1991R2568 — SV — 22.05.2002 — 019.001 — 1
Detta dokument är endast avsett som dokumentationshjälpmedel och institutionerna ansvarar inte för innehållet
►B KOMMISSIONENS FÖRORDNING (EEG) nr 2568/91
av den 11 juli 1991
om egenskaper hos olivolja och olivolja av pressrester och om lämpliga analysmetoder
(EGT L 248, 5.9.1991, s. 1)
Ändrad genom:
Officiella tidningen
nr sida datum
►M1Kommissionens förordning (EEG) nr 3682/91 av den 17 december 1991 L 349 36 18.12.1991
►M2Kommissionens förordning (EEG) nr 1429/92 av den 26 maj 1992 L 150 17 2.6.1992
►M3Kommissionens förordning (EEG) nr 1683/92 av den 29 juni 1992 L 176 27 30.6.1992
►M4Kommissionens förordning (EEG) nr 1996/92 av den 15 juli 1992 L 199 18 18.7.1992
►M5Kommissionens förordning (EEG) nr 3288/92 av den 12 november 1992 L 327 28 13.11.1992
►M6Kommissionens förordning (EEG) nr 183/93 av den 29 januari 1993 L 22 58 30.1.1993
►M7 ändrad genom commission Regulation (EEC) No 826/93 of 6 April
1993(*)L 87 6 7.4.1993
►M8Kommissionens förordning (EEG) nr 620/93 av den 17 mars 1993 L 66 29 18.3.1993
►M9Kommissionens förordning (EG) nr 177/94 av den 28 januari 1994 L 24 33 29.1.1994
►M10Kommissionens förordning (EG) nr 2632/94 av den 28 oktober 1994 L 280 43 29.10.1994
►M11Kommissionens förordning (EG) nr 656/95 av den 28 mars 1995 L 69 1 29.3.1995
►M12Kommissionens förordning (EG) nr 2527/95 av den 27 oktober 1995 L 258 49 28.10.1995
►M13Kommissionens förordning (EG) nr 2472/97 av den 11 december 1997 L 341 25 12.12.1997
►M14Kommissionens förordning (EG) nr 282/98 av den 3 februari 1998 L 28 5 4.2.1998
►M15Kommissionens förordning (EG) nr 2248/98 av den 19 oktober 1998 L 282 55 20.10.1998
►M16Kommissionens förordning (EG) nr 379/1999 av den 19 februari 1999 L 46 15 20.2.1999
►M17Kommissionens förordning (EG) nr 455/2001 av den 6 mars 2001 L 65 9 7.3.2001
►M18Kommissionens förordning (EG) nr 2042/2001 av den 18 oktober 2001 L 276 8 19.10.2001
►M19Kommissionens förordning (EG) nr 796/2002 av den 6 maj 2002 L 128 8 15.5.2002
(*) Denna rättsakt finns inte publicerad på svenska.
▼B
KOMMISSIONENS FÖRORDNING (EEG) nr 2568/91
av den 11 juli 1991
om egenskaper hos olivolja och olivolja av pressrester och om
lämpliga analysmetoder
EUROPEISKA GEMENSKAPERNAS KOMMISSION HAR ANTAGIT
DENNA FÖRORDNING
med beaktande av Fördraget om upprättandet av Europeiska ekono-
miska gemenskapen,
med beaktande av rådetsförordning nr 136/66/EEG av den 22
september 1966 om den gemensamma organisationen av marknadenför oljor och fetter(
1), senast ändrad genom förordning (EEG) nr 3577/
90(2), särskilt artikel 35a i denna, och
med beaktande av följande:Bilagan till förordning nr 136/66/EEG innehåller beskrivningar och
definitioner av olivolja och olivolja av pressrester som saluförs inom
varje medlemsstat, inom gemenskapen och i handeln med tredje länder.
För att kunna skilja mellan de olika typerna av olja bör de fysiska och
kemiska egenskaperna hos var och en av dem och de organoleptiskaegenskaperna hos jungfruolja definieras så att renheten och kvalitetenför de berörda varorna kan säkerställas med beaktande av andra befint-liga bestämmelser.
Egenskaperna hos de olika typerna av olja bör bestämmas enhetligt
inom hela gemenskapen. För detta ändamål bör gemenskapsmetoder
för kemisk analys och organoleptisk värdering upprättas. Under enövergångsperiod bör användningen av andra analysmetoder som tillä-mpas i medlemsstaterna tillåtas, under förutsättning att de resultat somerhålls med gemenskapsmetoden skall vara avgörande vid en skillnad i
resultaten.
Definitionen av de fysiska och kemiska egenskaperna hos olivolja och
av analysmetoderna medför ändringar av tilläggsanmärkningarna ikapitel 15 i Kombinerade nomenklaturen.
Metoden för utvärdering av de organoleptiska egenskaperna hos jung-
fruolja innefattar upprättandet av paneler med utvalda och utbildadeprovsmakare. Den tid som krävs för att upprätta en sådan struktur bördärför fastställas. Med hänsyn till de svårigheter som några medlems-
stater kommer att möta när det gäller att upprätta paneler med
provsmakare, bör användning av paneler i andra medlemsstater tillåtas.
För att säkerställa att det system med avgifter som tillämpas på import
av olivpressrester fungerar på avsett sätt bör en gemensam metod förbestämning av oljehalten i dessa varor fastställas.
För att inte skapa handelshinder bör åtgärder vidtas för att olja som är
förpackad innan denna förordning träder i kraft skall kunna avyttras
under en begränsad tid.
Det är nödvändigt att upphäva kommissionens förordning (EEG)
nr 1058/77(
3), senast ändrad genom förordning (EEG) nr 1858/88(4).
Förvaltningskommittén för oljor och fetter har inte yttrat sig inom den
tid som dess ordförande har bestämt.1991R2568 — SV — 22.05.2002 — 019.001 — 2
(1) EGT nr 172, 30.9.1966, s. 3025/66.
(2) EGT nr L 353, 17.12.1990, s. 23.
(3) EGT nr L 128, 24.5.1977, s. 6.
(4) EGT nr L 166, 1.7.1988, s. 10.
▼B
HÄRIGENOM FÖRESKRIVS FÖLJANDE
Artikel 1
1. Oljor vars egenskaper överensstämmer med dem som anges i
punkterna 1, 2 och 3 i bilaga 1 till denna förordning skall anses varajungfruolja enligt innebörden i punkterna 1 a, b och c i bilagan till
förordning nr 136/66/EEG.
2. Olja vars egenskaper överensstämmer med dem som anges i
punkt 4 i bilaga 1 till denna förordning skall anses vara bomolja i denmening som avses i punkt 1 d i bilagan till förordning nr 136/66/EEG.
3. Olja vars egenskaper överensstämmer med dem som anges i
punkt 5 i bilaga 1 till denna förordning skall anses vara raffineradolivolja i den mening som avses i punkt 2 i bilagan till förordningnr 136/66/EEG.
4. Olja vars egenskaper överensstämmer med dem som anges i
punkt 6 i bilaga 1 till denna förordning skall anses vara ren olivolja i
den mening som avses i punkt 3 i bilagan till förordning nr 136/66/EEG.
5. Olja vars egenskaper överensstämmer med dem som anges i
punkt 7 i bilaga 1 till denna förordning skall anses vara olivolja avpressrester i den mening som avses i punkt 4 i bilagan till förordning
nr 136/66/EEG.
6. Olja vars egenskaper överensstämmer med dem som anges i
punkt 8 i bilaga 1 till denna förordning skall anses vara raffineradolivolja av pressrester i den mening som avses i punkt 5 i bilagan tillförordning nr 136/66/EEG.
7. Olja vars egenskaper överensstämmer med dem som anges i
punkt 9 i bilaga 1 till denna förordning skall anses vara olivolja avpressrester i den mening som avses i punkt 6 i bilagan till förordning
nr 136/66/EEG.
8. För ►
M18regleringsåren 1998/1999 till 2002/2003 ◄skall
även olja i bulk, eller olja som omedelbart paketerats och med ennettovikt på 100 kg eller mer, med ursprung enbart i Marocko ochvars egenskaper motsvarar de som anges i punkt 1, 2, 3 respektive 4 ibilaga I till den här förordningen, och som trots vad som sägs i punkt 1
och 2 innehåller högst 1 % linolensyra, anses vara jungfruolja enligt
innebörden i punkterna 1 a, b, c eller d i bilagan till förordning nr 136/66/EEG.
Artikel 2
1. Egenskaperna hos de oljor som fastställts i bilaga 1 skall
bestämmas i enlighet med de analysmetoder som anges nedan.
— För bestämning av de fria fettsyrorna uttryckta som procent olje-
syra, den metod som anges i bilaga 2.
— För bestämning av peroxidindex, den metod som anges i bilaga 3.
— För bestämning av vaxinnehållet, den metod som anges i bilaga 4.— För bestämning av sterolhalten, den metod som anges i bilaga 5.
— För bestämning av erytrodiol och uvaol, den metod som anges i
bilaga 6.
— För bestämning av mättade fettsyror i ställning 2 hos triglycerider,
den metod som anges i bilaga 7.
— För bestämning av trilinolenhalten, den metod som anges i bilaga 8.— För spektrofotometri, den metod som anges i bilaga 9.
— För bestämning av fettsyresammansättningen, den metod som anges
i bilaga 10 A och 10 B.
— För bestämning av de flyktiga, halogenerade lösningsmedlen, den
metod som anges i bilaga 11.1991R2568 — SV — 22.05.2002 — 019.001 — 3
▼M15
▼B
▼M19
▼B
▼B
— För utvärdering av de organoleptiska egenskaperna för jungfruolja,
den metod som anges i bilaga 12, tillämpad enligt punkt 2.
— För bevis på att raffinering har genomförts, den metod som anges i
bilaga 13.
— För bestämning av stigmastadiener, den metod som anges i bilaga
XVII.
— För bestämning av sammansättningen av triglycerider i ECN42, den
metod som anges i bilaga XVIII.
— För bestämning av alifatisk alkohol, den metod som anges i bilaga
19.
2. Den granskning eller de kontrollundersökningar som nationella
myndigheter eller representanter för dessa utför av de organoleptiskaegenskaperna hos jungfruolja skall genomföras av paneler somgodkänts av medlemsstaterna.
De organoleptiska egenskaperna hos en olivolja skall anses
överensstämma med den angivna kategorin, om en panel som godkäntsav den berörda medlemsstaten bekräftar denna klassificering.
Om den godkända panelen beträffande de organoleptiska egenskaperna
inte bekräftar den kategori som angivits för olivoljan, skall de nation-
ella myndigheterna eller derasföreträdare, på begäran från den berördaparten, låta andra godkända paneler göra två kontrollundersökningar,varav minst en skall utföras av en panel som godkänts av den berördaproducentmedlemsstaten. Egenskaperna skall anses överensstämmamed de angivna, om bägge kontrollundersökningarna bekräftar den
angivna klassificeringen. I annat fall skall olivoljedeklaranten stå för
kostnader för kontrollundersökningar, utan att det påverkar tillämp-ningen av sanktioner.
3. När det gäller de nationella myndigheternaseller derasrepres en-
tanters granskningar av att oljorna har de egenskaper som föreskrivs ipunkt 1, skall proven samlas in i enlighet med de internationella stan-darderna EN ISO 661 och EN ISO 5555 för förberedelse av prover
inför testerna och för provtagning. Utan hinder av vad som sägs i punkt
6.8 i standard EN ISO 5555 skall emellertid proverna från partier avnämnda oljor i detaljhandelsförpackningar som rymmer 100 liter ellermindre, samlas in i enlighet med bilaga Ia till denna förordning.
Utan att det påverkar tillämpningen av standarden EN ISO 5555 och
kapitel 6 i standarden EN ISO 661, skall proven skyndsamt skyddasmot ljus och höga temperaturer och skickas till laboratorieanalys senast
— tio arbetsdagar efter provtagning under perioden oktober–maj, och
— fem arbetsdagar efter provtagning under perioden juni–september.
4. För utförandet av den kontroll som föreskrivs i punkt 3, skall de
analyser som avses i bilagorna II, III, IX och XII samt de eventuella
kontrollanalyser som föreskrivs i de nationella lagstiftningarna, utföras
före minsta hållbarhetsdatum. Om provtagningen sker mer än fyramånader före minsta hållbarhetsdatum, skall nämnda analyser genom-förasinom fyra månader efter den dag då provtagningen gjordes .Ingen tidsfrist skall tillämpas för de övriga analyser som föreskrivs i
ovannämnda förordning.
Om resultatet vid analyserna inte stämmer överens med egenskaperna
för den klass olivolja eller olivolja av pressrester som uppgetts, utom
om provtagningen gjorts mindre än en månad före minsta hållbarhets-datum, skall de berörda underrättas om detta minst en månad föreutgången av den tidsfrist som avses i första stycket.
5. För olivoljeegenskaper som fastställs med metoderna i punkt 1,
skall analysresultaten direkt jämföras med de gränser som föreskrivs iden här förordningen.1991R2568 — SV — 22.05.2002 — 019.001 — 4
▼M11
▼M13
▼M19
▼M17
▼M19
▼M17
▼M19
▼M19
Artikel►M193◄
Om det fastställs att de organoleptiska egenskaperna hos en olja inte
överensstämmer med beskrivningen, skall den berörda medlemsstaten,utan att det påverkar övriga påföljder, tillämpa administrativa ekono-miska sanktioner som skall bestämmas mot bakgrund av hur allvarligden upptäckta överträdelsen är.
Vid bedömningen av överträdelsen skall särskild vikt läggas vid natur-
liga förändringar av oljansegens kaper vid förvaring under normalaförhållanden.
I början av varje halvår skall medlemsstaterna underrätta kommissionen
om antal och typ av överträdelser som har upptäckts samt om de
påföljder som har tillämpats under det gångna halvåret.
Artikel 4
1. Medlemsstaterna kan godkänna provsmakningspaneler för de
nationella myndigheternaseller derasföreträdaresbedömning och
kontroll av de organoleptiska egenskaperna.
Villkoren för godkännande skall fastställas av medlemsstaterna, på ett
sådant sätt att
— de motsvarar villkoren i bilaga 12.4,
— det säkerställs att panelens ordförande har utbildats vid en inrätt-
ning, och under förhållanden, som godkänts av medlemsstaten,
— godkännandets giltighet är avhängig av de resultat som erhålls
genom ett system för årliga kontroller som medlemsstaten upprättat.
Varje medlemsstat skall delge kommissionen en förteckning över de
godkända panelerna samt meddela vilka åtgärder som vidtagits ienlighet med denna punkt.
2. Om medlemsstaterna har svårigheter att upprätta smakpaneler
inom sitt territorium, får de anlita en smakpanel som är godkänd i enannan medlemsstat.
3. Varje medlemsstat skall upprätta en förteckning över smakpaneler
som har upprättats av yrkes- eller branschorganisationer enligt de
villkor som fastställs i punkt 1 och skall säkerställa att dessa villkor
uppfylls.
Artikel 6
1. Oljehalten i oljekakor och andra rester som erhållits vid extrak-
tion av olivolja (KN-nr 2306 90 11 och 2306 90 19) skall bestämmas
med användning av den metod som anges i bilaga 15.
2. Den oljehalt som anges i punkt 1 skall uttryckas som viktprocent
olja i förhållande till torrsubstans.
Artikel 7
De gemenskapsbestämmelser som rör närvaron av andra oönskade
ämnen än de som anges i bilaga 11 skall tillämpas.
Artikel 8
1. Medlemsstaterna skall meddela kommissionen vilka åtgärder de
har vidtagit för att genomföra denna förordning.1991R2568 — SV — 22.05.2002 — 019.001 — 5
▼M5
▼M19
▼M5
▼M19
▼B
▼B
2. Medlemsstaterna skall till kommissionen i början av varje halvår
överlämna en redogörelse av de analysdata som hänför sig till proversom genomförts under det gångna halvåret.
Resultaten skall prövas av Förvaltningskommittén för oljor och fetter i
enlighet med förfarandet i artikel 39 i förordning nr 136/66/EEG.
Artikel 9
Förordning (EEG) nr 1058/77 skall upphöra att gälla.
Artikel 10
1. Denna förordning träder i kraft den tredje dagen efter det att den
har offentliggjortsi Europeiska gemenskapernas officiella tidning .D e n
metod som anges i bilaga 12 skall emellertid tillämpas från ►
M1den
1 november 1992 ◄, utom då det gäller åtgärder i samband med inter-
ventionssystemet.
Den metoden skall inte tillämpas för jungfruolja som iordningställs för
marknaden före den 1 november 1992
2. Denna förordning skall inte tillämpas på olivolja och olivolja av
pressrester som är förpackad före denna förordnings ikraftträdande ochsaluförs fram till och med den 31 oktober 1992.
Denna förordning är till alla delar bindande och direkt tillämplig i alla
medlemsstater.1991R2568 — SV — 22.05.2002 — 019.001 — 6
▼M5
▼B
▼B
BILAGOR
Sammanfattning
Bilaga 1 Egenskaper hos olivolja …
Bilaga 1a Provtagning på partier av olivolja och olivolja av pressrester i
detaljhandelsförpackningar om högst 100 liter …
Bilaga 2 Bestämning av fria fettsyror …
Bilaga 3 Bestämning av peroxidvärdet …
Bilaga 4 ►M6Bestämning av vaxinnehåll genom gaskromatografi
med kapillärkolonn ◄…
Bilaga 5 Bestämning av sammansättningen och halten av steroler
genom gaskromatografi med kapillärkolonn …
Bilaga 6 Bestämning av erytrodiol och uvaol …
Bilaga 7 Bestämning av fettsyror i 2-ställning i triglycerider …Bilaga 8 Bestämning av sammansättningen av trilinolein …
Bilaga 9 Spektrofotometrisk undersökning …
Bilaga 10 A Analys av metylestrar av fettsyror med gaskromatografi …Bilaga 10 B Preparering av metylestrar av fettsyror i enlighet med rubri-
kerna 1 och 2 i bilaga 6 till förordning (EEG) nr 72/77 eller
till den metod som beskrivs nedan …
Bilaga 11 Bestämning av halten flyktiga halogenerade lösningsmedel i
olivolja …
Bilaga 12 Organoleptisk värdering av jungfruolja …
Bilaga 13 ►
M6Neutralisering och blekning av olivolja i
laboratoriet ◄…
Bilaga 15 Oljehalt i pressrester av oliver …
Bilaga 16 Bestämning av jodtal …
Bilaga XVII Metod för bestämning av stigmastadiener i vegetabiliska oljor
…
Bilaga XVIII: Metod för bestämning av sammansättningen av triglycerider i
ECN42 ...
Bilaga XIX: Metod för bestämning av halten alifatiska alkoholer...1991R2568 — SV — 22.05.2002 — 019.001 — 7
▼M17
▼B
▼M19
▼B
▼M11
▼M13
▼M19
BILAGA I
EGENSKAPER HOS OLIVOLJA
KategoriSyra
(%) (*)Peroxidtal
mqv 02/
kg (*)Halogene-
rade
lösnings-
medel
mg/kg (*) (1)Vaxer
mg/kg (**)Mättade
fettsyror i 2-
ställning i
triglycerider
(%)Stigmasta-
diener
mg/kg (2)Skillnad
mellan
ECN42
HPLC och
ECN42
teoretisk
beräkningK232(*) K270(*)K270efter
behandling
med alumi-
niumoxid (3)Delta-K (*)Organolep-
tisk bedöm-
ning
Median-
värde för
defekt
(Md) (*)Organolep-
tisk bedöm-
ning
Median-
värde för
fruktighet
(Mf) (*)
1. Extra jungfruolja ≤1,0 ≤20 ≤0,20 ≤250 ≤1,3 ≤0,15 ≤0,2 ≤2,50 ≤0,20 ≤0,10 ≤0,01 Md = 0 Mf > 0
2. Jungfruolja ≤2,0 ≤20 ≤0,20 ≤250 ≤1,3 ≤0,15 ≤0,2 ≤2,60 ≤0,25 ≤0,10 ≤0,01 Md ≤2,5 Mf > 0
3. Ordinär jungfruolja ≤3,3 ≤20 ≤0,20 ≤250 ≤1,3 ≤0,15 ≤0,2 ≤2,60 ≤0,25 ≤0,10 ≤0,01 Md ≤6,0 (4)—
4. Bomolja > 3,3 > 20 > 0,20 ≤300 (5)≤1,3 ≤0,50 ≤0,3 ≤3,70 > 0,25 ≤0,11 — Md > 6 —
5. Raffinerad olivolja ≤0,5 ≤5 ≤0,20 ≤350 ≤1,5 — ≤0,3 ≤3,40 ≤1,20 — ≤0,16 — —
6. Olivolja ≤1,5 ≤15 ≤0,20 ≤350 ≤1,5 — ≤0,3 ≤3,30 ≤1,00 — ≤0,13 — —
7. Rå olivolja av
pressrester> 0,5 (**) — — >350 (6)≤1,8 — ≤0 , 6 ——————
8. Raffinerad olivolja av
pressresten≤0,5 ≤5 ≤0,20 > 350 ≤2,0 — ≤0,5 ≤5,50 ≤2,50 — ≤0,25 — —
9. Olivolja av pressrester ≤1,5 ≤15 ≤0,20 > 350 ≤2,0 — ≤0,5 ≤5,30 ≤2,00 — ≤0,20 — —
(1) Övre gräns för totalhalten av halogenerade föreningar som påvisats med hjälp av elektroninfärgningsdetektor.
För enskilda komponenter som påvisats är den övre gränsen 0,10 mg/kg.
(2) Summa isomerer som kan (eller inte kan) separeras i kapillärkolonn.
(3) I syfte att fastställa förekomst av raffinerad olja fastställs K270efter passage genom aluminiumoxid, om K270överstiger gränsen för den ifrågavarande kategorin.
(4) När medianvärdet för fruktighet är lika med 0 skall medianvärdet för defekt vara lägre än eller lika med 2,5.
(5) Olja med en sammanlagd vaxhalt på mellan 300 mg/kg och 350 mg/kg betraktas som bomolja om den sammanlagda halten alifatiska alkoholer är lägre än elle r lika med 350 mg/kg eller om andelen erytrodiol och uvaol är lägre
än eller lika med 3,5 %.
(6) Olja med en sammanlagd vaxhalt på mellan 300 mg/kg och 350 mg/kg betraktas som rå olivolja av pressrester om den sammanlagda halten alifatiska alkoho ler är högre än 350 mg/kg och om andelen erytrodiol och uvaol är
högre än 3,5 %.▼M191991R2568 — SV — 22.05.2002 — 019.001 — 8
KategoriFettsyrasammansättning
Summa
transolei-
nisomerer
(%)Summa
translinol
isomerer
och trans-
linoleni-
somerer
(%)Koles-
terol
(%)Brassi-
kasterol
(%)Kampes-
terol
(%)Stigmas-
terol
(%)Betasitos-
terol
(%) (1)Delta-7-
stigmas-
tenol
(%)Totalmä-
ngd
steroler
(mg/kg)Erytrodiol
och uvaol
(%) (**)Myristi-
nsyra
(%)Linolen-
syra
(%)Arakidin-
syra
(%)Eikosen-
syra
(%)Behen-
syra
(%)Lignoce-
rinsyra
(%)
1. Extra jungfruolja ≤0,05 ≤0,9≤0,6≤0,4≤0,2≤0,2≤0,05≤0,05 ≤0,5≤0,1≤4,0 < Camp. ≥93,0 ≤0,5≥1 000 ≤4,5
2. Jungfruolja ≤0,05 ≤0,9≤0,6≤0,4≤0,2≤0,2≤0,05≤0,05 ≤0,5≤0,1≤4,0 < Camp. ≥93,0 ≤0,5≥1 000 ≤4,5
3. Ordinär jung-
fruolja≤0,05 ≤0,9≤0,6≤0,4≤0,2≤0,2≤0,05≤0,05 ≤0,5≤0,1≤4,0 < Camp. ≥93,0 ≤0,5≥1 000 ≤4,5
4. Bomolja ≤0,05 ≤0,9≤0,6≤0,4≤0,2≤0,2≤0,10≤0,10 ≤0,5≤0,1≤4,0 — ≥93,0 ≤0,5≥1 000≤4,5 (2)
5. Raffinerad
olivolja≤0,05 ≤0,9≤0,6≤0,4≤0,2≤0,2≤0,20≤0,30 ≤0,5≤0,1≤4,0 < Camp. ≥93,0 ≤0,5≥1 000 ≤4,5
6. Olivolja ≤0,05 ≤0,9≤0,6≤0,4≤0,2≤0,2≤0,20≤0,30 ≤0,5≤0,1≤4,0 < Camp. ≥93,0 ≤0,5≥1 000 ≤4,5
7. Rå olivolja av
pressrester≤0,05 ≤0,9≤0,6≤0,4≤0,3≤0,2≤0,20≤0,10 ≤0,5≤0,2≤4,0 — ≥93,0 ≤0,5≥2 500 > 4,5 (3)
8. Raffinerad
olivolja av
pressrester≤0,05 ≤0,9≤0,6≤0,4≤0,3≤0,2≤0,40≤0,35 ≤0,5≤0,2≤4,0 < Camp. ≥93,0 ≤0,5≥1 800 > 4,5
9. Olivolja av
pressrester≤0,05 ≤0,9≤0,6≤0,4≤0,3≤0,2≤0,40≤0,35 ≤0,5≤0,2≤4,0 < Camp. ≥93,0 ≤0,5≥1 600 > 4,5
(1) Summan av: delta-5,23-stigmastadienol + chlerosterol + betasitosterol + sitostanol + delta-5-avenasterol + delta-5,24-stigmastadienol.
(2) Olja med en sammanlagd vaxhalt på mellan 300 mg/kg och 350 mg/kg betraktas som bomolja om den sammanlagda halten alifatiska alkoholer är lägre än elle r lika med 350 mg/kg eller om andelen erytrodiol och uvaol är lägre
än eller lika med 3,5 %.
(3) Olja med en sammanlagd vaxhalt på mellan 300 mg/kg och 350 mg/kg betraktas som rå olivolja av pressrester om den sammanlagda halten alifatiska alkoho ler är högre än 350 mg/kg och om andelen erytrodiol och uvaol är
högre än 3,5 %.
Anm.:
a) Analysresultaten skall anges med samma antal signifikanta siffror som anges för varje egenskap.
Den sista signifikanta siffran skall avrundas uppåt om efterföljande ej signifikant siffra är högre än 4.
b) Det räcker med att en enda av egenskaperna avviker från de fastställda kriterierna för att en olja skall klassas i en annan kategori eller förklaras e j uppfylla kraven när det gäller renhet.
c) Egenskaper markerade med asterisk (*) och som avser oljans kvalitet anger
— för bomolja, att samtliga gränsvärden (med undantag av K232) inte behöver vara samtidigt uppfyllda,
— för övriga jungfruoljor, att om minst ett av dessa gränsvärden inte är uppfyllt måste oljan byta kategori, men förblir dock klassad inom en kategori i nom en kategori för jungfruolja.
d) Egenskaper markerade med två asterisker (**) anger, för all olivolja av pressrester, att samtliga gränsvärden inte behöver vara samtidigt uppfyl lda.▼M191991R2568 — SV — 22.05.2002 — 019.001 — 9
▼M17
BILAGA 1a
Provtagning på partier av olivolja och olivolja av pressrester i detaljhan-
delsförpackningar om högst 100 liter
Denna metod för provtagning skall tillämpas på partier av olivolja eller olivolja
av pressrester om högst 125 000 liter i detaljhandelsförpackningar om högst 100
liter.
Om ett parti omfattar mer än 125 000 liter skall det delas upp i ungefär lika
stora delpartier om 125 000 liter eller mindre. Metoden skall sedan tillämpas
på varje delparti.
1. Ett delprovsinnehåll
Delprovet skall omfatta följande:
a) Om detaljhandelsförpackningarna rymmer 6 liter eller mer skall följande
gälla för en detaljhandelsförpackning med olja, fördelad på minst 6 behål-
lare om 1 liter vardera:
— 1 behållare till de analyser som avses i bilagorna II, III, IX och XII,
— ytterligare 1 behållare till de andra analyserna och
— övriga behållare till eventuella kontrollanalyser.
b) Om detaljhandelsförpackningarna rymmer minst 2 men högst 6 liter skall
följande gälla för 4 detaljhandelsförpackningar:
— 1 detaljhandelsförpackning till de analyser som avses i bilagorna II,
III, IX och XII,
— en tredjedel av en annan förpackning till andra analyser och— resten av oljan till eventuella kontrollanalyser.
c) Om detaljhandelsförpackningarna rymmer minst 0,75 men högst 2 liter
skall följande gälla för 6 detaljhandelsförpackningar:
— 1 detaljhandelsförpackning till de analyser som avses i bilagorna II,
III, IX och XII,
— ytterligare en förpackning till de andra analyserna och
— resten av oljan till eventuella kontrollanalyser.
d) Om detaljhandelsförpackningarna rymmer mindre än 0,75 liter, skall oljan
från det lägsta antal förpackningar som totalt rymmer mer än 4,5 liter
fördelass om följer:
— oljan från det lägsta antal förpackningar som rymmer mer än 0,75 liter
reserveras till analyser enligt bilagorna II, III, IX och XII,
— samma kvantitet reserveras till andra analyser och— resten av oljan sparas till eventuella kontrollanalyser.
