1991R2568 — SV — 01.04.2011 — 023.001

Detta dokument är endast avsett som dokumentationshjälpmedel och institutionerna ansvarar inte för innehållet

Ändrad genom:







(*) Denna rättsakt finns inte publicerad på svenska.









▼B

KOMMISSIONENS FÖRORDNING (EEG) nr 2568/91

av den 11 juli 1991

om egenskaper hos olivolja och olivolja av pressrester och om lämpliga analysmetoder







EUROPEISKA GEMENSKAPERNAS KOMMISSION HAR ANTAGIT DENNA FÖRORDNING med beaktande av Fördraget om upprättandet av Europeiska ekonomiska gemenskapen, med beaktande av rådets förordning nr 136/66/EEG av den 22 september 1966 om den gemensamma organisationen av marknaden för oljor och fetter ( 1 ), senast ändrad genom förordning (EEG) nr 3577/90 ( 2 ), särskilt artikel 35a i denna, och med beaktande av följande: med beaktande av följande: Bilagan till förordning nr 136/66/EEG innehåller beskrivningar och definitioner av olivolja och olivolja av pressrester som saluförs inom varje medlemsstat, inom gemenskapen och i handeln med tredje länder. För att kunna skilja mellan de olika typerna av olja bör de fysiska och kemiska egenskaperna hos var och en av dem och de organoleptiska egenskaperna hos jungfruolja definieras så att renheten och kvaliteten för de berörda varorna kan säkerställas med beaktande av andra befintliga bestämmelser. Egenskaperna hos de olika typerna av olja bör bestämmas enhetligt inom hela gemenskapen. För detta ändamål bör gemenskapsmetoder för kemisk analys och organoleptisk värdering upprättas. Under en övergångsperiod bör användningen av andra analysmetoder som tillämpas i medlemsstaterna tillåtas, under förutsättning att de resultat som erhålls med gemenskapsmetoden skall vara avgörande vid en skillnad i resultaten. Definitionen av de fysiska och kemiska egenskaperna hos olivolja och av analysmetoderna medför ändringar av tilläggsanmärkningarna i kapitel 15 i Kombinerade nomenklaturen. Metoden för utvärdering av de organoleptiska egenskaperna hos jungfruolja innefattar upprättandet av paneler med utvalda och utbildade provsmakare. Den tid som krävs för att upprätta en sådan struktur bör därför fastställas. Med hänsyn till de svårigheter som några medlemsstater kommer att möta när det gäller att upprätta paneler med provsmakare, bör användning av paneler i andra medlemsstater tillåtas. För att säkerställa att det system med avgifter som tillämpas på import av olivpressrester fungerar på avsett sätt bör en gemensam metod för bestämning av oljehalten i dessa varor fastställas. För att inte skapa handelshinder bör åtgärder vidtas för att olja som är förpackad innan denna förordning träder i kraft skall kunna avyttras under en begränsad tid. Det är nödvändigt att upphäva kommissionens förordning (EEG) nr 1058/77 ( 3 ), senast ändrad genom förordning (EEG) nr 1858/88 ( 4 ). Förvaltningskommittén för oljor och fetter har inte yttrat sig inom den tid som dess ordförande har bestämt. HÄRIGENOM FÖRESKRIVS FÖLJANDE







▼M20

Artikel 1

1. Oljor vars egenskaper överensstämmer med dem som anges i punkterna 1 och 2 i bilaga I till denna förordning skall anses vara jungfruolja i den mening som avses i punkt 1 a och 1 b i bilagan till förordning nr 136/66/EEG.

2. Olja vars egenskaper överensstämmer med dem som anges i punkt 3 i bilaga I till denna förordning skall anses vara bomolja i den mening som avses i punkt 1 c i bilagan till förordning nr 136/66/EEG.

3. Olja vars egenskaper överensstämmer med dem som anges i punkt 4 i bilaga I till denna förordning skall anses vara raffinerad olivolja i den mening som avses i punkt 2 i bilagan till förordning nr 136/66/EEG.

4. Olja vars egenskaper överensstämmer med dem som anges i punkt 5 i bilaga I till denna förordning skall anses vara olivolja sammansatt av raffinerad olivolja och jungfruolja i den mening som avses i punkt 3 i bilagan till förordning nr 136/66/EEG.

5. Olja vars egenskaper överensstämmer med dem som anges i punkt 6 i bilaga I till denna förordning skall anses vara oraffinerad olja av olivrestprodukter i den mening som avses i punkt 4 i bilagan till förordning nr 136/66/EEG.

6. Olja vars egenskaper överensstämmer med dem som anges i punkt 7 i bilaga I till denna förordning skall anses vara raffinerad olja av olivrestprodukter i den mening som avses i punkt 5 i bilagan till förordning nr 136/66/EEG.

7. Olja vars egenskaper överensstämmer med dem som anges i punkt 8 i bilaga I till denna förordning skall anses vara olivolja av olivrestprodukter i den mening som avses i punkt 6 i bilagan till förordning nr 136/66/EEG.

▼B

Artikel 2

1. Egenskaperna hos de oljor som fastställts i bilaga 1 skall bestämmas i enlighet med de analysmetoder som anges nedan.

— För bestämning av de fria fettsyrorna uttryckta som procent oljesyra, den metod som anges i bilaga 2.

— För bestämning av peroxidindex, den metod som anges i bilaga 3.

▼M19

— För bestämning av vaxinnehållet, den metod som anges i bilaga 4.

▼B

— För bestämning av sterolhalten, den metod som anges i bilaga 5.

— För bestämning av erytrodiol och uvaol, den metod som anges i bilaga 6.

▼M21

— För bestämning av andelen 2-glycerylmonopalmitat, den metod som anges i bilaga VII.

▼M20 —————

▼B

— För spektrofotometri, den metod som anges i bilaga 9.

— För bestämning av fettsyresammansättningen, den metod som anges i bilaga 10 A och 10 B.

— För bestämning av de flyktiga, halogenerade lösningsmedlen, den metod som anges i bilaga 11.

— För utvärdering av de organoleptiska egenskaperna för jungfruolja, den metod som anges i bilaga 12, tillämpad enligt punkt 2.

▼M20 —————

▼M11

— För bestämning av stigmastadiener, den metod som anges i bilaga XVII.

▼M13

— För bestämning av sammansättningen av triglycerider i ECN42, den metod som anges i bilaga XVIII.

▼M19

— För bestämning av alifatisk alkohol, den metod som anges i bilaga 19.

▼M23

— För bestämning av halterna av vaxer, fettsyreetylestrar och fettsyremetylestrar med kapillärgaskromatografi, den metod som anges i bilaga XX.

▼M19

2. Den granskning eller de kontrollundersökningar som nationella myndigheter eller representanter för dessa utför av de organoleptiska egenskaperna hos jungfruolja skall genomföras av paneler som godkänts av medlemsstaterna.

De organoleptiska egenskaperna hos en olivolja skall anses överensstämma med den angivna kategorin, om en panel som godkänts av den berörda medlemsstaten bekräftar denna klassificering.

Om den godkända panelen beträffande de organoleptiska egenskaperna inte bekräftar den kategori som angivits för olivoljan, skall de nationella myndigheterna eller deras företrädare, på begäran från den berörda parten, låta andra godkända paneler göra två kontrollundersökningar, varav minst en skall utföras av en panel som godkänts av den berörda producentmedlemsstaten. Egenskaperna skall anses överensstämma med de angivna, om bägge kontrollundersökningarna bekräftar den angivna klassificeringen. I annat fall skall olivoljedeklaranten stå för kostnader för kontrollundersökningar, utan att det påverkar tillämpningen av sanktioner.

▼M17

3. När det gäller de nationella myndigheternas eller deras representanters granskningar av att oljorna har de egenskaper som föreskrivs i punkt 1, skall proven samlas in i enlighet med de internationella standarderna EN ISO 661 och EN ISO 5555 för förberedelse av prover inför testerna och för provtagning. Utan hinder av vad som sägs i punkt 6.8 i standard EN ISO 5555 skall emellertid proverna från partier av nämnda oljor i detaljhandelsförpackningar som rymmer 100 liter eller mindre, samlas in i enlighet med bilaga Ia till denna förordning.

▼M19

Utan att det påverkar tillämpningen av standarden EN ISO 5555 och kapitel 6 i standarden EN ISO 661, skall proven skyndsamt skyddas mot ljus och höga temperaturer och skickas till laboratorieanalys senast

— tio arbetsdagar efter provtagning under perioden oktober–maj, och

— fem arbetsdagar efter provtagning under perioden juni–september.

▼M17

4. ►M20 För utförandet av den kontroll som föreskrivs i punkt 3, skall de analyser som avses i bilagorna II, III, IX, X och XII samt de eventuella kontrollanalyser som föreskrivs i de nationella lagstiftningarna, utföras före bästföredatum. Om provtagningen sker mer än fyra månader före bästföredatum, skall nämnda analyser genomföras inom fyra månader efter den dag då provtagningen gjordes. Ingen tidsfrist skall tillämpas för de övriga analyser som föreskrivs i ovannämnda förordning. ◄

Om resultatet vid analyserna inte stämmer överens med egenskaperna för den klass olivolja eller olivolja av pressrester som uppgetts, utom om provtagningen gjorts mindre än en månad före minsta hållbarhetsdatum, skall de berörda underrättas om detta minst en månad före utgången av den tidsfrist som avses i första stycket.

▼M19

5. För olivoljeegenskaper som fastställs med metoderna i punkt 1, skall analysresultaten direkt jämföras med de gränser som föreskrivs i den här förordningen.

▼M20

Artikel 2a

Den kontroll som nationella myndigheter eller deras representanter utför av att prover av olivolja och olja av olivrestprodukter motsvarar den deklarerade kategorin får ske antingen

a) genom att de analyser som föreskrivs i bilaga I genomförs oavsett ordning, eller

b) genom att man följer den ordning som anges i beslutsschemat i bilaga Ib till dess att man når fram till ett av de beslut som anges i beslutsschemat.

▼M19 —————

▼M5

Artikel ►M19 3 ◄

Om det fastställs att de organoleptiska egenskaperna hos en olja inte överensstämmer med beskrivningen, skall den berörda medlemsstaten, utan att det påverkar övriga påföljder, tillämpa administrativa ekonomiska sanktioner som skall bestämmas mot bakgrund av hur allvarlig den upptäckta överträdelsen är.

Vid bedömningen av överträdelsen skall särskild vikt läggas vid naturliga förändringar av oljans egenskaper vid förvaring under normala förhållanden.

I början av varje halvår skall medlemsstaterna underrätta kommissionen om antal och typ av överträdelser som har upptäckts samt om de påföljder som har tillämpats under det gångna halvåret.

▼M5

Artikel 4

▼M19

1. Medlemsstaterna kan godkänna provsmakningspaneler för de nationella myndigheternas eller deras företrädares bedömning och kontroll av de organoleptiska egenskaperna.

Villkoren för godkännande skall fastställas av medlemsstaterna, på ett sådant sätt att

— de motsvarar villkoren i bilaga 12.4,

— det säkerställs att panelens ordförande har utbildats vid en inrättning, och under förhållanden, som godkänts av medlemsstaten,

— godkännandets giltighet är avhängig av de resultat som erhålls genom ett system för årliga kontroller som medlemsstaten upprättat.

Varje medlemsstat skall delge kommissionen en förteckning över de godkända panelerna samt meddela vilka åtgärder som vidtagits i enlighet med denna punkt.

▼M5

2. Om medlemsstaterna har svårigheter att upprätta smakpaneler inom sitt territorium, får de anlita en smakpanel som är godkänd i en annan medlemsstat.

3. Varje medlemsstat skall upprätta en förteckning över smakpaneler som har upprättats av yrkes- eller branschorganisationer enligt de villkor som fastställs i punkt 1 och skall säkerställa att dessa villkor uppfylls.

▼M19 —————

▼B

Artikel 6

1. Oljehalten i oljekakor och andra rester som erhållits vid extraktion av olivolja (KN-nr 2306 90 11 och 2306 90 19) skall bestämmas med användning av den metod som anges i bilaga 15.

2. Den oljehalt som anges i punkt 1 skall uttryckas som viktprocent olja i förhållande till torrsubstans.

▼M20

Artikel 7

Gemenskapens bestämmelser om förekomst av föroreningar skall tillämpas.

Beträffande halten av halogenerade lösningsmedel gäller följande gränsvärden för samtliga kategorier av olivolja:

— Högsta tillåtna halt av varje påvisat halogenerat lösningsmedel: 0,1 mg/kg

— Högsta tillåtna total halt av påvisade halogenerade lösningsmedel: 0,2 mg/kg.

▼B

Artikel 8

1. Medlemsstaterna skall meddela kommissionen vilka åtgärder de har vidtagit för att genomföra denna förordning.

2. Medlemsstaterna skall till kommissionen i början av varje halvår överlämna en redogörelse av de analysdata som hänför sig till prover som genomförts under det gångna halvåret.

Resultaten skall prövas av Förvaltningskommittén för oljor och fetter i enlighet med förfarandet i artikel 39 i förordning nr 136/66/EEG.

Artikel 9

Förordning (EEG) nr 1058/77 skall upphöra att gälla.

Artikel 10

1. Denna förordning träder i kraft den tredje dagen efter det att den har offentliggjorts i Europeiska gemenskapernas officiella tidning. Den metod som anges i bilaga 12 skall emellertid tillämpas från ►M1 den 1 november 1992 ◄ , utom då det gäller åtgärder i samband med interventionssystemet.

▼M5

Den metoden skall inte tillämpas för jungfruolja som iordningställs för marknaden före den 1 november 1992

▼B

2. Denna förordning skall inte tillämpas på olivolja och olivolja av pressrester som är förpackad före denna förordnings ikraftträdande och saluförs fram till och med den 31 oktober 1992.

Denna förordning är till alla delar bindande och direkt tillämplig i alla medlemsstater.









