1994R0086 — SV — 03.02.1999 — 001.001 — 1
Detta dokument är endast avsett som dokumentationshjälpmedel och institutionerna ansvarar inte för innehållet
►B KOMMISSIONENS FÖRORDNING (EG) nr 86/94
av den 19 januari 1994
om införande av en referensmetod för bestämning av sitosterol och stigmasterol i smör
(EGT L 17, 20.1.1994, s. 7)
Ändrad genom:
Officiella tidningen
nr sida datum
►M1Kommissionens förordning (EG) nr 175/1999 av den 26 januari 1999 L 20 22 27.1.1999
1994R0086 — SV — 03.02.1999 — 001.001 — 2
▼B
KOMMISSIONENS FÖRORDNING (EG) nr 86/94
av den 19 januari 1994
om införande av en referensmetod för bestämning av sitosterol och
stigmasterol i smör
EUROPEISKA GEMENSKAPERNAS KOMMISSION HAR ANTAGIT
DENNA FÖRORDNING
med beaktande av Fördraget om upprättandet av Europeiska gemen-
skapen,
med beaktande av rådets förordning (EEG) nr 804/68 av den 27 juni
1968 om den gemensamma organisationen av marknaden för mjölk ochmjölkprodukter(
1), senast ändrad genom förordning (EEG) nr 2071/
92 (2), särskilt artikel 6.7 i denna, och
med beaktande av följande:Smör kan spåras och de spårade produkterna måste kontrolleras i
enlighet med artiklarna 3 oc h 6 i kommissionens förordning (EEG) nr
570/88 (
3), senast ändrad genom förordning (EG) nr 3049/93 (4).
För att förhindra otillåten användning av subventionerat smör är det
viktigt att kraven i samband med spårning av smör ovillkorligenuppfylls.
Med hänsyn till vikten av spårningen för att detta system skall fungera
korrekt är det nödvändigt att fastställa gemensamma metoder för påvis-ning av samtliga spårämnen som krävs enligt detta system och attmetoderna tillämpas på samma sätt inom hela gemenskapen. Dettaskulle bland annat säkerställa lika behandling av samtliga aktörer somhar tillgång till detta system samt undanröja ojämlika konkurrensförhål-landen som för närvarande kan förekomma till följd av tillämpningen avolika nationella analysmetoder.
En referensmetod för bestämning av stigmasterol och sitosterol i
smörolja har fastställts genom kommissionens förordning (EEG) nr3942/92 (
5). Denna metod kan tillämpas i något ändrad form för bestäm-
ning av sterolspårämnen i smör.
Metodens noggrannhet och toleransgränser måste bestämmas.De åtgärder som föreskrivs i denna förordning är förenliga med
yttrandet från Förvaltningskommittén för mjölk och mjölkprodukter.
HÄRIGENOM FÖRESKRIVS FÖLJANDE.
Artikel 1
Den referensmetod för analys som skall tillämpas för bestämning av
innehållet av stigmasterol eller β-sitosterol i smör i enlighet med artikel
6i►M1förordning (EG) nr 2571/97 ◄anges i bilagan.
Smör har spårats på ett korrekt sätt om de erhållna resultaten överens-
stämmer med de krav som anges i punk t 8 i bilagan till den här
förordningen.
Artikel 2
Denna förordning träder i kraft den tredje dagen efter det att den har
offentliggjorts i Europeiska gemenskapernas officiella tidning .
Den skall tillämpas från och med den 1 april 1994.
Denna förordning är till alla delar bindande och direkt tillämplig i alla
medlemsstater.
(1) EGT nr L 148, 28.6.1968, s. 13.
(2) EGT nr L 215, 30.7.1992, s. 64.
(3) EGT nr L 55, 1.3.1988, s. 31.
(4) EGT nr L 273, 5.11.1993, s. 7.
(5) EGT nr L 399, 31.12.1992, s. 29.
1994R0086 — SV — 03.02.1999 — 001.001 — 3
▼B
BILAGA
BESTÄMNING AV SITOSTEROL ELLER STIGMASTEROL I SMÖR
GENOM GASKROMATOGRAFI MED KAPILLÄRKOLONN
1. RÄCKVIDD OCH TILLÄMPNINGSOMRÅDE
Metoden utgörs av ett förfarande för kvantitativ bestämning av sitosterol
eller stigmasterol i smör. Med sitosterol avses summan av β-sitosterol
och 22-dihydro- β-sitosterol, andra sitosteroler anses vara utan betydelse.
