1978L0633 — SV — 20.12.1983 — 002.001 — 1
Detta dokument är endast avsett som dokumentationshjälpmedel och institutionerna ansvarar inte för innehållet
►B KOMMISSIONENS ÅTTONDE DIREKTIV
av den 15 juni 1978
om gemenskapsmetoder för analys vid den officiella foderkontrollen
(78/633/EEG)
(EGT L 206, 29.7.1978, s. 43)
Ändrat genom:
Officiella tidningen
nr sida datum
►M1Kommissionens direktiv 81/680/EEG av den 30 juli 1981 L 246 32 29.8.1981
►M2Kommissionens direktiv 84/4/EEG av den 20 december 1983 L 15 28 18.1.1984
▼B
KOMMISSIONENS ÅTTONDE DIREKTIV
av den 15 juni 1978
om gemenskapsmetoder för analys vid den officiella foderkon-
trollen
(78/633/EEG)
EUROPEISKA GEMENSKAPERNAS KOMMISSION HAR ANTAGIT
DETTA DIREKTIV
med beaktande av Fördraget om upprättandet av Europeiska ekono-
miska gemenskapen,
med beaktande av rådetsdirektiv 70/373/EEG av den 20 juli 1970 om
införande av gemenskapsmetoder för provtagning och analys vid denofficiella foderkontrollen(
1), senast ändrat genom anslutningsakten,
särskilt artikel 2 i denna, och
med beaktande av följande:I det ovan nämnda direktivet krävsatt den officiella foderkontrollen
skall utföras med användning av gemenskapsmetoder för provtagning
och analys i syfte att kontrollera att fodret motsvarar de krav somframgår av bestämmelser i lagar och andra författningar om foderskvalitet och sammansättning.
I kommissionens direktiv 71/250/EEG av den 15 juni 1971(
2), 71/393/
EEG av den 18 november 1971(3), 72/199/EEG av den 27 april
1972(4), 73/46/EEG av den 5 december 1972(5), 74/203/EEG av den
25 mars1974(6), 75/84/EEG av den 20 december 1974(7) och 76/372/
EEG av den 1 mars1976(8) har redan ett antal gemenskapsmetoder för
analys fastställts. Mot bakgrund av den utveckling som därefter skett påområdet är det lämpligt att nu anta en åttonde metodsamling.
De åtgärder som beslutas om i detta direktiv är förenliga med Ständiga
foderkommitténsyttrande.
HÄRIGENOM FÖRESKRIVS FÖLJANDE.
Artikel 1
1. Medlemsstaterna skall kräva att analyser vid den officiella foder-
kontrollen skall utföras med de metoder som beskrivs i bilagan till
detta direktiv då det gäller halter av zinkbacitracin, flavofosfolipol,
järn, koppar, mangan och zink.
Artikel 2
Medlemsstaterna skall sätta i kraft de lagar och andra författningar som
är nödvändiga för att följa detta direktiv den 1 januari 1979. De skall
genast underrätta kommissionen om detta.
Artikel 3
Detta direktiv riktar sig till medlemsstaterna.1978L0633 — SV — 20.12.1983 — 002.001 — 2
(1) EGT nr L 170, 3.8.1970, s. 2.
(2) EGT nr L 155, 12.7.1971, s. 13.
(3) EGT nr L 279, 20.12.1971, s. 7
(4) EGT nr L 123, 29.5.1972, s. 6.
(5) EGT nr L 83, 30.3.1973, s. 21.
(6) EGT nr L 108, 22.4.1974, s. 7.
(7) EGT nr L 32, 5.2.1975, s. 26.
(8) EGT nr L 102, 15.4.1976, s. 8▼M1
▼B
▼B
BILAGA
1.BESTÄMNING AV ZINKBACITRACIN
- genom diffusion i agarsubstrat -
1. SYFTE OCH RÄCKVIDD
Denna metod är avsedd för bestämning av zinkbacitracin i foder och
premixer. Lägsta gräns för bestämningen är 5 mg/kg (5 ppm)(1).
2. PRINCIP
Provet extraheras vid pH 2 med en blandning av metanol/vatten/saltsyra
och en natriumsulfidlösning. Tillsatsen av natriumsulfid är avsedd att
fälla ut alla lösliga kopparsalter som kan påverka analysen. Extraktet
bringas till pH 6,5, koncentreras (om så är nödvändigt) och späds ut.
Dess antibiotiska verkan bestäms genom mätning av zinkbacitracinets
diffusion i ett agarmedium som inokulerats med Micrococcus luteus
(flavus) . Diffusionen kan påvisas genom att det bildas hämningszoner
för mikroorganismen. Dessa zoners diameter antas stå i direkt proportion
till logaritmen för den antibiotiska koncentrationen inom spektrumet för
de använda antibiotiska koncentrationerna.
3. MIKROORGANISM: MICROCOCCUS LUTEUS (FLAVUS) ATCC
10240
3.1Skötsel av den lagerhållna odlingen
Inokulera provrör som innehåller skikt av odlingsmedium (4.1) med
Micrococcus luteus (flavus) och låt inkubera under 24 timmar vid
30 ºC. Förvara odlingen i kylskåp vid cirka 4 ºC. Upprepa inokuleringen
varannan vecka.
3.2Beredning av bakteriesuspensionen (a)
Samla in tillväxten från ett nypreparerat agarskikt (3.1) med 2-3 ml
koksaltlösning (4.3). Använd denna suspension till att inokulera 250 ml
odlingsmedium (4.1) som förvaras i en Rouxkolv och låt inkubera 18-20
timmar vid 30 ºC. Samla in tillväxten i 25 ml koksaltlösning (4.3) och
blanda.
Späd ut lösningen med koksaltlösning (4.3) i proportionen 1/10. Suspen-
sionens ljustransmission måste vara cirka 75 % uppmätt vid 650 nm i en
1 cm-cell mot koksaltlösning (4.3). Denna suspension kan förvaras en
vecka vid cirka 4 ºC.
