1991R2568 — SV — 01.03.2014 — 026.001

Detta dokument är endast avsett som dokumentationshjälpmedel och institutionerna ansvarar inte för innehållet

Ändrad genom:







(*) Denna rättsakt finns inte publicerad på svenska.









▼B

KOMMISSIONENS FÖRORDNING (EEG) nr 2568/91

av den 11 juli 1991

om egenskaper hos olivolja och olivolja av pressrester och om lämpliga analysmetoder







EUROPEISKA GEMENSKAPERNAS KOMMISSION HAR ANTAGIT DENNA FÖRORDNING med beaktande av Fördraget om upprättandet av Europeiska ekonomiska gemenskapen, med beaktande av rådets förordning nr 136/66/EEG av den 22 september 1966 om den gemensamma organisationen av marknaden för oljor och fetter ( 1 ), senast ändrad genom förordning (EEG) nr 3577/90 ( 2 ), särskilt artikel 35a i denna, och med beaktande av följande: med beaktande av följande: Bilagan till förordning nr 136/66/EEG innehåller beskrivningar och definitioner av olivolja och olivolja av pressrester som saluförs inom varje medlemsstat, inom gemenskapen och i handeln med tredje länder. För att kunna skilja mellan de olika typerna av olja bör de fysiska och kemiska egenskaperna hos var och en av dem och de organoleptiska egenskaperna hos jungfruolja definieras så att renheten och kvaliteten för de berörda varorna kan säkerställas med beaktande av andra befintliga bestämmelser. Egenskaperna hos de olika typerna av olja bör bestämmas enhetligt inom hela gemenskapen. För detta ändamål bör gemenskapsmetoder för kemisk analys och organoleptisk värdering upprättas. Under en övergångsperiod bör användningen av andra analysmetoder som tillämpas i medlemsstaterna tillåtas, under förutsättning att de resultat som erhålls med gemenskapsmetoden skall vara avgörande vid en skillnad i resultaten. Definitionen av de fysiska och kemiska egenskaperna hos olivolja och av analysmetoderna medför ändringar av tilläggsanmärkningarna i kapitel 15 i Kombinerade nomenklaturen. Metoden för utvärdering av de organoleptiska egenskaperna hos jungfruolja innefattar upprättandet av paneler med utvalda och utbildade provsmakare. Den tid som krävs för att upprätta en sådan struktur bör därför fastställas. Med hänsyn till de svårigheter som några medlemsstater kommer att möta när det gäller att upprätta paneler med provsmakare, bör användning av paneler i andra medlemsstater tillåtas. För att säkerställa att det system med avgifter som tillämpas på import av olivpressrester fungerar på avsett sätt bör en gemensam metod för bestämning av oljehalten i dessa varor fastställas. För att inte skapa handelshinder bör åtgärder vidtas för att olja som är förpackad innan denna förordning träder i kraft skall kunna avyttras under en begränsad tid. Det är nödvändigt att upphäva kommissionens förordning (EEG) nr 1058/77 ( 3 ), senast ändrad genom förordning (EEG) nr 1858/88 ( 4 ). Förvaltningskommittén för oljor och fetter har inte yttrat sig inom den tid som dess ordförande har bestämt. HÄRIGENOM FÖRESKRIVS FÖLJANDE







▼M20

Artikel 1

1. Oljor vars egenskaper överensstämmer med dem som anges i punkterna 1 och 2 i bilaga I till denna förordning skall anses vara jungfruolja i den mening som avses i punkt 1 a och 1 b i bilagan till förordning nr 136/66/EEG.

2. Olja vars egenskaper överensstämmer med dem som anges i punkt 3 i bilaga I till denna förordning skall anses vara bomolja i den mening som avses i punkt 1 c i bilagan till förordning nr 136/66/EEG.

3. Olja vars egenskaper överensstämmer med dem som anges i punkt 4 i bilaga I till denna förordning skall anses vara raffinerad olivolja i den mening som avses i punkt 2 i bilagan till förordning nr 136/66/EEG.

4. Olja vars egenskaper överensstämmer med dem som anges i punkt 5 i bilaga I till denna förordning skall anses vara olivolja sammansatt av raffinerad olivolja och jungfruolja i den mening som avses i punkt 3 i bilagan till förordning nr 136/66/EEG.

5. Olja vars egenskaper överensstämmer med dem som anges i punkt 6 i bilaga I till denna förordning skall anses vara oraffinerad olja av olivrestprodukter i den mening som avses i punkt 4 i bilagan till förordning nr 136/66/EEG.

6. Olja vars egenskaper överensstämmer med dem som anges i punkt 7 i bilaga I till denna förordning skall anses vara raffinerad olja av olivrestprodukter i den mening som avses i punkt 5 i bilagan till förordning nr 136/66/EEG.

7. Olja vars egenskaper överensstämmer med dem som anges i punkt 8 i bilaga I till denna förordning skall anses vara olivolja av olivrestprodukter i den mening som avses i punkt 6 i bilagan till förordning nr 136/66/EEG.

▼M26

Artikel 2

1. De egenskaper hos oljor som fastställs i bilaga I ska bestämmas med följande analysmetoder:

a) För bestämning av fria fettsyror, uttryckta som procent oljesyra, den metod som anges i bilaga II.

b) För bestämning av peroxidtal, den metod som anges i bilaga III.

c) För bestämning av vaxhalt, den metod som anges i bilaga IV.

d) För bestämning av sammansättningen och halten av steroler och triterpendialkoholer med kapillärgaskromatografi, den metod som anges i bilaga V.

e) För bestämning av andelen 2-glycerylmonopalmitat, den metod som anges i bilaga VII.

f) För spektrofotometri, den metod som anges i bilaga IX.

g) För bestämning av fettsyrasammansättning, den metod som anges i bilaga X A och X B.

h) För bestämning av flyktiga, halogenerade lösningsmedel, den metod som anges i bilaga XI.

i) För utvärdering av organoleptiska egenskaper hos jungfruolja, den metod som anges i bilaga XII.

j) För bestämning av stigmastadiener, den metod som anges i bilaga XVII.

k) För bestämning av triglyceridhalt enligt ECN 42, den metod som anges i bilaga XVIII.

l) För bestämning av halten av alifatiska alkoholer, den metod som anges i bilaga XIX.

m) För bestämning av halterna av vaxer, fettsyrametylestrar och fettsyraetylestrar, den metod som anges i bilaga XX.

För att påvisa förekomst av främmande vegetabiliska oljor i olivolja ska den analysmetod som anges i bilaga XXa tillämpas.

2. Den granskning som nationella myndigheter eller deras företrädare utför av organoleptiska egenskaper hos jungfruolja ska genomföras av paneler som godkänts av medlemsstaterna.

De organoleptiska egenskaper hos en olivolja som avses i första stycket ska anses överensstämma med den angivna kategorin om en panel som godkänts av den berörda medlemsstaten bekräftar denna klassificering.

Om panelen beträffande de organoleptiska egenskaperna inte bekräftar den kategori som angivits för olivoljan, ska de nationella myndigheterna eller deras företrädare, på begäran av den berörda parten, utan dröjsmål låta andra godkända paneler göra två kontrollbedömningar, varav minst en ska utföras av en panel som godkänts av den berörda producentmedlemsstaten. Egenskaperna ska anses överensstämma med de angivna egenskaperna om båda kontrollbedömningarna bekräftar den angivna klassificeringen. Om så inte är fallet ska den berörda parten stå för kostnaden för kontrollbedömningarna.

3. När det gäller de nationella myndigheternas eller deras företrädares granskningar av att oljorna har de egenskaper som föreskrivs i punkt 1, ska proverna tas i enlighet med de internationella standarderna EN ISO 661 beträffande provberedning och EN ISO 5555 beträffande provtagning. Utan hinder av vad som sägs i punkt 6.8 i standard EN ISO 5555 ska emellertid proverna från partier av nämnda oljor i detaljhandelsförpackningar tas i enlighet med bilaga Ia till denna förordning. När det gäller oljor i bulk för vilka provtagningen inte kan utföras i enlighet med EN ISO 5555, ska provtagningen utföras i enlighet med anvisningar som fastställts av den behöriga myndigheten i medlemsstaten.

Utan att det påverkar tillämpningen av standarden EN ISO 5555 och kapitel 6 i standarden EN ISO 661, ska proverna så snabbt som möjligt skyddas mot ljus och höga temperaturer och skickas till laboratorieanalys senast fem arbetsdagar efter provtagning, eller bevaras på ett sådant sätt att de inte bryts ner eller skadas under transport eller lagring innan de skickas till laboratorium.

4. För utförandet av den kontroll som föreskrivs i punkt 3 ska de analyser som avses i bilagorna II, III, IX, XII och XX, samt de eventuella kontrollanalyser som föreskrivs i de nationella lagstiftningarna, utföras före bästföredatum om det rör sig om förpackade produkter. När det gäller provtagning av oljor i bulk ska analyserna utföras senast sex månader efter den månad då provet togs.

Ingen tidsfrist ska tillämpas för de övriga analyser som föreskrivs i denna förordning.

Om resultatet av analyserna inte stämmer överens med egenskaperna för den kategori olivolja eller olivolja av pressrester som uppgetts, utom om provtagningen gjorts mindre än två månader före minsta hållbarhetsdatum, ska den berörda parten underrättas om detta minst en månad före utgången av den tidsfrist som avses i första stycket.

5. För olivoljeegenskaper som fastställs med metoderna i punkt 1 första stycket ska analysresultaten direkt jämföras med de gränser som föreskrivs i den här förordningen.

▼M25

Artikel 2a

1. Vid tillämpningen av denna artikel ska med saluförd olivolja avses den totala kvantitet olivolja och olivolja av pressrester från en viss medlemsstat som konsumeras i den medlemsstaten eller exporteras från den medlemsstaten.

2. Medlemsstaterna ska se till att kontroller av överensstämmelse utförs selektivt, baserat på en riskanalys, och med lämplig intervall, så att man säkrar att den olivolja som saluförs överensstämmer med den deklarerade kategorin.

3. Riskanalysen kan omfatta följande kriterier:

a) Kategori av olja, produktionsperiod, priset på oljor i förhållande till andra vegetabiliska oljor, blandning och förpackning, lagringsanläggningar och lagringsförhållanden, ursprungsland, destinationsland, transportmedel och partiets volym.

b) Aktörernas position i saluföringskedjan, den volym och/eller det värde som de saluför, de olika kategorier av oljor de saluför, den typ av verksamhet som utförs, t.ex. pressning, lagring, raffinering, blandning, förpackning eller återförsäljning.

c) Resultaten från tidigare kontroller, inklusive antal och typ av konstaterade brister, gängse kvalitet på de saluförda oljorna eller nivå på den tekniska utrustning som används.

d) Tillförlitligheten hos aktörernas kvalitetssäkringssystem eller system för egenkontroll vad avser överensstämmelsen med handelsnormerna.

e) Den plats där kontrollen utförs, i synnerhet om det är den första införselplatsen till unionen, sista utförselplatsen från unionen eller den plats där oljorna produceras, förpackas, lastas eller säljs till slutkonsumenten.

f) Varje annan uppgift som kan utgöra tecken på att det finns en risk för bristande överensstämmelse.

4. Medlemsstaterna ska i förväg fastställa

a) kriterier för bedömning av risken för att partier inte överensstämmer med normerna,

b) på grundval av en riskanalys för varje kategori, det minsta antalet aktörer eller partier och/eller kvantiteter som ska omfattas av en kontroll av överensstämmelse.

Minst en kontroll av överensstämmelse ska utföras per år och per tusen ton saluförd olivolja i medlemsstaten.

5. Medlemsstaten ska kontrollera överensstämmelsen genom att

a) i valfri ordning genomföra de analyser som föreskrivs i bilaga I, eller

b) följa den ordning som anges i beslutsschemat i bilaga Ib till dess att man når fram till ett av de beslut som anges i beslutsschemat.

▼M19 —————

▼M25

Artikel 3

Om det fastställs att en olja inte överensstämmer med kategoribeskrivningen, ska den berörda medlemsstaten, utan att det påverkar eventuella andra sanktioner, tillämpa effektiva, proportionella och avskräckande sanktioner som ska bestämmas mot bakgrund av hur allvarlig den konstaterade överträdelsen är.

Om det vid kontrollerna konstateras betydande oegentligheter ska medlemsstaterna öka antalet kontroller avseende försäljningsled, kategori av olja, ursprung eller andra kriterier.

▼M5

Artikel 4

▼M19

1. Medlemsstaterna kan godkänna provsmakningspaneler för de nationella myndigheternas eller deras företrädares bedömning och kontroll av de organoleptiska egenskaperna.

Villkoren för godkännande skall fastställas av medlemsstaterna, på ett sådant sätt att

— de motsvarar villkoren i bilaga 12.4,

— det säkerställs att panelens ordförande har utbildats vid en inrättning, och under förhållanden, som godkänts av medlemsstaten,

— godkännandets giltighet är avhängig av de resultat som erhålls genom ett system för årliga kontroller som medlemsstaten upprättat.

Varje medlemsstat skall delge kommissionen en förteckning över de godkända panelerna samt meddela vilka åtgärder som vidtagits i enlighet med denna punkt.

▼M5

2. Om medlemsstaterna har svårigheter att upprätta smakpaneler inom sitt territorium, får de anlita en smakpanel som är godkänd i en annan medlemsstat.

3. Varje medlemsstat skall upprätta en förteckning över smakpaneler som har upprättats av yrkes- eller branschorganisationer enligt de villkor som fastställs i punkt 1 och skall säkerställa att dessa villkor uppfylls.

▼M19 —————

▼B

Artikel 6

1. Oljehalten i oljekakor och andra rester som erhållits vid extraktion av olivolja (KN-nr 2306 90 11 och 2306 90 19) skall bestämmas med användning av den metod som anges i bilaga 15.

2. Den oljehalt som anges i punkt 1 skall uttryckas som viktprocent olja i förhållande till torrsubstans.

▼M20

Artikel 7

Gemenskapens bestämmelser om förekomst av föroreningar skall tillämpas.

Beträffande halten av halogenerade lösningsmedel gäller följande gränsvärden för samtliga kategorier av olivolja:

— Högsta tillåtna halt av varje påvisat halogenerat lösningsmedel: 0,1 mg/kg

— Högsta tillåtna total halt av påvisade halogenerade lösningsmedel: 0,2 mg/kg.

▼M25

Artikel 7a

Fysiska eller juridiska personer och grupper av personer som av någon form av professionella eller kommersiella skäl innehar olivolja eller olivolja av pressrester från utvinningen vid olivpressen fram till och med buteljeringsstadiet, ska vara skyldiga att föra register över inkommande eller utgående varor för varje kategori av sådan olja.