Metoden skall tillämpas på prover som tagits i enlighet med förordning(EEG) nr 570/88.
2. PRINCIP
Smöret förtvålas med kaliumhydroxid i en etanollösning och de icke-
förtvålningsbara beståndsdelarna extraheras med dietyleter.
Sterolerna omvandlas till trimetylsilyletrar och analyseras genom gask-
romatografi i en kapillärkolonn med betulin som intern standard.
3. UTRUSTNING
3.1. En 150 ml kolv till förtvålning med återloppskylare med inslipade
anslutningar.
3.2. 500 ml separertratt.3.3. 250 ml kolvar.3.4. Tryckutjämningskärl, 250 ml eller motsvarande, för att samla upp över-
bliven dietyleter.
3.5. Glaskolonn, 350 mm × 20 mm med insmält filterplatta.3.6. Vattenbad eller värmemantel.3.7. Reaktionskärl, 2 ml.3.8. Gaskromatograf lämplig för kapillärkolonn med splitinjektor bestående
av:
3.8.1. termostatstyrd kolonnugn som kan hålla den önskade temperaturen ± 1
°C.
3.8.2. injektorblock med temperaturinställning,
3.8.3. flamjonisationsdetektor och signalförstärkare,3.8.4. integratorskrivare som kan användas tillsammans med signalförstärkaren
(3.8.3).
3.9. Kapillärkolonn i kvartsglas helt belagd med BP1 eller motsvarande
beläggning med en enhetlig tjocklek av 0,25 µm. Kolonnen skall kunnaseparera trimetylsilylderivat av lanosterol och sitosterol; en BP1-kolonnsom är 12 m lång med en inre diameter på 0,2 mm är lämplig.
3.10. En 1 µl mikrospruta för gaskromatografi med härdad nål.
4. REAGENSER
Alla reagenser skall vara av för analytiska ändamål godkänd klass.
Vattnet skall vara destillerat vatten eller vatten med minst motsvaranderenhetsgrad.
4.1. Etanol med en lägsta renhetsgrad av 95 %.4.2. Kaliumhydroxid, 60-procentig lösning: lös 600 g kaliumhydroxid (minst
85 %) i vatten och späd med vatten till 1 liter.
4.3. Betulin med en lägsta renhetsgrad av 99 %.
4.3.1. Intern standardlösning. Betulin i dietyleter (4.4).
4.3.1.1. Betulinlösning som används vid bestämning av sitosterol skall ha
koncentrationen 1,0 mg/ml.
1994R0086 — SV — 03.02.1999 — 001.001 — 4
▼B
4.3.1.2. Betulinlösning som används vid bestämning av stigmasterol skall ha
koncentrationen 0,4 mg/ml.
4.4. Analytiskt ren dietyleter (fri från peroxider och återstod).4.5. Natriumsulfat, vattenfritt granulat som torkats vid 102 °C i två timmar.
4.6. Silyleringsreagens, t.ex. TRI-SIL (kan beställas från Pierce Chemical
Co., katalognr: 49001) eller motsvarande. (VARNING: TRI-SIL ärlättantändligt, frätande, giftigt och möjligen cancerogent. Laboratorie-personal skall ha kännedom om säkerhetsbestämmelserna för TRI-SILoch vidta lämpliga försiktighetsåtgärder.)
4.7. Lanosterol.4.8. Sitosterol, med en fastställd lägsta renhetsgrad av 90 % (P).
Anmärkning 1: Renhetsgraden hos standardämnen som används för
kalibrering skall bestämmas genom tillämpning av standardiseringsprin-cipen. Antag att alla steroler som finns i provet finns representerade påkromatogrammet, att topparnas totala area representerar 100 % av sterol-beståndsdelarna och att sterolerna ger samma detektorrespons. Systemetslinjäritet skall kontrolleras för de aktuella koncentrationsområdena.
4.8.1. Standardlösning av sitosterol - bered en lösning som med 0,001 mg/ml
noggrannhet innehåller ca 0,5 mg/ml (W
1) sitosterol (4.8) i dietyleter
(4.4).
