01991R2568 — SV — 04.12.2016 — 031.005

Den här texten är endast avsedd som ett dokumentationshjälpmedel och har ingen rättslig verkan. EU-institutionerna tar inget ansvar för innehållet. De autentiska versionerna av motsvarande rättsakter, inklusive ingresserna, publiceras i Europeiska unionens officiella tidning och finns i EUR-Lex. De officiella texterna är direkt tillgängliga via länkarna i det här dokumentet

Ändrad genom:





Rättad genom:







(*) Denna rättsakt finns inte publicerad på svenska.









▼B

KOMMISSIONENS FÖRORDNING (EEG) nr 2568/91

av den 11 juli 1991

om egenskaper hos olivolja och olivolja av pressrester och om lämpliga analysmetoder







▼M20

Artikel 1

1. Oljor vars egenskaper överensstämmer med dem som anges i punkterna 1 och 2 i bilaga I till denna förordning skall anses vara jungfruolja i den mening som avses i punkt 1 a och 1 b i bilagan till förordning nr 136/66/EEG.

2. Olja vars egenskaper överensstämmer med dem som anges i punkt 3 i bilaga I till denna förordning skall anses vara bomolja i den mening som avses i punkt 1 c i bilagan till förordning nr 136/66/EEG.

3. Olja vars egenskaper överensstämmer med dem som anges i punkt 4 i bilaga I till denna förordning skall anses vara raffinerad olivolja i den mening som avses i punkt 2 i bilagan till förordning nr 136/66/EEG.

4. Olja vars egenskaper överensstämmer med dem som anges i punkt 5 i bilaga I till denna förordning skall anses vara olivolja sammansatt av raffinerad olivolja och jungfruolja i den mening som avses i punkt 3 i bilagan till förordning nr 136/66/EEG.

5. Olja vars egenskaper överensstämmer med dem som anges i punkt 6 i bilaga I till denna förordning skall anses vara oraffinerad olja av olivrestprodukter i den mening som avses i punkt 4 i bilagan till förordning nr 136/66/EEG.

6. Olja vars egenskaper överensstämmer med dem som anges i punkt 7 i bilaga I till denna förordning skall anses vara raffinerad olja av olivrestprodukter i den mening som avses i punkt 5 i bilagan till förordning nr 136/66/EEG.

7. Olja vars egenskaper överensstämmer med dem som anges i punkt 8 i bilaga I till denna förordning skall anses vara olivolja av olivrestprodukter i den mening som avses i punkt 6 i bilagan till förordning nr 136/66/EEG.

▼M26

Artikel 2

1. De egenskaper hos oljor som fastställs i bilaga I ska bestämmas med följande analysmetoder:

a) För bestämning av fria fettsyror, uttryckta som procent oljesyra, den metod som anges i bilaga II.

b) För bestämning av peroxidtal, den metod som anges i bilaga III.

c) För bestämning av vaxhalt, den metod som anges i bilaga IV.

d) För bestämning av sammansättningen och halten av steroler och triterpendialkoholer med kapillärgaskromatografi, den metod som anges i bilaga V.

e) För bestämning av andelen 2-glycerylmonopalmitat, den metod som anges i bilaga VII.

f) För spektrofotometri, den metod som anges i bilaga IX.

▼M28

g) För bestämning av fettsyrasammansättning, den metod som anges i bilaga X.

▼M26

h) För bestämning av flyktiga, halogenerade lösningsmedel, den metod som anges i bilaga XI.

i) För utvärdering av organoleptiska egenskaper hos jungfruolja, den metod som anges i bilaga XII.

j) För bestämning av stigmastadiener, den metod som anges i bilaga XVII.

k) För bestämning av triglyceridhalt enligt ECN 42, den metod som anges i bilaga XVIII.

▼M28

l) För bestämning av halten av alifatiska alkoholer och triterpenalkoholer, den metod som anges i bilaga XIX.

▼M26

m) För bestämning av halterna av vaxer, fettsyrametylestrar och fettsyraetylestrar, den metod som anges i bilaga XX.

▼M28 —————

▼M26

2. Den granskning som nationella myndigheter eller deras företrädare utför av organoleptiska egenskaper hos jungfruolja ska genomföras av paneler som godkänts av medlemsstaterna.

De organoleptiska egenskaper hos en olivolja som avses i första stycket ska anses överensstämma med den angivna kategorin om en panel som godkänts av den berörda medlemsstaten bekräftar denna klassificering.

Om panelen beträffande de organoleptiska egenskaperna inte bekräftar den kategori som angivits för olivoljan, ska de nationella myndigheterna eller deras företrädare, på begäran av den berörda parten, utan dröjsmål låta andra godkända paneler göra två kontrollbedömningar, varav minst en ska utföras av en panel som godkänts av den berörda producentmedlemsstaten. Egenskaperna ska anses överensstämma med de angivna egenskaperna om båda kontrollbedömningarna bekräftar den angivna klassificeringen. Om så inte är fallet ska den berörda parten stå för kostnaden för kontrollbedömningarna.

3. När det gäller de nationella myndigheternas eller deras företrädares granskningar av att oljorna har de egenskaper som föreskrivs i punkt 1, ska proverna tas i enlighet med de internationella standarderna EN ISO 661 beträffande provberedning och EN ISO 5555 beträffande provtagning. Utan hinder av vad som sägs i punkt 6.8 i standard EN ISO 5555 ska emellertid proverna från partier av nämnda oljor i detaljhandelsförpackningar tas i enlighet med bilaga Ia till denna förordning. När det gäller oljor i bulk för vilka provtagningen inte kan utföras i enlighet med EN ISO 5555, ska provtagningen utföras i enlighet med anvisningar som fastställts av den behöriga myndigheten i medlemsstaten.

Utan att det påverkar tillämpningen av standarden EN ISO 5555 och kapitel 6 i standarden EN ISO 661, ska proverna så snabbt som möjligt skyddas mot ljus och höga temperaturer och skickas till laboratorieanalys senast fem arbetsdagar efter provtagning, eller bevaras på ett sådant sätt att de inte bryts ner eller skadas under transport eller lagring innan de skickas till laboratorium.

4. För utförandet av den kontroll som föreskrivs i punkt 3 ska de analyser som avses i bilagorna II, III, IX, XII och XX, samt de eventuella kontrollanalyser som föreskrivs i de nationella lagstiftningarna, utföras före bästföredatum om det rör sig om förpackade produkter. När det gäller provtagning av oljor i bulk ska analyserna utföras senast sex månader efter den månad då provet togs.

Ingen tidsfrist ska tillämpas för de övriga analyser som föreskrivs i denna förordning.

Om resultatet av analyserna inte stämmer överens med egenskaperna för den kategori olivolja eller olivolja av pressrester som uppgetts, utom om provtagningen gjorts mindre än två månader före minsta hållbarhetsdatum, ska den berörda parten underrättas om detta minst en månad före utgången av den tidsfrist som avses i första stycket.

5. För olivoljeegenskaper som fastställs med metoderna i punkt 1 första stycket ska analysresultaten direkt jämföras med de gränser som föreskrivs i den här förordningen.

▼M25

Artikel 2a

1. Vid tillämpningen av denna artikel ska med saluförd olivolja avses den totala kvantitet olivolja och olivolja av pressrester från en viss medlemsstat som konsumeras i den medlemsstaten eller exporteras från den medlemsstaten.

2. Medlemsstaterna ska se till att kontroller av överensstämmelse utförs selektivt, baserat på en riskanalys, och med lämplig intervall, så att man säkrar att den olivolja som saluförs överensstämmer med den deklarerade kategorin.

3. Riskanalysen kan omfatta följande kriterier:

a) Kategori av olja, produktionsperiod, priset på oljor i förhållande till andra vegetabiliska oljor, blandning och förpackning, lagringsanläggningar och lagringsförhållanden, ursprungsland, destinationsland, transportmedel och partiets volym.

b) Aktörernas position i saluföringskedjan, den volym och/eller det värde som de saluför, de olika kategorier av oljor de saluför, den typ av verksamhet som utförs, t.ex. pressning, lagring, raffinering, blandning, förpackning eller återförsäljning.

c) Resultaten från tidigare kontroller, inklusive antal och typ av konstaterade brister, gängse kvalitet på de saluförda oljorna eller nivå på den tekniska utrustning som används.

d) Tillförlitligheten hos aktörernas kvalitetssäkringssystem eller system för egenkontroll vad avser överensstämmelsen med handelsnormerna.

e) Den plats där kontrollen utförs, i synnerhet om det är den första införselplatsen till unionen, sista utförselplatsen från unionen eller den plats där oljorna produceras, förpackas, lastas eller säljs till slutkonsumenten.

f) Varje annan uppgift som kan utgöra tecken på att det finns en risk för bristande överensstämmelse.

4. Medlemsstaterna ska i förväg fastställa

a) kriterier för bedömning av risken för att partier inte överensstämmer med normerna,

b) på grundval av en riskanalys för varje kategori, det minsta antalet aktörer eller partier och/eller kvantiteter som ska omfattas av en kontroll av överensstämmelse.

Minst en kontroll av överensstämmelse ska utföras per år och per tusen ton saluförd olivolja i medlemsstaten.

5. Medlemsstaten ska kontrollera överensstämmelsen genom att

a) i valfri ordning genomföra de analyser som föreskrivs i bilaga I, eller

b) följa den ordning som anges i beslutsschemat i bilaga Ib till dess att man når fram till ett av de beslut som anges i beslutsschemat.

▼M19 —————

▼M25

Artikel 3

Om det fastställs att en olja inte överensstämmer med kategoribeskrivningen, ska den berörda medlemsstaten, utan att det påverkar eventuella andra sanktioner, tillämpa effektiva, proportionella och avskräckande sanktioner som ska bestämmas mot bakgrund av hur allvarlig den konstaterade överträdelsen är.

Om det vid kontrollerna konstateras betydande oegentligheter ska medlemsstaterna öka antalet kontroller avseende försäljningsled, kategori av olja, ursprung eller andra kriterier.

▼M5

Artikel 4

▼M19

1. Medlemsstaterna kan godkänna provsmakningspaneler för de nationella myndigheternas eller deras företrädares bedömning och kontroll av de organoleptiska egenskaperna.

Villkoren för godkännande skall fastställas av medlemsstaterna, på ett sådant sätt att

— de motsvarar villkoren i bilaga 12.4,

— det säkerställs att panelens ordförande har utbildats vid en inrättning, och under förhållanden, som godkänts av medlemsstaten,

— godkännandets giltighet är avhängig av de resultat som erhålls genom ett system för årliga kontroller som medlemsstaten upprättat.

Varje medlemsstat skall delge kommissionen en förteckning över de godkända panelerna samt meddela vilka åtgärder som vidtagits i enlighet med denna punkt.

▼M5

2. Om medlemsstaterna har svårigheter att upprätta smakpaneler inom sitt territorium, får de anlita en smakpanel som är godkänd i en annan medlemsstat.

3. Varje medlemsstat skall upprätta en förteckning över smakpaneler som har upprättats av yrkes- eller branschorganisationer enligt de villkor som fastställs i punkt 1 och skall säkerställa att dessa villkor uppfylls.

▼M19 —————

▼B

Artikel 6

1. Oljehalten i oljekakor och andra rester som erhållits vid extraktion av olivolja (KN-nr 2306 90 11 och 2306 90 19 ) skall bestämmas med användning av den metod som anges i bilaga 15.

2. Den oljehalt som anges i punkt 1 skall uttryckas som viktprocent olja i förhållande till torrsubstans.

▼M20

Artikel 7

Gemenskapens bestämmelser om förekomst av föroreningar skall tillämpas.

Beträffande halten av halogenerade lösningsmedel gäller följande gränsvärden för samtliga kategorier av olivolja:

— Högsta tillåtna halt av varje påvisat halogenerat lösningsmedel: 0,1 mg/kg

— Högsta tillåtna total halt av påvisade halogenerade lösningsmedel: 0,2 mg/kg.

▼M25

Artikel 7a

Fysiska eller juridiska personer och grupper av personer som av någon form av professionella eller kommersiella skäl innehar olivolja eller olivolja av pressrester från utvinningen vid olivpressen fram till och med buteljeringsstadiet, ska vara skyldiga att föra register över inkommande eller utgående varor för varje kategori av sådan olja.

Medlemsstaterna ska se till att skyldigheten enligt första stycket uppfylls på vederbörligt sätt.

▼M25

Artikel 8

1. Medlemsstaterna ska meddela kommissionen de åtgärder som genomför denna förordning. De ska informera kommissionen om alla efterföljande ändringar.

2. Medlemsstaterna ska senast den 31 maj varje år överlämna en rapport till kommissionen om genomförandet av denna förordning under det föregående kalenderåret. Rapporten ska minst innehålla resultaten av de kontroller av överensstämmelse som utförts avseende olivoljor enligt de mallar som fastställs i bilaga XXI.

3. De meddelanden som avses i denna förordning ska lämnas i enlighet med kommissionens förordning (EG) nr 792/2009 ( 1 ).

▼B

Artikel 9

Förordning (EEG) nr 1058/77 skall upphöra att gälla.

Artikel 10

1. Denna förordning träder i kraft den tredje dagen efter det att den har offentliggjorts i Europeiska gemenskapernas officiella tidning. Den metod som anges i bilaga 12 skall emellertid tillämpas från ►M1 den 1 november 1992 ◄ , utom då det gäller åtgärder i samband med interventionssystemet.

▼M5

Den metoden skall inte tillämpas för jungfruolja som iordningställs för marknaden före den 1 november 1992

▼B

2. Denna förordning skall inte tillämpas på olivolja och olivolja av pressrester som är förpackad före denna förordnings ikraftträdande och saluförs fram till och med den 31 oktober 1992.

Denna förordning är till alla delar bindande och direkt tillämplig i alla medlemsstater.









