1976L0372 — SV — 10.11.1992 — 002.001 — 1
Detta dokument är endast avsett som dokumentationshjälpmedel och institutionerna ansvarar inte för innehållet
►B KOMMISSIONENS SJUNDE DIREKTIV
av den 1 mars 1976
om gemenskapsmetoder för analys vid den officiella foderkontrollen
(76/372/EEG)
(EGT L 102, 15.4.1976, s. 8)
Ändrat genom:
Officiella tidningen
nr sida datum
►M1Kommissionens direktiv 81/680/EEG av den 30 juli 1981 L 246 32 29.8.1981
►M2Kommissionens direktiv 92/95/EEG av den 9 november 1992 L 327 54 13.11.1992
▼B
KOMMISSIONENS SJUNDE DIREKTIV
av den 1 mars 1976
om gemenskapsmetoder för analys vid den officiella foderkon-
trollen
(76/372/EEG)
EUROPEISKA GEMENSKAPERNAS KOMMISSION HAR ANTAGIT
DETTA DIREKTIV
med beaktande av Fördraget om upprättandet av Europeiska ekono-
miska gemenskapen,
med beaktande av rådets direktiv av den 20 juli 1970 om införande av
gemenskapsmetoder för provtagning och analys vid den officiellafoderkontrollen(
1), senast ändrat genom anslutningsakten(2), särskilt
artikel 2 i denna, och
med beaktande av följande:I det ovan nämnda direktivet krävs att den officiella foderkontrollen
skall utföras med användning av gemenskapsmetoder för provtagning
och analys i syfte att kontrollera att fodret motsvarar de krav somframgår av bestämmelser i lagar och andra författningar beträffandefoders kvalitet och sammansättning.
I kommissionens direktiv 71/250/EEG av den 15 juni 1971(
3), 71/393/
EEG av den 18 november 1971(4), 72/199/EEG av den 27 april
1972(5), 73/46/EEG av den 5 december 1972(6), 74/203/EEG av den
25 mars 1974(7) och 75/84/EEG av den 20 december 1974(8) har redan
ett antal gemenskapsmetoder för analys fastställts. Mot bakgrund avden utveckling som därefter skett på området är det lämpligt att nuanta en sjunde metodsamling.
De åtgärder som beslutas om i detta direktiv är förenliga med Ständiga
foderkommitténs yttrande.
HÄRIGENOM FÖRESKRIVS FÖLJANDE.
Artikel 1
Medlemsstaterna skall kräva att analyser vid den officiella foderkon-
trollen skall utföras med de metoder som beskrivs i bilagan till detta
direktiv då det gäller halter av aflatoxin B1.
Artikel 2
Medlemsstaterna skall senast den 1 oktober 1976 sätta i kraft de lagar
och andra författningar som är nödvändiga för att följa detta direktiv.De skall genast underrätta kommissionen om detta.
Artikel 3
Detta direktiv riktar sig till medlemsstaterna.1976L0372 — SV — 10.11.1992 — 002.001 — 2
(1) EGT nr L 170, 3.8.1970, s. 2.
(2) EGT nr L 73, 27.3.1972, s. 14.
(3) EGT nr L 155, 12.7.1971, s. 13.
(4) EGT nr L 279, 20.12.1971, s. 7.
(5) EGT nr L 123, 29.5.1972, s. 6.
(6) EGT nr L 83, 30.3.1973, s. 21.
(7) EGT nr L 108, 22.4.1974, s. 7.
(8) EGT nr L 32, 5.2.1975, s. 26.▼M1
▼B
▼B
BILAGA
BESTÄMNING AV AFLATOXIN B1
METOD A: ENDIMENSIONELL TUNNSKIKTSKROMATOGRAFI
1. Syfte och användningsområde
Denna metod gör det möjligt att bestämma halten av aflatoxin B1i
råvaror och oblandade foder. Metoden kan inte användas i närvaro
av citruspulpa. Den minsta mängd som kan bestämmas är 0,01 mg/
kg (10 ppb).
I närvaro av störande substanser måste analysen upprepas med
metod B (HPLC-metod, vätskekromatografi).
2. Princip
Provet extraheras med kloroform. Extraktet filteras och en del av
filtratet renas genom kolonnkromatografi på kiselgel. Eluatet indun-
stas och återstoden löses på nytt upp i en bestämd mängd kloroform
eller blandning av bensen och acetonitril. En del av denna lösning
undergår tunnskiktskromatografi (TK). Mängden aflatoxin B1bestäms under UV-bestrålning av kromatogrammet, antingenvisuellt eller genom fluorodensitometri, under jämförelse med
kända kvantiteter standardaflatoxin B
1. Identiteten hos det aflatoxin
B1som extraheras ur fodret måste bekräftas med den metod som
anges nedan.
3. Reagens
OBS!Samtliga reagens måste vara av ”analytiskk valitet”, om inte
annat anges.
3.1 Aceton.
3.2 Kloroform, stabiliserad med 0,5-1,0 % 96-procentig etanol
(volymprocent).
3.3 N-hexan.
3.4 Metanol.
3.5 Vattenfri dietyleter, peroxidfri.
3.6 Blandning av bensen och acetonitril: 98/2 (volym/volym).
3.7 Blandning av kloroform (3.2) och metanol (3.4): 97/3 (volym/
volym).
3.8 Kiselgel för kolonnkromatografi, partikelstorlek 0,05-0,20 mm.3.9 Absorberande bomull, som avfettats med kloroform, eller glasull.
3.10 Natriumsulfat, vattenfri, i granulatform.
3.11 Inert gas, t.ex. kväve.
3.12 Saltsyra 1 M.
3.13 50-procentig svavelsyra (volymprocent).3.14 Kiselgur (hyflosupercel), syratvättad.
