1994D0577 — SV — 05.07.1999 — 001.001 — 1
Detta dokument är endast avsett som dokumentationshjälpmedel och institutionerna ansvarar inte för innehållet
►B KOMMISSIONENS BESLUT
av den 15 juli 1994
om djurhälsokrav och utfärdande av veterinärintyg vid import av tjursperma från tredje land
(94/577/EG)
(EGT L 221, 26.8.1994, s. 26)
Ändrat genom:
Officiella tidningen
nr sida datum
►M1 Kommissionens beslut 1999/495/EG av den 1 juli 1999 L 192 56 24.7.1999
1994D0577 — SV — 05.07.1999 — 001.001 — 2
▼B
KOMMISSIONENS BESLUT
av den 15 juli 1994
om djurhälsokrav och utfärdande av veterinärintyg vid import av
tjursperma från tredje land
(94/577/EG)
EUROPEISKA GEMENSKAPERNAS KOMMISSION HAR ANTAGIT
DETTA DIREKTIV
med beaktande av Fördraget om upprättandet av Europeiska gemen-
skapen,
med beaktande av rådets direktiv 88/407/EEG av den 14 juni 1988 om
djurhälsokrav som är tillämpliga vid handel inom gemenskapen medoch import av sperma från tamdjur av nötkreatur (
1), senast ändat genom
direktiv 93/60/EEG (2), särskilt artiklarna 10 och 11 i detta, och
med beaktande av följande:Förteckningen över de tredje länder från vilka medlemsstaterna tillåter
import av tjursperma (nedan benämnd ”Förteckningen över tredjeländer”) fastställs i kommissionens beslut 90/14/EEG (
3), ändrat genom
beslut 91/276/EEG (4).
På grund av sjukdomssituationen i Israel infördes genom kommissio-
nens beslut 91/277/EEG (5) ett förbud mot import från det landet.
I kommissionens beslut 91/479/EEG (6), 91/549/EEG (7), 92/
123/EEG (8), 92/124/EEG (9), 92/125/EEG (10), 92/126/EEG (11), 92/
127/EEG (12), 92/128/EEG (13), 92/386/EEG (14), 92/387/EEG (15) och
92/445/EEG (16) fastställs kraven på djurens hälsa och villkoren för
utfärdande av veterinärintyg vid import av tjursperma från USA,Canada, Polen, Finland, Nya Zeeland, Österrike, Schweiz, Sverige,Ungern, Norge respektive Tjeckoslovakien.
Genom direktiv 93/60/EEG, vilket skall vara genomfört i medlemssta-
terna före den 1 juli 1994, ändras direktiv 88/407/EEG på ett sätt somgör det nödvändigt att ändra i de beslut avseende tredje land som nämnsovan. För att förenkla och förtydliga gemenskapens lagstiftning på dettaområde är det nödvändigt att sammanställa de ovan nämnda besluten tillett gemensamt beslut och att upphäva giltigheten för dem som gällerenskilda länder.
Tack vare bestämmelserna i Avtalet om Europeiska ekonomiska samar-
betsområdet är det inte nödvändigt att bibehålla kravet på djurhälsointygvid import av tjursperma från Österrike, Finland, Norge och Sverige.
Enligt yttrandet från Vetenskapliga veterinärmedicinska kommittén är
det nödvändigt att införa ett test avseende epizootisk hemorragisksjukdom.
Rutinmässiga förhandstester av denna sjukdom med sex månaders inter-
valler sker endast iCanada.
(1) EGT nr L 194, 22.7.1988, s. 10.
(2) EGT nr L 186, 28.7.1993, s. 28.
(3) EGT nr L 8, 11.1.1990, s. 71.
(4) EGT nr L 135, 30.5.1991, s. 58.
(5) EGT nr L 135, 30.5.1991, s. 60.
(6) EGT nr L 258, 16.9.1991, s. 1.
(7) EGT nr L 298, 29.10.1991, s. 6.
(8) EGT nr L 48, 22.2.1992, s. 1.