2. Antal delprover
Det lägsta antalet delprover skall fastställas med hänsyn till partiets storlek
enligt följande tabell:
Parti på mindre än (liter) Lägsta antal delprover
7 500 2
25 000 3
75 000 4
125 000 5
Detaljhandelsförpackningar avsedda för samma delprov skall stå intill
varandra i partiet.
Vid tveksamheter får medlemsstaten öka det antal delprover som skall tas.
3. Analyser och resultat
Oljan skall så långt det är möjligt förvaras i ursprungsbehållaren fram till
dess att analysen sker.
a) Varje delprov skall delas upp i laboratorieprover enligt punkt 2.5 i stan-
darden EN ISO 5555 för att genomgå följande analyser:
— Bestämning av de fria fettsyrorna enligt artikel 2.1 första strecksatsen.1991R2568 — SV — 22.05.2002 — 019.001 — 10
▼M17
— Bestämning av peroxidhalten enligt artikel 2.1 andra strecksatsen.
— Spektrofotometri enligt artikel 2.1 åttonde strecksatsen.
— Bestämning av fettsyresammansättningen enligt artikel 2.1 nionde
strecksatsen.
b) Om resultaten från de analyser som anges under a visar att minst ett av de
delprov, som tagits på samma parti, inte överensstämmer med egenska-
perna för den klass olja som uppgetts, skall hela det parti som berörs
förklaras ej överensstämmande med gällande krav.
Om samtliga resultat av analyserna som anges under a visar att varje
delprov som tagits på samma parti, med hänsyn tagen till metodernas
repetitiva karaktär, är homogena och överensstämmer med egenskaperna
för den klass olja som uppgetts, skall ett av delproven genomgå övriga
analyser.
c) Om något av de analysresultat som avses i punkt b andra stycket, inte
överensstämmer med egenskaperna för den klass olja som uppgetts skall
hela det parti som berörs förklaras ej överensstämmande med gällande
krav.
Om samtliga analysresultat som avses i punkt b andra stycket
överensstämmer med egenskaperna för den klass olja som uppgetts, skall
hela partiet förklaras överensstämma med gällande krav.1991R2568 — SV — 22.05.2002 — 019.001 — 11
▼B
BILAGA 2
BESTÄMNING AV FRIA FETTSYROR
1. BESTÄMNING AV SYRAHALT
Bestämning av fria fettsyror i olivoljor. Halten fria fettsyror uttrycks som
syrahalt beräknad på konventionellt sätt.
1.1Princip
Ett prov löses i en blandning av lösningsmedel och de närvarande fria
fettsyrorna titreras med en etanollösning av kaliumhydroxid.
1.2Reagenser
Alla reagenser bör vara av analyskvalitet och det vatten som används skall
vara destillerat eller ha motsvarande renhet.
1.2.1 Dietyleter. 95 % etanol (v/v), blandning av lika volymdelar.
Anm:Dietyleter är en mycket lättantändlig vätska och kan bilda explosiva
peroxider. Speciell försiktighet bör iakttas vid användning.
Neutralisera exakt vid användningstillfället med kaliumhydroxidlösningen
(1.2.2) med tillsats av 0,3 ml av fenolftaleinlösningen (1.2.3) per 100 ml
blandning.
Anm:Om det inte är möjligt att använda dietyleter kan en blandning av
lösningsmedel som innehåller etanol och toluen användas. Om så
erfordraskan etanolen ers ättasav propanol-2.
1.2.2 Kaliumhydroxid, filtrerad etanollösning, c(KOH) ca 0,1 mol/l eller, om
nödvändigt c(KOH), ca 0,5 mol/l.
Den exakta koncentrationen hos etanollösningen av kaliumhydroxid måste
vara känd och kontrollerad omedelbart före användning. Använd en
lösning som gjorts minst fem dagar före användning och dekanterats i en
brun glasflaska med gummipropp. Lösningen bör vara färglös eller
halmfärgad.
Anm:En stabil färglös lösning av kaliumhydroxid kan framställas på
följande sätt: Koka upp 1 000 ml etanol med 8 g kaliumhydroxid
och 0,5 g aluminiumspån och fortsätt att koka under återflöde under
1 timme. Destillera lösningen omedelbart. Lös den behövliga
mängden kaliumhydroxid i destillatet. Låt lösningen stå i flera
dagar och dekantera den klara vätskan från fällningen av kaliumkar-
bonat.
Lösningen kan också framställas utan destillation på följande sätt:
Tillsätt 4 ml aluminiumbutylat till 1 000 ml etanol och låt bland-
ningen stå i flera dagar. Dekantera den klara vätskan och lös den
behövliga mängden kaliumhydroxid i den. Lösningen är klar för
användning.
1.2.3 Fenolftalein, 10 g/l lösning i 95 till 96 %-ig etanol (v/v) eller alkaliskt
blått (då det gäller starkt färgade fetter) 20 g/l lösning i 95 till 96 %-ig
etanol (v/v).
1.3Utrustning
Vanlig laboratorieutrustning som innefattar:
1.3.1 Analysvåg
1.3.2 250 ml E-kolv
1.3.3 10 ml byrett graderad i 0,05 ml
1.4Utförande
1.4.1 Preparering av provet för analys
Genomför analysen på ett filtrerat prov. Om fukt och föroreningar tillsam-
mansär mindre än 1 % använd provet utan vidare behandling.
1.4.2 Provtagning
Ta ut ett prov beroende på det antagna syratalet i enlighet med följande
tabell:1991R2568 — SV — 22.05.2002 — 019.001 — 12
▼B
Förväntat syratalMängd prov
(g)Invägningsnoggrannhet
(g)
< 1 20 0,05
1 till 4 10 0,024 till 15 2,5 0,01
15 till 75 0,5 0,001
> 75 0,1 0,0002
Väg in provet i E-kolven (1.3.2).
1.4.3 Bestämning
Lösprovet (1.4.2) i 50 till 150 ml av den neutralis erade blandningen av
dietyleter och etanol (1.2.1).
Titrera under omrörning med 0,1 mol/l lösning av kaliumhydroxid (1.2.2)
(se anmärkning 2) tills indikatorn ändrar färg (den röda fenolftaleinfärgen
skall bestå under minst 10 sekunder).
Anm 1: Den ställda etanollösningen av kaliumhydroxid (1.2.2) kan
ersättas av en vattenlösning av kalium- eller natriumhydroxid
under förutsättning att vattenvolymen inte medför fasseparation.
Anm 2: Om den nödvändiga mängden 0,1 molar kaliumhydroxidlösning
överstiger 10 ml, använd 0,5-molar lösning.
Anm 3: Om lösningen blir ogenomskinlig under titreringen, tillsätt
tillräckligt med lösningsmedel (1.2.1) för att det skall bli en klar
lösning.
1.5Syramängd uttryckt som procent oleinsyra
Syramängden som massprocent motsvaras av:
V/C2c/C2M
1000/C2100
m¼V/C2c/C2M
10/C2m
där:
V = Volymen kaliumhydroxid i ml som används vid titreringen.
c = Exakta koncentrationen i mol/l av den ställda kaliumhydroxidlös-
ning som används.
M = Molvikt i gram per mol av syran som används för att ange resul-
tatet (= 282).
m = Provetsvikt i gram.
Det aritmetiska medelvärdet ►M6av två beräkningar ◄bör bedömas
som resultatet.1991R2568 — SV — 22.05.2002 — 019.001 — 13
▼B
BILAGA 3
BESTÄMNING AV PEROXIDVÄRDET
1. SYFTE
Denna standard beskriver en metod för bestämning av peroxidvärdet i oljor
och fetter.
2. TILLÄMPNINGSOMRÅDE
Denna standard är tillämplig på animaliska och vegetabiliska oljor och
fetter.
3. DEFINITION
Peroxidvärdet är den kvantitet av de substanser i provet uttryckta i milliek-
vivalenter aktivt O2/kg som oxiderar kaliumjodid under de förhållanden som
beskrivs.
4. PRINCIP
Behandling av provet i lösning i ättiksyra och kloroform med en lösning av
kaliumjodid. Titrering av den frigjorda joden med ställd natriumtiosulfatlös-
ning.
5. UTRUSTNING
All utrustning som skall användas skall vara fri från reducerande eller
oxiderande ämnen.
Anm:Smörj inte slipade ytor.
5.1 3 ml glassked.5.2 Kolvar med slipade halsar och proppar på ca 250 ml, torkade i förväg och
fyllda med en torr, ren, inert gas(kväve eller företrädes viskoldioxid).
5.3 25 eller 50 ml byrett graderad i 0,1 ml.
6. REAGENSER
6.1 Kloroform, P. A. som befriats från syre genom att en ström av ren, torr inert
gasbubblatsigenom den.
6.2 Ättiksyra, P. A. befriad från syre genom att en ström av torr, ren gas bubb-
latsigenom den.
6.3 Kaliumjodid, mättad vattenlösning, nyligen framställd, fri från jod och
jodater.
6.4 Natriumtiosulfat 0,01 eller 0,002 N exakt ställd vattenlösning, ställd
omedelbart före användning.
6.5 Stärkelselösning, 10 g per liter vattenlösning nyligen framställd av naturlig
löslig stärkelse.
7. PROV
Se till att provet tas och bevaras kallt och mörkt i glasbehållare som skall
vara helt fyllda, hermetiskt tillslutna med slipade glasproppar eller kork.
8. UTFÖRANDE
Analysen skall genomföras i diffust dagsljus eller artificiellt ljus. Väg in i
ett vägglas(5.1) eller om inte detta går i en kolv (5.2) på 0,001 g när, en
mängd av provet som överensstämmer medföljande tabell enligt det
förväntade peroxidvärdet:1991R2568 — SV — 22.05.2002 — 019.001 — 14
▼B
Förväntat peroxidvärde
(mekv)Provetsvikt
(g)
0 till 12 5,0 till 2,0
12 till 20 2,0 till 1,220 till 30 1,2 till 0,830 till 50 0,8 till 0,5
50 till 90 0,5 till 0,3
Ta bort proppen från en kolv (5.2) och för in vägglaset som innehåller
provet. Tillsätt 10 ml kloroform (6.1). Lös provet snabbt under omrörning.
Tillsätt 15 ml ättiksyra (6.2) och sedan 1 ml kaliumjodidlösning (6.3). Sätt
snabbt i proppen, skaka om under en minut och låt stå i mörker exakt 5
minuter vid en temperatur mellan 15 och 25 ºC.
Tillsätt ca 75 ml destillerat vatten. Titrera den frigjorda joden med natrium-
tiosulfatlösning (6.4) (0,002 N lösning för förväntade värden som är mindre
12 och 0,01 N lösning för förväntade värden över 12) under omskakning
och använd stärkelselösning (6.5) som indikator.
Genomför två bestämningar på samma prov.
Genomför samtidigt ett blindprov. Om resultatet av blindprovet överstiger
0,05 ml av 0,01 N natriumtiosulfatlösning (6.4) ersätt de orena reagenserna.
9. RESULTATANGIVELSE
Peroxidvärdet (PV), uttryckt som milliekvivalenter av aktivt O
2/kg erhålls
genom följande formel:
PV¼V/C2T/C21000
m
där:
V = antalet ml av den ställda tiosulfatlösningen (6.4) som används i
provet korrigerad för resultatet av blindprovet.
T = den exakta normaliteten hos natriumtiosulfatlösningen (6.4) som
används.
m = vikten i gram av provet.
Som resultat tas det aritmetiska medelvärdet av de två bestämningarna som
genomförts.1991R2568 — SV — 22.05.2002 — 019.001 — 15
▼M6
BILAGA 4
BESTÄMNING AV VAXINNEHÅLLET GENOM GASKROMATOGRAFI
MED KAPILLÄRKOLONN
1. SYFTE
Denna metod beskriver en procedur för bestämning av vaxinnehållet i
vissa fetter och oljor efter testförhållanden.
Den används särskilt för att skilja mellan olivolja som framställts
genom pressning och olivolja som framställts genom extraktion.
2. PRINCIP
En lämplig intern standard tillsätts till fettet eller oljan varefter fraktio-
nering sker genom kromatografi på en hydrerad kiselgelkolonn. Den
fraktion som först elueras under testförhållandena (och som har lägre
polaritet än triglyceriderna) samlas upp och analyseras därefter direkt
med hjälp av gaskromotografi med kapillärkolonner.
3. UTRUSTNING
3.1. 25 ml Erlenmeyerkolv.3.2. Glaskolonn för kromatografi, 15 mm invändig diameter och 30 40 cm
lång.
3.3. En lämplig gaskromatograf som kan fungera med en kapillärkolonn och
som är utrustad med ett system för direkt insprutning i kolonnen och
som består av följande:
3.3.1. Termostatstyrd ugn för kolonnerna, som kan hålla önskad temperatur
med en noggrannhet av ± 1 C.
3.3.2. Kall injektor för direkt insprutning i kolonnen.3.3.3. Flamjoniseringsdetektor och konverter/förstärkare.3.3.4. Skrivare/integrator som kan fungera med konvertern/förstärkaren (3.3.3)
med svarstider under 1 sekund och med variabel pappershastighet.
3.3.5. Kapillärkolonn av glas eller sintrat kvarts, 10-15 mm lång, 0,25-0,32
mm invändig diameter, täckt med SE-52 eller SE-54 vätskefas eller
motsvarande och med en enhetlig tjocklek på 0,10-0,30 µm.
3.4. Mikrosprutor på 10 l med härdad nål för direkt insprutning i kolonnen.
4. REAGENS
4.1. Kiselgel, 70 230 mesh, artikel 7754 Merck.
Placera kiselgelen i ugnen vid 500 C i fyra timmar. Låt svalna och
tillsätt sedan 2 % vatten. Skaka ordenligt för att homogenisera uppslam-
ning. Förvara mörkt i minst 12 timmar innan användning.
4.2. n-hexan för kromatografi.4.3. Etyleter för kromatografi.
4.4. n-heptan för kromatografi.
4.5. Standardlösning av 0,1 % (m/v) laurylarachidat i hexan (intern stan-
dard).
4.6. Bärargas: ren väte för gaskromatografi.4.7. Hjälpgaser:
— ren väte för gaskromatografi.
— ren luft för gaskromatografi.
5. UTFÖRANDE
5.1. Separation av vaxfraktionen.5.1.1. Preparering av kromatografikolonnen.
Slamma15 g kiselgel hydrerad med 2 % vatten i vattenfri n-hexan och
spruta in i kolonnen.1991R2568 — SV — 22.05.2002 — 019.001 — 16
▼M6
Låt sedimentera av sig självt. Slutför sedimenteringen med hjälp av en
elektrisk skakare för att göra det kromatografiska bandet mer homogent.
Filtrera 30 ml n-hexan för att avlägsna eventuella orenheter.
5.1.2. Kolonnkromatografi
Vägmed exakthet upp 500 mg av provet i en 25 ml kolv och tillsätt en
passande mängd intern standard, beroende på det uppskattade vaxin-
nehållet, t. ex. tillsätt 0,1 mg laurylarachidat till pressad olivolja, och
0,25-0,5 mg till extraherad olivolja.
Föröver det preparerade provet till kromatografikolonnen, preparerad
enligt 5.1, med hjälp av två 2 ml portioner n-hexan.
Låtlösningsmedlet stå 1 mm över kolonnmaterialet. Starta sedan kroma-
tografielueringen. Samla upp 140 ml av n-hexan/etyleterblandningen i
förhållandet 99:1, med en hastighet på cirka 15 droppar var 10:e sekund
(2,1 ml/minut).
Torka den framtagna fraktionen i en rotationsindunstare tills nästan allt
lösningsmedel försvunnit. Avlägsna de sista 2 eller 3 ml av lösnings-
medlet med hjälp av en svag kväveström och tillsätt sedan 10 ml n-
heptan.
5.2. Analysmed gas kromatografi5.2.1. Förberedelser och konditionering av kolonnen
5.2.1.1. Montera kolonnen på gaskromatografen genom att ansluta inloppet till
injektionssystemet och utloppet till detektorn.
Kontrollera gaskromatografen (att gasanslutningarna är täta, detektorns
och skrivarens effektivitet, etc.).
5.2.1.2. Om kolonnerna användsför förs ta gången är det bra att konditionera
dem. Låt en liten mängd bärargas flyta genom kolonnen och sätt sedan
på gaskromatografen. Värm upp den gradvis till en temperatur på minst
20 ºC över drifttemperaturen (OBS!). Behåll denna temperatur i minst
två timmar och ställ därefter in apparaturen enligt driftförhållandena
(inställning av gasflöde, tändning av delningsflamma, anslutning till
den elektroniska registreringen, inställning av temperaturen i kolonnens
ugn, detektorn och injektorn). Ställ in signalen på en känslighet som är
minst två gånger högre än den nivå som krävs för att utföra analysen.
Baslinjen skall vara linjär, inte ha några toppar och får inte visa på
några avvikelser.
En negativ rätlinjig avvikelse tyder på att kolonnen inte är korrekt
ansluten. En positiv avvikelse tyder på att kolonnen inte har blivit
ordentligt konditionerad.
OBS!Temperaturen vid konditioneringen skall alltid vara minst 20 ºC
under den maximala temperaturen som anges för den vätskefas
som används.
5.2.2. Val av driftförhållanden
5.2.2.1. Driftförhållandena är normalt enligt följande:
— Kolonntemperatur: 80 ºC till en början med en stegring på 30 ºC/
minut till 120 ºC, med en därpå följande programmering till en stig-
ning med 5 ºC/minut upp till 340 ºC,
— detektortemperatur: 350 ºC,
— linjär hastighet för bärargasen: väte 20-35 cm/sekund,— instrumentets känslighet: 4-16 gånger högre än minimikänsligheten,— registreringskänslighet: 1-2 mV, från skalans nedersta ände,— pappershastighet: 30 cm/timme,
— insprutad mängd: 0,5-1 µl lösning.
Dessa förhållanden kan ändras med hänsyn till kolonnens och gaskro-
matografens egenskaper (för att uppnå kromatogram som uppfyller
följande villkor: retentionstider för C32 intern standard måste vara 25
± 2 minuter, och vaxens mest representativa topp måste ligga på mellan
60 och 100 % från skalans nedersta ände).
5.2.2.2. Bestäm parametrarna för toppens integration på ett sådant sätt att en
korrekt uppskattning av de ifrågavarande toppareorna erhålls.
5.2.3. Analysförfarande
5.2.3.1. Sug med hjälp av en mikrospruta på 10 µl upp 1 µl av lösningsmedlet.
Dra tillbaka kolven tills sprutan är tom. För in nålen i injektionssys-
temet och injicera snabbt efter 1-2 sekunder. Efter cirka 5 sekunder
drasnålen förs iktigt ut.1991R2568 — SV — 22.05.2002 — 019.001 — 17
▼M6
5.2.3.2. Utför registreringen tills alla vaxer är helt eluerade.
Baslinjen måste alltid uppfylla de fastställda villkoren (5.2.1.2).
5.2.4. Identifiering av toppar
Identifiera topparna utifrån retentionstiderna genom att jämföra dem
med blandningar av vaxer med kända retentionstider analyserade under
samma förhållanden.
Figur 1 visar ett vaxkromatogram av jungfruolja.
5.2.5. Kvantitativ analys5.2.5.1. Bestäm de av toppareorna som motsvarar den interna standarden och de
alifatiska estrarna från C40-C46 med hjälp av integratorn.
5.2.5.2. Vaxinnehållet i var och en av estrarna erhålls i mg/kg fettämne med
följande formel:
alkohol (mg/kg) =A
x·ms·►M91000◄
As·m
där:
Ax= den area som motsvarar toppen för varje ester,
As= den area som motsvarar laurylarachidatetoppen,
ms= den area som motsvarar det tillsatta laurylarachidatet i
milligram,
m = den massa som provet som tagits ut för analys, i gram.
6. RESULTATANGIVELSE
De olika vaxinnehållen och summan av dessa anges i mg/kg fettämnen.1991R2568 — SV — 22.05.2002 — 019.001 — 18
▼M6
TILLÄGG
Bestämning av gasens linjära hastighet
Spruta in 1 3 µl metan (propan) i gaskromatografen sedan den ställts in till de
normala driftförhållandena. Mät den tid det tar för gasen att gå igenom
kolonnen, från det att den sprutas in tills toppen framgår (tM).
Den linjära hastigheten i cm/sekund erhålls genom formeln L/tM där L är kolon-
nenslängd i cm och tM är den uppmätta tiden i s ekunder.1991R2568 — SV — 22.05.2002 — 019.001 — 19
▼M61991R2568 — SV — 22.05.2002 — 019.001 — 20
▼B
BILAGA 5
BESTÄMNING AV SAMMANSÄTTNINGEN OCH HALTEN AV
STEROLER GENOM GASKROMATOGRAFI MED KAPILLÄRKO-
LONN
1. SYFTE
Förfarandet beskriver en metod för att bestämma de enskilda och totala
sterolhalterna hos fettämen.
2. METODENS PRINCIP
Fettämnet med tillsats av a-kolestanol som en inre standard, förtvålas
med kaliumhydroxid i etanollösning och de oförtvålbara ämnena extra-
heras sedan med etyleter. Sterolfraktionen separeras från det
oförtvålbara extraktet genom kromatografi på en basisk kiselgelplatta.
Sterolerna som återvunnits från kiselgelen överförs till trimetylsilyletrar
och analyseras genom gaskromatografi med kapillärkolonn.
3. UTRUSTNING
3.1 250 ml kolv försedd med återflödeskylare med slipningar.
3.2 500 ml separertrattar.
3.3 250 ml kolvar.3.4 Komplett apparatur för analys med tunnskiktskromatografi som
använder glasplattor 20 × 20 cm.
3.5 Ultraviolett lampa med en våglängd av 366 eller 254 nm.3.6 Mikrosprutor 100 µl och 500 µl.3.7 En cylindrisk filtrertratt med porositeten G 3 (porositet 15 till 40 µm)
och med en diameter på ca 2 cm, ett djup på 5 cm och försedd med en
hanslipning 12/21 som passar på en vakuumkolv.
3.8 50 ml vakuum-E-kolv med honslipning 12/21 som kan användas för filt-
rertratten (3.7).
3.9 10 ml provrör med konisk botten och propp.
3.10 Gaskromatograf lämpad för användning med kapillärkolonn försedd med
splitsystem bestående av:
3.10.1 En termostatkammare för kolonner som kan bibehålla önskad temperatur
med en noggrannhet av ± 1 ºC.
3.10.2 En förångningsenhet med inställbar temperatur och försedd med ett
förångningselement av glas med försiliniserad yta.
3.10.3 En flamjoniseringsdetektor och omformarförstärkare.3.10.4 En integrerad skrivare som är lämplig för användning med omfor-
marförstärkare (3.10.3).
3.11 En kapillärkolonn av glaseller kvartsmed en längd på 20 till 30 meter,
innerdiameter 0,25 till 0,32 mm och helt täckt med SE-52 eller SE-54-
vätska eller motsvarande i ett jämnt lager med en tjocklek av mellan
0,10 och 0,30 µm.
3.12 En 10 µl mikrospruta för gaskromatografi med härdad kanyl.
4. REAGENSER
4.1 Kaliumhydroxid ungefär 2 N i etanollösning. Lös 130 g kaliumhydroxid
(minimihalt 85 %) under kylning i 200 ml destillerat vatten och späd
sedan till 1 liter med etanol. Förvara lösningen i väl tillslutna, mörka
flaskor (etanol 95 % v/v).
4.2 Etyleter, P. A.
4.3 Vattenfritt natriumsulfat, P. A.4.4 Glasplattor täckta med kiselgel utan flouresceinsindikator, tjocklek
0,25 mm (finnsi handeln färdiga för användning).
4.5 Kaliumhydroxid, 0,2 N i etanollösning. Lös 13 g kaliumhydroxid i 20 ml
destillerat vatten och späd till 1 liter med etanol.1991R2568 — SV — 22.05.2002 — 019.001 — 21
▼B
4.6 Bensen, för kromatografi (se 5.2.2).
4.7 Aceton, för kromatografi (se 5.2.2).4.8 Hexan, för kromatografi (se 5.2.2).4.9 Etyleter, för kromatografi (se 5.2.2).
4.10 Kloroform, P. A. (se 5.2.2).
4.11 Referenslösning för tunnskiktskromatografi: kolesterol eller fytosterol,
►
M62%◄lösning i kloroform.
4.12 2.7-diklorflourecein, 0,2 % etanollösning. Denna görs lätt alkalisk
genom att tillsätta ett par droppar 2 N alkoholisk kaliumhydroxidlös-
ning.
4.13 Vattenfri pyridin, för kromatografi.
4.14 Hexametyldisilasan.4.15 Trimetylklorosilan.4.16 Referenslösning av steroltrimetylsilyletrar. Framställs omedelbart före
användning av rena steroler eller blandningar av steroler som erhållits
från oljor som innehåller dem.
4.17 α-kolestanol, 0,2 % lösning (m/v) i kloroform (inre standard).
4.18 Bärargas: väte eller helium, ren för gaskromatografi.4.19 Supplementerande gaser: väte eller helium, ren för gaskromatografi.
5. UTFÖRANDE
5.1 Preparering av oförtvålbara ämnen
5.1.1 Med hjälp av en 500 µl mikrospruta införs en volym av 0,2 % α-kole-
stanollösning i kloroform (4.17) som innehåller en mängd α-kolestanol
motsvarande ca 10 % sterolhalten i provet som tagits ut för analysen i
250 ml kolv. Exempelvistills ätts500 µl av den 0,2 % α-kolestanollös-
ningen per 5 g prov när det gäller olivolja och 1 500 µl för
►
M6 ◄olivoljor av pressrester.
Indunsta till torrhet under en ström av kväve och väg noggrannt upp 5 g
av det torra filtrerade provet i samma kolv.
►M6Oljor◄och fetter som innehåller uppskattningsbara kvantiteter
av kolesterol kan visa en topp med en retentionstid som är samma för
kolestanol. Om detta inträffar måste sterolfraktionen analyseras dubbelt
med och utan inre standard ►M6eller så måste betulinol användas
istället för kolestanol ◄.
5.1.2 Tillsätt 50 ml 2 N kaliumhydroxid i etanollösning, sätt på återflödesky-
laren och värm till svag kokning på vattenbad under kontinuerlig
omrörning tills förtvålning inträder (lösningen blir klar). Fortsätt upphet-
tningen under ytterligare 20 minuter, och tillsätt sedan 50 ml destillerat
vatten genom återflödeskylaren, ta bort kylaren och kyl kolven till ca
30 ºC.
5.1.3 Överför kvantitativt innehållet i kolven till en 500 ml separertratt och
skölj upprepade gånger med destillerat vatten av en mängd som totalt
får uppgå till 50 ml. Tillsätt ca 80 ml etyleter, skaka omsorgsfullt i
ungefär 30 sekunder och låt sedan innehållet separera (anm 1).
Separera av den lägre vattenfasen i en ny separertratt. Genomför ytterli-
gare två extraheringar på vattenfasen på samma sätt med användande av
60—70 ml etyleter vid varje tillfälle.
Anm 1: Eventuell emulsion kan tas bort genom tillsats av små kvanti-
teter etanol eller metanol i sprayform.
5.1.4 Samla eterextrakten i en separertratt och tvätta med destillerat vatten
(50 ml åt gången) tillstvättvattnet ger neutral reaktion.
När tvättvattnet har avlägsnats, torka med vattenfritt natriumsulfat och
filtrera på vattenfritt natriumsulfat ner i en i förväg vägd 250 ml kolv,
och tvätta därefter tratten och filtret med små mängder etyleter.
5.1.5 Destillera av etern tills endast ett par ml återstår, torka sedan under lätt
vakuum eller i en ström av kvävegas och torka sedan helt i ett torkskåp
vid 100 ºC i ungefär en kvart och väg därefter provet som fått svalna i
exsickator.
5.2 Separering av sterolfraktionen1991R2568 — SV — 22.05.2002 — 019.001 — 22
▼B
5.2.1 Preparering av plattorna. Sänk ner kiselgelplattorna (4.4) helt i 0,2 N
kaliumhydroxidetanollösning (4.5) i 10 sekunder och låt sedan torka i
dragskåp i två timmar varefter den placeras i torkskåp vid 100 ºC i en
timme.
