1994D0577 — SV — 01.05.2004 — 003.001 — 1
Detta dokument är endast avsett som dokumentationshjälpmedel och institutionerna ansvarar inte för innehållet
►B KOMMISSIONENS BESLUT
av den 15 juli 1994
om djurhälsokrav och utfärdande av veterinärintyg vid import av tjursperma från tredje land
(94/577/EG)
(EGT L 221, 26.8.1994, s. 26)
Ändrat genom:
Officiella tidningen
nr sida datum
►M1Kommissionens beslut 1999/495/EG av den 1 juli 1999 L 192 56 24.7.1999
►M2Kommissionens beslut 2004/52/EG av den 9 januari 2004 L 10 67 16.1.2004
Ändrat genom:
►A1Akt om villkoren för Republiken Tjeckiens, Republiken Estlands, Repu-
bliken Cyperns, Republiken Lettlands, Republiken Litauens, RepublikenUngerns, Republiken Maltas, Republiken Polens, Republiken Sloveniensoch Republiken Slovakiens anslutning till de fördrag som ligger till
grund för Europeiska Unionen och om anpassning av fördragenL 236 33 23.9.2003
▼B
KOMMISSIONENS BESLUT
av den 15 juli 1994
om djurhälsokrav och utfärdande av veterinärintyg vid import av
tjursperma från tredje land
(94/577/EG)
EUROPEISKA GEMENSKAPERNAS KOMMISSION HAR ANTAGIT
DETTA DIREKTIV
med beaktande av Fördraget om upprättandet av Europeiska gemenska-
pen,
med beaktande av rådetsdirektiv 88/407/EEG av den 14 juni 1988 om
djurhälsokrav som är tillämpliga vid handel inom gemenskapen medoch import av sperma från tamdjur av nötkreatur (
1), senast ändat
genom direktiv 93/60/EEG (2), särskilt artiklarna 10 och 11 i detta, och
med beaktande av följande:
Förteckningen över de tredje länder från vilka medlemsstaterna tillåter
import av tjursperma (nedan benämnd ”Förteckningen över tredjeländer”) fastställs i kommissionens beslut 90/14/EEG (
3), ändrat genom
beslut 91/276/EEG (4).
På grund av sjukdomssituationen i Israel infördes genom kommission-
ensbes lut 91/277/EEG (5) ett förbud mot import från det landet.
I kommissionens beslut 91/479/EEG (6), 91/549/EEG (7), 92/123/
EEG (8), 92/124/EEG (9), 92/125/EEG (10), 92/126/EEG (11), 92/127/
EEG (12), 92/128/EEG (13), 92/386/EEG (14), 92/387/EEG (15) och 92/
445/EEG (16) fastställs kraven på djurens hälsa och villkoren för
utfärdande av veterinärintyg vid import av tjursperma från USA,Canada, Polen, Finland, Nya Zeeland, Österrike, Schweiz, Sverige,Ungern, Norge respektive Tjeckoslovakien.
Genom direktiv 93/60/EEG, vilket skall vara genomfört i medlemssta-
terna före den 1 juli 1994, ändras direktiv 88/407/EEG på ett sätt somgör det nödvändigt att ändra i de beslut avseende tredje land somnämns ovan. För att förenkla och förtydliga gemenskapens lagstiftningpå detta område är det nödvändigt att sammanställa de ovan nämnda
besluten till ett gemensamt beslut och att upphäva giltigheten för dem
som gäller enskilda länder.
Tack vare bestämmelserna i Avtalet om Europeiska ekonomiska samar-
betsområdet är det inte nödvändigt att bibehålla kravet på
djurhälsointyg vid import av tjursperma från Österrike, Finland, Norge
och Sverige.
Enligt yttrandet från Vetenskapliga veterinärmedicinska kommittén är
det nödvändigt att införa ett test avseende epizootisk hemorragisksjukdom.
Rutinmässiga förhandstester av denna sjukdom med sex månaders
intervaller sker endast i Canada.1994D0577 — SV — 01.05.2004 — 003.001 — 2
(1) EGT nr L 194, 22.7.1988, s. 10.
