeln ”producerad mängd biomassa” får inte användas för jämförelser av känsligheten för tox ­
iska substanser mellan olika andmatsarter, inte ens mellan olika klo ­
ner. Ur vetenskaplig synpunkt är värdet på den genomsnittliga spe ­
cifika tillväxthastigheten att föredra för bestämning av toxiciteten. Toxicitetsbestämning med hjälp av värdet på producerad mängd bio ­
massa har tagits med i testmetoden för att tillgodose vissa länders 
nuvarande lagstiftningskrav.
 ▼M1 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1362
 
Toxiciteten bestäms med hjälp av två tillväxtvariabler: 1) frondantal, 
och 2) total frondarea, torrvikt eller färskvikt. Att två variabler an ­
vänds beror på att vissa substanser kan ha mycket större effekt på andra mätvariabler än på frondantalet. Om man bara höll sig till frondantalet skulle man inte märka detta förhållande. 
Frondantal samt övriga registrerade mätvariabler för respektive mät ­
tillfälle – t.ex. total frondarea, torrvikt eller färskvikt – förs in i en tabell tillsammans med koncentrationerna av testsubstansen. De ef ­
terföljande beräkningarna, för att bestämma t.ex. LOEC, NOEC eller 
EC
 x , ska grundas på värdena för de enskilda replikaten, inte på 
beräknade medelvärden för respektive testgrupp.  
2.2.1  Genomsnittlig specifik tillväxthastighet  
Den genomsnittliga specifika tillväxthastigheten för en given tids ­
period beräknas som den logaritmiska ökningen av två tillväxtvari ­
abler: frondantal och ytterligare en variabel (total frondarea, torrvikt 
eller färskvikt). Använd nedanstående formel för alla replikat av 
kontroll- och testlösningar:  
μ iÄj ¼ ln ðN j Þ – ln ðN i Þ 
t 
där: 
– μ i–j är genomsnittlig specifik tillväxthastighet från tidpunkten i till 
tidpunkten j, 
– N  i är värdet på tillväxtvariabeln i prov- respektive kontrollkärlet 
vid tidpunkten i, 
– N  j är värdet på tillväxtvariabeln i prov- respektive kontrollkärlet 
vid tidpunkten j, 
– t är tidslängden mellan tidpunkterna i och j. Beräkna ett medelvärde av tillväxthastigheten för varje testgrupp och 
kontrollgrupp tillsammans med variansskattningar. 
Den genomsnittliga specifika tillväxthastigheten ska beräknas för 
hela tiden för testets genomförande – ”i” i formeln betecknar början av tiden för testets genomförande, och ”j” slutet. Beräkna ett medel ­
värde av den genomsnittliga tillväxthastigheten för varje testkoncent ­
ration och kontrollgrupp tillsammans med variansskattningar. Bestäm 
dessutom tillväxthastigheten för flera intervall av exponeringstiden för att kunna bedöma testsubstansens tidsberoende effekt, t.ex. ge ­
nom analys av logaritmiska tillväxtkurvor. Stora skillnader mellan 
tillväxthastigheten i respektive intervall och genomsnittsvärdet tyder 
på en avvikelse från exponentiell tillväxt, och att tillväxtkurvorna måste studeras närmare. Vid en konservativ bedömning kan man i detta fall jämföra testlösningarnas specifika tillväxthastigheter under 
det tidsintervall som har den största tillväxthämningen med tillväxt ­
hastigheterna för kontrollerna under samma tidsintervall.
 ▼M1 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1363
 
Den procentuella tillväxthämningen (I  r ) beräknas sedan för varje 
testkoncentration (testgrupp) med formeln  
% I r ¼ ðμ C – μ T Þ 
μ C Ü 100  
där: 
– % I  r är den procentuella reduktionen av den genomsnittliga spe ­
cifika tillväxthastigheten, 
– μ C är medelvärdet av μ i kontrollgruppen, 
– μ T är medelvärdet av μ i testgruppen.  
2.2.2  Producerad mängd biomassa  
Effekterna på den producerade mängden biomassa bestäms med 
hjälp av två mätvariabler, varav den ena är frondantalet, och den andra någon av variablerna total frondarea, torrvikt eller färskvikt. 
Mätningarna görs vid början och slutet av testet. För torrvikt och 
färskvikt bestäms den initiala biomassan med hjälp av ett prov be ­
stående av fronder från samma kultur som används för att ympa provkärlen (se andra stycket i avsnitt 1.7.3). Beräkna ett medelvärde 
av den producerade mängden biomassa för varje testkoncentration 
och kontroll tillsammans med variansskattningar. Den genomsnittliga procentuella reduktionen av den producerade mängden biomassa (% I
 y ) beräknas för varje testgrupp med formeln  
% I y ¼ ðb C – b T Þ 
b C Ü 100  
där: 
– % I  y är den procentuella reduktionen av den producerade mäng ­
den biomassa, 
– b  C är slutlig biomassa minus initial biomassa för kontrollgrup ­
pen, 
– b  T är slutlig biomassa minus initial biomassa för testgruppen.  
2.2.3  Plottning av dos-respons-kurvor  
Dos-respons-kurvor ska plottas med den genomsnittliga procentuella 
hämningen av responsvariabeln (I  r eller I  y ) längs y-axeln och loga ­
ritmen av testsubstansens koncentration längs x-axeln. (I  r och I  y be­
räknas enligt avsnitt 2.2.1 respektive 2.2.2 ovan.)  
2.2.4  Bestämning av EC  x 
Bestämningar av EC  x – t.ex. EC  50 – ska baseras både på genomsnitt ­
lig specifik tillväxthastighet (E  r C x ) och på producerad mängd bio ­
massa (E  y C x ). De sistnämnda två responsvariablerna ska i sin tur 
bestämmas med hjälp av frondantal och en ytterligare mätvariabel (total frondarea, torrvikt eller färskvikt). Orsaken till att man ska 
använda två mätvariabler är att det finns testsubstanser vars inverkan 
på frondantalet skiljer sig åt från inverkan på andra mätvariabler. Toxicitetsparametrarna bör därför vara 4 EC
 x -värden för varje beräk ­
nad tillväxthämningsnivå x: E  r C x (frondantal), E  r C x (total frondarea, 
torrvikt eller färskvikt), E  y C x (frondantal) samt E  y C x (total frondarea, 
torrvikt eller färskvikt).  ▼M1 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1364
 
2.3 STATISTISK BEHANDLING 
Målet är att bestämma det kvantitativa förhållandet mellan koncent ­
ration och respons med hjälp av regressionsanalys. Man kan använda viktad linjär regression efter att ha gjort en linjär transformation av 
responsdata, t.ex. till probit-, logit- eller Weibullvärden (16). Icke- 
linjära regressionsmetoder är dock att föredra, eftersom de är bättre anpassade för att hantera sådana oregelbundenheter i data som inte går att undvika, liksom de hanterar avvikelser från jämna fördel ­
ningskurvor bättre. I närheten av nollpunkten (ingen tillväxthämning) 
och fullständig tillväxthämning kan sådana oregelbundenheter bli felaktigt uppförstorade genom lineariseringen och därigenom störa 
analysen (16). Observera att standardmetoder för analys med pro ­
bit-, logit- eller Weibulltransformationer är avsedda för dikotoma data (dvs. tvåpunktsfördelade data, t.ex. dödlighet–överlevnad) och därför måste modifieras för att kunna användas för data om tillväxt ­
hastighet eller producerad mängd biomassa. Speciella metoder för 
bestämning av EC
 x -värden ur kontinuerliga data återfinns i (17), 
(18) och (19). 
För varje analyserad responsvariabel används förhållandet mellan 
koncentration och responsvärde för att beräkna punktskattningar av EC
 x -värden. Om möjligt ska det 95-procentiga konfidensintervallet 
bestämmas för varje skattning. Anpassningsgraden (”goodness of 
fit”) mellan responsdata och regressionsmodellen ska bestämmas, 
antingen grafiskt eller statistiskt. Regressionsanalys ska göras på responsvärden från enskilda replikat, inte på medelvärden från test ­
grupper. 
När tillgängliga regressionsmodeller eller regressionsmetoder inte 
lämpar sig för de aktuella dataserierna kan skattningar av EC
 50 -vär­
den och konfidensintervall också bestämmas genom linjär interpola ­
tion och bootstrap (20). 
För skattning av LOEC (och därmed även av NOEC) jämförs medel ­
värden från testlösningarna med hjälp av variansanalysmetoder 
(ANOVA). Medelvärdet för respektive koncentration jämförs sedan med medelvärdet av kontrollvärdena med hjälp av en passande me ­
tod för multipeljämförelse eller trendtest, t.ex. Dunnetts eller Willi ­
ams test (21, 22, 23 och 24). Man måste avgöra om ANOVA-anta ­
gandet om varianshomogenitet är uppfyllt. Det kan göras grafiskt eller med ett etablerat test (25), t.ex. Levenes eller Bartletts test. 
Skulle antagandet inte vara uppfyllt kan man ibland korrigera för 
detta genom logaritmisk transformation av data. Om heterogeniteten i variansen är extremt stor och inte kan korrigeras genom transfor ­
mation, ska man överväga användning av analys med metoder som 
t.ex. Jonckheeres trendtest av ”step-down”-typ. Mer information om 
bestämning av NOEC finns i (19). 
Nya forskningsrön har lett till att man avråder från användning av 
NOEC-värdet. Det ska ersättas med punktskattningar av EC
 x base­
rade på regressionsanalys. För detta  Lemna -test har ännu inget pas ­
sande värde på x fastställts. Ett intervall på 10–20 % förefaller dock vara lämpligt, beroende på vilken responsvariabel som används. 
Både EC
 10 och EC  20 bör redovisas.  
3. REDOVISNING  
3.1 TESTRAPPORT 
Testrapporten ska innehålla följande uppgifter: 
Testsubstans: — Fysiskt tillstånd (gas, vätska eller fast form) och fysikalisk-ke ­
miska egenskaper, inklusive löslighetsgränsen i vatten.
 ▼M1 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1365
 
— Kemiska beteckningsuppgifter (t.ex. CAS-nummer), inklusive 
renhetsgrad. 
Testarter: — Vetenskapligt namn (om det är känt) och ursprung. 
Testbetingelser: 
— Typ av test (statiskt, semistatiskt eller genomflöde). — Startdatum och tid för testets genomförande. 
— Testmedium. 
— Beskrivning av uppställning av testet: provkärl och lock eller 
proppar (eller annan typ av förslutning); lösningsvolymer; antal 
kolonier och fronder per provkärl vid testets början. 
— Testkoncentrationer (nominella respektive uppmätta värden) och 
antal replikat per koncentration. 
— Metoder för beredning av stam- och testlösningar, med uppgift 
om användning av lösnings- eller dispergeringsmedel. 
— Temperatur under testets gång. 
— Ljuskälla, ljusintensitet och ljushomogenitet. 
— pH i test- och kontrollmedier. — Testsubstansens koncentrationer och analysmetod med relevanta 
uppgifter för kvalitetsbedömning (kontroll av testresultatens gil ­
tighet, standardavvikelser eller konfidensintervall för analyserna). 
— Metoder för bestämning av frondantal och andra mätvariabler, 
t.ex. torrvikt, färskvikt eller frondarea. 
— Alla avvikelser från den här beskrivna testmetoden. Resultat: 
— Rådata: frondantal och andra mätvariabler i alla test- och kon ­
trollprov vid respektive observation och analystillfälle. 
— Medelvärde och standardavvikelse för respektive mätvariabel. 
— Tillväxtkurvor för respektive koncentration. (Bör plottas med 
logaritmen av mätvariabeln. Se andra stycket i avsnitt 2.2.1.) 
— Fördubblingstid och tillväxthastighet i kontrollen beräknade med 
hjälp av frondantal. 
— Beräknade responsvariabler för respektive testreplikat, inklusive 
medelvärden och variationskoefficient för replikaten. 
— Diagram över förhållandet mellan koncentration och tillväxthäm ­
mande effekt. 
— Bestämningar av effektmått för toxicitet – t.ex. EC
 50 , EC  10 och 
EC 20 – och motsvarande konfidensintervall. Värden på LOEC 
och NOEC – såvida de har bestämts – och de statistiska metoder 
som använts för att bestämma dem.  ▼M1 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1366
 
— Om ANOVA har använts: storleken på märkbar effekt (t.ex. 
minsta signifikanta skillnad). 
— Tillväxtstimulans som har konstaterats i testlösningar. — Synliga tecken på fytotoxicitet samt observationer avseende test ­
lösningarna. 
— Diskussion av resultaten. Ta även upp sådan inverkan på test ­
resultatet som kan bero på avvikelser från den här beskrivna 
testmetoden.
 
4. LITTERATUR  
1. OECD TG 221 (2006).  Lemna  Sp. Growth Inhibition Test. 
2. I avsnitt 13.5.3 i EU:s Manual of Decisions från juli 2006 
redogörs närmare för användningen av  Lemna -undersökningar 
för färgade substanser. Se http://ecb.jrc.ec.europa.eu/ new-chemicals 
3. Guidance on information requirements and chemical safety as ­
sessment – Chapter R.7b: Endpoint specific guidance; Table 7.8.3 Summary of difficult substance testing issues. Se 
http://guidance.echa.europa.eu/docs/guidance_document/ 
information_requirements_en.htm?time=1234958685#A 
4. ASTM International (2003). Standard Guide for Conducting 
Static Toxicity Test With  Lemna gibba  G3. E 1415–91 (Förnyat 
godkännande 1998). s. 733–742. Återfinns i Annual Book of ASTM Standards, Vol. 11.05 Biological Effects and Environ ­
mental Fate; Biotechnology; Pesticides, ASTM, West Cons ­
hohocken, PA, USA. 
5. USEPA – United States Environmental Protection Agency 
(1996). OPPTS 850.4400 Aquatic Plant Toxicity Test Using 
Lemna spp., ”Public draft”. EPA 712-C-96–156. 8 s. 
6. AFNOR – Association Française de Normalisation (1996). XP 
T 90–337: Détermination de l’inhibition de la croissance de  
Lemna minor . 10 s. 
7. SIS – Svenska standardiseringsinstitutet (1995). Vattenunder ­
sökningar – Bestämning av tillväxthämning (7 dygn) hos flytbladsväxten  Lemna mino r, andmat. SS 02 82 13. 15 s. 
8. Environment Canada (1999). Biological Test Method: Test for 
Measuring the Inhibition of Growth Using the Freshwater Mac ­
rophyte,  Lemna minor . EPS 1/RM/37–120 s. 
9. Environment Canada (1993). Proposed Guidelines for Registra ­
tion of Chemical Pesticides: Non-Target Plant Testing and Eva ­
luation. Canadian Wildlife Service, Technical Report Series 
No. 145. 
10. Sims I., Whitehouse P. och Lacey R. (1999). The OECD  Lemna  
Growth Inhibition Test. Development and Ring-testing of draft 
OECD Test Guideline. R&D Technical Report EMA 003. WRc 
plc – Environment Agency. 
11. OECD (2000). Guidance Document on Aquatic Toxicity Tes ­
ting of Difficult Substances and Mixtures. OECD Environmen ­
tal Health and Safety Publications, Series on Testing and As ­
sessment No. 23. 
12. ISO DIS 20079. Water Quality – Determination of the Toxic 
Effect of Water Constituents and Waste Water to Duckweed 
(Lemna minor ) – Duckweed Growth Inhibition Test.
 ▼M1 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1367
 
13. Walbridge C. T. (1977). A flow-through testing procedure with 
duckweed ( Lemna minor  L.). Environmental Research Lab ­
oratory – Duluth, Minnesota 55804. US EPA Report No. EPA-600/3–77 108. September 1977. 
14. Lockhart W. L., Billeck B. N. och Baron C. L. (1989). Bio ­
assays with a floating plant ( Lemna minor ) for effects of 
sprayed and dissolved glyphosate. Hydrobiologia, 118/119, s. 
353–359. 
15. Huebert, D.B. och Shay J.M. (1993). Considerations in the 
assessment of toxicity using duckweeds. Environmental Tox ­
icology and Chemistry, 12, s. 481–483. 
16. Christensen, E.R., Nyholm, N. (1984). Ecotoxicological Assays 
with Algae: Weibull Dose-Response Curves. Env. Sci. Technol. 19, s. 713–718. 
17. Nyholm, N. Sørensen, P.S., Kusk, K.O. och Christensen, E.R. 
(1992). Statistical treatment of data from microbial toxicity 
tests. Environ. Toxicol. Chem. 11, s. 157–167. 
18. Bruce R.D. och Versteeg D.J. (1992). A statistical procedure for 
modelling continuous toxicity data. Environmental Toxicology and Chemistry, 11, s. 1485–1494. 
19. OECD (2004). Guidance Document on Statistical Analysis of 
Ecotoxicity Data. 
20. Norberg-King T.J. (1988). An interpolation estimate for chronic 
toxicity: The ICp approach. National Effluent Toxicity Assess ­
ment Center Technical Report 05–88. USEPA, Duluth, MN, USA. 
21. Dunnett, C.W. (1955). A multiple comparisons procedure for 
comparing several treatments with a control. J. Amer. Statist. Assoc., 50, s. 1096–1121. 
22. Dunnett, C.W. (1964). New tables for multiple comparisons 
with a control. Biometrics, 20, 482–491. 
23. Williams, D.A. (1971). A test for differences between treatment 
means when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics, 27, s. 103–117. 
24. Williams, D.A. (1972). The comparison of several dose levels 
with a zero dose control. Biometrics, 28, s. 510–531. 
25. Brain P. och Cousens R. (1989). An equation to describe dose- 
responses where there is stimulation of growth at low doses. 
Weed Research, 29, s. 93–96.
 ▼M1 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1368
 
Tillägg 1  
Beskrivning av  Lemna  spp.  
Den vattenväxt som i allmänt språkbruk kallas andmat –  Lemna  spp. – tillhör 
familjen  Lemnaceae  som förekommer över hela världen i ett antal arter av fyra 
släkten. Deras olika utseenden och taxonomi har beskrivits ingående (1, 2).  
Lemna gibba  och  L. minor  är arter som är vanliga i tempererade zoner och 
som ofta används i toxicitetstest. Bägge arterna lever i vatten med flytande eller nedsänkt skivlik stam (frond) utan blad. Från mitten av den undre ytan på varje frond utgår en hårfin rot.  Lemna  spp. blommar sällan – plantorna förökar sig i 
stället vegetativt genom avsnörning av fronder (3). I jämförelse med äldre plantor 
tenderar de yngre att vara blekare, ha kortare rötter och bestå av 2–3 fronder av olika storlek. Egenskaperna hos  Lemna  – enkel uppbyggnad, vegetativ förökning 
och kort generationstid – gör plantor av detta släkte mycket lämpliga för labo ­
ratorietest (4, 5). 
Eftersom känsligheten för toxisk påverkan sannolikt varierar mellan arterna, 
godtas enbart jämförelser av känsligheten inom en och samma art.
 
Litteratur – exempel på  Lemna -arter som har använts vid test  
Lemna aequinoctialis : Eklund, B. (1996). The use of the red alga  Ceramium 
strictum  and the duckweed  Lemna aequinoctialis  in aquatic ecotoxicological 
bioassays. Licentiatavhandling 1996:2. Institutionen för systemekologi, Stock ­
holms universitet.  
Lemna major : Clark, N. A. (1925). The rate of reproduction of  Lemna major  as a 
function of intensity and duration of light. J. phys. Chem., 29, s. 935–941.  
Lemna minor : United States Environmental Protection Agency (USEPA) (1996). 
OPPTS 850.4400 Aquatic Plant Toxicity Test Using  Lemna  spp., ”Public draft”. 
EPA 712-C-96-156. 8 s. 
Association Française de Normalisation (AFNOR) (1996). XP T 90–337: Déter ­
mination de l’inhibition de la croissance de  Lemna minor . 10 s. 
SIS – Svenska standardiseringsinstitutet (1995). Vattenundersökningar – Bestäm ­
ning av tillväxthämning (7 dygn) hos flytbladsväxten Lemna minor, andmat. SS 02 82 13. 15 s.  
Lemna gibba : ASTM International (2003). Standard Guide for Conducting Static 
Toxicity Test With  Lemna gibba  G3. E 1415–91 (Förnyat godkännande 1998). 
S. 733–742. 
United States Environmental Protection Agency (USEPA) (1996). OPPTS 
850.4400 Aquatic Plant Toxicity Test Using  Lemna  spp., ”Public draft”. EPA 
712-C-96–156. 8 s.  
Lemna paucicostata : Nasu, Y., Kugimoto, M. (1981).  Lemna  (duckweed) as an 
indicator of water pollution. I. The sensitivity of  Lemna paucicostata  to heavy 
metals. Arch. Environ. Contam. Toxicol., 10, s. 1959–1969.  
Lemna perpusilla : Clark, J. R. m.fl. (1981). Accumulation and depuration of 
metals by duckweed ( Lemna perpusilla ). Ecotoxicol. Environ. Saf., 5, s. 87–96.  
Lemna trisulca : Huebert, D. B., Shay, J. M. (1993). Considerations in the 
assessment of toxicity using duckweeds. Environ. Toxicol. and Chem., 12, 
s. 481–483.
 ▼M1 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1369
 
Lemna valdiviana : Hutchinson, T.C., Czyrska, H. (1975). Heavy metal toxicity and 
synergism to floating aquatic weeds. Verh.-Int. Ver. Limnol., 19, s. 2102–2111.  
Lemna -arter för test kan erhållas från följande institutioner:  
University of Toronto Culture Collection of Algae and Cyanobacteria 
Department of Botany, University of Toronto 
Toronto, Ontario, KANADA, M5S 3 B2 
Tfn +1 4169783641 Fax +1 4169785878 E-post: jacreman@botany.utoronto.ca 
Internet: http://www.botany.utoronto.ca/utcc 
North Carolina State University 
Forestry Dept Duckweed Culture Collection 
Campus Box 8002 
Raleigh, NC 27695–8002 FÖRENTA STATERNA Tfn +1 9195157572 
E-post: astomp@unity.ncsu.edu 
Institutionen före tillämpad miljövetenskap (ITM) Stockholms universitet 
SE-106 91 Stockholm SVERIGE 
Tfn +46 86747240 
Fax +46 86747636 
Federal Environmental Agency (UBA) 
FG III 3.4 
Schichauweg 58 
12307 Berlin TYSKLAND E-post: lemna@uba.de 
Internet: http://www.umweltbundesamt.de/contact.htm
 
Litteratur  
1. Hillman, W.S. (1961). The  Lemnaceae  or duckweeds: A review of the 
descriptive and experimental literature. The Botanical Review, 27, s. 221–287. 
2. Landolt, E. (1986). Biosystematic investigations in the family of duckweed 
(Lemnaceae ). Vol. 2. Geobotanischen Inst. ETH, Stiftung Rubel, Zürich, 
Schweiz. 
3. Björndahl, G. (1982). Growth performance, nutrient uptake and human utili ­
zation of duckweeds ( Lemnaceae  family). ISBN 82-991150-0-0. Norges 
lantbruksvetenskapliga forskningsråd, Universitetet i Oslo. 
4. Wang, W. (1986). Toxicity tests of aquatic pollutants by using common 
duckweed. Environmental Pollution, Ser B, 11, s. 1–14. 
5. Wang, W. (1990). Literature review on duckweed toxicity testing. Environ ­
mental Research, 52, s. 7–22.  ▼M1 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1370
 
Tillägg 2  
Behandling av stamkulturer  
Stamkulturer kan förvaras vid låga temperaturer (4–10 °C) under lång tid utan de 
behöver startas på nytt. Odlingsmediet för  Lemna  kan vara samma som det som 
används för testen, men för stamkulturer kan andra näringsrika medier användas. 
Med jämna mellanrum flyttas ett bestämt antal unga, ljusgröna plantor över 
aseptiskt till nya odlingskärl med färskt medium. Under de kalla betingelser 
som här rekommenderas kan subodling utföras i upp till tre månader långa intervall, eftersom det tar längre tid än normalt innan det uppstår överpopulation i kulturen. Man kan alltså vänta längre med att flytta över plantorna till nya 
odlingskärl för att starta en ny subkultur. 
Använd kemiskt rena (syratvättade) och sterila odlingskärl av glas. Hanteringen 
ska ske med aseptiska metoder. Om stamkulturen kontamineras av t.ex. alger eller svamp, måste man vidta åtgärder för att avlägsna de kontaminerande or ­
ganismerna. För alger och de flesta andra kontaminerande organismer kan detta 
åstadkommas genom ytsterilisering. Ett prov tas ur det kontaminerade växtmate ­
rialet och rötterna skärs av. Materialet skakas om kraftigt i rent vatten och hålls sedan nedsänkt i en lösning med 0,5 volymprocent natriumhypoklorit i mellan 30 
sekunder och 5 minuter. Växtmaterialet sköljs sedan med sterilt vatten och flyttas 
över satsvis till odlingskärl med färskt odlingsmedium. Många fronder dör av denna behandling, särskilt om exponeringstiderna är långa, men en del av de överlevande fronderna bör vara fria från kontamination. Dessa kan sedan använ ­
das för att ympa nya kulturer.
 ▼M1 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1371
 
Tillägg 3  
Odlingsmedier  
Olika odlingsmedier bör användas för  L. minor  och L. gibba . För  L. minor , bör 
ett medium enligt modifierad svensk standard (SS) användas, och för  L. gibba  
bör 20X-AAP användas. Sammansättningarna av respektive medium visas i ned ­
anstående tabell. Vid beredning av medierna ska kemikalier av reagenskvalitet 
eller p.a.-kvalitet användas, och vattnet ska vara avjoniserat.  
Odlingsmedium enligt modifierad svensk standard (SIS)  
— Sterilisera stamlösningarna I–V i autoklav (120 °C, 15 minuter) eller genom 
membranfiltrering (porstorlek ca 0,2 μm). 
— Sterilisera stamlösning VI (och i tillämpliga fall VII) genom membranfiltre ­
ring (använd inte autoklav). 
— Förvara de sterila stamlösningarna kallt och mörkt. Kassera stamlösningarna 
I–V efter 6 månader. Kassera stamlösningarna 1–V efter 6 månader. Stamlös ­
ning VI (och i tillämpliga fall VII) kan lagras i 1 månad.  
Stamlösning Kemikalie Koncentration i 
stamlösning (g/l) Koncentration i 
testmedium (mg/l) Testmedium 
Grundämne Koncentration 
(mg/l)  
I NaNO  3 
KH  2 PO4 8,50 
1,34 85 
13,4 Na; N 
K; P 32; 14 
6,0; 2,4 
II MgSO  4 . 7H  2 O 15 75 Mg; S 7,4; 9,8 
III CaCl  2 . 2H  2 O 7,2 36 Ca; Cl 9,8; 17,5 
IV Na 2 CO 3 4,0 20 C 2,3 
V H 3 BO 3 
MnCl  2 . 4H  2 O 
Na 2 MoO  4 . 2H  2 O 
ZnSO  4 . 7H  2 O 
CuSO  4 . 5H  2 O 
Co(NO  3 ) 2 . 6H  2 O 1,0 
0,20 0,010 
0,050 
0,0050 0,010 1,00 
0,20 0,010 
0,050 
0,0050 0,010 B 
Mn Mo 
Zn 
Cu Co 0,17 
0,056 0,0040 
0,011 
0,0013 0,0020 
VI FeCl
 3 . 6H  2 O 
Na 2 -EDTA. 2H  2 O 0,17 
0,28 0,84 
1,4 Fe 
— 0,17 
— 
VII MOPS (buffert) 490 490 — — 
— Tillsätt följande mängder stamlösningar i 900 ml avjoniserat vatten för be ­
redning av 1 liter medium: 
— 10 ml I — 5 ml II 
— 5 ml III 
— 5 ml IV
 ▼M1 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1372
 
— 1 ml V 
— 5 ml VI 
— 1 ml VII (i tillämpliga fall)  
Obs!  Stamlösning VII (MOPS-buffert) kan behövas för vissa testsubstanser (se sista 
stycket i avsnitt 1.4).  
— Justera pH till 6,5 ± 0,2 med 0,1 M eller 1 M HCl eller NaOH (beroende på 
utgångsvärdet). Tillsätt sedan avjoniserat vatten så att volymen blir 1 liter.  
Odlingsmedium 20Z-AAP  
Bered stamlösningar i sterilt destillerat eller avjoniserat vatten. 
Förvara de sterila stamlösningarna kallt och mörkt. Då kan de lagras i minst 
6–8 veckor. 
Bered 5 näringsstamlösningar (A1, A2, A3, B och C) med kemikalier av reagens ­
kvalitet. Tillsätt 20 ml av varje lösning i ca 850 ml avjoniserat vatten. Justera pH till 7,5 ± 0,1 med 0,1 M eller 1 M HCl eller NaOH (beroende på utgångsvärdet). 
Tillsätt avjoniserat vatten så att volymen blir 1 liter. Filtrera sedan mediet genom 
ett membranfilter med porstorlek ca 0,2 μm ner i en steril behållare. 
Bered odlingsmediet 1–2 dagar före testets genomförande så att pH hinner sta ­
biliseras. Mät pH före testet och justera vid behov genom tillsats av 0,1 M 
eller 1 M NaOH eller HCl (beroende på utgångsvärdet).
 
Stamlösning Kemikalie Koncentration i 
stamlösning 
(g/l) (*) Koncentration i 
testmedium 
(mg/l) (*) Testmedium 
Grundämne Koncentration 
(mg/l) (*)  
A1 NaNO  3 
MgCl  2 . 6H  2 O 
CaCl  2 . 2H  2 O 26 
12 4,4 510 
240 90 Na; N 
Mg Ca 190; 84 
58,08 24,04 
A2 MgSO
 4 . 7H  2 O 15 290 S 38,22 
A3 K 2 HPO  4 . 3H  2 O 1,4 30 K; P 9,4; 3,7 
B H 3 BO 3 
MnCl  2 . 4H  2 O 
FeCl  3 . 6H  2 O 
Na 2 EDTA. 2H  2 O 
ZnCl  2 
CoCl  2 . 6H  2 O 
Na 2 MoO  4 . 2H  2 O 
CuCl  2 . 2H  2 O 0,19 
0,42 0,16 
0,30 
3,3 mg/l 1,4 mg/l 
7,3 mg/l 
0,012 mg/l 3,7 
8,3 3,2 
6,0 
66 μg/l 
29 μg/l 
145 μg/l 
0,24 μg/l B 
Mn Fe 
— 
Zn Co 
Mo 
Cu 0,65 
2,3 0,66 
— 
31 μg/l 
7,1 μg/l 
58 μg/l 
0,080 μg/l 
C NaHCO
 3 15 300 Na; C 220; 43  
(*) Om inget annat anges särskilt.  ▼M1 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1373
 
Fotnot: Den teoretiskt ideala slutkoncentrationen av bikarbonat (NaHCO  3 ) – som gör att 
endast en smärre justering av pH krävs – är 15 mg/l, inte 300 mg/l som anges i 
tabellen ovan. I 20X-AAP, liksom i ringtestet för denna metod, är koncentrationen 
300 mg/l etablerad. (I. Sims, P. Whitehouse and R. Lacey [1999]: The OECD  Lemna  
Growth Inhibition Test. Development and Ring-testing of draft OECD Test Guideline. 
R&D Technical Report EMA 003. WRc plc – Environment Agency.)  
Steinbergs medium (enligt ISO 20079)  
Koncentrationer och stamlösningar  
— Det modifierade Steinbergs medium används i ISO 20079 uteslutande för  
Lemna minor  (eftersom enbart denna art är tillåten i denna standard). Test 
har dock visat att goda resultat kan uppnås även med  Lemna gibba . 
— Använd kemikalier av reagenskvalitet eller p.a.-kvalitet och avjoniserat 
vatten. 
— Bered näringsmediet från stamlösningar eller från ett medium med 10 gånger 
högre koncentration än testmediet så att mediet får högsta möjliga koncent ­
ration utan utfällning.  
Tabell 1  
pH-stabiliserat Steinbergmedium (modifierat enligt Altenburger)  
Kemikalie Näringsmedium  
Makroelement  Molvikt mg/l mmol/l  
KNO  3 101,12 350,00 3,46 
Ca(NO  3 ) 2 . 4H  2 O 236,15 295,00 1,25 
KH  2 PO 4 136,09 90,00 0,66 
K 2 HPO  4 174,18 12,60 0,072 
MgSO  4 . 7H  2 O 246,37 100,00 0,41  
Mikroelement  Molvikt μg/l μmol/l 
H 3 BO 3 61,83 120,00 1,94 
ZnSO  4 ·. 7H  2 O 287,43 180,00 0,63 
Na 2 MoO  4 . 2H  2 O 241,92 44,00 0,18 
MnCl  2 . 4H  2 O 197,84 180,00 0,91 
FeCl  3 . 6H  2 O 270,21 760,00 2,81 
EDTA-dinatriumdihydrat 372,24 1 500,00 4,03  ▼M1 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1374
 
Tabell 2  
Stamlösningar (makroelement)  
1. Makroelement (koncentrerat 50 ggr)  g/l  
Stamlösning 1:  
KNO  3 17,50 
KH  2 PO 4 4,5 
K 2 HPO  4 0,63 
Stamlösning 2:  
MgSO  4 . 7H  2 O 5,00  
Stamlösning 3:  
Ca(NO  3 ) 2 . 4H  2 O 14,75  
Tabell 3  
Stamlösningar (mikroelement)  
2. Mikroelement (koncentrerat 1 000 ggr)  mg/l  
Stamlösning 4:  
H 3 BO 3 120,0  
Stamlösning 5:  
ZnSO  4 . 7H  2 O 180,0  
Stamlösning 6:  
Na 2 MoO  4 . 2H  2 O 44,0  
Stamlösning 7:  
MnCl  2 . 4H  2 O 180,0  
Stamlösning 8:  
FeCl  3 . 6H  2 O 760,00 
EDTA-dinatriumdihydrat 1 500,00 
— Stamlösningarna 2 och 3 kan slås samman, liksom 4–7 (se då till att de 
fastställda koncentrationerna hålls). 
— Sterilisera stamlösningarna i autoklav (121 °C, 20 minuter) eller gör en steril ­
filtrering med porstorlek 0,2 μm, så kan de lagras längre. Stamlösning 8 bör 
behandlas genom sterilfiltrering med porstorlek 0,2 μm. 
Beredning av slutkoncentrationen av Steinbergs modifierade medium  
— Tillsätt 20 ml av stamlösningarna 1, 2 och 3 (tabell 2) i ca 900 ml avjoniserat 
vatten för att undvika utfällning. 
— Tillsätt 1,0 ml av stamlösningarna 4, 5, 6, 7 och 8 (tabell 3). 
— pH ska vara 5,5 ± 0,2 (justera genom tillsats av minsta möjliga volym NaOH- 
lösning eller HCl).  ▼M1 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1375
 
— Justera volymen med vatten till 1 000 ml. 
— Om stamlösningarna är steriliserade och föreskrivet vatten använts, behövs 
ingen ytterligare sterilisering. Om slutmediet steriliseras, ska stamlösning 8 
tillsättas efter autoklavering (121 °C, 20 minuter).  
Beredning av 10 ggr koncentrerat modifierat Steinbergmedium för temporär 
lagring  
— Tillsätt 20 ml av stamlösningarna 1, 2 och 3 (tabell 2) i ca 30 ml vatten för 
att undvika utfällning. 
— Tillsätt 1,0 ml av stamlösningarna 4, 5, 6, 7 och 8 (tabell 3). Justera med 
vatten till 100 ml. 
— Om stamlösningarna är steriliserade och föreskrivet vatten använts behövs 
ingen ytterligare sterilisering. Om slutmediet steriliseras, ska stamlösning 8 
tillsättas efter autoklavering (121 °C, 20 minuter). 
— pH (vid slutkoncentration) ska vara 5,5 ± 0,2.  ▼M1 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1376
 
C.27  TOXICITETSTEST I SEDIMENT- OCH VATTENFAS PÅ 
CHIRONOMIDLARVER MED SPIKAT SEDIMENT  
INLEDNING 
1. Denna testmetod motsvarar OECD:s testriktlinje 218 (2004). Syftet med 
testmetoden är att bedöma effekterna av långvarig kemikalieexponering på 
sedimentlevande larver i sötvatten av fjädermyggor  Chironomus  sp. Meto ­
den är baserad på befintliga toxicitetstestprotokoll för  Chironomus riparius 
och Chironomus tentans  som har tagits fram i Europa (1) (2) (3) och 
Förenta staterna (4) (5) (6) (7) (8) samt ringtestats (1) (6) (9). Även övriga 
väldokumenterade chironomider kan användas, t.ex.  Chironomus yoshimat ­
sui (10) (11). 
2. Exponeringsscenariot i denna testmetod går ut på att spika sediment med 
testämnet. Valet av lämpligt exponeringsscenario beror på den avsedda till ­
lämpningen för testet. Scenariot med spikning av sediment är avsett att 
simulera ackumulerade nivåer av kemikalier som finns kvar i sedimentet. Detta exponeringssystem innebär spikning av sediment i ett testsystem med sediment- och vattenfas. 
3. Ämnen som behöver testas på sedimentlevande organismer är sådana som i 
allmänhet blir kvar i sedimentet under långa tidsperioder. De sedimentle ­
vande organismerna kan exponeras via ett antal rutter. Den relativa betydel ­
sen av varje exponeringsrutt och den tid det tar för var och en av dem att 
bidra till de totala toxiska effekterna beror på den berörda kemikaliens fysikalkemiska egenskaper. För starkt adsorberande ämnen (t.ex. log K
 ow 
> 5) eller för ämnen som binds kovalent till sedimentet, kan förtäring av 
förorenad föda vara en betydande exponeringsrutt. För att toxiciteten hos 
starkt lipofila ämnen inte ska underskattas kan tillsättning av föda till sedi ­
mentet före applicering av testämnet övervägas. För att alla potentiella ex ­
poneringsrutter ska beaktas har denna testmetod fokus på långvarig expo ­
nering. Testets längd är 20–28 dagar för C.  riparius  och C.  yoshimatsui  och 
28–65 dagar för C.  tentans . Om korttidsdata krävs för ett specifikt ändamål, 
t.ex. för att undersöka effekterna av en instabil kemikalie, kan tilläggsrepli ­
kat avlägsnas efter tio dagar. 
4. De endpoints som mäts är det totala antalet kläckta vuxna exemplar och 
utvecklingstiden fram till kläckning. Det rekommenderas att mätningar av larvernas överlevnad och tillväxt endast görs efter en tiodagarsperiod i fall 
där ytterligare korttidsdata krävs, med användning av ytterligare replikat 
enligt vad som är lämpligt. 
5. För detta test rekommenderas syntetiskt sediment. Syntetiskt sediment har 
flera fördelar jämfört med naturliga sediment: 
— Variationen mellan experiment reduceras eftersom syntetiskt sediment 
bildar en reproducerbar ”standardmatris”, och behovet av att få fram oförorenade och rena sediment elimineras. 
— Testningen kan inledas när som helst utan att beakta säsongvariationer i 
testsedimentet och det behövs ingen förbehandling av sediment för att få bort naturligt förekommande fauna. När syntetiskt sediment används 
uppstår heller inte kostnader för insamling på fältet av tillräckliga mäng ­
der sediment för rutintestning. 
— Användning av syntetiskt sediment ger möjlighet till jämförelser av tox ­
icitet och därmed klassificering av ämnen. 
6. Definitioner finns i tillägg 1.
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1377
 
PRINCIP FÖR TESTMETODEN 
7. Chironomidlarver i första larvstadiet exponeras för ett urval koncentrationer 
av testkemikalien i sediment-vattensystem. Testämnet spikas i sedimentet och därefter tillförs larverna i testkärlen som har stabiliserade sediment- 
och vattenkoncentrationer. Kläckning av fullbildade myggor och utveck ­
lingshastighet mäts i slutet av testet. Överlevande larver och deras vikt kan också mätas efter tio dagar om så krävs (med användning av ytterligare replikat enligt det som är lämpligt). Dessa data analyseras med användning 
av en regressionsmodell för att uppskatta den koncentration som skulle 
orsaka × % minskning av antalet fullbildade myggor eller av larvernas överlevnad eller tillväxt (t.ex. EC
 15 , EC  50 osv.) eller genom användning 
av statistisk hypotesprövning för att bestämma NOEC/LOEC. Hypotespröv ­
ningen kräver en jämförelse mellan effektvärden och kontrollvärden med användning av statistiska test.
 