Ta ut plattorna från torkskåpet och förvara dem i en exsickator med
kalciumklorid tills de skall användas (plattor som behandlas på detta
sätt måste användas inom 15 dagar).
Anm 2: Om kiselelplatta används för att separera serolfraktionen
behöver inte de oförtvålbara ämnena behandlasmed aluminum-
oxid. På det här sättet kan alla sura föreningar (fettsyror och
andra) behållas på identifieringslinjen och sterolbanden sepa-
rerasklart från de alifatis ka och triterpena alkoholernasband.
5.2.2 Fyll på en 95:5 (v/v) benzen/acetonblandning i framkallningskammaren
till ett djup av ca 1 cm. En blandning av 65:35 (v/v) av hexan/etyleter
kan också användas. Stäng kammaren med tillhörande lock och låt stå
ca en halvtimme för att jämnvikten vätska/gas inställer sig. Remsor av
filtrerpapper som doppas ner i eluenten kan placeras på insidorna av
kammaren. Detta minskar framkallningstiden med ca en tredjedel och
åstadkommer en jämnare eluering av komponenterna.
Anm 3: Framkallningsblandningen skall bytas för varje prov för att få
exakt reproducerbara elueringsförhållanden.
5.2.3 Preparera en ca 5 % lösning av oförtvålbara ämnen (5.1.5) i kloroform
och stryk ut med hjälp av en 100 µl spruta på en kromatografiplatta
(5.2.1) 0,3 ml ca 2 cm från ena änden i en strykning som är så tunn
och jämn som möjligt. Placera i linje med strykningen 2 till 3 µl av
sterolreferenslösningen (4.11) i enda änden av plattan så att sterolbandet
kan identifierasefter framkallning.
5.2.4 Placera plattan i framkallningskammaren som preparerats enligt 5.2.2.
Genomsnittstemperaturen skall hållas mellan 15 och 20 ºC. Stäng
kammaren omedelbart med locket och påbörja elueringen tills lösnings-
medletsfrämre kant når till ca 1 cm från övre änden av plattan. Ta bort
plattan från framkallningskammaren och låt lösningsmedlet avdunsta i
en ström av varmluft eller genom att plattan ligger en kort stund i
dragskåp.
5.2.5 Spraya plattan lätt och jämnt med 2,7-diklorofluorosceinlösning. När
plattan betraktasi ultraviolett ljuskan s terolbandet identifierasgenom
att det ligger i höjd med fläcken som har erhållits från referenslös-
ningen. Markera änden av bandet längs kanterna av flouroscensen med
svart blyerts.
5.2.6 Skrapa med hjälp av en metallspatel bort silikagelen på det markerade
området. Placera det finfördelade materialet som tagits bort i filtrer-
tratten (3.7). Tillsätt 10 ml het kloroform, rör försiktigt med
metallspateln och filtrera i vakuum-E-kolven (3.8) som är ansluten till
filtrertratten.
Tvätta återstoden i kolven tre gånger med etyleter (ca 10 ml varje gång)
och samla filtratet i samma kolv som är ansluten till filtrertratten.
Indunsta filtratet till en volym på 4 till 5 ml, överför lösningen till ett
vägt 10 ml provrör (3.9), indunsta till torrhet genom lätt uppvärmning i
ett försiktigt flöde av kvävgas, lös igen med hjälp av ett par droppar
aceton, indunsta igen till torrhet, placera i ett värmeskåp vid 105 ºC i
ca 10 minuter och låt sedan provet svalna i exsickator och väg det.
Återstoden som finns i provröret består av sterolfraktionen.
5.3 Preparering av trimetylsilyletrar5.3.1 Tillsätt silyleringsreagensen, som består av 9:3:1 (v/v/v) blandning av
pyridin/hexametyldisdilasan/trimetylklorosilan (anm 4) i mängden 50 µl
för varje milligram steroler som finns i provröret som innehåller sterol-
fraktionen, varvid fukt ska undvikas (anm 5).
Anm 4: Lösningar klara för användning finns att köpa i handeln. Andra
silaniseringsreagenser som t ex bis-trimetylsilyl, triflourace-
tamid + 1 % trimetylklorosilan, som måste spädas med lika
stor mängd vattenfri pyridin finns också tillgängliga.
5.3.2 Sätt proppen i provröret, skaka försiktigt (utan att vända på det) tills
sterolerna är helt lösta. Låt stå i minst 15 minuter i rumstemperatur
och centrifugera sedan i ett par minuter. Den klara lösningen är nu
färdig för analysmed gas kromatografi.
Anm 5: Eventuell bildning av en svag opalescens är normal och inve-
rkar inte. Bildandet av en vit flockig fyllning eller rosafärgning1991R2568 — SV — 22.05.2002 — 019.001 — 23
▼B
är tecken på närvaro av fukt och sönderfall hos reagensen. Om
detta inträffar skall provet upprepas.
5.4 Analysmed gas kromatografi
5.4.1 Förberedelser och iordningsställande av kapillärkolonnen.
5.4.1.1 Kapillärkolonnen placerasinuti gas kromatografen genom att kolonnens
inlopp ansluts till injektorblocket som är ansluten till splitsystemet och
andra änden av kolonnen till detektorn.
En allmän kontroll av gaskromatografen genomförs (gasanslutningarna
skall vara täta, detektorn i fullgott skick, fungerarande splitsystem och
registreringssystem etc).
5.4.1.2 Kapillärkolonner som används för första gången skall prepareras. En
liten mängd bärargasfår flyta igenom kapillärkolonnen och s edan
kopplasgas kromatografen på och en gradvisupphettning genomförstills
temperaturen är minst 20 ºC över drifttemperaturen (se anm 6). Tempe-
raturen bibehålls i minst två timmar och sedan ställs kromatografen
iordning för driftförhållanden (inställning av gasflöde, tändning av
delningsflamma, anslutning till den elektroniska registreringen, inställ-
ning av temperaturen i kapillärkolonnensugn, detektorn och injektorn)
signalen ställs in på en känslighet som är minst två gånger den högsta
nivån som beräknas för genomförande av analysen. Baslinjens streck
skall vara linjärt, inte ha några spikar oavsett ursprung och inte visa
tecken på att driva.
Negativ drift av linjen är tecken på otäta kolonnanslutningar medan en
positivt drift tyder på otillräcklig preparering av kolonnen.
Anm 6: Temperaturen vid prepareringen skall vara minst 20 ºC lägre än
maximitemperaturen som specificeras för den använda fasen.
5.4.2 Val av driftförhållanden5.4.2.1 Allmänna driftförhållanden är följande:
— kolonntemperatur: 260 ± 5ºC
— injektorblocketstemperatur: 280 ºC,— detektornstemperatur: 290 ºC,— linjär hastighet för bärargasen: helium 20 till 35 cm/s, väte 30 till
50 cm/s,
— delningsförhållande 1:50 vid 1:100,— instrumentets känslighet: 4 till 16 gånger högre än minimikänslig-
heten,
— registreringskänslighet: 1 till 2 mV,— pappershastighet: 30 till 60 cm/timme,— kvantitet av det injicerade ämnet: 0,5 till 1 µl av TMSE-lösning.
Dessa förhållanden kan varieras beroende på egenskaper hos kolonn och
gaskromatograf för att få kromatogram som uppfyller följande krav:
— retentionstiden för β-sitosterol bör vara 20 ± 5 minuter,
— kampesteroltoppen bör vara: olivolja (medelinnehåll 3 %) 15 ± 5 %
av fullt utslag, för sojaolja (medelinnehåll 20 %) 80 ± 10 % av fullt
utslag,
— alla närvarande steroler måste separeras. Förutom att topparna måste
separeras måste de också återgå helt, dvs varje toppkurva skall
återvända till baslinjen innan nästa topp ritas. Ofullständig upplös-
ning kan emellertid tolererasunder föruts ättning att toppen vid
TRR 1,02 kan kvantifierasmed hjälp av topphöjden.
5.4.3 Analysförfarande
5.4.3.1 Sug med hjälp av en 10 µl spruta upp 1 µl hexan, sug in 0,5 µl luft och
sedan 0,5 till 1 µl av provlösningen. Drag ut kolven ur sprutan ytterli-
gare så att kanylen töms. Kör in kanylen genom membranet i
insprutningsenheten och spruta snabbt efter en till två sekunder in
innehållet och drag sedan sakta ut kanylen efter ca fem sekunder.
5.4.3.2 Fortsätt registreringen tills TMSE för de närvarande sterolerna är helt
eluerade.
Baslinjen måste fortsätta att uppfylla kraven i 5.4.1.2.
5.4.4 Identifiering av toppar.
Identifiera individuella toppar på grundval av retentionstiderna och
genom jämförelse med blandningar av sterol-TMSE som är analyserade
under samma förhållanden.1991R2568 — SV — 22.05.2002 — 019.001 — 24
▼B
Sterolerna elueras i följande följd: kolesterol, brassikasterol, 24-metylen-
kolesterol, kampesterol, kampestanol, stigmasterol, ∆7-kampesterol, ∆
5,23-stigmastadienol, klerosterol, β-sistosterol, sitostanol, ∆5-avenas-
terol, 5,24-stigmastadienol, ∆7-sigmastenol, ∆7-avenasterol.
Retentionstiderna för sitosterol för SE-52 och SE-54 kolonner framgår
av tabell 1.
Figurerna 1 och 2 visar typiska kromatogram för en del oljor.
5.4.5 Kvantitativ utvärdering
5.4.5.1 Beräkna områdena för α-kolestanol och steroltopparna med hjälp av
integratorn. Bortse från toppar för föreningar som inte finns med bland
de som är upptagna i tabell 1. Svarskoefficienten för α-kolestanol skall
vara lika med 1.
5.4.5.2 Beräkna koncentrationen för varje sterol i mg/100 g fettämne som följer:
sterol x =Ax·ms· 100
As·m
där:
Ax= arean av toppen för sterol x ►M6 ◄,
As= arean av toppen för α-kolestanol ►M6 ◄
ms= massan av tillsatt α-kolestanol i milligram
m = massan av provet som använts för bestämningen i gram
6. RESULTATANGIVELSE
6.1 Registrera enstaka sterolkoncentrationer som milligram per 100 g av
fettämne och deras summa som totala steroler.
6.2 Beräkna procenttalet för varje enskild sterol ur förhållandet mellan arean
av den aktuella toppen till summan av areorna av topparna för steroler.
% av sterol x =Ax
ΣA· 100
där:
Ax= arean av toppen för x,
ΣA = summan av areorna av topparna för steroler1991R2568 — SV — 22.05.2002 — 019.001 — 25
▼B
TILLÄGG
Bestämning av den linjära hastigheten för gasen
1 till 3 µl metan (eller propan) sprutas in i gaskromatografen under vanliga
driftförhållanden och den tid det tar för metanet (eller propanet) att passera
kolonnen från insprutningsögonblicket till det ögonblick toppen eluerar (tM)
mätsmed s toppur.
Den linjära hastigheten i cm/s erhålls genom L/tMdär L är kolonnenslängd i cm
och tMär tiden i sekunder som uppmäts med stoppur.
Tabell 1
Relativa retentionstiden för steroler
T-
op-
pIdentifieringRelativ retentionstid
SE 54
kolonnSE 52
kolonn
1 kolesterol ∆-5-kolesten-3 β-ol 0,67 0,63
2 kolestanol 5 α-kolestan-3 β-ol 0,68 0,64
3 brassikasterol [24S]-24-metyl- ∆-5,22-kolestadien-3 β-ol 0,73 0,71
4 24-metylenkolesterol 24-metylen- ∆-5,24-kolesten-3 β-ol 0,82 0,80
5 kampesterol [24R]-24-metyl- ∆-5-kolesten-3 β-ol 0,83 0,81
6 kampestanol [24R]-24-metyl-kolestan-3 β-ol 0,85 0,82
7 stigmasterol [24R]-24-etyl- ∆-5,22-kolestadien-3 β-ol 0,88 0,87
8 ∆-7-kampeterol [24R]-24-metyl- ∆-7-kolesten-3 β-ol 0,93 0,92
9 ∆-5,23-stigmastadienol [24R,S]-24-etyl- ∆-5,23-kolestadien-3 β-ol 0,95 0,95
10 klerosterol [24R]-24-etyl- ∆-5,25-kolestadien-3 β-ol 0,96 0,96
11 β-sitosterol [24R]-24-etyl- ∆-5-kolestan-3 β-ol 1,00 1,00
12 sitostanol 24-etyl-kolestan-3 β-ol 1,02 1,02
13 ∆-5-avenasterol [24Z]-24-etyliden-5-kolesten-3 β-ol 1,03 1,03
14 ∆-5,24-stigmasteadienol [24R,S]-24-etyl- ∆-5,24-kolestadien-3 β-ol 1,08 1,08
15 ∆-7-stigmastenol [24R,S]-24-etyl- ∆-7,24-kolestadien-3 β-ol 1,12 1,12
16 ∆-7-avenasterol [24Z]-24-etyliden- ∆-7-kolesten-3 β-ol 1,16 1,161991R2568 — SV — 22.05.2002 — 019.001 — 26
▼B
Figur 1
Gaskromatogram för sterolfraktionen hos en oraffinerad olivolja
1991R2568 — SV — 22.05.2002 — 019.001 — 27
▼B
Figur 2
Gaskromatogram för sterolfraktionen hos en raffinerad olivolja
1991R2568 — SV — 22.05.2002 — 019.001 — 28
▼B
BILAGA 6
BESTÄMNING AV ERYTRODIOL OCH UVAOL
INLEDNING
Erytrodiol (som vanligen förstås som glykolerna i erytrodiol och uvaol
tillsammans) är en del av den oförtvålbara reaktionen, som tillhör en del
typer av fettämnens karaktäristiska. Den kan påvisas i påtagligt högre
koncentration i olivolja som extraherats med lösningsmedel än i andra
oljor t. ex. pressad olivolja och druvolja som också innehåller den och
närvaron av den kan visa närvaron av olivolja som extraherats med
lösningsmedel.
1. SYFTE
Förfarandet beskriver en metod för att påvisa erytrodiol i fettämnen.
2. METODENS PRINCIP
Fettämnet förtvålasmed en kaliumhydroxid i metanol-etanol-lös ning. Den
oförtvålbara fraktionen extraherass edan med etyleter och renasgenom
passage över en kolonn med aluminumoxid. De oförtvålbara ämnen får
sedan genomgå tunnskiktskromatografi på kiselgelplattor till banden som
motsvarar sterol- och erytrodiolfraktionerna är separerade.
Sterolerna och erytrodiolerna återvinnsfrån plattan och överförstill trime-
tylsilyletrar och blandningarna analyseras senare med gaskromatografi.
Resultatet uttrycks som procent erytrodiol i blandningen av erytrodiol och
steroler.
3. UTRUSTNING
3.1 Utrustningen som beskrivs i bilaga 5 (bestämning av halten av sterol).
4. REAGENSER
4.1 De reagenser som beskrivs i bilaga 5 (bestämning av halten sterol).
4.2 Referenslösning av erytrodiol, 0,5 % lösning i kloroform.
5. UTFÖRANDE
5.1Preparering av oförtvålbara ämnen
Som beskrivits i punkt 5.1.2 i bilaga 5.
5.2Separering av erytrodiol och sterolerna.
5.2.1 Se punkt 5.2.1 i bilaga 5.
5.2.2 Se punkt 5.2.2 i bilaga 5.5.2.3 Gör iordning en 5 % lösning av de oförtvålbara ämnena i kloroform.
Med hjälp av en 0,1 ml mikrospruta stryks 0,3 ml av lösningen ut på en
kromatografiplatta ca 1,5 cm från nedre änden i en strykning som är så
tunn och jämn som möjligt. I ena änden av plattan placeras ett par mikro-
liter av lösningarna av kolesterol och erytrodiol som tjänar som referens.
5.2.4 Placera plattan i framkallningskammaren som iordningsställts enligt 5.2.1.
Omgivningstemperaturen bör vara omkring 20 ºC. Stäng kammaren
omedelbart med locket och låt elueringen fortgå tills lösningsmedlets front
når ca 1 cm från övre kanten av plattan. Ta bort plattan från framkall-
ningskammaren och låt lösningsmedlet avdunsta i ett varmt luftflöde.
5.2.5 Spraya plattan lätt och jämnt med den alkoholiska 2,7-dikloroflouro-
sceinlösningen. När plattan betraktas under ultraviolett ljus kan sterol-
och erytrodiolbanden identifierasgenom att de ligger mitt för s ina refe-
renspunkter. Markera med en punkt utanför gränserna för flouroscensen.
5.2.6 Skrapa med hjälp av en metallspatel bort silikagelen på de markerade
områdena. Placera materialet från plattan i en 50 ml kolv. Tillsätt 15 ml
varm kloroform. Skaka om väl och filtrera genom en glasfiltertratt så att
silikagelen överförs till filtret. Tvätta tre gånger med varm kloroform
(10 ml varje gång) och samla upp filtratet i en 100 ml kolv. Indunsta filt-
ratet till en volym av 4—5 ml, överför till en kalibrerat 10 ml centrifugrör1991R2568 — SV — 22.05.2002 — 019.001 — 29
▼B
med konisk botten, torka i en försiktig uppvärmning i kväveström och
väg.
5.3Framställning av trimetylsilylestrar
Som beskrivits i punkt 5.3 i bilaga 5.
5.4Gaskromatografianalys
Som beskrivits i punkt 5.4 om ovanstående metod.Driftförhållandena för gaskromatografen i analys måste vara sådana att de
går att genomföra sterolanalyser och separera TMSE från erytrodiol och
uvaol.
När provets sprutats in, fortsätt registreringen tills de närvarande stero-
lerna, erytrodiolen och uvaolen har eluerats. Identifiera sedan topparna
(retentionstiderna för ertytrodiol och uvaol relativt till β-sitosterol är ca
1,45 respektive 1,55) och beräkna områdena på samma sätt som för
steroler.
6. RESULTATANGIVELSE
erytrodiol i % =A
1+A2
A1+A2+ΣAsteroler× 100
där:
A1= arean av toppen för erytrodiol ►M6 ◄,
A2= arean av toppen för uvaol ►M6 ◄
ΣAsteroler= arean av toppen för steroler ►M6 ◄
Resultatet uttrycks med en decimal.1991R2568 — SV — 22.05.2002 — 019.001 — 30
▼B
BILAGA 7
BESTÄMNING AV FETTSYROR I 2-STÄLLNING I TRIGLYCERIDER
1. SYFTE
Den här standarden beskriver en metod för sammansättningen av den frak-
tion av fettsyror hos en olja eller ett fettämen som förestras i 2-ställning
(eller inre ställning) hos glycerolen.
2. TILLÄMPNINGSOMRÅDE
Denna standard kan tillämpas på oljor och fetter som har en smältpunkt
under 45 ºC beroende på de särskilda omständigheterna som följer av inve-
rkan av pankreatiskt lipas.
Den kan inte tillämpas oreserverat på oljor och fetter som innehåller påtag-
liga mängder av: fettsyror med 12 eller färre kolatomer (kokosnöt- och
palmkärneoljor, smörfett) eller mycket omättade fettsyror (med mer än
fyra dubbelbindningar) som innehåller 20 eller flera kolatomer (fiskoljor
och andra marina animaliska oljor) eller fettsyror som innehåller andra
oxygenerade grupper än syragruppen.
3. PRINCIP
Möjlig neutralisering av sura oljor och fetter i ett lösningsmedel. Rening
genom passage över en aluminumoxidkolonn. Delvis hydrolys av triglyce-
rider med pankreatiskt lipas under en bestämd tid. Separation av de bildade
monoglyceriderna med tunnskiktskromatografi och metanolys av dessa
monoglycerider. Analys av dessa metylestrar genom gas-vätskekromato-
grafi.
4. UTRUSTNING
4.1 100 ml rundkolv.4.2 25 ml rundkolv med slipning.4.3 1 m lång luftkylare, som passar i kolven 4.2.4.4 250 ml E-kolv.4.5 50 ml bägare.4.6 500 ml separertratt.4.7 Glaskolonn för kromatografi, 13 mm innerdiameter, 400 mm lång, försedd
med porös glasskiva och kran.
4.8 10 ml centrifugrör med slipad glaspropp.
4.9 5 ml byrett graderad i 0,05 ml.4.10 1 ml injektionsspruta försedd med en tunn kanyl.4.11 Mikrospruta som kan ge droppar på 3 till 4 µl.4.12 Utstrykare för tunnskiktskromatografi.4.13 Glasplattor för tunnskiktskromatografi, 20 × 20 cm.4.14 Framkallningstank av glas för tunnskiktskromatografi, med slipat glaslock,
lämplig för plattor, med måtten 20 × 20 cm.
4.15 Spray för tunnskiktskromatografi.4.16 Torkskåp för 103 ± 2ºC.
4.17 Termostat som kan ställas in mellan 30 och 45 ºC med en noggrannhet på
0,5 ºC.
4.18 Rotationsförgängare.4.19 Elektrisk skakapparat som tillåter kraftig omskakning av centrifugröret.4.20 Ultraviolett lampa för undersökning av tunnskiktsplattorna.
För kontroll av lipasaktiviteten:
4.21 pH-meter.
4.22 Spiralomrörare.1991R2568 — SV — 22.05.2002 — 019.001 — 31
▼B
4.23 5 ml byrett.
4.24 Stoppur.
För eventuell framställning av lipas:
4.25 Laboratorieomrörare, lämplig för dispergering och blandning av hetero-
gena material.
5. REAGENSER
5.1 N-hexan, eller om detta inte finns, lättbensin (kokpunkt 30 till 50 ºC)
kromatografikvalitet.
5.2 2-propanol, eller etanol, 95 % (v/v) P. A.5.3 2-propanol, eller etanol, 1/1 vattenlösning.
5.4 Dietyleter fri från peroxider.
5.5 Aceton.5.6 Myrsyra, minst 98 % (m/m).
5.7 Lösningsmedel för framkallning: blandning av n-hexan (5.1), dietyleter
(5.4) och myrsyra (5.6) i proportionerna 70/30/1 (v/v/v).
5.8 Aktiverad aluminumoxid för kromatografi, neutral, enligt Brockmann 1.
5.9 Kiselpulver, med bindemedel, av lämplig kvalitet för tunnskiktskromato-
grafi.
5.10 Pankreatiskt lipas av lämplig kvalitet (anm 1 och 2).
5.11 Natriumhydroxid, 120 g/l vattenlösning.5.12 Saltsyra, vattenlösning 6 N.
5.13 Kalciumklorid (CaCl
2), 220 g/l vattenlösning.
5.14 Natriumkolat (enzymkvalitet) 1 g/l vattenlösning.5.15 Buffertlösning: 1 M vattenlösning av tri-hydroxymetylaminometan som
ställs till pH 8 genom tillsats av saltsyra (5.12) (kontrolleras med potentio-
meter).
5.16 Fenolftalin, 10 g/l lösning i 95 % (v/v) etanol.
5.17 2,7-dikloroflourescein, 2 g/l lösning i 95 % (v/v) etanol, som gjorts lätt
alkalisk genom tillsats av en droppe 1 N natriumhydroxidlösning per
100 ml.
För kontroll av lipasaktiviteten:
5.18 Neutraliserad olja.
5.19 Natriumhydroxid, 0,1 N vattenlösning.
5.20 Natriumkolat (enzymkvalitet), 200 g/l vattenlösning.5.21 Gummi arabicum, 100 g/l vattenlösning.
6. PREPARERING AV PROVET
Om provet har en syrahalt under 3 %, bestämd enligt bilaga 2, kan det
renasdirekt över aluminumoxid enligt 6.2.
Om provet har en syrahalt över 3 %, bestämd enligt bilaga 2, neutraliseras
med alkali vid närvaro av lösningsmedel enligt 6.1 för passagen över
aluminumoxid enligt 6.2.
6.1Neutralisering med alkali vid närvaro av lösningsmedel
Häll 10 g av den råa oljan i en separertratt (4.6) och tillsätt 100 ml hexan
(5.1), 50 ml av 2-propanol (5.2), ett par droppar fenolftalinlösning (5.16)
och en mängd av natriumhydroxidlösningen (5.11) som motsvarar de fria
syrorna i oljan plus 0,3 % i överskott.
Skaka ordentligt i en minut, tillsätt 50 ml destillerat vatten, skaka igen och
låt stå.
Efter separering, tappa av såplagret i botten. Ta också bort andra mellan-
lager (t ex olösliga ämnen). Tvätta hexanlösningen som innehåller den
neutraliserade oljan med 25 till 30 ml portioner av 2-propanollösningen
(5.3) tills den rosa färgen från fenolftalin försvinner.1991R2568 — SV — 22.05.2002 — 019.001 — 32
▼B
Ta bort det mesta av hexanen genom destillation under vakuum i den rote-
rande injektorblocket (4.18). Torka oljan vid 30 till 40 ºC under vakuum
med hjälp av en ström av rent kväve tills hexanet avlägsnats helt och
hållet.
6.2Rening genom aluminumoxid
Gör iordning en suspension av 15 g aktiverat aluminumoxid (5.8) i 50 ml
hexan (5.1) och häll den under omrörning i kromatografikolonnen (4.7).
Låt aluminumoxidet sätta sig jämnt och låt lösningsmedelsnivån falla till
mellan 1 och 2 mm ovanför absorbentlagret. Häll försiktigt lösningen av
5 g olja i 25 ml hexan (5.1) i kolonnen och samla sedan ihop allt från
kolonnen i rundkolv (4.1).
7. PREPARERING AV KROMATOGRAFIPLATTOR
Rengör omsorgsfullt glasplattorna (4.13) med etanol, lättbensin och aceton
för att ta bort varje spår av fettämnen.
Häll upp 30 g kiselpulver (5.9) i en E-kolv (4.4). Tillsätt 60 ml destillerat
vatten. Sätt i proppen och skaka omsorgsfullt i en minut. Överför omedel-
bart suspensionen till utstrykaren (4.12) och täck de rena plattorna med ett
lager som är 0,25 mm tjockt.
Lufttorka plattorna i 15 minuter och sedan i en timme i torkskåpet (4.16)
vid 103 ± 2ºC.
Låt plattorna svalna i exsickator till rumstemperatur för användning.Färdigställda plattor finns tillgängliga i handeln.
8. UTFÖRANDE8.1Hydrolys med pankreatiskt lipas
Väg upp ca 0,1 g av det färdigställda provet i ett centrifugrör (4.8). Om
provet är fett i fast form lös upp i 0,2 ml hexan, under lätt uppvärmning
om så behövs.
Tillsätt 20 ml lipas (5.10) och 2 ml av buffertlösningen (5.15). Skaka om
ordentligt men försiktigt och tillsätt 0,5 ml av natriumkolatlösningen (5.14)
och 0,2 ml av kalciumkloridlösningen (5.13). Förslut provröret med den
slipade proppen, skaka försiktigt (se till att proppen inte blöts) och placera
sedan röret omedelbart i termostaten (4.17) som hålls vid 40 ± 0,5 ºC och
skaka för hand under exakt en minut. Ta bort röret från termostaten och
blanda omsorgsfullt med hjälp av en elektrisk skakapparat (4.19) i exakt
två minuter. Kyl omedelbart i rinnande vatten. Tillsätt 1 ml saltsyra
(5.12) och 1 ml dietyleter (5.4). Sätt i proppen och blanda omsorgsfullt
med hjälp av en elektrisk skakapparat. Låt stå och ta bort det organiska
lagret med hjälp av en spruta (4.10) om så behövs efter centrifugering.
8.2Separering av monoglyceriderna genom tunnskiktskromatografi
Placera extraktet på kromatografiplattan med hjälp av mikrosprutan (4.11)
ca 1,5 cm från nedre kanten i en tunn jämn sträng, så smal som möjligt.
Placera plattan i den väl mättade framkallningstanken (4.14) och framkalla
med framkallningslösningsmedel (5.7) vid 20 ºC upp till ca 1 cm från övre
änden av plattan.
Lufttorka plattan i samma temperatur som tanken har och spraya den 2,7-
dikloroflourosceinlösning (5.17). Identifiera monoglyceridernas band (R
fca
0,035) under ultraviolett ljus(4.20).
8.3Analys av monoglyceriderna genom gas- vätskekromatografi
Ta bort bandet som erhållits i 8.2 med hjälp av en spatel (undvik att ta bort
komponenter som stannat på baslinjen) och överför till metyleringskolven
(4.2).
Behandla den uppsamlade kiseln direkt med de metoder som beskrivits i
punkt 4.2 i bilaga 10 B för att överföra monoglyceriderna till metylestrar,
och undersök sedan estrarna med gaskromatografi som beskrivits i bilaga
10 A.
9. RESULTATANGIVELSE
Beräkna fettsyresammansättningen i 2-ställning med en decimal (anm 3).1991R2568 — SV — 22.05.2002 — 019.001 — 33
▼B
10. ANMÄRKNINGAR
Anm 1: Kontroll av lipasets aktivitet.
