10.

Bilaga 4 skall ersättas med följande text och diagram:



‘BILAGA 4 BESTÄMNING AV VAXINNEHÅLLET GENOM GASKROMATOGRAFI MED KAPILLÄRKOLONN 1. SYFTE Denna metod beskriver en procedur för bestämning av vaxinnehållet i vissa fetter och oljor efter testförhållanden. Den används särskilt för att skilja mellan olivolja som framställts genom pressning och olivolja som framställts genom extraktion. 2. PRINCIP En lämplig intern standard tillsätts till fettet eller oljan varefter fraktionering sker genom kromatografi på en hydrerad kiselgelkolonn. Den fraktion som först elueras under testförhållandena (och som har lägre polaritet än triglyceriderna) samlas upp och analyseras därefter direkt med hjälp av gaskromotografi med kapillärkolonner. 3. UTRUSTNING 3.1. 25 ml Erlenmeyerkolv. 3.2. Glaskolonn för kromatografi, 15 mm invändig diameter och 30 40 cm lång. 3.3. En lämplig gaskromatograf som kan fungera med en kapillärkolonn och som är utrustad med ett system för direkt insprutning i kolonnen och som består av följande: 3.3.1. Termostatstyrd ugn för kolonnerna, som kan hålla önskad temperatur med en noggrannhet av ± 1 C. 3.3.2. Kall injektor för direkt insprutning i kolonnen. 3.3.3. Flamjoniseringsdetektor och konverter/förstärkare. 3.3.4. Skrivare/integrator som kan fungera med konvertern/förstärkaren (3.3.3) med svarstider under 1 sekund och med variabel pappershastighet. 3.3.5. Kapillärkolonn av glas eller sintrat kvarts, 10-15 mm lång, 0,25-0,32 mm invändig diameter, täckt med SE-52 eller SE-54 vätskefas eller motsvarande och med en enhetlig tjocklek på 0,10-0,30 μm. 3.4. Mikrosprutor på 10 l med härdad nål för direkt insprutning i kolonnen. 4. REAGENS 4.1. Kiselgel, 70 230 mesh, artikel 7754 Merck. Placera kiselgelen i ugnen vid 500 C i fyra timmar. Låt svalna och tillsätt sedan 2 % vatten. Skaka ordenligt för att homogenisera uppslamning. Förvara mörkt i minst 12 timmar innan användning. 4.2. n-hexan för kromatografi. 4.3. Etyleter för kromatografi. 4.4. n-heptan för kromatografi. 4.5. Standardlösning av 0,1 % (m/v) laurylarachidat i hexan (intern standard). 4.6. Bärargas: ren väte för gaskromatografi. 4.7. Hjälpgaser: — ren väte för gaskromatografi. — ren luft för gaskromatografi. 5. UTFÖRANDE 5.1. Separation av vaxfraktionen. 5.1.1. Preparering av kromatografikolonnen. Slamma15 g kiselgel hydrerad med 2 % vatten i vattenfri n-hexan och spruta in i kolonnen. Låt sedimentera av sig självt. Slutför sedimenteringen med hjälp av en elektrisk skakare för att göra det kromatografiska bandet mer homogent. Filtrera 30 ml n-hexan för att avlägsna eventuella orenheter. 5.1.2. Kolonnkromatografi Vägmed exakthet upp 500 mg av provet i en 25 ml kolv och tillsätt en passande mängd intern standard, beroende på det uppskattade vaxinnehållet, t. ex. tillsätt 0,1 mg laurylarachidat till pressad olivolja, och 0,25-0,5 mg till extraherad olivolja. Föröver det preparerade provet till kromatografikolonnen, preparerad enligt 5.1, med hjälp av två 2 ml portioner n-hexan. Låtlösningsmedlet stå 1 mm över kolonnmaterialet. Starta sedan kromatografielueringen. Samla upp 140 ml av n-hexan/etyleterblandningen i förhållandet 99:1, med en hastighet på cirka 15 droppar var 10:e sekund (2,1 ml/minut). Torka den framtagna fraktionen i en rotationsindunstare tills nästan allt lösningsmedel försvunnit. Avlägsna de sista 2 eller 3 ml av lösningsmedlet med hjälp av en svag kväveström och tillsätt sedan 10 ml n-heptan. 5.2. Analys med gaskromatografi 5.2.1. Förberedelser och konditionering av kolonnen 5.2.1.1. Montera kolonnen på gaskromatografen genom att ansluta inloppet till injektionssystemet och utloppet till detektorn. Kontrollera gaskromatografen (att gasanslutningarna är täta, detektorns och skrivarens effektivitet, etc.). 