1991R2568 — SV — 31.10.1995 — 013.001 — 1
Detta dokument är endast avsett som dokumentationshjälpmedel och institutionerna ansvarar inte för innehållet
►B KOMMISSIONENS FÖRORDNING (EEG) nr 2568/91
av den 11 juli 1991
om egenskaper hos olivolja och olivolja av pressrester och om lämpliga analysmetoder
(EGT L 248, 5.9.1991, s. 1)
Ändrad genom:
Officiella tidningen
nr sida datum
►M1 Kommissionens förordning (EEG) nr 3682/91 av den 17 december 1991 L 349 36 18.12.1991
►M2 Kommissionens förordning (EEG) nr 1429/92 av den 26 maj 1992 L 150 17 2.6.1992
►M3 Kommissionens förordning (EEG) nr 1683/92 av den 29 juni 1992 L 176 27 30.6.1992
►M4 Kommissionens förordning (EEG) nr 1996/92 av den 15 juli 1992 L 199 18 18.7.1992
►M5 Kommissionens förordning (EEG) nr 3288/92 av den 12 november 1992 L 327 28 13.11.1992
►M6 Kommissionens förordning (EEG) nr 183/93 av den 29 januari 1993 L 22 58 30.1.1993
►M7 ändrad genom commission Regulation (EEC) No 826/93 of 6 April
1993 (*)L 87 6 7.4.1993
►M8 Kommissionens förordning (EEG) nr 620/93 av den 17 mars 1993 L 66 29 18.3.1993
►M9 Kommissionens förordning (EG) nr 177/94 av den 28 januari 1994 L 24 33 29.1.1994
►M10 Kommissionens förordning (EG) nr 2632/94 av den 28 oktober 1994 L 280 43 29.10.1994
►M11 Kommissionens förordning (EG) nr 656/95 av den 28 mars 1995 L 69 1 29.3.1995
►M12 Kommissionens förordning (EG) nr 2527/95 av den 27 oktober 1995 L 258 49 28.10.1995
(*) Denna rättsakt finns inte publicerad på svenska.
▼B
KOMMISSIONENS FÖRORDNING (EEG) nr 2568/91
av den 11 juli 1991
om egenskaper hos olivolja och olivolja av pressrester och om
lämpliga analysmetoder
EUROPEISKA GEMENSKAPERNAS KOMMISSION HAR ANTAGIT
DENNA FÖRORDNING
med beaktande av Fördraget om upprättandet av Europeiska ekono-
miska gemenskapen,
med beaktande av rådets förordning nr 136/66/EEG av den 22
september 1966 om den gemensamma organisationen av marknadenför oljor och fetter (
1), senast ändrad genom förordning (EEG) nr 3577/
90 (2), särskilt artikel 35a i denna, och
med beaktande av följande:Bilagan till förordning nr 136/66/EEG innehåller beskrivningar och
definitioner av olivolja och olivolja av pressrester som saluförs inom
varje medlemsstat, inom gemenskapen och i handeln med tredje länder.
För att kunna skilja mellan de olika typerna av olja bör de fysiska och
kemiska egenskaperna hos var och en av dem och de organoleptiskaegenskaperna hos jungfruolja definieras så att renheten och kvalitetenför de berörda varorna kan säkerställas med beaktande av andra befint-liga bestämmelser.
Egenskaperna hos de olika typerna av olja bör bestämmas enhetligt
inom hela gemenskapen. För detta ändamål bör gemenskapsmetoder
för kemisk analys och organoleptisk värdering upprättas. Under enövergångsperiod bör användningen av andra analysmetoder som tillä-mpas i medlemsstaterna tillåtas, under förutsättning att de resultat somerhålls med gemenskapsmetoden skall vara avgörande vid en skillnad i
resultaten.
Definitionen av de fysiska och kemiska egenskaperna hos olivolja och
av analysmetoderna medför ändringar av tilläggsanmärkningarna ikapitel 15 i Kombinerade nomenklaturen.
Metoden för utvärdering av de organoleptiska egenskaperna hos jung-
fruolja innefattar upprättandet av paneler med utvalda och utbildadeprovsmakare. Den tid som krävs för att upprätta en sådan struktur bördärför fastställas. Med hänsyn till de svårigheter som några medlems-
stater kommer att möta när det gäller att upprätta paneler med
provsmakare, bör användning av paneler i andra medlemsstater tillåtas.
För att säkerställa att det system med avgifter som tillämpas på import
av olivpressrester fungerar på avsett sätt bör en gemensam metod förbestämning av oljehalten i dessa varor fastställas.
För att inte skapa handelshinder bör åtgärder vidtas för att olja som är
förpackad innan denna förordning träder i kraft skall kunna avyttras
under en begränsad tid.
Det är nödvändigt att upphäva kommissionens förordning (EEG)
nr 1058/77 (
3), senast ändrad genom förordning (EEG) nr 1858/88 (4).
Förvaltningskommittén för oljor och fetter har inte yttrat sig inom den
tid som dess ordförande har bestämt.1991R2568 — SV — 31.10.1995 — 013.001 — 2
(1) EGT nr 172, 30.9.1966, s. 3025/66.
(2) EGT nr L 353, 17.12.1990, s. 23.
(3) EGT nr L 128, 24.5.1977, s. 6.
(4) EGT nr L 166, 1.7.1988, s. 10.
▼B
HÄRIGENOM FÖRESKRIVS FÖLJANDE
Artikel 1
1. Oljor vars egenskaper överensstämmer med dem som anges i
punkterna 1, 2 och 3 i bilaga 1 till denna förordning skall anses varajungfruolja enligt innebörden i punkterna 1 a, b och c i bilagan tillförordning nr 136/66/EEG.
2. Olja vars egenskaper överensstämmer med dem som anges i
punkt 4 i bilaga 1 till denna förordning skall anses vara bomolja i den
mening som avses i punkt 1 d i bilagan till förordning nr 136/66/EEG.
3. Olja vars egenskaper överensstämmer med dem som anges i
punkt 5 i bilaga 1 till denna förordning skall anses vara raffineradolivolja i den mening som avses i punkt 2 i bilagan till förordning
nr 136/66/EEG.
4. Olja vars egenskaper överensstämmer med dem som anges i
punkt 6 i bilaga 1 till denna förordning skall anses vara ren olivolja iden mening som avses i punkt 3 i bilagan till förordning nr 136/66/EEG.
5. Olja vars egenskaper överensstämmer med dem som anges i
punkt 7 i bilaga 1 till denna förordning skall anses vara olivolja avpressrester i den mening som avses i punkt 4 i bilagan till förordningnr 136/66/EEG.
6. Olja vars egenskaper överensstämmer med dem som anges i
punkt 8 i bilaga 1 till denna förordning skall anses vara raffineradolivolja av pressrester i den mening som avses i punkt 5 i bilagan tillförordning nr 136/66/EEG.
7. Olja vars egenskaper överensstämmer med dem som anges i
punkt 9 i bilaga 1 till denna förordning skall anses vara olivolja av
pressrester i den mening som avses i punkt 6 i bilagan till förordningnr 136/66/EEG.
Artikel 2
1. Egenskaperna hos de oljor som fastställts ibi laga 1 skall
bestämmas ienli ghet med de analysmetoder som anges nedan.
— För bestämning av de fria fettsyrorna uttryckta som procent olje-
syra, den metod som anges ibi laga 2.
— För bestämning av peroxidindex, den metod som anges i bilaga 3.— För bestämning av alifatiska alkoholer, den metod som anges i
bilaga 4.
— För bestämning av sterolhalten, den metod som anges i bilaga 5.
— För bestämning av erytrodiol och uvaol, den metod som anges i
bilaga 6.
— För bestämning av mättade fettsyror i ställning 2 hos triglycerider,
den metod som anges ibi laga 7.
— För bestämning av trilinolenhalten, den metod som anges i bilaga 8.— För spektrofotometri, den metod som anges i bilaga 9.— För bestämning av fettsyresammansättningen, den metod som anges
ibi laga 10 A och 10 B.
— För bestämning av de flyktiga, halogenerade lösningsmedlen, den
metod som anges ibi laga 11.
— För utvärdering av de organoleptiska egenskaperna för jungfruolja,
den metod som anges i bilaga 12, tillämpad enligt punkt 2.
— För bevis på att raffinering har genomförts, den metod som anges i
bilaga 13.
— För bestämning av stigmastadiener, den metod som anges i bilaga
XVII.
2. Utvärdering av de organoleptiska egenskaperna skall genomföras
av►
M3en analytiker som är specialicerad på sensorisk analys eller1991R2568 — SV — 31.10.1995 — 013.001 — 3
▼M11
▼B
▼B
som bistås av specialister ◄enligt det förfarande som beskrivs i de
smakanmärkningar som anges i bilaga 12. Om analysen visar andraegenskaper än dem som erhållits genom beskrivning av produkten skall
provet undersökas av en provsmakarpanel enligt bestämmelserna i
bilaga 12.
Varje ytterligare analys skall genomföras av panelen enligt dessa
bestämmelser.
För att säkerställa de organoleptiska egenskaperna i samband med
åtgärder avseende interventionssystemet, skall panelen av provsmakaregenomföra denna utvärdering enligt bestämmelserna i bilaga 12.
Artikel 3
Fram till ►
M628 februari1993 ◄skall införandet av de analysme-
toder som anges i artikel 2 inte förhindra att medlemsstaterna använderandra beprövade och vetenskapligt giltiga metoder, under förutsättningatt produkter som anses uppfylla gällande regler för gemenskapsme-
toder skall tillåtas fri rörlighet. Innan andra metoder används skall de
berörda medlemsstaterna meddela dessa till kommissionen.
Om någon av de andra metoderna ger ett resultat som skiljer sig från
dem som erhålls genom gemenskapsmetoden, skall det resultat som
erhålls genom den senare metoden vara avgörande.
Artikel 3a
Om tvist uppstår om de organoleptiska egenskaperna hos en olja som
har släppts ut på marknaden, får de berörda parterna hänskjuta ärendettill en av dem själva vald, godkänd smakpanel.
Artikel 3b
Om det fastställs att de organoleptiska egenskaperna hos en olja inte
överensstämmer med beskrivningen, skall den berörda medlemsstaten,utan att det påverkar övriga påföljder, tillämpa administrativa ekono-miska sanktioner som skall bestämmas mot bakgrund av hur allvarlig
den upptäckta överträdelsen är.
Vid bedömningen av överträdelsen skall särskild vikt läggas vid natur-
liga förändringar av oljans egenskaper vid förvaring under normalaförhållanden.
I början av varje halvår skall medlemsstaterna underrätta kommissionen
om antal och typ av överträdelser som har upptäckts samt om depåföljder som har tillämpats under det gångna halvåret.
Artikel 4
1. För att bedöma organoleptiska egenskaper skall medlemsstaterna
inrätta smakpaneler som är ansvariga för officiella kontroller av dessaegenskaper. Panelerna skall uppfylla följande villkor:
— De skall bestå av utvalda och utbildade provsmakare enligt de
bestämmelser som har fastställts för den metod som anges ibi laga12.
— De skall ha tillgång till de lokaler och den utrustning som fordras
för att genomföra organoleptiska bedömningar enligt de
bestämmelser som har fastställts för den metoden.
— De skall använda den särskilda vokabulär som används vid senso-
risk analys av olivolja, profilformuläret och den bedömningstabellsom har fastställts för denna metod.
— De skall åta sig att genomföra de organoleptiska bedömningar som
krävs på gemenskapsnivå eller på internationell nivå vid tiden för
de regelbundna proven och vid sammanträden om harmonisering-skriterier.
— De skall åta sig att årligen förse kommissionen med alla upplys-
ningar om förändringar bland panelernas medlemmar och om detantal bedömningar som de har genomfört som godkända paneler.1991R2568 — SV — 31.10.1995 — 013.001 — 4
▼M5
▼M5
Varje medlemsstat skall godkänna paneler som uppfyller ovanstående
kännetecken och som inrättas på deras territorium. Medlemsstaten skallutse en av dessa paneler för att utföra granskningar av analyser.
Paneler som upprättats av medlemsstaterna före den 1 november 1992
enligt de bestämmelser som fastställts för den metod som anges ibilaga 12, skall anses vara godkända enligt denna artikel.
Varje medlemsstat skall sända kommissionen och de andra medlems-
staterna en förteckning över godkända paneler.
2. Om medlemsstaterna har svårigheter att upprätta smakpaneler
inom sitt territorium, får de anlita en smakpanel som är godkänd i enannan medlemsstat.
3. Varje medlemsstat skall upprätta en förteckning över smakpaneler
som har upprättats av yrkes- eller branschorganisationer enligt de
villkor som fastställs i punkt 1 och skall säkerställa att dessa villkoruppfylls.
Artikel 5
Tilläggsanmärkningarna 2 4 till kapitel 15 i Kombinerade nomenkla-
turen, vilka fastställs i bilaga 1 till rådets förordning (EEG) nr 2658/
87 (
1), skall ersättas med texten i bilaga 14 till den här förordningen.
Artikel 6
1. Oljehalten i oljekakor och andra rester som erhållits vid extrak-
tion av olivolja (KN-nr 2306 90 11 och 2306 90 19) skall bestämmas
med användning av den metod som anges i bilaga 15.
2. Den oljehalt som anges ipunkt 1 skall uttryckas som vi ktprocent
olja iförhållande ti ll torrsubstans.
Artikel 7
De gemenskapsbestämmelser som rör närvaron av andra oönskade
ämnen än de som anges i bilaga 11 skall tillämpas.
Artikel 8
1. Medlemsstaterna skall meddela kommissionen vilka åtgärder de
har vidtagit för att genomföra denna förordning.
2. Medlemsstaterna skall till kommissionen i början av varje halvår
överlämna en redogörelse av de analysdata som hänför sig till proversom genomförts under det gångna halvåret.
Resultaten skall prövas av Förvaltningskommittén för oljor och fetter i
enlighet med förfarandet i artikel 39 i förordning nr 136/66/EEG.
Artikel 9
Förordning (EEG) nr 1058/77 skall upphöra att gälla.
Artikel 10
1. Denna förordning träder i kraft den tredje dagen efter det att den
har offentliggjorts i Europeiska gemenskapernas officiella tidning .D e n
metod som anges i bilaga 12 skall emellertid tillämpas från ►
M1den
1 november 1992 ◄, utom då det gäller åtgärder isamband med i nter-
ventionssystemet.
Den metoden skall inte tillämpas för jungfruolja som iordningställs för
marknaden före den 1 november 19921991R2568 — SV — 31.10.1995 — 013.001 — 5
(1) EGT nr L 256, 7. 9. 1987, s. 1.▼M6
▼B
▼M5
▼B
2. Denna förordning skall inte tillämpas på olivolja och olivolja av
pressrester som är förpackad före denna förordnings ikraftträdande ochsaluförs fram till och med den 31 oktober 1992.
Denna förordning är till alla delar bindande och direkt tillämplig i alla
medlemsstater.1991R2568 — SV — 31.10.1995 — 013.001 — 6
▼B
BILAGOR
Sammanfattning
Bilaga 1 Egenskaper hos olivolja …
Bilaga 2 Bestämning av fria fettsyror …
Bilaga 3 Bestämning av peroxidvärdet …Bilaga 4 ►
M6Bestämning av vaxinnehåll genom gaskromatografi med
kapillärkolonn ◄…
Bilaga 5 Bestämning av sammansättningen och halten av steroler genom
gaskromatografimed kapi llärkolonn …
Bilaga 6 Bestämning av erytrodiol och uvaol …Bilaga 7 Bestämning av fettsyror i 2-ställning i triglycerider …
Bilaga 8 Bestämning av sammansättningen av trilinolein …
Bilaga 9 Spektrofotometrisk undersökning …Bilaga 10 A Analys av metylestrar av fettsyror med gaskromatografi …
Bilaga 10 B Preparering av metylestrar av fettsyror i enlighet med rubrikerna
1 och 2 i bilaga 6 till förordning (EEG) nr 72/77 eller till den
metod som beskrivs nedan …
Bilaga 11 Bestämning av halten flyktiga halogenerade lösningsmedel i
olivolja …
Bilaga 12 Organoleptisk värdering av jungfruolja …
Bilaga 13 ►
M6Neutralisering och blekning av olivolja i laboratoriet ◄
…
Bilaga 14 Tilläggsanmärkningar 2, 3 och 4 till kapitel 15 i kombinerade
nomenklaturen …
Bilaga 15 Oljehalt i pressrester av oliver …
Bilaga 16 Bestämning av jodtal …
Bilaga XVII Metod för bestämning av stigmastadiener i vegetabiliska oljor
…1991R2568 — SV — 31.10.1995 — 013.001 — 7
▼M11
BILAGA I
EGENSKAPER HOS OLIVOLJA
Typ Syra %Peroxid-
värderne
jv/O2/kgHalogene-
rade
lösnings-
medel mg/
kg (1)Vaxer mg/
kgMättade
fettsyror i
ställning
hos trigly-
cerrides %Stigmasta-
diener (2)Erytrodiol
+ uvaal %Trilinolen
%Kolesterol
%Brassikas-
terol %Kampes-
terol %Stigmas-
terol %Betasistos-
terol (3)%Delta-7-
stigmas-
tenol %Totalmän-
gd steroler
mg/kg
1. Extra jungfruolja M 1,0 M 20 M 0,20 M 250 M 1,3 M 0,15 M 4,5 M 0,5 M 0,5 M 0,1 M 4,0 < Camp. m 93,0 M 0,5 m 1000
2. Jungfruolja M 2,0 M 20 M 0,20 M 250 M 1,3 M 0,15 M 4,5 M 0,5 M 0,5 M 0,1 M 4,0 < Camp. m 93,0 M 0,5 m 10003. Ordinär jung-
fruolja M 3,3 M 20 M 0,20 M 250 M 1,3 M 0,15 M 4,5 M 0,5 M 0,5 M 0,1 M 4,0 < Camp. m 93,0 M 0,5 m 1000
4. Bamolja m 3,3 m 20 m 0,20 M 350 M 1,3 M 0,50 M 4,5 M 0,5 M 0,5 M 0,1 M 4,0 — m 93,0 M 0,5 m 1000
5. Raffinerad
olivolja M 0,5 M 5 M 0,20 M 350 M 1,5 M 4,5 M 0,5 M 0,5 M 0,1 M 4,0 < Camp. m 93,0 M 0,5 m 1000
6. Olivolja M 1,5 M 15 M 0,20 M 350 M 1,5 M 4,5 M 0,5 M 0,5 M 0,1 M 4,0 < Camp. m 93,0 M 0,5 m 10007. Rå olivolja av
pressrester m 2,0 — — — M 1,8 m 12 M 0,7 M 0,5 M 0,1 M 4,0 — m 93,0 M 0,5 m 2500
8. Raffinerad
olivolja av
pressrester M 0,5 M 5 M 0,20 — M 2,0 m 12 M 0,6 M 0,5 M 0,1 M 4,0 < Camp. m 93,0 M 0,5 m 1800
9. Olivolja av
pressrester M 1,5 M 15 M 0,20 > 350 M 2,0 > 4,5 M 0,6 M 0,5 M 0,1 M 4,0 < Camp. m 93,0 M 0,5 m 1600
M = maximum, m = minimum
(1) Genomgående övre gräns för föreningar påvisade med elektrondetektor. För enskilda komponenter som påvisats är den övre gränsen 0,10 mg/kg
(2) Summa isomer som kunde (eller inte kunde) separera.
(3) Delta-5,23-stigmastadienol + chlerosterol + betasitosterol + sitostanol + delta-5-avenasterol + delta-5,24-stigmastadienoli.
Anm.
En olja diskvalificeras om bara en egenskap avviker från de fastställda kriterierna.▼M111991R2568 — SV — 31.10.1995 — 013.001 — 8
TypSyrasammansättning
Summa
transoleini-
somererSumma
translinoli-
somerer och
translinole-
nisomerer
%K232K270K270med
aluminium-
oxidDelta-K Panelprov
Myrsyror %Linolsyror
%Arakidsyror
%Elkosanol-
syror %Behensyror
%Lignocerin-
syror %
1. Extra jungfruolja M 0,05 M 0,9 M 0,6 M 0,4 M 0,2 M 0,2 M 0,05 M 0,05 M 2,50 M 0,20 M 0,10 M 0,01 m 6,5
2. Jungfruolja M 0,05 M 0,9 M 0,6 M 0,4 M 0,2 M 0,2 M 0,05 M 0,05 M 2,60 M 0,25 M 0,10 M 0,01 m 5,5
3. Ordinär jungfruolja M 0,05 M 0,9 M 0,6 M 0,4 M 0,2 M 0,2 M 0,05 M 0,05 M 2,60 M 0,25 M 0,10 M 0,01 m 3,54. Bomolja M 0,05 M 0,9 M 0,6 M 0,4 M 0,2 M 0,2 M 0,10 M 0,10 M 3,70 M 0,25 M 0,11 — < 3,55. Raffinerad olivolja M 0,05 M 0,9 M 0,6 M 0,4 M 0,2 M 0,2 M 0,20 M 0,30 M 3,40 M 1,20 — M 0,16 —6. Olivolja M 0,05 M 0,9 M 0,6 M 0,4 M 0,2 M 0,2 M 0,20 M 0,30 M 3,30 M 1,00 — M 0,13 —7. Rå olivolja av
pressrester M 0,05 M 0,9 M 0,6 M 0,4 M 0,3 M 0,2 M 0,20 M 0,10 —————
8. Raffinerad olivolja av
pressrester M 0,05 M 0,9 M 0,6 M 0,4 M 0,3 M 0,2 M 0,40 M 0,35 M 5,50 M 2,50 — M 0,25 —
9. Olivolja av
pressrester M 0,05 M 0,9 M 0,6 M 0,4 M 0,3 M 0,2 M 0,40 M 0,35 M 5,30 M 2,00 — M 0,20 —
M = maximum, m = minimum
Anm:
En olja skall förkastas om någon av egenskaperna ligger utanför de gränsvärden som fastställts.▼M111991R2568 — SV — 31.10.1995 — 013.001 — 9
▼B
BILAGA 2
BESTÄMNING AV FRIA FETTSYROR
1. BESTÄMNING AV SYRAHALT
Bestämning av fria fettsyror i olivoljor. Halten fria fettsyror uttrycks som
syrahalt beräknad på konventionellt sätt.
1.1Princip
Ett prov löses i en blandning av lösningsmedel och de närvarande fria
fettsyrorna titreras med en etanollösning av kaliumhydroxid.
1.2Reagenser
Alla reagenser bör vara av analyskvalitet och det vatten som används skall
vara destillerat eller ha motsvarande renhet.
1.2.1 Dietyleter. 95 % etanol (v/v), blandning av lika volymdelar.
Anm: Dietyleter är en mycket lättantändlig vätska och kan bilda explosiva
peroxider. Speciell försiktighet bör iakttas vid användning.
Neutralisera exakt vid användningstillfället med kaliumhydroxidlösningen
(1.2.2) med tillsats av 0,3 ml av fenolftaleinlösningen (1.2.3) per 100 ml
blandning.
Anm: Om det inte är möjligt att använda dietyleter kan en blandning av
lösningsmedel som innehåller etanol och toluen användas. Om så
erfordras kan etanolen ersättas av propanol-2.
1.2.2 Kaliumhydroxid, filtrerad etanollösning, c(KOH) ca 0,1 mol/l eller, om
nödvändigt c(KOH), ca 0,5 mol/l.
Den exakta koncentrationen hos etanollösningen av kaliumhydroxid måste
vara känd och kontrollerad omedelbart före användning. Använd en
lösning som gjorts minst fem dagar före användning och dekanterats i en
brun glasflaska med gummipropp. Lösningen bör vara färglös eller
halmfärgad.
Anm: En stabil färglös lösning av kaliumhydroxid kan framställas på
följande sätt: Koka upp 1 000 ml etanol med 8 g kaliumhydroxid
och 0,5 g aluminiumspån och fortsätt att koka under återflöde under
1 timme. Destillera lösningen omedelbart. Lös den behövliga
mängden kaliumhydroxid i destillatet. Låt lösningen stå i flera
dagar och dekantera den klara vätskan från fällningen av kaliumkar-
bonat.
Lösningen kan också framställas utan destillation på följande sätt:
Tillsätt 4 ml aluminiumbutylat till 1 000 ml etanol och låt bland-
ningen stå i flera dagar. Dekantera den klara vätskan och lös den
behövliga mängden kaliumhydroxid i den. Lösningen är klar för
användning.
1.2.3 Fenolftalein, 10 g/l lösning i 95 till 96 %-ig etanol (v/v) eller alkaliskt
blått (då det gäller starkt färgade fetter) 20 g/l lösning i 95 till 96 %-ig
etanol (v/v).
1.3Utrustning
Vanlig laboratorieutrustning som innefattar:
1.3.1 Analysvåg
1.3.2 250 ml E-kolv
1.3.3 10 ml byrett graderad i0,05 ml
1.4Utförande
1.4.1 Preparering av provet för analys
Genomför analysen på ett filtrerat prov. Om fukt och föroreningar tillsam-
mans är mindre än 1 % använd provet utan vidare behandling.
1.4.2 Provtagning
Ta ut ett prov beroende på det antagna syratalet ienli ghet med följande
tabell:1991R2568 — SV — 31.10.1995 — 013.001 — 10
▼B
Förväntat syratalMängd prov
(g)Invägningsnoggrannhet
(g)
< 1 20 0,05
1 till 4 10 0,024 till 15 2,5 0,01
15 till 75 0,5 0,001
> 75 0,1 0,0002
Väg in provet i E-kolven (1.3.2).
1.4.3 Bestämning
Lös provet (1.4.2) i 50 till 150 ml av den neutraliserade blandningen av
dietyleter och etanol (1.2.1).
Titrera under omrörning med 0,1 mol/l lösning av kaliumhydroxid (1.2.2)
(se anmärkning 2) tills indikatorn ändrar färg (den röda fenolftaleinfärgen
skall bestå under minst 10 sekunder).
Anm 1: Den ställda etanollösningen av kaliumhydroxid (1.2.2) kan
ersättas av en vattenlösning av kalium- eller natriumhydroxid
under förutsättning att vattenvolymen inte medför fasseparation.
Anm 2: Om den nödvändiga mängden 0,1 molar kaliumhydroxidlösning
överstiger 10 ml, använd 0,5-molar lösning.
Anm 3: Om lösningen blir ogenomskinlig under titreringen, tillsätt
tillräckligt med lösningsmedel (1.2.1) för att det skall bli en klar
lösning.
1.5Syramängd uttryckt som procent oleinsyra
Syramängden som massprocent motsvaras av:
V/C2c/C2M
1 000/C2100
m¼V/C2c/C2M
10/C2m
där:
V = Volymen kaliumhydroxid i ml som används vid titreringen.
c = Exakta koncentrationen i mol/l av den ställda kaliumhydroxidlös-
ning som används.
M = Molvikt i gram per mol av syran som används för att ange resul-
tatet (= 282).
m = Provets vikt i gram.
Det aritmetiska medelvärdet ►M6av två beräkningar ◄bör bedömas
som resultatet.1991R2568 — SV — 31.10.1995 — 013.001 — 11
▼B
BILAGA 3
BESTÄMNING AV PEROXIDVÄRDET
1. SYFTE
Denna standard beskriver en metod för bestämning av peroxidvärdet i oljor
och fetter.
2. TILLÄMPNINGSOMRÅDE
Denna standard är tillämplig på animaliska och vegetabiliska oljor och
fetter.
3. DEFINITION
Peroxidvärdet är den kvantitet av de substanser i provet uttryckta i milliek-
vivalenter aktivt O2/kg som oxiderar kaliumjodid under de förhållanden som
beskrivs.
4. PRINCIP
Behandling av provet i lösning i ättiksyra och kloroform med en lösning av
kaliumjodid. Titrering av den frigjorda joden med ställd natriumtiosulfatlös-
ning.
5. UTRUSTNING
All utrustning som skall användas skall vara fri från reducerande eller
oxiderande ämnen.
Anm: Smörj inte slipade ytor.
5.1 3 ml glassked.5.2 Kolvar med slipade halsar och proppar på ca 250 ml, torkade i förväg och
fyllda med en torr, ren, inert gas (kväve eller företrädesvis koldioxid).
5.3 25 eller 50 ml byrett graderad i0,1 ml.
6. REAGENSER
6.1 Kloroform, P. A. som befriats från syre genom att en ström av ren, torr inert
gas bubblats igenom den.
6.2 Ättiksyra, P. A. befriad från syre genom att en ström av torr, ren gas bubb-
lats igenom den.
6.3 Kaliumjodid, mättad vattenlösning, nyligen framställd, fri från jod och
jodater.
6.4 Natriumtiosulfat 0,01 eller 0,002 N exakt ställd vattenlösning, ställd
omedelbart före användning.
6.5 Stärkelselösning, 10 g per liter vattenlösning nyligen framställd av naturlig
löslig stärkelse.