Medlemsstaterna ska se till att skyldigheten enligt första stycket uppfylls på vederbörligt sätt.

▼M25

Artikel 8

1. Medlemsstaterna ska meddela kommissionen de åtgärder som genomför denna förordning. De ska informera kommissionen om alla efterföljande ändringar.

▼B

2. Medlemsstaterna skall till kommissionen i början av varje halvår överlämna en redogörelse av de analysdata som hänför sig till prover som genomförts under det gångna halvåret.

Resultaten skall prövas av Förvaltningskommittén för oljor och fetter i enlighet med förfarandet i artikel 39 i förordning nr 136/66/EEG.

▼M25

3. De meddelanden som avses i denna förordning ska lämnas i enlighet med kommissionens förordning (EG) nr 792/2009 ( 5 ).

▼B

Artikel 9

Förordning (EEG) nr 1058/77 skall upphöra att gälla.

Artikel 10

1. Denna förordning träder i kraft den tredje dagen efter det att den har offentliggjorts i Europeiska gemenskapernas officiella tidning. Den metod som anges i bilaga 12 skall emellertid tillämpas från ►M1 den 1 november 1992 ◄ , utom då det gäller åtgärder i samband med interventionssystemet.

▼M5

Den metoden skall inte tillämpas för jungfruolja som iordningställs för marknaden före den 1 november 1992

▼B

2. Denna förordning skall inte tillämpas på olivolja och olivolja av pressrester som är förpackad före denna förordnings ikraftträdande och saluförs fram till och med den 31 oktober 1992.

Denna förordning är till alla delar bindande och direkt tillämplig i alla medlemsstater.









BILAGOR

Sammanfattning







Bilaga I Egenskaper hos olivolja Bilaga Ia Provtagning av olivolja och olivolja av pressrester som levereras i detaljhandelsförpackningar Bilaga Ib Beslutsschema för kontroll av att ett prov av olivolja överensstämmer med den kategori som uppgetts Bilaga II ►M21 Bestämning av fria fettsyror, metod vid låg temperatur ◄ Bilaga III Bestämning av peroxidvärdet Bilaga IV ►M6 Bestämning av vaxinnehåll genom gaskromatografi med kapillärkolonn ◄ Bilaga V Bestämning av sammansättningen och halten av steroler och triterpendialkoholer genom gaskromatografi med kapillärkolonn Bilaga VII ►M21 Bestämning av procentandelen 2-glycerylmonopalmitat ◄ ▼M20 ————— ▼B ▼M20 ————— ▼M19 ————— ▼B ▼M23 Bilaga XX: Metod för bestämning av halter av vaxer, fettsyreetylestrar och fettsyremetylestrar med kapillärgaskromatografi ▼M26 Annex XXa: Metod för att påvisa förekomst av främmande oljor i olivolja ▼M25 Bilaga XXI: Resultat av kontroller av överensstämmelse som utförs på olivolja enligt artikel 8.2

▼M26









BILAGA I

EGENSKAPER HOS OLIVOLJA







Kategori Fettsyraetylestrar (FAEE) (mg/kg) (*) Syrahalt (%) (*) Peroxidtal (mEq O2/kg) (*) Vaxer (mg/kg) (*) 2-glycerilmonopalmitat (%) Stigmastadiener (mg/kg) (1) Skillnader: ECN 42 (HPLC) och ECN 42 (2) (teoretisk beräkning) K232 (*) K268 eller K270 (*) Delta-K (*) Organoleptisk bedömning Defekternas medianvärde (Md) (*) Organoleptisk bedömning Medianvärde för fruktighet (Mf) (*) 1. Extra jungfruolja FAEE ≤ 40 (skördeåret 2013–2014) (3) FAEE ≤ 35 (skördeåret 2014–2015) FAEE ≤ 30 (skördeåren efter 2015) ≤ 0,8 ≤ 20 C42 C44 C46150 ≤ 0,9 om totalhalten palmitinsyra ≤ 14 % ≤ 0,05 ≤ |0,2| ≤ 2,50 ≤ 0,22 ≤ 0,01 Md = 0 Mf > 0 ≤ 1,0 om totalhalten palmitinsyra > 14 % 2. Jungfruolja — ≤ 2,0 ≤ 20 C42 C44 C46150 ≤ 0,9 om totalhalten palmitinsyra ≤ 14 % ≤ 0,05 ≤ |0,2| ≤ 2,60 ≤ 0,25 ≤ 0,01 Md ≤ 3,5 Mf > 0 ≤ 1,0 om totalhalten palmitinsyra > 14 % 3. Bomolja — > 2,0 — C40 C42 C44 C46300 (4) ≤ 0,9 om totalhalten palmitinsyra ≤ 14 % ≤ 0,50 ≤ |0,3| — — — Md > 3,5 (5) — ≤ 1,1 om totalhalten palmitinsyra > 14 % 4. Raffinerad olivolja — ≤ 0,3 ≤ 5 C40 C42 C44 C46350 ≤ 0,9 om totalhalten palmitinsyra ≤ 14 % — ≤ |0,3| — ≤ 1,10 ≤ 0,16 — — ≤ 1,1 om totalhalten palmitinsyra > 14 % 5. Olivolja bestående av raffinerad olivolja och jungfruolja — ≤ 1,0 ≤ 15 C40 C42 C44 C46350 ≤ 0,9 om totalhalten palmitinsyra ≤ 14 % — ≤ |0,3| — ≤ 0,90 ≤ 0,15 — — ≤ 1,0 om totalhalten palmitinsyra > 14 % 6. Oraffinerad olivolja av pressrester — — — C40 C42 C44 C46350 (6) ≤ 1,4 — ≤ |0,6| — — — — — 7. Raffinerad olivolja av pressrester — ≤ 0,3 ≤ 5 C40 C42 C44 C46350 ≤ 1,4 — ≤ |0,5| — ≤ 2,00 ≤ 0,20 — — 8. Olivolja av pressrester — ≤ 1,0 ≤ 15 C40 C42 C44 C46350 ≤ 1,2 — ≤ |0,5| — ≤ 1,70 ≤ 0,18 — — (1) Totalvärde för isomerer som kan (eller inte kan) separeras på kapillärkolonn. (2) Olivoljan måste vara i överensstämmelse med den metod som anges i bilaga XXa. (3) Denna gräns gäller olivolja producerad från och med den 1 mars 2014. (4) Olja med en vaxhalt mellan 300 och 350 mg/kg betraktas som bomolja om den sammanlagda halten alifatiska alkoholer är lägre än eller lika med 350 mg/kg eller om halten erytrodiol och uvaol är lägre än eller lika med 3,5 %. (5) Elle när medianvärdet för defekter är över 3,5 eller när medianvärdet för defekter är lägre eller lika med 3,5 och medianvärdet för fruktighet är lika med 0. (6) Olja med en vaxhalt mellan 300 och 350 mg/kg betraktas som oraffinerad olivolja av pressrester om den totala halten alifatiska alkoholer är högre än 350 mg/kg eller om andelen erytrodiol och uvaol är högre än 3,5 %.







Kategori Fettsyrasammansättning (1) Totalt transolein-isomerer (%) Totalt isomerer av translinolsyra + isomerer av translinolensyra (%) Sterolsammansättning Summa steroler (mg/kg) Erytrodiol och uvaol (%) (**) Myrsyra (%) Linolensyra (%) Eikosansyra (%) Eikosensyra (%) Behensyra (%) Lignocerinsyra (%) Kolesterol (%) Brassikasterol (%) Kampesterol (2) (%) Stigmasterol (%) App sitosterol (%) (3) Delta-7-stigmastenol (2) (%) 1. Extra jungfruolja ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,40 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,05 ≤ 0,05 ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < Kamp. ≤ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 2. Jungfruolja ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,40 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,05 ≤ 0,05 ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < Kamp. ≤ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 3. Bomolja ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,40 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,10 ≤ 0,10 ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 — ≤ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 (4) 4. Raffinerad olivolja ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,40 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,30 ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < Kamp. ≤ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 5. Olivolja bestående av raffinerad olivolja och jungfruolja ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,40 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,30 ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < Kamp. ≤ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 6. Oraffinerad olivolja av pressrester ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,40 ≤ 0,30 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,10 ≤ 0,5 ≤ 0,2 ≤ 4,0 — ≤ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 2 500 > 4,5 (5) 7. Raffinerad olivolja av pressrester ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,40 ≤ 0,30 ≤ 0,20 ≤ 0,40 ≤ 0,35 ≤ 0,5 ≤ 0,2 ≤ 4,0 < Kamp. ≤ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 800 > 4,5 8. Olivolja av pressrester ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,40 ≤ 0,30 ≤ 0,20 ≤ 0,40 ≤ 0,35 ≤ 0,5 ≤ 0,2 ≤ 4,0 < Kamp. ≤ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 600 > 4,5 (1) Halt av övriga fettsyror (%): palmitinsyra: 7,50–20,00; palmitoleinsyra: 0,30–3,50; heptadekansyra: ≤ 0,30; heptadekensyra: ≤ 0,30; stearinsyra: 0,50–5,00; oljesyra: 55,00–83,00; linolsyra: 3,50–21,00. (2) (Se tillägget till denna bilaga.) (3) App β-sitosterol: Delta-5,23-stigmastadienol+klerosterol+beta-sitosterol+sitostanol+delta-5-avenasterol+delta-5,24-stigmastadienol. (4) Olja med en vaxhalt mellan 300 och 350 mg/kg betraktas som bomolja om den sammanlagda halten alifatiska alkoholer är lägre än eller lika med 350 mg/kg eller om halten erytrodiol och uvaol är lägre än eller lika med 3,5 %. (5) Olja med en vaxhalt mellan 300 och 350 mg/kg betraktas som oraffinerad olivolja av pressrester om den totala halten alifatiska alkoholer är högre än 350 mg/kg och om halten erytrodiol och uvaol är högre än 3,5 %.

Anm:

a) Analysresultaten ska anges med samma antal decimalers noggranhet som anges för varje egenskap. Den sista siffran ska avrundas uppåt om efterföljande siffra är högre än 4.

b) Det räcker med att en enda av egenskaperna inte motsvarar det angivna värdet för att en olja ska klassas i en annan kategori eller förklaras ej uppfylla renhetskraven enligt denna förordning.

c) Egenskaper markerade med asterisk (*) och som avser oljans kvalitet anger - för bomolja, att båda gränsvärdena samtidigt får skilja sig från de angivna värdena, - för jungfruoljor, att oljan måste byta kategori om ett eller flera av dessa gränsvärden inte är uppfyllt, men att den förblir klassad inom en kategori för jungfruolja.

d) Egenskaper markerade med två asterisker (**) anger, för all olivolja av pressrester, att båda gränsvärdena samtidigt får skilja sig från de angivna värdena.









Tillägg

Beslutsschema

Beslutsschema avseende kampesterol för jungfruolja och extra jungfruolja:

Övriga parametrar ska uppfylla de gränsvärden som fastställs i denna förordning.

Beslutsschema avseende delta-7-stigmastenol för

— Extra jungfruolja och jungfruolja —

Övriga parametrar ska uppfylla de gränsvärden som fastställs i denna förordning.

— Olivolja av pressrester (oraffinerad och raffinerad) —









BILAGA Ia

PROVTAGNING AV OLIVOLJA OCH OLIVOLJA AV PRESSRESTER SOM LEVERERAS I DETALJHANDELSFÖRPACKNINGAR

Denna metod för provtagning tillämpas på partier av olivolja och olivolja av pressrester i detaljhandelsförpackningar. Olika provtagningsmetoder tillämpas beroende på om detaljhandelsförpackningen innehåller mer än 5 liter eller inte.

Med parti avses ett antal försäljningsenheter som producerats, framställts och förpackats under sådana förhållanden att oljan i var och en av dessa enheter kan anses vara homogen med avseende på samtliga analysegenskaper. Identifikationen av ett parti ska ske i enlighet med Europaparlamentets och rådets direktiv 2011/91/EU ( 6 ).

Med delprov avses den volym olja som ingår i en detaljhandelsförpackning och tas från ett slumpvis utvalt ställe i partiet.

1. PARTIDELPROVETS INNEHÅLL

1.1. Detaljhandelsförpackningar om högst 5 liter

Med partidelprov för detaljhandelsförpackningar om högst 5 liter avses antalet delprov som tagits från ett parti i enlighet med tabell 1.







Tabell 1 Ett partidelprov ska åtminstone omfatta följande Om detaljhandelsförpackningen rymmer Ska partidelprovet omfatta olja från a) minst 1 liter a) 1 detaljhandelsförpackning b) mindre än 1 liter b) det lägsta antal förpackningar som krävs för att uppnå en total volym på minst 1,0 liter

Det antal förpackningar som avses i tabell 1 och som ska utgöra ett partidelprov kan ökas av varje medlemsstat i enlighet med dess egna behov (t.ex. om en organoleptisk bedömning utförs av ett annat laboratorium än det som gjorde de kemiska analyserna, kontrollanalysen, osv.).

1.2. Detaljhandelsförpackningar som överstiger 5 liter

Med partidelprov för detaljhandelsförpackningar som överstiger 5 liter avses en representativ del av det totala delprovet, vilken erhålls genom ett reduktionsförfarande och i enlighet med tabell 2. Partidelprovet måste bestå av flera exempel.

Med exempel av ett partidelprov avses var och en av de förpackningar som utgör partidelprovet.







Tabell 2 Minsta antalet delprover som ska väljas ut Antal förpackningar i varje parti Minsta antal delprover som ska väljas ut Upp till 10 1 Fr.o.m. … 11 t.o.m. 150 2 Fr.o.m. … 151 t.o.m. 500 3 Fr.o.m. … 501 t.o.m. 1 500 4 Fr.o.m. … 1 501 t.o.m. 2 500 5 > 2 500 per 1 000 förpackningar 1 extra delprov

För att minska volymen av förpackningar homogeniseras innehållet i delproverna för beredningen av partidelprovet. De olika delproven hälls i en gemensam behållare för homogenisering genom omrörning, så att de bäst skyddas från luften.

Innehållet i partidelprovet ska hällas i flera förpackningar med en kapacitet på minst 1,0 liter som var och en utgör ett exempel av partidelprovet.

Antalet partidelprover kan ökas av varje medlemsstat i enlighet med dess egna behov (t.ex. om en organoleptisk bedömning utförs av ett annat laboratorium än det som gjorde de kemiska analyserna, kontrollanalysen, osv.).

Varje förpackning måste fyllas på ett sätt som minimerar luftlagret längst upp och sedan lämpligt förslutas och förseglas för att säkerställa att produkten är skyddad mot åverkan.