BILAGOR

Sammanfattning







Bilaga I Egenskaper hos olivolja Bilaga Ia Provtagning på partier av olivolja och olivolja av pressrester i detaljhandelsförpackningar om högst 100 liter Bilaga Ib Beslutsschema Bilaga II ►M21 Bestämning av fria fettsyror, metod vid låg temperatur ◄ Bilaga III Bestämning av peroxidvärdet Bilaga IV ►M6 Bestämning av vaxinnehåll genom gaskromatografi med kapillärkolonn ◄ Bilaga V Bestämning av sammansättningen och halten av steroler genom gaskromatografi med kapillärkolonn Bilaga VI Bestämning av erytrodiol och uvaol Bilaga VII ►M21 Bestämning av procentandelen 2-glycerylmonopalmitat ◄ ▼M20 ————— ▼B ▼M20 ————— ▼M19 ————— ▼B ▼M23 Bilaga XX: Metod för bestämning av halter av vaxer, fettsyreetylestrar och fettsyremetylestrar med kapillärgaskromatografi

▼M23









BILAGA I

EGENSKAPER HOS OLIVOLJA







Kategori Fettsyremetylestrar (FAME) och fettsyreetylestrar (FAEE) Syrahalt (%) (*) Peroxidvärde mEq O2/kg (*) Vaxer mg/kg (**) 2-glycerilmonopalmitat (%) Stigmastadiene mg/kg (1) Skillnad mellan ECN42 (HPLC) och ECN42 (teoretisk beräkning) K232 (*) K270 (*) Delta-K (*) Organoleptisk bedömning Defekternas medianvärde (Md) (*) Organoleptisk bedömning Medianvärde för fruktighet (Mf) (*) 1. Extra jungfruolja Σ FAME + FAEE ≤ 75 mg/kg eller 75 mg/kg <Σ FAME + FAEE ≤ 150 mg/kg och (FAEE/FAME) ≤ 1,5 ≤ 0,8 ≤ 20 ≤ 250 ≤ 0,9 om total palmitinsyra ≤ 14 % ≤ 0,10 ≤ 0,2 ≤ 2,50 ≤ 0,22 ≤ 0,01 Md = 0 Mf > 0 ≤ 1,0 om total palmitinsyra > 14 % 2. Jungfruolja — ≤ 2,0 ≤ 20 ≤ 250 ≤ 0,9 om total palmitinsyra ≤ 14 % ≤ 0,10 ≤ 0,2 ≤ 2,60 ≤ 0,25 ≤ 0,01 Md ≤ 3,5 Mf > 0 ≤ 1,0 om total palmitinsyra > 14 % 3. Bomolja — > 2,0 — ≤ 300 (3) ≤ 0,9 om total palmitinsyra ≤ 14 % ≤ 0,50 ≤ 0,3 — — — Md > 3,5 (2) — ≤ 1,1 om total palmitinsyra > 14 % 4. Raffinerad olivolja — ≤ 0,3 ≤ 5 ≤ 350 ≤ 0,9 om total palmitinsyra ≤ 14 % — ≤ 0,3 — ≤ 1,10 ≤ 0,16 — — ≤ 1,1 om total palmitinsyra > 14 % 5. Olivolja – sammansatt av raffinerad olivolja och jungfruolja 5 — ≤ 1,0 ≤ 15 ≤ 350 ≤ 0,9 om total palmitinsyra ≤ 14 % — ≤ 0,3 — ≤ 0,90 ≤ 0,15 — — ≤ 1,0 om total palmitinsyra > 14 % 6. Oraffinerad olja av olivrestprodukter — — — > 350 (4) ≤ 1,4 — ≤ 0,6 — — — — — 7. Raffinerad olivolja av olivrestprodukter — ≤ 0,3 ≤ 5 > 350 ≤ 1,4 — ≤ 0,5 — ≤ 2,00 ≤ 0,20 — — 8. Olivolja av olivrestprodukter — ≤ 1,0 ≤ 15 > 350 ≤ 1,2 — ≤ 0,5 — ≤ 1,70 ≤ 0,18 — —







Kategori Syrahalt (1) Summa transoleinisomerer (%) Summa transoljetranslinol + transoljelinolenisomerer (%) Sterolsammansättning Summa steroler (mg/kg) Erytrodiol och uvaol (%) (**) Myrsyra (%) Linolensyra (%) Arakidsyra (%) Eikosansyra (%) Behensyra (%) Lignocerinsyra (%) Kolesterol (%) Brassicasterol (%) Kampesterol (%) Stigmasterol (%) Betasitosterol (%) (2) Delta-7-stigmastenol (%) 1. Extra jungfruolja ≤ 0,05 ≤ 1,0 ≤ 0,6 ≤ 0,4 ≤ 0,2 ≤ 0,2 ≤ 0,05 ≤ 0,05 ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < Camp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 2. Jungfruolja ≤ 0,05 ≤ 1,0 ≤ 0,6 ≤ 0,4 ≤ 0,2 ≤ 0,2 ≤ 0,05 ≤ 0,05 ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < Camp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 3. Bomolja ≤ 0,05 ≤ 1,0 ≤ 0,6 ≤ 0,4 ≤ 0,2 ≤ 0,2 ≤ 0,10 ≤ 0,10 ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 — ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 (3) 4. Raffinerad olivolja ≤ 0,05 ≤ 1,0 ≤ 0,6 ≤ 0,4 ≤ 0,2 ≤ 0,2 ≤ 0,20 ≤ 0,30 ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < Camp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 5. Olivolja – sammansatt av raffinerade och jungfruoljor ≤ 0,05 ≤ 1,0 ≤ 0,6 ≤ 0,4 ≤ 0,2 ≤ 0,2 ≤ 0,20 ≤ 0,30 ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < Camp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 6. Oraffinerad olja av olivrestprodukter ≤ 0,05 ≤ 1,0 ≤ 0,6 ≤ 0,4 ≤ 0,3 ≤ 0,2 ≤ 0,20 ≤ 0,10 ≤ 0,5 ≤ 0,2 ≤ 4,0 — ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 2 500 > 4,5 (4) 7. Raffinerad olivolja av olivrestprodukter ≤ 0,05 ≤ 1,0 ≤ 0,6 ≤ 0,4 ≤ 0,3 ≤ 0,2 ≤ 0,40 ≤ 0,35 ≤ 0,5 ≤ 0,2 ≤ 4,0 < Camp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 800 > 4,5 8. Olivolja av olivrestprodukter ≤ 0,05 ≤ 1,0 ≤ 0,6 ≤ 0,4 ≤ 0,3 ≤ 0,2 ≤ 0,40 ≤ 0,35 ≤ 0,5 ≤ 0,2 ≤ 4,0 < Camp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 600 > 4,5

▼M20









BILAGA Ia

Provtagning på olivolja och olivolja av pressrester som levereras i detaljhandelsförpackningar om högst 100 liter

Denna metod för provtagning skall tillämpas på leveranser av olivolja eller olivolja av pressrester om högst 125 000 liter i detaljhandelsförpackningar om högst 100 liter.

Om en leverans omfattar mer än 125 000 liter, skall det delas upp i partier om 125 000 liter eller mindre. Om en leverans omfattar mindre än 125 000 liter skall den utgöra ett parti. Metoden skall sedan tillämpas på varje parti.

Med hänsyn till partiets storlek skall det lägsta antalet delprover fastställas i enlighet med tabellen i punkt 1.

Delprovets omfattning skall bestämmas av hur mycket detaljhandelsförpackningarna rymmer, i enlighet med tabellen i punkt 2.1.

”Leverans”, ”elprov” och ”laboratorieprov” motsvarar definitionerna i standarden EN ISO 5555.

Med ”parti” avses ett antal försäljningsenheter som producerats, framställts och förpackats under sådana förhållanden att oljan i var och en av dessa enheter kan anses vara homogen med hänsyn till samtliga analysegenskaper.

1. ANTAL DELPROVER

Det lägsta antalet delprover skall fastställas med hänsyn till partiets storlek i enlighet med följande tabell:







Parti på mindre än (liter) Lägsta antal delprover 7 500 2 25 000 3 75 000 4 125 000 5

De detaljhandelsförpackningar som väljs ut för samma delprov skall stå intill varandra i partiet.

Vid tveksamheter får medlemsstaten öka det antal delprover som skall tas.

2. DELPROVETS INNEHÅLL

2.1 Ett delprov skall omfatta följande:







Om detaljhandelsförpackningarna rymmer skall delprovet omfatta olja från a) minst 5 liter a) tre detaljhandelsförpackningar b) minst 3 liter men mindre än 5 liter b) tre detaljhandelsförpackningar c) minst 2 liter men mindre än 3 liter c) tre detaljhandelsförpackningar d) minst 1 liter men mindre än 2 liter d) sex detaljhandelsförpackningar e) minst 0,75 liter men mindre än 1 liter e) sex detaljhandelsförpackningar f) mindre än 0,75 liter f) tre gånger olja från det lägsta antalet förpackningar som tillsammans rymmer mer än 1,5 liter

2.2 Delproven skall förvaras i detaljhandelsförpackningarna fram till dess att analysen sker. Oljan i delproverna delas därefter, i förekommande fall, upp i tre laboratorieprov för att genomföra

a) de analyser som avses i bilagorna II, III, IX och X,

b) den analys som avses i bilaga XII, samt

c) övriga analyser.

2.3 De förpackningar som utgör ett delprov skall delas upp i enlighet med de kontrollförfaranden som föreskrivs i nationell lagstiftning.

3. ANALYSER OCH RESULTAT

a) Varje delprov som avses i punkt 1 skall delas upp i laboratorieprover enligt punkt 2.5 i standarden EN ISO 5555 för att genomgå följande analyser: — Bestämning av fria fettsyror enligt artikel 2.1 första strecksatsen. — Bestämning av peroxidtal enligt artikel 2.1 andra strecksatsen. — Spektrofotometri enligt artikel 2.1 åttonde strecksatsen. — Bestämning av sammansättningen av fettsyror enligt artikel 2.1 nionde strecksatsen.

b) Om samtliga resultat från de analyser som anges under a visar, att minst ett av de delprov som tagits på samma parti inte överensstämmer med egenskaperna för den kategori olja som uppgetts, skall hela det parti som berörs förklaras ej överensstämmande med gällande krav. Om resultaten av de analyser som anges under a) och som genomförts för varje delprov som tagits på samma parti, inte alla är homogena med hänsyn tagen till metodernas repetitiva karaktär, skall hela partiet anses vara icke homogent och varje delprov skall genomgå de övriga analyser som krävs. I motsatt fall skall endast ett av delproven från partiet genomgå de föreskrivna analyserna.

c) Om något av de analysresultat som avses i b andra stycket, inte överensstämmer med egenskaperna för den kategori olja som uppgetts skall hela det parti som berörs förklaras ej överensstämmande med gällande krav. Om samtliga analysresultat som avses i led b andra stycket överensstämmer med egenskaperna för den kategori olja som uppgetts, skall hela partiet förklaras överensstämma med gällande krav.

▼M20









BILAGA Ib

BESLUTSSCHEMA FÖR KONTROLL AV ATT PROVER AV OLIVOLJA MOTSVARAR DEN DEKLARERADE KATEGORIN

Analysen som fastställer om en olivolja eller olja av pressrester motsvarar den deklarerade kategorin kan utföras, antingen

a) genom att de analyser som föreskrivs i bilaga I genomförs oavsett ordning, eller

b) genom att de analyser som anges i beslutsschemat genomförs i den ordning som anges i detta tills dess att man når fram till ett av de beslut som anges i nämnda beslutsschema.

De analyser av föroreningar och halogenerade lösningsmedel som krävs för att kontrollera att Europeiska gemenskapens normer uppfylls skall göras oberoende av varandra.

Beslutsschemat skall tillämpas för alla kategorier olivolja och olja av pressrester. Det består av numrerade tabeller från 1 till 11 som skall användas enligt anvisningarna och i den ordning som anges i översiktstabellen beroende på vilken kategori olja som deklarerats.

Översiktstabellen och tabellerna 1–11 skall läsas på följande sätt:

— Den dubbla linjen (=) visar det tillvägagångssätt som skall tillämpas när oljan motsvarar den deklarerade kategorin (positivt utslag) enligt villkoren i den föregående fält. Den prickade linjen (…) visar istället tillvägagångssättet när oljan inte motsvarar den deklarerade kategorin (negativt utslag).

— Rubrikerna i fälten i tabellerna 1–11 hänvisar till de analyser som föreskrivs i denna förordning i enlighet med den förteckning över samband mellan bilagorna till denna förordning och de analyser som avses i beslutsschemat och som anges i tillägg 1 till denna bilaga.

— Bokstäverna inom parentes i cirklarna för negativt utslag i tabellerna 1–11 hänvisar till informationen i tillägg 2 till denna bilaga. De innebär i sig inte något krav på att fortsätta analyserna eller att de antaganden som nämns är korrekta.

Översiktstabell

Tabell 1

Tabell 2

Tabell 3

Tabell 4

Tabell 5

Tabell 6

Tabell 7

Tabell 8

Tabell 9

Tabell 10

Tabell 11









Tillägg 1

Samband mellan bilagorna till denna förordning och de analyser som avses i beslutsschemat







▼M21 — Syrahalt: Bilaga II Bestämning av fria fettsyror, metod vid låg temperatur ▼M20 — Peroxidtal: Bilaga III Bestämning av peroxidtalet — UV-spektrofotometri: Bilaga IX Spektrofotometrisk undersökning — Organoleptisk bedömning: Bilaga XII Organoleptisk bedömning av jungfruolja — 3,5-stigmastadiener: Bilaga XVII Bestämning av stigmastadiener i vegetabiliska oljor — Transisomerer av fettsyror: Bilaga Xa och Analys av metylestrar av fettsyror med gaskromatografi bilaga Xb Preparering av metylestrar av fettsyror — Fettsyrasammansättning: Bilaga Xa och Analys av metylestrar av fettsyror med gaskromatografi bilaga Xb Preparering av metylestrar av fettsyror — ΔECN42: Bilaga XVIII Bestämning av sammansättningen av triglycerider i ECN42 (skillnad mellan faktisk sammansättning och teoretisk sammansättning) — Steroler — sammansättning och totalhalt: Bilaga V Bestämning av sammansättningen och halten av steroler genom gaskromatografi med kapillärkolonn — Erytrodiol och uvaol: Bilaga VI Bestämning av erytrodiol och uvaol — Vaxer: Bilaga IV Bestämning av vaxinnehåll genom gaskromatografi med kapillärkolonn — Alkoholer: Bilaga XIX Bestämning av halten alifatiska alkoholer genom gaskromatografi med kapillärkolonn ▼M21 — Fettsyror i 2-ställning: Bilaga VII Bestämning av procentandelen 2-glycerylmonopalmitat ▼M20









Tillägg 2

Tabell 1

a) Se jungfruolja eller bomolja (kvalitetskriterier – tabell 2, eller kvalitets- och renhetskriterier – tabellerna 4)

b) Se bomolja (kvalitets- och renhetskriterier – tabell 4)

Tabell 2

a) Se bomolja (kvalitets- och renhetskriterier – tabell 4)

b) Se extra jungfruolja (kvalitetskriterier – tabell 1)

Tabell 3

a) Förekomst av raffinerad olja (olivolja eller annan)

b) Förekomst av olivolja av pressrester

Tabell 4

a) Se extra jungfruolja och jungfruolja (kvalitetskriterier – tabellerna 1 och 2)

b) Förekomst av raffinerad olja (olivolja eller annan)

c) Förekomst av olivolja av pressrester

d) Förekomst av förestrade oljor

Tabell 7

a) Förekomst av olivolja av pressrester

b) Förekomst av förestrade oljor

Tabell 8

a) Förekomst av raffinerad olja (olivolja eller annan)

b) Se bomolja (kvalitets- och renhetskriterier – tabell 4)

c) Förekomst av förestrade oljor

Tabell 11

a) Förekomst av förestrade oljor

▼B









BILAGA II

▼M21

BESTÄMNING AV FRIA FETTSYROR, METOD VID LÅG TEMPERATUR

▼B

1. BESTÄMNING AV SYRAHALT

Bestämning av fria fettsyror i olivoljor. Halten fria fettsyror uttrycks som syrahalt beräknad på konventionellt sätt.