7. PROV
Se till att provet tas och bevaras kallt och mörkt i glasbehållare som skall
vara helt fyllda, hermetiskt tillslutna med slipade glasproppar eller kork.
8. UTFÖRANDE
Analysen skall genomföras i diffust dagsljus eller artificiellt ljus. Väg in i
ett vägglas (5.1) eller om inte detta går i en kolv (5.2) på 0,001 g när, en
mängd av provet som överensstämmer medföljande tabell enligt det
förväntade peroxidvärdet:1991R2568 — SV — 31.10.1995 — 013.001 — 12
▼B
Förväntat peroxidvärde
(mekv)Provets vikt
(g)
0 till 12 5,0 till 2,0
12 till 20 2,0 till 1,220 till 30 1,2 till 0,830 till 50 0,8 till 0,5
50 till 90 0,5 till 0,3
Ta bort proppen från en kolv (5.2) och för in vägglaset som innehåller
provet. Tillsätt 10 ml kloroform (6.1). Lös provet snabbt under omrörning.
Tillsätt 15 ml ättiksyra (6.2) och sedan 1 ml kaliumjodidlösning (6.3). Sätt
snabbt iproppen, skaka om under en mi nut och låt stå imörker exakt 5
minuter vid en temperatur mellan 15 och 25 ºC.
Tillsätt ca 75 ml destillerat vatten. Titrera den frigjorda joden med natrium-
tiosulfatlösning (6.4) (0,002 N lösning för förväntade värden som är mindre
12 och 0,01 N lösning för förväntade värden över 12) under omskakning
och använd stärkelselösning (6.5) som indikator.
Genomför två bestämningar på samma prov.
Genomför samtidigt ett blindprov. Om resultatet av blindprovet överstiger
0,05 ml av 0,01 N natriumtiosulfatlösning (6.4) ersätt de orena reagenserna.
9. RESULTATANGIVELSE
Peroxidvärdet (PV), uttryckt som milliekvivalenter av aktivt O
2/kg erhålls
genom följande formel:
PV¼V/C2T/C21 000
m
där:
V = antalet ml av den ställda tiosulfatlösningen (6.4) som används i
provet korrigerad för resultatet av blindprovet.
T = den exakta normaliteten hos natriumtiosulfatlösningen (6.4) som
används.
m = vikten i gram av provet.
Som resultat tas det aritmetiska medelvärdet av de två bestämningarna som
genomförts.1991R2568 — SV — 31.10.1995 — 013.001 — 13
▼M6
BILAGA 4
BESTÄMNING AV VAXINNEHÅLLET GENOM GASKROMATOGRAFI
MED KAPILLÄRKOLONN
1. SYFTE
Denna metod beskriver en procedur för bestämning av vaxinnehållet i
vissa fetter och oljor efter testförhållanden.
Den används särskilt för att skilja mellan olivolja som framställts
genom pressning och olivolja som framställts genom extraktion.
2. PRINCIP
En lämplig intern standard tillsätts till fettet eller oljan varefter fraktio-
nering sker genom kromatografi på en hydrerad kiselgelkolonn. Den
fraktion som först elueras under testförhållandena (och som har lägre
polaritet än triglyceriderna) samlas upp och analyseras därefter direkt
med hjälp av gaskromotografimed kapi llärkolonner.
3. UTRUSTNING
3.1. 25 ml Erlenmeyerkolv.3.2. Glaskolonn för kromatografi, 15 mm invändig diameter och 30 40 cm
lång.
3.3. En lämplig gaskromatograf som kan fungera med en kapillärkolonn och
som är utrustad med ett system för direkt insprutning i kolonnen och
som består av följande:
3.3.1. Termostatstyrd ugn för kolonnerna, som kan hålla önskad temperatur
med en noggrannhet av ± 1 C.
3.3.2. Kall injektor för direkt insprutning i kolonnen.3.3.3. Flamjoniseringsdetektor och konverter/förstärkare.3.3.4. Skrivare/integrator som kan fungera med konvertern/förstärkaren (3.3.3)
med svarstider under 1 sekund och med variabel pappershastighet.
3.3.5. Kapillärkolonn av glas eller sintrat kvarts, 10-15 mm lång, 0,25-0,32
mm invändig diameter, täckt med SE-52 eller SE-54 vätskefas eller
motsvarande och med en enhetlig tjocklek på 0,10-0,30 µm.
3.4. Mikrosprutor på 10 l med härdad nål för direkt insprutning i kolonnen.
4. REAGENS
4.1. Kiselgel, 70 230 mesh, artikel 7754 Merck.
Placera kiselgelen i ugnen vid 500 C i fyra timmar. Låt svalna och
tillsätt sedan 2 % vatten. Skaka ordenligt för att homogenisera uppslam-
ning. Förvara mörkt i minst 12 timmar innan användning.
4.2. n-hexan för kromatografi.4.3. Etyleter för kromatografi.
4.4. n-heptan för kromatografi.
4.5. Standardlösning av 0,1 % (m/v) laurylarachidat i hexan (intern stan-
dard).
4.6. Bärargas: ren väte för gaskromatografi.4.7. Hjälpgaser:
— ren väte för gaskromatografi.
— ren luft för gaskromatografi.
5. UTFÖRANDE
5.1. Separation av vaxfraktionen.5.1.1. Preparering av kromatografikolonnen.
Slamma15 g kiselgel hydrerad med 2 % vatten i vattenfri n-hexan och
spruta in i kolonnen.1991R2568 — SV — 31.10.1995 — 013.001 — 14
▼M6
Låt sedimentera av sig självt. Slutför sedimenteringen med hjälp av en
elektrisk skakare för att göra det kromatografiska bandet mer homogent.
Filtrera 30 ml n-hexan för att avlägsna eventuella orenheter.
5.1.2. Kolonnkromatografi
Vägmed exakthet upp 500 mg av provet ien 25 ml kolv och ti llsätt en
passande mängd intern standard, beroende på det uppskattade vaxin-
nehållet, t. ex. tillsätt 0,1 mg laurylarachidat till pressad olivolja, och
0,25-0,5 mg till extraherad olivolja.
Föröver det preparerade provet till kromatografikolonnen, preparerad
enligt 5.1, med hjälp av två 2 ml portioner n-hexan.
Låtlösningsmedlet stå 1 mm över kolonnmaterialet. Starta sedan kroma-
tografielueringen. Samla upp 140 ml av n-hexan/etyleterblandningen i
förhållandet 99:1, med en hastighet på cirka 15 droppar var 10:e sekund
(2,1 ml/minut).
Torka den framtagna fraktionen i en rotationsindunstare tills nästan allt
lösningsmedel försvunnit. Avlägsna de sista 2 eller 3 ml av lösnings-
medlet med hjälp av en svag kväveström och tillsätt sedan 10 ml n-
heptan.
5.2. Analys med gaskromatografi5.2.1. Förberedelser och konditionering av kolonnen
5.2.1.1. Montera kolonnen på gaskromatografen genom att ansluta inloppet till
injektionssystemet och utloppet till detektorn.
Kontrollera gaskromatografen (att gasanslutningarna är täta, detektorns
och skrivarens effektivitet, etc.).
5.2.1.2. Om kolonnerna används för första gången är det bra att konditionera
dem. Låt en liten mängd bärargas flyta genom kolonnen och sätt sedan
på gaskromatografen. Värm upp den gradvis till en temperatur på minst
20 ºC över drifttemperaturen (OBS!). Behåll denna temperatur i minst
två timmar och ställ därefter in apparaturen enligt driftförhållandena
(inställning av gasflöde, tändning av delningsflamma, anslutning till
den elektroniska registreringen, inställning av temperaturen i kolonnens
ugn, detektorn och injektorn). Ställ in signalen på en känslighet som är
minst två gånger högre än den nivå som krävs för att utföra analysen.
Baslinjen skall vara linjär, inte ha några toppar och får inte visa på
några avvikelser.
En negativ rätlinjig avvikelse tyder på att kolonnen inte är korrekt
ansluten. En positiv avvikelse tyder på att kolonnen inte har blivit
ordentligt konditionerad.
OBS! Temperaturen vid konditioneringen skall alltid vara minst 20 ºC
under den maximala temperaturen som anges för den vätskefas
som används.
5.2.2. Val av driftförhållanden
5.2.2.1. Driftförhållandena är normalt enligt följande:
— Kolonntemperatur: 80 ºC till en början med en stegring på 30 ºC/
minut till 120 ºC, med en därpå följande programmering till en stig-
ning med 5 ºC/minut upp till 340 ºC,
— detektortemperatur: 350 ºC,
— linjär hastighet för bärargasen: väte 20-35 cm/sekund,— instrumentets känslighet: 4-16 gånger högre än minimikänsligheten,— registreringskänslighet: 1-2 mV, från skalans nedersta ände,— pappershastighet: 30 cm/timme,
— insprutad mängd: 0,5-1 µl lösning.
Dessa förhållanden kan ändras med hänsyn till kolonnens och gaskro-
matografens egenskaper (för att uppnå kromatogram som uppfyller
följande villkor: retentionstider för C32 intern standard måste vara 25
± 2 minuter, och vaxens mest representativa topp måste ligga på mellan
60 och 100 % från skalans nedersta ände).
5.2.2.2. Bestäm parametrarna för toppens integration på ett sådant sätt att en
korrekt uppskattning av de ifrågavarande toppareorna erhålls.
5.2.3. Analysförfarande
5.2.3.1. Sug med hjälp av en mikrospruta på 10 µl upp 1 µl av lösningsmedlet.
Dra tillbaka kolven tills sprutan är tom. För in nålen i injektionssys-
temet och injicera snabbt efter 1-2 sekunder. Efter cirka 5 sekunder
dras nålen försiktigt ut.1991R2568 — SV — 31.10.1995 — 013.001 — 15
▼M6
5.2.3.2. Utför registreringen tills alla vaxer är helt eluerade.
Baslinjen måste alltid uppfylla de fastställda villkoren (5.2.1.2).
5.2.4. Identifiering av toppar
Identifiera topparna utifrån retentionstiderna genom att jämföra dem
med blandningar av vaxer med kända retentionstider analyserade under
samma förhållanden.
Figur 1 visar ett vaxkromatogram av jungfruolja.
5.2.5. Kvantitativ analys5.2.5.1. Bestäm de av toppareorna som motsvarar den interna standarden och de
alifatiska estrarna från C40-C46 med hjälp av integratorn.
5.2.5.2. Vaxi nnehållet ivar och en av estrarna erhålls img/kg fettämne med
följande formel:
alkohol (mg/kg) =A
x·ms·►M91000◄
As·m
där:
Ax= den area som motsvarar toppen för varje ester,
As= den area som motsvarar laurylarachidatetoppen,
ms= den area som motsvarar det tillsatta laurylarachidatet i
milligram,
m = den massa som provet som tagits ut för analys, i gram.
6. RESULTATANGIVELSE
De olika vaxinnehållen och summan av dessa anges i mg/kg fettämnen.1991R2568 — SV — 31.10.1995 — 013.001 — 16
▼M6
TILLÄGG
Bestämning av gasens linjära hastighet
Spruta in 1 3 µl metan (propan) i gaskromatografen sedan den ställts in till de
normala driftförhållandena. Mät den tid det tar för gasen att gå igenom
kolonnen, från det att den sprutas in tills toppen framgår (tM).
Den linjära hastigheten i cm/sekund erhålls genom formeln L/tM där L är kolon-
nens längd icm och tM är den uppmätta ti den isekunder.1991R2568 — SV — 31.10.1995 — 013.001 — 17
▼M61991R2568 — SV — 31.10.1995 — 013.001 — 18
▼B
BILAGA 5
BESTÄMNING AV SAMMANSÄTTNINGEN OCH HALTEN AV
STEROLER GENOM GASKROMATOGRAFI MED KAPILLÄRKO-
LONN
1. SYFTE
Förfarandet beskriver en metod för att bestämma de enskilda och totala
sterolhalterna hos fettämen.
2. METODENS PRINCIP
Fettämnet med tillsats av a-kolestanol som en inre standard, förtvålas
med kaliumhydroxid i etanollösning och de oförtvålbara ämnena extra-
heras sedan med etyleter. Sterolfraktionen separeras från det
oförtvålbara extraktet genom kromatografi på en basisk kiselgelplatta.
Sterolerna som återvunnits från kiselgelen överförs till trimetylsilyletrar
och analyseras genom gaskromatografimed kapi llärkolonn.
3. UTRUSTNING
3.1 250 ml kolv försedd med återflödeskylare med slipningar.
3.2 500 ml separertrattar.
3.3 250 ml kolvar.3.4 Komplett apparatur för analys med tunnskiktskromatografi som
använder glasplattor 20 × 20 cm.
3.5 Ultraviolett lampa med en våglängd av 366 eller 254 nm.3.6 Mikrosprutor 100 µl och 500 µl.3.7 En cylindrisk filtrertratt med porositeten G 3 (porositet 15 till 40 µm)
och med en diameter på ca 2 cm, ett djup på 5 cm och försedd med en
hanslipning 12/21 som passar på en vakuumkolv.
3.8 50 ml vakuum-E-kolv med honslipning 12/21 som kan användas för filt-
rertratten (3.7).
3.9 10 ml provrör med konisk botten och propp.
3.10 Gaskromatograf lämpad för användning med kapillärkolonn försedd med
splitsystem bestående av:
3.10.1 En termostatkammare för kolonner som kan bibehålla önskad temperatur
med en noggrannhet av ± 1 ºC.
3.10.2 En förångningsenhet med inställbar temperatur och försedd med ett
förångningselement av glas med försiliniserad yta.
3.10.3 En flamjoniseringsdetektor och omformarförstärkare.3.10.4 En integrerad skrivare som är lämplig för användning med omfor-
marförstärkare (3.10.3).
3.11 En kapillärkolonn av glas eller kvarts med en längd på 20 till 30 meter,
innerdiameter 0,25 till 0,32 mm och helt täckt med SE-52 eller SE-54-
vätska eller motsvarande iett jämnt lager med en tjocklek av mellan
0,10 och 0,30 µm.
3.12 En 10 µl mikrospruta för gaskromatografi med härdad kanyl.
4. REAGENSER
4.1 Kaliumhydroxid ungefär 2 N i etanollösning. Lös 130 g kaliumhydroxid
(minimihalt 85 %) under kylning i 200 ml destillerat vatten och späd
sedan till 1 liter med etanol. Förvara lösningen i väl tillslutna, mörka
flaskor (etanol 95 % v/v).
4.2 Etyleter, P. A.
4.3 Vattenfritt natriumsulfat, P. A.4.4 Glasplattor täckta med kiselgel utan flouresceinsindikator, tjocklek
0,25 mm (finns i handeln färdiga för användning).
4.5 Kaliumhydroxid, 0,2 N i etanollösning. Lös 13 g kaliumhydroxid i 20 ml
destillerat vatten och späd till 1 liter med etanol.1991R2568 — SV — 31.10.1995 — 013.001 — 19
▼B
4.6 Bensen, för kromatografi(se 5.2.2).
4.7 Aceton, för kromatografi(se 5.2.2).4.8 Hexan, för kromatografi(se 5.2.2).4.9 Etyleter, för kromatografi(se 5.2.2).
4.10 Kloroform, P. A. (se 5.2.2).
4.11 Referenslösning för tunnskiktskromatografi: kolesterol eller fytosterol,
►
M62%◄lösning i kloroform.
4.12 2.7-diklorflourecein, 0,2 % etanollösning. Denna görs lätt alkalisk
genom att tillsätta ett par droppar 2 N alkoholisk kaliumhydroxidlös-
ning.
4.13 Vattenfri pyridin, för kromatografi.
4.14 Hexametyldisilasan.4.15 Trimetylklorosilan.4.16 Referenslösning av steroltrimetylsilyletrar. Framställs omedelbart före
användning av rena steroler eller blandningar av steroler som erhållits
från oljor som innehåller dem.
4.17 α-kolestanol, 0,2 % lösning (m/v) i kloroform (inre standard).
4.18 Bärargas: väte eller helium, ren för gaskromatografi.4.19 Supplementerande gaser: väte eller helium, ren för gaskromatografi.
5. UTFÖRANDE
5.1 Preparering av oförtvålbara ämnen
5.1.1 Med hjälp av en 500 µl mikrospruta införs en volym av 0,2 % α-kole-
stanollösning i kloroform (4.17) som innehåller en mängd α-kolestanol
motsvarande ca 10 % sterolhalten iprovet som tagi ts ut för analysen i
250 ml kolv. Exempelvis tillsätts 500 µl av den 0,2 % α-kolestanollös-
ningen per 5 g prov när det gäller olivolja och 1 500 µl för
►
M6 ◄olivoljor av pressrester.
Indunsta till torrhet under en ström av kväve och väg noggrannt upp 5 g
av det torra filtrerade provet i samma kolv.
►M6Oljor◄och fetter som innehåller uppskattningsbara kvantiteter
av kolesterol kan visa en topp med en retentionstid som är samma för
kolestanol. Om detta inträffar måste sterolfraktionen analyseras dubbelt
med och utan inre standard ►M6eller så måste betulinol användas
istället för kolestanol ◄.
5.1.2 Tillsätt 50 ml 2 N kaliumhydroxid i etanollösning, sätt på återflödesky-
laren och värm till svag kokning på vattenbad under kontinuerlig
omrörning tills förtvålning inträder (lösningen blir klar). Fortsätt upphet-
tningen under ytterligare 20 minuter, och tillsätt sedan 50 ml destillerat
vatten genom återflödeskylaren, ta bort kylaren och kyl kolven till ca
30 ºC.
5.1.3 Överför kvantitativt innehållet i kolven till en 500 ml separertratt och
skölj upprepade gånger med destillerat vatten av en mängd som totalt
får uppgå till 50 ml. Tillsätt ca 80 ml etyleter, skaka omsorgsfullt i
ungefär 30 sekunder och låt sedan innehållet separera (anm 1).
Separera av den lägre vattenfasen ien ny separertratt. Genomför ytterli -
gare två extraheringar på vattenfasen på samma sätt med användande av
60—70 ml etyleter vid varje tillfälle.
Anm 1: Eventuell emulsion kan tas bort genom tillsats av små kvanti-
teter etanol eller metanol isprayform.
5.1.4 Samla eterextrakten ien separertratt och tvätta med desti llerat vatten
(50 ml åt gången) tills tvättvattnet ger neutral reaktion.
När tvättvattnet har avlägsnats, torka med vattenfritt natriumsulfat och
filtrera på vattenfritt natriumsulfat ner i en i förväg vägd 250 ml kolv,
och tvätta därefter tratten och filtret med små mängder etyleter.
5.1.5 Destillera av etern tills endast ett par ml återstår, torka sedan under lätt
vakuum eller ien ström av kvävegas och torka sedan helt iett torkskåp
vid 100 ºC i ungefär en kvart och väg därefter provet som fått svalna i
exsickator.
5.2 Separering av sterolfraktionen1991R2568 — SV — 31.10.1995 — 013.001 — 20
▼B
5.2.1 Preparering av plattorna. Sänk ner kiselgelplattorna (4.4) helt i 0,2 N
kaliumhydroxidetanollösning (4.5) i 10 sekunder och låt sedan torka i
dragskåp itvå ti mmar varefter den placeras itorkskåp vi d 100 ºC ien
timme.
Ta ut plattorna från torkskåpet och förvara dem ien exsi ckator med
kalciumklorid tills de skall användas (plattor som behandlas på detta
sätt måste användas inom 15 dagar).
Anm 2: Om kiselelplatta används för att separera serolfraktionen
behöver inte de oförtvålbara ämnena behandlas med aluminum-
oxid. På det här sättet kan alla sura föreningar (fettsyror och
andra) behållas på identifieringslinjen och sterolbanden sepa-
reras klart från de alifatiska och triterpena alkoholernas band.
5.2.2 Fyll på en 95:5 (v/v) benzen/acetonblandning i framkallningskammaren
till ett djup av ca 1 cm. En blandning av 65:35 (v/v) av hexan/etyleter
kan också användas. Stäng kammaren med tillhörande lock och låt stå
ca en halvtimme för att jämnvikten vätska/gas inställer sig. Remsor av
filtrerpapper som doppas ner i eluenten kan placeras på insidorna av
kammaren. Detta minskar framkallningstiden med ca en tredjedel och
åstadkommer en jämnare eluering av komponenterna.
Anm 3: Framkallningsblandningen skall bytas för varje prov för att få
exakt reproducerbara elueringsförhållanden.
5.2.3 Preparera en ca 5 % lösning av oförtvålbara ämnen (5.1.5) i kloroform
och stryk ut med hjälp av en 100 µl spruta på en kromatografiplatta
(5.2.1) 0,3 ml ca 2 cm från ena änden ien strykni ng som är så tunn
och jämn som möjligt. Placera i linje med strykningen 2 till 3 µl av
sterolreferenslösningen (4.11) i enda änden av plattan så att sterolbandet
kan identifieras efter framkallning.
5.2.4 Placera plattan i framkallningskammaren som preparerats enligt 5.2.2.
Genomsnittstemperaturen skall hållas mellan 15 och 20 ºC. Stäng
kammaren omedelbart med locket och påbörja elueringen tills lösnings-
medlets främre kant når till ca 1 cm från övre änden av plattan. Ta bort
plattan från framkallningskammaren och låt lösningsmedlet avdunsta i
en ström av varmluft eller genom att plattan ligger en kort stund i
dragskåp.
5.2.5 Spraya plattan lätt och jämnt med 2,7-diklorofluorosceinlösning. När
plattan betraktas i ultraviolett ljus kan sterolbandet identifieras genom
att det ligger i höjd med fläcken som har erhållits från referenslös-
ningen. Markera änden av bandet längs kanterna av flouroscensen med
svart blyerts.
5.2.6 Skrapa med hjälp av en metallspatel bort silikagelen på det markerade
området. Placera det finfördelade materialet som tagits bort i filtrer-
tratten (3.7). Tillsätt 10 ml het kloroform, rör försiktigt med
metallspateln och filtrera i vakuum-E-kolven (3.8) som är ansluten till
filtrertratten.
Tvätta återstoden ikolven tre gånger med etyleter (ca 10 ml varje gång)
och samla filtratet i samma kolv som är ansluten till filtrertratten.
Indunsta filtratet till en volym på 4 till 5 ml, överför lösningen till ett
vägt 10 ml provrör (3.9), indunsta till torrhet genom lätt uppvärmning i
ett försiktigt flöde av kvävgas, lös igen med hjälp av ett par droppar
aceton, indunsta igen till torrhet, placera i ett värmeskåp vid 105 ºC i
ca 10 minuter och låt sedan provet svalna i exsickator och väg det.
Återstoden som finns i provröret består av sterolfraktionen.
5.3 Preparering av trimetylsilyletrar5.3.1 Tillsätt silyleringsreagensen, som består av 9:3:1 (v/v/v) blandning av
pyridin/hexametyldisdilasan/trimetylklorosilan (anm 4) i mängden 50 µl
för varje milligram steroler som finns i provröret som innehåller sterol-
fraktionen, varvid fukt ska undvikas (anm 5).
Anm 4: Lösningar klara för användning finns att köpa i handeln. Andra
silaniseringsreagenser som t ex bis-trimetylsilyl, triflourace-
tamid + 1 % trimetylklorosilan, som måste spädas med lika
stor mängd vattenfri pyridin finns också tillgängliga.
5.3.2 Sätt proppen i provröret, skaka försiktigt (utan att vända på det) tills
sterolerna är helt lösta. Låt stå i minst 15 minuter i rumstemperatur
och centrifugera sedan i ett par minuter. Den klara lösningen är nu
färdig för analys med gaskromatografi.
Anm 5: Eventuell bildning av en svag opalescens är normal och inve-
rkar inte. Bildandet av en vit flockig fyllning eller rosafärgning1991R2568 — SV — 31.10.1995 — 013.001 — 21
▼B
är tecken på närvaro av fukt och sönderfall hos reagensen. Om
detta inträffar skall provet upprepas.
5.4 Analys med gaskromatografi
5.4.1 Förberedelser och iordningsställande av kapillärkolonnen.
5.4.1.1 Kapillärkolonnen placeras inuti gaskromatografen genom att kolonnens
inlopp ansluts till injektorblocket som är ansluten till splitsystemet och
andra änden av kolonnen till detektorn.
En allmän kontroll av gaskromatografen genomförs (gasanslutningarna
skall vara täta, detektorn i fullgott skick, fungerarande splitsystem och
registreringssystem etc).
5.4.1.2 Kapillärkolonner som används för första gången skall prepareras. En
liten mängd bärargas får flyta igenom kapillärkolonnen och sedan
kopplas gaskromatografen på och en gradvis upphettning genomförs tills
temperaturen är minst 20 ºC över drifttemperaturen (se anm 6). Tempe-
raturen bibehålls i minst två timmar och sedan ställs kromatografen
iordning för driftförhållanden (inställning av gasflöde, tändning av
delningsflamma, anslutning till den elektroniska registreringen, inställ-
ning av temperaturen i kapillärkolonnens ugn, detektorn och injektorn)
signalen ställs in på en känslighet som är minst två gånger den högsta
nivån som beräknas för genomförande av analysen. Baslinjens streck
skall vara linjärt, inte ha några spikar oavsett ursprung och inte visa
tecken på att driva.
Negativ drift av linjen är tecken på otäta kolonnanslutningar medan en
positivt drift tyder på otillräcklig preparering av kolonnen.
Anm 6: Temperaturen vid prepareringen skall vara minst 20 ºC lägre än
maximitemperaturen som specificeras för den använda fasen.
5.4.2 Val av driftförhållanden5.4.2.1 Allmänna driftförhållanden är följande:
— kolonntemperatur: 260 ± 5ºC
— injektorblockets temperatur: 280 ºC,— detektorns temperatur: 290 ºC,— linjär hastighet för bärargasen: helium 20 till 35 cm/s, väte 30 till
50 cm/s,
— delningsförhållande 1:50 vid 1:100,— instrumentets känslighet: 4 till 16 gånger högre än minimikänslig-
heten,
— registreringskänslighet: 1 till 2 mV,— pappershastighet: 30 till 60 cm/timme,— kvantitet av det injicerade ämnet: 0,5 till 1 µl av TMSE-lösning.
Dessa förhållanden kan varieras beroende på egenskaper hos kolonn och
gaskromatograf för att få kromatogram som uppfyller följande krav:
— retentionstiden för β-sitosterol bör vara 20 ± 5 minuter,
— kampesteroltoppen bör vara: olivolja (medelinnehåll 3 %) 15 ± 5 %
av fullt utslag, för sojaolja (medelinnehåll 20 %) 80 ± 10 % av fullt
utslag,
— alla närvarande steroler måste separeras. Förutom att topparna måste
separeras måste de också återgå helt, dvs varje toppkurva skall
återvända till baslinjen innan nästa topp ritas. Ofullständig upplös-
ning kan emellertid tolereras under förutsättning att toppen vid
TRR 1,02 kan kvantifieras med hjälp av topphöjden.
5.4.3 Analysförfarande
5.4.3.1 Sug med hjälp av en 10 µl spruta upp 1 µl hexan, sug in 0,5 µl luft och
sedan 0,5 till 1 µl av provlösningen. Drag ut kolven ur sprutan ytterli-
gare så att kanylen töms. Kör in kanylen genom membranet i
insprutningsenheten och spruta snabbt efter en till två sekunder in
innehållet och drag sedan sakta ut kanylen efter ca fem sekunder.
5.4.3.2 Fortsätt registreringen tills TMSE för de närvarande sterolerna är helt
eluerade.
Baslinjen måste fortsätta att uppfylla kraven i 5.4.1.2.
5.4.4 Identifiering av toppar.
Identifiera individuella toppar på grundval av retentionstiderna och
genom jämförelse med blandningar av sterol-TMSE som är analyserade
under samma förhållanden.1991R2568 — SV — 31.10.1995 — 013.001 — 22
▼B
Sterolerna elueras iföljande följd: kolesterol, brassi kasterol, 24-metylen-
kolesterol, kampesterol, kampestanol, stigmasterol, ∆7-kampesterol, ∆
5,23-stigmastadienol, klerosterol, β-sistosterol, sitostanol, ∆5-avenas-
terol, 5,24-stigmastadienol, ∆7-sigmastenol, ∆7-avenasterol.
Retentionstiderna för sitosterol för SE-52 och SE-54 kolonner framgår
av tabell 1.
Figurerna 1 och 2 visar typiska kromatogram för en del oljor.
5.4.5 Kvantitativ utvärdering
5.4.5.1 Beräkna områdena för α-kolestanol och steroltopparna med hjälp av
integratorn. Bortse från toppar för föreningar som inte finns med bland
de som är upptagna i tabell 1. Svarskoefficienten för α-kolestanol skall
vara lika med 1.
5.4.5.2 Beräkna koncentrationen för varje sterol i mg/100 g fettämne som följer:
sterol x =Ax·ms· 100
As·m
där:
Ax= arean av toppen för sterol x ►M6 ◄,
As= arean av toppen för α-kolestanol ►M6 ◄
ms= massan av tillsatt α-kolestanol i milligram
m = massan av provet som använts för bestämningen i gram
6. RESULTATANGIVELSE
6.1 Registrera enstaka sterolkoncentrationer som milligram per 100 g av
fettämne och deras summa som totala steroler.