Preparera en oljeemulsion genom att skaka en blandning av 165 ml
av lösningen av gummi arabicum (5.21), 15 g krossad is och 20 ml
av en neutraliserad olja (5.18) i en lämplig skakapparat.
Placera 10 ml av denna emulsion i en bägare (4.5) följt av 0,3 ml
av natriumkolatlösningen (5.20) och sedan 20 ml destillerat vatten.
Sätt bägaren på en termostat vid 37 ± 0,5 ºC (anm 4). Sänk ner
elektroderna till en pH-meter (4.21) och en spiralomrörare (4.22).
Tillsätt med hjälp av en byrett (4.23) droppvis natriumhydro-
xidlösning (5.19) tills pH går upp till 8,5.
Tillsätt en tillräcklig mängd av vattensuspensionen med lipas (se
nedan). Så snart pH-metern visar ett pH på 8,3 startas stoppuret
(4.24) och droppa i natriumhydroxidlösningen (5.19) i en sådan
takt att pH bibehållsvid 8,3. Läsav volymen förbrukad alkali
varje minut.
Rita upp avläsningarna i form av en kurva med användande av
tiden som abskissa och antal ml alkalilösning som gått åt för att
bibehålla konstant pH som ordinata.
En rät linje bör erhållas.
Lipassuspensionen som angivits ovan är en 1:1 000 (m/m) suspen-
sion i vatten. För varje prov bör tillräckligt med denna suspension
användas så att ca 1 ml av alkalilösningen förbrukas på fyra till
fem minuter.
Vanligen behövs1 till 5 mg av pulvret.Lipasenheten definieras som mängden enzym som kommer att
frigöra 10 mikroequivalenter syra per minut. Då erhålls aktiviteten
A av det pulver som använts, mätt i lipasenheter per mg genom
formeln:
A¼
V/C210
m
där:
V = mängden natriumhydroxidlösning (5.19) som använts per
minut och som tagits ur den uppritade kurvan,
m = mängden i mg av provdelen av pulvret.
Anm 2: Preparering av lipasen
Lipaser som har tillräcklig lipasaktivitet finns tillgängliga i
handeln. Det är också möjligt att framställa dem i laboratoriet på
följande sätt:
Kyl 5 kg färsk svinpankreas till 0 ºC. Ta bort det omgivande fettet
och anslutande vävnad och kör det i en mixer så att en pasta
erhålles. Rör pastan med omröraren (4.25) i 4 till 6 timmar med
2,5 l av vattenfri aceton och centrifugera sedan. Extrahera
återstoden tre gånger till med samma mängd aceton, och sedan
två gånger med 1:1 (v/v) blandning av aceton och dietyleter och
därefter två gånger med dietyleter.
Torka återstoden i vakuum i 48 timmar så att ett stabilt pulver
erhålls. Detta skall lagras i kylskåp.
Anm 3: I samtliga fall är det tillrådligt att bestämma sammansättningen av
de totala fettsyrorna i samma prov, eftersom jämförelse med dessa
i syror i 2-ställning kommer att vara till hjälp vid tolkningen av de
kurvor som erhålls.
Anm 4: Temperaturen för hydrolysen ställs in vid 37 ºC om en olja i
vätskeform används. Den ställs emellertid på 40 ºC för provet för
att tillåta undersökning av fetter med smältpunkter upp till 45 ºC.1991R2568 — SV — 22.05.2002 — 019.001 — 34
▼B
BILAGA 8
BESTÄMNING AV SAMMANSÄTTNINGEN AV TRILINOLEIN
1. SYFTE
Bestämning av sammansättning av triglycerider i olivoljor i förhållande till
deras motsvarande antal kolatomer genom högeffektiv vätskekromatografi
(HPLC).
I denna standard beskrivs en metod för separering och kvantitativ
bestämning av triglyceridsammansättningen i vegetabiliska oljor i
förhållande till derasmolekylvikter och hur omättade de är, s om en funktion
av deras motsvarande antal kolatomer (se anm 1).
2. TILLÄMPNINGSOMRÅDE
Denna standard är tillämplig på alla vegetabiliska oljor som innehåller trig-
lycerider av fettsyror med långa kedjor. Metoden är speciellt lämpad för
bestämning av närvaron av små kvantiteter av halvtorkande oljor (med hög
halt av linolsyra) i vegetabiliska oljor som innehåller oljesyra som den
övervägande omättade fettsyran, t. ex. olivolja.
3. PRINCIP
Separation av triglycerider enligt derasantal kolatomer genom HPLC
(omvänd faspolaritet) och tolkning av kromatogrammen.
4. UTRUSTNING
4.1 HPLC-kromatograf, med möjlighet till termostatkontroll av kolonntempera-
turen.
4.2 Insprutningsenhet för 10 µl.4.3 Detektor: Differentialrefraktometer. Känslighet vid fullt skalutslag bör vara
minst 10
−4enheter av refraktionsindex.
4.4 Kolonn: Rostfritt rör 250 mm långt och med innerdiametern 4,5 mm, fyllt
med kiselkorn med 5 µm diamter med 22 till 23 % kol i form av oktadekyl-
silan (anm 2).
4.5 Registreringsenhet och/eller integreringsenhet.
5. REAGENSER
Reagenserna bör vara av analysren kvalitet. Elueringslösningsmedlen bör
vara avgasade, och kan återvinnas flera gånger utan inverkan på separering-
arna.
5.1 Kloroform.5.2 Aceton.5.3 Acetonitril.
5.4 Elueringslösningsmedel: Acetontitril + aceton (proportionerna mellan dessa
kan justeras för att få önskad separering, börja med blandningen 50:50).
5.5 Lösningsgörande lösningsmedel: Aceton eller en blandning av 1:1 aceton-
kloroform.
5.6 Referenstriglycerider: Antingen kan triglycerider som finns i handeln
användas (tripalmitin, triolein, osv) och retentionstiderna plottas i enlighet
med motsvarande antal kolatomer, eller alternativt ett referenskromatogram
som erhållits ur sojaolja (se anm 3 och 4 och fig 1 och 2).
6. PREPARERING AV PROVEN
En 5 % lösning av proven som skall analyseras iordningställs genom att
väga in 0,5 ± 0,001 g av provet i en 10 ml mätkolv och späda till 10 ml
med det lösningsgörande lösningsmedlet (5.5).
7. UTFÖRANDE
7.1 Sätt upp kromatografisystemet. Pumpa elueringslösningsmedel (5.4) med en
hastighet av 1,5 ml/min så att hela systemet rengörs. Vänta tills en stabil
baslinje erhålls.1991R2568 — SV — 22.05.2002 — 019.001 — 35
▼B
Injicera 10 µl av provet som preparerats enligt punkt 6.
8. RESULTATANGIVELSE
Använd den interna standardiseringsmetoden, dvs antag att summan av
areorna av topparna som motsvarar de olika triglyceriderna är lika med
100 %.
Beräkna den relativa procenten av varje glycerid enligt formeln:
% triglycerid =toppensarea
summan av areorna av topparna× 100
Resultatet anges med en decimal.
Anm 1: Elueringsordningen kan bestämmas genom att beräkna motsvarande
antal kolatomer som ofta definieras av förhållandet ECN = CN −
2n, där CN är antalet kolatomer och n är antalet dubbelbindningar.
Den kan beräknasmera exakt genom att häns yn tastill dubbelbind-
ningarnasurs prung.
Om no,n1och n1när antalet dubbelbindningar som överförs till olin-
syra, linolsyra och linolensyra kan motsvarande antal kolatomer
beräknass om ett förhållanden genom formeln:
ECN = CN − dono−d1n1−d1an1a
där koefficienterna do,d1och d1nkan beräknasmed hjälp av referen-
striglycerider. Under de förhållanden som anges i denna metod
kommer det förhållandet som erhålls att vara nära:
ECN = CN − [2,60no] − [2,35n1] − [2,17n1n]
Anm 2: Exempel: Lichrosorb (Merck) RP 18, artikel 50333.
Lichrosphere (Merck) 100 CH18, artikel 50377, eller
liknande.
Anm 3: Med flera referenstriglycerider är det också möjligt att beräkna
upplösningen i fråga om triolein,
α=R T′/RT′olein.
Genom användning av den recuderade retentionstiden RT ′=R T−
RTlösningsmedel.
Kurvan av log αmot f (antal dubbelbindningar) gör det möjligt att
bestämma återgångsvärdena för alla triglycerider i fettsyror som
innehåller referenstriglyceriderna — se figur 2.
Anm 4: Effektiviteten hoskolonnen bör tillåta klar s eparering av trilinolen-
toppen (LLL) från topparna hosde triglycerider s om har en
näraliggande RT.
Anm 5: För att medge en klar separering av trilinolentoppen från näralig-
gande toppar eller eventuella interfererande substanser, skall
bomolja och rå olivolja av pressrester renas i förväg enligt följande
metod:
200µl outspädd olja absorberas i en silica-kolonn för extrahering
(typ SEP PAK silica cartridge-waters part. nr 51 900).
Triglyceriderna eluerasmed 20 ml vattenfri hexan för högeffektiv
vätskekromatografi (HPLC), under maximalt 20 sekunder.
Eluatet torkas i en kvävgasström och återupplöses i isopropanol
eller aceton (5 ml). 10—20 µl sprutas in i HPLC. Det är nödvändigt
att kontrollera att sammansättningen av oljans fettsyror är
densamma före och efter reningen, det vill säga att den ligger
inom de felmarginaler som den använda analysmetoden tillåter.1991R2568 — SV — 22.05.2002 — 019.001 — 36
▼M11
▼B
Figur 1
Kromatogram av ett prov på sojaolja
P = Palmitinsyra St = Stearinsyra O = Oljesyra L = Linolsyra Ln = Linolen-
syra1991R2568 — SV — 22.05.2002 — 019.001 — 37
▼B
Figur 2
Kurva för log αmot f (antal dubbelbindningar)
La = Laurinsyra My = Myristinsyra P = Palmitinsyra St = Stearinsyra O =
Oljesyra L = Linolsyra Ln = Linolensyra1991R2568 — SV — 22.05.2002 — 019.001 — 38
▼B
BILAGA 9
SPEKTROFOTOMETRISK UNDERSÖKNING
INLEDNING
Spektrofotometrisk undersökning i ultraviolett ljus kan ge information om
kvalitet på fett, dess grad av konservering och förändringar som inträffar i
dem beroende på tekniska processer.
Absorptionen vid våglängderna som anges i metoden beror på närvaron av
konjugerade dien- och triensystem. Dessa absorptioner uttrycks som speci-
fika extinktioner E 1 % 1 cm (extinktionen av 1 % lösning av fettet i ett
givet lösningsmedel med en tjocklek av 1 cm som konventionellt anges
genom K (även kallad extinktionskoefficienten).
1. SYFTE
Förfarandet beskriver en metod för genomförande av spektrofotometrisk
undersökning av fetter i ultraviolett ljus.
2. PRINCIP
Fettet i fråga löses i den behövliga mängden lösningsmedel och extinktionen
hos lösningen bestäms sedan vid de angivna våglängderna med rent
lösningsmedel som referens. Specifika extinktioner beräknas ur spektrofoto-
metervärdena.
3. UTRUSTNING
3.1 En spektrofotometer för mätning av extinktion vid ultraviolettområdet
mellan 220 och 360 nm med möjlighet till att avläsa enstaka nanometriska
enheter.
3.2 Rektangulära quartzkuvetter med lock och med en optisk längd av 1 cm.
När de är fyllda med vatten eller annat lämpligt lösningsmedel bör kuvet-
terna inte skiljas åt mer än 0,01 extinktionsenheter.
3.3 25 ml mätkolvar.
3.4 En kromatografikolonn varsövers ta del är 270 mm lång med en diameter av
35 mm, och varsneders ta del är 270 mm lång med en diameter av cirka 10
mm.
4. REAGENSER
4.1 Spektrografren iso-oktan (2,2,4-trimetylpentan). Med destillerat vatten som
referens skall denna ha en genomsläpplighet av minst 60 % vid 220 nm
och minst 95 % vid 250 nm, eller
— spektrografren cyklohexan. Med destillerat vatten som referens bör
denna ha en genomsläpplighet av minst 40 % vid 220 nm och minst
95 % vid 250 nm, eller.
4.2 Aluminumoxid för kolonnkromatografi som är iordningsställd och kontrol-
lerad som beskrivits i bilaga 1.
4.3 N-hexan för kromatografi.
5. UTFÖRANDE
5.1 Provet i fråga måste vara helt homogent och utan misstänkta föroreningar.
Oljor som är flytande vid den omgivande temperaturen skall filtreras genom
papper vid en temperatur av ca 30 ºC, hårdare fetter skall homogeniserasoch filtreras vid en temperatur på högst 10 ºC över smältpunkten.
5.2 Väg exakt in ungefär 0,25 g av provet som iordningsställts på detta sätt i en
25 ml mätkolv, späd till märket med det angivna lösningsmedlet och homo-
genisera. Den resulterande lösningen måste vara helt klar. Vid opalesens
filtreraslös ningen genom papper.1991R2568 — SV — 22.05.2002 — 019.001 — 39
▼M6
▼B
▼M6
▼B
▼B
5.3 Fyll en kuvett med den erhållna lösningen och mät extinktionen vid en
lämplig våglängd mellan 232 och 276 nm, med användande av lösnings-
medlet som referens.
Extinktionsvärdena som antecknas måste ligga inom området 0,1 till 0,8.
Om de inte gör detta måste mätningarna göras om och mera koncentrerad
eller mera utspädd lösning måste användas.
5.4 När en bestämning av den specifika extinktionen krävs efter passage över
aluminiumoxid, görsdet på följande s ätt. Placera 30 g aluminumoxid i
suspension i hexan i kromatografikolonnen. Sedan adsorbenten har satt sig,
ta bort överskottet av hexan ned till ca 1 cm ovanför aluminumoxidets övre
yta.
Lös 10 g av fettet, homogeniserat och filtrerat som beskrivits i 5.1, i 100 ml
hexan och häll lösningen i kolonnen. Samla upp eluatet och indunsta allt
lösningsmedel i vakuum vid en temperatur under 25 ºC.
Fortsätt därefter omdelbart som angivits i 5.2 med användande av det fett
som erhållits.
6. RESULTATANGIVELSE
6.1 Anteckna de specifika extinktionerna (extinktionskoefficienterna) vid de
olika våglängderna och beräkna på följande sätt:
Kλ¼Eλ
c/C1s
där:
Kλ= pecifika extinktionen vid våglängden λ
Eλ= extinktionen uppmätt vid våglängden λ
c = koncentrationen hoslös ningen i g/100 ml
s= tjockleken hos kuvetten i cm
Resultaten uttrycks med två decimaler.
6.2 Spektrofotometrisk analys av olivolja enligt den officiella metoden i EEG:s
förordningar anges bestämning av den specifika extinktionen i iso-oktanlös-
ning vid våglängderna 232 och 270 nm och bestämning av ∆K som ges
genom:
∆K¼Km/C0Km/C04þKmþ4
2
där Kmär den specifika extinktionen vid våglängden m, våglängden för
maximal absorbtion runt 270 mm.1991R2568 — SV — 22.05.2002 — 019.001 — 40
▼B
TILLÄGG I
Preparering av aluminumoxid och provning av dess aktivitet
A.1.1 Preparering av aluminumoxid
Placera aluminumoxidet som har torkats i en ugn vid 380 till 400 ºC i tre
timmar i en hermetiskt sluten behållare, sätt till destillerat vatten i
förhållandet 5 ml per 100 g aluminumoxid, stäng behållaren omedelbart,
skaka flera gånger och låt stå i minst 12 timmar före användning.
A.1.2 Kontroll av aluminumoxidetsaktivitet
Gör i ordning en kromatografikolonn med 30 g aluminumoxid. Gör på
samma sätt som beskrivits i punkt 5.4 och låt en blandning som består av
— 95 % jungfruolja med en specifik extinktion på mindre än 0,18 vid
268 nm
— 5 % jordnötsolja som behandlats med jord i raffineringsprocessen och
som har en specifik extinktion av minst 4 vid 268 nm
passera genom kolonnen.
Om blandningen sedan den passerat kolonnen har en specifik extinktion
av mer än 0,11 vid 268 nm kan aluminumoxidet accepteras, om inte
måste dehydreringsnivån ökas.1991R2568 — SV — 22.05.2002 — 019.001 — 41
▼B
TILLÄGG II
Kalibrering av fotospektrometer
A.2 Utrustningen måste kontrolleras med jämna mellanrum (minst var sjätte
månad) både beträffande våglängderna och noggrannheten hoss varet.
A.2.1 Våglängden kan kontrolleras med användning av kvicksilvergaslampa
eller med hjälp av lämpliga filter.
A.2.2 För att kontrollera svaret från fotocellen och fotomultiplikatorn gör på
följande sätt: Väg in 0,2 g ren kaliumkromat för spektrofotometri och
lösdetta i 0,05 N kaliumhydroxidlös ning i en 1 000 ml mätkolv och
späd till märket. Ta ut exakt 25 ml av lösningen, överför det till en
500 ml mätkolv och späd upp till märket med samma kaliumhydroxidlös-
ning.
Mät extinktionen hoslös ningen vid 275 nm med användning av kalium-
hydroxidlösningen som referens. Den uppmätta extinktionen med
användande av 1 cm kuvett bör vara 0,200 ± 0,005.1991R2568 — SV — 22.05.2002 — 019.001 — 42
▼B
BILAGA 10 A
ANALYS AV METYLESTRAR AV FETTSYROR MED GASKROMATO-
GRAFI
1. SYFTE
Denna metod ger allmänna riktlinjer för tillämpning av gaskromatografi
med användning av packade kolonner eller kapillärkolonner för att
bestämma den kvalitativa och kvantitativa sammansättning av en bland-
ning av fettsyremetylestrar som erhållits i enlighet med den metod som
angesi bilaga 10 B.
Metoden är inte tillämplig på polymeriserade fettsyror.
2. REAGENSER
2.1Bärargas
Inert gas (kväve, helium, argon, väte osv) som är omsorgsfullt torkad
och med en syrehalt som är mindre än 10 mg/kg.
Anm 1: Väte, som endast används som bärargas i kapillärkolonner, kan
fördubbla analyshastigheten men är farlig. Säkerhetsanordningar
finnsatt tillgå.
2.2Supplementerande gaser
2.2.1 Väte (renhet ≥99,9 %) fri från organiska föroreningar.
2.2.2 Luft eller syre fri från organiska föroreningar.
2.3Standard för referens
En blandning av metylestrar av rena fettsyror eller metylestrar av ett fett
av känd sammansättning, företrädesvis liknande det fett som skall analy-
seras.
Försiktighet skall iakttas för att förhindra oxidation av fleromättade fett-
syror.
3. UTRUSTNING
De anvisningar som ges här avser vanlig utrustning som används för
gaskromatografi, som använder packade kolonner eller kapillärkolonner
och en flamjoniseringsdetektor. Vilken apparatur som helst som ger
effektiviteten och upplösningen som anges i 4.1.2 är lämplig.
3.1Gaskromatograf
Gaskromatografen skall bestå av följande enheter.
3.1.1 Insprutningssystem
Använd ett insprutningssystem
a) med packade kolonner med minsta möjliga dödutrymme (i det här
fallet skall insprutningssystemet kunna upphettas till en temperatur
som är 20 till 50 ºC högre än kolonnens, eller
b) med kapillärkolonner, varvid insprutningssystemet skall vara speciellt
konstruerat för användning med sådana kolonner. Injektorn kan vara
med eller utan split.
Anm 2: Vid frånvaro av fettsyror med minst 16 kolatomer kan ett
insprutningssystem med rörlig nål användas.
3.1.2 Ugn
Ugnen skall kunna värma kolonnen till en temperatur av minst 260 ºC
och upprätthålla den önskade temperaturen inom 1 ºC med packad
kolonn och inom 0,1 ºC med kapillärkolonn. Det senaste kravet är
särskilt viktigt när kvartsrör används.
Användning av temperaturprogrammerad uppvärmning rekommenderasi
alla fall och särskilt för fettsyror med mindre än 16 kolatomer.
3.1.3 Packad kolonn1991R2568 — SV — 22.05.2002 — 019.001 — 43
▼B
3.1.3.1 En kolonn som är tillverkad av ett material som är inert mot de ämnen
som skall analyseras (dvs glas eller rostfritt ståll och som har följande
dimensioner:
a) längd: 1 till 3 m. En relativt kort kolonn bör användasom fetts yror
med långa kedjor (längre än C20) finnsnärvarande. I analysav fett-
syror med 4 eller 6 kolatomer rekommenderas att en kolonn på 2 m i
längd används.
b) innerdiameter: 2 till 4 mm.
Anm 3: Om fleromättade komponenter med fler än 3 dubbelbindningar
finns närvarande kan de sönderdelas i en kolonn av rostfritt stål.
Anm 4: Ett system med dubbla packade kolonner kan användas.
3.1.3.2 Fyllning, sammansatt av följande element
a) bärare: syratvättad och silaniserad kiselgur, eller annan lämplig inert
bärare med en kornstorlek med liten avvikelse (25 µm inom
gränserna 125 till 200 µm) varvid genomsnittskornstorleken skall
avpassas efter innerdiametern och längden på kolonnen.
b) stationär fas: polyestertyp av polar vätska (t.ex. dietylenglykolpoly-
succinat, butandiolpolysuccinat, etylenglykolpolyadipat, osv)
cyanosilikoner eller någon annan vätska som tillåter den behövliga
kromatografiska separationen (se punkt 4). Den stationära fasen bör
uppgå till 5 till 20 % (m/m) av fyllningen. En ickepolar stationär
fas kan användas för vissa separationer.
3.1.3.3 Preparering av kolonnen
Om möjligt taskolonnen bort från detektorn, ugnen upphettass tegvistill
185 ºC och en ström av inert gas blåses igenom den nybehandlade
kolonnen med en hastighet av 20 till 60 ml per minut i åtminstone 16
timmar vid denna temperatur och under ytterligare två timmar vid
195 ºC.
3.1.4 Kapillärkolonn3.1.4.1 Rör som är tillverkade av ett material som är inert för ämnen som skall
analyseras (vanligen glas eller kvarts). Innerdiametern skall vara mellan
0,2 och 0,8 mm. Den inre ytan skall genomgå en lämplig behandling (t
ex ytpreparering, inaktivering) innan den får täckning av den stationära
fasen. En längd på 25 mm är tillräcklig i de flesta fall.
3.1.4.2 Stationär fas, vanligen av typen polyglykol [poly(etylenglykol) 20 000],
polyester (butandiol polysuccinat) eller polärpolysiloxan (cyanosili-
koner). Tvärbundna kolonnfyllningar är lämpliga.
Anm 5: Det finns en risk att polära polysiloxaner ger upphov till
svårighet att identifiera och separera linolensyra och C
20-syror.
Beläggningen skall vara tunn, dvs 0,1 till 0,2 µm.
3.1.4.3 Sammansättning och konditionering av kolonnen
Följ de normala försiktighetsåtgärderna för att sätta ihop kapillärkolon-
nerna, dvsplaceringen av kolonnen i ugnen (bärare) val och
sammansättning av skarvar (läckaget) placering av kolonnens in- och
utlopp i injektorn och detektorn (minskning av dödutrymmen). Placera
kolonnen i en ström av bärargas [t.ex. 0,3 bar (30 kPa) för en kolonn
med längden 25 mm och en innerdiameter på 0,3 mm].
Behandla kolonnen genom temperaturprogrammering av ugnen till 3 ºC/
minut från omgivningstemperaturen till en temperatur som är 10 ºC
under sönderfallsgränsen för den stationära fasen. Håll ugnen vid denna
temperatur i en timme, tills baslinjen har stabiliserats. Gå tillbaka till
180 ºC för att arbeta under isoterma förhållanden.
Anm 6: Lämpliga förbehandlade kolonner finnstillgängliga i handeln.
3.1.5 Detektor som lämpligen skall kunna värmas upp till en temperatur som
ligger ovanför kolonntemperaturen.
3.2Sprutor
Sprutorna skall ha en maximivolym av 10 µl och vara graderade i 0,1 µl
delning.
3.3Registering
Om registreringskurvan skall användas för att beräkna sammansätt-
ningen av den blandning som analyseras, krävs en elektronisk1991R2568 — SV — 22.05.2002 — 019.001 — 44
▼B
registreringsapparat med hög precision och som är kompatibel med
apparaturen som används. Registreringsenheten skall ha följande
karaktäristika:
a) svarstid, under 1,5 sekunder, företrädesvis 1 sekund (svarshastigheten
är tiden det tar för pennan att gå från 0 till 90 % vid en plötslig
ingångssignal på 100 %),
b) pappersbredd minimum 20 cm,
c) pappershastighet inställbar på värden mellan 0,4 och 2,5 cm/minut.
3.4Integreringsenhet
Snabb och exakt beräkning kan genomförasmed hjälp av en elektronis k
integreringsenhet. Den skall ge ett linjärt svar med tillräcklig känslighet
och korrektionen för avvikelser från baslinjen skall vara tillfredsstäl-
lande.
4. UTFÖRANDE
De arbeten som beskrivs i 4.1 till 4.3 är relaterade till användning av en
flamjoniseringsdetektor.
Som alternativ kan en gaskromatograf som använder sig av en kataro-
meterdetektor användas(s om arbetar enligt principen om förändringar i
värmeledning). Driftförhållandena modifieras som beskrivs i punkt 6.
4.1Provningsförhållanden
4.1.1 Val av optimala provningsförhållanden.4.1.1.1 Packad kolonn
Vid val av provningsförhållanden skall hänsyn tas till följande variabler:
a) längden och diametern hoskolonnen,
b) sorten och mängden av den stationära fasen,
c) temperaturen hoskolonnen,
d) bärargasen flöde,
e) den upplösning som krävs,
f) storleken på det uttagna provet som har valts på ett sådant sätt att
detektorn och elektrometer ger ett linjärt utslag,
g) analysens tidslängd.
I allmänhet ger de värden som anges i tabell 1 och tabell 2 de önskade
resultatet, dvs minst 2 000 teoretiska bottnar per meter kolonnlängd för
metylstearat och en elueringstid på ca 15 minuter.
Om utrustningen tillåter skall injektorn hållas vid en temperatur av ca
200 ºC och detektorn vid en temperatur som är lika med eller högre än
den i kolonnen.
Som regel gäller att förhållandet mellan flödet hosvätet s om tillförstill
flamjoniseringsdetektorn och bärargasen varierar från 1:2 till 1:1
beroende på diametern på kolonnen. Syreflödet är ca 5 till 10 gånger
vätetsflöde.
Tabell 1
Inre diameter hoskolonnen
mmBärargasflöde
ml/min
2 15 till 25
3 20 till 40
4 40 till 60
Tabell 2
Koncentration av den stationära fasen
% (m/m)Kolonntemperatur
ºC
5 175
10 180
15 1851991R2568 — SV — 22.05.2002 — 019.001 — 45
▼B
Koncentration av den stationära fasen
% (m/m)Kolonntemperatur
ºC
20 185
4.1.1.2 Kapillärkolonn
Effektivitets- och permeabilitetsegenskaperna hos kapillärkolonnen
medför att separationen mellan komponenterna och tiden för analysen i
hög grad är beroende av flödeshastigheten på bärargasen i kolonnen. Det
är därför nödvändigt att optimera driftförhållandena genom att påverka
denna parameter (eller enklare tryckfall i kolonnen) beroende på om
man önskar förbättra separationen eller göra en snabb analys.
4.1.2 Bestämning av antalet teoretiska bottnar (effektivt) och upplösning (se
figur 1).
Genomför analysav en blandning av metyls tearat och metyloleat i
ungefär lika proportioner (t.ex. metylestrar av kakaosmör).
Välj temperaturen för kolonnen och bärargasens flöde så att maximum
på metylstearattoppen registreras ca 15 minuter efter lösningsmedels-
toppen. Använd en tillräcklig mängd av blandningen av metylestrar så
att metylstearattoppen upptar ungefär 3/4 av hela skalan.