4. ODLINGSMEDIUM OCH REAGENS
4.1Odlingsmedium (b)
Köttpepton 6,0 g
Trypton 4,0 gJästextrakt 3,0 gKöttextrakt 1,5 gGlukos1,0 gAgar 10,0-20,0 gVatten 1 000 mlpH 6,5-6,6 (efter sterilisering)
4.2Analysmedium (
b)
Trypton 10,0 g
Jästextrakt 3,0 gKöttextrakt 1,5 gGlukos1,0 gAgar 10,0-20,0 gTween 80 1 mlVatten 1 000 mlpH 6,5 (efter sterilisering)1978L0633 — SV — 20.12.1983 — 002.001 — 3
(1) 1 mg foderzinkbacitracin motsvarar 42 internationella enheter (IE).
(a) Andra metoder kan användas, förutsatt att det har fastställts att de ger liknande bakte-
riesuspensioner.
(b) Varje kommersiellt odlingsmedium med liknande sammansättning som ger samma
resultat kan användas.▼M2
▼M2
4.3 Koksaltlösning 0,8 % (vikt/volym): lös 8 g natriumklorid i vatten och
späd till 1 000 ml. Sterilisera.
4.4 Blandning av metanol/vatten/saltsyra (4.6) enligt följande:
80/17,5/2,5 (volym/volym/volym).
4.5Fosfatbuffert, pH 6,5
Kaliumvätefosfat, K2HPO422,15 g
Kaliumdivätefosfat, KH2PO427,85 g
Vatten till 1 000 ml
4.6 Saltsyra (d: 1,18 till 1,19).
4.7 Saltsyra (0,1 M).
4.8 Natriumhydroxidlösning 1 M.
4.9 Natriumsulfidlösning cirka 0,5 M.
4.10 Bromkresolpurpurlösning 0,04 % (vikt/volym): lös upp 0,1 g bromkre-
solpurpur i 18,5 ml natriumhydroxidlösning 0,01 M. Tillsätt vatten till
250 ml och blanda.
4.11 Standardsubstans: zinkbacitracin vars verkan är känd (i IE).
5. STANDARDLÖSNINGAR
Väg upp en mängd standardzinkbacitracin (4.11) som motsvarar 1050 IE
(enligt angiven aktivitet). Tillsätt 5 ml saltsyra 0,1 M (4.7) och låt stå i
15 minuter. Tillsätt 30 ml vatten, justera pH till 4,5 med fosfatbuffert
(4.5) (cirka 4 ml), tillsätt vatten till 50 ml volym och blanda väl (1 ml
= 21 IE).
Av denna lösning bereds genom successiv utspädning med fosfatbuffert
(4.5) följande lösningar:
s80,42 IE/ml
s40,21 IE/ml
s20,105 IE/ml
s10,0525 IE/ml
6. BEREDNING AV EXTRAKTET OCH ANALYSLÖSNINGARNA
6.1Extraktion
6.1.1 Premixer och mineralfoder
Väg upp 2,0-5,0 g av provet, tillsätt 29,0 ml av blandningen (4.4) och
1,0 ml natriumsulfidlösning (4.9) och skaka om hastigt. Kontrollera att
pH är cirka 2. Skaka om under 10 minuter, tillsätt 30 ml fosfatbuffert
(4.5), skaka om under 15 minuter och centrifugera. Ta en lämplig del
av dekanteringslösningen (supernatanten) och justera pH till 6,5 med
natriumhydroxidlösning 1 M (4.8) med hjälp av pH-mätare eller med
bromkresolpurpurlösningen (4.10) som indikator.
Späd ut med fosfatbuffert (4.5) så att en förväntad zinkbacitracinhalt av
0,42 IE/ml (= u8) erhålls.
6.1.2 Proteinkoncentrat
Väg upp 10,0 g av provet, tillsätt 49,0 ml av blandningen (4.4) och
1,0 ml natriumsulfidlösning (4.9) och skaka om hastigt. Kontrollera att
pH är cirka 2. Skaka om under 10 minuter. Tillsätt 50 ml fosfatbuffert
(4.5), skaka om under 15 minuter och centrifugera. Ta en lämplig volym
av dekanteringslösningen (supernatanten) och justera pH till 6,5 med
natriumhydroxidlösning 1 M (4.8) med hjälp av pH-mätare eller med
bromkresolpurpurlösningen (4.10) som indikator.
Indunsta till cirka halva volymen i rotationsindunstare vid högst 35 ºC.
Späd med fosfatbuffert (4.5) så att en förväntad zinkbacitracinhalt av
0,42 IE/ml (= u8) erhålls.
6.1.3 Övriga foder
Väg upp 10,0 g av provet (20,0 g vid en förväntad zinkbacitracinhalt av
5 mg/kg). Tillsätt en blandning av 24,0 ml av blandningen (4.4) och
1,0 ml natriumsulfidlösning (4.9) och homogenisera under 10 minuter.
Tillsätt 25 ml fosfatbuffert (4.5), skaka om under 15 minuter och centri-
fugera. Ta 20 ml av dekanteringslösningen (supernatanten) och justera
pH till 6,5 med natriumhydroxidlösning 1 M (4.8) med hjälp av pH-
mätare eller med bromkresolpurpurlösningen (4.10) som indikator.
Indunsta till cirka 4 ml i rotationsindunstare vid högst 35 ºC. Späd1978L0633 — SV — 20.12.1983 — 002.001 — 4
▼M2
återstoden med fosfatbuffert (4.5) så att en förväntad zinkbacitracinhalt
av 0,42 IE/ml (= u8) erhålls.
6.2Analyslösningar
Av lösning u8beredslös ningarna u4(förväntad halt: 0,21 IE/ml), u2(förväntad halt: 0,105 IE/ml) och u1(förväntad halt: 0,0525 IE/ml)
genom successiv utspädning (1 + 1) med fosfatbuffert (4.5).