BILAGOR

Sammanfattning







Bilaga I Egenskaper hos olivolja Bilaga Ia Provtagning av olivolja och olivolja av pressrester som levereras i detaljhandelsförpackningar Bilaga Ib Beslutsschema för kontroll av att ett prov av olivolja överensstämmer med den kategori som uppgetts Bilaga II Bestämning av fria fettsyror, metod vid låg temperatur Bilaga III Bestämning av peroxidvärdet Bilaga IV Bestämning av vaxhalt med kapillärgaskromatografi Bilaga V Bestämning av sammansättningen och halten av steroler och triterpendialkoholer genom gaskromatografi med kapillärkolonn Bilaga VII ►M21 Bestämning av procentandelen 2-glycerylmonopalmitat ◄ ▼M20 ————— ▼B Bilaga IX Spektrofotometrisk undersökning i ultraviolett ljus ▼M28 Bilaga X Bestämning av fettsyrametylestrar med gaskromatografi ▼B Bilaga XI Bestämning av halten flyktiga halogenerade lösningsmedel i olivolja Bilaga XII Internationella olivoljerådets metod för organoleptisk bedömning av jungfruolja ▼M20 ————— ▼M19 ————— ▼B Bilaga XV Oljehalt i pressrester av oliver Bilaga XVI Bestämning av jodtal Bilaga XVII Metod för bestämning av stigmastadiener i vegetabiliska oljor Bilaga XVIII Bestämning av skillnaden mellan faktiskt och teoretiskt innehåll av triglycerider meD ECN 42 Bilaga XIX ►M28 Bestämning av halten alifatiska alkoholer och triterpenalkoholer med kapillärgaskromatografi ◄ ▼M23 Bilaga XX Metod för bestämning av halter av vaxer, fettsyreetylestrar och fettsyremetylestrar med kapillärgaskromatografi ▼M28 ————— ▼M25 Bilaga XXI Resultat av kontroller av överensstämmelse som utförs på olivolja enligt artikel 8.2

▼M31









BILAGA I

EGENSKAPER HOS OLIVOLJA

Kvalitetsegenskaper







Kategori Syrahalt (%) (*) Peroxidtal mEq O2/kg (*) K232 (*) K268 eller K270 (*) Delta-K (*) Organoleptisk bedömning Fettsyraetylestrar mg/kg (*) Defekternas medianvärde (Md) (*) Medianvärde för fruktighet (Mf) (*) 1. Extra jungfruolja ≤ 0,8 ≤ 20 ≤ 2,50 ≤ 0,22 ≤ 0,01 Md = 0 Mf > 0 ≤ 35 2. Jungfruolja ≤ 2,0 ≤ 20 ≤ 2,60 ≤ 0,25 ≤ 0,01 Md ≤ 3,5 Mf > 0 — 3. Bomolja > 2,0 — — — — Md > 3,5 (1) — — 4. Raffinerad olivolja ≤ 0,3 ≤ 5 — ≤ 1,25 ≤ 0,16 — — — 5. Olivolja bestående av raffinerad olivolja och jungfruolja ≤ 1,0 ≤ 15 — ≤ 1,15 ≤ 0,15 — — — 6. Oraffinerad olivolja av pressrester — — — — — — — — 7. Raffinerad olivolja av pressrester ≤ 0,3 ≤ 5 — ≤ 2,00 ≤ 0,20 — — — 8. Olivolja av pressrester ≤ 1,0 ≤ 15 — ≤ 1,70 ≤ 0,18 — — — (1) Medianvärdet för defekter kan vara lägre än eller lika med 3,5 när medianvärdet för fruktighet lika med 0.

Renhetsegenskaper







Kategori Fettsyrahalt (1) Totalt transolein-isomerer (%) Totalt isomerer av translinolsyra + isomerer av translinolensyra (%) Stigmastadiener mg/kg (2) ►C1 Skillnader: ECN 42 (HPLC) och ECN 42 (teoretisk beräkning) ◄ 2-glycerilmonopalmitat (%) Myristinsyra (%) Linolensyra (%) Eikosansyra (arakinsyra) (%) Eikosensyra (%) Behensyra (%) Lignocerinsyra (%) 1. Extra jungfruolja ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,50 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,05 ≤ 0,05 ≤ 0,05 ►C1 ≤ |0,2| ◄ ≤ 0,9 om totalhalten palmitinsyra ≤ 14 % ≤ 1,0 om totalhalten palmitinsyra > 14 % 2. Jungfruolja ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,50 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,05 ≤ 0,05 ≤ 0,05 ►C1 ≤ |0,2| ◄ ≤ 0,9 om totalhalten palmitinsyra ≤ 14 % ≤ 1,0 om totalhalten palmitinsyra > 14 % 3. Bomolja ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,50 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,10 ≤ 0,10 ≤ 0,50 ►C1 ≤ |0,3| ◄ ≤ 0,9 om totalhalten palmitinsyra ≤ 14 % ≤ 1,1 om totalhalten palmitinsyra > 14 % 4. Raffinerad olivolja ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,50 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,30 — ►C1 ≤ |0,3| ◄ ≤ 0,9 om totalhalten palmitinsyra ≤ 14 % ≤ 1,1 om totalhalten palmitinsyra > 14 % 5. Olivolja bestående av raffinerad olivolja och jungfruolja ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,50 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,30 — ►C1 ≤ |0,3| ◄ ≤ 0,9 om totalhalten palmitinsyra ≤ 14 % ≤ 1,0 om totalhalten palmitinsyra > 14 % 6. Oraffinerad olivolja av pressrester ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,50 ≤ 0,30 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,10 — ►C1 ≤ |0,6| ◄ ≤ 1,4 7. Raffinerad olivolja av pressrester ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,50 ≤ 0,30 ≤ 0,20 ≤ 0,40 ≤ 0,35 — ►C1 ≤ |0,5| ◄ ≤ 1,4 8. Olivolja av pressrester ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,50 ≤ 0,30 ≤ 0,20 ≤ 0,40 ≤ 0,35 — ►C1 ≤ |0,5| ◄ ≤ 1,2







Kategori Sterolsammansättning Summa steroler (mg/kg) Erytrodiol och uvaol (%) (**) Vaxer mg/kg (**) Kolesterol (%) Brassikasterol (%) Kampesterol (3) (%) Stigmasterol (%) App. β–sitosterol (%) (4) Delta-7-stigmastenol (3) (%) 1. Extra jungfruolja ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < Kamp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 C42 + C44 + C46 ≤ 150 2. Jungfruolja ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < Kamp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 C42 + C44 + C46 ≤ 150 3. Bomolja ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 — ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 (5) C40 + C42 + C44 + C46 ≤ 300 (5) 4. Raffinerad olivolja ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < Kamp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 C40 + C42 + C44 + C46 ≤ 350 5. Olivolja bestående av raffinerad olivolja och jungfruolja ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < Kamp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 C40 + C42 + C44 + C46 ≤ 350 6. Oraffinerad olivolja av pressrester ≤ 0,5 ≤ 0,2 ≤ 4,0 — ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 2 500 > 4,5 (6) C40 + C42 + C44 + C46 > 350 (6) 7. Raffinerad olivolja av pressrester ≤ 0,5 ≤ 0,2 ≤ 4,0 < Kamp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 800 > 4,5 C40 + C42 + C44 + C46 > 350 8. Olivolja av pressrester ≤ 0,5 ≤ 0,2 ≤ 4,0 < Kamp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 600 > 4,5 C40 + C42 + C44 + C46 > 350

Anm.:

a) Analysresultaten ska anges med samma antal decimaler som anges för varje egenskap. Den sista siffran ska avrundas uppåt om efterföljande siffra är högre än 4.

b) Det räcker med att en enda av egenskaperna inte motsvarar det angivna värdet för att en olja ska klassas i en annan kategori eller förklaras ej uppfylla renhetskraven enligt denna förordning.

c) Egenskaper markerade med asterisk (*) och som avser oljans kvalitet anger – för bomolja, att båda gränsvärdena samtidigt får skilja sig från de angivna värdena, – för jungfruoljor, att oljan måste byta kategori om ett eller flera av dessa gränsvärden inte är uppfyllt, men att den förblir klassad inom en kategori för jungfruolja.

d) Egenskaper markerade med två asterisker (**) anger, för all olivolja av pressrester, att båda gränsvärdena samtidigt får skilja sig från de angivna värdena.









Tillägg

BESLUTSSCHEMA

Beslutsschema avseende kampesterol för jungfruolja och extra jungfruolja:

Övriga parametrar ska uppfylla de gränsvärden som fastställs i denna förordning.

Beslutsschema avseende delta-7-stigmastenol för

— Extra jungfruolja och jungfruolja —

Övriga parametrar ska uppfylla de gränsvärden som fastställs i denna förordning.

— Olivolja av pressrester (oraffinerad och raffinerad) —

▼M26









BILAGA Ia

PROVTAGNING AV OLIVOLJA OCH OLIVOLJA AV PRESSRESTER SOM LEVERERAS I DETALJHANDELSFÖRPACKNINGAR

Denna metod för provtagning tillämpas på partier av olivolja och olivolja av pressrester i detaljhandelsförpackningar. Olika provtagningsmetoder tillämpas beroende på om detaljhandelsförpackningen innehåller mer än 5 liter eller inte.

Med parti avses ett antal försäljningsenheter som producerats, framställts och förpackats under sådana förhållanden att oljan i var och en av dessa enheter kan anses vara homogen med avseende på samtliga analysegenskaper. Identifikationen av ett parti ska ske i enlighet med Europaparlamentets och rådets direktiv 2011/91/EU ( 8 ).

Med delprov avses den volym olja som ingår i en detaljhandelsförpackning och tas från ett slumpvis utvalt ställe i partiet.

1. PARTIDELPROVETS INNEHÅLL

1.1. Detaljhandelsförpackningar om högst 5 liter

Med partidelprov för detaljhandelsförpackningar om högst 5 liter avses antalet delprov som tagits från ett parti i enlighet med tabell 1.







Tabell 1 Ett partidelprov ska åtminstone omfatta följande Om detaljhandelsförpackningen rymmer Ska partidelprovet omfatta olja från a) minst 1 liter a) 1 detaljhandelsförpackning b) mindre än 1 liter b) det lägsta antal förpackningar som krävs för att uppnå en total volym på minst 1,0 liter

Det antal förpackningar som avses i tabell 1 och som ska utgöra ett partidelprov kan ökas av varje medlemsstat i enlighet med dess egna behov (t.ex. om en organoleptisk bedömning utförs av ett annat laboratorium än det som gjorde de kemiska analyserna, kontrollanalysen, osv.).

1.2. Detaljhandelsförpackningar som överstiger 5 liter

Med partidelprov för detaljhandelsförpackningar som överstiger 5 liter avses en representativ del av det totala delprovet, vilken erhålls genom ett reduktionsförfarande och i enlighet med tabell 2. Partidelprovet måste bestå av flera exempel.

Med exempel av ett partidelprov avses var och en av de förpackningar som utgör partidelprovet.







Tabell 2 Minsta antalet delprover som ska väljas ut Antal förpackningar i varje parti Minsta antal delprover som ska väljas ut Upp till 10 1 Fr.o.m. … 11 t.o.m. 150 2 Fr.o.m. … 151 t.o.m. 500 3 Fr.o.m. … 501 t.o.m. 1 500 4 Fr.o.m. … 1 501 t.o.m. 2 500 5 > 2 500 per 1 000 förpackningar 1 extra delprov

För att minska volymen av förpackningar homogeniseras innehållet i delproverna för beredningen av partidelprovet. De olika delproven hälls i en gemensam behållare för homogenisering genom omrörning, så att de bäst skyddas från luften.

Innehållet i partidelprovet ska hällas i flera förpackningar med en kapacitet på minst 1,0 liter som var och en utgör ett exempel av partidelprovet.

Antalet partidelprover kan ökas av varje medlemsstat i enlighet med dess egna behov (t.ex. om en organoleptisk bedömning utförs av ett annat laboratorium än det som gjorde de kemiska analyserna, kontrollanalysen, osv.).

Varje förpackning måste fyllas på ett sätt som minimerar luftlagret längst upp och sedan lämpligt förslutas och förseglas för att säkerställa att produkten är skyddad mot åverkan.

Dessa exempel ska märkas för att säkerställa en korrekt identifiering.

2. ANALYSER OCH RESULTAT

2.1. Varje partidelprov ska delas upp i laboratorieprover enligt punkt 2.5 i standarden EN ISO 5555 och analyseras enligt ordningsföljden i det beslutsschema som anges i bilaga Ib eller i någon annan slumpmässig ordning.

2.2. Om samtliga analysresultat överensstämmer med egenskaperna för den kategori olja som uppgetts, ska hela partiet förklaras överensstämma med gällande krav.

Om ett enskilt analysresultat inte överensstämmer med egenskaperna för den kategori olja som uppgetts, ska hela partiet förklaras inte överensstämma med gällande krav.

3. KONTROLL AV VILKEN KATEGORI PARTIET TILLHÖR

3.1. För att kontrollera vilken kategori ett parti tillhör får den behöriga myndigheten öka det antal partidelprover som tas i olika delar av partiet i enlighet med följande tabell:







Tabell 3 Antal partidelprov beroende på partiets storlek Partiets storlek (liter) Antal partidelprover Färre än 7 500 2 Från 7 500 till 25 000 3 Från 25 000 till 75 000 4 Från 75 000 till 125 000 5 Från 125 000 och uppåt 6 + 1 för varje ytteligare 50 000 liter

Varje delprov som utgör ett partidelprov ska tas från ett sammanhängande ställe i partiet. Det är nödvändigt att notera platsen för varje partidelprov och märka det på ett entydigt sätt.

Framställningen av varje partidelprov ska utföras enligt de förfaranden som anges i punkterna 1.1 och 1.2.

Varje partidelprov ska sedan underkastas de analyser som avses i artikel 2.1.

3.2. När ett av resultaten av de analyser som avses i artikel 2.1 på minst ett partidelprov inte överensstämmer med egenskaperna för den kategori olja som uppgetts, ska hela partiet förklaras inte överensstämma med gällande krav.









BILAGA Ib

BESLUTSSCHEMA FÖR KONTROLL AV ATT ETT PROV AV OLIVOLJA ÖVERENSSTÄMMER MED DEN KATEGORI SOM UPPGETTS

Tabell 1

Tabell 2

Tabell 3









Tillägg 1







Jämförelsetabell mellan bilagorna till denna förordning och de analyser som avses i beslutsschemat — Syrahalt Bilaga II Bestämning av fria fettsyror, metod vid låg temperatur — Peroxidtal Bilaga III Bestämning av peroxidtalet — UV-spektrofotometri Bilaga IX Spektrofotometrisk analys — Organoleptisk bedömning Bilaga XII Organoleptisk bedömning av jungfruolja — Etylestrar Bilaga XX Metod för bestämning av halten av vaxer, fettsyrametylestrar och fettsyraetylestrar med kapillärgaskromatografi — 3,5-stigmastadiener Bilaga XVII Metod för bestämning av stigmastadiener i vegetabiliska oljor ▼M28 — Transisomerer av fettsyror Bilaga X Bestämning av fettsyrametylestrar med gaskromatografi — Fettsyrahalt Bilaga X Bestämning av fettsyrametylestrar med gaskromatografi ▼M26 — ΔECN42 Bilaga XVIII Bestämning av triglyceridsammansättningen i ECN 42 (skillnad mellan HPLC-data och teoretisk halt) — Steroler: sammansättning och totalhalt — Erytrodiol och uvaol Bilaga V Bestämning av sammansättningen och halten av steroler och triterpendialkoholer genom gaskromatografi med kapillärkolonn — Vaxer Bilaga IV Bestämning av vaxhalten genom gaskromatografi med kapillärkolonn ▼M28 — Alifatiska alkoholer och triterpenalkoholer Bilaga XIX Bestämning av halten alifatiska alkoholer och triterpenalkoholer med kapillärgaskromatografi ▼M26 — Mättade fettsyror i 2-ställning Bilaga VII Bestämning av procentandelen 2-glycerylmonopalmitat

▼M29









BILAGA II

BESTÄMNING AV FRIA FETTSYROR, METOD VID LÅG TEMPERATUR

1. SYFTE OCH TILLÄMPNINGSOMRÅDE

Metoden avser bestämning av fria fettsyror i olivolja och olivolja av pressrester. Halten av fria fettsyror uttrycks som procentandel oljesyra.