6.2 Beräkna procenttalet för varje enskild sterol ur förhållandet mellan arean
av den aktuella toppen till summan av areorna av topparna för steroler.
% av sterol x =Ax
ΣA· 100
där:
Ax= arean av toppen för x,
ΣA = summan av areorna av topparna för steroler1991R2568 — SV — 31.10.1995 — 013.001 — 23
▼B
TILLÄGG
Bestämning av den linjära hastigheten för gasen
1 till 3 µl metan (eller propan) sprutas in i gaskromatografen under vanliga
driftförhållanden och den tid det tar för metanet (eller propanet) att passera
kolonnen från insprutningsögonblicket till det ögonblick toppen eluerar (tM)
mäts med stoppur.
Den linjära hastigheten i cm/s erhålls genom L/tMdär L är kolonnens längd icm
och tMär tiden i sekunder som uppmäts med stoppur.
Tabell 1
Relativa retentionstiden för steroler
T-
op-
pIdentifieringRelativ retentionstid
SE 54
kolonnSE 52
kolonn
1 kolesterol ∆-5-kolesten-3 β-ol 0,67 0,63
2 kolestanol 5 α-kolestan-3 β-ol 0,68 0,64
3 brassikasterol [24S]-24-metyl- ∆-5,22-kolestadien-3 β-ol 0,73 0,71
4 24-metylenkolesterol 24-metylen- ∆-5,24-kolesten-3 β-ol 0,82 0,80
5 kampesterol [24R]-24-metyl- ∆-5-kolesten-3 β-ol 0,83 0,81
6 kampestanol [24R]-24-metyl-kolestan-3 β-ol 0,85 0,82
7 stigmasterol [24R]-24-etyl- ∆-5,22-kolestadien-3 β-ol 0,88 0,87
8 ∆-7-kampeterol [24R]-24-metyl- ∆-7-kolesten-3 β-ol 0,93 0,92
9 ∆-5,23-stigmastadienol [24R,S]-24-etyl- ∆-5,23-kolestadien-3 β-ol 0,95 0,95
10 klerosterol [24R]-24-etyl- ∆-5,25-kolestadien-3 β-ol 0,96 0,96
11 β-sitosterol [24R]-24-etyl- ∆-5-kolestan-3 β-ol 1,00 1,00
12 sitostanol 24-etyl-kolestan-3 β-ol 1,02 1,02
13 ∆-5-avenasterol [24Z]-24-etyliden-5-kolesten-3 β-ol 1,03 1,03
14 ∆-5,24-stigmasteadienol [24R,S]-24-etyl- ∆-5,24-kolestadien-3 β-ol 1,08 1,08
15 ∆-7-stigmastenol [24R,S]-24-etyl- ∆-7,24-kolestadien-3 β-ol 1,12 1,12
16 ∆-7-avenasterol [24Z]-24-etyliden- ∆-7-kolesten-3 β-ol 1,16 1,161991R2568 — SV — 31.10.1995 — 013.001 — 24
▼B
Figur 1
Gaskromatogram för sterolfraktionen hos en oraffinerad olivolja
1991R2568 — SV — 31.10.1995 — 013.001 — 25
▼B
Figur 2
Gaskromatogram för sterolfraktionen hos en raffinerad olivolja
1991R2568 — SV — 31.10.1995 — 013.001 — 26
▼B
BILAGA 6
BESTÄMNING AV ERYTRODIOL OCH UVAOL
INLEDNING
Erytrodiol (som vanligen förstås som glykolerna i erytrodiol och uvaol
tillsammans) är en del av den oförtvålbara reaktionen, som tillhör en del
typer av fettämnens karaktäristiska. Den kan påvisas i påtagligt högre
koncentration i olivolja som extraherats med lösningsmedel än i andra
oljor t. ex. pressad olivolja och druvolja som också innehåller den och
närvaron av den kan visa närvaron av olivolja som extraherats med
lösningsmedel.
1. SYFTE
Förfarandet beskriver en metod för att påvisa erytrodiol i fettämnen.
2. METODENS PRINCIP
Fettämnet förtvålas med en kaliumhydroxid i metanol-etanol-lösning. Den
oförtvålbara fraktionen extraheras sedan med etyleter och renas genom
passage över en kolonn med aluminumoxid. De oförtvålbara ämnen får
sedan genomgå tunnskiktskromatografi på kiselgelplattor till banden som
motsvarar sterol- och erytrodiolfraktionerna är separerade.
Sterolerna och erytrodiolerna återvinns från plattan och överförs till trime-
tylsilyletrar och blandningarna analyseras senare med gaskromatografi.
Resultatet uttrycks som procent erytrodiol i blandningen av erytrodiol och
steroler.
3. UTRUSTNING
3.1 Utrustningen som beskrivs i bilaga 5 (bestämning av halten av sterol).
4. REAGENSER
4.1 De reagenser som beskrivs i bilaga 5 (bestämning av halten sterol).
4.2 Referenslösning av erytrodiol, 0,5 % lösning i kloroform.
5. UTFÖRANDE
5.1Preparering av oförtvålbara ämnen
Som beskrivits i punkt 5.1.2 i bilaga 5.
5.2Separering av erytrodiol och sterolerna.
5.2.1 Se punkt 5.2.1 ibi laga 5.
5.2.2 Se punkt 5.2.2 ibi laga 5.5.2.3 Gör iordning en 5 % lösning av de oförtvålbara ämnena i kloroform.
Med hjälp av en 0,1 ml mikrospruta stryks 0,3 ml av lösningen ut på en
kromatografiplatta ca 1,5 cm från nedre änden i en strykning som är så
tunn och jämn som möjligt. I ena änden av plattan placeras ett par mikro-
liter av lösningarna av kolesterol och erytrodiol som tjänar som referens.
5.2.4 Placera plattan i framkallningskammaren som iordningsställts enligt 5.2.1.
Omgivningstemperaturen bör vara omkring 20 ºC. Stäng kammaren
omedelbart med locket och låt elueringen fortgå tills lösningsmedlets front
når ca 1 cm från övre kanten av plattan. Ta bort plattan från framkall-
ningskammaren och låt lösningsmedlet avdunsta i ett varmt luftflöde.
5.2.5 Spraya plattan lätt och jämnt med den alkoholiska 2,7-dikloroflouro-
sceinlösningen. När plattan betraktas under ultraviolett ljus kan sterol-
och erytrodiolbanden identifieras genom att de ligger mitt för sina refe-
renspunkter. Markera med en punkt utanför gränserna för flouroscensen.
5.2.6 Skrapa med hjälp av en metallspatel bort silikagelen på de markerade
områdena. Placera materialet från plattan i en 50 ml kolv. Tillsätt 15 ml
varm kloroform. Skaka om väl och filtrera genom en glasfiltertratt så att
silikagelen överförs till filtret. Tvätta tre gånger med varm kloroform
(10 ml varje gång) och samla upp filtratet i en 100 ml kolv. Indunsta filt-
ratet till en volym av 4—5 ml, överför till en kalibrerat 10 ml centrifugrör1991R2568 — SV — 31.10.1995 — 013.001 — 27
▼B
med konisk botten, torka i en försiktig uppvärmning i kväveström och
väg.
5.3Framställning av trimetylsilylestrar
Som beskrivits i punkt 5.3 i bilaga 5.
5.4Gaskromatografianalys
Som beskrivits i punkt 5.4 om ovanstående metod.Driftförhållandena för gaskromatografen i analys måste vara sådana att de
går att genomföra sterolanalyser och separera TMSE från erytrodiol och
uvaol.
När provets sprutats in, fortsätt registreringen tills de närvarande stero-
lerna, erytrodiolen och uvaolen har eluerats. Identifiera sedan topparna
(retentionstiderna för ertytrodiol och uvaol relativt till β-sitosterol är ca
1,45 respektive 1,55) och beräkna områdena på samma sätt som för
steroler.
6. RESULTATANGIVELSE
erytrodiol i % =A
1+A2
A1+A2+ΣAsteroler× 100
där:
A1= arean av toppen för erytrodiol ►M6 ◄,
A2= arean av toppen för uvaol ►M6 ◄
ΣAsteroler= arean av toppen för steroler ►M6 ◄
Resultatet uttrycks med en decimal.1991R2568 — SV — 31.10.1995 — 013.001 — 28
▼B
BILAGA 7
BESTÄMNING AV FETTSYROR I 2-STÄLLNING I TRIGLYCERIDER
1. SYFTE
Den här standarden beskriver en metod för sammansättningen av den frak-
tion av fettsyror hos en olja eller ett fettämen som förestras i 2-ställning
(eller inre ställning) hos glycerolen.
2. TILLÄMPNINGSOMRÅDE
Denna standard kan tillämpas på oljor och fetter som har en smältpunkt
under 45 ºC beroende på de särskilda omständigheterna som följer av inve-
rkan av pankreatiskt lipas.
Den kan inte tillämpas oreserverat på oljor och fetter som innehåller påtag-
liga mängder av: fettsyror med 12 eller färre kolatomer (kokosnöt- och
palmkärneoljor, smörfett) eller mycket omättade fettsyror (med mer än
fyra dubbelbindningar) som innehåller 20 eller flera kolatomer (fiskoljor
och andra marina animaliska oljor) eller fettsyror som innehåller andra
oxygenerade grupper än syragruppen.
3. PRINCIP
Möjlig neutralisering av sura oljor och fetter i ett lösningsmedel. Rening
genom passage över en aluminumoxidkolonn. Delvis hydrolys av triglyce-
rider med pankreatiskt lipas under en bestämd tid. Separation av de bildade
monoglyceriderna med tunnskiktskromatografi och metanolys av dessa
monoglycerider. Analys av dessa metylestrar genom gas-vätskekromato-
grafi.
4. UTRUSTNING
4.1 100 ml rundkolv.4.2 25 ml rundkolv med slipning.4.3 1 m lång luftkylare, som passar ikolven 4.2.4.4 250 ml E-kolv.4.5 50 ml bägare.4.6 500 ml separertratt.4.7 Glaskolonn för kromatografi, 13 mm innerdiameter, 400 mm lång, försedd
med porös glasskiva och kran.
4.8 10 ml centrifugrör med slipad glaspropp.
4.9 5 ml byrett graderad i0,05 ml.4.10 1 ml injektionsspruta försedd med en tunn kanyl.4.11 Mikrospruta som kan ge droppar på 3 till 4 µl.4.12 Utstrykare för tunnskiktskromatografi.4.13 Glasplattor för tunnskiktskromatografi, 20 × 20 cm.4.14 Framkallningstank av glas för tunnskiktskromatografi, med slipat glaslock,
lämplig för plattor, med måtten 20 × 20 cm.
4.15 Spray för tunnskiktskromatografi.4.16 Torkskåp för 103 ± 2ºC.
4.17 Termostat som kan ställas in mellan 30 och 45 ºC med en noggrannhet på
0,5 ºC.
4.18 Rotationsförgängare.4.19 Elektrisk skakapparat som tillåter kraftig omskakning av centrifugröret.4.20 Ultraviolett lampa för undersökning av tunnskiktsplattorna.
För kontroll av lipasaktiviteten:
4.21 pH-meter.
4.22 Spiralomrörare.1991R2568 — SV — 31.10.1995 — 013.001 — 29
▼B
4.23 5 ml byrett.
4.24 Stoppur.
För eventuell framställning av lipas:
4.25 Laboratorieomrörare, lämplig för dispergering och blandning av hetero-
gena material.
5. REAGENSER
5.1 N-hexan, eller om detta inte finns, lättbensin (kokpunkt 30 till 50 ºC)
kromatografikvalitet.
5.2 2-propanol, eller etanol, 95 % (v/v) P. A.5.3 2-propanol, eller etanol, 1/1 vattenlösning.
5.4 Dietyleter fri från peroxider.
5.5 Aceton.5.6 Myrsyra, minst 98 % (m/m).
5.7 Lösningsmedel för framkallning: blandning av n-hexan (5.1), dietyleter
(5.4) och myrsyra (5.6) iproporti onerna 70/30/1 (v/v/v).
5.8 Aktiverad aluminumoxid för kromatografi, neutral, enligt Brockmann 1.
5.9 Kiselpulver, med bindemedel, av lämplig kvalitet för tunnskiktskromato-
grafi.
5.10 Pankreatiskt lipas av lämplig kvalitet (anm 1 och 2).
5.11 Natriumhydroxid, 120 g/l vattenlösning.5.12 Saltsyra, vattenlösning 6 N.
5.13 Kalciumklorid (CaCl
2), 220 g/l vattenlösning.
5.14 Natriumkolat (enzymkvalitet) 1 g/l vattenlösning.5.15 Buffertlösning: 1 M vattenlösning av tri-hydroxymetylaminometan som
ställs till pH 8 genom tillsats av saltsyra (5.12) (kontrolleras med potentio-
meter).
5.16 Fenolftalin, 10 g/l lösning i 95 % (v/v) etanol.
5.17 2,7-dikloroflourescein, 2 g/l lösning i 95 % (v/v) etanol, som gjorts lätt
alkalisk genom tillsats av en droppe 1 N natriumhydroxidlösning per
100 ml.
För kontroll av lipasaktiviteten:
5.18 Neutraliserad olja.
5.19 Natriumhydroxid, 0,1 N vattenlösning.
5.20 Natriumkolat (enzymkvalitet), 200 g/l vattenlösning.5.21 Gummi arabicum, 100 g/l vattenlösning.
6. PREPARERING AV PROVET
Om provet har en syrahalt under 3 %, bestämd enligt bilaga 2, kan det
renas direkt över aluminumoxid enligt 6.2.
Om provet har en syrahalt över 3 %, bestämd enligt bilaga 2, neutraliseras
med alkali vid närvaro av lösningsmedel enligt 6.1 för passagen över
aluminumoxid enligt 6.2.
6.1Neutralisering med alkali vid närvaro av lösningsmedel
Häll 10 g av den råa oljan ien separertratt (4.6) och ti llsätt 100 ml hexan
(5.1), 50 ml av 2-propanol (5.2), ett par droppar fenolftalinlösning (5.16)
och en mängd av natriumhydroxidlösningen (5.11) som motsvarar de fria
syrorna ioljan plus 0,3 % iöverskott.
Skaka ordentligt i en minut, tillsätt 50 ml destillerat vatten, skaka igen och
låt stå.
Efter separering, tappa av såplagret i botten. Ta också bort andra mellan-
lager (t ex olösliga ämnen). Tvätta hexanlösningen som innehåller den
neutraliserade oljan med 25 till 30 ml portioner av 2-propanollösningen
(5.3) tills den rosa färgen från fenolftalin försvinner.1991R2568 — SV — 31.10.1995 — 013.001 — 30
▼B
Ta bort det mesta av hexanen genom destillation under vakuum i den rote-
rande injektorblocket (4.18). Torka oljan vid 30 till 40 ºC under vakuum
med hjälp av en ström av rent kväve tills hexanet avlägsnats helt och
hållet.
6.2Rening genom aluminumoxid
Gör iordning en suspension av 15 g aktiverat aluminumoxid (5.8) i 50 ml
hexan (5.1) och häll den under omrörning i kromatografikolonnen (4.7).
Låt aluminumoxidet sätta sig jämnt och låt lösningsmedelsnivån falla till
mellan 1 och 2 mm ovanför absorbentlagret. Häll försiktigt lösningen av
5 g olja i25 ml hexan (5.1) ikolonnen och samla sedan i hop allt från
kolonnen irundkolv (4.1).
7. PREPARERING AV KROMATOGRAFIPLATTOR
Rengör omsorgsfullt glasplattorna (4.13) med etanol, lättbensin och aceton
för att ta bort varje spår av fettämnen.
Häll upp 30 g kiselpulver (5.9) i en E-kolv (4.4). Tillsätt 60 ml destillerat
vatten. Sätt iproppen och skaka omsorgsfullt ien mi nut. Överför omedel-
bart suspensionen till utstrykaren (4.12) och täck de rena plattorna med ett
lager som är 0,25 mm tjockt.
Lufttorka plattorna i15 mi nuter och sedan ien ti mme itorkskåpet (4.16)
vid 103 ± 2ºC.
Låt plattorna svalna i exsickator till rumstemperatur för användning.Färdigställda plattor finns tillgängliga i handeln.
8. UTFÖRANDE8.1Hydrolys med pankreatiskt lipas
Väg upp ca 0,1 g av det färdigställda provet i ett centrifugrör (4.8). Om
provet är fett ifast form lös upp i0,2 ml hexan, under lätt uppvärmni ng
om så behövs.
Tillsätt 20 ml lipas (5.10) och 2 ml av buffertlösningen (5.15). Skaka om
ordentligt men försiktigt och tillsätt 0,5 ml av natriumkolatlösningen (5.14)
och 0,2 ml av kalciumkloridlösningen (5.13). Förslut provröret med den
slipade proppen, skaka försiktigt (se till att proppen inte blöts) och placera
sedan röret omedelbart itermostaten (4.17) som hålls vi d 40 ± 0,5 ºC och
skaka för hand under exakt en minut. Ta bort röret från termostaten och
blanda omsorgsfullt med hjälp av en elektrisk skakapparat (4.19) i exakt
två minuter. Kyl omedelbart i rinnande vatten. Tillsätt 1 ml saltsyra
(5.12) och 1 ml dietyleter (5.4). Sätt i proppen och blanda omsorgsfullt
med hjälp av en elektrisk skakapparat. Låt stå och ta bort det organiska
lagret med hjälp av en spruta (4.10) om så behövs efter centrifugering.
8.2Separering av monoglyceriderna genom tunnskiktskromatografi
Placera extraktet på kromatografiplattan med hjälp av mikrosprutan (4.11)
ca 1,5 cm från nedre kanten ien tunn jämn sträng, så smal som möjli gt.
Placera plattan iden väl mättade framkallni ngstanken (4.14) och framkalla
med framkallningslösningsmedel (5.7) vid 20 ºC upp till ca 1 cm från övre
änden av plattan.
Lufttorka plattan isamma temperatur som tanken har och spraya den 2,7-
dikloroflourosceinlösning (5.17). Identifiera monoglyceridernas band (R
fca
0,035) under ultraviolett ljus (4.20).
8.3Analys av monoglyceriderna genom gas- vätskekromatografi
Ta bort bandet som erhållits i 8.2 med hjälp av en spatel (undvik att ta bort
komponenter som stannat på baslinjen) och överför till metyleringskolven
(4.2).
Behandla den uppsamlade kiseln direkt med de metoder som beskrivits i
punkt 4.2 i bilaga 10 B för att överföra monoglyceriderna till metylestrar,
och undersök sedan estrarna med gaskromatografi som beskrivits i bilaga
10 A.
9. RESULTATANGIVELSE
Beräkna fettsyresammansättningen i 2-ställning med en decimal (anm 3).1991R2568 — SV — 31.10.1995 — 013.001 — 31
▼B
10. ANMÄRKNINGAR
Anm 1: Kontroll av lipasets aktivitet.
Preparera en oljeemulsion genom att skaka en blandning av 165 ml
av lösningen av gummi arabicum (5.21), 15 g krossad is och 20 ml
av en neutraliserad olja (5.18) i en lämplig skakapparat.
Placera 10 ml av denna emulsion i en bägare (4.5) följt av 0,3 ml
av natriumkolatlösningen (5.20) och sedan 20 ml destillerat vatten.
Sätt bägaren på en termostat vid 37 ± 0,5 ºC (anm 4). Sänk ner
elektroderna till en pH-meter (4.21) och en spiralomrörare (4.22).
Tillsätt med hjälp av en byrett (4.23) droppvis natriumhydro-
xidlösning (5.19) tills pH går upp till 8,5.
Tillsätt en tillräcklig mängd av vattensuspensionen med lipas (se
nedan). Så snart pH-metern visar ett pH på 8,3 startas stoppuret
(4.24) och droppa i natriumhydroxidlösningen (5.19) i en sådan
takt att pH bibehålls vid 8,3. Läs av volymen förbrukad alkali
varje minut.
Rita upp avläsningarna i form av en kurva med användande av
tiden som abskissa och antal ml alkalilösning som gått åt för att
bibehålla konstant pH som ordinata.
En rät linje bör erhållas.
Lipassuspensionen som angivits ovan är en 1:1 000 (m/m) suspen-
sion i vatten. För varje prov bör tillräckligt med denna suspension
användas så att ca 1 ml av alkalilösningen förbrukas på fyra till
fem minuter.
Vanligen behövs 1 till 5 mg av pulvret.Lipasenheten definieras som mängden enzym som kommer att
frigöra 10 mikroequivalenter syra per minut. Då erhålls aktiviteten
A av det pulver som använts, mätt ili pasenheter per mg genom
formeln:
A¼
V/C210
m
där:
V = mängden natriumhydroxidlösning (5.19) som använts per
minut och som tagits ur den uppritade kurvan,
m = mängden img av provdelen av pulvret.
Anm 2: Preparering av lipasen
Lipaser som har tillräcklig lipasaktivitet finns tillgängliga i
handeln. Det är också möjligt att framställa dem i laboratoriet på
följande sätt:
Kyl 5 kg färsk svinpankreas till 0 ºC. Ta bort det omgivande fettet
och anslutande vävnad och kör det ien mi xer så att en pasta
erhålles. Rör pastan med omröraren (4.25) i 4 till 6 timmar med
2,5 l av vattenfriaceton och centri fugera sedan. Extrahera
återstoden tre gånger till med samma mängd aceton, och sedan
två gånger med 1:1 (v/v) blandning av aceton och dietyleter och
därefter två gånger med dietyleter.
Torka återstoden ivakuum i48 ti mmar så att ett stabi lt pulver
erhålls. Detta skall lagras ikylskåp.
Anm 3: I samtliga fall är det tillrådligt att bestämma sammansättningen av
de totala fettsyrorna isamma prov, eftersom jämförelse med dessa
i syror i 2-ställning kommer att vara till hjälp vid tolkningen av de
kurvor som erhålls.
Anm 4: Temperaturen för hydrolysen ställs in vid 37 ºC om en olja i
vätskeform används. Den ställs emellertid på 40 ºC för provet för
att tillåta undersökning av fetter med smältpunkter upp till 45 ºC.1991R2568 — SV — 31.10.1995 — 013.001 — 32
▼B
BILAGA 8
BESTÄMNING AV SAMMANSÄTTNINGEN AV TRILINOLEIN
1. SYFTE
Bestämning av sammansättning av triglycerider i olivoljor i förhållande till
deras motsvarande antal kolatomer genom högeffektiv vätskekromatografi
(HPLC).
I denna standard beskrivs en metod för separering och kvantitativ
bestämning av triglyceridsammansättningen i vegetabiliska oljor i
förhållande till deras molekylvikter och hur omättade de är, som en funktion
av deras motsvarande antal kolatomer (se anm 1).
2. TILLÄMPNINGSOMRÅDE
Denna standard är tillämplig på alla vegetabiliska oljor som innehåller trig-
lycerider av fettsyror med långa kedjor. Metoden är speciellt lämpad för
bestämning av närvaron av små kvantiteter av halvtorkande oljor (med hög
halt av linolsyra) i vegetabiliska oljor som innehåller oljesyra som den
övervägande omättade fettsyran, t. ex. olivolja.
3. PRINCIP
Separation av triglycerider enligt deras antal kolatomer genom HPLC
(omvänd faspolaritet) och tolkning av kromatogrammen.
4. UTRUSTNING
4.1 HPLC-kromatograf, med möjlighet till termostatkontroll av kolonntempera-
turen.
4.2 Insprutningsenhet för 10 µl.4.3 Detektor: Differentialrefraktometer. Känslighet vid fullt skalutslag bör vara
minst 10
−4enheter av refraktionsindex.
4.4 Kolonn: Rostfritt rör 250 mm långt och med innerdiametern 4,5 mm, fyllt
med kiselkorn med 5 µm diamter med 22 till 23 % kol i form av oktadekyl-
silan (anm 2).
4.5 Registreringsenhet och/eller integreringsenhet.
5. REAGENSER
Reagenserna bör vara av analysren kvalitet. Elueringslösningsmedlen bör
vara avgasade, och kan återvinnas flera gånger utan inverkan på separering-
arna.
5.1 Kloroform.5.2 Aceton.5.3 Acetonitril.
5.4 Elueringslösningsmedel: Acetontitril + aceton (proportionerna mellan dessa
kan justeras för att få önskad separering, börja med blandningen 50:50).
5.5 Lösningsgörande lösningsmedel: Aceton eller en blandning av 1:1 aceton-
kloroform.
5.6 Referenstriglycerider: Antingen kan triglycerider som finns i handeln
användas (tripalmitin, triolein, osv) och retentionstiderna plottas i enlighet
med motsvarande antal kolatomer, eller alternativt ett referenskromatogram
som erhållits ur sojaolja (se anm 3 och 4 och fig 1 och 2).
6. PREPARERING AV PROVEN
En 5 % lösning av proven som skall analyseras iordningställs genom att
väga in 0,5 ± 0,001 g av provet i en 10 ml mätkolv och späda till 10 ml
med det lösningsgörande lösningsmedlet (5.5).
7. UTFÖRANDE
7.1 Sätt upp kromatografisystemet. Pumpa elueringslösningsmedel (5.4) med en
hastighet av 1,5 ml/min så att hela systemet rengörs. Vänta tills en stabil
baslinje erhålls.1991R2568 — SV — 31.10.1995 — 013.001 — 33
▼B
Injicera 10 µl av provet som preparerats enligt punkt 6.
8. RESULTATANGIVELSE
Använd den interna standardiseringsmetoden, dvs antag att summan av
areorna av topparna som motsvarar de olika triglyceriderna är lika med
100 %.
Beräkna den relativa procenten av varje glycerid enligt formeln:
% triglycerid =toppens area
summan av areorna av topparna× 100
Resultatet anges med en decimal.
Anm 1: Elueringsordningen kan bestämmas genom att beräkna motsvarande
antal kolatomer som ofta definieras av förhållandet ECN = CN −
2n, där CN är antalet kolatomer och n är antalet dubbelbindningar.
Den kan beräknas mera exakt genom att hänsyn tas till dubbelbind-
ningarnas ursprung.
Om no,n1och n1när antalet dubbelbindningar som överförs till olin-
syra, linolsyra och linolensyra kan motsvarande antal kolatomer
beräknas som ett förhållanden genom formeln:
ECN = CN − dono−d1n1−d1an1a
där koefficienterna do,d1och d1nkan beräknas med hjälp av referen-
striglycerider. Under de förhållanden som anges i denna metod
kommer det förhållandet som erhålls att vara nära:
ECN = CN − [2,60no] − [2,35n1] − [2,17n1n]
Anm 2: Exempel: Lichrosorb (Merck) RP 18, artikel 50333.
Lichrosphere (Merck) 100 CH18, artikel 50377, eller
liknande.
Anm 3: Med flera referenstriglycerider är det också möjligt att beräkna
upplösningen i fråga om triolein,
α=R T′/RT′olein.
Genom användning av den recuderade retentionstiden RT ′=R T−
RTlösningsmedel.
Kurvan av log αmot f (antal dubbelbindningar) gör det möjligt att
bestämma återgångsvärdena för alla triglycerider i fettsyror som
innehåller referenstriglyceriderna — se figur 2.
Anm 4: Effektiviteten hos kolonnen bör tillåta klar separering av trilinolen-
toppen (LLL) från topparna hos de triglycerider som har en
näraliggande RT.
Anm 5: För att medge en klar separering av trilinolentoppen från näralig-
gande toppar eller eventuella interfererande substanser, skall
bomolja och rå olivolja av pressrester renas i förväg enligt följande
metod:
200 µl outspädd olja absorberas i en silica-kolonn för extrahering
(typ SEP PAK silica cartridge-waters part. nr 51 900).
Triglyceriderna elueras med 20 ml vattenfri hexan för högeffektiv
vätskekromatografi(HPLC), under maxi malt 20 sekunder.
Eluatet torkas ien kvävgasström och återupplöses ii sopropanol
eller aceton (5 ml). 10—20 µl sprutas in i HPLC. Det är nödvändigt
att kontrollera att sammansättningen av oljans fettsyror är
densamma före och efter reningen, det vill säga att den ligger
inom de felmarginaler som den använda analysmetoden tillåter.1991R2568 — SV — 31.10.1995 — 013.001 — 34
▼M11
▼B
Figur 1
Kromatogram av ett prov på sojaolja
P = Palmitinsyra St = Stearinsyra O = Oljesyra L = Linolsyra Ln = Linolen-
syra1991R2568 — SV — 31.10.1995 — 013.001 — 35
▼B
Figur 2
Kurva för log αmot f (antal dubbelbindningar)
La = Laurinsyra My = Myristinsyra P = Palmitinsyra St = Stearinsyra O =
Oljesyra L = Linolsyra Ln = Linolensyra1991R2568 — SV — 31.10.1995 — 013.001 — 36
▼B
BILAGA 9
SPEKTROFOTOMETRISK UNDERSÖKNING
INLEDNING
Spektrofotometrisk undersökning i ultraviolett ljus kan ge information om
kvalitet på fett, dess grad av konservering och förändringar som inträffar i
dem beroende på tekniska processer.
