1992R3942 — SV — 03.02.1999 — 002.001 — 1
Detta dokument är endast avsett som dokumentationshjälpmedel och institutionerna ansvarar inte för innehållet
►B KOMMISSIONENS FÖRORDNING (EEG) nr 3942/92
av den 22 december 1992
om införande av en referensmetod för bestämning av sitosterol och stigmasterol i smörolja
(EGT L 399, 31.12.1992, s. 29)
Ändrad genom:
Officiella tidningen
nr sida datum
►M1Kommissionens förordning (EEG) nr 2539/93 av den 15 september 1993 L 233 1 16.9.1993
►M2Kommissionens förordning (EG) nr 175/1999 av den 26 januari 1999 L 20 22 27.1.1999
1992R3942 — SV — 03.02.1999 — 002.001 — 2
▼B
KOMMISSIONENS FÖRORDNING (EEG) nr 3942/92
av den 22 december 1992
om införande av en referensmetod för bestämning av sitosterol och
stigmasterol i smörolja
EUROPEISKA GEMENSKAPERNAS KOMMISSION HAR ANTAGIT
DENNA FÖRORDNING
med beaktande av Fördraget om upprättandet av Europeiska ekono-
miska gemenskapen,
med beaktande av rådets förordning (EEG) nr 804/68 av den 27 juni
1968 om den gemensamma organisationen av marknaden för mjölk ochmjölkprodukter(
1), senast ändrad genom förordning (EEG) nr 2071/
92 (2), särskilt artikel 6 i denna, och
med beaktande av följande:Smörolja skall vara försett med ett spårämne och den spårämnesförs-
edda smöroljan skall kontrolleras i enlighet med kommissionens förord-ning (EEG) nr 3143/85 (
3), senast ändrad genom förordning (EEG) nr
1264/92 (4), särskilt artiklarna 5 oc h 6 i denna.
Smörolja får vara försett med ett spårämne och spårämnesförsedda
produkter skall kontrolleras i enlighet med kommissionens förordning(EEG) nr 570/88 (
5), senast ändrad genom förordning (EEG) nr 124/
92 (6), särskilt artiklarna 3 oc h 6 i denna.
Smörolja skall vara försett med ett spårämne och den spårämnesförs-
edda smöroljan skall kontrolleras i enlighet med kommissionens förord-ning (EEG) nr 429/90 (
7), senast ändrad genom förordning (EEG) nr
1264/92, särskilt artiklarna 10 och 11 i denna.
För att förebygga risken att subventionerat smör används på otillåtet sätt
är det viktigt att villkoren avseende tillsats av spårämne till smöroljauppfylls till fullo.
Med hänsyn till att tillsats av spårämnen spelar en viktig roll inom dessa
stödsystem, är det nödvändigt att fastställa gemensamma metoder förpåvisning av alla de spårämnen som krävs enligt dessa system, vilkametoder skall tillämpas på samma sätt inom hela gemenskapen. Dettaskulle bland annat säkerställa lika behandling av samtliga aktörer somkan utnyttja dessa system samt undanröja ojämlika konkurrensvillkorsom för närvarande kan förekomma till följd av att olika nationellaanalysmetoder tillämpas.
Det är svårt att fastställa sådana referensmetoder för samtliga
spårämnen samtidigt. Fastställandet av en referensmetod för påvisningav stigmasterol och sitosterol i smörolja utgör ett första steg i dennariktning.
De åtgärder som föreskrivs i denna förordning är förenliga med
yttrandet från Förvaltningskommittén för mjölk och mjölkprodukter.
HÄRIGENOM FÖRESKRIVS FÖLJANDE.
(1) EGT nr L 148, 28.6.1968, s. 13.
(2) EGT nr L 215, 30.7.1992, s. 64.
(3) EGT nr L 298, 12.11.1985, s. 9.
(4) EGT nr L 135, 19.5.1992, s. 5.
(5) EGT nr L 55, 1.3.1988, s. 31.