2. PRINCIP

Ett prov löses i en blandning av lösningsmedel och de närvarande fria fettsyrorna titreras med en lösning av kaliumhydroxid eller natriumhydroxid.

3. REAGENSER

Alla reagenser bör vara av analyskvalitet och det vatten som används ska vara destillerat eller ha motsvarande renhet.

3.1 Dietyleter: 95 % etanol (v/v), blandning av lika volymdelar. Neutralisera exakt vid användningstillfället med kaliumhydroxidlösningen (3.2) med tillsats av 0,3 ml av fenolftaleinlösningen (3.3) per 100 ml blandning. Anmärkning 1: Dietyleter är en mycket lättantändlig vätska och kan bilda explosiva peroxider. Särskild försiktighet bör iakttas vid användning. Anmärkning 2: Om det inte är möjligt att använda dietyleter kan en blandning av lösningsmedel som innehåller etanol och toluen användas. Vid behov kan etanolen ersättas av propanol-2.

3.2 Kaliumhydroxid eller natriumhydroxid, titrerad etanol- eller vattenlösning, c(KOH) [eller c(NaOH)] cirka 0,1 mol/l eller, vid behov, c(KOH) [eller c(NaOH)] cirka 0,5 mol/l. Lösningar finns i handeln. Den exakta koncentrationen av kaliumhydroxidlösning (eller natriumhydroxidlösning) ska vara känd och kontrolleras före användning. Använd en lösning som gjorts minst fem dagar före användning och dekanterats i en brun glasflaska med gummipropp. Lösningen bör vara färglös eller halmfärgad. Om fasseparation iakttas vid användning av vattenhaltig lösning av kaliumhydroxid eller natriumhydroxid ska vattenlösningen ersättas med en etanollösning. Anmärkning 3: En stabil färglös lösning av kaliumhydroxid (eller natriumhydroxid) kan framställas på följande sätt: Koka upp 1 000 ml etanol eller vatten med 8 g kaliumhydroxid (eller natriumhydroxid) och 0,5 g aluminiumspån och fortsätt att koka under återflöde under 1 timme. Destillera lösningen omedelbart. Lös den behövliga mängden kaliumhydroxid (eller natriumhydroxid) i destillatet. Låt lösningen stå i flera dagar och dekantera supernatanten från fällningen av kaliumkarbonat (eller natriumkarbonat). Lösningen kan också framställas utan destillation på följande sätt: Tillsätt 4 ml aluminiumbutylat till 1 000 ml etanol (eller vatten) och låt blandningen stå i flera dagar. Dekantera supernatanten och lös den behövliga mängden kaliumhydroxid (eller natriumhydroxid) i den. Lösningen är klar för användning.

3.3 Fenolftalein, 10 g/l lösning i 95–96 procentig etanol (v/v) eller alkaliskt blått 6B eller tymolftalein, 20 g/l lösning i 95–96 procentig etanol (v/v). Vid starkt färgade oljor ska alkaliskt blått eller tymolftalein användas.

4. UTRUSTNING

Vanlig laboratorieutrustning som innefattar:

4.1 Analysvåg

4.2 250 ml E-kolv

4.3 10 ml-byrett klass A, graderad i 0,05 ml, eller motsvarande automatisk byrett.

5. METOD

5.1 Provberedning

Om provet är grumligt ska det filtreras.

5.2 Provmängd

Ta ut ett prov beroende på den förväntade aciditeten i enlighet med följande tabell:







Förväntad aciditet: (oljesyra g/100g) Provmassa (g) Invägningsnoggrannhet (g) 0 till 2 10 0,02 > 2 till 7,5 2,5 0,01 > 7,5 0,5 0,001

Väg in provet i E-kolven (4.2).

5.3 Bestämning

Lös provet (5.2) i 50 till 100 ml av den neutraliserade blandningen av dietyleter och etanol (3.1).

Titrera under omrörning med 0,1 mol/l lösning av kaliumhydroxid (eller natriumhydroxid) (3.2) (se anmärkning 4) tills indikatorn ändrar färg (färgindikatorns färg ska bestå under minst 10 sekunder).

Anmärkning 4: Om den nödvändiga mängden kaliumhydroxidlösning på 0,1 mol/l (eller natriumhydroxidlösning på 0,1 mol/l) överstiger 10 ml, använd en lösning på 0,5 mol/l eller ändra på provets massa utifrån den förväntade fria aciditeten och tabellen över förväntad aciditet.

Anmärkning 5: Om lösningen blir ogenomskinlig under titreringen, tillsätt tillräckligt med lösningsmedel (3.1) för att det ska bli en klar lösning.

Gör en andra bestämning om det första resultatet är högre än det angivna gränsvärdet för den aktuella oljekategorin.

6. RESULTATANGIVELSER

Aciditeten som massprocent av oljesyran motsvaras av följande:

där:

V = volymen kaliumhydroxid (eller natriumhydroxid) i ml som används vid titreringen,

c = den exakta koncentrationen i mol/l av den titrerade kaliumhydroxidlösning (eller natriumhydroxidlösning) som används,

M = 282 g/mol, dvs. molvikten i gram per mol oljesyra,

m = provets massa i gram.

Oljesyran ska anges enligt följande:

a) med två decimaler för värden från 0 till och med 1.

b) med en decimal för värden större än 1 till och med 100.

▼M30









BILAGA III

BESTÄMNING AV PEROXIDVÄRDET

1. Tillämpningsområde

Denna bilaga beskriver en metod för bestämning av peroxidvärdet i animaliska och vegetabiliska oljor och fetter.

2. Definition

Peroxidvärdet är den kvantitet av de substanser i provet uttryckta i milliekvivalenter aktivt O2/kg som oxiderar kaliumjodid under de förhållanden som beskrivs.

3. Princip

Behandling av provet i lösning i ättiksyra och kloroform med en lösning av kaliumjodid. Titrering av den frigjorda joden med ställd natriumtiosulfatlösning.

4. Utrustning

All utrustning som ska användas måste vara fri från reducerande eller oxiderande ämnen.

Anmärkning 1: Smörj inte slipade ytor.

4.1 3 ml glassked.

4.2 Kolvar med slipade halsar och proppar på ca 250 ml, torkade i förväg och fyllda med en torr, ren, inert gas (kväve eller företrädesvis koldioxid).

4.3 Byrett med 5 ml, 10 ml eller 25 ml, graderade i 0,05 ml, helst med automatisk nollpunktsinställning eller motsvarande automatisk byrett.

4.4 Analysvåg.

5. Reagens

5.1 Kloroform, p.a. som befriats från syre genom att en ström av ren, torr inert gas bubblats igenom den.

5.2 Isättika, p.a. som befriats från syre genom att en ström av ren, torr gas bubblats igenom den.

5.3 Kaliumjodid, mättad vattenlösning, nyligen framställd, fri från jod och jodater. Lös cirka 14 g kaliumjodid i cirka 10 ml vatten i rumstemperatur.

5.4 Natriumtiosulfatlösning, 0,01 mol/l (motsvarande 0,01 N) exakt ställd vattenlösning, ställd omedelbart före användning.

Förbered dagligen 0,01 mol/l natriumtiosulfatlösningen färskt från en 0,1 mol/l standardlösning av natriumtiosulfat före användning, eller fastställ den exakta molariteten. Erfarenheten visar att stabiliteten är begränsad och beror på pH-värdet och volymen av fri koldioxid. Använd endast nykokt vatten för utspädning, eventuellt renat med kväve.

Följande förfarande rekommenderas för att fastställa den exakta molariteten av natriumtiosulfatlösningen:

Väg, på 0,001 g när, 0,27–0,33 g kaliumjodid (mKIO3) i en mätkolv (250 ml eller 500 ml) och späd sedan till märket med nykokt vatten (V2), nedkylt till rumstemperatur. Med hjälp av en pipett överförs 5 ml eller 10 ml av denna kaliumjodatlösning (V1) till en 250 ml E-kolv. Tillsätt 60 ml nykokt vatten, 5 ml saltsyra på 4 mol/l och 25 mg till 50 mg kaliumjodid eller 0,5 ml av den mättade kaliumjodidlösningen. Titrera lösningen med natriumtiosulfatlösningen (V3) för att fastställa den exakta molariteten för natriumtiosulfatlösningen.

där

mKIO3 är massan av kaliumjodat, i gram

V1 är volymen av kaliumjodatlösningen, i milliliter (5 ml eller 10 ml)

V2 är den totala volymen av kaliumjodatlösningen, i milliliter (250 ml eller 500 ml)

V3 är volymen av natriumtiosulfatlösningen, i milliliter

wKIO3 är renheten av kaliumjodat i g/100 g

MKIO3 är molekylmassan av kaliumjodat (214 g/mol)

T är den exakta molariteten hos natriumtiosulfatlösningen (mol/l).

5.5 Stärkelselösning, 10 g per liter vattenlösning nyligen framställd av naturlig löslig stärkelse. Motsvarande reagens kan också användas.

6. Prov

Se till att provet tas och bevaras kallt och mörkt i glasbehållare som ska vara helt fyllda, hermetiskt tillslutna med slipade glasproppar eller kork.

7. Förfarande

Analysen måste genomföras i diffust dagsljus eller artificiellt ljus. Väg in i ett vägglas (4.1) eller om inte detta går i en kolv (4.2) på 0,001 g när, en mängd av provet som överensstämmer med följande tabell enligt det förväntade peroxidvärdet:







Förväntat peroxidvärde (meq) Provets vikt (g) 0 till 12 5,0 till 2,0 12 till 20 2,0 till 1,2 20 till 30 1,2 till 0,8 30 till 50 0,8 till 0,5 50 till 90 0,5 till 0,3

Ta bort proppen från en kolv (4.2) och för in vägglaset som innehåller provet. Tillsätt 10 ml kloroform (5.1). Lös provet snabbt under omrörning. Tillsätt 15 ml ättiksyra (5.2) och sedan 1 ml kaliumjodidlösning (5.3). Sätt snabbt i proppen, skaka om under en minut och låt stå i mörker exakt 5 minuter vid en temperatur mellan 15 och 25 °C.

Tillsätt ca 75 ml destillerat vatten. Titrera den frigjorda joden med natriumtiosulfatlösning (5.4) under omskakning och använd stärkelselösning (5.5) som indikator.

Genomför två bestämningar på samma prov.

Genomför samtidigt ett blindprov. Om resultatet av blindprovet överstiger 0,05 ml av 0,01 N natriumtiosulfatlösning (5.4) ersätt de orena reagenserna.

8. Redovisning av resultaten

Peroxidvärdet (PV), uttryckt som milliekvivalenter av aktivt O2/kg erhålls genom följande formel:

där

V = antalet ml av den ställda tiosulfatlösningen (5.4) som används i provet korrigerad för resultatet av blindprovet.

T = den exakta molariteten hos natriumtiosulfatlösningen (5.4) som används, i mol/l.

m = vikten i gram av provet.

Som resultat tas det aritmetiska medelvärdet av de två bestämningarna som genomförts.

Rapportera resultatet uttryckt en decimal.

▼M21









BILAGA IV

BESTÄMNING AV VAXHALT MED KAPILLÄRGASKROMATOGRAFI

1. SYFTE

Metoden avser bestämning av vaxhalten i olivolja. Vaxerna separeras efter antalet kolatomer. Metoden används särskilt för att skilja mellan olivolja som framställts genom pressning och olivolja som framställts genom extraktion.

2. PRINCIP

Oljan blandas med lämplig intern standard och fraktioneras sedan genom kromatografi på kiselgelkolonn. Den fraktion som först elueras under testförhållanden (och som har lägre polaritet än triglyceriderna) samlas upp och analyseras därefter direkt med hjälp av gaskromatografi på kapillärkolonn.

3. UTRUSTNING

3.1 E-kolv 25 ml.

3.2 Gaskromatografikolonn av glas, innerdiameter 15,0 mm, längd 30–40 cm, med kran.

3.3 Gaskromatograf som är anpassad till kapillärkolonn, utrustad med ett system för direktinjektion i kolonnen och bestående av följande: 3.3.1 Termostatstyrd, programmerbar kolonnugn. 3.3.2 ”On column” -injektor för direktinjektion i kolonnen. 3.3.3 En flamjonisationsdetektor och förstärkare. 3.3.4 Skrivare/integrator som är anpassad till förstärkaren (3.3.3), med responstid på högst 1 sekund och med variabel pappershastighet. (Det går också att använda datasystem för insamling av gaskromatografidata via PC.) 3.3.5 Kapillärkolonn av glas eller kvarts, längd 8–12 m, innerdiameter 0,25–0,32 mm, vars vätskefas har en filmtjocklek på 0,10–0,30 μm. (Vätskefas anpassad efter användning, av typen SE52 eller SE 54 som finns i handeln.)

3.4 Sprutor på 10 μl med härdad nål för direktinjektion i kolonnen.

3.5 Elektrisk vibrator.

3.6 Rotationsindunstare.

3.7 Muffelugn.

3.8 Analysvåg med en noggrannhet på + 0,1 mg.

3.9 Standarduppsättning av laboratorieglas.

4. REAGENS

4.1 Kiselgel med en kornstorlek på 60–200 μm. Placera kiselgelen i ugnen vid 500 °C i minst fyra timmar. Efter kylning, tillsätt 2 % vatten till kiselgelen. Skaka ordentligt för att homogenisera blandningen. Förvara mörkt i minst 12 timmar före användning.

4.2 n-hexan för kromatografi.

4.3 Etyleter för kromatografi.

4.4 n-heptan för kromatografi.