3.15 Kiselgel G-HR eller motsvarande, för TK.
3.16 Standardlösning av cirka 0,1 µg aflatoxin B
1per ml i kloroform
(3.2) eller i blandningen av bensen och acetonitril (3.6). Lösningen
skall beredas och kontrolleras enligt anvisningarna i punkt 7.
3.17 Standardlösning för kvalitativa prov med ett innehåll av cirka 0,1 µg
aflatoxin B1och B2per ml i kloroform (3.2) eller blandningen av
bensen och acetonitril (3.6). Dessa halter anges som riktvärde. De
måste justeras så att båda aflatoxinerna får samma fluorescensinten-
sitet.
3.18 Framkallningslösningar:
3.18.1 Kloroform (3.2)/aceton (3.1): 9/1 (volymprocent), omättad vanna.1976L0372 — SV — 10.11.1992 — 002.001 — 3
▼M2
▼B
▼B
3.18.2 Dietyleter (3.5)/metanol (3.4)/vatten: 96/3/1 (volym/volym/volym),
omättad vanna.
3.18.3 Dietyleter (3.5)/metanol (3.4)/vatten: 96/4,5/1,5 (volym/volym/
volym), mättad vanna.
3.18.4 Kloroform (3.2)/ metanol (3.4): 94/6 (volym/volym), mättad vanna.
3.18.5 Kloroform (3.2)/ metanol (3.4): 97/3 (volym/volym), mättad vanna.
4. Utrustning
4.1 Mixerkvarn.
4.2 Skakapparat eller magnetisk omrörare.
4.3 Veckfilterpapper, Schleicher och Schüll nr 588 eller motsvarande,
diameter: 24 cm.
4.4 Glasrör för kromatografi (inre diameter: 22 mm, längd: 300 mm),
med kran av polytetrafluoretylen och en 250 ml behållare.
4.5 Vakuumrotationsindunstare med 500 ml rundbottnad kolv.
4.6 500 ml koniska kolvar med proppar av matterat glas.
4.7 TK-utrustning.
4.8 Glasplattor för TK, 200 × 200 mm, behandlade på följande sätt (de
angivna kvantiteterna räcker för att täcka fem plattor): Lägg 30 gkiselgel G-HR (3.15) i en konisk kolv. Tillsätt 60 ml vatten, tillslut
och skaka om under en minut. Bred ut ett jämnt, 0,25 mm tjockt
lager av suspensionen på plattorna. Låt lufttorka och förvara
därefter plattorna i en exsickator som innehåller kiselgel. Aktivera
plattorna innan de skall användas genom att sätta dem i ugnen vid
110 ºC under en timme.
Färdigtillverkade plattor är lämpliga om de ger liknande resultat
som plattor vilka behandlats på här angivet sätt.
4.9 Långvågslampa för UV-ljus (360 nm). Bestrålningsintensiteten
måste vara sådan att det är möjligt att klart urskilja en fläck av
1 ng aflatoxin B
1på en TK-platta på ett avstånd av 10 cm från
lampan.
4.10 10 ml mätcylindrar med proppar av polyetylen.
4.11 UV-spektralfotometer.
4.12 Fluorodensitometer (ej obligatoriskt).
5. Utförande
5.1 Preparering av provet (se Anmärkningar,del C,punkt 1)
Mal provet så att det i sin helhet passerar genom ett såll med 1 mm
maskor (enligt ISO R 565).
5.2 Extraktion
Placera 50 g av det malda och homogeniserade provet i en 500 ml
konisk kolv (4.6). Tillsätt 25 g kiselgur (3.14), 25 ml vatten och
250 ml kloroform (3.2). Tillslut kolven, skaka eller rör om under
30 minuter med apparat (4.2) och filtrera genom veckfilterpapper
(4.3). Avlägsna de första tio millilitrarna av filtratet och samla
därefter in 50 ml.
5.3 Rengöring i kolonn
Sätt en propp av bomull eller glasull (3.9) i nedre ändan av ett
kromatografirör (4.4), fyll röret till två tredjedelar med kloroform
(3.2) och tillsätt 5 g natriumsulfat (3.10).
Kontrollera att natriumsulfatskiktet upptill har en plan yta och
tillsätt därefter 10 g kiselgel (3.8) i småportioner. Rör om noggrant
efter varje tillsats så att alla luftbubblor avlägsnas. Låt stå under 15
minuter och tillsätt därefter försiktigt 15 g natriumsulfat (3.10). Låt
vätskan sjunka tills den är precis ovanför natriumsulfatskiktets
toppyta.
Blanda de 50 ml extrakt som insamlats enligt 5.2 med 100 ml n-
hexan (3.3) och överför hela blandningen utan förlust till kolonnen.
Låt vätskan sjunka tills den är precis ovanför natriumsulfatskiktets
toppyta. Avlägsna denna uppslamning. Tillsätt därefter 100 ml
dietyleter (3.5) och låt också detta sjunka till natriumsulfatskiktets1976L0372 — SV — 10.11.1992 — 002.001 — 4
▼B
toppyta. Se under dessa moment till att flödeshastigheten är 8-
12 ml/minut och att kolonnen inte tillåts torka. Avlägsna den vätska
som avskiljs. Eluera därefter med 150 ml kloroform/metanolbland-
ning (3.7) och samla in hela eluatet.
Indunsta eluatet tills det är nästan torrt med rotationsindunstaren
(4.5) vid högst 50 ºC i en ström inert gas (3.11). Överför hela
återstoden utan förlust i kloroform (3.2) eller en blandning av
bensen/acetonitril (3.6) till en 10 ml mätcylinder (4.10). Koncen-
trera lösningen i en ström inert gas (3.11) och justera därefter
volymen till 2 ml med kloroform (3.2) eller blandningen av bensen
och acetonitril (3.6).