(2) EGT nr L 186, 28.7.1993, s. 28.
(3) EGT nr L 8, 11.1.1990, s. 71.
(4) EGT nr L 135, 30.5.1991, s. 58.
(5) EGT nr L 135, 30.5.1991, s. 60.
(6) EGT nr L 258, 16.9.1991, s. 1.
(7) EGT nr L 298, 29.10.1991, s. 6.
(8) EGT nr L 48, 22.2.1992, s. 1.
(9) EGT nr L 48, 22.2.1992, s. 10.
(10) EGT nr L 48, 22.2.1992, s. 19.
(11) EGT nr L 48, 22.2.1992, s. 28.
(12) EGT nr L 48, 22.2.1992, s. 37.
(13) EGT nr L 48, 22.2.1992, s. 46.
(14) EGT nr L 204, 21.7.1992, s. 13.
(15) EGT nr L 204, 21.7.1992, s. 22.
(16) EGT nr L 247, 27.8.1992, s. 1.
▼B
För att ge de kanadensiska veterinärmyndigheterna tillräckligt med tid
för att införa det nya testet i sitt rutinprogram är det därför nödvändigtmed en övergångsperiod för införandet av detta beslut vad avser
Canada.
Framstegen på senare tid vad avser förståelsen av bluetongue-epide-
miologin gör det möjligt att framdelestillåta import av tjurs permafrån Australien.
Det förefaller som om djurhälsosituationen i de länder som finns med
på förteckningen över tredje länder är god och att den vad avser sjuk-domar som kan överföras via sperma kontrolleras av välstrukturerade
och välorganiserade veterinärväsende.
De ansvariga veterinärmyndigheterna i de tredje länderna har åtagit sig
att underrätta kommissionen och medlemsstaterna via telex eller telefaxsenast 24 timmar efter bekräftelse på förekomsten av någon av de sjuk-domar som finns på Internationella byrån för epizootiska sjukdomarOIEsförteckning A eller på varje förändring av vaccinations politiken
som berör dem, eller -inom rimlig tid - på förekomsten av sjukdomar
på OIEs förteckning B samt på varje föreslagen ändring av importreg-lerna för husdjur eller för sperma eller embryon av husdjur.
De ansvariga veterinärmyndigheterna i de länder som finns med på
förteckningen över tredje länder har åtagit sig att officiellt övervakautfärdandet av intyg enligt detta beslut och att säkerställa att samtligarelevanta intyg, avvikelser och laboratorieresultat som legat till grund
för utfärdandet av intyget förblir officiellt registrerade i minst 12
månader efter att sperman som de avser har avsänts.
De ansvariga veterinärmyndigheterna i de länder som finns med på
förteckningen över tredje länder har åtagit sig att för stationer förinsamling av tjursperma avsedd att exporteras till Europeiska ekono-miska gemenskapen ansvara för det officiella godkännande som
fastställs i artikel 9 i direktiv 88/407/EEG.
Kraven på djurenshäls a och villkoren för utfärdandet av veterinärintyg
skall anpassas till djurhälsosituationen i det berörda tredje landet.
De åtgärder som föreskrivs i detta beslut är förenliga med yttrandet
från den Ständiga veterinärkommittén.
HÄRIGENOM FÖRESKRIVS FÖLJANDE.
Artikel 1
Medlemsstaterna skall tillåta import av tjursperma som uppfyller de
krav som anges i intygen i del 1 av bilagorna A, B, C och D samtendast från de länder som anges i del 2 av bilagorna A, B, C respektiveD.
Fram till den 31 december 1994 skall dock medlemsstaterna tillåta
import från Canada av tjursperma som samlats in och behandlats i
enlighet med beslut 91/549/EEG.
Artikel 2
Beslut 91/479/EEG, 92/123/EEG, 92/124/EEG, 92/125/EEG, 92/126/
EEG, 92/127/EEG, 92/128/EEG, 92/386/EEG, 92/387/EEG, och 92/445/EEG skall upphöra att gälla.
Beslut 91/549/EEG skall upphöra att gälla från och med den 1 januari
1995.