Absorptionen vid våglängderna som anges i metoden beror på närvaron av
konjugerade dien- och triensystem. Dessa absorptioner uttrycks som speci-
fika extinktioner E 1 % 1 cm (extinktionen av 1 % lösning av fettet i ett
givet lösningsmedel med en tjocklek av 1 cm som konventionellt anges
genom K (även kallad extinktionskoefficienten).
1. SYFTE
Förfarandet beskriver en metod för genomförande av spektrofotometrisk
undersökning av fetter i ultraviolett ljus.
2. PRINCIP
Fettet i fråga löses i den behövliga mängden lösningsmedel och extinktionen
hos lösningen bestäms sedan vid de angivna våglängderna med rent
lösningsmedel som referens. Specifika extinktioner beräknas ur spektrofoto-
metervärdena.
3. UTRUSTNING
3.1 En spektrofotometer för mätning av extinktion vid ultraviolettområdet
mellan 220 och 360 nm med möjlighet till att avläsa enstaka nanometriska
enheter.
3.2 Rektangulära quartzkuvetter med lock och med en optisk längd av 1 cm.
När de är fyllda med vatten eller annat lämpligt lösningsmedel bör kuvet-
terna inte skiljas åt mer än 0,01 extinktionsenheter.
3.3 25 ml mätkolvar.
3.4 En kromatografikolonn vars översta del är 270 mm lång med en diameter av
35 mm, och vars nedersta del är 270 mm lång med en diameter av cirka 10
mm.
4. REAGENSER
4.1 Spektrografren iso-oktan (2,2,4-trimetylpentan). Med destillerat vatten som
referens skall denna ha en genomsläpplighet av minst 60 % vid 220 nm
och minst 95 % vid 250 nm, eller
— spektrografren cyklohexan. Med destillerat vatten som referens bör
denna ha en genomsläpplighet av minst 40 % vid 220 nm och minst
95 % vid 250 nm, eller.
4.2 Aluminumoxid för kolonnkromatografi som är iordningsställd och kontrol-
lerad som beskrivits i bilaga 1.
4.3 N-hexan för kromatografi.
5. UTFÖRANDE
5.1 Provet i fråga måste vara helt homogent och utan misstänkta föroreningar.
Oljor som är flytande vid den omgivande temperaturen skall filtreras genom
papper vid en temperatur av ca 30 ºC, hårdare fetter skall homogeniserasoch filtreras vid en temperatur på högst 10 ºC över smältpunkten.
5.2 Väg exakt in ungefär 0,25 g av provet som iordningsställts på detta sätt i en
25 ml mätkolv, späd till märket med det angivna lösningsmedlet och homo-
genisera. Den resulterande lösningen måste vara helt klar. Vid opalesens
filtreras lösningen genom papper.1991R2568 — SV — 31.10.1995 — 013.001 — 37
▼M6
▼B
▼M6
▼B
▼B
5.3 Fyll en kuvett med den erhållna lösningen och mät extinktionen vid en
lämplig våglängd mellan 232 och 276 nm, med användande av lösnings-
medlet som referens.
Extinktionsvärdena som antecknas måste ligga inom området 0,1 till 0,8.
Om de inte gör detta måste mätningarna göras om och mera koncentrerad
eller mera utspädd lösning måste användas.
5.4 När en bestämning av den specifika extinktionen krävs efter passage över
aluminiumoxid, görs det på följande sätt. Placera 30 g aluminumoxid i
suspension i hexan i kromatografikolonnen. Sedan adsorbenten har satt sig,
ta bort överskottet av hexan ned till ca 1 cm ovanför aluminumoxidets övre
yta.
Lös 10 g av fettet, homogeniserat och filtrerat som beskrivits i 5.1, i 100 ml
hexan och häll lösningen i kolonnen. Samla upp eluatet och indunsta allt
lösningsmedel i vakuum vid en temperatur under 25 ºC.
Fortsätt därefter omdelbart som angivits i 5.2 med användande av det fett
som erhållits.
6. RESULTATANGIVELSE
6.1 Anteckna de specifika extinktionerna (extinktionskoefficienterna) vid de
olika våglängderna och beräkna på följande sätt:
Kλ¼Eλ
c/C1s
där:
Kλ= pecifika extinktionen vid våglängden λ
Eλ= extinktionen uppmätt vid våglängden λ
c = koncentrationen hos lösningen i g/100 ml
s = tjockleken hos kuvetten icm
Resultaten uttrycks med två decimaler.
6.2 Spektrofotometrisk analys av olivolja enligt den officiella metoden i EEG:s
förordningar anges bestämning av den specifika extinktionen i iso-oktanlös-
ning vid våglängderna 232 och 270 nm och bestämning av ∆K som ges
genom:
∆K¼Km/C0Km/C04þKmþ4
2
där Kmär den specifika extinktionen vid våglängden m, våglängden för
maximal absorbtion runt 270 mm.1991R2568 — SV — 31.10.1995 — 013.001 — 38
▼B
TILLÄGG I
Preparering av aluminumoxid och provning av dess aktivitet
A.1.1 Preparering av aluminumoxid
Placera aluminumoxidet som har torkats i en ugn vid 380 till 400 ºC i tre
timmar i en hermetiskt sluten behållare, sätt till destillerat vatten i
förhållandet 5 ml per 100 g aluminumoxid, stäng behållaren omedelbart,
skaka flera gånger och låt stå i minst 12 timmar före användning.
A.1.2 Kontroll av aluminumoxidets aktivitet
Gör i ordning en kromatografikolonn med 30 g aluminumoxid. Gör på
samma sätt som beskrivits i punkt 5.4 och låt en blandning som består av
— 95 % jungfruolja med en specifik extinktion på mindre än 0,18 vid
268 nm
— 5 % jordnötsolja som behandlats med jord i raffineringsprocessen och
som har en specifik extinktion av minst 4 vid 268 nm
passera genom kolonnen.
Om blandningen sedan den passerat kolonnen har en specifik extinktion
av mer än 0,11 vid 268 nm kan aluminumoxidet accepteras, om inte
måste dehydreringsnivån ökas.1991R2568 — SV — 31.10.1995 — 013.001 — 39
▼B
TILLÄGG II
Kalibrering av fotospektrometer
A.2 Utrustningen måste kontrolleras med jämna mellanrum (minst var sjätte
månad) både beträffande våglängderna och noggrannheten hos svaret.
A.2.1 Våglängden kan kontrolleras med användning av kvicksilvergaslampa
eller med hjälp av lämpliga filter.
A.2.2 För att kontrollera svaret från fotocellen och fotomultiplikatorn gör på
följande sätt: Väg in 0,2 g ren kaliumkromat för spektrofotometri och
lös detta i 0,05 N kaliumhydroxidlösning i en 1 000 ml mätkolv och
späd till märket. Ta ut exakt 25 ml av lösningen, överför det till en
500 ml mätkolv och späd upp till märket med samma kaliumhydroxidlös-
ning.
Mät extinktionen hos lösningen vid 275 nm med användning av kalium-
hydroxidlösningen som referens. Den uppmätta extinktionen med
användande av 1 cm kuvett bör vara 0,200 ± 0,005.1991R2568 — SV — 31.10.1995 — 013.001 — 40
▼B
BILAGA 10 A
ANALYS AV METYLESTRAR AV FETTSYROR MED GASKROMATO-
GRAFI
1. SYFTE
Denna metod ger allmänna riktlinjer för tillämpning av gaskromatografi
med användning av packade kolonner eller kapillärkolonner för att
bestämma den kvalitativa och kvantitativa sammansättning av en bland-
ning av fettsyremetylestrar som erhållits i enlighet med den metod som
anges ibi laga 10 B.
Metoden är inte tillämplig på polymeriserade fettsyror.
2. REAGENSER
2.1Bärargas
Inert gas (kväve, helium, argon, väte osv) som är omsorgsfullt torkad
och med en syrehalt som är mindre än 10 mg/kg.
Anm 1: Väte, som endast används som bärargas ikapi llärkolonner, kan
fördubbla analyshastigheten men är farlig. Säkerhetsanordningar
finns att tillgå.
2.2Supplementerande gaser
2.2.1 Väte (renhet ≥99,9 %) fri från organiska föroreningar.
2.2.2 Luft eller syre fri från organiska föroreningar.
2.3Standard för referens
En blandning av metylestrar av rena fettsyror eller metylestrar av ett fett
av känd sammansättning, företrädesvis liknande det fett som skall analy-
seras.
Försiktighet skall iakttas för att förhindra oxidation av fleromättade fett-
syror.
3. UTRUSTNING
De anvisningar som ges här avser vanlig utrustning som används för
gaskromatografi, som använder packade kolonner eller kapillärkolonner
och en flamjoniseringsdetektor. Vilken apparatur som helst som ger
effektiviteten och upplösningen som anges i 4.1.2 är lämplig.
3.1Gaskromatograf
Gaskromatografen skall bestå av följande enheter.
3.1.1 Insprutningssystem
Använd ett insprutningssystem
a) med packade kolonner med minsta möjliga dödutrymme (i det här
fallet skall insprutningssystemet kunna upphettas till en temperatur
som är 20 till 50 ºC högre än kolonnens, eller
b) med kapillärkolonner, varvid insprutningssystemet skall vara speciellt
konstruerat för användning med sådana kolonner. Injektorn kan vara
med eller utan split.
Anm 2: Vid frånvaro av fettsyror med minst 16 kolatomer kan ett
insprutningssystem med rörlig nål användas.
3.1.2 Ugn
Ugnen skall kunna värma kolonnen till en temperatur av minst 260 ºC
och upprätthålla den önskade temperaturen inom 1 ºC med packad
kolonn och inom 0,1 ºC med kapillärkolonn. Det senaste kravet är
särskilt viktigt när kvartsrör används.
Användning av temperaturprogrammerad uppvärmning rekommenderas i
alla fall och särskilt för fettsyror med mindre än 16 kolatomer.
3.1.3 Packad kolonn1991R2568 — SV — 31.10.1995 — 013.001 — 41
▼B
3.1.3.1 En kolonn som är tillverkad av ett material som är inert mot de ämnen
som skall analyseras (dvs glas eller rostfritt ståll och som har följande
dimensioner:
a) längd: 1 till 3 m. En relativt kort kolonn bör användas om fettsyror
med långa kedjor (längre än C20) finns närvarande. I analys av fett-
syror med 4 eller 6 kolatomer rekommenderas att en kolonn på 2 m i
längd används.
b) innerdiameter: 2 till 4 mm.
Anm 3: Om fleromättade komponenter med fler än 3 dubbelbindningar
finns närvarande kan de sönderdelas i en kolonn av rostfritt stål.
Anm 4: Ett system med dubbla packade kolonner kan användas.
3.1.3.2 Fyllning, sammansatt av följande element
a) bärare: syratvättad och silaniserad kiselgur, eller annan lämplig inert
bärare med en kornstorlek med liten avvikelse (25 µm inom
gränserna 125 till 200 µm) varvid genomsnittskornstorleken skall
avpassas efter innerdiametern och längden på kolonnen.
b) stationär fas: polyestertyp av polar vätska (t.ex. dietylenglykolpoly-
succinat, butandiolpolysuccinat, etylenglykolpolyadipat, osv)
cyanosilikoner eller någon annan vätska som tillåter den behövliga
kromatografiska separationen (se punkt 4). Den stationära fasen bör
uppgå till 5 till 20 % (m/m) av fyllningen. En ickepolar stationär
fas kan användas för vissa separationer.
3.1.3.3 Preparering av kolonnen
Om möjligt tas kolonnen bort från detektorn, ugnen upphettas stegvis till
185 ºC och en ström av inert gas blåses igenom den nybehandlade
kolonnen med en hastighet av 20 till 60 ml per minut i åtminstone 16
timmar vid denna temperatur och under ytterligare två timmar vid
195 ºC.
3.1.4 Kapillärkolonn3.1.4.1 Rör som är tillverkade av ett material som är inert för ämnen som skall
analyseras (vanligen glas eller kvarts). Innerdiametern skall vara mellan
0,2 och 0,8 mm. Den inre ytan skall genomgå en lämplig behandling (t
ex ytpreparering, inaktivering) innan den får täckning av den stationära
fasen. En längd på 25 mm är tillräcklig i de flesta fall.
3.1.4.2 Stationär fas, vanligen av typen polyglykol [poly(etylenglykol) 20 000],
polyester (butandiol polysuccinat) eller polärpolysiloxan (cyanosili-
koner). Tvärbundna kolonnfyllningar är lämpliga.
Anm 5: Det finns en risk att polära polysiloxaner ger upphov till
svårighet att identifiera och separera linolensyra och C
20-syror.
Beläggningen skall vara tunn, dvs 0,1 till 0,2 µm.
3.1.4.3 Sammansättning och konditionering av kolonnen
Följ de normala försiktighetsåtgärderna för att sätta ihop kapillärkolon-
nerna, dvs placeringen av kolonnen i ugnen (bärare) val och
sammansättning av skarvar (läckaget) placering av kolonnens in- och
utlopp i injektorn och detektorn (minskning av dödutrymmen). Placera
kolonnen ien ström av bärargas [t.ex. 0,3 bar (30 kPa) för en kolonn
med längden 25 mm och en innerdiameter på 0,3 mm].
Behandla kolonnen genom temperaturprogrammering av ugnen till 3 ºC/
minut från omgivningstemperaturen till en temperatur som är 10 ºC
under sönderfallsgränsen för den stationära fasen. Håll ugnen vid denna
temperatur i en timme, tills baslinjen har stabiliserats. Gå tillbaka till
180 ºC för att arbeta under isoterma förhållanden.
Anm 6: Lämpliga förbehandlade kolonner finns tillgängliga i handeln.
3.1.5 Detektor som lämpligen skall kunna värmas upp till en temperatur som
ligger ovanför kolonntemperaturen.
3.2Sprutor
Sprutorna skall ha en maximivolym av 10 µl och vara graderade i 0,1 µl
delning.
3.3Registering
Om registreringskurvan skall användas för att beräkna sammansätt-
ningen av den blandning som analyseras, krävs en elektronisk1991R2568 — SV — 31.10.1995 — 013.001 — 42
▼B
registreringsapparat med hög precision och som är kompatibel med
apparaturen som används. Registreringsenheten skall ha följande
karaktäristika:
a) svarstid, under 1,5 sekunder, företrädesvis 1 sekund (svarshastigheten
är tiden det tar för pennan att gå från 0 till 90 % vid en plötslig
ingångssignal på 100 %),
b) pappersbredd minimum 20 cm,
c) pappershastighet inställbar på värden mellan 0,4 och 2,5 cm/minut.
3.4Integreringsenhet
Snabb och exakt beräkning kan genomföras med hjälp av en elektronisk
integreringsenhet. Den skall ge ett linjärt svar med tillräcklig känslighet
och korrektionen för avvikelser från baslinjen skall vara tillfredsstäl-
lande.
4. UTFÖRANDE
De arbeten som beskrivs i 4.1 till 4.3 är relaterade till användning av en
flamjoniseringsdetektor.
Som alternativ kan en gaskromatograf som använder sig av en kataro-
meterdetektor användas (som arbetar enligt principen om förändringar i
värmeledning). Driftförhållandena modifieras som beskrivs i punkt 6.
4.1Provningsförhållanden
4.1.1 Val av optimala provningsförhållanden.4.1.1.1 Packad kolonn
Vid val av provningsförhållanden skall hänsyn tas till följande variabler:
a) längden och diametern hos kolonnen,
b) sorten och mängden av den stationära fasen,
c) temperaturen hos kolonnen,
d) bärargasen flöde,
e) den upplösning som krävs,
f) storleken på det uttagna provet som har valts på ett sådant sätt att
detektorn och elektrometer ger ett linjärt utslag,
g) analysens tidslängd.
I allmänhet ger de värden som anges itabell 1 och tabell 2 de önskade
resultatet, dvs minst 2 000 teoretiska bottnar per meter kolonnlängd för
metylstearat och en elueringstid på ca 15 minuter.
Om utrustningen tillåter skall injektorn hållas vid en temperatur av ca
200 ºC och detektorn vid en temperatur som är lika med eller högre än
den ikolonnen.
Som regel gäller att förhållandet mellan flödet hos vätet som tillförs till
flamjoniseringsdetektorn och bärargasen varierar från 1:2 till 1:1
beroende på diametern på kolonnen. Syreflödet är ca 5 till 10 gånger
vätets flöde.
Tabell 1
Inre diameter hos kolonnen
mmBärargasflöde
ml/min
2 15 till 25
3 20 till 40
4 40 till 60
Tabell 2
Koncentration av den stationära fasen
% (m/m)Kolonntemperatur
ºC
5 175
10 180
15 1851991R2568 — SV — 31.10.1995 — 013.001 — 43
▼B
Koncentration av den stationära fasen
% (m/m)Kolonntemperatur
ºC
20 185
4.1.1.2 Kapillärkolonn
Effektivitets- och permeabilitetsegenskaperna hos kapillärkolonnen
medför att separationen mellan komponenterna och tiden för analysen i
hög grad är beroende av flödeshastigheten på bärargasen i kolonnen. Det
är därför nödvändigt att optimera driftförhållandena genom att påverka
denna parameter (eller enklare tryckfall ikolonnen) beroende på om
man önskar förbättra separationen eller göra en snabb analys.
4.1.2 Bestämning av antalet teoretiska bottnar (effektivt) och upplösning (se
figur 1).
Genomför analys av en blandning av metylstearat och metyloleat i
ungefär lika proportioner (t.ex. metylestrar av kakaosmör).
Välj temperaturen för kolonnen och bärargasens flöde så att maximum
på metylstearattoppen registreras ca 15 minuter efter lösningsmedels-
toppen. Använd en tillräcklig mängd av blandningen av metylestrar så
att metylstearattoppen upptar ungefär 3/4 av hela skalan.
Beräkna antalet teoretiska bottnar, n, med hjälp av formeln
n¼16dr1
W1/C20/C21
2
och upplösningen R, med hjälp av formeln
R¼2∆
W1þW2
där:
dr1är retentionsavståndet i mm från början av kromatogrammet
till maximitoppen för metylstearat,
w1och w2är bredderna imm av topparna för metylstearat respekti ve
metyloleat mätt mellan punkterna för tangeternas skärnings-
punkt vid de punkter där kurvorna skär baslinjen, och
∆är avståndet imm mellan toppmaxi ma för metylstearat och
metyloleat,
och upplösningsindex, lr, med hjälp av formeln
a
b
där:
a = höjden av den minsta toppen, mätt från baslinjen,
b = höjden av den lägsta punkten på botten mellan de två angränsande
topparna, mätt från baslinjen.1991R2568 — SV — 31.10.1995 — 013.001 — 44
▼M2
▼B
Figur 1
Kromatogram för bestämning av antalet teoretiska bottnar (effektivitet) och
upplösning
Driftförhållandena som skall väljas är sådana som kan ge åtminstone
2 000 teoretiska bottnar per meter av kolonnlängden för metylstearat
och en upplösning som är minst 1,25.
4.2Prov
Använd sprutan (3.2) och sug upp 0,1 till 2 µl av lösningen av mety-
lestrar som preparerats enligt bilaga 10 B och spruta in dem i kolonnen.
När det gäller estrar som inte är i lösning, preparera en lösning av ca
100 mg/ml av kromatografiskt ren heptan och spruta in 0,1 till 1 µl av
denna lösning.
Om analysen gäller ämnen ispårmängder, kan mängden av provet ökas
(upp till 10 gånger).
4.3Analys
I allmänhet skall driftförhållandena vara de som angetts i 4.1.1.
Det går emellertid att arbeta med en lägre kolonntemperatur när det
krävs bestämning av fettsyror med mindre än 12 kolatomer eller vid
högre temperaturer vid bestämning av fettsyror med mera än 20 kola-
tomer.
Ibland kan det vara möjligt att använda temperaturprogrammering i båda
dessa fall. Om provet t ex innehåller metylestrar av fettsyror med
mindre än 12 kolatomer, sprutas provet in vid 100 ºC (eller vid 50 till
60 ºC om smörsyra finns närvarande) och sedan höjs temperaturen
omedelbart med en hastighet av 4 till 8 ºC per minut till optimal tempe-
ratur. I vissa fall kan de två förfarandena kombineras.
Efter den programmerade uppvärmningen fortsätts elueringen vid en
konstant temperatur tills alla komponenterna eluerats. Om inte instru-
mentet har programmerad uppvärmning, använd det vid två bestämda
temperaturer mellan 100 och 195 ºC.1991R2568 — SV — 31.10.1995 — 013.001 — 45
▼B
Om så är nödvändigt rekommenderas att analysen genomförs på två
fasta faser med olika polaritet för att påvisa frånvaron av maskerade
toppar t ex när det gäller samtidig närvaro av C18:3och C20:0, eller C18:3och C18:2.
4.4Beredning av referenskromatogrammet och referensgraferna
Analysera referensstandardblandningen (2.3) med användande av samma
driftförhållande som de som använts för provet och mät retentionsti-
derna eller retentionsavstånden för de närvarande fettsyrorna. Rita på
halvlogaritmiskt papper för varje grad av omättnad de kurvor som visar
den logaritmiska retentionstiden eller avståndet som en funktion av
antalet kolatomer. Under isoterma förhållanden skall kurvorna för syror
med raka kolkedjor med samma grad av omättnad vara räta linjer. Dessa
linjer skall vara ungefär parallella.
Det är nödvändigt att undvika förhållanden som gör att ”maskerade
toppar” existerar, dvs där upplösningen är otillräcklig för att separera
två av de ingående ämnena.
5. RESULTATANGIVELSER5.1Kvalitativ analys
Identifiera topparna för metylestrarna från provet från de kurvor som
iordningställts enligt 4.4 om så behövs genom interpolering.
5.2Kvantitativ analys
5.2.1 Bestämning av sammansättningen
Bortsett från extrema fall användes den inre normaliseringsmetoden, dvs
antag att alla ingående komponenter i provet finns representerade på
kromatogrammet så att den totala ytan under topparna representerar
100 % av de ingående ämnena (total eluering).
Om utrustningen innefattar en integreringsenhet, använd de kurvor som
erhållits från denna. Om inte, bestäm arean under varje topp genom att
multiplicera höjden på toppen med dess bredd på mitten och där så
behövs med hänsyn till de olika avvikelserna som används under regi-
streringen.
5.2.2 Beräkningssätt5.2.2.1 Allmänt fall
Beräkna halten av en given komponent i, uttryckt som massprocent av
metylestrar, genom att bestämma den procent som representeras av
området hos motsvarande toppar relativt summan av områdena för alla
toppar med användning av formeln:
Ai
ΣA/C2100
där:
Aiär arean under toppen som motsvarar komponent i,
ΣA är summan av areorna under alla toppar,
Ange resultatet med en decimal.
Anm 7: I det här allmänna fallet anses resultatet av beräkningen som
baseras på relativa områden representera massprocent. För de
fall där inte detta antagande är tillåtet, se 5.2.2.2.
5.2.2.2 Användning av korrektionsfaktorer
I vissa fall, t.ex. i närvaro av fettsyror med färre än 8 kolatomer eller
fettsyror med sekundära grupper, när termiska ledningsdetektorer
används eller där högsta graden av noggrannhet särskilt krävs, skall
korrektionsfaktorer användas för att omvandla procenten för toppareorna
till massprocent hos komponenterna.
Bestäm korrektionsfaktorerna med hjälp av ett kromatogram som erhål-
lits genom analys av en referensblandning med metylestrar av känd
sammansättning genomförda under identiskt samma förhållanden som
de som används vid analys av provet.
För denna referensblandning erhålls massprocenten av komponenten i
genom formeln1991R2568 — SV — 31.10.1995 — 013.001 — 46
▼B
mi
Σm/C2100
där:
miär massan hos komponenten iireferensblandni ngen.
Σm är den totala massan av de olika komponenterna i referensbland-
ningen.
Beräkna ur kromatogrammet för referensblandningen (4.4) procenten
(area/area) för komponent ipå följande sätt:
AI
ΣA/C2100
där:
Aiär arean under toppen som motsvarar komponenten i,
ΣA är summan av areorna under alla topparna,
Korrektionsfaktorn beräknas sedan som:
Ki¼mi/C2ΣA
Ai/C2Σm
Vanligen är korrektionsfaktorerna uttryckta relativt till KC16så att de
relativa faktorerna blir:
K0
i¼Ki
KC16
För provet är innehållet av varje komponent iuttryckt som massprocent
av metylestrar:
K0
i/C2Ai
ΣK0
i/C2Ai/C0/C1 /C2100
Ange resultatet med en decimal.
5.2.2.3 Användning av inre standard
I vissa analyser (t ex där inte alla fettsyrorna är kvantifierade, såsom när
syror med fyra och sex kolatomer är närvarande tillsammans med syror
med 16 och 18 kolatomer, eller när det är nödvändigt att bestämma den
absoluta mängden fettsyror iett prov) är det nödvändi gt att använda en
inre standard. Fettsyror med 5, 15 eller 17 kolatomer används ofta.
Korrektionsfaktorn (om sådan finns) för den inre standarden bör
bestämmas.
Massprocenten av komponenten i, uttryckt som metylestrar, erhålls
genom formeln:
ms/C2K0
i/C2Ai
m/C2K0
s/C2As/C2100
där:
Aiär arean under toppen som motsvarar komponenten i,
Asär arean under toppen som motsvarar den inre standarden,
K′iär korrektionsfaktorn för komponent i (relativ till KC16)
K′sär korrektionsfaktorn för den inre standarden (relativt till KC16)
m är massan i milligram av provet, och
msär massan i milligram av den inre standarden.
Ange resultatet med en decimal.
6. SPECIALFALL - BESTÄMNING AV TRANSISOMERER
Det är möjligt att bestämma innehållet av transisomerer i fettsyror med
ett antal kolatomer mellan 10 och 24 genom separering av metylestrar
med användning av gaskromatografiska kapillärkolonner med en
bestämd polaritet.1991R2568 — SV — 31.10.1995 — 013.001 — 47
▼M2
▼M2
6.1. En kapillärkolonn tillverkad av kiseldioxid med en innerdiameter av
mellan 0,25 och 0,32 mm och en längd av 50 m, belagd med cyanpro-
pylkiseldioxid, där beläggningen är mellan 0,1 och 0,3 µm (typ SP 2380,
C. P. sil 88, silor 10 och likartade sorter).
6.2. Metylestrarna är beredda genom det förfarande som anges ibi laga 10 B.
För säkerhets skull skall fetthaltiga ämnen med en fri syrahalt över 3 %,
neutraliseras enligt 6.1 i bilaga 7.
6.3. Gaskromatografens driftsförhållanden är i allmänhet följande:
— Kolonntemperaturen inställd mellan 150 och 230º C (t. ex. 165º C i
15 minuter, och sedan ökad med 5º C per minut till 200º C).
— Insprutningstemperatur: 250º C om splitsystemet används eller
kolonnens ingångstemperatur om kolonnsystemet används.
— Detektortemperatur: 260º C.— Genomströmningshastighet för bärargas (helium och väte): 1,2 ml
per minut.
Den insprutade mängden skall vara sådan att höjden hos den topp som
under de sensoriska förhållanden som råder överensstämmer med
arachinsyras metylester, är lika stor som eller större än 20 % av fullt
utslag.
6.4. Identifieringen av de olika metylestrarna genomförs på grundval av
retentionstiderna som jämförs med referensblandningarnas retentions-
tider (som anges i punkt 2.3).
Estrarna från transfettsyrorna elueras före motsvarande cis-isomerer.
Exempel på ett kromatogram finns i figur 2.
Figur 2:
Gaskromatogram för transisomerer från fettsyror vid användning av kapillärko-
lonner.
6.5. Kolonnen enligt punkt 4.1.2 skall vara så effektiv att den medger sepa-
ration av vissa kritiska par, till exempel det par som består av
transoljesyra och oljesyra, trans C18:1/cis C18:1, med ett resolutionstal
högre än 2.
6.6. Procenten av de olika transfettsyrorna beräknas på grundval av
förhållandet mellan den tillämpliga toppens area och summan av alla
de förekommande topparnas areor.
Därvid beaktas de procentuella andelarna av
— transoktadekensyra (T 18:1) som anges i bilaga 1 till denna förord-
ning som summan av isomererna av transoljesyra,
— cis-trans- och trans-cis-oktadekadiensyra (CT/TC) 18:2 som anges i
bilaga 1 till denna förordning som summan av isomererna av transli-
nolsyra,1991R2568 — SV — 31.10.1995 — 013.001 — 48
▼M2
— trans-cis-trans-, cis-cis-trans-, cis-trans-cis-, trans-cis-cis- oktadeka-
triensyra [TCT + CCT + CTC + TCC)]18:3, angivna i bilaga 1 till
denna förordning som summan av isomererna av translinolensyra.
