1998L0057 — SV — 30.07.2006 — 001.001

Detta dokument är endast avsett som dokumentationshjälpmedel och institutionerna ansvarar inte för innehållet

Ändrad genom:









▼B

RÅDETS DIREKTIV 98/57/EG

av den 20 juli 1998

om bekämpning av Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi m.fl.







EUROPEISKA UNIONENS RÅD HAR ANTAGIT DETTA DIREKTIV med beaktande av Fördraget om upprättandet av Europeiska gemenskapen, särskilt artikel 43 i detta, med beaktande av kommissionens förslag ( 1 ), med beaktande av Europaparlamentets yttrande ( 2 ), med beaktande av Ekonomiska och sociala kommitténs yttrande ( 3 ), och av följande skäl: av följande skäl: Skadegöraren Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi m.fl. var tidigare känd som Pseudomonas solanacearum (Smith) Smith. Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi m.fl. kommer förmodligen att bli det allmänt godtagna namnet på skadegöraren. I detta direktiv bör hänsyn tas till denna vetenskapliga utveckling. Produktionen av potatis och tomater intar en viktig plats inom gemenskapens jordbruk. Potatis- och tomatskörden hotas ständigt av skadegörare. Om odlingen av potatis och tomater skyddas mot sådana skadegörare skulle produktionskapaciteten upprätthållas och dessutom skulle jordbruksproduktionen öka. Skyddsåtgärder mot införsel av skadegörare till en medlemsstats territorium skulle endast ha begränsad effekt om inte sådana skadegörare samtidigt och metodiskt bekämpades inom hela gemenskapen och hindrades från att sprida sig. En av skadegörarna på potatis och tomat är Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi m.fl., den sjukdomsalstrande organism som orsakar mörk ringröta hos potatis och bakteriologisk vissnesjuka hos potatis och tomat. Sjukdomar som orsakats av denna sjukdomsalstrande organism har brutit ut i några delar av gemenskapen, och det existerar fortfarande några begränsade smittkällor. Det föreligger en avsevärd risk för odlingen av potatis och tomater i hela gemenskapen om effektiva åtgärder inte vidtas med avseende på dessa grödor för att lokalisera denna skadegörare och avgöra dess utbredning, för att förhindra dess förekomst och spridning samt, om den påträffas, för att förhindra dess spridning och bekämpa den i syfte att utrota den. För att säkerställa detta måste vissa åtgärder vidtas inom gemenskapen. Medlemsstaterna måste dessutom kunna vidta ytterligare eller strängare åtgärder, där detta är nödvändigt förutsatt att dessa inte hindrar handeln med potatis eller tomater inom gemenskapen än de som anges i rådets direktiv 77/93/EEG av den 21 december 1976 om skyddsåtgärder mot att skadegörare på växter eller växtprodukter förs in till medlemsstaterna ( 4 ). Sådana åtgärder måste anmälas till de andra medlemsstaterna och till kommissionen. Åtgärderna måste beakta att systematiska officiella undersökningar är nödvändiga för att lokalisera den sjukdomsalstrande organismen. Sådana undersökningar bör omfatta besiktningar och där så är lämpligt stickprovskontroller och test, eftersom sjukdomen under vissa miljömässiga omständigheter kan förbli latent och obemärkt både i potatisens förökningsmaterial och i lagrade potatisknölar. Spridningen av den sjukdomsalstrande organismen inom förökningsmaterialet är inte den viktigaste faktorn, men eftersom den sjukdomsalstrande organismen kan spridas med ytvatten och genom vissa besläktade vilda växter av familjen Solanaceae, utgör bevattning av potatis- och tomatgrödor med angripet vatten en smittorisk för sådana grödor. Den sjukdomsalstrande organismen kan också övervintra i självsådda (övervintrade) potatis- och tomatplantor, och dessa kan utgöra en smittkälla då de för över smittan från en odlingssäsong till nästa. Den sjukdomsalstrande organismen sprids också genom att potatisplantor angrips vid kontakt med smittad potatis och vid kontakt med utrustning för sättning, upptagning och hantering eller med transport- och lagringsbehållare som har angripits av skadegöraren vid tidigare kontakt med smittad potatis. Spridningen av den sjukdomsalstrande organismen kan minskas eller förhindras genom desinfektion av sådana föremål. Varje angrepp på utsädespotatis innebär en stor risk för att den sjukdomsalstrande organismen sprids. Utsädespotatisens latenta smitta utgör på liknande sätt en stor risk för att den sjukdomsalstrande organismen sprids, och detta kan förhindras genom användning av utsädespotatis som har producerats i ett officiellt godkänt program, där utsädespotatis har testats och konstaterats vara fri från smitta. Den nuvarande kunskapen om de biologiska och epidemiologiska egenskaperna hos Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi m.fl. under europeiska förhållanden är ofullständig, och det förutses att en översyn av de föreslagna åtgärderna kommer att bli nödvändig om ett antal säsonger. Förbättringar av testprocedurerna förväntas också mot bakgrund av ytterligare forskning, särskilt kring testmetodernas sensibilitet och noggrannhet, för att optimala testmetoder skall kunna väljas ut och standardiseras. För att närmare kunna besluta om dessa allmänna åtgärder, liksom om de strängare eller ytterligare åtgärder som medlemsstaterna vidtar för att förhindra att den sjukdomsalstrande organismen förs in till deras territorium, är det önskvärt att medlemsstaterna samarbetar nära med kommissionen inom Ständiga kommittén för växtskydd (nedan kallad kommittén). HÄRIGENOM FÖRESKRIVS FÖLJANDE.







Artikel 1

Detta direktiv rör de åtgärder som i medlemsstaterna skall vidtas mot Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi m.fl., tidigare känd som Pseudomonas solanacearum (Smith) Smith (nedan kallad skadegöraren) för att, såvitt avser skadegörarens värdväxter, vilka förtecknas i del 1 i bilaga I, (nedan kallade det förtecknade växtmaterialet),

a) lokalisera skadegöraren och kartlägga dess utbredning,

b) förhindra dess förekomst och spridning, och

c) om det konstateras förekomst av den, förhindra dess spridning och bekämpa den i syfte att utrota den.

Artikel 2

1. Medlemsstaterna skall varje år genomföra systematiska officiella undersökningar för att kontrollera förekomst av skadegöraren på det förtecknade växtmaterialet med ursprung i deras territorium. För att identifiera andra möjliga smittkällor som hotar produktionen av det förtecknade växtmaterialet skall medlemsstaterna göra en riskbedömning och, om ingen risk för spridning av skadegöraren har konstaterats under den bedömningen skall de, i produktionsområdena för det förtecknade växtmaterialet, genomföra riktade officiella undersökningar för att kontrollera förekomst av skadegöraren på andra växter än det förtecknade växtmaterialet, även på vilda värdväxter av familjen Solanaceae samt på ytvatten som används för bevattning eller duschning av det förtecknade växtmaterialet och på flytande avfall som släpps ut från anläggningar för industriell bearbetning eller förpackning där det förtecknade växtmaterialet hanteras och som används för bevattning och duschning av det förtecknade växtmaterialet. Omfattningen av dessa riktade undersökningar skall bestämmas med beaktande av den konstaterade risken. Medlemsstaterna kan också utföra officiella undersökningar för att kontrollera förekomst av skadegöraren på annat material, t.ex. odlingssubstrat, jord och fast avfall från anläggningar för industriell bearbetning eller förpackning.

2. De officiella undersökningar som anges i punkt 1 skall genomföras

a) på det förtecknade växtmaterialet i enlighet med de uppgifter som anges i punkt 1 i avsnitt II i bilaga I,

b) på värdväxter som inte återfinns i det förtecknade växtmaterialet och på vatten, inklusive flytande avfall, i enlighet med lämpliga metoder, och stickprov skall, när så är lämpligt, tas och genomgå officiella eller officiellt övervakade laboratorietest, och

c) när så är lämpligt på annat material i enlighet med lämpliga metoder.

Ytterligare uppgifter om besiktningarna och om stickprovernas antal, ursprung och inledning samt om tidpunkten för deras insamling skall för dessa undersökningar beslutas av de ansvariga officiella organen enligt direktiv 77/93/EEG, på grundval av sunda vetenskapliga och statistiska principer och skadegörarens biologiska egenskaper samt med beaktande av de berörda medlemsstaternas särskilda produktionssystem för det förtecknade växtmaterialet och, i förekommande fall, för skadegörarens andra värdväxter.

3. Resultaten av och detaljerna i fråga om de officiella undersökningar som fastställs i punkt 1 skall varje år anmälas till de andra medlemsstaterna och till kommissionen i enlighet med bestämmelserna i punkt 2 i avsnitt II i bilaga I. Dessa anmälningar skall göras senast den 1 juni, med undantag av anmälningar om utsädespotatis som skall ges in före den 1 september. Detaljerna och resultaten ifråga om grödor skall avse föregående års produktion. Innehållet i dessa anmälningar kan överlämnas till kommittén.

4. Följande bestämmelse skall antas i enlighet med förfarandet i artikel 16a i direktiv 77/93/EEG:

— De lämpliga metoderna för de undersökningar och laboratorietest som avses i punkt 2 första stycket under b.

5. Följande bestämmelser får antas i enlighet med förfarandet i artikel 16a i direktiv 77/93/EEG:

— De lämpliga metoderna för de undersökningar som avses i punkt 2 första stycket under c.

— Närmare uppgifter om de undersöknignar som avses i punkt 2 andra stycket, för att säkerställa jämförbara nivåer på medlemsstaternas garantier.

Artikel 3

Medlemsstaterna skall säkerställa att misstänkt förekomst eller bekräftad närvaro av skadegöraren på deras territorium rapporteras till deras egna ansvariga officiella organ.

Artikel 4

1. Vid varje fall av misstänkt förekomst av skadegöraren skall de ansvariga officiella organen i den berörda medlemsstaten eller de berörda medlemsstaterna säkerställa att officiella eller officiellt övervakade laboratorietest genomförs på det förtecknade växtmaterialet enligt den lämpliga metod som anges i bilaga II och enligt de villkor som anges i punkt 1 i bilaga III, eller, i andra fall, någon annan officiellt godkänt metod, för att bekräfta eller vederlägga den misstänkta förekomsten. Om misstanken bekräftas skall de krav som fastställs i punkt 2 i bilaga III gälla.

2. I avvaktan på bekräftelse eller vederläggande av misstänkt förekomst enligt punkt 1, i varje enskilt fall av misstänkt förekomst där antingen

i) de sjukdomssymptom som orsakas av skadegöraren har diagnostiserats och ett eller flera snabbscreeningtest har genomförts med positivt resultat på sätt som anges i avsnitt I punkt 1 och avsnitt II i bilaga II, eller

ii) ett eller flera screeningtest har genomförts med positivt resultat på sätt som anges i avsnitt I punkt 2 och avsnitt III i bilaga II,

skall de ansvariga officiella organen i medlemsstaterna med hänsyn till sin egen produktion

a) förbjuda flyttning av plantor och knölar från alla grödor, partier eller sändningar från vilka stickproven har tagits, förutom då det sker under deras övervakning och förutsatt att det har konstaterats att det inte finns någon identifierbar risk för att skadegöraren skall spridas,

b) vidta åtgärder för att spåra den misstänkta förekomstens ursprung,

c) införa lämpliga ytterligare försiktighetsåtgärder på grundval av hur stor risken bedöms vara, särskilt i förhållande till produktionen av det förtecknade växtmaterialet och flyttning av andra partier av utsädespotatis än sådana som avses under a, som har producerats på den odlingsplats där de stickprov, som avses under a, har tagits, för att hindra att skadegöraren på något sätt sprids.

3. I fall av misstänkt förekomst av skadegöraren skall, om det finns risk för angrepp på det förtecknade växtmaterialet eller ytvattnet från eller till en annan medlemsstat, den medlemsstat där misstanken har rapporterats omedelbart till den eller de andra berörda medlemsstaterna, beroende på den konstaterade risken, anmäla den nämnda misstänkta förekomsten, och de nämnda medlemsstaterna skall då samarbeta på lämpligt sätt. Den eller de medlemsstater som fått anmälan skall vidta försiktighetsåtgärder enligt punkt 2 c och i förekommande fall vidta ytterligare åtgärder enligt punkterna 1 och 2.

4. Följande bestämmelse får antas i enlighet med förfarandet i artikel 16a i direktiv 77/93/EEG:

— De åtgärder som anges i punkt 2 c.