1.1 Princip

Ett prov löses i en blandning av lösningsmedel och de närvarande fria fettsyrorna titreras med en etanollösning av kaliumhydroxid.

1.2 Reagenser

Alla reagenser bör vara av analyskvalitet och det vatten som används skall vara destillerat eller ha motsvarande renhet.

1.2.1 Dietyleter. 95 % etanol (v/v), blandning av lika volymdelar. Anm: Dietyleter är en mycket lättantändlig vätska och kan bilda explosiva peroxider. Speciell försiktighet bör iakttas vid användning. Neutralisera exakt vid användningstillfället med kaliumhydroxidlösningen (1.2.2) med tillsats av 0,3 ml av fenolftaleinlösningen (1.2.3) per 100 ml blandning. Anm: Om det inte är möjligt att använda dietyleter kan en blandning av lösningsmedel som innehåller etanol och toluen användas. Om så erfordras kan etanolen ersättas av propanol-2.

1.2.2 Kaliumhydroxid, filtrerad etanollösning, c(KOH) ca 0,1 mol/l eller, om nödvändigt c(KOH), ca 0,5 mol/l. Den exakta koncentrationen hos etanollösningen av kaliumhydroxid måste vara känd och kontrollerad omedelbart före användning. Använd en lösning som gjorts minst fem dagar före användning och dekanterats i en brun glasflaska med gummipropp. Lösningen bör vara färglös eller halmfärgad. Anm: En stabil färglös lösning av kaliumhydroxid kan framställas på följande sätt: Koka upp 1 000 ml etanol med 8 g kaliumhydroxid och 0,5 g aluminiumspån och fortsätt att koka under återflöde under 1 timme. Destillera lösningen omedelbart. Lös den behövliga mängden kaliumhydroxid i destillatet. Låt lösningen stå i flera dagar och dekantera den klara vätskan från fällningen av kaliumkarbonat. Lösningen kan också framställas utan destillation på följande sätt: Tillsätt 4 ml aluminiumbutylat till 1 000 ml etanol och låt blandningen stå i flera dagar. Dekantera den klara vätskan och lös den behövliga mängden kaliumhydroxid i den. Lösningen är klar för användning.

1.2.3 Fenolftalein, 10 g/l lösning i 95 till 96 %-ig etanol (v/v) eller alkaliskt blått (då det gäller starkt färgade fetter) 20 g/l lösning i 95 till 96 %-ig etanol (v/v).

1.3 Utrustning

Vanlig laboratorieutrustning som innefattar:

1.3.1 Analysvåg

1.3.2 250 ml E-kolv

1.3.3 10 ml byrett graderad i 0,05 ml

1.4 Utförande

1.4.1 Preparering av provet för analys Genomför analysen på ett filtrerat prov. Om fukt och föroreningar tillsammans är mindre än 1 % använd provet utan vidare behandling.

1.4.2 Provtagning Ta ut ett prov beroende på det antagna syratalet i enlighet med följande tabell:



Förväntat syratal Mängd prov (g) Invägningsnoggrannhet (g) < 1 20 0,05 1 till 4 10 0,02 4 till 15 2,5 0,01 15 till 75 0,5 0,001 > 75 0,1 0,0002 Väg in provet i E-kolven (1.3.2).

1.4.3 Bestämning Lös provet (1.4.2) i 50 till 150 ml av den neutraliserade blandningen av dietyleter och etanol (1.2.1). Titrera under omrörning med 0,1 mol/l lösning av kaliumhydroxid (1.2.2) (se anmärkning 2) tills indikatorn ändrar färg (den röda fenolftaleinfärgen skall bestå under minst 10 sekunder). Anm 1: Den ställda etanollösningen av kaliumhydroxid (1.2.2) kan ersättas av en vattenlösning av kalium- eller natriumhydroxid under förutsättning att vattenvolymen inte medför fasseparation. Anm 2: Om den nödvändiga mängden 0,1 molar kaliumhydroxidlösning överstiger 10 ml, använd 0,5-molar lösning. Anm 3: Om lösningen blir ogenomskinlig under titreringen, tillsätt tillräckligt med lösningsmedel (1.2.1) för att det skall bli en klar lösning.

1.5 Syramängd uttryckt som procent oleinsyra

Syramängden som massprocent motsvaras av:

där:

V = Volymen kaliumhydroxid i ml som används vid titreringen.

c = Exakta koncentrationen i mol/l av den ställda kaliumhydroxidlösning som används.

M = Molvikt i gram per mol av syran som används för att ange resultatet (= 282).

m = Provets vikt i gram.

Det aritmetiska medelvärdet ►M6 av två beräkningar ◄ bör bedömas som resultatet.









BILAGA III

BESTÄMNING AV PEROXIDVÄRDET

1. SYFTE

Denna standard beskriver en metod för bestämning av peroxidvärdet i oljor och fetter.

2. TILLÄMPNINGSOMRÅDE

Denna standard är tillämplig på animaliska och vegetabiliska oljor och fetter.

3. DEFINITION

Peroxidvärdet är den kvantitet av de substanser i provet uttryckta i milliekvivalenter aktivt O2/kg som oxiderar kaliumjodid under de förhållanden som beskrivs.

4. PRINCIP

Behandling av provet i lösning i ättiksyra och kloroform med en lösning av kaliumjodid. Titrering av den frigjorda joden med ställd natriumtiosulfatlösning.

5. UTRUSTNING

All utrustning som skall användas skall vara fri från reducerande eller oxiderande ämnen.

Anm:

Smörj inte slipade ytor.

5.1 3 ml glassked.

5.2 Kolvar med slipade halsar och proppar på ca 250 ml, torkade i förväg och fyllda med en torr, ren, inert gas (kväve eller företrädesvis koldioxid).

5.3 25 eller 50 ml byrett graderad i 0,1 ml.

6. REAGENSER

6.1 Kloroform, P. A. som befriats från syre genom att en ström av ren, torr inert gas bubblats igenom den.

6.2 Ättiksyra, P. A. befriad från syre genom att en ström av torr, ren gas bubblats igenom den.

6.3 Kaliumjodid, mättad vattenlösning, nyligen framställd, fri från jod och jodater.

6.4 Natriumtiosulfat 0,01 eller 0,002 N exakt ställd vattenlösning, ställd omedelbart före användning.

6.5 Stärkelselösning, 10 g per liter vattenlösning nyligen framställd av naturlig löslig stärkelse.

7. PROV

Se till att provet tas och bevaras kallt och mörkt i glasbehållare som skall vara helt fyllda, hermetiskt tillslutna med slipade glasproppar eller kork.

8. UTFÖRANDE

Analysen skall genomföras i diffust dagsljus eller artificiellt ljus. Väg in i ett vägglas (5.1) eller om inte detta går i en kolv (5.2) på 0,001 g när, en mängd av provet som överensstämmer medföljande tabell enligt det förväntade peroxidvärdet:







Förväntat peroxidvärde (mekv) Provets vikt (g) 0 till 12 5,0 till 2,0 12 till 20 2,0 till 1,2 20 till 30 1,2 till 0,8 30 till 50 0,8 till 0,5 50 till 90 0,5 till 0,3

Ta bort proppen från en kolv (5.2) och för in vägglaset som innehåller provet. Tillsätt 10 ml kloroform (6.1). Lös provet snabbt under omrörning. Tillsätt 15 ml ättiksyra (6.2) och sedan 1 ml kaliumjodidlösning (6.3). Sätt snabbt i proppen, skaka om under en minut och låt stå i mörker exakt 5 minuter vid en temperatur mellan 15 och 25 °C.

Tillsätt ca 75 ml destillerat vatten. Titrera den frigjorda joden med natriumtiosulfatlösning (6.4) (0,002 N lösning för förväntade värden som är mindre 12 och 0,01 N lösning för förväntade värden över 12) under omskakning och använd stärkelselösning (6.5) som indikator.

Genomför två bestämningar på samma prov.

Genomför samtidigt ett blindprov. Om resultatet av blindprovet överstiger 0,05 ml av 0,01 N natriumtiosulfatlösning (6.4) ersätt de orena reagenserna.

9. RESULTATANGIVELSE

Peroxidvärdet (PV), uttryckt som milliekvivalenter av aktivt O2/kg erhålls genom följande formel:

där:

V = antalet ml av den ställda tiosulfatlösningen (6.4) som används i provet korrigerad för resultatet av blindprovet.

T = den exakta normaliteten hos natriumtiosulfatlösningen (6.4) som används.

m = vikten i gram av provet.

Som resultat tas det aritmetiska medelvärdet av de två bestämningarna som genomförts.

▼M21









BILAGA IV

BESTÄMNING AV VAXHALT MED KAPILLÄRGASKROMATOGRAFI

1. SYFTE

Metoden avser bestämning av vaxhalten i olivolja. Vaxerna separeras efter antalet kolatomer. Metoden används särskilt för att skilja mellan olivolja som framställts genom pressning och olivolja som framställts genom extraktion.

2. PRINCIP

Oljan blandas med lämplig intern standard och fraktioneras sedan genom kromatografi på kiselgelkolonn. Den fraktion som först elueras under testförhållanden (och som har lägre polaritet än triglyceriderna) samlas upp och analyseras därefter direkt med hjälp av gaskromatografi på kapillärkolonn.

3. UTRUSTNING

3.1 E-kolv 25 ml.

3.2 Gaskromatografikolonn av glas, innerdiameter 15,0 mm, längd 30–40 cm, med kran.

3.3 Gaskromatograf som är anpassad till kapillärkolonn, utrustad med ett system för direktinjektion i kolonnen och bestående av följande: 3.3.1 Termostatstyrd, programmerbar kolonnugn. 3.3.2 ”On column” -injektor för direktinjektion i kolonnen. 3.3.3 En flamjonisationsdetektor och förstärkare. 3.3.4 Skrivare/integrator som är anpassad till förstärkaren (3.3.3), med responstid på högst 1 sekund och med variabel pappershastighet. (Det går också att använda datasystem för insamling av gaskromatografidata via PC.) 3.3.5 Kapillärkolonn av glas eller kvarts, längd 8–12 m, innerdiameter 0,25–0,32 mm, vars vätskefas har en filmtjocklek på 0,10–0,30 μm. (Vätskefas anpassad efter användning, av typen SE52 eller SE 54 som finns i handeln.)

3.4 Sprutor på 10 μl med härdad nål för direktinjektion i kolonnen.

3.5 Elektrisk vibrator.

3.6 Rotationsindunstare.

3.7 Muffelugn.

3.8 Analysvåg med en noggrannhet på + 0,1 mg.

3.9 Standarduppsättning av laboratorieglas.

4. REAGENS

4.1 Kiselgel med en kornstorlek på 60–200 μm. Placera kiselgelen i ugnen vid 500 °C i minst fyra timmar. Efter kylning, tillsätt 2 % vatten till kiselgelen. Skaka ordentligt för att homogenisera blandningen. Förvara mörkt i minst 12 timmar före användning.

4.2 n-hexan för kromatografi.

4.3 Etyleter för kromatografi.

4.4 n-heptan för kromatografi.

4.5 Standardlösning av 0,1 % (m/V) laurylarakinat i hexan (intern standard). (Även palmitylpalmitat eller myristylstearat kan användas.) 4.5.1 Sudan-1-(1-fenyl-azo-2-naftol)

4.6 Bärgas: vätgas eller helium, ren, för gaskromatografi.

4.7 ”Make-up” -gas: — ren vätgas för gaskromatografi. — ren luft för gaskromatografi.

5. METOD

5.1 Preparering av kromatografikolonnen

Slamma upp 15 g kiselgel (4.1.) i n-hexan (4.2.) och häll det i kolonnen (3.2.). Låt kiselgelen sedimentera. Slutför sedimenteringen med hjälp av en elektrisk vibrator (3.5.) för att få den kromatografiska stationära fasen mer homogent packad. Skölj med 30 ml n-hexan för att avlägsna eventuella orenheter. Väg upp (3.8.) 500 mg av provet i en E-kolv på 25 ml (3.1.), tillsätt lämplig mängd intern standard (4.5.) beroende på uppskattad vaxhalt. Tillsätt 0,1 mg laurylarakinat för olivolja och 0,25–0,5 mg för olja av olivrestprodukter. Provet överförs sedan till kromatografikolonnen tillsammans med två portioner n-hexan (4.2) på 2 ml vardera.

Låt lösningen rinna till 1 mm ovanför adsorbentlagret, tillsätt sedan ytterligare 70 ml n-hexan för att eliminera de naturligt förekommande n-alkanerna. Börja sedan den kromatografiska elueringen genom att samla upp 180 ml av n-hexan/etyleterblandningen (99:1), med en hastighet på cirka 15 droppar/10 s. Elueringen av provet skall ske vid en temperatur på 22 + 4 °C.

Anmärkningar:

— Blandningen n-hexan/etyleter (99:1) skall beredas varje dag.

— För en visuell kontroll av att elueringen av vaxerna sker korrekt kan 100 μl sudan (1 %) tillsättas elueringsblandningen. Eftersom färgämnet har en retentionstid som ligger mellan den för vaxerna och triglyceriderna bör elueringen avslutas när färgningen nått botten av kolonnen, eftersom alla vaxer då har eluerats.

Torka den erhållna fraktionen i en rotationsindunstare (3.6.) tills nästan allt lösningsmedel försvunnit. Avlägsna de sista 2 ml av lösningsmedlet med hjälp av en svag kvävgasström, tillsätt sedan 2–4 ml n-heptan.