Artikel 3
Bestämmelserna i artikel 1 första stycket skall i fråga om Canada gälla
från och med den 1 januari 1995.
Artikel 4
Detta beslut riktar sig till medlemsstaterna.1994D0577 — SV — 01.05.2004 — 003.001 — 3
▼B
BILAGAA
DEL I
DJURHÄLSOINTYG
för import av tjursperma
1994D0577 — SV — 01.05.2004 — 003.001 — 4
▼B
1994D0577 — SV — 01.05.2004 — 003.001 — 5
▼B
►(1) (2)M11994D0577 — SV — 01.05.2004 — 003.001 — 6
▼A1
DEL 2
Förteckning över länder som får använda det djurhälsointyg som visas i del
1 i bilaga A
NYA ZEELAND
RUMÄNIEN
SCHWEIZ1994D0577 — SV — 01.05.2004 — 003.001 — 7
▼B
BILAGAB
DEL I
DJURHÄLSOINTYG
för import av tjursperma från USA
1994D0577 — SV — 01.05.2004 — 003.001 — 8
▼B
1994D0577 — SV — 01.05.2004 — 003.001 — 9
▼B
►(1) (2)M11994D0577 — SV — 01.05.2004 — 003.001 — 10
▼B
DEL 2
Förteckning över länder som får använda det djurhälsointyg som visas i
bilaga B del 1
USA1994D0577 — SV — 01.05.2004 — 003.001 — 11
▼B
BILAGAC
DEL I
DJURHÄLSOINTYG
för import av tjursperma
1994D0577 — SV — 01.05.2004 — 003.001 — 12
▼B
1994D0577 — SV — 01.05.2004 — 003.001 — 13
▼B
►(1) (2)M11994D0577 — SV — 01.05.2004 — 003.001 — 14
▼B
DEL 2
Förteckning över länder som får använda det djurhälsointyg som visas i
bilaga C del 1
CANADA: dock inte regionen Okanagan Valley i British Columbia, dvs. det
område som avgränsas av en linje dragen från en punkt på gränsenmellan Canada och USA 120º 15 ′longitud, 49º latitud nord till en
punkt 119º 35 ′longitud, 50º 30 ′latitud nordost till en punkt 119º
longitud, 50º 45 ′latitud syd till en punkt på gränsen mellan Canada
och USA 118º 15 ′longitud och 49º latitud.1994D0577 — SV — 01.05.2004 — 003.001 — 15
▼B
BILAGAD
DEL I
DJURHÄLSOINTYG
för import av tjursperma
1994D0577 — SV — 01.05.2004 — 003.001 — 16
▼B
1994D0577 — SV — 01.05.2004 — 003.001 — 17
▼B
►(1) (2)M11994D0577 — SV — 01.05.2004 — 003.001 — 18
▼B
DEL 2
Förteckning över länder som får använda det djurhälsointyg som visas i
bilaga D del 1
AUSTRALIEN1994D0577 — SV — 01.05.2004 — 003.001 — 19
▼B
BILAGAE
Protokoll avseende ett kompetitivt Elisa-test med användning av en grupps-
pecifik monoklonal antikropp (MAB) avsett påvisa eventuell förekomst av
antikroppar mot bluetongue-virus
KOMPETITIVT ELISA PÅ FÖREKOMST AV BLUETONGUE MED
ANVÄNDNING AV MONOKLONAL ANTIKROPP 3-17-A3
Testet kan användas för att påvisa förekomsten av antikroppar mot alla kända
serotyper av bluetongue-virus (BTV).
Testprincipen är den att avbryta reaktionen mellan BTV-antigen och en grupps-
pecifik monoklonal antikropp (3-17-A3) genom att tillsätta utspädningar av
testserum. Antikroppar mot BTV i testserumet blockerar den monoklonala antik-
roppensförmåga att reagera och medför en mins kning av den färgutveckling
som förväntas vid tillsättning av enzymsubstrat.