Dessa exempel ska märkas för att säkerställa en korrekt identifiering.

2. ANALYSER OCH RESULTAT

2.1. Varje partidelprov ska delas upp i laboratorieprover enligt punkt 2.5 i standarden EN ISO 5555 och analyseras enligt ordningsföljden i det beslutsschema som anges i bilaga Ib eller i någon annan slumpmässig ordning.

2.2. Om samtliga analysresultat överensstämmer med egenskaperna för den kategori olja som uppgetts, ska hela partiet förklaras överensstämma med gällande krav. Om ett enskilt analysresultat inte överensstämmer med egenskaperna för den kategori olja som uppgetts, ska hela partiet förklaras inte överensstämma med gällande krav.

3. KONTROLL AV VILKEN KATEGORI PARTIET TILLHÖR

3.1. För att kontrollera vilken kategori ett parti tillhör får den behöriga myndigheten öka det antal partidelprover som tas i olika delar av partiet i enlighet med följande tabell:



Tabell 3 Antal partidelprov beroende på partiets storlek Partiets storlek (liter) Antal partidelprover Färre än 7 500 2 Från 7 500 till 25 000 3 Från 25 000 till 75 000 4 Från 75 000 till 125 000 5 Från 125 000 och uppåt 6 + 1 för varje ytteligare 50 000 liter Varje delprov som utgör ett partidelprov ska tas från ett sammanhängande ställe i partiet. Det är nödvändigt att notera platsen för varje partidelprov och märka det på ett entydigt sätt. Framställningen av varje partidelprov ska utföras enligt de förfaranden som anges i punkterna 1.1 och 1.2. Varje partidelprov ska sedan underkastas de analyser som avses i artikel 2.1.

3.2. När ett av resultaten av de analyser som avses i artikel 2.1 på minst ett partidelprov inte överensstämmer med egenskaperna för den kategori olja som uppgetts, ska hela partiet förklaras inte överensstämma med gällande krav.









BILAGA Ib

BESLUTSSCHEMA FÖR KONTROLL AV ATT ETT PROV AV OLIVOLJA ÖVERENSSTÄMMER MED DEN KATEGORI SOM UPPGETTS

Tabell 1

Tabell 2

Tabell 3









Tillägg 1







Jämförelsetabell mellan bilagorna till denna förordning och de analyser som avses i beslutsschemat — Syrahalt Bilaga II Bestämning av fria fettsyror, metod vid låg temperatur — Peroxidtal Bilaga III Bestämning av peroxidtalet — UV-spektrofotometri Bilaga IX Spektrofotometrisk analys — Organoleptisk bedömning Bilaga XII Organoleptisk bedömning av jungfruolja — Etylestrar Bilaga XX Metod för bestämning av halten av vaxer, fettsyrametylestrar och fettsyraetylestrar med kapillärgaskromatografi — 3,5-stigmastadiener Bilaga XVII Metod för bestämning av stigmastadiener i vegetabiliska oljor — Transisomerer av fettsyror BILAGA X A och Analys av metylestrar av fettsyror med gaskromatografi BILAGA X B Beredning av metylestrar av fettsyror — Fettsyrahalt BILAGA X A och Analys av metylestrar av fettsyror med gaskromatografi BILAGA X B Beredning av metylestrar av fettsyror — ΔECN42 Bilaga XVIII Bestämning av triglyceridsammansättningen i ECN 42 (skillnad mellan HPLC-data och teoretisk halt) — Steroler: sammansättning och totalhalt — Erytrodiol och uvaol Bilaga V Bestämning av sammansättningen och halten av steroler och triterpendialkoholer genom gaskromatografi med kapillärkolonn — Vaxer Bilaga IV Bestämning av vaxhalten genom gaskromatografi med kapillärkolonn — Alifatiska alkoholer Bilaga XIX Bestämning av halten alifatiska alkoholer genom gaskromatografi med kapillärkolonn — Mättade fettsyror i 2-ställning Bilaga VII Bestämning av procentandelen 2-glycerylmonopalmitat

▼B









BILAGA II

▼M21

BESTÄMNING AV FRIA FETTSYROR, METOD VID LÅG TEMPERATUR

▼B

1. BESTÄMNING AV SYRAHALT

Bestämning av fria fettsyror i olivoljor. Halten fria fettsyror uttrycks som syrahalt beräknad på konventionellt sätt.

1.1 Princip

Ett prov löses i en blandning av lösningsmedel och de närvarande fria fettsyrorna titreras med en etanollösning av kaliumhydroxid.

1.2 Reagenser

Alla reagenser bör vara av analyskvalitet och det vatten som används skall vara destillerat eller ha motsvarande renhet.

1.2.1 Dietyleter. 95 % etanol (v/v), blandning av lika volymdelar. Anm: Dietyleter är en mycket lättantändlig vätska och kan bilda explosiva peroxider. Speciell försiktighet bör iakttas vid användning. Neutralisera exakt vid användningstillfället med kaliumhydroxidlösningen (1.2.2) med tillsats av 0,3 ml av fenolftaleinlösningen (1.2.3) per 100 ml blandning. Anm: Om det inte är möjligt att använda dietyleter kan en blandning av lösningsmedel som innehåller etanol och toluen användas. Om så erfordras kan etanolen ersättas av propanol-2.

1.2.2 Kaliumhydroxid, filtrerad etanollösning, c(KOH) ca 0,1 mol/l eller, om nödvändigt c(KOH), ca 0,5 mol/l. Den exakta koncentrationen hos etanollösningen av kaliumhydroxid måste vara känd och kontrollerad omedelbart före användning. Använd en lösning som gjorts minst fem dagar före användning och dekanterats i en brun glasflaska med gummipropp. Lösningen bör vara färglös eller halmfärgad. Anm: En stabil färglös lösning av kaliumhydroxid kan framställas på följande sätt: Koka upp 1 000 ml etanol med 8 g kaliumhydroxid och 0,5 g aluminiumspån och fortsätt att koka under återflöde under 1 timme. Destillera lösningen omedelbart. Lös den behövliga mängden kaliumhydroxid i destillatet. Låt lösningen stå i flera dagar och dekantera den klara vätskan från fällningen av kaliumkarbonat. Lösningen kan också framställas utan destillation på följande sätt: Tillsätt 4 ml aluminiumbutylat till 1 000 ml etanol och låt blandningen stå i flera dagar. Dekantera den klara vätskan och lös den behövliga mängden kaliumhydroxid i den. Lösningen är klar för användning.

1.2.3 Fenolftalein, 10 g/l lösning i 95 till 96 %-ig etanol (v/v) eller alkaliskt blått (då det gäller starkt färgade fetter) 20 g/l lösning i 95 till 96 %-ig etanol (v/v).

1.3 Utrustning

Vanlig laboratorieutrustning som innefattar:

1.3.1 Analysvåg

1.3.2 250 ml E-kolv

1.3.3 10 ml byrett graderad i 0,05 ml

1.4 Utförande

1.4.1 Preparering av provet för analys Genomför analysen på ett filtrerat prov. Om fukt och föroreningar tillsammans är mindre än 1 % använd provet utan vidare behandling.

1.4.2 Provtagning Ta ut ett prov beroende på det antagna syratalet i enlighet med följande tabell:



Förväntat syratal Mängd prov (g) Invägningsnoggrannhet (g) < 1 20 0,05 1 till 4 10 0,02 4 till 15 2,5 0,01 15 till 75 0,5 0,001 > 75 0,1 0,0002 Väg in provet i E-kolven (1.3.2).

1.4.3 Bestämning Lös provet (1.4.2) i 50 till 150 ml av den neutraliserade blandningen av dietyleter och etanol (1.2.1). Titrera under omrörning med 0,1 mol/l lösning av kaliumhydroxid (1.2.2) (se anmärkning 2) tills indikatorn ändrar färg (den röda fenolftaleinfärgen skall bestå under minst 10 sekunder). Anm 1: Den ställda etanollösningen av kaliumhydroxid (1.2.2) kan ersättas av en vattenlösning av kalium- eller natriumhydroxid under förutsättning att vattenvolymen inte medför fasseparation. Anm 2: Om den nödvändiga mängden 0,1 molar kaliumhydroxidlösning överstiger 10 ml, använd 0,5-molar lösning. Anm 3: Om lösningen blir ogenomskinlig under titreringen, tillsätt tillräckligt med lösningsmedel (1.2.1) för att det skall bli en klar lösning.

1.5 Syramängd uttryckt som procent oleinsyra

Syramängden som massprocent motsvaras av:

där:

V = Volymen kaliumhydroxid i ml som används vid titreringen.

c = Exakta koncentrationen i mol/l av den ställda kaliumhydroxidlösning som används.

M = Molvikt i gram per mol av syran som används för att ange resultatet (= 282).

m = Provets vikt i gram.

Det aritmetiska medelvärdet ►M6 av två beräkningar ◄ bör bedömas som resultatet.









BILAGA III

BESTÄMNING AV PEROXIDVÄRDET

1. SYFTE

Denna standard beskriver en metod för bestämning av peroxidvärdet i oljor och fetter.

2. TILLÄMPNINGSOMRÅDE

Denna standard är tillämplig på animaliska och vegetabiliska oljor och fetter.

3. DEFINITION

Peroxidvärdet är den kvantitet av de substanser i provet uttryckta i milliekvivalenter aktivt O2/kg som oxiderar kaliumjodid under de förhållanden som beskrivs.

4. PRINCIP

Behandling av provet i lösning i ättiksyra och kloroform med en lösning av kaliumjodid. Titrering av den frigjorda joden med ställd natriumtiosulfatlösning.

5. UTRUSTNING

All utrustning som skall användas skall vara fri från reducerande eller oxiderande ämnen.

Anm:

Smörj inte slipade ytor.

5.1 3 ml glassked.

5.2 Kolvar med slipade halsar och proppar på ca 250 ml, torkade i förväg och fyllda med en torr, ren, inert gas (kväve eller företrädesvis koldioxid).

5.3 25 eller 50 ml byrett graderad i 0,1 ml.

6. REAGENSER

6.1 Kloroform, P. A. som befriats från syre genom att en ström av ren, torr inert gas bubblats igenom den.

6.2 Ättiksyra, P. A. befriad från syre genom att en ström av torr, ren gas bubblats igenom den.

6.3 Kaliumjodid, mättad vattenlösning, nyligen framställd, fri från jod och jodater.

6.4 Natriumtiosulfat 0,01 eller 0,002 N exakt ställd vattenlösning, ställd omedelbart före användning.

6.5 Stärkelselösning, 10 g per liter vattenlösning nyligen framställd av naturlig löslig stärkelse.

7. PROV

Se till att provet tas och bevaras kallt och mörkt i glasbehållare som skall vara helt fyllda, hermetiskt tillslutna med slipade glasproppar eller kork.

8. UTFÖRANDE

Analysen skall genomföras i diffust dagsljus eller artificiellt ljus. Väg in i ett vägglas (5.1) eller om inte detta går i en kolv (5.2) på 0,001 g när, en mängd av provet som överensstämmer medföljande tabell enligt det förväntade peroxidvärdet:







Förväntat peroxidvärde (mekv) Provets vikt (g) 0 till 12 5,0 till 2,0 12 till 20 2,0 till 1,2 20 till 30 1,2 till 0,8 30 till 50 0,8 till 0,5 50 till 90 0,5 till 0,3

Ta bort proppen från en kolv (5.2) och för in vägglaset som innehåller provet. Tillsätt 10 ml kloroform (6.1). Lös provet snabbt under omrörning. Tillsätt 15 ml ättiksyra (6.2) och sedan 1 ml kaliumjodidlösning (6.3). Sätt snabbt i proppen, skaka om under en minut och låt stå i mörker exakt 5 minuter vid en temperatur mellan 15 och 25 °C.

Tillsätt ca 75 ml destillerat vatten. Titrera den frigjorda joden med natriumtiosulfatlösning (6.4) (0,002 N lösning för förväntade värden som är mindre 12 och 0,01 N lösning för förväntade värden över 12) under omskakning och använd stärkelselösning (6.5) som indikator.

Genomför två bestämningar på samma prov.

Genomför samtidigt ett blindprov. Om resultatet av blindprovet överstiger 0,05 ml av 0,01 N natriumtiosulfatlösning (6.4) ersätt de orena reagenserna.

9. RESULTATANGIVELSE

Peroxidvärdet (PV), uttryckt som milliekvivalenter av aktivt O2/kg erhålls genom följande formel:

där:

V = antalet ml av den ställda tiosulfatlösningen (6.4) som används i provet korrigerad för resultatet av blindprovet.

T = den exakta normaliteten hos natriumtiosulfatlösningen (6.4) som används.

m = vikten i gram av provet.

Som resultat tas det aritmetiska medelvärdet av de två bestämningarna som genomförts.

▼M21









BILAGA IV

BESTÄMNING AV VAXHALT MED KAPILLÄRGASKROMATOGRAFI

1. SYFTE

Metoden avser bestämning av vaxhalten i olivolja. Vaxerna separeras efter antalet kolatomer. Metoden används särskilt för att skilja mellan olivolja som framställts genom pressning och olivolja som framställts genom extraktion.

2. PRINCIP

Oljan blandas med lämplig intern standard och fraktioneras sedan genom kromatografi på kiselgelkolonn. Den fraktion som först elueras under testförhållanden (och som har lägre polaritet än triglyceriderna) samlas upp och analyseras därefter direkt med hjälp av gaskromatografi på kapillärkolonn.

3. UTRUSTNING

3.1 E-kolv 25 ml.

3.2 Gaskromatografikolonn av glas, innerdiameter 15,0 mm, längd 30–40 cm, med kran.

3.3 Gaskromatograf som är anpassad till kapillärkolonn, utrustad med ett system för direktinjektion i kolonnen och bestående av följande: 3.3.1 Termostatstyrd, programmerbar kolonnugn. 3.3.2 ”On column” -injektor för direktinjektion i kolonnen. 3.3.3 En flamjonisationsdetektor och förstärkare. 3.3.4 Skrivare/integrator som är anpassad till förstärkaren (3.3.3), med responstid på högst 1 sekund och med variabel pappershastighet. (Det går också att använda datasystem för insamling av gaskromatografidata via PC.) 3.3.5 Kapillärkolonn av glas eller kvarts, längd 8–12 m, innerdiameter 0,25–0,32 mm, vars vätskefas har en filmtjocklek på 0,10–0,30 μm. (Vätskefas anpassad efter användning, av typen SE52 eller SE 54 som finns i handeln.)