Artikel 5

1. Om ett officiellt eller officiellt övervakat laboratorietest som, med avseende på det förtecknade växtmaterialet, använder den lämpliga metod som anges i bilaga II, eller i andra fall, någon annan officiellt godkänd metod, bekräfter skadegörarens förekomst i ett stickprov som tagits på grund av detta direktiv, skall de ansvariga officiella organen i en medlemsstat, med beaktande av sunda vetenskapliga principer, skadegörarens biologiska egenskaper och de särskilda systemen för produktion, marknadsföring och bearbetning av skadegörarens värdväxt i den medlemsstaten,

a) i fråga om det förtecknade växtmaterialet vidta följande åtgärder: i) Genomföra en utredning för att, i enlighet med bestämmelserna i bilaga IV, fastställa angreppets omfattning och dess primärkälla eller -källor, med ytterligare test i enlighet med artikel 4.1 på åtminstone alla lager av utsädespotatis ur kloner som är närbesläktade. ii) Förklara följande angripet: Det förtecknade växtmaterialet, sändningen och/eller partiet som stickprovet togs från, maskinerna, fordonet, fartyget, lagret, eller delar av dessa, och alla andra föremål, inklusive förpackningsmaterialet som har varit i kontakt med det förtecknade växtmaterial från vilket stickprovet togs. I förekommande fall även förklara följande som angripet: Det eller de fält, den eller de enheter för skyddad växtproduktion och den eller de produktionsplatser där det förtecknade växtmaterialet har skördats och från vilka stickprovet tagits. I fråga om de stickprov som tagits under växtsäsongen förklara följande för angripet: Det eller de fält, den eller de produktionsplatser, och i förekommande fall den eller de enheter för skyddad växtproduktion som stickprovet togs ifrån. iii) I enlighet med bestämmelserna i punkt 1 i bilaga V fastställa omfattningen av troliga angrepp genom kontakt före eller efter skörd, genom produktionsmässig anknytning, bevattning eller duschning eller genom klonsläktskap med det angivna angreppet. iv) Avgränsa ett område på grundval av förklaringen om angreppet enligt punkt ii, fastställa omfattningen av det troliga angreppet enligt punkt iii och skadegörarens möjliga spridning, i enlighet med bestämmelserna i punkt 2 i i bilaga V.

b) I fråga om grödor från värdväxter som inte nämns under a, då det har konstaterats att det finns en risk vid produktionen av det förtecknade växtmaterialet vidta följande åtgärder: i) Genomföra en utredning i enlighet med punkt a i. ii) Förklara de av skadegörarens värdväxter som provet har tagits från för angripna. iii) Fastställa det troliga angreppet och avgränsa ett område i enlighet med punkterna a iii respektive a iv i förhållande till produktionen av det förtecknade växtmaterialet.

c) I fråga om ytvatten (även flytande avfall från anläggningar för industriell bearbetning eller förpackning där det förtecknade växtmaterialet hanteras) och besläktade vilda värdväxter av familjen Solanaceae, då det har konstaterats att produktionen av det förtecknade växtmaterialet utgör en risk genom bevattning, duschning eller översämning med ytvattnet vidta följande åtgärder: i) Genomföra en utredning som omfattar en officiell undersökning vid lämpliga tidpunkter på prov av ytvattnet och, om sådana finns, på vilda värdväxter av familjen Solanaceae för att fastställa angreppets omfattning. ii) Förklara det ytvatten som provet eller proven har tagits från för angripet i den utsträckning som det är lämpligt och på grundval av undersökningen enligt punkt i. iii) Fastställa det troliga angreppet och avgränsa ett område på grundval av förklaringen om angreppet enligt punkt ii och skadegörarens möjliga spridning med beaktande av bestämmelserna i punkt 1 och 2 ii i bilaga V.

2. Medlemsstaterna skall, i enlighet med bestämmelserna i punkt 3 i bilaga V, omedelbart till de andra medlemsstaterna och till kommissionen anmäla varje angrepp som fastställs enligt punkterna 1 a ii och 1 c ii och uppgifterna om avgränsning av områden enligt punkt 1 a iv och, där så är tillämpligt, enligt punkt 1 c iii. Innehållet i denna anmälan enligt detta stycke får överlämnas till kommittén.

Medlemsstaterna skall samtidigt till kommissionen överlämna en tilläggsanmälan enligt 3 a i bilaga V. Innehållet i denna anmälan enligt detta stycke skall omedelbart överlämnas till kommitténs ledamöter.

3. Till följd av den anmälan som avses i punkt 2 och dess beståndsdelar, skall de andra medlemsstater som anges i anmälan genomföra en utredning i enlighet med punkt 1 a i och, där så är tillämpligt, punkt 1 c i och om så är lämpligt vidta ytterligare åtgärder i enlighet med punkterna 1 och 2.

Artikel 6

1. Medlemsstaterna skall föreskriva att det förtecknade växtmaterial som förklarats för angripet enligt artikel 5.1 a ii inte får planteras och att det, under övervakning av och med godkännande av deras ansvariga officiella organ, skall underkastas någon av bestämmelserna i punkt 1 i bilaga VI, så att det kan fastställas att det inte finns någon identifierbar risk för att skadegöraren sprids.

2. Medlemsstaterna skall föreskriva att det förtecknade växtmaterial som förklarats troligen angripet enligt artikel 5.1 a iii och 5.1 c iii inbegripet det förtecknade växtmaterial för vilket en risk har konstaterats föreligga, och som producerats på produktionsplatser som förklarats troligen angripna enligt artikel 5.1 a iii inte får planteras och att det, under övervakning av deras ansvariga officiella organ, skall användas på lämpligt sätt eller bortförskaffas enligt punkt 2 i bilaga VI, så att det kan fastställas att det inte finns någon identifierbar risk för att skadegöraren sprids.

3. Medlemsstaterna skall föreskriva att alla maskiner, fordon, fartyg, lager, eller delar av dessa, och alla andra föremål, inklusive förpackningsmaterial, som har förklarats angripna enligt artikel 5.1 a ii eller förklarats troligen angripna enligt artikel 5.1 a iii och 5.1 c iii, antingen skall förstöras eller saneras med lämpliga metoder som fastställs i punkt 3 i bilaga VI. Efter saneringen skall inga sådana föremål längre betraktas som angripna.

4. Utan att det påverkar tillämpningen av de åtgärder som genomförs enligt punkterna 1-3 skall medlemsstaterna föreskriva att ett antal åtgärder skall genomföras enligt punkterna 4.1 och 4.2 i bilaga VI inom det område som avgränsas enligt artikel 5.1 a iv och 5.1 c iii. Uppgifter om dessa åtgärder skall varje år anmälas till de andra medlemsstaterna och till kommissionen. Innehållet i denna anmälan för överlämnas till kommittén.

Artikel 7

1. Medlemsstaterna skall föreskriva att utsädespotatis skall uppfylla kraven i direktiv 77/93/EEG och att de i direkt led skall härstamma ur potatismaterial som erhållits enligt ett officiellt godkänt program och som har konstaterats vara fritt från skadegöraren vid officiella eller officiellt övervakade tester då den lämpliga metod, som anges i bilaga II, har använts.

De ovannämnda testerna skall utföras av en medlemsstat

a) i de fall då bekräftade fynd av skadegöraren har gjorts i dess egen produktion av utsädespotatis i) genom tester av tidigare generationer inklusive det ursprungliga klonurvalet och systematiska tester av det ursprungliga klonurvalet av utsädespotatisen, eller ii) genom tester av allt ursprungligt klonurval av utsädespotatis eller tidigare generationer inklusive det ursprungliga klonurvalet i de fall då inget släktskap genom klon har påvisats och

b) i andra fall, antingen av varje planta i det ursprungliga klonurvalet eller av representativa stickprov av basutsädespotatis eller tidigare generationer.

2. Följande bestämmelser får antas i enlighet med förfarandet i artikel 16a i direktiv 77/93/EEG:

— Tillämpningsföreskrifterna i punkt 1, andra stycket, punkt a.

— De bestämmelser om representativa stickprov som föreskrivs i punkt 1, andra stycket, punkt b.

Artikel 8

Medlemsstaterna skall förbjuda innehav och hantering av skadegöraren.

Artikel 9

Utan att det påverkar tillämpningen av bestämmelserna i direktiv 77/93/EEG får bestämmelserna bevilja undantag från de åtgärder som avses i artiklarna 6 och 8 i det här direktivet i enlighet med bestämmelserna i direktiv 95/44/EG i experimentellt eller vetenskapligt syfte och för växtförädling ( 5 ).

Artikel 10

Medlemsstaterna får med avseende på sin egen produktion besluta om de ytterligare eller strängare åtgärder som kan krävas för att bekämpa skadegöraren eller för att hindra att den sprids, i den mån dessa är förenliga med bestämmelserna i direktiv 77/93/EEG.

Närmare upplysningar rörande dessa åtgärder skall meddelas de andra medlemsstaterna och till kommissionen. Närmare upplysningar rörande detta meddelande får överlämnas till kommittén.

Artikel 11

Ändringar i bilagorna till detta direktiv mot bakgrund av nya vetenskapliga eller tekniska rön skall antas i enlighet med förfarandet i artikel 16a i direktiv 77/93/EEG. När det gäller de metoder som anges i bilaga II och åtgärderna i punkt 4.1 och 4.2 i bilaga VI till detta direktiv, skall kommissionen förbereda en rapport där metoderna och åtgärderna granskas mot bakgrund av gjorda erfarenheter som vunnits, och rapporten skall överlämnas till kommittén före den 1 januari 2002.

Artikel 12

1. Medlemsstaterna skall sätta i kraft de lagar och andra författningar som är nödvändiga för att följa detta direktiv senast den 21 augusti 1999. De skall genast underrätta kommissionen om detta.

När en medlemsstat antar dessa bestämmelser skall de innehålla en hänvisning till detta direktiv eller åtföljas av en sådan hänvisning till detta direktiv när de offentliggörs. Närmare föreskrifter för hur hänvisningen skall göras skall varje medlemsstat själv utfärda.

2. Medlemsstaterna skall omedelbart till kommissionen överlämna texterna till de centrala bestämmelser i nationell lagstiftning som de antar inom det område som omfattas av detta direktiv. Kommissionen skall underrätta de övriga medlemsstaterna om detta.

Artikel 13

Detta direktiv träder i kraft samma dag som det offentliggörs i Europeiska gemenskapernas officiella tidning.

Artikel 14

Detta direktiv riktar sig till medlemsstaterna.









BILAGA I

AVSNITT I

Förteckning över de värdväxter för Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi m.fl. som anges i artikel 1:







Växter (inklusive knölar), andra än potatisfröer, av Solanum tuberosum L. Potatis Växter, andra än frukter och utsäde, av Lycopersicon lycopersicum (L.) Karsten ex Farw. Tomat

AVSNITT II

Undersökningar

1. De officiella undersökningar som anges i artikel 2.2 a skall grundas på skadegörarens biologi och på det särskilda produktionssystemet i den berörda medlemsstaten och skall omfatta följande: i) I fråga om potatis, — vid lämpliga tidpunkter visuell besiktning av den växande grödan och/eller stickprovskontroll av både utsäde och annan potatis under växtsäsongen eller i lager; dessa prov skall genomgå officiella eller officiellt övervakade visuella besiktningar genom att knölarna klyvs, — och — i fråga om utsädespotatis och där så är lämpligt för annan potatis, officiella eller officiellt övervakade laboratorietest, där den metod tillämpas för diagnostisering, spårande och identifiering av skadegöraren där delar av flödesschemat används och som anges i bilaga II. ii) I fråga om tomat, — visuell besiktning vid lämpliga tidpunkter av åtminstone den växande gröda som är avsedd för omplantering för yrkesmässigt bruk.

2. Anmälan av de officiella undersökningar som anges i artikel 2.3 skall innehålla följande: i) I fråga om undersökningar av potatis, — uppskattning av den totala areal i hektar där utsädespotatis och annan potatis odlas, — indelning i kategorierna utsädes- och matpotatis, och i förekommande fall i regioner, — antal prov som tagits för test och tidpunkt för detta, — antal okulärbesiktningar på fältet, — antal besiktningar av knölar (och stickprovets storlek). ii) I fråga om undersökningar av, åtminstone, växande tomater avsedda för omplanterng för yrkesmässigt bruk, — uppskattning av det totala antalet plantor, — antal okulärbesiktningar. iii) i fråga om undersökningar av värdväxter som inte är potatis- och tomatplantor, inklusive vilda värdväxter av familjen Solanacea, — art, — antal prov och när dessa tagits, — område eller vattendrag där prov tagits, — analysmetod. iv) I fråga om undersökningar av vatten och utsläpp av flytande avfall från anläggningar för industriell bearbetning eller förpackning, — antal prov och när dessa tagits, — område, vattendrag eller anläggningar där prov tagits, — analysmetod.

▼M1









BILAGA II

TESTPROGRAM FÖR ATT DIAGNOSTISERA, UPPTÄCKA OCH IDENTIFIERA RALSTONIA SOLANACEARUM (SMITH) YABUUCHI M. FL.

Testprogrammets omfatting

I det framtagna programmet beskrivs de olika förfarandena för att:

i) diagnostisera mörk ringröta i potatisknölar och bakteriologisk vissnesjuka på potatis- och tomatplantor och vissa andra värdväxter,

ii) upptäcka Ralstonia solanacearum i prover av potatisknölar, potatis- och tomatplantor och andra värdväxter, vatten och jord,

iii) identifiera Ralstonia solanacearum (R. solanacearum).