7. ANALYSMETOD
7.1Inokulering av analysmediet
Inokulera analysmediet (4.2) med bakteriesuspensionen (3.2) vid cirka
50 ºC. Bestäm genom preliminära försök på plattor med mediet (4.2)
vilken mängd av bakteriesuspensionen som krävs för att ge så stora
och tydliga hämningszoner som möjligt vid de olika koncentrationerna
av zinkbacitracin.
7.2Färdigställande av plattorna
Agardiffusionen utförs på plattor med de fyra koncentrationerna av stan-
dardlösningen (s8,s4,s2och s1) och av analyslösningen (u8,u4,u2och u1).
Det är nödvändigt att dessa fyra koncentrationer av extrakt och stan-
dardlösning placeras på varje platta. Välj därför plattor som är så stora
att minst åtta hål med en diameter av 10-13 mm och lägst 30 mm
mellan mittpunkterna kan görasi agarmediet. Provet kan utföraspå
glasplattor med en övertäckt aluminium- eller plastring, 200 mm i
diameter och 20 mm hög, placerad högst upp.
Täck plattorna med en så stor mängd av mediet (4.2), som inokulerats
enligt 7.1, att ett cirka 2 mm tjockt lager bildas(60 ml till en platta
med 200 mm diameter). Låt det jämnt fördelade lagret stelna, borra
hålen och placera de exakt uppmätta volymerna analys- och standardlös-
ning (mellan 0,10 och 0,15 ml i varje hål beroende på diameter) i hålen.
Anbringa varje koncentration minst fyra gånger så att varje bestämning
sker på grundval av en bedömning av 32 hämningszoner.
7.3Inkubation
Inkubera plattorna under 16-18 timmar vid 30 ± 2 ºC.
8. UTVÄRDERING
Mät hämningszonernas diameter med en noggrannhet av 0,1 mm. För in
genomsnittsvärdena för varje koncentration på semilogaritmiskt rutat
papper så att logaritmen för koncentrationen i förhållande till hämnings-
zonernas diameter visas. Fastställ optimumlinjerna för såväl
standardlösningen som extraktet, t.ex. enligt följande:
Bestäm optimumpunkten för lägsta nivå standardlösning (SL) med
formeln:
a) SL ¼7s1þ4s2þs4/C02s8
10
Bestäm optimumpunkten för högsta nivå standardlösning (SH) med
formeln:
b) SH ¼7s8þ4s4þs2/C02s1
10
Beräkna på motsvarande sätt optimumpunkterna för lägsta nivå extrakt
(UL) och högsta nivå extrakt (UH) genom att byta ut s1,s2,s4och s8mot u1,u2,u4och u8i ovanstående formler.
För in de beräknade värdena för SL och SH på samma papper och
förbind dem så att optimumlinjen för standardlösningen erhålls. För på
motsvarande sätt in UL och UH och förbind dem så att optimumlinjen
för extraktet erhålls.
Om ingen interferensförekommer s kall linjerna vara parallella. För
praktiska ändamål kan linjerna anses vara parallella om värdena (SH-
SL) och (UH-UL) inte avviker med mer än 10 % från sina medelvärden.
Om linjerna inte visar sig vara parallella kan antingen u1och s1eller u8och s8avlägsnas och SL, SH, UL och UH beräknas med alternativform-
lerna så att alternativa optimumlinjer erhålls:1978L0633 — SV — 20.12.1983 — 002.001 — 5
▼M2
a′)S L=5s1þ2s2/C0s4
6eller5s2þ2s4/C0s8
6
b′)S H=5s4þ2s2/C0s1
6eller5s8þ2s4/C0s2
6
och på motsvarande sätt för UL och UH. Samma parallellitetskriterium
måste tillfredsställas. Det skall anges på slutrapporten att resultatet har
beräknatsmed tre nivåer.
När linjerna kan anses parallella beräknas logaritmen för den relativa
aktiviteten (log A) med en av följande formler beroende på om tre eller
fyra nivåer har använtsför att påvis a parallellitet.
För fyra nivåer
c) Log A ¼u1þu2þu4þu8/C0s1/C0s2/C0s4/C0s8 ðÞ /C2 0;602
u4þu8þs4þs8/C0u1/C0u2/C0s1/C0s2
För tre nivåer
d) Log A ¼u1þu2þu4/C0s1/C0s2/C0s4 ðÞ /C2 0;401
u4þs4/C0u1/C0s1
eller
d′) Log A ¼u2þu4þu8/C0s2/C0s4/C0s8 ðÞ /C2 0;401
u8þs8/C0u2/C0s2
Provextraktets aktivitet = motsvarande standardlösnings aktivitet × A
(U8=S8×A )
Om den relativa aktiviteten befinnsligga utanför intervallet 0,5-2,0
upprepas analysen med lämpliga justeringar av koncentrationerna av
extraktet eller, om detta inte är möjligt, av standardlösningarna. Om
den relativa aktiviteten inte kan bringasinom det föres krivna intervallet
måste varje erhållet resultat anses vara approximativt och detta skall
angesi s lutrapporten.
Om linjerna inte befinnsvara parallella upprepasbes tämningen. Om
parallellitet ändå inte uppstår måste bestämningen anses vara otill-
fredsställande.
Uttryck resultatet i milligram zinkbacitracin per kilo foder.
9. REPETERBARHET
Skillnaden mellan resultaten av två parallella bestämningar som utförts
på samma prov av samma analytiker får inte överstiga:
2 mg/kg, absolutvärde, för halter av zinkbacitracin upp till 10 mg/kg,20 % i förhållande till det högsta värdet vid halter på 10-25 mg/kg,5 mg/kg, absolutvärde, för halter mellan 25 och 50 mg/kg och10 % i förhållande till det högsta värdet vid halter över 50 mg/kg.
2.BESTÄMNING AV FLAVOFOSFOLIPOL GENOM DIFFUSION I
AGARSUBSTRAT
1. SYFTE OCH RÄCKVIDD
Denna metod är avsedd för bestämning av flavofosfolipol i foder,
koncentrat och premixer. Lägsta gräns för bestämningen är 1 mg/kg
(1 ppm).