INFORMATION OM TESTÄMNET 
8. Testämnets vattenlöslighet, ångtryck, uppmätta eller beräknade fördelning i 
sedimentet samt stabilitet i vatten och sediment bör vara kända. Det bör finnas en tillförlitlig analysmetod för kvantifiering av testämnet i överlig ­
gande vatten, porvatten och sediment med känd och rapporterad exakthet 
och detektionsgräns. Det är också bra att känna till testämnets strukturformel och renhet. Hur testämnet agerar kemiskt (t.ex. upplösning, abiotisk och biotisk nedbrytning osv.) hör också till den information som är användbar. 
Närmare vägledning för testning av ämnen vars fysikalkemiska egenskaper 
försvårar detta test finns i (12).
 
REFERENSKEMIKALIER 
9. Referenskemikalier kan testas periodiskt för att säkerställa att testprotokollet 
och testbetingelserna är tillförlitliga. Exempel på toxiska referensämnen som med framgång har använts i ringtest och valideringsstudier är lindan, triflu ­
ranid, pentaklorfenol, kadmiumklorid och kaliumklorid (1) (2) (5) (6) (13).
 
TESTETS GILTIGHET 
10. För att testet ska vara giltigt gäller följande villkor: 
— Kläckningen av vuxna exemplar i kontrollkärlen måste vara minst 70 % 
i slutet av testet (1) (6). 
— Kläckningen av vuxna exemplar av  C. riparius  och  C. yoshimatsui  i 
kontrollkärlen bör inträffa 12–24 dagar efter att de har införts i kärlen, för C. tentans  krävs en period på 20–65 dagar. 
— Vid slutet av testet bör pH och koncentrationen upplöst syre mätas i 
varje kärl. Syrekoncentrationen bör vara minst 60 % av 
luftmättnadsvärdet (ASV) vid den använda temperaturen och pH i över ­
liggande vatten bör vara 6–9 i alla testkärl. 
— Variationen i vattentemperatur får inte vara större än ± 1,0 °C. Vatten ­
temperaturen kan hållas under kontroll genom att göra testningen i ett 
isotermiskt utrymme, varvid rumstemperaturen bör kontrolleras med 
lämpliga tidsintervall.
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1378
 
METODBESKRIVNING  
Testkärl  
11. Testet görs i 600 ml-glasbägare med 8 cm i diameter. Även andra slags kärl 
kan användas, men då måste det gå att garantera att överliggande vatten och sediment har lämpliga djup. Sedimentytan bör vara tillräckligt stor för att ge 2–3 cm
 2 per larv. Förhållandet mellan sedimentskiktets djup och överlig ­
gande vattnets djup bör vara 1:4. Testkärl och annan apparatur som kommer 
i kontakt med testsystemet bör vara gjorda av glas eller annat kemiskt inert material (t.ex. teflon).
 
Val av arter  
12. Den art som används i testet ska helst vara  Chironomus riparius . Chirono­
mus tentans  kan också vara lämplig, men den är svårare att hantera och 
kräver en längre testperiod. Även  Chironomus yohimatsui  kan användas. I 
tillägg 2 finns närmare uppgifter om odlingsmetoder för  Chironomus ripa ­
rius. Information om odlingsbetingelser finns också för andra arter, t.ex.  
Chironomus tentans  (4) och  Chironomus yoshimatsui  (11). Arternas identi ­
fiering måste bekräftas före testningen men är inte nödvändig före varje test 
om organismerna härrör från en odling inom laboratoriet.  
Sediment  
13. Helst ska syntetisk sediment användas. Om naturligt sediment används bör 
dess egenskaper bestämmas (minst pH, halten organiskt kol, och gärna även 
andra parametrar såsom förhållandet C/N och granulometri). Sedimentet 
måste även vara fritt från föroreningar och andra organismer som kan kon ­
kurrera med eller konsumera chironomiderna. Dessutom rekommenderas att naturligt sediment som är avsett att användas i ett chironomidtoxicitetstest 
konditioneras i sju dagar under samma betingelser som råder i det efter ­
följande testet. Följande syntetiska sediment, baserat på den syntetiska jord som används i testmetod C.8 (14), rekommenderas för detta test (1) (15) (16): 
a) 4–5 % (torrvikt) torv så nära pH 5,5–6 som möjligt; det är viktigt att 
använda endast lufttorkad och finmalen torv i pulverform (partikelstorlek 
≤ 1 mm). 
b) 20 % (torrvikt) kaolinlera (kaolinithalt helst över 30 %). 
c) 75–76 % (torrvikt) kvartssand (till största delen bestående av fin sand där 
mer än 50 % av partiklarna har storleken 50–200 μm). 
d) Avjoniserat vatten tillsätt så att blandningen får en slutlig fukthalt på 
30–50 %. 
e) Kemiskt rent kalciumkarbonat CaCO
 3 ) tillsätts för att justera den slutliga 
sedimentblandningens pH till 7,0 ± 0,5. Den slutliga blandningens kol ­
halt bör vara 2 % ± 0,5 % och kan justeras med hjälp av lämpliga mängder torv och sand, enligt punkterna a och c. 
14. Torv, kaolinlera och sand ska härröra från kända källor. Sedimentkom ­
ponenterna bör kontrolleras för att bekräfta avsaknaden av kemiska förore ­
ningar (t.ex. tungmetaller, organiska klorföreningar, organiska fosforför ­
eningar osv.) Ett exempel på hur syntetiskt sediment kan tillredas beskrivs i tillägg 3. Det är också godtagbart att blanda torra beståndsdelar om det går att demonstrera att tillsats av överliggande vatten inte leder till att sedimen ­
tets beståndsdelar separerar (t.ex. flytande torvpartiklar) och att torven eller 
sedimentet konditioneras tillräckligt.
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1379
 
Vatten  
15. Allt vatten som uppfyller de kemiska kriterierna för godtagbart utspädnings ­
vatten (se tilläggen 2 och 4) är lämpligt som testvatten. Allt lämpligt vatten, naturligt vatten (ytvatten eller grundvatten), rekonstituerat vatten (se tillägg 
2) och avklorerat kranvatten är godtagbart som odlings- och testvatten om 
chironomiderna överlever i det under odling, acklimatisering och testning utan att uppvisa tecken på stress. Vid teststart ska testvattnets pH vara mellan 6 och 9 och totalhårdheten får inte vara högre än 400 mg/l uttryckt 
som CaCO
 3 . Om man misstänker växelverkan mellan hårdhetsjoner och 
testämnet, bör vatten med lägre hårdhet användas (i en sådan situation får Elendt Medium M4 inte användas). Samma typ av vatten bör användas 
under hela testningen. De vattenkvalitetsegenskaper som förtecknas i tillägg 
4 bör mätas minst två gånger om året eller om man misstänker att egen ­
skaperna har ändrats betydligt.
 
Stamlösningar – spikat sediment  
16. Spikat sediment med vald koncentration bereds i regel genom tillsättning av 
en lösning av testämnet direkt i sedimentet. En stamlösning av testämnet upplöst i avjoniserat vatten blandas med det syntetiska sedimentet i en rullkvarn, matningsblandare eller manuellt. Om testämnet har låg löslighet 
i vatten kan det lösas upp i minsta möjliga volym lämpligt organiskt lös ­
ningsmedel (t.ex. hexan, aceton eller kloroform). Denna lösning blandas sedan med 10 g fin kvartssand för ett testkärl. Lösningsmedlet får avdunsta och måste vara helt avlägsnat ur sanden, och därefter blandas sanden med 
lämplig mängd sediment per testbägare. Endast ämnen som avdunstar lätt får 
användas för att upplösa, dispergera eller emulgera testämnet. Här bör no ­
teras att den sand som följer med testämnet och sandblandningen måste beaktas när sedimentet förbereds (dvs. sedimentet ska ha mindre mängd 
sand). Det är viktigt att se till att testämnet som tillsätts sedimentet fördelas 
omsorgsfullt och jämnt inom sedimentet. Vid behov kan delprover analyse ­
ras för att bestämma homogeniteten.
 
TESTETS UTFORMNING 
17. Testets utformning avser antalet koncentrationer och intervallen mellan dem, 
antalet kärl per koncentration och antalet larver per kärl. Här beskrivs ut ­
formningar för uppskattning av effektkoncentration, uppskattning av NOEC 
och för gränstest.  
Utformning för regressionsanalys  
18. Effektkoncentrationen (t.ex. EC  15 , EC  50 ) och det koncentrationsområde som 
är relevant för testämnet bör omfattas av de koncentrationer som ingår i 
testet. Allmänt taget gäller att exaktheten och särskilt giltigheten för upp ­
skattningar av effektkoncentrationer (EC  x ) förbättras när effektkoncentratio ­
nen ligger inom området för de koncentrationer som testas. Extrapolering under lägsta positiva koncentration eller över högsta koncentration bör und ­
vikas. Preliminära test kan användas för att hitta rätt koncentrationsområde 
(se punkt 27).
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1380
 
19. Om EC  x ska uppskattas bör testet omfatta minst fem koncentrationer och tre 
replikat för varje koncentration. Det är under alla omständigheter tillrådligt 
att använda tillräckligt många testkoncentrationer för att få en god modell ­
uppskattning. Faktorn mellan koncentrationer bör inte vara större än två (undantag kan göras i fall där dos-responskurvan har liten lutning). Antalet 
replikat per behandling kan minskas om antalet testkoncentrationer med 
olika respons ökas. En ökning av antalet replikat eller minskning av test ­
koncentrationsintervall tenderar att leda till ett smalare konfidensintervall för testet. Ytterligare replikat krävs om en uppskattning ska göras av larvernas 
överlevnad och tillväxt under en tiodagarsperiod.
 
Upplägg för uppskattning av NOEC/NOEC  
20. Om LOEC eller NOEC ska uppskattas bör fem testkoncentrationer med 
minst fyra replikat användas och faktorn mellan koncentrationerna bör inte 
vara större än två. Antalet replikat bör vara tillräckligt för att säkerställa 
tillräcklig statistisk styrka för att upptäcka en skillnad på 20 % jämfört med kontrollen vid nivån 5 % för signifikans (p = 0,05). För uppskattning av utvecklingshastighet är det i regel lämpligt med variansanalys (ANOVA), 
såsom Dunnets eller Williams test (17) (18) (19) (20). För kläckningsfre ­
kvens kan ett Cochran-Armitage-test, Fishers exakta test (med Bonferroni ­
korrigering) eller ett Mantel-Haenszel-test användas.
 
Gränstest  
21. Gränstest kan göras (en testkoncentration och kontroll) om inga effekter 
framkommit vid det preliminära testet för att fastställa testområde. Syftet med gränstest är att genomföra ett test vid en koncentration som är till ­
räckligt hög för att man ska kunna utesluta eventuella toxiska effekter av 
testämnet, och gränsen sätts vid en koncentration som inte förväntas före ­
komma i någon situation. 1 000 mg/kg (torrvikt) rekommenderas. I regel krävs minst sex replikat både för behandling och kontroll. Man måste kunna 
demonstrera tillräcklig statistisk styrka för att upptäcka en skillnad på 20 % 
jämfört med kontrollen vid nivån 5 % för signifikans (p = 0,05). Eftersom t-test ger kvantitativ respons (utvecklingshastighet och vikt) är t-test en lämplig statistisk metod förutsatt att data uppfyller testkraven (normalitet, 
homogena varianser osv.). Om dessa krav inte uppfylls kan man använda 
t-testet med olika varians eller ett icke-parametriskt test, såsom Wilcoxon-Mann-Whitneys test. För kläckningsfrekvens är det lämpligt att använda Fischers exakta test.
 
FÖRFARANDE  
Exponeringsbetingelser  
Beredning av systemet med spikat sediment och vatten  
22. Det förfarande för spikning som beskrivs i testmetod C.8 (Toxicitet för 
daggmaskar) rekommenderas för applicering av testämnet (14). Spikade 
sediment placeras i kärlen och överliggande vatten tillsätts så att förhållandet mellan sediment och vatten är 1:4 (se punkterna 11 och 15). Sedimentets djup bör vara 1,5–3 cm. För att undvika separation av sedimentets bestånds ­
delar och återsuspension av finfördelat material medan testvatten tillsätts i 
vattenkolumnen, kan sedimentet täckas med en plastplatta medan vattnet tillsätts, varefter plattan avlägsnas omedelbart. Även andra metoder kan vara lämpliga. 
23. Testkärlen bör vara täckta (t.ex. med glasplattor). Vid behov fylls under 
testets gång vatten på till ursprunglig volym för att kompensera för avdunst ­
ning. Detta bör göras med destillerat eller avjoniserat vatten för att före ­
bygga ackumulering av salter.
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1381
 
Stabilisering  
24. Efter beredning av spikat sediment och överliggande vatten rekommenderas 
att testämnet får fördelas från vattenfasen till sediment (3) (4) (6) (13). Detta bör helst göras med samma temperatur- och luftningsbetingelser som an ­
vänds vid testningen. Stabiliseringstiden beror på sedimentet och kemikali ­
en, och kan variera mellan några timmar och flera dagar, i sällsynta fall upp till flera veckor (4–5 veckor). Eftersom en lång stabiliseringstid kan leda till att vissa kemikalier sönderfaller, eftersträvas här inte jämvikt; i stället re ­
kommenderas en stabiliseringstid på 48 timmar. I slutet av denna jämvikts ­
period ska testämnets koncentration mätas i det överliggande vattnet, por ­
vattnet och sediment, åtminstone för den högsta koncentrationen och en 
lägre koncentration (se punkt 38). Dessa analytiska bestämningar av tes ­
tämnet gör det möjligt att beräkna massbalans och uttrycka resultaten på grundval av uppmätta koncentrationer.
 
Tillförsel av testorganismer  
25. Fyra till fem dagar innan testorganismerna tillförs testkärlen ska äggmas ­
sorna avlägsnas från odlingarna och placeras i små kärl i odlingsmedium. 
Åldrat medium från stamodling eller färskt berett medium kan användas. Om färskt medium används bör en liten mängd föda, t.ex. grönalger och/ eller några droppar filtrat från en finmald suspension av fiskfoder i flingform 
tillsättas odlingsmediet (se tillägg 2). Endast färska äggmassor får användas. 
I regel börjar larverna kläckas några dagar efter att äggen har lagts (2–3 dagar för Chironomus riparius  vid 20 °C och 1–4 dagar för  Chironomus tentans  vid 
23 °C och  Chironomus yoshimatsui  vid 25 °C), och larvernas tillväxt sker i 
fyra stadier på 4–8 dagar per stadium. För testet ska första stadiets larver 
användas (2–3 eller 1–4 dagar efter kläckningen). Bestämning av larvstadium kan möjligen göras genom mätning av huvudkapseldiameter (6). 
26. Tjugo första stadiets larver fördelas slumpvis till varje testkärl som innehål ­
ler spikat sediment och vatten, med användning av en trubbig pipett. Luft ­
ningen av vattnet måste stoppas medan larverna tillsätts testkärlen och hållas 
stoppad i ytterligare 24 timmar efter tillsättningen (se punkterna 25 och 32). 
Enligt det testupplägg som används (se punkterna 19 och 20) är antalet larver per testkoncentration minst 60 för uppskattning av EC-punkt och 80 för bestämning av NOEC.
 
Testkoncentrationer  
27. Ett preliminärt test kan användas för att fastställa koncentrationerna för det 
definitiva testet. För detta ändamål används en serie brett spridda koncent ­
rationer av testämnet. För att få samma ytdensitet per chironomid som ska användas för det slutliga testet, exponeras chironomiderna för varje kon ­
centration av testämnet under en period som ger möjlighet att uppskatta 
lämpliga testkoncentrationer. Inga replikat krävs. 
28. Testkoncentrationerna för det definitiva testet baseras på resultaten från det 
preliminära testet. Det ska finnas minst fem testkoncentrationer som väljs 
enligt beskrivningen i punkterna 18–20.
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1382
 
Kontrollkärl  
29. Kontrollkärl som inte innehåller testämne utan enbart sediment bör ingå i 
testet med lämpligt antal replikat (se punkterna 19 och 20). Om lösnings ­
medel har använts för applicering av testämnet (se punkt 16) bör det också 
finnas kontrollkärl med sediment och lösningsmedel.  
Testsystem  
30. De system som används är statiska. Semistatiska system eller genomflödes ­
system med intermittent eller kontinuerlig förnyelse av överliggande vatten 
kan användas i undantagsfall, t.ex. om vattenkvalitetspecifikationerna inte är lämpliga för testorganismen eller påverkar den kemiska jämvikten (t.ex. om syrenivåerna blir för låga, koncentrationen av utsöndrade produkter blir för 
hög eller om mineraler släpps ut från sedimentet och påverkar pH och/eller 
vattenhårdheten). I regel är det dock tillräckligt och rekommendabelt att använda andra metoder för kompensering av kvaliteten på överliggande vatten, såsom luftning.
 
Foder  
31. Larverna bör ges foder helst dagligen eller minst tre gånger per vecka. 
Fiskfoder (suspension i vatten eller finmalt foder, t.ex. Tetra-Min eller 
Tetra-Phyll, se närmare i tillägg 2) i mängder om 0,25–0,5 mg (0,35–0,5 
mg för C.  yoshimatsui ) per larv per dag anses vara lämpligt för unga larver 
under de tio första dagarna. För äldre larver kan det krävas lite större mängd: 0,5–1 mg per larv och dag bör vara tillräckligt för återstoden av 
testet. Mängden bör minskas för alla behandlingar och kontroller om det 
uppstår svamptillväxt eller mortalitet observeras i kontrollerna. Om svamp ­
tillväxten inte kan stoppas måste testet upprepas. Vid testning av starkt adsorberande ämnen (t.ex. log K
 ow > 5) eller ämnen som är kovalent bundna 
till sedimentet, kan mängden foder som krävs för att säkerställa överlevnad 
och naturlig tillväxt för organismerna tillsättas i det syntetiska sedimentet före stabiliseringsperioden. Då ska växtmaterial användas i stället för fisk ­
foder, t.ex. 0,5 % (torrvikt) finmalda löv från t.ex. brännässla ( Urtica dioi ­
ca), mullbär ( Morus alba ), vitklöver ( Trifolium repens ), spenat ( Spinacia 
oleracea ) eller annat växtmaterial ( Cerophyl  eller alfacellulosa).
 
Inkubationsbetingelser  
32. Skonsam luftning av överliggande vatten i testkärlen införs helst 24 timmar 
efter tillsättning av larverna och får pågå genom hela testet (se till att halten upplöst syre inte faller under 60 % av luftmättnadsvärdet ASV). Luftningen görs med hjälp av en Pasteur-glaspipett som är fäst 2–3 cm ovanför sedi ­
mentskiktet (en eller ett fåtal bubblor per sekund). Vid testning av flyktiga 
kemikalier kan man överväga att utesluta luftning av sediment-vattensyste ­
met. 
33. Testet genomförs vid konstant temperatur på 20 °C (± 2 °C). För C.  tentans  
och C.  yoshimatsui  rekommenderas temperaturer på 23 °C respektive 25 °C 
(± 2 °C). En ljusperiod på 16 timmar används och ljusintensiteten ska vara 
500–1 000 lux.
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1383
 
Exponeringstid  
34. Exponeringen inleds när larver tillsätts i spikade kärl och kontrollkärl. Den 
maximala exponeringstiden är 28 dagar för C.  riparius  och C.  yoshimatsui  
och 65 dagar för C.  tentans . Om myggor kläcks tidigare, kan testet avslutas 
efter minst fem dagar efter att det sista vuxna exemplaret har kläckts i 
kontrollen.  
Observationer  
Kläckning  
35. Utvecklingstiden och totalantalet fullbildade han- och honmyggor bestäms. 
Hanarna är lätta att känna igen på sina fjäderantenner. 
36. Testkärlen bör granskas visuellt minst tre gånger i veckan för att bedöma 
förekomsten av onormalt beteende (t.ex. exemplar som lämnar sedimentet, 
ovanligt simmande) jämfört med kontrollen. Under perioden för förväntad kläckning är det nödvändigt att dagligen räkna antalet kläckta exemplar. 
Kön och antal fullbildade exemplar registreras dagligen. Efter identifiering 
avlägsnas myggorna från kärlen. Ägg som har deponerats före testets slut ­
förande bör registreras och därefter avlägsnas för att förhindra att larver på nytt introduceras i sedimentet. Likaså ska registrering göras av antalet syn ­
liga puppor som inte har kläckts. Vägledning om övervakning av kläckning 
finns i tillägg 5.
 
Tillväxt och överlevnad  
37. Om det krävs data om överlevnad och tillväxt under en tiodagarsperiod bör 
ytterligare testkärl införlivas från början, så att dessa därefter kan användas. Larverna i sedimentet från dessa tilläggskärl tillvaratas genom sållning med 
ett 250 μm-såll. Kriterierna för död är orörlighet eller utebliven reaktion på 
mekanisk stimulans. Larver som inte tillvaratas bör räknas som döda (larver som har dött i början av testet kan ha sönderdelats av mikrober). Torrvikten (askfri) för överlevande larver per testkärl bestäms och den genomsnittliga 
individuella torrvikten per kärl beräknas. Det är bra att bestämma vilket 
stadium överlevande larver tillhör, och för detta kan mätning av huvud ­
kapselns bredd användas.
 
Analytiska mätningar  
Testämnets koncentration  
38. Innan testet inleds, dvs. före tillsättning av larver, tas prover av bulksedi ­
ment från minst ett kärl per behandling för analytisk bestämning av tes ­
tämnets koncentration i sedimentet. Man bör åtminstone analysera prover av 
överliggande vatten, porvatten och sediment i början (se punkt 24) och i slutet av testet, för den högsta koncentrationen och en lägre koncentration. Dessa bestämningar av testämneskoncentrationen ger information om tes ­
tämnets beteende/fördelning i vatten-sedimentsystemet. 
39. Om mellanliggande mätningar görs (t.ex. dag 7) och om det för analysen 
krävs stora prover som inte kan tas från testkärlen utan att testsystemet påverkas, bör de analytiska bestämningarna göras på prover som tas från 
extra testkärl som behandlas på samma sätt (inklusive förekomst av testorga ­
nismer) men som inte används för biologiska observationer.
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1384
 
40. Centrifugering vid t.ex. 10 000 g och 4 °C i 30 minuter är det rekommen ­
derade förfarandet för att isolera porvatten. Om det har demonstrerats att 
testämnet inte adsorberas på filter kan även filtrering godtas. I vissa fall är det kanske inte möjligt att analysera koncentrationerna i porvattnet därför att provet är för litet.
 
Fysikalkemiska parametrar  
41. Testkärlens pH och temperatur bör mätas på lämpligt sätt (se punkt 10). 
Hårdhet och ammonium bör mätas i kontrollerna och ett testkärl vid den 
högsta koncentrationen i början och slutet av testet.  
DATA OCH RAPPORTERING  
Behandling av resultaten  
42. Syftet med detta test är att bestämma testämnets effekt på utvecklingshas ­
tigheten och totalantalet fullbildade han- och honmyggor eller, om det gäller 
ett tiodagarstest, effekterna på larvernas överlevnad och vikt. Om det inte 
finns indikationer på statistiskt avvikande känslighet för hanar och honor, kan resultaten poolas för statistiska analyser. Känslighetsskillnaderna mellan hanar och honor kan bedömas statistiskt, t.ex. genom ett ” χ
 2 -r × 2 table 
test”. Larvernas överlevnad och genomsnittlig individuell torrvikt per kärl 
måste bestämmas efter tio dagar där detta krävs. 
43. Effektkoncentrationerna uttryckta och baserade på torrvikt beräknas helst 
på grundval av uppmätta sedimentkoncentrationer vid testets början (se punkt 38). 
44. För att beräkna en punktvis uppskattning av EC
 50 eller något annat EC  x - 
värde, kan statistiken per kärl användas som äkta replikat. Vid beräkning av konfidensintervallet för ett EC
 x -värde bör variansen mellan kärl beaktas, 
eller så bör man påvisa att variansen är så liten att den kan ignoreras. 
Om modellen anpassas med minsta kvadratmetoden bör transformation till ­
lämpas på den kärlvisa statistiken i syfte att förbättra variansens homogeni ­
tet. EC  x -värdena bör dock beräknas när responsen har transformerats tillbaka 
till det ursprungliga värdet. 
45. När syftet med den statistiska analysen är att bestämma NOEC/LOEC ge ­
nom hypotestestning, måste variansen mellan kärl beaktas, t.ex. genom näs ­
tad ANOVA. Alternativt kan mer robust testning (21) vara lämplig i situa ­
tioner där de vanliga ANOVA-antagandena inte gäller.  
Kläckningsfrekvens  
46. Kläckningsfrekvenser är dikotoma (tvåpunktsfördelade) data och kan analy ­
seras genom Cochran-Armitage test som tillämpas på step-down-grund där monoton dos-respons förväntas och dessa data stämmer överens med för ­
väntningen. Om inte, kan Fishers exakta test eller ett Mantel-Haenszel-test 
med Bonferroni-Holm-korrigerade p-värden användas. Om det finns bevis på större variation mellan replikat inom samma koncentration än det som en binomial fördelning skulle indikera (ofta kallad extra-binomial fördelning), 
bör ett robust Cochran-Armitage-test eller Fischers exakta test användas, 
enligt det som föreslås i punkt 21.
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1385
 
Det totala antalet myggor som kläckts per kärl, n  e , bestäms och divideras 
med antalet tillsatta larver, n  a enligt följande:  
ER ¼ n e 
n a 
där: 
ER = kläckningsfrekvens  
n e = antalet myggor som kläckts per kärl  
n a = antalet larver som tillsatts per kärl 
47. Ett alternativ som bäst lämpar sig för stora provstorlekar, när det finns 
extra-binomial varians, är att behandla kläckningsfrekvensen som en kon ­
tinuerlig respons och använda förfaranden såsom William-test när monoton 
dos-respons förväntas och stämmer överens med dessa data för kläcknings ­
frekvens. Dunnett-test är lämpligt i fall där det inte är hållbart med mono ­
tonicitet. I detta sammanhang definieras begreppet ”stort prov” som ett prov där antalet kläckta och antalet inte kläckta överstiger fem, per replikatkärl. 
48. Vid användning av ANOVA-metoder bör värdena för kläckningsfrekvens 
först transformeras genom arcsin-sqrt-transformation eller 
Freeman-Tukeytransformation för att få en ungefärlig normalfördelning och jämna ut varianserna. Cochran-Armitage-test, Fishers exakta test (Bon ­
ferroni) eller Mantel-Haenszel-test kan användas när absoluta frekvenser 
används. För att göra arcsin-sqrt-transformation tar man inverterad sinus 
(sin
 –1 ) av kvadratroten av kläckningsfrekvensen. 
49. EC  x -värden för kläckningsfrekvenser beräknas med regressionsanalys (t.ex. 
probit (22), logit, Weibull, lämplig kommersiell mjukvara eller dylikt). Om regressionsanalysen inte lyckas (om det t.ex. finns mindre än två partiella 
responser) används andra icke-parametriska metoder såsom glidande medel ­
värde eller enkel interpolering.
 
Utvecklingshastighet  
50. Med genomsnittlig utvecklingstid avses den genomsnittliga tidsomfattningen 
mellan tillsättning av larver (testdag 0) och kläckningen av den experimen ­
tella kohorten myggor (för beräkning av den faktiska utvecklingstiden bör man beakta larvernas ålder vid tillsättningstidpunkten). Värdet för utveck ­
lingshastighet är det reciproka värdet av tidsenheten för utveckling (enhet: 
1/dag) och representerar den andel larvutveckling som sker per dag. Utveck ­
lingshastigheten är det mått som helst ska användas för utvärdering av dessa sedimenttoxicitetsstudier eftersom variansen är lägre och homogenare samt 
närmare normalfördelningen i jämförelse med utvecklingstiden. Kraftfulla 
parametriska testförfaranden kan alltså användas baserade på utvecklings ­
hastighet hellre än på utvecklingstid. För utvecklingshastighet som en kon ­
tinuerlig respons kan EC
 x -värden uppskattas med hjälp av regressionsanalys 
(t.ex. (23), (24)). 
51. För efterföljande statistiska test antas antalet myggor observerade på inspek ­
tionsdag × ha kläckts i mitten av tidsintervallet mellan dag × och dag x-1 (l är inspektionsintervallets längd, i regel 1 dag). Genomsnittlig utvecklings ­
hastighet per kärl (x) beräknas enligt följande:
 
x ¼ X  m 
i¼1 ƒ i x i 
n e ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1386
 
där: 
x: genomsnittlig utvecklingshastighet per kärl 
i: index för inspektionsintervall 
m: maximiantalet inspektionsintervall  
ƒ i : antalet myggor som kläckts under inspektionsintervallet i 
n e : totalantalet myggor som kläckts i slutet av experimentet (=  P ƒ i ) 
x i : utvecklingshastigheten för myggor som kläckts under intervallet i 
x i ¼ 1 
Ê 
day  i Ä 1 i 
2 Ì 
där: 
dag  i : inspektionsdag (dagar från appliceringen) 
l i : inspektionsintervallets längd i (dagar, i regel 1 dag)  
Testrapport  
52. Testrapporten ska innehålla minst följande uppgifter:  
Testämne:  
— Fysikalisk natur och, där det är relevant, fysikalkemiska egenskaper 
(vattenlöslighet, ångtryck, fördelningskoefficient i jord (eller i sediment, 
om tillgänglig), stabilitet i vatten osv.). 
— Kemiska identifieringsdata (trivialnamn, kemiskt namn, strukturformel, 
CAS-nummer osv.) samt renhet och analysmetod för kvantifiering av 
testämnet.  
Testarter:  
— Organismer som använts för testet: art, vetenskapligt namn, ursprung 
och odlingsbetingelser. 
— Information om hantering av äggmassor och larver. 
— Organismernas ålder när de tillförs testkärlen.  
Testbetingelser : 
— Sediment som använts (naturligt eller syntetiskt). 
— För naturligt sediment, insamlingsplatsens belägenhet och beskrivning av 
sedimentet, inbegripet i mån av möjlighet föroreningshistoria och egen ­
skaper: pH, halten organiskt kol, C/N-kvot och granulometri (om lämp ­
ligt). 
— Beredning av syntetiskt sediment: beståndsdelar och egenskaper (halten 
organiskt kol, pH, fukthalt osv. vid testets början). 
— Beredning av testvatten (om rekonstituerat vatten används) och egenska ­
per (syrehalt, pH, konduktivitet, hårdhet osv. vid testets början). 
— Sedimentets och överliggande vattnets djup. — Volymen för överliggande vatten och porvatten, vikten för vått sediment 
med och utan porvatten.
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1387
 
— Testkärl (material och storlek). 
— Metod för spikning av sediment: testkoncentrationer, antalet replikat och, 
i förekommande fall, använt lösningsmedel. 
— Fasen för stabilisering av jämvikt i systemet med spikat sediment och 
vatten: varaktighet och betingelser. 
— Inkubationsbetingelser: temperatur, ljuscykel och intensitet samt luftning 
(frekvens och intensitet). 
— Detaljerad information om utfodringen, inklusive typ av foder, bered ­
ning, mängd och utfodringsschema.  
Resultat:  
— Nominella testkoncentrationer, uppmätta testkoncentrationer och resulta ­
ten av alla analyser för bestämning av testämnets koncentration i test ­
kärl. 
— Vattenkvaliteten i testkärlen – pH, temperatur, upplöst syre, hårdhet och 
ammonium. 
— Ersättning av avdunstat testvatten, i förekommande fall. — Antalet kläckta hon- och hanmyggor per kärl och dag. — Antalet larver som inte utvecklats till myggor, per kärl. — Genomsnittlig individuell torrvikt för larver per kärl och per stadium, om 
lämpligt. 
— Procentandel kläckta exemplar per replikat- och testkoncentration (han- 
och honmyggor poolade). 
— Genomsnittlig utvecklingshastighet för fullbildade myggor per replikat 
och behandlingsnivå (han- och honmyggor poolade). 
— Uppskattning av toxiska endpoints t.ex. EC
 x (och associerade konfidens ­
intervall), NOEC och/eller LOEC och de statistiska metoder som använts för bestämning av dem. 
— Diskussion av resultaten, inbegripet inverkan på testresultatet som kan 
tillskrivas avvikelser från denna testmetod.
 