4.5 Standardlösning av 0,1 % (m/V) laurylarakinat i hexan (intern standard). (Även palmitylpalmitat eller myristylstearat kan användas.) 4.5.1 Sudan-1-(1-fenyl-azo-2-naftol)

4.6 Bärgas: vätgas eller helium, ren, för gaskromatografi.

4.7 ”Make-up” -gas: — ren vätgas för gaskromatografi. — ren luft för gaskromatografi.

5. METOD

5.1 Preparering av kromatografikolonnen

Slamma upp 15 g kiselgel (4.1.) i n-hexan (4.2.) och häll det i kolonnen (3.2.). Låt kiselgelen sedimentera. Slutför sedimenteringen med hjälp av en elektrisk vibrator (3.5.) för att få den kromatografiska stationära fasen mer homogent packad. Skölj med 30 ml n-hexan för att avlägsna eventuella orenheter. Väg upp (3.8.) 500 mg av provet i en E-kolv på 25 ml (3.1.), tillsätt lämplig mängd intern standard (4.5.) beroende på uppskattad vaxhalt. Tillsätt 0,1 mg laurylarakinat för olivolja och 0,25–0,5 mg för olja av olivrestprodukter. Provet överförs sedan till kromatografikolonnen tillsammans med två portioner n-hexan (4.2) på 2 ml vardera.

Låt lösningen rinna till 1 mm ovanför adsorbentlagret, tillsätt sedan ytterligare 70 ml n-hexan för att eliminera de naturligt förekommande n-alkanerna. Börja sedan den kromatografiska elueringen genom att samla upp 180 ml av n-hexan/etyleterblandningen (99:1), med en hastighet på cirka 15 droppar/10 s. Elueringen av provet skall ske vid en temperatur på 22 + 4 °C.

Anmärkningar:

— Blandningen n-hexan/etyleter (99:1) skall beredas varje dag.

— För en visuell kontroll av att elueringen av vaxerna sker korrekt kan 100 μl sudan (1 %) tillsättas elueringsblandningen. Eftersom färgämnet har en retentionstid som ligger mellan den för vaxerna och triglyceriderna bör elueringen avslutas när färgningen nått botten av kolonnen, eftersom alla vaxer då har eluerats.

Torka den erhållna fraktionen i en rotationsindunstare (3.6.) tills nästan allt lösningsmedel försvunnit. Avlägsna de sista 2 ml av lösningsmedlet med hjälp av en svag kvävgasström, tillsätt sedan 2–4 ml n-heptan.

5.2 Analys med gaskromatografi

5.2.1 Förberedelser

Montera kolonnen i gaskromatografen (3.3.) genom att ansluta inloppet till injektionssystemet och utloppet till detektorn. Kontrollera gaskromatografen (att gasanslutningarna är täta, detektorns och skrivarens effektivitet, etc.).

Om kolonnen används för första gången bör den först konditioneras. Låt en liten mängd gas strömma genom kolonnen och sätt sedan på gaskromatografen. Värm upp den gradvis under ca 4 timmar till en temperatur på 350 °C. Behåll denna temperatur i minst 2 timmar och ställ därefter in lämpliga analysparametrar (ställ in gasflödet, tänd flamman, anslut skrivaren/integratorn (3.3.4.), ställ in injektor-, kolonn- och detektortemperaturen). Se till att signalen har en känslighet som är minst två gånger högre än den nivå som krävs för att utföra analysen. Baslinjen skall vara rak och stabil, utan toppar.

Om baslinjen driver nedåt tyder det på att kolonnen inte är korrekt ansluten. Om den driver uppåt tyder det på att kolonnen inte har blivit ordentligt konditionerad.

5.2.2 Val av analysparametrar

Analysparametrarna väljs normalt enligt följande:

— kolonntemperatur: —



20 °C/minut 5 °C/minut 20 °C/minut Starttemperatur 80 °C (1′) → 240 °C → 325 °C (6′) → 340 °C (10′)

— Detektortemperatur: 350 °C;

— Injicerad mängd: 1 μl lösning (2–4 ml) n-heptan

— Bärgas: helium eller vätgas med en linjär hastighet som är optimal för den gas som valts (se tillägget)

— Instrumentets känslighet: anpassad efter betingelserna nedan:

Beroende på kolonnens och gaskromatografens egenskaper kan betingelserna behöva ändras för att man skall få en separation av samtliga vaxer, en tillfredsställande upplösning av toppar (se figur) och en retentionstid för den interna standarden C32 på 18 + 3 minuter. Vaxernas mest representativa topp skall motsvara minst 60 % av fullt skalutslag.

Bestäm parametrarna för integration av topparna på ett sådant sätt att en korrekt uppskattning av toppareorna erhålls.

Anm.: Med tanke på den höga sluttemperaturen tillåts en positiv drift på högst 10 % av fullt skalutslag.

5.3 Analysförfarande

Sug med hjälp av en 10 μl spruta upp 1 μl av lösningen. Dra tillbaka kolven tills nålen är tom. För in nålen i injektorn och injicera snabbt efter 1–2 sekunder. Efter cirka 5 sekunder dras nålen försiktigt ut.

Utför registreringen tills alla vaxer är helt eluerade.

Baslinjen måste alltid uppfylla de fastställda villkoren.

5.4 Identifiering av toppar

Identifiera topparna utifrån retentionstiderna genom att jämföra dem med blandningar av vaxer med kända retentionstider analyserade under samma betingelser.

Figuren visar ett kromatogram för vaxer av jungfruolja.

5.5 Kvantitativ analys

Bestäm toppareorna för den interna standarden och de alifatiska estrarna från C40 till C46 med hjälp av integratorn.

Beräkna vaxhalten i var och en av estrarna (uttryckt som mg/kg fettämne) med hjälp av följande formel:

där:

Ax = topparean för varje ester, i kvadratmillimeter

As = topparean för den interna standarden, i kvadratmillimeter

ms = mängden tillsatt intern standard, i milligram

m = den mängd av provet som tagits ut för analys, i gram.

6. REDOVISNING AV RESULTAT

Ange totalhalten av de olika vaxerna från C40 till C46, i mg/kg fettämne (ppm).

Anm.: De komponenter som skall kvantifieras med hjälp av motsvarande toppar i kromatogrammet (se figur nedan) är estrar med ett jämnt antal kolatomer (C40 till C46). Om estertoppen C46 är svår att identifiera (dubbeltopp) bör man analysera vaxfraktionen för en olja av olivrestprodukter där C46-toppen är lättidentifierad eftersom den är klart störst.

Resultaten uttrycks med en decimal.

Figur

Kromatogram för vaxer i olivolja ( 9 )

Förklaringar:

I.S. = Laurylarakinat

1. = Diterpenestrar

2 + 2′ = C40-estrar

3 + 3′ = C42-estrar

4 + 4′ = C44-estrar

5. = C46-estrar

6. = Sterolestrar och triterpenestrar









Tillägg

Bestämning av gasens linjära hastighet

Ställ in normala gängse analysparametrar och injicera därefter 1–3 μl metan eller propan i gaskromatografen. Mät den tid det tar för gasen att gå igenom kolonnen, från det att den injiceras tills toppen passerat (tM).

Den linjära hastigheten i cm/sekund erhålls genom formeln L/tM där L är kolonnens längd i cm och tM är den uppmätta tiden i sekunder.

▼M26









BILAGA V

BESTÄMNING AV SAMMANSÄTTNINGEN OCH HALTEN AV STEROLER OCH TRITERPENDIALKOHOLER GENOM GASKROMATOGRAFI MED KAPILLÄRKOLONN

1. SYFTE

Metoden avser bestämning av de enskilda och totala sterol- och triterpendialkoholhalterna hos olivolja och olivolja av pressrester.

2. PRINCIP

Olja med tillsats av α-kolestanol som intern standard, förtvålas med kaliumhydroxid i etanollösning och de oförtvålbara ämnena extraheras sedan med etyleter.

Sterol- och triterpendialkoholfraktionen separeras från de oförtvålbara ämnena genom tunnskiktskromatografi på en basisk kiselgelplatta. De fraktioner som återvunnits från kiselgelen överförs till trimetylsilyletrar och analyseras genom gaskromatografi med kapillärkolonn.

3. UTRUSTNING

Sedvanlig laboratorieutrustning, i synnerhet följande:

3.1. 250 ml kolv försedd med återflödeskylare med slipade anslutningsfogar.

3.2. 500 ml separertratt.

3.3. 250 ml kolvar.

3.4. Komplett apparatur för tunnskiktskromatografi med 20 × 20 cm glasplattor.

3.5. UV-lampa: 254 eller 366 nm.

3.6. Mikrosprutor, 100 och 500 μl.

3.7. En cylindrisk filtrertratt med poröst membran G 3 (porositet 15–40 μm) och med en diameter på ca 2 cm, ett djup på 5 cm som passar för vakuumfiltrering, med hanslipning.

3.8. 50 ml vakuum-E-kolv med slipad glashals som kan användas för filtrertratten (punkt 3.7).

3.9. 10 ml provrör med konisk botten och glaspropp.

3.10. Gaskromatograf lämpad för användning med kapillärkolonn med splitinjektion, bestående av

3.10.1. termostatstyrd kolonnugn som kan hålla den önskade temperaturen med en noggrannhet av ± 1°C,

3.10.2. injektor med inställbar temperatur och försedd med ett förångningselement av glas med silaniserad yta och splitsystem,

3.10.3. Flamjoniseringsdetektor.

3.10.4. System för datainsamling lämpligt för användning tillsammans med flamjoniseringsdetektorn (punkt 3.10.3.) som kan ställas in på manuell integration.

3.11. Kapillärkolonn med kiseldioxid med en längd på 20 till 30 meter, innerdiameter 0,25 till 0,32 mm, belagd med 5 % difenyl - 95 % dimetylpolysiloxan (SE-52 eller SE-54 stationär fas eller motsvarande), med en enhetlig filmtjocklek mellan 0,10 och 0,30 μm.

3.12. Mikrospruta på 10 μl, för gaskromatografi, med härdad nål lämplig för splitinjektion.

3.13. Exsickator med kalciumklorid.

4. REAGENS

4.1. Kaliumhydroxid, minst 85 %.

4.2. Kaliumhydroxid, circa 2 N, i etanol.

Lös 130 g kaliumhydroxid (punkt 4.1) under kylning i 200 ml destillerat vatten och späd sedan till 1 liter med etanol (punkt 4.10). Förvara lösningen i väl tillslutna, mörka flaskor som lagras i högst två dagar.

4.3. Etyleter, av analyskvalitet.

4.4. Kaliumhydroxid, circa 0,2 N, i etanol.

Lös 13 g kaliumhydroxid (punkt 4.1) i 20 ml destillerat vatten och späd till 1 liter med etanol (punkt 4.10).

4.5. Vattenfritt natriumsulfat, av analyskvalitet.

4.6. Glasplattor (20 × 20 cm) täckta med kiselgel utan flouresceinsindikator, tjocklek 0,25 mm (finns i handeln färdiga för användning).

4.7. Toluen, av kromatografisk kvalitet.

4.8. Aceton, av kromatografisk kvalitet.

4.9. n-Hexan, av kromatografisk kvalitet.

4.10. Etyleter, av kromatografisk kvalitet.

4.11. Etanol av analytisk kvalitet.

4.12. Etylacetat av analytisk kvalitet.

4.13. Referenslösning för tunnskiktskromatografi: kolesterol eller fytosterol, och Erytrodiol 5 % lösning i etylacetat (punkt 4.11).

4.14. 2,7-diklorflourecein, 0,2 %, i etanollösning. Denna görs lätt basisk genom att tillsätta ett par droppar 2 N alkoholisk kaliumhydroxidlösning (punkt 4.2).

4.15. Vattenfri pyridin, av kromatografisk kvalitet (se Anmärkning 5).

4.16. Hexametyldisilasan av analyskvalitet.

4.17. Trimetylklorosilan av analyskvalitet.

4.18. Provlösningar av steroltrimetylsilyletrar.

Bereds omedelbart före användning av steroler och erytrodiol som erhållits från oljor som innehåller dem.

4.19. α-Kolestanol, renhet över 99 % (renheten måste kontrolleras genom analys med gaskromatografi)

4.20. α-kolestanol som intern standard, 0,2 % lösning (m/V) i etylacetat (punkt 4.11).

4.21. Fenolftaleinlösning, 10 g/l i etanol (punkt 4.10).

4.22. Bärgas: väte eller helium, av gaskromatografisk kvalitet.

4.23. Hjälpgaser: väte, helium, kväve och luft, av gaskromatografisk kvalitet.

4.24. n-Hexan (punkt 4.9)/etyleter (punkt 4.10): blandning 65:35 (V/V).

4.25. Silyleringsreagens, bestående av en blandning 9:3:1 (V/V/V) av pyridin/hexametyldisilasan/trimetylklorosilan.

5. UTFÖRANDE

5.1. Beredning av oförtvålbara ämnen 5.1.1. Med hjälp av en 500 μl mikrospruta (punkt 3.6) införs i 250 ml kolven (punkt 3.1) en volym α-kolestanol som intern standard (punkt 4.20) innehållande en mängd kolestanol motsvarande ca 10 % av sterolhalten i provet. Exempelvis tillsätts 500 μl α-kolestanollösning (punkt 4.20) per 5 g prov när det gäller olivolja och 1 500 μl för olivolja av pressrester. Indunsta till torrhet under en försiktig ström av kväve i ett varmt vattenbad. Kyl kolven. Väg upp 5±0,01 g torrt filtrerat prov i kolven. Anmärkning 1: Animaliska eller vegetabiliska oljor och fetter som innehåller betydande kvantiteter av kolesterol kan visa en topp med en retentionstid som är nära den för kolestanol. Om detta inträffar måste sterolfraktionen analyseras dubbelt med och utan intern standard. 5.1.2. Tillsätt 50 ml 2 N kaliumhydroxid i etanollösning (punkt 4.2) och lite pimpsten. Sätt på återflödeskylaren och värm till svag kokning tills förtvålning inträder (lösningen blir klar). Fortsätt upphettningen under ytterligare 20 minuter, och tillsätt sedan 50 ml destillerat vatten från toppen av återflödeskylaren. Ta bort kylaren och kyl kolven till ca 30 °C. 5.1.3. Överför kolvens innehåll kvantitativt till en 500 ml separertratt (punkt 3.2) genom att använda flera portioner destillerat vatten (50 ml). Tillsätt cirka 80 ml etyleter (punkt 4.10). Skaka omsorgsfullt i ungefär 60 sekunder och frigör regelbundet trycket genom att vända upp och ned på separertratten och öppna avstängningsventilen. Låt stå tills de två faserna har separerats fullständigt (Anmärkning 2). Överför därefter tvållösningen så fullständigt som möjligt i en annan separertratt. Genomför ytterligare två extraheringar av vatten-alkoholfasen på samma sätt med användande av 60–70 ml etyleter (punkt 4.10). Anmärkning 2: Eventuell emulsion kan förstöras genom tillsats av små kvantiteter etanol (punkt 4.11). 5.1.4. Samla de tre eterextrakten i en separertratt som innehåller 50 ml vatten. Fortsätt att tvätta med vatten (50 ml) till dess att tvättvattnet inte längre ger en rosa färg vid tillsättning av en droppe fenolftaleinlösning (punkt 4.21). När tvättvattnet har avlägsnats, filtrera på vattenfritt natirumsulfat (punkt 4.5) ner i en i förväg vägd 250 ml kolv, och tvätta därefter tratten och filtret med små mängder etyleter (punkt 4.10). 5.1.5. Låt lösningsmedlet avdunsta genom destillation i rotationsindunstare vid 30 °C under vakuum. Tillsätt 5 ml aceton och avlägsna det flyktiga lösningsmedlet helt i en svag luftström. Torka återstoden i torkskåp vid 103 ± 2 °C i 15 minuter. Kyl i exsickator och väg med 0,1 mg noggrannhet.