5.2 Analys med gaskromatografi

5.2.1 Förberedelser

Montera kolonnen i gaskromatografen (3.3.) genom att ansluta inloppet till injektionssystemet och utloppet till detektorn. Kontrollera gaskromatografen (att gasanslutningarna är täta, detektorns och skrivarens effektivitet, etc.).

Om kolonnen används för första gången bör den först konditioneras. Låt en liten mängd gas strömma genom kolonnen och sätt sedan på gaskromatografen. Värm upp den gradvis under ca 4 timmar till en temperatur på 350 °C. Behåll denna temperatur i minst 2 timmar och ställ därefter in lämpliga analysparametrar (ställ in gasflödet, tänd flamman, anslut skrivaren/integratorn (3.3.4.), ställ in injektor-, kolonn- och detektortemperaturen). Se till att signalen har en känslighet som är minst två gånger högre än den nivå som krävs för att utföra analysen. Baslinjen skall vara rak och stabil, utan toppar.

Om baslinjen driver nedåt tyder det på att kolonnen inte är korrekt ansluten. Om den driver uppåt tyder det på att kolonnen inte har blivit ordentligt konditionerad.

5.2.2 Val av analysparametrar

Analysparametrarna väljs normalt enligt följande:

— kolonntemperatur: —



20 °C/minut 5 °C/minut 20 °C/minut Starttemperatur 80 °C (1′) → 240 °C → 325 °C (6′) → 340 °C (10′)

— Detektortemperatur: 350 °C;

— Injicerad mängd: 1 μl lösning (2–4 ml) n-heptan

— Bärgas: helium eller vätgas med en linjär hastighet som är optimal för den gas som valts (se tillägget)

— Instrumentets känslighet: anpassad efter betingelserna nedan:

Beroende på kolonnens och gaskromatografens egenskaper kan betingelserna behöva ändras för att man skall få en separation av samtliga vaxer, en tillfredsställande upplösning av toppar (se figur) och en retentionstid för den interna standarden C32 på 18 + 3 minuter. Vaxernas mest representativa topp skall motsvara minst 60 % av fullt skalutslag.

Bestäm parametrarna för integration av topparna på ett sådant sätt att en korrekt uppskattning av toppareorna erhålls.

Anm.: Med tanke på den höga sluttemperaturen tillåts en positiv drift på högst 10 % av fullt skalutslag.

5.3 Analysförfarande

Sug med hjälp av en 10 μl spruta upp 1 μl av lösningen. Dra tillbaka kolven tills nålen är tom. För in nålen i injektorn och injicera snabbt efter 1–2 sekunder. Efter cirka 5 sekunder dras nålen försiktigt ut.

Utför registreringen tills alla vaxer är helt eluerade.

Baslinjen måste alltid uppfylla de fastställda villkoren.

5.4 Identifiering av toppar

Identifiera topparna utifrån retentionstiderna genom att jämföra dem med blandningar av vaxer med kända retentionstider analyserade under samma betingelser.

Figuren visar ett kromatogram för vaxer av jungfruolja.

5.5 Kvantitativ analys

Bestäm toppareorna för den interna standarden och de alifatiska estrarna från C40 till C46 med hjälp av integratorn.

Beräkna vaxhalten i var och en av estrarna (uttryckt som mg/kg fettämne) med hjälp av följande formel:

där:

Ax = topparean för varje ester, i kvadratmillimeter

As = topparean för den interna standarden, i kvadratmillimeter

ms = mängden tillsatt intern standard, i milligram

m = den mängd av provet som tagits ut för analys, i gram.

6. REDOVISNING AV RESULTAT

Ange totalhalten av de olika vaxerna från C40 till C46, i mg/kg fettämne (ppm).

Anm.: De komponenter som skall kvantifieras med hjälp av motsvarande toppar i kromatogrammet (se figur nedan) är estrar med ett jämnt antal kolatomer (C40 till C46). Om estertoppen C46 är svår att identifiera (dubbeltopp) bör man analysera vaxfraktionen för en olja av olivrestprodukter där C46-toppen är lättidentifierad eftersom den är klart störst.

Resultaten uttrycks med en decimal.

Figur

Kromatogram för vaxer i olivolja ( 5 )

Förklaringar:

I.S. = Laurylarakinat

1. = Diterpenestrar

2 + 2′ = C40-estrar

3 + 3′ = C42-estrar

4 + 4′ = C44-estrar

5. = C46-estrar

6. = Sterolestrar och triterpenestrar









Tillägg

Bestämning av gasens linjära hastighet

Ställ in normala gängse analysparametrar och injicera därefter 1–3 μl metan eller propan i gaskromatografen. Mät den tid det tar för gasen att gå igenom kolonnen, från det att den injiceras tills toppen passerat (tM).

Den linjära hastigheten i cm/sekund erhålls genom formeln L/tM där L är kolonnens längd i cm och tM är den uppmätta tiden i sekunder.

▼B









BILAGA V

BESTÄMNING AV SAMMANSÄTTNINGEN OCH HALTEN AV STEROLER GENOM GASKROMATOGRAFI MED KAPILLÄRKOLONN

1. SYFTE

Förfarandet beskriver en metod för att bestämma de enskilda och totala sterolhalterna hos fettämen.

2. METODENS PRINCIP

Fettämnet med tillsats av a-kolestanol som en inre standard, förtvålas med kaliumhydroxid i etanollösning och de oförtvålbara ämnena extraheras sedan med etyleter. Sterolfraktionen separeras från det oförtvålbara extraktet genom kromatografi på en basisk kiselgelplatta. Sterolerna som återvunnits från kiselgelen överförs till trimetylsilyletrar och analyseras genom gaskromatografi med kapillärkolonn.

3. UTRUSTNING

3.1 250 ml kolv försedd med återflödeskylare med slipningar.

3.2 500 ml separertrattar.

3.3 250 ml kolvar.

3.4 Komplett apparatur för analys med tunnskiktskromatografi som använder glasplattor 20 × 20 cm.

3.5 Ultraviolett lampa med en våglängd av 366 eller 254 nm.

3.6 Mikrosprutor 100 μl och 500 μl.

3.7 En cylindrisk filtrertratt med porositeten G 3 (porositet 15 till 40 μm) och med en diameter på ca 2 cm, ett djup på 5 cm och försedd med en hanslipning 12/21 som passar på en vakuumkolv.

3.8 50 ml vakuum-E-kolv med honslipning 12/21 som kan användas för filtrertratten (3.7).

3.9 10 ml provrör med konisk botten och propp.

3.10 Gaskromatograf lämpad för användning med kapillärkolonn försedd med splitsystem bestående av: 3.10.1 En termostatkammare för kolonner som kan bibehålla önskad temperatur med en noggrannhet av ± 1 °C. 3.10.2 En förångningsenhet med inställbar temperatur och försedd med ett förångningselement av glas med försiliniserad yta. 3.10.3 En flamjoniseringsdetektor och omformarförstärkare. 3.10.4 En integrerad skrivare som är lämplig för användning med omformarförstärkare (3.10.3).

3.11 En kapillärkolonn av glas eller kvarts med en längd på 20 till 30 meter, innerdiameter 0,25 till 0,32 mm och helt täckt med SE-52 eller SE-54-vätska eller motsvarande i ett jämnt lager med en tjocklek av mellan 0,10 och 0,30 μm.

3.12 En 10 μl mikrospruta för gaskromatografi med härdad kanyl.

4. REAGENSER

4.1 Kaliumhydroxid ungefär 2 N i etanollösning. Lös 130 g kaliumhydroxid (minimihalt 85 %) under kylning i 200 ml destillerat vatten och späd sedan till 1 liter med etanol. Förvara lösningen i väl tillslutna, mörka flaskor (etanol 95 % v/v).

4.2 Etyleter, P. A.

4.3 Vattenfritt natriumsulfat, P. A.

4.4 Glasplattor täckta med kiselgel utan flouresceinsindikator, tjocklek 0,25 mm (finns i handeln färdiga för användning).

4.5 Kaliumhydroxid, 0,2 N i etanollösning. Lös 13 g kaliumhydroxid i 20 ml destillerat vatten och späd till 1 liter med etanol.

4.6 Bensen, för kromatografi (se 5.2.2).

4.7 Aceton, för kromatografi (se 5.2.2).

4.8 Hexan, för kromatografi (se 5.2.2).

4.9 Etyleter, för kromatografi (se 5.2.2).

4.10 Kloroform, P. A. (se 5.2.2).

4.11 Referenslösning för tunnskiktskromatografi: kolesterol eller fytosterol, ►M6 2 % ◄ lösning i kloroform.

4.12 2.7-diklorflourecein, 0,2 % etanollösning. Denna görs lätt alkalisk genom att tillsätta ett par droppar 2 N alkoholisk kaliumhydroxidlösning.

4.13 Vattenfri pyridin, för kromatografi.

4.14 Hexametyldisilasan.

4.15 Trimetylklorosilan.

4.16 Referenslösning av steroltrimetylsilyletrar. Framställs omedelbart före användning av rena steroler eller blandningar av steroler som erhållits från oljor som innehåller dem.

4.17 α-kolestanol, 0,2 % lösning (m/v) i kloroform (inre standard).

4.18 Bärargas: väte eller helium, ren för gaskromatografi.

4.19 Supplementerande gaser: väte eller helium, ren för gaskromatografi.

5. UTFÖRANDE

5.1 Preparering av oförtvålbara ämnen 5.1.1 Med hjälp av en 500 μl mikrospruta införs en volym av 0,2 % α-kolestanollösning i kloroform (4.17) som innehåller en mängd α-kolestanol motsvarande ca 10 % sterolhalten i provet som tagits ut för analysen i 250 ml kolv. Exempelvis tillsätts 500 μl av den 0,2 % α-kolestanollösningen per 5 g prov när det gäller olivolja och 1 500 μl för ►M6 ————— ◄ olivoljor av pressrester. Indunsta till torrhet under en ström av kväve och väg noggrannt upp 5 g av det torra filtrerade provet i samma kolv. ►M6 Oljor ◄ och fetter som innehåller uppskattningsbara kvantiteter av kolesterol kan visa en topp med en retentionstid som är samma för kolestanol. Om detta inträffar måste sterolfraktionen analyseras dubbelt med och utan inre standard ►M6 eller så måste betulinol användas istället för kolestanol ◄ . 5.1.2 Tillsätt 50 ml 2 N kaliumhydroxid i etanollösning, sätt på återflödeskylaren och värm till svag kokning på vattenbad under kontinuerlig omrörning tills förtvålning inträder (lösningen blir klar). Fortsätt upphettningen under ytterligare 20 minuter, och tillsätt sedan 50 ml destillerat vatten genom återflödeskylaren, ta bort kylaren och kyl kolven till ca 30 °C. 5.1.3 Överför kvantitativt innehållet i kolven till en 500 ml separertratt och skölj upprepade gånger med destillerat vatten av en mängd som totalt får uppgå till 50 ml. Tillsätt ca 80 ml etyleter, skaka omsorgsfullt i ungefär 30 sekunder och låt sedan innehållet separera (anm 1). Separera av den lägre vattenfasen i en ny separertratt. Genomför ytterligare två extraheringar på vattenfasen på samma sätt med användande av 60—70 ml etyleter vid varje tillfälle. Anm 1: Eventuell emulsion kan tas bort genom tillsats av små kvantiteter etanol eller metanol i sprayform. 5.1.4 Samla eterextrakten i en separertratt och tvätta med destillerat vatten (50 ml åt gången) tills tvättvattnet ger neutral reaktion. När tvättvattnet har avlägsnats, torka med vattenfritt natriumsulfat och filtrera på vattenfritt natriumsulfat ner i en i förväg vägd 250 ml kolv, och tvätta därefter tratten och filtret med små mängder etyleter. 5.1.5 Destillera av etern tills endast ett par ml återstår, torka sedan under lätt vakuum eller i en ström av kvävegas och torka sedan helt i ett torkskåp vid 100 °C i ungefär en kvart och väg därefter provet som fått svalna i exsickator.

5.2 Separering av sterolfraktionen 5.2.1 Preparering av plattorna. Sänk ner kiselgelplattorna (4.4) helt i 0,2 N kaliumhydroxidetanollösning (4.5) i 10 sekunder och låt sedan torka i dragskåp i två timmar varefter den placeras i torkskåp vid 100 °C i en timme. Ta ut plattorna från torkskåpet och förvara dem i en exsickator med kalciumklorid tills de skall användas (plattor som behandlas på detta sätt måste användas inom 15 dagar). Anm 2: Om kiselelplatta används för att separera serolfraktionen behöver inte de oförtvålbara ämnena behandlas med aluminumoxid. På det här sättet kan alla sura föreningar (fettsyror och andra) behållas på identifieringslinjen och sterolbanden separeras klart från de alifatiska och triterpena alkoholernas band. 5.2.2 Fyll på en 95:5 (v/v) benzen/acetonblandning i framkallningskammaren till ett djup av ca 1 cm. En blandning av 65:35 (v/v) av hexan/etyleter kan också användas. Stäng kammaren med tillhörande lock och låt stå ca en halvtimme för att jämnvikten vätska/gas inställer sig. Remsor av filtrerpapper som doppas ner i eluenten kan placeras på insidorna av kammaren. Detta minskar framkallningstiden med ca en tredjedel och åstadkommer en jämnare eluering av komponenterna. Anm 3: Framkallningsblandningen skall bytas för varje prov för att få exakt reproducerbara elueringsförhållanden. 5.2.3 Preparera en ca 5 % lösning av oförtvålbara ämnen (5.1.5) i kloroform och stryk ut med hjälp av en 100 μl spruta på en kromatografiplatta (5.2.1) 0,3 ml ca 2 cm från ena änden i en strykning som är så tunn och jämn som möjligt. Placera i linje med strykningen 2 till 3 μl av sterolreferenslösningen (4.11) i enda änden av plattan så att sterolbandet kan identifieras efter framkallning. 5.2.4 Placera plattan i framkallningskammaren som preparerats enligt 5.2.2. Genomsnittstemperaturen skall hållas mellan 15 och 20 °C. Stäng kammaren omedelbart med locket och påbörja elueringen tills lösningsmedlets främre kant når till ca 1 cm från övre änden av plattan. Ta bort plattan från framkallningskammaren och låt lösningsmedlet avdunsta i en ström av varmluft eller genom att plattan ligger en kort stund i dragskåp. 5.2.5 Spraya plattan lätt och jämnt med 2,7-diklorofluorosceinlösning. När plattan betraktas i ultraviolett ljus kan sterolbandet identifieras genom att det ligger i höjd med fläcken som har erhållits från referenslösningen. Markera änden av bandet längs kanterna av flouroscensen med svart blyerts. 5.2.6 Skrapa med hjälp av en metallspatel bort silikagelen på det markerade området. Placera det finfördelade materialet som tagits bort i filtrertratten (3.7). Tillsätt 10 ml het kloroform, rör försiktigt med metallspateln och filtrera i vakuum-E-kolven (3.8) som är ansluten till filtrertratten. Tvätta återstoden i kolven tre gånger med etyleter (ca 10 ml varje gång) och samla filtratet i samma kolv som är ansluten till filtrertratten. Indunsta filtratet till en volym på 4 till 5 ml, överför lösningen till ett vägt 10 ml provrör (3.9), indunsta till torrhet genom lätt uppvärmning i ett försiktigt flöde av kvävgas, lös igen med hjälp av ett par droppar aceton, indunsta igen till torrhet, placera i ett värmeskåp vid 105 °C i ca 10 minuter och låt sedan provet svalna i exsickator och väg det. Återstoden som finns i provröret består av sterolfraktionen.