5.4 Tunnskiktskromatografi
Placera fläckvis följande volymer av standardlösningen och
extraktet på en TK-platta (4.8) 2 cm från nedre kanten och med
2 cm mellanrum:
— 10, 15, 20, 30 och 40 µl standardlösning av aflatoxin B1(3.16),
— 10 µl av det extrakt som erhållits enligt 5.3 och ovanpå detta
20 µl standardlösning (3.16),
— 10 och 20 µl av det extrakt som erhållits enligt 5.3.
Framkalla kromatogrammet i mörker med någon av framkall-
ningslösningarna (3.18). Valet av lösning måste ske i förväg
genom att man placerar 25 µl av den kvalitativa standardlösningen
(3.17) på plattan och kontrollerar att aflatoxin B1och B2är full-
ständigt separerade efter framkallning.
Låt lösningarna indunsta i mörker och bestråla därefter med UV-
ljus med plattan 10 cm från lampan (4.9). Fläckarna av aflatoxin
B1ger en blå fluorescens.
5.5 Kvantitativa bestämningar
Bestäm antingen visuellt eller genom fluorodensitometri enligt
följande anvisningar:
5.5.1 Visuell mätning
Bestäm mängden aflatoxin B1i extraktet genom att jämföra fluore-
scensintensiteten hos extraktfläckarna med
standardlösningsfläckarnas. Interpolera om så är nödvändigt. Den
fluorescens som uppnås då extrakt och standardlösning lagts på
varandra måste vara intensivare än vad 10 µl av extraktet ger och
det får inte finnas mer än en synlig fläck. Om 10 µl av extraktet ger
större fluorescensintensitet än 40 µl standardlösning skall extraktet
spädas 10 eller 100 gånger med kloroform (3.2) eller bensen/aceto-
nitrilblandning (3.6) innan det på nytt genomgår
tunnskiktskromatografi.
5.5.2 Mätning med fluorodensitometri
Mät fluorescensintensiteten hos aflatoxin B1-fläckarna med fluoro-
densitometern (4.12) exciteringsvåglängden 365 nm och
emissionsvåglängden 443 nm. Bestäm mängden aflatoxin B1i
fläckarna med extrakt genom att jämföra deras fluorescensintensitet
med den hos fläckarna med standardaflatoxin B1.
5.6 Bekräftelse av identiteten hos aflatoxin B1
Bekräfta identiteten hos det aflatoxin B1som förekommer i
extraktet med de processer som anges nedan.
5.6.1 Behandling med svavelsyra
Spruta svavelsyra (3.13) på det kromatogram som erhållits enligt
5.4. Fluorescensen hos fläckarna med aflatoxin B1måste övergå
från blått till gult under UV-bestrålning.
5.6.2 Två dimensionell kromatografi med bildande av afla-
toxin B1-halvacetal (aflatoxin B1a)
OBS!Under de nedan beskrivna momenten måste diagrammet i
figur 3 följas noggrant.
5.6.2.1 Applicering av lösningarna
Ritsa två räta linjer på plattan (4.8) parallellt med två angränsande
sidor (6 cm in från vardera sidan) för att begränsa lösningsmedels-1976L0372 — SV — 10.11.1992 — 002.001 — 5
▼B
fronternas migrering. Anbringa fläckar av följande lösningar på
plattan med kapillärpipetter eller mikrosprutor:
—på punkt A: en volym renat extrakt (enligt 5.3) av provet som
innehåller cirka 2,5 ng aflatoxin B1,
—på punkt B och C: 25 µl standardlösning (3.16).
5.6.2.2 Framkallning
Framkalla kromatogrammet i mörker i riktning I med framkall-
ningslösningen (3.18.1) (1 cm skikt i omättad vanna) tills
lösningens front når gränslinjen för lösningen.
Avlägsna plattan från vannan och låt den torka i mörker vid omgi-
vande temperatur under fem minuter. Spruta därefter saltsyra (3.12)
längs en 2,5 cm hög remsa som täcker punkterna A och B (det
skuggade området i figur 3) tills den mörknar och skydda samtidigt
resten av plattan med en glasskiva. Låt reaktionen fortgå i mörker
under 10 minuter och torka med en luftström vid omgivande
temperatur.
Framkalla därefter kromatogrammet i mörker i riktning II med
framkallningslösningen (3.18.1) (1 cm skikt i omättad vanna) tills
lösningens front når gränslinjen för lösningen. Avlägsna plattan
från vannan och låt den torka vid omgivande temperatur.
5.6.2.3 Tolkning av kromatogrammet
Granska kromatogrammet i UV-ljus (4.9) och kontrollera
förekomsten av följande:
a) En blå fluorescerande fläckaflatoxin B1framträder som
kommer från den standardlösning som applicerats på punkt C
(migrering i riktning I).
b) En blå fluorescerande fläckaflatoxin B1som inte reagerat med
saltsyran framträder samtidigt med en intensivare blå fluoresce-
rande fläckaflatoxin B1-halvacetal och båda fläckarna kommer
från den standardlösning som applicerats på punkt C (migrering
i riktning II).
c) Fläckar framträder som motsvarar dem som beskrivits i punkt b
och som kommer från provextraktet som applicerats på punkt A.
Dessa fläckars position definieras först genom migrering-
ssträckan för aflatoxin B1från punkt A i riktning I (samma
som för standardlösningen som applicerats på punkt C) och
därefter genom migreringssträckorna för aflatoxin B1-halvacetal
därifrån i riktning II (samma som för standardlösningen som
applicerats på punkt B). Fluorescensintensiteterna hos halvace-
talfläckarna från extraktet respektive den standardlösning som
applicerats på punkt B skall motsvara varandra.