(9) EGT nr L 48, 22.2.1992, s. 10.
(10) EGT nr L 48, 22.2.1992, s. 19.
(11) EGT nr L 48, 22.2.1992, s. 28.
(12) EGT nr L 48, 22.2.1992, s. 37.
(13) EGT nr L 48, 22.2.1992, s. 46.
(14) EGT nr L 204, 21.7.1992, s. 13.
(15) EGT nr L 204, 21.7.1992, s. 22.
(16) EGT nr L 247, 27.8.1992, s. 1.
1994D0577 — SV — 05.07.1999 — 001.001 — 3
▼B
För att ge de kanadensiska veterinärmyndigheterna tillräckligt med tid
för att införa det nya testet i sitt rutinprogram är det därför nödvändigtmed en övergångsperiod för införandet av detta beslut vad avserCanada.
Framstegen på senare tid vad avser förståelsen av bluetongue-epidemio-
login gör det möjligt att framdeles tillåta import av tjursperma frånAustralien.
Det förefaller som om djurhälsosituationen i de länder som finns med
på förteckningen över tredje länder är god och att den vad avsersjukdomar som kan överföras via sperma kontrolleras av välstrukture-rade och välorganiserade veterinärväsende.
De ansvariga veterinärmyndigheterna i de tredje länderna har åtagit sig
att underrätta kommissionen och medlemsstaterna via telex eller telefaxsenast 24 timmar efter bekräftelse på förekomsten av någon av desjukdomar som finns på Internationella byrån för epizootiska sjukdomarOIEs förteckning A eller på varje förändring av vaccinationspolitikensom berör dem, eller -inom rimlig tid - på förekomsten av sjukdomar påOIEs förteckning B samt på varje föreslagen ändring av importreglernaför husdjur eller för sperma eller embryon av husdjur.
De ansvariga veterinärmyndigheterna i de länder som finns med på
förteckningen över tredje länder har åtagit sig att officiellt övervakautfärdandet av intyg enligt detta beslut och att säkerställa att samtligarelevanta intyg, avvikelser och laboratorieresultat som legat till grundför utfärdandet av intyget förblir officiellt registrerade i minst 12månader efter att sperman som de avser har avsänts.
De ansvariga veterinärmyndigheterna i de länder som finns med på
förteckningen över tredje länder har åtagit sig att för stationer förinsamling av tjursperma avsedd att exporteras till Europeiska ekono-miska gemenskapen ansvara för det officiella godkännande som fast-ställs i artikel 9 i direktiv 88/407/EEG.
Kraven på djurens hälsa och villkoren för utfärdandet av veterinärintyg
skall anpassas till djurhälsosituationen i det berörda tredje landet.
De åtgärder som föreskrivs i detta beslut är förenliga med yttrandet från
den Ständiga veterinärkommittén.
HÄRIGENOM FÖRESKRIVS FÖLJANDE.
Artikel 1
Medlemsstaterna skall tillåta import av tjursperma som uppfyller de
krav som anges ii ntygen idel 1 av bi lagorna A, B, C och D samtendast från de länder som anges i del 2 av bilagorna A, B, C respektiveD.
Fram till den 31 december 1994 skall dock medlemsstaterna tillåta
import från Canada av tjursperma som samlats in och behandlats ienlighet med beslut 91/549/EEG.
Artikel 2
Beslut 91/479/EEG, 92/123/EEG, 92/124/EEG, 92/125/EEG, 92/
126/EEG, 92/127/EEG, 92/128/EEG, 92/386/EEG, 92/387/EEG, och92/445/EEG skall upphöra att gälla.
Beslut 91/549/EEG skall upphöra att gälla från och med den 1 januari
1995.
Artikel 3
Bestämmelserna iarti kel 1 första stycket skall ifråga om Canada gälla
från och med den 1 januari1995.
Artikel 4
Detta beslut riktar sig till medlemsstaterna.