MATERIAL OCH REAGENSER
1. Flatbottnade mikrotiterplåtar.
2. Antigen, beredd enligt beskrivningen nedan.
3. Blockerande buffertlösning: 5 % (mw/w) ”Marvel” torrmjölkpulver, 0,1% (v/
v) Tween-20 (levereras som polyoxyetylensorbitonmonolauratsirap) i fosfat-
buffrad saltlösning (PBS).
4. Monoklonal antikropp: 3-17-A3 (levereras som hybridom cellkultur superna-
tant), lagras vid −20 ºC eller frystorkad, utspädd till förhållandet 1:50 med
blockerande buffertlösning före användning, riktad mot den gruppspecifika
polypeptiden P7.
5. Konjugat: kanin-antimusglobulin (absorberat och eluerat), konjugerat till
pepparrotsperoxidase och förvarat i mörker vid 4 ºC.
6. Substrat och kromogen: 0,2 g ortofenyldiamin (OPD) upplöst i en buffertlös-
ning bestående av 2,553 g citronsyra och 4,574 g
dinatriumhydrogenortofosfat, vilken tillsatts destillerat vatten upp till
sammanlagt 500 ml, uppdelad i alikvoter om 25 ml och förvarad i mörker
vid −20 ºC och med tillsättning av 12 µl/25 ml väteperoxid (30 % w/v)
omedelbart före användningen.
IAKTTAG FÖRSIKTIGHET VID HANTERING AV OPD — BÄR
GUMMIHANDSKAR — MISSTÄNKS VARA MUTAGEN.
7. 1 Molar svavelsyra: 26,6 ml syra blandat i 473,4 ml destillerat vatten.
KOM IHÅG — DET ÄR SYRAN SOM SKALL BLANDAS I VATTNET,
ALDRIG VATTNET I SYRAN.
8. Roterande blandare.
9. Elisa-plåtläsare (provet kan avläsas visuellt).1994D0577 — SV — 01.05.2004 — 003.001 — 20
▼B
TESTFORMAT
1994D0577 — SV — 01.05.2004 — 003.001 — 21
▼B
TESTPROTOKOLL
Blindprovkontroll
1 A-H är en blindprovkontroll bestående av BTV-antigen och konjugat. Det kan
användas som ett blindprov för Elisa-läsaren.
KontrollavMAB2 A-H är kontrollen av den monoklonala antikroppen och består av BTV-
antigen, monoklonal antikropp och konjugat. Den är en negativ kontroll.
Medelvärdet av absorbansavläsningar från denna kontrollrad utgör inhibi-
tionsvärdet 0 %.
Positiv kontroll3 A-H är den positiva kontrollen. Den består av BTV-antigen, BTV-positiva
antiserumutspädningar, MAB och konjugat. Den är avsedd som en indikator
på att provet fungerar som det skall och inhibitionsnivåerna bör vara lika
från test till test.
Testserum
Enligt testformatet ovan kan 18 serum provas med ett utspädningsförhållande
av 1/2, 1/4, 1/8 och 1/16. Detta ger en viss antydan om antikropptitern i test-
serumet. Utspädningsserien kan utökas ytterligare så att titerna för
serumutspädning når slutpunkten. Alternativt kan serum vid storskaliga sero-
logiska undersökningar provas i en enkel utspädning (1/4) eller två
utspädningar (1/2 och 1/4) som ett snabbscreeningprov.
TILLVÄGAGÅNGSSÄTT
1. Späd ut BTV-antigen till förtitrerad koncentration i fosfatbuffrad saltlösning
(PBS), ultraljudsbehandla ett kort ögonblick för att sprida ut ackumulerat
virus (om ultraljudsutrustning inte finns tillgänglig, pipettera kraftigt) och
tillför 50 µl i Elisa-plåtens alla hål. Knacka på plåtens sidor så att antigenet
sprids.
2. Inkubera vid 37 ºC i 60 minuter i en roterande blandare. Tvätta plåtarna 3
gånger genom att skölja ur och tömma hålen med osteril PBS och läska torrt
med absorberande papper.