Anmärkning 8: Ange resultaten med 2 decimaler vid beaktande av de
särskilda kännetecknen för denna metod.
►M27.◄SPECIALFALL ANVÄNDNING AV KATAROMETERDE-
TEKTOR (SOM REGISTRERAR FÖRÄNDRINGAR AV
VÄRMELEDNINGSFÖRMÅGAN)
En gaskromatograf med en detektor som registrerar förändringar av
värmeledningsförmågan (en katorometer) kan också användas för
bestämning av den kvalitativa och kvantitativa sammansättningen av en
blandning av fettsyror metylestrar. Om en sådan används bör det
förhållande som anges i punkt 3 och punkt 4 modifieras enligt tabell 3.
För kvantitativ analys används korrektionsfaktorerna som definieras i
5.2.2.2.
Tabell 3
Variabel Värde/förhållande
Kolonn Längd: 2 till 4 m
Innerdiameter: 4 mm
Bärare Kornstorlek mellan 160 och
200 µm
Koncentration hos den stationära
fasen15 till 25 % (m/m)
Bärargas Helium eller, om detta saknas,
väte, med så låg halt av syre som
möjligt
Supplementerande gaser Ingen
Insprutningstemperatur Från 40 till 60 ºC över kolonn-
temperaturen
Kolonntemperatur 180 till 200 ºC
Flöde hos bärargasen Vanligen mellan 60 och 80 ml/
min
Storleken hos mängden prov som
sprutas inVanligen mellan 0,5 och 2 µl
►M28.◄PROVRAPPORT
Provrapporten skall ange de metoder som används för framställning av
metylestrarna och för gaskromatografanalysen och vilka resultat som
erhållits. Den skall också ange alla driftsdetaljer som inte anges i denna
internationella standard eller som betraktas som tillägg tillsammans med
enskildheter om varje incident som kan ha påverkat resultaten.
Provrapporten skall innehålla all information som behövs för en
komplett identifiering av provet.1991R2568 — SV — 31.10.1995 — 013.001 — 49
▼B
▼B
BILAGA 10 B
PREPARERING AV METYLESTRAR AV FETTSYROR I ENLIGHET
MED RUBRIKERNA 1 OCH 2 I BILAGA 6 TILL FÖRORDNING (EEG)
NR 72/77 ELLER TILL DEN METOD SOM BESKRIVS NEDAN
INLEDNING
Valet av förfarande bestäms av fettsyresammansättningen och surhetsgraden
för fettet som skall undersökas och den gaskromatografianalys som skall
genomföras.
Mer specificerat:
— endast processer med slutna ampuller eller processer som använder
dimetylsulfat kan användas för fettämnen som innehåller fettsyror med
mindre än 12 kolatomer,
— endast metanol-saltsyre eller metanol-sulfatprocesser kan användas för
fettämnen med en surhetsgrad över 3 %,
— endast processer som använder natriummetylat eller dimetylsulfat kan
användas för gaskromatografimätningar av transisomerer,
— metanol-hexan-svavelsyraprocessen skall användas för iordningställande
av metylestrarna i små kvantiteter av fettämnen från separationen genom
tunnskiktskromatografi.
Närvaron av oförtvålbara ämnen kan försummas under förutsättning att de
inte överskrider 3 %, i annat fall måste metylestrarna framställas från fettsy-
rorna.
1. SYFTE OCH TILLÄMPNINGSOMRÅDE
Här ges en beskrivning för fem metoder för framställning av metylestrar ur
fettämnen:
a) med natriummetylat,
b) med natriummetylat i en sluten ampull,
c) med metanol-saltsyra ien sluten ampull,
d) med dimetylsulfat,
e) med metanol-hexan-svavelsyra.
Metod A
2. PRINCIP
Fettämnet som skall underkastas analys uppvärms under återflöde med
metanol och natriummetylat. De metylestrar som erhålles extraheras med
etyleter.
3. UTRUSTNING
3.1 100 ml kolv med återflödeskylare som är försedd med natriumkalciumhyd-
roxidfyllt rör i toppen och normalslipningar.
3.2 50 ml mätglas.3.3 5 ml mätpipett som är graderad i 0,1 ml.
3.4 250 ml separertrattar.
3.5 200 ml kolv.
4. REAGENSER
4.1 Vattenfrimetanol.4.2 Lösning av ca 1 % natriummetylat i metanol. Denna iordningställs genom
att 0,34 g av metalliskt natrium löses i 100 ml vattenfri metanol.
4.3 Dietyleter.4.4 10 % natriumkloridlösning.4.5 40 till 60 ºC petroleumeter.1991R2568 — SV — 31.10.1995 — 013.001 — 50
▼B
5. UTFÖRANDE
5.1 2 g av fettämnet som tidigare har torkats över natriumsulftat och filtrerats,
överförs till 100 ml kolven. Tillsätt 35 ml metanol, sätt på återflödeskylaren
och koka under återflöde några minuter.
5.2 Stoppa uppvärmningsprocessen, ta bort kylaren och tillsätt snabbt 3,5 ml
natriummetylatlösning. Sätt tillbaka kylaren och koka under återflöde i
minst tre timmar. Metyliseringen är färdig när alla fettämnena har övergått
till vätskeform och blandningen är helt klar vid rumstemperatur.
5.3 Kyl och häll reagensblandningen i 250 ml separertratt, tillsätt 35 till 40 ml
etyleter, 100 ml vatten och 5 till 6 ml av 10 % natriumkloridlösning. Skaka
och låt sedan faserna separera. Överför vattenfasen till en ny separertratt
och extrahera ytterligare en gång med 25 ml dietyleter.
Tillsätt 50 ml 40 till 60 ºC petroleumeter till de sammanslagna eterex-
trakten. Vatten kommer att avskiljas och kan tas bort.
Tvätta eterfasen tre gånger med 10 till 15 ml vatten, låt torka över natrium-
sulfat och filtrera genom papper varvid filtratet samlas upp i en 200 ml
kolv.
Indunsta lösningsmedlet till 20 ml och fullfölj indunstningen på vattenbad i
en ström av ren kväve.
Metod B
2. PRINCIP
Fettämnet som skall underkastas analys behandlas med natriummetylat i en
metanollösning i en sluten ampull vid 85 till 90 ºC.
3. UTRUSTNING
3.1 Kraftig glasampull med en kapacitet på ca 5 ml (höjd 40 till 45 mm,
diameter 14 till 16 mm).
3.2 1 ml mätpipett som är graderad i 0,1 ml.
4. REAGENSER
4.1 Lösning av ca 1,5 % natriummetylat i metanol. Denna framställs genom att
0,50 g metalliskt natrium löses i 100 ml vattenfri metanol.
5. UTFÖRANDE
5.1 2 g av fettämnet som tidigare har torkats över natriumsulfat och filtrerats
förs in i glasampullen. Tillsätt 0,3 g (ca 0,4 ml) natriummetylatlösning och
smält sedan igen ampullen.
5.2 Sänk ner ampullen i 2 timmar i ett bad vid 85 till 90 ºC och skaka om då
och då. Förestringen är färdig när innehållet i ampullen är klart efter sedi-
mentering av glycerin och återstoden av reagenserna.
5.3 Kyl till rumstemperatur. Öppna ampullen när metylestrarna skall användas.
Dessa behöver inte någon vidare behandling innan de placeras i glaskroma-
tografen.
Metod C
2. PRINCIP
Fettämnet som skall underkastas analys behandlas med metanol-saltsyra ien
sluten ampull vid 100 ºC.
3. UTRUSTNING
3.1 Kraftig glasampull med en rymd av ca 5 ml (höjd 40 till 45 mm, diameter
14 till 16 mm).
3.2 1 ml och 2 ml kalibrerade pipetter.
4. REAGENSER
4.1 Lösning av saltsyra i 2 % metanol. Denna framställs ur klorväte och
vattenfrimetanol (anm 1).
4.2 Hexan för gaskromatografi.1991R2568 — SV — 31.10.1995 — 013.001 — 51
▼B
5. UTFÖRANDE
5.1 2 g av fettämnet som tidigare har torkats över natriumsulfat och filtrerats
förs in i glasampullen och 2 ml av saltsyra-metanollösningen tillsätts.
Smält igen glasampullen.
5.2 Sänk ner glasampullen i40 mi nuter iett bad vi d 100 ºC.5.3 Kyl ampullen under rinnande vatten, öppna den, tillsätt 2 ml destillerat
vatten och 1 ml hexan. Centrifugera och ta bort hexanfasen som är klar för
användning.
Metod D
2. PRINCIP
Fettämnet som skall underkastas analys förtvålas med en metanollösning av
kaliumhydroxid och behandlas sedan med dimetylsulfat. När saltsyra
tillsätts separareras automatiskt de bildade metylestrarna. Mycket rena mety-
lestrar framställs genom efterföljande behandling med aluminumoxid.
3. UTRUSTNING
3.1 Kraftigt provrör med en rymd av ca 20 ml, med 10/19 slipad propp och
säkerhetsfjädrar.
3.2 Återflödeskylare med normalslipningar 10/19.3.3 Glasfilter med sintrad skiva, G 2 storlek, 20 mm diameter.3.4 Provrör iglas med en rymd av ca 10 ml och koni sk botten.3.5 1 ml och 5 ml sprutor.
4. REAGENSER
4.1 Kaliumhydroxid 10 % lösning i metanol för gaskromatografi.4.2 Grön bromkresolindikator: 0,05 % lösning i metanol.4.3 Dimetylsulfat (d = 1,335 vid 15 ºC).4.4 Koncentrerad saltsyra (d = 1,19) spädd till lika delar med metanol för gask-
romatografi.
4.5 Brockmanns aluminiumoxid för adsorptionskromatografi.
5. UTFÖRANDE
5.1 2,2 ml av fettämnet som i förväg har torkats över natriumsulfat och filtrerats
förs över till ett 20 ml provrör. Tillsätt 5 ml av kaliumhydroxidlösningen
och några kvartsbitar som kokstenar. Anslut återflödeskylaren och värm
röret över en låg flamma i 5 minuter, skaka om. Förtvålningen är helt
genomförd när lösningen blir klar. Kyl slutligen med rinnande vatten och
ta bort återflödeskylaren.
5.2 Tillsätt 2 droppar av indikatorn och 1 ml dimetylsulfat med hjälp av en
spruta så att det sakta kan sprutas in. Förslut provröret hermetiskt och skaka
i 2 till 3 minuter och doppa ner botten av provröret i kokande vattenbad
med jämna mellanrum. Reaktionen är färdig när indikatorn ändrar färg från
blått till gult. Kyl slutligen provröret i rinnande vatten, öppna det och sätt
till 5 ml av saltsyra-metanollösningen.
5.3 Skaka om några sekunder, luta provröret åt sidan och knacka lätt på det.
Detta underlättar för metylestrarna att stiga till ytan i form av en oljig massa
(anm A).
Ta bort metylestrarna med hjälp av en spruta, överför dem till ett provrör
med konisk botten, tillsätt en mängd aluminumoxid som motsvarar ca 1/4
av volymen av metylestrarna, skaka och filtrera med filtrerpapper.
Anm A: Om inte metylestrarna separeras spontant, tillsätt 5 ml vatten till
provröret och skaka om.
Metod E
2. PRINCIP
Fettämnena som skall underkastas analys upphettas under återflöde med
metanol-hexan-svavelsyra. Metylestrarna som erhålles extraheras med petro-
leumeter.1991R2568 — SV — 31.10.1995 — 013.001 — 52
▼B
3. UTRUSTNING
3.1 Provrör med en rymd av ca 20 ml försedd med en luftåterflödeskylare ca 1
meter lång, med slipningar.
3.2 5 ml kalibrerad pipett.
3.3 50 ml separertratt.3.4 10 ml och 25 ml mätglas.3.5 15 ml provrör med konisk botten.
4. REAGENSER
4.1 Metyleringsreagens: vattenfri metanol-hexan-koncentrerad svavelsyra (d
= 1,84) iförhållandet 75:25:1 (v/v/v).
4.2 Petroleumeter 40 till 60 ºC.
4.3 Vattenfritt natriumsulfat.
5. UTFÖRANDE
5.1 För över ämnet som tagits från plattan i ett 20 ml provrör och tillsätt 5 ml
metyleringsreagens.
5.2 Sätt på återflödeskylaren och värm i30 mi nuter iett kokande vattenbad
(anm 2).
5.3 Överför kvantitativt blandningen i en 50 ml separertratt med tillsats av 10 ml
destillerat vatten och 10 ml petroleumeter. Skaka kraftigt och låt sedan
faserna separera, ta bort vattenfasen och tvätta eterfasen 2 gånger med
20 ml destillerat vatten. Tillsätt en liten mängd vattenfritt natriumsulfat i
separertratten, skaka om och låt det sätta sig under några minuter och filt-
rera. Samla upp filtratet i ett 15 ml provrör med konisk botten.
Indunsta lösningsmedlet på ett vattenbad i en ström av kväve.
Anm 1: Små mängder klorväte igasform kan lätt framställas ilaboratori et
ur den lösning som finns i handeln (d = 1,18) genom att koncen-
trerad svavelsyra (d = 1,84) doppas iden. Den fri gjorda gasen
torkas lätt genom att den får bubbla genom koncentrerad svavel-
syra. Eftersom klorväte mycket snabbt absorberas av metanol är
det tillrådligt att vidta de vanliga försiktighetsåtgärderna när man
löser det, t.ex. införa gasen genom en liten upp- och nervänd tratt
så att kanten på tratten precis når ytan på vätskan. Stora kvantiteter
metanol-klorvätelösning kan iordningställas i förväg eftersom det
håller sig utmärkt i ett provrör med glaspropp som förvaras mörkt.
Anm 2: För att styra kokpunkten sätt in en glasstav i provröret och ställ in
temperaturen på vattenbadet på 90 ºC.1991R2568 — SV — 31.10.1995 — 013.001 — 53
▼B
BILAGA 11
BESTÄMNING AV HALTEN FLYKTIGA HALOGENERADE
LÖSNINGSMEDEL I OLIVOLJA
1. METOD
Analys med gaskromatografi med användning av joniseringsteknik (head
space) .
2. UTRUSTNING
2.1 Gaskromatografiapparatur utrustad med elektronabsorbtionsdetektor (ECD).
2.2 Huvudutrymmesapparat (head space) .
2.3 Gaskromatografikolonn, av glas, 2 meter lång och 2 mm i diameter,
stationär fas.
OV101 10 % eller motsvarande uppsugen i kalcinerad diatomijord,
syramättad och silaniserad med en partikelstorlek på 80 till 100 mesh.
2.4 Bärar- och supplementerande gaser: Kväve för gaskromatografi, lämplig för
elektrondetektor.
2.5 Glaskolvar, 10 till 15 ml, med teflonskikt och aluminiumpropp med
membran för sprutor (septum).
2.6 Förslutningsklämmor.2.7 Gassprutor 0,5 till 2 ml.
3. REAGENSER
Standard: halogenerat lösningsmedel med en renhet som är lämplig för
gaskromatografi.
4. UTFÖRANDE
4.1 Väg exakt in ca 3 g olja i en glaskolv (som inte skall återanvändas) och
förslut den hermetiskt. Placera med en termostat vid 70 ºC i en timme.
Med hjälp av en spruta, ta försiktigt bort 0,2 till 0,5 ml av gasutrymmet
(head space). Injicera detta i kolonnen på gaskromatografen som har
följande inställningar:
— injektortemperatur 150 ºC
— kolonntemperatur 70 till 80 ºC— detektortemperatur 200 till 250 ºC
Andra temperaturer kan också användas under förutsättning att resultaten
blir de motsvarande.
4.2 Referenslösningar: Gör i ordning standardlösningar av raffinerad olivolja
som inte innehåller spår av lösningsmedel med koncentrationer som sträcker
sig från 0,05 till 1 ppm (mg/kg) och motsvarande för det antagna innehållet
i provet. De halogenerade lösningsmedlen kan spädas ut med användning av
pentan.
4.3 Kvantitativ uppskattning: Korrelera områdena eller höjderna på topparna på
provet och på standardlösningar hos den koncentration som ligger närmast.
Om avvikelsen är större än 10 % måste analysen upprepas i jämförelse med
en annan standardlösning tills avvikelsen ligger inom 10 %. Halten bestäms
på grundval av genomsnittet av de ursprungliga insprutningarna.
4.4 Resultatangivelse: Resultaten uttrycks i ppm (mg/kg). Registreringsgränsen
för metoden är 0,01 mg/kg.1991R2568 — SV — 31.10.1995 — 013.001 — 54
▼B
BILAGA 12
ORGANOLEPTISK VÄRDERING AV JUNGFRUOLJA
1. SYFTE
Avsikten med denna metod är att bestämma de kriterier som krävs för att
värdera smakegenskaper hos jungfruolja och för att utveckla den metod
som krävs för att göra detta.
2. TILLÄMPNINGSOMRÅDE
Förfarandet som beskrivs är bara tillämpligt för organoleptisk värdering
och klassificering av jungfruolja som kan användas för direkt konsum-
tion. Den inskränker sig till att gradera jungfruolja i numerisk skala som
står i relation till dess doft och smakämnen enligt bedömningen från en
grupp utvalda provsmakare som arbetar som en panel.
3. ALLMÄN GRUNDLÄGGANDE TERMINOLOGI FÖR SENSORISK
ANALYS
Se kapitlet med titeln ”Sensorisk analys: allmän grundläggande termino-
logi”.
4. SPECIELL TERMINOLOGI FÖR OLIVOLJA
4.1. Behagliga förnimmelser som framkallas av olivoljans egenskaper och
kvalitetsegenskaper.
Fruktig: arom som påminner både om lukten och smaken hos frisk, färsk
frukt plockad då den är perfekt mogen.
Moget fruktig: arom hos olivolja som erhållits från mogna frukter vilken
vanligen har en något fadd doft och söt smak.
Grönt fruktig: arom hos olja som erhållits från frukter som fortfarande är
omogna.
4.2. Förnimmelser som i varierande grad kan vara behagliga, beroende på
med vilken styrka de förnimms och som inte kan anses vara brister trots
att de påverkar oljans fruktighet i stort:
Äpple: arom av olivolja som påminner om denna frukt.
Söt:behaglig smak, inte exakt som socker, men som förekommer i olja i
vilken bittra, kärva och fräna egenskaper inte dominerar.
Gräs: karakteristisk arom hos vissa oljor som påminner om nyslaget gräs.
Gröna blad (bitter): arom hos olja som erhållits från extremt gröna oliver
eller oliver som har blivit krossade tillsammans med löv och kvistar.
Bitter : karakteristisk smak hos oljor som erhållits från gröna oliver eller
oliver som håller på att ändra färg. Smaken kan vara mer eller mindre
tilltalande, beroende på intensiteten.
Sträv: typisk förnimmelse hos vissa oljor som när de provas ger en känsla
av strävhet imunnen.
Skarp: skarp stickande smakförnimmelse, karakteristisk för oljor som
framställs ibörjan av skördeåret, framför allt av oli ver som fortfarande
är omogna. Denna framkallas genom fenolhaltiga ämnens inverkan på
trigenimusnervens ändar som är spridda över hela munhålan.
Mandel: denna smak kan uppträda itvå former, den form som är typi sk
för färska mandlar och den form som är speciell för torkade, friska
mandlar och som kan förväxlas med en begynnande härsken smak. En
utpräglad smak uppfattas som en eftersmak när oljan förblir i kontakt
med tungan och gommen. Förbinds med söta oljor som har en fadd doft.
Svag eller fadd: arom hos olivolja vars organoleptiska egenskaper är
mycket svaga beroende på förlust av de aromatiska komponenterna.
Hö:karakteristisk arom av vissa oljor som påminner om mer eller mindre
torkat gräs.
4.3. Förnimmelser som alltid är obehagliga även om deras intensitet nätt och
jämnt kan uppfattas och som skall anses vara organoleptiska brister:1991R2568 — SV — 31.10.1995 — 013.001 — 55
▼M3
▼M3
Esparto: karakteristisk arom hos olja som erhållits av oliver som pressats
inya mattor av espartogräs. Aromen kan vara oli ka, beroende på om
mattorna är tillverkade av färskt eller torkat espartogräs.
Jordig: karakteristisk arom hos olja som erhållits av oliver som har
insamlats med jord eller gyttja på oliverna och inte tvättats. Denna arom
kan ibland åtföljas av en unken, fuktig lukt.
Gammal: karakteristisk arom hos olja som har förvarats för länge i
lagringsbehållare. Kan också förekomma hos oljor som har varit
förpackade under för lång tid.
Larvsmak: karakteristisk arom hos olja som erhållits av oliver som har
varit utsatta för kraftiga angrepp av larver av oljeflugan (Dacus oleae) .
Metallisk: arom som påminner om metall. Karakteristisk för oljor som
under olämpliga förhållanden har varit i långvarig kontakt med
födoämnen eller metalliska ytor under krossning, blandning, pressning
eller lagring.
Unken-fuktig: karakteristisk arom hos oljor som erhållits från frukter, i
vilka stora mängder av svampar och jäsämnen har utvecklats beroende
på att de lagrats under fuktiga förhållanden i flera dagar.
Härsken: karakteristisk arom som är vanlig hos alla oljor och fetter som
har genomgått en oxidationsprocess som orsakats av förlängd kontakt
med luft. Denna arom är obehaglig och kan inte åtgärdas.
”Atrojado” (mögelaktig): karakteristisk arom hos olja som erhållits av
oliver som förvarats i högar och som har nått ett framskridet stadium av
jäsning.
Saltlake: arom av olja som utvunnits från oliver som har varit konserve-
rade isaltlösni ngar.
Pressrester: karakteristisk arom som påminner om aromen hos pressrester
av oliver.
Tvålig: en arom som skapar en lukt- och smaksensation som påminner
om den som framkallas av grönsåpa.
Grönsaksvatten: karakteristisk arom som olja fått till följd av dålig
dekantering och långvarig kontakt med grönsaksvatten.
Vinaktig-vinägeraktig: karakteristisk arom hos vissa oljor som påminner
om vin eller vinäger. Beror huvudsakligen på att ättiksyra, etylacetat och
etanol bildats i större mängder än vanligt i olivoljans arom.
Gurka: arom som uppstår när en olja är hermetiskt förpackad under allför
lång tid, särskilt i bleckbehållare, och som anses bero på att 2,6 nonadi-
enal bildats.
Upphettad eller bränd: karakteristisk arom hos oljor som orsakas av
allför kraftig eller långvarig upphettning under bearbetningen, i synnerhet
när massan blandas termiskt om detta sker under olämpliga förhållanden.
Grumligt sediment: karakteristisk arom hos olja som återvunnits ur
dekanterat sediment i fat eller underjordiska tankar.
Pressmatta: karakteristisk arom hos olja som erhållits från oliver som har
pressats ismutsi ga pressmattor, ivi lka jästa pressrester har lämnats kvar.
Fet:arom av olivolja som utvunnits i en fabrik där rester av petroleum,
fett eller mineralolja inte har avlägsnats på rätt sätt från maskinerna.
Rå:karakteristisk förnimmelse hos vissa oljor som när de provsmakas ger
en tjock, degliknande förnimmelse i munnen.
5. GLAS FÖR PROVSMAKNING AV OLJA
Se kapitlet som har rubriken ”Glas för provsmakning av olja”.
6. PROVNINGSRUM
Se kapitlet med rubriken ”Anvisningar för installation av ett provning-
srum”.1991R2568 — SV — 31.10.1995 — 013.001 — 56
▼B
▼B
7. UTRUSTNING
Följande utrustning, som krävs för att provsmakaren skall kunna utföra
sin uppgift ordentligt, skall finnas i varje bås och vara lätt tillgänglig:
— glas (standardiserade) som innehåller proven och som är märkta med
två slumpvis utvalda siffror eller två siffror och bokstäver. Märkena
skall vara gjorda med en permanent penna utan doft och smak,
— urglas med identisk märkning, att täcka glasen med,
— betygsark (se figur 2) som också innehåller instruktioner för dess
användning,
— penna,— små fat med äppelskivor,
— glas med vatten vid omgivningstemperatur.
8. METODIK
Detta avsnitt förutsätter sådana förkunskaper som krävs för att utföra
sensorisk analys av jungfruoljor och syftar till att standardisera
uppträdande och tillvägagångssätt för de provsmakare som deltar i sådana
prov och som måste vara medvetna om både de allmänna och speciella
rekommendationerna för olivoljeprovning.
8.1Uppgifter för den som organiserar eller övervakar panelen (eller
panelen)
Den som organiserar panelen skall vara en lämpligt utbildad, kunnig
person som är expert på den typen av oljor som han kommer att möta
under sitt arbete. Han är nyckelfiguren i panelen och ansvarig för organi-sation och genomförande. Han skall kalla provsmakarna i tillräckligt god
tid och skall klargöra varje tvivel som de kan ha beträffande genom-
förandet av proven men skall avstå från att föreslå någon uppfattning för
dem om provet.
Han skall vara ansvarig för att kontrollera apparaturen och för att
säkerställa att den är ordentligt rengjord, för iordningställande och
kodning av proverna och för att de förs fram till provsmakaren i enlighet
med vad som är lämpligt för experimentet samt för sammanställning och
statistisk analys av de data som erhållits så att de bästa resultaten erhålls
med minsta möjliga ansträngning.
Ett arbete som organisatör av panelen kräver sensorisk skicklighet,
noggrannhet vid preparering av proven och de rigorösa arrangemangen,
samt skicklighet och tålamod då det gäller planering och utförande av
proverna. Det är panelorganisatörens uppgift att stimulera moralen hos
medlemmarna i panelen genom att uppmuntra intresse, nyfikenhet och
tävlingsanda bland dem. Han skall säkerställa att hans egen uppfattning
inte är känd och skall förhindra att eventuella ledare sätter sina kriterier
över de andra provsmakarnas. Han skall också vara ansvarig för utbild-
ning, val och övervakning av provsmakarna för att kunna säkerställa att
de bibehåller en adekvat begåvning på området.
8.2Provningsförhållanden
8.2.1 Provstorlek
Varje glas skall innehålla 15 ml olja.
8.2.2 Provningstemperatur
Proverna på olja som skall provas skall hållas vid 28 ºC ± 2 ºC i glasen.
Denna temperatur har valts eftersom den är den bästa för att lätt kunna
observera organoleptiska skillnader vid normal temperatur när oljor
används som smaktillsats. En annan faktor som talar för detta är att vid
högre eller lägre temperaturer kan de aromatiska komponenterna bli
svårflyktiga eller också kan det bildas flyktiga komponenter som är speci-
fika för upphettade oljor.
8.2.3 Provningstider
Morgonen är bästa tiden för att prova oljor. Det har påvisats att de opti-
mala perceptionsperioderna när det gäller smak och lukt infaller under
den tiden på dagen.
Måltider föregås av en period då lukt- och smakkänslan ökar medan
denna uppfattning minskar efteråt.
Detta kriterium skall emellertid inte vara extremt så att hunger kan distra-
hera provsmakarna och därmed minska deras urskiljningsförmåga och
särskilt deras kriterier för godkännande och höga betyg.1991R2568 — SV — 31.10.1995 — 013.001 — 57
▼B
9. PROVSMAKARE
Personer som fungerar som provsmakare ide organolepti ska prov som
utförs på ätbara olivoljor skall utbildas och väljas ut i enlighet med deras
begåvning när det gäller att skilja mellan liknande prov. Det bör erinras
om att deras exakthet kommer att öka med utbildningen.
Åtta till tolv provsmakare behövs för provningen, men det är alltid
förståndigt att hålla några extra provsmakare i reserv för att täcka even-
tuell frånvaro.
9.1Allmänna rekommendationer för provsmakningskandidater och
provsmakare
Dessa rekommendationer är tillämpliga på provsmakarkandidater och
provsmakare under deras arbete.
När organisatören av panelen skickar ut kallelse för deltagande i ett orga-
noleptiskt prov, bör provsmakaren ha möjlighet att närvara vid den tid
som anges och skall iaktta följande:
9.1.1 Han får inte röka under en tidsrymd av minst 30 minuter före provning-
stiden.
9.1.2 Han får inte använda någon parfym, kosmetika eller tvål vars doft kan
dröja kvar tills tiden för provningen. Han skall använda en oparfymerad
eller lätt parfymerad tvål att tvätta händerna med och sedan skall han
skölja händerna och torka dem så ofta det behövs för att undvika varje
doft.
9.1.3 Han skall fasta minst en timma före provningens genomförande.9.1.4 Om han skulle känna fysisk ohälsa och särskilt om detta påverkar hans
sinnen för lukt och smak eller om han är påverkad av några psykologiska
effekter som hindrar att han koncentrerar sig på arbetet, skall provsma-
karen informera panelorganisatören om detta för att tas bort från
provningen eller vara avstängd tills korrekt beslut har fattats med hänsyn
till möjliga avvikelser i medelvärdet för resten av panelen.