1994D0577 — SV — 05.07.1999 — 001.001 — 4
▼B
BILAGA A
DEL I
DJURHÄLSOINTYG
för import av tjursperma

1994D0577 — SV — 05.07.1999 — 001.001 — 5
▼B

1994D0577 — SV — 05.07.1999 — 001.001 — 6
▼B
►(1)◄
►(2)◄
iii) har behandlats, förvarats och transporterats under förhållanden som uppfyller kraven i direktiv 88 /
407/EEG.
Utfärdat i ........................................................
(ort)den ..............................................................
(datum)
/SS74Stämpel (2)Underskrift (2): ......................................................................
Namn med tryckbokstäver: ........................................................
Officiell titel: . .......................................................................
►(2)◄
(2) Underskriften och stämpeln skall ha en färg som avviker från tryckfärgen.
►(1)M1
►(2)M1
1994D0577 — SV — 05.07.1999 — 001.001 — 7
▼B
DEL 2
Förteckning över länder som får använda det djurhälsointyg som visas i
bilaga A del 1
TJECKIENUNGERNNYA ZEELANDPOLENRUMÄNIENSCHWEIZSLOVAKIEN
1994D0577 — SV — 05.07.1999 — 001.001 — 8
▼B
BILAGA B
DEL I
DJURHÄLSOINTYG
för import av tjursperma från USA

1994D0577 — SV — 05.07.1999 — 001.001 — 9
▼B

1994D0577 — SV — 05.07.1999 — 001.001 — 10
▼B
►(1)◄
►(2)◄
iii) har behandlats, förvarats och transporterats under förhållanden som uppfyller kraven i direktiv 88 /
407/EEG.
iv) är samlad från tjurar som vid två tillfällen med högst 12 månaders mellanrum, med negativa resultat,
före och efter samlingen, har genomgått följande tester vid ett godkänt laboratorium (testet efte r
samlingen skall göras på ett blodprov taget senast 21 dagar efter samlingen av sperman avsedd fö r
export):
— ett kompetitivt Elisa-test på förekomsten av bluetongue i enlighet med bilaga E,
— ett agargelimmunodiffusionstest enligt bilaga E och ett virusneutralisationstest på förekomsten a v
alla serotyper av epizootisk hemorragisk sjukdom som är kända i det exporterande landet.
Utfärdat i ........................................................
(ort)den ..............................................................
(datum)
/SS74Stämpel (2)Underskrift (2): ......................................................................
Namn med tryckbokstäver: ........................................................
Officiell titel: . .......................................................................
►(2)◄
(2) Underskriften och stämpeln skall ha en färg som avviker från tryckfärgen.
►(1)M1
►(2)M1
1994D0577 — SV — 05.07.1999 — 001.001 — 11
▼B
DEL 2
Förteckning över länder som får använda det djurhälsointyg som visas i
bilaga B del 1
USA
1994D0577 — SV — 05.07.1999 — 001.001 — 12
▼B
BILAGA C
DEL I
DJURHÄLSOINTYG
för import av tjursperma

1994D0577 — SV — 05.07.1999 — 001.001 — 13
▼B

1994D0577 — SV — 05.07.1999 — 001.001 — 14
▼B
►(1)◄
►(2)◄
iii) har behandlats, förvarats och transporterats under förhållanden som uppfyller kraven i direktiv 88 /
407/EEG.
iv) är samlad från tjurar som
— vistades på den godkända tjurstationen den 1 juli 1994,
eller
— sattes in på den godkända tjurstationen efter den 1 juli 1994, och som med negativa resultat, för e
insättningen har genomgått följande tester på förekomsten av bluetongue och epizootisk hemorra -
gisk sjukdom vid ett godkänt laboratorium samt i båda avseendena, med negativa resultat var sjätt e
månad testas med
— ett kompetitivt Elisa-test på förekomsten av bluetongue i enlighet med bilaga E,— ett agargelimmunodiffusionstest enligt bilaga E och ett virusneutralisationstest på förekomsten a
v
alla serotyper av epizootisk hemorragisk sjukdom som är kända i det exporterande landet.