INNEHÅLL







Allmänna principer Avsnitt I: Tillämpning av testprogrammet 1. Program för diagnos på brun ringröta och bakteriologisk vissnesjuka (R. solanacearum) i potatisknölar och i potatisplantor, tomatplantor eller andra värdväxter med symtom på brun ringröta eller bakteriologisk vissnesjuka. 2. Program för att upptäcka och identifiera R. solanacearum i prover av asymtomatiska potatisknölar 3. Program för att upptäcka och identifiera R. solanacearum i prover av asymtomatiska potatisplantor, tomatplantor eller andra värdväxter. Avsnitt II: Detaljerade metoder för att upptäcka Ralstonia solanacearum i potatisknölar och i potatisplantor, tomatplantor eller andra värdväxter med symtom på brun ringröta eller bakteriologisk vissnesjuka 1. Symtom 2. Snabbscreeningtest 3. Isoleringsförfarande 4. Identifieringstest för R. solanacearum Avsnitt III: 1. Detaljerade metoder för att upptäcka och identifiera R. solanacearum i prover av asymtomatiska potatisknölar 1.1 Preparering av prover 1.2 Testning 2. Detaljerade metoder för att upptäcka och identifiera R. solanacearum i prover av asymtomatiska potatisplantor, tomatplantor eller andra värdväxter 2.1 Preparering av prover 2.2 Testning Avsnitt IV: 1. Program för att upptäcka och identifiera R. solanacearum i vatten 2. Metoder för att upptäcka och identifiera R. solanacearum i vatten 2.1 Preparering av prover 2.2 Testning Avsnitt V: 1. Program för att upptäcka och identifiera R. solanacearum i jord 2. Metoder för att upptäcka och identifiera R. solanacearum i jord 2.1 Preparering av prover 2.2 Testning Avsnitt VI: Optimerade protokoll för att upptäcka och identifiera R. solanacearum A. Test för diagnos och upptäckt 1. Kärlströmningstest 2. Upptäckt av poly-β-hydroxibutyratkorn (PHB) 3. Serumagglutinationstest 4. Selektiv isolering 4.1 Odling på selektivt medium 4.2 Anrikningsförfarande 5. Immunofluorescenstest (IF-test) 6. Polymeraskedjereaktionstest (PCR-test) 6.1 Metoder för rening av DNA 6.1 a) Metod enligt Pastrik (2000) 6.1 b) Andra metoder 6.2 PCR 6.3 Analys av PCR-produkten 7. Fluorescerande in situ-hybridisering (FISH-test) 8. Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA-test) 8 a) Indirekt ELISA 8 b) DASI (Double-Antibody Sandwich Indirect) ELISA 9. Biotest B. Identifieringstest 1. Nutrient- och enzymatiskt identifieringstest 2. IF-test 3. ELISA-test 4. PCR-test 5. FISH-test 6. Fettsyraprofilering (FAP) 7. Metoder för stamkarakterisering 7.1 Biovarbestämning 7.2 Genomiskt fingeravtryck 7.3 PCR-metoder C. Verifieringstest Tillägg 1 Laboratorier som utför optimering och validering av protokoll Tillägg 2 Medier för isolering och odling av R. solanacearum Tillägg 3 A) Standardiserade kontrollmaterial tillgängliga i handeln B) Preparering av kontroller Tillägg 4 Buffertar för testförfaranden Tillägg 5 Bestämning av kontamineringsnivå i IF- och FISH-tester Tillägg 6 Validerade PCR-protokoll och PCR-reagens Tillägg 7 Validerade reagens för FISH-test Tillägg 8 Odlingsbetingelser för tomater och äggplantor Referenser

ALLMÄNNA PRINCIPER

Optimerade protokoll för de olika metoderna, validerade reagenser och närmare uppgifter om beredningen av test- och kontrollmaterial finns i tilläggen. En förteckning över de laboratorier som togs med i optimeringen och valideringen av protokoll finns i tillägg 1.

Eftersom protokollen omfattar upptäckt av en karantänsorganism och användning av R. solanacearum som kontrollmaterial, är det nödvändigt att förfarandena tillämpas under lämpliga karantänförhållanden med lämpliga anordningar för avfallshantering och i enlighet med lämpliga licenser utfärdade av de officiella växtinspektionsmyndigheterna.

Testparametrarna skall utformas så att de säkerställer enhetliga och reproducerbara upptäckter av halter av R. solanacearum vid de fastställda tröskelvärdena för de valda metoderna.

En noggrann förberedning av de positiva kontrollerna är av största vikt.

Testning i enlighet med de föreskrivna tröskelvärdena fordrar även att utrustningen ställs in, underhålls och kalibreras på ett korrekt sätt, att reagenserna handhas och förvaras varsamt och att samtliga åtgärder för att förhindra nedsmittning mellan prover vidtas, t.ex. separering av positiva kontroller från prover. Standarder för kvalitetskontroll skall tillämpas för att undvika administrativa och andra fel, särskilt när det gäller märkning och dokumentering.

En misstänkt förekomst enligt artikel 4.2 i direktiv 98/57/EG innebär ett positivt resultat vid diagnostiska tester eller screeningtester som utförs på ett prov i enlighet med vad som anges i flödesdiagrammen. Om det första screeningtestet (IF-test, PCR/FISH, selektiv isolering) är positivt, skall detta bekräftas genom ett andra screeningtest, baserat på en annan biologisk princip.

Om det första screeningtestet är positivt, misstänks nedsmittning med R. solanacearum och ett andra screeningtest skall göras. Om det andra screeningtestet är positivt bekräftas misstanken (misstänkt förekomst) och testerna i enlighet med programmet skall fortsätta. Om det andra screeningtestet är negativt betraktas provet som icke nedsmittat med R. solanacearum.

Bekräftad närvaro enligt artikel 5.1 i direktiv 98/57/EG innebär isolering och identifiering av en renkultur av R. solanacearum med bekräftad patogenitet.

AVSNITT I

TILLÄMPNING AV TESTPROGRAMMET

1. Program för diagnos på brun ringröta och bakteriologisk vissnesjuka (Ralstonia solanacearum) i potatisknölar och i potatisplantor, tomatplantor eller andra värdväxter med symtom på brun ringröta eller bakteriologisk vissnesjuka.

Testförfarandet är avsedd för potatisknölar och potatisplantor som uppvisar typiska eller misstänkta symtom på mörk ringröta eller vissnesjuka. Den omfattar ett snabbscreeningtest, isolering av den sjukdomsalstrande organismen från infekterad kärlvävnad på ett (selektivt) medium och, vid positivt utslag, identifiering av kulturen som Ralstonia solanacearum.

2. Program för att upptäcka och identifiera Ralstonia solanacearum i prover av asymtomatiska potatisknölar

Princip:

Syftet med testförfarandet är att upptäcka latenta infektioner i potatisknölar. Minst två positiva screeningtest3 baserade på olika biologiska principer skall verifieras genom isolering av patogenet, vid isolering av typiska kolonier följt av identifiering av en renkultur som R. solanacearum. Endast ett positivt screeningtest är inte tillräckligt för att provet skall kunna betraktas som misstänkt.

Screening- och isoleringstesterna skall möjliggöra en upptäckt av 103–104 celler/ml återsuspenderade pellet, som är medtagna som positiva kontroller i varje testserie.

3. Program för att upptäcka och identifiera Ralstonia solanacearum i prover av asymtomatiska potatisplantor, tomatplantor eller andra värdväxter

AVSNITT II

DETALJERADE METODER FÖR ATT UPPTÄCKA RALSTONIA SOLANACEARUM I POTATISKNÖLAR OCH I POTATISPLANTOR, TOMATPLANTOR ELLER ANDRA VÄRDVÄXTER MED SYMTOM PÅ BRUN RINGRÖTA ELLER BAKTERIOLOGISK VISSNESJUKA

1. Symtom (se webbplats: http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main)

1.1 Symtom på potatis

Potatisplantan. Det tidiga skedet av infektionen på fältet känns igen på att bladen vissnar mot toppen av plantan vid höga dagstemperaturer, men återhämtar sig under natten. På de tidiga stadierna av vissnande är bladen fortfarande gröna, men senare gulnar de för att så småningom bli brunt nekrokiska. Även epinasti uppträder. Vissningen hos skottet eller hela plantan blir snabbt bestående och leder till att plantan faller samman och dör. Kärlvävnaden i stjälkar skurna på tvären från vissnade plantor är vanligen bruna, och ett mjölkaktigt bakteriellt sekret avsöndras från den skurna ytan eller kan pressas ut. När en skuren stjälk ställs i vatten strömmar trådar av slem ut från kärlknippena.

Potatisknölen. Potatisknölarna måste skäras på tvären nära naveländan (stolonändan) eller på längden över stolonändan. I det tidiga skedet av infektionen syns en glasaktig gul till ljusbrun missfärgning av kärlringen, från vilken ett blekgult krämartat bakteriellt sekret spontant kommer fram efter några minuter. Senare blir kärlmissfärgningen tydligare brun, och nekrosen kan sprida sig till parenkymvävnaden. Vid långt framskridna skeden bryter infektionen fram från naveländan och ögonen, från vilka bakterieslem utsöndras så att jordpartiklar häftar vid. Rödbruna lätt insjunkna lesioner i skalet kan uppträda på skalet på grund av kollaps av kärlringvävnader inuti knölen. Sekundära utvecklingsstadier av svamp- och bakteriebetingad blötröta är vanligt förekommande i långt framskridna stadier av sjukdomen.

1.2 Symtom på tomater

Tomatplantan. Det första synliga symtomet är att de yngsta bladen blir sladdriga. Under gynnsamma miljöförhållanden för patogenet (jordtemperatur cirka 25 °C, mättad fuktighet) följer epinasti och vissning av ena sidan eller hela plantan inom några få dagar, vilket leder till att hela plantan faller samman. Under mindre gynnsamma förhållanden (jordtemperatur under 21 °C) inträffar vissning mindre ofta, men ett stort antal extra rottrådar kan utvecklas på stjälken. Vattendränkta strimmor som löper från stjälkens bas kan observeras, vilket är tecken på nekros i kärlsystemet. När stjälken genomskärs utsöndrar missfärgade bruna kärlvävnader vitt eller gulaktigt bakteriellt sekret.

1.3 Symtom på andra värdväxter

Solanum dulcamara och S. nigrum. Under naturliga förhållanden uppträder vissningsymtom sällan hos detta ogräs som är värdväxt, om inte jordtemperaturen överskrider 25 °C eller om inokulationen är omfattande (t.ex. i fallet S. nigrum, om den växer i anslutning till potatis- eller tomatplantor som dött). När vissnande sker uppträder samma symtom som för tomater. Icke-vissnande plantor av S. dulcamara som växer med stjälkarna och rötterna i vatten kan uppvisa inre ljusbrun missfärgning hos kärlvävnaderna i ett tvärsnitt av stjälkbasen eller av de stjälkdelar som befinner sig under vatten. Bakterieslem kan utsöndras från avskurna kärlvävnader eller bilda trådar av slem om den skurna stjälken ställs vertikalt i vatten, även i frånvaro av vissningssymtom.

2. Snabbscreeningtest

Snabbscreeningtest underlättar presumtiv diagnos men är inte nödvändiga. Använd ett eller flera av följande validerade test:

2.1 Kärlströmningstest

(Se avsnitt VI.A.1.)

2.2 Upptäckt av poly-β-hydroxybutyratkorn (PHB)

Karakteristiska PHB-korn i celler av R. solanacearum kan göras synliga genom att färga värmefixerade utstrykningspreparat av bakteriellt sekret från infekterad vävnad på ett objektglas med Nilblått A eller Sudansvart B (se avsnitt VI.A.2.).

2.3 Serumagglutinationstest

(Se avsnitt VI.A.3.)

2.4 Andra test

Andra lämpliga snabbscreeningtest omfattar IF-test (se avsnitt VI.A.5.), FISH-test (se avsnitt VI.A.7.), ELISA-test (se avsnitt VI.A.8.) och PCR-test (se avsnitt VI.A.6).

3. Isoleringsförfarande

a) Avlägsna sekret eller partier med missfärgad vävnad från knölens kärlring på potatis eller från stjälkens kärlsträngar på potatis, tomat eller andra vissnande värdväxter. Suspendera i en mindre volym av sterilt destillerat vatten eller 50 mM fosfatbuffert (tillägg 4) och låt stå i 5–10 minuter.

b) Bered en serie av decimala utspädningar av suspensionen.

c) För över 50–100 µl av suspensionen och utspädningarna till ett vanligt näringsmedium (NA, YPGA eller SPA; se tillägg 2) och/eller till Kelmans tetrazolium medium (tillägg 2) och/eller till ett validerat selektivt substrat (t.ex. SMSA; se tillägg 2). Utsprid eller utstryk med lämplig plattspridning från spädningsserie. Bered, om det anses lämpligt, separata plattor med en utspädd cellsuspension av R. solanacearum biovar 2 som positiv kontroll.

d) Inkubera plattorna under 2–6 dagar vid 28 °C. — På det allmänna näringsmediet utvecklar virulenta isolat av R. solanacearum pärl-/krämvita, platta, oregelbundna, flödiga kolonier med karakteristiska virvlar i mitten. Icke virulenta former av R. solanacearum utvecklar små runda icke-flödiga smörlika kolonier som är helt krämvita. — På Kelmans tetrazolium- och SMSA-medier har virvlarna blodröd färg. Icke virulenta former av R. solanacearum utvecklar små runda icke-flödiga smörlika kolonier som är fullständigt djupröda.

4. Identifieringstest för R. solanacearum

Test för att bekräfta identiteten hos förmodade isolat av R. solanacearum behandlas i avsnitt VI.B.

AVSNITT III

1. Detaljerade metoder för att upptäcka och identifiera Ralstonia solanacearum i prover av asymtomatiska potatisknölar

1.1 Preparering av prover

Observera:

— Den standardiserade provmängden är 200 knölar per test. Vid intensivare provtagning krävs fler tester på prover av denna storlek. Ett större antal knölar i provet medför inhibering eller svårighet att tolka resultaten. Förfarandet kan emellertid användas för prover med färre än 200 knölar, om det endast finns färre knölar tillgängliga.

— Valideringen av samtliga nedan behandlade metoder för upptäckt har skett på grundval av test av stickprover på 200 knölar.

— Det nedan beskrivna potatisextraktet kan även användas för upptäckt av den bakterie som orsakar ljus ringröta hos potatis, Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus.

