1978L0633 — SV — 19.08.1981 — 001.001 — 1
Detta dokument är endast avsett som dokumentationshjälpmedel och institutionerna ansvarar inte för innehållet
►B KOMMISSIONENS ÅTTONDE DIREKTIV
av den 15 juni 1978
om gemenskapsmetoder för analys vid den officiella foderkontrollen
(78/633/EEG)
(EGT L 206, 29.7.1978, s. 43)
Ändrat genom:
Officiella tidningen
nr sida datum
►M1Kommissionens direktiv 81/680/EEG av den 30 juli 1981 L 246 32 29.8.1981
▼B
KOMMISSIONENS ÅTTONDE DIREKTIV
av den 15 juni 1978
om gemenskapsmetoder för analys vid den officiella foderkon-
trollen
(78/633/EEG)
EUROPEISKA GEMENSKAPERNAS KOMMISSION HAR ANTAGIT
DETTA DIREKTIV
med beaktande av Fördraget om upprättandet av Europeiska ekono-
miska gemenskapen,
med beaktande av rådets direktiv 70/373/EEG av den 20 juli 1970 om
införande av gemenskapsmetoder för provtagning och analys vid denofficiella foderkontrollen(
1), senast ändrat genom anslutningsakten,
särskilt artikel 2 i denna, och
med beaktande av följande:I det ovan nämnda direktivet krävs att den officiella foderkontrollen
skall utföras med användning av gemenskapsmetoder för provtagning
och analys i syfte att kontrollera att fodret motsvarar de krav somframgår av bestämmelser i lagar och andra författningar om foderskvalitet och sammansättning.
I kommissionens direktiv 71/250/EEG av den 15 juni 1971(
2), 71/393/
EEG av den 18 november 1971(3), 72/199/EEG av den 27 april
1972(4), 73/46/EEG av den 5 december 1972(5), 74/203/EEG av den
25 mars 1974(6), 75/84/EEG av den 20 december 1974(7) och 76/372/
EEG av den 1 mars 1976(8) har redan ett antal gemenskapsmetoder för
analys fastställts. Mot bakgrund av den utveckling som därefter skett påområdet är det lämpligt att nu anta en åttonde metodsamling.
De åtgärder som beslutas om i detta direktiv är förenliga med Ständiga
foderkommitténs yttrande.
HÄRIGENOM FÖRESKRIVS FÖLJANDE.
Artikel 1
1. Medlemsstaterna skall kräva att analyser vid den officiella foder-
kontrollen skall utföras med de metoder som beskrivs i bilagan till
detta direktiv då det gäller halter av zinkbacitracin, flavofosfolipol,
järn, koppar, mangan och zink.
Artikel 2
Medlemsstaterna skall sätta i kraft de lagar och andra författningar som
är nödvändiga för att följa detta direktiv den 1 januari 1979. De skall
genast underrätta kommissionen om detta.
Artikel 3
Detta direktiv riktar sig till medlemsstaterna.1978L0633 — SV — 19.08.1981 — 001.001 — 2
(1) EGT nr L 170, 3.8.1970, s. 2.
(2) EGT nr L 155, 12.7.1971, s. 13.
(3) EGT nr L 279, 20.12.1971, s. 7
(4) EGT nr L 123, 29.5.1972, s. 6.
(5) EGT nr L 83, 30.3.1973, s. 21.
(6) EGT nr L 108, 22.4.1974, s. 7.
(7) EGT nr L 32, 5.2.1975, s. 26.
(8) EGT nr L 102, 15.4.1976, s. 8▼M1
▼B
▼B
BILAGA
1.BESTÄMNING AV ZINKBACITRACIN GENOM DIFFUSION I
AGARSUBSTRAT
1. SYFTE OCH RÄCKVIDD
Denna metod är avsedd för bestämning av zinkbacitracin i foder,
koncentrat och premixer. Lägsta gräns för bestämningen är 5 mg/kg
(5 ppm)(*). Metoden är inte giltig om det förekommer påverkande
substanser, särskilt stora mängder koppar och askorbinsyra.
2. PRINCIP
Provet extraheras vid pH 2 med en blandning av metanol, vatten och
saltsyra. Extraktet bringas till pH 6,5, koncentreras (om så är
nödvändigt) och späds ut. Dess antibiotiska verkan bestäms genom
mätning av zinkbacitracinets diffusion i ett agarsubstrat som inokulerats
med Micrococcus luteus (Syn. M. flavus). Diffusion kan påvisas genom
att det bildas hämningszoner för mikroorganismen. Dessa zoners
diameter antas stå i direkt proportion till logaritmen på den antibiotiska
koncentrationen inom spektrumet för de använda antibiotiska koncentra-
tionerna.
3. MIKROORGANISM: MICROCOCCUS LUTEUS ATCC 10240
3.1Skötsel av den lagerhållna odlingen
Inokulera snedagar som odlingssubstrat (4.1) med Micrococcus luteus.
Inkubera under 24 timmar vid 30-37 ºC, förvara odlingen i kylskåp vid
cirka 4 ºC och upprepa inokuleringen varannan vecka på snedagar.
3.2Beredning av bakteriesuspensionen (a)
Samla in tillväxten från nypreparerad snedagar (3.1) med 2-3 ml koks-
altlösning (4.3). Använd denna suspension till att inokulera 250 ml
odlingssubstrat (4.1) som förvaras i en Rouxkolv och låt inkubera 18-
20 timmar vid 30-37 ºC. Samla in tillväxten i 25 ml koksaltlösning
(4.3) och blanda. Späd ut lösningen ett till tio med koksaltlösning (4.3).
Suspensionens ljustransmission måste vara cirka 75 % uppmätt vid
650 nm i en 1 cm-cell mot koksaltlösning (4.3).