5.2. Separation av sterol- och triterpendialkoholfraktionen (erytrodiol + uvaol) 5.2.1. Beredning av de basiska plattorna för tunnskiktskromatografi. Sänk ner kiselgelplattorna (punkt 4.6) circa 4 cm i 0,2 N kaliumhydroxidetanollösning (punkt 4.5) i 10 sekunder och låt sedan torka i dragskåp i två timmar varefter de placeras i ett torkskåp vid 100 °C i en timme. Ta ut plattorna från torkskåpet och förvara dem i en exsickator (punkt 3.13) med kalciumklorid tills de ska användas (plattor som behandlas på detta sätt måste användas inom 15 dagar). Anmärkning 3: Om kiselelplattor används för att separera sterolfraktionen behöver inte de oförtvålbara fraktionerna behandlas med aluminumoxid. På det här sättet kan alla sura föreningar (fettsyror och andra) behållas på identifieringslinjen och sterolbandet separeras klart från de alifatiska alkoholernas och triterpenalkoholernas band. 5.2.2. Fyll på n-hexan/etyleterblandningen (punkt 4.24) (Anmärkning 4) i framkallningskammaren till ett djup av circa 1 cm. Stäng kammaren med tillhörande lock och låt stå svalt ca en halvtimme så att jämnvikten vätska/gas inställer sig. Remsor av filtrerpapper som doppas ner i eluenten kan placeras på insidorna av kammaren. Detta minskar framkallningstiden med ca en tredjedel och åstadkommer en jämnare eluering av komponenterna. Anmärkning 4: Framkallningsblandningen ska bytas för varje test för att få exakt reproducerbara elueringsförhållanden. En blandning av 50:50 (V/V) av n-hexan/etyleter kan också användas. 5.2.3. Förbered en circa 5 % lösning av de oförtvålbara ämnena (punkt 5.1.5) i etylacetat (punkt 4.12) och stryk ut med 100 μl mikrosprutan 0,3 ml av lösningen smalt och jämnt på den nedre delen (2 cm) av kromatografiplattan. Placera i linje med strykningen 2 till 3 μl av referenslösningen (4.13) så att sterol- och triterpendialkoholbandet kan identifieras efter framkallning. 5.2.4. Placera plattan i framkallningskammaren som iordningställts enligt punkt 5.2.2. Rumstemperaturen ska hållas mellan 15 och 20 °C (Anmärkning 5). Stäng kammaren omedelbart med locket och påbörja elueringen tills lösningsmedlets främre kant når till ca 1 cm från övre änden av plattan. Ta ut plattan ur framkallningskammaren och låt lösningsmedlet avdunsta i en ström av varmluft eller genom att plattan får ligga en kort stund i dragskåp. Anmärkning 5: Högre temperatur kan försämra separationen. 5.2.5. Spraya plattan lätt och jämnt med 2,7-diklorfloureceinlösningen (punkt 4.14) och låt torka. När plattan betraktas i ultraviolett ljus kan sterol- och triterpendialkoholbanden identifieras genom att de ligger i höjd med fläckarna som erhållits från referenslösningen (punkt 4.13). Markera änden av banden längs kanterna av flouroscensen med svart blyerts (se TLC-platta, figur 3). 5.2.6. Skrapa med hjälp av en metallspatel bort kiselgelen från det markerade området. Placera det finfördelade materialet som tagits bort i filtrertratten (punkt 3.7). Tillsätt 10 ml het etylacetat (punkt 4.12), blanda omsorgsfullt med metallspateln under vakuum och filtrera i E-kolven (punkt 3.8) som är ansluten till filtrertratten. Tvätta återstoden i kolven tre gånger med etyleter (punkt 4.3) (circa 10 ml varje gång) och samla upp filtratet i samma kolv som är ansluten till filtrertratten, Indunsta filtratet till en volym på 4–5 ml och överför resterande lösning till det tidigare vägda 10 ml provröret (punkt 3.9), låt indunsta fullständigt under lätt uppvärmning, i svagt kväveflöde, fyll på nytt genom att använda några droppar aceton (punkt 4.8) och indunsta till torrhet. Återstoden i provröret består av sterol- och triterpendialkoholfraktionerna.

5.3. Preparering av trimetylsilyletrarna 5.3.1. Tillsätt silyleringsreagensen (punkt 4.25) (Anmärkning 6), i förhållandet 50 μl för varje mg steroler och triterpendialkoholer, i provröret som innehåller sterol- och triterpenfraktionen. Undvik upptag av fuktighet (Anmärkning 7). Anmärkning 6: Lösningar som är klara för användning finns i handeln. Andra silyleringsreagensen, såsom bistrimethylsilyltrifluoracetamid + 1 % trimetylklorosilan, som måste spädas med lika stor volym vattenfri pyridin finns också i handeln. Pyridinet kan ersättas med samma mängd acetonitril. 5.3.2. Sätt proppen i provröret, skaka försiktigt (utan att vända på det) tills föreningarna är helt lösta. Låt stå i minst 15 minuter i rumstemperatur och centrifugera sedan i ett par minuter. Den klara lösningen är nu färdig för analys med gaskromatografi. Anmärkning 7: Eventuell bildning av en svag opalescens är normal och inverkar inte. Bildandet av en vit flockning eller rosafärgning är tecken på närvaro av fukt och sönderfall hos reagensen. Om detta inträffar ska testet upprepas (endast om hexametyldisilazan/trimetylklorsilan används).

5.4. Analys med gaskromatografi 5.4.1. Förberedelser, iordningställande av kapillärkolonn. 5.4.1.1. Montera kolonnen (punkt 3.11) i gaskromatografen genom att kolonnens inlopp ansluts till splitinjektorn och kolonnens utlopp till detektorn. En allmän kontroll av gaskromatografen genomförs (gasanslutningarna ska vara täta, detektorn i fullgott skick, splitsystem och registreringssystem fungerarande etc). 5.4.1.2. Om kolonnen används för första gången rekommenderas det att den först prepareras: En liten mängd gas får flyta genom kolonnen och sedan kopplas gaskromatografen på och en gradvis upphettning genomförs tills temperaturen är minst 20 °C över drifttemperaturen (Anmärkning 8). Denna temperatur bibehålls i minst två timmar och sedan ställs kromatografen iordning för driftförhållanden (inställning av gasflöde och splittning, tändning av flamman, anslutning till databehandlingssystemet, inställning av temperaturen i kolonnen, detektorn och injektorn), och registrera signalen med en känslighet som är minst två gånger högre än den som beräknas för analysen. Baslinjen ska vara linjär, utan några toppar av något slag, och får inte visa tecken på drift. Negativ rak drift av linjen är tecken på otäta kolonnanslutningar, medan en positivt drift tyder på otillräcklig preparering av kolonnen. Anmärkning 8: Temperaturen vid prepareringen ska vara minst 20 °C lägre än den maximitemperatur som specificeras för den stationära fas som används. 5.4.2. 5.4.2 Val av analysparametrar. 5.4.2.1. Analysparametrarna väljs enligt följande: — Kolonntemperatur: 260 ± 5 °C. — Injektortemperatur: 280–300 °C. — Detektortemperatur: 280–300 °C. — Linjär hastighet för bärgasen: helium 20–35 cm/s, väte 30–50 cm/s. — Splitförhållande 1:50–1:100. — Instrumentets känslighet: 4–16 gånger högre än minimikänsligheten. — Registreringskänslighet: 1–2 mV fullt skalutslag. — Kvantitet av det injicerade ämnet: 0,5–1 μl TMSE-lösning. Dessa parametrar kan ändras beroende på egenskaperna hos kolonnen och gaskromatografen för att få kromatogram som uppfyller följande krav: — Retentionstiden för ß-sitosteroltoppen bör vara 20 ± 5 minuter. — Kampesteroltoppen bör vara följande: för olivolja (medelhalt 3 %) 20 ± 5 % av fullt utslag, för sojaolja (medelhalt 20 %) 80 ± 10 % av fullt utslag. — Alla närvarande steroler måste separeras. Förutom att separeras måste alla toppar vara helt och hållet synliga, dvs varje toppkurva ska återvända till baslinjen innan nästa topp ritas. Ofullständig upplösning kan emellertid tolereras under förutsättning att toppen vid RRT 1,02 (sitostanol) kan kvantifieras med hjälp av topphöjden. 5.4.3. Analysförfarande 5.4.3.1. Sug med hjälp av en 10 μl mikrospruta upp 1 μl hexan, sug in 0,5 μl luft och sedan 0,5–1 μl av provlösningen. Dra ut kolven ur sprutan ytterligare så att kanylen töms. Stick in kanylen genom membranet i injektorn och spruta snabbt efter en till två sekunder in innehållet och drag sedan sakta ut kanylen efter ca fem sekunder. En automatisk injektor kan även användas. 5.4.3.2. Genomför registreringen tills de närvarande triterpendialkoholernas TMSE har eluerats fullständigt. Baslinjen måste fortsätta att uppfylla kraven (punkt 5.4.1.2). 5.4.4. Identifiering av toppar Identifiera individuella toppar på grundval av retentionstiderna och genom jämförelse med blandningen av sterol- och triterpendialkohol-TMSE, som analyseras med samma parametrar (se tillägget). Sterolerna och triterpendialkoholerna elueras i följande ordning: kolesterol, brassikasterol, ergosterol, 24-metylenkolesterol, kampesterol, kampestanol, stigmasterol, Δ7-kampesterol, Δ5,23-stigmastadienol, klerosterol, ß-sistosterol, sitostanol, Δ5-avenasterol, Δ5,24-stigmastadienol, Δ7-stigmastenol, Δ7-avenasterol, erytrodiol och uvaol. Retentionstiderna för sitosterol för SE-52- och SE-54-kolonner framgår av tabell 1. Figurerna 1 och 2 visar typiska kromatogram för en del oljor. 5.4.5. Kvantitativ utvärdering 5.4.5.1. Beräkna areorna för α-kolestanol- och sterol- och triterpendialkoholtopparna med hjälp av databehandlingssystemet. Bortse från toppar för föreningar som inte finns med (ergosterol ska inte beräknas) bland de som är upptagna i tabell 1. Responsen för α-kolestanol ska vara lika med 1. 5.4.5.2. Beräkna koncentrationen för varje sterol i mg/100 g fett enligt följande: där Ax = arean av sterol x, enligt beräkning av databehandlingssystemet As = arean av toppen för α-kolestanol, enligt beräkning av databehandlingssystemet ms = massan av tillsatt α-kolestanol i milligram m = massan av det prov som använts för bestämningen, i gram.

6. RESULTAT

6.1. Ange de enskilda sterolkoncentrationerna i milligram per 100 g fett och summan av dem som "summan av sterolerna".

Sammansättningen av var och en av de enskilda sterolerna och av erytrodiol och uvaol bör uttryckas med en decimals noggrannhet.

Sammansättningen av summan av sterolerna ska anges utan decimal.

▼M28

6.2. Beräkna procentandelen av varje enskild sterol som förhållandet mellan den aktuella topparean och den totala topparean för steroler:

där

Ax = topparea för x,

ΣA = total topparea för steroler.

▼M26

6.3. Apparent β-sitosterol: Δ5-23-stigmastadienol + klerosterol + β-sitosterol + sitostanol + Δ5-avenasterol + Δ5-24-stigmastadienol.

6.4. Beräkna den procentuella andelen erytrodiol och uvaol:

där

ΣA = summan av areorna för sterol enligt beräkning av databehandlingssystemet

Er = arean för erytrodiol enligt beräkning av databehandlingssystemet

Uv = arean för uvaol enligt beräkning av databehandlingssystemet









Tillägg

Bestämning av den linjära hastigheten hos gasen

Spruta in 1–3 μl metan (eller propan) i gaskromatografen under vanliga ???analysparametrar??? och mät den tid det tar för gasen att passera kolonnen från insprutningsögonblicket till den tidpunkt då toppen framträder (tM).

Den linjära hastigheten i cm/s erhålls genom L/tM där L är kolonnens längd i cm och tM är den uppmätta tiden i sekunder.