Frivillig förbehandling före provpreparering:

a) Inkubation av prover vid 25–30 °C under upp till 2 veckor före testning för att främja förökning av alla populationer av R. solanacearum.

b) Tvätta knölarna. Använd lämpliga desinfektionsmedel (vid PCR-test klorföreningar för att avlägsna patogent DNA) och tvättmedel mellan varje stickprov. Lufttorka knölarna. Detta rengöringsförfarande är användbart (men inte obligatoriskt) i synnerhet vid jordiga prover och om ett PCR-test eller ett direkt isoleringstest skall göras.

1.1.1 Avlägsna med en ren, desinficerad skalpell eller grönsakskniv epidermis från varje knöls navelända (stolon) så att kärlringvävnaderna blir synliga. Skär försiktigt ur en liten kärna av kärlringvävnad i naveländan och minimera mängden icke-kärlringvävnad (se webbsida: http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Anmärkning: Lägg undan alla (ruttnande) knölar med misstänkta symtom på brunröta och testa dem separat. Om misstänkta symtom på mörk ringröta iakttas vid avlägsnandet av naveländan bör en okulärinspektion av denna knöl ske, och knölen bör skäras av nära naveländan. Alla skurna knölar med misstänkta symtom bör förvaras minst två dagar i rumstemperatur för att möjliggöra förkorkning och därefter lagras nedkylda (4–10 °C) under lämpliga karantänförhållanden. Alla knölar, inklusive dem med misstänkta symtom, bör förvaras i enlighet med bilaga III.

1.1.2 Samla naveländarna i oanvända avfallsbehållare som kan tillslutas och/eller förseglas (om behållare återanvänds bör de rengöras noggrant och desinficeras med klorföreningar). Naveländarna bör helst behandlas omedelbart. Om detta inte är möjligt bör de förvaras i behållaren, utan tillsats av buffert, nedkylda under högst 72 timmar eller i rumstemperatur under högst 24 timmar. Behandla naveländarna enligt något av följande förfaranden: a) Täck naveländarna genom att tillsätta en tillräcklig mängd (ungefär 40 ml.) extraktionsbuffert (tillägg 4) och skaka på en rotationsskak (50–100 r/min) under 4 timmar vid en temperatur lägre än 24 °C eller under 16–24 timmar nedkylt. b) Homogenisera naveländarna i en tillräcklig mängd (ungefär 40 ml) extraktionsbuffert (tillägg 4), antingen i en mixer (t.ex. Waring mixer eller Ultra Thurrax) eller genom att krossa dem i en förseglad engångspåse för finfördelning (t.ex. Stomacherpåse eller stark polyten från Bioreba, 150 × 250 mm, steriliserad genom strålning) med en gummihammare eller lämplig malapparat (t.ex. Homex). Anmärkning: Risken för korskontaminering av proverna är hög när de homogeniseras med en mixer. Vidta försiktighetsåtgärder för att undvika att det alstras aerosoler eller uppkommer spill under extraheringen. Se till att nyligen steriliserade mixerblad och behållare används för varje prov. Om PCR-test skall användas, undvik överföring av DNA till behållare eller malapparat. Krossning i engångspåsar och användning av engångsrör rekommenderas vid PCR-test.

1.1.3 Dekantera supernatanten. Om den är mycket grumlig, separera genom långsam centrifugering (högst 180 g under 10 minuter. vid en temperatur av 4–10 °C) eller genom vakuumfiltrering (40–100 µm), varvid filtret tvättas med ytterligare (ca 10 ml) extraktionsbuffert.

1.1.4 Koncentrera bakteriedelen genom centrifugering vid 7 000 g under 15 minuter (eller 10 000 g under 10 minuter) vid en temperatur av 4-10 °C och kasta bort supernatanten utan att störa pelleten.

1.1.5 Återsuspendera pelleten i 1,5 ml pelletbuffert (tillägg 4). Använd 500 µl för att testa för R. solanacearum, 500 µl för Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus och 500 µl i referenssyfte. Tillsätt steril glycerol till en slutkoncentration av 10–25 % (v/v) till 500 µl av referensportionen och till den återstående testportionen. Skaka och förvara vid 16 till 24 °C (veckor) eller vid 68 till 86 °C (månader). Förvara testportionerna vid 4–10 °C under testningen. Upprepade nedfrysningar och upptiningar är inte tillrådliga. Om transport av extraktet krävs, se till att leveransen sker i en kall behållare inom 24 timmar.

1.1.6 Det är absolut nödvändigt att alla positiva kontroller och prover av R. solanacearum hanteras skilda från varandra för att nedsmittning skall undvikas. Detta gäller även för IF-glas och samtliga test.

1.2 Testning

Se flödesdiagram och beskrivningar av testerna och de optimerade protokollen i de berörda bilagorna enligt följande:

Selektiv isolering (se avsnitt VI.A.4).

IF-test (se avsnitt VI.A.5).

PCR-test (se avsnitt VI.A.6).

FISH-test (se avsnitt VI.A.7).

ELISA-test (se avsnitt VI.A.8).

Biotest (se avsnitt VI.A.9).

2. Detaljerade metoder för att upptäcka och identifiera Ralstonia solanacearum i prover av asymtomatiska potatisplantor, tomatplantor eller andra värdväxter

2.1 Preparering av prover

Anmärkning: För upptäckt av latenta populationer R. solanacearum rekommenderas testning av blandprover. Förfarandet kan även lätt användas för blandprover bestående av upp till 200 stjälkdelar. Om undersökningar görs bör dessa grundas på ett statistiskt representativt prov av den plantpopulation som undersöks.

2.1.1 Samla 1–2 cm långa stjälksegment i en tillsluten steril behållare enligt följande provtagningsförfaranden: Tomatplantor från plantskolor: Med en ren, desinficerad kniv eller sekatör avlägsnas ett 1 cm långt segment av basen på varje stjälk strax ovanför markytan. Tomatplantor odlade på fält eller i växthus: Med en ren, desinficerad kniv avlägsnas det lägsta sidoskottet från varje planta genom att detta skärs av strax ovanför leden till huvudstjälken. Avlägsna ett 1 cm långt segment från den nedersta delen från varje sidoskott. Andra värdväxter: Med en ren, desinficerad kniv eller sekatör avlägsnas ett 1 cm långt segment av basen på varje stjälk strax ovanför markytan. Från S. dulcamara eller andra värdväxter som växer i vatten avlägsnas 1–2 centimeter långa delar från undervattensstjälken eller revor (stolon) med vattenrötter. Vid provtagning på en särskild plats rekommenderas ett statistiskt representativt prov av minst 10 plantor per provtagningsplats av varje ogräs som är potentiell värdväxt. Upptäckt av patogen är mest tillförlitligt under den sena vårsäsongen, samt sommar- och höstsäsongerna, även om naturliga infektioner kan upptäckas året runt hos den fleråriga Solanum dulcamara som växer i vattendrag. Kända värdväxter omfattar övervintrande potatisplantor (efterliggare), Solanum dulcamara, S. nigrum, Datura stramonium och andra arter i familjen Solanaceae. Andra värdar är Pelargonium spp. och Portulaca oleracea. Vissa europeiska ogräsarter som potentiellt kan vara infekterade med biovar 2/Ras 3-populationer av R. solanacearum i rötterna och/eller rhizosfärer under särskilda miljöförhållanden omfattar Atriplex hastata, Bidens pilosa, Cerastium glomeratum, Chenopodium album, Eupatorium cannabinum, Galinsoga parviflora, Ranunculus scleratus, Rorippa spp, Rumex spp., Silene alba, S. nutans., Tussilago farfarra och Urtica dioica. Anmärkning: Okulär besiktning för att påvisa inre symtom (färgning av vävnad eller bakteriellt sekret) kan göras på detta stadium. Lägg undan alla stjälksegment med symtom och testa dem separat (se avsnitt II).

2.1.2 Desinficera stjälksegmentet hastigt i 70-procentig etanol och torka omedelbart med mjukpapper. Behandla därefter stjälksegmenten enligt någon av följande metoder: a) Täck segmenten genom att tillsätta en tillräcklig mängd (ungefär 40 ml) extraktionsbuffert (tillägg 4) och skaka på en rotationsskak (50–100 r/min) under 4 timmar vid en temperatur under 24 °C eller under 16-24 timmar nedkylda. b) Behandla omedelbart segmenten genom att krossa dem i en kraftig påse för finfördelning (t.ex. Stomacherpåse eller Bioreba) i en lämplig mängd extraktionsbuffert (tillägg 4) med en gummihammare eller lämplig malapparat (t.ex. Homex). Om detta inte är möjligt, förvara stjälksegmenten under högst 72 timmar nedkylda eller under högst 24 timmar i rumstemperatur.

2.1.3 Dekantera supernatanten efter det att blandningen fått stå och sjunka under 15 minuter.

2.1.4 Ytterligare klarnande av extraheringen eller koncentrationen av bakteriedelen krävs vanligtvis inte men kan åstadkommas genom filtrering och/eller centrifugering enligt avsnitten III.1.1.3 till III.1.1.5.

2.1.5 Dela det outspädda eller koncentrerade provextraktet i två lika stora delar. Bibehåll ena hälften vid en temperatur av 4–10 °C under testet och lagra den andra hälften med 10- till 25-procentig (v/v) steril glycerol vid en temperatur av 16 till 24 °C (veckor) eller 68 till 86 °C (månader) för det fallet att ytterligare tester krävs.

2.2 Testning

Se flödesdiagram och beskrivningar av testerna och de optimerade protokollen i de berörda bilagorna enligt följande:

Selektiv isolering (se avsnitt VI.A.4).

IF-test (se avsnitt VI.A.5).

PCR-test (se avsnitt VI.A.6).

FISH-test (se avsnitt VI.A.7).

ELISA-test (se avsnitt VI.A.8).

Biotest (se avsnitt VI.A.9).

AVSNITT IV

1. Program för att upptäcka och identifiera Ralstonia solanacearum i vatten

2. Metoder för att upptäcka och identifiera Ralstonia solanacearum i vatten

Princip

Det validerade programmet för upptäckt som beskrivs i det här avsnittet är tillämpligt på upptäckt av patogen i prover av ytvatten och kan även tillämpas på testning av prover från process- eller avloppsvatten från verksamhet där potatis förädlas. Det är emellertid viktigt att påpeka att den förväntade detektionskänsligheten varierar beroende på substratet. Känsligheten hos isoleringstestet påverkas av populationerna av konkurrerande saprofytiska bakterier, som vanligtvis är mycket större i process- och avloppsvatten från verksamhet där potatis förädlas än i ytvatten. Programmet nedan är avsett att upptäcka ända ned till 103 celler per liter i ytvatten, men detektionskänsligheten vid process- eller avloppsvatten från anläggningar där potatis förädlas är troligen avsevärt lägre. Därför rekommenderas att testning av process- och avloppsvatten sker efter övrig rening (t.ex. sedimentering eller filtrering), då populationerna av saprofytiska bakterier minskar. Testprogrammets begränsningar i fråga om känslighet bör tas med i beräkningen vid bedömningen av tillförlitligheten hos alla eventuella negativa resultat. Det här programmet har med framgång använts i undersökningar för att påvisa närvaro eller frånvaro av patogenet i ytvatten, men dess begränsningar bör beaktas vid användning i liknande undersökningar av process- eller avloppsvatten från verksamhet där potatis förädlas.

2.1 Preparering av prover

Anmärkning:

— Upptäckt av of R. solanacearum i ytvatten är mest tillförlitlig under den sena vårsäsongen, samt sommar- och höstsäsongerna, när vattentemperaturerna överstiger 15 °C.

— Upprepade provtagningar vid olika tidpunkter under ovannämnda period och på bestämda provtagningsplatser ökar tillförlitligheten hos upptäckten genom att reducera inverkan av klimatvariationen.

— Beakta inverkan av kraftiga regnfall och vattendragens geografiska läge för att undvika alltför stora utspädningseffekter, som kan dölja närvaron av patogenet.

— Ta ytvattenproverna i närheten av värdväxterna om dessa förekommer.

2.1.1 På utvalda provtagningsplatser, samla vattenprover genom att fylla sterila engångsrör eller engångsflaskor om möjligt på ett djup av 30 cm och inom 2 m från strandkanten. Vid process- och avloppsvatten från verksamheter där potatis förädlas, samla in prover från den punkt där vätskorna släpps ut. Provstorlekar på upp till 500 ml per provtagningsplats rekommenderas. Om mindre prover föredras rekommenderas att proverna tas vid minst tre olika tillfällen per provtagningsplats och att varje prov består av två lika stora delprover av minst 30 ml. Vid intensiva undersökningar, välj minst tre provtagningsplatser per 3 km vattendrag och säkerställ att prover även tas på vattendragets tillflöden.

2.1.2 Transportera proverna svalt och mörkt (4–10 °C) och testa dem inom 24 timmar.

2.1.3 Bakteriedelen kan vid behov koncentreras genom en av följande metoder: a) Centrifugera 30–50 ml delprover vid 10 000 g under 10 minuter (eller 7 000 g under 15 minuter), helst vid 4–10 °C. Kasta bort supernatanten och återsuspendera pelleten i 1 ml pelletbuffert (tillägg 4). b) Membranfiltrering (lägsta porstorlek 0,45 µm) och därefter tvättning av filtret i 5–10 ml pelletbuffert och förvaring av tvättvätskan. Denna metod är lämplig vid större volymer vatten som innehåller små mängder av saprofyter. Koncentrering rekommenderas vanligtvis inte för prover av process- eller avloppsvatten från verksamhet där potatis förädlas, eftersom populationer av konkurrerande saprofytiska bakterier inhiberar upptäckten av R. solanacearum.