4.9. Stigmasterol med en fastställd lägsta renhetsgrad av 90 % (P).4.9.1. Standardlösning av stigmasterol - bered en lösning som med 0,001
mg/ml noggrannhet innehåller ca 0,2 mg/ml (W
1) stigmasterol (4.9) i
dietyleter (4.4).
4.10. Lösning för kontroll av upplösningsförmågan. Bered en lösning som
innehåller 0,05 mg/ml lanosterol (4.7) och 0,5 mg/ml sitosterol (4.8) idietyleter (4.4).
5. FÖRFARANDE
5.1. Beredning av standardlösningar för kromatografi. Den interna standard-
lösningen (4.3.1) skall tillsättas den aktuella sterolstandardlösningensamtidigt som den tillsätts det förtvålade provet (se 5.2.2).
5.1.1. Sitosterolstandardlösning för kromatografi: överför 1 ml sitosterolstan-
dardlösning (4.8.1) till vart och ett av de två reaktionskärlen (3.7) ochavlägsna dietyletern med en kväveström. Tillsätt 1 ml intern standardlös-ning (4.3.1.1) och avlägsna dietyletern med en kväveström.
5.1.2. Stigmasterolstandardlösning för kromatografi: överför 1 ml stigmaste-
rolstandardlösning (4.9.1) till vart och ett av de två reaktionskärlen (3.7)och avlägsna dietyletern med en kväveström Tillsätt 1 ml intern stan-dardlösning (4.3.1.2) och avlägsna dietyletern med en kväveström.
5.2. Beredning av icke-förtvålbara beståndsdelar
5.2.1. Smält smörprovet vid en temperatur på högst 35 °C. Blanda provet
noggrant genom omrörning.
Väg med 1 mg noggrannhet upp c a 1 g smör (W
2) i en 150 ml kolv
(3.1). Tillsätt 50 ml etanol (4.1) och 10 ml kaliumhydroxidlösning (4.2).Montera återloppskylaren och värm till ca 75 °C i 30 minuter. Avlägsna
kylaren och kyl kolven till omkring rumstemperatur.
5.2.2. Tillsätt 1,0 ml intern standardlösning (4.3.1.1) i kolven om det är sitos-
terol som skall bestämmas, eller (4.3.1.2) om det är stigmasterol somskall bestämmas. Blanda väl. Överför kolvens innehåll kvantitativt tillen 500 ml separertratt (3.2) och skölj kolyen med 50 ml vatten och 250ml dietyleter (4.4). Skaka separertratten kraftigt i två minuter och låtfaserna separera. Den nedre vattenhaltiga fasen tappas av och eterfasentvättas genom att tratten skakas fyra gånger med 100 ml vatten vardera.
1994R0086 — SV — 03.02.1999 — 001.001 — 5
▼B
Anmärkning 2: För att undvika att en emulsion bildas är det viktigt att
de två första vattentvättningarna utförs försiktigt (tratten vänds tiogånger). Vid tredje tvättningen kan tratten skakas kraftigt i 30 sekunder.Om en emulsion bildas kan den brytas ned genom tillsats av 5—10 mletanol. Om etanol tillsätts, är det viktigt att utföra ytterligare två grund-liga tvättningar med vatten.
5.2.3. Den klara, tvålfria eterfasen får passera en glaskolonn (3.5) som inne-
håller 30 g vattenfritt natriumsulfat (4.5). Etern uppsamlas i en 250 mlkolv (3.3). Tillsätt en koksten och förånga etern nästan helt i vattenbadeller med värmemantel och samla noggrant upp resterande lösnings-medel.
Anmärkning 3: Om provextrakt förångas fullständigt vid för hög
temperatur kan sterolförlust förekomma.
5.3 Beredning av trimetylsilyletrar
5.3.1. Överför den resterande eterlösningen i kolven till ett 2 ml reaktionskärl
(3.7) med 2 ml dietyleter och avlägsna etern med en kväveström. Sköljkolven ytterligare två gånger med 2 ml dietyleter vardera. Innehålletöverförs varje gång till reaktionskärlet och etern förångas med kväve.