3.4 Sprutor på 10 μl med härdad nål för direktinjektion i kolonnen.

3.5 Elektrisk vibrator.

3.6 Rotationsindunstare.

3.7 Muffelugn.

3.8 Analysvåg med en noggrannhet på + 0,1 mg.

3.9 Standarduppsättning av laboratorieglas.

4. REAGENS

4.1 Kiselgel med en kornstorlek på 60–200 μm. Placera kiselgelen i ugnen vid 500 °C i minst fyra timmar. Efter kylning, tillsätt 2 % vatten till kiselgelen. Skaka ordentligt för att homogenisera blandningen. Förvara mörkt i minst 12 timmar före användning.

4.2 n-hexan för kromatografi.

4.3 Etyleter för kromatografi.

4.4 n-heptan för kromatografi.

4.5 Standardlösning av 0,1 % (m/V) laurylarakinat i hexan (intern standard). (Även palmitylpalmitat eller myristylstearat kan användas.) 4.5.1 Sudan-1-(1-fenyl-azo-2-naftol)

4.6 Bärgas: vätgas eller helium, ren, för gaskromatografi.

4.7 ”Make-up” -gas: — ren vätgas för gaskromatografi. — ren luft för gaskromatografi.

5. METOD

5.1 Preparering av kromatografikolonnen

Slamma upp 15 g kiselgel (4.1.) i n-hexan (4.2.) och häll det i kolonnen (3.2.). Låt kiselgelen sedimentera. Slutför sedimenteringen med hjälp av en elektrisk vibrator (3.5.) för att få den kromatografiska stationära fasen mer homogent packad. Skölj med 30 ml n-hexan för att avlägsna eventuella orenheter. Väg upp (3.8.) 500 mg av provet i en E-kolv på 25 ml (3.1.), tillsätt lämplig mängd intern standard (4.5.) beroende på uppskattad vaxhalt. Tillsätt 0,1 mg laurylarakinat för olivolja och 0,25–0,5 mg för olja av olivrestprodukter. Provet överförs sedan till kromatografikolonnen tillsammans med två portioner n-hexan (4.2) på 2 ml vardera.

Låt lösningen rinna till 1 mm ovanför adsorbentlagret, tillsätt sedan ytterligare 70 ml n-hexan för att eliminera de naturligt förekommande n-alkanerna. Börja sedan den kromatografiska elueringen genom att samla upp 180 ml av n-hexan/etyleterblandningen (99:1), med en hastighet på cirka 15 droppar/10 s. Elueringen av provet skall ske vid en temperatur på 22 + 4 °C.

Anmärkningar:

— Blandningen n-hexan/etyleter (99:1) skall beredas varje dag.

— För en visuell kontroll av att elueringen av vaxerna sker korrekt kan 100 μl sudan (1 %) tillsättas elueringsblandningen. Eftersom färgämnet har en retentionstid som ligger mellan den för vaxerna och triglyceriderna bör elueringen avslutas när färgningen nått botten av kolonnen, eftersom alla vaxer då har eluerats.

Torka den erhållna fraktionen i en rotationsindunstare (3.6.) tills nästan allt lösningsmedel försvunnit. Avlägsna de sista 2 ml av lösningsmedlet med hjälp av en svag kvävgasström, tillsätt sedan 2–4 ml n-heptan.

5.2 Analys med gaskromatografi

5.2.1 Förberedelser

Montera kolonnen i gaskromatografen (3.3.) genom att ansluta inloppet till injektionssystemet och utloppet till detektorn. Kontrollera gaskromatografen (att gasanslutningarna är täta, detektorns och skrivarens effektivitet, etc.).

Om kolonnen används för första gången bör den först konditioneras. Låt en liten mängd gas strömma genom kolonnen och sätt sedan på gaskromatografen. Värm upp den gradvis under ca 4 timmar till en temperatur på 350 °C. Behåll denna temperatur i minst 2 timmar och ställ därefter in lämpliga analysparametrar (ställ in gasflödet, tänd flamman, anslut skrivaren/integratorn (3.3.4.), ställ in injektor-, kolonn- och detektortemperaturen). Se till att signalen har en känslighet som är minst två gånger högre än den nivå som krävs för att utföra analysen. Baslinjen skall vara rak och stabil, utan toppar.

Om baslinjen driver nedåt tyder det på att kolonnen inte är korrekt ansluten. Om den driver uppåt tyder det på att kolonnen inte har blivit ordentligt konditionerad.

5.2.2 Val av analysparametrar

Analysparametrarna väljs normalt enligt följande:

— kolonntemperatur: —



20 °C/minut 5 °C/minut 20 °C/minut Starttemperatur 80 °C (1′) → 240 °C → 325 °C (6′) → 340 °C (10′)

— Detektortemperatur: 350 °C;

— Injicerad mängd: 1 μl lösning (2–4 ml) n-heptan

— Bärgas: helium eller vätgas med en linjär hastighet som är optimal för den gas som valts (se tillägget)

— Instrumentets känslighet: anpassad efter betingelserna nedan:

Beroende på kolonnens och gaskromatografens egenskaper kan betingelserna behöva ändras för att man skall få en separation av samtliga vaxer, en tillfredsställande upplösning av toppar (se figur) och en retentionstid för den interna standarden C32 på 18 + 3 minuter. Vaxernas mest representativa topp skall motsvara minst 60 % av fullt skalutslag.

Bestäm parametrarna för integration av topparna på ett sådant sätt att en korrekt uppskattning av toppareorna erhålls.

Anm.: Med tanke på den höga sluttemperaturen tillåts en positiv drift på högst 10 % av fullt skalutslag.

5.3 Analysförfarande

Sug med hjälp av en 10 μl spruta upp 1 μl av lösningen. Dra tillbaka kolven tills nålen är tom. För in nålen i injektorn och injicera snabbt efter 1–2 sekunder. Efter cirka 5 sekunder dras nålen försiktigt ut.

Utför registreringen tills alla vaxer är helt eluerade.

Baslinjen måste alltid uppfylla de fastställda villkoren.

5.4 Identifiering av toppar

Identifiera topparna utifrån retentionstiderna genom att jämföra dem med blandningar av vaxer med kända retentionstider analyserade under samma betingelser.

Figuren visar ett kromatogram för vaxer av jungfruolja.

5.5 Kvantitativ analys

Bestäm toppareorna för den interna standarden och de alifatiska estrarna från C40 till C46 med hjälp av integratorn.

Beräkna vaxhalten i var och en av estrarna (uttryckt som mg/kg fettämne) med hjälp av följande formel:

där:

Ax = topparean för varje ester, i kvadratmillimeter

As = topparean för den interna standarden, i kvadratmillimeter

ms = mängden tillsatt intern standard, i milligram

m = den mängd av provet som tagits ut för analys, i gram.

6. REDOVISNING AV RESULTAT

Ange totalhalten av de olika vaxerna från C40 till C46, i mg/kg fettämne (ppm).

Anm.: De komponenter som skall kvantifieras med hjälp av motsvarande toppar i kromatogrammet (se figur nedan) är estrar med ett jämnt antal kolatomer (C40 till C46). Om estertoppen C46 är svår att identifiera (dubbeltopp) bör man analysera vaxfraktionen för en olja av olivrestprodukter där C46-toppen är lättidentifierad eftersom den är klart störst.

Resultaten uttrycks med en decimal.

Figur

Kromatogram för vaxer i olivolja ( 7 )

Förklaringar:

I.S. = Laurylarakinat

1. = Diterpenestrar

2 + 2′ = C40-estrar

3 + 3′ = C42-estrar

4 + 4′ = C44-estrar

5. = C46-estrar

6. = Sterolestrar och triterpenestrar









Tillägg

Bestämning av gasens linjära hastighet

Ställ in normala gängse analysparametrar och injicera därefter 1–3 μl metan eller propan i gaskromatografen. Mät den tid det tar för gasen att gå igenom kolonnen, från det att den injiceras tills toppen passerat (tM).

Den linjära hastigheten i cm/sekund erhålls genom formeln L/tM där L är kolonnens längd i cm och tM är den uppmätta tiden i sekunder.

▼M26









BILAGA V

BESTÄMNING AV SAMMANSÄTTNINGEN OCH HALTEN AV STEROLER OCH TRITERPENDIALKOHOLER GENOM GASKROMATOGRAFI MED KAPILLÄRKOLONN

1. SYFTE

Metoden avser bestämning av de enskilda och totala sterol- och triterpendialkoholhalterna hos olivolja och olivolja av pressrester.

2. PRINCIP

Olja med tillsats av α-kolestanol som intern standard, förtvålas med kaliumhydroxid i etanollösning och de oförtvålbara ämnena extraheras sedan med etyleter.

Sterol- och triterpendialkoholfraktionen separeras från de oförtvålbara ämnena genom tunnskiktskromatografi på en basisk kiselgelplatta. De fraktioner som återvunnits från kiselgelen överförs till trimetylsilyletrar och analyseras genom gaskromatografi med kapillärkolonn.

3. UTRUSTNING

Sedvanlig laboratorieutrustning, i synnerhet följande:

3.1. 250 ml kolv försedd med återflödeskylare med slipade anslutningsfogar.

3.2. 500 ml separertratt.

3.3. 250 ml kolvar.

3.4. Komplett apparatur för tunnskiktskromatografi med 20 × 20 cm glasplattor.

3.5. UV-lampa: 254 eller 366 nm.

3.6. Mikrosprutor, 100 och 500 μl.

3.7. En cylindrisk filtrertratt med poröst membran G 3 (porositet 15–40 μm) och med en diameter på ca 2 cm, ett djup på 5 cm som passar för vakuumfiltrering, med hanslipning.

3.8. 50 ml vakuum-E-kolv med slipad glashals som kan användas för filtrertratten (punkt 3.7).

3.9. 10 ml provrör med konisk botten och glaspropp.

3.10. Gaskromatograf lämpad för användning med kapillärkolonn med splitinjektion, bestående av 3.10.1. termostatstyrd kolonnugn som kan hålla den önskade temperaturen med en noggrannhet av ± 1°C, 3.10.2. injektor med inställbar temperatur och försedd med ett förångningselement av glas med silaniserad yta och splitsystem, 3.10.3. Flamjoniseringsdetektor. 3.10.4. System för datainsamling lämpligt för användning tillsammans med flamjoniseringsdetektorn (punkt 3.10.3.) som kan ställas in på manuell integration.

3.11. Kapillärkolonn med kiseldioxid med en längd på 20 till 30 meter, innerdiameter 0,25 till 0,32 mm, belagd med 5 % difenyl - 95 % dimetylpolysiloxan (SE-52 eller SE-54 stationär fas eller motsvarande), med en enhetlig filmtjocklek mellan 0,10 och 0,30 μm.

3.12. Mikrospruta på 10 μl, för gaskromatografi, med härdad nål lämplig för splitinjektion.

3.13. Exsickator med kalciumklorid.

4. REAGENS

4.1. Kaliumhydroxid, minst 85 %.

4.2. Kaliumhydroxid, circa 2 N, i etanol. Lös 130 g kaliumhydroxid (punkt 4.1) under kylning i 200 ml destillerat vatten och späd sedan till 1 liter med etanol (punkt 4.10). Förvara lösningen i väl tillslutna, mörka flaskor som lagras i högst två dagar.

4.3. Etyleter, av analyskvalitet.

4.4. Kaliumhydroxid, circa 0,2 N, i etanol. Lös 13 g kaliumhydroxid (punkt 4.1) i 20 ml destillerat vatten och späd till 1 liter med etanol (punkt 4.10).

4.5. Vattenfritt natriumsulfat, av analyskvalitet.

4.6. Glasplattor (20 × 20 cm) täckta med kiselgel utan flouresceinsindikator, tjocklek 0,25 mm (finns i handeln färdiga för användning).

4.7. Toluen, av kromatografisk kvalitet.

4.8. Aceton, av kromatografisk kvalitet.

4.9. n-Hexan, av kromatografisk kvalitet.

4.10. Etyleter, av kromatografisk kvalitet.

4.11. Etanol av analytisk kvalitet.

4.12. Etylacetat av analytisk kvalitet.

4.13. Referenslösning för tunnskiktskromatografi: kolesterol eller fytosterol, och Erytrodiol 5 % lösning i etylacetat (punkt 4.11).

4.14. 2,7-diklorflourecein, 0,2 %, i etanollösning. Denna görs lätt basisk genom att tillsätta ett par droppar 2 N alkoholisk kaliumhydroxidlösning (punkt 4.2).

4.15. Vattenfri pyridin, av kromatografisk kvalitet (se Anmärkning 5).

4.16. Hexametyldisilasan av analyskvalitet.

4.17. Trimetylklorosilan av analyskvalitet.

4.18. Provlösningar av steroltrimetylsilyletrar. Bereds omedelbart före användning av steroler och erytrodiol som erhållits från oljor som innehåller dem.

4.19. α-Kolestanol, renhet över 99 % (renheten måste kontrolleras genom analys med gaskromatografi)

4.20. α-kolestanol som intern standard, 0,2 % lösning (m/V) i etylacetat (punkt 4.11).

4.21. Fenolftaleinlösning, 10 g/l i etanol (punkt 4.10).

4.22. Bärgas: väte eller helium, av gaskromatografisk kvalitet.

4.23. Hjälpgaser: väte, helium, kväve och luft, av gaskromatografisk kvalitet.

4.24. n-Hexan (punkt 4.9)/etyleter (punkt 4.10): blandning 65:35 (V/V).