6. Resultatberäkning
6.1 Med visuell mätning
Halten aflatoxin B1i mikrogram per kg av provet (ppb) erhålls med
formeln:
S/C1Y/C1V
W/C1X
där
Y och X är de volymer i mikroliter av standardlösningen aflatoxin
B1(3.16) resp. extraktet som har liknande fluorescensintensitet,
S = standardlösningens (3.16) aflatoxin B1-koncentration i
mikrogram per ml,
V = extraktets slutliga volym i mikroliter, justerat efter eventu-
ella utspädningar som visat sig nödvändiga,
W = vikt i gram av det prov som motsvarar den volym av
extraktet som genomgått rengöring i kolonn.
6.2 Med fluorodensitometrisk mätning
Halten aflatoxin B1i mikrogram per kg av provet erhålls med
formeln:1976L0372 — SV — 10.11.1992 — 002.001 — 6
▼B
S/C1V
W/C1Y
där
Y = volymen i mikroliter av det extrakt som har applicerats på
plattan (10 eller 20 µl),
S = den mängd aflatoxin B1i nanogram i extraktfläcken (i
proportion till värdet av Y), som framgår av beräkningarna,
V = extraktets slutliga volym i mikroliter, justerat efter eventu-
ella utspädningar som visat sig nödvändiga,
W = vikt i gram av det prov som motsvarar den volym av
extraktet som genomgått rengöring i kolonn.
7. Preparering och test av standardlösningen (3.16)
7.1 Bestämning av aflatoxin B1-koncentrationen
Bered en standardlösning av aflatoxin B1i kloroform (3.2) eller
bensen-acetonitrilblandning (3.6) med en koncentration av 8-10 µg/
ml. Bestäm absorptionsspektrum mellan 330 och 370 nm med
spektralfotometern (4.11).
Mät den optiska densiteten (A) vid 363 nm för kloroformlösning
och vid 348 nm för lösning med bensen-acetonitrilblandning.
Beräkna aflatoxin B1-koncentrationen i mikrogram per ml lösning
med följande formler:
312/C1A/C11000
20600för kloroformlösning,
312/C1A/C11000
19800för lösning med bensen-acetonitriblblandning.
Späd i skydd för dagsljus så att en arbetsstandardlösning med en
aflatoxin B1-koncentration av cirka 0,1 µg/ml erhålls. Denna
lösning är hållbar i två veckor om den förvaras i kylskåp vid 4 ºC.
7.2 Test av kromatografisk renhet
Applicera på en platta (4.8) en fläckav 5 µl standardlösning av
aflatoxin B1som innehåller 8-10 µg/ml (7.1). Framkalla kromato-
grammet enligt anvisningarna i 5.4. I UV-ljus skall
kromatogrammet endast uppvisa en fläck och ingen fluorescens
skall kunna iakttas i det område där lösningen applicerades.
8. Repeterbarhet
Skillnaden mellan resultaten av två parallella bestämningar som
utförts på samma prov av samma analytiker får inte överstiga:
— 25 % av det högre resultatet för aflatoxin B1-halter från 10 till
och med 20 µg/kg,
— 5 µg, absolutvärde, för halter på över 20 och högst 50 µg/kg,— 10 % av det högre resultatet för halter över 50 µg/kg.
9. Reproducerbarhet
Se Anmärkningar, del C, punkt 2.
B. BESTÄMNING AV AFLATOXIN B
1. HPLC-METOD (vätskekromatografi).
1. Syfte och användningsområde
Denna metod är avsedd för bestämning av aflatoxin B1i djurfoder,
inklusive djurfoder som innehåller citruspulpa. Den minsta mängd
som kan bestämmas är 0,001 mg/kg (1 ppb).
2. Princip
Provet extraheras med kloroform. Extraktet filtreras och ett delprov
renas på en Florisil-kolonn och därefter på en C18-kolonn. Den slut-
liga separeringen och bestämningen görs med vätskekromatografi1976L0372 — SV — 10.11.1992 — 002.001 — 7
▼M2
▼M2
(HPLC), med användning av en omvänd-fas C18-kolonn för HPLC
och därpå följande derivatisering med jod i vatten samt fluorescens-
detektering.
Obs:Mykotoxiner är mycket giftiga ämnen. De bör hanteras i ett
speciellt dragskåp. Särskilda försiktighetsåtgärder bör vidtas när
gifterna befinner sig i torrt tillstånd, eftersom de är elektrostatiska
och har en tendens att spridas på arbetsplatsen.
3. Reagens
3.1 Kloroform, stabiliserad med 0,5-1,0 % (m/m) etanol. Se anmärk-
ning 10.2.
3.2 Metanol, HPLC-kvalitet för beredning av 3.6.3.3 Aceton.3.4 Acetonitril, HPLC-kvalitet.
3.5 Elueringsmedel: Bered dagen före användningen eller avlägsna
luften i lösningsmedlen med hjälp av ultraljud.
3.5.1 Aceton (3.3)/vatten, 98 + 2 (v + v).3.5.2 Vatten/metanol (3.2), 80 + 20 (v + v).3.5.3 Vatten/aceton (3.3), 85 + 15 (v + v).3.6 Rörlig fas för HPLC.
Den rörliga fasen består av vatten, metanol (3.2) och acetonitril
(3.4), 130 + 70 + 40 (v + v + v).
OBS:Den rörliga fasens sammansättning kan eventuellt behöva
anpassas, beroende på vilken typ av HPLC-kolonn som används.
3.7 Mättad jodlösning. Tillsätt 2 g jod till 400 ml vatten. Blanda under
minst 90 min. och filtrera sedan genom ett membranfilter (4.15).
Den mättade lösningen skyddas mot ljus för att förhindra fotoke-
misknedbrytning.