5.3.2. Provet silyleras genom tillsats av 1 ml TRI-SIL (4.6). Förslut kärlet och
skaka kraftigt så att provet löses. Om det inte löses fullständigt genomskakning, värm till 65-70 °C. Låt stå i minst fem minuter innan det
sprutas in i gaskromatografen. Silylera standardlösningarna på sammasätt som provet. Silylera lösningen för kontroll av upplösningsförmågan(4.10) på samma sätt som proven.
Anmärkning 4: Silylering skall ske i vattenfri miljö. Ofullständig sily-
lering av betulin indikeras av en andra topp intill betulinets topp.
Förekomst av etanol kommer att påverka silyleringen. Om tvättningen i
extraktionsskedet är otillräcklig kan detta problem uppstå. Omproblemet kvarstår kan en femte tvättning göras under extraktionenvarvid reaktionskärlet skakas kraftigt i 30 sekunder.
5.4. Gaskromatografisk analys
5.4.1. Kromatografiförhållanden
Installera gaskromatografen enligt bruksanvisningen.
Riktlinjerna för kromatografins utförande är följande:
— kolonntemperatur 265 °C
— injektortemperatur 280 °C
— detektortemperatur 300 °C
— bärargasens flödeshastighet 0,6 ml/minut— vätets tryck 84 kPa— lufttryck 155 kPa— splitsystemet ställs in på mellan 10:1 och 50:1 och optimeras i
enlighet med bruksanvisningen, varefter detektorresponsens linjäritetkontrolleras inom de aktuella koncentrationsområdena.
Anmärkning 5: Det är särskilt viktigt att injektorsatsen rengörs regel-
bundet.
— Insprutad mängd: 1 µl trimetylsilyleterlösning.
Systemet skall vara i jämvikt och responsen stabil innan analysen
påbörjas.
Dessa förhållanden kan varieras om särskilda egenskaper hos kolonnen
och gaskromatografen gör det nödvändigt för att erhålla kromatogramsom uppfyller följande krav:
1994R0086 — SV — 03.02.1999 — 001.001 — 6
▼B
— sitosteroltoppen skall vara tydligt skild från lanosteroltoppen. Figur
1 visar hur ett typiskt kromatogram av en silylerad lösning förkontroll av upplösningsförmågan (4.10) skall se ut,
— den relativa retentionstiden för följande steroler bör vara ungefär
kolesterol 1,0
stigmasterol 1,3sitosterol 1,5betulin 2,5
— retentionstiden för betulin bör vara ungefär 24 minuter.
5.4.2. Analysförfarande
Injicera 1 µl silylerad standardlösning (stigmasterol eller sitosterol) och
justera integratorns kalibreringsparametrar.
Injicera ytterligare 1 µl silylerad standardlösning för bestämning av
responsfaktorerna med betulin som intern standard.
Injicera 1 µl silylerad provlösning och mät topparnas areor. Varje
kromatografisk serie skall inledas och avslutas med insprutning av stan-dardlösningar.
Som regel bör en standardlösning insprutas efter varje serie om sex
insprutningar av provlösning.
Anmärkning 6: Integrering av stigmasteroltoppen bör inbegripa even-
tuell svansning enligt definition i punkterna 1, 2 oc h 3 i figur 2b.
Integrering av sitosteroltoppen bör inbegripa toppen för 22-dihydro- β-
sitosterol (stigmastanol) som eluerar omedelbart efter sitosterol, se figur3b, när den totala kvantiteten sitosterol bestäms.
6. BERÄKNING AV RESULTAT
6.1. Bestäm arean för steroltopparna och betulintopparna i båda referenskro-
matogrammen kring en serie och beräkna R
1på följande sätt:
R1=Genomsnittlig toppareal för sterol i standardlösning
Genomsnittlig toppareal för betulin i standardlösning
Bestäm arealen för steroltoppen (stigmasterol eller sitosterol) och betu-
lintoppen i provet och beräkna R2på följande sätt:
R2=Toppareal för sterol i provet
Toppareal för betulin i provet
W1= Mängden sterol (mg) i 1 ml standardlösning (4.8.1 eller 4.9.1).
W2= Provets vikt (g) (5.2.1).
P = Standardsterolens renhetsgrad (4.8 eller 4.9).
Mängden sterol i provet (mg/kg) =R2
R1×W1
W2×P×1 0 .