Beräkna antalet teoretiska bottnar, n, med hjälp av formeln
n¼16dr1
W1/C20/C21
2
och upplösningen R, med hjälp av formeln
R¼2∆
W1þW2
där:
dr1är retentionsavståndet i mm från början av kromatogrammet
till maximitoppen för metylstearat,
w1och w2är bredderna i mm av topparna för metylstearat respektive
metyloleat mätt mellan punkterna för tangeternas skärnings-
punkt vid de punkter där kurvorna skär baslinjen, och
∆är avståndet i mm mellan toppmaxima för metylstearat och
metyloleat,
och upplösningsindex, lr, med hjälp av formeln
a
b
där:
a = höjden av den minsta toppen, mätt från baslinjen,
b = höjden av den lägsta punkten på botten mellan de två angränsande
topparna, mätt från baslinjen.1991R2568 — SV — 22.05.2002 — 019.001 — 46
▼M2
▼B
Figur 1
Kromatogram för bestämning av antalet teoretiska bottnar (effektivitet) och
upplösning
Driftförhållandena som skall väljas är sådana som kan ge åtminstone
2 000 teoretiska bottnar per meter av kolonnlängden för metylstearat
och en upplösning som är minst 1,25.
4.2Prov
Använd sprutan (3.2) och sug upp 0,1 till 2 µl av lösningen av mety-
lestrar som preparerats enligt bilaga 10 B och spruta in dem i kolonnen.
När det gäller estrar som inte är i lösning, preparera en lösning av ca
100 mg/ml av kromatografiskt ren heptan och spruta in 0,1 till 1 µl av
denna lösning.
Om analysen gäller ämnen i spårmängder, kan mängden av provet ökas
(upp till 10 gånger).
4.3Analys
I allmänhet skall driftförhållandena vara de som angetts i 4.1.1.
Det går emellertid att arbeta med en lägre kolonntemperatur när det
krävs bestämning av fettsyror med mindre än 12 kolatomer eller vid
högre temperaturer vid bestämning av fettsyror med mera än 20 kola-
tomer.
Ibland kan det vara möjligt att använda temperaturprogrammering i båda
dessa fall. Om provet t ex innehåller metylestrar av fettsyror med
mindre än 12 kolatomer, sprutas provet in vid 100 ºC (eller vid 50 till
60 ºC om smörsyra finns närvarande) och sedan höjs temperaturen
omedelbart med en hastighet av 4 till 8 ºC per minut till optimal tempe-
ratur. I vissa fall kan de två förfarandena kombineras.
Efter den programmerade uppvärmningen fortsätts elueringen vid en
konstant temperatur tills alla komponenterna eluerats. Om inte instru-
mentet har programmerad uppvärmning, använd det vid två bestämda
temperaturer mellan 100 och 195 ºC.1991R2568 — SV — 22.05.2002 — 019.001 — 47
▼B
Om så är nödvändigt rekommenderas att analysen genomförs på två
fasta faser med olika polaritet för att påvisa frånvaron av maskerade
toppar t ex när det gäller samtidig närvaro av C18:3och C20:0, eller C18:3och C18:2.
4.4Beredning av referenskromatogrammet och referensgraferna
Analysera referensstandardblandningen (2.3) med användande av samma
driftförhållande som de som använts för provet och mät retentionsti-
derna eller retentionsavstånden för de närvarande fettsyrorna. Rita på
halvlogaritmiskt papper för varje grad av omättnad de kurvor som visar
den logaritmiska retentionstiden eller avståndet som en funktion av
antalet kolatomer. Under isoterma förhållanden skall kurvorna för syror
med raka kolkedjor med samma grad av omättnad vara räta linjer. Dessa
linjer skall vara ungefär parallella.
Det är nödvändigt att undvika förhållanden som gör att ”maskerade
toppar” existerar, dvs där upplösningen är otillräcklig för att separera
två av de ingående ämnena.
5. RESULTATANGIVELSER5.1Kvalitativ analys
Identifiera topparna för metylestrarna från provet från de kurvor som
iordningställts enligt 4.4 om så behövs genom interpolering.
5.2Kvantitativ analys
5.2.1 Bestämning av sammansättningen
Bortsett från extrema fall användes den inre normaliseringsmetoden, dvs
antag att alla ingående komponenter i provet finnsrepres enterade på
kromatogrammet så att den totala ytan under topparna representerar
100 % av de ingående ämnena (total eluering).
Om utrustningen innefattar en integreringsenhet, använd de kurvor som
erhållitsfrån denna. Om inte, bes täm arean under varje topp genom att
multiplicera höjden på toppen med dess bredd på mitten och där så
behövs med hänsyn till de olika avvikelserna som används under regi-
streringen.
5.2.2 Beräkningssätt5.2.2.1 Allmänt fall
Beräkna halten av en given komponent i, uttryckt som massprocent av
metylestrar, genom att bestämma den procent som representeras av
området hos motsvarande toppar relativt summan av områdena för alla
toppar med användning av formeln:
Ai
ΣA/C2100
där:
Aiär arean under toppen som motsvarar komponent i,
ΣA är summan av areorna under alla toppar,
Ange resultatet med en decimal.
Anm 7: I det här allmänna fallet anses resultatet av beräkningen som
baseras på relativa områden representera massprocent. För de
fall där inte detta antagande är tillåtet, se 5.2.2.2.
5.2.2.2 Användning av korrektionsfaktorer
I vissa fall, t.ex. i närvaro av fettsyror med färre än 8 kolatomer eller
fettsyror med sekundära grupper, när termiska ledningsdetektorer
används eller där högsta graden av noggrannhet särskilt krävs, skall
korrektionsfaktorer användas för att omvandla procenten för toppareorna
till massprocent hos komponenterna.
Bestäm korrektionsfaktorerna med hjälp av ett kromatogram som erhål-
lits genom analys av en referensblandning med metylestrar av känd
sammansättning genomförda under identiskt samma förhållanden som
de som används vid analys av provet.
För denna referensblandning erhålls massprocenten av komponenten i
genom formeln1991R2568 — SV — 22.05.2002 — 019.001 — 48
▼B
mi
Σm/C2100
där:
miär massan hos komponenten ii referensblandningen.
Σm är den totala massan av de olika komponenterna i referensbland-
ningen.
Beräkna ur kromatogrammet för referensblandningen (4.4) procenten
(area/area) för komponent ipå följande sätt:
AI
ΣA/C2100
där:
Aiär arean under toppen som motsvarar komponenten i,
ΣA är summan av areorna under alla topparna,
Korrektionsfaktorn beräknas sedan som:
Ki¼mi/C2ΣA
Ai/C2Σm
Vanligen är korrektionsfaktorerna uttryckta relativt till KC16så att de
relativa faktorerna blir:
K0
i¼Ki
KC16
För provet är innehållet av varje komponent iuttryckt som massprocent
av metylestrar:
K0
i/C2Ai
ΣK0
i/C2Ai/C0/C1 /C2100
Ange resultatet med en decimal.
5.2.2.3 Användning av inre standard
I vissa analyser (t ex där inte alla fettsyrorna är kvantifierade, såsom när
syror med fyra och sex kolatomer är närvarande tillsammans med syror
med 16 och 18 kolatomer, eller när det är nödvändigt att bestämma den
absoluta mängden fettsyror i ett prov) är det nödvändigt att använda en
inre standard. Fettsyror med 5, 15 eller 17 kolatomer används ofta.
Korrektionsfaktorn (om sådan finns) för den inre standarden bör
bestämmas.
Massprocenten av komponenten i, uttryckt som metylestrar, erhålls
genom formeln:
ms/C2K0
i/C2Ai
m/C2K0
s/C2As/C2100
där:
Aiär arean under toppen som motsvarar komponenten i,
Asär arean under toppen som motsvarar den inre standarden,
K′iär korrektionsfaktorn för komponent i (relativ till KC16)
K′sär korrektionsfaktorn för den inre standarden (relativt till KC16)
m är massan i milligram av provet, och
msär massan i milligram av den inre standarden.
Ange resultatet med en decimal.
6. SPECIALFALL - BESTÄMNING AV TRANSISOMERER
Det är möjligt att bestämma innehållet av transisomerer i fettsyror med
ett antal kolatomer mellan 10 och 24 genom separering av metylestrar
med användning av gaskromatografiska kapillärkolonner med en
bestämd polaritet.1991R2568 — SV — 22.05.2002 — 019.001 — 49
▼M2
▼M2
6.1. En kapillärkolonn tillverkad av kiseldioxid med en innerdiameter av
mellan 0,25 och 0,32 mm och en längd av 50 m, belagd med cyanpro-
pylkiseldioxid, där beläggningen är mellan 0,1 och 0,3 µm (typ SP 2380,
C. P. sil 88, silor 10 och likartade sorter).
6.2. Metylestrarna är beredda genom det förfarande som anges i bilaga 10 B.
För säkerhets skull skall fetthaltiga ämnen med en fri syrahalt över 3 %,
neutraliseras enligt 6.1 i bilaga 7.
6.3. Gaskromatografens driftsförhållanden är i allmänhet följande:
— Kolonntemperaturen inställd mellan 150 och 230º C (t. ex. 165º C i
15 minuter, och sedan ökad med 5º C per minut till 200º C).
— Insprutningstemperatur: 250º C om splitsystemet används eller
kolonnens ingångstemperatur om kolonnsystemet används.
— Detektortemperatur: 260º C.— Genomströmningshastighet för bärargas (helium och väte): 1,2 ml
per minut.
Den insprutade mängden skall vara sådan att höjden hos den topp som
under de sensoriska förhållanden som råder överensstämmer med
arachinsyras metylester, är lika stor som eller större än 20 % av fullt
utslag.
6.4. Identifieringen av de olika metylestrarna genomförs på grundval av
retentionstiderna som jämförs med referensblandningarnas retentions-
tider (som anges i punkt 2.3).
Estrarna från transfettsyrorna elueras före motsvarande cis-isomerer.
Exempel på ett kromatogram finnsi figur 2.
Figur 2:
Gaskromatogram för transisomerer från fettsyror vid användning av kapillärko-
lonner.
6.5. Kolonnen enligt punkt 4.1.2 skall vara så effektiv att den medger sepa-
ration av vissa kritiska par, till exempel det par som består av
transoljesyra och oljesyra, trans C18:1/cis C18:1, med ett resolutionstal
högre än 2.
6.6. Procenten av de olika transfettsyrorna beräknas på grundval av
förhållandet mellan den tillämpliga toppensarea och s umman av alla
de förekommande topparnasareor.
Därvid beaktasde procentuella andelarna av
— transoktadekensyra (T 18:1) som anges i bilaga 1 till denna förord-
ning som summan av isomererna av transoljesyra,
— cis-trans- och trans-cis-oktadekadiensyra (CT/TC) 18:2 som anges i
bilaga 1 till denna förordning som summan av isomererna av transli-
nolsyra,1991R2568 — SV — 22.05.2002 — 019.001 — 50
▼M2
— trans-cis-trans-, cis-cis-trans-, cis-trans-cis-, trans-cis-cis- oktadeka-
triensyra [TCT + CCT + CTC + TCC)]18:3, angivna i bilaga 1 till
denna förordning som summan av isomererna av translinolensyra.
Anmärkning 8: Ange resultaten med 2 decimaler vid beaktande av de
särskilda kännetecknen för denna metod.
►M27.◄SPECIALFALL ANVÄNDNING AV KATAROMETERDE-
TEKTOR (SOM REGISTRERAR FÖRÄNDRINGAR AV
VÄRMELEDNINGSFÖRMÅGAN)
En gaskromatograf med en detektor som registrerar förändringar av
värmeledningsförmågan (en katorometer) kan också användas för
bestämning av den kvalitativa och kvantitativa sammansättningen av en
blandning av fettsyror metylestrar. Om en sådan används bör det
förhållande som anges i punkt 3 och punkt 4 modifieras enligt tabell 3.
För kvantitativ analys används korrektionsfaktorerna som definieras i
5.2.2.2.
Tabell 3
Variabel Värde/förhållande
Kolonn Längd: 2 till 4 m
Innerdiameter: 4 mm
Bärare Kornstorlek mellan 160 och
200 µm
Koncentration hosden s tationära
fasen15 till 25 % (m/m)
Bärargas Helium eller, om detta saknas,
väte, med så låg halt av syre som
möjligt
Supplementerande gaser Ingen
Insprutningstemperatur Från 40 till 60 ºC över kolonn-
temperaturen
Kolonntemperatur 180 till 200 ºC
Flöde hosbärargas en Vanligen mellan 60 och 80 ml/
min
Storleken hosmängden prov s om
sprutas inVanligen mellan 0,5 och 2 µl
►M28.◄PROVRAPPORT
Provrapporten skall ange de metoder som används för framställning av
metylestrarna och för gaskromatografanalysen och vilka resultat som
erhållits. Den skall också ange alla driftsdetaljer som inte anges i denna
internationella standard eller som betraktas som tillägg tillsammans med
enskildheter om varje incident som kan ha påverkat resultaten.
Provrapporten skall innehålla all information som behövs för en
komplett identifiering av provet.1991R2568 — SV — 22.05.2002 — 019.001 — 51
▼B
▼M19
BILAGA X B
BEREDNING AV METYLESTRAR AV FETTSYROR FRÅN OLIVOLJA
OCH FRÅN OLIVOLJA AV PRESSRESTER
Följande två metoder rekommenderas för beredning av metylestrar av fettsyror
från olivolja och olivolja av pressrester.
Metod A: Transesterifiering vid låg temperatur i en metanollösning av kalium-
hydroxid.
Metod B: Metylering vid hög temperatur i en metanollösning av natriumme-
tylat följd av esterifiering i sur miljö.
Valet av metod beror på vilken analytisk parameter som skall bestämmas och på
kategori av olja, som anges nedan:
a) Bestämning av skillnaden mellan faktisk och teoretisk halt av triglycerider
med ECN42 ( ∆ECN42):
— Metod A tillämpaspå prov av oljor av alla kategorier efter det att oljan
renats genom att passera en kiselgelkolonn.
b) Bestämning av fettsyresammansättning:
— Metod A tillämpasdirekt på prov av olja av följande kategorier:
— Jungfruoljor med en halt av fria fettsyror lägre än 3,3 %.
— Raffinerad olivolja.— Olivolja (blandning av jungfruoljor och raffinerad olivolja).
— Raffinerad olivolja av pressrester.
— Olivolja av pressrester (blandning av jungfruoljor och raffinerad
olivolja av pressrester).
— Metod B tillämpasdirekt på prov av olja av följande kategorier:
— Jungfruolja med en halt av fria fettsyror högre än 3,3 %.
— Oraffinerad olivolja av pressrester.
c) Bestämning av transisomerer av fettsyror:
— Metod A tillämpasdirekt på prov av olja av följande kategorier:
— Jungfruoljor med en halt av fria fettsyror lägre än 3,3 %.
— Raffinerad olivolja.— Olivolja (blandning av jungfruoljor och raffinerad olivolja).— Raffinerad olivolja av pressrester.— Olivolja av pressrester (blandning av jungfruoljor och raffinerad
olivolja av pressrester).
— Metod A tillämpaspå prov av oljor av följande kategorier efter det att
oljan renats genom att passera en kiselgelkolonn:
— Jungfruolja med en halt av fria fettsyror högre än 3,3 %.
— Oraffinerad olivolja av pressrester.
RENING AV OLJEPROV
Vid behov renas proven genom att oljan får passera en kiselgelkolonn, i en
lösning av hexan och dietyleter (87:13 v/v) enligt metod IUPAC 2.507.
Alternativt görs en extraktion med fast fas i kiselgelpatron. Placera en kiselgel-
patron (1 g, 6 ml) i en apparat för eluering i vakuum och skölj med 6 ml hexan.
Bryt vakuumet för att undvika att kolonnen torkar. Tillför olja (circa 0,12 g) löst
i 0,5 ml hexan i kolonnen, sätt den under vakuum så att lösningen tränger in i
kiselgelen och eluera sedan med 10 ml hexan/dietyleter (87:13 v/v) under
vakuum. Homogenisera hela mängden eluat och dela upp det i två lika stora
volymer. Låt den ena volymen avdunsta till uttorkning i en roterande evaporator
under undertryck och i rumstemperatur. Lös återstoden i 1 ml heptan. Den
erhållna lösningen är färdig för analys av fettsyror med gaskromatografi. Låt
den andra volymen avdunsta och lös upp återstoden i 1 ml aceton för analys
av triglycerider med vätskekromatografi (HPLC) om nödvändigt.1991R2568 — SV — 22.05.2002 — 019.001 — 52
▼M19
METODER FÖR BEREDNING AV METYLESTRAR AV FETTSYROR
1.Metod A: Transesterifiering vid låg temperatur i en metanollösning av
kaliumhydroxid
1.1Tillämpning
Denna snabba metod tillämpas på olivolja och olivolja av pressrester
med en halt av fria fettsyror som är lägre än 3,3 %. De fria fettsyrorna
esterifieras inte av kaliumhydroxid. Etylestrar av fettsyror transesterifi-
eras inte lika snabbt som glyceridestrar och det är möjligt att de
metyleras endast delvis.
1.2Princip
Metylestrar bildas genom transesterifiering i en metanollösning av
kaliumhydroxid som en mellanprodukt före förtvålning (punkt 5 i metod
ISO 5509:2000, punkt 5 i metod IUPAC 2.301).
1.3Reagens
Metanol med en vattenhalt som inte överstiger 0,5 % (m/m).
Heptan för kromatografi.
Kaliumhydroxid i metanollösning, cirka 2 N: lös 11,2 g kaliumhydroxid
i 100 ml metanol.
1.4Utrustning
Provrör (volym 5 ml) med skruvkork försedd med teflonpackning.
Mätpipetter eller automatpipetter, 2 ml och 0,2 ml.
1.5Utförande
Mät upp cirka 0,1 g av oljeprovet i ett 5 ml provrör med skruvkork.
Tillsätt 2 ml heptan och skaka. Tillsätt 0,2 ml 2 N metanollösning av
kaliumhydroxid, tillslut väl med en kork försedd med teflonpackning
och skaka kraftigt i 30 sekunder. Låt provröret stå tills lösningens övre
skikt har klarnat. Häll av det övre skiktet, som innehåller metylestrarna.
Heptanlösningen är färdig att injiceras i kromatografen. Det är lämpligt
att förvara lösningen i kylskåp fram till dess att analysen med kromato-
grafi skall ske. Lösningen bör ej stå längre tid än tolv timmar.
2.Metod B: Metylering vid hög temperatur i en metanollösning av
natriummetylat följd av esterifiering i sur miljö
2.1Tillämpning
Denna metod tillämpas på olivolja och olivolja av pressrester med en
halt av fria fettsyror som är högre än 3,3 %.
2.2Princip
Neutralisering av fria fettsyror och alkalisk metanolys av glycerider,
följt av esterifiering av fria fettsyror i sur miljö (punkt 4.2 i metod
IUPAC 2.301).
2.3Reagens
— Heptan för kromatografi.
— Metanol med en vattenhalt som inte överstiger 0,05 % (m/m).— Natriummetylat i metanollösning, 0,2 N: lös 5 g natrium i 1000 ml
metanol (kan beredas av lösningar som finns i handeln).
— Fenolftalein, 0,2-procentig lösning i metanol.
— Svavelsyra, 1 N metanollösning: tillsätt 3 ml 96-procentig svavelsyra
i 100 ml metanol.
— Mättad vattenlösning av natriumklorid.
2.4Utrustning
— 50 ml flatbottnad mätkolv med lång, smal och slipad hals.
— Återflödeskylare. Luftkylare (1 m lång) med slipad anslutningsfog.— Kokstenar.
— Glastratt.1991R2568 — SV — 22.05.2002 — 019.001 — 53
▼M19
2.5Utförande
För över 0,25 g av oljeprovet i en 50 ml mätkolv med slipad hals.
Tillsätt med hjälp av tratten 10 ml 0,2 N metanollösning av natriumme-
tylat och kokstenar. Anslut återflödeskylaren, skaka och värm till
kokning. Lösningen bör klarna efter cirka tio minuter. Reaktionen är
praktiskt taget avslutad efter 15 minuter. Ta bort kolven från värmen,
vänta tills återflödet har avstannat, ta bort kylaren och tillsätt två
droppar fenolftaleinlösning. Tillsätt några milliliter 1 N svavelsyra i
metanollösningen tills den blir färglös, och tillsätt sedan ytterligare
1 ml. Anslut kylaren och låt på nytt koka i cirka 20 minuter. Ta bort
kolven från värmen och kyl den under rinnande vatten. Ta bort kylaren,
tillsätt 20 ml mättad natriumkloridlösning och skaka. Tillsätt 5 ml
heptan, tillslut kolven och skaka kraftigt i 15 sekunder.
Låt innehållet klarna tills de två faserna är fullständigt separerade.
Tillsätt på nytt mättad natriumkloridlösning till dess att vattenfasen når
nedre delen av kolvens hals. Det övre skiktet som innehåller metylestrar
befinner sig i kolvens hals. Den erhållna lösningen är färdig att injiceras
i gaskromatografen.
Varning: Metylering med metod B skall göras i dragskåp.
2.6Alternativ till metylering enligt metod B
2.6.1Metod C
2.6.1.1 Princip
Det fett som skall analyseras behandlas med en metanollösning av
väteklorid i en sluten behållare vid 100 C.
2.6.1.2 Utrustning
— Stark glasbehållare med cirka 5 ml volym (höjd 40–45 mm, diameter
14–16 mm).
— Mätpipetter, 1 och 2 ml.
2.6.1.3 Reagens
Saltsyralösning i 2-procentig metanol, bereds av gasformig väteklorid
och vattenfri metanol (anm. 1).
Hexan för kromatografi.
Anm.: I handeln finnsfärdigberedda lös ningar av väteklorid i metanol
som kan användas. I laboratoriet är det lätt att bereda små kvan-
titeter av gasformig väteklorid genom att den köpta lösningen
(d=1,18) försätts med några droppar koncentrerad svavelsyra.
Eftersom väteklorid löses mycket snabbt i metanol, är det
lämpligt att vidta brukliga försiktighetsåtgärder när den skall
lösas (exempelvis att tillföra gasen med hjälp av liten omvänd
tratt som når just till metanolens yta. Större mängder väteklorid
i metanollösning kan beredas i förväg och håller sig bra om
lösningen förvaras mörkt i kolvar med glaspropp. Detta reagens
kan också beredas genom att acetylklorid löses i vattenfri
metanol.
2.6.1.4 Utförande
— Till glasbehållaren överförs 0,2 g fett som torkats på natriumsulfat
och filtrerats och därefter 2 ml metanollösning av saltsyra. Tillslut
behållaren.
— Låt behållaren stå i vattenbad (100 ºC) i 40 minuter.
— Kyl behållaren under rinnande vatten, öppna den och tillsätt 2 ml
destillerat vatten och 1 ml hexan.
— Centrifugera och isolera hexanfasen, som är färdig att använda.
2.6.2Metod D
2.6.2.1 Princip
Det fett som skall analyseras värms under återflöde med metanol, hexan
och svavelsyra. De erhållna metylestrarna extraheras med petroleumeter.
2.6.2.2 Utrustning
— Provrör med cirka 20 ml volym anslutet till en cirka 1 m lång
återflödeskylare för luft med slipad anslutningsfog.
— Mätpipett, 5 ml.
— Separertratt, 50 ml.— Bägare, 10 ml och 25 ml.1991R2568 — SV — 22.05.2002 — 019.001 — 54
▼M19
— Provrör med konisk botten, 15 ml.
2.6.2.3 Reagens
— Metyleringsreagens: vattenfri metanol, hexan och koncentrerad
svavelsyra (d = 1,84) i förhållandet 75:25:1 (v/v/v).
— Petroleumeter 40–60 C.
— Vattenfritt natriumsulfat.
2.6.2.4 Utförande
Häll 0,1 g olja i ett 20 ml provrör och tillsätt 5 ml metyleringsreagens.Anslut återflödeskylaren och värm i vattenbad till kokning i 30 minuter
(not 2).
Överför blandningen kvantitativt till en 50 ml separertratt med 10 ml
destillerat vatten och 10 ml petroleumeter. Skaka kraftigt och låt faserna
separera. Skilj av vattenfasen och skölj eterskiktet två gånger med 20 ml
destillerat vatten. Tillsätt i separertratten en liten mängd vattenfritt
natriumsulfat, skaka, låt stå några minuter, filtrera sedan och samla upp
filtratet i ett 15 ml provrör med konisk botten.
Indunsta lösningsmedlet på ett vattenbad i en ström av kväve.Anm.För att styra kokningen, sätt in en glasstav i provröret och ställ in
temperaturen på vattenbadet på 90 C.
3.Precisionsparametrar
En statistisk utvärdering av noggrannheten hos metod A och B har
publiceratsav Internationella olivoljerådet i metod COI/T.20/Doc. nr 24.
REKOMMENDATIONER FÖR ANALYS MED GASKROMATOGRAFI AV
FETTSYREESTRAR AV OLIVOLJA OCH OLIVOLJA AV PRESSRESTER
1.Utförande
Analys med gaskromatografi av lösningar av fettestrar i hexan skall
görasi enlighet med norm ISO 5508, med hjälp av en kapillärkolonn
(50 m lång och med en inre diameter på 0,25 eller 0,30 mm) täckt
med cyanopropylsilikon, som anges för bestämning av transisomerer av
fettsyror (COI/T.20/Doc. nr 17).
I figur 1 visas en typisk kromatografisk profil av en olivolja av
pressrester som innehåller metyl- och etylestrar av fettsyror och transiso-
merer av metylestrar.
2.Beräkningar
2.1 Vid beräkning av fettsyresammansättning och ∆ECN42 skall följande
fettsyror beaktas:
Myristinsyra (C14:0).
Palmitinsyra (C16:0). Total area av de toppar som motsvarar metyl- och
etylestrar.
Palmitinoljesyra (C16:1). Total area av de toppar som motsvarar isome-
rerna ω9ochω7av metylester.
Heptadekansyra (C17:0).Heptadekensyra (C17:1).
Stearinsyra (C18:0).
Oljesyra (C18:1). Total area av de toppar som motsvarar isomererna ω9
ochω7av metylester, etylester och transisomerer av metylester.
Linolsyra (C18:2). Total area av de toppar som motsvarar isomererna
ω9ochω7av metyl- och etylestrar samt transisomerer av metylester.
Arakidinsyra (C20:0).
Linolensyra (C18:3). Total area av topparna för metylester och transiso-
merer av metylester.
Gadoljesyra (C20:1).
Behensyra (C22:0).Lignocerinsyra (C24:0).Skvalen beaktasinte vid beräkning av den totala arean.1991R2568 — SV — 22.05.2002 — 019.001 — 55
▼M19
2.2 Vid beräkning av procenttalet för trans-C18:1 används den topp som
motsvarar metylestrarna av denna fettsyra.Vid beräkning av summan
(trans-C18:2 + trans-C18:3) adderas alla toppar som motsvarar transiso-
mererna av dessa båda fettsyror.Vid beräkning av den totala arean
beaktas alla de toppar som nämns i punkt 2.1(se COI/T.20/Doc. Nr 17).
Procenttalet för varje enskild fettsyra beräknas enligt följande formel:%
X = (area X x 100)/(total area)
Figur 1: Kromatografisk profil för en olivolja av pressrester, erhållengenom metoden för metylering vid låg temperatur. De kromatografiska
topparna motsvarar metylestrar om inget annat anges.1991R2568 — SV — 22.05.2002 — 019.001 — 56
▼B
BILAGA 11
BESTÄMNING AV HALTEN FLYKTIGA HALOGENERADE
LÖSNINGSMEDEL I OLIVOLJA
1. METOD
Analys med gaskromatografi med användning av joniseringsteknik (head
space).
2. UTRUSTNING
2.1 Gaskromatografiapparatur utrustad med elektronabsorbtionsdetektor (ECD).
2.2 Huvudutrymmesapparat (head space) .
2.3 Gaskromatografikolonn, av glas, 2 meter lång och 2 mm i diameter,
stationär fas.
OV101 10 % eller motsvarande uppsugen i kalcinerad diatomijord,
syramättad och silaniserad med en partikelstorlek på 80 till 100 mesh.
2.4 Bärar- och supplementerande gaser: Kväve för gaskromatografi, lämplig för
elektrondetektor.
2.5 Glaskolvar, 10 till 15 ml, med teflonskikt och aluminiumpropp med
membran för sprutor (septum).
2.6 Förslutningsklämmor.2.7 Gassprutor 0,5 till 2 ml.
3. REAGENSER
Standard: halogenerat lösningsmedel med en renhet som är lämplig för
gaskromatografi.
4. UTFÖRANDE
4.1 Väg exakt in ca 3 g olja i en glaskolv (som inte skall återanvändas) och
förslut den hermetiskt. Placera med en termostat vid 70 ºC i en timme.
Med hjälp av en spruta, ta försiktigt bort 0,2 till 0,5 ml av gasutrymmet
(head space). Injicera detta i kolonnen på gaskromatografen som har
följande inställningar:
— injektortemperatur 150 ºC
— kolonntemperatur 70 till 80 ºC— detektortemperatur 200 till 250 ºC
Andra temperaturer kan också användas under förutsättning att resultaten
blir de motsvarande.