4. ODLINGSSUBSTRAT OCH REAGENS
4.1Odlingssubstrat (b)
Köttpepton 6,0 g
Trypton 4,0 gJästextrakt 3,0 gKöttextrakt 1,5 g
Glukos 1,0 g
Agar 15,0 gVatten 1 000 mlpH 6,5-6,6 (efter sterilisering)
4.2Analyssubstrat
Trypton 10,0 g
Jästextrakt 3,0 g
Köttextrakt 1,5 gGlukos 1,0 gAgar 20,0 gTween 801 ml
Vatten 1000 ml
pH 6,5 (efter sterilisering)
4.3 Koksaltlösning 0,8 % (vikt/volym): lös 8 g natriumklorid pa i vatten och
späd till 1000 ml. Sterilisera.
4.4 Blandning av ren metanol, vatten och saltsyra pa (d: 1,18-1,19): 80/17,5/
2,5 (volym/volym/volym).1978L0633 — SV — 19.08.1981 — 001.001 — 3
(*) 1 mg zinkbacitracin för inblandning i foder motsvarar 42 internationella enheter (IE).
(a) Andra metoder får användas, förutsatt att det har fastställts att de ger liknande bakterie-
suspensioner.
(b) Varje kommersiellt odlingssubstrat med liknande sammansättning som ger samma
resultat får användas.
▼B
4.5Fosfatbuffert, pH 6,5
Kaliumvätefosfat, K2HPO4pa 22,15 g
Kaliumdivätefosfat, KH2PO4pa 27,85 g
Vatten till 1 000 ml
4.6 Saltsyra pa (d: 1,18-1,19).4.7 Saltsyra pa (0,1 M).
4.8 Natriumhydroxidlösning 1 M pa.
4.9 Bromkresolpurpurlösning 0,04 % (vikt/volym): lös upp 0,1 g bromkre-
solpurpur i 18,5 ml natriumhydroxidlösning 0,01 M. Tillsätt vatten till
250 ml och blanda.
4.10 Standardsubstans: zinkbacitracin vars verkan (i IE) är känd.
5. STANDARDLÖSNINGAR
Väg upp en mängd standardzinkbacitracin (4.10) som motsvarar 1050 IE
(enligt angiven aktivitet). Tillsätt 5 ml saltsyra 0,1 M (4.7) och låt stå i
15 minuter. Tillsätt 30 ml vatten, justera pH till 4,5 med fosfatbuffert
pH 6,5 (4.5) (cirka 4 ml), tillsätt vatten till 50 ml volym och blanda
väl (1 ml = 21 IE).
Av denna lösning bereds genom successiv utspädning med fosfatbuffert
pH 6,5 (4.5) följande lösningar:
S
80,42 IE/ml
S40,21 IE/ml
S20,105 IE/ml
S10,0525 IE/ml
6. BEREDNING AV EXTRAKTET
6.1Extraktion
6.1.1Koncentrat, premixer och mineralfoder
Väg upp 2,0-5,0 g av provet, tillsätt 30 ml av blandningen (4.4) och
skaka om hastigt. Kontrollera att pH är cirka 2. Skaka om under 10
minuter, tillsätt 30 ml fosfatbuffert pH 6,5 (4.5) och skaka om under
15 minuter. Späd med fosfatbuffert (4.5) så att en förväntad zinkbacitra-
cinhalt av 0,42 IE/ml (= U8) erhålls.
6.1.2Proteinkoncentrat
Väg upp 10,0 g av provet, tillsätt 50 ml av blandningen (4.4) och skaka
om hastigt. Kontrollera att pH är cirka 2. Skaka om under 10 minuter,
tillsätt 50 ml fosfatbuffert pH 6,5 (4.5) och skaka om under 15 minuter.
Späd med fosfatbuffert (4.5) så att en förväntad zinkbacitracinhalt av
0,42 IE/ml (=U8) erhålls.
6.1.3Övriga foder
Väg upp 10,0 g av provet (20,0 g vid en förväntad zinkbacitracinhalt av
5 mg/kg), tillsätt 25 ml av blandningen (4.4) och homogenisera under 10
minuter. Tillsätt 25 ml fosfatbuffert pH 6,5 (4.5), skaka om under 15
minuter och centrifugera. Ta 20 ml av dekanteringslösningen (superna-tanten) och justera pH till 6,5 med natriumhydroxidlösning 1 M (4.8)
med bromkresolpurpurlösningen (4.9) som indikator. Indunsta till cirka
4 ml i rotationsindunstare vid högst 35 ºC. Späd återstoden med vatten
så att en förväntad zinkbacitracinhalt av 0,42 IE/ml (=U
8) erhålls.
6.2Analyslösningar
Av lösning U8bereds lösningarna U4(förväntad halt: 0,21 IE/ml), U2(förväntad halt: 0,105 IE/ml) och U1(förväntad halt: 0,0525 IE/ml)
genom successiv utspädning (1:1) med fosfatbuffert (4.5).
7. ANALYSMETOD
7.1Inokulering av analyssubstratet
Inokulera analyssubstratet (4.2) med bakteriesuspensionen (3.2) vid
cirka 50 ºC. Bestäm genom preliminära försök på plattor med analyssub-
stratet (4.2) vilken mängd av bakteriesuspensionen som krävs för att ge
så stora och tydliga hämningszoner som möjligt vid de olika koncentra-
tionerna av zinkbacitracin.1978L0633 — SV — 19.08.1981 — 001.001 — 4
▼B
7.2Preparering av plattorna
Agardiffusionen utförs på plattor med de fyra koncentrationerna av stan-
dardlösningen (S8,S4,S2och S1) och av analyslösningen (U8,U4,U2och
U1). Det är nödvändigt att dessa fyra koncentrationer av extrakt och
standardlösning placeras på varje platta. Välj därför plattor som är så
stora att minst åtta hål med en diameter av 10-13 mm och med minst
30 mm mellan mittpunkterna kan göras i agarsubstratet. Provet kan
utföras på glasplattor med en övertäckt aluminium- eller plastring,
200 mm i diameter och 20 mm hög, placerad högst upp.