5.3 Preparering av trimetylsilyletrar 5.3.1 Tillsätt silyleringsreagensen, som består av 9:3:1 (v/v/v) blandning av pyridin/hexametyldisdilasan/trimetylklorosilan (anm 4) i mängden 50 μl för varje milligram steroler som finns i provröret som innehåller sterolfraktionen, varvid fukt ska undvikas (anm 5). Anm 4: Lösningar klara för användning finns att köpa i handeln. Andra silaniseringsreagenser som t ex bis-trimetylsilyl, triflouracetamid + 1 % trimetylklorosilan, som måste spädas med lika stor mängd vattenfri pyridin finns också tillgängliga. 5.3.2 Sätt proppen i provröret, skaka försiktigt (utan att vända på det) tills sterolerna är helt lösta. Låt stå i minst 15 minuter i rumstemperatur och centrifugera sedan i ett par minuter. Den klara lösningen är nu färdig för analys med gaskromatografi. Anm 5: Eventuell bildning av en svag opalescens är normal och inverkar inte. Bildandet av en vit flockig fyllning eller rosafärgning är tecken på närvaro av fukt och sönderfall hos reagensen. Om detta inträffar skall provet upprepas.

5.4 Analys med gaskromatografi 5.4.1 Förberedelser och iordningsställande av kapillärkolonnen. 5.4.1.1 Kapillärkolonnen placeras inuti gaskromatografen genom att kolonnens inlopp ansluts till injektorblocket som är ansluten till splitsystemet och andra änden av kolonnen till detektorn. En allmän kontroll av gaskromatografen genomförs (gasanslutningarna skall vara täta, detektorn i fullgott skick, fungerarande splitsystem och registreringssystem etc). 5.4.1.2 Kapillärkolonner som används för första gången skall prepareras. En liten mängd bärargas får flyta igenom kapillärkolonnen och sedan kopplas gaskromatografen på och en gradvis upphettning genomförs tills temperaturen är minst 20 °C över drifttemperaturen (se anm 6). Temperaturen bibehålls i minst två timmar och sedan ställs kromatografen iordning för driftförhållanden (inställning av gasflöde, tändning av delningsflamma, anslutning till den elektroniska registreringen, inställning av temperaturen i kapillärkolonnens ugn, detektorn och injektorn) signalen ställs in på en känslighet som är minst två gånger den högsta nivån som beräknas för genomförande av analysen. Baslinjens streck skall vara linjärt, inte ha några spikar oavsett ursprung och inte visa tecken på att driva. Negativ drift av linjen är tecken på otäta kolonnanslutningar medan en positivt drift tyder på otillräcklig preparering av kolonnen. Anm 6: Temperaturen vid prepareringen skall vara minst 20 °C lägre än maximitemperaturen som specificeras för den använda fasen. 5.4.2 Val av driftförhållanden 5.4.2.1 Allmänna driftförhållanden är följande: — kolonntemperatur: 260 ± 5°C — injektorblockets temperatur: 280 °C, — detektorns temperatur: 290 °C, — linjär hastighet för bärargasen: helium 20 till 35 cm/s, väte 30 till 50 cm/s, — delningsförhållande 1:50 vid 1:100, — instrumentets känslighet: 4 till 16 gånger högre än minimikänsligheten, — registreringskänslighet: 1 till 2 mV, — pappershastighet: 30 till 60 cm/timme, — kvantitet av det injicerade ämnet: 0,5 till 1 μl av TMSE-lösning. Dessa förhållanden kan varieras beroende på egenskaper hos kolonn och gaskromatograf för att få kromatogram som uppfyller följande krav: — retentionstiden för β-sitosterol bör vara 20 ± 5 minuter, — kampesteroltoppen bör vara: olivolja (medelinnehåll 3 %) 15 ± 5 % av fullt utslag, för sojaolja (medelinnehåll 20 %) 80 ± 10 % av fullt utslag, — alla närvarande steroler måste separeras. Förutom att topparna måste separeras måste de också återgå helt, dvs varje toppkurva skall återvända till baslinjen innan nästa topp ritas. Ofullständig upplösning kan emellertid tolereras under förutsättning att toppen vid TRR 1,02 kan kvantifieras med hjälp av topphöjden. 5.4.3 Analysförfarande 5.4.3.1 Sug med hjälp av en 10 μl spruta upp 1 μl hexan, sug in 0,5 μl luft och sedan 0,5 till 1 μl av provlösningen. Drag ut kolven ur sprutan ytterligare så att kanylen töms. Kör in kanylen genom membranet i insprutningsenheten och spruta snabbt efter en till två sekunder in innehållet och drag sedan sakta ut kanylen efter ca fem sekunder. 5.4.3.2 Fortsätt registreringen tills TMSE för de närvarande sterolerna är helt eluerade. Baslinjen måste fortsätta att uppfylla kraven i 5.4.1.2. 5.4.4 Identifiering av toppar. Identifiera individuella toppar på grundval av retentionstiderna och genom jämförelse med blandningar av sterol-TMSE som är analyserade under samma förhållanden. Sterolerna elueras i följande följd: kolesterol, brassikasterol, 24-metylenkolesterol, kampesterol, kampestanol, stigmasterol, Δ 7-kampesterol, Δ 5,23-stigmastadienol, klerosterol, β-sistosterol, sitostanol, Δ 5-avenasterol, 5,24-stigmastadienol, Δ 7-sigmastenol, Δ 7-avenasterol. Retentionstiderna för sitosterol för SE-52 och SE-54 kolonner framgår av tabell 1. Figurerna 1 och 2 visar typiska kromatogram för en del oljor. 5.4.5 Kvantitativ utvärdering 5.4.5.1 Beräkna områdena för α-kolestanol och steroltopparna med hjälp av integratorn. Bortse från toppar för föreningar som inte finns med bland de som är upptagna i tabell 1. Svarskoefficienten för α-kolestanol skall vara lika med 1. 5.4.5.2 Beräkna koncentrationen för varje sterol i mg/100 g fettämne som följer: där: Ax = arean av toppen för sterol x ►M6 ————— ◄ , As = arean av toppen för α-kolestanol ►M6 ————— ◄ ms = massan av tillsatt α-kolestanol i milligram m = massan av provet som använts för bestämningen i gram

6. RESULTATANGIVELSE

6.1 Registrera enstaka sterolkoncentrationer som milligram per 100 g av fettämne och deras summa som totala steroler.

6.2 Beräkna procenttalet för varje enskild sterol ur förhållandet mellan arean av den aktuella toppen till summan av areorna av topparna för steroler. där: Ax = arean av toppen för x, A = summan av areorna av topparna för steroler









TILLÄGG

Bestämning av den linjära hastigheten för gasen

1 till 3 μl metan (eller propan) sprutas in i gaskromatografen under vanliga driftförhållanden och den tid det tar för metanet (eller propanet) att passera kolonnen från insprutningsögonblicket till det ögonblick toppen eluerar (tM) mäts med stoppur.

Den linjära hastigheten i cm/s erhålls genom L/tM där L är kolonnens längd i cm och tM är tiden i sekunder som uppmäts med stoppur.







Tabell 1 Relativa retentionstiden för steroler Topp Identifiering Relativ retentionstid SE 54 kolonn SE 52 kolonn 1 kolesterol Δ-5-kolesten-3β-ol 0,67 0,63 2 kolestanol 5α-kolestan-3β-ol 0,68 0,64 3 brassikasterol [24S]-24-metyl-Δ-5,22-kolestadien-3β-ol 0,73 0,71 4 24-metylenkolesterol 24-metylen-Δ-5,24-kolesten-3β-ol 0,82 0,80 5 kampesterol [24R]-24-metyl-Δ-5-kolesten-3β-ol 0,83 0,81 6 kampestanol [24R]-24-metyl-kolestan-3β-ol 0,85 0,82 7 stigmasterol [24R]-24-etyl-Δ-5,22-kolestadien-3β-ol 0,88 0,87 8 Δ-7-kampeterol [24R]-24-metyl-Δ-7-kolesten-3β-ol 0,93 0,92 9 Δ-5,23-stigmastadienol [24R,S]-24-etyl-Δ-5,23-kolestadien-3β-ol 0,95 0,95 10 klerosterol [24R]-24-etyl-Δ-5,25-kolestadien-3β-ol 0,96 0,96 11 β-sitosterol [24R]-24-etyl-Δ-5-kolestan-3β-ol 1,00 1,00 12 sitostanol 24-etyl-kolestan-3β-ol 1,02 1,02 13 Δ-5-avenasterol [24Z]-24-etyliden-5-kolesten-3β-ol 1,03 1,03 14 Δ-5,24-stigmasteadienol [24R,S]-24-etyl-Δ-5,24-kolestadien-3β-ol 1,08 1,08 15 Δ-7-stigmastenol [24R,S]-24-etyl-Δ-7,24-kolestadien-3β-ol 1,12 1,12 16 Δ-7-avenasterol [24Z]-24-etyliden-Δ-7-kolesten-3β-ol 1,16 1,16

Figur 1

Gaskromatogram för sterolfraktionen hos en oraffinerad olivolja

Figur 2

Gaskromatogram för sterolfraktionen hos en raffinerad olivolja









BILAGA VI

BESTÄMNING AV ERYTRODIOL OCH UVAOL

INLEDNING

Erytrodiol (som vanligen förstås som glykolerna i erytrodiol och uvaol tillsammans) är en del av den oförtvålbara reaktionen, som tillhör en del typer av fettämnens karaktäristiska. Den kan påvisas i påtagligt högre koncentration i olivolja som extraherats med lösningsmedel än i andra oljor t. ex. pressad olivolja och druvolja som också innehåller den och närvaron av den kan visa närvaron av olivolja som extraherats med lösningsmedel.

1. SYFTE

Förfarandet beskriver en metod för att påvisa erytrodiol i fettämnen.

2. METODENS PRINCIP

Fettämnet förtvålas med en kaliumhydroxid i metanol-etanol-lösning. Den oförtvålbara fraktionen extraheras sedan med etyleter och renas genom passage över en kolonn med aluminumoxid. De oförtvålbara ämnen får sedan genomgå tunnskiktskromatografi på kiselgelplattor till banden som motsvarar sterol- och erytrodiolfraktionerna är separerade.

Sterolerna och erytrodiolerna återvinns från plattan och överförs till trimetylsilyletrar och blandningarna analyseras senare med gaskromatografi.

Resultatet uttrycks som procent erytrodiol i blandningen av erytrodiol och steroler.

3. UTRUSTNING

3.1 Utrustningen som beskrivs i bilaga 5 (bestämning av halten av sterol).

4. REAGENSER

4.1 De reagenser som beskrivs i bilaga 5 (bestämning av halten sterol).

4.2 Referenslösning av erytrodiol, 0,5 % lösning i kloroform.

5. UTFÖRANDE

5.1 Preparering av oförtvålbara ämnen

Som beskrivits i punkt 5.1.2 i bilaga 5.

5.2 Separering av erytrodiol och sterolerna.

5.2.1 Se punkt 5.2.1 i bilaga 5.

5.2.2 Se punkt 5.2.2 i bilaga 5.

5.2.3 Gör iordning en 5 % lösning av de oförtvålbara ämnena i kloroform. Med hjälp av en 0,1 ml mikrospruta stryks 0,3 ml av lösningen ut på en kromatografiplatta ca 1,5 cm från nedre änden i en strykning som är så tunn och jämn som möjligt. I ena änden av plattan placeras ett par mikroliter av lösningarna av kolesterol och erytrodiol som tjänar som referens.

5.2.4 Placera plattan i framkallningskammaren som iordningsställts enligt 5.2.1. Omgivningstemperaturen bör vara omkring 20 °C. Stäng kammaren omedelbart med locket och låt elueringen fortgå tills lösningsmedlets front når ca 1 cm från övre kanten av plattan. Ta bort plattan från framkallningskammaren och låt lösningsmedlet avdunsta i ett varmt luftflöde.

5.2.5 Spraya plattan lätt och jämnt med den alkoholiska 2,7-dikloroflourosceinlösningen. När plattan betraktas under ultraviolett ljus kan sterol- och erytrodiolbanden identifieras genom att de ligger mitt för sina referenspunkter. Markera med en punkt utanför gränserna för flouroscensen.

5.2.6 Skrapa med hjälp av en metallspatel bort silikagelen på de markerade områdena. Placera materialet från plattan i en 50 ml kolv. Tillsätt 15 ml varm kloroform. Skaka om väl och filtrera genom en glasfiltertratt så att silikagelen överförs till filtret. Tvätta tre gånger med varm kloroform (10 ml varje gång) och samla upp filtratet i en 100 ml kolv. Indunsta filtratet till en volym av 4—5 ml, överför till en kalibrerat 10 ml centrifugrör med konisk botten, torka i en försiktig uppvärmning i kväveström och väg.

5.3 Framställning av trimetylsilylestrar

Som beskrivits i punkt 5.3 i bilaga 5.

5.4 Gaskromatografianalys

Som beskrivits i punkt 5.4 om ovanstående metod.

Driftförhållandena för gaskromatografen i analys måste vara sådana att de går att genomföra sterolanalyser och separera TMSE från erytrodiol och uvaol.

När provets sprutats in, fortsätt registreringen tills de närvarande sterolerna, erytrodiolen och uvaolen har eluerats. Identifiera sedan topparna (retentionstiderna för ertytrodiol och uvaol relativt till β-sitosterol är ca 1,45 respektive 1,55) och beräkna områdena på samma sätt som för steroler.