4.2 Referenslösningar: Gör i ordning standardlösningar av raffinerad olivolja
som inte innehåller spår av lösningsmedel med koncentrationer som sträcker
sig från 0,05 till 1 ppm (mg/kg) och motsvarande för det antagna innehållet
i provet. De halogenerade lösningsmedlen kan spädas ut med användning av
pentan.
4.3 Kvantitativ uppskattning: Korrelera områdena eller höjderna på topparna på
provet och på standardlösningar hos den koncentration som ligger närmast.
Om avvikelsen är större än 10 % måste analysen upprepas i jämförelse med
en annan standardlösning tills avvikelsen ligger inom 10 %. Halten bestäms
på grundval av genomsnittet av de ursprungliga insprutningarna.
4.4 Resultatangivelse: Resultaten uttrycks i ppm (mg/kg). Registreringsgränsen
för metoden är 0,01 mg/kg.1991R2568 — SV — 22.05.2002 — 019.001 — 57
▼M19
BILAGA XII
ORGANOLEPTISK VÄRDERING AV JUNGFRUOLJA
1. SYFTE OCH TILLÄMPNINGSOMRÅDE
Avsikten med denna metod är att bestämma de kriterier som krävs för att
värdera organoleptiska egenskaper hos jungfruolja i enlighet med punkt 1 i
bilagan till förordning nr 136/66/EEG och att beskriva hur de skall klassifi-
cerasi detta avs eende.
Det angivna förfarandet är bara tillämpligt för klassificering av jungfruolja
med avseende på förekomsten av fruktighet och på hur intensiva defekterna
är, vilket fastställts av en utvald grupp utbildade provsmakare, som utgör en
panel i enlighet med punkt 4.
2. ALLMÄNT
För allmän grundläggande terminologi, lokal, allmän metodik och glasför
provsmakning av olivolja rekommenderas användning av Internationella
olivoljerådetsföres krifter.
3. SPECIELL TERMINOLOGI
3.1Positiva egenskaper
Fruktig : Total doftupplevelse, beroende på olivsort och egenskaper hos
oljan från frisk, färsk frukt, grön eller mogen, som upplevs direkt eller retro-
nasalt.
Bitter: Karaktäristisk smak hos oljor som erhållits av gröna oliver eller
oliver som börjar ändra färg.
Stark: Stickande intryck, karaktäristisk för olja som framställts i början
säsongen, främst från ännu gröna oliver.
3.2Negativa egenskaper
Unken: Karaktäristisk doft och smak hos olja från ihopsamlade oliver i långt
framskriden anaerob jäsning.
Möglig-fuktig : Karaktäristisk doft och smak hos oljor som framställts av
oliver där svamp och jäst har utvecklats, beroende på att de lagrats under
fuktiga förhållanden i flera dagar.
Gyttjig fällning : Karaktäristisk doft och smak hos oljor som varit i kontakt
med dekanterad fällning i fat och underjordiska tankar.
Vin-vinäger : Karaktäristisk doft och smak hos vissa oljor som påminner om
vin eller vinäger. Beror i allmänhet på bildningen av ättikssyra, etylacetat
och etanol vid olivernasjäs ning.
Metallisk : Doft och smak som påminner om metall. Karaktäristisk för oljor
som har varit i längre kontakt med metalliska ytor under krossning, bland-
ning, pressning eller förvaring.
Härsken : Doft och smak hos oljor som har genomgått en oxideringsprocess.
Värmt eller bränt : Karaktäristisk doft och smak hos oljor som orsakas av för
hög och/eller för långvarig uppvärmning under framställningen, i synnerhet
när massan blandas termiskt om detta sker under olämpliga förhållanden.
Hö-trä: Karaktäristisk doft och smak hos vissa oljor från torkade oliver.
Rå: Tjock och mosig smakupplevelse hos vissa oljor.
Fett: Doft och smak som påminner om diesel, fett eller mineralolja.
Grönsaksvatten : Doft och smak som uppstått på grund av längre kontakt
med grönsaksvatten.
Saltlake : Doft och smak av olja som framställts av oliver som konserverats i
saltlösning.
Esparto : Karaktäristisk doft och smak hos olja som framställts av oliver
som pressats i nya espartomattor. Doften och smaken kan variera beroende
på om mattorna är tillverkade av färskt espartogräs eller torkat espartogräs.
Jordig: Karaktäristisk doft och smak hos oljor som framställts av oliver som
har insamlats med jord eller gyttja på dem och inte tvättats.1991R2568 — SV — 22.05.2002 — 019.001 — 58
▼M19
Maskig : Karaktäristisk doft och smak hos oljor från oliver som har varit
utsatta för kraftiga attacker av larver från olivflugan (Bactrocera Oleae).
Gurka: Karaktäristisk doft och smak som uppstår när en olja är hermetiskt
förpackad alltför länge, särskilt i plåtbehållare, och som anses bero på bild-
ningen av 2,6 nonadienal.
4. PANEL
Panelen skall utses av medlemsstaten och bestå av en ordförande och åtta
till tolv provsmakare. För regleringsåret 2001/2002 kan dock antalet prov-
smakare vara färre än åtta.
Panelensordförande mås te vara en välutbildad expert på olika typer av
olivolja. Han ansvarar för panelen, dess organisation och funktion, för
förberedande, kodning och presentation av proverna för provsmakarna samt
för insamling av data och statistisk bearbetning.
Panelens ordförande skall välja ut provsmakarna och ansvara för deras
utbildning samt för kontroll av deras arbete för att säkerställa att de
motsvarar de krav som ställs.
De provsmakare som skall utföra de organoleptiska kontrollerna av olivolja
skall väljas ut och utbildas med avseende på sin förmåga att skilja mellan
liknande prov, i enlighet med vägledningen från Internationella olivoljerådet
beträffande urval, utbildning och kontroll av kvalificerade provsmakare av
jungfruolja.
Panelerna skall åta sig att delta i organoleptiska bedömningar som före-
skrivs på nationell nivå, gemenskapsnivå eller internationell nivå för
återkommande kontroll och samordning av bedömningskriterier. De skall
dessutom årligen underrätta medlemsstaten om panelens sammansättning
och om hur många bedömningar den godkända panelen har gjort.
5. FÖRFARANDE FÖR ORGANOLEPTISK UTVÄRDERING OCH KLAS-
SIFICERING
5.1Provsmakarnas användande av profilformuläret
Det profilformulär som provsmakarna skall använda återfinns i tillägg A till
denna metodredogörelse.
Varje provsmakare som ingår i panelen skall först lukta på och därefter
provsmaka(1) den aktuella oljan i ett provsmakningsglas för att analysera
smak- och luktintryck samt taktila och kinestetiska intryck. Han skall i
profilformuläret ange hur intensivt han upplever de olika negativa och posi-
tiva egenskaperna.
Om provsmakaren upplever negativa egenskaper som inte återfinns i profil-
formuläret, skall dessa anges under rubriken ”övrigt”, med användande av
den eller de termer i punkt 3.2 i denna metodredogörelse som så exakt
som möjligt beskriver dem.
5.2Panelordförandens användande av data
Panelens ordförande skall samla in provsmakarnas ifyllda formulär och
kontrollera de intensiteter som angivits. Om en avvikelse föreligger, skall
han anmoda provsmakaren att se över sitt profilformulär, och vid behov
göra om testet.
Panelensordförande kan föra in uppgifterna från varje provs makare i ett
datorprogram i enlighet med den i tillägg B angivna metoden för statistisk
beräkning av medianvärdet. Uppgifterna för varje prov skall föras in i en
matris bestående av tio kolumner som motsvarar de tio egenskaperna och
av n rader som motsvarar panelens n provsmakare.
Om minst 50 % av panelen anger en negativ egenskap under rubriken
”övrigt”, skall panelens ordförande beräkna medianvärdet för denna egen-
skap och för den motsvarande klassificeringen.
När det gäller de analyser som gjorts vid kontrollen av att normerna är
uppfyllda, eller vid kontrollundersökningar, skall panelens ordförande låta
genomföra en trefaldig organoleptisk bedömning av oljan, med intervaller
på minst en dag. Medianvärdet för egenskaperna skall beräknas utifrån
samtliga uppgifter i profilformulären för de tre undersökningarna.1991R2568 — SV — 22.05.2002 — 019.001 — 59
(1) Han får avstå från att provsmaka, om han noterar extremt intensiva negativa egenskaper
och han skall då anteckna detta exceptionella förhållande i profiltabellen.
▼M19
5.3Klassificering av oljor
Oljan skall klassificeras enligt följande benämningar, med defekternas och
fruktighetens medianvärde som utgångspunkt. Med defekternas medianvärde
avses medianvärdet för den mest intensiva negativa egenskapen. En robust
variationskoefficient för den negativa egenskapen skall vara högst 20 %.
a)Extrajungfruolja : Defekternasmedianvärde är lika med 0 och medi-
anvärdet för fruktighet är större än 0.
b)Jungfruolja : Defekternasmedianvärde är s törre än 0 och mindre än eller
lika med 2,5 och medianvärdet för fruktighet är större än 0.
c)Ordinär jungfruolja : Defekternasmedianvärde är s törre än 2,5 och
mindre än eller lika med 6,0. Alternativt: medianvärdet är mindre än
eller lika med 2,5, och medianvärdet för fruktighet är lika med 0.
d)Jungfrubomolja : Defekternasmedianvärde är s törre än 6,0.
Fr.o.m. den 1 november 2003 skall dock kategorierna c och d ersättas med
följande kategori:
c)Bomolja : Defekternasmedianvärde är s törre än 2,5. Alternativt: defek-
ternasmedianvärde är mindre än eller lika med 2,5 och medianvärdet
för fruktighet är lika med 0.
5.4Särskilda fall
Om medianvärdet överstiger 5,0 för en annan positiv egenskap än fruktig,
skall panelens ordförande ange detta på analysintyget för oljan.1991R2568 — SV — 22.05.2002 — 019.001 — 60
▼M19
TILLÄGG A
1991R2568 — SV — 22.05.2002 — 019.001 — 61
▼M19
TILLÄGG B
METOD FÖR BERÄKNING AV MEDIANVÄRDE OCH KONFIDENSIN-
TERVALL
Medianvärde
Medianvärdet är det reella tal, Xm, som kännetecknas av att sannolikheten (P)
att värdena inom fördelningen (X) är lägre än (Xm) är mindre än eller lika med
0,5, samtidigt som sannolikheten (P) att värdena inom fördelningen (X) är
mindre än eller lika med Xm är större än eller lika med 0,5. Enligt en annan
definition utgör medianvärdet den 50:e percentilen av en uppsättning tal som
ordnatsi s tigande ordning. Medianvärdet är med andra ord centralvärdet i en
ordnad serie om antalet tal är ojämnt, eller medelvärdet av de två centralvärdena
i en ordnad serie om antalet tal är jämnt.
Robust standardavvikelse
För att få en tillförlitlig uppskattning av spridningen kring medianvärdet
används Stuarts och Kendalls metod för uppskattning av robust standardavvi-
kelse. I formeln är den asymptotiska standardavvikelsen S beroende av N och
IQR. N är antalet observationer och IQR är kvartilavståndet, dvs. en robust
uppskattning av spridningen hos uppgifterna i fråga (kvartilavståndet omfattar
exakt 50 % av elementen i en given sannolikhetsfördelning). Kvartilavståndet
erhållsgenom beräkning av s killnaden mellan den 75:e och den 25:e percen-
tilen.
IQR = 75:e percentilen - 25:e percentilenPercentilen är det värde Xpc för vilket sannolikheten (P) att fördelningens
värden är lägre än Xpc är lägre än eller lika med ett visst decimalvärde, samti-
digt som sannolikheten (P) att fördelningens värden är större än eller lika med
Xpc är större än eller lika med detta decimalvärde. Decimalvärdet anger vilken
del av fördelningen det rör sig om. När det gäller medianen är detta värde lika
med 50/100.
Percentilen är med andra ord det värde i fördelningen som motsvarar ett givet
område som avgränsas av fördelningskurvan eller frekvenskurvan. Den 25:e
percentilen utgör exempelvis det värde i fördelningen som motsvarar ett område
lika med 0,25 eller 25/100.
Robust variationskoefficient %
CVR är ett rent tal, dvs. det anger inte enheter utan utgör ett mått på talseriens
spridning som procentandel av medianvärdet Me. Denna koefficient är mycket
användbar som ett mått på panelmedlemmarnas tillförlitlighet.
Konfidensintervall på 95 % kring medianvärdet
Konfidensintervall (KI) på 95 % (risken för fel av första slaget uppgår till 0,05
eller 5 %) utgör det intervall inom vilket medianvärdet skulle ligga, om det vore1991R2568 — SV — 22.05.2002 — 019.001 — 62
▼M19
möjligt att upprepa försöket ett oändligt antal gånger. I praktiken anger konfi-
densintervallet hur stor försökets variabilitet är under rådande förhållanden, om
man antar att försöket kan upprepas ett flertal gånger. I likhet med CVR ger
konfidensintervallet ett mått på hur tillförlitligt försöket är.
I. C. (övre) = Me + (c.S)I. C. (nedre) = Me - (c.S)Där c är lika med 1,96 för
konfidensintervall på 0,95.
Klassificeringen görs genom att medianvärdena jämförs med de referensintervall
som fastställs i punkt 5.3 i metodredogörelsen. Genom programvaran kan klassi-
ficeringen visas grafiskt eller i en tabell över statistiska uppgifter.1991R2568 — SV — 22.05.2002 — 019.001 — 63
▼B
BILAGA 13
NEUTRALISERING OCH BLEKNING AV OLIVOLJA I LABORATO-
RIET
1. NEUTRALISERING OCH AVFÄRGNING AV OLIVOLJA I LABORA-
TORIUM
1.1Neutralisering av olja
1.1.1 Utrustning
— bägare, 300 ml, hög,
— laboratoriecentrifug med 100 ml centrifugrör,
— bägare, 250 ml,
— rundkolvar, 100 ml,— separertratt, 1 liter.
1.1.2 Reagenser
— vattenlösning med 12 % natriumhydroxid,
— etanollösning med 1 % fenolftalein,— ren hexan, P. A.,— ren propan-2-ol, P. A.
1.1.3 Utförande
a)Oljor med innehåll av fria fettsyror, uttryckta som oljesyra, på mindre
än 30 %
Placera 50 g rå olja i en hög 300 ml bägare och värm till 65 ºC i
vattenbad. Tillsätt en mängd 12 % lösning av natriumhydroxid motsva-
rande de fria syrorna i oljan med ett överskott av 5 % under försiktig
omrörning. Fortsätt att röra i fem minuter och håll temperaturen vid
65 ºC.
Överför blandningen till 100 ml centrifugrör och separera den tvålak-
tiga krämen genom centrifugering. Häll den dekanterade oljan i en
250 ml bägare och tvätta med 50 till 60 ml i kokande destillerat vatten,
ta bort tvättvattnet med hjälp av en hävert. Upprepa tvättningen tills
alla spår av kvarvarande tvål är borta (fenolftaleinets rosa färg
försvinner).
Centrifugera oljan för att avskilja små mängder av kvarvarande vatten.
b)Oljor med ett innehåll av fria fettsyror uttryckt som oljesyra som
överstiger 30 %
Häll upp 50 g rå olja i en 1 liters separertratt, tillsätt 200 ml hexan,
100 ml isopropylalkohol och en kvantitet av 12 % natriumhydroxidlös-
ning som motsvarar det fria fettsyreinnehållet i oljan med ett överskott
på 0,3 %. Rör om kraftigt i en minut. Tillsätt 100 ml destillerat vatten,
rör igen och låt stå.
Sedan skikten separerat, tappa det lägre skiktet som innehåller tvålen.
Mellan de två skikten (oljeskiktet upptill och vattenskiktet nedtill)
bildas ofta ett mellanskikt som består av föroreningar och olösliga
ämnen som också måste tas bort.
Tvätta hexanlösningen som inrehåller den neutraliserade oljan med 50-
60 ml portioner av en lösning av destillerat vatten 1/1 (v/v) tills den
rosa färgen från fenolftalin försvinner. Avlägsna all hexan genom
destillation under vacuum (t.ex. i roterande injektorblock).
1.2Avfärgning av neutraliserad olja
1.2.1 Utrustning
— Trehalsad rundkolv 250 ml med normalslipningar för placering av
a) en termometer graderad i grader som tillåter avläsningar att göras vid
90 ºC;
b) en mekanisk omrörare som roterar med en hastighet på 250 till 300
varv per minut, och som kan arbeta under vakuum;
c) anslutning för vakuumpump;1991R2568 — SV — 22.05.2002 — 019.001 — 64
▼M6
▼B
▼B
— Vakuumpump med manometer som kan ge ett tryck på 15 till 30
millibar.
1.2.2 Utförande
Väg in ca 100 g neutraliserad olja i den trehalsade kolven. Sätt in termo-
metern och omröraren, anslut vakuumpumpen och värm till 90 ºC underomrörning.
Bibehåll denna temperatur, fortsätt omrörningen tills oljan som skall
analyseras är helt fri från vatten (ca 30 minuter).
Återställ sedan normaltryck och tillsätt 2 till 3 gram aktiverad jord.
Upprätta vakuum på nytt tillstrycket är mellan 15 och 30 millibar och
rör om med 250 varv per minut vid en temperatur av 90 ºC.
Filtrera oljan medan den fortfarande är varm i ett termostatskåp (50 till
60 ºC).1991R2568 — SV — 22.05.2002 — 019.001 — 65
▼M19
▼B
BILAGA 15
1. OLJEHALT I PRESSRESTER AV OLIVER
1.1Utrustning
— lämpligt extraktionsapparatur som är utrustad med en 200 till 250 ml
rundkolv,
— elektriskt uppvärmt bad (t.ex. sandbad, vattenbad) och värmeplatta,
— analysvåg,
— värmeskåp som kan ställas in på max 80 ºC,— elektriskt uppvärmt värmeskåp som är utrustat med en termostatanord-
ning som skall ställas in på 103 ± 2 ºC och som kan tåla en
genomströmning av luft eller som kan arbeta under minskat tryck,
— mekanisk kvarn som är lätt att rengöra och som tillåter att olivrester kan
malasutan temperaturförhöjning eller någon förändring i derasfuktig-
hetsinnehåll, flyktiga ämnen eller ämnen som går att extrahera med
hexan,
— extraktionsskål och bomull eller filtrerpapper varifrån ämnen som är
extraherbara med hexan redan har blivit borttagna,
— exsickator,— sil med hål av 1 mm diammeter,— små partiklar av förtorkad pimpsten.
1.2Reagenser
N-hexan, teknisk kvalitet som inte får lämna större återstod än 0,002 g/
100 ml vid total förångning.
2. UTFÖRANDE2.1Preparering av provet
Om så behövs används den mekaniska kvarnen, som skall vara väl regjord
till malning av laboratorieprovet för att minska partikelstorleken så att
provet kan passera silen helt och hållet.
Använd ungefär en tjugondel av provet för att fullfölja rengöringen av
kvarnen, kasta det malda materialet, mal resten och samla upp, blanda
omsorgsfullt och analysera utan dröjsmål.
2.2Provmängd
Så fort malningen är färdig, väg upp ca 10 g av provet på 0,01 g när, för
undersökning.
2.3Preparering av extraktionsskålen
Placera provet i skålen och täck över med bomull. Om filtrerpapper
används, slå in provet i detta.
2.4Förtorkning
Om olivresterna är mycket fuktiga (dvs innehåller fukt och flyktiga ämnen
till större andel än 10 %) genomförs förtorkning genom att den fyllda filt-
rerskålen (eller filtrerpappret) placeras i ett värmeskåp under en lämplig tid
vid högst 80 ºC för att minska fukthalten och halten av flyktiga ämnen så
att de understiger 10 %.
2.5Preparering av rundkolven
Väg på 1 mg när kolven som innehåller en eller två bitar pimpsten, som
tidigare torkats i värmeskåp vid 103 ± 2 ºC och sedan svalnat i en
exsickator i minst en timme.
2.6Första extraktionen
Sätt in extraktionsskålen (eller filtrerpappret) som innehåller provet i appa-
raten. Häll en tillräcklig mängd hexan i kolven. Sätt fast kolven på
extraktionsapparaten och placera den sedan på ett elektriskt uppvärmt bad.
Justera uppvärmningen på så sätt att återflödeshastigheten inte är mindre än
tre droppar per sekund (lugn, inte våldsam kokning).1991R2568 — SV — 22.05.2002 — 019.001 — 66
▼B
Efter fyra timmars extraktion får apparaten svalna. Ta bort extraktionsskålen
från extraktionsapparaten och placera den i ett luftrum för att ta bort
återstoden av lösningsmedlet.
2.7Andra extraktionen
Häll innehållet i extraktionsskålen i mikrokvarnen och mal så fint som
möjligt. Överför den malda blandningen till skålen kvantitativt och sätt den
sedan tillbaka i extraktionsapparaten.
Fortsätt extraktionen under ytterligare två timmar med användning av
samma rundkolv som innehåller extraktet från första extraktionen.
Lösningen i extraktionskolven måste vara klar. Om det inte är det, filtrera
genom ett filtrerpapper och tvätta den ursprungliga kolven och filtrerpappret
flera gånger med hexan. Samla upp filtratet och tvättlösningen i en ny rund-
kolv som har torkats och vägts på 1 mg när.
2.8Borttagning av lösningsmedel och vägning av extraktet
Ta bort större delen av lösningsmedlet genom destillation på ett elektriskt
uppvärmt bad. Ta bort de sista resterna av lösningsmedlet genom att
upphetta kolven i ett värmeskåp till 103 ± 2 ºC i 20 minuter. Påskynda
processen antingen genom att blåsa in luft eller företrädesvis en inert gas i
intervaller eller använd undertryck.
Låt kolven kallna i en exsickator i minst en timme och väg på 1 mg när.
Upphetta igen 10 minuter under samma förhållanden, låt svalna i exsickator
och väg igen.
Skillnaden mellan vägningarna får inte överstiga 10 mg. Om den gör det,
upprepa upphettningen i 10 minutersperioder följt av avkylning och
vägning tills viktskillnaden är 10 mg eller mindre. Anteckna den sista
vägningen av kolven.
Genomför dubbelprov på provet.
3. RESULTATANGIVELSE
3.1Metod för beräkning och formel
a) Extraktet uttryckt som massprocent av provet som erhållits är lika med:
S=m1×100
mo
där:
S = massprocenten av extraktet från produkten,
mo= massan i gram av provet,
m1= massan i gram av extraktet efter torkning.
Som resultat tas det aritmetiska medelvärdet av dubbelproven under
förutsättning att repeterbara förhållanden har uppnåtts.
Uttryck resultaten med en decimal.
b) Extraktet uttrycks som torrsubstans genom formeln:
S×100
100 − U= oljeprocenten i extraktet beräknat som torrsubstans
där:
S = procenten av extraktet från provet som erhållits [se a)].
U = innehållet av fukt och flyktiga ämen.
3.2Repeterbarhet
Skillnaden mellan dubbelproven som utförts samtidigt eller i snabb följd av
samma analytiker skall inte överstiga 0,2 g hexanextrakt per 100 g prov.
Om detta förhållande inte är uppfyllt upprepasanalys en på två andra prover.
Om det även i det här fallet uppstår en skillnad som överstiger 0,2 g tas
resultatet genom att medelvärdet av de fyra bestämningarna tas.1991R2568 — SV — 22.05.2002 — 019.001 — 67
▼B
BILAGA 16
BESTÄMNING AV JODTAL
1. SYFTE
Denna internationella standard specificerar en metod för bestämning av
jodtal hos animaliska och vegetabiliska fetter och oljor som nedan kallas
fetter.
2. DEFINITION
I denna internationella standard används följande beteckningar:
2.1Jodtal: Massan av jod som absorberas av provet under de driftförhållanden
som anges i denna internationella standard.
Jodtalet uttryckss om gram jod per 100 g prov.
3. PRINCIP
Upplösning av ett prov i lösningsmedel och tillsats av Wijs reagens. Efter
en angiven tid tillsats av kaliumjodidlösning och vatten, titrering av den
frigjorda joden med natriumtiosulfat.
4. REAGENSER
Alla reagenser skall vara av analyskvalitet.
4.1Kaliumjodid , 100 g/l lösning, som inte innehåller jodat eller fri jod.
4.2Stärkelse , lösning.
Lös 5 g vattenlöslig stärkelse i 30 ml vatten, tillsätt denna blandning till
1 000 ml kokande vatten, koka i tre minuter och låt svalna.
4.3Natriumtiosulfat , ställd standardlösning c(Na2S2O3.5 H2O) = 0,1 mol/l, som
ställts högst sju dagar före användning.
4.4Lösningsmedel , erhållet genom blandning av lika volymer av cyklohexan
och ättiksyra.
4.5Wijs reagens , som innehåller jodmonoklorid i ättiksyra. Den Wijs reagens
som finns i handeln skall användas.
Anm:Reagensen innehåller 9 g ICl3och 9 g I i ättiksyra.
5. UTRUSTNING
Vanlig laboratorieutrustning och särskilt följande:
5.1Vägglas som är lämpliga för provet och för att kunna sättas in i kolvarna
(5.2).
5.2E-kolvar , 500 ml, utrustade med slipade glasproppar och helt torra.
6. PREPARERING AV PROVET
Det homogeniserade provet torkas över natriumsulfat och filtreras.
7. UTFÖRANDE
7.1 Prov
Mängden av det prov som tas ut varierar enligt det förväntade jodtalet
enligt tabell 1.
Tabell 1
Förväntat jodtal Mängd prov (gram)
mindre än 5 3,00
5 till 20 1,00
21 till 50 0,40
51 till 100 0,201991R2568 — SV — 22.05.2002 — 019.001 — 68
▼B
Förväntat jodtal Mängd prov (gram)
101 till 150 0,13
151 till 200 0,10
Väg provet på 0,1 mg när i ett vägglas(5.1).
7.2. Bestämning
Placera provet i en 500 ml kolv (5.2). Tillsätt 20 ml av lösningsmedlet (4.5)
för att lösa fettet. Tillsätt exakt 25 ml av Wijs reagens (4.6), sätt i proppen,
skaka om innehållet och placera kolven i mörker. Använd inte en vanlig
munpipett för Wijsreagens .
Gör i ordning ett blindprov på samma sätt med lösningsmedlet och reage-
nsen men utan prov.
För prov som har ett jodtal under 150 får kolven stå i mörker i en timma,
för de som har ett jodtal över 150 och för polymerizerade produkter eller
produkter som har oxiderats påtagligt får stå i två timmar.
När denna tid gått ut tillsätt 20 ml kaliumjodidlösning (4.2) och 150 ml
vatten (4.1) till var och en av kolvarna.
Titrera med den ställda natriumtiosulfatlösningen (4.4) tills den gula färgen
av joden nästan har försvunnit. Tillsätt ett par droppar av stärkelselösningen
(4.3) och fortsätt titreringen tills den blå färgen försvinner efter omsorgsfull
skakning.
Anm:Potentiometrisk bestämning av slutpunkten är tillåten.
7.3. Antal bestämningar
Genomför två bestämningar på samma prov.
8. RESULTATANGIVELSE
Jodtalet erhållesgenom uttrycket
12;69 c V 1/C0V2 ðÞ
m
där:
c = det numeriska värdet av den exakta koncentrationen i mol per liter
av den ställda natriumtiosulfatlösningen (4.4) som används;
V1= det numeriska värdet på volymen i milliliter på den ställda natrium-
tiosulfatlösningen (4.4) som används för blindprov;
V2= det numeriska värdet på volymen i milliliter på den ställda natrium-
tiosulfatlösningen (4.4) som används vid bestämningen;
m = det numeriska värdet på massan i gram hos provet (7.1).
Som resultat tas det aritmetiska medelvärdet av två bestämningar under
förutsättning att kravet för repeterbarhet är uppfyllt.1991R2568 — SV — 22.05.2002 — 019.001 — 69
▼M11
BILAGA XVII
METOD FÖR BESTÄMNING AV STIGMASTADIENER I VEGETABI-
LISKA OLJOR
1. SYFTE
Bestämning av stigmastadiener i vegetabiliska oljor som innehåller låga
halter av dessa kolväten, särskilt jungfruolivolja och rå olivolja av
pressrester.
2. TILLÄMPNINGSOMRÅDE
Metoden kan användasför alla vegetabilis ka oljor även om mätningarna
endast är tillförlitliga när halten av dessa kolväten är mellan 0,01 och
4,0 mg/kg. Metoden är särskilt lämpad för att påvisa förekomst av raffine-
rade vegetabiliska oljor (oliv, olivpressrester,solros, palm etc.) i
jungfruolivolja eftersom raffinerade oljor innehåller stigmastadiener
medan jungfruolivolja inte gör det.