Täckplattorna med en så stor mängd av substratet (4.2), som inok ulerats
enligt 7.1, att ett cirka 2 mm tjockt lager bildas (50 ml till en platta med
200 mm diameter). Låt det jämnt fördelade lagret stabiliseras, borra
hålen och placera de exakt uppmätta volymerna analys- och standardlös-
ning i hålen (mellan 0,10 och 0,15 ml i varje hål beroende på diameter).
Anbringa varje koncentration minst fyra gånger så att varje bestämning
sker på grundval av en bedömning av 32 hämningszoner.
7.3Inkubation
Inkubera plattorna under 16-18 timmar vid 28-30º C.
8. UTVÄRDERING
Mät hämningszonernas diameter med 0,1 mm noggrannhet. För in
genomsnittsvärdena för varje koncentration på semilogaritmiskt rutat
papper så att logaritmen på koncentrationerna i förhållande till
hämningszonernas diameter visas. Fastställ optimumlinjerna för såväl
standardlösningen som extraktet, t.ex. enligt följande:
Bestäm optimumpunkten för lägsta nivå standardlösning (SL) med
formeln:
a) SL ¼7S1þ4S2þS4/C02S8
10
Bestäm optimumpunkten för högsta nivå standardlösning (SH) med
formeln:
b) SH ¼7S8þ4S4þS2/C02S1
10
Beräkna på motsvarande sätt optimumpunkterna för lägsta nivå extrakt
(UL) och högsta nivå extrakt (UH) genom att byta ut S1,S2,S4och S8mot U1,U2,U4och U8i ovanstående formler.
För in de beräknade värdena för SL och SH på samma papper och
förbind dem så att optimumlinjen för standardlösningen erhålls. För på
motsvarande sätt in UL och UH och förbind dem så att optimumlinjen
för extraktet erhålls.
Om ingen interferens förekommer skall linjerna vara parallella. För
praktiska ändamål kan linjerna anses vara parallella om värdena (SH-
SL) och (UH-UL) inte avviker med mer än 10 % från sina medelvärden.
Om linjerna inte visar sig vara parallella kan antingen U1och S1eller U8och S8avlägsnas och SL, SH, UL och UH beräknas med följande alter-
nativformler så att alternativa optimumlinjer erhålls:
a′)S L¼5S1þ2S2/C0S4
6eller5S2þ2S4/C0S8
6
b′)S H¼5S4þ2S2/C0S1
6eller5S8þ2S4/C0S2
6
och på motsvarande sätt för UL och UH. Samma kontroll som tidigare
måste göras av parallelliteten. Det skall anges på slutrapporten att resul-
tatet har beräknats med tre nivåer.
När linjerna kan anses parallella beräknas logaritmen på den relativa
aktiviteten (log A) med någon av följande formler:
För fyra nivåer
c) log A ¼U1þU2þU4þU8/C0S1/C0S2/C0S4/C0S8Þ/C20;602
U4þU8þS4þS8/C0U1/C0U2/C0S1/C0S21978L0633 — SV — 19.08.1981 — 001.001 — 5
▼B
För tre nivåer
d) log A ¼U1þU2þU4/C0S1/C0S2/C0S4Þ/C20;401
U4þS4þU1/C0S1
eller
d′) log A ¼U2þU4þU8/C0S2/C0S4/C0S8Þ/C20;401
U8þS8/C0U2/C0S2
Reell aktivitet = antagen aktivitet × relativ aktivitet
Om linjerna inte befinns vara parallella upprepas bestämningen. Om
parallellitet ändå inte uppstår beräknas logaritmen på den relativa aktivi-
teten (log A) med formel c. Resultatet av detta måste dockbetrak tas
som approximativt och detta skall anges i slutrapporten.
9. REPETERBARHET
Skillnaden mellan resultaten av två bestämningar som utförts på samma
prov av samma analytiker får inte överstiga
20 % i förhållande till det högsta värdet vid halter av zinkbacitracin på 5
till och med 25 mg/kg,
5 mg/kg, absolutvärde, för halter över 25 och till och med 50 mg/kg,10 % i förhållande till det högsta värdet vid halter över 50 mg/kg.
2.BESTÄMNING AV FLAVOFOSFOLIPOL GENOM DIFFUSION I
AGARSUBSTRAT
1. SYFTE OCH RÄCKVIDD
Denna metod är avsedd för bestämning av flavofosfolipol i foder,
koncentrat och premixer. Lägsta gräns för bestämningen är 1 mg/kg
(1 ppm).
2. PRINCIP
Provet extraheras med utspädd metanol genom uppvärmning med
återloppskylare. Efter centrifugering renas extraktet (om så är
nödvändigt) genom behandling med jonbyteshartser och späds ut.
Extraktets antibiotiska verkan bestäms genom mätning av flavofosfoli-
polens diffusion i ett agarsubstrat som inokulerats med Staphylococcus
aureus. Diffusionen kan påvisas genom att det bildas hämningszoner
för mikroorganismen. Dessa zoners diameter antas stå i direkt proportion
till logaritmen på den antibiotiska koncentrationen inom spektrumet för
de använda antibiotiska koncentrationerna.
3. MIKROORGANISM: STAPHYLOCOCCUS AUREUS ATCC 6538 P
3.1Skötsel av den lagerhållna odlingen
Inokulera snedagar som odlingssubstrat (4.1) med Staphylococcus
aureus. Inkubera under 24 timmar vid 37 ºC, förvara odlingen i kylskåp
vid cirka 4 ºC och upprepa inokuleringen varje månad på snedagar.