6. RESULTATANGIVELSE

där:

A1 = arean av toppen för erytrodiol ►M6 ————— ◄ ,

A2 = arean av toppen för uvaol ►M6 ————— ◄

Asteroler = arean av toppen för steroler ►M6 ————— ◄

Resultatet uttrycks med en decimal.

▼M21









BILAGA VII

BESTÄMNING AV PROCENTANDELEN 2-GLYCERYLMONOPALMITAT

1. SYFTE OCH TILLÄMPNINGSOMRÅDE

Metoden avser bestämning av procentandelen palmitinsyra i 2-ställning för triglycerider genom bestämning av 2-glycerylmonopalmitat.

Metoden kan tillämpas på flytande vegetabiliska oljor vid en temperatur på 20 °C.

2. PRINCIP

Efter beredning av oljeprovet tillsätts pankreaslipas. Detta leder till partiell och specifik hydrolys i 1- och 3-ställning för triglyceridmolekylen varigenom monoglycerider i 2-ställning uppkommer. Procentandelen 2-glycerylmonopalmitat i monoglyceridfraktionen bestäms, efter silylering, med kapillärgaskromatografi.

3. UTRUSTNING

3.1 E-kolv 25 ml

3.2 Glasbägare, 100, 250 och 300 ml

3.3 Kromatografikolonn av glas, innerdiameter 21–23 mm, längd 400 mm, med porös glasskiva och kran

3.4 Graderade provrör 10, 50, 100 och 200 ml

3.5 Kolvar 100 och 250 ml

3.6 Rotationsindunstare

3.7 Centrifugrör 10 ml, med konformad botten och slipad propp

3.8 Centrifug för rör 10 och 100 ml

3.9 Termostat som håller temperaturen på 40 + 0,5 °C

3.10 Mätpipetter, 1 och 2 ml

3.11 Injektionsspruta 1 ml

3.12 Spruta 100 μl

3.13 Tratt, 1 000 ml

3.14 Kapillärgaskromatograf med ”on column” -injektor för direktinjektion av provet i kolonnen och en ugn som kan hålla vald temperatur med en noggrannhet på + 1 °C

3.15 ”On column” -injektor för direktinjektion av provet i kolonnen

3.16 En flamjonisationsdetektor och elektrometer

3.17 Skrivare/integrator som är anpassad till elektrometern, med responstid på högst 1 sekund och med variabel pappershastighet

3.18 Kapillärkolonn av glas eller kvarts, längd 8–12 meter, innerdiameter 0,25–0,32 mm, belagd med 5-procentig metylpolysiloxan eller fenylmetylpolysiloxan (tjocklek 0,10–0,30 μm) som kan användas vid 370 °C

3.19 Spruta 10 μl med härdad nål, minst 7,5 cm, för direktinjektion i kolonnen

4. REAGENS

4.1 Kiselgel med en kornstorlek på 0,063–0,200 mm (70/280 mesh), beredd enligt följande: placera kiselgelen i en porslinskapsel, torka i ugnen vid 160 °C i 4 timmar, låt svalna i exsickator. Tillsätt en mängd vatten som motsvarar 5 % av kiselgelens vikt, enligt följande: mät upp 152 g kiselgel i en E-kolv på 500 ml och tillsätt 8 g destillerat vatten, sätt på proppen och skaka lätt så att vattnet blir jämnt fördelat. Låt stå i minst 12 timmar före användning.

4.2 n-hexan för kromatografi

4.3 Isopropanol

4.4 Isopropanol, vattenlösning 1:1 (v/v)

4.5 Pankreaslipas. Lipaset skall ha en aktivitet på 2,0–10 lipasenheter/mg (i handeln finns det pankreaslipas med en aktivitet på 2–10 enheter per mg enzym).

4.6 Buffertlösning av tris(hydroximetyl)aminometan: vattenlösning 1 M där pH justeras till 8 (kontrolleras med potentiometer) genom tillsats av koncentrerad HCI (1:1 v/v)

4.7 Natriumkolat, enzymkvalitet, 1-procentig vattenlösning (lösningen bör användas inom 15 dagar efter det att den beretts

4.8 Kalciumklorid, 22-procentig vattenlösning

4.9 Dietyleter för kromatografi

4.10 Elueringsmedel: blandning n-hexan/dietyleter (87:13) (v/v)

4.11 Natriumhydroxid, lösning på 12 viktprocent

4.12 Fenolftalein, 1-procentig lösning i etanol

4.13 Bärgas: vätgas eller helium, för gaskromatografi

4.14 ”Make-up” -gas: vätgas, minst 99 %, fri från fukt och organiska ämnen – och luft för gaskromatografi, av samma renhetsgrad

4.15 Silyleringsreagens: blandning pyridin/hexametyldisilazan, trimetylklorsilan 9:3:1 (v/v/v). (Det finns färdiga lösningar i handeln. Andra silyleringsreagenser kan användas, t.ex. bis-trimetylsilyltrifluoracetamid + 1 % trimetylklorsilan, utspätt med lika mängd vattenfritt pyridin.)

4.16 Referensprover: rena monoglycerider eller blandningar av monoglycerider med en liknande procentuell sammansättning som provet

5. FÖRFARANDE

5.1 Provberedning

5.1.1 Oljor med en halt av fria syror lägre än 3 % behöver inte neutraliseras före kromatografi på kolonn med kiselgel. Oljor med en halt av fria syror över 3 % skall neutraliseras i enlighet med punkt 5.1.1.1. 5.1.1.1 Häll 50 g olja och 200 ml n-hexan i en tratt på 1 000 ml (3.13). Tillsätt 100 ml isopropanol och en mängd 1-procentig natriumhydroxidlösning (4.11) som motsvarar oljans fria syrahalt ökat med 5 %. Skaka kraftigt i 1 minut. Tillsätt 100 ml destillerat vatten, skaka igen och låt stå. Efter dekantering, avlägsna det nedre skiktet som innehåller tvål. Avlägsna eventuella mellanliggande skikt (slem och olösliga ämnen). Tvätta den neutraliserade hexanlösningen av oljan flera gånger med 50–60 ml lösning av isopropanol och vatten 1:1 (v/v) (4.4) till dess den rosafärgade tonen på fenolftaleinet försvunnit. Avlägsna det mesta av hexanet genom vakuumdestillation (t.ex. med en rotationsindunstare) och för över oljan till en kolv på 100 ml (3.5). Torka oljan i vakuum till dess att lösningsmedlet har försvunnit helt. När så skett bör oljans syrahalt ligga under 0,5 %.

5.1.2 Häll 1,0 g olja som beretts enligt ovan i en 25 ml E-kolv (3.1) och lös upp i 10 ml lösningsmedel (4.10). Låt lösningen stå i minst 15 minuter före kromatografi på kolonn med kiselgel. Om lösningen är grumlig, centrifugera den för att uppnå optimala förhållanden för kromatografi. (Till detta används t.ex. SPE-kolonner på 500 g med kiselgel, färdiga för användning).

5.1.3 Preparering av kromatografikolonnen Häll i ca 30 ml lösningsmedel (4.10) i kolonnen (3.3), placera en bomullstuss i den nedre delen av kolonnen med hjälp av en glasstav och pressa ut luften. Slamma upp 25 g kiselgel (4.1) i ca 80 ml lösningsmedel i en glasbägare och häll i den i kolonnen med hjälp av en tratt. Kontrollera att all kiselgel har hamnat i kolonnen. Tvätta med lösningsmedlet (4.10), öppna kranen och låt vätskenivån sjunka till ca 2 mm ovanför kiselgelens övre nivå.

5.1.4 Kromatografi Väg upp exakt 1,0 g av provet som beretts enligt punkt 5.1 i en E-kolv på 25 ml (3.1). Lös upp provet i 10 ml elueringsmedel (4.10). Häll lösningen i kromatografikolonnen som förberetts enligt punkt 5.1.3. Rubba inte kolonnytan. Öppna kranen och fyll på med provlösning upp till kiselgelen. Eluera med 150 ml elueringsmedel. Ställ in flödeshastigheten på 2 ml/min (så att 150 ml rinner igenom kolonnen på ca 60–70 minuter). Samla upp eluatet i en 250 ml rundkolv som tarerats i förväg. Förånga lösningsmedlet i vakuum och avlägsna lösningsmedelsresterna med en ström av kvävgas. Väg kolven och beräkna mängden extrakt som erhållits. (Vid användning av SPE-kolonn med kiselgel som är färdig för användning, förfar enligt följande: Fyll på 1 ml lösning (5.1.2.) i kolonnerna, som dessförinnan förberetts med 3 ml n-hexan. När lösningen passerat genom kolonnen, eluera med 4 ml n-hexan/dietyleter 9:1 (v/v). Samla upp eluatet i ett 10 ml rör och förånga med en ström av kvävgas tills all vätska försvunnit. Tillsätt pankreaslipas till torrsubstansen (5.2.). Det är absolut nödvändigt att kontrollera fettsyresammansättningen både före och efter passagen genom SPE-kolonnen).

5.2 Hydrolys med pankreaslipas

5.2.1 Väg upp 0,1 g olja som beretts enligt punkt 5.1. i centrifugröret. Tillsätt 2 ml buffertlösning (4.6.), 0,5 ml natriumkolatlösning (4.7.) och 0,2 ml kalciumkloridlösning och skaka väl efter varje tillsats. Förslut röret med den slipade proppen och placera det i termostaten vid en temperatur på 40 + 0,5 °C.

5.2.2 Tillsätt 20 mg lipas, blanda väl (undvik att blöta ner proppen) och placera röret i termostaten under exakt 2 minuter, ta ut det, skaka väl under exakt 1 minut och låt svalna.

5.2.3 Tillsätt 1 ml dietyleter, sätt i proppen och skaka väl, centrifugera och överför därefter eterlösningen till ett rent och torrt rör med hjälp av en spruta.

5.3 Beredning av silylerade derivat och förberedelser för gaskromatografi

5.3.1 För över 100 μl lösning (5.2.3.) till ett 10 ml provrör med konisk botten med hjälp av en spruta.

5.3.2 Avlägsna lösningsmedlet med svag kvävgasström, tillsätt 200 μl silyleringsreagens (4.15.), sätt i proppen i provröret och låt stå i 20 minuter.

5.3.3 Tillsätt efter 20 minuter 1–5 ml n-hexan (beroende på de kromatografiska betingelserna): den lösning som erhålls är färdig att användas för gaskromatografi.

5.4 Gaskromatografi

Följande analysparametrarna används:

— Injektortemperatur (”on column” -injektor) under lösningens kokpunkt (68 °C)

— Detektortemperatur: 350 °C

— Kolonntemperatur: programmering av ugnstemperatur: 60 °C under 1 minut, öka med 15 °C per minut upp till 180 °C, sedan med 5 °C per minut upp till 340 °C, denna temperatur bibehålls sedan under 13 minuter.

— Bärgas: vätgas eller helium, reglerad till lämplig linjär hastighet för den upplösning som visas i figur 1. Retentionstiden för triglyceriden C54 bör vara 40 + 5 minuter (se figur 2). (Analysparametrarna ovan är vägledande. De bör optimeras av den som utför analysen så att önskad upplösning erhålls. Toppen för 2-glycerylmonopalmitat skall ha en minsta höjd på 10 % av skrivarens skala.)

— Kvantitet av det injicerade ämnet: 0,5–1 μl av lösningen (5 ml) med n-hexan (5.3.3.).

5.4.1 Identifiering av toppar

De enskilda monoglyceriderna bör identifieras genom att retentionstiderna jämförs med dem som erhållits för standardblandningar med monoglycerider under samma förhållanden.

5.4.2 Kvantitativ analys

Arean för varje topp beräknas med hjälp av en elektronisk integreringsenhet.

6. BERÄKNING AV RESULTAT

Andelen glycerilmonopalmitat beräknas genom en jämförelse mellan arean för motsvarande topp och summan av toppareorna för samtliga monoglycerider (se figur 2), enligt formeln:

där:

Ax = topparean för glycerilmonopalmitat

ΣA = summan av toppareorna för alla monoglycerider

Resultatet skall anges med en decimal.

7. ANALYSRAPPORT

Följande skall anges i analysrapporten:

— Hänvisning till denna metod

— Alla uppgifter som behövs för att fullständigt identifiera provet

— Analysresultat

— Alla avvikelser från metoden, vare sig de hänför sig till ett beslut av de berörda parterna eller något annat skäl

— Uppgifter om laboratoriet, analysdag och underskrift av de ansvariga på laboratoriet

Figur 1

Kromatogram över reaktionsprodukter från silylering som erhållits genom att lipas fått verka på en raffinerad olivolja med tillsats av 20 % esterifierad olja (100 %).

Förklaringar: ”Acides gras libres” = fria fettsyror; ”Huile d’olive raffinée + 20 % huile estérifiée” = raffinerad olivolja + 20 % esterifierad olja; ”1-2 monopalmitine” = 1-2 monopalmitin; ”1-2 mono C18 insat.” = omättat 1-2-mono-C18

Figur 2

Kromatogram över:

A) Olja som inte esterifierats efter lipas; efter silylering; under dessa betingelser (kapillärkolonn 8–12 m), elueras vaxfraktionen samtidigt som diglyceridfraktionen eller kort därefter. Efter lipaset skall triglyceridhalten inte överstiga 15 %. Förklaringar: 1.- = Fria fettsyror 2.- = Monoglycerider 3.- = Diglycerider 4.- = Triglycerider * = 2-monopalmitin ** = Triglycerid C54

Kromatogram över:

B) Olja som esterifierats efter lipas; efter silylering; under dessa betingelser (kapillärkolonn 8–12 m), elueras vaxfraktionen samtidigt som diglyceridfraktionen eller kort därefter. Efter lipaset skall triglyceridhalten inte överstiga 15 %. Förklaringar: 1.- = Fria fettsyror 2.- = Monoglycerider 3.- = Diglycerider 4.- = Triglycerider * = 2-monopalmitin ** = Triglycerid C54

8. ANMÄRKNINGAR

I handeln finns det lipaser med lämplig aktivitet. Det går också att bereda lipas i laboratorium enligt följande:

Kyl 5 kg färsk bukspottskörtel från svin till 0 °C. Ta bort omgivande fett och bindväv och kör återstoden i mixer så att en tunn massa erhålles. Rör massan i 4–6 timmar med 2,5 liter vattenfritt aceton och centrifugera sedan. Extrahera återstoden tre gånger till med samma mängd vattenfritt aceton, och sedan två gånger med en blandning av aceton/dietyleter (1:1) (v/v) och därefter två gånger med dietyleter.