LITTERATUR  
(1) BBA (1995), ”Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Devel ­
opment and validation of a new test system”, redigerat av M. Streloke och H.Köpp. Berlin 1995. 
(2) Fleming R. m.fl. 1994), ”Sediment Toxicity Tests for Poorly Water-Soluble 
Substances”, Slutlig rapport till Europeiska kommissionen, rapport nr EC 
3738, augusti 1994, WRc, UK. 
(3) SETAC (1993), ”Guidance Document on Sediment toxicity Tests and Bio ­
assays for Freshwater and Marine Environments”, WOSTA Workshop, Ne ­
derländerna. 
(4) ASTM International/E1706-00 (2002), ”Test Method for Measuring the 
Toxicity of Sediment-Associated Contaminants with Freshwater Invertebra ­
tes”, s. 1125–1241,  ASTM International 2002 Annual Book of Standards , 
vol. 11.05, ”Biological Effects and Environmental Fate;Biotechnology; Pes ­
ticides”, ASTM International, West Conshohocken, PA. 
(5) Environment Kanada (1997), ”Test for Growth and Survival in Sediment 
using Larvae of Freshwater Midges ( Chironomus tentans  or Chironomus 
riparius ). Biological Test Method”,  Report SPE 1/RM/32 , december 1997.
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1388
 
(6) US-EPA (2000), ”Methods for Measuring the Toxicity and Bioaccumulation 
of Sediment-associated Contaminants with Freshwater Invertebrates”, andra 
utgåvan,  EPA 600/R-99/064 , mars 2000, revidering av första utgåvan juni 
1994. 
(7) US-EPA/OPPTS 850.1735  (1996), ”Whole Sediment Acute Toxicity Inver ­
tebrates”. 
(8) US-EPA/OPPTS 850.1790  (1996), ”Chironomid Sediment toxicity Test”. 
(9) Milani D., Day K. E., McLeay D. J. och Kirby R. S. (1996), ”Recent intra- 
and inter-laboratory studies related to the development and standardisation of Environment Kanada’s biological test methods for measuring sediment toxicity using freshwater amphipods  (Hyalella azteca)  and midge larvae  
(Chironomus riparius) ” Technical Report, Environment Kanada, National 
Water Research Institute, Burlington, Ontario, Kanada. 
(10) Sugaya Y. (1997), ”Intra-specific variations of the susceptibility of insecti ­
cides  in Chironomus yoshimatsui ”, Jp. J. Sanit. Zool.  48 (4), s. 345–350. 
(11) Kawai K. (1986), ”Fundamental studies on Chironomid allergy. I. Culture 
methods of some Japanese Chironomids (Chironomidae, Diptera)”,  Jp. J. 
Sanit. Zool.  37 (1), s. 47–57. 
(12) OECD, 2000, ”Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Diffic ­
ult Substances and Mixtures”,  OECD Environment, Health and Safety Pub ­
lications, Series on Testing and Assessment , Nr 23. 
(13) Environment Kanada (1995), ”Guidance Document on Measurement of 
Toxicity Test Precision Using Control Sediments Spiked with a Reference 
Toxicant”,  Report EPS 1/RM/30, september 1995 . 
(14) Testmetod C.8 i denna bilaga, Toxicitet hos daggmaskar. (15) Suedel B. C. och Rodgers J. H. (1994), ”Development of formulated ref ­
erence sediments for freshwater and estuarine sediment testing”,  Environ. 
Toxicol. Chem.  13, s. 1163–1175. 
(16) Naylor C. och Rodrigues C., (1995), ”Development of a test method for 
Chironomus riparius using a formulated sediment”,  Chemosphere  31, s. 
3291–3303. 
(17) Dunnett C. W. (1964), ”A multiple comparisons procedure for comparing 
several treatments with a control”,  J. Amer. Statis. Assoc. , 50, s. 1096–1121. 
(18) Dunnett C. W. (1964), ”New tables for multiple comparisons with a con ­
trol”,  Biometrics , 20, s. 482–491. 
(19) Williams D. A. (1971), ”A test for differences between treatment means 
when several dose levels are compared with a zero dose control”,  Bio­
metrics , 27, s. 103–117. 
(20) Williams D. A. (1972), ”The comparison of several dose levels with a zero 
dose control”,  Biometrics , 28, s. 510–531. 
(21) Rao J. N. K. och Scott A. J. (1992), ”A simple method for the analysis of 
clustered binary data”,  Biometrics , 48, s. 577–585. 
(22) Christensen E. R. (1984), ”Dose-response functions in aquatic toxicity tes ­
ting and the Weibull model”,  Water Research  18, s. 213–221. 
(23) Bruce och Versteeg (1992), ”A statistical procedure for modelling continu ­
ous toxicity data”,  Environmental Toxicology and Chemistry  11, s. 
1485–1494. 
(24) Slob W. (2002), ”Dose-response modelling of continuous endpoints”,  Tox­
icol. Sci.  66, s. 298–312.
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1389
 
Tillägg 1  
DEFINITIONER 
I denna testmetod gäller följande definitioner:  
syntetiskt sediment : rekonstituerat, konstgjort sediment som är en blandning av 
material avsedda att efterlikna de fysiska beståndsdelarna i naturligt sediment.  
överliggande vatten : det vatten som hålls ovanför sedimentet i testkärlet.  
porvatten : det vatten som finns i mellanrummen mellan sediment- och jordpar ­
tiklar.  
spikat sediment : sediment med tillsatt testämne.  
testkemikalie : alla ämnen eller blandningar som testas med denna testmetod.  ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1390
 
Tillägg 2  
Rekommendationer för odling av  Chironomus riparius  
1. Chironomus -larver kan odlas i kristalliseringskärl eller stora behållare. Fin 
kvartssand sprids som ett tunt skikt på cirka 5–10 mm på behållarens bot ­
ten. Även kiselgur (t.ex. Merck, Art. 8117) har visat sig vara ett lämpligt substrat (det räcker med ett tunt lager på några mm). Lämpligt vatten till ­
sätts till ett djup på flera cm. Vattennivåerna bör fyllas på efter behov för att 
ersätta avdunstning och förebygga uttorkning. Vattnet kan vid behov ersät ­
tas. Det bör finnas en skonsam luftning. De kärl som innehåller larver bör hållas i en lämplig bur som hindrar vuxna exemplar från att rymma. Buren 
bör vara tillräckligt stor för att de vuxna exemplaren ska kunna svärma, 
annars kan kopulation utebli (minimum är cirka 30 × 30 × 30 cm). 
2. Burarna ska hållas i rumstemperatur eller ett tempererat utrymme vid 20 
± 2 °C med en ljusperiod på 16 timmar (intensitet ca 1 000 lux) och 8 
timmar mörker. Det har rapporterats att luftfuktighet under 60 % RH kan 
hämma reproduktion.
 
Utspädningsvatten  
3. Allt lämpligt naturligt eller syntetiskt vatten kan användas. Ofta används 
källvatten, avklorerat kranvatten och artificiella medier (t.ex. Elendt M4 eller M7, se nedan). Vattnet måste luftas före användningen. Vid behov kan odlingsvattnet förnyas genom att försiktigt hälla eller sifonera använt 
vatten från odlingskärlen utan att förstöra larvrören.
 
Utfodring av larver  
4. Chironomus -larverna ges fiskfoder i flingform (Tetra Min®, Tetra Phyll® 
eller motsvarande patenterat märke), cirka 250 mg per kärl och dag. Fodret 
kan ges i form av torrt malet pulver eller som suspension i vatten: 1,0 g flingfoder blandas med 20 ml utspädningsvatten till en homogen blandning. Beredningen kan ges med en dosering på cirka 5 ml per kärl och dag (skaka 
om före användning). Äldre larver kan få en större dos. 
5. Utfodringen justeras enligt vattenkvaliteten. Om odlingsmediet blir grumligt 
bör dosen sänkas. Foderdoseringen måste övervakas noggrant. För liten mängd leder till att larverna emigrerar mot vattenkolumnen och för stor mängd leder till ökad mikrobiell aktivitet och lägre syrekoncentrationer. 
Båda omständigheterna kan leda till minskad tillväxt. 
6. Även celler av vissa grönalger (t.ex.  Scenedesmus subspicatus , Chlorella 
vulgaris ) kan tillsättas när nya odlingskärl läggs upp.
 
Utfodring av vuxna exemplar  
7. Vissa testutövare har föreslagit att bomullskompresser indränkta i mättad 
sukroslösning kan användas som foder för vuxna exemplar.  ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1391
 
Kläckning  
8. Vid 20 ± 2 °C börjar vuxna exemplar kläckas i odlingskärlen efter cirka 
13–15 dagar. Hanarna är lätta att känna igen på sina fjäderantenner.  
Äggmassor  
9. När vuxna exemplar finns i odlingsburen bör alla larver i odlingskärlen 
kontrolleras tre gånger per vecka för att se om gelatinösa äggmassor har 
deponerats. Om sådana upptäcks, bör de avlägsnas försiktigt. Äggmassorna 
överförs till ett litet kärl som innehåller ett prov av odlingsvattnet. De används sedan för att starta nya odlingskärl (t.ex. 2–4 äggmassor per kärl) eller för toxicitetstest. 
10. Första stadiets larver bör kläckas efter 2–3 dagar.
 
Uppläggning av nya odlingskärl  
11. När odlingarna är etablerade bör det vara möjligt att lägga upp en färsk 
larvodling veckovis eller med längre intervall beroende på testningskraven, 
och avlägsna äldre kärl efter att vuxna myggor har kläckts. På detta sätt fås regelbunden tillgång till vuxna exemplar med minimal insats.
 
Beredning av testlösningarna M4 och M7  
12. M4-mediet upptäcktes av Elendt (1990). M7-mediet bereds på samma sätt 
som M4-mediet med undantag för de ämnen som anges i tabell 1, för vilka 
koncentrationerna är fyra gånger lägre i M7 jämfört med M4. En publika ­
tion om M7-mediet är under arbete (Elendt, personlig kommunikation). Testlösningen ska inte beredas enligt Elendt och Bias (1990) eftersom de angivna koncentrationerna av NaSiO
 3 ·5H 2 O, NaNO  3 , KH  2 PO 4 och K  2 HPO  4 
inte är lämpliga.  
Beredning av M7-medium  
13. Varje stamlösning (I) bereds individuellt och en kombinerad stamlösning 
(II) bereds av dessa stamlösningar (I) (se tabell 1). 50 ml av den kom ­
binerade stamlösningen (II) och de mängder av varje stamlösning med makronäring som anges i tabell 2 och avjoniserat vatten tillsätts upp till 1 
liter för att bereda M7-mediet. En stamlösning med vitaminer bereds genom 
att tillsätta tre vitaminer till avjoniserat vatten enligt tabell 3, och 0,1 ml av den kombinerade vitaminstamlösningen tillsätts till det slutliga M7-mediet strax före användningen (vitaminstamlösningen förvaras djupfryst i små 
alikvoter). Mediet luftas och stabiliseras.
 
LITTERATUR  
BBA (1995), ”Long-term toxicity test with  Chironomus riparius : Development 
and validation of a new test system”, redigerat av M. Streloke och H. Köpp. 
Berlin 1995.  ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1392
 
Tabell 1  
Stamlösningar av spårelement för M4- och M7-medium  
Stamlösningar (I) Mängd (mg) som 
byggs upp till 1 
liter med avjoni ­
serat vatten Beredning av kombinerad 
stamlösning (II): blanda följande 
mängder (ml) stamlösning (I) och 
bygg upp till 1 liter med avjoniserat 
vatten Slutliga koncentrationer i 
testlösningarna (mg/l) 
M4 M7 M4 M7  
H 3 BO 3 ( 1 ) 57 190 1,0 0,25 2,86 0,715 
MnCl  2 · 4H  2 O (  1 ) 7 210 1,0 0,25 0,361 0,090 
LiCl (  1 ) 6 120 1,0 0,25 0,306 0,077 
RbCl (  1 ) 1 420 1,0 0,25 0,071 0,018 
SrCl  2 · 6H  2 O (  1 ) 3 040 1,0 0,25 0,152 0,038 
NaBr (  1 ) 320 1,0 0,25 0,016 0,004 
Na 2 MoO  4 · 2H  2 O (  1 ) 1 260 1,0 0,25 0,063 0,016 
CuCl  2 · 2H  2 O (  1 ) 335 1,0 0,25 0,017 0,004 
ZnCl  2 260 1,0 1,0 0,013 0,013 
CaCl  2 · 2H  6 O 200 1,0 1,0 0,010 0,010 
KI 65 1,0 1,0 0,0033 0,0033 Na
 2 SeO  3 43,8 1,0 1,0 0,0022 0,0022 
NH  4 VO  3 11,5 1,0 1,0 0,00058 0,00058 
Na 2 EDTA · 2H  2 O (  1 ) ( 2 ) 5 000 20,0 5,0 2,5 0,625 
FeSO  4 · 7H  2 O (  1 ) ( 2 ) 1 991 20,0 5,0 1,0 0,249  
( 1 ) Dessa ämnen avviker i M4 och M7, såsom anges ovan. 
( 2 ) Dessa ämnen bereds individuellt, blandas och autoklaveras omedelbart.  
Tabell 2  
Stamlösningar med makronäringsämnen för medium M4 och M7  
Mängd som byggs upp 
till 1 liter med 
avjoniserat vatten 
(mg) Mängd stamlösning med 
makronäringsämnen som 
tillsätts för att bereda 
medium M4 och M7 
(ml/l) Slutliga 
koncentrationer i 
testlösningarna 
M4 och M7 
(mg/l)  
CaCl  2 · 2H  2 O 293 800 1,0 293,8 
MgSO  4 · 7H  2 O 246 600 0,5 123,3 
KCl 58 000 0,1 5,8 NaHCO
 3 64 800 1,0 64,8 
NaSiO  3 · 9H  2 O 50 000 0,2 10,0 
NaNO  3 2 740 0,1 0,274 
KH  2 PO 4 1 430 0,1 0,143 
K 2 HPO  4 1 840 0,1 0,184  ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1393
 
Tabell 3  
Stamlösningar med vitaminer för medium M4 och M7 Alla tre vitaminlösningar kombineras 
till en enda vitaminstamlösning.  
Mängd som byggs upp 
till 1 liter med 
avjoniserat vatten 
(mg) Mängd stamlösning med 
vitaminer som tillsätts för 
att bereda medium 
M4 och M7 
(ml/l) Slutliga 
koncentrationer i 
testlösningarna 
M4 och M7 
(mg/l)  
Tiaminhydroklorid 750 0,1 0,075 
Cyanokobalamin (B12) 10 0,1 0,0010 Biotin 7,5 0,1 0,00075
 
LITTERATUR  
Elendt, B. P. (1990), ”Selenium Deficiency in Crustacean”,  Protoplasma  154, s. 
25–33. 
Elendt, B. P. och W. R. Bias (1990), ”Trace Nutrient Deficiency in  Daphnia 
magna  Cultured in Standard Medium for Toxicity Testing. Effects on the Opti ­
mization of Culture Conditions on Life History Parameters of  D. magna ”, Water 
Research  24 (9), s. 1157–1167.  ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1394
 
Tillägg 3  
BEREDNING AV SYNTETISKT SEDIMENT  
Sedimentsammansättning  
Syntetiskt sediment ska ha följande sammansättning:  
Beståndsdel Egenskaper % av sedimentets 
torrvikt  
Torv Sphagnum, så nära pH 5,5–6 
som möjligt utan synliga väx ­
trester och finfördelad (par ­
tikelstorlek ≤1 mm) och luft ­
torkad. 4–5 
Kvartssand Partikelstorlek: > 50 % av 
partiklarna bör ha storlek 
inom området 50–200 μm 75–76 
Kaolinitlera Kaolinithalt ≥ 30 % 20 
Organiskt kol Justeras genom tillsats av 
torv och sand 2 (± 0,5) 
Kalciumkarbonat CaCO  3 , pulveriserat, kemiskt 
rent 0,05–0,1 
Vatten Konduktivitet ≤ 10 μS/m 30–50  
Beredning  
Torven lufttorkas och mals ner till ett fint pulver. En suspension av behövlig 
mängd torvpulver i avjoniserat vatten bereds med effektiv homogeniseringsappa ­
rat. Suspensionens pH justeras till 5,5 ± 0,5 med CaCO  3 . Suspensionen kon ­
ditioneras minst två dagar med skonsam omrörning vid 20 ± 2 °C, för att sta ­
bilisera pH och etablera en stabil mikrobiell komponent, varefter pH uppmäts på 
nytt och bör vara 6,0 ± 0,5. Torvsuspensionen blandas sedan med de övriga beståndsdelarna (sand och kaolinlera) och avjoniserat vatten till ett homogent sediment med en vattenhalt som ger kring 30–50 procent torrvikt av sediment. 
Därefter mäts den slutliga blandningens pH på nytt och justeras vid behov till 
6,5–7,5 med CaCO
 3 . Prover tas av sedimentet för att bestämma torrvikten och 
halten organiskt kol. Likaså rekommenderas att det syntetiska sediment som ska användas i ett chironomidtoxicitetstest konditioneras före användningen i sju 
dagar i samma betingelser som råder i det efterföljande testet.
 
Förvaring  
De torra beståndsdelarna för beredning av syntetiskt sediment kan lagras i ett 
torrt och svalt utrymme vid rumstemperatur. Berett (vått) sediment ska inte lagras för användning i test. Det bör användas omedelbart efter den 7 dagar långa 
konditioneringsperioden i slutet av beredningen.
 
LITTERATUR  
Kapitel C.8 i denna bilaga, Toxicitet hos daggmaskar. 
Meller M., Egeler P., Rombke J., Schallnass H., Nagel R., Streit B. (1998), 
”Short-term Toxicity of Lindane, Hexachlorobenzene and Copper Sulfate on 
Tubificid Sludgeworms (Oligochaeta) in Artificial Media”,  Ecotox. and Environ. 
Safety  39, s. 10–20.  ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1395
 
Tillägg 4  
Krav på kemiska egenskaper hos utspädningsvatten  
Ämne Koncentrationer  
Partikelinnehåll < 20 mg/l 
Totalt organiskt kol < 2 mg/l 
Ojoniserad ammoniak < 1 μg/l 
Hårdhet som CaCO  3 < 400 mg/l (*) 
Restklor < 10 μg/l 
Bekämpningsmedel med organiska fosforföreningar, 
totalt. < 50 ng/l 
Bekämpningsmedel med organiska klorföreningar plus 
polyklorerade bifenyler, totalt. < 50 ng/l 
Totalt organiskt klor < 25 ng/l  
(*) Här bör noteras att om man misstänker växelverkan mellan hårdhetsjoner och testämnet, 
bör vatten med lägre hårdhet användas (och i en sådan situation får Elendt Medium M4 
inte användas).  ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1396
 
Tillägg 5  
Vägledning för övervakning av kläckning av chironomider  
Fällor placeras på testbägarna. Dessa fällor behövs från dag 20 fram till testets 
slut. Exempel på en fälla visas nedan.
  
A: nylonnät 
B: upp-och-nedvänd plastkopp C: exponeringskärl utan läpp D: filterportar för vattenutbyte 
E: vatten F: sediment
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1397
 
C. 28  TOXICITETSTEST I SEDIMENT- OCH VATTENFAS PÅ 
CHIRONOMID-LARVER MED SPIKAT VATTEN  
INLEDNING 
1. Denna testmetod motsvarar OECD:s testriktlinje 219 (2004). Syftet med 
testmetoden är att bedöma effekterna av långvarig kemikalieexponering på sedimentlevande larver i sötvatten av fjädermyggor  Chironomus  sp. Den 
baserar sig i huvudsak på BBA-vägledningen med ett sediment-vatten-test ­
system med syntetisk jord och vattenkolumnexponering (1). Metoden beak ­
tar också existerande toxicitetstestprotokoll för  Chironomus riparius  och  
Chironomus tentans  som har tagits fram i Europa och Förenta staterna (2) 
(3) (4) (5) (6) (7) (8) och ringtestats (1) (6) (9). Även övriga väldokumen ­
terade chironomider kan användas, t.ex.  Chironomus yoshimatsui  (10) (11). 
2. Exponeringen i denna testmetod görs med spikat vatten. Valet av lämpligt 
exponeringsscenario beror på den avsedda tillämpningen för testet. Vatten ­
exponeringen med spikad vattenkolumn är avsedd att simulera vindavdrift av bekämpningsmedel och täcker den inledande toppkoncentrationen i por ­
vatten. Metoden är också användbar för andra typer av exponering (inklu ­
sive kemikaliespill), med undantag för ackumuleringsprocesser som är 
längre än testperioden. 
3. Ämnen som behöver testas på sedimentlevande organismer är sådana som i 
allmänhet blir kvar i sedimentet under långa tidsperioder. De sedimentle ­
vande organismerna kan exponeras via ett antal rutter. Den relativa betydel ­
sen av varje exponeringsrutt och den tid det tar för var och en av dem att 
bidra till de totala toxiska effekterna beror på den berörda kemikaliens 
fysikalkemiska egenskaper. För starkt adsorberande ämnen (t.ex. log K
 ow 
> 5) eller för ämnen som binds kovalent till sedimentet, kan förtäring av 
förorenad föda vara en betydande exponeringsrutt. För att toxiciteten hos 
starkt lipofila ämnen inte ska underskattas kan tillsättning av föda till sedi ­
mentet före applicering av testämnet övervägas. För att alla potentiella ex ­
poneringsrutter ska beaktas har denna testmetod fokus på långvarig expo ­
nering. Testets längd är 20–28 dagar för C.  riparius  och C.  yoshimatsui  och 
28–65 dagar för C.  tentans . Om korttidsdata krävs för ett specifikt ändamål, 
t.ex. för att undersöka effekterna av instabila kemikalier, kan tilläggsreplikat avlägsnas efter tio dagar. 
4. De endpoints som mäts är det totala antalet kläckta vuxna exemplar och 
utvecklingstiden fram till kläckning. Det rekommenderas att mätningar av 
larvernas överlevnad och tillväxt endast görs efter en tiodagarsperiod i fall 
där ytterligare korttidsdata krävs, med användning av ytterligare replikat enligt vad som är lämpligt. 
5. För detta test rekommenderas syntetiskt sediment. Syntetiskt sediment har 
flera fördelar jämfört med naturliga sediment: 
— Variationen mellan testningar reduceras eftersom syntetiskt sediment 
bildar en reproducerbar ”standardmatris”, och behovet av att få fram oförorenade och rena sediment elimineras. 
— Testningen kan inledas när som helst utan att beakta säsongvariationer i 
testsedimentet och det behövs ingen förbehandling av sediment för att få bort naturligt förekommande fauna. När syntetiskt sediment används 
uppstår heller inte kostnader för insamling på fältet av tillräckliga mäng ­
der sediment för rutintestning.
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1398
 
— Användning syntetiskt sediment ger möjlighet till jämförelser av toxicitet 
och därmed klassificering av ämnen. Toxicitetsdata från tester med na ­
turliga och syntetiska sediment har visat sig vara jämförbara för flera kemikalier (2). 
6. Definitioner finns i tillägg 1.
 
PRINCIP FÖR TESTMETODEN 
7. Första stadiets chironomidlarver exponeras för ett urval koncentrationer av 
testämnet i ett sediment-vattensystem. Testet inleds genom att tillsätta första stadiets larver i testbägare som innehåller ett sediment-vatten-system och därefter spika vattnet med testämnet. Kläckning av fullbildade myggor 
och utvecklingshastighet mäts i slutet av testet. Överlevande larver och deras 
vikt kan också mätas efter tio dagar om så krävs (med användning av ytterligare replikat enligt det som är lämpligt). Dessa data analyseras med användning av en regressionsmodell för att uppskatta den koncentration som 
skulle orsaka × % minskning av antalet fullbildade myggor eller av larver ­
nas överlevnad eller tillväxt (EC
 15 , EC  50 osv.) eller genom användning av 
statistisk hypotesprövning för att bestämma NOEC/LOEC. För hypotespröv ­
ningen krävs en jämförelse mellan effektvärden och kontrollvärden med 
användning av statistiska test.  
INFORMATION OM TESTÄMNET 
8. Testämnets vattenlöslighet, ångtryck, uppmätt eller beräknad fördelning i 
sedimentet samt stabilitet i vatten och sediment bör vara kända. Det bör 
finnas en tillförlitlig analysmetod för kvantifiering av testämnet i överlig ­
gande vatten, porvatten och sediment med känd och rapporterad exakthet och detektionsgräns. Det är också bra att känna till testämnets strukturformel och renhet. Hur testämnet agerar kemiskt (t.ex. upplösning, abiotisk och 
biotisk nedbrytning osv.) hör också till den information som är användbar. 
Närmare vägledning för testning av ämnen vars fysikalkemiska egenskaper gör det svårt att genomföra detta test finns i (12).
 
REFERENSKEMIKALIER 
9. Referenskemikalier kan testas periodiskt för att säkerställa att testprotokollet 
och testbetingelserna är tillförlitliga. Exempel på toxiska referensämnen som 
med framgång har använts i ringtest och valideringsstudier är lindan, triflu ­
ranid, pentaklorfenol, kadmiumklorid och kaliumklorid (1) (2) (5) (6) (13).  
TESTETS GILTIGHET 
10. För att testet ska vara giltigt gäller följande villkor: 
— Kläckningen av vuxna exemplar i kontrollkärlen måste vara minst 70 % 
i slutet av testet (1) (6). 
— Kläckningen av vuxna exemplar av  C. riparius  och  C. yoshimatsui  i 
kontrollkärlen bör inträffa 12–24 dagar efter att de har införts i kärlen, 
för C. tentans  krävs en period på 20–65 dagar. 
— Vid slutet av testet bör pH och koncentrationen upplöst syre mätas i 
varje kärl. Syrekoncentrationen bör vara minst 60 % av 
luftmättnadsvärdet (ASV) vid den använda temperaturen och pH i över ­
liggande vatten bör vara 6–9 i alla testkärl.  ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1399
 
— Variationen i vattentemperatur får inte vara större än ± 1,0 °C. Vatten ­
temperaturen kan kontrolleras genom att göra testningen i ett isotermiskt 
utrymme, varvid rumstemperaturen bör kontrolleras med lämpliga tids ­
intervall.  
METODBESKRIVNING  
Testkärl  
11. Testet görs i 600 ml-glasbägare med 8 cm i diameter. Även andra slags kärl 
kan användas, men då måste det gå att garantera att överliggande vatten och sediment har lämpliga djup. Sedimentytan bör vara tillräckligt stor för att ge 
2–3 cm
 2 per larv. Förhållandet mellan sedimentskiktets djup och överlig ­
gande vattnets djup bör vara 1:4. Testkärl och annan apparatur som kommer i kontakt med testsystemet bör vara gjorda av glas eller annat kemiskt inert material (t.ex. teflon).
 
Val av arter  
12. Den art som används i testet ska helst vara  Chironomus riparius . Chirono­
mus tentans  kan också vara lämplig, men den är svårare att hantera och 
kräver en längre testperiod. Även  Chironomus yohimatsui  kan användas. I 
tillägg 2 finns närmare uppgifter om odlingsmetoder för  Chironomus ripa ­
rius. Information om odlingsbetingelser finns också för andra arter, t.ex.  
Chironomus tentans  (4) och  Chironomus yoshimatsui  (11). Arternas identi ­
fiering måste bekräftas före testningen men är inte nödvändig före varje test om organismerna härrör från en odling inom laboratoriet.
 
Sediment  
13. Helst ska syntetiskt sediment användas. Om naturligt sediment används bör 
dess egenskaper bestämmas (minst pH, halten organiskt kol, och gärna även andra parametrar såsom förhållandet C/N och granulometri). Sedimentet 
måste även vara fritt från föroreningar och andra organismer som kan kon ­
kurrera med eller konsumera chironomiderna. Dessutom rekommenderas att naturligt sediment som är avsett att användas i ett chironomidtoxicitetstest konditioneras i sju dagar under samma betingelser som råder i det efter ­
följande testet. Följande syntetiska sediment, baserat på den syntetiska jord 
som används i testmetod C.8 (14) rekommenderas för detta test (1) (15) (16): 
a) 4–5 % (torrvikt) torv så nära pH 5,5–6 som möjligt; det är viktigt att 
använda endast lufttorkad och finmalen torv i pulverform (partikelstorlek ≤ 1 mm). 
b) 20 % (torrvikt) kaolinlera (kaolinithalt helst över 30 %). 
c) 75–76 % (torrvikt) kvartssand (till största del bestående av fin sand där 
mer än 50 % av partiklarna har storleken 50–200 μm). 
d) Avjoniserat vatten tillsätt så att blandningen får en slutlig fukthalt på 
30–50 %. 
e) Kemiskt rent kalciumkarbonat CaCO
 3 ) tillsätts för att justera den slutliga 
sedimentblandningens pH till 7,0 ± 0,5. 
f) Den slutliga blandningens kolhalt bör vara 2 % ± 0,5 % och kan justeras 
med hjälp av lämpliga mängder torv och sand, enligt punkterna a och c.  ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1400
 
14. Torv, kaolinlera och sand ska härröra från kända källor. Sedimentkom ­
ponenterna bör kontrolleras för att bekräfta avsaknaden av kemiska förore ­
ningar (t.ex. tungmetaller, organiska klorföreningar, organiska fosforför ­
eningar osv.) Ett exempel på hur syntetiskt sediment kan tillredas beskrivs i tillägg 3. Det är också godtagbart att blanda torra beståndsdelar om det går 
att demonstrera att tillsats av överliggande vatten inte leder till att sedimen ­
tets beståndsdelar separerar (t.ex. flytande torvpartiklar) och att torven eller sedimentet konditioneras tillräckligt.
 
Vatten  
15. Allt vatten som uppfyller de kemiska kriterierna för godtagbart utspädnings ­
vatten (se tilläggen 2 och 4) är lämpligt som testvatten. Allt lämpligt vatten, 
naturligt vatten (ytvatten eller grundvatten), rekonstituerat vatten (se tillägg 
2) och avklorerat kranvatten är godtagbart som odlings- och testvatten om chironomiderna överlever i det under odling, acklimatisering och testning utan att uppvisa tecken på stress. Vid teststart ska testvattnets pH vara 
mellan 6 och 9 och totalhårdheten får inte vara högre än 400 mg/l uttryckt 
som CaCO
 3 . Om man misstänker växelverkan mellan hårdhetsjoner och 
testämnet, bör vatten med lägre hårdhet användas (i en sådan situation får Elendt Medium M4 inte användas). Samma typ av vatten bör användas 
under hela testningen. De vattenkvalitetsegenskaper som förtecknas i tillägg 
4 bör mätas minst två gånger om året eller om man misstänker att egen ­
skaperna har ändrats betydligt.
 
Stamlösningar – spikat vatten  
16. Testkoncentrationerna beräknas på grundval av vattenkolumnens koncent ­
rationer, dvs. det vatten som ligger över sedimentet. Testlösningar för de 
valda koncentrationerna bereds i regel genom utspädning av en stamlösning. Stamlösningarna ska helst beredas genom upplösning av testämnet i ett testmedium. I vissa fall kan det krävas lösningsmedel eller dispergerings ­
medel för att få en stamlösning med lämplig koncentration. Exempel på 
lämpliga lösningsmedel är aceton, etanol, metanol, etylenglykolmonoetyle ­
ter, etylenglykoldimetyleter, dimetylformamid och trietylenglykol. Disperge ­
ringsmedel som kan användas är Cremofor RH40, Tween 80, metylcellulosa 
0,01 % och HCO-40. Lösningsmedlets koncentration i det slutliga test ­
mediet bör vara minimal (t.ex. ≤ 0,1 ml/l) och bör vara samma för alla 
behandlingar. Om lösningsmedel används, får det inte ha någon betydande effekt på överlevnad eller synliga skadliga effekter på chironomidlarverna, 
vilket kan verifieras genom en kontroll med enbart lösningsmedel. Man bör 
dock in i det sista undvika att använda dessa medel.
 
TESTETS UTFORMNING 
17. Testets utformning avser antalet koncentrationer och intervallen mellan dem, 
antalet kärl per koncentration och antalet larver per kärl. Här beskrivs ut ­
formningar för uppskattning av effektkoncentration, uppskattning av NOEC 
och för gränstest. Regressionsanalys rekommenderas för att testa hypotesen.  
Utformning för regressionsanalys  
18. Effektkoncentrationen (t.ex. EC  15 , EC  50 ) och det koncentrationsområde som 
är relevant för testämnet bör omfattas av de koncentrationer som ingår i testet. Allmänt taget gäller att exaktheten och särskilt giltigheten för upp ­
skattningar av effektkoncentrationer (EC
 x ) förbättras när effektkoncentratio ­
nen ligger inom området för de koncentrationer som testas. Extrapolering  ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1401
 
under lägsta positiva koncentration eller över högsta koncentration bör und ­
vikas. Preliminära test kan användas för att hitta rätt koncentrationsområde 
(se punkt 27). 
19. Om EC  x ska uppskattas bör testet omfatta minst fem koncentrationer och tre 
replikat för varje koncentration. Det är under alla omständigheter tillrådligt att använda tillräckligt många testkoncentrationer för att få en god modell ­
uppskattning. Faktorn mellan koncentrationer bör inte vara större än två 
(undantag kan göras i fall där dos-responskurvan har liten lutning). Antalet replikat per behandling kan minskas om antalet testkoncentrationer med 
olika respons ökas. En ökning av antalet replikat eller minskning av test ­
koncentrationsintervall tenderar att leda till ett smalare konfidensintervall för testet. Ytterligare replikat krävs om en uppskattning ska göras av larvernas överlevnad och tillväxt under en tiodagarsperiod.
 
Upplägg för uppskattning av NOEC/NOEC  
20. Om LOEC eller LOEC ska uppskattas bör det finnas fem testkoncentrationer 
med minst fyra replikat och faktorn mellan koncentrationerna får inte vara större än två. Antalet replikat bör vara tillräckligt för att säkerställa till ­
räcklig statistisk styrka för att upptäcka en skillnad på 20 % jämfört med 
kontrollen vid nivån 5 % för signifikans (p = 0,05). För uppskattning av 
utvecklingshastighet är det i regel lämpligt med variansanalys (ANOVA), såsom Dunnets eller Williams test (17) (18) (19) (20). För kläckningsfre ­
kvens kan ett Cochran-Armitage-test, Fishers exakta test (med Bonferroni ­
korrigering) eller ett Mantel-Haenszel-test användas.
 
Gränstest  
21. Gränstest kan göras (en testkoncentration och kontroll) om inga effekter 
framkommit vid det preliminära testet för att fastställa testområde. Syftet med gränstest är att få indikation om att testämnets toxiska värde är högre 
än den testade gränskoncentrationen. Inga förslag på rekommenderade kon ­
centrationer kan ges i denna testmetod, utan frågan måste bedömas av till ­
synsmyndigheterna. I regel krävs minst sex replikat både för behandling och kontroll. Man måste kunna demonstrera tillräcklig statistisk styrka för att 
upptäcka en skillnad på 20 % jämfört med kontrollen vid nivån 5 % för 
signifikans (p = 0,05). Eftersom t-test ger kvantitativ respons (utvecklings ­
hastighet och vikt) är t-test en lämplig statistisk metod förutsatt att data uppfyller testkraven (normalitet, homogena varianser osv.). Om dessa krav 
inte uppfylls kan man använda t-testet med olika varians eller ett 
icke-parametriskt test, såsom Wilcoxon-Mann-Whitneys test. För kläck ­
ningsfrekvens är det lämpligt att använda Fischers exakta test.
 
FÖRFARANDE  
Exponeringsbetingelser  
Beredning av systemet med spikat vatten och sediment  
22. Lämpliga mängder syntetiskt sediment (se punkterna 13 och 14 och tillägg 
3) tillförs testkärlet så att det bildas ett lager på minst 1,5 cm. Vatten tillsätts till ett djup på 6 cm (se punkt 15). Förhållandet mellan sedimentskiktets djup och vattenskiktets djup ska inte överskrida 1:4 och sedimentskiktet ska 
inte vara djupare än 3 cm. Systemet sediment-vatten bör hållas under skon ­
sam luftning i sju dagar före tillsats av testorganismer (se punkt 14 och tillägg 3). För att undvika separation av sedimentets beståndsdelar och åter ­
suspension av finfördelat material medan testvatten tillsätts i vattenkolum ­
nen, kan sedimentet täckas med en plastplatta medan vattnet tillsätts, var ­
efter plattan avlägsnas omedelbart. Även andra metoder kan vara lämpliga.
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1402
 
23. Testkärlen bör vara täckta (t.ex. med glasplattor). Vid behov fylls under 
testets gång vatten på till ursprunglig volym för att kompensera för avdunst ­
ning. Detta bör göras med destillerat eller avjoniserat vatten för att före ­
bygga ackumulering av salter.  
Tillförsel av testorganismer  
24. Fyra till fem dagar innan testorganismerna tillförs testkärlen ska äggmas ­
sorna avlägsnas från odlingarna och placeras i små kärl i odlingsmedium. 
Åldrat medium från stamodling eller färskt berett medium kan användas. 
Om färskt medium används bör en liten mängd föda, t.ex. grönalger och/ eller några droppar filtrat från en finmald suspension av fiskfoder i flingform tillsättas odlingsmediet (se tillägg 2). Endast färska äggmassor får användas. 
I regel börjar larverna kläckas några dagar efter att äggen har lagts (2–3 dagar 
för Chironomus riparius  vid 20 °C och 1–4 dagar för  Chironomus tentans  vid 
23 °C och  Chironomus yoshimatsui  vid 25 °C), och larvernas tillväxt sker i 
fyra stadier på 4–8 dagar per stadium. För testet ska första stadiets larver 
användas (2–3 eller 1–4 dagar efter kläckningen). Bestämning av larvstadium 
kan möjligen göras genom mätning av huvudkapseldiameter (6). 
25. Tjugo första stadiets larver fördelas slumpvis till varje testkärl som innehål ­
ler spikat sediment och vatten, med användning av en trubbig pipett. Luft ­
ningen av vattnet måste stoppas medan larverna tillsätts testkärlen och hållas 
stoppad i ytterligare 24 timmar efter tillsättningen (se punkterna 24 och 32). 
Enligt det testupplägg som används (se punkterna 19 och 20) är antalet larver per testkoncentration minst 60 för uppskattning av EC-punkt och 80 för bestämning av NOEC. 
26. Tjugofyra timmar efter tillsättning av larverna spikas den överliggande vat ­
tenkolumnen med testämnet, och en lätt luftning införs på nytt. Små voly ­
mer av testämnet tillsätts under vattenytan med hjälp av en pipett. Därefter görs försiktig omrörning av det överliggande vattnet utan att störa sedimen ­
tet.
 
Testkoncentrationer  
27. Ett preliminärt test kan användas för att fastställa koncentrationerna för det 
definitiva testet. För detta ändamål används en serie brett spridda koncent ­
rationer av testämnet. För att få samma ytdensitet per chironomid som ska användas för det slutliga testet, exponeras chironomiderna för varje kon ­
centration av testämnet under en period som ger möjlighet att uppskatta 
lämpliga testkoncentrationer. Inga replikat krävs. 
28. Testkoncentrationerna för det definitiva testet baseras på resultaten från det 
preliminära testet. Det ska finnas minst fem testkoncentrationer som väljs enligt beskrivningen i punkterna 18–20.
 
Kontrollkärl  
29. Kontrollkärl som inte innehåller testämne utan enbart sediment bör ingå i 
testet med lämpligt antal replikat (se punkterna 19–20). Om lösningsmedel 
har använts för applicering av testämnet (se punkt 16) bör det också finnas 
kontrollkärl med sediment och lösningsmedel.  ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1403
 
Testsystem  
30. De system som används är statiska. Semistatiska system eller genomflödes ­
system med intermittent eller kontinuerlig förnyelse av överliggande vatten 
kan användas i undantagsfall, t.ex. om vattenkvalitetsspecifikationerna inte är lämpliga för testorganismen eller påverkar den kemiska jämvikten (t.ex. om syrenivåerna blir för låga, koncentrationen av utsöndrade produkter blir 
för hög eller om mineraler som släpps ut från sediment påverkar pH och/ 
eller vattenhårdheten). I regel är det dock tillräckligt och rekommendabelt att använda andra metoder för kompensering av kvaliteten på överliggande vatten, såsom luftning.
 