Utfärdat i ........................................................
(ort)den ..............................................................
(datum)
/SS74Stämpel (2)Underskrift (2): ......................................................................
Namn med tryckbokstäver: ........................................................
Officiell titel: . .......................................................................
►(2)◄
(2) Underskriften och stämpeln skall ha en färg som avviker från tryckfärgen.
►(1)M1
►(2)M1
1994D0577 — SV — 05.07.1999 — 001.001 — 15
▼B
DEL 2
Förteckning över länder som får använda det djurhälsointyg som visas i
bilaga C del 1
CANADA: dock inte regionen Okanagan Valley i British Columbia, dvs. det
område som avgränsas av en linje dragen från en punkt på gränsenmellan Canada och USA 120 °15 /prime1longitud, 49 °latitud nord till en
punkt 119 °35 /prime1longitud, 50 °30 /prime1latitud nordost till en punkt 119 °
longitud, 50 °45 /prime1latitud syd till en punkt på gränsen mellan Canada
och USA 118 °15 /prime1longitud och 49 °latitud.
1994D0577 — SV — 05.07.1999 — 001.001 — 16
▼B
BILAGA D
DEL I
DJURHÄLSOINTYG
för import av tjursperma

1994D0577 — SV — 05.07.1999 — 001.001 — 17
▼B

1994D0577 — SV — 05.07.1999 — 001.001 — 18
▼B
►(1)◄
►(2)◄
iii) har behandlats, förvarats och transporterats under förhållanden som uppfyller kraven i direktiv 88 /
407/EEG.
iv) är samlad från tjurar som vid två tillfällen med högst 12 månaders mellanrum, med negativa resultat,
före och efter samlingen, har genomgått följande tester vid ett godkänt laboratorium (testet efte r
samlingen skall göras på ett bodprov taget senast 21 dagar efter samlingen av sperman avsedd fö r
export):
— ett kompetitivt Elisa-test på förekomsten av bluetongue i enlighet med bilaga E,
— ett agargelimmunodiffusionstest enligt bilaga E och ett virusneutralisationstest på förekomsten a v
alla serotyper av epizootisk hemorragisk sjukdom som är kända i det exporterande landet,
— ett serumneutralisationstest på förekomsten av Akabanevirus.
Utfärdat i ........................................................
(ort)den ..............................................................
(datum)
/SS74Stämpel (2)Underskrift (2): ......................................................................
Namn med tryckbokstäver: ........................................................
Officiell titel: . .......................................................................
►(2)◄
(2) Underskriften och stämpeln skall ha en färg som avviker från tryckfärgen.
►(1)M1
►(2)M1
1994D0577 — SV — 05.07.1999 — 001.001 — 19
▼B
DEL 2
Förteckning över länder som får använda det djurhälsointyg som visas i
bilaga D del 1
AUSTRALIEN
1994D0577 — SV — 05.07.1999 — 001.001 — 20
▼B
BILAGA E
ProtokollavseendeettkompetitivtElisa-testmedanvändningavengrupps-
pecifik monoklonal antikropp (MAB) avsett påvisa eventuell förekomst av
antikroppar mot bluetongue-virus
KOMPETITIVT ELISA PÅ FÖREKOMST AV BLUETONGUE MED
ANVÄNDNING AV MONOKLONAL ANTIKROPP 3-17-A3
Testet kan användas för att påvisa förekomsten av antikroppar mot alla kända
serotyper av bluetongue-virus (BTV).
Testprincipen är den att avbryta reaktionen mellan BTV-antigen och en grupps-
pecifik monoklonal antikropp (3-17-A3) genom att tillsätta utspädningar avtestserum. Antikroppar mot BTV i testserumet blockerar den monoklonala antik-roppens förmåga att reagera och medför en minskning av den färgutveckling somförväntas vid tillsättning av enzymsubstrat.