3.8 Syratvättad Celite 545, eller motsvarande.3.9 Florisil-kolonn (Waters SEP-PAK), eller motsvarande.3.10 C
18-kolonn (Waters SEP-PAK), eller motsvarande.
3.11 Inert gas, t. ex. kväve.3.12 Aflatoxin B
1, standardlösning i kloroform, koncentration 10µg/ml.
Kontrollera lösningens koncentration på följande sätt: Bestäm
lösningens absorptionsspektrum till mellan 330 och 370 nm med
hjälp av en spektrofotometer (4.23). Mät absorbansen (A) vid
maximum nära 363 nm. Beräkna koncentrationen av aflatoxin B1i
µg per ml lösning med formeln:
Koncentration èmg =ml ðÞ ¼312/C2A/C21000
22300¼13;991/C2A
3.12.1 Aflatoxin B1, stamlösning i kloroform.
Överför 2,5 ml aflatoxin B1, standardlösning (3.12), till en 50 ml
mätkolv och fyll upp till märket med kloroform (3.1). Förvara
lösningen svalt (4 ºC), mörkt, väl tillsluten och invirad i luminium-
folie.
3.13 Aflatoxin B1kalibreringslösningar för HPLC.
OBS:Använd syratvättade glaskärl vid beredning av lösningar-
na.(Se punkt 4, Utrustning).
3.13.1 Kalibreringslösning 4 ng/ml.
Låt mätkolven med stamlösning (3.12.1) värmas till rumstempe-
ratur i aluminiumfolien (några timmar). Överför 400 µl av
stamlösningen (200 ng aflatoxin B1) till en 50 ml mätkolv och
indunsta till torrhet i en ström av inert gas (3.11). Lös upp
återstoden i ca 20 ml vatten/aceton (3.5.3), fyll upp till märket
med vatten/aceton och blanda väl.
3.13.2 Kalibreringslösning 3 ng/ml.1976L0372 — SV — 10.11.1992 — 002.001 — 8
▼M2
Överför 7,5 ml av kalibreringslösningen (3.13.1) till en 10 ml
mätkolv, fyll upp till märket med vatten/aceton (3.5.3) och blanda
väl.
3.13.3 Kalibreringslösning 2 ng/ml.
Överför 25 ml av kalibreringslösningen (3.13.1) till en 50 ml
mätkolv, fyll upp till märket med vatten/aceton (3.5.3) och blanda
väl.
Denna lösning kallas också referenslösning och används vid
upprepad insprutning under HPLC (5.5).
3.13.4 Kalibreringslösning 1 ng/ml.
Överför 2,5 ml av kalibreringslösningen (3.13.1) till en 10 ml
mätkolv, fyll upp till märket med vatten/aceton (3.5.3) och blandaväl.
3.14 Ampull med en blandning av aflatoxinerna B
1,B2,G1och G2i
koncentrationer på respektive ca 1, 0,5, 1 och 0,5 µg/ml i 1 ml
kloroform.
3.14.1 Kromatografisktestlösning.
Överför ampullens innehåll (3.14) till ett provrör med glaspropp
eller flaska med skruvlock. Överför 40 µl av lösningen till ett
provrör med glaspropp (syratvättat) (4.22). Låt kloroformen
avdunsta i en ström av inert gas (3.11) och lös åter upp i 10 ml
vatten/aceton (3.5.3).
3.15 Reagens till kontrolltest (6).
3.15.1 Mättad natriumkloridlösning.3.15.2 Vattenfritt granulerat natriumsulfat.
4. Utrustning
Varning! Om de glaskärl som används till vattenhaltiga aflato-
xinlösningar inte är syratvättade kan detta leda till förluster. Nya
glaskärl och glaskärl för engångsbruk bör hanteras särskilt försik-
tigt, t. ex småflaskor för provväxlare och Pasteurpipetter.
Laboratorieglas som kommer i kontakt med vattenhaltiga aflato-
xinlösningar bör därför läggas i blöt i utspädd syra (t. ex.
svavelsyra = 2 mol/l) under flera timmar och därefter sköljas väl
med destillerat vatten för att få bort all syra (t. ex. tre gånger,
kontrollera med lackmuspapper). I praktiken krävs sådan behand-
ling för den rundbottnade kolven (4.4), mätkolvar, mätglas, flaskor
eller provrör som används till kalibreringslösningar och slutliga
extrakt (särskilt småflaskor för provväxlare) och Pasteurpipetter,
om sådana används för att överföra kalibreringslösningar eller
extrakt.
4.1. Kvarn.
4.2. Såll med maskstorlek 1,0 mm, (ISO R 565).
4.3. Mekanisk skak.
4.4. Roterande vakuumtork, med rundbottnad kolv, 150-250 ml.4.5. Utrustning för HPLC vätskekromatografi, injektor med en loop
lämpad för insprutning av 250 µl. Se tillverkarens instruktioner för
hur loopen skall fyllas, helt eller delvis.
4.6. HPLC-analyskolonn packad med C
18-partiklar på 3 µm eller 5 µm.
4.7. Pulsfri pump för tillförsel av jodreagens efter kromatografering på
kolonn.
4.8. Valco's dödvolymskoppling (T-modell), rostfritt stål (1/16 ″
× 0,75 mm).
4.9. Spiralformad reaktionsslinga i teflon eller rostfritt stål. Dimensioner
på 3 000 × 0,5 mm till 5 000 × 0,5 mm har visat sig passa till 5 µm
eller 3 µm HPLC-kolonner.
4.10. Vattenbad med termostatkontroll, inställt på 60 ºC. Temperaturvari-
ationen skall kunna hållas under 0,1 ºC.