3. Tillsätt 50 µl blockerande buffertlösning i varje hål. Tillsätt testserum och
positivt serum i relevanta hål och späd ut utmed hela plåten med hjälp av
en flerkanalspipett. Tillsätt inte serum till blindprovkontrollen eller MAB-
kontrollen.
4. Späd, omedelbart efter tillsatsen av testserum, ut MAB i den blockerande
buffertlösning (för att förtitrera lösningen) och tillför 50 µl i plåtensalla
hål, dock inte för blindprovkontrollen.
5. Inkubera vid 37 ºC i 60 minuter i en roterande blandare. Skölj ur tre gånger
med PBS och läska torrt.
6. Späd ut kanin-antimuskoncentrat till 1/5 000 i blockerande buffertlösning och
tillsätt 50 µl i plattansalla hål.
7. Inkubera vid 37 ºC i 60 minuter i en roterande blandare. Skölj ur tre gånger
med PBS och läska torrt.
8. Tina OPDn och tillsätt omedelbart före användningen 12 µl av 30 % väteper-
oxid i varje 25 ml OPD. Tillsätt 50 µl i samtliga hål i plåten. Låt färgen
utvecklas i ca. 10 minuter och stoppa reaktionen med 1 M svavelsyra (50 µl
per hål). Färgen skall utvecklas i MAB-kontrollhålen och i de hål som
innehåller serum UTAN antikropp mot BTV.
9. Granska och registrera plåtarna visuellt eller med en spektrofotometrisk
läsare.
ANALYS AV RESULTATEN
Beräkna medelavläsningen för OD med hjälp av MAB-kontrollerna. Detta repre-
senterar inhibitionsvärdet 0 %. Absorbansavläsningar av testserumen uttrycks
som procent inhibitionsvärden med hjälp av följande formel:
Procent inhibitionsv¨ arde¼100/C0
OD vid f¨ orekomst av testserum
OD vid fr ˚anvaro av testserum/C2100
Större inhibitionsvärden än 40 % vid serumutspädning ¼ anses som positiva.
Visuell avläsning är möjlig eftersom 40 % inhibition är det lägsta värdet som
ögat lätt kan urskilja.1994D0577 — SV — 01.05.2004 — 003.001 — 22
▼B
BEREDNING AV BTV ELISA-ANTIGEN
1. Tvätta 10 roux konfluenta BHK-21-celler tre gånger med serumfritt Eagles
medium och infektera med bluetongue-virus, serotyp 1 i serumfritt Eagles
medium.
2. Inkubera vid 37 ºC och undersök dagligen med avseende på cytopatisk
effekt (CPE).
3. 3.Om CPE kan konstateras i 80-90 % av cellskiktet i varje roux skall viruset
samlas in genom att skaka loss de celler som eventuellt sitter kvar på glaset.
4. Centrifugera vid 2 000-3 000 vpm för att pressa samman cellerna.5. Tag bort supernatanten och slamma cellerna på nytt i ca. 30 ml PHS som
innehåller 1 % ”Sarkosyl” och 2 ml fenolmetylsulfonylfluorid (lysisbuffert).
Detta kan medföra att cellerna bildar en gelé och ytterligare lysisbuffert kan
tillförasför att mins ka denna effekt.
OBS!Fenylmetylsulfonylflorid är skadligt - iakttag mycket stor försiktighet.
6. Spräng cellerna i 60 sekunder med en ultraljudssond vid en amplitud av 30
mikron.
7. Centrifugera vid 10 000 vpm i 10 minuter.
8. Förvara supernatanten vid +4 ºC och slamma den kvarvarande cellmassan i
10-20 ml lysisbuffert.
9. Ultraljudsbehandla och genomför en klarning, med förvaring av superna-
tanten i varje skede, sammanlagt tre gånger.
10. Samla supernatanterna och centrifugera vid 24 000 vpm i 120 minuter vid
+4 ºC på en 5 ml kudde av 40 % sackaros (w/v i PBS) med hjälp av 30
ml centrifugrör typ Beckmann och en SW 28-rotor.
11. Tag bort supernatanten, töm rören helt och slamma massan i PBS med hjälp
av ultraljud. Förvara antigenen i alikvoter vid −70 ºC.