2.2 Testning

Se flödesdiagram och beskrivningar av testerna i de berörda bilagorna.

AVSNITT V

1. Program för att upptäcka och identifiera R. solanacearum i jord

2. Metoder för att upptäcka och identifiera R. solanacearum i jord

Principer

Det validerade program för upptäckt som beskrivs i detta avsnitt är tillämpligt på upptäckt av patogen i jordprover men kan även användas för testning av prover av fast avfall och avloppsslam från bearbetningen av potatis. Det bör emellertid noteras att dessa metoder inte är tillräckligt känsliga för att garantera upptäckt av små och/eller oregelbundet dispergerade populationer av R. solanacearum som kan förekomma i naturligt angripna prover av dessa substrat.

Detta testprograms begränsningar i fråga om känslighet bör beaktas vid bedömningen av tillförlitligheten hos alla eventuella negativa resultat och när det används i undersökningar för att påvisa närvaro eller frånvaro av patogenet i jord eller slam. Det mest tillförlitliga testet för att påvisa närvaro av patogenet i åkerjord är att plantera en mottaglig värdväxt och kontrollera om denna infekteras, men även med denna metod undgår små mängder av nedsmittning upptäckt.

2.1 Preparering av prover

2.1.1 Provtagningen av jordmån bör följa standardprinciperna för provtagning av nematoder. Samla in 0,5–1 kg jord per prov från 60 platser per 0,3 ha på ett djup av 10–20 cm (eller i ett rutnät av 7 x 7 m). Om förekomst av patogenet misstänks, öka mängden provtagningsplatser till 120 per 0,3 ha. Förvara proven vid 12–15 °C före testning. Ta prover på avfall och avloppsslam från bearbetning av potatis genom insamling av totalt 1 kg från platser som är representativa för den totala volym slam som skall testas. Blanda varje prov väl före testning.

2.1.2 Dispergera delprover av 10–25 g jord eller slam genom att skaka på en rotationsskak (250 rpm) i 60–150 ml extraktionsbuffert (tillägg 4) under upp till två timmar. Finfördelningen kan, om detta krävs, underlättas genom tillsats av 0,02 % steril Tween 20 och 10–20 g steriliserat grus.

2.1.3 Förvara suspensionen vid 4 °C under testningen.

2.2 Testning

Se flödesdiagram och beskrivningar av testerna i de berörda bilagorna.

AVSNITT VI

OPTIMERADE PROTOKOLL FÖR ATT UPPTÄCKA OCH IDENTIFIERA R. SOLANACEARUM

A. TEST FÖR DIAGNOS OCH UPPTÄCKT

1. Kärlströmningstest

Närvaro av R. solanacearum i stjälkar på vissnande potatis, tomat eller andra värdväxter kan påvisas genom följande enkla presumtiva test: Skär av stjälken strax ovan markytan. Suspendera den skurna ytan i ett rör med rent vatten. Sök efter karakteristiska spontana strömningar av trådar av bakterieslem som utsöndras från de avskurna kärlknippena efter några minuter.

2. Upptäckt av poly-β-hydroxibutyratkorn

1. Preparera ett utstryk av bakteriellt sekret från infekterad vävnad eller en 48-timmars kultur på YPGA- eller SPA-medium (tillägg 1) på ett objektglas.

2. Bered som kontroll positiva utstryk av en biovar 2-stam av R. solanacearum och om det anses lämpligt ett negativt kontrollutstryk från en känd PHB-negativ art.

3. Låt torka och för snabbt undersidan av glaset över lågan för att fixera utstryken.

4. Preparera färgning med antingen Nilblått A eller Sudansvart B och observera i mikroskop enligt beskrivningen nedan:

Nilblåttest:

a) Dränk in varje objektglas med 1 % vattenlösning av nilblått och inkubera under 10 minuter vid 55 °C.

b) Dränera av färglösningen. Tvätta snabbt i långsamt rinnande kranvatten. Avlägsna överskottsvatten med läskpapper.

c) Dränk in utstryket med 8 % lösning av ättiksyra i vatten, och inkubera i 1 minut vid rumstemperatur.

d) Tvätta snabbt i långsamt rinnande kranvatten. Avlägsna överskottsvatten med läskpapper.

e) Återfukta med en droppe vatten och lägg på ett täckglas.

f) Undersök det färgade utstryket i epifluorescensmikroskop vid 450 nm under oljeimmersion vid 600–1 000 gångers förstoring med ett olje- eller vattenimmersionsobjektiv.

g) Leta efter ljusorange fluorescens av PHB-korn. Undersök också provet i genomfallande vanligt ljus för att säkerställa att kornen är intracellulära och att cellmorfologin är typisk för R. solanacearum.

Sudansvarttest:

a) Dränk in varje objektglas med 0,3 % Sudansvart B-lösning i 70 % etanol och inkubera i 10 minuter vid rumstemperatur.

b) Dränera av färglösningen och tvätta snabbt i kranvatten, varvid överskottsvatten avlägsnas med läskpapper.

c) Doppa glasen hastigt i xylol och torka med mjukpapper. Varning: Xylol är skadligt. Vidta nödvändiga säkerhetsåtgärder och arbeta i ett dragskåp.

d) Dränk in glasen med 0,5 % (w/v) safranin i vatten och lämna i 10 sekunder vid rumstemperatur. Varning: Xylol är skadligt. Vidta nödvändiga säkerhetsåtgärder och arbeta i ett dragskåp.

e) Tvätta försiktigt i rinnande kranvatten, torka med mjukpapper och lägg på ett täckglas.

f) Undersök de färgade utstryken i ljusmikroskop (genomfallande ljus) under oljeimmersion vid 1 000 gångers förstoring med ett oljeimmersionsobjektiv.

g) Sök efter blåsvart färgning av PHB-korn i celler av R. solanacearum rosafärgade cellväggar.

3. Serumagglutinationstest

Agglutinering av R. solanacearum-celler i bakteriellt sekret eller symtomatisk vävnad observeras bäst genom användning av validerade antikroppar (se tillägg 3) försedda med lämpliga färgmärkningar, såsom röda Staphylococcus aureus-celler eller färgade latexpartiklar. Om en sats används som är tillgänglig i handeln (se tillägg 3), skall tillverkarens instruktioner följas. Om inte, skall följande förfarande tillämpas:

a) Blanda droppar av suspension av märkt antikropp och bakteriellt sekret (ungefär 5 µl var) på fönstren på multispot-objektglas.

b) Preparera positiva och negativa kontroller, varvid suspensioner av R. solanacearum biovar 2 och en heterolog stam används.

c) Sök efter agglutination i positiva prover efter försiktig blandning under 15 sekunder.

4. Selektiv isolering

4.1 Odling på selektivt medium

Anmärkning: Innan denna metod används för första gången, gör preliminära tester för att möjliggöra reproducerbar upptäckt av 103–104 koloniformande enheter av R. solanacearum per ml som tillsätts till provextrakt som tidigare testats och gett negativt svar.

Använd ett lämpligt validerat selektivt medium, såsom SMSA (modifierat av Elphinstone et al., 1996. Se tillägg 2).

R. solanacearum måste noga skiljas från andra bakterier som kan utveckla kolonier på mediet. Kolonier av R. solanacearum kan även uppvisa atypisk morfologi om plattorna är överfulla eller om antagonistiska bakterier även är närvarande. Om inverkan av konkurrens eller antagonism misstänks, bör provet testas igen, varvid ett annat test används.

Denna metod har högsta känslighetsnivå när nyligen preparerade provextrakt testas. Metoden är emellertid även tillämplig på extrakt som har lagrats i glycerol vid 68 till 86 °C.

Som positiva kontroller preparera decimala utspädningar från en suspension av 106 kolonibildande enheter per ml av R. solanacearum (t.ex. NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857). För att undvika risk för smitta, preparera positiva kontroller som är fullständigt åtskilda från de prover som skall testas.

För varje nyligen preparerat parti av selektivt medium bör dess lämplighet för tillväxt av patogenet testas innan det används för att testa rutinprover.

Testa kontrollmaterialen exakt som provet (proven).

4.1.1 Gör en lämplig plattspridning från spädningsserie för att se till att alla saprofytiska kolonibildande bakgrundspopulationer späds ut. Utsprid 50–100 µl per platta av provextrakt och för varje utspädning.

4.1.2 Inkubera plattorna vid 28 °C. Avläs plattorna efter 48 timmar och därefter dagligen under högst sex dagar. Typiska kolonier av R. solanacearum på SMSA-medium är mjölkvita, platta, oregelbundna, flödiga kolonier och utvecklar efter tre dagars inkubation rosa till blodröda centra med inre strimmor eller virvlar (se webbplats http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Anmärkning: Atypiska kolonier av R. solanacearum bildas ibland på detta medium. De kan vara små, runda, helt rödfärgade och icke-flödiga eller partiellt flödiga och därför svåra att urskilja från saprofytiska kolonibildande bakterier.

4.1.3 Rena presumtiva kolonier av R. solanacearum efter utstryk eller plattspridning från spädningsserie på ett vanligt näringsmedium för att erhålla isolerade kolonier (se tillägg 2).

4.1.4 Lagra kolonierna under lång tid i sterilt vatten (pH 6–8, klorfritt) i rumstemperatur i mörker, eller under kort tid i lämpligt frysskyddmedel i 68 till 86 °C eller frystorkat.

4.1.5 Identifiera presumtiva kulturer (se avsnitt VI. B) och gör ett patogenitetstest (se avsnitt VI. C).

Odlingen på selektivt medium är negativ om inga bakteriekolonier observeras efter sex dagar eller om inga förmodade kolonier typiska för R. solanacearum påvisas, förutsatt att ingen inhibition misstänks på grund av konkurrens eller antagonism från andra bakterier och att typiska kolonier av R. solanacearum påvisas i de positiva kontrollerna. Odlingen på selektivt medium är positiv om presumtiva kolonier av R. solanacearum isoleras.

4.2 Anrikningsförfarande

Använd ett validerat anrikningsmedium, såsom modifierad Wilbrink-buljong (se tillägg 2).

Detta förfarande kan användas för att selektivt öka populationerna av R. solanacearum i provextrakten och för att öka känsligheten för upptäckt. Förfarandet späder dessutom effektivt ut inhibitorer av PCR-reaktion (1:100). Det bör emellertid noteras att anrikning av R. solanacearum kan misslyckas på grund av konkurrens eller antagonism från saprofytiska organismer, som ofta anrikas samtidigt. Därför kan isolering av R. solanacearum från anrikningsbuljonger vara svårt. Eftersom populationerna av serologiskt besläktade saprofyter kan förökas, rekommenderas dessutom att specifika monoklonala antikroppar används i stället för polyklonala antikroppar om ELISA-test används.

4.2.1 Vid anriknings-PCR tillsätt 100 µl provextrakt till 10 ml anrikningsbuljong (tillägg 2) som dessförinnan portionerats i DNA-fria rör eller flaskor. Vid anriknings-ELISA kan en proportionellt större andel provextrakt i förhållande till buljong användas (t.ex. 100 µl i 1,0 ml anrikningsbuljong).

4.2.2 Inkubera under 72 timmar vid 27–30 °C med eller utan skak med locket löst påsatt för luftning.

4.2.3 Blanda väl före användning i ELISA- eller PCR-test.

4.2.4 Behandla anrikningsbuljongen på exakt samma sätt som provet (proverna) i ovannämnda test. Anmärkning: Om anrikningen av R. solanacearum förväntas inhiberas på grund av stora populationer av vissa konkurrerande saprofytiska bakterier, kan anrikning av provextrakten före centrifugering eller andra koncentrationssteg ge bättre resultat.

5. IF-test

Princip

Det rekommenderas att IF-test används som huvudsakligt screeningtest på grund av dess dokumenterade förmåga att uppnå de föreskrivna tröskelvärdena.

Om IF-testet används som huvudsakligt screeningtest och resultatet är positivt, skall ett andra screeningtest med isolerings-, PCR- eller FISH-test göras. Om IF-testet används som ett andra screeningtest och resultatet är positivt, krävs ytterligare testning enligt flödesschemat för att analysen skall bli fullständig.

Anmärkning: Använd antikroppar mot R. solanacearum med validerat ursprung (se webbplats: http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Det rekommenderas att titer bestäms för varje nytt parti antikroppar. Titern definieras som den högsta utspädning vid vilken en optimal reaktion sker när en suspension av 105–106 celler per ml av den homologa stammen av R. solanacearum testas och när en lämplig fluoresceinisothiocyanat (FITC) konjugat i överensstämmelse med tillverkarens rekommendationer används. Validerade polyklonala antiserum bör ha en IF-titer av minst 1:2 000. Vid testningen bör antikropparna användas vid en arbetsutspädning (arbetsutspädningar) nära eller vid titern.

Testet bör göras på nypreparerade provextrakt. Vid behov kan det göras på extrakt som lagrats i glycerol vid en temperatur på 68 till 86 °C. Glycerolen kan avlägsnas från provet genom tillsats av 1 ml pelletbuffert (tillägg 4), omcentrifugering under 15 minuter vid 7 000 g och återsuspension i en lika stor volym av pelletbuffert. Detta krävs vanligtvis inte, särskilt inte om glasproverna har fixerats på glasen med flambering.