(6) EGT nr L 14, 21.1.1992, s. 28.
(7) EGT nr L 45, 21.2.1990, s. 8.
1992R3942 — SV — 03.02.1999 — 002.001 — 3
▼B
Artikel 1
▼M1
Den referensmetod för analys som anges i bilagan skall tillämpas förbestämning av innehållet av stigmasterol i smörolja i enlighet medartikel 6 i förordning (EEG) nr 3143/85, artikel 6 i ►
M2förordning
(EG) nr 2571/97 ◄eller artikel 11 i förordning (EEG) nr 429/90, och
för bestämning av innehållet av β-sitosterolhalten i smörolja i enlighet
med artikel 6 i ►M2förordning (EG) nr 2571/97 ◄.
▼B
Smörolja har tillsatts spårämnen på korrekt sätt om de erhållna resul-taten överensstämmer med de krav som anges i punk t 8 i bilagan till
denna förordning.
Artikel 2
Denna förordning träder i kraft den tredje dagen efter det att den har
offentliggjorts i Europeiska gemenskapernas officiella tidning .
Den skall tillämpas från och med den 1 februari 1993.
Denna förordning är till alla delar bindande och direkt tillämplig i alla
medlemsstater.
1992R3942 — SV — 03.02.1999 — 002.001 — 4
▼B
BILAGA
BESTÄMNING AV SITOSTEROL ELLER STIGMASTEROL I
SMÖROLJA GENOM GASKROMATOGRAFI MED KAPILLÄRKO-
LONN
1. RÄCKVIDD OCH TILLÄMPNINGSOMRÅDE
Metoden utgörs av ett förfarande för kvantitativ bestämning av sitosterol
eller stigmasterol i smörolja. Med sitosterol förstås summan av β-sitos-
terol och 22-dihydro- β-sitosterol, andra sitosteroler anses vara utan bety-
delse. Metoden skall tillämpas på prover som tagits i enlighet medförordningarna (EEG) nr 3143/85, (EEG) nr 570/88 och (EEG) nr 429/90.
2. PRINCIP
Smöroljan förtvålas med kaliumhydroxid i en etanollösning och de
icke-förtvålningsbara beståndsdelarna extraheras med dietyleter.
Sterolerna omvandlas till trimetylsilyletrar och analyseras genom gask-
romatografi med en kapillärkolonn med betulin som intern standard.
3. UTRUSTNING
3.1. En 150 ml kolv till förtvålning med återloppskylare med inslipade
anslutningar.
3.2. 500 ml separertratt.3.3. 250 ml kolvar.3.4. Tryckutjämningsrör, 250 ml eller motsvarande, för att samla upp över-
bliven dietyleter.
3.5. Glaskolonn, 350 mm × 20 mm med sintrad glaspropp.3.6. Vattenbad eller värmemantel.3.7. Reaktionskärl, 2 ml.3.8. Gaskromatograf lämplig för kapillärkolonn med split-injektionssystem,
bestående av:
3.8.1. termostatstyrd kolonnugn som kan hålla den önskade temperaturen med
en noggrannhet av ± 1 °C.
3.8.2. förångningsenhet med temperaturinställning,3.8.3. flamjoniseringsdetektor och signalomvandlingsförstärkare,3.8.4. integrerad skrivare som kan användas tillsammans med signalomvand-
lingsförstärkaren (3.8.3).
3.9. Kapillärkolonn i kvartsglas helt belagd med BP1 eller likvärdigt med en
enhetlig tjocklek av 0,25 µm. Kolonnen skall kunna separera trimetylsi-
lylderivat av lanosterol och sitosterol; en BP 1-kolonn på 12 m med eninre diameter på 0,2 mm är lämplig.
3.10. En 1 µl mikrospruta för gaskromatografi med härdad nål.
4. REAGENSER
Alla reagenser skall vara av för analytiska ändamål godkänd klass.