MATERIAL OCH REAGENSER
1. Flatbottnade mikrotiterplåtar.
2. Antigen, beredd enligt beskrivningen nedan.3. Blockerande buffertlösning : 5 % (mw/w) ”Marvel” torrmjölkpulver, 0,1%
(v/v) Tween-20 (levereras som polyoxyetylensorbitonmonolauratsirap) ifosfatbuffrad saltlösning (PBS).
4. Monoklonal antikropp: 3-17-A3 (levereras som hybridom cellkultur super-
natant), lagras vid −20 °C eller frystorkad, utspädd till förhållandet 1:50
med blockerande buffertlösning före användning, riktad mot den gruppspe-cifika polypeptiden P7.
5. Konjugat: kanin-antimusglobulin (absorberat och eluerat), konjugerat till
pepparrotsperoxidase och förvarat i mörker vid 4 °C.
6. Substrat och kromogen: 0,2 g ortofenyldiamin (OPD) upplöst i en buffert-
lösning bestående av 2,553 g citronsyra och 4,574 g dinatriumhydrogenor-tofosfat, vilken tillsatts destillerat vatten upp till sammanlagt 500 ml,uppdelad iali kvoter om 25 ml och förvarad imörker vi d −20 °C och med
tillsättning av 12 µl/25 ml väteperoxid (30 % w/v) omedelbart före använd-
ningen.
IAKTTAG FÖRSIKTIGHET VID HANTERING AV OPD — BÄR
GUMMIHANDSKAR — MISSTÄNKS VARA MUTAGEN.
7. 1 Molar svavelsyra: 26,6 ml syra blandat i473,4 ml desti llerat vatten.
KOM IHÅG — DET ÄR SYRAN SOM SKALL BLANDAS I VATTNET,
ALDRIG VATTNET I SYRAN.
8. Roterande blandare.9. Elisa-plåtläsare (provet kan avläsas visuellt).
1994D0577 — SV — 05.07.1999 — 001.001 — 21
▼B
TESTFORMAT
TESTPROTOKOLL
Blindprovkontroll
1 A-H är en blindprovkontroll bestående av BTV-antigen och konjugat. Det kan
användas som ett blindprov för Elisa-läsaren.
Kontroll av MAB
2 A-H är kontrollen av den monoklonala antikroppen och består av BTV-
antigen, monoklonal antikropp och konjugat. Den är en negativ kontroll.Medelvärdet av absorbansavläsningar från denna kontrollrad utgör inhibitions-värdet 0 %.
Positiv kontroll
3 A-H är den positiva kontrollen. Den består av BTV-antigen, BTV-positiva
antiserumutspädningar, MAB och konjugat. Den är avsedd som en indikatorpå att provet fungerar som det skall och inhibitionsnivåerna bör vara lika fråntest till test.
1994D0577 — SV — 05.07.1999 — 001.001 — 22
▼B
Testserum
Enligt testformatet ovan kan 18 serum provas med ett utspädningsförhållande
av 1/2, 1/4, 1/8 och 1/16. Detta ger en viss antydan om antikropptitern itestserumet. Utspädningsserien kan utökas ytterligare så att titerna för seru-mutspädning når slutpunkten. Alternativt kan serum vid storskaliga serologiskaundersökningar provas i en enkel utspädning (1/4) eller två utspädningar (1/2och 1/4) som ett snabbscreeningprov.
TILLVÄGAGÅNGSSÄTT
1. Späd ut BTV-antigen till förtitrerad koncentration i fosfatbuffrad saltlös-
ning (PBS), ultraljudsbehandla ett kort ögonblick för att sprida ut ackumu-lerat virus (om ultraljudsutrustning inte finns tillgänglig, pipettera kraftigt)och tillför 50 µl i Elisa-plåtens alla hål. Knacka på plåtens sidor så att
antigenet sprids.
2. Inkubera vid 37 °C i60 mi nuter ien roterande blandare. Tvätta plåtarna 3
gånger genom att skölja ur och tömma hålen med osteril PBS och läskatorrt med absorberande papper.