Foder  
31. Larverna bör ges foder helst dagligen eller minst tre gånger per vecka. 
Fiskfoder (suspension i vatten eller finmalt foder, t.ex. Tetra-Min eller Tetra-Phyll, se närmare i tillägg 2) i mängder om 0,25–0,5 mg (0,35–0,5 mg för C.  yoshimatsui ) per larv per dag anses vara lämpligt för unga larver 
under de tio första dagarna. För äldre larver kan det krävas lite större 
mängd: 0,5–1 mg per larv och dag bör vara tillräckligt för återstoden av testet. Mängden bör minskas för alla behandlingar och kontroller om det uppstår svamptillväxt eller mortalitet observeras i kontrollerna. Om svamp ­
tillväxten inte kan stoppas måste testet upprepas. Vid testning av starkt 
adsorberande ämnen (t.ex. log K
 ow > 5) eller ämnen som är kovalent bundna 
till sedimentet, kan mängden foder som krävs för att säkerställa överlevnad och naturlig tillväxt för organismerna tillsättas i det syntetiska sedimentet 
före stabiliseringsperioden. Då ska växtmaterial användas i stället för fisk ­
foder, t.ex. 0,5 % (torrvikt) finmalda löv från t.ex. brännässla ( Urtica dioi ­
ca), mullbär ( Morus alba ), vitklöver ( Trifolium repens ), spenat ( Spinacia 
oleracea ) eller annat växtmaterial ( Cerophyl  eller  alfacellulosa ).
 
Inkubationsbetingelser  
32. Skonsam luftning av överliggande vatten i testkärlen införs helst 24 timmar 
efter tillsättning av larverna och får pågå genom hela testet (se till att halten upplöst syre inte faller under 60 % av luftmättnadsvärdet ASV). Luftningen görs med hjälp av en Pasteur-glaspipett som är fäst 2–3 cm ovanför sedi ­
mentskiktet (en eller ett fåtal bubblor per sekund). Vid testning av flyktiga 
kemikalier kan man överväga att utesluta luftning av sediment-vattensyste ­
met. 
33. Testet genomförs vid konstant temperatur på 20 °C (± 2 °C). För C. tentans 
och C. yoshimatsui rekommenderas temperaturer på 23 °C respektive 25 °C 
(± 2 °C). En ljusperiod på 16 timmar används och ljusintensiteten ska vara 500–1 000 lux.
 
Exponeringstid  
34. Exponeringen inleds när larver tillsätts i spikade kärl och kontrollkärl. Den 
maximala exponeringstiden är 28 dagar för C.  riparius  och C.  yoshimatsui  
och 65 dagar för C.  tentans . Om myggor kläcks tidigare, kan testet avslutas 
efter minst fem dagar efter att det sista vuxna exemplaret har kläckts i kontrollen.
 
OBSERVATIONER  
Kläckning  
35. Utvecklingstiden och totalantalet fullbildade han- och honmyggor bestäms. 
Hanarna är lätta att känna igen på sina fjäderantenner.  ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1404
 
36. Testkärlen bör granskas visuellt minst tre gånger i veckan för att bedöma 
förekomsten av onormalt beteende (t.ex. exemplar som lämnar sedimentet, 
ovanligt simmande) jämfört med kontrollen. Under perioden för förväntad kläckning är det nödvändigt att dagligen räkna antalet kläckta exemplar. Kön och antal fullbildade exemplar registreras dagligen. Efter identifiering 
avlägsnas myggorna från kärlen. Ägg som har deponerats före testets slut ­
förande bör registreras och därefter avlägsnas för att förhindra att larver på nytt introduceras i sedimentet. Likaså ska registrering göras av antalet syn ­
liga puppor som inte har kläckts. Vägledning om övervakning av kläckning 
finns i tillägg 5.
 
Tillväxt och överlevnad  
37. Om det krävs data om överlevnad och tillväxt under en tiodagarsperiod bör 
ytterligare testkärl införlivas från början, så att dessa därefter kan användas. 
Larverna i sedimentet från dessa tilläggskärl tillvaratas genom sållning med 
ett 250 μm-såll. Kriterierna för död är orörlighet eller utebliven reaktion på 
mekanisk stimulans. Larver som inte tillvaratas bör räknas som döda (larver som har dött i början av testet kan ha sönderdelats av mikrober). Torrvikten 
(askfri) för överlevande larver per testkärl bestäms och den genomsnittliga 
individuella torrvikten per kärl beräknas. Det är bra att bestämma vilket stadium överlevande larver tillhör, och för detta kan mätning av huvud ­
kapselns bredd användas.
 
Analytiska mätningar  
Testämnets koncentration  
38. Som ett minimum bör prover av överliggande vatten, porvatten och sedi ­
ment analyseras i början (helst inom en timme från tillsats av testämne) och 
i slutet av testet, för den högsta koncentrationen och för en lägre koncent ­
ration. Dessa bestämningar av testämneskoncentration ger information om testsubstansens beteende/fördelning i vatten-sedimentsystemet. Provtagning av sediment vid testets början kan påverka testsystemet (t.ex. genom att 
larver avlägsnas) och därför måste ytterligare testkärl användas för analy ­
tiska bestämningar vid testets start samt under testets gång om så är lämpligt (se punkt 39). Mätningar i sedimentet är eventuellt inte nödvändiga om fördelningen av testämnet mellan vatten och sediment har fastställts tydligt 
under motsvarande betingelser (t.ex. förhållandet mellan sediment och vat ­
ten, typ av applicering, sedimentets halt av organiskt kol). 
39. Om mellanliggande mätningar görs (t.ex. dag 7) och om det för analysen 
krävs stora prover som inte kan tas från testkärlen utan att testsystemet 
påverkas, bör de analytiska bestämningarna göras på prover som tas från extra testkärl som behandlas på samma sätt (inklusive förekomst av testorga ­
nismer) men som inte används för biologiska observationer. 
40. Centrifugering vid t.ex. 10 000 g och 4 °C i 30 minuter är det rekommen ­
derade förfarandet för att isolera porvatten. Om det har demonstrerats att testämnet inte adsorberas på filter kan även filtrering godtas. I vissa fall är 
det kanske inte möjligt att analysera koncentrationerna i porvattnet därför att 
provet är för litet.
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1405
 
Fysikalkemiska parametrar  
41. Mätning bör göras av pH, upplöst syre i vattnet och temperatur i testkärlen 
på lämpligt sätt (se punkt 10). Hårdhet och ammonium bör mätas i kont ­
rollerna och ett testkärl vid den högsta koncentrationen i början och slutet av testet.
 
DATA OCH RAPPORTERING  
Behandling av resultaten  
42. Syftet med detta test är att bestämma testämnets effekt på utvecklingshas ­
tigheten och totalantalet fullbildade han- och honmyggor eller, om det gäller 
ett tiodagarstest, effekterna på larvernas överlevnad och vikt. Om det inte 
finns indikationer på statistiskt avvikande känslighet för hanar och honor, kan resultaten poolas för statistiska analyser. Känslighetsskillnaderna mellan 
hanar och honor kan bedömas statistiskt t.ex. genom ” χ
 2 -r × 2 table test”. 
Larvernas överlevnad och genomsnittlig individuell torrvikt per kärl måste bestämmas efter tio dagar där detta krävs. 
43. Effektkoncentrationerna uttryckta som koncentrationer i överliggande vatten 
beräknas helst på grundval av uppmätta sedimentkoncentrationer vid testets början (se punkt 38). 
44. För att beräkna en punktvis uppskattning av EC
 50 eller något annat EC  x - 
värde, kan statistiken per kärl användas som äkta replikat. Vid beräkning av 
konfidensintervallet för ett EC  x -värde bör variansen mellan kärl beaktas, 
eller så bör man påvisa att variansen är så liten att den kan ignoreras. Om modellen anpassas med minsta kvadratmetoden bör transformation till ­
lämpas på den kärlvisa statistiken i syfte att förbättra variansens homogeni ­
tet. EC
 x -värdena bör dock beräknas när responsen har transformerats tillbaka 
till det ursprungliga värdet. 
45. När syftet med den statistiska analysen är att bestämma NOEC/LOEC ge ­
nom hypotestestning, måste variansen mellan kärl beaktas, t.ex. genom näs ­
tad ANOVA. Alternativt kan mer robust testning (21) vara lämplig i situa ­
tioner där de vanliga ANOVA-antagandena inte gäller.  
Kläckningsfrekvens  
46. Kläckningsfrekvenser är dikotoma (tvåpunktsfördelade) data och kan analy ­
seras genom Cochran-Armitage test som tillämpas på step-down-grund där monoton dos-respons förväntas och dessa data stämmer överens med för ­
väntningen. Om inte, kan Fishers exakta test eller ett Mantel-Haenszel-test 
med Bonferroni-Holm-korrigerade p-värden användas. Om det finns bevis på större variation mellan replikat inom samma koncentration än det som en binomial fördelning skulle indikera (ofta kallad extra-binomial fördelning), 
bör ett robust Cochran-Armitage-test eller Fischers exakta test användas, 
enligt det som föreslås i punkt 21. 
47. Det totala antalet myggor som kläckts per kärl, n
 e , bestäms och divideras 
med antalet tillsatta larver, n  a enligt följande:  
ER ¼ n e 
n a ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1406
 
där: 
ER = kläckningsfrekvensen  
n e = antalet myggor som kläckts per kärl  
n a = antalet larver som tillsatts per kärl 
48. Ett alternativ som bäst lämpar sig för stora provstorlekar, när det finns 
extra-binomial varians, är att behandla kläckningsfrekvensen som en kon ­
tinuerlig respons och använda förfaranden såsom William-test när monoton 
dos-respons förväntas och stämmer överens med dessa data för kläcknings ­
frekvens. Dunnett-test är lämpligt i fall där det inte är hållbart med mono ­
tonicitet. I detta sammanhang definieras begreppet ”stort prov” som ett prov 
där antalet kläckta och antalet inte kläckta överstiger fem, per replikatkärl. 
49. Vid användning av ANOVA-metoder bör värdena för kläckningsfrekvens 
först transformeras genom arcsin-kvadratsrotstransformation eller Freeman-Tukeytransformation för att få en ungefärlig normalfördelning och jämna ut varianserna. Cochran-Armitage-test, Fishers exakta test (Bon ­
ferroni) eller Mantel-Haenszel-test kan användas när absoluta frekvenser 
används. För att göra arcsin-kvadratrotstransformation tar man inverterad sinus (sin
 –1 ) av kvadratroten av kläckningsfrekvensen. 
50. EC  x -värden för kläckningsfrekvenser beräknas med regressionsanalys (t.ex. 
probit (22), logit, Weibull, lämplig kommersiell mjukvara eller dylikt). Om regressionsanalysen inte lyckas (om det t.ex. finns mindre än två partiella 
responser) används andra icke-parametriska metoder såsom glidande medel ­
värde eller enkel interpolering.
 
Utvecklingshastighet  
51. Med genomsnittlig utvecklingstid avses den genomsnittliga tidsomfattningen 
mellan tillsättning av larver (testdag 0) och kläckningen av den experimen ­
tella kohorten myggor (för beräkning av den faktiska utvecklingstiden bör 
man beakta larvernas ålder vid tillsättningstidpunkten). Värdet för utveck ­
lingshastighet är det reciproka värdet av tidsenheten för utveckling: (enhet: 1/dag) och representerar den andel larvutveckling som sker per dag. Utveck ­
lingshastigheten är det mått som helst ska användas för utvärdering av dessa 
sedimenttoxicitetsstudier eftersom variansen är lägre och homogenare samt närmare normalfördelningen i jämförelse med utvecklingstiden. Kraftfulla parametriska testförfaranden kan alltså användas baserade på utvecklings ­
hastighet hellre än på utvecklingstid. För utvecklingshastighet som en kon ­
tinuerlig respons kan EC
 x -värden uppskattas med hjälp av regressionsanalys 
(t.ex. (23), (24)). 
52. För efterföljande statistiska test antas antalet myggor observerade på inspek ­
tionsdag × ha kläckts i mitten av tidsintervallet mellan dag × och dag x-1 (l 
är inspektionsintervallets längd, i regel 1 dag). Genomsnittlig utvecklings ­
hastighet per kärl (x) beräknas enligt följande:  
x ¼ X  m 
i¼1 ƒ i x i 
n e 
där: 
x: genomsnittlig utvecklingshastighet per kärl 
i: index för inspektionsintervall m: maximiantalet inspektionsintervall
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1407
 
ƒ i : antalet myggor som kläckts under inspektionsintervallet i  
n e : totalantalet myggor som kläckts i slutet av experimentet (=  P ƒ i ) 
x i : utvecklingshastigheten för myggor som kläckts under intervallet i 
x i ¼ 1 Í 
day  i Ä l i 
2 Î 
där: 
dag  i : inspektionsdag (dagar från appliceringen) 
l i : inspektionsintervallets längd i (dagar, i regel 1 dag)  
Testrapport  
53. Testrapporten ska innehålla minst följande uppgifter: 
Testämne:  
— Fysikalisk natur och, där det är relevant, fysikalkemiska egenskaper 
(vattenlöslighet, ångtryck, fördelningskoefficient i jord (eller i sediment, om tillgänglig), stabilitet i vatten osv.). 
— Kemiska identifieringsdata (trivialnamn, kemiskt namn, strukturformel, 
CAS-nummer osv.) samt renhet och analysmetod för kvantifiering av 
testämnet.  
Testarter:  
— Organismer som använts för testet: art, vetenskapligt namn, ursprung 
och odlingsbetingelser. 
— Information om hantering av äggmassor och larver. 
— Organismernas ålder när de tillförs testkärlen.  
Testbetingelser : 
— Sediment som använts (naturligt eller syntetiskt). — För naturligt sediment, insamlingsplatsens belägenhet och beskrivning av 
sedimentet, inbegripet i mån av möjlighet föroreningshistoria och egen ­
skaper: pH, halten organiskt kol, C/N-kvot och granulometri (om lämp ­
ligt). 
— Beredning av syntetiskt sediment: beståndsdelar och egenskaper (halten 
organiskt kol, pH, fukthalt osv. vid testets början). 
— Beredning av testvatten (om rekonstituerat vatten används) och egenska ­
per (syrehalt, pH, konduktivitet, hårdhet osv. vid testets början). 
— Sedimentets och överliggande vattnets djup. — Volymen för överliggande vatten och porvatten, vikten för vått sediment 
med och utan porvatten. 
— Testkärl (material och storlek). — Metod för beredning av stamlösningar och testkoncentrationer.
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1408
 
— Tillsättning av testämne: antalet koncentrationer, antalet replikat och, i 
förekommande fall, använt lösningsmedel. 
— Inkubationsbetingelser: temperatur, ljuscykel och intensitet, luftning (fre ­
kvens och intensitet). 
— Detaljerad information om utfodringen, inklusive typ av foder, bered ­
ning, mängd och utfodringsschema.  
Resultat:  
— Nominella testkoncentrationer, uppmätta testkoncentrationer och resulta ­
ten av alla analyser för bestämning av testämnets koncentration i test ­
kärl. 
— Vattenkvaliteten i testkärlen – pH, temperatur, upplöst syre, hårdhet och 
ammonium. 
— Ersättning av avdunstat testvatten, i förekommande fall. 
— Antalet kläckta hon- och hanmyggor per kärl och dag. — Antalet larver som inte utvecklats till myggor, per kärl. 
— Genomsnittlig individuell torrvikt för larver per kärl och per stadium, om 
lämpligt. 
— Procentandel kläckta exemplar per replikat- och testkoncentration (han- 
och honmyggor poolade). 
— Genomsnittlig utvecklingshastighet för fullbildade myggor per replikat 
och behandlingsnivå (han- och honmyggor poolade). 
— Uppskattning av toxiska endpoints t.ex. EC
 x (och associerade konfidens ­
intervall), NOEC och/eller LOEC, och statistiska metoder som använts för bestämning av dem. 
— Diskussion av resultaten, inbegripet inverkan på testresultatet som kan 
tillskrivas avvikelser från denna testmetod.
 
LITTERATUR  
(1) BBA (1995), ”Long-term toxicity test with  Chironomus riparius : Devel­
opment and validation of a new test system”, redigerat av M. Streloke 
och H. Köpp. Berlin 1995. 
(2) Fleming R. m.fl. 1994), ”Sediment Toxicity Tests for Poorly Water-Soluble 
Substances”, Slutlig rapport till Europeiska kommissionen, rapport nr EC 
3738, augusti 1994, WRc, UK. 
(3) SETAC (1993), ”Guidance Document on Sediment toxicity Tests and Bio ­
assays for Freshwater and Marine Environments”, WOSTA Workshop, Ne ­
derländerna. 
(4) ASTM International/E1706-00 (2002), ”Test Method for Measuring the 
Toxicity of Sediment-Associated Contaminants with Freshwater Invertebra ­
tes”, s. 1125–1241,  ASTM International 2002 Annual Book of Standards , 
vol. 11.05, ”Biological Effects and Environmental Fate;Biotechnology; Pes ­
ticides”, ASTM International, West Conshohocken, PA. 
(5) Environment Kanada (1997), ”Test for Growth and Survival in Sediment 
using Larvae of Freshwater Midges ( Chironomus tentans  or Chironomus 
riparius ). Biological Test Method”,  Report SPE 1/RM/32 , december 1997. 
(6) US-EPA (2000), ”Methods for Measuring the Toxicity and Bioaccumulation 
of Sediment-associated Contaminants with Freshwater Invertebrates”, andra 
utgåvan,  EPA 600/R-99/064 , mars 2000, revidering av första utgåvan juni 
1994.  ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1409
 
(7) US-EPA/OPPTS 850.1735  (1996), ”Whole Sediment Acute Toxicity Inver ­
tebrates”. 
(8) US-EPA/OPPTS 850.1790  (1996), ”Chironomid Sediment toxicity Test”. 
(9) Milani D., Day K. E., McLeay D. J. och Kirby R. S. (1996), ”Recent intra- 
and inter-laboratory studies related to the development and standardisation of Environment Kanada’s biological test methods for measuring sediment toxicity using freshwater amphipods  (Hyalella azteca)  and midge larvae  
(Chironomus riparius) ” Technical Report, Environment Kanada, National 
Water Research Institute, Burlington, Ontario, Kanada. 
(10) Sugaya Y. (1997), ”Intra-specific variations of the susceptibility of insecti ­
cides  in Chironomus yoshimatsui ”, Jp. J. Sanit. Zool.  48 (4), s. 345–350. 
(11) Kawai K. (1986), ”Fundamental studies on Chironomid allergy. I. Culture 
methods of some Japanese Chironomids (Chironomidae, Diptera)”,  Jp. J. 
Sanit. Zool.  37 (1), s. 47–57. 
(12) OECD, 2000, ”Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Diffic ­
ult Substances and Mixtures”,  OECD Environment, Health and Safety Pub ­
lications, Series on Testing and Assessment  Nr 23. 
(13) Environment Kanada (1995), ”Guidance Document on Measurement of 
Toxicity Test Precision Using Control Sediments Spiked with a Reference Toxicant”,  Report EPS 1/RM/30, september 1995 . 
(14) Kapitel C.8 i denna bilaga, Toxicitet hos daggmaskar. (15) Suedel B. C. och Rodgers J. H. (1994), ”Development of formulated ref ­
erence sediments for freshwater and estuarine sediment testing”,  Environ. 
Toxicol. Chem.  13, s. 1163–1175. 
(16) Naylor C. och Rodrigues C., (1995), ”Development of a test method for 
Chironomus riparius using a formulated sediment”,  Chemosphere  31, s. 
3291–3303. 
(17) Dunnett C. W. (1964), ”A multiple comparisons procedure for comparing 
several treatments with a control”,  J. Amer. Statis. Assoc.  50, s. 1096–1121. 
(18) Dunnett C. W. (1964), ”New tables for multiple comparisons with a con ­
trol”,  Biometrics , 20, s. 482–491. 
(19) Williams D. A. (1971), ”A test for differences between treatment means 
when several dose levels are compared with a zero dose control”,  Bio­
metrics , 27, s. 103–117. 
(20) Williams D. A. (1972), ”The comparison of several dose levels with a zero 
dose control”,  Biometrics , 28, s. 510–531. 
(21) Rao J. N. K. och Scott A. J. (1992), ”A simple method for the analysis of 
clustered binary data”,  Biometrics  48, s. 577–585. 
(22) Christensen E. R. (1984), ”Dose-response functions in aquatic toxicity tes ­
ting and the Weibull model”,  Water Research  18, s. 213–221. 
(23) Bruce och Versteeg (1992), ”A statistical procedure for modelling continu ­
ous toxicity data”,  Environmental Toxicology and Chemistry  11, s. 
1485–1494. 
(24) Slob W. (2002), ”Dose-response modelling of continuous endpoints”,  Tox­
icol. Sci.  66, s. 298–312.
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1410
 
Tillägg 1  
DEFINITIONER 
I denna testmetod gäller följande definitioner:  
syntetiskt sediment : rekonstituerat, konstgjort sediment som är en blandning av 
material avsedda att efterlikna de fysiska beståndsdelarna i naturligt sediment.  
överliggande vatten : det vatten som hålls ovanför sedimentet i testkärlet.  
porvatten : det vatten som finns i mellanrummen mellan sediment- och jordpar ­
tiklar.  
spikat sediment : sediment med tillsatt testämne.  
testkemikalie : alla ämnen eller blandningar som testas med denna testmetod.  ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1411
 
Tillägg 2  
Rekommendationer för odling av  Chironomus riparius  
1. Chironomus -larver kan odlas i kristalliseringskärl eller stora behållare. Fin 
kvartssand sprids som ett tunt skikt på cirka 5–10 mm på behållarens botten. 
Även kiselgur (t.ex. Merck, Art. 8117) har visat sig vara ett lämpligt substrat (det räcker med ett tunt lager på några mm). Lämpligt vatten tillsätts till ett djup på flera cm. Vattennivåerna bör fyllas på efter behov för att ersätta 
avdunstning och förebygga uttorkning. Vattnet kan vid behov ersättas. Det 
bör finnas en skonsam luftning. De kärl som innehåller larver bör hållas i en lämplig bur som hindrar vuxna exemplar från att rymma. Buren bör vara tillräckligt stor för att de vuxna exemplaren ska kunna svärma, annars kan 
kopulation utebli (minimum är cirka 30 × 30 ×30 cm). 
2. Burarna ska hållas i rumstemperatur eller ett tempererat utrymme vid 20 
± 2 °C med en ljusperiod på 16 timmar (intensitet ca 1 000 lux) och 8 
timmar mörker. Det har rapporterats att luftfuktighet under 60 % RH kan 
hämma reproduktion.
 
Utspädningsvatten  
3. Allt lämpligt naturligt eller syntetiskt vatten kan användas. Ofta används 
källvatten, avklorerat kranvatten och artificiella medier (t.ex. Elendt M4 eller 
M7, se nedan). Vattnet måste luftas före användningen. Vid behov kan odlingsvattnet förnyas genom att försiktigt hälla eller sifonera använt vatten från odlingskärlen utan att förstöra larvrören.
 
Utfodring av larver  
4. Chironomus -larverna ges fiskfoder i flingform (Tetra Min®, Tetra Phyll® 
eller motsvarande patenterat märke), cirka 250 mg per kärl och dag. Fodret kan ges i form av torrt malet pulver eller som suspension i vatten: 1,0 g 
flingfoder blandas med 20 ml utspädningsvatten till en homogen blandning. 
Beredningen kan ges med en dosering på cirka 5 ml per kärl och dag (skaka om före användning). Äldre larver kan få en större dos. 
5. Utfodringen justeras enligt vattenkvaliteten. Om odlingsmediet blir grumligt 
bör dosen sänkas. Foderdoseringen måste övervakas noggrant. För liten mängd leder till att larverna emigrerar mot vattenkolumnen och för stor mängd leder till ökad mikrobiell aktivitet och lägre syrekoncentrationer. 
Båda omständigheterna kan leda till minskad tillväxt. 
6. Även celler av vissa grönalger (t.ex.  Scenedesmus subspicatus , Chlorella 
vulgaris ) kan tillsättas när nya odlingskärl läggs upp.
 
Utfodring av vuxna exemplar  
7. Vissa testutövare har föreslagit att bomullskompresser indränkta i mättad 
sukroslösning kan användas som foder för vuxna exemplar.  ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1412
 
Kläckning  
8. Vid 20 ± 2 °C börjar vuxna exemplar kläckas i odlingskärlen efter cirka 
13–15 dagar. Hanarna är lätta att känna igen på sina fjäderantenner.  
Äggmassor  
9. När vuxna exemplar finns i odlingsburen bör alla larver i odlingskärlen 
kontrolleras tre gånger per vecka för att se om gelatinösa äggmassor har deponerats. Om sådana upptäcks, bör de avlägsnas försiktigt. Äggmassorna överförs till ett litet kärl som innehåller ett prov av odlingsvattnet. De 
används sedan för att starta nya odlingskärl (t.ex. 2–4 äggmassor per kärl) 
eller för toxicitetstest. 
10. Första stadiets larver bör kläckas efter 2–3 dagar.
 
Uppläggning av nya odlingskärl  
11. När odlingarna är etablerade bör det vara möjligt att lägga upp en färsk 
larvodling veckovis eller med längre intervall beroende på testningskraven, och avlägsna äldre kärl efter att vuxna myggor har kläckts. På detta sätt fås 
regelbunden tillgång till vuxna exemplar med minimal insats.
 
Beredning av testlösningarna M4 och M7  
12. M4-mediet upptäcktes av Elendt (1990). M7-mediet bereds på samma sätt 
som M4-mediet med undantag för de ämnen som anges i tabell 1, för vilka koncentrationerna är fyra gånger lägre i M7 jämfört med M4. En publikation om M7-mediet är under arbete (Elendt, personlig kommunikation). Testlös ­
ningen ska inte beredas enligt Elendt och Bias (1990) eftersom de angivna 
koncentrationerna av NaSiO
 3 ·5H 2 O, NaNO  3 , KH  2 PO 4 och K  2 HPO  4 inte är 
lämpliga.  
Beredning av M7-medium  
13. Varje stamlösning (I) bereds individuellt och en kombinerad stamlösning (II) 
bereds av dessa stamlösningar (I) (se tabell 1). Femtio ml av den kombine ­
rade stamlösningen (II) och de mängder av varje stamlösning med makro ­
näring som anges i tabell 2 och avjoniserat vatten tillsätts upp till 1 liter för att bereda M7-mediet. En stamlösning med vitaminer bereds genom att tillsätta tre vitaminer till avjoniserat vatten enligt tabell 3, och 0,1 ml av 
den kombinerade vitaminstamlösningen tillsätts till det slutliga M7-mediet 
strax före användningen (vitaminstamlösningen förvaras djupfryst i små alikvoter). Mediet luftas och stabiliseras.
 
Tabell 1  
Stamlösningar av spårelement för M4- och M7-medium  
Stamlösningar (I) Mängd (mg) som 
byggs upp till 1 
liter med 
avjoniserat vatten Beredning av kombinerad 
stamlösning (II): blanda följande 
mängder (ml) stamlösning (I) och 
bygg upp till 1 liter med avjoniserat 
vatten Slutliga koncentrationer i 
testlösningarna (mg/l) 
M4 M7 M4 M7  
H 3 BO 3 ( 1 ) 57 190 1,0 0,25 2,86 0,715 
MnCl  2 · 4H  2 O (  1 ) 7 210 1,0 0,25 0,361 0,090 
LiCl (  1 ) 6 120 1,0 0,25 0,306 0,077  ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1413
 
Stamlösningar (I) Mängd (mg) som 
byggs upp till 1 
liter med 
avjoniserat vatten Beredning av kombinerad 
stamlösning (II): blanda följande 
mängder (ml) stamlösning (I) och 
bygg upp till 1 liter med avjoniserat 
vatten Slutliga koncentrationer i 
testlösningarna (mg/l) 
M4 M7 M4 M7  
RbCl (  1 ) 1 420 1,0 0,25 0,071 0,018 
SrCl  2 · 6H  2 O (  1 ) 3 040 1,0 0,25 0,152 0,038 
NaBr (  1 ) 320 1,0 0,25 0,016 0,004 
Na 2 MoO  4 · 2H  2 O (  1 ) 1 260 1,0 0,25 0,063 0,016 
CuCl  2 · 2H  2 O (  1 ) 335 1,0 0,25 0,017 0,004 
ZnCl  2 260 1,0 1,0 0,013 0,013 
CaCl  2 · 2H  6 O 200 1,0 1,0 0,010 0,010 
KI 65 1,0 1,0 0,0033 0,0033 
Na 2 SeO  3 43,8 1,0 1,0 0,0022 0,0022 
NH  4 VO  3 11,5 1,0 1,0 0,00058 0,00058 
Na 2 EDTA · 2H  2 O (  1 ) ( 2 ) 5 000 20,0 5,0 2,5 0,625 
FeSO4 · 7H2O (  1 ) ( 2 ) 1 991 20,0 5,0 1,0 0,249  
( 1 ) Dessa ämnen avviker i M4 och M7, såsom anges ovan. 
( 2 ) Dessa ämnen bereds individuellt, blandas och autoklaveras omedelbart.  
Tabell 2  
Stamlösningar med makronäringsämnen för medium M4 och M7  
Mängd som byggs upp 
till 1 liter med 
avjoniserat vatten 
(mg) Mängd stamlösning med 
makronäringsämnen som 
tillsätts för att bereda medium 
M4 och M7 
(ml/l) Slutliga koncentrationer 
i testlösningarna M4 och 
M7 
(mg/l)  
CaCl  2 · 2H  2 O 293 800 1,0 293,8 
MgSO  4 · 7H  2 O 246 600 0,5 123,3 
KCl 58 000 0,1 5,8 
NaHCO  3 64 800 1,0 64,8 
NaSiO  3 · 9H  2 O 50 000 0,2 10,0 
NaNO  3 2 740 0,1 0,274 
KH  2 PO 4 1 430 0,1 0,143 
K 2 HPO  4 1 840 0,1 0,184  ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1414
 
Tabell 3  
Stamlösningar med vitaminer för medium M4 och M7  
Alla tre vitaminlösningar kombineras till en enda vitaminstamlösning.  
Mängd som byggs upp 
till 1 liter med 
avjoniserat vatten 
(mg) Mängd stamlösning med 
vitaminer som tillsätts för 
att bereda medium 
M4 och M7 
(ml/l) Slutliga 
koncentrationer i 
testlösningarna 
M4 och M7 
(mg/l)  
Tiaminhydroklorid 750 0,1 0,075 
Cyanokobalamin (B12) 10 0,1 0,0010 
Biotin 7,5 0,1 0,00075  
LITTERATUR  
BBA (1995), ”Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Development 
and validation of a new test system”, redigerat av M. Streloke och H. Köpp. 
Berlin 1995. 
Elendt, B. P. (1990), ”Selenium Deficiency in Crustacean”,  Protoplasma  154, s. 
25–33. 
Elendt B. P. och Bias W. R.(1990), ”Trace Nutrient Deficiency in  Daphnia 
magna  Cultured in Standard Medium for Toxicity Testing. Effects on the Opti ­
mization of Culture Conditions on Life History Parameters of  D. magna ”, Water 
Research  24 (9), s. 1157–1167.  ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1415
 
Tillägg 3  
BEREDNING AV SYNTETISKT SEDIMENT  
Sedimentsammansättning  
Syntetiskt sediment ska ha följande sammansättning:  
Beståndsdel Egenskaper % av sedimentets 
torrvikt  
Torv Sphagnum, så nära pH 5,5–6 
som möjligt utan synliga väx ­
trester och finfördelad (par ­
tikelstorlek ≤1 mm) och luft ­
torkad. 4–5 
Kvartssand Partikelstorlek: > 50 % av 
partiklarna bör ha storlek inom området 50–200 μm 75–76 
Kaolinitlera Kaolinithalt ≥ 30 % 20 
Organiskt kol Justeras genom tillsats av 
torv och sand 2 (± 0,5) 
Kalciumkarbonat CaCO
 3 , pulveriserat, kemiskt 
rent 0,05–0,1 
Vatten Konduktivitet ≤ 10 μS/m 30–50  
Beredning  
Torven lufttorkas och mals ner till ett fint pulver. En suspension av behövlig 
mängd torvpulver i avjoniserat vatten bereds med effektiv homogeniseringsappa ­
rat. Suspensionens pH justeras till 5,5 ± 0,5 med CaCO  3 . Suspensionen kon ­
ditioneras minst två dagar med skonsam omrörning vid 20 ± 2 °C, för att sta ­
bilisera pH och etablera en stabil mikrobiell komponent, varefter pH uppmäts på 
nytt och bör vara 6,0 ± 0,5. Torvsuspensionen blandas sedan med de övriga 
beståndsdelarna (sand och kaolinlera) och avjoniserat vatten till ett homogent sediment med en vattenhalt som ger kring 30–50 procent torrvikt av sediment. Därefter mäts den slutliga blandningens pH på nytt och justeras vid behov till 
6,5–7,5 med CaCO
 3 . Prover tas av sedimentet för att bestämma torrvikten och 
halten organiskt kol. Likaså rekommenderas att det syntetiska sediment som ska användas i ett chironomidtoxicitetstest konditioneras före användningen i sju dagar i samma betingelser som råder i det efterföljande testet.
 
Förvaring  
De torra beståndsdelarna för beredning av syntetiskt sediment kan lagras i ett 
torrt och svalt utrymme vid rumstemperatur. Berett (vått) sediment ska inte lagras 
för användning i test. Det bör användas omedelbart efter den 7 dagar långa 
konditioneringsperioden i slutet av beredningen.  
LITTERATUR:  
Kapitel C.8 i denna bilaga, Toxicitet hos daggmaskar. 
Meller M., Egeler P., Rombke J., Schallnass H., Nagel R., Streit B. (1998), 
”Short-term Toxicity of Lindane, Hexachlorobenzene and Copper Sulfate on 
Tubificid Sludgeworms (Oligochaeta) in Artificial Media”,  Ecotox. and Environ. 
Safety  39, s. 10–20.  ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1416
 
Tillägg 4  
Krav på kemiska egenskaper hos utspädningsvatten  
Ämne Koncentrationer  
Partikelinnehåll < 20 mg/l 
Totalt organiskt kol < 2 mg/l 
Ojoniserad ammoniak < 1 μg/l 
Hårdhet som CaCO  3 < 400 mg/l (*) 
Restklor < 10 μg/l 
Bekämpningsmedel med organiska fosforföreningar, 
totalt. < 50 ng/l 
Bekämpningsmedel med organiska klorföreningar plus 
polyklorerade bifenyler, totalt. < 50 ng/l 
Totalt organiskt klor < 25 ng/l  
(*) Här bör noteras att om man misstänker växelverkan mellan hårdhetsjoner och testämnet, 
bör vatten med lägre hårdhet användas (och i en sådan situation får Elendt Medium M4 
inte användas).  ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1417
 
Tillägg 5  
Vägledning för övervakning av kläckning av chironomider  
Fällor placeras på testbägarna. Dessa fällor behövs från dag 20 fram till testets 
slut. Exempel på en fälla visas nedan.
  