3. PRINCIP
Separering av oförtvålbara ämnen. Separering av den steroida kolvätefrak-
tionen genom kolonnkromatografi på kiselgel och analys med
kapillärgaskromatografi.
4. UTRUSTNING
4.1 250 ml lämpliga kolvar med återflödeskylare.4.2 Separertrattar 500 ml.
4.3 Rundkolvar 100 ml.
4.4 Rotationsindunstare.4.5 Kromatografikolonn av glas(innerdiameter: 1,5—2,0 cm, längd: 50 cm)
med teflonpropp och en tuss glasull eller en sinterglasskiva i botten. För
beredning av kiselgelkolonnen, häll hexan på kromatografikolonnen till ett
djup av ca 5 cm och fyll därefter på med en lösning av kiselgel i hexan
(15 g i 40 ml) med hjälp av små portioner hexan. Låt stå och avsluta meden lätt omskakning. Tillsätt vattenfritt natriumsulfat till en höjd av cirka
0,5 cm och eluera slutligen överflödigt hexan.
4.6 Gaskromatograf med flamjoniseringsdetektor, separat injektor eller
injektor som är kallintegrerad i kolonnen och en ugn som kan program-
merasmed en noggrannhet av ± 1 ºC.
4.7 Kapillärkolonn av kvartsför gas kromatografi (innerdiameter: 0,25 eller
0,32 mm, längd: 25 m) täckta med 5 % fenylmetylsilikonfas med en film-
tjocklek av 0,25 µm.
Anm. 1:
Andra kolonner av samma eller lägre polaritet kan användas.
4.8 Integrerad registreringsenhet som ger möjlighet till integrering över varje
enskild topp.
4.9 5—10 µl mikrospruta för gaskromatografi med härdad nål.
4.10 Eluppvärmd mantel eller uppvärmningsplatta.
5. REAGENSER
Alla reagenser skall vara av analytisk renhet om inte annat anges. Det
vatten som används skall vara destillerat vatten eller vatten av minst
motsvarande renhetsgrad.
5.1 Hexan eller blandning av alkaner med ett kokpunktsintervall på 65—70 ºC,
destillerat med rektifieringskolonn.
Anm. 2:
Lösningen skall destilleras för att avlägsna orenheter.
5.2 96 % etanol (volymprocent).5.3 Vattenfritt natriumsulfat.1991R2568 — SV — 22.05.2002 — 019.001 — 70
▼M11
5.4 10-procentig alkoholkaliumhydroxidlösning. Tillsätt 10 ml vatten till 50 g
kaliumhydroxid, rör om och lösdärefter upp blandningen i etanol till
500 ml.
Anm. 3:
Alkoholkaliumhydroxid blir brun när den får stå. Den bör göras i ordning
varje dag och förvaras i väl tillslutna mörka glasflaskor.
5.5 Kiselgel 60 för kolonnkromatografi, 70—230 mesh (Merck ref. 7734 eller
liknande).
Anm. 4:
Kiselgel kan normalt användas direkt från behållaren utan föregående
behandling. Vissa partier kisel kan emellertid uppvisa låg aktivitet vilket
ger dåliga kromatografiska separeringar. I sådana fall bör kiselgelen
behandlas på följande sätt: Aktivera kiselgelen genom uppvärmning under
minst fyra timmar vid 550 ºC. Efter uppvärmningen placeras kiselgelen i
en exsickator där den får svalna och förs därefter över till en kolv med
tillslutningsanordning. Tillsätt 2 % vatten och skaka om tills inga klumpar
längre kan ses och pulvret flyter fritt.
Om partier av kiselgel ger kromatogram med interfererande toppar bör
kiselgelen behandlas på det sätt som beskrivs ovan. Alternativt kan extra
ren kiselgel 60 (Merck ref. 7754) användas.
5.6 Stamlösning (200 ppm) av kolesta-3,5-dien (Sigma, 99 % renhet) i hexan
(10 mg i 50 ml).
5.7 Standardlösning av kolesta-3,5-dien i hexan med en koncentration av
20 ppm erhållen genom utspädning av ovanstående lösning.
Anm. 5:
Om de lösningar som avses i 5.6 och 5.7 förvaras under 4 ºC så kommer
de inte att förfaras under åtminstone de första fyra månaderna.
5.8 Lösning av n-nonacosan i hexan med en koncentration av cirka 100 ppm.
5.9 Bärargasför kromatografi: helium eller väte med en renhets grad på
99,9990 %.
5.10 Hjälpgaser för flamjoniseringsdetektor: väte med en renhetsgrad på
99,9990 % och ren luft.
6. UTFÖRANDE
6.1Preparering av oförtvålbara ämnen
6.1.1 Väg 20 ± 0,1 g olja i en 250 ml kolv (4.1), tillsätt 1 ml standardlösning av
kolesta-3,5-dien (20 µg) och 75 ml 10-procentig alkoholkaliumhydroxid,
sätt på återflödeskylare och värm upp till sakta kokning i 30 minuter. Ta
bort kolven som innehåller provet från värmen och låt lösningen svalna
något (låt den inte kallna helt eftersom provet då tjocknar). Tillsätt
100 ml vatten och överför lösningen till en separertratt (4.2) genom att
använda 100 ml hexan. Omskaka blandningen kraftigt i 30 sekunder och
lämna sedan att separera.
Anm. 6:
Om en emulsion produceras och inte snabbt försvinner tillsätt små
mängder av etanol.
6.1.2 Överför den undre vattenfasen till en annan separertratt och gör ytterligare
en extraktion med användning av 100 ml hexan. Häll ur den undre fasen
en gång till och tvätta hexanextrakten (samlade i en annan separertratt) tre
gånger med 100 ml var gång med en blandning av etanol och vatten (1: 1)
tillsneutralt pH-värde uppnås .
6.1.3 Låt hexanlösningen flyta genom vattenfritt natriumsulfat (50 g), tvätta
med 20 ml hexan och indunsta i en rotationsindunstare vid 30 ºC och
under lätt tryck till torrhet.
6.2Separering av den steroida kolvätefraktionen
6.2.1 Överför återstoden till fraktioneringskolonnen med användning av två 1 ml
portioner hexan, häll provet på kolonnen genom att låta lösningens nivå
sjunka till toppen av natriumsulfatet och börja kromografisk eluering
med hexan med en hastighet av ca 1 ml/minut. Häll bort de första
25—30 ml av elueringen och samla in den följande 40 ml fraktionen.
Efter uppsamlingen överför denna fraktion till en 100 ml rundbottnad
cylinder (4.3).1991R2568 — SV — 22.05.2002 — 019.001 — 71
▼M11
Anm. 7:
Den första fraktionen innehåller mättade kolväten (fig. 1a) och den andra
fraktionen de steroida kolvätena. Ytterligare eluering ger skvalen och rela-
terade föreningar. För att uppnå en god separering mellan mättade och
steroida kolväten, krävs en optimering av fraktionernas volymer. I detta
syfte bör den första fraktionens volym justeras så att de toppar som repre-
senterar mättade kolväten är låga när den andra fraktionen analyseras (se
fig. 1c). Om de inte formas, utan standardtoppens intensitet är låg, bör
volymen minskas. En fullständig separering mellan den första och den
andra fraktionens komponenter är hur som helst inte nödvändig eftersom
det inte förekommer någon överlappning av topparna under analysen med
gaskromatografi om gaskromatografiska villkor ändras i enlighet med
6.3.1. En optimering av den andra fraktionensvolym är i allmänhet inte
nödvändig eftersom en god separering erhålls med de följande komponen-
terna. En hög topp med omkring 1,5 minuter kortare retentionstid är
standarden beror emellertid på skvalen och är ett tecken på en dålig sepa-
rering.
6.2.2 Indunsta den andra fraktionen i en indunstare vid 30 ºC och under lätt
tryck till torrhet och lösomedelbart upp åters toden i 0,2 ml hexan.
Förvara lösningen i kylskåp fram till analysen.
Anm. 8:
De återstoder som anges i 6.1.3 och 6.2.2 bör inte förvaras torrt eller i
rumstemperatur. Så snart de har erhållits, bör lösningsmedel tillsättas och
lösningarna bör förvaras i kylskåp.
6.3Gaskromatografi
6.3.1 Driftförhållanden för separerad injektion:
— Injektornstemperatur: 300 ºC.
— Detektornstemperatur: 320 ºC.— Integrerad registreringsenhet: parametrarna för integrering bör ställas
in så att en korrekt uppskattning av ytorna erhålls. Integration över
de enskilda topparna rekommenderas.
— Känslighet: omkring 16 gånger högre än minimikänsligheten.
— Kvantitet av det injicerade ämnet: 1 µl.
— Inställning av ugnstemperaturen: starttemperaturen skall vara 235 ºC i
6 minuter, därefter ökastemperaturen med 2 ºC/min upp till 285 ºC.
— Injektor med delningsförhållandet 1: 15.— Bärargas: helium eller väte vid ett tryck av ungefär 120 kPa.
Dessa förhållande kan ändras i enlighet med kromatograf- och kolonnka-
raktäristiken för att erhålla kromatogram som uppfyller följande krav:
intern standardtopp inom ca 5 minuter av den tid som anges i 6.3.2. Den
interna standardtoppen bör vara minst 80 % av hela skalvärdet.
Det gaskromatografiska systemet måste kontrolleras genom att en bland-
ning av stamlösningen av kolestadien (5.6) och n-nonacosanlösning (5.8)
sprutas in. Kolesta-3,5-dientoppen måste formas n-nonacosanet (fig. 1c).
Om den inte framträder kan två åtgärder vidtas: att sänka ugnstempera-
turen eller att använda kolonner som inte är lika polära.
6.3.2 Identifiering av toppar
Den inre standardtoppen formas vid omkring 19 minuter och stigmasta-
3,5-dien med en relativ retentionstid på cirka 1,29 (se fig. 1b). Med stig-
masta-3,5-dien förekommer små mängder av en isomer och vanligtvis
formar de båda en enda kromatografisk topp. Om kolonnen är för polär
eller uppvisar för stor upplösningsförmåga, kan isomeren emellertid
framträda som en liten topp före och mycket nära stigmasta-3,5-dien-
toppen (fig. 2). För att försäkra sig om att stigmastadienerna elueras till
en topp är det tillrådligt att ersätta kolonnen med en kolonn som inte är
lika polär eller en kolonn med större innerdiameter.
Anm. 9:
Stigmastadiener för kromatografisk referens kan erhållas genom analys av
en raffinerad vegetabilisk olja med användning av en mindre provmängd
(1—2 g). Stigmastadiener producerar en mycket tydlig och lätt identifi-
erbar topp.
6.3.3 Kvantitativ analys
Stigmastadienhalten bestäms enligt formeln
mg/kg stigmastadien =
As/C2Mc
Ac/C2Mo1991R2568 — SV — 22.05.2002 — 019.001 — 72
▼M11
där: As= arean av stigmastadientoppen (om toppen upplöses i två
isomer, summan av de två topparnas areor)
Ac= arean av inre standard (kolestadien)
Mc= massan av tillsatt standard i mikrogram
Mo= massan av oljan som tagits ut för undersökning i gram
Gränsför påvis barhet: ca 0,01 mg/kg.1991R2568 — SV — 22.05.2002 — 019.001 — 73
▼M11
Figur 1
Gaskromatogram erhållna genom analys av prover av olivolja på en
kapillärkolonn av kvarts(0,25 mm innerdiameter på en längd av 25 m)
täckt med 5-procentig fenylmetylsilikon med en filmtjocklek av 0,25 µm.
a) Första fraktionen (30 ml) från en jungfruolja med tillsatt standard.
b) Andra fraktionen (40 ml) från en olivolja innehållande 0,10 mg stig-
mastadien per kg.1991R2568 — SV — 22.05.2002 — 019.001 — 74
▼M11
c) Andra fraktionen (40 ml) innehållande en liten del av den första frak-
tionen.
Figur 2
Gaskromatogram som erhållits från ett prov av raffinerad olivolja analy-
serad på en DB-5 kolonn och som visar stigmasta-3,5-diens isomer.1991R2568 — SV — 22.05.2002 — 019.001 — 75
▼M13
BILAGA XVIII
BESTÄMNING AV TRIACYLGLYCEROLER MED ECN 42 (SKILLNAD
MELLAN HPCL-MÄTVÄRDEN OCH TEORETISKT INNEHÅLL)
1.Syfte
Bestämning av sammansättningen av triacylglyceroler i olivoljor, med
avseende på deras ekvivalenta koltal (ECN, Equivalent Carbon
Number), genom jämförelser mellan de analytiska resultat som erhålls
genom högseparerande vätskekromatografi (HPLC) och det teoretiska
innehållet beräknat utifrån fettsyresammansättningen.
2.Tillämpningsområde
Denna standard är tillämplig på olivoljor. Metoden används för
påvisande av små mängder fröoljor (som är rika på linolsyra) i alla
olivoljeklasser.
3.Princip
Det genom HPCL-analys fastställda innehållet av triacylglyceroler med
ECN 42 och det teoretiska innehållet av triacylglyceroler med ECN 42
(beräknat på grundval av GLC-bestämning av fettsyresammansätt-
ningen) överensstämmer inom vissa gränser för rena oljor. Skillnader
som är större än de värden som anges i tillämplig förordning för varje
typ av olja visar att oljan innehåller fröoljor.
4.Metod
Den metod som används för att bestämma det teoretiska innehållet av
triacylglyceroler med ECN 42 samt skillnaden mellan detta värde och
det värde som erhålls genom HPLC innebär i huvudsak en sammanställ-
ning av analytiska resultat som erhållits med andra metoder. Tre faser
kan här urskiljas: bestämning av fettsyresammansättningen genom gask-
romatografi med kapillärkolonn, beräkning av den teoretiska
sammansättningen av triacylglyceroler med ECN 42 samt bestämning
av triacylglyceroler med ECN 42 genom HPLC.
4.1Apparatur
4.1.1 Rundkolvar, 250 och 500 ml.4.1.2 Glasbägare, 100 ml.4.1.3 Glaskolonn för kromatografi, inre diameter 21 mm, längd 450 mm, med
kran och mattslipad övre mynning (hona).
4.1.4 Separertrattar, 250 ml, med mattslipad smal mynning som passar in i
kolonnesöverdel.
4.1.5 Glasstav, 600 mm lång.4.1.6 Glastratt, 80 mm i diameter.4.1.7 Mätkolvar, 50 ml.4.1.8 Mätkolvar, 20 ml.4.1.9 Roterande evaporator.4.1.10 Högseparerande vätskekromatograf med termostatstyrning av kolonnens
temperatur.
4.1.11 Injektionsenheter för provmängder på 10 µl.
4.1.12 Detektor: differentialrefraktometer. Den fullskaliga känsligheten bör
vara minst 10
−4brytningsindexenheter.
4.1.13 Kolonn: rostfritt stål, längd 250 mm, inre diameter 4,5 mm, packad med
kiselpartiklar med en diameter på 5 µm och med 22 - 23 % kol i form
av oktadecylsilan (not 2).
4.1.14 Skrivare och/eller integrator.
4.2Reagens
Reagensen bör vara av analytisk renhetsgrad. Elueringslösningarna bör
vara avgasade och kan återanvändas flera gånger utan att det inverkar
på separeringarna.1991R2568 — SV — 22.05.2002 — 019.001 — 76
▼M13
4.2.1 Petroleumeter, 40 - 60 ºC, för kromatografi.
4.2.2 Etyleter, fri från peroxider, nyligen destillerad.4.2.3 Elueringslösning för kromatografi i glaskolonn: blandning av petroleu-
meter och etyleter 87:13 (v/v).
4.2.4 Kiselgel, 70 - 230 mesh, av typen Merck 7734, standardiserad till ett
vatteninnehåll på 5 % (m/m).
4.2.5 Glasull.4.2.6 Aceton.4.2.7 Acetonitril.4.2.8 Elueringslösning för HPLC: acetonitril + aceton (proportionerna justeras
så att man får den önskade separeringen, börja med 50:50 blandning).
4.2.9 Lösningsmedel: aceton.4.2.10 Referenstriglycerider: Antingen används kommersiella triglycerider
(tripalmitin, triolein etc.), varvid retentionstiderna skall markeras i
enlighet med ekvivalent koltal, eller referenskromatogram från sojaolja,
blandning 30:70 sojaolja: olivolja och ren olivolja (se not 3 och 4 samt
figur 1, 2, 3 och 4).
4.3Beredning av proverna
Eftersom en del ämnen kan ge upphov till interferenser och felaktiga
positiva resultat måste provet alltid renas i enlighet med IUPAC-
metoden 2.507 för bestämning av polära ämnen i oxiderade oljor.
4.3.1 Iordningställande av kromatografikol onnen
Fyll kolonnen (4.1.3) med cirka 30 ml elueringslösning (4.2.3). För ned
en propp av glasull (4.2.5) till botten av kolonnen med hjälp av glas-
staven (4.1.5).
Slamma upp 25 g kiselgel (4.2.4) i 80 ml elueringsblandning (4.2.3) i en
100 ml glasbägare. För över uppslamningen till kolonnen med hjälp av
en glastratt (4.1.6).
För att vara säker på att all kiselgel förts över till kolonnen, skölj
glasbägaren med elueringsblandningen och för över sköljvätskan till
kolonnen.
Öppna kolonnens kran och låt så mycket av lösningen rinna genom
kolonnen att vätskenivån är cirka 1 cm ovanför kiselgelen.
4.3.2 Kromatografi
Väg med en noggrannhet av 0,001 g upp 2,5 ± 0,1 g filtrerad, homoge-
niserad och - om nödvändigt - avvattnad olja i en 50 ml mätkolv (4.1.7).Lös oljan i cirka 20 ml elueringslösning (4.2.3). Värm upp försiktigt om
det behövs för att underlätta upplösningen. Kyl sedan av till rumstempe-
ratur och fyll upp till märket med elueringslösningen.
Tillsätt med mätpipett 20 ml lösning i den enligt 4.3.1 iordningställda
kolonnen. Öppna kranen och låt lösningen eluera tills den står i nivå
med kiselgelen.
Eluera med 150 ml elueringslösning (4.2.3) i en takt av cirka 2 ml/min.
(Det tar då 60 - 70 min för 150 ml att passera genom kolonnen.)
Samla upp eluatet i en 250 ml rundkolv (4.1.1) som i förväg kalibrerats i
ugn och noggrant vägts. Avlägsna lösningsmedlet vid reducerat tryck
(Rotavapor) och väg den erhållna återstoden. Denna skall sedan
användasvid beredning av lös ningen för HPLC-analysoch för bered-
ningen av metylestrar.
Vad gäller kategorierna jungfruolja extra, jungfruolja, vanlig raffinerad
olivolja och olivolja måste minst 90 % av provet passera genom
kolonnen. Beträffande bomoljor och olivoljor som är tillverkade av
pressrester måste minst 80 % passera.1991R2568 — SV — 22.05.2002 — 019.001 — 77
▼M13
4.4HPLC-analys
4.4.1 Beredning av proverna för kromatografisk analys
Man bereder en 5 % lösning av det prov som skall analyseras genom att
väga upp 0,5±0,001 g av provet i en 10 ml mätkolv och fylla på med
lösningsmedlet upp till 10 ml (4.2.9).
4.4.2 Utförande
Gör i ordning kromatografisystemet. Pumpa elueringslösningen (4.2.8)
genom kolonnen med en hastighet av 1,5 ml/min för att rensa hela
systemet. Vänta tills baslinjen stabiliserats. Injicera 10 µl av det prov
som beretts enligt 4.3.
4.4.3 Beräkning och redovisning av resultat
Använd metoden med inre standard, d.v.s. antag att den sammanlagda
arean av de toppar som motsvarar triglyceriderna från ECN 42 till
ECN 52 motsvarar 100 %. Beräkna den relativa andelen för varje trigly-
cerid med hjälp av formeln
% triglycerid = toppensarea × 100/topparnass ammanlagda area
Resultaten skall anges med minst två decimaler.Not 1: Elueringsordningen kan bestämmas genom att man beräknar de
ekvivalenta koltalen, som ofta definieras genom formeln ECN = CN -
2n, där CN är koltalet och n antalet dubbelbindningar. Koltalet kan
beräkansmer exakt genom att häns yn tastill var dubbelbindningen
finns. Om n
o,nloch nlnär antalet dubbelbindningar i olje-, linol- respek-
tive linolensyra kan det ekvivalenta koltalet beräknas med hjälp av
formeln
ECN = CN − dono−dlnl−dlnnln,
där koefficienterna do,dloch dlnkan beräknasmed hjälp av referens trig-
lyceriderna. Under de förutsättningar som anges för denna metod
kommer det förhållande som erhålls att väl beskrivas av formeln
ECN = CN − (2,60 no) − (2,35 nl) − (2,15 nln)
Not 2: Exempel: Lichrosorb (Merck) RP18 Art 50333
Lichrosphere eller motsvarande (Merck) 100 CH18
Art 50377
Not 3: Om man använder sig av flera referenstriglycerider är det också
möjligt att beräkna upplösningen med avseende på triolein:
α=R T1/ RT triolein
med hjälp av den reducerade retentionstiden RT1= RT − RT lösnings-
medel
Grafen för log αsom funktion av f (antalet dubbelbindningar) möjliggör
bestämning av retentionsvärdena för alla triglycerider i referenstriglyce-
riderna; se figur 2.
Not 4: Kolonnen bör vara så beskaffad att den möjliggör en tydlig sepa-
rering av toppen för trilinolein från topparna för de triglycerider som har
närliggande retentionstider. Eluering görs fram till ECN 52-toppen.
Not 5: För att få ett korrekt mått på arean av alla de toppar som är av
intresse för denna undersökning måste den andra toppen, vilken
motsvarar ECN 50, motsvara 50 % av skrivarens fulla skala.
4.5Beräkning av triacylglycerolernas sammansättning
4.5.1 Bestämning av fettsyrornas sammansättning
Fettsyrornas sammansättning bestäms med den EEG-metod för gaskro-
matografi som anges i bilaga 10 A till förordning (EEG) nr 2568/91,
enligt vilken en kapillärkolonn skall användas. Metylestrarna bereds
enligt den metod som framgår av bilaga X B till nämnda förordning
(natriummetylat i metanollösning).
4.5.2 Fettsyror för beräkning
Glycerider grupperas efter sina ekvivalenta koltal (ECN), varvid hänsyn
tas till följande ekvivalensförhållanden mellan ECN och fettsyror.1991R2568 — SV — 22.05.2002 — 019.001 — 78
▼M13
Enbart fettsyror med 16 och 18 kolatomer beaktades, eftersom endast
dessa är av betydelse vad gäller olivolja.
Fettsyra FörkortningMolekylvikt
MEkvivalent
koltal ECN
Palmitinsyra P 256,4 16
Palmitoleinsyra Po 254,4 14Stearinsyra S 284,5 18Oljesyra O 282,5 16
Linolsyra L 280,4 14
Linolensyra Ln 278,4 12
4.5.3 Omvandling av areaprocent till mol för alla fettsyror
mol P ¼
area % P
MPmol S ¼area % S
MSmol Po ¼area % Po
MP o/C148/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C149/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C150(1)
mol O ¼
area % O
MOmol L ¼area % L
MLmol Ln ¼area % Ln
ML n
4.5.4 Normalisering av fettsyror till 100 %
molprocent P 1 ;2;3 ðÞ ¼mol P /C3100
mol P þSþPoþOþLþLn ðÞ/C148/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C149/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C150(2)molprocent S 1 ;2;3 ðÞ ¼
mol S /C3100
mol P þSþPoþOþLþLn ðÞ
molprocent Po 1 ;2;3 ðÞ ¼mol Po /C3100
mol P þSþPoþOþLþLn ðÞ
molprocent O 1 ;2;3 ðÞ ¼mol O /C3100
mol P þSþPoþOþLþLn ðÞ
molprocent L 1 ;2;3 ðÞ ¼mol L /C3100
mol P þSþPoþOþLþLn ðÞ
molprocent Ln 1 ;2;3 ðÞ ¼mol Ln /C3100
mol P þSþPoþOþLþLn ðÞ
Resultatet visar andelen av varje fettsyra i molprocent av triacylglycero-
lernas samtliga positioner (1,2,3)
Sedan beräknas summan av de mättade fettsyrorna P och S (SFA) och
de omättade fettsyrorna Po, O, L och Ln (UFA):
molprocent SFA = molprocent P + molprocent S/C148/C147/C147/C147/C147/C147/C149/C147/C147/C147/C147/C147/C150(3)molprocent UFA = 100 − molprocent SFA.
4.5.5 Beräkning av fettsyrornas sammansättning i triacylglycero-
lernas2- och 1,3- s tällning
Fettsyrorna fördelas i tre grupper enligt följande: två identiska för 1- och
3- ställning och en för 2-ställning, med olika koefficienter för de
mättade (P och S) och omättade syrorna (Po, O, L och Ln).
4.5.5.1 Mättade fettsyror i 2-ställning [P(2) och S(2)]
molprocent P(2) = molprocent P (1,2,3) * 0,06/C148/C147/C147/C147/C147/C147/C149/C147/C147/C147/C147/C147/C150(4)molprocent S(2) = molprocent S (1,2,3) * 0,061991R2568 — SV — 22.05.2002 — 019.001 — 79
▼M13
4.5.5.2 Omättade fettsyror i 2-ställning [Po(2), O(2), L(2) och Ln(2)]:
molprocent Po 2 ðÞ ¼mol% Po 1 ;2;3 ðÞ
mol% UFA/C3100/C0mol % P 2 ðÞ /C0mol% S 2 ðÞ ½/C138/C148/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C149/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C150(5)molprocent O 2 ðÞ¼
mol % O 1 ;2;3 ðÞ
mol% UFA/C3100/C0mol% P 2 ðÞ/C0mol% S 2 ðÞ ½/C138
molprocent L 2 ðÞ ¼mol% L 1 ;2;3 ðÞ
mol% UFA/C3100/C0mol% P 2 ðÞ /C0mol% S 2 ðÞ ½/C138
molprocent Ln 2 ðÞ ¼mol % Ln 1 ;2;3 ðÞ
mol% UFA/C3100/C0mol% P 2 ðÞ /C0mol% S 2 ðÞ ½/C138
4.5.5.3 Fettsyror i 1,3-ställning [P(1,3), S(1,3), Po(1,3) O(1,3), L(1,3) och
Ln(1,3)]:
molprocent P 1 ;3ðÞ ¼mol% P 1 ;2;3 ðÞ /C0 mol% P 2 ðÞ
2þmol P 1 ;2;3 ðÞ/C148/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C149/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C150(6)molprocent S 1 ;3ðÞ ¼
mol% S 1 ;2;3 ðÞ /C0 mol% S 2 ðÞ
2þmol% S 1 ;2;3 ðÞ
molprocent Po 1 ;3ðÞ ¼mol% Po 1 ;2;3 ðÞ /C0 mol% Po 2 ðÞ
2þmol% Po 1 ;2;3 ðÞ
molprocent O 1 ;3ðÞ ¼mol% O 1 ;2;3 ðÞ /C0 mol% O 2 ðÞ
2þmol% O 1 ;2;3 ðÞ
molprocent L 1 ;3ðÞ ¼mol% L 1 ;2;3 ðÞ /C0 mol% L 2 ðÞ
2þmol% L 1 ;2;3 ðÞ
molprocent Ln 1 ;3ðÞ ¼mol% Ln 1 ;2;3 ðÞ /C0mol% Ln 2 ðÞ
2þmol% Ln 1 ;2;3 ðÞ
4.5.6 Beräkning av triacylglyceroler
4.5.6.1 Triacylglyceroler med en fettsyra (AAA, här LLL, PoPoPo)
molprocent AAA ¼mol% A 1 ;3ðÞ /C3 mol% A 2 ðÞ/C3mol% A 1 ;3ðÞ
10000(7)
4.5.6.2 Triacylglyceroler med två fettsyror (AAB, här PoPoL, PoLL)
molprocent AAB ¼mol% A 1 ;3ðÞ /C3 mol% A 2 ðÞ/C3mol% B 1 ;3ðÞ /C3 2
10000/C148/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C149/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C150(8)
molprocent ABA ¼
mol% A 1 ;3ðÞ /C3 mol% B 2 ðÞ/C3mol% A 1 ;3ðÞ
10000
4.5.6.3 Triacylglyceroler med tre olika fettsyror (ABC, här OLLn, PLLn,
PoOLn, PPoLn)
molprocent ABC ¼mol% A 1 ;3ðÞ /C3 mol% B 2 ðÞ/C3mol% C 1 ;3ðÞ /C3 2
10000/C148/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C149/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C150(9) molprocent BCA ¼
mol% B 1 ;3ðÞ /C3 mol% C 2 ðÞ/C3mol% A 1 ;3ðÞ /C3 2
10000
molprocent CAB ¼mol% C 1 ;3ðÞ /C3 mol% A 2 ðÞ/C3mol% B 1 ;3ðÞ /C3 2
100001991R2568 — SV — 22.05.2002 — 019.001 — 80
▼M13
4.5.6.4 Triacylglyceroler med ECN 42
Följande triglycerider med ECN 42 beräknasi enlighet med ekvation 7,
8 och 9 alltefter derasförväntade eluering i HPLC (vanligtvisendas t tre
toppar).