2. PRINCIP
Provet extraherasmed uts pädd metanol genom uppvärmning med
återloppskylare. Efter centrifugering renas extraktet (om så är
nödvändigt) genom behandling med jonbyteshartser och späds ut.
Extraktets antibiotiska verkan bestäms genom mätning av flavofosfoli-
polens diffusion i ett agarsubstrat som inokulerats med Staphylococcus
aureus. Diffusionen kan påvisas genom att det bildas hämningszoner1978L0633 — SV — 20.12.1983 — 002.001 — 6
▼B
▼B
för mikroorganismen. Dessa zoners diameter antas stå i direkt proportion
till logaritmen på den antibiotiska koncentrationen inom spektrumet för
de använda antibiotiska koncentrationerna.
3. MIKROORGANISM: STAPHYLOCOCCUS AUREUS ATCC 6538 P
3.1Skötsel av den lagerhållna odlingen
Inokulera snedagar som odlingssubstrat (4.1) med Staphylococcus
aureus. Inkubera under 24 timmar vid 37 ºC, förvara odlingen i kylskåp
vid cirka 4 ºC och upprepa inokuleringen varje månad på snedagar.
3.2Beredning av bakteriesuspensionen (a)
Ta undan två provrör som fyllts med den lagerhållna odlingen (3.1) och
inokulera dem på nytt varje vecka. Inkubera under 24 timmar vid 37º C
och förvara provrören i kylskåp vid cirka 4 ºC.
Två till fyra provrör som innehåller odlingssubstrat (4.1) skall inokuleras
med denna tillväxt 24 timmar före analysen.
Inkubera under 16-18 timmar vid 37º C. Framställ en suspension av
tillväxten i koksaltlösning (4.3). Suspensionens ljustransmission måste
vara cirka 40 % uppmätt vid 578 nm i en 1 cm-cell mot koksaltlösning
(4.3).
4. ODLINGSSUBSTRAT OCH REAGENS
4.1Odlingssubstrat (b)
Köttpepton 6,0 g
Trypton 4,0 g
Jästextrakt 3,0 g
Köttextrakt 1,5 g
Glukos1,0 g
Agar 15,0 g
Vatten 1 00 ml
pH 6,5 (efter sterilisering)
4.2Analyssubstrat
4.2.1Basskikt (c)
Köttpepton 6,0 g
Jästextrakt 3,0 g
Köttextrakt 1,5 g
Agar 10,0 g
Vatten 1 00 ml
pH 6,5 (efter sterilisering)
4.2.2Ympningsskikt
Som punkt 4.1, men med tillsats av 2,0 g skumhämmande silikonemul-
sion(d).
4.3 Koksaltlösning 0,4 % (vikt/volym): lös 4 g natriumklorid pa i vatten och
späd till 1000 ml. Sterilisera.
4.4 Ren metanol.
4.5 50-procentig metanol (volym/volym): späd 500 ml metanol (4.4) med
500 ml vatten.
4.6 80-procentig metanol (volym/volym): späd 800 ml metanol (4.4) med
200 ml vatten.
4.7 Tris(hydroxymetyl)aminometan pa.
4.8 1,5-procentig lösning av kaliumklorid i metanol (vikt/volym): lös upp
1,5 g kaliumklorid pa i 20 ml vatten och fyll på metanol (4.4) till
100 ml.1978L0633 — SV — 20.12.1983 — 002.001 — 7
(a) Andra metoder får användas, förutsatt att det har fastställts att de ger liknande bakterie-
suspensioner.
(b) Varje kommersiellt odlingssubstrat med liknande sammansättning som ger samma
resultat får användas, t.ex. oxoidantibiotikasubstrat 1 (CM 327) med tillsats av oxoi-
dagar nr 3 (L 13).
(c) Varje kommersiellt odlingssubstrat med liknande sammansättning som ger samma
resultat får användas, t.ex. oxoidantibiotikasubstrat 2 (CM 335) med tillsats av oxoi-dagar nr 3 (L 13).
(
d) t.ex. SE 2 från Wacker Chemie GmbH, München.
▼B
4.9 Katjonbytare: Dowex 50W×8, 0,85-0,15 nm (DIN 4188), Na-form (kat.
Serva nr 41600) eller motsvarande.
4.10 Anjonbytare: Dowex 1×2, 0,30-0,15 nm (DIN 4188), Cl-form (kat.
Serva nr 41010) eller motsvarande. Förvaras före användning i 80-
procentig metanol under 12-14 timmar (4.6).
4.11 Glasull.
4.12 pH-indikatorpapper (pH 6,6-8,1).4.13 Askorbinsyra.4.14 Standardsubstans: flavofosfolipol med känd aktivitet.
5. UTRUSTNING
5.1 Glasrör för kromatografi, inre diameter: 9 mm, längd 150-200 mm, med
avstängningsventil i den insvängda delen nedtill och anslutningsstycke
av matterat glas[till dropptratten (5.2)] upptill.
5.2 Dropptratt 250 ml med avstängningsventil och anslutningsstycke av
matterat glas.
5.3 250 ml konisk kolv med anslutningsstycke av matterat glas.5.4 Återloppskylare med anslutningsstycke av matterat glas.
6. STANDARDLÖSNINGAR
Lös upp en noggrant uppvägd mängd standardsubstans (4.14) i 50-
procentig metanol (4.5) och späd så att en utgångslösning erhålls som
innehåller 100 µg flavofosfolipol per milliliter. Om denna lösning
förvaras i tillslutna kolvar vid 4 ºC är den stabil i upp till två månader.