A: nylonnät 
B: upp-och-nedvänd plastkopp 
C: exponeringskärl utan läpp D: filterportar för vattenutbyte 
E: vatten 
F: sediment  ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1418
 
C.29  LÄTT BIONEDBRYTBARHET – CO  2 I FÖRSLUTNA KÄRL 
(Headspace-test)  
INLEDNING 
1. Denna testmetod motsvarar OECD:s testriktlinje310 (2006). Denna test ­
metod är en screeningmetod för utvärdering av kemikaliers lättnedbrytbarhet och ger liknande information som de sex testmetoder som beskrivs i kapitel C.4 i denna bilaga A–F. En kemikalie som ger positiva testresultat med 
denna metod kan anses vara lätt bionedbrytbar och sönderfaller således 
snabbt i miljön. 
2. Den väletablerade koldioxidmetoden (1) är baserad på Sturms ursprungliga 
test (2) för bestämning av organiska kemikaliers bionedbrytbarhet, genom mätning av koldioxid (CO
 2 ) som produceras genom mikrobiell verksamhet, 
har i regel varit det första valet för testning av dåligt lösliga kemikalier och 
kemikalier med starkt adsorberande egenskaper. Testet väljs också för lös ­
liga (men inte flyktiga) kemikalier, eftersom många anser att utveckling av koldioxid är det enda otvivelaktiga beviset på mikrobiell aktivitet. Avlägs ­
nandet av upplöst organiskt kol kan påverkas av fysikalkemiska processer – 
adsorption, avdunstning, utfällning, hydrolys – såväl som av mikrobiell 
aktivitet och många icke-biologiska reaktioner som förbrukar syre; CO
 2 
produceras sällan från organiska kemikalier på abiotisk väg. I det ursprung ­
liga och modifierade Sturmtestet (1) (2) avlägsnas CO  2 från vätskefasen till 
de absorberande kärlen genom s.k. sparging (luftbubblor får strömma genom 
vätskemediet för att avlägsna CO  2 ), medan Larsons version (3) (4) går ut på 
att överföra CO  2 från reaktionskärlet till absorberingsenheterna genom att 
låta CO  2 -fri luft passera genom utrymmet ovanför vätskan samtidigt som 
testkärlet omskakas kontinuerligt. Omskakning av reaktionskärlet används 
endast i Larson-modifieringen, och omrörning anges endast för olösliga ämnen i ISO 9439 (5) och i den ursprungliga US-versionen (6), enligt vilka sparging rekommenderas hellre än ersättning av gasfasen. I en annan offi ­
ciell US EPA-metod (8) baserad på Gledhill-metoden (8) hålls reaktions ­
kärlet under omskakning och förseglat från atmosfären, och CO
 2 som pro­
duceras samlas in i en intern alkalisk fälla direkt från gasfasen, på samma sätt som i klassiska Warburg/Barcroft-respirometerflaskor. 
3. Det har dock visat sig att det för ett antal kemikalier ackumuleras oorganiskt 
kol i mediet vid användning av standard-Sturmtest i modifierad form (9). En 
koncentration på upp till 8 mg/l oorganiskt kol konstaterades under sönder ­
fall av 20 mg C/l anilin. Uppsamling av CO
 2 i alkaliska fällor gav således 
inte en äkta bild av mängden mikrobiologiskt producerad CO  2 vid mellan ­
liggande tidpunkter under sönderfallet. Det medför att specifikationen om att 
minst 60 % av teoretisk maximal CO  2 -produktion (ThCO  2 ) måste samlas 
upp inom ett tiodagarsfönster (de tio dagar som följer omedelbart efter att 10 % bionedbrytning har uppnåtts) för att en testkemikalie ska klassificeras som lätt bionedbrytbar, inte uppfylls för vissa kemikalier som skulle ges 
denna klassificering om man använder eliminering av upplöst organiskt 
kol (DOC). 
4. Om procentandelen sönderdelning är lägre än förväntat, är det möjligt att 
oorganiskt kol har ackumulerats i testlösningen. Då kan nedbrytbarheten 
bedömas med andra test för biologisk nedbrytbarhet.
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1419
 
5. De övriga nackdelarna med Sturmtest (besvärligt, tidskrävande, högre risk 
för experimentella fel och kan inte användas för flyktiga kemikalier) har 
tidigare lett till sökning efter en teknik med förslutet kärl, annan än Gledhill, hellre än gasgenomflöde (10) (11). Boatman m.fl. (12) granskade de tidigare metoderna och valde ett system med slutet utrymme ovan för vätskeytan där 
CO
 2 frigjordes till detta utrymme i slutet av inkubationen genom försurning 
av mediet. CO  2 uppmättes med gaskromatografi (GC)/IC i automatiskt tagna 
prover i gasutrymmet, medan upplöst oorganiskt kol (DIC) i vätskefasen inte beaktades. Likaså var de kärl som användes mycket små (20 ml) med endast 
10 ml medium, vilket orsakade problem t.ex. vid tillsättning av de mycket 
små mängderna av olösliga testkemikalier, och/eller eventuellt fanns det inte tillräckliga mängder eller inga mikroorganismer i det inokulerade mediet som kunde sönderbryta testkemikalierna. 
6. Dessa svårigheter har lösts genom oberoende studier gjorda av Struijs och 
Stoltenkamp (13) samt av Birch och Fletcher (14), där de senare byggde på 
erfarenheter med apparatur använd i test för anaerob biologisk nedbrytning 
(15). I den tidigare metoden (13) mäts CO
 2 i utrymmet ovanför vätskan efter 
försurning och jämvikt, medan den senare metoden (14) innebär att man mäter DIC i både gas- och vätskefaserna, utan behandling; över 90 % av 
bildat oorganiskt kol fanns i vätskefasen. Båda metoderna har fördelar jäm ­
fört med Sturmtest, i den meningen att testsystemet är mera kompakt och lätthanterligt, flyktiga kemikalier kan testas och man undviker risken för fördröjning vid mätning av producerad CO
 2 . 
7. De två principerna kombinerades i ISO Headspace CO  2 Standard (16) som 
ringtestades (17) och denna standard utgör grunden för den testmetod som 
beskrivs här. De två principerna har också använts i US EPA-metoden (18). 
Två metoder för mätning av CO  2 har rekommenderats – CO  2 i utrymmet 
ovanför vätskan (headspace) efter försurning (13) och oorganiskt kol i vät ­
skefasen efter tillförsel av överskottsalkali. Den senare metoden infördes av 
Peterson under CONCAWE-ringtestet (19) av denna headspace-metod som 
modifierats till att mäta lätt biologisk nedbrytbarhet. De ändringar som gjordes vid 1992 års revidering (20) av metoden i kapitel C.4 i denna bilaga om lätt bionedbrytbarhet har införlivats i denna testmetod, så att beting ­
elserna (medium, tidslängd osv.) för övrigt är desamma som betingelserna 
i det reviderade Sturmtestet (20). Birch och Fletcher (14) har visat att de resultat som erhölls med detta headspace-test är mycket lika de resultat som erhölls med samma kemikalier i OECD-ringtest (21) av de reviderade test ­
metoderna.
 
PRINCIP FÖR TESTMETODEN 
8. Testkemikalien, i regel 20 mg C/l, såsom enda källa för kol och energi, 
inkuberas i ett buffert-mineralsaltmedium som har inokulerats med en blan ­
dad population mikroorganismer. Testet genomförs i förslutna flaskor med ett luftutrymme ovanför vätskan som syrekälla för aerob biologisk nedbryt ­
ning. Utvecklingen av CO
 2 till följd av fullständig aerob biologisk nedbryt ­
ning av testkemikalien bestäms genom att mäta den mängd oorganiskt kol 
som produceras i testflaskorna utöver den mängd som produceras i kontroll ­
kärl för bakgrundsvärde som endast innehåller inokulerat medium. Graden 
av biologisk nedbrytning uttrycks som en procentandel av den teoretiska 
maximiproduktionen av oorganiskt kol (ThIC), jämfört med den mängd testkemikalie (i form av organiskt kol) som tillfördes i början. 
9. DOC-elimineringen och/eller graden av primär biologisk nedbrytning av 
testkemikalien kan också mätas (20).
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1420
 
INFORMATION OM TESTKEMIKALIEN 
10. Testkemikaliens halt av organiskt kol (viktprocent) måste vara känd, an ­
tingen på grundval av den kemiska strukturen eller genom mätning, så att 
den procentuella nedbrytningen kan beräknas. För flyktiga testkemikalier kan uppmätt eller beräknad Henrys lags konstant användas för beräkning av lämplig kvot mellan utrymmet ovanför vätskan och vätskevolymen. In ­
formation om testkemikaliens toxicitet för mikroorganismer kan användas 
för att välja en lämplig testkoncentration och för tolkning av resultat som tyder på dålig biologisk nedbrytbarhet – inhibitionskontroll rekommenderas om det inte är känt att testkemikalien inte inhiberar mikrobiella aktiviteter 
(se punkt 24).
 
METODENS LÄMPLIGHET 
11. Testmetoden kan användas för vattenlösliga och olösliga testkemikalier; god 
dispergering av testkemikalien bör säkerställas. Med användning av den 
rekommenderade kvoten på 1:2 mellan utrymmet ovanför vätskan och väts ­
kevolymen kan flyktiga kemikalier med en Henrys lags konstant upp till 50 Pa m
 3 mol  –1 testas eftersom andelen testkemikalie i utrymmet ovanför väts ­
kan inte överskrider 1 % (13). Ett mindre utrymme ovanför vätskan kan 
användas vid testning av kemikalier som är flyktigare, men deras biotill ­
gänglighet kan utgöra en begränsning, särskilt om de har dålig löslighet i vatten. Man bör dock se till att kvoten mellan utrymmet ovanför vätskan och vätskevolymen samt testkemikaliens koncentration ger tillgång till till ­
räckligt med syre för att fullständig aerob bionedbrytning ska kunna ske 
(t.ex. genom att undvika en hög substratkoncentration och för liten volym ovanför vätskan). Vägledning om detta finns i (13) och (23).
 
REFERENSKEMIKALIER 
12. I syfte att kontrollera testförfarandet bör en testkemikalie med känd bio ­
logisk nedbrytbarhet testas parallellt. För detta ändamål kan anilin, natrium ­
bensoat eller etylenglykol användas vid testning av vattenlösliga testkemi ­
kalier och 1-oktanol för testkemikalier med dålig löslighet. Referenskemi ­
kaliernas biologiska nedbrytbarhet bör nå upp till mer än 60 % av ThIC 
inom 14 dagar.  
REPRODUCERBARHET 
13. Vid ISO-ringtest av metoden (17) erhölls följande resultat i rekommende ­
rade betingelser, i vilket ingick 20 mg C testkemikalie/l.  
Testkemikalie Medelvärde för 
procentuell biologisk 
nedbrytning 
(28 d) Variationskoeffici ­
ent 
(%) Antal laboratorier  
Anilin 90 16 17 
1-oktanol 85 12 14 
Variationen mellan tester (replikerbarhet) med användning av anilin var låg, 
med variationskoefficienter under 5 % för de flesta testningskörningar. I de 
två fall där replikerbarheten var sämre berodde den större variationen san ­
nolikt på hög produktion av oorganiskt kol i kontrollkärlen för bakgrund ­
svärde. Replikerbarheten var sämre med 1-oktanol men var fortfarande lägre 
än 10 % för 79 % av testkörningarna. Denna större variation mellan tester 
kan ha berott på doseringsfel, eftersom en liten volym (3–4 μl) 1-oktanol 
måste injiceras i de förslutna testflaskorna. Variationskoefficienterna kan bli högre när lägre koncentrationer av testkemikalie används, särskilt vid kon ­
centrationer under 10 mg C/l. Detta kan delvis lösas genom att sänka kon ­
centrationen totalt oorganiskt kol (TIC) i inokulatet.
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1421
 
14. I ett EU-ringtest (24) med fem ytaktiva ämnen tillsatta såsom 10 mg C/l 
erhölls följande testresultat:  
Testkemikalie Medelvärde för 
procentuell biologisk 
nedbrytning 
(28 d) Variationskoeffici ­
ent 
(%) Antal laboratorier  
Tetrapropylen 
Bensensulfonat 17 45 10 
Di-iso-oktylsul ­
fo-succinat (anioniskt) 72 22 9 
Hexadekyl-tri ­
metyl (*) 
Ammoniumklo ­
rid 
(katjonisk) 75 13 10 
Iso-nonylfenol- 
(etoxylat)
 9 
(icke-joniskt) 41 32 10 
Cocoamido- 
propyl- 
betain (amfoteriskt) 60 23 11
 
(*) SiO  2 tillsattes för att neutralisera toxicitet.  
Resultaten tyder på att variationen allmänt taget var högre för de ytaktiva 
ämnen som hade sämre nedbrytning. Variationen mellan tester var mindre än 15 % för över 90 % av fallen, och den högsta variationen var 30–40 %.  
ANMÄRKNING : De flesta ytaktiva ämnen har inte enhetlig molekylär struk ­
tur utan är blandningar av isomerer, homologer osv. som 
sönderfaller efter olika långa lagfaser och med olika kine ­
tiska hastigheter, vilket resulterar i lägre kurvor, dvs. grän ­
svärdet på 60 % kanske inte nås inom tiodagarsfönstret, även om varje enskild molekylär enhet skulle nå detta 
värde vid testning för sig. Detta kan även observeras 
med andra komplexa blandningar.
 
METODBESKRIVNING  
Apparatur  
15. Normal laboratorieapparatur och följande: 
a) Glasserumflaskor, förseglade med butylgummiproppar och kapsyllock av 
aluminium. Rekommenderad storlek är ”125 ml” som har en total volym 
på cirka 160 ml (i detta fall bör man försäkra sig om att volymen för var 
och en flaska är 160 ±1 ml. Mindre kärl kan användas om resultaten uppfyller de villkor som beskrivs i punkterna 66 och 67. 
b) Kolanalysator eller annat instrument (t.ex. gaskromatograf) för mätning 
av oorganiskt kol.
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1422
 
c) Högprecisionssprutor för gas- och vätskeformiga prover. 
d) Orbitalt skakbord i temperaturkontrollerad omgivning. 
e) Tillförsel av CO  2 -fri luft – kan ordnas genom att låta luft flöda genom 
kalk-soda-granulat eller genom att använda en gasblandning av 80 % N  2 
och 20 % O  2 (frivilligt) (se punkt 28). 
f) Membranfiltreringsutrustning med 0,20–0,45 μm porstorlek (frivilligt). 
g) Analysutrustning för organiskt kol (frivilligt).  
Reagenser  
16. Alla reagenser som används ska vara av analytisk renhetsgrad.  
Vatten  
17. Destillerat eller avjoniserat vatten ska användas med ≤ 1 mg/l som totalt 
organiskt kol. Detta representerar ≤ 5 % av det ursprungliga organiska kol 
som tillförs genom den rekommenderade dosen testkemikalie.  
Stamlösningar av mineralsaltmediet  
18. Stamlösningar och mineralsaltmedium liknande de i testerna ISO 14593 (16) 
och C.4 för lätt biologisk nedbrytbarhet (20) ska användas. En högre kon ­
centration av ammoniumklorid (2,0 g/l i stället för 0,5 g/l) är endast nöd ­
vändigt i särskilda undantagsfall, t.ex. när koncentrationen testkemikalie överstiger 40 mg C/l. Stamlösningarna bör förvaras i kylskåp och slängas 
efter sex månader, eller tidigare om det finns tecken på fällning eller mi ­
krobiell tillväxt. Följande stamlösningar ska beredas: 
a) Kaliumdivätefosfat (KH
 2 PO 4 ) 8,50 g 
Dikaliumvätefosfat (K  2 HPO  4 ) 21,75 g 
Dinatriumvätefosfatdihydrat (Na  2 HPO  4 ·2H 2 O) 33,40 g 
Ammoniumklorid (NH  4 Cl) 0,50 g 
Lös upp i vatten och fyll upp till 1 liter. Lösningens pH bör vara 7,4 
(± 0,2). Om inte, bered en ny lösning. 
b) Kalciumkloriddihydrat (CaCl  2 ·2H 2 O) 36,40 g 
Lös upp i vatten och fyll upp till 1 liter. 
c) Magnesiumsulfatheptahydrat (MgSO  4 ·7H 2 O) 22,50 g 
Lös upp i vatten och fyll upp till 1 liter. 
d) Järn(III)kloridhexahydrat (FeCl  3 ·6H 2 O) 0,25 g 
Lös upp i vatten och fyll upp till 1 liter och tillsätt en droppe koncent ­
rerad väteklorid.  
Beredning av mineralmedium  
19. Blanda 10 ml av lösning a med cirka 800 ml vatten (punkt 17), tillsätt 1 ml 
av lösningarna b, c och d och fyll upp till 1 liter med vatten (punkt 17).
 
Övriga reagenser  
20. Koncentrerad ortofosforsyra (H  3 PO 4 ) (> 85 % massa per volym).  ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1423
 
Natriumhydroxidlösning 7 M  
21. Lös upp 280 g natriumhydroxid (NaOH) i 1 liter vatten (punkt 17). Bestäm 
DIC-koncentrationen i denna lösning och beakta värdet vid beräkning av 
testresultaten (se punkterna 55 och 61), särskilt med tanke på giltighets ­
kriteriet enligt punkt 66 b. Bered en ny, färsk lösning om koncentrationen DIC är för hög.
 
Testkemikalie  
22. Bered en stamlösning av en tillräckligt vattenlöslig kemikalie i vatten (punkt 
17) eller i testmedium (punkt 19) i en koncentration som helst är 100-faldig jämförd med den koncentration som ska användas i testet; det kan vara 
nödvändigt att justera stamlösningens pH. Stamlösning tillförs mineralme ­
diet så att den slutliga halten av organiskt kol blir mellan 2 och 40 mg C/l, helst 20 mg C/l. Om lägre koncentrationer används kan precisionen bli lidande. Lösliga och olösliga vätskeformiga kemikalier kan tillsättas i kärlen 
direkt med hjälp av högprecisionssprutor. För dåligt lösliga och olösliga 
testkemikalier kan det krävas specialbehandling (25). Det finns följande alternativ: 
a) Direkt tillsättning av kända vägda mängder. 
b) Dispergering med ultraljud före tillsättning. 
c) Dispergering med hjälp av emulgeringsmedel som krävs för att fastställa 
huruvida de har inhiberande eller stimulerande effekter på den mikrobi ­
ella aktiviteten före tillsättning. 
d) Adsorption av vätskeformig testkemikalie eller lösning i ett lämpligt 
flyktigt lösningsmedel, på ett annat medium eller underlag (t.ex. glas ­
fiberfilter), och därefter avdunstning av lösningsmedlet om sådant an ­
vänts och direkt tillsättning av kända mängder. 
e) Tillsättning av känd mängd av en lösning av testkemikalien i ett lätt ­
flyktigt lösningsmedel i ett tomt testkärl, och därefter avdunstning av lösningsmedlet. 
Medel eller lösningsmedel som används i c, d och e måste ha testats för 
stimulerande eller inhiberande effekt på mikrobiell aktivitet (se punkt 42 b).
 
Referenskemikalie  
23. Bered en stamlösning av (löslig) testkemikalie i vatten (punkt 17) i en 
koncentration som helst är 100-faldig i jämförelse med den slutliga kon ­
centration som ska användas (20 mg C/l) i testet.  
Inhibitionskontroll  
24. Det händer ofta att testkemikalier inte uppvisar någon betydande nedbrytning 
under de betingelser som används för bedömning av lätt bionedbrytbarhet. En 
tänkbar orsak är att testkemikalien fungerar inhiberande på inokulatet vid den 
koncentration som används i testet. Inhibitionskontroll kan införlivas i tes ­
tutformningen för att göra det möjligt att (i efterhand) identifiera inhibering som en möjlig orsak eller bidragande faktor. Alternativt kan man med hjälp 
av inhibitionskontrollen utesluta sådana störningar och påvisa att ingen eller 
svag nedbrytning endast beror på motstånd mot mikrobiell attack i testbeting ­
elserna. För att få information om testkemikaliens toxicitet för (aeroba) mik ­
roorganismer) bereds en lösning i testmediet med testkemikalien och referens ­
kemikalien (punkt 19), var och en i samma koncentration som tillsatt kon ­
centration (se punkterna 22 och 23).
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1424
 
Inokulat  
25. Inokulatet kan härröra från ett flertal källor: aktiverat slam, avloppsvatten 
(oklorerat), ytvatten och jordar eller från en blandning av dessa (20). Källans 
bionedbrytningsaktivitet bör kontrolleras med hjälp av en referenskemikalie. Oavsett källa bör mikroorganismer som tidigare exponerats för testkemika ­
lien inte användas om förfarandet är avsett att användas som ett test för lätt 
bionedbrytbarhet.
 
Varning: Aktiverat slam, avlopp och avloppsutflöde innehåller patogena 
organismer och måste hanteras försiktigt. 
26. Erfarenheter har visat att den optimala volymen för inokulat är en volym 
som 
— är tillräcklig för att ge en tillbörlig bionedbrytningsaktivitet, 
— ger tillräcklig nedbrytning av referenskemikalien (se punkt 66), 
— ger 10  2 till 10  5 kolonibildande enheter per milliliter i den slutliga bland ­
ningen, 
— i regel ger en koncentration på 4 mg/l suspenderade fasta ämnen i den 
slutliga blandningen när aktiverat slam används; koncentrationer upp till 30 mg/l kan användas men då uppstår betydlig ökning av CO
 2 -produk­
tionen i kontrollkärlen för bakgrundsvärde (26), 
— bidrar till mindre än 10 % av ursprungskoncentrationen av organiskt kol 
som tillförs genom testkemikalien, 
— i regel är 1–10 ml inokulat per 1 liter testlösning.  
Aktiverat slam  
27. Aktiverat slam tas i färsk form från luftningstanken i ett reningsverk eller en 
enhet i laboratorieskala som i huvudsak behandlar avlopp från hushåll. Vid 
behov kan grova partiklar avlägsnas genom sållning (t.ex. 1 mm  2 ) och 
slammet bör hållas aerobt fram till att det används. 
28. Alternativt kan slammet efter eliminering av grova partiklar få sedimentera 
eller slammet centrifugeras (t.ex. 1 100 × g i 10 minuter). Avlägsna super ­
natantvätskan. Slammet kan tvättas i minerallösningen. Det koncentrerade 
slammet suspenderas i mineralmediet till en koncentration på 3–5 g sus ­
penderade fasta ämnen per liter. Detta hålls under luftning tills att det används. 
29. Slammet bör tas från ett effektivt fungerande konventionellt reningsverk. 
Om slam måste tas från ett high rate-reningsverk (högre belastningsgrad och kortare retentionstider) eller kan förmodas innehålla inhibitorer, bör 
det tvättas. Sedimentera eller centrifugera det återsuspenderade slammet 
efter grundlig blandning, avlägsna överstående vätska och suspendera tvättat slam på nytt i en ny volym av mineralmedium. Upprepa förfarandet tills att slammet anses vara fritt från överflödigt substrat eller inhibitor. 
30. Efter fullständig återsuspension eller, om det gäller obehandlat slam, ta ett 
prov strax före användning för bestämning av torrvikten för suspenderade fasta ämnen. 
31. Ett annat alternativ är att homogenisera aktiverat slam (3–5 g suspenderade 
fasta ämnen/l). Behandla slammet i en Waring-blandare i 2 minuter på medelhastighet. Låt det blandade slammet sätta sig i 30 minuter eller vid 
behov längre och dekantera vätskan för användning som inokulat (cirka 10 
mg/l mineralmedium).
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1425
 
32. Ytterligare minskning av CO  2 -utveckling i kontrollprovet för bakgrund ­
svärde kan fås genom att lufta slammet över natten med CO  2 -fri luft. An ­
vänd 4 mg/l fasta ämnen från aktiverat slam som koncentration för inoku ­
latet i detta test (13).  
Sekundärt avloppsutflöde  
33. Alternativt kan inokulat tas från sekundärt utflöde från ett reningsverk eller 
en enhet i laboratorieskala som i huvudsak tar emot avloppsvatten från hushåll. Håll provet under aeroba förhållanden och använd det samma dag 
som det tagits eller gör vid behov förkonditionering. Utflödet filtreras ge ­
nom ett grovfilter för att avlägsna stora partiklar och därefter mäts pH. 
34. För att minska halten oorganiskt kol gör sparging av filtratet med CO
 2 -fri 
luft (punkt 15 e) i 1 timme medan pH hålls på 6,5 med hjälp av ortofos ­
forsyra (punkt 20). Därefter återställs pH-värdet till det ursprungliga med 
natriumhydroxid (punkt 21) och efter sedimentering cirka 1 timme tas en 
lämplig volym av supernatanten för inokulering. Genom sparging reduceras inokulatets halt av oorganiskt kol. Om t.ex. den maximala rekommenderade volymen av filtrerat utflöde som genomgått sparging (100 ml) per liter 
vatten använts som inokulat, är mängden oorganiskt kol i kontrollkärlen 
för bakgrundsvärde mellan 0,4 till 1,3 mg/l (14), vilket representerar 2–6,5 % av testkemikaliens kol vid 20 mg C/l och 4–13 % vid 10 mg C/l.
 
Ytvatten  
35. Ett prov tas av lämpligt ytvatten. Provet bör hållas i aeroba förhållanden och 
användas samma dag som det tas. Vid behov bör provet koncentreras genom 
filtrering eller centrifugering. Den volym inokulat som används i vart och ett 
testkärl bör bestämmas enligt kriterierna i punkt 26.  
Jordar  
36. Ett prov tas av lämplig jord på ned till 20 cm djup från jordytan. Stenar, 
växtrester och invertebrater bör avlägsnas från jordprovet innan det sållas genom 2 mm maskor (vid behov kan provet torkas lite om det är för vått för sållning). Provet bör hållas under aeroba förhållanden och användas samma 
dag som det tas (om provet transporteras i en löst sluten polyetenpåse kan 
det förvaras vid 2–4 °C upp till en månad).
 
Förkonditionering av inokulat  
37. Inokulatet kan förkonditioneras för försöksförhållandena men får inte för ­
anpassas till testkemikalien. Genom förkonditionering kan man minska bak ­
grundsutveckling av CO  2 i kontrollkärlen. Förkonditionering innebär att 
aktiverat slam luftas efter utspädning i testmediet till 30 mg/l med fuktig 
CO 2 -fri luft upp till 5–7 dagar vid testtemperatur.  
TESTFÖRFARANDE  
Antal flaskor  
38. Antalet flaskor (se punkt 15 a) som behövs för ett test beror på analys ­
frekvensen och testets tidslängd. 
39. Det rekommenderas att ett triplikat flaskor analyseras efter ett tillräckligt 
antal tidsintervall så att tiodagarsfönstret kan fastställas. Minst fem testflas ­
kor (se punkt 15 a) från uppsättningarna a, b och c (se punkt 42) analyseras 
i slutet av testet, som grund för beräkning av 95 %-konfidensintervall för 
den genomsnittliga procentuella biologiska nedbrytningen.  ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1426
 
Inokulerat medium  
40. Inokulatet används vid en koncentration på 4 mg/l aktiverat slam räknat som 
torrvikt. Bered omedelbart före användning tillräcklig mängd inokulerat 
medium genom tillsättning av t.ex. 2 ml lämpligt behandlat aktiverat slam (se punkterna 27–32) med 2 000 mg/l till 1 liter mineralsaltmedium (se punkt 19). När sekundärt avloppsutflöde ska användas, tillsätt upp till 100 
ml utflöde (se punkt 33) till 900 ml mineralsaltmedium (se punkt 19) och 
späd till 1 liter med medium.
 
Beredning av flaskor  
41. Alikvoter av inokulerat medium doseras till replikatflaskor så att kvoten 
mellan ovanförliggande utrymme och vatten är 1:2 (tillsätt t.ex. 107 ml till flaskor med 160 ml kapacitet). Andra kvoter kan användas, men se 
varningarna i punkt 11. Oavsett vilken typ av inokulat som används är 
det viktigt att se till att det inokulerade mediet blandas tillräckligt för att säkerställa enhetlig fördelning i testflaskorna. 
42. Flaskuppsättningarna (punkt 15 a) bereds enligt följande: 
a) Testkärl (betecknade F
 T ) som innehåller testkemikalie. 
b) Kontrollkärl för bakgrundsvärde (betecknade F  B ) som endast innehåller 
testmedium plus inokulat; likaså måste alla eventuella kemikalier, lös ­
ningsmedel, agenter eller glasfiberfilter som används för att införa test ­
kemikalien i testkärlen tillsättas. 
c) Kärl (betecknade F  C ) för kontroll av förfarandet med referenskemikalien. 
d) Vid behov, kärl (betecknade F  I ) för kontroll av eventuell inhiberande 
effekt från testkemikalien som innehåller både testkemikalie och refe ­
renskemikalie vid samma koncentrationer (punkt 24) som i flaskorna F
 T och F  C . 
e) Kärl (betecknade F  S ) för kontroll av eventuell abiotisk sönderdelning 
som i led a plus 50 mg/l HgCl  2 eller steriliserade på annat sätt (t.ex. i 
autoklav). 
43. Vattenlösliga testkemikalier och referenskemikalier tillsätts som vattenbase ­
rade stamlösningar (punkterna 22, 23 och 24) så att koncentrationer på 10–20 mg C/l erhålls. 
44. Olösliga testkemikalier och olösliga referenskemikalier tillsätts flaskorna på 
olika sätt (se punkt 22 a–e) beroende på testkemikaliens natur, antingen före 
eller efter tillsättning av inokulerat medium, beroende på metoden för be ­
handling av testkemikalien. Om något av de förfaranden som anges i punkt 22 a–e används ska kontrollflaskorna för bakgrundsvärde F
 B (punkt 42 b) 
behandlas på samma sätt, men testkemikalien och referenskemikalien ute ­
sluts. 
45. Flyktiga testkemikalier ska injiceras i förslutna flaskor (punkt 47) med 
användning av mikrospruta. Dosen beräknas utifrån injicerad volym och testkemikaliens densitet. 
46. Vid behov bör vatten tillsättas, för att få samma vätskevolym i varje kärl. 
Det är viktigt att se till att kvoten mellan utrymmet ovanför vätskan och vätska (i regel 1:2) och koncentrationen testkemikalie är sådana att det finns 
tillräckligt med syre i utrymmet ovanför vätskan för fullständig biologisk 
nedbrytning.
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1427
 
47. Därefter förseglas alla flaskor med t.ex. butylgummipropp (septum) och 
kapsyllock av aluminium. Om flyktiga kemikalier testas, tillsätts de i detta 
skede (punkt 45). Om övervakning ska göras av DOC-koncentrationsminsk ­
ningen i testlösning och tidpunkt noll-analyser göras för ursprunglig kon ­
centration av oorganiskt kol (sterila kontroller, punkt 43 e) eller andra 
determinanter, tas ett lämpligt prov från testkärlet. Därefter slängs testkärlet 
och dess innehåll. 
48. De förslutna flaskorna placeras på ett roterande skakbord (punkt 15 d) där 
skakhastigheten är tillräcklig för att hålla flaskornas innehåll väl blandat och suspenderat (t.ex. 150–200 rpm), och inkuberas i mörker vid 20 °C som bör 
hållas inom ± 1 °C.
 
Provtagning  
49. Provtagningsschemat beror på lagperioden och den kinetiska hastigheten för 
testkemikaliens biologiska nedbrytning. Flaskorna tas för analys på prov ­
tagningsdagen, och provtagning bör göras minst varje vecka eller oftare (t.ex. två gånger i veckan) om en fullständig nedbrytningskurva önskas. 
Behövligt antal replikatflaskor tas från skakbordet så att F
 T , F B och F  C 
representeras, och, i förekommande fall F  I och F  S (se punkt 42). Testperio ­
den är normalt 28 dagar. Om bionedbrytningskurvan tyder på att platåfasen har nåtts tidigare än efter 28 dagar, kan testet avslutas tidigare. Ta prover 
från de fem flaskor som reserverats för testdag 28 för analys, och använd 
resultaten för att beräkna konfidensintervall eller variationskoefficient för procentandelen biologisk nedbrytning. Provtagning från flaskor som repre ­
senterar kontrollerna av inhibering och abiotisk nedbrytning behöver inte 
göras lika ofta som för de övriga flaskorna – dag 1 och dag 28 är till ­
räckligt.
 
Analys av oorganiskt kol  
50. CO  2 -produktionen i flaskorna bestäms genom att mäta ökningen av kon ­
centrationen oorganiskt kol under inkubationen. Det finns två metoder som 
rekommenderas för mätning av mängden oorganiskt kol som produceras 
under testet; dessa beskrivs nedan. Eftersom metoderna kan ge något avvi ­
kande resultat, bör endast en av metoderna användas vid en testkörning. 
51. Metod a rekommenderas om mediet sannolikt innehåller rester av t.ex. glas ­
filterpapper och/eller olöslig testkemikalie. Analysen kan göras med gaskro ­
matograf om kolanalysator inte finns att tillgå. Det är viktigt att flaskorna 
har testtemperatur eller nära testtemperatur när gasen i utrymmet ovanför vätskan analyseras. Metod b kan vara enklare för laboratorier som använder kolanalysatorer för att mäta oorganiskt kol. Det är viktigt att natriumhydrox ­
idlösningen (punkt 21) som används för att omvandla CO
 2 till karbonat är 
antingen nyberedd eller att lösningens halt av oorganiskt kol är känd, så att detta kan beaktas vid beräkning av testresultaten (se punkt 66 b).
 
Metod a: försurning till pH < 3  
52. Före varje analyssats ska analysatorn av oorganiskt kol kalibreras med hjälp 
av en lämplig standard (t.ex. 1 % w/w CO  2 i N  2 ). Koncentrerad ortofos ­
forsyra (punkt 20) injiceras genom varje provtagningsflaskas gummipropp 
för att sänka mediets pH till < 3 (tillsätt t.ex. 1 ml till 107 ml testmedium). Flaskorna sätts tillbaka på skakbordet. Efter en timme på skakbordet i test ­
temperatur avlägsnas flaskorna, alikvoter (t.ex. 1 ml) av gas dras ur utrym ­
met ovanför vätskan i varje flaska och injiceras i analysatorn för oorganiskt 
kol. De uppmätta koncentrationerna oorganiskt kol registreras som mg C/l.
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1428
 
53. Principen med denna metod är att efter försurning till pH < 3 och stabili ­
sering vid 20 °C, få en jämviktskonstant för fördelningen av CO  2 mellan 
vätske- och gasfaserna i testflaskorna som är 1,0 när den uppmäts som en koncentration (13). Detta bör demonstreras för testsystemet minst en gång, enligt följande: 
Lägg upp flaskor som innehåller 5 och 10 mg/l oorganiskt kol med använd ­
ning av vattenfritt natriumkarbonat (Na
 2 CO 3 ) i CO  2 -fritt vatten som beretts 
genom försurning av vatten till pH 6,5 med koncentrerad ortofosforsyra (punkt 20), med sparging över natten med CO
 2 -fri luft och därefter höjning 
av pH till neutralt med alkali. Se till att kvoten mellan utrymmet ovanför 
vätskan och vätskans volym är samma som vid testningen (t.ex. 1:2). För ­
sura och stabilisera till jämvikt enligt beskrivningen i punkt 52 och mät koncentrationerna av oorganiskt kol i både gas- och vätskefasen. Kontrollera att båda koncentrationerna är desamma inom gränserna för försöksfel. Om 
de inte är det, bör förfarandena ses över. Denna kontroll av fördelningen av 
oorganiskt kol mellan vätske- och gasfasen behöver inte göras varje gång testet utförs, men kan rutinmässigt göras när kalibrering utförs. 
54. Om DOC-eliminering ska mätas (endast vattenlösliga testkemikalier) bör 
proverna tas från vätskefasen i separata (icke-försurade) flaskor, membran ­
filtreras och injiceras i DOC-analysatorn. Dessa flaskor kan enligt behov användas för andra analyser för mätning av primär bionedbrytning.
 
Metod b: omvandling av CO  2 till karbonat  
55. Före varje analyssats ska analysatorn för oorganiskt kol kalibreras med hjälp 
av lämplig standard, t.ex. en lösning av natriumbikarbonat (NaHCO  3 ) i 
CO 2 -fritt vatten (se punkt 53) inom området 0–20 mg/l räknat som oorga ­
niskt kol. Natriumhydroxidlösning (7 M, punkt 21) (t.ex. 1 ml till 107 ml medium) injiceras genom varje provtagningsflaskas gummipropp och flas ­
korna skakas i en timme vid testtemperaturen. Använd samma 
NaOH-lösning för alla flaskor som tas till provtagning på en viss dag, men inte nödvändigtvis för alla provtagningar under hela testets gång. Om absoluta bakgrundsvärden för oorganiskt kol krävs vid alla provtagningar, 
måste bestämning av oorganiskt kol göras för NaOH-lösningen varje gång 
den används. Flaskorna tas ur skakbordet och innehållet får sätta sig. Lämp ­
liga volymer (t.ex. 50–1 000 μl) av vätskefasen i varje kärl dras ut med 
injektionsspruta. Proverna injiceras i analysatorn för oorganiskt kol och 
koncentrationerna registreras. Man bör se till att analysatorn är tillbörligt 
utrustad för att tåla de alkaliska prover som analyseras i denna metod. 
56. Principen med metoden är att efter tillsättning av alkali och omskakning, ska 
koncentrationen av oorganiskt kol i utrymmet ovanför vätskan vara negli ­
gerbar. Detta bör kontrolleras för testsystemet minst en gång med använd ­
ning av standarder för oorganiskt kol, tillsats av alkali, jämviktsstabilisering och mätning av koncentrationen oorganiskt kol både i gas- och vätskefasen (se punkt 53). Koncentrationen i gasfasen bör närma sig noll. Denna kont ­
roll av virtuell fullständig absorption av CO
 2 behöver inte göras varje gång 
testet utförs. 
57. Om DOC-eliminering ska mätas (endast vattenlösliga testkemikalier) bör 
proverna tas från vätskefasen i separata flaskor (som inte innehåller tillsatt alkali), membranfiltreras och injiceras i DOC-analysatorn. Dessa flaskor kan 
enligt behov användas för andra analyser för mätning av primär bionedbryt ­
ning.
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1429
 
DATA OCH RAPPORTERING  
Beräkning av resultaten  
58. Utifrån ett antagande om 100 % mineralisering av testkemikalie till CO  2 , 
motsvarar det ThIC utöver det som produceras i kontrollkärlen för bak ­
grundsvärde det TOC som tillfördes till varje testkärl i testets början, vilket betyder att 
ThIC ¼ TOC 
Totalmassan (mg) oorganiskt kol (TIC) i varje flaska är då 
TIC ¼ ðmg C i vätskan þ mg C i gasfasenÞ 
¼ ðV
 L Ü C L Þ þ ðV H Ü C H Þ Ekvation 1 
där: 
V L = volymen vätska i flaskan (liter), 
C L = koncentrationen oorganiskt kol i vätskan (mg/l räknat som kol), 
V H = gasfasens volym (liter), 
C H = koncentrationen oorganiskt kol i gasfasen (mg/l räknat som kol). 
Beräkningarna av totalt oorganiskt kol för de två analysmetoderna som 
används för mätning av oorganiskt kol i detta test beskrivs nedan i punk ­
terna 60 och 61. Den procentuella bionedbrytningen (% D) i vart och ett fall 
fås genom följande: 
%D ¼ ðTIC  t Ä TIC  b Þ 
TOC Ü 100 Ekvation 2 
där: 
TIC  t = mg TIC i testflaskan vid tidpunkten t, 
TIC  b = genomsnitt för mg TIC i kontrollflaskorna för bakgrundsvärde vid 
tidpunkten t, 
TOC = mg TOC som i början tillfördes testkärlet. 
Den procentuella andelen biologisk nedbrytning % D beräknas för flaskorna 
för test (F  T ), referens (F  C ) och, om inhibitionsövervakning görs, övervak ­
ning (F  I ) utifrån de respektive mängder TIC som producerats fram till varje 
provtagningstidpunkt. 
59. Om det har förekommit en betydande ökning av TIC i de sterila kontrollerna 
(F S ) över testperioden, kan man sannolikt sluta sig till att det har förekom ­
mit abiotisk nedbrytning av testkemikalien, och detta måste beaktas vid beräkning av D i ekvation 2.
 