Tabell 1 Relativa retentionstiden för steroler Topp Identifiering Relativ retentionstid SE 54 kolumn SE 52 kolumn 1 Kolesterol Δ-5-kolesten-3ß-ol 0,67 0,63 2 Kolestanol 5α-kolestan-3ß-ol 0,68 0,64 3 Brassikasterol [24S]-24-metyl-Δ-5,22-kolestadien-3ß-ol 0,73 0,71 * Ergosterol [24S] 24 metyl Δ5-7-22 kolestatrien 3ß-ol 0,78 0,76 4 24-metylenkolesterol 24-metylen-Δ-5,24-kolestadien-3ß-o1 0,82 0,80 5 Kampesterol [24R]-24-metyl-Δ-5-kolesten-3ß-ol 0,83 0,81 6 Kampestanol [24R]-24-metylkolestan-3ß-ol 0,85 0,82 7 Stigmasterol [24S]-24-etyl-Δ-5,22-kolestadien-3ß-ol 0,88 0,87 8 Δ-7-kampesterol [24R]-24-metyl-Δ-7-kolesten-3ß-ol 0,93 0,92 9 Δ-5,23-stigmastadienol [24R,S]-24-etyl-Δ-5,23-koIestadien-3ß-ol 0,95 0,95 10 Klerosterol [24S]-24-etyl-Δ-5,25-kolestadien-3ß-ol 0,96 0,96 11 ß-sitosterol [24R]-24-etyl-Δ-5-kolesten-3ß-ol 1,00 1,00 12 Sitostanol 24-etyl-kolestan-3ß-ol 1,02 1,02 13 Δ-5-avenasterol [24Z]-24-etyliden-Δ-5-kolesten-3ß-ol 1,03 1,03 14 Δ-5-24-stigmastadienol [24R,S]-24-etyl-Δ-5,24-kolestadien-3ß-ol 1,08 1,08 15 Δ-7-stigmastenol [24R,S]-24-etyl-Δ-7-kolesten-3ß-ol 1,12 1,12 16 Δ-7-avenasterol [24Z]-24-etyliden-Δ-7-kolesten-3ß-ol 1,16 1,16 17 Erytrodiol 5α olean-12en-3ß28-diol 1,41 1,41 18 Uvaol Δ12-ursen-3ß28-diol 1,52 1,52

Figur 1

Gaskromatogram för sterol- och triterpendialkoholfranktionen av raffinerad olivolja (som tillsatts intern standard)

Figur 2

Gaskromatogram för sterol- och triterpendialkoholfranktionen av en bomolja (som tillsatts intern standard)

Figur 3

TLC-platta av olivolja av pressrester med det område som måste skrapas för att bestämma förekomsten av steroler och triterpendialkoholer

1 – Skvalen

2 – Triterpenalkoholer och alifatiska alkoholer

3 – Steroler och triterpendialkoholer

4 – ???Start??? och fria fettsyror

▼M26 —————

▼M21









BILAGA VII

BESTÄMNING AV PROCENTANDELEN 2-GLYCERYLMONOPALMITAT

1. SYFTE OCH TILLÄMPNINGSOMRÅDE

Metoden avser bestämning av procentandelen palmitinsyra i 2-ställning för triglycerider genom bestämning av 2-glycerylmonopalmitat.

Metoden kan tillämpas på flytande vegetabiliska oljor vid en temperatur på 20 °C.

2. PRINCIP

Efter beredning av oljeprovet tillsätts pankreaslipas. Detta leder till partiell och specifik hydrolys i 1- och 3-ställning för triglyceridmolekylen varigenom monoglycerider i 2-ställning uppkommer. Procentandelen 2-glycerylmonopalmitat i monoglyceridfraktionen bestäms, efter silylering, med kapillärgaskromatografi.

3. UTRUSTNING

3.1 E-kolv 25 ml

3.2 Glasbägare, 100, 250 och 300 ml

3.3 Kromatografikolonn av glas, innerdiameter 21–23 mm, längd 400 mm, med porös glasskiva och kran

3.4 Graderade provrör 10, 50, 100 och 200 ml

3.5 Kolvar 100 och 250 ml

3.6 Rotationsindunstare

3.7 Centrifugrör 10 ml, med konformad botten och slipad propp

3.8 Centrifug för rör 10 och 100 ml

3.9 Termostat som håller temperaturen på 40 + 0,5 °C

3.10 Mätpipetter, 1 och 2 ml

3.11 Injektionsspruta 1 ml

3.12 Spruta 100 μl

3.13 Tratt, 1 000 ml

3.14 Kapillärgaskromatograf med ”on column” -injektor för direktinjektion av provet i kolonnen och en ugn som kan hålla vald temperatur med en noggrannhet på + 1 °C

3.15 ”On column” -injektor för direktinjektion av provet i kolonnen

3.16 En flamjonisationsdetektor och elektrometer

3.17 Skrivare/integrator som är anpassad till elektrometern, med responstid på högst 1 sekund och med variabel pappershastighet

3.18 Kapillärkolonn av glas eller kvarts, längd 8–12 meter, innerdiameter 0,25–0,32 mm, belagd med 5-procentig metylpolysiloxan eller fenylmetylpolysiloxan (tjocklek 0,10–0,30 μm) som kan användas vid 370 °C

3.19 Spruta 10 μl med härdad nål, minst 7,5 cm, för direktinjektion i kolonnen

4. REAGENS

4.1 Kiselgel med en kornstorlek på 0,063–0,200 mm (70/280 mesh), beredd enligt följande: placera kiselgelen i en porslinskapsel, torka i ugnen vid 160 °C i 4 timmar, låt svalna i exsickator. Tillsätt en mängd vatten som motsvarar 5 % av kiselgelens vikt, enligt följande: mät upp 152 g kiselgel i en E-kolv på 500 ml och tillsätt 8 g destillerat vatten, sätt på proppen och skaka lätt så att vattnet blir jämnt fördelat. Låt stå i minst 12 timmar före användning.

4.2 n-hexan för kromatografi

4.3 Isopropanol

4.4 Isopropanol, vattenlösning 1:1 (v/v)

4.5 Pankreaslipas. Lipaset skall ha en aktivitet på 2,0–10 lipasenheter/mg (i handeln finns det pankreaslipas med en aktivitet på 2–10 enheter per mg enzym).

4.6 Buffertlösning av tris(hydroximetyl)aminometan: vattenlösning 1 M där pH justeras till 8 (kontrolleras med potentiometer) genom tillsats av koncentrerad HCI (1:1 v/v)

4.7 Natriumkolat, enzymkvalitet, 1-procentig vattenlösning (lösningen bör användas inom 15 dagar efter det att den beretts

4.8 Kalciumklorid, 22-procentig vattenlösning

4.9 Dietyleter för kromatografi

4.10 Elueringsmedel: blandning n-hexan/dietyleter (87:13) (v/v)

4.11 Natriumhydroxid, lösning på 12 viktprocent

4.12 Fenolftalein, 1-procentig lösning i etanol

4.13 Bärgas: vätgas eller helium, för gaskromatografi

4.14 ”Make-up” -gas: vätgas, minst 99 %, fri från fukt och organiska ämnen – och luft för gaskromatografi, av samma renhetsgrad

4.15 Silyleringsreagens: blandning pyridin/hexametyldisilazan, trimetylklorsilan 9:3:1 (v/v/v). (Det finns färdiga lösningar i handeln. Andra silyleringsreagenser kan användas, t.ex. bis-trimetylsilyltrifluoracetamid + 1 % trimetylklorsilan, utspätt med lika mängd vattenfritt pyridin.)

4.16 Referensprover: rena monoglycerider eller blandningar av monoglycerider med en liknande procentuell sammansättning som provet

5. FÖRFARANDE

5.1 Provberedning

5.1.1 Oljor med en halt av fria syror lägre än 3 % behöver inte neutraliseras före kromatografi på kolonn med kiselgel. Oljor med en halt av fria syror över 3 % skall neutraliseras i enlighet med punkt 5.1.1.1. 5.1.1.1 Häll 50 g olja och 200 ml n-hexan i en tratt på 1 000 ml (3.13). Tillsätt 100 ml isopropanol och en mängd 1-procentig natriumhydroxidlösning (4.11) som motsvarar oljans fria syrahalt ökat med 5 %. Skaka kraftigt i 1 minut. Tillsätt 100 ml destillerat vatten, skaka igen och låt stå. Efter dekantering, avlägsna det nedre skiktet som innehåller tvål. Avlägsna eventuella mellanliggande skikt (slem och olösliga ämnen). Tvätta den neutraliserade hexanlösningen av oljan flera gånger med 50–60 ml lösning av isopropanol och vatten 1:1 (v/v) (4.4) till dess den rosafärgade tonen på fenolftaleinet försvunnit. Avlägsna det mesta av hexanet genom vakuumdestillation (t.ex. med en rotationsindunstare) och för över oljan till en kolv på 100 ml (3.5). Torka oljan i vakuum till dess att lösningsmedlet har försvunnit helt. När så skett bör oljans syrahalt ligga under 0,5 %.

5.1.2 Häll 1,0 g olja som beretts enligt ovan i en 25 ml E-kolv (3.1) och lös upp i 10 ml lösningsmedel (4.10). Låt lösningen stå i minst 15 minuter före kromatografi på kolonn med kiselgel. Om lösningen är grumlig, centrifugera den för att uppnå optimala förhållanden för kromatografi. (Till detta används t.ex. SPE-kolonner på 500 g med kiselgel, färdiga för användning).

5.1.3 Preparering av kromatografikolonnen Häll i ca 30 ml lösningsmedel (4.10) i kolonnen (3.3), placera en bomullstuss i den nedre delen av kolonnen med hjälp av en glasstav och pressa ut luften. Slamma upp 25 g kiselgel (4.1) i ca 80 ml lösningsmedel i en glasbägare och häll i den i kolonnen med hjälp av en tratt. Kontrollera att all kiselgel har hamnat i kolonnen. Tvätta med lösningsmedlet (4.10), öppna kranen och låt vätskenivån sjunka till ca 2 mm ovanför kiselgelens övre nivå.

5.1.4 Kromatografi Väg upp exakt 1,0 g av provet som beretts enligt punkt 5.1 i en E-kolv på 25 ml (3.1). Lös upp provet i 10 ml elueringsmedel (4.10). Häll lösningen i kromatografikolonnen som förberetts enligt punkt 5.1.3. Rubba inte kolonnytan. Öppna kranen och fyll på med provlösning upp till kiselgelen. Eluera med 150 ml elueringsmedel. Ställ in flödeshastigheten på 2 ml/min (så att 150 ml rinner igenom kolonnen på ca 60–70 minuter). Samla upp eluatet i en 250 ml rundkolv som tarerats i förväg. Förånga lösningsmedlet i vakuum och avlägsna lösningsmedelsresterna med en ström av kvävgas. Väg kolven och beräkna mängden extrakt som erhållits. (Vid användning av SPE-kolonn med kiselgel som är färdig för användning, förfar enligt följande: Fyll på 1 ml lösning (5.1.2.) i kolonnerna, som dessförinnan förberetts med 3 ml n-hexan. När lösningen passerat genom kolonnen, eluera med 4 ml n-hexan/dietyleter 9:1 (v/v). Samla upp eluatet i ett 10 ml rör och förånga med en ström av kvävgas tills all vätska försvunnit. Tillsätt pankreaslipas till torrsubstansen (5.2.). Det är absolut nödvändigt att kontrollera fettsyresammansättningen både före och efter passagen genom SPE-kolonnen).

5.2 Hydrolys med pankreaslipas

5.2.1 Väg upp 0,1 g olja som beretts enligt punkt 5.1. i centrifugröret. Tillsätt 2 ml buffertlösning (4.6.), 0,5 ml natriumkolatlösning (4.7.) och 0,2 ml kalciumkloridlösning och skaka väl efter varje tillsats. Förslut röret med den slipade proppen och placera det i termostaten vid en temperatur på 40 + 0,5 °C.

5.2.2 Tillsätt 20 mg lipas, blanda väl (undvik att blöta ner proppen) och placera röret i termostaten under exakt 2 minuter, ta ut det, skaka väl under exakt 1 minut och låt svalna.

5.2.3 Tillsätt 1 ml dietyleter, sätt i proppen och skaka väl, centrifugera och överför därefter eterlösningen till ett rent och torrt rör med hjälp av en spruta.

5.3 Beredning av silylerade derivat och förberedelser för gaskromatografi

5.3.1 För över 100 μl lösning (5.2.3.) till ett 10 ml provrör med konisk botten med hjälp av en spruta.

5.3.2 Avlägsna lösningsmedlet med svag kvävgasström, tillsätt 200 μl silyleringsreagens (4.15.), sätt i proppen i provröret och låt stå i 20 minuter.

5.3.3 Tillsätt efter 20 minuter 1–5 ml n-hexan (beroende på de kromatografiska betingelserna): den lösning som erhålls är färdig att användas för gaskromatografi.

5.4 Gaskromatografi

Följande analysparametrarna används:

— Injektortemperatur (”on column” -injektor) under lösningens kokpunkt (68 °C)

— Detektortemperatur: 350 °C

— Kolonntemperatur: programmering av ugnstemperatur: 60 °C under 1 minut, öka med 15 °C per minut upp till 180 °C, sedan med 5 °C per minut upp till 340 °C, denna temperatur bibehålls sedan under 13 minuter.

— Bärgas: vätgas eller helium, reglerad till lämplig linjär hastighet för den upplösning som visas i figur 1. Retentionstiden för triglyceriden C54 bör vara 40 + 5 minuter (se figur 2). (Analysparametrarna ovan är vägledande. De bör optimeras av den som utför analysen så att önskad upplösning erhålls. Toppen för 2-glycerylmonopalmitat skall ha en minsta höjd på 10 % av skrivarens skala.)

— Kvantitet av det injicerade ämnet: 0,5–1 μl av lösningen (5 ml) med n-hexan (5.3.3.).

5.4.1 Identifiering av toppar

De enskilda monoglyceriderna bör identifieras genom att retentionstiderna jämförs med dem som erhållits för standardblandningar med monoglycerider under samma förhållanden.

5.4.2 Kvantitativ analys

Arean för varje topp beräknas med hjälp av en elektronisk integreringsenhet.

6. BERÄKNING AV RESULTAT

Andelen glycerilmonopalmitat beräknas genom en jämförelse mellan arean för motsvarande topp och summan av toppareorna för samtliga monoglycerider (se figur 2), enligt formeln:

Glycéril monopalmitate (%):

där:

Ax = topparean för glycerilmonopalmitat

ΣA = summan av toppareorna för alla monoglycerider

Resultatet skall anges med en decimal.

7. ANALYSRAPPORT

Följande skall anges i analysrapporten:

— Hänvisning till denna metod

— Alla uppgifter som behövs för att fullständigt identifiera provet

— Analysresultat

— Alla avvikelser från metoden, vare sig de hänför sig till ett beslut av de berörda parterna eller något annat skäl

— Uppgifter om laboratoriet, analysdag och underskrift av de ansvariga på laboratoriet

Figur 1

Kromatogram över reaktionsprodukter från silylering som erhållits genom att lipas fått verka på en raffinerad olivolja med tillsats av 20 % esterifierad olja (100 %).