4.11. Fluorescensdetektor, med 365 nm exciteringsvåglängd och 435 nm
emissionsvåglängd. (För filterinstrument: emissionsvåglängd
> 400 nm). Det skall vara möjligt att påvisa minst 0,05 ng aflatoxin
B1. Det kan vara lämpligt att använda ett visst mottryck (t. ex.1976L0372 — SV — 10.11.1992 — 002.001 — 9
▼M2
tryckrestriktor, dvs. en spiral av teflon eller rostfritt stål förbunden
med detektorns utgång), för att få bort luftbubblor i flödescellen.
4.12. Skrivare.
4.13. Elektronisk integrator (valfritt).
4.14. Veckat pappersfilter, 24 cm i diameter, Macherey-Nagel 617¼ eller
motsvarande.
4.15. Membranfilter med en porositet på 0,45 µm, Millipore HAWP
04700 eller motsvarande.
4.16. 500 ml konisk kolv, med glaspropp.4.17. Glaskolonn (inre diameter ca 1 cm, längd ca 30 cm), utrustad med
Lueranpassad spets.
4.18. Kloroformresistent Lueranpassad kran (t. ex. Bio-rad 7328017,
Analytichem A1 6078, J. T. Baker 4514 eller motsvarande).
4.19. Kemiskt resistent spruta, 10 ml, med Luerfattning.
4.20. Spruta för HPLC-insprutning av 250 µl (se 4.5).
4.21. 100 µl mikrospruta för beredning av kalibreringslösningar.
(Kontrollera genom vägning att noggrannheten ligger inom 2 %.)
4.22. 10 ml graderade mätkolvar med glaspropp.
4.23. Spektrofotometer för mätning inom spektrats UV-område.
4.24. Utrustning för kontrolltest (6).4.24.1. Syratvättad 100 ml separertratt med teflonkran.
4.24.2. Värmeenhet, 40-50 ºC.
5. Utförande
5.1. Provberedning
Mal provet så att det går igenom sållet (4.2.).
5.2. Analysprov
Väg upp 50 g av det preparerade provet i den koniska kolven
(4.16).
5.3. Extraktion
Tillsätt 25 g Celite (3.8), 250 ml kloroform (3.1) och 25 ml vatten
till analysprovet (5.2). Tillslut kolven och skaka under 30 min på
en mekanisk skak (4.3). Filtrera genom ett veckat filter (4.14).
Samla upp 50 ml av filtratet. Tag vid behov ett delprov av filtratet
och späd med kloroform till 50 ml så att koncentrationen av afla-
toxin B
1inte överstiger 4 ng/ml.
5.4. Rening (Reningen bör utföras utan betydande avbrott).
Varning!
— Laboratoriet där analyserna utförs skall omsorgsfullt skyddas
mot dagsljus. Detta kan ske med hjälp av:
1) UV-absorberade beläggning på fönsterrutorna och dämpat
ljus (ej direkt solljus).
2) Gardiner eller persienner och artificiellt ljus (lysrör kan
accepteras).
— Lösningar som innehåller aflatoxin skall i möjligaste mån
skyddas mot ljus (förvara mörkt, använd aluminiumfolie).
5.4.1. Rening på Florisil SEP-PAK
5.4.1.1. Preparering av kolonnuppställningen
Montera en kran (4.18) på den korta delen av Florisil-kolonnen
(3.9) (se bild 1). Tvätta kolonnen och avlägsna luften genom att ta
10 ml kloroform (3.1) och låta 8 ml gå genom kranen och snabbt
passera kolonnen med hjälp av en spruta (4.19). Anslut Florisil-
kolonnens långa del till en glaskolonn (4.17) och låt resterande
2 ml kloroform passera genom kolonnen till glaskolonnen. Stäng
kranen. Ta bort sprutan.
5.4.1.2. Rening1976L0372 — SV — 10.11.1992 — 002.001 — 10
▼M2
Filtratet som samlats upp i 5.3 placeras på kolonnuppställningen
och får rinna ut med hjälp av tyngdkraften. Skölj med 5 ml kloro-
form (3.1) och därefter med 20 ml metanol (3.2). Kassera
elueringsvätskorna. Se till att kolonnuppställningen inte blir torr
under processen. Eluera aflatoxin B1med 40 ml aceton/vatten
(3.5.1) och samla upp allt eluat i den rundbottnade kolven på den
roterande torken (4.4). Koncentrera eluatet på den roterande torken
vid 40-50 ºC tills destillationen av aceton avstannat. ( OBS:Ca
0,5 ml vätska finns då kvar i kolven. Försök har visat att ytterligare
avdunstning inte är skadlig och att det inte finns kvar någon signi-
fikant mängd aceton när 0,5 ml vätska återstår. Rester av aceton
kan leda till förluster av aflatoxin B1på C18-kolonnen). Tillsätt
1 ml metanol (3.2), snurra kolven så att aflatoxin B1löses upp på
kolvens sidor, tillsätt 4 ml vatten och blanda. Tag bort Florisil-
kolonnen och kassera den. Skölj glaskolonnen med vatten och spara
den för C18-reningen.
5.4.2. Rening på C18SEP-PAK
5.4.2.1. Preparering av kolonnuppställningen
Montera en kran (4.18) på den korta delen av C18-kolonnen (3.10)
(se bild 1). Preparera kolonnen och avlägsna eventuell luft genom
att med hjälp av en spruta (4.19) låta 10 ml metanol (3.2) gå
genom kranen och snabbt passera kolven. (Luftbubblor i kolonnen
syns som ljusa fläckar mot en i övrigt gråaktig bakgrund). Ta 10 ml
vatten och låt 8 ml passera genom kolonnen. (Undvik att få in luft i
kolonnen vid bytet från metanol till vatten). Anslut C18-kolonnens
långa del till en glaskolonn (4.17) och låt resterande 2 ml vatten
passera genom C18-kolonnen till glaskolonnen. Stäng kranen. Ta
bort sprutan.