Av denna lösning bereds genom successiv utspädning med 50-procentig
metanol (4.5) följande lösningar:
S
80,2 µg/ml
S40,1 µg/ml
S20,05 µg/ml
S10,025µg/ml
7. BEREDNING AV EXTRAKTET
7.1Extraktion
7.1.1Koncentrat, premixer och mineralfoder
Väg upp 2,0-5,0 g av provet och tillsätt cirka 150 mg askorbinsyra
(4.13). Homogenisera med 150 ml 50-procentig metanol (4.5) i en
konisk kolv (5.3) och justera pH till 8,1-8,2 med cirka 400 mg tris(hyd-
roxymetyl)aminometan (4.7). Kontrollera pH-värdet med
indikatorpapper (4.12). Låt stå under 15 minuter och justera därefter på
nytt pH till 8,1-8,2 med tris(hydroxymetyl)aminometan (4.7) och koka
under 10 minuter med återloppskylare (5.4) under ständig omrörning.
Låt svalna, centrifugera blandningen och dekantera extraktet.
7.1.2Andra foder
Väg upp en mängd av provet på 5,0-30,0 g som innehåller minst 30 µg
flavofosfolipol. Homogenisera med 150 ml 50-procentig metanol (4.5) i
en konisk kolv (5.3) och justera pH till 8,1-8,2 med cirka 400 mg
tris(hydroxymetyl)aminometan (4.7). Kontrollera pH-värdet med indika-
torpapper (4.12). Låt stå under 15 minuter och justera därefter på nytt
pH till 8,1-8,2 med tris(hydroxymetyl)aminometan (4.7) och koka under
10 minuter med återloppskylare (5.4) under ständig omrörning. Låt
svalna, centrifugera blandningen och dekantera extraktet.
7.2Rening (detta moment kan uteslutas då det gäller koncentrat,
premixer och mineralfoder)
Blanda 110 ml av extraktet med 11 g katjonbytare (4.9), koka under en
minut med återloppskylare (5.4) under ständig omrörning. Avskilj
katjonbytaren genom centrifugering eller filtrering. Blanda 100 ml av
extraktet med 150 ml metanol (4.4) och lagra lösningen under 12-15
timmar vid 4 ºC. Filtrera av den flockiga massan medan den är kall.
Plugga igen den nedre ändan av ett glasrör (5.1) med glasull (4.11), häll
5 ml anjonbytare (4.10) i röret och skölj kolonnen med 100 ml 80-
procentig metanol (4.6). Flytta med tratt (5.2) till kolonnen en volym
filtrat på minst 100 ml som kan antas innehålla 16 µg flavofosfolipol
(200 ml för ett foderprov på 30 g vid 1 ppm). Om så är nödvändigt1978L0633 — SV — 20.12.1983 — 002.001 — 8
▼B
späds filtratet innan det förs till kolonnen med 80-procentig metanol
(4.6) så att en antagen halt av flavofosfolipol på 16 µg/100 ml erhålls.
Justera flödeshastigheten till cirka 2 ml/minut. Kassera spillvätskan.
Skölj därefter kolonnen med 50 ml 80-procentig metanol (4.6) och
kassera spillvätskan.
Eluera flavofosfolipolen med kaliumklorid-metanollösningen (4.8) med
en fortsatt flödeshastighet av cirka 2 ml/minut. Samla in 50 ml av
eluatet i en mätkolv, tillsätt 30 ml vatten och blanda. Denna lösning
bör ha en flavofosfolipolhalt på 0,2 µg/ml (= U8).
7.3Analyslösningar
Om så är nödvändigt (dvs. om reningsmomentet har uteslutits) späds det
extrakt som har erhållits enligt 7.1.1 med 50-procentig metanol (4.5) så
att en förväntad flavofosfolipolhalt på 0,2 µg/ml (= U8) erhålls.
Av lösning U8beredslös ningarna U4(förväntad halt: 0,1 µg/ml), U2(förväntad halt: 0,05 µg/ml) och U1(förväntad halt: 0,025 µg/ml) genom
successiv utspädning (1:1) med 50-procentig metanol (4.5).
8. ANALYSMETOD
8.1Inokulering av analyssubstratet
Inokulera analyssubstratet (4.2.2) med bakteriesuspensionen (3.2) vid
cirka 50 ºC. Bestäm genom preliminära försök på plattor med analyssub-
stratet (4.2.2) vilken mängd av bakteriesuspensionen som krävs för att
ge så stora och tydliga hämningszoner som möjligt vid de olika koncen-
trationerna av flavofosfolipol (cirka 30 ml/liter).
8.2Preparering av plattorna
Agardiffusionen utförs på plattor med de fyra koncentrationerna av stan-
dardlösningen (S8,S4,S2och S1) och av analyslösningen (U8,U4,U2och
U1). Det är nödvändigt att dessa fyra koncentrationerav extrakt och stan-
dardlösning placeras på varje platta. Välj därför plattor som är så stora
att minst åtta hål med en diameter av 10-13 mm och med minst 30 mm
mellan mittpunkterna kan göras i agarsubstratet. Provet kan utföras på
glasplattor med en övertäckt aluminium- eller plastring, 200 mm i
diameter och 20 mm hög, placerad högst upp.
Täck plattorna med en så stor mängd av substratet (4.2.1), att ett cirka
1,5 mm tjockt lager bildas(45 ml till en platta med 200 mm diameter).
Låt det jämnt fördelade lagret stabiliseras och täck därefter med ett nytt
skikt av en så stor mängd av substratet (4.2.2), som inokulerats enligt
8.1, att det nya skiktets tjocklek blir 1 mm (30 ml till en platta med
200 mm diameter). Låt på nytt det jämnt fördelade skiktet stabiliseras,
borra hålen och placera de exakt uppmätta volymerna analys- och stan-
dardlösning i hålen (mellan 0,10 och 0,15 ml i varje hål beroende på
diameter).
Anbringa varje koncentration minst fyra gånger så att varje bestämning
sker på grundval av en bedömning av 32 hämningszoner.
8.3Inkubation
Inkubera plattorna under 16-18 timmar vid 28-30 ºC.