Bered separata positiva kontrollglas av den homologa stammen eller någon annan referensstam av R. solanacearum, som suspenderats i potatisextrakt, alternativt i en buffert, såsom anges i tillägg 3 B.

Naturligt infekterad vävnad (som har bevarats genom frystorkning eller nedfrysning vid en temperatur av 16 till 24 °C) bör om möjligt användas som en liknande kontroll på samma glas.

Som negativa kontroller kan användas portioner av provextrakt som tidigare givit negativt svar beträffande R. solanacearum när de testats.

Standardiserade positiva och negativa kontrollmaterial som kan användas i detta test förtecknas i tillägg 3.

Använd multispot-objektglas med helst 10 fönster av minst 6 mm diameter.

Testa kontrollmaterialen exakt som provet (proven).

5.1 Preparera testglas enligt någon av följande metoder

i) För pelletar med relativt litet stärkelsesediment: Pipettera på det första glaset en uppmätt standardvolym (15 µl är lämpligt för 6 mm fönsterdiameter – öka volymen för större fönster) av en 1/100-utspädning av den återsuspenderade potatispelleten. Pipettera en motsvarande volym av koncentrerad pellet (1/1) på de återstående fönstren på raden. Den andra raden kan användas som duplikat eller för ett andra prov enligt figur 1.

ii) För andra pelletar: Preparera decimala utspädningar (1/10, 1/100) av den återsuspenderade pelleten i pelletbuffert. Pipettera en uppmätt standardvolym (15 µl är lämpligt för 6 mm fönsterdiameter – öka volymen för större fönster) av den återsuspenderade pelleten och varje utspädning på en fönsterrad. Den andra raden kan användas som duplikat eller för ett andra prov enligt figur 2.

5.2 Torka dropparna i omgivande temperatur eller genom uppvärmning till en temperatur av 40–45 °C. Fixera bakteriecellerna på glaset antingen genom upphettning (15 minuter vid 60 °C), flambering med 95-procentig etanol eller enligt särskilda instruktioner från leverantören av antikropparna. Vid behov får fixerade glas lagras frysta i en torkad låda under så kort tid som möjligt (maximalt 3 månader) innan vidare testning sker.

5.3 IF-förfarande i) Enligt testglaspreparering i 5,1 (i): Preparera en serie dubbla utspädningar. Den första brunnen bör ha 1/2 av titern (T/2), de övriga 1/4 av titern (T/4), 1/2 av titern (T/2), titern (T) och två gånger titern (2T). ii) Enligt testglaspreparering i 5,1 ii: Preparera arbetsutspädningen av antikropp i IF-buffert. Arbetsutspädningen påverkar specificiteten.



Figur 1. Preparering av testglaset enligt 5.1 i och 5.3 i. Utspädningar av återsuspenderade pelletar 1/100 1/1 1/1 1/1 1/1  Utspädning av återsuspenderad pellet (T = titer) T/2 T/4 T/2 T 2T  Dubbla utspädningar av antiserum/antikropp Prov 1 1 2 3 4 5 Duplikat av prov 1 eller prov 2 6 7 8 9 10



Figur 2. Preparering av testglaset enligt 5,1 ii och 5,3 ii. Arbetsutspädning av antiserum/antikropp 1/1 1/10 1/100 tom tom  Decimal utspädning av återsuspenderad pellet Prov 1 1 2 3 4 5 Duplikat av prov 1 eller prov 2 6 7 8 9 10 5.3.1 Ordna glasen på fuktigt mjukpapper. Täck varje testfönster fullständigt med antikropputspädning(ar). Den volym antikroppar som tillsätts varje fönster skall vara minst lika stor som volymen tillsatt extrakt. Följande förfarande bör följas om det saknas särskilda instruktioner från leverantören av antikropparna: 5.3.2 Inkubera glasen på fuktigt papper övertäckta under 30 minuter vid omgivande temperatur (18–25 °C). 5.3.3 Skaka av dropparna från glaset och skölj glasen noga med IF-buffert. Tvätta genom att under 5 minuter sänka ned i IF-buffert-Tween (tillägg 4) och därefter i IF-buffert. Undvik uppkomst av aerosoler eller överföring av droppar som kan orsaka korskontaminering. Avlägsna noga överskottsfukt genom att försiktigt torka med läskpapper. 5.3.4 Ordna glasen på fuktigt mjukpapper. Täck testfönstren med den utspädning av FITC-konjugat som används för att bestämma titern. Den volym konjugat som tillsätts fönstren skall vara lika med volymen tillsatt antikropp. 5.3.5 Inkubera glasen på fuktigt papper övertäckta under 30 minuter vid omgivande temperatur (18–25 °C). 5.3.6 Skaka av konjugatdropparna från glaset. Skölj och tvätta som ovan (5.3.3). Avlägsna noga överskottsfukt. 5.3.7 Pipettera 5–10 µl 0,1 M fosfatbuffrad glycerol (tillägg 4) eller en monteringslösning som motverkar blekning som finns tillgänglig i handeln på varje fönster och lägg på ett täckglas.

5.4 Avläsning av IF-testet 5.4.1 Undersök testglasen i ett epifluorescensmikroskop med filter lämpliga för FITC under olje- eller vattenimmersion vid 500–1 000 gångers förstoring. Scanna fönstren utefter två diametrar i rät vinkel och runt perimetern. På de prover som inte uppvisar några celler eller endast ett litet antal celler, observera minst 40 mikroskopfält. Kontrollera glaset med positiv kontroll först. Cellerna skall vara klart fluorescerande och helt färgade vid den fastställda antikroppstitern eller arbetsutspädningen. IF-testet (avsnitt VI.A.5.) skall återupprepas om färgningen är avvikande. 5.4.2 Sök efter ljusa fluorescerande celler med morfologi som är karakteristisk för R. solanacearum i testfönstren på testglasen (se webbplats: http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Fluorescensintensiteten måste motsvara det positiva kontrollisolatets vid samma antikropputspädning. Celler med ojämn eller ofullständig färgning eller med svag fluorescens beaktas inte. Om smitta misstänks skall testet upprepas. Detta kan vara fallet om alla glas i ett parti uppvisar positiva celler på grund av nedsmittning av en buffert eller om positiva celler påträffas (utanför glasets fönster) på objektglasöverdraget. 5.4.3 Immunofluorescenstestets specificitet ger upphov till ett flertal problem. Bestånd av fluorescerande celler med atypisk morfologi och korsreagerande saprofytiska bakterier som har en liknande storlek och morfologi som R. solanacearum kan förekomma hos potatisar i naveländarna och i pelletar av stjälksegmentet. 5.4.4 Endast fluorescerande celler med typisk storlek och morfologi vid titern eller vid arbetsutspädningen av antikropparna skall beaktas, såsom i 5,3. 5.4.5 Tolkning av IF-testet: i) För varje prov med ljusa fluorescerande celler med karakteristisk morfologi, bestäm medeltalet typiska celler per mikroskopfält och beräkna antal typiska celler per ml återsuspenderad pellet (tillägg 5). IF-testet är positivt om proven innehåller minst 5 × 103 typiska celler per ml återsuspenderad pellet. Provet betraktas som potentiellt smittat, och ytterligare tester krävs. ii) IF-testet är negativt om proven innehåller färre än 5 × 103 celler per ml återsuspenderad pellet och provet betraktas som negativt. Inga ytterligare tester krävs.

6. PCR-test

Principer

Om ett PCR-test används som huvudsakligt screeningtest och resultatet är positivt, skall ett andra screeningtest i form av ett isoleringstest eller IF-test göras. Om PCR används som andra screeningtest och resultatet är positivt, krävs ytterligare testning enligt flödesschemat för att diagnosen skall bli fullständig.

Fullt utnyttjande av denna metod som huvudsakligt screeningtest rekommenderas endast när särskild fackkompetens har uppnåtts.

Anmärkning: Preliminär testning med denna metod bör möjliggöra reproducerbar upptäckt av 103–104 celler av R. solanacearum per ml som tillsätts till provextrakt som tidigare testats och gett negativt svar. Optimeringsexperiment kan krävas för att uppnå maximal sensitivitets- och specificitetsnivå i alla laboratorier.

Använd validerade PCR-reagens och PCR-protokoll (se avsnitt 6) Välj helst en metod med internkontroll.

Vidta lämpliga åtgärder för att undvika nedsmittning av prover med mål-DNA. PCR-testerna bör utföras av erfarna tekniker i specialiserade molekylärbiologiska laboratorier för att minimera risken för nedsmittning av mål-DNA.

Negativa kontroller (för DNA-extraktions- och PCR-förfaranden) bör alltid behandlas som slutligt prov i förfarandet för att tydligt kunna visa om överföring till mål-DNA har inträffat eller ej.

Följande negativa kontroller bör ingå i PCR-testet:

— Provextrakt som tidigare gett negativt svar när det testats med avseende på R. solanacearum.

— Buffertkontroller som används för extrahering av bakterien och DNA från provet.

— PCR-reaktionsblandning.

Följande positiva kontroller bör tas med:

— Portioner av återsuspenderad pellet till vilka R. solanacearum har tillsatts (information om preparering finns i tillägg 3 B).

— En suspension av 106 celler per ml av R. solanacearum i vatten från ett virulent isolat (t.ex. NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857; se tillägg 3 B).

— Om möjligt använd dessutom DNA från positiva kontrollprover från PCR-tester.

För att undvika risk för nedsmittning, preparera positiva kontroller i en separat omgivning från de prover som skall testas.

Provextrakten bör vara så fria från jord som möjligt. Om PCR-protokoll skall användas kan det därför i vissa fall vara tillrådligt att preparera extraheringar från tvättade potatisar.

Standardiserade positiva och negativa kontrollmaterial som kan användas i detta test förtecknas i tillägg 3.

6.1 Metoder för rening av DNA

Använd positiva och negativa kontrollprover såsom beskrivs ovan (se tillägg 3).

Testa kontrollmaterialen exakt som provet (proven).

Det finns en rad olika metoder för att rena mål-DNA från komplexa provsubstrat och på så sätt avlägsna inhibitorer av PCR och andra enzymreaktioner och koncentrera mål-DNA i provextraktet. Följande metod har optimerats för att användas tillsammans med den validerade PCR-metod som visas i tillägg 6.

a) Metod enligt Pastrik (2000)

1) Pipettera 220 µl av lyseringsbuffert (100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl [pH 8,0], 1 mM EDTA [pH 8,0]) i ett 1,5 ml Eppendorf-rör.

2) Tillsätt 100 µl provextrakt och placera i värmeblock eller vattenbad vid 95 °C under 10 minuter.

3) Ställ röret på kylning under 5 minuter.

4) Tillsätt 80 µl Lysozym stocklösning (50 mg lysozym per ml i 10 mM Tris HCl, pH 8,0) och inkubera vid 37 °C under 30 minuter.

5) Tillsätt 220 µl Easy DNA® lösning A (Invitrogen), blanda väl genom skakning och inkubera vid 65 °C under 30 minuter.

6) Tillsätt 100 µl Easy DNA® lösning B (Invitrogen), skaka kraftigt till fällningen svävar fritt i röret och provet är jämnt trögflytande.

7) Tillsätt 500 µl chloroform och skaka till viskositeten ökar och blandningen är homogen.

8) Centrifugera vid 15 000 g under 20 minuter vid 4 °C för att separera faserna och bilda interfasen.

9) För över den övre fasen till ett rent Eppendorf-rör.

10) Tillsätt 1 ml 100-procentig etanol (20 °C), skaka snabbt och inkubera under nedkylning under 10 minuter.

11) Centrifugera vid 15 000 g under 20 minuter vid 4 °C och avlägsna etanolen från pelleten.

12) Tillsätt 500 µl 80-procentig etanol (20 °C) och blanda genom att vända upp och ned på röret.

13) Centrifugera vid 15 000 g under 10 minuter vid 4 °C, spara pelleten och avlägsna etanolen.

14) Låt pelleten lufttorka eller torka i DNA speed vac.

15) Återsuspendera pelleten i 100 µl sterilt ultrarent vatten och låt stå i rumstemperatur under minst 20 minuter.

16) Lagra vid 20 °C fram till användning för PCR.

17) Blanda ned alla eventuella vita fällningar genom centrifugering och använd 5 µl av supernatanten innehållande DNA till PCR.

b) Andra metoder

Andra metoder för extraktion av DNA, t.ex. Qiagen DNeasy Plant Kit, skulle kunna användas, förutsatt att det är belagt att de har lika stor inverkan när det gäller att rena DNA från kontrollprover innehållande 103–104 patogena celler per ml.

6.2 PCR

6.2.1 Preparera test- och kontrollmallar för PCR enligt de validerade protokollen (avsnitt VI.A.6.). Preparera en decimal utspädning av DNA-provextrakt (1:10 i ultrarent vatten).

6.2.2 Preparera lämplig PCR-reaktionsblandning i en omgivning fri från smitta enligt de offentliggjorda protokollen (tillägg 6). Användning av multiplexa PCR-protokoll som även omfattar en intern PCR-kontroll rekommenderas där så är möjligt.

6.2.3 Tillsätt 2–5 µl DNA-extrakt per 25 µl PCR-reaktion i sterila PCR-rör enligt PCR-protokollen (se tillägg 6).

6.2.4 Blanda i ett negativt kontrollprov innehållande PCR-reaktionsblandning och tillsätt ultrarent vatten av samma ursprung som det som användes i PCR-blandningen i stället för provet.

6.2.5 Placera rören i samma termocykelapparat som användes vid föregående testning och kör lämpligt optimerat PCR-program (tillägg 6).