7. METODENS NOGGRANNHET
7.1. Repeterbarhet
7.1.1. Stigmasterol
Skillnaden mellan resultaten av två analyser som inom kortast möjliga
tidsintervall utförts av samma kemist med användning av samma utrust-ning på identiskt lika prover får inte överstiga 19,3 mg/kg.
7.1.2. Sitosterol
Skillnaden mellan resultaten av två analyser som inom kortast möjliga
tidsintervall utförts av samma kemist med användning av samma utrust-ning på identiskt lika prover får inte överstiga 23,0 mg/kg.
1994R0086 — SV — 03.02.1999 — 001.001 — 7
▼B
7.2. Reproducerbarhet
7.2.1. Stigmasterol
Skillnaden mellan resultaten av två analyser som utförts av kemister i
olika laboratorier med användning av olika utrustningar på identiskt likaprover får inte överstiga 31,9 mg/kg.
7.2.2. Sitosterol
Skillnaden mellan resultaten av två analyser som utförts av kemister i
olika laboratorier med användning av olika utrustningar på identiskt likaprover får inte överstiga 8,7 % av genomsnittet av resultaten.
7.3. Källa till precisionsdata
Precisionsdata bestämdes genom ett experiment som utfördes 1992 i åtta
olika laboratorier med sex prover (tredubbla blindtester) för stigmasteroloch med sex prover (tre dubbla blindtester) för sitosterol.
8. TOLERANSGRÄNSER
▼
M1
8.1 Tre prover skall tas från den spårade produkten för att kontrollera att
produkten har spårats på rätt sätt.
▼B
8.2. Stigmasterol
8.2.1. 150 g stigmasterol med en lägsta renhetsgrad av 95 % iblandas per ton
smör, dvs. 142,5 mg/kg, eller 170 g stigmasterol med en lägsta renhets-grad av 85 % per ton smör, dvs. 144,5 mg/kg.
▼
M1
8.2.2 Analysresultaten av de tre produktproverna skall användas för att
kontrollera renhetsgraden och homogeniteten av spårämnets iblandningoch det lägsta resultatet skall jämföras med följande gränser (med ettkonventionellt konfidensintervall på 95 % (CrD95)):
— 116,0 mg/kg (95 % av den minsta tilllåtna iblandningen för stigmas-
terol med en lägsta renhetsgrad av 95 %).
— 118,0 mg/kg (95 % av den minsta tilllåtna iblandningen för stigmas-
terol med en lägsta renhetsgrad av 85 %).
— 81,0 mg/kg (70 % av den minsta tillåtna iblandningen för stigmas-
terol med en lägsta renhetsgrad av 95 %).
— 82,0 mg/kg (70 % av den minsta tillåtna iblandningen för stigmas-
terol med en lägsta renhetsgrad av 85 %).
Koncentrationen av spårämne i det prov som ger det lägsta resultatet
jämförs med en interpolering mellan antingen 116,0 mg/kg och 81,0mg/kg eller 118,0 mg/kg och 82,0 mg/kg
▼
B
8.3. Sitosterol
8.3.1. 600 g sitosterol med en lägsta renhetsgrad av 90 % iblandas per ton
smör, dvs. 540 mg/kg.
▼M1
8.3.2 Analysresultaten av de tre produktproverna skall användas för att
kontrollera renhetsgraden och homogeniteten av spårämnets iblandningoch det lägsta resultatet skall jämföras med följande gränser (med ettkonventionellt konfidensintervall på 95 % (CrD95)):
— 486,0 mg/kg (95 % av den minsta tilllåtna iblandningen för sitosterol
med en lägsta renhetsgrad av 90 %).
— 358,0 mg/kg (70 % av den minsta tilllåtna iblandningen för sitosterol
med en lägsta renhetsgrad av 90 %).
Koncentrationen av spårämne i det prov som ger det lägsta resultatetjämförs med en interpolering mellan 486,0 mg/kg och 358,0 mg/kg.
1994R0086 — SV — 03.02.1999 — 001.001 — 8
▼M1

1994R0086 — SV — 03.02.1999 — 001.001 — 9
▼M1

1994R0086 — SV — 03.02.1999 — 001.001 — 10
▼M1