3. Tillsätt 50 µl blockerande buffertlösning i varje hål. Tillsätt testserum och
positivt serum i relevanta hål och späd ut utmed hela plåten med hjälp aven flerkanalspipett. Tillsätt inte serum till blindprovkontrollen eller MAB-kontrollen.
4. Späd, omedelbart efter tillsatsen av testserum, ut MAB i den blockerande
buffertlösning (för att förtitrera lösningen) och tillför 50 µl iplåtens alla
hål, dock inte för blindprovkontrollen.
5. Inkubera vid 37 °C i60 mi nuter ien roterande blandare. Skölj ur tre gånger
med PBS och läska torrt.
6. Späd ut kanin-antimuskoncentrat till 1/5 000 i blockerande buffertlösning
och tillsätt 50 µl iplattans alla hål.
7. Inkubera vid 37 °C i60 mi nuter ien roterande blandare. Skölj ur tre gånger
med PBS och läska torrt.
8. Tina OPDn och tillsätt omedelbart före användningen 12 µla v3 0%
väteperoxid i varje 25 ml OPD. Tillsätt 50 µl isamtli ga hål iplåten. Låt
färgen utvecklas i ca. 10 minuter och stoppa reaktionen me d 1 M svavel-
syra (50 µl per hål). Färgen skall utvecklas iMAB-kontrollhålen och ide
hål som innehåller serum UTAN antikropp mot BTV.
9. Granska och registrera plåtarna visuellt eller med en spektrofotometrisk
läsare.
ANALYS AV RESULTATEN
Beräkna medelavläsningen för OD med hjälp av MAB-kontrollerna. Detta repre-
senterar inhibitionsvärdet 0 %. Absorbansavläsningar av testserumen uttryckssom procent inhibitionsvärden med hjälp av följande formel:
Procent inhibitionsvärde = 100 − OD vid förekomst av testserumOD vid frånvaro
av testserum × 100
Större inhibitionsvärden än 40 % vid serumutspädning anses som positiva.
Visuell avläsning är möjlig eftersom 40 % inhibition är det lägsta värdet somögat lätt kan urskilja.
BEREDNING AV BTV ELISA-ANTIGEN
1. Tvätta 10 roux konfluenta BHK-21-celler tre gånger med serumfritt
Eagles medium och infektera med bluetongue-virus, serotyp 1 i serumfrittEagles medium.
2. Inkubera vid 37 °C och undersök dagligen med avseende på cytopatisk
effekt (CPE).
3. 3. Om CPE kan konstateras i80-90 % av cellski ktet ivarje roux skall
viruset samlas in genom att skaka loss de celler som eventuelltsitter kvar på glaset.
4. Centrifugera vid 2 000-3 000 vpm för att pressa samman cellerna.5. Tag bort supernatanten och slamma cellerna på nytt ica. 30 ml PHS som
innehålle r 1 % ”Sarkosyl” och 2 ml fenolmetylsulfonylfluorid (lysisbuf-
fert). Detta kan medföra att cellerna bildar en gelé och ytterligare lysisbuf-fert kan tillföras för att minska denna effekt.
OBS! Fenylmetylsulfonylflorid är skadligt - iakttag mycket stor försik-
tighet.
1994D0577 — SV — 05.07.1999 — 001.001 — 23
▼B
6. Spräng cellerna i 60 sekunder med en ultraljudssond vid en amplitud av
30 mikron.
7. Centrifugera vid 10 000 vpm i 10 minuter.8. Förvara supernatanten vid +4 °C och slamma den kvarvarande cellmassan
i10-20 ml lysi sbuffert.
9. Ultraljudsbehandla och genomför en klarning, med förvaring av superna-
tanten ivarje skede, sammanlagt tre gånger.
10. Samla supernatanterna och centrifugera vid 24 000 vpm i 120 minuter vid
+4°C på en 5 ml kudde av 40 % sackaros (w/v iPBS) med hjälp av 30
ml centrifugrör typ Beckmann och en SW 28-rotor.
11. Tag bort supernatanten, töm rören helt och slamma massan iPBS med
hjälp av ultraljud. Förvara antigenen i alikvoter vid −70 °C.