3.2Beredning av bakteriesuspensionen (
a)
Ta undan två provrör som fyllts med den lagerhållna odlingen (3.1) och
inokulera dem på nytt varje vecka. Inkubera under 24 timmar vid 37º C
och förvara provrören i kylskåp vid cirka 4 ºC.
Två till fyra provrör som innehåller odlingssubstrat (4.1) skall inokuleras
med denna tillväxt 24 timmar före analysen.
Inkubera under 16-18 timmar vid 37º C. Framställ en suspension av
tillväxten i koksaltlösning (4.3). Suspensionens ljustransmission måste
vara cirka 40 % uppmätt vid 578 nm i en 1 cm-cell mot koksaltlösning
(4.3).1978L0633 — SV — 19.08.1981 — 001.001 — 6
(a) Andra metoder får användas, förutsatt att det har fastställts att de ger liknande bakterie-
suspensioner.
▼B
4. ODLINGSSUBSTRAT OCH REAGENS
4.1Odlingssubstrat (a)
Köttpepton 6,0 g
Trypton 4,0 gJästextrakt 3,0 g
Köttextrakt 1,5 g
Glukos 1,0 gAgar 15,0 gVatten 1 00 mlpH 6,5 (efter sterilisering)
4.2Analyssubstrat
4.2.1Basskikt(
b)
Köttpepton 6,0 g
Jästextrakt 3,0 gKöttextrakt 1,5 gAgar 10,0 gVatten 1 00 mlpH 6,5 (efter sterilisering)
4.2.2Ympningsskikt
Som punkt 4.1, men med tillsats av 2,0 g skumhämmande silikonemul-
sion(
c).
4.3 Koksaltlösning 0,4 % (vikt/volym): lös 4 g natriumklorid pa i vatten och
späd till 1000 ml. Sterilisera.
4.4 Ren metanol.4.5 50-procentig metanol (volym/volym): späd 500 ml metanol (4.4) med
500 ml vatten.
4.6 80-procentig metanol (volym/volym): späd 800 ml metanol (4.4) med
200 ml vatten.
4.7 Tris(hydroxymetyl)aminometan pa.4.8 1,5-procentig lösning av kaliumklorid i metanol (vikt/volym): lös upp
1,5 g kaliumklorid pa i 20 ml vatten och fyll på metanol (4.4) till
100 ml.
4.9 Katjonbytare: Dowex 50W×8, 0,85-0,15 nm (DIN 4188), Na-form (kat.
Serva nr 41600) eller motsvarande.
4.10 Anjonbytare: Dowex 1×2, 0,30-0,15 nm (DIN 4188), Cl-form (kat.
Serva nr 41010) eller motsvarande. Förvaras före användning i 80-
procentig metanol under 12-14 timmar (4.6).
4.11 Glasull.4.12 pH-indikatorpapper (pH 6,6-8,1).4.13 Askorbinsyra.4.14 Standardsubstans: flavofosfolipol med känd aktivitet.
5. UTRUSTNING
5.1 Glasrör för kromatografi, inre diameter: 9 mm, längd 150-200 mm, med
avstängningsventil i den insvängda delen nedtill och anslutningsstycke
av matterat glas [till dropptratten (5.2)] upptill.
5.2 Dropptratt 250 ml med avstängningsventil och anslutningsstycke av
matterat glas.
5.3 250 ml konisk kolv med anslutningsstycke av matterat glas.5.4 Återloppskylare med anslutningsstycke av matterat glas.1978L0633 — SV — 19.08.1981 — 001.001 — 7
(a) Varje kommersiellt odlingssubstrat med liknande sammansättning som ger samma
resultat får användas, t.ex. oxoidantibiotikasubstrat 1 (CM 327) med tillsats av oxoi-
dagar nr 3 (L 13).
(b) Varje kommersiellt odlingssubstrat med liknande sammansättning som ger samma
resultat får användas, t.ex. oxoidantibiotikasubstrat 2 (CM 335) med tillsats av oxoi-dagar nr 3 (L 13).
(
c) t.ex. SE 2 från Wacker Chemie GmbH, München.
▼B
6. STANDARDLÖSNINGAR
Lös upp en noggrant uppvägd mängd standardsubstans (4.14) i 50-
procentig metanol (4.5) och späd så att en utgångslösning erhålls som
innehåller 100 µg flavofosfolipol per milliliter. Om denna lösning
förvaras i tillslutna kolvar vid 4 ºC är den stabil i upp till två månader.
Av denna lösning bereds genom successiv utspädning med 50-procentig
metanol (4.5) följande lösningar:
S80,2 µg/ml
S40,1 µg/ml
S20,05 µg/ml
S10,025µg/ml
7. BEREDNING AV EXTRAKTET
7.1Extraktion
7.1.1Koncentrat, premixer och mineralfoder
Väg upp 2,0-5,0 g av provet och tillsätt cirka 150 mg askorbinsyra
(4.13). Homogenisera med 150 ml 50-procentig metanol (4.5) i en
konisk kolv (5.3) och justera pH till 8,1-8,2 med cirka 400 mg tris(hyd-
roxymetyl)aminometan (4.7). Kontrollera pH-värdet med
indikatorpapper (4.12). Låt stå under 15 minuter och justera därefter på
nytt pH till 8,1-8,2 med tris(hydroxymetyl)aminometan (4.7) och koka
under 10 minuter med återloppskylare (5.4) under ständig omrörning.
Låt svalna, centrifugera blandningen och dekantera extraktet.