Försurning till pH < 3  
60. Eftersom försurning till pH < 3 och balansering till jämvikt leder till ut ­
jämning av TIC-koncentrationen i vätske- och gasfaserna, behöver endast 
IC-koncentrationen i gasfasen mätas. Från ekvation 1 fås således  
TIC ¼ ðV L þ V H Þ Ü C H ¼ V B Ü C H , där V  B = serumflaskans volym.  
Omvandling av CO  2 till karbonat  
61. I denna metod görs beräkningarna såsom i ekvation 1, men den negligerbara 
mängden IC i gasfasen ignoreras, dvs.  V H Ü C H ¼ 0 och  TIC ¼ V L Ü C L . ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1430
 
Presentation av resultaten  
62. En bionedbrytningskurva fås genom att plotta den procentuella biologiska 
nedbrytningen D mot inkubationstiden och, om möjligt, lagfasen, bioned ­
brytningsfasen, tiodagarsfönstret och platåfasen (den fas då maximal ned ­
brytning har uppnåtts och bionedbrytningskurvan fasar ut). Om det finns jämförbara resultat för parallella testkärl F
 T (< 20 % skillnad), plottas en 
genomsnittskurva (se figur 1 i tillägg 2), och om inte, plottas kurvor för 
varje kärl. Genomsnittsvärdet för den procentuella bionedbrytningen i pla ­
tåfasen bestäms eller det högsta värdet uppskattas (t.ex. när kurvan går nedåt i platåfasen), men i det senare fallet bör man se upp att det inte handlar om 
ett utomliggande värde. Ange i testrapporten den maximala nivån av bio ­
logisk nedbrytning såsom testkemikaliens grad av bionedbrytning. Om an ­
talet testkärl inte varit tillräckligt för att platåfasen ska framgå, används uppmätta data under testets sista dag för att beräkna ett medelvärde. Detta 
sista värde, medelvärdet av fem replikat, indikerar den precision med vilken 
den procentuella biologiska nedbrytningen bestämts. Rapportera också det värde som erhölls i slutet av tiodagarsfönstret. 
63. Plotta på samma sätt en kurva för referenskemikalien F
 C och, i förekom ­
mande fall, för den abiotiska elimineringskontrollen F  S och inhiberingskont ­
rollen F  I . 
64. Mängderna TIC i kontrollkärlen (F  B ) registreras, liksom mängderna i flas ­
korna F  S (abiotisk kontroll), om dessa kärl har ingått i testet. 
65. Beräkna D för F  I -kärlen, på grundval av teoretiskt IC-värde uppskattat en ­
dast från blandningens referenskomponent. Om på dag 28 [(D  FC ( 1 ) – 
D FI ( 2 ))/D  FC ] × 100 > 25 %, kan man anta att testkemikalien har inhiberat 
inokulatets aktivitet och detta kan vara orsaken till lägre värden på D  FT som 
erhållits under testbetingelserna. Då måste testet upprepas med en lägre 
testkoncentration och helst även med mindre DIC i inokulatet och TIC 
som bildas i kontrollkärlen, eftersom den lägre koncentrationen annars mins ­
kar metodens precision. Alternativt kan ett annat inokulat användas. Om det i flaskorna F
 S (abiotiska) observeras en betydande ökning (> 10 %) av mäng ­
den TIC, kan abiotiska nedbrytningsprocesser ha inträffat.  
Resultatens giltighet  
66. Ett test anses vara giltigt om 
a) den genomsnittliga procentuella nedbrytningen i F  C -kärl (som innehåller 
referenskemikalie) är > 60 % senast den 14:e dagen efter inkubation, och 
b) den genomsnittliga mängden TIC i kontrollkärlen F  B i slutet av testet är 
> 3 mg C/l. 
Om dessa gränsvärden inte nås, måste testet upprepas med inokulat från en 
annan källa och/eller testförfarandena bör ses över. Om t.ex. en hög pro ­
duktion av IC i kontrollkärlen är ett problem, bör förfarandet enligt punk ­
terna 27–32 användas.  ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1431  
( 1 ) Procentuell nedbrytning i F  C -kärl (som innehåller referensämne). 
( 2 ) Procentuell nedbrytning i F  I -kärl.
 67. Om testkemikalien inte når upp till 60 % ThIC och inte visat sig vara inhi ­
berande (punkt 65) kan testet upprepas med ökad koncentration av inokulat 
(upp till 30 mg/l) aktiverat slam och 100 ml utflöde/l) eller inokulat från andra källor, särskilt om nedbrytningen har legat inom området 20–60 %.
 
Tolkning av resultaten  
68. Biologisk nedbrytning > 60 % inom tiodagarsfönstret demonstrerar i detta 
test att testkemikalien är biologiskt lättnedbrytbar i aeroba betingelser. 
69. Om gränsvärdet på 60 % ThIC inte uppnås, bestäm pH-värdet i mediet i 
flaskor som inte har försurats eller alkaliserats – ett värde lägre än 6,5 kan 
tyda på att nitrifikation har inträffat. Upprepa i så fall testet med en buf ­
fertlösning med högre koncentration.  
Testrapport  
70. Sammanställ en tabell med % D för varje flaska med testkemikalie (F  T ), 
referenskemikalie (F  C ) och, i förekommande fall, inhibitionskontroll (F  I ) för 
varje provtagningsdag. Om jämförbara resultat erhålls för replikatflaskor, 
plotta en kurva med genomsnittet av % D mot tiden. Registrera mängden 
TIC i kontrollerna (F  B ) och i de sterila kontrollerna (F  S ) DOC och/eller 
andra determinanter och den procentuella elimineringen. 
71. Bestäm genomsnittsvärdet för % D för platåfasen eller använd det högsta 
värdet om bionedbrytningskurvan går nedåt i platåfasen, och rapportera detta som graden bionedbrytning för testkemikalien. Det är viktigt att se till att i 
det senare fallet se till att det högsta värdet inte är ett utanförliggande värde. 
72. Testrapporten ska innehålla följande information:  
Testkemikalie : 
— Trivialnamn, kemisk beteckning, CAS-nummer, strukturformel och rele ­
vanta fysikalkemiska egenskaper. 
— Testkemikaliens renhet (orenheter).  
Testbetingelser:  
— Hänvisning till denna testmetod. — Beskrivning av testsystemet (t.ex. kärlvolym, kvoten mellan volymen 
gasfas och volymen vätskefas, omrörningsmetod osv.). 
— Applicering av testkemikalie och referenskemikalie till testsystemet, test ­
koncentration och mängd kol som doserats till var och en testflaska, 
eventuell användning av lösningsmedel. 
— Uppgifter om inokulat, eventuell förbehandling och förkonditionering. 
— Inkubationstemperatur. 
— Validering av IC-analysens princip. — Huvudegenskaper för IC-analysatorn (och alla andra analysmetoder som 
använts). 
— Antalet replikat.  
Resultat:  
— Rådata och beräknade värden för biologisk nedbrytning i tabellform.
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1432
 
— Kurva över procentuell nedbrytning av test- och referenskemikalierna 
mot tiden, lagfas, nedbrytningsfas, tiodagarsfönster och lutning. 
— Procentandelen eliminering vid platåfasen, vid testets slut och efter tio ­
dagarsfönstret. 
— Motiveringar för eventuella förkastade testresultat — Övriga fakta som är relevanta för de förfaranden som har använts. 
— Diskussion om resultaten.
 
LITTERATUR  
(1) Kapitel C.4 i denna bilaga, Bestämning av ”lätt” bionedbrytbarhet – CO  2 - 
utveckling (metod C.4-C). 
(2) Sturm R. N. (1973), ”Biodegradability of Nonionic surfactants: screening 
test for predicting rate and ultimate biodegradation”,  J.A,.Oil Chem Soc.  50, 
s. 159–167. 
(3) Larson R. J. (1979), ”Estimation of biodegradation potential of xenobiotic 
organic chemicals”,  Appl Env. Microbiol.  38, s. 1153–1161. 
(4) Larson R. J., Hansmann M. A. och Bookland E. A. (1996), ”Carbon diox ­
ide recovery in ready biodegradability tests: mass transfer and kinetic con ­
stants”,  Chemosphere  33, s. 1195–1210. 
(5) ISO 9439 (1990; reviderad 1999),  Water Quality - Evaluation of ultimate 
aerobic biodegradability of organic compounds in aqueous medium - Car ­
bon dioxide evolution Test (Sturm) . 
(6) US EPA (1996), ”Fate, Transport and Transformation Test Guideline”, 835, 
”3110 Carbon dioxide evolution test”, Office of Prevention, Pesticides and 
Toxic Substances, Washington, DC. 
(7) US EPA (1996), ”Fate, Transport and Transformation Test Guideline”, 835, 
3100, ”Aerobic aquatic biodegradation”, Office of Prevention, Pesticides 
and Toxic Substances, Washington, DC. 
(8) Gledhill W. E., (1975), ”Screening test for assessment of biodegradability: 
Linear alkyl benzene sulfonate”,  Appl Microbiol.  30, s. 922–929. 
(9) Weytjens D., Van Ginneken I. och Painter H. A. (1994), ”The recovery of 
carbon dioxide in the Sturm test for ready biodegradability”,  Chemosphere  
28, s. 801–812. 
(10) Ennis D. M. och Kramer A. (1975), ”A rapid microtechnique for testing 
biodegradability of nylons and polyamides”,  J. Food Sci.  40, s. 181–185. 
(11) Ennis D. M., Kramer A., Jameson C. W., Mazzoccki P. H. och Bailey P. H. 
(1978),  Appl. Env. Microbiol.  35, s. 51–53. 
(12) Boatman R. J., Cunningham S. L. och Ziegler D. A. (1986), ”A method for 
measuring the biodegradation of organic chemicals”,  Env. Toxicol. Chem.  5, 
s. 233–243. 
(13) Struijs J. och Stoltenkamp J. (1990), ”Head space determination of evolved 
carbon dioxide in a biodegradability screening test”,  Ecotox. Env. Safety  19, 
s. 204–211. 
(14) Birch R. R. och Fletcher R. J. (1991), ”The application of dissolved in ­
organic carbon measurements to the study of aerobic biodegradability”,  
Chemosphere  23, s. 507–524. 
(15) Birch R. R., Biver C., Campagna R., Gledhill W. E., Pagga U., Steber J., 
Reust H. och Bontinck W. J. (1989), ”Screening of chemicals for anaerobic 
biodegradation”,  Chemosphere  19, s. 1527–1550.  ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1433
 
(16) ISO 14593, (1999),  Water Quality - Evaluation of ultimate aerobic bio ­
degradability of organic compounds in an aerobic medium-method by ana ­
lysis of inorganic carbon in sealed vessels (C0  2 headspace test) . 
(17) Battersby N. S. (1997), ”The ISO headspace C0  2 biodegradation test”,  
Chemosphere  34: s. 1813–1822. 
(18) US EPA (1996), ”Fate, Transport and Transportation”, Series 835, 3120, 
”Sealed vessel carbon dioxide production test”, Office, Prevention Pestici ­
des and Toxic Substance, Washington, DC. 
(19) Battersby N. S., Ciccognani D., Evans M. R., King D., Painter H.A., 
Peterson D. R. och Starkey M. (1999), ”An ’inherent’ biodegradability test for oil products: description and results of an international ring test”,  
Chemosphere  38, s. 3219–3235. 
(20) Kapitel C.4 i denna bilaga, Bestämning av ”lätt” bionedbrytbarhet. (21) OECD, 1988, ”OECD Ring-test of methods for determining ready bio ­
degradability: Chairman’s report (M. Hashimoto; MITI) and final report (M. Kitano and M. Takatsuki; CITI)”, Paris. 
(22) Kapitel C.11 i denna bilaga, Biologisk nedbrytbarhet – Aktiverat slam – 
Respirationshämningstest. 
(23) Struijs J., Stoltenkamp-Wouterse M. J. och Dekkers A. L. M. (1995), ”A 
rationale for the appropriate amount of inoculum in ready biodegradability tests”,  Biodegradation  6, s. 319–327. 
(24) EU (1999), ”Ring-test of the ISO Headspace CO
 2 method: application to 
surfactants: Surfactant Ring Test-1, Report EU4697”, Water Research Cent ­
re, maj 1999, Medmenham, SL7 2HD, UK. 
(25) ISO 10634 (1996)  Water Quality - Guidance for the preparation and treat ­
ment of poorly water-soluble organic compounds for the subsequent eva ­
luation of their biodegradability in an aqueous medium . ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1434
 
Tillägg 1  
FÖRKORTNINGAR OCH DEFINITIONER  
IC: oorganiskt kol.  
ThCO  2 : teoretisk koldioxid (mg) är den mängd koldioxid som enligt beräk ­
ningar produceras från känd eller beräknad kolhalt i testkemikalien vid fullstän ­
dig mineralisering, också uttryckt som mg koldioxid som utvecklas per mg test ­
kemikalie.  
DOC:  upplöst organiskt kol är den mängd organiskt kol som finns i lösningen 
eller som passerar ett 0,45-mikrometers filter eller som blir kvar i centrifugatet 
efter centrifugering vid cirka 4 000 g (cirka 40 000 m s  -2 ) i 15 minuter.  
DIC:  upplöst oorganiskt kol.  
ThIC:  teoretiskt oorganiskt kol.  
TIC:  totalt oorganiskt kol.  
lätt bionedbrytbar:  en godtycklig klass kemikalier som har klarat vissa speci ­
fika screeningtester för fullständig bionedbrytning; dessa tester är så krävande att 
man antar att kemikalierna snabbt bryts ned fullständigt i vattenmiljö i aeroba betingelser.  
tiodagarsfönster:  de 10 dagar som följer omedelbart efter att 10 % biologisk 
nedbrytning har uppnåtts.  
lätt biologisk nedbrytbarhet:  en klassificering för en kemikalie för vilken det 
finns otvetydiga belägg för biologisk nedbrytbarhet (primär eller fullständig) i 
alla tester för biologisk nedbrytbarhet.  
fullständig aerob biologisk nedbrytning:  den nivå av nedbrytning som nås när 
testkemikalien har förbrukats totalt av mikroorganismer under utveckling av kol ­
dioxid, vatten, mineralsalter och nya mikrobiella celler (biomassa).  
mineralisering:  mineralisering är en fullständig nedbrytning av en organisk ke ­
mikalie till CO
 2 och H  2 O i aeroba förhållanden, och till CH  4 , CO  2 och H  2 O i 
anaeroba förhållanden.  
lagfas:  tiden från teststart fram till acklimatisering och/eller anpassning av de 
nedbrytande mikroorganismerna och när nivån för biologisk nedbrytning av en 
testkemikalie eller organiskt material har nått upp till en detekterbar nivå (t.ex. 10 % teoretisk biologisk nedbrytning, eller lägre, beroende på mätningsteknikens precision).  
nedbrytningsfas:  tiden från lagfasens slut fram till den tidpunkt då 90 % av 
maximinivån för nedbrytning har nåtts.  
platåfas:  platåfasen inträffar när maximal nedbrytning har uppnåtts och bioned ­
brytningskurvan fasar ut.  
testkemikalie:  alla ämnen eller blandningar som testas med denna testmetod.
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1435
 
Tillägg 2  
Exempel på en bionedbrytningskurva  
Figur 1  
Biologisk nedbrytning av 1-oktanol i CO  2 Headspace-test
  
Ordlista : 
Bionedbrytning Nedbrytningsfas Maximal bionedbrytning Platåfas Tiodagarsfönster Testningstid (dagar)
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1436
 
C.30  BIOACKUMULERING I JORDLEVANDE OLIGOCHAETER 
(FÅBORSTMASKAR)  
INLEDNING 
1. Denna testmetod motsvarar OECD:s testriktlinje 317 (2010). Bland test ­
metoderna rörande omvandling, spridning och nedbrytning i miljön publi ­
cerades Biokoncentration: Genomflödestest med fisk (kapitel C.13 i denna bilaga (49)) och bioackumulering i sedimentlevande bottenlevande oligo ­
chaeter (53) 1996 respektive 2008. Att extrapolera data om bioackumulering 
i vattenlevande organismer till jordlevande organismer såsom daggmaskar är svårt eller omöjligt. Modellberäkningar baserade på en testkemikalies lipo ­
filicitet, t.ex. (14) (37), används för närvarande för bedömning av bioacku ­
mulering av kemikalier i jord, såsom t.ex. i EU:s tekniska väglednings ­
dokument (19). Behovet av en miljöspecifik testmetod har redan tagits upp, t.ex. (55). En sådan metod är särskilt viktig för utvärdering av sekun ­
där förgiftning i livsmedelskedjan för jordlevande organismer (4). Det finns 
flera nationella testmetoder som behandlar bioackumulering i andra orga ­
nismer än fisk, t.ex. (2) och (72). En metod för mätning av bioackumulering från förorenade jordar i daggmaskar ( Eisenia fetida,  Savigny) och ringmas ­
kar har utvecklats av American Society for Testing and Materials (3). 
Genom en internationellt accepterad metod för bestämning av bioackumu ­
lering i spikad jord förbättras riskbedömningen av kemikalier i ekosystem i jordar, t.ex. (25) (29). 
2. Jordätande invertebrater utsätts för jordbundna kemikalier. Bland dessa spe ­
lar jordlevande oligochaeter (fåborstmaskar) en viktig roll för jordarnas struktur och funktion (15) (20). Jordlevande oligochaeter lever i jorden 
och delvis på jordytan (särskilt i förnaskiktet) och de representerar ofta 
de vanligaste arterna i termer av biomassa (54). Genom att dessa sköter bioturbation av jorden och även utgör byte kan de ha en stark inverkan på kemikaliers biotillgänglighet för andra organismer såsom invertebrater (t.ex. 
jagande kvalster och skalbaggar, t.ex. (64)) eller jagande ryggradsdjur (t.ex. 
rävar och måsar) (18) (62). Vissa arter av jordlevande oligochaeter som för närvarande används för ekotoxikologisk testning beskrivs i tillägg 5. 
3. I ASTM:s Standard Guide for Conducting Laboratory Soil Toxicity or Bio ­
accumulation Tests with the Lumbricid Earthworm  Eisenia fetida  and the 
Enchytraeid Potworm  Enchytraeus albidus  (3) finns många väsentliga och 
användbara uppgifter för hur man kan genomföra denna testmetod för bio ­
ackumulering. Övriga dokument som det hänvisas till inom den här test ­
metoden är kapitel C.13 i denna bilaga, Biokoncentration: Genomflödestest med fisk (49) och OECD:s testriktlinje 315: bioackumulering i sedimentle ­
vande bottenlevande oligochaeter (53). Testmetoden bygger också i hög 
grad på praktisk erfarenhet från studier om bioackumulering i jordar och publicerad litteratur, t.ex. (1) (5) (11) (12) (28) (40) (43) (45) (57) (59) (76) (78) (79). 
4. Testmetoden lämpar sig bäst för stabila, neutrala organiska kemikalier som 
tenderar att adsorberas till jordar. Testning av bioackumulering av stabila metallorganiska föreningar som binds till jord kan göras med denna test ­
metod. Testet kan också användas för metaller och andra spårelement.
 
FÖRUTSÄTTNINGAR 
5. Tester för mätning av bioackumulering av en kemikalie i jordlevande oligo ­
chaeter har gjorts med tungmetaller (se t.ex. (63)) och långlivade organiska 
kemikalier med log K  ow -värden mellan 3,0 och 6,0, t.ex. (40). Sådana tester 
kan också användas för 
— kemikalier som har log K  ow på 6,0 eller högre (superhydrofoba kemi ­
kalier),  ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1437
 
— kemikalier som tillhör en klass av organiska kemikalier som är kända 
för att ha potential att bioackumuleras i levande organismer, t.ex. yt ­
aktiva eller mycket adsorptiva kemikalier, 
— kemikalier vars strukturella egenskaper indikerar potential för bioacku ­
mulering, t.ex. analoger till kemikalier med känd bioackumulerings ­
potential, 
— metaller. 
6. Information om testkemikalien, såsom trivialnamn, kemiskt namn (helst 
enligt IUPAC), strukturformel, CAS-nummer, renhet, säkerhetsåtgärder, lämpliga lagringsförhållanden och analysmetoder bör inhämtas innan stud ­
ien inleds. Därutöver bör det finnas information om 
a) vattenlöslighet, 
b) fördelningskoefficient oktanol-vatten, K
 ow , 
c) fördelningskoefficient jord-vatten, K  oc , 
d) ångtryck, 
e) nedbrytbarhet (t.ex. i jord, vatten), 
f) kända metaboliter. 
7. Radioaktivmärkta eller inte radioaktivmärkta testkemikalier kan användas. 
För att underlätta analysen rekommenderas dock radioaktivmärkta testkemi ­
kalier. Beslutet bör baseras på detektionsgränser eller krav på att mäta ursprunglig kemikalie och metaboliter. Om en radioaktivmärkt testkemikalie används och totala radioaktiva rester mäts, är det viktigt att de radioaktiv ­
märkta resterna både i jorden och i testorganismerna analyseras för procent ­
andelar av ursprunglig testkemikalie och radioaktivmärkta metaboliter, t.ex. i prover som tas i stabilt tillstånd eller i slutet av upptagningsfasen, för att göra det möjligt att beräkna bioackumuleringsfaktor (BAF) för den ur ­
sprungliga testkemikalien och berörda metaboliter i jorden (se punkt 50). 
Den metod som beskrivs här måste eventuellt modifieras, t.ex. för att ge tillräcklig biomassa för mätning av organiska testkemikalier som inte är radioaktivmärkta eller metaller. När totalmängden radioaktiva rester har 
uppmätts (genom vätskescintillationsräkning efter extraktion, förbränning 
eller vävnadsupplösning), baserar sig bioackumuleringsfaktorn på den ur ­
sprungliga kemikalien och metaboliterna. Beräkningen av bioackumule ­
ringsfaktorn bör helst baseras på den ursprungliga testkemikaliens koncent ­
ration i organismerna och totalmängden radioaktiva rester. Ackumulerings ­
faktorn biota-jord (BSAF), normaliserad till maskens fettinnehåll och jor ­
dens halt organiskt kol (OC) ska alltså beräknas utifrån BAF, med tanke på jämförbarhet mellan resultat från olika bioackumuleringstest. 
8. Testkemikaliens toxicitet för de arter som används i testet bör vara känd, 
t.ex. en effektkoncentration (EC
 x ) eller en dödlig koncentration (LC  x ) vid 
tidpunkten för upptagningsfasen, t.ex. (19). Den valda koncentrationen för 
testkemikalien bör helst vara 1 % av akut asymptotiskt LC  50 och bör vara 
minst tiofaldig jämfört med detektionsgränsen i jord med den analysmetod som används. Helst bör toxicitetsvärden, om sådana finns, från långvariga 
studier om subletala endpoints användas (51) (52). Om sådana uppgifter inte 
finns kan test om akut toxicitet ge värdefull information (se t.ex. (23)).
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1438
 
9. Det bör finnas en lämplig analysmetod med känd exakthet, precision och 
känslighet för kvantifiering av kemikalien i testlösningarna, i jorden och i 
det biologiska materialet, tillsammans med uppgifter om beredning och lagring av såväl prover som säkerhetsdatablad. De analytiska detektions ­
gränserna för testkemikalien i jord och maskvävnad bör också vara kända. 
Om en
 14 C-märkt testkemikalie används, bör den specifika radioaktiviteten 
(Bq mol  –1 ) och den procentuella andelen radioaktivitet associerad med or ­
enheter vara kända. Testkemikaliens specifika radioaktivitet bör vara till ­
räckligt hög för att möjliggöra analys, och de testkoncentrationer som an ­
vänds får inte framkalla toxiska effekter. 
10. Testet kan genomföras med syntetiska eller naturliga jordar. Information om 
egenskaper hos naturlig jord som används, t.ex. ursprung eller bestånds ­
delar, pH, halten organiskt kol, partikelstorleksfördelning (procentandel sand, dy och lera) och vattenhållningskapacitet (WHC), bör vara känd innan 
testet inleds (3) (48).
 
PRINCIP FÖR TESTMETODEN 
11. Till de parametrar som karakteriserar en testkemikalies bioackumulering hör 
bioackumuleringsfaktorn (BAF), upptagningskonstanten (k  s ) och elimine ­
ringskonstanten (k  e ). Definitioner av begreppen finns i tillägg 1. 
12. Testet består av två faser: upptagningsfasen (exponering) och eliminerings ­
fasen (efter exponering). Under upptagningsfasen exponeras replikerade 
grupper av maskar för jord som har spikats med testkemikalien. I tillägg 
till testdjuren hålls kontrollgrupper av maskar under identiska förhållanden utan testkemikalie. Testorganismernas torrvikt och fettinnehåll mäts. Detta kan göras med maskarna i kontrollgruppen. Analytiska bakgrundsvärden 
kan fås genom att analysera prover av kontrollmaskarna och kontrolljorden. 
För elimineringsfasen flyttas maskarna till en jord som inte innehåller test ­
kemikalie. En elimineringsfas krävs alltid, med undantag för om upptaget av testkemikalie under exponeringen har varit obetydligt. Elimineringsfasen 
ger information om den hastighet med vilken testkemikalien utsöndras av 
testorganismerna (se t.ex. (27)). Om stabilt tillstånd inte uppnås under upp ­
tagningsfasen bör bestämningen av de kinetiska parametrarna – kinetisk bioackumuleringsfaktor BAF
 k , upptagnings- och elimineringskonstanterna 
– helst baseras på simultan anpassning av resultaten från upptagnings- 
och elimineringsfaserna. Koncentrationen av testkemikalie i/på maskarna kontrolleras under testets båda faser. 
13. Under upptagningsfasen görs mätningar vid provtagningstidpunkterna upp 
till 14 dagar (enchytraeider) eller 21 dagar (daggmaskar) tills stabilt tillstånd 
uppnås (11) (12) (67). Stabilt tillstånd uppnås när en kurva som plottas för 
koncentrationen i maskarna mot tiden blir parallell med tidsaxeln, och tre på varandra följande koncentrationsanalyser på prover som tas med minst två dagars mellanrum inte varierar med mer än ± 20 % sinsemellan baserat på 
statistiska jämförelser (t.ex. variansanalys, regressionsanalys). 
14. För elimineringsfasen överförs testorganismerna till kärl som innehåller 
samma substrat men ingen testkemikalie. Under elimineringsfasen görs mät ­
ningar vid provtagningstidpunkterna under 14 dagar (enchytraeider) eller 21 dagar (daggmaskar), utom om tidigare analytisk bestämning visar en minsk ­
ning på 90 % av testkemikalierester i maskarna. Koncentrationen av test ­
kemikalie i maskarna i slutet av elimineringsfasen rapporteras som
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1439
 
icke-eliminerade rester. Bioackumuleringsfaktorn vid stabilt tillstånd 
(BAF  ss ) beräknas helst både som kvoten mellan koncentrationen i maskarna 
(Ca) och i jorden (Cs) vid uppenbar klart fastställt stabilt tillstånd, och som en kinetisk bioackumuleringsfaktor (BAFK) som kvoten mellan upptag ­
ningsfaktorn (k
 s ) och elimineringskonstanten (k  e ) (för definitioner, se tillägg 
1) utifrån ett antagande om första ordningens kinetik (för beräkningar, se 
tillägg 2). Om första ordningens kinetik uppenbart inte kan tillämpas, bör andra modeller användas. 
15. Upptagningskonstanten, elimineringskonstanten (eller konstanterna, om an ­
dra modeller ingår), den kinetiska bioackumuleringsfaktorn (BAFK) och, där det är möjligt, konfidensgränserna för var och en av dessa parametrar beräknas utifrån datoriserade modellekvationer (se vägledning i tillägg 2). 
Anpassningens kvalitet (Goodness of fit) för valfri modell kan göras t.ex. 
utifrån korrelationskoefficienten eller determinationskoefficienten (koeffici ­
enter nära ett tyder på god kvalitet) eller testas med chi-två-test. Även värdet på medelfelet eller konfidensgränsen kring de uppskattade paramet ­
rarna kan ge indikation på anpassningens kvalitet för modellen. 
16. För att minska testresultatens variation för testkemikalier med hög lipofili ­
citet bör bioackumuleringsfaktorerna uttryckas i förhållande till fettinnehål ­
let och halten organiskt kol (kg organiskt kol i jorden per kg fett i mask). 
Denna princip är baserad på att det för vissa kemiska klasser finns ett klart samband mellan potentialen för bioackumulering och lipofilicitet, vilket har klart etablerats för fisk (47). Det finns ett förhållande mellan fettinnehållet i 
fisk och bioackumulering av sådana kemikalier. För bottenlevande (bentis ­
ka) organismer har man funnit liknande korrelationer (se t.ex. (30) (44)). Denna korrelation har även påvisats för jordlevande oligochaeter (se t.ex. (5), (6), (7) (14)). Om tillräcklig mängd maskvävnad finns att tillgå, kan 
testdjurens fettinnehåll bestämmas på samma biologiska material som an ­
vänds för bestämning av koncentrationen testkemikalie. Alternativt kan kon ­
trolldjur användas för mätning av fettinnehållet.
 
TESTETS GILTIGHET 
17. För att ett test ska vara giltigt måste följande kriterier uppfyllas för både 
kontroll- och behandlingsgrupperna: 
— Vid slutet av testet får den totala dödligheten under upptagnings- och 
elimineringsfaserna inte överskrida 10 % (daggmaskar) eller 20 % (enchytraeider) av det totala antalet tillförda maskar. 
— För  Eisenia fetida  och  Eisenia andrei  får medelförlusten uppmätt vid 
slutet av upptagningsfasen och vid slutet av elimineringsfasen inte över ­
skrida 20 % jämfört med den ursprungliga färskvikten vid start av varje fas.
 
METODBESKRIVNING  
Testarter  
18. Det finns flera arter av jordlevande oligochaeter som rekommenderas för 
testning av bioackumulering. De oftast använda arterna  Eisenia fetida , Ei­
senia andrei  (Lumbricidae),  Enchytraeus albidus , Enchytraeus crypticus  
eller Enchytraeus luxuriosus  (Enchytraeidae) beskrivs i tillägg 5.  ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1440
 
Apparatur  
19. Uppmärksamhet bör fästas vid att undvika användning av material (gäller 
alla delar av utrustningen) som kan upplösas, adsorbera testkemikalien eller 
läcka andra kemikalier och som kan ha negativa effekter på testdjuren. Standardmässiga rektangulära eller cylindriska kärl gjorda av kemiskt inert material kan användas, av lämplig storlek för antalet testmaskar. Rostfritt 
stål, plast eller glas kan användas för utrustning som är i kontakt med 
testmediet. Testkärlen ska vara tillbörligen täckta så att maskarna inte kan komma ut, samtidigt som tillräcklig lufttillförsel säkerställs. För kemikalier med höga adsorptionskoefficienter, såsom syntetiska pyretroider, kan det 
vara nödvändigt med silaniserat glas. I sådana situationer måste utrustningen 
kasseras efter användning (49). Det är viktigt att se till att radioaktivmärkta testämnen och flyktiga kemikalier inte kan läcka ut. Det bör finnas fällor (t.ex. gastvättflaskor av glas) som innehåller lämpliga adsorbenter som hål ­
ler kvar eventuella rester som avdunstar från testkärlen.
 
Jord  
20. Testjorden bör ha en kvalitet som ger testorganismerna möjlighet att över ­
leva och helst föröka sig under acklimatiserings- och testperioderna utan avvikelser från normalt utseende och beteende. Maskarna bör vara inne i jorden. 
21. Den syntetiska jord som beskrivs i kapitel C.8 i denna bilaga (48) rekom ­
menderas som substrat för testningarna. Beredning av syntetisk jord för 
användning i bioackumuleringstest och rekommendationer för hur denna jord ska lagras beskrivs i tillägg 4. Lufttorkad syntetisk jord kan förvaras i rumstemperatur fram till användningen. 
22. Även naturliga jordar från oförorenade platser kan användas som test- och/ 
eller odlingsjord. För naturjordar bör minst anges ursprung (insamlings ­
plats), pH, halten organiskt kol, partikelstorleksfördelning (procentandel 
sand, dy och lera), maximal vattenhållningskapacitet (WHC
 max ) och pro ­
centuell andel vatten (3). Analys av jorden eller dess beståndsdelar med avseende på mikroföroreningar bör ge användbar information. Om fältjord 
från odlingsmark används, får den inte ha behandlats med växtskyddspro ­
dukter eller gödsel från behandlade djur under minst ett år eller med or ­
ganiska gödselmedel under minst sex månader innan jordprovet tas (50). De förfaranden som används för hantering av naturjordar innan dessa jordar 
används i ekotoxikologiska test med oligochaeter i laboratoriet beskrivs i 
(3). För naturjordar bör förvaringstiden i laboratoriet minimeras.
 
Applicering av testkemikalien  
23. Testkemikalien blandas in i jorden. Testkemikaliens fysikalkemiska egen ­
skaper bör beaktas. En vattenlöslig testkemikalie bör upplösas fullständigt i vatten innan den blandas med jorden. Det rekommenderade spikningsför ­
farandet för dåligt vattenlösliga kemikalier är att en eller flera beståndsdelar 
i (den syntetiska) jorden beläggs med testkemikalien. Till exempel kan kvartssand eller en del av den dränkas in med en lösning av testkemikalien i lämpligt organiskt lösningsmedel som får avdunsta långsamt tills det torkat 
bort. Därefter kan den belagda jordfraktionen blandas i den våta jorden. En 
viktig fördel med detta förfarande är att inget lösningsmedel tillförs jorden.
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1441
 
När naturjord används kan testkemikalien tillsättas genom att spika en 
lufttorkad del av jorden enligt det som beskrivs ovan för syntetisk jord, 
eller genom att blanda in testkemikalien i våt jord, med ett efterföljande avdunstningssteg om ett solubiliseringsmedel används. Allmänt taget bör man så långt som möjligt undvika kontakt mellan våt jord och lösnings ­
medel. Följande bör beaktas (3): 
— Om annat lösningsmedel än vatten används, bör det vara blandningsbart 
med vatten och/eller kunna avlägsnas (t.ex. genom avdunstning) så att 
endast testkemikalien blir kvar i jorden. 
— Om lösningsmedelskontroll används behövs ingen negativ kontroll. Lös ­
ningsmedelskontrollen bör ha den högsta koncentrationen av lösnings ­
medel som tillförs jorden och lösningsmedlet bör härstamma från 
samma sats som används för beredning av stamlösningen. Lösningsmed ­
lets toxicitet och flyktighet och testkemikaliens löslighet i det valda lösningsmedlet bör vara de huvudsakliga kriterierna vid valet av lämp ­
ligt solubiliseringsmedel. 
24. För kemikalier med dålig löslighet i vatten och organiska lösningsmedel kan 
2,0–2,5 g finmald kvartssand per testkärl blandas med mängden testkemi ­
kalie, t.ex. genom mortling, för att få önskad testkoncentration. Blandningen 
av kvartssand och testkemikalie tillförs den förhandsfuktade jorden och blandas omsorgsfullt med lämplig mängd avjoniserat vatten för att få öns ­
kad fukthalt. Den slutliga blandningen fördelas i testkärlen. Förfarandet 
upprepas för varje testkoncentration och likaså bereds en lämplig kontroll 
med 2,0–2,5 g finmald kvartssand per testkärl. 
25. Koncentrationen av testkemikalie i jorden bör fastställas efter spikning. 
Innan testorganismerna tillförs jorden bör det kontrolleras att testkemikalien 
är homogent fördelad i jorden. Metoden för spikning och motivering för valet av ett visst spikningsförfarande bör rapporteras (24). 
26. Jämvikten mellan jorden och porvattenfasen bör idealiskt sett etableras 
innan organismerna tillförs; en tidsperiod på fyra dagar vid 20 °C rekom ­
menderas. För ett antal dåligt vattenlösliga organiska kemikalier kan tiden för att nå faktisk jämvikt mellan adsorberade och upplösta fraktioner räknas 
i dagar eller månader. Beroende på studiens ändamål, t.ex. om man vill 
efterlikna vissa miljöförhållanden, kan den spikade jorden få ”åldras” för en längre period, t.ex. för metaller i tre veckor vid 20 °C (22).
 