TITRERING AV BTV ELISA-ANTIGEN
Bluetongue Elisa-antigen titreras med indirekt Elisa. Dubbla utspädningar av
antigen titreras mot en konstant utspädning (1:50) av monoklonal antikropp(3-17-A3). Här följer protokollet:
TILLVÄGAGÅNGSSÄTT
1. Späd ut BTV-antigen i PBS över hela mikrotiterplåten i en dubbel utspäd-
ningsserie (50 µl/hål) med en flerkanalspipett.
2. Inkubera i en timme vid 37 °C ien roterande blandare.
3. Skölj plåtarna tre gånger med PBS.4. Tillför 50 µl monoklonal antikropp 3-17-A3 (utspädd 1:50) i varje hål på
mikrotiterplåten.
5. Inkubera i en timme vid 37 °C ien roterande blandare.
6. Skölj plåtarna tre gånger med PBS.7. Tillsätt i varje hål av mikrotiterplåten 50 µl kanin-antimusglobulin konju-
gerat till pepparotsperoxidas, utspätt till en förtitrerad optimal koncentra-tion.
8. Inkubera i en timme vid 37 °C iden roterande blandaren.
9. Tillsätt substrat och kromogen enligt tidigare beskrivning. Stoppa reak-
tionen efter 10 minuter genom att tillsätta 1 Molar svavelsyra (50 µl/hål).
Vid det kompetitiva testet skall det finnas ett överskott på monoklonal antikropp.
Därför skall en utspädning av antigenet väljas som ligger på titreringskurvan(inte på den plana delen), vilket ger ca 0,8 OD efter 10 minuter.
Protokoll för ett agargelimmunodiffusionstest avsett att påvisande den ev.
förekomsten av antikroppar mot epizootisk hemorragisk sjukdom
Agargelimmunodiffusionstestet skall utföras enligt följande protokoll:
MATERIALOCH REAGENSER
1. Antigen
Antigen som fäller ut förbereds i ett cellodlingssystem som klarar den
snabba förökningen av de aktuella serotyperna av epizootisk hemorragisktsjukdomsvirus. BKH eller Vero-celler rekommenderas. Antigen före-kommer i den supernatanta vätskan när virustillväxten har upphört, menkräver en 50-100-faldig koncentration för att vara effektiv. Denna kanerhållas med en standardprocedur för proteinkoncentrering. Virus i anti-genet kan inaktiveras genom att tillsätta 0,3 % (v/v) betapropiolakton.
2. Känt positiv kontrollserum
Med hjälp av det internationella referensserumet och antigen framställs ett
nationellt standardserum, vilket standardiseras i det optimala förhållandetmot det internationella referensserumet, frystorkas och används som detkända kontrollserumet ivarje prov.
3. Testserum
TILLVÄGAGÅNGSSÄTT
1. 1 % agaros som beretts i borat eller natriumbarbitolbuffert, pH 8,5 till 9,
hälls i en petriskål med ett djup av minst 3 mm.
2. Ett testmönster bestående av sju fuktfria hål, vardera 5,0 mm i diameter,
skärs iagaren. Mönstret består av ett mi tthål och, runt detta, sex hål utlagdai en cirkel med en radie av 3 mm.
1994D0577 — SV — 05.07.1999 — 001.001 — 24
▼B
3. Hålet i mitten fylls med standardantigenet. De kringliggande hålen 2, 4 och
6 fylls med känt positivt serum medan hålen 1, 3 och 5 fylls med test-serum.
4. Systemet inkuberas i upp till 72 timmar vid rumstemperatur i en stängd
fuktkammare.
TOLKNING
Ett testserum är positivt om det bildar en tydlig utfällningslinje med antigenet
och en obruten identitetslinje med kontrollserumet. Ett testserum är negativt omdet inte bildar en tydlig linje med antigenet och inte böjer kontrollserumets linje.Petriskålarna skall granskas i indirekt belysning mot en mörk bakgrund.