7.1.2Andra foder
Väg upp en mängd av provet på 5,0-30,0 g som innehåller minst 30 µg
flavofosfolipol. Homogenisera med 150 ml 50-procentig metanol (4.5) i
en konisk kolv (5.3) och justera pH till 8,1-8,2 med cirka 400 mg
tris(hydroxymetyl)aminometan (4.7). Kontrollera pH-värdet med indika-
torpapper (4.12). Låt stå under 15 minuter och justera därefter på nytt
pH till 8,1-8,2 med tris(hydroxymetyl)aminometan (4.7) och koka under
10 minuter med återloppskylare (5.4) under ständig omrörning. Låt
svalna, centrifugera blandningen och dekantera extraktet.
7.2Rening (detta moment kan uteslutas då det gäller koncentrat,
premixer och mineralfoder)
Blanda 110 ml av extraktet med 11 g katjonbytare (4.9), koka under en
minut med återloppskylare (5.4) under ständig omrörning. Avskilj
katjonbytaren genom centrifugering eller filtrering. Blanda 100 ml avextraktet med 150 ml metanol (4.4) och lagra lösningen under 12-15
timmar vid 4 ºC. Filtrera av den flockiga massan medan den är kall.
Plugga igen den nedre ändan av ett glasrör (5.1) med glasull (4.11), häll
5 ml anjonbytare (4.10) i röret och skölj kolonnen med 100 ml 80-
procentig metanol (4.6). Flytta med tratt (5.2) till kolonnen en volym
filtrat på minst 100 ml som kan antas innehålla 16 µg flavofosfolipol
(200 ml för ett foderprov på 30 g vid 1 ppm). Om så är nödvändigt
späds filtratet innan det förs till kolonnen med 80-procentig metanol
(4.6) så att en antagen halt av flavofosfolipol på 16 µg/100 ml erhålls.
Justera flödeshastigheten till cirka 2 ml/minut. Kassera spillvätskan.
Skölj därefter kolonnen med 50 ml 80-procentig metanol (4.6) och
kassera spillvätskan.
Eluera flavofosfolipolen med kaliumklorid-metanollösningen (4.8) med
en fortsatt flödeshastighet av cirka 2 ml/minut. Samla in 50 ml av
eluatet i en mätkolv, tillsätt 30 ml vatten och blanda. Denna lösning
bör ha en flavofosfolipolhalt på 0,2 µg/ml (= U
8).
7.3Analyslösningar
Om så är nödvändigt (dvs. om reningsmomentet har uteslutits) späds det
extrakt som har erhållits enligt 7.1.1 med 50-procentig metanol (4.5) så
att en förväntad flavofosfolipolhalt på 0,2 µg/ml (= U8) erhålls.
Av lösning U8bereds lösningarna U4(förväntad halt: 0,1 µg/ml), U2(förväntad halt: 0,05 µg/ml) och U1(förväntad halt: 0,025 µg/ml) genom
successiv utspädning (1:1) med 50-procentig metanol (4.5).
8. ANALYSMETOD
8.1Inokulering av analyssubstratet
Inokulera analyssubstratet (4.2.2) med bakteriesuspensionen (3.2) vid
cirka 50 ºC. Bestäm genom preliminära försök på plattor med analyssub-1978L0633 — SV — 19.08.1981 — 001.001 — 8
▼B
stratet (4.2.2) vilken mängd av bakteriesuspensionen som krävs för att
ge så stora och tydliga hämningszoner som möjligt vid de olika koncen-
trationerna av flavofosfolipol (cirka 30 ml/liter).
8.2Preparering av plattorna
Agardiffusionen utförs på plattor med de fyra koncentrationerna av stan-
dardlösningen (S8,S4,S2och S1) och av analyslösningen (U8,U4,U2och
U1). Det är nödvändigt att dessa fyra koncentrationerav extrakt och stan-
dardlösning placeras på varje platta. Välj därför plattor som är så stora
att minst åtta hål med en diameter av 10-13 mm och med minst 30 mm
mellan mittpunkterna kan göras i agarsubstratet. Provet kan utföras på
glasplattor med en övertäckt aluminium- eller plastring, 200 mm i
diameter och 20 mm hög, placerad högst upp.
Täckplattorna med en så stor mängd av substratet (4.2.1), att ett cirk a
1,5 mm tjockt lager bildas (45 ml till en platta med 200 mm diameter).
Låt det jämnt fördelade lagret stabiliseras och täckdärefter med ett nytt
skikt av en så stor mängd av substratet (4.2.2), som inokulerats enligt
8.1, att det nya skiktets tjocklek blir 1 mm (30 ml till en platta med
200 mm diameter). Låt på nytt det jämnt fördelade skiktet stabiliseras,
borra hålen och placera de exakt uppmätta volymerna analys- och stan-
dardlösning i hålen (mellan 0,10 och 0,15 ml i varje hål beroende på
diameter).
Anbringa varje koncentration minst fyra gånger så att varje bestämning
sker på grundval av en bedömning av 32 hämningszoner.
8.3Inkubation
Inkubera plattorna under 16-18 timmar vid 28-30 ºC.
9. UTVÄRDERING
Mät hämningszonernas diameter med 0,1 mm noggrannhet. För in
genomsnittsvärdena för varje koncentration på semilogaritmiskt rutat
papper så att logaritmen på koncentrationerna i förhållande till
hämningszonernas diameter visas. Fastställ optimumlinjerna för såväl
standardlösningen som extraktet, t.ex. enligt följande:
Bestäm optimumpunkten för lägsta nivå standardlösning (SL) med
formeln:
a) SL ¼7S1þ4S2þS4/C02S8
10
Bestäm optimumpunkten för högsta nivå standardlösning (SH) med
formeln:
b) SH ¼7S8þ4S4þS2/C02S1
10
Beräkna på motsvarande sätt optimumpunkterna för lägsta nivå extrakt
(UL) och högsta nivå extrakt (UH) genom att byta ut S1,S2,S4och S8mot U1,U2,U4och U8i ovanstående formler.