Vattnet skall vara destillerat eller vatten med minst motsvaranderenhetsgrad.
4.1. Etanol med en lägsta renhetsgrad av 95 %.4.2. Kaliumhydroxid, 60-procentig lösning: lös 600 g kaliumhydroxid (minst
85 %) i vatten och späd med vatten till 1 liter.
4.3. Betulin med en lägsta renhetsgrad av 99 %.4.3.1. Intern standardlösning. Betulin i dietyleter (4.4).4.3.1.1. Betulinlösning som används vid bestämning av sitosterol skall ha
koncentrationen 1,0 mg/ml.
4.3.1.2. Betulinlösning som används vid bestämning av stigmasterol skall ha
koncentrationen 0,4 mg/ml.
1992R3942 — SV — 03.02.1999 — 002.001 — 5
▼B
4.4. Analytiskt ren dietyleter (fri från peroxider och återstod).
4.5. Natriumsulfat, vattenfritt granulat som torkats vid 102 °C i två timmar.
4.6. Silyleringsreagens, t. ex. TRI-SIL (kan beställas från Pierce Chemical
Co., katalognr: 49001) eller motsvarande. (VARNING: TRI-SIL ärlättantändligt, frätande, giftigt och möjligen cancerogent. Laboratorie-personal skall ha kännedom om säkerhetsbestämmelserna för TRI-SILoch vidta lämpliga försiktighetsåtgärder.)
4.7. Lanosterol.4.8. Sitosterol, med en fastställd lägsta renhetsgrad av 90 % (P).
Anmärkning 1: Renhetsgraden hos standardämnen som används för
kalibrering skall bestämmas med tillämpning av standardiseringsprin-cipen. Antag att alla steroler som finns i provet finns representerade påkromatogrammet, att topparnas totala area representerar 100 % av sterol-beståndsdelarna och att sterolerna ger samma detektorrespons. Systemetslinjäritet skall kontrolleras för de aktuella koncentrationsområdena.
4.8.1. Standardlösning av sitosterol - bered en lösning som med 0,001 mg/ml
noggrannhet innehåller ca 0,5 mg/ml (W
1) sitosterol (4.8) i dietyleter
(4.4).
4.9. Stigmasterol med en fastställd lägsta renhetsgrad av 90 % (P).4.9.1. Standardlösning av stigmasterol — bered en lösning som med 0,001
mg/ml noggrannhet innehåller ca 0,2 mg/ml (W
1) stigmasterol (4.9) i
dietyleter (4.4).
4.10. Lösning för kontroll av separationsförmågan. Bered en lösning som
innehåller 0,05 mg/ml lanosterol (4.7) och 0,5 mg/ml sitosterol (4.8) idietyleter (4.4).
5. FÖRFARANDE
5.1. Beredning av standardlösningar för kromatografi. Den interna standard-
lösningen (4.3.1) skall tillsättas den aktuella sterolstandardlösningensamtidigt som den tillsätts det förtvålade provet (se 5.2.2).
5.1.1. Standardkromatografilösning för sitosterol: överför 1 ml sitosterolstan-
dardlösning (4.8.1) till vart och ett av de två reaktionskärlen (3.7) ochavlägsna dietyletern med kväve. Tillsätt 1 ml intern standardlösning(4.3.1.1) och avlägsna dietyletern med kväve.
5.1.2. Standardkromatografilösning för sitosterol: överför 1 ml stigmasterols-
tandardlösning (4.9.1) till vart och ett av de två reaktionskärlen (3.7) ochavlägsna dietyletern med kväve. Tillsätt 1 ml intern standardlösning(4.3.1.2) och avlägsna dietyletern med kväve.
5.2. Beredning av icke-förtvålbara beståndsdelar5.2.1. Väg med 1 mg noggrannhet upp ca 1 g smörolja (W
2) i en 150 ml kolv
(3.1). Tillsätt 50 ml etanol (4.1) och 10 ml kaliumhydroxidlösning (4.2).Montera återloppskylaren och värm till ca 75 °C i 30 minuter. Avlägsna
kylaren och kyl kolven till rumstemperatur.