9.1.5 När provsmakaren har följt ovanstående skall han inta sin plats i det bås
som tilldelats honom så lugnt och tyst som möjligt.
9.1.6 När provsmakaren satt sig, skall han kontrollera att korrekt utrustning
finns tillgänglig och är rätt arrangerad, och han skall försäkra sig om att
koden på glaset motsvarar koden på urglaset.
9.1.7 Han skall omsorgsfullt läsa igenom instruktionerna som anges på proto-
kollet och skall inte börja undersöka provet förrän han är absolut säker
på den uppgift han har att genomföra. Om några tvivel om detta skulle
uppstå bör han diskutera svårigheterna i enrum med panelorganisatören.
9.1.8 Provsmakaren skall ta upp glaset och hålla det täckt med urglaset, luta
det försiktigt och sedan rotera glaset i detta läge för att väta insidan så
mycket som möjligt. När denna fas är genomförd skall han ta bort
urglaset och lukta på provet med jämna, långsamma andetag tills han
har bildat sig en uppfattning omoljan som provas. Luktandet får inte
överskrida 30 sekunder. Om han inte kommit till någon slutsats under
denna tid skall han ta en kort paus innan han försöker igen. När
luktförmågan prövats skall provsmakaren avgöra aromen (den övergri-
pande uppfattningen hos smak, lukt och känsel). För att göra detta skall
han ta en liten klunk på ca 3 ml av oljan i munnen. Det är mycket viktigt
att fördela oljan över hela munhålan från framdelen av munnen och
tungan längs sidorna till bakre delen och gomfästet, eftersom det är ett
känt faktum att uppfattningen av de fyra primära smakerna, sött, salt,
surt och bittert, varierar i intensitet beroende på området på tungan och
gommen.
Det bör särskilt påpekas att det är viktigt att en tillräcklig mängd olja
sprids mycket sakta över bakre delen av tungan mot strupen medan prov-
smakaren koncentrerar sig på i vilken ordning de bittra och beska
upplevelserna förnimms. Om inte detta sker kan båda dessa upplevelser
göra att upptäckter undgås ien del oljor eller också kan den bi ttra upple-
velsen döljas av den beska.
Genom att ta korta, upprepade andetag och dra in luften genom munnen
kan provsmakaren inte bara sprida provet ordentligt över hela munhålan
utan också uppleva de flyktiga, aromatiska komponenterna via näsans
bakre gångar.
Känselupplevelsen skall också tas med i bedömningen. Följaktligen skall
graden av lättflutenhet, klibbighet och skärpa eller udd noteras när de1991R2568 — SV — 31.10.1995 — 013.001 — 58
▼B
upptäcks, och om så behövs för provet skall intensiteten hos dessa
faktorer kvantifieras.
9.1.9 När en jungfruolja skall bedömas organoleptiskt skall endast ett prov
utvärderas vid samma tillfälle för att undvika de kontraster som kan
uppstå vid ett omedelbart prov av andra prover.
Eftersom efterföljande provningar skapar trötthet eller brist på känslighet
är det viktigt att använda en produkt som kan ta bort resterna av oljan imunnen från den föregående provningen.
Användningen av en liten bit äpple (ca 15 g) rekommenderas. Sedan den
tuggats kan den spottas ut ispottkoppen. Sedan sköljs munnen med li tet
vatten vid rumstemperatur. Minst 15 minuter skall gå mellan slutet av en
provning och början av nästa.
9.2Gallring av kandidater
Detta steg skall genomföras av panelorganisatören som personligen skall
intervjua kandidaterna för att lära känna deras personlighet och omgi-
vande miljö. De fysio-psykologiska förhållanden som krävs är inte
speciellt stränga, teoretiskt kan varje normal person delta. Faktorer som
kön, ålder, speciella vanor (rökning) etc anses numera mindre betydelse-
fulla än sådana som hälsa, personliga intressen och tillgänglig tid för
arbetet.
Under intervjun skall panelorganisatören förklara detaljerna i uppgiften
för kandidaten och ungefär hur mycket tid det kommer att ta. Han skall
sedan få information från kandidaten som gör att han kan uppskatta
dennes intresse och motivation och hur mycket tid vederbörande har
tillgänglig. Följande frågeformulär kan vara till hjälp.
1991R2568 — SV — 31.10.1995 — 013.001 — 59
▼B
Organisatören av panelen skall använda denna information för att gallra
kandidaterna och skall förkasta sådana som visar lite intresse för den här
typen av arbete, som inte är tillgängliga, eller som inte kan uttrycka sig
klart.
9.3Bestämning av ”medeltröskeln” i gruppen för ”karaktäristiska drag”
Välj omsorgsfullt ut fyra oljor som var och en anses vara representativ
för ett av följande drag: ”atrojado” (unken), vinig, härsken och bitter
och har så stor och klar intensitet som möjligt.
Ta en lika stor del av varje olja och iordningställ prov vars koncentra-
tioner skiljer sig åt med en faktor 2, som ger successiv utspädning med
ett lämpligt spädningsmedel tills ingen skillnad kan upptäckas mellan
glaset som innehåller enbart spädningsmedel och de två sista utspädning-
arna. Det sista paret skall vara två glas med spädningsmedlet.
Komplettera serien med glas som innehåller högre koncentrationer tills
totalt åtta stycken har uppnåtts.
Gör i ordning tillräckliga mängder av proven med de olika koncentratio-
nerna så att hela serien med egenskaper kan ges till varje kandidat.
För att upprätta ”medeltröskeln” hos kandidaterna för varje egenskap får
var och en av dem ett glas som innehåller 15 ml av någon av de
färdigställda koncentrationerna och ett glas som innehåller 15 ml av
utspädningsmedlet rent. Sedan provet genomförts skall kandidaterna
avgöra om de är samma eller olika.
Upprepa samma provning med de återstående koncentrationerna av de
egenskaper som skall tas hänsyn till.
Anteckna antalet korrekta svar som erhållits för varje koncentration av
alla provsmakarna och ange detta tal som ett procenttal av antalet provsom är genomförda.
Rita i ett koordinatsystem som x-koordinat i fallande ordning koncentra-
tionerna som provas och som y-koordinat procenten korrekta
identifieringar för varje koncentration.
Figur 1 är ett praktiskt exempel på dessa instruktioner. Känslighetströs-
keln bestäms genom extrapolering av den punkt på y-koordinaten som
representerar 75 % korrekta uppskattningar från kurvan på x-koordinaten.
Denna tröskelkoncentration, som kan vara olika för varje enskild olja
eftersom den beror på intensiteten hos den egenskap som finns närva-
rande, bör vara lika för de olika grupperna av kandidater till olika
paneler. Den kan inte hänföras till någon vana eller till någon tendens
att föredra något. I konsekvens härmed är det en referenspunkt som är
gemensam för varje normal grupp personer och som kan användas för
att homogenisera de olika panelerna enbart genom deras smak/luktkäns-
lighet.
På grundval av tröskelkoncentrationen som erhållits för gruppen fortsätts
som följer:1991R2568 — SV — 31.10.1995 — 013.001 — 60
▼B
Iordningställ en serie ökande och minskande koncentrationer på ett sådant
sätt att tröskelkoncentrationen hamnar på 10:e platsen på denna skala.
Naturligtvis kommer den 11:e och den 12:e koncentrationen att vara
mera utspädd, varför det kommer att vara svårare att upptäcka närvaron
av den olja som har de utvalda egenskaperna.
Genom att ta C10-koncentrationen som grundval kan de återstående
proven iordningställas i enlighet med följande formel:
C10×an, där ”a” är en konstant, utspädningsfaktorn, som motsvarar 1,5
och ”n” är exponenten som varierar mellan 9 och −2.
Exempel: Antag att tröskeln som erhållits för härsken olja är 0,32. C10= 0,32 och på grundval av detta eftersom ”a” = 1,5 skall serien med
prover ha följande koncentrationer.
Exempel 1 23456789 1 0 1 1 1 2
Koncentration 12,30 8,20 5,47 3,65 2,43 1,62 1,08 0,72 0,48 0,32 0,21 0,14
Om ovanstående procedur upprepas för de tre återstående egenskaperna
på grundval av deras respektive trösklar som beräknas på samma sätt
som visats ovan, erhålls skalor med likanande aromatiska intensiteter för
varje stimulus i alla laboratorier, även om felen i den ursprungliga oljan
kan uppfattas som varande av olika intensitet.
9.4Val av provsmakare genom intensitetssmakmetoden
I urvalsproceduren bör det finnas två till tre gånger flera kandidater än
som behövs för panelen, så att de personer som har bäst känslighet eller
bäst förmåga att skilja proverna åt, kan plockas ut. Det är alltid tillrådligt
att använda samma produkt som den som sedan skall analyseras (som
konsekvens härav skall alltid olivolja användas).
Figur 1
När man väljer metod bör man inte förbise att bortsett från att vara
effektiv skall metoden som används även vara så ekonomisk som möjligt1991R2568 — SV — 31.10.1995 — 013.001 — 61
▼B
när det gäller kvantiteter av olja, antal prover och den tid som används på
urval. Effektiviteten hos urvalsproceduren ligger i valet av att optimera
nivåerna för följande tre variabler som är beroende av: a) ”kostnad” som
bestäms av antalet prover, b) andelen potentiellt lämpliga kandidater som
av en slump har haft otur och blivit eliminerade under gallringen, och c)
andelen kandidater som av en slump har gått igenom urvalsprocessen
trots att de är olämpliga.
Fyra punkter av den valda urvalsproceduren, intensitetsuppskattnings-
provet, som beskrivs ASTM (American Society for Testing and
Materials), STP (Special Technical Publication) nr 440, 53, har modifie-
rats genom
1. minskning av antalet prover i serien,
2. breddning av området av stimuli för att öka antalet smak-, luktnoter-
ingar på vilket urvalet grundas för att anpassa dem till de vanligaste
defekterna som finns i olivolja,
3. variation av koncentrationsgraden i serierna, och
4. statistisk hantering av resultatet.
Utrustning som krävs— 1 500 ml flaskor eller glaskolvar,
— mörkfärgade provningsglas,— 10, 15, 1 000 och 1 500 ml graderade provrör.
Produkter som behövs— Mercks paraffin (referens 7.160, DAB 8, USP XX) eller ett oljigt
utspädningsmedel utan smak eller lukt (nyligen raffinerad olivolja
eller annan liknande olja),
— oljor: ”atrojado” (unken), vinig, härsken och bitter.
9.4.1 Utförande
Sedan utspädningarna preparerats börjar urvalssteget med 25 kandidater i
enlighet med den metodik som beskrivs nedan för varje stimulus:
1. Iordningställ serier med 12 provglas markerade med en kod (en serie
per kandidat). Häll 15 ml av var och en av de olika koncentrationerna
som iordningsställts enligt formeln: C
10×anirespekti ve provglas.
2. När provglasen har fyllts på skall de lämnas stående, täckta med ett
urglas i provningsrummet vid en temperatur av 20 till 22 ºC i åtmin-
stone en timme innan proven startar, så att deras temperatur kommer
att anta rumstemperatur.
3. Panelorganisatören skall sedan ställa upp de 12 provglasen i varje
serie i en rad med koncentrationer i fallande ordning.
Nästa steg är att be varje kandidat att genomföra provet själv enligt
följande instruktioner:
9.4.2 Instruktioner för kandidater
De 12 provglasen som radats upp framför varje kandidat innehåller
utspädningar av någon av ”atrojado” (unken), vinig, härsken eller bitter
stimulans. Den åtskiljande faktorn mellan innehållen i provglasen är
aromens intensitet. Glaset med den mest intensiva lukten är det som är
längst till vänster och resten av glasen är placerade i fallande ordning av
intensitet åt höger till. Det sista provglaset till höger kan ha en så svag
arom att det kan vara omöjligt att uppfatta den.
Gör på följande sätt: Lär känna de olika lukterna i vart och ett av provgl-
asen i serien. Börja på höger sida med nummer 12 och försök att komma
ihåg intensiteten hos alla lukterna utan att bli för trött.
När Du känner att Du har vant Dig vid skalan av koncentration av lukter,
lämna rummet.
Under tiden skall organisatören ta bort ett av provglasen från serien och
placera det i nivå med det sista på höger sida och flytta alla de andra såatt det tomma utrymmet fylls igen. Återvänd till rummet och fortsätt med
provet.
Provet innefattar följande:
Det provglas som tagits ut ur serien skall sättas tillbaks på exakt den plats
där det fanns tidigare. Lukta på det och jämför det med de andra så ofta
som önskas, men kom ihåg att det måste sättas tillbaka korrekt, vilket
innebär att det måste ha en starkare lukt än proverna omedelbart till
höger om det och en svagare lukt än proverna till vänster om det. Detta
prov kommer att upprepas med tre andra glas.1991R2568 — SV — 31.10.1995 — 013.001 — 62
▼B
Varje kandidat skall tilldelas en blankett, förutom de instruktioner som
just beskrivits, för att underlätta provet och insamlingen av svaren.
9.4.3. Framtagning av resultat
Panelorganisatören skall registrera data för var och en av kandidaterna på
följande sätt, för att underlätta deras inordning:
9.4.4. Statistisk graderingsprocedur
I det här speciella urvalsfallet skall de provglas som skall återföras till
sina exakta positioner vara samma för alla kandidater. Enligt de statis-
tiska beräkningar som gjorts för detta ändamål, skall de motsvara
följande positioner i den ordning i serierna som rör varje egenskap:
”Atrojado”
— Unken (U)Vinig
(V)Härsken
(H)Bitter
(B)
Glas nr Glas nr Glas nr Glas nr
(10, 5, 7, 2) (11, 3, 8, 6) (7, 4, 10, 2) (6, 3, 11, 9)
Det nummer som motsvarar glasets position i ordningen i serien får inte
variera eftersom de statistiska beräkningarna för detta prov har gjorts medtanke på sannolikheten för att glasen slumpvis skall kunna sättas tillbaka
på sina exakta positioner.
För att i möjligaste mån undvika att någon information skickas från den
ena kandidaten till den andra, skall panelorganisatören säkerställa
följande:
1. Det får inte finns några som helst möjligheter till kontakt mellan
kandidaterna. Olika koder skall användas för varje kandidat.
2. Det får inte finnas något sätt på vilket kandidaterna kan lista ut posi-
tionen på det glas som har tagits bort.
3. Kandidaterna skall förses med samma glas som angivits tidigare, men
ordningen i vilket det ges till kandidaterna skall variera.
Varje kandidat skall sedan betygsättas beroende på hans prestation, på
följande sätt:
Låt e
i
1,ei
2,…ei
12vara de 12 glasen med de 12 motsvarande koncentratio-
nerna av kännetecknet ”i” (i kan vara någon av de fyra egenskaperna
”atrojado” — unken, vinig, härsken och bitter) som ställts upp i fallande
ordning efter intensitet.
Låt ei
kvara ett av glasen som tagits ut och K ′den position där det
placeras av kandidaten när det åter ställs in i serien. Därför är värdena
på K och K ′heltal från och med 1 till och med 12 som motsvarar det
verkliga platsnumret för det glas som valts respektive det där det place-
rats av kandidaten.1991R2568 — SV — 31.10.1995 — 013.001 — 63
▼B
Låt T (maximalt tillåten avvikelse) vara ett värde som sätts på förhand,
vilket i det här fallet motsvarar 3, så att om K ′− K är T förkastas kandi-
daten automatiskt (1).
Om motsatsen, K ′−K≤T, accepteras kandidaten teoretiskt och kan fort-
sätta med provet eftersom han eller hon har förmåga att placera stimulus
på exakt rätt position, eller åtminstone mycket nära den.
I det här fallet skall betyget som ges till kandidaten som har bedömt ett
antal stimulus (koncentrationer) i t ex ”atrojado” — unkna serien (U),
vara lika med kvadraten på skillnaden mellan det exakta antalet glas i
ordningen i serien och den position där kandidaten har satt tillbaka det.
Det vill säga:
Ph(U)=( K′−K )2.
Eftersom detta förfarande kommer att genomföras av varje kandidat för
fyra olika stimuli (koncentrationer) av varje egenskap, bör den partiella
betygsättningen för kännetecknet (t.ex. U) vara:
ZU=PU
h+PU
j+PU
l+PU
m
Några exempel ges nedan för att underlätta förståelsen för detta förfa-
rande.
Exempel 1:Låt oss anta att svaren som har avgivits av kandidat A för de fyra olika
egenskaperna dragna ur serien för kännetecknet (i) är följande:
Glasets exakta posi-
tion i serien (K)Den position där det
sattes in av kandi-
daten
(K′)Avvikelse från exakta positionen
(K′−K )
7 7 7−7=0
4 5 4−5=− 1
10 6 10 − 6 = 4 (1)
2 4 2−4=− 2
(1) Den här kandidaten förkastas eftersom han har erhållit T > 3 i provet.
Exempel 2:
Låt oss anta att en kandidat placerar om glasen för en bestämd egenskap
enligt följande:
Glasets exakta posi-
tion i serien (K)Den position där det
sattes in av kandi-
daten
(K′)Avvikelse från exakta positionen
(K′−K )
77 7 − 7 = 0
44 4 − 4 = 0
10 7 10 − 7 = 3
23 2 − 3 = − 1
Den här kandidaten förkastas inte. Han har fått följande betyg:
Zi=02+02+32+ (−1)2=1 0
Kandidatens slutliga betyg som avgör om han skall godtas eller förkastas
iurvalet ti ll provsmakare beror på hans svar på de fyra egenskaper som
är under övervägande, vilka blir som följer:
PhU+PjU+PlU+PmU=ZU
PhV+PjV+PlV+PmV=ZV
PhH+PjH+PlH+PmH=ZH1991R2568 — SV — 31.10.1995 — 013.001 — 64
(1) Panelorganisatören bör uppfordra kandidaten att fortsätta vettigt, dvs utan att förlora
någon känslighet genom lukttrötthet.
▼B
PhB+PjB+PlB+PmB=ZB
Z slutlig = ZU,+…+ZAm
där:
U = ”atrojado” — unken
V = vinigH = härskenB = bitter
Det är nu en fråga att bestämma upp till vilket maximivärde för Z som
kandidaten kan anses ha goda nivåer för uppfattningsförmågan, lukt-
minnet och intellektuell förmåga att ge korrekta svar för de fyra stimuli
som avses. Det framgår att Z alltid har ett icke-negativt värde och att Z
= 0 betyder att kandidaten har känt igen och korrekt kvantifierat alla de
16 intensiteterna som givits honom (fyra för varje egenskap). Andra
värden på Z än 0 anger att kandidaten har upptäckt skalområdet från
vilket de utvalda intensiteterna har valts, men inom dessa områden har
han inte kunnat lokalisera den exakta positionen eftersom hans förmåga
att skilja de intensitetsskalor som getts honom för ett eller flera av stimuli
inte är tillfredsställande.
Därför måste ett kritiskt värde (Z
c) bestämmas så att, för den händelse
kandidaten slumpartat skulle återställa alla glasen inom de områden han
hade känt igen innan, sannolikheten för ett slutbetyg Z, som är mindre än
Zc, är tillräckligt liten ( α)som kan fastställas på förhand. Med andra ord
måste det säkerställas att sannolikheten med hjälp av detta förfarande vid
val av en provsmakare för panelen som inte visar tillräcklig urskilj-
ningsförmåga för intensiteterna hos de stimuli som används i
urvalsprocessen är mindre än α.
När värdet för αsätts (ivårt fall vi d 0,05), erhålls Zofrån den sannolika
fördelningen av variablen Z, som i sin tur är beroende av sannolikhets-
fördelningarna av p-variablerna (K ′).
Enligt de relevanta statistiska beräkningarna blir värdet för Zc34.
När Z-graderingen för alla kandidaterna har erhållits, skall alla kandidater
vars betyg ligger över 34 förkastas.
Betrakta graderingarna för kandidaterna A och B som exempel:
Egenskaper Kandidat A Kandidat B
”Atrojado” — unken (U) ZU=1 0 ZU=1 2
Vinig (V) ZV=1 0 ZV=1 1
Härsken (H) ZH=1 0 ZH=1 5
Bitter (B) ZB=4 ZB=0
Σ=3 4 Σ=3 8
Under förutsättning att de två kandidaterna under övervägande har Z-
värden på 34 respektive 38, kommer kandidat A att behållas medan
kandidat B förkastas. När alla kandidater med en gradering över 34 har
sållats bort, skall återstoden klassificeras enligt deras Z-värden tills de
12 bästa kandidaterna har valts.
9.5Utbildning
De huvudsakliga målen för utbildningen är:
a) att låta provsmakarna lära känna de många lukt-, smak- och känselva-
rianter som finns i jungfruoljor,
b) att låta provsmakarna lära känna den speciella sensorikmetodiken,
c) att öka den individuella skickligheten när det gäller att känna igen,
identifiera och kvantifiera de sensoriska egenskaperna, och
d) att öka känsligheten och förbättra minnet när det gäller de olika egen-
skaperna som avses så att slutresultatet är exakta och konsekventa
omdömen.1991R2568 — SV — 31.10.1995 — 013.001 — 65
▼B
Utbildningsstadiet innehåller normalt ett antal sessioner, beroende på
vilka möjligheter panelen har, och diskussioner under vilka provsma-
karna, sedan de individuellt har analyserat oljorna, diskuterar
svårigheterna de mött med panelorganisatören och ger kommentarer om
de betyg de satt, så att kriterier och uppfattningar kan förenas.
Den standard som uppnåtts under utbildningen efter ett antal sessioner
bedöms med hänsyn till ökningsprocenten i exakta svar — om
urvalsförsök används — eller genom analys av variationen i de genom-
snittliga individuella betygen hos panelen när proven använder sig av en
skala.
Den praktiska användningen av den här utbildningsperioden har diskute-
rats länge, men för närvarande anses den vara effektiv och till och med
viktig om exakta, noggranna sensoriska data skall erhållas.
9.6Prestandakontroller
Paneler med erfarna provsmakare utför normalt provningar kontinuerligt
som innefattar sensorikprov som kräver stor ansträngning från deras
sida. Beslut av stor teknisk och kommersiell vikt beror i de flesta fall på
deras bedömning. Av detta skäl bör provarens arbete efter urval och
utbildning kontrolleras för att säkerställa att resultatet är exakt.
Sedan panelen sammanställts och har gått igenom rutinförsöken är det
nödvändigt att kontrollera dess arbete med lämpliga mellanrum.
10. FÖRFARANDE FÖR ORGANOLEPTISK BEDÖMNING AV JUNG-
FRUOLJA
När de förhållanden som anges iovanstående standarder uppnåtts, de
nödvändiga hjälpmedlen finns tillgängliga och panelen har valts ut, skall
varje provsmakare lukta och smaka (1) på provet av den olja som skall
analyseras och som finns i provningsglaset. Han skall analysera lukt,
smak, känsel och kinastiska förnimmelser med hjälp av den blankett
som visas i figur 2, där han skall anteckna anmärkningarna som finns
och deras grad av intensitet. I nästa steg skall han gradera kvaliteten på
oljan.
10.1Användning av blanketten i figur 2 (arombeskrivning och kvalitetsgra-
dering)
Några av de mest karaktäristiska, sensoriska förnimmelserna som
vanligen erhålls från olivoljor och som beskriver deras arom finns beteck-
nade på vänster sida av blanketten. Om provsmakaren skulle stöta på
andra stimuli som inte motsvarar dessa beskrivningar, skall han notera
dem under ”andra” och använda den beskrivning som definierar dem så
exakt eller som möjligt.
Uppfattningsbara stimuli skall bedömas i proportion till deras intensitet
som skall anges genom ett kryss (x) i tillämplig ruta enligt följande
kriteria:
1: knappast förnimbar,
2: svag,3: medelstark,4: stark,5: extrem.
På höger sida av blanketten visas en skala från 1 till 9 (9 för utomor-
dentlig kvalitet, 1 för den sämsta) som provsmakaren skall använda för
att ge en enda övergripande gradering av egenskaperna för oljan som
undersöks. Denna gradering skall överensstämma med de positiva punk-
terna och med defekterna ioljan som redan antecknats på vänster si da av
blanketten.
Den första spalten (felaktigheter) på graderingsblanketten är uppdelade i
fem avdelningar. I konsekvens härmed skall klassificeringen av oljorna
primärt baseras på den frånvaron eller närvaron av felaktiga aromer,
samt av hur allvarliga eller intensiva sådana aromer är. Eftersom grader-
ingsskalan går upp till 9 poäng, bör emellertid vissa nyanser eller
aspekter tas med i beräkningen, som kan hjälpa till att nå ett sammanfat-1991R2568 — SV — 31.10.1995 — 013.001 — 66
(1) Provsmakaren kan avstå när han finner extrema eller intensivt obehagliga egenskaper i
aromen, och anteckna detta på formuläret som en exceptionell förekomst.
▼B
tande beslut om hela kvalitetsgraderingen och som beskrivs i den andra
spalten med rubriken ”egenskaper”.
10.2Slutgradering
Panelorganisatören skall samla in de ifyllda blanketterna från varje
provare och skall kontrollera att de sensoriska egenskaperna och de inten-
siteter med vilka de har uppfattats och noterats i profilblanketten
överensstämmer med uppskattningen av oljan som angetts på gradering-
sblanketten. Om det finns en påtaglig skillnad skall panelorganisatören
be provsmakaren att kontrollera sin graderingsblankett.
Om så är nödvändigt skall provsmakaren upprepa provet.Slutligen skall panelorganisatören göra upp en tabell med graderingarna
för hela gruppen och räkna fram det aritmetiska medelvärdet och standar-
davvikelse (av medelvärdet).
Om standardavvikelsen är högre än det metodiska felet skall provet göras
om av hela panelen.
Endast vid revisionsanalyser skall gruppen upprepa proven för att få en
uppskattning i triplikat av provet, och slutgraderingen med en decimal
skall vara medelvärdet av de tre graderingarna som man kommit fram till.
Om medelintensitetsuppfattningen för bitterhet och/eller unkenhet är
större än 2,5, skall oljan markeras enligt detta och det bör noteras att
den är bitter och/eller unken.
Resultatangivelse: På grundval av den genomsnittliga bedömningen skall
panelens kontrollant ange den kategori i vilken provet skall klassificeras,
ienli ghet med de gränser som fastställs ibi laga I. För detta ändamål skall
kontrollanten, om den genomsnittliga bedömningen inte är lägre än 5,
godkänna
— en tolerans på + 1,5 under regleringsåret 1992/93,
— en tolerans på + 1 från och med regleringsåret 1993/94.
För oljor som omfattas av interventionsätgärder gäller ingen tolerans.
Den statistiska skillnaden i repeterbarhet mellan analysresultaten och den
tolerans som lagligen har fastställts skall ligga inom de toleranser som
anges iföregående stycken.
Om den berörda parten under de regleringsår som anges ovan klassifi-
cerar olja utan att tillämpa den fastställda toleransen, får han på
detaljhandelsförpackningen ange den lägsta kontrollerade organoleptiska
bedömningen av varan under regleringsperioden.
Panelens kontrollant skall ianalysrapporten ange endast den kategori
enligt vilken provet har klassificerats. En analytiker som genomför en
undersökning enligt första stycket i artikel 2.2 skall tillämpa samma
metod för bestämning av kategorin.
Anm: Proven bör förvaras förslutna ikylskåp ti lls de analyseras och bör
ställas in i kylskåp igen efter analysen tills provet har utförts tre
gånger.1991R2568 — SV — 31.10.1995 — 013.001 — 67
▼M12
▼M9
▼M5
▼B
▼M3
Figur 2
Jungfruolja
SENSORISK ANALYS: ALLMÄNT GRUNDVOKABULÄR
1. SYFTE
Avsikten med denna standard är att samla de allmänna termer som
används inom sensorisk analys och ge definitioner för dem.
2. VOKABULÄR
2.1Allmän terminologi
Sensorisk analys (substantiv):
Verksamhet för bestämning av sensoriskt iakttagbara egenskaper med
hjälp av våra sinnen.
Perception (substantiv):1991R2568 — SV — 31.10.1995 — 013.001 — 68
▼B
▼B
Sinnesintryck av yttre ting eller skeenden.
Organoleptisk (adjektiv) (attribut):
Beskriver de egenskaper hos en produkt som kan uppfattas med våra
sinnen.
Expert (substanstiv):
(med hänsyn till undersökning av organoleptiska egenskaper)
Provsmakare som är specialiserad på sensorisk analys av en speciell
produkt och har en grundläggande kännedom om framställning av
produkten och dess marknadsföreträden.
Provsmakare (substantiv):
Bedömare som begagnar sig av smaksinnet samt i regel även av andra
sinnen för att bedöma de organoleptiska attributen hos livsmedel.
Panel:
Grupp av personer som speciellt har utvalts och utbildats och som samlas
för att genomföra sensorisk analys av produkten i fråga under kontrolle-
rade förhållanden.
Förnimmelse (substantiv):
Subjektivt fenomen som orsakas av stimulering av sinnessystemet. Detta
fenomen kan bedömas subjektivt eller definieras objektivt av de sinne-
sorgan som används, beroende på arten eller typen av stimulus och dess
intensitet.