4.25. Silyleringsreagens, bestående av en blandning 9:3:1 (V/V/V) av pyridin/hexametyldisilasan/trimetylklorosilan.

5. UTFÖRANDE

5.1. Beredning av oförtvålbara ämnen 5.1.1. Med hjälp av en 500 μl mikrospruta (punkt 3.6) införs i 250 ml kolven (punkt 3.1) en volym α-kolestanol som intern standard (punkt 4.20) innehållande en mängd kolestanol motsvarande ca 10 % av sterolhalten i provet. Exempelvis tillsätts 500 μl α-kolestanollösning (punkt 4.20) per 5 g prov när det gäller olivolja och 1 500 μl för olivolja av pressrester. Indunsta till torrhet under en försiktig ström av kväve i ett varmt vattenbad. Kyl kolven. Väg upp 5±0,01 g torrt filtrerat prov i kolven. Anmärkning 1: Animaliska eller vegetabiliska oljor och fetter som innehåller betydande kvantiteter av kolesterol kan visa en topp med en retentionstid som är nära den för kolestanol. Om detta inträffar måste sterolfraktionen analyseras dubbelt med och utan intern standard. 5.1.2. Tillsätt 50 ml 2 N kaliumhydroxid i etanollösning (punkt 4.2) och lite pimpsten. Sätt på återflödeskylaren och värm till svag kokning tills förtvålning inträder (lösningen blir klar). Fortsätt upphettningen under ytterligare 20 minuter, och tillsätt sedan 50 ml destillerat vatten från toppen av återflödeskylaren. Ta bort kylaren och kyl kolven till ca 30 °C. 5.1.3. Överför kolvens innehåll kvantitativt till en 500 ml separertratt (punkt 3.2) genom att använda flera portioner destillerat vatten (50 ml). Tillsätt cirka 80 ml etyleter (punkt 4.10). Skaka omsorgsfullt i ungefär 60 sekunder och frigör regelbundet trycket genom att vända upp och ned på separertratten och öppna avstängningsventilen. Låt stå tills de två faserna har separerats fullständigt (Anmärkning 2). Överför därefter tvållösningen så fullständigt som möjligt i en annan separertratt. Genomför ytterligare två extraheringar av vatten-alkoholfasen på samma sätt med användande av 60–70 ml etyleter (punkt 4.10). Anmärkning 2: Eventuell emulsion kan förstöras genom tillsats av små kvantiteter etanol (punkt 4.11). 5.1.4. Samla de tre eterextrakten i en separertratt som innehåller 50 ml vatten. Fortsätt att tvätta med vatten (50 ml) till dess att tvättvattnet inte längre ger en rosa färg vid tillsättning av en droppe fenolftaleinlösning (punkt 4.21). När tvättvattnet har avlägsnats, filtrera på vattenfritt natirumsulfat (punkt 4.5) ner i en i förväg vägd 250 ml kolv, och tvätta därefter tratten och filtret med små mängder etyleter (punkt 4.10). 5.1.5. Låt lösningsmedlet avdunsta genom destillation i rotationsindunstare vid 30 °C under vakuum. Tillsätt 5 ml aceton och avlägsna det flyktiga lösningsmedlet helt i en svag luftström. Torka återstoden i torkskåp vid 103 ± 2 °C i 15 minuter. Kyl i exsickator och väg med 0,1 mg noggrannhet.

5.2. Separation av sterol- och triterpendialkoholfraktionen (erytrodiol + uvaol) 5.2.1. Beredning av de basiska plattorna för tunnskiktskromatografi. Sänk ner kiselgelplattorna (punkt 4.6) circa 4 cm i 0,2 N kaliumhydroxidetanollösning (punkt 4.5) i 10 sekunder och låt sedan torka i dragskåp i två timmar varefter de placeras i ett torkskåp vid 100 °C i en timme. Ta ut plattorna från torkskåpet och förvara dem i en exsickator (punkt 3.13) med kalciumklorid tills de ska användas (plattor som behandlas på detta sätt måste användas inom 15 dagar). Anmärkning 3: Om kiselelplattor används för att separera sterolfraktionen behöver inte de oförtvålbara fraktionerna behandlas med aluminumoxid. På det här sättet kan alla sura föreningar (fettsyror och andra) behållas på identifieringslinjen och sterolbandet separeras klart från de alifatiska alkoholernas och triterpenalkoholernas band. 5.2.2. Fyll på n-hexan/etyleterblandningen (punkt 4.24) (Anmärkning 4) i framkallningskammaren till ett djup av circa 1 cm. Stäng kammaren med tillhörande lock och låt stå svalt ca en halvtimme så att jämnvikten vätska/gas inställer sig. Remsor av filtrerpapper som doppas ner i eluenten kan placeras på insidorna av kammaren. Detta minskar framkallningstiden med ca en tredjedel och åstadkommer en jämnare eluering av komponenterna. Anmärkning 4: Framkallningsblandningen ska bytas för varje test för att få exakt reproducerbara elueringsförhållanden. En blandning av 50:50 (V/V) av n-hexan/etyleter kan också användas. 5.2.3. Förbered en circa 5 % lösning av de oförtvålbara ämnena (punkt 5.1.5) i etylacetat (punkt 4.12) och stryk ut med 100 μl mikrosprutan 0,3 ml av lösningen smalt och jämnt på den nedre delen (2 cm) av kromatografiplattan. Placera i linje med strykningen 2 till 3 μl av referenslösningen (4.13) så att sterol- och triterpendialkoholbandet kan identifieras efter framkallning. 5.2.4. Placera plattan i framkallningskammaren som iordningställts enligt punkt 5.2.2. Rumstemperaturen ska hållas mellan 15 och 20 °C (Anmärkning 5). Stäng kammaren omedelbart med locket och påbörja elueringen tills lösningsmedlets främre kant når till ca 1 cm från övre änden av plattan. Ta ut plattan ur framkallningskammaren och låt lösningsmedlet avdunsta i en ström av varmluft eller genom att plattan får ligga en kort stund i dragskåp. Anmärkning 5: Högre temperatur kan försämra separationen. 5.2.5. Spraya plattan lätt och jämnt med 2,7-diklorfloureceinlösningen (punkt 4.14) och låt torka. När plattan betraktas i ultraviolett ljus kan sterol- och triterpendialkoholbanden identifieras genom att de ligger i höjd med fläckarna som erhållits från referenslösningen (punkt 4.13). Markera änden av banden längs kanterna av flouroscensen med svart blyerts (se TLC-platta, figur 3). 5.2.6. Skrapa med hjälp av en metallspatel bort kiselgelen från det markerade området. Placera det finfördelade materialet som tagits bort i filtrertratten (punkt 3.7). Tillsätt 10 ml het etylacetat (punkt 4.12), blanda omsorgsfullt med metallspateln under vakuum och filtrera i E-kolven (punkt 3.8) som är ansluten till filtrertratten. Tvätta återstoden i kolven tre gånger med etyleter (punkt 4.3) (circa 10 ml varje gång) och samla upp filtratet i samma kolv som är ansluten till filtrertratten, Indunsta filtratet till en volym på 4–5 ml och överför resterande lösning till det tidigare vägda 10 ml provröret (punkt 3.9), låt indunsta fullständigt under lätt uppvärmning, i svagt kväveflöde, fyll på nytt genom att använda några droppar aceton (punkt 4.8) och indunsta till torrhet. Återstoden i provröret består av sterol- och triterpendialkoholfraktionerna.

5.3. Preparering av trimetylsilyletrarna 5.3.1. Tillsätt silyleringsreagensen (punkt 4.25) (Anmärkning 6), i förhållandet 50 μl för varje mg steroler och triterpendialkoholer, i provröret som innehåller sterol- och triterpenfraktionen. Undvik upptag av fuktighet (Anmärkning 7). Anmärkning 6: Lösningar som är klara för användning finns i handeln. Andra silyleringsreagensen, såsom bistrimethylsilyltrifluoracetamid + 1 % trimetylklorosilan, som måste spädas med lika stor volym vattenfri pyridin finns också i handeln. Pyridinet kan ersättas med samma mängd acetonitril. 5.3.2. Sätt proppen i provröret, skaka försiktigt (utan att vända på det) tills föreningarna är helt lösta. Låt stå i minst 15 minuter i rumstemperatur och centrifugera sedan i ett par minuter. Den klara lösningen är nu färdig för analys med gaskromatografi. Anmärkning 7: Eventuell bildning av en svag opalescens är normal och inverkar inte. Bildandet av en vit flockning eller rosafärgning är tecken på närvaro av fukt och sönderfall hos reagensen. Om detta inträffar ska testet upprepas (endast om hexametyldisilazan/trimetylklorsilan används).

5.4. Analys med gaskromatografi 5.4.1. Förberedelser, iordningställande av kapillärkolonn. 5.4.1.1. Montera kolonnen (punkt 3.11) i gaskromatografen genom att kolonnens inlopp ansluts till splitinjektorn och kolonnens utlopp till detektorn. En allmän kontroll av gaskromatografen genomförs (gasanslutningarna ska vara täta, detektorn i fullgott skick, splitsystem och registreringssystem fungerarande etc). 5.4.1.2. Om kolonnen används för första gången rekommenderas det att den först prepareras: En liten mängd gas får flyta genom kolonnen och sedan kopplas gaskromatografen på och en gradvis upphettning genomförs tills temperaturen är minst 20 °C över drifttemperaturen (Anmärkning 8). Denna temperatur bibehålls i minst två timmar och sedan ställs kromatografen iordning för driftförhållanden (inställning av gasflöde och splittning, tändning av flamman, anslutning till databehandlingssystemet, inställning av temperaturen i kolonnen, detektorn och injektorn), och registrera signalen med en känslighet som är minst två gånger högre än den som beräknas för analysen. Baslinjen ska vara linjär, utan några toppar av något slag, och får inte visa tecken på drift. Negativ rak drift av linjen är tecken på otäta kolonnanslutningar, medan en positivt drift tyder på otillräcklig preparering av kolonnen. Anmärkning 8: Temperaturen vid prepareringen ska vara minst 20 °C lägre än den maximitemperatur som specificeras för den stationära fas som används. 5.4.2. 5.4.2 Val av analysparametrar. 5.4.2.1. Analysparametrarna väljs enligt följande: — Kolonntemperatur: 260 ± 5 °C. — Injektortemperatur: 280–300 °C. — Detektortemperatur: 280–300 °C. — Linjär hastighet för bärgasen: helium 20–35 cm/s, väte 30–50 cm/s. — Splitförhållande 1:50–1:100. — Instrumentets känslighet: 4–16 gånger högre än minimikänsligheten. — Registreringskänslighet: 1–2 mV fullt skalutslag. — Kvantitet av det injicerade ämnet: 0,5–1 μl TMSE-lösning. Dessa parametrar kan ändras beroende på egenskaperna hos kolonnen och gaskromatografen för att få kromatogram som uppfyller följande krav: — Retentionstiden för ß-sitosteroltoppen bör vara 20 ± 5 minuter. — Kampesteroltoppen bör vara följande: för olivolja (medelhalt 3 %) 20 ± 5 % av fullt utslag, för sojaolja (medelhalt 20 %) 80 ± 10 % av fullt utslag. — Alla närvarande steroler måste separeras. Förutom att separeras måste alla toppar vara helt och hållet synliga, dvs varje toppkurva ska återvända till baslinjen innan nästa topp ritas. Ofullständig upplösning kan emellertid tolereras under förutsättning att toppen vid RRT 1,02 (sitostanol) kan kvantifieras med hjälp av topphöjden. 5.4.3. Analysförfarande 5.4.3.1. Sug med hjälp av en 10 μl mikrospruta upp 1 μl hexan, sug in 0,5 μl luft och sedan 0,5–1 μl av provlösningen. Dra ut kolven ur sprutan ytterligare så att kanylen töms. Stick in kanylen genom membranet i injektorn och spruta snabbt efter en till två sekunder in innehållet och drag sedan sakta ut kanylen efter ca fem sekunder. En automatisk injektor kan även användas. 5.4.3.2. Genomför registreringen tills de närvarande triterpendialkoholernas TMSE har eluerats fullständigt. Baslinjen måste fortsätta att uppfylla kraven (punkt 5.4.1.2). 5.4.4. Identifiering av toppar Identifiera individuella toppar på grundval av retentionstiderna och genom jämförelse med blandningen av sterol- och triterpendialkohol-TMSE, som analyseras med samma parametrar (se tillägget). Sterolerna och triterpendialkoholerna elueras i följande ordning: kolesterol, brassikasterol, ergosterol, 24-metylenkolesterol, kampesterol, kampestanol, stigmasterol, Δ7-kampesterol, Δ5,23-stigmastadienol, klerosterol, ß-sistosterol, sitostanol, Δ5-avenasterol, Δ5,24-stigmastadienol, Δ7-stigmastenol, Δ7-avenasterol, erytrodiol och uvaol. Retentionstiderna för sitosterol för SE-52- och SE-54-kolonner framgår av tabell 1. Figurerna 1 och 2 visar typiska kromatogram för en del oljor. 5.4.5. Kvantitativ utvärdering 5.4.5.1. Beräkna areorna för α-kolestanol- och sterol- och triterpendialkoholtopparna med hjälp av databehandlingssystemet. Bortse från toppar för föreningar som inte finns med (ergosterol ska inte beräknas) bland de som är upptagna i tabell 1. Responsen för α-kolestanol ska vara lika med 1. 5.4.5.2. Beräkna koncentrationen för varje sterol i mg/100 g fett enligt följande: där Ax = arean av sterol x, enligt beräkning av databehandlingssystemet As = arean av toppen för α-kolestanol, enligt beräkning av databehandlingssystemet ms = massan av tillsatt α-kolestanol i milligram m = massan av det prov som använts för bestämningen, i gram.

6. RESULTAT

6.1. Ange de enskilda sterolkoncentrationerna i milligram per 100 g fett och summan av dem som "summan av sterolerna". Sammansättningen av var och en av de enskilda sterolerna och av erytrodiol och uvaol bör uttryckas med en decimals noggrannhet. Sammansättningen av summan av sterolerna ska anges utan decimal.

6.2. Beräkna procentandelen av varje enskild sterol som förhållandet mellan arean av den aktuella toppen och summan av areorna av topparna för sterolerna och erytrodiol och uvaol: där: Ax = topparea för x ΣA = total topparea för sterolerna

6.3. Apparent β-sitosterol: Δ5-23-stigmastadienol + klerosterol + β-sitosterol + sitostanol + Δ5-avenasterol + Δ5-24-stigmastadienol.

6.4. Beräkna den procentuella andelen erytrodiol och uvaol: där ΣA = summan av areorna för sterol enligt beräkning av databehandlingssystemet Er = arean för erytrodiol enligt beräkning av databehandlingssystemet Uv = arean för uvaol enligt beräkning av databehandlingssystemet









Tillägg

Bestämning av den linjära hastigheten hos gasen

Spruta in 1–3 μl metan (eller propan) i gaskromatografen under vanliga ???analysparametrar??? och mät den tid det tar för gasen att passera kolonnen från insprutningsögonblicket till den tidpunkt då toppen framträder (tM).

Den linjära hastigheten i cm/s erhålls genom L/tM där L är kolonnens längd i cm och tM är den uppmätta tiden i sekunder.