6.3 Analys av PCR-produkten

6.3.1 Lös PCR-kopior med agarosgelelektrofores. Använd minst 12 µl av amplifierad DNA-reaktionsblandning från varje prov blandat med 3 µl laddningsbuffert (tillägg 6) i 2,0 % (w/v) agarosgel i tris-acetat-EDTA (TAE) buffert (tillägg 6) vid 5–8 V per cm. Använd en lämplig DNA-markör, t.ex. 100 bp storleksmarkör.

6.3.2 Påvisa DNA-band genom att färga i ethidiumbromid (0,5 mg/l) under 30–60 minuter, varvid lämpliga försiktighetsåtgärder bör vidtas vid hanteringen av denna mutagen.

6.3.3 Observera det färgade gelet i kortvågs-UV-genomlysning (λ = 302 nm) och sök efter amplifierade PCR-produkter av förväntad storlek (tillägg 6) och dokumentera.

6.3.4 För varje ny upptäckt/nytt fall verifiera autenticiteten hos PCR-kopian genom att utföra restriktionsenzymanalys på ett prov av det återstående amplifierade DNA genom inkubation vid optimal temperatur och under optimal tid med en lämplig enzym och buffert (se tillägg 6). Lös de uppdelade fragmenten genom agarosgelelektrofores, som ovan, och observera det karakteristiska restriktionsfragmentsmönstret vid UV-genomlysning efter färgning i etidiumbromid, och jämför med den ouppdelade och uppdelade positiva kontrollen.

Tolkning av PCR-resultaten:

PCR-testet är negativt om det R. solanacearum-specifika PCR-kopian av den förväntade storleken inte upptäcks i provet, men upptäcks i alla positiva kontrollprover (i fallet multiplex-PCR med plantspecifika interna kontrollprimrar måste en andra PCR-produkt av förväntad storlek amplifieras med provet i fråga).

PCR-testet är positivt om det R. solanacearum-specifika PCR-kopian av den förväntade storleken och det förväntade restriktionsmönstret (vid behov) upptäcks, förutsatt att det inte amplifierats från någon av de negativa kontrollproven. Tillförlitlig bekräftelse av ett positivt resultat kan även erhållas genom att testet upprepas med en andra uppsättning PCR-primrar (tillägg 6).

Anmärkning: Inhibering av PCR kan misstänkas om den förväntade kopian erhålls från det positiva kontrollprovet innehållande R. solanacearum i vatten men negativa resultat erhålls från positiva kontroller med R. solanacearum i potatisextrakt. I multiplexa PCR-protokoll med interna PCR-kontroller anges inhibering av reaktionen när inget av de båda kopiorna erhålls.

Nedsmittning kan misstänkas om den förväntade kopian erhålls från en eller flera av de negativa kontrollerna.

7. FISH-test

Princip

Om FISH-testet används som första screeningtest och resultatet är positivt, skall ett andra screeningtest i form av isoleringstest eller IF-test göras. Om FISH-testet används som andra screeningtest och resultatet är positivt, krävs ytterligare testning enligt flödesschemat för att diagnosen skall bli fullständig.

Anmärkning: Använd validerade R. solanacearum-specifika oligo-prober (se tillägg 7). Preliminär testning med denna metod bör möjliggöra reproducerbar upptäckt av minst 103–104 celler av R. solanacearum per ml som tillsätts till provextrakt som tidigare testats och gett negativt svar.

Följande förfarande bör helst tillämpas på nypreparerade provextrakt men kan även tillämpas på provextrakt som lagrats i glycerol vid en temperatur av 16 till 24 °C eller 68 till 86 °C.

Som negativa kontroller använd portioner av provextrakt som tidigare givit negativt svar när de testats avseende R. solanacearum.

Som positiva kontroller preparera suspensioner innehållande 105–106 celler per ml av R. solanacearum biovar 2 (dvs. stam NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857, se tillägg 3) i 0,01 M fosfatbuffert från en 3–5 dagar gammal kultur. Bered separata positiva kontrollglas av den homologa stammen eller någon annan referensstam av R. solanacearum, som suspenderats i potatisextrakt, såsom anges i tillägg 3 B.

Användningen av FITC-märkt eubakteriell oligo-prob fungerar som en kontroll av hybridiseringsprocessen, eftersom den färgar alla eubakterier som finns i provet.

Standardiserade positiva och negativa kontrollmaterial som kan användas i detta test förtecknas i tillägg 3 punkt A.

Testa kontrollmaterialen exakt som provet (proverna).

7.1 Fixering av potatisextrakt

Följande protokoll utgår ifrån Wullings et al. (1998):

7.1.1 Preparera fixeringslösningen (se tillägg 7).

7.1.2 Pipettera 100 µl av varje provextrakt i ett Eppendorf-rör och centrifugera under 7 minuteruter på 7 000 g.

7.1.3 Avlägsna supernatanten och lös pelleten i 200 µl fixeringsvätska som preparerats 24 timmar tidigare. Skaka och inkubera under 1 timme i kylskåp.

7.1.4 Centrifugera under 7 minuter på 7 000 g, avlägsna supernatanten och återsuspendera pelleten i 75 µl 0,01 M fosfatbuffert (se tillägg 7).

7.1.5 Droppa 16 µl av de fixerade suspensionerna på ett rent multitest-objektglas, såsom anges i fig. 7.1. Förse varje glas med två olika prover som är outspädda, och använd 10 µl för att göra en 1:100 utspädning (i 0,01 M fosfatbuffert). Den återstående provlösningen (49 µl) kan lagras vid 20 °C efter tillsats av 1 volym 96-procentig etanol. Om FISH-testet skall upprepas, avlägsna etanolen genom centrifugering, och tillsätt en lika stor volym 0,01 fosfatbuffert (omskakas).



Fig. 7.1: FISH-glasets layout. Prov 1 Blankprov Blankprov Blankprov Prov 2 Fönster 1 Fönster 2 Fönster 3 Fönster 4 Fönster 5 Prov 1 Blankprov Blankprov Blankprov Prov 2 Fönster 6 Fönster 7 Fönster 8 Fönster 9 Fönster 10 Täckglas 1 Täckglas 2

7.1.6 Lufttorka glasen (eller torka på objektglastork vid 37 °C) och fixera dem genom flambering. Förfarandet kan på detta stadium avbrytas, och hybridiseringen kan fortsätta följande dag. Glasen bör förvaras dammfritt och torrt i rumstemperatur.

7.2 Hybridisering

7.2.1 Torka cellerna i en serie av etanol om 50 %, 80 % och 96 % under 1 minut vardera. Lufttorka glasen i en hållare för objektglas.

7.2.2 Preparera en fuktkammare för inkubation genom att täcka botten av en lufttät behållare med mjuk- eller filterpapper doppat i 1 x hybmix (tillägg 7). Preinkubera behållaren i hybridiseringsugn vid 45 °C under minst 10 minuter.

7.2.3 Tillsätt 10 μl hybridiseringslösning (tillägg 7) till 8 fönster (fönstren 1, 2, 4, 5, 6, 7, 9 och 10; se figur 7.1) på varje glas och lämna de två mittfönstren (3 och 8) tomma.

7.2.4 Anbringa täckglass (24 × 24 mm) på det första och de 4 sista fönstren utan att låta någon luft komma emellan. Placera glasen i den redan uppvärmda fuktkammaren och hybridisera under 5 timmar i ugn i 45 °C i mörker.

7.2.5 Preparera 3 bägare innehållande 1 l Milli Q-vatten (av molekylärbiologisk kvalitet), 1 l av 1 x hybmix (334 ml 3 x hybmix och 666 ml Milli Q-vatten) och 1 l av 1/8 x hybmix (42 ml 3 x hybmix och 958 ml Milli Q-vatten). Preinkubera var och en i vattenbad vid 45 °C.

7.2.6 Avlägsna täckglasen från glasen och placera glasen i en hållare för objektglas.

7.2.7 Tvätta bort överskott av probe genom inkubation under 15 minuter i bägaren med 1 x hybmix vid 45 °C.

7.2.8 För över hållaren för objektglas till 1/8 hybmix tvättlösning och inkubera under ytterligare 15 minuter.

7.2.9 Doppa glasen hastigt i Milli Q-vatten och placera dem på filterpapper. Avlägsna överskottsfukt genom att försiktigt täcka ytan med filterpapper. Pipettera 5-10 μl av inbäddningslösning som motverkar blekning (t.ex. Vectashield, Vecta Laboratories, CA, USA eller liknande) på varje fönster och lägg ett stort täckglas (24 × 60 mm) över hela glaset.

7.3 Avläsning av FISH-testet

7.3.1 Observera glasen omedelbart i ett mikroskop utrustat för epifluorescensmikroskopi vid 630 eller 1 000 × förstoring under oljeimmersion. Med ett filter lämpligt för fluoresceinisothiocyanat (FITC) färgas eubakteriecellerna (inklusive de flesta gramnegativa cellerna) i provet fluorescerande gröna. Med ett filter för tetrametylrodamin-5-isotiocyanat framträder Cy3-infärgade celler av R. solanacearum som fluroscerande röda. Jämför cellmorfologin med de positiva kontrollernas cellmorfologi. Cellerna skall vara klart fluorescerande och helt färgade. FISH-testet (avsnitt VI.A.7.) skall återupprepas om färgningen är avvikande. Scanna fönstren utefter två diametrar i rät vinkel och runt perimetern. På de prover som inte uppvisar några celler eller endast ett litet antal celler, observera minst 40 mikroskopfält.

7.3.2 Sök efter ljusa fluorescerande celler med morfologi som är karakteristisk för R. solanacearum i testfönstren på testglasen (se webbplats: http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Intensiteten hos fluorescensen skall vara likvärdig med eller större än fluorescensen hos den positiva kontrollstammen. Celler med ojämn eller ofullständig färgning eller med svag fluorescens beaktas inte.

7.3.3 Om nedsmittning misstänks skall testet upprepas. Detta kan vara fallet om alla glas i ett parti uppvisar positiva celler på grund av nedsmittning av en buffert eller om positiva celler påträffas (utanför glasets fönster) på objektglasöverdraget.

7.3.4 FISH-testets specificitet medför flera problem. Bestånd av fluorescerande celler med atypisk morfologi och korsreagerande saprofytiska bakterier som har en liknande storlek och morfologi som R. solanacearum kan förekomma hos potatisar, dels i naveländarna, dels i pelletar av stjälksegmentet, även om de är mycket mer lågfrekventa än i IF-test.

7.3.5 Endast fluorescerande celler med typisk storlek och morfologi tas i beaktande.

7.3.6 Tolkning av FISH-resultaten: i) Giltiga resultat från FISH-test erhålls om klart fluorescerande gröna celler med storlek och morfologi som är typiskt för R. solanacearum observeras när ett FITC-filter används respektive klart fluorescerande röda celler när ett rodamin-filter används i alla positiva kontroller och inte i någon av de negativa kontrollerna. För varje prov med ljusa fluorescerande celler med karakteristisk morfologi: bestäm medeltalet typiska celler per mikroskopfält och beräkna antal typiska celler per ml återsuspenderad pellet (tillägg 4). Prover som innehåller minst 5 × 103 typiska celler per ml återsuspenderad pellet betraktas som potentiellt nedsmittade. Ytterligare provtagning krävs. Prover som innehåller färre än 5 x 103 typiska celler per ml återsuspenderad pellet betraktas som negativa. ii) FISH-testet är negativt om klart fluorescerande röda celler med storlek och morfologi som är typiskt för R. solanacearum inte observeras när rodamin-filtret används, förutsatt att typiska klart fluorescerande röda celler observeras i de positiva kontrollpreparaten när rodamin-filtret används.

8. ELISA-test

Princip

ELISA kan endast användas som ett frivilligt test som komplement till IF, PCR eller FISH på grund av den relativt sett låga känsligheten hos detta test. Om DAS ELISA används är anrikning och monoklonala antikroppar obligatoriskt (se webbplats: http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Anrikning av proverna för ELISA kan vara användbart för att öka testets känslighet, men den kan misslyckas på grund av konkurrens från andra organismer i provet.

Anmärkning: Använd antikroppar mot R. solanacearum med validerat ursprung (se webbplats http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Det rekommenderas att titer bestäms för varje nytt parti antikroppar. Titern definieras som den högsta utspädning vid vilken en optimal reaktion sker när en suspension av 105 to 106 celler per ml av den homologa stammen av R. solanacearum testas och när lämpliga sekundära antikroppkonjugat i överensstämmelse med tillverkarens rekommendationer används. Vid testningen bör antikropparna användas vid en arbetsutspädning nära eller vid titern i den kommersiellt tillgängliga blandningen.

Bestäm titern av antikroppar i en suspension av 105 till 106 celler per ml av den homologa stammen av R. solanacearum.

Ta med ett provextrakt som tidigare gett negativt svar när det testats för R. solanacearum och en suspension av icke-korsreagerande bakterier i en fosfatbuffrad saltlösning (PBS) som negativa kontroller.

Som positiv kontroll använd portioner av provextrakt som tidigare gett negativt svar när de testats, blandade med 103 till 104 celler per ml R. solanacearum biovar 2 (t.ex. stam NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857, se tillägg 2 A och B). För jämförelse av resultaten på varje platta, använd en standardsuspension av celler per ml i PBS av solanacearum. Säkerställ att de positiva kontrollerna är väl åtskilda på mikrotiterplattan från provet (proven) under testet.

Standardiserade positiva och negativa kontrollmaterial som kan användas i detta test förtecknas i tillägg 3 A.