9. UTVÄRDERING
Mät hämningszonernas diameter med 0,1 mm noggrannhet. För in
genomsnittsvärdena för varje koncentration på semilogaritmiskt rutat
papper så att logaritmen på koncentrationerna i förhållande till
hämningszonernas diameter visas. Fastställ optimumlinjerna för såväl
standardlösningen som extraktet, t.ex. enligt följande:
Bestäm optimumpunkten för lägsta nivå standardlösning (SL) med
formeln:
a) SL ¼7S1þ4S2þS4/C02S8
10
Bestäm optimumpunkten för högsta nivå standardlösning (SH) med
formeln:
b) SH ¼7S8þ4S4þS2/C02S1
101978L0633 — SV — 20.12.1983 — 002.001 — 9
▼B
Beräkna på motsvarande sätt optimumpunkterna för lägsta nivå extrakt
(UL) och högsta nivå extrakt (UH) genom att byta ut S1,S2,S4och S8mot U1,U2,U4och U8i ovanstående formler.
För in de beräknade värdena för SL och SH på samma papper och
förbind dem så att optimumlinjen för standardlösningen erhålls. För på
motsvarande sätt in UL och UH och förbind dem så att optimumlinjen
för extraktet erhålls.
Om ingen interferensförekommer s kall linjerna vara parallella. För
praktiska ändamål kan linjerna anses vara parallella om värdena (SH-
SL) och (UH-UL) inte avviker med mer än 10 % från sina medelvärden.
Om linjerna inte visar sig vara parallella kan antingen U1och S1eller U8och S8avlägsnas och SL, SH, UL och UH beräknas med följande alter-
nativformler så att alternativa optimumlinjer erhålls:
a′)S L ¼5S1þ2S2/C0S4
6eller5S2þ2S4/C0S8
6
b′)S H ¼5S4þ2S2/C0S1
6eller5S8þ2S4/C0S2
6
och på motsvarande sätt för UL och UH. Samma kontroll som tidigare
måste göras av parallelliteten. Det skall anges på slutrapporten att resul-
tatet har beräknatsmed tre nivåer.
När linjerna kan anses parallella beräknaslogaritmen på den relativa
aktiviteten (log A) med någon av följande formler:
För fyra nivåer
c) log A ¼U1þU2þU4þU8/C0S1/C0S2/C0S4/C0S8Þ/C20;602
U4þU8þS4þS8/C0U1/C0U2/C0S1/C0S2
För tre nivåer
d) log A ¼U1þU2þU4/C0S1/C0S2/C0S4Þ/C20;401
U4þS4þU1/C0S1
eller
d′) log A ¼U2þU4þU8/C0S2/C0S4/C0S8Þ/C20;401
U8þS8/C0U2/C0S2
Reell aktivitet = antagen aktivitet × relativ aktivitet
Om linjerna inte befinns vara parallella upprepasbes tämningen. Om
parallellitet ändå inte uppstår beräknas logaritmen på den relativa aktivi-
teten (log A) med formel c. Resultatet av detta måste dock betraktas
som approximativt och detta skall anges i slutrapporten.
10. REPETERBARHET
Skillnaden mellan resultaten av två bestämningar som utförts på samma
prov av samma analytiker får inte överstiga
0,5 mg/kg, absolutvärde, för halter av flavofosfolipol från 1 och till och
med 2 mg/kg,
25 % i förhållande till det högsta värdet för halter över 2 och till och
med 10 mg/kg,
20 % i förhållande till det högsta värdet för halter över 10 och till och
med 25 mg/kg,
5 mg/kg, absolutvärde, för halter över 25 och till och med 50 mg/kg,10 % i förhållande till det högsta värdet vid halter över 50 mg/kg.
3.BESTÄMNING AV MIKROMINERALÄMNENA (SPÅRÄMNENA)
JÄRN, KOPPAR, MANGAN OCH ZINK
1. SYFTE OCH RÄCKVIDD
Med denna metod är det möjligt att bestämma spårämnena järn, koppar,
mangan och zink i foder. De lägsta gränserna för bestämningen är:
järn (Fe): 20 mg/kg1978L0633 — SV — 20.12.1983 — 002.001 — 10
▼B
koppar (Cu): 10 mg/kg
mangan (Mn): 20 mg/kg
zink (Zn): 20 mg/kg
2. PRINCIP
Provet löses upp i saltsyra efter sönderdelning av eventuella organiska
ämnen. Spårämnena järn, koppar, mangan och zink bestäms efter
lämplig utspädning genom atomabsorptionsspektrometri.
3. REAGENS
Inledande anmärkningar
Vid beredning av reagens och analyslösningar skall man använda vatten
som är fritt från de katjoner som skall bestämmas genom att det
antingen har dubbeldestillerats i en apparat av borsilikatglas eller
kvartsglas eller har genomgått dubbel behandling med jonbytesharts.
Reagensen måste minst vara av analytisk renhet (pa). Det måste kontrol-
leras genom ett blankprov att de är fria från det spårämne som skall
bestämmas. Om det visar sig nödvändigt måste reagensen renas ytterli-
gare.
I stället för de standardlösningar som beskrivs nedan kan kommersiella
standardlösningar användas, förutsatt att de är garanterade och att de
kontrollerasföre användningen.
3.1 Saltsyra pa (d: 1,19).
3.2 Saltsyra pa (6 M).
3.3 Saltsyra pa (0,5 M).3.4 38-40-procentig fluorvätesyra (volym/volym) med en järnhalt under 1 mg
Fe/liter och en återstod efter indunstning under 10 mg (som sulfat)/liter.
3.5 Svavelsyra pa (d: 1,84).
3.6 Väteperoxid pa [cirka 100 volymer syre (30 viktprocent)].
3.7 Standardjärnlösning (1 000 µg Fe/ml) beredd på följande sätt: lös upp 1 g
järntråd pa i 200 ml saltsyra 6 M (3.2), tillsätt 16 ml väteperoxid (3.6)
och fyll på vatten till en liter.
3.7.1 Arbetsstandardjärnlösning (100 µg Fe /ml) beredd genom utspädning av
standardlösningen (3.7) med vatten (1:9).
3.8 Standardkopparlösning (1 000 µg Cu/ml) beredd på följande sätt: lös upp
1 g koppar i pulverform (pa) i 25 ml saltsyra 6 M (3.2), tillsätt 5 ml
väteperoxid (3.6) och fyll på vatten till en liter.