För in de beräknade värdena för SL och SH på samma papper och
förbind dem så att optimumlinjen för standardlösningen erhålls. För på
motsvarande sätt in UL och UH och förbind dem så att optimumlinjen
för extraktet erhålls.
Om ingen interferens förekommer skall linjerna vara parallella. För
praktiska ändamål kan linjerna anses vara parallella om värdena (SH-
SL) och (UH-UL) inte avviker med mer än 10 % från sina medelvärden.
Om linjerna inte visar sig vara parallella kan antingen U1och S1eller U8och S8avlägsnas och SL, SH, UL och UH beräknas med följande alter-
nativformler så att alternativa optimumlinjer erhålls:
a′)S L¼5S1þ2S2/C0S4
6eller5S2þ2S4/C0S8
6
b′)S H¼5S4þ2S2/C0S1
6eller5S8þ2S4/C0S2
6
och på motsvarande sätt för UL och UH. Samma kontroll som tidigare
måste göras av parallelliteten. Det skall anges på slutrapporten att resul-
tatet har beräknats med tre nivåer.1978L0633 — SV — 19.08.1981 — 001.001 — 9
▼B
När linjerna kan anses parallella beräknas logaritmen på den relativa
aktiviteten (log A) med någon av följande formler:
För fyra nivåer
c) log A ¼U1þU2þU4þU8/C0S1/C0S2/C0S4/C0S8Þ/C20;602
U4þU8þS4þS8/C0U1/C0U2/C0S1/C0S2
För tre nivåer
d) log A ¼U1þU2þU4/C0S1/C0S2/C0S4Þ/C20;401
U4þS4þU1/C0S1
eller
d′) log A ¼U2þU4þU8/C0S2/C0S4/C0S8Þ/C20;401
U8þS8/C0U2/C0S2
Reell aktivitet = antagen aktivitet × relativ aktivitet
Om linjerna inte befinns vara parallella upprepas bestämningen. Om
parallellitet ändå inte uppstår beräknas logaritmen på den relativa aktivi-
teten (log A) med formel c. Resultatet av detta måste dockbetrak tas
som approximativt och detta skall anges i slutrapporten.
10. REPETERBARHET
Skillnaden mellan resultaten av två bestämningar som utförts på samma
prov av samma analytiker får inte överstiga
0,5 mg/kg, absolutvärde, för halter av flavofosfolipol från 1 och till och
med 2 mg/kg,
25 % i förhållande till det högsta värdet för halter över 2 och till och
med 10 mg/kg,
20 % i förhållande till det högsta värdet för halter över 10 och till och
med 25 mg/kg,
5 mg/kg, absolutvärde, för halter över 25 och till och med 50 mg/kg,
10 % i förhållande till det högsta värdet vid halter över 50 mg/kg.
3.BESTÄMNING AV MIKROMINERALÄMNENA (SPÅRÄMNENA)
JÄRN, KOPPAR, MANGAN OCH ZINK
1. SYFTE OCH RÄCKVIDD
Med denna metod är det möjligt att bestämma spårämnena järn, koppar,
mangan och zinki foder. De lägsta gränserna för bestämningen är:
järn (Fe): 20 mg/kg
koppar (Cu): 10 mg/kg
mangan (Mn): 20 mg/kgzink(Zn): 20 mg/k g
2. PRINCIP
Provet löses upp i saltsyra efter sönderdelning av eventuella organiska
ämnen. Spårämnena järn, koppar, mangan och zink bestäms efter
lämplig utspädning genom atomabsorptionsspektrometri.
3. REAGENS
Inledande anmärkningarVid beredning av reagens och analyslösningar skall man använda vatten
som är fritt från de katjoner som skall bestämmas genom att det
antingen har dubbeldestillerats i en apparat av borsilikatglas eller
kvartsglas eller har genomgått dubbel behandling med jonbytesharts.
Reagensen måste minst vara av analytiskrenhet (pa). Det måste k ontrol-
leras genom ett blankprov att de är fria från det spårämne som skall
bestämmas. Om det visar sig nödvändigt måste reagensen renas ytterli-
gare.
I stället för de standardlösningar som beskrivs nedan kan kommersiella
standardlösningar användas, förutsatt att de är garanterade och att de
kontrolleras före användningen.1978L0633 — SV — 19.08.1981 — 001.001 — 10
▼B
3.1 Saltsyra pa (d: 1,19).
3.2 Saltsyra pa (6 M).3.3 Saltsyra pa (0,5 M).3.4 38-40-procentig fluorvätesyra (volym/volym) med en järnhalt under 1 mg
Fe/liter och en återstod efter indunstning under 10 mg (som sulfat)/liter.
3.5 Svavelsyra pa (d: 1,84).3.6 Väteperoxid pa [cirka 100 volymer syre (30 viktprocent)].3.7 Standardjärnlösning (1 000 µg Fe/ml) beredd på följande sätt: lös upp 1 g
järntråd pa i 200 ml saltsyra 6 M (3.2), tillsätt 16 ml väteperoxid (3.6)
och fyll på vatten till en liter.
3.7.1 Arbetsstandardjärnlösning (100 µg Fe /ml) beredd genom utspädning av
standardlösningen (3.7) med vatten (1:9).
3.8 Standardkopparlösning (1 000 µg Cu/ml) beredd på följande sätt: lös upp
1 g koppar i pulverform (pa) i 25 ml saltsyra 6 M (3.2), tillsätt 5 ml
väteperoxid (3.6) och fyll på vatten till en liter.
3.8.1 Arbetsstandardkopparlösning (10 µg Cu/ml) beredd genom utspädning
av standardlösningen (3.8) med vatten (1:9) varefter den erhållna
lösningen späds med vatten (1:9).