Förklaringar: ”Acides gras libres” = fria fettsyror; ”Huile d’olive raffinée + 20 % huile estérifiée” = raffinerad olivolja + 20 % esterifierad olja; ”1-2 monopalmitine” = 1-2 monopalmitin; ”1-2 mono C18 insat.” = omättat 1-2-mono-C18

Figur 2

Kromatogram över:

A) Olja som inte esterifierats efter lipas; efter silylering; under dessa betingelser (kapillärkolonn 8–12 m), elueras vaxfraktionen samtidigt som diglyceridfraktionen eller kort därefter. Efter lipaset skall triglyceridhalten inte överstiga 15 %. Förklaringar: 1.- = Fria fettsyror 2.- = Monoglycerider 3.- = Diglycerider 4.- = Triglycerider * = 2-monopalmitin ** = Triglycerid C54

Kromatogram över:

B) Olja som esterifierats efter lipas; efter silylering; under dessa betingelser (kapillärkolonn 8–12 m), elueras vaxfraktionen samtidigt som diglyceridfraktionen eller kort därefter. Efter lipaset skall triglyceridhalten inte överstiga 15 %. Förklaringar: 1.- = Fria fettsyror 2.- = Monoglycerider 3.- = Diglycerider 4.- = Triglycerider * = 2-monopalmitin ** = Triglycerid C54

8. ANMÄRKNINGAR

BEREDNING AV LIPAS

I handeln finns det lipaser med lämplig aktivitet. Det går också att bereda lipas i laboratorium enligt följande:

Kyl 5 kg färsk bukspottskörtel från svin till 0 °C. Ta bort omgivande fett och bindväv och kör återstoden i mixer så att en tunn massa erhålles. Rör massan i 4–6 timmar med 2,5 liter vattenfritt aceton och centrifugera sedan. Extrahera återstoden tre gånger till med samma mängd vattenfritt aceton, och sedan två gånger med en blandning av aceton/dietyleter (1:1) (v/v) och därefter två gånger med dietyleter.

Torka återstoden i vakuum i 48 timmar så att ett stabilt pulver erhålls. Detta skall lagras i kylskåp och skyddas från fukt.

KONTROLL AV LIPASAKTIVITETEN

Bered en olivoljeemulsion enligt följande:

Bered i mixer i 10 minuter en blandning av 165 ml lösning av gummi arabicum 100 g/l, 15 g krossad is och 20 ml av en neutraliserad olivolja.

Häll 10 ml av lösningen i en 50 ml glasbägare, tillsätt sedan 0,3 ml natriumkolatlösning på 0,2 g/ml och 20 ml destillerat vatten.

Placera bägaren i en termostat inställd på 37 °C. Sänk ned pH-elektroderna i bägaren och lägg i omröraren.

Tillsätt med hjälp av en byrett droppvis 0,1 N natriumhydroxidlösning tills pH går upp till 8,3.

Tillsätt en mängd lipassuspension i pulverform till vattnet (0,1 g/ml lipas). När pH-värdet uppmäts till 8,3, starta kronometern och tillsätt natriumhydroxidlösningen droppvis i den takt som krävs för att pH-värdet skall ligga kvar på 8,3. Anteckna varje minut mängden använd lösning.

Plotta mätvärdena i ett koordinatsystem med tiden på x-axeln och antal ml 0,1 N alkalilösning som gått åt för att bibehålla konstant pH på y-axeln. Resultatet skall bli en rät linje.

Lipasaktiviteten mätt i lipasenheter per mg erhålls genom följande formel:

där:

A är aktiviteten i lipasenheter/mg

V är antalet ml 0,1 N natriumhydroxidlösning per minut (grafisk beräkning)

N är normaliteten hos natriumhydroxidlösningen

m är massan i mg av försökslipaset

Lipasenheten definieras som den mängd enzym som frigör 10 mikroekvivalenter syra per minut.

▼M20 —————

▼M28









BILAGA IX

SPEKTROFOTOMETRISK UNDERSÖKNING I ULTRAVIOLETT LJUS

INLEDNING

Spektrofotometrisk undersökning i ultraviolett ljus kan ge information om kvaliteten på ett fett, dess grad av konservering och förändringar i fettet till följd av tekniska processer. Absorptionen vid de våglängder som anges i metoden beror på närvaron av konjugerade dien- och triensystem som erhålls vid oxideringsprocesser och/eller raffineringsprocesser. Absorptionen uttrycks som den specifika absorptionen

(absorptionen i en 1 % w/v lösning av fettet i ett angivet lösningsmedel, i en 10 mm kyvett) som konventionellt betecknas K (även kallad absorptionskoefficient).

1. SYFTE

Denna bilaga beskriver processen för att utföra en spektrofotometrisk undersökning av olivolja i det ultravioletta området.

2. PRINCIP

Ett prov löses i lämpligt lösningsmedel och lösningens absorbans mäts sedan vid de angivna våglängderna med rent lösningsmedel som referens.

Den specifika absorptionen vid 232 nm och 268 nm i isooktan eller 232 nm och 270 nm i cyklohexan beräknas för en koncentration av 1 % w/v i en 10 mm kyvett.

3. UTRUSTNING

3.1 En spektrofotometer för mätning av absorption på ultravioletta våglängder (220–360 nm), med en noggrannhet på 1 nm. En regelbunden kontroll rekommenderas av spektrofotometerns våglängds- och absorbansskalor samt av ströljus. 3.1.1 Våglängdsskala: Denna kan kontrolleras med hjälp av ett referensmaterial bestående av ett optiskt glasfilter innehållande holmiumoxid eller en holmiumoxidlösning (förseglade eller inte) som har distinkta absorptionsband. Referensmaterialen är utformade för kontroll och kalibrering av våglängdsskalor hos spektrofotometrar för synligt och ultraviolett ljus med nominella spektrala bandbredder på 5 nm eller mindre. Mätningarna sker i förhållande till luft i våglängdsområdet 640–240 nm, enligt instruktionerna i referensmaterialen. För varje ändring av spaltbredden görs en grundkalibrering med tom strålväg. Standardens våglängder anges i certifikatet för referensmaterialet. 3.1.2 Absorbansskala: Denna kan kontrolleras med hjälp av kommersiellt tillgängliga förseglade referensmaterial bestående av sura lösningar av kaliumdikromat i vissa koncentrationer och med certifierade absorbansvärden vid λmax (i form av fyra lösningar av kaliumdikromat i perklorsyra som är förseglade i fyra UV-kvartskyvetter för mätning av linjäritet och fotometrisk noggrannhet som referens i UV-ljus). Kaliumdikromatlösningarna mäts mot ett blankprov med den använda syran, efter grundkalibrering, enligt instruktionerna i referensmaterialen. Absorbansvärdena anges i certifikatet för referensmaterialet. En annan möjlighet att kontrollera svaret från fotocellen och fotomultiplikatorn är att göra på följande sätt: väg in 0,2000 g rent kaliumkromat för spektrofotometri och lös detta i 0,05N kaliumhydroxidlösning i en 1 000 ml mätkolv och späd till märket. Ta ut exakt 25 ml av lösningen, överför till en 500 ml mätkolv och späd upp till märket med samma kaliumhydroxidlösning. Mät absorptionen hos lösningen vid 275 nm med användning av kaliumhydroxidlösningen som referens. Den uppmätta absorptionen med användande av 1 cm kyvett bör vara 0,200 ± 0,005.

3.2 Rektangulära kvartskyvetter med lock för mätning av absorption på ultravioletta våglängder (220–360 nm) och med en optisk väglängd av 10 mm. När de är fyllda med vatten eller annat lämpligt lösningsmedel bör kyvetterna inte skiljas åt mer än 0,01 enheter.

3.3 Mätkolvar med ett graderingsmärke, kapacitet 25 ml, klass A.

3.4 Analysvåg med en noggrannhet av 0,0001 g.

4. REAGENSER

Om inget annat anges, använd vid analysen endast reagenser som är särskilt avsedda för analysändamål och destillerat eller avmineraliserat vatten eller vatten av motsvarande renhetsgrad.

Lösningsmedel: Isooktan (2,2,4-trimetylpentan) för mätningar vid 232 nm och 268 nm och cyklohexan för mätningar vid 232 nm och 270 nm, med en absorbans på mindre än 0,12 vid 232 nm och mindre än 0,05 vid 270 nm mot destillerat vatten, mätt i en 10 mm kyvett.

5. UTFÖRANDE

5.1 Provet måste vara helt homogent och får inte innehålla några suspenderade föroreningar. Om det inte är det, måste det filtreras genom filtrerpapper vid ca 30 °C.

5.2 Väg upp ca 0,25 g (med en noggrannhet av 1 mg) av det beredda provet och överför till en 25 ml mätkolv, späd till märket med det angivna lösningsmedlet och homogenisera. Den erhållna lösningen måste vara helt klar. Vid opalescens eller grumlighet filtreras lösningen genom filtrerpapper. Anm.: I allmänhet är en massa på 0,25–0,30 g tillräcklig för absorbansmätningar för jungfruolja och extra jungfruolja vid 268 nm och 270 nm. För mätningar vid 232 nm behövs vanligen ett prov på 0,05 g, varför två skilda lösningar vanligen bereds. För absorbansmätningar av olivoljor av pressrester, raffinerade olivoljor och blandade olivoljor, behövs normalt ett mindre prov, t.ex. 0,1 g, på grund av deras högre absorbans.

5.3 Om nödvändigt, korrigera baslinjen (220–290 nm) med lösningsmedel i båda kvartskyvetterna (prov och referens), fyll därefter kvartskyvetten med provlösningen och mät absorptionen vid 232, 268 eller 270 nm, med lösningsmedlet som referens. De uppmätta absorptionsvärdena måste ligga inom området 0,1–0,8 eller inom spektrofotometerns linjäritetsintervall, som bör kontrolleras. I annat fall måste mätningarna göras om med mer koncentrerad eller mer utspädd lösning.

5.4 Efter mätning av absorbansen vid 268 eller 270 nm, mät absorbansen vid λmax, λmax + 4 och λmax – 4. Dessa absorbansvärden används för att bestämma variationen hos den specifika absorptionen (ΔΚ). Anm.: λmax anses vara 268 nm för isooktan som används som lösningsmedel och 270 nm för cyklohexan.

6. REDOVISNING AV RESULTAT

6.1 Registrera specifik absorption (absorptionskoefficient) vid de olika våglängderna, beräknat enligt formeln där: Kλ = specifik absorption vid våglängden λ, Eλ = absorption uppmätt vid våglängden λ, c = lösningens koncentration i g/100 ml, s = väglängd för kvartskyvetten i cm anges med två decimaler.

6.2 Variation i specifik absorption (ΔΚ) Variationen hos den specifika absorptionens absolutvärde (ΔΚ) bestäms med hjälp av formeln: där Km är den specifika absorptionen vid våglängden för maximal absorption vid 270 nm och 268 nm beroende på vilket lösningsmedel som används. Resultaten bör anges med två decimaler.









BILAGA X

BESTÄMNING AV FETTSYRAMETYLESTRAR MED GASKROMATOGRAFI

1. SYFTE

I denna bilaga ges vägledning om bestämning med gaskromatografi av fria och bundna fettsyror i vegetabiliska fetter och oljor efter deras omvandling till fettsyrametylestrar (Fame).

De bundna fettsyrorna av triglycerider och, beroende på esterifieringsmetod, de fria fettsyrorna, omvandlas till fettsyrametylestrar, som bestäms genom kapillärgaskromatografi.

Den metod som beskrivs i denna bilaga möjliggör bestämning av fettsyrametylestrar från C12 till C24, inbegripet mättade, cis- och trans-enkelomättade och cis- och trans-fleromättade fettsyrametylestrar.

2. PRINCIP

Gaskromatografi (GC) används för kvantitativ analys av fettsyrametylestrar. Fettsyrametylestrar bereds enligt del A. De injiceras sedan i injektorn och förångas i denna. Separation av fettsyrametylestrar utförs på analyskolonner av bestämd polaritet och längd. En flamjoniseringsdetektor används för detektion av fettsyrametylestrar. Analysförhållandena anges i del B.

Väte eller helium kan användas som bärgas (mobil fas) i gaskromatografi av fettsyrametylestrar med flamjoniseringsdetektor. Väte påskyndar separation och ger skarpare toppar. Den stationära fasen är ett mikroskopiskt skikt som består av en tunn vätskefilm på en inert fast yta av kvartsglas.

När de förångade föreningar som analyseras passerar genom kapillärkolonnen interagerar de med den stationära fasen som täcker kolonnens inneryta. På grund av att olika föreningar interagerar på olika sätt eluerar de vid olika tidpunkter; detta kallas föreningens retentionstid för en given uppsättning analysparametrar. Jämförelsen av de olika retentionstiderna används för att identifiera de olika föreningarna.

DEL A

BEREDNING AV METYLESTRAR AV FETTSYROR FRÅN OLIVOLJA OCH FRÅN OLIVOLJA AV PRESSRESTER

1. SYFTE

Denna del beskriver framställningen av metylestrar av fettsyror. Den innefattar metoder för beredning av metylestrar av fettsyror från olivolja och olivolja av pressrester.

2. TILLÄMPNINGSOMRÅDE

Beredning av metylestrar av fettsyror från olivolja och olivolja av pressrester utförs genom transesterifiering i en metanollösning av kaliumhydroxid vid rumstemperatur. Behovet av rening av provet före transesterifieringen beror på provets innehåll av fria fettsyror och på vilken analysparameter som ska bestämmas; den kan väljas enligt följande tabell:







Kategori av olja Metod Jungfruolja med en halt av fria fettsyror på ≤ 2,0 % 1. Fettsyror 2. Transfettsyror 3. ΔECN42 (efter rening med kiselgel fastfasextraktion – SPE) Raffinerad olivolja Olivolja bestående av raffinerad olivolja och jungfruolja Raffinerad olivolja av pressrester Olivolja av pressrester Jungfruolja med en halt av fria fettsyror > 2,0 % Oraffinerad olivolja av pressrester 1. Fettsyror (efter rening med kiselgel SPE) 2. Transfettsyror (efter rening med kiselgel SPE) 3. ΔECN42 (efter rening med kiselgel SPE)

3. METOD

3.1 Transesterifiering i en metanollösning av kaliumhydroxid i rumstemperatur

3.1.1 Princip

Metylestrar bildas genom transesterifiering i en metanollösning av kaliumhydroxid som en mellanprodukt före förtvålning.

3.1.2 Reagenser

3.1.2.1 Metanol med en vattenhalt som inte överstiger 0,5 % (m/m).

3.1.2.2 Hexan för kromatografi.

3.1.2.3 Heptan för kromatografi.

3.1.2.4 Dietyleter, stabiliserad för analys.

3.1.2.5 Aceton, för kromatografi.

3.1.2.6 Elueringslösning för rening av oljan genom kolonnkromatografi/SPE-kromatografi, blandning hexan/dietyleter (87:13 v/v).