Tabell 1 Relativa retentionstiden för steroler Topp Identifiering Relativ retentionstid SE 54 kolumn SE 52 kolumn 1 Kolesterol Δ-5-kolesten-3ß-ol 0,67 0,63 2 Kolestanol 5α-kolestan-3ß-ol 0,68 0,64 3 Brassikasterol [24S]-24-metyl-Δ-5,22-kolestadien-3ß-ol 0,73 0,71 * Ergosterol [24S] 24 metyl Δ5-7-22 kolestatrien 3ß-ol 0,78 0,76 4 24-metylenkolesterol 24-metylen-Δ-5,24-kolestadien-3ß-o1 0,82 0,80 5 Kampesterol [24R]-24-metyl-Δ-5-kolesten-3ß-ol 0,83 0,81 6 Kampestanol [24R]-24-metylkolestan-3ß-ol 0,85 0,82 7 Stigmasterol [24S]-24-etyl-Δ-5,22-kolestadien-3ß-ol 0,88 0,87 8 Δ-7-kampesterol [24R]-24-metyl-Δ-7-kolesten-3ß-ol 0,93 0,92 9 Δ-5,23-stigmastadienol [24R,S]-24-etyl-Δ-5,23-koIestadien-3ß-ol 0,95 0,95 10 Klerosterol [24S]-24-etyl-Δ-5,25-kolestadien-3ß-ol 0,96 0,96 11 ß-sitosterol [24R]-24-etyl-Δ-5-kolesten-3ß-ol 1,00 1,00 12 Sitostanol 24-etyl-kolestan-3ß-ol 1,02 1,02 13 Δ-5-avenasterol [24Z]-24-etyliden-Δ-5-kolesten-3ß-ol 1,03 1,03 14 Δ-5-24-stigmastadienol [24R,S]-24-etyl-Δ-5,24-kolestadien-3ß-ol 1,08 1,08 15 Δ-7-stigmastenol [24R,S]-24-etyl-Δ-7-kolesten-3ß-ol 1,12 1,12 16 Δ-7-avenasterol [24Z]-24-etyliden-Δ-7-kolesten-3ß-ol 1,16 1,16 17 Erytrodiol 5α olean-12en-3ß28-diol 1,41 1,41 18 Uvaol Δ12-ursen-3ß28-diol 1,52 1,52

Figur 1

Gaskromatogram för sterol- och triterpendialkoholfranktionen av raffinerad olivolja (som tillsatts intern standard)

Figur 2

Gaskromatogram för sterol- och triterpendialkoholfranktionen av en bomolja (som tillsatts intern standard)

Figur 3

TLC-platta av olivolja av pressrester med det område som måste skrapas för att bestämma förekomsten av steroler och triterpendialkoholer

1 – Skvalen

2 – Triterpenalkoholer och alifatiska alkoholer

3 – Steroler och triterpendialkoholer

4 – ???Start??? och fria fettsyror

▼M26 —————

▼M21









BILAGA VII

BESTÄMNING AV PROCENTANDELEN 2-GLYCERYLMONOPALMITAT

1. SYFTE OCH TILLÄMPNINGSOMRÅDE

Metoden avser bestämning av procentandelen palmitinsyra i 2-ställning för triglycerider genom bestämning av 2-glycerylmonopalmitat.

Metoden kan tillämpas på flytande vegetabiliska oljor vid en temperatur på 20 °C.

2. PRINCIP

Efter beredning av oljeprovet tillsätts pankreaslipas. Detta leder till partiell och specifik hydrolys i 1- och 3-ställning för triglyceridmolekylen varigenom monoglycerider i 2-ställning uppkommer. Procentandelen 2-glycerylmonopalmitat i monoglyceridfraktionen bestäms, efter silylering, med kapillärgaskromatografi.

3. UTRUSTNING

3.1 E-kolv 25 ml

3.2 Glasbägare, 100, 250 och 300 ml

3.3 Kromatografikolonn av glas, innerdiameter 21–23 mm, längd 400 mm, med porös glasskiva och kran

3.4 Graderade provrör 10, 50, 100 och 200 ml

3.5 Kolvar 100 och 250 ml

3.6 Rotationsindunstare

3.7 Centrifugrör 10 ml, med konformad botten och slipad propp

3.8 Centrifug för rör 10 och 100 ml

3.9 Termostat som håller temperaturen på 40 + 0,5 °C

3.10 Mätpipetter, 1 och 2 ml

3.11 Injektionsspruta 1 ml

3.12 Spruta 100 μl

3.13 Tratt, 1 000 ml

3.14 Kapillärgaskromatograf med ”on column” -injektor för direktinjektion av provet i kolonnen och en ugn som kan hålla vald temperatur med en noggrannhet på + 1 °C

3.15 ”On column” -injektor för direktinjektion av provet i kolonnen

3.16 En flamjonisationsdetektor och elektrometer

3.17 Skrivare/integrator som är anpassad till elektrometern, med responstid på högst 1 sekund och med variabel pappershastighet

3.18 Kapillärkolonn av glas eller kvarts, längd 8–12 meter, innerdiameter 0,25–0,32 mm, belagd med 5-procentig metylpolysiloxan eller fenylmetylpolysiloxan (tjocklek 0,10–0,30 μm) som kan användas vid 370 °C

3.19 Spruta 10 μl med härdad nål, minst 7,5 cm, för direktinjektion i kolonnen

4. REAGENS

4.1 Kiselgel med en kornstorlek på 0,063–0,200 mm (70/280 mesh), beredd enligt följande: placera kiselgelen i en porslinskapsel, torka i ugnen vid 160 °C i 4 timmar, låt svalna i exsickator. Tillsätt en mängd vatten som motsvarar 5 % av kiselgelens vikt, enligt följande: mät upp 152 g kiselgel i en E-kolv på 500 ml och tillsätt 8 g destillerat vatten, sätt på proppen och skaka lätt så att vattnet blir jämnt fördelat. Låt stå i minst 12 timmar före användning.

4.2 n-hexan för kromatografi

4.3 Isopropanol

4.4 Isopropanol, vattenlösning 1:1 (v/v)

4.5 Pankreaslipas. Lipaset skall ha en aktivitet på 2,0–10 lipasenheter/mg (i handeln finns det pankreaslipas med en aktivitet på 2–10 enheter per mg enzym).

4.6 Buffertlösning av tris(hydroximetyl)aminometan: vattenlösning 1 M där pH justeras till 8 (kontrolleras med potentiometer) genom tillsats av koncentrerad HCI (1:1 v/v)

4.7 Natriumkolat, enzymkvalitet, 1-procentig vattenlösning (lösningen bör användas inom 15 dagar efter det att den beretts

4.8 Kalciumklorid, 22-procentig vattenlösning

4.9 Dietyleter för kromatografi

4.10 Elueringsmedel: blandning n-hexan/dietyleter (87:13) (v/v)

4.11 Natriumhydroxid, lösning på 12 viktprocent

4.12 Fenolftalein, 1-procentig lösning i etanol

4.13 Bärgas: vätgas eller helium, för gaskromatografi

4.14 ”Make-up” -gas: vätgas, minst 99 %, fri från fukt och organiska ämnen – och luft för gaskromatografi, av samma renhetsgrad

4.15 Silyleringsreagens: blandning pyridin/hexametyldisilazan, trimetylklorsilan 9:3:1 (v/v/v). (Det finns färdiga lösningar i handeln. Andra silyleringsreagenser kan användas, t.ex. bis-trimetylsilyltrifluoracetamid + 1 % trimetylklorsilan, utspätt med lika mängd vattenfritt pyridin.)

4.16 Referensprover: rena monoglycerider eller blandningar av monoglycerider med en liknande procentuell sammansättning som provet

5. FÖRFARANDE

5.1 Provberedning

5.1.1 Oljor med en halt av fria syror lägre än 3 % behöver inte neutraliseras före kromatografi på kolonn med kiselgel. Oljor med en halt av fria syror över 3 % skall neutraliseras i enlighet med punkt 5.1.1.1. 5.1.1.1 Häll 50 g olja och 200 ml n-hexan i en tratt på 1 000 ml (3.13). Tillsätt 100 ml isopropanol och en mängd 1-procentig natriumhydroxidlösning (4.11) som motsvarar oljans fria syrahalt ökat med 5 %. Skaka kraftigt i 1 minut. Tillsätt 100 ml destillerat vatten, skaka igen och låt stå. Efter dekantering, avlägsna det nedre skiktet som innehåller tvål. Avlägsna eventuella mellanliggande skikt (slem och olösliga ämnen). Tvätta den neutraliserade hexanlösningen av oljan flera gånger med 50–60 ml lösning av isopropanol och vatten 1:1 (v/v) (4.4) till dess den rosafärgade tonen på fenolftaleinet försvunnit. Avlägsna det mesta av hexanet genom vakuumdestillation (t.ex. med en rotationsindunstare) och för över oljan till en kolv på 100 ml (3.5). Torka oljan i vakuum till dess att lösningsmedlet har försvunnit helt. När så skett bör oljans syrahalt ligga under 0,5 %.

5.1.2 Häll 1,0 g olja som beretts enligt ovan i en 25 ml E-kolv (3.1) och lös upp i 10 ml lösningsmedel (4.10). Låt lösningen stå i minst 15 minuter före kromatografi på kolonn med kiselgel. Om lösningen är grumlig, centrifugera den för att uppnå optimala förhållanden för kromatografi. (Till detta används t.ex. SPE-kolonner på 500 g med kiselgel, färdiga för användning).

5.1.3 Preparering av kromatografikolonnen Häll i ca 30 ml lösningsmedel (4.10) i kolonnen (3.3), placera en bomullstuss i den nedre delen av kolonnen med hjälp av en glasstav och pressa ut luften. Slamma upp 25 g kiselgel (4.1) i ca 80 ml lösningsmedel i en glasbägare och häll i den i kolonnen med hjälp av en tratt. Kontrollera att all kiselgel har hamnat i kolonnen. Tvätta med lösningsmedlet (4.10), öppna kranen och låt vätskenivån sjunka till ca 2 mm ovanför kiselgelens övre nivå.

5.1.4 Kromatografi Väg upp exakt 1,0 g av provet som beretts enligt punkt 5.1 i en E-kolv på 25 ml (3.1). Lös upp provet i 10 ml elueringsmedel (4.10). Häll lösningen i kromatografikolonnen som förberetts enligt punkt 5.1.3. Rubba inte kolonnytan. Öppna kranen och fyll på med provlösning upp till kiselgelen. Eluera med 150 ml elueringsmedel. Ställ in flödeshastigheten på 2 ml/min (så att 150 ml rinner igenom kolonnen på ca 60–70 minuter). Samla upp eluatet i en 250 ml rundkolv som tarerats i förväg. Förånga lösningsmedlet i vakuum och avlägsna lösningsmedelsresterna med en ström av kvävgas. Väg kolven och beräkna mängden extrakt som erhållits. (Vid användning av SPE-kolonn med kiselgel som är färdig för användning, förfar enligt följande: Fyll på 1 ml lösning (5.1.2.) i kolonnerna, som dessförinnan förberetts med 3 ml n-hexan. När lösningen passerat genom kolonnen, eluera med 4 ml n-hexan/dietyleter 9:1 (v/v). Samla upp eluatet i ett 10 ml rör och förånga med en ström av kvävgas tills all vätska försvunnit. Tillsätt pankreaslipas till torrsubstansen (5.2.). Det är absolut nödvändigt att kontrollera fettsyresammansättningen både före och efter passagen genom SPE-kolonnen).

5.2 Hydrolys med pankreaslipas

5.2.1 Väg upp 0,1 g olja som beretts enligt punkt 5.1. i centrifugröret. Tillsätt 2 ml buffertlösning (4.6.), 0,5 ml natriumkolatlösning (4.7.) och 0,2 ml kalciumkloridlösning och skaka väl efter varje tillsats. Förslut röret med den slipade proppen och placera det i termostaten vid en temperatur på 40 + 0,5 °C.

5.2.2 Tillsätt 20 mg lipas, blanda väl (undvik att blöta ner proppen) och placera röret i termostaten under exakt 2 minuter, ta ut det, skaka väl under exakt 1 minut och låt svalna.

5.2.3 Tillsätt 1 ml dietyleter, sätt i proppen och skaka väl, centrifugera och överför därefter eterlösningen till ett rent och torrt rör med hjälp av en spruta.

5.3 Beredning av silylerade derivat och förberedelser för gaskromatografi

5.3.1 För över 100 μl lösning (5.2.3.) till ett 10 ml provrör med konisk botten med hjälp av en spruta.

5.3.2 Avlägsna lösningsmedlet med svag kvävgasström, tillsätt 200 μl silyleringsreagens (4.15.), sätt i proppen i provröret och låt stå i 20 minuter.

5.3.3 Tillsätt efter 20 minuter 1–5 ml n-hexan (beroende på de kromatografiska betingelserna): den lösning som erhålls är färdig att användas för gaskromatografi.

5.4 Gaskromatografi

Följande analysparametrarna används:

— Injektortemperatur (”on column” -injektor) under lösningens kokpunkt (68 °C)

— Detektortemperatur: 350 °C

— Kolonntemperatur: programmering av ugnstemperatur: 60 °C under 1 minut, öka med 15 °C per minut upp till 180 °C, sedan med 5 °C per minut upp till 340 °C, denna temperatur bibehålls sedan under 13 minuter.

— Bärgas: vätgas eller helium, reglerad till lämplig linjär hastighet för den upplösning som visas i figur 1. Retentionstiden för triglyceriden C54 bör vara 40 + 5 minuter (se figur 2). (Analysparametrarna ovan är vägledande. De bör optimeras av den som utför analysen så att önskad upplösning erhålls. Toppen för 2-glycerylmonopalmitat skall ha en minsta höjd på 10 % av skrivarens skala.)

— Kvantitet av det injicerade ämnet: 0,5–1 μl av lösningen (5 ml) med n-hexan (5.3.3.).

5.4.1 Identifiering av toppar

De enskilda monoglyceriderna bör identifieras genom att retentionstiderna jämförs med dem som erhållits för standardblandningar med monoglycerider under samma förhållanden.

5.4.2 Kvantitativ analys

Arean för varje topp beräknas med hjälp av en elektronisk integreringsenhet.

6. BERÄKNING AV RESULTAT

Andelen glycerilmonopalmitat beräknas genom en jämförelse mellan arean för motsvarande topp och summan av toppareorna för samtliga monoglycerider (se figur 2), enligt formeln:

Glycéril monopalmitate (%):

där:

Ax = topparean för glycerilmonopalmitat

ΣA = summan av toppareorna för alla monoglycerider

Resultatet skall anges med en decimal.

7. ANALYSRAPPORT

Följande skall anges i analysrapporten:

— Hänvisning till denna metod

— Alla uppgifter som behövs för att fullständigt identifiera provet

— Analysresultat

— Alla avvikelser från metoden, vare sig de hänför sig till ett beslut av de berörda parterna eller något annat skäl

— Uppgifter om laboratoriet, analysdag och underskrift av de ansvariga på laboratoriet

Figur 1

Kromatogram över reaktionsprodukter från silylering som erhållits genom att lipas fått verka på en raffinerad olivolja med tillsats av 20 % esterifierad olja (100 %).