3.8.1 Arbetsstandardkopparlösning (10 µg Cu/ml) beredd genom utspädning
av standardlösningen (3.8) med vatten (1:9) varefter den erhållna
lösningen späds med vatten (1:9).
3.9 Standardmanganlösning (1 000 µg Mn/ml) beredd på följande sätt: lös
upp 1 g mangan i pulverform (pa) i 25 ml saltsyra 6 M (3.2) och fyll
på vatten till en liter.
3.9.1 Arbetsstandardmanganlösning (10 µg Mn/ml) beredd genom utspädning
av standardlösningen (3.9) med vatten (1:9) varefter den erhållna
lösningen späds med vatten (1:9).
3.10 Standardzinklösning (1 000 µg Zn/ml) beredd på följande sätt: lös upp
1 g zink i rems- eller bladform (pa) i 25 ml saltsyra 6 M (3.2) och fyll
på vatten till en liter.
3.10.1 Arbetsstandardzinklösning (10 µg Zn/ml) beredd genom utspädning av
standardlösningen (3.10) med vatten (1:9) varefter den erhållna
lösningen späds med vatten (1:9).
3.11 Lantankloridlösning beredd på följande sätt: lös upp 12 g lantanoxid i
150 ml vatten, tillsätt 100 ml saltsyra 6 M (3.2) och fyll på vatten till
en liter.
4. UTRUSTNING
4.1 Muffelugn med temperaturreglering och skrivare.
4.2 Laboratorieglaset måste vara av resistent borsilikattyp och helst endast
användas för bestämning av spårämnen.
4.3 Platinadegel och (ej obligatoriskt) kvartsdegel.1978L0633 — SV — 20.12.1983 — 002.001 — 11
▼B
4.4 Atomabsorptionsspektrofotometer som motsvarar de krav metoden
ställer i fråga om känslighet och precision inom det aktuella området.
5. UTFÖRANDE
5.1Prov som innehåller organiska ämnen
5.1.1Föraskning och preparering av lösningen för analys (*)
i) Placera 5-10 g av provet, som vägts upp med 0,2 mg noggrannhet, i
en degel av platina eller kvarts(4.3) (s e anmärkning b), torka i ugn
vid 105 ºC och för in degeln i den kalla muffelugnen (4.1). Stäng
ugnen (se anmärkning c) och höj temperaturen gradvis till 450-
475 ºC under cirka 90 minuter. Behåll denna temperatur under 4-16timmar (t.ex. över natten) så att kolhaltiga ämnen avlägsnas, öppna
därefter ugnen och låt svalna (se anmärkning d).
Tvätta ur degeln med sammanlagt cirka 5 ml saltsyra (3.1) som
sedan långsamt och försiktigt hälls över i bägaren (en kraftig reak-
tion kan uppstå på grund av CO
2-bildning).
Tillsätt saltsyra (3.1) droppvis under omskakning tills all skumning
har upphört. Indunsta tills det är torrt under omrörning då och då
med glasstav.
Tillsätt därefter 15 ml saltsyra 6 M (3.2) till återstoden följt av cirka
120 ml vatten. Rör om med glasstaven, som skall lämnas kvar i
bägaren, och täck bägaren med ett klockglas. Koka upp försiktigt
och behåll lösningen vid kokpunkten tills det inte längre kan iakttas
någon aska som löses upp. Filtrera på askfritt filterpapper och samla
in filtratet i en 250 ml mätkolv. Skölj bägaren och filtrera en gång
med 5 ml varm saltsyra 6 M (3.2) och två gånger med kokande
vatten. Fyll mätkolven till märket med vatten (HCl-koncentration
cirka 0,5 M).
ii) Om återstoden i filtret förefaller svart (kol) skall den på nytt placeras
i ugnen och åter föraskas vid 450-475º C. Denna föraskning, som
bara kräver några timmar (cirka tre till fem timmar), är avslutad när
askan förefaller vit eller nästan vit. Lös upp återstoden med cirka
2 ml saltsyra (3.1), indunsta tills detta är torrt och tillsätt 5 ml salt-
syra 6 M (3.2). Upphetta, filtrera lösningen till mätkolven och fyll på
vatten till märket (HCl-koncentration cirka 0,5 M).
Anmärkningar:
a) Vid bestämning av spårämnen är det viktigt att vara uppmärksam på
riskerna för kontaminering, särskilt av zink, koppar och järn. Därför
måste den utrustning som används vid prepareringen av proven varafri från dessa metaller.
För att minska den allmänna risken för kontaminering skall man
arbeta i dammfri miljö med ytterst noggrant rengjord utrustning och
omsorgsfullt diskat laboratorieglas. Bestämning av zink är särskilt
känslig för många slag av kontaminering, t.ex. genom glas, reagens
och damm.
b) Vikten av det prov som skall föraskas beräknas utifrån fodrets
ungefärliga halt av spårämnen i förhållande till känsligheten hos den
spektrofotometer som används. Då det gäller vissa foder med låga
halter av spårämnen kan det vara nödvändigt att utgå från ett prov
på 10-20 g och arbeta fram en slutlig lösning på endast 100 ml.
c) Föraskningen måste utföras i stängd ugn utan tillförsel av luft eller
syre.
d) Pyrometern får inte visa högre temperatur än 475º C.
