A.

Blockerande eller kompetitivt ELISA-test ska utföras i enlighet med följande protokoll: Det kompetitiva ELISA-testet med monoklonal antikropp 3-17-A3 kan påvisa antikroppar mot alla kända serotyper av blåtungevirus (BTV). Testets princip är att reaktionen mellan BTV-antigenet och en gruppspecifik monoklonal antikropp (3-17-A3) avbryts genom tillsats av testserum. Antikroppar mot BTV som finns i testserumet blockerar den monoklonala antikroppens (Mab) reaktivitet och leder till en minskning av den förväntade färgutvecklingen efter tillsats av enzymmärkt antimus-antikropp och kromogen/substrat. Serum kan testas i en enkel spädning 1:5 (spot test – tillägg 1) eller titreras (serumtitrering – tillägg 2) så att en sluttiter erhålls. Inhiberingsvärden över 50 % kan anses vara positiva. Material och reagens: 1. Mikrotiterplattor för ELISA-test. 2. Antigen: levereras som ett koncentrat extraherat ur celler, bereds enligt nedanstående beskrivning och lagras vid – 20 °C eller – 70 °C. 3. Blockerande buffert: fosfatbuffert (PBS) med 0,3 % BTV-negativt serum från vuxna nötkreatur, 0,1 % (v/v) Tween-20 (levereras som polyoxietylensorbitonmonolaurat-lösning) i PBS. 4. Monoklonal antikropp: 3-17-A3 (levereras som supernatant från odling av hybridomceller) riktad mot den gruppspecifika polypeptiden VP7, lagras vid – 20 °C eller frystorkad och spädd 1:100 med blockerande buffert före användning. 5. Konjugat: kanin-antimusglobulin (adsorberat och eluerat) konjugerat med pepparrotsperoxidas och förvarat mörkt vid 4 °C. 6. Kromogen och substrat: o-fenylendiamin (OPD-kromogen) med en slutlig koncentration på 0,4 mg/ml i sterilt destillerat vatten. 0,05 % (v/v) väteperoxid (30 % w/v substrat) tillsätts omedelbart före användning (5 μl H2O2 per 10 ml OPD). (Var försiktig vid hantering av OPD – använd gummihandskar – misstänks vara mutagent.) 7. 1 M svavelsyra: 26,6 ml svavelsyra i 473,4 ml destillerat vatten. (Kom ihåg – tillsätt alltid syra i vatten, aldrig vatten i syra.) 8. Orbitalskak. 9. ELISA-spektrofotometer (testet kan avläsas visuellt). Testformat Cc: konjugatkontroll (inget serum/ingen monoklonal antikropp); C++: starkt positiv serumkontroll; C+: svagt positiv serumkontroll; C-: negativ serumkontroll; Cm: monoklonal antikropp-kontroll (inget serum).



TILLÄGG 1 Spot test-spädning (1:5) (40 serum/platta) Kontroller Testserum 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A Cc C- 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 B Cc C- 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 C C++ C++ D C++ C++ E C+ C+ F C+ C+ G Cm Cm 40 H Cm Cm 40



TILLÄGG 2 Serumtitrering (10 serum/platta) Kontroller Testserum 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A Cc C- 1:5 1:5 B Cc C- 1:10 1:10 C C++ C++ 1:20 1:20 D C++ C++ 1:40 1:40 E C+ C+ 1:80 1:80 F C+ C+ 1:160 1:160 G Cm Cm 1:320 1:320 H Cm Cm 1:640 1:640 Testprotokoll: Konjugatkontroll (Cc) : Brunnarna 1A och 1B är blankprov som består av BTV-antigen och konjugat. Dessa kan användas för att nollställa ELISA-spektrofotometern. Mab-kontroll (Cm) : Kolumnerna 1 och 2, raderna G och H är monoklonal antikropp-kontroll och innehåller BTV-antigen, monoklonal antikropp och konjugat. Dessa brunnar motsvarar den kraftigaste färgreaktionen. Medelvärdet av absorbansvärdena från denna kontroll motsvarar 0 % inhibering. Positiv kontroll (C++, C+) : Kolumnerna 1 och 2, raderna C-D-E-F. Dessa brunnar innehåller BTV-antigen, starkt respektive svagt BTV-positivt antiserum, monoklonal antikropp och konjugat. Negativ kontroll (C-) : Brunnarna 