5.2.1.2. Om kolonnerna används för första gången är det bra att konditionera dem. Låt en liten mängd bärargas flyta genom kolonnen och sätt sedan på gaskromatografen. Värm upp den gradvis till en temperatur på minst 20 °C över drifttemperaturen (OBS!). Behåll denna temperatur i minst två timmar och ställ därefter in apparaturen enligt driftförhållandena (inställning av gasflöde, tändning av delningsflamma, anslutning till den elektroniska registreringen, inställning av temperaturen i kolonnens ugn, detektorn och injektorn). Ställ in signalen på en känslighet som är minst två gånger högre än den nivå som krävs för att utföra analysen. Baslinjen skall vara linjär, inte ha några toppar och får inte visa på några avvikelser. En negativ rätlinjig avvikelse tyder på att kolonnen inte är korrekt ansluten. En positiv avvikelse tyder på att kolonnen inte har blivit ordentligt konditionerad. Temperaturen vid konditioneringen skall alltid vara minst 20 °C under den maximala temperaturen som anges för den vätskefas som används. 5.2.2. Val av driftförhållanden 5.2.2.1. Driftförhållandena är normalt enligt följande: — Kolonntemperatur: 80 °C till en början med en stegring på 30 °C/minut till 120 °C, med en därpå följande programmering till en stigning med 5 °C/minut upp till 340 °C, — detektortemperatur: 350 °C, — linjär hastighet för bärargasen: väte 20-35 cm/sekund, — instrumentets känslighet: 4-16 gånger högre än minimikänsligheten, — registreringskänslighet: 1-2 mV, från skalans nedersta ände, — pappershastighet: 30 cm/timme, — insprutad mängd: 0,5-1 μl lösning. Dessa förhållanden kan ändras med hänsyn till kolonnens och gaskromatografens egenskaper (för att uppnå kromatogram som uppfyller följande villkor: retentionstider för C32 intern standard måste vara 25 ± 2 minuter, och vaxens mest representativa topp måste ligga på mellan 60 och 100 % från skalans nedersta ände). 5.2.2.2. Bestäm parametrarna för toppens integration på ett sådant sätt att en korrekt uppskattning av de ifrågavarande toppareorna erhålls. 5.2.3. Analysförfarande 5.2.3.1. Sug med hjälp av en mikrospruta på 10 μl upp 1 μl av lösningsmedlet. Dra tillbaka kolven tills sprutan är tom. För in nålen i injektionssystemet och injicera snabbt efter 1-2 sekunder. Efter cirka 5 sekunder dras nålen försiktigt ut. 5.2.3.2. Utför registreringen tills alla vaxer är helt eluerade. Baslinjen måste alltid uppfylla de fastställda villkoren (5.2.1.2). 5.2.4. Identifiering av toppar Identifiera topparna utifrån retentionstiderna genom att jämföra dem med blandningar av vaxer med kända retentionstider analyserade under samma förhållanden. Figur 1 visar ett vaxkromatogram av jungfruolja. 5.2.5. Kvantitativ analys 5.2.5.1. Bestäm de av toppareorna som motsvarar den interna standarden och de alifatiska estrarna från C40-C46 med hjälp av integratorn. 5.2.5.2. Vaxinnehållet i var och en av estrarna erhålls i mg/kg fettämne med följande formel: alkohol (mg/kg) = Ax · ms · 100As · m där: Ax = den area som motsvarar toppen för varje ester, As = den area som motsvarar laurylarachidatetoppen, ms = den area som motsvarar det tillsatta laurylarachidatet i milligram, m = den massa som provet som tagits ut för analys, i gram. 6. RESULTATANGIVELSE De olika vaxinnehållen och summan av dessa anges i mg/kg fettämnen. TILLÄGG Bestämning av gasens linjära hastighet Spruta in 1 3 μl metan (propan) i gaskromatografen sedan den ställts in till de normala driftförhållandena. Mät den tid det tar för gasen att gå igenom kolonnen, från det att den sprutas in tills toppen framgår (tM). Den linjära hastigheten i cm/sekund erhålls genom formeln L/tM där L är kolonnens längd i cm och tM är den uppmätta tiden i sekunder.’