Torka återstoden i vakuum i 48 timmar så att ett stabilt pulver erhålls. Detta skall lagras i kylskåp och skyddas från fukt.

Bered en olivoljeemulsion enligt följande:

Bered i mixer i 10 minuter en blandning av 165 ml lösning av gummi arabicum 100 g/l, 15 g krossad is och 20 ml av en neutraliserad olivolja.

Häll 10 ml av lösningen i en 50 ml glasbägare, tillsätt sedan 0,3 ml natriumkolatlösning på 0,2 g/ml och 20 ml destillerat vatten.

Placera bägaren i en termostat inställd på 37 °C. Sänk ned pH-elektroderna i bägaren och lägg i omröraren.

Tillsätt med hjälp av en byrett droppvis 0,1 N natriumhydroxidlösning tills pH går upp till 8,3.

Tillsätt en mängd lipassuspension i pulverform till vattnet (0,1 g/ml lipas). När pH-värdet uppmäts till 8,3, starta kronometern och tillsätt natriumhydroxidlösningen droppvis i den takt som krävs för att pH-värdet skall ligga kvar på 8,3. Anteckna varje minut mängden använd lösning.

Plotta mätvärdena i ett koordinatsystem med tiden på x-axeln och antal ml 0,1 N alkalilösning som gått åt för att bibehålla konstant pH på y-axeln. Resultatet skall bli en rät linje.

Lipasaktiviteten mätt i lipasenheter per mg erhålls genom följande formel:

där:

A är aktiviteten i lipasenheter/mg

V är antalet ml 0,1 N natriumhydroxidlösning per minut (grafisk beräkning)

N är normaliteten hos natriumhydroxidlösningen

m är massan i mg av försökslipaset

Lipasenheten definieras som den mängd enzym som frigör 10 mikroekvivalenter syra per minut.

▼M20 —————

▼B









BILAGA IX

SPEKTROFOTOMETRISK UNDERSÖKNING

INLEDNING

Spektrofotometrisk undersökning i ultraviolett ljus kan ge information om kvalitet på fett, dess grad av konservering och förändringar som inträffar i dem beroende på tekniska processer.

Absorptionen vid våglängderna som anges i metoden beror på närvaron av konjugerade dien- och triensystem. Dessa absorptioner uttrycks som specifika extinktioner E 1 % 1 cm (extinktionen av 1 % lösning av fettet i ett givet lösningsmedel med en tjocklek av 1 cm som konventionellt anges genom K (även kallad extinktionskoefficienten).

1. SYFTE

Förfarandet beskriver en metod för genomförande av spektrofotometrisk undersökning av fetter i ultraviolett ljus.

2. PRINCIP

Fettet i fråga löses i den behövliga mängden lösningsmedel och extinktionen hos lösningen bestäms sedan vid de angivna våglängderna med rent lösningsmedel som referens. Specifika extinktioner beräknas ur spektrofotometervärdena.

3. UTRUSTNING

3.1 En spektrofotometer för mätning av extinktion vid ultraviolettområdet mellan 220 och 360 nm med möjlighet till att avläsa enstaka nanometriska enheter.

3.2 Rektangulära quartzkuvetter med lock och med en optisk längd av 1 cm. När de är fyllda med vatten eller annat lämpligt lösningsmedel bör kuvetterna inte skiljas åt mer än 0,01 extinktionsenheter.

3.3 25 ml mätkolvar.

▼M6

3.4 En kromatografikolonn vars översta del är 270 mm lång med en diameter av 35 mm, och vars nedersta del är 270 mm lång med en diameter av cirka 10 mm.

▼B

4. REAGENSER

4.1 Spektrografren iso-oktan (2,2,4-trimetylpentan). Med destillerat vatten som referens skall denna ha en genomsläpplighet av minst 60 % vid 220 nm och minst 95 % vid 250 nm, eller — spektrografren cyklohexan. Med destillerat vatten som referens bör denna ha en genomsläpplighet av minst 40 % vid 220 nm och minst 95 % vid 250 nm, eller. ▼M6 ————— ▼B

4.2 Aluminumoxid för kolonnkromatografi som är iordningsställd och kontrollerad som beskrivits i bilaga 1.

4.3 N-hexan för kromatografi.

5. UTFÖRANDE

5.1 Provet i fråga måste vara helt homogent och utan misstänkta föroreningar. Oljor som är flytande vid den omgivande temperaturen skall filtreras genom papper vid en temperatur av ca 30 °C, hårdare fetter skall homogeniseras och filtreras vid en temperatur på högst 10 °C över smältpunkten.

5.2 Väg exakt in ungefär 0,25 g av provet som iordningsställts på detta sätt i en 25 ml mätkolv, späd till märket med det angivna lösningsmedlet och homogenisera. Den resulterande lösningen måste vara helt klar. Vid opalesens filtreras lösningen genom papper.

5.3 Fyll en kuvett med den erhållna lösningen och mät extinktionen vid en lämplig våglängd mellan 232 och 276 nm, med användande av lösningsmedlet som referens. Extinktionsvärdena som antecknas måste ligga inom området 0,1 till 0,8. Om de inte gör detta måste mätningarna göras om och mera koncentrerad eller mera utspädd lösning måste användas.

5.4 När en bestämning av den specifika extinktionen krävs efter passage över aluminiumoxid, görs det på följande sätt. Placera 30 g aluminumoxid i suspension i hexan i kromatografikolonnen. Sedan adsorbenten har satt sig, ta bort överskottet av hexan ned till ca 1 cm ovanför aluminumoxidets övre yta. Lös 10 g av fettet, homogeniserat och filtrerat som beskrivits i 5.1, i 100 ml hexan och häll lösningen i kolonnen. Samla upp eluatet och indunsta allt lösningsmedel i vakuum vid en temperatur under 25 °C. Fortsätt därefter omdelbart som angivits i 5.2 med användande av det fett som erhållits.

6. RESULTATANGIVELSE

6.1 Anteckna de specifika extinktionerna (extinktionskoefficienterna) vid de olika våglängderna och beräkna på följande sätt: där: Kλ = pecifika extinktionen vid våglängden λ Eλ = extinktionen uppmätt vid våglängden λ c = koncentrationen hos lösningen i g/100 ml s = tjockleken hos kuvetten i cm Resultaten uttrycks med två decimaler.

6.2 Spektrofotometrisk analys av olivolja enligt den officiella metoden i EEG:s förordningar anges bestämning av den specifika extinktionen i iso-oktanlösning vid våglängderna 232 och 270 nm och bestämning av Δ K som ges genom: där Km är den specifika extinktionen vid våglängden m, våglängden för maximal absorbtion runt 270 mm.









TILLÄGG I

Preparering av aluminumoxid och provning av dess aktivitet

A.1.1 Preparering av aluminumoxid Placera aluminumoxidet som har torkats i en ugn vid 380 till 400 °C i tre timmar i en hermetiskt sluten behållare, sätt till destillerat vatten i förhållandet 5 ml per 100 g aluminumoxid, stäng behållaren omedelbart, skaka flera gånger och låt stå i minst 12 timmar före användning.

A.1.2 Kontroll av aluminumoxidets aktivitet Gör i ordning en kromatografikolonn med 30 g aluminumoxid. Gör på samma sätt som beskrivits i punkt 5.4 och låt en blandning som består av — 95 % jungfruolja med en specifik extinktion på mindre än 0,18 vid 268 nm — 5 % jordnötsolja som behandlats med jord i raffineringsprocessen och som har en specifik extinktion av minst 4 vid 268 nm passera genom kolonnen. Om blandningen sedan den passerat kolonnen har en specifik extinktion av mer än 0,11 vid 268 nm kan aluminumoxidet accepteras, om inte måste dehydreringsnivån ökas.









TILLÄGG II

Kalibrering av fotospektrometer

A.2 Utrustningen måste kontrolleras med jämna mellanrum (minst var sjätte månad) både beträffande våglängderna och noggrannheten hos svaret. A.2.1 Våglängden kan kontrolleras med användning av kvicksilvergaslampa eller med hjälp av lämpliga filter. A.2.2 För att kontrollera svaret från fotocellen och fotomultiplikatorn gör på följande sätt: Väg in 0,2 g ren kaliumkromat för spektrofotometri och lös detta i 0,05 N kaliumhydroxidlösning i en 1 000 ml mätkolv och späd till märket. Ta ut exakt 25 ml av lösningen, överför det till en 500 ml mätkolv och späd upp till märket med samma kaliumhydroxidlösning. Mät extinktionen hos lösningen vid 275 nm med användning av kaliumhydroxidlösningen som referens. Den uppmätta extinktionen med användande av 1 cm kuvett bör vara 0,200 ± 0,005.









BILAGA X A

ANALYS AV METYLESTRAR AV FETTSYROR MED GASKROMATOGRAFI

1. SYFTE

Denna metod ger allmänna riktlinjer för tillämpning av gaskromatografi med användning av packade kolonner eller kapillärkolonner för att bestämma den kvalitativa och kvantitativa sammansättning av en blandning av fettsyremetylestrar som erhållits i enlighet med den metod som anges i bilaga 10 B.

Metoden är inte tillämplig på polymeriserade fettsyror.

2. REAGENSER

2.1 Bärargas

Inert gas (kväve, helium, argon, väte osv) som är omsorgsfullt torkad och med en syrehalt som är mindre än 10 mg/kg.

Anm 1:

Väte, som endast används som bärargas i kapillärkolonner, kan fördubbla analyshastigheten men är farlig. Säkerhetsanordningar finns att tillgå.

2.2 Supplementerande gaser

2.2.1 Väte (renhet ≥ 99,9 %) fri från organiska föroreningar.

2.2.2 Luft eller syre fri från organiska föroreningar.

2.3 Standard för referens

En blandning av metylestrar av rena fettsyror eller metylestrar av ett fett av känd sammansättning, företrädesvis liknande det fett som skall analyseras.

Försiktighet skall iakttas för att förhindra oxidation av fleromättade fettsyror.

3. UTRUSTNING

De anvisningar som ges här avser vanlig utrustning som används för gaskromatografi, som använder packade kolonner eller kapillärkolonner och en flamjoniseringsdetektor. Vilken apparatur som helst som ger effektiviteten och upplösningen som anges i 4.1.2 är lämplig.

3.1 Gaskromatograf

Gaskromatografen skall bestå av följande enheter.

3.1.1 Insprutningssystem Använd ett insprutningssystem a) med packade kolonner med minsta möjliga dödutrymme (i det här fallet skall insprutningssystemet kunna upphettas till en temperatur som är 20 till 50 °C högre än kolonnens, eller b) med kapillärkolonner, varvid insprutningssystemet skall vara speciellt konstruerat för användning med sådana kolonner. Injektorn kan vara med eller utan split. Anm 2: Vid frånvaro av fettsyror med minst 16 kolatomer kan ett insprutningssystem med rörlig nål användas.

3.1.2 Ugn Ugnen skall kunna värma kolonnen till en temperatur av minst 260 °C och upprätthålla den önskade temperaturen inom 1 °C med packad kolonn och inom 0,1 °C med kapillärkolonn. Det senaste kravet är särskilt viktigt när kvartsrör används. Användning av temperaturprogrammerad uppvärmning rekommenderas i alla fall och särskilt för fettsyror med mindre än 16 kolatomer.

3.1.3 Packad kolonn 3.1.3.1 En kolonn som är tillverkad av ett material som är inert mot de ämnen som skall analyseras (dvs glas eller rostfritt ståll och som har följande dimensioner: a) längd: 1 till 3 m. En relativt kort kolonn bör användas om fettsyror med långa kedjor (längre än C20) finns närvarande. I analys av fettsyror med 4 eller 6 kolatomer rekommenderas att en kolonn på 2 m i längd används. b) innerdiameter: 2 till 4 mm. Anm 3: Om fleromättade komponenter med fler än 3 dubbelbindningar finns närvarande kan de sönderdelas i en kolonn av rostfritt stål. Anm 4: Ett system med dubbla packade kolonner kan användas. 3.1.3.2 Fyllning, sammansatt av följande element a) bärare: syratvättad och silaniserad kiselgur, eller annan lämplig inert bärare med en kornstorlek med liten avvikelse (25 μm inom gränserna 125 till 200 μm) varvid genomsnittskornstorleken skall avpassas efter innerdiametern och längden på kolonnen. b) stationär fas: polyestertyp av polar vätska (t.ex. dietylenglykolpolysuccinat, butandiolpolysuccinat, etylenglykolpolyadipat, osv) cyanosilikoner eller någon annan vätska som tillåter den behövliga kromatografiska separationen (se punkt 4). Den stationära fasen bör uppgå till 5 till 20 % (m/m) av fyllningen. En ickepolar stationär fas kan användas för vissa separationer. 3.1.3.3 Preparering av kolonnen Om möjligt tas kolonnen bort från detektorn, ugnen upphettas stegvis till 185 °C och en ström av inert gas blåses igenom den nybehandlade kolonnen med en hastighet av 20 till 60 ml per minut i åtminstone 16 timmar vid denna temperatur och under ytterligare två timmar vid 195 °C.

3.1.4 Kapillärkolonn 3.1.4.1 Rör som är tillverkade av ett material som är inert för ämnen som skall analyseras (vanligen glas eller kvarts). Innerdiametern skall vara mellan 0,2 och 0,8 mm. Den inre ytan skall genomgå en lämplig behandling (t ex ytpreparering, inaktivering) innan den får täckning av den stationära fasen. En längd på 25 mm är tillräcklig i de flesta fall. 3.1.4.2 Stationär fas, vanligen av typen polyglykol [poly(etylenglykol) 20 000], polyester (butandiol polysuccinat) eller polärpolysiloxan (cyanosilikoner). Tvärbundna kolonnfyllningar är lämpliga. Anm 5: Det finns en risk att polära polysiloxaner ger upphov till svårighet att identifiera och separera linolensyra och C20-syror. Beläggningen skall vara tunn, dvs 0,1 till 0,2 μm. 3.1.4.3 Sammansättning och konditionering av kolonnen Följ de normala försiktighetsåtgärderna för att sätta ihop kapillärkolonnerna, dvs placeringen av kolonnen i ugnen (bärare) val och sammansättning av skarvar (läckaget) placering av kolonnens in- och utlopp i injektorn och detektorn (minskning av dödutrymmen). Placera kolonnen i en ström av bärargas [t.ex. 0,3 bar (30 kPa) för en kolonn med längden 25 mm och en innerdiameter på 0,3 mm]. Behandla kolonnen genom temperaturprogrammering av ugnen till 3 °C/minut från omgivningstemperaturen till en temperatur som är 10 °C under sönderfallsgränsen för den stationära fasen. Håll ugnen vid denna temperatur i en timme, tills baslinjen har stabiliserats. Gå tillbaka till 180 °C för att arbeta under isoterma förhållanden. Anm 6: Lämpliga förbehandlade kolonner finns tillgängliga i handeln.