2A och 2B är de negativa kontrollerna som innehåller BTV-antigen, BTV-negativt antiserum, monoklonal antikropp och konjugat. Testserum : För storskaliga serologiska undersökningar och snabb screening kan serum testas i en enda spädning på 1:5 (tillägg 1). Alternativt kan tio serum testas i spädningar mellan 1:5 och 1:640 (tillägg 2). Detta ger en viss indikation om antikroppstitern i testserumen. Metod: 1. Späd BTV-antigen till förtitrerad koncentration i PBS, och sonikera ett ögonblick för att sprida ackumulerat virus (pipettera kraftigt om det inte finns någon sonikator) och tillsätt 50 μl till alla brunnar i ELISA-plattan. Knacka på plattans sidor så att antigenet sprids. 2. Inkubera vid 37 °C i 60 minuter i orbitalskak. Tvätta plattorna tre gånger genom att fylla brunnarna med osteril PBS och tömma dem, och torka sedan med absorberande papper. 3. Kontrollbrunnar: Tillsätt 100 μl blockerande buffert till Cc-brunnarna. Tillsätt 50 μl positivt och negativt kontrollserum i spädningen 1:5 (10 μl serum + 40 μl blockerande buffert) till brunnarna C-, C+ respektive C++. Tillsätt 50 μl blockerande buffert till Mab-kontrollbrunnarna. Spottitrering: Tillsätt vart och ett av testserumen i spädningen 1:5 till dubbla brunnar i kolumnerna 3–12 (10 μl serum + 40 μl blockerande buffert). eller Serumtitrering: Bered en spädningsserie i 1:2-steg av varje prov (från 1:5 till 1:640) i blockerande buffert i åtta brunnar i vardera av kolumnerna 3–12. 4. Späd monoklonal antikropp 1:100 i blockerande buffert omedelbart efter det att testserumen tillsatts och tillsätt 50 μl till alla brunnar i plattan utom blankprovet. 5. Inkubera vid 37 °C i 60 minuter i orbitalskak. Tvätta tre gånger med PBS och torka med absorberande papper. 6. Späd kanin-antimuskoncentrat 1:5 000 i blockerande buffert och tillsätt 50 μl till alla brunnar i plattan. 7. Inkubera vid 37 °C i 60 minuter i orbitalskak. Tvätta tre gånger med PBS och torka med absorberande papper. 8. Tina o-fenylendiamindihydroklorid (OPD) och tillsätt omedelbart före användning 5 μl av 30 % väteperoxid för varje 10 ml OPD. Tillsätt 50 μl till alla plattans brunnar. Låt färg utvecklas i ungefär 10 minuter och avsluta reaktionen med 1 M svavelsyra (50 μl per brunn). Färg bör utvecklas i Mab-kontrollbrunnarna och i de brunnar som innehåller serum utan BTV-antikroppar. 9. Undersök och registrera plattorna, antingen visuellt eller med hjälp av en spektrofotometer. Analys av resultat: Använd programvaran för att skriva ut OD-värdena (optisk densitet) och procentuell inhibering (PI) för test- och kontrollserum på grundval av medelvärdet för antigenkontrollbrunnarna. OD- och PI-värden används för att bedöma testets tillförlitlighet. Övre kontrollgränser (UCL) och undre kontrollgränser (LCL) för Mab-kontrollen (antigen plus monoklonal antikropp utan testserum) ska ligga mellan OD-värdena 0,4 och 1,4. Plattor som inte uppfyller dessa kriterier ska kasseras. Om programvara inte finns tillgängligt skrivs OD-värdena ut med hjälp av ELISA-skrivaren. Beräkna medelvärdet av OD för antigenkontrollbrunnarna, och låt detta motsvara 100 %. Bestäm det OD-värde som motsvarar 50 % och beräkna manuellt hur positivt eller negativt varje prov är. Procentuell inhibering (PI) = 100 - (OD-värdet för varje testkontroll/medelvärdet för OD i Cm) × 100. De dubbla brunnarna för negativt kontrollserum och de dubbla blankproven måste ha PI-värden mellan + 25 % och – 25 % respektive mellan + 95 % och + 105 %. Om resultaten ligger utanför dessa värden betyder detta inte att plattan inte