5.1.2Spektrofotometrisk bestämning
5.1.2.1 Beredning av kalibreringslösningarna1978L0633 — SV — 20.12.1983 — 002.001 — 12
(*) Grönfoder (färskt eller torkat) innehåller ofta stora mängder vegetabilisk kisel som
kan binda spårämnen och måste avlägsnas. Då det gäller prov av sådant foder måste
därför följande modifierade utförande tillämpas: Utför moment 5.1.1 i till och med
filtreringen. Tvätta filterpapperet som innehåller den olösliga återstoden två gånger ikokande vatten och placera det i en platinadegel (4.3). Upphetta till glödning i muffe-lugnen (4.1) vid en temperatur under 550 ºC tillsalla kolhaltiga ämnen helt haravlägsnats. Låt svalna, tillsätt några droppar vatten och därefter 10-15 ml fluorväte-
syra (3.4) och indunsta vid cirka 150 ºC tills det är torrt. Om något kisel finns kvar i
återstoden löses detta med några milliliter fluorvätesyra (3.4) och indunstas tills det ärtorrt. Tillsätt fem droppar svavelsyra (3.5) och upphetta tills inga vita ångor längreavges. Tillsätt 5 ml saltsyra 6 M (3.2) och cirka 30 ml vatten, upphetta, filtreralösningen i en 250 ml mätkolv och fyll på vatten till märket (HCl-koncentration cirka
0,5 M). Fortsätt därefter med bestämningen från och med punkt 5.1.3.
▼B
Bered, för vart och ett av de spårämnen som skall bestämmas, en serie
kalibreringslösningar av arbetsstandardlösningarna (3.7.1, 3.8.1, 3.9.1
och 3.10.1) med en HCl-koncentration på cirka 0,5 M för varje kalibrer-
ingslösning och, i fråga om järn, mangan och zink, en
lantankloridkoncentration som motsvarar 0,1 % La (vikt/volym).
Koncentrationerna av spårämnena måste väljas så att de ligger inom
känslighetsområdet för den spektrofotometer som används. Följande
tabeller ger exempel på sammansättningen hos typiska serier av kalibrer-
ingslösningar; beroende på vilken typ av spektrofotometer som används
och den känslighet den har kan det dock vara nödvändigt att välja andra
koncentrationer.
Järn
µg Fe/ml 0 0,5 1 2 3 4 5
ml arbetsstan-
dardlösning (3.7.1)
(1 ml = 100 µg Fe) 0 0,5 1 2 3 4 5
+ ml 6 N HCl (3.2) 7 7 7 7 7 7 7
+ 10 ml lantankloridlösning (3.11) samt vatten till 100 ml.
Koppar
µg Cu/ml 0 0,1 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
ml arbetsstan-
dardlösning (3.8.1)
(1 ml = 100 µg Cu) 0 1 2 4 6 8 10
+ ml 6 N HCl (3.2) 8 8 8 8 8 8 8
Fyll på vatten till 100 ml.
Mangan
µg Mn/ml 0 0,1 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
ml arbetsstan-
dardlösning (3.9.1)
(1 ml = 10 µg Mn) 0 1 2 4 6 8 10
+ ml 6 M HCl (3.2) 7 7 7 7 7 7 7
+ 10 ml lantankloridlösning (3.11) samt vatten till 100 ml.
Zink
µg Zn/ml 0 0,05 0,1 0,2 0,4 0,6 0,8
ml arbetsstan-
dardlösning
(3.10.1)
(1 ml = 10 µg Zn) 0 0,5 1 2 4 6 8
+ ml 6 M HCl (3.2) 7 7 7 7 7 7 7
+ 10 ml lantankloridlösning (3.11) samt vatten till 100 ml.
5.1.2.2 Preparering av lösningen för analys
Vid bestämning av koppar kan normalt den lösning som beretts enligt
punkt 5.1.1 användas direkt. Om det är nödvändigt att justera dess
koncentration så att den ligger inom intervallet för kalibreringslösning-
arna kan en uppmätt del pipetteras till en 100 ml mätkolv och saltsyra
0,5 M (3.3) tillsättas upp till märket.
Vid bestämning av järn, mangan och zink pipetteras en uppmätt del av
den lösning som beretts enligt 5.1.1 till en 100 ml mätkolv, 10 ml
lantankloridlösning (3.11) tillsätts och saltsyra 0,5 M (3.3) fylls på upp
till märket (se även punkt 8, Anmärkning).1978L0633 — SV — 20.12.1983 — 002.001 — 13
▼B
5.1.2.3 Blankprov
Blankprovet måste omfatta samtliga moment som föreskrivs i denna
metod med undantag av att analysprovet utesluts.
Kalibreringslösning 0 får inte användas vid blankprovet.
5.1.2.4 Mätning av atomabsorption
Mät atomabsorptionen hos kalibreringslösningarna samt hos den lösning
som skall analyseras med en oxiderande luft-acetylenlåga vid följande
våglängder:
Fe: 248,3 nm
Cu: 324,8 nm
Mn: 279,5 nm
Zn: 213,8 nm
Utför varje mätning fyra gånger.
5.2Mineralfoder
Om provet inte innehåller några organiska ämnen behövs ingen förbe-
redande föraskning. Följ anvisningarna från och med punkt 5.1.1 i
andra stycket. Indunstning med fluorvätesyra kan uteslutas.
6. RESULTATBERÄKNING
Beräkna med hjälp av en kalibreringskurva koncentrationen av
spårämnet i den lösning som analyseras och uttryck resultatet i
milligram spårämne per kilogram av provet (ppm).
7. REPETERBARHET
Skillnaden mellan resultaten av två parallella bestämningar som utförts
på samma prov av samma analytiker får inte överstiga
— 5 mg/kg, absolutvärde, för halter av spårämnet i fråga på upp till
50 mg/kg,
— 10 % av det högsta resultatet för halter av spårämnet i fråga över 50
och upp till 100 mg/kg,
— 10 mg/kg, absolutvärde, för halter av spårämnet i fråga över 100 och
upp till 200 mg/kg,
— 5 % av det högsta resultatet för halter av spårämnet i fråga över
200 mg/kg.
8. ANMÄRKNING
Närvaron av stora mängder fosfater kan påverka bestämningen av järn,
mangan och zink. Denna påverkan måste korrigeras genom tillsats av
lantankloridlösning (3.11). Om viktförhållandetCaþMg
P>2 är större
än 2 kan tillsatsen av lantankloridlösning till analyslösningen och kalib-
reringslösningarna uteslutas.1978L0633 — SV — 20.12.1983 — 002.001 — 14