LLL
PoLL och ställningsisomeren LPoL
OLLn och ställningsisomererna OLnL och LnOLPoPoL och ställningsisomeren PoLPoPoOLn och ställningsisomererna OPoLn och OLnPo
PLLn och ställningsisomererna LLnP och LnPL
PoPoPoSLnLn och ställningsisomeren LnSLn
PPoLn och ställningsisomererna PLnPo och PoPLn
Triacylglycerolerna med ECN 42 erhålls som summan av de nio tria-
cylglycerolerna och deras ställningsisomerer. Resultaten skall anges
med minst två decimaler.
5.Utvärdering av resultaten
En jämförelse görs mellan det beräknade teoretiska innehållet och
innehållet enligt HPLC-bestämningen. Om skillnaden mellan HPLC-
värdet och det teoretiska värdet är större än det värde som anges i
förordningen för motsvarande kategori olivolja, innehåller provet fröolja.
Not:Resultaten skall anges med en decimal.
6.Exempel (siffrorna avser stycken i metoddelen)
4.5.1 Beräkning av molprocent fettsyror från GLC-data (areapro-
cent)
Följande uppgifter erhålls för fettsyrornas sammansättning genom GLC
FA
MP
256,4S
284,5Po
254,4O
282,5L
280,4Ln
278,4
areaprocent 10,0 3,0 1,0 75,0 10,0 1,0
4.5.3 Omvandling av areaprocent till mol för alla fettsyror
mol P ¼10
256 ;4¼0;03900 mol P Se formel (1)
mol S ¼3
284 ;5¼0;01054 mol S Se formel (1)
mol Po ¼1
254 ;4¼0;00393 mol Po Se formel (1)
mol O ¼75
282 ;5¼0;26549 mol O Se formel (1)
mol L ¼10
280 ;4¼0;03566 mol L Se formel (1)
mol Ln ¼1
278 ;4¼0;003594 mol Ln Se formel (1)
Summa = 0,35822 mol TG
4.5.4 Normalisering av fettsyror till 100 %
molprocent P 1 ;2;3 ðÞ ¼0;03900 mol P /C3100
0;35822 mol¼10;888 % Se formel (2)1991R2568 — SV — 22.05.2002 — 019.001 — 81
▼M13
molprocent S 1 ;2;3 ðÞ ¼0;01054 mol S /C3100
0;35822 mol¼2;944 % Se formel (2)
molprocent Po 1 ;2;3 ðÞ ¼0;00393 mol Po /C3100
0;35822 mol¼1;097 % Se formel (2)
molprocent O 1 ;2;3 ðÞ ¼0;26549 mol O /C3100
0;35822 mol¼74;113 % Se formel (2)
molprocent L 1 ;2;3 ðÞ ¼0;03566 mol L /C3100
0;35822 mol¼9;956 % Se formel (2)
molprocent Ln 1 ;2;3 ðÞ ¼0;00359 mol Ln /C3100
0;35822 mol¼1;003 % Se formel (2)
Summa molprocent = 100,0 %
Summa mättade och omättade fettsyror i 1, 2, 3-ställning hos triacylgly-
cerolerna:
molprocent SFA = 10,888 % + 2,944 % = 13,831 % Se formel (3)
molprocent UFA = 100,000 % − 13,831 % = 86,169 % Se formel (3)
4.5.5 Beräkning av fettsyrornas sammansättning i 2- och 1,3-
ställning i triacylglycerolerna
4.5.5.1 Mättade fettsyror i 2-ställning [P(2) och S(2)]
molprocent P(2) = 10,888 % * 0,06 = 0,653 molprocent Se formel (4)
molprocent S(2) = 2,944 % * 0,06 = 0,177 molprocent Se formel (4)
4.5.5.2 Omättade fettsyror i 1,3-ställning [Po(1,3), O(1,3), L(1,3) och Ln(1,3)]
molprocent Po 2 ðÞ ¼1;097 %
86;169 %/C3100/C0/C00;659/C00;177 ðÞ ¼ 1;263 molprocent Se formel
(5)
molprocent O 2 ðÞ ¼74;113 %
86;169 %/C3100/C0/C00;659/C00;177 ðÞ ¼ 85;295 molprocent Se formel
(5)
molprocent L 2 ðÞ ¼9;956 %
86;169 %/C3100/C0/C00;659/C00;177 ðÞ ¼ 11;458 molprocent Se formel
(5)
molprocent Ln 2 ðÞ ¼1;003 %
86;169 %/C3100/C0/C00;659/C00;177 ðÞ ¼ 1;154 molprocent Se formel
(5)
4.5.5.3 Fettsyror i 1,3-ställning [P(1,3), S(1,3), Po(1,3), O(1,3), L(1,3) och
Ln(1,3)]
molprocent P 1 ;3ðÞ ¼10;888/C00;659
210;888¼16;005 molprocent Se formel (6)
molprocent S 1 ;3ðÞ ¼2;944/C00;177
22;944¼4;327 molprocent Se formel (6)
molprocent Po 1 ;3ðÞ ¼1;097/C01;263
21;097¼1;015 molprocent Se formel (6)
molprocent O 1 ;3ðÞ ¼74;113/C085;295
274;113¼68;522 molprocent Se formel (6)
molprocent L 1 ;3ðÞ ¼9;956/C011;458
29;956¼9;205 molprocent Se formel (6)
molprocent Ln 1 ;3ðÞ ¼1;003/C01;154
21;003¼0;927 molprocent Se formel (6)1991R2568 — SV — 22.05.2002 — 019.001 — 82
▼M13
4.5.6 Beräkning av triacylglyceroler
Från den beräknade sammansättningen av fettsyror i sn-2 och sn-1,3-
ställning (se ovan)
FA i 1,3-ställning 2-ställning
P 16,005 % 0,653 %
S 4,327 % 0,177 %
Po 1,015 % 1,263 %
O 68,522 % 85,295 %L 9,205 % 11,458 %Ln 0,927 % 1,154 %Totalt 100,0 % 100,0 %
beräknasföljande triacylglyceroler:
LLL
PoPoPoPoLL med 1 ställningsisomerSLnLn med 1 ställningsisomerPoPoL med 1 ställningsisomerPPoLn med 2 ställningsisomererOLLn med 2 ställningsisomererPLLn med 2 ställningsisomerer
PoOLn med 2 ställningsisomerer
4.5.6.1 Triacylglyceroler med en fettsyra (LLL, PoPoPo) Se formel (7)
molprocent LLL ¼
9;205 % /C311;458 % /C39;205 %
10000= 0,09708 mol LLL
molprocent PoPoPo ¼1;015 % /C31;263 % /C31;015 %
10000= 0,00013 mol PoPoPo
4.5.6.2 Triacylglyceroler med två fettsyror (PoLL, SLnLn, PoPoL) Se formel
(8)
molprocent PoLL þLLPo ¼1;015 % /C311;458 % /C39;205 % /C32
10000= 0,02141
molprocent LPoL ¼9;205 % /C31;263 % /C39;205 %
10000= 0,01070
Summa: 0,03211 mol PoLL
molprocent SLnLn þLnLnS ¼4;327 % /C31;154 % /C30;927 % /C32
10000= 0,00093
molprocent LnSLn ¼0;927 % /C30;177 % /C30;927 %
10000= 0,00002
Summa: 0,00095 mol SLnLn
molprocent PoPoL þLPoPo ¼1;015 % /C31;263 % /C39;205 % /C32
10000= 0,00236
molprocent PoLPo ¼1;015 % /C311;458 % /C31;015 %
10000= 0,00118
Summa: 0,00354 mol PoPoL1991R2568 — SV — 22.05.2002 — 019.001 — 83
▼M13
4.5.6.3 Triacylglyceroler med tre olika fettsyror (PoPLn, OLLn, PLLn, PoOLn)
Se formel (9)
molprocent PPoLn ¼16;005 % /C31;263 % /C30;927 % /C32
10000= 0,00375
molprocent LnPPo ¼0;927 % /C30;653 % /C31;015 % /C32
10000= 0,00012
molprocent PoLnP ¼1;015 % /C31;154 % /C316;005 % /C32
10000= 0,00375
Summa: 0,00762 mol PPoLn
molprocent OLLn ¼68;522 % /C311;458 % /C30;927 % /C32
10000= 0,14577
molprocent LnOL ¼0;927 % /C385;295 % /C39;205 % /C32
10000= 0,14577
molprocent LLnO ¼9;205 % /C31;154 % /C368;522 % /C32
10000= 0,14577
Summa: 0,43671 mol OLLn
molprocent PLLn ¼16;005 % /C311;458 % /C30;927 % /C32
10000= 0,03400
molprocent LnPL ¼0;927 % /C30;653 % /C39;205 % /C32
10000= 0,00111
molprocent LLnP ¼9;205 % /C31;154 % /C316;005 % /C32
10000= 0,03400
Summa: 0,06911 mol PLLn
molprocent PoOLn ¼1;015 % /C385;295 % /C30;927 % /C32
10000= 0,01605
molprocent LnPoO ¼0;927 % /C31;263 % /C368;522 % /C32
10000= 0,01605
molprocent OLnPo ¼68;522 % /C31;154 % /C31;015 % /C32
10000= 0,01605
Summa: 0,04815 mol PoOLn
ECN42 = 0,69540 mol triacylglyceroler1991R2568 — SV — 22.05.2002 — 019.001 — 84
▼M14
Figur 1:Utvecklingen av log αi förhållande till f (antal dubbelbind-
ningar)
Anm.: La: Laurinsyra; My: myrsyra; P: palmitinsyra; St: stearinsyra; O:oleinsyra; L: linoleinsyra; Ln: linoleninsyra.1991R2568 — SV — 22.05.2002 — 019.001 — 85
▼M14
Figur 2:Sojaolja
Figur 3:Sojaolja/Olivolja 30/70
1991R2568 — SV — 22.05.2002 — 019.001 — 86
▼M14
Figur 4:Olivolja
1991R2568 — SV — 22.05.2002 — 019.001 — 87
▼M19
BILAGA XIX
BESTÄMNING AV HALTEN ALIFATISKA ALKOHOLER MED
KAPILLÄRGASKROMATOGRAFI
1. SYFTE
Förfarandet beskriver en metod för bestämning av halten alifatiska alko-
holer, enskilt eller totalt, i oljor och fetter.
2. PRINCIP
Fettämnet med 1-eicosanol tillsatt som standard, förtvålas med kalium-
hydroxid i metanol varefter de oförtvålbara ämnena extraherasmed
etyleter. Alkoholfraktionen separeras från de oförtvålbara ämnena
genom kromatografi på ett lager kiselgel impregnerat med kaliumhydr-
oxid. Alkoholerna som återvunnits från kiselgelen överförs till
trimetylsilyletrar och analyseras genom gaskromatografi med kapillärko-
lonn.
3. UTRUSTNING
3.1 250 ml kolv försedd med återflödeskylare med slipningar.3.2 500 ml separertratt.3.3 250 ml kolvar.3.4 Komplett apparatur för analys med tunnskiktskromatografi som
använder glasplattor 20 × 20 cm.
3.5 Ultraviolett lampa med en våglängd av 366 eller 254 nm.3.6 Mikrolitersprutor 100 µl och 500 µl.
3.7 En cylindrisk filtrertratt med porositeten G3 (porositet 15 till 40 µm)
och med en diameter på cirka 2 cm, ett djup på 5 cm och försedd med
en hanslipning 12/21 som passar på en vakuumkolv.
3.8 50 ml vakuum-E-kolv med honslipning 12/21 som kan användas för filt-
rertratten (3.7).
3.9 10 ml provrör med konisk botten och propp.3.10 Gaskromatograf för användning med kapillärkolonn och försedd med
spaltningssystem som består av:
3.10.1 En termostatkammare för kolonner som kan bibehålla önskad temperatur
med en noggrannhet av ± 1 ºC.
3.10.2 En injektor med inställbar temperatur och försedd med ett förångningse-
lement av glas med silaniserad yta.
3.10.3 En flamjoniseringsdetektor och omformarförstärkare.
3.10.4 Integrerad registreringsenhet för användning med omformarförstärkaren
med svarstider som inte överstiger 1 sekund och med variabel pappers-
hastighet.
3.11 Kapillärkolonn av glaseller kvarts , längd 20 till 30 meter, innerdiameter
0,25 till 0,32 mm, med SE-52 eller SE-54 vätskefas eller motsvarande
och med en filmtjocklek mellan 0,10 och 0,30 µm.
3.12 Mikrolitersprutor för gaskromatografi, 10 µl med härdad nål.
3.13 Precisionsvåg med en känslighet av 1 mg (med visning av 0,1 mg).
4. REAGENSER
4.1 Kaliumhydroxid, circa 2 N etanollösning: 130 g kaliumhydroxid (med
en lägsta koncentration av 85 %) löses under kylning i 200 ml destillerat
vatten som sedan späds till en liter med etanol. Lösningen bör förvaras i
en väl tillsluten mörk glasflaska.
4.2 Etyleter, P.A.4.3 Vattenfritt natriumsulfat, P.A.4.4 Glasplattor täckta med kiselgel utan fluorescensindikator, tjocklek
0,25 mm (finnsi handeln färdiga för användning).
4.5 Kaliumhydroxid, circa 0,2 N etanollösning. 13 g kaliumhydroxid löses i
20 ml destillerat vatten och spädes till en liter med etanol.1991R2568 — SV — 22.05.2002 — 019.001 — 88
▼M19
4.6 Bensen, för kromatografi (se 5.2.2).
4.7 Aceton, för kromatografi (se 5.2.2).4.8 Hexan, för kromatografi (se 5.2.2).4.9 Etyleter, för kromatografi (se 5.2.2).4.10 Kloroform, P.A.4.11 Referenslösning för tunnskiktskromatografi: kolesterol eller fytosterol,
5 % lösning i kloroform.
4.12 2.7-diklorfluorecein, 0,2 % etanollösning. Denna görs lätt alkalisk
genom tillsats av ett par droppar 2 N etanollösning av kaliumhydroxid.
4.13 Vattenfri pyridin, för kromatografi.4.14 Hexametyldisilasan.4.15 Trimetylklorosilan.4.16 Standardlösningar av trimetylsilyletrar av alifatiska alkoholer från C
20till C28. Framställs av blandningar av rena alkoholer omedelbart innan
de skall användas.
4.17 En 0,1 % (m/v) lösning av 1-eicosanol i CHCl3(inre standard).
4.18 Bärgas: väte eller helium, ren för gaskromatografi.
4.19 Supplementerande gaser: kväve, ren för gaskromatografi.
5. UTFÖRANDE5.1Preparering av oförtvålbara ämnen
5.1.1 Inför med hjälp av en 500 µl spruta i en 250 ml rundkolv en volym av
0,1 % 1-eicosanollösning (4.17) som innehåller en kvantitet av 1-eico-
sanol som ungefärligen motsvarar 10 % av halten alifatiska alkoholer i
den del av provet som tagits ut för analys. Tillsätt t.ex. 5 gram av provet
250µl av den 0,1 % 1-eicosanollösningen om det gäller olivolja och
1 500 µl om det gäller olivolja av pressrester.
Indunsta till torrhet under en ström av kväve och väg upp exakt 5 g torrt
filtrerat prov i kolven.
5.1.2 50 ml 2 N etanollösning av kaliumhydroxid i etanol tillsätts, sätt på
återflödeskylare och värm upp apparaten till sakta kokning på ångbad
under kontinuerlig omrörning under hela uppvärmningsprocessen tills
förtvålning har inträtt (lösningen blir klar). Fortsätt upphettningen under
ytterligare 20 minuter, och tillsätt sedan 50 ml destillerat vatten genom
återflödeskylaren, ta bort kylaren och kyl kolven till cirka 30 C.
5.1.3 Innehållet i kolven överförskvantitativt till en s eparertratt på 500 ml
och sköljs upprepade gånger med destillerat vatten av en mängd som
totalt får uppgå till 50 ml. Tillsätt cirka 80 ml etyleter, skaka omsorgs-
fullt i ungefär 30 sekunder och låt sedan innehållet separera ( anm1).
Separera av den lägre vattenfasen i en ny separertratt. Ytterligare två
extraktioner görs på vattenfasen på samma sätt, varje gång med använd-
ning av 60 till 70 ml etyleter.
Anm.1 :Eventuell emulsion kan tas bort genom tillsats av små kvanti-
teter etanol eller metanol i sprayform.
5.1.4 Etyleterextrakten samlas i en separertratt och tvättas med destillerat
vatten (50 ml åt gången) tillstvättvattnet ger neutral reaktion.
Kasta bort vattenfasen, torka med vattenfritt natriumsulfat och filtrera i
en kolv på 250 ml som har vägts innan. Tratten och filtret tvättas med
små kvantiteter etyleter som läggs till etyleterfasen.
5.1.5 Etern indunstas under försiktig uppvärmning till några ml och torkas
under lätt undertryck eller under ström av kväve. Torkningen avslutas i
torkskåp vid 100 ºC i ca 15 minuter och återstoden vägs sedan den
svalnat i exsickator.
5.2Separering av alkoholfraktionerna
5.2.1 Förberedning av alkaliska plattor: sänk ner silicagelplattorna (4.4) helt i
0,2 N kaliumhydroxidlösning i etanol (4.5) i tio sekunder och låt sedan
verka; torka väl i dragskåp i två timmar och placera slutligen i ett
värmeskåp vid 100 ºC i en timme.1991R2568 — SV — 22.05.2002 — 019.001 — 89
▼M19
Ta ut plattorna från torkskåpet och förvara dem i en exsickator med
kalciumklorid tills de skall användas (plattor som behandlas på detta
sätt måste användas inom 15 dagar).
Anm.2 :När kiselgelplattor används för separation av alkoholfraktionen
behöver inte oförtvålbara ämnen behandlasmed aluminium. På
detta sätt återfås alla sura komponenter (feta syror och övriga)
på ursprungsprovets linje. Man får också banden för de alifa-
tiska alkoholerna och terpenalkoholerna separerade av
sterolbandet.
5.2.2 Fyll på en blandning av 65:35 räknat per volym av hexan och etyleter i
framkallningskammaren till ett djup av circa 1 cm(*).
Kammaren försluts med ett passande lock och får stå minst en halv-
timme för att tillåta att jämvikt inträder mellan gas och vätska. Remsor
av filtrerpapper som doppas ner i eluenten kan placeras på insidan av
tankens ytor för att minska framkallningstiden med ungefär en tredjedel
och få en jämnare eluering av komponenterna.
Anm.3 :Framkallningslösningen måste ersättas för varje analys för att
få reproducerbara framkallningsförhållanden.
5.2.3 En circa 5 % lösning av oförtvålbara ämnen (5.1.5) i kloroform iord-
ningsställs och 0,3 ml av lösningen stryks ut jämnt till minsta möjliga
tjocklek med hjälp av en mikrospruta på 100 µl på en TLC-platta cirka
2 cm från dess nederkant. I jämnhöjd med ursprungsprovet placeras
2–3µl av referenslösningen med alifatiska alkoholer (4.11) för att man
skall kunna känna igen de alifatiska alkoholernas band efter det att
framkallningen har genomförts.
5.2.4 Plattan placeras i framkallningskammaren som anges i 5.2.2. Omgiv-
ningstemperaturen skall hållas mellan 15 och 20 ºC. Stäng kammaren
omedelbart med locket och påbörja elueringen tills lösningsmedlets
främre kant når till circa 1 cm från övre änden av plattan.
Plattan tas sedan bort från framkallningskammaren och lösningsmedlet
får avdunsta i varmluftström eller också får plattan torka en stund i
dragskåp.
5.2.5 Plattan sprayas lätt och jämnt med en lösning av 2,7-diklorflourescein.
När plattan betraktasi ultraviolett ljuskan de alifatis ka alkoholernas
band identifierasgenom att det ligger i höjd med fläcken s om har erhål-
lits från referenslösningen. De alifatiska alkoholernas band.
Anm.4 :Kravet för grupperingen av de alifatiska alkoholernas band och
triterpenalkoholernas band tillsammans bestäms av den möjliga
övergången av en del alifatiska alkoholer i triterpenalkohol-
bandet.
5.2.6 Skrapa med hjälp av en metallspatel bort silikagelen på det markerade
området. Placera det finfördelade materialet som tagits bort i filtrer-
tratten (3.7). Tillsätt 10 ml het kloroform, rör försiktigt med
metallspateln och filtrera i vakuum-E-kolven (3.8) som är ansluten till
filtrertratten.
Tvätta återstoden i kolven tre gånger med etyleter (circa 10 ml varje
gång) och samla filtratet i samma kolv som är ansluten till filtrertratten.
Indunsta filtratet till en voly m på 4 till 5 ml, överför lösningen till ett
vägt 10 ml provrör (3.9), indunsta till torrhet genom lätt uppvärmning i
ett försiktigt flöde av kvävgas, lös igen med hjälp av ett par droppar
aceton, indunsta igen till torrhet, placera i ett värmeskåp vid 105 ºC i
cirka 10 minuter och låt sedan provet svalna i exsickator och väg det.
Återstoden i provröret består av alkoholfraktionen.
5.3Beredning av trimetylsilyletrar
5.3.1 Reagensen för silyleringen, som består av en blandning av 9:3:1 räknat
per volym ( anm. 5) av pyridinhexametyldisalazen-trimetylklorosilan i
förhållandet 50 µl för varje mg alkoholer tillsätts till provröret som
innehåller alkoholfraktionen, varvid ingen fukt får absorberas ( anm. 6).
Anm.5 :Lösningar som är klara för användning kan köpas färdiga.
Dessutom finns också andra silaniseringsreagenser som t.ex.
bis-trimetylsilyl, trifluoracetamid + 1 % trimetylklorosilan,1991R2568 — SV — 22.05.2002 — 019.001 — 90
(*) I särskilda fall måste 95:5 (v/v) bensen/acetonblandning användas för att få en god
separation av banden.
▼M19
som måste spädas med lika stor mängd vattenfri pyridin
tillgängliga.
Anm.6 :Eventuell bildning av en svag opalescens är normalt och inve-
rkar inte. Bildandet av en vit flockig fyllning eller rosafärgning
är tecken på närvaro av fukt och sönderfall hos reagensen. Omdetta inträffar skall provet upprepas.
5.3.2 Provröret förses med propp och skakas om försiktigt utan att det vänds,
tills alkoholerna har blivit lösliga. Låt stå i minst 15 minuter i rumstem-
peratur och centrifugera sedan i ett par minuter. Den klara lösningen är
nu färdig för analysmed gas kromatografi.
5.4Analys med gaskromatografi
5.4.1 Förberedelser och iordningsställande av kapillärkolonnen
5.4.1.1 Kapillärkolonnen placerasinuti gas kromatografen genom att kolonnens
inlopp ansluts till injektorblocket som är ansluten till spaltningssystemet
och andra änden av kolonnen till detektorn. En allmän kontroll av gask-
romatografen genomförs (gasanslutningarna skall vara täta, detektorn i
fullgott skick, fungerande spaltningssystem och registreringssystem etc).
5.4.1.2 Kapillärkolonner som används för första gången skall prepareras. En
liten mängd bärgasfår flyta igenom kapillärkolonnen och s edan kopplas
gaskromatografen på och en gradvis upphettning genomförs tills tempe-
raturen är minst 20 C över drifttemperaturen (se anm. 7). Temperaturen
bibehålls i minst två timmar och sedan ställs kromatografen i ordning
för driftförhållanden (inställning av gasflöde, tändning av delnings-
flamma, anslutning till den elektroniska registreringen, inställning av
temperaturen i kapillärkolonnensugn, detektorn och injektorn) s ignalen
ställs in på en känslighet som är minst två gånger den högsta nivån som
beräknas för genomförande av analysen. Baslinjens streck skall vara
linjärt, inte ha några spikar oavsett ursprung och inte visa tecken på att
driva. Negativ drift av linjen är tecken på otäta kolonnanslutningar
medan en positiv drift tyder på otillräcklig preparering av kolonnen.
Anm.7 :Temperaturen vid prepareringen skall vara minst 20 ºC lägre än
maximitemperaturen som beräknas för den vätskefas som
används.
5.4.2 Val av driftförhållanden
5.4.2.1 Följande riktlinjer gäller för kromatografinsutförande:
— kolonntemperatur: startisotermen ställs in vid 180 ºC i åtta minuter
och programmerass edan med 5 ºC per minut till 260 ºC och ytterli-
gare 15 minuter vid 260 ºC,
— injektorblocketstemperatur: 280 ºC,— detektornstemperatur: 290 ºC,— linjär hastighet för bärgasen: helium 20 till 35 cm/s, väte 30 till
50 cm/s,
— delningsförhållande: 1:50 till 1:100,
— instrumentets känslighet: 4 till 16 gånger högre än minimikänslig-
heten,
— registreringskänslighet: 1 till 2 mV,— pappershastighet: 30 till 60 cm/tim,— kvantitet av det injicerade ämnet: 0,5 till 1 µl av TMSE-lösning.
Dessa förhållanden kan varieras beroende på egenskaper hos kolonn och
gaskromatograf för att få kromatogram som uppfyller följande krav:
— alkoholretentionstiden C
26skall vara 18 ± 5 minuter,
— toppen för alkoholen C22skall vara 80 ± 20 % av hela skalvärdet för
olivolja och 40 ± 20 % av hela skalvärdet för fröolja.
5.4.2.2 Att de tidigare nämnda kraven är uppfyllda kontrollerasgenom en
upprepad injicering av den ställda TMSE-blandningen av alkoholer,
och driftförhållandena justeras för att ge bästa resultat.
5.4.2.3 Parametrarna för integrering av topparna skall ställas in så att en korrekt
uppskattning av topparnas ytor erhålls.
5.4.3 Analysförfarande
5.4.3.1 Sug med hjälp av en 10 µl spruta upp 1 µl hexan, sug in 0,5 µl luft och
sedan 0,5 till 1 µl av provlösningen. Drag ut kolven ur sprutan ytterli-
gare så att kanylen töms. Kör in kanylen genom membranet i1991R2568 — SV — 22.05.2002 — 019.001 — 91
▼M19
injektionsenheten och spruta snabbt efter en till två sekunder in
innehållet och drag sedan sakta ut kanylen efter cirka fem sekunder.
5.4.3.2 Registreringen genomförs tills de närvarande alkoholernas TMSE har
eluerats totalt. Baslinjen skall alltid motsvara kraven i 5.4.1.2.
5.4.4 Identifiering av toppar
Identifieringen av enskilda toppar genomförs med ledning av retentions-
tiderna och genom jämförelse med den ställda TMSE-lösningen som
analyseras under samma förhållanden.
Ett kromatogram av alkoholfraktionen av en jungfruolja visas i figur 1.
5.4.5 Kvantitativ utvärdering
5.4.5.1 Toppområdena för 1-eicosanol och de alifatiska alkoholerna C22,C24,C26och C28beräknasgenom elektronis k integrering.
5.4.5.2 Halten av varje enskild alifatisk alkohol uttryckt i mg/1 000 g fettämne
beräknaspå följande s ätt:
där:
Ax= toppområde för alkohol x
Ax= toppområde för 1-eicosanol
ms= vikt för 1-eicosanol, i mg
m = vikt för provet som tagits ut för analys, i gram
6. RESULTATANGIVELSE
Innehållet av de enskilda alifatiska alkoholerna i mg/1 000 g fettämne
och summan av de totala alifatiska alkoholerna antecknas.1991R2568 — SV — 22.05.2002 — 019.001 — 92
▼M19
TILLÄGG
Bestämning av den linjära hastigheten för gasen
1 till 3 µl metan (eller propan) sprutas in i gaskromatografen under vanliga
driftförhållanden, och den tid det tar för metanet eller propanet att passera
kolonnen från injektionsögonblicket till det ögonblick toppen eluerar (tM) mäts
med stoppur.
Den linjära hastigheten i cm/s erhålls genom L/tM där L är kolonnens längd i
cm och tM är tiden i sekunder som uppmäts med stoppur.
Figur 1 – Kromatogram över alkoholfrakturen av jungfruolja
1 = Eicosanol
2 = Docosanol
3 = Tricosanol4 = Tetracosanol
5 = Pentacosanol
6 = Hexacosanol7 = Heptacosanol8 = Octacosanol1991R2568 — SV — 22.05.2002 — 019.001 — 93