Odling av testorganismer  
27. Maskarna bör helst hållas i en permanent laboratorieodling. Vägledning om 
laboratorieodlingsmetoder för  Eisenia fetida  och Eisenia andrei  och arter av 
enchytraeider finns i tillägg 5 (se också (48) (51) (52)). 
28. Maskarna som används för testet bör vara fria från synliga sjukdomar, 
abnormaliteter och parasiter.  
TESTFÖRFARANDE 
29. Testorganismerna exponeras för testkemikalien under upptagningsfasen. 
Upptagningsfasen ska pågå i 14 dagar (enchytraeider) eller 21 dagar (dagg ­
maskar) utom om det kan påvisas att stabilt stadium har uppnåtts.  ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1442
 
30. För elimineringsfasen flyttas maskarna till en jord som inte innehåller test ­
kemikalie. Den första provtagningen bör göras 4–24 timmar efter elimine ­
ringsfasens början. Exempel på provtagningsschema för en 21-dagars upp ­
tagningsfas och en 21-dagars elimineringsfas finns i tillägg 3.  
Testorganismer  
31. Många arter av jordlevande enchytraeider har en mycket låg individuell vikt 
(t.ex. 5–10 mg våtvikt per individ för  Enchytraeus albidus  och mindre för  
Enchytraeus crypticus  eller  Enchytraeus luxuriosus ). För vägning och ke ­
misk analys kan det vara nödvändigt att poola maskarna i replikattestkärlen 
(dvs. alla maskar i ett replikatkärl för att få de analytiska vävnadsresultaten). 
Tjugo individer enchytraeider tillförs varje replikat, och antalet replikat bör vara minst tre. Om testkemikaliens analytiska detektionsgräns är hög kan det krävas flera maskar. För testarter med högre individuell vikt ( Eisenia 
fetida  och Eisenia andrei ) kan replikatkärl med en enda individ användas. 
32. Daggmaskar som används i ett test bör ha liknande vikt (t.ex.  Eisenia fetida  
och Eisenia andrei  bör ha en individuell vikt på 250–600 mg). Enchytraei ­
der (t.ex.  Enchytraeus albidus ) bör ha en längd på cirka 1 cm. Alla maskar 
som används i ett visst test bör komma från samma källa och vara vuxna individer med clitellum (gördel) (se tillägg 5). Eftersom ett djurs vikt och 
ålder kan påverka BAF-värdena (t.ex. beroende på varierande fettinnehåll 
och/eller förekomsten av ägg), bör dessa parametrar registreras noggrant och beaktas vid tolkningen av resultaten. Dessutom kan kokonger deponeras under exponeringsperioden, vilket också påverkar BAF-värdena. Det rekom ­
menderas att ett delprov av testmaskarna vägs före testet för att få en upp ­
skattning av våt och torr medelvikt. 
33. Förhållandet mellan jord och maskar bör vara högt för att minimera sjun ­
kande koncentration av testkemikalien i jorden under upptagningsfasen. För  
Eisenia fetida  och Eisenia andrei  bör det finnas en minimimängd på 50 g 
jord (torrvikt) per mask och för enchytraeider rekommenderas en minimi ­
mängd på 10–20 g jord (torrvikt) per testkärl. Jordlagret i kärlen bör vara 
2–3 cm (enchytraeider) eller 4–5 cm (daggmaskar). 
34. Testmaskarna tas bort ur odlingen (t.ex. enchytraeider med användning av 
guldsmedstång). Vuxna exemplar överförs till obehandlad testjord för ackli ­
matisering och ges föda (se punkt 36). Om testbetingelserna avviker från 
odlingsbetingelserna bör en acklimatiseringsfas på 24–72 timmar vara till ­
räcklig för att maskarna ska anpassa sig till testbetingelserna. Efter ackli ­
matiseringen sköljs maskarna genom att överföras till glaskärl (t.ex. pet ­
riskålar) som innehåller rent vatten, och därefter vägs maskarna innan de 
överförs till testjorden. Före vägningen ska överskottsvatten avlägsnas från maskarna genom att försiktigt stryka av dem längs skålens kant eller för ­
siktigt torka av dem med en lätt fuktad pappersduk. 
35. Testorganismernas nedgrävningsbeteende bör observeras och registreras. I 
test med daggmaskar gräver sig djuren (kontroll och behandling) in i jorden inom några timmar; detta bör kontrolleras senast 24 timmar efter att mas ­
karna har placerats i testkärlen. Om maskarna inte gräver in sig i jorden 
(t.ex. över 10 % mer än hälften av maskarna i upptagningsfasen), tyder
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1443
 
detta på att testbetingelserna är olämpliga eller att testorganismerna inte är 
friska. Då bör testet stoppas och göras på nytt. Enchytraeiderna vistas i 
huvudsak i jordens håligheter och det är vanligt att deras integument inte alltid kommer i kontakt med omgivande substrat; exponeringen av grävande och icke-grävande enchytraeider antas vara ekvivalent och om enchytraei ­
derna inte gräver in sig i jorden betyder detta inte nödvändigtvis att testet 
måste upprepas.
 
Utfodring  
36. Utfodring rekommenderas om jorden har låg halt totalt organiskt kol. Om 
syntetisk jord används rekommenderas veckovis utfodring (dvs. maskarna får föda en gång i veckan) med 7 mg torr dynga per g torrvikt jord för daggmaskar och en veckovis mängd på 2–2,5 mg malda havreflingor per g 
torrvikt jord för enchytraeider (11). Den första portionen föda bör blandas 
med jorden omedelbart innan testorganismerna tillförs. Helst ska samma typ av föda som i odlingarna användas (tillägg 5).
 
Ljus och temperatur  
37. Testningarna bör genomföras med en kontrollerad ljus/mörker-cykel på 16/8 
timmar, helst med 400–800 lx i området där testkärlen finns (3). Testtem ­
peraturen bör vara 20 ± 2 °C under hela testet.  
Testkoncentrationer  
38. En enda koncentration används. Om ytterligare koncentrationer används 
måste detta motiveras. Om testkemikaliens toxicitet (ECx) ligger nära den analytiska detektionsgränsen rekommenderas användning av radioaktiv ­
märkt testkemikalie med hög specifik radioaktivitet. För metaller bör kon ­
centrationen ligga över bakgrundsnivåerna i vävnad och jord.
 
Replikat  
39. För kinetikmätningar (upptagnings- och elimineringsfaserna) bör det finnas 
minst tre behandlade replikatkärl per provtagningspunkt. Totalantalet repli ­
kat som bereds bör vara tillräckligt för att täcka alla provtagningstidpunkter under upptagnings- och elimineringsfaserna. 
40. För biologiska observationer och mätningar (t.ex. förhållandet mellan torr ­
vikt och våtvikt, fettinnehåll) samt för analys av bakgrundskoncentratio ­
nerna i maskar och jord, bör minst 12 replikatkärl med negativ kontroll 
(fyra provtagningar vid start, fyra vid slutet av upptagningen och fyra vid slutet av elimineringen) beredas om inget annat lösningsmedel än vatten används. Om solubiliseringsmedel används för applicering av testkemikalien 
bör det finnas en lösningsmedelskontroll (fyra replikatkärl för provtagningen 
vid start, fyra vid slutet av upptagningen och fyra vid slutet av eliminering ­
en) som innehåller alla beståndsdelar utom testämnet och som körs i tillägg till de behandlade replikaten. I detta fall kan fyra ytterligare replikatkärl 
med negativ kontroll (inget lösningsmedel) även användas för frivillig prov ­
tagning i slutet av upptagningsfasen. Dessa replikat kan jämföras biologiskt med lösningsmedelskontrollen för att få information om eventuella effekter av lösningsmedlet på testorganismerna. Likaså rekommenderas ett tillräck ­
ligt antal ytterligare reservreplikatkärl (t.ex. åtta) för behandling och kont ­
roll(er).
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1444
 
Frekvens för kvalitetsmätning av jord  
41. Vid start och slut av upptagnings- och elimineringsfaserna bör jordens pH, 
fukthalt och temperatur mätas (kontinuerligt). En gång per vecka bör jor ­
dens fukthalt kontrolleras genom att väga testkärlen och jämföra de vikterna med vikterna vid testets början. Vattenförlust bör kompenseras genom till ­
försel av avjoniserat vatten.
 
Provtagning och analys av maskar och jord  
42. Exempel på ett schema för upptagnings- och eliminationsfaserna i bioacku ­
muleringstest för daggmaskar och enchytraeider finns i tillägg 3. 
43. Jordprover tas från testkärlen för bestämning av koncentrationen testkemi ­
kalie innan maskarna tillförs, samt under upptagnings- och eliminerings ­
faserna. Under testet bestäms koncentrationerna testkemikalie i maskarna 
och jorden. I regel mäts de totala koncentrationerna i jorden. Alternativt kan koncentrationerna i porvatten mätas, och då bör motivering och lämp ­
liga metoder fastställas innan studien inleds, och inkluderas i rapporten. 
44. Prover av maskar och jord tas minst sex gånger under upptagnings- och 
elimineringsfaserna. Om man kan påvisa att testkemikalien är stabil, kan 
antalet jordanalyser reduceras. Det rekommenderas att minst tre replikat 
analyseras i början och slutet av upptagningsfasen. Om koncentrationen i jord uppmätt i slutet av upptagningsfasen avviker från den ursprungliga koncentrationen med mer än 30 %, bör även jordprover som tagits andra 
dagar analyseras. 
45. Ta bort maskarna i ett givet replikat varje gång prover ska tas (t.ex. genom 
att sprida ut jorden på en grund bricka och plocka bort maskarna med en 
mjuk guldsmedstång), och skölj dem snabbt i vatten på en grund glas- eller stålbricka. Avlägsna överflödigt vatten (se punkt 34). Överför maskarna försiktigt till ett förhandsvägt kärl och väg omedelbart kärlet plus maskar 
inklusive tarminnehåll. 
46. Därefter bör daggmaskarna ( Eisena  sp.) lämnas över natten för tömning av 
tarminnehåll, t.ex. på ett fuktat filterpapper i en täckt petriskål (se punkt 
34). Efter tömningen bestäms maskarnas vikt i syfte att bedöma eventuell minskning av biomassa under testet (se giltighetskriterierna i punkt 17). Vägning och vävnadsanalys av enchytraeider görs utan tarmtömning, efter ­
som detta är tekniskt svårt på grund av att maskarna är så små. Efter slutlig 
viktbestämning bör maskarna avlivas omedelbart med lämpligaste metod (t.ex. med flytande kväve eller nedfrysning under 18 °C). 
47. Under elimineringsfasen ersätter maskarna förorenat tarminnehåll med ren 
jord. Det betyder att mätningar i otömda maskar (i detta fall enchytraeider) som tas ut omedelbart före elimineringsfasen inkluderar förorenad jord i 
tarmen. För vattenlevande oligochaeter antas att största delen av förorenat 
tarminnehåll har ersatts med rent sediment efter de första 4–24 timmarna av elimineringsfasen (se t.ex. (46)). Liknande resultat har rapporterats för dagg ­
maskar i studier rörande ackumulering av radioaktivmärkt kadmium och 
zink (78). För icke-tömda enchytraeider kan koncentrationen i detta första 
prov från elimineringsfasen anses vara koncentrationen i vävnad efter tarm ­
tömning. För att beakta den utspädning av testämneskoncentrationen som kan tillskrivas oförorenad jord under elimineringsfasen kan tarminnehållets 
vikt uppskattas från förhållandena mellan maskarnas våtvikt/askvikt eller 
torrvikt/askvikt.
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1445
 
48. Jord- och maskproverna bör helst analyseras omedelbart efter att de tagits 
(inom 1–2 dagar) för att undvika nedbrytning eller andra förluster, och det 
rekommenderas att ungefärliga värden för upptagning och eliminering be ­
räknas medan testet framskrider. Om analysen måste vänta, bör proverna förvaras på lämpligt sätt, t.ex. i djupfryst form ( ≤ –18 °C). 
49. Kontroll bör göras av att den kemiska analysens precision och reproducer ­
barhet, såväl som extraktion av testkemikalie från jord- och maskproverna är tillfredsställande för den metod det gäller, och extraktionseffektiviteten, detektionsgränsen (LOD) och kvantifieringsgränsen (LOQ) bör rapporteras. 
Dessutom bör man kontrollera att testkemikalien inte kan detekteras i kon ­
trollkärlen i koncentrationer som är högre än bakgrunden. Om koncentratio ­
nen av testkemikalie i testorganismen C
 a är > 0 i kontrollmaskarna, bör 
detta inkluderas i beräkningen av de kinetiska parametrarna (se tillägg 2). 
Genom hela testet bör alla prover hanteras med tanke på minsta möjliga 
förorening och förlust (t.ex. till följd av att testkemikalien adsorberas på provtagningsutrustningen). 
50. När radioaktivitetsmärkta testkemikalier används är det möjligt att analysera 
ursprunglig kemikalie och metaboliter. Kvantifiering av ursprunglig test ­
kemikalie och metaboliter vid stabilt tillstånd eller i slutet av upptagnings ­
fasen ger viktig information. Proverna bör sedan putsas upp så att den 
ursprungliga testkemikalien kan kvantifieras separat. Om mängden av en 
enskild metabolit överskrider 10 % av den totala radioaktiviteten i det ana ­
lyserade provet (de analyserade proverna) rekommenderas identifiering av dessa metaboliter. 
51. Det totala utbytet, och utbytet av testkemikalie i maskar, jord och i före ­
kommande fall fällor med adsorbenter som fångar upp avdunstad testkemi ­
kalie, bör registreras och rapporteras. 
52. Pooling av enskilda prover från ett givet testkärl godtas för enchytraeider 
som är mindre än daggmaskar. Om poolingen inbegriper minskning av antalet replikat, begränsas de statistiska förfaranden som kan användas på 
erhållna data. Om det krävs ett specifikt statistiskt förfarande och en spe ­
cifik tyngd, bör testet omfatta tillräckligt många replikatkärl för att få den pooling, det förfarande och den tyngd som önskas. 
53. Det rekommenderas att BAF uttrycks både som funktion av total torrvikt 
och, när så krävs (t.ex. för starkt hydrofoba kemikalier), som en funktion av 
fettinnehållet. Lämpliga metoder bör användas för bestämning av fettinne ­
hållet (vissa befintliga metoder, t.ex. (31) (58), bör anpassas för ändamålet). Dessa metoder bygger på en kloroform/metanol-extraktionsteknik. För att 
undvika klorerade lösningsmedel bör en modifiering av Bligh och 
Dyer-metoden (9) enligt beskrivningen i (17) användas. Eftersom de olika metoderna inte ger identiska värden, är det viktigt att beskriva den metod som använts. Om det är möjligt, dvs. om det finns tillräckligt med maskväv ­
nad att tillgå, bör analysen av fettinnehåll helst göras på samma prov eller 
extrakt som det som används för analys av testkemikalien, eftersom fetterna ofta måste avlägsnas från extraktet innan det kan analyseras kromatografiskt (49). Alternativt kan kontrolldjur användas för att mäta fettinnehållet, som 
sedan kan användas för att normalisera BAF-värdena. Det senare förfarandet 
minskar föroreningen av utrustningen med testkemikalien.
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1446
 
DATA OCH RAPPORTERING  
Behandling av resultaten  
54. Upptagningskurvan för testkemikalien erhålls genom att plotta koncentratio ­
nen i/på maskarna under upptagningsfasen mot tiden enligt aritmetisk skala. 
När kurvan har nått en platå eller stabilt tillstånd (se definitionerna i tillägg 1) kan bioackumuleringsfaktorn vid stabilt tillstånd BAF
 ss beräknas enligt 
följande:  
C a vid stabilt tillstånd eller slutet av upptagningsfasen  ðgenomsnittÞ 
C s vid stabilt tillstånd eller slutet av upptagningsfasen  ðgenomsnittÞ 
C a är testkemikaliens koncentration i testorganismen 
C s är testkemikaliens koncentration i jorden 
55. Om stabilt tillstånd inte uppnås bör man i stället för att bestämma BAF  ss 
bestämma BAFK på grundval av upptagnings- och elimineringskonstanter ­
na, enligt följande: 
— Bestäm ackumuleringsfaktorn (BAF  K ) som kvoten k  s /k e . 
— Upptagning och eliminering ska helst beräknas samtidigt (se ekvation 11 
i tillägg 2). 
— Elimineringskonstanten (k  e ) bestäms i regel från elimineringskurvan 
(koncentrationen av testämnet i maskarna under elimineringsfasen). Där ­
efter beräknas upptagningskonstanten k  s utifrån k  e , och ett värde på C  a 
som härleds från upptagningskurvan – se tillägg 2 för en beskrivning av 
dessa metoder. För att få BAF  K och konstanterna k  s och k  e rekommen ­
deras datorstödda icke-linjära parameteruppskattningsmetoder. Om eli ­
mineringen uppenbart inte är av första ordningen bör mer komplexa modeller användas.
 
Testrapport  
56. Testrapporten ska innehålla följande information:  
Testkemikalie:  
— All tillgänglig information om akut toxicitet eller långtidstoxicitet (t.ex. 
EC x , LC  x „ NOEC) av testkemikalien på jordlevande oligochaeter. 
— Renhet, fysikalisk natur och fysikalkemiska egenskaper, t.ex. log K  ow , 
vattenlöslighet. 
— Kemisk identifiering, källa, identitet och koncentration för eventuella 
lösningsmedel som använts. 
— Om radioaktivmärkta testkemikalier används, uppgifter om exakt posi ­
tion för de märkta atomerna, specifik radioaktivitet och radiokemisk 
renhet.  
Testarter:  
— Vetenskapligt namn, stam, eventuell förbehandling, acklimatisering, ål ­
der, storleksintervall osv.  ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1447
 
Testbetingelser : 
— Testförfarande. 
— Belysningens typ, egenskaper och ljusperiod(er). — Testets utformning (t.ex. antalet kärl, kärlstorlek, jordmassa, jordlagrets 
tjocklek, antalet replikat, antalet maskar per replikat, antalet testkoncent ­
rationer, upptagnings- och elimineringsfasernas varaktighet samt prov ­
tagningsfrekvens. 
— Motivering för valet av testkärlens material. 
— Metod för beredning och applicering av testämne samt motivering för 
valet av en specifik metod. 
— Nominella testkoncentrationer, medelvärde för uppmätta värden och de ­
ras standardavvikelse i testkärlen och metoden för att erhålla dessa 
värden. 
— Källa för beståndsdelarna i syntetisk jord eller – om naturligt medium 
används – jordens ursprung, beskrivning av eventuell förbehandling, 
resultat för kontrollerna (överlevnad, utveckling av biomassa och repro ­
duktion), jordens egenskaper (pH, totalhalten organiskt kol, partikels ­
torleksfördelning (procent sand, dy och lera), WHC
 max , procentandelen 
vatten vid testets början och slut samt alla andra mätningar som har 
gjorts. 
— Detaljerad information om behandling av jord- och maskprover, inbegri ­
pet detaljer om beredning, lagring, spikningsförfaranden, extraktion och analytiska förfaranden (inklusive precision) för testämne i maskar och 
jord, fettinnehåll (om uppmätt) och utbyte för testämnet.  
Resultat:  
— Mortalitet för kontrollmaskarna och maskarna i varje testkärl och allt 
observerat onormalt beteende (t.ex. undvikande av jorden och utebliven 
reproduktion i bioackumuleringstest med enchytraeider). 
— Förhållandet mellan torrvikt och våtvikt för jorden och testorganismerna 
(utnyttjas vid normalisering). 
— Maskarnas våtvikt vid varje provtagningstidpunkt; för daggmaskar våt ­
vikterna vid testets början och vid varje provtagningstidpunkt före och efter tarmtömning. 
— Testorganismernas fettinnehåll (om detta bestäms). 
— Kurvor som visar upptagnings- -och elimineringskinetiken för testkemi ­
kalien i maskarna och tiden fram till stabilt tillstånd. 
— C
 a och C  s (med standardavvikelse och område, om lämpligt) för alla 
provtagningstidpunkter (C  a uttryckt som g per kg våtvikt och torrvikt 
för hela kroppen, C  s uttryckt som g per kg våtvikt och torrvikt för jord). 
Om det krävs en ackumuleringsfaktor biota-jord (BSAF) (t.ex. för jäm ­
förelse av resultat från två eller flera test med djur som har olika fett ­
innehåll), kan C  a även uttryckas som g per kg fettinnehåll i organismen 
och C  s kan uttryckas som g per kg organiskt kol i jorden. 
— BAF (uttryckt som kg jord per kg mask), jordens upptagningskonstant 
k s (uttryckt som g jord per kg mask per dag) och elimineringskonstanten 
k e (uttryckt per dag), BSAF (uttryckt som kg totalt organiskt kol i 
jorden per kg fettinnehåll i mask) kan också rapporteras.  ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1448
 
— Om uppmätt: procentandelen ursprunglig kemikalie, metaboliter och 
bundna rester (den procentandel testkemikalie som inte kan extraheras 
med vanliga extraktionsmetoder) som detekteras i jord och testdjur. 
— Metoder som använts för statistiska analyser av data.  
Utvärdering av resultaten  
— Resultatens överensstämmelse med giltighetskriterierna som förtecknas i 
punkt 17. 
— Oförväntade eller ovanliga resultat, t.ex. ofullständig eliminering av 
testkemikalien från testdjuren.  
LITTERATUR  
(1) Amorim M. (2000), ”Chronic and toxicokinetic behavior of Lindane ( γ- 
HCH) in the Enchytraeid  Enchytraeus albidus ”, examensarbete, University 
Coimbra. 
(2) ASTM (2000), ”Standard guide for the determination of the bioaccumula ­
tion of sediment-associated contaminants by benthic invertebrates”,  Amer­
ican Society for Testing and Materials , E 1688–00a. 
(3) ASTM International (2004), ”Standard guide for conducting laboratory soil 
toxicity or bioaccumulation tests with the Lumbricid earthworm  Eisenia 
fetida  and the Enchytraeid potworm  Enchytraeus albidus”, ASTM Interna ­
tional  (2004), s. 26. 
(4) Beek B., Boehling S., Bruckmann U., Franke C., Joehncke U., Studinger G. 
(2000), ”The assessment of bioaccumulation”, I Hutzinger, O. (red.)  The 
Handbook of Environmental Chemistry , Vol. 2 Part J (Vol. editor: B. Beek), 
”Bioaccumulation - New Aspects and Developments”, Springer-Verlag Ber ­
lin Heidelberg, s. 235–276. 
(5) Belfroid A., Sikkenk M., Seinen W., Van Gestel C., Hermens J. (1994), 
”The toxicokinetic behavior of chlorobenzenes in earthworms ( Eisenia an ­
drei): Experiments in soil”,  Environ. Toxicol. Chem.  13, s. 93–99. 
(6) Belfroid A., Van Wezel A., Sikkenk M., Van Gestel C., Seinen W. och 
Hermens J. (1993). ”The toxicokinetic behavior of chlorobenzenes in earth ­
worms ( Eisenia andrei ): Experiments in water”,  Ecotox. Environ. Safety  25, 
s. 154–165. 
(7) Belfroid A., Meiling J., Drenth H., Hermens J., Seinen W., Van Gestel C. 
(1995), ”Dietary uptake of superlipophilic compounds by earthworms ( Ei­
senia andrei )”, Ecotox. Environ. Safety  31, s. 185–191. 
(8) Bell A. W. (1958), ”The anatomy of  Enchytraeus albidus , with a key to the 
species of the genus  Enchytraeus”, ann. Mus. Novitat.  1902, s. 1–13. 
(9) Bligh E. G. och Dyer W. J. (1959), ”A rapid method of total lipid extraction 
and purification”,  Can. J. Biochem.  Pysiol. 37, s. 911–917. 
(10) Bouche M. (1972), ”Lombriciens de France. Ecologie et Systematique”,  
INRA, Annales de Zoologie-Ecologie animale , Paris, s. 671. 
(11) Bruns E., Egeler Ph., Moser T., Römbke J., Scheffczyk A, Spörlein P. 
(2001a), ”Standardisierung und Validierung eines Bioakkumulationstests mit terrestrischen Oligochaeten”, rapport till tyska federala miljöbyrån (Um ­
weltbundesamt Berlin), R&D nr 298, s. 64–416. 
(12) Bruns E., Egeler Ph., Römbke J. Scheffczyk A., Spörlein P. (2001b), ”Bio ­
accumulation of lindane and hexachlorobenzene by the oligochaetes  Ench­
ytraeus luxuriosus  and  Enchytraeus albidus  (Enchytraeidae, Oligochaeta, 
Annelida)”,  Hydrobiologia  463, s. 185–196. 
(13) Conder J. M. och Lanno R. P. (2003), ”Lethal critical body residues as 
measures of Cd, Pb, and Zn bioavailability and toxicity in the earthworm  
Eisenia fetida”, J. Soils Sediments  3, s. 13–20.
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1449
 
(14) Connell D. W. och Markwell R. D. (1990), ”Bioaccumulation in the Soil to 
Earthworm System”,  Chemosphere  20, s. 91–100. 
(15) Didden W. A. M. (1993), ”Ecology of Terrestrial Enchytraeidae”,  Pedo­
biologia  37, s. 2–29. 
(16) Didden W. (2003), ”Oligochaeta”, i  Bioindicators and biomonitors , Mar­
kert, B. A., Breure, A.M. och Zechmeister, H. G. (red.) Elsevier Science 
Ltd, Nederländerna, s. 555–576. 
(17) De Boer J., Smedes F., Wells D., Allan A. (1999), ”Report on the QUASH 
interlaboratory study on the determination of total-lipid in fish and shell ­
fish”, Round 1 SBT-2, Exercise 1000, EU, Standards, Measurement and 
Testing Programme. 
(18) Dietrich D. R., Schmid P., Zweifel U., Schlatter C., Jenni-Eiermann S., 
Bachmann H., Bühler U., Zbinden N. (1995), ”Mortality of birds of prey 
following field application of granular carbofuran: A Case Study”  Arch. 
Environ. Contam. Toxicol.  29, s. 140–145. 
(19) Europaparlamentets och rådets förordning (EG) nr 1907/2006 av den 
18 december 2006 om registrering, utvärdering, godkännande och begräns ­
ning av kemikalier (Reach), inrättande av en europeisk kemikaliemyndighet, 
ändring av direktiv 1999/45/EG och upphävande av rådets förordning (EEG) nr 793/93 och kommissionens förordning (EG) nr 1488/94 samt rådets direktiv 76/769/EEG och kommissionens direktiv 
91/155/EEG, 93/67/EEG, 93/105/EG och 2000/21/EG, EUT L 396, 
30.12.2006, s. 1. 
(20) Edwards C. A. och Bohlen P. J. (1996), ”Biology and ecology of earth ­
worms”, Tredje utgåvan, Chapman & Hall, London, s. 426. 
(21) OECD (2008),  Bioaccumulation in Sediment-dwelling Benthic Oligochates , 
Test Guideline No. 315, Guidelines for the testing of chemicals, OECD, Paris. 
(22) Egeler Ph., Gilberg D., Scheffczyk A., Moser Th. och Römbke J. (2009), 
”Validation of a Soil Bioaccumulation Test with Terrestrial Oligochaetes by an International Ring Test (Validierung einer Methode zur standardisierten Messung der Bioakkumulation mit terrestrischen Oligochaeten)”, rapport till 
tyska federala miljöbyrån (Umweltbundesamt Dessau-Rosslau), R&D 
nr 204 67 458, s. 149. Finns för nedladdning på: http://www.oecd.org/ dataoecd/12/20/42552727.pdf 
(23) Elmegaard N. och Jagers op Akkerhuis G. A. J. M. (2000), ”Safety factors 
in pesticide risk assessment, Differences in species sensitivity and 
acute-chronic relations”, National Environmental Research Institute,  NERI 
Technical Report  325, s. 57. 
(24) Environment Kanada (1995), ”Guidance document on measurement of tox ­
icity test precision using control sediments spiked with a reference tox ­
icant”,  Environmental Protection Series Report EPS 1/RM/30 . 
(25) EPPO (2003), ”Environmental Risk Assessment scheme for plant protection 
products. Soil organisms and functions”, EPPO (European Plant Protection 
Organization) Standards, Bull, OEPP/EPPO 33, s. 195–208. 
(26) Franke C. (1996), ”How meaningful is the bioconcentration factor for risk 
assessment?”,  Chemosphere  32, s. 1897–1905. 
(27) Franke C., Studinger G., Berger G., Böhling S., Bruckmann U., 
Cohors-Fresenborg D., Jöhncke U., (1994), ”The assessment of bioaccumu ­
lation”,  Chemosphere  29, s. 1501–1514. 
(28) Füll C. (1996), ”Bioakkumulation und Metabolismus von -1,2,3,4,5,6- 
Hexachlorcyclohexan (Lindan) und 2-(2,4-Dichlorphenoxy)-propionsäure 
(Dichlorprop) beim Regenwurm  Lumbricus rubellus  (Oligochaeta, Lumbri ­
cidae)”, Dissertation University Mainz, s. 156.
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1450
 
(29) Füll C., Schulte C., Kula C. (2003), ”Bewertung der Auswirkungen von 
Pflanzenschutzmitteln auf Regenwürmer”,  UWSF - Z. Umweltchem, Ökotox.  
15, s. 78–84. 
(30) Gabric A. J., Connell D. W., Bell P. R. F. (1990), ”A kinetic model for 
bioconcentration of lipophilic compounds by oligochaetes”,  Wat. Res.  24, s. 
1225–1231. 
(31) Gardner W. S., Frez W. A., Cichocki E. A., Parrish C. C. (1985), ”Micro ­
methods for lipids in aquatic invertebrates”,  Limnology and Oceanography  
30, s. 1099–1105. 
(32) Hawker D. W. och Connell D. W. (1988), ”Influence of partition coefficient 
of lipophilic compounds on bioconcentration kinetics with fish”,  Wat. Res.  
22, s. 701–707. 
(33) Hund-Rinke K. och Wiechering H. (2000), ”Earthworm avoidance test for 
soil assessments: An alternative for acute and reproduction tests”,  J. Soils 
Sediments  1, s. 15–20. 
(34) Hund-Rinke K., Römbke J., Riepert F., Achazi R. (2000), ”Beurteilung der 
Lebensraumfunktion von Böden mit Hilfe von Regenwurmtests” ingår i ”Toxikologische Beurteilung von Böden”, Heiden, S., Erb, R., Dott, W. 
och Eisentraeger, A. (red.), Spektrum Verl., Heidelberg, s. 59–81. 
(35) ISO 11268–2 (1998),  Soil Quality – Effects of pollutants on earthworms 
(Eisenia fetida).  Del 2:  Determination of effects on reproduction . 
(36) Jaenike J. (1982), ”E isenia foetida  is two biological species”,  Megadrilo ­
gica 4, s. 6–8. 
(37) Jager T. (1998), ”Mechanistic approach for estimating bioconcentration of 
organic chemicals in earthworms (Oligochaeta)”,  Environ. Toxicol. Chem.  
17, s. 2080–2090. 
(38) Jager T., Sanchez P. A., Muijs B., van der Welde E., Posthuma L. (2000), 
”Toxicokinetics of polycyclic aromatic hydrocarbons in  Eisenia andrei  (Oli­
gochaeta) using spiked soil”,  Environ. Toxicol. Chem.  19, s. 953–961. 
(39) Jager T., Baerselman R., Dijkman E., De Groot A. C., Hogendoorn E. A., 
DeJong A., Kruitbosch J. A. W., Peijnenburg W. J. G. M. (2003a), ”Avail ­
ability of polycyclic aromatic hydrocarbons to earthworms ( Eisenia andrei , 
Oligochaeta) in field-polluted soils and soil-sediment mixtures”,  Environ. 
Toxicol. Chem.  22, s. 767–775. 
(40) Jager T., Fleuren R. L. J., Hoogendoorn E., de Korte G. (2003b), ”Eluci ­
dating the routes of exposure for organic chemicals in the earthworm,  
Eisenia andrei  (Oligochaeta)”,  Environ. Sci. Technol.  37, s. 3399–3404. 
(41) Janssen M. P. M., Bruins A., De Vries T. H., Van Straalen N. M. (1991), 
”Comparison of cadmium kinetics in four soil arthropod species”,  Arch. 
Environ. Contam. Toxicol.  20, s. 305–312. 
(42) Kasprzak K, (1982), ”Review of enchytraeid community structure and 
function in agricultural ecosystems”,  Pedobiologia  23, s. 217–232. 
(43) Khalil A. M. (1990), ”Aufnahme und Metabolismus von
 14 C-Hexachlorben ­
zol und  14 C-Pentachlornitrobenzol in Regenwürmern”,  Dissertation Univer ­
sity München , s. 137. 
(44) Landrum P. F. (1989), ”Bioavailability and toxicokinetics of polycyclic 
aromatic hydrocarbons sorbed to sediments for the amphipod  Pontoporeia 
hoyi”, Environ. Sci. Toxicol.  23, s. 588–595. 
(45) Marinussen M. P. J. C., Van der Zee S. E. A. T. M., De Haan F. A. (1997), 
”Cu accumulation in  Lumbricus rubellus  under laboratory conditions com ­
pared with accumulation under field conditions”,  Ecotox. Environ. Safety  
36, s. 17–26. 
(46) Mount D. R., Dawson T. D., Burkhard L. P. (1999), ”Implications of gut 
purging for tissue residues determined in bioaccumulation testing of sedi ­
ment with  Lumbriculus variegates”, Environ. Toxicol. Chem.  18, s. 
1244–1249.  ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1451
 
(47) Nendza M. (1991), ”QSARs of bioaccumulation: Validity assessment of log 
K ow /log BCF correlations”, i R. Nagel och R. Loskill (red.):  Bioaccumula ­
tion in aquatic systems, Contributions to the assessment, Proceedings of an international workshop , Berlin 1990, VCH, Weinheim. 
(48) Kapitel C.8 i denna bilaga, Toxicitet hos daggmaskar. 
(49) Kapitel C.13 i denna bilaga, Biokoncentration: Genomflödesprovning med 
fisk. 
(50) Kapitel C.21 i denna bilaga, Jordlevande mikroorganismer: Test rörande 
omvandling av kväve. 
(51) OECD (2004a), Enchytraeid reproduction test, Test Guideline No. 220, 
Guidelines for the testing of chemicals, OECD, Paris. 
(52) OECD (2004b), Earthworm reproduction test (Eisenia fetida/Eisenia An ­
drei), Test Guideline No. 222, Guidelines for the testing of chemicals, 
OECD, Paris. 
(53) OECD (2008), Bioaccumulation in Sediment-dwelling Benthic Oligochates, 
Test Guideline No. 315, Guidelines for the testing of chemicals, OECD, 
Paris. 
(54) Petersen H. och Luxton M. (1982), ”A comparative analysis of soil fauna 
populations and their role in decomposition processes”,  Oikos  39, s. 
287–388. 
(55) Phillips D. J. H. (1993), ”Bioaccumulation”, ingår i  Handbook of Ecotox ­
icology  Vol. 1, Calow P. (red.). Blackwell Scientific Publ., Oxford, s. 
378–396. 
(56) Pflugmacher J. (1992), ”Struktur-Aktivitätsbestimmungen (QSAR) zwischen 
der Konzentration von Pflanzenschutzmitteln und dem Octanol-Wasser-Ko ­
effzienten”,  UWSF- Z. Umweltchem. Ökotox , 4, s. 77–81. 
(57) Posthuma L., Weltje L., Anton-Sanchez F. A. (1996), ”oint toxic effects of 
cadmium and pyrene on reproduction and growth of the earthworm  Eisenia 
fetida”, RIVM Report No. 607506001 , Bilthoven. 
(58) Randall R. C., Lee II H., Ozretich R. J., Lake J. L., Pruell R. J. (1991), 
”Evaluation of selected lipid methods for normalising pollutant bioaccumu ­
lation”,  Environ.Toxicol. Chem.  10, s. 1431–1436. 
(59) Römbke J., Egele P., Füll C. (1998), ”Literaturstudie über Bioakkumula ­
tionstests mit Oligochaeten im terrestrischen Medium”,  UBA-Texte  28/98, 
84 S. 
(60) Römbke J. och Moser Th. (1999), ”Organisation and performance of an 
international ring-test for the validation of the Enchytraeid reproduction test” UBA-Texte  4/99, s. 373. 
(61) Römbke J., Riepert F., Achazi R. (2000), ”Enchytraeen als Testorganis ­
men”, i ”Toxikologische Beurteilung von Böden”, Heiden S., Erb, R., Dott, W. och Eisentraeger, A. (reds),  Spektrum Verl ., Heidelberg, s. 105–129. 
(62) Romijn CA. FM., Luttik R., Van De Meent D., Slooff W.,Canton J. H. 
(1993), ”Presentation of a General Algorithm to Include Effect Assessment on Secondary Poisoning in the Derivation of Environmental Quality Crite ­
ria, Part 2: Terrestrial food chains”,  Ecotox. Envir. Safety  27, s. 107–127. 
(63) Sample B. E., Suter D. W., Beauchamp J. J., Efroymson R. A. (1999), 
”Literature-derived bioaccumulation models for earthworms: Development 
and validation”,  Environ. Toxicol. Chem.  18, s. 2110–2120. 
(64) Schlosser H. J. och Riepert F. (1992), ”Entwicklung eines Prüfverfahrens 
für Chemikalien an Bodenraubmilben (Gamasina), Teil 2: Erste Ergebnisse 
mit Lindan und Kaliumdichromat in subletaler Dosierung”,  Zool. Beitr. NF  
34, s. 413–433. 
(65) Schmelz R. och Collado R. (1999), ” Enchytraeus luxuriosus sp . nov., a new 
terrestrial oligochaete species (Enchytraeide, Clitellata, Annelida)”,  Caroli­
nea 57, s. 93–100.
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1452
 