Förklaringar: ”Acides gras libres” = fria fettsyror; ”Huile d’olive raffinée + 20 % huile estérifiée” = raffinerad olivolja + 20 % esterifierad olja; ”1-2 monopalmitine” = 1-2 monopalmitin; ”1-2 mono C18 insat.” = omättat 1-2-mono-C18

Figur 2

Kromatogram över:

A) Olja som inte esterifierats efter lipas; efter silylering; under dessa betingelser (kapillärkolonn 8–12 m), elueras vaxfraktionen samtidigt som diglyceridfraktionen eller kort därefter. Efter lipaset skall triglyceridhalten inte överstiga 15 %. Förklaringar: 1.- = Fria fettsyror 2.- = Monoglycerider 3.- = Diglycerider 4.- = Triglycerider * = 2-monopalmitin ** = Triglycerid C54

Kromatogram över:

B) Olja som esterifierats efter lipas; efter silylering; under dessa betingelser (kapillärkolonn 8–12 m), elueras vaxfraktionen samtidigt som diglyceridfraktionen eller kort därefter. Efter lipaset skall triglyceridhalten inte överstiga 15 %. Förklaringar: 1.- = Fria fettsyror 2.- = Monoglycerider 3.- = Diglycerider 4.- = Triglycerider * = 2-monopalmitin ** = Triglycerid C54

8. ANMÄRKNINGAR

BEREDNING AV LIPAS

I handeln finns det lipaser med lämplig aktivitet. Det går också att bereda lipas i laboratorium enligt följande:

Kyl 5 kg färsk bukspottskörtel från svin till 0 °C. Ta bort omgivande fett och bindväv och kör återstoden i mixer så att en tunn massa erhålles. Rör massan i 4–6 timmar med 2,5 liter vattenfritt aceton och centrifugera sedan. Extrahera återstoden tre gånger till med samma mängd vattenfritt aceton, och sedan två gånger med en blandning av aceton/dietyleter (1:1) (v/v) och därefter två gånger med dietyleter.

Torka återstoden i vakuum i 48 timmar så att ett stabilt pulver erhålls. Detta skall lagras i kylskåp och skyddas från fukt.

KONTROLL AV LIPASAKTIVITETEN

Bered en olivoljeemulsion enligt följande:

Bered i mixer i 10 minuter en blandning av 165 ml lösning av gummi arabicum 100 g/l, 15 g krossad is och 20 ml av en neutraliserad olivolja.

Häll 10 ml av lösningen i en 50 ml glasbägare, tillsätt sedan 0,3 ml natriumkolatlösning på 0,2 g/ml och 20 ml destillerat vatten.

Placera bägaren i en termostat inställd på 37 °C. Sänk ned pH-elektroderna i bägaren och lägg i omröraren.

Tillsätt med hjälp av en byrett droppvis 0,1 N natriumhydroxidlösning tills pH går upp till 8,3.

Tillsätt en mängd lipassuspension i pulverform till vattnet (0,1 g/ml lipas). När pH-värdet uppmäts till 8,3, starta kronometern och tillsätt natriumhydroxidlösningen droppvis i den takt som krävs för att pH-värdet skall ligga kvar på 8,3. Anteckna varje minut mängden använd lösning.

Plotta mätvärdena i ett koordinatsystem med tiden på x-axeln och antal ml 0,1 N alkalilösning som gått åt för att bibehålla konstant pH på y-axeln. Resultatet skall bli en rät linje.

Lipasaktiviteten mätt i lipasenheter per mg erhålls genom följande formel:

där:

A är aktiviteten i lipasenheter/mg

V är antalet ml 0,1 N natriumhydroxidlösning per minut (grafisk beräkning)

N är normaliteten hos natriumhydroxidlösningen

m är massan i mg av försökslipaset

Lipasenheten definieras som den mängd enzym som frigör 10 mikroekvivalenter syra per minut.

▼M20 —————

▼M25









BILAGA IX

SPEKTROFOTOMETRISK UNDERSÖKNING I ULTRAVIOLETT LJUS

INLEDNING

Spektrofotometrisk undersökning i ultraviolett ljus kan ge information om kvaliteten på ett fett, dess grad av konservering och förändringar i fettet till följd av tekniska processer.

Absorptionen vid de våglängder som anges i metoden beror på närvaron av konjugerade dien- och triensystem. Absorptionen uttrycks som den specifika absorptionen E 1 % 1 cm (absorptionen i en 1 % lösning av fettet i ett angivet lösningsmedel; tjocklek 1 cm) som konventionellt betecknas K (även kallad absorptionskoefficient).

1. SYFTE

Metodbeskrivningen avser spektrofotometrisk undersökning av olivolja (vars egenskaper beskrivs i tillägget) i ultraviolett ljus.

2. PRINCIP

Fettet i fråga löses i lämpligt lösningsmedel och lösningens absorption bestäms sedan vid de angivna våglängderna med rent lösningsmedel som referens. Specifika absorptioner beräknas ur spektrofotometervärdena. Den specifika absorbansen vid 232 nm och 268 nm i isooktan eller 232 nm och 270 nm i cyklohexan beräknas för en koncentration av 1 g/100 ml i en 10 mm kyvett.

3. UTRUSTNING

3.1 En spektrofotometer för mätning av absorption i UV-området mellan 220 och 360 nm med en noggrannhet på 1 nm. Det rekommenderas att spektrofotometerns våglängds- och absorbansskalor kontrolleras före användning enligt följande. 3.1.1 Våglängdsskala: Denna kan kontrolleras med hjälp av ett referensmaterial bestående av ett optiskt glasfilter innehållande holmiumoxid som har distinkta absorptionsband. Referensmaterialet är utformat för kontroll och kalibrering av våglängdsskalor hos spektrofotometrar för synligt och ultraviolett ljus med nominella spektrala bandbredder på 5 nm eller mindre. Glasfiltrets absorbans mäts i förhållande till luft (tom kyvetthållare) i våglängdsområdet 640–240 nm. För varje spektral bandbredd (0,10 – 0,25 – 0,50 – 1,00 – 1,50 – 2,00 och 3,00) görs en grundkalibrering mot en tom kyvetthållare. Den spektrala bandbreddens våglängder anges i certifikatet för referensmaterialet i ISO 3656. 3.1.2 Absorbansskala: Denna kan kontrolleras med hjälp av ett referensmaterial som består av fyra lösningar av kaliumdikromat i perklorsyra förseglade i fyra UV-kvartskyvetter för mätning av linjäritet och fotometrisk noggrannhet som referens i UV-ljus. De kaliumdikromatfyllda kyvetterna (40 mg/ml, 60 mg/ml, 80 mg/ml och 100 mg/ml) mäts mot ett blankprov med perklorsyra. Nettoabsorbansvärden anges i certifikatet för referensmaterialet i ISO 3656.

3.2 Rektangulära kvartskyvetter med lock och med en optisk längd av 1 cm. När kyvetterna är fyllda med vatten eller annat lämpligt lösningsmedel bör deras absorption inte skilja sig mer än 0,01 enheter.

3.3 Mätkolvar, 25 ml.

3.4 Analysvåg med en noggrannhet av 0,0001 g.

4. REAGENS

Använd endast reagens av analytisk kvalitet, om inte annat anges.

Lösningsmedel: Isooktan (2,2,4-trimetylpentan) för mätning vid 232 nm och 268 nm eller cyklohexan för mätning vid 232 nm och 270 nm, med en absorbans på mindre än 0,12 vid 232 nm och mindre än 0,05 vid 250 nm mot destillerat vatten, mätt i en 10 mm kyvett.

5. UTFÖRANDE

5.1 Provet måste vara helt homogent och får inte innehålla några suspenderade föroreningar. Oljor som är flytande vid rumstemperatur ska filtreras genom filtrerpapper vid ca 30 °C, fetter i fast form ska homogeniseras och filtreras vid en temperatur av högst 10 °C över smältpunkten.

5.2 Väg upp ca 0,25 g (med en noggrannhet av 1 mg) av det beredda provet och överför till en 25 ml mätkolv, späd till märket med det angivna lösningsmedlet och homogenisera. Den erhållna lösningen måste vara helt klar. Vid opalescens eller grumlighet filtreras lösningen genom filtrerpapper.

5.3 Fyll en kvartskyvett med den erhållna lösningen och mät absorptionen vid lämplig våglängd mellan 232 och 276 nm, med lösningsmedlet som referens. De uppmätta absorptionsvärdena måste ligga inom området 0,1 till 0,8. I annat fall måste mätningarna göras om med mer koncentrerad eller mer utspädd lösning. Anm.: Absorbansen behöver inte alltid mätas i hela våglängdsområdet.

6. REDOVISNING AV RESULTAT

6.1 Registrera specifik absorption (absorptionskoefficient) vid de olika våglängderna, beräknat enligt formeln där Κλ = specifik absorption vid våglängden λ Ελ = absorption uppmätt vid våglängden λ c = lösningens koncentration i g/100 ml s = kvartskyvettens tjocklek i cm Resultaten uttrycks med två decimaler.

6.2 Variation i specifik absorption (ΔΚ) Vid spektrofotometrisk analys av olivolja i enlighet med den officiella metoden i unionslagstiftningen ska även variationen hos den specifika absorptionens absolutvärde (ΔΚ) bestämmas med hjälp av formeln där Km är den specifika absorptionen vid våglängden m, varvid våglängden för maximal absorption beror på vilket lösningsmedel som används: 270 nm för cyklohexan och 268 nm för isooktan.









Tillägg







EGENSKAPER HOS OLIVOLJA Kategori Fettsyrametylestrar (FAME) och fettsyraetylestrar (FAEE) Syrahalt (%) (*) Peroxidvärde mEq 02/kg (*) Vaxer mg/kg (**) 2-glycerilmonopalmitat (%) Stigmastadien mg/kg (1) Skillnad mellan ECN42 (HPLC) och ECN42 (teoretisk beräkning) K232 (*) K270 (*) ”K 270 eller K 268 (5)” Delta-K (*) (5) Organoleptisk bedömning Medianvärde för defekter (Md) (*) Organoleptisk bedömning Medianvärde för fruktighet (Mf) (*) 1. Extra jungfruolja Σ FAME + FAEE ≤75 mg/kg eller 75 mg/kg <Σ FAME + FAEE ≤150 mg/kg och (FAEE/FAME) ≤1,5 ≤ 0,8 ≤ 20 ≤ 250 ≤ 0,9 om total palmitinsyra % ≤ 14 % ≤ 0,10 ≤ 0,2 ≤ 2,50 ≤ 0,22 ≤ 0,01 Md = 0 Mf > 0 ≥ 1,0 om total palmitinsyra % > 14% 2. Jungfruolja — ≤ 2,0 ≤ 20 ≤ 250 ≤ 0,9 om total palmitinsyra % ≤ 14% ≤ 0,10 ≤ 0,2 ≤ 2,60 ≤ 0,25 ≤ 0,01 Md ≤ 3,5 Mf > 0 ≤ 1,0 om total palmitinsyra % > 14% 3. Bomolja — > 2,0 — ≤ 300 (3) ≤ 0,9 om total palmitinsyra % ≤ 14 % ≤ 0,50 ≤ 0,3 — — — Md > 3,5 (2) — ≤ 1,1 om total palmitinsyra % > 14% 4. Raffinerad olivolja — ≤ 0,3 ≤ 5 ≤ 350 ≤ 0,9 om total palmitinsyra % ≤ 14 % — ≤ 0,3 — ≤ 1,10 ≤ 0,16 — — ≤ 1,1 om total palmitinsyra % > 14% 5. Olivolja bestående av raffinerad olivolja och jungfruolja — ≤ 1,0 ≤ 15 ≤ 350 ≤ 0,9 om total palmitinsyra % ≤ 14 % — ≤ 0,3 — ≤ 0,90 ≤ 0,15 — — ≤ 1,0 om total palmitinsyra % > 14% 6. Oraffinerad olivolja av pressrester — — — > 350 (4) ≤ 1,4 — ≤ 0,6 — — — — — 7. Raffinerad olivolja av pressrester — ≤ 0,3 ≤ 5 > 350 ≤ 1,4 — ≤ 0,5 — ≤ 2,00 ≤ 0,20 — — 8. Olivolja av pressrester ≤ 1,0 ≤ 15 > 350 ≤ 1,2 — ≤ 0,5 — ≤ 1,70 ≤ 0,18 — — (1) Totalvärde för isomerer som kan (eller inte kan) separeras i kapillärkolonn. (2) Eller när medianvärdet för defekter är högst 3,5 och medianvärdet för fruktighet är lika med 0. (3) Olja med en vaxhalt mellan 300 och 350 mg/kg betraktas som bomolja om den totala halten alifatiska alkoholer är högst 350 mg/kg eller om andelen erytrodiol och uvaol är högst 3,5 %. (4) Olja med en vaxhalt mellan 300 och 350 mg/kg betraktas som oraffinerad olivolja av pressrester om den totala halten alifatiska alkoholer är högre än 350 mg/kg eller om andelen erytrodiol och uval är högre än 3,5 %. (5) K 270 om lösningsmedlet är cyklohexan, K 268 om lösningsmedlet är isooktan.

▼B









BILAGA X A

ANALYS AV METYLESTRAR AV FETTSYROR MED GASKROMATOGRAFI

1. SYFTE

Denna metod ger allmänna riktlinjer för tillämpning av gaskromatografi med användning av packade kolonner eller kapillärkolonner för att bestämma den kvalitativa och kvantitativa sammansättning av en blandning av fettsyremetylestrar som erhållits i enlighet med den metod som anges i bilaga 10 B.

Metoden är inte tillämplig på polymeriserade fettsyror.

2. REAGENSER

2.1 Bärargas

Inert gas (kväve, helium, argon, väte osv) som är omsorgsfullt torkad och med en syrehalt som är mindre än 10 mg/kg.

Anm 1:

Väte, som endast används som bärargas i kapillärkolonner, kan fördubbla analyshastigheten men är farlig. Säkerhetsanordningar finns att tillgå.

2.2 Supplementerande gaser

2.2.1 Väte (renhet ≥ 99,9 %) fri från organiska föroreningar.

2.2.2 Luft eller syre fri från organiska föroreningar.

2.3 Standard för referens

En blandning av metylestrar av rena fettsyror eller metylestrar av ett fett av känd sammansättning, företrädesvis liknande det fett som skall analyseras.

Försiktighet skall iakttas för att förhindra oxidation av fleromättade fettsyror.