5.2.2. Tillsätt 1,0 ml intern standardlösning (4.3.1.1) i kolven om det är sitos-
terol som skall bestämmas, eller (4.3.1.2) om det är stigmasterol somskall bestämmas. Blanda väl. Överför kolvens innehåll kvantitativt tillen 500 ml separertratt (3.2) och skölj kolven med 50 ml vatten och 250ml dietyleter (4.4). Skaka separertratten kraftigt i två minuter och låtfaserna separera. Den nedre vattenhaltiga fasen tappas av och eterfasentvättas genom att separertratten skakas fyra gånger med 100 ml vattenvardera.
Anmärkning 2: För att undvika att en emulsion bildas, är det viktigt att
de två första vattentvättningarna utförs försiktigt (tratten vänds tiogånger). Vid tredje tvättningen kan tratten skakas kraftigt i 30 sekunder.Om en emulsion bildas, kan den brytas ned genom tillsats av 5-10 mletanol. Om etanol tillsätts, är det viktigt att utföra ytterligare två grund-liga tvättningar med vatten.
5.2.3. Den klara, tvålfria eterfasen får passera en glaskolonn (3.5) som inne-
håller 30 g vattenfritt natriumsulfat (4.5). Etern uppsamlas i en 250 mlkolv (3.3). Tillsätt en koksten och förånga etern nästan helt i vattenbadeller värmeisolerande mantel och samla noggrant upp resterandelösningsmedel.
Anmärkning 3: Om provextrakt förångas fullständigt vid för hög tempe-
ratur kan sterolförlust förekomma.
1992R3942 — SV — 03.02.1999 — 002.001 — 6
▼B
5.3. Beredning av trimetylsilyletrar
5.3.1. Överför den resterande eterlösningen i kolven till ett 2 ml reaktionskärl
(3.7) med 2 ml dietyleter och avlägsna etern med en kväveström. Sköljkolven ytterligare två gånger med 2 ml dietyleter. Innehållet överförsvarje gång till reaktionskärlet och etern förångas med kväve.
5.3.2. Provet silyleras genom tillsats av 1 ml TRI-SIL (4.6). Förslut kärlet och
skaka kraftigt så att provet löses. Om det inte löses fullständigt genomskakning, värm till 65-70 °C. Låt stå i minst fem minuter innan det
sprutas in i gaskromatografen. Silylera standardlösningarna på sammasätt som provet. Silylera lösningen för kontroll av separationsförmågan(4.10) på samma sätt som proven.
Anmärkning 4: Silylering skall ske i vattenfri miljö. Ofullständig sily-
lering av betulin indikeras av en andra topp intill betulinetstopp.Förekomst av etanol kommer att påverka silyleringen. Om tvätt-ningen i extraktionsskedet är otillräcklig kan detta problem uppstå. Omproblemet kvarstår kan en femte tvättning göras under extraktionenvarvid reaktionskärlet skakas kraftigt i 30 sekunder.
5.4. Gaskromatografisk analys5.4.1. Kromatografiförhållanden
Förbered gaskromatografen enligt bruksanvisningen.Riktlinjerna för kromatografins utförande är följande:
— kolonntemperatur 265 °C
— insprutningstemperatur 280 °C
— detektortemperatur 300 °C
— bärargasens flödeshastighet 0,6 ml/minut— vätets tryck 84 kPa— lufttryck 155 kPa— splitsystemet ställs in på mellan 10:1 och 50:1 och optimeras i
enlighet med bruksanvisningen, varefter detektorresponsens linjäritetkontrolleras inom de aktuella koncentrationsområdena.
Anmärkning 5: Det är särskilt viktigt att injektionssystemets linerinsats
rengörs regelbundet.Insprutad mängd: 1 µl trimetylsilyleterlösning.