Testa kontrollmaterialen exakt som provet (proven).

Två ELISA-protokoll har validerats:

a) Indirekt ELISA (Robinson-Smith m.fl., 1995)

1) Använd 100–200 µl portioner av provextraktet. (Upphettning till 100 °C under 4 minuter i vattenbad eller värmeblock kan minska icke-specifika resultat i vissa fall.)

2) Tillsätt en motsvarande volym coatingbuffert av dubbel styrka (tillägg 4) och skaka.

3) Tillsätt 100 µl portioner till var och en av de sista två brunnarna på en mikrotiterplatta (t.ex. Nunc-Polysorp eller motsvarande) och inkubera under 1 timme i 37 °C eller över natten i 4 °C.

4) Häll ut extrakten från brunnarna. Tvätta brunnarna tre gånger med PBS-Tween (tillägg 4), varvid den sista tvättlösningen får vara kvar i brunnarna minst 5 minuter.

5) Bered den tillämpliga utspädningen av antikroppar mot R. solanacearum i blockeringsbuffert (tillägg 4). För validerade antikroppar som finns i handeln används de rekommenderade utspädningarna (vanligtvis dubbelt så hög koncentration som titern).

6. Tillsätt 100 µl till varje brunn och inkubera under 1 timme i 37 °C.

7) Häll ut antikroppslösningen från brunnarna och tvätta som ovan (4).

8) Bered den tillämpliga utspädningen av sekundär antikropp-alkalin fosfatas konjugat i blockeringsbuffert. Tillsätt 100 µl till varje brunn och inkubera under 1 timme i 37 °C.

9) Häll ut antikroppskonjugatet från brunnarna och tvätta som ovan (4).

10) Tillsätt 100 µl alkalisk fosfatassubstratlösning (tillägg 4) till varje brunn. Inkubera i mörker vid omgivande temperatur och läs av absorptionen vid 405 nm vid regelbundna intervaller inom 90 minuter.

b) DASI ELISA

1) Preparera lämplig utspädning av anti-R. solanacearum polyklonala immunoglobuliner i coatingbuffert pH 9,6 (tillägg 4). Tillsätt 200 µl till varje brunn. Inkubera vid 37 °C under 4–5 timmar eller vid 4 °C under 16 timmar.

2) Tvätta brunnarna tre gånger med PBS-Tween (tillägg 4). Tillsätt 190 µl provextrakt till minst 2 brunnar. Tillsätt också positiva och negativa kontroller i två brunnar på varje platta. Inkubera under 16 timmar vid 4 °C.

3) Tvätta brunnarna tre gånger med PBS-Tween (tillägg 4).

4) Preparera en lämplig utspädning av R. solanacearum-specifika monoklonala antikroppar i PBS (tillägg 4) som även innehåller 0,5 % bovint serumalbumin (BSA) och tillsätt 190 µl till varje brunn. Inkubera vid 37 °C under 2 timmar.

5) Tvätta brunnarna tre gånger med PBS-Tween (tillägg 4).

6) Preparera en lämplig utspädning av antimus-antikroppar som konjugerats med alkaliskt fosfatas i PBS. Tillsätt 190 µl till varje brunn. Inkubera vid 37 °C under 2 timmar.

7) Tvätta brunnarna tre gånger med PBS-Tween (tillägg 4).

8) Preparera en alkalisk fosfatassubstratlösning som innehåller 1 mg p-nitrofenylfosfat per ml substratbuffert (tillägg 4). Tillsätt 200 µl till varje brunn. Inkubera i mörker vid omgivande temperatur och läs av absorptionen vid 40 nm vid regelbundna intervaller inom 90 minuter.

Tolkning av resultaten av ELISA-testet:

ELISA-testet är negativt om den genomsnittliga optiska densiteten (OD) i duplicerade provbrunnar är < 2 x OD för den i kontrollbrunnen med det negativa provextraktet, förutsatt att OD för samtliga positiva kontroller är över 1,0 (efter 90 minuter inkubation med substratet) och är mer än dubbelt så hög som den OD som erhålls för de negativa provextrakten.

ELISA-testet är positivt om den genomsnittliga OD i duplicerade provbrunnar är > 2 x OD i brunnen med det negativa provextraktet, förutsatt att OD för samtliga negativa kontroller är < 2 x den i de positiva kontrollbrunnarna.

Negativa ELISA-resultat i positiva kontrollbrunnar antyder att testet inte har utförts korrekt eller har inhiberats. Positiva ELISA-resultat i negativa kontrollbrunnar antyder att korskontaminering eller icke-specifik antikroppsbindning har inträffat.

9. Biotest

Anmärkning: Preliminär testning med denna metod bör möjliggöra reproducerbar upptäckt av 103–104 kolonibildande enheter av R. solanacearum per ml som tillsätts till provextrakt som tidigare testats och gett negativt svar (information om prepareringen finns i tillägg 3).

Högst känslighetsnivå för upptäckt kan förväntas då nyligen preparerade provextrakt används och optimala tillväxtförhållanden tillämpas. Metoden kan emellertid med framgång tillämpas på extrakt som har lagrats i glycerol vid 68 till 86 °C.

Nedanstående protokoll grundar sig på Janse (1988):

9.1 Använd 10 testplantor av mottagliga tomatsorter (t.ex. Moneymaker eller sorter med motsvarande mottaglighet enligt testlaboratoriet) Detaljerad information om odling finns i tillägg 8. Alternativt, använd äggplantor (t.ex. sorten Black Beauty eller sorter med motsvarande mottaglighet), och använd endast plantor på bladstadierna 2–3 upp till full utveckling av trebladsstadiet. Tidigare studier har visat att symtomen hos äggplantor är mindre påtagliga och utvecklas långsammare. Därför rekommenderas att tomatplantor används där så är möjligt.

9.2 Fördela 100 µl provextrakt mellan testplantorna. 9.2.1 Inympning med en spruta Inokulera plantornas stjälkar just ovanför hjärtbladen med en spruta som är försedd med injektionsnål (minst 23 G). Fördela provet mellan testplantorna. 9.2.2 Inokulation genom skåra Håll plantan mellan två fingrar, droppa med hjälp av en pipett en droppe (ca 5–10 µl) av det uppslammade koncentrerade extraktet på stjälken mellan hjärtbladen och det första bladet. Gör med en steril skalpell en diagonal skåra ungefär 1,0 cm lång och ungefär lika djup som två tredjedelar av stjälkens diameter med början vid droppen med det koncentrerade extraktet. Förslut skåran med sterilt vaselin från en spruta.

9.3 Inokulera med samma teknik, 5 småplantor med en vattensuspension av 105-106 celler per ml preparerad av en 48-timmarskultur av en virulent biovar 2-stam av R. solanacearum som positiv kontroll och med pelletbuffert (tillägg 4) som negativ kontroll. Separera de positiva och negativa kontrollplantorna från de andra plantorna för att undvika korskontaminering.

9.4 Odla testplantorna i karantänsanläggningar upp till 4 veckor vid 25–30 °C och med hög relativ luftfuktighet och med lämplig bevattning för att undvika vattenmättnad eller vissnande på grund av vattenbrist. För att undvika nedsmittning, inkubera positiva och negativa kontrollplantor på strikt separata bänkar i ett växthus eller odlingsrum eller, vid platsbrist, se till att hanteringen sker strikt separat. Om plantor från olika prover skall inkuberas tätt tillsammans, separera dem med lämpliga skärmar. Vid gödning, bevattning, inspektion och annan behandling, var noga med att undvika korskontaminering. Det är mycket viktigt att hålla växthus och odlingsrum fria från alla skadeinsekter eftersom de kan överföra bakterien från prov till prov. Sök efter symtom på vissning, epinasti, kloros och/eller försvagad tillväxt.

9.5 Isolera från infekterade plantor (avsnitt II.3) och identifiera renkulturer av förmodad R. solanacearum (avsnitt VI. B).

9.6 Om inga symtom observeras efter 3 veckor, utför IF/PCR/isolering på ett blandprov av 1 cm stjälksegment från varje testplanta taget ovanför inokulationsstället. Om testet är positivt, utför plattspridning från spädningsserie (se avsnitt 4.1).

9.7 Identifiera och rena kulturerna av förmodad R. solanacearum (avsnitt VI. B).

Giltiga resultat från biotest erhålls om plantor från den positiva kontrollen uppvisar typiska symtom, bakterier kan omisoleras från dessa plantor och inga symtom återfinns på de negativa kontrollerna. Biotestet är negativt om testplantorna inte är infekterade av R. solanacearum och under förutsättning att R. solanacearum detekterats i de positiva kontrollerna. Biotestet är positivt om testplantorna är infekterade av R. solanacearum.

B. IDENTIFIERINGSTEST

Identifiera renkulturer av presumtiva R. solanacearum-isolat genom att utföra minst två av följande tester baserade på olika biologiska principer.

Ta med kända referensstammar när så är lämpligt vid varje test som utförs (se tillägg 3).

1. Närings- och enzymtest

Fastställ följande fenotypiska egenskaper som alltid är närvarande eller frånvarande i R. solanacearum enligt metoderna Lelliott och Stead (1987), Klement m.fl. (1990), Schaad (2001).







Test Förväntat resultat Produktion av fluorescerande pigment – poly-β-hydroxybutyrat-inklusioner + Oxidations-/fermenteringstest (O/F-test). O+/F– Katalasaktivitet + Kovacs oxidastest + Reduktion av nitrat + Användning av citrat + Tillväxt vid 40 °C – Tillväxt i 1 % NaCl + Tillväxt i 2 % NaCl – Arginindihydrolas-aktivitet – Smältning av gelatin – Hydrolys av stärkelse – Hydrolys av aesculin – Levanproduktion –

2. IF-test

2.1 Preparera en suspension av ungefär 106 celler per ml i IF-buffert (tillägg 4).

2.2 Preparera en serie dubbla utspädningar av ett lämpligt antiserum (se webbplats: http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).

2.3 Tillämpa IF-förfarandet (avsnitt VI.A.5.).

2.4 Ett positivt IF-test erhålls om kulturen har samma IF-titer som den positiva kontrollen.

3. ELISA-test

Anmärkning: Om endast två identifieringstest görs, använd inget annat serologiskt test som komplement till den här metoden.

3.1 Preparera en suspension av ungefär 108 celler per ml i 1 x fosfatbuffrad koksaltlösning (tillägg 4).

3.2 Utför ett lämpligt ELISA-test med en specifik monoklonal antikropp till R. solanacearum.

3.3 ELISA-testet är positivt om ELISA-resultatet från kulturen är minst hälften så högt som det från den positiva kontrollen.

4. PCR-test

4.1 Preparera en suspension av ungefär 106 celler per ml i sterilt vatten av molekylärbiologisk kvalitet.

4.2 Upphetta 100 µl av cellsuspensionen i tillslutna rör i värmeblock eller kokande vattenbad i 100 °C under 4 minuter. Proverna kan därefter lagras i 16 till 24 °C fram till användning.

4.3 Använd lämpliga PCR-förfaranden för att amplifiera R. solanacearum-specifika kopior (t.ex. Seal m.fl. [1993]; Pastrik and Maiss [2000]; Pastrik m.fl. [2002]; Boudazin m.fl. [1999]; Opina m.fl. [1997], Weller m.fl. [1999]).

4.4 En positiv identifiering av R. solanacearum erhålls om PCR-kopiorna har samma storlek och samma RFLP (restriction fragment length polymorphisms) som den positiva kontrollstammen.

5. FISH-test

5.1 Preparera en suspension av ungefär 106 celler per ml i ultrarent vatten.

5.2 Tillämpa FISH-förfarandet (avsnitt VI.A.7.) med minst 2 R. solanacearum-specifika oligo-prober (tillägg 7).

5.3 Ett positivt FISH-test föreligger om samma reaktioner erhålls från kulturen och den positiva kontrollen.

6. Fettsyraprofilering (FAP)

6.1 Odla kulturen på trypticase-soja-agar (Oxoid) under 48 timmar i 28 °C.

6.2 Tillämpa ett lämpligt FAP-förfarande (Janse, 1991; Stead, 1992).

6.3 Ett positivt FAP-test erhålls om den presumtiva kulturen har samma profil som den positiva kontrollen. Förekomsten av karakteristiska fettsyror är 14:0 3OH, 16:0 2OH, 16:1 2OH och 18:1 2OH, och frånvaron av 16:0 3OH tyder i hög grad på Ralstonia sp.

7. Metoder för stamkarakterisering

Stamkarakterisering är en av följande metoder som rekommenderas för varje nytt fall av isolering av R. solanacearum.

Ta med kända referensstammar när så är lämpligt vid varje test som utförs (se tillägg 3).

7.1 Biovarbestämning

R. solanacearum separeras i biovarer på grundval av förmågan att använda och/eller oxidera tre disackarider och tre hexosalkoholer (Hayward, 1964 och Hayward m.fl. 1990). Odlingsmedier för biovartest beskrivs i tillägg 2. Testet kan tillämpas genom att mediet stickinokuleras med renkulturer av R. solanacearum-isolat och inkuberas i 28 °C. Om mediet fördelas i sterila cellodlingsplattor med 96 brunnar (200 µl per brunn) kan färgändring från olivgrön till gul observeras inom 72 timmar, vilket indikerar ett positivt testresultat.







Biovar 1 2 3 4 5 Användning av: Maltos - + + - + Laktos - + + - + D (+) Cellobios - + + - + Mannitol - - + + + Sorbitol - - + + - Du