(66) Sims R. W. och Gerard B. M. (1985), ”Earthworms”, i Kermack D. M. och 
Barnes R. S. K. (Hrsg.),  Synopses of the British Fauna (New Series)  nr 31, 
171 S, London, E. J. Brill/Dr. W. Backhuys. 
(67) Sousa J. P., Loureiro S., Pieper S., Frost M., Kratz W., Nogueira A. J. A., 
Soares A.M. V. M. (2000), ”Soil and plant diet exposure routes and tox ­
icokinetics of lindane in a terrestrial isopod”,  Environ. Toxicol. Chem.  19, s. 
2557–2563. 
(68) Spacie A. och Hamelink J. L. (1982), ”Alternative models for describing the 
bioconcentration of organics in fish”,  Environ. Toxicol. Chem.  1, s. 
309–320. 
(69) Stephenson G. L., Kaushik A., Kaushik N. K., Solomon K. R., Steele T., 
Scroggins R. P. (1998), ”Use of an avoidance-response test to assess the 
toxicity of contaminated soils to earthworms”, ingår i ”Advances in earth ­
worm ecotoxicology”, Sheppard S., Bembridge J., Holmstrup M., Posthuma L. (red.),  Setac Press , Pensacola, s. 67–81. 
(70) Sterenborg I., Vork N. A., Verkade S. K., Van Gestel C. A. M., Van 
Straalen N. M. (2003), ”Dietary zinc reduces uptake but not metallothionein 
binding and elimination of cadmium in the springtail  Orchesella cincta”, 
Environ. Toxicol. Chemistry  22, s. 1167–1171. 
(71) UBA (Umweltbundesamt) (1991), ”Bioakkumulation - Bewertungskonzept 
und Strategien im Gesetzesvollzug”,  UBA-Texte  42/91, Berlin. 
(72) US EPA (2000), ”Methods for measuring the toxicity and bioaccumulation 
of sediment-associated contaminants with freshwater invertebrates”, andra utgåvan, EPA 600/R-99/064, US Environmental Protection Agency, Duluth, MN, mars 2000. 
(73) Van Brummelen T. C. och Van Straalen N. M. (1996), ”Uptake and elimi ­
nation of benzo(a)pyrene in the terrestrial isopod  Porcellio scaber”, Arch. 
Environ. Contam. Toxicol.  31, s. 277–285. 
(74) Van Gestel C. A. M. 1992), ”The influence of soil characteristics on the 
toxicity of chemicals for earthworms; a review”, i  Ecotoxicology of Earth ­
worms  (red. Becker H., Edwards, P.J., Greig-Smith P. W. och Heimbach 
F.). Intercept Press, Andover (GB). 
(75) Van Gestel C. A. och Ma W. C. (1990), ”An approach to quantitative 
structure-activity relationships (QSARs) in earthworm toxicity studies”,  
Chemosphere  21, s. 1023–1033. 
(76) Van Straalen N. M., Donker M. H., Vijver M. G., van Gestel C. A. M. 
(2005), ”Bioavailability of contaminants estimated from uptake rates into soil invertebrates”,  Environmental Pollution  136, s. 409–417. 
(77) Venter J. M. och Reinecke A. J. (1988), ”The life-cycle of the 
compost-worm  Eisenia fetida  (Oligochaeta)”,  South African J. Zool.  23, s. 
161–165. 
(78) Vijver M. G., Vink J. P. M., Jager T., Wolterbeek H. T., van Straalen N. 
M., van Gestel C. A. M. (2005), ”Biphasic elimination and uptake kinetics of Zn and Cd in the earthworm  Lumbricus rubellus  exposed to contamina ­
ted floodplain soil”,  Soil Biol, Biochem . 37, s. 1843–1851. 
(79) Widianarko B. och Van Straalen N. M. (1996), ”Toxicokinetics-based sur ­
vival analysis in bioassays using nonpersistent chemicals,  Environ. Toxicol. 
Chem.  15, s. 402–406.
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1453
 
Tillägg 1  
DEFINITIONER  
bioackumulering : ökningen av testkemikaliens koncentration i eller på en orga ­
nism i förhållande till testkemikaliens koncentration i det omgivande mediet. 
Bioackumulering uppstår till följd av både biokoncentrations- och biomagnifie ­
ringsprocesser (se nedan).  
biokoncentration : ökningen av testkemikaliens koncentration i eller på en or ­
ganism till följd av upptagning av kemikalien som endast sker från det omgi ­
vande mediet (t.ex. via kroppsytan och förtärd jord) i förhållande till testkemi ­
kaliens koncentration i det omgivande mediet.  
biomagnifiering : ökningen av testkemikaliens koncentration i eller på en orga ­
nism, främst till följd av upptagning från förorenad föda eller förorenat byte, i 
förhållande till testkemikaliens koncentration i födan eller bytet. Biomagnifiering kan leda till överföring eller ackumulering av testämnet inom näringsvävar.  
eliminering : eliminering av en testkemikalie betyder att kemikalien avlägsnas 
från testorganismens vävnad genom aktiva eller passiva processer som inträffar oberoende av om testämnet finns eller inte finns i det omgivande mediet.  
bioackumuleringsfaktor (BAF) : den koncentration av testkemikalien under 
valfri tidpunkt under upptagningsfasen som förekommer i eller på testorganismen 
(C
 a uttryckt som g per kg torrvikt mask) dividerad med testkemikaliens koncent ­
ration i det omgivande mediet (C  s uttryckt som g per kg torrvikt jord); BAF 
uttrycks med enheten kg jord per kg mask.  
bioackumuleringsfaktor vid stabilt tillstånd (BAF  ss ): den BAF som gäller vid 
stabilt tillstånd och som inte förändras betydligt över en längre tidsperiod medan koncentrationen av testkemikalie i det omgivande mediet (C
 s uttryckt som g 
per kg torrvikt jord) är konstant under denna tidsperiod.  
kinetisk bioackumuleringsfaktor  (BAF  K ): de bioackumuleringsfaktorer som be ­
räknas direkt från förhållandet mellan upptagningskonstant och elimineringskon ­
stant (k  s och k  e , se nedan).  
bioackumuleringsfaktor biota-jord (BSAF) : den fettnormaliserade koncent ­
rationen av testkemikalien i eller på testorganismen dividerad med den organiskt 
kol-normaliserade koncentrationen av testkemikalien vid stabilt tillstånd. C  a ut­
trycks som g per kg fettinnehåll i organismen och C  s som g per kg organiskt 
innehåll i jorden; BSAF har enheten kg organiskt kol per kg fett.  
platå eller stabilt tillstånd : jämvikt råder mellan upptagnings- och eliminerings ­
processer som inträffar samtidigt under exponeringsfasen. Stabilt tillstånd syns i kurvan över BAF mot tiden när kurvan blir parallell med tidsaxeln och tre på varandra följande analyser av BAF på prover som tagits med minst två dagars 
mellanrum ligger inom 20 % från varandra, och det inte finns några statistiskt 
signifikanta skillnader mellan de tre provtagningsperioderna. För testkemikalier som tas upp långsamt är det lämpligare med ett intervall på sju dagar (49).  
fördelningskoefficienten organiskt kol-vatten (K
 oc ): förhållandet mellan en ke ­
mikalies koncentration i eller på jordens fraktion av organiskt kol och kemika ­
liens koncentration i vatten vid jämvikt.  
fördelningskoefficienten oktanol-vatten (K  ow ): förhållandet mellan en kemika ­
lies löslighet i n-oktanol och i vatten vid jämvikt; uttrycks även som P  ow . Lo­
garitmen av K  ow (log K  ow ) används som indikator för en kemikalies potential för 
bioackumulering i vattenlevande organismer.  ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1454
 
upptagnings- eller exponeringsfasen : den tid under vilken testorganismerna är 
exponerade för testkemikalien.  
upptagningskonstant (k  s ): ett numeriskt värde som definierar hur snabbt kon ­
centrationen av testämnet ökar i eller på testorganismen till följd av upptagning från jordfasen; k
 s uttrycks som g jord per kg mask per dag.  
elimineringsfas : den tid efter överföringen av testorganismerna från ett förorenat 
medium till ett medium som inte innehåller testämne, under vilken eliminering 
(eller nettoförlust) av kemikalien från testorganismerna studeras.  
elimineringskonstant (k  e ): det numeriska värde som definierar reduktionshas ­
tigheten för koncentrationen av testämne i eller på testorganismen efter över ­
föring av testorganismerna från ett medium som innehåller testämnet till ett 
medium som inte innehåller testämnet; k  e uttrycks som d  -1 . 
testkemikalie : alla ämnen eller blandningar som testas med denna testmetod.  ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1455
 
Tillägg 2  
Beräkning av upptagnings- och elimineringsparametrar  
Den huvudsakliga endpointen för ett bioackumuleringstest är bioackumulerings ­
faktorn BAF. Uppmätt BAF kan beräknas genom att dividera koncentrationen i 
testorganismen C  a med koncentrationen i jorden C  s vid stabilt tillstånd. Om 
stabilt tillstånd inte uppnås under upptagningsfasen beräknas BAF  K utifrån kon ­
stanterna i stället för utifrån BAF  SS . Det bör dock finnas en anmärkning om 
huruvida BAF är baserat på koncentrationer vid stabilt tillstånd eller inte. 
Den vanliga metoden för att få fram kinetisk bioackumuleringsfaktor (BAF  K ), 
upptagningskonstant (k  s ) och elimineringskonstant (k  e ) är att använda icke-linjära 
datorbaserade parameteruppskattningsmetoder, t.ex. baserade på de modeller som 
beskrivs i (68). Utifrån en viss uppsättning sekventiella tid-koncentrationsdata 
och modellekvationerna 
C a ¼ k s 
k e Ü C s ð1 Ä e –k e t Þ 
0 < t < t  c (ekvation 1) 
eller 
C a ¼ k s 
k e Ü C s ðe –k e ðtÄtcÞ Ä e –k e t Þ 
t > t  c (ekvation 2) 
där 
C a = koncentrationen kemikalie i maskar (g per kg våt- eller torrvikt) 
k s = upptagningshastigheten i vävnad (g jord per kg mask per dag) 
C s = koncentrationen kemikalie i jord (g per kg våt- eller torrvikt) 
k e = elimineringskonstant (d  -1 ) 
t c = tidpunkten vid slutet av upptagningsfasen 
beräknar dessa datorprogram värden för BAF  K , k s och k  e . 
Om bakgrundskoncentrationen i icke-exponerade maskar t.ex. på dag 0 avviker 
betydligt från noll (kan vara fallet t.ex. för metaller) bör denna bakgrundskon ­
centration C  a,0 införlivas i ekvationerna, enligt följande:  
C a ¼ C a;0 þ k s 
k e Ü C s ð1 Ä e –k e t Þ 0 < t < t  c (ekvation 3) 
och 
C a ¼ C a;0 þ k s 
k e Ü C s ðe –k e ðtÄtcÞ Ä e –k e t Þ t > t  c (ekvation 4) 
Om en signifikant minskning av testkemikaliekoncentrationen i jorden kan ob ­
serveras över tid under upptagningsfasen, kan följande modeller användas, t.ex. 
(67) (79):  
C s ¼ C 0 ðe –k 0 t Þ (ekvation 5)  ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1456
 
där 
C s = kemikaliekoncentrationen i jorden (g per kg våt- eller torrvikt) 
k 0 = sönderfallskonstant i jord (d  -1 ) 
C 0 = ursprunglig kemikaliekoncentration i jord (g per kg våt- eller torrvikt)  
C a ¼ k s 
k e Ä k 0 Ü ðe –k 0 t Ä e –k e t Þ 
0 < t < t  c (ekvation 6)  
C a ¼ k s 
k e Ä k 0 Ü e –k 0 tc Ä e –k e tc ä e ÄkðtÄtcÞ t > t  c (ekvation 7) 
där 
C a = koncentrationen kemikalie i maskar (g per kg våt- eller torrvikt) 
k s = upptagningshastigheten i vävnad (g jord per kg mask per dag) 
k 0 = sönderfallskonstant i jord (d  -1 ) 
k e = elimineringskonstant (d  -1 ) 
t c = tidpunkten vid slutet av upptagningsfasen. 
Om stabilt tillstånd nås under upptagningsfasen (t.ex. t = ∞) kan ekvation 1  
C a ¼ k s 
k e Ü C s ð1 Ä e –k e t Þ 0 < t < t  c (ekvation 1) 
reduceras till 
C a ¼ k s 
k e Ü C s 
eller 
C a=C s ¼ k s=k e ¼ BAF  K (ekvation 8). 
Då är k  s /k e x C  s en tillnärmning av testämneskoncentrationen i maskvävnad vid 
stabilt tillstånd (C  a,ss ). 
Ackumuleringsfaktorn biota-jord (BSAF) kan beräknas enligt följande:  
BSAF ¼ BAF  K ä f oc 
f lip (ekvation 9) 
där f  oc är fraktionen organiskt kol i jorden och f  lip är fraktionen fett i maskar, 
båda helst bestämda på prover som tagits i testet och på grundval av torrvikt eller våtvikt. 
Elimineringskinetiken kan modelleras med stöd av data från elimineringsfasen 
och med tillämpning av följande modellekvation och en datorstödd icke-linjär metod för modelluppskattning. Om datapunkterna plottade mot tiden indikerar en 
konstant exponentiell minskning av testämneskoncentrationen i djuren, kan en 
one-compartment-modell (ekvation 9) användas för att beskriva elimineringens tidsförlopp.
 
C a ðtÞ ¼ C a;ss Ü e –k e t (ekvation 10)  ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1457
 
Elimineringsprocesserna verkar i bland ha två faser med en snabb minskning av 
C a till en början och därefter en långsammare avgång av testämne senare under 
elimineringen, t.ex. (27) (68). De två faserna kan tolkas genom antagande om att det finns två olika enheter i organismen från vilka testämnet avgår med olika hastigheter. I sådana fall bör information inhämtas från specifik litteratur, t.ex. 
(38) (39) (40) (78). 
Med användning av modellekvationerna ovan kan de kinetiska parametrarna k
 s 
och k  e även kalkyleras i ett steg genom att samtidigt tillämpa modeller för första 
ordningens kinetik på alla data från både upptagnings- och elimineringsfasen. Beskrivning av en metod som ger möjlighet till en sådan kombinerad beräkning 
av upptagnings- och elimineringskonstanter kan sökas i hänvisningarna (41), (73) 
och (70).
 
C a ¼ " 
K s 
K e · C s ð1 Ä e –k e t Þ Ü ðm ¼ 1Þ # 
þ " 
K s 
k e Ü C s ðe ÄK e ðtÄt c Þ Ä e –K e t Þ Ü ðm ¼ 2Þ # 
(ekvation 11)  
Anmärkning:  När upptagnings- och elimineringsparametrar uppskattas samtidigt 
utifrån kombinerade upptagnings- -och elimineringsdata är ”m” såsom visas i ekvation 11 en deskriptor som gör det möjligt för 
datorprogrammet att tilldela ekvationens subtermer till datauppsätt ­
ningarna för respektive fas och göra utvärderingen korrekt (m = 1 för upptagningsfasen och m = 2 för elimineringsfasen). 
Dessa modellekvationer bör dock användas med försiktighet, särskilt när det sker 
ändringar i testkemikaliens biotillgänglighet eller om (bio)nedbrytning sker under 
testet (se t.ex. (79)).
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1458
 
Tillägg 3  
EXEMPEL PÅ SCHEMAN FÖR TEST AV BIOACKUMULERING FRÅN 
JORDAR  
Test med daggmaskar  
a) Upptagningsfas med 8 provtagningsdatum som används för beräkning av 
kinetik.  
Dag 
Aktivitet  
– 6 Konditionering av förberedd jord under 48 timmar. 
– 4 Spikning av jordfraktionen med testkemikalielösning, avdunst ­
ning av eventuellt lösningsmedel, blandning av jordbestånds ­
delarna, fördelning av jord i testkärlen och stabilisering till jäm ­
vikt under testbetingelserna i 4 dagar (3 veckor för metallspikad 
jord). 
– 3 till – 1 Separation av testorganismerna från odlingen för acklimatisering, 
beredning och fuktning av jordbeståndsdelarna. 
0 Mätning av temperatur och jordens pH, avlägsnande av jordpro ­
ver från behandlade kärl och lösningsmedelskontroller för be ­
stämning av testkemikaliens koncentration, tillsats av föda, väg ­
ning och slumpvis fördelning av maskarna till testkärlen med 
bibehållande av tillräckligt antal maskar för bestämning av analy ­
tiska bakgrundsvärden, våt- och torrvikt och fettinnehåll, vägning av alla testkärl för kontroll av jordens fukthalt och kontroll av 
lufttillförsel om stängda testsystem används. 
1 Kontroll av lufttillförsel, registrering av maskarnas beteende och 
temperatur samt tagning av jord- och maskprover för bestämning 
av koncentrationen testämne. 
2 Samma som dag 1. 3 Kontroll av lufttillförsel, maskarnas beteende och temperatur. 4 Samma som dag 1. 
5–6 Samma som dag 3. 
7 Samma som dag 1: tillförsel av föda, kontroll av jordens fukthalt 
genom vägning av testkärlen och vattenpåfyllnad motsvarande 
avdunstningen. 
8–9 Samma som dag 3. 
10 Samma som dag 1. 
11–13 Samma som dag 3. 
14 Samma som dag 1: tillförsel av föda, kontroll av jordens fukthalt 
genom vägning av testkärlen och vattenpåfyllnad motsvarande 
avdunstningen. 
15–16 Samma som dag 3. 
17 Samma som dag 1. 
18–20 Samma som dag 3.
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1459
 
Dag 
Aktivitet  
21 Samma som dag 1: mätning av temperatur och jordens pH, kont ­
roll av jordens fukthalt genom vägning av testkärlen, slut på upptagningsfasen, överföring av maskarna från återstående expo ­
nerade replikat till kärl som innehåller ren jord för eliminerings ­
fasen (ingen tarmtömning) samt provtagning av jord och maskar från lösningsmedelskontrollerna. 
Aktiviteterna före exponering (stabiliseringsfasen) bör tidplaneras 
med beaktande av testkemikaliens egenskaper. 
Aktiviteterna för dag 3 bör genomföras dagligen (åtminstone på 
arbetsdagar). 
b) Elimineringsfas
 
Dag Aktivitet  
– 6 Beredning och fuktning av jordens beståndsdelar samt konditio ­
nering av beredd jord i 48 timmar. 
– 4 Blandning av jordens beståndsdelar, fördelning av jord till test ­
kärlen och inkubation under testbetingelserna i 4 dagar. 
0 (upptagnings ­
fasens slut) Mätning av temperatur och jordens pH, vägning och slumpmäs ­
sig fördelning av maskar till testkärlen, tillförsel av föda, över ­
föring av maskar från återstående exponerade replikat till kärl som innehåller ren jord samt tagning av jord- och maskprover efter 4–6 timmar för bestämning av testkemikaliens koncent ­
ration. 
1 Kontroll av lufttillförsel, registrering av maskarnas beteende och 
temperatur samt tagning av jord- och maskprover för bestämning 
av testkemikaliens koncentration. 
2 Samma som dag 1. 3 Kontroll av lufttillförsel, maskarnas beteende och temperatur. 
4 Samma som dag 1. 
5–6 Samma som dag 3. 
7 Samma som dag 1: tillförsel av föda, kontroll av jordens fukthalt 
genom vägning av testkärlen och vattenpåfyllnad motsvarande 
avdunstningen. 
8–9 Samma som dag 3. 
10 Samma som dag 1. 
11–13 Samma som dag 3. 
14 Samma som dag 1: tillförsel av föda, kontroll av jordens fukthalt 
genom vägning av testkärlen och vattenpåfyllnad motsvarande avdunstningen. 
15–16 Samma som dag 3. 
17 Samma som dag 1.
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1460
 
Dag Aktivitet  
18–20 Samma som dag 3. 
21 Samma som dag 1: mätning av temperaturen och jordens pH, 
kontroll av jordens fuktighet genom vägning av testkärlen samt 
tagning av jord- och maskprover från lösningsmedelskontrollerna. 
Beredning av jorden före elimineringsfasens början bör göras på 
samma sätt som beredningen före upptagningsfasen. 
Aktiviteterna för dag 3 bör genomföras dagligen (åtminstone på 
arbetsdagar).  
Test med enchytraeider  
a) Upptagningsfas med 8 provtagningsdatum som används för beräkning av 
kinetik.  
Dag Aktivitet  
– 6 Konditionering av förberedd jord under 48 timmar. 
– 4 Spikning av jordfraktionen med testkemikalielösning, avdunst ­
ning av eventuellt lösningsmedel, blandning av jordbestånds ­
delarna, fördelning av jord i testkärlen och stabilisering till jäm ­
vikt i testbetingelserna i 4 dagar (3 veckor för metallspikad jord). 
– 3 till – 1 Separation av testorganismerna från odlingen för acklimatisering, 
beredning och fuktning av jordbeståndsdelarna. 
0 Mätning av temperatur och jordens pH, avlägsnande av jordpro ­
ver från behandlade kärl och lösningsmedelskontroller för be ­
stämning av testkemikaliens koncentration, tillsats av föda till jorden, vägning och slumpvis fördelning av maskarna till test ­
kärlen med bibehållande av tillräckligt antal maskar för bestäm ­
ning av analytiska bakgrundsvärden, våt- och torrvikt och fett ­
innehåll, vägning av alla testkärl för kontroll av jordens fukthalt och kontroll av lufttillförsel om stängda testsystem används. 
1 Kontroll av lufttillförsel, registrering av maskarnas beteende och 
temperatur samt tagning av jord- och maskprover för bestämning av koncentrationen testämne. 
2 Samma som dag 1. 3 Kontroll av lufttillförsel, maskarnas beteende och temperatur. 4 Samma som dag 1. 
5–6 Samma som dag 3. 
7 Samma som dag 1: tillförsel av föda till jorden, kontroll av 
jordens fukthalt genom vägning av testkärlen och vattenpåfyllnad 
motsvarande avdunstningen. 
9 Samma som dag 1. 
10 Samma som dag 3.
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1461
 
Dag Aktivitet  
11 Samma som dag 1. 
12–13 Samma som dag 3. 
14 Samma som dag 1: tillförsel av föda till jorden, mätning av 
temperaturen och jordens pH, kontroll av jordens fukthalt genom 
vägning av testkärlen; slut på upptagningsfasen; överföring av 
maskarna från återstående exponerade replikat till kärl som inne ­
håller ren jord för elimineringsfasen (ingen tarmtömning) samt provtagning av jord och maskar från lösningsmedelskontrollerna. 
Aktiviteterna före exponering (stabiliseringsfasen) bör tidplaneras 
med beaktande av testkemikaliens egenskaper. 
Aktiviteterna för dag 3 bör genomföras dagligen (åtminstone på 
arbetsdagar).
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1462
 
Tillägg 4  
Syntetisk jord – rekommendationer för beredning och lagring  
Eftersom naturjordar från en viss källa inte alltid finns att tillgå under hela året, 
och ingående organismer och mikroföroreningar kan påverka testet, rekommen ­
deras syntetiskt substrat, syntetisk jord enligt kapitel C.8 i denna bilaga, Toxicitet för daggmaskar (48), för användning i detta test. Flera olika testarter kan över ­
leva, växa och föröka sig i denna jord, och den ger också maximal standardise ­
ring såväl som jämförbarhet inom och mellan laboratorier och odlingsbetingelser. 
Jordens beståndsdelar 
Torv: 
10 % Sphagnum-torv, enligt OECD:s riktlinje 207 
(48) 
Kvartssand: 70 % 
Industriell kvartssand (lufttorkad), minst 
50 % av partiklarna bör ha en storlek inom området 50–200 μm, men alla partiklar bör 
vara ≤ 2 mm 
Kaolinitlera: 20 % Kaolinithalt ≥ 30 % 
Kalciumkarbonat: ≤ 1 % CaCO
 3 , pulveriserat, kemiskt rent 
Alternativt kan jordens organiska kolhalt minskas, t.ex. genom att sänka torvhal ­
ten till 4–5 % av torrjord och öka sandhalten i motsvarande grad. Med en sådan 
minskning av halten organiskt kol kan möjligheterna till adsorption av testkemi ­
kalien till jorden (organiskt kol) minskas, och då blir testkemikalien bättre till ­
gänglig för maskarna (74). Det har demonstrerats att  Enchytraeus albidus  och  
Eisenia fetida  kan uppfylla validitetskriterierna för reproduktion vid testning i 
fältjordar med lägre halt organiskt kol, t.ex. 2,7 % (33), (61), och det finns erfarenheter som visar att detta också kan uppnås i syntetisk jord med 5 % torv.
 
Beredning  
Jordens torra beståndsdelar blandas omsorgsfullt (t.ex. i en storskalig laborato ­
rieblandare). Detta bör göras cirka en vecka innan testet inleds. De blandade torra 
jordbeståndsdelarna bör fuktas med avjoniserat vatten minst 48 timmar före applicering av testämnet för att nå surhetsjämvikt. För bestämning av pH används en blandning av jord och 1 M lösning av KCl i förhållandet 1:5. Om pH-värdet 
inte ligger inom rekommenderat område (6,0 ± 0,5) bör tillräcklig mängd CaCO
 3 
tillföras jorden eller så måste en ny sats jord beredas. 
Den syntetiska jordens maximala vattenhållningskapacitet (WHC) bestäms enligt 
ISO 11268-2 (35). Minst två dagar innan testet inleds fuktas den torra syntetiska jorden med tillräcklig mängd avjoniserat eller rekonstituerat vatten till en vatten ­
halt som motsvarar cirka hälften av den slutliga vattenhalten. Den slutliga vat ­
tenhalten bör vara cirka 40–60 % av maximal vattenhållningskapacitet (WHC). Vid teststart ska den förhandsfuktade jorden delas upp i lika många delar som antalet testkoncentrationer och kontroller som används för testet, och fukthalten 
justeras till 40–60 % av WHC
 max genom användning av en lösning av testämnet 
och/eller genom tillförsel av avjoniserat eller rekonstituerat vatten. Fukthalten bestäms i början och i slutet av testet (vid 105 °C). Fukthalten bör vara optimal för den art som testas (fukthalten kan också kontrolleras genom att försiktigt 
krama jorden i handen och då bör det komma fram små vattendroppar mellan 
fingrarna).
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1463
 
Förvaring  
De torra beståndsdelarna av syntetisk jord kan förvaras i rumstemperatur fram till 
användningen. Den förberedda förfuktade jorden kan förvaras i svalt utrymme i 
upp till tre dagar före spikningen, och vattenavdunstningen bör minimeras. Jord som spikats med testämne bör användas omedelbart, med undantag för om det finns information om att jorden i fråga kan förvaras utan att testämnets toxicitet 
och biotillgänglighet påverkas. Prover av spikad jord kan sedan förvaras i de 
förhållanden som rekommenderas för testsystemet i fråga fram till analys.
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1464
 
Tillägg 5  
Arter av jordlevande oligochaeter som rekommenderas för testning av 
bioackumulering från jord  
Daggmaskar  
Rekommenderad testart är  Eisenia fetida  (Savigny 1826), som tillhör familjen 
Lumbricidae. Från och med 1972 är den uppdelad i två underarter ( Eisenia fetida  
och Eisenia andrei  (10)). Enligt Jaenike (36) är dessa äkta, separata arter.  Eisenia 
fetida  känns lätt igen genom de klargula banden mellan segmenten medan  Eise­
nia andrei  har en enhetlig mörkröd färg. De härstammar sannolikt från Svarta ­
havsregionen och finns numera över hela världen, särskilt i antropogent modi ­
fierade livsmiljöer såsom komposthögar. Båda kan användas för både ekotox ­
ikologiska test och bioackumuleringstest.  
Eisenia fetida  och Eisenia andrei  säljs allmänt på marknaden, t.ex. som fiskbete. 
Jämfört med andra daggmaskar (familjen Lumbricidae) har de en kort livscykel 
och når vuxenstadiet inom cirka 2–3 månader (vid rumstemperatur). Den opti ­
mala temperaturen för dessa daggmaskar ligger kring 20–24 °C. De föredrar relativt fuktiga substrat med nästan neutralt pH och en hög halt av organiskt 
material. Dessa arter har använts i stor utsträckning i standardiserade ekologiska 
tester i cirka 25 år och odling av dem är därför väl etablerad (48) (77). 
Båda arterna kan odlas i ett stort urval djuravfall. Som odlingsmedium rekom ­
menderas enligt ISO (35) en 50/50-blandning av häst- eller boskapsgödsel och torv. Mediet bör ha pH på cirka 6–7 (reglerat med kalciumkarbonat), låg jonisk 
konduktivitet (lägre än 6 mS/cm eller en salthalt under 0,5 %) bör inte ha för hög 
halt av ammoniak eller animaliskt urin. Likaså kan man använda kommersiell trädgårdsjord fri från tillsatser eller syntetisk jord enligt OECD (48) eller en 50/50-blandning av båda. Substratet bör vara fuktigt men inte för vått. Lämplig 
storlek på odlingslådorna är 10–50 liter. 
För att få maskar med standardålder och standardmassa är det bäst att inleda 
odlingen med kokonger. För detta tillsätts vuxna maskar till en odlingslåda med färskt substrat för att de ska producera kokonger. Erfarenheterna har visat att en populationsdensitet på cirka 100 vuxna maskar per kg substrat (våtvikt) ger goda 
förökningsnivåer. Efter 28 dagar avlägsnas de vuxna maskarna. Daggmaskarna 
som kläckts ur kokonger används för testning när de har nått vuxenstadium efter minst 2 månader men högst 12 månader. 
Maskar av de arter som beskrivs ovan kan anses vara friska om de rör sig genom 
substratet, inte försöker lämna substratet och förökar sig kontinuerligt. Mycket långsamma rörelser eller gul bakre del (i fråga om  Eisenia fetida ) tyder på 
utarmat substrat. Då rekommenderas färskt substrat och/eller mindre antal djur 
per låda.
 
Valda ytterligare hänvisningar  
Gerard B. M. (1964),  Synopsis of the British fauna , nr 6 Lumbricidae,  Linnean 
Soc. London, 6, s. 1–58. 
Graff O. (1953), ”Die Regenwürmer Deutschlands”,  Schr. Forsch. Anst. Land ­
wirtsch.  7, s. 1–81. 
Römbke J. E., Egeler P., Füll C. (1997), ”Literaturstudie über Bioakkumulations ­
tests mit Oligochaeten im terrestrischen Medium”,  Bericht für das UBA , F + E 
206 03 909, 86 S. 
Rundgren S. (1977), ”Seasonality of emergence in lumbricids in southern Swe ­
den”,  Oikos  28, s. 49–55. 
Satchell J. E. (1955), ”Some aspects of earthworm ecology”,  Soil Zoology (Ke ­
van), s. 180–201.  ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1465
 
Sims R. W. och Gerard B. M. (1985), ”A synopsis of the earthworms”,  Linnean 
Soc. London , 31, s. 1–171. 
Tomlin A. D. (1984), ”The earthworm bait market in North America”, ingår i 
”Earthworm Ecology - from Darwin to vermiculture”. Satchell, J.E. (red.), Chap ­
man & Hall, London, s. 331–338.  
Enchytraeider  
Den rekommenderade testarten är  Enchytraeus albidus  Henle 1837 (vit ring ­
mask).  Enchytraeus albidus  är en av de största arterna (upp till 15 mm) bland 
ringmaskar (Annelida) i Oligochaetfamiljen Enchytraeidae och finns över hela världen, se t.ex. (8).  Enchytraeus albidus  finns i marina och limniska livsmiljöer 
och livsmiljöer på land, främst i multnande organiskt material (tång, kompost) 
men är sällsynt på ängar (42). Denna breda ekologiska tolerans och vissa mor ­
fologiska variationer tyder på att det kan finnas olika raser av denna art.  
Enchytraeus albidus  säljs allmänt på marknaden som fiskfoder. Kontroll bör 
göras av om odlingen är förorenad av andra, i regel mindre arter (60). Om 
förorening förekommer bör alla maskar tvättas med vatten i en petriskål. Stora vuxna exemplar av  Enchytraeus albidus  väljs sedan ut (med användning av 
stereomikroskop) för start av en ny odling. Alla andra maskar kasseras. Livs ­
cykeln är kort eftersom maskarna blir könsmogna mellan 33 dagar (vid 18 °C) 
och 74 dagar (vid 12 °C). Endast odlingar som har hållits i laboratoriet minst 5 veckor (en generation) utan problem får användas för testning. 
Även andra arter av  Enchytraeus  är lämpliga, särskilt  Enchytraeus luxuriosus.  
Denna art är en äkta jordlevande mask, vilket nyligen har beskrivits i (65). Om andra arter av  Enchytraeus  används bör de identifieras tydligt och rapporten bör 
innehålla motivering för valet av denna art.  
Enchytraeus crypticus  (Westheide & Graefe 1992) är en art som tillhör samma 
grupp som  Enchytraeus luxuriosus . Man har inte med säkerhet kunna bekräfta 
dess existens på fältet, eftersom den endast har beskrivits utifrån daggmaskod ­
lingar och komposthögar (Römbke 2003). Artens ursprungliga ekologiska krav är 
därför inte kända. Nyligen gjorda laboratoriestudier av olika slags fältjordar har 
dock bekräftat att denna art har en bred tolerans när det gäller jordegenskaper som pH och textur (Jänsch m.fl. 2005). Under de senaste åren har denna art ofta använts i ekotoxikologiska studier eftersom den är lätt att odla och testa(se t.ex. 
Kuperman m.fl. 2003). Den är dock liten (3–12 mm, i genomsnitt 7 mm, West ­
heide & Müller 1996), vilket gör hanteringen svårare i jämförelse med  Ench­
ytraeus albidus . När denna art används i stället för  Enchytraeus albidus , kan 
storleken på testkärlen vara mindre, men det är inget krav. Dessutom bör man 
beakta att arten förökar sig mycket snabbt med en generationstid på mindre än 20 
dagar vid 20 ± 2 °C (Achazi m.fl. 1999) och ännu snabbare vid högre tempera ­
turer. 
Enchytraeider av arten  Enchytraeus albidus  (såväl som andra  Enchytraeus -arter) 
kan odlas i stora plastlådor (t.ex. 30 × 60 × 10 cm eller 20 × 12 × 8 cm, som 
lämpar sig för odling av små maskar) fyllda med en blandning av syntetisk jord och allmänt tillgänglig oförorenad trädgårdsjord utan tillsatser. Kompostmaterial bör undvikas eftersom det kan innehålla giftiga kemikalier såsom tungmetaller. 
Fauna bör avlägsnas från odlingsjorden före användning genom djupfrysning i tre 
omgångar. Rent syntetisk jord kan också användas men då kan förökningshas ­
tigheten vara lägre jämfört med blandade substrat. Substratet bör ha pH 6,0 ± 0,5. Odlingen hålls i en inkubator vid 15 ± 2 °C utan ljus. Under alla omständigheter 
ska temperaturer över 23 °C undvikas. Jorden (syntetisk eller naturlig) ska vara 
fuktig men inte våt. När jorden kramas försiktigt i handen ska endast små vattendroppar komma fram. Under alla omständigheter bör anoxiska betingelser undvikas (om t.ex. lock används, bör det ha tillräckligt antal hål för att ge 
tillräcklig luftväxling). Odlingsjorden bör luftas genom försiktig omblandning 
en gång per vecka.
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1466
 
Maskarna bör utfodras minst en gång per vecka ad libitum med havreflingor som 
placeras i en kavitet på jordens yta och täcks med jord. Om det finns kvar foder 
från föregående utfodring bör mängden foder justeras i motsvarande grad. Om det växer svamp på överblivet foder bör det ersättas med en ny mängd havref ­
lingor. För att stimulera förökningen kan havreflingorna kompletteras med all ­
mänt tillgängligt vitaminberikat proteinpulver varannan vecka. Efter tre månader 
överförs djuren till en färsk kultur eller färskt odlingssubstrat. Havreflingorna ska förvaras i kärl med tättslutande lock och bör behandlas i autoklav eller hettas upp före användning för att undvika infektion med mjölkvalster (t.ex.  Glyzyphagus  
sp., Astigmata, Acarina) eller rovkvalster (t.ex.  Hypoaspis (Cosmolaelaps) miles , 
Gamasida, Acarina). Efter desinfektering mals fodret så att det enkelt kan spridas på jordytan. En annan tänkbar foderkälla är bakningsjäst eller fiskfoder Tetra ­
Min
 ® . 
Allmänt taget gäller att odlingsbetingelserna är tillräckliga om maskarna inte 
försöker lämna substratet, rör sig snabbt genom jorden, har en glansig yta utan 
vidhäftande jordpartiklar, har en mer eller mindre vitaktig färg och det går att iaktta maskar av olika åldrar. Dessutom kan maskarna anses vara friska om de förökar sig kontinuerligt.
 
Valda ytterligare hänvisningar  
Achazi R. K., Fröhlich E., Henneken M., Pilz C. (1999), ”The effect of soil from 
former irrigation fields and of sewage sludge on dispersal activity and colonizing success of the annelid  Enchytraeus crypticus  (Enchytraeidae, Oligochaeta)”,  
Newsletter on Enchytraeidae  6, s. 117–126. 
Jänsch S., Amorim M. J. B., Römbke J. (2005), ”Identification of the ecological 
requirements of important terrestrial ecotoxicological test species”,  Environ. Re ­
views  13, s. 51–83. 
Kuperman R. G., Checkai R. T., Simini M., Phillips C. T., Kolakowski J. E., 
Kurnas C. W., Sunahara G. I. (2003), ”Survival and reproduction of  Enchytraeus 
crypticus  (Oligochaeta, Enchytraeidae) in a natural sandy loam soil amended with 
the nitro-heterocyclic explosives RDX and HMX”,  Pedobiologia  47, s. 651–656. 
Römbke J. (2003), ”Ecotoxicological laboratory tests with enchytraeids: A re ­
view”,  Pedobiologia  47, s. 607–616. 
Westheide W. och Graefe U. (1992), ”Two new terrestrial  Enchytraeus  species 
(Oligochaeta, Annelida)”,  J. Nat. Hist.  26, s. 479–488. 
Westheide W. och Müller M. C. (1996), ”Cinematographic documentation of 
enchytraeid morphology and reproductive biology”,  Hydrobiologia  334, s. 
263–267.
 ▼M4 2008R0440 — SV — 24.08.2014 — 005.001 — 1467