Systemet skall vara i jämvikt och responsen stabil innan analysen
påbörjas.
Dessa förhållanden kan varieras om särskilda egenskaper hos kolonnen
och gaskromatografen gör det nödvändigt för att erhålla kromatogramsom uppfyller följande krav:
— Sitosteroltoppen skall vara tydligt skild från lanosteroltoppen. Figur
1 visar hur ett typiskt kromatogram av en silylerad lösning förkontroll av separationsförmågan (4.10) skall se ut.
— Den relativa retentionstiden för följande steroler bör vara ungefär
kolesterol 1,0,
stigmasterol 1,3,sitosterol 1,5,betulin 2,5.
— Retentionstiden för betulin bör vara ungefär 24 minuter.
5.4.2. Analysförfarande
Spruta in 1 µl silylerad standardlösning (stigmasterol eller sitosterol) och
justera integratorns kalibreringsparametrar.
Spruta in ytterligare 1 µl silylerad standardlösning för bestämning av
responsfaktorerna för betulin.
Spruta in 1 µl silylerad provlösning och mät topparnas areor. Varje
kromatografisk serie skall inledas och avslutas med insprutning av stan-dardlösningar.
Som regel bör en standardlösning insprutas efter varje serie om sex
insprutningar av provlösning.
Anmärkning 6: Integrering av stigmasteroltoppen bör inbegripa even-
tuell svansning enligt definition i punkterna 1, 2 oc h 3 i figur
2b.Integrering av sitosteroltoppen bör inbegripa toppen för 22-
1992R3942 — SV — 03.02.1999 — 002.001 — 7
▼B
dihydro- β-sitosterol (stigmastanol) som eluerar omedelbart efter sitos-
terol, se figur 3b, när den totala kvantiteten sitosterol bestäms.
6. BERÄKNING AV RESULTAT
6.1. Bestäm arean för steroltopparna och betulintopparna i båda referenskro-
matogrammen kring en serie och beräkna R1på följande sätt:
R1=Genomsnittlig toppareal för sterol i standardlösning
Genomsnittlig toppareal för betulin i standardlösning
Bestäm arealen för steroltoppen (stigmasterol eller sitosterol) och betu-
lintoppen i provet och beräkna R2på följande sätt:
R2=Toppareal för sterol i provet
Toppareal för betulin i provet
W1= Mängden sterol (mg )i1m l standardlösning (4.8.1 eller 4.9.1).
W2= Provets vikt (5.2.1).
P = Standardsterolens renhetsgrad (4.8 eller 4.9).
Mängden sterol i provet mg/kg =R2
R1×W1
W2×P×1 0 .
7. METODENS NOGGRANNHET
7.1. Repeterbarhet7.1.1. Stigmasterol
Skillnaden mellan resultaten av två analyser som inom kortast möjliga
tidsintervall utförts av samma kemist med användning av samma utrust-ning på identiskt lika prover får inte överstiga 10,2 mg/kg.
7.1.2. Sitosterol
Skillnaden mellan resultaten av två analyser som inom kortast möjliga
tidsintervall utförts av samma kemist med användning av samma utrust-ning på identiskt lika prover får inte överstiga 3,6 % av genomsnittet avresultaten.
7.2. Reproducerbarhet7.2.1. Stigmasterol
Skillnaden mellan resultaten av två analyser som utförts av olika
kemister i olika laboratorier med användning av olika utrustningar påidentiskt lika prover får inte överstiga 25,3 mg/kg.
7.2.2. Sitosterol
Skillnaden mellan resultaten av två analyser som utförts av olika
kemister i olika laboratorier med användning av olika utrustningar påidentiskt lika prover får inte överstiga 8,9 % av genomsnittet av resul-taten.
7.3. Källa till precisionsdata
Precisionsdata bestämdes genom ett experiment som utfördes 1991 i nio
olika laboratorier och med sex prover (tre dubbla blindtester) för stig-masterol, sex prover (tre dubbla blindtester) för sitosterol.