Känslighet (substantiv):
Förmåga att uppfatta kvantitativt och kvalitativt svaga stimuli eller små
skillnader mellan stimuli med hjälp av sinnesorganen.
Provning (substantiv):
Verksamhet som innefattar varseblivning, analys och bedömning av de
organoleptiska attributen hos en produkt, i synnerhet lukt, smak, känseloch textur hos livsmedelsprodukter.
Acceptans (substantiv):
Då en individ eller en befolkning godtar en produkt.
Harmoni (substantiv):
Egenskaper för en produkt som ger upphov till en övergripande behaglig
förnimmelse. Förnimmelsen åstadkommes genom uppfattningen av
produktkomponenterna som lukt, smak, känsel och konsistensstimuli
eftersom de finns närvarande i lämpliga koncentrationer.
Godtagbarhet (substantiv):
Tillstånd hos en produkt som mottagits positivt av en individ eller befolk-
ning i fråga om dess organoleptiska egenskaper.
Åtskillnad (substantiv):
Verksamhet som innebär kvalitativ och/eller kvantitativ åtskillnad mellan
två eller flera stimuli.
Kompensering (substantiv):
Resultatet av samverkan av en kombination av stimuli på ett sådant sätt
att vart och ett uppfattas med mindre intensitet än om det hade funnits
ensamt.
Aspekt (substantiv):
Kombination av organoleptiska egenskaper som uppfattas visuellt:
storlek, form, färg, struktur, grumlighet, renhet, viskositet, skum och
bubbling. Denna term är att föredra framför termen utseende.
Attribut (substantiv):
En förnimbar egenskap.
2.2Fysiologiska termer
Stimulus (substantiv):
Fysiskt eller kemiskt medel som specifikt skapar ett svar från de externa
eller interna receptorerna.1991R2568 — SV — 31.10.1995 — 013.001 — 69
▼B
Smak (substantiv):
(Smaksinne)
Si nne vars receptorer är placerade imunnen, isynnerhet på tungan, och
som aktiveras av olika föreningar i lösning.
Smaklig (adjektiv):
Beskriver attributen hos en produkt som kan stimulera smaksinnet genom
att få det att reagera för sensationer som hänför sig till en eller flera av de
fyra primärsmakerna: söt, salt, sur och bitter.
Receptor (substantiv):
En speciell struktur hos ett sinnesorgan som kan retas och kan mottaga ett
stimulus och förvandla det till en nervimpuls.
Anm: Receptorer klassificeras med hänsyn till den typ av energi som
förknippas med stimulus (ljus, värme, ljud, etc).
Lukt (substantiv):
En funktion hos luktsinnet för att känna av och skilja mellan de mole-
kyler som når dem i gasform från en yttre miljö, direkt eller indirekt via
näsan.
Intensitet (substantiv):
Storleken av den energi i ett attribut, som kan mätas efter en kvantitativ
värdeskala över tröskelvärdet.
Anpassning (substantiv):
Tillfällig ändring av uppfattningsförmågan av känselretningar på grund av
fortlöpande, upprepad utsättning för en viss retning eller en som liknar
den.
Inhibering (substantiv):
Brist på reaktion från ett sinnesorgan eller en del av det, även om det har
utsatts för påverkan av en lämplig retning som är starkare än organets
tröskel.
Reaktion (substantiv):
En reaktion varigenom känselcellen svarar på retning från en eller flera
stimuli i fråga om ett bestämt sinesorgan.
Kropp (substantiv):
En förnimbar känsla i munnen som ger en produkt olika grader av
densitet, viskositet, konsistens eller fasthet.
Doft (substantiv):
Frisk, behaglig, god lukt.
Att lukta (verb):
(aktivt form av substantivet lukt)
Beskriver hur en lukt uppfattas.
Objektiv (adjektiv):
a) beskriver det som ger en riktig, bevisbar framställning av objektet
genom att undvika den mänskliga faktorn i värderingen (t. ex. tycke,
vana, böjelse).
b) beskriver den teknik som med hjälp av antingen sinnesintryck eller
mekaniska eller elektroniska hjälpmedel reducerar självframkallade
fel.
Anm: Det är inte lämpligt att använda uttrycket instrumentell som
synonym.
Subjektiv (adjektiv):
Beskriver det som framkallar ett sinnesintryck som är inte bara är fram-
kallat av retningen utan även av vårt sätt att tänka och känna.
Kinestesi:
Känslor som uppstår från tryck på provet genom en rörelse imunhålan
eller med fingrarna (t. ex. att pressa en ostbit mellan fingrarna).
Tröskel (substantiv):1991R2568 — SV — 31.10.1995 — 013.001 — 70
▼B
Absolut tröskel:
Minsta styrkan av en sinnesretning som ger upphov till
— en känsla (retningströskel eller varseblivningströskel), eller
— identifieringen av känslan (igenkänningströskeln).
Differenströskel:
Minsta styrkan av en sinnesretning som ger upphov till uppfattningsbara
skillnader i känslans styrka.
Maximal tröskel:
Den högsta styrkan av en retning varvid en ökning i styrka inte uppfattas.Preferenströskel:
Minsta mängd av en retning eller det kritiska övertröskelvärdet av den
retningen, vid vilken ett positiv eller negativ reaktion uppstår i
förhållande till en neutral retning, t. ex. i valet mellan vatten och en sock-
erhaltig lösning.
Anm: En skillnad bör göras mellan en absolut preferenströskel och en
differentierad preferenströskel.
Undertröskel (adjektiv):
Under den absoluta tröskeln.
Övertröskel (adjektiv):
Över den absoluta tröskeln.Sinnesutmattning:
Särskild form av sinnesanpassning då en minskning i mottaglighet
inträffar.
Kompensering (substantiv):
Resultatet av ömsesidig påverkan från en kombination av retningar,
varvid var och en uppfattas med mindre styrka än om den var ensam att
påverka.
Synergistisk (adjektiv):
Samverkan från bestämda ämnen varvid styrkan av de organoleptiska
egenskaperna som uppstår genom att blandningen är större än summan
av varje enskild egenskaps styrka.
Kontrastverkan:
Ökning i reaktion på skillnaderna mellan två samtidiga eller på varandra
följande retningar.
Motsatsen till konvergensverkan.
Konvergensverkan:Minskning i reaktion på skillnaderna mellan två samtidiga eller på
varandra följande retningar.
Motsats till kontrastverkan.
2.3Terminologi avseende organoleptiska egenskaper
Syrlig (adjektiv):
a) beskriver den primära smak som erhålls av utspädda vattenlösningar
av de flesta sura ämnena (t.ex. citronsyra, mjölksyra, vinsyra),
b) beskriver egenskapen hos rena ämnen eller blandningar som fram-
kallar denna smak.
Det motsvarande substantivet är syrlighet.
Sur(adjektiv):
Beskriver den förnimmelse av lukt och smak där de syror som
uppkommer genom jäsning överväger samt även de livsmedel som fram-
kallar denna förnimmelse.
Några faktorer som medverkar till denna förnimmelse har samband med
jäsning, t.ex. mjölksyra eller ättiksyrajäsning i en livsmedelsprodukt.
Bitter (adjektiv):1991R2568 — SV — 31.10.1995 — 013.001 — 71
▼B
a) beskriver den primära smak som uppstår från utspädda vattenlösningar
av olika ämnen t.ex. kinin, koffein och vissa andra alkaloider,
b) beskriver egenskapen hos de ämnen eller blandningar som framkallar
denna smak.
Det motsvarande substantivet är bitterhet.
Salt(adjektiv):
a) karakteristiska förnimmelser som uppfattas av smaksinnet av vilka det
mest typiska exemplet framkallas av lösningar av natriumklorid,
b) beskriver egenskapen för de ämnen eller blandningar som framkallar
denna smak.
Det mostvarande substantivet är sälta.
Söt(adjektiv):
a) beskriver den primära smak som uppstår från utspädda vattenlösningar
av olika ämnen, t. ex. sukros,
b) beskriver egenskapen hos de ämnen eller blandningar som framkallar
denna smak.
Det motsvarande substantivet är sötma.
Sträv (adjektiv):
a) beskriver den primära smak som uppstår från utspädda vattenlösningar
av olika ämnen, såsom garvämnen (t.ex. av kakitanning och slåntan-
ning),
b) beskriver egenskapen hos de ämnen eller blandningar som framkallar
denna smak.
Det motsvarande substantivet är strävhet.
Bouquet (substantiv):
Bouquet innebär en blandning av förnimmelser av smak, lukt och kines-
tesi som gör det möjligt för en bedömare att identifiera och fastställa
positiva eller negativa förnimmelser på flera nivåer.
Smak (substantiv):
a) förnimmelser som uppfattas när smaklökarna stimuleras av lättlösliga
ämnen,
b) egenskap hos de särskilda förnimmelserna som framkallas av dessa
ämnen.
Primär smak (substantiv):
Vilken som helst av de som anses vara de utpräglade smakerna: söt, salt,
sur, besk.
Lukt (substantiv):
a) en blandning av förnimmelser som uppfattas av luktorganet när man
luktar på bestämda flyktiga ämnen,
b) egenskap hos den särskilda förnimmelsen som framkallas av någon av
de nämnda ämnena.
Arom (substantiv):
a) behagliga förnimmelser som uppfattas indirekt av luktorganet när man
smakar på mat,
b) inom parfymeri och i icke fackspråk tillämpas denna term även för
samma förnimmelser när den uppfattas direkt genom näsan.
Eftersmak, kvardröjande smak (substantiv):
En kombination av förnimmelser som uppfattas efter att retningen har
försvunnit från munnen och som skiljer sig från dem som uppfattades
innan.
Aromatisk (adjektiv):
a) beskriver egenskaper hos rena ämnen eller blandningar som när de
avsmakas framkallar de förnimmelser som kallas arom,
b) beskriver de produkter som när de undersöks direkt genom näsan
framkallar förnimmelser av doft och friskhet.
Textur (substantiv):1991R2568 — SV — 31.10.1995 — 013.001 — 72
▼B
En produkts egenskaper ifråga om fasthet och motstånd som kan sti mu-
lera de mekaniska receptorerna vid förtäring, särskilt dem som finns i
munnen.
Anm: Denna term avser endast de objektiva egenskaperna och inte de
framkallade förnimmelser som betecknas med allmänna uttryck,
t.ex. konsistens, struktur, fetthalt, m.m.
Munsköljning (substantiv):
En handling varigenom mat som finns i munnen berör alla munnens
känsliga delar så att förnimmelserna som framkallas i gommen kan
uppfattas.
Anm: Denna ordlista kan utökas med användning av ISO-normerna 5492,
del I—V och andra utgåvor som t.ex. den av J. L. Magnen med
titelnLes cahiers techniques du Centre national de coordination
des études et recherches sur la nutrition et l'alimentation , m.m.
GLAS FÖR ANVÄNDNING VID PROVSMAKNING AV OLJOR
1. SYFTE
Ändamålet med denna standard är att beskriva egenskaperna hos det glas
som skall användas vid organoleptisk analys av ätbara oljor (lukt, smak,
bouquet).
Den beskriver dessutom en lämplig värmeenhet som behövs för att uppnå
och bibehålla den rätta temperaturen vid denna analys.
2. BESKRIVNING AV GLASET
I ritningen på bild 1 anges de bästa egenskaper som behövs hos ett glas
av denna typ, vilket kan specificeras på följande sätt:
a) Det skall vara absolut stadigt för att förhindra att glaset välter och
oljan rinner ut.
b) Det skall ha en botten som lätt passar in i värmeenhetens fästen så att
glasets botten blir jämnt uppvärmt.
c) Glasets form skall vara bredast ibotten så att de flykti ga ämnena i
oljan lätt utlöses, men avsmalnande vid mynningen så att samma
komponenter lätt samlas där och på så sätt lättare kan uppfattas och
identifieras av näsan.
d) Det skall vara tillverkat av mörkfärgat glas för att förhindra att avsma-
karen uppfattar oljans färg. Därmed undviks alla omdömen på förhand
och eventuella subjektiva uppfattningar eller böjelser.
2.1Glasets mått
En skiss av glaset finns på bild 1 och har följande mått:
— total kapacitet …. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 130 ml ± 10 ml,
— total höjd …. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60 mm ± 1 mm,— mynningens diameter … . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50 mm ± 1 mm,— diameter vid bredaste punkten …. . . . . . . . . . . . . . . 70 mm ± 1 mm,— bottendiameter …. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35 mm ± 1 mm,— glasets tjocklek på sidorna … ................... 1 , 5m m±0 , 2m m ,
— glasets tjocklek ibotten …. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 mm ± 1 mm.
Varje glas skall vara utrustat med ett urglas, vars diameter skall vara
10 mm större än glasets mynning. Detta urglas skall användas som ett
skydd för att förhindra förlust av arom och inträngande av damm.
2.2Tillverkning
Glaset skall vara tillverkat av motståndskraftigt glas, vara mörkfärgat så
att färgen på innehållet inte kan urskiljas samt vara utan rispor och
bubblor.
Glaskanten skall vara jämn, slät och flänskantad.Glaset skall vara härdat så att det motstår temperaturförändringarna under
analysen.1991R2568 — SV — 31.10.1995 — 013.001 — 73
▼B
2.3Bruksanvisning
Glaset skall diskas med oparfymerad tvål eller diskmedel och skall sedan
sköljas upprepade gånger tills diskmedlet har försvunnit helt och hållet.
Sista sköljningen skall göras med destillerat vatten varefter glaset får
droppa av och sedan torkas itorkskåp.
Varken koncentrerade syror eller kromsyreblandningar skall användas.
Glasen skall förvaras itorkskåp ti ll de skall användas eller iett skåp där
de är skyddade från kontaminering från alla yttre luktämnen.
Före användning skall varje glas provluktas för att säkerställa att ingen
främmande lukt finns närvarande. När provet iordningställts skall
märkningen på glaset och oljan det innehåller, noggrant registreras.
Provorganisatören skall vara den enda person som känner till förhållandet
mellan märkning och olja.
3. ANORDNING FÖR UPPVÄRMNING AV PROVER
Proverna skall undersökas organoleptiskt vid en viss temperatur, som i
fråga om oljor skall vara 28 ± 2ºC. För detta ändamål skall en
uppvärmningsanordning (se figur 2) installeras i varje bås inom räckhåll
för provaren. Det består av ett aluminiumblock som är nedsänkt i ett
termostatstyrt vattenbad för att hålla konstant temperatur. Blocket har en
rad inbuktningar som passar bottnarna på glasen. Temperaturskillnaden
mellan uppvärmningsanordningen och oljan som finns i glasen som är
placerade i inbuktningarna på de olika blocken får inte vara mera än
± 2ºC.
Figur 1 — Provningsglas
(Dimensioner i mm)1991R2568 — SV — 31.10.1995 — 013.001 — 74
▼B
Figur 2 — Anordning för uppvärmning av prover (dimensioner i
mm)
ANVISNINGAR FÖR INSTALLATION AV ETT PROVNINGSRUM
1. INLEDNING
Provningsrummet är konstruerat för att tillhandahålla panelen som deltar i
sensoriska prov en lämplig, bekväm, standardiserad miljö som underlättar
arbetet och hjälper till att förbättra repeterbarheten och reproducerbar-
heten hos resultaten.
2. SYFTE
Avsikten med denna standard är att specificera de grundförhållanden som
måste uppfyllas när man installerar ett provningsrum.
3. ALLMÄNNA SPECIFIKATIONER FÖR INSTALLATION
Lokalerna skall, oavsett deras storlek (se 3.1), uppfylla följande specifika-
tioner:1991R2568 — SV — 31.10.1995 — 013.001 — 75
▼B
De skall vara angenämt och lämpligt upplysta (se 3.2) men neutrala i
stilen. För detta ändamål rekommenderas en lugn, enkel, ljus färg på
väggarna så att en avslappad atmosfär skapas (1).
Lokalerna skall vara sådana att de är lätta att hålla rena och de skall vara
avskilda från varje ljudkälla och bör därför vara ljudisolerade. De skall
också hållas fria från yttre lukter och för detta ändamål om möjligt vara
utrustade med en effektiv ventilationsanordning. Om variationerna i
omgivningstemperaturen kräver detta skall provningsrummet förses med
luftkonditionering för att hålla lufttemperaturen nära 20 till 22 ºC.
3.1Mått
Måtten på lokalerna beror ofta på laboratoriernas eller företagens möjlig-
heter. I allmänhet bör de vara tillräckligt rymliga för att tillåta installation
av 10 bås och ett område där proverna kan iordningställas.
Det är emellertid uppenbart att ju större yta som reserveras för installa-
tionen desto bättre, eftersom biytor då kan tillhandahållas för att t ex
rengöra apparater, göra kulinariska förberedelser och samla öppna
paneler.
3.2Beslysning
Allmänbelysningen, vare sig den kommer från solljus eller armaturer (t
ex lysrörsarmaturer) skall vara jämn, kontrollerbar och diffus.
3.3Temperatur- och fuktförhållanden
Lokalerna skall konstant hållas vid en angenäm temperatur och behagliga
fuktförhållanden. Förutom under speciella omständigheter rekommen-
deras en temperatur på 20 till 22 ºC och fuktförhållanden till 60—70 %
relativ fuktighet.
4. BESKRIVNING AV BÅSEN4.1Allmänna egenskaper
Båsen för den sensoriska analysen skall placeras bredvid varandra i loka-
lerna.
De skall vara identiska och åtskiljas av väggar som skall vara tillräckligt
höga och breda för att helt isolera provarna när de sitter.
Båsen kan byggas i varje lämpligt material som är lätt att hålla rent och
underhålla (t.ex. trä, hård plywood, lamellträ, etc). Om färg används
måste den vara helt luktfrinär den torkat.
Stolarna ibåsen skall vara bekväma och skall kunna justeras ihöjdled.Varje bås skall också utrustas med individuell belysning, där ljusstyrka
och riktning kan ställas in.
Det kan kommenderas att båsen utrustas med en knapp som är ansluten
till en yttre signallampa som gör det möjligt för provaren att annonsera
för vakten utanför att han är klar med proven, behöver ytterligare prov,
saknar en del av utrustningen, har observerat något ovanligt, eller önskar
upplysningar etc, utan att distrahera de andra provarna.
4.2Mått
Båsen skall vara tillräckligt stora och bekväma. I allmänhet skall de ha
följande mått:
— bredd:
0,75 m (utan vask)0,85 m (med vask)
— längd:
0,50 m (bord)0,20 m (ytterligare för avdelning med vägg)
— väggens höjd:
0,60 m minimum räknat från bordet
— bordets höjd:1991R2568 — SV — 31.10.1995 — 013.001 — 76
(1) Färgskalan i rummet och dess belysning kan påverka resultaten av den sensoriska
analysen.
▼B
0,75 m
4.3Inredning
Bordsytan skall vara sådan att den är lätt att hålla ren.En del av ytan skall användas för en vask som är försedd med rinnande
dricksvatten. Om detta inte är praktiskt möjligt kan emellertid detta
utrymme används för en skål, spottkopp eller liknande utrustning.
När proven måste hållas vid konstant temperatur som ligger över eller
under omgivningstemperaturen vid ett prov är det tillrådligt att ha en
lämplig anordning för detta ändamål (vattenbad, värmeplatta, etc).
En hylla kan också sättas upp på en höjd av ca 1,10 meter från golvet för
placering av olika tillbehör (glas, små apparater, etc).
Om inredningen i båsen i provningsrummet tillåter det kan det löna sig
att installera en anordning för att underlätta presentationen av proven.
Denna kan vara i form av en glidlucka (figur 1), en roterande vertikal
anordning (figur 2) som är lämplig för glas eller koppar (höga behållare),
eller en lucka som öppnas horisontellt när behållarna där proven förvaras
är små (figur 3). Det är helt enkelt en fråga om att säkerställa att
öppningen är tillräckligt stor för skålarna och glasen som innehåller
proven att komma igenom.
5. BIUTRYMMEN
Om det finns tillräckligt med utrymme är det tillrådligt att tillhandahålla
separata utrymmen för att iordningställa proven (kulinariska eller andra),
ställa upp glas och apparatur och hålla diskussioner före eller efter prov-
ningarna. Om sådana utrymmen finns tillgängliga skall de hållas rena.
Under inga förhållanden får några lukter, ljud eller samtal från dessa
utrymmen störa provarnas arbete iprovni ngsrummet.
Se figur 4 för ett exempel på ett provningsrum med biutrymme.
Anm: De förhållanden som beskrivs här är ideala. Om det inte är möjligt
att göra en sådan installation enbart för sensorisk analys, kan prov-
ningarna genomföras i lokaler som uppfyller de
minimiförhållanden som beskrivs (ljus, temperatur, ljud, lukt)
genom flyttbara bås som ställts upp med hjälp av hopfällbara
byggelement på ett sådant sätt att de åtminstone isolerar provarna
från varandra.1991R2568 — SV — 31.10.1995 — 013.001 — 77
▼B
BÅSETS INREDNING
Figur 1
1991R2568 — SV — 31.10.1995 — 013.001 — 78
▼B
ROTERANDE ANORDNING FÖR ATT PRESENTERA PROVERNA
Figur 2
1991R2568 — SV — 31.10.1995 — 013.001 — 79
▼B
LUCKA FÖR ATT PRESENTERA PROVERNA
Figur 3
1991R2568 — SV — 31.10.1995 — 013.001 — 80
▼B
LABORATORIUM FÖR SENSORISK ANALYS
Figur 4 — Exempel på provningsrum
1991R2568 — SV — 31.10.1995 — 013.001 — 81
▼B
BILAGA 13
NEUTRALISERING OCH BLEKNING AV OLIVOLJA I LABORATO-
RIET
1. NEUTRALISERING OCH AVFÄRGNING AV OLIVOLJA I LABORA-
TORIUM
1.1Neutralisering av olja
1.1.1 Utrustning
— bägare, 300 ml, hög,
— laboratoriecentrifug med 100 ml centrifugrör,
— bägare, 250 ml,
— rundkolvar, 100 ml,— separertratt, 1 liter.
1.1.2 Reagenser
— vattenlösning med 12 % natriumhydroxid,
— etanollösning med 1 % fenolftalein,— ren hexan, P. A.,— ren propan-2-ol, P. A.
1.1.3 Utförande
a)Oljor med innehåll av fria fettsyror, uttryckta som oljesyra, på mindre
än 30 %
Placera 50 g rå olja ien hög 300 ml bägare och värm ti ll 65 ºC i
vattenbad. Tillsätt en mängd 12 % lösning av natriumhydroxid motsva-
rande de fria syrorna i oljan med ett överskott av 5 % under försiktig
omrörning. Fortsätt att röra i fem minuter och håll temperaturen vid
65 ºC.
Överför blandningen till 100 ml centrifugrör och separera den tvålak-
tiga krämen genom centrifugering. Häll den dekanterade oljan i en
250 ml bägare och tvätta med 50 till 60 ml i kokande destillerat vatten,
ta bort tvättvattnet med hjälp av en hävert. Upprepa tvättningen tills
alla spår av kvarvarande tvål är borta (fenolftaleinets rosa färg
försvinner).
Centrifugera oljan för att avskilja små mängder av kvarvarande vatten.
b)Oljor med ett innehåll av fria fettsyror uttryckt som oljesyra som
överstiger 30 %
Häll upp 50 g rå olja i en 1 liters separertratt, tillsätt 200 ml hexan,
100 ml isopropylalkohol och en kvantitet av 12 % natriumhydroxidlös-
ning som motsvarar det fria fettsyreinnehållet i oljan med ett överskott
på 0,3 %. Rör om kraftigt i en minut. Tillsätt 100 ml destillerat vatten,
rör igen och låt stå.
Sedan skikten separerat, tappa det lägre skiktet som innehåller tvålen.
Mellan de två skikten (oljeskiktet upptill och vattenskiktet nedtill)
bildas ofta ett mellanskikt som består av föroreningar och olösliga
ämnen som också måste tas bort.
Tvätta hexanlösningen som inrehåller den neutraliserade oljan med 50-
60 ml portioner av en lösning av destillerat vatten 1/1 (v/v) tills den
rosa färgen från fenolftalin försvinner. Avlägsna all hexan genom
destillation under vacuum (t.ex. i roterande injektorblock).
1.2Avfärgning av neutraliserad olja
1.2.1 Utrustning
— Trehalsad rundkolv 250 ml med normalslipningar för placering av
a) en termometer graderad i grader som tillåter avläsningar att göras vid
90 ºC;
b) en mekanisk omrörare som roterar med en hastighet på 250 till 300
varv per minut, och som kan arbeta under vakuum;
c) anslutning för vakuumpump;1991R2568 — SV — 31.10.1995 — 013.001 — 82
▼M6
▼B
▼B
— Vakuumpump med manometer som kan ge ett tryck på 15 till 30
millibar.
1.2.2 Utförande
Väg in ca 100 g neutraliserad olja i den trehalsade kolven. Sätt in termo-
metern och omröraren, anslut vakuumpumpen och värm till 90 ºC underomrörning.
Bibehåll denna temperatur, fortsätt omrörningen tills oljan som skall
analyseras är helt frifrån vatten (ca 30 mi nuter).
Återställ sedan normaltryck och tillsätt 2 till 3 gram aktiverad jord.
Upprätta vakuum på nytt tills trycket är mellan 15 och 30 millibar och
rör om med 250 varv per minut vid en temperatur av 90 ºC.
Filtrera oljan medan den fortfarande är varm i ett termostatskåp (50 till
60 ºC).1991R2568 — SV — 31.10.1995 — 013.001 — 83
▼M6
BILAGA 14
TILLÄGGSANMÄRKNINGAR2 4 TILL KAPITEL 15 I KOMBINERADE
NOMENKLATUREN
2. A. KN-nr 1509 och 1510 omfattar endast oljor som uteslutande har
framställts av oliver vars analytiska egenskaper med hänsyn till innehåll
av fettsyror och sterol är enligt följande:
Tabell I: Innehåll av fettsyra ivi ktprocent av totala
fettsyrorTabell II: Sterolsammansättning i viktprocent av
totala steroler
Myristinsyra M 0,1 Kolestorol M 0,5
Linolensyra M 0,9 Brassikasterol M 0,2
Arakinsyra M 0,7 Kampesterol M 4,0
Eicosansyra M 0,5 Stigmasterol (1) < Kampesterol
Behensyra M 0,3 Betasitosterol (1) m 93,0
Lignocerinsyra M 0,5 —7-stigmasterol M 0,5
M = maximum
m = minimum
(1) Villkoret gäller inte för bomolja (undernummer 1509 10 10) eller för olivolja av pressrester (under-
nummer 1510 00 10).
(2) -5,23-Stigmastadienol + Kolesterol + Betasitosterol + Sitostanol + -5-Avenasterol + -5,24-Stigmastadi-
enol.
KN-nr1509 och 1510 omfattar inte kemiskt modifierad olivolja (särskilt
återestifierad olivolja) eller blandningar av olivolja med andra oljor.
Närvaron av återestifierad olivolja eller andra oljor konstateras i enlighet
med metoderna i bilagorna 5, 7, 10 A och X B till förordning (EEG) nr
2568/91.
B. Undernummer 1509 10 omfattar endast olivoljor som definieras i avsnitt I
och II nedan och som framställts uteslutande på mekanisk väg eller med
andra fysiska metoder under förhållanden, särskilt värmeförhållanden,
som inte leder till sönderdelning av oljan och som inte har genomgått
någon annan behandling än tvättning, dekantering, centrifugering eller
filtrering. Oljor som framställts av oliver med hjälp av lösningsmedel
omfattas av KN-nr 1510.
I. I undernummer 1509 10 10 avses med bomolja , oavsett surhetsgrad,
olivolja med
a) ett innehåll av ►M9vax◄som inte överstiger ►M9350◄
mg/kg,
b) ett innehåll av eritrodiol och uvaol som inte överstiger 4,5 %,
c) ett innehåll av mättade fettsyror i 2-ställning i triglyceriderna som
inte överstiger 1,3 %
eller
d) summan av transoleinisomerer understiger 0,10 % och summan av
translinolisomerer + translinolenisomerer understiger 0,10 %,
e) ett eller fler av följande egenskaper:
1) ett peroxidtal som överstiger 20 mekv aktiv O2/kg,
2) ett innehåll av flyktiga halogenerade lösningsmedel som
överstiger 0,2 mg/kg eller söverstiger 0,1 mg/kg för minst ett
av dem,
3) en extinktionskoefficient K270 (100) som överstiger 0,250 och
som efter det att oljan behandlats med aktiverad aluminumoxid
inte överstiger 0,11. En del oljor som har ett innehåll av fria
fettsyror, uttryckta som oljesyra, av mer än 3,3 g/100 g får efter
behandling med aktiverad aluminiumoxid i enlighet med den
metod som anges i bilaga 15 till förordning (EEG) nr 2568/91,
ha extinktionskoefficienter K270 som överstiger 0,10. Om så ärfallet skall de efter neutralisering och blekning i laboratoriet, i
enlighet med den metod som anges i bilaga 13 till ovan nämnda
förordning ha följande egenskaper:
— en extinktionskoefficient K270 som inte överstiger 1,20,1991R2568 — SV — 31.10.1995 — 013.001 — 84
▼M6
— en variation (K) av extinktionskoefficienten i
våglängdsområdet omkring 270 nm, som överstiger 0,01
men inte överstiger 0,16, t. ex.