TITRERING AV BTV ELISA-ANTIGEN
Bluetongue Elisa-antigen titreras med indirekt Elisa. Dubbla utspädningar av
antigen titreras mot en konstant utspädning (1:50) av monoklonal antikropp (3-
17-A3). Här följer protokollet:
TILLVÄGAGÅNGSSÄTT
1. Späd ut BTV-antigen i PBS över hela mikrotiterplåten i en dubbel
utspädningsserie (50 µl/hål) med en flerkanalspipett.
2. Inkubera i en timme vid 37 ºC i en roterande blandare.
3. Skölj plåtarna tre gånger med PBS.4. Tillför 50 µl monoklonal antikropp 3-17-A3 (utspädd 1:50) i varje hål på
mikrotiterplåten.
5. Inkubera i en timme vid 37 ºC i en roterande blandare.6. Skölj plåtarna tre gånger med PBS.
7. Tillsätt i varje hål av mikrotiterplåten 50 µl kanin-antimusglobulin konjugerat
till pepparotsperoxidas, utspätt till en förtitrerad optimal koncentration.
8. Inkubera i en timme vid 37 ºC i den roterande blandaren.
9. Tillsätt substrat och kromogen enligt tidigare beskrivning. Stoppa reaktionen
efter 10 minuter genom att tillsätta 1 Molar svavelsyra (50 µl/hål).
Vid det kompetitiva testet skall det finnas ett överskott på monoklonal antik-
ropp. Därför skall en utspädning av antigenet väljas som ligger på
titreringskurvan (inte på den plana delen), vilket ger ca 0,8 OD efter 10 minuter.1994D0577 — SV — 01.05.2004 — 003.001 — 23
▼B
Protokoll för ett agargelimmunodiffusionstest avsett att påvisande den ev.
förekomsten av antikroppar mot epizootisk hemorragisk sjukdom
Agargelimmunodiffusionstestet skall utföras enligt följande protokoll:
MATERIAL OCH REAGENSER
1. Antigen
Antigen som fäller ut förbereds i ett cellodlingssystem som klarar den snabba
förökningen av de aktuella serotyperna av epizootisk hemorragiskt sjukdoms-
virus. BKH eller Vero-celler rekommenderas. Antigen förekommer i den
supernatanta vätskan när virustillväxten har upphört, men kräver en 50-100-
faldig koncentration för att vara effektiv. Denna kan erhållasmed en s tan-
dardprocedur för proteinkoncentrering. Virusi antigenet kan inaktiveras
genom att tillsätta 0,3 % (v/v) betapropiolakton.
2. Känt positiv kontrollserum
Med hjälp av det internationella referensserumet och antigen framställs ett
nationellt standardserum, vilket standardiseras i det optimala förhållandet
mot det internationella referensserumet, frystorkas och används som det
kända kontrollserumet i varje prov.
3. Testserum
TILLVÄGAGÅNGSSÄTT
1. 1 % agaross om berettsi borat eller natriumbarbitolbuffert, pH 8,5 till 9,
hälls i en petriskål med ett djup av minst 3 mm.
2. Ett testmönster bestående av sju fuktfria hål, vardera 5,0 mm i diameter,
skärs i agaren. Mönstret består av ett mitthål och, runt detta, sex hål utlagda
i en cirkel med en radie av 3 mm.
3. Hålet i mitten fyllsmed s tandardantigenet. De kringliggande hålen 2, 4 och 6
fylls med känt positivt serum medan hålen 1, 3 och 5 fylls med testserum.
4. Systemet inkuberas i upp till 72 timmar vid rumstemperatur i en stängd fukt-
kammare.
TOLKNING
Ett testserum är positivt om det bildar en tydlig utfällningslinje med antigenet
och en obruten identitetslinje med kontrollserumet. Ett testserum är negativt
om det inte bildar en tydlig linje med antigenet och inte böjer kontrollserumets
linje. Petriskålarna skall granskas i indirekt belysning mot en mörk bakgrund.1994D0577 — SV — 01.05.2004 — 003.001 — 24