3.1.2.7 Kaliumhydroxid i metanollösning, ca 2 M: lös 11,2 g kaliumhydroxid i 100 ml metanol.

3.1.2.8 Kiselgelpatroner, 1 g (6 ml), för fastfasextraktion.

3.1.3 Utrustning

3.1.3.1 Provrör (volym 5 ml) med skruvkork försedd med teflonpackning.

3.1.3.2 Mätpipetter eller automatpipetter, 2 ml och 0,2 ml.

3.1.4 Rening av oljeprov

Vid behov renas proven genom att oljan får passera en kiselgelpatron för fastfasextraktion. Placera en kiselgelpatron (3.1.2.8) i en apparat för eluering i vakuum och skölj med 6 ml hexan (3.1.2.2); sköljningen utförs utan vakuum. Tillför olja (ca 0,12 g) löst i 0,5 ml hexan (3.1.2.2) i kolonnen. Låt lösningen tränga in i kiselgelen och eluera sedan med 10 ml hexan/dietyleter (87:13 v/v) (3.1.2.6). Homogenisera hela mängden eluat och dela upp det i två lika stora volymer. Låt den ena volymen avdunsta till uttorkning i en roterande evaporator under undertryck och i rumstemperatur. Lös återstoden i 1 ml heptan. Den erhållna lösningen är färdig för analys av fettsyror med gaskromatografi. Låt den andra volymen avdunsta och lös upp återstoden i 1 ml aceton för analys av triglycerider med vätskekromatografi (HPLC) om nödvändigt.

3.1.5 Utförande

Mät upp ca 0,1 g av oljeprovet i ett 5 ml provrör med skruvkork (3.1.3.1). Tillsätt 2 ml heptan (3.1.2.2) och skaka. Tillsätt 0,2 ml 2 M metanollösning av kaliumhydroxid (3.1.2.7), tillslut väl med en kork försedd med teflonpackning och skaka kraftigt i 30 sekunder. Låt provröret stå tills lösningens övre skikt har klarnat. Häll av det övre skiktet, som innehåller metylestrarna. Heptanlösningen är färdig att injiceras i kromatografen. Det är lämpligt att förvara lösningen i kylskåp fram till dess att analysen med kromatografi ska ske. Lösningen bör ej stå längre tid än tolv timmar.

DEL B

ANALYS AV FETTSYRAMETYLESTRAR MED GASKROMATOGRAFI

1. SYFTE

Denna del ger allmänna riktlinjer för tillämpning av gaskromatografi på kapillärkolonn för att bestämma den kvalitativa och kvantitativa sammansättning av en blandning av fettsyrametylestrar som erhållits i enlighet med den metod som anges i del A.

Delen är inte tillämplig på polymeriserade fettsyror.

2. REAGENSER

2.1 Bärgas

Inert gas (helium eller väte) som är omsorgsfullt torkad och med en syrehalt som är mindre än 10 mg/kg.

Anm. 1: Väte kan fördubbla analyshastigheten men är farlig. Säkerhetsanordningar finns att tillgå.

2.2 Supplementerande gaser

2.2.1 Väte (renhet ≥ 99,9 %) utan organiska föroreningar.

2.2.2 Luft eller syre utan organiska föroreningar.

2.2.3 Kväve (renhet > 99 %)

2.3 Standard för referens

Blandning av metylestrar av rena fettsyror eller metylestrar av ett fett av känd sammansättning, företrädesvis liknande det fett som ska analyseras. Cis- och transisomerer av metylestrar av oktadekensyra, oktadekadiensyra och oktadekatriensyra kan användas för att identifiera transisomerer av omättade fettsyror.

Försiktighet bör iakttas för att förhindra oxidation av fleromättade fettsyror.

3. UTRUSTNING

De anvisningar som ges här avser vanlig utrustning som används för gaskromatografi, som använder kapillärkolonner och en flamjoniseringsdetektor.

3.1 Gaskromatograf

Gaskromatografen ska bestå av följande enheter:

3.1.1 Injektionssystem

Använd ett injektionssystem med kapillärkolonner, varvid injektionssystemet bör vara speciellt konstruerat för användning med sådana kolonner. Injektorn kan vara med eller utan split.

3.1.2 Ugn

Ugnen ska kunna värma kapillärkolonnen till en temperatur av minst 260 °C och upprätthålla den önskade temperaturen inom 0,1 °C. Det senaste kravet är särskilt viktigt när kvartsrör används.

Användning av temperaturprogrammerad uppvärmning rekommenderas i alla fall och särskilt för fettsyror med mindre än 16 kolatomer.

3.1.3 Kapillärkolonn

3.1.3.1 Rör som är tillverkade av ett material som är inert för ämnen som ska analyseras (vanligen glas eller kvarts). Innerdiametern ska vara mellan 0,20 och 0,32 mm. Den inre ytan ska genomgå en lämplig behandling (t ex ytpreparering, inaktivering) innan den får täckning av den stationära fasen. En längd av 60 m räcker för fettsyror och cis- och transisomerer av fettsyror.

3.1.3.2 Stationär fas, polär polysiloxan (cyanopropylsilikon) tvärbundna kolonnfyllningar är lämpliga. Anm. 2: Det finns en risk att polära polysiloxaner kan ge upphov till svårighet att identifiera och separera linolensyra och C20-syror. Beläggningen ska vara tunn, dvs 0,1 till 0,2 μm.

3.1.3.3 Sammansättning och konditionering av kolonnen Följ de normala försiktighetsåtgärderna för att sätta ihop kapillärkolonnerna, dvs. placeringen av kolonnen i ugnen (bärare) val och sammansättning av skarvar (läckaget) placering av kolonnens in- och utlopp i injektorn och detektorn (minskning av dödutrymmen). Placera kolonnen i en ström av bärgas (t.ex. 0,3 bar [30 kPa] för en kolonn med längden 25 m och en innerdiameter på 0,3 mm). Behandla kolonnen genom temperaturprogrammering av ugnen till 3 °C/minut från omgivningstemperaturen till en temperatur som är 10 °C under sönderfallsgränsen för den stationära fasen. Håll ugnen vid denna temperatur i en timme, tills baslinjen har stabiliserats. Gå tillbaka till 180 °C för att arbeta under isoterma förhållanden. Anm. 3: Lämpliga förbehandlade kolonner finns tillgängliga i handeln.

3.1.4 Flamjonisationsdetektor och omformarförstärkare

3.2 Sprutor

Sprutorna ska ha en maximivolym av 10 μl med 0,1 μl gradering.

3.3 System för datainsamling

System för datainsamling, som är uppkopplade online med detektorer och används med en programvara som lämpar sig för integrering av toppar och normalisering.

4. UTFÖRANDE

De arbeten som beskrivs i 4.1 till 4.3 avser användning av en flamjoniseringsdetektor.

4.1 Provningsförhållanden

4.1.1 Val av optimala provningsförhållanden för kapillärkolonner

På grund av effektivitets- och permeabilitetsegenskaperna hos kapillärkolonnen är separationen mellan komponenterna och tiden för analysen i hög grad beroende av flödeshastigheten på bärgasen i kolonnen. Det är därför nödvändigt att optimera driftförhållandena genom att anpassa denna parameter (eller, enklare, tryckfallet i kolonnen) beroende på om man önskar förbättra separationen eller påskynda analysen.

Följande villkor har visat sig vara lämpliga för separation av fettsyrametylestrar (C4–C26). Exempel på kromatogram visas i tillägg B:







Injektortemperatur: 250 °C Detektortemperatur: 250 °C Ugnstemperatur: 165 °C (8 minuter) till 210 °C med 2 °C/min. Bärgas väte: tryck i kolonninloppet 179 kPa Totalt flöde: 154,0 ml/min Delningsförhållande: 1:100 Injektionsvolym: 1 μl

4.1.2 Bestämning av upplösningen (se tillägg A)

Beräkna upplösningen R för två angränsande toppar I och II med hjälp av formeln

R = 2 × ((dr(II) – d r(I))/(ω(I) + ω(II))) eller R = 2 × ((tr(II) – t r(I))/(ω(I) + ω(II))) (USP) (Förenta Staternas farmakopé),

eller

R = 1,18 × ((tr(II) – tr(I))/(ω0,5(I) + ω0,5(II))) (EP, BP, JP, DAB), (JP [Japanska farmakopén], EP [Europeiska farmakopén], BP [Brittiska farmakopén])

där:

d r(I) är retentionsavståndet för topp I,

d r(II) är retentionsavståndet för topp II,

t rI) är retentionstiden för topp I,

t r(II) är retentionstiden för topp II,

ω(I) är bredden av basen av topp I,

ω(II) är bredden av basen av topp II,

ω0,5 är toppbredden av den angivna föreningen, vid mitten av toppen,

Om ω(I) ≈ ω(II), beräkna R med hjälp av följande formler:

R = (dr(II) – d r(I))/ω = (dr(II) – d r(I))/4σ

där:

σ är standardavvikelsen (se tillägg A, figur 1).

Om avståndet dr mellan de två topparna d r(II) – d r(I) är lika med 4σ, är upplösningsfaktorn R = 1.

Om två toppar inte är helt åtskilda skär tangenterna till de två topparnas inflexionspunkter varandra i punkt C. För att de två topparna ska vara helt åtskilda, måste avståndet mellan de två topparna vara lika med:

d r(II) – d r(I) = 6 σ som ger R = 1,5 (se tillägg A, figur 3).

5. RESULTATANGIVELSER

5.1 Kvalitativ analys

Identifiera provets metylestertoppar från kromatogrammet i tillägg B, figur 1, om så behövs genom interpolering eller genom en jämförelse med dessa blandningar av metylestrar (som anges i punkt 2.3).

5.2 Kvantitativ analys

5.2.1 Bestämning av sammansättningen

Beräkna massfraktionen w i av de enskilda fettsyrametylestrarna, uttryckt som massprocent av metylestrar, enligt följande:

5.2.2 Beräkningssätt

5.2.2.1 Allmänt fall

Beräkna halten av en given komponent i, uttryckt som massprocent av metylestrar, genom att bestämma hur stor procentandel den motsvarande toppens area utgör i förhållande till summan av areorna för alla topparna, med användning av formeln:

wi = (Ai/ΣA) × 100

där:

Ai är arean under toppen för den enskilda fettsyrametylestern i,

ΣA är summan av areorna under alla topparna för samtliga enskilda fettsyrametylestrar.

Resultaten uttrycks med två decimaler.

Anm. 4: För fetter och oljor är massfraktionen av fettsyrametylestrar lika med massfraktionen av triglyceriderna i gram per 100 g. För de fall där detta antagande inte är tillåtet, se 5.2.2.2.

5.2.2.2 Användning av korrektionsfaktorer

I vissa fall, t.ex. i närvaro av fettsyror med färre än åtta kolatomer eller fettsyror med sekundära grupper, ska areorna korrigeras med specifika korrektionsfaktorer (Fci). Dessa faktorer ska fastställas för varje enskilt instrument. För detta ändamål ska lämpliga referensmaterial med certifierad fettsyrasammansättning i motsvarande intervall användas.

Anm. 5: Dessa korrektionsfaktorer är inte identiska med de teoretiska FID-korrektionsfaktorer som anges i tillägg A, eftersom de också innefattar injektionssystemets prestanda etc. När det gäller större skillnader, bör dock hela systemet kontrolleras med avseende på resultat.

För denna referensblandning erhålls massprocenten av Fame i genom formeln

wi = (mi /Σm) × 100

där

m i är massan hos Fame i i referensblandningen,

Σm är den totala massan av de olika komponenterna som Fame i referensblandningen.

Beräkna ur kromatogrammet för referensblandningen procenten per area för komponent Fame i på följande sätt:

wi = (Ai/ΣA) × 100

där:

Ai är arean för Fame i i referensblandningen,

ΣA är summan av areorna för alla fettsyrametylestrarna i referensblandningen.

Korrektionsfaktorn Fc är sedan

Fc = (mi × ΣA)/(Ai/Σm)

För provet är massprocenten av varje fettsyrametylester i:

wi = (Fi × Ai)/Σ (Fi × Ai)

Resultaten uttrycks med två decimaler.

Anm. 6: Det beräknade värdet motsvarar massprocenten av den enskilda fettsyran beräknad som triglycerider per 100 g fett.

5.2.2.3 Användning av intern standard

I vissa analyser (t.ex. där inte alla fettsyrorna är kvantifierade, såsom när syror med 4 och 6 kolatomer är närvarande tillsammans med syror med 16 och 18 kolatomer, eller när det är nödvändigt att bestämma den absoluta mängden fettsyror i ett prov) är det nödvändigt att använda en intern standard. Fettsyror med 5, 15 eller 17 kolatomer används ofta. Korrektionsfaktorn (om sådan finns) för den interna standarden bör bestämmas.

Massprocenten av komponenten i, uttryckt som metylestrar, erhålls genom formeln:

wi = (mIS × Fi × Ai)/(m × FIS × AIS)

där:

A i är arean för Fame i,

A IS är arean för den interna standarden,

F i är korrektionsfaktorn för fettsyran i, uttryckt som Fame,

F IS är korrektionsfaktorn för den interna standarden,

m är massan av provet, i milligram,

m IS är massan av den interna standarden, i milligram.

Resultaten uttrycks med två decimaler.

6. PROVRAPPORT

Provrapporten ska ange de metoder som används för framställning av metylestrarna och för gaskromatografanalysen. Den ska också ange alla driftsdetaljer som inte anges i denna standardmetod eller som betraktas som tillägg tillsammans med enskildheter om varje incident som kan ha påverkat resultaten.

Provrapporten ska innehålla all information som behövs för en komplett identifiering av provet.

7. PRECISION

7.1 Resultat av provningsjämförelse

Uppgifter om en jämförelse mellan laboratorier avseende metodens precision anges i bilaga C till standard IOC/T.20/Doc. Nr 33. De värden som härrör från denna provningsjämförelse behöver inte vara tillämpbara för andra koncentrationsintervall- och koncentrationsmatriser än dem som anges.

7.2 Repeterbarhet

Den absoluta skillnaden mellan två oberoende enskilda provresultat, som har erhållits med samma metod på identiskt provmaterial i samma laboratorium av samma person som använder samma utrustning inom en kort tidsintervall, kommer i högst 5 % av fallen att vara större än r som anges i tabellerna 1–14 i bilaga C till standard IOC/T.20/Doc. Nr 33.

7.3 Reproducerbarhet

Den absoluta skillnaden mellan två enskilda provresultat som har erhållits med samma metod på identiskt provmaterial i olika laboratorier av olika personer som använder olika utrustning, kommer i högst 5 % av fallen att vara större än R som anges i tabellerna 1–14 i bilaga C till standard IOC/T.20/Doc. Nr 33.









Tillägg A

Figur 1

Med ω0,5 bredd på halva höjden av triangeln (ABC) och b bredd på halva höjden av triangeln (NPM).







Figur 2 Figur 3









Till