3.9 Standardmanganlösning (1 000 µg Mn/ml) beredd på följande sätt: lös
upp 1 g mangan i pulverform (pa) i 25 ml saltsyra 6 M (3.2) och fyll
på vatten till en liter.
3.9.1 Arbetsstandardmanganlösning (10 µg Mn/ml) beredd genom utspädning
av standardlösningen (3.9) med vatten (1:9) varefter den erhållna
lösningen späds med vatten (1:9).
3.10 Standardzinklösning (1 000 µg Zn/ml) beredd på följande sätt: lös upp
1 g zinki rems- eller bladform (pa) i 25 ml saltsyra 6 M (3.2) och fyll
på vatten till en liter.
3.10.1 Arbetsstandardzinklösning (10 µg Zn/ml) beredd genom utspädning av
standardlösningen (3.10) med vatten (1:9) varefter den erhållna
lösningen späds med vatten (1:9).
3.11 Lantankloridlösning beredd på följande sätt: lös upp 12 g lantanoxid i
150 ml vatten, tillsätt 100 ml saltsyra 6 M (3.2) och fyll på vatten till
en liter.
4. UTRUSTNING
4.1 Muffelugn med temperaturreglering och skrivare.
4.2 Laboratorieglaset måste vara av resistent borsilikattyp och helst endast
användas för bestämning av spårämnen.
4.3 Platinadegel och (ej obligatoriskt) kvartsdegel.4.4 Atomabsorptionsspektrofotometer som motsvarar de krav metoden
ställer i fråga om känslighet och precision inom det aktuella området.
5. UTFÖRANDE
5.1Prov som innehåller organiska ämnen
5.1.1Föraskning och preparering avlösningen för analys (*)
i) Placera 5-10 g av provet, som vägts upp med 0,2 mg noggrannhet, i
en degel av platina eller kvarts (4.3) (se anmärkning b), torka i ugn
vid 105 ºC och för in degeln i den kalla muffelugnen (4.1). Stäng1978L0633 — SV — 19.08.1981 — 001.001 — 11
(*) Grönfoder (färskt eller torkat) innehåller ofta stora mängder vegetabilisk kisel som
kan binda spårämnen och måste avlägsnas. Då det gäller prov av sådant foder måste
därför följande modifierade utförande tillämpas: Utför moment 5.1.1 i till och med
filtreringen. Tvätta filterpapperet som innehåller den olösliga återstoden två gånger ikokande vatten och placera det i en platinadegel (4.3). Upphetta till glödning i muffe-lugnen (4.1) vid en temperatur under 550 ºC tills alla kolhaltiga ämnen helt haravlägsnats. Låt svalna, tillsätt några droppar vatten och därefter 10-15 ml fluorväte-
syra (3.4) och indunsta vid cirka 150 ºC tills det är torrt. Om något kisel finns kvar i
återstoden löses detta med några milliliter fluorvätesyra (3.4) och indunstas tills det ärtorrt. Tillsätt fem droppar svavelsyra (3.5) och upphetta tills inga vita ångor längreavges. Tillsätt 5 ml saltsyra 6 M (3.2) och cirka 30 ml vatten, upphetta, filtreralösningen i en 250 ml mätkolv och fyll på vatten till märket (HCl-koncentration cirka
0,5 M). Fortsätt därefter med bestämningen från och med punkt 5.1.3.
▼B
ugnen (se anmärkning c) och höj temperaturen gradvis till 450-475 ºC
under cirka 90 minuter. Behåll denna temperatur under 4-16 timmar
(t.ex. över natten) så att kolhaltiga ämnen avlägsnas, öppna därefter
ugnen och låt svalna (se anmärkning d).
Tvätta ur degeln med sammanlagt cirka 5 ml saltsyra (3.1) som
sedan långsamt och försiktigt hälls över i bägaren (en kraftig reak-
tion kan uppstå på grund av CO2-bildning).
Tillsätt saltsyra (3.1) droppvis under omskakning tills all skumning
har upphört. Indunsta tills det är torrt under omrörning då och då
med glasstav.
Tillsätt därefter 15 ml saltsyra 6 M (3.2) till återstoden följt av cirka
120 ml vatten. Rör om med glasstaven, som skall lämnas kvar ibägaren, och täck bägaren med ett klockglas. Koka upp försiktigt
och behåll lösningen vid kokpunkten tills det inte längre kan iakttas
någon aska som löses upp. Filtrera på askfritt filterpapper och samla
in filtratet i en 250 ml mätkolv. Skölj bägaren och filtrera en gång
med 5 ml varm saltsyra 6 M (3.2) och två gånger med kokande
vatten. Fyll mätkolven till märket med vatten (HCl-koncentration
cirka 0,5 M).
ii) Om återstoden i filtret förefaller svart (kol) skall den på nytt placeras
i ugnen och åter föraskas vid 450-475º C. Denna föraskning, som
bara kräver några timmar (cirka tre till fem timmar), är avslutad när
askan förefaller vit eller nästan vit. Lös upp återstoden med cirka
2 ml saltsyra (3.1), indunsta tills detta är torrt och tillsätt 5 ml salt-
syra 6 M (3.2). Upphetta, filtrera lösningen till mätkolven och fyll på
vatten till märket (HCl-koncentration cirka 0,5 M).
Anmärkningar:
a) Vid bestämning av spårämnen är det viktigt att vara uppmärksam på
riskerna för kontaminering, särskilt av zink, koppar och järn. Därför
måste den utrustning som används vid prepareringen av proven vara
fri från dessa metaller.