5.4.2.2. Rening
Överför extraktet som samlats upp i 5.4.1.2 till glaskolonnen (4.17),
skölj kolven två gånger med 5 ml vatten/metanol (3.5.2) och låt
rinna ut med hjälp av tyngdkraften. Se till att kolonnuppställningen
inte blir torr under processen. (Om det bildas luftbubblor i den
smala delen nära C18-kolonnen — stoppa flödet och slå lätt på
övre delen av glaskolonnen så att luftbubblorna försvinner. Fortsätt
sedan.) Eluera med 25 ml vatten/metanol. Kassera eluatet. Eluera
aflatoxin B1med 50 ml vatten/aceton (3.5.3) och samla upp allt
eluat i en 50 ml mätkolv. Fyll med vatten till märket och blanda.
Den provlösning som då erhålls används för kromatografi (5.5).
Varning! Filtrering av det slutliga extraktet före HPLC är normalt
inte nödvändig. Om filtrering anses nödvändig får cellu-
losafilter inte användas eftersom de kan medföra förluster
av aflatoxin B1. Teflonfilter kan accepteras.
5.5. HPLC,vätskekromatografi
(Se bild 2 för montering av utrustningen). Anslå tillräcklig tid för
konditionering och stabilisering av instrumenten.
Anmärkning 1:
De flöden som anges för den rörliga fasen och för reagens efter
kromatografering på kolonn är enbart vägledande. De kan behöva
anpassas beroende på HPLC-kolonnens särskilda egenskaper.
Anmärkning 2:
Detektorvärdena för aflatoxin B1är beroende av temperaturen och
bör därför korrigeras för avvikelser (se bild 3). Genom att spruta
in en bestämd mängd aflatoxin B1-referenslösning (3.13.3) med
jämna mellanrum (dvs. var tredje insprutning), kan toppvärdena
för aflatoxin B1mellan referenslösningarna korrigeras genom
användning av medelvärdet, förutsatt att skillnaden mellan värdena
från de på varandra följande referenslösningarna är mycket liten
(< 10 %). Insprutningarna skall därför göras fortlöpande. Om det
är nödvändigt att göra avbrott skall den sista insprutningen före
avbrottet och den första insprutningen efter avbrottet bestå av refe-
renslösningen (3.13.3). Eftersom kalibreringskurvan är lineär och
går genom origo bestäms mängderna aflatoxin B1direkt med
hänvisning till de närgränsande referenslösningarna.
5.5.1. Inställning av HPLC-pump
Ställ in HPLC-pumpen (4.5) så att flödet blir 0,5 eller 0,3 ml/min
för en 5µm eller en 3 µm HPLC-kolonn (4.6) vid användning av
den rörliga fasen (3.6).1976L0372 — SV — 10.11.1992 — 002.001 — 11
▼M2
5.5.2. Inställning av derivatiseringspump
Ställ in pumpen (4.7) på ett flöde av 0,2-0,4 ml/min av den jodmät-
tade vattenlösningen (3.7). Som riktmärke kan anges: Flöden på ca
0,4 eller 0,2 ml/min kan rekommenderas tillsammans med 0,5 och
0,3 ml/min flöde av den rörliga fasen (3.6).
5.5.3. Fluorescensdetektor
Ställ in fluorescensdetektorn (4.11) på excitationsvåglängd = 365 nm
och emissionsvåglängd = 435 nm (filterinstrument: > 400 nm).
Justera detektorkänsligheten så att 1 ng aflatoxin B1ger ca 80 %
av fullt utslag på skrivaren.
5.5.4. Injektor
Alla lösningar sprutas in i mängder på 250 µl och enligt tillverka-
rens anvisningar.
5.5.5. Kontroll av den kromatografiska separationen
Spruta in den kromatografiska testlösningen (3.14.1). Lägsta höjden
mellan två toppar skall vara lägre än 5 % av summan för de
angränsande topparnas höjder.
5.5.6. Kontroll av systemets stabilitet
Spruta in referenslösning (3.13.3) före varje analysserie tills stabila
toppytor ernås ( OBS:Toppvärdena för aflatoxin B1mellan på
varandra följande insprutningar får inte variera med mer än 6 %).
Fortsätt omedelbart med kontroll av lineariteten (5.5.7).
5.5.7. Kontroll av lineariteten
Spruta in aflatoxin B1, kalibreringslösningar (3.13.1-3.13.4).
Använd referenslösningen (3.13.3) vid var tredje insprutning för
korrigering av avvikelser i värdena. ( OBS!Toppvärdena för refe-
renslösningen får inte avvika med mer än 10 % under 90
minuter). Korrigera för avvikelse enligt formeln i 7. Kalibrering-
skurvan bör vara en rät linje genom origo (avvikelser från O i
intercept får inte överstiga ± 1 standardavvikelse i Y). De erhållna
värdena får inte avvika med mer än 3 % från de nominella värdena.
Om dessa krav är uppfyllda, fortsätt omedelbart. I motsatt fall skall
felkällorna dessförinnan identifieras och korrigeras.
5.5.8. Insprutning av provextrakt
Spruta in de renade provextrakten (5.4.2.2). Referenslösning
(3.13.3) skall alltid sprutas in efter två insprutningar av provextrakt,
enligt följande: referenslösning, extrakt, extrakt, referenslösning,
extrakt, extrakt, referenslösning osv.
6. Kontrolltest
6.1. Behandling av extraktet (5.4.2.2)
Tillsätt 5 ml natriumkloridlösning (3.15.1) till det slutliga extrakt
som erhållits i 5.4.2.2. Extrahera tre gånger med 2 ml kloroform
(3.1) under en minut i separertratt (4.24.1).