8. TOLERANSGRÄNSER
▼
M28.1 Tre prover skall tas från den spårade produkten för att kontrollera att
produkten har spårats på rätt sätt.
▼B8.2. Stigmasterol
8.2.1. 150 g stigmasterol med en lägsta renhetsgrad av 95 % iblandas per ton
smörolja, dvs. 142,5 mg/kg, eller 170 g stigmasterol med en lägstarenhetsgrad av 85 % per ton smörolja, dvs. 144,5 mg/kg.
1992R3942 — SV — 03.02.1999 — 002.001 — 8
▼M28.2.2 Analysresultaten av de tre produktproverna skall användas för att
kontrollera renhetsgraden och homogeniteten av spårämnets iblandningoch det lägsta resultatet skall jämföras med följande gränser (med ettkonventionellt konfidensintervall på 95 % (CrD95)):— 120,0 mg/kg (95 % av den minsta tilllåtna iblandningen för stigmas-
terol med en lägsta renhetsgrad av 95 %).
— 122,0 mg/kg (95 % av den minsta tilllåtna iblandningen för stigmas-
terol med en lägsta renhetsgrad av 85 %).
— 84,0 mg/kg (70 % av den minsta tillåtna iblandningen för stigmas-
terol med en lägsta renhetsgrad av 95 %).
— 86,0 mg/kg (70 % av den minsta tillåtna iblandningen för stigmas-
terol med en lägsta renhetsgrad av 85 %).
Koncentrationen av spårämne i det prov som ger det lägsta resultatetjämförs med en interpolering mellan antingen 120,0 mg/kg och 84,0mg/kg eller 122,0 mg/kg och 86,0 mg/kg.
▼
B8.3. Sitosterol8.3.1. 600 g sitosterol med en lägsta renhetsgrad av 90 % iblandas per ton
smörolja, dvs. 540 mg/kg.
▼
M28.3.2 Analysresultaten av de tre produktproverna skall användas för att
kontrollera renhetsgraden och homogeniteten av spårämnets iblandningoch det lägsta resultatet skall jämföras med följande gränser (med ettkonventionellt konfidensintervall på 95 % (CrD95)):— 486,0 mg/kg (95 % av den minsta tilllåtna iblandningen för sitosterol
med en lägsta renhetsgrad av 90 %).
— 358,0 mg/kg (70 % av den minsta tilllåtna iblandningen för sitosterol
med en lägsta renhetsgrad av 90 %).
Koncentrationen av spårämne i det prov som ger det lägsta resultatetjämförs med en interpolering mellan 486,0 mg/kg och 358,0 mg/kg.
1992R3942 — SV — 03.02.1999 — 002.001 — 9
▼B
Figur 1 Kromatogram av lösning för kontroll av separationsförmåga,
Det bästa är om topparna är helt åtskilda, dvs. att linjen för lanosterol-
toppen går ner till baslinjen innan den går upp till sitosteroltoppen. Enviss överlappning kan tolereras.

1992R3942 — SV — 03.02.1999 — 002.001 — 10
▼B
Figur 2a
Standardstigmasterol

1992R3942 — SV — 03.02.1999 — 002.001 — 11
▼B
Figur 2b
Smöroljeprov denaturerat med stigmasterol
Anmärkning: Integrering av stigmasteroltoppen bör inbegripa eventuell svans-
ning som av gränsas av punkt 1, 2 och 3.
1992R3942 — SV — 03.02.1999 — 002.001 — 12
▼B
Figur 3a
Standardsitosterol

1992R3942 — SV — 03.02.1999 — 002.001 — 13
▼B
Figur 3b
Smöroljeprov denaturerat med β-sitosterol
Anmärking: β-sisterol innehåller ofta en orenhet (identifierad som stigmasterol)
som cluerar onmedelbart efter β-sitosterol. Dessa två toppars arealer bör adderas
vid bestämning av det totala innehållet av β-sitosterol.