För att minska den allmänna risken för kontaminering skall man
arbeta i dammfri miljö med ytterst noggrant rengjord utrustning och
omsorgsfullt diskat laboratorieglas. Bestämning av zink är särskilt
känslig för många slag av kontaminering, t.ex. genom glas, reagens
och damm.
b) Vikten av det prov som skall föraskas beräknas utifrån fodrets
ungefärliga halt av spårämnen i förhållande till känsligheten hos den
spektrofotometer som används. Då det gäller vissa foder med låga
halter av spårämnen kan det vara nödvändigt att utgå från ett prov
på 10-20 g och arbeta fram en slutlig lösning på endast 100 ml.
c) Föraskningen måste utföras i stängd ugn utan tillförsel av luft eller
syre.
d) Pyrometern får inte visa högre temperatur än 475º C.
5.1.2Spektrofotometrisk bestämning
5.1.2.1 Beredning av kalibreringslösningarna
Bered, för vart och ett av de spårämnen som skall bestämmas, en serie
kalibreringslösningar av arbetsstandardlösningarna (3.7.1, 3.8.1, 3.9.1
och 3.10.1) med en HCl-koncentration på cirka 0,5 M för varje kalibrer-
ingslösning och, i fråga om järn, mangan och zink, en
lantankloridkoncentration som motsvarar 0,1 % La (vikt/volym).
Koncentrationerna av spårämnena måste väljas så att de ligger inom
känslighetsområdet för den spektrofotometer som används. Följande
tabeller ger exempel på sammansättningen hos typiska serier av kalibrer-
ingslösningar; beroende på vilken typ av spektrofotometer som används
och den känslighet den har kan det dock vara nödvändigt att välja andra
koncentrationer.
Järn
µg Fe/ml 0 0,5 1 2 3 4 5
ml arbetsstan-
dardlösning (3.7.1)
(1 ml = 100 µg Fe) 0 0,5 1 2 3 4 5
+ ml 6 N HCl (3.2) 7 7 7 7 7 7 7
+ 10 ml lantankloridlösning (3.11) samt vatten till 100 ml.1978L0633 — SV — 19.08.1981 — 001.001 — 12
▼B
Koppar
µg Cu/ml 0 0,1 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
ml arbetsstan-
dardlösning (3.8.1)
(1 ml = 100 µg Cu) 0 1 2 4 6 8 10
+ ml 6 N HCl (3.2) 8 8 8 8 8 8 8
Fyll på vatten till 100 ml.
Mangan
µg Mn/ml 0 0,1 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
ml arbetsstan-
dardlösning (3.9.1)
(1 ml = 10 µg Mn) 0 1 2 4 6 8 10
+ ml 6 M HCl (3.2) 7 7 7 7 7 7 7
+ 10 ml lantankloridlösning (3.11) samt vatten till 100 ml.
Zink
µg Zn/ml 0 0,05 0,1 0,2 0,4 0,6 0,8
ml arbetsstan-
dardlösning
(3.10.1)
(1 ml = 10 µg Zn) 0 0,5 1 2 4 6 8
+ ml 6 M HCl (3.2) 7 7 7 7 7 7 7
+ 10 ml lantankloridlösning (3.11) samt vatten till 100 ml.
5.1.2.2 Preparering av lösningen för analys
Vid bestämning av koppar kan normalt den lösning som beretts enligt
punkt 5.1.1 användas direkt. Om det är nödvändigt att justera dess
koncentration så att den ligger inom intervallet för kalibreringslösning-
arna kan en uppmätt del pipetteras till en 100 ml mätkolv och saltsyra
0,5 M (3.3) tillsättas upp till märket.
Vid bestämning av järn, mangan och zinkpipetteras en uppmätt del av
den lösning som beretts enligt 5.1.1 till en 100 ml mätkolv, 10 ml
lantankloridlösning (3.11) tillsätts och saltsyra 0,5 M (3.3) fylls på upp
till märket (se även punkt 8, Anmärkning).
5.1.2.3 Blankprov
Blankprovet måste omfatta samtliga moment som föreskrivs i denna
metod med undantag av att analysprovet utesluts.
Kalibreringslösning 0 får inte användas vid blankprovet.
5.1.2.4 Mätning av atomabsorption
Mät atomabsorptionen hos kalibreringslösningarna samt hos den lösning
som skall analyseras med en oxiderande luft-acetylenlåga vid följande
våglängder:
Fe: 248,3 nm
Cu: 324,8 nmMn: 279,5 nmZn: 213,8 nm
Utför varje mätning fyra gånger.
5.2Mineralfoder
Om provet inte innehåller några organiska ämnen behövs ingen förbe-
redande föraskning. Följ anvisningarna från och med punkt 5.1.1 i
andra stycket. Indunstning med fluorvätesyra kan uteslutas.1978L0633 — SV — 19.08.1981 — 001.001 — 13
▼B
6. RESULTATBERÄKNING
Beräkna med hjälp av en kalibreringskurva koncentrationen av
spårämnet i den lösning som analyseras och uttryckresultatet i
milligram spårämne per kilogram av provet (ppm).
7. REPETERBARHET
Skillnaden mellan resultaten av två parallella bestämningar som utförts
på samma prov av samma analytiker får inte överstiga
— 5 mg/kg, absolutvärde, för halter av spårämnet i fråga på upp till
50 mg/kg,
— 10 % av det högsta resultatet för halter av spårämnet i fråga över 50
och upp till 100 mg/kg,
— 10 mg/kg, absolutvärde, för halter av spårämnet i fråga över 100 och
upp till 200 mg/kg,
— 5 % av det högsta resultatet för halter av spårämnet i fråga över
200 mg/kg.
8. ANMÄRKNING
Närvaron av stora mängder fosfater kan påverka bestämningen av järn,
mangan och zink. Denna påverkan måste korrigeras genom tillsats av
lantankloridlösning (3.11). Om viktförhållandetCaþMg
P>2 är större
än 2 kan tillsatsen av lantankloridlösning till analyslösningen och kalib-
reringslösningarna uteslutas.1978L0633 — SV — 19.08.1981 — 001.001 — 14