Häll de uppsamlade kloroformextrakten över ca 1 g natriumsulfat
(3.15.2) i ett 10 ml provrör. En liten tratt (4 cm i diameter) kan
användas med en bomullspropp i den avsmalnande delen, täckt
med ca 1 g natriumsulfat (3.15.2).
Tvätta natriumsulfatskiktet med några ml kloroform som samlas
upp i samma provrör. Låt kloroformextraktet avdunsta till torrhet i
samma provrör med hjälp av värmeenheten (4.24.2) och lös
därefter upp det på nytt i 1 ml kloroform.
6.2. Förberedelser för derivatisering och tunnskiktskromatografi:
Se bilagan till rådets direktiv 76/372/EEG metod A, punkt 5.6.2.
7. Resultatberäkning
Beräkna innehållet av aflatoxin B1(µg/kg) i provet med hjälp av
formeln:
Inneh˚all av aflatoxin B 1i èmg =kg¼m/C2Vext
Vm/C2M/C2Vf
Vc1976L0372 — SV — 10.11.1992 — 002.001 — 12
▼M2
där:
m = mängden aflatoxin B1i ng återgiven som B1-toppvärde,
beräknat på följande sätt:
m¼P provðÞ
Ps t1ðÞ þPs t2ðÞ/C22r stðÞ
P(prov) = aflatoxin B1, toppyta i provet
P(st1) = aflatoxin B1, toppyta från föregående insprutning av
referenslösning (3.13.3)
P(st2) = aflatoxin B1, toppyta från efterföljande insprutning av
referenslösning (3.13.3)
r(st) = insprutad mängd av aflatoxin B1i referenslösningen
(3.13.3), i ng
Vm= volym insprutat provextrakt, i ml
Vext= slutlig volym provextrakt, i ml, med hänsyn tagen till
eventuell utspädning (5.3)
M = provets massa i g
Vf= volym filtrat som överförts till Florisil-kolonn
(5.4.1.2), i ml
Vc= volym kloroform som använts för extraktion av provet,
im l
Om ovan beskrivna tillvägagångssätt används kan formeln förkortas
till:
aflatoxin B1, innehåll i µg/kg = 20 × m.
7.1 Resultaten kan också beräknas genom mätning av toppvärdena.
8. Repeterbarhet
Se 10.1.
9. Reproducerbarhet
Se 10.1.
10. Anmärkningar
10.1 Precision
En jämförande studie(1) som genomförts på internationell nivå på
blandade foder gav de resultat för repeterbarhet och reproducer-
barhet som anges i tabell 1. Termen repeterbarhet (r), så som den
används här, definieras som det största förhållande mellan två
avläsningar av samma prov i samma laboratorium under likartade
förhållanden, som inte är signifikant vid en sannolikhetsnivå på
95 %. Termen reproducerbarhet (R) definieras på motsvarande sätt
vid jämförelse av två olika laboratorier. I enlighet med ISO 3534-
1977, 2.35(2) och kommissionens beslut 89/610/EEG(3), anges r
och R i tabell 1 också som variationskoefficienter.
Tabell 1
Repeterbarhet (r) och reproducerbarhet (R) uttryckta som
förhållanden och motsvarande variationskoefficienter
(15 laboratorier)
Nivå r R CVr(*) CVR(*)
(µg/kg) (%) (%)
8 & 14 1,4 1,7 11 181976L0372 — SV — 10.11.1992 — 002.001 — 13
(1) Egmond, H. P. van, Heisterkamp, S. H. and Paulsch, W. E. (1991). Food Additives and
Contaminants 8, 17-29.
(2) ISO 3534-1977.
(3) EGT nr L 351, 2.12.1989, s. 39.
▼M2
(*) CV = variationskoefficient
10.2 Stabilisering av kloroform (3.1)
Florisil-kolonnens absorptionsförmåga får ändras om andra stabili-
satorer än etanol används. Detta bör kontrolleras enligt 10.3 om
den typ av kloroform som beskrivs inte går att anskaffa.
10.3 Noggrannhet
Att metoden tillämpas korrekt skall kontrolleras genom upprepade
mätningar på certifierat referensmaterial. Om sådant inte kan
anskaffas skall metodens effektivitet prövas genom utbytesförsök
på spikade blankprov. Medelvärdet får inte avvika från det verkliga
värdet med mer än −20 till + 10 %.
Bild 1: Kolonnuppställning1976L0372 — SV — 10.11.1992 — 002.001 — 14
▼M2
Bild 2: Flödesdiagram för LC-systemet med post-kolonn derivati-
sering med jod
Bild 3: kompensation för avvikelse i värde för aflatoxin B1 genom
insprutning av referenslösning (3.13.3) med jämna mellanrum.
C. ANMÄRKNINGAR BETRÄFFANDE METODERNA A OCH B
1.Avfettning
Prover som innehåller mer än 5 % fetter måste avfettas med petroleumeter
(kokpunkt: 40-60 ºC) efter den beredning som beskrivs i 5.1.
I sådana fall måste analysresultaten uttryckas i det ej avfettade provets vikt.
2.Reproducerbarhet för resultaten
Reproducerbarheten för resultaten, d.v.s. variationen mellan de resultat som
erhålls av två eller flera laboratorier för samma prov har uppskattats till:
50 % av medelvärdet för medelvärden av aflatoxin B1från 10 till och med
20 µg/kg,
10 µg/kg på medelvärdet för medelvärden från mer än 20 till och med 50 µg/
kg,
20 % av medelvärdet för medelvärden över 50 µg/kg.1976L0372 — SV — 10.11.1992 — 002.001 — 15
▼B
▼B
TILLÄGG TILL BILAGAN
Figur 1
Figur 21976L0372 — SV — 10.11.1992 — 002.001 — 16
▼B
Figur 31976L0372 — SV — 10.11.1992 — 002.001 — 17