Delta K= Km− 0,5 (Km−4+Km+4)
Km = extinktionskoefficienten för de i
området omkring 270 nm liggande
våglängder, som ligger i absorp-
tionskurvans topp.
Km−4 och Km + 4 = extinktionskoefficienterna för
våglängder som ligger 4 nm lägre
respektive högre än vid Km.
4) organoleptiska egenskaper som inbegriper påvisbara defekter
som överstiger gränsen för det acceptabla och en panelbedöm-
ning som ger under 3,5 poäng i enlighet med bilaga 12 till
förordning (EEG) nr 2568/91.
II. I undernummer 1509 10 90 avses med jungfruolja olivolja med
följande egenskaper:
a) ett syrainnehåll, uttryckt som oljesyra, som inte överstiger 3,3 g/
100g,
b) ett peroxidtal som inte överstiger 20 mekv aktiv O2/kg,
c) ett innehåll av ►M9vax◄som inte överstiger ►M9250◄
mg/kg,
d) ett innehåll av flyktiga halogenerade lösningsmedel som tillsam-
mans inte överstiger 0,2 mg/kg och som var och en för sig inte
överstiger 0,1 mg/kg,
e) en extinktionskoefficient K270 som inte överstiger 0,250, och som
efter oljan behandlats med aktiverad aluminumoxid, inte överstiger
0,10,
f) en variation (K) av extinktionskoefficienten i våglängdsområdet
omkring 270 nm, som inte överstiger 0,01,
g) organoleptiska egenskaper som kan inbegripa påvisbara defekter
inom gränserna för det acceptabla och en panelbedömning som
ger under 3,5 poäng i enlighet med bilaga 12 till förordning
(EEG) nr 2568/91.
h) ett innehåll av erytrodiol och uvaol som inte överstiger 4,5 %.
i) ett innehåll av mättade fettsyror i 2-ställning i triglyceriderna som
inte överstiger 1,3 %.
j) summan av transoleinisomerer understiger 0,03 % och summan av
translinolisomerer + translinolenisomerer understiger 0,03 %.
C. Undernummer 1509 90 00 omfattar olivoljor som framställts genom
behandling av olivoljor som omfattas av undernummer 1509 10 10 eller
1509 10 90, vare sig de är blandade med jungfruolja eller inte, med
följande egenskaper:
a) ett syrainnehåll, uttryckt som oljesyra, som inte överstiger 3,3 g/100 g,
b) ett innehåll av ►M9vax◄som inte överstiger 350 mg/kg,
c) en extinktionskoefficient vid 270 nm (K270) som inte är högre än
1,20,
d) en variation ( ∆Κ) av extinktionskoefficienten i området kring 270 nm
som inte är högre än 0,16,
e) ett innehåll av erytrodiol och uvaol som inte överstiger 4,5 %,
f) ett innehåll av mättade fettsyror i 2-ställning i triglyceriderna som inte
överstiger 1,5 %,
g) summan av transoleinisomerer understiger 0,20 % och summan av
translinolisomerer + translinolenisomerer understiger 0,30 %.
D. I undernummer 1510 00 10 avses med råa oljor oljor, särskilt olivoljor av
pressrester, med följande egenskaper:
a) ett syrainnehåll, uttryckt som oljesyra, som överstiger 2 g/100 g,
b) ett innehåll av erytrodiol och uvaol som överstiger 12 %,
c) ett innehåll av mättade fettsyror i 2-ställning i triglyceriderna som inte
överstiger 1,8 %,1991R2568 — SV — 31.10.1995 — 013.001 — 85
▼M9
▼M6
▼M6
d) summan av transoleinisomerer understiger 0,20 % och summan av
translinolisomerer + translinolenisomerer understiger 0,10 %.
E. Undernummer 1510 00 90 omfattar oljor som framställts genom behand-
ling av oljor som omfattas av undernummer 1510 00 10, blandade med
jungfruolja eller inte, och oljor som inte har de egenskaper som de oljor
har som avses i tilläggsanmärkningarna 2B, 2C och 2D. De oljor som
omfattas av detta undernummer måste ha ett innehåll av mättade fettsyror
i 2-ställning i triglyceriderna som inte överstiger 2 %, summan av trans-
oleinisomerer understiger 0,4 % och summan av translinolisomerer +
translinolenisomerer understiger 0,35 %.
3. Undernummer 1522 00 31 och 1522 00 39 omfattar inte:
a) restprodukter från behandling av fettämnen som innehåller olja med ett
jodtal, bestämt i enlighet med metoden i bilaga 16 till förordning (EEG)
nr 2568/91, som understiger 70 eller överstiger 100.
b) restprodukter från behandling av fettämnen som innehåller olja med ett
jodtal som är mellan 70 och 100, för vilket arean av den topp som
motsvarar retentionstiden för Betasitosterol (1), bestämd ienli ghet med
bilaga 5 i förordning (EEG) nr 2568/91, understiger 93 % av den totala
steroltopparean.
4. De analysmetoder för bestämning av ovannämnda produkters egenskaper är
de som fastställs i bilagorna till förordning (EEG) nr 2568/91.1991R2568 — SV — 31.10.1995 — 013.001 — 86
(1) -5,23-Stigmastadienol + Kolesterol + Betasitosterol + Sitostanol + -5-Avenasterol + -
5,24- Stigmastadienol
▼B
BILAGA 15
1. OLJEHALT I PRESSRESTER AV OLIVER
1.1Utrustning
— lämpligt extraktionsapparatur som är utrustad med en 200 till 250 ml
rundkolv,
— elektriskt uppvärmt bad (t.ex. sandbad, vattenbad) och värmeplatta,
— analysvåg,
— värmeskåp som kan ställas in på max 80 ºC,— elektriskt uppvärmt värmeskåp som är utrustat med en termostatanord-
ning som skall ställas in på 103 ± 2 ºC och som kan tåla en
genomströmning av luft eller som kan arbeta under minskat tryck,
— mekanisk kvarn som är lätt att rengöra och som tillåter att olivrester kan
malas utan temperaturförhöjning eller någon förändring i deras fuktig-
hetsinnehåll, flyktiga ämnen eller ämnen som går att extrahera med
hexan,
— extraktionsskål och bomull eller filtrerpapper varifrån ämnen som är
extraherbara med hexan redan har blivit borttagna,
— exsickator,— sil med hål av 1 mm diammeter,— små partiklar av förtorkad pimpsten.
1.2Reagenser
N-hexan, teknisk kvalitet som inte får lämna större återstod än 0,002 g/
100 ml vid total förångning.
2. UTFÖRANDE2.1Preparering av provet
Om så behövs används den mekaniska kvarnen, som skall vara väl regjord
till malning av laboratorieprovet för att minska partikelstorleken så att
provet kan passera silen helt och hållet.
Använd ungefär en tjugondel av provet för att fullfölja rengöringen av
kvarnen, kasta det malda materialet, mal resten och samla upp, blanda
omsorgsfullt och analysera utan dröjsmål.
2.2Provmängd
Så fort malningen är färdig, väg upp ca 10 g av provet på 0,01 g när, för
undersökning.
2.3Preparering av extraktionsskålen
Placera provet iskålen och täck över med bomull. Om fi ltrerpapper
används, slå in provet i detta.
2.4Förtorkning
Om olivresterna är mycket fuktiga (dvs innehåller fukt och flyktiga ämnen
till större andel än 10 %) genomförs förtorkning genom att den fyllda filt-
rerskålen (eller filtrerpappret) placeras i ett värmeskåp under en lämplig tid
vid högst 80 ºC för att minska fukthalten och halten av flyktiga ämnen så
att de understiger 10 %.
2.5Preparering av rundkolven
Väg på 1 mg när kolven som innehåller en eller två bitar pimpsten, som
tidigare torkats i värmeskåp vid 103 ± 2 ºC och sedan svalnat i en
exsickator i minst en timme.
2.6Första extraktionen
Sätt in extraktionsskålen (eller filtrerpappret) som innehåller provet i appa-
raten. Häll en tillräcklig mängd hexan i kolven. Sätt fast kolven på
extraktionsapparaten och placera den sedan på ett elektriskt uppvärmt bad.
Justera uppvärmningen på så sätt att återflödeshastigheten inte är mindre än
tre droppar per sekund (lugn, inte våldsam kokning).1991R2568 — SV — 31.10.1995 — 013.001 — 87
▼B
Efter fyra timmars extraktion får apparaten svalna. Ta bort extraktionsskålen
från extraktionsapparaten och placera den i ett luftrum för att ta bort
återstoden av lösningsmedlet.
2.7Andra extraktionen
Häll innehållet i extraktionsskålen i mikrokvarnen och mal så fint som
möjligt. Överför den malda blandningen till skålen kvantitativt och sätt den
sedan tillbaka i extraktionsapparaten.
Fortsätt extraktionen under ytterligare två timmar med användning av
samma rundkolv som innehåller extraktet från första extraktionen.
Lösningen i extraktionskolven måste vara klar. Om det inte är det, filtrera
genom ett filtrerpapper och tvätta den ursprungliga kolven och filtrerpappret
flera gånger med hexan. Samla upp filtratet och tvättlösningen i en ny rund-
kolv som har torkats och vägts på 1 mg när.
2.8Borttagning av lösningsmedel och vägning av extraktet
Ta bort större delen av lösningsmedlet genom destillation på ett elektriskt
uppvärmt bad. Ta bort de sista resterna av lösningsmedlet genom att
upphetta kolven iett värmeskåp ti ll 103 ± 2 ºC i20 mi nuter. Påskynda
processen antingen genom att blåsa in luft eller företrädesvis en inert gas i
intervaller eller använd undertryck.
Låt kolven kallna i en exsickator i minst en timme och väg på 1 mg när.
Upphetta igen 10 minuter under samma förhållanden, låt svalna i exsickator
och väg igen.
Skillnaden mellan vägningarna får inte överstiga 10 mg. Om den gör det,
upprepa upphettningen i 10 minuters perioder följt av avkylning och
vägning tills viktskillnaden är 10 mg eller mindre. Anteckna den sista
vägningen av kolven.
Genomför dubbelprov på provet.
3. RESULTATANGIVELSE
3.1Metod för beräkning och formel
a) Extraktet uttryckt som massprocent av provet som erhållits är lika med:
S=m1×100
mo
där:
S = massprocenten av extraktet från produkten,
mo= massan igram av provet,
m1= massan igram av extraktet efter torkni ng.
Som resultat tas det aritmetiska medelvärdet av dubbelproven under
förutsättning att repeterbara förhållanden har uppnåtts.
Uttryck resultaten med en decimal.
b) Extraktet uttrycks som torrsubstans genom formeln:
S×100
100 − U= oljeprocenten iextraktet beräknat som torrsubstans
där:
S = procenten av extraktet från provet som erhållits [se a)].
U = innehållet av fukt och flyktiga ämen.
3.2Repeterbarhet
Skillnaden mellan dubbelproven som utförts samtidigt eller i snabb följd av
samma analytiker skall inte överstiga 0,2 g hexanextrakt per 100 g prov.
Om detta förhållande inte är uppfyllt upprepas analysen på två andra prover.
Om det även i det här fallet uppstår en skillnad som överstiger 0,2 g tas
resultatet genom att medelvärdet av de fyra bestämningarna tas.1991R2568 — SV — 31.10.1995 — 013.001 — 88
▼B
BILAGA 16
BESTÄMNING AV JODTAL
1. SYFTE
Denna internationella standard specificerar en metod för bestämning av
jodtal hos animaliska och vegetabiliska fetter och oljor som nedan kallas
fetter.
2. DEFINITION
I denna internationella standard används följande beteckningar:
2.1Jodtal: Massan av jod som absorberas av provet under de driftförhållanden
som anges i denna internationella standard.
Jodtalet uttrycks som gram jod per 100 g prov.
3. PRINCIP
Upplösning av ett prov i lösningsmedel och tillsats av Wijs reagens. Efter
en angiven tid tillsats av kaliumjodidlösning och vatten, titrering av den
frigjorda joden med natriumtiosulfat.
4. REAGENSER
Alla reagenser skall vara av analyskvalitet.
4.1Kaliumjodid , 100 g/l lösning, som inte innehåller jodat eller fri jod.
4.2Stärkelse , lösning.
Lös 5 g vattenlöslig stärkelse i 30 ml vatten, tillsätt denna blandning till
1 000 ml kokande vatten, koka itre mi nuter och låt svalna.
4.3Natriumtiosulfat , ställd standardlösning c(Na2S2O3.5 H2O) = 0,1 mol/l, som
ställts högst sju dagar före användning.
4.4Lösningsmedel , erhållet genom blandning av lika volymer av cyklohexan
och ättiksyra.
4.5Wijs reagens , som innehåller jodmonoklorid i ättiksyra. Den Wijs reagens
som finns i handeln skall användas.
Anm: Reagensen innehåller 9 g ICl3och 9 g I iätti ksyra.
5. UTRUSTNING
Vanlig laboratorieutrustning och särskilt följande:
5.1Vägglas som är lämpliga för provet och för att kunna sättas in i kolvarna
(5.2).
5.2E-kolvar , 500 ml, utrustade med slipade glasproppar och helt torra.
6. PREPARERING AV PROVET
Det homogeniserade provet torkas över natriumsulfat och filtreras.
7. UTFÖRANDE
7.1 Prov
Mängden av det prov som tas ut varierar enligt det förväntade jodtalet
enligt tabell 1.
Tabell 1
Förväntat jodtal Mängd prov (gram)
mindre än 5 3,00
5 till 20 1,00
21 till 50 0,40
51 till 100 0,201991R2568 — SV — 31.10.1995 — 013.001 — 89
▼B
Förväntat jodtal Mängd prov (gram)
101 till 150 0,13
151 till 200 0,10
Väg provet på 0,1 mg när iett vägglas (5.1).
7.2. Bestämning
Placera provet i en 500 ml kolv (5.2). Tillsätt 20 ml av lösningsmedlet (4.5)
för att lösa fettet. Tillsätt exakt 25 ml av Wijs reagens (4.6), sätt i proppen,
skaka om innehållet och placera kolven i mörker. Använd inte en vanlig
munpipett för Wijs reagens.
Gör i ordning ett blindprov på samma sätt med lösningsmedlet och reage-
nsen men utan prov.
För prov som har ett jodtal under 150 får kolven stå imörker ien ti mma,
för de som har ett jodtal över 150 och för polymerizerade produkter eller
produkter som har oxiderats påtagligt får stå i två timmar.
När denna tid gått ut tillsätt 20 ml kaliumjodidlösning (4.2) och 150 ml
vatten (4.1) till var och en av kolvarna.
Titrera med den ställda natriumtiosulfatlösningen (4.4) tills den gula färgen
av joden nästan har försvunnit. Tillsätt ett par droppar av stärkelselösningen
(4.3) och fortsätt titreringen tills den blå färgen försvinner efter omsorgsfull
skakning.
Anm: Potentiometrisk bestämning av slutpunkten är tillåten.
7.3. Antal bestämningar
Genomför två bestämningar på samma prov.
8. RESULTATANGIVELSE
Jodtalet erhålles genom uttrycket
12;69 c V 1/C0V2 ðÞ
m
där:
c = det numeriska värdet av den exakta koncentrationen i mol per liter
av den ställda natriumtiosulfatlösningen (4.4) som används;
V1= det numeriska värdet på volymen i milliliter på den ställda natrium-
tiosulfatlösningen (4.4) som används för blindprov;
V2= det numeriska värdet på volymen i milliliter på den ställda natrium-
tiosulfatlösningen (4.4) som används vid bestämningen;
m = det numeriska värdet på massan i gram hos provet (7.1).
Som resultat tas det aritmetiska medelvärdet av två bestämningar under
förutsättning att kravet för repeterbarhet är uppfyllt.1991R2568 — SV — 31.10.1995 — 013.001 — 90
▼M11
BILAGA XVII
METOD FÖR BESTÄMNING AV STIGMASTADIENER I VEGETABI-
LISKA OLJOR
1. SYFTE
Bestämning av stigmastadiener i vegetabiliska oljor som innehåller låga
halter av dessa kolväten, särskilt jungfruolivolja och rå olivolja av
pressrester.
2. TILLÄMPNINGSOMRÅDE
Metoden kan användas för alla vegetabiliska oljor även om mätningarna
endast är tillförlitliga när halten av dessa kolväten är mellan 0,01 och
4,0 mg/kg. Metoden är särskilt lämpad för att påvisa förekomst av raffine-
rade vegetabiliska oljor (oliv, olivpressrester,solros, palm etc.) i
jungfruolivolja eftersom raffinerade oljor innehåller stigmastadiener
medan jungfruolivolja inte gör det.
3. PRINCIP
Separering av oförtvålbara ämnen. Separering av den steroida kolvätefrak-
tionen genom kolonnkromatografi på kiselgel och analys med
kapillärgaskromatografi.
4. UTRUSTNING
4.1 250 ml lämpliga kolvar med återflödeskylare.4.2 Separertrattar 500 ml.
4.3 Rundkolvar 100 ml.
4.4 Rotationsindunstare.4.5 Kromatografikolonn av glas (innerdiameter: 1,5—2,0 cm, längd: 50 cm)
med teflonpropp och en tuss glasull eller en sinterglasskiva i botten. För
beredning av kiselgelkolonnen, häll hexan på kromatografikolonnen till ett
djup av ca 5 cm och fyll därefter på med en lösning av kiselgel i hexan
(15 g i40 ml) med hjälp av små porti oner hexan. Låt stå och avsluta meden lätt omskakning. Tillsätt vattenfritt natriumsulfat till en höjd av cirka
0,5 cm och eluera slutligen överflödigt hexan.
4.6 Gaskromatograf med flamjoniseringsdetektor, separat injektor eller
injektor som är kallintegrerad i kolonnen och en ugn som kan program-
meras med en noggrannhet av ± 1 ºC.
4.7 Kapillärkolonn av kvarts för gaskromatografi (innerdiameter: 0,25 eller
0,32 mm, längd: 25 m) täckta med 5 % fenylmetylsilikonfas med en film-
tjocklek av 0,25 µm.
Anm. 1:
Andra kolonner av samma eller lägre polaritet kan användas.
4.8 Integrerad registreringsenhet som ger möjlighet till integrering över varje
enskild topp.
4.9 5—10 µl mikrospruta för gaskromatografi med härdad nål.
4.10 Eluppvärmd mantel eller uppvärmningsplatta.
5. REAGENSER
Alla reagenser skall vara av analytisk renhet om inte annat anges. Det
vatten som används skall vara destillerat vatten eller vatten av minst
motsvarande renhetsgrad.
5.1 Hexan eller blandning av alkaner med ett kokpunktsintervall på 65—70 ºC,
destillerat med rektifieringskolonn.
Anm. 2:
Lösningen skall destilleras för att avlägsna orenheter.
5.2 96 % etanol (volymprocent).5.3 Vattenfritt natriumsulfat.1991R2568 — SV — 31.10.1995 — 013.001 — 91
▼M11
5.4 10-procentig alkoholkaliumhydroxidlösning. Tillsätt 10 ml vatten till 50 g
kaliumhydroxid, rör om och lös därefter upp blandningen i etanol till
500 ml.
Anm. 3:
Alkoholkaliumhydroxid blir brun när den får stå. Den bör göras i ordning
varje dag och förvaras iväl ti llslutna mörka glasflaskor.
5.5 Kiselgel 60 för kolonnkromatografi, 70—230 mesh (Merck ref. 7734 eller
liknande).
Anm. 4:
Kiselgel kan normalt användas direkt från behållaren utan föregående
behandling. Vissa partier kisel kan emellertid uppvisa låg aktivitet vilket
ger dåliga kromatografiska separeringar. I sådana fall bör kiselgelen
behandlas på följande sätt: Aktivera kiselgelen genom uppvärmning under
minst fyra timmar vid 550 ºC. Efter uppvärmningen placeras kiselgelen i
en exsickator där den får svalna och förs därefter över till en kolv med
tillslutningsanordning. Tillsätt 2 % vatten och skaka om tills inga klumpar
längre kan ses och pulvret flyter fritt.
Om partier av kiselgel ger kromatogram med interfererande toppar bör
kiselgelen behandlas på det sätt som beskrivs ovan. Alternativt kan extra
ren kiselgel 60 (Merck ref. 7754) användas.
5.6 Stamlösning (200 ppm) av kolesta-3,5-dien (Sigma, 99 % renhet) i hexan
(10 mg i50 ml).
5.7 Standardlösning av kolesta-3,5-dien i hexan med en koncentration av
20 ppm erhållen genom utspädning av ovanstående lösning.
Anm. 5:
Om de lösningar som avses i 5.6 och 5.7 förvaras under 4 ºC så kommer
de inte att förfaras under åtminstone de första fyra månaderna.
5.8 Lösning av n-nonacosan i hexan med en koncentration av cirka 100 ppm.
5.9 Bärargas för kromatografi: helium eller väte med en renhetsgrad på
99,9990 %.
5.10 Hjälpgaser för flamjoniseringsdetektor: väte med en renhetsgrad på
99,9990 % och ren luft.
6. UTFÖRANDE
6.1Preparering av oförtvålbara ämnen
6.1.1 Väg 20 ± 0,1 g olja i en 250 ml kolv (4.1), tillsätt 1 ml standardlösning av
kolesta-3,5-dien (20 µg) och 75 ml 10-procentig alkoholkaliumhydroxid,
sätt på återflödeskylare och värm upp till sakta kokning i 30 minuter. Ta
bort kolven som innehåller provet från värmen och låt lösningen svalna
något (låt den inte kallna helt eftersom provet då tjocknar). Tillsätt
100 ml vatten och överför lösningen till en separertratt (4.2) genom att
använda 100 ml hexan. Omskaka blandningen kraftigt i 30 sekunder och
lämna sedan att separera.
Anm. 6:
Om en emulsion produceras och inte snabbt försvinner tillsätt små
mängder av etanol.
6.1.2 Överför den undre vattenfasen till en annan separertratt och gör ytterligare
en extraktion med användning av 100 ml hexan. Häll ur den undre fasen
en gång till och tvätta hexanextrakten (samlade i en annan separertratt) tre
gånger med 100 ml var gång med en blandning av etanol och vatten (1: 1)
tills neutralt pH-värde uppnås.
6.1.3 Låt hexanlösningen flyta genom vattenfritt natriumsulfat (50 g), tvätta
med 20 ml hexan och indunsta i en rotationsindunstare vid 30 ºC och
under lätt tryck till torrhet.
6.2Separering av den steroida kolvätefraktionen
6.2.1 Överför återstoden till fraktioneringskolonnen med användning av två 1 ml
portioner hexan, häll provet på kolonnen genom att låta lösningens nivå
sjunka till toppen av natriumsulfatet och börja kromografisk eluering
med hexan med en hastighet av ca 1 ml/minut. Häll bort de första
25—30 ml av elueringen och samla in den följande 40 ml fraktionen.
Efter uppsamlingen överför denna fraktion till en 100 ml rundbottnad
cylinder (4.3).1991R2568 — SV — 31.10.1995 — 013.001 — 92
▼M11
Anm. 7:
Den första fraktionen innehåller mättade kolväten (fig. 1a) och den andra
fraktionen de steroida kolvätena. Ytterligare eluering ger skvalen och rela-
terade föreningar. För att uppnå en god separering mellan mättade och
steroida kolväten, krävs en optimering av fraktionernas volymer. I detta
syfte bör den första fraktionens volym justeras så att de toppar som repre-
senterar mättade kolväten är låga när den andra fraktionen analyseras (se
fig. 1c). Om de inte formas, utan standardtoppens intensitet är låg, bör
volymen minskas. En fullständig separering mellan den första och den
andra fraktionens komponenter är hur som helst inte nödvändig eftersom
det inte förekommer någon överlappning av topparna under analysen med
gaskromatografi om gaskromatografiska villkor ändras i enlighet med
6.3.1. En optimering av den andra fraktionens volym är i allmänhet inte
nödvändig eftersom en god separering erhålls med de följande komponen-
terna. En hög topp med omkring 1,5 minuter kortare retentionstid är
standarden beror emellertid på skvalen och är ett tecken på en dålig sepa-
rering.
6.2.2 Indunsta den andra fraktionen i en indunstare vid 30 ºC och under lätt
tryck till torrhet och lös omedelbart upp återstoden i 0,2 ml hexan.
Förvara lösningen i kylskåp fram till analysen.
Anm. 8:
De återstoder som anges i6.1.3 och 6.2.2 bör i nte förvaras torrt eller i
rumstemperatur. Så snart de har erhållits, bör lösningsmedel tillsättas och
lösningarna bör förvaras i kylskåp.
6.3Gaskromatografi
6.3.1 Driftförhållanden för separerad injektion:
— Injektorns temperatur: 300 ºC.
— Detektorns temperatur: 320 ºC.— Integrerad registreringsenhet: parametrarna för integrering bör ställas
in så att en korrekt uppskattning av ytorna erhålls. Integration över
de enskilda topparna rekommenderas.
— Känslighet: omkring 16 gånger högre än minimikänsligheten.
— Kvantitet av det injicerade ämnet: 1 µl.
— Inställning av ugnstemperaturen: starttemperaturen skall vara 235 ºC i
6 minuter, därefter ökas temperaturen med 2 ºC/min upp till 285 ºC.
— Injektor med delningsförhållandet 1: 15.— Bärargas: helium eller väte vid ett tryck av ungefär 120 kPa.
Dessa förhållande kan ändras ienli ghet med kromatograf- och kolonnka-
raktäristiken för att erhålla kromatogram som uppfyller följande krav:
intern standardtopp inom ca 5 minuter av den tid som anges i 6.3.2. Den
interna standardtoppen bör vara minst 80 % av hela skalvärdet.
Det gaskromatografiska systemet måste kontrolleras genom att en bland-
ning av stamlösningen av kolestadien (5.6) och n-nonacosanlösning (5.8)
sprutas in. Kolesta-3,5-dientoppen måste formas n-nonacosanet (fig. 1c).
Om den inte framträder kan två åtgärder vidtas: att sänka ugnstempera-
turen eller att använda kolonner som inte är lika polära.
6.3.2 Identifiering av toppar
Den inre standardtoppen formas vid omkring 19 minuter och stigmasta-
3,5-dien med en relativ retentionstid på cirka 1,29 (se fig. 1b). Med stig-
masta-3,5-dien förekommer små mängder av en isomer och vanligtvis
formar de båda en enda kromatografisk topp. Om kolonnen är för polär
eller uppvisar för stor upplösningsförmåga, kan isomeren emellertid
framträda som en liten topp före och mycket nära stigmasta-3,5-dien-
toppen (fig. 2). För att försäkra sig om att stigmastadienerna elueras till
en topp är det tillrådligt att ersätta kolonnen med en kolonn som inte är
lika polär eller en kolonn med större innerdiameter.
Anm. 9:
Stigmastadiener för kromatografisk referens kan erhållas genom analys av
en raffinerad vegetabilisk olja med användning av en mindre provmängd
(1—2 g). Stigmastadiener producerar en mycket tydlig och lätt identifi-
erbar topp.
6.3.3 Kvantitativ analys
Stigmastadienhalten bestäms enligt formeln
mg/kg stigmastadien =
As/C2Mc
Ac/C2Mo1991R2568 — SV — 31.10.1995 — 013.001 — 93
▼M11
där: As= arean av stigmastadientoppen (om toppen upplöses i två
isomer, summan av de två topparnas areor)
Ac= arean av inre standard (kolestadien)
Mc= massan av tillsatt standard i mikrogram
Mo= massan av oljan som tagits ut för undersökning i gram
Gräns för påvisbarhet: ca 0,01 mg/kg.1991R2568 — SV — 31.10.1995 — 013.001 — 94
▼M11
Figur 1
Gaskromatogram erhållna genom analys av prover av olivolja på en
kapillärkolonn av kvarts (0,25 mm innerdiameter på en längd av 25 m)
täckt med 5-procentig fenylmetylsilikon med en filmtjocklek av 0,25 µm.
a) Första fraktionen (30 ml) från en jungfruolja med tillsatt standard.
b) Andra fraktionen (40 ml) från en olivolja innehållande 0,10 mg stig-
mastadien per kg.1991R2568 — SV — 31.10.1995 — 013.001 — 95
▼M11
c) Andra fraktionen (40 ml) innehållande en liten del av den första frak-
tionen.
Figur 2
Gaskromatogram som erhållits från ett prov av raffinerad olivolja analy-
serad på en DB-5 kolonn och som visar stigmasta-3,5-diens isomer.1991R2568 — SV — 31.10.1995 — 013.001 — 96