kan användas, utan att bakgrundsfärg håller på att utvecklas. De starka och svaga positiva kontrollserumen måste ha PI-värden mellan + 81 % och + 100 % respektive mellan + 51 % och + 80 %. Det diagnostiska tröskelvärdet för testserum är 50 % (PI 50 % eller OD 50 %). Prov med PI-värden > 50 % registreras som negativa. Prov med PI-värden över eller under tröskelvärdena för dubbelkontrollerna ska betraktas som tveksamma. Sådana prov kan testas om med spot test och/eller titrering. Positiva prov kan också titreras för att man ska få en uppfattning om hur positiva de är. Visuell avläsning: Positiva och negativa prov kan lätt urskiljas med blotta ögat. Svagt positiva eller starkt negativa prov kan dock vara svårare att bedöma med blotta ögat. Beredning av BTV-ELISA-antigen: 1. Skölj ur 40–60 odlingsflaskor med konfluenta BHK-21-celler tre gånger med serumfritt Eagles-medium och infektera med blåtungevirus serotyp 1 i serumfritt Eagles-medium. 2. Inkubera vid 37 °C och undersök dagligen för cytopatisk effekt (CPE). 3. Samla in viruset när CPE är fullständig i 90 % till 100 % av cellagret i varje odlingsflaska genom att skaka av alla celler som fortfarande sitter kvar på glaset. 4. Centrifugera vid 2 000 -3 000 rpm för att pressa samman cellerna. 5. Avlägsna supernatanten och slamma upp cellerna på nytt i cirka 30 ml PBS med 1 % ”Sarkosyl” och 2 ml fenylmetylsulfonylfluorid (lyseringsbuffert). Detta kan få cellerna att bilda en gel, vilket kan motverkas genom att mer lyseringsbuffert tillsätts. (OBS: Fenylmetylsulfonylfluorid är skadligt – hanteras med yttersta försiktighet.) 6. Slå sönder cellerna i 60 sekunder med en ultraljudssond med en amplitud på 30 μm. 7. Centrifugera vid 10 000 rpm i 10 minuter. 8. Lagra supernatanten vid + 4 °C och slamma på nytt upp den återstående cellpelleten i 10–20 ml lyseringsbuffert. 9. Sonikera, låt klarna och ta vara på supernatanten. Detta upprepas sammanlagt tre gånger. 10. Slå samman supernatanterna och centrifugera vid 24 000 rpm (100,000 g) i 120 minuter vid + 4 °C på en 5 ml kudde bestående av 40 % sackaros (w/v i PBS) med 30 ml Beckmann centrifugrör och en SW 28-rotor. 11. Ta bort supernatanten, töm rören helt och lös de centrifugerade cellerna igen i PBS genom att sonikera. Lagra antigenen i alikvoter vid – 20 °C. Titrering av BTV-ELISA-antigen: Blåtunge-ELISA-antigen titreras med indirekt ELISA. Spädningar i 1:2-steg av antigen titreras mot en konstant spädning (1:100) av monoklonal antikropp 3-17-A3. Titreringen utförs enligt följande: 1. BTV-antigen som spätts 1:20 i PBS titreras på mikrotiterplattan i en spädningsserie i 1:2-steg (50 μl per brunn) med hjälp av en flerkanalspipett. 2. Inkubera vid 37 °C i en timme i orbitalskak. 3. Tvätta plattorna tre gånger med PBS. 4. Tillsätt 50 μl monoklonal antikropp 3-17-A3 (spädning 1:100) till varje brunn på mikrotiterplattan. 5. Inkubera vid 37 °C i en timme i orbitalskak. 6. Tvätta plattorna tre gånger med PBS. 7. Tillsätt 50 μl kanin-antimusglobulin konjugerat med pepparrotsperoxidas, utspätt till en optimal förtitrerad koncentration, till varje brunn på mikrotiterplattan. 8. Inkubera vid 37 °C i en timme i orbitalskak. 9. Tillsätt substrat och kromogen enligt den tidigare beskrivningen. Avsluta reaktionen efter 10 minuter genom att tillsätta 1 M svavelsyra (50 μl per brunn). Vid det kompetitiva testet måste det finnas ett överskott av monoklonal antikropp. Välj därför en antigenspädning som ligger på titreringskurvan (inte på den plana delen). Efter 10 minuter erhålls då ett OD-värde på ca 0,8.