3. UTRUSTNING

De anvisningar som ges här avser vanlig utrustning som används för gaskromatografi, som använder packade kolonner eller kapillärkolonner och en flamjoniseringsdetektor. Vilken apparatur som helst som ger effektiviteten och upplösningen som anges i 4.1.2 är lämplig.

3.1 Gaskromatograf

Gaskromatografen skall bestå av följande enheter.

3.1.1 Insprutningssystem Använd ett insprutningssystem a) med packade kolonner med minsta möjliga dödutrymme (i det här fallet skall insprutningssystemet kunna upphettas till en temperatur som är 20 till 50 °C högre än kolonnens, eller b) med kapillärkolonner, varvid insprutningssystemet skall vara speciellt konstruerat för användning med sådana kolonner. Injektorn kan vara med eller utan split. Anm 2: Vid frånvaro av fettsyror med minst 16 kolatomer kan ett insprutningssystem med rörlig nål användas.

3.1.2 Ugn Ugnen skall kunna värma kolonnen till en temperatur av minst 260 °C och upprätthålla den önskade temperaturen inom 1 °C med packad kolonn och inom 0,1 °C med kapillärkolonn. Det senaste kravet är särskilt viktigt när kvartsrör används. Användning av temperaturprogrammerad uppvärmning rekommenderas i alla fall och särskilt för fettsyror med mindre än 16 kolatomer.

3.1.3 Packad kolonn 3.1.3.1 En kolonn som är tillverkad av ett material som är inert mot de ämnen som skall analyseras (dvs glas eller rostfritt ståll och som har följande dimensioner: a) längd: 1 till 3 m. En relativt kort kolonn bör användas om fettsyror med långa kedjor (längre än C20) finns närvarande. I analys av fettsyror med 4 eller 6 kolatomer rekommenderas att en kolonn på 2 m i längd används. b) innerdiameter: 2 till 4 mm. Anm 3: Om fleromättade komponenter med fler än 3 dubbelbindningar finns närvarande kan de sönderdelas i en kolonn av rostfritt stål. Anm 4: Ett system med dubbla packade kolonner kan användas. 3.1.3.2 Fyllning, sammansatt av följande element a) bärare: syratvättad och silaniserad kiselgur, eller annan lämplig inert bärare med en kornstorlek med liten avvikelse (25 μm inom gränserna 125 till 200 μm) varvid genomsnittskornstorleken skall avpassas efter innerdiametern och längden på kolonnen. b) stationär fas: polyestertyp av polar vätska (t.ex. dietylenglykolpolysuccinat, butandiolpolysuccinat, etylenglykolpolyadipat, osv) cyanosilikoner eller någon annan vätska som tillåter den behövliga kromatografiska separationen (se punkt 4). Den stationära fasen bör uppgå till 5 till 20 % (m/m) av fyllningen. En ickepolar stationär fas kan användas för vissa separationer. 3.1.3.3 Preparering av kolonnen Om möjligt tas kolonnen bort från detektorn, ugnen upphettas stegvis till 185 °C och en ström av inert gas blåses igenom den nybehandlade kolonnen med en hastighet av 20 till 60 ml per minut i åtminstone 16 timmar vid denna temperatur och under ytterligare två timmar vid 195 °C.

3.1.4 Kapillärkolonn 3.1.4.1 Rör som är tillverkade av ett material som är inert för ämnen som skall analyseras (vanligen glas eller kvarts). Innerdiametern skall vara mellan 0,2 och 0,8 mm. Den inre ytan skall genomgå en lämplig behandling (t ex ytpreparering, inaktivering) innan den får täckning av den stationära fasen. En längd på 25 mm är tillräcklig i de flesta fall. 3.1.4.2 Stationär fas, vanligen av typen polyglykol [poly(etylenglykol) 20 000], polyester (butandiol polysuccinat) eller polärpolysiloxan (cyanosilikoner). Tvärbundna kolonnfyllningar är lämpliga. Anm 5: Det finns en risk att polära polysiloxaner ger upphov till svårighet att identifiera och separera linolensyra och C20-syror. Beläggningen skall vara tunn, dvs 0,1 till 0,2 μm. 3.1.4.3 Sammansättning och konditionering av kolonnen Följ de normala försiktighetsåtgärderna för att sätta ihop kapillärkolonnerna, dvs placeringen av kolonnen i ugnen (bärare) val och sammansättning av skarvar (läckaget) placering av kolonnens in- och utlopp i injektorn och detektorn (minskning av dödutrymmen). Placera kolonnen i en ström av bärargas [t.ex. 0,3 bar (30 kPa) för en kolonn med längden 25 mm och en innerdiameter på 0,3 mm]. Behandla kolonnen genom temperaturprogrammering av ugnen till 3 °C/minut från omgivningstemperaturen till en temperatur som är 10 °C under sönderfallsgränsen för den stationära fasen. Håll ugnen vid denna temperatur i en timme, tills baslinjen har stabiliserats. Gå tillbaka till 180 °C för att arbeta under isoterma förhållanden. Anm 6: Lämpliga förbehandlade kolonner finns tillgängliga i handeln.

3.1.5 Detektor som lämpligen skall kunna värmas upp till en temperatur som ligger ovanför kolonntemperaturen.

3.2 Sprutor

Sprutorna skall ha en maximivolym av 10 μl och vara graderade i 0,1 μl delning.

3.3 Registering

Om registreringskurvan skall användas för att beräkna sammansättningen av den blandning som analyseras, krävs en elektronisk registreringsapparat med hög precision och som är kompatibel med apparaturen som används. Registreringsenheten skall ha följande karaktäristika:

a) svarstid, under 1,5 sekunder, företrädesvis 1 sekund (svarshastigheten är tiden det tar för pennan att gå från 0 till 90 % vid en plötslig ingångssignal på 100 %),

b) pappersbredd minimum 20 cm,

c) pappershastighet inställbar på värden mellan 0,4 och 2,5 cm/minut.

3.4 Integreringsenhet

Snabb och exakt beräkning kan genomföras med hjälp av en elektronisk integreringsenhet. Den skall ge ett linjärt svar med tillräcklig känslighet och korrektionen för avvikelser från baslinjen skall vara tillfredsställande.

4. UTFÖRANDE

De arbeten som beskrivs i 4.1 till 4.3 är relaterade till användning av en flamjoniseringsdetektor.

Som alternativ kan en gaskromatograf som använder sig av en katarometerdetektor användas (som arbetar enligt principen om förändringar i värmeledning). Driftförhållandena modifieras som beskrivs i punkt 6.

4.1 Provningsförhållanden

4.1.1 Val av optimala provningsförhållanden. 4.1.1.1 Packad kolonn Vid val av provningsförhållanden skall hänsyn tas till följande variabler: a) längden och diametern hos kolonnen, b) sorten och mängden av den stationära fasen, c) temperaturen hos kolonnen, d) bärargasen flöde, e) den upplösning som krävs, f) storleken på det uttagna provet som har valts på ett sådant sätt att detektorn och elektrometer ger ett linjärt utslag, g) analysens tidslängd. I allmänhet ger de värden som anges i tabell 1 och tabell 2 de önskade resultatet, dvs minst 2 000 teoretiska bottnar per meter kolonnlängd för metylstearat och en elueringstid på ca 15 minuter. Om utrustningen tillåter skall injektorn hållas vid en temperatur av ca 200 °C och detektorn vid en temperatur som är lika med eller högre än den i kolonnen. Som regel gäller att förhållandet mellan flödet hos vätet som tillförs till flamjoniseringsdetektorn och bärargasen varierar från 1:2 till 1:1 beroende på diametern på kolonnen. Syreflödet är ca 5 till 10 gånger vätets flöde.



Tabell 1 Inre diameter hos kolonnen mm Bärargasflöde ml/min 2 15 till 25 3 20 till 40 4 40 till 60



Tabell 2 Koncentration av den stationära fasen % (m/m) Kolonntemperatur °C 5 175 10 180 15 185 20 185 4.1.1.2 Kapillärkolonn Effektivitets- och permeabilitetsegenskaperna hos kapillärkolonnen medför att separationen mellan komponenterna och tiden för analysen i hög grad är beroende av flödeshastigheten på bärargasen i kolonnen. Det är därför nödvändigt att optimera driftförhållandena genom att påverka denna parameter (eller enklare tryckfall i kolonnen) beroende på om man önskar förbättra separationen eller göra en snabb analys.

4.1.2 Bestämning av antalet teoretiska bottnar (effektivt) och upplösning (se figur 1). Genomför analys av en blandning av metylstearat och metyloleat i ungefär lika proportioner (t.ex. metylestrar av kakaosmör). Välj temperaturen för kolonnen och bärargasens flöde så att maximum på metylstearattoppen registreras ca 15 minuter efter lösningsmedelstoppen. Använd en tillräcklig mängd av blandningen av metylestrar så att metylstearattoppen upptar ungefär 3/4 av hela skalan. Beräkna antalet teoretiska bottnar, n, med hjälp av formeln och upplösningen R, med hjälp av formeln där: dr1 är retentionsavståndet i mm från början av kromatogrammet till maximitoppen för metylstearat, w1 och w2 är bredderna i mm av topparna för metylstearat respektive metyloleat mätt mellan punkterna för tangeternas skärningspunkt vid de punkter där kurvorna skär baslinjen, och Δ är avståndet i mm mellan toppmaxima för metylstearat och metyloleat, ▼M2 och upplösningsindex, lr, med hjälp av formeln där: a = höjden av den minsta toppen, mätt från baslinjen, b = höjden av den lägsta punkten på botten mellan de två angränsande topparna, mätt från baslinjen. ▼B Figur 1 Kromatogram för bestämning av antalet teoretiska bottnar (effektivitet) och upplösning Driftförhållandena som skall väljas är sådana som kan ge åtminstone 2 000 teoretiska bottnar per meter av kolonnlängden för metylstearat och en upplösning som är minst 1,25.

4.2 Prov

Använd sprutan (3.2) och sug upp 0,1 till 2 μl av lösningen av metylestrar som preparerats enligt bilaga 10 B och spruta in dem i kolonnen.

När det gäller estrar som inte är i lösning, preparera en lösning av ca 100 mg/ml av kromatografiskt ren heptan och spruta in 0,1 till 1 μl av denna lösning.

Om analysen gäller ämnen i spårmängder, kan mängden av provet ökas (upp till 10 gånger).

4.3 Analys

I allmänhet skall driftförhållandena vara de som angetts i 4.1.1.

Det går emellertid att arbeta med en lägre kolonntemperatur när det krävs bestämning av fettsyror med mindre än 12 kolatomer eller vid högre temperaturer vid bestämning av fettsyror med mera än 20 kolatomer.

Ibland kan det vara möjligt att använda temperaturprogrammering i båda dessa fall. Om provet t ex innehåller metylestrar av fettsyror med mindre än 12 kolatomer, sprutas provet in vid 100 °C (eller vid 50 till 60 °C om smörsyra finns närvarande) och sedan höjs temperaturen omedelbart med en hastighet av 4 till 8 °C per minut till optimal temperatur. I vissa fall kan de två förfarandena kombineras.

Efter den programmerade uppvärmningen fortsätts elueringen vid en konstant temperatur tills alla komponenterna eluerats. Om inte instrumentet har programmerad uppvärmning, använd det vid två bestämda temperaturer mellan 100 och 195 °C.

Om så är nödvändigt rekommenderas att analysen genomförs på två fasta faser med olika polaritet för att påvisa frånvaron av maskerade toppar t ex när det gäller samtidig närvaro av C18:3 och C20:0, eller C18:3 och C18:2.

4.4 Beredning av referenskromatogrammet och referensgraferna

Analysera referensstandardblandningen (2.3) med användande av samma driftförhållande som de som använts för provet och mät retentionstiderna eller retentionsavstånden för de närvarande fettsyrorna. Rita på halvlogaritmiskt papper för varje grad av omättnad de kurvor som visar den logaritmiska retentionstiden eller avståndet som en funktion av antalet kolatomer. Under isoterma förhållanden skall kurvorna för syror med raka kolkedjor med samma grad av omättnad vara räta linjer. Dessa linjer skall vara ungefär parallella.

Det är nödvändigt att undvika förhållanden som gör att ”maskerade toppar” existerar, dvs där upplösningen är otillräcklig för att separera två av de ingående ämnena.

5. RESULTATANGIVELSER

5.1 Kvalitativ analys

Identifiera topparna för metylestrarna från provet från de kurvor som iordningställts enligt 4.4 om så behövs genom interpolering.

5.2 Kvantitativ analys

5.2.1 Bestämning av sammansättningen Bortsett från extrema fall användes den inre normaliseringsmetoden, dvs antag att alla ingående komponenter i provet finns representerade på kromatogrammet så att den totala ytan under topparna representerar 100 % av de ingående ämnena (total eluering). Om utrustningen innefattar en integreringsenhet, använd de kurvor som erhållits från denna. Om inte, bestäm arean under varje topp genom att multiplicera höjden på toppen med dess bredd på mitten och där så behövs med hänsyn till de olika avvikelserna som används under registreringen.

5.2.2 Beräkningssätt 5.2.2.1 Allmänt fall Beräkna halten av en given komponent i, uttryckt som massprocent av metylestrar, genom att bestämma den procent som representeras av området hos motsvarande toppar relativt summan av områdena för alla toppar med användning av formeln: där: Ai är arean under toppen som motsvarar komponent i, ΣA är summan av areorna under alla toppar, Ange resultatet med en decimal. Anm 7: I det här allmänna fallet anses resultatet av beräkningen som baseras på relativa områden representera massprocent. För de fall där inte detta antagande är tillåtet, se 5.2.2.2. 5.2.2.2 Användning av korrektionsfaktorer I vissa fall, t.ex. i närvaro av fettsyror med färre än 8 kolatomer eller fettsyror med sekundära grupper, när termiska ledningsdetektorer används eller där högsta graden av noggrannhet särskilt krävs, skall korrektionsfaktorer användas för att omvandla procenten för toppareorna till massprocent hos komponenterna. Bestäm korrektionsfaktorerna med hjälp av ett kromatogram som erhållits genom analys av en referensblandning med metylestrar av känd sammansättning genomförda under identiskt samma förhållanden som de som används vid analys av provet. För denna referensblandning erhålls massprocenten av komponenten i genom formeln där: mi är massan hos komponenten i i referensblandningen. m är den totala massan av de olika komponenterna i referensblandningen. Beräkna ur kromatogrammet för referensblandningen (4.4) procenten (area/area) för komponent i på följande sätt: där: Ai är arean under toppen som motsvarar komponenten i, A är summan av areorna under alla topparna, Korrektionsfaktorn beräknas sedan som: Vanligen är korrektionsfak