3.1.5 Detektor som lämpligen skall kunna värmas upp till en temperatur som ligger ovanför kolonntemperaturen.

3.2 Sprutor

Sprutorna skall ha en maximivolym av 10 μl och vara graderade i 0,1 μl delning.

3.3 Registering

Om registreringskurvan skall användas för att beräkna sammansättningen av den blandning som analyseras, krävs en elektronisk registreringsapparat med hög precision och som är kompatibel med apparaturen som används. Registreringsenheten skall ha följande karaktäristika:

a) svarstid, under 1,5 sekunder, företrädesvis 1 sekund (svarshastigheten är tiden det tar för pennan att gå från 0 till 90 % vid en plötslig ingångssignal på 100 %),

b) pappersbredd minimum 20 cm,

c) pappershastighet inställbar på värden mellan 0,4 och 2,5 cm/minut.

3.4 Integreringsenhet

Snabb och exakt beräkning kan genomföras med hjälp av en elektronisk integreringsenhet. Den skall ge ett linjärt svar med tillräcklig känslighet och korrektionen för avvikelser från baslinjen skall vara tillfredsställande.

4. UTFÖRANDE

De arbeten som beskrivs i 4.1 till 4.3 är relaterade till användning av en flamjoniseringsdetektor.

Som alternativ kan en gaskromatograf som använder sig av en katarometerdetektor användas (som arbetar enligt principen om förändringar i värmeledning). Driftförhållandena modifieras som beskrivs i punkt 6.

4.1 Provningsförhållanden

4.1.1 Val av optimala provningsförhållanden. 4.1.1.1 Packad kolonn Vid val av provningsförhållanden skall hänsyn tas till följande variabler: a) längden och diametern hos kolonnen, b) sorten och mängden av den stationära fasen, c) temperaturen hos kolonnen, d) bärargasen flöde, e) den upplösning som krävs, f) storleken på det uttagna provet som har valts på ett sådant sätt att detektorn och elektrometer ger ett linjärt utslag, g) analysens tidslängd. I allmänhet ger de värden som anges i tabell 1 och tabell 2 de önskade resultatet, dvs minst 2 000 teoretiska bottnar per meter kolonnlängd för metylstearat och en elueringstid på ca 15 minuter. Om utrustningen tillåter skall injektorn hållas vid en temperatur av ca 200 °C och detektorn vid en temperatur som är lika med eller högre än den i kolonnen. Som regel gäller att förhållandet mellan flödet hos vätet som tillförs till flamjoniseringsdetektorn och bärargasen varierar från 1:2 till 1:1 beroende på diametern på kolonnen. Syreflödet är ca 5 till 10 gånger vätets flöde.



Tabell 1 Inre diameter hos kolonnen mm Bärargasflöde ml/min 2 15 till 25 3 20 till 40 4 40 till 60



Tabell 2 Koncentration av den stationära fasen % (m/m) Kolonntemperatur °C 5 175 10 180 15 185 20 185 4.1.1.2 Kapillärkolonn Effektivitets- och permeabilitetsegenskaperna hos kapillärkolonnen medför att separationen mellan komponenterna och tiden för analysen i hög grad är beroende av flödeshastigheten på bärargasen i kolonnen. Det är därför nödvändigt att optimera driftförhållandena genom att påverka denna parameter (eller enklare tryckfall i kolonnen) beroende på om man önskar förbättra separationen eller göra en snabb analys.

4.1.2 Bestämning av antalet teoretiska bottnar (effektivt) och upplösning (se figur 1). Genomför analys av en blandning av metylstearat och metyloleat i ungefär lika proportioner (t.ex. metylestrar av kakaosmör). Välj temperaturen för kolonnen och bärargasens flöde så att maximum på metylstearattoppen registreras ca 15 minuter efter lösningsmedelstoppen. Använd en tillräcklig mängd av blandningen av metylestrar så att metylstearattoppen upptar ungefär 3/4 av hela skalan. Beräkna antalet teoretiska bottnar, n, med hjälp av formeln och upplösningen R, med hjälp av formeln där: dr1 är retentionsavståndet i mm från början av kromatogrammet till maximitoppen för metylstearat, w1 och w2 är bredderna i mm av topparna för metylstearat respektive metyloleat mätt mellan punkterna för tangeternas skärningspunkt vid de punkter där kurvorna skär baslinjen, och Δ är avståndet i mm mellan toppmaxima för metylstearat och metyloleat, ▼M2 och upplösningsindex, lr, med hjälp av formeln där: a = höjden av den minsta toppen, mätt från baslinjen, b = höjden av den lägsta punkten på botten mellan de två angränsande topparna, mätt från baslinjen. ▼B Figur 1 Kromatogram för bestämning av antalet teoretiska bottnar (effektivitet) och upplösning Driftförhållandena som skall väljas är sådana som kan ge åtminstone 2 000 teoretiska bottnar per meter av kolonnlängden för metylstearat och en upplösning som är minst 1,25.

4.2 Prov

Använd sprutan (3.2) och sug upp 0,1 till 2 μl av lösningen av metylestrar som preparerats enligt bilaga 10 B och spruta in dem i kolonnen.

När det gäller estrar som inte är i lösning, preparera en lösning av ca 100 mg/ml av kromatografiskt ren heptan och spruta in 0,1 till 1 μl av denna lösning.

Om analysen gäller ämnen i spårmängder, kan mängden av provet ökas (upp till 10 gånger).

4.3 Analys

I allmänhet skall driftförhållandena vara de som angetts i 4.1.1.

Det går emellertid att arbeta med en lägre kolonntemperatur när det krävs bestämning av fettsyror med mindre än 12 kolatomer eller vid högre temperaturer vid bestämning av fettsyror med mera än 20 kolatomer.

Ibland kan det vara möjligt att använda temperaturprogrammering i båda dessa fall. Om provet t ex innehåller metylestrar av fettsyror med mindre än 12 kolatomer, sprutas provet in vid 100 °C (eller vid 50 till 60 °C om smörsyra finns närvarande) och sedan höjs temperaturen omedelbart med en hastighet av 4 till 8 °C per minut till optimal temperatur. I vissa fall kan de två förfarandena kombineras.

Efter den programmerade uppvärmningen fortsätts elueringen vid en konstant temperatur tills alla komponenterna eluerats. Om inte instrumentet har programmerad uppvärmning, använd det vid två bestämda temperaturer mellan 100 och 195 °C.

Om så är nödvändigt rekommenderas att analysen genomförs på två fasta faser med olika polaritet för att påvisa frånvaron av maskerade toppar t ex när det gäller samtidig närvaro av C18:3 och C20:0, eller C18:3 och C18:2.

4.4 Beredning av referenskromatogrammet och referensgraferna

Analysera referensstandardblandningen (2.3) med användande av samma driftförhållande som de som använts för provet och mät retentionstiderna eller retentionsavstånden för de närvarande fettsyrorna. Rita på halvlogaritmiskt papper för varje grad av omättnad de kurvor som visar den logaritmiska retentionstiden eller avståndet som en funktion av antalet kolatomer. Under isoterma förhållanden skall kurvorna för syror med raka kolkedjor med samma grad av omättnad vara räta linjer. Dessa linjer skall vara ungefär parallella.

Det är nödvändigt att undvika förhållanden som gör att ”maskerade toppar” existerar, dvs där upplösningen är otillräcklig för att separera två av de ingående ämnena.

5. RESULTATANGIVELSER

5.1 Kvalitativ analys

Identifiera topparna för metylestrarna från provet från de kurvor som iordningställts enligt 4.4 om så behövs genom interpolering.

5.2 Kvantitativ analys

5.2.1 Bestämning av sammansättningen Bortsett från extrema fall användes den inre normaliseringsmetoden, dvs antag att alla ingående komponenter i provet finns representerade på kromatogrammet så att den totala ytan under topparna representerar 100 % av de ingående ämnena (total eluering). Om utrustningen innefattar en integreringsenhet, använd de kurvor som erhållits från denna. Om inte, bestäm arean under varje topp genom att multiplicera höjden på toppen med dess bredd på mitten och där så behövs med hänsyn till de olika avvikelserna som används under registreringen.

5.2.2 Beräkningssätt 5.2.2.1 Allmänt fall Beräkna halten av en given komponent i, uttryckt som massprocent av metylestrar, genom att bestämma den procent som representeras av området hos motsvarande toppar relativt summan av områdena för alla toppar med användning av formeln: där: Ai är arean under toppen som motsvarar komponent i, ΣA är summan av areorna under alla toppar, Ange resultatet med en decimal. Anm 7: I det här allmänna fallet anses resultatet av beräkningen som baseras på relativa områden representera massprocent. För de fall där inte detta antagande är tillåtet, se 5.2.2.2. 5.2.2.2 Användning av korrektionsfaktorer I vissa fall, t.ex. i närvaro av fettsyror med färre än 8 kolatomer eller fettsyror med sekundära grupper, när termiska ledningsdetektorer används eller där högsta graden av noggrannhet särskilt krävs, skall korrektionsfaktorer användas för att omvandla procenten för toppareorna till massprocent hos komponenterna. Bestäm korrektionsfaktorerna med hjälp av ett kromatogram som erhållits genom analys av en referensblandning med metylestrar av känd sammansättning genomförda under identiskt samma förhållanden som de som används vid analys av provet. För denna referensblandning erhålls massprocenten av komponenten i genom formeln där: mi är massan hos komponenten i i referensblandningen. m är den totala massan av de olika komponenterna i referensblandningen. Beräkna ur kromatogrammet för referensblandningen (4.4) procenten (area/area) för komponent i på följande sätt: där: Ai är arean under toppen som motsvarar komponenten i, A är summan av areorna under alla topparna, Korrektionsfaktorn beräknas sedan som: Vanligen är korrektionsfaktorerna uttryckta relativt till KC16 så att de relativa faktorerna blir: För provet är innehållet av varje komponent i uttryckt som massprocent av metylestrar: Ange resultatet med en decimal. 5.2.2.3 Användning av inre standard I vissa analyser (t ex där inte alla fettsyrorna är kvantifierade, såsom när syror med fyra och sex kolatomer är närvarande tillsammans med syror med 16 och 18 kolatomer, eller när det är nödvändigt att bestämma den absoluta mängden fettsyror i ett prov) är det nödvändigt att använda en inre standard. Fettsyror med 5, 15 eller 17 kolatomer används ofta. Korrektionsfaktorn (om sådan finns) för den inre standarden bör bestämmas. Massprocenten av komponenten i, uttryckt som metylestrar, erhålls genom formeln: där: Ai är arean under toppen som motsvarar komponenten i, As är arean under toppen som motsvarar den inre standarden, K′i är korrektionsfaktorn för komponent i (relativ till KC16) K′s är korrektionsfaktorn för den inre standarden (relativt till KC16) m är massan i milligram av provet, och ms är massan i milligram av den inre standarden. Ange resultatet med en decimal.

▼M2

6. SPECIALFALL - BESTÄMNING AV TRANSISOMERER

Det är möjligt att bestämma innehållet av transisomerer i fettsyror med ett antal kolatomer mellan 10 och 24 genom separering av metylestrar med användning av gaskromatografiska kapillärkolonner med en bestämd polaritet.

6.1. En kapillärkolonn tillverkad av kiseldioxid med en innerdiameter av mellan 0,25 och 0,32 mm och en längd av 50 m, belagd med cyanpropylkiseldioxid, där beläggningen är mellan 0,1 och 0,3 μm (typ SP 2380, C. P. sil 88, silor 10 och likartade sorter).

▼M21

6.2. Metylestrarna skall beredas enligt förfarande B i bilaga X ”B”. Fettämnen med en halt av fria syror på över 3 % skall först neutraliseras enligt punkt 5.1.1 i bilaga VII.

▼M2

6.3. Gaskromatografens driftsförhållanden är i allmänhet följande: — Kolonntemperaturen inställd mellan 150 och 230° C (t. ex. 165° C i 15 minuter, och sedan ökad med 5° C per minut till 200° C). — Insprutningstemperatur: 250° C om splitsystemet används eller kolonnens ingångstemperatur om kolonnsystemet används. — Detektortemperatur: 260° C. — Genomströmningshastighet för bärargas (helium och väte): 1,2 ml per minut. Den insprutade mängden skall vara sådan att höjden hos den topp som under de sensoriska förhållanden som råder överensstämmer med arachinsyras metylester, är lika stor som eller större än 20 % av fullt utslag.

6.4. Identifieringen av de olika metylestrarna genomförs på grundval av retentionstiderna som jämförs med referensblandningarnas retentionstider (som anges i punkt 2.3). Estrarna från transfettsyrorna elueras före motsvarande cis-isomerer. Exempel på ett kromatogram finns i figur 2. Figur 2: Gaskromatogram för transisomerer från fettsyror vid användning av kapillärkolonner.

6.5. Kolonnen enligt punkt 4.1.2 skall vara så effektiv att den medger separation av vissa kritiska par, till exempel det par som består av transoljesyra och oljesyra, trans C18:1/cis C18:1, med ett resolutionstal högre än 2.

6.6. Procenten av de olika transfettsyrorna beräknas på grundval av förhållandet mellan den tillämpliga toppens area och summan av alla de förekommande topparnas areor. Därvid beaktas de procentuella andelarna av — transoktadekensyra (T 18:1) som anges i bilaga 1 till denna förordning som summan av isomererna av transoljesyra, — cis-trans- och trans-cis-oktadekadiensyra (CT/TC) 18:2 som anges i bilaga 1 till denna förordning som summan av isomererna av translinolsyra, — trans-cis-trans-, cis-cis-trans-, cis-trans-cis-, trans-cis-cis- oktadekatriensyra [TCT + CCT + CTC + TCC)]18:3, angivna i bilaga 1 till denna förordning som summan av isomererna av translinolensyra. Anmärkning 8: Ange resultaten med 2 decimaler vid beaktande av de särskilda kännetecknen för denna metod.

▼B

7. SPECIALFALL ANVÄNDNING AV KATAROMETERDETEKTOR (SOM REGIS